(57)【要約】【課題】水素同位元素を活用し、かつラベリング剤の合成費用は減らしながらも一度に多重の試料を定量することが可能な化合物を提供する。【解決手段】本発明は、ラベリング剤を用いて相異なる量のタンパク質およびペプチド分析体を定量分析する方法を提供するもので、ラベリング剤を分析体に結合させた後、タンデム質量分析を通してラベリング剤の一部のみが取り除かれて残った、分析体を含む大きい質量のｙタイプの断片イオンを活用して、定量分析を行う新規方法を提供する。【選択図】図１
2013536433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表される化合物。
【化１】
2013536433.tif 000008
（式中、
【化２】
2013536433.tif 000009
Ｒ3はアミノ酸残基の側鎖であり、
Ｒ4はヒドロキシまたは反応性リンカーであり、
Ｒ5は水素、Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルキニルであり、
Ｒ6は水素、Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルキニルであり、
ｎとｍはそれぞれ独立して１〜４の整数であり、および
前記Ｒ1およびＲ2は重水素を含まないか、或いは前記Ｒ1およびＲ2の少なくとも一つは重水素を含む。）
【請求項２】
【化３】
2013536433.tif 000010
Ｒ5は水素、プロピルまたはプロプ−１−イニル(prop-1-ynyl)であり、
Ｒ6は水素、プロピルまたはプロプ−１−イニル(prop-1-ynyl)であり、および
ｎとｍはそれぞれ独立して１〜４の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1はオクチルであり、および
Ｒ2はヘプチルであることを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1はＣ1-10アルキルであり、Ｒ2はＣ1-10アルキルであるか、或いは
【化４】
2013536433.tif 000011
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｒ1およびＲ2は、
それぞれＣＨ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2およびＣＤ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＤ2−ＣＨ2であり、
それぞれＣＨ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＤ2およびＣＤ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−ＣＨ2であり、
それぞれＣＤ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2およびＣＨ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＤ2−ＣＨ2であり、または
それぞれＣＤ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＤ2およびＣＨ3−Ｃ≡Ｃ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−ＣＨ2であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ3は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基の側鎖であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ4は、ヒドロキシ、スクシンイミド−Ｎ−オキシ、３−スルホスクシンイミド−Ｎ−オキシ、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ、ペンタハロベンジルオキシ、４−ニトロフェノキシまたは２−ニトロフェノキシであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物は、
１）２−（Ｎ−（４−プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
２）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
３）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
４）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イル）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
５）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
６）２−（Ｎ−（４−プロピルベンジル）−２−（４−プロピルフェニル）アセトアミド）酢酸、
７）２−（５−フェニル−Ｎ−（３−フェニルプロピル）ペンタンアミド）酢酸、および
８）２−（Ｎ−オクチルオクタンアミド）酢酸よりなる群から選ばれるいずれか一つの化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項の化合物を２種以上含む組成物。
【請求項１０】
前記２種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、
１）２−（Ｎ−（４−プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
２）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド ）酢酸、
３）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イル）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、および
４）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
下記一般式２で表される化合物を含むラベリング剤を分析体と結合させる段階と、
前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階と、
前記断片イオンのうち、分析体とＲCを含む断片イオンを定量する段階とを含む、分析体の定量方法。
【化５】
2013536433.tif 000012
（式中、
ＲAは直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ18アルキルであり、ＲBは質量調節基であり、
ＲCは直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ18アルキルであり、
リンカーは分析体との結合を誘導する反応性リンカーであり、
ＲAおよびＲCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つが一つ以上の重水素を含む。）
【請求項１３】
前記ＲAおよびＲCはそれぞれメチルであり、ＲAおよびＲCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１４】
前記ＲAおよびＲCはそれぞれエチルであり、ＲAおよびＲCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１５】
前記ＲAおよびＲCは、それぞれＣＨ3およびＣＤ3であり、或いはそれぞれＣＤ3およびＣＨ3であることを特徴とする、請求項１３に記載の定量方法。
【請求項１６】
前記ＲAおよびＲCは、それぞれＣ2Ｈ5およびＣ2Ｄ5であるか、或いはそれぞれＣ2Ｄ5およびＣ2Ｈ5であることを特徴とする、請求項１４に記載の定量方法。
【請求項１７】
前記ＲBは天然または人工アミノ酸残基の側鎖であることを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１８】
前記ＲBは直鎖または分岐鎖のＣ1-18アルキルであることを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１９】
前記リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、４−ニトロフェニル基、および２−ニトロフェニル基よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項２０】
前記ラベリング剤は、前記一般式１で表される化合物を２種以上含むことを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項２１】
前記２種以上の化合物それぞれのＲAおよびＲCに含まれた重水素の数が異なり、前記２種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項２０に記載の定量方法。
【請求項２２】
前記一つの化合物のＲAおよびＲCがそれぞれＣＨ3およびＣＤ3であり、前記もう一つの化合物のＲAおよびＲCはそれぞれＣＤ3およびＣＨ3であることを特徴とする、請求項２１に記載の定量方法。
【請求項２３】
前記一つの化合物のＲAおよびＲCがそれぞれＣ2Ｈ5およびＣ2Ｄ5であり、前記もう一つの化合物のＲAおよびＲCはそれぞれＣ2Ｄ5およびＣ2Ｈ5であることを特徴とする、請求項２１に記載の定量方法。
【請求項２４】
前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項２５】
前記分析体はペプチドであることを特徴とする、請求項２４に記載の定量方法。
【請求項２６】
前記分析体は核酸、核酸誘導体およびステロイドであることを特徴とする、請求項２４に記載の定量方法。
【請求項２７】
前記定量方法は四重極イオントラップ質量分析器を用いることを特徴とする、請求項１２に記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラベリング剤とこれを用いたアミノ酸配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に係り、より詳しくは、強い定量信号を示すことが可能なラベリング剤とこれを用いたアミノ酸配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質とペプチドの同定および定量分析には質量分析技術が広く用いられている。例えば、タンパク質を酵素で分解して生じるペプチドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization、ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化法（Electrospray Ionization、ＥＳＩ）を用いてイオン化させた後、質量分析機器で質量を正確に測定し、遺伝子配列が与えるペプチド情報と比較してタンパク質の正体を解明し、さらに明確には、一部のペプチドを質量分析機器で選択して気体と衝突分解させて生じる断片イオンからペプチド配列を得てタンパク質の正体を解明する。
【０００３】
タンパク質とペプチドの定量分析には、同位元素を含んでいる化学標識物を分析対象タンパク質またはペプチドに標識して質量を分析する方法が広く用いられている。定量的に比較すべき同一種類の様々なタンパク質とペプチドの試料に同位元素標識の異なる同一の化学標識を付けて質量分析を行うと、同位元素の質量差のため、質量分析スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル上における各試料の質量が異なるから、その相対存在量を比較することにより定量分析が可能となる。
【０００４】
上述したタンパク質またはペプチドの同定と定量分析を同時に行うために、同重体化学標識法が使われている。米国特許公開ＵＳ２００５／０１４８０８７号および国際特許公開ＷＯ２００５／０６８４４６号などには、ペプチドに付けて衝突分解させると、タンデム質量分析スペクトルから定量信号が現れるように考案された同重体化学標識物を開示している。ところが、前記文献が提示するラベリング剤は、炭素−１３、窒素−１５または酸素−１８などの同位元素を使用しているため、多様な同重体の合成に限界があり、価格が高いという問題点を持つ。また、既存の同重体標識試薬を用いた定量分析は、ポールトラップ(Paul trap)、線形イオントラップ(Linear ion trap)などの四重極イオントラップ質量分析器では活用が不可能である。よって、多様な水素置換が可能で相対的に価格が低い水素同位元素を用いてアミノ酸配列とタンパク質の量を同時に確認することが可能な新規の同重体ラベリング剤が求められる。
【０００５】
一方、四重極イオントラップ質量分析器は、他の質量分析器に比べて価格が低く、メンテナンスが容易で使用が便利であるうえ、イオンを気体状に捕集して多数回のタンデム質量分析を行うことが可能な能力を持っているから、タンパク質およびペプチドの正体解明に広く活用されてきた。これにより、タンパク質体研究分野において四重極イオントラップ質量分析器が最も広く普及されて運営されている。この四重極イオントラップにおけるタンデム質量分析は、理論的に限定されるものではないが、一般に共鳴励起衝突由来分解（Resonant Excitation Collision-Induced Dissociation、ＲＥ−ＣＩＤ）という技術で行われる。この場合、断片イオンの質量対電荷比が親イオンの質量対電荷比の約１／３より小さいと、イオントラップ内で安定的に捕集されないため検出されず、これを「ｌｏｗ−ｍａｓｓ ｃｕｔｏｆｆ」効果という。既存の技術に用いられた同重体ラベリング剤は、質量が１００〜２００Ｄａ程度と小さい断片イオンを定量信号として使用しているから、四重極イオントラップ質量分析器ではｌｏｗ−ｍａｓｓ ｃｕｔｏｆｆ効果によって定量信号イオンが検出されないという問題点がある。さらに、１００〜２００Ｄａの質量領域では、分析体であるタンパク質またはペプチドから誘導できる小さい質量の内部断片イオンが定量信号イオンを妨害する可能性が非常に大きいため、正確な定量分析が不可能なこともある。
【０００６】
したがって、上述した特許に開示された物質では低い質量の断片イオンのみが分析できるので、四重極イオントラップ質量分析器で使用することができないという決定的限界を持っている。これにより、最も広く普及された四重極イオントラップ定量分析器においても制限なく活用が可能な同重体標識物質とこれを活用した分析方法の発明が求められる。また、上述の限界を克服するためには、定量信号が十分に大きい質量の断片イオンとして示される必要がある。大きい質量を持つ断片イオンの場合、小さい質量の断片イオンに比べて雑音信号に妨害される確率が非常に低く、四重極イオントラップから発生可能なｌｏｗ−ｍａｓｓ ｃｕｔｏｆｆにも制限を受けないから、非常に活用価値が高い。
【０００７】
一方、本発明者は、韓国特許出願第２００８−００７０２７２号を通して、水素同位元素のみを利用し、定量信号の質量調節が可能で、かつジペプチド構造を持つＭＢＩＴ(Mass-balanced isotope tag)と命名された新規の同重体ラベリング剤を開示している。また、韓国特許公開第２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第２０１０−０００９４７９号、および国際特許公開ＷＯ１０／００８１５９号では、質量調節基を変形させて同重体ラベリング剤の物性および定量信号の質量を多変化させた可変質量ラベリング剤およびラベリング剤セットを開示しており、これを活用した多重定量分析法として、２種以上のラベリング剤を用いた３つ以上の試料の同時多重定量分析法であるｍｕｌｔｉ ２−ｐｌｅｘ定量法も開示している。上述の方法で容易かつ低廉な同重体ラベリング剤の合成が可能であり、多重の試料も定量することができるが、ｍｕｌｔｉ ２−ｐｌｅｘ定量法で多重定量を行うときは、基準となる試料の消費が多くなり、一度に分析すべき試料の全量も増加するという問題点がある。
【０００８】
そこで、本発明者は、水素同位元素を活用し、且つラベリング剤の合成費用は減らしながらも一度に多量の試料を定量することが可能なラベリング剤を研究したところ、新しい化学構造によってこのような目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。また、 多重の試料を分析する場合に定量信号の強さが弱くなりかつ定量正確度が減少するという問題点を、従来の技術を改善することにより、タンデム質量分析の際に定量信号が強く発生することを見出し、本発明を完成した。また、本発明者は、本発明者によって提示された同重体ラベリング剤を用いて四重極イオントラップ質量分析器においても適用することが可能な分析方法を研究したところ、大きい質量の定量信号イオンを用いて分析することが可能な方法を確認したとともに、これを活用して、四重極イオントラップ質量分析器を含む全ての質量分析器でペプチドおよびタンパク質の相対的な量を定量することが可能な方法を確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、水素同位元素を活用し、かつラベリング剤の合成費用は減らしながらも一度に多重の試料を定量することが可能な新しい化学構造の化合物を提供しようとする。
【００１０】
また、本発明は、前記化合物を２種以上含む組成物を提供しようとする。
【００１１】
また、本発明は、前記化合物または前記組成物を用いて２種以上の分析体を同時に定量分析することが可能な新規の定量分析方法を提供しようとする。
【００１２】
また、本発明は、水素同位元素を含む、２つ以上のアミノ酸配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体可変質量ラベリング剤を用いて、分析体より大きい質量値から検出される定量分析信号で定量分析する方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明は、下記一般式１で表される化合物を提供する。
【００１４】
【化１】
2013536433.tif 000003
（式中、
【化２】
2013536433.tif 000004
【００１５】
Ｒ3はアミノ酸残基の側鎖であり、
Ｒ4はヒドロキシまたは反応性リンカーであり、
Ｒ5は水素、Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルキニルであり、
Ｒ6は水素、Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルキニルであり、
ｎとｍはそれぞれ独立して１〜４の整数であり、および
前記Ｒ1およびＲ2は重水素を含まないか、或いは前記Ｒ1およびＲ2の少なくとも一つは重水素を含む。）
【００１６】
次に、図１を参照して、前記一般式１で表される化合物の一例を説明する。図１に示すように、前記化学式１で表される化合物がタンデム質量分析に使用される場合、定量信号を示すイオンが発生し、特にＲ1+およびＲ1−ＮＨ+＝ＣＨ−Ｒ3が定量信号を示すイオンとなる。本発明の一実施例によれば、Ｒ1にベンジル基が置換される場合、Ｒ1+が強い定量信号を示すことを確認することができた。
【００１７】
好ましくは、前記一般式１で表される化合物の定量信号は、４−（１−プロピニル）ベンジル陽イオンである。Ｒ1に重水素が含まれることにより、定量信号が異なることがあり、一例として、定量信号は１２９Ｔｈ（ＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2+）、１３１Ｔｈ（ＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2+）、１３２Ｔｈ（ＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2+）または１３４Ｔｈ（ＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2+）が可能である。
【００１８】
好ましくは、前記一般式１において、
【化３】
2013536433.tif 000005
【００１９】
Ｒ5は水素、プロピルまたはプロプ−１−イニル(prop-1-ynyl)であり、
Ｒ6は水素、プロピルまたはプロプ−１−イニル(prop-1-ynyl)であり、および
ｎとｍはそれぞれ独立して１〜４の整数である。
【００２０】
より好ましくは、前記一般式１において、
Ｒ1はオクチルであり、Ｒ2はヘプチルである。
【００２１】
また、前記一般式式１において、Ｒ1とＲ2は種類が同一であることが好ましく、すなわち、Ｒ1はＣ1-10アルキル、Ｒ2はＣ1-10アルキルであり或いは、
【００２２】
【化４】
2013536433.tif 000006
【００２３】
また、好ましくは、前記Ｒ1およびＲ2は、
それぞれＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2およびＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2ＣＨ2であり、
それぞれＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2およびＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2ＣＨ2であり、
それぞれＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2およびＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2ＣＨ2であり、
またはそれぞれＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2およびＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2ＣＨ2である。
【００２４】
前記一般式１において、Ｒ3はアミノ酸の残基の側鎖であり、これは一般式１がアミノ酸のアミン基にＲ1およびＲ2が置換された構造を持つことに起因する。
【００２５】
本発明で使用される用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸または人工アミノ酸を意味し、好ましくは天然アミノ酸を意味する。例えば、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシンまたはトリプトファンを意味する。
【００２６】
また、本発明で使用される用語「アミノ酸の残基の側鎖」とは、アミノ酸の構造のうち、ＮＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨを除いた残りの構造、すなわちＮＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨのＣＨ2に置換された基を意味する。例えば、グリシンの場合、グリシンの残基の側鎖は水素を意味し、セリンの場合、セリンの残基の側鎖はヒドロキシメチルを意味する。前記一般式１の製造過程において、前記Ｒ3をアミノ酸の種類によって自由に調節することができ、これにより定量信号の調節も可能である。
【００２７】
前記一般式１において、Ｒ4はヒドロキシまたは反応性リンカーである。
【００２８】
本発明で使用される用語「反応性リンカー」とは、前記一般式１の化合物と分析体が結合できるようにする反応基を意味する。本発明において、前記一般式１の化合物をタンパク質またはペプチドの分析に使用する場合、タンパク質またはペプチドに存在するアミン基またはヒドロキシ基と反応することが可能な反応基が好ましい。一例として、スクシンイミド−Ｎ−オキシ、３−スルホスクシンイミド−Ｎ−オキシ、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ、ペンタハロベンジルオキシ、４−ニトロフェノキシまたは２−ニトロフェノキシであってもよく、これに限定されない。また、Ｒ4がヒドロキシである場合には、前記化学式１が全体的にカルボキシ基を持つ化合物であるから、カルボキシ基を、反応性リンカーが置換されたカルボニル基とすることができる。
【００２９】
前記一般学式１で表される化合物のうち、好ましい化合物の例は、下記のとおりである：
１）２−（Ｎ−（４−プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
２）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
３）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
４）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イル）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
５）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸、
６）２−（Ｎ−（４−プロピルベンジル）−２−（４−プロピルフェニル）アセトアミド）酢酸、
７）２−（５−フェニル−Ｎ−（３−フェニルプロピル）ペンタンアミド）酢酸、および
８）２−（Ｎ−オクチルオクタンアミド）酢酸。
【００３０】
また、本発明は、前記一般式１で表される化合物を２種以上含む組成物を提供する。
本発明で使用される用語「２種以上」とは、互いの化学構造が同一でない化合物が２種以上含まれたことを意味し、２〜４種の化合物を含むことが好ましい。より好ましくは、重水素と水素の置換有無についてのみ化学構造が同一でない化合物を２種以上含む。
【００３１】
前記２種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることが好ましい。互いの化学構造が同一でないながらも、互いに重水素の数は同一であるため、定量信号を示すイオンの質量差が生ずるので、質量分析スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル上での各試料の質量が異なる。よって、その相対存在量を比較分析して定量分析が可能である。
【００３２】
前記組成物の一例としては、下記化合物よりなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を含む組成物が挙げられる：
１）２−（Ｎ−（４−プロプ−１−イニル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、
２）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）フェニル）プロパンアミド ）酢酸、
３）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イル）フェニル）プロパンアミド−３，３−ｄ2）酢酸、および
４）２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イニル−３，３，３−ｄ3）ベンジル−１，１−ｄ2）−３−（４−（プロプ−１−イニル）フェニル）プロパンアミド）酢酸。
【００３３】
また、本発明は、前記一般式１で表される化合物、または前記一般式１で表される化合物を２種以上含む組成物を用いて分析体を定量分析する方法を提供する。分析体を定量分析するためには前記化合物を分析体に結合させなければならず、前記化合物と分析体との結合は、リンカーが分析体のアミンと反応し、脱離基として作用して分離されることにより行われる。
【００３４】
前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする。また、前記分析体はペプチドであることを特徴とする。また、前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする。また、前記分析体はステロイドであることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明は、前記一般式１で表される化合物を２種以上含む組成物を分析体に結合させる段階と、前記分析体を分解して前記分析体を定量する段階とを含むことを特徴とする、アミノ酸配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。
【００３６】
前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることが好ましい。前記定量信号の質量を与える定量信号はＲ1+またはＲ1ＮＨ+＝ＣＨＲ3の内部断片であり、好ましい様態として、前記定量信号の質量を与える定量信号は４−（１−プロピニル）ベンジル陽イオンである。
【００３７】
好ましくは、前記定量信号の質量を与える定量信号は、１２９Ｔｈ（ＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2+）、１３１Ｔｈ（ＣＨ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2+）、１３２Ｔｈ（ＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＨ2+）または１３４Ｔｈ（ＣＤ3Ｃ≡ＣＣ6Ｈ4ＣＤ2+）である。
【００３８】
また、本発明は前記一般式１で表される化合物の製造方法を提供し、具体的な製造方法を図３〜図５に基づいて説明する。
【００３９】
図３に示すように、前記一般式１で表される化合物は、ハロアルカン形態のｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとカルボン酸形態のｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔおよびエステル化されたアミノ酸を用いて合成される。
【００４０】
また、重水素を含む前記一般式１で表される化合物は、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔに重水素を導入する反応を行った後、これを用いて製造することができる。重水素を導入する方法は、本発明の属する分野における公知の方法を使用することができる。具体的に、図２に示された方法を使用することができる。一つの重水素を導入する方法には、塩基性の重水（Ｄ2Ｏ）において末端アルキンの水素を重水素に置換する方法と、一つのカルボニル基を重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ4）または重水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＤ4）で部分的に還元する方法がある。２つの重水素を導入する方法には、アルケンを金属触媒の存在下に重水素気体（Ｄ2）で還元する方法と、ペプチド結合またはエステル結合のカルボニル基をＬｉＡｌＤ2で還元する方法と、メトキシドナトリウム（ＮａＯＣＤ3）を用いてエステル化合物のアルファ位置に重水素を導入する方法がある。３つの重水素はヨウ化メタン−ｄ3（ＣＤ3Ｉ）を用いて２次アミンまたは末端アルキンをアルキル化させる方法で導入することができる。４つの重水素を導入する方法には、２つのカルボニル基をＬｉＡｌＤ4により還元する方法と、アルキルを金属触媒の存在下にＤ2で還元する方法がある。これらの方法の中でも、本発明では、一実施例として、エステル結合のカルボニル基をＬｉＡｌＤ4で還元して２つの重水素を導入する方法と、アルキンをＣＤ3Ｉでアルキル化して３つの重水素を導入する方法とを組み合わせて４重の同重体ラベリング剤（図１（ｂ）、ｔａｇα）を合成した。
【００４１】
本発明では、一例として、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔをまず合成し、合成されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの一部を３段階の追加反応で変形させてｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを合成した。具体的なｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔおよびｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔの製造方法は図４を参照して説明する。
【００４２】
まず、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの合成方法について説明する。
【００４３】
パラジウム触媒とヨウ化第一銅を用いた薗頭カップリング法(Sonogashira coupling)を用いて、４−ブロモ安息香酸メチルエステルにトリメチルシリル（ＴＭＳ）で保護されたアルキルを導入する。次いで、エステルをアルコールに還元する。この際、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）または重水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＤ4）を使用すると、それぞれの場合に水素または重水素が２つずつ置換された化合物が生成される。
【００４４】
生成されたアルコールを塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＳＣｌ）で処理してｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＳ）で保護し、炭酸カリウムを用いて、アルキンを保護しているＴＭＳのみを選択的に除去する。このように生成された末端アルキンにヨウ化メタン−ｄ0（ＣＨ3Ｉ）または−ｄ3（ＣＤ3Ｉ）を用いてメチル−ｄ0または−ｄ3を導入する。次いで、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を用いてＴＢＳを除去する。
【００４５】
生成された化合物に塩化メタンスルホン酸を処理し、ヨウ化ナトリウムを用いてヨウ素に置換すると、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔが合成される。反応中間にＬｉＡｌＨ4／ＬｉＡｌＤ4とＣＨ3Ｉ／ＣＤ3Ｉの組み合わせによって総４種のｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔが得られる。ＬｉＡｌＨ4とＣＨ3Ｉを使用すると、重水素のないｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ0が生成され、ＬｉＡｌＤ4とＣＨ3Ｉを使用すると、２つの重水素が含まれたｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ2が生成され、ＬｉＡｌＨ4とＣＤ3Ｉを使用すると、３つの重水素が含まれたｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ3が生成され、ＬｉＡｌＤ4とＣＤ3Ｉを使用すると、５つの重水素が含まれたｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ5が生成される。
【００４６】
次に、ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔの合成方法について説明する。
【００４７】
合成されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの一部を用いてマロン酸ジエチルをアルキル化する。還流(reflux)を通してマロン酸のカルボキシル基の一つを除去した後、水酸化ナトリウム水溶液でエチルエステルを加水分解してｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを合成する。ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔをｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔに変形させる過程には重水素を使用しないので、ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔの重水素の数は使用したｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔによって決定される。
【００４８】
上述したように製造されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを用いて、重水素を含む化学式１で表される化合物を図３に示された方法で製造することができ、この際、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔに含まれた重水素の全体数を維持する。すなわち、図６のように４重同重体ラベリング剤ｔａｇ αを例として挙げると、ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄnを使用した場合には、ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔは５−ｎ個の重水素が含まれたもの（ｂａｌａｎｃｅ−ｄ5-n）を用いて同重体を合成する。グリシンメチルエステルのアミンをｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄn（ｎ＝０、２、３および５）でアルキル化する。合成された化合物とｂａｌａｎｃｅ−ｄ5-nを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて結合反応させ、水酸化ナトリウム水溶液でメチルエステルを加水分解すると、定量信号の質量値が１２９＋ｎである酸型の同重体ラベリング剤ｔａｇα129+nが得られる。また、上述と同様の方法で、図５のようにｔａｇβを製造することができる。
また、本発明は、下記一般式２で表される化合物を含むラベリング剤を分析体と結合させる段階（段階１）と、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階（段階２）と、前記断片イオンのうち、分析体とＲCを含む断片イオンを定量する段階（段階３）とを含む、分析体の定量方法を提供する。
【００４９】
【化５】
2013536433.tif 000007
【００５０】
（式中、
ＲAは直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ18アルキルであり、ＲBは質量調節基であり、
ＲCは直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ18アルキルであり、
Ｌｉｎｋｅｒは分析体との結合を誘導する反応性リンカーであり、
ＲAおよびＲCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つが一つ以上の重水素を含む。）
【００５１】
前記段階１は、前記一般式２で表されるラベリング剤を分析体と結合させる段階であって、分析体にラベリング剤を結合させ、後続の定量分析に利用するための段階である。前記結合は、ラベリング剤のリンカーと分析体のアミン基とが反応することにより行われる。結合方法は、韓国特許公開第２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第２０１０−０００９４７９号、および国際特許公開ＷＯ２０１０／００８１５９号に開示されているとおりであり、当業界における公知のアミン基とリンカーの結合反応で結合させることができる。分析体に多数のアミン基が２つ以上存在する場合には、前記一般式２で表されるラベリング剤が２つ以上結合できる。
【００５２】
本発明で使用される用語「ラベリング剤」とは前記化学式２で表される化合物を意味し、前記化合物は韓国特許公開第２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第２０１０−０００９４７９号、および国際特許公開ＷＯ２０１０／００８１５９号に開示されているとおりであり、これらの特許文献は本発明の参照として含まれる。
【００５３】
具体的に、本発明で使用される用語「リンカー」は、アミンの求核性攻撃により脱離基となる活性エステルであることを意味する。前記アミンは１次アミンであることを特徴とする。また、前記反応性リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、４−ニトロフェニル基、および２-ニトロフェニル基よりなる群から選択できる。
【００５４】
また、本発明で使用される用語「前記質量調節基（ＲB）」は、分析体と結合した後、質量分析過程で分解されるとき、Ｎ−アシル化されたアミノ酸断片の質量を調節して定量信号がスペクトル上で他の断片と重ならないようにするために導入されるものを意味する。ＲBの種類を変えることにより、定量信号の質量を様々に変化させることができる。前記質量調節基は、類似または同一物性の天然または人工アミノ酸残基の側鎖の一つであってもよい。また、前記質量調節基は類似または同一の物性を有することを特徴とする。また、前記質量調節基はＣ1-18の直鎖または分岐鎖のアルキルであってもよく、一例としてメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルなどの直鎖または分岐鎖のアルキルであってもよい。
【００５５】
前記ＲAおよびＲCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つは重水素を含み、同位元素の質量差による定量分析を可能とする役割を果たす。好ましくは、前記ＲAおよびＲCはメチル、または一つ以上の重水素を含むメチルであり、或いは前記ＲAおよびＲCはそれぞれエチルであり、ＲAおよびＲCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする。また、前記ＲAおよびＲCは炭素の個数が同じアルキルからなっているが、含まれた重水素の数が互いに異なるべきである。このような観点から、前記ＲAとＲCはそれぞれＣＨ3およびＣＤ3であり、或いはＣＤ3およびＣＨ3であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、ＲAとＲCは、ＲAがＣＨ3であれば、ＲCはＣＤ3であり、ＲCがＣＨ3であれば、ＲAがＣＤ3である。或いは、前記ＲAおよびＲCは、それぞれＣ2Ｈ5およびＣ2Ｄ5であり、またはそれぞれＣ2Ｄ5およびＣ2Ｈ5であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、ＲAとＲCは、ＲAがＣ2Ｈ5であればＲCはＣ2Ｄ5であり、ＲCがＣ2Ｈ5であればＲAがＣ2Ｄ5である。
