(57)【要約】アディポサイトカインシグナル伝達、糖代謝、脂肪酸代謝、アラキドン酸代謝、ＰＰＡＲシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、脂質代謝、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）−受容体相互作用、またはそれらの組み合わせに関連する遺伝子の発現を調節する方法、高脂血症、肥満症、過剰コレステロール、心血管疾患、肝疾患、糖尿病、またはそれらの組み合わせを治療する方法、およびグルコース取り込みを刺激する方法であって、その方法を必要とする動物において、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を前記動物に投与することを含む方法を開示する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において、アディポサイトカインシグナル伝達、糖代謝、脂肪酸代謝、アラキドン酸代謝、ＰＰＡＲシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、脂質代謝、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）−受容体相互作用またはそれらの組み合わせに関連する遺伝子の発現を調節する、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ／〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝子が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され、且つ、ＡＤＩＰＯＱ；ＤＧＡＴ２；ＧＰＤｌ；ＧＹＳ１；ＬＥＰ；ＬＰＩＮ１；ＬＰＬ；ＰＬＩＮ；ＰＰＡＲＧ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記遺伝子が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され、且つ、ＡＣＡＣＢ；ＡＣＡＴ１；ＡＣＯＸｌ；ＡＧＰＡＴ２；ＡＨＳＧ；ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＣＡＰ１；ＣＤ３６；ＣＥＢＰＢ；ＣＲＫ；ＤＢＩ；ＥＩＦ２Ｂ１；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＦＢＰ１；ＦＯＳ；ＧＰＤｌ；ＧＰＡＭ；ＨＡＤＨ；ＨＲＡＳ１；ＩＴＧＡ７；ＬＰＬ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＯＲＭ１；ＰＬＩＮ；ＰＲＫＡＲ２Ｂ；ＰＴＧＤＳ；ＰＴＰＮ１；ＰＴＰＮ１１；ＳＯＲＢＳ１；ＳＲＥＢＦ１；ＶＥＧＦＡ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝子が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して下方制御され、且つ、ＡＥＢＰ１；ＡＲＡＦ；ＣＢＬ；ＣＥＢＰＡ；ＣＥＢＰＤ；ＣＳＮ２；ＤＯＫ２；ＤＯＫ３；ＥＩＦ４Ｅ；ＦＲＳ３；Ｇ６ＰＣ；ＧＣＧ；ＧＣＫ；ＧＰＤ２；ＧＲＢ１０；ＧＲＢ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＩＧＦ２；ＩＮＳ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ８；ＬＤＬＲ；ＮＣＫ２；ＮＯＳ２；ＮＰＹ；ＯＬＲ１；ＰＨＩＰ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３Ｒ２；ＰＰＰ１ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＰＲＦ；ＲＥＴＮ；ＳＤＣ１；ＳＨＣ３；ＳＬＣ２７Ａ４；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を必要とする動物において、高脂血症、肥満症、過剰コレステロール、心血管疾患、肝疾患、糖尿病またはそれらの組み合わせを治療するための少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、且つ、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ／〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
糖尿病を治療するために、前記組成物が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＤＩＰＯＱ；ＤＧＡＴ２；ＧＰＤ１；ＧＹＳ１；ＬＥＰ；ＬＰＩＮ１；ＬＰＬ；ＰＬＩＮ；ＰＰＡＲＧ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を増加させる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
糖尿病を治療するために、前記組成物が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、前記動物において、総コレステロール（ＴＣ）を低下させ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールを低下させ、トリグリセリド（ＴＧ）を増加させ、またはそれらの組み合わせをなす、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
肥満症を治療するために、前記組成物が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＣＡＣＢ；ＡＣＡＴ１；ＡＣＯＸ１；ＡＧＰＡＴ２；ＡＨＳＧ；ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＣＡＰ１；ＣＤ３６；ＣＥＢＰＢ；ＣＲＫ；ＤＢＩ；ＥＩＦ２Ｂ１；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＦＢＰ１；ＦＯＳ；ＧＰＤ１；ＧＰＡＭ；ＨＡＤＨ；ＨＲＡＳｌ；ＩＴＧＡ７；ＬＰＬ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＯＲＭ１；ＰＬＩＮ；ＰＲＫＡＲ２Ｂ；ＰＴＧＤＳ；ＰＴＰＮ１；ＰＴＰＮ１１；ＳＯＲＢＳ１；ＳＲＥＢＦ１；ＶＥＧＦＡ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を増加させる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
肥満症を治療するために、前記組成物が、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＥＢＰ１；ＡＲＡＦ；ＣＢＬ；ＣＥＢＰＡ；ＣＥＢＰＤ；ＣＳＮ２；ＤＯＫ２；ＤＯＫ３；ＥＩＦ４Ｅ；ＦＲＳ３；Ｇ６ＰＣ；ＧＣＧ；ＧＣＫ；ＧＰＤ２；ＧＲＢ１０；ＧＲＢ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＩＧＦ２；ＩＮＳｌ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ８；ＬＤＬＲ；ＮＣＫ２；ＮＯＳ２；ＮＰＹ；ＰＨＩＰ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３Ｒ２；ＰＰＰ１ＣＡ；ＰＴＰＲＦ；ＲＥＴＮ；ＳＤＣ１；ＳＨＣ３；ＳＬＣ２７Ａ４；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を減少させる、請求項に１１記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を必要とする動物において、グルコース取り込みを刺激する少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、且つ、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩ、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンが、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物がインスリンをさらに含むか、またはインスリンを必要とする動物においてグルコース取り込みを刺激するインスリンを含むさらなる組成物も提供される、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、それぞれ本明細書に援用した、２００９年１２月２２日出願の米国特許仮出願第６１／２８４，６２３号および２０１０年７月８日出願の米国特許仮出願第６１／３９９，２２４号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし
【０００３】
共同研究契約者の名前
該当なし
【０００４】
コンパクト・ディスクにより提出された資料の援用
該当なし
【０００５】
本発明は、高脂血症、肥満症、過剰コレステロール、心血管疾患、糖尿病、肝疾患およびそれらの組み合わせなどの状態を治療および／または予防する方法として、ストレス条件下で生育したダイズに見出されるイソフラボノイドファイトアレキシン化合物であるグリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの使用に関する
【背景技術】
【０００６】
（関連技術の説明）
肥満症は西欧人に蔓延しつつあり、その原因は一般に高い脂肪消費量および西欧人のほとんど体を動かさない生活様式にある。肥満症は重要な公衆衛生上の問題であり、２型糖尿病および心血管疾患といった疾患に関係している。特に、内蔵型（中心性）肥満症は、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、脂質異常症、高血圧症、血栓形成促進性状態および炎症誘発性状態に関連している。用語「メタボリックシンドローム」は、中心性肥満症に関係するかまたは関係しないこともあるこれら生化学的異常および臨床状態を包含する。肥満症はエネルギー平衡の異常であり、高インスリン血症、インスリン抵抗性および脂質代謝の異常と関連する。肥満症は２型糖尿病、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症およびある種の癌の発症において最も重要なリスク因子の１つである。
【０００７】
アジア諸国ではこれら疾患の頻度は低いことから、アジアの食事（ダイズ食品およびダイズをベースにした食品から主に構成される）に注目が集まっている。脂肪細胞は脊椎動物系の脂質恒常性およびエネルギー平衡維持において重要な役割を果たす。過剰な脂肪消費は既存の脂肪細胞の肥大を刺激し休止状態の前駆脂肪細胞が成熟した脂肪細胞に分化するのを誘発する可能性がある。エストラジオールなどのホルモンは、脂肪生成と呼ばれるこのプロセスの調節因子である。ダイズイソフラボン（ファイトアレキシンとも呼ばれる）はエストロゲン受容体（ＥＲ）に結合し、ひいては脂肪生成を変化させることによってある種のエストラジオールの作用を模倣する。脂肪生成は主要な脂肪生成転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ−ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δおよびＰＰＡＲγ）ファミリーによって調節される。エビデンスの蓄積から、ダイズイソフラボンはエストロゲン受容体を介して機能するだけでなく、ＰＰＡＲによって調節される経路などのほかの経路を介して作用を及ぼすことが明らかとなっている。
【０００８】
イソフラボンゲニステイン（ＥＲアゴニスト）はＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγに直接結合し、その両者を活性化することができることが研究者らによって明らかとなっている。
肝では、ＰＰＡＲαが活性化されると、脂肪酸のβ酸化が増大し、トリグリセリド（ＴＧ）が減少し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）が合成される。このダイズイソフラボンゲニステインの作用の大半はコレステロール代謝に関与する遺伝子の発現の変化によって媒介されることが一般に認められている。ゲニステインはＰＰＡＲが調節する遺伝子の上方制御を介して抗糖尿病作用および脂質低下作用を及ぼす。しかし、脂肪酸合成または他の脂質代謝の局面に対するゲニステインおよび他のファイトアレキシンまたはファイトアレキシンイソフラボン代謝物の作用についてはほとんど知られていない。
【０００９】
肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲαおよびＬＸＲβ）は、本来はオーファン受容体として同定された核内受容体スーパーファミリーの別のメンバーである。この２つの受容体はコレステロール代謝および輸送ならびにグルコース代謝および炎症の調節に重要な役割を果たす。この肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）は、脂質代謝の転写制御に重要な役割を果たす核内受容体である。ＬＸＲは多様な細胞タイプにおいて細胞内コレステロール濃度の上昇に応答して活性化される核内コレステロールセンサとして機能する。活性化されると、ＬＸＲはコレステロールの吸収、流出、輸送および排出に関与する遺伝子のアレイの発現を誘発する。脂質代謝におけるそのような機能に加えて、ＬＸＲはマクロファージの免疫応答および炎症応答を調節することも見出されている。ＬＸＲ受容体の活性の調節は、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症および糖尿病を含む多数の病態生理学的状態の治療に有用であると考えられる。
【００１０】
