(57)【要約】【解決手段】繊維状組織スキャフォールドであって、スキャフォールドの繊維はホスホン酸ポリマーを含む。繊維は、ビニルホスホン酸−アクリル酸の共ポリマーを組み込むことが好ましく、更にポリカプロラクトンを含んでよい。ホスホン酸ポリマーを含む医療用インプラントコーティング、ホスホン酸ポリマーを含む生体適合繊維、及びポリカプロラクトンとホスホン酸ポリマーを含む生体適合ポリマーが更に説明される。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のホスホン酸ポリマーを含む、繊維状組織スキャフォールド。
【請求項２】
スキャフォールドの繊維が、第１の種類のホスホン酸ポリマーから形成される、請求項１に記載のスキャフォールド。
【請求項３】
スキャフォールドの繊維が、前記第１の種類のホスホン酸ポリマーの溶液をエレクトロスピニングすることによって製造される、請求項２に記載のスキャフォールド。
【請求項４】
前記ホスホン酸ポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含む、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項５】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸ホモポリマー、又は、他の１種若しくは複数種のポリマーを組み込んでいるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項６】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ホスホノ置換したモノカルボン酸、ホスホノ置換したジカルボン酸、次亜リン酸、次亜リン酸塩、及びホスホノコハク酸からなる群から選ばれるホスホン酸ホモポリマーである、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項７】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸と、カルボン酸、スルホン酸、アミド、アミン、ポリアルキレンイミン、及びアミン末端ポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる１又は複数の更なるモノマーとのホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項８】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸とアクリル酸、ビニルホスホン酸とメタクリル酸、ビニルホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とメタクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とメタクリル酸、及びビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリルアミドからなる群から選ばれるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項９】
前記ホスホン酸ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である、請求項１乃至３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項１０】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項１乃至９の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項１１】
スキャフォールドの繊維には、第２の種類のホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられている、請求項１乃至１０の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項１２】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含む、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１３】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸ホモポリマー、又は，他の１種若しくは複数種のポリマーを組み込んでいるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１４】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ホスホノ置換したモノカルボン酸、ホスホノ置換したジカルボン酸、次亜リン酸、次亜リン酸塩、及びホスホノコハク酸からなる群から選ばれるホスホン酸ホモポリマーである、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１５】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸と、カルボン酸、スルホン酸、アミド、アミン、ポリアルキレンイミン、及びアミン末端ポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる１又は複数の更なるモノマーとのホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１６】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸とアクリル酸、ビニルホスホン酸とメタクリル酸、ビニルホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とメタクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とメタクリル酸、及びビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリルアミドからなる群から選ばれるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１７】
前記第２の種類のホスホン酸ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である、請求項１１に記載のスキャフォールド。
【請求項１８】
第２の種類のホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項１１乃至１７の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項１９】
スキャフォールドの繊維内に組み込まれるホスホン酸ポリマー、及びコーティングに含まれる更なるホスホン酸ポリマーは、同じ種類のホスホン酸ポリマーである、請求項１１乃至１８の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２０】
スキャフォールドの繊維内に組み込まれるホスホン酸ポリマー、及びコーティングに含まれる更なるホスホン酸ポリマーは、異なる種類のホスホン酸ポリマーである、請求項１１乃至１８の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２１】
スキャフォールドの繊維は、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−ｃｏ−グリコール酸)、及びポリ(メタクリル酸メチル)からなる群から選ばれる少なくとも１つの付加的な生体適合ポリマーを含む、請求項１乃至２０の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２２】
スキャフォールドの繊維は、サブミクロンの平均直径を有する、請求項１乃至２１の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２３】
スキャフォールドの繊維は、約１０乃至１０００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１乃至２１の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２４】
スキャフォールドは多孔性である、請求項１乃至２３の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２５】
スキャフォールドは、約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至２４の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２６】
スキャフォールドは、約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至２５の何れかに記載のスキャフォールド。
【請求項２７】
ポリマーから形成された繊維を具える繊維状組織スキャフォールドの調製方法であって、スキャフォールドの繊維が、前記ポリマーの溶液をエレクトロスピニングし、エレクトロスピニングされた繊維を、ホスホン酸ポリマーを含む組成物で処理することによって製造される方法。
【請求項２８】
前記組成物は、約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物は、約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ホスホン酸ポリマーから形成された繊維を具える繊維状組織スキャフォールドの調製方法であって、スキャフォールドの繊維が、前記ホスホン酸ポリマーの溶液をエレクトロスピニングすることによって製造される方法。
【請求項３１】
前記ポリマー溶液は、約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマー溶液は、約７乃至１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリマー溶液は、約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー溶液は、エレクトロスピニング用の針を通して、約０．０１乃至０．１ｍｌ／分の供給量で供給される、請求項２７乃至３３の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
エレクトロスピニング中、約５乃至４０ｋＶの電圧が前記ポリマー溶液に印加される、請求項２７乃至３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
エレクトロスピニング用の針が、コレクタプレートから約１０ｃｍ乃至２０ｃｍ離される、請求項２７乃至３５の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
ホスホン酸ポリマーを含む、医療用インプラントコーティング。
【請求項３８】
