(57)【要約】  本発明は、対象における急性脳損傷の診断を補助するための方法であって、（ｉ）前記対象由来の試料における、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、（ii）パネルＡから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、（iii）（ｉ）及び（ii）の濃度を標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、（iv）前記試料においてアッセイしたそれぞれのポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が１．３を超えると、急性脳損傷が前記対象において生じている可能性の増加を示す方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における急性脳損傷の診断を補助するための方法であって、
（ｉ）前記対象由来の試料における、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、
（ii）パネルＡから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、
（iii）（ｉ）及び（ii）の濃度を標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、
（iv）前記試料においてアッセイしたそれぞれのポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が１．３を超えると、急性脳損傷が前記対象において生じている可能性の増加を示す、方法。
【請求項２】
ステップ（ii）が、パネルＢから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ii）が、パネルＣから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ii）が、パネル１から選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ii）が、パネル１Ｈから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ii）が、パネル１Ｃから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ii）が、パネル１Ａから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ii）が、パネル１Ｂから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ii）が、パネル２から選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ii）が、パネル２Ａから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ii）が、パネル２Ｂから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉ）が、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも２つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）が、酸化ストレスポリペプチドＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１のそれぞれの濃度をアッセイすることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ii）が、前記パネルから選択される少なくとも２つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ii）が、前記パネルから選択される少なくとも４つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
急性脳損傷が、脳卒中である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試料が、脳微小透析液、脳脊髄液、又は血液である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試料が、血液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉ）が、対象由来の試料におけるＰＲＤＸ１の濃度をアッセイすることを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質が、ウエスタンブロッティングによって検出される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質が、ビーズサスペンションアレイ又は平面アレイによって検出される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質が、アイソバリックタンパク質タギング又は同位体タンパク質タギングによって検出される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質が、質量分析計ベースのアッセイによって検出される、請求項１〜１９又は請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
第１及び第２のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、急性脳損傷に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、前記第１のポリペプチドが、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１から選択され、前記第２のポリペプチドが、パネルＡから選択される、使用。
【請求項２５】
ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、脳卒中に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、前記ポリペプチドが、パネル２から選択される、使用。
【請求項２６】
各々１つ又は２つ以上のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有するそれぞれの物質の組み合わせの、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
物質又はそれぞれの物質が、抗体又は抗体チップである、請求項２４〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
物質が、１つ又は２つ以上のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントに対して特異性を有する抗体である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
急性脳損傷の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、第１及び第２のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、前記第１のポリペプチドが、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１から選択され、前記第２のポリペプチドが、パネルＡから選択される、アッセイデバイス。
【請求項３０】
脳卒中の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、前記ポリペプチドが、パネル２から選択される、アッセイデバイス。
【請求項３１】
物質が、抗体又は抗体チップである、請求項２９又は３０に記載のアッセイデバイス。
【請求項３２】
それぞれの抗体について固有のアドレス指定可能な位置を有し、それによって、それぞれの個々のポリペプチド又はポリペプチドの任意の組み合わせについてアッセイの読み取りを可能にする、請求項３１に記載のアッセイデバイス。
【請求項３３】
脳卒中の診断において使用するためのキットであって、請求項２９〜３２のいずれかに記載のアッセイデバイス、及び対象から採取される体液の試料における１又は２以上のポリペプチドの量を検出するための手段を含む、キット。
【請求項３４】
対象における急性脳損傷の診断又は予後モニタリングの方法であって、
（ａ）個体由来の適切な組織試料からタンパク質を得、抽出するステップと、
（ｂ）前記タンパク質を消化してペプチドの集団を産生するステップと、
（ｃ）表１５において列挙される１又は２以上のトランジションの選択反応モニタリングを使用して、表１４において列挙される１又は２以上の前記ペプチドの存在量を決定するステップと、
（ｄ）前記１又は２以上のペプチドの存在量を、急性脳損傷の診断に関連する、あらかじめ決定されたペプチドの存在量と比較するステップと、
（ｅ）前記１又は２以上のペプチドの存在量の差異に基づいて、前記対象が急性脳損傷を患っているかどうか及び／又は急性脳損傷が悪化している若しくは改善していることを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
あらかじめ決定されたペプチドの存在量が、表１４から選択される対応する合成ペプチドの既知の量を使用して決定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
表１４において列挙される群から選択される１又は２以上の合成ペプチドを含む、急性脳損傷の診断又は急性脳損傷を有する対象の予後モニタリングを行うための調製物。
【請求項３７】
１又は２以上の合成ペプチドが、
GSTP1   TFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLLSAYVGR
MPPYTVVYFPVR
DDYVK
DQQEAALVDMVNDGVEDLR
FQDGDLTLYQSNTILR
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PRDX1   HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVQK
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PRDX6   GMPVTAR
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DINAYNCEEPTEK
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DGDSVMVLPTIPEEEAK
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DDAH1   ALPESLGQHALR
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DYAVSTVPVADGLHLK
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MDPETCPCPSGGSCTCADSCK
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PEPB1   GNDISSGTVLSDYVGSGPPK
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NRPTSISWDGLDSGK
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から選択される、請求項３６に記載の調製物。
【請求項３８】
それぞれのペプチドが、水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄から選択される１又は２以上の安定した重同位体を含有する、請求項３６又は３７に記載の調製物。
【請求項３９】
合成ペプチドが、同位体タグ又はアイソバリックタグにより標識される、請求項３６又は３７に記載の調製物。
【請求項４０】
急性脳損傷の診断又は予後モニタリングのための、請求項３６〜３９のいずれかに記載の調製物。
【請求項４１】
急性脳損傷が、虚血性脳卒中又は一過性脳虚血発作である、請求項４０に記載の調製物。
【請求項４２】
実質的に本明細書において記載される方法、使用、デバイス、又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性脳外傷の診断の補助に関する。特に、本発明は、脳卒中の診断の補助に関する。新規なバイオマーカー及びバイオマーカーのパネルが本発明の方法において記載される。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、工業先進国における、死亡及び身体障害の主要な原因である。急性脳卒中の迅速な診断は、それが疑われている患者に優先順位を付け、確認した患者を専門の脳卒中ユニット（stroke unit）に移送するのに不可欠である。
【０００３】
非脳血管性状態が、脳卒中を模倣する臨床像を示し得ることはよく知られており、真の脳卒中からのそのような「模倣物」の初期の正確な区別は、患者を適切なケアに導くのに不可欠である。現時点で、急性脳虚血のための単純で広く利用可能な診断試験がないことは、脳卒中の診断（多くは臨床的な根拠及び神経画像処理技術に基づく）並びに管理において、課題となっている。さらに、脳卒中患者の予後判断は、治療及び経過観察を合理的に説明するのに適切である。
【０００４】
そのため、脳卒中の診断並びに／又はその疾患のほぼ確実な経過及び結果の予測のためのマーカーの必要性は、医療の労働力にとって主な課題となっている（Foerch, C., Montaner, J., Furie, K. L., Ning, M. M., and Lo, E. H. (2009) Invited Article: Searching for oracles? Blood biomarkers in acute stroke. Neurology 73, 393-399）。
【０００５】
ヒト大脳の微小透析は、脳における細胞外液（ＥＣＦ，extracellular fluid）の組成の変化をモニターするためのインビボ試料採取技術である。基本的に、可動性のマイクロプローブが、患者の脳の中に挿入され、脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebrospinal fluid）の組成に非常に近い組成を有する溶液が、灌流される（Poca, M. A., Sahuquillo, J., Vilalta, A., De los Rios, J., Robles, A., and Exposito, L. (2006) Percutaneous implantation of cerebral microdialysis catheters by twist-drill craniostomy in neurocritical patients: Description of the technique and results of a feasibility study in 97 patients. J. Neurotrauma 23, 1510-1517）。プローブは、有窓毛細血管の機能をまねる。プローブ先端に位置する半透性膜を通過することができる内因性物質は、間質液から微小透析溶液に拡散する。
【０００６】
過去数年間に、基質（例えばグルコース）、代謝物質（例えばピルビン酸、乳酸）、及び神経伝達物質（例えばグルタミン酸）などのヒト脳微小透析液における小分子を測定するいくつかの研究が、実行されてきた（Hutchinson, P. J., O'Connell, M. T., Kirkpatrick, P. J., and Pickard, J. D. (2002) How can we measure substrate, metabolite and neurotransmitter concentrations in the human brain? Physiol. Meas. 23, R75-R109、Reinstrup, P., Stahl, N., Mellergard, P., Uski, T., Ungerstedt, U., and Nordstrom, C. H. (2000) Intracerebral microdialysis in clinical practice: Baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery 47, 701-709、Tisdall, M. M., and Smith, M. (2006) Cerebral microdialysis: research technique or clinical tool. Br. J. Anaesth. 97, 18-25）。逆に、現在までに報告されている、これらのまれな物質に関するプロテオミクス研究は、ほとんどない（Maurer, M. H. (2008) Proteomics of brain extracellular fluid (ECF) and cerebrospinal fluid (CSF). Mass Spectrom. Rev., DOI:10.1002/mas.20213、Maurer, M. H., Haux, D., Unterberg, A. W., and Sakowitz, O. W. (2008) Proteomics of human cerebral microdialysate: From detection of biomarkers to clinical application. Proteomics Clin. Appl. 2, 437-443）。タンパク質を回収する能力は、それらの分子量、疎水性／親水性、電荷、形状、回転半径、及び他の分子との相互作用などのいくつかの物理化学的要因に依存する。微小透析カテーテルの構造、膜の孔径、流速、温度、及び灌流液の内部でのタンパク質の拡散特性は、タンパク質及び体液の回収の両方に影響を及ぼす（Helmy, A., Carpenter, K. L. H., Skepper, J. N., Kirkpatrick, P. J., Pickard, J. D., and Hutchinson, P. J. (2009) Microdialysis of Cytokines: Methodological Considerations, Scanning Electron Microscopy, and Determination of Relative Recovery. J. Neurotrauma 26, 549-561）。例として、重要な細胞内及び細胞外機能を有する１２ｋＤａカルシウム結合タンパク質であるタンパク質Ｓ１００−Ｂ（Ｓ１００Ｂ）のインビトロでの回収（Donato, R. (2001) S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 637-668）は、２０ｋＤａの正式なカットオフ値と比較して、１００ｋＤａのカテーテルＭＷカットオフにより改善された（Afinowi, R., Tisdall, M., Keir, G., Smith, M., Kitchen, N., and Petzold, A. (2009) Improving the recovery of S100B protein in cerebral microdialysis: Implications for multimodal monitoring in neurocritical care. J. Neurosci. Methods 181, 95-99）。カテーテル内の生物学的デブリ（debris）の蓄積もまた、ある期間にわたって回収を減少させることが示された（Helmy, A., Carpenter, K. L. H., Skepper, J. N., Kirkpatrick, P. J., Pickard, J. D., and Hutchinson, P. J. (2009) Microdialysis of Cytokines: Methodological Considerations, Scanning Electron Microscopy, and Determination of Relative Recovery. J. Neurotrauma 26, 549-561）。したがって、微小透析アプローチは、依然として、技術的に非常に困難なままである。さらに、それらは、切開及び脳の内側の部分への接触を必要とする侵襲性の手順に相当し、これは、非常に特殊であり、実行するのが困難な手順である。
【０００７】
このような状況において、Maurer et al.は、二次元ゲル電気泳動及び質量分析（ＭＳ，mass spectrometry）を用いてヒト脳微小透析液のプロテオミクス分析を実行し、脳卒中患者の非梗塞（つまり対側（ＣＴ，contralateral））脳半球から２７のタンパク質を同定した（Maurer, M. H., Berger, C., Wolf, M., Futterer, C. D., Feldmann, R. E., Jr., Schwab, S., and Kuschinsky, W. (2003) The proteome of human brain microdialysate. Proteome Science 1, 7）。それらのタンパク質の多くは、以前に、ＣＳＦにおいて検出されたが、ほとんどは、脳微小透析液中に独占的に存在するようには思われなかった。どれも脳卒中のバイオマーカーとして十分な有用性を示すようには思われなかった。より最近の調査では、血管攣縮を発症している又はしていないクモ膜下出血（ＳＡＨ，subarachnoid hemorrhage）を有する患者の微小透析液試料が比較された（Maurer, M. H., Haux, D., Sakowitz, O. W., Unterberg, A. W., and Kuschinsky, W. (2007) Identification of early markers for symptomatic vasospasm in human cerebral microdialysate after subarachnoid hemorrhage: Preliminary results of a proteome-wide screening. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1675-1683）。グリセルアルデヒド−３−リン酸及び熱ショック類似７１ｋＤａタンパク質（heat-shock cognate 71 kDa protein）は、副作用として脳梗塞をもたらす可能性がある後部血管攣縮を患っていた群においてそれぞれ増加及び減少した。その著者らは、これらのタンパク質を、ＳＡＨ後の症候性血管攣縮の発症についての初期マーカーとして使用することができるという結論を下した。
【０００８】
上記のゆえに、急性脳外傷を示すマーカーの同定及び／又は脳卒中の診断は、当分野において未解決の課題のままである。
【０００９】
本発明は、先行技術に関連する課題（複数可）を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Foerch, C., Montaner, J., Furie, K. L., Ning, M. M., and Lo, E. H. (2009) Invited Article: Searching for oracles? Blood biomarkers in acute stroke. Neurology 73, 393-399
【非特許文献２】Poca, M. A., Sahuquillo, J., Vilalta, A., De los Rios, J., Robles, A., and Exposito, L. (2006) Percutaneous implantation of cerebral microdialysis catheters by twist-drill craniostomy in neurocritical patients: Description of the technique and results of a feasibility study in 97 patients. J. Neurotrauma 23, 1510-1517
【非特許文献３】Hutchinson, P. J., O'Connell, M. T., Kirkpatrick, P. J., and Pickard, J. D. (2002) How can we measure substrate, metabolite and neurotransmitter concentrations in the human brain? Physiol. Meas. 23, R75-R109
【非特許文献４】Reinstrup, P., Stahl, N., Mellergard, P., Uski, T., Ungerstedt, U., and Nordstrom, C. H. (2000) Intracerebral microdialysis in clinical practice: Baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery 47, 701-709
【非特許文献５】Tisdall, M. M., and Smith, M. (2006) Cerebral microdialysis: research technique or clinical tool. Br. J. Anaesth. 97, 18-25
【非特許文献６】Maurer, M. H. (2008) Proteomics of brain extracellular fluid (ECF) and cerebrospinal fluid (CSF). Mass Spectrom. Rev., DOI:10.1002/mas.20213
【非特許文献７】Maurer, M. H., Haux, D., Unterberg, A. W., and Sakowitz, O. W. (2008) Proteomics of human cerebral microdialysate: From detection of biomarkers to clinical application. Proteomics Clin. Appl. 2, 437-443
【非特許文献８】Donato, R. (2001) S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 637-668
【非特許文献９】Afinowi, R., Tisdall, M., Keir, G., Smith, M., Kitchen, N., and Petzold, A. (2009) Improving the recovery of S100B protein in cerebral microdialysis: Implications for multimodal monitoring in neurocritical care. J. Neurosci. Methods 181, 95-99
【非特許文献１０】Helmy, A., Carpenter, K. L. H., Skepper, J. N., Kirkpatrick, P. J., Pickard, J. D., and Hutchinson, P. J. (2009) Microdialysis of Cytokines: Methodological Considerations, Scanning Electron Microscopy, and Determination of Relative Recovery. J. Neurotrauma 26, 549-561
【非特許文献１１】Maurer, M. H., Berger, C., Wolf, M., Futterer, C. D., Feldmann, R. E., Jr., Schwab, S., and Kuschinsky, W. (2003) The proteome of human brain microdialysate. Proteome Science 1, 7