合成ＬＸＲアゴニストはｉｎ  ｖｉｖｏでコレステロール流出を促進し、炎症を阻害し、動物モデルではアテローム性動脈硬化症の発症を阻害する。ＬＸＲには代謝のシグナル伝達と炎症のシグナル伝達とを統合する能力があるために、ヒトの代謝疾患における介入の特に魅力的なターゲットとなっている。ＬＸＲαまたはＬＸＲβの選択的活性化が、コレステロール恒常性に差次的効果（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）を及ぼすか否か、または機能的に冗長なパラログ（Ｘ，Ｙ）として存在しているか否かについて依然として議論されている。ＬＸＲα／βヌルマウスを用いた研究からは、コレステロール恒常性に関与する肝および周囲組織の遺伝子の調節は主にＬＸＲαの制御下であり、ＬＸＲβの活性化は末梢コレステロールの総蓄積からＬＸＲαヌル動物を部分的に保護することができることが示唆されている。しかし、コレステロール流出におけるその役割の他に、ＬＸＲβの幅広い生物学的機能が浮かびつつあるが、未だ明らかとはなっていない。ＬＸＲαの転写制御下では排他的であるようにみえるＡＢＣＧ１  ｍＲＮＡ発現とは異なり、多数の細胞タイプではＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡはＬＸＲイソタイプにもそのコレステロール輸送の役割にも依存しないシグナル伝達機序を介して調節される。それにもかかわらず、ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの変化の測定はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＬＸＲ活性化の代理マーカーとして使用されることが多い。
【００１１】
肝臓は脂質、糖質およびタンパク質の代謝にとって重要な器官である。したがって、肥満症の研究では肝臓は魅力的な標的器官である。乳腺組織などの他の組織も遺伝子発現の分析に用いることができる。霊長類モデルでは、乳腺組織の遺伝子発現は、グリセオリンに富んだダイズタンパク質分離物（エストラジオール併用）とのダイズタンパク質分離物（エストラジオール併用）の経口治療から行われた。グリセオリンの経口投与による動物系の遺伝子の変化についてはほとんど知られていない。
【００１２】
食事由来の化合物の中で、ダイズ製品に豊富に含まれるゲニステインおよびダイゼインなどのイソフラボンは潜在的関心がある。このイソフラボンはファイトアレキシンとしても周知である。ファイトアレキシンはデノボ合成される低分子量の抗菌性化合物の化学的に不均一なグループを構成し、ストレスに応答して植物に蓄積する。ダイズには、食事由来の肥満症を予防する化合物の候補物質と考えられている構成的なイソフラボンであるダイゼインおよびゲニステインなどのいくつかのファイトアレキシンが含まれている。これ
ら化合物への最初の関心は、アジア諸国のダイズ製品の消費量と肥満症の発症率の低下とを関連付ける研究から起こった。したがって、これらの化合物を肥満症予防に使用することの可能性が示唆された。
【００１３】
食事要因は種々の慢性疾患の病因にますます関与している。近年、これらの疾患の予防または治療において、特に食用植物からの特異的な生理活性成分の役割が大きく注目されている。イソフラボノイドはダイズ製品の一部として広く消費されている生理活性のある植物化学物質の重要なクラスである。ダイズタンパク質は、グリコシル化型のイソフラボンであるゲニステインおよびダイゼイン（内因性エストロゲンに構造的に類似し、ヒトの健康に関係する種々の生物学的機能を呈する）を豊富に含んでいる。最近のエビデンスからは、イソフラボン代謝産物はダイズ食品のある種の健康関連作用も媒介し得ることが示唆されている。もっともよく研究されているのはエコールであり、これはヒトのダイズ消費者および種々のヒト以外の種のサブセットの腸内細菌によってダイゼインから形成される。外傷または感染症などのストレッサーの影響下では、ダイゼインはグリセオリンと呼ばれる防御化合物の固有のクラスへとダイズ内で代謝されることもある。これまでの研究から、グリセオリンはゲニステインおよびダイゼインと比較して、はっきりと異なる作用（エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達の調節など）を示すことが明らかとなっている。しかし、その他の生物学的経路ならびに生物学的系に対するグリセオリンの作用については研究されていない。本発明者らは乳腺脂肪組織の遺伝子発現プロフィールに対するグリセオリンに富んだダイズタンパク質の短期効果を評価した。本発明者らは候補となるグリセオリンの標的経路を同定し、標準的なダイズタンパク質分離物とのグリセオリンに富んだダイズタンパク質の比較効果を評価した。
【００１４】
食事は代謝症候群および併存症の状態の主要な決定因子であり、これまでの知見からは、グリセオリンはエストロゲン受容体（ＥＲ）を競合的に結合し、ダイズイソフラボノイドとははっきり異なる選択的なＥＲ調節性を誘発し得ることが示唆されている。代謝経路の調節における特異的なイソフラボノイドおよびその誘導体の役割は未だよくわかっていない。
【００１５】
遺伝子発現ＤＮＡマイクロアレイは医学研究者にとって複雑な疾患（例えば肥満症）の機序を研究するための強力なツールとなっている。この技術によって、生理学的状態および病理学的状態の裏にある機序に関与する多様な遺伝子を包括的に理解することが可能となる。マイクロアレイは種々の細胞または組織におけるｍＲＮＡ発現の変化に従った疾患状態分類を容易にする。ヒトおよび動物両方の肥満症の研究では、遺伝子発現プロファイリングがＤＮＡマイクロアレイの主要な用途である。正常状態および疾患状態下の皮下脂肪、内臓脂肪、脂肪細胞および前駆脂肪細胞、筋肉、肝臓、膵臓および癌細胞が、肥満症の遺伝子発現のプロファイルに対処するのに用いられている。
【００１６】
いくつかのファイトアレキシン（レスベラトロールなど）は、癌、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病およびさらには神経変性などの種々の加齢性疾患を遅延させることが他の研究から明らかとなっている。ファイトアレキシンであるレスベラトロールの有益な健康効果を考慮すると、他の植物ファイトアレキシンが同様の有用な活性を有していると提唱することは合理的である。マメ科植物に基づいた最新の食物研究は構造的である植物化合物に注目している。しかし、植物性食品は現行の食物には含まれていない何千ものファイトアレキシン化合物を含むこともある。マメ科植物だけでも、肥満症に関連する未活用の予防効果の可能性を持つ２００を超えるファイトアレキシンがある。これらの化合物には、肥満症予防を標的にして増強する新規のファイトアレキシンに富んだ食物を生み出す可能性がある。
【００１７】
ゲニステインおよびダイゼインに加え、グリセオリンはストレス信号に応答して生合成
が増大する別のグループのファイトアレキシンを表す。グリセオリンのアイソフォームＩ−ＩＩＩ（図１）は前駆体のダイゼイン由来のものであり、クメストロールに類似したコア構造を示す。グリセオリン（Ι−ＩＩＩ）は、ダイズを発酵させて醤油および味噌を製造するのに一般に用いられる非毒産生性のアスペルギルス株のショウユコウジカビ（ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）にダイズを暴露することに由来し得る。ゲニステインおよびダイゼインと比較して、精製したグリセオリンはＬＸＲ受容体などのある種の遺伝子の活性を調節する能力が大きい。これらの知見から、グリセオリンに富んだダイズタンパク質は標準大豆タンパク質と比較してはっきりと異なる遺伝子調節性を有し得ることが示唆される。
【００１８】
合成供給源および天然供給源から、肥満症の新しい治療法を開発する必要がある。したがって、脂質および糖代謝に関与する経路（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＰＡＲおよびアディポサイトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼ、トリグリセリド代謝およびＬＸＲｓ）に対するグリセオリンの調節効果を考慮し、さらにグリセオリンに毒性がないことを考慮して、新規肥満症治療としてのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグリセオリンの効果を試験した。
【００１９】
本発明は、脂質および糖代謝に関与する経路に対する、（ＰＰＡＲおよびアディポサイトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼおよびトリグリセリド代謝など）ならびにＬＸＲに対して調節作用を有することが見出された、誘発されたダイズから単離されたグリセオリンに関する。したがってこれらのグリセオリンは、肥満症および心血管疾患の予防および治療に有用であると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この発見によれば、本発明の目的は、誘発されたダイズから単離されたグリセオリン（グリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は肥満症を予防または最小化するためのグリセオリンを含んだ組成物を提供することである
【００２２】
本発明の別の目的は、血清総コレステロール（具体的には非高密度リポタンパク質コレステロール）を低下させる方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、糖尿病を予防または最小化する方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、脂質異常症を予防または最小化する方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、アテローム性動脈硬化症を予防または最小化する方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、肥満症および高脂血症に関連する心疾患および血管疾患を予防または治療する方法を提供することである  
【００２７】
本発明の別の目的は、糖尿病を予防、最小化または軽減する方法を提供することである。
【００２８】
肥満症を予防または最小化するか、血清総コレステロール（具体的には非高密度リポタンパク質コレステロール）低下させるか、あるいは糖尿病を予防、最小化または軽減するグリセオリンを含有した組成物を含んだキットも本発明の一部である。
【００２９】
肥満症、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症または糖尿病を予防または最小化するためのグリセオリンを含有した組成物を含んだキットも本発明の一部である。
【００３０】
グリセオリンの使用についての詳細な情報は、ＵＳ２００６／０２４６１６２として公開されている米国特許出願第１１／１１８，４３１号に開示されており、その開示を本明細書に援用する。
【００３１】
動物においてアディポサイトカインシグナル伝達、糖代謝、脂肪酸代謝、アラキドン酸代謝、ＰＰＡＲシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、脂質代謝、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）−受容体相互作用またはそれらの組み合わせに関連する遺伝子の発現を調節する方法であって、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を前記動物に投与することを含む方法を提供する。少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、誘発されたダイズから単離され得、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせであり得る。少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供され得る。少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ／〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供され得る。前記遺伝子は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され得、且つ、ＡＤＩＰＯＱ；ＤＧＡＴ２；ＧＰＤｌ；ＧＹＳ１；ＬＥＰ；ＬＰＩＮ１；ＬＰＬ；ＰＬＩＮ；ＰＰＡＲＧ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。前記遺伝子は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され得、且つ、ＡＣＡＣＢ；ＡＣＡＴ１；ＡＣＯＸｌ；ＡＧＰＡＴ２；ＡＨＳＧ；ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＣＡＰ１；ＣＤ３６；ＣＥＢＰＢ；ＣＲＫ；ＤＢＩ；ＥＩＦ２Ｂ１；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＦＢＰ１；ＦＯＳ；ＧＰＤｌ；ＧＰＡＭ；ＨＡＤＨ；ＨＲＡＳ１；ＩＴＧＡ７；ＬＰＬ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＯＲＭ１；ＰＬＩＮ；ＰＲＫＡＲ２Ｂ；ＰＴＧＤＳ；ＰＴＰＮ１；ＰＴＰＮ１１；ＳＯＲＢＳ１；ＳＲＥＢＦ１；ＶＥＧＦＡ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。前記遺伝子は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して下方制御され得、且つ、ＡＥＢＰ１；ＡＲＡＦ；ＣＢＬ；ＣＥＢＰＡ；ＣＥＢＰＤ；ＣＳＮ２；ＤＯＫ２；ＤＯＫ３；ＥＩＦ４Ｅ；ＦＲＳ３；Ｇ６ＰＣ；ＧＣＧ；ＧＣＫ；ＧＰＤ２；ＧＲＢ１０；ＧＲＢ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＩＧＦ２；ＩＮＳ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ８；ＬＤＬＲ；ＮＣＫ２；ＮＯＳ２；ＮＰＹ；ＯＬＲ１；ＰＨＩＰ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３Ｒ２；ＰＰＰ１ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＰＲＦ；ＲＥＴＮ；ＳＤＣ１；ＳＨＣ３；ＳＬＣ２７Ａ４；およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【００３２】
高脂血症、肥満症、過剰コレステロール、心血管疾患、肝疾患、糖尿病またはそれらの組み合わせを治療するための方法であって、その方法を必要とする動物において、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を前記動物に投与することを含む、方法を提供する。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、誘発されたダイズから単離され得、且つ、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせであり得る。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供され得る。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供され得る。この方法は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＤＩＰＯＱ；ＤＧＡＴ２；ＧＰＤ１；ＧＹＳ１；ＬＥＰ；ＬＰＩＮ１；ＬＰＬ；ＰＬＩＮ；ＰＰＡＲＧ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現を前記動物において増加させることをさらに含み得る。この方法は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、前記動物において、総コレステロール（ＴＣ）を低下させ、低密度リポタンパク質（ＬＤ
