(57)【要約】  本明細書には、イソプレンの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法が提供される。同様に、本明細書は、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法も提供する。【選択図】図２９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の組み換え細胞又はそれらの子孫細胞であって、前記細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、前記核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、
前記エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、
得られる前記組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する、組み換え細胞又はそれらの子孫細胞。
【請求項２】
前記エシェリキア・コリ染色体に、モリブデン取り込みポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項３】
前記モリブデン取り込みポリペプチドが、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択される、請求項２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項４】
前記エシェリキア・コリ染色体に、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項５】
前記ガラクトース代謝ポリペプチドがｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項４に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項６】
前記エシェリキア・コリ染色体に、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピー及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードする非相同性の核酸の１つ以上のコピーが更に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項７】
（ａ）前記ＰＧＬポリペプチドがエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）前記モリブデン取り込みポリペプチドが、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）前記ガラクトース代謝ポリペプチドが、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項８】
前記ＰＧＬポリペプチド、ガラクトース代謝ポリペプチド、及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードしている核酸が、図２０に示すような１７，２５７塩基対片の一部である、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項９】
前記細胞が、（ａ）及び（ｂ）を含有しない同様の細胞よりもより高い比生産性でイソプレンを生産する、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１０】
比生産性が少なくとも１５ｍｇ／ＯＤ／時間である、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１１】
前記ＰＧＬポリペプチド、モリブデン取り込みポリペプチド、及び／又はガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている核酸が、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５の誘導体である、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１２】
前記細胞がエシェリキア・コリ株Ｂのものである、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１のものである、請求項１２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のものである、請求項１２に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１５】
更に（ｃ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする非相同性の核酸を含む、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１６】
更に（ｄ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする非相同性の核酸を含む、請求項７に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１７】
前記ＭＶＡ経路上流のポリペプチドが：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１８】
前記ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項１９】
（ａ）前記ＰＧＬポリペプチドがエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）前記モリブデン取り込みポリペプチドがｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）前記ガラクトース代謝ポリペプチドが、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される、請求項１６に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項２０】
イソプレン合成酵素がウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来である、請求項１に記載の組み換えエシェリキア・コリ細胞。
【請求項２１】
イソプレン生産法であって：
（ａ）イソプレンを生産させるために、請求項１又は７に記載の組み換え細胞を含む組成物を、好適な培養条件下で培養すること、並びに
（ｂ）イソプレンを生産させること、を含む、方法。
【請求項２２】
更に、前記イソプレンを回収することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組み換え細胞が、約１５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
メバロン酸生産法であって、
（ａ）メバロン酸生産に好適な培養条件下で、請求項１５に記載の組み換え細胞を含む組成物を培養すること、並びに
（ｂ）メバロン酸を生産させること、を含む、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の組み換え細胞の製造方法であって：
（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸をエシェリキア・コリ細胞に形質導入すること（ここで、前記エシェリキア・コリ細胞は組み換え前にＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を含有しない）；
（ｂ）前記ＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸を、エシェリキア・コリ染色体に組み込むこと；及び
（ｃ）イソプレン合成酵素をコードしている非相同性の核酸（１つ以上）をエシェリキア・コリ細胞に１つ以上導入すること；を含む、製造方法。
【請求項２６】
請求項１又は７に記載の組み換え細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／２８９，９５９号（２００９年１２月２３日出願）に対する優先権を主張するものであり、その開示は本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、エシェリキア・コリ（E. coli）での生化学物質の生産を増加させるよう改良された組成物及び方法、並びにエシェリキア・コリによるイソプレンの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えばイソプレンは、多数の化学組成物及びポリマーの合成において中間体又は出発物質として採用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
【０００４】
１９６０年代初頭にイソプレンのステレオ制御重合が工業的に可能になり、イソプレンはｃｉｓ−１，４−ポリブタジエンの合成に利用される重要なモノマーになった。このようなステレオ制御重合により調製されたシス−１，４−ポリイソプレンは、構造及び特性が天然ゴムと類似する。イソプレンは天然ゴムと同一ではないものの、多くの用途において天然ゴムの代わりに使用できる。例えば、合成シス−１，４−ポリイソプレンゴムは、車両用タイヤ及び他のゴム製品の製造に幅広く使用される。合成シス−１，４−ポリイソプレンゴムに対するこれらの需要が、世界市場で利用可能なイソプレンの大部分を占める。残りのイソプレンは、他の合成ゴム、ブロックコポリマー、及び他の化学製品の製造に使用される。例えば、イソプレンは、ブタジエン−イソプレンゴム、スチレン−イソプレンコポリマーゴム、スチレン−イソプレン−ブタジエンゴム、スチレン−イソプレン−スチレン−ブロックコポリマー、スチレン−イソプレンブロックコポリマーの製造に使用される。
【０００５】
工業用途で使用されるイソプレンは、典型的には石油又は粗製ガソリンの熱分解時の副生成物として生産され、あるいはさもなければ石油化学製品流（petrochemical streams）から抽出される。このプロセスは比較的高価であり、エネルギーを大量消費する。石油化学系製品に対する世界的な需要は一貫して増加しているため、イソプレンの価格は長期的に高騰することが見込まれ、供給はいずれにせよ制限されることになる。将来的に、石油化学系資源からのイソプレンの供給が、事業のニーズを満たすのには不十分なものになり、前例のないレベルにまで価格が高騰しかねないことに対し関心が集まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、イソプレンの、低価格で環境に親和的な再生可能資源が必要とされている。本明細書に記載される改良法及び改良組成物は、このような、低価格でかつ再生可能資源から誘導することができるイソプレン資源を提供する。
【０００７】
再生可能資源からイソプレンを生産するにあたり、現在までにいくつかの前進が起きた（例えば、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号を参照されたい）。このような方法は、堅調な商業プロセスによる需要に応えるのに十分な速度、力価、及び純度でイソプレンを生産するが、しかしながら生物資源から誘導されるイソプレンの生産と関係のある運用コストを削減し、イソプレンの収率を上昇させるような工程改善が、例えば、イソプレンの生産を増加させ及び本明細書において提供される生物活性を有する他の非相同ポリペプチドの生産を増加させるなどするための、改良された組成物及び方法が必要とされている。
【０００８】
本明細書に引用されるすべての特許、特許公開、文書、ヌクレオチド及びタンパク質配列のデータベースアクセッション番号、並びに論文は、参照により本明細書にその全文が組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書には、イソプレンの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法が開示される。同様に、本明細書は、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産を増加させるよう改良された組成物及び方法も提供する。本発明は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしている核酸を欠損したエシェリキア・コリ株の染色体に、ＰＧＬを組み込むことで、異なる種類の産物、例えば、イソプレン又はメバロン酸の生産が改良されるという観測に基づくものである。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、イソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の組み換え細胞（１種又は複数）、又はそれらの子孫細胞を提供し、細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、ここで、得られる組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する。
【００１１】
本明細書における任意の態様では、モリブデン取り込みポリペプチドをコードしている非相同性の核酸の１つ以上のコピーをエシェリキア・コリ染色体に更に組み込む。本明細書における任意の態様では、モリブデン取り込みポリペプチドは、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸の１つ以上のコピーをエシェリキア・コリ染色体に更に組み込む。本明細書における任意の態様では、ガラクトース代謝ポリペプチドは、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、更に、ガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸の１つ以上のコピー及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードしている非相同性の核酸の１つ以上のコピーをエシェリキア・コリ染色体に組み込む。本明細書における任意の態様では、（ａ）ＰＧＬポリペプチドはエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）モリブデン取り込みポリペプチドは、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）ガラクトース代謝ポリペプチドは、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、ＰＧＬポリペプチド、ガラクトース代謝ポリペプチド、及びモリブデン取り込みポリペプチドをコードしている核酸は、図２０に示すように、１７，２５７塩基対断片の一部である。本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含有しない同様の細胞よりもより高い比生産性でイソプレンを生産する。
【００１２】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、少なくとも１５ｍｇ／ＯＤ／時間の比生産性を有する。本明細書における任意の態様では、ＰＧＬポリペプチド、モリブデン取り込みポリペプチド、及び／又はガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている核酸は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５の誘導体である。本明細書における任意の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株Ｂのものである。本明細書における任意の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１のものである。本明細書における任意の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のものである。
【００１３】
本明細書における任意の態様では、組み換えエシェリキア・コリ細胞は、更に（ｃ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。
【００１４】
本明細書における任意の態様では、組み換えエシェリキア・コリ細胞は、更に（ｄ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、（ａ）ＰＧＬポリペプチドはエシェリキア・コリＰＧＬポリペプチドであり；（ｂ）モリブデン取り込みポリペプチドは、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣからなる群から選択され；並びに（ｃ）ガラクトース代謝ポリペプチドは、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥからなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のものである。
【００１５】
本発明は、イソプレンの生産方法も提供し、この方法は：（ａ）本明細書に記載される任意の組み換え細胞を含む組成物を、イソプレンの生産に好適な培養条件下で培養すること、並びに（ｂ）イソプレンを生産させること、を含む。一部の態様では、この方法は更に、イソプレンを回収することを含む。他の態様では、組み換え細胞が有する具体的なイソプレン生産効率は約１５ｍｇ／ＯＤ／時間を超える。
【００１６】
本発明は、メバロン酸塩の生産方法も提供し、この方法は：（ａ）請求項１５の組み換え細胞を含む組成物をメバロン酸塩の生産に好適な培養条件下で培養すること、並びに（ｂ）メバロン酸塩を生産させること、を含む。一部の態様では、この方法は更にメバロン酸塩を回収することを含む。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載される任意の組み換え細胞を製造する方法も提供し、この方法は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸をエシェリキア・コリ細胞に形質導入すること（ここで、エシェリキア・コリ細胞は組み換え前にＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸を含有しない）；（ｂ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸を、エシェリキア・コリ染色体に組み込むこと；及び（ｃ）イソプレン合成酵素をコードしている非相同性の核酸をエシェリキア・コリ細胞に１つ以上導入すること、を含む。
【００１８】
本発明は本明細書に記載される任意の組み換え細胞を含む組成物も提供する。
【００１９】
他の態様では、本明細書では、ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ細胞株の細胞を提供し、ここで、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられる、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含みかつ生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸を含み、並びに細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられる、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも比生産性の高い生物活性を有する非相同ポリペプチドを生産する。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキス及び１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス（Pseudomonas）属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【００２０】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドは、テルペノイド（イソプレノイド）又はカロテノイド化合物の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを含み、並びに細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞と比べ、高い比生産性でテルペノイド又はカロテノイドを生産する。一部の態様では、テルペノイドはヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより大きなポリテルペノイドからなる群から選択される。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドはゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンである。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドはゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンである。一部の態様では、トリテルペノイドはスクアレン又はラノステロールである。一部の態様では、テトラテルペノイドはリコピン又はカロテンである。一部の態様では、カロテノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロテンはα−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
【００２１】
他の態様では、本明細書では、ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ細胞株の細胞を提供し、ここで、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられる、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含みかつイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同的な核酸を含み、並びに細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられる、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりもイソプレン比生産性が高い。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。一部の態様では、細胞は更に、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドである。
【００２２】
一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス（Enterococcus）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＫポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものである。
【００２３】
一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキス及び１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス（Pseudomonas）属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【００２４】
一部の態様では、細胞は、約２０ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、細胞は、約２５ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２０ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２５ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。
【００２５】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、１つの核酸はイソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドはイソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。
【００２６】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはプエラリア（Pueraria）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、タイワンクズ（Pueraria montana）から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（Populus）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）から天然に生じるポリペプチドである。
【００２７】
一部の態様では、細胞は、（ｉ）グルコースイソメラーゼプロモーター及びメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）をコードしている核酸；ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードしている核酸；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）をコードしている核酸；及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードしている核酸；を含む、ＭＶＡ経路の下流をコードしている、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）由来の組み換え核酸；（ｉｉ）ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素をコードしている核酸；（ｉｉｉ）メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼをコードしている核酸；並びに（ｉｖ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチドをコードしている核酸；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチドをコードしている核酸；及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドをコードしている核酸；を含む、ＭＶＡ経路上流をコードしている、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の核酸、を含む。
【００２８】
別の態様では、本明細書では、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産に関する改良法を提供し、この方法は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞を培養すること（ここで、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸を含む）；並びに（ｂ）生物活性を有する非相同ポリペプチドを生産させること（ここで、細胞を最少培地で培養した場合に、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性で非相同ポリペプチドを生産する）；を含む。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、この方法は更に、生物活性を有する非相同ポリペプチドを回収する工程を含む。
【００２９】
一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキス及び１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有する非相同ポリペプチドは、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有する非相同ポリペプチドはシュードモナス属由来のものである。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【００３０】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドは、テルペノイド（イソプレノイド）又はカロテノイド化合物の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを含み、並びに細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞と比べ、高い比生産性でテルペノイド又はカロテノイドを生産する。一部の態様では、テルペノイドはヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより大きなポリテルペノイドからなる群から選択される。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドはゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンである。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドはゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンである。一部の態様では、トリテルペノイドはスクアレン又はラノステロールである。一部の態様では、テトラテルペノイドはリコピン又はカロテンである。一部の態様では、カロテノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。
【００３１】
他の態様では、本明細書では、イソプレンの生産に関する改良法が提供され、この方法は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞を培養すること（ここで、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む）；並びに（ｂ）イソプレンを生産させること（ここで、細胞を最少培地で培養した場合に、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりもイソプレン比生産性が高い）；を含む。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、改良法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。一部の態様では、細胞は更に、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドである。
【００３２】
一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス（Enterococcus）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＫポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものである。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキス及び１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５又はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス（Pseudomonas）属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【００３３】
一部の態様では、細胞は、約２０ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、細胞は、約２５ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、ここで、細胞は約２０ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、ここで、細胞は約２５ｍｇ／Ｌブロス／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。
【００３４】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、１つの核酸はイソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドはイソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはプエラリア（Pueraria）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、タイワンクズ（Pueraria montana）から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（Populus）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）から天然に生じるポリペプチドである。
【００３５】
一部の態様では、細胞は、（ｉ）グルコースイソメラーゼプロモーター及びメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）をコードしている核酸；ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードしている核酸；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）をコードしている核酸；及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードしている核酸；を含む、ＭＶＡ経路の下流をコードしている、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）由来の組み換え核酸；（ｉｉ）ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素をコードしている核酸；（ｉｉｉ）メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼをコードしている核酸；並びに（ｉｖ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチドをコードしている核酸；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチドをコードしている核酸；及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドをコードしている核酸；を含む、ＭＶＡ経路上流をコードしている、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来の核酸、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】イソプレンのＭＶＡ及びＤＸＰ代謝経路を示す（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７〜４２９，２００５に基づく）。以降の記載には、経路中の各ポリペプチドに対する別名を包含し、並びに記載のポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示する参照を包含する。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ  ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ，ＭｖａＳ，ＥＣ  ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４０６５〜４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ  １．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ１２，ＥＣ  ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９〜１４，１９９１．ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ８，ＥＣ  ２．７．４．２，アッセイ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：６２０〜６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ，ＭＶＤ１，ＥＣ  ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３３５５〜１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ，ＩＤＩ１，ＥＣ  ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９〜１９１７５，１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ，ｄｘｓ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９４：１２８５７〜６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ，ｄｘｒ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６〜４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ，ＩｓｐＤ，ＥＣ  ２．７．７．６０．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：６４５１〜６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ，ＩｓｐＥ，ＥＣ  ２．７．１．１４８．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：１０６２〜１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ，ＩｓｐＦ，ＥＣ  ４．６．１．１２．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９６：１１７５８〜１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ，ｉｓｐＧ，ＥＣ  １．１７．４．３．アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９１６８〜９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ，ＩｓｐＨ，ＥＣ  １．１７．１．２．アッセイ：ＪＡＣＳ，１２６：１２８４７〜１２８５５，２００４。
