(57)【要約】【課題】広範なタンパク質について、濃縮可能でありかつ安定性が高いタンパク質複合体を含有する水性懸濁剤を提供する。【解決手段】緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が耐酸化性を有する水性懸濁剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が耐酸化性を有するタンパク質水性懸濁剤。
【請求項２】
前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して前記タンパク質が溶解可能である請求項１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がカチオン性ポリアミノ酸、またはアニオン性ポリアミノ酸である請求項１または２に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項４】
前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである請求項３に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項５】
前記カチオン性または前記アニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲である請求項３または４に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項６】
前記タンパク質の分子量が、３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項７】
前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に、前記タンパク質の最大濃縮率が存在するように濃縮可能である請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項８】
前記耐酸化性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質水溶液と比較して耐酸化性が高い請求項１ないし７のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項９】
前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である請求項１ないし８のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１０】
前記タンパク質が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質の少なくとも１つである請求項１ないし９のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１１】
前記タンパク質が糖鎖を有する請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１２】
前記ポリアミノ酸が分岐鎖を有しないポリアミノ酸である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１３】
前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびｐＨ調製剤以外の添加剤を含有しない請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１４】
前記複合体を形成しその後可溶化する工程で前記タンパク質の二次構造が保持される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか1項に記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質とポリアミノ酸との複合体で、前記タンパク質が複合体中で濃縮時に活性が劣化しない、振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、耐熱性、および凝集抑制性の少なくとも１つを有する水性懸濁剤に関する。また、前記複合体を緩衝液中で再溶解して得られる水性液に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の進歩により、種々のタンパク質が医薬品として提供される機会が増している。特に抗体についての技術進歩は目覚しく、キメラ抗体やヒト化抗体、さらには糖鎖改変技術を応用した抗体も実用化され、数々の抗体医薬品が大きな治療効果を上げている。タンパク質医薬品は、従来用時溶解して用いる凍結乾燥製剤として提供されることが多かったが、近年では、より簡便に使用できる水性剤として提供されるようになってきている。また、投与についても、従来静脈注射による投与が一般的であったが、患者の利便性まで考慮し、皮下注射により投与されるタンパク質医薬品が増している。皮下注射では、静脈注射に比べ投与容量を少なくする必要があるため、タンパク質を高濃度化することが必須となる。また、特に抗体医薬品は、高用量で用いられるため、抗体医薬品を皮下注射する場合には、より高濃度化することが要求される。さらに最近は、投与回数を減らす目的で高濃度化する試みもなされており、提供される市販製剤にはタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上のものも存在する。
しかしながら、元来生体高分子であるタンパク質は、振とう等の物理的ストレスや酸化等の化学的ストレスに弱く、特に凍結乾燥製剤に比べ水に溶解して水性剤とした場合には変性しやすい。変性したタンパク質は、本来の活性を失い凝集体や会合体を形成することが多く、また、この反応は不可逆な場合が多い。このような凝集体の形成は、一般にタンパク質が高濃度である程起きやすく、振とう等による気液界面への暴露およびタンパク質分子どうしの相互作用の機会が増えることにより、特に長期保存時や輸送時に凝集体が形成される可能性が高まる。凝集体の形成は、タンパク質医薬品の有効性を低下させ、さらに安全性をも脅かす。すなわち、投与後に抗薬物抗体の産生がおこる等の望まれない免疫反応を惹起する可能性を有する（非特許文献１）。このため、米国ＦＤＡおよび欧州ＥＭＥＡでは、免疫原性の評価に対するガイドラインを設定し、対策を喚起している。また、酵素やサイトカイン等の低濃度のタンパク質製剤においても、種類や製剤によって凝集体を形成しやすいものが存在し、溶解時や投与時に激しく振とうしない、フィルターを通す等、用時の取扱に注意を要するものも少なくない。
このような背景から、タンパク質の各種ストレスに対する安定性を向上させることは極めて重要な課題であり、特にタンパク質が高濃度な状態や凝集体を形成しやすいタンパク質においても適用できる汎用性が高い安定化技術の構築が望まれている。
【０００３】
これに対し、タンパク質の安定性を向上させるための取組みとして、主に各種添加剤による安定化が数多く検討されている。特許文献１では、アミノ酸エステル、ポリアミンの添加によるタンパク質の安定化方法が、また、特許文献２では、ポリエチレングリコール、および特定のアミノ酸としてアラニン、アルギニン、グルタミン酸、またはこれらの誘導体を共存させることによる熱ストレスに対するタンパク質の安定化方法が開示されている。
一方、タンパク質とポリアミノ酸による複合体に関して、ドラッグデリバリーシステムとしての検討もなされている。特許文献３では、生体内での安定性と機能性の付与を目的とし、疎水化ポリアミノ酸と抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドとの複合体が、免疫原性を高める免疫アジュバントとして利用できることを開示している。また、特許文献４では、カチオン性ポリマーの一つとしてポリアミノ酸を用いた複合体が、内包させるタンパク質とデリバリーシステムを構成するポリマーマトリックスとの相互作用を低減させ、優れた持続放出性を示すシステムに組み込まれる技術として開示されている。しかし、これら複合体を含む水性懸濁剤の輸送時や保存時の安定性については検討されていない。
【０００４】
特許文献５には、請求項１に、「抗体製剤を作製する方法であって、抗体をポリカチオンと組み合わせる工程を含む方法。」が、記載されている。請求項４には、「ポリカチオンが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン、およびカチオン性多糖類、またはその混合物からなる群より選択される。」、請求項２４には、「製剤が、前記ポリカチオン組成物と組み合わせたときに、ポリカチオンの非存在下での前記抗体製剤の溶解性と比較して、より大きい溶解性を有する」、請求項２５には、「製剤が、ポリカチオン組成物と組み合わせていない抗体製剤と比較して、増大した貯蔵寿命を有する」ことが記載されている。しかし、抗体とポリアミノ酸との複合体である固体粒子の形成、抗体とポリアニオンとの組合せについての記載はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，  Ｈ．  Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ２４（１１）：１７２０−１７４０．  ２００２．
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３９７６２５７号
【特許文献２】特許第５１１９５４５号
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２０１０／１１０４５５
【特許文献４】特表平７−５０３７００
【特許文献５】特表２０１０−５３６７８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上述の状況に鑑みてなされたもので、タンパク質を含み輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる水性懸濁剤を提供することにある。本発明者らは、上記目的で種々のタンパク質について鋭意研究を重ねた結果、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で懸濁する複合体を形成し、この複合体中でタンパク質が耐酸化性を有し安定性が向上することを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、タンパク質とポリアミノ酸とを組み合わせる工程を含む方法で、タンパク質が耐酸化性を有し安定性が向上することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性、流動性、耐酸化性、耐熱性、および凝集抑制性からなる群から選択される少なくとも1つを有するタンパク質水性懸濁剤。
（２）前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して前記タンパク質が溶解可能である（１）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（３）前記ポリアミノ酸がカチオン性ポリアミノ酸、またはアニオン性ポリアミノ酸である（１）または（２）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（４）前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである（３）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（５）前記カチオン性または前記アニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲である（３）または（４）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（６）前記タンパク質の分子量が、３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である（１）ないし（５）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（７）前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に、前記タンパク質の最大濃縮率が存在するように濃縮可能である（１）ないし（６）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（８）前記振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して振とうストレス耐性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（９）前記流動性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質水溶液と比較して粘度が低い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１０）前記耐酸化性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質水溶液と比較して耐酸化性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１１）前記耐熱性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して耐熱性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１２）前記凝集抑制性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して凝集抑制性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１３）前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である（１）ないし（１２）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１４）前記タンパク質が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質の少なくとも１つである（１）ないし（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１５）前記タンパク質が糖鎖を有する（１）ないし（１４）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１６）前記ポリアミノ酸が分岐鎖を有しないポリアミノ酸である（１）ないし（１５）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１７）前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびｐＨ調製剤以外の添加剤を含有しない（１）ないし（１６）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１８）前記複合体を形成しその後可溶化する工程で前記タンパク質の二次構造が保持される（１）ないし（１７）のいずれか１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１９）上記（１）ないし（１８）のいずれか１つに記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁し、前記タンパク質が複合体中で濃縮時に活性が劣化しない、振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、耐熱性、および凝集抑制性の少なくとも１つの効果を有する。具体的にはタンパク質とポリアミノ酸が複合体を形成し安定化され、水性懸濁液から水分を除去することにより濃縮可能である。輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。一般にタンパク質医薬品の安定化には、賦形剤、界面活性剤、安定化剤等の添加剤が用いられるが、これらを用いる際には、タンパク質医薬品毎にその種類や組合せ、添加量を最適化するための複雑かつ膨大な検討が必要となる。本発明の水性懸濁剤は、ポリアミノ酸との複合体を形成することで簡便に安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま投与する、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解させて水性液として投与することができる。さらに、タンパク質が高濃度であっても粘度が低いという特徴を有するため、使用時に容器中に残存し無駄となる量を減らすことができ、また、シリンジを用いて投与する際には、同濃度のタンパク質水溶液に比べ弱い力で投与することができる。
