(57)【要約】【課題】治療薬、診断薬のスクリーニング、老化研究に用いることができる非ヒト動物、細胞の老化モデルを提供することにある。【解決手段】ＳＴＡＭ１遺伝子のノックアウトマウスが、骨粗鬆症様の症状を呈することから、詳細に解析した結果、骨の異常のみではなく、胸腺萎縮等、老化に伴う様々な症状を有することが明らかとなった。そこで、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウス、ＳＴＡＭ１発現調節細胞を、治療薬、診断薬のスクリーニング、老化研究に用いる老化モデルとして提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＭ１遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とする老化モデル非ヒト動物。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１に記載の老化モデル非ヒト動物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の老化モデル非ヒト動物において、老化とは、骨粗鬆症、生殖細胞の機能障害、胸腺・脾臓・リンパの萎縮、皮膚萎縮、皮下脂肪消失、運動機能障害、記憶障害をいうことを特徴とする老化モデル非ヒト動物。
【請求項４】
加齢に伴う現象や老化抑制物質の効果を解析するために用いるＳＴＡＭ１遺伝子機能を欠損している、あるいは調節可能な老化モデル培養細胞。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載の老化モデル非ヒト動物、又は請求項４に記載の老化モデル培養細胞に被験物質を投与することを特徴とする老化抑制物質スクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載の老化モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、骨粗鬆症、生殖細胞の成熟障害、胸腺・脾臓・リンパの萎縮、皮膚萎縮、皮下脂肪消失、運動機能障害、記憶障害を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれか１項に記載の老化モデル非ヒト動物、又は請求項４に記載の老化モデル培養細胞に被験物質を投与することを特徴とする骨粗鬆症治療薬スクリーニング方法。
【請求項８】
ＳＴＡＭ１を正常に発現する非ヒト動物又は細胞株に被験物質を投与し、ＳＴＡＭ１発現を指標とする老化抑制物質スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＴＡＭ１の遺伝子をノックアウトした非ヒトモデル動物、及びＳＴＡＭ１遺伝子の機能を染色体上で欠損させた細胞、あるいは発現を調節した系を用いた老化物質のスクリーニング方法、及びこれら遺伝子機能の欠損に起因する疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＴＡＭ（signal transducing adapter molecule）１は、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＸＳＣＩＤ）の原因遺伝子であるサイトカイン共通受容体γｃ鎖に会合するＪａｋ３キナーゼの基質分子として単離同定された。ＳＴＡＭ１は、ＳＴＡＭ２とともにＳＴＡＭファミリーを形成し、ＳＨ３領域やＩＴＡＭ領域を含むチロシンクラスター領域、さらにＮ末側にＮＰＦ（Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｐｈｅ）モチーフを有している。ＩＴＡＭ領域を介してチロシンキナーゼであるＪａｋ2やＪａｋ３と会合することから、シグナル伝達系に関与することが示唆され、実際にin vitroの実験系でＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦを介したシグナル伝達経路の調節に関与することが示された（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、これらin vitroの実験系の結果から予測されることとは異なり、ＳＴＡＭ１を遺伝子操作によりノックアウトしたマウスでは、骨髄、脾臓、胸腺でのＴ細胞やＢ細胞の分化・成熟を４週齢で解析したところ、何ら異常は見られなかった。さらに、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、生下時は野生型マウスと明らかな差異はないものの３週齢頃より発育遅滞が明らかとなり、５週齢以降体重の増加が認められず、その後、６週齢以降死亡するマウスが現れ、平均７０日程度で死亡し、２４週齢までに全例死亡することが示されている（非特許文献２）。
【０００４】
また、病理組織学的な解析から、大脳海馬のＣＡ３領域の錐体細胞層が脱落することが明らかになった。ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスと野生型マウスは、生後３週齢まではＣＡ３錐体細胞に明らかな差異は認められないが、５~７週齢では、錐体細胞数が野生型に比べ明らかに減少し、９週齢ではほとんどの錐体細胞が脱落していた。
【０００５】
このようにＳＴＡＭ１ノックアウトマウス作製時には、該マウスの特徴として、大脳海馬ＣＡ３領域の異常、発育遅滞、早期に死亡するということが挙げられていた。
【０００６】
本発明者は、その後の詳細な研究からＳＴＡＭ１ノックアウトマウスには、先に得られていた上記のような海馬ＣＡ３領域での異常知見の他に、骨密度等、骨の形成異常が見られることを見出した。そして、早くから骨粗鬆症様の疾患を呈するという知見に基づき、さらに組織を詳細に解析した結果、胸腺や脾臓の萎縮等、老化に伴う現象が５週齢前後の非常に早い時期から見られることがわかった。また、運動機能障害、腎機能の低下等、老化とともに現れる諸現象も早期から現れることを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takeshita T.,  Biochem Biophys Res Commun. 1996, Vol. 225(3), p.1035-1039.
