(57)【要約】【課題】嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する微生物が望まれていた。【解決手段】本発明は、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８で寄託された微生物である。【選択図】図１
2015012822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８で寄託された微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物を炭化水素化合物または油分で汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、工場やガソリンスタンドなどの跡地を再利用する際に、跡地の土壌が鉱物油やその他の化学物質に汚染されている場合があり、これら汚染土壌への対策が必要になっている。
そして、このような汚染土壌の浄化方法の１つに、微生物が有する汚染物質の分解能を利用したバイオレメディエーション法がある。またこのようなバイオレメディエーション法に用いる新規な微生物が各種単離されている（特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４２２７８６１号公報
【特許文献２】特許第４３９５８７０号公報
【特許文献３】特許第４８３６５５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１〜３に記載されている新規微生物は、全て好気条件下において分解能力が発現するものであり、嫌気条件下において分解能力が発現するものであるかは不明である。
【０００５】
ここで一般的に、汚染土壌の浄化では、地表面近傍においては空気が供給されることから好気状態での浄化が行われることになるが、地表面から深くなるにしたがって空気が供給されにくくなることから徐々に嫌気状態となってくる。加えて、バイオレメディエーション法において用いられている微生物は一般的に好気条件下において分解能力を発現するものである。
従って、従前の汚染土壌の浄化においては、地表面から深い土壌においても微生物の分解能力を発現させるために、地中内に空気を供給する配管を設置したり、定期的に土壌を撹拌したりすることなどを行って、人為的に地中深くの土壌についても好気条件を作り出すことが行われている。
【０００６】
しかしながら、空気供給用の配管を設置したり、定期的に土壌を撹拌したりすることは、設備が大規模化し、浄化コストの上昇に繋がってしまうという問題がある。
【０００７】
そこで、空気を供給しなくても汚染土壌を分解することができれば、空気供給用の配管などの設備が不要となり、省力化を実現することができる。また、浄化コストも下げることができることにもなる。
【０００８】
今回、本願発明者らは、鋭意検討を行った結果、嫌気条件下においても炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物を単離することに成功したのである。
すなわち、本発明は従前のバイオレメディエーション法による汚染土壌の浄化における上記の問題点に鑑みてなされたものであって、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の請求項１は、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８で寄託された微生物である。
【００１０】
本発明の請求項２は、請求項１に記載の微生物を炭化水素化合物または油分で汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８で特定される新規微生物を用いることで、嫌気条件下においても油分で汚染された土壌や水の浄化を行うことができる。その結果、設備の省力化を図ることができ、浄化コストも下げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６）の分子系統解析結果である。
【図２】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６）のコロニー像である。
【図３】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６）のグラム染色像である。
【図４】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８）の分子系統解析結果である。
【図５】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８）のコロニー像である。
【図６】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８）のグラム染色像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る微生物は、Pseudomonas属に属するものであり、さらにシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas  aeruginosa）に帰属するものであり、株名は１５−Ｂ株と５５−Ｄ株である。また、本発明に係る微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構
特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に平成２５年６月１７日に受託されており、その受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６（１５−Ｂ株）とＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８（５５−Ｄ株）である微生物である。
なお、本発明に係る微生物については、炭化水素化合物または油分を分解する能力を有しつつ、紫外線照射や放射線照射などの公知の手法にて変異をさせた変異株や、自然界において変異した変異株も含まれるものである。
【００１４】
本発明に係る微生物の単離方法は以下の通りである。
（１）１次スクリーニング
まず、土壌サンプル０．１ｇを１．５ｍｌ容マイクロチューブに入れ、蒸留水１ｍｌを加えてボルテックスミキサーで撹拌し、土壌懸濁液を作製した。次に、１０ｍｌ容バイアル瓶にＡ重油を０．２％（ｗ／ｖ）含む改変ＳＷ培地１０ｍｌと、作製した土壌懸濁液１％（ｖ／ｖ）を加え、窒素を充填した嫌気ボックス内で密閉した。これを３０℃の環境恒温下で培養し、濁度が上昇した培養液１００  μＬをＧＡＭ寒天培地（ＧＡＭ培地に寒天末を２０ｇ／Ｌとなるように加えたもの）に塗布した。そして、このプレートを３０℃、７２時間静置培養し、単離できたコロニーを１次スクリーニング通過サンプルとした。なお、改変ＳＷ培地の組成を表１に、ＧＡＭ培地の組成を表２に示す。
【００１５】
【表１】
2015012822.tif 000003
【００１６】
【表２】
2015012822.tif 000004
（２）２次スクリーニング
次に、１０ｍｌ容バイアル瓶に改変ＳＷ培地１０ｍｌを入れて１次スクリーニング通過菌株を植菌した後、これにＡ重油を０．２％（ｖ／ｖ）加えて嫌気ボックス内で密栓し、３０℃、７２時間振盪培養した。そして、増殖が見られたサンプルを２次スクリーニング通過菌株とした。
