(57)【要約】  本発明は、改善された溶解性および安定性を有するグルカゴンペプチドアゴニスト、療法における前記ペプチドの使用、それを必要とする患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法ならびに医薬品の製造における前記ペプチドの使用に関する。本発明のグルカゴンペプチドは、低血糖、糖尿病および肥満、さらに低血糖、糖尿病および肥満に関連する様々な疾患または状態の治療に関して特に重要である。
2013523620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置25のアミノ酸残基X25が、His、Lys、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Gln、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、配列番号1を含むグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【請求項２】
位置25のアミノ酸残基、即ちX25が、His、Lysまたは(p)Tyrを表す、請求項1に記載のグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【請求項３】
位置25のアミノ酸残基、X25が、His、Arg、Lys、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Gln、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、配列番号1を含み、グルカゴン受容体のアゴニストである、グルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【請求項４】
位置25のアミノ酸残基、即ちX25が、His、Arg、Lysまたは(p)Tyrを表す、請求項3に記載のグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【請求項５】
ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に10個までのアミノ酸残基置換を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項６】
前記置換がアミノ酸位置X3、X20、X24、X16、X17、X18、X21、X27、X28および/またはX29にある、請求項5に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項７】
[Glu21,Arg25,Leu27]グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L N T-OH  
[(0-ホスホ)Tyr25,Leu27]グルカゴン
【化１】
2013523620.tif 000011
;
[Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L N T-OH;
[Glu21,Arg25,Leu27,Ser28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L S T-OH;
[His25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q H L L N T-OH;
[Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q K L L N T-OH;
[Glu21,Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q K L L N T-OH;
[Glu15,Glu21,Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L E S R R A Q E F V Q R L L N T-OHおよび
[Arg25,Leu27,Glu28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L E T-OH
からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
非経口投与に適している、請求項9から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
療法で使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１２】
医薬品を調製するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
【請求項１３】
高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
【請求項１４】
2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、
肥満を治療するための、
または過体重を予防するための、
食物摂取量を低下させるための、
エネルギー消費を増大させるための、
体重を減少させるための、
耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;
2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;
食欲を制御するための;満腹を誘発するための;
体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;
過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;
大食症を治療するための;暴食を治療するための;
アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、
ベータ遮断薬中毒を治療するための、
X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための、
医薬品を調製するための請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
【請求項１５】
低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォン・ギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された物理的安定性を有する新規なグルカゴンペプチドアナログ、療法における前記ペプチドの使用、患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法ならびに医薬品の製造における前記ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値の正確な管理は、ヒトはもちろん他の哺乳動物にとっても非常に重要である。2種のホルモン、即ちインスリンおよびグルカゴンが正しい血糖値を維持するために重要であることが十分に確立されている。インスリンが肝臓および末梢組織において、グルコースの末梢取り込みの増大および肝臓からのグルコース放出の低下を介して血糖値を下げることによって作用する一方で、グルカゴンは、主に膵臓および肝臓で、グルコース新生およびグリコーゲン分解のアップレギュレーションを介して血糖値を上げることによって作用する。グルカゴンはまた、脂肪分解を増大させ、ケトーシスを誘発し、かつ血漿中の血漿トリグリセリド値を低下させることが報告されている[SchadeおよびEaton、Acta Diabetologica、1977、14、62頁]。
【０００３】
ヒトグルカゴンは、29残基長の線状ペプチドであり、グルカゴンに特有のサイズおよび配列の組み合わせが、製造および使用におけるペプチドの取り扱いをかなり困難にしている。その分子は、生産的で安定化された第三級構造を保証するには小さすぎ、相転移を保証するには、例えば、凝集体または原線維構造などのベータシートを形成するにはまだ十分に大きい。したがって、pH3〜9の範囲でのグルカゴンに固有の低い溶解性に加えて、溶液でグルカゴンを取り扱う際の問題は、完全にランダムなコンホメーションと、例えば受容体に結合するために必要な構造および原線維を形成し得る構造を包含するより特有の構造とを分離するむしろ小さなエネルギー障壁から生じている。グルカゴンの溶液を取り扱う際には、pH3〜9では溶解性が非常に低いので、酸性および塩基性製剤を選択しなければならない。塩基に触媒される脱アミドを受けやすい天然グルカゴン中のいくつかの残基の存在によって、グルカゴンは、高いpH(>10)で短時間取り扱い得るに過ぎない。
【０００４】
市販のグルカゴン(Eli LillyおよびNovo Nordisk)は、使用前に溶解しなければならない凍結乾燥された固体として供給されている。単純な水性製剤へと溶解されると、グルカゴンは凝集および原線維形成を受けやすいので、調製の後は短時間でその溶液は注射されなければならい。グルカゴンの溶液は、溶解の後には数時間で粘稠性になるか、または混濁することがあり、その結果、注射に不適切となる。患者は低血糖によって精神的に影響を受け得るし、かつ関係者が溶解プロセスに未熟なこともあり得るので、溶解プロセス自体が、低血糖を迅速に阻止するように行動する必要があり得る患者または関係者にとっては大きな問題である。急性低血糖(例えば「インスリンショック」)を治療するためのグルカゴンの周知の使用に加えて、最も重要な用途は、いくつかの撮像手順、特に腹部領域のX線に関係して臨床的に使用される平滑筋に対するその鎮痙効果に基づく。
【０００５】
例えば特許WO2008/086086、WO2008/101017、WO2007/056362、WO2008/152403およびW096/29342など、種々のグルカゴンをベースとするアナログおよびGLP-1/グルカゴン受容体共アゴニスト(co-agonists)を開示しているいくつかの特許出願が当分野で公知である。これらの特許において開示されているGLP-1/グルカゴン受容体共アゴニストのうちの一部は、天然ヒトグルカゴンに対する特異的な突然変異に関する。開示されている他のグルカゴンアナログは、ペグ化されているか(例えばWO2007/056362)、または天然ヒトグルカゴンの特異的な位置でアシル化されている(例えばWO96/29342)。低血糖を予防するためのグルカゴンは、例えば特許出願の米国特許第7314859号に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2008/086086
【特許文献２】WO2008/101017
【特許文献３】WO2007/056362
【特許文献４】WO2008/152403
【特許文献５】WO96/29342
【特許文献６】米国特許第7314859号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】SchadeおよびEaton、Acta Diabetologica、1977、14、62頁
【非特許文献２】Beavenら、European J. Biochem. 11(1969)37〜42頁
【非特許文献３】J. Pharm. Sci.(1977) 66、2頁
【非特許文献４】Remington's Pharmaceutical Sciences、1985年
【非特許文献５】Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年
【非特許文献６】WilliamsおよびPolli(1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48〜59頁
【非特許文献７】Masters(1991)、Spray Drying Handbook(第5版;Longman Scientific and Technical、Essez、U.K.)、491〜676頁
【非特許文献８】Broadheadら(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169〜1206頁
【非特許文献９】Mumenthalerら(1994) Pharm. Res. 11:12〜20頁
【非特許文献１０】CarpenterおよびCrowe(1988) Cryobiology 25:459〜470頁;
【非特許文献１１】Roser(1991) Biopharm. 4:47〜53頁
【非特許文献１２】Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L.編、Marcel Dekker、New York、2000)
【非特許文献１３】Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99:Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J.編、Marcel Dekker、New York、2000)
【非特許文献１４】Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J. & Manning M.C.、Plenum Press、New York 1992
【非特許文献１５】Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177、244〜249頁
【非特許文献１６】LeVine(1999) Methods. Enzymol. 309、274〜284頁
【非特許文献１７】Nielsenら(2001) Biochemistry 40、6036〜6046頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明のペプチドは、溶液中に改善された物理的安定性を有する新規の修飾されたグルカゴンペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、溶液において改善された物理的安定性を有する新規なグルカゴンペプチド、療法における前記ペプチドの使用、患者に前記ペプチドを投与することを含む治療方法ならびに、糖尿病、肥満ならびに低血糖などの関連疾患および状態を治療する際に使用するための医薬品の製造における前記ペプチドの使用に関する。
【００１０】
第1の実施形態(実施形態1)では、本発明は、位置25のアミノ酸残基、即ちX25がHis、Lys、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Gln、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、配列番号1を含むグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグに関する。
【００１１】
本発明はさらに、療法における本発明の化合物の使用、本発明の化合物を含む医薬組成物および医薬品の製造における本発明の化合物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】化合物が物理的応力で原線維形成しないことを示している、実施例1のグルカゴンアナログのThTアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２】実施例2のグルカゴンアナログのThTアッセイからの結果を示すグラフである。1)250μMの実施例2からのグルカゴンアナログ、10mMのHepes緩衝液pH7.5;2)290μMのグルカゴン、50mMのグリシンpH2.5および3)1.45mMのグルカゴン、50mMのグリシンpH2.5。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、水溶液での前記グルカゴンペプチドの物理的または化学的安定性を意外にも改善する位置25における化学的修飾を有するグルカゴンペプチドに関する。
【００１４】
特にさらなる本発明の実施形態は下記である:
【００１５】
2.  式[I]のアミノ酸配列:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-X25-Leu-Met-Asn-Thr [I]
を含む、実施形態1によるグルカゴンペプチド。
【００１６】
3.  X25がHis、Lysまたは(p)Tyrを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００１７】
4.  X25がLysを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００１８】
5.  X25がHisを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００１９】
6.  X25が(p)Tyrを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２０】
7.  X27がLeuを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２１】
8.  X25がTyrを表し、X27がLeuを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２２】
9.  X25がArgを表すが、但し、X27がLeuを表すことを条件とする、実施形態2によるグルカゴンペプチド。
【００２３】
10.  位置25のアミノ酸残基、即ち、X25がHis、Arg、Lys、Ile、Leu、Ala、Met、Pro、Cys、Asn、Val、Ser、Gln、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、グルカゴン受容体のアゴニストであるグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【００２４】
11.  位置25のアミノ酸残基、即ち、X25がHis、Arg、Lys、Ile、Leu、Ala、Met、Cys、Asn、Val、Ser、Gln、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、0.1nMなどのEC50<1nMを有するグルカゴン受容体のアゴニストであるグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【００２５】
12.  式[I]のアミノ酸配列:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-X25-Leu-Met-Asn-Thr[I]
を含む、実施形態10〜11によるグルカゴンペプチド。
【００２６】
13.  X25がHis、Arg、Lysまたは(p)Tyrを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２７】
14.  X25がHisを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２８】
15.  X25がArgを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００２９】
