(57)【要約】  白血病に罹患している対象を選択し、及び処置する方法であって、上記方法において、前記対象の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含んでいるという理由で、対象が処置のために選択され、ＭＤＭ２阻害剤で処置される、前記方法が本明細書中に提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病に罹患している患者を処置する方法であって、
治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を、患者の細胞が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含んでいる患者に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
ＭＤＭ２阻害剤で処置する白血病に罹患している患者を選択する方法であって、
（ａ）患者から生体試料を得る工程；
（ｂ）該生体試料が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含むかどうかを決定する工程；及び
（ｃ）該生体試料が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含む場合に、処置する患者を選択する工程；
を含んでなる、上記方法。
【請求項３】
更に、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を患者に投与する工程を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
白血病に罹患している患者の処置アウトカムを予測する方法であって、
（ａ）患者から生体試料を得る工程；及び
（ｂ）該生体試料が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含むかどうかを決定する工程；を含んでなり、
ここで、活性化変異を有しているＦＬＴ３の検出は、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を患者に投与することが良好な治療応答を引き起こすことになることを示す、上記方法。
【請求項５】
白血病に罹患している患者を処置する方法であって、
（ａ）患者から生体試料を得る工程；
（ｂ）該生体試料が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含むかどうかを決定する工程；及び
（ｃ）該生体試料が活性化変異を有しているＦＬＴ３を含む場合に、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を患者に投与する工程；
を含んでなる、上記方法。
【請求項６】
該生体試料が血球を含んでなる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
更に、該生体試料が１つ又はそれより多いｐ５３変異を含むかどうかを決定する工程を含んでなる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＦＬＴ３活性化変異が遺伝子内縦列重複である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
患者がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
白血病が急性骨髄性白血病である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＤＭ２阻害剤がスピロオキシインドールＭＤＭ２阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
スピロオキシインドールＭＤＭ２阻害剤が下記：
【化１】
2013523820.tif 000037
【化２】
2013523820.tif 000038
【化３】
2013523820.tif 000039
から成る群より選択されるか、又はその製薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの追加の抗がん剤が患者に投与される、請求項１又は３〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの追加の抗がん剤がＦＬＴ３阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
急性骨髄性白血病に罹患しているヒト患者を処置する方法であって、
治療的に有効な量の下記：
【化４】
2013523820.tif 000040
【化５】
2013523820.tif 000041
【化６】
2013523820.tif 000042
から成る群より選択される化合物、又はその製薬学的に許容される塩を、患者に投与することを含んでなり、ここで、患者の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含む、上記方法。
【請求項１６】
下記：
【化７】
2013523820.tif 000043
【化８】
2013523820.tif 000044
【化９】
2013523820.tif 000045
から成る群より選択される化合物、又はその製薬学的に許容される塩で処置する急性骨髄性白血病に罹患しているヒト患者を選択する方法であって、
（ａ）患者から生体試料を得る工程；
（ｂ）該生体試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含むかどうかを決定する工程；及び
（ｃ）該生体試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含む場合に、処置する患者を選択する工程；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
急性骨髄性白血病に罹患しているヒト患者の処置アウトカムを予測する方法であって、
（ａ）患者から生体試料を得る工程；及び
（ｂ）患者の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含むかどうかを決定する工程；
を含んでなり、
ここで、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の検出は、治療的に有効な量の下記：
【化１０】
2013523820.tif 000046
【化１１】
2013523820.tif 000047
【化１２】
2013523820.tif 000048
から成る群より選択される化合物、又はその製薬学的に許容される塩を患者に投与することが、良好な治療応答を引き起こすことになることを示す、上記方法。
【請求項１８】
急性骨髄性白血病に罹患しているヒト患者を処置する方法であって、
（ａ）生体試料を患者から得る工程；
（ｂ）該生体試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含んでいるかどうか決定する工程；及び
（ｃ）該生体試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含んでいる場合に、治療的に有効な量の下記：
【化１３】
2013523820.tif 000049
【化１４】
2013523820.tif 000050
【化１５】
2013523820.tif 000051
の化合物、又はその製薬学的に許容される塩を患者に投与する工程；
を含んでなる、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照：
この特許出願は、２０１０年４月９日に出願された係属中の米国仮特許出願番号第６１／３２２，５９２号、及び２０１１年３月１１日に出願された係属中の米国仮特許出願番号６１／４５１，９５６に対する優先権を主張し、その内容は引用によって全体として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
ＭＤＭ２阻害剤で白血病対象を特定し、そして処置する方法が本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
侵襲性のがん細胞表現型は、細胞内シグナル伝達経路の脱制御をもたらす様々な遺伝的、かつエピジェネティックな（epigenetic）変化の結果である。しかしながら、すべてのがん細胞の共通性は、アポトーシスプログラムが実行できなかったことであり、そして正常なアポトーシスマシナリー（apoptosis machinery）の欠陥による、適切なアポトーシスの欠如ががんの特性である。従って、がん細胞が正常なアポトーシスマシナリーの欠陥によってアポトーシスプログラムを実行できないことは、しばしば、化学療法、放射線療法、又は免疫療法によって誘導されるアポトーシスに対する抵抗性の増加に関連する。アポトーシス欠陥による現在の処置プロトコールに対する種々の源のヒトのがんの一次性又は後天的抵抗性は、現在のがん処置療法における主要な問題である。従って、がん患者の生存率及びクオリティ・オブ・ライフを改善するための新規な分子の標的特異的抗がん治療法をデザインし、開発することに向けての現在及び将来の努力は、アポトーシスに対するがん細胞抵抗性を特異的に標的とするストラティジーを含んでいなければならない。この関連で、がん細胞におけるアポトーシスを直接阻害する重要な役割を演じる重大なネガティブレギュレーターを標的とすることは、新規な抗がん薬物デザインの極めて有望な治療ストラティジーに相当する。
【０００４】
ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、細胞周期の進行及びアポトーシスを制御する際に重要な役割を演じており、その腫瘍抑制活性が腫瘍細胞を絶滅させるように刺激することができるので、抗がん薬物デザインの関心をそそる治療標的である（非特許文献１）。ｐ５３の活性を刺激するアプローチは、非ペプチド小分子阻害剤を用いてタンパク質ＭＤＭ２との相互作用の阻害を介している。ＭＤＭ２及びｐ５３は、自己制御性フィードバックループの一部分であり、ＭＤＭ２は、ｐ５３によって転写的に活性化され、次いで少なくともＭＤＭ２が３つのメカニズムによってｐ５３活性を阻害する（非特許文献２）。第一に、ＭＤＭ２タンパク質がｐ５３トランス活性化ドメインに直接結合し、それによってｐ５３媒介性トランス活性化が阻害される。第二に、ＭＤＭ２タンパク質には、細胞核輸出シグナル配列が含まれ、ｐ５３に結合するとｐ５３の核輸出が誘導され、ｐ５３が標的ＤＮＡに結合することが妨げられる。第三に、ＭＤＭ２タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼであり、ｐ５３に結合するとｐ５３の分解を促進することができる。それ故、ｐ５３活性の強力な内因性の細胞阻害剤として機能することによって、ＭＤＭ２は、ｐ５３媒介性アポトーシス、細胞周期停止及びＤＮＡ修復を効果的に阻害する。それ故、ＭＤＭ２に結合し、そしてＮＤＭ２とｐ５３の間の相互作用をブロックする小分子阻害剤は、機能的ｐ５３を含む細胞内のｐ５３の活性を促進し、そして、細胞周期停止、アポトーシス、又はＤＮＡ修復などのｐ５３媒介性細胞作用を刺激することができる（非特許文献３、４）。
【０００５】
ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用を標的にする非ペプチド小分子阻害剤のデザインは現在、抗がん剤の関心をそそるストラティジーとして探求されている（非特許文献５、６）。この相互作用の構造ベースはＸ線結晶解析によって確立されている（非特許文献７）。
【０００６】
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ３）は、造血器系（hematopoietic system）に関与するクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に属するタンパク質である（非特許文献８）。構造的には、ＲＴＫは、５つの免疫グロブリン様ドメインを含む細胞外領域、１つの膜近傍領域（ＪＭドメイン）、キナーゼ挿入ドメイン（ＫＩドメイン）が間に入っている２つのチロシンドメイン（ＴＫ１及びＴＫ２）、及びＣ末端ドメインを有している。ＦＬＴ３のリガンドは、骨髄中の間質細胞から発現され、膜結合形態又は可溶性形態で存在する。このリガンドは独立して、又は他のサイトカインと共に幹細胞を刺激する（非特許文献９）。それ故、ＦＬとＦＬＴ３の間のリガンド受容体相互作用は、造血器系において重要な役割を演じていると考えられる。ＦＬＴ３阻害剤であるＦＩ−７００による変異体ＦＬＴ３、及びＭＤＭ２阻害剤であるヌトリン−３（Nutlin-3）によるｐ５３の活性化の同時阻害のアポトーシス作用が報告されている（非特許文献１０）。
【０００７】
高レベルのＦＬＴ３発現が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は急性・慢性リンパ性白血病（ＡＬＬ）に罹患している患者からの大部分の検体中で観察されている。高レベルのＦＬＴ３発現はまた、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に罹患している患者で見出されている。ＦＬは、ＡＭＬ細胞と比較してＡＭＬ細胞の増殖をより著しく促進するということで知られている（非特許文献１１）。
【０００８】
ＦＬＴ３における体細胞変異は、ＡＭＬ患者において見出される（非特許文献１２）。こうした変異体では、遺伝子内縦列重複（internal tandem duplication）（ＩＴＤ）が、ＦＬＴ３遺伝子のＪＭ領域をコードしている領域中で見出された。この重複配列は、それぞれの試料によって長さは様々であるけれども、エクソン１１／１２（現在、エクソン１４−１５）及びイントロン２０を主として含み、そしてそれらは一般的に、拡大したインフレームのオープンリーディングフレームによってタンパク質内で翻訳可能な拡大したＪＭドメインを有する。このＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）変異は、ＡＭＬ患者の２３％に見いだされた（非特許文献１３）。
【０００９】
成人ＡＭＬの治療結果は、依然として満足できないままであり、新たな処置のアプローチが罹患した患者の予後を改善するのに必要である。１つの有望なアプローチは、ｐ５３とＭＤＭ２の結合を妨げる薬物（ＭＤＭ２阻害剤）を使用することによるｐ５３の化学的活性を包含している：がん細胞アポトーシスを誘発する遺伝毒性に関係のないアプローチ。ＭＤＭ２阻害剤であるヌトリン（Nutlins）及びＭＩ系を含む、ｐ５３とＭＤＭ２の結合を直接妨げる種々の化合物が開発されている（非特許文献１４〜１８）。現在利用可能な証拠によれば、ヌトリン又はＭＩ系化合物によるＭＤＭ２阻害を介するｐ５３の誘発が、ｐ５３タンパク質レベルの上昇、引き続いてｐ５３媒介性アポトーシス、又はｐ５３／ｐ２１媒介性細胞周期の停止をもたらすことが示されている(非特許文献１９〜２３）。
【００１０】
大部分は知られていない理由によって、非がん性細胞は、ＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシスに比較的抵抗性があり、そして通例、一過性の細胞周期停止を受ける（非特許文献２４、２５）。種々のｐ５３ネットワーク／エフェクター分子の性質及びＭＤＭ２阻害剤誘発アポトーシスへの正確な寄与については同様に不明であり、従って、個々のｐ５３エフェクター遺伝子又はシグナル伝達経路が、ＭＤＭ２阻害剤誘発アポトーシスが起こるのに絶対的に必要であるかどうかは依然として知られていない(非特許文献２６〜３０）。
【００１１】
ＭＤＭ２阻害剤誘発アポトーシスにおける内因性及び外因性アポトーシス経路の関与、並びにミトコンドリアアポトーシス分子に対するｐ５３タンパク質の直接的作用の証拠が提供されており、従ってＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシスは、機能的に冗長なアポトーシス経路を使用することが可能である(非特許文献３１〜３７）。
