(57)【要約】インフルエンザ抗原を含有するエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を伴う溶液を安定化させる方法、およびこのような安定化させた溶液について記載する。本開示の別の態様は、インフルエンザを治療または予防する方法であって、対象に、免疫原性量の、前出の態様およびその多様な実施形態のうちのいずれかによる、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または前出の方法の態様およびその多様な実施形態のうちのいずれかに従い安定化させた、免疫原性量の、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含有する溶液を投与するステップを含む方法を提供する。
2013515748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含有する溶液を安定化させる方法であって、
（ａ）前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含有する溶液を用意するステップと、
（ｂ）（１）安定化量の、単糖、ソルビトール、二糖、トレハロース、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択される安定化剤を、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物に添加するステップ、（２）ｐＨを、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７とするように、前記溶液を緩衝化するステップ、または（３）ステップ（１）およびステップ（２）の両方と
を含み、
ステップ（ｂ）の後の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、以下の特徴：（ｉ）光学濃度により測定した前記ウイルス様粒子の凝集が、ステップ（ｂ）の前の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること；（ｉｉ）円偏光二色性またはＡＮＳ結合により測定したインフルエンザ抗原が、ステップ（ｂ）の前の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して安定化していること；および（ｉｉｉ）ラウルダン蛍光により測定した、前記ウイルス様粒子の脂質二重層の、温度により誘導される水和が、ステップ（ｂ）の前の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること
のうちの少なくとも１つを呈示する、方法。
【請求項２】
前記緩衝化するステップを、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、クエン酸バッファー、および他のＧＲＡＳバッファーからなる群から選択される緩衝剤を用いて実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定化剤が、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択され、そして前記特徴が（ｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化剤が、トレハロース、ソルビトール、および前出の安定化剤の組合せから選択され、そして前記特徴が（ｉｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記安定化剤が、トレハロースおよびグリシンから選択され、そして前記特徴が（ｉｉｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化剤がトレハロースであり、そして３つの特徴すべてが存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含む、請求項１から６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、ニューカッスル病ウイルスマトリックスポリペプチド、エボラウイルスＶＰ４０ポリペプチド、およびマールブルグウイルスＶＰ４０ポリペプチドを含む群から選択される第２のポリペプチドを含む、請求項１から７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスに由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルスに由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、請求項１から１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記安定化剤が、単糖、ソルビトール、二糖、およびトレハロースから選択され、そして前記安定化量が、１０％（ｗ／ｗ）を超えるか、または少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）である、請求項１から１１のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記安定化させるステップが、ガラス形成を必要としない、請求項１から１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定化量が、凝固時のガラス形成に必要とされる量未満である、請求項１から１３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定化剤が、スクロースではない、請求項１から１４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と混合させたアジュバントをさらに含む、請求項１から１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の内部に配置される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の外部に配置される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントを、前記第２のポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項１６から１８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントを、前記赤血球凝集素ポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項１６から１８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントが、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む、請求項１６から２０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ｃ）前記溶液を、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１年間にわたり液体形態で保存するステップをさらに含み、このような期間後の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、このような期間前の前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物により誘導される免疫反応の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも９５パーセントを誘導する、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と、安定化量の、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択される、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物に対する安定化剤とを含み、以下の特徴：（ｉ）光学濃度により測定した前記ウイルス様粒子の凝集が、前記安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること；（ｉｉ）円偏光二色性またはＡＮＳ結合により測定したインフルエンザ抗原が、前記安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して安定化していること；および（ｉｉｉ）ラウルダン蛍光により測定した、前記ウイルス様粒子の脂質二重層の、温度により誘導される水和が、前記安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること
のうちの少なくとも１つを呈示する、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２４】
前記緩衝化を、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、クエン酸バッファー、および他のＧＲＡＳバッファーからなる群から選択される緩衝剤を用いて実施する、請求項２３に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２５】
前記安定化剤が、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択され、そして前記特徴が（ｉ）である、請求項２３に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２６】
前記安定化剤が、トレハロース、ソルビトール、および前出の安定化剤の組合せから選択され、そして前記特徴が（ｉｉ）である、請求項２３に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２７】
前記安定化剤が、トレハロースおよびグリシンから選択され、そして前記特徴が（ｉｉｉ）である、請求項２３に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２８】
前記安定化剤がトレハロースであり、そして３つの特徴すべてが存在する、請求項２３に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項２９】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含む、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３０】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、ニューカッスル病ウイルスマトリックスポリペプチド、エボラウイルスＶＰ４０ポリペプチド、およびマールブルグウイルスＶＰ４０ポリペプチドを含む群から選択される第２のポリペプチドを含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３１】
前記ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスに由来する、請求項３０に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３２】
前記ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルスに由来する、請求項３０に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３３】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、請求項２３から３２のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３４】
前記安定化剤が、単糖、ソルビトール、二糖、およびトレハロースから選択され、そして前記安定化量が、１０％（ｗ／ｗ）を超えるか、または少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）である、請求項２３から３３のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３５】
前記安定化させるステップが、ガラス形成を必要としない、請求項２３から３４のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３６】
前記安定化量が、凝固時のガラス形成に必要とされる量未満である、請求項２３から３５のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３７】
前記安定化剤が、スクロースではない、請求項２３から３６のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３８】
前記インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と混合させたアジュバントをさらに含む、請求項２３から３７のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項３９】
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の内部に配置される、請求項３８に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の外部に配置される、請求項３８に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項４１】
前記アジュバントを、前記第２のポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項３８から４０のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項４２】
前記アジュバントを、前記赤血球凝集素ポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項３８から４０のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項４３】
前記アジュバントが、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む、請求項３８から４２のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
【請求項４４】
インフルエンザを治療または予防する方法であって、対象に、免疫原性量の、請求項２３から４３のいずれか一項に記載のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法に従い安定化させた、免疫原性量の、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含有する溶液を投与するステップを含む方法。
【請求項４５】
前記投与するステップが、前記対象において防御的免疫反応を誘導する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記投与するステップが、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、経皮送達、皮内送達、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）送達、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、および頭蓋内送達からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ抗原を包含する、エンベロープウイルスベースの安定化させたウイルス様粒子の分野に関する。本明細書では特に、このようなウイルス様粒子を安定化させる方法、およびこのようなウイルス様粒子を含む安定化させた組成物が開示される。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスは、流行性ヒト疾患を引き起こすインフルエンザウイルスの２つの型である（１１１）。Ａ型インフルエンザウイルスは、２つの表面抗原：赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に基づく亜型にさらに類別される。Ｂ型インフルエンザウイルスは、亜型に類別されていないが、時間と共にウイルス株が分岐するドリフトを経る。１９７７年以来、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスが、世界中に蔓延している。おそらく、ヒトＡ型（Ｈ３Ｎ２亜型）ウイルスと、ヒトＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）ウイルスとが遺伝子再結合した後に出現したＡ型（Ｈ１Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスは、近年多くの国々で検出されている。Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスのいずれもが、抗原特徴に基づき、さらに群分けされている。新型インフルエンザウイルスの変異型は、ウイルスの複製において生じる点突然変異の結果としてもたらされる、頻繁な抗原変化（すなわち、抗原ドリフト）から生じる。Ｂ型インフルエンザウイルスは、抗原ドリフトを経るのが、Ａ型インフルエンザウイルスほど急速でない。抗原ドリフトによる抗原変異型の頻繁な発生が、例年の流行のウイルス学的基礎であり、毎年のインフルエンザワクチンに少なくとも１つの新たなウイルス株を組み込む理由でもある。
【０００３】
表面抗原、とりわけ、赤血球凝集素タンパク質に対する対象者の免疫が、感染の可能性、および万一感染が生じた場合の疾患の重症度を低減する（１１２）。一般に、インフルエンザウイルスの１つの型または１つの亜型に対する抗体は、別の型もしくは別の亜型に対してもたらす防御が限定されたものであるか、または別の型もしくは別の亜型に対しては防御をもたらさないと考えられている。さらに、インフルエンザウイルスの１つの抗原変異型に対する抗体では、同じ型または同じ亜型の新たな抗原変異型に対する防御とならない可能性があることも、一般的に受け入れられている（１１３）。したがって、交差防御の実証は期待されない。
【０００４】
１９５７年および１９６８年における、過去の二度にわたるインフルエンザ大流行の原因となったのは、ヒト−トリ間リアソータントのインフルエンザウイルスであった。１９６８年以後にＨ２亜型ウイルスがヒトにおいて蔓延しなくなって以来、Ｈ２亜型のリアソータントウイルスから抗原シフトが生じる可能性が、理論的にはいつでも存在する。しかし、高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルス（Ｈ５亜型およびＨ７亜型）が近年になって出現し、１９９７年以来、これらのウイルスが、散発的ながらも、トリからヒトに直接的に伝染するようになった（１〜５）ことから、Ｈ２亜型ウイルスに対する集団の感受性がかつてなく増大しているのに加えて、ヒトにおいて新たに大流行する脅威の可能性が高まっている。ヒトにおけるＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１亜型の大発生が、異なる抗原によるものであったという事実は、大流行の脅威に対して、十分に適合させたワクチンの備蓄を前もって準備することをほとんど不可能にしている（５、６）。マウスにおけるＨ５亜型による免疫化および抗原曝露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）のデータは、このモデルにおける各種のＨ５亜型単離物間に良好な交差反応性が見られることを示唆する（７）が、既存のワクチン法で、ヒトにおいても同様レベルの交差反応性が見られるかどうかは公知ではない。したがって、新たなウイルスの大発生に由来する抗原を包含するように迅速に適合させうるインフルエンザワクチンプラットフォームが必要とされている。
【０００５】
現行の卵ベースの不活化ワクチン法では、卵内でＨＰＡＩウイルスを増殖させることが不可能であるために、新興の大流行による需要を満たし、バイオコンテインメントを増強する必要を満たすのには不十分である（６、８）。逆遺伝学法は、卵内で培養しうる所望のＨＡ遺伝子組成およびＮＡ遺伝子組成を伴う、低病原性のリアソータントを生成させる手段をもたらしている（７、９〜１１）が、この手法により生成させるワクチンは、過去の知的財産および規制に関する問題のために、ようやく臨床段階に入りつつあるに過ぎない（８）。さらなる懸念は、ヒト臨床試験で評価されている、赤血球凝集素Ｈ５タンパク質と関連する免疫原性レベルが明らかに低いこと（１２〜１４）であり、これは、Ｈ５亜型に対して完全にナイーブな集団における防御を効率的に誘導するには、ワクチン、送達系、およびアジュバント使用の改善が必要とされることを明らかにしている。したがって、アジュバントと組み合わせたＨＰＡＩ抗原の発現を可能とするインフルエンザワクチンプラットフォームが必要とされている。
【０００６】
インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザワクチンを生成させるための代替的な技法を代表する。インフルエンザＶＬＰとは、昆虫細胞内で発現させたインフルエンザのマトリックスタンパク質、ＨＡタンパク質、およびＮＡタンパク質を用いて生成させたもので、鼻腔内送達後における免疫原性が顕著である（２６：非特許文献１、２７：非特許文献２）。実際、ＶＬＰは一般に、ロタウイルスＶＬＰ、ノロウイルスＶＬＰ、およびパピローマウイルスＶＬＰについて示されている通り、鼻腔内送達後において、粘膜および全身における免疫を誘導するのに十分に適すると考えられる（２８〜３１：非特許文献３〜６）。インフルエンザＶＬＰとは、真核細胞発現系において、インフルエンザのマトリックスタンパク質、ＨＡタンパク質、およびＮＡタンパク質を発現させることにより生成させたものである。インフルエンザマトリックスタンパク質は、ウイルスの出芽を後押しする駆動力であり、インフルエンザＮＡタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質も発現している場合、細胞表面のシアル酸とのＨＡタンパク質の会合により、出芽したＶＬＰが生成細胞から放出されるのに必要とされる（５１：非特許文献６）。また、マトリックスタンパク質と、ＨＡタンパク質のＣ末端との相互作用が、出芽過程の一部として、マトリックスタンパク質を膜に方向づけるのに役割を果たすことを示唆するデータも存在する（５１：非特許文献６）。昆虫細胞のバキュロウイルス発現系内で生成させたインフルエンザＶＬＰは、動物試験において免疫原性であることが分かっており、将来の大流行に備えるための重要な戦略を代表する（２６：非特許文献１、２７：非特許文献２、４７：非特許文献７）。加えて、インフルエンザＶＬＰの鼻腔内送達は、非経口投与後に得られる抗体力価を超える抗体力価を結果としてもたらしうる。しかし、ＶＬＰは、膜内に包埋されるか、または膜と会合する、１または複数の異なる糖タンパク質と共に包埋される脂質膜の複合体構造である。実用性を有するために、ＶＬＰは、十分に長い保管寿命を有する必要がある。したがって、溶液中にインフルエンザ抗原を包含するウイルス様粒子を安定化させる方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌａｔｈａｍ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍ．  Ｇａｌａｒｚａ．  ２００１．  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｌｙ  ｆｏｕｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：６１５４．
