(57)【要約】【課題】シグナル増幅のための方法と試薬の提供。【解決手段】本発明は、デキストラン部分にコンジュゲートした結合部を含む試薬、このような試薬を作る方法、およびこのような試薬の種々の分子および細胞アッセイへの使用を提供する。本発明は、少なくとも一部は複数のデキストランおよびそれらの配置が検出可能試薬の一部として使用可能であるという発見に基づいている。従って、本発明は種々の検出アッセイ、例えば細胞検出アッセイに有用な、複数のデキストランを含む検出可能試薬を提供する。ある実施形態では、本発明はデキストラン成分にコンジュゲートした結合部を含む検出可能試薬を提供する。デキストラン成分は、さらに、検出可能実体に結合できる。【選択図】図８。
2015227895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年９月２３日出願の米国特許仮出願第６１／３８５，９３７号の優先権を主張する。この特許は、参照することによりその全体が組み込まれる。
発明の分野
本発明は、検出アッセイに有用な試薬、例えば、デキストラン部分にコンジュゲートした結合部を含む試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液または他の生物試料由来の希少な細胞を単離するプロセスの間に、試料に存在する可能性のある他の有核細胞の中から標的細胞を特定する必要がある。希少な細胞
を単離する場合、例えば、白血球細胞（ＷＢＣ）等の他の種々の細胞も存在する可能性がある。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離するため、標準的な方法はサイトケラチン抗体を使って上皮細胞を染色し、ＣＴＣのみを検出する目的で、抗ＣＤ４５抗体でさらに染色することにより擬陽性サイトケラチン染色細胞を除外することを含む。
【０００３】
係属中の特許文献１（この特許は、参照することによりその全体が組み込まれる）には、ＣＴＣ捕獲用の複数の抗体を使用する方法が記載されている。
【０００４】
これらの方法の有用性にもかかわらず、ＣＴＣ等の細胞の検出のために、さらなる検出試薬および方法が必要とされている。このような試薬および方法は、診断アッセイならびに他の臨床関連アッセイを可能とするであろう。
【０００５】
本発明は、生物試料中の細胞の検出のために有用な試薬と方法を記載している。例えば、本発明は生物試料中のＣＴＣなどの希少な細胞の検出に使用できる試薬と方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２５５４７９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、少なくとも一部は複数のデキストランおよびそれらの配置が検出可能試薬の一部として使用可能であるという発見に基づいている。従って、本発明は種々の検出アッセイ、例えば細胞検出アッセイに有用な、複数のデキストランを含む検出可能試薬を提供する。ある実施形態では、本発明はデキストラン成分にコンジュゲートした結合部を含む検出可能試薬を提供する。デキストラン成分は、さらに、検出可能実体に結合できる。
【０００８】
ある実施形態では、検出可能試薬のデキストラン成分は約２〜約１０のデキストラン、約４〜約８のデキストランまたは約６のデキストランを含む。各デキストランは約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量、または約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量であってもよい。ある実施形態では、デキストランは約７０ｋＤａの分子量である。
【０００９】
ある実施形態では、デキストラン成分は２つ以上のデキストランを含み、各デキストランは実質的に同じ分子量を有する。ある実施形態では、デキストラン成分は２つ以上のデキストランを含み、少なくとも１つのデキストランは別のデキストランとは異なる分子量を有する。
【００１０】
ある実施形態では、検出可能実体はフルオロフォアであり、これは緑色蛍光、オレンジ色蛍光、赤色蛍光、および遠赤外蛍光を有するフルオロフォアから選択できる。ある実施形態では、フルオロフォアは約３５０ｎｍ〜約７７５ｎｍの範囲の励起および発光スペクトルを有するフルオロフォアから選択される。ある実施形態では、フルオロフォアは約３４６ｎｍ／４４６ｎｍ、約４９４ｎｍ／５１９ｎｍ、約５５４ｎｍ／５７０ｎｍ、約５５５ｎｍ／５７２ｎｍ、約５９０ｎｍ／６１７ｎｍ、約６５１ｎｍ／６７２ｎｍ、約６７９ｎｍ／７０２ｎｍまたは約７４９ｎｍ／７７５ｎｍの励起および発光スペクトルをそれぞれ有するフルオロフォアから選択される。
【００１１】
ある実施形態では、検出可能試薬の結合部はアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、免疫試薬、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇから選択される。
【００１２】
本発明は、デキストラン成分を提供し、デキストラン成分と反応によりデキストラン−結合部複合体を形成する結合部をコンジュゲートさせ、検出可能実体をデキストラン−結合部複合体に結合させることにより検出可能試薬を作る方法を提供する。
【００１３】
本発明は、結合部をコアデキストラン−結合部を形成するデキストランにコンジュゲートさせ、コアデキストラン−結合部をデキストラン−結合部複合体を形成するデキストランと反応させ、その後、検出可能実体をコアデキストラン−結合部複合体に結合させることにより検出可能試薬を作る方法を提供する。ある実施形態では、結合部はアビジンである。
【００１４】
本発明は、請求項１に記載の検出可能試薬を標的分子を含むと疑われる試料と接触させ、結合部が標的分子に結合でき、デキストラン成分に結合した検出可能実体のシグナルを検出し、それの結果標的分子を検出または定量する、標的分子を検出または定量する方法を提供する。
【００１５】
本発明は複数の相互連結デキストランを含む試薬であって、この試薬は少なくとも２つのデキストランを含むことを特徴とする試薬を提供する。ある実施形態では、合計分子量は少なくとも５００ｋＤａである。ある実施形態では、複数の相互連結デキストランは層状配置または分岐配置として構成される。ある実施形態では、複数の相互連結デキストランは検出対象実体に結合される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
デキストラン成分にコンジュゲートした結合部を含む検出可能試薬。
（項目２）
デキストラン成分が検出可能実体に結合されている、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目３）
デキストラン成分が約２〜約１０のデキストラン、約４〜約８のデキストランまたは約６のデキストランを含む、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目４）
