(57)【要約】  本発明は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上；ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上の脂肪酸プロフィールを示す、従属栄養発酵から生成される微生物バイオマス組成物、抽出組成物、およびこのような組成物を生成する方法に関する。
2013531494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
従属栄養発酵から生成される微生物バイオマスであって、
−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上、および
−ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上
を示す脂肪酸プロフィールを有する微生物バイオマス。
【請求項２】
ジュニペロン酸（ＪＰＡ）および／またはスシアドン酸が、前記共濃縮脂肪酸の中に存在しない、請求項１に記載の微生物バイオマス。
【請求項３】
前記微生物バイオマスが、微細藻類バイオマスである、請求項１または２に記載の微生物バイオマス。
【請求項４】
前記微細藻類バイオマスが、ニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)バイオマスである、請求項３に記載の微生物バイオマス。
【請求項５】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上であり、ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上である脂肪酸プロフィールを示す微生物バイオマスを生成するための方法であって、
（ｉ）微生物を従属栄養的に培養する工程と、
（ｉｉ）前記微生物バイオマスを回収する工程と
を含む方法。
【請求項６】
前記微生物が、非制限的な窒素および非制限的なリン酸塩供給下で培地中にて培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５または６の方法によって得られうる、または得られる微生物バイオマス。
【請求項８】
前記バイオマスから脂肪酸を抽出して脂肪酸組成物を得る工程をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
ＥＰＡに関し脂肪酸組成物を濃縮するか、または脂肪酸組成物からＥＰＡを精製して、濃縮または精製脂肪酸組成物を得る工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法によって得られた、または得られうる脂肪酸組成物。
【請求項１１】
前記脂肪酸組成物中のＥＰＡレベルが、前記組成物中の総脂肪酸の少なくとも５重量％である、請求項１０に記載の脂肪酸組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって得られた、または得られうる濃縮または精製脂肪酸組成物。
【請求項１３】
前記濃縮または精製脂肪酸組成物中のＥＰＡレベルが、前記組成物中の脂肪酸の少なくとも３０重量％である、請求項１２に記載の濃縮または精製脂肪酸組成物。
【請求項１４】
心臓血管障害または肥満関連症状の治療に使用するための、請求項１２または１３に記載の濃縮または精製脂肪酸組成物。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載の脂肪酸組成物を含む、ヒトまたは動物消費用の製品。
【請求項１６】
高純度ＥＰＡ組成物の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物バイオマスの使用。
【請求項１７】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも６０重量％のＥＰＡ純度を有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも７０重量％のＥＰＡを有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも８０重量％のＥＰＡを有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも９０重量％のＥＰＡを有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも９５重量％のＥＰＡを有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記高純度ＥＰＡ組成物が、総脂肪酸の少なくとも９７重量％のＥＰＡを有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２３】
エイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを少なくとも１４：１の比で含み、エイコサペンタエン酸が、珪藻類の乾燥重量の少なくとも１．５％ｗ／ｗを形成する、従属栄養的に増殖した珪藻類。
【請求項２４】
前記珪藻類が、ニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)である、請求項２３に記載の珪藻類。
【請求項２５】
エイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを少なくとも１４：１の比で含む、請求項２３または２４に記載の珪藻類に由来する脂質混合物。
【請求項２６】
エイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを少なくとも１４：１の比で含む、請求項２３または２４に記載の珪藻類に由来する脂肪酸混合物。
【請求項２７】
ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも５％を形成する、請求項２６に記載の脂肪酸混合物。
【請求項２８】
エイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを少なくとも１４：１の比で含み、かつエイコサペンタエン酸として乾燥細胞重量の少なくとも１．５％ｗ／ｗを含む珪藻類を生成する方法であって、
ａ．以下のもの、すなわち、
（ｉ）初期濃度が少なくとも０．５Ｍ炭素の有機炭素源
（ｉｉ）有機炭素と窒素とのモル比が３０：１（モルＣ：モルＮ）以下、および
（ｉｉｉ）生物が利用可能なケイ素の非制限的供給源
を含む栄養液を含有する従属栄養培養物中で珪藻類を培養する工程と、
ｂ．前記従属栄養培養物から前記珪藻類を回収する工程と
を含む方法。
【請求項２９】
前記珪藻類が、発酵槽の従属栄養培養物中で培養される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記培養が、連続発酵を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記珪藻類が、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養が、約１２℃〜約３５℃の温度で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養が、約７．０〜約８．７のｐＨで実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記炭素源が、グルコースを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記炭素源が、グルコース、加水分解デンプン、または加水分解乳漿から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記窒素源が、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムの形態である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記窒素源が、アミノ酸源で補充される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記アミノ酸源が、コーンスティープリカー、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、リジン、およびグルタメートから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物が利用可能なケイ素源が、ケイ酸塩の形態である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
ケイ酸塩濃度が、１５０μＭ未満に低下しない、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ケイ酸塩が、メタケイ酸ナトリウムまたはカリウムの形態である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記栄養液が、リン酸塩形態のリンを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
有機炭素とリン酸塩形態のリンとのモル比が、１２５０：１（モルＣ：モルＰ）以下である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＥＰＡを含有する脂質物質を生成する方法であって、
ａ．利用可能な炭素と窒素とを１：１〜３０：１のモル比で含みかつ生物が利用可能なケイ素源を含む栄養液を含有する発酵槽中で珪藻類を培養する工程と、
ｂ．前記栄養液の温度を約１２℃〜約３５℃に維持し、前記栄養液のｐＨを約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．７に維持する工程と、
前記発酵槽から珪藻類を採取する工程と、
ｄ．採取した前記珪藻類からＥＰＡを含有する脂質物質を回収する工程と
を含む方法。
【請求項４５】
利用可能な炭素と窒素を１：１〜３０：１のモル比で含む新たな栄養液を培養中に前記発酵槽に加える、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
利用可能な炭素と窒素を１：１〜３０：１のモル比で含む新たな栄養液で、採取した容量を置換する場合に、前記発酵槽中の珪藻類の平均数が経時的に一定になるような割合で前記発酵槽から珪藻類を採取する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物が利用可能なケイ素源が、ケイ酸塩の形態である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ケイ酸塩濃度が１５０μＭ未満に低下しないように、ケイ酸塩を前記発酵槽に加える、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
炭素とケイ酸塩源形態のケイ素とのモル比が、１００：１〜８５０：１である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記栄養液が、リン酸塩形態のリンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
炭素とリン酸塩形態のリンとのモル比が、１００：１〜１２５０：１である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸を含有し、エイコサペンタエン酸が乾燥細胞重量の少なくとも１．５％を形成する珪藻類を生成する方法であって、恒久的な表現型変化を誘導するように設計された条件下で従属栄養珪藻類を培養する工程と、エイコサペンタエン酸とアラキドン酸との比が少なくとも１４：１である単離物を求めて、得られた珪藻類集団をスクリーニングする工程とを含む方法。
【請求項５３】
前記条件が、突然変異誘発物質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記条件が、ＥＰＡ生産性の増加に対して選択的な薬剤を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記条件が、ＡＲＡ生産性の減少に対して選択的な薬剤を含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、医薬および工業用途のための濃縮および精製に適した、エイコサペンタエン酸を含有する組成物、ならびにそのような組成物を製造するための方法および工程に関する。
【背景技術】
【０００２】
極長鎖オメガ−３脂肪酸（ＶＬＣ  ｎ−３  ＦＡ）を含有する医薬品は、何十万もの人々を治療するために現在使用されており、心臓血管疾患に罹患している、またはそれを発症するリスクがある何百万もの患者を治療するためにまもなく使用されることになろう。さらに、他の症状を治療するための医薬品の中にこれらの物質を使用することが検討されている。
【０００３】
ＶＬＣ  ｎ−３  ＦＡは、化学的にデノボ合成することは経済的に不可能であり、そのため、生物学的供給源から抽出しなければならない。そのような供給源では、ＶＬＣ  ｎ−３  ＦＡの大部分は、膜または脂肪体などの細胞構造の中に存在し、したがって、医薬製品の中では所望されない可能性のある他の分子と結合している。これらの場合には、ＶＬＣ  ｎ−３  ＦＡを抽出し、使用前にある程度精製する必要がある。
【０００４】
医薬品製造業者は、現在、原体製造用のＶＬＦ  ｎ−３  ＦＡの供給源として魚に依存している。しかしながら、このような目的のために魚油にもっぱら依存することは、医薬品製造業者および製薬会社ならびに可能性としてこのような医薬を投与される患者にいくつかの重大なリスクを負わせる。そのようなリスクには、これに限定されないが、潜在的な供給不足に関連したものが含まれ、供給不足によって、製薬会社が財政的に打撃を受けるとともに、健康のために医薬に頼る患者に悪影響が及ぶ可能性がある。
【０００５】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、原体中の活性代謝物として使用されるＶＬＣ  ｎ−３  ＦＡである。治療が患者に十分受容されることを可能にし、かつ薬物が所望の効果を発揮するのに必要なバイオアベイラビリティレベルを達成するために、高純度形態のＥＰＡが送達されることが望ましい。
【０００６】