前記ホスホン酸ポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含む、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項３９】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸ホモポリマー、又は，他の１種若しくは複数種のポリマーを組み込んでいるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項４０】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ホスホノ置換したモノカルボン酸、ホスホノ置換したジカルボン酸、次亜リン酸、次亜リン酸塩、及びホスホノコハク酸からなる群から選ばれるホスホン酸ホモポリマーである、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項４１】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸と、カルボン酸、スルホン酸、アミド、アミン、ポリアルキレンイミン、及びアミン末端ポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる１又は複数の更なるモノマーとのホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項４２】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸とアクリル酸、ビニルホスホン酸とメタクリル酸、ビニルホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とメタクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とメタクリル酸、及びビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリルアミドからなる群から選ばれるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項４３】
前記ホスホン酸ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である、請求項３７に記載のコーティング。
【請求項４４】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項３７乃至４３の何れかに記載のコーティング。
【請求項４５】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項３７乃至４４の何れかに記載のコーティング。
【請求項４６】
約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項３７乃至４５の何れかに記載のコーティング。
【請求項４７】
ホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられた、医療用インプラント。
【請求項４８】
請求項３７乃至４６の何れかに記載のコーティングである、請求項４７に記載のインプラント。
【請求項４９】
少なくとも１種のホスホン酸ポリマーを含む、生体適合繊維。
【請求項５０】
前記繊維は、第１の種類のホスホン酸ポリマーから形成される、請求項４９に記載の繊維。
【請求項５１】
前記繊維は、前記第１の種類のホスホン酸ポリマーの溶液をエレクトロスピニングすることによって製造される、請求項５０に記載の繊維。
【請求項５２】
スキャフォールドの繊維には、第２の種類のホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられている、請求項４９乃至５１の何れかに記載の繊維。
【請求項５３】
ポリカプロラクトン及びホスホン酸ポリマーを含む、生体適合ポリマー組成物。
【請求項５４】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項５３又は請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
約７乃至１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項５３又は請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項５３又は請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
本発明の第１１の態様が、骨粗鬆症の治療に用いる注射可能な薬物に関し、ホスホン酸ポリマーを含む。
【請求項５９】
ホスホン酸ポリマーを含む、パジェット病の治療に用いる注射可能な薬物。
【請求項６０】
ホスホン酸ポリマーを含む、骨部位への急性外傷の治療に用いる注射可能な薬物。
【請求項６１】
哺乳類の組織細胞の培養方法であって、哺乳類の組織細胞を繊維状組織スキャフォールド上で培養する工程を含み、スキャフォールドの繊維がホスホン酸ポリマーを含み、前記細胞を細胞培養用培地に曝して前記細胞のスキャフォールドへの付着を促進する工程を含む、方法。
【請求項６２】
哺乳類の組織の修復又は再生方法であって、哺乳類の組織細胞を繊維状組織スキャフォールド上で培養する工程を含み、スキャフォールドの繊維がホスホン酸ポリマーを含み、前記細胞を細胞培養用培地に曝して前記細胞のスキャフォールドへの付着を促進する工程と、細胞が付着したスキャフォールドを、修復又は再生が必要な哺乳類の組織の近くに配置する工程を含む方法。
【請求項６３】
骨粗鬆症の治療方法であって、骨粗鬆症の個体に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与する工程を含む方法。
【請求項６４】
パジェット病の治療方法であって、パジェット病の個体に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与する工程を含む方法。
【請求項６５】
骨部位への急性外傷の治療方法であって、前記急性外傷を抱える個体の前記部位に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビーズ、フィルム等の形態の組織スキャフォールド(scaffold)等の生体適合材料、医療用インプラントのコーティング、組成物及び製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成手段によって製造される骨移植片代替物(bone graft substitutes)等の生体適合材料は、これまで以上に重要となってきている。というのも、新たな製品や方法が、急性外傷(例えば、事故による骨又は歯の破砕)から慢性疾患(例えば、骨粗鬆症、パジェット病又は虫歯)に及ぶ経験に由来する病状を治療するために選別されているからである。
【０００３】
健常者においては、急性外傷に由来する比較的深刻でない骨折は、通常、短期間で自然治癒する。さらに深刻な場合では、ある種の骨移植片又はインプラントが必要となることがある。骨欠損が非常に大きい場合、長期間に亘る臨床的問題が存在し得る。骨粗鬆症患者においては、特有の骨状態であるので、初期破砕のリスクは健常者と比較して著しく大きく、患者が自然回復する能力は大幅に低い。骨移植片代替物としての製品であって、骨折している、及び／又は間接置換術と共に適用される骨充填材を必要としている骨粗鬆症患者のために臨床上使用され得る製品が、臨床的に必要とされている。
【０００４】
骨粗鬆症は骨の疾患であり、骨のミネラル密度が標準よりも低く、骨の微細構造及びたんぱく質構造が崩壊している。これは、骨芽細胞として知られる細胞による骨形成と破骨細胞として知られる細胞による骨吸収との間の恒常的な不均衡の結果である。
【０００５】
骨粗鬆症は、世界中で推定７５００万人が患っている慢性疾患であり、２０００年には推定９００万件の骨粗鬆症性骨折があった。骨粗鬆症を患っている女性の２４％及び男性の３３％が、股関節を骨折して１年以内に死亡している。欧州の人々が高齢化するにつれて、骨粗鬆症を患う人の数は顕著な上昇へと向かっている。この兆候は、股関節骨折だけで５０年以内に倍増すると予想されることを示唆している。欧州における骨粗鬆症の直接費用の総額は、２１０億ポンドと推定され、２０５０年までに５１０億ポンドに増大すると予想されている。
【０００６】
パジェット病(変形性骨炎)は慢性疾患であり、骨形成と骨吸収との間の不均衡に由来する点に限れば、骨粗鬆症と類似している。その結果として、２つの病気の間で患者に行われる治療には類似点がある。
【０００７】
現在、骨粗鬆症患者及びパジェット病患者は、ビスフォスフォネートと呼ばれる薬物群が経口で投与されている。ビスフォスフォネートは、骨においてヒドロキシアパタイトに結合することによって作用する。その結果、薬物は破骨細胞に取り込まれ、このことが破骨細胞のアポトーシスをもたらす。残念なことに、ビスフォスフォネートが投与された患者は、非常に望ましくない副作用に悩まされることがあり、例えば、発熱やインフルエンザ様症状を示す。また、骨粗鬆症及び／又はパジェット病の患者用に設計されたインプラントは、或いは、必要とされる特定の部位に埋め込むことができるインプラントは、市販されていない。通常の患者及び骨粗鬆症の患者の双方のための骨移植片代替物は現在、ヒト／動物由来のスキャフォールド、又は合成スキャフォールドであるが、これらは生物活性及び骨誘導性を欠いている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、前述の問題の１又は複数を未然に防ぐこと、若しくは軽減すること、並びに／或いは、骨移植片代替物などの、組織の再生及び／又は修復用に設計された生体適合材料を改良することである。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、ホスホン酸ポリマーを含む繊維状組織スキャフォールドが提供される。
【００１０】
本発明の第１の態様は、組織付着及び／又は組織増殖用のスキャフォールド(即ち、二次元又は三次元の支持構造体)に関し、スキャフォールド構造体はホスホン酸ポリマーを含む。ホスホン酸ポリマーは、スキャフォールドの繊維物質に組み込まれてよく、及び／又は少なくともスキャフォールドの領域にコーティングとして与えてもよい。このため、一部若しくは全てのスキャフォールド繊維は、ホスホン酸ポリマーから形成されてよく、及び／又は、一部若しくは全てのスキャフォールド繊維は、ホスホン酸ポリマーを含むコーティングを具えてよい。例として、スキャフォールド繊維は１種若しくは複数種のホスホン酸ポリマーから形成されてよく、及び／又は、コーティングは１種若しくは複数種のホスホン酸ポリマーを組み込んでよい。更に、繊維は、１種のホスホン酸ポリマーから形成されてよく、コーティングは異なる種類のホスホン酸ポリマーを含んでよい。加えて、ホスホン酸部分(phosphonic acid moieties)が、スキャフォールド表面の化学反応によって、又は、ホスホン酸部分を具える適切な分子によるスキャフォールドの機能化(functionalisation)によって、形成されてよい。
【００１１】
本明細書中で「ホスホン酸ポリマー」という場合、ホスホン酸基及び重合可能部分(例えばビニル基)を組み込んでいるモノマーの重合化によって作られるあらゆる種類のポリマーを包含しており、任意選択的に他の１種又は複数種のモノマーと組み合わされる。本明細書中で「ホスホン酸ポリマー」という場合、ホスホン酸塩のポリマーを包含することも理解できるであろう。更に、前述のポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分(phosphono moiety)又はホスフィノ部分(phosphino moiety)を含んでよい。
