(57)【要約】毒性転写物の発現に基づく疾患の治療において使用される化合物を提供する。本発明は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、好ましくは、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡの予防及び／または治療のために設計されたペプチド分子、具体的にはヘキサペプチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ    ‥‥‥（Ｉ）
［式中、
Ａは、アミノ酸ｃまたはｐのいずれかであり、
Ｂは、アミノ酸ｐまたはｑのいずれかであり、
Ｃは、アミノ酸ｙであり、
Ｄは、アミノ酸ａまたはｔのいずれかであり、
Ｅは、アミノ酸ｑまたはｗのいずれかであり、
Ｆは、アミノ酸ｅである］
を有するヘキサペプチド、その薬学上許容される塩、誘導体または立体異性体を含む
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
配列番号１〜１９から選択されるいずれかの配列である
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘキサペプチドの配列が、配列番号１０の配列である
請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ヘキサペプチドの配列が、配列番号５、１１、１２、１５から選択されるいずれかである
請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
式Ｉの一部を形成する前記アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはそれらの混合物である
請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
ヘキサペプチドの配列が、ダイレクト配列またはレトロインベルソ配列であるペプチドを含む
請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物を含有する
ことを特徴とする医薬。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物を含有し、
病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡからなる群に含まれる疾患の予防及び／または治療において使用される
ことを特徴とする医薬。
【請求項９】
病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡからなる群に含まれる疾患の予防及び／または治療のために設計された医薬組成物の製造のために用いる
ことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物を含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡからなる群に含まれる疾患の予防及び／または治療のための方法であって、
請求項１ないし６のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物、または請求項１０に記載の医薬組成物の治療上有効な量を患者に投与する
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の発現に基づく疾患、例えば、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）及びフリートライヒ運動失調（ＦＡ）など、それぞれの予防及び／または治療において使用される、ヘキサペプチドを含む化合物に関する。
【０００２】
本発明は、一般的には医学の分野、詳しくは、遺伝性遺伝病の予防及び／または治療に関連する分野に含まれ得る。
【背景技術】
【０００３】
ＤＭ１、またはスタイナート病（ＤＭ１、ＯＭＩＭ番号１６０９００）は、成人人口において最も頻度の高いタイプの筋ジストロフィーであり、世界的な罹患率は８，０００人当たり患者１人程度であり、希少疾病として分類される。この疾患は神経筋疾患であり、主に筋肉に影響を及ぼす症状、例えば、筋緊張及び筋力低下などが定義されているが、他の器官及び系では、心臓系（心不整脈、視覚系（白内障）、内分泌系（高インスリン血症）及び生殖器系（性腺機能低下症）にも影響を及ぼす多系統疾患であることが特徴である。
【０００４】
遺伝子レベルでは、ＤＭ１は常染色体優性遺伝性であり、浸透度が高く、発現度の変動を示す。この疾患の起源は、１９ｑ１３．２−ｑ１３．３染色体領域に位置する、筋緊張性異栄養症プロテインキナーゼ遺伝子（ＤＭＰＫ、Ｅｎｔｒｅｚ番号１７６０）の非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ）内での動的突然変異にある。前記突然変異は、前記ＤＭＰＫ遺伝子のエキソン１５におけるＣＴＧトリヌクレオチドのリピートの異常伸長からなり、そのリピートは、健康な集団では５〜３５コピーの間の様々な数で見られるのに対し、患者ではその数は５０を超える。ＣＴＧトリプレットの数は、症状の重篤度及びこれらが現れる年齢と相関している。例えば、リピートの数が５０〜数百の間にわたる場合には、成人発症型ＤＭ１と呼ばれ、最初の臨床兆候は通常１０代で現れる。リピートの数がより多く、何千コピーにも達している場合には、その病理は、先天型ＤＭ（ＣＤＭまたはトムゼン病）として生まれたときから現れる。先天型ＤＭはこの疾患の最も重篤な異型であり、例えば、とりわけ、精神遅滞、呼吸器障害及び筋肉分化問題などの症状がある。
【０００５】
近年では、ＤＭ１の発症に関連する分子機構に関して複数の仮説が提示され、最も大きなコンセンサスを得たものとしては、ＲＮＡ毒性機能獲得(RNA toxic gain-of-function)がある。この機構によれば、ＣＵＧ伸長を有するＲＮＡはヘアピンループを形成し、これらのループはそのＲＮＡを発現する細胞に対して毒性があり、分子変化の中でもとりわけ、その調節因子を隔離することによって、特定の転写物の選択的スプライシングの変化を引き起こす。トランスジェニックマウスについての非特許文献１の研究では、この仮説の決定的な裏付けがなされている。前記マウスは、異種ｍＲＮＡにおいておよそ２５０のＣＵＧトリヌクレオチドリピートを発現し、ＤＭ１に典型的な筋緊張及び筋異常を生じるが、これにより、ＣＵＧ伸長はそれらの状況に関係なくそれら自体で毒性作用を発揮することが示されている（非特許文献１）。それ以降、ショウジョウバエ(Drosophila)で作製された他のモデルによってＤＭＰＫとは無関係にＣＵＧリピートの毒性が確認された（非特許文献２）。
【０００６】
ＣＵＧ伸長を有するＲＮＡは細胞に対して毒性であり得るという発見以来、一連の科学的証拠全体を見れば、これらの伸長、または他のＲＮＡでの類似の伸長は、ＤＭ１と類似した遺伝性遺伝病理を引き起こし得るという仮説が裏付けられている。例えば、ＤＭ２では、ＺＮＦ９（ジンクフィンガータンパク質９、Ｅｎｔｒｅｚ番号７５５５）遺伝子から転写されたＲＮＡの第１イントロンにおけるＣＣＵＧテトラヌクレオチドの伸長は、ＤＭ１と極めてよく似た病理を誘発する（ＯＭＩＭ番号６０２６６８）。実際、技術の現状においては、ＤＭ１患者及びＤＭ２患者の両方においてレベルの変化を示す、神経機能に関連する遺伝子が存在することが知られており、これによって、両方の疾患に共通した発症機構という見解が支持される。
【０００７】
その一方で、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８、ＯＭＩＭ番号６０３６８０）は、ＳＣＡ８遺伝子の非コード転写物におけるＣＴＧトリプレットの伸長によって起こる神経変性疾患である。この遺伝子の双方向転写によって、ＣＵＧ伸長を有するＲＮＡ（非翻訳型）（ＤＭ１に関して記載したものに関連する分子変化を誘発する）とＣＡＧ伸長を有する転写物（ポリグルタミンを有するタンパク質へと翻訳される）の両方の発現がもたらされることが見出されている。
【０００８】
核内では、ＣＵＧ伸長を有するＲＮＡは、ＲＮＡ結合因子の結合及び隔離が可能なヘアピンループ構造を形成するように折り畳まれ、大きなリボヌクレオタンパク質封入体を形成する。これまでに、ＣＵＧリピートが、転写因子及び選択的スプライシング因子を含む、核タンパク質の増数活性を阻害することが開示されている。選択的スプライシング因子としては、ｈｎＲＮＰ  Ｆヘテロ核リボヌクレオタンパク質、ｈｎＲＮＰ  Ｈヘテロ核リボヌクレオタンパク質、及びＭＢＮＬ１−３（Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様タンパク質）ファミリーに属するタンパク質が挙げられる。この隔離のために、患者は何百もの特異的転写物の選択的プロセシングの違いを示し、これによって、スプライスオパシー(spliceopathy)という用語が造り出された。その記載された最初の例がＤＭ１である。また、種々のマイクロＲＮＡの活性が変更され得ることも提示されている。
【０００９】
核タンパク質は隔離によって、細胞において正常な機能を果たせなくなる。in  vitro及びin  vivoの両方で二本鎖ＣＵＧヘアピンループと結合し得るいくつかのタンパク質が単離及び同定されている。これらには、特異性タンパク質１（Ｓｐ１）、レチノイン酸受容体ガンマ（ＲＡＲγ）ならびにシグナル伝達兼転写活性化因子ファミリーメンバーＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３などの転写因子が含まれる。これらの因子のいくつかは、培養下のＤＭ１細胞において最大９０％の隔離を受ける可能性があり、この隔離によって、それらの因子は標的遺伝子の転写を活性化できなくなり、その結果、標的遺伝子の発現が低下することになる。
【００１０】
ＤＭ１において変更される他の転写因子として、ＮＫＸ２−５及びＭｙｏＤがある。これらのタンパク質はそれぞれ、心臓の発生・伝導及び筋芽細胞の分化と関連している。患者においてＮＫＸ２−５のレベルは増加しているのに対し、ＭｙｏＤは低下している。これらの転写因子のレベルが脱調節される理由、ならびにＣＵＧヘアピンループ形成とのそれらの関わりは不明である。
【００１１】
これまでに、いくつかの研究によって、ＣＵＧリピートが多数の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが証明されている。マウスマイクロアレイを用いて、伸長ＣＵＧ転写物の発現によって変更されている少なくとも１７５の筋肉転写物が検出された。さらに、ＭＢＮＬ１ノックアウトマウスにおいても少なくとも１２８の転写物が脱調節されており、これによって、隔離及び続いて起こるＭＢＮＬ１機能喪失がその疾患において重要な役割を果たすことが示唆される。
【００１２】
ＭＢＮＬ１ノックアウトマウスは、虹視型白内障を示し、筋緊張及び筋肉レベルでの組織学的異常を抱えている。ＭＢＮＬ２ノックアウトマウスもまた、ＤＭ１に典型的な筋緊張（Ｃｌｃｎ−１転写物の不適切なプロセシングによる）及び他の筋変化を起こす。加えて、２５０のＣＴＧリピートを発現するモデルマウスにおけるＭＢＮＬ１の過剰発現は、少なくとも４つの転写物（Ｓｅｒｃａ１、Ｃｌｃｎ１、Ｔｎｎｔ３及びＺＡＳＰ）のプロセシングにおける異常、ならびに筋緊張を元の状態に戻す。ショウジョウバエでは、ｍｂｌ変異胚は、筋節Ｚ帯の構成不足、腹部の過剰収縮、ならびにＺＡＳＰ、トロポニンＴ（ｔｎＴ）及びα−アクチニンなどの転写物の選択的プロセシングにおける変化を示す。同様に、４８０のＣＴＧリピートを発現するモデルハエにおけるＭＢＮＬ１の過剰発現は、それらのリピートによって起こる表現型を抑制する。これらの結果は全て、ＤＭ１の研究において重大な変化をもたらし、それ以降、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ（Ｍｂｌ）タンパク質はその疾患の発症において決定的な要素であると考えられた。
【００１３】
ＤＭは１９０９年に始めて報告されたが、利用できる有効な治療はまだない。適用される全ての治療は一時しのぎの手段であり、症状の発生の抑制に寄与するが、その発現を予防したり、またはその疾患を確定した方法で治療したりするものではない。現在のところ、筋緊張を軽減するために塩素コンダクタンスの欠如を元の状態に戻すことが可能な化合物はない。この症状を治療するためには、インパルスの開始及び伝播に必要なナトリウム流入を阻害するいくつかの化合物、例えば、メキシチール、キニジン、フェニトイン、プロカインアミドまたはカルバマゼピンなどが患者に投与される。同様に、心不整脈の治療として前記分子が使用されることもあるが、結果として、心機能に対するそれらの作用からそれに伴うリスクを考えると、筋緊張緩和薬としてそれらを使用することは避けることが好ましい。さらに、これらの治療の多くは筋力を低下させる。もう１つのナトリウムチャネル遮断薬であるデヒドロエピアンドロステロンスルファート（ＤＨＥＡＳ）は、患者において試験され、筋力低下を促進することなく筋緊張及び心臓の問題を軽減することに成功したようである。ＤＨＥＡＳは、血清中に豊富に存在するステロイドホルモンであり、そのレベルは年齢に伴って低下する。ＤＭ１患者では、このホルモンは最大６０％低下している。さらに、ＤＨＥＡＳの有効用量は非常に高く、この理由から、静脈内経路によって投与しなければならず、長期治療としての使用には不都合となる。場合によっては、筋力を高めるために、ＤＨＥＡＳと一緒にクレアチニンが投与される。しかしながら、患者においてクレアチニンを用いた１回目の臨床試験では有望な結果が示されたものの、その後の試験は肯定的なものではない。筋緊張の治療について試験された他の薬物としては、三環系抗鬱薬、ベンゾジアゼピン、カルシウムイオン拮抗薬、タウリンまたはプレドニゾンが挙げられるが、一貫した結果は得られていない。
【００１４】
主な疾患誘因として隔離及び続いて起こるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質の機能喪失が提示されている上記疾患の作用機序に基づいて、ＭＢＮＬ１とＣＵＧリピートを有するヘアピンループとの間の相互作用を阻害する分子を見つけるためも戦略が開発された。このようにして、in  vitroで前記相互作用を阻害することが可能な化合物が同定された。配列（（Ｑｕｉｎ／Ｐｉｐ）−（Ａｓｎ／Ｐｒｏ）−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ）を有する分子では、リピートとの結合においてＭＢＮＬ１をシフトさせることが可能であった。さらに、抗生物質であるペンタミジン及びネオマイシンＢ、ならびに臭化エチジウム及びチアゾールオレンジでは、ＭＢＮＬ１とＣＵＧリピートとの結合が阻害された。さらに、ペンタミジンは、培養下のＨｅＬＡ細胞においてＩＲ転写物及びＴＮＮＴ２転写物のスプライシング異常を元の状態に戻し、ＭＢＮＬ１を含有する核内封入体の形成を２１％減少させる。また、ＤＭ１モデルマウスにおいて、ペンタミジンは、大きくはないが、明らかな用量応答なく、Ｃｌｃｎ−１及びＳｅｒｃａ１のスプライシングを向上させた。このように、ペンタミジンは、in  vivoでＣＵＧリピートに対して潜在的治療効果を有する、in  vitroで同定された最初の分子例である。しかしながら、この分子は、リピートの不在下でＭＢＮＬ１の他の標的転写物のプロセシングに影響を及ぼし得るため、その長期的な治療価値は減殺されるであろう。ＣＴＧリピート及び／またはＣＵＧリピートの三次元構造に基づいている分子もまた、技術の現状において開発されており、その標的はＴ−Ｔ非対合またはＵ−Ｕ非対合であった。Ｇ−Ｇ、Ｃ−ＣまたはＡ−Ａと結合可能な小分子はすでに知られているが、これまでに、Ｔ−ＴまたはＵ−Ｕと選択的に結合する化合物は見出されていなかった。例えば、トリアミノトリアジン（Ｔ−Ｔ及びＵ−Ｕと相互作用する）とアクリジン（インターカレート剤）によって形成されるリガンドはＣＴＧリピート及びＣＵＧリピートと特異的にかつ他の配列に比べて高い親和性で結合することが示された。
