(57)【要約】      （修正有）【課題】非天然ヌクレアーゼを形成するためにＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（または、切断ハーフドメイン）を連結するためのリンカーを含む組成物及びその使用方法の提供。【解決手段】Ｎ末端及びＣ末端を有するＤＮＡ結合ドメインと、Ｎ末端及びＣ末端を有するＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素からの切断ドメインであって、前記切断ドメインの前記Ｎ末端領域中のアミノ酸残基が野生型と比較した場合に変更されているドメインと、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端と切断ドメインのＮ末端との間のＺＣリンカーと、を含む融合タンパク質、及び、細胞中の対象領域における細胞クロマチンの標的化切断方法。【選択図】図１
2015133974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端およびＣ末端を有するＤＮＡ結合ドメイン；
Ｎ末端およびＣ末端を有する切断ドメインであって、前記切断ドメインの前記Ｎ末端領域中のアミノ酸残基が野生型と比較した場合に変更されているドメイン；
ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端と切断ドメインのＮ末端との間のＺＣリンカー（配列番号２）
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記切断ドメインの前記Ｎ末端領域の変更が、１つ以上のアミノ酸残基の付加、１つ以上のアミノ酸残基の置換、野生型アミノ酸の欠失、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記切断ドメインが前記野生型切断ドメインと比較して３または５個の付加的アミノ酸残基を含む請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記付加的アミノ酸残基がアミノ酸残基ＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）（Ｘはプロリンまたはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である）を含む請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガータンパク質である請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記切断ドメインがＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素からの切断ドメインを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項７記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項９】
細胞中の対象領域における細胞クロマチンの標的化切断のための方法であって、
細胞クロマチンが対象領域で切断されるような条件下で細胞中の一対のヌクレアーゼを発現することを包含し、前記ヌクレアーゼが対象領域中の標的部位と結合し、さらに、少なくとも１つのヌクレアーゼが請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、方法。
【請求項１０】
両ヌクレアーゼが請求項１〜６記載の融合タンパク質を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼに関する標的部位が３〜９塩基対離れている請求項９記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）対象領域中の第一配列を選択すること；
（ｂ）前記第一配列と結合するために第一ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；
（ｃ）細胞中で第一融合タンパク質を発現すること（前記第一融合タンパク質は前記第一ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ハーフドメインを含む）；ならびに
（ｄ）細胞中で第二融合タンパク質を発現すること（前記第二融合タンパク質は第二ジンクフィンガー結合ドメインおよび第二切断ハーフドメインを含む）、
を含む請求項９記載の方法であって、細胞クロマチンが対象領域で切断されるよう、前記第一または第二融合タンパク質のうちの少なくとも１つが請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含み、さらに、前記第一融合タンパク質が第一配列と結合し、第二融合タンパク質が前記第一配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第二配列と結合する方法。
【請求項１３】
両融合タンパク質が請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞中にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む請求項１２または請求項１３記載の方法であって、前記ドナーポリヌクレオチドの全部または一部が切断後に対象領域中に組み入れられる方法。
【請求項１５】
ヌクレアーゼを産生するためのキットであって、１つ以上の容器中に含入される請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項７記載のポリヌクレオチド、任意のハードウェア、ならびにキットの使用のための使用説明書を包含するキット。
【請求項１６】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記述）
適用なし
【０００２】
本発明の開示は、ゲノムおよびタンパク質工学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
切断ドメインと操作可能的に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼは、ゲノム配列の標的化変更のために用いられてきた。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、外因性配列を挿入し、１つ以上の内因性遺伝子を不活性化し、変更された遺伝子発現パターンを有する生物体（例えば作物）および細胞株を作製する等のために用いられてきた。例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００７０１３４７９６号；同第２００８００１５１６４号および国際公開第２００７／１３９９８２号を参照されたい。
【０００４】
一対のジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、ゲノム配列を切断するために用いられる。この対におけるそれぞれのメンバーは、一般的には、ヌクレアーゼの１つ以上の切断ドメイン（またはハーフドメイン）と連結される、改変された（非天然）ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質がそれらの標的部位と結合する場合、それらのジンクフィンガータンパク質と連結される切断ドメインは、二量体化およびその後のゲノムの切断が、ジンクフィンガーヌクレアーゼの対の間で一般的に起こり得るよう、配置される。
【０００５】
ＺＦＮ対の切断活性は、ジンクフィンガーおよび切断ドメインを連結するリンカー（「ＺＣ」リンカー）の長さ、ならびに標的部位（結合部位）間の距離の両方に関連する、ということが示されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９；Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７を参照されたい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質（ＺＦＮ）の対を用いる場合、一般に利用可能なＺＣリンカーおよび切断ハーフドメインによる最適切断は、融合タンパク質に関する結合部位が（各結合部位の近い縁から測定して）５または６ヌクレオチド離れて位置する場合に得られている。例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４号を参照されたい。
【０００６】
したがって、人工ヌクレアーゼが、５ｂｐまたは６ｂｐ以外の結合部位分離で内因性ゲノム配列を切断し得る標的化修飾を可能にする方法および組成物に対する必要性が依然として存在する。異なる空間的配置を有する配列を標的にする能力は、切断され得るゲノム標的の数を増大する。異なる数の塩基対により分離される標的部位間の優先度の変更も、人工ヌクレアーゼをより大きな特異性で作用させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヌクレアーゼ、例えば従来のリンカーと比較して変更された標的部位分離（ｇａｐ）優先度を有するヌクレアーゼを形成するためにＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを連結するための組成物が、本明細書中で開示される。本開示は、対象領域における細胞クロマチンの標的化切断、および／または細胞中の対象予定領域での相同組換えのためのこれらの融合タンパク質の使用方法、およびその組成物も提供する。
【０００８】
したがって、一態様において、本明細書中に記載されるリンカーは、従来のＺＣリンカーを含み、さらに、切断ドメインのＮ末端領域を変更する配列を包含する。ある実施形態では、変更は、例えば、安定的なαらせん立体配座を採用し、および／または野生型切断ドメインのα立体配座を伸張するＮ末端配列を形成するために、Ｎ末端領域における付加または置換を包含する。したがって、Ｎ末端領域の変更は、野生型残基の付加、置換および／または欠失、例えばＦｏｋＩ切断ハーフドメインのＮ末端領域における野生型残基の欠失、ならびに付加的残基の挿入を包含し得る。ある実施形態では、切断ドメインは、野生型と比較して切断ドメイン中に３または５つの付加的アミノ酸残基を、例えばＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）（ここで、Ｘはプロリンまたはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である）を含む切断ドメインＮ末端領域を包含する。ある実施形態では、切断ドメインのＮ末端に対する変更は、図２または３に示されるものである。ある実施形態では、Ｎ末端領域に対する変更は、αらせんが切断ドメインのＮ末端領域中に形成されるようなものである。５または６塩基対分離されたＤＮＡ配列を切断するために二量体化するＺＦＮに組み入れられる以前に開示された切断ドメインと違って、本発明の開示の切断ドメインは、ＺＦＮの対の標的部位が５または６塩基対離れていない場合、標的化切断を可能にする。
【０００９】
Ｎ末端領域を変更することにより切断ドメインが生成される実施形態のいずれかにおいて、切断ドメインの野生型αらせん領域は変更され得ない。さらに、変更されたＮ末端領域は、野生型切断ドメイン中のＮ末端の大部分のらせんを伸張し得る（例えば、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインのＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫ配列へのＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）Ｎ末端の付加）らせんを形成するよう意図され得る。
【００１０】
別の態様では、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、改変されたジンクフィンガー結合ドメイン）、切断ハーフドメインおよび本明細書中に記載されるようなリンカーを含む融合ポリペプチドが提供される。