【００５６】
前記一般式２は、Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端に、アミンの求核性攻撃により脱離基となるリンカーが付着し、同位元素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。また、前記ジペプチドは重水素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。
【００５７】
次に、前記「ラベリング剤」の化学構造および分析原理を図１３〜図１５を参照して説明する。
図１３はラベリング剤の化学構造を図式的に示す。特許文献（韓国特許公開第２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第２０１０−０００９４７９号、および国際特許公開ＷＯ２０１０／００８１５９号）に開示された化合物を「ＭＢＩＴ」と命名し、理論的に限定されたものではないが、Ｎ末端がアシル化され且つＣ末端にリンカーが付着したジペプチドの構造を持つ。
図１４は、理論的に限定されるものではないが、ペプチドおよびタンパク質にＭＢＩＴ物質が結合する様子を図式的に示す図である。ペプチドおよびタンパク質のＮ末端の１次アミンだけでなく、リシン側鎖の１次アミンとも結合が起こりうる。よって、一つのペプチドまたはタンパク質にラベリング剤を結合させるとき、タンパク質およびペプチドが含まれるリシンの個数に応じて２つ以上のラベリング剤が多重結合できる。分析体がタンパク質またはペプチドではなくても、分析体が持っている１次または２次アミンの個数だけのラベリング剤が最大に分析体と結合することができる。
【００５８】
特に、本発明は、ＲAおよびＲCに含まれた総重水素の数が一定である、前記化学式２で表される化合物の２種以上、好ましくは２種を一つのセットとして使用することが好ましい。前記セットを構成する化合物対をそれぞれ第１化合物、第２化合物とするとき、前記第１化合物と第２化合物は同一の質量調節基（ＲB）を有することが好ましい。また、化合物対において、第１化合物のＲAおよびＲCのいずれか１つがもう１つに比べて多数の重水素を含んでいると、第２化合物では第１化合物のＲCをＲAとし、第１化合物のＲAをＲCとすることが好ましい。一例として、化合物対において、第１化合物のＲAおよびＲCがそれぞれＣＨ3、ＣＤ3の場合、第２化合物のＲAおよびＲCはＣＤ3、ＣＨ3から構成される化合物の対を挙げることができる。或いは、化合物対において、第１化合物のＲAおよびＲCがそれぞれＣ2Ｈ5、Ｃ2Ｄ5の場合、第２化合物のＲAおよびＲCはＣ2Ｄ5、Ｃ2Ｈ5からなる化合物の対を挙げることができる。特に、本発明はｙSイオンを用いて定量するために、第１化合物と第２化合物のうちいずれか１つのＲCにのみ重水素を含むことが好ましい。
【００５９】
前記ラベリング剤セットの第１化合物と第２化合物でそれぞれ区分標識された分析体をタンデム質量分析したとき、ＲAおよびＲCが分離されるようにラベリング剤が分解される場合、分解を介して生成された断片イオンは、ＲAおよびＲCにおいて異なる重水素の質量だけの差を示し、その結果がタンデム質量分析スペクトルに現れることになる。これらの相対的な強さを比較して分析体の相対的な量を定量することができる。理論的に限定されたものではないが、一般にタンデム質量分析過程で分離されて生成される、互いに異なる相補的な２つの断片イオンがそれぞれ独立な定量分析信号として活用できる。
【００６０】
本発明で使用される用語「分析体」は、本発明に係るラベリング剤によって分析される物質を意味する。前記分析体は、タンパク質、炭水化物または脂質であってもよく、ペプチド、核酸または核酸誘導体、或いはステロイドであってもよい。
【００６１】
前記段階２は、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階であって、結合体に存在するアミド結合が壊されながら断片イオンを生成させる段階である。
【００６２】
本発明の結合体のアミド結合が壊されて生成できる断片イオンのうち、ＲAおよびＲBを含む断片イオン、およびＲCと分析体を含む断片イオンが生成できる。本発明において、ＲAおよびＲBを含む断片イオンを「ｂSイオン」と命名し、ＲCと分析体を含む断片イオンを「ｙSイオン」と命名する。次に、これを図１５および図１６を参照して説明する。
【００６３】
図１５は結合体がタンデム質量分析過程で分解されたときに生成される断片イオンを示す図である。この際、同一の分子式に重水素が標識された部位のみ異なるＭＢＩＴ試薬対を便宜によってHＭＢＩＴとLＭＢＩＴに区分するが、ＲAまたはＲBに重水素が標識されたものをHＭＢＩＴと呼び、ＲCに重水素が標識されたものをLＭＢＩＴと呼ぶ。HＭＢＩＴとLＭＢＩＴが結合した分析体は、全体的な重さは同一である。
【００６４】
同位元素暗号化基として選択された２つのうち、重水素を含むものとそうでないものの左側上端にそれぞれＨ（重水素を含む）とＬ（重水素を含まない）を添え字として表記した。図１５に示すように、理論的に限定されるものではないが、結合体は、タンデム質量分析過程でジペプチドの２つのアミノ酸間のアミド結合が壊されながら、ＲAとＲBを含む断片イオン（ｂS）と、ＲCと分析体を含む断片イオン（ｙS）に分離できる。分析体から化学式２に該当する部分のみ離れた断片イオンを「−ｔａｇ」と命名する。
【００６５】
図１６は、理論的に限定されるものではないが、２つ以上の一般式２の化合物と結合したペプチドをタンデム質量分析したときに理論的に生成できるタンデム質量分析スペクトルを示している。図１６に示すように、ペプチドのＮ末端およびＣ末端のアミノ酸を含んで２つ以上のアミン基と一般式２の化合物とが結合した場合、ペプチドから生成可能な全てのｂおよびｙタイプ配列イオンの質量は−ｔａｇの質量より小さい質量値を有する。よって、−ｔａｇより質量が大きいｙSイオンは、理論的にペプチドから誘導される他の断片イオンの妨害を全く受けない質量範囲で現れる。
【００６６】
理論的に限定されるものではないが、最も広く活用されているタンパク質分解酵素であるトリプシンまたはＬｙｓＣを用いてタンパク質を酵素分解すると、Ｃ末端にリシンを含んでいるペプチドを得ることができるため、Ｎ末端のアミン基とＣ末端のリシン側鎖のアミン基に２つの化学式２の化合物を結合させることができる。
【００６７】
前記段階３は、前記断片イオンのうち、分析体とＲCを含む断片イオン（ｙS）を定量する段階であって、大きい質量を有する断片イオンで分析体を分析するための段階である。
【００６８】
ｙS定量信号の質量値は、親イオンの質量値の１／３以上であるため、イオントラップ質量分析器で共鳴励起衝突由来分解法を用いてタンデム質量分析を行う場合にも、ｌｏｗ−ｍａｓｓ ｃｕｔｏｆｆに関係なくｙSイオンの検出が可能である。よって、小さい質量値を有する定量信号を活用する既存の他の同重体標識とは異なり、四重極イオントラップ質量分析器においてもｙS定量信号を活用した定量分析を行うことができるという特徴がある。
【００６９】
前記分析方法に係る本発明の一実施例によれば、一般式２の化合物を用いて、大きい質量値を有するｙS断片イオンで定量分析が可能であることを確認することができる。特に、分析体自体より大きい質量を有する断片イオンを活用するから、四重極イオントラップ質量分析器においても定量分析が可能であり、また信号の強さも増幅される。よって、既存の一般式２の化合物を用いた分析よりさらに効果的な分析が可能である。
【発明の効果】
【００７０】
本発明は、水素同位元素を含みながら、定量信号の強さを強く発生させることができ、２つ以上のタンパク質を同時に定量異分析することができる新規化合物、および前記化合物を２種以上含む組成物を提供し、前記ラベリング剤または組成物を用いてアミノ酸配列を分析すると同時にタンパク質の量を定量分析する方法を提供することができる。
【００７１】
また、本発明は、同重体ラベリング剤を活用して、ペプチドのアミノ酸配列を分析すると同時に量を定量分析する新規方法を提供することができる。既存の他の同重体標識試薬の場合は、標識物質を分析体と結合させた後、タンデム質量分析で標識物質中間の結合を分解させた後、分析体を含まない小さい質量の断片イオンを活用して定量分析を行うが、これに対し、本発明は、同重体ラベリング剤を活用して標識物質の結合をタンデム質量分析過程で分解させた後、断片イオンのうち、分析体を含み且つ大きい質量値を有する断片イオン（ｙS）を活用して定量分析を行うことができるという特徴がある。これにより、既存の小さい質量値を有する定量信号イオンを活用する場合に比べて、最大５倍以上強い信号強さで定量分析が可能であり、四重極イオントラップ質量分析器を含む全ての質量分析器でペプチドおよびタンパク質の相対的な量を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明に係る化合物の構造を示す。図１（ａ）は本発明の化合物の代表構造、および化合物で生成される定量信号の構造を示す。図１（ｂ）〜図１（ｄ）は本発明の一実施例に係る化合物の４つの構造を示す。図１（ｂ）は水素同位元素を用いて多重同重体に合成された構造であり、ここで、それぞれのＸ1〜Ｘ4は選択的に水素同位元素で置換される位置を示す。
【図２】本発明に係る化合物を、水素同位元素を用いて同重体ラベリング剤に製造するために、活用できる代表的な重水素添加および置換反応を示す。
【図３】本発明の化合物の合成過程を示す。ハロアルカン形態のＲｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｒ1−Ｂｒ）とカルボン酸形態のｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ（Ｒ2−ＣＯＯＨ）およびエステル化されたアミノ酸を用いて合成される。
【図４】本発明の一実施例に係る化合物（ｔａｇα）の合成に必要なｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを重水素添加および置換反応を用いて合成する過程を示す。ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔはｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの変形を通して合成する。２つの重水素を導入する方法(エステル結合のカルボニル基をLiAID4に還元させて、２つの重水素を導入する方法)とアルキンをＣＤ3Ｉでアルキル化して３つの重水素を導入する方法）を組み合わせてｒｅｐｏｒｔｅｒおよびｂｌａｎａｃｅ ｕｎｉｔをそれぞれ４種ずつ合成する。
【図５】本発明の一実施例に係る化合物（ｔａｇβ）の合成に必要なｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを合成する過程を示す。ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔはｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの変形を通して合成する。
【図６】本発明の一実施例に係る化合物の構造を示す。ｎ個の重水素を含むｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄn、５−ｎ個の重水素を含むｂａｌａｎｃｅ−ｄ5-nおよびグリシンを用いて合成したもので、ｔａｇαmは定量信号の質量値がｍのｔａｇαを意味する。
【図７】本発明に係る化合物の活性化方法の一実施例を示すもので、化合物をスクシンイミジルエステルで活性化し、ペプチドに結合する方法を示す。
【図８】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα129〜α134）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図９】本発明の一実施例の化合物で生成される定量信号（ベンジル陽イオンとイミニウム陽イオン)の相対的強さを示す。定量信号の強さはモデルペプチドから生成されたヒスチジンインモニウムイオン（１１０Ｔｈ）の強さに対して相対的な値で表示した。
【図１０】本発明の一実施例の多重同重体で標識されたモデルペプチドを一定の割合で混ぜてタンデム質量分析した結果を示す。図１０（ａ）は多重同重体で標識されたペプチドを２：１：２：１（ｔａｇα129：α131：α132：α134）の比率で混ぜた試料の結果を示し、図１０（ｂ）は１：２：１：２（ｔａｇα129：α131：α132：α134）の比率で混ぜた試料の結果を示す。
【図１１】多重同重体（ｔａｇα129−α134）を用いて測定することが可能なペプチドの量または濃度の範囲を測定した結果を示す。多重同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、bovine serum albumin）中でＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲおよびＳＥＩＡＨＲをタンデム質量分析した結果を示すもので、ｔａｇα129とｔａｇα131で標識されたペプチドを３：１の比率で混ぜ、全体タンパク質の量を４．２ピコモルから１３フェムトモルまで変化させた後、タンデム質量分析した結果である。各濃度で観測される親イオンの強さを図１１（ａ）に示し、タンデム質量分析で測定された定量信号の比率を図１１（ｂ）に示す。
【図１２】液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ定量分析器を連動して、多重同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡを定量分析した結果を示す。図１２（ａ）は各ペプチドがＬＣから溶出した時間によってＭＡＬＤＩ質量分析器で観測された親イオンの強さを示し、図１２（ｂ）は各ペプチドで測定された定量信号の量をｔａｇα129の定量信号の量と比較して示す。同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡ中で６種のペプチド（ＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲ、ＱＥＰＥＲ、ＡＷＳＶＡＲ、ＳＥＩＡＨＲおよびＹＬＹＥＩＡＲ）から得た結果である。
【図１３】本発明のラベリング剤の化学構造を図式的に示す。
【図１４】本発明のラベリング剤がペプチドおよびタンパク質に結合する反応を図式的に示す。
【図１５】分析体のアミンと結合したラベリング剤がタンデム質量分析過程で分解されたときに生成できる断片イオンの種類を概略的に示す。
【図１６】２つ以上のラベリング剤と結合したペプチドをタンデム質量分析したときに理論的に生成できるタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１７】モデルペプチド２種と本発明の一実施例に係るラベリング剤を結合させた後、それぞれをエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量分析した結果を示す。
【図１８】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ22+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ22+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２２】本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲ（図１０（ａ））とＬＩＳＦＹＡＧＫ（図１０（ｂ））の＋２価電荷を帯びる親イオン（ＭＨ22+）を四重極イオントラップでタンデム質量分析したときに現れるｙS定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占める比率を示す。
【図２３】本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧ（図１１（ａ））とＬＩＳＦＹＡＧＫ（図１１（ｂ））の＋１価電荷を帯びる親イオン（ＭＨ+）を四重極イオントラップでタンデム質量分析したときに現れるｙS定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占める比率を示す。図１１（ｃ）は本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲの＋１価電荷を帯びる親イオンをＭＡＬＤＩイオン化法で生成してＴＯＦ／ＴＯＦ装備でタンデム質量分析したときに現れるｂS定量信号の強さ比を示す図である。
【図２４】図２４（ａ）はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにＶａｌ−ｔａｇが結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ22+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ2タンデム質量分析スペクトルを示し、図２４（ｂ）はＭＳ2タンデム質量分析で生成されたLｙSイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たＭＳ3タンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２５】Ｇｌｎ−ｔａｇのHＭＢＩＴとLＭＢＩＴで区分標識して多様な比率で混ぜたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫをタンデム質量分析して生成されたLｙSおよびHｙSイオンの信号の強さ比で定量分析を行って得た標準定量分析曲線を示す。
【図２６】図２６（ａ）および図２６（ｂ）はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＹＧＧＦＬＫにエチル−ｔａｇのHＭＢＩＴ（図２６（ａ））またはLＭＢＩＴ（図２６（ｂ））が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ+）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ2タンデム質量分析スペクトルを示し、図２６（ｃ）と図２６（ｄ）は図２６（ａ）と図２６（ｂ）においてｙS定量信号イオンが出る範囲を拡大して示す図である。
【図２７】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにエチル−ｔａｇが結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ2タンデム質量分析スペクトルを示すもので、エチル−ｔａｇのLＭＢＩＴに結合したペプチドとHＭＢＩＴに結合したペプチドを２：１の比率で混合してタンデム質量分析したスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、実施例および添付図面を参照して、本発明に係る化合物と、これを用いたアミノ酸配列およびタンパク質定量同時分析方法について詳細に説明する。本発明が後述の内容に限定されるのではなく、該当分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を外れない範囲内で本発明を多様な形態に実現することができるであろう。
【実施例１】
【００７４】
図１（ａ）で代表される化合物（ラベリング剤）において、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3位置に多様な構造または官能基を導入することができる。本発明では、実施例として、図１（ｂ）〜図１（ｅ）に示すように、４つの構造を持つ化合物（ｔａｇα〜δ）を合成し、各構造または作用基によって定量信号がどのように現れるかを確認した。
【００７５】
４つの構造の中でも、図１（ｂ）は水素同位元素を用いて多重のタンパク質を定量することが可能な同重体ラベリング剤に合成した例である。図１（ｂ）のＸ1〜Ｘ4は置換された重水素の位置を示す。
【００７６】
実施例１−１）非同重体ラベリング剤の合成
ラベリング剤は、図３に示したような順序で合成した。非同重体ラベリング剤の中でも、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを商業的に入手することが可能なｔａｇγとｔａｇδの場合は、各ｕｎｉｔ（γのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ、３−ヨードプロピルベンゼン；δのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ、１−ヨードオクタン；γのｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ、５−フェニルペンタン酸；およびδのｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ、オクタン酸）を購入して各ラベリング剤の合成を行った。ｔａｇβの場合は、ラベリング剤を構成するｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ（１−（ヨードメチル）−４−プロピルベンゼン）とｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ（２−（４−プロピルフェニル）酢酸）は図５の過程で合成し、これらを用いてｔａｇβを合成した。
【００７７】
ｔａｇβの合成
