(57)【要約】代替の実施態様において、本発明は、例えば薬物スクリーニングまたは毒性試験のための、細胞および小分子または薬物のような化合物を含む、アレイまたはマイクロアレイのような製品を提供する。一実施形態において、本発明は、細胞の付着を防止もしくは阻害するか、または細胞の付着を維持することができない表面、被膜またはコーティングを実質的に含む、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を含む製品を提供する。
2013536440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の付着を防止もしくは阻害するか、または細胞の付着を維持することができない表面、被膜またはコーティングを実質的に含む、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を含む製品であって、
該表面、該被膜または該コーティングは、複数のスポットまたは境界が定められた領域であって、１つの細胞または複数の細胞が該スポットまたは該境界が定められた領域に付着し得る、複数のスポットまたは境界が定められた領域を含み、
ここで必要に応じて、細胞の付着を防止または阻害する該表面、該被膜または該コーティングは、ポリアクリルアミドもしくはヒドロゲル、またはポリアクリルアミドでコーティングされた表面もしくはヒドロゲルでコーティングされた表面を含み、そして
必要に応じて、表面、被膜またはコーティングを含む、該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体の表面は、ポリアクリルアミドでコーティングされたかまたはヒドロゲルでコーティングされたガラスまたはスライドガラスであり、そして
必要に応じて、ヒドロゲルでコーティングされたガラスまたはスライドガラスを、配置またはプリントする工程の前に脱水し、そして
必要に応じて、該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体は、ガラスまたは同等物を含むか、またはそれから成り、そして必要に応じて該ポリアクリルアミドまたは該ヒドロゲルは、シラン活性化ガラスまたはスライドガラスに架橋され、そして
必要に応じて、１つの細胞または複数の細胞が付着し得る、複数の該スポットまたは該境界が定められた領域は、複数の該スポットまたは該境界が定められた領域への該細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る、１つまたはそれより多い組成物または組成物の混合物を含み（そして必要に応じて、該細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る、１つまたはそれより多い該組成物を含む、該スポットまたは該境界が定められた領域は、細胞の付着を防止または阻害する該表面または該被膜または該コーティング上ではなく、該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体に直接結合した、１つまたはそれより多い該組成物を有する）、そして
必要に応じて、該細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い該組成物は、例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、１つまたはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物または分子の混合物を含み、そして
必要に応じて、該細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞であり、そして
必要に応じて、該製品は、アレイまたはマイクロアレイを含むか、またはそれらから成るか、またはそれらとして製造される、
製品。
【請求項２】
製品であって、該製品は、以下：
（ａ）化合物、薬物、小分子、または小分子薬物、および重合し得るモノマー溶液を提供する工程；
（ｂ）固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を提供する工程；
（ｃ）（ｉ）該化合物、該薬物、該小分子、または該小分子薬物、および該モノマー溶液を混合し、そして必要に応じてまた該モノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を含ませ（またはそれらと混合し）、そしてその混合物を、該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体の表面の複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に配置またはプリントする工程、あるいは
（ｉｉ）該化合物、該薬物、該小分子、または該小分子薬物を、該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体の表面の、複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に配置またはプリントし、続いて実質的に配置またはプリントされた化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のスポットまたはプリントそれぞれの上に（それらの頂部に）、重合し得るモノマー溶液を配置またはプリントする工程であって、ここで必要に応じて：