【図１Ｂ】古典的ＭＶＡ経路及び改良型ＭＶＡ経路を例示する。１，アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＣＴ）；２，ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）；３，ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；４，メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；５，ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；６，ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ又はＤＰＭＤＣ）；７，イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；８，ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）；９，イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）。古典的ＭＶＡ経路が反応５及び６を介し反応１〜反応７を進行する一方、改良型ＭＶＡ経路は反応８及び９を経由する。構造式中のＰ及びＰＰはそれぞれホスフェート及びピロホスフェートである。この図は、Ｋｏｇａ及びＭｏｒｉｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７１：９７〜１２０，２００７から取り込んだ。改良型ＭＶＡ経路は、例えば、一部の古細菌、例えばメタノサルシナ・マゼイ中に存在する。
【図２】ｐＥＴ２４ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＨＧＳのプラスミドマップ。
【図３Ａ】ｐＥＴ２４ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＨＧＳプラスミドのヌクレオチド配列である（配列番号１）。
【図３Ｂ】ｐＥＴ２４ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＨＧＳプラスミドのヌクレオチド配列である（配列番号１）。
【図４】ＥＷＬ２３０プラスミドコンストラクトのエンドヌクレアーゼ消化に関し使用される制限部位、並びにＢｓｐＨＩ部位及びＮｃｏＩ部位間の相補性接着端を示す概略図。
【図５】ＥＷＬ２３０のプラスミドマップ。
【図６Ａ】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列である（配列番号２）。
【図６Ｂ】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列である（配列番号２）。
【図７】プラスミドコンストラクトＥＷＬ２４４のエンドヌクレアーゼ消化に関し使用される制限部位、並びにＮｓｉＩ部位及びＰｓｔＩ部位間の相補性接着端を示す概略図。
【図８】ＥＷＬ２４４のプラスミドマップ。
【図９Ａ】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列である（配列番号３）。
【図９Ｂ】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列である（配列番号３）。
【図１０Ａ】メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌の下流経路のオペロンのマップ。
【図１０Ｂ】メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌の下流経路のオペロンのヌクレオチド配列である（配列番号４）。
【図１０Ｃ】メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌の下流経路のオペロンのヌクレオチド配列である（配列番号４）。
【図１１Ａ】ｐＥＴ２００Ｄのメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌由来のＭＣＭ３７６−ＭＶＫマップ。
【図１１Ｂ】ｐＥＴ２００Ｄのメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌由来のＭＣＭ３７６−ＭＶＫヌクレオチド配列である（配列番号５）。
【図１１Ｃ】ｐＥＴ２００Ｄのメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）古細菌由来のＭＣＭ３７６−ＭＶＫヌクレオチド配列である（配列番号５）。
【図１２】ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのプラスミドマップ。
【図１３Ａ】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列である（配列番号６）。
【図１３Ｂ】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列である（配列番号６）。
【図１４Ａ−Ｆ】メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現している、かつ１５Ｌスケールでフェドバッチ式培養により増殖させたエシェリキア・コリ株による、イソプレン生産のグラフ。
【図１４Ａ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内の吸光度の時間経過を示す。
【図１４Ｂ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。この力価は、発酵ブロス１Ｌあたりに生産されたイソプレンの量として定義される。イソプレンの算出方法：５９時間経過時点での累積イソプレン産量，ｇ／５９時間経過時点での発酵槽容積，Ｌ［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図１４Ｃ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレンの算出方法：∫（瞬間的なイソプレン生産速度，ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ，ｔ＝０〜５９時間［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図１４Ｄ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクターから生産された合計イソプレン量の時間経過を示す。
【図１４Ｅ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内の容積生産性（volumetric productivity）を示す。
【図１４Ｆ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内の二酸化炭素展開速度（ＣＥＲ）、又は代謝活性プロファイルを示す。
【図１５】Ａ〜Ｂは１５Ｌのバイオリアクターでの発酵により発生するガスの解析を示すグラフである。試料Ａは、６４．８時間の時点で試料採取したＲＭ１１１６０８−２株である。試料Ｂは、３４．５時間の時点で採取したエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３），ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ，ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫの株ＥＷＬ２５６である。いずれの試料も水素は基準を超えて検出された（０．９５×１０−８トール（１．２７マイクロパスカル））。
【図１６Ａ】例示のイソプレン回収ユニットを示す。
【図１６Ｂ】例示のイソプレンの脱離／凝縮設定を示す。
【図１７】イソプレン産物のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。この物質は純度９９．７％であると測定された。
【図１８Ａ】イソプレン試料の処理前のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図１８Ｂ】イソプレン試料のアルミナによる処理後のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図１８Ｃ】イソプレン試料のシリカによる処理後のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【００３７】
これらのクロマトグラムではイソプレンピークは検出されなかった。
【図１９Ａ】ＰＴｒｃプロモーター及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫの制御下でウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素（ＭＥＡ変異体）の切断型をコードしているｐＤＷ３４プラスミドマップを示す。
【図１９Ｂ】プラスミドｐＤＷ３４の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図１９Ｃ】プラスミドｐＤＷ３４の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図１９Ｄ】プラスミドｐＤＷ３４の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図２０】エシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５のｐｇｌ座付近の染色体構成を示す（グラフはｗｗｗ．ｅｃｏｃｙｃ．ｃｏｍから挿入）。エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ６５５と比較したエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の欠失領域、並びにＣＭＰ２１５株及びＣＭＰ２５８株の復元部位を角括弧で示す。ｙｂｇＳ遺伝子の予想されたＯＲＦを丸で囲む。順方向の矢印（→）はｇａｌＭＦプライマー（配列番号８）のアニーリング部位を示す。逆方向の矢印（←）ｇａｌＭＲプライマー（配列番号９）のアニーリング部位を示す。
【図２１】ＰＧＬ＋（ＣＭＰ３１２）及びＰＧＬ−（ＣＭＰ３２３）培養物で実施した微小発酵実験の吸光度（ＯＤ）プロットを示す。Ｘ軸に沿っている黒い三角形は、オフラインで試料を採取した時点を示す。他のＯＤ値を内挿する。
【図２２】ＰＧＬ＋（ＣＭＰ３１２）及びＰＧＬ−（ＣＭＰ３２３）培養物で実施した微小発酵実験のイソプレン比生産性プロットを示す。Ｘ軸に沿っている黒い三角形は、オフラインで試料を採取した時点を示す。他のＯＤ値を内挿する。
【図２３】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内の吸光度の時間経過を示す。
【図２４】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター中のイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレン力価は、発酵ブロス１Ｌあたりに生産されたイソプレンの量として定義される。イソプレン力価を算出するための等式：∫（瞬間的なイソプレン生産速度，ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ，ｔ＝０〜ｔ時間［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図２５】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクターから生産された合計イソプレン量の時間経過を示す。
【図２６】グルコースを加えた１５Ｌバイオリアクター内でのイソプレン比生産性を示す。比生産性レベルを算出するための等式：（イソプレンｔｍｇ−イソプレンｔｏｍｇ）／［（ＯＤ５５０ｔ＊ブロスｔＬ−ＯＤ５５０ｔｏ＊ブロスｔｏＬ）／（２．７ＯＤ＊Ｌ／細胞ｇ）］／（ｔ−ｔ０）［＝］イソプレンｍｇ／細胞ｇ／時間。
【図２７】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内の吸光度の時間経過を示す。ｐｇｌ＋試料は、ＣＭＰ３１２株の培養物であった。ｐｇｌ−試料は、ＣＭＰ３２３株の培養物であった。
【図２８】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。この力価は、発酵ブロス１Ｌあたりに生産されたイソプレンの量として定義される。ｐｇｌ＋試料は、ＣＭＰ３１２株の培養物であった。ｐｇｌ−試料は、ＣＭＰ３２３株の培養物であった。イソプレン力価を算出するための等式：∫（瞬間的なイソプレン生産速度，ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ，ｔ＝０〜２０時間［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図２９】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター内でのイソプレン比生産性を示す。ｐｇｌ＋試料は、ＣＭＰ３１２株の培養物であった。ｐｇｌ−試料は、ＣＭＰ３２３株の培養物であった。比生産性レベルを算出するための等式：（イソプレンｔｍｇ−イソプレンｔｏｍｇ）／［（ＯＤ５５０ｔ＊ブロスｔＬ−ＯＤ５５０ｔｏ＊ブロスｔｏＬ）／（２．７ＯＤ＊Ｌ／細胞ｇ）］／（ｔ−ｔ０）［＝］イソプレンｍｇ／細胞ｇ／時間。
【図３０】グルコースを加えたエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５を含有している１５Ｌのバイオリアクターの吸光度の時間経過を示す。
【図３１】グルコースを加えたエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５を含有している１５Ｌのバイオリアクターのイソプレン力価の時間経過を示す。この力価は、発酵ブロス１Ｌあたりに生産されたイソプレンの量として定義される。イソプレン力価を算出するための等式：∫（瞬間的なイソプレン生産速度，ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ，ｔ＝０〜ｔ時間［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図３２】グルコースを加えたエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５を含有している１５Ｌのバイオリアクターより生産されたイソプレンの合計産量の時間経過を示す。
【図３３】グルコースを加えたエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５を含有している１５Ｌのバイオリアクターのイソプレン比生産性の時間経過を示す。比生産性を算出するための等式：（イソプレンｔｍｇ−イソプレンｔｏｍｇ）／［（ＯＤ５５０ｔ＊ブロスｔＬ−ＯＤ５５０ｔｏ＊ブロスｔｏＬ）／（２．７ＯＤ＊Ｌ／細胞ｇ）］／（ｔ−ｔ０）［＝］イソプレンｍｇ／細胞ｇ／時間。
【図３４Ａ】エンテロバクター・フェカリス（Enterobacter faecalis）由来のＭＶＡ経路上流のポリペプチドｍｖａＥ及びｍｖａＳを発現している、ｐＤＷ１５のプラスミドマップを示す。
【図３４Ｂ】プラスミドｐＤＷ１５の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号１０）。
【図３４Ｃ】プラスミドｐＤＷ１５の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号１０）。
【図３４Ｄ】プラスミドｐＤＷ１５の完全ヌクレオチド配列を示す（配列番号１０）。
【図３５】０．１％酵母エキス及び１％グルコースを含有しているＴＭ３最少培地中のバクテリア株の、メバロン酸比生産性を示す。実験は単独のコロニーから３つ組みで実施した。株は表２９により詳細に記載される。ＢＬ２１＋ｐＣＬ  ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７０株；ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ｐＣＬ  ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７４株；ＢＬ２１＋ｐＢＢＲ  ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７１株；ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ｐＢＢＲ  ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７５株；ＢＬ２１＋ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７２；ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ｐＴｒｃＵｐｐｅｒ＝ＭＣＭ８７６。
【図３６】０．０２％酵母エキス及び１％グルコースを含有しているＴＭ３最少培地中でのエシェリキア・コリ株ＭＣＭ８７２及びＭＣＭ８７６の増殖を示す。
【図３７】０．０２％酵母エキス及び１％グルコースを含有しているＴＭ３最少培地中でのエシェリキア・コリ株ＭＣＭ８７２（ＢＬ２１  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）及びＭＣＭ８７６（ＢＬ２１  ｐｇｌ  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）のメバロン酸生産速度を示す。
【図３８】２つの異なる時点で採った、０．０２％酵母エキスを含むＴＭ３最少培地中でのエシェリキア・コリ株ＭＣＭ８７２（ＢＬ２１  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）及びＭＣＭ８７６（ＢＬ２１  ｐｇｌ  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）のＯＤあたりのＭｖａＳタンパク質濃度を示す。
【図３９】０．０２％酵母エキスを含むＴＭ３最少培地中で増殖させたエシェリキア・コリ株ＭＣＭ８７２（ＢＬ２１  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）及びＭＣＭ８７６（ＢＬ２１  ｐｇｌ  ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ）のＯＤあたりのＭｖａＥタンパク質濃度を示す。
【図４０Ａ】エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）のアミノ酸配列を示す（配列番号１１）。
【図４０Ｂ】シュードモナス・アエルギノサ（P. aeruginosa）由来のＰＧＬのアミノ酸配列を示す（配列番号１２）。
【図４０Ｃ】サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）由来のＰＧＬのアミノ酸配列を示す（配列番号１３）。
【図４０Ｄ】エシェリキア・コリＰＧＬ及びシュードモナス・アエルギノサ（P. aeruginosa）ＰＧＬのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一のアミノ酸は灰色にハイライトして示す。保存型のアミノ酸置換は黒色にハイライトして示す。
【図４１Ａ−Ｂ】ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）、及びＢＬ２１  ｐｇｌとして標識されるＣＭＰ２５８株（実施例６）の増殖速度を示す。増殖は、０．４％（重量／体積）のグルコースを含有しているＭ９最少培地（６ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４，３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ，０．５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，２ｍＭのＭｇＳＯ４）で評価した。増殖はＯＤ６００で測定した。
【図４１Ａ】ＢＬ２１及びＣＭＰ２５８株（ＢＬ２１  ｐｇｌとして標識される）の増殖を示す。
【図４１Ｂ】ｐｇｌあり及びなしの場合のＢＬ２１の比増殖速度（μ）を示す。ＢＬ２１にｐｇｌを含む１７，２５７ｂｐの欠失部位を復元させたところ、比増殖速度が約１５％増加した。
【図４２Ａ】グルコースを加えた１５Ｌのバイオリアクター中のイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレン力価は、発酵ブロス１Ｌあたりに生産されたイソプレンの量として定義される。イソプレン力価を算出するための等式：∫（瞬間的なイソプレン生産速度，ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ，ｔ＝０〜ｔ時間［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図４２Ｂ】グルコースを加えた１５Ｌバイオリアクター内でのイソプレン比生産性を示す。比生産性レベルを算出するための等式：（イソプレンｔｍｇ−イソプレンｔｏｍｇ）／［（ＯＤ５５０ｔ＊ブロスｔＬ−ＯＤ５５０ｔｏ＊ブロスｔｏＬ）／（２．７ＯＤ＊Ｌ／細胞ｇ）］／（ｔ−ｔ０）［＝］イソプレンｍｇ／細胞ｇ／時間。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
エシェリキア・コリＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）は、組み換えタンパク質の生産に広く使用される宿主である。これらの宿主はイソプレンなどの他の産物の生産にも使用することができる。エシェリキア・コリ株などでの組み換えタンパク質、生化学物質、及び他の産物の収率は、細胞増殖に重要な代謝経路であるペントースリン酸経路の活性を増加させることで改良することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（ＧＡ  ＩＩ）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いＣｏｄｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により調製されたエシェリキア・コリＢＬ２１のゲノム配列を、エシェリキア・コリＭＧ１６５５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）と比較することで、エシェリキア・コリＢＬ２１ゲノムが、ガラクトース利用能に関与する遺伝子、並びに本明細書において更に詳細に記載される他の遺伝子をコードしている領域において、１７，２５７ｂｐの欠失を保有していたことが明らかになった。予想外にも、この欠失は、ペントースリン酸経路の第２酵素である６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）酵素をコードするｙｂｈＥ遺伝子にも包含された（Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．、Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．、Ｄａｔｔａ，Ａ．、Ｋｈａｎｎａ，Ｒ．及びＲｏｓｎｅｒ，Ｊ．、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｙｂｈＥ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ｐｇｌ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ，」Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：８２４８〜８２５３（２００４））。この欠失は、エシェリキア・コリＢＬ２１の親株にＵＶ照射し、Ｐ１形質導入を行なうことで作製されたものである（Ｓｔｕｄｉｅｒ  Ｆ．、Ｄａｅｇｅｌｅｎ，Ｐ．、Ｌｅｎｓｋｉ，Ｒ．、Ｍａｓｌｏｖ，Ｓ．、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｆ．、「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ  ｓｔｒａｉｎｓ  ＲＥＬ６０６  ａｎｄ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｋ−１２  ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  Ｓｅｐｔ．１５，２００９）。結果的に、エシェリキア・コリＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）はどちらもＰＧＬ活性及び炭素源としてのガラクトース利用能を欠失している。（Ａｏｎら、「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｇｌｕｃｏｎｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：９５０〜９５８（２００８））。
【００３９】
加えて、この欠失は、親和性の高いモリブデン酸輸送に必要とされる遺伝子も包含していた。モリブデンは、ほんの微量に必要とされる一方、すべての生物においていくつかの代謝経路で重要な役割を果たしている。モリブデン酸は、バクテリアにより、多くの酸化／還元反応において酵素の補因子として使用され、窒素代謝において決定的な役割を果たし、並びに特に嫌気性呼吸の場合にはエネルギー生産に貢献する。（例えば、Ｓｅｌｆら、Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：３１１〜３２１（２００１）；Ｇｒｕｎｄｅｎ  ＆  Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８：３４５〜３５４（１９９７）を参照されたい）。
【００４０】
増殖時にペントースリン酸経路（ＰＰＰ）が使用され、ＮＡＤＰＨ及びペントース（５炭糖）が生産される（Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｆ．、Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．及びＳｃｈａｅｃｈｔｅｒ，Ｍ．、１９９０，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ））。ＰＰＰは、２種の別個のフェーズを有する：（１）ＮＡＤＰＨが生成される酸化相、並びに（２）非酸化的な５炭糖の合成相。ＰＰＰは解糖系の代わりになる一方、グルコースの酸化を包含し、その主要な役割は異化と言うよりも同化である。この経路の主要な結果は：（１）細胞内での還元的な生合成反応、例えば脂肪酸合成などにおいて使用するための、ＮＡＤＰＨの形態での等価物の還元の生成；（２）ヌクレオチド及び核酸の合成に使用されるリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）の生産；並びに（３）芳香族アミノ酸の合成に使用されるエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の生産；である。次に、芳香族アミノ酸は多くの生合成経路の前駆体になる。核酸の消化により得られる食物由来のペントース糖は、ペントースリン酸経路を介して代謝することができ、食物由来の炭水化物の炭素骨格は解糖中間体又は糖新生中間体として変換し得る。哺乳類では、ほとんどの場合ＰＰＰは細胞質で行なわれ、体が還元力により分子を生成する３つの主要な方法のうちの１つの方法であり、ヒトにおけるＮＡＤＰＨ生産のおよそ６０％を占める。
【００４１】
ペントースリン酸経路は、脂肪酸合成などの細胞内での還元的な生合成反応に使用される等価物の還元、ヌクレオチド及び核酸の合成に使用されるリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、並びに（３）芳香族アミノ酸の合成に使用されるエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）を提供することから、エシェリキア・コリＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）株でのＰＧＬ遺伝子及び関連付けられる発現制御配列を復元することで、実質的に増殖利益が伝達されることになる。加えて、利用可能な炭素源の範囲を拡大させるために、ガラクトース利用能を有する類似の株を得ることは、工業用途に有用である（例えば、エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）株）。
【００４２】
加えて、親和性の高いモリブデン酸輸送タンパク質をコードしている遺伝子を復元させることで、共同因子としてモリブデンが必要とされる代謝反応において細胞がより効率的にモリブデン酸を利用することができるようになるなどの更なる増殖利益が提供され得る。本発明は、バクテリア染色体に組み込まれたＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を発現している、組み換えバクテリア細胞に関し、改良された方法及び組成物を包含する。ＰＧＬ単独での組み込み又はＰＧＬと、ガラクトース代謝及び／又はモリブデン輸送に関するポリペプチドをコードしている１つ以上の他の非相同性の核酸とを組み合わせての組み込みは、組み換えバクテリア細胞のイソプレン生産能を改良し得る。
【００４３】
したがって、一態様では、本発明はイソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ株の組み換え細胞を包含し、細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー、ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、ここで、得られる組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する。一部の場合では、組み換えエシェリキア・コリ細胞は、自身の内在性プロモーター（１つ以上）及び／又はその他の制御系を使用して組み込みＰＧＬ核酸の転写及び続く発現を制御することができる。このような場合、非相同性の核酸（例えば、ＰＧＬ又はイソプレン）の発現は、プラスミド又はプラスミド上の要素により駆動される常時発現型の発現ではない。他の場合では、組み換えエシェリキア・コリ細胞は、プロモーター（１つ以上）、並びに／又は組み込んだＰＧＬ核酸の転写及び続く発現を制御するためにエシェリキア・コリ細胞に組み込まれた他の制御系を使用することができる。
【００４４】
本発明はまた、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞を包含し、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸を含む。一態様では、ＰＧＬポリペプチドは、プラスミド上の核酸によりコードされていない。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性で、生物活性を有するポリペプチドを生産する。同様に、本明細書では、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産に関する改良法が提供され、この方法はＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ細胞を、最少培地中で培養する工程、並びに非相同ポリペプチドを生産させる工程を含み、培養する工程において、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸、を含む。一部の態様では、細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性で、非相同ポリペプチドを生産する。
【００４５】
他の態様では、本明細書においてはＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞が提供され、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、並びにメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、及び／又はイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸、を含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりもイソプレン比生産性が高い。同様に、本明細書では、イソプレンの生産に関する改良法が提供され、この方法はＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ細胞を、最少培地中で培養する工程、並びにイソプレンを生産させる工程を含み、培養する工程において、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及びメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、又はイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸、を含む。一部の態様では、この細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりもイソプレン比生産性が高い。
【００４６】
一般的技術
本発明の実施は、別途記載のない限り、当該技術分野の範囲内のものである、分子生物学（組み換え技術など）、微生物学、細胞生物学、生物化学、及び免疫学の従来の技術を使用するものである。このような技術は、次のような文献：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７及びｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、並びにＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）において、十分に説明されており、本出願に使用される多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
【００４７】
定義
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリールピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで得られる、直接的にかつ最終的に揮発性のＣ５炭化水素生成物であり得る。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「６−ホスホグルコノラクトン」は、６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン（ＣＡＳ＃  ２６４１−８１−８）を指す。本明細書で使用するとき、用語「６−ホスホグルコネート」は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネート（ＣＡＳ＃  ９２１−６２−０）を指す。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。単離されたタンパク質は非自然発生的なポリペプチドであってもよい。
【００５１】
「非相同ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の態様では、非相同ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００５３】
「組み換え核酸」は、対象とする核酸が誘導された生物に天然に生じるゲノムにおいて対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば、遺伝子）を含まない、対象とする核酸を意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される一部の態様では、組み換え核酸は天然に生じるものではないポリペプチドをコードしている核酸である。
【００５４】
「非相同性の核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の態様では、非相同性の核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。例えば、Ｐ１形質導入によりエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の染色体に組み込まれ、細胞中で発現される、エシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５又はそれらの誘導体から単離されたＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸は、非相同性の核酸である。一態様では、「非相同性の核酸」は、対象とする核酸を有さない宿主細胞に、対象とする核酸を導入することを意味し得る。一部の場合では、非相同性の核酸は、非相同性の遺伝子であり得る。当業者であれば違いを認識し、また教示に従って使用することができるであろう。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「発現制御配列」は、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、常時発現型若しくは誘導型のプロモーター、又はエンハンサなどのプロモーターであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は非相同性の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。非相同性の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモーター」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモーターである。発現制御配列は、転写されることになる核酸断片に制御可能なように連結される。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal medium）」は、細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸の存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には：（１）バクテリアを増殖させるための炭素源；（２）バクテリア種及び増殖条件によって異なる様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」又は「イソプレノイド」は、テルペンと類似する、天然に生じる幅広く多様な部類の有機化合物を指す。テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を組み合わせ、かつ様々な方法で修飾することで誘導されるものであり、構成員として使用されるイソプレン単位の数に基づいて分類される。ヘミテルペノイドは、イソプレン単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレン単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレン単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレン単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレン単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレン単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレン単位を８つ超有する。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「カロテノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種のバクテリア、のクロロプラスト中で生産される、天然に生じる有機色素群を指す。カロテノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。