【非特許文献１２】Maurer, M. H., Haux, D., Sakowitz, O. W., Unterberg, A. W., and Kuschinsky, W. (2007) Identification of early markers for symptomatic vasospasm in human cerebral microdialysate after subarachnoid hemorrhage: Preliminary results of a proteome-wide screening. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1675-1683
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
損傷を受けた組織のすぐ近くのリアルタイムのモニタリング及び試料採取を可能にすることにより、ヒト脳微小透析液は、脳特異的バイオマーカーの発見のための非常に有益な供給源材料である。ヒト脳微小透析試料のプロテオミクス分析は、脳卒中などの脳血管障害の診断及び予後判断のための革新的な分子を見出すために、本発明者らによって適用された。
【００１２】
これらの研究は、特定のバイオマーカーの同定を可能にし、それらを脳卒中との関連について調べることをさらに可能にした。バイオマーカーは、損傷を受けた領域の中心の近く又は他のそのような特性などの外傷の特定の形態又は要素とのそれらの関連の点からさらに特徴づけることができた。
【００１３】
これらの大変な研究から得られた見識は、脳卒中などの急性脳外傷についてのある種のバイオマーカーの同定を可能にした。したがって、本発明者らは、本明細書において詳述されるように、状態の診断を補助するための方法を発明することができた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、一態様では、本発明は、対象における急性脳損傷（brain damage）の診断を補助するための方法であって、
（ｉ）前記対象由来の試料における、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、
（ii）パネルＡから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、
（iii）（ｉ）及び（ii）の濃度を標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、
（iv）前記試料においてアッセイしたそれぞれのポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が１．３を超えると、急性脳損傷が前記対象において生じている可能性の増加を示す方法に関する。
【００１５】
酸化ストレスポリペプチドは、酸化ストレス関連ポリペプチドと呼ぶことができる。
【００１６】
任意選択で、（ｉ）のうちの少なくとも１つの酸化ストレスポリペプチドは、酸化ストレスタンパク質Ｓ１００Ｂと組み合わせてアッセイすることができる。
【００１７】
ポリペプチドは、適切には、酸化ストレスポリペプチドである。ポリペプチドは、適切には、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される。この群は、酸化ストレスタンパク質となる共通の特性を共有する。これらのタンパク質は、抗酸化酵素である。それらは、それぞれ活性酸素種の排除への関与によって関連している。したがって、これらのポリペプチドは、概念的に関連づけられる。さらに、それらは、機能的に関連づけられる。これらのポリペプチドは、脳卒中の診断に役立つものとして、初めて、群として教示される。したがって、本発明によって当技術分野に対して成された１つの貢献は、ポリペプチドのこの生物学的に関連する群を、脳卒中の診断インジケータとなる単一の群に、ともに分類することである。
【００１８】
任意選択で、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１の群は、酸化ストレスによって誘発される他のタンパク質を含んでいてもよい。例えば、群は、酸化ストレスにおいて誘発されるタンパク質Ｓ１００Ｂを含んでいてもよい。これらのポリペプチドは、脳卒中の診断に役立つものとして、初めて、群として教示される。
【００１９】
上記に述べられる共通の特性に加え、また、この群について初めて本明細書で教示された特異的な共通の有用性に加え、また、ポリペプチドのこのクラスターの小さく、定められたサイズに加えて、それらがまた、互いに、直接的な相互作用物質として証拠づけられることによっても関連することに注目することは重要である。例えば、これらのタンパク質は、単一の生物学的複合体の一部であることが実証されている。
【００２０】
例えば、ＰＲＤＸ１及びＧＳＴＰ１は、同様のレドックス防御メカニズムに関係する。さらに、それらは、ともに相互作用することが証拠づけられている（Krapfenbauer, K., Engidawork, E., Cairns, N., Fountoulakis, M., and Lubec, G. (2003) Aberrant expression of peroxiredoxin subtypes in neurodegenerative disorders. Brain Res. 967, 152-160）。さらに、ＧＳＴＰ１は、酸化ＰＲＤＸ６を再活性化することが示されている（Schreibelt, G., van Horssen, J., Haseloff, R. F., Reijerkerk, A., van der Pol, S. M. A., Nieuwenhuizen, O., Krause, E., Blasig, I. E., Dijkstra, C. D., Ronken, E., and de Vries, H. E. (2008) Protective effects of peroxiredoxin-1 at the injured blood-brain barrier. Free Radic. Biol. Med. 45, 256-264）。さらに、複合体の形成は、生化学的に実証されている（Kim, Y. J., Lee, W. S., Ip, C., Chae, H. Z., Park, E. M., and Park, Y. M. (2006) Prx1 suppresses radiation-induced c-Jun NH2-terminal kinase signaling in lung cancer cells through interaction with the glutathione S-transferase Pi/c-Jun NH2-terminal kinase complex. Cancer Res. 66, 7136-7142）。
【００２１】
共通の生物学的機能のこれらの強力な指標に加えて、ＧＳＴＰ１は，酸化ＰＲＤＸ６を再活性化すると示されている（Manevich, Y., Feinstein, S. I., and Fisher, A. B. (2004) Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 3780-3785）。さらに、これらのポリペプチドの間の複合体形成もまた、証明されている（Ralat, L. A., Manevich, Y., Fisher, A. B., and Colman, R. F. (2006) Direct evidence for the formation of a complex between 1-cysteine peroxiredoxin and glutathione S-transferase pi with activity changes in both enzymes. Biochemistry (Mosc). 45, 360-372）。
【００２２】
したがって、少なくともこれらの理由で、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群は、一つの発明を形成し、この非常に小さな群のそれぞれのメンバーは、一つの発明概念を形成するように関連づけられる。この概念は、脳卒中のインジケータとしての酸化ストレスタンパク質のアッセイとして特徴づけることができる。その代わりに、この概念は、一つの生物学的集合体（つまり上記に記載のペルオキシレドキシン複合体）についてのアッセイが、脳卒中の診断を補助することができるということを教示するとして特徴づけることができる。最も明確な用語において本発明を定義するために、複合体の個々の異なる分子メンバーは、個々に詳述される。しかしながら、これらの個々のポリペプチドが、上記に示される理由で技術的な関係性を共有することに注意されたい。したがって、言及される個々のタンパク質のそれぞれは、同じ生物学的複合体中にあり、同じ生物学的機能に寄与し、同じインビボ巨大分子集合体中にあるという特有の技術的特徴及び記載される他の共通の特性を共有する。したがって、本出願は、この複合体のメンバーを脳卒中の診断に関連させる新しい教示によって特徴づけられる一つの発明に関する。
【００２３】
適切には、ステップ（ｉ）は、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも２つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００２４】
適切には、ステップ（ｉ）は、酸化ストレスポリペプチドＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１のそれぞれの濃度をアッセイすることを含む。
【００２５】
適切には、ステップ（ii）は、他の機能を有するタンパク質と組み合わせた、より大きなパネルの一部としての、上記に記載の酸化ストレス関連タンパク質のパネルの１又は２以上の測定値を含んでいてもよい。例えば、これは、脳微小透析液において発見された他のタンパク質を含む。
【００２６】
適切には、ステップ（ii）は、パネルＢから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００２７】
適切には、ステップ（ii）は、パネルＣから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００２８】
適切には、ステップ（ii）は、拡大パネルＡＢＣから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００２９】
適切には、ステップ（ii）は、パネル１から選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３０】
適切には、ステップ（ii）は、パネル１Ｈから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３１】
適切には、ステップ（ii）は、パネル１Ｃから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３２】
適切には、ステップ（ii）は、パネル１Ａから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３３】
適切には、ステップ（ii）は、パネル１Ｂから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３４】
適切には、ステップ（ii）は、パネル２から選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３５】
適切には、ステップ（ii）は、パネル２Ａから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３６】
適切には、ステップ（ii）は、パネル２Ｂから選択される少なくとも１つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３７】
適切には、ステップ（ii）は、前記パネルから選択される少なくとも２つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３８】
適切には、ステップ（ii）は、前記パネルから選択される少なくとも４つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。
【００３９】
適切には、前記パネルからの少なくとも１つのさらなるマーカーの濃度のアッセイが、実行される。
【００４０】
適切には、急性脳外傷は、脳卒中である。
【００４１】
適切には、試料は、脳微小透析体液、脳脊髄液、又は血液である。
【００４２】
最も適切には、試料は、血液である。
【００４３】
適切には、ステップ（ｉ）は、前記対象由来の試料におけるＰＲＤＸ１の濃度をアッセイすることを含む。
【００４４】
適切には、タンパク質は、ウエスタンブロッティングによって検出される。
【００４５】
適切には、タンパク質は、ビーズサスペンションアレイ又は平面アレイによって検出される。
【００４６】
適切には、タンパク質は、アイソバリックタンパク質タギング（isobaric protein tagging）又は同位体タンパク質タギング（isotopic protein tagging）によって検出される。
【００４７】
適切には、タンパク質は、質量分析計ベースのアッセイによって検出される。
【００４８】
他の態様では、本発明は、第１及び第２のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、急性脳損傷に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、第１のポリペプチドが、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１から選択され、第２のポリペプチドが、パネルＡから選択される使用に関する。
【００４９】
他の態様では、本発明は、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、脳卒中に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、ポリペプチドが、パネル２から選択される使用に関する。
【００５０】
他の態様では、本発明は、それぞれ、１つ又は２つ以上の前記ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性をそれぞれが有する物質の組み合わせの、上記に記載の使用に関する。
【００５１】
他の態様では、本発明は、物質又はそれぞれの物質が、抗体又は抗体チップである、上記に記載の使用に関する。
【００５２】
他の態様では、本発明は、物質が、１つ又は２つ以上の前記ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントに対して特異性を有する抗体である、上記に記載の使用に関する。
【００５３】
他の態様では、本発明は、急性脳損傷の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、第１及び第２のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、第１のポリペプチドが、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１から選択され、第２のポリペプチドが、パネルＡから選択されるアッセイデバイスに関する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、脳卒中の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する、位置を有する固体基質を含み、ポリペプチドが、パネル２から選択されるアッセイデバイスに関する。
【００５５】
上記に記載のアッセイデバイスにおいて、適切には、物質は、抗体又は抗体チップである。
【００５６】
適切には、アッセイデバイスは、それぞれの抗体について固有のアドレス指定可能な位置を有し、それによって、それぞれの個々のポリペプチド又はポリペプチドの任意の組み合わせについてアッセイの読み取りを可能にする。
【００５７】
他の態様では、本発明は、脳卒中の診断において使用するためのキットであって、上記に記載のアッセイデバイス、及び対象から採取される体液の試料における１又は２以上のポリペプチドの量を検出するための手段を含むキットに関する。
【００５８】
より適切には、ポリペプチドは、ペルオキシレドキシンである。より適切には、ポリペプチドは、ＰＲＤＸ１である。
【００５９】
他の態様では、本発明は、対象における急性脳損傷の診断又は予後モニタリングの方法であって、
（ａ）個体由来の適切な組織試料からタンパク質を得、抽出するステップと、
（ｂ）前記タンパク質を消化してペプチドの集団を産生するステップと、
（ｃ）表１５において列挙される１又は２以上のトランジションの選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring）を使用して、表１４において列挙される１又は２以上の前記ペプチドの存在量を決定するステップと、
（ｄ）前記１又は２以上のペプチドの存在量を、急性脳損傷の診断に関連する、あらかじめ決定されたペプチドの存在量と比較するステップと、
（ｅ）前記１又は２以上のペプチドの存在量の差異に基づいて、対象が急性脳損傷を患っているかどうか及び／又は急性脳損傷が悪化している若しくは改善していることを決定するステップと
を含む方法に関する。
【００６０】
適切には、あらかじめ決定されたペプチドの存在量は、表１４から選択される対応する合成ペプチドの既知の量を使用して決定される。
【００６１】
他の態様では、本発明は、表１４において列挙される群から選択される１又は２以上の合成ペプチドを含む、急性脳損傷の診断又は急性脳損傷を有する対象の予後モニタリングを行うための調製物に関する。
【００６２】
適切には、前記１又は２以上の合成ペプチドは、
GSTP1   TFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLLSAYVGR
MPPYTVVYFPVR
DDYVK
DQQEAALVDMVNDGVEDLR
FQDGDLTLYQSNTILR
ASCLYGQLPK
AFLASPEYVNLPINGNGK
MLLADQGQSWK
LSARPK
TLGLYGK
EEVVTVETWQEGSLK
ALPGQLKPFETLLSQNQGGK
YISLIYTNYEAGK
PRDX1   HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVQK
QGGLGPMNIPLVSDPK
ADEGISFR
DISLSDYK
LVQAFQFTDK
IGHPAPNFK
LNCQVIGASVDSHFCHLAWVNTPK
YVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDR
MSSGNAK
TIAQDYGVLK
ATAVMPDGQFK
PRDX6   GMPVTAR
MPGGLLLGDVAPNFEANTTVGR
DFTPVCTTELGR
VVFVFGPDK
LIALSIDSVEDHLAWSK
ELAILLGMLDPAEK
LSILYPATTGR
VATPVDWK
NFDEILR
LPFPIIDDR
VVISLQLTAEK
DINAYNCEEPTEK
LAPEFAK
DGDSVMVLPTIPEEEAK
FHDFLGDSWGILFSHPR
DDAH1   ALPESLGQHALR
DENATLDGGDVLFTGR
DYAVSTVPVADGLHLK
GAEILADTFK
GEEVDVAR
QHQLYVGVLGSK
TPEEYPESAK
CYTB    HDELTYF
SQVVAGTNYFIK
VFQSLPHENKPLTLSNYQTNK
VHVGDEDFVHLR
ACBP    MSQAEFEK
AAEEVR
QATVGDINTERPGMLDFTGK
TKPSDEEMLFIYGHYK
WDAWNELK
MWGDLWLLPPASANPGTGTEAEFEK
MPAFAEFEK 
CSRP1   GFGFGQGAGALVHSE
GLESTTLADK
GYGYGQGAGTLSTDK
MT3     GGEAAEAEAEK
MDPETCPCPSGGSCTCADSCK
SCCSCCPAECEK
PEPB1   GNDISSGTVLSDYVGSGPPK
LYEQLSGK
LYTLVLTDPDAPSR
NRPTSISWDGLDSGK
VLTPTQVK
YVWLVYEQDRPLK
から選択される。
【００６３】
他の態様では、本発明は、それぞれのペプチドが、水素、炭素、酸素、窒素、又は硫黄から選択される１又は２以上の安定した重同位体を含有する、上記に記載の調製物に関する。
【００６４】
他の態様では、本発明は、前記合成ペプチドが、同位体タグ（isotopic tag）又はアイソバリックタグ（isobaric tag）により標識される、上記に記載の調製物に関する。
【００６５】
他の態様では、本発明は、急性脳損傷の診断又は予後モニタリングのための、上記に記載の調製物に関する。
【００６６】
他の態様では、本発明は、急性脳損傷が、虚血性脳卒中又は一過性脳虚血発作である、上記に記載の調製物に関する。
【００６７】
他の態様では、本発明は、対象における脳卒中の診断を補助するための方法であって、
（ｉ）前記対象由来の試料における、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ６、及びＧＳＴＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、
（ii）（ｉ）の濃度を、標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、
（iii）前記試料におけるポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が、１．３を超えると脳卒中が前記対象において生じている可能性の増加を示す方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本明細書において説明されるある方法ステップは、方法の他の必要条件に加えて、１又は２以上の「さらなるポリペプチド（複数可）」のアッセイを必要とする。さらなるポリペプチドは、既にアッセイされることが必要とされている１又は２以上のポリペプチドとは異なるポリペプチドである。本明細書において示されるポリペプチドの群のうちのいくつかが、本明細書において示される他の群に共通のメンバーを含有するので、これは重要である。明確に、「さらなるポリペプチド」についての言及は、方法の初期の部分によってアッセイされる又は既にアッセイされているあらゆるポリペプチドに加えて、追加のポリペプチドのアッセイを課することが意図される。したがって、方法が、Ａ／Ｂ／Ｃのうちの１つがアッセイされることを必要とし、Ａ／Ｂ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇから選択されるさらなるポリペプチドについてのアッセイを必要とする場合、次いで、単に、Ａを２回又はＢを２回アッセイすることは、本明細書において説明される「さらなる」ポリペプチドをアッセイすることを構成せず、Ａ、次いでＢをアッセイすることは、さらなるポリペプチドについてのアッセイを構成し、Ａ、次いでＤをアッセイすることは、さらなるポリペプチドについてのアッセイを構成するなどとなる。したがって、適切には、さらなるポリペプチドは、追加のポリペプチドであり、適切には、さらなるポリペプチドは、同じ方法においてアッセイされる他のそれぞれのポリペプチドとは異なる。
【００６９】
急性脳損傷は、脳に対する任意の急な発病の傷害又は外傷を包含する。急性脳損傷は、外傷性脳障害を含んでいてもよい。急性脳損傷は、虚血発作などの脳卒中から結果として生じる影響を含んでいてもよい。急性脳損傷は、任意の他の急性脳外傷を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、急性脳外傷は、脳卒中であり、最も好ましくは虚血発作である。
【００７０】
試料は、試験されることとなる対象由来の任意の適した生物学的試料であってもよい。試料は、脳の微小透析から集められた微小透析体液であってもよい。これは、可能性のある外傷の部位に最も密接に関連するという利点を有する。
【００７１】
試料は、脳脊髄液であってもよい。これは、微小透析液よりも容易に採取されるという利点を有する。これは、そのため、患者及び採取を実行する熟練したオペレーターに対してそれほど大変ではない。
【００７２】
試料は、血液であってもよい。これは、最小限に侵襲性の様式で容易に採取されるという利点を有する。血液の採取は、通常の一般に入手可能な設備及び採取を実行する医療従事者のわずかな訓練を必要とする。
【００７３】
試料は、きれいにされた血液（cleared blood）（つまり血漿又はきれいにされた血漿（cleared plasma））であってもよく、赤血球及び白血球は、例えば遠心分離によって除去されている。これらには、試料を安定させ、それを保存する若しくは扱うのをより容易にする又はさらに分析する／アッセイするのを容易にするという利点がある。
【００７４】
適切には、記載される方法（複数可）は、対象由来の試料の採取の実際のステップを含まない。適切には、試料採取のステップは、本発明の方法から省かれる。適切には、試料は、あらかじめ採取される。適切には、方法は、インビトロの方法である。適切には、方法は、試料があらかじめ採取された対象の物理的な存在を必要としない。適切には、試料は、インビトロの試料である。
【００７５】
血漿は、比較的容易に得ることができ、脳を含む他の器官のサブプロテオームを反映してもよい。候補タンパク質パネル及びゲルベースのプロテオミクスの両方は、可能性のあるバイオマーカーを同定するために血漿及び血清において以前に使用され、いくらか成功してきた。
【００７６】
質量分析を用いる血漿のプロテオミクス分析に関する課題のうちの１つは、血漿タンパク質の莫大なダイナミックレンジ（dynamic range）である。タンパク質レベルは、並はずれた１０桁に及び、これは、（より）少量のタンパク質の調査をほとんど不可能にする（Anderson and Anderson, 2002, Jacobs et al., 2005）。短期間で最も目立つピークが断片化のために選ばれるＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける機器の設定は、血清アルブミン及び他のタンパク質の高度な存在量により、未分画血漿における少量タンパク質の同定及び定量化を可能にしない。これは、少数の同定されるタンパク質において影響を及ぼされる。ダイナミックレンジを低下させるための１つのアプローチは、最も多量のタンパク質の試料を除去することであり、この場合、本発明者らは、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アンチトリプシン、及びハプトグロビンを除去するために免疫親和性カラムを使用するこのアプローチを例示する。同定可能で定量化できるタンパク質の数は、かなり増加させることができ、相対的タンパク質レベルを、異なる試料の間で比較した。
【００７７】
ある種のアッセイ形式については、本発明による試料は、処理された血漿であってもよい。これは、試料が質量分析によって分析されることになっている場合、好都合である。例えば、血漿は、非常に多量のタンパク質を除去し、それによって、検出可能なタンパク質の数を増加させるために又は低度の絶対的濃度で存在するタンパク質の検出性を増加させるために処理することができる。血漿由来の非常に多量のタンパク質の除去のための技術は、当技術分野においてよく知られている。特に、マルチプル親和性除去システム（multiple affinity removal system）は、分析のために血漿を処理するために好都合に使用することができる。
【００７８】
さらに、試料は、適切には、濃縮血漿タンパク質などの血漿タンパク質を含んでいてもよい。本実施形態では、血漿は、本明細書において記載されるように処理してもよく、次いで、前記血漿由来のタンパク質を含む試料に至るために、サイズ排除クロマトグラフィー、バッファー交換、又は他のそのような処理にかけてもよく、これは、分析機器における優れた性能などの利点を提供することができる。
【００７９】
さらに、脳卒中などの急性脳外傷に関連することが本明細書において教示されるバイオマーカーの多くが、実存の対象由来の血液からの検出又はモニタリングに初めて適用可能であることは、試料が血液又は血液産物である場合に、本発明の実施形態の特定の利点となり、既知の技術は、多くの場合、死亡した対象由来の脳脊髄液のアッセイに依存し、そのため、本明細書において教示されるように、生きている対象における診断を補助するための開示に以前に達していなかった。