各デキストランが約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量、または約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量である、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目５）
デキストランが約７０ｋＤａの分子量である、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目６）
デキストラン成分が２つ以上のデキストランを含み、各デキストランが実質的に同じ分子量を有する、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目７）
デキストラン成分が２つ以上のデキストランを含み、少なくとも１つのデキストランが別のデキストランとは異なる分子量を有する、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目８）
検出対象実体がフルオロフォアである、項目２に記載の検出可能試薬。
（項目９）
フルオロフォアが緑色蛍光、オレンジ色蛍光、赤色蛍光、および遠赤外蛍光を有するフルオロフォアから選択される、項目８に記載の検出可能試薬。
（項目１０）
フルオロフォアが約３５０ｎｍ〜７７５ｎｍの範囲の励起および発光スペクトルを有するフルオロフォアから選択される、項目８に記載の検出可能試薬。
（項目１１）
フルオロフォアが約３４６ｎｍ／４４６ｎｍ、約４９４ｎｍ／５１９ｎｍ、約５５４ｎｍ／５７０ｎｍ、約５５５ｎｍ／５７２ｎｍ、約５９０ｎｍ／６１７ｎｍ、約６５１ｎｍ／６７２ｎｍ、約６７９ｎｍ／７０２ｎｍまたは約７４９ｎｍ／７７５ｎｍの励起および発光スペクトルを有するフルオロフォアから選択される、項目１０に記載の検出可能試薬。
（項目１２）
結合部がアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、免疫試薬、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇからなる群より選択される、項目１に記載の検出可能試薬。
（項目１３）
デキストラン成分を提供し、
デキストラン−結合部複合体を形成するために、デキストラン成分を結合部とコンジュゲートさせ、および
検出可能実体をデキストラン−結合部複合体に結合させること、
を含む、検出試薬を作る。
（項目１４）
コアデキストラン−結合部を形成するために、結合部をデキストランにコンジュゲートさせ、
デキストラン−結合部複合体を形成するために、コアデキストラン−結合部をデキストランと反応させ、および
検出可能実体をデキストラン−結合部複合体に結合させること、
を含む、検出試薬を作る方法。
（項目１５）
結合部がアビジンである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
項目２に記載の検出可能試薬と標的分子を含むと疑われる試料を接触させ、そこに結合部が標的分子に結合でき、および
デキストラン成分に結合した検出可能実体のシグナルを検出し、それにより、標的分子を検出または定量することを含む、標的分子を検出または定量する方法。
（項目１７）
複数の相互連結デキストランを含む試薬であって、少なくとも２つのデキストランを含む試薬。
（項目１８）
デキストランの合計分子量が少なくとも５００ｋＤａである、項目１７に記載の試薬。
（項目１９）
複数の相互連結デキストランが層状配置または分岐配置に構成されている、項目１７に記載の試薬。
（項目２０）
複数の相互連結デキストランが検出可能実体に結合されている、項目１７に記載の試薬。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】強化染色−捕獲細胞の標的細胞表面抗体この図は、マイクロチャネル上の抗体カクテルで捕獲されてた細胞を検出するために使用できる３つの異なるタイプの染色方法を示す。反応Ａでは、ＣＴＣ分野でよく使われるように、捕獲細胞は抗ＣＫで染色された。サイトケラチンは細胞質タンパク質であり、細胞は緑色蛍光染料（４８８と表記）で標識された抗サイトケラチン抗体と培養することにより染色される。反応Ｂでは、同じ細胞が４８８染料で標識されたアビジン（アビジン−４８８）を付与することによりさらに染色された。この場合、抗体は細胞質ＣＫを染色し、ビオチンで標識されていた捕獲抗体に結合することにより、アビジンがさらに細胞表面を染色した。両染色は付加的であり、より強い細胞標識を導く。この実験例を図２に示す。反応Ｃでは、細胞はサイトケラチン染色されず、アビジン−４８８のみで染色された。この場合、細胞は細胞表面上のビオチン化捕獲抗体に結合したアビジンの数のみに基づいて可視化された。この実験例を図３に示す。
【図２】染色を増強するために捕獲抗体を使うと、臨床ＣＫ＋ＣＴＣの検出が強化される。この図は、乳癌腫瘍細胞の抗体カクテルを使った捕獲、およびＣＫ染色による検出を示す（パネルＡ）。この場合染色は極めて弱かったが、背景に対し腫瘍細胞として特定されるには充分であった。いつものとおり、これらのＣＴＣ細胞は赤色蛍光標識ＣＤ４５で同時に染色され、この細胞はＣＤ４５陰性である。この細胞の位置を記録され、次にマイクロチャネルをアビジン−４８８で染色した。パネルＢはアビジン−４８８処理後のこの細胞の再配置を示し、より一層明るく染色されたことを示す。両パネルで白血球細胞（ＤＡＰＩで核染色）が観察されたが、これらの細胞は検出可能な染色が認められなかった。
【図３】細胞捕獲抗体の標識のみに基づいて血液から捕獲された添加細胞の検出。この図は、捕獲抗体の染色のみに基づく細胞検出の例を示す。この実験では、ＳＫＯＶ細胞が血液中に混ぜられ、試料がＣＴＣ捕獲用に通常のように処理された。絶対的尺度ではないが、ＳＫＯＶ細胞の核のサイズは典型的ＷＢＣの核よりも通常２〜３倍大きい。アビジン−４８８のみで染色後、ＳＫＯＶ細胞は明るく染色されたが、一方、ＷＢＣは検出可能な染色が認められなかった。これは、ＣＫ染色されていない細胞またはＣＫを含まない細胞はそれらの表面捕獲抗体の標識により検出できる可能性があることを立証した。米国特許出願第２０１００２５５４７９号に記載のように、染色は複数の抗体の使用により顕著に強化される可能性がある。
【図４】標識抗サイトケラチンおよび標識ニュートラアビジンで検出された捕獲乳癌細胞の計数。この図は、マイクロチャネル上の乳癌試料の計数を示す。この実験では、細胞を最初に、標準条件下、蛍光標識４８８抗ＣＫ抗体で染色した。緑色標識細胞を検出し、それらのマイクロチャネル上のＸ−Ｙ座標を記録した。次いで、そのチャネルを緑色蛍光標識アビジンで処理し、細胞表面上の抗体を標識した。ＣＫ染色に対する記録とは別の位置で、そのチャネルを緑色蛍光細胞に対して記録した。従って、特定された全細胞はまたＣＤ４５陰性であると判定された。バーチャートは大抵の場合にアビジンがＣＫ染色より有意に多くの細胞を検出したことを示す。同じ条件下で抗ＣＫ−４８８のアビジン−４８８との組み合わせによる同時染色実験の場合の、健康なドナー血液を使った対照実験では、検出可能な細胞が認められなかった。（データは示さず）。
