(57)【要約】  本発明は、ラマリンの合成方法に関し、より詳細には、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）と、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させることを特徴とする、ラマリンの合成方法及び前記ラマリンの分解防止方法に関する。本発明によると、抗酸化及び抗炎症効果に優れたラマリンを安定した収率で合成できて、ラマリンの大量生産が可能になる。また、ラマリンを長期間安定的に維持できて、ラマリンの産業上の利用も容易である。
2013531035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ヒドラジニルフェノールと、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させた後、前記保護を取り除くことを特徴とする、下記一般式（１）で表されるラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法：
【化１】
2013531035.tif 000008
【請求項２】
前記２−ヒドラジニルフェノールは、トシル塩形態であることを特徴とする請求項１に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項３】
前記２−ヒドラジニルフェノールのトシル塩は、以下の段階を含む工程によって製造されることを特徴とする請求項２に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法：
（ａ）２−アミノフェノールをメタノールに溶かし塩化水素ガスを流して２−アミノフェノール塩酸（ＨＣｌ）塩を得る段階、
（ｂ）前記２−アミノフェノール塩酸塩をエタノールに溶かし、亜硝酸イソペンチルを用いてニトロアミド形態の中間体を作る段階、及び
（ｃ）前記中間体エタノール溶液を、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ  ｏｒ  ＴｓＯＨ）及び塩化スズ（ＳｎＣｌ２）を含むエタノール溶液に添加して、２−ヒドラジニルフェノールのトシル塩を得る段階。
【請求項４】
前記１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、前記カルボキシル基と前記アミノ基が環化されているＬ−グルタミン酸ラクトンであることを特徴とする請求項１に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項５】
前記Ｌ−グルタミン酸ラクトンは、Ｌ−グルタミン酸を２次アミン形態で作った後、環化させることを特徴とする請求項４に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項６】
前記２次アミン形態は、Ｌ−グルタミン酸に２，２，２−トリクロロ−エチル−クロロホルム酸（Ｔｒｏｃ）を添加し、反応させることによって製造したことを特徴とする請求項５に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項７】
前記１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、５位炭素のカルボキシル基が追加的に活性化していることを特徴とする請求項１または請求項４に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項８】
前記５位炭素のカルボキシル基の活性化は、Ｌ−グルタミン酸にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を反応させて行われることを特徴とする請求項７に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項９】
前記５位炭素のカルボキシル基の活性化は、トリエチル−アミン（ＴＥＡ）で、追加的に処理して反応させることによって行われることを特徴とする請求項８に記載のラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法。
【請求項１０】
ラマリンをビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を含有する溶媒に溶解させて維持することを特徴とするラマリンの分解防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマリンの合成方法に関し、より詳細には、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）と、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させることを特徴とする、ラマリンの合成方法及び前記ラマリンの分解防止方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
地衣類は花をつけない植物（non-flowering plants）と似ていて、かび（mycobiont）及び藻類（alga、photobiant）及び／または、シアノバクテリアの共生連合（symbiotic association）である。地衣類において、かびは、葉状体、または典型的な二次代謝産物を含有している苔化された基質を形成する（Ahmadjin V., The lichen symbiosis, Wiley, New York, pp.1-6, 1993）。地衣類は、十分量の天然サンプルを収集するのが困難で、大量栽培技術が知られていないため、高等植物と比較して、研究が十分には行われていない。
