(57)【要約】  本発明は、種々の試料におけるサルモネラ属の検出のためのペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブの開発に言及する。ＰＮＡは、ＤＮＡに類似した合成分子であり、その物理化学的特性のためにＤＮＡプローブよりも高い感度で速い解析を可能にする。これらのプローブは、試料における微生物の直接的な視覚化を可能にする分子生物学的技術である蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法と組み合わされる。これら２つの技術を組み合わせることにより、ＦＩＳＨ法はより速く、より簡単、且つより効率的になる。このプローブは、血液、食物、生検、糞便、水、並びに他の臨床試料、環境試料、又は農業及び食品産業の試料等、種々様々な試料に適用することができる。本発明は、上述の試料タイプを使用した、サルモネラ属菌の検出のキット及び同定に対するそれぞれの手順の開発も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ菌の検出及び／又は定量化のためのＰＮＡプローブであって、配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３に対して少なくとも８６％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含むことを特徴とする上記ＰＮＡプローブ。
【請求項２】
以下の配列、
−  配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’、
−  配列番号２  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ−３’、
−  配列番号３  −  ５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ−３’、
−  配列番号４  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣ−３’、
−  配列番号５  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’
のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項３】
ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はサルモネラ菌のｒＲＮＡに相補的な配列における標的配列を検出できることを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項４】
配列番号５  −  ５’−ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ−３’に対して少なくとも８６％の類似性を有する１つの配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項５】
少なくとも１種類の検出可能部分に接続されていることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項６】
前記プローブの前記種類の検出可能部分が、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの１つから選択されることを特徴とする、請求項５に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項７】
前記フルオロフォアの群が、Ａｌｅｘａシリーズのフルオロフォア、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（及び−６）カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）のうちの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項６に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載のプローブのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、サルモネラ菌を検出するためのキット。
【請求項９】
以下の溶液、１つの固定液、１つのハイブリダイゼーション溶液、及び１つの洗浄液のうち少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記固定液が、パラホルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、２〜８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒド及び２５〜９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション溶液がホルムアミドを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
サルモネラ菌の検出のための方法であって、請求項１から７までに記載のＰＮＡプローブを使用し、
ａ．ＰＮＡプローブを生物学的試料と接触させるステップ、
ｂ．ＰＮＡプローブを、前記試料中に存在する微生物の標的配列とハイブリダイズさせるステップ、
ｃ．ハイブリダイゼーションを、前記試料の前記検出及び定量化の指標として検出するステップ
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料が、血液、空気、食物、水又は生検から得られることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーションが蛍光により起こることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料中のサルモネラ属菌を検出するための方法に適用されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＰＮＡプローブの使用。
【請求項１６】
生物学的試料中のサルモネラ属菌の検出に適用されることを特徴とする、請求項８から１１までのいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床及び食品の安全性に関連した微生物の検出のためのプロセスに関する。その目的のため、サルモネラ属の検出のためのＰＮＡプローブを開発した。
【０００２】
プローブに加えて、本発明は、ＯＮＡ  ＦＩＳＨ法、並びにサルモネラ属菌の検出及び／又は定量化のためのキットに対するその適用を含み、食品及び臨床の分野において使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
サルモネラ属は、単純性胃腸炎から全身性感染症に及ぶ疾患を引き起こし得るいくつかの病原性細菌を含む。疾患重症度は、一般的に、サルモネラ種／菌株のビルレンス、宿主（ヒト又は他の動物種）、及び宿主の健康状態によって決定される。
【０００４】
サルモネラ属は、その系統発生解析により、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の２つの種に分けられるということが示されてきた。それにもかかわらず、２５００を超える血清型が現在までに同定され、その大部分が、ヒト及び広範囲の動物種に感染する能力を持つ。サルモネラ菌株は、慣習的に、外膜に存在する抗原のタイプに基づくカウフマン・ホワイト血清型別抗原分析表に従って同定及び分類される。
【０００５】