本発明の水性懸濁剤は、上記のいずれか１つの特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｌ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジン（Ｐｏｌｙ‐Ｋ、分子量４ｋＤａ−１５ｋＤａ)添加の状態を示す図である。図１の１）、２）図においてそれぞれ右側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ、左側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジンが添加されている。図１の１)は添加直後で、左試料で複合体が形成された水性懸濁液を示す。２）は一定時間経過後、左試料は形成された複合体が自然沈降する状態を示す。一方ポリリジンを添加しない右試料は１）および２）で複合体ができていないことを示す。
【図２】図２は、図１と同じ試料の遠心分離後の状態を示す図である。図２の３）の左試料は、図１の２）の左試料を遠心分離して複合体がペレット状になった状態を示す。図２の４）の左試料は、遠心分離後の上清の緩衝液が除去され複合体中のタンパク質がポリリジン添加前と比べ１０倍濃縮された状態を示す。図２の３）、４）の右試料は、遠心分離後も変化がないことを示す。
【図３】図３は、図３の５）左試料で、図２の４）の左試料の全体を振って、ペレット状であった複合体を再懸濁させた状態を示す図である。図３の５）の右試料は図２の４）の右試料の全体を振っても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。  図３の６−１）は図３の５）にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−１）左試料は、図３の５）の左試料にＮａＣlを添加して複合体を再溶解させた状態を示す。図３の６−１）の右試料は、図３の５）の右試料にＮａＣｌを添加しても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。図３の６−１）の左試料はポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−１）の右試料は図３の５）の右試料と同程度あるいはＮａＣｌを添加した分希釈された状態を示す。  また図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで量を調整しても再溶解させた状態が変わらないことを示す。図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液を加えることで、ポリリジン添加前と同等のタンパク質濃度となっている状態を示す。  図３の６−３）の右試料は図３の５）の右試料から上清の緩衝液を除去しさらに両試料にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の左試料は図３の６−１）の左試料と同様にポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−３）の右試料はポリリジン添加前と比べＮａＣlを添加した分希釈され、さらにタンパク質量として９割が失われている状態を表わす。
【図４】図４は、ＭＯＰＳ緩衝液中に添加したＬ-アスパラギナーゼとポリリジンとの混合質量部の比に対する、Ｌ-アスパラギナーゼの濃縮倍率を示すグラフである。実線はタンパク質濃度（濃縮倍率）、破線はタンパク質の活性倍率を示す。両グラフは一致しており、複合体を形成し、その後可溶化した後にタンパク質の活性が保持されていることが示される。
【図５】図５は、タンパク質とポリアミノ酸との複合体の最大濃縮倍率が、緩衝液のｐＨとタンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に存在することを示すグラフである。
【図６】図６は、後に説明する試験例１０において得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（ＭＯＰＳ緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８０（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８０（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した後に、タンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図７】図７は、後に説明する試験例１１において得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（クエン酸緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８１（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８１（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した際に、濃縮されたタンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図８】図８は、後に説明する試験例１８において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例８５）の振とう後（破線）について、およびポリアミノ酸を含有しない対照液（比較例８５）の振とう前（実線）について、測定されたＣＤスペクトルを示すグラフである。抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致し、複合体中のタンパク質に振とうストレスを加えてもタンパク質の二次構造が保持されていることが示される。
【図９】図９は、後に説明する試験例１９において抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例８７）の振とう後（破線）について、およびポリアミノ酸を含有しない対照液（比較例８７）の振とう前（実線）および振とう後（破線）について、測定されたＣＤスペクトルを示すグラフである。対照液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致せず二次構造変化が生じているのに対し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致し、複合体中でタンパク質が振とうストレスを加えてもタンパク質の二次構造が保持されていることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤の一例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔タンパク質〕
本発明に使用されるタンパク質は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質であれば特に限定されない。好ましくは生物活性を有するタンパク質であり、より具体的には、植物、動物、微生物等の生物由来のタンパク質、あるいは遺伝子組換え技術を用いて製造されたタンパク質などが挙げられる。本発明において、より好ましい形態のタンパク質は、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質等の医療用タンパク質である。
タンパク質が抗体または抗体フラグメントであると、これらのタンパク質を製剤または診断剤としてヒトに適用する際に、本発明の水性懸濁剤を用いればより安定に運搬、保存が可能であり、しかも用時にヒトに投与することが容易であり有用性が高い。タンパク質は糖鎖を有していてもよく、糖鎖は親水性であり、本発明の複合体含有水性懸濁液中で何らかの相互作用を有すると考えられる。
〔ポリアミノ酸〕
本発明に使用されるポリアミノ酸またはその水溶性塩は、緩衝液中で表面電荷を有するポリアミノ酸またはその水溶性塩であれば特に限定されない。具体的にはカチオン性あるいはアニオン性ポリアミノ酸またはその塩である。カチオン性ポリアミノ酸として、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸のナトリウム塩等、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリシトルリン等の塩酸塩等が挙げられる。本発明において、より好ましい形態のポリアミノ酸の形態は、カチオン性ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩、アニオン性ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩、ポリ−Ｌ−アルギニン臭化水素酸塩、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩が例示できる。
【００１２】
〔緩衝液〕
本発明に使用する緩衝液は、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液を指し、緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないように調整された水溶液である。緩衝液は通常化学的に用いられるものであれば特に限定されないが、生物学的に用いられる緩衝液が好ましい。より好ましい形態の緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝液、ＴｒｉｓＨＣl緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−pｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等の生体試料に適したもので，生体への投与が可能な緩衝液を用いることができる。
【００１３】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体〕
１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体
本発明の複合体は、以下の（１）〜（４）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、濃縮時に活性が劣化しない。
【００１４】
以下にタンパク質が、Ｌ-アスパラギナーゼ、ポリアミノ酸がポリリジンである場合を例として上記（１）〜（３）の特性を説明する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
図１は、Ｌ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジン（Ｐｏｌｙ−Ｋ、分子量４ｋＤａ−１５ｋＤａ)添加の状態を示す図である。右側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ、左側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ１質量部に対して、ポリリジンが０．０５質量部添加されている。１)の左試料は、添加直後で、白い固体粒子状の複合体が形成された水性懸濁液を示す写真である。２）の左試料は、形成された複合体が、一定時間経過後自然沈降する状態を示す写真である。一方ポリリジンを添加しない右試料は１）および２）で複合体ができていないことがわかる。
図２は、図１と同じ試料で、３）の左試料は、図１の２）の左試料を遠心分離して複合体がペレット状になった状態を示す写真である。４）の左試料は、上清の緩衝液を除いて複合体が１０倍濃縮された状態を示す写真である。
複合体の形成時に条件によっては一部のタンパク質が上清中に残存することもあると考えられる。
【００１５】
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
図２の４）左試料中に示すように、得られたタンパク質・ポリアミノ酸複合体は、上清の緩衝液を除去して濃縮されたタンパク質を保持する複合体を得ることができる。図２の３）の左試料に示すように遠心分離して複合体を得てもよい。複合体含有水性懸濁液は緩衝液、水等を添加して任意の濃度に薄めることもできる。
（３）複合体は、前記複合体含有水性懸濁液に無機塩である低濃度の電解質を添加して溶解可能である。電解質としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等が例示できるが、好ましくは生体適合性が最も高いＮａＣｌが選択される。電解質濃度は限定されないが５質量％以下で、複合体が溶解する十分量を用いることができる。
【００１６】
図３は、図２と同じ試料で、図３の５）の左試料は、図２の４）の左試料の全体を振ってペレット状であった複合体を再懸濁させた状態を示す写真である。図３の５）の右試料は複合体が形成されていない図２の３）、４）の右試料と同様に全体を振っても複合体が形成されないことに変わりがないことを示す。
図３の６−１）左試料は、図３の５）の左試料にＮａＣlを添加して複合体を再溶解させた状態を示す。図３の６−１）の右試料は、図３の５）の右試料にＮａＣlを添加しても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。図３の６−１）の左試料はポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−１）の右試料は図３の５）の右試料と同程度あるいはＮａＣlを添加した分希釈された状態を示す。
また図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで量を調整しても再溶解させた状態が変わらないことを示す。図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで、ポリリジン添加前と同等のタンパク質濃度となっている状態を示す。