【非特許文献２】Ｇａｌａｒｚａ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｔ．  Ｌａｔｈａｍ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｃｕｐｏ．  ２００５．  Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：３６５．
【非特許文献３】Ｆｒｏｍａｎｔｉｎ，  Ｃ．，  Ｂ．  Ｊａｍｏｔ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｌ．  Ｐｉｒｏｔｈ，  Ｐ．  Ｐｏｔｈｉｅｒ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｋｏｈｌｉ．  ２００１．  Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ２／６  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ，  ｉｎｄｕｃｅ  ａ  Ｔｈ１／Ｔｈ２−ｌｉｋｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１０１０．
【非特許文献４】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｐ．  Ｒ．，  Ｂ．  Ｙｏｕｎｔ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｎ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｃ．  Ｍｏｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓ．  Ｂａｒｉｃ．  ２００２．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ，  ｍｕｃｏｓａｌ，  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７３０．
【非特許文献５】Ｓｈｉ，  Ｗ．，  Ｊ．  Ｌｉｕ，  Ｙ．  Ｈｕａｎｇ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｑｉａｏ．  ２００１．  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１０１３９．
【非特許文献６】Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ，  Ｐ．，  Ｃ．  Ａｌｂｏ，  Ｅ．  Ｐｅｒｅｚ−Ｐａｓｔｒａｎａ，  Ａ．  Ｖｉｖｏ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｏｒｔｅｌａ．  ２０００．  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｂｕｄｄｉｎｇ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：１１５３８．
【非特許文献７】Ｐｕｓｈｋｏ，  Ｐ．，  Ｔ．  Ｍ．  Ｔｕｍｐｅｙ，  Ｆ．  Ｂｕ，  Ｊ．  Ｋｎｅｌｌ，  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｓｍｉｔｈ．  ２００５．  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＡ，  ＮＡ，  ａｎｄ  Ｍ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈ９Ｎ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：５７５１．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の開示は、インフルエンザ抗原を包含するウイルス様粒子を溶液中で安定化させる方法を、該安定化させた溶液、およびこのような安定化させた溶液を用いる方法と併せて提供することにより、この必要を満たす。
【０００９】
開示の一態様は、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含有する溶液を安定化させる方法であって、（ａ）インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含有する溶液を用意するステップと、（ｂ）（１）安定化量の、単糖、ソルビトール、二糖、トレハロース、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択される安定化剤を、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物に添加するステップ、（２）ｐＨを、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７とするように、該溶液を緩衝化するステップ、または（３）ステップ（１）およびステップ（２）の両方とを含み、ステップ（ｂ）の後のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、以下の特徴：（ｉ）光学濃度により測定した該ウイルス様粒子の凝集が、ステップ（ｂ）の前のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること；（ｉｉ）円偏光二色性またはＡＮＳ結合により測定したインフルエンザ抗原が、ステップ（ｂ）の前のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して安定化していること；および（ｉｉｉ）ラウルダン蛍光により測定した、該ウイルス様粒子の脂質二重層の、温度により誘導される水和が、ステップ（ｂ）の前のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していることのうちの少なくとも１つを呈示する方法を提供する。ある実施形態では、緩衝化するステップを、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、クエン酸バッファー、および他のＧＲＡＳバッファーからなる群から選択される緩衝剤を用いて実施する。前出の緩衝剤についての実施形態と組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択され、該特徴は（ｉ）である。前出の緩衝剤についての実施形態と組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、トレハロース、ソルビトール、および前出の安定化剤の組合せから選択され、該特徴は（ｉｉ）である。前出の緩衝剤についての実施形態と組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、トレハロースおよびグリシンから選択され、特徴は（ｉｉｉ）である。前出の緩衝剤についての実施形態と組み合わせうるある実施形態では、安定化剤はトレハロースであり、３つの特徴すべてが存在する。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、ニューカッスル病ウイルスマトリックスポリペプチド、エボラウイルスＶＰ４０ポリペプチド、およびマールブルグウイルスＶＰ４０ポリペプチドを含む群から選択される第２のポリペプチドを含む。ｇａｇポリペプチドを包含する前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、およびレンチウイルスに由来しうる。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、単糖、ソルビトール、二糖、およびトレハロースから選択され、安定化量は、１０％（ｗ／ｗ）を超えるか、または少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化させるステップが、ガラス形成を必要としない。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化量は、凝固時のガラス形成に必要とされる量未満である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、スクロースではない。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、該インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と混合させたアジュバントをさらに含み、アジュバントは、前記ウイルス様粒子の内部に配置されてもよく、該ウイルス様粒子の外部に配置されてもよい。アジュバントおよび第２のポリペプチドを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、アジュバントを、該第２のポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる。アジュバントおよび赤血球凝集素ポリペプチドを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該アジュバントを、前記赤血球凝集素ポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる。アジュバントを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該アジュバントは、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該方法は、（ｃ）溶液を、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１年間にわたり液体形態で保存するステップをさらに含み、このような期間後のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、このような期間前のインフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物により誘導される免疫反応の少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも９５パーセントを誘導する。
【００１０】
本開示の別の態様は、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と、安定化量の、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択される、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物に対する安定化剤とを含み、以下の特徴：（ｉ）光学濃度により測定した該ウイルス様粒子の凝集が、該安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していること；（ｉｉ）円偏光二色性またはＡＮＳ結合により測定したインフルエンザ抗原が、該安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して安定化していること；および（ｉｉｉ）ラウルダン蛍光により測定した、該ウイルス様粒子の脂質二重層の、温度により誘導される水和が、該安定化剤を伴わない、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と比較して低減していることのうちの少なくとも１つを呈示する、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を提供する。ある実施形態では、緩衝化を、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、クエン酸バッファー、および他のＧＲＡＳバッファーからなる群から選択される緩衝剤を用いて実施する。ある実施形態では、安定化剤は、トレハロース、ソルビトール、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、および前出の安定化剤の組合せから選択され、該特徴は（ｉ）である。ある実施形態では、安定化剤は、トレハロース、ソルビトール、および前出の安定化剤の組合せから選択され、該特徴は（ｉｉ）である。ある実施形態では、安定化剤は、トレハロースおよびグリシンから選択され、該特徴は（ｉｉｉ）である。ある実施形態では、安定化剤はトレハロースであり、３つの特徴すべてが存在する。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子は、赤血球凝集素ポリペプチドを含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子は、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、ニューカッスル病ウイルスマトリックスポリペプチド、エボラウイルスＶＰ４０ポリペプチド、およびマールブルグウイルスＶＰ４０ポリペプチドを含む群から選択される第２のポリペプチドを含む。ｇａｇポリペプチドを包含する前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該ｇａｇポリペプチドは、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスに由来する。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子は、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、単糖、ソルビトール、二糖、およびトレハロースから選択され、安定化量は、１０％（ｗ／ｗ）を超えるか、または少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化させるステップが、ガラス形成を必要としない。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化量は、凝固時のガラス形成に必要とされる量未満である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、安定化剤は、スクロースではない。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、該インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と混合させたアジュバントをさらに含む。アジュバントを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該アジュバントは、前記ウイルス様粒子の内部に配置される。アジュバントを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該アジュバントは、前記ウイルス様粒子の外部に配置される。アジュバントおよび第２のポリペプチドを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、該アジュバントを、前記第２のポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる。アジュバントを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、アジュバントを、前記赤血球凝集素ポリペプチドに共有結合させて、共有結合を形成させる。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせうるある実施形態では、アジュバントは、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む。
【００１１】
本開示の別の態様は、インフルエンザを治療または予防する方法であって、対象に、免疫原性量の、前出の態様およびその多様な実施形態のうちのいずれかによる、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または前出の方法の態様およびその多様な実施形態のうちのいずれかに従い安定化させた、免疫原性量の、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含有する溶液を投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、投与するステップは、対象において防御的免疫反応を誘導する。前出の実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、投与するステップは、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、経皮送達、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬（ｂｕｃｃａｌ）送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ）送達、肛門（ａｎａｌ）送達、および頭蓋内送達からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、個別のＧａｇ遺伝子ベクター、ＨＡ遺伝子ベクター、または対照ベクターを感染させたＳｆ９細胞、およびＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ三重遺伝子ベクターを感染させたＳｆ９細胞に由来する培地についてのウェスタンブロットを示す図である。（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体によりプローブしたものであり、（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体によりプローブしたものである。
【図２】図２は、ペレット化させたＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ  ＶＬＰを、段階的なスクロース勾配上で再遠心分離することによる画分についてのウェスタンブロットを示す図である。（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体によりプローブしたものであり、（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体によりプローブしたものである。
【図３】図３は、インフルエンザＶＬＰによる動的光散乱を示す図である。有効直径（Ａ）、静的光散乱の強度（Ｂ）、および試料の多分散性（Ｃ）を、温度の関数としてプロットする。各点は、３つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図４】図４は、インフルエンザＶＬＰの円偏光二色性スペクトルを示す図である。低温（１０℃）では、４〜８の各単位ｐＨにおけるスペクトル（Ａ）を示し、ｐＨ７では、多様な温度におけるスペクトル（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、熱ストレスに対する、インフルエンザＶＬＰのタンパク質二次構造の反応を示す図である。２２７ｎｍにおける標準化した（−１〜０の）ＣＤを、温度の関数として示す。各点は、３つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図６】図６は、インフルエンザＶＬＰの内部蛍光のピーク位置を、温度の関数として示す図である。また、３３０ｎｍにおける標準化した（０〜１の）蛍光強度も、温度の関数として示す（右下）。各点は、３つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図７】図７は、インフルエンザＶＬＰの物理的構造のプローブとしての、ＡＮＳ蛍光を示す図である。ピーク発光の波長を、温度の関数として示す。また、４８５ｎｍにおける標準化した（０〜１の）ＡＮＳ蛍光強度も、温度の関数として示す（右下）。各点は、３つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図８】図８は、インフルエンザＶＬＰの存在下におけるラウルダン蛍光による一般化偏光（ＧＰ）を、温度の関数として示す図である。各点は、３つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図９】図９は、インフルエンザＶＬＰの生物物理的特徴づけに由来する実験相図（ＥＰＤ）である。ＥＰＤは、温度に依存する有効直径、静的光散乱、多分散性、２２７ｎｍにおけるＣＤ、内部蛍光（ピーク位置、および３３０ｎｍにおける相対強度）、ＡＮＳ蛍光（ピーク位置、および４８５ｎｍにおける相対強度）、および４〜８のｐＨ範囲にわたり収集されたラウルダン蛍光データによるＧＰから作成した。
【図１０】図１０は、選択した安定化剤の存在下における、インフルエンザＶＬＰによる内部蛍光を示す図である。ピーク発光の位置（波長）を、温度の関数として示す。各点は、２つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１１】図１１は、選択した安定化剤と共に調合されたインフルエンザＶＬＰの存在下における、ラウルダン蛍光によるＧＰを示す図である。各点は、２つの個別の試料の平均を表わし、誤差バーは、標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのＶＬＰを安定化させた製剤に基づく。例示的なエンベロープウイルスベースのＶＬＰは、ＶＬＰ製剤のベースとして、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来するｇａｇポリペプチドなどのｇａｇポリペプチドを包含する。バキュロウイルス発現系において各種のレトロウイルスから得ることができるｇａｇ  ＶＬＰの収量が大きいため、このようなｇａｇタンパク質ベースのＶＬＰを生成させる例示的な方法は、好ましくは、インフルエンザＨＡポリペプチド抗原およびインフルエンザＮＡポリペプチド抗原の共発現を含めた、昆虫細胞における発現を介する。
【００１４】
安定化は、インフルエンザ抗原のウイルスベースのＶＬＰ調製物中に包含される安定化量の安定化剤を介する。例示的な安定化剤には、単糖（デキストロース、マンニトール、ソルビトールなど）、二糖（ラクトース、トレハロース、スクロースなど）、ジエタノールアミン、グリセロール、グリシン、またはこれらの組合せが含まれる。
【００１５】