まず、ｒｅｐｏｒｅｔｅｒ ｕｎｉｔを合成した過程、および各段階で生成された化合物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）の結果を下記の段階１〜段階８に示す。
【００７８】
段階１：４−（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステルの合成
アルゴン条件の下で１０ｍＬのよく乾燥したテトラヒドロフラン（ｄｒｙ ＴＨＦ）に４−ブロモ安息香酸メチルエステル（５００ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド（Ｐｄ（ＰＰｈ3）2Ｃｌ2：８６．１ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ3：１８．３ｍｇ、０．０６９８ｍｍｏｌ）、トリメチルシリルアセチレン（ＴＭＳアセチレン：４９３μＬ、３．４９ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ：４８６μＬ、３．４９ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅（ＣｕＩ：８．８６ｍｇ、０．０４６５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、ｎ−ペンタン２０ｍＬを入れてセライト(celite)パッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を５０３ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ、９３％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H)
【００７９】
段階２：（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノールの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬに４−（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステル（３１６ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ4（２．０４ｍＬ、１．０Ｍ ＴＨＦ溶液、２．０４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、順次水７７μＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１５４μＬおよび水２３１μＬを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２５８ｍｇ（１．２６ｍｍｏｌ、９３％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
【００８０】
段階３：ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（（トリメチルシリル）エチニル）ベンジル）オキシ）シランの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬに（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノール（２５８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、イミダゾール（１０３ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）とｄｒｙ ＴＨＦ３ｍＬに溶かしたＴＢＳＣｌ（２２８ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、１５時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（１０ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を３８３ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
【００８１】
段階４：ｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシランの合成
アルゴン条件の下でメタノール４ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（（トリメチルシリル）エチニル）ベンジル）オキシ）シラン（３８３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（３３２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を溶かした後、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２８０ｍｇ（１．１４ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
【００８２】
段階５：ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シランの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシラン（２４７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を溶かした後、−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（８０５μＬ、２．４９Ｍ ｎ−ヘキサン溶液、２．００ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。２０分間−７８℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン（３１３μＬ、５．００ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、３０分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２５３ｍｇ（０．９７１ｍｍｏｌ、９７％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
【００８３】
段階６：ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−プロピルベンジル）オキシ）シランの合成
酢酸エチル２０ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シラン（２５２ｍｇ、０．９６８ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０ｂａｒの水素圧力を有するＨ−Ｃｕｂｅ装備に１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを装着し、室温で分当り０．５ｍＬの速度で通過させた。通過した溶液を減圧蒸留で濃縮させて目的化合物を２５１ｍｇ（０．９４９ｍｍｏｌ、９８％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.12 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.69 (s, 2H), 2.26 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.65-1.58 (m, 2H), 0.94-0.85 (m, 12H), 0.08 (s, 6H)
【００８４】
段階７：（４−プロピルフェニル）メタノールの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−プロピルベンジル）オキシ）シラン（２７５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を溶かした後、フッ化−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ；１．５６ｍＬ、１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１．５６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間０℃で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を１９８ｍｇ（０．８３８ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.25 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.57 (s, 2H), 2.97 (s, 1H), 2.62 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.74-1.62 (m, 2H), 0.99 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
【００８５】
段階８：１−（ヨードメチル）−４−プロピルベンゼンの合成
よく乾燥したジクロロメタン（ＤＣＭ）３ｍＬにアルゴン条件の下で（４−プロピルフェニル）メタノール（１００ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸（ＭｓＣｌ：６２．１μＬ、０．７９９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ：１４０μＬ、０．９９９ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（３ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン６ｍＬに溶かした後、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ：１５０ｍｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水１０ｍＬを加え、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｔａｇβ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ）を１５７ｍｇ（０．６０４ｍｍｏｌ、９０％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.44 (s, 2H), 2.53 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.92 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
前記で合成されたｔａｇβのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔからｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを合成する過程、および各段階で生成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階９と段階１０に示す。
【００８６】
段階９：２−（４−プロピルフェニル）アセトニトリルの合成
アルゴン条件の下でよく乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（dry DMF）１ｍＬに１−（ヨードメチル）−４−プロピルベンゼン（７３．６ｍｇ、０．２８３ｍｍｏｌ）を溶かした後、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ：２７．７ｍｇ、０．５６６ｍｍｏｌ）を加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加え、反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を４１．０ｍｇ（０．２５７ｍｍｏｌ、９１％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23-7.16 (m, 4H), 3.69 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.69-1.57 (m, 2H), 1.93 (t, 3H, J = 7.3 Hz)
【００８７】
段階１０：２−（４−プロピルフェニル）酢酸の合成
３０％水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬに２−（４−プロピルフェニル）アセトニトリル（４１．０ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）を溶かした後、４時間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、１０％塩化水素水溶液３ｍＬを加えて溶液を酸性化させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｔａｇβのｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ）を３４．８ｍｇ（０．１９５ｍｍｏｌ、７６％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.13 (m, 4H), 3.16 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.70-1.58 (m, 2H), 0.95 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
【００８８】
前記で製造されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを用いて、図３のような過程でｔａｇβの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階１１〜段階１３に示す。
【００８９】
段階１１：メチル２−（（４−プロピルベンジル）アミノ）アセテートの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ５ｍＬにグリシンメチルエステル（４４８ｍｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を溶かした後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：７７７μＬ、４．４６ｍｍｏｌ）と１−（ヨードメチル）−４−プロピルベンジル（２３２ｍｇ、０．８９２ｍｍｏｌ）を加え、１日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水１０ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（１０ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を１５２ｍｇ（０．６８７ｍｍｏｌ、７７％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.20 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.73 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.38 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.94 (br, 1H), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.91 (t, 3H, J = 7.3 Hz)
【００９０】
段階１２：メチル２−（Ｎ−（４−プロピルベンジル）−２−（４−プロピルフェニル）アセトアミド）アセテートの合成
よく乾燥したＤＣＭ１ｍＬにアルゴン条件の下でメチル２−（（４−プロピルベンジル）アミノ）アセテート（２４．５ｍｇ、０．０９８３ｍｍｏｌ）と２−（４−プロピルフェニル）酢酸（１７．５ｍｇ、０．０９８３ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＥＤＣ（５６．５ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３９．８ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８４．３μＬ、０．４９１ｍｍｏｌ）を加え、２０時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物３１．１ｍｇ（０．０７８９ｍｍｏｌ、８０％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.62 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.61 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H)
【００９１】
段階１３：２−（Ｎ−（４−プロピルベンジル）−２−（４−プロピルフェニル）アセトアミド）酢酸の合成
メタノール０．５ｍＬにメチル２−（Ｎ−（４−プロピルベンジル）−２−（４−プロピルフェニル）アセトアミド）アセテート（３０．０ｍｇ、０．０７８６ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２６．４ｍｇ（０．０７１８ｍｍｏｌ、９１％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.54 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.77 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.58 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.63 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H)
【００９２】
ｔａｇγの合成
購入したｒｅｐｏｒｔｅｒおよびｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを用いて、図３のような過程でｔａｇγの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階１〜段階３に示す。
段階１：メチル２−（（３−フェニルプロピル）アミノ）アセテートの合成
【００９３】
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ３ｍＬにグリシンメチルエステル（３３０ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＤＩＰＥＡ（５７３μＬ、３．２９ｍｍｏｌ）と１−ブロモ−３−フェニルプロパン（１００μＬ、０．６５８ｍｍｏｌ）を加え、１日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（４ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を１９．６ｍｇ（０．０９４６ｍｍｏｌ、１４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.18-7.13 (m, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.39 (s, 2H), 2.68-2.60 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 2H)
【００９４】
段階２：メチル２−（５−フェニル−Ｎ−（３−フェニルプロピル）ペンタンアミド）アセテートの合成
よく乾燥したＤＣＭ１ｍＬにアルゴン条件の下でメチル２−（（３−フェニルプロピル）アミノ）アセテート（２０．０ｍｇ、０．０９６５ｍｍｏｌ）と５−フェニル吉草酸（２２．０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＥＤＣ（５５．５ｍｇ、０．２８９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３９．１ｍｇ、０．２８９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８２．７μＬ、０．４８２ｍｍｏｌ）を加え、２０時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を３４．２ｍｇ（０．０９３１ｍｍｏｌ、９６％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 4.01 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.30 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.24 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 3.95 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.42 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.18 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H)