【図５】ＮＡを凌駕：デキストランを使って染色を増幅。この図は、蛍光染料で標識したアビジン−デキストランコンジュゲート（検出可能実体を含む代表的検出可能試薬）を図示したものである。アビジン当たりの理論的染料の数は、アビジン単独標識よりも大きくなるであろう。
【図６】ＳＫＯＶ細胞上のＦＡＣＳ蛍光強度この図は、単一ビオチン化ＥｐＣＡＭ抗体を使って培養され、その後、（緑色蛍光標識された）アビジン−４８８およびアビジン−デキストラン−４８８を使って培養したＳＫＯＶ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。最初と二番目のバーは添加したアビジンまたはコンジュゲートを加えているが、ビオチン化ＥｐＣＡＭ抗体のない対照細胞の染色強度である。３番目のバーは、アビジン−４８８がＥｐＣＡＭ処理細胞に添加された場合の細胞の染色強度を示す。４番目のバーは、アビジン−デキストラン−４８８を使って培養した同じ細胞の染色強度を示す。これらのデータは、アビジン−デキストランコンジュゲートがアビジン−４８８単独よりも３〜４倍大きい蛍光強度を有していたことを示している。
【図７】ＡＤＳの利点ＩＩ−低ＷＢＣ染色は、ＳＫＯＶおよび白血球細胞（ＷＢＣ）に対し相対的な染色を示す。この実験では、ＳＫＯＶ細胞を血液中に混ぜ、通常通りに処理し、捕獲抗体の抗体カクテルを使ってマイクロチャネル上で捕獲した。次に、異なるチャネル中の細胞をアビジン−５４６（５４６はオレンジ蛍光染料を示す）およびアビジン−デキストラン−５４６のみで染色した。ＡおよびＣパネルでは、非常に強く染色された細胞は、オレンジ色蛍光標識された。対応するＢおよびＤの顕微鏡像はＤＡＰＩ染色細胞で、ＳＫＯＶまたはＷＢＣのいずれかの有核細胞を示した。パネルＢの場合は、１０のＤＡＰＩ陽性ＷＢＣが検出された（矢印で示す）。オレンジ色蛍光標識細胞が適切なフィルターを使って示されている画像が対応するスライドＡでは、２秒露出後、１０個のＷＢＣの内の９個が、種々のレベルのオレンジ色染色を含むものとして認められる可能性がある。同じ基準をアビジン−デキストラン処理チャネルに適用した場合は、９個のＤＡＰＩ陽性のＷＢＣがパネルＤで検出され、一方、オレンジフィルターを使った対応するパネルＣでは、２秒露出後ＷＢＣの内の１個のみがわずかに検出された。この実験は、アビジン−デキストラン染色はアビジン単独よりも細胞をより強く染色する（図６）のみならず、周辺のＷＢＣへのより低い背景染色を行うことを立証した。
【図８】７０ｋＤａ ｘ ６デキストラン＊４８８および５００ｋＤａデキストランの間の相対的蛍光。この図は、アビジンにコンジュゲートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８で蛍光標識した単一の５００ｋＤａ分子のデキストラン−アミンを使ったことを除いて同じ方法で調製したアビジン−デキストランコンジュゲート（Ｂ）と比べて、本発明のアビジン−デキストランコンジュゲート（Ａ）を使ったＳＫＯＶ細胞の標識により得られた相対的蛍光強度の比較である。各コアアビジン−デキストランコンジュゲートがアビジン分子当たり同等の重量のデキストランを含み、それぞれは同じモル過剰のＮＨＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８で誘導体化されている一方、順次調製された（相互連結デキストラン）コンジュゲートはほぼ３倍高いレベルの細胞蛍光標識を生じた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、複数のデキストランおよびそれらの配置が検出可能試薬の一部として使用可能であるという発見に基づいている。従って、本発明は種々の検出アッセイ、例えば、細胞検出アッセイに有用な複数のデキストランを含む検出可能試薬を提供する。ある実施形態では、本発明はデキストラン成分にコンジュゲートした結合部を含む検出可能試薬を提供する。デキストラン成分は、さらに検出可能実体に結合できる。
【００１８】
本発明によると、検出可能試薬のデキストラン成分は複数のデキストランの組み合わせ、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の相互連結デキストランの組み合わせのいずれかであってもよい。ある実施形態では、複数のデキストランは検出可能実体の結合部位の有用性を最大化するように構成されるか相互連結される。他の実施形態では、複数のデキストランは分岐配置で構成されるか相互連結される。他のある実施形態では、複数のデキストランは層状配置で構成されるか相互連結される。例えば、複数のデキストランは互いの上に整然と、または無秩序に積層できる。他のある実施形態では、複数のデキストランは各デキストランが少なくとももう一つのデキストランに結合されるように構成されるか相互連結される。さらに他のある実施形態では、複数のデキストランは各デキストランが少なくとも２、３、４、５つまたはそれ超の他のデキストランに結合されるように構成されるか相互連結される。
【００１９】
さらに他のある実施形態では、複数のデキストランは直接的または間接的に相互連結される。例えば、デキストランは誘導体化等の既知の方法を介して直接的に相互連結してもよい。ある実施形態では、複数のデキストランは間接的に、例えば官能基または反応性部位を導入できる実体または分子を介して相互連結される。他のある実施形態では、複数のデキストランはデキストランまたは検出可能実体を含む他の実体の結合のための官能基、例えばチオールやマレイミド基を提供できる１つまたは複数の分子を介して間接的に相互連結される。ある実施形態では、複数のデキストランは検出対象実体のために結合部位を提供することもできる１つまたは複数の実体、例えば架橋剤、タンパク質または核酸を介して間接的に相互連結される。
【００２０】
さらにある実施形態では、デキストラン成分は約２〜約４０のデキストランを含む。ある実施形態では、デキストラン成分は約２〜約３０のデキストランを含む。ある実施形態では、デキストラン成分は約２〜約２０のデキストランを含む。ある実施形態では、デキストラン成分は約２〜約１０のデキストランを含む。ある実施形態では、デキストラン成分は約４〜約８のデキストランを含む。ある実施形態では、デキストラン成分は約４、約６または約８のデキストランを含む。
【００２１】