【００１２】
種々の細胞系におけるＭＤＭ２阻害剤に対する抵抗性メカニズムについての研究によって、損なわれていないｐ５３が、ＭＤＭ２阻害剤誘発アポトーシスが起こるのに必要でありうることが示されている（非特許文献３８〜４０）。更に不透明であることは、野生型ｐ５３状態は、感受性の予測因子として単独で、どのくらいの頻度で、どの様な細胞環境のもとで十分であるか、あるいはどんな他の感受性／抵抗性決定因子が使用可能であるかということである（非特許文献４１〜４３）。ｐ５３媒介性アポトーシスの提案制御因子のうちの２つは、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸであり、そしてこうしたタンパク質レベルの上昇が、種々の実験セッティングにおけるＭＤＭ２阻害剤の感受性に影響を与えることが示されている。それにもかかわらず、こうしたタンパク質の重要な役割を裏付ける利用可能な証拠は、実験系を通して最終的でもないし、一貫しておらず、従って、こうしたｐ５３制御分子が、ヒト腫瘍のすべてにおいてＭＤＭ２阻害剤の有効性の重要な決定因子であるわけではないことが依然として起こりうる（非特許文献４４〜４６）。
【００１３】
どの白血病患者がＭＤＭ２阻害剤治療から利益を受ける可能性があるかを予測することが可能になるようなニーズが依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Vogelstein et al., Nature 408:307 (2000）
【非特許文献２】Wu et al., Genes Dev. 7:1126 (1993）
【非特許文献３】Chene, Nat. Rev. Cancer 3:102 (2003)
【非特許文献４】Vassilev et al., Science 303:844 (2004）
【非特許文献５】Chene, Nat. Rev. Cancer 3:102 (2003)
【非特許文献６】Vassilev et al., Science 303:844 (2004）
【非特許文献７】Kussie et al., Science 274:948 (1996）
【非特許文献８】Rosnet, O. et al., Genomics 9:380-385 (1991）
【非特許文献９】Hannum, C. et al., Nature 368: 643-648 (1994）
【非特許文献１０】Kojima, K. et al., Leukemia 24: 33-43 (2010）
【非特許文献１１】Piacibello, W. et al., Blood 86: 4105-4114 (1995）
【非特許文献１２】Nakao, M. et al., Leukemia 10: 1911-1918 (1996）
【非特許文献１３】Kottaridis, P.D. et al., Blood 98: 1752 (2010）
【非特許文献１４】Shangary, S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 3933-3938 (2008)
【非特許文献１５】Vassilev, L.T., Trends Mo.l Med. 13:23-31 (2007)
【非特許文献１６】Vassilev, L.T. et al., Science 303:844-848 (2004)
【非特許文献１７】Ding, K. et al., J. Med. Chem. 49:3432-3435 2006
【非特許文献１８】Shangary, S. et al., Clin. Cancer Res. 14:5318-5324 (2008）
【非特許文献１９】Vassilev, L.T. et al., Science 303:844-848 (2004)
【非特許文献２０】Kruse, J.P. et al., Cell. 137:609-622 (2009)
【非特許文献２１】Haupt, Y. et al., Nature 387:296-299 (1997)
【非特許文献２２】Kubbutat, M.H. et al., Nature 387:299-303 (1997)
【非特許文献２３】Kussie, P.H. et al., Science 274: 948-953 (1996）
【非特許文献２４】Secchiero, P. et al., Blood (2006)
【非特許文献２５】Stuhmer, T., et al., Blood 106:3609-3617 (2005)
【非特許文献２６】Kruse, J. et al., Cell 137:609-622 (2009)
【非特許文献２７】Tovar, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:1888-1893 (2006)
【非特許文献２８】Levine, A.J. et al., Nat. Rev. Cancer 9: 749-758 (2009)
【非特許文献２９】Villunger, A. et al., Science 302:1036-1038 (2003)
【非特許文献３０】Shibue, T. et al., Genes Dev. 17: 2233-2238 (2003))。
【非特許文献３１】Vaseva, A.V. et al., Cell Cycle 8:1711-1719 (2009)
【非特許文献３２】Morselli, E. et al., Cell Cycle 8:1647-1648 (2009)
【非特許文献３３】Du, W. et al., J. Biol. Chem. 284: 26315-26321 (2009)
【非特許文献３４】Kojima, K. et al., Blood 108:993-1000 (2006)
【非特許文献３５】Kojima, K. et al.,  Blood 106:3150-3159 (2005)
【非特許文献３６】Vousden, K.H. et al., Cell 137: 413-431 (2009)
【非特許文献３７】Saddler, C. et al., Blood 111: 1584-1593 (2008))。
【非特許文献３８】Secchiero, P. et al., Blood 107: 4122-4129 (2006)
【非特許文献３９】Saddler, C. et al., Blood 111: 1584-1593 (2008)
【非特許文献４０】Coll-Mulet, L. et al., Blood 107: 4109-4114 (2006）
【非特許文献４１】Secchiero, P. et al., Blood 113: 4300-4308 (2009)
【非特許文献４２】Kitagawa, M. et al., Oncogene 27: 5303-5314 (2008)
【非特許文献４３】Kitagawa, M. et al.,  Mol. Cell. 29: 217-231 (2008）
【非特許文献４４】Laurie, N.A. et al., Nature 444: 61-66 (2006)
【非特許文献４５】Hu, B. et al., J. Biol. Chem. 281: 33030-33035 (2006)
【非特許文献４６】Francoz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 3232-3237 (2006）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の簡単な概要
本明細書では、白血病を処置するための、ヒト対象を選択する方法が提供されている。ある種の実施形態では、この方法は、
（ａ）対象の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含むかどうかを決定すること、及び
（ｂ）細胞が変異を含む場合に、白血病の処置対象を選択することを含んでなる。
【００１６】
また、白血病を処置する方法が提供されている。ある種の実施形態では、この方法は、ＭＤＭ２阻害剤を、対象の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含む白血病に罹患しているヒト対象に投与することを含んでなる。
【００１７】
また、白血病を処置するためのヒト対象を選択する方法が提供される。ある種の実施形態では、この方法は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異が存在するかどうかについて、対象の細胞を試験することを含んでなる。
【００１８】
また、白血病に罹患しているヒト対象における処置アウトカムを予測する方法が提供される。ある種の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤をＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する対象に投与することが、対象における良好な治療応答を生じさせる可能性を増大させることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＭＤＭ２阻害剤 ＭＩ−２１９（図１Ａ）及びＭＩ−６３（図１Ｂ）に対するＡＭＬ芽球（AML blasts）の抵抗性を描いている線グラフである。１０９の（ＭＩ−２１９）及び６０の（ＭＩ−６３）ＡＭＬ試料は、ネガティブ選択により＞９０％芽球純度に濃縮し、そしてＭＩ−２１９又はＭＩ−６３の種々の濃度で４０時間インキュベートした。試料をアネキシンＶ及びＰＩ染色のために調製し、流動細胞計測法によって分析し、そして残留生存及び非アポトーシス細胞分画を、未処理対照アリコートと比較することによって各濃度で算出した。Ａ．ＭＩ−２１９アッセイ結果。赤：ｐ５３配列変異体；緑：存在しないｐ５３（absent p53）ｍＲＮＡを有する症例；黒：野生型ｐ５３状態。Ｂ．ＭＩ−６３アッセイ結果。赤：ｐ５３配列変異体；緑：存在しないｐ５３ｍＲＮＡを有する症例；黒：野生型ｐ５３状態。
【図２】１９のＡＭＬ細胞株のＭＩ−２１９に対する感受性を描いている線グラフである。
【図３Ａ】ＭＩ−２１９、ヌトリン３（Nutlin3）又は外部照射で処置した後の初代ＡＭＬ芽球中の野生型及び変異ｐ５３レベルを描いている免疫ブロットである。ＡＭＬ芽球は、ネガティブ選択によって精製し、そして未処置の状態のままにするか、あるいはＭＩ−２１９（５μＭ）、ヌトリン３（Nutlin 3）（５μＭ）又は１回の外部照射（５Ｇｙ）で８時間にわたって処置した。８時間後、細胞を溶解し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。各ゲルに更に内部標準として一定量のＭＯＬＭ １３ ＡＭＬ細胞株ライセート（lysate）をローディングした（それぞれ、１．２５、２．５及び５μｇのＭＩ−２１９で処理したライセート、又は５μｇの未処理ライセート（ＵＴ）としてローディングした）。タンパク質をメンブレンに転写し、そして免疫ブロッティングのために抗ｐ５３抗体及び抗アクチン抗体で調製した。双方、ｐ５３及びアクチン用のフィルムを同時に展開した。ＭＩ−２１９に対するＩＣ50値をカッコ内に示す。
【図３Ｂ】ＭＩ−２１９、ヌトリン３（Nutlin3）又は外部照射で処置した後の初代ＡＭＬ芽球中の野生型及び変異ｐ５３レベルを描いている免疫ブロットである。ＡＭＬ芽球は、ネガティブ選択によって精製し、そして未処置の状態のままにするか、あるいはＭＩ−２１９（５μＭ）、ヌトリン３（Nutlin 3）（５μＭ）又は１回の外部照射（５Ｇｙ）で８時間にわたって処置した。８時間後、細胞を溶解し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。各ゲルに更に内部標準として一定量のＭＯＬＭ １３ ＡＭＬ細胞株ライセート（lysate）をローディングした（それぞれ、１．２５、２．５及び５μｇのＭＩ−２１９で処理したライセート、又は５μｇの未処理ライセート（ＵＴ）としてローディングした）。タンパク質をメンブレンに転写し、そして免疫ブロッティングのために抗ｐ５３抗体及び抗アクチン抗体で調製した。双方、ｐ５３及びアクチン用のフィルムを同時に展開した。ＭＩ−２１９に対するＩＣ50値をカッコ内に示す。
【図４】ＭＩ−２１９で処理したＡＭＬ芽球におけるＭＤＭ２ ｍＲＮＡ（図４Ａ）及びｍＲＮＡ ＭＤＭＸ（図４Ｂ）のレベルを描いている点グラフである。ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ ｍＲＮＡの正規化された発現レベルをＦＡＣＳソーティングしたＡＭＬ芽球に起源するＲＮＡから作製したｃＤＮＡにおいて測定した。示されているようにＭＩ−２１９ ＩＣ50値によってグループ化されたデルタＣｔ値（delta Ct values）［（Ｃｔ平均値（ＭＤＭ２又はＭＤＭｘ）からＣｔ平均値（ＰＧＫ１）を差し引く(Ct mean MDM2 or MDMx − Ct mean PGK1)］が表示されている。赤の菱形は変異ｐ５３を有するＡＭＬ芽球を示している。
【図５−１】ＡＭＬ患者の口腔内（buccal）試料（図５Ａ）及び芽球試料（図５Ｂ）におけるｐ５３レベルを描いている免疫ブロットである。図５Ｃは、ＬＯＨ解析である。すべての患者に対してアフィメトリクスプログラムジェノタイピングコンソール（Affymetrix program Genotyping Console）を使用することによって作成されたファイルを、ソフトウェアツールＰＬＵＴを用いてLOH tool version 2に入れ込み、そして口腔内ＤＮＡ及び対の腫瘍ＤＮＡ（paired tumor DNA）の間のＬＯＨの個々の位置がすべて、染色体長にわたり青のチェックマーク（tick mark）としてグラフ化された。すべての患者のすべてのＳＮＰの位置のコピー数測定がdChipSNPによって記載の通り作成され、染色体長にわたり表示された。コピー数減少は青色で、コピー数増加は赤色で表示されている。Ａ，Ｂ：ＳＮＰ６．０アレイプロファイリングに基づいて１７ｐにおける染色体コピー数変化のヒートマップの表示。青：コピー数減少；赤：コピー数増加。Ａ：口腔内ＤＮＡ。Ｂ：ＡＭＬ芽球ＤＮＡ。Ｃ：１７ｐにおけるＬＯＨ解析（対の芽球及び口腔内ＤＮＡを比較する）。赤ナンバリング：コピーニュートラルＬＯＨ（後天性片親性ダイソミー）；黒：コピー数減少を伴うＬＯＨ。Ｄ：ｐ５３エクソン５−９変異解析結果。Ｅ：示されたＭＩ−２１９ ＩＣ50値によってグループ化されたＡＭＬ芽球における正規化されたｐ５３ｍＲＮＡ発現。赤の菱形は、変異したｐ５３を有するＡＭＬ芽球を示す。
【図５−２】図５Ｄは、ｐ５３変異解析を説明している表である。図５Ｅは、ＱＰＣＲによるｐ５３発現を描いている点グラフである。すべての患者に対してアフィメトリクスプログラムジェノタイピングコンソール（Affymetrix program Genotyping Console）を使用することによって作成されたファイルを、ソフトウェアツールＰＬＵＴを用いてLOH tool version 2に入れ込み、そして口腔内ＤＮＡ及び対の腫瘍ＤＮＡ（paired tumor DNA）の間のＬＯＨの個々の位置がすべて、染色体長にわたり青のチェックマーク（tick mark）としてグラフ化された。すべての患者のすべてのＳＮＰの位置のコピー数測定がdChipSNPによって記載の通り作成され、染色体長にわたり表示された。コピー数減少は青色で、コピー数増加は赤色で表示されている。Ａ，Ｂ：ＳＮＰ６．０アレイプロファイリングに基づいて１７ｐにおける染色体コピー数変化のヒートマップの表示。青：コピー数減少；赤：コピー数増加。Ａ：口腔内ＤＮＡ。Ｂ：ＡＭＬ芽球ＤＮＡ。Ｃ：１７ｐにおけるＬＯＨ解析（対の芽球及び口腔内ＤＮＡを比較する）。赤ナンバリング：コピーニュートラルＬＯＨ（後天性片親性ダイソミー）；黒：コピー数減少を伴うＬＯＨ。Ｄ：ｐ５３エクソン５−９変異解析結果。Ｅ：示されたＭＩ−２１９ ＩＣ50値によってグループ化されたＡＭＬ芽球における正規化されたｐ５３ｍＲＮＡ発現。赤の菱形は、変異したｐ５３を有するＡＭＬ芽球を示す。