この細菌は、糞口経路を介して、又は土、水、及び食物の糞便汚染が生じた場合に、外部の保有源との直接的接触によって人間から人間に直接伝播する可能性がある。したがって、これら全ての試料タイプにおいて細菌の同定を可能にするロバスト検出方法を開発することが重要である。例えば、卵殻が微生物の伝播において重要であるとして確認されてきたため、「食品医薬品局」は、汚染された卵殻に対する食鳥飼育場における試験プログラムの実行を通して腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）の伝播を制御するよう意図する。
【０００６】
サルモネラ菌の検出は、従来、培養方法を使用して行われる。しかし、これらの方法は、労力を要し、正しくは時間のかかる（４から６日）、労力を要するプロセスである。したがって、人間においても動物においても細菌の制御に寄与してサルモネラ症を抑えることができる、より速く且つ信頼できる新たな方法の開発が必要とされる。この目的のため、いくつもの分子検出方法が、食物、糞便、水、及び臨床試料におけるサルモネラ菌の同定に要求される時間を短縮するために開発されてきた。これらの方法は、免疫酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びＦＩＳＨ法を含む。しかし、ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡに基づく方法は培養方法によって陽性であった一部の試料を検出できないことが、いくつかの研究によって示された。そうであったとしても、ＰＣＲに基づく方法は、ＥＬＩＳＡ法よりも正確であると証明してきた。一方、選択的な濃縮ステップがＰＣＲの前に行われる場合に、全ての培養陽性の試料が検出されるだけでなく、培養方法によって検出されなかったサルモネラ菌の存在もＰＣＲによって検出することができる。これらの研究は、食物及び糞便の試料等、特定のタイプの試料における少ない数の細菌及び抑制物質の存在等の問題を取り除くことによって濃縮ステップが分子アッセイの感度を上げることができることを明らかにしている。しかし、ＰＣＲに基づく方法は、通常、ＤＮＡ抽出ステップを要求し、ＦＩＳＨ法を除く上記の方法のうちいずれも、試料中の細菌の直接的な視覚化を可能にしない。これは、例えば、試料中の卵殻におけるサルモネラ菌汚染の直接的な評価を可能にすることによって重要であり得る。
【０００７】
ＦＩＳＨ法は、試料中の細菌の同定及び位置決定に広く適用される分子アッセイである。この方法は、特定のｒＲＮＡ領域に対する短いオリゴヌクレオチド（プローブ）の特異的結合に基づいている。プローブは、蛍光色素にカップリングし、ハイブリダイゼーションの後、細胞内の多いｒＲＮＡコピー数のために、蛍光信号を検出することができる。ＤＮＡプローブを使用したサルモネラ菌検出を報告する研究はすでにいくつかある（Ｋｕｔｔｅｒら、２００６；Ｎｏｒｄｅｎｔｏｆｔら、１９９７）。
【０００８】
より最近では、ペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ）が微生物検出のために開発されてきた。これらの分子は、ＤＮＡを模倣し、ワトソン・クリックのルールに従い相補核酸と特異的にハイブリダイズする能力を持つ。しかし、確立された結合は、ＰＮＡ分子において、その負の電荷をもつ糖・リン酸骨格構造が中性の反復（２−アミノエチル）グリシン単位によって置き換えられるため、より強力である。ＦＩＳＨ技術におけるこの分子の適切な使用は、手順をよりロバストに、より迅速に、且つより効率的にした。
【０００９】
サルモネラ菌に対して、ＰＮＡ  ＦＩＳＨ法が以前に開発された（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、２００１）。しかし、使用されたプローブは、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、及びエルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ）等の他の種に相補的な配列を有し、診断にとってはあまり魅力的ではないものとなっている。したがって、この特定の微生物に対して、新たなプローブを設計及びテストすること、並びに新たな方法を開発することは重要であると考慮された。
【００１０】
最適化された後は非常にロバストであるが、ＰＮＡ  ＦＩＳＨ法の開発は、まさにＰＣＲ法の開発のように、極度に大変な労力を要し、且つ、関わる種々のパラメータの化学的及び物理的特徴について多くの知識を要求するということに留意することが重要である。さらに、ＰＮＡ  ＦＩＳＨ法を生物に対して用いることは、同じ生物を標的とする他の配列が作用することを保証しないということが周知である。また、研究者等は、通常、否定的な結果を発表することに関して当然興味を持たないけれども、同じ微生物に対するプローブの一部を著者が導入することができただけである研究をいくつか文献において見つけることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、サルモネラ属の検出（すなわち、同定又は定量化）のためのペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、及びその方法に言及する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明において記載されるプローブは、微生物の２３Ｓ  ｒＲＮＡ、又は該ｒＲＮＡに対応するゲノム配列を認識する。ＰＮＡプローブは、その構造に固有な生理化学的特徴を有し、ＦＩＳＨに基づく方法に適用された場合に、ＤＮＡを使用した場合よりも高速で、ロバスト性及び特異性が高い解析を可能にする。
【００１３】
この方法の利点の１つは、プローブが各種の生物学的試料においてロバストに機能することであり、これは通常他の検出分子方法では起こらない。
【００１４】
別の関連する側面は、検出に要求される時間である。本発明において開発された方法は、試料の種類によって解析に先立ち濃縮ステップが必要とされる場合でさえも、その他の分子方法に対して報告された最短時間に匹敵する。当該方法の迅速性及び信頼性は、臨床安全性の展望に対しても食品安全性の展望に対しても汚染及び／又は感染の適切且つ時宜を得た処置を決定することができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、敏速且つ簡単な形で広範囲の生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出を可能にする、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法への当該プローブの適用に基づいたキットの開発に関する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、本明細書に記載されたＰＮＡプローブは、サルモネラ菌のｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はｒＲＮＡの相補的配列における標的配列の検出を可能にする。
【００１７】
本発明の実施形態の１つは、サルモネラ菌の検出及び／又は定量化に使用されるＰＮＡプローブであって、配列番号１の配列、１５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’に対して少なくとも８６％の類似性、好ましくは、配列番号１の配列、１５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３に対して８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の類似性を有することを特徴とする上記ＰＮＡプローブの記載である。
【００１８】
本発明のより好ましい実施形態において、前述の配列は、少なくとも１種類の検出可能部分に連結されている。使用される種類の検出可能部分は、中でも、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの１つから選択することができる。
