(57)【要約】  本発明は、（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、任意選択的に、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを有する組換え宿主細胞に関する。さらに本発明は、例えば、グルコース消費の増大方法、酸化還元バランスの改善方法、および／またはピルベート利用経路の産物の産生の増大方法を含む、このような組換え宿主細胞の作製および使用方法に関する。
2013515507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾であって、（ａ）のポリペプチドの活性が減少するかまたは実質的に除去される修飾；および
（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド
を含む組換え酵母宿主細胞。
【請求項２】
グルコース消費速度が、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない宿主細胞のそれと比較して、増大する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
（ａ）の修飾が欠失である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
組換え宿主細胞がさらに、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾；を含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が減少するかまたは実質的に除去される、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）のポリペプチドがＨＸＫ２であり、組換え宿主細胞がＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１に記載の組換え宿主。
【請求項７】
（ａ）のポリペプチドがＲＡＧ５であり、組換え宿主細胞がＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）であるか、または
（ａ）のポリペプチドがＨＰＧＬＫ１であり、組換え宿主細胞がＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であるか、または
（ａ）のポリペプチドがＨＸＫ２であり、組換え宿主細胞がＳ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）である、
請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
（ｂ）のポリヌクレオチドが、（ｂ）のポリペプチドが条件的に発現されるようなプロモーターを含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
（ｂ）のポリヌクレオチドが、（ｂ）のポリペプチドが構成的に発現されるようなプロモーターを含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、転写制御因子としての機能を妨げるタンパク質相互作用ドメインの欠失を有する（ａ）のポリペプチドを含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、配列番号２、１１５、１１７、１１９、４、６、８、１２１、または１２３に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、配列番号４、６、８、１２１、または１２３のポリペプチドをコードする、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、配列番号４、６、８、１２１、または１２３に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、配列番号１３０に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが構成的に発現される、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが、ｉ）Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１プロモーター領域に由来するプロモーター領域、またはｉｉ）配列番号１３１に対して少なくとも約８５％の同一性を有するプロモーター領域を含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが条件的プロモーターを含み、配列番号４または配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
条件的プロモーターが、ＯＬＥ１プロモーター領域に由来する配列を含む、請求項１７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール、１−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、マレート、イソアミルアルコール、およびイソプレノイドからなる群から選択される生成物を形成するピルベート利用生合成経路をさらに含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
生成物がイソブタノールである、請求項１９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１９に記載の組換え宿主細胞であって、
ピルベート利用生合成経路が、以下の基質から生成物への変換：
（ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、
（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｉｖ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および
（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
のそれぞれのためのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路であり、ここで宿主細胞がイソブタノールを生成する、上記組換え宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９に記載の組換え宿主細胞であって、
ピルベート利用生合成経路が、以下の基質から生成物への変換：
（ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、
（ｉｉ）アセトラクテートからアセトインへの変換、
（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、および
（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換
のそれぞれのためのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む２−ブタノン生合成経路であり、ここで宿主細胞が２−ブタノンを生成する、上記組換え宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１９に記載の組換え宿主細胞であって、
ピルベート利用生合成経路が、以下の基質から生成物への変換：
（ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、
（ｉｉ）アセトラクテートからアセトインへの変換、
（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、
（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換、および
（ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換
のそれぞれのためのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む２−ブタノール生合成経路であり、ここで宿主細胞が２−ブタノールを生成する、上記組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１９に記載の組換え宿主細胞であって、
ピルベート利用生合成経路が、以下の基質から生成物への変換：
（ｉ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換、
（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換、
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換、
（ｉｖ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換、
（ｖ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換、および
（ｖｉ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換
のそれぞれのためのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む１−ブタノール生合成経路であり、ここで宿主細胞が１−ブタノールを生成する、上記組換え宿主細胞。
【請求項２５】
請求項６に記載の組換え宿主細胞であって、
イソブタノール生合成経路を含み、イソブタノール生合成経路が、以下の基質から生成物への変換：
（ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、
（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、（ｉｖ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および
（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで宿主細胞がイソブタノールを生成する、上記組換え宿主細胞。
【請求項２６】
（ａ）請求項２５に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｂ）イソブタノールが生成される条件下で請求項２５に記載の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む、イソブタノールの生産方法。
【請求項２７】
（ｉ）請求項１に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能的形態で発現される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、組換え宿主細胞のグルコース消費を増大させる方法であって、組換え宿主細胞のグルコース消費が、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない宿主細胞のグルコース消費よりも大きい、上記方法。
【請求項２８】
（ｉ）請求項１９に記載の組換え宿主細胞、またはその組み合わせを備えるステップと、
（ｉｉ）ピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、ピルベート利用生合成経路の生成物の形成を増大させる方法であって、組換え宿主細胞によって形成される生成物の量が、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない宿主細胞によって形成される生成物の量よりも大きい、上記方法。
【請求項２９】
生成物がブタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブタノールがイソブタノールである、請求項２９に記載のブタノール。
【請求項３１】
（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾、および（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、を含む組換え宿主細胞を備えるステップと、
（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能的形態で発現される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、組換え宿主細胞の酸化還元バランスの改善方法であって、
そのような組換え宿主細胞の酸化還元バランスが（ｉ）（ａ）を含むが（ｉ）（ｂ）を含まない組換え宿主細胞の酸化還元バランスと比較して、改善される、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書中に援用される２００９年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、工業微生物学およびアルコール製造の分野に関する。より具体的には、本発明は、（ａ）組換え宿主細胞中で二重役割（ｄｕａｌ−ｒｏｌｅ）ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、任意選択的に、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む前記組換え宿主細胞に関する。さらに本発明は、例えば、グルコース消費の増大方法、酸化還元バランスの増強方法、およびピルベート利用経路の産物の産生の増大方法を含む、このような組換え宿主細胞の作製および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体輸送燃料に対する世界的な需要は、環境的に駆り立てられる特定の目標、例えば、石油備蓄の保全および温室効果ガスの排出制限を満たすための能力に負担をかけることが予測される。このような需要は、石油備蓄の枯渇を軽減し、温室効果ガスの排出を最小限にするために、再生可能資源の利用を可能にする技術の発展を駆り立てている。
【０００４】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック工業における原料化学物質として、そして食品および香料産業における食品グレードの抽出剤として有用である、重要な工業用化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって製造されており、この汎用化学物質の必要性は将来的に高まる可能性が高いであろう。
【０００５】
ブタノールの異性体であるイソブタノールの化学合成方法は、例えば、オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）、およびメタノールとｎ−プロパノールのＧｕｅｒｂｅｔ縮合（非特許文献２）などが知られている。これらの方法は、石油化学物質に由来する出発材料を使用し、一般に高価であり、そして環境に優しくない。植物由来の原材料からのイソブタノールの製造は温室効果ガスの排出を最小限にし、当該技術分野における進歩を表すであろう。
【０００６】
メチルエチルケトン（ＭＥＫ）とも称される２−ブタノンは広く使用されている溶媒であり、アセトンの次に商業的に製造される最も重要なケトンである。これは、塗料、樹脂、および接着剤のための溶媒として、そして酸化反応の選択的な抽出剤、活性化剤として使用され、触媒の存在下で水素と反応させることによって２−ブタノールに化学的に変換することができる（非特許文献３）。２，３−ブタンジオールは、現在は分解油から得られる重要な工業用化学物質であるブテンおよびブタジエンの化学合成において使用することができ、２，３−ブタンジオールのエステルは、可塑剤として使用することができる（非特許文献４）。
【０００７】
ピルベートを利用して、例えば、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノールおよびイソブタノールを産生する生合成経路の発現のために、微生物を操作することができる。特許文献１には、イソブタノールの産生のための組換え微生物の操作が開示されている。特許文献２および３には、２−ブタノンまたは２−ブタノールの産生のための組換え微生物の操作が開示されている。イソブタノールおよび２−ブタノールの生合成のための多数の経路が開示されており、これらは全て細胞ピルベートから開始される。ブタンジオールは、特許文献３に開示される２−ブタノール経路における中間体である。
【０００８】
ピルベートの利用能を増大させ、そして／あるいはグルコース抑制を低減するために組換え宿主細胞を操作することによって、ピルビン酸を利用する生合成経路の産物の形成の増大が可能になる。例えば、グルコース抑制の低減は、酵母の呼吸容量を改善し、バイオマス産生を増大させるために使用されている。また、特許文献４は、グルコース抑制を低減するためのＨａｐ１転写因子の過剰発現が、呼吸容量の増大およびバイオマス産生の増大をもたらすことを開示している。特許文献５には、好気的条件下で増殖されるＨａｐ１転写因子を過剰発現する酵母を用いるバイオマス産生のための方法が開示されている。
【０００９】
ヘキソキナーゼ２遺伝子の機能欠失は、グルコース抑制を低減させ、生合成経路において利用するためのピルベートの利用能を増大させるために使用されている。例えば、特許文献６には、１つまたは複数の機能欠失ヘキソキナーゼ２遺伝子または類似体を有する酵母を好気的に増殖させることによる、酵母バイオマスの産生が開示されている。さらに、Ｒｏｓｓｅｌｌら（非特許文献５）は、ヘキソキナーゼ２遺伝子の欠失を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、糖過剰および嫌気的条件下における二酸化炭素の比産生率として定義される発酵能力の７５％の低下を示すことを見出した。飢餓の後、発酵能力は、ヘキソキナーゼ２遺伝子の欠失のない株と同様であった。Ｄｉｄｅｒｉｃｈら（非特許文献６）は、ヘキソキナーゼ２遺伝子の欠失を有するＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がより低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有することを見出した。
【００１０】
また、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の機能欠失も、生合成経路において利用するためのピルベートの利用能を増大させるために使用されている。例えば、特許文献７には、１つまたは複数のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の破壊と、Ｄ−乳酸の産生のために使用されるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現とを有する酵母菌株が開示されている。特許文献８には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たないグルコース耐性の２つの炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母菌株が開示されており、これらは、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有し得る。ＮｅｖｏｉｇｔおよびＳｔａｈｌ（非特許文献７）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの低減およびＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの増大がグリセロール収率に与える影響を記載している。特許文献９には、サイトゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現およびピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的な除去のために酵母を操作することによる、ピルベートからアセトラクテートへの変換の増大が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／００９２９５７Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開第１９９８／２６０７９Ａ１号パンフレット
【特許文献５】欧州特許第１７２８８５４号明細書
【特許文献６】国際公開第２０００／０６１７２２Ａ１号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／００３１９５０Ａ１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／００５９１３６Ａ１号明細書
【特許文献９】米国特許出願第１２／４７７，９４２号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【非特許文献３】Ｎｙｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｆ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｇ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９４７）６９：１１９８
【非特許文献４】Ｖｏｌｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ２，３−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，”ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｖｏｌ．２，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３：９３３−９４７（１９８６）
【非特許文献５】Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１５５−１６４（２００８）
【非特許文献６】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６７：１５８７−１５９３（２００１）
【非特許文献７】Ｙｅａｓｔ  １２：１３３１−１３３７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ヘキソキナーゼ２遺伝子などの二重役割（ｄｕａｌ−ｒｏｌｅ）ヘキソキナーゼをコードする遺伝子の機能欠失を含む組換え宿主細胞における酸化還元バランス、グルコース消費および／またはピルベート利用生合成経路の産物形成を改善することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書には、（ａ）宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾であって、（ａ）のポリペプチドの活性が低減または実質的に除去される修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え酵母細胞が提供されている。実施形態において、組換え酵母細胞は、（ａ）を有するが（ｂ）を有さない酵母細胞と比較して、グルコース消費速度が増大されている。実施形態において、（ａ）の修飾は欠失である。実施形態において、組換え酵母細胞は、（ａ）を有するが（ｂ）を有さない酵母細胞と比較して、グルコース抑制が改変されている。実施形態において、組換え酵母細胞は、さらに、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾を含む。実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は低減されるか、あるいは実質的に除去される。実施形態において、（ａ）のポリペプチドはＨＸＫ２であり、組換え酵母細胞はＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態において、（ａ）のポリペプチドはＲＡＧ５であり、組換え宿主細胞はＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）であるか、あるいは（ａ）のポリペプチドはＨＰＧＬＫ１であり、組換え宿主細胞はＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であるか、あるいは（ａ）のポリペプチドはＨＸＫ２であり、組換え宿主細胞はＳ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）である。本発明の別の態様では、（ｂ）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）ＥＣ２．７．１．１に相当し、そして／あるいは酵素番号ＥＣ２．７．１．２に相当する。実施形態において、（ｂ）のポリヌクレオチドは、（ｂ）のポリペプチドが条件的に発現されるようなプロモーターを含有する。実施形態において、条件的プロモーターは、ＯＬＥ１プロモーター領域に由来する配列を含む。実施形態において、（ｂ）のポリヌクレオチドは、（ｂ）のポリペプチドが構成的に発現されるようなプロモーターを含有する。実施形態において、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、転写制御因子としての機能を阻止するタンパク質相互作用ドメインの欠失を有する（ａ）のポリペプチドを含む。実施形態において、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、配列番号２、１１５、１１７、１１９、４、６、８、１２１、または１２３に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。実施形態において、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、ｉ）Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１プロモーター領域に由来するプロモーター領域、またはｉｉ）配列番号１３１に対して少なくとも約８５％の同一性を有するプロモーター領域を含む。実施形態において、酵母細胞はＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１２１、または１２３のポリペプチドをコードするか、あるいは（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１２１、または１２３に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。実施形態��おいて、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは、配列番号１３０に対して少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。実施形態において、（ｂ）の異種ポリヌクレオチドは条件的プロモーターを含み、配列番号４または配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００１５】
本発明の１つの態様は、ピルベート利用生合成経路を発現する、本明細書で開示される組換え宿主細胞に関する。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は異種ポリヌクレオチドを含む。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は、２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール、１−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、マレート、イソアミルアルコール、およびイソプレノイドから選択される産物を形成する。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート、（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレート、（ｉｖ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、および／または（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路である。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン、（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール、および／または（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む２−ブタノン生合成経路である。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン、（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール、（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン、および／または（ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む２−ブタノール生合成経路である。本発明の別の態様では、このようなピルベート利用生合成経路は、（ｉ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ、（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、（ｉｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ、（ｉｖ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ、（ｖ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド、および／または（ｖｉ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１−ブタノール生合成経路である。