【００１５】
さらに、技術の現状において、ＣＵＧリピート及びＣＡＧリピートと結合し、どちらの場合でもＲＮＡ−ＭＢＮＬ１複合体の形成を阻害することが可能である化合物Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８ペンタマーの設計が開示されている。この分子は、少なくともマウス筋芽細胞において透過性であり、毒性を示さなかった。これと並行して、２つのピリミジンリッチ内部非対合（例えば、ＤＭ２においてＣＣＵＧリピートによって形成されるものなど）を有するＲＮＡ分子に対して高い親和性を有するリガンドもまた開発された。この化合物は、ペプトイド骨格と結合し４つのスペーサーモノマーによって隔てられた、６’−Ｎ−５−ヘキシノアートカナマイシンＡの３つのモジュールで構成された。スペーサー数を４つから２つへ減らすことによって、この分子はＣＵＧリピートに対して、ＣＣＵＧリピートに対するよりも高い親和性を有するリガンドとなる。
【００１６】
技術の現状において示されているこれらの戦略または化合物によって、ＭＢＮＬ１を放出させ、それによってスプライシング異常を元の状態に戻すことが可能となる。さらに、核内封入体がなくなると、翻訳されるより多くの遊離ＭＰＫ転写物が細胞質内に存在するようになる。しかしながら、突然変異ＲＮＡの再分布によって新たな毒性作用を示す可能性がある。心筋細胞の細胞質内にＣＵＧ及びＭＢＮＬ１の凝集体が形成されてもマウスには異常は生じないが、他のタンパク質が短期または長期の影響を受ける可能性がある。さらに、ＭＢＮＬ１とＣＵＧとの間の結合を妨げる分子は、ペンタミジンで見出されたように、核内でＭＢＮＬ１と他の標的転写物との間の結合も阻害する可能性があり、またはＭＢＮＬ１と類似したＲＮＡ結合機構を有する他のタンパク質にも干渉する可能性がある。最後に、ＭＢＮＬ１に基づく治療アプローチはいずれも、ＣＵＧリピートの毒性の必ずしも全てがＭＢＮＬ１の隔離によるものではないという限界がある。
【００１７】
ほとんどの神経筋疾患の起源は、単一遺伝子における突然変異にあり、そのため、それらの突然変異は遺伝子療法の開発のための良い候補である。しかしながら、ＤＭ１の場合、病変組織は主に有糸分裂後のものであり、これはほとんどのウイルスベクターに関して不都合を伴う。これに関連して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの分子を用いることが有利であり得るという提案がなされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子のコピーを提供しないが、その代わりに、既存の遺伝子の産物をモジュレートする。現在、この戦略に基づいたいくつかの分子がすでに臨床試験段階にある。一例がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ＯＭＩＭ番号３００３７７）のケースであり、それに関してＡＶＩ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社は、米国において前臨床段階にある２つの分子を有しており、そのうち１つは英国においてすでに第１ｂ／２相臨床段階にある(www.avibio.com)。２５０のＣＴＧリピートを発現するモデルマウス、ならびにＭＢＮＬ１ノックアウトマウスにおけるＡＳＯの使用は、技術の現状において公知であり、Ｃｌｃｎ−１転写物のエキソン７ａのスプライシングに対するその影響が研究されてきた。両方のモデルにおいて、前脛骨筋への１回の注射により、Ｃｌｃｎ−１転写物の正常なスプライシングパターンが少なくとも３週間回復し、筋緊張を元の状態に戻す。しかしながら、患者においてプロセシングが変更されているメッセンジャーは多数あるため、異なる症状を効果的に治療するために、いくつかのＡＳＯを異なる標的と組み合わせる必要がある。
【００１８】
ＡＳＯの組合せ使用に代わる１つの方法は、毒性源を取り除くようにＤＭＰＫ転写物のレベルで作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することである。技術の現状において、特異的ＡＳＯを用いた培養下の患者細胞におけるＤＭＰＫ発現の阻害を目的とするアッセイはすでに行われている。しかしながら、このアプローチは変異型転写物と野生型転写物とを区別するものではなかった。心機能及びインスリン代謝におけるＤＭＰＫの重要な役割を考えれば、ＤＭＰＫの総発現量の減少は総じて病的と言える。技術の現状におけるいくつかの研究では、その作用を好ましくは長いＣＵＧリピートを有する転写物に向けるために、ＣＡＧリピート（ＣＡＧ７またはＣＡＧ２５）で構成されているＡＳＯが使用されてきた。培養下の筋芽細胞及びＤＭ１モデルマウスの両方において、これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃｌｃｎ−１のスプライシング異常を元の状態に戻し、さらには、特に変異型転写物のレベルを最大５０％低下させるが、おそらくこれは短いＣＡＧリピート配列と毒性ＲＮＡとの間の結合によって非対合のないヘテロ二本鎖の形成が促されたためであり、これにより、ピリミジン非対合が結合に不可欠な構造要素である、ＭＢＮＬ１などのタンパク質の隔離が妨げられる。
【００１９】
よって、技術の現状において公知の分子の主な作用機序は、ＭＢＮＬタンパク質におけるＣＵＧリピートを有するヘアピンループによって発揮される隔離の阻害であり、それによって、ヘアピンループの脱構造化に直接影響を及ぼすことなく、ヘアピンループとＭＢＮＬタンパク質との間の相互作用は妨げられる。
【００２０】
これに対して、本発明では、病因が、ＣＵＧリピートまたはＣＣＵＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＤＭ２及びＳＣＡ８などを治療するための関連生物活性を有する化合物を同定するため、化学ライブラリーからの薬物のスクリーニングに焦点を当てる。本発明の化合物は、技術の現状において公知のものよりも効果的な作用機序に基づいており、それは、最も可能性が高い作用機序によれば、ＣＵＧリピートを有する毒性フラグメントからなる二本鎖ヘアピンループが結合を受け脱構造化されるか、または伸長を有するＲＮＡが一本鎖構造にとどまり、それによって、その結合が病理学的表現型をもたらし得る、または強め得る任意の他の分子とＭＢＮＬ１の異常な結合を妨げるためである。さらに、それらの化合物はＭＢＮＬ１とＣＵＧヘアピンループ（そのタンパク質の天然の標的と構造的に極めて類似している）との間の異常な結合とは競合しないことから、それらは細胞においてＭＢＮＬ１により調節される転写物に干渉するとは考えられない。本発明では、ＣＴＧリピートについての毒性モデルとしてショウジョウバエを使用し（非特許文献２）、本発明の化合物をアッセイし、ＣＴＧリピートの毒性におけるそれらの作用機序を確認した。その後、ＤＭ１脊椎動物モデルにおいてそれらの効力を検証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Mankodiet al.,2000(Mankodi,A.,Logigian,E.,Callahan,L.,McClain,C.,White,R.,Henderson,D.,etal.(2000).Myotonicdystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat.Science, 289,1769-1773)
【非特許文献２】Garcia-Lopezet al.,2008(Garcia-Lopez,A.,Monferrer,L.,Garcia-Alcover,I.,Vicente-Crespo,M.,Alvarez-Abril,M.C.,&Artero,R.D.(2008).Geneticand chemical modifiers of a CUG toxicity model in Drosophila.PLoS One,3,e1595)
【非特許文献３】Benzer,1973
【非特許文献４】Powell&Moriyama,1997
【非特許文献５】Chorev&Goodman,1995
【非特許文献６】P.M.Fischer,2003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどを予防または治療するための治療可能性を有する化合物を同定するための方法を行った。その方法は、好ましくは、ショウジョウバエ疾患モデルにおける、ヘキサペプチド化学ライブラリーのin  vivoスクリーニング、及びその病態を元の状態に戻す化合物の選択を含む。
【００２３】
分子量が大きすぎると化合物の細胞吸収が制限されるため、潜在的治療薬の探索に用いる分子サイズは考慮すべき重要な側面である。より活性の高い化合物を生み出すための分子の最適化は、通常、その最終サイズの増大を伴う。しかしながら、分子量が１０００より大きくなると、そのバイオアベイラビリティが低下することにより分子の治療可能性が下がるので、小さな化合物から出発することが必要となる。従って、現在商品化されている薬物の８０％は分子量が４５０未満である。アミノ酸の平均分子量は約１３５Ｄａである。そのため、ヘキサペプチドのおよそのサイズは８１０Ｄａ前後である。６個を越えるアミノ酸によって形成されるペプチドライブラリーのスクリーニングでは非常に大きな分子になる。他方、ジ−、トリ−、テトラ−及びペンタペプチドのコレクションが存在するが、分子を構成するアミノ酸の数が増えると、デコンボリューション中により多くの定義されたペプチドがもたらされ、それによって活性のある化合物を発見する確率が高まる。
【００２４】
４８０のＣＴＧリピート（ＣＴＧ（４８０））を発現する、非特許文献２に記載されているショウジョウバエモデルが示す表現型は成熟蛹期で致死性表現型に至るが、Ｍｂｌのレベルに応答し、化学修飾を受けやすいことから、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどを予防または治療するための治療可能性を有する化合物の系統的探索にこのモデルが好適となることが見出された。
【００２５】
本発明は、位置スキャニング形式でのコンビナトリアルペプチド化学ライブラリーのスクリーニングで始まる。この化学ライブラリーは１２０個のバイアルで構成され、各バイアルは、特定の位置において単一のアミノ酸を共有し残り全てが異なるヘキサペプチドの混合物からなる。そのため、有望なバイアルが検出されると、活性アミノ酸が所定位置で同定される。アッセイした各位置（バイアル）において最も活性が高いアミノ酸を組み合わせることはデコンボリューションとして知られている。本発明の好ましい実施形態では、体内でのペプチドの平均寿命を引き延ばすために、本発明において用いられる化学ライブラリーのペプチドは、腸内プロテアーゼによって認識されず分解を受けにくい、天然アミノ酸のＤ−立体異性体で構成した。
【００２６】
よって、本発明は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピートまたはＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどの予防及び／または治療のための、ショウジョウバエ及びマウスにおいて検証されたin  vivo治療可能性を有するヘキサペプチドを含む化合物に関する。本発明の化合物の作用機序は、技術の現状において公知の化合物によってもたらされるものよりも効果的であるが、これは、本発明の化合物が、前記リピートを有する毒性フラグメントによって形成された二本鎖ヘアピンループに結合して脱構造化することが可能であるか、または伸長を有するＲＮＡを一本鎖構造で維持することが可能であり、それによって、ＣＵＧヘアピンループとの結合によって病理学的表現型をもたらすか、または強める可能性もある任意の他の分子とＭＢＮＬの異常な結合または隔離が妨げられるためである。
【００２７】
詳しくは、本発明では、式（Ｉ）（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ）を有するペプチドを含む化合物、またはその薬学上許容される立体異性体、混合物、塩もしくは模倣ペプチドをアッセイした。以下に、式Ｉの位置Ａ〜Ｆのそれぞれの部分であり得るアミノ酸を定義する。なお、これらのアミノ酸は、天然アミノ酸の立体異性体を表すために通常用いられる三文字コード及び小文字コードの両方を用いて呼称する。
・Ａは、アミノ酸ｃｙｓ（ｃ）またはｐｒｏ（ｐ）であってよく、
・Ｂは、アミノ酸ｐｒｏ（ｐ）またはｇｌｎ（ｑ）であってよく、
・Ｃは、アミノ酸ｔｙｒ（ｙ）であってよく、
・Ｄは、アミノ酸ａｌａ（ａ）またはｔｈｒ（ｔ）であってよく、
・Ｅは、アミノ酸ｇｌｎ（ｑ）またはｔｒｐ（ｗ）であってよく；かつ
・Ｆは、アミノ酸ｇｌｕ（ｅ）である。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドの一部であるアミノ酸は、腸内プロテアーゼによって認識されず分解を受けにくいＤ−アミノ酸である。しかしながら、実施例で示すように、Ｌ−アミノ酸からなるペプチドも活性を示す。
【００２９】
本発明において、模倣ペプチドとは、式（Ｉ）を有するペプチドの配列と相補的、相同かつ／または等価な配列を特徴とするペプチド有機分子を意味すると理解される。本発明の化合物はまた、一般式Ｉを有するペプチドの相補的、相同かつ／または等価な機能的配列も含む。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、一般式Ｉを有するペプチドの配列と少なくとも８０％同一または相同である相同配列を含む。さらに、本発明の化合物は、式Ｉを有するものの化学的類似体であるペプチド、誘導環状ペプチド、ダイマー及び／またはマルチマーを含み得る。
【００３０】
