(57)【要約】【課題】観察対象面の波長間のズレを簡単かつ確実に抑えること。【解決手段】本発明の構造化照明装置の一例は、光源からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐部と、分岐した前記２つの分岐光束による干渉縞を標本に形成する光学系と、波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束に位相差を付与する位相差付与部材とを備える。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐部と、
分岐した前記２つの分岐光束による干渉縞を標本に形成する光学系と、
波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束に位相差を付与する位相差付与部材とを備える
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項２】
請求項１に記載の構造化照明装置において、
前記分岐部は、前記２種類の射出光束を互いに異なる角度で分岐する回折光学素子であり、
前記位相差付与部材は、前記２種類の射出光束の光路が空間的に分離した箇所に配置される
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項３】
請求項２に記載の構造化照明装置において、
前記光学系は、対物レンズを含み、
前記位相差付与部材は、前記対物レンズの瞳面又は瞳共役面の近傍に配置される
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の構造化照明装置において、
前記位相差付与部材は、前記２種類の射出光束の一方に所定の位相を付与する第１の領域と、前記２種類の射出光束の他方に前記所定の位相とは異なる位相を付与する第２の領域とを有する
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項５】
請求項４に記載の構造化照明装置において、
前記第１の領域及び前記第２の領域のうち少なくとも一方の位相は、前記光軸から離れるに従って変化する
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項６】
請求項５に記載の構造化照明装置において、
前記第１の領域及び前記第２の領域のうち少なくとも一方の位相は、前記光軸から離れるほど大きく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記位相差付与部材が前記２種類の射出光束に付与する位相差は、前記２種類の射出光束の軸上色収差に相当する値に設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記位相差付与部材が前記２種類の射出光束に付与する位相差は、前記２種類の射出光束間で前記標本における焦点面を一致させる値に設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項９】
請求項１〜請求項８の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記光学系が形成する前記干渉縞は、
前記２つの分岐光束と他の１つの分岐光束との３つの分岐光束による３光束干渉縞である
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記光源は、
前記２種類の射出光束を同時又は順次に出射する
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記標本に形成される前記干渉縞の方向を複数の方向の間で切り替える切替部を更に備え、
前記位相差付与部材は、前記複数の方向毎に用意されている
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１０の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記標本に形成される前記干渉縞の方向を切り替える第１切替部と、
前記位相差付与部材の方向を切り替える第２切替部と、
を更に備えたことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１２の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト部を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明装置。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系と、
を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記光検出器が生成した画像に基づき前記標本の復調像を演算する演算部を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
標本の観察や計測の分野では、対物レンズの性能を超えた解像度を達成するために、空間変調された照明光により標本を照明して変調画像を取得し、その変調画像に含まれる変調成分を除去（復調）することにより、標本の超解像画像を生成する構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）が提案されている（例えば、特許文献１等を参照）。
【０００３】
特に、特許文献１に記載の構造化照明顕微鏡では、光源から射出した光束を回折格子で複数の光束に分岐し、それら光束を対物レンズの瞳面の互いに異なる位置へ集光し、標本の近傍で互いに干渉させ、その干渉縞を構造化照明光としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国再発行特許発明第３８３０７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今後、標本の蛍光色素が多様化されると、構造化照明顕微鏡の光源波長も多様化される必要があるが、干渉縞の干渉強度が最大となる位置（観察対象面）の光軸方向の位置は光源波長によってずれる虞がある。本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、観察対象面の波長間のズレを簡単かつ確実に抑えることのできる構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の構造化照明装置の一例は、光源からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐部と、分岐した前記２つの分岐光束による干渉縞を標本に形成する光学系と、波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束に位相差を付与する位相差付与部材と、を備える。
【０００７】
本発明の構造化照明顕微鏡装置の一例は、本発明の構造化照明装置の一例と、前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系とを備える。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、観察対象面の波長間のズレを簡単かつ確実に抑えることのできる構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置が実現する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。
【図２】回折格子１３を説明する図である。
【図３】１／２波長板１７の機能を説明する図である。
【図４】光束選択部材１８の機能を説明する図である。
【図５】１／２波長板１７及び光束選択部材１８の機能を説明する図である。
【図６】光束選択部材１８の形状を説明する図である。
【図７】並進機構１５Ａの機能を説明する図である。
【図８】回折格子１３における回折角度と波長との関係を説明する図である。
【図９】第１実施形態の位相板２００を説明する図である。
【図１０】波長λＳ、λＬに対する対物レンズ６の焦点面のズレを説明する図である。
【図１１】波長λＳの焦点面５ＡＳを波長λＬの焦点面５ＡＬに一致させるために必要な延長量Δｄｐを示す図である。
【図１２】位相遅延部２００Ｂの作用を説明する図である。