【図６】ＭＤＭ２阻害剤 ＭＩ−２１９に対する、種々のｐ５３変異を有するＡＭＬ芽球の感受性を描いている点グラフである。１）ｐ５３変異状態、ｉｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤの存在、及びｉｉｉ）他のすべてによって類別されているＭＩ−２１９ ＩＣ50値の表示。ＦＬＴ３−ＩＴＤ＋と他のすべての場合の間の平均ＩＣ50値の相違は、有意である（ｐ＝０．０２）。
【００２０】
本発明の詳細な説明
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している大部分の患者の生存率は依然としてわずかであり、治療結果を改善するために新規な治療アプローチが必要である。白血病細胞のＭＤＭ２阻害剤に対する感受性の詳細な特徴付けの結果が本明細書中で述べられている。一実施形態では、白血病は、急性リンパ性（ＡＬＬ）である。一実施形態では、白血病は、慢性骨髄性（ＣＭＬ）である。別の実施形態では、処置される白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００２１】
本明細書中で使用される際には、用語“急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）（ＡＭＬ）”と“急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）”は同義語である。
【００２２】
別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ０タイプ（最未分化型急性骨髄芽球性白血病）（minimally differentiated acute myeloblastic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ１タイプ（急性骨髄芽球性白血病（成熟なし））（acute myeloblastic leukemia, without maturation）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ２タイプ（急性骨髄芽球性白血病（顆粒球成熟あり）（acute myeloblastic
leukemia, with granulocytic maturation））である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ３タイプ（前骨髄球性又は急性前骨髄球性白血病）（promyelocytic or acute promyelocytic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ４タイプ（急性骨髄単球性白血病）（acute myelomonocytic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ４ｅｏタイプ（骨髄好酸球増多を伴う骨髄単球性）（myelomonocytic together with bone marrow eosinophilia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ５ａタイプ（急性単芽球性白血病）（acute monoblastic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ５ｂタイプ（急性単球性白血病）（acute monocytic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ６タイプ（急性赤白血病）（acute erythroid leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ６ａタイプ（赤白血病）（erythro leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ６ｂタイプ（極めて稀な赤白血病）（very rare erythroid leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ７タイプ（急性巨核芽球性白血病）（acute megakaryoblastic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、Ｍ８タイプ（急性好塩基球性白血病）（acute basophilic leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、急性好塩基球性白血病である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、急性好酸球性白血病である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、マスト細胞白血病である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、急性骨髄性樹状細胞白血病（acute myeloid dendritic cell leukemia）である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症である。別の実施形態では、急性骨髄性白血病は、骨髄性肉腫である。
【００２３】
一実施形態では、細胞は、白血病細胞である。別の実施形態では、細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。
【００２４】
一局面では、開示は、白血病に罹患している患者のためのテーラーメード医療に関連し、そして個々の白血病患者のための結果が成功する高い可能性を有する処置選択肢を選択することを包含する。別の局面では、開示は、白血病に罹患している患者における処置アウトカム（例えば、良好な応答又は処置奏功の可能性）を予測するアッセイ（複数を含む）の使用に関連する。
【００２５】
本明細書中では、ＭＤＭ２阻害剤で白血病を処置する患者、例えば、ヒト対象を選出する方法であって、生体試料、例えば、血球を患者から得ること、患者からの生体試料を、バイオマーカー、例えば、活性化変異（activation mutation）を持っているＦＬＴ３が存在しているかどうかを試験すること、及び生体試料が活性化変異を持っているＦＬＴ３を含んでいる場合に、処置患者を選択することを含んでなる、前記方法が提供される。一実施形態では、この方法は更に、生体試料がＦＬＴ３の活性化変異を含んでいる場合に、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を患者に投与することを含んでなる。ＦＬＴ３の活性化変異の例には、例えば、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（遺伝子内縦列重複）変異及びＦＴＬ３−ＫＤ（チロシンキナーゼドメイン）変異が含まれる。
【００２６】
本明細書中では、白血病に罹患している患者における処置アウトカムを予測する方法であって、生体試料を患者から得ること、患者からの生体試料を、活性化変異を持っているＦＬＴ３が存在しているかどうかを試験することを含んでなり、活性化変異を検出する場合に、患者が治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を投与することに対して良好に応答することになることを指摘することを特徴とする、前記方法が提供される。良好な応答には、血液学的応答、例えば、患者の血球数−白血球数、赤血球数、及び血小板数（簡単な血液試験によって検出可能）の正常化；細胞遺伝学的応答、例えば、患者のフィラデルフィア染色体陽性細胞の数の減少又は消失（標準的な検査法によって検出可能）及び／又は分子応答、例えば、患者の異常なＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質量の減少又は消失（ＰＣＲアッセイによって検出可能）が含まれるが、これらには限定されない。
【００２７】
本明細書中では、白血病を処置する方法であって、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤を、患者の細胞が活性化変異を持っているＦＬＴ３を含む、白血病に罹患している患者、例えば、ヒト対象に投与することを含んでなる、前記方法が提供される。一実施形態では、患者の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を含んでいると確定された後、患者がＭＤＭ２阻害剤で処置するために選択される。一実施形態では、白血病に罹患している患者を処置する方法は、生体試料を患者から得ること、生体試料が活性化変異を持っているＦＬＴ３を含んでいるかどうかを決定すること、及び生体試料が活性化変異を持っているＦＬＴ３を含んでいる場合に、治療的に有効な量のＭＤＭ２阻害剤、例えば、チャート１の化合物を患者に投与することを含んでなる。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書中で提供される方法は、更に患者の細胞がｐ５３変異を含んでいるかどうかを決定することを含んでなる。
【００２９】
本明細書中で使用される際は、用語“バイオマーカー（biomarker）”は、患者のインビボで、あるいは患者から得られる生体試料中で検出及び／又は数量化することができる、任意の生体化合物、例えば、タンパク質、タンパク質の断片、ペプチド、ポリペプチド、核酸などを意味する。更に、バイオマーカーは、完全な損なわれていない分子であってもよいし、それともその一部分又は断片であってもよい。一実施形態では、このバイオマーカーの発現レベルが測定される。バイオマーカーの発現レベルは、例えば、バイオマーカーのタンパク質又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）レベルを検出することによって測定することができる。ある種の実施形態では、バイオマーカーの一部分又は断片は、例えば、抗体又は他の特異的な結合剤によって、検出又は測定することができる。ある種の実施形態では、バイオマーカーの測定可能な態様は、がんの具体的なステージなどの患者の所与の状態に関連している。タンパク質又はＲＮＡレベルで検出されるバイオマーカーの場合には、こうした測定可能な態様は、例えば、患者体内、又は患者から得られる生体試料中のバイオマーカーの存在、不存在、又は濃度（すなわち、発現レベル）を含むことができる。核酸レベルで検出されるバイオマーカーの場合には、こうした測定可能な態様は、例えば、バイオマーカーの対立遺伝子バージョン、あるいはバイオマーカーの変異のタイプ、比率、及び／または程度が含むことができ、また本明細書中では変異状態とも呼ばれる。
【００３０】
タンパク質又はＲＮＡの発現レベルに基づいて検出されるバイオマーカーの場合、例えば、異なるグループのバイオマーカーの発現レベルの平均値又は中央値が統計的に有意であると算出されるならば、異なる表現型状態（phenotypic statuses）の間で測定される発現レベルは異なっていると考えられうる。統計的有意性のための通例の試験には、とりわけ、ｔ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、クラスカル−ウォリス検定（Kruskal-Wallis）、ウィルコクソン検定（Wilcoxon）、マン・ホイットニー検定（Mann-Whitney）、マイクロアレイの有意性分析（Significance Analysis of Microarrays）、オッズ比（odds ratio）などが含まれる。バイオマーカーは、単独又は組み合わせて、対象が種々の表現型状態に属する相対的な可能性を測定することを可能にする。それ故、こうしたものはとりわけ、疾患のマーカーとして、そして具体的な治療計画が利益のある患者の結果をもたらす可能性があるインジケーターとして有用である。
【００３１】
この開示の一実施形態では、このバイオマーカーは、ＦＬＴ３受容体（本明細書中ではＦＬＴ３とも呼ばれる）である。この開示の一実施形態では、ＦＬＴ３レセプターの測定可能な態様は変異状態である。この開示の一実施形態では、変異状態は、ＦＬＴ３レセプターのチロシンキナーゼ活性の増加及び／又はＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼの構成的活性化（constitutive activation）をもたらすものである。こうした変異は、例えば、膜近傍ドメイン（juxtamembrane domain）の１つ又は複数の遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）及び／又はチロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）の１つ又は複数の変異を含む。
【００３２】
従って、この開示のいくつかの局面では、このバイオマーカーはＦＬＴ３であり、このＦＬＴ３は、別の表現型状態（例えば、変異を持っている細胞がない、正常で病気にかかっていない患者、又はがんに罹患している患者）と比べると、１つの表現型状態（例えば、変異を受けている細胞を持っているがん（例えば、白血病）に罹患している患者）の対象で特異的に見られる。
【００３３】
本明細書中で使用される際は、用語“バイオマーカー（biomarker）”は、個々の生体化合物（例えば、ＦＬＴ３、ｐ５３）のほかに、群として、又はセットとしての複数の生体化合物を含むことを意図している。例えば、ＦＬＴ３とｐ５３の組み合わせは、バイオマーカーを構成することが可能である。従って、“バイオマーカー（biomarker）”は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個又はそれ以上の生体化合物を含むことができる。
【００３４】
患者のバイオマーカーの発現レベル又は変異状態の決定は、当技術分野で知られている任意の多くの方法を用いて行うことができる。患者または生体試料中の特定のタンパク質を定量化するための、並びに／あるいはＦＬＴ３及び／又はｐ５３変異を検出するための当技術分野で知られた任意の方法は、この開示の方法で使用することができる。例としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、又はＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、ＲＮＡ発現の遺伝子チップ解析、免疫組織化学、又は免疫蛍光法（例えば、Slagle et al. Cancer 83:1401 (1998）参照）が含まれるが、これらに限定されない。この開示のいくつかの実施形態は、バイオマーカーＲＮＡ発現（転写）が決定される方法を含む。この開示の他のいくつかの実施形態は、生体試料中のタンパク質発現が決定される方法を含む。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd Edition, (1995）を参照されたい。ノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲ解析の場合には、ＲＮＡはＲＮＡｓｅフリーの手法を用いて腫瘍組織試料から単離される。こうした手法は当技術分野で一般的に知られている。
【００３５】
患者のインビボで数量化するとき、ＦＬＴ３又はその変異体などのタンパク質の発現レベルは、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗体を投与し（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２７９４５号参照）、そして結合の程度を決定することによって確定することができる。この抗体は、例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、及びフッ素−１８などの放射性同位体を用いて検出可能に標識することができる。次いでこの標識を陽電子放出Ｘ線断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出することができる。
【００３６】