【００１１】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなリンカーまたは融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
さらに別の態様では、ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）および／または本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドも提供される。一実施形態では、細胞は、各々が本明細書中に開示されるような切断ドメインを含む一対の融合ポリペプチドを含む。
【００１３】
さらに別の態様では、対象領域における細胞クロマチンの標的化切断のための方法；相同組換えを細胞中で起こさせる方法；感染を治療する方法；および／または疾患を治療する方法が提供される。方法は、そのうちの少なくとも１つが本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカーおよび変更された切断ドメイン）を含む一対の融合ポリペプチドを発現するために細胞中の対象予定領域で細胞クロマチンを切断することを包含する。ある実施形態では、一融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカー、および切断ドメインの変更されたＮ末端領域）を含み、そして他の実施形態では、両融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカー、および切断ドメインの変更されたＮ末端領域）を含む。さらに、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関する結合部位が３、４、５、６、７、８、９またはそれより多くの塩基対離れている場合、融合ポリペプチド対は標的化領域を切断する。
【００１４】
本明細書中に記載されるようなリンカーを含むポリペプチドは、対象領域における細胞クロマチンの標的化切断、および／または細胞中の対象予定領域での相同組換えのための方法に用いられ得る。細胞としては、培養細胞、生物体中の細胞、ならびに細胞および／またはそれらの子孫が治療後に生物体に戻される症例における治療のために生物体から取り出された細胞が挙げられる。細胞クロマチン中の対象領域は、例えばゲノム配列またはその一部であり得る。
【００１５】
融合タンパク質は、例えば、細胞に融合タンパク質を送達することにより、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することにより、細胞中で発現され得るが、この場合、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである場合、転写され、細胞に送達されるＲＮＡ分子または細胞に送達されるＤＮＡ分子の転写物が翻訳されて、融合タンパク質を精製する。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示中の他の箇所で示される。
【００１６】
したがって、別の態様では、対象領域中の細胞クロマチンを切断するための方法は、（ａ）対象領域中の第一配列を選択すること；（ｂ）第一配列と結合するために第一ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；（ｃ）細胞中で第一融合タンパク質を発現すること（前記第一融合タンパク質は前記第一ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ハーフドメインを含む）；ならびに（ｄ）細胞中で第二融合タンパク質を発現すること（前記第二融合タンパク質は第二ジンクフィンガー結合ドメインおよび第二切断ハーフドメインを含む）を包含し、この場合、細胞クロマチンが対象領域で切断されるよう、融合タンパク質のうちの少なくとも１つが本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカーおよび切断ドメインの変更されたＮ末端領域）を含み、さらに、第一融合タンパク質が第一配列と結合し、第二融合タンパク質が第一配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第二配列と結合する。
【００１７】
他の実施形態では、開示は、（ａ）対象領域中の第一および第二配列を選択すること（ここで、第一および第二配列は２〜５０ヌクレオチド離れて存在する）；（ｂ）第一配列と結合するために第一ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；（ｃ）第二配列と結合するために第二ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；（ｄ）細胞中で第一融合タンパク質を発現すること（本明細書中に記載されるように、第一融合タンパク質は第一改変ジンクフィンガー結合ドメイン、第一ＺＣリンカーおよび第一切断ハーフドメインを含む）；（ｅ）細胞中で第二融合タンパク質を発現すること（第二融合タンパク質は第二改変ジンクフィンガー結合ドメイン、第二ＺＣリンカーおよび第二切断ハーフドメインを含む）による細胞クロマチンの切断方法であって、第一融合タンパク質が第一配列と結合し、第二融合タンパク質が第二配列と結合して、それにより、対象領域中の細胞クロマチンを切断する方法を提供する。ある実施形態では、第二融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、切断ハーフドメインも含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、対象領域中の細胞クロマチンの切断方法は、（ａ）対象領域を選択すること；（ｂ）対象領域中の第一配列と結合するために第一ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；（ｃ）対象領域中の第二配列と結合する第二ジンクフィンガー結合ドメインを提供すること（ここで、第二配列は、第一配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する）；（ｄ）細胞中で第一融合タンパク質を発現すること（本明細書中に記載されるように、第一融合タンパク質は第一ジンクフィンガー結合ドメイン、第一ＺＣリンカーおよび第一切断ハーフドメインを含む）；ならびに（ｅ）細胞中で第二融合タンパク質を発現すること（第二融合タンパク質は第二ジンクフィンガー結合ドメイン、第二ＺＣリンカーおよび第二切断ハーフドメインを含む）を包含し、この場合、第一融合タンパク質が第一配列と結合し、第二融合タンパク質が第二配列と結合して、それにより、対象領域中の細胞クロマチンを切断する。ある実施形態では、第二融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、切断ハーフドメインも含む。
【００１９】
例えば、標的化突然変異を導入するために、細胞クロマチンの領域を変更する方法も提供される。ある実施形態では、細胞クロマチンを変更する方法は、予定部位での細胞クロマチン中に二本鎖切断を作製するために１つ以上の標的化ヌクレアーゼを、ならびに切断の領域中の細胞クロマチンのヌクレオチド配列との相同性を有するドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入することを包含する。細胞ＤＮＡ修復工程は二本鎖切断の存在により活性化され、ドナーポリヌクレオチドは、切断の修復のための鋳型として用いられて、細胞クロマチン中へのドナーのヌクレオチド配列の全部または一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の配列は変更され得るし、ある実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に転換され得る。
【００２０】
標的化変更としては、点突然変異（すなわち、単一塩基対の、異なる塩基対への変換）、置換（すなわち、複数の塩基対の、同一長の異なる配列への変換）、１つ以上の塩基対の挿入、１つ以上の塩基対の欠失、ならびに前記配列変更の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、線状または環状であり、ならびに一本鎖または二本鎖であり得る。それは、裸核酸として、１つ以上の送達作因（例えば、リポソーム、ポロキサマー）との複合体として、細胞に送達され得るし、ウイルス送達ビヒクル、例えばアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）中に含入され得る。ドナー配列は、１０〜１，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数値のヌクレオチド）長の範囲であり得るし、またはそれより長い。
【００２２】
ある実施形態では、相同組換えの頻度は、細胞周期のＧ２期に細胞を休止することにより、および／または相同組換えに関与する１つ以上の分子（タンパク質、ＲＮＡ）の発現を活性化することにより、および／または非相同末端結合に関与するタンパク質の発現または活性を抑制することにより、増強され得る。
【００２３】
本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、融合タンパク質の第一および第二ジンクフィンガータンパク質は、２、３、４、５、６、７、８または９塩基対離れた標的部位と結合し得る。さらに、方法のいずれかにおいて、第二ジンクフィンガー結合ドメインは、第二配列と結合するよう改変され得る。
【００２４】
さらに、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、融合タンパク質は、単一ポリヌクレオチドによりコードされ得る。前記方法のいずれかに関して、細胞クロマチンは、染色体、エピソームまたは細胞小器官ゲノム中に存在し得る。細胞クロマチンは、任意の種類の細胞中に、例えば原核生物細胞および真核生物細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞（これらに限定されない）中に存在し得る。
【００２５】
別の態様では、本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカーおよび切断ドメインの変更されたＮ末端領域）、または本明細書中に記載されるようなリンカー（例えば、ＺＣリンカーおよび切断ドメインの変更されたＮ末端領域）をコードするポリヌクレオチド；補助試薬；ならびに任意に使用説明書および適切な容器を包含するキットが、本明細書中に記載される。キットは、１つ以上のヌクレアーゼまたはこのようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドも包含し得る。
【００２６】
本明細書中に記載されるタンパク質、方法およびキットのいずれかにおいて、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）は、ＴｙｐｅＩＩＳ切断ドメイン、例えばＦｏｋＩからの切断ハーフドメインを含み得る。
【００２７】
これらのおよび他の態様は、全体としての開示を考慮して、当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＣＣＲ５（配列番号１）中の標的部位と結合する例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼの配列を示す。ジンクフィンガードメインに、二重下線を付している。全ＦｏｋＩ切断ドメインに下線を付し、Ｎ末端領域には下線を付し且つ太字で示す。「ＺＣ」リンカー（ＬＲＧＳ；配列番号２）を、ジンクフィンガーと切断ドメインとの間の通常文字で示す。