【図１３】（Ａ）は、第１実施形態の位相板２００を光軸に沿った方向（標本側）から見た図であり、（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【図１４】（Ａ）は、第１実施形態における位相板２００の変形例（回転型）を光軸Ｏに沿った方向から見た図であり、（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【図１５】（Ａ）は、第１実施形態における位相板２００の変形例（リング型）を光軸Ｏに沿った方向から見た図であり、（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【図１６】（Ａ）は、第１実施形態における位相板２００の変形例（ダブルリング型）を光軸Ｏに沿った方向から見た図であり、（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【図１７】３Ｄ−ＳＩＭに適用される光束選択部材１８’の形状を説明する図である。
【図１８】（Ａ）は、第２実施形態の位相板２００を光軸Ｏに沿った方向（標本側）から見た図であり、（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【図１９】高さρＳが異なると遅延量Δｄｐが異なることを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
【００１１】
図１は、構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。以下では構造化照明顕微鏡装置１を全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence  Microscopy）として使用する場合も併せて説明する。ＴＩＲＦＭは、蛍光性を有した試料（標本）５の表面の極めて薄い層を、観察することができる。
【００１２】
先ず、構造化照明顕微鏡装置１の構成を説明する。
【００１３】
図１に示すとおり構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、第１撮像素子３５１と、第２撮像素子３５２と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５とが備えられる。なお、照明光学系１０は落射型であり、結像光学系３０の対物レンズ６及びダイクロイックミラー７を利用して標本５の照明を行う。
【００１４】
レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７が備えられる。第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長をλＬ、第２レーザ光源１０２の波長をλＳとおき、λＬ＞λＳと仮定する。これらの第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２は、それぞれ制御装置３９によって駆動・制御される。
【００１５】
光ファイバ１１は、レーザユニット１００から射出したレーザ光を導光するために、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバによって構成される。この光ファイバ１１の出射端の光軸Ｏ方向の位置は、位置調節機構１１Ａによって調節可能である。この位置調整機構１１Ａは、制御装置３９によって駆動・制御される。なお、位置調整機構１１Ａとしては、例えば、ピエゾ素子等が用いられる。
【００１６】
照明光学系１０には、光ファイバ１１の出射端側から順に、コレクタレンズ１２と、偏光板２３と、光束分岐部１５と、集光レンズ１６と、位相板２００と、光束選択部２４と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。
【００１７】
なお、光ファイバ１１として偏波面保存型のシングルモードファイバを使用した場合は、光ファイバ１１の前後でレーザ光の偏波面が保存されるので、偏光板２３は非必須であるが、レーザ光の偏光の品質を保つためには有効である。一方、光ファイバ１１としてマルチモードファイバを使用した場合、偏光板２３は必須である。
【００１８】
光束分岐部１５には、回折光学素子（回折格子）１３と、並進機構１５Ａとが備えられ、光束選択部２４には、１／２波長板１７と、光束選択部材１８と、回動機構２４Ａとが備えられる。なお、並進機構１５Ａ、回動機構２４Ａは、制御装置３９によって駆動・制御される。
【００１９】
結像光学系３０には、標本５の側から順に、対物レンズ６と、ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２と、第２ダイクロイックミラー３５と、が配置される。
【００２０】
標本５は、例えば、平行平板状のガラス表面に配置された蛍光性の細胞（蛍光色素で染色された細胞）や、シャーレ内に存在する蛍光性の生体細胞（蛍光色素で染色された動く細胞）などの細胞である。この細胞には、波長λＬの光によって励起される第１蛍光領域と、波長λＳの光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。なお、第１蛍光領域は、波長λＬの光に応じて中心波長λＬ’の第１蛍光を発生させ、第２蛍光領域は、波長λＳの光に応じて中心波長λＳ’の第２蛍光を発生させる。
【００２１】
構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用される場合、対物レンズ６は、液浸型（油浸型）の対物レンズとして構成される。つまり、対物レンズ６と標本５のガラスとの間隙は、浸液（油）で満たされる。
【００２２】
第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等からなる二次元の撮像素子である。第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々は、制御装置３９によって駆動されると、第１撮像素子３５１の撮像面３６１、第２撮像素子３５２の撮像面３６２の各々に形成された像を撮像し、画像を生成する。これら第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々が生成した画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。
【００２３】
なお、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々のフレーム周期（撮像の繰り返し周期）は、撮像素子の撮像時間（すなわち電荷蓄積及び電荷読出に要する時間）、干渉縞の方向切り換えに要する時間、その他の所要時間のうち、律速によって定められる。
【００２４】
制御装置３９は、レーザユニット１００、位置調整機構１１Ａ、並進機構１５Ａ、回動機構２４Ａ、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２を駆動・制御する。
【００２５】
画像記憶・演算装置４０は、制御装置３９を介して与えられた画像に対して演算を施し、演算後の画像を不図示の内部メモリに格納すると共に、画像表示装置４５へ送出する。
【００２６】
次に、構造化照明顕微鏡装置１におけるレーザ光の振る舞いを説明する。
【００２７】
第１レーザ光源１０１から射出した波長λＬのレーザ光（第１レーザ光）は、シャッタ１０３１を介してミラー１０５へ入射すると、ミラー１０５を反射し、ダイクロイックミラー１０６へ入射する。一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λＳのレーザ光（第２レーザ光）は、シャッタ１０３２を介してビームスプリッタ１０６へ入射し、第１レーザ光と統合される。ダイクロイックミラー１０６から射出した第１レーザ光及び第２レーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射する。なお、制御装置３９がレーザユニット１００を制御すると、光ファイバ１１の入射端に入射するレーザ光の波長（＝光源波長）を、長い波長λＬと短い波長λＳとの間で切り替えたり、光源波長を長い波長λＬと短い波長λＳとの双方に設定したりすることができる。
【００２８】
光ファイバ１１の入射端に入射したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換され、偏光板２３を介して回折格子１３へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これら各次数の回折光束（以下、「回折光束群」と称す）は、集光レンズ１６に入射すると、集光レンズ１６によって瞳共役面６Ａ’の互いに異なる位置に集光される。
【００２９】