【非特許文献２】Yamada M. et al.,，Mol Cell Biol. 2001, Vol. 21(11), p.3807-3819
【非特許文献３】Kuro-o M., et al.,  Nature. 1997, Vol. 390(6655), p.45-51
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、かかる発見に基づき、ＳＴＡＭ１遺伝子を染色体上で欠損させたモデル非ヒト動物、特にマウスモデル、すなわちＳＴＡＭ１ノックアウトマウスを老化のモデルとして、治療薬、診断薬のスクリーニングに利用する方法を提供することにある。また、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスのみでなく、ＳＴＡＭ１欠損細胞、ＳＴＡＭ１を抑制あるいは過剰に発現させた細胞系を治療薬、診断薬の開発に利用する方法を提供することにある。
【０００９】
老化に伴う疾患は、高齢化社会において様々な問題を引き起こしており、老化に伴う疾患を治療するための新薬の開発が望まれている。今までに老化のマウスモデルとしては、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子を欠損させたマウスが知られている。
【００１０】
Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウスは、鍋島らにより単一遺伝子欠損により多彩なヒト老化症状を呈する遺伝子変異マウスとして報告されている（非特許文献３）。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックアウトしたマウスは、パーキンソン様の運動障害、骨粗鬆症、生殖細胞の成熟障害、胸腺の萎縮等、老化に伴って生じる様々な疾患が早期に現れ、平均６０日程度で死亡する。
【００１１】
今回、本発明者によって見出されたＳＴＡＭ１ノックアウトマウスにおける早老現象は骨粗鬆症様の病態、生殖細胞の成熟障害等、Ｋｌｏｔｈｏマウスと多くの類似点を有するものの、本発明のモデルマウスは動脈硬化を生じない等相違点も多い。このことは、ＳＴＡＭ１遺伝子の欠損による早老現象は、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子の欠損による早老現象とは異なる経路によるものであることを示唆している。したがって、ＳＴＡＭ１遺伝子を欠損したモデル動物、また、ＳＴＡＭ１遺伝子発現を制御した細胞系を用いることによって、Ｋｌｏｔｈｏマウスを用いた場合とは異なる経路による老化現象の研究が可能である。それにより、老化を抑制する新たな化合物をスクリーニングすること、老化に伴う症状を診断する新たな診断方法の確立が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ＳＴＡＭ１遺伝子を染色体上で欠損させたＳＴＡＭ１ノックアウトマウスを用いてＳＴＡＭ１の生理的機能を解明するために鋭意研究を進め、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスが骨に異常をきたしていることを新たに見出した。そして、病理組織学的解析、生化学的解析を行った結果、骨の異常だけではなく老化に伴って発症する様々な異常を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＳＴＡＭ１遺伝子機能を染色体上で欠損させた老化モデル非ヒト動物、特にＳＴＡＭ１ノックアウトマウスに関する。本発明で、老化とは骨粗鬆症、生殖細胞の機能障害、胸腺・脾臓・リンパ節の萎縮、皮膚萎縮、皮下脂肪消失、運動機能障害、記憶障害をさす。
【００１４】
本発明のＳＴＡＭ１ノックアウト非ヒト動物、すなわちＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、骨粗鬆症等、上記の加齢に伴う現象を早期から表現型として有する。したがって、ＳＴＡＭ１ノックアウト非ヒト動物、特にＳＴＡＭ１ノックアウトマウスを老化のモデル動物として用い、老化現象に関する解析を行うことが可能である。本モデル動物を用いることにより、複雑な生理現象の結果である「老化」を遺伝子レベルで捉え、解析することが可能となる。
【００１５】
本発明は、加齢に伴う現象や老化抑制物質の効果を解析するために用いるＳＴＡＭ１遺伝子機能を欠損、あるいは調節可能な培養細胞であることを特徴とする。
【００１６】