【００９５】
段階３：２−（５−フェニル−Ｎ−（３−フェニルプロピル）ペンタアミド）酢酸の合成
メタノール０．５ｍＬにメチル２−（５−フェニル−Ｎ−（３−フェニルプロピル）ペンタンアミド）アセテート（３４．２ｍｇ、０．０９３１ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２６．２ｍｇ（０．０７４１ｍｍｏｌ、８０％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.99 (s, 2H), 3.28 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.91 (s, 2H), 3.40 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H)
【００９６】
ｔａｇδの合成
購入したｒｅｐｏｒｔｅｒおよびｂａｌａｎａｃｅ ｕｎｉｔを用いて、図３のような過程でｔａｇδの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階１〜段階３に示す。
【００９７】
段階１：メチル２−（オクチルアミノ）アセテートの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ２ｍＬにグリシンメチルエステル（３５８ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＤＩＰＥＡ（６２０μＬ、３．５６ｍｍｏｌ）と１−ブロモオクタン（１２３μＬ、０．７１２ｍｍｏｌ）を加え、１日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（４ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を３１．６ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌ、２２％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.68 (s, 3H), 3.36 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 1.77 (s, 1H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.24-1.22 (m, 10H), 0.83 (t, 3H, J = 6.5 Hz)
【００９８】
段階２：メチル２−（Ｎ−オクチルオクタアミド）アセテートの合成
よく乾燥したＤＣＭ１ｍＬにアルゴン条件の下でメチル２−（オクチルアミド）アセテート（３１．６ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）とｎ−オクタン酸（３０．０μＬ、０．１８８ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＥＤＣ（９０．３ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６３．６ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１３５μＬ、０．７８５ｍｍｏｌ）を加え、１２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（４ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を４４．７ｍｇ（０．１３６ｍｍｏｌ、８７％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.00 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.28 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 2.32 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.98 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.15 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H)
【００９９】
段階３：２−（Ｎ−オクチルオクタンアミド）酢酸の合成
メタノール０．５ｍＬにメチル２−（Ｎ−オクチルオクタアミド）アセテート（４４．７ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を３６．５ｍｇ（０．１１６ｍｍｏｌ、８６％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.01 (s, 2H), 3.30 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.97 (s, 2H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.19 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H)
【０１００】
実施例１−２）多重同重体ラベリング剤の合成
まず、４種のｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの中でもｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ5とｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ0を合成する過程、および各段階で生成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階１〜段階７に示す。
【０１０１】
段階１：
４−（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステルの合成
アルゴン条件の下で１０ｍＬのｄｒｙ ＴＨＦに４−ブロモ安息香酸メチルエステル（５００ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド（Ｐｄ（ＰＰｈ3）2Ｃｌ2：８６．１ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ3：１８．３ｍｇ、０．０６９８ｍｍｏｌ）、トリメチルシリルアセチレン（ＴＭＳアセチレン：４９３μＬ、３．４９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ：４８６μＬ、３．４９ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅（ＣｕＩ：８．８６ｍｇ、０．０４６５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、ｎ−ペンタン２０ｍＬを入れ、セリットパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を５０３ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ、９３％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H)
【０１０２】
段階２：
１）（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノール−ｄ2の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ２０ｍＬに４−（（トリエチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステル（１．００ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ＬｉＡｌＤ4（２１７ｍｇ、５．１６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、水２２０μＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液４４０μＬおよび水６６０μＬを順次加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を７８８ｍｇ（３．８２ｍｍｏｌ、８９％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
【０１０３】
２）（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノールの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬに４−（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステル（３１６ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ4（２．０４ｍＬ、１．０Ｍ ＴＨＦ溶液、２．０４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、順次水７７μＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液１５４μＬ、水２３１μＬを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２５８ｍｇ（１．２６ｍｍｏｌ、９３％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
【０１０４】
段階３：
１）ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（トリメチルシリル）エチニル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ2の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ１５ｍＬに（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノール−ｄ2（６００ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、イミダゾール（２４０ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）とｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬに溶かした塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＳＣｌ：５３１ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、１５時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液２０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（２０ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を８９５ｍｇ（２．７９ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
【０１０５】
２）ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（（トリメチルシリル）エチニル)ベンジル）オキシ）シラン−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬに（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノール（２５８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、イミダゾール（１０３ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）とｄｒｙ ＴＨＦ３ｍＬに溶かしたＴＢＳＣｌ（２２８ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、１５時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（１０ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を３８３ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
【０１０６】
段階４：
１）ｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシラン−ｄ2の合成
アルゴン条件の下でメタノール１２ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（（トリメチルシリル）エチニル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ2（１．１６ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１．００ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）を溶かした後、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１５ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（１０ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を８５８ｍｇ（３．４５ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
【０１０７】
２）ｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシラン−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でメタノール４ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（（トリメチルシリル）エチニル)ベンジル）オキシ）シラン（３８３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（３３２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を溶かした後、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２８０ｍｇ（１．１４ｍｍｏｌ、９５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
【０１０８】
段階５：
１）ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ5の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシラン−ｄ2（２６３ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を溶かした後、−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（８５１μＬ、２４９Ｍ ｎ−ヘキサン溶液、２．１２ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。２０分間−７８℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン−ｄ3（３３１μＬ、５．３０ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、３０分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２８０ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ、９９％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
【０１０９】
２）ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチル（（４−エチニルベンジル）オキシ）ジメチルシラン（２４７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を溶かした後、−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（８０５μＬ、２．４９Ｍ ｎ−ヘキサン溶液、２．００ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。２０分間−７８℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン−ｄ0（３１３μＬ、５．００ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、３０分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２５３ｍｇ（０．９７１ｍｍｏｌ、９７％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
【０１１０】
段階６：
１）（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）メタノール−ｄ5の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ5（２８０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を溶かした後、フッ化−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ：１．５８ｍＬ、１．０Ｍのテトラヒドロフラン溶液、１．５８ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を１９８ｍｇ（０．８３８ｍｍｏｌ、８８％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
【０１１１】
２）（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）メタノール−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ５ｍＬにｔｅｒｔ−ブチルジメチル（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）オキシ）シラン−ｄ0（３２６ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を溶かし後、フッ化−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ：１．８８ｍＬ、１．０Ｍ テトラヒドロフラン溶液、１．８８ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間０℃で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を１８２ｍｇ（１．２４ｍｍｏｌ、９９％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.56 (s, 2H), 2.44 (br, 1H), 2.01 (s, 3H)
【０１１２】
段階７：
１）１−（ヨードメチル）−４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンゼン−ｄ5の合成
よく乾燥したＤＣＭ５ｍＬにアルゴン条件の下で（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）メタノール−ｄ5（１４０ｍｇ、０．９２６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸（ＭｓＣｌ：８６．３μＬ、１．１１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ：１９４μＬ、１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（５ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン１０ｍＬに溶かした後、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ：２０７ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水１０ｍＬを加え、酢酸エチルで抽出して（１０ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ5）を２２０ｍｇ（０．８４３ｍｍｏｌ、９１％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H)