【００１２】
骨格上にペンダント基としてリンを有するホスホン酸ポリマーを含み、それはビスフォスフォネートの活性部分に類似しているので、スキャフォールドは、骨及び歯の主要構成物質、ヒドロキシアパタイトに結合し、破骨細胞を吸収する(resorb)ことによって取り込まれる(internalised)能力を有する。本発明の第１の態様のスキャフォールドの化学分析は、実施例において詳細に記載されており、リン濃度が高い領域においてカルシウムが濃縮されることを示した。このことは、リンとカルシウムの結合が生じたことを示唆している。インビトロ研究及びインビボ研究により、スキャフォールドとの細胞の相互作用(cellular interaction)が細胞付着と細胞増殖、及び細胞外マトリックス(extracellular matrix)の形成をもたらすことが実証された。スキャフォールドの好ましい実施形態は、至る所で細胞の移動を可能とする多孔質構造を有し、このため細胞相互作用を獲得し易い(accessible)領域を更に増やしている。
【００１３】
以上を考慮すると、組織工学によって作り出された(tissue engineered)本発明の第１の態様のスキャフォールドは、骨粗鬆症、パジェット病、及び／又は慢性的な歯の疾患の患者が使用して、最も必要とされている領域において骨量(bone mass)及び／又は骨ストック(bone stock)を改善するのに大いに適している。ホスホン酸ポリマー含有スキャフォールドは、ビスフォスフォネートファミリー化合物の活性部分(即ち、リン−炭素結合)のみを含んでいるので、本発明の第１の態様のスキャフォールドは非医薬的(non-pharmaceutical)製品として考えることができ、従来のビスフォスフォネート治療に現在関連している、全部とは言わなくとも一部の望ましくない副作用を除外するはずであることが理解できるであろう。
【００１４】
本発明の第１の態様のスキャフォールドの更なる利点は、好ましい実施形態において、生分解可能であるので更なる侵襲的手術の必要を除外し、結果として入院費や感染の危険性を減らすことである。
【００１５】
更なる利点は、スキャフォールド及び構成要素である繊維の種々の実施形態が親水性であり、このことが、より疎水性の物質と比較して、細胞接着を大いに支援するということで生じる。骨マトリックスにおいてみられる生体ポリマーとヒドロキシアパタイトとの化学反応も起こり易い。このことが更に、骨の修復と治癒を改善するであろう。
【００１６】
スキャフォールドの製造に関する以下の詳解から理解できるように、本発明の別の利点は、スキャフォールドが製造される方法が比較的単純であり、例えば、ＵＶ応答性モノマー又は両性イオン化合物の使用を必要としない。
【００１７】
当業者であれば、スキャフォールドは、骨及び歯以外は健康である患者の骨及び歯の修復及び再生において、より幅広い用途に適していることが理解できるであろう。例えば、骨又は歯のある種の急性外傷に悩まされている患者の治療においてである。
【００１８】
本発明の好ましい第１の実施形態は、スキャフォールドの繊維がホスホン酸ポリマーから形成されている繊維状組織スキャフォールドを提供する。
【００１９】
従って、好ましい第１の実施形態は、ホスホン酸ポリマーを組み込んでいる物質から構造が作り出されるスキャフォールドに関する。即ち、ホスホン酸表面コーティングをスキャフォールドに与えるためにある種の表面処理プロセスが施されている場合を除いて、ホスホン酸ポリマーは、スキャフォールド物質の一体部分を形成している。しかし、スキャフォールドは、望ましいあらゆる種類の表面コーティングが与えられてよいことが理解できるであろう。表面コーティングは、ホスホン酸ベースの化合物又はポリマーを組み込んでいるコーティングを含み、ホスホン酸ポリマーベースの繊維を組み込んでいるスキャフォールドの化学特性、生物学的特性及び／又は物理特性を修飾又は強化する。
【００２０】
更に、本発明の好ましい第１の実施形態のスキャフォールドは、ホスホン酸ポリマーだけから作られた繊維を組み込んでよい。また、スキャフォールドは、異なる種類の繊維の組合せを組み込んでおり、スキャフォールドを作り上げる繊維の全部でなく一部がホスホン酸ポリマーから形成されてよい。
【００２１】
好ましい第２の実施形態は、ホスホン酸ポリマーを含むコーティングがスキャフォールドの繊維に与えられている繊維状組織スキャフォールドを提供する。
【００２２】
ホスホン酸ポリマー含有コーティングは、スキャフォールドを作り上げる繊維のほぼ全てに、又はその一部に付与されてよい。更に、このようなコーティングが与えられるスキャフォールドの各繊維は、コーティングによってほぼ完全に覆われてよい。また、コーティングは、各繊維の一部又はある領域にだけ付与されてよい。コーティングは、繊維の表面積の約０．００００１％乃至１００％、より好ましくは約０．００１％乃至１００％、更により好ましくは約０．１％乃至１００％を覆うのがよい。更に、覆われる繊維の目的とする用途に応じて、コーティングの厚さは、１層であってよく、又は最大で何千層であってよい。
【００２３】
ホスホン酸ポリマーが、好ましい第１の実施形態のようなスキャフォールド繊維の構造内に与えられるか、第２の実施形態のようなコーティングとして与えられるか、双方の組合せであるかに関わらず、ホスホン酸ポリマーの総濃度は約７ｗ／ｖ％乃至８ｗ／ｖ％よりも高いことが好ましく、及び／又は、約２０ｗ／ｖ％を超えないことが好ましい。ホスホン酸ポリマー濃度の範囲は、約７ｗ／ｖ％乃至１５ｗ／ｖ％であることが好ましい。ホスホン酸ポリマー濃度は、約１０ｗ／ｖ％乃至１８ｗ／ｖ％であることがより好ましく、約１３ｗ／ｖ％乃至１７ｗ／ｖ％であることが更により好ましく、約１５ｗ／ｖ％であることが最も好ましい。
【００２４】
本発明の好ましい第１の実施形態によるスキャフォールドの繊維へと形成される開始物質は、ホスホン酸オリゴマー、ホモポリマー若しくはヘテロポリマー(例えば、共ポリマー、ターポリマー等)であってよく、又は他の１若しくは複数のポリマーと組み合わせた、任意のホスホン酸部分の混合若しくはブレンドであってよい。ポリマーの分子量は、ポリマーの目的とする用途に応じて、(調節体(regulatory bodies)により「ポリマー」として規定される)ポリマーを形成する数モノマー単位の数百万の組合せの分子量であり得る。分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのがより好ましく、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至２００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのが最も好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態において、スキャフォールドの繊維は、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)等のホスホン酸モノマーのホモポリマーから形成される。代わりに、スキャフォールドの繊維は、ホスホン酸モノマーに第２の種類の重合可能モノマーが共重合した共ポリマーから形成されてよい。好ましい共重合可能モノマーは、アクリル酸モノマー及びメタクリル酸(本明細書では概して「(メタ)アクリル酸という」)モノマー等の重合可能カルボン酸モノマーを含む。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によると、ポリマーは、ホスホノ成分及び／又はホスフィノ成分から選ばれる活性部分を組み込んでよい。ホスホノ成分又はホスフィノ成分は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸(ＶＤＰＡ)、ホスホノ置換したモノ又はジカルボン酸、次亜リン酸、或いは、次亜リン酸のアルカリ金属塩等の塩からなってよい。例として、ホスホノ成分は、基本的にＶＰＡ、ＶＤＰＡ、又はホスホノコハク酸のホモポリマーからなってよい。
【００２７】
ポリマーを組み込む組成物は更に、１又は複数の追加成分を含んでよく、不飽和スルホン酸、飽和若しくは不飽和カルボン酸、不飽和アミド、第１級若しくは第２級アミン、ポリアルキレンイミン、又はアミン末端ポリアルキレングリコール等が挙げられる。例えば、ポリマー組成物は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とビニルスルホン酸(ＶＳＡ)との共ポリマー、又はビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とアクリル酸(ＡＡ)、メタクリル酸(ＭＡＡ)若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡとＶＳＡとの共ポリマー、又はＶＤＰＡとＡＡ、ＭＡＡ若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。別の例として、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡと、ＶＳＡと、ＡＡ、ＭＡＡ又はアクリルアミドの何れか１つとのターポリマーからになってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＰＡ若しくはＶＤＰＡと、又はＶＰＡとＶＤＰＡの混合物と、以下の何れか１つとの反応産物からなってよい：
ａ．第１級アミン；
ｂ．第２級アミン；
ｃ．ポリエチレンイミン；
ｄ．アミン末端ポリエチレン若しくはポリプロピレングリコール(例えばジェファミン(jeffamine))；及び／又は
ｅ．次亜リン酸若しくはその塩。
【００２８】
スキャフォールド用繊維を製造する際に用いる特に好ましい共ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である。
【００２９】
前述のポリマー、共ポリマー又はターポリマーは何れも、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含んでよいことは理解できるであろう。
【００３０】
本発明の第１の態様によるスキャフォールドは、１又は複数の生体適合ポリマーから形成されるのが好ましい。スキャフォールドの繊維は、ポリカプロラクトンから作られる、又はポリカプロラクトンを含むことが好ましい。ポリカプロラクトン(ポリ−ε−カプロラクトン)は生体適合材料であり、米国食品医薬品局(ＦＤＡ)によって生物医学的用途における使用が認可されている。このため、ポリカプロラクトンは、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドに使用するのに大いに適している。本発明によると、ポリカプロラクトンに加えて、又はポリカプロラクトンの代わりに、その他の生体適合ポリマーを用いることができ、その他の生体適合ポリマーとしては、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−ｃｏ−グリコール酸)、及び／又はポリ(メタクリル酸メチル)等が挙げられる。
【００３１】
