(57)【要約】  本発明は、第1分子と、粒子に結合する第2分子との間での相互作用を解析する方法に関する。当該方法は、前記相互作用を可能にする条件下で前記第1分子と前記粒子に結合する前記第2分子とを接触させる手順、前記第2分子に結合する前記粒子へ所定の液体流を与える手順、前記液体流により生じる前記第2分子に結合する前記粒子を観察する手順、前記液体流と前記運動による前記相互作用を解析する手順を有する。前記粒子は、前記第1分子及び/又は前記第2分子よりも大きな流体力学的抵抗、並びに、1よりも大きな質量ペクレ数を有する。本発明はまた、第1分子と少なくとも1つの第2分子との間での相互作用を解析する装置、及び、薬を開発する候補となる分子のスクリーニングにおける当該方法又は装置の使用にも関する。
2013536409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1分子と、粒子と結合する第2分子との間での相互作用を解析する方法であって：
前記相互作用を可能にする条件下で前記第1分子と前記粒子に結合する前記第2分子とを接触させる手順；
前記第2分子に結合する前記粒子へ所定の液体流を与える手順；
前記液体流により生じる前記第2分子に結合する前記粒子の運動を観察する手順；
前記液体流と前記運動による前記相互作用を解析する手順；
を有し、
前記粒子は、前記第1分子及び/又は前記第2分子よりも大きな流体力学的抵抗、1よりも大きな質量ペクレ数、並びに、1乃至100nmナノメートルサイズの寸法を有する、
方法。
【請求項２】
前記粒子の運動が、前記粒子の物理的特性及び/又は化学的特性によって観察される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記観察する手順は、光学的方法、化学的方法、電気化学的方法、及び磁気的方法からなる群から選ばれる方法によって実行される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記観察する手順は、蛍光放出体の利用、励起手段の利用、及び、蛍光検出手段の利用からなる群から選ばれる方法によって実行される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光放出体は、前記粒子自体、又は、前記粒子及び/若しくは前記第1分子と前記第2分子からなる群から選ばれる少なくとも1つの分子に係るラベルである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の液体流が、6πμRvに等しい力Fを前記粒子に加えることを可能にし、
ここで、μは前記流体の粘度を表し、Rは前記粒子の流体力学的半径を表し、vは前記粒子の位置での前記流体の速度を表す、
請求項1乃至5のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記解析する手順が定量的又は定性的である、請求項1乃至6のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記相互作用が、生物分子同士の相互作用又は生物分子と化学分子との間での相互作用である、請求項1乃至7のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第1分子が細胞膜の分子である、請求項1乃至8のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第1分子と少なくとも1つの第2分子との間での相互作用を解析する装置であって：
所定の液体流を与える手段；
第1分子及び該第1分子と相互作用しうる第2分子と結合しうる1乃至100nmナノメートルサイズの寸法を有する粒子を受ける支持体；
前記粒子の運動を観察する手段；
を有し、
前記粒子は、前記第1分子及び/又は前記第2分子よりも大きな流体力学的抵抗、及び、1よりも大きな質量ペクレ数を有する、
装置。
【請求項１１】
前記所定の液体流を与える手段が、前記所定の液体流を介して6πμRvに等しい力Fを前記粒子に加えることを可能にする手段で、
ここで、μは前記流体の粘度を表し、Rは前記粒子の流体力学的半径を表し、vは前記粒子の位置での前記流体の速度を表す、
請求項10に記載の装置。
【請求項１２】
前記粒子の運動を観察する手段が、前記粒子の物理的特性及び/又は化学的特性を利用した観察手段である、請求項10又は11に記載の装置。
【請求項１３】
医薬開発の候補となる分子のスクリーニングでの請求項1乃至9のうちのいずれか一項に記載の方法又は請求項10乃至12のうちのいずれか一項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子に力を加えることによって、第1分子と、前記粒子に結合する少なくとも1つの第2分子との間で生じる相互作用を解析する装置と方法、及び、薬を開発する候補となる分子のスクリーニングにおける当該方法又は装置の使用にも関する。
【０００２】
本発明は特に、研究分野における実験用装置としての用途を有する。
【背景技術】
【０００３】
生物分子−具体的にはタンパク質だけではなくたとえばオリゴヌクレオチドのような低分子質量の分子−の相互作用の高スループット測定は、研究、診断、又は、新たな薬を探索するためのスクリーニングのような分野における重大な課題である。
【０００４】
これらの相互作用を測定するため、たとえば生物分子間での会合の容量及び動特性を測定することが可能である。
【０００５】
現在利用可能な技術の中で、表面プラズモン共鳴は、ラベル付けすることなく、溶液中に存在するタンパク質が、表面上に固定されるリガンドと相互作用するのか否かを測定することを可能にする方法として広く用いられている（非特許文献1を参照のこと）。この方法は、人口の脂質二重層内で固定されるリガンドによって実行されても良い（非特許文献2を参照のこと）。検出は、表面へのタンパク質の結合が、屈折率の変化を誘起するという事実に基づく。この結果、表面プラズモン共鳴周波数が移動する。この移動は、一定の角度での反射強度の変化又は最大反射強度が観測される角度の変化によって反映される。この手法の課題の1つは、小さな分子が結合する間での信号の変化が非常に小さく、検出するのが困難なことである。
【０００６】
分子間相互作用を解明する方法は、2つの分子の一方に力を与えること、又は、小さな分子構造により加わる若しくは発生する力を測定することを−特にリアルタイムで−可能にする装置の開発において模索されてきた。
【０００７】
よって光ピンセットは、対象物をナノオーダーで操作する−具体的には、その対象に触れることなく（つまりその対象物には如何なる物質も接触していない状態で）その対象物に力を加える−ことを可能にする装置である（非特許文献3を参照のこと）。光ピンセットは、ミクロンスケールのビーズを移動させることで、そのビーズに付着する対象物に力を加えることを可能にするように集光されたレーザーにより生成される最小のエネルギーを利用する。よって膜タンパク質又は脂質に付着するビーズは、光ピンセットによって力が加えられた後に生じる膜との相互作用を調べるために捕らえられる（非特許文献4,5を参照のこと）。
【０００８】
生物分子を操作する他の方法は、磁気ピンセットを用いることである。たとえばガラス表面と常磁性マイクロビーズとの間に端部を介してDNA分子を選択的に付着することによって、磁石により発生する磁場によってそのビーズに作用させることでその分子を力学的に操作することが可能となる。
【０００９】
分子間相互作用を研究するために力を加えるための以下のような他の装置が提案されてきた。原子間力顕微鏡(AFM)（非特許文献6,7を参照のこと）、及び、端部での膜カプセルによるマイクロピペットの力学的運動に基づく「生体膜力検出器」として知られる手法である（非特許文献8,9を参照のこと）。生体膜力検出器では、膜の張力はマイクロピペットの吸い込み圧力によって変調可能である。
【００１０】
光若しくは磁気ピンセットによる力の印加又はAFMチップ若しくはマイクロピペットによる力の印加は複雑な処理を含む。その複雑な処理は、ピンセットの場合であれば高価な材料−たとえば高出力レーザー又は磁石−を必要とし、AFMの場合であれば複雑な電子機器を必要とし、かつ、マイクロピペットの場合であれば難しい位置合わせを必要とする。それに加えて、用いられる材料はかさばるため容易に移動できない。そのため携帯可能器具内で用いることは困難で、さらには不可能である。しかも光ピンセットの場合であれば、レーザーのエネルギーが、培地によって吸収され、熱として放散され、かつ、研究対象の分子の変質を引き起こす恐れがある。さらにこれらの方法は、多重化には十分に適さない。
【００１１】
これらの装置−特にレーザー−を用いることなく生物分子間での相互作用を評価する方法が開発されてきた。
【００１２】
たとえば特許文献1は、流れに従う細胞の接合、運動、及びモフォロジー特性の評価について記載している。特許文献1に記載された装置は、表面上の血小板又はタンパク質の膜の堆積物をマクロスケールで解析する装置である。しかしその装置では、分子レベルでの相互作用を解析することはできない。
【００１３】
特許文献2は、生体内及び試験管内で利用可能な分子相互作用を検出する方法、及び、2つの生物分子間の相互作用を決定するマイクロ流体装置について記載している。そのマイクロ流体装置では、複数の生物分子のうちの一にラベルが付され、かつ、前記複数の生物分子は、加えられる流れによって接触する。この方法の課題は、力を及ぼすのに磁場を利用することである。そのように磁場を利用するには高価な装置が必要となる。しかも力の印加と検出が2つの独立した手順であるため、生物分子間での相互作用の動力学的特性を利用する機会を得ることができない。
【００１４】