【００１９】
さらにより好ましい実施形態において、フルオロフォアの群は、中でも、Ａｌｅｘａシリーズのフルオロフォア、シアニン、５−（及び−６）カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）のうちの少なくとも１つであり得る。
【００２０】
生物学的試料におけるサルモネラ菌の有無の検出及び／又は定量化のためのキットは、さらに本発明の対象である。
【００２１】
本発明のより好ましい実施形態において、当該キットは、以下の溶液、固定液、ハイブリダイゼーション溶液、及び洗浄液のうちの少なくとも１つをさらに示し得る。
【００２２】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、固定液は、パラホルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、２〜８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒド及び２５〜９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールを含むことができ、並びに／又はハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアミドを含み得る。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、前述のＰＮＡプローブを使用した、生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出のための、又はサルモネラ菌の検出のための方法であって、
−  ＰＮＡプローブを生物学的試料と接触させるステップ、
−  ＰＮＡプローブを、生物学的試料中に存在する微生物の標的配列とハイブリダイズさせるステップ、
−  ハイブリダイゼーションを、生物学的試料中の前述の検出及び定量化の指標として検出するステップ
を含む方法の記載であり、好ましくは、ハイブリダイゼーションは蛍光によって実行することができる。
【００２４】
生物学的試料は、中でも、血液、空気、食物、水、生検、又は糞便から採取することができる。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、前述のＰＮＡプローブの使用、前述のキットの使用、及び生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出、又はサルモネラ菌の検出の方法に適用されることになる方法である。
【００２６】
本発明は、サルモネラ菌株の検出又は定量化を目的とするＰＮＡプローブ、試薬、方法、及びキットを含む。
【００２７】
本明細書に記載されたＰＮＡプローブは、ｒＲＮＡ、ｒＲＮＡに対応するゲノム配列（ｒ）、又はその相補的配列への結合を介したサルモネラ属の特異的検出を可能にする。
【００２８】
（ＤＮＡプローブに対して）ＰＮＡプローブのより高い特異性は、関連するヌクレオチド配列の間のより優れた識別を可能にする。
【００２９】
これは、選択された標的領域内にミスマッチ（本発明に記載されたプローブの位置１４のヌクレオチド）を１つのみ示すサルモネラ菌に対して系統学的に関連する微生物がいくつか存在するため、当該プローブと特定の関係がある。この状況のいくつかの例は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）の菌種、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２の菌株である。
【００３０】
本発明に記載されたＰＮＡプローブは、以下のヌクレオチド配列、
配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’
を有した１５ヌクレオチドを有する。
【００３１】
しかし、検出に使用されることになるプローブは、前述の配列に対して少なくとも８６％の同一性を示し得る。
【００３２】
このプローブは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法による解析に適用され、サルモネラ菌陽性試料の場合には、蛍光顕微鏡を介して、又はフローサイトメトリーを介して、検出可能な蛍光信号を発光する。
【００３３】
特定のソフトウェアを使用して、新たなＰＮＡ−ＦＩＳＨ法プローブの開発を経験的に実行した。関連する微生物の配列に標的微生物のｒＤＮＡ配列を一列に並べることによって、プローブ配列の選択を初めに行った。これは、潜在的に有用な領域の同定を可能にし、その領域は、次に、特異性、ハイブリダイゼーション温度、グアニン／シトシンの割合、結合自由エネルギー、及び二次構造等、他のパラメータに基づき評価される。
【００３４】
プローブの設計及び合成後、固定化／透過処理、ハイブリダイゼーション、及び洗浄といったＦＩＳＨ法手順の３つのステップを、選択したプローブのために開発及び最適化しなくてはならない。この工程には、通常、以下のパラメータ、温度、ホルムアミド及びエタノールの濃度、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄の時間が含まれる。この工程の複雑さ及び多数の変数のため、配列ごとに方法を開発することが常に可能であるわけではなく、したがって、いくつかの代替物及び配列がテストされることが多くあるということに気がつくことが重要である。
【００３５】
十分に成功したハイブリダイゼーションは、その後、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、又はリアルタイムＰＣＲによって、微生物の有無に関する推測、及び微生物の濃度に関する推測でさえも可能にする。検出した蛍光信号は、一般的に、細菌の細胞質に存在する何十又は何百というｒＲＮＡコピーに対する小さいプローブの特異的結合の結果である。プローブ及び標的によって形成された安定した複合体の実在を報告するそのプローブの検出可能部分は、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの１つから選択される。
【００３６】
本発明に記載された方法は、前述の配列に類似の配列を有する少なくとも１つのＰＮＡプローブとの試料の接触を含む。その結果、その解析は、表現型の特徴に基づく及び結果を生じるために何日か必要とするサルモネラ菌検出のための従来の方法に反対して決定的な結果を有する１つのテストに基づいている。
【００３７】
生物学的試料に存在するサルモネラ菌を検出する、すなわち、見つける、同定する、又は測定するためにテストを実行するのに適したキットは、さらに本発明の目的である。当該キットは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションテストを行うのに必要とされるＰＮＡプローブ及び他の選択された試薬又は化合物を含む。
【００３８】
より好ましい現実化において、サルモネラ菌の検出、同定、又は定量化のためのアッセイを行うのに適した当該キットは、固体液、ハイブリダイゼーション溶液、及び洗浄液をさらに含む。
【００３９】
好ましくは、当該方法は、治療上の決定及び品質管理のための診断上の補助手段であるように意図される。したがって、サルモネラ菌同定のためのこの方法の実行は、細菌に対する適切な臨床処置、及び汚染源の早期特定を可能にする。
【００４０】
スライド上に調製した試料に直接ＰＮＡプローブを適用することができ、それは、これらのプローブの適用が、ハイブリダイゼーション前の細胞膜の透過処理のために試薬又は酵素の使用を含まないためである。しかし、ハイブリダイゼーションにおいて頻繁に使用される化合物の一部が要求される。
【００４１】
したがって、当該プローブは、通常、より扱いやすいキットに含まれる。
【００４２】