開示される方法およびプロトコールの実施は、別段に示唆されない限り、当業者の能力の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学による従来の技法を使用する。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら（１９９５年、および定期的な補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．  Ｒｏｅ、Ｊ．  Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ．  Ｋａｈｎ、１９９６年、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．  Ｍ．  ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．  ＭｃＧｅｅ、１９９０年、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ（編）、１９８４年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．  Ｍ．  Ｊ．  ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．  Ｅ．  Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ａ部：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的な教科書の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
定義
本明細書で用いられる「エンベロープウイルスベースのＶＬＰ」とは、エンベロープウイルスに由来する１または複数のコンポーネントを用いて形成されるウイルス様粒子を指す。限定なしに述べると、好ましい例には、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドと共にｇａｇポリペプチドを用いて生成させたＶＬＰ、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドを用いて、または赤血球凝集素ポリペプチドと共にＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ属ウイルス（インフルエンザウイルスを含めた）Ｍ１ポリペプチドを用いて（場合によって、各場合にノイラミニダーゼポリペプチドを伴う）生成させたＶＬＰ、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドと共にＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（Ｐａｒｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）属ウイルス（ニューカッスル病ウイルスを含めた）マトリックスポリペプチドを用いて生成させたＶＬＰ、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドと共にＦｉｌｏｖｉｒｕｓ属ウイルス（エボラウイルスまたはマールブルグウイルスを含めた）ＶＰ４０ポリペプチドを用いて生成させたＶＬＰが含まれる。
【００１７】
さらなる例には、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを形成するのに用いうる、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスなどのフィロウイルス（例えば、細胞内でフィロウイルスに由来するウイルス性ＧＰタンパク質およびウイルス性ＶＰ４０タンパク質を共発現させ、脂質ラフト内でこれら２つのウイルス性タンパク質を会合させることにより、ＶＬＰを生成させる（米国特許公開第２００６００９９２２５号を参照されたい））；ＳＡＲＳウイルスなどのコロナウイルス（例えば、コロナウイルスのＶＬＰを形成させるには、Ｅタンパク質およびＭタンパク質で十分である（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９８年）、７２巻：７８８５〜７８９４頁；およびＶｅｎｎｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９６年）、１５巻：２０２０〜２０２８頁を参照されたい））；ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）など、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス（例えば、ＲＳＶウイルスのＭタンパク質を発現させることにより、ＶＬＰを生成させる（例えば、米国特許公開第２００８０２３３１５０号を参照されたい））；ならびに西ナイルウイルスなど、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス（例えば、バキュロウイルス発現系内で西ナイルウイルスのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む構築物を発現させることにより、ＶＬＰを生成させる（例えば、米国特許公開第２００８０２３３１５０号を参照されたい））が含まれる。
【００１８】
ｇａｇポリペプチドには、本明細書で説明するウイルス様粒子を形成する一因となる、レトロウイルス由来の構造ポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡをパッケージングする傾向、または粒子形成および粒子出芽の効率など、一定の特徴に影響を及ぼす目的で、ｇａｇポリペプチドを意図的に突然変異させることができる。このような突然変異の一例をあげるならば、ｇａｇ由来のＶＬＰがＲＮＡを組み込む能力に影響を及ぼすアミノ酸変化となろう。ＶＬＰ出芽の効率を改善または改変する、他のこのようなアミノ酸変化ももたらしうるであろう。レトロウイルスのゲノムは、３つの主要な遺伝子産物：構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子；逆転写酵素、ならびに関連するタンパク質分解ポリペプチド、ヌクレアーゼ、およびインテグラーゼに関連する機能をコードするｐｏｌ遺伝子；それによりコードされる糖タンパク質である膜タンパク質が、感染細胞表面上で検出され、また、放出された成熟ウイルス粒子の表面上でも検出されるｅｎｖ遺伝子による遺伝子産物をコードする。すべてのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子は、全体的な構造類似性を有し、各レトロウイルス群内において、そのアミノ酸レベルが保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除いたコアタンパク質をもたらす。ＭＬＶでは、Ｇａｇ前駆体であるポリタンパク質が、Ｐｒ６５Ｇａｇであり、該前駆体におけるその順序がＮＨ２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ｐ１０−ＣＯＯＨである４つのタンパク質に切断される。これらの切断は、ウイルス性プロテアーゼに媒介され、ウイルスに応じて、ウイルス放出の前に生じる場合もあり、ウイルス放出の後に生じる場合もある。ＭＬＶ  Ｇａｇタンパク質は、グリコシル化形態および非グリコシル化形態で存在する。グリコシル化形態は、非グリコシル化Ｐｒ６５ＧａｇのＡＵＧコドンより上流に位置する、異なるインフレームの開始コドンにより合成される、ｇＰｒ８０Ｇａｇから切断される。グリコシル化Ｇａｇを合成しないＭＬＶの欠失突然変異体もなお感染性であり、該非グリコシル化Ｇａｇもなおウイルス様粒子を形成し得ることから、グリコシル化イベントの重要性について疑問が生じる。ウイルスによりコードされるプロテアーゼを介してＨＩＶ−１  Ｇａｇ前駆体であるｐｒ５５Ｇａｇが翻訳後切断されると、Ｎ−ミリストイル化および内部リン酸化されたｐ１７マトリックスタンパク質（ｐ１７ＭＡ）、リン酸化ｐ２４カプシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、およびｐ１５ヌクレオカプシドタンパク質（ｐ１５ＮＣ）（これはｐ９およびｐ６にさらに切断される）がもたらされる。
【００１９】
構造的には、原型的なＧａｇポリタンパク質が、レトロウイルスｇａｇ遺伝子では常に同じ順序で生じる３つの主要なタンパク質：マトリックスタンパク質（ＭＡ）（インフルエンザマトリックスタンパク質であるＭ１は、マトリックスという名称を共有しているが、ＭＡとは異なるタンパク質であり、これとは区別する）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）に分けられる。Ｇａｇポリタンパク質の成熟タンパク質へのプロセシングは、レトロウイルスによりコードされるプロテアーゼを介して触媒され、新たに出芽したウイルス粒子が成熟するときに生じる。機能的には、Ｇａｇポリタンパク質が、３つのドメイン：細胞膜をＧａｇポリタンパク質の標的とする膜結合ドメイン；Ｇａｇの多量体化を促進する相互作用ドメイン；および宿主細胞から発生したビリオンの放出を促進する後期ドメインに分けられる。アセンブリーを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。したがって、アセンブリードメインは、後期に形成される切断産物のうちのいずれかの内部にもれなく収まる必要がない。こうして、本明細書に包含されるＧａｇポリペプチドは、ＶＬＰの形成および放出に重要な機能的エレメントを包含する。当技術分野の現況は、これらの重要な機能エレメントに関して、極めて進展している。例えば、Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６４巻、５３０６〜５３１６頁、１９９０年；Ｗｉｌｌら、ＡＩＤＳ  ５巻、６３９〜６５４頁、１９９１年；Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、７９５０〜７９５９頁、１９９８年；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７９巻、９２１〜９２８頁、１９９８年；ＳｃｈｕｌｔｚおよびＲｅｉｎ、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻、２３７０〜２３７２頁、１９８９年；Ａｃｃｏｌａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、２０７２〜２０７８頁、１９９８年；Ｂｏｒｓｅｔｔｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、９３１３〜９３１７頁、１９９８年；Ｂｏｗｚａｒｄら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、９０３４〜９０４４頁、１９９８年；Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、５６４〜５７７頁、１９９８年；Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６８巻、６６０５〜６６１８頁、１９９４年；Ｘｉａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７０巻、５６９５〜５７００頁、１９９６年；Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７３巻、２３０９〜２３２０頁、１９９９年を参照されたい。
【００２０】
例示的なレトロウイルスのＧａｇポリペプチド供給源には、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス（ニワトリ白血病ウイルス、またはラウス肉腫ウイルスなど）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス、およびメーソン−ファイザーサルウイルスなど）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびテナガザル白血病ウイルスなど）、デルタレトロウイルス（ヒトＴリンパ向性ウイルス、およびウシ白血病ウイルスなど）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルスなど）、またはレンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルスなど）が含まれる。
【００２１】
本明細書で用いられる「赤血球凝集素ポリペプチド」は、インフルエンザウイルスが感染される細胞に結合することを媒介するインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。赤血球凝集素タンパク質は、単一の膜貫通ドメインを介してインフルエンザウイルスの表面に係合されていることが見出される、抗原性の糖タンパク質である。インフルエンザウイルスの赤血球凝集素については、少なくとも１６の亜型が同定され、Ｈ１〜Ｈ１６と標識されている。ヒトインフルエンザウイルスにおいて見出されるのは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３である。赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７または赤血球凝集素Ｈ９を伴う、高病原性トリインフルエンザウイルスがヒトに感染する割合は小さいことが判明している。赤血球凝集素Ｈ５がトリＨ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を著明に変化させることを可能とし、それらにヒト受容体に結合する能力をもたらすようにその受容体特異性を変化させる、トリインフルエンザウイルス株の赤血球凝集素Ｈ５型における単一のアミノ酸変化が、ヒト患者において見出されている（１０９および１１０）。この知見は、通常ではヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスが、どのようにして突然変異し、ヒト細胞に効率的に感染し得るようになるのかを説明する。
【００２２】
赤血球凝集素は、ホモ三量体の内在性膜ポリペプチドである。その膜貫通ドメインは、天然でラフト脂質ドメインと会合し、それをｇａｇポリペプチドと会合させて、ＶＬＰに組み込むことを可能とする。赤血球凝集素は、円筒様の形状であり、約１３５Åの長さである。ＨＡを構成する３つの同一の単量体は、中央部のコイルドコイルおよびＶＬＰ表面上に曝露されているシアル酸結合部位を含有する球状ヘッドを形成する。ＨＡの単量体は、グリコシル化されて２つの小型のポリペプチド：ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットに切断される、単一のポリペプチド前駆体として合成される。ＨＡ２サブユニットは、膜に係合する三量体のコイルドコイルを形成し、ＨＡ１サブユニットは、球状ヘッドを形成する。
【００２３】
本発明のＶＬＰにおいて用いられる赤血球凝集素ポリペプチドは、少なくとも膜アンカードメインおよび赤血球凝集素由来の少なくとも１つのエピトープを包含するものとする。赤血球凝集素ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの任意の類型、亜型、株、または亜株、例えば、赤血球凝集素Ｈ１、赤血球凝集素Ｈ２、赤血球凝集素Ｈ３、赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７および赤血球凝集素Ｈ９に由来することが可能である。加えて、赤血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザ赤血球凝集素のキメラ体でもあり得る。赤血球凝集素ポリペプチドは場合によって、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、そのコード配列にスプライシングすることにより生成させ得る、１または複数のさらなるポリペプチドを包含し得る。さらなるポリペプチドを赤血球凝集素ポリペプチドに挿入するための例示的な部位は、Ｎ末端である。
【００２４】
本明細書で用いられる「ノイラミニダーゼポリペプチド」は、糖タンパク質から末端のシアル酸残基を切断することにより、細胞からのインフルエンザウイルスの放出を媒介する、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する。ノイラミニダーゼの糖タンパク質は、ウイルス表面に発現する。ノイラミニダーゼタンパク質は、四量体であり、ベータ−ピンホイール構造を伴う球状ヘッド、細いストーク状領域、および単一の膜貫通ドメインを介してウイルス膜に該タンパク質を係合させる小型の疎水性領域からなる共通の構造を共有する。シアル酸残基切断の活性部位は、すべてのＡ型インフルエンザウイルスにおいて保存されている１５の帯電アミノ酸により形成される各サブユニット表面においてポケット部分を包含する。インフルエンザノイラミニダーゼについては、少なくとも９つの亜型が同定されており、Ｎ１〜Ｎ９と標識されている。
【００２５】
本明細書で開示されるＶＬＰで用いられ得るノイラミニダーゼポリペプチドは、少なくとも膜アンカードメインおよび少なくともシアル酸残基切断活性を包含するものとする。機能領域に関する当技術分野の現況は、極めて高度である。例えば、Ｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３巻、３５〜４０頁、１９８３年；Ｃｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３巻、４１〜４４頁、１９８３年；Ｌｅｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６巻、５３２１〜５３８５頁、１９８７年；Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．１３５巻、３０〜４２頁、１９８４年を参照されたい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、インフルエンザウイルスの任意の類型、亜型、株、または亜株、例えばノイラミニダーゼＮ１およびノイラミニダーゼＮ２に由来することが可能である。加えて、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラ体でもあり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは場合によって、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、赤血球凝集素ポリペプチドのコード配列にスプライシングすることにより生成させ得る、１または複数のさらなるポリペプチドを包含し得る。さらなるポリペプチドをノイラミニダーゼポリペプチドに挿入するための例示的な部位は、Ｃ末端である。
【００２６】
本明細書で用いられる「ＧＲＡＳバッファー」とは、該当する政府の規制機関により公示されている通り、「一般に安全であると認識されている」バッファーを指す。ＧＲＡＳバッファーは、ｐＨ６〜ｐＨ８（例えば、ｐＫａ５〜９）の範囲内で緩衝作用をもたらすことが好ましい。化合物に有効な緩衝範囲は一般に、ｐＫａ±約１ｐＨ単位である、例えば、ｐＫａが７．２であるＨ３ＰＯ４の緩衝能力は、約６．５〜８．０である。例示的なＧＲＡＳバッファーには、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、クエン酸水素またはクエン酸二水素、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミンクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン、ヒスチジンなどのアミノ酸残基、酢酸、水酸化アンモニウム、イミダゾール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（ビス−トリス）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス−トリスプロパン）、カルボン酸、クエン酸、エタノールアミン、グリシルグリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、およびマレイン酸が含まれる。適切な範囲で緩衝作用をもたらしうる例示的な官能基には、イミダゾール、カルボン酸、リン酸、ピペラジン、アミン、およびスルホン酸が含まれる。ＧＲＡＳは一般に、食品での使用について規定されているが、本明細書で用いられるＧＲＡＳバッファーはまた、薬物製剤中に組み入れるのに薬学的に許容されるとみなされているバッファーも包含する。
【００２７】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰを生成させる例示的な方法
エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、当業者に適用可能な任意の方法により生成させることができる。エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、インフルエンザ抗原ポリペプチドに加えて、ＶＬＰを形成する一因となる１または複数のポリペプチドを包含することが典型的であり、これらは、ＶＬＰを形成する一因となるポリペプチドが、それ自体、Ｍ１タンパク質などのインフルエンザ抗原であるか、または該インフルエンザ抗原ポリペプチドに連結される、キメラ形態を包含する。加えて、エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、第２のインフルエンザ抗原または別の抗原など、さらなる抗原をもたらすために、膜（脂質ラフトを含めた）会合ポリペプチドなど、１または複数のさらなるポリペプチドを包含することも可能である。ある実施形態では、ポリペプチドを、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、細胞膜内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの系など、任意の適用可能なタンパク質発現系内で共発現させることができる。
【００２８】
組換えによるＶＬＰ用ポリペプチドの発現は、該ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを伴う。ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該ポリペプチドを生成させるためのベクターを、当技術分野において周知の技法を用いる組換えＤＮＡ法により生成させることができる。このようにして、本明細書では、ＶＬＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうちのいずれかを含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が説明される。当業者に周知の方法を用いて、ＶＬＰポリペプチドのコード配列と、適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ法、合成法、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、すべてを１または複数のプロモーターに作動可能に連結した、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【００２９】
発現ベクターを、従来の技法により宿主細胞に形質導入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を、従来の技法により培養して、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を生成させることができる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結したＶＬＰポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。ＶＬＰを生成させるためのある実施形態では、以下で詳述する通り、ｇａｇポリペプチド、およびインフルエンザ抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチド（またはインフルエンザ抗原自体が脂質ラフト会合ポリペプチドの場合もある）の両方をコードするベクターを、宿主細胞内で共発現させて、ＶＬＰを生成させる。