【００５９】
本明細書で特に規定のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６０】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００６１】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書全体を通じて記載される最小数値限定は、それより大きいあらゆる数値限定を、そのような大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含する。本明細書全体を通じて記載される数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るそれよりも狭いあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように包含する。
【００６２】
エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）に復元させた、ポリペプチドをコードしている遺伝子
エシェリキア・コリＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノム中の１７，２５７ｂｐの欠失には、ｙｇｈＥ遺伝子（ＰＧＬ）、炭素源としてのガラクトースの利用に関与するタンパク質をコードしている遺伝子、モリブデン輸送に関与するタンパク質をコードしている遺伝子、並びに未知の機能を有する他の数種の遺伝子が包含される。例えば、図２０を参照されたい。ガラクトース利用に関与する遺伝子は、ガラクトース−１−エピメラーゼをコードするｇａｌＭ、ガラクトキナーゼをコードするｇａｌＫ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするｇａｌＴ、及びＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼをコードするｇａｌＥである。モリブデン輸送に関与するタンパク質をコードしている遺伝子は、ＡＢＣスーパーファミリーの融合型モリブデン酸輸送体（fused molybdate transporter）サブユニットをコードするｍｏｄＦ、モリブデン輸送用のｍｏｄＡＢＣオペロンのリプレッサーをコードするｍｏｄＥ、並びにそれぞれモリブデン酸輸送体サブユニットタンパク質をコードするｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、及びｍｏｄＣである。
【００６３】
したがってバクテリア（例えば、エシェリキア・コリ）染色体中に、ＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸が組み込まれるよう、エシェリキア・コリ細胞を組み換えることもできる。イソプレン合成酵素（例えば、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素）をコードしている非相同性の核酸を導入することでイソプレン生産に関する合計力価及び／又は比活性を増加させることができる。更に、ＰＧＬの組み込みに加え、炭素源としてのガラクトースの利用に関与するタンパク質又はモリブデン輸送体に関与するタンパク質をコードしている１つ以上の遺伝子をエシェリキア・コリ細胞に組み込んで、組み換え細胞の全体的な適応度を増加させ、ひいてはイソプレン生産を増加させることができる。
【００６４】
ＰＧＬ単独の組み込み、あるいは炭素源としてのガラクトースの利用に関与するタンパク質、又はモリブデン輸送に関与するタンパク質をコードしている１つ以上の遺伝子と組み合わせたＰＧＬの組み込みに関し、様々な選択肢が本発明の範囲内で企図される。したがって、一部の態様では、ＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ及びｇａｌＭである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はｇａｌＫである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ及びｇａｌＴである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ及びｇａｌＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ及びｇａｌＫである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ及びｇａｌＴである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ及びｇａｌＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ及びｇａｌＴである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ及びｇａｌＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ及びｇａｌＴである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ及びｇａｌＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥである。
【００６５】
一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｍｏｄＦ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣある。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。
【００６６】
一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＴ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。
【００６７】
一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＴ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＥ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＴ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。
【００６８】
一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＥ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＦである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｍｏｄＥである。一部の態様ではＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに復元される遺伝子はＰＧＬ、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、並びにｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣである。
【００６９】
一部の態様では、１７，２５７ｂｐのゲノム片にコードされる１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピー（ＰＧＬ以外）を、エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）にプラスミドで復元させる。一部の態様では、１７，２５７ｂｐのゲノム片にコードされる１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーを、エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）に常時発現型のプラスミドで復元させる。一部の態様では、１７，２５７ｂｐのゲノム片にコードされる１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーを、エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）に誘導時発現型のプラスミドで復元させる。一部の態様では、１７，２５７ｂｐのゲノム片全体がプラスミドであり、エシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質移入される。一部の態様では、１７，２５７ｂｐのゲノム片にコードされる１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体に組み込むことによりエシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）に復元される（例えば、図２０に示されるように）。一部の態様では、１７，２５７ｂｐゲノム片の全体は、染色体に組み込むことによりエシェリキア・コリＢＬ２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）に復元される。
【００７０】
例示的なＰＧＬポリペプチド及び核酸
６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）は６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコネートに変換する。例示的なＰＧＬポリペプチドとしては、ＰＧＬポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＰＧＬポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにＰＧＬポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７１】
ＰＧＬポリペプチド変異体としては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換されているものの、ＰＧＬ活性を保有している（すなわち、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコネートヘと変換させることのできる）ものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【００７２】
ＰＧＬポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ＰＧＬポリペプチドの基質への結合親和性を増加させる、あるいは６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコネートヘと変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ＰＧＬポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド変異体は、１つ以上の非保存的なアミノ酸置換を含有する。
【００７３】
Ａ．Ｓｉｎｈａ及びＰ．Ｋ．Ｍａｉｔｒａ，「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｎｏ−ｄｅｌｔａ−ｌａｃｔｏｎｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１８６５〜１８７３（１９９２）に記載されるものなどの標準法を使用して、ポリペプチドがＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨヘと還元する能力を測定することで、ポリペプチドがＰＧＬ活性を有するか否かを判定することができる。例示的なアッセイでは、ＰＧＬ活性は、５０μＭのグルコース−６−ホスフェート、０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋、及び５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）中０．５ユニットのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有している反応混合物を、反応が完了するまでプレインキュベートすることでアッセイされる。プレインキュベート後に、続いて１ユニットの６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを添加した。６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは、反応初期に生じたラクトンの自発的な加水分解により、蛍光をゆっくりと増加させる。次に、細胞を含まない抽出物を加え、ＰＧＬにより触媒されるラクトナーゼ反応によりＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへと還元させる速度を増加させる。実際のラクトナーゼ反応速度は、最終的な速度から、予め測定しておいたブランク速度を減算することで計算する。
【００７４】
あるいは、６−ホスホグルコノラクトンの６−ホスホグルコネートへの変換は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によりモニターすることもできる。例えば、Ｅ．Ｍｉｃｌｅｔら、「ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｔｗｏ  Ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｎｔｏｓｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ６−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３７）：３４８４０〜３４８４６（２００１）を参照されたい。
【００７５】
例示的なＰＧＬ核酸としては、ＰＧＬポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。例示的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。例示的なＰＧＬ核酸としては、例えば、以下のものが挙げられる：エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５又はそれらの誘導体から単離されたＰＧＬ（ＥｃｏＧｅｎｅアクセッション番号ＥＧ１３２３１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ００９６で参照される、エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５ゲノム配列の一部；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ５２６９７（ＰＧＬポリペプチド）としても参照される）（図４０Ａ及び配列番号１１を参照されたい）；シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）株ＰＡＯ１から単離されるＰＧＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ００４０９１，遺伝子座タグＰＡ３１８２）；同様にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ０６５７０．１を参照されたい（ＰＧＬポリペプチド））（図４０Ｂ及び配列番号１２を参照されたい）；並びにサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）より単離されたＰＧＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１４０，遺伝子座タグＹＨＲ１６３Ｗ；同様にＵＮＩＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３８８５８（ＰＧＬポリペプチド）を参照されたい）（図４０Ｃ及び配列番号１３を参照されたい）。他の例示的なＰＧＬ核酸は、例えば、アリシェワネラ（Alishewanella）、アルテロコッカス（Alterococcus）、アクアモナス（Aquamonas）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae））、パントエア（Pantoea）（例えば、パントエア・シトロエア（Pantoea citroea））、プロテウス（Proteus）（例えば、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris））、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）（例えば、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens））、シゲラ（Shigella）、及びエルシニア（Yersinia）（例えば、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）を含むエンテロバクテリアセエファミリーの任意の属から単離することができる。
【００７６】
例示的なガラクトース代謝ポリペプチド及び核酸
ガラクトース−１−エピメラーゼ（ｇａｌＭ）は、β−Ｄ−ガラクトースのα−Ｄ−ガラクトースへの変換を触媒する。例示的なガラクトース−１−エピメラーゼポリペプチドとしては、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びにガラクトース−１−エピメラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する融合ポリペプチド、が挙げられる。例示的なガラクトース−１−エピメラーゼポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにガラクトース−１−エピメラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７７】
ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）は、Ｄ−ガラクトースのＤ−ガラクトース−１−ホスフェートへのリン酸化を触媒する。例示的なガラクトキナーゼポリペプチドとしては、ガラクトキナーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なガラクトキナーゼポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにガラクトキナーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７８】
ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）は、ＵＤＰ−グルコース及びガラクトース１−リン酸をグルコース１−リン酸及びＵＤＰ−ガラクトースヘと変換することにより、ガラクトース代謝のＬｅｌｏｉｒ経路の第２工程を触媒する。例示的なガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼポリペプチドとしては、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７９】
ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）は、ＵＤＰ−ガラクトースのＵＤＰ−グルコースへの変換を可逆的に触媒する。例示的なＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼポリペプチドとしては、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８０】
例示的なガラクトース代謝に関する核酸としては、ガラクトース代謝ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。例示的なガラクトース代謝に関する核酸としては、例えば、以下のものが挙げられる：エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５又はそれらの誘導体から単離されるガラクトース代謝性の遺伝子；シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）株ＰＡＯ１から単離されるガラクトース代謝性の遺伝子；及びサッカロミサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisie）から単離されるガラクトース代謝性の遺伝子。他の例示的なガラクトース代謝に関する核酸は、例えば、アリシェワネラ（Alishewanella）、アルテロコッカス（Alterococcus）、アクアモナス（Aquamonas）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae））、パントエア（Pantoea）（例えば、パントエア・シトロエア（Pantoea citroea））、プロテウス（Proteus）（例えば、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris））、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）（例えば、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens））、シゲラ（Shigella）、及びエルシニア（Yersinia）（例えば、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis））を含むエンテロバクテリアセエファミリーの任意の属から単離することができる。
【００８１】
例示的なモリブデン輸送体ポリペプチド及び核酸
ｍｏｄＦ遺伝子によりコードされているポリペプチドは、ＡＢＣスーパーファミリーの融合型モリブデン輸送体サブユニットのうちの性質不明のメンバーである。ｍｏｄＦによりコードされている例示的なポリペプチドとしては、ｍｏｄＦによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。ｍｏｄＦによりコードされている例示的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｏｄＦによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８２】
モリブデン輸送（ｍｏｄＥ）ポリペプチドに関するｍｏｄＡＢＣオペロンのリプレッサーは、モリブデン酸の存在下でｍｏｄＡＢＣオペロンの転写を阻害するようフィードバックを行う調節タンパク質であると考えられている。ｍｏｄＥによりコードされている例示的なポリペプチドとしては、ｍｏｄＥによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。ｍｏｄＥによりコードされている例示的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｏｄＥによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８３】
ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣによりコードされる、非常に親和性の高いモリブデン輸送体の３量体タンパク質は、細胞へのモリブデンの取り込みに関する膜介在性のＡＢＣ輸送系である。ｍｏｄＡＢＣ遺伝子のうちの任意の１つを変異又は欠失させた場合、ＡＢＣ型の硫酸輸送系により、又は非特異的なアニオン輸送体によりモリブデン酸輸送が実施されるが、この場合、効率は約１００分の１になる（Ｓｅｌｆら、２００１，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：３１１〜３２１）。ｍｏｄＡＢＣによりコードされている例示的なポリペプチドとしては、ｍｏｄＡＢＣによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。ｍｏｄＡＢＣによりコードされている例示的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｏｄＡＢＣによりコードされているポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８４】
例示的なモリブデン輸送体の核酸としては、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はモリブデン輸送ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。例示的なモリブデン輸送体の核酸としては、例えば、以下のものが挙げられる：エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５又はそれらの誘導体から単離されるモリブデン輸送体遺伝子；シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）株ＰＡＯ１から単離されるモリブデン輸送体遺伝子；及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisie）から単離されるガラクトース代謝性の遺伝子。他の例示的なモリブデン輸送体の核酸は、例えば、アリシェワネラ（Alishewanella）、アルテロコッカス（Alterococcus）、アクアモナス（Aquamonas）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae））、パントエア（Pantoea）（例えば、パントエア・シトロエア（Pantoea citroea））、プロテウス（Proteus）（例えば、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris））、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）（例えば、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens））、シゲラ（Shigella）、及びエルシニア（Yersinia）（例えば、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis））を含む、エンテロバクテリアセエファミリーの任意の属から単離することができる。
【００８５】
例示的な宿主細胞
本明細書に記載の方法でイソプレン合成酵素、ＰＧＬポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、及びＭＶＡ経路ポリペプチドを発現させるにあたり、エシェリキア・コリ宿主細胞を使用することができる。一態様では、宿主細胞はイソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ（E. coli）株の組み換え細胞、又はそれらの子孫細胞を提供し、細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、ここで、得られる組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する。一部の態様では、宿主細胞は６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞であり、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸を更に含む。一部の態様では、バクテリア細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性で、非相同ポリペプチドを生産する。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。
【００８６】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドは、テルペノイド（イソプレノイド）又はカロテノイド化合物の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを含み、並びに細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞と比べ、高い比生産性でテルペノイド又はカロテノイドを生産する。一部の態様では、方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
【００８７】
一部の態様では、宿主細胞は６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞であり、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及びイソプレン合成酵素をコードしている非相同性の核酸を更に含む。一部の態様では、バクテリア細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性でイソプレンを生産する。
【００８８】
一部の態様では、細胞は更に、ＭＶＡ経路のポリペプチドを含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス（Enterococcus）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＫポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものである。
【００８９】
一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、バクテリア株はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００９０】
例示的な細胞培養培地
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には：（１）バクテリアを増殖させるための炭素源；（２）バクテリア種及び増殖条件によって異なる様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００９１】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。例示的な最少培地処方としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地１Ｌには、（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩（１Ｌあたり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（重量／体積）のグルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）；が含有される。ＴＭ３最少培地１Ｌには、（１）１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４；（２）１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）２ｇのクエン酸一水和物；（５）０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム；（６）３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；（７）０．２ｇの酵母エキス；及び（８）１ｍＬの１０００Ｘ微量元素溶液；が含有され、ｐＨは約６．８に調整され、溶液は濾過滅菌される。１０００Ｘ微量元素１Ｌには：（１）４０ｇのクエン酸一水和物；（２）３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ；（３）１０ｇのＮａＣｌ；（４）１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ；（５）１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（６）１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；（７）１００ｍｇのＨ３ＢＯ３；及び（８）１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；が含有され、ｐＨは約３．０に調整される。
【００９２】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝することのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
【００９３】
例示的な多糖としては、グルコース及びフルクトースが挙げられる；例示的なオリゴ糖としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに例示的な多糖としてはデンプン及びセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【００９４】
例示的な細胞培養条件
本発明の組み換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。微生物培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開番号第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔら編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）に見出すことができる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入した核酸によりコードされる、イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド又はＭＶＡ経路ポリペプチドのうちの１つ以上を発現させる条件下で、培養培地中で培養する。
【００９５】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）で増殖し、維持される。一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。反応は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で実施することができる。
【００９６】
使用することのできる標準的な培養条件、並びにバッチ式、フェドバッチ式、又は連続式発酵などのｍｏｄＥ発酵は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。バッチ式及びフェドバッチ式発酵は一般的であり、当業者に周知であり、例はＢｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見出すことができる。
【００９７】
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【００９８】
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【００９９】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞はバッチ式培養で増殖させる。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞はフェドバッチ式培養で増殖させる。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は連続式培養で増殖させる。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、最少培地はＭ９培地又はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地には１．０％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。特定の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコース及び０．１％（重量／体積）以下が添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【０１００】
本発明はイソプレンを生産することのできるエシェリキア・コリ（E. coli）株の組み換え細胞を包含し、細胞は：（ａ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー、ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる；並びに（ｂ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、ここで、得られる組み換え細胞は、（ａ）及び（ｂ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する。
【０１０１】
一部の態様では、宿主細胞は６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞であり、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及びイソプレン合成酵素をコードしている非相同性の核酸を更に含む。一部の態様では、宿主細胞はエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞であり、細胞は６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチド、ガラクトース代謝に関する遺伝子から転写されるポリペプチド（例えば、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥ）、又はモリブデン酸輸送に関する遺伝子から転写されるポリペプチド（例えば、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣ）をコードしておらず、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸、１つ以上のガラクトース代謝ポリペプチドの１つ以上のコピーをコードしている非相同性の核酸、及び１つ以上のモリブデン酸輸送体ポリペプチドの１つ以上のコピーをコードしている非相同性の核酸を更に含む。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、ガラクトース代謝ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び／又はモリブデン酸輸送体ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。
【０１０２】