この開示の一実施形態では、生体試料は、患者から得られ、そして生体組織検査において細胞はバイオマーカー発現又は変異状態の決定のためにアッセイされる。
【００３７】
この開示の一実施形態では、ＰＥＴ画像がバイオマーカー発現を決定するために使用される。
【００３８】
この開示の別の実施形態では、腫瘍細胞試料におけるバイオマーカー転写のノーザンブロット解析が行なわれる。ノーザン解析は、試料中のｍＲＮＡレベルを検出するための、及び／又は定量化するための標準的方法である。まず、ノーザンブロット解析を用いてアッセイする試料からＲＮＡを単離する。この解析では、最初に、変性条件下においてアガロースゲル中で電気泳動によって、ＲＮＡ試料をサイズ分離する。次いでＲＮＡをメンブレンに転写し、標識プローブと架橋及びハイブリダイズさせる。通例、ノーザンハイブリダイゼーションには、放射性標識ＤＮＡ又は非同位標識ＤＮＡをインビトロで重合させるか、あるいはハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの作成が必要である。通例、ＲＮＡ試料を保持しているメンブレンは、プローブハイブリダイゼーションの前にプレハイブリダイズするか、あるいはブロックして、プローブがメンブレンをコートすることを防止し、すなわち、非特異的バックグラウンドシグナルを減少させる。ハイブリダイゼーション後、通例、緩衝液をいくつか変更して洗浄することにより、ハイブリダイズしなかったプローブを除去する。当技術分野の当業者であれば、洗浄条件およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを設計し、選択し、そして実施することができる。検出は、検出可能に標識されたプローブ及び適切な検出方法を用いて行うことができる。放射標識及び非放射標識プローブ及びそれらの使用については当技術分野に周知である。アッセイされているバイオマーカーの発現の存在及び又は相対的レベルは、例えば、デンシトメトリーを使用して定量化することができる。
【００３９】
この開示の別の実施形態では、バイオマーカーの発現及び／又は変異状態は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定される。ＲＴ−ＰＣＲにより、標的遺伝子のＰＣＲ増幅の進行をリアルタイムで検出することが可能になる。この開示のバイオマーカーの発現及び／又は変異状態を検出するのに必要なプライマー及びプローブを設計することは、当技術分野の当業者の技術の範囲内である。ＲＴ−ＰＣＲは、腫瘍組織試料中にあるこの開示のバイオマーカーをコードするＲＮＡのレベルを決定するのに使用することができる。この開示の一実施形態では、生体試料からのＲＮＡは、ＲＮＡｓｅフリーの条件下において単離され、その後逆転写酵素で処理することによりＤＮＡに変換される。ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写酵素変換のための方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲについての説明は、次のレファレンスに提供されている：Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1986); ＥＰ ５０，４２４；ＥＰ ８４，７９６；ＥＰ ２５８，０１７；ＥＰ ２３７，３６２；ＥＰ ２０１，１８４；米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，５８２，７８８号；同第４，６８３，１９４号。
【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲプローブは、標的アンプリコン（バイオマーカー遺伝子）にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを加水分解するために、ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性に依存する。ＲＴ−ＰＣＲプローブは、５’末端に結合する蛍光リポーター色素、及び３’末端に結合する消光部分を有する（又は逆の場合も同じ）オリゴヌクレオチドである。こうしたプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計されている。ハイブリダイズされていない状態では、蛍光分子と消光分子とが接近しているため、プローブからの蛍光シグナルの検出が妨げられる。ＰＣＲ増幅中、ＲＴ−ＰＣＲプローブが結合するテンプレートをポリメラーゼが複製するとき、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断する。これにより、蛍光色素と消光色素は結合せず、ＦＲＥＴはもはや生じない。すなわち、蛍光は各サイクルにおいて、プローブ切断量に比例した形で増加する。この反応から放出される蛍光シグナルは、商業的に入手可能な装置を用いて、ルーチンであり、かつ従来から行なわれている手法を使用して、時間と共に測定するか、あるいは追跡することができる。
【００４１】
この開示の更に別の実施形態では、バイオマーカーによってコードされているタンパク質の発現はウェスタンブロット解析によって検出される。ウェスタンブロット（また、イムノブロットとも呼ばれている）は、組織ホモジネート又は抽出物の所与の試料中のタンパク質検出のための方法である。これはゲル電気泳動を用いて、質量によって変性タンパク質を分離する。次いでタンパク質をゲルからメンブレン（例えば、ニトロセルロース又はポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ））上に転写し、特異的にタンパク質に結合する一次抗体を用いて検出する。次いで結合した抗体を検出可能な標識（例えば、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）でコンジュゲートする二次抗体によって検出することができる。二次標識シグナルの検出はタンパク質の存在を示す。
【００４２】
この開示の更に別の実施形態では、バイオマーカーによってコードされているタンパク質の発現は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出される。この開示の一実施形態では、“サンドイッチ ＥＬＩＳＡ（sandwich ELISA）”は、プレートを捕捉抗体でコートすること；存在する任意の抗原を捕捉抗体に結合する試料を加えること；更に抗原に結合する、検出する抗体を加えること；検出する抗体に結合する酵素結合二次抗体を加えること；及び二次抗体上の酵素によって検出可能な形態に変換する基質を加えることを含んでなる。二次抗体からのシグナルの検出は、バイオマーカー抗原タンパク質の存在を示す。
【００４３】
この開示の更に別の実施形態では、バイオマーカーの発現は、遺伝子チップ又はマイクロアレイを用いることによって評価される。こうした手法は当技術分野で保持されている通常のスキルの範囲内にある。
【００４４】
本明細書中で使用される際は、用語“生体試料（biological sample）”とは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異状態のような、バイオマーカーを検出するのに適している患者からの任意の組織又は液体を意味する。有用な生体試料の例としては、生検組織及び／又は細胞、例えば、固形腫瘍、リンパ腺、炎症組織、病態又は疾患に関与している組織及び／又は細胞、血液、血漿、漿液、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液（cerebral spinal fluid）などが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な生体試料は、該当する技術分野の当業者によく知られているところである。生体試料は、当技術分野で知られている任意の手法を用いてバイオマーカー発現及び／又は変異の有無を分析することができ、そして適切に臨床専門家の通常の知識の範囲内に含まれる手法を用いて得ることができる。この開示の一実施形態では、生体試料は血球を含んでなる。
【００４５】
本明細書中で使用される際は、“ＭＤＭ２阻害剤（MDM2 inhibitor）”とは、ＭＤＭ２活性を妨げる化合物をである。ＭＤＭ２阻害剤は、当技術分野の当業者に周知である。例えば、Shangary, S. et al., Annual Review Of Pharmacology and Toxicology 49: 223-241 (2009)；及びWeber, L. Expert Opinion On Therapeutic Patents 20: 179-191 (2010）を参照されたい。
【００４６】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、スピロオキシインドール化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“スピロオキシインドールＭＤＭ２阻害剤（spiro-oxindole
MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許出願番号第６１／２６０，６８５号；同第６１／２６３，６６２号；同第６１／４１３，０９４号、同第６１／４５１，９６８号、同第１１／３６０，４８５号（ＵＳ ２００６／０２１１７５７ Ａ１）；同第１１／８４８，０８９号（ＵＳ ２００８／０１２５４３０ Ａ１）；若しくは同第１２／９４５，５１１号、又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６２（ＷＯ ２００６／０９１６４６）若しくは同ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９１２８（ＷＯ ２００８／０３６１６８）中に開示されている化合物を意味する。特定の実施形態では、スピロオキシインドールＭＤＭ２阻害剤はチャート１の化合物である。別の特定の実施形態では、スピロオキシインドールＭＤＭ２阻害剤はチャート２の化合物である。チャート１の化合物は、蛍光偏光ベース生化学的結合アッセイ（fluorescence-polarization based biochemical binding assay）において、高親和性を有するヒトＭＤＭ２タンパク質に結合し、ｐ５３を有効的に活性化し、そして野生型ｐ５３を有する腫瘍細胞において細胞増殖阻害及び細胞死を誘発する。こうした化合物はヒトがんの異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を有意に抑制することができ、その結果、こうした化合物が新規な抗がん薬物として有望であることが示唆されている。
【００４７】
【化１】
2013523820.tif 000002
【００４８】
【化２】
2013523820.tif 000003
【００４９】
【化３】
2013523820.tif 000004
【００５０】
【化４】
2013523820.tif 000005
【００５１】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、シス−イミダゾリン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“シス−イミダゾリンＭＤＭ２阻害剤（cis-imidazoline MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許番号第６，６１７，３４６号；同第６，７３４，３０２号；同第７，１３２，４２１号；同第７，４２５，６３８号；若しくは同第７，５７９，３６８号；又は米国特許出願公開番号第２００５／０２８８２８７号又はＵ．Ｓ．２００９／０１４３３６４中に開示されている化合物を意味する。シス−イミダゾリンＭＤＭ２阻害剤は通例、“ヌトリン（nutlin）”と呼ばれている。特定の実施形態では、このシス−イミダゾリンは、ヌトリン−１（Nutlin-1）、ヌトリン−２（Nutlin-2）、又はヌトリン−３（Nutlin-3）（チャート３；Vassilev, L.T. et al., Science 303:844-848 (2004)参照）である。
【００５２】
【化５】
2013523820.tif 000006
【００５３】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、置換ピペリジン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“置換ピペリジンＭＤＭ２阻害剤（substituted piperidine MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許番号第７，０６０，７１３号又は同第７，５５３，８３３号中に開示されている化合物を意味する。
【００５４】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤はスピロインドリノン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“スピロインドリノンＭＤＭ２阻害剤（spiroindolinone MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許番号第６，９１６，８３３号；同第７，４９５，００７号；又は同第７，６３８，５４８号中に開示されている化合物を意味する。
【００５５】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤はオキシインドール化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“オキシインドールＭＤＭ２阻害剤（oxindole MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．７，５７６，０８２中に開示されている化合物を意味する。
【００５６】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ジフェニル−ジヒドロ−イミダゾピリジノン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“ジフェニル−ジヒドロ−イミダゾピリジノンＭＤＭ２阻害剤（diphenyl-dihydro-imidazopyridinone MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．７，６２５，８９５中に開示されている化合物を意味する。
【００５７】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、イミダゾチアゾール化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“イミダゾチアゾールＭＤＭ２阻害剤（imidazothiazole MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．２００９／０３１２３１０中に開示されている化合物を意味する。
【００５８】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、デアザフラビン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“デアザフラビンＭＤＭ２阻害剤（deazaflavin MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許出願公開番号第２００６／０２１１７１８号又は同第２０１０／００４８５９３号中に開示されている化合物を意味する。
【００５９】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ベンゾジアザピン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“ベンゾジアザピンＭＤＭ２阻害剤（benzodiazapine MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．２００５／０２２７９３２中に開示されている化合物を意味する。