図３の６−３）の左試料は図３の５）の左試料にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の右試料は図３の５）の左試料と量が同等となるよう図３の５）の右試料の一部を除去しさらにＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の左試料は図３の６−１）の左試料と同様にポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−３）の右試料はポリリジン添加前と比べＮａＣlを添加した分希釈され、さらにタンパク質量として９割が失われている状態を表わす。
図４は、ＭＯＰＳ緩衝液中に添加したＬ-アスパラギナーゼと、Ｌ-アスパラギナーゼ1質量部に対するポリリジン混合比に対する、Ｌ-アスパラギナーゼの非濃縮に対する濃縮倍率を示すグラフである。Ｌ-アスパラギナーゼの濃縮倍率は、複合体を含む水性懸濁液を遠心分離して得られた複合体にＮａＣlを添加して再溶解し、得られた水性液中で、Ｌ-アスパラギナーゼ濃度を吸光度から算出する。
【００１７】
本発明の複合体は、緩衝液中に表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とを含み、前記タンパク質と前記ポリアミノ酸とが好ましくは静電的相互作用によって形成される複合体で、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が、好ましくは０．５〜４．０で、１超の濃縮倍率が得られる。図５に示すように濃縮倍率はタンパク質の種類が変わっても｜ｐＨ-ｐＩ｜が０．５から２付近の範囲では濃縮率が上がり、約１０倍の濃縮倍率が得られその後は｜ｐＨ-ｐＩ｜の値にかかわらずほぼ横ばい状態の濃縮率を示す。つまり、｜ｐＨ-ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、より好ましくは１．０〜３．５、より好ましくは１．８〜３．５、より好ましくは１．８〜３．０、さらに好ましくは１．８〜２．５の範囲で適切に濃縮できることがわかる。
【００１８】
タンパク質とポリアミノ酸との複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に存在する理由は不明である。本発明者らは、複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が１．５〜４．０、好ましくは１．０〜４．０、より好ましくは１．０〜３．５、より好ましくは１．５〜３．５、より好ましくは１．８〜３．５、より好ましくは１．８〜３．０、さらに好ましくは１．８〜２．５の範囲に存在することは、タンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成する静電的相互作用の状態を表す１つの特徴であると考えているが、本発明はこれらの機序に限定されるものではない。
【００１９】
（４）前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、濃縮時に活性が劣化しない。
ここで、活性が劣化しないとは、複合体が濃縮操作によっても同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対してその生物活性が好ましくは８０％以上保持されることをいう。さらに好ましくは８５％以上、９０％以上保持されることをいう。場合によっては１００％超の測定値を示す場合もあるがその原因は測定誤差によるものか何かの機序によるものか不明である。
【００２０】
また、前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。タンパク質が本発明の複合体を形成し濃縮された後、再溶解されても、タンパク質の二次構造の変化はほとんどないことが分かっている。後に説明する実施例８０、８１の結果を示す、図６、７でそれぞれ複合体形成前と、複合体形成および再溶解後とのそれぞれのＣＤスペクトルを測定して確認されている。
【００２１】
本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体はその特性により異なる用途を持つ以下の５つの特性で特徴付けられる複合体［１］〜複合体［５］として説明できる。
〔１．振とうストレス耐性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［１］という）〕
本発明の複合体［１］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［１］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［１］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［１］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［１］中で振とうストレス耐性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
【００２２】
（５）前記タンパク質は前記複合体中で振とうストレス耐性を有する。
ここで、振とうストレス耐性を有するとは、複合体［１］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して振とうストレス耐性がより高いことを言い、具体的には振とう後の活性残存率がより高いこと、またはタンパク質の構造がより保持されること、またはタンパク質の残存率がより高いことをいう。
振とうストレスとは、例えば後に実施例の試験例で示すような１００〜５００ｒｐｍ×１０〜１００時間の振とうを緩衝液中のタンパク質または複合体に与えることを言う。振とうストレス耐性とはタンパク質の種類によって異なるので限定できないが、振とうストレス前と比較して振とうストレス後のタンパク質の残存活性率が、複合体を形成しない場合の残存活性率と比較して１０％〜９９％高いことをいう。好ましくは１０％〜５０％、さらには１５％〜４０％であってもよい。
また、上記の振とうストレスの前後において、タンパク質の濃度を吸光度で測定すると、複合体を形成しない場合は多量の不溶性の沈殿物ができて振とう後、遠心分離して凝集体を除くと緩衝液中のタンパク質の濃度が低くなりタンパク質含量の残存率が小さくなり、７％未満となる場合もある。一方複合体を形成する場合は振とうストレスの前後において複合体中のタンパク質が安定でありタンパク質含量の残存率が測定によっては１００％以上の値となる。複合体中のタンパク質含量の残存率の値は、複合体を形成しない場合の対照液のタンパク質含量の残存率の値より、好ましくは１５％〜９９％高く、より好ましくは１８％〜９５％高く、さらには２５％〜９０％高い。
【００２３】
〔２．流動性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［２］という）〕
本発明の複合体［２］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［２］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［２］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［２］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［２］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［２]中で流動性に優れる。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
【００２４】
（５）タンパク質は前記複合体［２］中で流動性に優れる。
ここで、流動性を有する、流動性に優れる、または流動性の向上とは、複合体［２］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対してより流動性を有することを言い、具体的には同一緩衝液同一濃度で、複合体［２］中に含まれるタンパク質の粘度がより低いことをいう。
複合体［２］中のタンパク質の粘度はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。対照液の粘度の６０％以下であり、好ましくは５５％以下、さらには５０％以下であってもよい。
【００２５】
〔３．耐酸化性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［３］という）〕
本発明の複合体［３］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［３］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［３］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［３］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［３］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［３］中で耐酸化性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
（５）タンパク質は複合体［３］中で耐酸化性を有する。
ここで、酸化ストレスとは、添加された酸化性化合物中の活性酸素種等がタンパク質中の酸化を受けやすいアミノ酸側鎖に切断、会合、修飾などを引き起こし、タンパク質の一次構造に生じさせる変化を言い、耐酸化性を有するとは、複合体［３］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して耐酸化性がより高いことを言い、具体的には同一緩衝液同一濃度で、酸化性化合物の添加に対して複合体［３］中のタンパク質の活性残存率が同一化合物添加の対照液より高いこと、またはタンパク質の構造がより保持されることをいう。
用いる酸化性化合物としては、０．０１〜３．００質量％の過酸化水素水と緩衝液との混合物、１〜１０ｍＭ銅イオン存在下の１〜１０ｍＭアスコルビン酸等が例示でき、所定時間、所定温度後のタンパク質の活性変化または一次構造の変化を測定する。所定時間、所定温度は例えば、１〜１０時間、２０℃〜４０℃であってもよい。
複合体［３］中のタンパク質の耐酸化性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一酸化ストレス下の対照液の残存活性との差が５％〜３０％高く、好ましくは５％〜２５％高く、さらには１０％〜２０％高くてもよい。
また、タンパク質の構造保持は、複合体を形成しない対照液（比較例）における酸化ストレス下の一次構造変化率を１００％とした場合、複合体中のタンパク質における同様の酸化ストレス下の一次構造変化率は好ましくは９５％以下、より好ましくは９１％以下、さらには８７％以下に抑制される。
【００２６】
〔４．耐熱性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［４］という）〕
本発明の複合体［４］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［４］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［４］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［４］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［４］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［４］中で耐熱性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
【００２７】
（５）タンパク質は前記複合体［４］中で耐熱性を有する。
ここで、耐熱性を有するとは、複合体［４］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して耐熱性がより高いことを言い、具体的には同一緩衝液、同一濃度で、熱負荷後の複合体［４］中のタンパク質の活性が複合体を形成しない対照液と比較してより高いこと，またはタンパク質の変性温度がより高温であることをいう。
熱負荷とは例えば後に実施例の試験例で示すような、所定温度、所定時間、例えば、室温〜６０℃×５分〜２０時間で複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に熱を加えることを言う。耐熱性は、複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液を室温放置した場合の活性を１００％として上記熱負荷を与えた複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液における活性保持率を測定することで評価できる。または、複合体[４]と同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液とを示差走査熱量測定し各変性温度を測定することで評価できる。
複合体［４］中のタンパク質の耐熱性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一熱ストレス下の対照液の活性残存率との差が５％〜９５％、好ましくは１０％〜９５％以下、さらには２０％〜８５％であってもよい。
複合体［４］中のタンパク質の熱変性温度は対照液と比較して好ましくは、１℃〜２０℃高い。
【００２８】
〔５．凝集抑制性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［５］という）〕
本発明の複合体［５］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［５］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［５］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［５］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［５］中で凝集抑制性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
（５）前記タンパク質は凝集抑制性を有する。
ここで、凝集抑制性を有するとは、複合体［５］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して凝集抑制により優れていることを言い、具体的には複合体の形成により凝集体の形成が抑制されることを言う。凝集体の形成は、複合体［５］および同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液中のタンパク質の振とうストレス前後の凝集量を総タンパク質量から上清のタンパク質量を差し引くことで算出する、あるいはサイズ排除クロマトグラフ法による可溶性凝集体ピーク面積を測定することで評価できる。あるいは複合体［５］および同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液中のタンパク質の加熱ストレス前後の凝集体数増加率、あるいは濁度増加率を算出することで評価できる。これらの測定により複合体[５]中のタンパク質が種々の条件下で凝集体の形成が抑制されていることを評価できる。