【００３０】
各種の宿主発現ベクター系を使用して、ＶＬＰポリペプチドを発現させることができる。このような宿主発現系は、共発現などによりＶＬＰを生成させる目的で、それを介してＶＬＰポリペプチドを生成させうる媒体を表わす。広範囲にわたる宿主を、適切な発現ベクター構築物内において用いることができ、脂質ラフトベースのアセンブリーに依拠する場合、好ましい宿主発現系は、ＶＬＰのアセンブリーに適する脂質ラフトを有する宿主である。これらには、ＶＬＰポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクター、もしくは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換した細菌（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ＶＬＰポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属）などの微生物；ＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させるか、もしくはＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるがこれらに限定されない。ＶＬＰアセンブリーが、脂質ラフトの会合により駆動される場合は、哺乳動物細胞または昆虫細胞を用いて、ＶＬＰポリペプチドを発現させることができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要即初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用される、ＭＲＣ−５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、およびＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞は、ＶＬＰポリペプチドの有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ、４５巻：１０１頁（１９８６年）；  Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：２頁（１９９０年））。
【００３１】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いることができる。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。ＶＬＰポリペプチドのコード配列（複数可）は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子領域）内に個別にクローニングすることができ、また、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【００３２】
哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を使用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、対象のＶＬＰポリペプチド配列（複数可）を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えにより、このキメラ遺伝子を、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）内に挿入する結果、感染された宿主内において生存可能であり、また、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：３５５〜３５９頁（１９８４年）を参照されたい）。挿入されたＶＬＰポリペプチドのコード配列（複数可）を効率的に翻訳するには、特定の開始シグナルもまた必要とされうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン、および隣接配列が含まれる。さらに、全挿入配列の翻訳を確保するには、該開始コドンが、所望されるコード配列のリーディングフレームと同フレームでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が多様であることが可能であり、天然および合成のいずれもが可能である。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを組み込むことにより、増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：５１〜５４４頁（１９８７年）を参照されたい）。一例をあげるならば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＡｄＥＡＳＹ−ＸＬ（ＴＭ）システムなど、アデノウイルスベースのベクター系において用いられる、ヒトＣＭＶ即初期プロモーターであろう。
【００３３】
加えて、挿入した配列の発現を調節するか、または該遺伝子産物を、所望される特定の形で修飾およびプロセシングする宿主細胞株も選択することができる。タンパク質産物に対するこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断または膜への輸送）は、ＶＬＰを生成させるのに、またはＶＬＰポリペプチド、もしくはアジュバントなどのさらなるポリペプチド、もしくはさらなる抗原が機能するのに重要でありうる。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。発現させる外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確保するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物を適正にプロセシングし、遺伝子産物を適正にグリコシル化およびリン酸化するための細胞機構を保有する真核宿主細胞を用いることができる。
【００３４】
宿主細胞には、ｇａｇポリペプチドをコードする第１のベクターと、ウイルス性膜抗原、または抗原に連結した脂質ラフト関連ポリペプチドをコードする第２のベクターという、本発明の２つの発現ベクターを共トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、各ＶＬＰポリペプチドの同等の発現を可能とする、同一の選択マーカーを含有しうる。代替的に、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト関連ポリペプチドとの両方をコードし、また、これらの両方を発現することが可能な単一のベクターを用いることもできる。
【００３５】
宿主細胞によりＶＬＰを生成させたら、ポリペプチドの精製について当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特に、該ポリペプチドに付加した任意のアフィニティー精製タグによるアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィー）、遠心分離、吸収率較差溶解度法により、またはタンパク質もしくは他の高分子を精製するための他の任意の標準的な技法によりこれを精製することができる。加えて、ＶＬＰポリペプチドを、本明細書で説明されるか、またはこれ以外に当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合させ、ＶＬＰの精製を容易にすることもできる。精製後、ＶＬＰポリペプチドに対する共有結合を介して、または他の非共有結合機構により、さらなる抗原またはアジュバントなどのさらなるエレメントを、ＶＬＰに物理的に連結することができる。哺乳動物細胞および昆虫細胞など、脂質ラフトドメインを有する宿主細胞内においてＶＬＰポリペプチドを共発現させるある実施形態では、ＶＬＰが自己アセンブリーして放出され、これにより、上記の方法のうちのいずれかによるＶＬＰの精製が可能となる。ＶＬＰのある実施形態には、例えば、同種ウイルスのタンパク質から操作されたＶＬＰ、例えば、インフルエンザウイルスに由来するＭ１タンパク質、ＨＡタンパク質、また、場合によってＮＡタンパク質から構築されたＶＬＰ、また、異種ウイルスのタンパク質から操作されたＶＬＰ、例えば、ＭＬＶもしくはＨＩＶまたは他のレトロウイルスに由来するＧａｇタンパク質を、異なるウイルスに由来する抗原、例えば、インフルエンザＨＡタンパク質およびインフルエンザＮＡタンパク質と共に操作することにより形成したＶＬＰが含まれる。
【００３６】
Ｇａｇタンパク質ベースのＶＬＰを生成させる例示的な方法
当業者に適用可能な任意の方法により、ＶＬＰを容易にアセンブリーすることができ、この結果、ｇａｇポリペプチドと、インフルエンザ抗原ポリペプチドとを包含するＶＬＰがアセンブリーされることが好ましい。ある実施形態では、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、脂質内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの発現系など、任意の適用可能なタンパク質発現系において、ポリペプチドを共発現させることができる。
【００３７】
ｇａｇポリペプチドを用いて形成されるＶＬＰ発現の例が数多く公表されており、これにより、ＶＬＰを生成させるのに適用可能な発現系の範囲が裏付けられている。複数のレトロウイルスによる研究は、他のウイルスコンポーネントの非存在下で発現させたＧａｇポリペプチドが、細胞表面におけるＶＬＰの形成および出芽に十分であることを裏付けている（ＷｉｌｌｓおよびＣｒａｖｅｎ、ＡＩＤＳ、５巻、６３９〜６５４頁、１９９１年；  Ｚｈｏｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年；  Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８３巻、２８８〜２９７頁、１９９１年；  Ｒｏｙｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８４巻、４１７〜４２２頁、１９９１年；  Ｇｈｅｙｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、５９巻、１０３〜１１２頁、１９８９年；  Ｈｕｇｈｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻、２４２〜２５５頁、１９９３年；  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１４巻、５０〜５８頁、１９９５年）。バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞において、Ｇａｇ前駆体を発現させるとＶＬＰが形成されることについては、複数の研究グループにより裏付けられている（Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８巻、２６５３〜２６６０頁、１９８９年；  Ｌｕｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７９巻、８７４〜８８０頁、１９９０年；  Ｒｏｙｅｒ  ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８４巻、４１７〜４２２頁、１９９１年；  Ｍｏｒｉｋａｗａ  ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８３巻、２８８〜２９７頁、１９９１年；  Ｚｈｏｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年；  Ｇｈｅｙｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、５９巻、１０３〜１１２頁、１９８９年；  Ｈｕｇｈｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻、２４２〜２５５頁、１９９３年；  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１４巻、５０〜５８頁、１９９５年）。これらのＶＬＰは、未成熟レンチウイルス粒子に類似しており、昆虫細胞の細胞膜から出芽することにより、効率的にアセンブリーされて放出される。
【００３８】
Ｇａｇ前駆体のアミノ末端領域は、ウイルスアセンブリーに必要とされる、細胞表面への輸送および膜結合を標的とするシグナル領域であることが報告されている（Ｙｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻、４９６６〜４９７１頁、１９９２年；  Ｙｕａｎ，  Ｘら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、６３８７〜６３９４頁、１９９３年；  Ｚｈｏｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年；  ＬｅｅおよびＬｉｎｉａｌ、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、６６４４〜６６５４頁、１９９４年；  Ｄｏｒｆｍａｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、１６８９〜１６９６頁、１９９４年；  Ｆａｃｋｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、４９７２〜４９８０頁、１９９３年）。牛痘ウイルスによる発現系を用いて、Ｇａｇ構造タンパク質のほか、Ｅｎｖ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ４１も含有する、組換えＨＩＶベースのＶＬＰのアセンブリーが報告されている（Ｈａｆｆａｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻、４２７９〜４２８７頁、１９９２年）。
【００３９】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物中における感染作用物質を不活化する例示的方法
電磁放射は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性を実質的に低下させることなく、感染作用物質を不活化することが可能なので、例示的な不活化の方法は、電磁放射を介する方法である。電磁放射の例示的な３つの方式のすべて（すなわち、光反応性化合物を伴うＵＶ照射、ＵＶ照射単独、およびガンマ照射）には、血液、食品、ワクチンなど、多種多様な試料中における病原体を不活化するのに用いられてきた長い歴史があるため、不活化用電磁放射を適用するための多種多様な装置が市販されており、これらは、本明細書で開示される方法を実施するのにほとんど〜まったく改変せずに用いることができる。さらに、当技術分野では、波長および線量の最適化がルーチン化しており、したがって、当業者の能力範囲内で容易に実施される。
【００４０】
光反応性化合物を伴うＵＶ照射
電磁放射による例示的な不活化の方法は、感染作用物質中のポリヌクレオチドと反応する光反応性化合物などの、光反応性化合物の存在下における、ＵＶ−Ａ照射などの紫外線照射の組合せである。
【００４１】
例示的な光反応化合物には、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、アントラマイシン、ベンゾジピロン、フルオレン、フルオレノン、フロクマリン、イソアロキサジン、マイトマイシン、Ｍｏｎｏｓｔｒａｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ、Ｎｏｒｐｈｉｌｌｉｎ  Ａ、フェナントリジン、フェナザチオニウム塩、フェナジン、フェノチアジン、フェニルアジド、キノリン、およびチオキサンテノン（ｔｈｉａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅｓ）が含まれる。１つの分子種は、２つの主要なカテゴリーのうちの１つに属するフロクマリンである。第１のカテゴリーは、ソラーレン［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オン、または６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、直鎖状であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の６位に結合している。第２のカテゴリーは、イソソラーレン［２Ｈ−フロ（２，３−ｈ）−（１）−ベンゾピラン−２−オン、または４−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、曲鎖状であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の８位に結合している。３、４、５、８、４’、または５’位において直鎖状フロクマリンを置換することによりソラーレン誘導体を生成させ得る一方、３、４、５、６、４’、または５位において曲鎖状フロクマリンを置換することによりイソソラーレン誘導体を生成させ得る。ソラーレンは、二本鎖核酸の塩基対間に挿入することができ、長波長の紫外光（ＵＶＡ）を吸収すると、ピリミジン塩基に対する共有結合付加体を形成する。例えば、Ｇ．  Ｄ．  Ｃｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４巻：１１５１頁（１９８５年）；Ｈｅａｒｓｔら、Ｑｕａｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７巻：１頁（１９８４頁）を参照されたい。
【００４２】
例示的なＵＶ（または場合によって、可視光）放射の波長は、適切な反応および／または光付加体が生成される波長に依存し、これは、光反応性化学物質の化学反応に依存する。例示を目的として述べると、多くのソラーレンには、３２０〜３８０ｎｍの波長にあるＵＶ放射が極めて有効であり、３３０〜３６０ｎｍが最大の有効性を示す。また、同様のＵＶ−Ａ波長は、４１９ｎｍなど、可視光とも併せて用いうる光反応性化合物であるリボフラビンと併用しても、病原体を不活化するのに極めて有効である。
【００４３】
ＵＶ照射単独
光反応性化合物の存在下におけるＵＶ照射に加え、感染作用物質は、ＵＶ照射単独でも不活化することができる。ある実施形態では、放射の波長が、約１８０〜３２０ｎｍ、または約２２５〜２９０ｎｍ、または約２５４ｎｍ（すなわち、ポリヌクレオチドの高吸光度ピークおよび低減したタンパク質吸収を有するスペクトル領域）であるＵＶ−Ｃ放射である。ＵＶ−Ｃ放射は、エンベロープを形成する脂質二重層およびエンベロープ内のタンパク質など、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰのコンポーネントに対して、安定性および免疫原性の両面で有害性が低い一方で、感染作用物質を不活化するのに十分なエネルギーを保持するので、用いることができる。しかし、例えば、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂなど、他の種類のＵＶ放射もまた用いることができる。
【００４４】
ガンマ照射
本明細書で開示される方法を実施して組成物を生成させるには、ガンマ照射（すなわち、イオン化放射）もまた用いることができる。この実施形態では、１０〜６０ｋＧｙのガンマ照射線量が、病原体の不活化に有効である。ガンマ照射は、感染作用物質のゲノムをコードするポリヌクレオチド内において鎖の切断を導入することにより、感染作用物質を直接不活化することもでき、該ポリヌクレオチドを損傷させるフリーラジカルを生成することにより、感染作用物質を間接的に不活化することもできる。エンベロープＶＬＰの脂質コンポーネントおよびタンパク質コンポーネントへの、ラジカルを介する損傷を阻止するには、ガンマ照射と共に、フリーラジカルスカベンジャーおよび低温を用いることができる。
【００４５】
ＶＬＰを用いる例示的な方法
製剤
本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰの例示的な使用は、ワクチン調製物としての使用である。典型的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液の注射剤として調製されるが、注射前に液体中に溶解させるか、または懸濁させるのに適する固体形態もまた調製することができる。このような調製物はまた、乳化させることもでき、乾燥粉末として生成させることもできる。免疫原性の有効成分は、薬学的に許容され、また、有効成分に適合する、賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノールなどであり、また、これらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントを含有し得る。
【００４６】
ワクチンは、注射、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）注射、皮内注射、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）注射、または筋肉内注射を介する、従来の非経口投与が可能である。他の投与方式に適する、さらなる製剤には坐剤が包含され、場合によっては、経口製剤、鼻腔内製剤、口腔内製剤、舌下製剤、腹腔内製剤、膣内製剤、経肛門製剤、および頭蓋内製剤も包含される。坐剤の場合、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）またはトリグリセリドが包含される場合があり、このような坐剤は、０．５％〜１０％、または１〜２％の範囲でも、有効成分を含有する混合物から形成することができる。ある実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低温溶融ワックスをまず溶融させ、本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰを、例えば、撹拌することにより、均一に分散させる。次いで、溶融した均一の混合物を、適当なサイズの鋳型に流し込み、冷却して固形化させる。
【００４７】
鼻腔内送達に適する製剤には、液体（例えば、エアゾールまたは点鼻液として投与する水溶液）および乾燥粉末（例えば、鼻孔内への急速沈殿用）が包含される。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、およびキトサンなど、通常用いられる賦形剤を包含する。液体製剤または粉末製剤において、キトサンなどの粘膜付着剤を用いて、鼻腔内投与された製剤の粘液線毛クリアランスを遅延させることができる。マンニトールおよびスクロースなどの糖を、液体製剤では安定化剤として用いることができ、また、乾燥粉末製剤では安定化剤、充填剤、または粉末流動剤および粉末サイズ剤として用いることができる。加えて、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）などのアジュバントを、液体製剤および乾燥粉末製剤の両方において、免疫刺激性アジュバントとして用いることもできる。
【００４８】