【００６０】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、イソインドリン−１−オン化合物である。本明細書中で使用される際は、用語“イソインドリン−１−オンＭＤＭ２阻害剤（isoindolin-1-one MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．２００８／０２６１９１７中に開示
されている化合物を意味する。
【００６１】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ボロン酸である。本明細書中で使用される際は、用語“ボロン酸ＭＤＭ２阻害剤（boronic acid MDM2 inhibitor）”とは、例えば、米国特許出願公開番号第２００９／０２２７５４２号又は同第２００８／０１７１７２３号中に開示されている化合物を意味する。
【００６２】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ペプチド又はポリペプチドである。本明細書中で使用される際は、用語“ペプチド性ＭＤＭ２阻害剤（peptidic MDM2 inhibitor）”とは、例えば、Ｕ．Ｓ．７，０８３，９８３；Ｕ．Ｓ．２００６／０２１１７５７ Ａ１；Ｕ．Ｓ．２００５／０１３７１３７；Ｕ．Ｓ．２００２／０１３２９７７；Ｕ．Ｓ．２００９／００３０１８１；又はＷＯ ２００８／１０６５０７中に開示されている化合物を意味する。
【００６３】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、Shangary, S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 105:3933-3938 (2008); Vassilev, L.T., Trends Mol. Med. 13:23-31 (2007); Vassilev, L.T. et al., Science 303:844-848 (2004); Ding, K. et al., J. Med. Chem. 49:3432-3435 2006; Shangary, S. et al., Clin. Cancer Res. 14:5318-5324 (2008); Chene, P., Molecular Cancer Research 2:20-28 (2004); Pazgier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 106:4665-4670 (2009); U.S. 2008/0280769; U.S. 2008/0039472; U.S. 2009/0149493; 又はU.S. 2004/0171035のいずれかに開示されている化合物である。
【００６４】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＷＯ ２００９／１５１０６９ Ａ１；ＷＯ ２００９／０３７３４３ Ａ１（米国出願番号第１２／６７８，６８０号）；ＷＯ ２００８／１２５４８７ Ａ１（米国特許番号第７，６２５，８９５号）；ＷＯ ２００８／１１９７４１ Ａ２（米国出願番号第１２／５９３，７２１号）；及びＷＯ ２００９／１５６７３５ Ａ２のいずれかに開示されている化合物である。
【００６５】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式Ｉ：
【化６】
2013523820.tif 000007
｛式中、
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、及びＲ1dは、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるシクロアルケニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、カルボキサミド、及びスルホンアミドから成る群より選択され；
Ｒ2は、場合により置換されていることもあるアリール及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ3は、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されているこ
ともある（シクロアルキル）アルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるシクロアルケニル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ4は、水素及び場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
Ｒ5は、水素、場合により置換されていることもあるアルキル［ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、（シクロアルキル）アルキル（（cycloalkyl）alkyl）、及び（ヘテロシクロ）アルキル（（heterocyclo）alkyl）を含むが、これらに限定されない］、場合により置換されていることもあるシクロアルキル；場合により置換されていることもあるヘテロシクロ（optionally substituted heterocyclo）、
又は：
【００６６】
【化７】
2013523820.tif 000008
［上式で、
Ｒ6a及びＲ6bは、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ7は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ8a及びＲ8bは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ8a及びＲ8bは、それらが結合している炭素と一緒になって３員〜８員の、場合により置換されていることもあるシクロアルキルを形成し；
Ｗ1は、−ＯＲ9a及び−ＮＲ9bＲ9cから成る群より選択され；
【００６７】
Ｒ9aは水素であり；
Ｒ9bは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、−ＳＯ2Ｒ9d、及び−ＣＯＮＲ9eＲ9fから成る群より選択され；
Ｒ9cは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ9b及びＲ9cは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｒ9dは、場合により置換されていることもあるアルキル及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ9e及びＲ9fは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ9e及びＲ9fは、それらが結合している窒素原子と一緒になって４員〜８員の、場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｗ2は、−ＯＲ10及び−ＮＲ11aＲ11bから成る群より選択され；
Ｒ10は水素であり；
又は
Ｒ9a及びＲ10の一方は、水素であり、そして他方は、代謝的に切断可能な基であり；
Ｒ11aは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、−ＳＯ2Ｒ11c、及び−ＣＯＮＲ11dＲ11eから成る群より選択され；
Ｒ11bは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
【００６８】
Ｒ11a及びＲ11bは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｒ11cは、場合により置換されていることもあるアルキル及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ11d及びＲ11eは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ11d及びＲ11eは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
ｎは、１、２、３、４、又は５であり；
Ｒ12a、Ｒ12b、Ｒ12c及びＲ12dは、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ13は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ14は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｚは、−ＯＲ15及び−ＮＲ16aＲ16bから成る群より選択され；
又は
Ｚ及びＲ14は、一緒になってカルボニル基、すなわち、Ｃ＝Ｏを形成する。
【００６９】
Ｒ15は、水素及び代謝的に切断可能な基から成る群より選択され；
Ｒ16aは、−ＳＯ2Ｒ16c及び−ＣＯＮＲ16dＲ16eから成る群より選択され；
Ｒ16bは、水素及び場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
Ｒ16cは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ16d及びＲ16eは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ16d及びＲ16eは、それらが結合している窒素原子と一緒になって４員〜８員のヘテロシクロを形成し；
ｏは、１、２、又は３であり；
ｐは、０、１、２、又は３であり；
Ｒ17a、Ｒ17b、Ｒ17c及びＲ17dは、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ18は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ19は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ20は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ21a及びＲ21bは、それぞれ、水素であり；
又は
Ｒ21a及びＲ21bの一方は、水素であり、そして他方は、代謝的に切断可能な基であり；
ｑは、０、１、２、又は３であり；
ｒは、１、２、又は３であり；
【００７０】
Ｒ22a、Ｒ22b、Ｒ22c、及びＲ22dは、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ23は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ24は、−ＳＯ2Ｒ24a及び−ＣＯＮＲ24bＲ24cから成る群より選択され；
Ｒ24aは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ24b及びＲ24cは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ24b及びＲ24cは、それらが結合している窒素原子と一緒になって４員〜８員のヘテロシクロを形成し；
ｓ及びｔは、それぞれ、独立して１、２、又は３である］であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ’から成る群より選択され；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ”から成る群より選択され；
Ｒ’は、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、アラルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
そして
Ｒ”は、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、アラルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され、
又は
Ｒ4及びＲ5は、それらが結合している窒素と一緒になって４員〜８員の、場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成する｝
の化合物、又はその立体異性体、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００７１】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩ：
【化８】
2013523820.tif 000009
［式中、
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｘ、及びＹは、式Ｉの場合に上記に述べられている意味を有する］
の化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００７２】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩにおいて：
Ｘ及びＹは、それぞれ、ＮＨであり；
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、及びＲ1dは、それぞれ、独立して、水素、クロロ、及びフルオロから成る群より選択され；
Ｒ2は、場合によりクロロ若しくはフルオロで置換されていることもあるフェニルであり；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ6アルキルであり；
Ｒ4は水素であり；
そして
【００７３】
Ｒ5は、その立体異性体、例えば、エナンチオマーを含む、下記：
【化９】
2013523820.tif 000010
［式中、
Ｒ7は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ4アルキルから成る群より選択され；
【００７４】
Ｒ9a及びＲ10は、それぞれ、水素であり；
又は
Ｒ9a及びＲ10の一方は、水素であり、そして他方は代謝的に切断可能な基であり；
Ｒ9bは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、−ＳＯ2Ｒ9d、及び−ＣＯＮＲ9eＲ9fから成る群より選択され；
【００７５】
Ｒ9cは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ9b及びＲ9cは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｒ9dは、場合により置換されていることもあるアルキル及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ9e及びＲ9fは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ9e及びＲ9fは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｒ11aは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、−ＳＯ2Ｒ11c、及び−ＣＯＮＲ11dＲ11eから成る群より選択され；
Ｒ11bは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ11a及びＲ11bは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
Ｒ11cは、場合により置換されていることもあるアルキル及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ11d及びＲ11eは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ11d及びＲ11eは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜８員の場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成し；