本発明のデキストラン成分のデキストランは、多様な分子量を有してもよい。ある実施形態では、各デキストランは約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量である。ある実施形態では、各デキストランは約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量である。ある実施形態では、各デキストランは約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量である。ある実施形態では、各デキストランは約７０ｋＤａの分子量である。
【００２２】
本発明のデキストラン成分は、同様の分子量のデキストランを含んでも、または異なる分子量のデキストランの混合物を含んでもよい。ある実施形態では、各デキストランは、実質的に同じ、または同じ分子量を有する。例えば、デキストラン成分は全て１０ｋＤａのデキストラン、全て３０ｋＤａのデキストラン、全て７０ｋＤａのデキストラン、全て１００ｋＤａのデキストランまたは全て２００ｋＤａのデキストランの組み合わせでもよい。他の実施形態では、デキストラン成分は少なくとも１つのデキストランが、別のデキストランとは実質的に異なる分子量を有するデキストランの混合物を含む。例えば、デキストラン成分は１０ｋＤａのデキストラン、３０ｋＤａのデキストラン、７０ｋＤａのデキストラン、１００ｋＤａのデキストランおよび２００ｋＤａのデキストランのいずれの組み合わせでもよい。また他の実施形態では、デキストラン成分は低分子量デキストランおよび高分子量デキストランの混合物を含む。また他のある実施形態では、デキストラン成分はこれらのデキストランの合計分子量が合計で所定の分子量、例えば、約５００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、１５００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、またはそれ超になるデキストランの混合物を含む。
【００２３】
本発明のデキストラン成分は、この分野で既知の、または利用可能ないずれかの適切な方法により作製できる。例えば、デキストラン成分は標準誘導体化法を使って所望のデキストランを逐次的に誘導体化することにより作製できる。
【００２４】
検出可能実体は当業者に既知のいずれかの検出可能実体でよく、フルオロフォア、酵素（例えばペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼだがこれに限定されない）、重金属（例えば金またはフェリチンだがこれに限定されない）、標的実体の検出に使用される当業者に既知の放射性標識またはいずれかの他の分子が含まれる。検出可能実体には、蛍光検出アッセイ、酵素検出アッセイ、金検出アッセイ、放射性標識、例えば、放射性の亜リン酸（例えば、３１Ｐ、３２Ｐまたは３３Ｐ）、硫黄（例えば、３２Ｓまたは３５Ｓ）、およびジゴキシゲニン標識で使用されるものを含めてもよい。
【００２５】
ある実施形態では、検出可能実体は、フルオロフォアである。フルオロフォアは、市販されており、既知のおよび／または市販のフルオロフォアのいずれも、本発明の検出可能実体として採用可能である。ある実施形態では、フルオロフォアは緑色蛍光（例えば、４９４ｎｍ／５１９ｎｍ）、オレンジ色蛍光（例えば、５５４ｎｍ／５７０ｎｍ）、赤色蛍光（例えば、５９０ｎｍ／６１７ｎｍ）、または遠赤外蛍光（例えば、６５１ｎｍ／６７２ｎｍ）励起／発光スペクトルを示す。ある実施形態では、フルオロフォアは約３５０ｎｍ〜約７７５ｎｍの範囲の励起および発光スペクトルを有するフルオロフォアである。ある実施形態では、励起および発光スペクトルは、約３４６ｎｍ／４４６ｎｍ、約４９４ｎｍ／５１９ｎｍ、約５５４ｎｍ／５７０ｎｍ、約５５５ｎｍ／５７２ｎｍ、約５９０ｎｍ／６１７ｎｍ、約６５１ｎｍ／６７２ｎｍ、約６７９ｎｍ／７０２ｎｍまたは約７４９ｎｍ／７７５ｎｍである。
【００２６】
ある実施形態では、フルオロフォアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ７５０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ  ｄｙｅｓ）を含んでもよい。ある実施形態では、フルオロフォアはそれに限定されないが、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅｓから入手可能）を含むＣｙ染料を含んでもよい。ある実施形態では、フルオロフォアはＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０およびＤｙＬｉｇｈｔ  ８００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から入手可能）を含んでもよいがこれらに限定されない。ある実施形態では、フルオロフォアはＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ３９０、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ４８８、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ５３２、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ５４７Ｈ、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ５９４、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ６４７Ｈ、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ６８２、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ７５２およびＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ  ７８２を含んでもよいがそれらに限定されない。
【００２７】
結合部は別の分子または分子の基に結合可能ないずれかの分子または分子の基を含んでもよく、これには、限定されないが、タンパク質および核酸ベース結合部を含む。種々の結合部が当技術分野で既知であり、いずれの既知の結合部が本発明の方法での使用のために意図されてもよい。ある実施形態では、結合部はアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、免疫試薬、オリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体、ペプチドまたはそれらの誘導体、核酸またはその誘導体、ペプチド核酸またはその誘導体、ならびにそれらのタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇリガンド結合部分を含むが、それらに限定されない。免疫試薬は抗体またはその抗原結合部分を含んでもよいがそれらに限定されず、例えば、Ｆａｂ断片を含んでもよい。