ここで、瞳共役面６Ａ’は、フィールドレンズ２７及びレンズ２５に関して対物レンズ６の瞳６Ａ（±１次回折光が集光する位置）と共役な位置のことである。集光レンズ１６は、集光レンズ１６の焦点位置（後ろ側焦点位置）が瞳共役面６Ａ’と一致するように配置されている。但し、ここでいう「共役な位置」の概念には、当業者が対物レンズ６、フィールドレンズ２７、レンズ２５の収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれるものとする。
【００３０】
なお、光ファイバ１１から射出したレーザ光は基本的に直線偏光しているので、偏光板２３は、省略することも可能であるが、余分な偏光成分を確実にカットするために有効である。また、レーザ光の利用効率を高めるため、偏光板２３の軸は、光ファイバ１１から射出したレーザ光の偏光方向に一致していることが望ましい。
【００３１】
瞳共役面６Ａ’に向かった各次数の回折光束は、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された位相板２００を介して、同じく瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された光束選択部２４へ入射する。
【００３２】
ここで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用される場合、光束選択部２４は、入射した各次数の回折光束のうち、１対の回折光束のみ（ここでは±１次回折光束のみ）を選択的に通過させる。
【００３３】
光束選択部２４を通過した±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で回折格子１３と共役な面を形成する。その後、±１次回折光束の各々は、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、さらに励起フィルタ２８を経てからダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａ上の互いに異なる位置に集光する。なお、励起フィルタ２８には、これまでの光路で発生する自家蛍光などを除去する機能がある。
【００３４】
瞳面６Ａ上に集光した±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から射出される際には平行光束となり、標本５の表面で互いに重なり合い、干渉縞を形成する。この干渉縞が、構造化照明光として使用される。
【００３５】
また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用される場合、標本５の表面に入射する際の入射角度は、エバネッセント場の生成条件（全反射条件）を満たすべきである。以下、全反射条件を「ＴＩＲＦ条件」と称す。
【００３６】
ＴＩＲＦ条件を満たすためには、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点は、瞳面６Ａの最外周に位置する所定の輪帯状領域に位置していればよい。この場合、標本５の表面近傍には、干渉縞によるエバネッセント場が生起する。
【００３７】
このような干渉縞により標本５を照明すると、干渉縞の周期構造と標本５上の蛍光領域の周期構造との差に相当するモアレ縞が現れるが、このモアレ縞においては、蛍光領域の高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す蛍光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かうことになる。よって、干渉縞により標本５を照明すると、蛍光領域の高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達される。
【００３８】
標本５で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー７とバリアフィルタ３１を透過し、第２ダイクロイックミラー３５へ入射する。第２ダイクロイックミラー３５へ入射した波長λＬ’の第１蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を反射し、第２ダイクロイックミラー３５へ入射した波長λＳ’の第２蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を透過する。
【００３９】
第２ダイクロイックミラー３５を反射した第１蛍光は、第１撮像素子３５１の撮像面３６１上に第１蛍光領域の変調像を形成し、第２ダイクロイックミラー３５を透過した第２蛍光は、第２撮像素子３５２の撮像面３６２上に第２蛍光領域の変調像を形成する。
【００４０】
撮像面３６１に形成された第１蛍光領域の変調像、撮像面３６２に形成された第２蛍光領域の変調像は、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２によって個別に画像化され、第１蛍光領域の変調画像、第２蛍光領域の変調画像としてそれぞれ出力される。
【００４１】
第１蛍光領域の変調画像と、第２蛍光領域の変調画像とは、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。さらに、取り込まれた第１蛍光領域の変調画像と、第２蛍光領域の変調画像との各々には、画像記憶・演算装置４０において公知の復調演算が施され、第１蛍光領域の復調画像（超解像画像）と、第２蛍光領域の復調画像（超解像画像）とが生成される。そして、これらの超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へと送出される。なお、公知の復調演算としては、例えば、米国特許第８１１５８０６号明細書に開示された方法が用いられる。
【００４２】
次に、回折格子１３を詳しく説明する。
【００４３】
図２（Ａ）は、回折格子１３を光軸Ｏ方向から見た図であり、図２（Ｂ）は、±１次回折光束が瞳共役面に形成する集光点の位置関係を示す図である。なお、図２（Ａ）は模式図であるため、図２（Ａ）に示した回折格子１３の構造周期は実際の構造周期と同じとは限らない。
【００４４】
図２（Ａ）に示すように、回折格子１３は、照明光学系１０の光軸Ｏと垂直な面内において互いに異なる複数方向にかけて周期構造を有した回折格子である。この回折格子１３の材質は、例えばガラスである。ここでは、回折格子１３は、１２０°ずつ異なる第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々にかけて周期構造を有した３方向回折格子であって、その周期構造の周期は、それら３つの方向の間で共通と仮定する。
【００４５】
なお、回折格子１３の周期構造は、濃度（透過率）を利用して形成された濃度型の周期構造、または段差（位相差）を利用して形成された位相型の周期構造の何れであってもよいが、位相差型の周期構造の方が＋１次回折光の回折効率が高いという点で好ましい。
【００４６】
このような回折格子１３に入射した平行光束は、第１方向Ｖ１にかけて分岐した第１回折光束群と、第２方向Ｖ２にかけて分岐した第２回折光束群と、第３方向Ｖ３にかけて分岐した第３回折光束群とに変換される。
【００４７】
第１回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
【００４８】
同様に、第２回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
【００４９】
同様に、第３回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
【００５０】
これら第１回折光束群の±１次回折光束、第２回折光束群の±１次回折光束、第３回折光束群の±１次回折光束は、前述した集光レンズ１６により、瞳共役面内の互いに異なる位置に集光される。
【００５１】
そして、図２（Ｂ）に示すように、第１回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｄ、１４ｇは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点１４ｄ、１４ｇの配列方向は第１方向Ｖ１に対応している。
【００５２】
また、第２回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｃ、１４ｆは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点１４ｃ、１４ｆの配列方向は、第２方向Ｖ２に対応している。なお、第２回折光束群の集光点１４ｃ、１４ｆから光軸Ｏまでの距離は、第１回折光束群の集光点１４ｄ、１４ｇから光軸Ｏまでの距離と同じである。
【００５３】