本発明において示されるように、上述のペプチドを含む化合物は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピートまたはＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどの予防及び／または治療において用い得る。配列番号１〜１６の配列に相当するヘキサペプチドを前記疾患の治療について試験し、ヘキサペプチドｐ１０（配列番号１０）が、上述のショウジョウバエモデルにおいて、脳及び筋肉の両方で、どちらの場合でも用量依存的に毒性を元の状態に戻したことから、とりわけ好ましかった。さらに、ｐ１０を、そのレトロインベルソ配列を含む配列を有するペプチドの内因的発現により、モデルのハエの眼及び筋肉における表現型は元の状態に戻り、それによって、ＣＴＧリピートの毒性に対するｐ１０及びその誘導体の作用が確認される。アラニンスキャニングの結果、ならびにトランスジェニックハエの作出により、ｐ１０の配列内の全てのアミノ酸がその活性に必要であること、そして活性がその残基の側鎖にあることが示された。ｐ１０は、in vitroでＣＵＧリピートと結合し、ヘアピンループを展開する。この結合は、ペプチド配列に依存し、リピートの数が増えると多くなる。ＤＭ１モデルマウスにおけるｐ１０の筋肉内注射により、筋肉転写物のスプライシング異常だけでなく、組織学的レベルでの異常も元の状態に戻った。この作用は全身性であり、１回の注射の後少なくとも４週間維持された。
【００３１】
上述のように、ｐ１０は、試験したもののうち最も効果的なものであることから、本発明の好ましい化合物であるが、本発明は、式Ｉの範囲内に含まれる他の化合物、例えば、ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５などもまた、毒性ＣＵＧ転写物の存在下で異なる程度の特異性及び効力を示すことも示している（実施例１６及び図２９参照）。
【００３２】
従って、本発明の第１の態様は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどの予防及び／または治療において用いられる、式Ｉを有するヘキサペプチドを含む化合物、またはそれらの模倣ペプチドに関する。
【００３３】
本発明の第２の態様は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２  ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどの予防及び／または治療のために設計された医薬組成物の製造のための前記化合物の使用に関する。
【００３４】
本発明において開示される化合物は、生薬開発の技術の現状における知識に従って、ヒト患者または動物において有効成分として用いることができ、処方物に調製し、かつ／または投与することができる。よって、本発明の第３の態様は、本発明のペプチドの少なくとも１種を少なくとも別の有効成分と組み合わせて含む医薬組成物に関する。前記組成物はまた、例えば、前記有効成分の体内吸収またはその活性化に寄与する、不活性物質として有効成分とともに加えられる少なくとも１種の賦形剤も含み得る。
【００３５】
前記賦形剤は、前記組成物の結合成分、例えば、デンプン、糖またはセルロースなど；増量剤、例えば、植物性セルロース、第二リン酸カルシウム、ベニバナなど；崩壊剤；滑沢剤、例えば、タルク、シリカまたはステロイド脂肪など；コーティング剤；甘味剤；香味剤；着色剤などの維持のために設計され得る。
【００３６】
前記組成物は、有効成分をその治療標的に到達させるのに有用な任意の投与経路によって、例えば、消化経路（経口、舌下、胃腸または直腸）、非経口経路（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、脊髄内、腹腔内、皮内または関節内）、呼吸経路または局所経路によって投与することができる。
【００３７】
本発明のもう１つの態様は、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２、ＦＸＴＡＳ、ＨＤ及びＦＡなどの予防及び／または治療のための方法に関し、その方法は、本発明のヘキサペプチドの少なくとも１種を含む医薬組成物の治療上有効な量を患者に投与することを含む。本発明において、「治療上有効な量」とは、病因が、ＣＵＧリピート、ＣＣＵＧリピート、ＣＧＧリピート、ＣＡＧリピート及びＡＡＧリピートを含む毒性転写物の存在に基づく疾患、例えば、ＤＭ１、ＳＣＡ８、ＤＭ２及びＳＣＡ８などに関連する病態を予防または治療することが可能な量を意味すると理解される。
【００３８】
本発明では、ショウジョウバエＤＭ１モデルにおいて４０μＭより高く２５０μＭより低いｐ１０濃度、好ましくは７０．４μＭで有望な結果が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】位置スキャニング戦略の説明図  （Ａ）有望なバイアルが特定されたところで、特定の位置をそれぞれにどのアミノ酸が占めるのかを調べた。定義された配列のペプチドを生み出すために有望なアミノ酸を組み合わせることはデコンボリューションとして知られている。  （Ｂ）Ｏ１、Ｏ２…Ｏ６は、可能性がある天然アミノ酸のＤ−立体異性体２０個が占有する特定の位置を表し、Ｘは、天然アミノ酸のＤ−立体異性体２０個のうち１９個の等モル混合物を意味する（システインはＸには含められないが、特定の位置には含められる）。２０個の可能なアミノ酸に対して６つの位置があるため、１２０の組合せがもたらされ、各組合せは化学ライブラリーにおけるバイアルを表す。  実施例１は、図１から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２】一次スクリーニング及びデコンボリューションの結果の説明図  （Ａ）化学ライブラリーのスクリーニング及びその後の統計分析により合計２８の有望なバイアルが明らかになり（ｐ値＜０．０５）、その数値コードを各グラフのＸ軸に示している。これらのうち、１０個の表示アミノ酸（最大の活性を有するバイアルに相当する）を選択して、デコンボリューションを行った。Ｏ１ＸＸＸＸＸ、ＸＯ２ＸＸＸＸ、ＸＸＯ３ＸＸＸ、ＸＸＸＯ４ＸＸ、ＸＸＸＸＯ５Ｘ及びＸＸＸＸＸＯ６は、位置１、２、３、４、５及び６それぞれに、特定のアミノ酸を有するバイアルを表す。  （Ｂ）デコンボリューションにより１２の定義されたヘキサペプチドがもたらされた。  グラフのＹ軸は、活性の尺度として一次スクリーニングで得られたｐ値の逆数を示している。  実施例１は、図２から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３】ショウジョウバエＤＭモデルにおけるｐ１０の用量応答アッセイのグラフ  Ｙ軸はハエモデルの生存増加を表し、Ｘ軸はｐ１０濃度（μＭ）を表す。ｐ１０は、１０３Ｙ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋ハエにおいて８０〜１２５μＭの間で最も効果的に致死性表現型を抑制した。濃度を２５０μＭへ高めるとこの傾向はなくなった。生存値の増加は、（［処置誕生雌］−［対照誕生雌］／ｎ）×１００に相当する。  実施例１は、図３から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図４】野生型個体におけるｐ１０の毒性試験のグラフ  自家製食餌によりＤＭＳＯをＯｒＲ遺伝子型（野生型遺伝子型）の胚（Ａ）またはＬ１幼虫（Ｂ）に投与したときのＤＭＳＯに対する用量応答挙動を示している。Ｙ軸は成虫の数を表し、Ｘ軸はＤＭＳＯの割合％を表す。  （Ｃ）蛹期及び成虫期に到達しているＬ１幼虫の数がいずれの濃度においても対照と変わらなかったことからｐ１０はＯｒＲ個体において毒性がないことが示される。各アッセイは三反復で１反復５０個体を用いて行った（各濃度につき合計１５０個体）。Ｙ軸は個体数を表し、Ｘ軸はｐ１０濃度（μＭ）を表す。３つのカラムからなる各群において、左側のカラムは幼虫の数を表し、中央のカラムは蛹の数を表し、右側のカラムは成虫の数を表す。  実施例２は、図４から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図５】アラニンスキャニングのグラフ  ペプチドｐ１０の残基のいずれかをアラニンと置換することによって活性の喪失が起こることを示している。食餌によりペプチドを１０３Ｙ−Ｇａｌ４＋／＋；ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋幼虫に投与した。Ｙ軸は雌の数を表し、Ｘ軸は、アッセイした本発明のヘキサペプチドを表す。左側のカラムは対照（０．１％ＤＭＳＯ）、それに続いて、左から右へ向かって、ｐ１０ペプチド及び次の配列：ｐｐｙａｗａ、ｐｐｙａａｅ、ｐｐａａｗｅ、ｐａｙａｗｅ、ａｐｙａｗｅを有するアラニン置換を含む該ペプチドに対応する。バーは平均値とその標準誤差を示す。＊はｐ値＜０．０５を示す。  実施例３は、図５から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図６】ペプチドｐ１０は間接飛翔筋（ＩＦＭ：indirect flight muscles）においてＣＴＧ（４８０）の毒性抑制を示す画像  左から右へ向かって、正常ハエ（Ａ）、ＣＴＧ（４８０）を発現したハエ（Ｂ）及びペプチドｐ１０で経口的に処置した、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４の制御下でＣＴＧ（４８０）を発現したハエ（Ｃ）についてのＩＦＭの１．５μｍ断面を示している。ペプチドで処置したハエは、ＤＭＳＯを用いた対照より大きな筋肉パッケージを有していた。画像は倍率１０倍で撮影した。  実施例４は、図６から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図７】ＩＦＭにおけるペプチドｐ１０に対する用量応答を示すの画像及びグラフ、０．１２％ＤＭＳＯ（対照）（Ａ）及び種々の濃度、すなわち、６２．５μＭ（Ｂ）、１２５μＭ（Ｃ）、２５０μＭ（Ｄ）及び５００μＭ（Ｅ）のペプチドｐ１０で処置したＭｈｃ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−（ＣＴＧ）４８０／＋ハエのＩＦＭの断面。（Ｆ）のＹ軸は相対筋肉面積（μｍ）を示す。さらに、（Ｆ）は得られた結果を示し、ここで、最初のカラムはＤＭＳＯに対応し、それに続いて、左から右へ向かって、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ及び５００μＭのｐ１０濃度に対応する。ペプチドｐ１０は、６２．５μＭ〜２５０μＭの間で、対照ハエ（Ｆ）と比べて筋肉面積の著しい増加をもたらし、さらに繊維喪失の減少ももたらした（Ａの矢印の先）。５００μＭでは、ＩＦＭの面積は対照ハエよりも小さかった。グラフ中のバーは平均値とその標準誤差を示す。＊はｐ値＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ値＜０．０００１を示す。  実施例４は、図７から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図８】ｐ１０は、ショウジョウバエにおいて、毒性ＣＵＧリピートを含むリボ核凝集体（病巣）の数を減少させ、そこからＭｂｌを放出させる状態を示すグラフ及び画像  ｐ１０での処置により、ＣＵＧリピートを含むリボ核凝集体（病巣）の数（Ｙ軸）が、試験した全てのｐ１０濃度（Ｘ軸）において激減したことを示している（Ａ）。さらに、それは、ＤＭＳＯ（０．１２％；対照）（Ｂ）またはｐ１０（２５０μＭ）（Ｃ）で処置したハエのＩＦＭにおける免疫蛍光（灰色）によるＭｂｌの検出も示す。ｐ１０の経口投与により、Ｍｂｌの細胞分布において、凝集体の形での分布（矢印参照）（Ｂ）から分散した形での分布（Ｃ）へと変化が起こった。ＤＡＰＩを用いて核の染色を行った。＊平均ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０００５。これらの結果は、in  vivo処置（ショウジョウバエモデルにおける）及び化合物（ｐ１０）の経口摂取後の、ＤＭ１患者に特徴的な最も顕著な分子表現型のうちの２つの低減における効力レベルの高さを示す。
【図９】ショウジョウバエにおける内因的発現のために設計されたペプチドｐ１０の誘導体の説明図  配列番号１７〜１９（ｐ１７〜ｐ１９）のペプチドの配列を上から下へ順番に示す。示しているのは開始メチオニン、３つのスペーサーグリシン及びペプチドｐ１０の正（→）または逆（←）配列である。  実施例５は、図９から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１０】Ｇａｌ４／ＵＡＳ系による、ｐ１０を含むＬ−アミノ酸ペプチドの内因的発現は、ＣＴＧ（４８０）によって起こる眼の粗面化を抑制する状態を示す画像  ＵＡＳ−ｐ１８及びｐ１９は、１９℃及び２１℃で眼におけるＣＴＧ（４８０）の毒性を抑制し、対照ハエよりも粗面化の少ない表現型とより眼のサイズの拡大をもたらした（Ｂ、Ｅ対Ｃ、Ｆ）。温度を高くすると、この現象は逆転し、ＵＡＳ−ｐ１８及びｐ１９はリピートの作用のエンハンサーとなった（２５℃；Ｈ対Ｉ）。ＵＡＳ−ｐ１８単独では２５℃で粗面眼を生じなかった（Ｇ）。図（Ａ）は野生型の眼を示す。（Ｄ）ＣＴＧ（４８０）とＭＢＮＬ１との間の相互作用を陽性対照として用いた。画像（Ａ〜Ｆ）は、走査電子顕微鏡下で撮影した。画像（Ｇ〜Ｉ）は、拡大鏡下で撮影した。  実施例５は、図１０から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１１】（ＣＴＧ）４８０及びｐ１０配列の種々の変異型の同時発現による眼の表現型の抑制の定量のグラフ  ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／ＵＡＳ−ｐ１９ハエの眼の背腹軸方向長さの定量では、対照ハエの眼のサイズの有意な増加が示された（ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋；ｐ値＜０．０５、Ｔ検定）。温度を１９℃から２１℃へと高くすると、この効果は大きくなった。Ｙ軸はペプチドを用いていない対照に対する眼の相対サイズを示し、Ｘ軸は、左から右へ向かって、対照カラム、１９℃でのＵＡＳ−ｐ１９のカラム及び２１℃でのＵＡＳ−ｐ１９のカラムを示す。  実施例５は、図１１から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１２】Ｇａｌ４／ＵＡＳ系による、ＩＦＭにおける、ｐ１０を含むＬ−アミノ酸ペプチドの内因的発現の状態を示すグラフ及び画像  Ｍｈｃプロモーターの制御下でＣＴＧ（４８０）を発現するハエ（Ａ）またはＣＴＧ（４８０）及びｐ１８を同時に発現するハエ（Ｂ）の胸部の断面（１．５μｍ）。ｐ１８の存在によって、筋肉サイズの増加が起こった（Ｃ）。図ＣはＹ軸に筋肉面積を示し、Ｘ軸は、左側のカラムで陰性対照としてのＵＡＳ−ＧＦＰの効果、右側のカラムでＵＡＳ−ｐ１８の効果を表す。  実施例５は、図１２から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１３】ペプチドｐ１０についての、ＣＴＧ（４８０）の毒性に対する可能性がある作用機序の説明図  ｐ１０は、該リピートの発現に影響を及ぼし（Ａ）、ＲＮＡヘアピンループからＭｂｌをシフトさせ（Ｂ）、毒性のヘアピンループを不安定にし（Ｃ）、または該リピートから下流で作用することができた（Ｄ）。