【０００３】
しかし、地衣類の組織培養法、大量生産方法及び生化学的分析方法等の改善に伴って、これに対する研究が活発に行われている（Behera, B.C. et al., Lebensm. Wiss. Technol.,39:805, 2006）。細胞毒性、抗真菌、抗微生物、抗酸化等の多くの生物学的活性を持つ脂肪酸、デプシド（depside）及びデプシドン（depsidones）、ジベンゾフラン（debenzofurans）、ジテルペン（diterpenes）、アントラキノン（anthraquinones）、ナプトキノン（naphtoquinones）、ウスニン酸（usnic acid）、プルビン酸（pulvinic acids）、キサントン（xanthones）及びエピジチオピペラジンジオン（epidithiopiperazinediones）を含む化合物が地衣類から分離されるようになった（Muller, K., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:9-16, 2001）。
【０００４】
ラマリナ・テレブラタ（Ramalina terebrata）は南極大陸キングジョージ島に群落を成し自生する地衣類であり、キングジョージ島で容易に採取することができる。本発明者等は、前記南極地衣類ラマリナ・テレブラタの研究において、優れた抗酸化活性を持つラマリン（Ramalin）という新規化合物を分離した（韓国公開特許公報第１０−２０１０−００５２１３０号）。また、ラマリンは、優れた抗炎症活性を持つことが報告された（韓国特許出願番号第１０−２０１０−００５２５５１号）。
【０００５】
ラマリンは、優れた抗酸化活性及び抗炎症活性が確認され、大量生産が望まれていた。しかし、従来ラマリナ・テレブラタからのメタノールを利用した分離方法（韓国公開特許公報第１０−２０１０−００５２１３０号）によると、極地地衣類特有の遅い成長速度、自然から大量採取が難しい点、及びラマリナ・テレブラタから抽出される量が非常に少量である点から、その生産に費用と時間が多く掛かる問題があった。また、ラマリンは、それ自身高抗酸化力によって分解され易い。常温で４日以内に半分以上消失するほど不安定であり、その維持が困難であるという問題があった。
【０００６】
Ｌ−グルタミン酸（L-Glutamic acid）は、従来調味料の一種のアミノ酸系調味料として用いられてきたアミノ酸の一種で、塩の代替用、食餌補充剤、栄養強化剤、香味増進剤等として用いられている。従って、安価で大量確保も可能であり、ラマリンと同じ光学活性部位を持っている。
【０００７】
そこで、本発明者等は、ラマリンの化学的合成方法を開発するために鋭意努力した結果、ラマリンと同じ光学活性部位を持っているＬ−グルタミン酸（L-Glutamic acid）を利用して、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）との合成を計画して行った結果、天然物由来のラマリンと同じ効能を示すラマリンが合成されることを確認すると共に、これをビタミンＣと共に保管する場合、ラマリンの分解を防止して、長期間維持が可能であることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、優れた抗酸化及び抗炎症活性を持つラマリン、その塩、その溶媒和物、または、その塩の溶媒和物の合成方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、合成されたラマリンの分解を防止する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）と、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させた後、前記保護を取り除くことを特徴とする、下記一般式（１）で表されるラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法を提供する：
【化１】
2013531035.tif 000003
本発明はまた、ラマリンをビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を含有する溶媒に溶解させて維持することを特徴とするラマリンの分解防止方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】出発物質Ｌ−グルタミン酸と２−ヒドラジニルフェノールの合成部位を示した簡略図である。
【図２】本発明に係るＬ−グルタミン酸でラマリンを合成する方法を含む反応の一実施例を示す概略図である。
【図３】本発明の２−アミノフェノールで２−ヒドラジニルフェノールを合成する方法を含む反応の一実施例を示す概略図である。
【図４】合成ラマリンの１Ｈ ＮＭＲ結果を示す写真である。
【図５】合成ラマリンの維持期間に応じた保存量を各２５℃、３８℃で実験して確認したグラフである。
【図６】合成ラマリンと天然物由来ラマリンの抗酸化活性を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１２】