非特許文献10は、第1分子と第2分子との間での相互作用を、その第2分子に結合するマイクロ粒子の運動を観察し、かつ、流れを与えることによって解析する方法について提案している。粒子がマイクロ粒子である場合、多数の第2分子がマイクロ粒子に結合する。この状況では、多数の第1分子と第2分子との間での相互作用間の平均を観察することしかできない。この方法では、1対の第1分子と第2分子を研究することはできない。たとえば2種類の形態の第1分子M1とM1*又は2種類の形態の第2分子M2とM2*が存在する場合、この方法では、M1-M2の相互作用とM1*-M2の相互作用の差異又はM1-M2の相互作用とM1-M2*の相互作用の差異を区別することができない。同様にこの方法では、第2分子を介して力が加えられた後での1つの第1分子とその周囲との相互作用を研究することはできない。特に非特許文献10の方法では、「未知の数の」分子M1の組とその周囲との相互作用を研究することができない。よって1つの分子とその周囲との相互作用のエネルギー又は2つの分子間での相互作用のエネルギーの分布に還元することは不可能である。
【００１５】
しかしこの情報を得ることは、これらの相互作用の性質を理解することを可能にするだけではなく、医薬の開発のための候補となる分子の有効なスクリーニングを可能にする上でも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第2009/098272号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2006/009398号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2007/036544号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Piehler  et  al.,  “New  methodologies  for  measuring  protein  interactions  in  vivo  and  in  vitro”,  Curr  Opin  Struct  Biol.  2005  Feb;15(1):4-14
【非特許文献２】Cooper  MA,  “Advances  in  membrane  receptor  screening  and  analysis”,  J  Mol  Recognit.  2004  Jul-Aug;17(4):286-315
【非特許文献３】S.  Chu,  Laser  Manipulation  of  Atoms  and  Particles,  Science  253,  861  (1991)
【非特許文献４】A.  Pralle,  P.  Keller,  E.-L.  Florin,  K.  Simons,  and  J.K.H.  Hoerber,  Sphingolipid-Cholesterol  Rafts  Diffuse  as  Small  Entities  in  the  Plasma  Membrane  of  Mammalian  Cells,  J.  Cell  Biol.  148,  997-1007  (2000)
【非特許文献５】Kenichi  Suzuki,  Ronald  E.  Sterba,  and  Michael  P.  Sheetz,  Outer  Membrane  Monolayer  Domains  from  Two-Dimensional  Surface  Scanning  Resistance  Measurements,  Biophys.  J.  79  448-459  (2000)
【非特許文献６】Moy,  V.T.,  Florin,  E.-L.  &  Gaub,  H.E.  Intermolecular  forces  and  energies  between  ligands  and  receptors.  Science  264,  257±259  (1994)
【非特許文献７】Hinterdorfer,  P.,  Baumgartner,  W.,  Gruber,  H.J.,  Schilcher,  K.  &  Schindler,  H.  Detection  and  localization  of  individual  antibody-antigen  recognition  events  by  atomic  force  microscopy.  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  93,  3477-3481  (1996)
【非特許文献８】Evans,  E.,  Ritchie,  K.  &  Merkel,  R.  Sensitive  force  technique  to  probe  molecular  adhesion  and  structural  linkages  at  biological  interfaces.  Biophys.  J.  68,  2580-2587  (1995)
【非特許文献９】R.  Merkel,  P.  Nassoy,  A.  Leung,  K.  Ritchie,  E.  Evans,  Nature  397,  50-53  (1999)
【非特許文献１０】Schmidt  Brian  J.  et  al.  “Catch  Strip  Assay  for  the  Relative  Assessment  of  Two-Dimensional  Protein  Association  Kinetics”,  Anal.  Chem.  2008,  80:944-950
【非特許文献１１】I.  Barbulovic-Nad,  M.  Lucente,  Y.  Sun,  M.  Zhang,  A.R.  Wheeler,  M.  Bussmann,  Bio−Microarray  Fabrication  Techniques−A  Review,  Critical  Reviews  in  Biotechnology,  26:237-259,  2006
【非特許文献１２】A.J.  Goldman,  R.G.  Cox,  H.  Brenner,  Slow  viscous  motion  of  a  sphere  parallel  to  a  plane  wall−I  Motion  through  a  quiescent  fluid,  Chem.  Eng.  Sci.  22  637-651  (1967)
【非特許文献１３】A.J.  Goldman,  R.G.  Cox,  H.  Brenner,  Slow  viscous  motion  of  a  sphere  parallel  to  a  plane  wall−II  Couette  flow  Chem.  Eng.  Sci.  22  653-660  (1967)
【非特許文献１４】E.  Lauga,  T.M.  Squires,  Brownian  motion  near  a  partial-slip  boundary:  A  local  probe  of  the  no-slip  condition,  Phys.  Fluids  17,  103102  (2005)
【非特許文献１５】J.  Happel  and  H.  Brenner,  Low  Reynolds  Number  Hydrodynamics,  Martinus  Nijhoff,  The  Hague  (1983),  p.  286-340
【非特許文献１６】Huignard,  A.;  Gacoin,  T.;  Boilot,  J.-P.  Chem.  Mat.  2000,  12,  1090
【非特許文献１７】P.  Cousson  C.  Ancey,  Rheophysique  des  pates  et  des  suspensions  [Rheophysics  of  pastes  and  suspensions],  publisher  EDP  Sciences  (1999)
【非特許文献１８】P.  Tabelling,  Introduction  a  la  microfluidique  [Introduction  to  microfluidics],  Editions  Belin  (2003),  p.  178-202
【非特許文献１９】Jin-Woo  Choi,  Kwang  W.  Oh,  Jennifer  H.  Thomas,  William  R.  Heineman,  H.  Brian,  Halsall,  Joseph  H.  Nevin,  Arthur  J.  Helmicki  H.  Thurman  Henderson  and  Chong  H.  Ahn,  An  integrated  microfluidic  biochemical  detection  system  for  protein  analysis  with  magnetic  bead-based  sampling  capabilities,  Lab  Chip,  2002,  2,  27-30
【非特許文献２０】Maria  A.  Schwarz  and  Peter  C.  Hauser,  Recent  developments  in  detection  methods  for  microfabricated  analytical  devices,  Lab  on  a  Chip,  2001,  1,  1-6