しかしながら、これらの図及び下記実施例に示されるように、ｐ１０の最も可能性の高い作用機序は毒性のヘアピンループの不安定化に基づいている（Ｃ）。  実施例６は、図１３から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１４】ルシフェラーゼリポータータンパク質の発現に対するｐ１０発現の影響を示すグラフ  ｐ１０による処置では、同量のＤＭＳＯ（０．１２％）に暴露したハエと比べて、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系によって誘導されたルシフェラーゼの発現に有意な影響を及ぼさない。しかしながら、ＤＭＳＯは単独で導入遺伝子の発現に影響を及ぼした。バーは平均値とその標準誤差を示す。＊＊はｐ値＜０．０１を示す。Ｙ軸はルシフェラーゼ（ＣＰＳ）を示し、Ｘ軸は、左から右へ向かって、０％ＤＭＳＯ、０．１％ＤＭＳＯ及び２５０μＭのｐ１０の影響を示す。  実施例７は、図１４から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１５】ＣＴＧ（４８０）の発現に対するｐ１０の影響を示す画像及びグラフ  （Ａ）ＳＶ４０ターミネーターの領域の半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した、０．１２％ＤＭＳＯ（対照）（左側のカラム）または種々の濃度のｐ１０（２番目のカラム：６２．５μＭ、３番目のカラム：１２５μＭ、４番目のカラム：２５０μＭ、５番目のカラム：５００μＭ）で処置したＭｈｃ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋ハエにおけるＣＵＧ（４８０）転写物の発現レベルを示すアガロースゲル。Ｒｐ４９遺伝子転写物をｃＤＮＡ鋳型ローディング対照として用いた。ＩｍａｇｅＪプログラムを用いたバンド強度の定量では、いずれの場合においても有意な変化は見られなかった（α＝０．０５、Ｔ検定）。  （Ｂ）。バーは（Ａ）で得られた結果の平均と標準偏差を示す。ＤＭＳＯ（対照）（左側のカラム）または種々の濃度で投与されたｐ１０（２番目のカラム：６２．５μＭ、３番目のカラム：１２５μＭ、４番目のカラム：２５０μＭ、５番目のカラム：５００μＭ）。  実施例７は、図１５から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１６】ｐ１０は、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの第１ジンクフィンガーと部分的に一致する状態を示す説明図  上から下へ順番に、以下を示す：キイロショウジョウバエ(Drosophila  melanogaster)（第１列）、シノラブディス・エレガンス(Caenorhabditis  elegans)（第２列）、セキショクヤケイ(Gallus  gallus)（第３列）、ゼブラフィッシュ(Danio  Rerio)（第４列）及びホモ・サピエンス(Homo  Sapiens)（第５列、第６列及び第７列：３つのヒトパラログ）に相当するＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ第１ジンクフィンガーの配列。ｐ１０の逆配列（最終列）は、該タンパク質とＲＮＡとの結合に重要な領域と一致する。保存されたアミノ酸を黒で示している。  実施例８は、図１６から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１７】大腸菌(E.coli)におけるＭｂｌＺＦ（Ｍｂｌジンクフィンガー）タンパク質の獲得の画像  （Ａ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株におけるＭｂｌＺＦの発現。Ａ．Ｉ．：ＩＰＴＧでの誘導前；Ｓ：細胞溶解物の上清（可溶性画分）；Ｐ：細胞溶解物のペレット（不溶性画分）。該タンパク質の大部分は、矢印で示されるように、可溶性画分（Ｓ）に見られる。  （Ｂ）ＦＰＬＣによるイミダゾール勾配でのＭｂｌＺＦタンパク質の精製例。画分１０〜１４を合わせて、タンパク質原液（Ｃ）を得た。アスタリスク＊１及び＊２は、ＭｂｌＺＦ（＊１）であることを確認するために、質量分析によって配列されたバンドを示す。バンド＊２は、大腸菌の５０Ｓタンパク質であると判明し、それによって、それがＭｂｌＺＦの分解産物である可能性が排除された。  実施例９は、図１７から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１８】Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質のジンクフィンガーのＣＤ（円偏光二色性）スペクトルのグラフ  （Ａ）ヒトＭＢＮＬ１タンパク質（２μＭ）は２０３ｎｍに顕著なピークと２２０ｎｍに弱いピークを示し、これにより、ＭＢＮＬ１ＺＦ（第１のジンクフィンガー対）は、αヘリックス型のごく一部を除いて、二次構造を持たないことが示される（Ｂのパターンと比較）。ＭｂｌＺＦも同様に挙動し、２０５ｎｍに顕著なピークと２２２ｎｍに弱いピークを示した（Ｃ）。（Ｄ）分子排除カラムに通すと、ＭｂｌＺＦは単一ピークとして溶出した。溶出容量は、分子量マーカーのパターンと比較し、モノマー型のＭｂｌＺＦのサイズと一致する。  実施例は、図１８から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図１９】蛍光偏光アッセイの説明図  蛍光偏光アッセイは、小分子を蛍光体で標識すること（本発明の場合には、ＣＵＧリピートがカルボキシフルオレセインとコンジュゲートされる；Ａ）からなり、これにより、蛍光体が分子量のより大きい分子（ＭｂｌＺＦタンパク質など）と結合すると、その回転速度が変化する（Ｂ）。回転速度の変化は、垂直面内及び水平面内で偏光ビームにより分子を励起し、放射される蛍光の偏光方向を測定することによって検出できる。小さい分子（ｐ１０）によってＭｂｌＺＦとＦＡＭ−ＣＵＧ２３（２３のＣＵＧリピートがカルボキシフルオレセイン蛍光体とコンジュゲートされたもの）との間の結合を阻害することが可能であったならば、蛍光性ＲＮＡは再度その回転速度を速め、その偏光が減少する（Ｃ）。  実施例１０は、図１９から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２０】ＭｂｌＺＦ及びｐ１０はＣＵＧリピートと結合する状態を示すグラフ  ＭｂｌＺＦによってＦＡＭ−ＣＵＧ２３の偏光の増加が起こり、これは両分子間の結合によって生じたものである。この結合は、ＭｂｌＺＦが非標識ＣＵＧ２３  ＲＮＡと競合する場合には可逆的であり（Ａ）、ＭｂｌＺＦの量に比例する（Ｂ）。ｐ１０によってもＦＡＭ−ＣＵＧ２３の偏光の増加が起こる（Ｃ）。この増加はペプチドサイズが小さいことから大きくはなく、その濃度を高くしても有意な変化はない（Ｄ）。ｐ１０は、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３に対するＭｂｌＺＦの影響を元の状態に戻すことはない。＊はｐ値＜０．０５を示す（Ｔ検定）。図Ａ及び図ＣのＹ軸は相対偏光を示し、図Ｂ及び図ＤのＹ軸は偏光の増加を示す。  実施例１０は、図２０から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２１】ゲルリターデイションアッセイによる、ＭｂｌＺＦとＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３との結合試験の画像  ＭｂｌＺＦはＦＡＭ−ＣＵＧ２３と結合し、その複合体はウェル内に保持される。これは、固定タンパク質の濃度についてアッセイした全てのＲＮＡ濃度で起こる（Ａ）。ＭｂｌＺＦは非標識ＣＵＧ２３  ＲＮＡと競合し得るため、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３とＭｂｌＺＦとの間の結合は特異的であり（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３：ＣＵＧ２３比  １：１００；図Ｂ、レーン３）、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３とともにインキュベートする前に該タンパク質を熱変性させた場合にはこれは起こらない（図Ｂ、レーン４）。ＭｂｌＺＦと同じ濃度で用いたコラーゲンα−３タンパク質はＲＮＡと結合しない（図Ｂ、レーン５）（＊１：熱変性させたＭｂｌＺＦ、＊２：コラーゲンα−３とともにインキュベートした）。ＭｂｌＺＦはまた、より小さなＲＮＡ（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）４）とも結合して複合体を形成し、複合体はゲルウェル内に保持される（Ｃ）。  実施例１０は、図２１から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２２】ＭｂｌＺＦのヒスチジンテールは、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３とのＭｂｌＺＦの結合に影響を及ぼさない状態を示す画像及びグラフ  （Ａ）ＭｂｌＺＦタンパク質の６個のヒスチジンを除去するためのＴＥＶプロテアーゼでの消化を示すゲル。消化産物（ＭｂｌＺＦΔＨｉｓ）をニッケル親和性カラムに通してヒスチジンを保持させ、ＴＥＶを除去した（ＴＥＶは、ＭｂｌＺＦΔＨｉｓとは別に溶出される）（Ｂ）。（Ｃ）精製後の結果。（Ｄ）ＭｂｌＺＦΔＨｉｓはＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３と結合し、この結合は該タンパク質濃度に比例する。  実施例１０は、図２２から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２３】ＭｂｌＺＦ／ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３複合体は陽極へ移動しない状態を示す画像  （Ａ）用いた電気泳動条件下では、ＭｂｌＺＦタンパク質はゲルにほとんど入らない（銀染色、図Ａ左）。該タンパク質及びＲＮＡ−タンパク質複合体の両方を、ウェルを中央に置いた水平のゲルで泳動した場合には、タンパク質は陰極へ移動するだけであることが観察された。電気泳動バッファーのｐＨをＭｂｌＺＦのＩｐより１ポイント上げた場合には、そのタンパク質は陰極へ移動し続けた（Ｂ）。ＭｂｌＺＦΔＨｉｓタンパク質もまたゲルに入らなかった（Ｂ）。ＦＡと架橋させることによりＲＮＡ−タンパク質複合体を固定し、それを変性ゲルで解析しても（この場合、ＳＤＳはタンパク質に負電荷を与える）、ＭｂｌＺＦの挙動は変化しなかった（Ｃ）。  実施例１０は、図２３から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２４】ｐ１０は、ＭｂｌＺＦをシフトさせずにＣＵＧリピートと結合する状態を示す画像  （Ａ）ｐ１０（１ｍＭ）はＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡ（６０ｎＭ）と結合し得る。（Ｂ）この結合はペプチドの量に比例し、約５００μＭから検出される。ｐ１０（１ｍＭ）は、短いリピート（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）４、６０ｎＭ）とより低い親和性で結合する（Ｃ）。該ペプチドとＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３との結合はＭｂｌＺＦタンパク質の相互作用に干渉せず（Ｄ）、少なくともこのアッセイでは有意でない。  実施例１０は、図２４から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２５】ペプチドｐ１０の特異性を示す画像及び説明図  （Ａ）アラニンスキャニングの５つのペプチド（左側の最初のチューブは対照であり、それに続く５つはペプチド：ｐｐｙａｗａ、ｐｐｙａａｅ、ｐｐａａｗｅ、ｐａｙａｗｅ及びａｐｙａｗｅに相当する）（２．５ｍＭ）でＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡ（６０ｎＭ）と有意に結合したものはなく、それによって、ｐ１０について記載した相互作用は特異的であることが示される。（Ｂ）ｐ１０（１ｍＭ）は二本鎖（ｄｓ）及び一本鎖（ｓｓ）両方のＲＮＡ及びＤＮＡ（６０ｎＭ）と結合し得る。（Ｃ）（Ｂ）に示した実験に用いた核酸の二次構造を示す図。  実施例１１は、図２５から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２６】ｐ１０はＤＭＰＫ−ＣＵＧ４とより高い親和性で結合する状態を示すグラフ  （Ａ）ｐ１０のトリプトファンの蛍光消光実験（５μＭ）。該ペプチドを異なる核酸とともにインキュベートした（２．５μＭ、５μＭ、７．５μＭ、１０μＭ及び１２．５μＭ）。蛍光消光率（Ｙ軸は相対蛍光を表す）は、各濃度ポイントでの遊離ペプチドに関して３５１ｎｍでの蛍光放射値を表した際に得られる直線の傾きとして測定した。各ポイントについて少なくとも２回の測定を行った。全ての場合において、蛍光消光率はＤＭＰＫ−ＣＵＧ４の場合でより高かったが、ＣＡＧ・ＣＵＧ４では有意ではなかった（Ｂ）。  実施例１１は、図２６から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２７】ｐ１０はＣＵＧリピートのパッケージングを減少させる状態を示すグラフ  ＭｂｌＺＦ（Ａ、１μＭ及び１．５μＭ）及びｐ１０（Ｂ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）はどちらも、ＣＵＧ（６０）（１μＭ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを変化させ、ＲＮＡの放射ピークは該タンパク質またはペプチドの濃度に比例して約２６５ｎｍに移った。しかしながら、該ＲＮＡをＭｂｌＺＦ及びｐ１０と一緒にインキュベートした場合には、添加順序に関係なく、この現象は元の状態に戻らなかった（Ｃ）。この変化は、実験期間中のＲＮＡの分解によって起こらず（Ｄ）、配列ｐｐｙａｗａ（Ｅ、０．５μＭ及び１μＭ）及びｐａｙａｗｅ（Ｆ、１μＭ）を有するアラニンスキャニングヘキサペプチドとともにＣＵＧ６０をインキュベートした場合にも起こらなかった。  実施例１２は、図２７から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２８】ｐ１０はＣＵＧリピートによって形成されたヘアピンループを開く状態を示すグラフ  遊離ＲＮＡにより放射される蛍光と比較した、ＭｂｌＺＦ（０．１μＭ、１μＭ、２μＭ及び５μＭ）（Ａ）またはｐ１０（０．１μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ及び１００μＭ）（Ｂ）の存在下で（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡ（１μＭ）中の２−アミノプリンによって、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定された、放射蛍光の測定値（Ｙ軸）。  