（３）該モノマー溶液は最初に、該モノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を含み、そして該モノマー溶液を、該配置またはプリントする工程の後に重合させ、
（４）該モノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を、実質的に配置またはプリントされた化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のスポットまたはプリントそれぞれの上に（それらの頂部に）配置またはプリントして、該モノマーの重合を開始または触媒する、工程、あるいは
（ｉｉｉ）該固体担体、該半固体担体、該ゲルまたはゲル様担体、該コロイド状担体または該ゾル−ゲル担体の表面の複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に、該化合物、該薬物、該小分子または該小分子薬物を配置またはプリントし、そして該モノマー溶液を外部の供給源によって、例えば紫外光のような光放射、または熱への曝露によって重合するよう誘発する工程；
を包含する方法によって作製され、
ここで必要に応じて、各化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のための該境界が定められた、配置またはプリントされる領域は、およそ約０．０１ｍｍ２および０．０５ｍｍ２の間、またはおよそ約０．０２ｍｍ２および０．０４ｍｍ２の間、またはおよそ０．０３ｍｍ２であり；そして
必要に応じて、該混合物または該モノマーを配置またはプリントする工程を、インクジェットプリンターまたは同等物、または液体取扱いロボットによって行い、そして
必要に応じて、該化合物、該薬物、該小分子、または該小分子混合物の溶液を、望ましい濃度で調製するか、および／またはプレポリマー溶液と混合するか、または封入脂質、リポソーム、または粒子、またはナノ封入粒子中で調製し、そして
必要に応じて、該溶液を、マイクロアレイロボットを用いて、脱水したゲルスライドに直接プリントし得るか；または該化合物、該薬物、該小分子、または該小分子薬物／プレポリマーまたは封入された該化合物、該薬物、該小分子、または該小分子薬物の溶液を、脱水したゲルスライドにプリントし得る、製品。
【請求項３】
請求項１および／または請求項２に記載の製品の組み合わせを含むか、複数の請求項１および／または請求項２に記載の製品を含む、製品。
【請求項４】
前記製品が、複数の前記スポット、前記プリント、または前記境界が定められた領域への前記細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物を配置またはプリントする工程を包含する方法によって作製される担体表面をさらに含み、そして必要に応じて該細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い該組成物は、例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、１つまたはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物、または分子の混合物、またはその混合物、またはその同等物を含む、請求項２に記載の製品。
【請求項５】
前記製品が、細胞または複数の細胞を、複数の前記スポット、前記プリント、または前記境界が定められた領域に置くか、または配置またはプリントすることを含み、複数の該スポット、該プリント、または該境界が定められた領域は、それらの上に層状になった、該細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物を有する、請求項４に記載の製品。
【請求項６】
化合物、薬物、小分子、または小分子薬物が、細胞に対して任意または所望の効果または細胞応答を有するか否かを決定するための方法であって、該方法は：
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の（「テスト」）製品（例えばアレイ、マイクロアレイ）上で、（例えば、該細胞に対する任意または所望の効果または細胞応答に関して）細胞を測定または観察する工程（ここで、該製品は、化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む）、ならびに
必要に応じて、「コントロール」製品上で同じ細胞を比較する工程を包含し、ここで、該「コントロール」製品は、請求項１から５のいずれか一項に記載の製品と同じであるが、該「コントロール」製品が：化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含まない；異なる化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む；該細胞に対して異なる効果を有することが公知である化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む；または該「テスト」製品と同じ化合物、薬物、小分子、または小分子薬物であるが異なる濃度で含み；