【００８０】
標準試料
標準試料は、典型的に、健康な個体、つまり、急性脳損傷、脳血管発作、又は関連する外傷を患っていない個体由来の試料を指す。
【００８１】
標準試料は、並行して分析される実際の試料とすることができる。その代わりに、標準試料は、比較試料、例えば健康な対象由来の試料から以前に導き出された１又は２以上の値とすることができる。そのような実施形態では、単なる数の比較は、対象由来の試料について決定された値を、あらかじめ分析された参照試料の数値と比較することによって行うことができる。この利点は、対象由来の試料が分析されるごとに、並行して、個々の参照試料における濃度を決定することによって分析を再現する必要がないことである。
【００８２】
適切には、標準試料は、例えば性別が、例えば年齢が、例えば民族的背景が、又は当技術分野においてよく知られている他の基準が、分析されている対象に一致する。標準試料は、１又は２以上の従来の研究によって得られた絶対的な濃度などの数であってもよい。
【００８３】
標準試料は、適切には、特定の患者サブグループ、例えば高齢の対象又は脳卒中に対する素因などの以前の関連する履歴を有する対象又は人生において以前に１若しくは２以上の脳卒中を経験した対象に一致してもよい。
【００８４】
適切には、標準試料は、分析されている試料タイプに一致する。例えば、アッセイされているバイオマーカーポリペプチド（複数可）の濃度は、試料のタイプ又は性質に依存して変化してもよい。標準試料についての濃度値（複数可）が、本発明の方法（複数可）において試験されている試料と同じ又は同等の試料についてのものであるはずであることは、当業者に直ちに明らかになるであろう。例えば、アッセイされている試料が血液である場合、標準試料値は、それが、意味のある相互比較が可能である、そのため計算されている意味のある量比であることを確実にするために、血液についてのものであるはずである。特に、試料の性質が２つの間で同一でない、所望の対象について決定される濃度及び標準試料について決定される濃度の間の比較によって推論が試みられる場合、細心の注意が払われなければならない。適切には、標準試料についての試料タイプ及び所望の対象についての試料タイプは、同じである。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態については、決定されるポリペプチド濃度が、同じ対象由来の以前の試料と比較できることに注目されたい。これは、対象における脳損傷の進行をモニターするのに有益になり得る。これは、対象の治療の経過及び／又は効力のモニターにおいて有益になり得る。本実施形態では、方法は、所望の試料について決定される量比を、同じ対象について異なる時点で採取される試料などの異なる試料由来の同じポリペプチドについて決定される１又は２以上の量比と比較するさらなるステップ（複数可）を含んでいてもよい。そのような比較を行うことによって、情報は、特定のポリペプチドマーカーが特定の対象において増加している又は減少しているかどうかに関して集めることができる。この情報は、ある期間にわたる変化又は特定の治療若しくは治療方式によって阻害される若しくは刺激される変化又は所望の任意の他の変化するものを診断する又は予測するのに有用であり得る。したがって、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において上昇する又はさらに上昇する場合、次いで、これは、前記対象において進行する又は悪化する脳損傷の可能性を示す。同様に、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において減少する場合、これは、前記対象における急性脳損傷の改善又は緩和の可能性を示す。明確に、これらの効果が、脳損傷のための治療を受けている対象において観察される場合、治療の効力に関する対応する推論は、本発明によって同様に得ることができる。言いかえれば、対象が治療を受けている場合、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において減少する場合、これは、治療が有効である可能性を示し、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において上昇する又はさらに上昇する場合、これは、治療が効果的でない可能性を示す。
【００８６】
このように、本発明は、例えば、薬剤若しくは候補の薬剤を用いる患者の治療後に疾患が進行したかどうか又は疾患進行の速度が修正された（modified）ことを決定するために使用することができる。結果は、疾患の結果についての予後判断を導くことができる。
【００８７】
組み合わせ
本発明は、よりロバストな診断又は予後判断を提供するためにバイオマーカーのパネルの一部として適用することができる。さらに、本発明は、所与の患者についての疾患状態のより完全な像又は可能性のある結果を提供するためにバイオマーカーのパネルの一部として適用することができる。
【００８８】
もちろん、当業者は、本発明の特定のバイオマーカーを、当技術分野において知られている他のマーカーと好都合にも組み合わせてもよいことを十分に理解するであろう。本明細書において説明される特定のバイオマーカー又はバイオマーカーのパネルを含むそのような拡張された群は、もちろん、本発明によって包含されるように意図される。そのような一実施形態において試験するためのさらに知られているマーカーの選択は、適切な供給源によって当業者によって達成することができる。この状況では、さらなるバイオマーカーは、脳卒中に、脳卒中の特異な診断が必要とされる他の急性脳損傷障害に、又は脳卒中を有する患者若しくは患者の症状が脳卒中の症状を模倣する患者と一般に関連する他の疾患に関連してもよい。
【００８９】
適切には、前記対象は、ヒトである。
【００９０】
適切には、前記対象は、非ヒト哺乳動物である。
【００９１】
適切には、前記対象は、げっ歯動物である。
【００９２】
位置情報
本発明のマーカーポリペプチドは、脳外傷（brain injury）又は傷害(insult)の部位のそれらの近くに直接関連する微小透析体液における濃度の勾配を示すことができる。本発明のいくつかの実施形態については、決定されるポリペプチド濃度が、脳の異なる領域と比較できることに注目されたい。特に、傷害又は外傷の部位のすぐ付近の脳領域におけるポリペプチド濃度は、同じ脳の脳半球内のより遠位の領域と及び／又は無影響の対側脳半球と比較することができる。
【００９３】
より適切には、脳外傷のタイプが虚血性脳卒中である場合、付近の領域は、梗塞中心部であり、同じ脳半球内のより離れた領域は、ペナンブラである。
【００９４】
検出
マーカータンパク質は、その発現を変え得る、つまり、脳卒中などの急性脳損傷を有する患者において量的に増加し得る又は減少し得る。発現が正常対罹患状態において異なる程度は、２Ｄ電気泳動ゲルの銀染色、アイソバリック質量タギング（isobaric mass tagging）及び質量分析を使用する代表的なペプチドイオンの測定、又はウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）、若しくはラジオイムノアッセイを含む免疫学的検出方法などの標準的な特徴づけの技術を介して視覚化するのに十分に大きい必要があるのみである。発現差異が視覚化され得る他の標準的な解析技術は、当業者らによく知られている。これらは、画分の連続的クロマトグラフィー分離及びピークの比較、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ上でのものを含むマイクロチャネルネットワークを使用する分離、並びに多重反応モニタリング（ＭＲＭ，multiple reaction monitoring）及びTMTcalibratorを含む質量分析法を含む（Dayon et al 2009）。
【００９５】
タンパク質レベルが変わる程度は、典型的に、脳損傷の部位からの距離と逆比例の関係で変化する。脳微小透析液の場合には、見られる変化は、比較的大きくなり、また、典型的に、２を超える比は、発現における疾患関連性の変化を示す。脳脊髄液及び／又は血漿などのより遠位の部位では、変化（検出されるタンパク質の濃度における変化）の程度は、脳微小透析液よりも低くてもよいが、なお、診断又は予後的に有用な情報を提供する。そのような物質（例えば脳脊髄液及び／又は血漿）において、典型的に、１．３を超える比は、脳損傷を表すと考えられる。
【００９６】
クロマトグラフィー分離は、Pharmacia社の文献において記載されるように、高速液体クロマトグラフィーによって実行することができ、クロマトグラムは、分離の時間に対する２８０ｎｍでの光の吸光度のプロットの形態で得られる。次いで、不完全に分離したピークを生ずる物質に、再度クロマトグラフィーなどを行う。
【００９７】
キャピラリー電気泳動は、多くの刊行物において、例えば、それらのP/ACE 5000 systemと共にBeckman社によって提供される文献「Total CE Solutions」において記載される技術である。この技術は、小さなキャピラリーチューブ中に含有される試料の両端に電位をかけることに依存する。チューブは、負荷電ケイ酸塩ガラスなどの荷電表面を有する。逆に荷電したイオン（この場合、陽イオン）は、表面に引きつけられ、次いで、表面と同じ極性の適切な電極（この場合、陰極）に移動する。試料のこの電気浸透流（ＥＯＦ，electroosmotic flow）において、陽イオンは、最も速く動き、これに、無電荷物質及び負荷電イオンが続く。したがって、タンパク質は、本質的にそれらに対する電荷によって分離される。
【００９８】
マイクロチャネルネットワークは、いくぶん、キャピラリーのように機能し、ポリマー物質の光剥離によって形成することができる。この技術において、ＵＶレーザーは、適したＵＶ吸収特性を有するポリマー、例えばポリエチレンテレフタレート又はポリカーボネート上への射撃において放たれる高エネルギー光パルスを生成するために使用される。入射光子は、制限された空間を有する化学結合を壊し、内圧の上昇、小さな爆発、及び剥離した物質の放出を導き、マイクロチャネルを形成する空隙を通り過ぎる。マイクロチャネル物質は、キャピラリー電気泳動と同様にＥＯＦに基づいて分離を達成する。それは、それぞれのチップがそれ自体の試料インジェクター、分離カラム、及び電気化学的検出器を有するマイクロチップ形態に適応可能である。J.S.Rossier et al., 1999, Electrophoresis 20: pages 727-731を参照されたい。
【００９９】
他の方法は、マーカータンパク質について結合アッセイを実行することを含む。任意の適度に特異的な結合剤を使用することができる。好ましくは、結合剤は、標識される。好ましくは、アッセイは、とりわけバイオマーカー及びタンパク質を認識する抗体、とりわけ標識抗体の間のイムノアッセイである。それは、マーカータンパク質の一部又はすべてに対して産生される抗体、例えば、マーカータンパク質に対して高度な特異性のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清とすることができる。
【０１００】
結合アッセイがイムノアッセイである場合、それは、タンパク質／抗体相互作用の程度を測定することによって実行することができる。イムノアッセイの任意の知られている方法を使用することができる。サンドイッチアッセイは、好ましい。例示的なサンドイッチアッセイにおいて、マーカータンパク質に対する第１の抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相に結合し、試料及びアッセイされることとなるタンパク質に特異的な標識二次抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体捕捉アッセイを使用することができる。ここで、被検試料は、固相に結合し、次いで、抗マーカータンパク質抗体を添加し、結合させる。非結合物質を洗浄した後に、固相に結合した抗体の量は、第１の抗体に対する標識二次抗体を使用して決定される。
【０１０１】
他の実施形態では、競合アッセイは、試料及び標識マーカータンパク質又はそれから誘導されるペプチドの間で実行され、２つの抗原は、固体支持体に結合した、限られた量の抗マーカータンパク質抗体について競合する。標識マーカータンパク質又はそのペプチドは、固相上の抗体と共にあらかじめインキュベートすることができ、それによって、試料中のマーカータンパク質は、抗体に結合したマーカータンパク質又はそのペプチドの一部に取って代わる。
【０１０２】
他の実施形態では、２つの抗原を、抗体との単一の同時インキュベーションにおいて競合させる。洗浄による支持体からの非結合抗原の除去後に、支持体に付加された標識の量が決定され、試料中のタンパク質の量は、あらかじめ確立された標準滴定曲線に対する参照によって測定される。
【０１０３】
結合アッセイ中の結合剤は、抗体又は他の特異的結合剤であってもよい標識された特異的な結合剤であってもよい。結合剤は、通常、それ自体標識されるが、その代わりに、それは、シグナルが例えば他の標識物質から生成される二次反応によって検出することができる。
【０１０４】
標識は、酵素であってもよい。酵素に対する基質は、例えば発色、蛍光、又は化学発光基質であってもよい。
【０１０５】
アッセイの増幅形態を使用することができ、それによって、増強された「シグナル」は、比較的低レベルの検出されることとなるタンパク質から産生される。増幅イムノアッセイの１つの特定の形態は、増強化学発光アッセイである。好都合に、抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより標識され、これは、ルミノール、ペルオキシド基質、並びに放射された光の強度及び持続時間を増強する化合物、典型的に４−ヨードフェノール又は４−ヒドロキシケイ皮酸との化学発光反応に関与する。
【０１０６】
増幅イムノアッセイの他の形態は、イムノＰＣＲである。この技術において、抗体は、ＰＣＲプライマーを含む任意のＤＮＡの分子に共有結合し、それによって、それに付加された抗体を有するＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995)を参照されたい。シグナルは、従来どおり読み取られる。
【０１０７】
アッセイに必要とされる時間は、M. Robers et al., "Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial infarction", Clin. Chem. 1998;44:1564-1567によって具体化されるタイプなどの急速微粒子増強比濁イムノアッセイの使用によって低下させてもよい。
【０１０８】
M.Robers et al.  前掲によって記載されるHoffmann-La Roche社からのCOBAS（商標）MIRA Plus system又はAbbott Laboratories社からのAxSYM(商標） systemなどの広く使用される臨床化学分析器において企図される任意のイムノアッセイの完全なオートメーションは可能であり、ルーチン的な臨床診断のために適用されるはずである。
【０１０９】
（ｉ）その抗体と相互作用する１又は２以上のタンパク質を検出することができる抗体アレイ若しくは「チップ」又はビーズサスペンションアレイを使用することもまた、本発明の範囲内で企図される。
【０１１０】
抗体チップ、抗体アレイ、又は抗体マイクロアレイは、連続的な固体表面上の固有のアドレス指定可能なエレメントのアレイであり、それによって、それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントで、抗原に対する定められた特異性を有する抗体は、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で固定される。それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントは、特異的な抗原の結合及び検出が、あらゆる付近のそのような固有のアドレス指定可能なエレメントに干渉しないように、固体表面上で、他のすべての固有のアドレス指定可能なエレメントから間を置いて配置される。
【０１１１】
「ビーズサスペンションアレイ」は、１又は２以上の同定可能な別個の粒子の水性懸濁液であり、それによって、それぞれの粒子は、そのサイズ及び色又は蛍光特性に関連するコーディング特徴を含有し、これに対して、そのようなコーディング特徴の特定の組み合わせのビーズはすべて、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で、抗原に対する定められた特異性を有する抗体によりコーティングされる。そのようなアレイの例は、Luminex（登録商標）100（商標）Systemに対するxMAP（登録商標）ビーズサスペンションアレイの適用が記載されているwww.luminexcorp.comで見出すことができる。
【０１１２】
その代わりに、診断試料は、本明細書において記載されるようにアイソバリック質量タギング及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけることができる。アイソバリックタンパク質タギングを実行するための好ましい方法の例は、本出願の実施例の部において説明される。
【０１１３】
タンデム質量タグを使用するアイソバリックタンパク質タギングは、非常に正確な様式で相対的タンパク質レベルを決定することができることが以前に示された（Thompson, A., Schafer, J., Kuhn, K., Kienle, S., Schwarz, J., Schmidt, G., Neumann, T., and Hamon, C. (2003) Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, 1895-1904、Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931）。さらに、様々な組織及び体液におけるタンパク質タギングにｉＴＲＡＱを使用する多数の報告が、過去数年間に公開されてきた（Aggarwal et al., 2006）。とりわけ、様々な状態におけるバイオマーカーの発見については、ｉＴＲＡＱは、非常に適したツールであることが証明され、癌（Maurya et al., 2007, Garbis et al., 2008, Matta et al., 2008, Ralhan et al., 2008）及び糖尿病研究（Lu et al., 2008）において並びにＣＳＦ中にもかかわらず神経変性障害におけるバイオマーカーについての探究（Abdi et al., 2006）において使用されてきた。
【０１１４】
多重選択反応モニタリング（ＳＲＭ又はＭＲＭ）
ＭＲＭ／ＳＲＭは、最も高度なデューティサイクル（duty cycle）を有するスキャンタイプであり、高感度で１又は２以上の特異的なイオントランジションをモニターするために使用される。ここで、Ｑ１は、特定の親ｍ／ｚに対して設定され（Ｑ１はスキャンしていない）、衝突エネルギーは、その親イオンの最適な診断上の荷電断片をもたらすように設定され、Ｑ３は、その断片の特定のｍ／ｚに対して設定される。この正確なトランジションを有するイオンのみが、検出されることになる。薬剤代謝物質などの小分子を定量化するために歴史的に使用されるように、同じ原理は、ペプチド、内因性成分又はタンパク質の酵素消化から産生されるものに対して適用することができる。さらに、歴史的に、実験は、三連四重極質量分析計を使用して実行されたが、イオントラップと四重極を組み合わせるハイブリッド機器設計の最近の導入は、同様の改善された実験が試みられるのを可能にする。そのため、4000QTRAP機器は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して非常に高度な特異性及び感度でペプチド及び生体分子定量化が実行されるのを可能にする。これは、ほとんど、複雑な混合物において多くの特異的なイオン（１００までの異なるイオン）の存在を検出するために、続いて多くのＭＲＭスキャンをともに束ねて１つの実験にすることができるLINAC（登録商標）Collision Cellの使用によるものである。したがって、単一のクロマトグラフィー分離において多くのタンパク質から多数のペプチドを測定し、定量化することは現在、実現可能である。ＭＲＭ  ＬＣピーク下の面積は、存在する分析物の量を定量するために使用される。典型的な定量化実験において、標準濃度曲線は、所望の分析物について生成される。次いで、未知の試料が同一の条件下で流されると、未知の試料中の分析物についての濃度は、ピーク面積及び標準濃度曲線を使用して決定することができる。
【０１１５】
診断試料は、イオントラップ質量分析計上のＭＲＭによる分析にかけることができる。下記に記載されるマーカータンパク質の質量分析プロファイルに基づいて、好適なイオン化の特徴を有する、特定の既知の質量及びアミノ酸配列を有する単一のトリプシンペプチドが同定される。次いで、質量分析計は、特定の質量及び配列のペプチドについて特異的に調査し、それらの相対的シグナル強度を報告するようにプログラムされる。ＭＲＭを使用して、１回のＬＣ−ＭＳの実行において、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００までの異なるマーカータンパク質について調査することが可能である。診断試料中の本発明の特定のバイオマーカーのＭＲＭペプチドの強度は、疾患を有していない対象由来の試料中に見出されるものと比較され、診断又は予後判断が行われるのを可能にする。
【０１１６】
ＭＲＭアッセイは、マーカータンパク質のＭＲＭペプチドに対応する合成絶対的定量（ＡＱＵＡ，absolute quantification）ペプチドからなる内部標準試料の使用によって、より正確に量的にすることができ、１又は２以上の原子は、炭素１３又は窒素１５などの安定同位体と置換され、そのような置換により、ＡＱＵＡペプチドは、診断試料に由来するＭＲＭペプチドの天然の、より軽い形態に対して定められた質量差異を有する。したがって、天然のＭＲＭペプチド及びＡＱＵＡペプチドの相対的イオン強度を比較することによって、診断試料中の親タンパク質の真の濃度を決定することができる。そのような同位体希釈法による絶対的な定量化の一般的な方法は、Gerber, Scott A, et al. "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS" PNAS, June 10, 2003. Vol 100. No 12. p 6940-6945において提供されている。
【０１１７】
いくつかの場合には、ＳＲＭ実験において絶対的な定量化を提供するために同位体をドープした標準物質を使用することが望ましいが、上記に記載のＡＱＵＡアプローチを使用することは可能ではない。そのような場合、１対の同位体質量タグ、つまり、同一の化学構造を有するが、異なるレベルの同位体置換を有し、それぞれの固有の質量を生ずる２つのタグを使用することが可能である。５Ｄａだけ質量が異なるTandem Mass Tag（登録商標）（TMT（登録商標））の２つの形態を使用して、アッセイにおいてすべての標的ペプチドについての全般的な基準を形成するために、混合前に軽いタグで標準合成参照ＳＲＭペプチドを標識することが可能である。次いで、患者試料はそれぞれ、トリプシン消化にかけられ、結果として生じるペプチドは、重いＴＭＴタグにより標識される。次いで、ＴＭＴ標識参照ペプチドのアリコートは、試料に添加され、患者試料において測定されることとなる標的範囲に適切な、参照ペプチドの最終濃度を生ずる。次いで、スパイクされた試料は、標準的な同位体希釈ＳＲＭアッセイにかけられ、患者試料由来のＳＲＭペプチドの濃度は、軽い方の形態の既知濃度のイオン強度に対して重い形態のイオン強度を比較することによって、計算される。
【０１１８】
バイオマーカー候補として同定された調節ペプチドの相対的又は絶対的定量化のためのＭＳベースのアッセイの代替形態は、Proteome Sciences plc社によって開発されたTMTcalibrator法である。好適なＭＳ／ＭＳ反応を有する候補バイオマーカー（複数可）のトリプシン断片に相当する既知の量の合成ペプチドは、アイソバリック質量タグのTMT6セットの６つの試薬のうちの４つ（TMT6-128〜TMT6-131）により標識され、一定の比で混合される。これは、生理的濃度及び／又は疾患修飾濃度を反映するマルチポイント検量線が素速く設計され、構築されるのを可能にする。続いて、脳卒中などの急性脳外傷に罹患している又は罹患していることが疑われている患者から採取される診断試料は、TMT6-126により標識され、キャリブレーション混合物は、研究試料に添加される。個々のペプチドのＭＳ／ＭＳの間に、検量体ペプチドのTMT6レポーターイオンが産生され、検量線を確立するために使用される。次いで、研究試料中のペプチドの絶対量は、検量線に対してＴＭＴ６１２６イオン強度を読み取ることによって容易に導き出される。TMTcalibratorアッセイについてのさらなる情報は、Proteome Sciences社のウェブサイト（www.proteomics.com）から得ることができる。
【０１１９】
診断の好ましい方法は、マーカータンパク質についての結合アッセイを実行するステップを含む。任意の適度に特異的な結合パートナーを使用することができる。好ましくは、結合パートナーは、標識される。好ましくは、アッセイは、とりわけマーカー及びタンパク質を認識する抗体、とりわけ標識抗体の間のイムノアッセイである。それは、その一部又はすべてに対して産生される抗体、最も好ましくは、マーカータンパク質に対して高度な特異性のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清とすることができる。
【０１２０】
したがって、上記に記載のマーカータンパク質は、診断試料中に存在するマーカータンパク質の濃度の増加又は減少を検出するために使用することができる、それに対する抗体を産生するのに有用である。そのような抗体は、免疫診断の分野においてよく知られている方法のうちのいずれかによって産生することができる。
【０１２１】
抗体は、タンパク質の任意の生物学的に関連する状態に対するものであってもよい。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で体内に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆物質タンパク質の、例えばそのシグナル配列がない、より成熟した形態に対して、又はマーカータンパク質の関連するエピトープを保持するペプチドに対して産生することができる。
【０１２２】
試料は、哺乳動物又は非哺乳動物対象の任意の有効な体組織、とりわけ体液から採取することができるが、好ましくは血液、血漿、血清、又は尿から採取することができる。他の使用可能な体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、及び涙液を含む。好ましくは、対象は、マウス、ラット、モルモット、イヌ、又は霊長動物などの哺乳動物種である。最も好ましくは、対象は、ヒトである。
【０１２３】
好ましいイムノアッセイは、タンパク質／抗体相互作用の程度を測定することによって実行される。イムノアッセイの任意の知られている方法を使用することができる。サンドイッチアッセイは、好ましい。この方法において、マーカータンパク質に対する第１の抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相に結合し、試料及びアッセイされることとなるタンパク質に特異的な標識二次抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体捕捉アッセイを使用することができる。ここで、被検試料は、固相に結合し、次いで、抗マーカータンパク質抗体を添加し、結合させる。非結合物質を洗浄した後に、固相に結合した抗体の量は、第１の抗体に対する標識二次抗体を使用して決定される。
【０１２４】
他の実施形態では、競合アッセイは、試料及び標識マーカータンパク質又はそれから誘導されるペプチドの間で実行され、２つの抗原は、固体支持体に結合した、限られた量の抗マーカータンパク質抗体について競合する。標識マーカータンパク質又はそのペプチドは、固相上の抗体と共にあらかじめインキュベートすることができ、それによって、試料中のマーカータンパク質は、抗体に結合したマーカータンパク質又はそのペプチドの一部に取って代わる。
【０１２５】
他の実施形態では、２つの抗原を、抗体との単一の同時インキュベーションにおいて競合させる。洗浄による支持体からの非結合抗原の除去後に、支持体に付加された標識の量が決定され、試料中のタンパク質の量は、あらかじめ確立された標準滴定曲線に対する参照によって測定される。