ｐ１０は、１００μＭにおいて、２−ＡＰの蛍光に２．９の増加を引き起こし、それによって、一本鎖への変化が示される。ＤＭＳＯとともに、または配列ｐｐｙａｗａ及びｐａｙａｗｅを有するアラニンスキャニングペプチドとともに該ＲＮＡをインキュベートした場合には、この現象は見られなかった（Ｃ）。  実施例１２は、図２８から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図２９】ＣＵＧリピートによって形成されたヘアピンループの脱構造化または開環における本発明のいくつかのペプチド（ｐ１０、ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５）の比較アッセイのグラフ  コンビナトリアルペプチドライブラリーのデコンボリューションから得られた、４種のペプチド（ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５）をｐ１０とともにアッセイするために２−アミノプリンアッセイを用いた実験（前掲図面と同様）を示している。これらの結果によって、該ペプチドに関して得られた活性（表１）とＣＵＧ２３プローブが二次構造を解き、一本鎖となる能力との間の相関が示される。全ての場合において用いた濃度は１００μＭであり（ＲＮＡ：ｐ１０  １：１００比）、この場合、ｐ１０は肯定的な応答を示した（前の図）。よって、この実験により、ｐ１０は、最も活性が高いことから好ましいペプチドであるが、表１の残りのペプチド、特に、ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５もまた、かなりのレベルの特異性及び効力を示すことが示される。  実施例１６は、図２９から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３０（１Ａ）】ＣＵＧリピートとは異なるリピート、例えば、ＡＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＵＧ及びＣＡＧなどによって形成されたヘアピンループとの結合における本発明のペプチド（特にｐ１０）のアッセイのグラフ  ＣＵＧリピートとは異なるリピートと結合するｐ１０及びその能力を試験した実験を示しており、これらのリピートもリピートの伸長を有するＲＮＡの毒性が報告されている疾患に関与している。（１）ｐ１０＋ＡＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＵＧ及びＣＡＧを異なるＲＮＡ濃度（５μＭ、７．５μＭ及び１０μＭ）で用いて、トリプトファン消光アッセイを用いた。ＡＡＧは、二次構造を形成しないことが開示されていることから、参照リピート（対照）として用いている。他方、（２）は同じ実験を示しているが、アラニンスキャニング後に得られたペプチドの１つ（ｐｐｙａｗａ）を用いており、用いた最大ＲＮＡ濃度（１０μＭ）での結果を示している。  実施例１６は、図３０から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３０（１Ｂ）】
【図３０（２Ａ）】
【図３０（２Ｂ）】
【図３１】組織病理学的解析例の画像  ＦＶＢマウスにおける０．２％ＤＭＳＯ（Ａ）または０．５μｇのｐ１０（Ｂ）の筋肉内注射によって小さな粘液水腫部位が生じたが、どちらの場合でも関連の炎症反応はほとんどなかった。  実施例１３は、図３１から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３２】ｐ１０は、ＤＭ１モデルマウスにおいてＳｅｒｃａ１及びＴｎｎｔ３のスプライシング異常を元の状態に戻す状態を示す画像及びグラフ  ２％ＤＭＳＯ（−）または１０μｇのｐ１０（＋）の筋肉内注射によって、２週間及び４週間ｐ／ｉのＳｅｒｃａ１転写物のエキソン２２の封入率（Ｂ、Ｃ及びＤ）ならびに注射後１週間、２週間及び４週間のＴｎｎｔ３の胎児型エキソンＦの除外率（ｐ／ｉ；Ａ、Ｂ及びＣ）が高まった。ペプチドｐ１０は、ＦＶＢマウスまたはＨＳＡＳＲマウスにおいてこれらの転写物のプロセシングを変更しなかったが、対照Ｃａｐｚｂ転写物にも影響を及ぼさなかった（Ａ〜Ｃ）。図（Ａ〜Ｃ）は、２５サイクル行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。同じ動物の左下肢（２％ＤＭＳＯを含有する血清を注射）及び右下肢（１０μｇのペプチドを注射）を、この順序で、横線により結んでいる。（Ｄ）のバーは平均値とその標準誤差に相当する。Ｔ検定を用いてｐ値を決定した。  実施例１４は、図３２から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３３】Ｓｅｒｃａ１の選択的スプライシングに対するｐ１０の全身性効果のグラフ  １０μｇのｐ１０の注射後４週間のＦＶＢマウス及びＨＳＡＳＲマウスにおけるエキソン２２の封入率（Ｙ軸）は１００％であった。この値は両下肢に２％ＤＭＳＯを注射したＨＳＡＬＲ動物では１６．８％±１０．５であった。処置したＨＳＡＬＲ動物では、封入率は、ｐ１０を注射した下肢では５５．１％±４．９であり、同じ動物の左下肢（２％ＤＭＳＯを含有する血清を注射）では３１．５％±９．８であると判明した。  実施例１４は、図３３から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３４】ｐ１０は、中心核を有する筋肉細胞の数を減少させる状態を示す画像及びグラフ  ＨＳＡＬＲ動物における、中心核の存在を示すヘマトキシリンエオシンで染色した前脛骨筋の凍結切片（Ａ）、ＦＶＢ動物では、中心核は細胞の周辺に位置する（Ｃ）。ｐ１０は、０．５μｇ及び１０μｇのどちらの注射の後も、４週間経過後にＨＳＡＬＲマウスにおいて中心核を有する繊維の割合を有意に減少させた（Ｂ及びＤ）。（１）により示す動物の対照には０．２％ＤＭＳＯを注射した。（２）により示す動物の対照には２％ＤＭＳＯを注射した。  実施例１５は、図３４から得られた結論の詳細な説明、ならびにそのより網羅的な解析を含む。
【図３５】ｐ１０は、ＤＭ１モデルマウスにおいて筋肉レベルで組織学的異常を抑制する状態を示す画像  この図は、Ｃｌｃｎ−１タンパク質の位置が骨格筋部位において検出される疾患のマウスモデルにおいて行った実験を示している。Ｃｌｃｎ−１は、ＤＭ１患者の筋肉組織においてスプライシングレベルで変更される遺伝子の１つである（Ａ）。ｐ１０の投与によって膜レベルのタンパク質の正常レベルへの回復がもたらされることが見て取れる（Ｂ）。ｐ１０の筋肉内注射は該マウスの下肢の筋肉レベルで行った。この結果は、このヒト病理において異常な発現を見せる細胞的側面及び機能的側面を改善するための、in  vivoＤＭ１モデルにおけるｐ１０処置の効能（図３２〜３４ですでに見られている）にも拡大される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に、本発明において行った実施例を示して得られた結果を例示するが、それらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４１】
コンビナトリアルヘキサペプチド化学ライブラリーのスクリーニング：
各化学ライブラリーバイアルは、特定の位置において単一のアミノ酸を共有し残りが異なる２５０万のペプチドの混合物からなる（図１Ａ）。よって、占め得る２０のアミノ酸によって定義される６つの位置の組合せによって、計５千万の異なる配列に加えてこの化学ライブラリーを構成する１２０のバイアルが得られる。位置スキャニングコンビナトリアル化学ライブラリーの使用は、その分子の各位置が残りの位置と独立にアッセイされ、その結果、６つのヘキサペプチド位置のそれぞれについて最も良い候補アミノ酸を特定することが可能となるという原理に基づく。よって、このスクリーニングの結果を読み取ることによって、各位置に関して最も活性の高いアミノ酸が得られた。次に、それらの組合せを基に、特定の配列のペプチドを合成し（デコンボリューションとして知られる）（図１Ｂ）、これらの分子を再びアッセイした。
【００４２】
化学ライブラリーを構成する１２０のバイアルを個々に、８０μＭ濃度の１０３Ｙ−Ｇａｌ４の制御下で４８０  ＣＴＧを発現させることによって起こる蛹の致死性表現型に関してアッセイした。これらの結果の統計分析を行ったところ、計２８の有望なバイアル（ｐ＜０．０５；全体の２３．３％）が明らかになり、そのそれぞれは特定の位置に活性なアミノ酸を示す。このように、ヘキサペプチドの位置Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５及びＯ６に対してそれぞれ計６、３、６、４、２及び７つの活性アミノ酸が得られた（図２Ａ）。デコンボリューションを行うために、生物学的アッセイにおけるそれらの活性の程度に基づいて、これら２８個のアミノ酸から１０個を選択した（図２Ａ）。最後に、定義されたヘキサペプチドの合成を行うために、可能性がある組合せのうち１６の配列を選択した（図２Ｂ）。これらの１６のペプチドの選択は、類似の位置にある活性アミノ酸の物理的特性と化学的特性の間の冗長な基準に基づいた。
【００４３】
１６の定義されたヘキサペプチドを最大可能濃度で、それらが溶解したＤＭＳＯの割合％の関数としてアッセイした。ｐ１０は、８０μＭ濃度でＤＭＳＯを用いた対照に比べて、誕生した雌の数に有意な増加を示した。表１は、本発明のペプチドの活性を示す。＊はｐ値＜０．０５を示す。−は、対照チューブでも試験チューブでも雌が誕生しなかったことを示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
ｐ１０の効果を確認するために、以下の濃度：２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、１２５μＭ、２５０μＭで用量応答アッセイを行った（図３）。ｐ１０は２０μＭ及び４０μＭでは活性を示さなかったが、８０μＭ（雌の数は対照より１．４３倍多い）及び１２５μＭ（雌の数は対照より１．４７倍多い）では活性が高まった。非線形検定によってデータ解析を行ったところ、この表現型では、ｐ１０の有効用量５０（ＥＤ５０）は７０．４μＭであることが明らかになった。２５０μＭでは、おそらくは高濃度でのペプチドの毒性作用のために、ペプチドの活性は低下した。
【実施例２】
【００４６】
ｐ１０の毒性試験：
ｐ１０の毒性を分析するために、自家製栄養培地で、野生型遺伝子型（ＯｒＲ）を有するハエに対する効果を試験した。この食餌においてハエが耐用性を示し得るＤＭＳＯの最大値は知られていないので、胚期からかまたはＬ１幼虫期からかのいずれかでそれらの個体を漸増濃度の溶媒に曝すことからなる第１の実験を行った。自家製食餌中のＤＭＳＯに対する耐用性は、Ｓｉｇｍａから供給されているインスタント栄養培地で測定されたものの３〜４倍程度高いことが判明した（０．１％に対して０．３〜０．４％、図４）。胚期からＤＭＳＯで処置した個体で得られた生存結果は、おそらくは選択された胚の中に無精卵が存在したために、極めて高い変動性を示した（図４Ａ）。幼虫期から処置した個体は、はるかに均一な挙動を示した（図４Ｂ）。よって、Ｌ１幼虫に漸増濃度のｐ１０を与えることとし、蛹期及び成虫期に達した個体を数えた。ｐ１０は、アッセイしたどの濃度でも、どの発達段階でも毒性は無く（６７．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ及び１ｍＭ；各場合、ｎは１５０；図４Ｃ）、結論として、図３に示される場合において、遺伝子型依存的な毒性作用があると言える。
【実施例３】
【００４７】
ペプチド配列における各アミノ酸の妥当性試験：
ｐ１０の各残基のＣＴＧ（４８０）に対する活性への寄与を調べるために、アラニンスキャニング実験を行った。これらの実験はこのペプチドの各アミノ酸をアラニンで置換し、残りのアミノ酸を保持することに基づく。アラニンは小型のアミノ酸であり、一般に、あまり大きな活性がないことから、このタイプの試験に用いられる。各アラニン置換によって個々のアミノ酸の寄与を調べられることから、この実験は、一方でｐ１０が最適化を受け得るかどうかを評価すること（置換がその分子の効力を高める場合）、またはどのアミノ酸がその機能に重要か決定すること（置換がその活性を低下させる場合）を可能とする。ｐ１０の配列は５種類の置換が可能であり、そのため、５つの新規なヘキサペプチドを合成し、これらを１０３Ｙ−Ｇａｌ４；ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋ハエ、市販の食餌で致死性表現型に関してアッセイした。それらは全て元の分子よりも低い活性を示し、このことは、この機能アッセイにおいてｐ１０の配列中のアミノ酸は全て、このペプチドの最終的な活性に必要であることを示す（図５）。
【実施例４】
【００４８】
他の組織におけるｐ１０の活性の確認  ｐ１０は間接飛翔筋において、ＣＴＧ（４８０）によって起こる組織学的異常を改善する：
ＤＭ１に特徴的な主な症状は筋肉に影響を及ぼすので、モデルハエにおいてこの組織に対するｐ１０の効果を検討することにした。ミオシン重鎖プロモーター（Ｍｈｃ−Ｇａｌ４系統）の制御下でのＣＴＧ（４８０）の発現は、間接飛翔筋（ＩＦＭ）に組織学的レベルでの異常をきたし、これには筋繊維の喪失及び進行性の退化が含まれる。これらの異常はその機能に影響を及ぼし、ハエは飛翔できなくなる。ペプチドｐ１０を、自家製栄養培地にて、Benzer（Benzer, 1973（非特許文献３））により開発された「シリンダー落下法」を用いて飛翔欠如表現型に関してアッセイした。ＤＭＳＯを用いた対照（ｎは５５）に比べてハエの飛翔能に変化は見られなかった（アッセイ濃度は６２．５μＭ及び１２５μＭ；それぞれｎは１１７及び７７）。しかしながら、３〜４日齢のモデルハエの胸部断面の顕微鏡分析では、筋肉に組織学的レベルでの改善が明らかになった（図６）。ハエの飛翔能はＩＦＭ筋節の構造変換及び代謝変化に極めて敏感であることから、このことは見られた改善がなぜ機能的改善をもたらさなかったという理由となり得る。
【００４９】
この知見を確認するため、ならびに見られた効果を定量するために、ｐ１０に対して以下の濃度：６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ及び５００μＭで用量応答アッセイを行い、１０日齢のハエで準超薄組織切片を作製した（図７Ａ〜Ｅ）。処置区のハエにおいて筋肉面積を定量したところ、有意な用量依存的改善が明らかになった（図７Ｆ）。これらの結果はまた、ｐ１０は脳及び筋肉の双方で活性があることから、このｐ１０の効果は組織特異的因子とは無関係であることも示す。しかしながら、５００μＭでは、これらの筋肉は縮小を示し、ハエの生存力は低下した。
【実施例５】
【００５０】
ｐ１０を含むＬ−アミノ酸ペプチドの内因的発現はＣＴＧリピートによって起こる表現型を抑制する：