【図２】「Ｌ６ａ」と呼ばれるリンカーなどの本明細書中に記載されるような例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼの配列を示す（配列番号３）。ジンクフィンガードメインに、二重下線を付している。全ＦｏｋＩ切断ドメインに下線を付し、野生型と比較した場合に変更を含むＮ末端領域には下線を付し且つ太字で示す。野生型と異なるアミノ酸を、イタリック体で示す（ＥＡＡＡＲ；配列番号５）。「ＺＣ」リンカー（ＬＲＧＳ；配列番号２）を、ジンクフィンガーと切断ドメインとの間の通常文字で示す。
【図３】「Ｌ７ａ」と呼ばれるリンカーなどの本明細書中に記載されるような別の例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼの配列を示す（配列番号４）。ジンクフィンガードメインに、二重下線を付している。全ＦｏｋＩ切断ドメインに下線を付し、野生型と比較した場合に変更を含むＮ末端領域には下線を付し且つ太字で示す。野生型と異なるアミノ酸を、イタリック体で示す（ＫＳＥＡＡＡＲ；配列番号６）。「ＺＣ」リンカー（ＬＲＧＳ；配列番号２）を、ジンクフィンガーと切断ドメインとの間のプレーンテキストで示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
人工ヌクレアーゼを形成するためにＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを連結するための組成物、ならびに、例えば、標的化切断と、その後の非相同末端連結による；標的化切断と、その後の外因性ポリヌクレオチド（細胞ヌクレオチド配列と相同性を有する１つ以上の領域を含む）およびゲノム配列間の相同組換えにより；１つ以上の内因性遺伝子の標的化不活性化による、これらのヌクレアーゼの使用方法が、本明細書中で開示される。
【００３０】
図２および３に示されるような例示的リンカーは、切断ドメインのＮ末端領域に対する変更を含む。変更は、ＺＦＮ標的部位が５または６塩基対より大きく（または少なく）離れている場合に切断する一対のＺＦＮの能力を増大する。したがって、本明細書中に記載されるあるリンカーは、ジンクフィンガー標的部位が５または６塩基対まで分離されない場合に切断活性を増大することにより、標的化ゲノム変更を実施する能力を有意に増大する。
【００３１】
概説
本明細書中に開示される方法の実行ならびに組成物の調製および使用は、別記しない限り、当業者の理解の範囲内である分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、コンピューター化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野における従来技術を用いる。これらの技法は、文献で詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的改訂版；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３２】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、線状または環状立体配座の、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本発明の開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定されるよう意図されるべきでない。本用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分で修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート主鎖）を包含し得る。概して、特定ヌクレオチドの類似体は同一塩基対合特性を有し、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
【００３３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００３４】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的、非共有的相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基と接触する）。このような相互作用は、一般的に、１０-6Ｍ―1またはそれより低い解離定数（Ｋd）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性増大は、低Ｋdと相関する。
【００３５】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有的に結合し得るタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体と結合し（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）、および／または、それは、異なるタンパク質の１つ以上の分子と結合し得る。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００３６】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その結合が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーにより配列特異的方法でＤＮＡを結合するタンパク質または大型タンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３７】
ジンクフィンガー結合ドメインは、予定ヌクレオチド配列と結合するよう「改変」され得る。ジンクフィンガータンパク質を改変するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されるジンクフィンガータンパク質は、その設計／組成が合理的判定基準から主に生じる天然でないタンパク質である。設計のための合理的判定基準としては、置換規則の適用、現行のＺＦＰ設計および結合データのデータベース分類情報における情報処理のためのコンピューターアルゴリズムが挙げられる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号も参照のこと。
【００３８】
「選択される」ジンクフィンガータンパク質は、その産生が主に経験的プロセス、例えばファージ表示、相互作用トラップまたはハイブリッド選択から生じる天然に見出されないタンパク質である。例えば米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１号；ＷＯ９６／０６１６６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ９８／５４３１１号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／６０９７０号；ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００３９】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る；線状、環状または分枝鎖であり得る、そして一本鎖または二本鎖であり得る、任意長のヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意長、例えば２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間のまたはそれより大きい任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、さらに好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長を有し得る。
【００４０】
「相同、非同一配列」は、第二配列と配列同一性度を共有するが、その配列が第二配列と同一ではない第一配列を指す。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同且つ非同一である。ある実施形態では、２つの配列の相同性の程度は、正常細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするのに十分である。２つの相同非同一配列は任意長であり得るし、それらの非相同度は、単一ヌクレオチドと同じくらい小さい（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の補正に関して）か、あるいは１０キロ塩基またはそれ以上という大きさ（例えば、染色体中の予定異所性部位での遺伝子の挿入に関して）であり得る。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一長である必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドの外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）またはヌクレオチド対が用いられ得る。
【００４１】
核酸およびアミノ酸配列同一性を確定するための技法は、当該技術分野で既知である。典型的には、このような技法は、遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を確定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を確定すること、そしてこれらの配列を第二ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを包含する。ゲノム配列も、この様式で確定され、比較され得る。概して、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、精確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性％を確定することにより比較され得る。２つの配列の同一性％は、核酸配列であれ、アミノ酸配列であれ、２つの整列配列間の精確な整合数を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けた値である。本明細書中に記載される配列に関して、所望の配列同一度の範囲は、約８０％〜１００％、そしてその間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性％は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００４２】
代替的には、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定二重鎖の形成とその後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）による消化、ならびに消化断片の確定を可能にする条件下で、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより確定され得る。上記の方法を用いて確定されるように、分子の限定長全体で、配列が少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、実質的には互いに相同である。本明細書中で用いる場合、実質的に相同であるとは、特定ＤＮＡまたはポリペプチド配列との完全同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、特定の系に関して定義されるように、例えば緊縮条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の理解の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００４３】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように確定され得る。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、標的分子との完全同一配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に抑制する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの抑制は、当該技術分野でよく知られたハイブリダイゼーション検定を用いて査定され得る（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。このような検定は、種々の程度の選択性を用いて、例えば、低緊縮から高緊縮に変わる条件を用いて、実行され得る。低緊縮条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在は、非特異的結合事象の非存在下で、第二プローブが標的とハイブリダイズしないよう、部分的程度の配列同一性をさえ欠く第二プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて査定され得る。