16.  X25がLysを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３０】
17.  X25が(p)Tyrを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３１】
18.  X27がLeuを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３２】
19.  X25がTyrを表し、X27がLeuを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３３】
20.  X25がArg表し、X27がLeuを表す、実施形態10〜12のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３４】
21.  X15がGluを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３５】
22.  X21がGluを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３６】
23.  X28がSerまたはGluを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３７】
24.  X28がSerを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３８】
25.  X28がGluを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００３９】
26.  [Glu21,Arg25,Leu27]グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L N T-OH  
[(0-ホスホ)Tyr25,Leu27]グルカゴン
【００４０】
【化１】
2013523620.tif 000003
【００４１】
;
[Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L N T-0H;
[Glu21,Arg25,Leu27,Ser28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L S T-0H;
[His25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q H L L N T-0H;
[Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q K L L N T-0H;
[Glu21,Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q K L L N T-0H;
[Glu15,Glu21,Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L E S R R A Q E F V Q R L L N T-0Hおよび
[Arg25,Leu27,Glu28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L E T-0H
からなる群から選択される、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００４２】
本発明者らは意外にも、現在の商品と比較して改善されたグルカゴンをベースとする化合物を発見した。これらのアナログは、重症の低血糖を治療するための、より安全で簡便な予め充填されていてすぐに使用することができるデバイスにおいて使用することができるであろう。
【００４３】
本発明者らは意外にも、例えば前記グルカゴンペプチドのアミノ酸位置25に変異を有するヒトグルカゴンのアナログが液体製剤に適していることを発見した。
【００４４】
ヒトグルカゴン(1-29)の一次配列における変異は、古典的なペプチド合成を使用して行われている。薬理学的方法セクションのアッセイ(II)に記載されているとおりのアッセイは、新規アナログの安定性製剤をpH4で、またはpH7.5で、振盪しながら37°に加熱し、次いで原線維およびベータシート構造に結合することが当分野で知られている染料(チオフラビンT)の添加に由来する蛍光を測定することによって確立されている。ThTシグナルが45時間以内に観察されず、アナログがUPLC分析によって完全に回収される場合、アナログは完全に安定していると推測された。
【００４５】
酸性pHで溶かした場合、グルカゴンは、濃度および温度に応じた様々な相転移を受け得る。グルカゴンの試料を0.01Nの塩酸に溶かした後、試料の粘度が低く、溶液が完全に透明であるラグ相(lag-phase)が生じることがある。数時間の後に(Beavenら、European J. Biochem. 11(1969)37〜42)、粘度は上昇し始めるが、これはゲル形成を示している。プラトーに達した後に、粘度は再び低下し始めることがあり、同時に原線維が現れ、溶液から沈殿することがある。このプロセスはシードすることができ(seedable)、少量の予め形成したゲルを加えることによって、ラグ相は低下する。ゲルの形成および原線維形成は、両方ともプロセスの速度を速める加熱および振盪などの物理的応力に高度に依存している。
【００４６】
発明者らはまた意外にも、本発明のグルカゴンアナログは、水溶液中でのゲルおよび原線維の形成に対して改善された安定性を有することを発見した。本発明の化合物の安定性は、薬理学的方法セクションのアッセイ(II)に記載されているとおりの方法によって測定することができる。
【００４７】
本発明は、ゲルおよび原線維の形成に対して改善された物理的安定性を有する新規なグルカゴンアナログに関する。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態は、次に関する:
【００４９】
27.  ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に5個までのアミノ酸残基置換を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５０】
28.  ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に10個までのアミノ酸残基置換を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５１】
29.  前記置換がアミノ酸位置X3、X20、X24、X16、X17、X18、X21、X27、X28および/またはX29にある、実施形態27〜28のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５２】
30.  前記置換がアミノ酸位置X17、X18、X21、X27、X28および/またはX29にある、実施形態27〜28のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５３】
31.  ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に3個までのアミノ酸残基置換を含み、その際、前記置換が、アミノ酸位置X21、X27、X28および/またはX29にある、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５４】
32.  ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に3個までのアミノ酸残基置換を含み、その際、前記置換が、アミノ酸位置X27、X28および/またはX29にある、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５５】
33.  グルカゴン(1-29)、グルカゴン(1-29)-アミドまたはそれらのアナログから選択される、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５６】
34.  ヒトグルカゴン(1-29)の配列と比較した場合に交換、付加もしくは欠失されている15個以下のアミノ酸残基またはヒトグルカゴン(1-29)の配列と比較した場合に交換、付加もしくは欠失されている10個以下のアミノ酸残基を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５７】
35.  ヒトグルカゴン(1-29)と比較した場合に交換、付加または欠失されている6個以下のアミノ酸残基を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５８】
36.  前記グルカゴンペプチドが3個までのアミノ酸残基からなるC末端伸長を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００５９】
37.  前記グルカゴンペプチドが2個までのアミノ酸残基からなるC末端伸長を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００６０】
38.  前記グルカゴンペプチドが1個のアミノ酸残基からなるC末端伸長を含む、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００６１】
39.  グルカゴンペプチドがC末端アミドまたはC末端カルボン酸である、いずれか1つの先行実施形態によるグルカゴンペプチド。
【００６２】
40.  前記グルカゴンペプチドがC末端アミドである、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００６３】
41.  前記グルカゴンペプチドがC末端カルボン酸である、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００６４】
本発明の実施形態では、ヒトグルカゴン(1-29)に対して、グルカゴンペプチド中の最大17個のアミノ酸が修飾(置換、欠失、付加またはそれらの任意の組み合わせ)されている。本発明の実施形態では、グルカゴンペプチド中の最大15個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大10個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大8個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大7個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大6個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大5個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大4個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大3個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の最大2個のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施形態では、グルカゴンアナログ中の1個のアミノ酸が修飾されている。
【００６５】
さらなる本発明の実施形態は次に関する:
【００６６】
42.  前記化合物がグルカゴン受容体のアゴニストである、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００６７】
43.  前記化合物が、0.1nMなどのEC50<1nMを有するグルカゴン受容体のアゴニストである、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００６８】
44.  前記グルカゴンペプチドがDPPIV保護されている化合物である、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００６９】
45.  前記グルカゴンペプチドがDPPIV安定化されている、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７０】
46.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて回収率70%超を有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７１】
47.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて回収率90%超を有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７２】
48.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて回収率約100%を有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７３】
49.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて7時間を超えるラグタイムを有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７４】
50.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて20時間を超えるラグタイムを有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７５】
51.  前記グルカゴンペプチドがThT原線維形成アッセイにおいて45時間を超えるラグタイムを有する、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【００７６】
「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって接続されている少なくとも5個の構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸の群からであってよく、それらは、遺伝コードによってコードされない天然アミノ酸、さらに合成アミノ酸であってよい。遺伝コードによってコードされない天然アミノ酸は例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成によって製造されるアミノ酸、即ちD-アラニンおよびD-ロイシンなどの遺伝コードによってコードされるアミノ酸のD-異性体、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
【００７７】
光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解されたい。
【００７８】
「グルカゴンペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、グルカゴンペプチド、グルカゴン化合物、本発明による化合物、本発明の化合物、式Iの化合物、グルカゴンアナログ、グルカゴン誘導体またはグルカゴンアナログのアナログ、ヒトグルカゴン、ヒトグルカゴン(1-29)、グルカゴン(1-30)、グルカゴン(1-31)、グルカゴン(1-32)、さらにグルカゴン活性を維持しているそれらのアナログ、融合ペプチドおよび誘導体を意味する。
【００７９】
グルカゴン化合物中の位置ナンバリングに関して:本目的では、任意のアミノ酸置換、欠失および/または付加は、天然ヒトグルカゴン(1-29)(配列番号1)の配列に対して示されている。ヒトグルカゴンアミノ酸位置1-29は本明細書において、アミノ酸位置X1からX29と同じであることとする。ヒトグルカゴン(1-29)配列は、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(配列番号1)である。
【００８０】
グルカゴン(1-30)は、C-末端に1個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味し、グルカゴン(1-31)は、C-末端に2個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味し、グルカゴン(1-32)は、C-末端に3個のアミノ酸の伸長を伴うヒトグルカゴンを意味する。
【００８１】
「DPP-IV保護」という用語は、ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、前記化合物を血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-4(DPP-IV)に対して耐性にするために化学的に修飾されているポリペプチドを意味する。血漿中のDPP-IV酵素は、数種のペプチドホルモン、例えばグルカゴン、GLP-1、GLP-2、オキシントモジュリンなどの分解に関与していることが知られている。したがって、DPP-IVによる分解速度を低下させるために、DPP-IV媒介加水分解を受けやすいポリペプチドのアナログおよび誘導体を開発するかなりの努力が成されている。
【００８２】
さらに、本発明のグルカゴンペプチドは、アッセイIIIに記載されているとおりのアルブミン不含アッセイにおけるDPP-IV切断に対して安定化されている。
【００８３】
「グルカゴンアゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン受容体を完全に、または部分的に活性化する任意のグルカゴンペプチドを指す。好ましい実施形態では、「グルカゴンアゴニスト」は、アッセイ1などの当分野で公知の方法によって測定した場合にグルカゴン受容体に好ましくは1μM未満、例えば、100nMまたは1nM未満の親和定数(KD)または効力(EC50)で結合する任意のグルカゴンペプチドである。
【００８４】
本内容において、「アゴニスト」という用語は、該当する受容体タイプを活性化させる物質(リガンド)を示すことが意図されている。
【００８５】
本内容において、「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストの作用を遮断、中和または打ち消す物質(リガンド)を示すことが意図されている。
【００８６】
より具体的には、受容体リガンドは、下記のとおり分類され得る:
受容体を活性化させる受容体アゴニスト;受容体を活性化させるも、完全アゴニストよりも低い効力を有する部分アゴニスト。部分アゴニストは、完全アゴニストの作用を部分的に阻害する受容体部分アンタゴニストとして機能する。
アゴニストの作用を遮断するが、受容体構成活性に影響を及ぼさない受容体中和アンタゴニスト。
アゴニストの作用を遮断すると同時に、受容体-構成活性を弱める受容体インバースアゴニスト。完全インバースアゴニストは、受容体-構成活性を完全に弱め;部分インバースアゴニストは、受容体-構成活性をより低い規模に弱める。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語には、中性アンタゴニストおよび部分アンタゴニスト、さらにインバースアゴニストが包含される。「アゴニスト」という用語には、完全アゴニスト、さらに部分アゴニストが包含される。