ｐ１０の投与は、ＣＴＧ（４８０）によって起こる表現型を少なくとも部分的に抑制した。本発明において最初に行ったこれらの実験では、ｐ１０は食餌に加えられたので、多くの分子がどのように最終的に細胞に到達したのかを特定することはできなかった。ｐ１０の投与を厳密に制御し、このペプチドがＣＵＧ（４８０）転写物と同じ組織に同時に存在することを保証するために、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系を用い、内因的かつ制御された様式でｐ１０を発現することができるトランスジェニックハエを作出した。
【００５１】
このようにして、全てｐ１０に相当する配列番号１０の配列に基づくが（図９）、ショウジョウバエにおけるコドン使用頻度傾向（すなわち、同義部位においてＧ、特にＣの使用を好む；Powell & Moriyama, 1997（非特許文献４））を考慮し、配列番号１０の配列に開始メチオニンならびに３つのスペーサーグリシンを付加した種々のペプチドをコードした、配列番号１７〜１９を有する３つの異なる導入遺伝子（ｐ１７〜ｐ１９）を設計した。さらに、導入遺伝子の発現を増強するために、ＡＴＣ開始コドンの上流に、Ｋｏｚａｋ配列を含んだショウジョウバエのａｃｔ５Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲの２１個のヌクレオチドを付加した。
【００５２】
ｐ１７は、配列番号１０のそのままのペプチド配列を含んだ。上記に述べたように、このヘキサペプチド化学ライブラリーのペプチドはＤ−アミノ酸からなる。Ｄ−型（右旋性）のアミノ酸はＬ−型（左旋性）の立体異性体であり、細胞ではＬ−アミノ酸だけが合成され、タンパク質に組み込まれる。結果として、ｐ１０の側鎖の配置がその機能に重要であるならば、ｐ１７がＬ−アミノ酸からショウジョウバエにより合成される場合には、その機能は失われる。このため、配列番号１０のペプチド配列が逆転して逆ペプチドとなった構築物ｐ１８（非特許文献５、６）を作出することにした。これらの導入遺伝子を作出した時点で、文献に記載されている最小の構築物は２０を越えるアミノ酸を有するペプチドをコードするものであったが、これはペプチドｐ１７及びｐ１８（１０個のアミノ酸しか持たない）の大きさの２倍である。このため、ペプチドｐ１７とｐ１８の構築物を合わせて１９個のアミノ酸を有するペプチドとした構築物ｐ１９を作出した。これら３つの構築物をショウジョウバエ胚の生殖細胞系統の前駆体にマイクロインジェクションし、各導入遺伝子に対して１０系統のトランスジェニックハエを得た。
【００５３】
得られたトランスジェニックハエを、本発明に際して作出された、ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／ＣｙＯ及びＭｈｃ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／ＴＭ６ｂ組換えハエ系統（それぞれ眼及び筋肉においてＣＴＧリピートの発現を指令した）と交配させた。ｓｅｖ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／＋ハエの場合と同様に、成虫ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／ＵＡＳ−ＧＦＰハエは著しい粗面眼の表現型を示した。１９℃及び２１℃でのＣＴＧ（４８０）とｐ１８またはｐ１９（ｐ１７はこの限りでない）の同時発現は、対照個体よりも目に見えて粗面度の低い眼を持つハエをもたらした（図１１；図１０Ｂ〜Ｃ及びＥ〜Ｆ）。これらの結果から、ｐ１０の配列を逆向きに含むＬ−アミノ酸ペプチドは、これらのリピートにより誘発される表現型を抑制し得ることが確認され、ペプチドｐ１８及びｐ１９の発現がＣＴＧ（４８０）の毒性を改変することから、これらのペプチドが翻訳され、短いにもかかわらず活性があったことが示される。しかしながら、２５℃及び２９℃ではこれとは反対の減少が起こった。２５℃では、ｐ１８またはｐ１９の内因的発現はＣＴＧリピートの毒性を増大させ、眼の縮小、色素沈着の欠如及び個眼の劇的な癒着をもたらした（図１０Ｈ〜Ｉ）。２９℃では、ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）／ＣｙＯハエとＵＡＳ−ｐ１８ハエまたはＵＡＳ−ｐ１９ハエとの交配からは、ＣｙＯバランサーを持たない後代は生まれなかったが、このことはｐ１０が前記の温度でＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）個体の生存力を引き下げた。２５℃及び２９℃においてｐ１８及びｐ１９単独の発現はいずれの表現型も生じなかったことは注目に値する（図１０Ｇ）。温度変化がＣＴＧ（４８０）導入遺伝子とペプチドｐ１７〜ｐ１９の発現に異なる影響を及ぼすことを考えれば、ペプチドｐ１７〜ｐ１９はゲノムの異なる領域に挿入されるので、到達されるべきペプチド量とリピート量の間の関係が存在する可能性がり、その後、ｐ１０が毒性となる。
【００５４】
重要なことに、アッセイされたｐ１８導入遺伝子を有する全系統（ＵＡＳ−ｐ１８）（すなわち、５系統）及びｐ１９導入遺伝子を有する３系統（ＵＡＳ−ｐ１９）のうち１系統は、ＧＭＲ−Ｇａｌ４  ＵＡＳ−ＣＴＧ（４８０）ハエの表現型を改善したが、アッセイした構築物ｐ１７の５系統（ＵＡＳ−ｐ１７）にそのような系統は無かった。このことは、ｐ１０のアミノ酸の側鎖の配向がその活性に不可欠な役割を果たすということを示す。
【００５５】
２５℃、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４系統でのＣＴＧ（４８０）とｐ１８またはｐ１９の同時発現はまた、羽化したばかりの成虫においてＩＦＭの組織学的異常を抑制し、筋肉パッケージの大きさを増した（図１２）。このことにより、ＣＴＧ（４８０）に対するｐ１０の効果が確認される。ここでもまた、ｐ１８及びｐ１９導入遺伝子を有する系統だけが表現型を改善した。
【実施例６】
【００５６】
ｐ１０の作用機序の研究：
in  vivoで得られた結果は、ＣＴＧリピートの毒性に対するｐ１０の効果を示した。さらに、図１３は、いかにしてｐ１０が細胞に対してその効果を発揮し得るのかを概説するいくつかの仮説を示す。まず、ｐ１０は、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系に干渉するかまたは毒性ＲＮＡの安定性を低下させるかのいずれかによって、ＣＵＧ（４８０）転写物のレベルに影響を及ぼし得る（図１３Ａ）。他方、ｐ１０はＣＵＧリピートと結合して、それにより隔離されているＭｂｌなどの核因子を放出することができる。このようにして、前記タンパク質は再びそれらの正常な機能を遂行することができる（図１３Ｂ）。ｐ１０はまた、ＣＵＧリピートと結合して、毒性の二本鎖ヘアピンループを形成するような折り畳みを防ぐこともできる（図１３Ｃ）。最後に、ｐ１０は、これらのリピートによって起こった変更の下流にある、例えばＭｂｌの拮抗薬を阻害し、その結果としてこれらのタンパク質の機能の欠損を補完する他のタンパク質または転写物に作用し得る（図１３Ｄ）。
【００５７】
提案されている各仮説を検証するために、分子レベルで、またin vitroで、下記の実施例に説明される複数の実験を行うことにした。
【実施例７】
【００５８】
ｐ１０はＣＴＧ（４８０）の発現レベルに影響を及ぼさない：
ｐ１０がＣＴＧ（４８０）の発現に影響を及ぼしたかどうかを調べるために、２つの異なる戦略を用いた。第一に、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−ルシフェラーゼ／＋ハエに、自家製栄養培地中、２５０μＭのペプチドを与えた。ｐ１０は光放射レベルに若干の低下を生じた。しかしながら、この違いはＤＭＳＯを用いた対照に対して有意ではなく（α＝０．０５、Ｔ検定；図１４）、このことから、このペプチドは非特異的にＧａｌ４／ＵＡＳ系に影響を及ぼすのではなかったことが示される。しかしながら、対照ハエの食餌にＤＭＳＯ単独が存在する場合には、ルシフェラーゼタンパク質レベルの上昇が起こった。これらの結果は、この溶媒が、おそらくは位置依存的多様性(position-dependent variegation)の抑制と呼ばれる効果のために、この導入遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性がある。
【００５９】
第二に、ｐ１０を種々の濃度で与えたＭｈｃ−Ｇａｌ４／＋；ＵＡＳ−ＣＴＧ／＋ハエで始め、ＲＴ−ＰＣＲにより、ｐ１０がＣＵＧ（４８０）転写物のレベルに特異的に影響を及ぼしたかどうかを判定した。ＰＣＲ反応において得られたバンドの強度を定量した後、いずれの濃度においてもＣＵＧ（４８０）のレベルに有意な違いは検出されなかったが（図１５）、このことは、ｐ１０が転写物の量に影響を及ぼさなかったことを示す。
【実施例８】
【００６０】
ｐ１０とＭｂｌの間の配列類似性の研究：
ＭＥＧＡ配列比較プログラム(www.megasoftware.net)を用いたバイオコンピューター解析により、ｐ１０のアミノ酸が、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質の第１ジンクフィンガー（このドメインを介して該タンパク質はＲＮＡと結合する）の保存された配列の逆配列と部分的に一致することが判明した（図１６）。このアライメントにおいて、ｐ１０のトリプトファンはＭｂｌのフェニルアラニン（芳香族、非極性及び疎水性でもあるアミノ酸）の位置と一致し、そのタンパク質とＣＵＧリピートとの結合を媒介する。この類似性を考えて、Ｍｂｌと毒性ＲＮＡとの結合に対する該ペプチドの影響を検討することにした。
【実施例９】
【００６１】
Ｍｂｌのジンクフィンガーの発現及び精製：
このペプチドがこれらのリピートとの結合においてＭｂｌと競合し得るかどうかを確認するために、ＲＮＡとタンパク質の間のin  vitro結合アッセイを行うことにした。このようなアッセイを行うために、Ｍｂｌタンパク質を発現及び精製することが必要であった。様々な理由で、Ｍｂｌのジンクフィンガーに相当する部分（ＭｂｌＺＦ、アミノ酸１〜９８）のみを用いた。第一には、ショウジョウバエには７つの異なるＭｂｌイソ型が存在する。ＭｂｌＤイソ型以外のものは全て、２つのジンクフィンガーを含む領域（Ｎｔ末端）を共通に持ち、Ｃｔ配列が異なる。他方、ＭＢＮＬ１とＭｂｌのジンクフィンガーはどちらもその標的配列と結合するのに十分である。
【００６２】
誘導ベクターに市販のｐＥＴ−１５ｂベクターをクローニングする際に、ＭｂｌＺＦタンパク質を、その精製を容易にするための６つのヒスチジン、ならびにＴＥＶ（タバコエッチウイルス(Tobacco  Etch  Virus)）プロテアーゼ切断部位と融合させた。大腸菌におけるＭｂｌＺＦ発現の至適条件を見つけるために、種々の因子の組合せをアッセイした。まず、本発明者らは３つの異なる細菌株から出発した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、Ｔ７バクテリオファージプロモーターに基づく発現系のために設計された株である。この株は非毒性組換えタンパク質の発現に適切である。発現されるタンパク質が毒性である場合には、大腸菌(E.coli)のＢＬ２１  ｐＬｙｓ（ＤＥ３）は、低レベルのＴ７リゾチームを構成的に発現するという利点を有し、これにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのレベルを抑制することによって、組換え遺伝子の基底発現が低減される。最後に、ＢＬ２１  ｐＬｙｓ（ＤＥ３）コドン＋株は、ヒトコドンのｔＲＮＡをコードし、細菌が極めて低レベルでしか持たない遺伝子を含む。第二に、ジンクフィンガードメインは、システイン残基とヒスチジン残基の間の硫黄イオンの１原子と結合する核酸結合ドメインである。亜鉛金属は、それが存在しないとジンクフィンガーは展開され、それらの標的と結合する能力を消失することから、このタイプのドメインの安定性に極めて重要である。このため、ＭｂｌＺＦタンパク質の発現の際に用いた全ての培養培地で、２種類の異なる濃度のＺｎＣｌ２をアッセイした（５０μＭ及び１００μＭ）。さらに、ジンクフィンガーを有するタンパク質はほとんど不溶性で、不安定な分子である傾向がある。このため、本発明者らは、２つの異なる温度、３０℃と１６℃でアッセイを行った。試験した全ての組合せのうち、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、５０μＭ濃度のＺｎＣｌ２及び誘導温度１６℃、１ｍＭのＩＰＴＧを用いた場合に、高い割合の可溶性ＭｂｌＺＦを得るに至った（図１７Ａ）。
【００６３】
精製プロセスは、培地中に亜鉛の存在が維持されたＦＰＬＣシステムでのアフィニティークロマトグラフィーによって行った。タンパク質の最大溶出は、およそ３００ｍＭのイミダゾールで起こった（図１７Ｂ）。得られた総タンパク質濃度は２．７３ｍｇ／ｍｌ（１９８μＭ；図１７Ｃ）であり、これは培養液１リットル当たりタンパク質１．４ｍｇの収率を意味する。その後の精製サイクルでも、この値は有意には変化しなかった。
【００６４】
精製済みタンパク質が精製後もその天然のコンフォメーションであるかどうか確認するために、その円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを分析した。円偏光二色性は、分子による右旋性及び左旋性偏光ビームの分子の吸収の違いに基づく電子吸収分光技術である。タンパク質が違えばその円偏光二色性スペクトルも違うので、この技術は、理論スペクトルとの比較により、異なる分子のコンフォメーションを同定することを可能とする（図１８Ｂ）。リン酸バッファー中のＭｂｌＺＦで得られる円偏光二色性スペクトルはＭＢＮＬ１のジンクフィンガーに関して示されているものと類似し、２０３ｎｍに顕著なピーク（構造欠損を表す）と２２０ｎｍに弱いピーク（αヘリックスを表す）を有する（図１８Ａ）。ＭｂｌＺＦの場合、このパターンは保存されているが、それらの値はやや右へシフトしていた（図１８Ｃ）。最後に、ＭｂｌＺＦが溶液中で単量体として見られるのか複合体を形成しているのかを判定するため、本発明者らは分子排除クロマトグラフィーを行った（図１８Ｄ）。分子排除クロマトグラフィーは、分子をそれらの分子量の関数として分離するカラムクロマトグラフィー法である。ＭｂｌＺＦに関して得られた排除容量は、単量体型のタンパク質サイズに等しい分子量１３．４ＫＤａに相当していた。このクロマトグラフィーにより単一の溶出ピークが明らかになり、このことは、少なくともこれらのアッセイ条件下では、ＭｂｌＺＦはそれ自体で複合体を形成しないことを示す。
【実施例１０】
【００６５】
ｐ１０はin vitroにおいてＣＵＧリピートと結合するが、ＭｂｌＺＦと競合しない：
タンパク質と核酸の間の相互作用のin vitro研究のための種々の技術のうち、蛍光偏光（ＦＰ）アッセイは、その迅速性と感度の点で特筆に値する。この技術は懸濁液中での蛍光性分子の回転運動の変化に基づく。従って、偏光ビームが、小分子にコンジュゲートされた蛍光体を励起すると、この小分子は蛍光放射に必要な時間より早く回転拡散を受け、その結果、蛍光放射時に分子のランダムな再配列が起こる（偏光解消）。しかしながら、この分子の回転は、媒体の粘度または分子の体積が変化すると遅くなり、放射される光の偏光が増す。従って、分子の偏光変化を測定することにより、その分子と媒体に加えられた別の分子との間の結合を検出することができる（図１９）。本発明では、これらの分子はｐ１０、ＭｂｌＺＦ、及びカルボキシフルオレセイン蛍光体とコンジュゲートされた２３のＣＵＧリピート（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３）であった。