複合体［５］中のタンパク質の凝集抑制性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一振とうストレス下の対照液との不溶性凝集体化率の差が５％〜２０％、好ましくは振とうストレス後に凝集物を実質的に有しない特性であってもよい。同一振とうストレス下で可溶性凝集体増加率は対照液との比率で３０％以下、好ましくは１０％以下、さらには５％以下であってもよい。同一加熱ストレス下で凝集体数増加率は対照液との比率で１．０％以下、好ましくは０．５％以下、さらには０．３％以下であってもよい。同一加熱ストレス下で濁度増加率は対照液との比率で１０％以下、好ましくは６％以下、さらには４％以下であってもよい。
【００２９】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁剤の特性〕
タンパク質が正又は負の表面電荷を有する。ポリアミノ酸がカチオン性またはアニオン性である。
カチオン性またはアニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲である。タンパク質の分子量が、１０ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である。
タンパク質が正の表面電荷を有する場合はアニオン性ポリアミノ酸と組合せ、タンパク質が負の表面電荷を有する場合はカチオン性ポリアミノ酸と組合せるのが好ましい。
タンパク質は、水性懸濁液中で０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれる。
水性懸濁液に用いる緩衝液のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ９の範囲である。
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中に表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸を含み、これらの配合比が前記タンパク質１質量部に対し前記ポリアミノ酸が０．００５質量部〜６質量部の範囲であり、前記緩衝液のｐＨが含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより０．５以上塩基性又は酸性側に調整されていて、前記タンパク質と前記ポリアミノ酸が静電的相互作用による複合体を形成している、安定なタンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤である。
本発明の水性懸濁剤は、タンパク質の等電点に応じて緩衝液のｐＨとポリアミノ酸を選択するのみで簡便に濃縮、安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。水性懸濁剤は、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸、ｐＨ調製剤以外の添加剤を加えることもできるが加える必要はない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま製剤として投与できる。あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解して製剤として投与することができる。
【００３０】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁剤の製造方法〕
（工程１）：緩衝液のｐＨを、含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより絶対値で０．５以上４．０以下塩基性側および・または酸性側に調整する。
（工程２）：前記緩衝液に、表面電荷を有する前記タンパク質を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、前記ポリアミノ酸を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて前記タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を形成させる。
（工程３）：このタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水分、または緩衝液を遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、前記タンパク質が０．１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるよう調整する。
（工程４）：工程３で調製した水性懸濁液に、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも少ない量の緩衝液、水等を添加することにより濃縮されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量と等しい量の緩衝液、水等を添加することにより同等のタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも多い量の緩衝液、水等を添加することにより希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
（工程５）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から水分を除去せずに、緩衝液、水等を添加することにより希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁を得る。
【００３１】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２、工程３および工程４あるいは上記の工程１、工程２および工程５により水性懸濁剤が製造される。
【００３２】
〔タンパク質の濃縮方法、濃縮された、あるいは同等の、あるいは希釈されたタンパク質濃度を有する水性剤の製造方法〕
（工程１）：緩衝液のｐＨを、含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより絶対値で０．５以上４．０以下塩基性側および・または酸性側に調整する。
（工程２）：前記緩衝液に、表面電荷を有する前記タンパク質を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、前記ポリアミノ酸を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて前記タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を形成させる。
（工程３）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水分、または緩衝液を遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、前記タンパク質が０．１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるように水性懸濁液を調整する。
（工程４）工程３で調製した水性懸濁液に、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも少ない量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより濃縮されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量と等しい量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより同等のタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも多い量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
（工程５）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から水分を除去せずに、低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
【００３３】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２、工程３および工程４あるいは上記の工程１、工程２および工程５により水性剤が製造される。
工程１では、前記緩衝液のｐＨを、含まれるタンパク質の等電点をｐＩとして、｜ｐＩ−ｐＨ｜を０．５〜４．０の範囲に調整して、複合体を得るのが好ましい。
【００３４】
（１）タンパク質の濃縮方法
以下の工程１）〜３）は任意の順序で行うことができ、同時に行っても逐次に行ってもよい。
１）タンパク質を緩衝液に加える。
２）ポリアミノ酸を緩衝液に加える。
３）緩衝液のｐＨを、含まれるタンパク質の等電点をｐＩとして、｜ｐＩ−ｐＨ｜を０．５以上に調整する。
４）緩衝液中でタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成し水性懸濁液が得られる。
５）少なくとも一部の水分または緩衝液を除去する。得られる複合体中のタンパク質濃度は工程１）の緩衝液中のタンパク質濃度より濃縮したタンパク質が得られる。
６）必要な場合は、得られた水性懸濁液を遠心分離して複合体を得る。
【００３５】
（２）複合体の溶解方法
得られた複合体は、水性懸濁液中に、低濃度の電解質を添加して再溶解することができる。電解質としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2等が例示できるが、好ましくは生体適合性が最も高いＮａＣｌが選択され、濃度は５質量％以下である。
得られた複合体を再溶解して緩衝液中に溶解したタンパク質を可逆的量で得るためには、｜ｐＩ−ｐＨ｜を０．５〜４．０の範囲とするのが好ましい。
【００３６】
（３）タンパク質濃度測定方法
緩衝液中のタンパク質濃度は、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。複合体中のタンパク質濃度は遠心分離して得られる複合体を上記（２）の方法で溶解して、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。例えばタンパク質濃縮時の濃度変化を非濃縮に対する濃縮倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の濃度変化を負荷前に対する残存率で算出する。
（４）タンパク質の二次構造の変化の測定方法
複合体中のタンパク質のＣＤスペクトルを当該タンパク質を上記（２）の方法で溶解した水溶液として測定する。複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷前後でのＣＤスペクトルを測定し、タンパク質の二次構造変化を検出する。同様にタンパク質の対照液を同一緩衝液中で同濃度でＣＤスペクトルを測定し、複合体の負荷後のＣＤスペクトルと比較して変化が見られない場合は上記負荷によっても複合体中のタンパク質の二次構造は変化しなかったことが示される。
【００３７】
（５）タンパク質活性測定方法
１）Ｌ-アスパラギナーゼ活性：水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。Ｌ-アスパラギナーゼが触媒する、アスパラギンをアスパラギン酸とアンモニアに分解する反応で、反応液中のアンモニア濃度を定量し、Ｌ-アスパラギナーゼ活性を求める。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。
２）抗ＩｇＥ抗体活性（ＩｇＥ結合能またはＩｇＥ受容体阻害能）
水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。ＥＬＩＳＡ法により抗ＩｇＥモノクローナル抗体による、ＩｇＥとの結合活性またはＩｇＥ受容体に対するＩｇＥ結合の阻害活性を測定する。両者とも、ＩｇＥ−抗ＩｇＥ抗体の結合を見るアッセイであり、ＩｇＥ結合試験はＩｇＥと結合した抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度が測定され、ＩｇＥ受容体阻害試験はＩｇＥ受容体と結合したＩｇＥ濃度が測定される。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。具体的には実施例７４の試験例４がＩｇＥ結合試験で、その他の抗ＩｇＥ抗体活性は受容体阻害試験で測定される。
３）抗ＴＮＦα抗体活性：（ＴＮＦα結合能）
水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。ＥＬＩＳＡ法により抗ＴＮＦαモノクローナル抗体による，ＴＮＦαとの結合活性を測定する。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。
【００３８】
（６）振とうストレスに対する安定性の測定方法
１）振とうストレスに対する抗ＥＧＦＲ抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク率含量残存率を求める。
２）振とうストレスに対する抗ＴＮＦα抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
３）振とうストレスに対する抗ＩｇＥ抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
【００３９】
（７）タンパク質の一次構造の変化率の測定方法
１）ペプチドマッピング法：タンパク質を化学的もしくは酵素的に消化して、生じたペプチド断片を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）などで分離検出、そのクロマトパターンを比較することで、構成しているアミノ酸の変化を確認する試験法。タンパク質の一次構造の変化の状態を一次構造の変化率で算出できる。
【００４０】
（８）熱ストレスに対する安定性の測定方法
１）示差走査熱量測定法：一定の熱を与えながら基準物質と試料の温度を測定し、試料の状態変化による吸熱反応や発熱反応を測定する試験法。タンパク質の構造転移に伴う熱の出入りを直接測定でき、タンパク質の熱変性温度が測定できる。
【００４１】
（９）凝集抑制性の測定方法
１）抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の複合体および複合体を形成しない対照液に振とうストレスを加えた前後のサンプルについて、後に実施例で具体的に記載する条件で遠心分離して沈降した不溶性凝集量を，振とう後に上清中に残存する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体量を振とう前における総抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体量から差し引いた量として求める。
２）Ｌ-アスパラギナーゼのポリアミノ酸との複合体および対照液を加熱した前後のサンプルについて，各凝集体数を、マイクロフローイメージング法を用いて求める。
３）上記２）と同じサンプルについて吸光度を測定し濁度を求める。