【００８８】
本発明の他の実施形態は医薬組成物に関する:
【００８９】
52.  先行する実施形態のいずれか1つによるグルカゴンペプチドを含む医薬組成物。
【００９０】
53.  1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、実施形態52による医薬組成物。
【００９１】
54.  単位剤形中に、実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド約0.001mgから約100mg、約0.01mgから約10mg、例えば約0.1mgから約1gなどを含む、実施形態52〜53のいずれか1つによる医薬組成物。
【００９２】
55.  非経口投与に適した、実施形態52〜53のいずれか1つによる医薬組成物。
【００９３】
56.  療法で使用するための、実施形態1〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【００９４】
本内容では、「薬学的に許容される塩」という用語は、患者に有害でない塩を示すことが意図されている。そのような塩には、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が包含される。酸付加塩には、無機酸、さらに有機酸の塩が包含される。適切な無機酸の代表的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸および硝酸などが包含される。適切な有機酸の代表的な例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などが包含される。薬学的に許容される無機酸または有機酸の付加塩のさらなる例には、参照によって本明細書に組み込まれるJ. Pharm. Sci.(1977) 66、2頁に列挙されている薬学的に許容される塩が包含される。該当する金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびマグネシウム塩などが包含される。アルキル化アンモニウム塩の例には、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウムおよびテトラメチルアンモニウムなどが包含される。
【００９５】
本明細書で使用される場合、化合物の「治療的有効量」という用語は、所定の疾患および/またはその合併症の臨床的症状発現を治癒、緩和または部分的に停止させるのに十分な量を指す。このことを達成するために適した量を「治療的有効量」と定義する。各目的での有効量は、疾患または損傷の重症度、さらに、対象の体重および全身状態に左右されるであろう。適切な投薬量の決定は、常套的な実験を使用して、値のマトリックスを構築し、マトリックスの異なるポイントで試験することによって達成することができることは理解されるであろうが、これらは全て、経験を積んだ医師または獣医師の通常の技能レベルの範囲内である。
【００９６】
本発明による方法で使用する場合、本発明の化合物の典型的な投薬量は、1回から3回用量などの1回または複数回用量で投与される1日当たり約0.001から約100mg/体重kg、好ましくは約0.01から約10mg/体重kg、より好ましくは1日当たり約0.01から約5mg/体重kg、例えば1日当たり約0.05から約10mg/体重kgまたは1日当たり約0.03から約5mg/体重kgの範囲である。正確な投薬量は、投与頻度および投与方法、治療される対象の性別、年齢、体重および全身状態、治療される状態の性質および重症度、治療される任意の随伴疾患ならびに当業者には明らかな他の因子に左右される。
【００９７】
本発明の化合物を便宜的には、当業者によく知られている技術を使用して単位剤形で製剤化することができる。1日当たり1回から3回など、1日当たり1回または複数回の経口投与が意図されている典型的な単位剤形は、本発明の化合物約0.05から約1000mg、好ましくは約0.5から約200mgなどの約0.1から約500mgを適切には含有してよい。
【００９８】
本発明の化合物は、例えば日に1回よりも長い間隔での投与によく適していると考えられる化合物を含み、したがって、適切に製剤化された本発明の化合物は、本明細書に開示されている経路の1つなど、適切な投与経路によって、週に2回または週に1回の投与に適していることがある。
【００９９】
本発明の化合物は、1種または複数の追加の治療活性化合物または物質と組み合わせて投与または施与することができ、適切な追加の化合物または物質は、例えば抗糖尿病薬、抗高脂血症薬、抗肥満薬、抗高血圧症薬および糖尿病から生じているか、またはそれに随伴する合併症を治療するための薬から選択することができる。
【０１００】
本内容では、別段に述べられていなければ、「溶解性の」、「溶解性」、「水溶液に溶解性の」、「水性溶解性」、「水溶性」、「水-溶性」、「水溶解性」および「水-溶解性」という用語は、水への、または水性塩もしくは水性緩衝液、例えば10mMのリン酸塩溶液への、または他の化合物を含有するが、有機溶媒は含有しない水溶液への化合物の溶解性を指す。
【０１０１】
さらに本発明の実施形態は、下記に関する:
【０１０２】
57.  高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０３】
58.  2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０４】
59.  肥満を治療するための、または過体重を予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０５】
60.  食物摂取量を低下させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０６】
61.  エネルギー消費を増大させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０７】
62.  体重を減少させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０８】
63.  耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１０９】
64.  2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１０】
65.  食欲を制御する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１１】
66.  満腹を誘発する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１２】
67.  体重減少の成功後に体重再増加を予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１３】
68.  過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１４】
69.  大食症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１５】
70.  暴食を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１６】
71.  アテローム硬化症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１７】
72.  高血圧を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１８】
73.  2型糖尿病を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１１９】
74.  耐糖能障害を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２０】
75.  脂質異常症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２１】
76.  冠状動脈性心疾患を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２２】
77.  肝脂肪症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２３】
78.  肝脂肪症を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２４】
79.  ベータ遮断薬中毒を治療する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２５】
80.  X線、CT-およびNMR-走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害で使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２６】
81.  低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２７】
82.  インスリン誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２８】
83.  反応性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１２９】
84.  糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３０】
85.  非糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３１】
86.  空腹時低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３２】
87.  薬物誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３３】
88.  胃バイパス誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３４】
89.  妊娠時低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３５】
90.  アルコール誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３６】
91.  インスリノーマを治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３７】
92.  フォン・ギールケ病を治療または予防する際に使用するための、場合によって1種または複数の追加の治療活性な化合物と組み合わされた実施形態1〜51のいずれかによるグルカゴンペプチド。
【０１３８】
さらに本発明の実施形態は、下記の方法に関する:
【０１３９】
93.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防する方法。
【０１４０】
94.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための方法。
【０１４１】
95.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、肥満を治療するための、または過体重を予防するための方法。
【０１４２】
96.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、食物摂取量を低下させるための方法。
【０１４３】
97.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、エネルギー消費を増大させる際に使用するための方法。
【０１４４】
98.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、体重を減少させる際に使用するための方法。
【０１４５】
99.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための方法。
【０１４６】
100.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させる際に使用するための方法。
【０１４７】
101.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、食欲を制御する際に使用するための方法。
【０１４８】
102.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、満腹を誘発する際に使用するための方法。
【０１４９】
103.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、体重減少の成功後に体重再増加を予防する際に使用するための方法。
【０１５０】
104.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療する際に使用するための方法。
【０１５１】
105.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、大食症を治療する際に使用するための方法。
【０１５２】
106.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、暴食を治療する際に使用するための方法。
【０１５３】
107.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、アテローム硬化症を治療する際に使用するための方法。
【０１５４】
108.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、高血圧を治療する際に使用するための方法。
【０１５５】
109.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、2型糖尿病を治療する際に使用するための方法。
【０１５６】
110.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、耐糖能障害を治療する際に使用するための方法。
【０１５７】
111.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、脂質異常症を治療する際に使用するための方法。
【０１５８】
112.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、冠状動脈性心疾患を治療する際に使用するための方法。
【０１５９】
113.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、肝脂肪症を治療する際に使用するための方法。
【０１６０】
114.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、ベータ遮断薬中毒を治療する際に使用するための方法。
【０１６１】
115.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、X線、CT-およびNMR-走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害で使用するための方法。
【０１６２】
116.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６３】
117.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、インスリン誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６４】
118.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、反応性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６５】
119.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６６】
120.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、非糖尿病性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６７】
121.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、空腹時低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６８】
122.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、薬物誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１６９】
123.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、胃バイパス誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１７０】
124.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、妊娠時低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１７１】
125.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、アルコール誘発性低血糖を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１７２】
126.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、インスリノーマを治療または予防する際に使用するための方法。
【０１７３】
127.  それを必要とする患者に、有効量の実施形態1〜51のいずれかによる化合物を、場合によって1種または複数の追加の治療活性化合物と組み合わせて投与することを含む、フォン・ギールケ病を治療または予防する際に使用するための方法。
【０１７４】
さらなる本発明の実施形態は、下記の使用に関する:
【０１７５】
128.  医薬品を調製するための、実施形態1〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
【０１７６】
129.  高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態1〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
【０１７７】
130.  