Ｌ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールを低下させ、トリグリセリド（ＴＧ）を増加させること、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。この方法は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＣＡＣＢ；ＡＣＡＴ１；ＡＣＯＸ１；ＡＧＰＡＴ２；ＡＨＳＧ；ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＣＡＰ１；ＣＤ３６；ＣＥＢＰＢ；ＣＲＫ；ＤＢＩ；ＥＩＦ２Ｂ１；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＦＢＰ１；ＦＯＳ；ＧＰＤ１；ＧＰＡＭ；ＨＡＤＨ；ＨＲＡＳｌ；ＩＴＧＡ７；ＬＰＬ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＯＲＭ１；ＰＬＩＮ；ＰＲＫＡＲ２Ｂ；ＰＴＧＤＳ；ＰＴＰＮ１；ＰＴＰＮ１１；ＳＯＲＢＳ１；ＳＲＥＢＦ１；ＶＥＧＦＡ；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現を前記動物において増加させることをさらに含み得る。この方法は、少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ＡＥＢＰ１；ＡＲＡＦ；ＣＢＬ；ＣＥＢＰＡ；ＣＥＢＰＤ；ＣＳＮ２；ＤＯＫ２；ＤＯＫ３；ＥＩＦ４Ｅ；ＦＲＳ３；Ｇ６ＰＣ；ＧＣＧ；ＧＣＫ；ＧＰＤ２；ＧＲＢ１０；ＧＲＢ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＩＧＦ２；ＩＮＳｌ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ８；ＬＤＬＲ；ＮＣＫ２；ＮＯＳ２；ＮＰＹ；ＰＨＩＰ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３Ｒ２；ＰＰＰ１ＣＡ；ＰＴＰＲＦ；ＲＥＴＮ；ＳＤＣ１；ＳＨＣ３；ＳＬＣ２７Ａ４；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現を前記動物において減少させることをさらに含み得る。
【００３３】
グルコース取り込みを刺激する方法であって、その方法を必要とする動物において、グルコース取り込みを刺激する少なくとも１つの単離されたグリセオリンを含む組成物を前記動物に投与することを含む、方法を提供する。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、誘発されたダイズから単離され得、且つ、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩ、またはそれらの組み合わせであり得る。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、約１００ｎＭ〜約５０μΜの量で提供され得る。前記少なくとも１つの単離されたグリセオリンは、動物１匹あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜動物１匹あたり約１００ｍｇ／ｋｇの量で提供され得る。本発明の組成物はさらにインスリンを含んでもよいし、インスリンを含むさらなる組成物を前記動物に投与し得る。
【００３４】
本開示の本質、目的および利点をさらに理解するために、以下の詳細な説明を参照し、添付図面と併せて読まれたい。同様の参照符号は同様の要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ダイズイイソフラボンファイトアレキシンのゲニステイン、ダイゼイン、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩおよびグリセオリンＩＩＩの構造を示す図である。
【図２】ＡＢＣＧ１（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＮＣａＰ細胞の肝臓Ｘ受容体によるコレステロール流出に関与する遺伝子である）の上方制御に対するグリセオリンの効果を示すグラフである。ＡＢＣＧ１はコレステロール流出ポンプとして機能するＬＸＲ応答性遺伝子である。図２に示すように、ＬＮＣａＰ細胞の結果からＬＸＲに対するグリセオリンの効果が示唆される。５μΜのグリセオリンで４８時間治療したところ、ＡＢＣＧ１は８．１倍上方制御された（＊＝ｐ＜  ０．０１）。
【図３】カゼイン／ラクトアルブミンと比較した遺伝子の総数（ＧｅｎＢａｎｋの識別子）を示すベン図である（ＦＣ＞１．５，ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０５，質＞２、ｔ検定  Ｐ＜０．０５）。
【図４Ａ】階層クラスタ分析デンドログラムである。
【図４Ｂ】遺伝子プローブの主要成分分析を示す図である（ＦＣ＞１．５およびＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０５  （ｎ＝２５２）。デンドログラムおよびクラスタ分析にはユークリッド距離および平均連結法を用いた。
【図５】グリセオリンと標準ダイズタンパク質とのプロフィールの差を示す図であり、ＦＣ＞１．５で変化した遺伝子のヒートマップから質的に明白である。
【図６】古典的分類および機能的分類によって変化した遺伝子を分類するのに用いた経路分析を示す図である。グリセオリン群の変化した遺伝子のＩＰＡで最も過剰出現した古典的経路はいずれも脂質、糖質および／またはエネルギー代謝に関係した（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓでは、ＧＬＹ食餌およびＳＯＹ食餌によってＦＣ＞１．５で有意に変化した）。これらの経路には、グリセロリン脂質およびグリセロ脂質代謝、チトクロムｐ４５０代謝およびＡＭＰＫシグナル伝達が含まれた（いずれもＰ＜０．０１）。
【図７】実施例１１のインスリン刺激試験で用いたプレート用チャレンジマップである。
【図８】実施例１２のグリセオリンインキュベーション試験で用いたプレート用チャレンジマップである。
【図９】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によるインスリン媒介グルコース取り込みを示す用量反応曲線である。
【図１０】試験前に脂肪細胞維持培地を２４時間飢餓させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によるインスリン媒介グルコース取り込みを示す用量反応曲線である。
【図１１】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によるインスリン媒介グルコース取り込みを示す、迅速なピペット操作を用いて生成した用量反応曲線である。
【図１２】ＫＲＨまたはグリセオリンで２４時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するグリセオリン、インスリン、またはグリセオリン＋インスリンの効果を示すグラフである。
【図１３】ＫＲＨまたはグリセオリンで２４時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するグリセオリン、インスリン、またはグリセオリン＋インスリンの迅速なピペット操作を用いた効果を示すグラフである。互いに違う柱（ｐ＜０．０５）には異なる上付き文字を付している。
【図１４】ＫＲＨまたはグリセオリンで２４時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するグリシノール、インスリン、グリシノール＋インスリンの迅速なピペット操作を用いた効果を示すグラフである。「＊」は他の全群との有意差を示す。
【図１５】グリセオリンでプレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するインスリンへの３０分間の曝露の効果を示すグラフである。
【図１６】ＫＲＨでプレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するグリセオリン、インスリンまたはグリシノールへの３０分間の曝露の効果を示すグラフである。柱は以下を示す：１）ＤＭＳＯ対照；２）ＫＲＨ対照；３）グリセオリン混合物（５μΜ）；４）グリセオリンＩ（５μΜ）；５）グリセオリンＩＩ（５μΜ）；６）グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）；７）グリシノール（１μΜ）；８）グリシノール（０．１μΜ）。互いに異なる柱（ｐ＜０．０５）には異なる上付き文字を付している。
【図１７】ＫＲＨでプレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するグリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩＩ（インスリンありまたはインスリンなし）への３０分間の曝露の効果を示すグラフである。柱は以下を示す：１）ＤＭＳＯ対照；２）０．３ｎＭインスリン；３）グリセオリンＩ（５μΜ）；４）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩ（１μΜ）；５）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩ（５μΜ）；６）グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）；７）グリセオリンＩ（１μΜ）；８）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）。互いに異なる柱（ｐ＜０．０５）には異なる上付き文字を付している。
【図１８】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によるグリセオリン媒介グルコース取り込みを示す、迅速なピペット操作を用いて生成した用量反応曲線である。
【図１９】ＫＲＨまたはグリセオリンで２４時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するインスリンへの３０分間の曝露の効果を示すグラフである。
【図２０】ＫＲＨまたはグリセオリンで３時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みに対するインスリンへの３０分間の曝露の効果を示すグラフである。互いに異なる柱（ｐ＜０．０５）には異なる上付き文字を付している。
【図２１】グリセオリン（●）またはＫＲＨ緩衝液（○）に４５分間曝露後の３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるインスリン媒介グルコース取り込みを示すグラフである。いずれのインスリン濃度でも平均は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図２２】ＫＲＨで２４時間プレインキュベートし、種々の量のグリセオリンで４５分間インキュベートし、その後ＫＲＨで３０分間インキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞によるグルコース取り込みを示すグラフである。互いに異なる柱（ｐ＜０．０５）には異なる上付き文字を付している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を更に説明する前に、本発明は以下に記載される具体的な実施態様に限定されるものではないことを理解しておけなければならない。なぜなら、具体的な実施態様のバリエーションを行うことができ、それはなお添付の請求の範囲の範囲内にあるからである。また使用される用語は具体的な実施態様を説明する目的のものであって、限定を意図したものではないことは言うまでもない。それに代わって、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって確定される。
【００３７】
本明細書の操作例以外に、または別途指摘される場合に、明細書中または特許請求の範囲中で使用される、成分量、反応条件等を表すすべての数は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によってあらゆる場合に変更されるものと理解されたい。したがって、それとは反対に指摘されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、得ようとされる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくともそれぞれの数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮し、一般的な四捨五入法によって、少なくとも、添付の特許請求の範囲の同等物の教義を適用することを制限しようとするものではないものとして解釈されるべきである
【００３８】
本開示の広い範囲を説明する記載の数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載の数値は可能な限り正確に報告されている。しかし、どのような数値もそれらの個々の試験測定に認められる標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を本質的に含んでいる。
【００３９】
本明細書に引用したどのような数値範囲も、本明細書に包含されるあらゆる部分的範囲（ｓｕｂ−ｒａｎｇｅｓ）を包含することも理解されたい。例えば、範囲１”〜１０”は再度引用した最小値１と再度引用した最大１０との間およびこれを含む（すなわち、１以上の最小値および１０以下の最大値を有する）あらゆる部分的範囲を包含することを意図している。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」とは、文脈が別途明示する場合を除き、複数形も含む。別途本明細書に規定されない限りは、本明細書で使用する技術的および科学的用語はいずれも、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「最小化する（ｍｉｎｉｍｉｚｅ）」または「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、あるいはそれらの変形例には、特定の生物学的作用の完全阻害または部分阻害を含む（用語「最小化する」が用いられる文脈から明白である）。用語「グリセオリン」とは、グリセオリンが、グリセオリンの選択された群の少なくとも１つとして定義される場合、単一のグリセオリンまたは複数のグリセオリンの両方を意味し得る。