一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、バクテリア株はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１．０％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。特定の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコース及び０．１％（重量／体積）以下が添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地はＭ９培地又はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。
【０１０３】
一部の態様では、細胞は更に、ＭＶＡ経路のポリペプチドを含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス（Enterococcus）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のものである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＫポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものである。一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドはメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものである。
【０１０４】
本明細書に記載の組み換えバクテリア細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い比生産性でイソプレンを生産する能力を有する。一部の場合では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸であり、宿主細胞の染色体に組み込まれる。一部の態様では、バクテリア細胞は、細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、ガラクトース代謝ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び／又はモリブデン酸輸送ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞と比べ、高い比生産性でイソプレンを生産する。
【０１０５】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１６ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１７ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１８ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１９ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２０ｍｇ／Ｌブロス／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２１ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２２ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２３ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２４ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。
【０１０６】
他の態様では、エシェリキア・コリ細胞のイソプレン比生産性の上限は約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５ｍｇ／ＯＤ／時間である。他の態様では、エシェリキア・コリ細胞のイソプレン比生産性の下限は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ｍｇ／ＯＤ／時間である。
【０１０７】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約１５ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約１６ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約１７ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約１８ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約１９ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２０ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２１ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２２ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２３ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２４ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は、制御可能なようにプロモーターに連結され、かつ細胞は約２５ｍｇ／ＯＤ／時間を超えるイソプレン比生産性を有する。
【０１０８】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、核酸は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミド（multiple plasmids）は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１０９】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の場合では、イソプレン合成酵素は内在性イソプレン合成酵素の１つ以上のコピーであり得る。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはプエラリア（Pueraria）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素は、タイワンクズ（Pueraria montana）から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（Populus）属から天然に生じるポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）から天然に生じるポリペプチドである。本発明を実施するために使用することのできる、他のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体としては、限定するものではないが、国際公開第２００９／１３２２２０号又は国際公開第２０１０／１２４１４６号（特にイソプレン合成酵素、それらの変型及び／又はイソプレン合成酵素変異体に関し、内容全体が本明細書に参考として組み込まれる）に記載されるようなイソプレン合成酵素、それらの変型及び／又はイソプレン合成酵素変異体が挙げられる。
【０１１０】
イソプレンの生産を増加させる方法
イソプレンをより効率的に、より大量に、より高純度に及び／又は独特の不純物プロファイルで生産する、バイオリアクター内の遺伝子組み換えされた細胞培養物、並びに再生可能資源から商業的に有用な量のイソプレンを生産する方法は、例えば、国際特許出願第２００９／０７６６７６（Ａ２）号、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２（Ａ１）号、米国特許第２０１０／０００３７１６（Ａ１）号、同第２０１０／００４８９６４（Ａ１）号、同第２０１０／００８６９７８（Ａ１）号、同第２０１０／０１６７３７０（Ａ１）号、同第２０１０／０１１３８４６（Ａ１）号、同第２０１０／０１８４１７８（Ａ１）号、同第２０１０／０１６７３７１（Ａ１）号、同第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号、同第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）；米国仮出願特許第６１／１８７，９３０号、同第６１／１８７，９４１号及び第６１／１８７，９５９号に記載され例示される。
【０１１１】
同様に、本明細書では改良された、イソプレンの生産方法が提供される。一部の態様では、イソプレンの生産に関する改良法は：（ａ）イソプレンを生産することのできる、エシェリキア・コリ株又はそれらの子孫細胞の組み換え細胞（１つ以上）を含む、組成物を培養すること（ここで、細胞は：（ｉ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；及び（ｉｉ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；を含み、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、得られる組み換え細胞は、（ｉ）及び（ｉｉ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する）；並びに（ｂ）イソプレンを生産させること、を含む。一部の態様では、イソプレンの生産に関する改良法は：（ａ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞を培養する工程（ここで、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む）；並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程（ここで、細胞を最少培地で培養した場合に、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりもイソプレン比生産性が高い）を含む。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、イソプレン生産の改良法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０１１２】
一部の態様では、イソプレン生産の改良法は、イソプレンの生産に好適な条件下で、本明細書に記載の組み換え細胞を培養する工程、並びに組み換え細胞にイソプレンを生産させる工程、を含む。一部の態様では、イソプレン生産の改良法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０１１３】
理論に束縛されるものではないが、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を染色体に組み込まれた組み換え細胞は、非相同性のＰＧＬ核酸がプラスミド上に存在する細胞よりも、より高い力価及び高い比生産性でイソプレンを生産する。驚くべきことに、染色体に組み込まれたＰＧＬポリペプチドの１つ以上のコピー、並びに所望により、染色体に組み込まれたガラクトース代謝遺伝子によりコードされる１種以上のポリペプチドの１つ以上のコピー（例えば、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥ）、及び／又は染色体に組み込まれたモリブデン輸送体遺伝子によりコードされる１種以上のポリペプチドの１つ以上のコピー（例えば、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、及びｍｏｄＣ）を含む組み換え細胞は、非相同性のＰＧＬ核酸をプラスミド上に含む細胞と比較して、実質的な増殖利益、より高いイソプレン生産力価、及び／又はより高いイソプレンの比生産性を細胞に伝達する。
【０１１４】
したがって、イソプレン生産の改良法の一態様は：（ａ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチド、ガラクトース代謝に関する遺伝子によりコードされる１種以上のポリペプチド（例えば、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ及びｇａｌＥ）、及び／又はモリブデン輸送体に関する遺伝子によりコードされる１つ以上のポリペプチド（例えば、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ及びｍｏｄＣ）をコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞を培養する工程（ここで、エシェリキア・コリ細胞は、染色体に組み込まれた、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸、ガラクトース代謝ポリペプチドを１種以上及び／又はモリブデン輸送ポリペプチドを１種以上コードしている非相同性の核酸の１つ以上のコピーを含む）；並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程を含み、ここで、エシェリキア・コリ細胞は、ＰＧＬをコードしている非相同性の遺伝子がプラスミド上に存在する同様の細胞よりもより速い比増殖速度、イソプレンの比生産性及び／又はイソプレン生産力価を有する。
【０１１５】
一部の態様では、細胞は更に、ＭＶＡ経路のポリペプチドを含む。このような場合、本発明は同様にメバロン酸を生産するための組成物及び方法を想到する。ＰＧＬを染色体に組み込んだ宿主細胞系を用い、メバロン酸を生産する方法には、所望により、メバロン酸の回収が包含され得る。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドである。
【０１１６】
一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは：（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド；からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドはアセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）である。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドはバクテリア由来のものである。一部の態様では、バクテリアはエンテロコッカス（Enterococcus）属由来のものである。一部の態様では、バクテリアはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のものである。
【０１１７】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＫである。一部の態様では、ＭＶＫはメタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものである。一部の態様では、このメタノサルシナ属はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）である。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＰＭＫ、ＭＶＤ、又はＩＤＩである。一部の態様では、ＰＭＫ、ＭＶＤ、又はＩＤＩは、サッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＰＭＫである。一部の態様では、ＰＭＫはサッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、このサッカロマイセス属はサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＭＶＤである。
【０１１８】
一部の態様では、ＭＶＤはサッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドはＩＤＩである。一部の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、サッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１１９】
一部の態様では、イソプレン合成酵素は植物由来のものである。一部の態様では、植物は葛である。一部の態様では、植物はポプラである（ウラジロハコヤナギｘトレムラ（Populus alba x tremula）ＣＡＣ３５６９６）。一部の態様では、植物はヤマナラシ（Populus tremuloides）である。一部の態様では、植物はヨーロッパナラである（Quercus robur）。一態様では、植物はウラジロハコヤナギ（Populus alba）である。本発明を実施するために使用することのできる、他のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体としては、限定するものではないが、国際公開第２００９／１３２２２０号又は国際公開第２０１０／１２４１４６号（特にイソプレン合成酵素、それらの変型及び／又はイソプレン合成酵素変異体に関し、内容全体が本明細書に参考として組み込まれる）に記載されるようなイソプレン合成酵素、それらの変型及び／又はイソプレン合成酵素変異体が挙げられる。
【０１２０】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、１つの核酸はイソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミドは、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１２１】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２２】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス（Pseudomonas）属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ポリペプチドは配列番号１２のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ポリペプチドは、配列番号１２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１２に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２３】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、サッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ポリペプチドは配列番号１３のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ポリペプチドは、配列番号１３と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１３に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２４】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞はエシェリキア・コリ株Ｂのものである。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１のものである。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のものである。
【０１２５】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株Ｂのエシェリキア・コリ細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１のエシェリキア・コリ細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のエシェリキア・コリ細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。特定の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコース及び０．１％（重量／体積）以下が添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地はＭ９培地又はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。
【０１２６】
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１５ｍｇ／Ｌブロス／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１６ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１７ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１８ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、１９ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２０ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２１ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２２ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２３ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２４ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、２５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。
【０１２７】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１６ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１７ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１８ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１９ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２０ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２１ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２２ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２３ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２４ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２５ｍｇ／ＯＤ／時間超のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約２５ｍｇ／ＯＤ／時間超〜約１００ｍｇ／ＯＤ／時間のイソプレン比生産性を有する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸は制御可能なようにプロモーターに連結され、エシェリキア・コリ細胞は約１５ｍｇ／ＯＤ／時間超〜約１００ｍｇ／ＯＤ／時間のイソプレン比生産性を有する。
【０１２８】
本発明は、イソプレンを生産するよう組み換えされた、ＰＧＬを組み込まれた組み換えエシェリキア・コリ細胞も提供し、全体的な適応度が増加することにより細胞は同様により良好に増殖する。当業者は、増殖速度の増加が、イソプレンの生産性の改良、例えば、より高い比活性、期間中のイソプレン生産の増加、又はより高いイソプレン力価などをもたらし得ることを認識し得る。一態様では、イソプレンを生産するよう組み換えされた、ＰＧＬを組み込まれた組み換えエシェリキア・コリ細胞は、ＰＧＬを組み込まれていない細胞と比較して増殖が少なくとも１０％増加しており、及び／又は本明細書に記載されるような１７，２５７塩基対片が復元されている（例えば、図２０を参照されたい）。他の態様では、ＰＧＬを組み込まれた、イソプレンを生産するよう組み換えられた組み換えエシェリキア・コリ細胞は、ＰＧＬを組み込まないこれらの細胞と比較して増殖が少なくとも約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％増加しており、及び／又は本明細書に記載されるような１７，２５７塩基対片が復元されている。
【０１２９】
生物活性を有する他の非相同ポリペプチドの生産を増加させる方法
同様に、本明細書では、生物活性を有する他の非相同ポリペプチド又は他の産物を生産するための改良法が提供される。産物の１つの非限定例はメバロン酸である。当業者は：（ａ）イソプレンを生産することのできる、エシェリキア・コリ（E. coli）株又はそれらの子孫細胞の組み換え細胞（１つ以上）を含む、組成物を培養すること（ここで、細胞は：（ｉ）ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の核酸（１つ以上）の１つ以上のコピー（ここで、核酸はエシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）；（ｉｉ）イソプレン合成酵素をコードしている１つ以上の非相同性の核酸（１つ以上）；及び（ｉｉｉ）（ｃ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸；を含み、ここで、エシェリキア・コリ細胞はＰＧＬポリペプチドをコードしている核酸（１つ以上）を組み込み前に含有せず、得られる組み換え細胞は、メバロン酸の生産に好適な培養条件下で、（ｉ）及び（ｉｉ）を含まない同様の細胞よりも大きい力価でイソプレンを生産する）；並びに（ｂ）メバロン酸を生産させることにより、メバロン酸を生産することができる。
【０１３０】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産に関する改良法は：（ａ）１つ以上の発現制御配列と関連付けられる６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸を更に含む、ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞を培養すること；並びに（ｂ）非相同ポリペプチドを生産させること；を含み、ここで、細胞を最少培地で培養した場合に、細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも、非相同ポリペプチドの比生産性が高い。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている、非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチド生産の改良法は、ポリペプチドを回収する工程を含む。
【０１３１】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【０１３２】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体に由来する。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１１に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３３】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、シュードモナス（Pseudomonas）属に由来する。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ポリペプチドは配列番号１２のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ポリペプチドは、配列番号１２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（P. aeruginosa）ポリペプチドは、配列番号１２に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３４】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子は、サッカロマイセス（Saccharomyces）属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ポリペプチドは配列番号１３のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ポリペプチドは、配列番号１３と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドは、配列番号１３に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３５】
一部の態様では、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチドをコードしていないエシェリキア・コリ株のバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株Ｂのバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１のバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。特定の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコース及び０．１％（重量／体積）以下が添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地はＭ９培地又はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。
【０１３６】
同様に、本明細書では、生物活性を有する他の非相同ポリペプチドを生産するための改良法が提供される。一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドの生産に関する改良法は：（ａ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝ポリペプチドをコードしている遺伝子（例えば、ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴ、及びｇａｌＥ）、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送体ポリペプチドをコードしている遺伝子（例えば、ｍｏｄＦ、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、及びｍｏｄＣ）をコードしていないエシェリキア・コリ株の細胞を培養する工程（ここで、更に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び生物活性を有する非相同ポリペプチドをコードしている核酸、ガラクトース代謝ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び／又はモリブデン輸送体ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含む）；並びに（ｂ）非相同ポリペプチドを生産させる工程（ここで、細胞を最少培地で培養した場合に、エシェリキア・コリ細胞は、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、ガラクトース代謝ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び／又はモリブデン輸送体ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも、非相同ポリペプチドの比生産性が高い）を含む。一部の態様では、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、ガラクトース代謝ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピー、及び／又はモリブデン輸送体ポリペプチドを１つ以上コードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーは、染色体コピーである（例えば、エシェリキア・コリ染色体に組み込まれる）。一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は培養される。一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチド生産の改良法は、更にポリペプチドを回収する工程を含む。
【０１３７】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝性の遺伝子、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送体遺伝子をコードしていない、エシェリキア・コリ株のバクテリア細胞はエシェリキア・コリ株Ｂである。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１である。一部の態様では、バクテリア細胞はエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【０１３８】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝性の遺伝子、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送体遺伝子をコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝性の遺伝子、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送体遺伝子をコードしている非相同性の遺伝子は、エシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５誘導体由来のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性、ガラクトース代謝活性、及び／又はモリブデン輸送活性を有するエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５ポリペプチドは、ネイティブなエシェリキア・コリ株Ｋ１２ＭＧ１６５５ポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性、ガラクトース代謝活性、及び／又はモリブデン輸送活性を有するエシェリキア・コリ株Ｋ１２  ＭＧ１６５５ポリペプチドは、ネイティブなエシェリキア・コリＫ１２株ＭＧ１６５５ポリペプチドに対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３９】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝ポリペプチド、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送ポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はシュードモナス（Pseudomonas）属由来のものである。一部の態様では、シュードモナスはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性、ガラクトース代謝活性、及び／又はモリブデン輸送活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（P. aeruginosa）ポリペプチドは、ネイティブなシュードモナス・アエルギノサポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性、ガラクトース代謝活性、及び／又はモリブデン輸送活性を有するシュードモナス・アエルギノサ（P. aeruginosa）ポリペプチドは、ネイティブなシュードモナス・アエルギノサポリペプチドに対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１４０】
一部の態様では、ＰＧＬポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝ポリペプチド、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送ポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子はサッカロマイセス属由来のものである。一部の態様では、サッカロマイセスはサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。一部の態様では、ＰＧＬ活性、ガラクトース代謝活性、及び／又はモリブデン輸送活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）ポリペプチドは、ネイティブなサッカロマイセス・セレヴィシエポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は保存型のものである。一部の態様では、アミノ酸置換は非保存型のものである。一部の態様では、ＰＧＬ活性を有するサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ポリペプチドは、ネイティブなサッカロマイセス・セレヴィシエポリペプチドに対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１４１】
一部の態様では、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）ポリペプチド、１つ以上のガラクトース代謝ポリペプチド、及び／又は１つ以上のモリブデン輸送ポリペプチドをコードしていない、エシェリキア・コリ株のバクテリア細胞は、最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株Ｂのバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１のバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のバクテリア細胞は最少培地で培養される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコースが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。特定の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）以下のグルコース及び０．１％（重量／体積）以下が添加される。一部の態様では、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスが添加される。一部の態様では、最少培地はＭ９培地又はＴＭ３培地である。一部の態様では、最少培地はＭ９培地である。一部の態様では、最少培地はＴＭ３培地である。