【００４４】
ハイブリダイゼーションベースの検定系を利用する場合、参照核酸配列と相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件を選択することにより、プローブおよび参照配列は、選択的に互いとハイブリダイズするかまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中等度緊縮ハイブリダイゼーション条件下で参照配列と選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的には、選択核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の欠失を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択核酸プローブの配列と約９０〜９５％以上の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の欠失を可能にする。プローブおよび参照配列が特定程度の配列同一性を有するプローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知であるように確定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００４５】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者によく知られている。ハイブリダイゼーション緊縮性は、ハイブリダイゼーション条件が不整合ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を退ける程度を指し、より高い緊縮性は不整合ハイブリッドに対するより低い耐容性と相関した。ハイブリダイゼーションの緊縮性に影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、例としては、温度、ｐＨ、イオン強度および有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に既知であるように、ハイブリダイゼーション緊縮性は、温度が高いほど、イオン強度が低いほど、および溶媒濃度が低いほど増大する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションのための緊縮条件に関して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断剤（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度およびパラメーター、ならびに種々の洗浄条件を変更することにより、特定の緊縮性を確立するために多数の等価の条件が用いられ得る、ということは当該技術分野で周知である。特定組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００４７】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるこのような交換の特殊化形態を指す。このプロセスは、ドナーから標的に遺伝情報を移動させるため、ヌクレオチド配列相同性を要し、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、そして「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として種々に知られている。如何なる特定の理論にも縛られるものではないが、このような移動は、切断標的およびドナー間に生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡの不整合補正、および／または「合成依存性鎖アニーリング」を包含し得るが、この場合、ドナーは、標的および／または関連プロセスの一部となる遺伝情報を再合成するために用いられる。このような特殊化ＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み入れられるよう、標的分子の配列の変更を生じる。
【００４８】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合主鎖の破損を指す。切断は、種々の方法、例えば、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解（これらに限定されない）により開始され得る。１本鎖切断および二本鎖切断はともに可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端を生じ得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために用いられる。
【００４９】
「切断ハーフドメイン」は、第二ポリペプチド（同一であるかまたは異なる）と協力して、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第一および第二切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、互換的に用いられて、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００５０】
「改変切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の改変切断ハーフドメイン）と絶対的へテロ二量体を形成するよう修飾された切断ハーフドメインである。米国特許出願公開第２００５００６４４７４号およびＷＯ２００７／１３９８９号（これらの記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【００５１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造物である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにタンパク質、例えばヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、この場合、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のうちの各々２つを含む八量体と会合された約１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体によって種々の長さを有する）がヌクレオソームコア間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと会合される。本発明の開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方の、全種類の細胞核タンパク質を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５２】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含む全染色体の収集物であるその核型を特徴とする。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００５３】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５４】
「接近可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子により結合され得る細胞クロマチン中の部位である。如何なる特定の理論にも縛られるものではないが、接近可能領域は、ヌクレオソーム構造中にパッケージされないものである。異なる構造の接近可能領域は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により検出され得る。
【００５５】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の部分を限定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００５６】
「外因性」分子は、細胞中に常態では存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的または他の方法により細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の正常な存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して確定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば機能バージョンの機能障害性内因性分子、機能障害バージョンの正常機能内因性分子またはオルソログ（異なる種からの機能バージョンの内因性分子）を含み得る。
【００５７】
外因性分子は、とりわけ、小分子（例えば組合せ化学プロセスにより生成される）、または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、または１つ以上の上記分子を含む任意の複合体）であり得る。核酸としてはＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、一本鎖または二本鎖であり得るし；線状、分枝鎖または環状であり得るし；任意の長さを有し得る。核酸は、二重鎖を形成し得るもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
外因性分子は、内因性分子と同一型の分子、例えば外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞中に導入されるプラスミドまたはエピソーム、あるいは細胞中に常態では存在しない染色体を含み得る。細胞中に外因性分子を導入するための方法は当業者に既知であり、脂質媒介性移入（すなわち、リポソーム、例えば中性および陽イオン性脂質）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
それに対して、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定発生段階で特定細胞中に常態で存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体または他の細胞小器官、あるいは天然エピソーム核酸を含み得る。付加的内因性分子は、タンパク質、例えば転写因子および酵素を包含し得る。
