(57)【要約】組換えによって産生されたポリペプチドから高分子量化合物を除去するために、一般的にクロマトグラフィー法が用いられる。非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（uCPG）は、溶液中に存在する高分子量化合物に選択的に結合することが見いだされている。精製ポリペプチドを、たとえば、クロマトグラフィー材料としてuCPGを含有するクロマトグラフィーカラムのフロースルーから回収することができる。この効果は、緩衝溶液において約4から6のpH値で顕著であることが見いだされている。ポリペプチド1gあたりおよそ100 m2から150 m2のuCPG表面によって、高分子量化合物のほぼ80％から95％が除去され、ポリペプチドの収率は80％から90％である。2013523865.tif 000003
2013523865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含むことを特徴とする、単量体型または凝集型のポリペプチドを得る方法：
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（controlled pore glass）と共にインキュベートする段階、および
b）上清を回収し、それによって単量体型のポリペプチドを得る段階、
または、
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階、
b）溶液からコントロールド・ポア・ガラスを回収する段階、
c）回収されたコントロールド・ポア・ガラスをpH 2からpH 3、またはpH 7からpH 8のpH値の第二の溶液と共にインキュベートし、それによって凝集型のポリペプチドを得る段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、ポリペプチドを産生する方法：
a）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階；
b）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階；
c）回収したポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；および
d）上清を回収し、それによってポリペプチドを産生する段階。
【請求項３】
非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスが非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチド1グラムあたり100 m2から150 m2の表面を有する非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
溶液が各々のpH値の緩衝溶液であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
最後の段階として、
-  1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によってポリペプチドを精製する段階、
を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
回収する段階が、遠心分離または濾過によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
インキュベートする段階が、1分から6時間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
pH 4からpH 6のpH値で高分子量のポリペプチドを吸着させるための非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの使用。
【請求項１１】
a）非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズ；
b）pH 4からpH 6のpH値の緩衝溶液；
c）pH 2からpH 3のpH値の緩衝溶液；
d）pH 7からpH 8のpH値の緩衝溶液
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（controlled pore glass）に選択的に吸着させることにより、単量体の免疫グロブリンから二量体およびオリゴマーの免疫グロブリンを分離する方法を報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質および特に免疫グロブリンは、今日の医学のポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。薬学的応用において用いるためのポリペプチドは主に、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（登録商標）細胞等などの哺乳動物細胞において産生される。
【０００３】
分子量、および二次的修飾を含むドメインの構築などのその物理化学的特性により、免疫グロブリンの後処理プロセスは非常に複雑である。たとえば、調合された薬剤のみならず、後処理プロセス（DSP）における中間体についても、経済的な取扱いおよび貯蔵用途のために低容量を達成するために、濃縮溶液が必要である。生物工学によって産生された免疫グロブリンの後処理プロセスは一般的に、次の3つのクロマトグラフィー段階を含む：非免疫グロブリン分子を除去するための、たとえばプロテインAを用いる第一のアフィニティクロマトグラフィー段階、通常この後の、2つのイオン交換クロマトグラフィー段階。最後の段階は、DNAおよびHCP混入物を除去するためのいわゆる仕上げ段階である。精製免疫グロブリンは低濃度溶液で得られ、抗体を薬学的製剤に調合する前に濃縮段階を必要とする。後処理プロセスの際に必要な非天然条件により、通常は単量体である免疫グロブリンは、二量体、オリゴマー、および高次凝集体を形成する傾向がある。これらの凝集体は、単量体の免疫グロブリンの意図される抗原結合活性を保持せず、除去する必要がある。
【０００４】
Ghose, S., et al.（Biotechnol. Bioeng. 87 (2004) 413-423）（非特許文献1）は、非誘導体化シリカ上での分取的タンパク質精製を報告している。Reifsnyder, D.H., et al. (J. Chrom. A 753 (1996) 73-80)（非特許文献2）は、粗発酵ブロスからIGF-Iを捕捉して、エタノールおよびNaClの混合物を用いて特異的に溶出したことを報告している。Lifsics, M.R. and Williams, R.C.Jr（Biochem 23 (1984) 2866-2875）（非特許文献3）は、ウシニューロフィラメントからタンパク質の単量体型および凝集型を分離するための、コントロールド・ポア・ガラス上の8 M尿素中での分子ふるいクロマトグラフィーを報告している。Ghose, S., et al.（論文の抄録、224th ACS National Meeting, Boston, MA, United States, August 18-22, 2002 (2002), BIOT-317 Publisher: American Chemical Society, Washington, D. C.）（非特許文献4）は、タンパク質のプロセス精製のための分取的静止相として、誘導体化されていない裸のシリカゲルを用いることを報告している。
【０００５】
US 4,606,825（特許文献1）において、非架橋共有結合ポリエチレンイミン官能基を担持するコントロールド・ポア・ガラスを用いて、免疫グロブリンGを分離および回収する方法が報告されている。イオン交換クロマトグラフィー樹脂および勾配溶出を用いて、二量体および／または多量体を含む混合物からポリペプチド単量体を分離する方法は、US 2002/0010319（特許文献2）に報告されている。Mizutani, T. and Mizutani, A., J. Chrom. 168 (1979) 143-150（非特許文献5）は、コントロールド・ポア・ガラスおよびカルボキシメチルセルロース上でクロマトグラフされたタンパク質の溶出パターンの比較を報告している。カルボキシメチル化コントロールド・ポア・ガラスによるクロマトグラフィーを用いた酵素ミエロペルオキシダーゼの単離および精製は、DE 39 07 162 A1（特許文献3）に報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US 4,606,825
【特許文献２】US 2002/0010319
【特許文献３】DE 39 07 162 A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ghose, S., et al.（Biotechnol. Bioeng. 87 (2004) 413-423）
【非特許文献２】Reifsnyder, D.H., et al. (J. Chrom. A 753 (1996) 73-80)
【非特許文献３】Lifsics, M.R. and Williams, R.C.Jr（Biochem 23 (1984) 2866-2875）
【非特許文献４】Ghose, S., et al.（論文の抄録、224th ACS National Meeting, Boston, MA, United States, August 18-22, 2002 (2002), BIOT-317 Publisher: American Chemical Society, Washington, D. C.