【００１６】
本発明の１つの態様は、２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール、１−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、リンゴ酸、イソアミルアルコール、およびイソプレノイドから選択される産物の製造方法に関し、（ａ）産物が産生される条件下で本明細書において開示される組換え宿主細胞を増殖させるステップと、（ｂ）任意選択的に、産物を回収するステップとを含む。本発明の別の態様では、このような方法は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート、（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレート、（ｉｖ）２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、および／または（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路を含む。本発明の別の態様では、このような方法は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン、（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール、および／または（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む２−ブタノン生合成経路を含む。本発明の別の態様では、このような方法は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート、（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン、（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール、（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン、および／または（ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む２−ブタノール生合成経路を含む。本発明の別の態様では、このような方法は、（ｉ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ、（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、（ｉｉｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ、（ｉｖ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ、（ｖ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド、および／または（ｖｉ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１−ブタノール生合成経路を含む。
【００１７】
本発明の１つの態様は、（ｉ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドにより（ｉ）の組換え宿主細胞を形質転換するステップとを含む、組換え宿主細胞の作製方法に関する。本発明の別の態様では、このような方法は、さらに、（ｉｉｉ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、および／または置換を導入するステップを含む。
【００１８】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能性形態で発現される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、組換え宿主細胞のグルコース消費の増大方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞のグルコース消費は、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞のグルコース消費よりも大きい。
【００１９】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能性形態で発現される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、組換え宿主細胞のグルコース消費の増大方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞のグルコース消費は、（ａ）および（ｃ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞のグルコース消費よりも大きい。
【００２０】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能性形態で発現される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、組換え宿主細胞の酸化還元バランスの改善方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞の酸化還元バランスは、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞の酸化還元バランスと比較して改善される。
【００２１】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）（ｂ）の異種ポリヌクレオチドが機能性形態で発現される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、組換え宿主細胞の酸化還元バランスの改善方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞の酸化還元バランスは、（ａ）および（ｃ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞の酸化還元バランスと比較して改善される。
【００２２】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ピルベート利用経路の産物が形成される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、ピルベート利用生合成経路の産物の形成の増大方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞によって形成される産物の量は、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞によって形成される産物の量よりも大きい。本発明の別の態様では、産物はイソブタノール、２−ブタノール、または１−ブタノールである。
【００２３】
本発明の１つの態様は、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ピルベート利用経路の産物が形成される条件下で（ｉ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、ピルベート利用生合成経路の産物の形成の増大方法に関する。本発明の別の態様では、このような組換え宿主細胞によって形成される産物の量は、（ａ）および（ｃ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞によって形成される産物の量よりも大きい。本発明の別の態様では、産物はイソブタノール、２−ブタノール、または１−ブタノールである。
【００２４】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本明細書と共に電子出願され、参照によって本明細書中に援用される添付の配列表中の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則のセクション２０８および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００２５】
配列番号１〜２および１１４〜１１９は、表３に記載される、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における実例の二重役割ヘキソキナーゼである。
【００２６】
配列番号３〜８および１２０〜１２３は、表４に記載される実例のヘキソースキナーゼコード領域およびタンパク質である。
【００２７】
配列番号９〜２８は、表５に記載されるピルビン酸デカルボキシラーゼ配列である。
【００２８】
配列番号３０は、ＣＵＰ１プロモーター領域に由来する配列である。
【００２９】
配列番号３１および３２は、Ｂ．スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アセト乳酸シンターゼコード領域およびタンパク質配列である。
【００３０】
配列番号３３〜３６は、それぞれ、ＣＹＣ１ターミネーター領域、ＩＬＶ５プロモーター領域、ＩＬＶ５ターミネーター領域、およびＦＢＡ１プロモーター領域に由来する配列である。
【００３１】
配列番号３７および３８は、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域およびタンパク質配列である。
【００３２】
配列番号３９および４０は、ＩＬＶ５コード領域およびタンパク質配列である。
【００３３】
配列番号４１および４２は、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−ＪＥＡ１コード領域およびタンパク質配列である。
【００３４】
配列番号４４および４７は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に最適化されたＬ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤコード領域配列コドンおよびコード化タンパク質である。
【００３５】
配列番号４５および４６は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に最適化されたウマ肝臓ＡＤＨコード領域配列コドンおよびコード化タンパク質である。
【００３６】
配列番号４９、５３、および５４は、それぞれ、ＴＤＨ３プロモーター領域、ＧＰＭ１プロモーター領域、およびＡＤＨ１ターミネーター領域に由来する配列である。
【００３７】
配列番号５５および５６は、それぞれ、ｓａｄＢコード領域およびタンパク質配列である。
【００３８】
配列番号６０および６１は、ＦＢＡターミネーター領域由来の配列およびＣＹＣ１ターミネーター領域由来の配列である。
【００３９】
配列番号６２および６３は、それぞれ、ｉｌｖＤコード領域およびタンパク質配列である。
【００４０】
配列番号１２４および１２５は、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）からのＫｌＧｌｋ１の核酸およびアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１２６および１２７は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からのＨＰＨＸＫ１の核酸およびアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１３１は、ＡＤＨ１プロモーター領域由来の配列である。
【００４３】
配列番号１４０および１４１は、ＳＮＯ１およびＳＮＺ１プロモーター領域由来の配列である。
【００４４】
配列番号５０〜５１、５７〜５８、６６〜７５、７７〜８０、８２〜１００、１０４〜１０５、１０７〜１０９、１１２〜１１３、１２９、および１３３〜１３８は、実施例において使用されるプライマーである。
【００４５】
以下は合成構築物に相当する：
【００４６】
配列番号２９は、ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８プラスミドの配列である。
【００４７】
配列番号４３は、ｐＬＨ４６８プラスミドの配列である。
【００４８】
配列番号４８は、ベクターｐＮＹ８の配列である。
【００４９】
配列番号５２は、ベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢの配列である。
【００５０】
配列番号５９は、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）の配列である。
【００５１】
配列番号６４は、ＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント配列である。
【００５２】
配列番号６５は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ配列である。
【００５３】
配列番号７６は、ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセット配列である。
【００５４】
配列番号８１は、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットの配列である。
【００５５】
配列番号１０２は、ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰの配列である。
【００５６】
配列番号１０３は、ｐＬＡ２５の配列である。
【００５７】
配列番号１０６は、ｐＬＡ３１の配列である。
【００５８】
配列番号１１０は、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅの配列である。
【００５９】
配列番号１１１は、ｐＬＡ３２の配列である。
【００６０】
配列番号１２８は、ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１プラスミドである。
【００６１】
配列番号１３０は、ＨＸＫ２（ＤＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）配列である。
【００６２】
配列番号１３２は、ＡＤＨ１ターミネーター領域由来の配列を有するＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５領域の内部欠失を有するＨＸＫ２をコードするコドン最適化配列である。
【００６３】
配列番号１３９は、ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ−ＨＸＫ２（Ｌｙｓ６−Ｍｅｔ１５）−ＡＤＨ１ｔの配列である。
【００６４】
配列番号１４２は、ｐＬＨ４６７の配列である。
【００６５】
配列番号１４３は、ｐＬＨ４３５の配列である。
【００６６】
配列番号１４４は、ｐＬＨ４４１の配列である。
【００６７】
本発明の種々の実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述（本出願の一部を形成する）からより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例３に記載されるように、ヘキソキナーゼ２欠失を有さない酵母菌株（ＮＹＬＡ７４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］）と比較して、ヘキソキナーゼ２欠失酵母菌株（ＮＹＬＡ８４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］）の増殖（図１Ａ）およびイソブタノール産生（図１Ｂ）を示す。
【図２】ヘキソキナーゼ２欠失を有する株（ＮＹＬＡ８４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］、図２Ｂ）およびヘキソキナーゼ２欠失を有さない株（ＮＹＬＡ７４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］、図２Ａ）について、増殖およびイソブタノール産生の比較を示す。
【図３】細胞１グラム当たりで産生されるイソブタノールのグラム数で測定される、ヘキソキナーゼ２欠失を有する株（ＮＹＬＡ８４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］およびヘキソキナーゼ２欠失を有さない株（ＮＹＬＡ７４［ｐＬＨ４６８／ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８］）の比生産性を経時的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、以下の詳細な説明および添付の配列説明（本出願の一部を形成する）からより完全に理解することができる。
【００７０】
本発明は、植物由来の原材料を、液体輸送燃料として有用な産物ストリームに変換するための改善された方法の必要性に対処する。このような方法は、燃料需要および環境問題の両方を満たすであろう。本出願人らは、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾を含む組換え宿主細胞において、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを導入することによって、酸化還元バランス、グルコース消費、および／またはピルベート利用生合成経路の産物形成を改善する手段を提供している。このような細胞は、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドが導入されていない、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾を含む組換え宿主細胞と比較して、改善された酸化還元バランス、増大されたグルコース消費、および／またはピルベート利用生合成経路の増大された産物形成を示す。また本出願人らは、このような組換え宿主細胞の作製および使用方法も提供しており、例えば、酸化還元バランスの改善方法、グルコース消費の増大方法、およびピルベート利用生合成経路の産物の産生の増大方法が含まれる。
【００７１】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、特許または特許公報の特定の部分だけが参照によって援用されると示されない限り、あたかも個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参照によって援用されると明確にそして個々に示されたかのように、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。
【００７２】
本明細書に開示されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に開示される。材料、方法および実施例は単に例示的であって、限定的であることは意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００７３】
本発明をさらに定義するために、以下の用語、略語および定義が提供される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはこれらの他のあらゆる変化形は、非排他的または非制約的であることが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるのではなく、明白に記載されていないか、あるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含み得る。さらに、反対する明確な記載がない限り、「または（ｏｒ）」は包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。
【００７５】
また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その要素または成分の例、すなわち発生の数に関して非限定的であることが意図される。そのため、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは少なくとも１つを含むように読み取られるべきであり、要素または成分の単数形の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【００７６】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書で使用される場合、非限定的な用語であり、どれか１つの特定の本発明の実施形態を指すことは意図されず、本出願で開示される全ての可能性のある実施形態を包含する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、使用される本発明の原料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物の製造または溶液の使用のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは、報告される数値の５％以内を意味する。
【００７８】
「ブタノール」という用語は、本明細書で使用される場合、２−ブタノール、１−ブタノール、イソブタノール、またはこれらの混合物を指す。
【００７９】
「ピルベート利用生合成経路」という用語は、ピルベートから生合成産物を産生するための酵素経路を指す。
【００８０】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートからイソブタノールを産生するための酵素経路を指す。
【００８１】
「２−ブタノン生合成経路」という用語は、ピルベートから２−ブタノンを産生するための酵素経路を指す。
【００８２】
「２−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートから２−ブタノールを産生するための酵素経路を指す。
【００８３】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートから１−ブタノールを産生するための酵素経路を指す。
【００８４】
「ｈｘｋ２突然変異体」、「ＨＸＫ２ノックアウト」または「ＨＸＫ２−ＫＯ」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞が実質的または完全にヘキソキナーゼ２酵素活性を欠くように、ヘキソキナーゼ２をコードする遺伝子の発現を不活性化または低下させるための遺伝子修飾を有するＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞を指す。
【００８５】
「ｐｄｃ突然変異体」、「ＰＤＣノックアウト」または「ＰＤＣ−ＫＯ」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞が実質的または完全にピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性を欠くように、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｐｄｃ）をコードする遺伝子の発現を不活性化または低下させるための遺伝子修飾を有する細胞を指す。細胞が２つ以上の発現（活性）ＰＤＣ遺伝子を有する場合、活性ＰＤＣ遺伝子のそれぞれが不活性化されるか、あるいは最小限の発現を有し得る。
【００８６】
「炭素基質」という用語は、本明細書において開示される組換え宿主細胞によって代謝されることが可能な炭素源を指す。炭素基質の非限定的な例は本明細書で提供されており、単糖（グルコース、フルクトース、キシロース、およびアラビノースを含むがこれらに限定されない）、オリゴ糖（スクロースおよびマルトースを含むがこれらに限定されない）、多糖、および非炭水化物炭素源（エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロール、二酸化炭素、メタノールを含むがこれらに限定されない）、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
「ポリヌクレオチド」という用語は単一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡ配列、またはその断片（非翻訳５’および３’配列ならびにコード配列を含む）のヌクレオチド配列を含有することができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでも修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００８８】
ポリヌクレオチド配列は、「単離された」（その天然環境から取り出されている）とみなされることもある。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の純粋な（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。本発明に従う単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成的に生成されるような分子を含む。ＤＮＡのポリマー形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成されてもよい。
【００８９】
「遺伝子」という用語は、特異的タンパク質として発現されることが可能な核酸断片を指し、任意選択的に、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列が含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「コード領域」という用語は、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は単一の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用することができる。ポリペプチドは天然の生物学的ソースに由来してもよいし、あるいは組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定される核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ヘキソースキナーゼ活性」は、本明細書で提供される例を含むヘキソースキナーゼ生物学的機能を有する任意のポリペプチドの活性を指す。このようなポリペプチドは、グルコキナーゼおよびヘキソキナーゼを含む。またこのようなポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、およびＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換を触媒するポリペプチドも含む。またこのようなポリペプチドは、酵素番号ＥＣ２．７．１．１または酵素番号ＥＣ２．７．１．２に相当するポリペプチドも含む。このようなポリペプチドは、当該技術分野において周知であり、本明細書において開示される方法によって決定することができる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「ヘキソキナーゼ２活性」は、本明細書で提供される例を含むサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ヘキソキナーゼ２酵素の生物学的機能を有する任意のポリペプチドの活性を指す。このようなポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、およびＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換を触媒するポリペプチドを含む。またこのようなポリペプチドは、酵素番号ＥＣ２．７．１．１に相当するポリペプチドも含む。このようなポリペプチドは、当該技術分野において周知の方法によって決定することができる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「二重役割（ｄｕａｌ−ｒｏｌｅ）ヘキソキナーゼ活性」は、ヘキソースキナーゼ酵素の生物学的機能を有し、発現される細胞内でグルコース抑制表現型を発揮する任意のポリペプチドの活性を指す。このようなポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、およびＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換を触媒するポリペプチドを含む。ヘキソースキナーゼが有し得る第２の役割は制御性であり、ヘキソキナーゼは、グルコース抑制遺伝子においてグルコース抑制を発揮する働きをする場合に、酵母宿主において二重役割である。これは、そのヘキソキナーゼをコードする遺伝子の突然変異を有する株におけるグルコース抑制からの解放によって実証することができる。二重役割は特定の宿主細胞に特異的であり、従って、１つの種においてヘキソースキナーゼ活性およびグルコース抑制活性の両方を有するヘキソースキナーゼは、別の種では、グルコース抑制機能を発現しないこともある。二重機能ヘキソキナーゼを含むヘキソースキナーゼは当該技術分野において知られている。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性」は、本明細書で提供される例を含むピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素の生物学的機能を有する任意のポリペプチドを指す。このようなポリペプチドは、ピルベートからアセトアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドを含む。またこのようなポリペプチドは、酵素番号４．１．１．１に相当するポリペプチドも含む。このようなポリペプチドは当該技術分野において周知であり、本明細書において開示される方法によって決定することができる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「低減された活性」は、低減された活性をもたらす変化の前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときの、ポリペプチドの既知の生物活性の測定可能な減少を指す。このような変化は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を含むことができる。本明細書に開示されるポリペプチドの低減された活性は、当該技術分野において周知であり、本明細書において開示される方法によって決定することができる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「実質的に除去された活性」は、実質的に除去された活性をもたらす変化の前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときに、活性のほぼ完全な消滅をもたらすポリペプチドの既知の生物活性の測定可能な減少を指す。このような変化は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を含むことができる。本明細書に開示されるポリペプチドの実質的に除去された活性は、当該技術分野において周知であり、本明細書において開示される方法によって決定することができる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「除去された活性」は、除去された活性をもたらす変化の前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときに、ポリペプチド既知の生物活性の完全な消滅を指す。このような変化は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を含むことができる。除去された活性は、除去された活性をもたらす変化の前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときに、測定できないポリペプチドの生物活性を含む。本明細書に開示されるポリペプチドの除去された活性は、当該技術分野において周知であり、本明細書において開示される方法によって決定することができる。