（ｂ）（ａ）の方法であって、ここで細胞に対する該任意または所望の効果または細胞応答は、細胞死（例えばアポトーシス）、生体分子（例えばタンパク質、脂質、多糖類、核酸等）の分泌、増殖（例えば有糸分裂）、細胞−細胞相互作用、細胞表面のポリペプチド代謝回転またはリサイクリング、小胞の放出、膜脱分極、イオン（例えばナトリウム、カルシウム、またはカリウム）の細胞内変動または細胞膜を横切る移動等を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に薬物の開発および生化学に関連する。代替の実施態様において、本発明は、例えば薬物スクリーニングまたは毒性試験のための、細胞および小分子または薬物のような化合物を含む、アレイまたはマイクロアレイのような、製品を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来のハイスループット小分子スクリーニングを、マルチウェル形式で液体取扱いロボットを用いて行う。典型的には、細胞をマルチウェルプレート、例えば９６から３４５６ウェルで培養する；そして小分子を各ウェルに加える。各ウェルの単位培養面積（例えば３４５６ウェルプレートに関して）は、各化合物に関して約３ｍｍ２である。高価な液体取扱いロボットが、大規模スクリーニングのために必要である。各試験は、１μｌの化合物を必要とする。
【０００３】
従来のマイクロアレイ薬物スクリーニングは、ポリ（ｄｌ−ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）中でスライドガラスに薬物を固定し、次いでスライド全体を覆って細胞をまく。有効な薬物は細胞の生存および増殖に干渉し、細胞の無いスポットを生じる。しかし、スライド全体を覆うために、より多数の細胞を必要とする。各スポットの間に障壁は存在しないので、細胞は自由に１つのスポットから別のスポットへ移動する。異なるスポットによって影響された細胞が相互作用し得、そしてより独立性の低い実験を生じる。障壁の欠如はまた、より画定されていない読み取り領域を生じ、定量をより困難に、そして不正確にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
代替の実施態様において、本発明は、アレイまたはマイクロアレイを含む、またはそれらから成る製品、およびそれらを作製および使用する方法を提供する。代替の実施態様において、本発明は、アレイまたはマイクロアレイを作製する方法を提供し、そして本発明の製品は、本発明の方法によって作製したアレイまたはマイクロアレイを含む。
【０００５】
代替の実施態様において、本発明は、以下：
細胞の付着を防止もしくは阻害するか、または細胞の付着を維持することができない表面または被膜（ｃｏａｔ）（またはコーティング）を実質的に含む、固体担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を含む製品を提供し、そして
その表面または被膜（またはコーティング）は、細胞をそこに付着し得る、複数のスポットまたは境界が定められたかもしくは画定された領域を含み、
ここで必要に応じて、細胞の付着を防止または阻害するその表面または被膜（またはコーティング）は、ポリアクリルアミドもしくはヒドロゲル、またはポリアクリルアミドでコーティングされた表面もしくはヒドロゲルでコーティングされた表面、またはその組み合わせを含み、そして
必要に応じて、表面または被膜（またはコーティング）を含む、その固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体の表面は、ポリアクリルアミドでコーティングされたかまたはヒドロゲルでコーティングされたガラスまたはスライドガラスを含むか、またはそれらであり、そして
必要に応じて、ヒドロゲルでコーティングされたガラスまたはスライドガラスを、配置（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）またはプリントする工程の前に脱水し、そして
必要に応じて、その固体担体または半固体担体は、ガラスまたは同等物を含むか、またはそれらから成り、そして必要に応じてそのポリアクリルアミドまたはヒドロゲルは、シラン活性化ガラスまたはスライドガラスに架橋され；そして
必要に応じて、１つの細胞または複数の細胞が付着し得る複数のスポットまたは境界が定められた領域は、その複数のスポットまたは境界が定められた領域への細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る、１つまたはそれより多い組成物または組成物の混合物を含み（そして必要に応じて、細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る、１つまたはそれより多い組成物を含む、スポットまたは境界が定められた領域は、細胞の付着を防止または阻害する表面または被膜またはコーティング上ではなく、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体に直接結合した、１つまたはそれより多い組成物または組成物の混合物を有する）、そして