2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、
肥満を治療するための、または
過体重を予防するための、
食物摂取量を低下させるための、
エネルギー消費を増大させるための、
体重を減少させるための、
耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;
2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;
食欲を制御するための;満腹を誘発するための;
体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;
エネルギー消費を増大させるための;
過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;
大食症を治療するための;
暴食を治療するための;
アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、
ベータ遮断薬中毒を治療するための、
X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための
医薬品を調製するための、実施形態1〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
【０１７８】
131.  低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォン・ギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態1〜51のいずれか1つによるグルカゴンペプチドの使用。
【０１７９】
他の本発明の実施形態は次に関する:
【０１８０】
132.  位置25のアミノ酸残基、即ち、X25がHis、Arg、Lys、Ile、Phe、Leu、Ala、Met、Pro、Cys、Asn、Val、Gly、Ser、Gln、Tyr、Asp、Glu、Thrまたは(p)Tyrを表す、グルカゴンペプチド(1-29)アゴニストまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、カルボン酸もしくはプロドラッグ。
【０１８１】
133.  式[I]のアミノ酸配列:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-X25-Leu-Met-Asn-Thr[I]
を含む、実施形態132によるグルカゴンペプチド。
【０１８２】
134.  [Glu21,Arg25,Leu27]グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L N T-OH
および
[(0-ホスホ)Tyr25,Leu27]グルカゴン
【０１８３】
【化２】
2013523620.tif 000004
【０１８４】
からなる群から選択される実施形態132〜133による化合物。
【０１８５】
135.  X25がHis、Arg、Lys、Glu、Asp、Gly、Pro、Tyrまたは(p)Tyrを表す、実施形態132〜134のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
【０１８６】
136.  X25がArgまたはTyrを表す、実施形態132によるグルカゴンペプチド。
【０１８７】
137.  X25がArgを表す、実施形態132によるグルカゴンペプチド。
【０１８８】
138.  X25がTyrを表す、実施形態132によるグルカゴンペプチド。
【０１８９】
139.  実施形態132〜133のうちのいずれか1つによるペプチドを含む医薬組成物。
【０１９０】
140.  1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、実施形態139による医薬組成物。
【０１９１】
141.  非経口投与に適している、実施形態139〜140のいずれか1つによる医薬組成物。
【０１９２】
142.  療法で使用するための、実施形態132〜133のいずれか1つのいずれかによるペプチド。
【０１９３】
143.  医薬品を調製するための、実施形態132〜133のいずれか1つによるペプチドの使用。
【０１９４】
144.  高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態132〜133のいずれか1つによるペプチドの使用。
【０１９５】
145.  
2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、
肥満を治療するための、または
過体重を予防するための、
食物摂取量を低下させるための、
エネルギー消費を増大させるための、
体重を減少させるための、
耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;
2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;
食欲を制御するための;
満腹を誘発するための;
体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;
過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;
大食症を治療するための;暴食を治療するための;
アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、
ベータ遮断薬中毒を治療するための、
X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための
医薬品を調製するための、実施形態132〜133のいずれか1つによるペプチドの使用。
【０１９６】
146.  低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォン・ギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、実施形態132〜133のいずれか1つによるペプチドの使用。
【０１９７】
「治療」、「治療する」という用語およびその他のその変化形は、本明細書で使用される場合、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした患者の管理およびケアを指す。それらの用語は、症状もしくはその合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは除くため、かつ/または状態を予防するための該当する活性化合物の投与など、患者が罹患している所定の状態について治療の全範囲を包含することが意図されており、ここで予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした患者の管理およびケアであると理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防ぐための該当する活性化合物の投与が包含される。治療される患者は好ましくは、哺乳動物、特定するとヒトであるが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはブタなどの他の動物の治療は本発明の範囲内である。
【０１９８】
「肥満」という用語は、過剰な脂肪組織を意味する。エネルギー摂取が、エネルギー消費を超えると、過剰なカロリーが脂肪組織に蓄積され、この正味でプラスの平衡が持続すると、肥満が生じる。即ち、体重のバランスには2つの成分が存在し、いずれかの側(摂取または消費)の異常が肥満をもたらし得る。この内容において、肥満は、健康リスクをもたらすある程度過剰な脂肪組織とみなされるのが最適である。正常な個体と肥満個体との相違は、概算しかできないが、肥満によってもたらされる健康リスクはおそらく、脂肪組織の増加と連続している。しかしながら、本発明の内容では、25を超える肥満指数(BMI=体重(キログラム)を身長(メートル)の二乗で割った値)を有する個体を肥満とみなすこととする。
【０１９９】
本発明の使用および方法のある種の実施形態では、本発明の化合物を、1種を超える上述の適切な追加の治療活性化合物または物質と組み合わせて、例えばグリブリドなどのメトホルミンおよびスルホニル尿素;スルホニル尿素およびアカルボース;ナテグリニドおよびメトホルミン;アカルボースおよびメトホルミン;スルホニル尿素、メトホルミンおよびトログリタゾン;インスリンおよびスルホニル尿素;インスリンおよびメトホルミン;インスリン、メトホルミンおよびスルホニル尿素;インスリンおよびトログリタゾン;インスリンおよびロバスタチン;などと組み合わせて投与または施与することができる。
【０２００】
本内容中で使用されているアミノ酸の略語は次の意味を有する:
【０２０１】
【表１】
2013523620.tif 000005
【０２０２】
D-Ser、D-HisなどのD-から始まって、3文字コードが続くアミノ酸の略語は、対応するアミノ酸のD-鏡像異性体、例えばD-セリン、D-ヒスチジンなどを指す。
【０２０３】
医薬組成物
本発明による化合物を含有する医薬組成物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、1985年またはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年に記載されているとおりの慣用の技術によって調製することができる。
【０２０４】
既に述べたとおり、本発明の一態様は、約1mg/mLから約10mg/mL、約1mg/mLから約5mg/mLなど、約0.01mg/mlから約25mg/mlの濃度で存在する本発明による化合物を含み、pH2.0から10.0を有する医薬製剤を提供することである。医薬製剤は、約0.01mg/mLから約50mg/mlの濃度で存在する本発明による化合物を含んでよく、前記製剤はpH2.0から10.0を有する。製剤は、緩衝剤系、防腐剤、等張化剤、キレート化剤、安定剤および界面活性剤をさらに含んでよい。本発明の一実施形態では、医薬製剤は、水性製剤、即ち、水を含む製剤である。そのような製剤は典型的には、液剤または懸濁剤である。本発明のさらなる実施形態では、医薬製剤は水性液剤である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む製剤と定義される。同様に、「水性液剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む液剤と定義され、「水性懸濁剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁剤と定義される。
【０２０５】
さらなる態様では、本発明は、本発明による化合物の水溶液および緩衝剤を含む医薬製剤に関し、ここで、前記化合物は、0.1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤はpH約2.0から約10.0を有する。
【０２０６】
さらなる態様では、本発明は、本発明による化合物の水溶液および緩衝剤を含む医薬製剤に関し、ここで、前記化合物は、0.1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤はpH約7.0から約8.5を有する。
【０２０７】
本発明の他の実施形態では、製剤のpHは、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9および10.0からなるリストから選択される。好ましくは、製剤のpHは、本発明による化合物の等電点から少なくとも1pH単位であり、なおより好ましくは、製剤のpHは、本発明による化合物の等電点から少なくとも2pH単位である。
【０２０８】
本発明のさらなる実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ヘペス、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な緩衝剤のそれぞれが、本発明の代替実施形態を構成する。
【０２０９】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、薬学的に許容される防腐剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、エタノール、クロロブタノールおよびチオメロザール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3(p-クロルフェノキシ)プロパン-1,2-ジオール)またはそれらの混合物からなる群から選択される。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、0.1mg/mLから30mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、0.1mg/mLから20mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、0.1mg/mｌから5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、5mg/mｌから10mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、防腐剤は、10mg/mｌから20mg/mlの濃度で存在する。これらの具体的な防腐剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。医薬組成物中での防腐剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