【００９９】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、または誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換えで産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドなので、本発明の目的では単離されていると考えられる。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「天然」は、存在する場合にはそれ自体の制御配列を有する、天然に見出されるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物または生物のゲノム中のその天然位置にあるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。「内因性ポリヌクレオチド」は、生物のゲノム中のその天然位置にある天然ポリヌクレオチドを含む。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を含む。「内因性ポリペプチド」は、生物中のその天然位置にある天然ポリペプチドを含む。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「異種」は、通常は宿主生物中に見出されないが、宿主生物中に導入されるか、あるいは別の方法でその天然状態から修飾されたポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」は、対応する天然ポリヌクレオチドとは異なる形態で宿主生物に再導入されるかまたは別の方法で修飾された宿主生物からの天然コード領域またはその一部、および異なる生物からのコード領域またはその一部を含む。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態でソース生物中に再導入されるかまたは別の方法で修飾された天然コード領域またはその一部、および異なる生物からのコード領域を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入された非天然制御領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード領域を含むことができる。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態である天然ポリペプチド、および別の生物からのポリペプチドを含む。発現パターン（転写もしくは翻訳プロファイルまたは細胞局在など）が天然ポリペプチドの発現パターンとは異なるように改変されたポリペプチドは、異種であると考えられる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプリド（ｐｏｌｙｐｅｐｒｉｄｅ）の低減、実質的に除去または除去された活性をもたらすポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変化と、ポリペプチドの低減、実質的に除去または除去された活性をもたらす本明細書に開示されるポリペプチドの変化とを指す。このような変化は当該技術分野において周知の方法によって行うことができ、欠失、突然変異（例えば、自然変異誘発、ランダム変異誘発、変異誘発遺伝子によって生じる変異誘発、またはトランスポゾン変異誘発）、置換、挿入、下方制御、細胞位置の改変、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態の改変（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子の除去、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線による照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換法、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾可能であるかを決定するためのガイドラインは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、酵母または細菌）との配列を比較し、相同性の高い領域（保存領域）またはコンセンサス配列において成される修飾の数を最大にすることによって見出すことができる。ポリヌクレオチドに対するその他の修飾は、産物の産生のための生合成経路の場合のように、増大された発現をもたらし得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、例えば、変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を用いて作製された、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および置換によって、特に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が対象となる活性を消滅させることなく置換、付加、または欠失され得るかを決定するためのガイドラインは、特定のポリペプチドと、相同ポリペプチド（例えば、酵母または細菌）との配列を比較し、相同性の高い領域（保存領域）において成されるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることによって、あるいはコンセンサス配列によりアミノ酸を置換することによって見出すことができる。
【０１０５】
あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体は、遺伝コードの「冗長性」を用いることによって、合成または選択され得る。種々の制限部位を生じるサイレント変化などの種々のコドン置換を導入して、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異はポリペプチドまたはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。
【０１０６】
アミノ酸「置換」は、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよいし、異なる構造および／または化学特性を有するアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正帯電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、そして負帯電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における差異を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質により構造的または機能的に許容される変異の範囲内であり得る。可能とされる変異は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定することができる。
【０１０７】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらに、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者によって理解される。ほとんどの時点でほとんどの細胞型で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【０１０８】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことができる場合、そのコード配列と作動可能に連結される（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
【０１０９】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【０１１０】
「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一または関連の遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。異種遺伝子は、その発現が同等の内因性遺伝子の発現よりも高ければ、過剰発現される。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、核酸断片の宿主生物への転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１１２】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。そのために、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１１４】
種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域におけるコドンの改変を指す。このような最適化は、その生物の遺伝子中で使用されることがより多い１つまたは複数のコドンによる、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンの置換を含む。
【０１１５】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されるので、６４個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする）。「遺伝コード」は、表１のように本明細書においてどのアミノ酸が再現されるかをどのコドンがコードするかを示す。結果として、多数のアミノ酸が２つ以上のコドンによって設計される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡ塩基組成は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく広範囲にわたって変化することができる。
【０１１６】
【表１】
2013515507.tif 000003
【０１１７】
多数の生物は、成長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用に対するバイアスを示す。生物間におけるコドン使用の差異であるコドン選択またはコドンバイアスは遺伝コードの縮重によって提供され、多数の生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは次に、特に、翻訳中のコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能に依存していると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡが優勢であることは、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
【０１１８】
様々な種類の動物、植物および微生物種に対して多数の遺伝子配列が利用可能であれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日訪問）で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２８．０［２００２年２月１５日］から計算される酵母のためのコドン使用表は、以下の表２のように再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用するので、ＤＮＡ中に見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、この表では、ＲＮＡ中に見出されるウラシル（Ｕ）が使用される。表２は、頻度が６４個の全てのコドンに対してではなく各アミノ酸に対して計算されるように適合されている。
【０１１９】
【表２】
2013515507.tif 000004
【０１２０】
【表３】
2013515507.tif 000005
【０１２１】
【表４】
2013515507.tif 000006
【０１２２】
この表または類似の表を用いることによって、当業者は任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが所与の種にとって最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を生じることができる。
【０１２３】
コドンを最適化頻度でランダムに割り当てて所与のポリペプチド配列をコード化することは、各アミノ酸のコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって手作業で行うことができる。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅにおける「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅの折り返し翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅにおける「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能である。さらに、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日訪問）における「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能、およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（２００２年７月９日訪問）において利用可能な「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能など、種々の資源がコドン最適化コード領域配列にとって公的に入手可能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。
【０１２４】
コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）などのソフトウェアパッケージを含む当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。
【０１２５】
ポリヌクレオチドまたは核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で核酸断片の一本鎖形態が他の核酸断片にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（参照によって本明細書中に完全に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した断片（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましいストリンジェント条件セットはより高温を用い、最終の０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。別の好ましい高ストリンジェント条件セットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃における最終の２回の洗浄を用いる。付加的なストリンジェント条件セットには、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃におけるハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄と、その後の０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が含まれる。
【０１２６】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の９．５０〜９．５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【０１２７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０以上の近接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的な部分を当業者に既知の目的のためにこれから使用することができる。従って、本発明は、本明細書において提供されるような完全な配列、ならびに上記で定義したこれらの配列の実質的な部分を含む。
【０１２８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。
【０１２９】
「同一性パーセント」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  ＧｒｉｆＦｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）、および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）において開示される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
【０１３０】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されるアライメント法に相当する「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）によって開示される）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムにおいて見出される「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を用いて実施される。多重アライメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるペアワイズアライメントおよびタンパク質配列の同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法」も利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアライメント法に相当し（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ  ｖ６．１プログラムにおいて見出される。多重アライメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【０１３１】
他の種などからのポリペプチドの同定において多数の配列同一性レベルが有用であることは、当業者によって十分に理解されており、このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する。同一性パーセントの有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５５％〜１００％の任意の整数の百分率が本発明の説明において有用であり得る。適切な核酸断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドもコードする。
【０１３２】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、１．）ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される
場合、他に指定されない限り、分析結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた任意の値またはパラメータのセットを意味するであろう。
【０１３３】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する）によって、そしてＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）によって、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版）（１９８７）によって記載されている。本明細書で使用される付加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にある。
【０１３４】
本明細書に開示される組換え宿主細胞の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリーニングを用いて実施することができ、遺伝子操作に適した任意の宿主細胞において行うことができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用な任意の酵母または真菌宿主であり得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞は、サッカロミセス属、ザイゴサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、デッケラ属、トルロプシス属、イサトケンキア属、ブレタノマイセス属、トルラスポラ属、ハンセニアスポラ属、クルイベロミセス属、およびいくつかのカンジダ種のメンバーであり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。
【０１３５】
二重役割ヘキソキナーゼの修飾
本明細書に開示される組換え酵母細胞は、前記宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾、および／または前記宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドにおける修飾を含むことができる。実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、二重役割ヘキソキナーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの修飾または破壊を有することができる。実施形態において、組換え宿主細胞は、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子における、あるいは二重役割ヘキソキナーゼ活を有する１つまたは複数の内因性ポリペプチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む。このような修飾、破壊、欠失、突然変異、および／または置換は、低減または実質的に除去された二重役割ヘキソキナーゼ活性をもたらすことができ、例えば二重役割ヘキソキナーゼノックアウト表現型が生じる。
【０１３６】
実施形態において、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換を触媒することができ、そして／あるいはＤ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、および／またはＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換を触媒することができる。他の実施形態では、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドは、酵素番号ＥＣ２．７．１．１に相当し得る。
【０１３７】
実施形態において、組換え宿主細胞は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドは、ヘキソキナーゼ２（ＨＸＫ２）であり得る。実施形態において、組換え宿主細胞はＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）であり、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドはＲＡＧ５であり得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞はＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドはＨＰＧＬＫ１であり得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞はＳ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）であり、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドはＨＸＫ２であり得る。ヘキソキナーゼ２ノックアウト株は当該技術分野において既知である（Ｖｏｊｔｅｋ  ａｎｄ  Ｆｒａｅｎｋｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：３７１−３７５，１９９０、Ｌｏｂｏ  ａｎｄ  Ｍａｉｔｒａ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６：７２７−７４４，１９７７、Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：９０１−９０６，１９９９、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＃４００４６２０、＃４０１４６２０、＃４０２４６２０、および＃４０３４６２０）。
【０１３８】
本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾または不活性化の標的とされ得る二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの他の例としては、本明細書に開示される配列のいずれか１つに対して少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチド（ここで、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子は二重役割ヘキソキナーゼ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドは二重役割ヘキソキナーゼ活性を有する）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾または不活性化の標的とされ得る二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドのさらにその他の例としては、本明細書に開示される配列のいずれか１つの活性変異体、断片または誘導体（ここで、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子は二重役割ヘキソキナーゼ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドは二重役割ヘキソキナーゼ活性を有する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
実施形態において、その他の二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドの配列は文献において同定することができ、本明細書に開示される当該技術分野で入手可能な配列を用いて、当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて候補を同定することができる。例えば、このような配列は、既知のヘキソースキナーゼコード化ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を用いて公的に入手可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索を介して同定することができる。このような方法では、同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくことができる。