また、第３回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｂ、１４ｅは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点１４ｂ、１４ｅの配列方向は、第３方向Ｖ３に対応している。なお、第３光束群の集光点１４ｂ、１４ｅから光軸Ｏまでの距離は、第１回折光束群の集光点１４ｄ、１４ｇから光軸Ｏまでの距離と同じである。
【００５４】
ここで、光ファイバ１１から射出されるレーザ光の波長をλ、回折格子１３の構造周期をＰ、レンズ１６の焦点距離をｆｃとすると、光軸Ｏから集光点１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆ、１４ｇまでの距離Ｄは下記の式で表される。
【００５５】
Ｄ∝２ｆｃλ／Ｐ
したがって、レーザ光の波長を変更すると、光軸Ｏから集光点１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆ、１４ｇまでの距離にズレが生じる。
なお、ここでいう集光点とは、最大強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置をいう。そのため、本実施形態の照明光学系１０は、完全な集光点が形成されるまで光束を集光する必要はない。
【００５６】
そして、以上の回折格子１３は、ピエゾモータ等からなる並進機構１５Ａ（図１参照）によって並進移動可能である。並進機構１５Ａによる回折格子１３の並進移動の方向は、照明光学系１０の光軸Ｏと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々に対して非垂直な方向である。この方向に回折格子１３が並進移動すると、干渉縞の位相がシフトする（詳細は後述）。
【００５７】
次に、１／２波長板１７及び光束選択部材１８の機能を詳しく説明する。
【００５８】
図３は、１／２波長板１７の機能を説明する図であり、図４は、光束選択部材１８の機能を説明する図である。
【００５９】
図３に示すとおり、１／２波長板１７は、入射した各次数の回折光束の偏光方向を設定する波長板であって、図４に示すとおり、光束選択部材１８は、第１〜第３回折光束群のうち何れか１群の±１次回折光束のみを選択的に通過させるマスクである。
【００６０】
これらの１／２波長板１７及び光束選択部材１８は、回動機構２４Ａ（図１参照）によって光軸Ｏの周りに回動可能である。
【００６１】
回動機構２４Ａには、例えば、光束選択部材１８の周りに形成された第１の歯車と、第１の歯車に噛み合う不図示の第２の歯車と、第２の歯車に連結された不図示のモータ（回転モータ）とが備えられる。このモータが駆動されると第２の歯車が回転し、その回転力が第１の歯車へと伝達され、光束選択部材１８が光軸Ｏの周りに回転する。
【００６２】
回動機構２４Ａは、光束選択部材１８を回動させることにより、選択される±１次回折光束を第１〜第３回折光束群の間で切り替えると共に、光束選択部材１８に連動して１／２波長板１７を回動させることにより、選択された±１次回折光束が標本５に入射するときの偏光方向をＳ偏光に保つ。つまり、１／２波長板１７及び光束選択部材１８は、干渉縞の状態を保ちつつ、干渉縞の方向を切り替える。以下、縞の状態を保つための条件を具体的に説明する。
【００６３】
先ず、１／２波長板１７の進相軸（速い軸）の向きは、選択される±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ１〜第３方向Ｖ３のいずれか）に対して±１次回折光束の偏光方向が垂直となるように設定される必要がある。なお、ここでいう1／２波長板１７の進相軸とは、その軸の方向に偏光した光が１／２波長板１７を通過するときの位相遅延量が最小となるような方向のことである。
【００６４】
また、光束選択部材１８の開口パターンは、同一の回折光束群に属する±１次回折光束の一方及び他方を個別に通過させる第１の開口部１９及び第２の開口部２０からなり、これら第１の開口部１９と第２の開口部２０との各々の光軸Ｏ周りの長さは、前述した方向に直線偏光した回折光束が通過できるような長さに設定されている。よって、第１の開口部１９及び第２の開口部２０の各々の形状は、部分輪帯状（扇状）に近い形状である。
【００６５】
ここで、図３（Ａ）に示すように、１／２波長板１７の進相軸の方向が偏光板２３の軸の方向と平行になるときの１／２波長板１７の回転角を、１／２波長板１７の回転角の基準とする（以下、「第１の基準位置」と称する。）。
【００６６】
また、光束選択部材１８の光束選択方向（＝選択される±１次回折光束の分岐方向）が、偏光板２３の軸の方向と垂直になるときの光束選択部材１８の回転角を、光束選択部材１８の回転角の基準とする（以下、「第２の基準位置」と称する。）。
【００６７】
このとき、図３（Ｂ）に示すように、１／２波長板１７の第１基準位置からの回転角は、光束選択部材１８の第２基準位置からの回転角の２分の１に制御されるべきである。
【００６８】
すなわち、１／２波長板１７の第１基準位置からの回転角がθ／２であるときには、光束選択部材１８の第２基準位置からの回転角は、θに設定される。
【００６９】
したがって、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第１回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第１方向Ｖ１）を選択するために、図４（Ａ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ１だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ１／２だけ回転させる。
【００７０】
このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）中に破線両矢印で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ１だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ１）に対して垂直となる。
【００７１】
また、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第２回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第２方向Ｖ２）を選択するために、図４（Ｂ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ２だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ２／２だけ回転させる。
【００７２】
このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ２だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第２方向Ｖ２）に対して垂直となる。
【００７３】
また、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第３回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第３方向Ｖ３）を選択するために、図４（Ｃ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から左方（標本側から見て。以下同じ）に回転角θ３だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から左方に回転角θ３／２だけ回転させる。
【００７４】
このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、左方に回転角θ３だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）に実両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第３方向Ｖ３）に対して垂直となる。
【００７５】
したがって、回動機構２４Ａは、１／２波長板１７及び光束選択部材１８をギア比２：１で連動すればよい。
【００７６】
なお、以上の説明では、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために回動可能な１／２波長板１７を使用したが、回動可能な１／２波長板１７の代わりに固定配置された液晶素子を使用し、その液晶素子を１／２波長板１７として機能させてもよい。液晶素子の配向を電気的に制御すれば、液晶素子の屈折率異方性を制御することができるので、１／２波長板としての進相軸を光軸周りに回転させることができる。因みに、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つための方法は他にもある。