【００７６】
Ｒ14は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、又はＣ3−Ｃ6シクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ15は、水素又は代謝的に切断可能な基であり；
Ｒ16aは、−ＳＯ2Ｒ16c及び−ＣＯＮＲ16dＲ16eから成る群より選択され；
Ｒ16bは、水素及び場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
Ｒ16cは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ16d及びＲ16eは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
又は
Ｒ16d及びＲ16eは、それらが結合している窒素原子と一緒になって４員〜８員のヘテロシクロを形成し；
Ｒ19は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ20は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び場合により置換されていることもあるシクロアルキルから成る群より選択され；
Ｒ21a及びＲ21bは、それぞれ、水素であり；
又は
Ｒ21a及びＲ21bの一方は、水素であり、そして他方は、代謝的に切断可能な基であり；
Ｒ24は、−ＳＯ2Ｒ24a及び−ＣＯＮＲ24bＲ24cから成る群より選択され；
Ｒ24aは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
そして
Ｒ24b及びＲ24cは、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもある
シクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され、
又は
Ｒ24b及びＲ24cは、それらが結合している窒素原子と一緒になって４員〜８員のヘテロシクロを形成する］から成る群より選択される、
式ＩＩの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００７７】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、以下の化合物：
【化１０】
2013523820.tif 000011
から成る群より選択される化合物である。
【００７８】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａ：
【化１１】
2013523820.tif 000012
［式中、
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｘ、及びＹは、式Ｉの場合に上記に述べられている意味を有する］
の化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００７９】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいて、
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、及びＲ1dは、それぞれ、独立して、水素、フルオロ、及びクロロから成る群より選択され；
Ｒ2は、
【化１２】
2013523820.tif 000013
［上式で、
Ｒ25a、Ｒ25b、Ｒ25c、Ｒ25d、及びＲ25eは、それぞれ、独立して、水素、フルオロ、及びクロロから成る群より選択される］であり；
Ｒ3は、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ8アルキルであり；
Ｒ4は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
【００８０】
Ｒ5は、下記：
【化１３】
2013523820.tif 000014
［上式で、
Ｒ14は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ4アルキルから成る群より選択される］から成る群より選択され：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ’から成る群より選択され；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ”から成る群より選択され；
Ｒ’は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ4アルキルから成る群より選択され；
そして
Ｒ”は、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ4アルキルから成る群より選択される、
化合物であって、ここでこの化合物は１つ又は複数の他の立体異性体を実質的に含まない、式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和若しくはプロドラッグである。
【００８１】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいてＲ4が水素である式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８２】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいてＸがＮＨである式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８３】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいてＹがＮＨである式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８４】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいてＲ3が−ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）3である式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８５】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａにおいて、Ｒ5が下記：
【化１４】
2013523820.tif 000015
から成る群より選択される式ＩＩａの化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８６】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩａの化合物であって、式ＩＩａにおいて、
Ｒ1aは、水素であり；
Ｒ1b、Ｒ1c、及びＲ1dは、それぞれ、独立して、水素、フルオロ、及びクロロから成る群より選択され；
Ｒ3は、Ｃ4−Ｃ8アルキルであり；
Ｒ4は、水素であり；
【００８７】
Ｒ5は、下記：
【化１５】
2013523820.tif 000016
から成る群より選択され：
そして
Ｘ及びＹは、ＮＨである、
化合物、又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００８８】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、下記：
【化１６】
2013523820.tif 000017
【００８９】
【化１７】
2013523820.tif 000018
又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される。
【００９０】
別の特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、下記：
【化１８】
2013523820.tif 000019
又はその製薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００９１】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、Ｕ．Ｓ．６，７３４，３０２中に記載されている阻害剤のうちのいずれかである。
【００９２】
例えば、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＩＩ：
【化１９】
2013523820.tif 000020
｛式中、
Ｒは−Ｃ＝ＯＲ1であり；
ここで、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、−Ｃ＝ＣＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｒ2、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ3、飽和の４員、５員及び６員の環、並びにヘテロ原子がＳ、Ｎ及びＯより選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む飽和及び不飽和５員及び６員の環［この環は、場合により、低級アルキル、−Ｃ＝Ｏ−Ｒ5、−ＯＨ、ヒドロキシで置換された低級アルキル、−ＮＨ2で置換された低級アルキル、Ｎ−低級アルキル、−ＳＯ2ＣＨ3、＝Ｏ、−ＣＨ2Ｃ＝ＯＣＨ3、及びＳ、Ｎ及びＯより選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員及び６員の飽和の環より選択される基で置換されていることもある］より選択され、
上記において、
Ｒ5は、Ｈ、低級アルキル、−ＮＨ2、−Ｎ−低級アルキル、ヒドロキシで置換されている低級アルキル、及びＮＨ2で置換されている低級アルキルより選択され；
上記において、
Ｒ2は、−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2、−ＮＨ2、モルホリニル及びピペラジニルより選択され；
Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は、独立して、−ＯＨ、Ｃ1−Ｃ2アルキル、Ｃ1−Ｃ5アルコキシ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、−ＣＨ2ＯＣＨ3、及び−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3より選択され；
又は
Ｘ1、Ｘ2又はＸ3の１つは、Ｈであり、そして他の２つは、独立して、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、−ＣＦ3、−ＣＨ2ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ3、−ＯＣＨ2ＣＦ3、及び−ＯＲ4より選択され；
又は
Ｘ1、Ｘ2又はＸ3の１つは、Ｈであり、そして他の２つは、それらが置換されているベンゼン環からの、２つの炭素原子及びそれらの間の結合と一緒になって、Ｓ、Ｎ、及びＯ、より選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員又は６員の飽和環を形成し、
上記において、
Ｒ3は、−Ｆ、−ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ3、少なくとも１つのヘテロ原子（上記において、へテロ原子はＳ、Ｎ及びＯより選択される）を含む不飽和の５員及び６員の環より選択され；
上記において、
Ｒ4は、３員〜５員の飽和の環であり；
そして
Ｙ1及びＹ2は、それぞれ、独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＮＯ2、−Ｃ≡Ｎ、及び−Ｃ≡ＣＨより選択される｝
の化合物、又はその製薬学的に許容される塩又はエステルである。
【００９３】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、下記：
【化２０】
2013523820.tif 000021
から成る群より選択される化合物（その立体異性体、例えば、エナンチオマーを含む）である。
【００９４】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＷＯ ２００９／１５６７３５ Ａ２中に記載されている阻害剤のうちのいずれかである。例えば、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＩＶ又はＶ：
【化２１】
2013523820.tif 000022
【００９５】
式ＩＶ及びＶの双方において、
Ｘは、Ｏ、Ｎ又はＳより選択され；
Ｒ1は、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヒドロキシアルキル、置換若しくは非置換アルキルアミン、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換アラルキル、及び置換若しくは非置換ヘテロアラルキルより選択され；
Ｒ2は、水素、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、置換若しくは非置換の分岐状のヒドロキシアルキル、６個又はそれより多い環炭素原子を有する置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルケニル、ヒドロキシアルキルアラルキル、ヒドロキシアルキルヘテロアラルキル、及びカルボン酸を含む基より選択され；
Ｒ3は、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヒドロキシアルキル、置換若しくは非置換アルキルアミン、置換若しくは非置換アルコキシ、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換アラルキル、及び置換若しくは非置換ヘテロアラルキルより選択され；及び
Ｒ4−Ｒ7は、基Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7を表し、この基Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヒドロキシアルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換ヘテロアラルキル、置換若しくは非置換アルキルアミン、置換若しくは非置換アルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、カルボニルメチルスルホン（carbonylmethylsulfone）、トリフルオロメチルスルホン（trifluoromethylsulfone）、シアノ及び置換若しくは非置換スルホンアミドより選択され；
上記において、
Ｒ2が、置換若しくは非置換の分岐状のヒドロキシアルキルである場合には、Ｘは、Ｏ又はＳであり；そして
上記において、
Ｒ2が水素である場合には、Ｒ4−Ｒ7の少なくとも１つは、水素ではなく、そしてＲ3は、ベンゾイミダゾール誘導体又はベンゾイミダゾリン誘導体ではなく；そして
上記において、式Ｖで、６員の環は、０、１、又は２個のＣ＝Ｃ二重結合を有していてもよい、
式ＩＶ又はＶの化合物、又はその製薬学的に許容される塩である。
【００９６】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＷＯ ２００９／１５１１０６９ Ａ１中に記載されている阻害剤のうちのいずれかである。例えば、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＶＩ：
【化２２】
2013523820.tif 000023
の化合物、又はその製薬学的に許容される塩である。
【００９７】