所望のアプローチがフローサイトメトリーによるＰＮＡ  ＦＩＳＨ法解析を含む場合、同じハイブリダイゼーション化合物を使用して、当該プローブを懸濁液における試料に適用することができる。
【００４３】
定義
ａ）本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、核酸に関連づけられた技術を使用する者に一般的に知られ、その結果、核酸に特異的に結合するポリマーを生じる天然及び人工の分子を含む。
ｂ）「ヌクレオチド配列」という用語は、使用される場合、サブユニット、この場合はヌクレオチドを含有するポリマーのセグメントを意味するのと同じである。
ｃ）「標的配列」という用語は、テストにおいて検出されるように意図されるサルモネラ菌のヌクレオチド配列を意味し、プローブのヌクレオチドの一部がハイブリダイズするように設計される。
ｄ）「ＰＮＡプローブ」という用語は、ヌクレオチド配列を有し、対象の微生物の標的配列とハイブリダイズするよう特異的なＰＮＡのサブユニットのポリマーを意味する。ＰＮＡ分子は、負の電荷をもつ糖・リン酸骨格構造が、反復Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位によりａキラルで電気的に中性に形成されたものによって置き換えられたＤＮＡ模倣物である。
ｅ）「検出可能部分」という用語は、使用される場合、プローブに接続することができ、その結果、機器又は方法によってプローブを検出可能にする分子を意味する。
ｆ）「試料」という用語は、検出のための微生物又は標的配列を含有し得るいかなる生物学的試料も意味する。試料は、臨床試料（例えば、血液、尿、糞便等）、食物試料（例えば、肉、卵、乳幼児用調合乳、ミルク等）、又は環境試料（例えば、水）であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】プローブ選択のための２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の部分的なアライメントを示す図である。ＳａｌＰＮＡ１８７３プローブの相補的配列は上記において示され、そのアライメント及び多形成位置も標識されている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ＰＮＡプローブ設計：
潜在的に有用なオリゴヌクレオチドを同定してプローブとして使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にて入手可能な１７個の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を選んだ。この選択は、１０個のサルモネラ菌配列を含有し、７つの亜種それぞれの代表的な菌株、及び関連する腸内細菌科に属する種由来の７つの他の菌株を含んだ（図１）。欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）にて入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを使用して、配列を一列に並べ、対象の領域を選択した。６つの潜在的に有用な領域を同定し、該領域を、その後、ＮＣＢＩ（ＢＬＡＳＴソフトウェア）において、及びＳＩＬＶＡ  ｒＲＮＡデータベースプロジェクト（ソフトウェアＰｒｏｂｅ  Ｃｈｅｃｋ）においてテストして、最も多いサルモネラ菌配列が検出され且つ最も少ない非サルモネラ菌配列が検出されたプローブを見つけた。プローブの選択に対して、高いグアニン／シトシンの割合、二次構造のタイプ、及びハイブリダイゼーション温度等、他の判断基準も使用した。
【００４６】
１８ｂｐの領域１つのみが、ＮＣＢＩデータベースにおけるサルモネラ菌株全てを検出する能力を持つように見えた。この領域に対して、４つの可能なプローブを設計した。これらのプローブのうちの１つを、いかなる非サルモネラ菌配列ともハイブリダイズせず、且つ、６０％のＧＣ塩基を含有したため選択した。前述の選択判断基準に従い、選んだ配列は、５’−ＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣ−３’であった。この配列は、菌株サルモネラ菌（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型チフィリウムＬＴ２（ＡＴＣＣ  ４３９７１）、受託番号Ｕ７７９２０の２３Ｓ  ｒＲＮＡの位置１８７３と１８８７との間でハイブリダイズする。菌株ＬＴ２における標的配列の最初の位置から、プローブをＳａｌＰＮＡ１８７３と名付けた。その後、選んだ配列を合成し、オリゴヌクレオチドを、Ｎ末端にて、蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４に付着させた。
【００４７】
ＰＮＡプローブの性能に関する理論的評価：
プローブの設計後、感度及び特異性に対する理論的価値を決定することによってその性能を評価した。ｒＲＮＡ  ＳＩＬＶＡデータベースにおいて利用可能な前述のソフトウェアＰｒｏｂｅＣｈｅｃｋを用いて、これらのパラメータを評価した。この理論的推定のために、（少なくとも１，９００ｂｐを有した良質の配列のみを含んだ）データベースにおける全ての１０１のサルモネラ菌配列を考慮した。当該プローブを、大きなＲＮＡサブユニット（ＬＳＵ、２３Ｓ／２８Ｓ）に対してデータベースに存在する全１１，１２４の配列と一列に並べ、小さいサブユニット（ＳＳＵ、１６Ｓ／１８Ｓ）に対してもデータベースに対してテストし、あり得る１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列とのクロスハイブリダイゼーションの実在を査定した。特異性を、ｎＳｓ／（ＴｎＳ）×１００で計算した。式中ｎＳｎは、当該プローブとは反応しなかった非サルモネラ菌株の数を意味し、ＴｎＳは、検査した非サルモネラ菌株の総数である。感度を、Ｓｓ／（ＴＳｓ）×１００で計算した。式中Ｓｓは、当該プローブによって検出したサルモネラ菌株の数を意味し、ＴＳｓは、データベースに存在するサルモネラ菌株の総数である。
【００４８】
この検索は、データベースに実在する１０１のサルモネラ属菌配列のみを当該プローブＳａｌＰＮＡ１８７３が検出したことを裏付けた。その結果、１００％の理論的特異性及び感度を得た（表１）。
【００４９】
本研究において開発したプローブを以前に開発されたプローブと比較するために、プローブの理論的特異性及び感度をテストした。
−  Ｓａｌ２３Ｓ１０（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、２００１）  −  配列番号６；
−  Ｓａｌｍ６３（Ｋｕｔｔｅｒら、２００６）  −  配列番号７；
−  Ｓａｌ３（Ｎｏｒｄｅｎｔｏｆｔら、１９９７）  −  配列番号８；
も、ＰｒｏｂｅＣｈｅｃｋソフトウェアを使用して査定した（表１）。
【００５０】
これらの配列の理論的査定は、当該プローブの配列番号６、配列番号７、及び配列番号８がデータベースに実在する１０１の菌株のサルモネラ菌のうちそれぞれ９５、７３、及び９６の配列を検出し、９４％、７２％、及び９５％の感度値に相当するということを示した。検出した非サルモネラ菌配列の数について、配列番号１及び配列番号８は、配列番号６及び配列番号７とは異なり、いかなる配列も検出しなかった。これらの値は、１００％（配列番号１及び配列番号８）、９８．１３％（配列番号６）、並びに９９．９７％（配列番号７）の特異性を推定することを可能にした。
【００５１】
行った理論的評価によって、主に２つの態様、ＰＮＡ分子の利点並びに本明細書に記載されたプローブの特異性及び感度の値のため当該プローブＳａｌＰＮＡ１８７３がサルモネラ菌の検出を改善するということが示された。ＰＮＡ分子は、プローブＳａｌ３及びＳａｌｍ６３に対するＤＮＡ  ＦＩＳＨ法の手順と比較した場合にＦＩＳＨ法の手順をより簡単且つより速くし、一方、実在するＰＮＡプローブのうちいずれも、プローブＳａｌＰＮＡ１８７３に対して得た特異性及び感度の理論的な値を超えない。