ＳＴＡＭ１遺伝子発現を欠損させることにより、マウスモデルで早老現象が生じることから、培養細胞でＳＴＡＭ１遺伝子機能を欠損、あるいはｓｉＲＮＡ等により、ＳＴＡＭ１発現を消失させる系を用いることによって、ＳＴＡＭ１と早老現象の関連を分子レベルで解析することが可能となる。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明の老化モデル非ヒト動物、又は培養細胞系に被験物質を投与することを特徴とする老化抑制物質、特に骨粗鬆症薬のスクリーニング方法であることを特徴とする。
【００１８】
ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの表現型である、骨粗鬆症、胸腺等の萎縮を老化の指標として、あるいは、培養細胞系では下流のシグナル伝達系の解析等により老化に伴う諸現象を抑制する化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。特に、本マウスは骨量、骨塩量、骨密度いずれも雌雄で差がなく低下しており、原発性骨粗鬆症の研究や治療薬の探索に有効である。骨粗鬆症は、Ｘ線等非侵襲的な診断方法により検査が可能であることから、モデル動物にスクリーニング化合物を投与しながら、経時的に観察、解析することが可能であり、個体レベルで化合物の投薬効果を観察するのに適している。
【００１９】
また、これら老化モデル非ヒト動物だけではなく、ＳＴＡＭ１欠損細胞株等、ＳＴＡＭ１発現を調節した細胞株、あるいはＳＴＡＭ１発現を指標に老化抑制物質のスクリーニングを行うことが可能である。培養細胞系を用いることにより、より多くの化合物のスクリーニングが可能となることから、老化を抑制する候補化合物の一次スクリーニングを効果的に行うことが可能である。
【００２０】
ＳＴＡＭ１欠損細胞株では、エンドサイトーシスされた分子の分解遅延が見られることが知られている。そこで、エンドサイトーシスされた分子の分解速度を指標として、老化抑制物質のスクリーニングを行うことが可能である。細胞株を用いることによって、簡便に多くの老化を抑制する候補化合物の一次スクリーニングを行うことができる。
【００２１】
また、本発明は、ＳＴＡＭ１を正常に発現する非ヒト動物又は細胞株に被験物質を投与し、ＳＴＡＭ１発現を指標とする老化抑制物質スクリーニング方法であることを特徴とする。
【００２２】
ＳＴＡＭ１欠損によって老化が促進されることから、ＳＴＡＭ１を正常に発現、あるいは強制発現させている培養細胞において、ＳＴＡＭ１発現を調節する物質をスクリーニングすることによって、老化を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】野生型（ＷＴ）及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウス（ＫＯ）の大腿骨のＣＴ画像を示す。
【図２】ＣＴ画像から算出した骨塩量、骨面積、骨密度を野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスで比較した図。（Ａ）は♂、（Ｂ）は♀の結果を示す。
【図３】野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの病理組織学的解析。（Ａ）精巣、（Ｂ）前立腺、（Ｃ）卵巣、（Ｄ）子宮。
【図４】野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの皮膚の病理組織学的解析。
【図５】野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの血液の生化学的解析。
【図６】野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの記憶行動解析。
【図７】野生型及びＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの破骨細胞分化解析。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の老化モデル非ヒト動物とは、ＳＴＡＭ１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたモデル動物であり、出生後早い時期に骨密度の低下、骨量の低下等を伴う骨粗鬆症様の症状や、胸腺、脾臓、リンパの萎縮、皮膚萎縮、皮下脂肪消失等、老化に伴う症状を呈する非ヒト動物をいう。
【００２５】
また、上記ＳＴＡＭ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＳＴＡＭ１をコードする非ヒト動物の遺伝子の全部、又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、生理的機能を有するＳＴＡＭ１発現を失った非ヒト動物をいう。