【非特許文献２１】Jun  Yang,  Jianlong  Zhao,  Mengsu  Yang,  Optical  and  electrochemical  detection  techniques  for  cell-based  microfluidic  systems,  Anal  Bioanal  Chem  (2006)384:1259-1268
【非特許文献２２】Homola  J.  “Present  and  future  of  surface  plasmon  resonance  biosensors”,  ANALYTICAL  AND  BIOANALYTICAL  CHEMISTRY  377,  528-53  (2003)
【非特許文献２３】Molloy  JE,  Padgett  MJ,  “Lights,  action:  optical  tweezers”,  CONTEMP.  PHYS.  43,  241-258  (2002)
【非特許文献２４】D.  Boyer,  P.  Tamarat,  A.  Maali,  B.  Lounis,  M.  Orrit,  “Photothermal  Imaging  of  Nanometer-Sized  Metal  Particles  Among  Scatterers”,  Science  297,  1160  (2002)
【非特許文献２５】D.  Lasne,  G.A.  Blab,  S.  Berciaud,  M.  Heine,  L.  Groc,  D.  Choquet,  L.  Cognet,  B.  Lounis,  “Single  Nanoparticle  Photothermal  Tracking  (SNaPT)  of  5-nm  Gold  Beads  in  Live  Cells”,  Biophys.  J.  91,  4598-4604  (2006)
【非特許文献２６】Arbouet  A,  Christofilos  D,  Del  Fatti  N,  Valle  F,  Huntzinger  JR,  Arnaud  L,  Billaud  P,  Broyer  M,  “Direct  measurement  of  the  single-metal-cluster  optical  absorption”,  Phys.  Rev.  Lett.  93,  127401  (2004)
【非特許文献２７】Muskens  OL,  Del  Fatti  N,  Vallee  F,  Huntzinger  JR,  Billaud  P,  Broyer  M,  “Single  metal  nanoparticle  absorption  spectroscopy  and  optical  characterization”,  Appl.  Phys.  Lett.  88,  063109  (2006)
【非特許文献２８】De  Brabander,  M.,  R.  Nuydens,  G.  Geuens,  M.  Moeremans,  and  J.  de  Mey,  “The  ue  of  submicroscopic  gold  particles  combined  with  video  contrast  enhancement  as  a  simple  molecular  probe  for  the  living  cell”.  Cell  Motil.  Cytoskeleton.  6:105-113  (1986)
【非特許文献２９】D.  Boyer,  P.  Tamarat,  A.  Maali,  B.  Lounis,  M.  Orrit,  “Photothermal  Imaging  of  Nanometer-Sized  Metal  Particles  Among  Scatterers”,  Science  297,  1160  (2002)
【非特許文献３０】D.  Lasne,  G.A.  Blab,  S.  Berciaud,  M.  Heine,  L.  Groc,  D.  Choquet,  L.  Cognet,  B.  Lounis,  “Single  Nanoparticle  Photothermal  Tracking  (SNaPT)  of  5−nm  Gold  Beads  in  Live  Cells”,  Biophys.  J.  91,  4598−4604  (2006)
【非特許文献３１】Homola  J,  “Present  and  future  of  surface  plasmon  resonance  biosensors”.  Anal  Bioanal  Chem,  vol.  377,  528-539,  2003
【非特許文献３２】M.J.  Saxton,  K.  Jacobson,  “Single-Particle  Tracking:  Applications  to  Membrane  Dynamics”,  Annu.  Rev.  Biophys.  Biomol.  Struct.,  26,  373-99  (1997)
【非特許文献３３】Chen  et  al.  Nano  Letters,  vol.  7,  No.  3,  690-696,  2007
【非特許文献３４】Bek  et  al.,  Nano  Letters,  vol.  8,  No.  2,  485-490,  2008
【非特許文献３５】Aslan  et  al.,  Current  Opinion  in  Chemical  Biology,  9:538-544,  2005
【非特許文献３６】W.R.  Zipfel,  R.M.  Williams,  W.W.  Webb,  Nonlinear  magic:  multiphoton  microscopy  in  the  biosciences,  Nat.  Biotech.  21,  1369  (2003)
【非特許文献３７】A.L.  Stout  and  D.  Axelrod,  Evanescent  field  excitation  of  fluorescence  by  epi-illumination  microscopy,  Appl.  Opt.  28,  5237  (1989)
【非特許文献３８】N.L.  Thompson  and  B.C.  Lagerholm,  Total  internal  reflection  fluorescence:  applications  in  cellular  biophysics,  Curr.  Opin.  Biotech.,  8,  58-64  (1997)
【非特許文献３９】M.K.  Cheezum,  W.F.  Walker,  and  W.H.  Guilford,  Quantitative  Comparison  of  Algorithms  for  Tracking  Single  Fluorescent  Particles,  Biophys.  J.  81  2378-2388  (2001)
【非特許文献４０】R.E.  Thompson,  D.R.  Larson,  and  W.W.  Webb,  Precise  Nanometer  Localization  Analysis  for  Individual  Fluorescent  Probes,  Biophysical  J.  82  2775-2783  (2002)
【非特許文献４１】R.J.  Ober,  S.  Ram,  and  E.S.  Ward,  Localization  Accuracy  in  Single-Molecule  Microscopy  Biophysical  J.  86,  1185-1200  (2004)
【非特許文献４２】Kramers,  H.A.,  “Brownian  motion  in  a  field  of  force  and  the  diffusion  model  of  chemical  reactions”  Physica  (Amsterdam)  7,  284  (1940)
【非特許文献４３】Bell,  G.I.,.  Models  for  the  specific  adhesion  of  cells  to  cells.  Science  200,  618-627  (1978)
【非特許文献４４】Evan  Evans  and  Ken  Ritchie,  Dynamic  Strength  of  Molecular  Adhesion  Bonds,  Biophys.  J.  72  1541-1555  (1997)
【非特許文献４５】D.  Casanova  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  129,  12592  (2007)
【非特許文献４６】Casanova  et  al.,  Appl.  Phys.  Lett.  89,  253103  (2006)