【００６０】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有的に、連結される分子である。サブユニット分子は、同一化学型の分子であり得るし、または異なる化学我他の分子であり得る。第一の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えばＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）、および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第二型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および小溝結合物質と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達に起因し得るし、あるいは細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因し得るが、この場合、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド結紮も、細胞中のタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に示されている。
【００６２】
本発明の開示の目的のための「遺伝子」としては、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域（このような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず）が挙げられる。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界領域、複製の起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を包含するが、これらに限定されない。
【００６３】
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物中への転換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、あるいはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集のようなプロセスにより修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチン化およびグリコシル化により修飾されるタンパク質も包含する。
【００６４】
遺伝子発現の「調整」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調整としては、遺伝子活性化および遺伝子抑圧が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子不活性化は、本明細書中に記載されるようなＺＦＰを含まない細胞と比較した場合の、遺伝子発現の任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００６５】
「真核生物」細胞としては、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
「対象領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば遺伝子、あるいは遺伝子内または遺伝子に隣接する非コード配列であり、ここは、外因性分子を結合するのが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。対象領域は、遺伝子のコード領域内、転写非コード領域、例えばリーダー配列、トレーラー配列またはイントロン内、あるいはコード領域の上流または下流の非転写領域内であり得る。対象領域は、単一ヌクレオチド対と同じくらい小さいか、または２，０００ヌクレオチド対長まで、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００６７】
「操作的連結」および「操作的に連結される」（または「操作可能的に連結される」）という用語は、２つ以上の構成成分（例えば、配列素子）の近位に関して、互換的に用いられるが、この場合、構成成分は、両構成成分が正常に機能し、そして構成成分のうちの少なくとも一つが、他の構成成分の少なくとも１つで発揮される機能を媒介し得る可能性を許すよう、整列される。例証として、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、転写調節配列、例えばプロモーターはコード配列と操作的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで操作的に連結されるが、それと直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続的でなくても、コード配列と操作的に連結される転写調節配列である。
【００６８】
融合ポリペプチドに関して、「操作的に連結される」という用語は、構成成分の各々が、そのように連結されなかった場合に成すのと同じ機能を、他の構成成分との連結において遂行する、という事実を指す。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合される融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合し得るが、一方、切断ドメインは標的部位に近接してＤＮＡを切断し得る場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは操作的転結で存在する。
【００６９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、未だ全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する未変性分子より多い、少ない、または同数の残基を保有し得るし、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えばコード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を確定するための方法は、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を確定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降検定により確定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動により検定され得る（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．上記、参照）。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば共免疫沈降、２−ハイブリッド検定または相補性（遺伝的および生化学的の両方）により確定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【００７０】
リンカー
ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質）およびヌクレアーゼ（例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン）を融合（連結）するアミノ酸配列が、本明細書中に記載される。
【００７１】
一般に、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてゲノム配列を切断する場合、最適切断は、５〜６塩基対隔たれた標的部位と、ジンクフィンガータンパク質が結合すると得られ、グリシンとセリンが豊富な可動性「ＺＣ」リンカーを用いて、その対の各ジンクフィンガーを切断ドメインと結びつける。特に、今日までに用いられた「ＺＣ」リンカーは、ジンクフィンガー結合ドメインのＣ末端と切断ドメインのＮ末端残基（ＦｏｋＩの場合、Ｑ残基である）との間のアミノ酸配列ＬＲＧＳ（配列番号２）からなる。例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４号およびＷＯ０７／１３９８９８号を参照されたい。
【００７２】
本明細書中に記載されるリンカーは、従来用いられているリンカーより剛直であり、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼの標的部位が５〜６塩基対離れていない場合、切断を可能にする。リンカー配列は、「ＺＣ」リンカーに付加的残基を付加することにより、例えば、アミノ酸残基（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）を、切断ドメインの最初の残基（Ｑ）に対するリンカー配列Ｎ末端に付加することにより、作製され得る。ジンクフィンガーおよび切断ドメイン間に付加される残基の数は、ある程度、切断ドメインに対してなされるアミノ酸変更によっている、ということは明らかである。例えば、残基が切断ドメインのＮ末端領域から欠失される場合、付加的残基がジンクフィンガーおよび切断ドメイン間に付加され得る。代替的には、残基が切断ドメインのＮ末端領域内に付加される場合（例えば、ＦｏｌＩ切断ドメインの最初の残基（Ｑ）に対してＣ末端）、ＺＣリンカー（または他の４残基配列）はジンクフィンガータンパク質および切断ドメイン間に用いられ得る。
【００７３】
本明細書中に記載されるリンカーは、選択切断ドメインのＮ末端領域を変更することによっても生成され得る。変更は、切断ドメインの１つ以上のＮ末端残基の置換、付加および／または欠失を包含し得る。ある実施形態では、切断ドメインはＦｏｋＩから得られ、野生型ＦｏｋＩ  Ｎ末端領域の１つ以上のアミノ酸が取り替えられて、付加的アミノ酸がこの領域に付加される。例えば、図２に示されるように、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインのアミノ酸残基４および５（すなわち、残基ＫおよびＳ）は、それぞれ残基ＥおよびＡに取り替えられ、残基ＡＡＲは第二置換残基に対してＣ末端に付加される。別の例示的実施形態（図３）は、ＦｏｋＩ切断ドメインのＮ末端領域における７つの残基挿入（ＫＳＥＡＡＡＲ；配列番号６）を包含する。
【００７４】
ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインをつなぐ配列は、ゲノム配列を二量体化するかおよび／または切断するためにその標的部位または切断ドメインと結合するＤＮＡ結合ドメインの能力を実質的に妨げない任意のアミノ酸配列を含み得る。野生型ＦｏｋＩでは、切断ドメインのＮ末端領域は、残基３８９〜４００（ＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫ；配列番号７）から伸びるαらせん領域を包含する（例えば、Ｗａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：９７−１００参照）。したがって、ある実施形態では、例えば、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインのＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫに３〜５アミノ配列Ｎ末端を挿入することにより、この構造モチーフを伸長するかまたは保存するよう、リンカー配列は設計される。
【００７５】
したがって、リンカーは、ＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）のような配列を含み得るが、ここで、Ｘ残基はα螺旋を形成する任意の残基、すなわち、安定α螺旋リンカーを形成するために、野生型α螺旋領域に隣接するプロリンまたはグリシン以外の任意の残基（例えば、ＥＡＡＡＲ（配列番号８））である。例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：８５１７−２４およびＭｅｒｕｔｋａ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：４２４５−８を参照されたい。ＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫペプチドに隣接して（またはその近くに）ＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）ペプチドを配置することは、ＦｏｋＩ切断ドメイン中にこのα螺旋を伸長するために設計される。これは、ＺＦＰおよびＦｏｋＩ切断ドメイン間により剛直なリンカーを作製し、このことが、長い可動性リンカーがＺＦＰおよびＦｏｋＩドメイン間に用いられる場合に観察され得る活性および特異性を損失することなく、半部位間に６ｂｐ以上を有して標的を結果的に生じるＺＦＮ対に切断させる（Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：２８９−２９７）。さらに、本明細書中に記載されるリンカーは、一般的ＺＦＮと比較して、５ｂｐ間隔を上回る６ｂｐ間隔に対するより大きな選択を示す。