４）サイズ排除クロマトグラフ：サイズ排除クロマトグラフィー、分子篩（ふるい）クロマトグラフィー、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）とも呼ばれる。試料の分子サイズに基づく篩い分けを原理とするクロマトグラフィーである。タンパク質分子は担体内部にまで拡散できるが、凝集体は担体内部に到達できず担体の外部を流れ去るので凝集体の量が測定できる。後に記載する実施例９８の測定では可溶性凝集体量がピーク面積として測定される。
【実施例】
【００４２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔１．ポリアミノ酸による濃縮可能性を示す実施例１〜７２および比較例１〜７２、ポリアミノ酸ではないアミノ酸単体では濃縮が出来ないことを示す陰性対照比較例７−２、２７−２〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼ（ｐＩ：４．７、ＭＷ：１４１ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４３】
（実施例２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４４】
（実施例６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．９）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．３〜２質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７）
ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４５】
（実施例８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１４．７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．５〜７質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４６】
（実施例１０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．００５〜０．３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１１）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例１０と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１２）
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１３）
１０ｍＭ  ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例１２と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４７】
＜ヒト血清アルブミン＞
（実施例１４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ヒト血清アルブミン（ｐＩ：５．０、ＭＷ：６９ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト血清アルブミン１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１５）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例１４と同じ操作を行い、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１６）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例１４と同じ操作を行い、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４８】
＜ウシ血清アルブミン＞
（実施例１７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシ血清アルブミン（ｐＩ：５．０、ＭＷ：６９ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシ血清アルブミン１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４）を用いた以外は実施例１７と同じ操作を行い、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシ血清アルブミンを４９．７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシ血清アルブミン１質量部に対し０．０３〜０．１５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００４９】
＜ＩＮＦ−α−２ｂ＞
（実施例２０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、インターフェロン（ＩＮＦ）−α−２ｂ（ｐＩ：５．７、ＭＷ：１８ｋＤａ）を０．０４ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ＩＮＦ−α−２ｂ、１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ＩＮＦ−α−２ｂ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ＩＮＦ−α−２ｂを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ＩＮＦ−α−２ｂ、１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ＩＮＦ−α−２ｂ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５０】
＜ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド＞
（実施例２２）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中において、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐＩ：１０．５、ＭＷ：３ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：０．７５ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例２２と同じ操作を行い、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５１】
＜ウシサイログロブリン＞
（実施例２４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシサイログロブリン（ｐＩ：５．５、ＭＷ：６７０ｋＤａ）を０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシサイログロブリン、１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシサイログロブリン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２５）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例２４と同じ操作を行い、ウシサイログロブリン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５２】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例２６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αモノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜２質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．５〜７質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：０．７５ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２９）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例２９と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は実施例２９と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５３】
（実施例３２）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：１５ｋＤａ−５０ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３４）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を用いた以外は実施例３３と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３５）
１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３６）
１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３７）
１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３８）
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５４】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例３９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）モノクローナル抗体（ｐＩ：７．６、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は実施例３９と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０３〜１質量部のポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜０．３質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５５】
（実施例４４）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）を用いた以外は実施例４４と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４６）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４７）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０３〜０．１５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４８）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例４７と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４９）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例４８と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５０）
ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いた以外は実施例４７と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５６】
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例５１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体（ｐＩ：６．９、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０１〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を用いた以外は実施例５１と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５７】
（実施例５４）
１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた以外は実施例５３と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。（実施例５５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．３〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．９）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．５〜１．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５８）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例５７と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５９）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例５７と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５８】
＜抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体＞
（実施例６０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）２モノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例６０と同じ操作を行い、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６２）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例６０と同じ操作を行い、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５９】
＜抗ＣＤ２０モノクローナル抗体＞
（実施例６４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６５）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例６４と同じ操作を行い、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例６３と同じ操作を行い、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６７）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６０】