一観点において、本発明は、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）と、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させた後、前記保護を取り除くことを特徴とする、下記一般式（１）で表されるラマリン、その塩、その溶媒和物、またはその塩の溶媒和物の合成方法に関する：
【化２】
2013531035.tif 000004
【００１３】
本発明のラマリンは、南極地衣類のラマリナ・テレブラタから分離した抗酸化活性を持つ化合物で、前記ラマリンは高分解能ＥＳ−ＭＳを利用して確認した結果、分子量が２５４１．１４１で、分子式Ｃ１１Ｈ１６Ｎ３Ｏ４の化合物で一般式（１）の構造を持つことを確認し、ラマリナ・テレブラタから分離した化合物であるため、ラマリンと命名された。
【００１４】
本発明では、ラマリンをラマリナ・テレブラタから分離抽出する代わりに化学的に合成する方法を開発するために、２−ヒドラジニルフェノール（2-Hydrazinylphenol）と、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸を反応させた後、前記保護を取り除くことでラマリンが合成されることを確認した。
【００１５】
本発明において、前記ラマリンの塩（salt）としては、薬学的に許容される塩であれば、特に制限されることなく、前記薬学的に許容されるは、当該技術分野で通常の方法によって製造される。例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、硫酸水素ナトリウム、リン酸、炭酸等の無機酸との塩、またはギ酸、硝酸、シュウ酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、ラクトビオン酸、サリチル酸、またはアセチルサリチル酸（アスピリン）のような有機酸と共に薬学的に許容可能な酸の塩を形成したり、または、ナトリウム、及びカリウム等のアルカリ金属イオンと反応して、これらの金属塩を形成したり、または、アンモニウムイオンと反応して、さらに他の形態の薬学的に許容可能な塩を形成することができる。
【００１６】
本発明において、「溶媒和物」とは、溶媒分子と配位結合して、錯体（complex）を形成する固体または液体状態の本発明に係るラマリン、またはその塩の形態を称する。水和物は、水と配位結合した溶媒和物の特定形態であり、本発明と関連して好ましい溶媒和物は水和物である。
【００１７】
本発明において、前記２−ヒドラジニルフェノールは、トシル（Tosyl）塩形態であってもよい。前記２−ヒドラジニルフェノールのトシル塩形態は、下記のような段階で製造することができる：（ａ）２−アミノフェノールをメタノールに溶かし塩化水素ガスを流して２−アミノフェノール塩酸（ＨＣｌ）塩を得る段階、（ｂ）前記２−アミノフェノール塩酸塩をエタノールに溶かし、亜硝酸イソペンチル（Isopentyl nitrite）を用いてニトロアミド（Nitramide）形態の中間体を作る段階、及び（ｃ）前記中間体エタノール溶液を、ｐ−トルエンスルホン酸（para-toluenesulfonic acid、ＰＴＳＡ  ｏｒ  ＴｓＯＨ）及び塩化スズ（ＳｎＣｌ２）が混ざったエタノール溶液に添加して、２−ヒドラジニルフェノールのトシル塩を得る段階。
【００１８】
本発明の好ましい一例として、前記（ａ）段階で塩化水素ガスを流しながらｐＨを２〜５に維持させることができ、その結果、２−アミノフェノール塩酸塩を固体形態で得ることができる。また、前記（ｂ）段階で、エタノールに溶かした２−アミノフェノール塩酸塩を低い温度、約−５℃で亜硝酸イソペンチルを使ってニトロアミド形態の中間体を作ることができる。その後、前記（ｃ）段階で、中間体エタノール溶液を、ｐ−トルエンスルホン酸（para-toluenesulfonic acid、ＰＴＳＡ  ｏｒ  ＴｓＯＨ）及び塩化スズ（ＳｎＣｌ２）が混ざったエタノール溶液に低い温度（−５℃）を維持しながらゆっくり添加して２−ヒドラジニルフェノールのトシル塩を得ることができる。
【００１９】
各化合物は、下記のような一般式で示す：２−アミノフェノール（2-aminophenol）（一般式（２））、２−アミノフェノール塩酸塩（一般式（３））、２−アミノフェノールニトロアミド中間体（一般式（４））、２−ヒドラジニルフェノールトシル塩（一般式（５））。
【化３】
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【００２０】
本発明において、前記１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、一般に知らされたカルボキシル基及びアミノ基を保護する方法を利用して保護することができる。例えば、ベンジル（Benzyl）基を導入して、カルボキシル基及びアミノ基を保護することができる。ただ、ベンジル基を用いて保護する場合、１位炭素と２位炭素だけでなく、５位炭素のカルボキシル基までベンジル基が導入されることがあるため、５位炭素のカルボキシル基のベンジル基を取り除く段階が追加的に必要で、その場合、１位炭素のカルボキシル基の保護ベンジル基も取り除かれることがあり、収率損失が起きる。また、２−ヒドラジニルフェノールと反応後に保護を取り除く段階においても速度が遅くなることもある。
【００２１】