【０１２６】
標識は、好ましくは酵素である。酵素に対する基質は、例えば発色、蛍光、又は化学発光基質であってもよい。
【０１２７】
結合アッセイにおける結合パートナーは、好ましくは、標識された特異的な結合パートナーであるが、必ずしも抗体ではない。結合パートナーは、通常、それ自体標識されるが、その代わりに、それは、シグナルが例えば他の標識物質から生成される二次反応によって検出することができる。
【０１２８】
アッセイの増幅形態を使用することは非常に望ましく、それによって、増強された「シグナル」は、比較的低レベルの検出されることとなるタンパク質から産生される。増幅イムノアッセイの１つの特定の形態は、増強化学発光アッセイである。好都合に、抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより標識され、これは、ルミノール、ペルオキシド基質、並びに放射された光の強度及び持続時間を増強する化合物、典型的に４−ヨードフェノール又は４−ヒドロキシケイ皮酸との化学発光反応に関与する。
【０１２９】
M. Robers et al., "Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial infarction", Clin. Chem. 1998;44:1564-1567.によって具体化されるタイプなどの急速微粒子増強比濁イムノアッセイの使用は、アッセイの時間を著しく減少させる。したがって、M.Robers et al.  前掲によって記載されるHoffmann-La Roche社からのCOBAS（商標） MIRA Plus system又はAbbott Laboratories社からのAxSYM（商標） systemなどの広く使用される臨床化学分析器において企図される任意のイムノアッセイの完全なオートメーションは、可能であり、ルーチン的な臨床診断のために適用されるはずである。
【０１３０】
その代わりに、診断試料は、マーカータンパク質の位置が分かる、染色ゲルを得るための二次元ゲル電気泳動にかけることができ、ゲル上の適切なスポットでの染色の相対的強度は、濃度測定によって決定し、対応する対照又は比較ゲルと比較することができる。
【０１３１】
さらなる実施形態では、診断試料は、三連四重極質量分析計上の又はある種のタイプのイオントラップ質量分析計上の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）などの質量分析計ベースのアッセイによる分析にかけることができる。それぞれの差次的に発現するタンパク質について、特定の既知の質量（親の質量）及びアミノ酸配列を有し、断片化に際して、それぞれのタンパク質に特有の特定の質量（断片の質量）の断片を放出するトリプシンペプチドのセットを同定することが可能である。定められた親の質量イオンからの断片の質量の検出は、トランジションとして知られている。
【０１３２】
そのようなプロテオタイプペプチド（proteotypic peptide）の同定は、バイオマーカー発見の間に見られる、差次的に発現されるタンパク質の質量分析プロファイルに基づいて行うことができ、又は当業者に知られている予測アルゴリズムを使用して、インシリコにおいて設計することができる。次いで、質量分析計は、それぞれのタンパク質について選択される特定の親の質量及び断片の質量のトランジションについてのみ特に調査するようにプログラムされ、それらの相対的シグナル強度を報告する。ＭＲＭを使用して、１回のＬＣ−ＭＳの実行において、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００までの異なるマーカータンパク質について調査することが可能である。診断試料におけるそれぞれのマーカータンパク質についてのプロテオタイプペプチドの相対的存在量は、脳卒中などの急性脳外傷を有していない対象由来の試料中に見出されるものと比較され、診断が行われるのを可能にする。その代わりに、比較は、同じ患者由来の以前の試料からのタンパク質のレベルを用いて行われ、したがって、前記患者における脳卒中などの急性脳外傷の進行の段階及び／又は速度の予後のアセスメントを可能にしてもよい。
【０１３３】
本発明のさらなる実施形態では、ＭＲＭアッセイは、マーカータンパク質のプロテオタイプペプチドに対応する合成絶対的定量（ＡＱＵＡ）ペプチドからなる内部標準試料の使用によって、より正確に量的にすることができ、１又は２以上の原子は、炭素１３又は窒素１５などの安定同位体と置換され、そのような置換により、ＡＱＵＡペプチドは、診断試料に由来する天然のプロテオタイプペプチドに対して定められた質量差異を有する。一度、差次的に発現されるバイオマーカーからのそれぞれのプロテオタイプペプチドと等価なＡＱＵＡペプチドが産生されたら、それらは、患者試料のトリプシン消化物にその後スパイクされる標準試料を形成するように混合することができる。その後、組み合わせられた試料は、プログラムされた質量分析計ベースのアッセイにかけられ、天然及びＡＱＵＡペプチドからの所定のトランジションの強度が検出される。試料由来の天然ペプチド及びスパイクされたＡＱＵＡ参照ペプチドの相対的イオン強度を比較することによって、診断試料中の親タンパク質の真の濃度を決定することができる。絶対的定量化の一般的な方法は、参照によって本明細書において組み込まれるGerber, Scott A, et al. "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS" PNAS, June 10, 2003. Vol 100. No 12. p 6940-6945において提供されている。
【０１３４】
本発明のさらなる実施形態では、絶対的定量化は、ＴＭＴ−ＳＲＭアッセイを使用することによって行うことができる。マーカータンパク質のプロトタイプペプチドに対応する標準合成参照ＳＲＭペプチドは、アッセイにおけるすべてのマーカータンパク質についての全般的な基準を形成するために、混合前に、同位体置換を有していない軽いTMTタグ（軽いタグ）を用いて標識される。次いで、患者試料はそれぞれ、トリプシン消化にかけられ、結果として生じるペプチドは、５つの同位体置換を有するTMTタグ（重いタグ）を用いて標識される。次いで、軽いTMT標識基準ペプチドのアリコートは、重いTMT標識試料に添加され、患者試料において測定されることとなる標的範囲に適切な、参照ペプチドの最終濃度を生ずる。次いで、スパイクされた試料は、標準的な同位体希釈ＳＲＭアッセイにかけられ、患者試料由来のＳＲＭペプチドの濃度は、軽い方の形態の既知濃度のイオン強度に対して重い形態のイオン強度を比較することによって、計算される。
【０１３５】
本発明は、上記に指定されるマーカータンパク質を認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有するパートナー物質の診断（したがっておそらく予後判断）又は治療の目的での使用をさらに含む。したがって、例えば、必要な場合には適切にヒト化される、マーカータンパク質に対する抗体は、治療において使用することができる。パートナー物質は、通常、抗体であり、任意のアッセイ適合形式、好都合には、固定形式で、例えばビーズ又はチップとして使用される。パートナー物質が標識され、又はそれは標識と相互作用することができる。
【０１３６】
本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の診断及び予後モニタリングの方法における使用のためのキットであって、診断試料中に存在するマーカータンパク質との相互作用についての、上記に記載されている、アッセイ適合形式での、上記に記載のパートナー物質を含むキットをさらに含む。
【０１３７】
（ｉ）脳卒中などの急性脳外傷において差次的に発現される１又は２以上のタンパク質を検出することができる抗体チップ若しくはチップのアレイ又はビーズサスペンションアレイを使用することが、本発明の範囲内でさらに企図される。
【０１３８】
方法は、脳卒中などの急性脳外傷を治療するための有効な療法を決定することをさらに含んでいてもよい。
【０１３９】
さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の発症又は進行を予防するための、正常な状態において見出されるものに向けて、脳卒中状態などの急性脳外傷において１又は２以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を回復させる作用物質の使用による治療の方法を提供する。好ましくは、タンパク質の発現は、正常な状態まで回復する。
【０１４０】
さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷を有する個体の組織試料又は体液試料において差次的に発現するタンパク質のパターンが、脳卒中などの急性脳外傷を軽減するための最も適切で有効な療法を予測するために使用される方法を提供する。
【０１４１】
脳卒中などの急性脳外傷を治療する際のその有用性を決定するために作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）スクリーニングされている作用物質を用いて治療された、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象から採取される又はそれを代表する適切な組織の試料を得るステップと、
（ｂ）治療された対象由来の又はそれを代表する組織において差次的に発現するタンパク質（複数可）の存在、非存在、又は発現の程度を決定するステップと、
（ｃ）脳卒中症状などの急性脳外傷を有する、治療された対象において、差次的に発現するタンパク質（複数可）の発現、活性、又は量を変化させる程度によって作用物質を選択する又は拒否するステップと
を含む方法もまた提供される。
【０１４２】
好ましくは、それが差次的に発現するタンパク質の発現を正常な対象の発現に向けて変換する場合、作用物質が選択される。より好ましくは、それがタンパク質（複数可）の発現を正常な対象の発現に変換する場合、作用物質が選択される。
【０１４３】
脳卒中などの急性脳外傷を治療する際のその有用性を決定するために作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）スクリーニングされている作用物質を用いて治療された、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象から採取される又はそれを代表する適切な組織又は体液の試料をある期間にわたって得るステップと、
（ｂ）前記試料において差次的に発現するタンパク質（複数可）の存在、非存在、又は発現の程度を決定するステップと、
（ｃ）作用物質が、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する、治療された対象における発現が異なるタンパク質の発現におけるある期間にわたる変化に影響を与えるかどうかを決定するステップと
を含む方法もまた、提供される。
【０１４４】
ある期間にわたって採取される試料は、数週間、数か月間、又は数年間の間隔で採取することができる。例えば、試料は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、６か月ごと、８か月ごと、又は１２か月ごとの間隔で採取することができる。
【０１４５】
ある期間にわたる発現における変化は、対象由来の試料における発現の最初のレベル及び／又は正常な対象由来の試料における発現のレベルと比較した、発現の増加又は減少であってもよい。それがある期間にわたって発現の変化を遅らせる又は停止する場合、作用物質が選択される。
【０１４６】
上記に記載のスクリーニング方法において、特異なレベルのタンパク質発現を有する対象は、
（ａ）正常な対象及び脳卒中などの急性脳外傷を有する対象、並びに
（ｂ）作用物質を用いて治療されていない脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象及び作用物質を用いて治療されている脳卒中などの急性脳外傷を有する対象を含む。
【０１４７】
診断及び予後判断
本明細書において使用される用語「診断」は、患者における脳卒中などの急性脳外傷の存在、非存在、又は可能性に関するあらゆる情報の提供を含む。それは、それに関連して経験する又は経験する可能性がある障害又は症状のタイプ又は分類に関する情報提供をさらに含む。それは、状態の医学的経過の予後判断を包含する。それは、発病年齢に関する情報をさらに包含する。
【０１４８】
治療
治療が関係している場合には、治療が、患者に対する脳卒中などの急性脳外傷の影響を軽減するために医師によって取られるあらゆる手段を含むことが理解されるであろう。したがって、損傷の回復又は脳卒中などの急性脳外傷の損傷若しくは影響の排除が、望ましいゴールであるが、有効な治療はまた、損傷の程度又は影響の深刻さ又は進行における低下を達成することができるあらゆる手段を含む。
【０１４９】
一態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の発症又は進行を予防するための、正常な状態において見出されるものに向けて、脳卒中状態などの急性脳外傷において１又は２以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を回復させる作用物質の使用による治療の方法を提供する。好ましくは、タンパク質の発現は、正常な状態まで回復する。
【０１５０】
さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷を有する個体由来の試料において差次的に発現するタンパク質のパターンが、神経損傷を軽減するための最も適切で有効な療法を予測するために使用される方法を提供する。
【０１５１】
抗体
本明細書において開示されるマーカータンパク質に対する抗体は、知られている方法を使用して産生することができる。抗体を産生するためのこれらの方法は、タンパク質により哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はサル）を免疫することを含む。抗体は、当技術分野において知られている様々な技術のいずれかを使用して、免疫された動物から得ることができ、好ましくは所望の抗原に対する抗体の結合を使用してスクリーニングすることができる。動物からの抗体及び／又は抗体産生細胞の単離は、動物を屠殺するステップを伴ってもよい。
【０１５２】
タンパク質による哺乳動物の免疫の代わり又は補足として、タンパク質に特異的な抗体は、例えばそれらの表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して、発現免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから得ることができる。例えば国際公開第９２／０１０４７号パンフレットを参照されたい。ライブラリーは、ナイーブであってもよく、つまり、タンパク質により免疫していない生物から得られる配列から構築してもよく、又は所望の抗原に暴露された生物から得られる配列を使用して構築されるものであってもよい。
【０１５３】
抗体は、タンパク質の任意の生物学的に関連する状態に結合してもよく又はそれに対して産生してもよい。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で体内に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆物質タンパク質の、例えばそのシグナル配列がない、より成熟した形態に対して、又はマーカータンパク質の関連するエピトープを保持するペプチドに対して産生することができる。
【０１５４】
抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、多特異性（二特異性を含む）、キメラ、又はヒト化抗体であってもよい。本発明による抗体は、多くの方法において修飾することができる。実際、用語「抗体」は、所定の特異性を有する結合ドメインを有するあらゆる結合物質を包含するとして解釈されるべきである。したがって、本発明は、合成分子及び形状が、それが抗原又はエピトープに結合するのを可能にする抗体の形状を模倣する分子を含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物、及び相同体を包含する。
【０１５５】
抗原又は他の結合パートナーに結合することができる抗体断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃｌ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；単離ＣＤＲ領域、並びにヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片である。単鎖Ｆｖ断片も含まれる。
【０１５６】
特異的なエピトープを認識する抗体断片は、知られている技術によって生成することができる。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２断片及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。その代わりに、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の急速で容易な同定を可能にするために構築することができる（Huse, et al., 1989, Science 246: 1275-1281）。
【０１５７】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体を指す、つまり、集団を含む個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異は別として、同一である。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975によって最初に記載された方法によって産生することができ、又は組換え法によって作製することができる。Cabilly et al、米国特許第４，８１６，５６７号明細書又はMage and Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pages 79-97, Marcel Dekker Inc, New York, 1987を参照されたい。
【０１５８】
ハイブリドーマ方法において、マウス又は他の適切な宿主動物は、免疫に使用されるナノ粒子に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発するために、皮下、腹腔内、又は筋肉内経路によって抗原により免疫される。その代わりに、リンパ球は、インビトロで免疫することができる。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するためにポリエチレングリコールなどの適した融合剤を使用して、ミエローマ細胞と融合される。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)を参照されたい。
【０１５９】
したがって、調製されたハイブリドーマ細胞は、非融合親ミエローマ細胞の成長又は生存を阻害する、１又は２以上の物質を好ましくは含有する適した培地に接種し、それにおいて成長させることができる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を予防する。
【０１６０】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のものである。
【０１６１】
ハイブリドーマ細胞が成長中の培地は、タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、結合特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunoabsorbance assay）によって決定される。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質に特異的に結合するものである。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、例えばスキャチャード解析によって決定されるように、マイクロモル以上の親和性を超える親和性（つまり１０−６モルを超える親和性）を有する。Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220, 1980を参照されたい。
【０１６３】
所望の特異性及び親和性の中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンは、限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる。この目的に適した培地は、ダルベッコ変法イーグル培地又はＲＰＭ１−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。
【０１６４】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、通常の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
【０１６５】
本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野においてよく知られている手順を使用して、例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって容易に単離され、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、抗体又はその断片をコードする核酸の好ましい供給源である。一度単離されたら、核酸は、発現又はクローニングベクターにライゲーションされ、これらは、次いで、モノクローナル抗体が組換え体宿主細胞培養物において産生されるように、培養することができる宿主細胞にトランスフェクトされる。
【０１６６】
本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子突然変異又は他の変化を受けてもよい。モノクローナル抗体は、もとの抗体の特異性を保持する他の抗体、ヒト化抗体、又はキメラ分子を産生するために、組換えＤＮＡ技術の技術にかけることができることが当業者らによってさらに理解されるであろう。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域に導入することを含んでいてもよい。例えば欧州特許出願公開第０  １８４  １８７  Ａ号公報、英国特許出願公開第２  １８８  ６３８  Ａ号公報、又は欧州特許出願公開第０  ２３９  ４００  Ａ号公報を参照されたい。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第０  １２０  ６９４  Ａ号公報及び欧州特許出願公開第０  １２５  ０２３  Ａ号公報において記載されている。
【０１６７】
本明細書において記載されるマーカータンパク質に対する抗体は、前記タンパク質に結合する。好ましくは、前記抗体は、前記タンパク質に特異的に結合する。「特異的な」によって、抗体が、それが他の分子に対して示すよりも著しく高度な親和性により前記タンパク質に結合することを意味する。
【０１６８】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、単鎖及びＦａｂ断片などの抗体の断片、並びに遺伝子操作された抗体を含む。抗体は、キメラ又は単一の種のものであってもよい。
【０１６９】
用語「マーカータンパク質」又は「バイオマーカー」は、翻訳後修飾を含めて、同定されるタンパク質の生物学的に関連する形態をすべて含む。例えば、マーカータンパク質は、グリコシル化、リン酸化、多量体、前駆物質の形態で体組織中に存在することができる。
【０１７０】
用語「対照」は、正常なヒト対象、つまり、脳卒中などの急性脳外傷に罹患していない対象を指す。
【０１７１】
用語「対照試料と比較して増加した又は減少した濃度」は、多くの場合、濃度が異常に高度である又は低度であることは当業者にとって明らかであるので、比較するステップが実際に行われることを意味しない。さらに、脳卒中などの急性脳外傷の段階が連続的にモニターされている場合又は治療の経過がモニターされている場合、行われる比較は、疾患の進行の初期の段階で又は治療の初期の段階で若しくは治療を始める前に同じ対象において以前に見られた濃度とのものとすることができる。
【０１７２】
用語「有効な体組織」又は「適切な組織」は、脳卒中などの急性脳外傷に関連するマーカータンパク質が蓄積するであろうということが合理的に予想され得るあらゆる組織を意味する。それは、脳脊髄液試料又は血液又は血漿若しくは血清などの血液誘導体の試料であってもよい。
【０１７３】
用語「抗体アレイ」又は「抗体マイクロアレイ」は、連続的な固体表面上の固有のアドレス指定可能なエレメントのアレイを意味し、それによって、それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントで、抗原に対する定められた特異性を有する抗体は、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で固定される。それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントは、特異的な抗原の結合及び検出が、あらゆる付近のそのような固有のアドレス指定可能なエレメントに干渉しないように、固体表面上で、他のすべての固有のアドレス指定可能なエレメントから間を置いて配置される。
【０１７４】
用語「ビーズサスペンションアレイ」は、１又は２以上の同定可能な別個の粒子の水性懸濁液を意味し、それによって、それぞれの粒子は、そのサイズ及び色又は蛍光特性に関連するコーディング特徴を含有し、これに対して、そのようなコーディング特徴の特定の組み合わせのビーズはすべて、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で、抗原に対する定められた特異性を有する抗体によりコーティングされる。そのようなアレイの例は、Luminex（登録商標）100（商標）Systemに対するｘＭＡＰ（登録商標）ビーズサスペンションアレイの適用が記載されているwww.luminexcorp.comで見出すことができる。
【０１７５】
「質量分析アッセイ」は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ，selected reaction monitoring）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、同位体をドープしたペプチドを使用する絶対的定量化（ＡＱＵＡ）、ＳＲＭを用いるTandem Mass Tag（ＴＭＴＳＲＭ，Tandem Mass Tags with SRM）、及びTMTcalibratorを含むが、これらに限定されない、質量分析の任意の定量的方法を意味する。
【０１７６】
本発明のポリペプチドバイオマーカーなどのバイオマーカーの「ミュータント」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有する。ミュータントは、時に「バリアント」又は「対立遺伝子」と呼ばれる。重要なことは、本明細書において説明されているように、バイオマーカーを検出することである。バイオマーカーは、研究されている個体の間で突然変異又は対立遺伝子バリアントの形態の個体差を有していてもよい。そのため、本明細書において提供される例示的な配列番号からある程度の偏りがあってもよい。本明細書において提供される配列番号は、本発明のポリペプチド／バイオマーカーを同定し、扱う際に当業者を助けるためのものであり、アッセイされている個々のポリペプチドの制限された不変の定義として意図されない。したがって、提供される配列番号及び検出されているポリペプチドバイオマーカーの実際の配列の間のわずかな配列差異は、対象の間の正常な差の範囲内であることが予想されるであろう。これは、本発明の作業に影響を与えない。
【０１７７】
用語「含む（comprises）」（含む（comprise）、含む（comprising））は、当技術分野におけるその通常の意味を有する、つまり、明示される特徴又は特徴の群が含まれるが、用語が、いかなる他の明示される特徴又は特徴の群も、同様に存在することから除くわけではないことを理解されたい。
【０１７８】
断片／ペプチド