経口送達に適する製剤には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、トローチなどが包含される。経口送達に適する製剤には、錠剤、トローチ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが包含される。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常用いられる賦形剤を包含する。他のエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、持続放出製剤、または粉末の形態を取る場合があり、１０〜９５％の有効成分、または２５〜７０％の有効成分を含有する場合がある。経口製剤の場合、コレラ毒素が興味深い製剤パートナーである（また、可能なコンジュゲーションパートナーでもある）。
【００４９】
膣内投与用に調合する場合、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンは、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーの形態であり得る。前出の製剤のうちのいずれもが、エンベロープウイルスベースのＶＬＰに加えて、担体など、当技術分野で適切であることが公知の薬剤を含有し得る。
【００５０】
一部の実施形態では、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンを、全身送達用に調合する場合もあり、局所送達用に調合する場合もある。このような製剤は、当技術分野において周知である。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が包含される。静脈内媒体には、流体および栄養物質補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づく補給剤など）などが包含される。全身投与経路および局所投与経路には、例えば、皮内経路、局所適用経路、静脈内経路、筋肉内経路などが包含される。
【００５１】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、中性製剤または塩ベースの製剤を包含するワクチンに調合することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され、また、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される）が包含される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【００５２】
ワクチンは、剤形に適合した形で、また、治療的に有効であり免疫原性となる量で投与することができる。投与量は、例えば、個体の免疫系が免疫反応を誘発する能力、および所望される防御の程度を包含する、治療される対象に依存する。適切な用量範囲は、１回のワクチン接種当たりの有効成分が数百マイクログラムのオーダーであり、例示的な範囲は、約０．５μｇ〜１０００μｇの範囲、１μｇ〜５００μｇの範囲、または、約１０μｇ〜１００μｇの範囲など、約０．１μｇ〜２０００μｇの範囲である（１〜１０ｍｇの範囲にある高量も意図される）。初回投与および追加投与に適するレジメンもまた可変的であるが、初回投与にその後の接種または他の投与が続く形が典型的である。
【００５３】
適用方式は多様に変化させることができる。従来のワクチン投与方法のうちのいずれもが適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容されるベース上における経口適用、または注射など、生理学的に許容される分散剤による非経口適用が包含される。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人の年齢、および抗原製剤により変化する。
【００５４】
ワクチン製剤の一部は、製剤自体でワクチンとして十分に免疫原性であるが、他の製剤では、該ワクチンがアジュバント物質をさらに含むと、免疫反応が増強される場合がある。
【００５５】
とりわけ、鼻腔内ベース、経口ベース、または肺内ベースの送達製剤の場合、送達および免疫原性を改善するには、粘膜付着を改善する送達剤を用いることもできる。このような化合物である、キチンのＮ−脱アセチル化形態であるキトサンは、多くの医薬製剤で用いられる（３２）。それが粘液線毛クリアランスを遅延させ、粘膜による抗原の取込みおよびプロセシングのためにより多くの時間を許容する能力のために、キトサンは、鼻腔内におけるワクチン送達にとって魅力的な粘膜付着剤である（３３、３４）。加えて、キトサンは、密着結合を一過性に開口させ、これにより、ＮＡＬＴへの抗原の経上皮輸送が増強され得る。近年のヒト試験では、キトサンを伴うが、さらなるアジュバントは伴わずに、三価の不活化インフルエンザワクチンを鼻腔内投与したところ、筋肉内接種後に得られたセロコンバージョンおよびＨＩ力価をごくわずかに下回るセロコンバージョンおよびＨＩ力価がもたらされた（３３）。
【００５６】
キトサンはまた、遺伝子的に解毒したＥ．  ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンの突然変異体であるＬＴＫ６３など、鼻腔内において良好に機能するアジュバントと共に調合することもできる。これにより、キトサンにより付与される送達および付着の利益の上に、免疫刺激効果が付加され、その結果、粘膜反応および全身反応の増強をもたらす（３５）。
【００５７】
最後に、キトサン製剤はまた、ワクチンの安定性を改善し、さらに、粘液線毛クリアランスにおいて液体製剤を上回る遅延を結果としてもたらすことが示されている乾燥粉末フォーマットでも調製することができる（４２）。これは、キトサンと共に調合された、鼻腔内用乾燥粉末によるジフテリア毒素ワクチンを伴う、近年のヒト臨床試験において見られ、ここで、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同程度に有効であり、分泌性ＩｇＡ反応の利益が付加された（４３）。該ワクチンはまた、忍容性も極めて良好であった。キトサンおよびＭＰＬを含有する炭疽菌用の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、ウサギにおいて、筋肉内接種より強力な反応を誘導し、また、エアゾールによる胞子投与に対しても防御的であった（４４）。
【００５８】
鼻腔内ワクチンは、下気道に対してより良好に作用する非経口投与ワクチンに対して、上気道および下気道に作用し得るので、好ましい製剤を表わす。これは、アレルゲンベースのワクチンには忍容性を誘導し、また、病原体ベースのワクチンには免疫性を誘導する点で有益である。
【００５９】
鼻腔内ワクチンは、上気道および下気道の両方において防御をもたらすのに加え、注射針による接種の煩雑さを回避し、また、粒子抗原および／または可溶性抗原が、鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）と相互作用することを介して、粘膜および全身における体液性反応および細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす（１６〜１９）。歴史的に、鼻腔内経路は、非経口接種ほど有効ではなかったが、新規の送達製剤であるエンベロープウイルスベースのＶＬＰおよびアジュバントを用いることにより、この枠組みが変わりつつある。実際、鼻腔粘膜内にはシアル酸を含有する受容体が豊富であるため、鼻腔内送達には、機能性の赤血球凝集素分子を含有するインフルエンザワクチンがとりわけよく適しており、その結果、ＨＡ抗原の結合が増強され、粘液線毛クリアランスが低減される可能性をもたらす。
【００６０】
インフルエンザについては、並行する非経口投与の免疫原性が低く、ヘテロ亜型的防御が誘導されなかった実験の鼻腔内ワクチン送達後において、ヘテロ亜型的防御を含めた防御的免疫反応が報告されている（２０〜２２）。さらに、不活化インフルエンザは、鼻腔内投与されるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）によるＶＬＰワクチンと混合すると、全身および粘膜における体液性反応および細胞性反応に有効なアジュバントであることも示されている（２３）。このアジュバント効果は、不活化インフルエンザビリオンが、ＶＬＰと共に凝集し、粘膜表面への結合を増強する能力に帰せられた。また、インフルエンザＨＡタンパク質をＳＩＶ  ＶＬＰに直接に組み込んだところ、樹状細胞（ＤＣ）への結合およびＤＣの活性化が増強された場合にも、同様のアジュバント効果が見られた（２４、２５）。
【００６１】
アジュバント
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する各種の方法が公知であり、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に用いることができる。一般的な原理および方法は、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．  Ｓ．  Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．、ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６において詳述されており、また、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇら（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９においても詳述されており、どちらも参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
一部の実施形態では、ＶＬＰワクチンが、重量ベースの比率約１０：１〜約１０１０：１のＶＬＰ：アジュバント、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、または約１０９：１〜約１０１０：１のＶＬＰ：アジュバントで、少なくとも１つのアジュバントと混合したエンベロープウイルスベースのＶＬＰを含む。当業者は、アジュバントに関する情報、また、最適の比を決定する日常的実験に関する情報により、適切な比率を容易に決定することができる。当業者は、アジュバントに関する情報、および最適の比率を決定する日常的実験に関する情報により、適切な比率を容易に決定することができる。限定なしに述べると、本明細書で開示されるＶＬＰとアジュバントとの混合物には、同じ溶液における個別のＶＬＰとアジュバントとの混合物、共有結合させたＶＬＰおよびアジュバント、イオン結合させたＶＬＰおよびアジュバント、疎水性結合させたＶＬＰおよびアジュバント（ＶＬＰ膜内に部分的または完全に包埋させることを含めた）、親水性結合させたＶＬＰおよびアジュバント、ならびに前出の任意の組合せを含め、当業者に利用可能な任意の形態の組合せが含まれうる。
【００６３】
例示的なアジュバントには、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａの模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、水中油エマルジョン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子、ポロキサマー粒子、マイクロ粒子、およびリポソームが包含され得るがこれらに限定されない。アジュバントは、細菌由来の外毒素ではないことが好ましい。好ましいアジュバントは、３ＤＭＰＬ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはＱＳ２１など、Ｔｈ１型反応を刺激するアジュバントである。
【００６４】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに由来する、脂質Ａの非毒性誘導体であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）は、ワクチンアジュバントとして開発された、強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Ｅｖａｎｓら、２００３年）。マウスによる前臨床研究では、鼻腔内ＭＰＬが、分泌性ならびに全身性の体液反応を増強することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、２０００年；Ｙａｎｇら、２００２年）。ＭＰＬはまた、１２０，０００例を超える患者による臨床研究でも、ワクチンアジュバントとして安全かつ有効であることが分かっている（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００２年；２００４年）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激し、したがって、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ウイルス、および寄生虫を包含する、広範な範囲にわたる感染性病原体に対して、非特異的な免疫反応を誘発することが可能である（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００４年；Ｐｅｒｓｉｎｇら、２００２年）。鼻腔内製剤中にＭＰＬを包含することにより、ウイルス感作に由来する非特異的な免疫反応を誘発する自然反応が迅速に誘導される一方で、該ワクチンの抗原成分により生成させる特異的反応が増強される。
【００６５】
したがって、一実施形態では、本発明が、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））または３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３  Ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））を、後天免疫および自然免疫の増強剤として含む組成物を提供する。化学的に述べると、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）とは、４位アシル化鎖、５位アシル化鎖、または６位アシル化鎖との３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの例示的な形態は、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ）において開示されている。別の実施形態では、本発明が、合成脂質Ａ、ＢｉｏＭｉｒａによるＰＥＴ  Ｌｉｐｉｄ  Ａなど、脂質Ａの模倣体もしくは類似体、またはＴＬＲ−４アゴニストと同様に機能するようにデザインされている合成誘導体を含む組成物を提供する。
【００６６】
例示的なアジュバントは、ＶＬＰポリペプチドと共発現させるか、またはＶＬＰポリペプチドと融合させて、キメラポリペプチドを生成させることにより、本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰに容易に添加し得るポリペプチドアジュバントである。鞭毛の主要なタンパク質成分である細菌性フラジェリンは、それが、ｔｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ５を介する先天性免疫系により認識されるために、アジュバントタンパク質としてますます注目を集めているアジュバントである（６５）。ＴＬＲ５を介するフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟化および移動の他、マクロファージ、好中球、および腸上皮細胞の活性化も誘導することにより、先天性免疫機能および後天性免疫機能の両方に影響を及ぼし、その結果、炎症促進メディエーターを生成させる（６６〜７２）。
【００６７】
ＴＬＲ５は、免疫学的圧力に応答するその突然変異を除外し、このタンパク質に固有であり、また、鞭毛機能に必要とされる、フラジェリン単量体内における保存的構造を認識する（７３）。該受容体は、１００ｆＭの濃度に対して感受性であるが、完全な線維は認識しない。鞭毛が単量体に解体されることが、結合および刺激に必要とされる。
【００６８】
アジュバントとしてのフラジェリンは、非経口投与または鼻腔内投与された異種抗原に対する防御反応を誘導する強力な活性を有し（６６、７４〜７７）、また、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果もまた報告されている（７８）。マウスまたはサルにおいてフラジェリンを用いると、Ｔｈ２バイアス（これは、インフルエンザなどの呼吸器ウイルスには適切である）は観察されるが、ＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。加えて、サルにおける鼻腔内投与または全身投与後における、局所炎症反応または全身炎症反応も報告されていない（７４）。ＴＬＲ５を介して、ＭｙＤ８８依存的な形でなされるフラジェリンシグナル、およびＴＬＲを介する、他のすべてのＭｙＤ８８依存的シグナルは、Ｔｈ１バイアスを結果としてもたらすことが示されている（６７、７９）ため、フラジェリンを使用した後で誘発される反応におけるＴｈ２の特徴は、ある意味で驚くべきことである。フラジェリンに対して予め存在する抗体が、アジュバントの有効性に対してさほどの影響を及ぼさない（７４）ことから、フラジェリンは、複数回使用のためのアジュバントとして魅力的となっていることが重要である。
【００６９】
近年における鼻腔内ワクチン試験における共通の主題は、ワクチンの有効性を改善するアジュバントおよび／または送達系の使用である。このような一研究では、遺伝子的に解毒したＥ．  ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ  Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンが、Ｈ５による感作に対してヘテロ亜型的な防御を結果としてもたらしたが、これは、鼻腔内送達後に限られた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づき、これにより、新たなインフルエンザワクチンの開発における鼻腔内経路についての重要な示唆が示された（２２）。
【００７０】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、および他の同様の増殖因子は、ＶＬＰポリペプチドと混合または融合させることにより、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン内に容易に包含され得るので、これらもまたアジュバントとして用いることができる。
【００７１】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン組成物が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む、核酸のＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンのＴＬＲ７リガンド；置換グアニンのＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリイノシン酸、イミキモド（Ｒ−８３７）、およびレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンド；またはＭＰＬ（登録商標）もしくは合成誘導体などのＴＬＲ４アゴニストなど、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを包含し得る。
【００７２】
ある種のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア派生物などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＰＬ；および封入アジュバントからなる群から選択される。
【００７３】
アジュバントのさらなる例には、緩衝生理食塩液中０．０５〜０．１パーセントの溶液として一般的に用いられる水酸化物またはリン酸などのアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ（１９９２年）Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３巻：４８９〜４９３頁を参照されたい）、０．２５パーセントの溶液として用いられる糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物、それぞれ、７０℃〜１０１℃の範囲の温度で３０秒間〜２分間にわたる熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集物などの薬剤が包含され、また、架橋形成剤による凝集物も可能である。ペプシン処理した、アルブミンに対する抗体（Ｆａｂ断片）との再活性化による凝集物、Ｃ．  ｐａｒｖｕｍまたはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖コンポーネントなどの細菌細胞との混合物、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容される油媒体中におけるエマルジョン、または保護置換基として用いられる、ペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０パーセント溶液によるエマルジョンもまた用いることができる。スクアレンおよびＩＦＡなどの油との混合物もまた用いることができる。
【００７４】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、アジュバントの興味深い候補物質であるが、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントの他、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ２１などのキラヤサポニンもまた興味深い。さらなる可能性には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など、リポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン（ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｅａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）誘導体が包含される。例えば、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａなどのモノホスホリル脂質Ａをアルミニウム塩と併せた組合せを包含する、主にＴｈ１型の反応をもたらすリポ多糖ベースのアジュバントを用いることができる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから市販されている（例えば、それらの各々が、それらのリポ多糖に関する教示に対する具体的な言及を伴うそれらの全体において参照により組み込まれる、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照されたい）。
【００７５】
リポソーム製剤もまた、アジュバント効果を付与することが知られており、したがって、リポソームアジュバントは、エンベロープウイルスベースのＶＬＰと併用して用いることができる。
【００７６】