従って、本発明の好ましい一様態として、前記１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、前記カルボキシル基と前記アミノ基が環化されているＬ−グルタミン酸ラクトンであってもよい。
【００２２】
本発明のより好ましい様態では、前記Ｌ−グルタミン酸ラクトンは、Ｌ−グルタミン酸を２次アミン形態で作った後、環化させてもよい。１次アミン形態で環化させる場合、１位炭素だけでなく５位炭素まで共に７七角形リングが作られる場合があるため、所望の反応を進行させ難くなる。
【００２３】
本発明の一実施例によると、Ｔｒｏｃを利用して、２次アミン形態に作る反応を炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を用いて、２４時間進行させる場合、約８５％の収率で別途精製過程なしに得られることを確認した。
【００２４】
本発明の一実施例によると、Ｔｒｏｃを利用して一次酸形態に作られたＬ−グルタミン酸は、パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）を添加して、酸触媒としてＰＴＳＡ（para-toluenesulfonic acid）を用いてトルエンで還流（reflux）させ、反応途中生成される水を取り除き、水がそれ以上生成されなければ炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を用いて触媒を取り除いてジエチルエーテル（Diethyl ether）と石油エーテル（petroleum ether）で再結晶すると、純粋な白色固体１次酸が得られることが確認された。前記１次酸は、Ｌ−グルタミン酸ラクトンであり、下記一般式（６）のような構造で表すことができる。
【化４】
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【００２５】
従って、本発明の最も好ましい様態は、前記２次アミン形態は、Ｌ−グルタミン酸に２，２，２−トリクロロ−エチル−クロロホルム酸（2,2,2-Trichloro-ethyl-chloroformate、Ｔｒｏｃ）を添加・反応させて製造したことを特徴とする。
【００２６】
本発明の一実施例によると、前記一般式（６）で表される１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸（１次酸）の５位炭素のカルボキシル基を活性化させて、２−ヒドラジニルフェノールと結合反応させる場合、収率５０％で反応が起きることを確認した。
【００２７】
従って、本発明において、好ましくは１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、５位炭素のカルボキシル基が追加的に活性化していることを特徴とする。カルボキシル基の活性化は、例えば、ジシクロヘキシルアルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide、ＤＣＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（1-Hydroxybenxotriazole、ＨＯＢｔ）、チオニルクロライド（Thionyl chloride）、またはエチルクロロホルム酸（Ethylcholoroformate）を添加して誘導することができる。
【００２８】
本発明一実施例において、前記活性化物質として、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide、ＤＣＣ）及び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（1-Hydroxybenxotriazole、ＨＯＢｔ）を用いる場合、活性化と同時に結合反応が起きるが、反応時間が２０時間以上であるため、不安定状態のヒドラジニルフェノールが分解される問題点があることを発見したが、チオニルクロライド、またはエチルクロロホルム酸等を用いる場合、収率が３０％となるため、ＤＣＣとＨＯＢｔ（収率５０％）を用いて活性化させることがより優れていることを確認した。
【００２９】
従って、本発明の最も好ましい様態は、１位炭素のカルボキシル基及び２位炭素のアミノ基が保護されたＬ−グルタミン酸は、５位炭素のカルボキシル基を活性化させるためにジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide、ＤＣＣ）及び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（1-Hydroxybenxotriazole、ＨＯＢｔ）を用い、トリエチル−アミン（Triethyl amine、ＴＥＡ）を追加的に処理して反応させて行われることを特徴とする。
【００３０】
本発明は一実施例において、結合した物質において保護を取り除くために、同時に亜鉛（Zinc）と酢酸（Acetic acid）を用いてラマリンを取得した。
【００３１】
従って、本発明において、好ましくは保護を取り除くために、亜鉛と酢酸を同時に用いることができる。その他当業界において既に公知の方法で保護を取り除いてもよい。
【００３２】
本発明は一実施例において、高抗酸化活性によって、常温で維持期間が短いラマリンをビタミンＣが含まれた溶媒に溶解させて維持させる場合、明らかに長く維持されることを確認した。
【００３３】