【００７７】
図５は、以上説明した１／２波長板１７及び光束選択部材１８の機能を説明する図である。なお、図５において円形枠で囲まれた両矢線は、光束の偏光方向を示し、四角枠で囲まれた両矢線は、光学素子の軸方向を示している。
【００７８】
また、図６に示すように、光束選択部材１８の外周部には、複数の（図６に示す例では６個の）切り欠き２１が形成されており、回動機構２４Ａには、これらの切り欠き２１を検出するためのタイミングセンサ２２が備えられている。これによって、回動機構２４Ａは、光束選択部材１８の回動角、ひいては１／２波長板１７の回動角を検知することができる。
【００７９】
次に、並進機構１５Ａ（図１参照）の機能を詳しく説明する。
【００８０】
図７は、並進機構１５Ａの機能を説明する図である。
【００８１】
先ず、上述した復調演算を可能とするためには、例えば、同一の標本５に関する変調画像であって、干渉縞の位相の異なる複数枚の変調画像が使用される。なぜなら、構造化照明顕微鏡装置１が生成する変調画像には、標本５の蛍光領域の構造のうち、干渉縞により空間周波数の変調された構造情報である０次変調成分、＋１次変調成分、−１次変調成分が含まれており、それら３つの未知パラメータを復調演算で既知とする必要があるからである。
【００８２】
そこで、並進機構１５Ａは、干渉縞の位相をシフトするために、図７（Ａ）に示すように、照明光学系１０の光軸Ｏと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の全てに対して非垂直な方向（ｘ方向）にかけて回折格子１３をシフトさせる。
【００８３】
但し、干渉縞の位相を所望のシフト量φだけシフトさせるのに必要な回折格子１３のシフト量Ｌは、光束選択部２４による光束選択方向が第１方向Ｖ１であるときと、第２方向Ｖ２であるときと、第３方向Ｖ３であるときとでは、同じとは限らない。
【００８４】
図７（Ｂ）に示すとおり、回折格子１３の第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々の構造周期をＰとおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第１方向Ｖ１とのなす角をθ１とおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第２方向Ｖ２とのなす角をθ２とおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第３方向Ｖ３とのなす角をθ３とおくと、光束選択方向が第１方向Ｖ１であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ１は、Ｌ１＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ１｜）で表され、光束選択方向が第２方向Ｖ２であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ２は、Ｌ２＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ２｜）で表され、光束選択方向が第３方向Ｖ３であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ３は、Ｌ３＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ３｜）で表される。
【００８５】
すなわち、干渉縞の位相シフト量を所望の値φとするために必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌは、波長選択方向（第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の何れか）とｘ方向とのなす角θにより式（１）のとおり表される。
【００８６】
Ｌ＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ｜）  …（１）
因みに、干渉縞の位相シフト量φを２πとするために必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌは、Ｐ／（ａ×２×｜ｃｏｓθ｜）となる。これは、回折格子１３の半周期に相当する量である。つまり、回折格子１３を半周期分シフトさせるだけで、干渉縞の位相を１周期分シフトできる（なぜなら、±１次回折光からなる干渉縞の縞周期は、回折格子１３の構造周期の２倍に相当する。）。
【００８７】
但し、ａ＝１（Ｍ＝１、２のとき）、ａ＝２（Ｍ＝３のとき）である。Ｍは、回折格子１３が有する周期構造の方向数である（本実施形態ではＭ＝３、ａ＝２である。）。
【００８８】
次に、本実施形態のレーザユニット１００、対物レンズ６、回折格子１３、位相板２００を詳しく説明する。
【００８９】
先ず、レーザユニット１００に搭載された第１レーザ光源１０１の波長λＬは、可視光域に属する５６１ｎｍであるのに対して、第２レーザ光源１０２の波長λＳは、紫外光域に属する４０５ｎｍであると仮定する。
【００９０】
一方、対物レンズ６の軸上色収差の補正波長域は、４３５ｎｍ〜６５６ｎｍの範囲であって、ｄ線（＝５８８ｎｍ）を基準として補正されていると仮定する。
【００９１】
つまり、対物レンズ６の軸上色収差の補正波長域は、第１レーザ光源１０１の波長λＬ（＝５６１ｎｍ）をカバーしているものの、第２レーザ光源１０２の波長λＳ（＝４０５ｎｍ）をカバーしていないと仮定する。
【００９２】
この場合、波長λＳ（＝４０５ｎｍ）に対する対物レンズ６の軸上色収差量は、標本側で、例えば数μｍ程度となる。
【００９３】
このため、光軸Ｏ方向において干渉縞の干渉強度が最大となる位置（観察対象面）は、波長λＬ（＝５６１ｎｍ）と波長λＳ（＝４０５ｎｍ）との間でずれてしまう。
【００９４】
因みに、このズレを抑えるために、例えば、使用波長を波長λＬ（＝５６１ｎｍ）と波長λＳ（＝４０５ｎｍ）との間で切り替える度に、光ファイバ１１の出射端又は回折格子１３の光軸Ｏ方向の位置調整を行うという方法も考えられる。
【００９５】
しかし、この方法だと、位置調整の手間が掛かるばかりか、波長λＬ（＝５６１ｎｍ）による観察と、波長λＳ（＝４０５ｎｍ）による観察とを同時に行うことができないという難点がある。
【００９６】
そこで、本実施形態では、図８（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり、回折格子１３における回折角度が、波長λＬ（＝５６１ｎｍ）の±１次回折光束と、波長λＳ（＝４０５ｎｍ）の±１次回折光束との間で異なるため、波長λＬ（＝５６１ｎｍ）の±１次回折光束の集光点と、波長λＳ（＝４０５ｎｍ）の±１次回折光束の集光点とが、ずれることを利用する。
【００９７】
具体的に、回折格子１３の構造周期（ピッチ）をｐとおくと、波長λＬの±１次回折光束の回折角度θＬ、波長λＳの±１次回折光束の回折角度θＳは、以下のとおり表される。
【００９８】
ｓｉｎθＬ＝λＬ／ｐ、
ｓｉｎθＳ＝λＳ／ｐ
そして、レンズ１６の焦点距離をｆ１６とおくと、波長λＬの±１次回折光束が瞳共役面６Ａ’に形成する集光点ＰＬの光軸Ｏからの高さｈＬ、波長λＳの±１次回折光束が瞳共役面６Ａ’に形成する集光点ＰＳの光軸Ｏからの高さｈＳは、以下のとおり表される。
【００９９】
ｈＬ＝ｆ１６×ｓｉｎθＬ、
ｈＳ＝ｆ１６×ｓｉｎθＳ
これを利用し、本実施形態では、瞳共役面６Ａ’に位相板２００を配置することで、波長λＳの±１次回折光束の位相と、波長λＬの±１次回折光束の位相とに、位相差を付与する。つまり、本実施形態では、波長λＳの集光点ＰＳの近傍における位相板２００の位相遅延量を、波長λＬの集光点ＰＬの近傍における位相板２００の位相遅延量よりも大きく設定する。換言すると、本実施形態では、波長λＳの±１次回折光束の光路長と、波長λＬの±１次回折光束の光路長とに、光路長差を付与する。
【０１００】
このような機能を持った位相板２００としては、例えば図９に示すような構成の位相板２００が挙げられる。
【０１０１】
この位相板２００は、波長λＬ、λＳに対して透明な平行平板からなる基板２００Ａ上に、波長λＬ、λＳに対して透明な位相遅延部２００Ｂを、部分的に形成したものである。基板２００Ａの材質は、例えばガラスであり、位相遅延部２００Ｂは、例えばＳｉＯ２などの薄膜によって構成される。
【０１０２】