【非特許文献５】Mizutani, T. and Mizutani, A., J. Chrom. 168 (1979) 143-150
【発明の概要】
【０００８】
非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（uCPG）表面は、pH 5からpH 7.5のpH値で溶液中に存在する二量体型およびオリゴマー型、すなわち凝集型のクラスG免疫グロブリン（IgG）に選択的に結合することが見いだされた。総IgG 1グラムあたり50 m2から150 m2のuCPG表面を適用することによって、可溶性凝集体の95％までが粒子に結合する（SE-HPLCによって決定した場合）。同時に、表面に吸着するのは、単量体の約10％から20％に過ぎない。このことは、単に、単量体および凝集体を含む溶液にuCPGをバッチ毎に添加する段階、およびその後の、凝集体が結合したuCPGを遠心分離または濾過によって除去する段階によって達成することができる。タンパク質をuCPGと共に6日間インキュベートしても、凝集体の形成は起こらなかった。しかも、uCPGと共にインキュベートした後でも、タンパク質の二次または三次構造に対する検出可能な変化は観察できなかった。
【０００９】
このように、本明細書において報告される局面は、以下の段階を含む、単量体型または凝集型のポリペプチドを得る方法である：
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を提供する段階；
b）溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階、および
c）インキュベートした溶液からポリペプチドを回収し、それによって単量体型のポリペプチドを得る段階、
または、
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を提供する段階；
b）溶液を、pH 4からpH 6のpH値で、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；
c）溶液からコントロールド・ポア・ガラスを除去する段階；
d）除去したコントロールド・ポア・ガラスをpH 2からpH 3またはpH 7からpH 8のpH値の溶液と共にインキュベートし、それによって凝集型のポリペプチドを得る段階。
【００１０】
本明細書において報告される別の局面は、以下の段階を含む、ポリペプチドを産生する方法である：
a）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を提供する段階；
b）ポリペプチドを発現させるために細胞を培養する段階；
c）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階；
d）pH 4からpH 6のpH値で、回収されたポリペプチドを含む溶液を非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階、および
e）インキュベートした溶液からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを産生する段階。
【００１１】
1つの態様において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスは、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズである。さらなる態様において、ポリペプチド1グラムあたり100 m2から150 m2の表面を有する非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスが用いられる。別の態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートである。同様に1つの態様において、pH値は、それぞれのpH値の緩衝溶液によって調節される。さらなる態様において、方法は、バッチ法である。同様に1つの態様において、溶液は、個別の量のポリペプチドを含み、溶液は個別の量の非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートされる。同様に1つの態様において、溶液は緩衝溶液である。1つの態様において、回収する段階は、遠心分離または濾過によって行われる。さらなる態様において、インキュベートする段階は、1分から6時間である。
【００１２】
1つの態様において、方法は全て、最後の段階として、
-  1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によってポリペプチドを精製する段階、
を含みうる。
【００１３】
同様に本明細書において報告される局面は、pH 4からpH 6のpH値で高分子量ポリペプチドを吸着させるために非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることである。
【００１４】
本明細書において報告されるさらなる局面は、
a）非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズ；
b）pH 4からpH 6のpH値の緩衝溶液；
c）pH 2からpH 3のpH値の緩衝溶液；
d）pH 7からpH 8のpH値の緩衝溶液
を含むパーツのキットである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
概して、凝集免疫グロブリンのみならず他の高分子量化合物から単量体の免疫グロブリンを分離する場合、一般的にクロマトグラフィー法が使用される。現在、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（uCPG）が、たとえば非誘導体化Sepharose（商標）と比較して、溶液中に存在する二量体およびオリゴマーの免疫グロブリンならびに高分子量化合物に選択的に結合することが見いだされている。単量体の免疫グロブリンは、たとえばクロマトグラフィー材料としてuCPGを含有するクロマトグラフィーカラムのフロースルーから、または溶液をuCPGと共にインキュベートした上清から回収することができる。この効果は、緩衝溶液中の約5.0のpH値で顕著である。免疫グロブリン1 gあたりおよそ50 m2から150 m2のuCPG表面により、凝集体の95％までを回収することができ、単量体の免疫グロブリンの収量は80％から90％である。
【００１６】
uCPGの適用を用いて、貯蔵前、または貯蔵後でさえも、活性な薬学成分バルクまたは最終調合材料から二量体およびオリゴマーを除去することができる。
【００１７】
「ポリペプチド」は、天然または合成で産生されるか否かによらず、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマーである。アミノ酸残基約20個未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれる。「タンパク質」は、1つもしくは複数のポリペプチド鎖または100個より多くのアミノ酸残基の少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む高分子である。ポリペプチドはまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含みうる。炭水化物基および他の非ペプチド置換基を、ポリペプチドが産生される細胞によってポリペプチドに付加してもよく、置換基は細胞のタイプによって変化するであろう。ポリペプチドは、そのアミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義される；炭水化物基などの置換基は一般的に明記されないが、それにもかかわらず存在しうる。