従って、他の観点において、本発明は、ラマリンをビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を含有する溶媒に溶解させて維持することを特徴とするラマリンの分解防止方法に関する。
【００３４】
本発明において、前記ラマリンを溶解させる濃度は、ビタミンＣの濃度と同じであることを特徴とする。好ましくは、ラマリンを溶解させる溶媒を水にしてもよい。より好ましくは、水にビタミンＣとラマリンを１０００ｐｐｍ濃度で溶解させて維持することを特徴とする。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３６】
実施例１：１位炭素のカルボキシル基と２位炭素のカルボキシル基が保護されたグルタミン酸の製造及び２−ヒドラジニルフェノールの準備
１−１：Ｔｒｏｃ−Ｌ−グルタミン酸の製造
図１に示された概略図で確認できるように、ラマリンの合成に必要なＴｒｏｃ−Ｌ−グルタミン酸を製造するために、下記のような方法で実験を行った。５００ｍＬ二口丸底フラスコ（two neck round flask）に３１．５ｇ（０．３７５ｍｏｌ）のＮａＨＣＯ３を水１２５ｍＬに溶かして水溶液（solution）を作った。還流冷却器（Reflux condenser）と滴下漏斗（dropping funnel）を設置し、１４．７ｇ（０．１ｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸（L-Glutamic acid）を常温でマグネティック・バー（magnetic bar）を利用して撹拌しながらゆっくり添加した。反応水の温度を３５℃に上げて、２，２，２−トリクロロエチルクロロフロメート（2,2,2-Trichloroethylchloroflomate）をゆっくり滴下（dropping）させた。反応混合物を４０〜４５℃の温度に加熱して６時間撹拌した。
【００３７】
以後、温度をまた常温に下げた後、約１５時間程度撹拌し続けた。反応が完了すると、ジエチルエーテル（Diethylether（３０ｍＬ））を添加して水層を洗浄して有機層を取り除いた。水層に５Ｍ ＨＣｌを徐々に添加してｐＨを２以下に下げた後、酢酸エチル（Ethylacetate（以下、ＥＡ））を３回（５０ｍＬ×３）に亘って抽出（extraction）しながら水層に残っている生成物を溶かした。ＥＡ抽出物をＭｇＳＯ４で水を取り除いてロータリーエバポレーター（rotary evaporator）で乾燥させた。ＥＡが全て取り除かれた後、薄い黄色の液体の生成物が得られた。
【００３８】
その結果、図２の１番目の反応後現れた化合物のように、Ｎ−Ｔｒｏｃで保護されたＴｒｏｃ−Ｌ−グルタミン酸の収率は、約８５％程度であって、別の精製過程なしに高純度で得られた。
【００３９】
また、生成物の構造を確認するために、ＮＭＲスペクトル（１Ｄ及び２Ｄ）はＤ２Ｏに加えて、アセトン−ｄ６を用いて、ＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＰ−４００スペクトロメーター（１３Ｃ１Ｈ及び５００ＭＨｚに対する５００ＭＨｚ）を利用して記録した。この時、ケミカルシフトは残のアセトン−ｄ６（ｄＨ／ｄＣ＝２．２２／２１．０）を参照した。ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験は、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚ、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚ条件で最適化された。
【００４０】
その結果、１Ｈ ＮＭＲ（δｐｐｍ、ａｃｅｔｏｎｅ  ｄ６）：１．５５−２．７５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）；４．１５−４．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）；４．７０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＣｌ３）；６．６５（ｄ，Ｊ  ８Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ）；１０．６（ｓ，２Ｈ，ＯＨ）のような結果を示すことを確認した。
【００４１】
１−２：環化反応
実施例１−１によって得られたＴｒｏｃ−Ｌ−グルタミン酸の保護されたカルボキシル基とアミノ基を互いに輪形態で構成して保護するために、下記のような方法で環化反応をさせた。これのために、５００ｍＬの丸底フラスコにＮ−Ｔｒｏｃグルタミン酸（０．０４ｍｏｌ）を入れて、トルエン（toluene）２００ｍＬを添加して溶かした。フラスコにディーン・スターク（Dean-stark）装置を連結しその上に還流冷却器を設置した後、前記フラスコに０．０８ｍｏｌのパラホルムアルデヒド（２．４ｇ）、０．００２４ｍｏｌのＰＴＳＡ（０．４６ｇ）を添加した。反応温度を１２０℃に高めて撹拌しながら還流させて、ディーン・スターク（Dean-stark）にそれ以上水が発生しない時まで（約３時間）加熱した。
【００４２】
反応が完結した後、常温で冷まし、ＥＡ５０ｍＬを添加した。その後、有機層を層分離して、０．３Ｍ Ｋ２ＣＯ３ ４ｍＬを添加して層分離させた。水を３回に亘って５ｍＬずつ添加して洗い落とした。有機層をＭｇＳＯ４で水分を取り除いて、溶媒をエバポレーションで取り除いた。乾燥後出来た白色固体をエーテル５ｍＬ、石油エーテル５ｍＬ添加して洗浄した。