本明細書において説明されるバイオマーカーの詳細、特に、それらについて示される配列は、それらの検出を促進するために示されることが当業者によって十分に理解されるであろう。集められている重要な情報は、研究されている試料におけるバイオマーカーの存在若しくは非存在（又は特定のレベル）である。完全長ポリペプチドがスコア化されるという特定の条件はない。実際、本明細書において説明される検出の適した質量分析ベースのモードの多くを介して、検出は、したがって試料における全体的なバイオマーカーポリペプチドの存在を示すために使用される、存在する所望のポリペプチドの特定の断片をアッセイすることによって起こる。そのため、本発明は、ポリペプチドバイオマーカーの断片の検出を包含する。さらに、本発明のキット及びペプチドは、ポリペプチドの断片を含んでいてもよく、本明細書において例示される完全長配列を含む必要はない。適切には、断片は、質量分析によるその固有の同定を可能にするのに十分に長い。
【０１７９】
したがって、断片は、適切には、長さが少なくとも６のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも７のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも８のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも９のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも１０のアミノ酸、適切には、少なくとも１５のアミノ酸、適切には、少なくとも２５のアミノ酸、適切には、少なくとも５０のアミノ酸、適切には、少なくとも１００のアミノ酸、又は適切には、所望のバイオマーカーポリペプチドの大部分である。適切には、断片は、所望のバイオマーカーポリペプチドの小さな断片を含むが、同定可能な質量を保持するのに十分に長い。
【０１８０】
所定のポリペプチド又は質量分析ベースのアッセイによって検出されているポリペプチドのセットについて、アッセイは、本明細書において言及されるＭＲＭ技術を介して行われてもよい。本実施形態では、ある種の固有のペプチド、特にある種のトランジションは、所望のペプチドを検出するのにとりわけ好都合である。これらは、最高の表示を示すために典型的に選択される（又は多数の断片／トランジションが同様のレベルを示す場合、特定のレベルの表示を示す任意の又はすべてのペプチドなどの組み合わせを使用することができる）。モニタリングに使用されるとりわけ好ましいトランジションは、添付の実施例及び／又は図面において言及されるものである。
【０１８１】
配列相同性／同一性
配列相同性は、機能的な類似性（つまり、類似する化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から考慮することができるが、本明細書との関連において、配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。配列比較は、眼によって又はより通常では、容易に入手可能な配列比較プログラムの援助によって行うことができる。これらの公的に、また市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の間の相同性パーセント（同一性パーセントなど）を計算することができる。
【０１８２】
同一性パーセントは、連続する配列にわたり計算することができる、つまり、一方の配列は、他方の配列とアライメントされ、一方の配列におけるそれぞれのアミノ酸は、他方の配列における対応するアミノ酸と直接、同時に１つの残基が比較される。これは、「アンギャップ」アライメントと呼ばれる。典型的に、そのようなアンギャップアライメントは、比較的短い数の残基（例えば５０未満の連続するアミノ酸）にわたってのみ実行される。より長い配列にわたる比較については、ギャップスコアリングは、互いに関して、挿入（複数可）又は欠失（複数可）を有する関連する配列における同一性レベルを正確に反映するように最適なアライメントをもたらすために使用される。そのようなアライメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージである（University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例は、BLASTパッケージ、FASTA（Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）、及び比較ツールのGENEWORKSスーツを含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
本明細書との関連において、相同なアミノ酸配列は、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むように解釈される。最も適切には、所望のバイオマーカーに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドは、そのバイオマーカーが存在を示すものとして解釈される；より適切には、アミノ酸レベルで９５％又はより適切には９８％同一であるポリペプチドは、そのバイオマーカーの存在を示すように解釈される。適切には、前記比較は、少なくとも、所望のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するためにアッセイされているポリペプチド又は断片の長さにわたり行われる。最も適切には、その比較は、完全長の所望のポリペプチドにわたって行われる。同じ考慮は、核酸ヌクレオチド配列に当てはまる。
【０１８４】
代替方法
本明細書において例示される特定の技術は、所望される場合、同じ効果を達成するための容易に入手可能な代替案を使用して変化させることができることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、血液試料中のバイオマーカーレベルのアッセイは、ウエスタンブロットによって又はアイソバリックタンパク質タギングによって又はＥＬＩＳＡによって又は当技術分野において知られている任意の他の適した手段によって実行することができる。
【０１８５】
量比
脳卒中などの急性脳損傷を患っている対象において著しく減少する、本明細書において開示される多くのバイオマーカーがあることが十分に理解されるであろう。添付の実施例の部において説明されるように、これらは、科学的に同様に根拠がある。しかしながら、実際の問題として、分析されている試料中の特定のバイオマーカーの非存在又は減少を決定することは、より技術的に困難である。特に、検出における課題に対して減少した量のマーカーの純粋な検出を制御することは困難である。この理由で、本発明の好ましい実施形態では、使用されるバイオマーカーは、脳卒中などの急性脳損傷において上昇する又は増加するものである。これらは、所望のバイオマーカー（複数可）の陽性の同定が、診断を積極的に補助することができるという利点を有する。
【０１８６】
したがって、本明細書において決定される量比が、標準試料における濃度に対する、分析されている対象の試料における濃度の比を記載することに注目されたい。したがって、試料における濃度が標準試料における１．３倍の濃度である場合、１．３の比は、達成される。明確に、比は、他の様式で表現することができるが（例えば、反対の方法で）、一貫性のために、試料における濃度が、標準物質における濃度よりも３０％大きいことを１．３の比が意味するように、比は、試料：標準物質として本明細書において説明される。
【０１８７】
バイオマーカー
本発明の方法において１つを超えるバイオマーカーを使用することに利点がある。利点は、本発明の方法に対する特異性及び／又は感度の増加を含む。本発明者らは、本発明の方法（複数可）において特に好都合なバイオマーカーのパネルを示す。
【０１８８】
ＧＳＴＰ−１及びペルオキシレドキシン１＆６は、脳卒中の管理のための有用なマーカーを示す。上記に言及される理由で、本発明者らはまた、タンパク質のより大きなパネルをも示す。これらのパネルは、診断の感度及び／又は特異性を改善するなどの技術的な利点をさらに有する。
【０１８９】
開示されるある種のパネルはまた、予後情報を提供するという利点をも有する。したがって、本発明者らは、脳卒中及び心臓血管バイオマーカーに関連する文献の調査を実行し、５３のタンパク質すべてについてのパスウェイ解析（ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、対側脳微小透析液と比較して、梗塞部及びペナンブラにおいて差次的に発現されることが分かった。この包括的な生物情報学アプローチに従って、バイオマーカーの３つのグループ、パネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣが選択された。これらは、降順の優先度の順に下記に示される。
パネルＡ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＡＣＢＰ＿ＨＵＭＡＮ    アシルＣｏＡ結合タンパク質
Ｎ°２    ＣＳＲＰ１＿ＨＵＭＡＮ  システイングリシンリッチタンパク質１
Ｎ°３    ＰＥＢＰ１＿ＨＵＭＡＮ  ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質１
Ｎ°４    ＤＤＡＨ１＿ＨＵＭＡＮ  Ｎ（Ｇ），Ｎ（Ｇ）−ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ１
Ｎ°５    ＭＴ３＿ＨＵＭＡＮ      メタロチオネイン−３（ＭＴ−３）
Ｎ°６    ＣＹＴＢ＿ＨＵＭＡＮ    シスタチン−Ｂ
パネルＢ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＰＰＩＡ＿ＨＵＭＡＮ    ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ
Ｎ°２    ＮＦＭ＿ＨＵＭＡＮ      ニューロフィラメントミディアムポリペプチド（neurofilament medium polypeptide）
Ｎ°３    ＵＢＩＱ＿ＨＵＭＡＮ    ユビキチン
Ｎ°４    Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ    ベータ−２−ミクログロブリン前駆物質
Ｎ°５    ＣＹＴＣ＿ＨＵＭＡＮ    シスタチンＣ前駆物質（シスタチン−３）
Ｎ°６    ＳＨ３Ｌ１＿ＨＵＭＡＮ  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチ様タンパク質
Ｎ°７    ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ    トリオースリン酸イソメラーゼ
Ｎ°８    ＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ      ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ，Myelin basic protein)
Ｎ°９    ＭＴ２＿ＨＵＭＡＮ      メタロチオネイン−２（ＭＴ−２，Metallothionein-2）
パネルＣ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＮＦＭ＿ＨＵＭＡＮ      ニューロフィラメントミディアムポリペプチド
Ｎ°２    ＣＯＴＬ１＿ＨＵＭＡＮ  コアクトシン（Coactosin）様タンパク質
Ｎ°３    ＴＨＹ１＿ＨＵＭＡＮ    Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質前駆物質
Ｎ°４    ＰＲＯＦ１＿ＨＵＭＡＮ  プロフィリン−１
Ｎ°５    ＴＹＢ４＿ＨＵＭＡＮ    チモシンベータ−４
Ｎ°６    ＭＴ１Ｅ＿ＨＵＭＡＮ    メタロチオネイン−１Ｅ
Ｎ°７    ＦＡＢＰＢ＿ＨＵＭＡＮ  脂肪酸結合タンパク質、脳（Ｂ−ＦＡＢＰ，Fatty acid-binding protein, brain）
Ｎ°８    ＧＦＡＰ＿ＨＵＭＡＮ    グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ，Glial fibrillary acidic protein）
Ｎ°９    ＣＡＨ２＿ＨＵＭＡＮ    カルボニックアンヒドラーゼ２
Ｎ°１０  ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ    セルロプラスミン前駆物質
Ｎ°１１  ＤＣＤ＿ＨＵＭＡＮ      ダームシジン前駆物質
Ｎ°１２  ＤＥＦ１＿ＨＵＭＡＮ    好中球デフェンシン１前駆物質（ＨＮＰ−１）
【０１９０】
いくつかの実施形態では、パネルＡ、Ｂ、及びＣは、拡大パネルＡＢＣと呼ぶことができる、バイオマーカーの単一のまとまりのある群と見なすことができる。
【０１９１】
定められたパネルＡ〜Ｃに加えて、バイオマーカータンパク質のより大きなパネルを、本発明の方法において使用することができる。
【０１９２】
【表１】
2013531784.tif 000002
2013531784.tif 000003
2013531784.tif 000004
【０１９３】
パネル１におけるマーカーの利点は、それらがすべて、罹患対象において増加するということである。言いかえれば、そのようなバイオマーカーのレベルの増加は、急性脳損傷の可能性の増加を示す。これは、陽性の検出を促進し、特定のバイオマーカーが対象において減少するという指標について間違えられる検出の技術的問題による偽陰性から生じる可能性のある問題をなくすのを助ける。特に、パネル１におけるマーカーは、前記ポリペプチドについての量比がそれぞれ１．３を超えるという利点を共有する。これは、実施例の部において証拠づけられる。これは、本発明による方法においてこのパネルから使用されるそれぞれのマーカーにおける統計的に有意な信頼度を提供するという利点を有する。
【０１９４】
パネル１はまた、それらの統計的に有意な発現の増加が検出される特定のタイプの分析によってマーカーのサブグループを定める。したがって、「さらなる詳細」のカラムにおける指定「ＩＣ対ＣＴ」、「ＩＣ対Ｐ」、及び「Ｐ対ＣＴ」は、マーカーの３つのさらなるサブグループを提供する。
パネル１Ａ−「ＩＣ対ＣＴ」
パネル１Ｂ−「ＩＣ対Ｐ」
パネル１Ｃ−「Ｐ対ＣＴ」
【０１９５】
パネル１はまた、１つを超えるタイプの分析において統計的に有意なレベルまで上昇すること分かっているマーカーのサブグループを定める。したがって、下線を引いて示す個々のバイオマーカーは、行われる３つのタイプの分析（「ＩＣ対ＣＴ」、「ＩＣ対Ｐ」、及び「Ｐ対ＣＴ」）のうちの少なくとも２つにおいて、罹患対象において高いレベルで生じることが示される。さらに、行われる３つのタイプの分析（「ＩＣ対ＣＴ」、「ＩＣ対Ｐ」、及び「Ｐ対ＣＴ」）の３つすべてにおいて、罹患対象において高いレベルで生じることが示される少数のマーカーがある。これらは、３つの処理において下線を引いたバイオマーカーを比較し、上記のパネル１におけるそれらの３つの処理のそれぞれにおいて生じるものに注目することによって容易に同定することができる。したがって、マーカーのさらに４つのサブグループが定められる（［パネル１Ｄ−「ＩＣ対ＣＴ」及び「ＩＣ対Ｐ」］；［パネル１Ｅ「ＩＣ対ＣＴ」及び「Ｐ対ＣＴ」］；［パネル１Ｆ「ＩＣ対Ｐ」及び「Ｐ対ＣＴ」］；［パネル１Ｇ「ＩＣ対ＣＴ」及び「ＩＣ対Ｐ」及び「Ｐ対ＣＴ」］）。
【０１９６】
パネル１はまた、「Ｘ対ＣＴ」として記載することができるさらなるサブグループをも定め、ここでＸは、Ｐ又はＩＣである。言いかえれば、このサブグループは、ＩＣ対ＣＴ（パネル１Ａ）又はＰ対ＣＴ（パネル１Ｃ）（又はその両方）にある任意のマーカーを含む。したがって、パネル１Ｈは、「いずれか対ＣＴ」として定められる。これは、対照と比較した、罹患試料において増加を示すすべてのマーカーを照らし合わせるという利点を有する。
【０１９７】
【表２】
2013531784.tif 000005
【０１９８】
パネル２は、任意の種類の脳損傷に対する、特に脳卒中などの急性脳損傷に対する関連を有することが初めて本明細書において開示されるバイオマーカーポリペプチドを示す。したがって、それらが脳損傷に関連して初めて開示されるのはパネル２の個々のマーカーの利点となる。
【０１９９】
【表３】
2013531784.tif 000006
【０２００】
パネル２Ａバイオマーカーは、パネル２のサブグループであり、それらが、実施例の部において示される３つの微小透析研究（ＩＣ：Ｐ、ＩＣ：ＣＴ、及びＰ：ＣＴ）のうちの少なくとも２つにおいて増加するというさらなる特性を有し、脳損傷の部位との関連を示唆する。
【０２０１】
【表４】
2013531784.tif 000007
【０２０２】
パネル２Ｂのバイオマーカーは、パネル２Ａのサブグループであり、それらが、実施例の部において示される３つの微小透析研究（ＩＣ：Ｐ、ＩＣ：ＣＴ、及びＰ：ＣＴ）のそれぞれにおいて増加するというさらなる特性を有し、脳損傷の部位との密接な関連を示す。
【０２０３】
多数のマーカーが、実施例の部など、本明細書において実証される。いくつかのマーカーは、データの表及び図面における１を超える患者／実験において強力な関連を示す。本明細書において２以上の患者／実験について関連を示すマーカーが好ましい。
【０２０４】
メタロチオネイン−１Ｅ（ＭＴ１Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）に対する言及は、適切には、受託番号Ｐ０４７３２の配列を有するタンパク質を指す。
【０２０５】
定義
用語「含む（comprises）」（含む（comprise）、含む（comprising））は、当技術分野におけるその通常の意味を有する、つまり、明示される特徴又は特徴の群が含まれるが、用語が、いかなる他の明示される特徴又は特徴の群も、同様に存在することから除くわけではないことを理解されたい。
【０２０６】
以下の略語を本明細書において使用することができる：１−Ｄ  ＰＡＧＥ、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＣＴ、対側；ＣＳＦ、脳脊髄液；ＥＣＦ、細胞外液；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＧＳＴＰ１；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ；ＩＣ、梗塞中心部；ＨＵＧ、Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ；ＩＥＦ、等電点電気泳動；ＬＡＣＢ、β−ラクトグロブリン；ＭＡＬＤＩ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化；ＭＣＡ、中大脳動脈；ＭＳ、質量分析；ＭＳ／ＭＳ、タンデム質量分析；ＰＲＤＸ、ペルオキシレドキシン；Ｐ、ペナンブラ；ＲＰ−ＬＣ、逆相液体クロマトグラフィー；ＳＡＨ、クモ膜下出血；Ｓ１００Ｂ、タンパク質Ｓ１００−Ｂ；ＴＢＩ、外傷性脳障害；ＴＭＴ、タンデム質量タグ；ＴＭＴ２、２連ＴＭＴ；ＴＭＴ６、６連ＴＭＴ；ＴＯＦ／ＴＯＦ、タンデム飛行時間。ｍｓ／ｍｓベースの定量的プロテオミクスを用いる脳卒中患者の脳微小透析液の調査が記載される。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】１−Ｄ  ＰＡＧＥ（手製１５％  Tris−グリシンゲル）を用いる分離及び銀染色後の研究下の微小透析試料のうちの４つのゲル画像（つまりＣＴｄ、ＩＣｄ、Ｐｅ、及びＣＴｅ）である。１０μＬのそれぞれの微小透析液をゲル上にロードした。
【図２】ＣＴ微小透析液と比較した、ＩＣにおけるＧＳＴＰ１のレベルの増加についての免疫ブロットによる検証を示す図である。プールした微小透析試料（ｎ＝３；つまりＩＣａ〜ｃ及びＣＴｄ〜ｆ；１．５μｇ）を、１−Ｄ  ＰＡＧＥ（手製１５％  Tris−グリシンゲル）を用いて分離した。組換えＧＳＴＰ１（３１．２５ｎｇ）及び死後ＣＳＦ（１０μＬ）は、陽性対照として使用し、死前ＣＳＦ（２０μＬ）は、陰性対照として使用した。
【図３】対照及び脳卒中患者の血清における、タンパク質ＧＳＴＰ１（ａ）、ＰＲＤＸ１（ｂ）、及びＳ１００Ｂ（ｃ）のＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。
【図４】最終標準化ステップ前後のＥｘｐａ〜ｆについてのＴＭＴ２レポーターイオンの相対的存在量の分布を示す図である。基本的に、平行移動は、両方の分布の間の共通の面積が最大となる（つまり、両方の集団の間の定量的差異を最小限にする）ように、ｍ／ｚ＝１２６．１（赤色の分布）及び１２７．１（緑色の分布）でのレポーターイオンについての両方のデータについての相対的存在量に対して操作した。
【図５】Ｅｘｐａ〜ｃ及びＥｘｐｆに関する微小透析試料の銀染色１−Ｄ  ＰＡＧＥ画像を示す図である。１０μＬのそれぞれの微小透析液を手製１５％  Tris−グリシンゲル上にロードした。これらの画像は、ＴＭＴ２ベースの定量的研究を設計するために使用した。
【図６】ヒト脳微小透析液のＴＭＴ２ベースの定量的実験を設定するためのカットオフ値の実験的評価を示す図である。製品において詳述される実験手順に従って、ＴＭＴ６は、ＩＣ、Ｐ、及びＣＴ微小透析液の同一の試料にタグを付けるために使用した。差異が同一の試料（例えば２つのＩＣ試料）の間で予想されなかったので、１：１比からの偏りは、偽陽性に関して評価した。平均カットオフ値は、ＩＣ、Ｐ、及びＣＴの結果から平均した。１％ＦＤＲで対称的なカットオフ値を有するように、１．６８及び０．５９（０．６１の代わりに）のカットオフ比を選ぶ必要があった。
【図７】ＭＤにおけるいくつかのタンパク質のレベルの進行の棒グラフである。示される結果は、ＭＳよって得られる比から進展を決定することができる、対応する表において報告されるタンパク質に相当する。
【図８】ＭＤにおけるＰＲＤＸ１及びＰＲＤＸ６のレベルの進展の棒グラフである；これらの傾向は、ＭＳによって得られる比から決定した。
【図９】脳卒中患者のヒト脳ＭＤの分析に使用したプロテオミクス定量的ワークフローの略図である。
【図１０】ＩＣ及びＰのＭＤを比較する場合に得られるタンデム質量スペクトル（ａ）及びＴＭＴレポーターイオン面積をズームしたタンデム質量スペクトル（ｂ）の例を示す図である。
【図１１】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＤＥＮＡＴＬＤＧＧＤＶＬＦＴＧＲペプチド（ＤＤＡＨ１タンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【図１２】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＴＰＥＥＹＰＥＳＡＫペプチド（ＤＤＡＨ１タンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【図１３】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＳＱＶＶＡＧＴＮＹＦＩＫペプチド（ＣＹＴＢタンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【図１４】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＧＹＧＹＧＱＧＡＧＴＬＳＴＤＫペプチド（ＣＳＲＰ１タンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【図１５】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＧＬＥＳＴＴＬＡＤＫペプチド（ＣＳＲＰ１タンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【図１６】トリプシンを用いて消化したヒト血漿におけるＬＹＥＱＬＳＧＫペプチド（ＰＥＢＰ１タンパク質）のｉＳＲＭクロマトグラムである。
【０２０８】
本発明は、ここでは、実施例として記載される。これらの例は、例証となるように意図され、添付の請求項を限定するようには意図されない。
［実施例］
【０２０９】
実施例の要約
脳卒中患者のインビボヒト大脳微小透析体液は、脳血管障害に関連する、可能性のあるタンパク質バイオマーカーの発見のために調査した。虚血発作を患っている患者の梗塞中心部（ＩＣ）、ペナンブラ（Ｐ）、及び無影響の対側（ＣＴ）脳領域からの微小透析液は、ショットガンプロテオミクスアプローチを使用して質的量的に比較した。タンパク質量における変化は、いくつかのケースにおいて評価した；例えばＩＣ対Ｐ（ｎ＝２）、ＩＣ対ＣＴ（ｎ＝２）、及びＰ対ＣＴ（ｎ＝２）。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）は、還元、アルキル化、及びトリプシンを用いる消化後に微小透析体液の内容物を標識するために使用した。ＴＭＴ標識後、プールした試料は、オフゲル電気泳動を用いて分画し、結果として生じる画分は、ＲＰ−ＬＣ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦを用いて分析した。１５６のタンパク質が、全脳微小透析液において同定された。ＭＳ／ＭＳ定量分析は、Ｐ及びＣＴ試料と比較して、ＩＣにおいて量が増加した４３のタンパク質を示した。２６のタンパク質が、ＣＴと比較してＰにおいて増加した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ（ＧＳＴＰ１）、ペルオキシレドキシン−１（ＰＲＤＸ１）、及びタンパク質Ｓ１００−Ｂ（Ｓ１００Ｂ）の変化は、プールした微小透析試料に対する免疫ブロット及び／又は無関係な対照及び脳卒中患者（ｎ＝２８）の血液に対するＥＬＩＳＡを用いて検証した。結論として、ヒト脳微小透析のプロテオミクス定量的データ及び脳卒中患者由来の血液試料に対する初期の検証の間の相関は、本明細書において記載される方法及びバイオマーカーパネルの価値を実証する。
【０２１０】
実験手順：
材料
ウシ乳由来のβ−ラクトグロブリン（ＬＡＣＢ）（約９０％）、ブタ膵臓由来のトリプシン、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ、９９％以上）、組換えＧＳＴＰ１（ヒト由来、大腸菌において発現）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ）  ０．５Ｍ、及びα−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸は、Sigma社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。トリエチルアンモニウム炭酸水素バッファー（ＴＥＡＢ）  １Ｍ  ｐＨ＝８．５、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、９８％以上）、及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、９９．５％以上）は、Fluka社（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。Ｈ２Ｏ中ヒドロキシルアミン溶液５０重量％（９９．９９９％）は、Aldrich社（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）からのものであった。塩酸（２５％）及びリン酸二水素アンモニウム（（ＮＨ４）（Ｈ２ＰＯ４）は、Merck社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものであった。クロマトグラフィーLiChrosolv（登録商標）用の水及びＨＰＬＣ用のアセトニトリルChromasolv（登録商標）（≧９９．９％）は、それぞれ、Merck社及びSigma−Aldrich社（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。２連及び６連TMT（TMT2及びTMT6）は、Proteome Sciences社（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。Oasis（登録商標）HLB 1cc（１０及び３０ｍｇ）抽出カートリッジは、Waters社（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものであった。Immobiline（商標） DryStryp  ｐＨ３〜１０、１３ｃｍ及びＩＰＧバッファーｐＨ３〜１０は、GE Healthcare社（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。グリセロール５０％及び鉱油は、Agilent Technologies社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）からのものであった。