必要に応じて、細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物は、例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、１つまたはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物または分子の混合物を含み、そして
必要に応じて、その細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【０００６】
代替の実施態様において、その製品は、アレイまたはマイクロアレイを含むか、またはそれらから成るか、またはそれらとして製造される。
【０００７】
代替の実施態様において、本発明は、以下：
（ａ）化合物、薬物、小分子、または小分子薬物、および重合し得るモノマー溶液を提供する工程；
（ｂ）固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を提供する工程；
（ｃ）（ｉ）化合物、薬物、小分子、または小分子薬物、およびモノマー溶液を混合し、そして必要に応じてまたモノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を含ませ（またはそれらと混合し）、そしてその混合物を、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体の表面の複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に配置またはプリントする工程、あるいは
（ｉｉ）化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体の表面の、複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に配置またはプリントし、続いて実質的に配置またはプリントされた化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のスポットまたはプリント（ｐｒｉｎｔ）それぞれの上に（それらの頂部に）、重合し得るモノマー溶液を配置またはプリントする工程であって、ここで必要に応じて：
（１）そのモノマー溶液は最初に、モノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を含み、そしてそのモノマー溶液を、配置またはプリントする工程の後に重合させ、
（２）モノマーの重合を開始および／または触媒し得る第２の溶液または組成物を、実質的に配置またはプリントされた化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のスポットまたはプリントそれぞれの上に（それらの頂部に）配置またはプリントして、モノマーの重合を開始または触媒する、工程、あるいは
（ｉｉｉ）固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体の表面の複数の境界が定められた領域（例えば、スポット）に、化合物、薬物、小分子または小分子薬物を配置またはプリントし、そしてモノマー溶液を外部の供給源によって、例えば紫外光のような光放射、または熱への曝露によって重合するよう誘発する工程；
を包含する方法によって作製された製品を提供し、
ここで必要に応じて、各化合物、薬物、小分子、または小分子薬物のための配置またはプリントされた領域は、およそ約０．０１ｍｍ２および０．０５ｍｍ２の間、またはおよそ約０．０２ｍｍ２および０．０４ｍｍ２の間、またはおよそ０．０３ｍｍ２であり；そして
必要に応じて、その混合物またはモノマーの配置またはプリントする工程を、インクジェットプリンターまたは同等物、または液体取扱いロボットによって行い、そして
必要に応じて、その化合物、薬物、小分子、または小分子混合物の溶液を、望ましい濃度で調製するか、および／またはプレポリマー溶液と混合するか、または封入脂質（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ）、リポソーム、または粒子、またはナノ封入粒子（ｎａｎｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）中で調製し、そして
必要に応じて、その溶液を、マイクロアレイロボットを用いて、脱水したゲルスライドに直接プリントし得るか；またはその化合物、薬物、小分子、または小分子薬物／プレポリマーまたは封入された化合物、薬物、小分子、または小分子薬物の溶液を、脱水したゲルスライドにプリントし得る。
【０００８】
代替の実施態様において、その製品は、アレイまたはマイクロアレイを含むか、またはそれらから成るか、またはそれらとして製造される。
【０００９】
代替の実施態様において、本発明は、本発明の製品の組み合わせ、または複数の本発明の製品を含む製品を提供する。
【００１０】