【００４３】
その結果、図２の２番目の反応後現れた化合物のように、ろ過（Filter）後、乾燥して、純粋な白色固体が収率８５％で得られた。この白色固体はＮ−トリクロロエチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ラクトン（N-Trichloroethyloxy carbonyl-L-glutamic acid lactone）で、環化反応が起きて、１位炭素のカルボキシル基と２位炭素のアミノ基が環化されて保護された化合物として確認した。
【００４４】
また、生成物の構造を確認するために、ＮＭＲスペクトル（１Ｄ及び２Ｄ）は、Ｄ２Ｏに加えて、アセトン−ｄ６を用いて、ＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＰ-４００スペクトロメーター（１３Ｃ１Ｈ及び５００ＭＨｚに対する５００ＭＨｚ）を利用して記録した。この時、ケミカルシフトは残のアセトン-ｄ６（ｄＨ／ｄＣ＝２．２２／２１．０）を参照した。ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験は、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚ、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚ条件で最適化された。
【００４５】
その結果、１Ｈ ＮＭＲ（δｐｐｍ，ａｃｅｔｏｎｅ  ｄ６）：２．１５-２．６５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）；４．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）；４.８２−５.００（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＣｌ３）；５．３７−５．５９（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ２Ｏ）；１０．３２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）のような結果を示すことを確認した。
【００４６】
１−３：２−ヒドラジニルフェノールの準備
２−ヒドラジニルフェノールを作るために、２−アミノフェノールを準備して、丸底フラスコに２−アミノフェノール（2-Aminophenol）５０ｇ（０.４６ｍｏｌ）を入れて、常温でメタノールに完全に溶かした。別途のＨＣｌガス投入管を介してバブリング（bubbling）させながらｐＨを２〜５程度に維持させて１５時間以上撹拌を行った。ｐＨを２〜５に維持しながら、窒素ガスで約３０分間パージした後、ロータリーエバポレーターで濃縮したところ、茶色の固体が生成された。この固体をＥＡ：ヘキサン＝３：７溶液で洗浄した後、ろ過（filter）し、完全乾燥させた。生成された固体（２−アミノフェノールヒドロゲンクロライド）を取得した。
【００４７】
その後、前記取得された固体６０ｇ（０.４１ｍｏｌ）をエタノール３００ｍＬに完全溶かした後、温度を−５℃に下げた。亜硝酸イソペンチル（Isopentyl nitrite）５５.３ｇ（０.４１ｍｏｌ）をエタノールに希釈してスタート溶液（starting solution）にゆっくり滴下させた後、温度を−５℃に維持しながら、３０分間撹拌した。他の丸底フラスコに塩化スズ（Tin chloride）１５６.３ｇ（０.８２ｍｏｌ）とＰＴＳＡ７８.４ｇ（０.４１ｍｏｌ）をエタノールに溶かした後、温度を−５℃に下げておいて、反応中であったアミノフェノール混合物を徐々に添加しながら撹拌を１時間以上続けた。反応が終了すると、ジエチルエーテル５００ｍＬを投じて１０分間撹拌した後析出された固体をろ過（filter）した。ろ過（Filter）された固体をＥＡ ２００ｍＬ、ヘキサン４００ｍＬで洗浄した後、乾燥して２−ヒドロキシフェニルヒドラジントルエンスルホン酸塩（2-Hydroxy phenyl hydrazine toluene sulfonic aicd salt）を得た。本反応の概略図を図３に示す。
【００４８】
その結果、図３の概略図の右端に示した化合物のように、２−ヒドラジニルフェノールを製造し、前記反応の収率は約８０％であることを確認した。
【００４９】
また、生成物の構造を確認するために、ＮＭＲスペクトル（１Ｄ及び２Ｄ）は、Ｄ２Ｏに加えて、アセトン−ｄ６を用いて、ＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＰ−４００スペクトロメーター（１３Ｃ１Ｈ及び５００ＭＨｚに対する５００ＭＨｚ）を利用して記録した。この時、ケミカルシフトは残りのアセトン−ｄ６（ｄＨ／ｄＣ＝２.２２／２１.０）を参照した。ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験は、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚ、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚの条件で最適化された。
【００５０】