【００２６】
本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等のげっ歯目動物を具体的に上げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら例示に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例）
〔ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの作製方法〕
本発明で用いたＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの作成方法は非特許文献２に詳細を開示しているが、以下に簡単に説明する。また、ＳＴＡＭ１の発現を欠失させるようなゲノム構造であれば、これに限ることはなくどのようなものであってもよい。
【００２９】
ＳＴＡＭ１ｃＤＮＡの５’領域をプローブとして、λＦｉｘＩＩ  マウス１２９／Ｓｖゲノムライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)をスクリーニングすることによって、ＳＴＡＭ１遺伝子のゲノムＤＮＡを単離した。ターゲッティングベクターは、ｌｏｘＰ遺伝子とポリアデニレーション部位のないジフテリア毒素A鎖を備えたｐＧＫ−ｎｅｏカセットを用いて構築された。このコンストラクトを１２９／Ｓｖゲノムライブラリに由来するエクソン３と４を含む０．６−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩゲノム断片を置き換えた。コンストラクトはエレクトロポレーションで１２９/Ｓｖ由来のＪ１  ＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択した。相同組換えの有無をＳｏｕｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔで解析し、４つのＥＳクローンを同定した。選択した上記ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ/６の胚盤胞に注入し、キメラマウスを得るために仮親に移植した。得られた雄のキメラマウスはＣ５７ＢＬ/６のメスと交配し、ＳＴＡＭ１突然変異をヘテロ接合で有するＦ１マウスをＳｏｕｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔで同定し、相互交配しホモ接合のＦ２を得た。Ｆ２マウスの遺伝子型はＳｏｕｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔとＰＣＲによって確認した。
【００３０】
〔ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの表現型解析〕
（１）外見、解剖所見
すでに本発明者らにより、開示されているように、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、３〜４週齢までは正常に成長するが、その後、成長遅延が明らかとなる。５週齢のマウスでは、野生型に比べ平均２／３程度の体重しかない。また、行動も徐々に不活発となり、衰弱し、１０週齢で半数のマウスが死亡する。死亡時は成長遅延が見られるものの外見は正常である。また、成長遅延、衰弱死は雌雄の差なく現れる（非特許文献２）。
【００３１】
本発明者は、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスに骨の形態異常を新たに認めたことから、発育遅延が明らかとなる５週齢以降のマウスを解剖し、詳細に観察を行った。その結果、解剖時の所見としては、発育初期には胸腺は正常であるが、週齢を経るとともに萎縮が観察され、６〜９週齢ではかろうじて存在が確認できる程度となることが新たに明らかとなった。胸腺の萎縮は、マウスだけではなく、ヒトを含む哺乳動物で老化時に広く認められる現象であり、本マウスの老化表現型の特徴である。
【００３２】
また、子宮、卵巣も外観上の明らかな萎縮が見られる。生殖器のこのような変化も老化に伴う現象の１つである。
【００３３】
次に、各器官についての詳細な解析結果に関して述べる。
【００３４】
（２）骨
［方法］
骨の解析は、マイクロフォーカスＸ線ＣＴスキャナーを用いた断層画像撮影により行った。８週齢のマウスの大腿骨の断層画像をもとに、骨塩量、骨面積、骨密度を算出した。
【００３５】
［結果］