【００７６】
典型的には、本発明のリンカーは、リンカー、およびリンカーアミノ酸配列を介して融合されるＤＮＡ結合ドメインをコードする組換え核酸を作製することにより作製される。任意に、リンカーは、ペプチド合成を用いても作製され、次いで、ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインに連結され得る。
【００７７】
ヌクレアーゼ
本明細書中に記載されるリンカー配列は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質をヌクレアーゼ切断ドメインまたはハーフドメインに連結して、特異的標的化非天然ヌクレアーゼを形成するために有益に用いられる。
【００７８】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書中に開示される方法に用いられ得る。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選り抜きの標的部位と結合するよう改変されるという点で、非天然である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。改変ジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。改変方法としては、合理的設計および種々の型の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計としては、例えば、三重鎖（四重鎖）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられるが、この場合、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列を結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合される。例えば、共有米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照（この記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
例示的選択方法、例えばファージ表示および２−ハイブリッド系は、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６．４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／８８１９７号およびＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の増強は、例えば共有ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００８０】
標的部位；ＺＦＰの選択、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に既知であり、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および２００６０１８８９８号（これらの記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【００８１】
さらに、これらのおよび他の参考文献中に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多指化ジンクフィンガータンパク質は、任意の適切なリンカー配列、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを用いて、一緒に連結され得る。６以上のアミノ酸長の例示的リンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９、６２６号；同第６，９０３，１８５号および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書中に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを包含し得る。
【００８２】
代替的には、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩのようなホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３；およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位を結合するよう改変され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：  ２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００８３】
Ｂ．切断ドメイン
本明細書中に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）は、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られる。切断ドメインが由来し得る例示的エンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば２００２−２００３カタログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：  ３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する付加的酵素が知られている（例えばＳ１ヌクレアーゼ；緑豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。１つ以上のこれらの酵素（またはその機能的断片）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として用いられ得る。
【００８４】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を要する、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。代替的には、２つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは、同一エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し、あるいは各切断ハーフドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。
【００８５】
さらに、それらのそれぞれの標的部位との２つの融合タンパク質の結合が、例えば二量体化により、切断ハーフドメインに機能的切断ドメインを形成させる互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインを配置するよう、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは互いに関して配置される。したがって、ある実施形態では、標的部位の近縁は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド分離される。しかしながら、任意整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介入され得る（例えば２〜５０ヌクレオチド対以上）。概して、切断の部位は、標的部位間にある。
【００８６】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多数の種において存在し、ＤＮＡとの配列特異的結合（制限部位での）、ならびに結合部位またはその近くでのＤＮＡの切断を可能にする。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖の上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、ならびに改変されることもされないこともある１つ以上のジンクフィンガードメインを含む。
【００８７】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な例示的ＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５）。したがって、本発明の開示の目的のために、開示された融合タンパク質に用いられるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物の細胞性配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質は、触媒的に活性名切断ドメインを再構成するために用いられ得る。代替的には、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一ポリペプチド分子も用いられ得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いる標的化切断および標的化配列変更に関するパラメーターは、この開示中の他の箇所で提供される。
【００８８】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【００８９】
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、国際公開番号ＷＯ０７／０１４２７５号（この記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。付加的制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは、本発明の開示により意図される（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０参照）。
【００９０】
ある実施形態では、切断ドメインは、例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４および２００６０１８８９８７に、ならびに米国特許出願第１１／８０５，８５０号（２００７年５月２３日出願）（これらの記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する１つ以上の改変切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための全ての標的である。
【００９１】
絶対的へテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的改変切断ハーフドメインとしては、第一切断ハーフドメインがＦｏｋＩの位置４９０および５３８のアミノ酸残基での突然変異を含み、第二切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９９での突然変異を含む対が挙げられる。
【００９２】
したがって、一実施形態では、４９０での突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）