（３）３次スクリーニング
最後に、３次スクリーニングを行うことによって、本発明に係る微生物１５−Ｂ株、５５−Ｄ株を単離した。具体的には、まずＧＡＭ培地で２次スクリーニング通過菌株を一晩培養し、前培養液を作製した。次に、５００ｍｌ容培養瓶に改変ＳＷ培地５００ｍｌを入れ、作製した前培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌した。さらにＡ重油を０．２％（ｗ／ｖ）加えて嫌気ボックス内で密栓し、３０℃、７２時間振盪培養した。そして、増殖が見られたサンプルに、クロロホルム・メタノール（３：１）混合溶液を３０％入れてよく撹拌し、残存油分を抽出した。Ａ重油の初期添加量と残存量を比較し、減少が認められたものをスクリーニング取得菌株すなわち本発明に係る微生物１５−Ｂ株、５５−Ｄ株とした。
【００１７】
（１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６））
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の分類学的性質及び形態的性質を説明する。
【００１８】
（分類学的性質）
まず、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の塩基配列は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ塩基配列である。
次に、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表３に示す結果となり、Pseudomonas属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas  aeruginosa  ＤＳＭ５００７１株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
さらに、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行った結果においても表４に示す通り、Pseudomonas属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas  aeruginosa  ＡＴＣＣ１０１４５株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
【００１９】
【表３】
2015012822.tif 000005
【００２０】
【表４】
2015012822.tif 000006
【００２１】
次に、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析を行ったところ図１に示す結果となり、Pseudomonas属の種で形成されるクラスターに含まれ、ブーツストラップ確率が１００％でPseudomonas aeruginosaと同一の分類系統学的位置を示した。
【００２２】
（形態的性質）
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の形態観察を、LB寒天培地（Polypeptone ：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、Agar：２０ｇ／Ｌ）上で、３０℃下、培養２４時間において行ったところ以下に示す通り、桿菌で、黄色のコロニー色を示した。コロニー像を図２に、グラム染色像を図３に示す。
細胞形態      ：  桿菌（０．７−０．８×１．０−１．２μｍ）
グラム染色    ：  −
芽胞形成      ：  −
コロニー色調  ：  黄色
【００２３】
（培養条件、保管条件）
最後に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の培養条件、保管条件を以下に示す。なお、以下に記載の培養条件、保管条件は一例に過ぎず、本発明に係る微生物１５−Ｂ株が増殖できるものであれば特に限定されるものではない。
［培養条件］
培地名：LB培地（Polypeptone：１０ｇ／Ｌ、Extract  Yeast  Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）
培養温度：３０℃
培養期間：１〜２日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性：不要
［保管条件］
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：５℃付近、保護剤の組成：１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ無調整、加圧滅菌（１１５℃、１５分））
凍結法による保管（−８０℃付近）：可能（保護剤：２０％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：１ヶ月、保管温度：５℃）
【００２４】
以上の分類学的性質（塩基配列解析）および形態的性質（形状的特徴）の結果から、本発明に係る微生物１５−Ｂ株はPseudomonas aeruginosaに属せしめるのが適当であることが認められた。
ここで、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する微生物であるが、Pseudomonas aeruginosaに属する微生物においてこのような能力を有する微生物はこれまで単離されていない。
従って、これらの結果から本発明に係る微生物１５−Ｂ株は新規微生物であることが確認できた。なお、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は好気条件下においても生育可能な通性嫌気性微生物であるため、使用状況が嫌気条件下のみに限定されるものではない。
【００２５】
また、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有するものであることから、水中においても特段空気の供給を行うことなく使用することができる。従って、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、汚染土壌の浄化だけでなく、汚染水の浄化にも使用することができる。
【００２６】
さらに、本発明に係る微生物１５−Ｂ株を使用する際には、必要に応じて適宜、窒素やリンなどの栄養素や各種の栄養塩を添加することもできる。
【００２７】
（５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８））
次に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の分類学的性質及び形態的性質を説明する。
【００２８】
（分類学的性質）
まず、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の塩基配列は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ塩基配列である。