図１に示すのは、８週齢の野生型（ＷＴ）、又はＳＴＡＭ１ノックアウトマウス（ＫＯ）の大腿骨のＣＴスキャナーによる断層画像写真である。
【００３６】
雌雄ともにＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、骨の発達が悪く、骨の径が小さいことが観察される。骨の径は、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、野生型に比べ、約８５％程度の太さしかない。また、骨断面を観察するとＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは皮質骨が薄くなっている。
【００３７】
さらに、ここでは、図示しないが、軟Ｘ線写真を用いて解析したところ、骨幹部の長さが短くなっている。８週齢のマウスで比較したところ野生型では骨の長さが平均１．４ｃｍであるのに対し、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは平均１．０ｃｍと約７０％の長さしかない。
【００３８】
また、図２は、マイクロフォーカスＸ線ＣＴスキャナーにより算出した骨塩量、骨面積、骨密度を示している。ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスと野生型の骨塩量を比較すると、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの雄では６０％程度、雌では４０％程度しかなく、著しく減少していることが観察される。また、骨面積に関しても、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、雄では野生型の８０％程度、雌では６０％程度、骨密度については雄、雌ともに約７０％程度しかなく、顕著な減少が観察される。
【００３９】
上記骨の形成異常は雌雄ともに認められることから、原発性骨粗鬆症の研究や治療薬の探索に用いることができる。
【００４０】
（３）器官の病理組織学的解析
［方法］
マウスは脱血後、１０％フォルムアルデヒド‐ＰＢＳで固定した。各組織はパラフィン包埋し、５〜１０μｍの厚さにミクロトームで薄切した。５μｍの組織切片はヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行い、顕微鏡観察により解析した。
【００４１】
［結果］
（３−１）脳
脳組織に関しては３週齢までは、野生型、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスともにほとんど差が認められないが、５〜７週齢のＳＴＡＭ１ノックアウトマウスで多くのＣＡ３領域の錐体細胞層の脱落が見られる（非特許文献２参照。）。
（３−２）生殖器
雄の生殖器は、精巣、前立腺ともに成熟阻害が観察される（図３（Ａ）、（Ｂ））。精巣の萎縮は認められるものの精細管の萎縮は認められない。また、精子形成の低下が観察される。
【００４２】
雌では、卵巣、子宮の著しい萎縮が観察される（図３（Ｃ）、（Ｄ））。ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの卵巣には卵胞は観察されるものの、いずれも野生型マウスの卵巣内の卵胞と比較して小さく、成熟状態は不明である。子宮は、野生型マウスに比べ、子宮壁が薄く、発情休止期状態にある。
【００４３】
（３−３）胸腺
雌のＳＴＡＭ１ノックアウトマウスの胸腺は、６〜９週齢で萎縮が著しく、痕跡を含めて胸腺組織自体の確認ができなかった。これに対し、雄の胸腺は非常に萎縮していることが観察されたが、８週齢でも存在が確認できた。５週齢以下の幼若マウスでは、胸腺は野生型と差異がなく、Ｔ細胞も正常に分化していることが確認されていることから、５週齢以降、急激に胸腺の萎縮が起こるものと考えられる。なお、胸腺の萎縮に関する雌雄の差が何に由来するかが不明である。８週齢雄の胸腺の病理検査の結果、ノックアウトマウスでは著しい胸腺萎縮は認められるものの、組織構造の違いは認められなかった。
【００４４】
（３−４）脾臓・リンパ節
ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、脾臓、リンパ節の顕著な萎縮が認められる。白脾髄、赤脾髄ともに、顕著な萎縮が観察される。
【００４５】
（３−５）皮膚
図４に示すように、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、皮膚構造が菲薄化しているが、表皮層には違いは認められない。表皮より下層の組織構造に野生型との違いが認められ、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、真皮下に数層の未熟な脂肪細胞が存在するのみであり、皮下組織における脂肪の発達が認められない。