【００２８】
本発明の別の態様によると、検出可能試薬を作る方法が提供される。ある実施形態では、これらの方法は複数の相互連結デキストランを用意し、相互連結デキストランを結合部とコンジュゲートさせることを含む。他のある実施形態では、これらの方法は任意選択で検出可能実体を相互連結デキストランに結合させることを含む。
【００２９】
複数の相互連結デキストランを作る方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、標準的ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）およびイミノチオランアミン誘導体化試薬を、当分野でよく知られた標準的方法に従って使用できる。複数の相互連結デキストランの結合部へのコンジュゲーションは、いずれかの当分野で既知または利用可能な適切なコンジュゲーション方法に従って行うことができる。ある実施形態では、コンジュゲーションは、２つの実体、例えば、複数の相互連結デキストランおよび結合部の間の１つ以上の共有結合または非共有結合またはこれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、結合部、例えば、アビジンをイミノチオランで誘導体化してもよい。イミノチオラン反応は当技術分野で多く報告されている（例えば、購入した市販イミノチオランと一緒に入手可能なＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのインストラクション；ならびにＴｒａｕｔ、Ｒ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２（１７）：３２６６−３２７３（１９７３）を参照）。ある実施形態では、誘導体化反応を行って、アビジン当たり３〜５チオールの置換割合を得ることができる。
【００３０】
ある実施形態では、デキストランは、よく使われるヘテロ二官能性試薬、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使ってデキストラン−アミンを形成するために誘導体化することもできる。ＳＭＣＣ反応は多く報告されており、当技術分野でよく知られている（例えば、市販品として購入されたＳＭＣＣと一緒に入手可能なＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのインストラクション；ならびにＩｓｈｉｋａｗａ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ４：２０９−３２７（１９８３）；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ３：２−１３（１９９２）；およびＭａｔｔｓｏｎ、Ｇ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７：１６７−８３（１９９３）を参照）。ある実施形態では、誘導体化反応を行い、デキストラン当たり１〜２マレイミド基を得ることができる。ある実施形態では、複数の相互連結デキストランは所望の量のデキストランの逐次的誘導体化により作ることができる。
【００３１】
検出可能実体は、種々の方法により検出可能試薬に付加または結合でき、これらの全ての方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、フルオロフォア（蛍光染料とも呼ばれることも多い）をデキストラン分子に付加または連結するためにＮＨＳ反応を採用できる。ある実施形態では、フルオロフォアはＮＨＳエステル、スクシンイミジルエステル（ＳＥ）またはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルであってもよい。市販のフルオロフォアはフルオロフォアを他の分子に付加するための詳細なインストラクションを含み、これらのフルオロフォア標識方法は当技術分野でよく知られている（例えば、購入フルオロフォアまたは他の検出対象実体と共に入手可能な製品パンフレット；ならびにＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖＤ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（２２）：４５３５−４５４２（１９９６）、核酸化学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００３；分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００２）；および免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（２００２）を参照）。
【００３２】
ある実施形態では、検出可能試薬を作る方法は結合部をデキストランとコンジュゲートさせてコアデキストラン−結合部を形成し、そのコアデキストラン−結合部を１つ以上のデキストランとコンジュゲートさせること、つまりデキストランの１つ以上の層または分岐部にコアデキストラン−結合部を逐次的に付加することを含む。得られたデキストラン−結合部複合体は、任意選択で検出可能実体に結合できる。
【００３３】
ある実施形態では、デキストランは、例えばＮＨＳエステルのアミン反応性誘導体を使う場合に、１次反応性部位を提供するために使用できる。他のある実施形態では、デキストランを、他の分子、例えば、デキストランまたは検出可能実体と反応させる、またはそれらと連結させるのに有用な２次機能性、官能基または反応性部位、例えば、チオールまたはマレイミド基を導入するために使用できる。他のある実施形態では、デキストランを使用して、例えば、デキストランまたは検出可能実体と連結させるための、さらなる官能基、反応性部位または結合部位を提供するために他の実体と反応させることができる。例えば、蛍光分子のＮＨＳエステルを使う代わりに、フィコエリトリン等のタンパク質をデキストランに結合させて、内因性蛍光標識レベルを与えることができる。別の例では、核酸を、デキストラン中に導入して、反応における他の分子のための第２の結合部位として機能させるか、またはさらなる官能性のためのプローブとして機能させることができる。
【００３４】
さらに他の実施形態では、本発明はアビジンベース検出可能試薬を作る方法を提供する。ある実施形態では、方法は、デキストラン−アミンを誘導体化してマレイミド基を生成すること、およびアビジンを誘導体化してチオール基を生成することを含んでもよい。次に、誘導体化アビジンを、あるモル比率の１つ以上の誘導体化デキストラン−アミン分子と反応させるが、この場合、誘導体化アビジンと誘導体化デキストラン−アミンの反応により、デキストラン−アビジンを生じる。次に、デキストラン−アビジンを誘導体化して、デキストラン当たり１つまたは複数のチオール基を生成し、誘導体化デキストラン−アビジンを、あるモル比率の１つまたは複数のマレイミド−誘導体化デキストランアミン分子とさらに反応させるが、この場合、誘導体化デキストラン−アビジンとマレイミド−誘導体化デキストランアミンの間の反応により、層状または分岐デキストラン−アビジン複合体を生じる。次に、任意選択で、デキストラン−アビジン複合体と、あるモル比率の１つまたは複数の検出対象実体と反応させてもよく、この場合、デキストラン−アビジン複合体と検出対象実体との反応により、本発明の検出可能試薬を生ずる。