【０２１１】
試料採取
微小透析液
中大脳動脈（ＭＣＡ）領域における重症の、いわゆる悪性の梗塞を有する患者は、減圧開頭術と低体温麻酔療法（induced moderate hypothermia）（３２．５℃）を組み合わせる施設内のプロトコールに従って、Vall d'Hebron University HospitalのNeurointensive Care Unitにおいて治療した。６人の悪性ＭＣＡ梗塞患者が、含まれた（平均年齢５０±９．３歳；悪性ＭＣＡ梗塞の側：２人左、４人右；性別：４人女性、２人男性）。
【０２１２】
悪性ＭＣＡ梗塞患者は、異なる脳領域（ＣＴ、Ｐ、及びＩＣ）に挿入した高カットオフ（１００ｋＤａ）大脳微小透析カテーテル（CMA-71、CMA Microdialysis社、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてモニターした。コンピューター断層撮影は、脳微小透析カテーテルの位置を確認するために使用した。微小透析液試料は、CMA 106 micropump（CMA microdialysis社）を使用することによって人工ＣＳＦ溶液（つまりＮａＣｌ  １４７ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．２ｍＭ、及びＭｇＣｌ２  ０．８５ｍＭ）を用いる灌流後に５日間、１時間ごとに得た。
【０２１３】
−８０℃での凍結及び保存前に、微小透析試料におけるグルコース、乳酸、ピルビン酸、及びグリセロール／グルタミン酸／尿素濃度のためのルーチン分析は、CMA600 analyser（CMA microdialysis社）を用いて実行した。プロテオミクス分析は、脳モニタリングの最初の２４時間の間に得たプールした脳微小透析液について実行した。表１は患者、試料採取した様々な脳領域、及び使用した実験標識を要約する。
【０２１４】
【表５】
2013531784.tif 000008
【０２１５】
ＣＳＦ試料
死亡患者及び生きている患者の死前及び死後ＣＳＦの採取及び臨床データは、以前に報告されている（Lescuyer, P., Allard, L., Zimmermann-Ivol, C. G., Burgess, J. A., Hughes-Frutiger, S., Burkhard, P. R., Sanchez, J. C., and Hochstrasser, D. F. (2004) Identification of post-mortem cerebrospinal fluid proteins as potential biomarkers of ischemia and neurodegeneration. Proteomics 4, 2234-2241）。手短に言えば、対照の死前ＣＳＦ試料は、生きている健康な患者からルーチン的な診断用腰椎穿刺によって採取した。死後ＣＳＦ試料は、死体解剖での脳室穿刺によって採取した。
【０２１６】
血液試料
対照及び脳卒中患者の血液試料は、Geneva University Hospitals（ＨＵＧ）で２００５年１０月〜２００８年１月に採取した。この期間に、ＨＵＧに入院していた急性又は亜急性脳卒中の明白な症状及び徴候を示したすべての患者を、研究に登録した。除外基準は、以下のように定めた：（１）発病期間が３日間を上回る又は前３か月間における以前の脳卒中後に生じる脳卒中；（２）ＳＡＨ、硬膜下血腫、又は外傷性脳障害（ＴＢＩ）などの脳外出血又は傷害；（３）癌、腎又は肝不全、心筋梗塞、及び精神状態などの他の可能性として混同する病態の存在。研究において含まれる患者はそれぞれ、臨床及び神経放射線学アセスメントの標準化プロトコール並びにＨＵＧのDepartment of Neurologyからの熟練した神経科医によって管理される治療的介入を受けた。
【０２１７】
対照は、患者の家族親戚として、様々なタイプの医学的及び外科的状態又はさらに非脳血管性神経学的状態に罹患している患者として定めた。彼らは、脳卒中、脳血管疾患、又は血栓疾患の過去及び現在の病歴を有しないことが必要とされる。
【０２１８】
血液試料は、SOP Internal Working Groupによって記載される標準操作手順（ＳＯＰ，Standard Operating Procedures）に従って採取した（Tuck, M. K., Chan, D. W., Chia, D., Godwin, A. K., Grizzle, W. E., Krueger, K. E., Rom, W., Sanda, M., Sorbara, L., Stass, S., Wang, W., and Brenner, D. E. (2009) Standard operating procedures for serum and plasma collection: early detection research network consensus statement standard operating procedure integration working group. J Proteome Res 8, 113-117）。手短に言えば、血液試料は、赤色栓血液採取チューブに得（シリカコーティングチューブ、６ｍＬ、１３＊  １００ｍｍ、ｒｅｆ  ３６８８１５、BD vacutainers、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＵＫ）、血餅を形成させるために４５分間、室温で保存した。添加剤（抗凝固剤、プロテアーゼ阻害剤、又は保存剤）は使用しなかった。凝固時間の終わりに、試料は、遠心分離機にかけ（室温で１０分間、１０００×ｇ）、細胞ペレットを廃棄した。直後に、血清試料はそれぞれ、等分し、使用まで−８０℃で保存した。本明細書で報告される研究については、年齢及び性別が一致する１４人の対照及び１４人の脳卒中患者は、採取したすべての参加者の間でランダムに選択した。表２は、脳卒中患者及び対照の特徴を要約する。
【０２１９】
【表６】
2013531784.tif 000009
【０２２０】
地域の倫理委員会は、これらの研究を承認し、承諾書は、ヘルシンキ宣言に従って患者（又は親戚）から得た。
【０２２１】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
１０μＬの脳微小透析液は、手製１５％  Tris−グリシンゲル（８×７×０．１ｃｍ）上で一次元（１−Ｄ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離した。２０μＬの死前及び死後ＣＳＦ試料（１７２及び３５９μｇ・ｍＬ−１のそれぞれの濃度は、Bradford社のアッセイを用いて決定した（Bradford, M. M. (1976) Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254））もロードし、対照として使用した。ゲルは、硝酸銀を用いて染色した（Blum, H., Beier, H., and Gross, H. J. (1987) Improved silver staining of plant-proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8, 93-99）。ゲル画像は、ImageQuant TL software（GE Healthcare社）を用いて分析した。それぞれのレーンのシグナルは、統合し、同じゲル上で得られた他のレーンシグナルと比較して相対的に定量化した。
【０２２２】
還元、アルキル化、消化、及びＴＭＴ標識
微小透析試料の適切な容量は、それぞれの定量的実験（つまり表１におけるＥｘｐａ〜ｆ）において等タンパク質量（つまり重量）を比較するために１−Ｄ  ＰＡＧＥ分析に従って採取した。ＬＡＣＢは、予想タンパク質量（つまり重量）の１／５０でそれぞれの試料対に同量でスパイクした。６×２試料を乾燥させた。
【０２２３】
試料は、希釈ＨＣｌを用いてｐＨ＝８に調整した、１００μＬのＴＥＡＢ  １００ｍＭ中に溶解した。１μＬのＳＤＳ  １％及び２μＬ  ＴＣＥＰ  ５０ｍＭをそれぞれのチューブに添加した。還元は、１時間、６０℃で実行した。アルキル化は、暗中で、３０分間、実行した（１μＬのＩＡＡ  ４００ｍＭの添加）。ＴＥＡＢ溶液中で新たに調製した１０μＬトリプシン０．２μｇ・μＬ−１を添加した。消化は、３７℃で一晩実行した。
【０２２４】
TMT2標識は、ＣＨ３ＣＮ中４０．３μＬのTMT2試薬（つまり０．８３ｍｇ、２．４２×１０−６  モル）の添加後に１時間で達成された。タグは、表３において記載されるように使用した。
【０２２５】
【表７】
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【０２２６】
標識に対するペプチドの量は、様々な利用可能なタンパク質量のために、微小透析液試料の対によって変動した。これらの量は、使用した微小透析液容量に従って、１．５〜２７μｇに及ぶことが推定され、推定濃度は、死前ＣＳＦと比較して決定した（上記を参照されたい）。８μＬのヒドロキシルアミン５％を１５分間の反応に添加した。差次的にTMT2標識した試料は、新しいチューブ中にプールした。プールした試料は、乾燥させた。ＴＭＴ６実験は、同じプロトコールを用いて実行した。
【０２２７】
オフゲル電気泳動
試料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ  １ｃｃ（３０ｍｇ）抽出カートリッジを用いて脱塩した。乾燥後、試料は、１７２．８μＬグリセロール５０％及び１０．８μＬの担体両性電解質ＩＰＧバッファーｐＨ３〜１０と共に１６１６．４μＬ  Ｈ２Ｏ中に溶解した。ＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０、１３ｃｍ）は、オフゲルトレー上に構築し、８９．８％Ｈ２Ｏ、９．６％グリセロール５０％、及び０．６％の担体両性電解質の溶液を用いて３０分間、再水和した。試料は、１２のオフゲルウェル上にロードした。等電点電気泳動（ＩＥＦ，isoelectric focusing）分離は、電圧を５００Ｖに保持する前に５０μＡの限界電流及び２０ｋＶ・ｈ限界と共に3100 OFFGEL Fractionator（Agilent Technologies）を使用して実行した。画分は、採取し、それらのｐＨを測定した（Metrohm社（Ｈｅｒｉｓａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの744 pH Meter及びBiotrode）。画分は、乾燥させ、Oasis（登録商標）HLB 1cc（１０ｍｇ）抽出カートリッジを用いてきれいにし、再び乾燥させた。
【０２２８】
ＲＰ−ＬＣ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）タンデム飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）  ＭＳは、Applied Biosystems社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）からの4800 Proteomics Analyzerで実行した。オフゲル画分は、フロースプリッターを装備したWaters社からのAlliance systemを使用して、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）を用いて最初に分離した。自社製の（home-packed）５μｍ  ２００Å  Magic C18 AQ  ０．１×１００ｍｍカラムを使用した。分離は、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ  ９７％／３％／０．１％（溶媒Ａ）及びＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ  ５％／９５％／０．１％（溶媒Ｂ）の勾配を使用して、６０分間実行した。勾配は、以下のように実行した：４００ｎＬ・ｍｉｎ−１と推定される流速で０〜１０分、９８％Ａ及び２％Ｂ、次いで、１２分で９０％Ａ及び１０％Ｂ、５５分で５０％Ａ及び５０％Ｂ、６０分で９８％Ｂ。１分間の画分は、手製ＬＣロボットを使用して、ＭＡＬＤＩプレート上に置いた。次いで、マトリックス（１０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を有するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ  ５０％／５０％／０．１％中α−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸）は、プレート上にスポットした。質量スペクトルはすべて、８００〜４０００のｍ／ｚスキャン範囲により陽性イオン化モードにおいて得た（４０００ａ．ｕ．のレーザー強度による１０００回の発射）。最大で２０の最も強度の前駆物質を選択した後に、ＭＳ／ＭＳ実験（４５００ａ．ｕ．のレーザー強度による１５００回の発射）は、中程度の衝突エネルギーで実行した。
【０２２９】
タンパク質同定及び定量化
ピークリストは、Applied Biosystems社からの4000 Series Explorer softwareを使用して生成した。それぞれの試料について、１２オフゲル画分の分析から結果として生じるｍｇｆファイルを組み合わせ、Phenyx 2.6（GeneBio、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、UniProt-Swiss-Prot/TrEMBLデータベース（１２．６＿０４−Ｄｅｃ−２００７、５６１０８５５のタンパク質エントリー）に対して検索した。ホモサピエンスタクソノミー（９３００５タンパク質エントリー）（これとは別に、スパイクしたＬＡＣＢを探索するためのウシ（Bos taurus）（１７２６８タンパク質エントリー））をデータベース検索のために指定した。可変アミノ酸修飾（variable amino acid modification）は、酸化メチオニンであった。
【０２３０】
TMT2標識ペプチドアミノ末端及びTMT2標識リシン（＋２２５．１５５８Ｄａ）は、システインのカルバミドメチル化（carbamidomethylation）と同様に固定修飾（fixed modification）として設定した。ＴＭＴ６を使用する場合、＋２２９．１６２９Ｄａの質量インクリメントは、ＴＭＴ６標識ペプチドアミノ末端及びＴＭＴ６標識リシンについて特定された。トリプシンは、１の切断もれ（missed cleavage）の可能性と共に、酵素として選択し、通常の切断モード（cleavage mode）を使用した。１回の検索ラウンドのみを「ターボ」スコアリングの選択と共に使用した。ペプチドｐ値は、すべての実行について１  Ｅ−６であった。ＡＣ及びペプチドスコアは、ペプチド偽ペプチド発見率を１％未満にペプチドを制御するために設定した（スコアは７．０〜７．５まで変動した）。親イオン許容差は、１．１Ｄａとした。２つの異なるペプチド配列に一致するタンパク質のみを選択し、専用のＰｈｅｎｙｘエクスポートを使用してｅｘｃｅｌファイルに抽出した。さらなるフィルターを適用した。２つの異なる固有のペプチドにより同定されたタンパク質のみを最終的に保存した。質量スペクトルがいくつかのペプチド配列に帰した場合、一致したペプチドはすべて、除去した。
【０２３１】
レポーターイオンの面積は、4000 Series Explorer softwareの分析ツールを使用してタンデム質量スペクトルから抽出した。定量化は、タンパク質に特有であったペプチドのみにより実行した。異なる配列を有する少なくとも２つのペプチドがタンパク質を定量化するために必要であった。データの処理は、既に記載されているように実行した（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931）。処理は、スパイクしたＬＡＣＢ標準物質を用いる同位体補正及び標準化を含んだ。それぞれのペプチドについては、それぞれのレポーターイオンの相対的存在量は、すべてのレポーターイオン存在量の合計によるレポーターイオン存在量の比として計算した。次いで、タンパク質比は、Trans-Proteomic Pipelineにおいて使用されるLibra moduleに従って、それらのペプチド相対的存在量（それぞれのレポーターイオンチャネルに対応する）の単純平均の比として計算した。最終的な標準化ステップは、ほとんどのペプチドが比較した試料中で同量であることを仮定して実行した、つまり、両方のＴＭＴ２標識群の相対的存在量度数分布の間の共通の面積は、最大となる必要があった（図４に示す）。標準化係数は、全レポーターイオンデータセット全体について（つまり、ペプチドがあらゆる配列に一致しなかった場合でさえ）得た。
【０２３２】
定量的カットオフ値は、以前に記載されるプロトコールにより分析した同一の微小透析試料の比較によって決定した。基本的に、ＴＭＴ６試薬は、ＩＣ、Ｐ、及びＣＴ微小透析液の同一の試料にタグを付けるために使用した。差異が同一の試料（例えば２つのＩＣ試料）の間で予想されなかったので、１：１比からの偏りは、偽陽性として見なした。それぞれのＴＭＴチャネルにおいて提供される相対的存在量は、ランダムに混合した。次いで、比は、同一の試料の間で計算し、相乗平均は、１０の比のデータポイントのクラスターから得た。次いで、これらの平均比は、所与の偽陽性率でカットオフ値を評価するために使用した。最終的なカットオフ値は、ＩＣ、Ｐ、及びＣＴの結果から平均した。
【０２３３】
プールしたＩＣ及びＣＴ微小透析液の免疫ブロット分析
１．５μｇのプールしたＩＣ（ｎ＝３；つまりＩＣａ〜ｃ）及び１．５μｇのプールしたＣＴ微小透析液（ｎ＝３；つまりＣＴｄ〜ｆ）は、１−Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離した。２０μＬの死前ＣＳＦ、１０μＬの死後ＣＳＦ、及び３１．２５ｎｇの組換えＧＳＴＰ１もまた、分離した。分離されたタンパク質は、（Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 4350-4354）によって記載されるように、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜は、ブロッキングのために５％ミルク−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％と共に１時間インキュベートした。免疫検出は、１％ミルク−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％中で１／２０００に希釈した抗ヒトＧＳＴＰウサギポリクローナル抗体（MBL International Corp.社、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により実行した。数回の洗浄ステップ後に、適切な二次抗体ＨＲＰ（Dako社、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、１／２０００で１時間インキュベートした。ECL plus Western Blotting detection system Kit（GE Healthcare社）を検出に使用した。膜は、Typhoon 9400（GE Healthcare社）により最終的にスキャンした。
【０２３４】
ＥＬＩＳＡ
Ｓ１００Ｂ及びＰＲＤＸ１は、メーカーの推奨に従って、それぞれ、Abnova Corp. 社（Ｔａｉｐｅｉ  ｃｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）及びBiovendor GmbH社（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して検証した。ＧＳＴＰ１に関して、市販のアッセイが現在入手可能でないので、以前に記載される（Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681、Hainard, A., Tiberti, N., Robin, X., Lejon, V., Ngoyi, D. M., Matovu, E., Enyaru, J. C., Fouda, C., Ndung'u, J. M., Lisacek, F., Muller, M., Turck, N., and Sanchez, J. C. (2009) A Combined CXCL10, CXCL8 and H-FABP Panel for the Staging of Human African Trypanosomiasis Patients. PLoS Neglected Tropical Diseases 3, e459）ように、サンドイッチイムノアッセイを社内で開発し、使用した。統計分析及び図は、GraphPad Prism software（version 4.03、GraphPad software Inc. 社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実行した。
【実施例１】
【０２３５】
微小透析分析
タンデム質量タグ（TMT）（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931、Thompson, A., Schafer, J., Kuhn, K., Kienle, S., Schwarz, J., Schmidt, G., Neumann, T., and Hamon, C. (2003) Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, 1895-1904）は、虚血発作患者の脳微小透析試料を比較するために本明細書において使用した。TMTは、アイソバリック標識のセットを含む。これらのアイソバリック標識は、同じ質量合計を示すが、衡突解離による活性化及び続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）後に異なる質量でレポーターイオンを提供する重い同位体及び軽い同位体により合成される。レポーターイオン存在量は、TMTの異なるバージョンにより標識したペプチドの相対的定量化を実行するために使用され、ひいては、相対的タンパク質量を決定する。
【０２３６】
脳卒中を患っている患者の梗塞中心部（ＩＣ）、ペナンブラ（Ｐ）、及び対側（ＣＴ）脳領域からの試料を調査した。このプロテオミクス研究は、Ｐ及びＣＴ微小透析液と比較して、ＩＣにおいて量が増加した４３のタンパク質を目立たせた。２６のタンパク質は、ＣＴ試料と比較して、Ｐにおいて増加した。候補マーカーとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ（ＧＳＴＰ１）、ペルオキシレドキシン−１（ＰＲＤＸ１）、及びＳ１００Ｂは、脳卒中の症例においてそれらのレベルの増加を最終的に確認した、脳卒中患者の微小透析試料及び／又は血液に対するイムノアッセイによりさらに評価した。
【０２３７】
ヒト脳微小透析液は、６人の脳卒中患者の２つの脳領域から対で試料採取した。ｍ／ｚ＝１２６．１及び１２７．１でのレポーターイオンと共に、ＴＭＴ２による６つの定量的ＭＳ／ＭＳベースの比較は、実験Ｅｘｐａ〜ｆにおいて実行した（表３）。
【０２３８】
ＩＣ、Ｐ、及びＣＴ微小透析試料の濃度
図１に、１−Ｄ  ＰＡＧＥにより分離した脳微小透析液ＩＣｄ、ＣＴｄ、Ｐｅ、及びＣＴｅを示す（他の試料の１−Ｄ  ＰＡＧＥ画像は、図５に示す）。１０μＬの微小透析液中のタンパク質量は、試料ごとに不均一であった。
【０２３９】
ＴＭＴベースの実験についての定量的カットオフの決定
ＴＭＴ２実験についてのタンパク質量における有意な増加及び減少を反映する定量的カットオフは、実験的に評価した（図６に示す）。ＴＭＴ６は、実験手順において詳述されるＴＭＴ２実験について使用した同じプロトコールに従って、ＩＣ、Ｐ、及びＣＴ微小透析液の２つの同一の試料を標識するために使用した（つまり還元、アルキル化、消化、特異なＴＭＴ６標識、オフゲル電気泳動（Horth, P., Miller, C. A., Preckel, T., and Wenz, C. (2006) Efficient fractionation and improved protein identification by peptide OFFGEL electrophoresis. Mol. Cell. Proteomics 5, 1968-1974、Ros, A., Faupel, M., Mees, H., van Oostrum, J., Ferrigno, R., Reymond, F., Michel, P., Rossier, J. S., and Girault, H. H. (2002) Protein purification by Off-Gel electrophoresis. Proteomics 2, 151-156）、ＲＰ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ、同定、及び定量化）。定量的データのランダムな混合の後に、所与のカットオフでの偽陽性率を評価した。例えば、偽陽性の１％は、１．６８及び０．５９のカットオフ比で見出された（実験手順を参照されたい、また図６に示す）。最終的に、０．５及び２．０のカットオフ値を選んだ。これらの値は、実際に実験的に評価したカットオフと比較してより大きな間隔に相当し、偽陽性を見出すためにさらなる危険性を減少させた。さらに、免疫ブロットを用いる検証中にそのような差異を評価することができた。
【０２４０】
定性的及び定量的ＭＳ分析
タンパク質試料は、還元し、アルキル化し、トリプシンにより消化し、結果として生じるペプチドは、表３において報告されるようにＴＭＴ２により標識した。オフゲル電気泳動を実行した。１２の採取したオフゲル画分は、ＲＰ−ＬＣ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳを用いて分析した。定量的ワークフローは、以前に特徴づけられている（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931、Dayon, L., Turck, N., Kienle, S., Schulz-Knappe, P., Hochstrasser, D. F., Scherl, A., and Sanchez, J. C. (2010) Isobaric tagging-based selection and  quantitation of cerebrospinal fluid tryptic peptides with reporter calibration curves. Anal. Chem., DOI 10.1021/ac901854k）。定量的データの品質管理は、スパイクしたＬＡＣＢタンパク質標準物質により評価した（表３）。１２．１％及び１７．０％（Ｅｘｐｆ）の平均及び最大相対的標準偏差は、アイソバリックタギング技術性能と相関した（表３）（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931）。
【０２４１】
これらのプロテオミクス分析から、１５６のタンパク質が、９３９の固有のペプチドと共に同定された。より正確に、１０８のタンパク質が、ＩＣにおいて同定され、１３７が、Ｐにおいて、１３４が、ＣＴ微小透析液において同定された。
【０２４２】
ＴＭＴ２を用いて実行した６つの比較は、９４のタンパク質を示し、これらは、比較した試料の対内で増加した（比が２．０を超える；５３のタンパク質）又は減少した（比が０．５未満；４７のタンパク質）（表３）。要約すると、２５のタンパク質は、Ｐ試料と比較してＩＣにおいて増加し、２４のタンパク質は、ＣＴ試料と比較してＩＣにおいて増加し、２６のタンパク質は、ＣＴ試料と比較してＰにおいて増加した（表７〜９）。それぞれの脳領域の間の調節性タンパク質の全リストを表４〜６に提供する。
【０２４３】
【表８】
2013531784.tif 000011
2013531784.tif 000012
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【０２４４】
【表９】
2013531784.tif 000021
2013531784.tif 000022
2013531784.tif 000023
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【０２４５】
【表１０】
2013531784.tif 000028