【非特許文献４７】S.  Miyata,  J.  Minami,  E.  Tamai,  O.  Matsushita,  S.  Shimamoto,  A.  Okabe,  J.  Biol.  Chem.  277,  39463  (2002)
【非特許文献４８】C.  Chassin  et  al.,  Am.  J.  Pathol.  Renal  Physiol.  293,  F927  (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って従来技術のこれらの欠点、課題、及び障害を克服する分子間相互作用を解析する装置及び方法が現実に必要とされている。具体的には、より単純で、より実用的で、より安価で、複数の相互作用の一度に調査するのに適していて、分子スケールでの分子間相互作用の解析を十分厳密に行うことのできる装置が必要とされている。
【００１９】
従って特に、1対の分子レベルでの分子間相互作用を解析する装置及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
よって本発明の第1態様は、少なくとも1つの第1分子と少なくとも1つの第2分子との間での相互作用を解析する方法に関する。当該方法は：
−  前記相互作用を可能にする条件下で前記第1分子と前記粒子に結合する前記第2分子とを接触させる手順；
−  前記第2分子に結合する前記粒子へ所定の液体流を与える手順；
−  前記液体流により生じる前記第2分子に結合する前記粒子の運動を観察する手順；
−  前記液体流と前記運動による前記相互作用を解析する手順
を有する。前記粒子は、前記第1分子及び/又は前記第2分子よりも大きな流体力学的抵抗、及び、1よりも大きな質量ペクレ数を有する。
【００２１】
本発明の第2態様は第1分子と少なくとも1つの第2分子との間での相互作用を解析する装置に関する。当該装置は：
−  所定の液体流を与える手段；
−  第1分子及び該第1分子と相互作用しうる第2分子と結合する粒子を受ける支持体；
−  前記粒子の運動を観察する手段
を有する。前記粒子は、前記第1分子及び/又は前記第2分子よりも大きな流体力学的抵抗、及び、1よりも大きな質量ペクレ数を有する。
【００２２】
本明細書において、「分子」とは、「少なくとも1つの分子」つまり1つ以上の分子を意味する。分子が複数の分子であるときには、その複数の分子は同一であっても良いし、又はそれぞれ異なっていても良い。第1分子と第2分子は同一であっても良いし、又はそれぞれ異なっていても良い。これはまた、2種類以上の形態で存在する第1分子−たとえばM1とM1*−又は2種類以上の形態で存在する第2分子−たとえばM2とM2*−をも含んで良い。この厳密な場合では、同一実験の間での、第2分子M2*と対比される1つの第2分子M2に関する1つの第1分子M1の親和性の検出と比較、又は、同一実験の間での、第1分子M1*と対比される1つの第1分子M1関する1つの第2分子M2の親和性の検出と比較が問題となる。
【００２３】
分子は有機分子であっても良いし、又は無機分子であっても良い。分子が有機分子であるとき、その分子は、合成分子であっても良いし、又は生物の分子であっても良い。2種類以上の形態−たとえばMとM*−で存在する場合、分子はたとえば、同一のタンパク質の2種類以上の異なる配列であっても良いし、又は、2種類以上の異なるDNAヘリックスであっても良い。
【００２４】
換言すると、本発明は、任意の種類の分子相互作用の解析に対して有利となるように用いられ得るので、任意の種類の相互作用する分子の解析に対して有利となるように用いられ得る。分子相互作用は、有機/有機、有機/無機、又は無機/無機の分子相互作用であって良い。
【００２５】
本発明では、「分子相互作用」は、共有結合ではない可逆性の結合を意味すると解される。分子相互作用は選択的であっても良いし、又は、非選択的であっても良い。選択的相互作用の場合、分子相互作用はたとえば、抗原−抗体、リガンド−受容体、又は酵素−基板の相互作用であって良い。ただしこれらの限定される訳ではない。非選択的相互作用の場合、分子相互作用は生物分子と表面との相互作用であって良い。
【００２６】
第1分子及び/又は第2分子が有機分子であるとき、その第1分子及び/又は第2分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、脂肪酸、単純若しくは複雑脂質、糖、単糖類、多糖類、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、グリコリポタンパク質、又は他の分子と相互作用する（ことの可能な）他の生物の分子を含む群から選ばれて良い。分子が核酸分子であるとき、その分子はDNA（デボキシ核酸）又はRNA（リボ核酸）であって良い。分子がペプチド又はタンパク質分子であるとき、その分子は、候補となる医薬、細胞膜の分子、毒素、抗体、皮膚の母体成分−たとえばコラーゲン又はフィブロネクチン−又は受容体−具体的には膜受容体−を含む群から選ばれる分子であって良い。分子は、多分子系−たとえばリボゾーム、プロテオゾーム、アポトソーム、セントロソーム、細胞内区画(cell  compartment)−たとえばミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、ファソソーム、ベシクル−、又は、1つの細胞、単細胞有機体−たとえばバクテリア、イースト、菌類、単細胞藻類、原生動物−であっても良い。分子はまた多細胞系−たとえば細胞培養、表皮、細胞分裂、又はバクテリアコロニー−であっても良い。
【００２７】
分子が無機分子であるとき、その分子は、当業者に知られた任意の無機分子、又は、無機表面−たとえばポリマー表面、金属表面、フッ素化表面、又はシリコン表面−であって良い。例として、第1分子は細胞膜受容体で、かつ、第2分子は、前記受容体のリガンド又は前記受容体と結合可能な分子であって良い。
【００２８】
第1分子又は第2分子は有利となるように、300〜300000g/molの範囲の分子量を有して良い。有利となるように第1分子又は第2分子は、100〜4000g/molの範囲の分子量を有して良い。
【００２９】
第1分子は、受容支持体と結合して良いし、又は、その受容支持体の分子であっても良い。受容支持体は、第1分子を受容可能にする任意の表面であって良い。好適には、この表面は、分子の配列を保存しながら、第1分子がその表面に付着することを可能にする。この理由はたとえば、タンパク質が第2分子と相互作用するとき、そのタンパク質と第2分子との相互作用領域にとっては、そのタンパク質が表面に付着することでその第2分子が変性しないことが重要だからである。有利となるように第1分子は、本発明の方法の実施中、所定の液体流によって支持体から脱離しないように、十分強く支持体に結合する。
【００３０】
第1分子の付着は直接的であっても良いし、又は間接的であっても良い。第1分子が表面と直接的に相互作用するとき、その付着は直接的である。その理由は、表面が、事前に官能化されるか、又は、その第1分子の付着を可能にする本質的な化学特性を有しているからである。スペーサアーム又は多分子構造−たとえば細胞壁の断片−が表面に付着しているとき、第1分子の付着は間接的である。
【００３１】
有利となるように、支持体は、第1分子が上に結合する1つ以上の結合領域を有して良い。支持体が1つの結合領域を有するとき、1種類以上の第1分子が、その領域に結合して良い。支持体が複数の結合領域を有するとき、各領域は1種類以上の第1分子を有して良い。有利となるように第1分子は一の領域と他の領域とで異なって良い。複数の結合領域は、表面上の制御された位置に様々な分子を堆積することを可能にするマイクロディスペンサ（スポッタとも呼ばれる）を用いて生成されて良い（非特許文献11を参照のこと）。
【００３２】
有利となるように、支持体は、たとえば様々な種類の粒子、並びに/又は、様々な種類の第1分子、並びに/又は、様々な種類の第2分子、並びに/又は、様々な種類の互いにわずかに異なる第1分子及び/若しくは互いにわずかに異なる第2分子によって、同時又は順次に解析を行う複数の方法を実行することを可能にする。
【００３３】
支持体は、DNAチップ又はタンパク質チップにおいて用いられる種類の支持体であって良い。しかしこれらに限定されるわけではない。上記の支持体はたとえば、Affmetrixによって販売される支持体であって良い。
【００３４】
これらの特性を得ることを可能にする当業者に知られた任意の材料が用いられて良い。そのような材料とはたとえば、ガラス、シリコン、プラスチック−たとえばポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、又はポリメタクリラート−であって良いが、これらに限定される訳ではない。支持体は、当業者に知られた任意の方法に従って製造されて良い。支持体はたとえば、VWRによって販売されているガラス支持体であって良い。
【００３５】
支持体は透明な表面であって良いし、又は不透明な表面であっても良い。
【００３６】
本発明では、「粒子」は、有機又は無機の対象物を構成する原子の集まりを意味すると解される。粒子は、第2分子へ力を印加することを可能にする。有利となるように粒子は、観察すなわち視覚化されうる。それにより、第2分子の位置又は運動を同時に観察すなわち視覚化することが可能となる。
【００３７】
本発明では、「流体力学的抵抗」とは、所定の液体流が流れることによって生じるすべての応力から生じる粒子への力を意味すると解される。粒子の寸法は、その粒子が、第1分子及び/又は第2分子よりも大きな流体力学的抵抗を有するようなものである。有利となるように粒子の流体力学的抵抗によって、制御された液体流によって、その粒子の運動及び第2分子の運動が引き起こされうる。
【００３８】