【０１１３】
２）１−（ヨードメチル）−４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンゼン−ｄ0の合成
よく乾燥したＤＣＭ４ｍＬにアルゴン条件の下で（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）メタノール−ｄ0（１８２ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸（ＭｓＣｌ：１１６μＬ、１．４９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ：２６０μＬ、１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（５ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン１２ｍＬに溶かした後、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ：２８０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。１時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水１０ｍＬを加え、酢酸エチルで抽出し（１０ｍＬずつ合計３回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ0）を２７９ｍｇ（１．０９ｍｍｏｌ、８８％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H), 4.42 (s, 2H), 2.02 (s, 3H)
【０１１４】
前記で合成されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔからｂａｌａｎｃｅ−ｄ5とｂａｌａｎｃｅ−ｄ0を合成する過程、および各段階で生成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階８〜段階１０に示す。
【０１１５】
段階８：
１）ジエチル−２−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）マロネート−ｄ5の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ２ｍＬに１−（ヨードメチル）−４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンゼン−ｄ5（０．３９２ｍｍｏｌ）と水酸化ナトリウム（ＮａＨ：１９．８ｍｇ、６０％ミネラルオイル混合物、０．４７３ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ジエチルマロン酸（８９．８μＬ、０．５９２ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、３時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を８８．５ｍｇ（０．３０２ｍｍｏｌ、７７％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.11-7.07 (m, 2H), 4.17-4.06 (m, 4H), 3.57 (s, 1H), 1.21-1.14 (m, 3H)
【０１１６】
２）ジエチル２−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）マロネート−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ３ｍＬに１−（ヨードメチル）−４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンゼン−ｄ0（９８．０ｍｇ、０．３８３ｍｍｏｌ）と水素化ナトリウム（ＮａＨ：１８．４ｍｇ、６０％ミネラルオイル混合物、０．４５９ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ジエチルマロン酸（８７．２μＬ、０．５７４ｍｏｌ）を加えた。その後、室温に温度を上げ、３時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を９４．８ｍｇ（０．３２９ｍｍｏｌ、８６％）得た。
【０１１７】
段階９：
１）３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン−ｄ5エチルエステルの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ２ｍＬにジエチル２−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）マロネート−ｄ5（８８．５ｍｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）を溶かした後、塩化ナトリウム（３５．３ｍｇ、０．６０４ｍｍｏｌ）と水１００μＬを加え、２日間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を５０．０ｍｇ（０．２２６ｍｍｏｌ、７５％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.56 (s, 2H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
【０１１８】
２）エチル３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン−ｄ0エチルエステルの合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ２ｍＬにジエチル２−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）マロネート−ｄ0（９４．８ｍｇ、０．３２９ｍｍｏｌ）を溶かした後、塩化ナトリウム（３８．５ｍｇ、０．６５８ｍｍｏｌ）と水２００μＬを加え、２日間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を５０．０ｍｇ（０．２３１ｍｍｏｌ、７０％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.89 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
【０１１９】
段階１０：
１）３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン酸−ｄ5  メタノール０．５ｍＬに３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン−ｄ5エチルエステル（４３．０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｂａｌａｎｃｅ−ｄ5）を３２．２ｍｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、８６％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.64 (s, 2H)
【０１２０】
２）３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン酸−ｄ0  メタノール０．５ｍＬに３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン−ｄ0エチルエステル（５０．０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物（ｂａｌａｎｃｅ−ｄ0）を３７．３ｍｇ（０．１９８ｍｍｏｌ、８６％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H)
【０１２１】
前記で製造されたｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを用いて、同重体および多重同重体ラベリング剤の合成方法、および各段階で合成された化合物のＮＭＲ結果を下記の段階１１〜段階１３に示す。多重同重体の合成方法は同一であるから、同重体ラベリング剤ｔａｇα129の場合を詳細に記述し、他の同重体ラベリング剤の場合は合成過程の相違点を記述した。
【０１２２】
段階１１：
メチル２−（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）アミノ）アセテート−ｄ0の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＤＭＦ２ｍＬにグリシンメチルエステル（１６９ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＤＩＰＥＡ（２９２μＬ、１．６８ｍｍｏｌ）と１−（ヨードメチル）−４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンゼン−ｄ0（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ0：２３２ｍｇ、０．８９２ｍｍｏｌ）を加え、１日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水５ｍＬを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し（５ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を５８．６ｍｇ（０．２７０ｍｍｏｌ、８０％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d. 2H, J = 8.2 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 3.72 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.35 (s, 2H), 2.20 (br, 1H), 1.99 (s, 3H)
【０１２３】
段階１２：
メチル２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロパンアミド）アセテート−ｄ5の合成
よく乾燥したＤＣＭ１ｍＬにアルゴン条件の下でメチル２−（（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）アミノ）アセテート−ｄ0（１８．３ｍｇ、０．０８４５ｍｍｏｌ）と３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロパン酸−ｄ5（ｂａｌａｎｃｅ−ｄ5：１３．６ｍｇ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を溶かした後、ＥＤＣ（４０．５ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２８．５ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６０．３μＬ、０．３５２ｍｍｏｌ）を加え、２０時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水３ｍＬを加えて反応を終結させ、ＤＣＭで抽出し（３ｍＬずつ合計４回）、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を２５．０ｍｇ（０．０７５９ｍｍｏｌ、９１％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.51 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.65 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.58 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.60 (s, 3H), 2.52 (s, 2H), 2.02 (s, 3H)
【０１２４】
段階１３：
２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル−３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロパンアミド）酢酸−ｄ5の合成
メタノール０．５ｍＬにメチル２−（Ｎ−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）ベンジル）−３−（４−（プロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロパンアミド）アセテート−ｄ5（２５．０ｍｇ、０．０６３７ｍｍｏｌ）を溶かした後、２０％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、２時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル３ｍＬを加えて希釈し、１０％塩化水素水溶液２００μＬを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して同重体ラベリング剤ｔａｇα129を２１．０ｍｇ（０．０５５４ｍｍｏｌ、８７％）得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 77.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H)
【０１２５】
上記の段階１１〜段階１３と類似した方法で下記のとおり同重体ラベリング剤ｔａｇα131、 ｔａｇα132およびｔａｇα134を製造した。
【０１２６】
同重体ラベリング剤α１３１
同重体ラベリング剤ｔａｇα129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階１１にはｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ2を使用し、段階１２にはｂａｌａｎｃｅ−ｄ3
を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H)
【０１２７】
同重体ラベリング剤α１３２
同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階１１にはｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ3を使用し、段階１２にはｂａｌａｎｃｅ−ｄ2を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H)
【０１２８】
同重体ラベリング剤α１３４
同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階１１にはｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄ5を使用し、段階１２にはｂａｌａｎｃｅ−ｄ0を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H)
【０１２９】
上記で製造された化合物を用いて下記のとおり定量分析実験に使用した。
【０１３０】
実施例１−３）定量分析実験
段階１：ラベリングジと分析体の結合
実施例１−２の化合物とペプチドの結合反応を図７に示した。実施例１−２の化合物とＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をＤＭＦに溶かし、それぞれの濃度が６０、３５および４０ｍＭとなるように混ぜて室温で４５分間反応させ、ラベリング剤のカルボン酸の末端基をシクインイミジルエステルで活性化させた。
ウシ血清アルブミンをトリプシン酵素で分解して得たペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡ）またはアンジオテンシンII（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）を炭酸水素ナトリウム水溶液（Ｎａ
ＨＣＯ3、１００ｍＭ）に溶かした後、活性化されたラベリング剤を入れて６時間反応を行った。ヒドロキシル基に起こる標識反応は、エステル結合を形成して不安定な結合を形成し、反応の効率も低いから、正確な定量のために、炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＭ）に溶かしたヒドロキシルアミン（８０ｍＭ）を用いて、ペプチドのヒドロキシル基に標識された副反応を除去した。全体反応はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて終結させた。
【０１３１】
段階２：ＭＡＬＤＩおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩ質量分析
標識されたアンジオテンシンIIは、５０ＴＡ溶液（０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニト
リル／５０％Ｈ2Ｏ）で希釈した後、ＨＣＣＡマトリックス溶液（a-cyano-4-hydroxycinnamic acid、５ｍｇ／ｍＬ、５０ＴＡ）と１：１で混ぜてＭＡＬＤＩプレートにのせて乾燥させた後、タンデム飛行時間型質量分析器（time-of-flight/time-of-flight(ＴＯＦ／ＴＯＦ) mass spectrometry）を用いて分析した。タンデム質量分析によって設計したとおりに定量信号および標識信号が観測されるか、また、その強さがどれほどであるかを確認した。
標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡを用いて同重体ラベリング剤で測定可能な分析試料の濃度或いは量の範囲を確認し、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と連動して多重の試料を同時に定量分析することができるかを確認した。同重体ラベリング剤で測定可能な試料の濃度範囲を確認するために、多重同重体のうちｔａｇα129とｔａｇα131で標識された試料を３：１の比率で混ぜた後、５０ＴＡを用いて希釈する過程を繰り返し行った。各濃度の試料をＨＣＣＡマトリックス溶液と１：１の比率で混ぜてＭＡＬＤＩプレートにロードした。この際、ロードされたペプチドの量はスポット当たり約４２００、１３００、４２０、１３０、４２および１３フェムトモルである。ＬＣと連動した多重定量分析をテストするためには、４種の同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡを２：１：４：８の比率で混ぜてｎａｎｏＬＣで分離し、ＬＣから溶出されるペプチドをＨＣＣＡマトリクス溶液と共にＭＡＬＤＩプレートにロードしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦで分析した。
【０１３２】
実験結果
１）モデルペプチドを用いたラベリング剤の検証
各ラベリング剤と結合したモデルペプチド（angiotensin II、ＤＲＶＹＩＨＰＦ）を質
量分析した結果、一つのラベリング剤と結合した質量値（ｔａｇα129−α134は１４０６．７、ｔａｇβは１３９５．７、ｔａｇγは１３８１．７、そしてｔａｇβは１３４１．８Ｔｈ）でイオンが観測された。さらに正確な検証のために、質量スペクトルで観測されたイオンを選択してタンデム質量分析を行った。結果は図８に示す。
【０１３３】
図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα129−α134）で標識されたペプチドの結果であり、図８（ｅ）〜図８（ｇ）はそれぞれ非同重体であるｔａｇβ、ｔａｇγ、およびｔａｇδで標識されたペプチドの結果である。各ラベリング剤で生成されるイオン、すなわち標識信号と定量信号は設計された質量値で観測された。標識信号はｔａｇα129−α134は３６１、ｔａｇβは３５０、ｔａｇγは３３６、そしてｔａｇδは２９６Ｔｈで観測された。定量信号は、ｔａｇα129は１２９、ｔａｇα131は１３１、ｔａｇα132は１３２、ｔａｇα134は１３４、ｔａｇβは１３３、ｔａｇγは１４８、およびｔａｇδは１４２Ｔｈで観測された。
【０１３４】