2013531784.tif 000029
2013531784.tif 000030
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【０２４６】
Ｓ１００Ｂ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などの数個のタンパク質が、脳卒中又は他の脳病理に関連することが既に報告されている（Herrmann, M., Vos, P., Wunderlich, M. T., de Bruijn, C., and Lamers, K. J. B. (2000) Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke - A comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein. Stroke 31, 2670-2677、Jauch, E. C., Lindsell, C., Broderick, J., Fagan, S. C., Tilley, B. C., Levine, S. R., and Grp, N. r.-P. S. S. (2006) Association of serial biochemical markers with acute ischemic stroke - The National Institute of Neurological Disorders and Stroke recombinant tissue plasminogen activator Stroke Study. Stroke 37, 2508-2513、Lamers, K. J. B., Vos, P., Verbeek, M. M., Rosmalen, F., van Geel, W. J. A., and van Engelen, B. G. M. (2003) Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res. Bull. 61, 261-264）。Ｓ１００Ｂタンパク質は、Ｅｘｐｂにおいてであるが、１つの固有のペプチドのみによって実際に同定された（１１．６７のＰｈｅｎｙｘペプチドスコア）。そのＩＣ／Ｐ比は、３．３８であった。死後ＣＳＦにおいて増加することが最初に発見されたタンパク質であるＧＳＴＰ１（Lescuyer, P., Allard, L., Zimmermann-Ivol, C. G., Burgess, J. A., Hughes-Frutiger, S., Burkhard, P. R., Sanchez, J. C., and Hochstrasser, D. F. (2004) Identification of post-mortem cerebrospinal fluid proteins as potential biomarkers of ischemia and neurodegeneration. Proteomics 4, 2234-2241、Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681）は、Ｅｘｐａにおいて２．７９のＩＣ／Ｐ比を示した。数個のペルオキシレドキシンもまた、表７において報告されるようにＩＣ試料において増加した。
【０２４７】
【表１１】
2013531784.tif 000039
【０２４８】
カットオフ未満の比の値のために表において報告されなかったが、ＰＲＤＸ１は、Ｅｘｐｂにおいて１．９３の比で測定された。Ｐ及びＣＴ微小透析試料の比較において、ＰＲＤＸ１及びペルオキシレドキシン−６（ＰＲＤＸ６）は、Ｅｘｐｆにおいて１．２４及び１．６９の比でそれぞれ測定された。
【０２４９】
【表１２】
2013531784.tif 000040
【０２５０】
【表１３】
2013531784.tif 000041
【０２５１】
０．５より下の比を有するタンパク質を表１０〜１２に報告する。
【０２５２】
【表１４】
2013531784.tif 000042
【０２５３】
【表１５】
2013531784.tif 000043
【０２５４】
【表１６】
2013531784.tif 000044
【実施例２】
【０２５５】
候補バイオマーカーの検証
イムノアッセイ実験は、ＭＳ／ＭＳにより得られた定量的測定値を確認するために実行した。評価されることとなる候補バイオマーカーの選択は、市販及び社内で開発したイムノアッセイの有用性に本質的に基づいた。
【０２５６】
ＧＳＴＰ１タンパク質（ＭＷ＝２３ｋＤａ）は、図２において例証されるように、プールした微小透析液試料（ｎ＝３）において免疫ブロット分析によりプローブした。ＣＴと比較したＩＣ微小透析液における増加は、疑う余地がなく、死後及び死前ＣＳＦの以前の研究と同様にＴＭＴベースの発見による結果を確証した（Lescuyer, P., Allard, L., Zimmermann-Ivol, C. G., Burgess, J. A., Hughes-Frutiger, S., Burkhard, P. R., Sanchez, J. C., and Hochstrasser, D. F. (2004) Identification of post-mortem cerebrospinal fluid proteins as potential biomarkers of ischemia and neurodegeneration. Proteomics 4, 2234-2241、Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681）。
【０２５７】
次に、ＥＬＩＳＡは、対照及び脳卒中患者（ｎ＝２８）の血清に対してＧＳＴＰ１、ＰＲＤＸ１、及びＳ１００Ｂについて実行した。ＥＬＩＳＡ結果は、図３に示し、表１３に要約する。
【０２５８】
【表１７】
2013531784.tif 000045
【０２５９】
ＧＳＴＰ１は、対照と比較して、脳卒中患者の血液において著しく上昇することが分かった（ｐ＝０．０００２、ウィルコクソン順位和検定）。脳卒中患者及び対照の間の血液中の平均比は８．４７であった（表１３）、つまり、脳微小透析試料において分かった比ＩＣ／Ｐよりも３倍高かった（Ｅｘｐａ、表７）。ペルオキシレドキシンファミリーの間で、血液ＰＲＤＸ１は、ｐ＝０．０００１の有意水準で対照と脳卒中患者を区別するのを可能にした。約２０倍のそのレベルの増加が、脳卒中集団において観察された。文献において先に記載されている結果に従って（Buttner, T., Weyers, S., Postert, T., Sprengelmeyer, R., and Kuhn, W. (1997) S-100 protein: Serum marker of focal brain damage after ischemic territorial MCA infarction. Stroke 28, 1961-1965、Missler, U., Wiesmann, M., Friedrich, C., and Kaps, M. (1997) S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke 28, 1956-1960）、血液Ｓ１００Ｂの濃度測定値は、対照よりも脳卒中患者において有意に高度であった（ｐ＝０．００９３）。
【０２６０】
したがって、本発明者らは、虚血発作患者のＩＣ、Ｐ、及びＣＴ由来の微小透析試料の比較によって例証した、脳卒中のタンパク質マーカーを開示する。ヒト脳微小透析液は、ペプチド等電点電気泳動分画に連結されられたアイソバリックタギング技術及びＲＰ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を使用して分析した。ＩＣ微小透析液中のＧＳＴＰ１、ＰＲＤＸ１、及びＳ１００Ｂのレベルの増加は、プールした微小透析試料に対する免疫ブロット並びに／又は対照及び脳卒中患者の血液に対するＥＬＩＳＡによりさらに検証した。したがって、本発明者らは、本明細書において示されるマーカー及び方法の有用性及び適用可能性を明確に確立した。
【実施例３】
【０２６１】
微小透析試料中のタンパク質量
研究下の異なる微小透析試料の１−Ｄ  ＰＡＧＥによる分析は、試料の間のタンパク質の全濃度においてわずかに異なるパターン及び大きな差を明らかにした（図１及び図５）。これらの差は、おそらく、生物学的差及び／又は脳卒中の重症度に加えて、例えば、微小透析膜を通しての回収の問題から結果として生じ得る。脳卒中患者のＣＴ微小透析液の以前の研究において、１８の試料中でタンパク質濃度は、０．０８３〜０．３９５ｇ・Ｌ−１に及び、平均含有量は０．２１±０．１１ｇ・Ｌ−１であることが決定された（Maurer, M. H., Berger, C., Wolf, M., Futterer, C. D., Feldmann, R. E., Jr., Schwab, S., and Kuschinsky, W. (2003) The proteome of human brain microdialysate. Proteome Science 1, 7）。グルタミン酸、グリセロール、乳酸、及びピルビン酸などのより小さな分子は、ＣＴ微小透析液において、３．９±０．３μｍｏｌ・Ｌ−１、３８．９±１．９μｍｏｌ・Ｌ−１、２．０±０．１ｍｍｏｌ・Ｌ−１、及び５８．４±３．３μｍｏｌ・Ｌ−１で、同じ試料採取期間にわたり５０の患者においてそれぞれ測定されたのに対して、ＩＣにおいて、同じ分子についての中央値は、それぞれ、１９６．５μｍｏｌ・Ｌ−１（１２６．０〜４５３．０に及ぶ）、６００．５μｍｏｌ・Ｌ−１（４６４．２〜１１８７．１に及ぶ）、６．１ｍｍｏｌ・Ｌ−１（０．１〜１２．０に及ぶ）、及び１７．４μｍｏｌ・Ｌ−１（４．２〜５９１．７に及ぶ）であった（Berger, C., Dohmen, C., Maurer, M. H., Graf, R., and Schwab, S. (2004) Cerebral microdialysis in stroke. Nervenarzt 75, 113-123）。手短に言えば、タンパク質濃度は、ＣＴ微小透析液において試料ごとにかなり変動したのに対して、小分子の濃度は、ＣＴが均一であったが、ＩＣにおいてより不均一であった。したがって、大きなタンパク質の濃度変化は、ＩＣ試料及びＰ微小透析液において予想され得る。タンパク質濃度変化を本明細書で確認した。
【０２６２】
全タンパク質濃度における差異のために、試料の均一化は、定量的プロテオミクス研究を実行するために必要であった。
【０２６３】
比較するための試料は、定量分析の前にそれらのタンパク質量（つまり重量）によって均一にした。
【０２６４】
１−Ｄ  ＰＡＧＥ画像は、濃度測定により試料濃度を比較するために使用した（実験手順を参照されたい）。この相対的タンパク質定量化に従って、比較するための対の間の等タンパク質量を、ＴＭＴ２ベースの定量的アセスメントのために使用した。
【０２６５】
結果として、さらなる標準化をＴＭＴ２定量的データに対して実行した。本発明者らは、ほとんどのタンパク質、そのため、ほとんどのペプチド及びレポーターイオンシグナルが、試料の間で等しいはずであることを仮定した（図４に示す）。したがって、両方のＴＭＴ２標識対のペプチド相対的存在量の度数分布の間の共通の面積は、最大となる必要があった。そのうえ、この処理は、１−Ｄ  ＰＡＧＥ画像から実行した第１の標準化と一貫性があった。
【実施例４】
【０２６６】
タンパク質の増加及び減少
本発明者らの知っている限りでは、これは、ヒト脳微小透析液の最も広範囲なプロテオミクス研究であり、脳虚血を標的にする最初のものであるMaurer, M. H. (2008) Proteomics of brain extracellular fluid (ECF) and cerebrospinal fluid (CSF). Mass Spectrom. Rev., DOI:10.1002/mas.20213。研究を通して、本発明者らは、脳卒中患者の脳におけるＥＣＦのモニタリングとして、ヒト脳微小透析液の定量的マップを得た。微小透析によりプローブした脳領域によって、脳卒中の関連タンパク質マーカーを発見した。
【０２６７】
発見したタンパク質の多くは、ＣＳＦにおいて以前に同定されている（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931、Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681、Zougman, A., Pilch, B., Podtelejnikov, A., Kiehntopf, M., Schnabel, C., Kurnar, C., and Mann, M. (2008) Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J. Proteome Res. 7, 386-399）。より正確には、比較した対内で量が増加した数個のタンパク質（表７〜９）は、死前及び死後ＣＳＦの比較研究において以前に同定されている（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931）。これは、例えば、シスタチン−Ｂ、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＰＲＤＸ１、及びペルオキシレドキシン−２（ＰＲＤＸ２）についてのケースであった。その以前の研究において、ＰＲＤＸ１は、死前ＣＳＦと比較して、死後ＣＳＦにおいて１４．７４の比で増加した。両方の研究の間の定量的結果の多くの相関は、重症の脳外傷のモデルとして死後ＣＳＦを検証しただけではなく、微小透析試料で得られた定量的プロテオームマップの値を強調した。
【０２６８】
表７〜９において、いくつかのタンパク質は、量の増加及び減少を示した。これは、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＩＢＡ）、血小板塩基性タンパク質、プロフィリン−１、カルボニックアンヒドラーゼ１、及びＧＦＡＰについてのケースであった。９５ｋＤａの分子量で、ＦＩＢＡは、透析膜を通して非効率的に回収された可能性がある。差は、他のタンパク質について直接、説明することができなかったが、例えば、ＧＦＡＰ（５０ｋＤａ）は、ビメンチン、デスミン、及びアネキシンのような他のタンパク質と二量体化し、オリゴマー形成し、共重合し得る（da Silva, S. F., Correa, C. L., Tortelote, G. G., Einicker-Lamas, M., Martinez, A. M. B., and Allodi, S. (2004) Glial fibrillary acidic protein (GFAP)-like immunoreactivity in the visual system of the crab Ucides cordatus (Crustacea, Decapoda). Biol. Cell 96, 727-734）。次いで、その回収が改変された可能性がある。本発明の方法における試料が微小透析液以外である場合、例えば、試料がＣＳＦ又は血液である場合、そのような試料を使用する場合に分子量カットオフがないので、そのような問題（複数可）は、好都合にも回避される。
【０２６９】
虚血発作は、脳に供給される血流の妨害によって引き起こされる。脳血流は、ペナンブラにおいて減少し、梗塞中心部においてさらにより減少することが示された（Kaufmann, A. M., Firlik, A. D., Fukui, M. B., Wechsler, L. R., Jungries, C. A., and Yonas, H. (1999) Ischemic core and penumbra in human stroke. Stroke 30, 93-99）。興味深いことには、ＩＣ対Ｐ、ＩＣ対ＣＴ、及びＰ対ＣＴ研究において見つけられる減少したタンパク質のほとんどは（表１０〜１２）、血液タンパク質（例えば血清アルブミン、血清トランスフェリン（serotransferrin）、ハプトグロビン、ヘモグロビン）であり、これらの別個の脳エリアにおける血流の改変についての局所的な差をどういう訳か反映した。
【０２７０】
図７は、上記の表において報告されるタンパク質についてＭＤにおいて観察されたタンパク質レベルの進展を示す。ほとんどのこれらのタンパク質は、ＣＴからＰ及びＰからＩＣのＭＤで増加することが分かった。図８において示されるように、ＰＲＤＸ１及びＰＲＤＸ６は、ＣＴ、Ｐ、及びＩＣのＭＤから増加することが分かった。ほとんどのケースにおいて、ＣＴからＩＣへのタンパク質レベルの進展／上昇は、図７及び８において示されるように、脳損傷の深刻さとの直接的な関係を反映する。これらの結果は、本発明の医学的に関連する態様を強化する、関連する生物学的傾向を示す。
【実施例５】
【０２７１】
バイオマーカーのさらなる検証
数個の同定されたタンパク質を、代替の診断ツール（つまりＥＬＩＳＡ）の有用性及び／又は脳虚血への関与についての強力な科学的な論理的根拠に基づいて本発明者らの発見アプローチの有効性を実証するために選択した。脳損傷の十分に立証されているバイオマーカーであるＳ１００Ｂは（Rothermundt, M., Peters, M., Prehn, J. H. M., and Arolt, V. (2003) S100B in brain damage and neurodegeneration. Microsc. Res. Tech. 60, 614-632）、脳組織において高度に発現しているカルシウム結合及び成長調節分泌タンパク質であるDonato, R. (2001) S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 637-668。Ｓ１００Ｂの濃度は、多くの脳傷害及び機能不全において評価されている。Ｓ１００Ｂは、脳卒中（Buttner, T., Weyers, S., Postert, T., Sprengelmeyer, R., and Kuhn, W. (1997) S-100 protein: Serum marker of focal brain damage after ischemic territorial MCA infarction. Stroke 28, 1961-1965、Missler, U., Wiesmann, M., Friedrich, C., and Kaps, M. (1997) S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke 28, 1956-1960）、ＳＡＨ（Wiesmann, M., Missler, U., Hagenstrom, H., and Gottmann, D. (1997) S-100 protein plasma levels after aneurysmal subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochir. (Wien). 139, 1155-1160）、及びＴＢＩ（Romner, B., Ingebrigtsen, T., Kongstad, F., and Borgesen, S. E. (2000) Traumatic brain damage: Serum S-100 protein measurements related to neuroradiological findings. J. Neurotrauma 17, 641-647）において増加した。Ｓ１００Ｂは、微小透析技術を使用して、急性脳外傷を有する２人の患者の脳ＥＣＦにおいて以前に測定された（Sen, J., Belli, A., Petzold, A., Russo, S., Keir, G., Thompson, E. J., Smith, M., and Kitchen, N. (2005) Extracellular fluid S100B in the injured brain: a future surrogate marker of acute brain injury? Acta Neurochir. (Wien). 147, 897-900）。Ｐ試料と比較したあるＩＣ微小透析液におけるＳ１００Ｂの検出及び増加したレベルの決定並びに脳卒中患者の血液におけるその検証は、本明細書で報告される知見を確認し、研究試料の優れた価値を実証した。
【０２７２】
ＧＳＴＰ１タンパク質は、多くの毒性求電子試薬及び有機過酸化物を不活性化することができる酵素である（Salinas, A. E., and Wong, M. G. (1999) Glutathione S-transferases - A review. Curr. Med. Chem. 6, 279-309）。ＧＳＴＰ１は、中枢神経系において記載される３つのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのうちの１つである（Theodore, C., Singh, S. V., Hong, T. D., and Awasthi, Y. C. (1985) Glutathione S-transferases of human brain. Evidence for two immunologically distinct types of 26500-Mr subunits. Biochem. J. 225, 375-382）。いくつかの研究は、パーキンソン病とのその関連を示唆した（Shi, M., Bradner, J., Bammler, T. K., Eaton, D. L., Zhang, J. P., Ye, Z. C., Wilson, A. M., Montine, T. J., Pan, C., and Zhang, J. (2009) Identification of Glutathione S-Transferase Pi as a Protein Involved in Parkinson Disease Progression. Am. J. Pathol. 175, 54-65）。高レベルのＧＳＴＰ１は、ヒトアフリカトリパノソーマ症を患っている末期患者のＣＳＦにおいて最近報告された（Hainard, A., Tiberti, N., Robin, X., Lejon, V., Ngoyi, D. M., Matovu, E., Enyaru, J. C., Fouda, C., Ndung'u, J. M., Lisacek, F., Muller, M., Turck, N., and Sanchez, J. C. (2009) A Combined CXCL10, CXCL8 and H-FABP Panel for the Staging of Human African Trypanosomiasis Patients. PLoS Neglected Tropical Diseases 3, e459）。このタンパク質は、生きている患者と比較して死亡した患者のＣＳＦにおいて濃度が増加したことが分かったので、初期の脳細胞死に関連することが知られている（Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681）。微小透析及び血液試料におけるＧＳＴＰ１の増加の高度な相関は、脳マーカーの発見のための適切なモデルとしての脳卒中患者の脳微小透析液の得られた定量的プロテオームマップの関連を強調した。
【０２７３】
ペルオキシレドキシンは、酸素ペルオキシド及び他の活性酸素種の分解に関与する遍在性の酸化防止酵素である（Rhee, S. G., Yang, K. S., Kang, S. W., Woo, H. A., and Chang, T. S. (2005) Controlled elimination of intracellular H2O2: Regulation of peroxiredoxin, catalase, and glutathione peroxidase via post-translational modification. Antioxidants & Redox Signaling 7, 619-626、Wood, Z. A., Schroder, E., Harris, J. R., and Poole, L. B. (2003) Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem. Sci. 28, 32-40）。これらのチオール特異的酸化防止タンパク質もまた、チオレドキシンペルオキシダーゼと呼ばれる。ペルオキシレドキシンのファミリーは、還元プロセスに関与するシステイン残基の数によって、２つの種類、１−Ｃｙｓ及び２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンに分類することができる６つの別個の群から構成される。ペルオキシレドキシン−６（ＰＲＤＸ６）は、実際に、唯一の１−Ｃｙｓメンバーである。脳において、ＰＲＤＸ１及びＰＲＤＸ６は、星状細胞において主として発現されることが示されたのに対して、ＰＲＤＸ２は、もっぱら、ニューロンにおいて発現した（Power, J. H. T., Asad, S., Chataway, T. K., Chegini, F., Manavis, J., Temlett, J. A., Jensen, P. H., Blumbergs, P. C., and Gai, W. P. (2008) Peroxiredoxin 6 in human brain: molecular forms, cellular distribution and association with Alzheimer's disease pathology. Acta Neuropathol. (Berl). 115, 611-622、Sarafian, T. A., Verity, M. A., Vinters, H. V., Shih, C. C. Y., Shi, L. R., Ji, X. D., Dong, L. P., and Shau, H. Y. (1999) Differential expression of peroxiredoxin subtypes in human brain cell types. J. Neurosci. Res. 56, 206-212）。ＰＲＤＸ２は、パーキンソン病患者由来の黒質（Basso, M., Giraudo, S., Corpillo, D., Bergamasco, B., Lopiano, L., and Fasano, M. (2004) Proteome analysis of human substantia nigra in Parkinson's disease. Proteomics 4, 3943-3952）並びにダウン症候群、アルツハイマー病、及びピック病を有する患者の前頭皮質及び小脳において（Krapfenbauer, K., Engidawork, E., Cairns, N., Fountoulakis, M., and Lubec, G. (2003) Aberrant expression of peroxiredoxin subtypes in neurodegenerative disorders. Brain Res. 967, 152-160）、有意に増加した。ＰＲＤＸ１は、脳内皮細胞における酸化ストレスに対する適応応答の一部であり、損傷した血液脳関門で保護効果を有することが実証された（Schreibelt, G., van Horssen, J., Haseloff, R. F., Reijerkerk, A., van der Pol, S. M. A., Nieuwenhuizen, O., Krause, E., Blasig, I. E., Dijkstra, C. D., Ronken, E., and de Vries, H. E. (2008) Protective effects of peroxiredoxin-1 at the injured blood-brain barrier. Free Radic. Biol. Med. 45, 256-264）。本明細書において、それぞれ、脳卒中患者の脳の損傷した部分の微小透析液及び血液におけるＰＲＤＸ１の増加した量及び増加した濃度は、そのため、脳血管疾患におけるさらなる調査について高度に関連するように思われた。非常に、興味深いことには、ＰＲＤＸ１及びＧＳＴＰ１は、同様のレドックス防御メカニズムに関係し、ともに相互作用することが証拠づけられた（Kim, Y. J., Lee, W. S., Ip, C., Chae, H. Z., Park, E. M., and Park, Y. M. (2006) Prx1 suppresses radiation-induced c-Jun NH2-terminal kinase signaling in lung cancer cells through interaction with the glutathione S-transferase Pi/c-Jun NH2-terminal kinase complex. Cancer Res. 66, 7136-7142）。同様に、ＧＳＴＰ１は、複合体の形成（Ralat, L. A., Manevich, Y., Fisher, A. B., and Colman, R. F. (2006) Direct evidence for the formation of a complex between 1-cysteine peroxiredoxin and glutathione S-transferase pi with activity changes in both enzymes. Biochemistry (Mosc). 45, 360-372）を通して酸化ＰＲＤＸ６（Manevich, Y., Feinstein, S. I., and Fisher, A. B. (2004) Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 3780-3785）を再活性化することが示された。