なお、基板２００Ａに対する位相遅延部２００Ｂの形成には、例えば、エッチングや蒸着などの技術が適用されることが望ましい。エッチングや蒸着などの技術によれば、位相遅延部２００Ｂの形状及び厚さの設定を、十分な精度で行うことができるからである。
【０１０３】
また、基板２００Ａにおける位相遅延部２００Ｂの形成先は、波長λＳの±１次回折光束の集光点ＰＳをカバーし、かつ、波長λＬの±１次回折光束の集光点ＰＬから外れている。また、基板２００Ａにおける位相遅延部２００Ｂの形成先は、０次回折光束の集光点Ｐ０（波長λＳと波長λＬとの間で共通）から外れている。
【０１０４】
なお、位相遅延部２００Ｂの形成先を０次回折光束の集光点Ｐ０から外した理由は、構造化照明顕微鏡装置１が３Ｄ−ＳＩＭ（後述）として使用される場合を想定したからである。３Ｄ−ＳＩＭでは、±１次回折光束だけでなく０次回折光束も標本５へ導光する必要がある。
【０１０５】
また、位相遅延部２００Ｂの光軸Ｏ方向の厚さｄｃは、波長λＳ、λＬに対する照明光学系１０の焦点面のズレ（標本側の焦点面のズレ）を打ち消すような値に予め設定されている。
【０１０６】
ここで、波長λＳ、λＬに対する照明光学系１０の焦点面のズレとは、照明光学系１０に固有の軸上色収差（＝Δｄｃがゼロであるときに集光レンズ１６から対物レンズ６までの光学系で発生する軸上色収差）に起因したズレのことである。
【０１０７】
但し、照明光学系１０に固有の軸上色収差は、対物レンズ６に固有の軸上色収差によってほぼ決まる。
【０１０８】
よって、以下では簡単のため、対物レンズ６以外の光学系（レンズ１６、２５、２７）に起因する軸上色収差をゼロとみなし、対物レンズ６に固有の軸上色収差のみを検討する。
【０１０９】
さて、対物レンズ６に固有の軸上色収差の補正波長域は、前述したとおり、波長λＬをカバーしているのに対して、波長λＳをカバーしておらず、波長λＳに対する対物レンズ６の軸上色収差は、標本側で数μｍ程度である。
【０１１０】
よって、本実施形態における位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃは、その数μm程度の軸上色収差を補正できるような値に設定されればよい。
【０１１１】
次に、対物レンズ６の軸上色収差と位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃとの関係を詳しく説明する。
【０１１２】
図１０は、波長λＳ、λＬに対する対物レンズ６の焦点面のズレを説明する図である。
【０１１３】
ここでは簡単のため、瞳共役面６Ａ’から瞳面６Ａまでの倍率を１と仮定する。この場合、瞳面６Ａのサイズが瞳共役面６Ａ’のサイズと等しくなり、瞳共役面６Ａ’に投影される位相板２００の像（不図示）のサイズも位相板２００のサイズと等しくなり、瞳面６Ａにおける波長λＬの±１次回折光の集光点ＰＬの高さはｈＬとなり、瞳面６Ａにおける波長λSの±１次回折光の集光点ＰSの高さはｈSとなる。
【０１１４】
なお、前述したように集光点は、完全な集光点である必要はなく、通常所定の大きさ（面積）を有するので、位相遅延部２００Ｂの大きさ（面積）は、所定の大きさを有した集光点をカバーできる程度に確保される必要がある。
【０１１５】
また、図１０では、対物レンズ６の標本側の焦点面が波長λＬ、λＳの間でずれていることを明確化するために、＋１次回折光束の光路（波長λＬ、λＳの間で非共通）と共に、標本５に向かう０次回折光束（波長λＳと波長λＬとの間で共通）の光路も描いた。
【０１１６】
先ず、図１０に示すとおり、波長λＬの光による対物レンズ６の焦点面を５ＡＬとおき、波長λＳの光による対物レンズ６による焦点面を５ＡＳとおく。
【０１１７】
また、図１０に示すとおり、波長λＬの焦点面５ＡＬを基準とした、波長λＳの焦点面５ＡＳのズレを、Δｄｏとおく。
【０１１８】
本実施形態では、このズレΔｄｏをゼロとするために、波長λＳの±１次回折光束の光路にのみ位相遅延部２００Ｂを配置し、標本側から見た集光点ＰＳの光軸Ｏ方向の仮想距離を延長する。
【０１１９】
図１１は、波長λＳの焦点面５ＡＳを波長λＬの焦点面５ＡＬに一致させるために必要な延長量Δｄｐを示す図である。この延長量Δｄｐは、「デフォーカス収差の式」よって以下のとおり表される。
【０１２０】
【数１】
2015049467.tif 000003
【０１２１】
なお、遅延量Δｄｐの単位は、波長λＳの位相の単位とした。また、ρＳは、集光点ＰＳの高さｈＳを開口数の単位で表したものであり、ｎｏは、対物レンズ６の標本側の媒質（ここでは浸液）の屈折率である。
【０１２２】
一方、位相遅延部２００Ｂの厚さをｄｃとおき、位相遅延部２００Ｂの屈折率をｎｃとおくと、位相遅延部２００Ｂが波長λＳの光に与える位相遅延量Δｄは、以下のとおり表わされる。
【０１２３】
【数２】
2015049467.tif 000004
【０１２４】
したがって、本実施形態では、ΔｄがΔｄｐに一致するように位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃを設定すればよい。つまり、位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃは、以下の式（３）を満たすように設定されればよい。
【０１２５】
【数３】
2015049467.tif 000005
【０１２６】
この設定によると、図１２に示すとおり、標本側から見た集光点ＰＳの仮想距離が適度に延長され、波長λＳの焦点面５ＡＳが波長λＬの焦点面５ＡＬに一致する。なお、図１２において符号Ｐｓ’で示すのは、標本側から見た集光点ＰＳの虚像である。
【０１２７】
したがって、例えば、波長λＳ、λＬの焦点面５ＡＳ、５ＡＬのズレΔｄｏが０．２ｍｍであり、浸液の屈折率ｎｏが１．５１５であり、位相遅延部２００Ｂの屈折率ｎｃが１．５１６８であり、集光点ＰＳの高さρＳが１．４であったならば、式（３）より、位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃは０．３６ｍｍに設定されればよいことがわかる。このような厚さの位相遅延部２００Ｂは、エッチングや蒸着などの従来技術によって十分に製作可能である。
【０１２８】
なお、式（３）を満たすように位相遅延部２００Ｂの厚さｄｃを設定すれば、理論的には、互いに異なる波長の焦点面を完全に一致させることができるが、複数波長間の焦点面のズレは、光軸方向の分解能の約１／４までなら許容でき、具体的には、標本５において約６０ｎｍまでなら許容でき、この程度のズレであれば、焦点面は一致しているとみなせる。
【０１２９】
ところで、本実施形態では、干渉縞の方向を上述した３方向（第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３）の間で切り替える。それに対応するため、位相板２００には、上述した構成の位相遅延部２００Ｂが、それら３方向の各々について形成されているものとする（図１３参照）。
【０１３０】
図１３（Ａ）は、位相板２００を光軸Ｏに沿った方向（標本側）から見た図であり、図１３（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【０１３１】
この例では、位相遅延部２００Ｂが３方向（第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３）の各々に亘って形成されており、そのうち或る位相遅延部２００Ｂは、分岐方向が第１方向Ｖ１である１対の集光点ＰＳをカバーし、他の位相遅延部２００Ｂは、分岐方向が第２方向Ｖ２である１対の集光点ＰＳをカバーし、残りの位相遅延部２００Ｂは、分岐方向が第３方向Ｖ３である１対の集光点ＰＳをカバーしている。
【０１３２】
［第１実施形態の変形例］
なお、第１実施形態では、位相板２００の配置先を、図１に示したとおり瞳共役面６Ａ’の近傍としたが、瞳面６Ａの近傍としてもよいことは言うまでもない。少なくとも位相板２００の配置先は、波長λＳの±１次回折光束の光路と、波長λＬの±１次回折光束の光路とが空間的に分離されている箇所であればよい。
【０１３３】
また、第１実施形態では、複数の光束間に位相差を付与するために、基板２００Ａ上に位相遅延部２００Ｂを形成してなる位相板２００を光路へ配置したが、位相遅延部２００Ｂのみからなる位相板（つまり、基板を有しない位相板）を光路へ配置してもよい。
【０１３４】
また、第１実施形態では、波長λＬの±１次回折光束の位相遅延量と波長λＳの±１次回折光束の位相遅延量とに差異を付けるために、波長λＬの±１次回折光束の光路と波長λＳの±１次回折光束の光路との一方にのみ位相遅延部２００Ｂを挿入したが、波長λＬの±１次回折光束の光路と波長λＳの±１次回折光束の光路との双方に位相遅延部２００
Ｂを挿入してもよい。
【０１３５】