【００３５】
ある実施形態では、アビジンをイミノチオランで誘導体化し、アビジン当たり３〜５チオールを得た。その後、よく使われるヘテロ二官能性試薬、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使って、１〜２つのマレイミド基で誘導体化された３倍モル過剰の７０ｋＤａデキストラン−アミンを添加した。アビジン−デキストランをイミノチオランでさらに誘導体化し、デキストラン当たり２〜３つのチオールの置換割合を得て、次に、元のアビジンに対し６倍モル過剰のデキストランと共にさらにインキュベートした。次に、デキストラン−アビジン複合体を、デキストランに対し１０倍過剰のＮＨＳ−フルオロフォアで標識できる。ある実施形態では、フルオロフォアは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５４６である。
【００３６】
試薬のモル比は、所望の数のマレイミド基、チオール基または検出可能実体に対する所望の標識度合を得るために調節でき、、このような変更は当技術分野でよく知られている。反応は当業者により容易に調節でき、所望の反応を得ることができる。例えば、特定の適用のための要望どおりに、特定の数のマレイミドおよびチオール基を得るために反応を変更することができる。
【００３７】
本発明はまた、標的分子の検出または定量化方法を提供する。このような方法は、本発明の検出可能試薬を標的実体を含むと疑われる、検出試薬の結合部が標的実体に結合できる試料と接触させ、その後標的分子を検出または定量するために検出可能実体シグナルを検出することを含んでいる。。標的実体はタンパク質、タンパク質の基、ペプチド、核酸または細胞を含むことができるがこれらに限定されない。
【００３８】
試料は、任意の生物学的または非生物試料を含むことができる。ある実施形態では、試料は任意の未処理または処理済細胞、組織および／またはヒト分泌試料を含む。他のある実施形態では、試料は任意の核酸、タンパク質、または未加工生物試料から部分的にまたは完全に単離または精製された細胞内成分を含んでいる。他のある実施形態では、本発明に有用な試料は血清、血液、血漿、全血およびそれらの誘導体、皮膚、髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟液、汗、涙、上皮組織、尿、精子、精液、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、および組織抽出物試料もしくは生検またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。（例えば、分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｅｄ．Ａｎｔｏｎｉａ  Ｖｌａｈｏｕ（２００８）中の、臨床的プロテオミクス：方法とプロトコル（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｖｏｌ．４２８；およびＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４３（３）：２１７−２３４（２００３）中の、Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｎ．、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｒｅｖｉｅｗｓを参照されたい。これら文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）
検出と定量に関する方法について、そういった方法は当技術分野でよく知られており、いずれの標準的方法も採用できる。当業者なら、本発明の検出可能試薬と一緒に採用される検出可能実体に基づいてどの方法を採用すべきか容易にわかるであろう。このような検出と定量プロトコルはよく知られており、いずれの標準的方法も採用可能である。（例えば、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．（２０１０）；タンパク質科学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌａｓｔ、Ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ、ＪｏｈｎＥ．、ｅｔ  ａｌ．（２０１０）；核酸化学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｅｄ．Ｅｇｌｉ、Ｍａｒｔｉｎ（２０１０）；および分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊｏｓｅｐｈ（２００１）、を参照されたい。これら全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
本発明の検出可能試薬は、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、細胞選別アッセイ（限定されないが、例えば、ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリーアッセイ、核酸アッセイ、タンパク質アッセイ、薬剤相互作用アッセイ、ミクロ流体アッセイ、希少な細胞検出もしくは定量、または当技術分野で現在使用され、報告されているいずれか他の種々の選別、検出もしくは定量アッセイと一緒に使用できる。このようなアッセイは、マニュアル式でも、自動式であってもよい。ある実施形態では、本発明の試薬は例えばマイクロチャネルまたは他のミクロ流体装置と一緒での使用が見出されている。
【００４０】
本発明の検出可能試薬は、標的実体（例えば、分子、タンパク質および／または核酸）の検出と定量に使用できる。このような標的実体には希少な細胞を含めてもよい。ある実施形態では、希少な細胞には通常の生物試料中には存在せず、疾患または異常な病態の指標として存在する可能性のある細胞を含んでもよい。ある実施形態では、これらの細胞は試料中の他の細胞より１桁以上少なく存在する。このような疾患または病態には慢性疾患（例えば癌）、傷害または妊娠を含んでもよい。ある実施形態では、希少な細胞には生物学的試料中に正常に存在するが、試料中に存在する他の細胞より１桁以上少ない頻度で存在する細胞を含んでもよい。希少な細胞は循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）、胎生細胞および幹細胞を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００４１】