【００４６】
（３−６）その他
肝臓、胆嚢、腎臓、副腎、甲状腺は臓器の大きさが野生型に比べ小さいが、細胞の大きさ、組織構造の違い、病変等は認められなかった。心臓は、臓器全体及び心筋細胞は小さいが組織構造に違いは認められなかった。
肺、及び唾液腺、胃、小腸、大腸、すい臓等の消化器系臓器において、違い及び病変は認められない。また、組織の石灰化ならびに動脈硬化病変は認められなかった。
【００４７】
（４）血液の生化学的検査
［方法］
７〜９週齢のマウスの血液を自動分析機により血液検査を行った。
［結果］
血液中の成分について生化学的検査を行った。血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）、カルシウム（Ｃａ）、無機リン（ＩＰ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アミラーゼ（ＡＭＹ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、中性脂肪（ＴＧ）、血糖値（ＢＵＮ）の測定を行った。図５に結果を示す。
【００４８】
ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは尿素窒素（ＢＵＮ）の増加、及び血糖値（ＢＵＮ）の低下が顕著である。一般に尿素窒素が正常値よりも高い場合には、腎不全が疑われる。また、血糖値の低下も認められ、副腎皮質の機能低下も生じているものと考えられる。この結果は、組織学的には腎臓の異常は認められないものの、肉眼所見で腎臓の萎縮が認められるという解剖所見と良く一致している。
【００４９】
また、血中のＣａ濃度が、ノックアウトマウスで減少していることが認められるが、無機リン濃度は野生型と同程度である。Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウスでは、血中のＣａ濃度、無機リンの濃度ともに増加していることが報告されており、この点でも本発明のＳＴＡＭ１ノックアウトマウスと大きく相違する。ＳＴＡＭ１ノックアウトマウス、Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウス両者ともに骨粗鬆症様の症状を呈しているものの、Ｃａ代謝を示す血液検査の結果は異なっており、骨粗鬆症を引き起こす経路は違うものと考えられる。したがって、ＳＴＡＭ１老化モデルを用いることによって、Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウスとは異なる治療薬、診断薬のスクリーニングが可能になると考えられる。
【００５０】
（５）運動機能
［方法］
運動機能を測定するために、７〜８週齢のマウスを用いて野生型、ノックアウトマウスの平均の歩幅を測定した。歩幅はマウスの前足にインクを付け、紙の上を自由に歩かせ、歩幅の平均を算出した。
【００５１】
［結果］
野生型マウスの歩幅は平均３０ｍｍであるのに対し、ノックアウトマウスでは平均１９ｍｍと２／３以下の歩幅であった。ノックアウトマウスの体型が小さいことを考慮にいれても、運動機能が劣っているものと認められる。
【００５２】
（６）記憶
［方法］
７〜８週齢のマウスを用いて空間認知・記憶の指標となるＹ−迷路試験を行った。マウスをＹ字型の装置の中に置き、８分間にわたって迷路内を自由に探索させて、マウスが移動したアームを順番通りに記録し、３回連続して異なるアームへ進入した回数をアームへの総進入回数から１を引いた値で除したのち、１００を乗ずることで交替行動率(alternation behavior(%))を求めた。
【００５３】
［結果］
交替行動率は、野生型マウスで７５％であったのに対し、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは５５％で、野生型マウスに比較して空間認知・記憶力の低下が観察された（図６）。
【００５４】
ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスに見られる運動機能障害は、興奮症状であり、運動能力の低下ではない。したがって、探索行動そのものが低下しているわけではなく、上記結果は空間作業記憶が低下していることを示している。また、上記結果が海馬ＣＡ３領域の脱落とどのような関連があるかは、今後の研究課題である。
【００５５】