置換基の可能性のある例には、以下が含まれる。式ＶＩにおいて：
Ａｒ1及びＡｒ2は、それぞれ、独立して、場合により置換されていることもあるアリール及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ1は、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、及び−ＣＯＲ1aから成る群より選択され；
Ｒ1aは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、及び場合により置換されていることもあるアリールから成る群より選択され；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ2及びＲ3は、一緒になって３員〜６員の場合により置換されていることもあるシクロアルキル又はヘテロシクロを形成し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ、独立して、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、及び場合により置換されていることもあるアリールから成る群より選択され；
【００９８】
Ｗは、下記：
【化２３】
2013523820.tif 000024
から成る群より選択され：
上式で、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ、独立して、水素、ヒドロキシ及び場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ6及びＲ7は、一緒になって３員〜６員の場合により置換されていることもあるシクロアルキル、又はオキソ、すなわち、Ｃ＝Ｏを形成し；
Ｒ8は、水素又は場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ、独立して、水素又は場合により置換されていることもあるアルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ9及びＲ10は、一緒になって３員〜６員の場合により置換されていることもあるシクロアルキル又はヘテロシクロを形成し；
そして
Ｘは、炭素原子である。
【００９９】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、式ＶＩの化合物であり、上式で置換基の可能性のある例には、以下が含まれる。
【０１００】
式ＶＩにおいて：
Ａｒ1及びＡｒ2は、それぞれ、独立して、場合により置換されていることもあるフェニル及び場合により置換されていることもあるピリジルから成る群より選択され；
Ｒ1は、水素、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、及び−ＣＯＲ1aから成る群より選択され；
Ｒ1aは、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ2及びＲ3は、一緒になって３員〜６員の場合により置換されていることもあるシクロアルキルを形成し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
【０１０１】
Ｗは、
【化２４】
2013523820.tif 000025
であり；
上式で、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ、独立して、水素及び場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルから成る群より選択され；
又は
Ｒ6及びＲ7は、一緒になって３員〜６員の場合により置換されていることもあるシクロアルキル、又はオキソを形成する。
【０１０２】
本明細書中で使用される際には、用語“代謝的に切断可能な基（metabolically cleavable group）”とは、代謝プロセスによって親分子から切断でき、水素で置換することができる基を意味する。代謝的に切断可能な基を含むある種の化合物は、プロドラッグであってもよく、すなわち、それらは薬理学的に不活性である。代謝的に切断可能な基を含む他のある種の化合物は、ｐ５３とＭＤＭ２の相互作用のアンタゴニストであってもよい。このような場合には、こうした化合物は、親分子の活性と比較してより高いか、より低いか、あるいは同等である。代謝的に切断可能な基の例には、スキーム１に図解したようなアミノ酸から誘導されるもの（例えば、ＵＳ ２００６／０２４１０１７ Ａ１；ＵＳ ２００６／０２８７２４４ Ａ１；及びＷＯ ２００５／０４６５７５ Ａ２参照）、又はリン含有化合物（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２４９５６４ Ａ１参照）が含まれる。
【０１０３】
【化２５】
2013523820.tif 000026
【０１０４】
本明細書中で使用される際には、用語“製薬学的に許容される塩（pharmaceutically acceptable salt）”とは、標的動物（例えば、哺乳類）において生理学的に許容しうる本明細書中で提供される化合物の任意の塩（例えば、酸又は塩基との反応によって得られる）を意味する。本明細書中で提供される化合物の塩は、無機又は有機の酸及び塩基から誘導することができる。酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれるが、これらに限定されない。それ自体製薬学的に許容されないが、シュウ酸などの他の酸は、その製薬学的に許容される酸付加塩を含む、本明細書中で提供される化合物を得る際の中間体として有用である塩の製造に使用することができる。
【０１０５】
塩基の例には、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ4+（ここで、ＷはＣ1-4アルキルである）の化合物などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
塩の例には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩（camphorate）、ショウノウスルホン酸塩（camphorsulfonate）、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩（flucoheptanoate）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩（hemisulfate）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物（chloride）、臭化物（bromide）、ヨウ化物（iodide）、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート（tosylate）、ウンデカン酸塩など。他の塩の例としては、本明細書中で提供される化合物のアニオン化合物と、例えば、Ｎａ+、ＮＨ4+、及びＮＷ4+（ここで、ＷはＣ1-4アルキル基である）などの適切なカチオンとの化合物が含まれる。治療用途の場合には、本明細書中で提供される化合物の塩が製薬学的に許容されるものとして想定されている。しかしながら、製薬学的に許容されるものではない酸と塩基の塩はまた、例えば、製薬学的に許容される化合物の製造又は精製に有用でありうる。
【０１０７】
本明細書中で使用される際には、用語“溶媒和物（solvate）”とは、本明細書中で提供される化合物と、有機であっても、それとも無機あっても、１つ又は複数の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、しばしば水素結合を含む。いくつかの例では、例えば１つ又は複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に組み込まれるとき、溶媒和物は単離することが可能である。“溶媒和物（solvate）”は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。例示的な溶媒和物には、水和物、エタノール付加物、及びメタノール付加物が含まれる。
【０１０８】
本明細書中で使用される際には、用語“一価の製薬学的に許容されるカチオン（monovalent pharmaceutically acceptable cation）”とは、非限定的に、アルカリ金属イオン、例えば、Ｎａ+及びＫ+のような無機カチオン、並びにアンモニウム及び置換アンモニウムイオン（非限定的に、例えば、ＮＨ4+、ＮＨＭｅ3+、ＮＨ2Ｍｅ2+、ＮＨＭｅ3+及びＮＭｅ4+）などの有機カチオンを意味する。
【０１０９】
本明細書中で使用される際には、用語“二価の製薬学的に許容されるカチオン（divalent pharmaceutically acceptable cation）”とは、アルカリ土類金属カチオン、例えば、Ｃａ2+及びＭｇ2+などの無機カチオン（これらに限定されない）を意味する。
【０１１０】
一価及び二価の製薬学的に許容されるカチオンの例は、例えば、 Berge et al. J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1997）中に論じられている。
【０１１１】
本明細書中で使用される際には、用語“治療的に有効な量（therapeutically effective amount）”とは、１つ又は複数の障害の症状の寛解をもたらし、又は障害の進行を妨げ、又は障害の退縮を起こさせるのに十分な治療剤の量を意味する。一例を示せば、がん、例えば、白血病の処置に関しては、一実施形態では、治療的に有効な量は、治療的応答、例えば、血球数の正常化、腫瘍増殖の比率の減少、腫瘍塊の減少、転移の数の減少、腫瘍増悪までの期間の増加、及び／又は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも１００％、又はそれ以上の生存期間の増加をもたらす治療剤の量を意味する。
【０１１２】
用語“製薬学的に許容される担体（pharmaceutically acceptable carrier）”又は“製薬学的に許容されるビヒクル（pharmaceutically acceptable vehicle）”とは、標準的な製薬の担体、溶媒、界面活性剤、又はビヒクルのすべてを包含する。適切な製薬学的に許容されるビヒクルは、水性ビヒクル、非水性ビヒクルを含む。標準的な製薬担体及びそれらの製剤化は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995中に記載されている。
【０１１３】
用語“アルキル（alkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１〜１８の炭素、又は指示されている炭素の数を有する直鎖状又は分岐状の飽和脂肪族炭化水素を意味する（例えば、Ｃ1−Ｃ18は、１〜１８の炭素を意味する）。一実施形態では、アルキルは、Ｃ1−Ｃ10アルキルである。別の実施形
態では、アルキルは、Ｃ1−Ｃ6アルキルである。別の実施形態では、アルキルは、Ｃ1−Ｃ4アルキルである。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、ｎ−オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。
【０１１４】
用語“場合により置換されていることもあるアルキル（optionally substituted alkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるアルキルが、非置換であるか、あるいは、ヒドロキシ（すなわち、−ＯＨ）、ニトロ（すなわち、−ＮＯ2）、シアノ（すなわち、−ＣＮ）、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド、又はスルホンアミドより、独立して選択される、１つ、２つ又は３つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。一実施形態では、場合により置換されていることもあるアルキルは、２つの置換基で置換されている。別の実施形態では、場合により置換されていることもあるアルキルは１つの置換基で置換されている。別の実施形態では、置換基は、ヒドロキシル（すなわち、ヒドロキシアルキル）、場合により置換されていることもあるシクロアルキル（すなわち、（シクロアルキル）アルキル）、又はアミノ（すなわち、アミノアルキル）より選択される。例示的な場合により置換されていることもあるアルキル基としては、−ＣＨ2ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ（ＣＨ3）、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ3、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなどが挙げられる。
【０１１５】
用語“アルキレニル（alkylenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれよリ多い連結したメチレン基を含む二価のアルキルラジカルを意味する。例示的なアルキレニル基としては、−（ＣＨ2）−、−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）3−、−（ＣＨ2）4−、などが挙げられる。
【０１１６】
用語“場合により置換されていることもあるアルキレニル（optionally substituted alkylenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるアルキレニルが、非置換であるか、あるいは、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、及び場合により置換されていることもあるヘテロアリールから成る群より、独立して選択される、１つ、２つ、３つ、又は４つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。一実施形態では、場合により置換されていることもあるＣ1−Ｃ6アルキルは、メチルである。一実施形態では、場合により置換されていることもあるアリールは、場合により、１つ又は２つのハロ基（halo groups）で置換されていることもあるフェニルである。例示的な場合により置換されていることもあるアルキレニル基としては、−ＣＨ（ＣＨ3）−、−Ｃ（ＣＨ3）2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ（Ｐｈ）ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ（ＣＨ3）−などが挙げられる。
【０１１７】
用語“ハロアルキル（haloalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１〜６個のハロ置換基を有する上記に定義されているアルキルを意味する。一実施形態では、ハロアルキルは、１個、２個又は３個のハロ置換基を有している。例示的なハロアルキル基としては、トリフルオロメチル、−ＣＨ2ＣＨ2Ｆなどが挙げられる。
【０１１８】
用語“ヒドロキシアルキル（hydroxyalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１つのヒドロキシ置換基を有する上記に定義されるアルキルを意味する。例示的なヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなどが挙げられる。
【０１１９】