魚油からの医薬品または他の治療薬の製造は複雑であり、魚の捕獲および／または養殖ならびに魚油の製造方法における固有の変動により、最終生成物の組成が変化する可能性がある。さらに、野生魚資源および水産養殖の長期持続性に関して懸念が広がっている。
【０００７】
したがって、医薬品または他の治療薬の製造において、その使用のために望ましいＥＰＡ純度がその後に得られ得る、魚油の代わりのＥＰＡ供給源に対する緊急の必要性が存在する。
【０００８】
高純度ＥＰＡを製造するための現行の工業的方法では、多くの場合、濃縮工程（ここでは、短鎖脂肪酸および飽和脂肪酸が混合物から除去される）、次いで精製工程（ここでは、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した化合物が除去される）が実施される。
【０００９】
前者の工程では、多くの場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）および２０以上の炭素を含みかつ少なくとも１つの二重結合を含有する他の脂肪酸（共濃縮脂肪酸co-concentrating fatty acids）からＥＰＡを分離することができないため、これらの脂肪酸含量が最小限である、魚油以外のＥＰＡ供給源の開発が大変望まれている。
【００１０】
精製工程では、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した分子を分離することの困難さが経験されている。ＥＰＡと最も類似した天然分子種で最もよく見られるのは、別の脂肪酸のＡＲＡである。したがって、そのような分子を実質的に含まない、魚油以外のＥＰＡ供給源の開発が大変望まれている。
さらに、主流の人口母集団の食事の中に評価可能な濃度では見出されないか、またはまったく見出されない脂肪酸は、それらを医薬用途に適さないものにする生物活性が十分に特徴づけられていない可能性があるので、理想的には、このような供給源には含まれるべきではない。このことは、前記脂肪酸がＥＰＡに構造的または生理化学的に十分類似して、ＥＰＡから精製するのが困難となる場合に、特に当てはまる。
ＥＰＡは、オメガ−３およびオメガ−６脂肪酸を生成する２重並行生合成経路の一部として合成される（例えば、非特許文献１、Damude and Kinney(Lipids 42:179-185,2007）を参照のこと）。酵素の多くは、経路間で共有され、オメガ−３またはオメガ−６形態の脂肪酸のいずれかに作用することになり、そのため、オメガ−６経路の生成物は、オメガ−３経路の生成物と並んで通常見出される。特に、ＡＲＡがＥＰＡと一緒に見出されることがよく見られる。合成経路の各段階は、別々の酵素により触媒され、経路中間体が蓄積することは珍しくなく、これらの中間体には、二重結合数は少ないが、炭素分子は同数の脂肪酸が含まれることになる。ＡＲＡおよびＥＰＡはまた、さらなる伸長および不飽和化によりドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの脂肪酸になる基質となり得る。したがって、ＥＰＡを含有する生物が、一般に、顕著な量のＡＲＡおよび共濃縮脂肪酸をさらに含有することは驚くことではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Damude and Kinney(Lipids 42:179-185,2007）
【００１２】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、治療用途のための高純度精製が可能な形態でかつ豊富な供給量でＥＰＡを提供する必要性が当技術分野には存在する。特に、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した他の脂肪酸（例えば、ＡＲＡ）から分離可能な形態でＥＰＡを提供する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様では、本発明は、従属栄養(heterotropic)発酵から生成される微生物バイオマスであって、
−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上；および
−ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上
を示す脂肪酸プロフィールを有するバイオマスを提供する。
【００１５】
好ましくは、ジュニペロン酸（ＪＰＡ）および／またはシアドン酸が共濃縮脂肪酸の中に存在しない。
【００１６】
好ましくは、微生物バイオマスは、微細藻類バイオマスである。
【００１７】
好ましくは、微細藻類バイオマスは、ニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)バイオマスである。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上であり、ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上である脂肪酸プロフィールを示す微生物バイオマスを生成するための方法であって、
（ｉ）微生物を従属栄養的に培養する工程と；
（ｉｉ）前記微生物バイオマスを回収する工程と
を含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、微生物は非制限的な炭素供給下で培地(culture medium)中にて培養される。
【００２０】
好ましくは、微生物は非制限的な窒素および非制限的なリン酸塩(phosphate)供給下で培地中にて培養される。
【００２１】
好ましくは、微生物は微細藻類(microalgal)である。
【００２２】
好ましくは、微生物は珪藻類(diatom)である。
【００２３】
好ましくは、微生物が珪藻類である場合、この微生物は、生物が利用可能なケイ素の非制限的な供給下で培地中にて培養される。
【００２４】
好ましくは、この方法は、前記バイオマスから脂肪酸を抽出して脂肪酸組成物を得る工程をさらに含む。
【００２５】
好ましくは、この方法は、ＥＰＡに関し脂肪酸組成物を濃縮するか、または脂肪酸組成物からＥＰＡを精製して、濃縮または精製した脂肪酸組成物を得る工程をさらに含む。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法によって得られうる(obtainable)か、または得られる微生物バイオマスを提供する。
【００２７】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の方法によって得られうるか、または得られた脂肪酸組成物を提供する。
【００２８】
好ましくは、前記脂肪酸組成物中のＥＰＡレベルは、組成物中の総脂肪酸の少なくとも５重量％である。
【００２９】
第５の態様では、本発明は、第２の態様の方法によって得られたか、または得られうる、濃縮または精製脂肪酸組成物を提供する。
【００３０】
好ましくは、前記濃縮または精製脂肪酸組成物中のＥＰＡレベルは、組成物中の脂肪酸の少なくとも３０重量％である。
【００３１】
第６の態様では、本発明は、心臓血管障害または肥満関連症状の治療に使用するための、第４の態様の濃縮または精製脂肪酸組成物を提供する。
【００３２】
第７の態様では、本発明は、第４または第５の態様の脂肪酸組成物を含む、ヒトまたは動物消費用の製品を提供する。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、高純度ＥＰＡ組成物の製造における、第１の態様の微生物バイオマスの使用を提供する。
【００３４】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも６０重量％のＥＰＡを有する。
【００３５】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも７０重量％のＥＰＡを有する。
【００３６】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも８０重量％を有する。
【００３７】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも９０重量％を有する。
【００３８】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも９５重量％を有する。
【００３９】
好ましくは、高純度ＥＰＡ組成物は、総脂肪酸の少なくとも９７重量％を有する。
【００４０】
第８の態様では、本発明は、少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを含み、エイコサペンタエン酸が、珪藻類の乾燥重量の少なくとも１．５％ｗ／ｗを形成する、従属栄養的に増殖した珪藻類を提供する。
【００４１】
好ましくは、珪藻類はニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）である。
【００４２】
第９の態様では、本発明は、高純度ＥＰＡ組成物の製造における、第８の態様の珪藻類の使用を提供する。
【００４３】
第１０の態様では、本発明は、少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを含む、第８の態様の珪藻類に由来する脂質混合物を提供する。
【００４４】
第１１の態様では、本発明は、少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを含む、第８の態様の珪藻類に由来する脂肪酸混合物を提供する。
【００４５】
好ましくは、ＥＰＡは総脂肪酸の少なくとも５％を形成する。
【００４６】
第１２の態様では、本発明は、少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸、ならびにエイコサペンタエン酸として、乾燥細胞重量の少なくとも１．５％ｗ／ｗを含む、珪藻類を生成する方法であって、
ａ．以下のもの、すなわち、
（ｉ）初期濃度が少なくとも０．５Ｍ炭素の有機炭素源
（ｉｉ）有機炭素と窒素とのモル比が３０：１（モルＣ：モルＮ）以下、および
（ｉｉｉ）生物が利用可能なケイ素の非制限的供給源
を含む栄養液を含有する従属栄養培養物(heterotropic culture)中で珪藻類を培養する工程と、
ｂ．従属栄養培養物から珪藻類を回収する工程と
を含む方法。
【００４７】
好ましくは、珪藻類は発酵槽の従属栄養培養物中で培養される。
【００４８】
好ましくは、培養(cultivation)は連続発酵を含む。
【００４９】
好ましくは、珪藻類はニッチア(Nitzschia)種である。
【００５０】
好ましくは、培養は約１２℃〜約３５℃の温度で実施される。
【００５１】
好ましくは、培養は約７．０〜約８．７のｐＨで実施される。
【００５２】
好ましくは、前記炭素源はグルコースを含む。
【００５３】
好ましくは、前記炭素源は、グルコース、加水分解デンプン、または加水分解乳漿から選択される。
【００５４】
好ましくは、前記窒素源は、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムの形態である。
【００５５】
好ましくは、前記窒素源はアミノ酸源で補充される。
【００５６】
好ましくは、前記アミノ酸源は、コーンスティープリカー、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、リジン、およびグルタメート(glutamate)から選択される。
【００５７】
好ましくは、生物が利用可能なケイ素源はケイ酸塩(silicate)の形態である。
【００５８】
好ましくは、ケイ酸塩濃度は１５０μＭ未満に低下しない。
【００５９】
好ましくは、前記ケイ酸塩はメタケイ酸ナトリウムまたはカリウムの形態である。
【００６０】
好ましくは、栄養液はリン酸塩形態のリンを含む。
【００６１】
好ましくは、有機炭素とリン酸塩形態のリンとのモル比は、１２５０：１（モルＣ：モルＰ）以下である。
【００６２】
第１３の態様では、本発明は、高純度ＥＰＡ組成物の製造における、第１２の態様の方法により生成する珪藻類の使用を提供する。
【００６３】
第１４の態様では、本発明は、ＥＰＡを含有する脂質物質を生成する方法であって、
ａ．１：１〜３０：１のモル比の利用可能な炭素と窒素、ならびに生物が利用可能なケイ素源を含む栄養液を含有する発酵槽中で珪藻類を培養する工程と、
ｂ．前記栄養液の温度を約１２℃〜約３５℃に維持し、前記栄養液のｐＨを約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．７に維持する工程と、
ｃ．発酵槽から珪藻類を採取する工程と、
ｄ．採取した珪藻類からＥＰＡを含有する脂質物質を回収する工程と
を含む方法を提供する。
【００６４】
好ましくは、利用可能な炭素と窒素のモル比が１〜３０である新たな栄養液を培養中に発酵槽に加える。
【００６５】
好ましくは、利用可能な炭素と窒素のモル比が１〜３０である新たな栄養液で、採取した容量を置換する(replace)場合に、発酵槽中の珪藻類の平均数が経時的に一定になるような割合で発酵槽から珪藻類を採取する。
【００６６】
好ましくは、生物が利用可能なケイ素源はケイ酸塩の形態である。
【００６７】
好ましくは、ケイ酸塩濃度が１５０μＭ未満に低下しないように、ケイ酸塩を発酵槽に加える。
【００６８】
好ましくは、炭素とケイ酸塩源形態のケイ素とのモル比は、１００：１〜８５０：１である。
【００６９】
好ましくは、栄養液はリン酸塩形態のリンを含む。
【００７０】
好ましくは、炭素とリン酸塩形態のリンとのモル比は、１００：１〜１２５０：１である。
【００７１】
第１５の態様では、本発明は、少なくとも１４：１の比のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸とを含有し、エイコサペンタエン酸が乾燥細胞重量の少なくとも１．５％を形成する珪藻類を生成する方法であって、恒久的な表現型変化を誘導するように設計された条件下で従属栄養珪藻類を培養する工程と、エイコサペンタエン酸とアラキドン酸との比が少なくとも１４：１である単離物を求めて、得られた珪藻類集団をスクリーニングする工程とを含む方法を提供する。
【００７２】
好ましくは、この条件は突然変異誘発物質を含む。
【００７３】
好ましくは、この条件はＥＰＡ生産性の増加に対して選択的な薬剤を含む。
【００７４】
好ましくは、この条件はＡＲＡ生産性の減少に対して選択的な薬剤を含む。
【００７５】