次に、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表５に示す結果となり、Pseudomonas属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas  aeruginosa ＤＳＭ５００７１株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
さらに、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行った結果においても表６に示す通り、Pseudomonas属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas  aeruginosa ＡＴＣＣ１０１４５株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
【００２９】
【表５】
2015012822.tif 000007
【００３０】
【表６】
2015012822.tif 000008
【００３１】
次に、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析を行ったところ図４に示す結果となり、Pseudomonas属の種で形成されるクラスターに含まれ、ブーツストラップ確率が１００％でPseudomonas aeruginosaと同一の分類系統学的位置を示した。
【００３２】
（形態的性質）
次に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の形態観察を、LB寒天培地（Polypeptone ：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、Agar：２０ｇ／Ｌ）上で、３０℃下、培養２４時間において行ったところ以下に示す通り、桿菌で、黄色のコロニー色を示した。コロニー像を図５に、グラム染色像を図６に示す。
細胞形態      ：  桿菌（０．７−０．８×１．０−１．２μｍ）
グラム染色    ：  −
芽胞形成      ：  −
コロニー色調  ：  黄色
【００３３】
（培養条件、保管条件）
最後に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の培養条件、保管条件を以下に示す。なお、以下に記載の培養条件、保管条件は一例に過ぎず、本発明に係る微生物５５−Ｄ株が増殖できるものであれば特に限定されるものではない。
［培養条件］
培地名：LB培地（Polypeptone：１０ｇ／Ｌ、Extract  Yeast  Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）
培養温度：３０℃
培養期間：１〜２日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性：不要
［保管条件］
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：５℃付近、保護剤の組成：１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ無調整、加圧滅菌（１１５℃、１５分））
凍結法による保管（−８０℃付近）：可能（保護剤：２０％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：１ヶ月、保管温度：５℃）
【００３４】
以上の分類学的性質（塩基配列解析）および形態的性質（形状的特徴）の結果から、本発明に係る微生物５５−Ｄ株はPseudomonas aeruginosaに属せしめるのが適当であることが認められた。
ここで、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する微生物であるが、Pseudomonas aeruginosaに属する微生物においてこのような能力を有する微生物はこれまで単離されていない。
従って、これらの結果から本発明に係る微生物５５−Ｄ株は新規微生物であることが確認できた。なお、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は好気条件下においても生育可能な通性嫌気性微生物であるため、使用状況が嫌気条件下のみに限定されるものではない。
【００３５】
また、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有するものであることから、水中においても特段空気の供給を行うことなく使用することができる。従って、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、汚染土壌の浄化だけでなく、汚染水の浄化にも使用することができる。
【００３６】
さらに、本発明に係る微生物５５−Ｄ株を使用する際には、必要に応じて適宜、窒素やリンなどの栄養素や各種の栄養塩を添加することもできる。
【実施例】
【００３７】
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株および５５−Ｄ株について、嫌気条件下における炭化水素化合物または油分の分解能を実施例に基づいて説明する。
【００３８】
（実施例１）
まず、嫌気性ボックス（Thermo Scientific社製）内で改変ＳＷ培地にＡ重油を２０００ｐｐｍ添加することによって試験用培地を作製した。
【００３９】
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株を上記の試験用培地に添加し、３０℃で７２時間静置培養した。
【００４０】
最後に、培養後の試験用培地の油分を有機溶媒にて抽出し、残存油分濃度をガスクロマトグラフィーにて分析することで、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の嫌気条件下における炭化水素化合物または油分の分解能を評価した。
【００４１】
（実施例２）
１５−Ｂ株を５５−Ｄ株に変更した以外は実施例１と同様にして、実施例２を行った。
【００４２】
その結果、微生物１５−Ｂ株を添加した実施例１は７２時間後のＡ重油が７．３％低下し、微生物５５−Ｄ株を添加した実施例２は７２時間後のＡ重油が７．２％低下した。
従って、本発明に係る微生物１５−Ｂ株および５５−Ｄ株は、従前の微生物では生育が困難である嫌気条件下においても生育するだけでなく、かかる条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を発現するものであることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明に係る微生物は、バイオレメディエーション法による汚染土壌または汚染水の浄化に用いることができる。
【受託番号】
【００４４】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９６
【００４５】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１５９８
【図１】
2015012822.tif 000009
【図２】
2015012822.tif 000010
【図３】
2015012822.tif 000011
【図４】
2015012822.tif 000012
【図５】
2015012822.tif 000013
【図６】
2015012822.tif 000014
【配列表】
2015012822000001.app