各ラベリング剤で生成される定量信号の強さをモデルペプチドの断片イオンのうち最も強く観測されるヒスチジンインモニウムイオン（１１０Ｔｈ）と比較して図９に示す。ラベリング剤の構造によって異なるタイプの定量信号が観測された。すなわち、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔがベンジル誘導体であるｔａｇαとｔａｇβはベンジル陽イオン構造の定量信号が観測され、ベンジル誘導体でないｔａｇγとｔａｇδはイミニウム陽イオン構造の定量信号が観測された。たとえラベリング剤によって定量信号のタイプは異なっても、各ラベリング剤の定量信号はモデルペプチドの断片イオンに比べて一層強く観測された。モデルペプチドの断片イオンを見ると、ペプチドのＣ末端基を含む断片イオン、すなわちｙ2、ｙ3およびｙ7はラベリング剤を問わずに同位置で観測されたとともに、ペプチドのＮ末端基を含む断片イオン、すなわちｂ2、ｂ3−ＮＨ3、ａ5、およびｂ7＋Ｈ2Ｏなどは｛各ラベリング剤の分子量−Ｈ2Ｏ｝だけ質量が増加したところで観測された。質量分析およびタンデム質量分析の結果より、合成された全ての各ラベリング剤の分子量と定量および標識信号が予想とおり観測されることにより各ラベリング剤が設計とおりに合成されたことを確認した。ペプチドの断片イオンからラベリング剤がＮ末端基にのみ標識されたことを確認した。
【０１３５】
多重同重体で標識されたモデルペプチドを一定の比率で混ぜ、タンデム質量分析した結果を図１０に示す。混合比率（モル比）がｔａｇα129：α131：α132：α134＝２：１：２：１の場合は図１０（ａ）に示し、１：２：１：２の場合は図１０（ｂ）に示す。各多重同重体ラベリング剤の定量信号は逆三角形に表示した。多重同重体それぞれを別途分析した図８（ａ）〜図８（ｄ）に比べて、多重定量分析を行う場合にはそれぞれの定量信号の強さは相対的に弱くなり、ペプチドの断片イオンはさらに強く観測された。このように全体分子量は同一であり、定量信号の質量値のみ異なる多重同重体を使用する場合には、定量信号とは異なり、それ以外のイオンは質量値が同一であるため、重畳してその強さが強化される。このような理由により、本発明で開発されたラベリング剤のように、定量信号が強く観測されるほど多重定量分析に有利である。
【０１３６】
２）ｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡを用いた多重同重体の性能検証
多重同重体を用いて測定することが可能なペプチドの量または濃度の範囲を図１１に示す。ＢＳＡの絶対量をよく反映することができるように、同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡのうち、比較的強く観測されたペプチドであるＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲ、およびＳＥＩＡＨＲを用いて実験を行った。ｔａｇα129とｔａｇα131で標識されたペプチドを３：１の比率で混ぜ、全体タンパク質の量を４．２ピコモルから１３フェムトモルまで変化させながらタンデム質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ質量分析器は、レーザーによってイオン化される量が制限されて試料の量が少ないときに比べて、量が多いときはロードされた試料の量に対する親イオンの強さが小さく測定されるが、タンデム質量分析による定量分析には関係ないことを確認した。
【０１３７】
また、本発明の同重体ラベリング剤は、定量信号が強いため、１３フェムトモルの少ない量の試料も定量分析することができた。
また、ＬＣとＭＡＬＤＩ質量分析器を連動した定量分析結果を図１２に示す。図１２（ａ）はＬＣから溶出した親イオンの強さを示し、図１２（ｂ）は各スポットで測定された定量信号の量をｔａｇα129の定量信号と比較して示す。総６種のペプチド（ＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲ、ＱＥＰＥＲ、ＡＷＳＶＡＲ、ＳＥＩＡＨＲ、およびＹＬＹＥＩＡＲ）をタンデム質量分析で定量した。ペプチドの種類を問わず、各同重体ラベリング剤によって一定の比率（ｔａｇα129：α131：α132：α134＝１：０．５１：１．９６：３．８１）で測定された。また、同一ペプチドの場合にはＬＣから溶出する間に同一の定量信号の比率で測定された。これは本発明の同重体で多重標識されたペプチドがｎａｎｏＬＣ上で同時に移動しており、これにより特定時点の溶出液のみでも正確な定量が行われることを意味する。また、モデルペプチドを介して観測されたように、観測される定量信号の比率が試料の全体量には影響されないことを確認した。
【実施例２】
【０１３８】
実施例２−１）ラベリング剤の製造
韓国特許公開第１０−２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第１０−２０１０−０００９４７９号および国際特許公開ＷＯ２０１０／００８１５９号を参照して、本発明の一般式２のラベリング剤を製造した。
まず、同位元素暗号化基であるＲAとＲCがメチル（ＣＨ3またはＣＤ3）であり、質量調節基であるＲBがバリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖であるラベリング剤を製造した。質量調節基がバリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖であるものを、便宜上、それぞれＶａｌ−ｔａｇ、Ｇｌｎ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｐｈｅ−ｔａｇ、およびＡｒｇ−ｔａｇと命名した。また、同位元素暗号化基であるＲAとＲCがエチル（Ｃ2Ｈ5またはＣ2Ｄ5）であり、質量調節基ＲBがメチルであるラベリング剤を製造した。これは、便宜上、Ｅｔｈｙｌ−ｔａｇと命名した。
【０１３９】
実施例２−２）結合体の製造
実施例２−１）で製造されたラベリング剤を、３種のモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲまたはＬＩＳＦＹＡＧＫまたはＹＧＧＦＬにＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、Ａｒｇ−ｔａｇおよびＥｔｈｙｌ−ｔａｇを結合させた。また、ウシ血清タンパク質(bovine serum albumin)、ミオグロビン(myoglobin)、およびユビキチン(ubiquitin)タンパク質を相異なる量で混合した２つのタンパク質混合物試料を準備した。混合試料Ａにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で準備され、混合試料Ｂにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、および０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で準備された。混合試料ＡとＢをそれぞれトリプシンで酵素分解した後、混合試料ＡにはLＭＢＩＴを、混合試料ＢにはHＭＢＩＴを結合させた。この際、Ｇｌｎ−ｔａｇをＭＢＩＴ標識で使用した。ペプチド試料にＭＢＩＴで結合させる方法は韓国特許公開第１０−２０１０−０００９４６６号、韓国特許公開第１０−２０１０−０００９４７９号および国際特許公開ＷＯ２０１０／００８１５９号を参照した。
ラベリング剤で結合したモデルペプチドは、ＺｉｐＴｉｐ−Ｃ18（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で塩を除去した後、最終的に各５Ｍの濃度でアセトニトリルと水が体積比１：１で混合され且つ０．５％のギ酸が添加された溶液に溶けている状態で準備した。ラベリング剤で結合した混合試料ＡとＢは、１：１の体積比で混合され、真空で完全に溶媒が除去された後、０．５％のギ酸が添加された水溶液に溶けている状態で準備した。
【０１４０】
実施例２−３）定量分析
実施例２−２の結合体を用いて、下記のとおり定量分析を行った。
実施例２−２に記述されたモデルペプチドとＭＢＩＴとの結合体の定量分析実施に活用された質量分析器は、エレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ装備としてＢｒｕｋｅｒ社製のＥｓｑｕｉｒｅ ＨＳＴ製品またはＴｈｅｒｍｏ社製のＬＴＱ Ｖｅｌｏｓを使用した。試料溶液１００μＬが注射器ポンプ(syringe pump)にロードされた後、１μＬ／ｍｉｎの流速でエレクトロスプレーチップに運搬された。エレクトロスプレーは４ｋＶの電圧で行われた。１周期に一つのスペクトル測定のためにイオントラップの内部に最大２００ｍｓの間試料イオンが捕集されて質量分析されたうえ、１分間最大２５０周期の反復測定が行われた。
【０１４１】
実施例２−２に記述された混合試料ＡおよびＢとＭＢＩＴとの結合体の定量分析実施に活用された質量分析器は、液体クロマトグラフィーと連結されているエレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ装備としてＴｈｅｒｍｏ社製のＬＴＱ ＸＬを使用した。試料溶液は０．３μＬ／ｍｉｎの流速で液体クロマトグラフィーを通過してエレクトロスプレーイオン化された。この際、エレクトロスプレーは２ｋＶの電圧で行われた。液体クロマトグラフィーから溶出するペプチドの０．２秒毎の質量分析およびタンデム質量分析スペクトルを得た。
【０１４２】
１）ＬＩＳＦＹＡＧＲおよびＬＩＳＦＹＡＧＫにそれぞれＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合の質量分析結果
ＬＩＳＦＹＡＧＲおよびＬＩＳＦＹＡＧＫにそれぞれＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合について定量分析を行った。結果を図１７に示す。
【０１４３】
図１７はモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲ（図１７（ａ））およびＬＩＳＦＹＡＧＫ（図１７（ｂ））にＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた後、これをエレクトロスプレーイオン化して四重極イオントラップ質量分析器を用いて得た質量分析スペクトルを示す。それぞれ＋１、＋２の電荷を帯びるペプチドイオンが検出された。
【０１４４】
ＬＩＳＦＹＡＧＲペプチドの元来質量は９２５．５Ｄａであり、プロトンが１つまたは２つ付いて検出される＋１価、＋２価イオン（ＭＨ+、ＭＨ22+）が９２６．５Ｔｈ、４６３．８Ｔｈでそれぞれ検出される。このペプチドにラベリング剤を結合させた場合、各標識物質１個の質量に該当する分だけ増加した質量でペプチドが検出された。Ｖａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合、それぞれ＋１価イオンはｍ／ｚ １１４１．６、１１７０．６、１１７９．６、１１８９．６、および１１９８．６Ｔｈで検出されており、＋２価イオンはｍ／ｚ ５７１．３、５８５．８、５９０．３、５９５．３および５９９．９Ｔｈで検出されている。
【０１４５】
ＬＩＳＦＹＡＧＫペプチドの元来質量は８９７．５Ｄａであり、プロトンが１つまたは２つ付いて検出される＋１価、＋２価イオン（ＭＨ+、ＭＨ22+）が８９８．５Ｔｈ、４４９．８Ｔｈでそれぞれ検出された。前記ペプチドにラベリング剤を結合させた場合、各標識物質２つの質量に該当する分だけ増加した質量でペプチドが検出される。Ｖａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合、それぞれ＋１価イオンはｍ／ｚ１３２８．９、１３８６．９、１４０４．９、１４２４．９、および１４４２．９Ｔｈで検出されており、＋２価イオンはｍ／ｚ６５４．９、６９３．９、７０３．０、７１２．９、および７２１．９Ｔｈで検出されている。
【０１４６】
前記の結果より、１つのアミンを持つＬＩＳＦＹＡＧＲには１つのラベリング剤、２つのアミンを持つＬＩＳＦＹＡＧＫには２つのラベリング剤が結合したことを確認することができる。
【０１４７】
２）ＬＩＳＦＹＡＧＲおよびＬＩＳＦＹＡＧＫにそれぞれＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合のタンデム質量分析結果
ＬＩＳＦＹＡＧＲおよびＬＩＳＦＹＡＧＫにそれぞれＶａｌ−、Ｇｌｎ−、Ｈｉｓ−、Ｐｈｅ−、およびＡｒｇ−ｔａｇを結合させた場合のタンデム質量分析を行った。この際、LＭＢＩＴで標識されたペプチドとHＭＢＩＴで標識されたペプチドを１：１の比率で混合して実験した。その結果を図１８〜図２１に示す。
【０１４８】
図１８はＮ末端に１つのアミンを持つペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルである。ペプチドのＮ末端にのみラベリング剤と結合したため、ｙタイプの断片イオンはいずれもラベリング剤の種類を問わずに一定の質量対電荷の比（ｍ／ｚ）で検出されている。これに対し、ｂタイプの断片イオンはラベリング剤の種類に応じて質量対電荷の比（ｍ／ｚ）が増加して検出が行われている。
【０１４９】
定量信号として活用できるLｙS、HｙSイオンは、＋１価の電荷を帯びたままｍ／ｚ９８７Ｔｈと１０００Ｔｈでそれぞれ検出されている。強い塩基性を持つＨｉｓ−およびＡｒｇ−ｔａｇの場合はｙSイオンが強く検出されている。Ｖａｌ−、Ｇｌｎ−、およびＰｈｅ−ｔａｇの場合にも信号の強さが弱いものの、ｙS定量信号イオンが検出されていることが分かる。
【０１５０】
図１９はＮ末端に１つのアミンを持つペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。この場合、定量信号イオンが検出されるものの、非常に小さい信号強さと測定されているから、定量分析への活用に適さないことが分かる。
【０１５１】
図２０はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。図８に示すように、Ｎ末端のアミンとＣ末端のリシンのアミンにそれぞれラベリング剤が結合したため、ラベリング剤の種類に応じてｂタイプおよびｙタイプの断片イオンがいずれも一定の質量対電荷の比だけ増加して検出されることも確認することができる。特に、＋１価電荷を帯びるｙSイオンは−ｔａｇより大きい質量対電荷の比で測定され、他の配列イオンに全く妨害されていない領域で検出されていることが分かる。また、信号の強さも、他の配列イオンと同様に強く現れており、１：１の混合比によく合う［LｙS］：［HｙS］イオンの強さ比を示した。
【０１５２】
Ｖａｌ−、Ｐｈｅ−ｔａｇの場合、＋２価を帯びるｙSイオンも検出されており、これも１：１の混合比によく合うイオン強さ比を示した。これに対し、弱く塩基性を帯びるＧｌｎ−ｔａｇ、および強い塩基性を帯びるＨｉｓ−、Ａｒｇ−ｔａｇの場合は、＋２価のｙSイオンが殆ど検出されておらず、それだけ＋１価のｙSイオンが強く検出されている。理論的に限定されるものではないが、＋２価のｙSイオンは＋１価の他の配列イオンによって妨害され得るため、＋１価のｙSイオンを定量分析信号として活用することが一層有利であると判断される。
【０１５３】
図２１はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。＋２価親イオンで実験した場合と同様に、ラベリング剤の種類に応じてｂタイプおよびｙタイプの断片イオンがいずれも一定の質量対電荷の比だけ増加して検出されることを確認することができる。ところが、特徴的に、＋１価親イオンを選択して実験した結果では、＋１価のｙS定量信号イオンが非常に強く現れることを確認することができる。また、［LｙS］：［HｙS］イオンの信号の強さ比も１：１の混合比と殆ど一致するように検出されていることが分かる。
【０１５４】
３）ｙS定量信号の強さ測定
図２２および図２３は、ラベリング剤で標識されたモデルペプチドをタンデム質量分析したときに現れるｙS定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占有する比率を示す図である。図１０は、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化された後、＋２価電荷を帯びる親イオンを選択して分解した結果を示している。一つのラベリング剤が結合したＬＩＳＦＹＡＧＲの場合に比べて、２つのラベリング剤がＮ末端とＣ末端に結合したＬＩＳＦＹＡＧＫの場合、定量信号イオンｙSの強さが２倍以上強く発生することを確認することができた。
【０１５５】
図２３（ａ）と図２３（ｂ）は、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化されて＋１価電荷を帯びるＬＩＳＦＹＡＧＲとＬＩＳＦＹＡＧＫをそれぞれ選択して分解した結果を示す。既存のｂSイオンを活用する場合と比較するために、図２３（ｃ）には、ラベリング剤で標識されたＬＩＳＦＹＡＧＲ＋１価親イオンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ装備で検出したときのｂS定量信号イオンの比率を示した。２つのラベリング剤が結合したＬＩＳＦＹＡＧＫはＭＡＬＤＩイオン化方法によっては検出されなかった。その結果、Ｎ末端のアミンとＣ末端のリシンのアミンに２つのラベリング剤が結合したＬＩＳＦＹＡＧＫを分解して生成されるｙSイオンの相対的な強さが、既存のｂSを活用する場合に比べて５倍以上強い定量信号の強さを得ることができることを確認することができた。
【０１５６】
前記結果に基づいて、理論的に限定されたものではないが、Ｎ末端に追加してリシンの側鎖までラベリング剤が結合して総２個以上のラベリング剤が結合した場合、非常に強いｙS定量信号を得ることができることが分かった。また、Ｎ末端のアミンとＣ末端のリシンにラベリング剤が２つ結合した場合、＋１価のｙSイオンは他の配列イオンの妨害を全く受けない質量対電荷の比で非常に強い信号の強さで検出されて雑音信号の妨害なく非常に正確で再現性のある定量分析を可能にすることが分かった。大きい質量値を有するｙSを利用すると、既存の小さい質量値を有する定量信号イオンを活用する場合に比べて最大５倍以上強い信号強さで定量分析が可能である。
【０１５７】
４）ｙSイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たＭＳ3タンデム質量分析スペクトルの分析
図２４はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２価電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成された＋１価のｙSイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たＭＳ3タンデム質量分析スペクトルを示す。
【０１５８】
Ｖａｌ−ｔａｇと結合したＬＩＳＦＹＡＧＫのLｙSイオンを選択して実験した結果を示した。もしＮ末端のラベリング剤が分解されてｙSイオンが生成された場合には、ＭＳ3スペクトルではｂnイオンがいずれも１４４Ｔｈずつ減少して現れなければならず、もしリシンの側鎖に結合したラベリング剤でｙSイオンが生成された場合には、ＭＳ3スペクトルではｙnイオンがいずれも１４４Ｔｈずつ減少して現れなければならない。ＭＳ3スペクトルで１４４Ｔｈ減少して現れるｂnおよびｙn断片イオンをそれぞれｂn’、ｙn’と命名する。図２４（ｂ）から確認できるように、Ｎ末端を含むｂタイプの断片イオンの位置は同一に維持されるが、Ｃ末端を含むｙタイプの断片イオンの位置はいずれも１４４Ｔｈだけ減少してｙn’と検出されることを確認することができた。ｂn’は殆ど検出されなかった。結果として、タンデム質量分析によって強く示されるｙS定量信号は、ペプチドのＮ末端に付いたラベリング剤ではなくリシンの側鎖のアミン基と結合したラベリング剤に由来することを確認することができた。
【０１５９】
図１８〜図２４の結果を考慮するとき、ｙSを活用する定量分析は、理論的に限定されるものではないが、リシンを含んでおり２つ以上のラベリング剤が結合しうるペプチドを分析体とするときに最も良い性能を示すものと判断することができる。特に、理論的に限定されるものではないが、ペプチドのＣ末端にリシンがある場合、＋１価のｙSイオンが他の断片イオンの妨害を全く受けることなく検出できるという大きい利点を持つ。
【０１６０】
５）標準定量曲線の分析
図２５はHＭＢＩＴとLＭＢＩＴで区分標識して多様な比率で混ぜたモデルペプチドをタンデム質量分析して生成されたLｙSおよびHｙSイオンの強さで定量分析を行って得た標準定量分析曲線を示す図である。実施に活用されたラベリング剤はＧｌｎ−ｔａｇであり、モデルペプチドとしてはＬＩＳＦＹＡＧＫが活用された。＋１価、＋２価の電荷を帯びるペプチドイオンについてそれぞれ実施結果を得た。ラベリング剤で標識されたペプチド溶液の濃度は混合比を問わずに約５μＭに維持された。図２５に示すように、強い信号の強さを示すｙSイオンを活用した定量分析は、実際混合比によく合う測定比を示していることが分かった。特に＋１価親イオンを選択した場合、ｙSの信号の強さが上述の如く特異的に強く示されるため、１：６４の混合比に達するまで非常に良い定量分析結果を得ることができることが分かる。＋２価親イオンを選択して定量分析する場合も、１：３６の混合比まで非常に優れた線形性を示す。既存の小さい質量を有するｂS定量信号を活用した場合には、１：１６の混合比が定量限界であったことを考えると、ｙSを導入しながら最大約４倍程度定量限界が改善された。
【０１６１】
６）ＹＧＧＦＬＫおよびＬＩＳＦＹＡＧＫにＥｔｈｙｌ−ｔａｇを結合させた場合のタンデム質量分析結果