その結果、１Ｈ ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＣＤ３ＯＤ）：２.３７（ｓ，３Ｈ）；６.８５（ｍ，２Ｈ）；７.００（ｍ，２Ｈ）；７.２４（ｄ，Ｊ＝１０，２Ｈ）；７.７１（ｄ，Ｊ＝１０，２Ｈ）のような結果を示すことを確認した。
【００５１】
実施例２：ラマリンの合成
２−１：２−ヒドラジニルフェノールとＬ−グルタミン酸ラクトンの結合反応
２−１−１：ＤＣＣ及びＨＯＢｔで活性化したＬ−グルタミン酸ラクトンとの結合反応
実施例１−２の結果物であるＮ−トリクロロエチルオキシカルボニルＬ−グルタミン酸ラクトン５ｇ（１４.９ｍｍｏｌ）を８０ｍＬのＭＣ（methylene chloride）に溶かした後、（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）１.３５ｅｑ ＤＣＣ ４.１６ｇ、１.５ｅｑ ＨＯＢｔ ３.０３ｇを添加して、マグネティック・バーを利用して撹拌した。他のフラスコに１.２ｅｑの２−ヒドラジニルフェノールトシル塩（2-Hydroxyl phenyl hydrazine tosyl salt）４.９ｇとＴＥＡ２.５ｍＬをＭＣに入れて、温度を０℃に下げた。作られたヒドラジン溶液（Hydrazine solution）を前記スタート溶液に０℃でゆっくり滴下させた。０℃で１時間反応後、常温に温度を上げて１２時間以上反応させた。ＴＬＣを介して反応完結の有無を確認して反応が完結すると、反応物を１Ｎ ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで各々３回ずつ洗い落とした。有機層を分離してＭｇＳＯ４で水を取り除いた。
【００５２】
その結果、溶媒が取り除かれた粗生成物を得た。これは精製過程なしに次の反応に用いることができる。精製結果、反応収率は約５０％程度と確認された。
【００５３】
２−１−２：チオニルクロライドで活性化したＬ−グルタミン酸ラクトンとの結合反応
５０ｍＬフラスコに実施例１−２の結果物であるＮ−トリクロロエチルオキシカルボニルＬ−グルタミン酸ラクトン０.０１ｍｏｌを純粋なＣＣｌ４２ｍＬに溶かした後、撹拌しながら０.０５ｍｏｌの塩化チオニル（３.７ｍＬ）を添加した。還流冷却器を設置し、水槽を利用して温度を７０℃に加熱した。加熱が進むとカスガ発生するが、ガスメーター機、または風船を利用してガス発生の有無を確認した。それ以上ガスが発生しない時、温度を常温に下げて溶媒を全て取り除いた。純粋な無水状態のＣＨ２Ｃｌ２を添加して、再度エバポレーションさせて、残存物であるＨＣｌや二酸化硫黄（sulfur dioxide）を取り除いた。
【００５４】
次に、完全乾燥された１００ｍＬ丸底フラスコに活性化したＬ−グルタミン酸ラクトン（約０.０１ｍｏｌ）を添加して、５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で溶かした。他のフラスコに２−ヒドラジニルフェノールトシル塩（2-Hydrazinylphenol tosyl salt）（０.００９５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（０.００９５ｍｏｌ）をＭＣに入れて、完全に溶かした。作られたヒドラジン溶液を前記スタート溶液にゆっくりいれて、ピリジン（０.８ｍＬ）を添加した。反応物を４０℃で約３時間加熱して温度を常温に下げて、約１５時間撹拌を行った。以後、蒸溜水１５ｍＬとＮａＨＣＯ３飽和溶液１５ｍＬで洗浄して、再度蒸溜水１５ｍＬで２回洗い落とした。有機層をＭｇＳＯ４で処理して水を取り除いてろ過した後、濃縮して粗生成物を得た。
【００５５】
その結果、粗生成物の収率は、約３０％程度と確認された。
【００５６】
２−２：保護を取り除いてラマリンを取得する反応
実施例２−１の産生物、即ちカップリングされたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ラクトンフェニルヒドラジン（N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamic acid lactone phenyl hydrazine）で保護基を取り除いて純粋なラマリンを得るために、７９０ｍｇの（０.００１８）産生物を１００ｍＬ丸底フラスコに入れて、酢酸６ｍＬに溶かした。マグネティク・バーで撹拌しながら水７ｍＬを徐々に添加して亜鉛粉末１ｇを添加した。亜鉛粉末を添加した時点から約２分程度反応物の色が透明になるのを観測した。この時、水５ｍＬをゆっくり添加した後、５分間さらに撹拌した。５分後ろ過（filter）して亜鉛を取り除き、ＭＣ１０ｍＬで２回洗浄した。水層を濃縮して、逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、ラマリン（Ramalin）を得た。以上１−１〜２−２に対する反応方法の概略図を図１〜図３に示した。
【００５７】
この反応によって、ラマリンが得られ、精製後、収率約４０％であることを確認し、純度は９９％程度と確認された。合成したラマリンは、固体状態で低温（−２４℃）保管した。
【００５８】