【０１４０】
さらに、本明細書に開示されるかまたは当該技術分野において既知の二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、天然の他の候補ヘキソースキナーゼ相同体を同定するために使用することができる。例えば、本明細書に開示されるヘキソースキナーゼコード化核酸断片のそれぞれは、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用することができる。配列依存性プロトコールを用いる相同遺伝子の単離は当該技術分野においてよく知られている。配列依存性プロトコールの例としては、（１）核酸ハイブリダイゼーション法、（２）核酸増幅技術の種々の使用により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）、またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］、および（３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
特定のヘキソースキナーゼが二重役割ヘキソキナーゼであるかどうかは、ヘキソースキナーゼが発現される宿主細胞に特異的である。例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＨＰＧＬＫ１は天然生物中で二重役割ヘキソキナーゼであるが、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中ではグルコース抑制に関連しない。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で二重役割であるヘキソースキナーゼのさらなる例は、表３に与えられる。特定のヘキソースキナーゼの二重役割性は当該技術分野において知られており、ヘキソースキナーゼが特定の宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼであるかどうかは、当該技術から、そして／あるいは当業者に既知の方法を用いて容易に決定することができる。例えば、任意のヘキソースキナーゼの役割の１つは、Ｅ．Ｃ．定義２．７．１．１または２．７．１．２のようにヘキソースをリン酸化する酵素活性であり、このような活性は、当該技術分野において知られているアッセイによって確認することができる。二重役割ヘキソキナーゼが有し得る第２の役割は制御性であり、すなわちグルコース抑制遺伝子においてグルコース抑制を発揮する。これは、そのヘキソースキナーゼをコードする遺伝子の突然変異を有する株におけるグルコース抑制からの解放によって実証される。突然変異株におけるグルコース抑制の解放は、
１．  細胞がグルコース含有培地（遺伝系が誘発および抑制を伴う場合には、同族の非グルコース炭素源も添加されなければならない、例えば、ガラクトース、マルトース）中で増殖される場合に、その宿主においてグルコース抑制されることが知られている酵素（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、インベルターゼ、マルターゼ、ガラクトキナーゼ）の酵素活性の発現を測定すること、
２．  細胞がグルコース含有培地（遺伝系が誘発および抑制を伴う場合には、同族の非グルコース炭素源も添加されなければならない、例えば、ガラクトース、マルトース）中で増殖される場合に、その宿主においてグルコース抑制されることが知られている遺伝子の転写を測定すること。転写は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）転写などによって測定することができる。転写は、グルコース抑制遺伝子からのプロモーターの調節下に置かれるレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ｌａｃＺ、ｇｕｓＢ）の発現によって測定することができる、
３．  グルコースと、通常はグルコースによってその消費が抑制される炭素源（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、スクロース、マルトース、ガラクトース）とを同時消費する突然変異株の能力を測定すること、
４．  増殖培地が無償性グルコースリプレッサー（例えば、２−デオキシグルコース、５−チオグルコース）も含有する場合に、通常はグルコースによってその消費が抑制される炭素源において、突然変異株が増殖する能力を試験すること、
を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の方法によって実証することができる。
【０１４２】
上記の試験は全て、参照のために非突然変異株によっても実行され得る。
【０１４３】
実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞に関連する二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは修飾または破壊され得る。発現を低減または除去するための標的遺伝子の遺伝子修飾および破壊ための多数の方法は当業者に知られており、本明細書に開示される組換え宿主細胞を作製するために使用することができる。使用することができる修飾には、二重役割ヘキソキナーゼタンパク質をコードする全遺伝子または遺伝子の一部を欠失させること、タンパク質が発現されないかあるいは低レベルで発現されるようにＤＮＡ断片をコード化遺伝子（プロモーターまたはコード領域のいずれかにおいて）へ挿入すること、機能性タンパク質が発現されるように終止コドンまたはフレームシフトを付加するコード領域に突然変異を導入すること、そして非機能性または活性の低いタンパク質が発現されるようにアミノ酸を改変するためにコード領域に１つまたは複数の突然変異を導入することが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、標的遺伝子の発現はアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によって遮断することができ、同時抑制をもたらす構築物が導入され得る。他の実施形態では、突然変異によって転写物の合成または安定性が低下され得る。実施形態において、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率は、突然変異によって調節することができる。これらの方法は全て、標的タンパク質をコードする既知の配列または同定された配列を用いて、当業者により容易に実施され得る。
【０１４４】
他の実施形態では、標的の二重役割ヘキソキナーゼコード配列を包囲するＤＮＡ配列もいくつかの修飾手順において有用であり、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母では、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって識別ＧＯＰＩＤ＃１３８３８でコーディネートされるゲノムプロジェクトのゲノムプロジェクトＩＤ９５１８によってコーディネートされる完全ゲノム配列において利用可能である。酵母ゲノム配列の付加的な非限定的例は、ＧＰＩＤ＃１０７７１、＃１０７０１および＃１６３７３に含まれるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のものである。その他の酵母ゲノム配列は、公的に入手可能なデータベースにおいて当業者により容易に見出され得る。
【０１４５】
他の実施形態では、標的の二重役割ヘキソキナーゼコード配列を包囲するＤＮＡ配列は、相同組換えを用いる修飾方法のために有用であり得る。この方法の非限定的な例では、二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子フランキング配列を、相同組換えを仲介するために選択可能なマーカー遺伝子と境を接して配置することができ、それにより、マーカー遺伝子は二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子を置換し得る。別の非限定的な例では、選択可能なマーカー遺伝子と境を接する部分的な二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子配列および二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子フランキング配列を、相同組換えを仲介するために使用することができ、それにより、マーカー遺伝子は標的二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子の少なくとも一部を置換する。実施形態において、選択可能なマーカーは部位特異的な組換え部位によって境界され得るので、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現に続いて、二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子を再活性化することなく、耐性遺伝子が二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子から切除される。実施形態では、部位特異的な組換えによって、二重役割ヘキソキナーゼタンパク質の発現を破壊する組換え部位が残される。他の実施形態では、当業者によく知られているように、選択可能なマーカーの切除の後に二重役割ヘキソキナーゼ遺伝子の欠失を同様に残すように相同組換えベクターを構築することができる。
【０１４６】
他の実施形態では、Ｗａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１０：１７９３−１８０８，１９９４）によって記載されるように、欠失は、有糸分裂組換えを用いて二重役割ヘキソキナーゼ標的遺伝子に対して行うことができる。このような方法は、２０ｂｐという短さであり得ると共に、標的ＤＮＡ配列と境を接するゲノム領域間に選択可能なマーカーを含有するＤＮＡ断片の作製を伴い得る。他の実施形態では、このＤＮＡ断片は、マーカー遺伝子の端部とハイブリッド形成し、酵母ゲノムと組み換えることができるゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、選択可能なマーカー遺伝子のＰＣＲ増幅によって作製することができる。実施形態において、線状ＤＮＡ断片は効率的に酵母に形質転換され、ゲノムに組み換えられることが可能であり、標的ＤＮＡ配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらす（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ、２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において開示されるように）。
【０１４７】
さらに、プロモーター置換方法を用いて内因性転写調節要素を交換することができ、Ｍｎａｉｍｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８（１）：３１−４４）によって記載されるような、発現を調節する別の手段が可能になる。
【０１４８】
他の実施形態では、二重役割ヘキソキナーゼ標的遺伝子コード化活性はランダム変異誘発を用いて破壊することができ、そしてその後、低減または実質的に除去された活性を有する株を同定するためにスクリーニングを行うことができる。このタイプの方法では、標的遺伝子コード領域のＤＮＡ配列、または増殖のための炭素基質依存性に影響を与えるゲノムの任意の他の領域は分からなくてもよい。実施形態において、低減された二重役割ヘキソキナーゼ活性を有する細胞、または低減された二重役割ヘキソキナーゼ活性を有する他の突然変異体のためのスクリーンは、本発明の組換え宿主細胞としてとして有用であり得る。
【０１４９】
遺伝子突然変異を作製するための方法は一般的であり、当該技術分野において周知であり、突然変異体の作製の実施に適用することができる。一般的に使用されるランダム遺伝子修飾法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにおいて概説される）には、自然変異誘発、変異誘発遺伝子によって生じる変異誘発、化学変異誘発、ＵＶもしくはＸ線による照射、またはトランスポゾン変異誘発が含まれる。
【０１５０】
宿主細胞の化学変異誘発は、以下のＤＮＡ突然変異原：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、硫酸ジエチル、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）のうちの１つによる処理を含むことができるが、これらに限定されない。このような変異誘発方法は、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）において概説されている。実施形態において、ＥＭＳによる化学変異誘発は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに開示されるように実施することができる。紫外（ＵＶ）光またはＸ線による照射も、酵母細胞においてランダム変異誘発を生じるために使用することができる。ＵＶ照射による変異誘発の主要な効果は、ＤＮＡ複製の忠実度を破壊するピリミジンダイマーの形成である。酵母のＵＶ−変異誘発のためのプロトコールは、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）において見出すことができる。実施形態において、変異誘発遺伝子表現型の導入は、宿主細胞においてランダム染色体突然変異を発生させるために使用することもできる。実施形態において、一般的な変異誘発遺伝子表現型は、以下の遺伝子：ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８またはＲＡＤ５１のうちの１つまたは複数の破壊によって得ることができる。他の実施形態では、非変異誘発遺伝子表現型の修復は、野生型対立遺伝子の挿入によって得ることができる。他の実施形態では、これらまたは他の既知のランダム変異誘発プロセスのいずれかから生じる修飾細胞の収集は、低減または除去された二重役割ヘキソキナーゼ活性についてスクリーニングされ得る。
【０１５１】
以下の酵母菌株：アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＡＴＣＣ１０８９５、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣＢＳ１３８、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４０、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ６０５４、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）９７２ｈ−、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＬＩＢ１２２について、ゲノムは完全に配列決定され注釈が付けられており、公的に入手可能である。通常、本明細書で提供されるような既知の二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を有する公的に入手可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記）検索は、酵母細胞などの他の宿主細胞の候補二重役割ヘキソキナーゼコード配列を同定するために使用される。
【０１５２】
従って、本明細書に開示されるヘキソキナーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかに対して少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドを提供することは、本発明の範囲内に包含される。同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づく。
【０１５３】
二重役割ヘキソキナーゼ活性を低減または除去するための本明細書に開示される組換え宿主細胞における二重役割ヘキソキナーゼの修飾は、当該技術分野において既知の方法を用いて確認することができる。例えば、ＰＣＲ（例えば、実施例２に列挙されるようなプライマーによりＰＣＲ産物の欠乏を探す）によって、あるいはヘキソキナーゼ２配列に対して設計されたプローブを用いるサザンブロッティングによって、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるヘキソキナーゼ２の破壊についてスクリーニングすることができる。あるいは、減少されたグルコース消費および表現型的にヘキソキナーゼ２破壊を示すより高い収率のバイオマスについてスクリーニングすることができる。
【０１５４】
ヘキソースキナーゼ活性の導入
本出願人らは、二重役割ヘキソキナーゼ活性を有する内因性ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドにおける修飾（二重役割ヘキソキナーゼの活性が低減または除去される）を含む組換え宿主細胞において、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを挿入すると、組換え宿主細胞におけるグルコース抑制の改変が生じ得ることを見出した。ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドの導入は、酸化還元バランスの改善、グルコース消費の増大および／またはピルベート利用生合成経路による産物形成の増大をもたらすことができる。
【０１５５】
当該技術分野において既知であるか、あるいは本明細書に開示されるように同定されるヘキソースキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドは、本明細書に開示される組換え宿主細胞中で発現され得る。
【０１５６】
適切なヘキソースキナーゼポリペプチドには、通常は宿主細胞中で二重役割ヘキソキナーゼであるが、グルコース抑制機能を低減または除去するように修飾されているものが含まれるがこれらに限定されない。このようなヘキソースキナーゼポリペプチドは、ポリペプチドの発現が条件的であるように条件的プロモーターを含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。一例として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の二重役割ヘキソキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドには、表３のものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１５７】
【表５】
2013515507.tif 000007
【０１５８】
実施形態において、適切な異種ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞中で二重機能ヘキソキナーゼであるヘキソースキナーゼをコードするが、このヘキソースキナーゼは、プロモーターが活性化されないかあるいは有意な程度までは活性化されない条件下でグルコース抑制が改変されるように、条件的プロモーターの調節下において前記宿主細胞中で発現される。実施形態において、ＨＸＫ２は、条件的プロモーターの調節下において、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現される。実施形態において、配列番号２、１１５、１１７、または１１９（表３を参照）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する二重機能ヘキソキナーゼは、条件的プロモーター配列を含むポリヌクレオチドによって、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でコードされる。実施形態において、配列番号２、１１５、１１７、または１１９（表３を参照）の二重機能ヘキソキナーゼは、条件的プロモーター配列を含むポリヌクレオチドによって、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でコードされる。実施形態において、条件的プロモーター配列は、ＯＬＥ１プロモーター領域に由来する。実施形態において、プロモーター配列は、配列番号９８に対して少なくとも９５％同一である。実施形態において、プロモーター配列は配列番号９８を含む。実施形態において、プロモーターはＳＮＯ１（配列番号１４０）またはＳＮＺ１（配列番号１４１）である。実施形態において、プロモーター配列は、配列番号１４０または１４１に対して少なくとも約９５％同一である。
【０１５９】
実施形態において、  本明細書に開示されるかあるいは当該技術分野において既知である二重役割ヘキソキナーゼをコードするポリヌクレオチドは、細胞局在化ｏｄ  ｒｈｗ  ｗｎｘｏｓｗｓポリペプチドを改変することによりグルコース抑制活性が低減または除去されるように、本明細書に開示される方法を用いて修飾することができる。例えば、ヘキソキナーゼ２のＮ−末端のデカペプチド（Ｌｙｓ６−Ｍｅｔ１５）は、ＭＩＧ１の結合に関与するドメインとして関係しており、ヘキソキナーゼ２−ＭＩＧ１複合体は核内に移入されると考えられ、両方の遺伝子が転写制御因子の役割を果たすことができる。Ａｈｕａｔｚｉらは、ＨＸＫ２のＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５欠失突然変異体はもうＭＩＧ１に結合することができず、サイトゾルに局在化され、核内に入れなかったと記載している（Ａｈｕａｔｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｔｈｅ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ２  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｉｓ  Ｍｉｇ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ＪＢＣ  ２７９（１４）：１４４４０−６）。
【０１６０】
従って、当該技術分野において既知の分子生物学的方法を用いるヘキソキナーゼ２（または関連ヘキソキナーゼ）からのＭＩＧ１−相互作用ドメインの欠失または突然変異は、酵素が解糖酵素の役割を果たすことを可能にするが、酵素が核に移動されて、転写制御因子としての役割を果たすことを阻止し得る。この修飾を伴い、低減または実質的に除去されたヘキソキナーゼ２活性を含む組換え宿主細胞において、ヘキソキナーゼ２低減の増殖利益を得ることができるが、野生型株に類似の高いグルコース取込み速度も得ることができる。そのため、本明細書では、核トランスロケーションのために必要なタンパク質結合ドメインにおける突然変異または欠失を含む、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドが提供される。実施形態において、ドメインはＭＩＧ１−相互作用ドメインである。実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３２に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有する。実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号１３２である。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３０に対して少なくとも約約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有する。実施形態において、ポリペプチドは配列番号１３０である。
【０１６１】
実施形態において、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは過剰発現されるか、同一または関連の内因性遺伝子（もしあれば）の内因性発現よりも高いレベルで発現される。他の実施形態では、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドは、組換え宿主細胞にとって天然ある。他の実施形態では、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドは組換え宿主細胞にとって天然ではない。
【０１６２】
実施形態において、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター配列を含む。実施形態において、構成的プロモーター配列は、ＡＤＨ１プロモーター領域に由来する。実施形態において、構成的プロモーター配列は、配列番号１３１に対して少なくとも９５％の同一性を有する。実施形態において、構成的プロモーター配列は配列番号１３１である。
【０１６３】
実施形態において、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、および／またはＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換を触媒する。
【０１６４】
実施形態において、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＲＡＧ５、Ｈ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＨＰＧＬＫ１、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＨＸＫ２、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１６５】
実施形態において、ヘキソースキナーゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、酵素番号ＥＣ２．７．１．１に相当する。他の実施形態では、ヘキソースキナーゼをコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、以下の表４からまたは表３から選択される配列を含むことができるが、これらに限定されない。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に適したヘキソースキナーゼは、表４に開示されるものを含む。表４に開示されるヘキソースキナーゼは、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現される場合に二重機能ヘキソキナーゼではないが、当業者は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に適したヘキソースキナーゼの特定のものが他の型の宿主細胞中では二重機能ヘキソキナーゼであり得ることを認識するであろう。
【０１６６】
【表６】
2013515507.tif 000008
【０１６７】
他の実施形態では、ヘキソースキナーゼをコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、表３または表４の配列のいずれか１つに対して少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有することができ、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はヘキソースキナーゼ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドはヘキソースキナーゼ活性を有する。本明細書に開示される組換え宿主細胞において発現され得るヘキソースキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドのさらにその他の例には、表３または表４の配列のいずれか１つの活性変異体、断片または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はヘキソースキナーゼ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドはヘキソースキナーゼ活性を有する。本明細書に開示される組換え宿主細胞において発現され得るヘキソースキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドのさらにその他の例には、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＫｌＧＬＫ１（核酸配列番号１２４、アミノ酸配列番号１２５）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＨＰＨＸＫ１（核酸配列番号１２６、アミノ酸配列番号１２７）の配列のいずれか１つの活性変異体、断片または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はヘキソースキナーゼ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドはヘキソースキナーゼ活性を有する。
【０１６８】
他の実施形態では、ヘキソースキナーゼをコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、二重役割ヘキソキナーゼについて上記で開示されたように、別のヘキソースキナーゼポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチド配列を同定するために使用することができ、そして／あるいは他の細胞中のヘキソースキナーゼ相同体を同定するために使用することができる。このようなヘキソースキナーゼコード化配列は、例えば、文献において同定することができ、そして／あるいは当業者によく知られているバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、バイオインフォマティクスを用いる別の細胞型におけるヘキソースキナーゼコード化配列の同定は、本明細書において提供されるもののいずれかのような既知のヘキソースキナーゼコード化ＤＮＡおよびポリペプチド配列による公的に入手可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記で開示したような）検索によって達成することができる。同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づく。