に置き換え；５３８での突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；４８６での突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置き換え；そして４９９での突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換える。具体的には、一切断ハーフドメインにおける位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異化して改変切断ハーフドメインを産生することにより（「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる）、そして別の切断ハーフドメインにおける位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異化して改変切断ハーフドメインを産生することにより（「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる）、本明細書中に記載される改変切断ハーフドメインは調製された。本明細書中に記載される改変切断ハーフドメインは、異所性切断が最小限にされるかまたは廃止される絶対的へテロ二量体突然変異体である（例えばＷＯ０７／１３９８９８号の実施例１参照）。
【００９３】
本明細書中に記載される改変切断ハーフドメインは、例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４号（例えば、実施例５参照）およびＷＯ０７／１３９８９８号に記載されたような野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発により、任意の適切な方法を用いて調製され得る。
【００９４】
代替的には、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技法を用いて、核酸標的部位でｉｎ  ｖｉｖｏで集合され得る（例えば米国特許出願公開第２００９００６８１６４号参照）。このようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現構築物で発現され得るし、あるいは個々の構成成分が、例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により分離される１つのオープンリーディングフレーム中で連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのうちのドメインであり得る。
【００９５】
キット
本明細書中に記載されるリンカーのいずれかを含み、および／または上記方法のいずれかを実施するためのキットも提供される。キットは、典型的には、本明細書中に記載されるようなリンカー配列（または本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド）を含有する。キットは、リンカー単独を供給し得るし、またはＤＮＡ結合ドメインおよび／または選りすぐりのヌクレアーゼが容易に挿入されるベクターを提供し得る。キットは、細胞、細胞の形質転換のための緩衝液、細胞のための培地、および／または検定を実施するための緩衝液も含有し得る。典型的には、キットは、キットの他の構成成分に添付されるかそうでなければ添えられる使用説明書、包装または広告用チラシのような任意の構成要素を包含するラベルも含有する。
【００９６】
用途
開示されるリンカーは、例えば、切断のために用いられる一対のジンクフィンガータンパク質の標的部位が５または６塩基対離れていない場合、ＤＮＡを切断するためにジンクフィンガータンパク質と組合せて用いられるのが有益である。切断は、細胞クロマチン中の対象領域で（例えば、ゲノム中の、例えば遺伝子（突然変異体または野生型）中の所望のまたは予定の部位で）なされて；ゲノム配列（例えば、細胞クロマチン中の対象領域）を相同非同一配列に置き換え（すなわち、標的化組換え）；ゲノム中の１つ以上の部位でＤＮＡを切断し、次いで、切断部位が非騒動末端連結（ＮＨＥＪ）により連結されることによりゲノム配列を欠失し；相同組換えを促す細胞因子に関してスクリーニングし；および／または野生型配列を突然変異体配列に置き換えるか、あるいはある対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換し得る。このような方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；国際特許公開番号ＷＯ０７／０１４２７５号（これらの記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【００９７】
したがって、開示されるリンカーは、具体的には標的化切断が望ましい任意の方法のために、および／または任意のゲノム配列を相同非同一配列に置き換えるために、任意のＺＦＮ中で用いられ得る。例えば、突然変異体ゲノム配列は、その野生型対応物により置き換えられ、それにより、例えば遺伝子疾患、遺伝性障害、癌および自己免疫疾患の治療のための方法を提供し得る。同様にして、本明細書中に開示される方法および組成物を用いて、遺伝子の一方の対立遺伝子は異なる対立遺伝子に置き換えられ得る。実際、特定のゲノム配列に依っている任意の病態は、任意の方式で、本明細書中に開示される方法および組成物を用いて矯正されるかまたは軽減され得る。
【００９８】
例示的遺伝子疾患としては、軟骨形成不全、赤緑色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１０２７００）、副腎白質萎縮症、エカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファ地中海貧血、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈性右心室異形成、毛細管拡張性運動失調、バルト症候群、ベータ地中海貧血、青色ゴムまり様母斑症候群、キャナヴァン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ泣き症候群、嚢胞性繊維症、ダーカム病、外胚葉性異形成、ファンコーニ症候群、進行性骨化性繊維形成異常症、脆弱Ｘ染色体症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えばＧＭ１）、血色素症、ベータグロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、フルラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メービウス症候群、ムコ多糖沈着症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎原発性尿崩症、神経繊維症、ニーマン・ピック病、骨形成不全、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＤＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球病（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マジェニス症候群、スティックラー症候群、テイ・ザックス病、血小板減少性橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素回路障害、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッヒ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．３０８２４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
標的化ＤＮＡ切断および／または相同組換えにより治療され得る付加的疾患の例としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ・ザックス病）、ムコ多糖沈着症（ハンター病、フルラー病）、ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α−地中海貧血、β−地中海貧血）ならびに血友病が挙げられる。
【０１００】
感染または組込みウイルスゲノムの標的化切断を用いて、宿主におけるウイルス感染を治療し得る。さらに、ウイルスに対する受容体をコードする遺伝子の標的化切断を用いてこのような受容体の発現を遮断し、それにより、宿主生物体中のウイルス感染および／またはウイルス蔓延を防止し得る。ウイルス受容体（例えば、ＨＩＶに関するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）をコードする遺伝子の標的化突然変異誘発を用いて受容体をウイルスと結合できないようにさせて、それにより新規の感染を防止し、存在する感染の蔓延を遮断し得る（国際特許公開番号ＷＯ２００７／１３９９８２号参照）。標的化され得るウイルスまたはウイルス受容体の非限定例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、例えばＨＳＶ−１およびＨＳＶ２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。肝炎ファミリーのウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。その他のウイルスまたはそれらの受容体が標的化され、例としては、ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス等）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルス等）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラボドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス等）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス等）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス等）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ等としても既知）、ＨＩＶ−ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよびその他のウイルスの説明に関しては、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３rd  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）を参照されたい。ＨＩＶに対する受容体としては、例えばＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４が挙げられる。
【０１０１】
開示されたリンカーを含有するＺＦＮは、１つ以上のゲノム配列の（部分的または完全な）不活性化のためにも用いられ得る。不活性化は、例えば、単一切断事象により、切断とその後の相同末端連結により、２つの部位での切断と、その後の、２つの切断部位間の配列を欠失するための連結により、コード領域へのミスセンスまたはナンセンスコドンの標的化組換えにより、遺伝子または調節領域を分断するための、遺伝子またはその調節領域への無関連配列（すなわち、「スタッファー」配列）の標的化組換えにより、あるいは転写物のミススプライシングを引き起こすためのイントロンへのスプライス受容体配列の標的化組換えにより達成され得る。
【０１０２】
内因性遺伝子のＺＦＮ媒介性不活性化（例えば、ノックアウト）は、例えば、アポトーシスまたはタンパク質産生（例えば、フコシル化のような翻訳後修飾）に関与する遺伝子を欠く細胞株を生成するために用いられ得る。ＺＦＮ媒介性不活性化は、トランスジェニック生物（例えば、植物、齧歯類およびウサギ）を生成するためにも用いられ得る。
【０１０３】