生成物の構造を確認するために、ＮＭＲスペクトル（１Ｄ及び２Ｄ）はＤ２Ｏに加えて、アセトン−ｄ６を用いて、ＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＰ−４００スペクトロメーター（１３Ｃ１Ｈ及び５００ＭＨｚに対する５００ＭＨｚ）を利用して記録した。この時、ケミカルシフトは残りのアセトン−ｄ６（ｄＨ／ｄＣ＝２.２２／２１.０）を参照した。ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験は１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚ、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚの条件で最適化された。
【００５９】
その結果、図４に示されたように、前記合成されたラマリンのＮＭＲ結果を１Ｈ ＮＭＲ（δｐｐｍ，ＣＤ３ＯＤ ｄ６）：２.１８（ｍ，２Ｈ）；２.５０（ｍ，２Ｈ）；３.７７（ｔ，Ｊ＝６，１Ｈ）；６.８５（ｍ，４Ｈ）のように得ており、その構造が天然物から分離したラマリンと同じであることを確認した。
【００６０】
実施例３：ＨＰＬＣを介したラマリン安全性増進確認
ラマリンは、自身の高い抗酸化力によって分解し易く、常温で４日以内に半分以上消えるほど不安定であるため、本実施例ではラマリンを長く維持するための方法を得るために、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を１：１（各１０００ｐｐｍ）添加して、各２５℃、３８℃の水で保管して安全性を確認した。
【００６１】
時間毎に１０μＬのサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８コラム（４.６×１５０ｍｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣ（semi-preparative reverse phase HPLC）で分析した。用いられた溶媒システムは、０.１％ギ酸が混ざった水（Ａライン）と０.１％ギ酸が混ざったメタノール（Ｂライン）を用いた。開始はメタノール０％から５％まで１５分、５％から９０％まで５分、９０％からまた０％まで５分、最後の０％で５分維持して、合わせて３０分分析を行う。流速は、０.７ｍＬ／分で。その後、ＨＰＬＣのエリア値（ｍＡＵ×Ｓ）でラマリン量の変化を確認した。
【００６２】
その結果、図５に示されたように、何も添加しなかった場合、時間に伴ってラマリンが速い速度で分解されることを確認した。それに対して、ラマリンとビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を１：１（各１０００ｐｐｍ）で添加して、水に保管した場合、ラマリンの安全性が維持されることを確認した。一方、４日以前に全ラマリンが消える、厳しい条件である３８℃でもある程度の安全性を確認することができた。３８℃の条件の場合、ビタミンＣが先に壊れて行き、以後ラマリンが消え始めるが、約２００時間以後、即ちビタミンＣがほとんど消えた後にもある程度安全性を維持させる効果を示すことを確認した。
【００６３】
実施例４：天然物由来ラマリンと合成ラマリンの抗酸化活性比較
天然物から抽出した天然物由来ラマリンと、合成ラマリンの抗酸化活性を比較するために、２，２−ジ（４−テルト−オクチルフェニール）−１−ピクリルヒドラジル（2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl：ＤＰＰＨ）自由ラジカルに対する活性を測定した。ブチルヒドロキシアニソール（Butylated hydroxyl anisole：ＢＨＡ）を対照群として用いた。また、実験に用いられた化合物の純度は、いずれも９８％以上の状態で測定した。
【００６４】
具体的に、１.５ｍＬの種々の濃度（０.１〜３.０μｇ／ｍＬ）のメタノールに溶かした天然物由来ラマリン、合成ラマリンと対照群であるＢＨＡを同一溶媒に溶かした０.１ｍＭ ＤＰＰＨ ０.５ｍＬを混合した。光を遮断させた常温で３０分間反応させた後、吸光度測定は、ＵＶ可視スペクトロフォトメーター（ＳＣＩＮＣＯ、韓国）を利用して、５１７ｎｍで測定した。Ｂｌａｎｋは、１.５ｍＬメタノールに０.１ｍＭ ＤＰＰＨ ０.５ｍＬと反応させたものである。電子供与能は下記の式で計算した。
Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｏｎａｔｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｉｅｓ（ＤＥＡ）（％）
＝｛１−（Ｓ／Ｂ）｝×１００
Ｓは、ＤＰＰＨと試料を反応させた後、吸光度５１７ｎｍで測定した値、Ｂは、ＤＰＰＨとメタノールを反応させた後、吸光度５１７ｎｍで測定した値である。
【００６５】
その結果、図６及び表１に示されたように、天然物由来ラマリンのＩＣ５０値が１.２２μｇ／ｍＬであり、合成したラマリンの場合、０.９６μｇ／ｍＬで天然物から抽出したラマリンと合成したラマリンが略同等な優れた抗酸化力を示すことを確認した。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上、説明したように、本発明によると、抗酸化及び抗炎症効果に優れたラマリンを安定した収率で合成できて、ラマリンの大量生産が可能になる。また、ラマリンを長期間安定的に維持できて、ラマリンの産業上の利用が容易である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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