【０１６９】
ピルビン酸デカルボキシラーゼの修飾
実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾、またはＰＤＣ活性を有する内因性ポリペプチドにおける修飾を含むことができる。実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ＰＤＣをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドの修飾または破壊を有することができる。実施形態において、組換え宿主細胞は、ＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子における、あるいはＰＤＣ活性を有する１つまたは複数の内因性ポリペプチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む。このような修飾、破壊、欠失、突然変異、および／または置換は、低減または実質的に除去されたＰＤＣ活性をもたらすことができ、例えば、ＰＤＣノックアウト（ＰＤＣ−ＫＯ）表現型が生じる。
【０１７０】
実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞の内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性はピルベートをアセトアルデヒドに変換し、これは次に、アセテートを介してエタノールまたはアセチル−ＣｏＡに転換され得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含有するクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含有するカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、またはピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含有するシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である。
【０１７１】
他の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子によってコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのアイソザイム、ならびにピルビン酸デカルボキシラーゼ制御遺伝子ＰＤＣ２を含有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における非限定的な例では、ＰＤＣ１およびＰＤＣ５遺伝子、またはＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子が破壊される。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における別の非限定的な例では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、ＰＤＣ２制御遺伝子を破壊することによって低減され得る。別の非限定的な例では、ＰＤＣ１およびＰＤＣ５遺伝子、またはＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の発現が低減される。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における別の非限定的な例では、ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６に対して約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するものなどのピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子を破壊することができる。
【０１７２】
実施形態において、ＰＤＣ活性を有するポリペプチド、またはＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは遺伝子は、酵素番号ＥＣ４．１．１．１に相当する。他の実施形態では、本明細書に開示される組換え宿主細胞のＰＤＣ遺伝子は、使用される発酵条件下で活性ではなく、そのため、このような遺伝子は修飾または不活性化されることを必要としないであろう。
【０１７３】
ピルビン酸デカルボキシラーゼコード化遺伝子の破壊のためにピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低減された組換え宿主細胞の例は、例えばサッカロミセス属についてはＦｌｉｋｗｅｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｙｅａｓｔ（１９９６）１２：２４７−２５７）に、クルイベロミセス属についてはＢｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）１９（１）：２７−３６）に報告されており、そして制御遺伝子の破壊はＨｏｈｍａｎｎ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）２４１：６５７−６６６）に報告されている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有さないサッカロミセス株は、受入＃２０００２７および＃２０００２８でＡＴＣＣから入手可能である。
【０１７４】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において修飾または不活性化の標的とされ得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドの例には、以下の表５のものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７５】
【表７】
2013515507.tif 000009
【０１７６】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において修飾または不活性化の標的とされ得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの他の例には、表５の配列のいずれか１つに対して少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドが含まれるがこれらに限定されず、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はＰｄｃ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドはＰｄｃ活性を有する。本明細書に開示される組換え宿主細胞において修飾または不活性化の標的とされ得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドのさらにその他の例には、表５の配列のいずれか１つの活性変異体、断片または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、このようなポリヌクレオチドまたは遺伝子はＰｄｃ活性をコードし、あるいはこのようなポリペプチドはＰｄｃ活性を有する。
【０１７７】
実施形態において、本明細書に開示されるかあるいは当該技術分野において既知であるＰＤＣ配列をコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、ヘキソキナーゼについて上記で開示されたように修飾することができる。他の実施形態では、ＰＤＣをコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、ヘキソキナーゼについて上記で開示されたように、別のＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチド配列を同定するために、あるいは他の細胞中のＰＤＣ相同体を同定するために使用することができる。このようなＰＤＣコード化配列は、例えば、文献において同定することができ、そして／あるいは当業者によく知られているバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、バイオインフォマティクス
を用いる他の細胞型におけるＰＤＣコード化配列の同定は、本明細書において提供されるものなどの既知のＰＤＣコード化ＤＮＡおよびポリペプチド配列による公的に入手可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記で開示したような）検索によって達成することができる。同一性は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づく。
【０１７８】
ＰＤＣ活性を低減または除去するための本明細書に開示される組換え宿主細胞におけるＰＤＣの修飾は、当該技術分野において既知の方法を用いて確認することができる。例えば、実施例２に列挙されるプライマーによるＰＣＲ産物の欠乏によって、あるいはＰＤＣ配列に対して設計されたプローブを用いるサザンブロッティングによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼの破壊についてスクリーニングすることができる。
【０１７９】
組換え宿主細胞における遺伝子発現
組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子発現のための方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照）。実施形態において、発現されるヘキソースキナーゼ遺伝子のコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞のために最適化されたコドンであり得る。組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子の発現は、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、および転写ターミネーターを必要とし得る。酵母中での使用に適した以下の構成的プロモーター：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３（ＧＰＤ）、ＡＤＨ１、ＧＰＭ１、およびＴＥＦ１、ならびに酵母中での使用に適した以下の誘導性プロモーター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＣＵＰ１を含むがこれらに限定されない多数のプロモーターを、遺伝子のための発現カセットの構築において使用することができる。条件的発現に適しているのは、遺伝子の転写が嫌気的条件下で誘発されるＯＬＥ１プロモーターである。理論によって束縛されることは望まないが、定常期の間、特に工業発酵では、多くの場合、嫌気的条件が優勢であると考えられる。ＳＮＯ１およびＳＮＺ１など、定常期発現を伴う他のプロモーターが当該技術分野において既知であり、同様に適切であり得る。発現のためのキメラ遺伝子構築物において使用可能な適切な転写ターミネーターには、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、およびＡＤＨ１ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８０】
組換えポリヌクレオチドは、通常、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター、ならびにリボソーム結合部位および終結調節領域を含む、形質転換に使用されるキメラ遺伝子の一部としてコード配列を用いて、発現のためにクローン化される。コード領域は形質転換のための宿主細胞に由来し、ヘキソースキナーゼをコードする天然遺伝子に対して天然ではない制御配列と結合され得る。あるいは、コード領域は別の宿主細胞に由来してもよい。
【０１８１】
様々な宿主細胞の形質転換に有用なベクターは一般的であり、文献に開示されている。通常、ベクターは、所望の宿主における自己複製または染色体の組込みを可能にする選択可能なマーカーおよび配列を含有する。さらに、適切なベクターは、転写開始調節および転写終結調節領域（これらの間に、コード領域ＤＮＡ断片が挿入され得る）を有するプロモーター領域を含み、挿入されたコード領域の発現を提供することができる。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞に相同の遺伝子に由来することができるが、このような調節領域が、産生宿主として選択される特定の種に天然でない遺伝子に由来することもできることは理解されるべきである。
【０１８２】
実施形態において、適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびヘキソースキナーゼコード領域は大腸菌−酵母シャトルベクターにクローン化され、酵母細胞に形質転換され得る。このようなベクターは、大腸菌および酵母菌株の両方におけるプラスミドの伝播を可能にし、所望の宿主における自己複製または染色体の組込みを可能にする選択可能なマーカーおよび配列を含有することができる。酵母において通常使用されるプラスミドには、大腸菌複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２ミクロン複製開始点、および栄養選択のためのマーカーを含有するシャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が含まれるがこれらに限定されない。これらの４つのベクターのための選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。
【０１８３】
実施形態において、開示されるヘキソースキナーゼをコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、酵母におけるギャップ修復組換え方法によって実施することができる。ギャップ修復クローニングアプローチは、酵母における高効率の相同組換えを利用する。実施形態において、酵母ベクターＤＮＡは消化され（例えば、その多重クローニング部位において）、その配列内に「ギャップ」を形成する。５’端部および３’端部の両方に約２１ｂｐの配列を含有する、対象となる多数の挿入ＤＮＡが生成され、互いに、そしてベクターＤＮＡの５’末端および３’末端と順次オーバーラップされる。例えば、「遺伝子Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターが発現カセットのために選択される。プロモーターおよびターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘはそのソース生物からＰＣＲ増幅されるか、あるいは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られる。直線化ベクターの５’端部とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、およびターミネーターと直線化ベクターの３’端部との間には、少なくとも、２１ｂｐのオーバーラップ配列が存在する。次に「ギャップ化」ベクターおよび挿入ＤＮＡは酵母菌株に同時形質転換され、プラスミドにおける栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入の組み合わせの存在は、選択された細胞から作製されるプラスミドＤＮＡを用いるＰＣＲマッピングによって確認することができる。次に、酵母から単離されるプラスミドＤＮＡ（通常は低濃度）は大腸菌株、例えばＴＯＰ１０に形質転換された後、プラスミド構築物をさらに検証するためにミニプレップおよび制限マッピングが行われる。最後に、構築物は配列分析によって検証され得る。
【０１８４】
ギャップ修復技術のように、酵母ゲノムへの組込みも酵母における相同組換えシステムを利用する。実施形態において、コード領域プラス調節要素（プロモーターおよびターミネーター）ならびに栄養要求性マーカーを含有するカセットは、カセットとハイブリッド形成すると共に、挿入が所望されるゲノム区域の領域５’および３’に対して４０〜７０塩基対の配列相同性を含有するプライマーを用いて、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅される。次に、ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター構築物は、プラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ  ＰＣＲによって、あるいは一般的な制限消化およびクローニングによって、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合される。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含有する全カセットは、酵母染色体上の位置「Ｙ」の領域５’および３’に対して４０〜７０ｂｐの相同性を含有するプライマー配列によりＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシル欠乏増殖培地において選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれによって検証され得る。
【０１８５】
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、当該技術分野において既知の標準実験技術を用いて培養することができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２を参照）。本明細書に開示される組換え宿主細胞の増殖は、当該技術分野において既知の方法によって測定することができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２を参照）。
【０１８６】
本出願人らは、（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、任意選択的に、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む組換え宿主細胞を提供した。実施形態において、このような組換え宿主細胞は、改善された酸化還元バランス、増大されたグルコース消費および／またはピルベート利用生合成経路の産物の増大された形成を有することができる。従って、本出願人らは、（ａ）二重役割活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、任意選択的に、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾とを含む組換え宿主細胞の酸化還元バランスの改善方法、グルコース消費の増大方法、および／またはピルベート利用生合成経路の産物の形成の増大方法も提供した。
【０１８７】
本明細書に開示される組換え宿主細胞の酸化還元バランスおよびグルコース消費は、当該技術分野において既知の方法によって測定することができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２を参照）。非限定的な例では、グルコース消費は、ＨＰＬＣにより培地中のグルコースの量を定量するによって測定することができる。酸化還元バランスは、例えば、グリセロール形成を測定することによって間接的に評価することができ、ここで、グリセロール形成がより多いことは、インバランスがより大きいことを意味する。あるいは、酸化還元バランスは、当該技術分野において既知の方法によるＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨプールの直接分析によって評価することができる。
【０１８８】
他の実施形態では、（ｉ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドにより前記組換え宿主細胞を形質転換するステップと、任意選択的に、（ｉｉｉ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を導入するステップとを含む、組換え宿主細胞の作製方法が提供される。
【０１８９】
他の実施形態では、（ｉ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドにより前記組換え宿主細胞を形質転換するステップと、任意選択的に、（ｉｉｉ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を導入するステップとを含む、ヘキソースからヘキソース−６−リン酸への変換方法。他の実施形態では、（ｉ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドにより前記組換え宿主細胞を形質転換するステップと、任意選択的に、（ｉｉｉ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換を導入するステップとを含む、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース６−リン酸、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−リン酸、および／またはＤ−マンノースからＤ−マンノース６−リン酸への変換方法が提供される。
【０１９０】
ピルベートを用いる生合成経路の操作
実施形態において、（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾（例えば、欠失、突然変異、および／または置換）と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、任意選択的に、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾（例えば、欠失、突然変異、および／または置換）とを含む組換え宿主細胞は、ピルベートを利用する生合成経路の産物の産生のための生合成経路を有するように操作することができる。このような組換え宿主細胞は、ピルベートを利用する生合成経路の産物の増大された産生を示すことができる。従って、実施形態では、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾（例えば、欠失、突然変異、および／または置換）と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ピルベート利用経路の産物が形成される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、ピルベートを利用する生合成経路の産物の産生の増大方法も提供され、組換え宿主細胞によって形成される産物の量は、（ａ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞により形成される産物の量よりも大きい。
【０１９１】
他の実施形態では、（ｉ）（ａ）二重役割ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾（例えば、欠失、突然変異、および／または置換）と、（ｂ）ヘキソースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾（例えば、欠失、突然変異、および／または置換）とを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｉｉ）ピルベート利用経路の産物が形成される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、ピルベートを利用する生合成経路の産物の産生の増大方法が提供され、組換え宿主細胞によって形成される産物の量は、（ａ）および（ｃ）を含むが（ｂ）を含まない組換え宿主細胞により形成される産物の量よりも大きい。
【０１９２】
本明細書に開示される組換え宿主細胞と関連して使用されるピルベート利用生合成経路からの産物には、２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール、１−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、リンゴ酸、イソアミルアルコール、および／またはイソプレノイドが含まれるが、これらに限定されない。任意のピルベート利用生合成経路の特徴は、任意の順序で、本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作することができる。初期基質としてピルベートを有する生合成経路を用いて製造される産物はどれも本明細書に開示される組換え宿主細胞においてより高い有効性で産生され得る。本明細書に開示される組換え宿主細胞の生合成経路は、ピルベートおよびを利用し所望の産物を産生するどの経路であってもよい。いくつかの実施形態では、生合成経路において基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは異種である。いくつかの実施形態では、生合成経路の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの基質−産物変換が、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、生合成経路は、酵母細胞にとって異種である２つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、生合成経路のそれぞれの基質から産物への変換は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは異種である。
【０１９３】
２，３−ブタンジオールを産生するための生合成経路の一例は、米国特許出願第１２／４７７，９４２号明細書に開示されるように、本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作することができる。２，３−ブタンジオール経路は、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書に開示される２−ブタノール生合成経路の一部である。このような経路ステップには、例えばアセト乳酸シンターゼによるピルベートからアセトラクテートへの変換、例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによるアセトラクテートからアセトインへの変換、および例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによるアセトインから２，３−ブタンジオールへの変換が含まれるがこれらに限定されない。ブタンジオールデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨを必要とし、それにより、酸化還元バランスに寄与する。当業者は、このような経路ステップの活性を有するポリペプチドを様々なソースから単離することができ、本明細書に開示される組換え宿主細胞において使用可能であることを認識するであろう。
【０１９４】
さらに、本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能な２−ブタノンまたは２−ブタノールの産生のための生合成経路の例は、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０Ａ１号明細書に開示されている。米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書の経路は、以下のステップ：
−  例えばジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼによって触媒されるような、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへのステップと、
−  例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されるような、２−ブタノンから２−ブタノールへのステップと
が付加された、ブタンジオール産生のために開示される経路と同じである。
【０１９５】
米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０Ａ１号明細書には、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７Ａ１号明細書に開示される生合成経路を用いた、２−ブタノールの産生のためのキメラ遺伝子の構築および酵母の遺伝子操作が開示されている。これらの経路に関連する遺伝子の構築および発現についてのさらなる記載は、例えば、国際公開第２００９／０４６３７０号パンフレット（例えば、ブタンジオールデヒドラターゼ）、および米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３Ａ１号明細書（例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼ）、および米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書において見出すことができる。当業者は、このような経路ステップの活性を有するポリペプチドを様々なソースから単離することができ、本明細書に開示される組換え宿主細胞において使用可能であることを認識するであろう。