本発明の実施形態は、実施例のみを介して、添付の図面に関連して以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】バイオマス中のＥＰＡ：ＡＲＡ比と、バイオマスが形成される培地中の最小メタケイ酸ナトリウム濃度との間の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
予想外なことに、本発明者らは、ＥＰＡとＡＲＡとの比が約１１：１以上であると同時にさらに、共濃縮脂肪酸すべてを合わせた量の８倍を超えるＥＰＡを含有する、ＥＰＡを含む組成物を従属栄養微生物から得ることが可能であることを発見した。このような微生物は、５ｍｇＥＰＡ／Ｌ／時を上回る生産速度で培養物中にて生成させることが可能であり、総乾燥細胞重量の１．５％を超えるＥＰＡ含量は、この微生物を工業的方法に適するものにする。
【００７８】
さらに想定外に、本発明者らは、ＥＰＡとＡＲＡとの比が約１４：１以上である、ＥＰＡを含む組成物を従属栄養珪藻類から得ることが可能であることを発見した。このような微生物は、５ｍｇＥＰＡ／Ｌ／時を上回る生産速度で培養物中にて生成させることが可能であり、総乾燥細胞重量の１．５％を超えるＥＰＡ含量は、この微生物を工業的方法に適するものにする。
【００７９】
本発明の一部は、微生物の従属栄養培養物中に蓄積し得る共濃縮脂肪酸（本明細書に定義した）の量をＥＰＡに対して制御することが、脂肪酸混合物を濃縮する目的にとって望ましいだけでなく、これらの微生物の増殖条件を制御することにより、そうすることも実行可能であるという認識である。
【００８０】
本発明の別の一部は、微生物の従属栄養培養物中に蓄積し得る、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した分子の相対量を制御することが、ＥＰＡ精製の目的にとって望ましいだけでなく、これらの微生物の増殖条件を制御することにより、そうすることも実行可能であるという認識である。
【００８１】
本発明のさらなる一部は、濃縮および精製にとって重要なことは、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した分子の絶対レベルではなく相対レベルであること、および、驚くべきことに、バイオマス中のＥＰＡの最大生成量は必ずしも高純度ＥＰＡの最大生成量と等しくないという認識である。
【００８２】
したがって、本発明は、以下の脂肪酸プロフィール、すなわち、
−エイコサペンタノン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上、および
−ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上
のプロフィールを示す、従属栄養発酵から生成される微生物バイオマスを提供する。
【００８３】
本発明は、
−少なくとも１４：１の比のエイコサペンタノン酸とアラキドン酸とを含み、エイコサペンタエン酸が、珪藻類の乾燥重量の少なくとも１．５％を形成する、従属栄養的に増殖した珪藻類と、
−少なくとも１４：１のエイコサペンタエン酸とアラキドン酸との比、ならびにエイコサペンタエン酸として乾燥細胞重量の少なくとも１．５％を含む珪藻類を生成する方法であって、
ａ．以下のもの、すなわち、
（ｉ）初期濃度が少なくとも０．５Ｍ炭素の有機炭素源、
（ｉｉ）有機炭素と窒素とのモル比が３０：１（モルＣ：モルＮ）以下、
（ｉｉｉ）生物が利用可能な(bioavailable)ケイ素の非制限的供給源
を含むことを特徴とする栄養液を含有する従属栄養培養物中で珪藻類を培養する工程；
ｂ．従属栄養培養物から珪藻類を回収する工程
を含む方法をさらに提供する。
【００８４】
定義および略語
オメガ−３脂肪酸は、分子のｎ−メチル末端から３番目の炭素原子に最初の二重結合を有する脂肪酸である。オメガ−３は、ｎ−３と短縮されることが多い。
【００８５】
オメガ−６脂肪酸は、分子のｎ−メチル末端から６番目の炭素原子に最初の二重結合を有する脂肪酸である。オメガ−６は、ｎ−６と短縮されることが多い。
【００８６】
脂肪酸はＣＸ：Ｙの形で記載され、ここで、数字Ｘは脂肪酸中の炭素原子の数を記載し、数字Ｙは脂肪酸中の二重結合の数を記載する。Ｙがゼロに等しい場合は、脂肪酸は飽和として記載され、Ｙがゼロを超える場合は、脂肪酸は不飽和として記載される。二重結合の位置およびタイプは、例えば「ｃｉｓ５、１１、１４」と指定することができ、ここで、数字は、分子のカルボン酸末端から数えた、炭素−炭素二重結合の位置を表わす。
【００８７】
Ｃ２０：５などの用語は、遊離脂肪酸ならびにエステルの脂肪酸部分のみを参照した場合の炭素原子および二重結合の数を有する脂肪酸のエステル形態の両方を含むと理解される。
【００８８】
ＥＰＡ、Ｃ２０：５  ｎ−３、エイコサペンタエン酸は、２０の炭素原子および５つの二重結合を有するオメガ−３脂肪酸である。
【００８９】
ＡＲＡ、Ｃ２０：４  ｎ−６、アラキドン酸は、２０の炭素原子および４つの二重結合を有するオメガ−６脂肪酸である。
【００９０】
共濃縮脂肪酸は、２０以上の炭素を含み、かつ少なくとも１つの二重結合を含有する、ＥＰＡおよびＡＲＡ以外の脂肪酸として定義される。これらには、Ｃ２０：１、Ｃ２０：２、Ｃ２０：３、Ｃ２０：４、Ｃ２２：５、Ｃ２２：６、およびＣ２４：１の種々の形態が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
ＤＨＡ、Ｃ２２：６  ｎ−３、ドコサヘキサエン酸は、２２の炭素原子および６つの二重結合を有するオメガ−３脂肪酸である。
【００９２】
ＤＰＡ、Ｃ２２：５  ｎ−３、ドコサペンタエン酸は、２２の炭素原子および５つの二重結合を有するオメガ−３脂肪酸である。
【００９３】
ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３  ｎ−６、ジホモ−ガンマ−リノール酸は、２０の炭素原子および３つの二重結合を有するオメガ−６脂肪酸である。
【００９４】
ＥＴＡｎ−３、Ｃ２０：４ｎ−３、エイコサテトラエン酸は、２０の炭素原子および４つの二重結合を有するオメガ−３脂肪酸である。
【００９５】
ＴＦＡ、総脂肪酸は、組成物または混合物中のすべての脂肪酸の合計を意味する。
【００９６】
ＤＣＷ、乾燥細胞重量は、一旦すべての水が除去された場合の、バイオマスの重量を意味する。
【００９７】
従属栄養培養は、培養のためのエネルギー供給の少なくとも９０％が、通常は、一形態または複数形態の有機炭素（例えば、グルコース、アセテートacetate）である供給栄養素に由来する生物培養を意味する。したがって、エネルギー供給の最大１０％は、光エネルギーに由来する。好ましくは、エネルギー供給の５％未満または１％未満が、光エネルギーに由来する。より好ましくは、エネルギー供給全体が、供給栄養素由来である。
【００９８】
光独立栄養培養は、唯一のエネルギー源が光である生物培養を意味する。
【００９９】
混合栄養培養は、エネルギー源が１０％以上の光エネルギーと９０％未満の供給栄養素由来エネルギーの混合である、生物培養を意味する。
【０１００】
栄養素の制限は、問題とする栄養素の欠如または低レベルにより、その栄養素が高レベルで存在する場合より、生物がゆっくり増殖するようになることを意味する。したがって、非制限的な栄養素供給は、問題とする栄養素以外の因子が生物の増殖に関して制限しており、問題とする栄養素を多量に供給しても、増殖の促進効果が得られないことを意味する。したがって、この栄養素は、バイオマスの中への取り込みによって、枯渇することがないほど十分な量で存在し、その結果、栄養液中のその遊離濃度はゼロにならない。
【０１０１】
本発明の組成物
従属栄養培養で生成される場合に、遺伝子改変微生物は、大量のＥＰＡを潜在的に蓄積することができる。Ｄａｍｕｄｅらは、米国特許出願公開第２００６０１１５８８１号明細書において、遺伝子改変酵母株で生成されたＥＰＡを含む組成物を提供している。しかしながら、これらでは、ＥＰＡと、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似した他の分子との比が比較的低く、その結果、濃縮および精製にあまり適さないものになっている。著者は、共濃縮脂肪酸と精製ＥＰＡの製造との関係についてまったく教示しておらず、この問題に対処できる方法も示唆していない。
【０１０２】
Ｘｕｅらは、米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書において、遺伝子改変酵母株で生成されたＥＰＡを含む組成物を提供している。これらの組成物の１つは、すでに市販されており、Futurebiotics Newharvest OMEGA-3として現在販売されている。記載の組成物では、ＥＰＡの含量が特に高く（ある場合には、総脂肪酸の５０％を上回る）、ＡＲＡの含量は低いが、共濃縮するＣ２０脂肪酸の含量が大きく、その結果、本目的にあまり適さないものになっている。さらに、著者は、少なくとも１つの遺伝子改変酵母株の脂肪酸プロフィールにおいてジュニペロン酸(C20:4 cis5,11,14,17)の存在を開示している。この脂肪酸は、ＥＰＡに生理化学的かつ構造的に類似しているために、分離するのが特に困難になっているだけでなく、ヒトの食事にも通常は見出されることがなく、そのため、ヒトでの使用に対して、いかなる精製ＥＰＡにおいても汚染物質として具体的に問題となっている。著者は、共汚染している脂肪酸の割合の低減と精製ＥＰＡの製造との関係について、またはこのような組成物を得られうる方法について教示していない。
【０１０３】
米国特許第５６８３８９８号明細書および米国特許第５７９８２５９号明細書において、Ｙａｚａｗａらは、ＥＰＡが総脂肪酸の約１．５％を占める遺伝子組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を提供している。著者は、それらの物質中の他の脂肪酸の有無を明示しておらず、それらの物質からのＥＰＡの精製も論述していない。著者は、共濃縮脂肪酸と精製ＥＰＡとの関係についてまったく教示しておらず、この問題に対処できる方法も示唆していない。
【０１０４】
Ｄａｍｕｄｅら、Ｘｕｅら、Ｙａｚａｗａら、および他のいずれの著者も、ＥＰＡと、生理化学的または構造的に類似した他の脂肪酸との比が十分高く、同時に濃縮および精製に適したものになっている、遺伝子組換え微生物で生成されたＥＰＡを含む組成物を提供していない。
【０１０５】
さらに、Ｄａｍｕｄｅら、Ｘｕｅら、Ｙａｚａｗａら、および他のいずれの著者も、培養微生物は、本明細書に教示のように、ＥＰＡと、生理化学的または構造的に類似した他の分子との比について、所定範囲を含むべきであると教示しておらず、また、そのような分子の除去を達成する方法も具体的には教示していない。
【０１０６】
これに限定されないが、非遺伝子改変（非ＧＥ）海洋細菌の特定株を含む特定の原核微生物は、ＥＰＡをデノボ生成する固有の能力を有し、遺伝子改変に頼ることなく、培養物中に多量のＥＰＡを蓄積することができる。例えば、Ｙａｚａｗａら(J.Biochem.103:5-7 1988)は、非ＧＥ  ＳＣＲＣ−８１３２細菌由来のＥＰＡを含む組成物を提供している。著者は、「かなり驚くべきことに、アラキドン酸（Ｃ２０：４）．．．などの他の多価不飽和脂肪酸は、［培養細菌では］まったく検出されなかった」こと、および「このユニークな脂肪酸組成物により、この菌株の培養物からＥＰＡを単離することが容易になる」ことを述べているが、他のＣ２０脂肪酸および濃縮におけるそれらの役割に関して論評していない。さらに、著者は、高レベルのＥＰＡおよび低レベルのＡＲＡを真核生物の培養物で達成し得る方法を教示していない。Ｂｏｗｍａｎら(Int J Syst Bacteriol 47:1040-1047,1997)は、総脂肪酸の割合として高レベルのＥＰＡを有する原核微生物を含む組成物を提供している。著者は、ＥＰＡおよびＡＲＡ以外のＣ２０脂肪酸を記録しておらず、ある場合には、ＡＲＡを測定していないように見えるため、我々の組成物の開示はない。著者は、このような組成物と濃縮および精製との関係についても、このような組成物が真核生物の培養物で得られうる方法も示唆していない。
【０１０７】
これら原核生物源はいずれも収率が低レベルであるため商業化ができていない。例えば、Ｙａｚａｗａらの報告による最大生産速度は、１．１ｍｇＥＰＡ／Ｌ／時であるが、ＥＰＡの形成は乾燥細胞重量の０．５％未満である。非ＧＥ原核生物は、ＥＰＡの相対的に低い乾燥重量のため、ＥＰＡの供給源として真核微生物と競合することができず、そのため、本目的にはあまり適していない。原核生物と真核生物は基本的に異なるので、一方からの教示を他方に直接適用することはできず、そのため、天然の原核生物のＥＰＡ含量に関する、Ｙａｚａｗａら、もしくはＢｏｗｍａｎらの観察も、または他のいずれの著者の観察も、真核生物のＥＰＡ生成をさらに進展させるために使用することができるという期待は根拠のあるものとはなり得ない。
【０１０８】
幾人かの著者が、増殖のための主要エネルギー源として光を利用する天然の真核微生物の培養物中に生成された微生物成分としてのＥＰＡを含む組成物を提供している。光が唯一のエネルギー源である場合、これらの培養物は、光合成的または光独立栄養的であると考えられる。有機炭素を光合成培養物に加えて、混合栄養的にすることができる。これらの培養物は、池もしくは開放水路中、または大量の人工光が内部に供給され、かつ／または光が培養物の中に進行することを可能にするために高い表面積対体積比を有する透明材料から構成された光バイオリアクター中で、一般に製造される。低収率、高資本費用、及び／またはこのような製造に付随した技術的困難ならびにこのようにＥＰＡを製造する結果生ずる費用により、これらの培養物は本目的に適さないものとなる。
【０１０９】
例えば、ＶａｚｈａｐｐｉｌｌｙおよびＣｈｅｎ(JAOCS 75:393-397,1998)は、光独立栄養条件下で増殖した微細藻類のいくつかの種において、ＥＰＡを含む組成物を提供しており、これらの中で最良の種のみが、１日当たり約２５６ｍｇ細胞の平均増殖速度を示し、多くの種がはるかに低い速度を示した。著者は、「ＡＲＡが健康への有害作用およびＥＰＡ回収における問題を引き起こし得るので、ＥＰＡまたはＤＨＡと一緒にアラキドン酸（ＡＲＡ，Ｃ２０：４ｎ−６）の蓄積が高まることは不利である」と指摘しているが、従属栄養培養物中のＡＲＡ含量を低減する手段を示唆していない。さらに、著者は、「ポルフィリジウム・クルエンタム(Por[phyridium] cruentum)以外の２０の微細藻類すべてにおいて、ＡＲＡ培養物は比較的少なかった」と述べている。上述の種の多くは、この２つの脂肪酸をほとんど同量有し、２種においてはＥＰＡよりもＡＲＡの方が多くさえあったので、これは、ＡＲＡの絶対量がＥＰＡとＡＲＡとの比よりもむしろ重要であると著者が考えていることを示唆する。いずれの脂肪酸の絶対量よりもむしろ重要なのはＥＰＡとＡＲＡとの比であることを我々は教示しているので、この教示は我々の発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）。