【００１８】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。認められている免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子のみならず免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、たとえばFv、Fab、およびF(ab)2ならびに一本鎖（scFv）、またはダイアボディを含む多様な形状で存在しうる。
【００１９】
「完全な免疫グロブリン」という用語は、2つの軽鎖免疫グロブリンポリペプチド（軽鎖）と2つの重鎖免疫グロブリンポリペプチド（重鎖）とを含む免疫グロブリンを意味する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの各々は、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域、一般的にアミノ末端部分）を含有する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの各々は、定常領域（一般的にカルボキシル末端部分）を含む。免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変ドメインは、順に異なるセグメント、すなわち、4つのフレームワーク領域（FR）および3つの超可変領域（CDR）を含む。
【００２０】
「免疫グロブリン断片」という用語は、重鎖の可変ドメイン（VH）、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、もしくはCH4ドメイン、または軽鎖の可変ドメイン（VL）もしくはCLドメインから選択される少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。同様に、その誘導体および変種が含まれる。たとえば、1つまたは複数のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在しうる。
【００２１】
「免疫グロブリンコンジュゲート」という用語は、さらなるポリペプチドとのペプチド結合を介して結合された免疫グロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、ホルモン、または毒素、または増殖因子受容体、または抗融合ペプチド、または補体因子等などの非免疫グロブリンペプチドでありうる。
【００２２】
組換えによって産生された免疫グロブリンを精製するために、異なるカラムクロマトグラフィー段階の組み合わせを用いることができる。一般的に、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーの後に、1つまたは2つの追加の分離段階を行う。最終精製段階は、凝集免疫グロブリン、残留HCP（宿主細胞タンパク質）、DNA（宿主細胞核酸）、ウイルス、または内毒素などの、微量の不純物および混入物を除去するためのいわゆる「仕上げ段階」である。この仕上げ段階に関して、フロースルーモードの陰イオン交換材料を用いることができる。
【００２３】
タンパク質を回収および精製するために、微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィー（たとえば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合モード交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（たとえば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（たとえば、フェニル-Sepharose、アザ-アレノフィリック（arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（たとえば、Ni(II)およびCu(II)アフィニティ材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの）などの異なる方法を用いることができる。
【００２４】
互換的に用いることができる「単量体型免疫グロブリン」および「単量体の免疫グロブリン」という用語、ならびにその文法的同等物は、第二の免疫グロブリン分子に結合していない、すなわち別の免疫グロブリン分子に共有的にまたは非共有的に結合していない免疫グロブリン分子を意味する。互換的に用いることができる「凝集型免疫グロブリン」および「凝集免疫グロブリン」という用語、ならびに「二量体の免疫グロブリン」および「多量体の免疫グロブリン」という用語ならびにその全ての文法的同等物は、少なくとも1つの追加の免疫グロブリン分子に共有的または非共有的に結合して、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから1つのピークとして溶出される免疫グロブリン分子を意味する。本出願において用いられる「単量体型」という用語およびその文法的同等物は、免疫グロブリン分子の100％が単量体型で存在することを必ずしも意味するわけではない。この用語は、サイズ排除クロマトグラムのピーク面積として決定した場合に、免疫グロブリンが本質的に単量体型であること、すなわち免疫グロブリンの少なくとも90％が単量体型であること、ある態様においては、免疫グロブリンの少なくとも95％が単量体型であること、別の態様においては、免疫グロブリンの少なくとも98％が単量体型であること、さらなる態様においては、免疫グロブリンの少なくとも99％が単量体型であること、および最後の態様においては、免疫グロブリンの99％より多くが単量体型であることを意味する。「単量体型および凝集型」という用語は、他の免疫グロブリンに結合していない免疫グロブリン分子と、他の免疫グロブリン分子に結合している免疫グロブリン分子との混合物を意味する。この混合物において、単量体型も凝集型も、排他的に存在するわけではない。「高分子量（HMW）型」という用語は、ポリマーの、すなわち凝集した免疫グロブリンを意味し、この場合、該凝集体は水性緩衝溶液中でなおも可溶性である。
【００２５】
本出願において用いられる「100％」という用語は、明記された成分以外の成分の量が、明記された条件下で言及された分析法の検出限界未満であることを意味する。
【００２６】
本出願において用いられる「90％」、「95％」、「98％」、「99％」という用語は、正確な値ではないが、明記された条件下で言及された分析法の精度内である値を意味する。
【００２７】
クロマトグラフィー材料は、コア材料およびそれに付着したクロマトグラフィー官能基を含む。コア材料は、シリカ、ゼオライト、ヒドロキシアパタイト、もしくはガラスなどの無機材料、セルロースもしくはアガロースなどの有機材料、またはポリ(メタクリレート)などの合成ポリマー材料でありうる。
【００２８】