【０１９６】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能なイソブタノールの産生のための生合成経路の例は、同様に、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７Ａ１号明細書において提供される。米国特許出願公開第２００７／００９２９５７Ａ１号明細書に開示されるように、実例のイソブタノール生合成経路のステップは、以下の変換を含む：
−  アセト乳酸シンターゼによって触媒されるようなピルベートからアセトラクテート
への変換、
−  例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ケトール酸レダクトイソメラーゼとも呼ばれる）によって触媒されるようなアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
−  例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼとも呼ばれる）によって触媒されるような２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換、
−  例えば分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるような２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および
−  例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。
【０１９７】
この経路に関連する遺伝子の構築および発現についてのさらなる記載は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３Ａ１号明細書において見出すことができる。当業者は、このような経路ステップの活性を有するポリペプチドを様々なソースから単離することができ、本明細書に開示される組換え宿主細胞において使用可能であることを認識するであろう。表示される基質−産物変換を触媒する能力を有する適切なタンパク質は当該技術分野において記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１６３３７６号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書、および米国特許出願第１２／８９３０７７号明細書には、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼが記載されており、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書および米国特許出願公開第２０１０００８１１５４号明細書には、適切なジヒドロキシ酸デヒドラターゼが記載されており、適切なアルコールデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書および米国仮特許出願第６１／２９０，６３６号明細書に記載されている。
【０１９８】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能な１−ブタノールの産生のための生合成経路の一例は、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８Ａ１号明細書に開示されている。この公報に開示されるように、開示される１−ブタノール生合成経路のステップには以下の変換が含まれる：
−  例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されるようなアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換、
−  例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換、
−  例えばクロトナーゼによって触媒されるような３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換、
−  例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなクロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換、
−  例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換、および
−  例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換。
【０１９９】
これらの酵素の発現のために使用され得る遺伝子は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８Ａ１号明細書に開示されており、使用可能な付加的な遺伝子は当業者によって同定することができる。
【０２００】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能なバリンの産生のための生合成経路の一例には、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ＩＬＶ５）によるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートへの変換ステップ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩＬＶ３）による２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートから２−ケト−イソバレレートへの変換ステップ、および分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）による２−ケト−イソバレレートからバリンへの変換ステップが含まれる。ロイシンの生合成には、２−ケト−イソバレレートまでの同じステップの後、アルファ−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬＥＵ９、ＬＥＵ４）による２−ケト−イソバレレートからアルファ−イソプロピルマレートへの変換、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬＥＵ１）によるアルファ−イソプロピルマレートからベータ−イソプロピルマレートへの変換、ベータ−ＩＰＭデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）によるベータ−イソプロピルマレートからアルファ−ケトイソカプロエートへの変換、そして最後に、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるアルファ−ケトイソカプロエートからロイシンへの変換が含まれる。バリンまたはロイシンの産生のためには、開示されるこれらの経路における酵素の少なくとも１つを過剰発現させることが所望される。
【０２０１】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能なイソアミルアルコールの産生のための生合成経路の一例は、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるロイシンからアルファ−ケトイソカプロエートへの変換ステップ、ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼ（ＴＨＩ３）またはデカルボキシラーゼＡＲＯ１０によるアルファ−ケトイソカプロエートから３−メチルブタナールへの変換ステップ、そして最後に、ＡＤＨ１またはＳＦＡ１などのアルコールデヒドロゲナーゼによる３−メチルブタナールからイソアミルアルコールへの変換ステップを含む。イソアミルアルコールの産生は、ロイシンまたはアルファ−ケトイソカプロエート中間体のための生合成経路における１つまたは複数の酵素の過剰発現によって、これらの化学物質の産生の増大から利益を得る。さらに、最後の２つのステップの一方または両方の酵素を過剰発現させることができる。
【０２０２】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能な乳酸の産生のための生合成経路の一例は、乳酸デヒドロゲナーゼによるピルベートから乳酸への変換を含む。ＥＣ１．１．１．２７として知られている乳酸デヒドロゲナーゼを用いる乳酸の産生のための酵母の操作は、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１９６４−７０（２００５））などにおいて当該技術分野でよく知られている。
【０２０３】
本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作可能なマレートの産生のための生合成経路の一例は、Ｚｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：２７６６−７７（２００８））に開示されるように、ピルビン酸カルボキシラーゼによるピルベートからオキサロアセテートへの変換、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼによるオキサロアセテートからマレートへの変換を含む。さらに、リンゴ酸トランスポーターを発現させることができる。
【０２０４】
イソプレノイドの産生のための生合成経路の例も、本明細書に開示される組換え宿主細胞において操作することができる。非限定的な例では、メバロン酸経路を使用することができ（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７９６−８０２）、この経路はピルベートからアセチル−ＣｏＡへの変換を含み、これはアセトアセチル−ＣｏＡに変換され、これは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換され、これはメバロネート、そして次にイソプレノイドに変換される。別の非限定的な例では、非メバロン酸経路は、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋｅｉｓｌｉｎｇ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７２：４０８−１５（２００１））によって記載される。
【０２０５】
当業者は、上記の生合成経路の活性を有するポリペプチドを様々なソースから単離することができ、本明細書に開示される組換え宿主細胞において使用可能であることを認識するであろう。
【０２０６】
付加的な修飾
本明細書において提供される細胞において有用であり得る付加的な修飾は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるようなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾と、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるようなＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路による炭素フラックスの増大または還元当量バランス（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｂａｌａｎｃｅ）を提供する宿主細胞への修飾とを含む。その活性のためにＦｅ−Ｓクラスタの結合を必要とする異種タンパク質の活性が増大された酵母菌株は、米国特許出願公開第２０１０００８１１７９号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されている。その他の修飾には、米国仮特許出願第６１／３８０５６３号明細書に記載されるピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが含まれる（参照される仮出願はいずれも参照によってその全体が本明細書中に援用される）。本明細書における実施形態のために適切であり得る付加的な修飾は、米国特許出願第１２／８９３０８９号明細書に記載される。
【０２０７】
さらに、Ｆｅ−Ｓクラスタの生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む宿主細胞は米国仮特許出願第６１／３０５３３３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されており、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、およびホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されている。
【０２０８】
産生のための増殖
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。炭素基質は、フルクトースまたはガラクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、またはこれらの混合物、ならびにチーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物を含むことができるがこれらに限定されない。その他の炭素基質は、エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロールを含み得る。
【０２０９】
さらに、炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝的変換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質でもよい。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸などの多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ，Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々なカンジダ種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝するであろう（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明において利用される炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限され得ることが意図される。
【０２１０】
上記の炭素基質およびその混合物は全て本発明において適切であることが意図されるが、いくつかの実施形態では、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、またはＣ５糖を使用するように改変された酵母細胞についてはこれらと、キシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖との混合物であり得る。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびこれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀類を含むデンプンベースの原料の糖化による再生可能な穀類源に由来し得る。さらに、発酵性の糖は、例えば、米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載されるような前処理および糖化のプロセスによる再生可能なセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスに由来し得る。
【０２１１】
バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含み、そして任意選択的に、さらにヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖を含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および／または脂質などの付加的な成分を含むこともできる。バイオマスは単一のソースに由来してもよいし、あるいはバイオマスは２つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残基、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、および培養物の増殖に適していることが当業者に知られている他の成分を含有することができる。
【０２１３】
培養条件
通常、細胞は、適切な培地中、約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース（炭素／エネルギー原として）を含むブロス、またはＹＰＤ培地（ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンド）などの一般的な市販の培地である。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸塩の使用も発酵培地中に組み込むことができる。
【０２１４】
発酵のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０を初期条件として使用することができる。酵母の発酵のための適切なｐＨ範囲は、通常、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０を初期条件として使用することができる。他の微生物の発酵のための適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５である。一実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５を初期条件として使用することができる。
【０２１５】
発酵は、好気または嫌気的条件下で実施することができる。一実施形態では、発酵のために嫌気または微好気的条件を使用することができる。
【０２１６】
工業的バッチおよび連続発酵
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、バッチ発酵方法を用いて作製することができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵中は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）において見出すことができる。
【０２１７】
本明細書に開示される組換え宿主細胞に関連するピルベート利用生合成経路の産物は、連続発酵法を用いて産生することもできる。連続発酵は開放系であり、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、処理のために同時に等量の条件培地が除去される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、培養物を一定の高い密度に維持する。連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。連続発酵プロセスのための栄養物および成長因子の調節方法、ならびに産物形成速度を最大にするための技術は工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法が上記のＢｒｏｃｋによって詳述されている。
【０２１８】
ピルベート利用生合成経路の産物はバッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、任意の既知の発酵モードが適切であり得ることが意図される。さらに、本明細書に開示される組換え宿主細胞は全細胞触媒として基質上に固定化可能であり、イソブタノールの産生のために発酵条件にさらされることが意図される。
【０２１９】
発酵培地からの産物の単離方法
ピルベート利用生合成経路の産物は、アセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去することができる。次に、産物は、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離させることができる。
【０２２０】
産物が低沸点（例えば、イソブタノール）の水との共沸混合物を有する場合、蒸留は、混合物をその共沸組成に至るまで分離するために使用することができる。蒸留は、共沸混合物付近の分離を得るために、別の分離方法と組み合わせて使用することができる。ブタノールを単離および精製するために蒸留と組み合わせて使用することができる方法には、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ブタノールは、共沸剤を用いた共沸蒸留を用いて単離され得る（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。
【０２２１】
ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するので、イソブタノールを単離および精製するために、デカンテーションと組み合わせて蒸留を使用することができる。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスは、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物は濃縮され、デカンテーションによって発酵培地からイソブタノールが分離される。デカントされた水相は、還流として第１の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第２の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製することができる。
【０２２２】
またピルベート利用生合成経路の産物は、蒸留と組み合わせて液液抽出を用いて発酵培地から単離することもできる。この方法では、産物（例えば、イソブタノール）は、適切な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出することができる。次に、産物含有有機相は、産物を溶媒から分離するために蒸留することができる。
【０２２３】
吸着と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地から産物（例えば、イソブタノール）を単離することもできる。この方法では、産物を含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、モレキュラーシーブなどの吸着剤の使用により残りの水が除去される（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０２２４】
さらに、パーベーパレイションと組み合わせた蒸留を用いて、発酵培地から産物（例えば、イソブタノール）を単離および精製することもできる。この方法では、産物を含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性膜を通るパーベーパレイションによって残りの水が除去される（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
【実施例】
【０２２５】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例が、本発明の実施形態を示すが、実例として提供されるだけであることは理解されるべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確かめることができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適合させるために本発明の種々の変化および修飾を行うことができる。
【０２２６】
一般的な方法
実施例において使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  （１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）によって、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹによって記載されている。
【０２２７】
微生物培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当該技術分野において周知である。以下の実施例において使用するために適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））において、あるいはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）によって記載されているように見出すことができる。微生物細胞の増殖および維持のために使用される試薬、制限酵素および材料は全て、他に指定されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。微生物株は、他に言及されない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。以下の実施例で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の表において提供される。オリゴヌクレオチドプライマーは全て、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。
【０２２８】
合成完全培地は、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒＢｏｒ，ＮＹによって記載されている。
【０２２９】
ＧＣ法
ＧＣ方法は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）からのＺＢ−ＷＡＸｐｌｕｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍフィルム）を用いた。キャリアガスは、２．３ｍＬ／分の一定流速のヘリウムであり、インジェクタスプリットは２５０℃において１：２０であり、オーブン温度は、７０℃で１分間、１０℃／分で７０℃〜１６０℃、そして３０℃／分で１６０℃〜２４０℃であった。ＦＩＤ検出は、４０ｍｌ／分のヘリウムメイクアップガスと共に、２６０℃で使用した。培養ブロスサンプルは、注入前に０．２μｍのスピンフィルタによりろ過した。所望される分析感度に応じて、０．１μｌまたは０．５μｌの注入容積を使用した。以下の化合物：エタノール、イソブタノール、アセトイン、ｍｅｓｏ−２，３−ブタンジオール、および（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対して較正標準曲線を作成した。（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの保持時間は６．８分である。ｍｅｓｏ−２，３−ブタンジオールの保持時間は７．２分である。イソブトリアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、イソ酪酸、およびイソアミルアルコールの保持時間を確認するために分析標準も用いた。
【０２３０】
ＨＰＬＣ法
グルコースおよび発酵副産物の組成の分析は当業者によく知られている。例えば、１つの高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）方法は、屈折率（ＲＩ）検出と共に、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−Ｇガードカラムの付いたＳｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１カラム（いずれもＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）を用いる。クロマトグラフ分離は、移動相として流速０．５ｍＬ／分の０．０１ＭのＨ２ＳＯ４を用い、５０℃のカラム温度で達成される。イソブタノールの保持時間は４７．６分である。
【０２３１】
略語の意味は次の通りである：「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、そして「ＧＣ」はガスクロマトグラフィを意味する。「モル選択性（ｍｏｌａｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、消費される糖基質１モルにつき産生される産物のモル数であり、パーセントで報告される。「ＳＬＰＭ」は、（空気の）１分当りの標準リットルを表し、「ｄＯ」は溶解酸素であり、Ｑｐは細胞１グラムあたりのイソブタノールのグラム数で経時的に測定される「比生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）」である。「ｎｔ」という用語はヌクレオチドを意味する。
【０２３２】
実施例１
Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるイソブタノール経路遺伝子発現のための発現ベクターの構築
ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８の構築
酵母におけるＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のためにｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８プラスミド（配列番号２９）を構築した。ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８は、以下のキメラ遺伝子を含有するｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ＃８７５４１）である：Ａ）ＣＵＰ１プロモーター領域由来の配列（配列番号３０）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのアセト乳酸シンターゼコード領域（ＡｌｓＳ、配列番号３１および３２）およびＣＹＣ１ターミネーター領域由来の配列（「ＣＹＣ１ターミネーター２」、配列番号３３）、Ｂ）ＩＬＶ５プロモーター領域由来の配列（配列番号３４）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域（配列番号３７および３８）およびＩＬＶ５ターミネーター領域由来の配列（配列番号３５）、ならびにＣ）ＦＢＡ１プロモーター領域由来の配列（配列番号３６）、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５、配列番号３９および４０）およびＣＹＣ１ターミネーター領域由来の配列。