【００６６】
ＦＰ実験を構成するために、まず、２種類の異なる濃度のＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡ（６ｎＭ及び６０ｎＭ）をアッセイした。両場合ともＲＮＡが検出され、ＭｂｌＺＦを加えた際に蛍光偏光値に有意な増加が見られ（ｐ値＜０．０００１）、結合が起こったことが示される。プローブ及びタンパク質両方の使用を減らすために、６ｎＭ濃度のＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３で検討することにした。ＭｂｌＺＦとＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３の間に見られた相互作用はタンパク質量に比例した（図２０Ｂ）。結合曲線の統計分析から、ＩＣ５０の理論値は９００ｎＭであった。この結合の特異性を確認するために、非標識ＲＮＡである（ＣＵＧ）２３（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３に対して１：１０、１：１００及び１：２００）を用いた競合試験を行った。全ての場合において、アッセイした全ての非標識プローブ濃度で競合が見られた（図２０Ａ）。ｐ１０も、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３の偏光に若干の増加を生じた（ｐ値：０．０１７６；図２０Ｄ）。しかしながら、漸増量のｐ１０を加えても、おそらくはｐ１０のサイズが小さいために結合曲線は得られなかった（図２０Ｄ）。ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３にｐ１０とＭｂｌＺＦを同時に加えると、ＲＮＡの偏光に、ＭｂｌＺＦ単独の添加によって生じるものよりも大きな増加が生じた（ｐ値：０．０１５８；図２０Ｃ）。この結果は、両分子が、他の分子の結合に干渉することなくＲＮＡと結合し得ることを示唆する。しかしながら、ＭｂｌＺＦとｐ１０を同時に添加した後の偏光値の増加は、双方単独により生じた増加の合計よりも低かった（ΔｍＰ（Ｍｂｌ）：９９．５；ΔｍＰ（ｐ８８）：２１．７５；ΔｍＰ（Ｍｂｌ＋ｐ８８）：１０８．２５）が、これは部分的競合の存在を除外するものではない。
【００６７】
ＦＰアッセイにおいてｐ１０により起こったＲＮＡの変化は、おそらくはその分子の分子量が小さい（９００Ｄａ未満）ために小さい。このため、本研究をゲルリターデイション実験で補助することにした。これらのアッセイは、安定なタンパク質−核酸複合体とそれらの個々の成分との間の電気泳動移動度の違いに基づく。ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡは入手可能であることから、蛍光ゲルリターデイションアッセイを設定することにした。検出のためのＲＮＡの最適量を決定した後（６０ｎＭ；図２１Ａ）、このＲＮＡとＭｂｌＺＦの間の結合を調べた。前記結合は、ゲルにおける遊離ＲＮＡに相当するバンドの強度の低下とゲル孔の内部におけるシグナルの出現（結合したＲＮＡ）の両方を生じた。しかしながら、このゲルにはリターデイションバンドは見られず、このことは、結合後に生じた複合体が全てゲル孔内に保持されていたことを示す。このゲル孔内部のシグナルは、結合が非標識（ＣＵＧ）２３プローブと競合した際に（１：１００）低下し、これは相互作用の特異性を示す。さらに、蛍光性ＲＮＡを熱変性したＭｂｌＺＦタンパク質とともにインキュベートした場合にも、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３と、ＭｂｌＺＦと同じ濃度の異なるタンパク質（コラーゲンα３）との間で反応が行った場合にも結合は起こらなかったが、この場合にも結合の特異性が確認される（図２１Ｂ）。
【００６８】
ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３がＭｂｌＺＦの６−ヒスチジンタグと結合する可能性を除外するために、この６−ヒスチジンタグをＴＥＶプロテアーゼ消化によって除去した（図２２Ａ−Ｃ）。ヒスチジンを含まないＭｂｌＺＦタンパク質（ＭｂｌＺＦΔＨｉｓ）はＲＮＡ結合能力を保持していた（図２２Ｄ）。
【００６９】
ＭｂｌＺＦとＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３の間で形成された複合体の、ゲル孔内での保持は、ＲＮＡとこのタンパク質の間で大型の凝集体が形成されることによって起こり得る。前記複合体のサイズを小さくするために、本発明者らは４つのＣＵＧリピートを含むＲＮＡ（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）４）を用いた。ＭＢＮＬ１のジンクフィンガーは、その配列の中央部に４つの非相補的ヌクレオチドを付加することによってループの形成を助長するならば、最小４トリプレットによって形成されるＣＵＧリピートと結合し得る。図２１Ｃに示されるように、ＭｂｌＺＦはＦＡＭ−（ＣＵＧ）４と結合するが、形成された複合体は同様にゲル孔内に保持された。
【００７０】
ＭｂｌＺＦの等電点（Ｉｐ）は９．５である。本発明者らのアッセイにおいて使用される電気泳動バッファーのｐＨは８．５であり、これは本ゲル内でのＭｂｌＺＦの総電荷は正であることを意味する。リターデイションゲルは非変性ゲルであり、従って、分子に負電荷を与えるＳＤＳはこの媒体中に存在せず、そのため、分子は陽極へ向かって移動する。ＲＮＡは負電荷を有し、電気泳動中に複合体を引きずる可能性があることから、一般に、前記のことはゲルリターデイションアッセイにおいては通常不都合なことではない。しかしながら、中央にゲル孔を配置した水平２．５％アガロースゲルに複合体を流し、クーマシーで染色することにより、ＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３がＭｂｌＺＦを動員できるかどうかを確認することにした（図２３Ａ）。この実験では、単独のＭｂｌＺＦタンパク質が、タンパク質分子量マーカーとは逆方向の陰極に向かって移動した。ＭｂｌＺＦをＦＡＭ−ＣＵＧ（２３）とともにインキュベートした場合、陰極に向かって移動したタンパク質（おそらく非結合タンパク質）の量は減ったが、ＭｂｌＺＦのＩｐより大きいｐＨ１０．５で電気泳動を行った場合さえ、やはりゲルの陽極側にはシグナルが見られなかった（図２３Ｂ）。
【００７１】
必要な負電荷を与えるために、ホルムアルデヒド（ＦＡ）と架橋させてその反応物を変性条件下でポリアクリルアミドゲルに流すか（ＳＤＳの存在下；図２３Ｃ）、あるいはタンパク質を変性させることなくタンパク質に電荷を与えるＳｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｇを加えることによってＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３−ＭｂｌＺＦ複合体を固定化した。どの場合にも、複合体がゲルの内部に浸透することはなかった。
【００７２】
ｐ１０がＣＵＧ  ＲＮＡ分子と結合できるかどうかを判定するために、該ペプチドとＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３との間で同様のゲルリターデイション実験を行うことにした。ｐ１０はこのＲＮＡと結合し、ＭｂｌＺＦに関して記載したように、複合体の一部がゲル孔内に保持された。しかしながら、この場合には、リターデイションバンドはゲル内部に見られなかった（図２４Ａ）。ｐ１０は高ペプチド濃度（５００μＭ以上、図２４Ｂ）でＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３と結合したが、このことは、少なくともこのアッセイ条件下では両分子間の親和性が低いことを示す。この親和性は、リピートのサイズを減じると低下した（ＦＡＭ−（ＣＵＧ）４、図２４Ｃ）。ｐ１０がＲＮＡとの結合に関してＭｂｌＺＦと競合し得るかどうかを判定するために、両者をＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３の存在下でインキュベートした。ｐ１０はＭｂｌＺＦの結合を妨げなかった（この場合には、全てのＲＮＡがゲル孔内に保持されたため）（図２４Ｄ）。これはタンパク質とペプチドの間の相乗効果か、または両者が異なるＲＮＡ部位に結合すべき場合には相加作用かのいずれかによるものであり得る。
【実施例１１】
【００７３】
ｐ１０は他の配列に対するより高い親和性でＣＵＧリピートと結合する：
ｐ１０とＣＵＧリピートとの間で見られた結合の特異性を検討するために、２つの実験を行った。第一に、アラニンスキャニングの際に作出された５つのヘキサペプチドをアッセイした。これらにはＦＡＭ−（ＣＵＧ）２３と有意に結合するものはなく（図２５Ａ）、全てのｐ１０残基がこのＲＮＡとの相互作用に必要であることを示す。興味深いことに、これらのペプチドはショウジョウバエにおいてＣＴＧ（４８０）導入遺伝子の毒性を抑制することはなかったが、このことは、ｐ１０の、ＣＵＧリピートと結合する能力がそのin  vivo活性に必要であることを示す。第二に、本発明者らは、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で蛍光標識された他のＲＮＡ及びＤＮＡ配列（二本鎖及び一本鎖の両方）に対するｐ１０の効果を検討した（図２５Ｃ）。前記分子には、（１）ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ領域に由来する１９ｎｔで構成されている一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、（２）ＤＭＰＫの一本鎖配列と融合された４つのＣＵＧリピートで構成されているＲＮＡ（ｄｓ＋ｓｓＲＮＡ）、（３）４つのＣＡＧ・ＣＵＧリピートからなる完全な二本鎖ヘアピンループを形成し得るＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、（４）４つのＣＴＧリピートで構成されているＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及び（５）同じＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ領域の１９ｎｔに相当するＤＮＡを含んだ。ｐ１０は全ての場合で結合した（図２５Ｂ）。さらに、配列（ＧＵＣ）４を有する非標識変異型ＲＮＡ（これにはヒトＭＢＮＬ１タンパク質のジンクフィンガーは結合しない）及びｔＲＮＡは、ｐ１０とＦＡＭ−（ＣＴＧ）２３の間の結合をシフトさせた。全体として、これらのデータは、ＲＮＡに対するｐ１０の結合が配列特異的であること（他のヘキサペプチドは違う挙動を示したため）及びこのペプチドが２種類以上の核酸と結合し得ることを示す。
【００７４】
しかしながら、ｐ１０は試験した核配列と異なる親和性で結合できた。ゲルリターデイション実験で検出されたペプチド−ＲＮＡ複合体及びペプチド−ＤＮＡ複合体はゲル孔内に保持されたことから、各相互作用に関する解離定数（Ｋｄ）を決定することはできなかった。ｐ１０と前記核酸の間の結合を定量するため、ならびに全ての場合において前記ペプチドがカルボキシフルオレセインと結合したという可能性を除外するために、ｐ１０の配列中に存在するトリプトファンに関して固有蛍光消光実験を設定することにした。トリプトファンは、２８０ｎｍの波長に最大吸収を有し、３００〜３５０ｎｍの間に（溶媒極性による）最大放射ピークを有する。この残基の蛍光は、それを含むタンパク質のコンフォメーションが例えば別の分子との結合により改変された際に変化する。従って、漸増量のＤＭＰＫ−ＣＵＧ４、ＤＭＰＫ及びＣＡＧ・ＣＵＧ４  ＲＮＡ分子、ならびにＣＴＧ４及びＤＭＰＫ  ＤＮＡを固定量（５μＭ）のｐ１０とともにインキュベートし、ペプチドの蛍光放射の変化を３５１ｎｍで測定した。いずれの場合にも、媒体に加えたＲＮＡまたはＤＮＡの量に比例してシグナルが低下し、これにより、これまでに見られた結合が確認される。しかしながら、遊離ペプチドの蛍光に対して各濃度点について放射される蛍光を直線で表したところ傾きの異なる直線が得られ、このことは核酸が異なれば、蛍光消光率（及び従って結合親和性）が異なることを示す（図２６）。この曲線の傾きは、ＤＭＰＫ−ＣＵＧ４分子（−０．０３４±０．００３）ではＣＴＧ４（−０．０１９±０．００５）及びＤＭＰＫ（ＲＮＡ：−０．０２４±０．００３及びＤＮＡ：−０．０２８±０．００２）よりも有意に大きかった（ｐ値＜０．０１）。しかしながら、ＣＡＧ・ＣＵＧ  ＲＮＡ（−０．０２８±０．００３）では、この違いは統計的に有意ではなかった（ｐ値＞０．１；図２６Ｂ）。ＤＭＰＫ−ＣＵＧ４分子は、それらのＤＭＰＫ環境中でＣＵＧリピートを含んだ。全体として、このことは、ペプチドの一部に標的結合選択性が存在しており、従って、それがin  vivoにおいて毒性ＲＮＡと好ましく結合することが可能であったことを示す。
【実施例１２】
【００７５】
ｐ１０はＣＵＧリピートのコンフォメーション変化を起こす：
ｐ１０により誘導されるＲＮＡの二次構造における可能性のある変化を検討するために、まず、本発明者らは非標識ＣＵＧリピート（ＣＵＧ６０）を有するＲＮＡを用いて円偏光二色性（ＣＤ）実験を行った。核酸の円偏光二色性はその配列を構成している塩基の集積によって生じる。結果として、分子がＲＮＡと結合してその構造に影響を及ぼすとそのＣＤスペクトルに変化が検出される。ＣＵＧ６０  ＲＮＡ（１μＭ）をＭｂｌＺＦタンパク質（１μＭ及び１．５μＭ）とともにインキュベートすると、スペクトルのピーク波長はシフトしなかったが、そのタンパク質により放出されるシグナルの強度が低下し（図２７Ａ）、このことは、ＭｂｌＺＦの結合がＲＮＡ塩基のパッケージングに影響を及ぼしたことを示す。前記ＲＮＡを漸増濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ及び２０μＭ）の配列番号１０のペプチドとともにインキュベートしたところ、同様の効果が見られた（図２７Ｂ）。読み取り中、ＲＮＡは円二色計内のキュベットで１０℃に維持された。各３時間の実験中にＲＮＡが分解された可能性があり、このことが観察されたシグナル強度の低下を説明すると考えられる。この可能性を除外するために、ＣＵＧ６０  ＲＮＡのＣＤスペクトルを０時点及び３時間の時点で測定した（ＣＵＧ６０  ＲＮＡは常に１０℃で維持した）。３時間の時点で、ＣＵＧ６０のスペクトルは０時点で得られたスペクトルから変化を示さなかったが、このことは見られた効果が特異的であったことを示す（図２７Ｄ）。さらに、アラニンスキャニングペプチドｐ２９．１（０．５μＭ及び１μＭ）及びｐ２９．４（１μＭ）はＲＮＡスペクトルを変化させず（図２７Ｅ及び２７Ｆ）、これにより、結合特異性が確認される。最後に、ＲＮＡにＭｂｌＺＦ（０．５μＭ）を加えた後にｐ１０（０．５μＭ）を加えた場合、またはその逆の場合には、ＣＤシグナルの増強は見られなかったが、このことは、それらの一方によってＲＮＡにもたらされた変化が、その後に他方を加えても可逆的とはならないことを示唆する。