免疫刺激複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、とりわけ、この型のアジュバントが、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することが可能であるため、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いることもできる。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａに由来する（場合によって画分された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質からなる。ＶＬＰ中のものなどの免疫原性タンパク質と混合する場合、結果として得られる粒子状製剤は、サポニンが６０〜７０％ｗ／ｗを占めることが可能であり、コレステロールおよびリン脂質が１０〜１５％ｗ／ｗ、およびタンパク質が１０〜１５％ｗ／ｗを占めることが可能な、ＩＳＣＯＭ粒子として公知の製剤である。免疫刺激複合体の組成および使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱う上述の教科書中に見出し得るが、また、Ｍｏｒｅｉｎ  Ｂら、１９９５年、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３巻：４６１〜４７５頁の他、Ｂａｒｒ  Ｉ  ＧおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ  Ｇ  Ｆ、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４巻：８〜２５頁（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）も、完全な免疫刺激複合体を調製するのに有益な教示を提供している。
【００７７】
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンとのアジュバントの組合せにおいて用い得るサポニンには、それらがＩＳＣＯＭ形態にある場合であれ、そうでない場合であれ、米国特許第５，０５７，５４０号（Ｑｕｉｌ  Ａ画分、およびそれらを単離して用いる方法に対する具体的な言及を伴うその全体において参照により本明細書に組み込まれる）、および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｋｅｎｓｉｌ，  Ｃ．  Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、１９９６年、１２巻（１〜２号）：１〜５５頁；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１で説明される、Ｑｕｉｌ  Ａと称する、Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するサポニン、ならびにそれらの画分が包含される。Ｑｕｉｌ  Ａの例示的な画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、およびＱＳ１７である。
【００７８】
β−エスシンは、本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンのアジュバント組成物中で用いる別の溶血性サポニンである。エスシンは、メルクインデックス（第１２版：登録番号３７３７）において、ラテン名：Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍであるトチノキの種子内で発生するサポニンの混合物として説明されている。クロマトグラフィーおよび精製（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．４巻、２１３頁（１９５３年））による、およびイオン交換樹脂（Ｅｒｂｒｉｎｇら、米国特許第３，２３８，１９０号）によるその単離が、説明されている。エスシンの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍら（Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（東京）、１９９６年８月；４４巻（８号）：１４５４〜１４６４頁））。β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）はまた、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても公知である。
【００７９】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いる別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、メルクインデックス（第１２版：登録番号３２０４）において、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来し、また、Ｇｉｓｖｏｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．、１９３４年、２３巻、６６４頁；およびＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５５年、３０１巻、６２１頁において説明される手順により精製されるサポニンとして説明されている。その使用は、コレステロールを判定するための臨床試薬であると説明されている。
【００８０】
アジュバント効果を達成する別の興味深い可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、１９９２年（参照により本明細書に組み込まれる）において説明される技法を用いることである。略述すると、本明細書で説明されるＶＬＰポリペプチドまたはさらなる抗原などの関与抗原の提示は、該抗原を、単球／マクロファージ上におけるＦＣ受容体に対する抗体（または抗原に結合する抗体断片）にコンジュゲートすることにより増強することができる。とりわけ、抗原と抗ＦＣＲＩとのコンジュゲートは、ワクチン接種のための免疫原性を増強することが示されている。該抗体は、ＶＬＰポリペプチドのうちのいずれか１つに対する融合体としての発現によることを包含する生成後において、または該生成の一部として、エンベロープウイルスベースのＶＬＰにコンジュゲートすることができる。
【００８１】
他の可能性は、標的化物質および免疫調節物質（すなわち、サイトカイン）の使用を伴う。加えて、ポリＩ：Ｃなど、合成のサイトカイン誘導物質もまた用いることができる。
【００８２】
適切なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、フロイントの完全アジュバント、ならびに、ＴＤＭおよびＴＤＥなど、トレハロースのジエステルからなる群から選択することができる。
【００８３】
適切な免疫標的化アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体、またはこれらの特異的結合断片（上記の議論を参照されたい）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が包含される。
【００８４】
適切なポリマーアジュバントの例には、デキストランなどの炭水化物、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、およびマンノース；塑性ポリマー；ならびにラテックスビーズなどのラテックスが包含される。
【００８５】
免疫反応を調節するさらに別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ、Ｉｎｃ．、３６０  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．  １００１７−６５０１により開発された、特許品の医療デバイス）内に免疫原（場合によって、アジュバント、ならびに薬学的に許容される担体および媒体と併せて）を包含することである。ＶＬＮ（細長型の管状デバイス）は、リンパ節の構造および機能を模倣する。ＶＬＮを皮下に挿入することにより、サイトカインおよびケモカインの急増による無菌的炎症部位が創出される。Ｔ細胞およびＢ細胞の他、ＡＰＣも、危険シグナルに応答し、炎症部位に至り、ＶＬＮの多孔性マトリックスの内部に蓄積される。ＶＬＮを用いると、抗原に対する免疫反応を誘発するのに必要とされる抗原用量が低下し、ＶＬＮを用いるワクチン接種により付与される免疫的防御が、Ｒｉｂｉをアジュバントとして用いる従来の免疫化を凌駕することが示されている。この技法は、Ｇｅｌｂｅｒ  Ｃら、１９９８年、「Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｍａｌｌ  Ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ」、「Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ、梗概、１９９８年１０月１２〜１５日、Ｓｅａｓｃａｐｅ  Ｒｅｓｏｒｔ、Ａｐｔｏｓ  Ｃａｌｉｆ．」において略述されている。
【００８６】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いることができ、少なくとも３つ、または少なくとも６つ以上のヌクレオチドで隔てられた２つ以上のジヌクレオチドによるＣｐＧモチーフを含有することができる。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていない）は、主にＴｈ１反応を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、それらの各々が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをアジュバントとして生成させて用いる方法に対する具体的な言及を伴うそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号において説明されている。
【００８７】
このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。ある実施形態では、該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート結合であるか、またはホスホロチオエート結合であるが、骨格結合を混合したオリゴヌクレオチドを包含する、ホスホジエステル骨格、およびＰＮＡなど他のヌクレオチド骨格をエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いることができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを生成させる方法は、それらの各々が、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートについての教示に対する具体的な言及を伴うそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号、およびＷ０９５／２６２０４において説明されている。
【００８８】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチド骨格を含有することができる。
【００８９】
【化１】
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代替的なＣｐＧオリゴヌクレオチドには、これらに対する重要でない欠失または付加を伴う上記の配列が包含される。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の方法（例えば、ＥＰ４６８５２０）により合成することができる。例えば、自動合成器を用いてこのようなオリゴヌクレオチドを合成し得る。このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドと、サポニン誘導体との組合せを伴い、特に、ＣｐＧとＱＳ２１との組合せが、ＷＯ００／０９１５９において開示されている。
【００９０】
多くの単相または複相のエマルジョン系が説明されている。エマルジョンが、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの構造を破壊しないように、当業者は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に用いられるこのようなエマルジョン系を容易に適合させることができる。水中油エマルジョンによるアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰＯ３９９８４３Ｂ）、また、水中油エマルジョンと他の活性薬剤との組合せも、ワクチン用のアジュバントとして説明されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ０４８０９８２Ｂ２）、および水中油中水エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）など、他の油エマルジョンによるアジュバントが説明されている。
【００９１】
本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に用いられる油エマルジョンによるアジュバントは、天然の場合もあり、合成の場合もあり、また、無機性の場合もあり、有機性の場合もある。鉱油および有機油の例は、当業者に容易に明らかであろう。
【００９２】
任意の水中油組成物が、ヒトへの投与に適するためには、エマルジョン系の油相が、代謝性油を包含していてよい。代謝性油という用語の意味は、当技術分野において周知である。代謝性とは、「代謝により変換可能であること」と定義することができる（「Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第２５版（１９７４年））。油は、受容者に毒性でなく、代謝により変換可能な、任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であることが可能である。堅果（ラッカセイ油など）、種、穀類が、植物油の一般的な供給源である。合成油もエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いることができ、これらには、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）および他の油など、市販の油が包含され得る。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に高量で見出され、また、オリーブ油、コムギ胚種油、コメぬか油中、および酵母に低量で見出される不飽和油であり、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いることができる。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実により、代謝性油である（「メルクインデックス」、第１０版、登録番号８６１９）。
【００９３】
例示的な油エマルジョンは水中油エマルジョンであり、特に、水中スクアレンエマルジョンである。
【００９４】
加えて、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンにおいて用いる油エマルジョンによるアジュバントには、油であるα−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）などの、抗酸化剤が含まれ得る。
【００９５】
ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、場合によって、免疫刺激剤であるＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬと共に調合される、スクアレン、α−トコフェロール、およびＴＷＥＥＮ  ８０（ＴＭ）に基づくエマルジョンによるアジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相へのステロールの添加による、これらのスクアレンエマルジョンに対する改善を開示している。加えて、エマルジョンを安定化させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを、油相に添加することができる（ＷＯ９８／５６４１４）。
【００９６】
安定的な水中油エマルジョン中で見出される油滴のサイズは、光子相関分光分析により測定したときに、１ミクロン未満であってよく、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲内、実質的に直径約３０〜５００ｎｍ、実質的に直径１５０〜５００ｎｍ、または直径約１５０ｎｍであり得る。この点で、油滴数の８０％がこれらの範囲内にあるものとし、油滴数の９０％、または油滴数の９５％超が規定のサイズ範囲内にある。油エマルジョン中に存在する成分の量は、従来、スクアレンなどの油が２〜１０％の範囲内にあり；また、存在する場合、アルファトコフェロールが２〜１０％であり、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が０．３〜３％である。油：アルファトコフェロールの比は、より安定的なエマルジョンがもたらされるため、１以下であり得る。ＳＰＡＮ  ８５（ＴＭ）もまた、約１％のレベルで存在し得る。一部の場合には、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンが、安定化剤をさらに含有することが有利であり得る。
【００９７】
水中油エマルジョンを生成させる方法は、当業者に周知である。一般に、該方法は、油相を、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、その後、ホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションを包含するステップを含むが、該混合物に、シリンジ針内を２回流過させるステップを含む方法が、小容量の液体をホモジナイズするのには適切であることが、当業者には明らかであろう。同様に、当業者は、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍ１１０Ｓ型マイクロ流体生成器、最大入力圧６バールで２分間にわたり、最大５０回の流過（約８５０バールの出力圧））内で乳化過程を適合させれば、より低量または高量のエマルジョンを生成させることができるであろう。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物が達成されるまで、結果として得られるエマルジョンの測定を含む日常的な実験により達成し得るであろう。
【００９８】
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン調製物は、前記ワクチンを、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与を介して投与することにより、ウイルス性インフルエンザを受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物またはトリを防御または治療するのに用いることができる。ワクチン調製物を全身投与する方法には、従来のシリンジおよび注射針、または固体ワクチンを弾道送達するためにデザインされたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）、または注射針なしの高圧液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）が包含され得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、皮膚に貼付することもできる（経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンは、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンまたはアジュバントによる組成物を予め充填した全身投与用の送達デバイスを包含し得る。したがって、哺乳動物またはトリなどの個体において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰ組成物のうちのいずれかを含み、また、場合によって、アジュバントおよび／または担体を包含するワクチンを該個体に投与するステップを含み、該ワクチンが、非経口経路または全身経路により投与される方法が提供される。
【００９９】
本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン調製物は、前記ワクチンを、経口／経消化管経路、または経鼻経路などの粘膜経路を介して投与することにより、ウイルス性インフルエンザを受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物またはトリを防御または治療するのに用い得る。代替的な粘膜経路は、膣内経路および直腸内経路である。例示的な粘膜投与経路は、経鼻経路を介し、鼻腔内ワクチン接種と称することができる。免疫化される個体の鼻咽頭内に、ワクチンの液滴形態、スプレー形態、または乾燥粉末形態を投与することを包含する、鼻腔内ワクチン接種の方法は、当技術分野において周知である。噴霧化またはエアゾール化されたワクチン製剤が、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンの例示的な形態である。経口投与用の胃液耐性のカプセルおよび顆粒などの腸溶製剤、直腸内投与または膣内投与用の坐剤もまた、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンの製剤である。
【０１００】
本明細書で開示される、例示的なエンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン組成物は、ヒトへの適用に適する経粘膜ワクチンのクラスを表わし、経粘膜ワクチン接種により全身ワクチン接種を代替する。
【０１０１】
エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、経口経路を介して投与することもできる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤にはまた、アルカリ性バッファー、または腸溶性のカプセルもしくはマイクロ顆粒も包含され得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、膣内経路によっても投与することができる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、また、膣内クリームおよび膣内坐剤である他の公知の安定化剤も包含され得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、直腸内経路によっても投与することができる。このような場合、賦形剤には、直腸内坐剤を形成するために当技術分野で公知のワックスおよびポリマーも包含され得る。
【０１０２】
代替的に、エンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン製剤は、キトサン（上記で説明した）または他のポリカチオンポリマー、ポリラクチド粒子およびポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖または化学修飾した多糖からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチン媒体と組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下において調合し、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成することもできる。さらに、サポニンは、非粒子状の溶液もしくは懸濁液中、または小ラメラリポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造内において、ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと併せて調合することができる。