【０２３３】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域は、米国特許出願公開第２００９−０１６３３７６Ａ１号明細書に開示されるように、特定の突然変異を有するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するＫＡＲＩをコードする配列である。より具体的には、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード化ＫＡＲＩ（配列番号３８）は、天然シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩと比較して、以下のアミノ酸変化を有する：
Ｃ３３Ｌ：位置３３のシステインのロイシンへの変化、
Ｒ４７Ｙ：位置４７のアルギニンのチロシンへの変化、
Ｓ５０Ａ：位置５０のセリンのアラニンへの変化、
Ｔ５２Ｄ：位置５２のスレオニンのアスパラギンへの変化、
Ｖ５３Ａ：位置５３のバリンのアラニンへの変化、
Ｌ６１Ｆ：位置６１のロイシンのフェニルアラニンへの変化、
Ｔ８０Ｉ：位置８０のスレオニンのイソロイシンへの変化、
Ａ１５６Ｖ：位置１５６のアラニンのスレオニンへの変化、および
Ｇ１７０Ａ：位置１７０のグリシンのアラニンへの変化。
【０２３４】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域（配列番号３７）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により合成した。
【０２３５】
ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１の構築
酵母におけるＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のためにｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１プラスミド（配列番号１２８）を構築した。ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１は、以下のキメラ遺伝子を含有するｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ＃８７５４１）である：１）ＣＵＰ１プロモーター（配列番号３０）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのアセト乳酸シンターゼコード領域（ＡｌｓＳ、（配列番号３１および３２））およびＣＹＣ１ターミネーター２（配列番号３３）、２）ＩＬＶ５プロモーター（配列番号３４）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−ＪＥＡ１コード領域およびＩＬＶ５ターミネーター（配列番号３５）、ならびに３）ＦＢＡ１プロモーター（配列番号３６）、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５、配列番号３９および４０）およびＣＹＣ１ターミネーター。
【０２３６】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−ＪＥＡ１コード領域は、米国特許出願公開第２００９０１６３３７６Ａ１号明細書に開示されるように、特定の突然変異を有するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するＫＡＲＩをコードする配列である。より具体的には、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−ＪＥＡ１コード化ＫＡＲＩ（それぞれ配列番号４１および４２の核酸およびアミノ酸配列）は、天然のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩと比較して、以下のアミノ酸変化を有する：
Ｙ２４Ｆ：位置２４のチロシンのフェニルアラニンへの変化、
Ｃ３３Ｌ：位置３３のシステインのロイシンへの変化、
Ｒ４７Ｐ：位置４７のアルギニンのプロリンへの変化、
Ｓ５０Ｆ：位置５０のセリンのフェニルアラニンへの変化、
Ｔ５２Ｄ：位置５２スレオニンのアスパラギンへの変化、
Ｌ６１Ｆ：位置６１のロイシンのフェニルアラニンへの変化、
Ｔ８０Ｉ：位置８０のスレオニンのイソロイシンへの変化、
Ａ１５６Ｖ：位置１５６のアラニンのスレオニンへの変化。
【０２３７】
発現ベクターｐＬＨ４６８
酵母におけるＤＨＡＤ、ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現のためにｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号４３）を構築した。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）のコード領域を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいてＤＮＡ２．０により合成し（配列番号４４および４５）、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供した。コード化タンパク質はそれぞれ配列番号４７および４６である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨのための個々の発現ベクターを構築した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）を組み立てるために、ベクターｐＮＹ８（配列番号４８、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８Ａ１号明細書、実施例１７に開示され、ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも命名される）をＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化し、従ってＧＰＤプロモーター領域由来の配列およびａｌｄコード領域を切除した。ｐＮＹ８からのＴＤＨ３プロモーター領域由来の配列断片（配列番号４９）をＰＣＲ増幅し、５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号５０および５１）を用いて、５’端部にＡｓｃＩ部位を付加し、３’端部にＳｐｅＩ部位を付加した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩ消化されたｐＮＹ８ベクター断片を、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化されたＴＤＨ３プロモーターＰＣＲ産物、ならびにベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離されたコドン最適化ｋｉｖＤコード領域を含有するＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片と連結した。トリプル連結により、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）が生じた。制限マッピングおよび配列決定によりｐＬＨ４６７（配列番号１４２）を検証した。
【０２３８】
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、特許仮出願第６１／０５８９７０号明細書、実施例３に開示されるベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号５２）に由来した。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター領域由来の配列（配列番号５３）、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼからのコード領域（ｓａｄＢ、配列番号５５、米国仮特許出願第６１／０４８，２９１号明細書に開示、アミノ酸配列番号５６）、およびＡＤＨ１ターミネーター領域由来の配列（配列番号５４）を含有するキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ＃７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’端部にそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を含有する。プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号５７および５８）を用いる部位特異的変異誘発によって、ｓａｄＢコード領域の５’端部にＮｈｅＩ部位を付加して、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、これを配列決定により検証した。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩをＮｈｅＩおよびＰａｃＩにより消化して、ｓａｄＢコード領域を消失させ、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０からのコドン最適化ＨＡＤＨコード領域を含有するＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片と連結して、ｐＬＨ４３５（配列番号１４３）を作製した。
【０２３９】
ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨ発現カセットを単一ベクター内で結合させるために、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ＃８７４７４）をＳａｃＩおよびＮｏｔＩにより消化し、トリプル連結反応において、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを含有するｐＬＨ４３５からのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片と一緒に、ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔカセットを含有するｐＬＨ４６７からのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片と連結させた。これにより、ベクターｐＲＳ４１１：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１、配列番号１４４）が得られ、これを制限マッピングにより検証した。
【０２４０】
低級（ｌｏｗｅｒ）イソブタノール経路における３つの遺伝子：ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙおよびＨａｄｈｙの全てのための同時発現ベクターを生成するために、ｉｌｖＤ遺伝子のソースとして、米国仮特許出願第６１／１００，７９２号明細書に開示されるｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号５９）を用いた。このシャトルベクターは、大腸菌における維持のためのＦ１複製開始点（ｎｔ  １４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロン開始点（ｎｔ  ８０８２〜９４２６）を含有する。ベクターは、ＦＢＡ１プロモーター領域由来の配列（ｎｔ  ２１１１〜３１０８、配列番号３６）およびＦＢＡ１ターミネーター領域由来の配列（ｎｔ  ４８６１〜５８６０、配列番号６０）を有する。さらに、酵母における選択のためのＨＩＳ３マーカー（ｎｔ  ５０４〜１１６３）および大腸菌における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ  ７０９２〜７９４９）を保有する。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ＃７００６１０）からのｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ３１１６〜４８２８、ベクターのｉｌｖＤコード領域は配列番号６２であり、ｉｌｖＤの野生型タンパク質配列は配列番号６３である）は、ＦＢＡ１プロモーター領域由来の配列と、ＦＢＡ１ターミネーター領域由来の配列との間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ４８２９〜４８４９）に融合されたｌｕｍｉｏタグが存在する。
【０２４１】
第１のステップは、ｐＲＳ４２３：：ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも呼ばれる）を、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化されたＳａｃＩＩ部位を有する）により直線化して、全長９，４８２ｂｐのベクターを得ることであった。第２のステップは、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットを、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化されたＫｐｎＩ部位を有する）によりｐＬＨ４４１から単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることであった。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏからの９，４８２ｂｐのベクター断片と連結した。これにより、ベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、これを制限マッピングおよび配列決定によって確認した。
【０２４２】
実施例２
ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびヘキソキナーゼ２遺伝子の不活性化
この実施例は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内因性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の挿入−不活性化を記載する。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主要なアイソザイムをコードする。得られたＰＤＣ不活性化株を、実施例１において記載された発現ベクターｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８およびｐＬＨ４６８のための宿主として使用した。
【０２４３】
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ組込みカセットの構築およびＰＤＣ６の欠失：
ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（上記）からのＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号６４）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒからのＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合させることによって、ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットを作製した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号６５）は、インビボの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするために、７５ｂｐの相同反復配列に隣接されるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ＃７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）、およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号６６〜６９）、および１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号７０および７１）と共に、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いるＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８により記載される）によって、２つのＤＮＡセグメントを結合させた。ＳＯＥ  ＰＣＲのための外側プライマー（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）は、それぞれＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流側の領域に相同の５’および３’の約５０ｂｐ領域を含有した。完成したカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００（ＡＴＣＣ＃２００８６６）に形質転換し、標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地上で形質転換体を維持した。プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号７２および７３）、ならびに１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号７４および７５）を用いるＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングして、ＰＤＣ６遺伝子座においてＰＤＣ６コード領域の欠失を有する組込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコールに従って、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用した。マーカーの除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ  ＵＲＡ−培地上にパッチングすることにより確認し、増殖がないことを検証した。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。
【０２４４】
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組込みカセットの構築およびＰＤＣ１の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号７７〜８０）と共に、ｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いるＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８によって記載される）によって、ｐＬＨ４６８（上記）からのｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号７６）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒからのＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合させることにより、ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットを作製した。
【０２４５】
ＳＯＥ  ＰＣＲのための外側プライマー（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）は、ＰＤＣ１プロモーターの下流側およびＰＤＣ１コード配列の下流側の領域に相同の５’および３’の約５０ｂｐ領域を含有した。完成したカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔに形質転換し、標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地上で形質転換体を維持した。プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号８２および８３）、ならびにプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号７５および１２９）を用いるＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングして、ＰＤＣ１遺伝子座においてＰＤＣ１コード領域の欠失を有する組込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコールに従って、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用した。マーカーの除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチングすることにより確認し、増殖がないことを検証した。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：＿ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。
【０２４６】
ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットを、ＵＲＡ３ｒ２テンプレートＤＮＡ（配列番号８１）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするために、５００ｂｐの相同反復配列に隣接されるｐＲＳ４２６からのＵＲＡ３マーカー（ＡＴＣＣ＃７７１０７）を含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号８４および８５）を用いてＰＣＲを行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ６７に形質転換し、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択した。３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジン欠乏合成完全培地上に形質転換体をレプリカプレーティングすることによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコールに従って、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用した。マーカーの除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチングすることにより確認し、増殖がないことを検証した。得られた同定株は、ＮＹＬＡ７３と呼ばれ、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔΔｈｉｓ３を有する。
【０２４７】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットの構築およびＰＤＣ５の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号８６および８７）を用いて、ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、株ＹＬＲ１３４Ｗの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号４０３４０９１）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７３に形質転換し、３０℃で１％のエタノールおよびジェネテシン（２００μｇ／ｍｌ）が補充されたＹＰ培地において形質転換体を選択した。プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号８８および８９）を用いて、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングして、ＰＤＣ遺伝子座においてＰＤＣ５コード領域の置換を有する正しい組込みを検証した。同定された正しい形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔΔｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。この株をＮＹＬＡ７４と命名した。
【０２４８】
ヘキソキナーゼ２の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー３８４および３８５（配列番号９０および９１）を用いて、ＵＲＡ３ｒ２テンプレート（上記）からｈｘｋ２：：ＵＲＡ３ｒカセットをＰＣＲ増幅し、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＸＫ２部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みがＨＸＫ２コード領域の置換をもたらすように、ＨＸＫ２プロモーター上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来した。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７３に形質転換し、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択した。プライマーＮ８６９およびＮ８７１（配列番号９２および９３）を用いて、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングして、ＨＸＫ２遺伝子座においてＨＸＫ２コード領域の置換を有する正しい組込みを検証した。ＵＲＡ３ｒ２マーカーは、標準プロトコールに従って、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用した。マーカーの除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチングすることにより確認して、増殖がないことを検証し、プライマーＮ９４６およびＮ９４７（配列番号９４および９５）を用いてＰＣＲにより正しいマーカーの除去を検証した。得られた同定株は、ＮＹＬＡ８３と命名され、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔΔｈｉｓ３Δｈｘｋ２を有する。
【０２４９】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットの構築およびＰＤＣ５の欠失
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを上記のようにＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＮＹＬＡ８３に形質転換し、上記のように、形質転換体を選択およびスクリーニングした。同定された正しい形質転換体は、ＮＹＬＡ８４と命名され、遺伝子型：ＢＹ４７００ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔΔｈｉｓ３Δｈｘｋ２  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。
【０２５０】
標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、プラスミドベクターｐＬＨ４６８およびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８を、株ＮＹＬＡ８４（ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔΔｈｉｓ３Δｈｘｋ２  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４）に同時に形質転換し、得られた株を、３０℃において１％のエタノールが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地上で維持した。
【０２５１】
実施例３
イソブタノールの産生
この実施例の目的は、酵母菌株ＮＹＬＡ８４におけるイソブタノールの産生を説明することである。酵母菌株は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのアイソザイムをコードする遺伝子であるＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６の欠失と、ＡｌｓＳ（アセト乳酸シンターゼ）、ＫＡＲＩ（ケト酸レダクトイソメラーゼ）、ＤＨＡＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）、ＫｉｖＤ（ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ）、およびＳａｄＢ（第２級アルコールデヒドロゲナーゼ）の異種発現のための構築物とを含む。
【０２５２】
株の構築