【０１４２】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチドは、テルペノイド（イソプレノイド）又はカロテノイド化合物（１種以上）の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを含み、並びに細胞を最少培地で培養した場合に、１つ以上の発現制御配列と関連付けられるＰＧＬポリペプチドをコードしている非相同性の遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞と比べ、高い比生産性でテルペノイド又はカロテノイドを生産する。一部の態様では、方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」又は「イソプレノイド」は、テルペンに類似する、天然に生じる幅広く多様な部類の有機化合物を指す。テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を組み合わせ、かつ様々な方法で修飾することで誘導されるものであり、構成員として使用されるイソプレン単位の数に基づいて分類される。ヘミテルペノイドは、イソプレン単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレン単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレン単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレン単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレン単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレン単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレン単位を８つ超有する。当業者であれば、非相同ポリペプチドの生物活性、例えば、適切な数のイソプレン単位を組み合わせることにより、様々な部類のテルペノイドを生産する能力、及びそれらを適切に修飾する能力を特定することができるであろう。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、用語「カロテノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種のバクテリア、のクロロプラスト中で生産される、天然に生じる有機色素群を指す。カロテノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。
【０１４５】
一部の態様では、テルペノイドはヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより大きなポリテルペノイドからなる群から選択される。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドはゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンである。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドはゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンである。一部の態様では、トリテルペノイドはスクアレン又はラノステロールである。一部の態様では、テトラテルペノイドはリコピン又はカロテンである。一部の態様では、カロテノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロテンはα−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
【０１４６】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチド用の微生物源は真菌である。一部の態様では、真菌はアスペルギルス（Aspergillus）種、例えば、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）及びアスペルギルス・ニガー（A. niger）など、サッカロマイセス種、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）など、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種、例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（S. pombe）など、あるいはトリコデルマ（Trichoderma）種、例えばトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）などの種である。一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチド用の微生物源は糸状菌である。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、トリコデルマ・コニンギ（T. koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウムｓｐ．（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレン（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ランヌギノース（H. lanuginose）、ヒュミコラ・グリセア（H. grisea）、クリソスポリウムｓｐ．（Chrysosporium sp.）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウムｓｐ．（Gliocladium sp.）、アスペルギルスｓｐ．（Aspergillus sp.）、例えば、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ソジャエ（A sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアスペルギルス・アワモリ（A. awamori）、フザリウムｓｐ．（Fusarium sp.）、例えばフザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミナム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポリウム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum）、ニューロスポラｓｐ．（Neurospora sp.）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、ヒポクレアｓｐ．（Hypocrea sp.）、ムコールｓｐ．（Mucor sp.）、例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei）、リゾプスｓｐ．（Rhizopus sp.）又はエメリセラｓｐ．（Emericella sp.）由来のものである。一部の態様では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アスペルギルス・アワモリ（A. awamori）、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレアタス（A. aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、フザリウム・オキシスポリウム（F. oxysporum）又はフザリウム・ソラニ（F. solani）である。一部の態様では、微生物源は酵母であり、例えば、サッカロマイセスｓｐ．（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセスｓｐ．（Schizosaccharomyces sp.）、ピキアｓｐ．（Pichia sp.）又はカンジダｓｐ．（Candida sp.）である。一部の態様では、サッカロマイセスｓｐ．はサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１４７】
一部の態様では、生物活性を有する非相同ポリペプチド用の微生物源はバクテリアである。一部の態様では、バクテリアは、バチルス（Bacillus）属、例えば、バチルス・リケニフォルミス（B. lichenformis）又はバチルス・サブチルス（B. subtilis）、パントエア（Pantoea）属、例えば、パントエア・シトレア（P. citrea）、シュードモナス（Pseudomonas）属、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、シュードモナス・プチダ（P. putida）、又はシュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、又はストレプトマイセス・ルビギノサス（S. rubiginosus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、例えば、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、又はエシェリキア属、例えばエシェリキア・コリのうちの１種である。一部の態様では、バクテリアは、バチルス・サブチルス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィリス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）からなる群から選択される。
【０１４８】
一部の態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、微生物源は葛、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ又はウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６など）、ヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。一部の態様では、微生物源は藍藻類であり、例えば形態学に基づき以下の群のいずれかに分類されるラン藻類：クロロコックム（Chlorococcales）目、プレウロカプサ（Pleurocapsales）目、ユレモ（Oscillatoriales）目、ネンジュモ（Nostocales）目、又はスティゴネマ目（Stigonematales）。
【０１４９】
再生可能資源から生産されるイソプレン組成物
再生可能資源から生産されるイソプレン組成物は、再生可能資源から生産されたイソプレンが、石油系イソプレン組成物に存在しない、又はごく少量に存在する、例えば、アルコールアルデヒド、ケトン及び同様物などの他の生物学的な副産物（生物資源から誘導され及び／又は生物学的過程に関連付けられ、イソプレンと共に得られる化合物）と共に生産されるという点で、石油系イソプレン組成物とは区別される。生物学的な副産物としては、限定するものではないが、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、シス−及びトランス−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オール又は３−メチル−２−ブテン−１−オールなど）、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、メタンチオール、酢酸メチル、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、酢酸エチル、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１−ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、酢酸ブチル、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（トランス−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、又は直鎖イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から誘導される、直鎖イソプレン二量体又は直鎖イソプレン三量体）が挙げられる。再生可能資源から生産されるイソプレンから誘導される産物は、１つ以上の生物学的副産物又は任意の副産物から誘導される化合物を含有する。加えて、再生可能資源から生産されるイソプレンから誘導される産物は、続く化学的変換時にこれらの副産物から生成される化合物を含有し得る。これらの化合物の例としては、ジエノフィルのイソプレンへのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化、又はイソプレンの酸化から誘導されるものが挙げられる。
【０１５０】
再生可能資源から生産される、特定の副産物又は不純物を含むイソプレン組成物は、米国仮出願特許第６１／１８７，９５９号及び国際公開第２０１０／１４８２５号により詳細に記載される。
【０１５１】
細胞により生産されるイソプレンの量は、例えば、国際特許出願第２００９／０７６６７６（Ａ２）号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号、同第１２／４２９，１４３号、同第１２／４９６，５７３号、同第１２／５６０，３９０号、同第１２／５６０，３１７号、同第１２／５６０，３７０号、同第１２／５６０，３０５号、及び同第１２／５６０，３６６号；同第６１／１８７，９３０号；同第６１／１８７，９４１号；同第６１／１８７，９５９号；米国特許公開第２０１０／０１９６９７７号及び国際公開第２０１０／０７８４５７号に記載されるように、イソプレン合成酵素ポリペプチド（例えば、植物イソプレン合成酵素）、ＤＸＳポリペプチド、他のＤＸＰ経路ポリペプチド、及び／又は細胞内へのＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を導入することで、非常に増加することになる。
【０１５２】
例示的なイソプレン合成酵素ポリペプチド（例えば、植物イソプレン合成酵素）、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１５３】
例示的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸
一部の態様では、エシェリキア・コリ細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている非相同性の核酸を含む。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、タイワンクズ（葛）（Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、クズ（Pueraria lobata）、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギｘトレムラ（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ）Ｓｉｌｖｅｒら、ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）（Ｚｉｍｍｅｒら、国際公開第９８／０２５５０）由来のポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、天然に生じるイソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、天然に生じるイソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸ではない。例示的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸、並びにイソプレン合成酵素活性の測定方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２）号、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５４】
例示的なＤＸＳポリペプチド及び核酸
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。例示的なＤＸＳポリペプチド及び核酸並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５５】
例示的なＤＸＰ経路ポリペプチド及び核酸
例示的なＤＸＰ経路のポリペプチドとしては、限定するものではないが以下のポリペプチドのうちの任意のものが挙げられる：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ又は２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路に関する核酸としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１５６】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。例示的なＤＸＳポリペプチド及び核酸並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５７】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５８】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５９】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６０】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６１】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６２】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６３】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６４】
ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェートをジメチルアリールジホスフェートヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがイソペンテニルジホスフェートを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６５】
例示的なＩＤＩポリペプチド及び核酸
イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。例示的なＩＤＩポリペプチド及び核酸並びにＩＤＩ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１６６】
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸並びにＩＤＩ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１６７】
一部の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸を包含する上流のＭＶＡ経路を含有する。一部の態様では、細胞は、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸を包含する下流のＭＶＡ経路を含有する。一部の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸を包含するＭＶＡ経路全体を含有する。一部の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＤＣ、ＩＰＫ、及びＩＤＩの核酸を包含するＭＶＡ経路全体を含有する。
【０１６８】
本明細書に記載されるエシェリキア・コリ細胞は、イソプレン、及び例えば水素、エタノール、又はプロパンジオール（例えば、１，２−プロパンジオール又は１，３−プロパンジオール）などの副産物の生産に関する改良法に使用することもできる。同様に、記載の組成物及び方法に、例示的なヒドロゲナーゼポリペプチド及び核酸、発酵副産物の生産に関連する遺伝子に関するポリペプチド及び核酸、及び水素の再取り込みに関連する遺伝子に関するポリペプチド及び核酸を、使用することもできる。このようなポリペプチド及び核酸は、米国特許広報第２０１０／０１９６９７７号及び国際公開第２０１０／０７８４５７号に記載されるものである。
【０１６９】
核酸を単離するための例示的な方法
イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ変異体及び／又は転写因子の核酸は、標準法を用い単離することができる。対象とする微生物資源（例えばバクテリアのゲノムなど）から所望の核酸を得る方法は、一般的であり、分子生物学の分野では周知である（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。既知の配列のＰＣＲによる増幅、核酸の合成、ゲノムライブラリの選別、コスミドライブラリの選別などの、核酸単離の標準法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載される。
【０１７０】
例示的なプロモーター及びベクター
本明細書に記載される、イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ変異体、転写因子、ガラクトース代謝に関する核酸、及び／又はモリブデン輸送体の核酸に関する任意の核酸を１つ以上のベクターに含有させることができる。したがって同様に、本明細書に記載のイソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ変異体、転写因子ポリペプチド、ガラクトース代謝に関する核酸、及び／又はモリブデン輸送ポリペプチドのうちの任意のものをコードしている核酸を１つ以上有しているベクターが本明細書に記載される。一部の態様では、ベクターは、発現制御配列の制御下の核酸を含有する。一部の態様では、発現制御配列はネイティブな発現制御配列である。一部の態様では、発現制御配列は非ネイティブな発現制御配列である。一部の態様では、ベクターは選択マーカー（selective marker又はselectable marker）を含有する。一部の態様では、選択マーカーは使用せずに、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳの核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写制御に関する核酸、ガラクトース代謝に関する核酸、及び／又はモリブデン輸送体の核酸を細胞染色体に組み込む。一部の態様では、選択マーカーを使用して、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳの核酸、ＩＤＩの核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写制御に関する核酸、ガラクトース代謝に関する核酸、及び／又はモリブデン輸送体の核酸を細胞染色体に組み込む。
【０１７１】
好適なベクターは、選択された宿主細胞と適合性があるものである。好適なベクターは、例えば、バクテリア、ウィルス（バクテリオファージＴ７又はＭ−１３から誘導されたファージなど）、コスミド、酵母又は植物から誘導され得る。好適なベクターは、培地中にはコピーナンバー数を少なく維持すること、又は宿主細胞中でコピー数が大きくなるよう維持することができる。このようなベクターを得て使用するためのプロトコルは当該技術分野で既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたい）。本明細書に記載される細胞及び方法と適合性のある好適なベクターは、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されるものである。
【０１７２】
プロモーターは当該技術分野において周知である。イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳの核酸、ＩＤＩの核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸を宿主細胞で発現させるにあたり、宿主細胞で機能する任意のプロモーターを使用することができる。様々な宿主細胞でイソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳの核酸、ＩＤＩの核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸の発現を駆動するのに有用である開始制御領域、すなわちプロモーターは、多数存在し、当業者には周知である（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。これらの核酸を駆動することのできる、実質上任意のプロモーター、例えばグルコースイソメラーゼプロモーターを使用することができる（例えば、米国特許第７，１３２，５２７号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。本明細書に記載の細胞及び方法と適合性のある好適なプロモーターは、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号及び米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２（Ａ１）号に記載される。
【０１７３】
一部の態様では、発現ベクターには転写終結配列も包含される。転写終結制御領域は、宿主細胞にとってネイティブな様々な遺伝子から誘導されるものであり得る。一部の態様では、転写終結配列及びプロモーター配列は同じ供給源から誘導される。本明細書に記載の細胞及び方法と適合性のある好適な転写終結配列は、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号及び米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２（Ａ１）号に記載される。
【０１７４】
標準法を用い、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳの核酸、ＩＤＩの核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデンの核酸を、ベクター、例えば、発現ベクターに組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）。本明細書に記載の細胞及び方法と適合性のある好適な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号、及び米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２（Ａ１）号に記載される。
【０１７５】
一部の態様では、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸は、現在天然に生じる細胞で見られるものよりもはるかに高レベルに過剰発現させることが望ましい場合がある。一部の態様では、イソプレン合成酵素をコードしている核酸、ＤＸＰ経路をコードしている核酸、ＩＤＩをコードしている核酸、ＭＶＡ経路をコードしている核酸、ＰＧＬをコードしている核酸、ヒドロゲナーゼをコードしている核酸、ヒドロゲナーゼ変異体をコードしている核酸、転写因子ポリペプチドをコードしている核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体ポリペプチドをコードしている核酸は、現在天然に生じる細胞で見られるものよりもはるかに低レベルに過小発現（例えば、変異、不活化又は欠失）させることが望ましい場合がある。本明細書に記載の細胞及び方法に適合性のあるイソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸を過剰又は過小発現させるのに好適な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号及び米国特許出願公開番号第２００９／０２０３１０２（Ａ１）号に記載される。
【０１７６】
例示的な生物資源
イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸（及びそれらのコードするポリペプチド）は、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。上記のように、イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。生物は、イソプレンを生産するためにＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する（図１Ａ及び１Ｂ）。したがってＤＸＰ経路に関する核酸は、例えば、ＤＸＰ経路を含有する、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する、任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びイソプレン合成酵素の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から得ることができる。ヒドロゲナーゼ核酸は、例えば、水素を酸化させる、すなわち水素イオンを還元させる任意の生物から得ることができる。発酵副産物の遺伝子は、例えば、酸素制限耐性のある、すなわち解糖系などの、嫌気性呼吸耐性のある任意の生物から得る又は単離することができる。
【０１７７】
イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異の核酸体、転写因子、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸の核酸配列は、バクテリア、真菌、植物、藻類、又は藍藻類から単離することができる。例示的な生物資源としては、例えば、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）、バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、エシェリキア・コリ）、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えば葛又はポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。例示的な宿主生物は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載される。
【０１７８】
例示的な形質転換方法
例えば、形質転換、電気穿孔法、核のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション介在型又はＤＥＡＥ−デキストリン介在型の形質移入又は組み換えファージウィルスを用いる形質移入）、リン酸カルシウムとインキュベーションすることによるＤＮＡ沈降、ＤＮＡをコーティングした微粒子銃による高速衝撃、及びプロトプラストの融合などの、ＤＮＡコンストラクト又はベクターの宿主細胞導入に関する標準的技法を用い、イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＰ経路に関する核酸、ＩＤＩの核酸、ＭＶＡ経路に関する核酸、ＰＧＬの核酸、ヒドロゲナーゼの核酸、ヒドロゲナーゼ変異体の核酸、転写因子の核酸、ガラクトース代謝に関する核酸及び／又はモリブデン輸送体の核酸又はこれらを含有しているベクターを宿主細胞（例えば、本明細書に記載される植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、すなわちバクテリア細胞）に挿入することができる。一般的な形質転換技術が当該技術分野において既知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選別することができる。形質転換体の選別に好適な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６に記載される。
【０１７９】
例示的な精製方法
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは吸収脱離（absorption stripping）により回収される（例えば、米国仮出願特許第６１／２８８，１４２号又は米国特許出願第１２／９６９，４４０号を参照されたい）。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、非相同ポリペプチドを回収する工程を含む。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
【０１８０】
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号；及び米国仮出願特許第６１／１８７，９５９号により詳細に記載される。
【０１８１】
他の技術
イソプレン及び副産物（例えば、水素）の生産及び回収に有効な方法の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号に記載される。
【０１８２】
本明細書に記載の細胞及び方法に使用することができる、他の技術（例えば、細胞増殖により生産されたイソプレンの脱カップリング、高いイソプレン力価で細胞が生存可能である、安全な制御範囲内でイソプレンを製造する方法、イソプレン及び副産物（例えば、水素、エタノール、又は１，３−プロパンジオール）を生産及び回収するのに有効な方法）の例は、国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号；米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４（Ａ１）号、同第２０１０／００８６９７８（Ａ１）号、同第２０１０／０１１３８４６（Ａ１）号、同第２０１０／０１８４１７８（Ａ１）号及び同第２０１０／０１６７３７１（Ａ１）号、同第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号；米国仮出願特許第６１／１８７，９３０号、同第６１／１８７，９５９号及び同第６１／１８７，９４１号；及び国際公開第２００４／０３３６４６（Ａ２）号及び国際公開第１９９６／０３５７９６（Ａ２）号に記載される。
【０１８３】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩオペロン、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ及びｍｖａＳ）及びｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現しているエシェリキア・コリ株の作製
（ｉ）ＥＷＬ２０１株（ＢＬ２１，Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の作製
エシェリキア・コリＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ  ｂｒａｎｄ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、ＭＣＭ３３１  Ｐ１細胞可溶化物（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載の方法に従って調製した可溶化液）により形質導入したレシピエント株であった。ＭＣＭ３３１細胞は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びＩＰＰイソメラーゼをコードしている染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ（すなわち、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロン；このコンストラクトは国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号の実施例１０及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）に記載される）を含有している。細胞をＬ寒天及び２０μｇ／μＬクロラムフェニコール上に広げることで、形質導入体を選別した。このプレートを３０℃で一晩インキュベートした。形質導入について解析したところ、対照プレートではコロニーは示されなかった（復元に関し水＋細胞の対照プレート、並びに可溶化液の混入に関し水及びＰ１細胞可溶化液対照プレート）。
【０１８５】
４つの形質導入体を採取し、５ｍＬのＬブロス及び２０μｇ／μＬのクロラムフェニコールに接種した。２００ｒｐｍで振とうしながら培養物を３０℃で一晩増殖させた。ＰＣＲ解析に際し各形質導入体のゲノムＤＮＡ調製物を作製するため、一晩細胞培養物１．５ｍＬを遠心分離した。細胞ペレットを４００μＬの再懸濁用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ，１ｍＭのＥＤＴＡ，５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ  ７．５））に再懸濁し、４μＬのＲＮａｓｅ，ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。チューブを３７℃で３０分インキュベートし、続いて４μＬの１０％のＳＤＳ及び４μＬの１０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ原液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。チューブを３７℃で１時間インキュベートした。細胞可溶化物を２ｍＬのＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ｇｅｌ  ｔｕｂｅｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、飽和フェノール（ｐＨ  ７．９）（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）及びクロロホルムを各２００μＬ添加した。チューブをよく混合し、５分間微量遠心した。４００μＬのクロロホルムにより第２の抽出を行い、水層を新しいエッペンドルフチューブに移した。１００％のエタノールを１ｍＬ添加することによりゲノムＤＮＡを沈殿させ、５分間遠心分離した。ゲノムＤＮＡのペレットを７０％のエタノール１ｍＬにより洗浄した。エタノールを除去し、ゲノムＤＮＡのペレットを簡単に風乾させた。ゲノムＤＮＡのペレットを２００μＬのＴＥに再懸濁した。
【０１８６】
Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びテンプレートとして２００ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを用い、製造元のプロトコルに従って２つの異なる設定のＰＣＲ反応チューブを準備した。設定１では、プライマーＭＣＭ１３０及びＧＢ  Ｃｍ−Ｒｅｖ（表１）を使用し、形質導入体が首尾よくａｔｔＴｎ７座に組み込まれたことを確認した。設定１のＰＣＲパラメーターは、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で２５秒（工程２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分というものであった。設定２に関しては、ｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロンを確実に適切に組み込むためにＭＶＤ順方向プライマー及びＭＶＤ逆方向プライマー（表１）を使用した。設定２のＰＣＲパラメーターは、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１０秒（工程２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分というものであった。１．２％のＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）でＰＣＲ増幅産物を解析したところ、全部で４つの形質導入体クローンが回収（correct）された。１つを採取し、ＥＷＬ２０１株と命名した。
【０１８７】
（ｉｉ）ＥＷＬ２０４株（ＢＬ２１，ｌｏｏｐｏｕｔ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の作製
Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ（２０００）（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６６４０〜６６４５，２０００）により記載されるようにｐＣＰ２０プラスミドを用い、ＥＷＬ２０１株からクロラムフェニコールマーカーをループアウト（looped out）した。ＥＷＬ２０１細胞を対数増殖期中期までＬブロスで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを１μＬのｐＣＰ２０と混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）を用い、細胞懸濁液混合物を２ｍｍキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。直ちに１ｍＬのＬＢを細胞に添加し、次に金属製の蓋を持つ１４ｍＬのポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で１時間増殖させ、細胞を回復させた。Ｌ寒天及び２０μｇ／μＬのクロラムフェニコール及び５０μｇ／μＬのカルベニシリンで形質転換体を選別し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、単独のコロニーを１０ｍＬのＬブロス及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン中で、対数増殖期初期まで３０℃で増殖させた。温度を４２℃に上昇させ、培養物を２時間増殖させた。連続希釈物を作製し、次に細胞をＬＡプレート（選別用の抗菌剤は不含有）上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、２０コロニーを採取し、Ｌ寒天（抗菌剤不含有）、及びＬＡ及び２０μｇ／μＬのクロラムフェニコールプレート上に接種した。次にプレートを３０℃で一晩インキュベートした。ＬＡプレート上では増殖可能であるが、ＬＡ及び２０μｇ／μＬのクロラムフェニコールプレート上では増殖不能であった細胞を、クロラムフェニコールマーカーをループアウトしているものと見なした（１つを採取し、ＥＷＬ２０４株と命名した）。
【０１８８】
（ｉｉｉ）ｐＥＷＬ２３０プラスミド（ウラジロハコヤナギ（P. alba）ｐＴｒｃ）の作製
エシェリキア・コリ発現に際しコドンが最適となる方法に基づき、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）イソプレン合成酵素（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）をコードしている合成遺伝子の生成をＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）に外注した。合成遺伝子はプラスミドｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ  ｂｒａｎｄ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）にカスタムクローニングし、凍結乾燥させて輸送した（図２，３Ａ〜Ｂ；配列番号１）。
【０１８９】
製造元のプロトコルに従ってテンプレートとしてｐＥＴ２４ウラジロハコヤナギＨＧＳ、プライマーＭＣＭ１８２及びＭＣＭ１９２、並びにＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ反応を実施してウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２０秒、７２度で１分（これらの工程を２５サイクル繰り返す）、７２℃で３分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用い、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素ＰＣＲ産物を精製した。
【０１９０】
次に、１μＬのＢｓｐＨＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と２μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液４を含有している２０μＬの反応溶液で、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素ＰＣＲ産物を消化した。反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次にＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用い精製した。１μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と２μＬの１０Ｘ緩衝液Ｈを含有している２０μＬの反応溶液で制限酵素による２度目の消化を実施した。反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次にＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用い精製した。１μＬのＮｃｏＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ、及び２μＬの１０Ｘ緩衝液Ｈを含有している２０μＬの反応溶液でｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）プラスミドを消化した。反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした。消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターを１．２％のＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い抽出した（図４）。ＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩ部位の相補性接着端を用い、５μＬのウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素挿入断片、２μＬのｐＴｒｃベクター、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液、及び１０μＬのｄｄＨ２Ｏを含有している２０μＬのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を室温で４０分インキュベートした。ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かせ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を室温で３０分間穏やかに適用することでライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬＢで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。細胞懸濁液の５０μＬアリコートを、５μＬの脱塩したｐＴｒｃウラジロハコヤナギＨＧＳライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、細胞懸濁液混合物を２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。直ちに１ｍＬのＬＢを細胞に添加し、次に金属製の蓋を持つ１４ｍＬのポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で２時間増殖させ、細胞を回復させた。Ｌ寒天及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン及び１０ｍＭのメバロン酸上で形質転換体を選別し、３０℃でインキュベートした。翌日、６つの形質転換体を回収し、５ｍＬのＬブロス及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン入のチューブで３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した。プラスミドの増殖にＢＬ２１細胞を使用したことから、ＰＢ緩衝液５Ｘ及びＰＥ緩衝液３Ｘによるスピンカラムの洗浄法を改変し、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準法に組み込んだ。適切な大きさの線状断片を確実に得るため、２０μＬの反応溶液でＰｓｔｌによ���プラスミドを消化した。６つのプラスミドすべてが正しいサイズであった。これらのプラスミドをプライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００（表１）により配列決定するためにＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に輸送した。ＤＮＡ塩基配列決定法により、６つのプラスミドすべてが正しいものであることが示された。１つのプラスミドを回収し、ＥＷＬ２３０プラスミドとして命名した（図５，６Ａ〜Ｂ；配列番号２）。
【０１９１】
ｉｖ）ｐＥＷＬ２４４プラスミド（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の作製
製造元のプロトコルに従ってテンプレートとしてＭＣＭ３７６、プライマーＭＣＭ１６５及びＭＣＭ１７７（表１を参照されたい）、及びＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ反応を実施し、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）ＭＶＫ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１８秒（これらの工程を２８サイクル繰り返す）、最後の伸長サイクルを７２℃で１分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いメタノサルシナ・マゼイＭＶＫＰＣＲ産物を精製した。
【０１９２】
次に、メタノサルシナ・マゼイＭＶＫ  ＰＣＲ産物を、８μＬのＰＣＲ産物、２μＬのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液４、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  ＢＳＡ、及び２２μＬのｄｄＨ２Ｏを含有している４０μＬの反応溶液で消化した。反応物を３７℃で３時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次にＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用い精製した。２μＬのＮｓｉＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、４．７μＬの１０Ｘ緩衝液Ｈ、及びＰｍｅＩ消化したメタノサルシナ・マゼイＭＶＫ断片４０μＬを含有している４７μＬの反応溶液で制限酵素による２度目の消化を実施した。反応溶液を３７℃で３時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次に１．２％  Ｅ−ｇｅｌを用い精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い抽出した。１０μＬのプラスミド、２μＬのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液４、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  ＢＳＡ、及び２０μＬのｄｄＨ２Ｏを含有している４０μＬの反応溶液でＥＷＬ２３０プラスミドを消化した。反応溶液を３７℃で３時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次にＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用い精製した。２μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、４．７μＬの１０Ｘ緩衝液Ｈ、及びＰｍｅＩ消化したＥＷＬ２３０の線状断片４０μＬを含有している４７μＬの反応溶液で制限酵素による２度目の消化を実施した。反応溶液を３７℃で３時間インキュベートした。消化したＰＣＲ断片を次に１．２％のＥ−ｇｅｌを用いゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い抽出した（図７）。ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩ部位の相補性接着端を用い、８μＬのメタノサルシナ・マゼイＭＶＫ挿入断片、３μＬのＥＷＬ２３０ベクター、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液、及び６μＬのｄｄＨ２Ｏを含有している２０μＬのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を１６℃で一晩インキュベートした。翌日、ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かせ、ニトロセルロース膜フィルタ上にライゲーション混合物を室温で３０分間穏やかに適用することでライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬブロスで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを、５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫライゲーション混合物と混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、細胞懸濁液混合物を２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。直ちに１ｍＬのＬＢを細胞に添加し、次に細胞を金属製の蓋を持つ１４ｍＬのポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させ、細胞を回復させた。ＬＡ及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン及び５ｍＭのメバロン酸プレート上で形質転換体を選別し、３０℃でインキュベートした。翌日、６つの形質転換体を回収し、５ｍＬのＬＢ及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン入のチューブで３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃ���  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施したプラスミドの増殖にＢＬ２１細胞を使用したことから、ＰＢ緩衝液５Ｘ及びＰＥ緩衝液３Ｘによるスピンカラムの洗浄法を改変し、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準法に組み込んだ。適切な大きさの線状断片を確実に得るため、２０μＬの反応溶液でＰｓｔｌによりプラスミドを消化した。６つのプラスミドすべてが正しいサイズであった。これらのプラスミドをプライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００、ＥＬ１００３、及びＥＬ１００６（表１）により配列決定するためにＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに輸送した。ＤＮＡ塩基配列決定法により、３つのプラスミドすべてが正しいものであることが示された。１つのプラスミドを回収し、ＥＷＬ２４４プラスミドとして命名した（図８及び９Ａ〜Ｂ；配列番号３）。
【０１９３】
ｖ）ｐＥＴ２００Ｄでのメタノサルシナ・マゼイ古細菌からのＭＣＭ３７６−ＭＶＫ  Ｌｏｗｅｒプラスミドの作製
プライマーＭＣＭ１６１及びＭＣＭ１６２（表１）を用い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲミックスを用い、メタノサルシナ・マゼイ古細菌の経路下流のオペロン（図１０Ａ−Ｃ；配列番号４）由来のＭＶＫ翻訳領域をＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲ混合物を１μＬのテンプレート、１０μＭの各プライマー１μＬ、及び２μＬの水と混合した。反応は以下のようにサイクルさせた：９４℃で２分間；９４℃で０：３０分、５５℃で０：３０分、及び６８℃で１：１５分を３０サイクル；７２℃で７分、及び冷却するまで４℃。製造元のプロトコルに従ってこのＰＣＲ反応物３μＬをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＥＴ２００Ｄプラスミドにライゲートした。このライゲーション物３μＬをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０で選別した。形質転換細胞からプラスミドを単離し、挿入断片を配列決定してＭＣＭ３７６を得た（図１１Ａ〜Ｃ）。
【０１９４】
ｖｉ）ＥＷＬ２５１（ＢＬ２１（ＤＥ３），Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）株の作製
ＭＣＭ３３１細胞（サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロホスフェートデカルボキシラーゼ、及びＩＰＰイソメラーゼをコードしている染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有している）を対数増殖期中期までＬＢで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。５０μＬの懸濁液を１μＬのＥＷＬ２４４プラスミドと混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、細胞懸濁液混合物を２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。直ちに１ｍＬのＬＢを細胞に添加し、次に細胞を金属製の蓋を持つ１４ｍＬのポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させ、細胞を回復させた。ＬＡ及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン及び５ｍＭのメバロン酸プレート上で形質転換体を選別し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ２５１株と命名した。
【０１９５】
ｖｉｉ）ＥＷＬ２５６（ＢＬ２１（ＤＥ３），Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ，ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）株の作製
ＥＷＬ２５１細胞を対数増殖期中期までＬＢで増殖させ、次に氷冷した滅菌水で３度洗浄した。５０μＬの細胞懸濁液を１μＬのＭＣＭ８２プラスミド（エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしているｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（「ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ」としても既知）を含む）と混合した。ｐＣＬ  Ｐｔｒｃ  Ｕｐｐｅｒ  Ｐａｔｈｗａｙプラスミドを国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号の実施例８及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）に記載されるように作製した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、細胞懸濁液混合物を２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。直ちに１ｍＬのＬＢを細胞に添加した。次に細胞を金属製の蓋を持つ１４ｍＬのポリプロピレンチューブ）に移した。３０℃で２時間増殖させ、細胞を回復させた。ＬＡ及び５０μｇ／μＬのカルベニシリン及び５０μｇ／μＬのスペクチノマイシンプレート上で形質転換体を選別し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを採取し、ＥＷＬ２５６株と命名した。
【表１】
2013515491.tif 000003
【０１９６】
ｖｉｉｉ）ＲＭ１１１６０８−２株（Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ，ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ，ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ）の作製
イソプレンを生産するエシェリキア・コリ（ＥＷＬ２５６）ＢＬ２１株を、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）（Ｄｒ．Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手）の自己複製によりｙｂｈＥ遺伝子（エシェリキア・コリ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードしている）が常時発現するよう作製した。
【０１９７】
ＦＲＴ系の組み換えカセット、及びＲｅｄ／ＥＴ介在型組み込み用プラスミド及び抗菌剤マーカーのループアウトをＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓのプロトコルに従って、これらの材料を用い手順を実施した。プライマーＰｇｌ−Ｆ（配列番号２９）及びＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ（配列番号３０）を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎキットを使用してＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートから耐性カセットを増幅させた。ＰＣＲ反応液（最終容量５０μＬ）には以下のものを含有させた：５μＬの緩衝液、１μＬのテンプレートＤＮＡ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓからのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−Ｆ）、１０ｐｍｏｌｓの各種プライマー、及び１．５μＬの２５ｍＭのｄＮＴＰミックスにｄＨ２Ｏを加え５０μＬにした。反応は以下のようにサイクルさせた：９５℃で２分×１サイクル、次に（９５℃で３０秒；６３℃で３０秒；７２℃で３分）を３０サイクル。
【０１９８】
得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い精製し、ｐＲｅｄ−ＥＴリコンビナーゼ含有プラスミドを以下のように内包している電気的な形質転換受容性のあるＭＧ１６５５細胞に電気穿孔した。細胞はＯＤ６００が約０．６になるまで５ｍＬのＬブロスで３０℃で増殖させて調製した。４％アラビノースを添加し、３０℃で３０分増殖させ、続いて３７℃で３０分増殖させることで細胞にリコンビナーゼを発現誘導した。この細胞アリコート１．５ｍＬを、氷冷したｄＨ２Ｏで３〜４回洗浄した。最終的に細胞ペレットを４０μＬの氷冷したｄＨ２Ｏに再懸濁し、２〜５μＬのＰＣＲ産物を添加した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）で１ｍｍギャップのキュベットで、１．３ｋＶにて電気穿孔法を実施した。３０℃で１〜２時間細胞を回復させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有しているＬ寒天に蒔いた。組み込み部位に隣接するプライマー（２つのプライマー対：ｐｇｌ及び４９ｒｅｖ及び３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ；Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２及びＴｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６））を用い、ＰＣＲ及び配列決定により５つの形質転換体を解析した。正しい形質転換細胞を選別し、この株をＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰと命名した。
【０１９９】
ＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰの染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＦＲＴ−ＣＭＰ−ＦＲＴ−ＧＩ１．５−ｙｂｈＥコンストラクトを含有しているＰＣＲ断片を生成した。このコンストラクトを以下のようにｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）にクローン化した。ここではＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌと呼ぶこの断片を、５’プライマーＰｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ（配列番号３１）及び３’プライマー３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ（配列番号３２）を用い増幅した。得られた断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングキットを用い、製造元からの推奨通りにプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローン化した。ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ断片を内包しているＮｓｉＩ断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）のＰｓｔＩ座にクローン化した。５μＬのＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ挿入断片、２μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）ベクター、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液、及び１０μＬのｄｄＨ２Ｏを含有している２０μＬのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を室温で４０分インキュベートし、次に電気的な形質転換受容性のあるＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、上記に開示したパラメーターを用い２〜４μＬを電気穿孔した。１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有しているＬ寒天で形質転換体を選別した。選別したクローンの配列を、上記の多くのプライマー並びにＳｅｑｕｅｔｅｃｈ（ＣＡ）により提供される自家Ｔ３プライマー及び逆方向プライマーを用い決定した。このプラスミドをｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ（図１２，１３Ａ〜Ｂ及び配列番号６）と命名した。
【０２００】
ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌプラスミドを本明細書に記載されるようにＥＷＬ２５６に電気穿孔し、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、及びカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有しているＬ寒天に形質転換体を蒔いた。形質転換細胞を１つ選別し、ＲＭ１１１６０８−２株と命名した。
【０２０１】
プライマー：
Ｐｇｌ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２９）
ＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ
５’−ＧＣＴＧＧＣＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号３０）
３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ：
５’−ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ（配列番号３１）
ｐｇｌ＋４９  ｒｅｖ：ＣＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号３２）
Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２：ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号３３）
Ｔｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６）：ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣ（配列番号３４）
Ｐｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号３５）
実施例２：エシェリキア・コリにおいてプラスミドからｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を常時発現させることにより改良されたイソプレン生産法
この例は、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を常時発現しているエシェリキア・コリ株におけるイソプレンの生産を、ｙｂｈＥを野生型のレベルで発現している対照株（すなわち、ＥＷＬ２５６）と比較して示す。エシェリキア・コリ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードしているｙｂｈＥ（ｐｇｌ）遺伝子は、非相同的に発現させたタンパク質の翻訳後グルコニル化を抑制し、生産物の溶解度及び及び収率を改良させつつ、バイオマス収率及びペントースリン酸経路を介する流れも改良する（Ａｏｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ及びＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（４）：９５０〜９５８，２００８）。
【０２０２】
ｉ）小規模解析
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを１ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整した。０．２２マイクロメートルフィルタで培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース５．０ｇ及び抗菌剤を添加した。
【０２０３】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌあたり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各構成要素をｄｉＨ２Ｏに１つずつ溶解させた。ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に容量を調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２０４】
（ａ）実験手順
ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）で株を増殖させることでイソプレン生産を解析した。試験容量は２４ウェルそれぞれにつき４．５ｍＬであった。温度を３０℃に維持し、ｐＨは７．０に設定し、酸素流は２０ｓｃｃｍに設定し、攪拌速度は８００ｒｐｍであった。凍結したバイアル瓶からエシェリキア・コリ株の接種材料を回収し、ＬＢブロス寒天プレート（抗菌剤含有）に画線し、３０℃でインキュベートした。抗菌剤を含有している培地にシングルコロニーを摂取し、一晩増殖させた。抗菌剤を含有させた４．５ｍＬの培地に、５５０ｎｍで測定される吸光度が０．０５になるまでバクテリアを希釈した。
【０２０５】
ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペース解析を用い、イソプレンガスの放出に関する解析を実施した。試料調製は以下の通りであった：１００μＬの全ブロスをＧＣバイアル瓶に配置してシールし、３０℃にて定刻の３０分間インキュベートした。７０℃で５分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填した。
【０２０６】
実験過程の間、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用い、波長５５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を得た。イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をＯＤ読み取り値及び時間で除算することで比生産性を得た。
【０２０７】
２００及び４００μＭのＩＰＴＧインキュベーション濃度で、２つの株ＥＷＬ２５６及びＲＭ１１６０８−２を評価した。インキュベート後１、２．５、４．７５、及び８時間の時点で、イソプレン生産及び細胞増殖（ＯＤ５５０）について試料を解析した。試料は２つ組みで実施した。
【０２０８】
（ｂ）結果
実験は、２種の異なる濃度のＩＰＴＧ下で、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）発現株のイソプレンの比生産性が対照株と比較して劇的に２〜３倍も増加したことを例証した。
【０２０９】
ｉｉ）Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、メタノサルシナ・マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素、及びｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）を発現しているエシェリキア・コリからのイソプレン発酵、及び１５Ｌスケールでのフェドバッチ式増殖。
【０２１０】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：Ｋ２ＨＰＯ４を７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、酵母エキスを０．５ｇ、１０００Ｘ改変微量原子溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブ処理した。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。グルコースを１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌを０．１ｇ、及び抗菌剤を滅菌及びｐＨ調整後に添加した。
【０２１１】
１０００Ｘ改変微量金属溶液：クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各成分をｄｉＨ２Ｏに１つずつ溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、次に容量を適量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２１２】
１５Ｌのバイオリアクターで、メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来の高発現型メバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の高発現型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）、及び高発現型のエシェリキア・コリｐｇｌ（ｐＢＢＲ−ｐｇｌ）を含有しているＢＬ２１（ＤＥ３）エシェリキア・コリ細胞により発酵を実施した。本実験は、所望の発酵ｐＨ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。エシェリキア・コリ株の凍結バイアル瓶を解凍し、トリプトン−酵母エキス培地に接種した。接種後、５５０ｎｍでの測定でＯＤ１．０になるまで増殖させ、開始タンク容量を５Ｌにする前に、培養物の内５００ｍＬを用い１５Ｌのバイオリアクターに接種した。
【０２１３】
細胞が定常期に到達するまで指数関数的な割合でグルコースを加えた。定常期に到達後、代謝に必要とされる程度にまでグルコースの添加量を減少させた。４０時間（５９時間）の発酵の間にバイオリアクターに供給したグルコースの合計量は３．１ｋｇ（５９時間では４．２ｋｇ）であった。ＩＰＴＧを添加することで導入を実施した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が４に到達した際に、ＩＰＴＧ濃度を１１０μＭにした。ＯＤ５５０が１５０に到達した際に、ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。バイオリアクター内部のＯＤ５５０の経時的なプロファイルを図１４Ａに示す。Ｈｉｄｅｎ質量分析計を用い、バイオリアクターから放出されるガス中のイソプレン濃度を測定した。発酵過程にわたりイソプレン力価は増加し、４０時間で最大値３３．２ｇ／Ｌ（５９時間では４８．６ｇ／Ｌ）に達した（図１４Ｂ）。発酵過程にわたりイソプレン力価は増加し、４０時間で最大値４０．０ｇ／Ｌ（５９時間では６０．５ｇ／Ｌ）に達した（図１４Ｃ）。４０時間（５９時間）の発酵時に生産されたイソプレンの合計量は２８１．３ｇ（５９時間では４５１．０ｇ）であった。生産の時間経過を図１４Ｄに示す。容量生産の時間経過を図１４Ｅに示し、０〜４０時間の間に平均速度１．０ｇ／Ｌ／時間（１９〜５９時間の間では１．４ｇ／Ｌ／時間）が維持されたことを示す。ＣＥＲにより測定される代謝活性プロファイルを図１４Ｆに示す。発酵時にイソプレン生産に使用された炭素のモル収率は４０時間の時点で１９．６％（５９時間の時点では２３．６％）であった。グルコースからのイソプレンの収率重量％は４０時間の時点で８．９％（５９時間の時点では１０．７％）であった。