【０２７４】
本発明者らの研究に含まれる患者のような悪性ＭＣＡ梗塞患者は、記載されるタンパク質のうちのいくつかの発現パターンを修飾する可能性がある、低体温療法（moderate hypothermia）など、神経疾患集中治療施設でいくつかの治療を受ける、重度に障害性の患者である。他の妨げは、１００ｋＤａ微小透析プローブによる回収率がほとんどの発見されたタンパク質について未知であるということである。分子量が限られた経路を通して採取されない試料を選ぶことによって、例えば試料としてＣＳＦ又は血液を使用することによって、これらの妨げを軽減することは好都合にも可能であり得る。
【０２７５】
結論として、本発明の研究は、プロテオミクス分析を通して脳卒中患者の脳微小透析液を調査した。質的な結果は、ヒト脳由来の微小透析液及び細胞外液の広範囲なプロテオームマップを提供した。さらに、ヒト虚血脳のいくつかのエリアの微小透析液の定量的比較は、脳血管疾患についてのバイオマーカーの有益な供給源を提供することが示された。増加したタンパク質のいくつかのものは、対照及び脳卒中患者の小さなコホートの血液試料に対して検証された。発見及び初期の検証データの間の相関は、発見されたタンパク質の多くが、脳卒中及び他の急性脳損傷関連障害の診断及び／又は予後判断についてのバイオマーカーに相当することを実証した。
【実施例６】
【０２７６】
脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化
急性虚血発作患者のインビボヒト脳細胞外液（ＥＣＦ）は、脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化を評価するために調査した。虚血発作を患っている患者の梗塞中心部（ＩＣ）、ペナンブラ（Ｐ）、及び無影響の対側（ＣＴ）脳領域からの微小透析液（ＭＤ，microdialysate）は、アイソバリックタギング及び質量分析（ＭＳ）に基づいて、ショットガンプロテオミクスアプローチを使用して比較した。定量分析は、ＣＴ試料と比較して、ＩＣ又はＰにおいて量が増加した５３のタンパク質を示した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ（ＧＳＴＰ１）、ペルオキシレドキシン−１（ＰＲＤＸ１）、及びタンパク質Ｓ１００−Ｂ（Ｓ１００Ｂ）は、無関係な対照及び脳卒中患者（ｎ＝２８）の血液に対するＥＬＩＳＡを用いてさらに評価した。８、２０、及び１１倍の有意な増加が、それぞれ見出された。まとめると、これらの結果は、虚血性障害に関連するＰ及びＩＣの間のＥＣＦタンパク質レベルにおける明らかな差異を実証した。さらに、ＰＲＤＸ１の評価は、血液脳卒中マーカーをさらに発見するための効率的な供給源としてＥＣＦの価値を目立たせた。
【０２７７】
脳卒中患者の微小透析試料採取は、地域の施設倫理委員会によって承認された。悪性中大脳動脈梗塞患者は、高カットオフ（１００ｋＤａ）大脳微小透析カテーテルを用いてモニターした。コンピューター断層撮影は、脳微小透析カテーテルの位置を確認するために使用した。ＭＤは、人工ＣＳＦ溶液による灌流後に５日間、１時間ごとに得た。プロテオミクス分析は、脳モニタリングの最初の２４時間の間に得た脳ＭＤについて実行した。２連アイソバリックTandem Mass Tag（ＴＭＴ）技術（Dayon, L., Hainard, A., Licker, V., Turck, N., Kuhn, K., Hochstrasser, D. F., Burkhard, P. R., and Sanchez, J. C. (2008) Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931）は、脳卒中を患っている６人の患者の２つの脳領域由来のトリプシン消化抽出物を標識するために使用した（図９）。標識に続いて、プールした試料は、オフゲル電気泳動（ＯＧＥ，off-gel electrophoresis）によって最初に分画した。次いで、画分は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）及びマトリックス支援レーザー脱離タンデム飛行時間（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ）ＭＳによって分析した（図１０）。タンパク質の同定及び定量化は、Swiss-ProtヒトデータベースにおいてPhenyx検索を使用して、ストリンジェントな基準を用いて評価した。
【０２７８】
免疫ブロット検証は、ＧＳＴＰ１について実行した。プールしたＩＣ及びＣＴ  ＭＤ（ｎ＝３）は、１−Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１５％）を用いて分離した。免疫検出は、抗ヒトＧＳＴＰ１ウサギポリクローナル抗体を用いて実行した。Ｓ１００Ｂ、ＧＳＴＰ１、及びＰＲＤＸ１は、対照及び脳卒中患者（ｎ＝２８）の血液のＥＬＩＳＡを用いてさらに検証した。Ｓ１００Ｂ及びＰＲＤＸ１は、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して検証した。ＧＳＴＰ１に関して、現在入手可能な市販のアッセイがなかったので、手製のサンドイッチを、（Burgess, J. A., Lescuyer, P., Hainard, A., Burkhard, P. R., Turck, N., Michel, P., Rossier, J. S., Reymond, F., Hochstrasser, D. F., and Sanchez, J. C. (2006) Identification of brain cell death associated proteins in human post-mortem cerebrospinal fluid. J. Proteome Res. 5, 1674-1681、Hainard, A., Tiberti, N., Robin, X., Lejon, V., Ngoyi, D. M., Matovu, E., Enyaru, J. C., Fouda, C., Ndung'u, J. M., Lisacek, F., Muller, M., Turck, N., and Sanchez, J. C. (2009) A Combined CXCL10, CXCL8 and H-FABP Panel for the Staging of Human African Trypanosomiasis Patients. PLoS Neglected Tropical Diseases 3, e459）において以前に記載されるように開発した。
【０２７９】
微小透析は、生きている組織において生じる事象を連続的にモニターするための生物分析試料採取ツールである。それは、ＥＣＦのプローブに基づき、細胞外空間から内因性物質を採取するのを可能にし、これは、微小透析プローブの先端の半透性膜を通して拡散することができる。そのような技術は、多くの器官においてリアルタイムで生化学的マーカーを検索し、追うのにかなり適切である。ヒト脳ＭＤのプロテオミクス比較は、ＣＴ及びＰの対応物と比較して、ＩＣにおいて、有意に過剰に示されるタンパク質（２を上回る比で）を示した（図１０）。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びＳ１００Ｂなどのタンパク質は、脳損傷に関連することが既に報告されており、１つ又はいくつかのＩＣ  ＭＤにおいて増加するように思われた。図８は、２つのペルオキシレドキシンタンパク質についてＭＤにおいて観察された、タンパク質レベルの進展の例を示す。多くのタンパク質は、ＣＴからＰ及びＰからＩＣのＭＤで増加することが分かった。
【０２８０】
同様に、ＧＳＴＰ１における増加は、図２において例証されるように、プールしたＭＤ（ｎ＝３）における免疫ブロット実験を用いて検証した。
【０２８１】
血清におけるＳ１００Ｂ、ＧＳＴＰ１、及びＰＲＤＸ１のレベルはまた、１４人の脳卒中患者及び１４人の対照の血清におけるＥＬＩＳＡによっても測定し（図３）、虚血性脳卒中における血流の低下によって引き起こされた脳損傷の周辺のマーカーとしてそれらの有用性を実証した。
【０２８２】
ＧＳＴＰ１濃度は、対照と比較して、脳卒中患者の血液において著しく上昇することが分かった（ｐ＝０．０００２、ウィルコクソン順位和検定）。脳卒中患者及び対照の間の血液中の平均比は８．４７であった。血液ＰＲＤＸ１レベルは、ｐ＝０．０００１の有意水準で対照と脳卒中患者を区別するのを可能にした。約２０倍のそのレベルの増加が、脳卒中集団において観察された。以前の結果（Buttner, T., Weyers, S., Postert, T., Sprengelmeyer, R., and Kuhn, W. (1997) S-100 protein: Serum marker of focal brain damage after ischemic territorial MCA infarction. Stroke 28, 1961-1965、Missler, U., Wiesmann, M., Friedrich, C., and Kaps, M. (1997) S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke 28, 1956-1960）に一致して、血液Ｓ１００Ｂの濃度測定値は、対照よりも脳卒中患者において有意に高度であった（ｐ＝０．００９３）。
【０２８３】
本実施例は、プロテオミクス分析を用いて脳卒中患者の脳ＭＤを調査した。質的な結果は、ヒト脳由来の微小透析液及びＥＣＦの広範囲なプロテオームマップを提供した。さらに、ヒト脳のＩＣ、Ｐ、及びＣＴ部分のＭＤの定量的比較は、脳血管疾患についてのバイオマーカーの有益な供給源を提供することが示された。増加したタンパク質のいくつかのものは、対照及び脳卒中患者の小さなコホートに対して検証された。発見及び初期の検証データの間の相関は、脳卒中及び他の脳損傷関連障害の診断及び／又は予後判断についての本発明の工業的応用を実証した。
【実施例７】
【０２８４】
拡大パネルタンパク質の選択
急性虚血発作患者のインビボヒト脳細胞外液（ＥＣＦ）は、本明細書に記載されるように、脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化を評価するために以前に調査された。虚血発作を患っている患者の梗塞中心部（ＩＣ）、ペナンブラ（Ｐ）、及び無影響の対側（ＣＴ）脳領域からの微小透析液（ＭＤ）（ｎ＝６））は、アイソバリックタギング及び質量分析（ＭＳ）に基づいて、ショットガンプロテオミクスアプローチを使用して比較した。定量分析は、ＣＴ試料と比較して、ＩＣ又はＰにおいて量が増加した５３のタンパク質を示した。これらの結果は、虚血性障害に関連するＣＴ、Ｐ、及びＩＣの間のＥＣＦタンパク質レベルにおける明らかな差異を実証した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ（ＧＳＴＰ１）、ペルオキシレドキシン−１（ＰＲＤＸ１）、及びタンパク質Ｓ１００−Ｂ（Ｓ１００Ｂ）は、無関係な対照（ｎ＝１４）及び脳卒中患者（ｎ＝１４）の血液に対するＥＬＩＳＡを用いてさらに評価した。８（ｐ＝０．０００２）、２０（ｐ＝０．０００１）、及び１１倍（ｐ＝０．００９３）の有意な増加が、それぞれ見出された。これらは、血液脳卒中マーカーをさらに発見するための効率的な供給源としてＥＣＦの価値を目立たせた。
【０２８５】
ＧＳＴＰ−１及びペルオキシレドキシン１及び６は、脳卒中の管理のための有用なマーカーを示すが、本発明者らは、診断感度及び／若しくは特異性をさらに改善するため並びに／又は予後情報を提供するためのタンパク質のより大きなパネルを構築したかった。そのため、本発明者らは、ＭＤにおいて以前に見つけられた脳卒中バイオマーカー候補の立証及び検証を行った。
【０２８６】
候補タンパク質の包括的な生物情報学分析に従って、バイオマーカーの３つの群が、降順の優先度順に選択された。
パネルＡ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＡＣＢＰ＿ＨＵＭＡＮ    アシルＣｏＡ結合タンパク質
Ｎ°２    ＣＳＲＰ１＿ＨＵＭＡＮ  システイングリシンリッチタンパク質１
Ｎ°３    ＰＥＢＰ１＿ＨＵＭＡＮ  ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質１
Ｎ°４    ＤＤＡＨ１＿ＨＵＭＡＮ  Ｎ（Ｇ），Ｎ（Ｇ）−ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ１
Ｎ°５    ＭＴ３＿ＨＵＭＡＮ      メタロチオネイン−３（ＭＴ−３）
Ｎ°６    ＣＹＴＢ＿ＨＵＭＡＮ    シスタチン−Ｂ
パネルＢ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＰＰＩＡ＿ＨＵＭＡＮ    ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ
Ｎ°２    ＮＦＭ＿ＨＵＭＡＮ      ニューロフィラメントミディアムポリペプチド
Ｎ°３    ＵＢＩＱ＿ＨＵＭＡＮ    ユビキチン
Ｎ°４    Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ    ベータ−２−ミクログロブリン前駆物質
Ｎ°５    ＣＹＴＣ＿ＨＵＭＡＮ    シスタチンＣ前駆物質（シスタチン−３）
Ｎ°６    ＳＨ３Ｌ１＿ＨＵＭＡＮ  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチ様タンパク質
Ｎ°７    ＴＰＩＳ＿ＨＵＭＡＮ    トリオースリン酸イソメラーゼ
Ｎ°８    ＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ      ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
Ｎ°９    ＭＴ２＿ＨＵＭＡＮ      メタロチオネイン−２（ＭＴ−２，Metallothionein-2）
パネルＣ  ＩＤ                    説明
Ｎ°１    ＮＦＭ＿ＨＵＭＡＮ      ニューロフィラメントミディアムポリペプチド
Ｎ°２    ＣＯＴＬ１＿ＨＵＭＡＮ  コアクトシン様タンパク質
Ｎ°３    ＴＨＹ１＿ＨＵＭＡＮ    Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質前駆物質
Ｎ°４    ＰＲＯＦ１＿ＨＵＭＡＮ  プロフィリン−１
Ｎ°５    ＴＹＢ４＿ＨＵＭＡＮ    チモシンベータ−４
Ｎ°６    ＭＴ１Ｅ＿ＨＵＭＡＮ    メタロチオネイン−１Ｅ
Ｎ°７    ＦＡＢＰＢ＿ＨＵＭＡＮ  脂肪酸結合タンパク質、脳（Ｂ−ＦＡＢＰ）
Ｎ°８    ＧＦＡＰ＿ＨＵＭＡＮ    グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ，Glial fibrillary acidic protein）
Ｎ°９    ＣＡＨ２＿ＨＵＭＡＮ    カルボニックアンヒドラーゼ２
Ｎ°１０  ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ    セルロプラスミン前駆物質
Ｎ°１１  ＤＣＤ＿ＨＵＭＡＮ      ダームシジン前駆物質
Ｎ°１２  ＤＥＦ１＿ＨＵＭＡＮ    好中球デフェンシン１前駆物質（ＨＮＰ−１）
【０２８７】
ともに、パネルＡ、Ｂ、及びＣは、拡大パネルＡＢＣと呼ばれる拡大パネルを形成する。
【０２８８】
上記に報告される５３のバイオマーカー候補の中で、Ｎ（Ｇ）；Ｎ（Ｇ）−ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ１（ＤＤＡＨ１＿ＨＵＭＡＮ）、シスタチン−Ｂ（ＣＹＴＢ＿ＨＵＭＡＮ）、アシルＣｏＡ結合タンパク質（ＡＣＢＰ＿ＨＵＭＡＮ）、システイングリシンリッチタンパク質１（ＣＳＲＰ１＿ＨＵＭＡＮ）、メタロチオネイン−３（ＭＴ３＿ＨＵＭＡＮ）、並びにホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質１（ＰＥＰＢ１＿ＨＵＭＡＮ）（パネルＡ）を優先させた。
【実施例８】
【０２８９】
脳卒中バイオマーカー候補のシグネチャペプチドを測定するための選択反応モニタリング質量分析法
拡大パネルタンパク質の検証をさらに提供するために、単一タンパク質及び多重タンパク質アッセイを、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び質量分析（ＭＲＭ）法を使用して開発する。
【０２９０】
本実施例は、多重パネルを開発するためのＭＲＭの迅速な能力を実証する。本実施例では、本発明者らは、方法を例証するために使用する実施例７のパネルＡからタンパク質を選択した。しかしながら、この方法が、バイオマーカーのその特定のパネルに制限されるように意図されない。検出のある好都合なモードを実行する方法を理解するのを支援するために、バイオマーカーのこのパネルは便利なパネルとして使用されている。検出の同じモードは、単に本明細書で説明される方法に従うが、その代りに、開示される異なるパネル又は群のマーカーを使用することによって、本明細書において開示されるマーカーの任意の他の群について使用することができる。
【０２９１】
したがって、本実施例は、パネルＡの優先された脳卒中バイオマーカー候補のシグネチャペプチドを選択的に検出するための選択反応モニタリング（ＳＲＭ）  ＭＳに基づく方法の開発及び評価を示す。
【０２９２】
方法の設計
ＭＲＭ方法の設計は、最初に、それぞれのマーカータンパク質を代表する標的ペプチド（プロテオタイプペプチド）の選択を必要とする。第２のステップは、タンデム質量分析の間に親ペプチドの衡突解離において生じる特異的なペプチド断片の選択を含む。親及び娘イオンの質量電荷（ｍ／ｚ）比における差異は、トランジションとして知られている。
【０２９３】
インシリコアプローチは、それぞれの脳卒中バイオマーカー候補を代表するプロテオタイプトリプシンシグネチャペプチドを選択するために使用した。合計７、４、７、３、３、及び６のプロテオタイプシグネチャペプチドが、ＤＤＡＨ１、ＣＹＴＢ、ＡＣＢＰ（３つのアイソフォーム）、ＣＳＲＰ１、ＭＴ３、及びＰＥＰＢ１についてそれぞれ選択された。
【０２９４】
シグネチャペプチド選択は、ｉ）手製Proteotypeソフトウェアを用いて決定したヒトタンパク質データベース（UniProt Swiss-Prot）におけるペプチド配列の特有性、ii）関連するＭＳの検出のためのペプチド前駆イオンのｍ／ｚ値、iii）可能な場合、配列におけるシステイン及びメチオニン残基の非存在に基づく（下記の表１４）。
【０２９５】
【表１８】
2013531784.tif 000046
2013531784.tif 000047
2013531784.tif 000048
【０２９６】
それぞれのペプチドについての最も適切なトランジションの選択を支援するために、タンデム質量スペクトルの公的なリポジトリ（Peptide Atlas［http://www.peptideatlas.org/］）中及び／又は前の発見のための作業（上記に記載）の間のペプチドの以前の経験的観察を再検討した。
【０２９７】
好ましいが、非限定的な方法として、いわゆる第一及び第二のトランジションの組み合わせからなるインテリジェントＳＲＭ（intelligent SRM）（ｉＳＲＭ）法を設定した。そのようなアプローチにおいて、所与のペプチドに関連のある第一のトランジションがすべて、定められる閾値を超えて検出される場合、次いで、第二のトランジションは、標的分子の同一性を確認するのを支援するために引き起こされる。本明細書で、アプローチは、アッセイにおいて連続的にモニターされ、かつ特定のマトリックスにおいてペプチド検出レベルを評価するためのトランジションの数を低下させることを目標とした。表１５において報告されるように、２つの第一のトランジション及び６つの第二のトランジションを選択した。
【０２９８】
【表１９】
2013531784.tif 000049
2013531784.tif 000050
2013531784.tif 000051
2013531784.tif 000052
2013531784.tif 000053
2013531784.tif 000054
2013531784.tif 000055
2013531784.tif 000056
2013531784.tif 000057
【０２９９】
データが入手可能ではなかった場合、SRM Atlas又はPinpointソフトウェア（Thermo Scientific社）からの予測を、トランジションを選ぶために使用した。その場合、表１５において報告されるように、４つの第一のトランジション及び４つの第二のトランジションを選択した。それぞれの前駆イオンについてのＳ−レンズパラメーターは、ｍ／ｚ値及び以前の実験データに従って設定した。衝突エネルギーは、あらかじめ定められた計算を使用してPinpointによって決定した。選んだサイクル時間は、８０の第一のトランジションをモニターするために１．６秒とした。合計２４０のトランジションを、３０のシグネチャペプチドをモニターするために使用した。引き起こされたトランジションのスキャン時間は、０．２秒とした。ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ質量分析計（Thermo Scientific社）は、０．７のＱ１ピーク幅（ＦＷＨＭ）及び１．２ｍＴｏｒｒの衝突セルにおけるアルゴン圧力を使用して使用した。陽イオン化を使用した。キャピラリー温度、気化器、シースガス、及び補助ガスは、最大のイオン感度のために最適化した。
【０３００】
逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）分離は、ＭＳの前に実行した。ペプチド分離は、３０％ＣＨ３ＣＮの１３．２５分間の勾配により１００μＬ／分で５０×１ｍｍのカラム上で生じた。Finnigan Surveyor MS Pump Plus LC system（Thermo Scientific）を使用した。
【０３０１】
方法の試験
より容易に入手可能な試料中の標的タンパク質の存在を実証するために、開発したＭＲＭ方法は、トリプシンを用いて消化したヒト血漿試料に対して評価した。手短に言えば、３０μＬの容量の血漿（Dade Behring社）を、１６８０μＬトリエチルアンモニウム炭酸水素バッファー（ＴＥＡＢ）  １００ｍＭ及び９０μＬ硫酸ドデシルナトリウム１％に添加した。還元は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンハイドロクロライド２０ｍＭ（９５．４μＬ）を用いて１時間、５５℃で実行した。次いで、９０μＬの容量のヨードアセトアミド１５０ｍＭを、室温で、暗中で、１時間の反応のために添加した。１８０μＬの容量の、ＴＥＡＢ中０．４μｇ／μＬのトリプシン（Promega社）を添加した。消化は、３７℃で一晩実行した。試料精製は、Hypersep C18 500 mg（Thermo Scientific社）を用いて最初に実行した。強力な陽イオン交換カートリッジは、さらなる精製のために使用した。試料は、３つのアリコートに分割した。アリコートは、ＲＰ−ＬＣ  ＳＲＭ分析前に５００μＬ  ３％ＣＨ３ＣＮ、０．２％ギ酸、０．２ｍｇ／ｍｌグルカゴン中で再懸濁した。ＲＰ−ＬＣ  ｉＳＲＭ分析につき、２０μＬを使用した。データ分析は、Ｐｉｎｐｏｉｎｔを使用して実行した。
【０３０２】
図１１〜１６は、タンパク質ＤＤＡＨ１、ＣＹＴＢ、ＣＳＲＰ１、及びＰＥＢＰ１を代表するシグネチャペプチドＤＥＮＡＴＬＤＧＧＤＶＬＦＴＧＲ、ＴＰＥＥＹＰＥＳＡＫ、ＳＱＶＶＡＧＴＮＹＦＩＫ、ＧＹＧＹＧＱＧＡＧＴＬＳＴＤＫ、ＧＬＥＳＴＴＬＡＤＫ、及びＬＹＥＱＬＳＧＫのトランジションのｉＳＲＭシグナルのクロマトグラムを示す。
【０３０３】
したがって、本明細書において開発したＳＲＭ法は、６つの脳卒中バイオマーカー候補を代表する３０のシグネチャペプチドのモニタリングを可能にすることが実証される。方法応用可能性の原理証明は、トリプシンを用いて消化した血漿試料において実証した。方法は、いくつかの試料マトリックスに応用することができ得る。
【０３０４】
本実施例における実証は、パネルＡのマーカーを使用して実行した。上記に述べるように、これは、検出のこのモードの例証となる。検出のこのモードは、本文において開示される任意の他のマーカー又はマーカーの群に同様に適用することができる。検出のこのモードに従ってそれらの他のマーカーを使用して、本発明を使用するために、当業者は、上記に示される手引きに単純に従うが、パネルＡのマーカーを彼らが選択した他のマーカーと置き換えるであろう。
【０３０５】
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【０３０６】
上記の本明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される態様及び実施形態の様々な変更及び差異は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、特許請求に係る本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことを理解されたい。実際、当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な変更は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2013531784.tif 000058
【図２】
2013531784.tif 000059
【図３】
2013531784.tif 000060
【図４−１】
2013531784.tif 000061
【図４−２】
2013531784.tif 000062
【図４−３】
2013531784.tif 000063
【図４−４】
2013531784.tif 000064
【図５】
2013531784.tif 000065
【図６】
2013531784.tif 000066
【図７−１】
2013531784.tif 000067
【図７−２】
2013531784.tif 000068
【図７−３】
2013531784.tif 000069
【図７−４】
2013531784.tif 000070
【図８】
2013531784.tif 000071
【図９】
2013531784.tif 000072
【図１０】
2013531784.tif 000073
【図１１】
2013531784.tif 000074
【図１２】
2013531784.tif 000075
【図１３】
2013531784.tif 000076
【図１４】
2013531784.tif 000077
【図１５】
2013531784.tif 000078
【図１６】
2013531784.tif 000079
【配列表】
2013531784000001.app
【国際調査報告】
2013531784.tif 000080
2013531784.tif 000081
2013531784.tif 000082
2013531784.tif 000083
2013531784.tif 000084
2013531784.tif 000085
2013531784.tif 000086
2013531784.tif 000087