種々の検出可能実体由来のシグナルを比較する方法は当技術分野でよく知られており、当業者ならこのような比較分析を実行する方法が容易にわかるであろう。強化され、増加され、および／または増幅された検出は１つ以上の検出可能実体に直接コンジュゲートした結合部、または１つ以上の検出対象実体を含む単一デキストランにコンジュゲートした結合部と比較できる。強化され、増加さえ、および／または増幅された検出は、例えば、非標的実体（例えば、白血球細胞：ＷＢＣに対し結合減少等）に対する結合減少、減少した非特異的結合、増加した検出対象実体シグナル（例えば、フルオロフォアからの増加した光シグナル、放射標識からの増加した放射性シグナル、または酵素反応からの増加した光）、ならびに増加したアッセイ感度（例えば、試料中の希少な細胞の検出レベルが高められ、それにより、さらに希少な細胞が検出できる）を含めてもよい。ＣＴＣ、胎生細胞、幹細胞または他の希少な細胞等の標的実体検出の選択性の増加はまた、本発明の検出可能試薬を使って実現できる。本発明の検出可能試薬は、試料中で検出されるＣＴＣの数を増やすことをために、臨床的試料中のＣＫ染色細胞の検出を高めるように使用でき、また同様に、種々のアッセイにおけるＣＫ染色を含まない細胞を検出するように使用できる。
【００４２】
ある実施形態では、本発明の検出可能試薬は、本発明のデキストラン成分が無い場合検出可能実体にコンジュゲートした結合部、または１つ以上の検出可能実体を含む単一のデキストランにコンジュゲートした結合部から達成される検出に比べて、強化され、増加され、および／または増幅された検出を提供する。ある実施形態では、本発明の検出可能試薬が検出可能実体にコンジュゲートした場合、検出可能試薬は、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍あるいはそれ以上のシグナルを与える。ある実施形態では、本発明の検出可能試薬が非標的実体に対する非特異的結合を減らすあるいは低下させた。ある実施形態では、減らされた非特異的結合がノイズ比に対して５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の増加した／改良されたシグナルを有する検出試薬をもたらす。
【００４３】
実施例
以下の実施例は例示のために提供されるものであり、請求項記載の発明を制限するものではない。
実施例１：蛍光標識アビジン−デキストランバイオコンジュゲートを使った、Ｂｉｏｃｅｐｔ社マイクロチャネル中の強化された細胞染色
本実施例は臨床試料中のＣＫ染色細胞の検出を強化するために使用でき、またＣＫ染色を含まない細胞の検出に使用できる代替染色用試薬と方法について記載する。強化または増幅された染色は、アビジン等の結合部を蛍光標識（フルオロフォア検出可能実体）を含むアミノ−デキストランにコンジュゲートすることにより達成された。この強化されたバージョンのアビジンは、蛍光標識アビジンよりも数倍明るく、重要なことに血液中の非標的細胞に対するより低い非特異的結合を有していた。累積的にこれは蛍光標識アビジン−デキストランは、５〜１０倍優れたシグナル対ノイズ比であることを意味した。非標的白血球細胞（ＷＢＣ）に対するより少ない非特異的結合により、これは捕獲ＣＴＣの選択的検出において別の利点を提供した。
【００４４】
蛍光標識アビジン−デキストランの調製
これらの実験では、標準ＮＨＳおよびイミノチオランアミン誘導体化試薬を使った。これらの試薬に対する基本的反応条件は、当技術分野でよく知られている。しかし、これらのコンジュゲートのそれぞれに対するインキュベーションの順序とモル比は、アビジン−デキストランコンジュゲートの最終的性能にとって重要であった。以下は、アビジン−デキストランコンジュゲートの調製のための好ましい実施形態である。アビジン当たり３〜５つのチオールの置換割合を達成するために、アビジンをイミノチオランで誘導体化した。これに、３倍モル過剰の７０ｋＤａデキストラン−アミンを添加した。このデキストラン−アミンは、よく使われるヘテロ二機能性試薬、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使って１〜２マレイミド基で誘導体化されていた。ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。アビジン−デキストランコンジュゲートができるとすぐに、デキストラン当たり２〜３つのチオールの置換割合を達成するためにイミノチオランでさらに誘導体化し、、次に元のアビジンに対し６倍モル過剰のデキストランと共にさらにインキュベートした。最終的に、このコンジュゲートを現在の試料中でデキストランに対し１０倍過剰のＮＨＳ−蛍光染料（４８８または５４６）で標識した。マレイミド、チオール基のモル比または蛍光標識度合は調節して、コンジュゲートに対する特性を変更してもよい。このプロセスは７０ｋＤａの４〜８個が結合したデキストランを有するアビジンを生ずることが見込まれ、本実施例中ではこれをアビジンベース検出可能試薬７０ｋＤａデキストランとした。
【００４５】
代替アビジン−デキストランコンジュゲート、５００ｋＤａデキストラン−アミンを使って調製した。この場合、同じ誘導体化試薬を採用した。チオール化アビジンを上述のように調製した。５００ｋＤａデキストラン−アミンもＳＭＣＣを使って記載のように誘導体化され、アビジンにコンジュゲートした。本実施例では、５００ｋＤａアビジン−デキストランコンジュゲートを、次に、７０ｋＤａデキストラン−アミンを使った逐次的プロセスで使用されたのと同様に、同じモル比過剰（１０倍）を使ってＮＨＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で蛍光標識した。この試薬は本実施例でアビジンベース試薬５００ｋＤａデキストランとする。
【００４６】
結果と考察
マイクロチャネル上で抗体カクテルにより捕獲されている細胞を検出するために、３つの異なるタイプの染色方法を使うことができる（図１参照）。反応Ａでは、ＣＴＣ分野で一般的にそのままで採用されるように、捕獲細胞を抗ＣＫで染色した。サイトケラチンは細胞質のタンパク質であり、細胞は緑色蛍光染料（４８８と表記）で標識した抗サイトケラチン抗体と共にインキュベートすることにより染色した。反応Ｂでは、同じ細胞をアビジン−４８８（４８８染料で標識したアビジン）を加えることによりさらに染色した。この場合、抗体が細胞質ＣＫを染色し、アビジンがビオチン標識捕獲抗体に結合することにより細胞表面をさらに染色した。両染色は付加的であり、より強い細胞標識を生ずる。この一例を図２で参照する。反応Ｃでは、細胞をサイトケラチンでは染色しなかったが、アビジン−４８８のみで染色した。この場合は、細胞は細胞表面のビオチン化捕獲抗体に結合したアビジンの数のみに基づいて可視化された。この実験例を図３に示す。