【０２１０】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、等張化剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばPEG400)またはそれらの混合物からなる群から選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース-Naを包含する単糖、二糖もしくは多糖または水溶性グルカンなどの任意の糖を使用することができる。一実施形態では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも1個の--OH基を有するC4〜C8炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール(galacititol)、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールが包含される。一実施形態では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖または糖アルコールは、個別に、または組み合わせて使用することができる。糖または糖アルコールが液体調剤に可溶性である限り、使用される量に決められた限界はなく、本発明の方法を使用して達成される安定化作用に有害に作用することはない。一実施形態では、糖または糖アルコール濃度は、約1mg/mlから約150mg/mlの間である。本発明のさらなる実施形態では、等張化剤は、1mg/mｌから50mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、等張化剤は、1mg/mｌから7mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、等張化剤は、8mg/mｌから24mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、等張化剤は、25mg/mｌから50mg/mlの濃度で存在する。これらの具体的な等張化剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。医薬組成物中での等張化剤の使用は、当業者にはよく
知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
【０２１１】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、キレート化剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、キレート化剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸の塩ならびにそれらの混合物から選択される。本発明のさらなる実施形態では、キレート化剤は、0.1mg/mlから5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、キレート化剤は、0.1mg/mlから2mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態では、キレート化剤は、2mg/mlから5mg/mlの濃度で存在する。これらの具体的なキレート化剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。医薬組成物中でのキレート化剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
【０２１２】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、安定剤をさらに含む。医薬組成物中での安定剤の使用は、当業者にはよく知られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
【０２１３】
より詳細には、本発明の組成物は、安定化された液体医薬組成物であり、その治療活性な成分には、液体医薬製剤での貯蔵の間に凝集体形成を示すこともあるポリペプチドが包含される。「凝集体形成」では、溶解したままか、または溶液から沈殿する大きな可視凝集体であり得るオリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子同士の物理的相互作用が意図されている。「貯蔵の間」では、いったん調製された液体医薬組成物または製剤が直ちには対象に投与されないことが意図されている。むしろ調製の後に、液体形態で、凍結状態で、または後で液体形態に再構成するために乾燥された形態で、または対象に投与するために適した他の形態で貯蔵のためにパッケージングされる。「乾燥された形態」では、液体医薬組成物または製剤が、冷凍乾燥(即ち、凍結乾燥;例えば、WilliamsおよびPolli(1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48〜59頁を参照されたい)、噴霧乾燥(Masters(1991)、Spray Drying Handbook(第5版;Longman Scientific and Technical、Essez、U.K.)、491〜676頁;Broadheadら(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169〜1206;およびMumenthalerら(1994) Pharm. Res. 11:12〜20を参照されたい)または空気乾燥(CarpenterおよびCrowe(1988) Cryobiology 25:459〜470頁;およびRoser(1991) Biopharm. 4:47〜53頁を参照されたい)のいずれかによって乾燥されていることが意図されている。液体医薬組成物を貯蔵している間のポリペプチドによる凝集体の形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼして、医薬組成物の治療効果を失わせ得る。さらに、ポリペプチド含有医薬組成物が点滴系を使用して投与される場合には、凝集体形成は、配管、膜またはポンプの詰まりなどの他の問題を引き起こすこともある。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、組成物を貯蔵している間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させるために十分な量のアミノ酸塩基をさらに含んでよい。「アミノ酸塩基」では、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせが意図されており、その際、任意の所定のアミノ酸が、その遊離塩基の形態で、またはその塩の形態のいずれかで存在する。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、全てのアミノ酸が、その遊離塩基の形態で存在してよいか、全てがその塩の形態で存在してよいか、または一部はその遊離塩基の形態で存在してよく、他はその塩の形態で存在する。一実施形態では、本発明の組成物を調製するために使用されるアミノ酸は、アルギニン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの荷電側鎖を持つものである。一実施形態では、本発明の組成物を調製するために使用されるアミノ酸は、グリシンである。その特定のアミノ酸がその遊離塩基の形態またはその塩の形態で存在する限り、特定のアミノ酸(例えばメチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンおよびそれらの混合物)の任意の立体異性体(即ちLまたはD)またはこれらの立体異性体の組み合わせが、本発明の医薬組成物中に存在してよい。一実施形態では、L-立体異性体を使用する。本発明の組成物はまた、これらのアミノ酸のアナログを用いて製剤化することができる。「アミノ酸アナログ」では、本発明の液体医薬組成物を貯蔵している間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させる所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体が意図されている。適切なアルギニンアナログには例えば、アミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンが包含され、適切なメチオニンアナログには、エチオニンおよびブチオニンが包含され、適切なシステインアナログには、S-メチル-Lシステインが包含される。他のアミノ酸と同様に、アミノ酸アナログを、その遊離塩基の形態またはその塩の形態で組成物に組み込む。本発明のさらなる実施形態では、アミノ酸またはアミノ酸アナログを、タンパク質の凝集を防ぐか、または遅延させるのに十分な濃度で使用する。
【０２１５】
本発明のさらなる実施形態では、メチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために、治療薬として作用するポリペプチドが、そのような酸化を受けやすい少なくとも1個のメチオニン残基を含むポリペプチドである場合には、メチオニン(または他の含硫アミノ酸またはアミノ酸アナログ)を加えることができる。「阻害する」では、時間の経過に伴うメチオニン酸化種の蓄積を最小限にすることが意図されている。メチオニン酸化を阻害することで、ポリペプチドのより多くが、その適正な分子形態に維持される。メチオニンの任意の立体異性体(L、Dまたはそれらの混合物)を使用することができる。加えられる量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に許容されるように、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきである。典型的にはこれは、組成物が約10%から約30%以下のメチオニンスルホキシドを含有することを意味する。一般にこれは、加えられるメチオニンとメチオニン残基との比が10:1から約100:1など、約1:1から約1000:1であるようにメチオニンを加えることによって達成することができる。
【０２１６】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、安定剤を、ポリエチレングリコール(例えばPEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールなどの硫黄含有物質ならびに種々の塩(例えば塩化ナトリウム)から選択する。これらの具体的な安定剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。
【０２１７】
医薬組成物はまた、その中の治療活性なポリペプチドの安定性をさらに増大させる追加の安定化剤を含んでよい。本発明に特に重要な安定化剤には、これらに限られないが、メチオニン酸化に対してポリペプチドを保護するメチオニンおよびEDTAならびに凍結-解凍または機械的剪断に関連した凝集に対してポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が包含される。
【０２１８】
本発明のさらなる実施形態では、製剤は、界面活性剤をさらに含む。本発明のさらなる実施形態では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコリル化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えばPluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188および407、Triton X100などのポロキサマー)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、星状PEO、アルキル化誘導体およびアルコキシル化誘導体などのポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体(Tween、例えばTween-20、Tween-40、Tween-80およびBrij-35)、ポリオキシエチレンヒドロキシステアレート、モノグリセリドまたはそのエトキシ化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン)、誘導体のリン脂質(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾホスホ脂質(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリンまたはトレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスフェートエステル)ならびにリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ならびに極性ヘッド基、すなわちコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、トレオニン、グリセロール、イノシトールの修飾体、ならびに正に荷電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルトレオニン、ならびにグリセロリン脂質(例えばケファリン)、グリセロ糖脂質(例えば、ガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、セラミド、ガングリオシド)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えば、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウムなど)、長鎖(C6〜C12)脂肪酸およびその塩(例えばオレイン酸およびカプリル酸)、アシルカルニチンおよび誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのNα-アシル化誘導体またはリシンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンおよび中性アミノ酸もしくは酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含むジペプチドのNα-アシル化誘導体、中性アミノ酸および2種の荷電アミノ酸の任意の組み合わせを含むトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS(ドクセートナトリウム、CAS登録番号[577-11-7])、ドクセートカルシウム、CAS登録番号[128-49-4])、ドクセートカリウム、CAS登録番号[7491-09-0])、SDS(ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩ならびにグリシンまたはタウリン結合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、陰イオン性(アルキル-アリール-��ルホネート)一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート、3-コラミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホンネート、陽イオン性界面活性剤(第四級アンモニウム塩基)(例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβD-グルコピラノシド)、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次付加することに由来する四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン(例えば、Tetrronic)から選択されるか、または界面活性剤は、イミダゾール誘導体またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。これらの特定の界面活性剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。