代替の実施態様において、本発明の製品はさらに、複数のスポット、プリント、または境界が定められた領域への細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物を配置またはプリントする工程を包含する方法によって作製される担体表面を含み、そして必要に応じて細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物は、例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、１つまたはそれより多い細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物、または分子の混合物、またはその混合物、またはその同等物を含む。
【００１１】
代替の実施態様において、本発明の製品はさらに、細胞または複数の細胞を、複数のスポット、プリント、または境界が定められた領域に置くか、または配置またはプリントすることを含み、その複数のスポット、プリント、または境界が定められた領域は、それらの上に層状になった、細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る１つまたはそれより多い組成物、例えば、例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、タンパク質および／または多糖類を含む細胞外マトリックス成分、および／または細胞外マトリックス様組成物または、分子の混合物、またはその混合物、またはその同等物を有する。
【００１２】
代替の実施態様において、本発明は、化合物、薬物、小分子、または小分子薬物が、細胞に対して任意または所望の効果または細胞応答を有するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）項目１から５のいずれかに記載の（「テスト」）製品（例えばアレイ、マイクロアレイ）上で、（例えば細胞に対する任意または所望の効果または細胞応答に関して）細胞を測定または観察する工程（ここでその製品は、化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む）、ならびに
必要に応じて、「コントロール」製品上で同じ細胞を比較する工程を包含し、ここで、この「コントロール」製品は、項目１から５のいずれかに記載の製品と同じであるが、この「コントロール」製品が：化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含まない；異なる化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む；細胞に対して異なる効果を有することが公知である化合物、薬物、小分子、または小分子薬物を含む；または「テスト」製品と同じ化合物、薬物、小分子、または小分子薬物であるが異なる濃度で含み；
（ｂ）（ａ）の方法であって、ここで細胞に対する任意または所望の効果または細胞応答は、細胞死（例えばアポトーシス）、生体分子（例えばタンパク質、脂質、多糖類、核酸等）の分泌、増殖（例えば有糸分裂）、細胞−細胞相互作用、細胞表面のポリペプチド代謝回転またはリサイクリング、小胞の放出、膜脱分極、イオン（例えばナトリウム、カルシウム、またはカリウム）の細胞内変動または細胞膜を横切る移動等を含む。
【００１３】
１つまたはそれより多い本発明の実施態様の詳細を、添付の図面および下記の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点が、その説明および図面から、および請求の範囲から明らかになる。
【００１４】
本明細書中で引用された全ての刊行物、特許、特許出願は、全ての目的のために参考として本明細書中で明白に援用される。
【００１５】
本明細書中で示す図は、本発明の実施態様の説明であり、そして請求の範囲によって包含される本発明の範囲を制限することを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、下記の実施例１で議論されるような、本発明の代表的な小分子マイクロアレイを製造するための代表的なプロトコールを模式的に説明する。
【図２】図２は、下記の実施例１で議論されるような、本発明の代表的な小分子マイクロアレイを製造するための代表的なプロトコールを模式的に説明する。
【図３】図３は、小分子を本発明の製品に付着させるための代表的なプロトコールを模式的に説明し、ここで下記の実施例１で議論されるように、その分子を、ポリアクリルアミドゲル担体の上の最初の層に示されるマイクロアレイにプリントする。
【図４】図４は、本発明の代表的な組成物（製品）を説明し、ここでＡおよびＢにおけるスポットの最初の２行は、固定化された蛍光性小分子のスポットであり、ここで第２の２行は固定化されていない；下記の実施例１で議論するように、図４Ａは、媒体溶液に沈める前の蛍光性小分子を示し、そして図４Ｂは、媒体溶液に沈めてから１０分後の蛍光性小分子を示す。
【図５】図５は、本発明の代表的な組成物（製品）を説明し、ここで下記の実施例１で議論するように、媒体溶液に沈めながら、様々な時点で固定化小分子マイクロアレイの蛍光強度を画像化する、図５Ａ；次いで図５Ｂにおいてグラフで示すように、蛍光強度の変化をプロットする。
【図６】図６は、本発明の代表的な組成物（製品）を説明し、ここで下記の実施例１で議論するように、図６Ｂに示すような蛍光抗癌剤ドキソルビシンを、図６Ａに示すように、様々な濃度で、代表的なマイクロアレイにプリントする。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【００１８】