【０２１４】
実施例３：再生可能資源から生産されたイソプレンの回収
活性炭へ吸着させることにより発酵ガス流からイソプレンを取り除くこと、続いてオフライン蒸気により脱着及び凝集させて液体プロピレンを得ること、を包含する２工程の操作で、１４Ｌスケールの４つの発酵のセットからイソプレンを回収した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。４つの発酵により生産されたイソプレンの合計量は１１５０ｇ（１６．９ｍｏｌ）であり、そのうち９５３ｇ（１４ｍｏｌ，８３％）がカーボンフィルターに吸着した。蒸気脱着／凝集工程後に回収された液体イソプレンの量は８１０ｇであり、これは全体的な収率７０％に相当する。回収したイソプレンを不純物の存在について解析した。
【０２１５】
液体イソプレンの解析及び不純物プロファイル
回収した液体イソプレンをＧＣ／ＭＳ及びガスクロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＧＣ／ＦＩＤ）により解析し、性質及び不純物濃度について測定した。測定した産物は＞９９．５％純粋であり、数種の主要な不純物に加え、多くの微量成分を含有していた。ＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを図１７に記載し、典型的な不純物濃度を表１９に記す。不純物プロファイルはこのスケールでバッチ生産した他のイソプレンのものと類似していた。
【表２】
2013515491.tif 000004
【０２１６】
吸着剤を用いる処理による、再生可能資源から生産したイソプレンの精製
吸着剤は、炭化水素原料から微量の不純物を除去するために、産業界で幅広く使用されている。好適な吸着としては、ゼオライト、アルミナ及びシリカ系材料が挙げられる。再生可能資源から生産したイソプレンは、シリカゲルを通過させることで実質的に純粋なものになり得、アルミナを用いることでシリカゲルほどではないにせよ実質的に純粋なものになり得る。図１８は、イソプレン試料のアルミナでの処理前（Ａ）及び処理後（Ｂ）、あるいはシリカ（Ｃ）での処理後のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。ＢＡＳＦの製品Ｓｅｌｅｘｓｏｒｂ（商標）吸着剤は、再生可能資源から生産したイソプレンから極性不純物を除去するための吸着剤の選択肢のうちの１つである。具体的には、イソプレン及びブタジエン原料から極性不純物を除去するのにあたり、その有用性が証明されていることから、製品Ｓｅｌｅｘｓｏｒｂ（商標）ＣＤ及びＣＤＸが好ましい。
【０２１７】
実施例４：ＭＣＭ５１８〜５２１及び５２８〜５３１株の作製：組み込みｍＫＫＤｙＩを駆動するλプロモーター
Ｐ１形質導入により、１００ｋｂまでのＤＮＡをバクテリア株間で移動させることができる（Ｔｈｏｍａｓｏｎら、２００７）。Ｐ１形質導入を用い、バクテリア染色体片をエシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５からエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）へと移動させることで、１７，２５７ｂｐが欠失しているエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（図２０を参照されたい）を交換した。
【０２１８】
２つのストラテジーを使用し、異なる選択マーカーを用い、組み換えされたバクテリア染色体を含有しているクローンを同定した。まず始めに、導入することになる１７，２５７ｂｐ配列の近くの遺伝子に、欠失させることで株に害をなさないような抗菌剤マーカーを挿入した。抗菌剤マーカーを含有している株は、バクテリア染色体の１７，２５７ｂｐの片をマーカーと同時に形質導入されているようであった。この場合、カナマイシン耐性をコードしている遺伝子（「ｋａｎＲ」）を、アミノ酸が１２６個の機能未知のタンパク質をコードしているｙｂｇＳ遺伝子に挿入した。第２に、ガラクトースの利用に関与する多くの遺伝子が、エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入される１７，２５７ｂｐ片中のｐｇｌに隣接し、Ｐ１細胞可溶化液により形質導入されたコロニーが、エシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５（１７，２５７ｂｐ配列が欠失しているエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を含む）から得られかつ０．４％（重量／体積）のガラクトースを含有しているＭ９培地（６ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４，３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ，０．５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，２ｍＭのＭｇＳＯ４）で単離されたことから、バクテリアの染色体の１７，２５７ｂｐ片が含有されているであろうことが判明している。
【０２１９】
プライマーＭＣＭ１２０（配列番号３６）及びＭＣＭ２２４（配列番号３７）を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）ＩＩ融合キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートからクロラムフェニコール耐性（「ＣｍＲ」）カセットを増幅させた。４つの５０μＬのＰＣＲ反応物を以下のようにサイクルさせた：９５℃／２分；９５℃／２０秒、５５℃／２０秒、７２℃／１分を３０サイクル；及び７２℃／３分。反応物を次に４℃に冷却した。４つの反応物をプールし、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラムに装填し、５５℃にて６０μＬの溶出緩衝液（「ＥＢ」）により溶出した。
【０２２０】
標準法を用い、ｐＲｅｄＥＴ−カルベニシリンＲ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）プラスミドをエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株ＭＣＭ４４６（ＣｍＲ，ｇｉ１．６ｍＫＫＤｙＩ  Ａ１〜３）に電気穿孔した。３０℃にてＳＯＣ培地で１時間振とうすることで形質転換体を回復させ、次にＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（「ＬＢ／ｃａｒｂ５０」）プレートで３０℃にて一晩選別した。カルベニシリン耐性コロニーをＭＣＭ５０８株として凍結した。
【０２２１】
５ｍＬのＬＢ／ｃａｒｂ５０に新たに画線し、３０℃にてＯＤ６００が約０．５になるまでＭＣＭ５０８株を増殖させた。約０．５になった時点で４０ｍＭのＬ−アラビノースを添加し、培養物を３７℃にて１．５時間インキュベートした。次いで遠心分離により細胞を回収し、上記のように精製した増幅産物３μＬを電気穿孔し、５００μＬのＳＯＣ培地で３７℃にて１．５〜３時間回復させた。形質転換体を３７℃にてＬＢ＋１０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ＬＢ／ｋａｎ１０）プレートで選別した。
【０２２２】
標的座への増幅産物の組み込みを、プライマーＧＢ−ＤＷ（配列番号３８）及びＭＣＭ２０８（配列番号３９）を用いＰＣＲにより確認した。配列決定した結果、得られた増幅産物は以下に列挙する配列を有する４つのクローンと同一であった。４つのカルベニシリン感受性クローンをＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株として凍結した。
【０２２３】
ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株をＬＢ／ｋａｎ１０に再画線し、３７℃で一晩増殖させた。ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株のコロニーを回収し、３７℃にてＬＢ／ｋａｎ１０で培養し、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性遺伝子をコードしかつ宿主細胞に温度感受性の複製を付与するｐＣＰ２０プラスミドを用い電気的に形質転換した（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ  １５８（１）：９〜１４（１９９５））。細胞を、５００μＬのＳＯＣ培地で振とうしながら３０℃で１時間回復させた。形質転換体を３０℃で一晩ＬＢ／ｃａｒｂ５０プレートで選別した。各プレート由来のコロニーを３０℃にてＬＢ／ｃａｒｂ５０培地で増殖させ、視覚的に濁りが観察されるまでモニターした。培養を次に３７℃で少なくとも３時間行った。培養物から細胞をＬＢプレートに画線し、３７℃で一晩増殖させた。
【０２２４】
翌日、コロニーをＬＢ、ＬＢ／ｃａｒｂ５０及びＬＢ／ｋａｎ１０に植えた。カルベニシリン及びカナマイシンの両方に感受性であるコロニー（すなわち、ｃａｒｂ５０及びｋａｎ１０で増殖できない）を液体ＬＢで培養し、ＭＣＭ５２８〜ＭＣＭ５３１株として凍結した。
【表３】
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【表４】
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【０２２５】
プロモーター／ｍＭＶＫアセンブリの上流に組み込まれた、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴカセット由来の配列を有する、バクテリオファージラムダ（λ）由来の新しいＰＬプロモーター及びｍＭＶＫ翻訳領域のごく初めの配列、並びにＭＣＭ５０８株由来のＭＶＡ経路下流のインテグロンの残りが後に続くｍＭＶＫ翻訳領域の残部、を含有する、ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株の染色体にアセンブリを組み込んだ。
【０２２６】
ＭＣＭ５１８に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号４０）：
ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５１９に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号４１）：
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ＭＣＭ５２０に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号４２）：
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ＭＣＭ５２１に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号４３）：
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実施例５：ＤＷ１９９及びＤＷ２０２株の作製
本実施例は、ＰＴｒｃプロモーター制御下に切断型のウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＭＥＡ変異型）を内包する、イソプレンを生産するエシェリキア・コリ株の作製について記載する。
【０２２７】
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いｐＥＷＬ２４４テンプレート（ｐＴｒｃ−Ｐ．ａｌｂａ（ＭＥＡ）−ｍＭＶＫとも呼ばれ、米国特許第１２／３３５，０７１号の実施例１０に記載される）からＰＣＲにより変異誘導することで、切断型のウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）を内包するプラスミドを作製した。ＰＣＲ反応物は以下の成分を含有した：１μＬのｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫをコードしている）、５μＬの１０Ｘ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、１μＬの１００ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μＬの５０μＭのＱＣ  ＥＷＬ２４４  ＭＥＡ  Ｆプライマー（配列番号４４）、１μＬの５０μＭ  ＱＣ  ＥＷＬ２４４  ＭＥＡ  Ｒプライマー（配列番号４５）、２μＬのＤＭＳＯ、１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及び３９μＬのｄｉＨ２Ｏ。ＰＣＲ反応は以下のようにサイクルさせた：９５℃／１分；及び９５℃／３０秒、５５℃／１分、６８℃／７．３分を１８サイクル。次にこの反応物を４℃に冷却した。
【０２２８】
Ｅ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いＰＣＲ産物をゲル電気泳動により可視化し、次に１μＬのＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により３７℃で３時間処理した。次に微小透析膜（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用い１０μＬのＰＣＲ産物を脱塩し、標準的な分子生物学技法を用い、電気的な形質転換受容性のあるエシェリキア・コリＭＣＭ５３１株（上記のように調製）を形質転換した。細胞を１ｍＬのＬＢ培地で３０℃で１．５時間回復させ、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５ｍＭのメバロン酸を含有しているＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、増殖に関し陽性のコロニー（ＤＷ１９５株，下記を参照されたい）を選別し、プラスミドを精製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）し、以下に列挙するプライマーを用いＤＮＡ塩基配列決定法（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）により確認した。最終ｐＤＷ３４プラスミド（図１９Ａ；配列番号７）が、切断型のウラジロハコヤナギＩｓｐＳをコードする翻訳領域を担持していることを確認した。
【０２２９】
ｐＤＷ３４及びｐＭＣＭ８２（米国特許第１２／３３５，０７１号の実施例１０に記載）を用い、電気的な形質転換受容性のあるＭＣＭ５３１（上記のように調製）を形質転換させることでＤＷ１９９株を生成した。細胞を１ｍＬのＬＢ培地で３７℃で１時間回復させ、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有しているＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＤＷ１９９株の抗菌剤耐性コロニーを更なる研究のため選別した。
【０２３０】
ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ（実施例１に記載）を用い、電気的な形質転換受容性のあるＤＷ１９９（上記のように調製）を形質転換することでＤＷ２０２株を生成した。細胞を１ｍＬのＬＢ培地で３７℃で１時間回復させ、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有しているＬＢ寒天プレートに蒔き、次に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＤＷ２０２株の抗菌剤耐性コロニーを更なる研究のために選択した。
【表５】
2013515491.tif 000007
【表６】
2013515491.tif 000008
【０２３１】
実施例６：エシェリキア・コリＢＬ２１株ＣＭＰ２１５、ＣＭＰ２５８及びＣＭＰ２３４の作製
本実施例は、エシェリキア・コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを含有しているＰ１ファージにより形質導入されたＢＬ２１から誘導され、１７，２５７ｂｐ片がＭＧ１６５５に存在するが、但しＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）では欠損している組み換えに関し選別された、エシェリキア・コリ株の作製を記載する。
【０２３２】
カナマイシン耐性遺伝（「ＫａｎＲ」）によりｙｂｇＳ遺伝子が置換されているＪＷ０７３６株（すなわち、ｙｂｇＳ：：ＫａｎＲ変異体）のＰ１細胞可溶化液を、Ｋｅｉｏコレクションから作製した（Ｂａｂａら、２００６）。細胞可溶化液を使用してＭＣＭ５３１株（上記）に感染させ、ＣＭＰ２１５株を生成した。プライマーｇａｌＭ  Ｒ（５’−ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＣＧ−３’；配列番号８）及びｇａｌＭ  Ｆ（５’−ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧ−３’；配列番号９）を用い、ＣＭＰ２１５の遺伝子型をＰＣＲにより確認した。これらのプライマーは、図２０に示すようにｇａｌＭ遺伝子とアニーリングするが、１７，２５７ｂｐが欠失したエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）染色体ＤＮＡのＰＣＲ産物のみを生産する。
【０２３３】
Ｐ１形質導入後の１７，２５７ｂｐ断片の組み込みを、以下のプロトコルを用いＰＣＲにより検証した。１つのバクテリアコロニーを３０μＬのＨ２Ｏに撹拌し、９５℃で５分加熱した。得られる溶液をスピンダウンし、２μＬの上清を以下のＰＣＲ反応物にテンプレートとして用いた：Ｈ２Ｏ中のコロニー２μＬ、５μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液、１μＬの１００ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭの順方向プライマー、１μＬの１０μＭのμ逆方向プライマー、０．５μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及び３９．５μＬのｄｉＨ２Ｏ。ＰＣＲ反応物はＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で以下のようにサイクルさせた：９５℃／２分；９５℃／３０秒、５２℃／３０秒、７２℃／６０秒を３０サイクル；及び７２℃／７分。次にこの反応物を４℃に冷却した。アニーリング温度は５２℃であり、プライマー対の低い方のＴｍよりも３℃低かった。ＤＮＡ分子量マーカーＸ（７５〜１２，２１６ｂｐ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をサイズマーカーとして用い、０．８％のプレキャストＥ−ｇｅｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により、得られたＰＣＲ断片の大きさを測定した。ガラクトースの存在下でのＣＭＰ２１５株の増殖能により形質導入の成功を確認した。
【０２３４】
あるいは、エシェリキア・コリＭＧ１６５５の細胞可溶化液を用い、ＢＬ２１株を形質導入した（上記実施例１に記載されるように）。０．４％（重量／体積）のガラクトースを添加したＭ９培地でコロニーを選別し、ＣＭＰ２５８と命名した。ｐｇｌを含有している１７，２５７ｂ領域が存在することを、基本的に上記のようにプライマーｇａｌＭ  Ｒ（配列番号９）及びｇａｌＭ  Ｆ（配列番号８）を用いＰＣＲにより確認した。
【０２３５】
ｍｖａＥ及びｍｖａＳを発現するｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙプラスミド（米国特許第１２／３３５，０７１号の実施例８に記載）及びｐＤＷ３４（切断型のウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素及びメタノサルシナ・マゼイメバロン酸キナーゼを含有している，上記のもの）を用い、電気穿孔法により、ＣＭＰ２１５株を共形質転換させた。５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン＋５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有しているＬＢ寒天プレートで形質転換体を選別した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ２３４と命名した。
【０２３６】
実施例７：エシェリキア・コリＢＬ２１株ＣＭＰ２６９及びＣＭＰ３１２の作製
本実施例は、エシェリキア・コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを含有しているＰ１ファージにより形質導入されたＢＬ２１から誘導され、１７，２５７ｂｐ片がＭＧ１６５５に存在するが、但しＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）では欠損している組み換えに関し選別された、エシェリキア・コリ株の作製を記載する。選別に使用したマーカーをループアウトさせた。
【０２３７】
ｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．ら、１９９５，Ｇｅｎｅ  １５８（１）：９〜１４；Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１２）：６６４５）を用いＣＭＰ２１５株（上記）を形質転換し、ｙｂｇＳ遺伝子を含有しているｋａｎＲマーカーを予め記載された手順に従ってループアウトした（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１２）：６６４５（２０００））。ｙｂｇＳＡｍｐ  Ｆプライマー（５’−ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＧＣ−３’；配列番号５２）及びｙｂｇＳＡｍｐ  Ｒプライマー（５’−ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＧＧ−３’；配列番号５３）を用いたことを除き、マーカーのループアウトを上記のようにＰＣＲにより確認した。この株はＣＭＰ２６９と命名した。切断型ウラジロハコヤナギＩｓｐＳ及びメタノサルシナ・マゼイＭＶＫを含有しているプラスミドｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｍｖａＥ及びｍｖａＳを発現する）及びｐＤＷ３４（図１９Ａを参照）を用い、電気穿孔法によりＣＭＰ２６９株を共形質転換することで、ＣＭＰ３１２株を作製した。
【０２３８】
実施例８：エシェリキア・コリＢＬ２１株ＣＭＰ２９６、ＣＭＰ３１５及びＣＭＰ３２３の作製
本実施例は、エシェリキア・コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを含有しているＰ１ファージによるエシェリキア・コリＢＬ２１形質導入から誘導され、１７，２５７ｂｐ片がＭＧ１６５５中に存在するが、ＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）では欠失するような組み換えが選択されたことで、ｐｇｌの機能コピーがエシェリキア・コリＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）誘導株に復元される株の作製について記載する。復元させたｐｇｌ遺伝子を、カナマイシンカセットを挿入することで正確にノックアウトさせ、続いてこのカセットをループアウトた株も作製した。
【０２３９】
ｋａｎＲ遺伝子を挿入したｐｇｌ／ｙｂｈＥコピーを含有しているＰＣＲ産物（ｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲ）は、プライマー対ｐｇｌＡｍｐＦ（５’−ＣＡＧＣＡＡＡＴＡＧＣＡＧＧＴＧＴＡＴＣＣＡＧＣ−３’；配列番号５４）及びｐｇｌＡｍｐＲ（５’−ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＡＡＣ−３’；配列番号５５）を用い、Ｋｅｉｏコレクションのエシェリキア・コリ株ＪＷ０７５０から増幅させた。プライマー対は、ｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲに加え変異の各端部に約３５０ｂｐの隣接配列を含有している断片を生産する。ＰＣＲテンプレートは以下のように調整した：ｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲを保有しているエシェリキア・コリＪＷ０７５０の１つのコロニーを３０μＬのＨ２Ｏに撹拌し、９５℃で５分加熱した。得られる溶液をスピンダウンし、２μＬの上清を以下のＰＣＲ反応物にテンプレートとして用いた：Ｈ２Ｏ中のコロニー２μＬ、５μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ緩衝液、１μＬの１００ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭの順方向プライマー、１μＬの１０μＭのμ逆方向プライマー、１μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及び３９μＬのＨ２Ｏ。ＰＣＲ反応物はＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で以下のようにサイクルさせた：９５℃／２分；９５℃／２０秒、５３．４℃／２０秒、７２℃／４０秒を３０サイクル；及び７２℃／３分。次に反応物を４℃に冷却した。
【０２４０】
ＤＮＡ分子量マーカーＸ（７５−１２，２１６ｂｐ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をサイズマーカーとして用い、０．８％のプレキャストＥ−ｇｅｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により、得られたＰＣＲ断片の大きさを測定した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、ＰＣＲ反応物を精製した。
【０２４１】
ｐＲｅｄＥＴＡｍｐプラスミド（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  Ｇｍｂｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＣＭＰ２６９に電気穿孔しＣＭＰ２９６を生成した。ＣＭＰ２９６を増殖させ、製造元（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）の取扱説明書に従ってＬ−アラビノースを導入し、本実施例に記載されるようにｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲＰＣＲ産物により形質転換した。２０ｐｐｍカナマイシンを含有しているＬＢ寒天で形質転換体を選別した。１つのコロニーを採取し、ｐｇｌＡｍｐＦ（５’−ｃａｇｃａａａｔａｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃｃａｇｃ−３’；配列番号５４）及びｐｇｌＲｅｃＣｈｅｃｋ（５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＣ−３’；配列番号５６）を用い、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ポリメラーゼを用いるＰＣＲにより遺伝子型を確認し、ＣＭＰ２９８と命名した。上記実施例２に記載のようにマーカーを除去し、ＣＭＰ３１５株を生成した。上記の実施例４〜５のようにプラスミドｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ及びｐＤＷ３４（実施例１を参照）をＣＭＰ３１５に導入し、ＣＭＰ３２３株を作製した。
【表７】
2013515491.tif 000009
【０２４２】
引用文献：Ａｏｎら、２００８，「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｇｌｕｃｏｎｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．７４：９５０〜９５８；Ｂａｂａら、２００６，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，」Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．２：２００６．０００８；Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．ら、１９９５，「Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ＴｃＲ  ａｎｄ  ＫｍＲ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｐ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ，」Ｇｅｎｅ  １５８（１）：９〜１４；Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．及びＷａｎｎｅｒ，Ｂ．、２０００，「Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０〜６６４５；Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｆ．、Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．及びＳｃｈａｅｃｈｔｅｒ，Ｍ．、１９９０，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）；Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．、Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．、Ｄａｔｔａ，Ａ．、Ｋｈａｎｎａ，Ｒ．およびＲｏｓｎｅｒ、Ｊ．，２００４，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｙｂｈＥ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ｐｇｌ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ，」Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：８２４８〜８２５３；Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｎ．、Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．、２００７，「Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐ１  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｕｎｉｔ  １．１７；Ｓｔｕｄｉｅｒ  Ｆ．、Ｄａｅｇｅｌｅｎ，Ｐ．、Ｌｅｎｓｋｉ，Ｒ．、Ｍａｓｌｏｖ，Ｓ．、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｆ．、２００９，「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ  ｓｔｒａｉｎｓ  ＲＥＬ６０６  ａｎｄ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｋ−１２  ｇｅｎｏｍｅｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９４（４）：６５３〜８０，２００９）。
【０２４３】
実施例９：ｐｇｌをコードしている１７，２５７ｂｐの染色体断片を形質導入したＢＬ２１株でのイソプレン生産
本実施例は、メバロン酸経路を保持しているエシェリキア・コリを用い、４．５ｍＬのバッチ式小規模発酵において高い比生産性でイソプレンを生産するにはバクテリア染色体にｐｇｌを復元させる必要があることを例証する。
【０２４４】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、３．２ｇのＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＬの１０００Ｘ微量金属溶液を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。２８％（重量／体積）水酸化アンモニウムによりｐＨを６．８に調整し、最終容量に調整した。０．２２マイクロメートルのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後、グルコース（一晩培養に際し１０ｇ、及び主培養に際し５．０ｇ）及び適切な抗菌剤を添加し、続いて１００ｇ／Ｌ原液から１ｇの酵母エキス及び１ＭのＭｇＳＯ４溶液から１ｇのＭｇＳＯ４を添加した。
【０２４５】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させた。次にＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタを用い濾過滅菌した。
【０２４６】
エシェリキア・コリ株：（１）ＣＭＰ３１２：メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２ＫＫＤｙＩ）、並びに切断型Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ（単離ＭＥＡ）及びメタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼを含むプラスミド（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ）を含有するようエシェリキア・コリＢＬ２１細胞を組み換えた。この株は、ガラクトース利用に関する遺伝子を含有し、エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）で欠失していることが判明しているｐｇｌをコードしている、１７，２５７ｂｐセグメントの組み込みコピーも含有した。このセグメントはエシェリキア・コリＫ−１２染色体ＤＮＡから誘導された。（２）ＣＭＰ３２３：この株は、Ｋ−１２ＤＮＡの形質導入片からｐｇｌが正確に切除され、カナマイシン耐性を付与する遺伝子で置換された（ｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲ）ことを除き、上記のＣＭＰ３１２株と同一である。
【０２４７】
実験手順：ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）で株を増殖させることによりイソプレン生産を解析した。試験容量は２４ウェルそれぞれにつき４．５ｍＬであった。温度は３０℃に維持し、ｐＨは制御せず、酸素流は１０ｓｃｃｍに設定し（「立方センチメートル毎秒」）、撹拌速度は５５０ｒｐｍであった。凍結させたバイアル瓶からエシェリキア・コリ接種材料を得、適切な抗菌剤を含有しているＬＢ寒天プレートに画線し、３０℃でインキュベートした。抗菌剤を含有している増殖培地にシングルコロニーを接種し、一晩増殖させた。適切な抗菌剤を含有している４．５ｍＬの培地により、５５０ｎｍ（「ＯＤ５５０」）で測定される吸光度（「ＯＤ」）が０．０５になるようバクテリアを希釈した。反応の開始時に、最終濃度２００μＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、イソプレンの生産を誘導した。
【０２４８】
低流量にカスタマイズしたプロテウスバルブを備える、オンラインのＨｉｄｅｎ質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用い、イソプレンガスの放出に関する解析を実施した。弁は、２４ウェルプレートを通してサイクルしながら一度に１つのウェルから試料採取した。一度に１つのポートのみが試料を採取されるものの、放出されるガス流はキャピラリーを通して持続的に質量分析計に流れるため、プロテウス弁に対応するポートに対し２４ウェルそれぞれからキャピラリーが取り付けられるようヘッドプレートをカスタムした。ヘッドプレートは外部の試料採取を促進させつつ、プレートを回転させた。
【０２４９】
実験過程の間、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用い、ＯＤ５５０測定値をオフラインで得た。作成した検量線を用いマイクロプレートの複数のＯＤをＯＤ（経路長１ｃｍ）に変換した。質量分析計により測定されたイソプレン濃度（μｇ／Ｌ）と酸素の流速を乗じ、ＯＤ読み取り値及びウェル中に残存する容量により除算することで比生産性を得た。対象とするウェル用のＯＤ試料を小規模発酵過程の４つの時点で採取した。測定値間に線形補間を用いることで、これらの時点間のＯＤ値を算出した。
【０２５０】
結果。両方の株についてＯＤ（図２１）及び比生産性（図２２）のそれぞれのプロットを示す。ｐｇｌ＋株（バクテリア染色体にｐｇｌ遺伝子を組み込んだ株）からのイソプレンの比生産性をｐｇｌ−株と比較した。小規模発酵において炭素源としてグルコースを含有する合成培地で、同一の条件下でバクテリアを増殖させた。オンラインでの経時的なイソプレン測定により、培養物に含有させる細胞数がより少ない場合でさえ（図２１）、ｐｇｌ−株（ＣＭＰ３２３）と比較してｐｇｌ＋株（ＣＭＰ３１２）がより高いイソプレン比生産性を有することが明らかになった（図２２）。
【０２５１】
実施例１０：ｐｇｌ発現を有する場合及びｐｇｌ発現を有さない場合の、メタノサルシナ・マゼイメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の過剰発現
本実施例は、１５Ｌスケールでフェドバッチ式培養で増殖させた、メバロン酸経路及びイソプレン合成酵素由来の遺伝子を発現しているエシェリキア・コリＢＬ２１からの、イソプレン生産を示す。
【０２５２】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母エキス、及び１ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液を共に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。溶液を１２３℃で２０分にわたって加熱滅菌し、次いで２８％（重量／体積）水酸化アンモニウムを用いｐＨ  ７．０に調整し、最終容量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬの水銀ビタミン溶液、及び適切な抗菌剤を添加した。
【０２５３】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２５４】
水銀ビタミン溶液（１Ｌあたり）：１ｇのチアミン塩酸塩、１ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１ｇのニコチン酸、４．８ｇのＤ−パントテン酸、及び４ｇのピリドキシン塩酸塩を１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２５５】