本明細書において報告される方法において用いられる溶液は、1つの態様において緩衝溶液である。「緩衝溶液」という用語は、酸またはアルカリ物質の添加または放出によるpHの変化が、溶存する緩衝物質によって平均される溶液を意味する。そのような特性を有する任意の緩衝物質を用いることができる。一般的に、薬学的に許容される緩衝物質が用いられる。1つの態様において、緩衝溶液は、リン酸および／またはその塩からなるリン酸緩衝溶液、または酢酸および／またはその塩からなる酢酸緩衝溶液、またはクエン酸および／またはその塩からなるクエン酸緩衝溶液、またはモルフォリン緩衝溶液、または2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝溶液、またはヒスチジン緩衝溶液、またはグリシン緩衝溶液、またはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）緩衝溶液から選択される。別の態様において、緩衝溶液は、リン酸緩衝溶液、または酢酸緩衝溶液、またはクエン酸緩衝溶液、またはヒスチジン緩衝溶液から選択される。任意で、緩衝溶液は、たとえば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、またはクエン酸カリウムなどの追加の塩を含みうる。
【００２９】
非誘導体化クロマトグラフィーコア材料、特に非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いて、ポリペプチド、特に凝集型免疫グロブリン、すなわち二量体およびオリゴマーの免疫グロブリン分子を選択的に吸着させることができる。
【００３０】
一般的に、CPGビーズは、約125μmの平均粒子径を有する。本明細書において用いられるCPGビーズの特異的表面積は36 m2/gであると決定された。
【００３１】
図1Aにおいて、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス、架橋アガロース（Sepharose（商標））、およびポリ(メタクリレート)の吸着特性を示す。ポリペプチドは、一方で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスに結合することができることが認められ、他方で、結合能の、強いpH依存性を認めることができる。図1Bに認められうるように、ProSep vAウルトラ培地は、pH 7.5でIgGの最高の吸着を示す。ProSep vAウルトラ培地は、プロテインAアフィニティリガンドがガラス表面に結合している官能化CPG材料である。pH 5.0では、CPGに対するIgGの吸着は、官能化プロテインAゲルより高いことが観察された。
【００３２】
pH 3.0、5.0、および7.5の異なるpH値でIgGをuCPGと共にインキュベートした後、上清をSE-HPLCによって分析した。pH5.0および7.5での非誘導体化CPGビーズとのインキュベーション後、溶液から可溶性凝集体がほぼ完全に除去されたことが観察された（図2）。
【００３３】
図6は、pH 5.0のpH値で12時間のインキュベーション後にuCPGに吸着したIgGの量対上清中のタンパク質濃度を示す。比較的低いタンパク質濃度で飽和に達することができ、2.0 mg IgG/m2 CPGで最大吸着に達することができる。タンパク質をロードしたCPGをpH 3.0のpH値の緩衝溶液中でインキュベートすると、定量的脱離を行うことができる。シリカ表面に対するタンパク質の吸着は一般的に、定義された条件下で可逆的であると報告されている。クロロホルム、メタノール、または2-プロパノールなどの刺激の強い化学溶媒を用いることができる（たとえば、Manning, J.N., et al, Journal of Chromatography B 487 (1989) 41-50; Stankovic, C.J., et al, Anal. Biochem. 184 (1990) 100-103を参照されたい）。その上、pH値を変化させることに加えて（たとえば、Edy, V.G., et al, J. Gen. Virol. 33 (1976) 517-521を参照されたい）、カオトロピック塩を用いることができる（たとえば、Mecs, I., et al, Arch. Virol. 81 (1984) 303-311を参照されたい）。
【００３４】
最大の吸着はpH5.0で観察することができる（図7）。IgG吸着の減少は、pHをIgGの等電点（IP）より上に上昇させた場合に観察することができる（たとえば、IPは、図8に示されるIgGのゼータ電位測定を用いることによって8.0であると決定された）。IgGのゼータ電位は、pH値滴定に応じて決定することができる。
【００３５】
ナノサイズのCPGの表面電荷も同様にpH値に依存する。CPGのIPは、約4であると測定され得る。pH 4を超えるpH値では、CPGの表面電荷は、陽性から陰性へと変化する。
【００３６】
たとえば、6.8％HMWを含有する溶液を、約5のpH値で0.1 m2から10 m2の異なるuCPG表面積と共にインキュベートした。溶液中の残留HMW（高分子量化合物）の百分率を、SE-HPLCを用いて上清中で決定した。図4において、インキュベーション前に当初存在した、タンパク質1グラムあたりのCPG表面積に吸着した百分率での単量体およびHMWの量を示す。50 m2 CPG表面/g IgGを用いる場合、溶液中に当初存在したHMWの63％を吸着させることができる。溶液中に当初存在した単量体の9％が粒子に結合する。140 m2 CPG表面/gタンパク質を適用することにより、HMWのほぼ95％が結合することができるが、単量体の22％が吸着されるに過ぎない。約250 m2 CPG表面/gタンパク質では、HMWのほぼ100％がCPG表面に吸着することができる（図5を参照されたい）。50 m2から150 m2 CPG表面/gタンパク質のあいだで、オリゴマーをほぼ完全に除去することができる。インキュベーションの際に存在するCPG表面積は、溶液中に残っているLMW（低分子量化合物）の量に対して効果を有しない。
【００３７】
このように、免疫グロブリンの可溶性凝集体を、非誘導体化CPGに吸着させることができる。タンパク質1グラムあたりに利用することができるCPGの表面積を用いて、インキュベーション後に溶液中に残っている凝集種および単量体種の量を制御することができる。100 m2から150 m2/gタンパク質の表面積を用いて、約5のpH値でIgG溶液から可溶性凝集体の60％から95％を除去することができ、同時に単量体IgGの80％から90％が溶液中に残っている。
【００３８】
タンパク質のコンフォメーションを、表面への吸着前、吸着中、および吸着後に調べた。6日間のインキュベーションのあいだ、不溶性凝集体の形成によるタンパク質の喪失は認められない。SE-HPLCによって測定されたHMWのレベルは、CPGの表面積が増加すると減少した。1日インキュベーション後、インキュベーションを5日間延長しても、可溶性凝集体レベルのさらなる減少は検出されない。上清中のHMWの増加は測定されない。1つの態様において、インキュベーションは1分から24時間である。さらなる態様において、インキュベーションは1分から6時間である。
【００３９】
uCPGにIgGを曝露しても、FT-IR分光法によって測定した場合に二次構造のコンフォメーションの変化は起こらなかった。
【００４０】
本明細書において報告される局面は、
-  pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にポリペプチドをインキュベートする段階、
を含む、ポリペプチドを得る方法である。
【００４１】
1つの態様において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスは、pH4.5からpH 5.5のpH値で用いられる。別の態様において、uCPGは、約pH 5のpH値で用いられる。別の態様において、インキュベートする段階は緩衝溶液中である。
【００４２】