ここで、本発明の様々な代表的な実施態様に対して詳細に言及し、その実施例を添付の図面において示す。以下の詳細な説明は、読者に本発明の局面および実施態様のある詳細のより良い理解を与えるために提供され、そして本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。
【００１９】
代替の実施態様において、本発明は、実質的に、細胞の付着を防止する、または細胞の付着を維持することができない表面、被膜、またはコーティングを含む、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を含むアレイまたはマイクロアレイを含む、またはそれらから成る製品を提供し、そしてその表面、被膜、またはコーティングは、１つの細胞または複数の細胞を付着し得る複数のスポットまたは境界が定められた領域を含む。
【００２０】
代替の実施態様において、本発明は、実質的に複数のプリントまたはスポットを含む、固体担体、半固体担体、ゲルまたはゲル様担体、コロイド状担体またはゾル−ゲル担体を含むアレイまたはマイクロアレイを含む、またはそれらから成る製品を提供し、ここで実質的に各プリントまたはスポットは、
細胞の付着を阻害するか、または細胞の付着を維持もしくは促進しない組成物（例えばポリアクリルアミドまたは同等物）を含む、それ自体層状（単層または多層）であり得る、固体表面、半固体表面、ゲルまたはゲル様表面、コロイド状表面またはゾル−ゲル表面上の最初の層として、必要に応じてポリマー（例えば重合化したモノマー）に埋め込まれた、固定化小分子（例えば薬物）を含む（１つの代替の実施態様において、小分子がプリントまたは配置された、境界が定められた領域またはスポットは、細胞の付着を阻害するか、または細胞の付着を維持もしくは促進しない組成物、例えばポリアクリルアミドまたは同等物を有さない）；ならびに
第２の層として、細胞の付着を促進、開始、および／または維持し得る組成物；ならびに
第３の層として、１つの細胞または複数の細胞
を含む、多層の「サンドイッチ」を含み、ここで必要に応じてその細胞は患者の細胞、例えば正常な細胞または異常な細胞、例えば癌細胞である。
【００２１】
代替の実施態様において、本発明は、小分子（複数の小分子）または他の化合物を、例えば少数の細胞を用いた、小分子または他の化合物およびその組み合わせの効果のスクリーニング、例えばハイスループットスクリーニングのための、アレイ（例えばマイクロアレイ）形式で固定化するための方法を含む。固定化のために使用するポリマーを操作することによって、細胞に放出される小分子の量およびタイミングを調節し得る。重合および架橋鎖の量、使用する鎖の型、その鎖によって作られるメッシュ（またはメッシュ状アレイ）の幾何学的形状、ゲルポリマーの化学的特性、ポリマーの分解、および／または異なる特性を有するポリマーの層のような、ポリマーの特性を変えることによって、徐放性メカニズムを達成し得る。代替の実施態様において、徐放性メカニズムを達成するための他の方法は、固定化した薬物放出ナノカプセルまたはナノ粒子、および／または微粒子の組込みを含む。
【００２２】
代替の実施態様において、細胞の応答、例えば望ましい細胞応答を誘発する、個々の化合物または化合物混合物を同定し得る。代替の実施態様において、誘発される細胞応答は、細胞死（例えばアポトーシス）、生体分子（例えばタンパク質、脂質、多糖類、核酸等）の分泌、増殖（例えば有糸分裂）、細胞−細胞相互作用、細胞表面のポリペプチド代謝回転またはリサイクリング、小胞の放出、膜脱分極等を含む。
【００２３】
代替の実施態様において、本発明の製品の使用（適用）は、以下を含む：
・患者の正常な細胞、発生中の細胞、および／または罹患した細胞または感染細胞に対する、薬物およびその組み合わせの効果をスクリーニングすることによる、個別化治療
・患者の正常な細胞、発生中の細胞、および／または罹患した細胞または感染細胞に対する効果、例えば望ましい効果、または有害作用に関する個別化スクリーニング
・少量の細胞および化合物を用いた、ハイスループット小分子スクリーニング。
【００２４】
代替の実施態様において、本発明の製品の使用は、従来の方法と比較して、ハイスループット薬物スクリーニングに必要な細胞の数および小分子化合物の量を、有意に低減し得る。例えば、１つの実施態様において、本発明のアレイ（例えばマイクロアレイ）形式は、各小分子に関して、約３ｍｍ２の伝統的な単位培養面積の１／１００未満である、約０．０３ｍｍ２の培養面積を使用し、従って必要な細胞数を１／１００未満に低減する。結果として、この実施態様は、１人の患者由来の限られた細胞を用いた薬物スクリーニングを可能にし、従って個別化治療デザインの基礎を提供する。１つの実施態様において、本発明のアレイ（例えばマイクロアレイ）形式は、スクリーニングされる非常に少量の化合物、例えば１回のテストあたり１（１）ナノリットル（ｎｌ）、すなわち、１（１）マイクロリットル（μｌ）の従来の体積に対して１／１０００を使用する。
【００２５】
代替の実施態様において、本発明の製品は、徐放性メカニズムを含む；例えば細胞に曝露させる化合物の量およびタイミングを、徐放性メカニズムによって調節し得る。代替の実施態様において、このことは、重合および架橋鎖の量、鎖の型、その鎖によって作られるメッシュの幾何学的形状、ゲルポリマーの化学的特性、ポリマーの分解、異なる特性を有するポリマーの層等のような、アレイ（例えばマイクロアレイ）ポリマーの特性を変えることによって行われる。