【００７６】
これらの結果は、ｐ１０がＲＮＡ塩基の集積を減らし、従って、その分子の二次的コンフォメーションに影響を及ぼしたことを示す。このような変化がヘアピンループ構造の消失を起こすかどうかを確認するために、グアニンがその類似体２−アミノプリンで置換された、２３ＣＵＧリピートからなるＲＮＡ（２−ＡＰ−（ＣＵＧ）２３）を用いて実験を行った。２−ＡＰが一本鎖環境にある場合、それは３７５ｎｍで蛍光を放射する。しかしながら、前記の放射は、その分子が二重ヘリックスの一部を形成している場合には著しく消光される。ＣＤ実験及びＴｒｐ−ＦＱ実験で結合が検出された低濃度のＭｂｌＺＦ及びｐ１０では（ＲＮＡ：タンパク質≦１：５）、そのいずれもが２−ＡＰの蛍光に変化を生じなかった（図２８Ａ〜Ｂ）。しかしながら、ｐ１０の濃度を１００μＭ（ＲＮＡ：ペプチド１：１００）まで高めると、２ＡＰ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡは、二本鎖から一本鎖へとコンフォメーション変化を受け、分子の蛍光放射が２．９倍高まる（図２８Ｂ）。この効果の特異性を確認するために、アラニンスキャニングペプチド（ｐａｙａｗｅ及びｐｐｙａｗａ）をｐ１０と同じ濃度（１００μＭ）の２−ＡＰ−（ＣＵＧ）２３  ＲＮＡとともにインキュベートする同様の実験を行った。これらのペプチドに蛍光放射に変化を生じるものはなく、ＤＭＳＯ単独でも同じであった（図２８Ｃ）。従って、これらの結果は、ｐ１０はＣＵＧリピートによって形成された二本鎖を脱安定化し得ることを示し、ＭｂｌＺＦとペプチドは異なる様式でＲＮＡと結合することが確認される。
【実施例１３】
【００７７】
ＤＭ１マウスモデルにおけるｐ１０の効果の検証  哺乳類におけるｐ１０の毒性試験：
哺乳類においてｐ１０の潜在的毒性作用を試験し、次のアッセイのための最大耐用量を確定するために、前記ペプチドをＦＶＢ野生系統由来のマウスに投与した。腸管壁によるペプチドの吸収が低いため、４〜５週齢のマウスの前脛骨筋に、４種類の用量（０．５μｇ、１μｇ、１０μｇ及び１００μｇ）を用い、各用量につき計６個体のマウス（雌３個体、雄３個体）を用いて筋肉注射を行うことにした。注射４週間後に、マウスを犠牲にし、視覚的剖検を行い、筋肉の組織形態学的試験と血液検査を併用した（図３１）。対照として、同量のＤＭＳＯ（０．５μｇ及び１μｇ用量の場合には０．２％、１０μｇ及び１００μｇ用量の場合には２％）を注射したマウスを用いた。
【００７８】
処置マウスの筋肉の視覚的剖検及び組織学的解析では、ＤＭＳＯ対照に比べて有意な違いは見られなかった。場合によっては、やや粘液水腫（体液の蓄積）の徴候が見られ、おそらくは注射自体によって生じた軽度の炎症が見られた（図３１）。しかしながら、血液検査では、処置マウスと対照マウスの間に違いは見られなかった。腎活性のマーカーとして、本発明者らは血中の胆汁酸、尿素及びクレアチニンの量を測定した。骨格筋及び心臓の傷害のマーカーとしてクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）酵素を用い、肝臓傷害のマーカーとしてアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を用いた。全てのマウス（対照を含む）は標準値に比べて高い尿素値及びＡＰ値を示した。さらに、２％ＤＭＳＯを施した対照動物は異常に高いＧＰＴ値及びＣＰＫ値を示した。これはＤＭＳＯの毒性または注射自体によるものである可能性がある。しかしながら、１０μｇ及び１００μｇ用量では、対照よりもはるかに高い血中尿素値及びＧＰＴ値を示した。尿素はタンパク質代謝の最終産物である。尿素は肝臓で生成され、尿中に排泄される。腎臓が適切に機能していなければ、血中に尿素が蓄積する。ＧＰＴは肝臓に高濃度で存在し、少ないが腎臓、心臓及び筋肉にも存在する。これらの器官に傷害があれば、この酵素が血中に放出され、検査値に高く現れる。さらに、１００μｇ用量で処置したマウスのうち２個体が注射（ｐ／ｉ）およそ１１日後に死に至ったことは注目に値することであり、これにより、閾値を超えた場合のｐ１０の毒性が確認される。これらの２個体のうち１個体から死ぬ直前に採血することができた。このマウスは極端に高い血中尿素値、クレアチニン値、ＣＰＫ値及びＧＧＴ値を示した（例えば、ＣＰＫは標準値の上限の２８倍、ＤＭＳＯ対照の１５倍）。
【実施例１４】
【００７９】
ｐ１０はＨＳＡＬＲマウスにおけるＳｅｒｃａ１転写物及びＴｎｎｔ３転写物のスプライシング異常を元の状態に戻す：
ｐ１０は、ショウジョウバエのＣＮＳ、筋肉及び眼におけるＣＴＧ（４８０）の影響を抑制し、in vitroにおいてＣＵＧリピートと結合した。ＤＭ１哺乳類モデルにおいてこれらの結果の妥当性を検証するために、ＨＳＡＬＲマウスにおいてｐ１０をアッセイすることにした。これらのマウスは異種転写物であるヒト骨格アクチン（ＨＳＡ）において２５０のＣＵＧリピートを発現し、転写物の選択的スプライシングに異常を含む、ＤＭ１の大部分の症状を再現する。患者及びＨＳＡＬＲマウスの両方において選択的スプライシングの最も明確な例の１つが、Ｃａ＋２依存性ＡＴＰアーゼＳｅｒｃａ１転写物のエキソン２２のスプライシングである。健康な集団では、このエキソンは、胎児型では排除され、成体には含まれる。しかしながら、患者とＨＳＡＬＲマウスの両方で、エキソン２２は生涯を通じて排除され、従って、胎児パターンが成体個体でも維持される。Ｔｎｎｔ３タンパク質は骨格筋の速筋繊維の筋節に見られる。その転写物は、いわゆる胎児型エキソンＦの選択的スプライシングを受ける。健康な集団では、このエキソンは成体個体には存在しないが、ＤＭ１患者及びＨＳＡＬＲマウスでは、この胎児型エキソンが維持される。
【００８０】
ｐ１０がＨＳＡＬＲマウスにおけるＳｅｒｃａ１及びＴｎｎｔ３のスプライシング異常を元の状態に戻すことができるかどうかを調べるために、このペプチドの２種類の用量（０．５μｇ及び１０μｇ）の筋肉注射を施した。処置マウスを注射１週間後、２週間後及び４週間後に犠牲にし、右下肢（ｐ１０を注射）及び左下肢（０．５μｇ用量の場合には生理食塩水血清(saline serum)中０．２％ＤＭＳＯ、１０μｇ用量の場合には生理食塩水血清中２％ＤＭＳＯを注射）の両方の前脛骨筋を解剖した。対照として、本発明者らは、両下肢にＤＭＳＯ含有血清を注射したＨＳＡＬＲマウスの場合と同様に、両下肢に注射を行ったＦＶＢマウス及びＨＳＡＳＲマウス（ヒト骨格アクチン転写物において５つのＣＵＧリピートを発現する）を用いた。
【００８１】
０．５μｇで処置したマウスのＳｅｒｃａ１転写物及びＴｎｎｔ３転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析では、アッセイを行ったどの時点でも、それぞれエキソン２２及び胎児型Ｆの封入体に有意な変化は明らかにならなかった(ゲルは示されていない）。しかしながら、１０μｇの注射を行った５個体のうち２個体のマウス、両場合ともｐ１０がスプライシング異常を元の状態に戻した（図３２Ａ〜Ｃ）。Ｔｎｎｔ３転写物に関して得られた複雑なバンドパターンを考えても、本発明者らはｐ１０により誘導された胎児型エキソンＦの封入率％の増加を正確に定量することはできなかった。Ｓｅｒｃａ１の場合、ｐ１０はエキソン２２の封入率％を１．３％（１週間ｐ／ｉ、ｐ値＞０．０５）、２５．９％（２週間ｐ／ｉ、ｐ値＜０．０５）及び３８．３％（４週間ｐ／ｉ、ｐ値＜０．０１）高めた（図Ｒ４０Ｄ）。最後に、ｐ１０はＣａｐｚｂ遺伝子の筋肉転写物のスプライシングに影響を及ぼさなかったが、そのプロセシングはモデルＨＳＡＬＲマウスにおいては変更されないので、これを特異性対照として用いた（図３２Ａ〜Ｃ）。
【００８２】
４週間ｐ／ｉにて同じマウスの右下肢（ｐ１０を注射）及び左下肢（血清及び２％ＤＭＳＯを注射）におけるＳｅｒｃａ１転写物のプロセシングを分析したところ、処置されていない下肢において、エキソン２２の封入率％は、両下肢にＤＭＳＯを注射したＨＳＡＬＲマウスによって示されるものよりも大きかった（図３３）。このことは、血液によって左下肢の前脛骨筋に到達したｐ１０の量が全身的にスプライシング異常を部分的に元の状態に戻すのに十分なものであったことを示す。
【実施例１５】
【００８３】
ｐ１０はＨＳＡＬＲマウスの筋肉の組織学的異常を元の状態に戻す：
ＤＭ１マウス及びＨＳＡＬＲマウス両方の主要な組織学的レベルの特徴は、筋繊維における中心核の存在である。これらのマウスの前脛骨筋に０．５μｇ及び１０μｇの注射を行うと、ＤＭＳＯで処置したＨＳＡＬＲマウスに比べて中心核を有する細胞の割合％を有意に減ったが、ＦＶＢマウスにおいては変化は見られなかった（図３４）。この効果は注射４週間後により顕著となり、それが遅効性のプロセスであることを示す。
【００８４】
全体として、このモデルマウスにおいて得られた結果により哺乳類におけるｐ１０の治療可能性が確認され、これはＤＭ１及びＤＭ２及びＳＣＡ８の治療法の嘆息に新たな試験経路を拓く。
【実施例１６】
【００８５】
ＡＡＧ（対照）、ＣＧＧ、ＣＣＵＧ及びＣＡＧなどの、ＣＵＧリピートとは異なるリピートによって形成されたヘアピンループの脱構造化または開環における本発明のいくつかのペプチド（ｐ１０、ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５）の比較アッセイ：
図２９に見て取れるように、本実施例において、本発明者らは、ｐ１０の他、本発明で説明されるコンビナトリアルペプチドライブラリーのデコンボリューションから得られた４つのペプチド（ｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５）をアッセイするために２−アミノプリンアッセイを用いる。これらの結果は、これらのペプチドで得られた活性（表１）と、ＣＵＧ２３プローブの、二次構造を脱構造化して一本鎖となる能力との間の相関を示す。全ての場合で用いる濃度は１００μＭである。従って、この実験により、ｐ１０は最も活性が高いことから好ましいペプチドであるが、表１の残りのペプチド、特にｐ１１、ｐ５、ｐ１２及びｐ１５も有意なレベルの特異性及び効力を示すことが示される。
【００８６】
他方、図３０に示されるように、本発明のペプチド（特にｐ１０）は、例えば、ＡＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＵＧ及びＣＡＧなどの、ＣＵＧリピート以外のリピートによって形成されるヘアピンループに対して異なる結合親和性を有する。本実施例で、本発明者らはｐ１０と、ＣＵＧリピートとは異なるが、これもまた長いリピートを有するＲＮＡの毒性が報告されている疾患に関与しているリピートに結合するｐ１０の能力を試験した。一方でｐ１０＋ＡＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＵＧ及びＣＡＧ（ＡＡＧは二次構造を形成しないので対照として使用）を用い、他方で、アラニンスキャニング後に得られた不活性ペプチドの１つ（ｐｐｙａｗａ）を用いる同じ実験を用いるトリプトファン消光アッセイを用いた。これらの結果は、ｐ１０が、他のタイプの繰り返し配列に対し、これまでにＤＭＰＫ−ＣＵＧ４（ｐ１０に対するその結合の特異性が高い）で見られたものと同等の結合レベルを示すことを示す（図２６）。この結合は、それぞれＦＸＴＡＳ疾患及びＤＭ２疾患に関与するＣＧＧリピート及びＣＣＵＧリピートの存在下で増強された。３種類のアッセイ点（３種類の異なるプローブ濃度）を用い、それぞれ２回測定した。これらの結果を、ｐ１０単独によって与えられるシグナルに対してノーマライズした。ｐ１０についての結果は、アラニンスキャニングペプチドの１つ（ｐｐｙａｗａ）（活性無し）と比べて、異なるＲＮＡリピートの存在に対して全く異なる応答を示した。ほぼ全てのタイプのリピートの存在下でｐ１０によって示される強度の低下は、ペプチドｐｐｙａｗａを用いる場合、劇的に方向を転じる（強度を増す）。この強度の低下ではなく増強はまたプローブの結合のタイプの指標にもなり、ｐ１０の効力は、異なるタイプのリピートによって形成される二次構造との相互作用のタイプと密接に関連している。単一のアッセイ点が示される（プローブ１０μＭ）。結果は、供試ペプチドの最初の値を含めることができるようにノーマライズせずに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０（１Ａ）】
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【図３０（１Ｂ）】
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【図３０（２Ａ）】
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【図３０（２Ｂ）】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月22日(2012.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０、５、１１、１２、１５から選択されるいずれかのダイレクト配列（→）またはレトロインベルソ配列（←）の式Ｉ：
（式１）
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ    ‥‥‥（Ｉ）
［式中、
Ａは、アミノ酸ｃまたはｐのいずれかであり、
Ｂは、アミノ酸ｐまたはｑのいずれかであり、
Ｃは、アミノ酸ｙであり、
Ｄは、アミノ酸ａまたはｔのいずれかであり、
Ｅは、アミノ酸ｑまたはｗのいずれかであり、
Ｆは、アミノ酸ｅである］
を有するヘキサペプチド、その薬学上許容される塩または立体異性体を含む
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
配列番号１７〜１９から選択されるいずれかの配列である
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式Ｉの一部を形成する前記アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはそれらの混合物である
請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物を含有する
ことを特徴とする医薬。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物を含有し、
ＤＭ１の予防及び／または治療において使用される
ことを特徴とする医薬。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物を含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【国際調査報告】
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