本発明の第１の態様の特に好ましい実施形態では、少なくとも一部の繊維が、ポリカプロラクトン及びポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)を含むポリマー溶液から形成される繊維状組織スキャフォールドが提供される。
【００３２】
本発明の第１の態様によるスキャフォールドは、サブミクロンの直径の繊維を具えることが好ましい。繊維は、約１０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、より好ましくは約１００ｎｍ乃至５００ｎｍ、更により好ましくは約２００ｎｍ乃至４００ｎｍの範囲の平均直径を有してよい。直径は、約２５０ｎｍ乃至３００ｎｍの平均直径を有することが特に好ましい。
【００３３】
スキャフォールド内の繊維は、ほとんど規則正しく配置されてよく、部分的に規則正しく配置されてよく、又は基本的に不規則に配置されてよい。繊維は、不規則に配置されることが特に好ましい。というのも、この不規則な配置が、スキャフォールドが用いられる予定の自然の生物環境の物理的構造を最も厳密に反映しているからである。
【００３４】
スキャフォールドは、望ましい任意の大きさ及び形状の、三次元のビーズ物質(bead material)又はパッキング物質(packing material)の形態で与えられてよい。スキャフォールド物質は、ビーズの形態で特定の用途に利用されてよい。このビーズは、単一の大きさ及び形状を、或いは、様々な範囲の大きさ及び／又は形状を有する。比較的小さいものから比較的大きいものまで、異なる大きさの範囲を有するホスホン酸ポリマー物質のビーズを用いることが好ましいことが考えられる。というのも、ビーズは、特定の標的部位内で最も適切な充填配置を選ぶように、自身で自己組織化(self-organise)できるからである。
【００３５】
代わりに、スキャフォールドは、繊維状物質の、本質的に二次元のシート又はストリップとして与えてもよい。勿論、このような「二次元の」物質でも、例えば厚さといった第三次元を有するが、この種の物質は、例えば幅及び長さといった主たる二次元を有することが理解できるであろう。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の第１の態様に基づくスキャフォールドは、骨の又は歯の穴への挿入用のポリマーパッキング物質の形態で与えられる。パッキング物質は、体内のインプラント部位が体験する圧縮力のレベルに耐えられることが重要であることが理解できるであろう。パッキング物質は、望ましい任意の大きさ及び／又は形状であってよいが、パッキング物質はペレットの形態であることが好ましい。特定の用途において用いられるペレットは、全て同じ大きさ及び形状であってよく、或いは、標的部位の大きさ及び形状に最適な充填配置を想定可能な大きさ及び／又は形状の範囲であってよい。多孔性構造及びミクロ／マクロ構造は、特定の化学的用途に最適な構造を与えるように変えることができる。
【００３７】
更に好ましい実施形態において、スキャフォールドは、ポリマーシートの形態で与えられる。このポリマーシートは、望ましい程度の可撓性を示して、埋込みの目標部位に適合できる。
【００３８】
スキャフォールドは、多孔性であることが好ましい。このことは有利である。というのも、スキャフォールドの構造の全体に亘って細胞の浸潤を可能とし、非多孔性の物質と比較して、細胞増殖の表面積を顕著に増やすことができるからである。多孔性のスキャフォールドはまた、栄養物が細胞培養用培地からスキャフォールドを通って、スキャフォールドによって支持される増殖細胞にまで浸透することを促進する。加えて、スキャフォールドに多孔性構造を与えることは、特定の用途に適合するように調整できるように、スキャフォールドの種々の物理、化学及び生物学的特性を操作及び制御する手段を提供する。
【００３９】
本発明のスキャフォールドのホスホン酸ベースの繊維を製造する特に好ましい方法は、適切なホスホン酸ポリマーの溶液、又は適切なホスホン酸ポリマーを含むポリマー混合物若しくはブレンドの溶液をエレクトロスピニングするものである。
【００４０】
エレクトロスピニングプロセス中、ポリマーが針から一定量で供給され、電圧が印加される。電圧により、針先にテイラーコーン(Taylor cone)が形成される。静電気力がポリマー溶液の表面張力を克服すると、ポリマージェットが形成されて、接地コレクタプレートに引き付けられる。
【００４１】
ポリマーの供給量は変化されてよく、形成される繊維の性質が制御され、そして紡がれている特定のポリマーの特性が考慮される。供給量は、約０．０１ｍｌ／分乃至０．１ｍｌ／分であるのが好ましく、約０．０５ｍｌ／分であるのがより好ましい。印加電圧は、エレクトロスピニングされる特定のポリマーの特性に応じて、及び／又は最終繊維の望ましい特性に応じて変えてよい。印加電圧は、約５ｋＶ乃至４０ｋＶとしてよく、約１０ｋＶ乃至３０ｋＶであるのがより好ましく、約２０ｋＶであるのが最も好ましい。コレクタプレートから針までの間隔が更なるパラメータであって、用いるポリマーに応じて最終繊維の性質を制御するように変えてよい。針は、コレクタプレートから約１０ｃｍ乃至２０ｃｍ離すことができ、約１５ｃｍ離すことが好ましい。
【００４２】
ポリマーの非繊維状凝集体(non-fibrous agglomerations)ではなく、明確な形の(well-defined)繊維を主に含むスキャフォールドを製造するために、エレクトロスピニング溶液は、繊維を形成するように紡がれるポリマー又はポリマー混合物(ホスホン酸ポリマーを含んでも含まなくてもよい)を、少なくとも約６ｗ／ｖ％含むのが好ましく、約７ｗ／ｖ％乃至１５ｗ／ｖ％含むのがより好ましく、約１０ｗ／ｖ％含むのが最も好ましい。
【００４３】
エレクトロスピニングされるポリマー溶液は、任意の適切な溶媒を組み込むことができる。好ましい溶媒はアセトンである。
【００４４】
前述のように、本発明の第１の態様による繊維状スキャフォールドの好ましい実施形態は、ビニルホスホン酸／アクリル酸共ポリマー、及びポリカプロラクトンを含むポリマー混合物から作られる繊維を含む。この場合、以下のエレクトロスピニングパラメータを採用することが好ましい：アセトン中１０ｗ／ｖ％ポリマー混合物(ＶＰＡ濃度は約１５ｗ／ｖ％)；印加電圧２０ｋＶ；ポリマー流量０．０５ｍｌ／分；及び針／コレクタ間の距離１５ｃｍ。
【００４５】
本発明の第２の態様は、ホスホン酸ポリマーを含む生体適合繊維を提供する。
【００４６】
本発明の第２の態様による生体適合繊維は、本発明の第１の態様に関して上述したように、コーティングとして、及び／又は繊維の構造内に、ホスホン酸ポリマーを組み込むことができる。従って、第２の態様による繊維は、本発明の第１の態様によるスキャフォールドにおいて用いられたホスホン酸ポリマー含有繊維について先に述べた、任意の物理、化学及び／又は生物学的特性を有してよい。
【００４７】
本発明の第３の態様は、ホスホン酸ポリマーを含む医療用インプラントコーティングを提供する。
【００４８】
本発明の第４の態様は、ホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられた医療用インプラントを提供する。
【００４９】
第３の態様及び第４の態様のコーティングは、１種又は複数種のホスホン酸ポリマーを含むことができ、任意選択的に更に１又は複数のポリマーと組み合わせている。コーティングは、ホスホン酸ホモポリマー又はヘテロポリマーであってよく、或いは、他の１又は複数のポリマーと組み合わせた、任意のホスホン酸ポリマーの混合若しくはブレンドであってよい。ポリマーの分子量は、ポリマーの目的とする用途に応じて、(調節体により「ポリマー」として規定される)ポリマーを形成する数モノマー単位の数百万の組合せの分子量であり得る。分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのがより好ましく、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至２００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのが最も好ましい。
【００５０】
好ましい実施形態において、コーティングは、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)等のホスホン酸モノマーのホモポリマーを含む。別の実施形態において、コーティングは、重合可能カルボン酸モノマーなどの第２の種類の重合可能モノマーがホスホン酸モノマーに共重合した共ポリマーである。好ましい共重合可能モノマーの例には、(メタ)アクリル酸モノマーが含まれる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、ポリマーは、ホスホノ成分及び／又はホスフィノ成分から選ばれる活性部分を組み込んでよい。ホスホノ成分又はホスフィノ成分は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸(ＶＤＰＡ)、ホスホノ置換したモノ又はジカルボン酸、次亜リン酸、又は次亜リン酸のアルカリ金属塩等の塩、からなってよい。例として、ホスホノ成分は、基本的に、ＶＰＡ、ＶＤＰＡ又はホスホノコハク酸のホモポリマーからなってよい。
【００５２】
ポリマーを組み込む組成物は更に、不飽和スルホン酸、飽和若しくは不飽和カルボン酸、不飽和アミド、第１級若しくは第２級アミン、ポリアルキレンイミン、又はアミン末端ポリアルキレングリコールなどの１又は複数の追加成分を含んでよい。例えば、ポリマー組成物は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とビニルスルホン酸(ＶＳＡ)との共ポリマー、又はビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とアクリル酸(ＡＡ)、メタクリル酸(ＭＡＡ)若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡとＶＳＡとの共ポリマー、又はＶＤＰＡとＡＡ、ＭＡＡ若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。別の例として、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡと、ＶＳＡと、ＡＡ、ＭＡＡ又はアクリルアミドの何れか１つとのターポリマーからなってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＰＡ若しくはＶＤＰＡと、又はＶＰＡとＶＤＰＡの混合物と、以下の何れか１つとの反応産物からなってよい：
ａ．第１級アミン；
ｂ．第２級アミン；
ｃ．ポリエチレンイミン；
ｄ．アミン末端ポリエチレン若しくはポリプロピレングリコール(例えばジェファミン)；及び／又は
ｅ．次亜リン酸若しくはその塩。
【００５３】
コーティングに用いる特に好ましい共ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である。
【００５４】
コーティングは、ホスホン酸ポリマーに加えて、ポリカプロラクトン(ポリ−ε−カプロラクトン)などの１又は複数の生体適合ポリマーを含むことが好ましい。本発明では、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−ｃｏ−グリコール酸)、ポリ(メタクリル酸メチル)等の他の生体適合ポリマーを用いることもできる。
【００５５】