【表１】
2013523118.tif 000002
【００５２】
本発明のＰＮＡプローブは、好ましくは１５ヌクレオチドを含み、配列番号１の配列  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’と少なくとも８６％同一でありえ、好ましくは、配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’と８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％類似し得る。
【００５３】
或いは、本発明は、当該プローブのヌクレオチド配列の変化も企図する。そのような変化は、中でも欠落、挿入を含み得る。例えば、以下の配列、
−  配列番号２  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ−３’、
−  配列番号３  −  ５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ−３’、
−  配列番号４  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣ−３’、
−  配列番号５  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’、
の１つである。
【００５４】
ＰＮＡプローブの検出可能部分：
以下の例に限定されず、ＰＮＡプローブの検出可能部分は、中でもデキストランコンジュゲート、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、化学発光化合物等、多様な種類の分子を含み得る。
【００５５】
例として、フルオロフォアの分類の中で、使用するのに好ましいものは（それだけに限定されないが）、Ａｌｅｘａシリーズのフルオロフォア、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（及び−６）カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）である。
【００５６】
方法：
本発明は、本明細書に記載された１５ヌクレオチドの領域、配列番号１と少なくとも８６％の相同性を有するヌクレオチド配列を使用してサルモネラ菌の存在を決定するための方法を示す。
【００５７】
当該方法は、（例１において示された）不適切なハイブリダイゼーション条件又は適切なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション条件において、本明細書に記載されたＰＮＡプローブとの細菌の標的配列を有する試料の接触を含み得る。
【００５８】
当該方法は、試料の調製（必要に応じて濃縮ステップを含む）、固定化、ハイブリダイゼーション、洗浄、及び結果の視覚化に分けることができる（例１を参照）。
【００５９】
当該方法は、付着した細胞又は懸濁した細胞に対して行うことができる。
【００６０】
ハイブリダイゼーション条件−最適化：
以下のステップは、本発明を限定することのない、ハイブリダイゼーション条件のあり得る最適化である。
【００６１】
ＰＮＡプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションに影響を与える要因がいくつかある。これらの要因は、ホルムアミド（又は他の変性化学試薬）の割合、塩濃度、したがってイオン強度、ハイブリダイゼーションの温度、洗浄剤濃度、ｐＨ等を含む。
【００６２】
最適なハイブリダイゼーション条件を決定するために、種々の要因を固定する、且つ、所望の差別的程度が達成されるまで各要因を個々に変えることが必要であり得る。
【００６３】
試料において標的配列が別の非標的配列から近いほど、より大きなストリンジェンシーの程度が、ハイブリダイゼーションに影響を与える多様な要因を定めるために必要とされる。本発明において、シゲラ種等の非標的配列は、標的配列と比較して異なるヌクレオチド１つのみを有し得、したがって、高い識別レベルが、非特異的ハイブリダイゼーションを回避するために必要である。
【００６４】
本明細書に記載されたプローブに対して、以下の条件を検出した。
−  ５３℃から５９℃のハイブリダイゼーション温度。スライド内でのハイブリダイゼーションに対しても懸濁液内でのハイブリダイゼーションに対しても最も強い蛍光信号を５７℃にて得た。
−  ５０％から８０％に及ぶエタノール濃度を使用した固定化ステップ。しかし、信号強度において違いは観察されなかった。
−  ハイブリダイゼーション時間（３０、４５、６０、９０分）をテストしたが、短い時間は、長い時間と同じくらい効率的であった。
【００６５】
前述のパラメータ全てを最適化した後、より強い蛍光信号を生じると発見された手順は以下の通りであった。
【００６６】
蛍光顕微鏡観察のために、各細菌培養の塗抹標本を、充当したスライドにおいて調製した。次に、塗抹標本を、
−  ４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社）に１０分間浸漬し、次に、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールにも１０分間浸漬した。
−  試料を風乾し、次に、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社）、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のホルムアミド（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ社）、０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のフィコール（Ｓｉｇｍａ社）、５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ社）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５；Ｓｉｇｍａ社）、及び２００ｎＭのＰＮＡプローブを含有する２０μｌのハイブリダイゼーション溶液で覆った。
−  試料を、カバーガラスで覆い、光から保護された小さい湿気箱に置き、５７℃で３０分間インキュベートした。
−  その後、カバーガラスを取り除き、５ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）、１５ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社）、及び１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトンＸ１００（ｐＨ１０；Ｓｉｇｍａ社）を含有する予熱した洗浄液（５７℃）にスライドを浸した。
−  洗浄ステップも、５７℃にて３０分間実行した。後に、スライドを洗浄液から取り除き、同じインキュベーターにおいて約５分間、５７℃にて乾燥させた。
−  顕微鏡観察前に、非蛍光性のイマージョンオイル（Ｍｅｒｃｋ社）を一滴のせ、カバーガラスで覆った。顕微鏡検査の前にそのスライドを最長２４時間暗所で保管した。
【００６７】