＜ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質＞
（実施例６８）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中において、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質（ｐＩ：８．０、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６９）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例６８と同じ操作を行い、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７０）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例６８と同じ操作を行い、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６１】
＜ヒト免疫グロブリンＧ＞
（実施例７１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）（ｐＩ：６．９、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ｈＩｇＧ１質量部に対し０．０１〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ｈＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７２）
ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を用いた以外は実施例７１と同じ操作を行い、ｈＩｇＧ・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６２】
（比較例１〜７２）
上記実施例１〜７２においてポリアミノ酸を加えなかった以外は実施例１〜７２と同じ操作を行った。
［試験例１］
上記実施例１〜７２について、得られた各タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。また、上記比較例１〜７２について、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。これらの結果より、各比較例におけるタンパク質濃度に対する各実施例のタンパク質濃度比を求めたところ、実施例１〜７２の全てで、タンパク質濃度が上昇しており、濃縮できることが示された。結果の詳細を表１〜７に示した。
【００６３】
【表１】
2015086141.tif 000002
【００６４】
【表２】
2015086141.tif 000003
【００６５】
【表３】
2015086141.tif 000004
【００６６】
【表４】
2015086141.tif 000005
【００６７】
【表５】
2015086141.tif 000006
【００６８】
【表６】
2015086141.tif 000007
【００６９】
【表７】
2015086141.tif 000008
【００７０】
（比較例７−２、比較例２７−２）
上記実施例７において、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いるかわりにＬ-アルギニンを用い、それ以外は実施例７と同じ操作を行って、陰性対照とした（比較例７−２）。また、上記実施例２７において、ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を用いるかわりにアスパラギン酸を用い、それ以外は実施例２７と同じ操作を行って陰性対照とした（比較例２７−２）。
（比較例７および２７）〕
上記陰性対照の比較例としてアミノ酸もポリアミノ酸も加えなかった上記比較例7、比較例２７と同じ試料を作成した。
［試験例２］
上記比較例７−２および２７−２について、得られた各タンパク質・アミノ酸含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。また、上記比較例７および２７について、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。これらの結果より、各比較例におけるタンパク質濃度に対する各実施例のタンパク質濃度比を求めたところ、陰性対照比較例７−２および２７−２においてはタンパク質濃度の上昇が認められず、ポリアミノ酸ではないアミノ酸単独では、濃縮できないことが示された。結果の詳細を表８に、ポリアミノ酸により濃縮が可能だった実施例７および２７の結果と併記して示した。
【００７１】
【表８】
2015086141.tif 000009
【００７２】
〔２．タンパク質の濃縮は最大濃縮率を有する。〕
本発明の複合体を形成するタンパク質の濃縮方法は、用いた緩衝液のｐＩ、ｐＨ，に対して濃縮率を表にすると最大濃縮率を示すことがわかる。
下記表９は、表１〜７の濃縮中のタンパク質の等電点ｐIに対して緩衝液のｐＨを変化させて、ｐＩ‐ｐＨの絶対値（｜ｐＩ‐ｐＨ｜）が表１〜７に示す値となっている状態で、タンパク質とポリアミノ酸とを緩衝液中に添加してタンパク質とポリアミノ酸との複合体を形成した。得られた複合体中のタンパク質濃度を測定し、濃縮率の最大値が得られる｜ｐＩ‐ｐＨ｜の値を示した。
濃縮率を｜ｐＩ‐ｐＨ｜に対してプロットすると図５に示すグラフが得られる。複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、｜ｐＩ−ｐＨ｜、１．５〜４．０の範囲に存在することが図５に示されている。
濃縮率の最大値が得られる｜ｐＩ−ｐＨ｜の値は以下である。
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
抗ＩｇＥモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
Ｌ-アスパラギナーゼ−ポリ-Ｌ-リジン：２．３
【００７３】
【表９】
2015086141.tif 000010
【００７４】
〔３．タンパク質の濃縮で活性が損なわれないことを示す実施例７３〜７９〕
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例７３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．２５、０．０５、０．１、０．１５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７３）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７３と同じ操作を行った。
［試験例３］
上記実施例７３について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７３について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例７３におけるタンパク質濃度に対する実施例７３のタンパク質濃度比、および比較例７３における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７３の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１０に示した。
【００７５】
【表１０】
2015086141.tif 000011
【００７６】
（実施例７４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５、０．１０、０．１５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７４）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７４と同じ操作を行った。
［試験例４］
上記実施例７４について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７４について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例７４におけるタンパク質濃度に対する実施例７４のタンパク質濃度比、および比較例７４における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７４の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１１に示した。
【００７７】
【表１１】
2015086141.tif 000012
【００７８】
（実施例７５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．６質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７５）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７５と同じ操作を行った。
［試験例５］
上記実施例７５について、得られた各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７５について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例７５におけるタンパク質濃度に対する実施例７５のタンパク質濃度比、および比較例７５における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７５の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１２に示した。
【００７９】
【表１２】
2015086141.tif 000013
【００８０】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例７６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５、０．０５、０．１０、０．１５、０．３、０．５、０．７および１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７６）
ポリ−Ｌ−リジンを加えなかった以外は実施例７６と同じ操作を行った。
［試験例６］
上記実施例７６について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、比較例７６について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらにＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、比較例７６におけるタンパク質濃度に対する実施例７６のタンパク質濃度比、および比較例７６におけるＬ−アスパラギナーゼ活性に対する実施例７６のＬ−アスパラギナーゼ活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、Ｌ−アスパラギナーゼの活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１３に示した。
【００８１】
【表１３】
2015086141.tif 000014
【００８２】
（実施例７７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５、０．０５、０．１、０．１５および０．３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７７）
ポリ−Ｌ−リジンを加えなかった以外は実施例７７と同じ操作を行った。
［試験例７］
上記実施例７７について、得た各Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、比較例７７について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらにＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これら結果より、比較例７７におけるタンパク質濃度に対する実施例７７のタンパク質濃度比、および比較例７７におけるＬ−アスパラギナーゼ活性に対する実施例７７のＬ−アスパラギナーゼ活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、Ｌ−アスパラギナーゼの活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１４に示した。
【００８３】
【表１４】
2015086141.tif 000015
【００８４】
（実施例７８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５、０．１、０．１５、０．３、０．５および１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７８）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７８と同じ操作を行った。
［試験例８］
上記実施例７８について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７８について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例７８におけるタンパク質濃度に対する実施例７８のタンパク質濃度比、および比較例７８における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性に対する実施例７８の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１５に示した。
【００８５】
【表１５】
2015086141.tif 000016
【００８６】
（実施例７９）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．４質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７９）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７９と同じ操作を行った。
［試験例９］
上記実施例７９について、得られた各抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７９について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例７９におけるタンパク質濃度に対する実施例７９のタンパク質濃度比、および比較例７９における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性に対する実施例７９の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１６に示した。
【００８７】
【表１６】
2015086141.tif 000017
【００８８】
〔４．タンパク質の濃縮で二次構造が保たれる実施例８０，８１〕