「約」という用語は、その後に続く値が正確な値ではないが、1つの態様において、その値の±10％、または別の態様において、その値の±5％、またはさらなる態様において、その値の±2％、または1つの態様において、その値の±1％である範囲の中心点であることを意味する。値が百分率で与えられる相対値である場合、「約」という用語はまた、その後に続く値が正確な値ではないが、1つの態様において、その値の±10％、または別の態様において、その値の±5％、またはさらなる態様において、その値の±2％、または1つの態様において、その値の±1％である範囲の中心点であることを意味し、範囲の上限は100％の値を超えることはできない。
【００４３】
1つの態様において、ポリペプチド、特に単量体型の免疫グロブリンを得る方法は、以下の段階を含む：
a）pH 4からpH 6のpH値で、単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；
b）上清を回収し、それによって段階a）の上清から単量体型のポリペプチドを得る段階。
【００４４】
別の態様において、ポリペプチド、特に凝集型の免疫グロブリンを得る方法は以下の段階を含む：
a）pH 4からpH 6のpH値で、単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；
b）インキュベートした非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを回収する段階；
c）段階a）の溶液のpH値とは少なくとも2 pH単位異なるpH値での溶液のインキュベーションにより、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスから凝集型ポリペプチドを回収する段階。
【００４５】
1つの態様において、インキュベーションは、ポリペプチドを含む溶液に、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの規定量を添加する段階によって行われる。同様に1つの態様において、インキュベートする段階は、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を適用することによって行われる。第一の態様において、ポリペプチドは、インキュベーションの上清から回収される。第二の態様において、ポリペプチドはカラムのフロースルーから回収される。高分子量化合物の回収は、いずれの態様においてもインキュベーション溶液のpH値から少なくとも2 pH単位異なるpH値で、溶液をコントロールド・ポア・ガラスに適用することによって行われる。1つの態様において、第一の方法はバッチ法である。
【００４６】
1つの態様において、方法は以下の段階を含む：
-  免疫グロブリンを含む溶液をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製する段階；
-  任意で、免疫グロブリンをイオン交換クロマトグラフィーによって精製する段階；
-  pH 4からpH 6のpH値で、溶液を含む得られた免疫グロブリンを非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；
-  先の段階の上清を回収し、それによって単量体型の免疫グロブリンを得る段階。
【００４７】
本明細書において報告される別の局面は、以下の段階を含む、ポリペプチド、特に単量体型の免疫グロブリンを産生する方法である：
a）ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階；
b）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階；
c）pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にポリペプチドをインキュベートする段階；
d）段階c）の上清を回収し、それによって単量体型のポリペプチドを産生する段階。
【００４８】
1つの態様において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階は、1分から120分である。
【００４９】
図3において、pH値および緩衝化合物に依存した非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスへの高分子量（HMW）化合物の蓄積を示す。非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスは、およそpH 5のpH値で、緩衝物質とは無関係に免疫グロブリン溶液から高分子量化合物を吸着することが認められうる。1つの態様において、緩衝物質は、酢酸または酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウムなどのその塩、およびクエン酸またはクエン酸ナトリウムもしくはクエン酸カリウムなどのその塩から選択される。
【００５０】
図4において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスに対する高分子量（HMW）化合物の吸着を、単量体の免疫グロブリンの吸着と比較する。HMW化合物の吸着量は、適用したポリペプチドの質量あたりのコントロールド・ポア・ガラスの表面積に対して指数関数的依存性を示すことが認められうる。単量体の免疫グロブリンの吸着量は、適用されたポリペプチドの質量あたりコントロールド・ポア・ガラスの表面に対して一次関数的依存性を示す。
【００５１】
図5において、異なるように処置した溶液のサイズ排除クロマトグラムを示す。たとえば140 m2 CPG表面/gポリペプチドを用いることによって、高分子量化合物の低減が起こることが認められうる。
【００５２】
図6において、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの表面被覆を示す。表面被覆は、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの2 mg/m2表面に達したことが認められうる。吸着は、pH値を変化させることによって元に戻すことができる。ある態様では、吸着した高分子量化合物は、pH値をpH 5から少なくとも2 pH単位異なる値に変化させることによって、ある態様では、pH 3.0またはpH 7.0に変化させることによって、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスから回収される。二次微分UVまたはIR-分光法によって、吸着が二次または三次構造に影響を及ぼさないことが示されうる。
【００５３】
免疫グロブリン調製物からの高分子量化合物の選択的吸着により、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることは、凝集型の残留免疫グロブリンを除去するために、後処理プロセスの終了時の活性な薬学的成分の精製にとって適当でありうる。pH 5からpH 6へのpH値の操作は、バルクの活性な薬学的成分のpH値に対応する。非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いると、オリゴマー型、および用いない場合に後処理プロセスの後期段階では除去が難しい二量体型の免疫グロブリンでさえも除去することが可能である。加えて、バッチモードでの取り扱いは、非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズをバルクのタンパク質溶液と単にインキュベートする段階、およびたとえば遠心分離または濾過によってCPGを除去することによって凝集体を除去する段階によって行うことができる。