【００４７】
乳癌腫瘍細胞の抗体カクテルによる捕獲、およびＣＫ染色によるその検出（パネルＡ）を図２に示す。この場合、染色は極めて弱いが、腫瘍細胞として特定されるには背景に対して充分に強い。通例のように、これらのＣＴＣ細胞を赤色蛍光標識ＣＤ４５で同時に染色し、この細胞はＣＤ４５陰性である。この細胞の位置を記録し、次いでマイクロチャネルをアビジン−４８８で染色した。パネルＢはアビジン−４８８処理後のこの細胞の再配置を示し、さらにより一層明るく染色されたことを示す。両パネルで、白血球細胞（ＤＡＰＩで核染色）が観察されたが、これらの細胞は検出可能な染色が認められなかった。
【００４８】
捕獲抗体の染色のみに基づく細胞検出の例を図３に示す。この実験では、ＳＫＯＶ細胞が血液中に加えられ、試料がＣＴＣの捕獲のために処理された（例えば、米国特許出願第２０１００２５５４７９号参照）。絶対的尺度ではないが、ＳＫＯＶ細胞の核のサイズは通常典型的ＷＢＣの核よりも２〜３倍大きい。アビジン−４８８のみで染色後、ＳＫＯＶ細胞は明るく染色されたが、一方、ＷＢＣは検出可能な染色が認められなかった。これは、ＣＫ染色されていない細胞またはＣＫを含まない細胞はそれらの表面捕獲抗体の標識により検出できる可能性があることを立証した。米国特許出願第２０１００２５５４７９号に記載のように、この染色は複数の抗体の使用により顕著に強化される可能性がある。
【００４９】
マイクロチャネル上の乳癌試料の計数を図４に示す。この実験では、細胞を最初に標準条件下、蛍光標識４８８抗ＣＫ抗体で染色した。緑色標識細胞を検出し、それらのマイクロチャネル上のＸ−Ｙ座標を記録した。次いで、そのチャネルを緑色蛍光標識アビジンで処理し、細胞表面上の抗体を標識した。ＣＫ染色に対する記録以外の位置で、そのチャネルを緑色蛍光細胞に対して記録した。特定された全細胞はまたＣＤ４５陰性であると判定された。バーチャートは大抵の場合に、アビジンはＣＫ染色より有意に多くの細胞を検出したことを示す。同じ条件下で、抗ＣＫ−４８８のアビジン−４８８との組み合わせによる同時染色実験の場合の健康なドナー血液を使った対照実験では、検出可能な細胞が認められなかった。（データは示さず）。
【００５０】
蛍光染料で標識したアビジンデキストランコンジュゲート（アビジンベース検出試薬）を模式的に表現したものを図５に示す。アビジン当たりの理論的染料の数は、アビジン単独標識よりも大きくなるであろう。
【００５１】
図６に、単一ビオチン化ＥｐＣＡＭ抗体と培養し、その後アビジン−４８８（緑色蛍光標識アビジン）およびアビジン−デキストラン−４８８（アビジンベース検出試薬７０ｋＤａデキストラン）と培養したＳＫＯＶ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。最初と二番目のバーは、添加したアビジンまたはコンジュゲートを有するが、ビオチン化ＥｐＣＡＭ抗体のない対照細胞の染色強度である。３番目のバーは、アビジン−４８８がＥｐＣＡＭ処理細胞に添加された場合の細胞の染色強度を示す。４番目のバーは、アビジン−デキストラン−４８８とインキュベートした同じ細胞の染色強度を示す。これらのデータは、アビジン−デキストランコンジュゲートが、アビジン−４８８単独よりも３〜４倍大きい蛍光強度を有していたことを示している。
【００５２】
ＳＫＯＶおよび白血球細胞（ＷＢＣ）のアビジン−５４６（オレンジ蛍光標識アビジン）およびアビジン−デキストラン−５４６（アビジンベース検出試薬７０ｋＤａデキストラン）による相対的染色である。この実験では、ＳＫＯＶ細胞を血液中に加え、通常通りに処理し、捕獲抗体用の抗体カクテルを使ってマイクロチャネル上で捕獲した。次に、異なるチャネル中の細胞を、アビジン−５４６（５４６はオレンジ蛍光染料を示す）およびアビジン−デキストラン−５４６のみで染色した。ＡおよびＣパネルでは、非常に強く染色された細胞は、オレンジ色蛍光標識されている。対応するＢおよびＤの顕微鏡像は、ＤＡＰＩ染色細胞であり、ＳＫＯＶまたはＷＢＣのいずれかの有核細胞を示した。パネルＢの場合は、１０ＤＡＰＩ陽性ＷＢＣが検出された（矢印で示す）。オレンジ色蛍光標識細胞が適切なフィルターを使って示されている、画像が対応するスライドＡでは、２秒露出後、１０個のＷＢＣの内の９個が、種々のレベルのオレンジ色染色を含むものとして認められる可能性がある。同じ基準をアビジン−デキストラン処理チャネルに適用した場合は、９個のＤＡＰＩ陽性のＷＢＣがパネルＤでは検出され、一方、オレンジフィルターを使った対応するパネルＣでは、２秒露出後ＷＢＣの内の１個のみがわずかに検出された。この実験は、アビジン−デキストラン染色は、アビジン単独よりも細胞をより強く染色する（図６）のみならず、周辺のＷＢＣへの、より低い背景染色を行うことを立証した。
【００５３】
アビジンにコンジュゲートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８で蛍光標識した単一の５００ｋＤａ分子のデキストラン−アミンを使ったことを除いて同じ方法で調製したアビジン−デキストランコンジュゲート（Ｂ；アビジンベース検出試薬５００ｋＤａデキストラン）と比べて、本発明のアビジン−デキストランコンジュゲート染色（Ａ；アビジンベース検出試薬７０ｋＤａデキストラン）を使ったＳＫＯＶ細胞の標識により得られた相対的蛍光強度の比較である。各コアアビジン−デキストランコンジュゲートは、アビジン分子当たり同程度の重量のデキストランを含み、それぞれは、同じモル過剰のＮＨＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８で誘導体化されているが、順次調製された層状または分岐デキストランを含むコンジュゲートは、ほぼ３倍高いレベルの蛍光細胞標識を生じた。
【００５４】
本明細書で考察、引用した全公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。記載された特定の方法、プロトコルおよび材料は、変わってもよいので、開示された発明は、これらに限定されないことは理解されよう。また、本明細書で使用された用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付請求項のみにより限定される本発明の範囲を制限する意図はないことも理解されよう。
【００５５】
当業者なら、単に、ルーチン実験を行うだけで、本明細書記載の発明の具体的実施形態に対する多くの等価物を認識または確認できるであろう。このような等価物は、添付の請求項に包含されるべきであることが意図されている。
【図１】
2015227895.tif 000003
【図２】
2015227895.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
2015227895000001.pdf