同位元素暗号化基であるＲAおよびＲCとしてメチル基を活用する場合、定量信号イオンの質量差が３Ｄａであって、LｙS定量信号イオンの自然同位元素パターンによってHｙS定量信号イオンが干渉される可能性がある。このような問題点は、同位元素暗号化基であるＲAおよびＲCとしてエチル基を使用すると、定量信号イオンの質量差が５Ｄａと十分に大きくなって克服が可能である。これを実施するためにモデルペプチドにＥｔｈｙｌ−ｔａｇを結合させてタンデム質量分析した。
【０１６２】
ＹＧＧＦＬＫにＥｔｈｙｌ−ｔａｇを結合させてタンデム質量分析した結果を図２６および図２７に示す。ＬＩＳＦＹＡＧＫにＥｔｈｙｌ−ｔａｇを結合させてタンデム質量分析した結果は図２８に示す。
【０１６３】
図２６はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＹＧＧＦＬＫにＥｔｈｙｌ−ｔａｇが結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。特に、図２６（ａ）と図２６（ｂ）はＥｔｈｙｌ−ｔａｇのHＭＢＩＴとLＭＢＩＴがそれぞれ結合した場合の結果である。Ｅｔｈｙｌ−ｔａｇのHＭＢＩＴで標識された場合、質量対電荷の比９８６．５で１＋価のLｙSイオンが検出され、LＭＢＩＴで標識された場合、９９１．５で＋１価のHｙSイオンが検出された。図２６（ｃ）と図２６（ｄ）はｙSイオンが検出される領域を拡大した図であって、LｙSとHｙSイオンの質量差が５Ｄａであるから、自然同位元素分布によって互いに干渉されないことを確認するこができる。
【０１６４】
図２７はＬＩＳＦＹＡＧＫの配列を有するペプチドにＥｔｈｙｌ−ｔａｇのLＭＢＩＴを結合させたものと、HＭＢＩＴを結合させたものを２：１の比率で混合してタンデム質量分析した結果である。質量対電荷の比１３３２．６で検出される、＋１価の電荷を帯びるイオンを選択してタンデム質量分析した結果、質量対電荷の比１２００．６と１２０５．６で＋１価のLｙSおよびHｙSイオンが［HｙS］：［LｙS］＝２：１の比率でLＭＢＩＴとHＭＢＩＴの混合比を成功的に再現しながら検出された。
【０１６５】
７）タンパク質混合試料をＧｌｎ−ｔａｇで定量分析した結果
実際タンパク質をＭＢＩＴのｙSイオンで定量分析した実施を行うために、３種のタンパク質が相異なる比率で混合されている２つのタンパク質混合試料（混合試料ＡとＢ）を準備し、Ｇｌｎ−ｔａｇを用いて分析した。混合試料Ａのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンは混合試料Ｂのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンに比べて量的にそれぞれ２倍、４倍および０．５倍となるように準備した。これをトリプシンで酵素分解し、Ｇｌｎ−ｔａｇのLＭＢＩＴおよびHＭＢＩＴで標識して液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析によって定量分析した結果が図２８に示されている。
【０１６６】
図２８（ａ）は検出されたペプチドの液体クロマトグラフィーの溶出時間に対して測定された［HｙS］：［LｙS］の比率を示す図であり、図２８（ｂ）は検出されたペプチドの質量対電荷の比に対して測定された［HｙS］：［LｙS］の比を示す図である。ウシ血清タンパク質に由来するものと解明されたペプチドの場合は［HｙS］：［LｙS］＝２．０１±０．０６、ミオグロビンの場合は［HｙS］：［LｙS］＝４．１３±０．１１、ユビキチンの場合は［HｙS］：［LｙS］＝０．４９±０．０２の結果をそれぞれ得ることができた。これは混合試料ＡとＢにおける各タンパク質の比率を５％誤差範囲以内で成功的に定量分析した実施である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２０ｅ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2013536433.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月7日(2013.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
【図１】本発明に係る化合物の構造を示す。図１（ａ）は本発明の化合物の代表構造、および化合物で生成される定量信号の構造を示す。図１（ｂ）〜図１（ｅ）は本発明の一実施例に係る化合物の４つの構造を示す。図１（ｂ）は水素同位元素を用いて多重同重体に合成された構造であり、ここで、それぞれのＸ１〜Ｘ４は選択的に水素同位元素で置換される位置を示す。
【図２】本発明に係る化合物を、水素同位元素を用いて同重体ラベリング剤に製造するために、活用できる代表的な重水素添加および置換反応を示す。
【図３】本発明の化合物の合成過程を示す。ハロアルカン形態のＲｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｒ１−Ｂｒ）とカルボン酸形態のｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔ（Ｒ２−ＣＯＯＨ）およびエステル化されたアミノ酸を用いて合成される。
【図４】本発明の一実施例に係る化合物（ｔａｇα）の合成に必要なｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを重水素添加および置換反応を用いて合成する過程を示す。ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔはｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの変形を通して合成する。２つの重水素を導入する方法(エステル結合のカルボニル基をLiAID4に還元させて、２つの重水素を導入する方法)とアルキンをＣＤ３Ｉでアルキル化して３つの重水素を導入する方法）を組み合わせてｒｅｐｏｒｔｅｒおよびｂｌａｎａｃｅ ｕｎｉｔをそれぞれ４種ずつ合成する。
【図５】本発明の一実施例に係る化合物（ｔａｇβ）の合成に必要なｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔとｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔを合成する過程を示す。ｂａｌａｎｃｅ ｕｎｉｔはｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｉｔの変形を通して合成する。
【図６】本発明の一実施例に係る化合物の構造を示す。ｎ個の重水素を含むｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｄｎ、５−ｎ個の重水素を含むｂａｌａｎｃｅ−ｄ５−ｎおよびグリシンを用いて合成したもので、ｔａｇαｍは定量信号の質量値がｍのｔａｇαを意味する。
【図７】本発明に係る化合物の活性化方法の一実施例を示すもので、化合物をスクシンイミジルエステルで活性化し、ペプチドに結合する方法を示す。
【図８ａ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｂ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｃ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｄ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｅ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｆ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図８ｇ】本発明の一実施例の化合物と結合したモデルペプチド（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）のタンデム質量分析スペクトルを示す。図８（ａ）〜図８（ｄ）は多重同重体（ｔａｇα１２９〜α１３４）を使用した結果を示し、図８（ｅ）〜図８（ｇ）は非同重体（ｔａｇβ−δ）を使用した結果を示す。
【図９】本発明の一実施例の化合物で生成される定量信号（ベンジル陽イオンとイミニウム陽イオン)の相対的強さを示す。定量信号の強さはモデルペプチドから生成されたヒスチジンインモニウムイオン（１１０Ｔｈ）の強さに対して相対的な値で表示した。
【図１０】本発明の一実施例の多重同重体で標識されたモデルペプチドを一定の割合で混ぜてタンデム質量分析した結果を示す。図１０（ａ）は多重同重体で標識されたペプチドを２：１：２：１（ｔａｇα１２９：α１３１：α１３２：α１３４）の比率で混ぜた試料の結果を示し、図１０（ｂ）は１：２：１：２（ｔａｇα１２９：α１３１：α１３２：α１３４）の比率で混ぜた試料の結果を示す。
【図１１】多重同重体（ｔａｇα１２９−α１３４-）を用いて測定することが可能なペプチドの量または濃度の範囲を測定した結果を示す。多重同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、bovine serum albumin）中でＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲおよびＳＥＩＡＨＲをタンデム質量分析した結果を示すもので、ｔａｇα１２９とｔａｇα-１３１で標識されたペプチドを３：１の比率で混ぜ、全体タンパク質の量を４．２ピコモルから１３フェムトモルまで変化させた後、タンデム質量分析した結果である。各濃度で観測される親イオンの強さを図１１（ａ）に示し、タンデム質量分析で測定された定量信号の比率を図１１（ｂ）に示す。
【図１２】液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ定量分析器を連動して、多重同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡを定量分析した結果を示す。図１２（ａ）は各ペプチドがＬＣから溶出した時間によってＭＡＬＤＩ質量分析器で観測された親イオンの強さを示し、図１２（ｂ）は各ペプチドで測定された定量信号の量をｔａｇα１２９の定量信号の量と比較して示す。同重体で標識されたｔｒｙｐｔｉｃ ＢＳＡ中で６種のペプチド（ＦＧＥＲ、ＶＡＳＬＲ、ＱＥＰＥＲ、ＡＷＳＶＡＲ、ＳＥＩＡＨＲおよびＹＬＹＥＩＡＲ）から得た結果である。
【図１３】本発明のラベリング剤の化学構造を図式的に示す。
【図１４ａ】本発明のラベリング剤がペプチドおよびタンパク質に結合する反応を図式的に示す。
【図１４ｂ】本発明のラベリング剤がペプチドおよびタンパク質に結合する反応を図式的に示す。
【図１５】分析体のアミンと結合したラベリング剤がタンデム質量分析過程で分解されたときに生成できる断片イオンの種類を概略的に示す。
【図１６】２つ以上のラベリング剤と結合したペプチドをタンデム質量分析したときに理論的に生成できるタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１７ａ】モデルペプチド２種と本発明の一実施例に係るラベリング剤を結合させた後、それぞれをエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量分析した結果を示す。
【図１７ｂ】モデルペプチド２種と本発明の一実施例に係るラベリング剤を結合させた後、それぞれをエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量分析した結果を示す。
【図１８ａ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１８ｂ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１８ｃ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１８ｄ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１８ｅ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＥに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９ａ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９ｂ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９ｃ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９ｄ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図１９ｅ】Ｎ末端に１つのアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０ａ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０ｂ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０ｃ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０ｄ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２０ｅ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１ａ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１ｂ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１ｃ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１ｄ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２１ｅ】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫに本発明の一実施例に係るラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２２】本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲ（図２２（ａ））とＬＩＳＦＹＡＧＫ（図２２（ｂ））の＋２価電荷を帯びる親イオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップでタンデム質量分析したときに現れるｙＳ定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占める比率を示す。
【図２３】本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧ（図２３（ａ））とＬＩＳＦＹＡＧＫ（図２３（ｂ））の＋１価電荷を帯びる親イオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップでタンデム質量分析したときに現れるｙＳ定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占める比率を示す。図２３（ｃ）は本発明の一実施例に係るラベリング剤で標識されたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＲの＋１価電荷を帯びる親イオンをＭＡＬＤＩイオン化法で生成してＴＯＦ／ＴＯＦ装備でタンデム質量分析したときに現れるｂＳ-定量信号の強さ比を示す図である。
【図２４】図２４（ａ）はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにＶａｌ−ｔａｇが結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオン（ＭＨ２２＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ２タンデム質量分析スペクトルを示し、図２４（ｂ）はＭＳ２タンデム質量分析で生成されたＬｙＳ-イオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たＭＳ３タンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２５】Ｇｌｎ−ｔａｇのＨＭＢＩＴとＬＭＢＩＴで区分標識して多様な比率で混ぜたモデルペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫをタンデム質量分析して生成されたＬｙＳ-およびＨｙＳイオンの信号の強さ比で定量分析を行って得た標準定量分析曲線を示す。
【図２６】図２６（ａ）および図２６（ｂ）はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＹＧＧＦＬＫにエチル−ｔａｇのＨＭＢＩＴ（図２６（ａ））またはＬＭＢＩＴ（図２６（ｂ））が結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオン（ＭＨ＋）を四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ２タンデム質量分析スペクトルを示し、図２６（ｃ）と図２６（ｄ）は図２６（ａ）と図２６（ｂ）においてｙＳ-定量信号イオンが出る範囲を拡大して示す図である。
【図２７】Ｎ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにエチル−ｔａｇが結合した親イオンのうち、＋１電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成されたＭＳ２タンデム質量分析スペクトルを示すもので、エチル−ｔａｇのＬＭＢＩＴに結合したペプチドとＨＭＢＩＴに結合したペプチドを２：１の比率で混合してタンデム質量分析したスペクトルを示す図である。
【図２８】図２８（ａ）は検出されたペプチドの液体クロマトグラフィーの溶出時間に対して測定された［ＨｙＳ］：［ＬｙＳ］の比率を示す図であり、図２８（ｂ）は検出されたペプチドの質量対電荷の比に対して測定された［ＨｙＳ］：［ＬｙＳ］の比を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
段階２：
１）（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）メタノール−ｄ２の合成
アルゴン条件の下でｄｒｙ ＴＨＦ２０ｍＬに４−（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸メチルエステル（１．００ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）を溶かした後、０℃に冷却し、ＬｉＡｌＤ４（２１７ｍｇ、５．１６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３０分間０℃で攪拌した後、反応が完結すると、水２２０μＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液４４０μＬおよび水６６０μＬを順次加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を７８８ｍｇ（３．８２ｍｍｏｌ、８９％）得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
図２０はＮ末端とリシンの側鎖にそれぞれ１個ずつ総２個のアミンを持っているペプチドＬＩＳＦＹＡＧＫにラベリング剤が結合した親イオンのうち、＋２電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。図２０に示すように、Ｎ末端のアミンとＣ末端のリシンのアミンにそれぞれラベリング剤が結合したため、ラベリング剤の種類に応じてｂタイプおよびｙタイプの断片イオンがいずれも一定の質量対電荷の比だけ増加して検出されることも確認することができる。特に、＋１価電荷を帯びるｙＳイオンは−ｔａｇより大きい質量対電荷の比で測定され、他の配列イオンに全く妨害されていない領域で検出されていることが分かる。また、信号の強さも、他の配列イオンと同様に強く現れており、１：１の混合比によく合う［ＬｙＳ］：［ＨｙＳ］イオンの強さ比を示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
３）ｙＳ定量信号の強さ測定
図２２および図２３は、ラベリング剤で標識されたモデルペプチドをタンデム質量分析したときに現れるｙＳ定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占有する比率を示す図である。図２２は、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化された後、＋２価電荷を帯びる親イオンを選択して分解した結果を示している。一つのラベリング剤が結合したＬＩＳＦＹＡＧＲの場合に比べて、２つのラベリング剤がＮ末端とＣ末端に結合したＬＩＳＦＹＡＧＫの場合、定量信号イオンｙＳの強さが２倍以上強く発生することを確認することができた。
【国際調査報告】
2013536433.tif 000066
2013536433.tif 000067
2013536433.tif 000068
2013536433.tif 000069
2013536433.tif 000070
2013536433.tif 000071