本発明では、「質量ペクレ数」は、質量の固有拡散時間と前記質量の対流時間との比を意味すると解される。これはvL/Dに等しい。ここで、vは流れの固有速度で、Lは粒子の固有サイズで、Dは粒子の拡散係数である。粒子のペクレ数は1よりもはるかに大きい。ペクレ数はたとえば1〜10000であって良い。これらの固有質量ペクレ数は、その粒子が、所定の流れによる同調化の効果と比較して無視できるブラウン運動に起因する運動に対して十分なサイズを有することを示唆している。
【００３９】
粒子はマイクロ粒子であって良い。つまり粒子は、ミクロンサイズの寸法を少なくとも1つ有して良い。たとえばマイクロ粒子は、1〜100μm、10〜80μm、20〜70μm、又は30〜50μmのサイズを有する。
【００４０】
有利となるように粒子はナノ粒子であって良い。つまり粒子は、ナノメートルサイズの寸法を少なくとも1つ有して良い。たとえばナノ粒子は、1〜500nm、1〜200nm、1〜100nm、10〜80nm、20〜70nm、又は30〜50nmのサイズを有する。
【００４１】
粒子は当業者に知られた任意の粒子であって良い。そのような粒子とはたとえば、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、又は、金属粒子−たとえば金、銀、銅−及び磁性材料から作られる粒子であって良いが、これらに限定される訳ではない。
【００４２】
粒子はまた、天然若しくは合成の生物のナノ粒子又はマイクロ粒子であって良い。そのような粒子とはたとえば、金属、半導体、金属酸化物、ポリマー、又はナノ球であって良いが、これらに限定される訳ではない。
【００４３】
ナノ粒子を利用する人たちの間では、細胞膜分子に付着した粒子を取り囲む水性培地は、その粒子の運動に影響を及ぼさないことが一般的に認められている。制御された流体の運動が存在しない状態では、ナノ粒子の運動は、周囲の流体によっては制御されず、その粒子が付着する対象物の挙動によって制御されることが示されてきた。この理由は、膜分子（膜脂質又は膜タンパク質）のサイズと比較してナノ粒子のサイズは大きいとはいえ、膜の粘性が水の粘性よりもはるかに大きいので、全体の運動は、膜分子の運動によって決定されるからである。
【００４４】
しかも、ナノ粒子に加わる流体力学的な力を予測することは容易ではない。また、速度が壁でゼロとなり、かつ、ナノ粒子と付着したその系は、他すべての流れのスケールでは概して非常に小さいと仮定した、ポアズイユの法則とストークスの定理に基づく大きさの桁の簡単な計算によると、力は、第1分子と第2分子との間での相互作用又は第1分子の挙動に重大な影響を及ぼすには小さ過ぎることを示している。これらの事実が示唆することとは対照的に、たとえば流れの中のナノ粒子によって、細胞膜内部で膜分子を運動させるのに十分大きな力を加えることは可能である。特にチャネルの表面近傍では、ストークスの定理はもはや有効ではなく、加えられる流体力学的な力は、ストークスの定理によって予測されるものよりもはるかに大きくなる（非特許文献12〜15を参照のこと）。
【００４５】
粒子の次元のうちの少なくとも1つのサイズは、第2分子のサイズよりも大きくて良い。粒子は、第2分子のサイズの5〜100倍−たとえば10〜20倍−の次元を少なくとも1つ有して良い。
【００４６】
粒子は、所定の液体流によって同調されるのに適した形状を有して良い。粒子は実質的に球形状−たとえば実質的に円形又は楕円形−を有して良い。粒子はこの場合ビーズであって良い。あるいはその代わりに粒子は、非球体−たとえば卵形、円筒形、又は円盤形状−であっても良い。
【００４７】
粒子はたとえば、半導体量子ドットについてはInvitrogenから市販されている適切な分子であって良く、又は、金のナノ粒子についてはBritish  Biocell  Internationalから市販されている適切な分子であって良い。あるいは粒子は、当業者に知られた手段−たとえば希土類がドープされたナノ粒子については非特許文献16に記載された方法−に従って作製されても良い。
【００４８】
好適には粒子と第2分子との結合は、所定の液体流によって破壊されない程度に十分安定である。粒子と第2分子は、当業者に知られた任意の手段によって結合されて良い。当業者に知られた任意の手段とはたとえば、弱い化学結合−たとえば静電力、ファンデルワールス力−、水素結合、疎水結合−、強い化学結合−たとえばイオン結合、共有結合、金属結合−、又は、結合剤−たとえば一方で粒子の表面に存在する官能基（たとえばアミン官能又はカルボキシル酸官能）へ付着し、他方で第2分子（たとえばアミン官能又はスルフヒドリル官能）へ付着することを可能にする2つの官能を備える結合剤−であって良い。そのような結合剤は、たとえばPierceから市販されている。粒子の第2分子はまた、たとえば強い親和性有する生物学的相互作用−たとえばビオチン−ストレプトアビジン相互作用（又はリガンド−受容体相互作用若しくは抗体−抗原相互作用）及び多段結合−つまり最初にストレプトアビジン（又はビオチン）を粒子と結合させ、ビオチン（又はストレプトアビジン）を第2分子と結合させ、続いて2つの結合物同士を相互作用させる−を用いることによって結合されても良い。
【００４９】
第1分子と第2分子は、本発明の解析装置内で接触した状態にされて良い。本発明の装置はこの点について、第1分子と第2分子とを接触した状態にする手段を有して良い。前記手段は、第1分子と第2分子とを接触した状態にするのに適した構造を備えるチャネルであって良い。チャネルの構造はたとえば、直線、T字、若しくはY字、又は、独立に反応物を追加することを可能にするより複雑な構造であっても良い。構造は、導入される反応物の数又は導入される各異なる第1分子及び/若しくは第2分子の数に依存して、当業者によってすぐに決定されうる。
【００５０】
有利となるように、当該装置は、第1分子、粒子と結合する第2分子、及び所定の液体流を導入できるように、少なくとも1つの流入部を有して良い。当該装置はまた、該装置へ注入される各異なる多数の第1分子及び/若しくは第2分子が必要とする数の流入口、又は、同時若しくは順次実行される多数解析が必要とする数の流入口を有して良い。たとえば装置は2つの流入口を有しても良い。前記2つの流入口の一は第2分子と結合する粒子を注入するためで、前記2つの流入口の他は液体流を与えるためである。2つの別個の流入口が存在することで、第2分子と結合する粒子を含まない流れを得ることが可能となる。よって2つの別個の流入口が存在することで、1つの流入口を備える装置と比較して、信号/バックグラウンド雑音の比を増大させることが可能となる。
【００５１】
有利となるように装置はまた流出口をも有して良い。流出口は容器と接続されて良い。容器は、装置へ気泡を導入する危険性なく流れの方向を修正することを可能にする。容器は、流れの方向を変化させる手順を含む実施例においてしか有利となるように必要とされない。
【００５２】
チャネルの寸法は、第1分子、第2分子、及び/又は粒子の性質並びにサイズに従って選ばれて良い。たとえばチャネルは高さを有して良い。高さとは、第1分子の受容支持体とチャネルの上壁との間の距離である。この距離は、第1分子の相互作用と第2分子の相互作用を研究することが可能な程度に十分大きい。従って高さは、第1分子及び/又は第2分子の寸法に依存しうる。たとえば第1分子が細胞であるとき、チャネルの高さが不十分であることで、その細胞は閉じこめられ、その細胞の生理学的特性に望ましくない影響が生じる恐れがある。チャネルの高さは、使用される流れを制御する手段の機能として、粒子のレベルでの所望の流体速度範囲で制限される。具体的にはチャネルの高さが高いほど、速度は低下する。例としてチャネルは20〜70μm−たとえば30μm、40μm、50μm、又は60μm−の高さを有して良い。たとえば第1分子が細胞である場合、チャネルの高さは約50μmであって良い。チャネルの幅は、所望量の第1分子の観察を可能にするのに十分大きくなければならない。有利となるように高さ/幅の比は、層流に相当する所定の液体流の生成を化膿にする程度に十分小さくなければならない。比はたとえば1/00〜1/2であって良い。チャネルは100μm〜2mm−たとえば約500μm−の幅を有して良い。チャネルは、所定の液体流が流入口及び/又は流出口へ向かうときに中断しないように十分長くなければならない。有利となるようにその長さは、チャネルの十分長い領域全体にわたってそのチャネルの壁に対して平行な流体力学的な流れのラインのプロファイルを供するのに十分なものでなければならない。チャネルは1mm〜10cm−たとえば約1.5cm−の長さを有して良い。長さは、相互作用の解析を可能にするように十分多数の第1分子を結合することを可能にする。チャネルの長さは、そのチャネルが光学デバイス−たとえば光学板−上に存在する場合に限定されても良い。
【００５３】
第1分子と第2分子とを接触した状態にする条件は、その第1分子と第2分子に従って当業者によって容易に決定することができる。
【００５４】
本発明では、「液体流」は、任意の液体の流れを意味すると解される。有利となるように流れによって、粒子に力を及ぼすことが可能となる。流れはまた粒子を同調化させることをも可能にする。流れは、一方向であっても良いし、又は、複数の方向−たとえば互い違いの方向−を有しても良い。有利となるように流れは層流であって良い。流れは、溶液−たとえば水溶液、リン酸緩衝液(PBS)若しくはHEPES緩衝液によりpHが一定に保たれた食塩水溶液、細胞培養培地、又は、良好な条件下で第1分子及び/若しくは第2分子を研究するのに必要な任意の他の溶液−又は分散物の液体流であって良い。有利となるように所定の液体流は、流れの中で浮いていて、その流れによって移動する対象物を含んで良い。有利となるように、これらの対象物の速度を測定することで、粒子の周囲での流体の速度を測定することが可能となる。この測定は、第1分子と第2分子との間での相互作用の解析手順とは別個の手順において実行されて良い。