【００５４】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。記載の技法に改変を行うことができ、それらも本発明の精神の範囲内であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】A：pH値3.0、5.0、および7.2での非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（a）、架橋アガロース（Sepharose）（b）、およびポリ(メタクリレート)（c）の吸着特性の比較。B：pH 3、pH 5、pH 7.5でのCPGマトリクスへのIgGの吸着。インキュベーション前に当初存在したタンパク質質量に関連するビーズ表面1平方メートルあたりに吸着したタンパク質の百分率：pH 3.0（明灰色）、pH 5.0（暗灰色）、およびpH 7.5（黒色）での吸着；結果を、3回の測定値の平均値±SDとして表す。
【図２】CPG表面1平方メートルあたりの残留HMW：表面とのインキュベーションの前に当初存在したHMWの量に関連する上清中の、SE-HPLCによって測定したHMWの百分率；インキュベーション前（明灰色）、クロマトグラフィー表面なしでのインキュベーション（暗灰色）、およびクロマトグラフィー表面とのインキュベーション（黒色）；結果を3回の測定の平均値±SDとして表す。
【図３】pH値および緩衝化合物に依存した非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス上の高分子量（HMW）化合物の特異的蓄積の比較。
【図４】CPGに対するIgG単量体（白）およびHMW（黒）の吸着；6.8％HMWを含有するIgG 20 mgが、0.1〜10 m2 CPGとのインキュベーション前に当初存在した；実験データを3回の測定の平均値±SDとして表す。
【図５】タンパク質1グラムあたり350 m2までのCPG表面積と共にインキュベートした後の、IgG溶液のSE-クロマトグラム：6.8％HMWを含有するIgG 20 mgがCPGとのインキュベーション前に当初存在した（黒色のプロフィール）；CPG表面の増加によるUVシグナルの減少は、黒色から明灰色へと色が変化することによって示される。
【図６】CPG粒子上のIgGの吸着および脱離の等温線；吸着（黒色の菱形）試験をpH 5.0で行い、脱離（白色の菱形）試験をpH 3.0で行った；結果を3回の測定の平均値±SDとして表す。
【図７】異なるpHでのCPG粒子に対するIgGの吸着：可溶性タンパク質の2 mg/mlまたはそれより高い濃度で、飽和領域で実験を行った。結果を3回の測定の平均値±SDとして表す。
【図８】IgG（黒色）およびナノサイズのCPG粒子（灰色）のゼータ電位滴定曲線；実験データを3回の測定の平均値±SDとして表す。
【実施例】
【００５６】
実施例1
材料および方法
抗体
pH 6.0のヒスチジン緩衝液中でキメラFc（IgG1）/ラットFab抗体の完全に精製したバルク（IgG A）を実験のために得た。アリコートを、pH 3.0の100 mM酢酸緩衝液、pH 5.0の100 mM酢酸緩衝液、およびpH 7.5の200 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の中で透析した。その後Sterivex-GV 0.22μmフィルター（Millipore, Billerica, USA）を用いることによって溶液を濾過した。
【００５７】
CPG
Millipore（Billerica, USA）のControlled pored glass（CPG 700）ビーズを用いた。
【００５８】
化学物質
用いた他の全ての化学物質および試薬は少なくとも分析等級であった。酸性酸は、Fluka（Steinheim, Germany）から得、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム、および塩化ナトリウムは、Merck KG（Darmstadt, Germany）から得、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタンはAngus（Ibbenbueren, Germany）から得た。L-ヒスチジンはAjinomoto（Raleigh, USA）から得た。
【００５９】
表面に対する吸着
モノクローナル抗体（mAb）のCPG表面に対する吸着を、規定の表面を規定量のタンパク質と共にインキュベートすることによって異なるpHで調べた。それゆえ、ビーズスラリーを精製水（Milli-Q, Millipore, Billerica, USA）に懸濁し混合した。ビーズを真空濾過（0.22μmセルロースフィルターディスク、Sartorius, Goettingen, Germany）によって収集して、その後精製水（Milli-Q, Millipore, Billerica, USA）によってすすいだ。次に、ビーズを40℃で乾燥させて、ガス吸着（BET）によって測定された規定の表面を表す、規定の質量を量り取った。次にビーズを、規定のpHでタンパク質溶液と混合して、ロータリーミキサーRM5（Froebel, Lindau, Germany）において35 rpmで上部空き高なしで室温で12時間インキュベートした。次に試料を、10,000×gで10分間遠心分離して、ビーズをタンパク質溶液から分離した。遠心分離した試料の上清についてタンパク質濃度の測定およびSE-HPLC分析を行った。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表す。
【００６０】
異なるビーズ表面に対するmAbの吸着等温線を、5 m2ビーズ表面を含有する試料および0.2 mg/mlから6.0 mg/mlまでの様々な濃度のmAbを調製することによって決定した。先に記述したように試料を12時間インキュベートし、10,000×gで10分間遠心分離して、タンパク質溶液からビーズを分離し、上清中のタンパク質濃度を決定した。上清中で測定されたタンパク質の量を、インキュベーション前に当初存在したタンパク質の量から差し引くことによって、吸着したタンパク質の量を決定した。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表す。
【００６１】
CPG表面に対するHMWの選択的吸着を調べるために、6.8％HMWを含有するpH 5の100 mM酢酸緩衝液中のIgGを、0.1〜10 m2 CPG表面と共にインキュベートした。試料を先に記述したように12時間インキュベートし、10,000×gで10分間遠心分離して、タンパク質溶液からビーズを分離し、上清中のタンパク質濃度を測定した。加えて、上清をSE-HPLCによって分析した。吸着したHMWおよび単量体の量をそれぞれ、上清中で測定されたHMWの量を、インキュベーション前に当初存在したHMWの量から差し引くことによって、決定した。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表記する。
【００６２】
タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度を、緩衝液ブランクを差し引いた後の280 nmおよび320 nmでの測光吸光度を用いることによって決定した（UV-Vis spectrophotometer Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）。320 nmでの吸光度を、280 nmでの吸光度から差し引き、この吸光度の値を用いて、ランベルト・ベールの法則に従ってタンパク質含有量を計算した。