本発明の第３の態様及び／又は第４の態様の特に好ましい実施形態において、ポリカプロラクトン及びポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)を含む医療用インプラントコーティングが提供される。
【００５６】
コーティングは、所望の任意の医療用インプラントに付与されてよいことが想定される。コーティングは、医療用インプラントの表面が、骨及び／又は歯の隣接領域(adjacent area)と接触するような用途における使用に特に適していると考えられる。従って、コーティングが付与される予定の、又付与された医療用インプラントの表面は、埋込み後に骨及び／又は歯と接触する表面であることが好ましい。医療用インプラント装置は、様々な生体適合材料から製造することができ、その一般的なものはチタンである。以下の実施例８は、ポリカプロラクトン／ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)ポリマーコーティングをチタン基板(substrate)に付与できたことを説明している。たった３日後に、インプラントのインプラント／骨接合部分において、顕著な骨芽細胞付着レベルが観察され、医療用コーティングとしての用途について、このコーティングの適合性が実証された。
【００５７】
本発明の第５の態様は、ポリカプロラクトン及びホスホン酸ポリマーを含む生体適合ポリマー組成物を提供する。
【００５８】
ポリマー組成物は、共重合したホスホン酸及びカプロラクトンモノマーを組み込む混合物、ブレンド、又はヘテロポリマーであって、任意選択的に更に１又は複数のモノマーを含んでよい。ポリマー組成物がホスホン酸成分及びポリカプロラクトン成分の混合物又はブレンドである場合、ホスホン酸成分はホスホン酸ホモポリマー又はヘテロポリマーであってよい。ポリマーの分子量は、ポリマーの目的とする用途に応じて、(調節体により「ポリマー」として規定される)ポリマーを形成する数モノマー単位の数百万の組合せの分子量であってよい。分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのがより好ましく、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至２００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあるのが最も好ましい。
【００５９】
好ましい実施形態において、ポリマー組成物のホスホン酸成分は、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)等のホスホン酸モノマーのホモポリマーを含む。別の実施形態において、ホスホン酸成分は、第２の種類の重合可能モノマーが、ホスホン酸モノマーに共重合した共ポリマーであり、第２の種類の重合可能モノマーは、例えば(メタ)アクリル酸である重合可能カルボン酸モノマーなどである。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態によると、ポリマーは、ホスホノ成分及び／又はホスフィノ成分から選ばれる活性部分を組み込んでよい。ホスホノ成分又はホスフィノ成分は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸(ＶＤＰＡ)、ホスホノ置換したモノ又はジカルボン酸、次亜リン酸、又は次亜リン酸のアルカリ金属塩等の塩、からなってよい。例として、ホスホノ成分は、基本的に、ＶＰＡ、ＶＤＰＡ又はホスホノコハク酸のホモポリマーからなってよい。
【００６１】
ポリマーを組み込む組成物は更に、不飽和スルホン酸、飽和若しくは不飽和カルボン酸、不飽和アミド、第１級若しくは第２級アミン、ポリアルキレンイミン、又はアミン末端ポリアルキレングリコールなどの１又は複数の追加成分を含んでよい。例えば、ポリマー組成物は、基本的に、ビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とビニルスルホン酸(ＶＳＡ)との共ポリマー、又はビニルホスホン酸(ＶＰＡ)とアクリル酸(ＡＡ)、メタクリル酸(ＭＡＡ)若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡとＶＳＡとの共ポリマー、又はＶＤＰＡとＡＡ、ＭＡＡ若しくはアクリルアミドとの共ポリマーからなってよい。別の例として、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＤＰＡと、ＶＳＡと、ＡＡ、ＭＡＡ又はアクリルアミドの何れか１つとのターポリマーからなってよい。代わりに、ポリマー組成物は、基本的に、ＶＰＡ若しくはＶＤＰＡと、又はＶＰＡとＶＤＰＡの混合物と、以下の何れか１つとの反応産物からなってよい：
ａ．第１級アミン；
ｂ．第２級アミン；
ｃ．ポリエチレンイミン；
ｄ．アミン末端ポリエチレン若しくはポリプロピレングリコール(例えばジェファミン)；及び／又は
ｅ．次亜リン酸若しくはその塩。
【００６２】
ポリマー組成物のホスホン酸成分に用いる特に好ましい共ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)である。このため、本発明の第５の態様の特に好ましい実施形態は、ポリカプロラクトンとポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)の混合物を含むポリマー組成物を提供する。
【００６３】
本発明の第５の態様によるポリマー組成物は、本発明の第３の態様及び第４の態様について上述したような、医療用インプラントへのコーティングとしての用途に大いに適している。さらに、本発明の第５の態様によるポリマー組成物は、注射(injection)に適した製剤への組込みに大いに適している。このような製剤は、液体医薬組成物として、注射による投与用の滅菌溶液又は懸濁液の形態で提供されてよい。本発明による注射可能な組成物はまた、必要に応じて、結合剤、懸濁化剤及び防腐剤を含んでよいことが理解できるであろう。このような薬剤の適当な例は、当該技術の当業者によく知られている。
【００６４】
本発明の第６の態様は、哺乳類の組織細胞の培養方法を提供する。この方法は、哺乳類の組織細胞を繊維状組織スキャフォールド上で培養することを含んでおり、スキャフォールドの繊維はホスホン酸ポリマーを含んでいる。そしてこの方法は、前記細胞を細胞培養用培地に曝して前記細胞のスキャフォールドへの付着を促進することを含んでいる。
【００６５】
本発明の第７の態様は、哺乳類の組織の修復又は再生方法を提供する。この方法は、哺乳類の組織細胞を繊維状組織スキャフォールド上で培養することを含んでおり、スキャフォールドの繊維はホスホン酸ポリマーを含んでいる。そしてこの方法は、前記細胞を細胞培養用培地に曝して前記細胞のスキャフォールドへの付着を促進することと、細胞が付着したスキャフォールドを、修復又は再生が必要な哺乳類の組織の近く(adjacent to)に配置することを含んでいる。
【００６６】
本発明の第８の態様は、骨粗鬆症の治療方法を提供する。この方法は、骨粗鬆症患者に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与することを含んでいる。
【００６７】
本発明の第９の態様は、パジェット病の治療方法を提供する。この方法は、パジェット病患者に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与することを含んでいる。
【００６８】
本発明の第１０の態様は、骨部位への急性外傷の治療方法を提供する。この方法は、前記急性外傷を抱える患者の前記部位に、ホスホン酸ポリマーを含む組成物の治療量を投与することを含んでいる。
【００６９】
本発明の第８、第９及び第１０の態様において、組成物は、本発明の先に規定した第５の態様によるのが好ましい。更に、組成物は、骨粗鬆症、パジェット病、又は急性外傷(例えば骨又は歯の破砕)を罹っている患者体内の部位に直接的に投与されるのが好ましい。投与は、本発明の第１の態様によるスキャフォールドの、例えば、繊維状シート若しくはフィルムとしての、又はペレット、ビーズ若しくはパッキング物質としての埋込みを介するか、注射を介することができる。
【００７０】
本発明の第１１の態様は、ホスホン酸ポリマーを含んでおり、骨粗鬆症の治療に用いる注射可能な薬物(medicament)に関する。
【００７１】
本発明の第１２の態様は、ホスホン酸ポリマーを含んでおり、パジェット病の治療に用いる注射可能な薬物に関する。
【００７２】
本発明の第１３の態様は、ホスホン酸ポリマーを含んでおり、部位への急性外傷の治療に用いる注射可能な薬物に関する。
【００７３】
本発明の第１１、第１２及び第１３の態様に用いられる薬物は、本発明の先に規定した第５の態様による組成物であるのが好ましい。
【００７４】
当業者は、前述の組成物の治療的に有効な量は、症状又は病気を治療するのに十分な量に関係することを理解するであろう。
【００７５】
治療される患者はヒト又は動物であってよい。治療される骨は、患者の骨格(skeleton)の任意の骨形成部分(bone forming part)であるか、歯であってよい。
【００７６】
局部的な(localised)非経口投与に適した本発明の組成物は、生理的に許容される任意の担体、賦形剤又は安定剤とホスホン酸ポリマーとを混合することによって、例えば、使用前に再構成される凍結乾燥粉末製剤及び非凍結乾燥粉末製剤、非水溶液及び水溶液、並びに半固体製剤の形態で調製されてよい。許容される担体は、賦形剤を含み、使用時の投与量及び濃度で受容者に対して毒性を有さない。許容される担体、適切な緩衝剤、酸化防止剤、毒性モディファイア(toxicity modifier)、防腐剤及び／又は陰イオン界面活性剤を含むが、これらに限られない。
【００７７】
本発明による組成物は、滅菌溶液か滅菌懸濁液のバイアル、アンプル、又は予め充填されたシリンジ、或いは、局所的な非経口投与に適した他の任意の医薬的に許容される形態で提供されてよい。
【００７８】
本発明の第６乃至第１０の態様に用いられるスキャフォールドは、本発明の第１の態様によるスキャフォールドの好ましい実施形態において述べたあらゆる特徴を含んでよいことは理解できるであろう。更に、本発明の第６乃至第１０の態様に用いられるスキャフォールドは、本発明の第２の態様による生体適合繊維を組み込んでよい。
【００７９】
本発明の態様の好ましい実施形態を、以下の非限定的な例を参照して明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１ａは、健康な骨の走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、図１ｂは、骨粗鬆症の骨の走査電子顕微鏡画像である。
【図２】図２ａは、５％ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)含有ポリマー溶液をエレクトロスピニングすることによって形成された繊維状物質の走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、図２ｂは、１０％ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)含有ポリマー溶液をエレクトロスピニングすることによって形成された繊維状物質の走査電子顕微鏡画像である。