【００２６】
代替の実施態様において、本発明の製品は、非細胞付着担体、細胞外マトリックスタンパク質スポットおよび「薬物スポット」を含む；例えば、非細胞付着担体は、細胞の事実上の障壁を提供し得る。１つの実施態様において、細胞は、細胞外マトリックスタンパク質のスポットにのみ存在する。これは、十分に画定された読み取り領域を提供し得る。「薬物スポット」および「細胞外マトリックス」スポットは、様々な目的のために様々なサイズを有し得る。
【００２７】
１つの実施態様において、個々のスポット上の細胞は、他のスポット上の細胞から十分に隔離されている；このことは細胞が１つのスポットから別のスポットへ移動すること、またはスポット間の相互作用を防止し、そして各スポットからより信頼性高く、そして独立した結果を提供する。これは、以前の小分子マイクロアレイ法と比較して有意に異なる。
【００２８】
ロボットおよびマルチウェルスクリーニング
本発明のハイスループット小分子スクリーニング
まず細胞の付着を妨げる担体を選択する。１つの実施態様は、ポリアクリルアミドまたはヒドロゲルでコーティングされたスライドガラスを含む。そのガラス表面を、まずシランを用いて活性化し得る。ポリアクリルアミドまたはヒドロゲルを、シラン活性化スライドガラスに架橋し得る。そのヒドロゲルでコーティングされたスライドを、マイクロアレイのプリントの前に脱水し得る。従って、１つの実施態様において、本発明の製品は、シラン活性化表面を有する、ポリアクリルアミドまたはヒドロゲルでコーティングされたスライドガラスを含む。
【００２９】
次に、化合物または化合物混合物の溶液を、望ましい濃度で調製し得るか、および／またはプレポリマー溶液と混合し得るか、またはナノ封入粒子中に調製し得る。その溶液を、マイクロアレイロボットを用いて、脱水したゲルスライド上に直接プリントし得るか；または化合物／プレポリマーまたは封入化合物溶液を、脱水したゲルスライド上にプリントし得る。純粋なプレポリマー溶液を、化合物／化合物混合物の頂部にプリントし得、そして重合を誘発して化合物を固定化し得る。様々なポリマー化学または封入を、望ましい薬物保持および放出パラメーターを有するようにデザインし得る。
【００３０】
代替の実施態様において、本発明の製品は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。その細胞外マトリックスタンパク質を、化合物アレイの頂部にプリントし得、細胞が付着することを可能にする。
【００３１】
代替の実施態様において、細胞を、アレイ、例えば細胞外マトリックスタンパク質表面を有するアレイにまく。代替の実施態様において、そのアレイスポット上の細胞は、細胞外マトリックスタンパク質表面に付着し得る。
【００３２】
望ましい細胞応答を誘発する個々の化合物または化合物混合物を、任意の手段によって同定し得る。そのような応答は、細胞死（例えばアポトーシス）、生体分子（例えばタンパク質、脂質、多糖類、核酸等）の分泌、増殖（例えば有糸分裂）、細胞−細胞相互作用、細胞表面のポリペプチド代謝回転またはリサイクリング、小胞の放出、膜脱分極、イオン（例えばナトリウム、カルシウム、またはカリウム）の細胞内変動または細胞膜を横切る移動等を含み得るが、これに限らない。
【００３３】
代替の実施態様において、その表面、被膜、またはコーティングは、１つの細胞または複数の細胞を付着し得る複数のスポットまたは境界が定められた領域を含み、そしてこれらのスポットまたは境界が定められた領域を、例えば、反応性スポットのアレイを光学的に作製することによる、例えば、担体のパターン形成によって製造し得る。例えば、１つの実施態様において、ガラスプレートを、ガラスに吸着して（ａｂｓｏｒｂ）ガラスをコーティングする有機シランで洗浄する。その有機シランコーティングに、光学的マスクを通して、またはアレイのパターンを画定するマイクロミラーアレイを用いることによって、深ＵＶ光を照射する。その照射はＳｉ−Ｃ結合を切断して、反応性のＳｉラジカルを形成する。水との反応は、Ｓｉラジカルに極性シラノール基を形成させる。例えば米国特許第（ＵＳＰＮ）５，３２４，５９１号および６，６５３，１２４号において開示されたように、その極性シラノール基は、アレイ上のスポットを構成し、そしてさらに修飾されて他の反応性分子をそのスポットに結合する。例えば、遊離アミノ部分のような、生物学的に機能的な基を含むシランは、シラノール基と反応し得る。遊離アミノ基を、細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物または分子の混合物のような生体分子のための共有結合部位として使用する。
【００３４】