【００４２】
本開示では、特に、ストレス条件下で成育したダイズ植物（誘発されたダイズ）におけるイソフラボノイドファイトアレキシン化合物（グリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）の増大された生合成、ならびにＬＸＲαおよび／またはＬＸＲβ機能、ＰＰＡＲおよびアディポサイトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼおよびトリグリセリド代謝など脂質および糖代謝に関与する経路に対するそれら著明な効果を説明する。
【００４３】
肝機能におけるグリセオリンの役割を十分に理解するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで確立されているＬＮＣａＰ癌細胞モデルを用いて、選択的遺伝子発現に対するグリセオリンの作用を試験した。このモデルでは、ＬＮＣａＰ癌細胞を用い、ＬＸＲαまたはＬＸＲβに対するグリセオリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が確立されている。
【００４４】
本発明の組成物および方法に用いるグリセオリン化合物は、ストレス下のダイズまたは誘発物質で処理したダイズのような植物に見出すことのできる天然物質である。前記グリセオリン化合物は、誘発物質による処理後に自然発生する植物源から単離することもできるし、当該技術で周知の方法から合成することもできる。
【００４５】
本発明の組成物および方法に有用なグリセオリンは、天然発生する植物から抽出するのが好ましい。前記グリセオリン化合物を単離する好適な方法は、アルコール（好適にはメタノールまたはエタノール）またはメタノール水溶液を用いて植物材料を抽出し、植物材料からグリセオリンを取り出すことである。グリセオリン化合物を抽出する前に植物材料を粉末状にして、植物材料からのグリセオリン化合物の回収を最大にすることが好ましい。グリセオリン化合物は高速液体クラマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような従来の分離法によってこの抽出物から単離される。
【００４６】
好ましい実施形態において、グリセオリン化合物はダイズ原料から単離される。グリセオリン化合物が単離され得るダイズ原料には、誘発剤で処理した：ダイズ種子、ダイズ、脱皮ダイズ、ダイズ子葉、ダイズ葉組織、ダイズ根およびダイズ胚軸が挙げられる。一実施形態において、グリセオリンは、低分子量の有機抽出剤（好ましくはアルコール、酢酸エチル、アセトンまたはエーテル、最も好ましいのはエチルアルコール水溶液またはメチルアルコール水溶液）を用いてダイズ種子から抽出される。
【００４７】
本開示は、誘発されたダイズから単離された特定のグリセオリンが、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＰＡＲおよびアディポサイトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼおよびトリグリセリド代謝、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬＸＲαまたはＬＸＲβなど、脂質および糖代謝に関与する経路に対して調節作用を呈したことを明らかにする。グリセオリン（グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせ）の調節作用は、約０．５〜約１０μΜ、約０．５〜約５．０μΜ、約０．５〜約１．０μΜ、約１．０〜約１０μΜ、約１．０〜約５μΜ、約５．０〜約１０μΜ、および好ましくは約５．０μΜで観察され得る。ＬＮＣａＰ細胞に対するグリセオリンの調節作用はゲニステインに観察された作用に類似していた（図１）。グリセオリン（グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩまたはそれらの組み合わせ）は、動物１匹あたり０超ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／
ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約３０ｍｇ／ｋｇの量で動物に提供することもできるし、動物に投与することもできるし、あるいは動物によって消費させることもできる
【００４８】
材料と方法：肝臓Ｘ受容体
化学物質
ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびゲニステイン、１７β−エストラジオールはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州セントルイス所在）からのものとした。細胞培地および試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールズバッド所在）から購入した。
【００４９】
ダイズの処理および収穫
ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）（ＳＲＲＣ１１２５）培養基を暗室にてポテトデキストロース寒天で２５℃で培養した。５日後、１５ｍｌの滅菌蒸留水中で分生子（３．４ｘ１０７／ｍｌ）を収穫することによって接種材料を調製した。市販のダイズ品種Ａｓｇｒｏｗ  ５９０２からの種子の表面を７０％エタノールで３分間滅菌し、脱イオン水で迅速にすすぎ、脱イオン水で２分間すすいだ。種子を滅菌脱イオン水に４〜５時間、事前浸漬し、Ｃｕｉｓｉｎａｒｔフードプロセッサで２分間みじん切りにした。ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）胞子懸濁液（３００ｍｌ）を各トレイ上の種子の切断表面に塗布した。全トレイを暗室にて２５℃で３日間保管し、水ですすいで胞子を除去し、４０℃で２４時間オーブン乾燥した。抽出前にワーリングブレンダーを用いて種子を破砕した。
【００５０】
グリセオリン（Ｉ〜ＩＩＩ）の単離
１Ｌのメタノールにより３００ｇの破砕種子からグリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを抽出した。延長チューブを併用した２台のＷａｔｅｒｓ社の２５ｍｍ×１０ｍｍ粒径ｍＢｏｎｄａｐａｋ  ＣＩ８  ラジアルコンプレッションカラムセグメントを用いた分取スケールのＨＰＬＣによりグリセオリン単離した。Ｗａｔｅｒｓ社のＵＶ−ＶＩＳ９９６検出器を併用したＷａｔｅｒｓ社の６００Ｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒによりＨＰＬＣを行った。流速８．０ｍｌ／分で以下の溶媒系：Ａ＝アセトニトリル、Ｂ＝水；５％Ａにより１０分間、５％Ａ〜９０％Ａで６０分間溶離し、次に９０％Ａで２０分間維持することによって溶離した。注入量は２０ｍＬであった。グリセオリンを含む画分を真空下で濃縮し、凍結乾燥した。ＵＶ−ＶＩＳ分光光度法、質量分析およびＮＭＲによってこのグリセオリンを確認した。溶媒のアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）およびメタノールはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅシステムを用いて得、試料調製およびＨＰＬＣ分析中に使用した。グリセオリンＩ（６８％）、ＩＩ（２１％）およびＩＩＩ（１１％）の混合物を単離し（図１を参照）、治療に用いた。平均分子量３３８を用いて全細胞培養試験に用いたグリセオリンの濃度を算出した。
【００５１】
細胞および細胞培養
ＬＮＣａＰ細胞はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ヴァージニア州マナッサス所在）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド所在）とともに、Ｍｅｄｉａ  Ａ［ＲＰＭＩ１６４０培地（フェノールレッド付）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド所在）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、カリフォルニア州カマリロ所在）で維持した。細胞を空気中５％二酸化炭素の存在下３７℃でインキュベートした。
【００５２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＣＦ−７細胞を用いた遺伝子スーパーアレイ
７５ｃｍ２フラスコの５％ウシ胎仔血清を補給したＤＭＥＭ培地にＭＣＦ−７細胞を播種した。翌日、培地を２日間５％活性炭処理済血清を補給したフェノールレッドフリーＤＭＥＭと交換した。ＤＭＳＯ（ビヒクル）、１ｎＭの１７β−エストラジオール、１０μΜのグリセオリン混合物および１００ｎＭのタモキシフェンにより細胞を処理した。全ＲＮＡを抽出した。各アレイは９６遺伝子のパネルの発現を表す。各アレイのために、製造業者のプロトコルに記載の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で４μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡテンプレートを適した準備済のＰＣＲマスターミックスと混合し、同じプレートの各ウェルに等分し、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびエストロゲン受容体シグナル伝達スーパーアレイ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在）を用いてリアルタイムＰＣＲサイクリングプログラムを実行した。２−ΔΔＣｔ法を用いて相対遺伝子発現を算出した（Ｃｔは蛍光シグナルが検出閾値に達する部分サイクル数を示す）。この「ΔΔ」法（Ｐｆａｆｆｌらが記載）は、計５つの対照の内在性遺伝子（１８ＳｒＲＮＡ，ＨＰＲＴｌ，ＲＰＬ１３Ａ，ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢ）を用いて算出された各試料の正規化ΔＣｔ値を使用する。平均の倍数変化の値は、対照試料と比較して治療した遺伝子の平均倍数変化＝２−（ａｖｅｒａｇｅ  ΔΔＣｔ）として表した。記述統計学を用いて臨床変数を特徴付け、群間の遺伝子発現の統計学的有意差をスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【００５３】
霊長類の研究および食餌
本発明者らは外科的に閉経させた平均年齢１７．８±０．５歳の成熟カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）３０匹を用いた。全動物を４年間卵巣切除し、以降、各３−４匹の安定した社会集団で飼育した。これらの動物は微量または低用量の経口エストラジオールのいずれかを与えた場合のダイズイソフラボンを評価する無作為化ラテン方格クロスオーバー試験に先に登録されていた。この以前の試験では、各社会集団の動物には同じ試験治療を施行したが、順序は変えた。治療フェーズ間の４週間の休薬期間にわたる乳房のエンドポイントのいずれにも有意なキャリーオーバー効果は認められなかった。先の試験に用いたエストラジオール用量（女性の０．０９または０．５ｍｇ／日に相当）ホルモン療法として閉経後女性に一般に処方される用量（〜１．０ｍｇ／日）未満であり、イソフラボン用量（女性の０，６０，１２０または２４０ｍｇ／日に相当）はヒトの食餌またはサプリメント曝露の範囲内にあった。このレベルのエストロゲンまたはイソフラボン曝露がその後で成人乳腺組織のホルモン応答を変化させるというエビデンスはない。本試験では、試験開始前に全サルに対照のカゼイン／ラクトアルブミン食を６週間与えた。次いで、サルを社会集団ごとに無作為割付し、以下を含む３種の食餌の１つを与えた：１）エストラジオール（Ｅ２，１ｍｇ／１，８００ｋｃａｌ）＋カゼイン／ラクトアルブミン［対照（Ｃｏｎ），９例］；２）１９３．６ｍｇ／１，８００ｋｃａｌのイソフラボノイドを含むＥ２＋ダイズタンパク質分離物（ＳＰＩ）（１１例）；および３）１８８．５ｍｇ／１，８００ｋｃａｌのイソフラボノイドおよび１３４．１ｍｇ／１，８００ｋｃａｌのグリセオリンを含むＥ２＋グリセオリンに富んだダイズタンパク質（ＧＬＹ）（１０例）。対照の食餌には６．７ｍｇ／１，８００ｋｃａｌのイソフラボノイドを含む微量のダイズタンパク質を含有した。イソフラボノイド用量はいずれもアグリコン当量で示す。食餌は等カロリーで、主要栄養素、コレステロール、カルシウムおよびリンの点で同様である。グリセオリンに富んだタンパク質は、破砕した（ｓｃａｒｒｅｄ）ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）を酵素処理して親イソフラボンダイゼインをグリセオリンに転換させることにより製造した。次に、このダイズを粉砕、脱脂し、繊維濃縮物に組み込んだ。ＧＬＹサプリメントは、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）および紫外線（ＵＶ）モニタリング（可視分光光度法）によって定量した場合に、製品１ｇあたり９５９．５μｇの非抱合型グリセオリンを含んだ（７６．８％グリセオリンＩ、９．９％グリセオリンＩＩおよび１３．６％グリセオリンＩＩＩ）。グリセオリンのＨＰＬＣ分析は、ＵＶ