【図３】図３ａは、エネルギー分散Ｘ線(ＥＤＸ)分析から作成した、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドの内部構造の色分け画像である。図３ｂは、図３ａに示した物質に関するエネルギー分散Ｘ線(ＥＤＸ)スペクトルである。
【図４】図４ａは、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドに付着したヒト骨芽細胞の５００倍に拡大した走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、図４ｂは、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドに付着したヒト骨芽細胞の１０００倍に拡大した走査電子顕微鏡画像である。
【図５】図５ａ乃至図５ｄは、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドに付着した生細胞(上側)及び死細胞(下側)の画像ペアと(図５ａ及び図５ｃ)、対照として機能するポリカプロラクトン(ＰＣＬ)から作った組織スキャフォールドに付着した生細胞(上側)及び死細胞(下側)の画像ペア(図５ｂ及び図５ｄ)である。図５ａ及び図５ｂは、２時間後に撮影した画像である。図５ｃ及び図５ｄは、２４時間後に撮影した画像である。
【図６】図６は、アリザリンレッド染色を用いて分析した組織スキャフォールドの写真であり、各スキャフォールドへのカルシウムイオンの結合レベルを判断できる。左側の組織スキャフォールドは、対照として機能するＰＣＬから作られており、右側の組織スキャフォールドは、本発明の第１の態様に従った。
【図７】図７ａ乃至図７ｄは、致命的な大きさ(１．５ｍｍ直径)の欠陥を与えた後、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドで治療した頭蓋冠サンプルの、顕微鏡Ｘ線コンピュータ断層撮影(ｍｉｃｒｏ−ＣＴ)画像(図７ａ及び図７ｃ)と、ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)から作った対照組織スキャフォールドで治療した頭蓋冠サンプルの、顕微鏡Ｘ線コンピュータ断層撮影画像である(図７ｂ及び図７ｄ)。図７ａ及び図７ｂは、１週間後に撮影した画像である。図７ｃ及び図７ｄは、６週間後に撮影した画像である。
【図８】図８は、図７ｃに示す本発明の第１の態様による組織スキャフォールド、及び図７ｄに示すＰＣＬから作った対照組織スキャフォールドについて観察された骨形成レベルを示すグラフである。
【図９】図９ａは、致命的な大きさ(１．５ｍｍ直径)の欠陥を与えた後、ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)から作った対照組織スキャフォールドで治療した頭蓋冠サンプルの、走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、図９ｂは、致命的な大きさ(１．５ｍｍ直径)の欠陥を与えた後、本発明の第１の態様による組織スキャフォールドで治療した頭蓋冠サンプルの、走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像である。これら画像は埋込み６週間後に撮影した。
【図１０】図１０は、本発明の第１の態様によるスキャフォールドの埋込み後の走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、ヒドロキシアパタイト様形成を示している。
【図１１】図１１は、本発明の第２の態様によるポリマーコーティングによりコーティングしたチタン基板の表面の走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像であり、骨芽細胞の付着及び形成を示している。
【図１２】図１２は、更なる誘導体化をせずに対照として機能するＰＣＬの繊維で作ったインビボ皮下インプラントのＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像(Faxitron X-ray image)である。
【図１３】図１３は、本発明によるスキャフォールドを与えるためにホスホン酸ポリマー組成物でコーティングしたＰＣＬの繊維で作ったインビボ皮下インプラントのＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像である。
【図１４】図１４は、更なる誘導体化をせずに第２の対照として機能するＰＣＬの繊維で作ったインビボ皮下インプラントであって、ヒト骨髄間質細胞(ＨＢＭＳＣ)に浸したインプラントのＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像である。
【図１５】図１５は、本発明によるスキャフォールドを与えるためにホスホン酸ポリマー組成物でコーティングしたＰＣＬの繊維で作ったインビボ皮下インプラントであって、ヒト骨髄間質細胞(ＨＢＭＳＣ)に浸したインプラントのＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像である。
【図１６】図１６は、蛍光強度のグラフであり、異なるホスホン酸ポリマー濃度が骨芽細胞の応答に及ぼす影響を示している。
【図１７】図１７は、破骨細胞アポトーシスのグラフであり、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社のＡｐｏｐｅｒｃｅｎｔａｇｅキットを用いて測定している。
【図１８】図１８は、３つのスキャフォールドについての細胞計数のグラフであり、スキャフォールドの１つは本発明によるもの(ＰＣＬ+Ｐ)であり、２つは比較用(対照及びＰＣＬ)である。
【図１９】図１９は、３つのスキャフォールドに付着した細胞物質の走査電子顕微鏡画像を示し、スキャフォールドの１つは本発明によるもの(ＰＣＬ+Ｐ)であり、２つは比較用(対照及びＰＣＬ)である。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
[実施例１]
スキャフォールド製造の最適化
種々のエレクトロスピニングパラメータを調べて、繊維状スキャフォールドを調製するのに最適なものを判断した。ここで、繊維状スキャフォールドとは、ホスホン酸ポリマー組成物でコーティングすることができ、及び／又はホスホン酸含有ポリマー組成物から製造した繊維を含むものである。ポリカプロラクトンの濃度を２％乃至２０％まで変化させ、そして印可電圧を変えて、最適条件を得た。
【００８２】
ポリカプロラクトン繊維をエレクトロスピニングプロセスによって製造した。アセトンを溶媒として用いて、ポリカプロラクトンペレットを、ゆっくりかき混ぜて加熱して溶解し、１０ｗ／ｖ％濃度のポリカプロラクトンを得た。
【００８３】
ポリマー溶液を１０ｍｌシリンジに入れた。１０ｍｌシリンジには直径０．８ｍｍの尖っていない針(blunted needle)を付けた。高圧電源を針に取り付け、２０ｋＶの電圧を印加した。針先から１５ｃｍの一定の距離を置いて接地コレクタプレートを配置した。
【００８４】
シリンジポンプを用いてポリカプロラクトンポリマーを針から０．０５ｍｌ／分の一定割合で供給した。電圧を印加するとテイラーコーンが形成された。これによって、接地コレクタプレートに引き付けられるポリマージェットが形成された。
【００８５】
走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)分析によって、ＰＣＬ濃度がより低い２ｗ／ｖ％及び５ｗ／ｖ％であると、繊維状マット内にビードが生じ(図２ａ参照)、ＰＣＬ濃度がより高い例えば１０ｗ／ｖ％であると、平均繊維径が２６６ｎｍである明確な形の繊維が生じる(図２ｂ参照)ことが実証された。ビードになった繊維状構造(Beaded fibrous structure)は前述の用途に望ましくない。１０ｗ／ｖ％よりもかなり高いＰＣＬ濃度、例えば１５ｗ／ｖ％を超える濃度は、その溶液の粘度のためにエレクトロスピニングに適していない。
【００８６】
以下の実施例に用いる本発明による繊維状組織スキャフォールドを、前述のように１０ｗ／ｖ％のＰＣＬポリマー溶液をエレクトロスピニングすることによって調製し、このＰＣＬスキャフォールドを、脱イオン水を含む１５ｗ／ｖ％ポリビニルホスホン酸ポリマー水溶液内に２４時間浸した。生じたＰＣＬ／ＰＶＰＡフィルムを４８時間風乾し、その後５５°Ｃに２４時間加熱した。
【００８７】
[実施例２]
スキャフォールドへのカルシウムイオン吸着
ホスホン酸ポリマーを含む本発明の第１の態様によるスキャフォールドを、カルシウム高濃度溶液に３日間浸した。３日後、エネルギー分散Ｘ線(ＥＤＸ)分析によって、高リン濃度領域におけるカルシウムイオンの増加が実証された(図３ａ参照)。リン酸カルシウム形成は骨形成にとって極めて重要であり、２元素のインビトロ凝集はインビボ骨形成に有望である。リン及びカルシウムの存在は、図３ｂに示すように、ＥＤＸスペクトルにおいて確認される。また、このスペクトルによって、液体浸漬の３日後でもリンが存在していたことが確認される。
【００８８】
[実施例３]
スキャフォールドでの細胞増殖
図４に示すように、ヒト骨芽細胞が、本発明の第１の態様によるスキャフォールドに付着し、増殖していることが示された。細胞は、スキャフォールドの表面上に広がっており、正常な骨芽細胞構造を示していることが観察された。
【００８９】
[実施例４]
スキャフォールドでの細胞生存
生死染色(Live/dead staining)により、生細胞(図５の夫々上側の画像において見ることができる)が死細胞(図５の夫々下側の画像において見ることができる)から見分けられる。２時間後、対照スキャフォールド(純粋ＰＣＬ)、及びホスホン酸ポリマーを含む本発明の第１の態様によるスキャフォールドの双方において、細胞は、予想されるように、丸みを帯びている。図５に示すように、ホスホン酸ポリマーを含むスキャフォールドでは生細胞がより多いように見えた。純粋ＰＣＬスキャフォールドでは生細胞がより少なく、死細胞がより多かった。２４時間後、細胞は、スキャフォールドの表面の端から端に亘って広がっていることが観察され、２時間の時点と同様に、本発明の第１の態様によるホスホン酸ポリマーを含むスキャフォールドでは死細胞がより少なかった。
【００９０】
[実施例５]
スキャフォールドのミネラル化能(Mineralising Capacity)−アリザリン染色
ヒト骨芽細胞を、２つの対照スキャフォールド(純粋ＰＣＬ)、及び本発明の第１の態様による２つのスキャフォールドに播種した。３週間後、カルシウムイオンの存在を識別するためにアリザリンレッド染色を行なった。図６に示すように、ホスホン酸ポリマーを含むスキャフォールドは深い赤色に染色されるが、純粋ＰＣＬスキャフォールドは赤の小さい点しかないことが観察された。この結果により、本発明の第１の態様によるホスホン酸ポリマーを含むスキャフォールドにおいて、カルシウムアパタイトがはるかに早く形成されたことが示唆される。
【００９１】
[実施例６]
スキャフォールドのミネラル化能−骨ミネラル容積