【０２１９】
医薬組成物中での界面活性剤の使用は当業者によく知られている。便宜的に、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
【０２２０】
追加の成分もまた、本発明の医薬製剤中に存在してよい。そのような追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張性調節剤、キレート化剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質)および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、ヒスチジンなどのアミノ酸)が包含され得る。そのような追加の成分は勿論、本発明の医薬製剤の安定性全体に有害な影響を及ぼすべきではない。
【０２２１】
本発明による化合物を含有する医薬組成物をそのような治療を必要とする患者に、いくつかの部位で、例えば局所的部位、例えば皮膚および粘膜部位で、吸収をバイパスする部位で、例えば動脈、静脈、心臓への投与で、かつ吸収を伴う部位で、例えば皮膚、皮下、筋肉または腹部への投与で投与することができる。
【０２２２】
本発明による医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路を介する、例えば、舌、舌下、頬側で口中への、経口で胃および小腸内への、経鼻で肺への、例えば細気管支および肺胞またはそれらの組み合わせを介する、表皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼で例えば結膜、尿管(uretal)および非経口を介する、そのような治療を必要とする患者への投与であってよい。
【０２２３】
本発明の組成物は、いくつかの剤形で、例えば液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロエマルション剤、多層乳剤、泡剤、膏薬、ペースト剤、プラスター剤、軟膏剤、錠剤、コーティング錠剤、リンス剤、カプセル剤、例えば、硬質ゼラチンカプセル剤および軟質ゼラチンカプセル剤、坐剤、直腸用カプセル剤、滴剤、ゲル剤、噴霧剤、散剤、エアゾール剤、吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、眼用リンス剤、膣用ペッサリー剤、膣用リング、膣用軟膏剤、注射液、インサイツ形状変換液剤(in situ transforming solution)、例えば、インサイツゲル化、インサイツ硬化、インサイツ沈殿およびインサイツ結晶化、輸液ならびに埋込剤として投与することができる。
【０２２４】
化合物の安定性をさらに増大させ、生物学的利用能を高め、溶解性を高め、有害作用を減らし、当業者によく知られている時間治療を達成し、患者の服薬遵守を高めるか、またはそれらの任意の組み合わせのために、例えば共有結合、疎水的および静電的相互作用を介して、本発明の組成物を薬物担体、薬物送達系および高度薬物送達系にさらに混合または結合させることができる。担体、薬物送達系および高度薬物送達系の例には、これらに限られないが、ポリマー、例えばセルロースおよび誘導体、多糖、例えばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ微粒子、液晶およびそれらの分散液、脂質-水系の相動態の当業者によく知られているL2相およびそれらの分散液、ポリマーミセル、多層乳剤、自己乳化、自己マイクロエマルション化、シクロデキストリンおよびその誘導体ならびにデンドリマーが包含される。
【０２２５】
本発明の組成物は、例えば、全て当業者にはよく知られているデバイスである計測用量吸入器、乾燥散剤吸入器およびネブライザーを使用する、化合物を肺投与するための固体、半固体、粉末および溶液の製剤で有用である。
【０２２６】
本発明の組成物は、制御、持続、遷延、遅延および遅効放出薬物送達系の製剤において特に有用である。より具体的には、これらに限られないが、組成物は、当業者によく知られている非経口制御放出および持続放出系の製剤(どちらの系も投与回数を数分の一に大きく減らす)において有用である。なおより好ましくは、皮下投与される制御放出および持続放出系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系および組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、マイクロスフェア、ナノ粒子である。
【０２２７】
本発明の組成物に有用な制御放出系の製造方法には、これらに限られないが、結晶化、濃縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散化、高圧均一化、カプセル封入、噴霧乾燥、マイクロカプセル封入、コアセルベーション、相分離、マイクロスフェアを製造するための溶媒蒸発、抽出および超臨界流体法が包含される。Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L.編、Marcel Dekker、New York、2000)およびDrug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99:Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J.編、Marcel Dekker、New York、2000)が一般的に参照される。
【０２２８】
非経口投与は、シリンジ、場合によってペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うことができる。別法では、非経口投与は、点滴ポンプを用いて行うことができる。さらなる選択肢は、経鼻または肺用噴霧剤の形態で本発明による化合物を投与するための液剤または懸濁剤であってよい組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明の化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば無針注射によるか、またはパッチ、場合によってイオン泳動パッチからか、または経粘膜、例えば頬側投与を介しての経皮投与のために適応することができる。
【０２２９】
「安定化された製剤」という用語は、高い物理的安定性、高い化学的安定性または高い物理的および化学的安定性を有する製剤を指す。
【０２３０】
タンパク質製剤の「物理的安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、熱-機械的ストレスへのタンパク質の曝露および/または疎水性界面および表面などの不安定化性の表面および界面との相互作用の結果として、タンパク質が生物学的に非活性で、かつ/または不溶性の凝集体を形成するタンパク質の傾向を指す。適切な容器(例えばカートリッジまたはバイアル)中に充填された製剤を機械的/物理的ストレス(例えば撹拌)に種々の温度で様々な期間にわたって曝露した後に、視覚的検査および/または混濁度測定によって、水性タンパク質製剤の物理的安定性を評定する。製剤の視覚的検査は、暗い背景で鋭く集束させた光の中で行う。製剤の混濁度は、混濁度の程度を例えば0から3のスケールで格付けする視覚的スコアによって特徴付ける(混濁を示さない製剤は視覚的スコア0に対応し、日光で視覚的混濁を示す製剤は視覚的スコア3に対応する)。日光で視覚的混濁を示す場合には、その製剤を、タンパク質凝集に関して物理的に不安定と分類する。別法では、製剤の混濁度は、当業者によく知られている簡単な混濁測定によって評定することができる。水溶性タンパク質製剤の物理的安定性はまた、タンパク質の立体配座状態の分光剤(spectroscopic agent)またはプローブを使用することによって評定することができる。プローブは好ましくは、タンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの1例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド原線維を検出するために広く使用されている蛍光色素である。原線維および、もしかすると他のタンパク質構造が存在する場合には、原線維タンパク質形態に結合すると、チオフラビンTは、約450nmで新たな励起最大および約482nmで強い放出を生じる。未結合のチオフラビンTは、それらの波長では本質的に非蛍光である。
【０２３１】
他の小分子を、天然から非天然状態へのタンパク質構造の変化のプローブとして使用することができる。例えば、タンパク質の露出疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブ。疎水性パッチは一般に、その天然状態ではタンパク質の三次構造内に埋もれているが、タンパク質がほどけるか、または変性し始めると、露出される。これらの小分子、分光学的プローブの例は、アントラセン、アクリジン、フェナントロリンなどの芳香族疎水性色素である。他の分光学的プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンなどの疎水性アミノ酸のコバルト金属複合体などの金属アミノ酸複合体である。
【０２３２】
タンパク質製剤の「化学的安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、天然タンパク質構造と比較した場合に、潜在的な生物学的効力の低下および/または潜在的な免疫原性特性の増大を有する化学的分解産物の形成をもたらすタンパク質構造における化学的共有変化を指す。様々な化学的分解産物が、天然タンパク質の種類および性質ならびにタンパク質が曝露される環境に応じて形成され得る。化学的分解の排除は、おそらく多くの場合に完全に回避することはできず、化学的分解産物の量の増大は多くの場合に、当業者によく知られているとおりタンパク質製剤を貯蔵および使用している間に見られる。多くのタンパク質は、グルタミニルまたはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成する脱アミド化のプロセスを受けやすい。他の分解経路は、2個以上のタンパク質分子がトランスアミド化および/または二硫化物相互作用を介して互いに共有結合して、共有結合ダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解産物の形成をもたらしている高分子量変換生成物の形成を伴う(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J. & Manning M.C.、Plenum Press、New York 1992)。酸化(例えばメチオニン残基の)は、化学的分解の他の変種として述べることができる。種々の環境条件に曝露した後の様々な時点で化学的分解産物の量を測定することによって、タンパク質製剤の化学的安定性を評定することができる(分解産物の形成は多くの場合に、例えば温度を上げることによって促進することができる)。多くの場合に、様々なクロマトグラフィー技術(例えばSEC-HPLCおよび/またはRP-HPLC)を使用して、分子サイズおよび/または荷電に応じて分解産物を分離することによって、個々の分解産物のそれぞれの量を決定する。
【０２３３】
したがって上記で概説したとおり、「安定化製剤」は、高い物理的安定性、高い化学的安定性または高い物理的および化学的安定性を有する製剤を指す。一般に、有効期限に達するまでは使用および貯蔵(推奨されている使用および貯蔵条件に従って)の間に、製剤は安定でなければならない。
【０２３４】
本発明の一実施形態では、本発明による化合物を含む医薬製剤は、6週間超の使用について、かつ3年間超の貯蔵について安定である。
【０２３５】
本発明の他の実施形態では、本発明による化合物を含む医薬製剤は、4週間超の使用について、かつ3年間超の貯蔵について安定である。
【０２３６】
本発明のさらなる実施形態では、本発明による化合物を含む医薬製剤は、4週間超の使用について、かつ2年間超の貯蔵について安定である。
【０２３７】
本発明のさらなる実施形態では、化合物を含む医薬製剤は、2週間超の使用について、かつ2年間超の貯蔵について安定である。
【０２３８】
本発明のさらなる実施形態では、化合物を含む医薬製剤は、1年間超の使用について、かつ2年間超の貯蔵について安定である。