上記説明してきたとおり、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスは、非常に早期から老化に伴う諸症状が多発する。老化促進マウスとして先に発表されているＫｌｏｔｈｏマウスの表現型とは、いくつかの点で類似するものの、異なる点も多い。表１にＳＴＡＭ１ノックアウトマウスと、Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウスの表現型を比較する。
【００５６】
【表１】
2015012808.tif 000003
【００５７】
表１に見られるように、骨粗鬆症様の症状や、胸腺の萎縮等、老化に伴う現象がＳＴＡＭ１ノックアウトマウス、Ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウス両者で共通に観察される。しかしながら、生化学的検査結果等を参照すると、例えば血中のＣａ濃度等、Ｃａ代謝を示す検査値等に相違が見られることから、骨粗鬆症をはじめとする老化現象を引き起こす経路は異なっているものと考えられる。したがって、治療薬のスクリーニング等に用いれば、異なる治療薬を探索できる可能性が高い。
【００５８】
（７）細胞を用いた解析
破骨細胞分化
［方法］
７〜８週齢のマウスの骨髄細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の系において、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭα培地にＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫ  Ｌｉｇａｎｄを添加・培養して、破骨細胞へ分化させた。破骨細胞はＴＲＡＰ染色にて染色した。
【００５９】
［結果］
図７に示すように、野生型マウスでは破骨細胞分化が観察されたが、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは多核化は観察されるものの、破骨細胞への分化が不十分であった。また、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスにおいては多核の細胞の数も野生型に比較して減少していた。
【００６０】
ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、上記のように破骨細胞ならびに骨芽細胞の減少が見られ、そして、骨粗鬆症が観察される。このことは、骨代謝が全般的に低下していることを示すものであり、この病態は老人性の骨粗鬆症に類似している。
【００６１】
上記のように、ＳＴＡＭ１ノックアウトマウスでは、破骨細胞ならびに骨芽細胞の減少が見られることから、in vivo ならびにin vitroの系で骨粗鬆症治療薬のスクリーニングが可能である。
【００６２】
また、骨髄培養細胞のみではなく、ＳＴＡＭ１の発現が欠失、減少、増加している細胞を用いることによって、ＳＴＡＭ１遺伝子が関与する老化現象を調節する化合物を簡便にスクリーニングすることが可能であることはいうまでもない。
【００６３】
ＳＴＡＭ１発現を欠失させた細胞としては、本発明のモデル動物を作成する際に樹立されたＥＳ細胞クローンを挙げることができる。また、ｓｉＲＮＡ等を用いることによって、ＳＴＡＭ１発現を減少させることも可能である。遺伝子発現を増強させるには、発現ベクターにクローニングされたＳＴＡＭ１遺伝子を用いて、強制発現させる等、通常の遺伝子工学で用いられる方法によることができる。
【００６４】
本発明のＳＴＡＭ１遺伝子機能を欠損させたモデル動物は、老化に伴う様々な症状を呈することから老化モデルとして有用である。したがって、本発明の老化モデル動物を老化研究、老化抑制物質のスクリーニングに用いることができる。また、ＳＴＡＭ１発現を調節した細胞系を用いることによっても、簡便に老化抑制物質のスクリーニングを行うことができる。
【００６５】
本発明のモデル動物は、先に老化モデル動物として知られているＫｌｏｔｈｏと表現型で相違する点も有することから、老化を促進する経路が異なるものと考えられる。したがって、Ｋｌｏｔｈｏと異なる経路を通して効果を有する薬剤を探索することが可能であると考えられる。
【００６６】
また、本発明のモデルマウスだけではなく、ＳＴＡＭ１発現を欠失、減少、増加等、遺伝子やタンパク質の発現を調節した細胞を用いることによって、老化に関与する遺伝子の探索や、化合物のスクリーニングを行うことも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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