【０１０３】
本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰを用いる医薬組成物およびワクチン組成物中で用いられる、さらなる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９７年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６５巻（５号）：１７１０〜１７１５頁を参照されたい）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍのアジュバントシステム番号２；ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油エマルジョン）；ＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍのアジュバントシステム番号４；ミョウバンおよびＭＰＬを含有する）；ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、およびＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ならびに、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる係属中の米国特許継続出願第０８／８５３，８２６号、および同第０９／０７４，７２０号において説明されるものなど、他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）が包含される。
【０１０４】
アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒによるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ニトロセルロース（ＮｉｌｓｓｏｎおよびＬａｒｓｓｏｎ（１９９２年）Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３巻：５５３〜５５７頁）；Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのモンタニドアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；Ｓｅｐｐｉｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）など、鉱油エマルジョン、非鉱油エマルジョン、油中水エマルジョン、または水中油エマルジョンを包含する、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの製剤；およびＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＯＭ−１７４（脂質Ａと関連するグルコサミンジサッカリド）；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの伸長因子；ＣＲＬ  １００５など、ミセルを形成する非イオン性のブロックコポリマー；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が包含されるがこれらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．１８巻（３号）：６９〜８５頁；および「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｄ．  Ｏ’Ｈａｇａｎ編（２０００年）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１０５】
他のアジュバントには、一般式
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ  （Ｉ）
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキル、またはフェニルＣ１〜５０アルキルである］のアジュバント分子が包含される。
【０１０６】
本明細書で説明されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン製剤の一実施形態は、一般式（Ｉ）［式中、ｎは１〜５０、４〜２４、または９であり；Ｒ成分はＣ１〜５０、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、またはＣ１２アルキルであり；また、Ａは結合である］のポリオキシエチレンエーテルを包含する。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、０．１〜１０％、または０．１〜１％の範囲であるものとする。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックス（第１２版；登録番号７７１７）で説明されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９で説明されている。
【０１０７】
所望の場合、上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルを、別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、アジュバントの組合せは、上記で説明したＣｐＧを包含し得る。
【０１０８】
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いるのに適する、薬学的に許容される賦形剤のさらなる例には、水、リン酸緩衝生理食塩液、等張性緩衝液が包含される。
さらなるインフルエンザ抗原
本明細書で開示される安定化させたＶＬＰは、インフルエンザウイルスの特定の株に対して、かつ／またはインフルエンザウイルスの複数の株にわたり免疫原性を増大させるために、インフルエンザウイルスに由来するさらなる抗原を包含しうる。
【０１０９】
例示的なさらなるインフルエンザ抗原は、Ｍ２ポリペプチド（インフルエンザＢにおいてＢＭ２とも呼ばれる）である。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、スプライシングイベント後におけるＲＮＡのセグメント７（マトリックスセグメント）によりコードされる、９７アミノ酸の低分子ＩＩＩ型内在性膜タンパク質である（８０、８１）。ウイルス粒子上に存在するＭ２は極めてわずかであるが、感染細胞上においてより豊富に見出すことができる。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要な、プロトン選択性イオンチャネルとして用いられる（８２、８３）。感染時または従来のワクチン接種時における免疫原性は最小限であることから、その保存が説明されるが、代替的なフォーマットで存在する場合は、より免疫原性であり防御性である（８４〜８６）。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２モノクローナル抗体の受動伝達により、ウイルスクリアランスが加速化され、結果として防御がもたらされるという観察（８７）と符合する。Ｍ２の外部ドメインエピトープを、融合タンパク質として、ＨＢＶのコア粒子に連結すると、非経口接種および鼻腔内接種のいずれによっても、マウスにおいて防御性であり、３回のタンデムコピーを該コアタンパク質のＮ末端に融合させると、最も免疫原性となる（８８〜９０）。これは、エピトープ密度が増大すると免疫原性が増大することを示す他のキャリア−ハプテンデータ（９１）と符合する。
【０１１０】
Ｍ２ワクチンを鼻腔内送達する場合、良好な防御を達成するにはアジュバントが必要とされる場合があり、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）により良好な結果が達成されている。ペプチドはまた、ＫＬＨ、またはＮ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓの外膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスのＶＬＰなどのキャリアに化学的にコンジュゲートすることもでき、マウスおよび他の動物におけるワクチンとして防御性である（９２、９３）。
【０１１１】
Ｍ２タンパク質は、高度に保存性ではあるが、配列の相違をまったく示さないわけではない。一般的な株であるＡ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８株（Ｈ３Ｎ２）のＭ２外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７株（Ｈ５Ｎ１）を除き、今日配列決定されている他のすべてのヒト株と、免疫学的に交差反応性であることが示された（９２）。インフルエンザデータベースの配列の検討からも、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株など、他のより近年の病原性Ｈ５Ｎ１ヒト単離物のＭ２配列内において、同様の相違が示されている。この知見は、Ｍ２エピトープを組み込む、有効なＨ５特異的な流行性ワクチンが、ヒトＨ１単離物およびＨ３単離物中において現在行きわたっているＭ２配列ではなく、病原性のトリ株に固有のＭ２配列を反映する必要があることを裏付ける。
【０１１２】
インフルエンザウイルスに由来するさらなるタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２以外のタンパク質）も、共発現により、またはさらなる抗原の全部もしくは一部を、ｇａｇもしくはＨＡポリペプチドに連結することにより、ＶＬＰワクチン内に組み込むことができる。これらのさらなる抗原には、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＢＭ２、ＮＳ、ＮＳ１、およびＮＳ２が包含される。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、例には、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＡタンパク質、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、およびＮＳ２タンパク質が含まれる。Ｂ型インフルエンザウイルスの場合、例には、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、ＮＰタンパク質、Ｍタンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、ＮＳタンパク質、およびＢＭ２タンパク質が含まれる。これら後者の抗原は、一般に、抗体反応を中和するための標的ではなく、Ｔ細胞により認識される重要なエピトープを含有し得る。このようなエピトープに対してＶＬＰワクチンにより誘導されるＴ細胞反応が、防御的免疫性を促進するのに有益であることが判明し得る。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１）
インフルエンザ抗原のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の生成
ＭＬＶ  ｇａｇタンパク質のコード配列は、モロニーマウス白血病ウイルスの両種性プロウイルス配列全体を含有するプラスミドｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ）から、ＰＣＲにより得た。該ｇａｇタンパク質のコード配列を、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のポリへドロンプロモーターの後に挿入し、結果として得られるプラスミドでＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を形質転換し、バキュロウイルスゲノムに組み換えた。次いで、高分子量のバクミドＤＮＡを精製し、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトし、ｇａｇタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを生成させた。ウイルスＲＮＡに由来するＨＡタンパク質のコード配列およびＮＡタンパク質のコード配列をＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした後で、Ａ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１亜型）の赤血球凝集素タンパク質およびノイラミニダーゼタンパク質のそれぞれをコードする他の２つの組換えバキュロウイルスも、同様の形で生成させた。最後に、個別のｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドに由来する、ＨＡタンパク質発現ユニット、ｇａｇタンパク質発現ユニット、およびＮＡタンパク質発現ユニット（ポリへドロンプロモーター−コード配列−ポリＡ部位）を、単一のｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターに統合することにより、３つの産物すべて（ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ）をコードする単一のバキュロウイルスベクターを生成させた。当初の解析のために、ｇａｇタンパク質またはＨＡタンパク質またはｇａｇ−ＨＡ−ＮＡタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを、ＭＯＩを＞１とする６ウェルプレート内のＳｆ９細胞に感染させた。感染の３日後、培地上清から破砕物を除去し、次いで、２０％のスクロースクッションを介する１００，０００×ｇでこれをペレット化させた。ｇａｇタンパク質特異的抗血清およびＨ１Ｎ１亜型特異的抗血清を用いるウェスタンブロット解析によりペレットを解析した（図１ＡおよびＢを参照されたい）。
【０１１４】
図１ＡおよびＢの各ブロットにおける左側の３つのレーンは、それぞれ、培地を収集する前の、Ｓｆ９細胞に、個別のｇａｇ遺伝子によるバキュロウイルスまたはＨＡ遺伝子によるバキュロウイルスまたは対照（ＥＶ＝空ベクター）のバキュロウイルスを感染させた結果を示す。予測される通り、ｇａｇ遺伝子だけによるバキュロウイルスを感染させると、ＶＬＰの出芽により、高分子量の培地画分中に著明量のｇａｇ抗原が結果としてもたらされる（図１Ａ；レーン「Ｇａｇ」）。これに対し、ＨＡ遺伝子だけによるバキュロウイルスを感染させると、それ自体で培地中に放出される少量のＨＡタンパク質が結果としてもたらされる（図１Ｂ；レーン「ＨＡ」）。しかし、ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ三重遺伝子ベクターをＳｆ９細胞に感染させると、ｇａｇタンパク質およびＨＡタンパク質の両方が著明量で１００，０００×ｇ画分中に結果として現れる（レーン１〜９；図１ＡおよびＢ）ことから、ｇａｇタンパク質の発現が、ＨＡタンパク質を細胞から引き出しうることが示される。
【０１１５】
図２ＡおよびＢは、ペレット化させたＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ  ＶＬＰを、２０〜６０％の段階的なスクロース勾配上で再遠心分離した後、個々の勾配画分に対してウェスタンブロット解析を行った結果を示す。ｇａｇタンパク質およびＨＡタンパク質の両方が、同じ画分中でピークに達することから、密度約１．１６ｇ／ｍｌにおけるバンド形成の符合が裏付けられ、これにより、ｇａｇタンパク質およびＨＡタンパク質がＶＬＰ中に存在したことが示唆される。
【０１１６】
（実施例２）
ＶＬＰの安定性についての生物物理的特徴づけ：ｐＨおよび温度
濃度は、モル濃度または容量当たりの重量百分率で報告する。６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン（ラウルダン）および８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中に溶解させることにより、１．２ｍＭのラウルダン原液および１０ｍＭのＡＮＳ溶液を調製した。
【０１１７】
特徴づけされるＶＬＰの調製
実施例１で示した通り、「三重遺伝子」による組換えバキュロウイルスを感染させた培養Ｓｆ９細胞内でＶＬＰを生成させた。４〜８の各単位ｐＨであるクエン酸／リン酸（ＣＰ）バッファーに透析することにより、特徴づけされるＶＬＰを調製した。ＮａＣｌを用いて、バッファーのイオン強度を０．１に維持した。透析カセット（１０，０００ＭＷＣＯ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から回収した材料を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ超遠心分離器（１０，０００ＭＷＣＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、４℃、３，１５０×ｇで濃縮した。残余物のタンパク質濃度は、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）比色法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により推定した。別段に言及しない限り、残余物を適切なｐＨの２０ｍＭ  ＣＰバッファーで希釈することにより、最終タンパク質濃度が９０μｇ／ｍＬの三連試料を調製した。
【０１１８】
表面赤血球凝集素タンパク質に対するトリプシン処理
トリプシン（Ｓｉｇｍａ；５μｇ／ｍＬの最終濃度）をＶＬＰ原液（ｐＨ７．４の３０％のスクロース／トリス緩衝生理食塩液中０．２６ｍｇ／ｍＬの全タンパク質）に添加し、２〜８℃の低温室で５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ダイズ（Ｆｌｕｋａ）に由来する、モル濃度を３倍としたトリプシン阻害剤を添加し、結果として得られる溶液に、０．４５μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を流過させた。次いで、上記で説明した通りに、試料を適切なＣＰバッファーに透析し、濃縮したが、１００，０００ＭＷＣＯの透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を用いた。ＨＡタンパク質の切断、ならびにＭＬＶ  ｇａｇタンパク質の非切断は、ウェスタンブロット解析により確認した。
【０１１９】
動的光散乱
動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、温度上昇の関数としての、ＶＬＰの平均有効直径の変化を測定した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｏｌｔｚｖｉｌｌｅ、ＮＹ）のシステムにより測定を行った。１２５ｍＷのダイオード励起レーザーにより、５３２ｎｍの入射光を生成させた。入射光に対して９０°で散乱光を集光し、デジタル式自己相関計（ＢＩ−９０００ＡＴ）を用いて、自己相関関数を創出した。１０〜８５℃の範囲にわたり、２．５℃おきに５回の測定を行った。キュムラント解析を用いて、相関関数から粒子の拡散係数を抽出し、ストークス−アインシュタインの式により、これらを粒子直径に変換した。この方法により計算される有効直径が正確なのは、直径が＜１μｍの粒子についてである（これより大きな粒子についての測定から得られる値は、定性的な比較だけに用いるべきである）ことに留意されたい。粒子サイズに加え、粒子拡散係数の分布についての第２キュムラントもまた、試料の多分散性の尺度としての相関関数から抽出した。
【０１２０】
実施例１のプロトコールを用いてなされた、ＶＬＰ懸濁液についてのＤＬＳ測定値は、ｐＨにより誘導される粒子サイズの変化および温度により誘導される粒子サイズの変化の両方についての証拠を示した（図３（Ａ））。低温では、ｐＨ４または５における粒子サイズが、ｐＨ６〜８における粒子サイズの２〜３倍であったことから、酸性のｐＨにより、著明な凝集および／または膨張が誘導されたことが示唆される。ｐＨ４における試料は、約７５℃まで、温度により誘導される粒子サイズの変化を示さないが、その後、有効直径の漸増が観察された。これに対し、ｐＨ５では、約５０℃で粒子サイズが急激に増大したが、約７５〜８０℃でもさらなる増大が生じた可能性がある。６〜８の各ｐＨの試料は、約５８℃までの温度上昇に対して安定であったが、それより高温では、ｐＨ６および７の試料が、粒子サイズの顕著な増大を示した。また、ｐＨ８の試料も、約６０℃でサイズ増大の証拠を示した。後者の場合におけるサイズの増大は、比較的小さく、ＶＬＰの凝集ではなく、ＶＬＰの膨張によった可能性がある。一般に、酸性度が増大するのに伴い、ＶＬＰの多分散性の増大が見られた（図３（Ｃ））。ｐＨ４および５の試料の多分散性が、温度範囲全体でほぼ一定を維持したのに対し、ｐＨ６以上の試料は、約６０℃で多分散性の増大を示し、サイズデータで見られる変化と符合する。
【０１２１】
ＤＬＳの測定時にはまた、散乱光の強度も記録した（図３（Ｂ））。測定器の設定を各試料に応じて最適化させるために、標準化値を報告することから、試料間における有意義な直接的比較は不可能となる。一般に、粒子サイズまたは粒子の屈折率（溶媒と比べた）が増大すると、散乱光の強度が結果として増大する。しかし、粒子密度の減少（例えば、膨張による）の結果として屈折率が低下するならば、それは、散乱強度の低下として顕在化するであろう。これが、散乱光強度の滑らかで漸進的な低下が温度勾配の大半にわたって見られる、ｐＨ８の試料についてのデータに対する最良の説明である。６０℃付近で曲線状の低下がわずかに乱れているが、これは、これらの試料について見られる有効直径の増大に対応する（図３（Ａ））。また、ｐＨ５の試料による散乱光のプロットも、散乱光強度の急激な低下により顕在化する、６０℃付近で生じる構造的変化の証拠を示す。ｐＨ６および７に対応するプロットは類似し、散乱光の低下が高温（約７５℃）で生じる。これらの低下は、沈降する材料が入射光ビームの外で沈殿するために生じる可能性があり、上記で示したサイズデータについての解釈と符合する。ｐＨ４の加熱曲線は、強度の漸減だけを示し、粒子直径の測定された変化と相関する急激な変化は示さなかった（例外は、３０〜３５℃における散乱強度の一過性の低下であるが、以下のラウルダン蛍光についての結果を参照されたい）。
【０１２２】
円偏光二色性分光光度法