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例８０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１０］
上記実施例８０について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８０）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図６に示した。
（実施例８１）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１１］
上記実施例８１について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８１）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図７に示した。
〔５．振とうストレスに対する安定化効果を示す実施例８２〜８７〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例８２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１２］
上記実施例８２について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後のＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８２）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液のＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液（実施例８２）および対照液（比較例８２）について、振とう前に対する振とう後のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表１７に示した。
【００８９】
【表１７】
2015086141.tif 000018
【００９０】
（実施例８３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した以外は実施例８１と同じ操作を行った。
［試験例１３］
上記実施例８３について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後のＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８３）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液のＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表１８に示した。
【００９１】
【表１８】
2015086141.tif 000019
【００９２】
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例８４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を１３．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０７質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１４］
上記実施例８４について、得た抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、７８．５ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を７８．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８４）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液（比較例８４）に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の低下がみられたが、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下はみられず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表１９に示した。
【００９３】
【表１９】
2015086141.tif 000020
【００９４】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例８５）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１５］
上記実施例８５について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、０．５ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８５）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２０に示した。
【００９５】
【表２０】
2015086141.tif 000021
【００９６】
（実施例８６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１６］
上記実施例８６について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８６）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２１に示した。
【００９７】
【表２１】
2015086141.tif 000022
【００９８】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例８７）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１７］
上記実施例８７について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を加え、０．５ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８７）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２２に示した。
【００９９】
【表２２】
2015086141.tif 000023
【０１００】
〔６．振とうストレスに対して二次構造が保たれる実施例８５、８７〕
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
［試験例１８］
上記試験例１５において得た抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例８５）の振とう後について、ＣＤスペクトルを測定した。一方上記試験例１５において得た対照液（比較例８５）の振とう前について、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液において振とうストレスを加えても二次構造が保たれていることが明らかとなった。結果を図８に示した。
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
［試験例１９］
上記試験例１７において得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例８７）の振とう後について、ＣＤスペクトルを測定した。一方上記試験例１７において得た対照液（比較例８７）の振とう前後について、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、対照液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致せず二次構造変化が生じているのに対し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液において振とうストレスを加えても二次構造が保たれていることが明らかとなった。結果を図９に示した。
【０１０１】
〔７．流動性向上を示す実施例８８〕
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例８８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６．０ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬおよび１０．０ｍｇ／ｍＬの各濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０８質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）をそれぞれ加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２０］
上記実施例８８について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、それぞれ６０．０ｍｇ／ｍＬ、８０．０ｍｇ／ｍＬおよび１００．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液について、差圧式粘度計で粘度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６０．０ｍｇ／ｍＬ、８０．０ｍｇ／ｍＬおよび１００．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８８）とし、差圧式粘度計で粘度を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液は対照液と比べて粘度が低く、流動性に優れることが示された。結果を表２３に示した。
【０１０２】
【表２３】
2015086141.tif 000024
【０１０３】
〔８．酸化ストレスに対する安定化効果を示す実施例８９、９０〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ  タンパク質濃度４０．０ｍｇ／ｍＬ＞
（実施例８９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２１］
上記実施例８９について、得たＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、９０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に０．１８％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２時間、４時間および６時間の間それぞれ３７℃に保った。また、０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを９０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ／０．１％過酸化水素とし、さらに０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼとした。これらの対照液を、同時に３７℃に保った。２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の顕著な低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における活性の低下はより軽微であり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２４に示した。
【０１０４】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ  タンパク質濃度８０．０ｍｇ／ｍＬ＞
［試験例２２］
上記実施例８９について、得たＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、９０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２、４及び６時間３７℃に保った。また、０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを９０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ／０．１％過酸化水素とし、さらに０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼとした。これらの対照液を、同時に３７℃に保った。２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の顕著な低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における活性の低下はより軽微であり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２４に示した。
【０１０５】
【表２４】
2015086141.tif 000025
【０１０６】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例９０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２３］
上記実施例９０について、得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、６０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に０．６％質量過酸化水素を０．１倍量加えることで、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２時間３７℃に保った。また、０．６質量％過酸化水素の代わりに水を０．１倍量加えることで、５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２時間３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えた。さらにトリプシンによる断片化を行ったものについて、ペプチドマッピング法による一次構造分析を行った。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９０）とし、０．６質量％過酸化水素を０．１倍量加えることで５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体／０．１％過酸化水素とし、さらに０．６質量％過酸化水素の代わりに水を０．１倍量加えることで、５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体とした。これらの対照液を、２時間３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えた。さらにトリプシンによる断片化を行ったものについて、ペプチドマッピング法による一次構造分析を行った。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下の一次構造変化率を、ピーク面積の減少率により算出した。抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例９０）における一次構造の変化率は、対照液（比較例９０）における一次構造の変化率と比べ有意に抑制されており、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。対照液における一次構造の変化率を１とした際の結果を表２５に示した。