【００５５】
本発明では、「所定の流れ」とは、粒子に加わる力を制御することが可能となるような特性を有する任意の流れを意味すると解される。換言すると、所定の流れは、粒子に加わる力の大きさと方向を選ぶことを可能にするような特性を有する流れであって良い。有利となるように所定の流れは、粒子の運動を引き起こす前記粒子へ力を加えることを可能にする。力は、支持体からの第1分離の脱離もその支持体への損傷も引き起こさない。流れの特性は、液体の流速、液体の粘性、及び液体に加えられる圧力を含む群から選ばれる少なくとも1つのパラメータを制御することによって決定されて良い。
【００５６】
液体の粘性は、当業者に既知の任意の方法によって決定されて良い。既知の方法とはたとえば、毛細管の2つの端部での圧力差によって発生する流速を測定する毛管粘度計の利用（ポアズイユの法則）又はクエット板（Couette-Plate）粘度計の利用（非特許文献17を参照のこと）である。
【００５７】
所定の液体流の速度は連続的であって良い。つまり所定の液体流の速度は一定値を有して良い。あるいはその代わりに所定の液体流の速度は不連続であって良い。つまり所定の液体流の速度は複数の値を有して良い。この場合、速度は線形的に増大又は減少して良い。あるいはその代わりに速度はステップ状に増大又は減少しても良い。このステップ間の周期は、当業者が収集したい情報に依存して、その当業者によって容易に決定されうる。
【００５８】
所定の液体流の速度は、当業者に既知の任意の方法によって測定されて良い。所定の液体流の速度は、当業者に既知の任意の方法−たとえばポアズイユの法則に従った壁からの距離の関数としての速度の計算−によって各場面で容易に決定されうる。液体流が電気浸透流である場合、速度は、チャネル内で一定であり、かつ、印加された電場とそのチャネルの構造に依存する（非特許文献18を参照のこと）。粒子の位置での所定の液体流の速度は、粒子の上流及び/又は下流の速度から計算されうる。この場合では、粒子は、流れをわずかに変化させるだけで、他の特性や流速の測定には影響を及ぼさない。この計算法はまた、複数の実験同士の定量的な比較をも可能にする。あるいはその代わりに速度は、第1分子とも第2分子とも相互作用せず、流れによって輸送される未結合の浮遊マーカーを視覚化することによって測定されうる。様々な−たとえば様々なサイズの−浮遊マーカーが流れに注入されて良い。たとえばこの目的のために蛍光ビーズが用いられて良い。
【００５９】
所定の液体流は、6πμRvに等しい力Fを粒子に加えることを可能にする。ここで、μは流体の粘度を表し、Rは粒子の流体力学的半径を表し、vは粒子の位置での流体の速度を表し、力Fは6πμRvに等しく、かつ、壁近傍の効果が補正されても良い。流体の速度は、粒子の上流又は下流の、粒子に対して大きいが他の流れの変化に対しては小さい距離で測定されて良い。数10nmの球状の粒子の場合では、その半径は流体力学的半径と非常に近くなる。非常に小さなサイズの粒子又は非球状粒子の場合では、その流体力学的半径は、たとえば動的光散乱によって決定されうる。動的光散乱による粒子又は分子の流体力学的半径の測定装置はとりわけ、Malvern社から市販されている。粒子が流体力学的半径に匹敵するチャネル壁からの距離に位置するとき、具体的にはその粒子から壁までの距離、その粒子の幾何学形状、及び流れの特性（粘度と速度）に関連付けられる補正因子が、たとえば非特許文献12乃至15に記載された手法に従って、上の式に適用されて良い。
【００６０】
所定の液体流が与えられて良い。その所定の液体流のパラメータは、当業者に知られた手段−たとえば流れを制御するマイクロ流体において用いられる任意の装置−によって制御されて良い。流れはたとえば、シリンジドライバ上に設けられたシリンジ、又は、ペリスタルティックポンプを介して与えられても良い。
【００６１】
本発明では、「運動」とは、第1分子と第2分子とが相互作用する瞬間に関する粒子の空間的位置の変化を意味すると解される。有利となるように、粒子の位置は、第1分子と第2分子とが相互作用する瞬間、及び、任意で所定の液体流が与えられ始める瞬間に測定される。有利となるように、粒子の位置は、所定の液体流が与えられる前後に規則的な間隔で測定されて良い。有利となるように、粒子の運動は、第2分子の運動に伴って引き起こされうる。有利となるように、粒子の運動は、第1分子と第2分子との間での相互作用を破りうる。
【００６２】
粒子の運動又は位置は、その粒子の物理的特性及び/又は化学的特性を利用して観察されうる。粒子の観察可能な物理的特性は、光の吸収、反射、若しくは散乱、蛍光、又は、磁気若しくは電気特性であって良い。粒子の化学的特性はたとえば、基板との反応を引き起こして良い。その結果、蛍光又は吸収生成物が生成される。これは、化学発光又は生物発光を含んで良い。
【００６３】
与えられた流れによって引き越される第2分子に結合する第1分子の運動は、当業者に知られた任意の手段によって観察されて良い。そのような当業者に知られた任意の手段とはたとえば、光学的方法、化学的方法、電気化学的方法、及び磁気的方法からなる群から得られ張る手法であって良い（非特許文献19乃至21を参照のこと）。
【００６４】
光学的方法はたとえば、蛍光信号を測定する方法、表面プラズモン共鳴による解析方法（非特許文献22を参照のこと）、光ピンセットの利用を含む方法（非特許文献23を参照のこと）、レーザーの利用を含む方法からなる群から選ばれた方法であって良い。ただしこれらに限定される訳ではない。光学的方法が表面プラズモン共鳴による解析方法であるとき、支持体は透明であって良い。
【００６５】
有利となるように、光学的方法は、吸収の検出（非特許文献24乃至27を参照のこと）、反射、散乱（非特許文献28を参照のこと）、回折、屈折率変化（非特許文献29乃至31を参照のこと）、蛍光放出体の利用、励起手段の利用、及び、蛍光検出手段の利用（非特許文献32を参照のこと）からなる群から選ばれた方法であって良い。
【００６６】
換言すると、観察は、蛍光放出体の利用、蛍光検出手段の利用、吸収検出手段の利用、反射検出手段の利用、散乱検出手段の利用、及び、回折検出手段の利用からなる群から選ばれる方法であって良い。
【００６７】
粒子の運動が蛍光方法によって検出される場合、蛍光放出体は、粒子自体であって良いし、又は、その粒子及び/若しくは第1分子と第2分子からなる群から選ばれる少なくとも1つの分子に係るラベルであっても良い。好適には蛍光放出体は、粒子自体であって良いし、又は、その粒子及び/若しくは第2分子に係るラベルであっても良い。蛍光は1つ以上の蛍光波長によって表されて良い。有利となるように蛍光放出体は、光エネルギーを吸収し、かつ、そのエネルギーをすぐに解放する特性を有する当業者に知られた任意の種類の分子であって良い。この放出体は有機の蛍光体であって良いし、又は、無機粒子であっても良い。そのような放出体はたとえば、量子ドット、ランタン系イオンがドープされたナノ粒子、ナノダイヤモンド、有機蛍光体−たとえばローダミン、FITC（フルオレセイン）、シアニン、Alexa（登録商標）、ドーパミン、又はクロモマイシンA−、蛍光タンパク質（たとえばGFP、YGF、DsRed）、及び、有機蛍光体を含む無機粒子から選ばれる放出体であって良い。
【００６８】
蛍光放出体が粒子それ自体ではないとき、その粒子のラベル付け又は蛍光放出体を備える第2分子のラベル付けは、当業者に知られた任意の手段によって実行されて良い。これはたとえば、非特許文献33、非特許文献34、特許文献3、及び非特許文献35に記載されたラベル付け方法であって良い。
【００６９】
有利となるように蛍光は、高い信号対雑音比を得ることを可能にする。
【００７０】
粒子の位置はたとえば、Zeiss、オリンパス、又はニコンから市販されている広視野顕微鏡による可視化によって視覚化されて良い。前記手段には、たとえばPrinceton  Instruments、Andor、又は浜松フォトニクスから市販されているCCDカメラ、EM-CCDカメラ、又はCMOSカメラが備えられて良い。位置は、軸解像度を有する方法−たとえば2光子励起若しくは非線形励起（非特許文献36を参照のこと）又は内部全反射（非特許文献37,38を参照のこと）−によって視覚化されて良い。
【００７１】
観察される運動及び加えられる流れに従った相互作用の解析は、当業者に知られた任意の手段によって実行されて良い。
【００７２】
相互作用の解析は定量的であっても良いし又は定性的であっても良い。その解析はたとえば、第1分子と第2分子との間での親和性を測定することを可能にする。その解析はたとえば、第1分子及び第2分子の会合定数並びに/又は解離定数の測定を可能にする。
【００７３】
たとえば力Fが加えられた状態で第1分子と第2分子との間での解離定数koff(F)の測定は、多くの分子の組−たとえば30−で脱離時間を測定することによって定量的に測定されうる。有利となるようにこの測定は、脱離粒子の割合を時間の関数として与える。これは、固有の指数時間の法則（characteristic  exponential  time  law）1/koff(F)に従う。よってkoff(F)は2つ（以上の）力Fの値について測定されて良い。
【００７４】
外力の存在しない状態での解離定数koff(0)は、クラマースモデルを用いることによって、koff(0)=w*exp(-ΔE/kBT)と決定することができる（非特許文献42を参照のこと）。ここでwは係数で、ΔEは解離するために超えなければならないエネルギーバリアで、kBはボルツマン定数で、Tは実験の温度である。力Fが加えられるとき、エネルギーバリアは、エネルギーFaだけ減少する。ここでaはエネルギーの壁の固有距離である（この値を知る必要はない）。よって新たな解離定数は、koff(F)=w*exp(-ΔE/kBT)exp(Fa/kBT)=koff(0)exp(Fa/kBT)となる（非特許文献43を参照のこと）。