【０２３９】
本発明のさらなる実施形態では、化合物を含む医薬製剤は、6カ月間超の使用について、かつ2年間超の貯蔵について安定である。
【０２４０】
本発明によるグルカゴンペプチドを含有する医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に非経口投与することができる。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内または静脈内注射によって行うことができる。別法では、非経口投与は、点滴ポンプを用いて行うことができる。さらなる選択肢は、グルカゴンペプチドを経鼻または肺噴霧剤の形で投与するための散剤または液剤であってよい組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のグルカゴンペプチドはまた、例えばパッチ、場合によってイオン泳動パッチからか、または経粘膜、例えば頬側で、経皮投与することもできる。
【０２４１】
したがって、本発明のグルカゴンペプチドの注射用組成物は、成分を適切に溶解および混合して、所望の目的生成物を得ることを伴う医薬工業の慣用の技術を使用して調製することができる。
【０２４２】
本発明の一実施形態では、グルカゴンペプチドを、注射によって投与するのに適した組成物の形態で提供する。そのような組成物は、すぐに使用することができる注射用液剤であってよいか、または溶媒に溶かした後に初めて注射することができる量の固体組成物、例えば凍結乾燥生成物であってよいかのいずれかである。
【０２４３】
本発明のグルカゴンペプチドは、様々な疾患の治療で使用することができる。使用される特定のグルカゴンペプチドおよび任意の患者への最適な用量レベルは、治療される疾患に、かつ使用される具体的なペプチド誘導体の効力、患者の年齢、体重、身体的活性および食事を包含する様々な因子に、他の薬物との可能な組み合わせに、かつ症例の重症度に左右される。本発明のグルカゴンペプチドの投薬量は、個々の患者それぞれに対して当業者が決定することが推奨される。
【０２４４】
本発明による化合物での治療はまた、例えば抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲抑制薬、抗高血圧症薬、糖尿病から生じているか、または糖尿病に関連している合併症を治療および/または予防するための薬剤ならびに肥満から生じているか、または肥満に関連している合併症および障害を治療および/または予防するための薬剤から選択される第2か、またはそれ以上の薬理学的活性物質と組み合わせることができる。本内容では、「抗糖尿病薬」という表現には、インスリン耐性および疾患を治療および/または予防するための化合物が包含され、ここで、インスリン耐性は病態生理学的機構である。
【０２４５】
これらの薬理学的活性物質の例は、インスリン、GLP-1アゴニスト、スルホニル尿素(例えばトルブタミド、グリベンクラミド、グリピジドおよびグリクラジド)、ビグアニド、例えばメトホルミン、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害薬(例えばアコルボース(acorbose))、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害薬、グルコース新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与している肝酵素の阻害薬、グルコース取り込み調節薬、トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジンジオン、HMG CoA阻害薬(スタチン)としての抗高脂血症薬などの脂質代謝を調節する化合物、食物摂取量を低下させる化合物、RXRアゴニストおよびβ細胞のATP-依存性カリウムチャネルに作用する薬剤、例えばグリベンクラミド、グリピジド、グリクラジドおよびレパグリニド;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロサイロキシン、ネテグリニド(neteglinide);レパグリニド;アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロールなどのβ遮断薬、ベナゼプリル(benazepril)、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル(fosinopril)、リシノプリル、アラトリオプリル(alatriopril)、キナプリルおよびラミプリル(ramipril)などのACE(アンジオテンシン転換酵素)阻害薬、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬ならびにドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシンなどのα遮断薬;CART(コカインアンフェタミン規制されたトランスクリプト)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチン(urocortin)アゴニスト、β3アゴニスト、MSH (メラノサイト-刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラノサイト-濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害薬、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害薬、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(チレオトロピン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(未結合タンパク質2または3)調節薬、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン(doprexin))、リパーゼ/アミラーゼ阻害薬、RXR(レチノイドX受容体)調節薬、TR  βアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニストである。
【０２４６】
本発明による化合物と、1種または複数の上述の化合物および場合によって1種または複数のさらなる薬理学的活性物質との任意の適切な組み合わせも、本発明の範囲内と考えられることを理解すべきである。
【０２４７】
本発明を下記の実施例によってさらに説明するが、しかしながら、これらは、保護範囲を限定するものと解釈されるべきではない。前記の記載および下記の実施例において開示されている特徴は、別々にでも、それらの任意の組み合わせでも、本発明をその多様な形態で実現するための材料であり得る。
【０２４８】
(実施例)
略語のリスト:
DCM:  ジクロロメタン
DIC:  ジイソプロピルカルボジイミド
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HPLC:  高速液体クロマトグラフィー
LCMS:  液体クロマトグラフィー質量分析
MeCN:  アセトニトリル
NMP: N-メチル-ピロリドン
RP:  逆相
RP-HPLC:  逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:  室温
Rt:  保持時間
SPPS：  固相ペプチド合成
TFA:  トリフルオロ酢酸
TIPS:  トリイソプロピルシラン
UPLC:  超高速液体クロマトグラフィー
【０２４９】
一般的な方法
この項は、樹脂結合ペプチドを合成する方法(アミノ酸を脱保護する方法、樹脂からペプチドを切断し、それを精製する方法を包含するSPPS法)、さらに、生じたペプチドを検出および特性決定する方法(LCMSおよびUPLC法)に関する。
【０２５０】
SPPS一般法
使用されるFmoc-保護アミノ酸誘導体は、例えばAnaspec、Bachem、Iris BiotechまたはNovabiochemから供給される標準推奨の:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OHおよびFmoc-Val-OHであった。
【０２５１】
SPPSは、Protein Technologies(Tucson、AZ 85714  米国)製のPrelude Solid Phase Peptide SynthesizerでのFmocベースの化学を使用して行った。C-末端カルボン酸を調製するために適した樹脂は、Novabiochemから入手可能な予め負荷された低負荷Wang樹脂である(例えば、低負荷fmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂、LL、0.27mmol/g)。C-末端アミドを有するグルカゴンアナログを合成するのに適した樹脂は、Matrix-Innovationから入手可能なPAL-ChemMatrix樹脂である。N-末端αアミノ基をBocで保護した。
【０２５２】
Fmoc-脱保護は、NMP中20%のピペリジンを2×3分間用いて達成した。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。アミノ酸/HOAt溶液(NMP中0.3M/0.3M、3〜10倍のモル過剰で)を樹脂に加え、続いて同じモル当量のDIC(NMP中3M)、続いてコリジン(NMP中3M)を加えた。例えば、下記の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液をカップリングごとに、下記スケールの反応のために使用した:スケール/ml、0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。カップリング時間は2×30分または1×240分のいずれかであった。
【０２５３】
樹脂からの切断
合成の後に、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)で2〜3時間処理することによってペプチドを樹脂から切断し、続いて、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈澱物をジエチルエーテルで洗浄した。
【０２５４】
精製および定量化
粗製ペプチドを、水/MeCN(4:1)などの水およびMeCNの適切な混合物に溶かし、逆相分取HPLC(Waters Deltaprep 4000またはGilson)によって、C18-シリカゲルを含有するカラムで精製する。溶離を0.1%のTFAを含有する水中の、MeCNの上昇勾配で行う。該当フラクションを分析用HPLCまたはUPLCによってチェックする。純粋な標的ペプチドを含有するフラクションを混合し、減圧下で濃縮する。生じた溶液を分析し(HPLC、LCMS)、化学発光窒素特異的HPLC検出器(Antek 8060 HPLC-CLND)を使用して、または280nmでのUV吸収を測定することによって、生成物を定量化する。生成物をガラスバイアル中に分散させる。バイアルに、Milliporeガラス線維プレフィルターで封をする。凍結乾燥によって、ペプチドトリフルオロアセテートが白色の固体として得られる。
【０２５５】
検出および特性決定のための方法
LCMS方法
LCMS
LCMSを、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromass製のLCT Premier XE質量分析計からなる構成で行った。UPLCポンプを、
A:水中0.1%のギ酸
B:アセトニトリル中0.1%のギ酸
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。適切な体積の試料(好ましくは2〜10μl)をカラムに注入し、これを、AおよびBの勾配で溶離することによって、分析を室温で行った。
UPLC条件、検出器設定および質量分析計設定は:
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。
勾配:0.4ml/分で4.0分(別法では8.0分)の間に線形で5%〜95%のアセトニトリル。
検出:214nm(TUV(可変UV検出器)から類似の出力)
MSイオン化モード:API-ES
走査:100〜2000amu(別法では500〜2000amu)、0.1amuステップ。
【０２５６】
方法:05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で8分かけて60%のA、40%のBから30%のA、70%のBへ。
【０２５７】
方法  04_A3_1
UPLC法
方法  04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて75%のA、25%のBから45%のA、55%のBへ。
【０２５８】
方法  04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて65%のA、35%のBから25%のA、65%のBへ。
【０２５９】
方法:08_B2_1
UPLC(方法08_B2_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
【０２６０】
方法:08_B4_1
UPLC(方法08_B4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
【０２６１】
方法:10_B4_2
UPLC(方法08_B4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で12分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
【０２６２】
方法:10_B5_2
UPLC(方法08_B4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:70%のMeCN、30%の水
B: 0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のMeCN、pH2.25を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で1分で40%のA、7分で40%から70%のAへ。