標準的なＰＥＧ／酢酸リチウム仲介形質転換法によって、実施例２に記載されるＮＹＬＡ７４またはＮＹＬＡ８４にプラスミドｐＬＨ４６８およびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８を導入した。グルコース、ヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地において、形質転換体を選択した。エタノール（１％ｖ／ｖ）を炭素源として使用した。３日後に、２％のグルコースおよび１％のエタノールの両方が炭素源として補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に形質転換体をパッチングした。０．２％のグルコースおよび０．５％のエタノールの両方が補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に培養物を接種することによって、発酵シードバイアルを作製した。グリセロールを１５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるまで添加し、バイアルを−８０℃で貯蔵した。
【０２５３】
イソブタノールの産生
３０℃において炭素源として１％のエタノールが補充され、２５０ｒｐｍで振とうするヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地中で発酵接種材料を増殖させた。発酵槽の接種容積は８０ｍｌであった。以下に記載される８００ｍｌの発酵培地中の８０ｍｌの接種材料は、０．１％のエタノールの存在をもたらす。
【０２５４】
ＮＹＬＡ８４／ｐＬＨ４６８＋ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８株の発酵槽を作製し、０．４Ｌの水で滅菌した。冷却した後、フィルタ滅菌培地を添加して、接種後の８００ｍＬ中で以下の最終濃度を得た：
培地（最終濃度）：
６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）
２．８ｇ／Ｌの、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地補充剤（Ｓｉｇｍａ  Ｙ２００１）
２０ｍＬ／Ｌの１％（Ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン
４ｍＬ／Ｌの１％（Ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン
１０ｇ／Ｌのグルコース
１ｍＬ／Ｌの、５０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０／エタノール溶液中１％のエルゴステロール
０．２ｍＬ／ＬのＳｉｇｍａ  ＤＦ２０４消泡剤（ａｎｔｉｆｏａｍ）
【０２５５】
ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、攪拌による初期ｄＯ（溶解酸素）３０％、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定した。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、次に０．２ＳＬＰＭに増大させた。グルコースは、最初から最後まで５〜１５ｇ／Ｌに維持した。
【０２５６】
ＮＹＬＡ７４／ｐＬＨ４６８＋ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８株の発酵槽は、１ｍＬ／Ｌのエルゴステロール／ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液および０．２ｍＬ／ＬのＳｉｇｍａ  ＤＦ２０４消泡剤を含まず、グルコースが２ｇ／Ｌであった除いて、ＮＹＬＡ８４／ｐＬＨ４６８＋ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８株の発酵槽の場合と同様に作製した。発酵槽中の初期エタノール濃度は０．１％であった。
【０２５７】
ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、攪拌による初期ｄＯ３０％、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定した。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、次に０．２ＳＬＰＭに増大させた。グルコースは、最初から最後まで０．１〜２ｇ／Ｌに維持した。
【０２５８】
サンプルを定期的に採取し、ＯＤ６００によって増殖を測定し、一般的な方法において記載されるように、ＨＰＬＣによりイソブタノール含量を測定した。図１は、増殖（１Ａ）およびイソブタノール産生（１Ｂ）について、ヘキソキナーゼ２欠失を有する株と、ヘキソキナーゼ２欠失を有さない株とを比較する結果を示す。図２は、ヘキソキナーゼ２欠失を有さない株（２Ａ）と、ヘキソキナーゼ２欠失を有する株（２Ｂ）について、増殖およびイソブタノール産生の比較を示す。図３は、細胞１グラム当たりのイソブタノールのグラム数で経時的に測定される「比生産性」（Ｑｐ）としての結果をプロットする。ヘキソキナーゼ２の欠失を有さない株では、もはや増殖がなかったときに、細胞の比生産性は６０時間から９０時間まで降下したが、ヘキソキナーゼ２欠失株では、６０時間から１４０時間まで比生産性は比較的よく維持され、この株は、より良い非増殖関連の産生が可能であることが示された。
【０２５９】
実施例４（予言的）
ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびヘキソキナーゼ２活性が欠けているＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株におけるヘキソキナーゼの制御発現
この実施例は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Δｐｄｃ１／５／６）およびヘキソキナーゼ２（Δｈｘｋ２）活性が除去されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における調節発現下でのヘキソキナーゼ酵素の挿入を説明する。ＮＹＬＡ８４（Δｐｄｃ１／５／６Δｈｘｋ２）株の作製は、実施例２において記載された。
【０２６０】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５８８（配列番号９６）およびＬＡ５８９（配列番号９７）を用いて、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＨＸＫ２遺伝子および天然ターミネーター（配列番号１０１）を、株ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ＃２００８６６）からのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。ＯＬＥ１プロモーター領域由来の配列（配列番号９８）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５８６（配列番号９９）およびＬＡ５８７（配列番号１００）を用いて、ＢＹ４７００ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化した。ＨＸＫ２およびＰＯＬＥ１産物を連結させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより既に消化されたｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰにサブクローニングした。ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号１０２）は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位に隣接される（ＡＴＣＣ＃７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含有する。得られるベクターをｐＬＡ２５（配列番号１０３）と命名した。
【０２６１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５９３およびＬＡ５９４（配列番号１０４および１０５）を用いて、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）からのＲＡＧ５遺伝子（配列番号３）を、株ＧＧ７９９（＃Ｃ１００１Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化した。ゲル精製ＲＡＧ５産物を上記からのＯＬＥ１プロモーター領域由来の配列と連結させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより既に消化されたｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰにサブクローニングした。得られたベクターをｐＬＡ３１（配列番号１０６）と命名した。
【０２６２】
ＴＲＰ１遺伝子座に組み込むために、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＢＫ６００およびＢＫ６０１（配列番号１０７および１０８）を用いて、ＰＯＬＥ１−ＨＸＫ２−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰおよびＰＯＬＥ１−ＲＡＧ５−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットをプラスミドｐＬＡ２５およびｐＬＡ３１からＰＣＲ増幅させる。各プライマーのＴＲＰ１部分は、ＰＯＬＥ１−ＨＸＫ２−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰまたはＰＯＬＥ１−ＲＡＧ５−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットの組込みがＴＲＰ１コード領域の置換をもたらすように、ＴＲＰ１プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来する。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＣＲ産物をＮＹＬＡ８４に形質転換し、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択する。プライマー１１２５９０−４９Ｅ（配列番号７５）およびＬＡ６０６（配列番号１０９）を用いて、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングして、ＴＲＰ１遺伝子座においてＴＲＰ１コード領域の置換を有する正しい組込みを検証する。ＵＲＡ３マーカーは、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１１０）により形質転換し、３０℃において１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠乏合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用する。コロニーを３０℃でＹＰ（１％のガラクトース）プレート上にパッチングしてＵＲＡ３マーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰ（１％のエタノール）プレート上に移す。コロニーをＹＰ（１％のエタノール）プレートから、１％のエタノールが補充されたウラシル欠乏合成完全培地上にパッチングすることによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認し、増殖がないことを検証する。
【０２６３】
実施例５（予言的）
ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびヘキソキナーゼ２活性が欠けているＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株におけるヘキソキナーゼの構成的な発現
この実施例は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Δｐｄｃ１／５／６）およびヘキソキナーゼ２（Δｈｘｋ２）活性が除去されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における構成的なＡＤＨ１由来のプロモーター配列の調節下でのヘキソキナーゼ酵素の挿入を説明する。ＮＹＬＡ８４（Δｐｄｃ１／５／６Δｈｘｋ２）株の作製は、実施例２において記載された。
【０２６４】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５９３およびＬＡ５９４（配列番号１０４および１０５）を用いて、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）からのＲＡＧ５遺伝子（配列番号３）を、株ＧＧ７９９（＃Ｃ１００１Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５９５およびＬＡ５９７（配列番号１１２および１１３）を用いて、ＡＤＨ１プロモーター領域由来の配列（配列番号１３１）をＢＹ４７００ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化した。ゲル精製ＲＡＧ５産物をＡＤＨ１プロモーター断片と連結させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより既に消化されたｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰにサブクローニングした。得られたベクターをｐＬＡ３２（配列番号１１１）と命名した。
【０２６５】
ＴＲＰ１遺伝子座に組み込むために、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＢＫ６００およびＢＫ６０１（配列番号１０７および１０８）を用いて、ＰＡＤＨ１−ＲＡＧ５−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットをプラスミドｐＬＡ３２からＰＣＲ増幅させる。各プライマーのＴＲＰ１部分は、ＰＡＤＨ１−ＲＡＧ５−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットの組込みがＴＲＰ１コード領域の置換をもたらすように、ＴＲＰ１プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来する。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ８４に形質転換し、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択する。プライマー１１２５９０−４９Ｅ（配列番号７５）およびＬＡ６０６（配列番号１０９）を用いて、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングして、ＴＲＰ１遺伝子座においてＴＲＰ１コード領域の置換を有する正しい組込みを検証する。ＵＲＡ３マーカーは、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１１０）により形質転換し、３０℃において１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠乏合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用する。コロニーを３０℃でＹＰ（１％のガラクトース）プレート上にパッチングしてＵＲＡ３マーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰ（１％のエタノール）プレート上に移す。コロニーをＹＰ（１％のエタノール）プレートから、１％のエタノールが補充されたウラシル結合合成完全培地上にパッチングすることによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認し、増殖がないことを検証する。
【０２６６】
実施例６（予言的）
ヘキソースキナーゼの制御発現を有するＮＹＬＡ８４株を用いたイソブタノールの産生
イソブタノール株および産生
標準的なＰＥＧ／酢酸リチウム仲介形質転換法によって、発現構築物ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１およびｐＬＨ４６８（実施例１に記載）を株ＮＹＬＡ８４、ＮＹＬＡ８４ｔｒｐ１：：ＰＯＬＥ１−ＨＸＫ２およびＮＹＬＡ８４ｔｒｐ１：：ＰＯＬＥ１−ＲＡＧ５（実施例４に記載）に形質転換する。グルコース、ヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択する。エタノール（１％ｖ／ｖ）を炭素源として使用する。３日後に、炭素源として２％のグルコースおよび１％のエタノールの両方が補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地上に形質転換体をパッチングする。０．２％のグルコースおよび０．５％のエタノールの両方が補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に培養物を接種することによって、シードバイアルを作製する。グリセロールを１５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるまで添加し、バイアルを−８０℃で貯蔵する。
【０２６７】
イソブタノールの産生
ＮＹＬＡ８４ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１、ＮＹＬＡ８４ｔｒｐ１：：ＰＯＬＥ１−ＨＸＫ２、およびＮＹＬＡ８４ｔｒｐ１：：ＰＯＬＥ１−ＲＡＧ５のシードバイアルを、３０℃において０．２５％のグルコースおよび０．５％のエタノールの両方が炭素源として補充された８０ｍＬのヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に接種する。１リットルの発酵槽を作製し、０．４Ｌの水で滅菌する。冷却した後、フィルタ滅菌培地を添加して、接種後の８００ｍＬ中で以下の最終濃度が得られる：
培地（最終濃度）：
６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）
２．８ｇ／Ｌの、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地補充剤（Ｓｉｇｍａ  Ｙ２００１）
２０ｍＬ／Ｌの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン
４ｍＬ／Ｌの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン
１ｍＬ／Ｌのエルゴステロール／ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液
０．２ｍＬ／ＬのＳｉｇｍａ  ＤＦ２０４
１０ｇ／Ｌのグルコース
【０２６８】
ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、３０％ｄＯ、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定する。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、次に、増殖が確立されたら、０．２ＳＬＰＭに増大させる。グルコースは、手で添加することによって、最初から最後まで５〜１５ｇ／Ｌに維持する。あるいは、ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、３〜５％ｄＯ、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定する。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、増殖が確立されたら０．２ＳＬＰＭに増大させる。
【０２６９】
放散によるイソブタノールの損失を定量するために、発酵槽からのオフガスを質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に直接送り、ガス流中のイソブタノールの量を定量する。７４または４２の電荷比のイソブタノールの質量ピークを連続的にモニターし、ガス流中のイソブタノールの量を定量する。発酵中、ＨＰＬＣを用いて水相中のグルコースおよび有機酸をモニターする。またグルコースは、グルコース分析器（ＹＳＩ、Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて迅速にモニターされる。水相中のイソブタノールおよびイソ酪酸は、本明細書中の上記の一般的な方法のセクションに記載されるように、水相を発酵槽から定期的に取り出してから、ＨＰＬＣによって定量される。
【０２７０】
実施例７（予言的）
ヘキソースキナーゼ機能の修飾
この実施例の目的は、転写制御因子としての機能を阻止するタンパク質相互作用ドメインの欠失によってヘキソースキナーゼの機能がどのように改変され得るかを説明することである。ＭＩＧ１−相互作用ドメイン（Ｌｙｓ６−Ｍｅｔ１５）がＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＸＫ２から除去され、これは、解糖酵素としての機能を可能にするが核へのトランスロケーションを阻止する。
【０２７１】
Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＸＫ２からＮ末端のＭＩＧ１−相互作用ドメインを除去するために、ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰプラスミドを用いて組込みカセットを構築する。Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するコドン最適化を有するＤＮＡ２．０によって、Ｌｙｓ６−Ｍｅｔ１５領域（ｂｐ１９〜４８）の内部欠失およびＡＤＨ１ターミネーター領域由来の配列を有する、ＨＸＫ２をコードする遺伝子を合成する（配列番号１３２）。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＥ００１およびＥ００２（配列番号１３３および１３４）を用いて、ＨＸＫ２（ΔＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）−ＡＤＨ１ｔカセットをＰＣＲ増幅させ、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＢａｍＨＩ部位を介してｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰにサブクローニングして、プラスミドｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ−ＨＸＫ２（Ｌｙｓ６−Ｍｅｔ１５）−ＡＤＨ１ｔ（配列番号１３９）を作製する。
【０２７２】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＥ００３およびＥ００４（配列番号１３５および１３６）を用いて、ＨＸＫ２（ΔＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットをＰＣＲ増幅する。プライマーＥ００３はＨＸＫ２プロモーター領域からの配列を含有し、ＨＸＫ２（ΔＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットの組込みが天然ＨＸＫ２コード配列の置換をもたらすように、プライマーＥ００４はＨＸＫ２ターミネーターからの配列を含有する。標準的な遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７４に形質転換し、３０℃において２％のグルコースが補充されたウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択する。形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングし、プライマーＥ００５およびＥ００６（配列番号１３７および１３８）を用いてＨＸＫ２遺伝子座における正しい組込みを検証する。ＵＲＡ３マーカーは、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１１０）により形質転換し、３０℃において１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠乏合成完全培地上にプレーティングすることによって再利用する。コロニーを３０℃でＹＰ（１％のガラクトース）プレート上にパッチングしてＵＲＡ３マーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰ（１％のエタノール）プレート上に移す。コロニーをＹＰ（１％のエタノール）プレートから、１％のエタノールが補充されたウラシル欠乏合成完全培地上にパッチングすることによってＵＲＡ３マーカーの除去を確認し、増殖がないことを検証する。
【０２７３】
実施例８（予言的）
ヘキソースキナーゼの調節機能を有するＮＹＬＡ４４株を用いたイソブタノールの産生
イソブタノール株および産生
標準的なＰＥＧ／酢酸リチウム仲介形質転換法によって、発現構築物ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１およびｐＬＨ４６８（実施例１に記載）を株ＮＹＬＡ７４ｈｘｋ２Δ：：ＨＸＫ２（ΔＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）（実施例７記載）に形質転換する。グルコース、ヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地において形質転換体を選択する。エタノール（１％ｖ／ｖ）を炭素源として使用する。３日後に、炭素源として２％のグルコースおよび１％のエタノールの両方が補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地上に形質転換体をパッチングする。０．２％のグルコースおよび０．５％のエタノールの両方が補充されたヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に培養物を接種することによって、シードバイアルを作製する。グリセロールを１５％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるまで添加し、バイアルを−８０℃で貯蔵する。
【０２７４】
イソブタノールの産生
ＮＹＬＡ７４ｈｘｋ２Δ：：ＨＸＫ２（ΔＬｙｓ６−Ｍｅｔ１５）ｐＬＨ４６８ｐＬＨ４７５−ＪＥＡ１のシードバイアルを、３０℃において０．２５％のグルコースおよび０．５％のエタノールの両方が炭素源として補充された８０ｍＬのヒスチジンおよびウラシル欠乏合成完全培地に接種する。１リットルの発酵槽を作製し、０．４Ｌの水で滅菌する。冷却した後、フィルタ滅菌培地を添加して、接種後の８００ｍＬ中で以下の最終濃度が得られる：
培地（最終濃度）：
６．７ｇ／Ｌの、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）
２．８ｇ／Ｌの、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地補充剤（Ｓｉｇｍａ  Ｙ２００１）
２０ｍＬ／Ｌの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン
４ｍＬ／Ｌの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン
１ｍＬ／Ｌのエルゴステロール／ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液
０．２ｍＬ／ＬのＳｉｇｍａ  ＤＦ２０４
１０ｇ／Ｌのグルコース
【０２７５】
ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、３０％ｄＯ、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定する。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、次に、増殖が確立されたら０．２ＳＬＰＭに増大させる。グルコースは、手で添加することによって、最初から最後まで５〜１５ｇ／Ｌに維持した。あるいは、ＫＯＨによりｐＨ５．５に調節し、３〜５％ｄＯ、温度３０℃、そして０．２ＳＬＰＭ（または、０．２５ｖｖｍ）の空気流になるように発酵槽を設定する。接種の際、初めに空気流を０．０１ＳＬＰＭに設定し、増殖が確立されたら０．２ＳＬＰＭに増大させる。
【０２７６】
放散によるイソブタノールの損失を定量するために、発酵槽からのオフガスを質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に直接送り、ガス流中のイソブタノールの量を定量する。７４または４２の電荷比のイソブタノールの質量ピークを連続的にモニターし、ガス流中のイソブタノールの量を定量する。発酵中、ＨＰＬＣを用いて水相中のグルコースおよび有機酸をモニターする。またグルコースは、グルコース分析器（ＹＳＩ、Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて迅速にモニターされる。水相中のイソブタノールおよびイソ酪酸は、本明細書中の上記の一般的な方法のセクションに記載されるように、水相を発酵槽から定期的に取り出してから、ＨＰＬＣによって定量される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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