供給溶液（１ｋｇあたり）：０．５７ｋｇのグルコース、０．３８ｋｇのｄｉＨ２Ｏ、７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０ｇの１００％のＦｏａｍｂｌａｓｔを共に混合し、オートクレーブ処理した。滅菌溶液を２５℃に放冷させた後、３．４ｍＬのマクロ塩溶液（マクロ塩溶液）、０．８ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液、及び６．７ｍＬの水銀ビタミン溶液を添加した。
【０２５６】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、及び４９．６ｇのクエン酸鉄アンモニウムをｄｉＨ２Ｏに溶解させ、最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２５７】
３種の異なるエシェリキア・コリＢＬ２１細胞株を用い、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した：（１）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現するが、ｐｇｌ遺伝子は欠損しているＤＷ１９９；（２）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現し、ｐｇｌ遺伝子をコードしている１７，２５７ｂｐのセグメントが染色体に復元されている（株作製時に使用したｙｂｇＳ：：ｋａｎＲマーカーがループアウトした）ＣＭＰ３１２；並びに（３）復元させたＤＮＡ片からｐｇｌ遺伝子が正確に切除され、カナマイシン耐性を付与する遺伝子で置換された（ｐｇｌ／ｙｂｈＥ：：ｋａｎＲ）ことを除き、ＣＭＰ３１２株と同一であるＣＭＰ３２３。
【０２５８】
本実施例は、所望の発酵ｐＨ及び温度（ｐＨ＝７．０及び３４℃）でのグルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。凍結したバイアル瓶からエシェリキア・コリ株を解凍し、各バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。接種材料をＯＤ５５０＝１．０まで増殖させた後、開始タンク容量を５Ｌにする前に、培養物のうち５００ｍＬを用い１５Ｌのバイオリアクタに接種した。
【０２５９】
最高供給速度が５．８ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加した。この時間後、５．８ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量のグルコースを添加した。バイオリアクタに供給したグルコースの合計量は、ＤＷ１９９株に対しては４４時間の発酵間に５．８ｋｇ、ＣＭＰ３１２株に対しては４５時間の発酵間に３．４ｋｇ、及びＣＭＰ３２３株に対しては４４時間の発酵間に６．３ｋｇであった。表２５に示す濃度でイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加することでイソプレンの生産を誘導した。バイオリアクタ内での経時的なＯＤ５５０プロファイルを図２３に示す。Ｈｉｄｅｎ質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用い、バイオリアクタからの放出ガス中のイソプレン濃度を測定した。イソプレン力価は発酵が経過するにつれ増加し、ＤＷ１９９株については４４時間で７６ｇ／Ｌ、ＣＭＰ３１２株については４５時間で６８ｇ／Ｌ、及びＣＭＰ３２３株については４４時間で７９ｇ／Ｌの最大値に達した（図２４を参照）。発酵時に生産されたイソプレンの合計量は、ＤＷ１９９株については４４時間で６３７ｇ、ＣＭＰ３１２株については４５時間で４８２ｇ、及びＣＭＰ３２３株については４４時間で６４０ｇであった（図２５）。比生産性の時間経過を図２６に示す。グルコースからのイソプレンのモル収率及び質量収率を表９に示す。
【表８】
2013515491.tif 000010
【表９】
2013515491.tif 000011
【０２６０】
実施例１１：メタノサルシナ・マゼイメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素を過剰発現させ、並びにｐｇｌを含有しているＫ１２ＤＮＡを復元（ＣＭＰ３１２）し、ｐｇｌを正確に切除された同様の株（ＣＭＰ３２３）と比較する
本実施例は、１５Ｌスケールでフェドバッチ式培養で増殖させた、ｐｇｌ遺伝子を復元させた、メバロン酸経路及びイソプレン合成酵素由来の遺伝子を発現しているエシェリキア・コリ株、及びｐｇｌ遺伝子を正確に欠失させた、メバロン酸経路及びイソプレン合成酵素由来の遺伝子を発現しているエシェリキア・コリ株からのイソプレン生産を比較する。
【０２６１】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母エキス、１ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液を共に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液を１２３℃で２０分加熱滅菌し、次に２８％（重量／体積）水酸化アンモニウムを用いｐＨ７．０に調整し、最終容量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、１０ｇのグルコース、０．０５ｇのチアミン塩酸塩及び適切な抗菌剤を添加した。
【０２６２】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、次に溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２６３】
供給溶液（１ｋｇあたり）：０．５７ｋｇのグルコース、０．３８ｋｇのｄｉＨ２Ｏ、及び１０ｇの１００％のＦｏａｍｂｌａｓｔを共に混合し、オートクレーブ処理した。
【０２６４】
本実施例は、ｐｇｌを復元させた株及び復元させたｐｇｌを正確にノックアウトさせた株で、所望の発酵ｐＨ及び温度（ｐＨ＝７．０及び３４℃）での、グルコースからのイソプレン生産を比較するために実施した。２つのエシェリキア・コリ株に関し、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した：（１）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現し、ｐｇｌ遺伝子を含有する微生物染色体の１７，２５９ｂｐセグメントが復元された（ｙｂｇＳ：：ＫａｎＲマーカーがループアウト）エシェリキア・コリＢＬ２１細胞、ＣＭＰ３１２；並びに（２）上記のように復元したＤＮＡ片からｐｇｌを正確に欠損しているエシェリキア・コリ株ＣＭＰ３２３。各株を凍結したバイアル瓶を解凍し、各バイオリアクタのトリプトン−酵母エキス培地に接種した。接種材料を５５０ｎｍでの測定（ＯＤ５５０）でＯＤ５５０＝１．０になるまで増殖させた後、５００ｍＬを用い１５Ｌのバイオリアクタに接種し、開始タンク容量を５Ｌにした。
【０２６５】
最高供給速度が５．８ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加した。この時間後、５．８ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量のグルコースを添加した。２０時間の発酵時にバイオリアクタに供給したグルコースの合計量は、ｐｇｌ＋株については１．６ｋｇであり、ｐｇｌ−株については２．０ｋｇであった。培地中にグルコースが蓄積されることを避け、これらの株に供給した。
【０２６６】
ＯＤ５５０が４に到達したところで、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を９０μＭ添加することで、イソプレン生産を誘導した。ＯＤ５５０が１００に到達したときには、ＩＰＴＧ濃度は１７０μＭに増加していた。
【０２６７】
図２７は、バイオリアクタ中のＯＤ５５０プロファイルを発酵過程にわたって示す。２つのタンクでこのプロファイルは類似していた。Ｈｉｄｅｎ質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用い、バイオリアクタからの放出ガス中のイソプレン濃度を測定した。発酵時間にわたりイソプレン力価は増加し、試料採取の最終時点で最大値１７ｇ／Ｌまで増加していた（図２８を参照されたい）。しかしながら、この力価はｐｇｌ＋株ではｐｇｌ−株よりも早く達成された。比生産性の時間経過を図２９に示す。ＯＤ及び力価の傾向に従って、ｐｇｌ＋株はｐｇｌ−株で実施した場合と比較してより高い比生産性を有した。
【０２６８】
実施例１２：メタノサルシナ・マゼイメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の過剰発現
本実施例は、１５Ｌスケールでフェドバッチ式培養で増殖させた、メバロン酸経路及びイソプレン合成酵素由来の遺伝子を発現しているエシェリキア・コリＫ１２  ＭＧ１６５５（エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）から１７，２５７ｂｐを欠失させたもの）からのイソプレン生産を示す。
【０２６９】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母エキス、及び１ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液を共に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液を１２３℃で２０分加熱滅菌し、２８％（重量／体積）水酸化アンモニウムを用いｐＨ  ７．０に調整し、最終容量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬの水銀ビタミン溶液、及び適切な抗菌剤を添加した。
【０２７０】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００のＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００のＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、次に溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２７１】
水銀ビタミン溶液（１Ｌあたり）：１ｇのチアミン塩酸塩、１ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１ｇのニコチン酸、及び４．８ｇのＤ−パントテン酸、４ｇのピリドキシン塩酸塩を１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、次に溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２７２】
供給溶液（１ｋｇあたり）：０．５７ｋｇのグルコース、０．３８ｋｇのｄｉＨ２Ｏ、７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０ｇの１００％のＦｏａｍｂｌａｓｔを共に混合し、及びオートクレーブ処理した。溶液を２５℃に放冷させた後、３．４ｍＬのマクロ塩溶液、０．８ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液、及び６．７ｍＬの水銀ビタミン溶液を添加した。
【０２７３】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、及び４９．６ｇのクエン酸鉄アンモニウムをｄｉＨ２Ｏに溶解させ、最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２７４】
本実施例は、所望の発酵ｐＨ及び温度（ｐＨ＝７．０及び３４℃）でのグルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。発酵はＭＣＭ７６９株を用い１５Ｌのバイオリアクタで実施した：メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現しているエシェリキア・コリＭＧ１６５５細胞。凍結させたバイアル瓶からＭＣＭ７６９株を解凍し、各バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。接種材料をＯＤ５５０＝１．０まで増殖させた後、５００ｍＬを用い１５Ｌのバイオリアクタに接種し、開始タンク容量を５Ｌにした。
【０２７５】
最高供給速度が３．９ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加した。この時間後、３．９ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量の供給溶液を添加した。４４時間の発酵の間にバイオリアクターに供給したグルコースの合計量は２．３ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）のショット添加によりイソプレン生産を誘導し、ＯＤ５５０値で測定された、表１０に示す濃度を得た。バイオリアクタ内での経時的なＯＤ５５０プロファイルを図３０に示す。Ｈｉｄｅｎ質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用い、バイオリアクターから放出されるガス中のイソプレンレベルを測定した。発酵過程にわたりイソプレン力価は増加し、４４時間で最大値３０．４ｇ／Ｌに増加した（図３１）。発酵時に生産されたイソプレンの合計量は、４４時間で２２６．８ｇであった（図３２）。比生産性の時間経過を図３３に示す。発酵時にイソプレン生産に使用された炭素のモル収率は４４時間の時点で２１．１％であった。グルコースからのイソプレンの収率重量％は４４時間の時点で９．７％であった。
【表１０】
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【０２７６】
実施例１３：エシェリキア・コリＢＬ２１でのメバロン酸の比生産性に対するｐｇｌの効果
メバロン酸生合成経路は２つの部分を含む：（１）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）を含有する、メバロン酸経路上流；並びに（２）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を含有するメバロン酸経路下流。上流経路のタンパク質を発現させると、イソプレン生産において中間体であるメバロン酸が生産された。
【０２７７】
これらの実施例は、エシェリキア・コリＢＬ２１におけるメバロン酸の比生産に対し、ｐｇｌ機構がどのように影響するのか、及びどの機構により影響するのかを調査することを目的として設計した。融合させたチオラーゼ／ＨＭＧＲ（ｍｖａＥ）及びエンテロコッカス・フェカリスのＨＭＧＳ（ｍｖａＳ）をｐＣＬ、ｐＢＢＲ、及びｐＴｒｃプラスミドで作製し、ｐｇｌを欠損しているエシェリキア・コリＢＬ２１及びバクテリア染色体に組み込まれたｐｇｌを含有しているエシェリキア・コリを形質転換させた。
【０２７８】
高濃度の酵母エキスを含有させた最少培地で増殖させた場合、ｐｇｌを含有している株は、ｐｇｌを欠損している株よりも比生産性が大きかった。この増殖条件はフェドバッチ式発酵の対数増殖期初期を模倣するものである。低濃度の酵母エキスを含有させた最小培地で増殖させた場合も、ｐｇｌの存在している株では、ｐｇｌを欠損している株と比較してメバロン酸の生産性が有意に高くなった。しかしながら、この効果がメバロン酸経路の酵素濃度を増加させたことに起因するものではなかったことは、これらの増殖条件下でｐｇｌが存在することで、エシェリキア・コリに関し中心的な代謝に影響が生じることにより、メバロン酸経路へ又はメバロン酸経路を通しての流れに正の影響が与えられることを例証するものである。これらの増殖条件は、フェドバッチ式発酵の対数増殖期後期に見られる条件を模倣する。
【０２７９】
ｐＤＷ１５（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５に対するＰｔｒｃ−ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ経路）の作製ＭＶＡ経路上流をｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクターに挿入するため、プラスミドｐＭＣＭ８２のテンプレート並びにプライマーＵｐｐｅｒ５’ＸｈｏＩ（配列番号５７）及びＵｐｐｅｒ３’ＸｂａＩ（配列番号５８）を用い、Ｐｔｒｃ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、及びｒｒｎ転写集結因子を含有している完全な発現カセットをＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲプライマーの配列を下表２８に掲載する。各反応物は１μＬのｐＭＣＭ８２（約３０ｎｇ）、１０μＬの５Ｘ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、０．５μＬのｄＮＴＰｓ（各１００ｍＭ）、１μＬのＵｐｐｅｒ５’ＸｈｏＩ（２０μＭ）、１μＬのＵｐｐｅｒ３’ＸｂａＩ（２０μＭ）、３５．５μＬのｄｉＨ２Ｏ、及び１μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有した。反応物を９５℃で４分加熱し、９５℃で２０分／５２℃で２０秒／７２℃で４分を５サイクル、９５℃で２０分／５５℃で２０秒／７２℃で４分を２５サイクル処理し、続いて７２℃で１０分処理し、及び最終的に４℃に冷却した。
【０２８０】
プレキャストＥ−ｇｅｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の大きさを確認し、製造元の推奨するプロトコルに従ってＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）精製カラムを用い（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）４．２ｋｂの産物を精製した。精製したＰＣＲ産物及びｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクターを、次にＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼを用い３７℃で一晩、次のように消化した：６μｌのｄｉＨ２Ｏ、２μＬの１０Ｘ  ＳｕＲＥ／Ｃｕｔ緩衝液Ｈ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）、１０μＬのＤＮＡ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５又はＰＣＲ挿入断片）、１μＬのＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、及び１μＬのＸｂａＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。翌日、ライゲーション前に、制限酵素を６５℃で２０分かけて熱失活させた。ライゲーション反応（下記条件を参照）には２μＬのｄｉＨ２０、１μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬベクター（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５）、及び４μＬ挿入断片（ＭＶＡ上流発現カセット）を含有させ、４℃で一晩実施した。微小透析（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いライゲーション反応液を脱塩し、製造元の推奨するプロトコルに従って、化学的に形質転換受容性のあるエシェリキア・コリＴＯＰ１０細胞を各反応物約５μＬにより形質転換させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。電気穿孔した細胞を３７℃のＬＢで１時間回復させ、次にＸ−ｇａｌ及び１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔いた。挿入断片の存在を確認するために、β−ガラクトシダーゼ活性を全く示さなかったコロニーを選別し、プライマーＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ及びＭＣＭ１６３を用いるＰＣＲにより更に解析した。これらのコロニー由来のプラスミドを精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、完全に配列決定し（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，プライマー配列については表１１を参照）、完全なＭＶＡ経路上流の発現カセットを適切な配向で含有していることを確認し、ｐＤＷ１５（配列番号６９）と命名した。ｐＤＷ１５のプラスミドマップを図３４Ａに示し、及び完全配列を図３４Ｂ〜Ｃ〜Ｄに掲載する。
【表１１】
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【０２８１】
ＭＶＡ生産株ＭＣＭ８７０〜８７７の作製エンテロコッカス・フェカリスｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をコードしているプラスミドを、電気穿孔法によりエシェリキア・コリ宿主に導入した。宿主細胞を、３７℃にて２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００≒１になるまでＬＢ培地で増殖させた。冷却されるまで培養物を氷上に設置した。各電気穿孔法反応に際し、１．５ｍＬの培養物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製の微量遠心チューブで室温で２〜３分にわたり６０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去後、細胞ペレットを１ｍＬの氷冷滅菌脱イオンＨ２Ｏに再懸濁した。スピン及び洗浄手順を３回繰り返し、ペレットを最終的に１００μＬに再懸濁した。
【０２８２】
各１μＬのｐＤＷ１５（配列番号６７）、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１及びｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（各プラスミドの作製は米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例８に記載される）を含有しているプラスミド混合物を１００μＬの細胞懸濁液に添加し、形質転換受容性のあるエシェリキア・コリ細胞に２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。ｓ２Ａ同様に、ｐＤＷ１５、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１又はｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのいずれかを１μＬを１００μＬの細胞懸濁液に添加し、形質転換受容性のあるエシェリキア・コリ細胞に２ｍｍキュベット中で２．５ボルト及び２５μＦｄで電気穿孔した。細胞を直ちに５００μＬのＬＢ培地で３７℃で１時間回復させた。下表１２に掲載される適切な抗菌剤（１つ以上）を含有しているＬＢで形質転換体を選別した。各形質転換体由来のシングルコロニーを指定の抗菌剤を加えたＬＢ培地で３７℃、２５０ｒｐｍにてＯＤ６００≒１まで増殖させ、次に０．５ｍＬの培養物を１ｍＬの５０％滅菌グリセロールと混合し、ドライアイス上で凍結させ、−８０℃で保存した。
【表１２】
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【０２８３】
ＣＭＰ２１５、ＣＭＰ２５８及びＣＭＰ２３４株の作製は上記実施例６に記載する。メバロン酸比生産性をアッセイするために、０．１％（重量／体積）の酵母エキス、１％（重量／体積）のグルコース、及び適切な抗菌剤を含有しているＴＭ３培地で、すべての株を３つ組みで３０℃で一晩増殖させた。一晩培養物を、１％（重量／体積）グルコース及び０．１％（重量／体積）又は０．０２％（重量／体積）のいずれかの濃度で酵母エキスを含有している新しいＴＭ３培地で、ＯＤ６００が０．０５になるよう希釈した。培養物をＯＤ６００が０．５〜１．０に到達するまで３４℃でインキュベートし、到達した時点で、４００μＭのＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した。発現誘導後１時間及び２時間で、ＯＤ、メバロン酸濃度並びにＭｖａＳ及びＭｖａＥタンパク質濃度を測定するために、試料を回収した。１時間の時間単位でのメバロン酸濃度の差を、１時間の時間単位での平均ＯＤ（１時間及び２時間のＯＤから算出）で除算することでメバロン酸の比生産を決定した。
【０２８４】
メバロン酸濃度を測定するため、３００μＬのブロスを１４，０００×ｇで５分遠心分離した。次に２５０μＬの上清を７．５μＬの７０％（重量／体積）過塩素酸に添加し、氷上で５分インキュベートした。次に混合物を１４，０００×ｇで５分遠心分離し、以下の条件下でＨＰＬＣ解析を行うために上清を回収した：（１）ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（カタログ番号１２５〜０１４０）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；（２）カラム温度＝５０℃；（３）カラム詰め替え用ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ  ｇｕａｒｄ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）（カタログ番号１２５〜０１２９）（ＢｉｏＲａｄ）；（４）ランニングバッファ＝０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；（５）ランニングバッファ流速＝０．６ｍＬ／分；（６）およその流圧＝約６．５５ＭＰａ（９５０ｐｓｉ）；（７）注入容量＝１００マイクロリットル；（８）実行時間＝２６分。
【０２８５】
結果。０．１％（重量／体積）の酵母エキス及び１％（重量／体積）のグルコースを含有しているＴＭ３培地で株を増殖させた。メバロン酸生産に対する、バクテリア染色体から発現させたｐｇｌの効果を試験するために、６つの株を作製した（表１３）。株は上記のように培養した。バクテリアの染色体からｐｇｌを発現している株が、ｐｇｌ領域の欠失を除いて同質遺伝子的である株（図３５を参照）よりも大きなメバロン酸比生産活性を有していたことは、染色体によるｐｇｌの発現が、エシェリキア・コリＢＬ２１でのメバロン酸比生産性を改良することを例証した。メバロン酸はメバロン酸経路下流の基質である。したがって、メバロン酸比生産性が大きい株は、相補的な下流経路及びイソプレン合成酵素の存在下で、イソプレン比生産性も大きくなり得る。
【表１３】
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【０２８６】
０．０２％の酵母エキス及び１％のグルコースを含有しているＴＭ３培地で株を増殖させた。メバロン酸生産における染色体によるｐｇｌの発現の役割について更に調査するために、最少培地中の酵母エキスの濃度が低い条件下で、２つの株ＭＣＭ８７２及びＭＣＭ８７６を、上記のように０．０２％の酵母エキスを含有しているＴＭ３培地で増殖させた。この増殖培地は、フェドバッチ式発酵の対数増殖期後期で見られる条件を模倣する。２つの株は、ＭＣＭ８７６に存在するｐｇｌの機能的な染色体コピーを除いて、同質遺伝子的である。最少培地での株の増殖は類似していたが、図３６に示すようにＭＣＭ８７６はＭＣＭ８７２よりも速く増殖することが本実験から明らかになったことは、染色体によるｐｇｌの発現は酵母エキスの濃度が低い最小培地でのエシェリキア・コリの増殖に正の影響を与えることを示す。
【０２８７】
図３７に示すように、ＭＣＭ８７２と比較してＭＣＭ８７６で細胞あたりのメバロン酸の蓄積速度が有意に（２．７倍）高かったことは、酵母エキスを制限濃度で含有している最小培地で増殖させた場合に、バクテリアの染色体上にｐｇｌが存在するとメバロン酸生産が有意に増加することを例証する。
【０２８８】
ＭＣＭ８７６株でのメバロン酸生産速度の増加が、低濃度の酵母エキスを含有させた培地でのタンパク質生産の速さに起因するものなのか調査するために、上流経路の酵素、ＭｖａＳ及びＭｖａＥの濃度を測定し、それぞれの培養物の吸光度に関し基準化した（図３８及び３９）。バクテリア染色体上にｐｇｌを存在させても、試験した特定の増殖条件下でメバロン酸経路の酵素の濃度に有意な変化は生じなかった。しかしながら、これらの増殖条件下でメバロン酸の生産速度が２．７倍増加したことから、染色体によるｐｇｌ発現が、メバロン酸経路の酵素の濃度を増加させる機構以外の機構によりメバロン酸生産速度を増加させているに違いない。このような機構の１つは、ペントースリン酸経路を介して等価物を還元する生産であり得る。これについては本実施例では更なる試験は行わなかった。
【０２８９】
エシェリキア・コリ中の、ｐｇｌの機能的な染色体コピーは、メバロン酸の生産を増加させ、したがって栄養の豊富な増殖条件下（発酵初期）で経路タンパク質の生産を増加させるのみだけでなく、発酵の後期に低濃度の酵母エキスを含有させた最少培地で増殖させた場合に、ＭＶＡ経路を通る炭素流を制御する因子によってもイソプレンの生産が増加するようである。驚くべきことに、この増加がプラスミドからＰＧＬを常時発現している株で観察されるものよりも大きいということは、染色体による状況又はバクテリアの自然な染色体状況からのＰＧＬの発現制御能が、イソプレンなどの生化学物質の生産の増加で役割を果たすことを示唆する。
【０２９０】
実施例１４：イソプレン生産株でのＰＧＬ酵素活性の比較
ＰＧＬ酵素活性を３つの株で測定した：ＲＨＭ１１１６０８−２（このエシェリキア・コリ株の作製は国際公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号の実施例１３及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号に記載される）、ＤＷ１９９、ＣＭＰ３１２及びＣＭＰ３２３（他の実施例で記載する）。酵素活性は、記載のようにＮＭＲ法により測定することができる（例えば、Ｅ．Ｍｉｃｌｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３７）：３４８４０〜３４８４６（２００１）を参照されたい）。ＲＨＭ１１１６０８−２は常時発現型プロモーターの制御下でｙｂｈＥ遺伝子（ＰＧＬをコードしている）を含有し、ＤＷ１９９はＰＧＬを発現する任意の遺伝子を欠き、ＣＭＰ３１２及びＣＭＰ３２３は同質遺伝子的なものであり、ＣＭＰ３１２は形質導入によりｙｂｈＥが復元されておりかつｙｂｈＥが欠損したＣＭＰ３２３の親である。
【０２９１】
ＰＧＬ酵素活性は以下のように測定した：簡潔に述べると、５ｍＭのグルコース−６−リン酸、７．５ｍＭのＮＡＤＰ＋、及び１００ｍＭのＢＥＳ（ｐＨ  ７．４）を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と約３分インキュベートすることで、δ−Ｄ−６−ホスホ−グルコノ−１，５−ラクトン及びγ−Ｄ−６−ホスホ−グルコノ−１，４−ラクトンの混合物を調製した。インキュベーション後、約１５〜３０分間溶液を室温に平衡化させた。続いて、４００μＬのラクトン溶液をＮＭＲキュベットに加え、開始時スペクトルを採取した（Ｖａｒｉａｎ  ５００ｍＨｚ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。続いて、５０μＬの粗細胞可溶化物をラクトン溶液に添加し、２及び８分経過時点でＮＭＲスペクトルを読み取りした。シグマ及びデルタラクトンシグナルをそれぞれの開始時ピーク強度に対し基準化した。実施にあたり基準化したピーク強度を表１４に示す。
【表１４】
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【０２９２】
株はマイクロ発酵槽及び１５Ｌのフェドバッチ式発酵槽で実施した（上記実施例９及び１０に記載のように）。すべての株で、小規模実施又は発酵の過程にわたりＰＧＬ活性を測定した。ＤＷ１９９は陰性対照であり、活性をほとんどあるいは全く示さない（この反応は化学的に低速で触媒され得ることから、微量の活性が観察される場合もある）。ＲＨＭ１１１６０８−２は実施全体にわたって類似の活性を有する。ＣＭＰ３２３はＤＷ１９９と類似する活性レベルを示す。ＣＭＰ３１２は発酵過程を通して変化する活性を示し、株が比生産性の増加を示すとき、発酵初期では高活性が見られ、発酵後期では活性の低下が見られる。細胞の活性制御能は、イソプレン生産の全般的な改善に貢献する。
【０２９３】
ＣＭＰ３１２でのｙｂｈＥ遺伝子の発現は、転写アレイ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることで判定できる。試料をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）に回収することで、発酵の全過程にわたり、１５Ｌの発酵槽からＲＮＡ試料を単離する（上記のように）。ＲＮＡ試料は、製造元の指示に従いＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い調製する。試料の更なる加工及びカスタムアレイに対するハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより実施される。ｙｂｈＥ遺伝子の発現は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのソフトウェアを用い解析する。
【０２９４】
実施例１５：プラスミドで発現させたｐｇｌ対染色体に組み込んだｐｇｌ
本実施例は、１５Ｌスケールでフェドバッチ式培養で増殖させた、メバロン酸経路及びイソプレン合成酵素由来の遺伝子を発現しているエシェリキア・コリＢＬ２１からの、イソプレン生産を示す。
【０２９５】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母エキス、及び１ｍＬの１０００Ｘ改質微量金属溶液を共に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。Ｈ２Ｏ溶液を１２３℃で２０分間加熱滅菌し、次に２８％（重量／体積）水酸化アンモニウムでｐＨ＝７．０に調整し、最終容量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬの水銀ビタミン溶液、及び適切な抗菌剤を添加した。
【０２９６】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２９７】
水銀ビタミン溶液（１Ｌあたり）：１ｇのチアミン塩酸塩、１ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１ｇのニコチン酸、４．８ｇのＤ−パントテン酸、及び４ｇのピリドキシン塩酸塩を１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０２９８】
供給溶液（１ｋｇあたり）：０．５７ｋｇのグルコース、０．３８ｋｇのｄｉＨ２Ｏ、７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０ｇの１００％のＦｏａｍｂｌａｓｔを共に混合し、オートクレーブ処理した。滅菌溶液を２５℃に放冷させた後、３．４ｍＬのマクロ塩溶液（マクロ塩溶液）、０．８ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液、及び６．７ｍＬの水銀ビタミン溶液を添加した。
【０２９９】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、及び４９．６ｇのクエン酸鉄アンモニウムをｄｉＨ２Ｏに溶解させ、最終容量に調整し、０．２２マイクロメートルのフィルタで濾過滅菌した。
【０３００】
２つの異なるエシェリキア・コリＢＬ２１細胞株を用い、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した：（１）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現し、ｐｇｌがｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌプラスミドで発現されるＤＷ２０２（実施例１を参照）；（２）メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、組み込まれたＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレン合成酵素（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）＋ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現し、ｐｇｌ遺伝子をコードしている１７，２５７ｂｐセグメントを染色体に復元させた（株作製時に使用したｙｂｇＳ：：ｋａｎＲマーカーはループアウトした）ＣＭＰ２３４。
【０３０１】
本実施例は、所望の発酵ｐＨ及び温度（ｐＨ＝７．０及び３４℃）でのグルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。凍結したバイアル瓶からエシェリキア・コリ株を解凍し、各バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。接種材料をＯＤ５５０＝１．０まで増殖させた後、開始タンク容量を５Ｌにする前に、培養物のうち５００ｍＬを用い１５Ｌのバイオリアクタに接種した。
【０３０２】
最高供給速度が５．８ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加した。この時間後、５．８ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量のグルコースを添加した。バイオリアクタに供給したグルコースの合計量は、ＤＷ２０２株に対しては５９時間の発酵間に５．５ｋｇ、ＣＭＰ２３４株に対しては７２時間の発酵間に７．８ｋｇであった。表１５に示す濃度でイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加することでイソプレンの生産を誘導した。Ｈｉｄｅｎ質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用い、バイオリアクタからの放出ガス中のイソプレン濃度を測定した。発酵過程にわたりイソプレン力価は増加し、ＤＷ２０２株では５９時間で最大値５６ｇ／Ｌに、ＣＭＰ２３４株では７０時間で最大値８１ｇ／Ｌに達した（図４２を参照）。比生産性の時間経過を図４２Ｂに示す。
【表１５】
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【０３０３】
本明細書に提供される見出しは様々な態様又は本発明の態様を制限するものではなく、全体として、本明細書に参照として用いることのできるものである。
【０３０４】
上記の本発明は、理解の明瞭化を目的とした例証及び実例により一部詳細に記載されるが、本発明の教示を考慮すれば、添付の「特許請求の範囲」の精神又は範囲から逸脱することなく本発明に特定の変更及び修正を行い得ることは当業者には容易に理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013515491.tif 000088
2013515491.tif 000089
2013515491.tif 000090