【０２６３】
方法:05_B7_1
UPLC(方法:05_B7_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて80%のA、20%のBから40%のA、60%のBへ。
【０２６４】
方法:04_A9_1
UPLC(方法:04_A9_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、C18、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、60℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O/10%のCH3CN、pH7.2中の200mMのNa2SO4+20mMのNa2HPO4+20mMのNaH2PO4
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次のステップ勾配を使用した:0.40ml/分の流速で3分かけて90%のA、10%のBから80%のA、20%のBへ、17分かけて80%のA、20%のBから50%のA、50%のBへ。
【０２６５】
(実施例1)
[Glu21,Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 08_B2_1:Rt=8.595分;98%純度
UPLC 08_B4_1:Rt=5.829分;100%純度
LCMS: m/z=1150.1(M+3H)3+,862.9(M+4H) 4+,690.5(M+5)5+
【０２６６】
(実施例2)
[(O-ホスホノ)Tyr25,Leu27]グルカゴン
【０２６７】
【化３】
2013523620.tif 000006
【０２６８】
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに、Fmoc-Tyr(PO(NMe2)2)-OH(Novabiochem)を使用して調製した。樹脂から切断した後、水を全部で10%(V/V)まで切断カクテルに加えることによって、保護(O-ホスホノ)-チロシンを脱保護した。TFA-水混合物を16時間維持して、ホスホチロシンの脱保護を確実にした。
UPLC 08_B2_1:Rt=9.0
UPLC 08_B4_1:Rt=6.1
UPLC 05_B5_1:Rt=1.2
LCMS: m/z=1174.499((M/3)+3);881.11((M/4)+4)。
【０２６９】
(実施例3)
グルカゴンアナログ[Glu21,Arg25,Leu27]グルカゴン(実施例1)を1μMのThT、10mMのグリシルグリシン緩衝液(pH4.0)に250μMの濃度まで溶かした。この試料をThT原線維形成アッセイに掛け、激しく振盪(960rpm)しながら37℃で45時間インキュベートした。これらの条件下では、ThT放出は生じなかった。さらに、このアッセイの終了後に当初試料においてと同じ濃度のグルカゴンアナログ[Glu21,Arg25,Leu27]グルカゴン(実施例1)が溶液中に見出され、即ち回収率は100%であった。Table 1(表2)に示されているアナログを同じアッセイで試験した。結果が、最後の2つの欄にラグタイムおよび回収率として示されている。原線維形成は、いずれのアナログでも観察されなかった。
【０２７０】
(実施例4)
グルカゴンアナログ[(O-ホスホノ)Tyr25,Leu27]グルカゴン(実施例2)を1μMのThT、10mMのHepes緩衝液(pH7.5)中に250μMまで溶かした。比較のために、290μMのグルカゴン、50mMのグリシン(pH2.5)および1.45mMのグルカゴン、50mMのグリシン(pH2.5)(両方とも1μMのThTを含有)をThT原線維形成アッセイに包含させた。グルカゴンアナログ[(O-ホスホノ)Tyr25,Leu27]グルカゴン(実施例2)は、約16時間の原線維形成前ラグタイムを有した。これは、それぞれ290μMおよび1.45mMで約1.5時間および30分未満のラグタイムを有する天然グルカゴンについてよりも有意に長い。
【０２７１】
(実施例5)
[Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 08_B2_1:Rt=8.5分;98%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=5.1分;100%純度
LCMS: m/z=1145.2(M+3H)3+,859.1(M+4H) 4+,687.5(M+5)5+
【０２７２】
(実施例6)
[Glu21,Arg25,Leu27,Ser28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q R L L S T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 08_B2_1:Rt=8.8分;97%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=10.0分;100%純度
LCMS: m/z=1140.9(M+3H)3+,855.9(M+4H) 4+,684.9(M+5)5+
【０２７３】
(実施例7)
[His25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q H L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 08_B2_1:Rt=8.2分;96%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=9.2分;96%純度
LCMS: m/z=1139.2(M+3H)3+,854.6(M+4H) 4+,683.9(M+5)5+
【０２７４】
(実施例8)
[Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q K L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 05_B7_1:Rt=5.3分;98%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=8.6分;100%純度
LCMS: m/z=1139.2(M+3H)3+,854.6(M+4H) 4+,683.9(M+5)5+
【０２７５】
(実施例9)
[Glu21,Lys25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q E F V Q K L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 05_B7_1:Rt=5.4分;98%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=9.3分;100%純度
LCMS: m/z=1140.6(M+3H)3+,855.7(M+4H) 4+,684.7(M+5)5+
【０２７６】
(実施例10)
[Glu15,Glu21,Arg25,Leu27]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L E S R R A Q E F V Q R L L N T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 05_B7_1:Rt=5.2分;100%純度
UPLC 04_A9_1:Rt=7.9分;98%純度
LCMS: m/z=1154.5(M+3H)3+,866.1(M+4H) 4+,693.1(M+5)5+
【０２７７】
(実施例11)
[Arg25,Leu27,Glu28]-グルカゴン
H-H S Q G T F T S D Y S K Y L D S R R A Q D F V Q R L L E T-OH;
ペプチドを、本質的に一般的な方法に記載されているとおりに調製した。
UPLC 05_B7_1:Rt=5.9分;100%純度
LCMS: m/z=1150.8(M+3H)3+,863.3(M+4H) 4+
【０２７８】
薬理学的方法
アッセイ(I)
グルカゴン活性
グルカゴン受容体を膜結合cAMPバイオセンサー(ACTOne(商標))を有するHEK-293細胞にクローニングした。細胞(1ウェル当たり14000)を(37℃、5%CO2)で一晩、384ウェルプレート中でインキュベートした。翌日、細胞に細胞質にのみ分布するカルシウム応答性色素を負荷した。有機アニオントランスポーターの阻害薬であるプロベネシドを加えて、色素が細胞を離脱するのを防いだ。PDE阻害薬を加えて、初期化cAMPが分解するのを防いだ。プレートをFLIPRTETRAに入れ、グルカゴンアナログを加えた。終点データを6分後に集めた。細胞内cAMPの上昇は、細胞質中のカルシウム濃度の上昇と比例した。カルシウムが無水で結合すると、蛍光シグナルが生じた。EC50値をPrism5で算出した。
【０２７９】
【表２】
2013523620.tif 000007
【０２８０】
【表３】
2013523620.tif 000008
【０２８１】
アッセイ(II)
タンパク質製剤の物理的安定性を評価するためのThT原線維形成アッセイ
ペプチドの低い物理的安定性は、アミロイド原線維形成をもたらすことがあり、これは、整列した糸様高分子構造として試料中で観察され、最終的にゲル形成をもたらす。これは慣例では、試料を視覚的に検査することによって測定されている。しかしながら、その種の測定は非常に主観的で、観察者に依存している。したがって、小分子インジケータープローブを適用することが、より有利である。チオフラビンT(ThT)はそのようなプローブであり、原線維に結合すると、明瞭な蛍光サインを有する[Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177、244〜249頁;LeVine(1999) Methods. Enzymol. 309、274〜284頁]。
【０２８２】
原線維形成についての時間経過は、下式の表現でS字状曲線によって表すことができる[Nielsenら(2001) Biochemistry 40、6036〜6046頁]:
【０２８３】
【数１】
2013523620.tif 000009
【０２８４】
式中、Fは、時間tでのThT蛍光である。定数t0は、最大蛍光の50%に達するのに必要な時間である。原線維形成を表す2つの重要なパラメーターは、t0-2τによって算出されるラグタイムおよび見かけ速度定数kapp1/τである。
【０２８５】
【表４】
2013523620.tif 000010
【０２８６】
ペプチドの部分的に折りたたまれた中間体の形成は、原線維形成への一般的な開始機構であると示唆されている。これらの中間体のうちのほとんどは、さらなる中間体が集成し、原線維形成が進行するテンプレートをその上に形成するための核となることはない。ラグタイムは、核の臨界質量が構成される時間間隔に対応し、見掛け速度定数は、原線維自体が形成される速度である。
【０２８７】
各アッセイの前に、試料を新たに調製した。各試料組成物は、説明文中に記載されている。適切な量の濃NaOHおよびHClを使用して、試料のpHを所望の値に調節した。チオフラビンTを、H2O中のストック溶液から試料に、1μMの最終濃度まで加えた。
【０２８８】
試料アリコット200μlを96ウェルマイクロタイタープレート(Packard OptiPlate(商標)96、白色ポリスチレン)に入れた。通常、各試料の4つまたは8つのレプリカ(1つの試験条件に対応する)をウェルの1つのカラムに入れた。プレートをScotch Pad(Qiagen)で密閉した。
【０２８９】
所定の温度でのインキュベーション、振盪およびThT蛍光放出の測定を、Fluoroskan Ascent FL蛍光プレートリーダー(Thermo Labsystems)で行った。温度を所望の値、典型的には30℃または37℃に調節した。振盪せずに(外部物理的ストレスなし)、または1mmの振幅で960rpmに調節して軌道振盪しながら、プレートをインキュベートした。444nmフィルターを介しての励起および485nmフィルターを介しての発光の測定を使用して、蛍光測定を行った。
【０２９０】
プレートをアッセイ温度で10分間インキュベートすることによって、各操作を開始した。プレートを20分毎に所望の期間測定した。各測定の間、前記のとおりにプレートを振盪および加熱した。
【０２９１】
ThTアッセイが完了した後に、各試料の4つまたは8つのレプリカを貯留し、20000rpm、18℃で30分間遠心分離した。上清を0.22μmフィルターで濾過し、アリコットをHPLCバイアルに移した。
【０２９２】
当初試料および濾過上清中でのペプチド濃度を逆相HPLCによって、適切な標準を参照として使用して決定した。当初試料の濃度のうち、濾過された試料の濃度が占めるフラクションパーセンテージを回収率として報告した。
【０２９３】
測定点を、さらなる処理のためにMicrosoft Excelフォーマットで保存し、曲線の製図およびフィッティングは、GraphPad Prismを使用して行った。原線維の不在下でのThTからの背景発光は無視することができた。データ点は典型的には、4つまたは8つの試料の平均であり、標準偏差誤差バーと共に示されている。同じ実験(即ち、同じプレート上の試料)で得られたデータのみを、同じグラフに示して、実験間での原線維形成の比較測定を確実にした。データセットを式(1)にフィットさせることができる。しかしながら、曲線を視覚的に検査して、ThT蛍光が背景レベルよりも有意に強まった時点を同定することによって、原線維形成前のラグタイムを評価することができる。
【図１】
2013523620.tif 000012
【図２】
2013523620.tif 000013
【配列表】
2013523620000001.app
【国際調査報告】
2013523620.tif 000014
2013523620.tif 000015
2013523620.tif 000016