４日齢のマウス由来の頭蓋冠を無菌的に摘出し、１．５ｍｍ直径の大きさの致命的欠陥を創出した。この欠陥は、通常の状況下では治癒しない。本発明の第１の態様によるホスホン酸ポリマーを含むスキャフォールドをこのような欠陥に加え、対照スキャフォールド(純粋ＰＣＬ)を別の欠陥に加えた。総計５対のサンプルをこのようにして試験用に用意した。培養６週間後(骨形成培地−１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５ｍＭアスコルビン酸、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭβ−グリセロリン酸二ナトリウム塩が、ＤＭＥＭに補充されている)、顕微鏡Ｘ線コンピュータ断層撮影法(ｍｉｃｒｏ−ＣＴ)を用いて調べると、図７に示すように、２つのサンプル間で骨ミネラル容積に顕著な差異があった。また、処理サンプルの走査電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像により、本発明の第１の態様によるスキャフォールドは、対照スキャフォールドよりも欠陥部位内へのより良好な融合を示すことが実証された(図９ａ及び図９ｂ参照)。
【００９２】
破骨細胞は頭蓋冠にほとんど存在していないので、ホスホン酸ポリマーは骨芽細胞の活性及び破骨細胞の活性に影響を及ぼすと想定できる。５対のサンプルの骨充填パーセンテージにおける統計学的差異を図８に示す。そこから、本発明の第１の態様によるスキャフォールドは、対照スキャフォールドと比較して、骨形成の有意な増加をもたらしたと結論することができる。
【００９３】
生物医学的用途の使用に対する本発明の第１の態様によるスキャフォールドの適合性は更に、培養後のヒドロキシアパタイト様形成の観察によって実証された。
【００９４】
[実施例７]
コーティング製剤の調製
蒸留水中ポリ(ビニルホスホン酸−ｃｏ−アクリル酸)[Ｐｏｌｙ(ＶＰＡ−ｃｏ−ＡＡ)]含有１０乃至１５％固体ポリマー溶液を調製した。
【００９５】
[実施例８]
コーティング製剤の基板への付与
チタン(Ｔｉ)基板を１００°Ｃ乃至１５０°Ｃに加熱し、予熱したｐｏｌｙ(ＶＰＡ−ｃｏ−ＡＡ)のバスに浸した。その後Ｔｉ基板をバスから取り出し、水洗した。その結果、チタン基板の表面は、本発明の第２の態様の好ましい実施形態によるｐｏｌｙ(ＶＰＡ−ｃｏ−ＡＡ)のポリマーコーティングでコーティングされた。
【００９６】
３日後、図１１に示すように、コーティングへの骨芽細胞の顕著な付着が観察された。
【００９７】
[実施例９]
皮下インプラントマウスモデル
ＰＣＬスキャフォールド及びＰＣＬ−Ｐスキャフォールドを、抗真菌／抗生物質(ＡＭ／ＢＭ)溶液(Ｓｉｇｍａ社、英国)を用いて、１×ＰＢＳ中５×ＡＭ／ＢＭで１時間、１×ＰＢＳ中１×ＡＭ／ＢＭで一晩滅菌し、最終的に１×ＰＢＳで２４時間洗浄した。
【００９８】
前述のように調製した４つのＰＣＬスキャフォールドの第１セットを、更に修飾することなく以下に記載するように試験した(結果を図１２に示す)。前述のように調製した本発明による４つのＰＣＬ−Ｐスキャフォールドの第１セットを、更に修飾することなく以下に記載するように試験した(結果を図１３に示す)。
【００９９】
前述のように調製した４つのＰＣＬスキャフォールドの第２セットを、１ｍｌの１０％  ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、アルファ最小必須培地(ＭＥＭ)及び１×１０6ヒト骨髄間質細胞(ＨＢＭＳＣ)中で、ロトミックス(rotomix)を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ2平衡エアー(balanced air)のインキュベータ内で一晩インキュベートした後、以下に記載するように試験した(結果を図１４に示す)。
【０１００】
前述のように調製した本発明による４つのＰＣＬ−Ｐスキャフォールドの第２セットを、１ｍｌの１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、アルファ最小必須培地(ＭＥＭ)及び１×１０6ヒト骨髄間質細胞(ＨＢＭＳＣ)中で、ロトミックスを用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ2平衡エアーのインキュベータ内で一晩インキュベートした後、以下に記載するように試験した(結果を図１５に示す)。
【０１０１】
全てのインビボ研究について、雌ＭＦ−１ ｎｕ／ｎｕ免疫不全マウスをＨａｒｌａｎ社(英国、ラフバラ)で購入し、実験前に最低１週間馴化させた。動物はいつでも、通常のマウスの食事及び水に自由に(ad libitum)アクセスできた。全ての手順は事前に倫理的承認を受けて行ない、動物(科学的処置)法(１９８６年)にある規則に従って実行した。
【０１０２】
クラス１キャビネットにおいて、マウスの体重を量り、滅菌水中フェンタニル−フルアニソン(ヒプノルム)(Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ社)及びミダゾラム(ヒプノベル)(Ｒｏｃｈｅ社)の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。フェンタニル−フルアニソンとミダゾラムの比率は、１対１であり、１回投与量は１０ｍｌ／ｋｇであった。スカルペルＮｏ．１０を用いて脊柱の片側を縦切開した。その切開の側方に、鈍的切開により皮下袋を作出した。スキャフォールドをこの袋内にて皮下に配置し、Ｍｉｃｈｅｌ社のステープルクリップを用いて切開を接合した。群あたりｎ＝４のスキャフォールドを個々の袋に配置した。
【０１０３】
実験期間は２８日とした。
【０１０４】
実験の終わりに、高いＣＯ2濃度にマウスを曝した後、上部頸椎の位置をトランスロケーション(translocation)した。皮下細胞／スキャフォールドインプラントを摘出し、ＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像用に処理し、ミネラル化が起こったかを評価した。
【０１０５】
図１２乃至図１５を参照すると、ホスホン酸ポリマーを含まないＰＣＬスキャフォールド(図１２及び図１４)は、ミネラル化のある程度の証拠を示すが、そのミネラル化のレベルは、ホスホン酸ポリマーを含む本発明によるスキャフォールド(図１３及び図１５)で観察され得るレベルよりもかなり低いことが観察された。
【０１０６】
これらの結果は、先に記載したインビトロ細胞培養の結果を支持している。それは、ホスホン酸ポリマーの存在下でミネラル化が増したことである。本発明によるスキャフォールドによって示されたミネラル化の増加は、スキャフォールドのホスホン酸部分が骨芽細胞のミネラル化能を高めていることを示唆している。本実施例において、スキャフォールドを「骨の無い(non-bone)」領域に埋め込んだとしても、カルシウムアパタイト形成が観察されたことは留意すべきである。このことは、本発明によるスキャフォールドが骨誘導性(osteoinductive)であることを示唆している。
【０１０７】
[実施例１０]
骨芽細胞培養
ヒト骨芽細胞(ＨＯＢ)を欧州細胞カルチャーコレクション(European Collection of Cell Cultures)(英国)で購入した。細胞をダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Ｇｉｂｃｏ社、英国)内で培養した。ＤＭＥＭには、１０％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)(Ｇｉｂｃｏ社、英国)、抗生物質(１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン)(Ｇｉｂｃｏ社、英国)、１００ｎＭデキサメタゾン(Ｓｉｇｍａ社、英国)、５０μＭアスコルビン酸(Ｓｉｇｍａ社、英国)、及び１０ｍＭβ−グリセロリン酸(β-glycerophosphate)(Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国)が補充されている。
【０１０８】
細胞を７５ｃｍ2の組織培養フラスコ内で培養した。培地を２日おきに注ぎ足した(replenish)。必要な細胞をトリプシン処理によって培養フラスコから剥がす際、トリパンブルーで細胞の数及び生存率を確認した。
【０１０９】
本発明によるホスホン酸含有スキャフォールドを、セルクラウンインサート(CellCrown inserts)(Ｓｃａｆｆｄｅｘ社、フィンランド)を用いて２４ウェルプレートに固定し、ラミナーフローキャビネットにおいてエタノール濃度を連続的に上昇させて滅菌した。
【０１１０】
エタノール内での最終浸漬後、スキャフォールドを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(Ｇｉｂｃｏ社、英国)で３回洗浄し、エタノールを全く残さず除去した。細胞を数え、４０，０００細胞／ｃｍ2の濃度でスキャフォールド上に播種した。プレートを、通常の条件、即ち３７°Ｃ、９５％の湿度、５％のＣＯ2濃度で４日目まで培養した。
【０１１１】
骨芽細胞の代謝活性
第１、２、３及び４日で培地を除去し、サンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、１ｍｌの新鮮培地を１００μｌのアラマーブルー(AlamerBlue)溶液(５ｍｇレザズリン塩／４０ｍｌＰＢＳ)(Ｓｉｇｍａ社、英国)と共に加えた。
【０１１２】
プレートを３７°Ｃ、９５％の湿度、５％のＣＯ2濃度で２時間インキュベートした。２時間後、２００μｌの懸濁液を９６ウェルプレートに移した。蛍光光度計を用いて５３０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光で蛍光を測定した。結果を図１６に示す。
【０１１３】
４日の培養期間を通して、蛍光が時間と共に概して増加した。このことは、代謝活性の増加を示唆している。４日を通して、１５％のホスホン酸ポリマーを含むサンプルの代謝活性が最も高かった。２２．５％のホスホン酸ポリマーと３０％のホスホン酸ポリマーを含むサンプルについて、４日目の代謝活性に有意差は無かったが、これらの結果は４日目の１５％ホスホン酸塩(phosphonate)について得られた代謝活性よりも低い。
【０１１４】
この段階で、これらの初期結果は、アラマーブルーアッセイにより、約１５％のホスホン酸ポリマー濃度が骨芽細胞の代謝活性を高めるのに最適なレベルであることを示唆している。これらの結果はまた、ホスホン酸ポリマー濃度が約２０％を超えるにつれ、細胞の代謝活性が減少し得ることを示唆しており、ホスホン酸ポリマー濃度が高すぎると、細胞を休眠状態にさせ得るか、アポトーシスへ向かわせ得ることを示唆している。
【０１１５】
[実施例１１]
破骨細胞培養
ヒト破骨細胞前駆細胞をＬｏｎｚａ社(英国)で購入した。３０，０００細胞／ウェルの濃度で、破骨細胞基礎培地中の細胞を３つのスキャフォールドに播種した。この基礎培地は、ＲＡＮＫ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＢＳ、グルタミン及び抗生物質が補充されていた。用いた３つのスキャフォールドは、ガラススキャフォールド(対照)、ＰＣＬ製スキャフォールド(ＰＣＬ)、及びホスホン酸ポリマーをコーティングしたＰＣＬ製の本発明によるスキャフォールド(ＰＣＬ＋Ｐ)であった。
【０１１６】
４時間、６時間及び２４時間でサンプルを試験した。試験には、アポパーセンテージ(apopercentage)アポトーシス検出キット(Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、英国)を用いた。結果を図１７に示す。見て分かるように、本発明によるスキャフォールド(ＰＣＬ+Ｐ)においては、他の２つのスキャフォールド(対照及びＰＣＬ)と比較して、アポトーシスの有意な増加があった。アポトーシスの増加は、細胞アポトーシスを引き起こす破骨細胞によるＰ−Ｃの吸収を示唆している。