【０１０７】
【表２５】
2015086141.tif 000026
【０１０８】
〔９．熱ストレスに対する安定化効果を示す実施例９１〜９４〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例９１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２４］
上記実施例９１について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を５分間、１５分間および３０分間、６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９１）とし、５分間、１５分間および３０分間、６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の非加熱時に対するＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性が顕著に低下したが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２６に示した。
【０１０９】
【表２６】
2015086141.tif 000027
【０１１０】
（実施例９２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを４．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）、または０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）、または０．０３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）、または０．０５質量部のポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２５］
上記実施例９２について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、４３．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液（実施例９２）について、示差走査熱量測定を行った。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを４３．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９２）とし、示差走査熱量測定を行った。各水性懸濁液または対照液の変性温度を求めたところ、対照液と比べ、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液ではより高温でタンパク質の変性が生じることが明らかとなり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２７に示した。
【０１１１】
【表２７】
2015086141.tif 000028
【０１１２】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例９３）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２６］
上記実施例９３について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．６ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を１５時間、６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１０．６ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、１５時間、６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の非加熱時に対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性残存率を求めたところ、対照液では活性が低下したが、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下が抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２８に示した。
【０１１３】
【表２８】
2015086141.tif 000029
【０１１４】
（実施例９４）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０７５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２７］
上記実施例９４について、得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液について、示差走査熱量測定を行った。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、示差走査熱量測定を行った。各水性懸濁液または対照液の変性温度を求めたところ、対照液と比べ、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではより高温でタンパク質の変性が生じることが明らかとなり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２９に示した。
【０１１５】
【表２９】
2015086141.tif 000030
【０１１６】
〔１０．凝集体抑制効果を示す実施例９５〜９８〕
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例９５）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を５．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９．４割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２８］
上記実施例９５について、得られた抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、８９．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した（実施例９５）。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を８９．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９５）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、総タンパク質量から上清部のタンパク質量を差し引くことでタンパク質の不溶性凝集体量を算出し、振とう前に対する振とう後のタンパク質の不溶性凝集体化率を求めたところ、対照液と比べて抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではタンパク質の不溶性凝集体化率が抑制されており、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集体抑制効果が示された。結果を表３０に示した。
【０１１７】
【表３０】
2015086141.tif 000031
【０１１８】
（実施例９６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を５．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９.５割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２９］
上記実施例９６について、得られた抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１１４．９ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した（実施例９６）。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を１１４．９ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９６）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、総タンパク質量から上清部のタンパク質量を差し引くことでタンパク質の不溶性凝集体量を算出し、振とう前に対する振とう後のタンパク質の不溶性凝集体化率を求めたところ、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではタンパク質凝集を認めず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集体抑制効果が示された。結果を表３１に示した。
【０１１９】
【表３１】
2015086141.tif 000032
【０１２０】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例９７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３０］
上記実施例９７について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液（実施例９７）を５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）法により凝集体数を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９７）とし、５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング法により凝集体数を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の凝集体数を非加熱時の凝集体数で除することにより、凝集体数の増加率を求めたところ、対照液における凝集体増加率と比べて、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における凝集体増加率は有意に低く、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集体抑制効果が示された。結果を表３２に示した。
［試験例３１］
上記実施例９７について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、濁度測定として波長６００ｎｍの吸光度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、濁度測定として波長６００ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の濁度を非加熱時の濁度で除することにより、濁度の増加率を求めたところ、対照液における濁度増加率と比べて、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における濁度増加率は有意に低く、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集体抑制効果が示された。結果を表３２に示した。
【０１２１】
【表３２】
2015086141.tif 000033
【０１２２】
＜抗IgＥモノクローナル抗体＞
（実施例９８）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗IgＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３２］
上記実施例９８について、得られた抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、サイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法による分析を行った（実施例９８）。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において抗IgＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９８）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、サイズ排除クロマトグラフ法による分析を行った。これらの結果より、抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、求めたところ、対照液では可溶性凝集体ピーク面積が顕著に増大したのに対し、抗IgＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では可溶性凝集体ピーク面積の増大が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集体抑制効果が示された。結果を表３３に示した。
【０１２３】
【表３３】
2015086141.tif 000034
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明は以下のいずれかの特性を有するので有用性が高い。
広範なタンパク質について、輸送時の振動や保存時の熱ストレス、酸化ストレスに対して安定である水性懸濁剤である。本発明は複合体を形成し安定化され、輸送時や保存時の安定性に優れる。本発明の複合体は限外ろ過等の特別な設備を必要とせずにタンパク質濃度を簡便に高濃度に濃縮できる。濃縮による活性の低下が少ない。本発明の水性懸濁剤は、タンパク質の等電点に応じて緩衝液のｐＨとポリアミノ酸を選択するのみで簡便にタンパク質を安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、複合体含有水性懸濁液をそのまま製剤として投与でき、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて再溶解して水性液として投与することができる。本発明の水性懸濁剤は、タンパク質が高濃度であっても粘度が低いという特徴を有するため、使用時に容器中に残存し無駄となる量を減らすことができ、また、シリンジを用いて投与する際には、同濃度のタンパク質水溶液に比べ弱い力で投与することができる。
【図１】
2015086141.tif 000035
【図２】
2015086141.tif 000036
【図３】
2015086141.tif 000037
【図４】
2015086141.tif 000038
【図５】
2015086141.tif 000039
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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