−ＶＩＳ９９６検出器を併用したＷａｔｅｒｓ  ６００Ｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて行われた。グリセオリンを抽出して０．５ｍｌの８０％ＥｔＯＨでホモジナイズし、５０℃で１時間加熱し、冷却し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離して濾過した。ＨＰＬＣによって上清アリコート（２０μＬ）を直接分析した。波長２８５ｎｍでグリセオリンをモニターし、Ｖｙｄａｃ  Ｍｕｌｔｉｒｉｎｇ  ＣＩ８（４．６ｘ２５０ｍｍ；５μｍ）逆位相カラムを用いて分離した。標準的な溶媒系を用いて流速１．０ｍｌ／分で溶離した。ＨＰＬＣ分析はいずれも３回ずつ行った。相対的イソフラボノイド含有量も７５ユニットごとに測定した（ダイズタンパク質分離物には６１．５％ゲニステイン、３４．６％ダイゼインおよび３．８％グリシテイン、グリセオリンに富んだタンパク質には５２．６％ゲニステイン、４３．０％ダイゼインおよび４．４％グリシテイン）。食餌のバランスをとるために、繊維濃縮物（ＦＩＢＲＩＭ２０００（登録商標）を対照食餌およびＳＰＩ食餌に添加した。この濃縮物には製品１ｇあたり０．１７ｍｇ（ＨＰＬＣで測定した場合）のイソフラボノイドをもたらす少量のダイズタンパク質（重量あたり１１．４％）を含んだ。ダイズタンパク質分離物および他の繊維濃縮物はＤｕｐｏｎｔ社の一部門であるＳｏｌａｅ（ミズーリ州セントルイス所在）から豊富に提供を受けた。グリセオリンに富んだタンパク質はＳｏｌａｅ、農務省南部研究所およびチューレーン大学医学部の協力により提供された。エストラジオール錠はマイラン製薬（ウエストバージニア州モーガントン所在）から入手した。動物には体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり１２０ｋｃａｌを１日１回給餌した。サル被験体とヒト被験者との間の代謝率差を埋め合わせるために、エストラジオール、イソフラボノイドおよびグリセオリンの１日量を（ＢＷではなく）１８００ｋｃａｌ（米国女性の推定１日摂取量）の食事に合わせて調整した。したがって、サルには体重１ｋｇあたり６６．７μｇのＥ２（全群）；体重１ｋｇあたり０．４４ｍｇ（Ｃｏｎ）、１２．９１ｍｇ（ＳＰＩ）または１２．５７ｍｇ（ＧＬＹ）のイソフラボノイド、ならびに体重１ｋｇあたり８．９４ｍｇのグリセオリン（ＧＬＹ）を各日給餌した。注目すべきなのは、最初のＳＰＩおよびＧＬＹ食餌処方には十分な嗜好性が欠けていたため、全動物を対照群の食餌（Ｅ２）に１週間１４日置いて試験した。この期間に甘いアップルソースを用いて全食餌を再処方し、以降３週間給餌し、コンプライアンスの問題はなかった。動物に関わる全手順は、州法および連邦法、米国保健社会福祉省の基準およびウェイクフォレスト大学動物実験委員会が作製したガイドラインに準拠して行った。ウェイクフォレスト大学の施設および実験動物計画は実験動物管理評価認定協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によっていずれも認証を受けている。
【００５４】
霊長類の乳房生検
食餌療法の開始および終了時に、ケタミンおよびブプレノルフィンにより動物を麻酔して乳房生検、採血、子宮超音波検査、膣細胞診および体重測定を行った。乳房生検では、事前に選択した乳房四分円を１．５ｃｍ切開し、小さな（〜０．４ｇ）乳腺試料を摘出した。ＡＣＵＣに認可された臨床手順に従って、切開部を縫合し、動物をモニターし、回復中に麻酔を与えた。生検部位には後で同部位を再び採取しないように入れ墨を入れた。生検試料の半分は凍結させ、残りの半分は４％パラホルムアルデヒドにより４℃で２４時間固定し、標準的手順を用いた組織化学検査用に処理した。
【００５５】
実施例１
グリセオリンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＮＣａＰ細胞の肝臓Ｘ受容体を介してＡＢＣＧ１を上方制御する
図１に示すように、ＬＮＣａＰ細胞からの試験結果はＬＸＲに対するグリセオリンの役割を示唆している。５μΜで４８時間グリセオリン処理すると、ＡＢＣＧ１は８．１倍上方制御された。ＡＢＣＡ１の有意な上方制御も観察された（データは示さず）。ゲニステイン治療によって３倍上方制御され、ダイゼインおよびゲニステインでは２倍上方制御さ
れた。
【００５６】
実施例２
グリセオリン治療によってＬＸＲ応答遺伝子ＡＢＣＧ１およびＡＢＣＡ１は上方制御される
２つのＬＸＲ応答遺伝子ＡＢＣＧ１およびＡＢＣＡ１はコレステロール排出ポンプとして協働する。これらの分子作用が、ダイズグリセオリンが肥満症および肥満関連症候群（高コレステロール血症および炎症など）を予防し得る潜在的機序をもたらす。ＬＸＲαおよびＬＸＲβアイソタイプは、コレステロール逆輸送体であるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１（ＡＢＣＡ１）およびサブファミリーメンバーＧ１（ＡＢＣＧ１；４−５）の調節を介した周辺組織およびマクロファージにおける遊離コレステロールの蓄積を制限する重要な役割について研究されてきた。ＬＸＲαは主に肝細胞、脂肪細胞および腸細胞に発現し、そこではＬＸＲβが普遍的に発現する。
【００５７】
実施例３
グリセオリンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＣＦ７細胞の遺伝子発現を変化させる
表１はＭＣＦ−７細胞においてエストラジオール、グリセオリン混合物およびタモキシフェン治療によって変化した遺伝子のＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ分析の結果を示している。太字の数字は１．５を超える遺伝子発現の倍数変化を表す。ＳＤＦ−１およびＰｇＲ遺伝子発現に対するグリセオリンおよびタモキシフェン治療の差次的効果を試験し、スーパーアレイ分析を行うことによって、乳癌およびエストロゲンシグナル伝達において一般に変化されるさらに広い遺伝子パネルを用いて２種の化合物間の差をさらに調べることにした。上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータに基づき、本発明者らはＤＭＳＯ（ビヒクル）、１ｎＭのＥ２、１００ｎＭのタモキシフェンまたは１０μΜのグリセオリンでＭＣＦ−７細胞を４時間処理することにした。全ＲＮＡを抽出・定量し、リアルタイムＰＣＲアレイを行った。本発明者らはグリセオリンによって上方制御されたいくつかの遺伝子を同定した（ＳＲＥＢＦ１，ＳＲＥＢＦ２，ＡＣＯＸ１，ＰＰＡＲＡ，ＦＡＳＮ，ＡＧＰＡＴ７，ＡＧＰＡＴ６，ＳＣＤ５，ＣＰＴ２，ＡＢＣＧ１，ＡＣ０２，ＥＣＨｌ，ＥＣＨＤＣｌ，ＥＣＨＤＣ２，ＥＣＨＤＣ３）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【００５８】
実施例４
グリセオリンは霊長類の乳腺組織の遺伝子発現を変化させる
表２はグリセオリンに富んだダイズタンパク質分離物と標準的ダイズタンパク質分離物とを比較した、乳腺組織で上方制御および下方制御された遺伝子の数を示している。脂肪酸代謝に関与するＨＡＤＨ遺伝子はグリセオリン治療によって上方制御された。ＧＰＤ１、ＧＰＡＭ、ＡＧＰＡＴ２およびＧＰＡＭなどのグリセロ脂質代謝に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。アラキドン酸代謝に関与するＰＴＧＤＳ遺伝子は上方制御された。ＩＴＧＡ８，ＳＤＣ１，シンデカン１およびＩＴＧＡ２など、ＥＣＭ−受容体相互作用に関与するいくつかの遺伝子は下方制御された。上方制御された遺伝子はＩＴＧＡ７およびＣＤ３６であった。ＬＰＬ，ＰＬＩＮ，ＳＯＲＢＳｌ，ＣＤ３６およびＤＢＩなど、ＰＰＡＲシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。ＰＲＫＡＲ２Ｂ，ＳＯＲＢＳｌおよびＡＣＡＣＢなど、インスリンシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００５９】
実施例５
グリセオリンはマウス肝組織の遺伝子発現を変化させる
表３はグリセオリンで治療した肝組織の遺伝子発現を、表４は有意に上方制御（＞１．５）された数を、表５はグリセオリン治療したマウス肝組織において有意に下方制御（＜１．５）された遺伝子の数を対照と比較して示している。
【００６０】
表３，４および５からわかるように、グリセオリンによる治療によって遺伝子発現は有意に変化した。グリセオリン治療によって、計１３遺伝子が上方制御され、１３遺伝子が下方制御された。本試験では、脂質代謝遺伝子ＡＣＯＸ１が有意に上方制御された。この遺伝子の上方制御は肝臓で行われて過剰な脂質蓄積を防止し得る。また、ＡＨＳＧ遺伝子およびＬＥＰ遺伝子の上方制御は体脂肪およびインスリン感受性の調節を変化させる。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表４】
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【表５】
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【００６１】
表６はグリセオリン（Ｅ２添加）で治療したマウス肝組織において有意に上方制御（＞１．５）された遺伝子数を、表７は有意に下方制御された（＜１．５）遺伝子数を対照（Ｅ２添加）と比較して示す。計１９遺伝子がグリセオリン治療によって有意に上方制御され、計３１遺伝子が有意に下方制御された。また、本試験では、脂質代謝遺伝子ＡＣＯＸ１が有意に上方制御され、ＡＨＳＧ遺伝子の上方制御が検出された。脂質およびコレステ
ロール機能に関与する上方制御された他のいくつかの遺伝子は、グリセオリン治療によって生じた。ＳＯＲＢＳ１遺伝子は脂質輸送に重要であり、ＳＲＥＢＦ１はコレステロール輸送に関与している。表７は有意に下方制御された遺伝子もいくつか示している。ＩＮＳ１はインスリン調節に重要である。
【表６】
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【表７】
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【００６２】
コレステロールは真核細胞の脂質膜の必要不可欠な構成要素で、膜流動性を維持し且つ膜関連タンパク質の輸送およびシグナル伝達を促すのに必要である。コレステロールはステロイドホルモン、胆汁酸塩およびオキシステロールなどの重要な代謝産物にとって不可欠な前駆物質でもある。いくつかの経路が体内のコレステロール恒常性を調節する。つまり、第１の経路では、細胞は主として循環するコレステロールに富んだ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を細胞のリポタンパク質受容体に結合させることによりコレステロー
ルを取り込む。受容体−リガンド複合体はクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞に吸収され、次いで、コレステロールが種々の下流の生化学経路によって使用される。第２の経路では、細胞内濃度が低い場合にＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰシグナル伝達カスケードの活性化によりコレステロールが合成される。ＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）は、多数のコレステロール合成遺伝子の発現を調節する転写因子であり、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質）がその活性を調節する。最終的に、細胞が過剰なコレステロールを蓄積すると、コレステロール逆輸送経路が活性化され、過剰なコレステロールは肝臓へ輸送されて胆汁に分泌される必要がある。この第３の経路では、循環する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は非肝細胞からのコレステロールの第一の受容体として機能する。
【００６３】
ゲニステインは肝臓における脂肪酸代謝に関与する遺伝子の上方制御により脂質低下作用を生じることが明らかとなっている。脂肪酸代謝に関与するＡＣＯＸ１などの遺伝子の発現に観察される変化は特に興味深い。
【００６４】
材料と方法：糖尿病
霊長類試験および食餌
本試験の対象は外科的に閉経させた平均年齢１７．８±０．５歳の成熟カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）３０匹とした。全動物を４年間卵巣切除し、以降各３−４匹の安定した社会集団で飼育した。全動物を社会集団ごとに無作為割付し以下を含む３種の食餌のうちの１つを与えた：（１）カゼイン／ラクトアルブミン（Ｃ／Ｌ，９例）；（２）１９３．６ｍｇ／１８００ｋｃａｌのイソフラボンを含むダイズタンパク質分離物（ＳＯＹ，１１例）；および（３）１８８．５ｍｇ／１８００ｋｃａｌのイソフラボンおよび１３４．１ｍｇ／１８００ｋｃａｌのグリセオリンを含むグリセオリンに富んだダイズタンパク質（ＧＬＹ、１０例）。イソフラボン用量はいずれもアグリコン当量で表す。これまでに報告されているように（Ｗｏｏｄら、２００６年）、各食餌には生理学的投与量の微粉化１７β−エストラジオール（Ｅ２，１ｍｇ／１８００ｋｃａｌ）も含んだ。食餌の製造、組成物および分析に関するさらなる詳細も、この先の報告（Ｗｏｏｄら、２００６年）に記載されている。
【００６５】
つまり、ＧＬＹサプリメントには、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）およびＵＶモニタリング（可視分光測光）によって定量した場合、製品１ｇあたり９５９．５ｇの非抱合型グリセオリンを含んだ（７６．８％グリセオリンＩ、９．９％グリセオリンＩＩおよび１３．６％グリセオリンＩＩＩ）。ＨＰＬＣ（製造業者による）を用いて相対的イソフラボン含有量も測定し（ＳＯＹには６１．５％ゲニステイン、３４．６％ダイゼインおよび３．８％グリシテイン、ＧＬＹには５２．６％ゲニステイン、４３．０％ダイゼインおよび４．４％グリシテイン）アグリコン単位で示した。食餌は等カロリーで、主要栄養素、コレステロール、カルシウムおよびリンの点で類似している。ダイズタンパク質分離物はＳｏｌａｅ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）から入手し、グリセオリンに富んだタンパク質はＳｏｌａｅ社、農務省南部研究所およびチューレーン大学医学部の協力により提供された。エストラジオール錠はマイラン製薬（ウエストバージニア州モーガントン所在）から入手した。
【００６６】
動物には体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり〜１２０ｋｃａｌを１日１回給餌した。サル被験体とヒト被験者との間の代謝率差を埋め合わせるために、イソフラボン、グリセオリンおよびＥ２の１日量を（ＢＷではなく）１８００ｋｃａｌの食事に合わせて調整した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００４年）。したがって、サルには体重１ｋｇあたり０．４４ｍｇ（Ｃ／Ｌ）、１２．９１ｍｇ（ＳＯＹ）または１２．５７ｍｇ（ＧＬＹ）のイソフラボン、体重１ｋｇあたり８．９４ｍｇのグリセオリン（ＧＬＹ）、および体重１ｋｇあたり６６．７μｇのＥ２（全群）を各日給餌した。動物に関わる全手順は、州法および連邦法、米
国保健社会福祉省の基準およびウェイクフォレスト大学動物実験委員会が作製したガイドラインに準拠して行った。ウェイクフォレスト大学の施設および実験動物計画は実験動物管理評価認定協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によっていずれも認証を受けている
【００６７】