【００７５】
よって少なくとも2つの力F1とF2について実験で得られた解離定数に基づいて、距離aを知ることなく、力が存在しない状態での解離定数koff(0)を決定することが可能である。この方法の変化型が提案され、かつ利用可能である（非特許文献44を参照のこと）。
【００７６】
たとえば第1分子と第2分子との間での平衡定数の測定は、付着時間と脱離時間の両方に対して長い時間待ちながら、粒子に付着する既知量の第2分子を注入することによって実行されて良い。第2分子と粒子が存在しない溶液によって低速で洗浄し、かつ、付着したままの粒子の割合を決定することによって、平衡状態で付着した濃度ひいては脱離した濃度が得られる。脱離濃度に対する付着濃度の比によって、反応の平衡定数が与えられる。待ち時間が脱離時間に対して短い場合、当該方法は、付着定数の測定を可能にする。付着粒子の量は時間に対して指数関数的に増大する。
【００７７】
本発明の解析方法は、第1分子と相互作用しなかった第2分子と結合する粒子を検出する手順を有して良い。当該装置はこの場合、チャネルの流出口−つまり流れが到着する端部−で第1分子又は第2分子を検出する手段を有して良い。この検出は、粒子若しくは第2分子の物理的特性（光の吸収、反射、若しくは散乱、蛍光、又は磁気若しくは電気特性）及び/又は化学的特性（たとえばアッセイ用の他の反応物との相互作用）に基づいて良い。この検出は、ある第2分子が第1分子と結合する一方で他の第2分子は結合しない間に分子をスクリーニングする方法において有利である。
【００７８】
本発明の第3態様は、医薬開発の候補となる分子のスクリーニングにおいて当該方法又は装置を使用することである。
【００７９】
本発明の方法又は装置は、分子同士での親和性の並列かつ高スループット測定にも用いられて良い。
【００８０】
本発明の方法又は装置は、細胞間での相互作用又は細胞と分子との間での相互作用を探索するのにも用いられて良い。
【００８１】
本発明の方法又は装置は、互いに結合し、又は支持体と結合する粒子の移動度を評価するのにも用いられて良い。
【００８２】
本発明の方法又は装置は、結合した粒子の運動を評価するのに用いられて良い。
【００８３】
本発明の方法又は装置は、ポリマー、核酸、又はタンパク質の伸縮、弾性、及び曲げを評価するのに用いられて良い。
【００８４】
本発明の方法又は装置は、細胞膜の特性を評価するのにも用いられて良い。この場合、第1分子は細胞又は細胞膜であって良く、かつ、第2分子は細胞の膜分子又は膜タンパク質であって良い。
【００８５】
他の利点は、添付図面によって示される以降の例によって当業者には十分理解されうる。
【発明の効果】
【００８６】
本発明は実際、従来技術の課題を克服して上記の必要性を満たすことを可能にする。
【００８７】
これまでの重要な研究に続いて、本願出願人は、分子間相互作用を解析する方法を開発した。当該方法の実施は、単純で、安価で、実用的で、かつ、分子間相互作用の分子スケールでの十分厳密な解析を可能にする。特に当該方法では、力を発生させるのにレーザーも磁石もAFMチップの使用する必要がなく、その結果を読み取るのに複雑な装置も必要としない。当該方法では、分子への損傷や変性を及ぼすことなくその分子間相互作用を解析することも可能となる。本発明は、非常に小さな分子とリガンドとの相互作用、又は、非常に小さな分子同士での相互作用の解析をも可能にする。さらに本発明は、少数（さらには1つ）の第1分子と第2分子との間での相互作用を研究することをも可能にする。本発明はまた、多重化を実現する能力を有し、かつ、第1分子と第2分子からなる対同士の多数の相互作用を同時かつ一度に研究することをも可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】マイクロ流体チャネルの構造を表している。
【図１Ｂ】顕微鏡による測定方法を表している。
【図２Ａ】時間t=95〜128sの間に流速7.5μl/minの流れ(f)を与えた後、細胞膜表面での毒素タンパク質の受容体の運動(Dp)（単位μm）をtの関数として表している。
【図２Ｂ】一連の各異なる流速の流れをtの関数として表している。
【図３】一連の各異なる流速(De)（μl/minで表される）の関数として、図2Bの実験と同一条件下で行われた実験から得られた、流れ(f)によって加えられた力が生じさせた平均の運動（単位μm）を表している。
【図４】一連の異なる流速（破線で示されている）の流れ（f）（単位μl/min）が与えられた後、初期位置に対する受容体の運動（単位μm）を時間tの関数として表している。
【図５】白色光の透過によって得られた混合MDSK（イヌ腎臓由来）細胞の像を表している。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
図1Aはマイクロ流体チャネルの構造を表している。図示されたマイクロ流体チャネルは、培養培地(EM)用の流入口、ナノ粒子溶液(ENP)用の流入口、流出口、及び、それらの間に存在する測定領域を有する。図1Bは、顕微鏡による測定方法を表している。当該方法では、流れ(f)がナノ粒子(NP)及び第1分子(M1)と結合する第2分子(M2)に与えられる。第2分子(M2)はその受容体と結合するペプチド毒素で構成される。第1分子(M1)は、細胞膜及び毒素受容体が相互作用する細胞（細胞骨格を含む）のすべての要素で構成される。粒子(NP)に所定の流れを与えることで、その粒子(NP)に流体力学的な力が生じる。この力は第2分子に伝えられ、第1分子(M1)と第2分子(M2)との間での相互作用にこの力が及ぼす影響が観察されうる。
【００９０】
図2Aは、時間t=95〜128sの間に流速7.5μl/minの流れ(f)を与えた後、細胞膜表面での毒素タンパク質の受容体の運動(Dp)（単位μm）をtの関数として表している。受容体の位置はナノ粒子の蛍光によって視覚化される。受容体は、流れ(f)の方向に移動し、その後その流れ(f)が与えられる前の初期位置に対して約2μmだけ移動した新たな位置で安定する。流れ(f)の方向に対して垂直な方向での移動は、その流れ(f)の方向での移動に比べて無視できる。流れ(f)が止まった後、受容体は初期位置の近くの位置に戻る。このように初期位置の近くの位置に戻るということは、粒子への流体力学的な力を介して受容体に加えられる力が、細胞の復元力と等しいことを示唆している。流れ(f)が止まるとき、細胞の復元力しか受容体に作用しない。このため受容体は、ストークスの定理F=γvによって決定される速度vで初期位置に戻る。ここで、γは膜と細胞骨格からなる系内の受容体の抗力係数で、Fは流れ(f)に起因する力である。よってvとFが分かることで、摩擦係数の決定が可能となる。図2B（上図）は、tの関数として表される一連の各異なる流速の流れ（下図）が与えられた後、初期位置に対する受容体の運動（単位μm）をtの関数として表している。流れのある状態と流れのない状態の平衡位置が示されている。破線の長方形は、図2Aで示された実験の部分を示している。
【００９１】
図3は、一連の各異なる流速(De)（μl/minで表される）の関数として、図2Bの実験と同一条件下で行われた実験から得られた、流れ(f)によって加えられた力が生じさせた平均の運動（単位μm）を表している。毒素受容体の運動は印加された力に対して線形依存する。示されているように、流れのある状態での平衡位置は、粒子への流体力学的な力を介して受容体に加えられる力が細胞による復元力と等しくなる位置に対応する。細胞の復元力は、フックの法則F=kxによってモデル化することができる。ここでkはスティフネス係数で、xは平衡位置に対する変位である。フックの法則によるモデル化によって、細胞の変位が弾性的であり、かつ、受容体の運動が可逆的であるという仮説が成立する。実際毒素受容体は初期位置に近い位置へ戻る。図3の実験データを線形にフィッティングさせると、スティフネス係数kを求めることができる。
【００９２】
図4は、一連の異なる流速（破線で示されている）の流れ（f）（単位μl/min）が与えられた後、初期位置に対する受容体の運動（単位μm）を時間tの関数として表している。流れのある状態とない状態の平衡位置のみが示されている。複数の生体力学的効果がこの実験中に特定されうる。弾性変形状態が観測される。ここでは、流れ(f)が止まった後に、受容体が初期位置に戻る。流速30μl/minの流れ(f)が加えられた後、その流れ(f)が止まった後でも受容体は初期位置に戻らない。これは塑性変形状態である。最終的に、流速50μl/minの流れ(f)が加えられることで、毒素は受容体から脱離する。ある数の脱離事象を観察することは、本明細書で説明しているように、毒素と受容体との間での解離定数koffを決定するのに用いられて良い。
【００９３】
図5は、白色光の透過によって得られた混合MDSK（イヌ腎臓由来）細胞の像を表している。図2Bのような一連の異なる流速の流れを加えた後に得られた4つの受容体の運動経路が、位置X（PX単位μm）と位置Y（PY単位μm）で表され、図中の黒い線で示されている。この図はこの手法が多重化を行うことが可能であることを示している。
【００９４】
1)  粒子の特性及びペプチド毒素への結合
粒径が20〜80nmのユーロピウムイオンがドープされたバナジン酸イットリウムのナノ粒子(NPs)が、Y(NO3)3、Eu(NO3)3、及びNa3VO4を共沈されることによって得られる（非特許文献16を参照のこと）。これらのナノ粒子は蛍光である。これらのナノ粒子内部のユーロピウムイオンは、466nmで励起され、かつ、617nmを中心とした蛍光を放出しうる。
【００９５】