さらに、ＺＦＮは２つの半部位間のＤＮＡに対する特異性を有するとは思われないため、結果的に生じる一本鎖オーバーハングが任意の所望の配列を有するようＤＮＡを切断するために、本明細書中に記載されるようなリンカーを有するＺＦＮが設計され得る。特に、本明細書中に記載されるようなリンカーは、開始配列に関してこれらの一本鎖オーバーハングのサイズおよび位置の両方に影響を及ぼすよう設計され得る。したがって、ＺＦＮ中に組み入れられる場合、本明細書中に記載されるようなリンカーは、切断後により均一な末端を生じ得る。したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、ＺＦＮを用いてＤＮＡをより効率的にクローン化するためにも用いられ、これは、バイオテクノロジーおよび基礎科学の多数の領域に広範に適用可能である。
【０１０４】
したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、遺伝子修飾用途におけるＺＦＮ媒介性切断を改善するための広範な有用性を提供する。本明細書中に記載されるようなリンカーは、標準クローニング、合成生物学のための大型ゲノムの構築、大型配列の新型ＲＦＬＰ分析における多数の用途に用いられるべき部位特異的突然変異誘発または標準クローニングにより、任意の現存ＺＦＮ中に容易に組み入れられ得るし、あるいは非常に大きなＤＮＡ配列を包含する新型のクローニングを可能にさえする。剛直リンカーを有するＺＦＮの潜在的特質も、ＤＮＡ計算のような用途において理想的であり得る。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：剛直リンカーを有するＺＦＮの設計および構築
ヒトＣＣＲ５遺伝子座に対して標的化されるジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を、ＷＯ２００７／１３９９８２号に開示されたように調製した。野生型構築物は、「ＺＣ」リンカーを包含した。「Ｌ６ａ」と呼ばれる剛直リンカーを有するＺＦＮ構築物を、図２に示す。「Ｌ７ａ」と呼ばれる剛直リンカーを有する構築物を、図３に示す。
【０１０６】
さらに、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア筋疾患、脳疾患、乳酸アシドーシスおよび卒中）を引き起こす突然変異を含有するヒトミトコンドリア中の配列に対して標的化されるＺＦＮの対も、Ｌ７ａを含むよう調製した。
【０１０７】
実施例２：ＺＦＮ活性
Ａ．ＣＣＲ５標的化ＺＦＮ
ＷＯ２００９／０４２１６３号に記載された酵母Ｍｅｌ−Ｉ受容体系で、ＣＣＲ５標的化ＺＦＮ  ＳＢＳ＃８２６６をコードする構築物を最初に試験した。特に、３、４、５、６、７または８ｂｐ離されたＳＢＳ＃８２６６標的部位の逆方向反復を有する酵母菌株を用いて、構築物を特性化した。
【０１０８】
野生型ＺＦＮ（標準ＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳリンカーを有する）は、５ｂｐおよび６ｂｐ半部位間隔で強力な活性を示した。さらに、Ｌ６ａリンカー配列を有する構築物（図２）は６ｂｐ間隔で活性を示し、Ｌ７ａリンカー配列（図３）は７ｂｐおよび８ｂｐ間隔で有意の活性を示した。
【０１０９】
ＭＥＬＡＳ標的化ＺＦＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ結合および切断活性も検定し、剛直Ｌ７ａリンカーを含むＺＦＮの対はそれらの標的を切断した。
【０１１０】
最後に、半部位間に種々の数の塩基対を含有する細胞株中の内因性ヒトＣＣＲ５遺伝子座でのＮＨＥＪ活性に関して、Ｌ７ａリンカーを含むＣＣＲ５  ＺＦＮを試験した。結果を、表１に示す。
【表１】
2015133974.tif 000003
【０１１１】
予測どおり、野生型ＺＦＮのみが、５また６ｂｐ離された半部位で高い活性を示した。しかしながら、剛直Ｌ７ａリンカーを含むＣＣＲ５標的化ＺＦＮは、７ｂｐ間隔で高い活性を、８ｂｐ間隔で顕著な活性を示した。７ｂｐ間隔でのＬ７ａ構築物の効率は、５ｂｐ間隔での野生型ＺＦＮ（野生型細胞株または半部位間に５ｂｐの異なる配列を有する細胞株で）の効率と非常に類似する、ということに留意すべきである。
【０１１２】
さらに、リンカーの組合せも、ＣＣＲ５標的化ＺＦＮ対で試験した。要するに、ＣＣＲ５  ＺＦＮ結合部位間に４〜８塩基対（ｂｐ）のギャップを有するよう、Ｋ５６２細胞を改変した。異なるリンカー組合せ（Ｗｔ／Ｌ７ａ）を有する２つのＣＣＲ５  ＺＦＮを、ＡｍａｘａシャトルによりこれらのＫ５６２細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に試料を採取して、ＣＥＬ１−Ｉ検定分析に付した。ＣＥＬ１−Ｉミスマッチ検定を、本質的にメーカーの使用説明書（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に従って実施した。
【０１１３】
Ｗｔ／ＷｔリンカーＺＦＮは５ｂｐギャップ標的配列で最高活性を有する；Ｌ７ａ／Ｌ７ａリンカーＺＦＮは７ｂｐギャップ配列で最高活性を有した；Ｗｔ／Ｌ７ａまたはＬ７ａ／Ｗｔリンカー組合せを有するＺＦＮは、６ｂｐギャップ配列で最高活性を有した、ということを、結果は示している。
【０１１４】
Ｂ．ＲＯＳＡ標的化ＺＦＮ
６ｂｐギャップを有する標的部位を用いて、Ａｍａｘａシャトルにより、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、ｍＲＯＳＡ標的化ＺＦＮの組合せ（例えば米国特許出願公開第２００７／０１３４７９６号参照）でトランスフェクトした。対の一方のＺＦＮは野生型リンカー（「ＺＣ」）を含み、他方は、野生型または本明細書中に記載されるようなＬ７ａリンカーを包含した。上記ならびに米国特許出願公開第２００７／０１３４７９６号に記載されたように、試料をトランスフェクション後３日目に採取し、ＣＥＬ−Ｉ分析に付した。
【０１１５】
以下の表２に示すように、一対のＺＦＮ中の野生型（ＷＴ）／Ｌ７ａリンカーは、６ｂｐギャップで活性である。
【表２】
2015133974.tif 000004
【０１１６】
Ｃ．ラットＩｇＭ
６ｂｐギャップを有する標的部位を用いて、Ａｍａｘａシャトルにより、ラットＣ６細胞を、ラットＩｇＭ標的化ＺＦＮの組合せ（例えば米国特許出願第６１／２０５，９７０号参照）でトランスフェクトした。対の一方のＺＦＮは野生型リンカー（「ＺＣ」）を含み、他方は、野生型または本明細書中に記載されるようなＬ７ａリンカーを包含した。上記ならびに米国特許出願公開第２００７／０１３４７９６号に記載されたように、試料をトランスフェクション後９日目に採取し、ＣＥＬ−Ｉ分析に付した。
【０１１７】
Ｌ７ａリンカーを含むＺＦＮの対を含有する細胞は、ＺＣリンカーを含む一対のＺＦＮを含有する細胞（１．９３％ＮＨＥジェイを示す）と比較して、２．４３％ＮＨＥジェイを示した。さらに、Ｌ７ａ含有リンカーＺＦＮ対を用いてラットＥＳ細胞に注射し（米国特許出願第６１／２０５，９７０号に記載）、これらのＥＳ細胞は、ホモ接合型ＩｇＭ遺伝子ノックアウトラット子孫を首尾よく産生した。
【０１１８】
本明細書中に記述した特許、特許出願および出版物は全て、その記載内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
理解を明快にするという目的のために図および実施例により多少詳細に開示を提供してきたが、本発明の開示の精神または範囲を逸脱しない限り、種々の変更および修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。したがって、前記の説明および実施例は、本発明を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2015133974000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月16日(2015.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端およびＣ末端を有するＤＮＡ結合ドメイン；
Ｎ末端およびＣ末端を有するＦｏｋＩ切断ドメインであって、前記切断ドメインの前記Ｎ末端領域中のアミノ酸残基が、野生型ＦｏｋＩ配列と比較した場合に変更されている配列を含み、前記変更された配列が、配列番号１の１６０〜１６９位に存在する、ドメイン；および
ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端と切断ドメインのＮ末端との間のＺＣリンカー（配列番号２）
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガータンパク質である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記切断ドメインがＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素からの切断ドメインを含む請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項４記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項６】
細胞中の対象領域における細胞クロマチンの標的化切断のための方法であって、
細胞クロマチンが対象領域で切断されるような条件下で細胞中の一対のヌクレアーゼを発現することを包含し、前記ヌクレアーゼが対象領域中の標的部位と結合し、さらに、少なくとも１つのヌクレアーゼが請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、方法。
【請求項７】
両ヌクレアーゼが請求項１〜３記載の融合タンパク質を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼに関する標的部位が３〜９塩基対離れている請求項６記載の方法。
【請求項９】
（ａ）対象領域中の第一配列を選択すること；
（ｂ）前記第一配列と結合するために第一ジンクフィンガー結合ドメインを改変すること；
（ｃ）細胞中で第一融合タンパク質を発現すること（前記第一融合タンパク質は前記第一ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ハーフドメインを含む）；ならびに
（ｄ）細胞中で第二融合タンパク質を発現すること（前記第二融合タンパク質は第二ジンクフィンガー結合ドメインおよび第二切断ハーフドメインを含む）、
を含む請求項６記載の方法であって、細胞クロマチンが対象領域で切断されるよう、前記第一または第二融合タンパク質のうちの少なくとも１つが請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含み、さらに、前記第一融合タンパク質が第一配列と結合し、第二融合タンパク質が前記第一配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第二配列と結合する方法。
【請求項１０】
両融合タンパク質が請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞中にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む請求項９または請求項１０記載の方法であって、前記ドナーポリヌクレオチドの全部または一部が切断後に対象領域中に組み入れられる方法。
【請求項１２】
ヌクレアーゼを産生するためのキットであって、１つ以上の容器中に含入される請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項４記載のポリヌクレオチド、任意のハードウェア、ならびにキットの使用のための使用説明書を包含するキット。
【請求項１３】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む請求項１２記載のキット。
【外国語明細書】
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