【０１１０】
これらに限定されないが、特定の微細藻類、真菌、および酵母を含む特定の非ＧＥ真核微生物は、従属栄養的に増殖させることができ、従属栄養培養で生成される場合に、大量のＥＰＡを蓄積することができる。これらには、光バイオリアクターに比較して、相対的に低い表面積対体積比を有する従来の蒸気滅菌可能な反応器中で屋内にてこれらの微生物を生成することができるという利点がある。
【０１１１】
Yongmanitchai and Ward(Process Biochemistry 24:117-125,1989)は、ＥＰＡおよびＤＨＡを生成する微生物のリストを提供している。著者は、従属栄養的に増殖させることができる生物か、または光合成的に増殖させなければならない生物かを識別しておらず、そのため、これらの生物がＥＰＡの工業生産に適しているか否かを、この参考文献から予想することはできない。また、開示の脂肪酸組成データが従属栄養的に増殖させた培養物に由来するものか否かを判断することもできない。いずれの場合にも、生物の脂肪酸含量に関して提供されるデータによって、ＡＲＡおよび他の共濃縮脂肪酸に対するＥＰＡの含量を、本発明の組成物を記載するように、完全に確認することは不可能である。著者は、高純度ＥＰＡの製造については論述しているが、ＥＰＡが精製され得る容易さに対して、他の多価不飽和脂肪酸が及ぼす影響については論述していない。この文献では、本明細書に記載の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１１２】
Ｂａｒｃｌａｙは、米国特許第５１３０２４２号明細書および米国特許第５９０８６２２号明細書において、いくつかの藻類株の単離、従属栄養増殖、および脂肪酸プロフィールについて報告している。ＥＰＡの存在およびＡＲＡの欠如が同時に起こることが、これらの藻類株のいくつか（標準スクリーニング条件下で増殖する）に関して報告されている一方、もっと多数の株が、ＥＰＡと比較して、ＡＲＡレベルが低い。これらの大多数は、ＥＰＡ：ＤＨＡ比が８未満であり、本目的にはあまり適していない。
【０１１３】
ＢＲＢＧ株について、米国特許第５１３０２４２号明細書の表３に、ＡＡ（ＡＲＡ）がなく、ＥＰＡとＤＨＡとの比が１２であること、また表４に、ＥＰＡとＤＨＡとの比が１０．９であることが報告されている。同じデータが米国特許第５９０８６２２号明細書に使用されている。
【０１１４】
しかしながら、ジホモ−ガンマ−リノール酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）については報告がなく、そのため、著者は、濃縮および精製の目的に対する、２０以上の炭素の他の長鎖脂肪酸の相対レベルの重要性について明らかに認識していない。脂肪酸プロフィール中のＥＰＡ量が相対的に低い場合、これらまたは他のＣ２０化合物が少量でもあれば、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比に対して顕著な影響を及ぼし得る。これらの株の増殖に関する生産性データは提供されていない。
【０１１５】
著者は、１つの群としてオメガ−３脂肪酸の精製を検討しているが、個々の脂肪酸の精製については検討しておらず、そのため、組成と個々の脂肪酸の濃縮および精製の関係について教示していない。
【０１１６】
ＡＲＡを含むオメガ−６脂肪酸は、食事療法目的には不利であることを明記する一方、著者は、「一部の用途にとっては望ましくないＣ２０：４ｎ−６およびＣ２２：５ｎ−６  ＨＵＦＡを１％未満（総脂肪酸の％として）有する株もまた単離することができる」と述べており、これにより、この著者は、ＡＲＡの相対量よりもむしろ総量が重要であると考えていることが示される。この教示は、いずれの脂肪酸の絶対量よりもむしろ重要なのはＥＰＡとＡＲＡとの比であることを教示する本発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）。
【０１１７】
幾人かの著者は、珪藻類で生成されたＥＰＡを含む組成物を提供している。例えば、Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓ(Journal of Applied Phycology 8:59-64,1996)は、数種の珪藻類の従属栄養増殖について報告しているが、細胞のＡＲＡ含量またはＣ２０：３以外の他の共濃縮脂肪酸については、記録も言及もしていない。この文献では、本明細書に記載の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１１８】
Ｋｉｔａｎｏら(Journal of Applied Phycology 9:559-563,1997)は、珪藻類のナビキュラ・サプロフィラ(Navicula saprophila)の従属栄養増殖について報告しているが、得られたＥＰＡとＣ２０：４との比は１０未満である。２０以上の炭素他の長鎖脂肪酸の含量については、開示も、精製に関するいかなる検討もなされていない。この文献では、我々の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１１９】
米国特許第５２４４９２１号明細書および同第５５６７７３２号明細書において、ＫｙｌｅおよびＧｌａｄｕｅは、従属栄養培養で珪藻類のニッチア・アルバ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｌｂａ）からエイコサペンタエン酸を生成する方法を開示している。この方法により生成された細胞では、ＥＰＡとＣ２０：４との比はわずか４：１である。ＥＰＡと他の共濃縮脂肪酸との比も、精製に対するその影響の可能性も検討されていない。この文献では、我々の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１２０】
Ｃｈｕら(Journal of Applied Phycology 8:389-396,1996)は、アセテートおよびグルコース上での珪藻類のニッチア・インコンスピクア(Nitzschia inconspicua)の従属栄養培養について報告している。著者は、ＥＰＡおよびＡＲＡ以外の、２０以上の炭素の長鎖脂肪酸含量を開示していない。これら２種の脂肪酸の比は、いかなる場合も、従属栄養条件下で２未満である。この文献では、本明細書に記載の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１２１】
ＷｅｎおよびＣｈｅｎは、いくつかの論文(Biotechnology Letters 22:727-733,2000;Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 25:218-224,2000;Enzyme and Microbial Technology 29:341-347,2001;Biotechnol Bioeng 75:159-169,2001.;Biotechnol.Prog.18:21-28,2002;Process Biochemistry 37:1447-1453,2002;Process Biochemistry 38:523-529,2002)において、珪藻類のニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)に対する従属栄養増殖条件の最適化を記載している。著者はＥＰＡ生成の最大化に取り組んでいるが、ＥＰＡとＡＲＡとの比が重要であることも、その比を最適化することの検討も指摘していない。同様に、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との相対レベルについても、濃縮または精製についても検討していない。この文献は、本明細書に記載の組成についても、この組成が濃縮および精製に適していることも教示していない。
【０１２２】
Ｐａｈｌら(J Bioscience and Bioeng 109:235-239,2010)では、著者は、水産養殖産業で使用するための飼料を製造する目的で、珪藻類のキクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）の従属栄養増殖を報告している。著者は、精製ＥＰＡを製造する可能性についても、ＥＰＡと他の長鎖脂肪酸との相対レベルが濃縮または精製に及ぼす影響についても検討していない。特に、ＡＲＡの量については論文では報告もされていない。著者は、窒素源、リン酸塩、およびケイ酸塩は豊富であるが、炭素が相対的に低量である培地を使用する。その結果、細胞のＥＰＡ含量は乾燥細胞重量の１．５％未満にとどまる。この文献では、本明細書に記載の組成についても、そのような組成が濃縮および精製に適していることも、また、そのような組成を成功裡に得られうるという期待があることも示唆されていない。
【０１２３】
ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＧｅｉｒｉｎｇｅｒは、国際公開第２００８００４９００号パンフレットにおいて、ＥＰＡに類似した構造的および生理化学的特性を有する分子が低レベルである、ＥＰＡを含む珪藻類に由来する組成物を提供している。これらの著者は、特定の脂肪酸が低レベルである、ＥＰＡを含む薬物治療用途のための組成物が一般的に望ましいことを開示している。特に、「ＥＰＡの所望の有益な健康への効果に対して、拮抗し、競合し、遮断し、撤回し、媒介し、相乗的に作用し、またはさもなければ変化させ得る作用を介して所望の効果を減少させ得る」ＡＲＡおよび他のオメガ−３およびオメガ−６脂肪酸を望ましくないと見なしている。著者はまた、後の薬物治療用途のために精製する目的にとって、前述の望ましくない脂肪酸が低レベルである、ＥＰＡを含む組成物が一般的に望ましいことを開示している。著者は、ＥＰＡの有益な健康への効果に対して影響を及ぼさないが、可能な濃縮度または精製度に影響するであろう他のＣ２０脂肪酸について検討していない。
【０１２４】
著者は、治療目的にとってＡＲＡが低レベルであるＥＰＡ組成物が望ましいことを教示しているが、彼らの組成物がバイオマスからの最初の単離工程を必要とし、かつ彼らの組成物がすべての共濃縮脂肪酸ではなく、ＥＰＡの生物活性に対して影響するもののみを考慮に入れているため、本発明の組成物を示唆していない。さらに、本発明の組成物を得られうる方法またはその工業的用途について教示していない。
【０１２５】
さらに、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＧｅｉｒｉｎｇｅｒも、また他の著者も、本明細書に教示のような、ＥＰＡとＡＲＡまたは共濃縮脂肪酸分子との所定範囲の比が、高度の濃縮、次いで精製を可能にする組成物を得るために、微生物の従属栄養培養において重要であることを教示していない。
【０１２６】
微生物、特に天然の真核微細藻類の従属栄養培養物が、培養物中への大量のＥＰＡ蓄積を通して取り出す代替のオメガ−３脂肪酸源として働き得る可能性がある一方、高度な濃縮および精製が可能になるほど十分に、ＥＰＡに生理化学的または構造的に類似した分子が同時に含まれない、ＥＰＡのこのような供給源の開発に、あったとしても比較的小さな組織的努力しか向けられなかったことは驚くべきことと思われるかもしれない。
【０１２７】
第１の幅広い態様では、本発明は、重量対重量に基づいた比を用いた場合、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１であり、かつＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である、従属栄養増殖した微生物を含む組成物を提供する。
【０１２８】
好ましくは、組成物は、少なくとも１２：１のＥＰＡとＡＲＡとの比で構成され、より好ましくはその比は少なくとも１３：１であり、より好ましくは少なくとも１４：１であり、さらにより好ましくは少なくとも１５：１である。
【０１２９】
好ましくは、組成物は、少なくとも９：１のＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比で構成され、より好ましくはその比は少なくとも１０：１であり、より好ましくは少なくとも１１：１であり、さらにより好ましくは少なくとも１２：１である。
【０１３０】
好ましくは、総脂肪酸の１％ｗ／ｗ未満が、ジュニペロン酸（共濃縮脂肪酸）である。より好ましくは、組成物は、０．５％ｗ／ｗ未満のジュニペロン酸を含む。最も好ましくは、ジュニペロン酸は組成物中に存在しない。
【０１３１】
好ましくは、総脂肪酸の１％ｗ／ｗ未満が、スシアドン酸（共濃縮脂肪酸）である。より好ましくは、組成物は、０．５％ｗ／ｗ未満のスシアドン酸を含む。最も好ましくは、スシアドン酸は組成物中に存在しない。
【０１３２】
好ましくは、従属栄養増殖した微生物は真核生物である。典型的には、微生物は同定された微細藻類または真菌を含む。好ましくは、微生物は微細藻類で構成される。より好ましくは、微生物は珪藻類、好ましくは海洋性珪藻類で構成され、より好ましくは、微生物はニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属由来の海洋性単細胞珪藻類で構成され、さらにより好ましくは、微生物はニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）として知られる海洋性単細胞珪藻類で構成される。
【０１３３】
好ましくは、培養条件下で、回収可能なＥＰＡの収率の改善に対して選択された微生物株。好ましくは、微生物は、培養条件下で、ＥＰＡに対して回収可能なＡＲＡの収率が低減していることに対して選択された微生物株を含む。好ましくは、微生物は、培養条件下で、ＥＰＡに対して回収可能な共濃縮脂肪酸の収率が低減していることに対して選択された微生物株を含む。
【０１３４】
一態様では、上記組成物は微生物バイオマスである。
【０１３５】
好ましくは、バイオマス組成物は、総乾燥重量のある割合で脂肪酸を含む；その割合の５〜８０％の間の範囲にある割合はＥＰＡである；ＥＰＡの割合は２〜８０％の間の範囲にあり（脂肪酸の乾燥重量基準で）、より好ましくはこの割合は１０％超であり、より好ましくは２０％超であり、さらにより好ましくは３０％超である。典型的には、総脂肪酸のＥＰＡである割合（乾燥重量基準で）は、１０〜８０％、２０〜８０％、または３０〜８０％の範囲にある。