【０１１７】
１４日で細胞をサンプル表面から剥がし、血球計数器を用いて細胞を数えた。結果を図１８に示す。培養１４日後、本発明によるスキャフォールド(ＰＣＬ+Ｐ)においては、他の２つのスキャフォールド(対照及びＰＣＬ)と比較して、細胞数の有意な減少があった。
【０１１８】
１日及び７日で、走査電子顕微鏡法により細胞を可視化した。得られた画像を図１８に示す。１日で破骨細胞前駆体は３種のスキャフォールド全てに付着した。しかし、７日目において、本発明によるスキャフォールド(ＰＣＬ＋Ｐ)に細胞残滓の証拠があり、細胞はアポトーシスを受けたことを示唆している。７日目において、他の２つのスキャフォールド(対照及びＰＣＬ)には多核細胞の形成がある。
【図１】
2013501560.tif 000003
【図２】
2013501560.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2013501560.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2013501560.tif 000015
【図１４】
2013501560.tif 000016
【図１５】
2013501560.tif 000017
【図１６】
2013501560.tif 000018
【図１７】
2013501560.tif 000019
【図１８】
2013501560.tif 000020
【図１９】
2013501560.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月16日(2012.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホン酸ポリマーを含む、医療用インプラントコーティング。
【請求項２】
前記ホスホン酸ポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含む、請求項１に記載のコーティング。
【請求項３】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸ホモポリマー、又は他の１種若しくは複数種のポリマーを組み込んでいるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項４】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ホスホノ置換したモノカルボン酸、ホスホノ置換したジカルボン酸、次亜リン酸、次亜リン酸塩、及びホスホノコハク酸からなる群から選ばれるホスホン酸ホモポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項５】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸と、カルボン酸、スルホン酸、アミド、アミン、ポリアルキレンイミン、及びアミン末端ポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる１又は複数の更なるモノマーとのホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項６】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸とアクリル酸、ビニルホスホン酸とメタクリル酸、ビニルホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とメタクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とメタクリル酸、及びビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリルアミドからなる群から選ばれるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項７】
前記ホスホン酸ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸‐ｃｏ‐アクリル酸)である、請求項１に記載のコーティング。
【請求項８】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項１乃至７の何れかに記載のコーティング。
【請求項９】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至８の何れかに記載のコーティング。
【請求項１０】
約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至９の何れかに記載のコーティング。
【請求項１１】
ホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられた、医療用インプラント。
【請求項１２】
前記コーティングは、請求項１乃至１０の何れかに記載のコーティングである、請求項１１に記載のインプラント。
【請求項１３】
少なくとも１種のホスホン酸ポリマーを含む、生体適合繊維。
【請求項１４】
前記繊維は、第１の種類のホスホン酸ポリマーから形成される、請求項１３に記載の繊維。
【請求項１５】
スキャフォールドの繊維には、第２の種類のホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられている、請求項１３又は請求項１４に記載の繊維。
【請求項１６】
ポリカプロラクトン及びホスホン酸ポリマーを含む、生体適合ポリマー組成物。
【請求項１７】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１６又は請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
約７乃至１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１６又は請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
骨粗鬆症、パジェット病、及び骨部位への急性外傷からなる群から選ばれる症状の治療に用いる、ホスホン酸ポリマーを含む注射可能な薬物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月24日(2012.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホン酸ポリマーを含む、医療用インプラントコーティング。
【請求項２】
前記ホスホン酸ポリマーは、少なくとも１つのホスホノ部分又はホスフィノ部分を含む、請求項１に記載のコーティング。
【請求項３】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸ホモポリマー、又は他の１種若しくは複数種のポリマーを組み込んでいるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項４】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ホスホノ置換したモノカルボン酸、ホスホノ置換したジカルボン酸、次亜リン酸、次亜リン酸塩、及びホスホノコハク酸からなる群から選ばれるホスホン酸ホモポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項５】
前記ホスホン酸ポリマーは、ホスホン酸と、カルボン酸、スルホン酸、アミド、アミン、ポリアルキレンイミン、及びアミン末端ポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる１又は複数の更なるモノマーとのホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項６】
前記ホスホン酸ポリマーは、ビニルホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸とアクリル酸、ビニルホスホン酸とメタクリル酸、ビニルホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とビニルスルホン酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とメタクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸とアクリルアミド、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリル酸、ビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とメタクリル酸、及びビニリデン−１，１−ジホスホン酸、ビニルスルホン酸とアクリルアミドからなる群から選ばれるホスホン酸ヘテロポリマーである、請求項１に記載のコーティング。
【請求項７】
前記ホスホン酸ポリマーは、ポリ(ビニルホスホン酸‐ｃｏ‐アクリル酸)である、請求項１に記載のコーティング。
【請求項８】
ホスホン酸ポリマーの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある、請求項１乃至７の何れかに記載のコーティング。
【請求項９】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至８の何れかに記載のコーティング。
【請求項１０】
約１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１乃至９の何れかに記載のコーティング。
【請求項１１】
ホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられた、医療用インプラント。
【請求項１２】
前記コーティングは、請求項１乃至１０の何れかに記載のコーティングである、請求項１１に記載のインプラント。
【請求項１３】
少なくとも１種のホスホン酸ポリマーを含む、生体適合繊維。
【請求項１４】
前記繊維は、第１の種類のホスホン酸ポリマーから形成される、請求項１３に記載の繊維。
【請求項１５】
スキャフォールドの繊維には、第２の種類のホスホン酸ポリマーを含むコーティングが与えられている、請求項１３又は請求項１４に記載の繊維。
【請求項１６】
ポリカプロラクトン及びホスホン酸ポリマーを含む、生体適合ポリマー組成物。
【請求項１７】
約７乃至２０ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
約７乃至１５ｗ／ｖ％のホスホン酸ポリマーを含む、請求項１６又は請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
骨粗鬆症、パジェット病、及び骨部位への急性外傷からなる群から選ばれる症状の治療に用いる、ホスホン酸ポリマーを含む注射可能な薬物。
【国際調査報告】
2013501560.tif 000022
2013501560.tif 000023
2013501560.tif 000024
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