遺伝子マイクロアレイおよび定量的遺伝子発現解析
マイクロアレイ分析では、Ｔｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、オハイオ州シンシナティ所在）を用いて凍結乳腺脂肪体生検から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いて精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００紫外線可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ社、デラウェア州ウィルミントン所在）を用いて定量した。生検採取については既に記載されている（Ｗｏｏｄら、２００６年）。ＲＮＡの無損傷性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）および品質はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、デラウェア州ウィルミントン所在）を用いて確認した。各群からの品質の最も高い３つの試料（計１２例）をマイクロアレイ分析に供した。ＲＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州サンタクララ所在）にハイブリダイズし、洗浄し、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（登録商標）の臨床データ部門（ノースカロライナ州モリスビル所在）にてスキャンした。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、スキャン画像から強度データを抽出した。脂質およびグルコース代謝経路に関連する１０個の遺伝子（マイクロアレイ分析で同定）の発現を定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて決定した。内部対照遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＢＡＣＴとしてマカクに特異的なｑＲＴ−ＰＣＲプライマー／プローブセットを生成し、ターゲットアッセイにはアカゲザルまたはヒトＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブセットを用いた（ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した標的遺伝子用のプライマー／プローブセットを示す表１１を参照のこと）。上記のように全乳腺試料（３０例）から、全ＲＮＡを抽出し、定量し、上記のように逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによりＴａｑｍａｎ試薬および標準的なサーモサイクリングプロトコルを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＡＢＩ相対定量７５００ソフトウェアｖ２．０．１．によって算出したΔΔＣｔ法を用いて相対発現を決定した。外部検量用試料として原乳腺（ｓｔｏｃｋ  ｍａｍｍａｒｙ）組織を各プレート上で２回試験（ｒｕｎ）した。
【表８】
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【００６８】
血清マーカー
ベースライン時および治療終了後に採血して血清マーカーを測定した。液体クロマトグラフィ−フォトダイオードアレイ質量分光分析によって総グリセオリン（Ｉ〜ＩＩＩ）およびダイズイソフラボノイドの血清濃度を決定した。放射免疫測定用（Ｅ２，ＤＳＬ−４８００超高感度、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、テキサス州ウェブスター所在）または酵素結合免疫吸着検定用（ＭＣＰ−１およびＥＴ−１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス所在；ＸＬＡＰｓ、Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａ／Ｓ社、デンマーク国ヘアレブ所在；ＧＬＰ−１（総）、レプチンおよびインスリン、ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ニューハンプシャー州セーレム所在；アディポネクチン、Ｍｅｒｃｏｄｉａ社、ノースカロライナ州ウィンストンセーレム）の市販のキットおよびプロトコルを用いてＥ２、血管および骨代謝回転マーカー（単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、エンドセリン（ＥＴ）−１およびＣｒｏｓｓＬａｐｓコラーゲン分解産物（ＸＬＡＰｓ））および代謝マーカー（インスリン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−ｌ）、アディポネクチンおよびレプチン）の血清濃度を測定した。ＣＯＢＡＳ  ＦＡＲＡ  ＩＩ分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ニュージャージー州モントクレア所在）により標準的なプロトコルおよび試薬
を用いた酵素法を利用して、総コレステロール（ＴＣ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）およびトリグリセリド（ＴＧ）濃度を測定した。ウェイクフォレスト大学医学部の完全に標準化された臨床化学実験室にて血清分析を行った。ヘパリン・マンガン沈殿法を用いてＨＤＬ濃度を測定した。低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）＋超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ）をＴＰＣとＨＤＬとの間の差として算出した。ベースランおよび治療後の時点からの試料を同時に分析して全部の血清測定を行った。
【００６９】
統計解析
ＧｅｎｅＳｉｆｔｅｒ（登録商標）ソフトウェアプログラム（Ｇｅｏｓｐｉｚａ社、ワシントン州シアトル所在）を用いてマイクロアレイデータを解析した。強度データをＲＭＡで正規化し、ｌｏｇ２スケールに変換し、試料および群間の不均一性をスクリーニングし、管理された（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）分散分析（ＡＮＯＶＡ）および治療間のペアワイズ比較を用いて評価した。結果に記載のように、選別されたデータについて主成分分析（ＰＣＡ）、パターンナビゲーション、クラスタ分析、ヒートマップおよびＫＥＧＧ経路分析を行った。各治療によって変化した遺伝子数の違いをカイ２乗検定を用いて比較し、平均連結法を用いた階層的クラスタ分析デンドログラムの一部としてユークリッド距離（治療ベクトル間の数値差を表す）を算出した。ＫＥＧＧ分析により経路を評価した。ｚスコア（＞２．０）を特定の経路における遺伝子の有意な過剰出現と考えた。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアｖ８．０（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州レッドウッドシティー所在）を用いて特定の古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）分類および機能的分類内の発現量の異なる遺伝子の出現を評価した。フィッシャーの直接確率検定を用いてＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正法によりＩＰＡにおいて所与のカテゴリー内の遺伝子数の有意性を決定し、各治療群について-ｌｏｇ１０（Ｐ値）で表した。その他のデータはＳＡＳ統計パッケージ（バージョン９．１，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社；ノースカロライナ州カリー所在）を用いて分析した。一般線形モデルを用いて平均値を決定し、群間差を算出した。正規分布および群間の等分散性について全データを評価した。遺伝子発現および血清マーカーのデータを対数変換して分布を改善し、次いでデータを元のスケールに再変換し、対照の倍数変化として報告した（９０％信頼区間）。ＲＮＡの質が悪かったため、ＳＯＹ群の動物１匹を遺伝子発現分析から除外した。これにより最終的なグループサイズは、ｑＲＴ−ＰＣＲデータについてはＣ／Ｌが９例、ＳＯＹが１０例、ＧＬＹが１０例であった。治療後の血清脂質およびマーカーのデータをベースライン値によって共変した。ボンフェローニ補正を用いて、ペアワイズテストの数についてペアワイズの全Ｐ値を調整した。いずれの比較にも両側検定の有意水準０．０５を選択した。
【００７０】
実施例６
食餌摂取量
食餌摂取量の指標として体重、血清Ｅ２および血清イソフラボノイドを測定した。治療群ではベースライン時または治療後の平均ＢＷ、ＢＷの変動または血清Ｅ２濃度に有意な違いはなかった（いずれもＡＮＯＶＡ  Ｐ＞０．０５）。給餌４時間後、平均血清グリセオリン濃度はＧＬＹ群では１３４．２±３４．６ｎｍｏｌ／Ｌ、ＳＯＹ群では無視できるほど小さかったが（ＧＬＹと比較してＰ＜０．００１）、給餌４時間後（いずれもＰ＜０．００１）および２４時間後（いずれもＰ＜０．０５）、総血清イソフラボノイド濃度はＣ／Ｌ群と比較してＳＯＹ群およびＧＬＹ群では有意に高かった。ＳＯＹ群およびＧＬＹ群では、給餌４時間後（Ｐ＝０．５９）または２４時間後（Ｐ＝０．７３）の総血清イソフラボノイドに差はなかった。個々のイソフラボノイドも２種の食餌間で同程度であった。給餌４時間後のＳＯＹ食餌およびＧＬＹ食餌の総血清イソフラボノイドは、ヒトダイズインターベンション試験で報告されたものと同程度であった。
【００７１】
実施例７
カゼイン／ラクトアルブミン（Ｃ／Ｌ）、標準ダイズタンパク質（ＳＯＹ）およびグリセオリンに富んだダイズタンパク質（ＧＬＹ）を含有した食餌の乳腺脂肪における遺伝子発現プロフィール
網羅的発現プロフィールから、ＳＯＹと比較して、ＧＬＹによって多数の遺伝子が変化したことがわかった。例えば、ＦＣ＞１．５およびＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０５の遺伝子（名称付き）計１３９のうち、ＳＯＹ群（４４例）と比較してＧＬＹ群（１１１例）では多数に変化がみられ（Ｐ＜０．００１、カイ２乗検定）、ＧＬＹ遺伝子とＳＯＹ遺伝子とのオーバーラップはわずか１４％であった（図３）。図３からは、網羅的発現プロフィールは、標準ダイズタンパク質と比較して多数の遺伝子がグリセオリンによって変化したことは明らかである。例えば、ＦＣ＞１．５およびＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０５の遺伝子（名称付き）計１３９のうち、標準ダイズタンパク質群（４４例）と比較してグリセオリン群（１１１例）では多数に変化がみられ（Ｐ＜０．００１、カイ２乗検定）、グリセオリン遺伝子と標準ダイズタンパク質とのオーバーラップはわずか１４％であった。管理された（Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）階層的クラスタ分析からは、Ｃ／ＬおよびＳＯＹ（ＧＬＹおよびＳＯＹではなく）は最も密接な関係がある群であり、ＦＣ＞１．５で有意に変化した遺伝子ではユークリッド距離は〜１１であることがわかった（図４）。図４は管理された階層的クラスタ分析を示しており、カゼイン／ラクトアルブミンおよび標準ダイズタンパク質（グリセオリンおよび標準ダイズタンパク質ではない）は最も密接な関係がある群であり、ＦＣ＞１．５で有意に変化した遺伝子ではユークリッド距離は〜１１であることがわかった。グリセオリンと標準ダイズタンパク質とのはっきりと異なるプロフィールの差も、ＦＣ＞１．５で変化した遺伝子のＰＣＡベクトルから質的に明白である。ＧＬＹとＳＯＹとのはっきりと異なるプロフィールの差もＦＣ＞１．５で変化したＰＣＡベクトル（図４）およびヒートマップ（図５）から質的に明白である。ＡＮＯＶＡおよび管理されたペアワイズ比較によるＦＣ＞１．５で有意に変化した全遺伝子の完全なリストを表９に示す。ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した脂質および／または糖代謝、ＰＰＡＲおよびＡＭＰＫシグナリングおよび／またはアディポサイトカイン活性に関連する１０遺伝子を表９に示す。これらの標的のうち、カゼイン／ラクトアルブミンと比較してグリセオリン群では１０個のうち８個が上方制御され（いずれもＰ＜０．０５）、標準ダイズタンパク質とカゼイン／ラクトアルブミン群との間では１０個のうちいずれも差がなかった。
【００７２】
実施例８
経路分析
経路分析を用いて、古典的分類および機能的分類によって変化した遺伝子を分類した。ＧＬＹ群の変化した遺伝子のＩＰＡで最も過剰出現した古典的経路はいずれも脂質、糖質および／またはエネルギー代謝に関係した。これらの経路には、ＫＥＧＧ経路分析により、グリセロリン脂質およびグリセロ脂質代謝、チトクロムｐ４５０代謝、およびＡＭＰＫシグナル伝達（いずれもＰ＜０．０１）（表８を参照。ＧＬＹおよび標準的タンパク質食餌によって有意に変化した遺伝子を示す（脂質、グルコースおよびエネルギー代謝に関連する）を含んだ。遺伝子プローブからのＫＥＧＧ経路分析によって経路を同定した（この経路ではＦＣ＞１．５、Ｐ＜０．０５および＞２の遺伝子が変化した。ｚスコアが有意（＞２）な経路のみを示す）。注目すべき経路には、グリセロ脂質代謝、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）シグナル伝達およびチトクロムｐ４５０代謝が含まれる。ＳＯＹ群では、ｚスコアが有意な経路または関連する経路の過剰出現はみられなかった。ＧＬＹ遺伝子のＩＰＡに最も過剰出現した機能的経路は、脂質代謝、低分子生化学および糖代謝であった（いずれもＰ＜０．０５）。脂質代謝の最も有意なサブカテゴリーはトリアシルグリセロール生合成であった（−ｌｏｇ１０（Ｐ値）＝６．９）。ＫＥＧＧ経路分析についても同様のパターンがみられ、脂質、グルコースおよびエネルギー代謝（表８）に関連するＧＬＹ群の変化した遺伝子が有意に過剰出現（ｚスコア＞２）することが明らかとなった。本明細書で注目すべき経路には、グリセロ脂質代謝、ペルオキシソーム
増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）シグナル伝達およびチトクロムｐ４５０代謝が含まれた。
【表９】
2013515085.tif 000028
【００７３】
実施例９
遺伝子発現の定量