その場合は、一方に挿入される位相遅延部２００Ｂと他方に挿入される位相遅延部２００Ｂとの間に厚さの差を設ければよい。或いは、厚さの差を設ける代わりに屈折率の差を設けてもよい。或いは、厚さ及び屈折率の組み合わせの差を設けてもよい。
【０１３６】
また、第１実施形態の位相板２００は、干渉縞の方向の切り替えに対処するために、位相遅延部２００Ｂを３組み設けたが（図１３を参照。）、位相遅延部２００Ｂを１組みだけ設けると共に、位相板２００の全体を光軸Ｏの周りに回動させる機構を更に備えてもよい（図１４を参照。）。その場合、上述した制御装置３９は、位相板２００の回動角を、光束選択部１８の回動角に連動させればよい。
【０１３７】
また、第１実施形態の位相板２００は、干渉縞の方向の切り替えに対処するために、位相遅延部２００Ｂを３組み設けたが（図１３を参照。）、これらの位相遅延部２００Ｂの一部又は全部を共通の部材で構成してもよい。例えば、図１５に示すとおり、全ての位相遅延部２００Ｂを共通の部材（例えばリング状部材）で構成してもよい。このような位相遅延部２００Ｂを採用した場合、位相板２００の光軸Ｏ周りの回転角の調整が容易となる（基本的に回転角調整は不要となる。）。
【０１３８】
また、第１実施形態では、光源波長の数を「２」とし、撮像素子の個数を「２」としたので、２種類の波長λＬ、λＳの一方による観察と他方による観察とを同時に行うことができる。しかし、第１実施形態では、撮像素子の個数を１とし、２種類の波長λＬ、λＳの一方による観察と他方による観察とを順次に行っても構わない。
【０１３９】
また、第１実施形態では、光源波長の数を「２」としたが、３以上に拡張してもよいことは言うまでもない。
【０１４０】
また、３以上の光源波長のうち、２以上の光源波長が上述した補正波長域（ここでは４３５ｎｍ〜６５６ｎｍ）から外れていた場合には、それら２以上の光源波長の各々に適した位相遅延部２００Ｂを、位相板２００に形成すればよい。
【０１４１】
例えば、光源波長として３種類の波長λＬ、λＳ１、λＳ２が使用され、このうち２つの波長λＳ１、λＳ２が補正波長域から外れていた場合には、例えば図１６に示すとおり、波長λＳ１に適した位相遅延部２００Ｂ−１と、波長λＳ２に適した位相遅延部２００Ｂ−２との双方が位相板２００に形成される。
【０１４２】
このうち、位相遅延部２００Ｂ−１の形成位置の光軸Ｏからの高さは、波長λＳ１の集光点の光軸Ｏからの高さと同じに設定され、位相遅延部２００Ｂ−２の形成位置の光軸Ｏからの高さは、波長λＳ２の集光点の光軸Ｏからの高さと同じに設定される。
【０１４３】
また、位相遅延部２００Ｂ−１の光軸Ｏ方向の厚さは、波長λＳ１の焦点面を波長λＬの焦点面に一致させるための厚さに設定され、位相遅延部２００Ｂ−２の光軸Ｏ方向の厚さは、波長λＳ２の焦点面を波長λＬの焦点面に一致させるための厚さに設定される。
【０１４４】
なお、図１６では、２つの位相遅延部２００Ｂ−１、２００Ｂ−２を別部材で構成したが、同一部材で構成してもよいことは言うまでもない。
【０１４５】
また、図１６に示した位相板は、図１５に示した位相板（リング型）の変形例であるが、図１３に示した位相板（６ブロック型）、図１４に示した位相板（回転型）を同様に変形してもよいことは言うまでもない。
【０１４６】
また、第１実施形態では、光路に対して位相板２００を挿脱可能とし、光源波長の少なくとも１つが補正波長域（ここでは４３５ｎｍ〜６５６ｎｍ）から外れていたときには位相板２００を光路へ挿入し、光源波長の全てが補正波長域（ここでは４３５ｎｍ〜６５６ｎｍ）に収まっていたときには位相板２００を光路から離脱させることとしてもよい。しかし、本実施形態の位相板２００は、全ての波長の間で焦点面を一致させることができるので、常時挿入されていても問題ない。
【０１４７】
また、第１実施形態では、光源からの射出光束を分岐する手段として、分岐方向の異なる複数の回折光束群を同時に生成する回折格子１３（図２（Ａ）参照）を使用したが、分岐方向が共通の回折光束群を１群のみ生成する回折格子（１方向回折格子）を使用してもよい。但し、その場合は、干渉縞の方向を切り替えるために、１方向回折格子を光軸Ｏの周りに回動させる機構が備えられる。
【０１４８】
また、その場合は、回動可能な光束選択部１８の代わりに、非回動の０次光カットマスクを使用してもよい。０次光カットマスクは、２次以降の高次回折光束の光路となり得る領域にマスク部を配し、かつ、±１次回折光束の光路となり得る領域に開口部を配し、かつ、０次回折光束の光路となる領域にマスク部を配したマスクである。
【０１４９】
また、第１実施形態では、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために、光軸Ｏの周りを回動可能な１／２波長板１７を使用したが、固定配置した１／４波長板と光軸Ｏの周りを回動可能な１／４波長板とを使用してもよい。但し、その場合は、第１の基準位置を基準とした１／４波長板の回転角は、第２の基準位置を基準とした光束選択部材１８の回転角と同じに設定される。
【０１５０】
また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１が全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）として利用される場合を説明したが、構造化照明顕微鏡装置１を３次元構造化照明顕微鏡装置（３Ｄ−ＳＩＭ：3D-Structured Illumination Microscopy）として利用することもできる。
【０１５１】
但し、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合は、回折格子１３で発生した０次回折光束を瞳共役面６Ａ’にてカットせずに±１次回折光と共に標本５へ入射させる。そのためには、例えば、図６に示した光束選択部材１８の代わりに、図１７に示すような光束選択部材１８’を使用すればよい。この光束選択部材１８’は、図６に示した光束選択部材１８において、０次回折光束を通過するための開口部２９を設けたものである。なお、この開口部２９の形成先は、光軸Ｏの近傍であって、この開口部２９の形状は、例えば円形である。このような光束選択部材１８’によると、±１次回折光束だけでなく０次回折光束をも干渉縞に寄与させることができる。
【０１５２】
このように、３つの回折光束の干渉（３光束干渉）によって生成される干渉縞は、標本５の表面方向だけでなく、標本５の深さ方向にも空間変調されている。よって、この干渉縞によると、標本５の３次元超解像画像を生成することが可能となる。
【０１５３】
また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
【０１５４】
また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束と０次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
【０１５５】
［第１実施形態の作用効果］
以上、第１実施形態の構造化照明装置は、光源（レーザユニット１００）からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束（±１次回折光束）に分岐する分岐部（回折格子１３）と、分岐した前記２つの分岐光束による干渉縞を標本（５）に形成する光学系（照明光学系１０）と、波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束（λＬ、λＳ）に位相差を付与する位相差付与部材（位相板２００）とを備える。
【０１５６】
したがって、前記２種類の射出光束（λＬ、λＳ）に対する前記光学系（照明光学系１０）に固有の軸上色収差が仮にゼロでなかったとしても、前記２種類の射出光束（λＬ、λＳ）の一方と他方との間で観察対象面を一致させることが可能である。
【０１５７】
また、前記分岐部（回折格子１３）は、前記２種類の射出光束を互いに異なる角度で分岐する回折光学素子であり、前記位相差付与部材（位相板２００）は、前記２種類の射出光束の光路が空間的に分離した箇所に配置される。
【０１５８】
このような箇所においては、前記２種類の射出光束（λＬ、λＳ）の位相関係を調節することが容易である。
【０１５９】
また、前記光学系（照明光学系１０）は、対物レンズ（６）を含み、前記位相差付与部材（位相板２００）は、前記対物レンズ（６）の瞳面（６Ａ）又は瞳共役面（６Ａ’）の近傍に配置される。
【０１６０】
この瞳面（６Ａ）又は瞳共役面（６Ａ’）では、前記２種類の射出光束（λＬ、λＳ）の空間的な分離量が最大となるので、前記位相関係の調節が最も容易となる。
【０１６１】
また、前記位相差付与部材（位相板２００）は、前記２種類の射出光束の一方に所定の位相を付与する第１の領域（波長λＳの通過域）と、前記２種類の射出光束の他方に前記所定の位相とは異なる位相を付与する第２の領域（波長λＬの通過域）とを有する。