【０１３６】
したがって、本発明は、従属栄養発酵から生成される微生物バイオマスであって、
−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）との比が約１１：１以上；
−ＥＰＡと共濃縮総脂肪酸との比が約８：１以上
を示す脂肪酸プロフィールを有するバイオマスを提供する。
【０１３７】
好ましくは、ジュニペロン酸（ＪＰＡ）もスシアドン酸もバイオマス中に存在しない。
【０１３８】
典型的には、微生物バイオマスは真核微生物バイオマスであり、最も典型的には、微細藻類バイオマスである。最も好ましくは、微細藻類バイオマスはニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）バイオマスなどの海洋性珪藻類バイオマスである。
【０１３９】
典型的には、微生物バイオマスは、従属栄養培地から微生物を採取し、場合によっては細胞を加熱またはさもなければ死滅させ（例えば、内在性酵素を変性させるために）、そして細胞をバイオマスに成型する（例えば、バイオマスのケーキ）ことにより、微生物培養物から生成される。バイオマスは、場合によっては乾燥させて、水を低減または除去する。本発明のバイオマスの形成には、脂肪酸、または水以外の物質を回収するための抽出または精製の工程が含まれない。しかしながら、本発明のバイオマスのＥＰＡ：ＡＲＡ比のお陰で、治療目的のためにＥＰＡを濃縮するために使用される、その後の抽出および精製の工程が容易になる。本発明の微生物バイオマスを、バイオマスから脂肪酸を抽出する、１つまたは複数の抽出工程に付して、脂肪酸組成物を得られうる。適切な抽出手法が当技術分野で周知である。例えば、バイオマスを、非選択的な脂質溶媒（例えば、臨界近傍のジメチルエーテルまたはエタノール）で抽出して、残査として溶媒から回収することができる。
【０１４０】
抽出後、前記脂肪酸組成物中のＥＰＡレベルは、組成物中の脂肪酸重量を基準として５〜９０％、５〜７５％、または５〜５０％である。ＥＰＡとＡＲＡとの比は、抽出前と実質的に同じレベルに、好ましくは少なくとも１１：１に保持することができる。ＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比は、抽出前と実質的に同じレベルに、好ましくは少なくとも約８：１に保持することができる。
【０１４１】
抽出後、ＥＰＡに関し脂肪酸組成物を濃縮するかまたは脂肪酸組成物からＥＰＡを精製するさらなる工程は、当技術分野で周知の手法を使用して実施することができる。例えば、抽出物を、アルコールまたは水の存在下で、酸、アルカリ、および／または酵素で処理して、脂肪酸または脂肪酸アルキルエステル混合物を形成させることができる。次いで、この混合物を、純度の要求基準を満たすためにさらに濃縮および精製してもよい。組成物中のＥＰＡとＡＲＡとの比は、濃縮および／または精製の前と実質的に同じレベルに、好ましくは少なくとも１１：１に保持することができる。組成物中のＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比は、濃縮および／または精製の前と実質的に同じレベルに、好ましくは少なくとも約８：１に保持することができる。より好ましくは、ＥＰＡとＡＲＡとの比およびＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比は、濃縮および／または精製の工程の後に、増加することになる。しかしながら、ＡＲＡおよび共濃縮脂肪酸からＥＰＡを分離することが相対的に困難でありかつコストがかかる場合、濃縮および／または精製の工程の前に、組成物中のＥＰＡとＡＲＡとの比およびＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が相対的に高いことが利点となる。
【０１４２】
濃縮または精製の後、前記脂肪酸中のＥＰＡレベルは、組成物中の脂肪酸重量基準で、少なくとも３０％もしくは少なくとも５０％であり、または少なくとも６０％、少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％の高純度ＥＰＡ組成物である。本明細書の目的のための高純度ＥＰＡ組成物は、適宜定義することができる。本発明の別の態様を形成するそのような高純度ＥＰＡ組成物。
【０１４３】
関連する態様では、本発明は、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１であり、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である、従属栄養増殖した微生物を含む組成物に由来する脂肪酸と脂質の混合物を提供する。
【０１４４】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の消費用製品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１であり、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である、従属栄養増殖した微生物を含む組成物の使用を提供する。このような製品は、公知の手法を使用して、当業者により製剤化可能であり、例えば、充填剤、担体、緩衝剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる。それは、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、溶液の形態を取ることが可能であり、さらに、パンおよびシリアルなどの食品、ジャム、および乳製品、他の製品と組み合わせることもできる。
【０１４５】
関連する態様では、本発明は、他の脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルとブレンドされた組成物を含む製品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１であり、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である、従属栄養増殖した微生物を含む組成物の使用を提供する。
【０１４６】
さらに別の態様では、本発明は、これらに限定されないが、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、糖血症障害、糖尿病関連高血圧症、癌、骨関節炎、自己免疫性疾患、慢性関節リウマチ、関節炎以外の炎症性および自己免疫性疾患、呼吸器疾患、神経障害、神経変性障害（ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、大うつ病、単極性うつ病、双極性うつ病、強迫性障害、境界性人格障害、産後うつ病、器質性脳障害、および外傷性脳損傷を含む）、腎および尿路障害、心臓血管障害、脳血管障害、眼の変性疾患、精神障害、生殖性障害、内臓障害、筋疾患、代謝障害、前立腺肥大症および前立腺炎、インポテンスおよび男性不妊、乳房痛、男性型脱毛症、骨粗鬆症、皮膚障害、失読症および他の学習障害、癌性悪液質、肥満症、潰瘍性大腸炎、クローン病、神経性食欲不振症、熱傷、骨関節炎、骨粗鬆症、注意欠陥／多動性障害、ならびに初期段階の結腸直腸癌、肺および腎臓疾患、ならびに成長異常および発達異常に関連した障害から選択されるものを含む、特定の医学的症状または障害に冒された患者の治療のための医薬品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１であり、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である、従属栄養増殖した微生物を含む組成物の使用を提供する。好ましくは、障害の医学的症状は、心臓血管障害または肥満症関連症状である。
【０１４７】
第２の幅広い態様では、本発明は、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１４：１である、従属栄養増殖した珪藻類を含む組成物を提供する。
【０１４８】
好ましくは、組成物は、少なくとも１５：１のＥＰＡとＡＲＡとの比で構成され、より好ましくはその比は少なくとも１６：１であり、より好ましくは少なくとも１７：１であり、さらにより好ましくは少なくとも１８：１である。
【０１４９】
好ましくは、珪藻類はニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属由来の海洋性単細胞珪藻類で構成される。好ましくは、珪藻類はニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）として知られる海洋性単細胞珪藻類で構成される。
【０１５０】
珪藻類は、培養条件下で、回収可能なＥＰＡの収率の改善に対して選択された珪藻類株を含む。
【０１５１】
別の態様では、珪藻類は、培養条件下で、ＥＰＡに対して回収可能なＡＲＡの収率が低減していることに対して選択された珪藻類株を含む。
【０１５２】
好ましくは、珪藻類組成物は、総乾燥重量のある割合で脂肪酸を含む；ＥＰＡである割合は５〜８０％の範囲にある；脂肪酸のＥＰＡの割合（乾燥重量基準で）は、２〜８０％の範囲にあり、より好ましくはこの割合は１０％超であり、より好ましくは２０％超であり、さらにより好ましくは３０％超である。
【０１５３】
関連する態様では、本発明は、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１４：１である、従属栄養増殖した珪藻類を含む組成物に由来する脂質と脂肪酸の混合物を提供する。
【０１５４】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物消費用の製品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１４：１である、従属栄養増殖した珪藻類を含む組成物の使用を提供する。
【０１５５】
関連する態様では、本発明は、他の脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルとブレンドされた組成物を含む製品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１４：１である、従属栄養増殖した珪藻類を含む組成物の使用を提供する。
【０１５６】
さらに別の態様では、本発明は、これらに限定されないが、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、糖血症障害、糖尿病関連高血圧症、癌、骨関節炎、自己免疫性疾患、慢性関節リウマチ、関節炎以外の炎症性および自己免疫性疾患、呼吸器疾患、神経障害、神経変性障害（ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、大うつ病、単極性うつ病、双極性うつ病、強迫性障害、境界性人格障害、産後うつ病、器質性脳障害、および外傷性脳損傷を含む）、腎および尿路障害、心臓血管障害、脳血管障害、眼の変性疾患、精神障害、生殖性障害、内臓障害、筋疾患、代謝障害、前立腺肥大症および前立腺炎、インポテンスおよび男性不妊、乳房痛、男性型脱毛症、骨粗鬆症、皮膚障害、失読症および他の学習障害、癌性悪液質、肥満症、潰瘍性大腸炎、クローン病、神経性食欲不振症、熱傷、骨関節炎、骨粗鬆症、注意欠陥／多動性障害、ならびに初期段階の結腸直腸癌、肺および腎臓疾患、ならびに成長異常および発達異常に関連した障害から選択されるものを含む、特定の医学的症状または障害に冒された患者の治療のための医薬品の製造における、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１４：１である、従属栄養増殖した珪藻類を含む組成物の使用を提供する。好ましくは、障害の医学的症状は、心臓血管障害または肥満症関連症状である。医薬品の製造は当業者には周知である。このような医薬品は、公知の手法を使用して、当業者により製剤化可能であり、例えば、医薬として許容される充填剤、担体、緩衝剤、安定剤、および／または防腐剤を含むことができる。それは、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、および／または溶液の形態を取ることができる。
【０１５７】
本発明の方法
幾人かの著者は、珪藻類を増殖させてＥＰＡを生成することができる方法を教示している。
【０１５８】
例えば、ＴａｎおよびＪｏｈｎｓ(Journal of Applied Phycology 8:59-64,1996)は、数種の珪藻類の従属栄養増殖について報告しているが、細胞のＡＲＡ含量またはＣ２０：３以外の２０超の炭素原子を有する脂肪酸含量については、記録も言及もしていない。光合成および混合栄養の増殖方法の検討以外、著者は、栄養素のいかなる変更も試みず、またこれが脂肪酸組成物に影響を及ぼし得るという事実についても論評していない。これらの著者は、炭素、窒素、ケイ酸塩、およびリン酸塩栄養素の相対比が脂肪酸組成物に影響することを認識していないため、本発明の方法を示唆していない。また、著者は、増殖培地の栄養素含量を介してバイオマス中のＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことが望ましい場合があることも開示していない。
【０１５９】
Ｋｉｔａｎｏら(Journal of Applied Phycology 9:559-563,1997)は、珪藻類のナビキュラ・サプロフィラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ）の従属栄養増殖について報告しているが、得られたＥＰＡとＣ２０：４との比は１０未満である。光合成および混合栄養の増殖方法の検討以外、著者は、栄養素のいかなる変更も試みず、またこれが脂肪酸組成物に影響を及ぼすという事実についても論評していない。これらの著者は、炭素、窒素、ケイ酸塩、およびリン酸塩栄養素の相対比が脂肪酸組成物に影響することを認識していないため、本発明の方法を示唆していない。また、著者は、増殖培地の栄養素含量を介してバイオマス中のＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことが望ましい場合があることも開示していない。
【０１６０】