円偏光二色性分光光度法（ＣＤ）の測定は、１００ｍｄｅｇの感度設定、２秒間の反応時間、および１ｎｍのバンド幅を用いる、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光光度計により行った。走査速度を２０ｎｍ／秒、データピッチを０．５ｎｍ／秒として、ＶＬＰの複合スペクトル（３つ〜５つのスペクトルの集積）を得た。２２７ｎｍにおけるＣＤシグナルをモニタリングする温度可変実験を実施して、全ＶＬＰタンパク質の二次構造の変化を、温度の関数として検出した。温度勾配を１５℃／時間、遅延時間を２秒間として、１０〜９０℃の範囲にわたり、０．５℃おきに測定を行った。Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）データ解析ソフトウェアを用いて、温度に依存するデータをシグモイド関数に数学的に近似することにより、中点転移温度（Ｔｍ）値を決定した。スペクトルおよび加熱曲線では、３つの異なるタンパク質のうちで最も量の多いタンパク質からの寄与が優越すると推測されるが、スペクトルおよび加熱曲線のいずれもが、これらのタンパク質からの相加的寄与を反映する。これらのＶＬＰでは、ＭＬＶ  ｇａｇタンパク質の量が、ＨＡタンパク質の量より３〜４倍多いことが示されたが、ＨＡタンパク質の量は、ＮＡタンパク質の量をおそらく１桁上回る。
【０１２３】
ｐＨ４〜８では、インフルエンザＶＬＰのＣＤスペクトルが、２１０ｎｍおよび２２７ｎｍ付近で極小点を示したことは、対象のｐＨ範囲にわたり著明な螺旋特徴が存在することを示唆する（図４（Ａ））。高温ではシグナルが見られなくなる（図４（Ｂ））ことから、二次構造が温度に依存して見られなくなることが示唆された。この効果をさらに探索するため、２２７ｎｍにおけるシグナルを、温度の関数としてモニタリングした（図５）。ＣＤシグナルの急激な変化が観察されたことは、温度に依存するタンパク質構造の転移と符合した。ｐＨ６の試料は、５５℃付近で最高のＴｍを示す。試料の酸性度を上昇させると、３８℃（ｐＨ４）および４７℃（ｐＨ５）という顕著に低いＴｍ値がもたらされるのに対し、ｐＨ７または８の試料は、Ｔｍ値が、それぞれ、５３℃および５１℃で酷似している。溶融曲線の形状は、複数の成分を示唆し、系の異種性を反映すると推測される。
【０１２４】
蛍光分光光度法
別段に言及しない限り、Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによる蛍光測定器（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＮＪ）を用いて、１０〜８５℃の範囲にわたり、２．５℃おきに蛍光発光スペクトルを収集した。１５℃／時間の勾配で温度を上昇させ、すべての測定について、１ｎｍのステップサイズおよび１秒間の積分時間を用いた。蛍光実験ではまた、第２の検出器（蛍光検出器から１８０°に配向させた）を用いることにより、静的光散乱もモニタリングした。Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）ソフトウェアパッケージを用いて、微分解析により発光ピークの位置を決定し、温度に依存するデータを、シグモイド関数に数学的に近似することにより、Ｔｍ値を決定した。
【０１２５】
芳香族アミノ酸であるトリプトファンおよびチロシンの内部蛍光を使用して、ＶＬＰタンパク質の三次構造の変化を、温度の関数として同定した。２８０ｎｍで励起させた蛍光発光スペクトルを、３００〜３８０ｎｍで収集した。励起および発光のスリット幅は、それぞれ、３ｎｍおよび４ｎｍに設定した。
【０１２６】
ＶＬＰ存在下における８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）の蛍光発光を、ＶＬＰタンパク質の三次構造の安定性をモニタリングする代替的な方法として使用した。タンパク質の非極性領域に対してアフィニティーを有することが公知の低分子であるＡＮＳは、溶液中で示す蛍光は弱いが、結合すると、発光強度を増大させ、発光をシフト（通常は青色に）させる（１１４）。７０μＭのＡＮＳと共に調製したＶＬＰ試料を３８５ｎｍで励起させた後で、その蛍光発光スペクトルを４２５〜５５０ｎｍで収集した。ＡＮＳ蛍光を測定するときの励起および発光のスリット幅はいずれも、４ｎｍに設定した。
【０１２７】
熱により誘導されるＶＬＰ膜の流動性の変化を直接的にモニタリングするには、別の分子プローブである６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン（ラウルダン）を用いた。ラウルダンの化学構造は、誘導体化されたナフタレンに結合した長いアシル鎖を含有し、これにより、脂質二重層への容易な組込みが可能となる。膜における水和の増大は、二重層の流動性を、ゲル（流動性が低い）から液晶（流動性が高い）に転移させる可能性がある。３４０ｎｍで励起させる場合、膜の水分含量が増大すると、ラウルダンの発光が約４４０ｎｍから４９０ｎｍ付近にシフトする。有用なパラメータは、（１１５）において、ＧＰ＝（Ｉ４４０−Ｉ４８０）／（Ｉ４４０＋Ｉ４８０）［式中、Ｉｘ＝波長ｘにおける強度］として定義されている、一般化偏光（ＧＰ）である。これにより、ＧＰ値が低下すると、膜における流動性の増大が示唆され、この逆も成り立つ。ラウルダンによる実験のスリット幅は、２ｎｍ（励起時）および５ｎｍ（発光時）に設定した。
【０１２８】
１．内部蛍光
すべての試料について、内部蛍光発光のピーク位置を、温度の関数として決定した（図６）。各場合において、約１０〜４０℃の温度範囲にわたり、ピーク位置がやや短波長となった後に、長波長への急激な遷移が生じた。タンパク質試料では、蛍光性アミノ酸側鎖を極性の大きな環境に曝露すると、ピーク極大点が熱に誘導されて赤方にシフトすることが観察された。これは、通常は少なくとも部分的に非極性のタンパク質コア内に包埋されているアミノ酸のフルオロフォアが水性溶媒に曝露される、アンフォールディングイベントと符合した。５５〜６５℃の温度では（ｐＨに依存して）ピーク極大点が短波長に戻るが、これは、高温で観察されるＶＬＰの凝集と符合する。３３０ｎｍにおける（標準化された）発光強度も、温度の関数としてプロットした（図６）。構造転移の非存在下では、このようなプロットが、内部の温度効果に起因する温度の上昇と共に、発光強度の滑らかで曲線状の低下を呈示することが典型的である。４５〜６５℃の範囲にあるすべての試料について、曲線状のプロファイルからの逸脱が生じることから、加熱すると内部フルオロフォア環境が変化することが確認された。
【０１２９】
２．ＡＮＳ蛍光
ＶＬＰの存在下におけるピーク位置（≧４７０ｎｍ）およびＡＮＳ蛍光発光強度の増大から、低温では、これらの高分子複合体の非極性領域にＡＮＳが結合したことが示唆されるが、これは、脂質二重層の存在を踏まえれば予測されることであった。ＡＮＳ発光のピーク位置を温度の関数としてプロットする（図７）と、すべての試料において、温度に依存する短波長へのシフトの後、場合によっては（すなわち、ｐＨ５、６、および７では）長波長へのシフトが生じることが示される。すべての試料において、ピーク位置の変化の度合い（２〜３ｎｍ）は、内部蛍光により観察される変化の度合いよりはるかに小さい。高温では、ピーク位置のばらつきおよびノイズが大きくなるために、これらのデータから実質的な結論を引き出すことは困難となる。４８５ｎｍにおけるＡＮＳの相対強度（図７）は、温度により誘導されて非極性モチーフが曝露されることについてのより明確な証拠を顕示した。これは特に、予測される、蛍光に対する熱による非特異的な消光作用に対応する、発光の曲線状の低下の上に重ね合わせて、発光強度のわずかな増大（ｐＨ５では３８℃付近で始まり、ｐＨ６〜８では４３℃付近で始まる）が見られる、ｐＨ５〜８の試料についてのプロットに当てはまった。
【０１３０】
３．ラウルダン蛍光
一般化偏光（ＧＰ）を温度の関数としてプロットする（図８）ことにより、加熱すると、ＶＬＰの膜における水和（流動性）が漸増することが示唆される。ＶＬＰ懸濁液のｐＨが、膜における水和の速度および程度に対して影響を及ぼしたことは、驚くべきことではない。低温では、すべての試料について、膜における水和の程度（すなわち、ＧＰ値）が酷似した。４０℃を超えると、ｐＨ４の試料が示す膜における水和の変化が一貫してわずかであり、一般に、低いｐＨで調製された試料は、温度を上昇させても二重層内に水分子を取り込むのが遅かった（酸性度の高い試料では、ＧＰ＝０となる温度が上昇した）。ｐＨ４、７、または８で調製した試料のＧＰ値が、温度と共にシグモイド様に変化したのに対し、ｐＨ５および６の試料は、検討した温度範囲にわたり、ＧＰの準直線的な低下を示した。ｐＨ５および６の試料では、膜における水和の程度が高温（すなわち、７５℃を超える）で最大となった。また、ラウルダン蛍光による実験でも、３４０ｎｍにおける静的光散乱をモニタリングした。これらのデータは、ＤＬＳ実験で測定された静的光散乱と同様であったが、このさらなる実験では、ｐＨ４の試料について観察された散乱光強度の一過性の低下（図３（Ｂ）、３０〜３５℃）が観察されなかったことから、これはアーチファクトであった可能性が示唆される。
【０１３１】
実験相図
ＶＬＰの物理的な安定性についての包括的な視覚的表示を創出するために、上記で論じた各種の生物物理的方法に由来するデータを、多次元ベクトル空間の基底系に変換した。測定を行った温度およびｐＨ（１０〜８５℃にわたる２．５℃おきの温度、４〜８の単位ｐＨ値）のすべての組合せについてｎ次元ベクトルを構築し、各ベクトルの成分を、適用したｎ種類の技法の各々による標準化された測定値とした。次いで、基底系におけるすべてのベクトルの射影演算子を足し合わせて、ｎ個の固有ベクトルを伴うｎ×ｎ密度行列を得た。次いで、データセットに対して最大の寄与（すなわち、最大の固有値）をもたらす３つの固有ベクトルを用いて、元のｎ次元ベクトル系を三次元に変換した。最後に、新たな三次元ベクトル各々の３つの成分に、３つの異なる色（赤色、緑色、青色）を割り当て、各個別のベクターに固有の色の組合せを得た。次いで、この方法により、ｎ種類の測定を行った温度およびｐＨのすべての組合せに着色マーカーを割り当てることが可能となり、全データセットを温度およびｐＨの関数とする三色マップが得られた。このような相図の有用性は、各技法により検出される粒子構造の最も際立った変化を、ＶＬＰ構造の見かけの「相」の差違と同時に視覚化しうることである。ＥＰＤの作成についてのより詳細な説明は、他所（１１６、１１７）において示されている。
【０１３２】
前出の節において示した、温度に依存するデータから、実験相図（図９）を作成した。実験空間にわたり、約１０の異なる相を見ることができ、最大の相（ｐＨ６〜８、低温、青色）は、ＶＬＰの構造的破壊が最小となる状態に対応する。この相の上方に、ｐＨ６〜７では３５〜５５℃にわたり、かつ、ｐＨ８では３５〜５０℃にわたり転移領域が現れた（紫色）。ｐＨ６および７では６０℃を超える色の変化する領域は、粒子の凝集に対応した。ｐＨ８では、著明な凝集がみられないことから、高温で、ｐＨ６または７で見られた相とは異なる相（暗赤色）がもたらされた。ｐＨ４および５では、低温で２つの異なる相が見られ、いずれも著明な構造の破壊を表わした（明青色）。ｐＨが低い領域の３５℃超では、温度に誘導されるさらなる立体構造変化により、複数の相がもたらされた（緑色／橙色）。ｐＨ５とｐＨ６との間、および４０℃超における見かけの相境界は、安定性が中程度である状態を表し、したがって、以下の実施例３の賦形剤スクリーニングアッセイを開発するための出発点を示す。
【０１３３】
結論
ＶＬＰの生物物理的特徴づけを組み合わせた結果に基づくと、凝集および溶解性に対する変化が、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの分解における重要な因子となる。ＶＬＰは、ｐＨ７〜ｐＨ８において最も安定的であった。安定性の理由および化学的な理由で、好ましい範囲は、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５である。この範囲で用いうる代表的なバッファーは、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、およびクエン酸バッファーである。
【０１３４】
（実施例３）
ＶＬＰ賦形剤のスクリーニング
別段に言及しない限り、すべての潜在的な安定化剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。グアニジンＨＣｌ、塩化カルシウム二水和物、デキストロース、Ｄ−マンニトール、クエン酸、および二塩基性リン酸ナトリウムは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。Ａ型ブタゼラチンは、Ｄｙｎａｇｅｌ（Ｃａｌｕｍｅｔ  Ｃｉｔｙ、ＩＬ）から購入し、Ｄ−スクロースおよびＤ−トレハロースは、Ｆｅｒｒｏ−Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｕｋｅｇａｎ、ＩＬ）から購入した。エクトイン（超純粋）は、Ｂｉｔｏｐ  ＡＧ（Ｗｉｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＮＶ１０は、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ（旧Ｎｏｖｅｘｉｎ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。適切なｐＨの２０ｍＭクエン酸／リン酸（ＣＰ）バッファーに溶解させることにより、濃縮賦形剤溶液を調製した。次いで、濃縮したＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、ｐＨを、標的ｐＨに調整した（必要な場合）。０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）（ＰＶＤＦ）膜によるシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、最終原液を濾過した。
【０１３５】
賦形剤のスクリーニング
濁度（３５０ｎｍにおける光学濃度；ＯＤ３５０）を時間の関数として測定することにより、ｐＨ６および６０℃におけるＶＬＰの凝集をモニタリングした。各種のＧＲＡＳ（一般に安全と認識される）薬剤の存在下または非存在下において、濃縮した残余物（上記を参照されたい）を、２０ｍＭのＣＰバッファーおよび／または適切なｐＨの濃縮賦形剤溶液で希釈することにより、５５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、二連のＶＬＰ試料を調製した。温度制御型Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３分光光度計（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて、２時間にわたり、３０秒間ごとに測定を行った。
【０１３６】
溶液中のＶＬＰに対する潜在的な安定化剤について、ＧＲＡＳ化合物のライブラリーをスクリーニングした。実施例２の特徴づけ研究から作成した実験相図（図９）を使用して、ＶＬＰの凝集（最も明らかな物理的分解過程）を防止する賦形剤を同定するためのスクリーニングアッセイを開発した。スクリーニングアッセイの温度およびｐＨについての初期条件の選択は、該相図（前出の実施例を参照されたい）を指針としたが、最終条件は、潜在的な安定化剤間のわずかな差違を増大させるように最適化した。対照試料の挙動に応じて、ｔ＝１５分またはｔ＝３０分（凝集が最大となる時点を表わすいずれかの時点）において、凝集の阻止百分率（表１）を計算した。洗浄剤、ポリオール、アミノ酸、糖、および糖アルコールを含めた各種の分子クラスにおいて、最も有望な凝集阻止化合物が見出された。
【０１３７】
個々の安定化剤の効果
複数の分子クラス（すなわち、トレハロース、グリセロール、ソルビトール、リシン、およびジエタノールアミン（脂質二重層を破壊する洗浄剤の傾向を踏まえれば、凝集阻止剤としてのＴｗｅｅｎ  ２０およびＢｒｉｊ  ３５の見かけの成功は、アーチファクトでありうる））に由来する、効能が最上位にある凝集阻止剤を用いて、潜在的な賦形剤の存在下におけるＶＬＰのＣＤおよび蛍光の測定を実施した。実際のワクチン製剤をより緊密に近似するために、これらの実験では、溶液のｐＨを７に設定した。
【０１３８】
上記で説明した通り、温度可変ＣＤの測定を使用して、選択された化合物のうちのいずれかが、ＶＬＰタンパク質（例示しない）の二次構造を安定化させるかどうかを決定した。調べたすべての化合物のうちで、ソルビトールだけが正の効果を示した；ソルビトールを含有する試料のＴｍ（５５℃）は、対照のＴｍ（５４℃）と比べてわずかに高かったが、他の賦形剤は、５０℃（トレハロース）〜５３℃（リシン）の範囲のＴｍ値を示した。
【０１３９】
内部蛍光法を使用して、ＶＬＰタンパク質の三次構造に対する潜在的安定化剤の効果を測定した。発光のピーク位置を温度と対比させてプロットする（図１０）と、調べた製剤の大半について、４０℃またはその付近で始まる、約３２９ｎｍから３３６ｎｍへの遷移が示される。例外は、リシンを含有する製剤であり、これは、低温では３４４ｎｍ付近でその蛍光ピークを呈示し、４３℃で始まる、わずかな長波長への可能な遷移（＋１〜２ｎｍ）の証拠を示す（これらの測定値における誤差により、このシフトが統計学的に有意であるという結論は退けられる）。対照のＴｍは、５１℃である。ジエタノールアミンは、４９℃のＴｍを誘導するので有効な安定化剤ではないのに対し、グリセロール、トレハロース、およびソルビトールを含有する製剤はすべて、それぞれ、５２、５３、および５４℃の、やや高温のＴｍ値を示す。これらの実験において収集された静的光散乱（データは示さない）は、リシンを含有する製剤を除くすべての製剤間で同様の挙動を示唆した。リシンの存在下では、光散乱の強度が１０分の１未満に低下したことから、ＶＬＰの構造破壊が示唆される。複数の化合物によるＶＬＰ膜の流動性に対する効果を、上昇させる温度の関数として測定するには、ラウルダン蛍光を用いた。これらの実験では、物理的安定性に対する正の効果が弱いかまたは正の効果が見られない賦形剤（すなわち、ジエタノールアミン、グリセロール、およびリシン）を、グリシン、エクトイン、およびＮＶ１０で置き換えた。グリシンは、インフルエンザＨＡタンパク質および／またはインフルエンザＮＡタンパク質を安定化させうるという私信により導入した。エクトイン（有機浸透圧調節物質）およびＮＶ１０（５ｋＤａの直鎖状炭水化物ポリマー）は、それらが、高分子系を安定化させるのに一般に有効であるという報告（１１８）に基づき、潜在的な新規のＶＬＰ膜安定化剤として調べた。温度に依存するＧＰデータ（図１１）を目視すると、調べた化合物のうちの１つまたは２つが、ゲルから液晶への転移を阻止すると考えられる。ここでもまた、データを近似するためにはシグモイド近似を用い、Ｔｍ値を抽出して、各安定化剤の効果を定量的に比較した。対照試料（Ｔｍ＝５２℃）と比較すると、ソルビトールまたはエクトインを含有する製剤は、５４℃のやや高いＴｍ値を示す。しかし、これらの測定に随伴する誤差の大きさを踏まえるなら、Ｔｍの見かけの上昇は、いずれの場合にもおそらく有意ではない。他方、グリシンおよびトレハロースは、それぞれ、Ｔｍ値が５９℃および６０℃と高く、著明な安定化効果を及ぼしている。ＮＶ１０は、２０℃を超える温度でＧＰ値の低下（膜における水和の増大）を誘導（対照と比べて）して、ＶＬＰエンベロープの安定性に対して負の効果を及ぼしている。ＮＶ１０製剤について計算されたＴｍは、４６℃である。
【０１４０】
結論
代表的な単糖（デキストロース、マンニトール、ソルビトール）および二糖（ラクトース、トレハロース、スクロース）を含めた、複数の炭水化物について調べた。デキストロースを除くすべての場合において、１０％溶液では凝集が増大した。しかし、すべての場合において、２０％溶液は、ＶＬＰ溶液の凝集を阻止するのに有効であった（トレハロースが最も有効で、８４％の阻止を示し、ソルビトールおよびラクトースがわずかの差でこれに続いた）。これに対し、オリゴ糖（シクロデキストランなど）は一般に、凝集を低減するのに有効ではなかった。グリセロール（ポリアルコールは、炭水化物と構造的な類似性を共有する）もまた、凝集を低減する（１０％で８２％の阻止）のに有効であった。
【０１４１】
４つの非イオン性界面活性剤を、０．０１〜０．１０パーセントの範囲の濃度で評価した。調べた４つの洗浄剤すべて（Ｂｒｉｊ  ３５、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）が、凝集を阻止するのに有効であった。調べたすべての洗浄剤が凝集の阻止を示したが、Ｔｗｅｅｎ  ２０が、他の洗浄剤に優ると考えられる。
【０１４２】
調べた一般に用いられる２つのタンパク質であるアルブミンおよびゼラチンは、凝集を阻止するのには有効でなかったが、この結果は、ＶＬＰではなく、アルブミンに関する問題に起因した可能性がある。
【０１４３】
また、代表的なアミノ酸についても調べた。３００ｍＭのジエタノールアミン、アルギニン、およびリシンは、凝集を７０％阻止した。グアニジン（３０％）、ヒスチジン（３０％）、およびグリシン（１２％）は、それほど有効でなく、アスパラギン酸は、凝集を加速化させた。しかし、凝集の阻止または加速化が、有機化合物により直接的に引き起こされたのか、またはｐＨの変化を介して間接的に引き起こされたのかは明確でない。リシンのさらなる特徴づけは、リシンを用いる結果として、ＶＬＰ構造が破壊されることを明らかにし、したがって、濁度の低下はアーチファクトと考えられ、凝集を阻止する証拠ではないと考えられる。
【０１４４】
また、代表的な有機酸についても調べた。アスコルビン酸（１５０ｍＭ）が凝集を大幅に増大させたのに対し、同様の濃度の乳酸およびリンゴ酸は、わずかながら凝集を阻止した。ここでもまた、これらの観察が、ｐＨの変化の結果であるのか、または有機酸がＶＬＰと直接的に相互作用した結果であるのかは明確でない。
【０１４５】
調べた複数の炭水化物は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを安定化させるのに有望である。炭水化物の濃度は重要であり、２０％溶液では保護がもたらされるが、１０％溶液または１５％溶液では保護がもたらされない。しかし、これに対して、１０％のグリセロールは、凝集を阻止するのに有効であった。以上に基づくなら、当業者は、安定化量のこれらの安定化剤を容易に選択することができる。
【０１４６】
最後に、トレハロースおよびソルビトールについての生物物理的研究により、炭水化物が、ウイルス性タンパク質の三次構造を安定化させることが示され、トレハロースはまた、温度により誘導される脂質二重層の水和を遅延させることも示された。
【０１４７】
したがって、この炭水化物は、高温で凝集を低減し、タンパク質の三次構造を安定化させ、膜における水和を最小化することが示されたので、ＶＬＰを安定化させるのに最も有望な候補物質は、２０％のトレハロースであった。構造が類似し、凝集の阻止が濃度に依存するため、他の炭水化物も、同様の保護特性をもたらすと推測される。
【０１４８】
さらなる参考文献
【０１４９】
【数１】
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【０１５０】
【数２】
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【０１５１】
【数３】
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【０１５２】
【数４】
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【０１５３】
【数５】
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【０１５４】
【数６】
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【０１５５】
【数７】
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【０１５６】
【数８】
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【０１５７】
【数９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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