ハイブリダイゼーションは、懸濁液においても行うことができる。ある場合には、この手順が、自己蛍光、すなわち、血液試料の場合には赤血球の自己蛍光、及び乳幼児用調合乳におけるタンパク質の自己蛍光をほぼ完全に除去するのに寄与する。この場合、滅菌水中でホモジナイズされた培養物が（１０，０００×ｇを５分間）遠心分離され、ペレットが５００μｌの４％パラホルムアルデヒド中でホモジナイズされる。１時間後、パラホルムアルデヒドを取り除くために細胞を再度遠心分離し、ペレットが、５００μｌの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中でホモジナイズされる。−２０℃での３０分間のインキュベーション後、細胞は、２００ｎＭ  ＰＮＡプローブを有する１００μｌのハイブリダイゼーション溶液中で再度ホモジナイズされ、５７℃にて３０分間インキュベートされる。ハイブリダイゼーションの後、細胞を遠心分離し、（上記のように）５００μｌの洗浄液中でホモジナイズし、５７℃にて３０分間インキュベートした。最後に、細胞は、洗浄液を取り除くために遠心分離され、５００μｌの滅菌水中でホモジナイズされる。次に、２０μｌの細胞懸濁液は、蛍光に適した顕微鏡用スライド上に広げられるか、又は２００μｌが膜（ポアサイズ０．２μｍ、ニトロセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ社）を通して濾過される。
【００６８】
得た信号が自己蛍光に関係していないということを調べるために、顕微鏡において利用可能な他のフィルターを用いて全ての試料を観察した。同時に、試料をＤＡＰＩで染色もし、試料に存在する全ての細胞が（本発明において記載された）プローブＳａｌＰＮＡ１８７３  −  配列番号１で標識されたことを確かめた。さらに、ハイブリダイゼーション溶液に対してプローブを添加することなく、手順のステップ全てに従い、各アッセイにおいてネガティブコントロールを行った。
【００６９】
プローブの実験的特異性及び感度の試験
ハイブリダイゼーション法を十分に最適化すると、ＰＮＡプローブの特異性及び感度の実験値をテストした。
【００７０】
これに対して、当該手順を６１の（２つのサルモネラ菌種及び６つのサルモネラ菌亜種に属する）代表的なサルモネラ菌株、並びに４６の他の菌株に適用した。後者の菌株は、同じ科に属する２５の分類学的に関連する菌株（シゲラ、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、エルシニア、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ））、並びに異なる目（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））、鋼（ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ））、又は門（リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））にさえも属する２１の菌株を含んだ。ＳａｌＰＮＡ１８７３  −  配列番号１によって検出されなかったサルモネラ菌亜種ＶＩは別にして、残り５９のサルモネラ菌株全てを検出したが、使用した他の種に対してハイブリダイゼーションは観察されなかった。３つのシゲラ種に対して、陽性の試料においても（プローブのない）陰性の試料においても検出したこれらの菌株の強い自己蛍光信号のため、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法の結果を査定することは可能ではなかった。この結果は、類似のＲＮＡ配列を有するシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）が当該プローブとはハイブリダイズしなかったため、プローブとシゲラ種との間の１ヌクレオチドのみの差に関連はない。さらに、エンテロコリチカ菌（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）及び大腸菌Ｋ−１２等の他の種も、まさに同じ位置において１つのミスマッチのみを有し、交差反応は観察されなかった。この結果は、１ヌクレオチドのみのミスマッチを有する配列をＰＮＡプローブが区別するのを可能にすると述べる他の著者による観察（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００４）を支持する。これらの結果に基づいて、１００％の実験的特異性及び９６．７％の実験的感度を得た。
【００７１】
濃縮：
解析されることになる試料は、中でも、食物、生検、血液、水、糞便から得ることができる。
【００７２】
サルモネラ菌を含有する試料は、通常、低い汚染レベルを示す。このため、検出工程を促進する濃縮ステップが推奨される。この濃縮ステップは、腸内細菌科及び／又はサルモネラ菌に対して複合富栄養培地から選択培地まで、いくつかのタイプの培地を使用して行うことができる。インキュベーション温度は、選んだ培地次第でありえ、推奨されるインキュベーション時間は、８から２４時間であるべきである。
【００７３】
本発明に記載されたＰＮＡプローブを、４つの異なるタイプの試料、水、糞便、乳幼児用調合乳、及び血液においてテストした。各タイプの試料の解析において一般に使用される手順に従い試料を濃縮した。水及び糞便の試料の場合、国際標準化機構（ＩＳＯ）によって推奨されるように、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）を使用して（１６〜１８時間）第１のプレ濃縮ステップを行った。この濃縮の後、当該プローブは、テストした試料全てにおけるサルモネラ菌の検出を可能にし、且つ、結果は、これらの試料に推奨されるＩＳＯ法、それぞれ糞便並びに水の試料に対してＩＳＯ  ６５７９：２００２（食物及び動物用飼料におけるサルモネラ菌の検出）並びにＩＳＯ  ６３４０：１９９５（水質−サルモネラ菌の検出及び列挙）によって得られたものと一致した。
【００７４】
乳幼児用調合乳の場合には、同じタイプの試料におけるエンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）の検出に対して以前に示唆されたように、後者を水に溶解し（１：１０）、３７℃にて８時間インキュベートした。血液試料の場合には、１６〜１８時間の濃縮を３７℃にて、血液培養において一般に使用される培地（ＴＢＳ−トリプチケースソイブロス）において行った。濃縮後、スライド又は懸濁液において細菌検出を行った。ハイブリダイゼーションの前に、試料は、（例えば乳幼児用調合乳のタンパク質又は赤血球のような）一部の成分の自己蛍光の干渉を最小限にするために蒸留滅菌水において１対１０に希釈されるべきである。サルモネラ菌を含有する全ての試料が、本発明に記載されたＰＮＡプローブを使用して陽性であった。
【００７５】
これらの実験は、当該ＰＮＡプローブを使用した検出方法が一般的に２０時間未満に種々のタイプの試料におけるサルモネラ菌を検出することができたということを示してきた。さらに、８時間のみの濃縮ステップを行って１ｍｌあたり１ＣＦＵのみを含有する試料を検出することができるということが示された。
【００７６】
各タイプの試料に対して推奨された濃縮培地がテストされてきたけれども、濃縮ステップを標準化することが可能である。何人かの著者は、サルモネラ菌を含有する試料の濃縮に対して、高いレベルの競合微生物を有する試料に対してさえも普遍的な培地として緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）を使用することができるということを示してきている。
【００７７】
使用される従来の方法に対する当該方法、又は前述の試料の比較は、ＰＮＡ試料の実行がサルモネラ属の細菌の検出において少なくとも３日省くことができるということを示した。
【００７８】
固体及び小型の試料の場合には、これらを、フラットブレードを用いた衝撃の機械的工程にさらし、試料を分解して、緩衝ペプトン水に細菌を放出するべきである。生検の場合には、試料は、３〜５・ｍのスライスにカットされ、スライド上に置かれ、濃縮ステップの必要なく、直接ハイブリダイズされる。サルモネラ菌の検出のために開発されたほとんどの方法は、ＰＣＲ技術又は選択培地に基づいている。前者は、より技術的に大変な労力を要し、且つ通常、検出限界を改善するために濃縮ステップも必要とし、後者は、時間のかかる、且つ不正確な結果を与え得る（１２、３４、３８）。本研究において示されたＰＮＡ−ＦＩＳＨ法のプロトコールは、技術的にＰＣＲ法よりも労力を要さず、培養法よりも速く、且つより正確である。濃縮ステップは必要であるけれども、結果を得るために必要とされる全時間は、２０時間未満（１２時間しかかからないＰＩＦは除く）であり、値は、ＰＣＲに基づく方法に対して報告されたものに類似するか、又はそれらよりも良くさえあった（９、１２、３５、３９）。