【００６３】
SE-HPLC
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）実験を、Summit HPLC-システム（Dionex, Idstein, Germany）においてTSK 3000 SWXLカラム（Tosoh Bioseparation, Stuttgart, Germany）を用いて行った。溶出のピークを、Dionex（Idstein, Germany）のUVダイオードアレイ検出器UVD170Uによって、280 nmでモニターした。200 mMリン酸カリウムおよび250 mM塩化カリウムで構成されるpH 7.0の水性緩衝液を用いて、流速0.5 ml/分でイソクラティッククロマトグラフィーを室温で行った。各試料は、注入1回あたり100μgのmAbロードを含有した。Chromeleonソフトウェア（Dionex, Idstein, Germany）を用いることによってクロマトグラムをマニュアル通りに積分した。二量体およびより大きい可溶性オリゴマーを含むより高い分子量種（HMW）の百分率を、単量体のピークおよびより低分子量種（LMW）のピークを含む総面積に関連する相対面積（mAU*分）として決定した。
【００６４】
FT-IR分光法
ビーズ表面上のタンパク質の二次構造を調べるために、FT-IRスペクトルを、ゲルマニウム結晶を用いるMIRacle減衰全反射（ATR）セルを適用してTensor 27（Bruker Optics, Ettlingen, Germany）によって記録した。CPGビーズを、pH 5.0の酢酸緩衝液中6 mg/ml IgGの溶液と共に室温で12時間インキュベートした。インキュベーション前にSE-HPLCによって測定したところ、溶液は1.5％HMWのレベルを示した。インキュベーションは飽和モードで行った。インキュベーション後、ビーズを緩衝液によって洗浄した。pH 9.0の200 mMトリス緩衝液を用いてビーズから脱離させた後、AquaSpec透過セルを用いて、タンパク質の二次構造を調べた。850〜4000 cm-1で記録した各々のスペクトルに関して、120スキャンのインターフェログラムを、4 cm-1の分解能を有する両面獲得モードで収集した。緩衝液と湿ったビーズの参照スペクトルをそれぞれ差し引いて、タンパク質のスペクトルを得た。ベクトルの標準化によってスペクトルを編集した後、OPUS 6.0ソフトウェア（Bruker Optics, Ettlingen, Germany）を適用して 13-point Savitsky-Golay平滑化関数を用いて、二次微分の生成および平滑化を行った。さらに、透過モードで記録したスペクトルとの比較を可能にするために、ATRモードで記録した吸収スペクトルを、バンドの強度およびバンドの位置に関して修正した。それゆえ、波数依存的異常分散を克服するために、Fringeli（Fringeli, U.P., Chimia 46 (1992) 200-214）に従ってソフトウェアOPUS 6.0（Bruker Optics, Ettlingen, Germany）のさらなるATR修正を用いた（Goldberg, M.E., and Chaffotte, A.F., Protein Sci. 14 (2005) 2781-2792; Grdadolnik, J., Int. J. Vibr. Spec. 6, ed. 2 (2002)）。
【００６５】
ゼータ電位測定
異なるpH値でのタンパク質および超音波処理ナノサイズCPG 700の電荷を決定するために、タンパク質およびCPG 700ビーズの電気泳動移動度を、Malvern Zetasizer Nano S（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を用いるレーザー・ドップラー・速度測定法を行うことによって測定した。ゼータ電位ζを、Malvern DTSソフトウェア（バージョン5.0, Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を用いて、均一な電荷分布を仮定してヘンリーの方程式から計算した。試料の調製に関して、5 mg/ml mAb溶液をpH 5.0の50 mM酢酸緩衝液の中で透析して、その後0.2 M塩酸を用いることによってpHを2.0に滴定した。CPG 700ビーズを同じ緩衝液システムに懸濁し、pHを2.0に調節した。滴定装置MPT2（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を適用することによって、試料を、0.2 M水酸化ナトリウム溶液によってpH 2からpH 12まで滴定した。ゼータ電位を、温度制御折り返しキャピラリーセル（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）において25℃でpH 2から12のあいだで15段階で決定した。各測定を3回繰り返し、平均値±SDを報告する。
【図１】
2013523865.tif 000004
【図２】
2013523865.tif 000005
【図３】
2013523865.tif 000006
【図４】
2013523865.tif 000007
【図５】
2013523865.tif 000008
【図６】
2013523865.tif 000009
【図７】
2013523865.tif 000010
【図８】
2013523865.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月26日(2012.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含むことを特徴とする、単量体型の免疫グロブリンを得る方法：
a）単量体型および凝集型の免疫グロブリンを含む溶液を、pH 4.5からpH 5.5のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（controlled pore glass）と共にインキュベートする段階であって、該インキュベートする段階が非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を適用することによって行われる、段階、および
b）フロースルーを回収し、それによって単量体型の免疫グロブリンを得る段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、免疫グロブリンを産生する方法：
a）免疫グロブリンをコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階；
b）細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収する段階；
c）回収した免疫グロブリンを含む溶液を、pH 4.5からpH 5.5のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；および
d）上清を回収し、それによって免疫グロブリンを産生する段階、
ここで、
前記インキュベートする段階は非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を適用することによって行われ、かつ
前記回収はカラムのフロースルーに由来する。
【請求項３】
非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスが非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチド1グラムあたり100 m2から150 m2の表面を有する非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