上記知見をさらに検証するために、脂質および／または糖代謝、ＰＰＡＲおよびＡＭＰＫシグナル伝達、および／またはアディポサイトカイン活性に関連する１０個の遺伝子標的をｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｃ／Ｌと比較してＧＬＹ群では、評価した１６の標的のうち９個が上方制御されたが（いずれもＰ＜０．０５）、ＳＯＹ群とＣ／Ｌ群との間には１６個の標的に差はなかった（表９を参照。ｑＲＴ−ＰＣＲによる定量では、食餌タンパク質が乳腺脂肪組織内の脂質およびグルコース代謝、ＰＰＡＲシグナル伝達およびアディポサイトカイン活性に関連する選択的遺伝子の相対的発現に作用することを示す。）。ＧＬＹ群で増加した標的には、アディポサイトカインシグナル伝達（アディポネクチンおよびレプチン）、糖代謝（グリセロール−３−リン酸脱水酵素およびグリコーゲン合成酵素）、ＰＰＡＲシグナル伝達（ＰＰＡＲγおよびリピン１）および脂質代謝（リポタンパク質リパーゼおよびペリリピン）の遺伝子が含まれた。これらのカテゴリー間では相当なクロストークが生じ、ひいては特定の分子が多様な経路で機能し得ることは注目すべきである。
【表１０】
2013515085.tif 000029
【００７４】
実施例１０
血清マーカー
ベースライン時には血清脂質測定に有意な差はなかった（ＡＮＯＶＡ、いずれもＰ＞０．０５）。治療後、ＧＬＹ群では、Ｃ／Ｌ群およびＳＯＹ群と比較してＴＣおよびＬＤＬ＋ＶＬＤＬは低く（いずれもＰ＜０．０１）、Ｃ／Ｌ群と比較してＴＧは高かった（Ｐ＝０．００８）（表１０を参照。血清脂質、血管、骨代謝回転および代謝マーカーに対する治療効果を示す）。ＳＯＹ群でも、Ｃ／Ｌ群と比較してＴＧは高かった（Ｐ＝０．０２）。ＨＤＬまたはＴＣ／ＨＤＬ比に有意な群間差は認められなかった。ベースライン時または治療後に、血清ＭＣＰ−１，ＥＴ−１，ＸＬＡＰＳまたは代謝マーカーに群間差はみられなかった（いずれもＡＮＯＶＡ  Ｐ＞０．０５）。
【表１１】
2013515085.tif 000030
【００７５】
ＴＣ＝総コレステロール；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＶＬＤＬ＝超低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；ＴＧ＝トリグリセリド；ＧＬＰ−１＝グルカゴン様ペプチド１
【００７６】
表１０から、ベースライン時には血清脂質測定値に有意な群間差はなかったことがわかる（いずれもＡＮＯＶＡ  Ｐ＞０．０５）。治療後、グリセオリン群ではカゼイン／ラクトアルブミン群および標準ダイズタンパク質群と比較して総コレステロールおよび低密度リポタンパク質＋超低密度リポタンパク質は低く（いずれもＰ＜０．０１）、カゼイン／ラクトアルブミン群と比較してトリグリセリドは高かった（Ｐ＝０．００８）。表１０の値はベースライン時の測定値により共変した治療後の平均（９０％信頼区間）を表す。Ｐ値を補正して多重対比較を行った。脂質の値をＳＩ単位（ｍｍｏｌ／ｌ（Ｌ））に変換するため、ＴＣ，ＬＤＬ＋ＶＬＤＬおよびＨＤＬについては３８．６７で割り、ＴＧについては８８．５７で割った。記号はカゼイン／ラクトアルブミン群（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）または標準ダイズタンパク質群（＃＃Ｐ＜０．０１）との有意差を示す。
【００７７】
グリセオリンはある種の豆科植物（特にダイズ）によってストレスに応答して防御分子として産生される新規クラスのファイトアレキシン化合物である。この試験では、本発明者らは標準ダイズタンパク質分離物と比較して、グリセオリンに富んだダイズタンパク質から生じる乳腺脂肪組織の転写プロフィールを評価した。本発明者らは（ＳＯＹの遺伝子発現プロフィールとのオーバーラップが最小である）はっきりと違うＧＬＹの遺伝子発現プロフィールを同定した。脂質および糖代謝に関与する経路（ＰＰＡＲおよびアディポサ
イトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼおよびトリグリセリド代謝など）にＧＬＹの作用が主に関連した。ＧＬＹ食餌もＣ／Ｌ食餌と比較して血清総コレステロール（具体的には非高密度リポタンパク質コレステロール）を低下させた。これらの予備的知見からは、グリセオリンに富んだダイズタンパク質には標準ダイズとは異なる、脂肪細胞活性および栄養素代謝に関連する作用があることが示唆される。
【００７８】
食餌は代謝症候群および関連する併存症状態の主要な決定因子であり、有益な代謝効果を有する食餌介入は乳癌予防に重要な役割を果たし得る。これまでの知見から、グリセオリンはエストロゲン受容体（ＥＲ）を競合的に結合し、ダイズイソフラボノイドとははっきり異なる選択的ＥＲ調節特性を誘発し得ることが示唆される。代謝経路の調節における特異的イソフラボノイドおよびその誘導体の役割については未だによくわかっていない。ＧＬＹ食餌によって上方制御される著明な遺伝子には、ＰＰＡＲγ、アディポネクチン、リピン１およびリポタンパク質リパーゼがあった。
【００７９】
これまでの結果から、グリセオリンは天然の選択的ＥＲ調節因子として機能し得ることが明らかとなっている。本パイロット試験の結果からは、グリセオリンに富んだダイズタンパク質も脂質、糖質およびエネルギー代謝に関連する経路に生物学的に関連する作用も及ぼし得ることが示唆される。本発明者らの知見から、加工前にダイズを処理すればダイズタンパク質の生理活性成分の特性を変化させて、標準ダイズタンパク質分離物とははっきりと異なる生理学的作用および代謝作用をもたらすことができることが明らかとなっている。この考え方は他の植物性食品の生理活性成分の同定にも重要な意味を持つと考えられる。
【００８０】
材料と方法：グルコース取り込み
溶液
２００ｍＬの水、３００μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、３００μＬの１．２Ｍ  ＭｇＳ０４、３００μＬの１Ｍ  ＫＨ２Ｐ０４、３ｍＬの０．１４Ｍ  ＫＣｌ、１．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３中の６ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、および１５ｍＬの２．６Ｍ  ＮａＣｌを用いてＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ−Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）緩衝液を調製した。ｐＨを７．４に調製し、Ｈ２Ｏを添加して最終量を３００ｍＬにした。得られた溶液を０．２２μｍフィルタにより滅菌した。１８０．１６ｍｇのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅを１０ｍＬのＨ２０に溶解することによってＤグルコース（分子量＝１８０．１６）原液（１００ｍＭ）を調製した。
【００８１】
３μｌのトレーサー原液（１μＣｉ／μｌ）を２９７μＬの１００ｍＭ  Ｄグルコースに添加して９９ｍＭグルコース中０．１μＣｉ［３Ｈ］２−デオキシグルコースを得ることによって、各プレートに新しいトレーサー溶液を調製した。１０μＬを各ウェルに加えて各ウェルの最終量を１０００μＬ＝０．１μＣｉ（０．９９ｍＭ  Ｄグルコースで）とした。
【００８２】
２．９０ｍｇのインスリンを５ｍＬの０．０１Ｎ  ＨＣ１に溶解することによってインスリン（分子量＝５８０８）原液（１００μΜ）を調製した。希釈標準溶液を調製するために、１００μＬの原液を９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって原液を１：１０で希釈して溶液Ａ（１０μΜ）を得、４００μＬのＡを９３２μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｂ（３μΜ）を得、１００μＬの溶液Ａを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｃ（１μΜ）を得、１００μＬの溶液Ｂを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｂを希釈して溶液Ｄ（３００ｎＭ）得、１００μＬの溶液Ｃを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｃを希釈することによって溶液Ｅ（１００ｎＭ）を得、１００μＬの溶液を９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｄを希釈して溶液Ｆ（３０ｎＭ）を得、１００μＬの溶液Ｅを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｅを希釈して
溶液Ｇ（１０ｎＭ）を得、１００μＬの溶液Ｆを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｆを希釈して溶液Ｈ（３ｎＭ）を得、１００μＬの溶液Ｇを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｇを希釈して溶液Ｉ（１ｎＭ）を得、１００μＬの溶液Ｈを９００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｈを希釈して溶液Ｊ（０．３ｎＭ）を得た。１００μＬの各濃縮物を各ウェルに加えて、各ウェルの最終量を１０００μＬ（細胞への添加時に１：１０で希釈）とした。
【００８３】
グリセオリンＩ（約７６．８％）、グリセオリンＩＩ（約９．９％）およびグリセオリンＩＩＩ（約１３．６％）の混合物３．３８ｍｇを１ｍＬのＤＭＳＯと混合することによって１０ｍＭのグリセオリン原液を調製した。この原液を冷蔵保存した。希釈標準溶液を調製するために、３９２０μＬのＫＲＨ緩衝液により８０μＬの原液を希釈して溶液Ａ（２００μΜ）を得、５００μＬの溶液Ａを３３５μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｂ（１２０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ａを１０００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｃ（１００μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ａを１５００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｄ（８０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ａを２３３０μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ａを希釈して溶液Ｅ（６０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ｄを１０００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｄを希釈して溶液Ｆ（４０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ｆを１０００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｆを希釈して溶液Ｇ（２０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ｇを１０００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｇを希釈して溶液Ｈ（１０μΜ）を得、１０００μＬの溶液Ｈを１０００μＬのＫＲＨ緩衝液に加えることによって溶液Ｈを希釈して溶液Ｉ（５μΜ）を得た。１００μＬの各濃縮物を各ウェルに加えて、各ウェルの最終量を１０００μＬ（細胞への添加時に１：１０で希釈）とした。別途指示のない限り（例えば、実施例１４および１５を参照）、以下の実施例がグリセオリンに言及する場合、グリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの混合物を使用した。
【００８４】
細胞
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の細胞培養および分化は、脂肪細胞分化、グルコース取り込みおよびインスリン作用の研究にとって広く容認されているモデルである。適したホルモンカクテルによって刺激した場合に、これらの細胞は、大きな脂質液滴蓄積による分化発現のプログラムを施行する。初代脂肪細胞と同様に、脂肪細胞はマーカー（例えば、レプチンおよびアディポネクチン）を発現し、Ｇｌｕｔ４を発現し、グルコース取り込みを増大させることによってインスリン刺激に応答する。このような試験では、凍結前駆脂肪細胞はＺｅｎｂｉｏ社（ノースカロライナ州Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ所在）から購入した。凍結前駆脂肪細胞を３７℃で解凍し、Ｚｅｎｂｉｏ社の前駆脂肪細胞培養液で希釈し、集密になるまで９５％空気および５％Ｃ０２を含んだ湿気のある環境下にて２４ウェルプレートで３７℃でインキュベートした。さらに２日インキュベートすることによって集密に由来するシグナルを認めた。前駆脂肪細胞培地をＺｅｎｂｉｏ社の分化培地と交換し細胞をさらに３日間インキュベートした。細胞の９５％超が大きな脂質液滴に満たされたとき、この培地をＺｅｎｂｉｏ社の脂肪細胞維持培地と約２週間交換した。
【００８５】
実施例１１
グルコース刺激およびグリセオリンインキュベーション
ＫＲＨ１ｍＬで洗浄後、Ｚｅｎｂｉｏ社の脂肪細胞維持培地にて、１ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒバッファー中３７℃で各図面に示した種々の時間インキュベートすることによって、細胞を血清、インスリンおよびグルコースの飢餓状態にした後、完全に分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いてグルコース取り込み試験を行った。翌日、細胞をＫＲＨ緩衝液で１回洗浄し、図７および８のチャレンジマップに従ってＫＲＨ、インスリンおよ