米国特許第５２４４９２１号明細書および同第５５６７７３２号明細書において、ＫｙｌｅおよびＧｌａｄｕｅは、従属栄養培養で珪藻類のニッチア・アルバ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｌｂａ）からエイコサペンタエンを生成する方法を開示している。この明細書で、著者は、採取前に、細胞から最初に窒素を、次いでケイ酸塩を欠乏させるという、本発明からは遠のく教示を行っている（阻却事由を有する）。細胞は脂質を蓄積するが、ＥＰＡとＣ２０：４との比はわずか４：１である。ＥＰＡと２０以上の炭素の他の長鎖脂肪酸との比も、精製に対するその影響の可能性も検討されていない。
【０１６１】
ＷｅｎおよびＣｈｅｎは、いくつかの論文(Biotechnology Letters 22:727-733,2000;Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 25:218-224,2000;Enzyme and Microbial Technology 29:341-347,2001;Biotechnol Bioeng 75:159-169,2001.;Biotechnol.Prog.18:21-28,2002;Process Biochemistry 37:1447-1453,2002;Process Biochemistry 38:523-529,2002)において、珪藻類のニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)に対する従属栄養増殖条件の最適化を記載している。著者は、流加培地中の栄養素レベルを操作して、ＥＰＡの生成を最大化したが、グルコース以外のいかなる残存栄養素を測定することも試みておらず、したがって、培養物自体の中の窒素、リン酸塩、またはケイ酸塩栄養素の欠乏による制限の効果を研究していない。著者は、ＥＰＡとＡＲＡとの十分高い比を得られうる、本明細書に教示のような所定範囲の栄養素成分比を得ていない。
【０１６２】
これらの著者は、窒素またはケイ酸塩栄養素の欠乏による制限がバイオマスにおけるＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことを認識していないため、本発明の方法を示唆していない。また、著者は、増殖培地の栄養素含量を介してバイオマス中のＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことが望ましい場合があることも開示していない。
【０１６３】
Ｐａｈｌら(J Bioscience and Bioeng 109:235-239,2010)では、著者は、水産養殖産業で使用するための飼料を製造する目的で、珪藻類のキクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）の従属栄養増殖を報告している。著者は、窒素源、リン酸塩、およびケイ酸塩に富むが、炭素が相対的に低量の培地を使用し、その結果、本明細書に教示のような所定の栄養素組成物を得ていない。著者は、精製ＥＰＡを製造する可能性についても、ＥＰＡとＡＲＡとの相対レベルが濃縮または精製に及ぼす影響についても検討していない。ＡＲＡの量については論文では報告もされていない。著者は、ケイ酸塩の制限により、不飽和度が低い脂肪酸の割合が増加すると予測され得ることを言及しているが、培地中の栄養素比の変化が異なる高度不飽和長鎖脂肪酸間の比に影響を及ぼし得ることは検討していない。これらの著者は、炭素、窒素、ケイ酸塩、およびリン酸塩栄養素の相対比がバイオマスにおけるＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことを認識していないため、本発明の方法を示唆していない。また、著者は、増殖培地の栄養素含量を介してバイオマス中のＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことが望ましい場合があることも開示していない。
【０１６４】
Ｒｏｅｓｓｌｅｒ(J Phycol 24:394-400,1988)は、珪藻類のキクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica)の光独立栄養培養におけるケイ素欠乏の影響を検討している。著者は、ケイ素欠乏が細胞物質中の脂質量を増加させるが、ＰＵＦＡの相対的な割合を減少させることを言及しており、バイオマスをＰＵＦＡの製造のために生成する場合、増殖培地は栄養素で満たすべきであるとさえ示唆している。しかしながら、著者は、ケイ酸塩欠乏が引き起こすＰＵＦＡ間の比のいかなる変化に関しても論評していない。さらに、材料からのＥＰＡの濃縮または精製について、またこの目的に対する、ＥＰＡと２０以上の炭素の他の長鎖脂肪酸との相対レベルの重要性について検討していない。著者は、彼らの方法が培養のための主要エネルギー源として光を使用するため、本発明の方法を示唆していない。また、著者は、炭素、窒素、ケイ酸塩、およびリン酸塩栄養素の相対比が、バイオマスにおけるＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすという認識がないため、主要エネルギー源に光を使用しない方法の成功も示唆していない。また、著者は、増殖培地の栄養素含量を介してバイオマス中のＥＰＡとＡＲＡとの相対比に影響を及ぼすことが望ましい場合があることも開示していない。
【０１６５】
Ｔａｇｕｃｈｉら(J Phycol 23:260-267,1987)は、光独立栄養条件下のケイ酸塩欠乏条件下で海洋性珪藻類の脂質含量を検討している。「藻類が硝酸塩およびリン酸塩よりもケイ酸塩を最初に確実に利用することができるように、決定的なＮ：Ｐ：Ｓｉ比を確立することが不可欠である。培地からケイ酸塩が枯渇したことにより藻類がさらに増殖することができない場合でも、硝酸塩およびリン酸塩を低濃度に保つことにより、藻類は生存し続けて、細胞当たりより多くの脂質を生成する。」と著者は述べており、したがって、ケイ酸塩の欠乏が有益であると彼らが信じていることが示され、その教示は本発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）。著者は、細胞の脂肪酸組成の開示も検討もしていない。著者は、彼らの方法が培養のための主要エネルギー源として光を使用するため、本発明の方法を示唆していない。また、細胞からケイ酸塩を欠乏させて脂質収率を増加させるという著者の教示が本発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）ため、主要エネルギー源に光を使用しない方法の成功も示唆していない。
【０１６６】
Ｃｈｕら(Journal of Applied Phycology 8:389-396,1996)は、アセテートおよびグルコース上での珪藻類のニッチア・インコンスピクア(Nitzschia inconspicua)の従属栄養培養について報告しており、さらに、光合成培養物中の利用可能なケイ素および窒素レベルの変化が及ぼす影響を検討している。著者は、これらの変化がＥＰＡとＡＲＡとの間の比に対して及ぼす影響に関して論評しておらず、また、材料からのＥＰＡの濃縮または精製についても、この目的に対する、ＥＰＡと２０以上の炭素の他の長鎖脂肪酸との相対レベルの重要性についてもまったく検討していない。さらに、著者は、「窒素欠乏が、Ｎ．インコンスピクア(N.inconspicua)の総脂肪酸含量を高め、低レベルのＮａＮＯ３で増殖させると、２０：５（ｎ−３）が最高収率で生成された」と述べている。これは、本発明とは反して、ＥＰＡ収率が増殖条件を決定する最も重要な因子であると著者が考えていることを示す。彼らの方法の大部分が培養のための主要エネルギー源として光を使用するため、著者は本発明の方法を示唆していない。また、細胞から窒素を欠乏させて脂質収率を増加させるという著者の教示が本発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）ため、主要エネルギー源に光を使用しない方法の成功も示唆していない。
【０１６７】
Ｂａｒｃｌａｙは、米国特許第５１３０２４２号明細書および米国特許第５９０８６２２号明細書において、いくつかの藻類（非珪藻類）株の単離、従属栄養増殖、および脂肪酸プロフィールについて報告している。著者は、「脂質およびオメガ−３高度不飽和脂肪酸が顕著に高い製品が所望される場合、栄養素が制限されるように、好ましくは、適切な時間窒素が制限されるように培養が行われ得る．．．」ことを教示しており、したがって、本発明からはまったく遠く離れている（阻却事由を有する）ことを教示している。さらに、著者は、オメガ−３脂肪酸の精製についてグループとして検討しているが、個々の脂肪酸の精製については検討していない。ＡＲＡを含むオメガ−６脂肪酸は、食事療法目的には不利であることを明記する一方、著者は、「一部の用途にとっては望ましくないＣ２０：４ｎ−６およびＣ２２：５ｎ−６  ＨＵＦＡを１％未満（総脂肪酸の％として）有する株もまた単離することができる」と述べており、これは、本発明とは反して、この著者が、ＡＲＡの相対量よりもむしろ総量が重要であると考えていることを示す。著者は、その方法が非珪藻類培養物を使用するため、本発明の方法を示唆していない。また、細胞から栄養素を欠乏させて脂質収率を増加させるという著者の教示が本発明からは遠く離れている（阻却事由を有する）ため、珪藻類培養物の成功も示唆していない。
【０１６８】
従属栄養増殖した珪藻類中のＥＰＡが、十分に高いＥＰＡとＡＲＡとの比で得られて、濃縮および精製が可能になる方法について提供している著者は他にいない。
【０１６９】
さらに、培養珪藻類を生成する方法は、十分に高いＥＰＡとＡＲＡとの比を得ることができるように、好ましくは、本明細書で教示のように、所定範囲の栄養素成分比を使用することにより、窒素制限を回避しかつ培養物中の最小ケイ酸塩濃度を維持することを含むべきであると教示している著者は他にいない。
【０１７０】
微生物、特に天然の真核珪藻類の従属栄養培養物を含む方法が、培養物中への大量のＥＰＡ蓄積を通して、魚の代替となるオメガ−３脂肪酸源を提供し得る可能性がある一方、高度な濃縮および精製が可能になるほど十分に、ＥＰＡに生理化学的または構造的に類似した分子が同時に含まれない、ＥＰＡのこのような供給源の開発に、あったとしても比較的小さな組織的努力しか向けられなかったことは驚くべきことと思われるかもしれない。実際、現行の方法論は、ＥＰＡの絶対量を最大化することを強調するが、最大化の際に多くの場合、生理化学的または構造的に類似した分子の絶対量が不釣り合いに増加し、そのためＥＰＡの精製が困難になる。
【０１７１】
したがって、第３の幅広い態様では、本発明は、上記の組成物を得る方法であって、この方法が従属栄養増殖の能力およびＥＰＡの生成能力ならびにＥＰＡに生理化学的または構造的に類似した分子の相対的低含量に対して選択された微生物タイプの培養物を使用し；この方法がエネルギー源として有機炭素が使用される条件下で、細胞が増殖する培養相を含み；好ましくは、その条件がリン、窒素、および／またはケイ素を含むある範囲から選択される非制限の栄養素を含み；前記手順が、ＥＰＡとＡＲＡとの比が少なくとも１１：１（好ましくは１４：１）であり、ＥＰＡとすべての共濃縮脂肪酸との比が少なくとも８：１である回収可能なバイオマス量を最大化するために行われる方法を提供する。
【０１７２】
しかしながら、本発明者らは、非制限レベルのリン酸塩が好ましい一方、窒素および／またはケイ酸塩レベルの影響に比較して、リン酸塩濃度レベルの影響がＥＰＡとＡＲＡとの比ならびにＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比に対して少ないことを見出した。非制限レベル（または大過剰）の栄養素が、最終生成物中のＥＰＡ：ＡＲＡ比を実質的に増加させる効果を及ぼし得るため、非常に好ましい（例えば、図１を参照のこと）。
【０１７３】
培養または発酵の種々の方法が可能である。このうち最も簡単なものは、細胞を栄養培地に播種し、一定時間増殖させた後、採取する回分発酵である。流加回分発酵は、回分に類似しているが、濃縮栄養素を増殖期に培養物に供給する点が異なる。連続発酵は、発酵容器からバイオマスおよび栄養液を含む培養物を連続的に採取し、新たな栄養液と交換することを含む。培養物中の細胞密度が一定であるように、連続発酵の採取速度が選ばれる。半連続発酵は、採取が連続的というよりむしろ間欠的であること以外は連続発酵に類似している。連続発酵または半連続発酵が、本発明の微生物バイオマスの製造のために好ましいが、回分または流加回分発酵も使用することができよう。
【０１７４】
ＥＰＡの工業生産にとっては、コスト効率の良い方法を提供するために生産速度が重要である。この理由により、高い製造速度が好ましい。５ｍｇＥＰＡ／Ｌ／時を下回る製造速度でも有用となり得るが、本発明者らは、連続または半連続発酵／培養手法を使用する本発明の方法および工程を使用して、５ｍｇＥＰＡ／Ｌ／時を超える製造速度を達成することができることを示した。好ましい選択肢では、培養物１リットル当たり少なくとも５ｍｇＥＰＡが毎時生成される。より好ましい選択肢では、培養物１リットル当たり少なくとも１０ｍｇＥＰＡが毎時生成される。
【０１７５】
生産速度に加えて、バイオマス内部のＥＰＡ（ｗ／ｗ）レベルも、本発明の工程および方法の工業的な適用可能性にとって重要である。好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも１．５％を形成する。より好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも２％を形成し、さらにより好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも３％を形成する。
【０１７６】
関連する態様では、本発明は、微生物の培養物が、同定された微細藻類または真菌を含む、このセクションで上述された方法を提供する。好ましくは、微生物は微細藻類で構成される。より好ましくは、微生物は珪藻類、より好ましくは海洋性珪藻類で構成され、より好ましくは、微生物はニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属由来の海洋性単細胞珪藻類で構成され、さらにより好ましくは、微生物はニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）として知られる海洋性単細胞珪藻類で構成される。
【０１７７】
関連する態様では、本発明は、このセクションで上述された、培養物に由来する脂質混合物および脂肪酸混合物を生成するための方法であって、これらの混合物が、