別の実施態様において、その表面、被膜、またはコーティングは、細胞を付着し得る複数のスポットまたは境界が定められた領域を含み、そして例えばＵＳＰＮ６，６４９，４９１において記載されたように、これらのスポットまたは境界が定められた領域を、例えば実質的に規則的なアレイの構造を担体上に形成することによって製造し得、ここで最初の材料の表面層を、第２の材料の担体上に置き、そしてその表面層は、その表面層および担体の界面での応力場が、別々の領域の形成を引き起こすのに十分薄く；粒子ビームを、表面層に、およびそれぞれに対して鋭角で向けて、別々の領域の整列の方向、および／または隣接する別々の領域の相対的な位置に影響を与える。粒子ビームを表面層へ向けることによって、別々の領域の整列の方向、および／または隣接する別々の領域の相対的な位置が画定され、そしてこれは高度な規則性を有するナノメートル規模の構造を表面上に形成し得るという利点を提供する。
【００３５】
本発明を、以下の実施例に関してさらに説明する；しかし、本発明はそのような実施例に制限されないことが理解される。
【実施例】
【００３６】
実施例１：本発明のアレイを作製し、そしてその効果を実証する
本明細書中で示すデータは、本発明のアレイ、例えば小分子マイクロアレイを作製する方法を示す。代替の実施態様において、本発明は、患者特異的薬物スクリーニングおよび低コスト薬物スクリーニングのような領域における薬物スクリーニングにおいて有用な小分子マイクロアレイを提供する。以下は、そのような小分子マイクロアレイを作製する方法および結果として得られたデータを説明する。
【００３７】
代替の実施態様において、マイクロアレイ上で細胞応答をスクリーニングするために、その細胞は、明確な読み出しを有するために、マイクロアレイのスポットにのみ存在するべきである。１つの方法は、細胞の付着を防止する表面を有するマイクロアレイの担体を用いることである。ポリアクリルアミドでコーティングされたスライドガラスが、１つの選択肢である。
【００３８】
細胞のスクリーニングを溶液中で行うので、その小分子は、媒体溶液中に溶解するのを防止するために固定化する必要がある。代表的な方法を本明細書中で説明する。
【００３９】
図１に示す代替の実施態様において、その小分子薬物を、モノマー溶液と混合する；その薬物−モノマー混合物を、次いでアレイ形式で担体上に配置する；次いでモノマーから重合プロセスを誘発し、小分子を固定化するポリマーゲルを形成する。
【００４０】
図２に示す代替の実施態様において、その小分子薬物の溶液を、まず担体上のマイクロアレイにプリントする。各薬物スポットの頂部に、モノマー溶液をプリントする。次いで重合プロセスを誘発して、小分子薬物を覆い、そして固定化する。
【００４１】
１つの実施態様において、その小分子薬物をマイクロアレイ形式に固定化した後、次いで細胞付着材料を、各スポットの頂部にプリントする。例えば線維性タンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の絡み合うメッシュのような、細胞外マトリックスタンパク質、または細胞外マトリックス様組成物、または分子の混合物、またはその混合物、またはその同等物は、全て代替的かつ例示的な選択肢である。
【００４２】
図３に示す代替の実施態様において、その小分子薬物を、ポリアクリルアミドゲル担体の上の最初の層に示されるマイクロアレイにプリントする。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、またはタンパク質およびＧＡＧ、またはプロテオグリカン（ＰＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞接着分子（ＣＡＭ）またはＣＡＭリガンド、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、アドレシン、またはその混合物、またはその同等物の混合物、またはその混合物、またはその同等物を、各薬物スポットの上に配置する。次いで細胞をマイクロアレイにまく。配置していないポリアクリルアミド表面は、細胞の付着を許容しないので、細胞は各スポット上にのみ存在する。
【００４３】
図４に示す代替の実施態様において、ＡおよびＢのスポットの最初の２行は、固定化された蛍光性小分子のスポットであり、ここで第２の２行は、固定化されていない。媒体溶液に１０分間沈めた後、非固定化スポット（第２の２行）は、その蛍光シグナルの大部分を失い、大部分の分子がスポットから除去されたことを示唆する。他方、固定化されたスポット（最初の２行）は、蛍光シグナルの持続した強度によって示される、その小分子内容物を有効に保持した。
【００４４】
図５に示す代替の実施態様において、固定化小分子マイクロアレイの蛍光強度を、媒体溶液に沈めながら、様々な時点で画像化した（Ａ）。次いで蛍光強度の変化をプロットした（Ｂ）。蛍光強度の喪失は、スポットに保持される小分子の量の減少を示す。その曲線はまた、小分子の量の溶液中に放出される速度を示唆する。この速度を、重合および架橋の量、固定化ポリマーの分解、化学的特性等のような、様々な因子によって調節し得る。
【００４５】
図６に示す代替の実施態様において、蛍光性抗癌剤ドキソルビシンを、様々な濃度でマイクロアレイにプリントする。媒体溶液に２時間沈めた後、画像を得た。
【００４６】
本発明の多くの実施態様を説明した。それでも、本発明の精神および範囲から離れることなく、様々な修飾を行い得ることが理解される。よって、他の実施態様が、以下の請求の範囲内にある。
【図６Ａ−６Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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