【００７９】
本明細書に記載された方法は、現在使用される培養に基づく技術に代わる、現存するサルモネラ菌プローブに代わる、且つ、ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡのプロトコールにさえも代わる信頼できるものであることを実証した。本明細書に記載されたＰＮＡプローブは、従来の培養技術と比較した場合に検出において３日省くのを可能にする、ＤＮＡであろうとＰＮＡであろうと以前に記載されたプローブよりも高い特異性を示す（表１を参照）、且つ、一部の分子アプローチ、すなわちＰＣＲにおいて抑制物質として作用する物質の存在によって影響されないことが示された。
【００８０】
結果の視覚化：
このステップは、使用したフルオロフォアに感受性があるフィルターを有したいかなる落射蛍光顕微鏡においても行うことができる。プローブの蛍光信号を検出することができない、顕微鏡に存在する他のフィルターを使用して、自己蛍光の非存在を確かめた。
【００８１】
キット：
本発明は、サルモネラ属由来の細菌の存在をテストすることを可能にするキットにも言及する。
【００８２】
本発明のキットは、配列番号１と少なくとも８６％同一のＰＮＡプローブ、及びテストを行うために選択された別の試薬又は組成物を含む。
【００８３】
本発明のＰＮＡプローブ、その特徴、方法、及びキットは、標的生物内に存在するか、又は内部には存在しない核酸配列の解析に適している。したがって、本発明は、生物の解析にも、興味の対象である生物から抽出されたか若しくは得られた核酸の解析にも使用することができ、標的配列の供給源は本発明に対する限定ではないということを意味する。
【００８４】
以下の例は、本発明を実行するための種々の状況及びいくつかのステップを例示しており、そのうちのいずれの限定も意図することなく、発明の好ましい実施形態である。
【実施例】
【００８５】
（例１）
種々の試料（臨床、食物、又は環境試料）におけるサルモネラ属に属する細菌の検出
配列：
配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に結合）
【００８６】
試料の調製：
臨床、食物、又は環境試料に、ＰＮＡプローブの適用前に濃縮ステップを前もって施した。これは、通常サルモネラ菌が低い汚染レベルを示すためである。この濃縮ステップは、各試料に対して使用される従来の解析法に推奨された培地を使用して行うことができる。食物、動物用飼料、糞便、又は水の場合には、ＢＰＷを使用した。粉乳又は乳幼児用調合乳に対しては、滅菌水を使用して、１／１０（ｗｔ／ｖｏｌ）の比で粉を溶解した。血液試料に対しては、血液培養において一般的に使用される複合ＴＳＢ培地を使用した。
【００８７】
インキュベーション時間は、３７℃にて１２０ｒｐｍで８時間（粉ミルク及び乳幼児用調合乳）から１６〜１８時間（糞便、水、血液等）に及んだ。異なる試料タイプの同時分析に対しては、３７℃にて１２０ｒｐｍで８時間ＢＰＷにおいて濃縮を行うことによって使用される方法が標準化されることが推奨される。８時間のインキュベーション後の陰性結果の場合には、ＰＮＡ  ＦＩＳＨ法の解析が、一晩の濃縮（１６〜１８時間）後に繰り返されるべきである。濃縮ステップに続いて、蛍光に適したスライドに培地を一滴のせた。そのスライドを、５７℃のインキュベーターオーブンに約５分間置くか、又は風乾するために放置した。濃縮ステップを必要としない試料は、固定化ステップにおける手順を開始するべきである。
【００８８】
固定化：
ハイブリダイゼーション工程の間の２３Ｓ  ｒＲＮＡの損失を防ぐために、４％のパラホルムアルデヒド（ｗｔ／ｖｏｌ）及び５０％のエタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶液に試料をそれぞれ１０分間浸漬した。
【００８９】
ハイブリダイゼーション：
固定化の後、次に試料を、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社）、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のホルムアミド（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ社）、０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のフィコール（Ｓｉｇｍａ社）、５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ社）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５；Ｓｉｇｍａ社）、及び２００ｎＭのＰＮＡプローブを含有する一滴のハイブリダイゼーション溶液で覆った。その試料を、（均一なプローブの広がりを保証するために）カバーガラスで覆い、（ハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぐために）光から保護された小さい湿気箱の中に置き、５７℃にて３０分間インキュベートした。
【００９０】
洗浄：
ハイブリダイゼーションの時間の後、カバーガラスを取り除き、５ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、１５ｍＭのＮａＣｌ、及び１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトンＸ１００（ｐＨ１０）を含有する５７℃にて予熱した洗浄液にスライドを浸漬した。次に試料を、ハイブリダイゼーション温度にて３０分間オーブンの中に置いた。その後、スライドを洗浄液から取り除き、同じインキュベーターにおいて約５分間、５７℃にて乾燥させた。顕微鏡での視覚化前に、非蛍光性のイマージョンオイル（Ｍｅｒｃｋ社）を一滴のせ、カバーガラスで覆った。顕微鏡検査の前にそのスライドを最長２４時間の間暗所で保存した。
【００９１】
結果：
ＰＮＡプローブに結合した蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４を検出する能力を持つフィルターを有した蛍光顕微鏡における観察を介して結果を得た。
【００９２】
（例２）
乳幼児用調合乳におけるサルモネラ属及びクロノバクター属の細菌の検出
この例は、Ａｌｍｅｉｄａら、２００９において以前に開発されたクロノバクター属菌に対するプローブと共にサルモネラ属菌に対するプローブを使用する可能性を例示する。これら２つの属は、近年、最も頻繁な粉状の乳幼児用調合乳の汚染として同定され、その汚染は、新生児における菌血症、髄膜炎、及び壊死性腸炎の主原因である。これら２つのプローブは、非常に類似したハイブリダイゼーション温度を示し、且つ、マルチプレックスアッセイ（いくつかのプローブの同時使用）において容易に使用することができる。
【００９３】
配列：
配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に結合）
配列番号６  −  ５’−ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ−３’（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合）
【００９４】
試料の調製：