培地から細胞を採取する工程と、
場合によっては、加熱またはさもなければ細胞を殺して内在性酵素を変性させる工程と、
バイオマスのケーキに細胞を成型する工程と、
場合によっては、バイオマスを乾燥させて水を低減または除去する工程と、
非選択的脂質溶媒を用いてバイオマスのケーキを抽出し、残査として溶媒から抽出物を回収する工程と（例えば、臨界近傍のジメチルエーテルの使用が１つの選択肢であり、エタノールの使用が別の選択肢である）、
場合によっては、アルコールまたは水の存在下で、酸、アルカリ、および／または酵素で抽出物を処理し、脂肪酸または脂肪酸アルキルエステル混合物を形成させ、場合によってはさらに、純度の要求基準を達成するために前記混合物を濃縮および精製する工程と
を含む採取方法によって得られる方法を提供する。
【０１７８】
バイオマスは、当業者に公知となる多くの方法によって、培養物から採取または回収することができる。これらの方法には、遠心分離法、濾過法、沈降法、およびデカンテーション法が含まれる。あるいは、培養物全体を集めて、乾燥または脂質抽出手順に付することができる。
【０１７９】
第４の幅広い態様では、本発明は、珪藻類を培養するための方法であって、この方法が従属栄養増殖の能力およびＥＰＡの生成能力ならびにＥＰＡに生理化学的または構造的に類似した分子の相対的低含量に対して選択された珪藻類の培養物を使用し；この方法が、
初期濃度が少なくとも０．５Ｍ炭素の有機炭素源、
窒素制限が生じないことを保証するのに十分高い初期濃度の１種または複数の窒素源（有機炭素と窒素とのモル比は３０（モルＣ：モルＮ）以下が好ましい）、
ケイ素制限が生じないほど十分な量の生物が利用可能なケイ素濃度（好ましくは、生物が利用可能なケイ素はケイ酸塩の形態であり、好ましくは、ケイ酸塩濃度は１５０μＭを下回らない）
を含む栄養液中で細胞が増殖する培養相を含む方法を提供する。
【０１８０】
好ましい態様では、有機炭素源の初期濃度は、０．５Ｍ〜１０Ｍ、１Ｍ〜１０Ｍ、または５Ｍ〜１０Ｍである。
【０１８１】
好ましい態様では、有機炭素と窒素との比は、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、または１５〜３０である。
【０１８２】
好ましい態様では、有機炭素とリン酸塩形態のリンとのモル比は、１２５０以下（モルＣ：モルＰ）であり、より好ましい態様では、このモル比は７５０以下である。典型的には、このモル比は、１００〜１２５０、２５０〜１２５０、２５０〜７５０、または３５０〜６５０（モルＣ：モルＰ）である。
【０１８３】
生物が利用可能なケイ素は、取り込まれてバイオマスに組み込まれ得るケイ素の化合物を意味する。これは、ケイ酸またはアルカリ金属ケイ酸塩の形態を取ることができる。好ましくは、メタケイ酸ナトリウムまたはメタケイ酸カリウムが使用される。
【０１８４】
好ましい態様では、ケイ酸塩形態のケイ素濃度は、培養中常に１５０μＭ以上であり、より好ましい態様では、この濃度は２００μＭ以上である。典型的には、最低濃度は、１５０μＭ〜１．３ｍＭ、２００μＭ〜１ｍＭ、２００μＭ〜７５０μＭ、または２００μＭ〜５００μＭである。本発明者らは、培養物中のケイ酸塩の遊離濃度が培養中１５０μＭを超えていることが有益であることを見出したが、この濃度を若干下回っても、得られるＥＰＡとＡＲＡとの比に顕著な影響はないと思われる。したがって、ケイ酸塩濃度が短時間１５０μＭを下回る場合に、本発明のこの態様から逸脱していると考えるべきではない。表７および図１に示されるように、１１：１〜１３：１の範囲にあるＥＰＡとＡＲＡとの比は、培養物中に遊離ケイ酸塩がない場合に得られ得るものである。しかしながら、濃度が１５０μＭを上回ると、ＥＰＡとＡＲＡとの比は顕著に増加する。培養物中の遊離ケイ酸塩の最も好ましい維持濃度は、２００〜７００μＭの範囲であり、より好ましくは４００〜６００μＭの範囲である。図１および実施例３に示される結果から、これらの最も好ましい濃度範囲でＥＰＡとＡＲＡとの比が驚くほど高くなることがわかる。この驚くべき結果は予期されたものではなく、成分間の相乗的相互作用の存在が示される。
【０１８５】
最も好ましくは、栄養液は、０．５Ｍ〜１０Ｍの有機炭素源の初期濃度、１〜３０の有機炭素と窒素とのモル比、常に１５０μＭ以上のケイ酸塩形態のケイ素濃度を含む。
【０１８６】
一選択肢では、培養物は、時間を通して、それが増殖する速度と同じ速度でバイオマスが取り出されるような平均速度で連続的または不連続的に採取される。
【０１８７】
好ましい選択肢では、培養物１リットル当たり少なくとも５ｍｇＥＰＡが毎時生成されるような速度でバイオマスが生成される。より好ましい選択肢では、培養物１リットル当たり少なくとも１０ｍｇＥＰＡが毎時生成される。
【０１８８】
別の好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも１．５％を形成する。より好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも２％を形成し、さらにより好ましい選択肢では、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも３％を形成する。
【０１８９】
関連する態様では、本発明は、このセクションで上述された、培養物に由来する脂質混合物および脂肪酸混合物を生成するための方法であって、これらの混合物が、
培地から細胞を採取する工程と、
場合によっては、加熱またはさもなければ細胞を殺して内在性酵素を変性させる工程と、
バイオマスのケーキに細胞を成型する工程と、
場合によっては、バイオマスを乾燥させて水を低減または除去する工程と、
非選択的脂質溶媒を用いてバイオマスのケーキを抽出し、残査として溶媒から抽出物を回収する工程と（臨界近傍のジメチルエーテルの使用が１つの選択肢であり、エタノールの使用が別の選択肢である）、
場合によっては、抽出物を、アルコールまたは水の存在下で、酸、アルカリ、および／または酵素で処理して、脂肪酸または脂肪酸アルキルエステル混合物を形成させる工程と、
場合によってはさらに、純度の要求基準を達成するために前記混合物を濃縮および精製する工程と
を含む採取方法によって得られる方法を提供する。
【実施例】
【０１９０】
以下の一般実験技術を使用する。
バイオマス乾燥重量の測定
バイオマス乾燥重量は、以下のとおりに、前秤量したガラス繊維フィルター法を使用して測定する。細胞および細胞凝集物を幅広く均一に分散させるために撹拌しながら、大きな代表試料から試料１０ｍｌを取り出す。この試料１０ｍｌを遠心管に入れ、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｓｅｐａｔｅｃｈ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  １．０中でスイングアウト式ローターを用いて、３０００ｒｐｍで４分間回転させ、液体をデカントして細胞ペレットを得る。リン酸塩緩衝生理食塩水を用いて細胞ペレットを洗浄し、再度遠心分離する。脱イオン水１００ｍｌを通してＳａｒｔｏｒｉｕｓガラス繊維フィルターを洗浄し、次いで、秤量前に６０℃のオーブンに２時間入れられる。真空濾過装置中で、前秤量したフィルターに試料１０ｍｌを通し、脱イオン水５０ｍｌで洗浄し、次いで、６０℃で２時間オーブン中に放置した後、再秤量する。前後の重量差（グラム）を１００倍したものを、１リットル当たりの乾燥重量の測定値とする。
【０１９１】
脂質含有物質の採取および抽出
細胞を採取し、洗浄して過剰な培地を除去する。乾燥細胞重量０．７５ｇに相当する湿潤細胞物質を使用して、細胞抽出物を生成する。脂質含有細胞抽出物は、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）の方法に従って、Ｆｏｌｃｈ抽出により得られうる。
【０１９２】
総脂肪酸分析
細胞抽出物試料の総脂肪酸を分析して、培養物質の組成を同定する。Ｃ２３：０などの内部標準を反応に加えることにより、細胞の総脂肪酸含量の測定が可能になる。脂肪酸生成の方法は、メタノール中の０．５Ｍメトキシドによる塩基性エステル転移反応の後に、メタノール中の乾燥ＨＣｌを使用した酸性エステル転移反応を必要とする。脂肪酸メチルエステルは、ヘキサンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させることにより回収した後、ガスクロマトグラフィーを使用して分析する。この試料は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ２０１０ＧＣ内部にある３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ  Ｆａｍｅｗａｘ（ｃｒｏｓｓｂｏｎｄポリエチレングリコール）ガラスキャピラリーカラムにて、自動注入により分析する。脂肪酸の同定は、標準動作条件下のピーク保持時間を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ供与の既知標準物質の保持時間と比較して行った。
【０１９３】
栄養素比の計算
種々の炭素源および窒素源を含む培地を比較可能にするために、培地内の栄養素比を構成原子のモル比に換算する。例えば、グルコース１ｍｏｌは炭素を６ｍｏｌ含有するが、酢酸１ｍｏｌは炭素を２ｍｏｌのみ含有する。
これらの計算のために、グルコースの分子量を１８０．１６とすると、グルコース１００ｇは炭素を６×１００／１８０．１６ｍｏｌ含有する。
これらの計算のために、酵母抽出物が少なくとも約１０％（ｗ／ｗ）の総窒素含量を有すると仮定すると、酵母抽出物１００ｇは窒素を少なくとも約（１０／１００）×１００／１４ｍｏｌ含有する。同様に、トリプトンの窒素含量は少なくとも約１３％（ｗ／ｗ）である。
これらの計算のために、酵母抽出物およびトリプトンでは、エネルギー源としての炭素量の寄与は無視できると仮定する。
硝酸塩からのモル窒素含量およびケイ酸塩からのモルケイ素含量は、各化合物の分子量を使用して直接計算することができる。
【０１９４】
実施例１
ニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）株Ｉｎ１の培養物３ｇ（乾燥重量）を、作業容量１９．４Ｌの撹拌型タンク発酵槽の中に移した。容器には、グルコースを３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物を１．２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムを１．３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを４０ｍｇ／Ｌ、およびメタケイ酸ナトリウム五水和物を２７０ｍｇ／Ｌの濃度で含む栄養素と共に、表１に詳述される塩類およびビタミン類を含む増殖培地が含有されていた。
【０１９５】
【表１】
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【０１９６】
培養物に、毎分１容器容量の無菌空気を通気し、溶存酸素含量が５０％を超えるように撹拌制御した。０．４Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを８．０に維持した。発酵槽容器のまわりのジャケットを通して、熱水または冷却水を循環させて、要求どおり温度を２０℃に維持した。
【０１９７】
細胞から培地を分離するように設計された沈降装置を、反応器に装着した。培養物をこの装置に送り込み、細胞を主要発酵槽容器に戻す一方、使用済み培地を吸引して廃棄することができた。開始培地と同じ組成の新たな無菌培地を発酵槽容器に加えて、容器容量を１９．４Ｌで一定に維持した。
【０１９８】
廃棄のために取り出す培地量を、増殖期間にわたって徐々に増加させ、培養物密度が約１０．５ｇ／Ｌ乾燥重量の採取密度に到達する２４時間にわたって１９．４Ｌの培地を取り出した。
【０１９９】
一旦培養物が採取密度に到達したならば、藻類細胞を含有する培養物を、培養物の乾燥重量が１０〜１１ｇ／Ｌの間に保持される割合で採取物として取り出した。廃棄するために取り出す使用済み培地の容量を調整して、１日あたりに反応器から取り出す総容量を１９．４Ｌとして一定に維持した。発酵槽から取り出した容量は、開始培地と同じ組成の新たな培地で補充した。
【０２００】
細胞密度、採取、および組成が安定している定常状態が得られた。廃棄培地中のグルコース濃度は５ｇ／Ｌを超えており、細胞が炭素制限状態ではなかったことが示された。
【０２０１】
次いで、他の成分はすべて前のレベルを維持しながら、２．１ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムおよび８０ｍｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムを含有するように、容器中に投入する新たな培地の栄養素含量を変化させた。
【０２０２】
連続培養をさらに４８時間維持して、細胞が新しい栄養素レベルに順応できるようにした。この時間の間、同じ培養物乾燥重量を維持するのに必要な採取速度は約２５％増加し、高レベルの窒素および／またはリン酸塩が供給された場合に、培養物の増殖速度がより高くなることが示され、培養物がそれまで窒素および／またはリン酸塩制限状態にあったことが示された。廃棄培地中のグルコース濃度は５ｇ／Ｌを超えたままであり、細胞が再度炭素制限状態ではなかったことが示された。
【０２０３】
バイオマスの無菌試料を、栄養素の変化前および変化後の両方の培養物から得て、それらから脂質を抽出した。抽出物内の脂肪酸プロフィールおよび成分比を表２に示し、培養条件の変化が、ＥＰＡ：ＡＲＡ比に関する組成の改善およびＥＰＡと共濃縮成分との比の改善をどのようにもたらすかを示す。ＥＰＡは、栄養素変化後の乾燥細胞重量の２．３％を形成した。
【０２０４】
この試料の後に続いて、培地の硝酸ナトリウム含量をさらに増加しても、増殖速度の顕著な増加は生じず、培養物はもはや窒素制限状態にはなかったことが示された。
【０２０５】
【表２】
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【０２０６】
【表３】
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【０２０７】
実施例２
ニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）株Ｉｎ１の培養物３ｇ（乾燥重量）を、作業容量１８Ｌの撹拌型タンク発酵槽の中に移した。容器には、グルコースを３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物を１．６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムを２．９８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを８０ｍｇ／Ｌ、およびメタケイ酸ナトリウム五水和物を２７０ｍｇ／Ｌの濃度で含む栄養素と共に、表１に詳述される塩類およびビタミン類を含む増殖培地が含有されていた。
【０２０８】
培養物に、毎分１容器容量の無菌空気を通気し、溶存酸素含量が５０％を超えるように撹拌制御した。０．４Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを８．０に維持した。発酵槽容器のまわりのジャケットを通して、熱水または冷却水を循環させて、温度を２０℃に維持した。
【０２０９】
細胞から培地を分離するように設計された沈降装置を、反応器に装着した。培養物をこの装置に送り込み、細胞を主要発酵槽容器に戻す一方、使用済み培地を吸引して廃棄することができた。新たな無菌培地を発酵槽容器に加えて、容器容量を１８Ｌで一定に維持した。培地には、グルコースを３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物を１．６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムを２．９８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを８０ｍｇ／Ｌ、およびメタケイ酸ナトリウム五水和物を５３０ｍｇ／Ｌの濃度で含む栄養素と共に、表１の塩類が含有されていた。培地には、窒素制限を回避するように、３０：１未満のモル比Ｃ：Ｎ（表５を参照のこと）が含有されていた。
【０２１０】
廃棄のために取り出す培地量を、増殖期間にわたって徐々に増加させ、培養物密度が約１０ｇ／Ｌ乾燥重量の採取密度に到達する２４時間にわたって１８Ｌの培地を取り出した。
【０２１１】
一旦培養物が採取密度に到達したならば、藻類細胞を含有する培養物を、培養物の乾燥重量が１０〜１１ｇ／Ｌの間に保持される割合で採取物として取り出した。廃棄するために取り出す使用済み培地の容量を調整して、１日あたりに反応器から取り出す総容量を１８Ｌとして一定に維持した。発酵槽から取り出した容量は、開始培地と同じ組成の新たな培地で補充した。
【０２１２】
細胞密度、採取、および組成が安定している定常状態が得られた。この時点で、培養物１リットル当たり乾燥細胞重量６．１ｇが２４時間で採取された。ｇ乾燥重量当たり約３２５μｍｏｌのケイ酸塩が必要とすると、バイオマス合成のための毎日のケイ酸塩必要量は、１９８６μｍｏｌＬ−１ｄａｙ−１であった。ケイ酸塩の供給は、５０５μｍｏｌの過剰Ｓｉ濃度を与える２４９１μｍｏｌＬ−１ｄａｙ−１であった。
【０２１３】
バイオマスの無菌試料を培養物から得て、それから脂質を抽出した。抽出物内の脂肪酸プロフィールおよび成分比を表４に示す。ＥＰＡは、これらの条件下で乾燥細胞重量の２％を形成し、毎時培養物１リットルあたり５．１ｍｇＥＰＡのＥＰＡ生産速度がもたらされた。
【０２１４】
【表４】
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【０２１５】
【表５】
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【０２１６】
実施例３
ニッチア・ラエビス(Nitzschia laevis)株Ｉｎ１の培養物３ｇ（乾燥重量）を、作業容量１４Ｌの撹拌型タンク発酵槽の中に移した。容器には、グルコースを５０ｇ／Ｌ、酵母抽出物を１．９ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムを４．０ｇ／Ｌ、およびリン酸二水素カリウムを１７０ｍｇ／Ｌの濃度で含む栄養素と共に、表１に詳述される塩類およびビタミン類を含む増殖培地が含有されていた。メタケイ酸ナトリウム五水和物は、１４３ｍｇ／Ｌの濃度に濃縮された原液として別に加えられた。
【０２１７】
培養物に、毎分１容器容量の無菌空気を通気し、溶存酸素含量が５０％を超えるように撹拌制御した。０．４Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを８．０に維持した。発酵槽容器のまわりのジャケットを通して、熱水または冷却水を循環させて、温度を２０℃に維持した。
【０２１８】
培地には、窒素制限を回避するように、３０：１未満のモル比Ｃ：Ｎ（表６を参照のこと）が含有されていた。採取された培地中のレベル測定ではすべて、培養物中の硝酸塩が８０ｍｇ／Ｌ以上であることが確認された。発酵槽は採取直後に新たな培地で補充されるので、この測定は、発酵槽中の最低硝酸塩濃度を示すため、窒素は、この実施例を通して制限的ではなかった。
【０２１９】
【表６】
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【０２２０】
一旦培養物が採取密度に到達したならば、培養物の乾燥重量が約７．５ｇ／Ｌを保持する種々の容量で、藻類細胞を含有する培養物を６時間ごとに採取した。発酵槽から取り出した容量は、開始培地と同じグルコース、硝酸ナトリウム、酵母抽出物、およびリン酸二水素カリウムを含む新たな培地で補充した。
【０２２１】
ケイ素は、メタケイ酸ナトリウムの濃縮水溶液として、他の培地とは別個に加えられ、培地補充時にすべてではなく、高濃度による沈殿の問題を回避するためにその日を通して一定間隔で加えられた。メタケイ酸ナトリウム添加の頻度を変えて、培地中のケイ素濃度を変化させた。
【０２２２】
脂肪酸分析のために試料を毎日取り出し、バイオマス内のＥＰＡ：ＡＲＡ比を算出した。
【０２２３】
発酵槽中の利用可能なメタケイ酸ナトリウムレベルは、残存ケイ酸塩レベルを得て、添加ケイ酸塩量を加算し、バイオマスに組み込まれた量（ｇ乾燥重量当たり３２５μｍｏｌケイ素で）を減算し、発酵槽が採取され、ケイ酸塩フリーの培地で補充された場合に生じる希釈を補正して算出した。
【０２２４】
表７および図１に示す結果から、利用可能なケイ酸塩とＥＰＡ：ＡＲＡ比との間に強い相関があり、培養物中のケイ酸塩レベルが制限されるようになる（すなわち、ゼロに低下する）場合はすべて、ＥＰＡ：ＡＲＡ比は１４：１未満であることがわかる。驚くべきことに、メタケイ酸ナトリウムの最小レベルが１５０μＭを超えるまで、１４：１を超える比は認められなかった。
【０２２５】
測定が行われたすべての試料（表７の試料３〜１１）で、ＥＰＡは、バイオマスの乾燥重量の少なくとも３％を形成した。
【０２２６】
【表７】
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【０２２７】
実施例４
上記方法に従ってバイオマスを生成し、凍結乾燥バイオマスから脂質を抽出した。エタノール：水（２：１）中でＫＯＨを使用して、脂質を遊離脂肪酸に変換し、乾燥させて水を除去し、次いでエタノール中でＨ２ＳＯ４を使用してエチルエステルに変換した。
【０２２８】
得られたエチルエステルを、Ｗ．Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ(“Supercritical Fluid Technology in Oil and Lipid Chemistry” Editors J.W.King & G.R.List,AOCS Press,ISBN0-935315-T1-3,1996,pp.180-212)により開示の方法に従って濃縮した。濃縮前および濃縮後における、２０以上の炭素を有する脂肪酸の濃度を表８に示す。
【０２２９】
これらの脂肪酸それぞれの相対的な割合は数倍増加したが、ＥＰＡとＡＲＡとの比はわずかに変化したのみであり、したがって、ＥＰＡとＡＲＡとの比が高い出発原料を生成することの利点が実証されたことに留意されたい。
【０２３０】
【表８】
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【０２３１】
実施例５
モルティエラ(Mortierella)属の真菌であるモルティエラ・レニスポラ(Mortierella renispora)を、約１１：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比および約８：１以上のＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた条件下で従属栄養培養する。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３２】
実施例６
クロレラ(Chlorella)属の藻類であるクロレラ・ミヌティシマ(Chlorella minutissima)を、約１１：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比および約８：１以上のＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた条件下で従属栄養培養する。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３３】
実施例７
ナノクロロプシス(Nannochloropsis)属の藻類であるナノクロロプシス・オシアニカ(Nannochloropsis oceanica)を、約１１：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比および約８：１以上のＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた条件下で従属栄養培養する。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３４】
実施例８
総脂肪酸の百分率としてのＥＰＡレベルが、ＡＲＡおよび共濃縮脂肪酸の割合に比べて高いスラウストキトリッド(Thraustochytrid)種を同定するためのＢａｒｃｌａｙ（米国特許第５１３０２４２号明細書）の方法に従って、スクリーニングを実施する。次いで、微生物を、約１１：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比および約８：１以上のＥＰＡと総共濃縮脂肪酸との比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた従属栄養条件下で増殖させる。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３５】
実施例９
珪藻類のキクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica)を、約１４：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた条件下で従属栄養培養する。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３６】
実施例１０
真正の光独立栄養生物である珪藻類のフェオダクチラム・トリコルヌタム(Phaeodactylum tricornutum)を、Ａｐｔら（米国特許第７９３９７１０号明細書）の方法に従って形質転換し、エネルギーおよび炭素の供給源としてグルコースを使用して従属栄養増殖する能力を付与する。形質転換した生物を、約１４：１以上のＥＰＡとＡＲＡとの比を含む脂肪酸組成物を有するバイオマスを生成するために選ばれた条件下で従属栄養培養する。バイオマスを採取し、脂質を抽出する。抽出した脂質をエステル転移反応に供してエチルエステルを形成する。次いで、エチルエステルを処理して、ＥＰＡが総脂肪酸の少なくとも６０重量％を形成する脂肪酸エチルエステル濃縮物を生成し、次いで、この濃縮物を精製して９０％を超える純度のＥＰＡエチルエステルを生成する。
【０２３７】
全般
したがって、実施例は、総脂肪酸の２０重量％の範囲（またはそれ以上）のＥＰＡを含有し、ＥＰＡとＡＲＡとの比が１１：１以上であり、ＥＰＡと共濃縮脂肪酸との比が８：１以上である組成物（微生物バイオマスおよび脂肪酸組成物を含む）を示す。この組成物はさらに、組成物中のＥＰＡとＡＲＡとの比を少なくとも維持しながら、ＥＰＡが総脂肪酸の７０重量％を超えるまで精製され得ることが示されている。
【０２３８】
文脈上他のことが明確に要求されない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、単語「含む(comprise)」、「含む(comprising)」等は、排他的または網羅的な意味とは反対に、包括的な意味に解釈すべきである。すなわち、「含むが、これに限定されない」の意味に解釈すべきである。
【０２３９】
本明細書においていかなる従来技術に言及しても、その従来技術が世界のいずれの国においても当技術分野の一般常識の一部を形成していると認識するものでも、または何らかの形で示唆するものでもなく、また、そのように解釈されるべきものでもない。
【０２４０】
本発明は、個々にまたは集合的に、本願明細書に言及または指摘の部品、要素、および特徴に、２つ以上の前記部品、要素、または特徴の任意またはすべての組合せに存すると幅広く述べることができる。
【０２４１】
前述の説明において、周知の等価物を有する完全体または構成要素に言及がなされた場合、それらの完全体は、あたかも個々に記載されたように本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
本明細書に記載の現在好ましい実施形態に対する種々の変形および修正が当業者には明らかであることに留意されたい。このような変形および修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつそれに付随する利点を減ずることなく行うことができる。したがって、このような変形および修正は、特許請求の範囲のとおりに、本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
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【国際調査報告】
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2013531494.tif 000013
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