び／またはグリセオリン溶液をウェル１〜２４に加えた。細胞をインキュベートし、ＫＲＢ中３７℃で種々の濃度のグリセオリン、インスリンまたはその両方に３０分間または４５分間（グリセオリン単独）曝露した後、Ｄグルコース中１０μＬの［３Ｈ］２−デオキシグルコースを添加した。次に、各プレートを３７℃の水浴で１０分間インキュベートし、氷上に設置した。上を覆っている培地を除去し、１ｍＬの氷冷ＫＲＨ緩衝液と交換し、新しい氷冷ＫＲＨ緩衝液で２回各ウェルを洗浄した。ＫＲＨ緩衝液を除去し、５００μＬの放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファーを加えた後、１ｍＬピペットを用いて目に見える細胞すべてを各ウェルの底から洗い落とした（移動した）。各ウェルから、４５０μＬを集めてアッセイに供し、液体シンチレーションカウンターで［３Ｈ］を測定した。データをＣＰＭ／ウェルとして表した。インスリンとのインキュベーション前に細胞を血清飢餓状態にしない同様の試験を行った。このデータを図９に示しており、インスリン媒介性グルコース取り込みが比較的小さく増加したことを反映している。例えば図１０に示すように、維持培地をＫＲＨと交換することによりＺｅｎＢｉｏ社の脂肪細胞維持培地（高濃度のグルコースおよび有意なレベル濃度のインスリンを含む）の細胞を２４時間飢餓状態にすることによって、インスリン媒介性グルコース取り込みは大幅に増加した（図９と比較して感受性は約１０倍増大し、最大インスリン媒介性グルコース取り込みは約５倍改善した）。図９と図１０を比較すると、ＺｅｎＢｉｏ社の脂肪細胞維持培地をグルコースもインスリンも含まないＫＲＨ緩衝液と交換したところ細胞のインスリン応答性は改善したことは明らかである。図１１は図１０と同じ試験からの別のインスリン用量応答曲線を示しているが、迅速なピペット操作（ｒａｐｉｄ  ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いている。これらのデータから、この細胞株ではインスリン抵抗性を生じさせる可能性があることがわかる。また、データからはＰａｒｋ，Ｓ．らが「Ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎｓ，Ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｕｎｄｅｒ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｓｔｒｅｓｓ，  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｅｒｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ａｃｔｉｏｎｓ」（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１０；５８（３）：１５５１−１５５７）で示唆しているように、グリセオリンはインスリン感受性を変化させないことが明らかである。
【００８６】
実施例１２
ＫＲＨ単独またはグリセオリン併用ＫＲＨとのプレインキュベーション
実施例１１の試験を広げ、２４時間血清飢餓中に存在するグリセオリンが無視できないほどの効果を生じるか否かを検証するために、維持培地をＫＲＨ単独または５μΜのグリセオリンを補充したＫＲＨと交換することによって細胞を血清飢餓状態にした。この血清飢餓プロトコルに従って、ＫＲＢ中の０．３ｎＭのインスリン（きわめて低用量）に３７℃で３０分間細胞を曝露した後、Ｄグルコース中の１０μＬの［３Ｈ］２−デオキシグルコースを添加した。グルコース取り込みを上記のように試験した。図１２に示すように、グリセオリンとのプレインキュベーションなしの場合、５μΜのグリセオリン単独では０．３ｎＭのインスリンが刺激した以上にグルコース取り込みが刺激された（柱２および３を比較されたい）。インスリン不存在下ではグリセオリンはグルコース取り込み刺激しないことが示唆されているため、この結果は驚くべきものである。ピペット操作技術を用いて、２４時間血清飢餓状態なしでこの試験を繰り返し、その結果を図１３に示す。Ｐａｒｋらの結果は、図１３の柱５および６の比較により示す結果を反映するものであり、５ｕＭのグリセオリンの添加によりグルコース取り込みが増強されたことから（図１３、柱５）インスリン感受性が増大したものと考えられた。しかし、図１３の柱３は、５μΜのグリセオリンが０．３ｎＭのインスリン単独（柱２を参照）よりも一層大きくグルコース取り込みを刺激することも示している。
【００８７】
柱４はインスリンとグリセオリンを併用した作用を示しており、少なくとも相加的であるように見え、相乗効果があると考えられる（柱２または３と比較）。グリセオリンが効
果を発揮するには少なくとも１６〜２４時間必要であり、図１３の柱５−８（無血清培地を使用）のプレインキュベーション条件はこの仮説を検討するために設計されている。しかし、図１３の柱２および４の比較は、２４時間血清飢餓状態にし、インスリン（柱２）またはインスリン併用グリセオリン（柱４）で３０分間刺激した細胞のデータを示しており、グリセオリンはプレインキュベーションなしで、グルコース取り込みの刺激に明らかに有効であるという驚くべき知見を明らかにしている。
【００８８】
実施例１３
ＫＲＨ単独またはグリシノール併用ＫＲＨとのプレインキュベーション
２４時間血清飢餓中に存在するグリシノール（グリセオリンの代わり）が無視できないほどの効果を生じるか否かを検証するために、維持培地をＫＲＨ単独または５μΜのグリシノールを補充したＫＲＨに交換することによって細胞を２４時間血清飢餓状態にし、この試験は実施例１２に記載したのとは別法で行った。グリシノールはグリセオリンよりも非常に強力なエストロゲンアゴニストであり、Ｐａｒｋらは選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）としてグリセオリンを同定し、グリセオリンにはエストロゲンアゴニスト作用によりグルコース取り込みを増強する可能性があることを提唱している。しかし、図１４に示すように、グリシノールはグルコース取り込みを刺激する効果がなく、実際にはグルコース取り込みを阻害することもある（柱１および８を比較されたい）。このデータからはエストロゲンが媒介する経路はグルコース取り込みの刺激に関与していないことが示唆される。
【００８９】
実施例１４
種々のグリセオリンによるプレインキュベーション
グリセオリン混合物（先の実施例で使用）と同混合物を構成する個々のグリセオリン（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）とを比較するために、グリセオリン混合物（グリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩまたはグリセオリンＩＩＩのいずれかで細胞を２４時間プレインキュベートした。図１５に示すように、各グリセオリンはインスリン媒介性グルコース取り込みを増強するのに有効であり、グリセオリンＩおよびＩＩＩはグリセオリンＩＩよりも有効であると考えられる。図１６のデータからこの知見が裏付けられ、３種のグリセオリンいずれもがインスリン媒介性グルコース取り込みを増強することは明らかである。図１６に示した試験では、ＫＲＨ（血清飢餓）により２４時間プレインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞をインスリン存在下で５μΜのグリセオリン混合物または個々のグリセオリンに、またはインスリンの不存在下でグリシノールに３０分間曝露した。図１６柱は以下の通りである：１）ＤＭＳＯ対照；２）ＫＲＨ対照；３）グリセオリン混合物（５μΜ）；４）グリセオリンＩ（５μΜ）；５）グリセオリンＩＩ（５μΜ）；６）グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）；７）グリシノール（１μΜ）；８）グリシノール（０．１μΜ）。グリセオリンＩはグリセオリンＩＩおよびＩＩＩよりもグルコース取り込みを刺激すると考えられる。このグリセオリン混合物は約７５％のグリセオリンＩを含んでいるため、精製したグリセオリンＩよりも活性が弱いと考えられる。柱７および８からは、先に示したように、グリシノールはグリセオリンと同じ生物活性を示さないことが示唆される。最後に、柱１からはＤＭＳＯビヒクルにはグルコース取り込みに及ぼす影響が全くないことがわかる。
【００９０】
実施例１５
グリセオリンＩおよびＩＩＩはインスリン不存在下でグルコース取り込みを刺激する
細胞をＫＲＨで２４時間プレインキュベート（血清飢餓）し、次いでインスリンの存在下または不存在下でグリセオリンＩまたはグリセオリンＩＩＩに曝露した。図１７のデータからは、グリセオリンＩおよびＩＩＩはいずれもインスリン不存在下でグルコース取り込みを刺激することができるが、グルコース取り込みはインスリン添加後にさらに増強されることがわかる。図１７の各柱は次の通りである：１）ＤＭＳＯ対照；２）０．３ｎＭ
インスリン；３）グリセオリンＩ（５μΜ）；４）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩ（１μΜ）；５）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩ（５μΜ）；６）グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）；７）グリセオリンＩ（１μΜ）；８）０．３ｎＭインスリン＋グリセオリンＩＩＩ（５μΜ）。ｐ＜０．０５の互いに異なる柱には異なる上付き文字を付けている。
【００９１】
実施例１６
非常に低用量のインスリンに対する３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞の反応
低濃度のインスリンを用いて実施例１１に記載の実験を繰り返した。図１８の用量反応曲線は、３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞のグルコース取り込みに対する非常に低い用量のインスリン濃度の影響を示す。
【００９２】
実施例１７
グリセオリン混合物を用いた１９時間プリインキュベーション後のグルコース取り込み
３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞を指示された濃度でＫＲＨまたはグリセオリン混合物（グリセオリンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）と１９時間プレインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、指示された濃度でインスリンを負荷し、その結果を図１９に示す。柱２は０．２ｎＭのインスリン単独によるグルコース取り込みの刺激を示している（１と２の柱を比較されたい）。柱３，４および５からグルコース取り込みをさらに刺激するには５μΜのグリセオリンが必要である（すなわち、０．５および１．０μΜのグリセオリン濃度では不十分である）ことが示唆される。柱６は最大インスリン用量（１ｎＭ）を示し、柱８はグリセオリン（５μΜ）とのプレインキュベーションによってグルコース取り込みはさらに一層増強されることを示している。グリセオリンが高用量のインスリン以上にグルコース取り込みを刺激することができることは知られていないので、このようなデータは驚くべきものである。これらのデータはまた、グリセオリンはインスリン感受性を増強するのではなく、インスリン非依存性の機序を介してグルコース取り込みを刺激することも示唆している。この試験を３時間だけ（１９時間の代わりに）プレインキュベーションすることにより繰り返したところ、そのデータからはインスリン単独で得られた値よりも高い値までグルコース取り込みを刺激するのにグリセオリン混合物との３時間のプレインキュベーションで十分であることがわかる（図２０）。
【００９３】
実施例１８
グリセオリン混合物とのプレインキュベーション４５分後のグルコース取り込み
３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞を対照としてＫＲＨに４５分間（図２１の「ｏ」を参照）または５μΜのグリセオリン混合物（図２１の「●」を参照）のいずれかに曝露し、種々の用量のインスリンを負荷して上記の用量反応曲線を得た（例えば実施例１１を参照）。その結果を図２１に示す。上記の血清飢餓試験とは異なり、この試験には２４時間の血清除去を含まなかった。これはインスリン無反応系（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を作ってグリセオリンがインスリン感受性を増大させるか否かを確かめることが目的であった。白丸に示しているように、一晩の培地交換（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｗｉｔｃｈ）（２４時間血清飢餓；図１８参照）後の用量反応曲線と比較して、細胞をＫＲＨとプレインキュベートしたときに観察された反応は非常に鈍く、インスリン無反応性である。グリセオリンがインスリン感受性を増大させると、一般に想定されるように図２１のインスリン用量反応曲線は左に移動するはずであるが、そうはならなかった。すなわち、どのインスリン負荷レベルでもグルコース取り込みは有意に増大した。このことから、グリセオリンはインスリンに依存しない機序を介してグルコース取り込みを刺激するはずであることが示唆される。インスリン媒介性グルコース取り込みＧＬＵＴ４トランスポーターによって媒介され、これら細胞はＧＬＵＴ１トランスポーター（これが基礎的グルコース取り込みを担っていると考えられている）を有していることから、グリセオリンはＧＬＵＴ４を変化させることによってインスリン感受性を増大させるのではなく、ＧＬＵ
Ｔ１を介して基礎的（ｂａｓａｌ）グルコース取り込みを増大させている可能性が高いと考えられる。
【００９４】
実施例１９
先に示したように、３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞をＫＲＨ中で２４時間プレインキュベート（血清飢餓）してグルコースおよびインスリンから細胞を飢餓させた。これによって非常に高感度のグルコース取り込み試験が行える。次に細胞を種々の濃度のグリセオリン混合物と４５分間インキュベートし、洗浄し、続いてＫＲＨ中でさらに３０分間インキュベートした。図２２に示すように、グリセオリン混合物単独でグルコースの基礎的取り込みをインスリン非依存的に刺激する。
【００９５】
本明細書に引用した全参照物は、各参照物が参照により援用されるように特定的かつ個々に示されているかのように、本明細書に参照により援用される。いかなる参照物の引用も出願日より前のその開示のためであり、本開示が従来の発明に基づいて係る参照物に先行する権利を与えられないということを承認するものとして解釈されるべきではない。
【００９６】
上記要素の各々またはその２つ以上の組合せが、上記タイプとは異なる別のタイプの方法にも有用である可能性があることを理解されたい。さらなる分析をしなくても、上記から本発明の主旨が完全に明らかになるであろうから、他者は現在の知識を適用することによって、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に示される本開示の一般的または特定の態様の本質的特徴を適正に構成する特徴を損なうことなく、本発明を種々の用途に容易に適合させることができる。上記実施例は例示として示したに過ぎず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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