【０１６２】
また、前記位相差付与部材（位相板２００）が前記２種類の射出光束に付与する位相差は、前記２種類の射出光束の軸上色収差に相当する値に設定される。
【０１６３】
したがって、前記位相差付与部材（位相板２００）は、前記軸上色収差に起因した観察対象面のズレを、確実に抑えることができる。
【０１６４】
或いは、前記位相差付与部材が前記２種類の射出光束に付与する位相差は、前記２種類の射出光束間で前記標本における焦点面を一致させる値に設定されてもよい。
【０１６５】
また、構造化照明顕微鏡装置（１）が３Ｄ−ＳＩＭとして使用されるときには、前記光学系（照明光学系１０）が形成する前記干渉縞は、前記２つの分岐光束（±１次回折光束）と他の１つの分岐光束（０次回折光束）との３つの分岐光束による３光束干渉縞である。
【０１６６】
このように構造化照明顕微鏡装置（１）が３Ｄ−ＳＩＭとして使用される場合は、観察対象面のズレが大きな問題となるので、前記位相差付与部材（位相板２００）の配置は、特に有効である。
【０１６７】
また、前記光源（１００）は、前記２種類の射出光束を同時又は順次に出射する。
【０１６８】
したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、前記２種類の射出光束（λＬ、λＳ）による順次照明又は同時照明が可能である。
【０１６９】
また、第１実施形態の構造化照明装置は、前記標本（５）に形成される前記干渉縞の方向を複数の方向の間で切り替える切替部（光束選択部材１８）を更に備え、前記位相差付与部材（位相板２００）は、前記複数の方向毎に用意されている。
【０１７０】
或いは、第１実施形態の構造化照明装置は、前記標本（５）に形成される前記干渉縞の方向を切り替える第１切替部（光束選択部材１８）と、前記位相差付与部材の方向を切り替える第２切替部（図１４参照）とを更に備える。
【０１７１】
また、第１実施形態の構造化照明装置は、前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト部（並進機構１５Ａ）を更に備える。
【０１７２】
したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、前記干渉縞の方向及び位相を切り替えることが可能である。
【０１７３】
また、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、第１実施形態の構造化照明装置と、前記干渉縞で変調された前記標本（５）からの観察光束を光検出器（撮像素子３５１、３５２）に結像する結像光学系（３０）と、前記光検出器（撮像素子３５１、３５２）が生成した画像に基づき前記標本（５）の復調像を演算する演算手段（画像記憶・演算装置４０）とを備える。
【０１７４】
したがって、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）によれば、標本（５）における同一の観察対象面を２種類の波長（λＬ、λＳ）で超解像観察することができる。
【０１７５】
しかも、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、２種類の波長（λＬ、λＳ）の一方による超解像観察と他方による超解像観察との間で、光学素子の位置調整（例えば、光ファイバ１１の出射端又は回折格子１３の光軸Ｏ方向の位置調整）を行う必要がない。
【０１７６】
よって、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、２種類の波長（λＬ、λＳ）の一方による超解像観察と他方による超解像観察とを同時に行うこと（同時励起・同時露光）も可能である。
【０１７７】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。相違点は、位相板２００に形成された位相遅延部２００Ｂの形状にある。
【０１７８】
図１８（Ａ）は、本実施形態の位相板２００を光軸Ｏに沿った方向（標本側）から見た図であり、図１８（Ｂ）は、光軸Ｏを含む平面で位相板２００を切断してできる断面図である。
【０１７９】
図１８（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり、本実施形態の位相遅延部２００Ｂの光軸Ｏ方向の厚さは、光軸Ｏからの距離に依存しており、具体的には、その厚さは、光軸Ｏからの距離が大きくなるほど大きく設定されている。
【０１８０】
なぜなら、第１に、位相遅延部２００Ｂがカバーすべき集光点ＰＳ（波長λＳの±１次回折光束の集光点）は、或る拡がりを有しており、その拡がり方は、光ファイバ１のファイバ端のサイズに依存する。このため、光軸Ｏから集光点ＰＳまでの高さρＳも、若干の拡がりを有する。
【０１８１】
第２に、高さρＳが異なると、必要な遅延量Δｄｐが異なるので（図１９における湾曲した点線を参照。）、位相遅延部２００Ｂに必要な厚さｄｃも異なる。具体的には、高さρＳが大きいときほど、必要な厚さｄｃは大きくなる。
【０１８２】
したがって、例えば、対物レンズ６のＮＡが１．４９であり、照明のσが０．０５であり、集光点ＰＳの高さρＳが１．３２５〜１．４の範囲であったと仮定すると、高さρＳが１．４である光線にとって必要な厚さｄｃは０．３６ｍｍであり、高さρＳが１．３２５である光線にとって必要な厚さｄｃは、０．３０ｍｍである（式（３）を参照。）。
【０１８３】
したがって、本実施形態の位相遅延部２００Ｂには、例えば、ρＳ＝１．３２５〜１．４の範囲にｄｃ＝０．３０ｍｍ〜０．３６ｍｍの範囲の勾配が付与される。
【０１８４】
以上、第２実施形態の構造化照明装置（１００、１０）は、第１実施形態の構造化照明装置において、前記第１の領域（波長λＳの通過域）及び前記第２の領域（波長λＬの通過域）のうち少なくとも一方の位相は、前記光軸Ｏから離れるに従って変化する。
【０１８５】
具体的には、前記第１の領域（波長λＳの通過域）及び前記第２の領域（波長λＬの通過域）のうち少なくとも一方の位相は、前記光軸Ｏから離れるほど大きく設定される。
【０１８６】
したがって、第２実施形態の前記位相差付与部材（位相部材２００Ｂ）は、波長λＳの光束及び波長λＬの光束のうち少なくとも一方の拡がりに対処できる。
【０１８７】
なお、第２実施形態も第１実施形態と同様に変形することが可能である。例えば、第２実施形態における位相板２００は、図１４（Ａ）に示すような回転型に構成されてもよいし、図１５（Ａ）に示すようなリング型に構成されてもよいし、図１６（Ａ）に示すようなダブルリング型に構成されてもよい。例えば、基板２００Ａ上に位相遅延部２００Ｂを形成してなる位相板２００を光路へ配置する代わりに、位相遅延部２００Ｂのみからなる位相板（つまり、基板を有しない位相板）を光路へ配置してもよい。
【０１８８】
また、第１実施形態又は第２実施形態の照明光学系１０は、対物レンズ６による落射照明光学系で構成されたが、これに限られず、対物レンズ６に代えてコンデンサレンズによる透過・反射照明光学系で構成されてもよい。その場合、集光点が形成されるのは、コンデンサレンズの瞳面である。
【０１８９】
また、第１実施形態又は第２実施形態では、干渉縞（２光束干渉縞、３光束干渉縞）を形成するための回折光として、±１次回折光及び０次回折光の組み合わせを用いたが、他の組み合わせを用いてもよい。３光束干渉縞を形成するためには、回折次数の間隔が等間隔な３つの回折光による３光束干渉を生起させればよいので、例えば、０次回折光、１次回折光、２次回折光の組み合わせ、±２次回折光及び０次回折光の組み合わせ、±３次回折光及び０次回折光の組み合わせ、などを用いることが可能である。
【０１９０】
［その他］
なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１９１】
１…構造化照明顕微鏡装置、１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、３０…結像光学系、３５１…第１撮像素子、３５２…第２撮像素子、３９…制御装置、４０…画像記憶・演算装置、４５…画像表示装置、１２…コレクタレンズ、２３…偏光板、１３…回折格子、１６…集光レンズ、２００…位相板、１８…光束選択部材、２５…レンズ、２６…視野絞り、２７…フィールドレンズ、２８…励起フィルタ、７…ダイクロイックミラー、６…対物レンズ、５…標本、６Ａ…瞳面、６Ａ’…瞳共役面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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