溶液が各々のpH値の緩衝溶液であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
最後の段階として、
-  1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によって免疫グロブリンを精製する段階、
を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
インキュベートする段階が、1分から6時間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
pH 4.5からpH 5.5のpH値で高分子量の免疫グロブリンを吸着させるための非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの使用。
【請求項９】
a）非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズ；
b）pH 4.5からpH 5.5のpH値の緩衝溶液；
c）pH 2からpH 3のpH値の緩衝溶液；
d）pH 7からpH 8のpH値の緩衝溶液
を含むキット。
【請求項１０】
以下の段階を含むことを特徴とする、凝集型の免疫グロブリンを得る方法：
a）単量体型および凝集型の免疫グロブリンを含む溶液を、pH 4.5からpH 5.5のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階であって、該インキュベートする段階が非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を適用することによって行われる、段階、
b）回収されたコントロールド・ポア・ガラスをpH 2からpH 3、またはpH 7からpH 8のpH値の第二の溶液と共にインキュベートし、それによって凝集型の免疫グロブリンを得る段階。
【請求項１１】
非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスが非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズであることを特徴とする、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチド1グラムあたり100 m2から150 m2の表面を有する非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることを特徴とする、請求項10〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
溶液が各々のpH値の緩衝溶液であることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
最後の段階として、
-  1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によって免疫グロブリンを精製する段階、
を含むことを特徴とする、請求項10〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
インキュベートする段階が、1分から6時間であることを特徴とする、請求項10〜14のいずれか1項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本明細書において報告されるさらなる局面は、
a）非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズ；
b）pH 4からpH 6のpH値の緩衝溶液；
c）pH 2からpH 3のpH値の緩衝溶液；
d）pH 7からpH 8のpH値の緩衝溶液
を含むパーツのキットである。
[本発明1001]
以下の段階を含むことを特徴とする、単量体型または凝集型のポリペプチドを得る方法：
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス（controlled pore glass）と共にインキュベートする段階、および
b）上清を回収し、それによって単量体型のポリペプチドを得る段階、
または、
a）単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階、
b）溶液からコントロールド・ポア・ガラスを回収する段階、
c）回収されたコントロールド・ポア・ガラスをpH 2からpH 3、またはpH 7からpH 8のpH値の第二の溶液と共にインキュベートし、それによって凝集型のポリペプチドを得る段階。
[本発明1002]
以下の段階を含む、ポリペプチドを産生する方法：
a）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階；
b）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階；
c）回収したポリペプチドを含む溶液を、pH 4からpH 6のpH値で非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスと共にインキュベートする段階；および
d）上清を回収し、それによってポリペプチドを産生する段階。
[本発明1003]
非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスが非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
ポリペプチド1グラムあたり100 m2から150 m2の表面を有する非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスを用いることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
ポリペプチドが免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
溶液が各々のpH値の緩衝溶液であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
最後の段階として、
-  1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によってポリペプチドを精製する段階、
を含むことを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
回収する段階が、遠心分離または濾過によって行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
インキュベートする段階が、1分から6時間であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
pH 4からpH 6のpH値で高分子量のポリペプチドを吸着させるための非誘導体化コントロールド・ポア・ガラスの使用。
[本発明1011]
a）非誘導体化コントロールド・ポア・ガラス・ビーズ；
b）pH 4からpH 6のpH値の緩衝溶液；
c）pH 2からpH 3のpH値の緩衝溶液；
d）pH 7からpH 8のpH値の緩衝溶液
を含むキット。
【国際調査報告】
2013523865.tif 000012
2013523865.tif 000013
2013523865.tif 000014