各乳幼児用調合乳１０ｇを秤量し、９０ｍｌの滅菌水で水和させた。より多い量の乳幼児用調合乳を使用することができるが、１／１０（ｗｔ／ｖｏｌ）の比は維持する。その後、水和した試料を、３７℃にて１２０ｒｐｍで８時間インキュベートした。濃縮後、試料を採取し、１／１０に希釈して、乳幼児用調合乳のタンパク質からの自己蛍光の干渉を最小限にした。最後に、希釈した試料を一滴、適したスライドにのせ、５７℃にて約５分間インキュベーターにおいて風乾した。
【００９５】
ハイブリダイゼーション：
ハイブリダイゼーションを、わずかな違いを１つ有して例１において記載したように行った。ハイブリダイゼーション溶液は、２つのプローブ、サルモネラ菌を検出するためのＰＮＡプローブ、及びクロノバクターを検出するためのＰＮＡプローブを、どちらも２００ｎＭの濃度で含有した。
【００９６】
洗浄：
例１に記載された手順に従って洗浄を行った。
【００９７】
結果：
ＰＮＡプローブに結合した蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４及び４８８を検出するために充当したフィルターが備わった蛍光顕微鏡で試料を観察することによって、結果を得た。
【００９８】
（参考文献）
- Almeida, C., N. F. Azevedo, C. Iversen, S. Fanning, C. W. Keevil, and M. J. Vieira, 2009. Development and application of a novel peptide nucleic acid probe for the specific detection of Cronobacter genomospecies (Enterobacter sakazakii) in powdered infant formula. Appl Environ Microbiol 75:2925-30.
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- WO 02/27036 A2 - Probes, probe sets, methods and kits pertaining for the detection, identification and/or enumeration of bacteria.
【図１】
2013523118.tif 000003
【配列表】
2013523118000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月26日(2011.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ菌の検出及び／又は定量化のためのＰＮＡプローブであって、配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３に対して少なくとも８６％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含むことを特徴とする上記ＰＮＡプローブ。
【請求項２】
以下の配列、
−  配列番号１  −  ５’−ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ−３’、
−  配列番号２  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ−３’、
−  配列番号３  −  ５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ−３’、
−  配列番号４  −  ５’−ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣ−３’ 
のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項３】
ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、又はサルモネラ菌のｒＲＮＡに相補的な配列における標的配列を検出できることを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項４】
配列番号６  −  ５’−ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ−３’に対して少なくとも８６％の類似性を有する１つの配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項５】
少なくとも１種類の検出可能部分に接続されていることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項６】
前記プローブの前記種類の検出可能部分が、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの１つから選択されることを特徴とする、請求項５に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項７】
前記フルオロフォアの群が、Ａｌｅｘａシリーズのフルオロフォア、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ、シアニン、５−（及び−６）カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）のうちの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項６に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載のプローブのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、サルモネラ菌を検出するためのキット。
【請求項９】
以下の溶液、１つの固定液、１つのハイブリダイゼーション溶液、及び１つの洗浄液のうち少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記固定液が、パラホルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、２〜８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒド及び２５〜９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション溶液がホルムアミドを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
サルモネラ菌の検出のための方法であって、請求項１から７までに記載のＰＮＡプローブを使用し、
ａ．ＰＮＡプローブを生物学的試料と接触させるステップ、
ｂ．ＰＮＡプローブを、前記試料中に存在する微生物の標的配列とハイブリダイズさせるステップ、
ｃ．ハイブリダイゼーションを、前記試料の前記検出及び定量化の指標として検出するステップ
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料が、血液、空気、食物、水又は生検から得られることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーションが蛍光により起こることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料中のサルモネラ属菌を検出するための方法に適用されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＰＮＡプローブの使用。
【請求項１６】
生物学的試料中のサルモネラ属菌の検出に適用されることを特徴とする、請求項８から１１までのいずれか一項に記載のキットの使用。
【国際調査報告】
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