粒子は、ホモ二官能性架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)−スベリン酸(BS3)を介してペプチド毒素と結合する。結合方法は、非特許文献45,46でより詳細に記載されているが、その手順は以下の通りである。
i)  遠心分離によってナノ粒子をサイズで選択する
ii)  NPsを水溶液からジメチルスルホキシド(DMSO)溶媒へ移す
iii)  ナノ粒子とBS3架橋剤との間での第1アシル化反応を起こす
iv)  NPsをDMSOから水溶液に移し、ナノ粒子−BS3とタンパク質との間での第2反応を起こす
v)  自由タンパク質とタンパク質が結合したナノ粒子とを遠心分離により分離する
選ばれたタンパク質は、嫌気性バクテリアであるB型及びD型ボツリヌス菌により生成されるイプシロン毒素である。毒素は、MDCK細胞の膜内の洗浄耐性を有する領域内に存在する固有の受容体と結合する（非特許文献47,48を参照のこと）。
【００９６】
単一分子をナノ粒子に付着されることが望ましく、かつ、手順iv)の反応が100%近い効率を有するとき、手順iv)を実行するのにナノ粒子の濃度と関心分子の濃度との比を1:1付近に選択することが必要である。反応前のBS3が結合したナノ粒子の濃度と生物分子の濃度は、これらの吸収によって決定されて良い。反応後では生物分子の吸収とナノ粒子の吸収が重なるため、タンパク質の濃度は、標準的な試験−たとえばブラッドフォード法−によって決定されて良い。
【００９７】
手順iv)の反応効率が100%未満であることが分かっている場合、ナノ粒子の濃度と関心分子の濃度との比もそれに従って修正されて良い。ナノ粒子に結合する分子の数はポアソン分布に従う。よって分子が結合していないナノ粒子と、1つ以上の分子と結合するナノ粒子と、3分子以上と結合する小数のナノ粒子が存在する。
【００９８】
分子が結合していないナノ粒子は、膜受容体と相互作用せず、測定を妨害しない。2又は3つの分子と結合する、所与のサイズ(20〜80nm)のナノ粒子の場合、分子が2つ以上の受容体と相互作用することが可能なように配置される確率は無視できる。
【００９９】
2)  マイクロチャネルの特性
ポリジメチルシロキサン(PDMS)で構成されるマイクロチャネルがソフトリソグラフィによって準備される（非特許文献18を参照のこと）。
【０１００】
マイクロチャネルの寸法は、高さが50μm、幅が500μm、長さが1.5cmである。マイクロチャネルはY字形状の構造を有し、かつ、2つの流入口を有する。前記2つの流入口のうちの一は、ペプチド毒素と結合するナノ粒子を注入するためで、前記2つの流入口のうちの他は、所定の液体流を発生させるためである。
【０１０１】
マイクロチャネルはまた、容器と接続する流出口をも有する。容器は、そのマイクロチャネルに気泡を導入する危険性を生じさせること縛、流れの方向を調節することを可能にする。
【０１０２】
3)マイクロチャネルへの細胞の注入
培養培地（DMEM＋10%のウシ胎児血清(FCS)＋1%のペニシリン−ストレプトマイシン）中のMDCK細胞の濃縮溶液（〜6×106個/ml）が、マイクロチャネルに注入される。続いて細胞は37℃かつ5%CO2で1日間培養される。そのように培養されることで、細胞は、マイクロチャネルの表面に付着して、その内部で分化する。
【０１０３】
気泡の生成は避けなければならない。なぜならマイクロチャネルを通過する気泡は細胞を脱離させるか、又は、表面を劣化させる恐れがあるからである。このため、マイクロチャネルは完全に培養培地で満たされる。細胞の注入前に1日間培養培地でマイクロチャネルを満たすことで、そのマイクロチャネル内に存在する空気をも追い出すことが可能となる。
【０１０４】
4)マイクロチャネルへのナノ粒子が結合したペプチドの注入
ペプチド毒素が結合したナノ粒子が、バナジン酸イオンの濃度が.05mMの最小培地からなる溶液（HBSS＋10mMのHEPES＋1%のFCS）中で懸濁される。ナノ粒子は、シリンジドライバを用いることによって顕微鏡に注入される。粒子が結合した毒素が細胞と結合することを可能にするため、培養が5〜30分間行われる。その間流れは与えられない。
【０１０５】
この段階では、これらの操作が細胞を劣化させないこと、及び、その細胞は依然としてマイクロチャネルの表面に付着していることを、白色光透過及び細胞の蛍光信号の観察によって確認することが必要である。粒子が、細胞の付着するマイクロチャネルの領域に確実に到達したことを蛍光顕微鏡によって確認することも有用である。
【０１０６】
5)マイクロチャネル内での流れの付与、及び、加えられた力の決定
流れによる試料の操作が顕微鏡内で実行される。所定の流れがマイクロチャネル内で与えられる。所定の流れは、シリンジドライバを用いて単位時間あたりに流体の選ばれた体積を注入することによって生成される。使用される流体は最小培地（HBSS＋10mMのHEPES＋1%のFCS）である。この流体注入方法は、マイクロチャネル内でのポアズイユ型の流れを生成する。流体の流れはどこであっても壁に対して平行で、流体の速度は壁ではゼロで、かつ、圧力は流れの幅の範囲内では変化しない。
【０１０７】
実験中、流れは0〜200μl/minで変化する。粒子に作用する抗力は、F=6πμRvで表されるストークスの関係式によって決定される。ここで、μは流体の粘度を表し、Rは粒子の流体力学的半径を表し、vは粒子の周辺での流体の速度を表す。この関係式は無限長のチャネルの近似である。粒子は、その流体力学的半径に匹敵する細胞からの距離に位置するので、上式には補正因子が適用されなければならない（非特許文献12乃至15を参照のこと）。
【０１０８】
流体の粘度は、圧力差が加わる端部で毛細管を貫流するのに必要な時間を測定することによって決定される（非特許文献17を参照のこと）。20℃で10-3Ns/m2の粘度が測定された。各粒子の半径は、非特許文献46に記載された方法を用いて単位時間あたりに放出される光子数によって決定される。球形粒子については、流体力学的半径はそのようにして決定された値に非常に近い。
【０１０９】
10μl/minの流速については、流体の平均速度は7mm/sである。ポアズイユの法則に従うと、流体の速度は、チャネル中心で最大となる放物状のプロファイルを有する。10μl/minの流速については、チャネル中心での最大速度は10mm/sである。これらの速度は、マイクロチャネルを損傷させず、そのマイクロチャネルの表面からの細胞の脱離を生じさせない。さらに制御された実験によって、これらの流速が、細胞の運動を生じさせず、その細胞内部での微小管の分布を変化させず、細胞膜での脂質ラフトの分布を変化させないことを判断することが可能となる。
【０１１０】
粒子周辺での流体の速度は、流れの中で浮遊する対象物を監視することによって決定された。この場合、蛍光物質Y0.6Eu0.4VO4のナノ粒子を用いて監視された。
【０１１１】
この研究のため、流れは、0〜200μl/minの速度で一方向に加えられる。流速の値は、様々な流速の値、ひいては力の値についての粒子の運動を測定するように、段階的に増大する。流速の各値は約30秒間与えられ、その後流れは約30秒間中断され、その後新たな流速の値が適用される（図2Bの下図を参照のこと）。
【０１１２】
本願のナノ粒子の場合では、加えられた力は、受容体あたり0〜数pNで変化して良い。
【０１１３】
6)粒子によって放出される蛍光の像の記録
粒子は、粒子により放出される蛍光信号を広視野蛍光顕微鏡によって監視することによって監視される。ナノ粒子は、530DCXR二色ミラー（クロマ社製）を用いて465.8nmのアルゴンレーザーによって励起される。レーザーは、顕微鏡の対物レンズ（63倍、NA=1.4の油浸対物レンズ（Zeiss社製））によって集束される。励起領域の中央での高さは82μmである。粒子によって放出される蛍光は、同一の対物レンズを用いて収集され、かつ、617/8M帯域フィルタ（クロマ社製）を用いてフィルタリングされる。蛍光像は、EM-CCDカメラ（Roper  Scientific  Qaunt：512SC）によって記録される。像1枚の取得時間は200msである。
【０１１４】
7)粒子の運動の像解析及び監視
像は、バックグラウンドノイズを除去するため、ローパスフィルタ及びラプラスフィルタによってフィルタリングされる。最初の手順後、粒子の位置が、2Dガウス関数による修正によって決定される。これによって、顕微鏡の分解能によって課される限界を超えた精度で粒子の発光スポットの中心を与えることが可能となる。順次記録される像から得られる一連の粒子の位置によって、その粒子の運動の測定は可能となる。一定の流速が与えられた後、粒子は移動し、数秒後に新たな平衡位置に到達する。図2A及び図2B（上の図）での粒子の運動は、流れが与えられる前の初期位置に対して示される。平均の運動を得るためには、所与の流速が与えられた後の平衡状態で測定されたすべての位置の平均値が計算される。この平均値と流れが与えられる前の初期位置との差異が、平均運動と呼ばれる。この平均運動は、様々な流速の値について計算された、加えられた力の関数として図3に示されている。
【図１Ａ】
2013536409.tif 000003
【図１Ｂ】
2013536409.tif 000004
【図２Ａ】
2013536409.tif 000005
【図２Ｂ】
2013536409.tif 000006
【図３】
2013536409.tif 000007
【図４】
2013536409.tif 000008
【図５】
2013536409.tif 000009
【国際調査報告】
2013536409.tif 000010
2013536409.tif 000011
2013536409.tif 000012
2013536409.tif 000013
2013536409.tif 000014
2013536409.tif 000015