用語“ジヒドロキシアルキル（dihydroxyalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、２つのヒドロキシル置換基を有する上記に定義されるアルキルを意味する。例示的なジヒドロキシアルキル基としては、その立体異性体を含む、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＣＨ3（ＯＨ）ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）2、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（ＣＨ3）2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＣＨ3（ＯＨ）ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨなどが挙げられる。
【０１２０】
用語“ヒドロキシシクロアルキル（hydroxycycloalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、少なくとも１つ、例えば、１つ又は２つのヒドロキシ置換基を有する下記に定義される、場合により置換されていることもあるシクロアルキルを意味する。例示的なヒドロキシシクロアルキル基としてはその立体異性体を含む下記：
【化２６】
2013523820.tif 000027
などが挙げられる
【０１２１】
用語“場合により置換されていることもある（シクロアルキル）アルキル（optionally
substituted(cycloalkyl)alkyl)”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、場合により置換されていることもあるシクロアルキル（下記に定義されている）置換基を有する上記に定義される、場合により置換されていることもあるアルキルを意味する。例示的な場合により置換されていることもある（シクロアルキル）アルキル基としては、その立体異性体を含む、下記：
【化２７】
2013523820.tif 000028
などが挙げられる
【０１２２】
用語“アラルキル（aralkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基
の一部分として使用される際には、１つ、２つ又は３つの、場合により置換されていることもあるアリール置換基を有する上記に定義される、場合により置換されていることもあるアルキルを意味する。一実施形態では、アラルキルは、２つの、場合により置換されていることもあるアリール置換基を有する。別の実施形態では、アラルキルは、１つの、場合により置換されていることもあるアリール置換基を有する。別の実施形態では、アラルキルは、アリール（Ｃ1−Ｃ4アルキル）である。別の実施形態では、アリール（Ｃ1−Ｃ4アルキル）は、２つの、場合により置換されていることもあるアリール置換基を有する。別の実施形態では、アリール（Ｃ1−Ｃ4アルキル）は、１つの場合により置換されていることもあるアリール置換基を有する。例示的なアラルキル基としては、例えば、ベンジル、フェニルエチル、（４−フルオロフェニル）エチル、フェニルプロピル、ジフェニルメチル（すなわち、Ｐｈ2ＣＨ−）、ジフェニルエチル（Ｐｈ2ＣＨＣＨ2−）などが挙げられる。
【０１２３】
用語“シクロアルキル（cycloalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、３〜１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキル）又は指示された炭素数を有する、１〜３個の環を含む飽和及び部分的に不飽和（１つ又は２つの二重結合を含む）の環状の炭化水素基を意味する。一実施形態では、シクロアルキルは１個の環を有する。別の実施形態では、シクロアルキルは、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルである。例示的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ノルボルニル、デカリン、アダマンチルなどが挙げられる。
【０１２４】
用語“場合により置換されていることもあるシクロアルキル（optionally substituted
cycloalkyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されているシクロアルキルが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される、１つ、２つ又は３つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。用語“場合により置換されていることもあるシクロアルキル（optionally substituted cycloalkyl）”はまた、上記に定義されるシクロアルキルが場合により置換されていることもあるアリールと縮合している場合もありうることを意味する。例示的な場合により置換されていることもあるシクロアルキル基としては、
【化２８】
2013523820.tif 000029
などが挙げられる。
【０１２５】
用語“アルケニル（alkenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１つ、２つ又は３つの炭素−炭素二重結合を含む上記に定義されるアルキル基を意味する。一実施形態では、アルケニルは、１つの炭素−炭素二重結合を有している。例示的なアルケニル基としては、−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ3などが挙げられる。
【０１２６】
用語“場合により置換されていることもあるアルケニル（optionally substituted alkenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるアルケニルが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される１つ、２つ又は３つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。例示的な場合により置換されていることもあるアルケニル基としては、−ＣＨ＝ＣＨＰｈ、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＰｈなどが挙げられる。
【０１２７】
用語“シクロアルケニル（cycloalkenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１つ、２つ又は３つの炭素−炭素二重結合を含む上記に定義されるシクロアルキル基を意味する。一実施形態では、シクロアルケニルは、１つの炭素−炭素二重結合を有している。例示的なシクロアルケニル基としては、シクロペンテン、シクロヘキセンなどが挙げられる。
【０１２８】
用語“場合により置換されていることもあるシクロアルケニル（optionally substituted cycloalkenyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるシクロアルケニル基が、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される、１つ、２つ又は３つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。
【０１２９】
用語“アルキニル（alkynyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、１〜３個の炭素−炭素三重結合を含む上記に定義されるアルキル基を意味する。一実施形態では、アルキニルは、１個の炭素−炭素三重結合を有する。例示的なアルキニル基としては、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ≡ＣＣＨ3、−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ及び−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3が挙げられる。
【０１３０】
用語“場合により置換されていることもあるアルキニル（optionally substituted alkynyl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるアルキニルが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される、１つ、２つ又は３つの置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。例示的な場合により置換されていることもあるアルキニル基(alkenyl groups)としては、−Ｃ≡ＣＰｈ、−ＣＨ2Ｃ≡ＣＰｈなどが挙げられる。
【０１３１】
用語“アリール（aryl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、６〜１４個の炭素原子（すなわち、Ｃ6−Ｃ14アリール）を有する単環及び二環の芳香族式環系を意味し、例えば、フェニル（Ｐｈと略す）、１−ナフチル及び２−ナフチルなどがある。
【０１３２】
用語“場合により置換されていることもあるアリール（optionally substituted aryl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるアリールが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される１〜５個の置換基で置換されるているかのどちらかであることを意味する。一実施形態では、場合により置換されていることもあるアリールは、場合により置換されていることもあるフェニルである。一実施形態では、場合により置換されていることもあるフェニルは、４つの置換基を有する。別の実施形態では、場合により置換されていることもあるフェニルは、３つの置換基を有する。別の実施形態では、場合により置換されていることもあるフェニルは、２つの置換基を有する。別の実施形態では、場合により置換されていることもあるフェニルは、１つの置換基を有する。例示的な置換アリールとしては、２−メチルフェニル、２−メトキシフェニル、２−フルオロフェニル、２−クロロフェニル、２−ブロモフェニル、３−メチルフェニル、３−メトキシフェニル、３−フルオロフェニル、３−クロロフェニル、４−メチルフェニル、４−エチルフェニル、４−メトキシフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２，６−ジ−フルオロフェニル、２，６−ジ−クロロフェニル、２−メチル、３−メトキシフェニル、２−エチル、３−メトキシフェニル、３，４−ジ−メトキシフェニル、３，５−ジ−フルオロフェニル、３，５−ジ−メチルフェニル及び３，５−ジメトキシ、４−メチルフェニル、２−フルオロ−３−クロロフェニル、３−クロロ−４−フルオロフェニルなどが挙げられる。用語「場合により置換されていることもあるアリール」は、縮合された、場合により置換されていることもあるシクロアルキル環、及び縮合された、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ環を有する基を包含することを意図している。
【０１３３】
例には、
【化２９】
2013523820.tif 000030
などがある。
【０１３４】
用語“ヘテロアリール（heteroaryl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、５〜１４個の炭素原子（すなわち、Ｃ5-Ｃ14ヘテロアリール）、そして酸素、窒素及び硫黄から成る群より、独立して、選択される１つ、２つ、３つまたは４つのヘテロ原子を有する単環及び二環の芳香族式環系を意味する。一実施形態では、ヘテロアリールは、３つのヘテロ原子を有する。一実施形態では、ヘテロアリールは、２つのヘテロ原子を有する。一実施形態では、ヘテロアリールは、１つのヘテロ原子を有する。例示的なヘテロアリール基の例としては、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾチアゾリル（2-benzthiazolyl）、４−ベンゾチアゾリル（4-benzthiazolyl）、５−ベンゾチアゾリル（5-benzthiazolyl）、５−インドリル、３−インダゾリル、４−インダゾリル、５−インダゾリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、２−キノリル、３−キノリル、６−キノリルなどが挙げられる。用語「ヘテロアリール」は、可能なＮ−オキシドを包含することを意図している。例示的なＮ−オキシドとしては、ピリジル Ｎ−オキシドなどが挙げられる。
【０１３５】
用語“場合により置換されていることもあるヘテロアリール（optionally substituted
heteroaryl）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるヘテロアリールが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド又はスルホンアミドより、独立して選択される、１〜４個の置換基、通例、１又は２個の置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。一実施形態では、場合により置換されていることもあるヘテロアリールは、１個の置換基を有する。別の実施形態では、置換基は、場合により置換されていることもあるアリール、アラルキル、又は場合により置換されていることもあるアルキルである。別の実施形態では、置換基は、場合により置換されていることもあるフェニルである。任意の利用可能な炭素原子又は窒素原子が置換されうる。例示的な、場合により置換されていることもあるヘテロアリール基としては、下記：
【化３０】
2013523820.tif 000031
などが挙げられる。
【０１３６】
用語“ヘテロシクロ（heterocyclo）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、２〜１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ2-Ｃ12ヘテロシクロ）、そして１つ又は２つの酸素、硫黄又は窒素原子を有する、１〜３個の環を含む飽和及び部分的に不飽和の（１つ又は２つの二重結合を含む）環状の基を意味する。ヘテロシクロは、場合により炭素原子又は窒素原子を介して分子の残りと連結していることもありうる。例示的なヘテロシクロ基としては、以下：
【化３１】
2013523820.tif 000032
などが挙げられる。
【０１３７】
用語“場合により置換されていることもあるヘテロシクロ（optionally substituted heterocyclo）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、上記に定義されるヘテロシクロが、非置換であるか、あるいは、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、場合により置換されていることもあるアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、場合により置換されていることもあるアルキニル、場合により置換されていることもあるアリール、場合により置換されていることもあるヘテロアリール、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アルキルチオ、カルボキサミド、スルホンアミド、−ＣＯＲc、−ＳＯ2Ｒd、−Ｎ（Ｒe）ＣＯＲf、−Ｎ（Ｒe）ＳＯ2Ｒg又は−Ｎ（Ｒe）Ｃ＝Ｎ（Ｒh）−アミノ［上記において、Ｒcは、水素、場合により置
換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールであり；Ｒdは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールであり；Ｒeは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールであり；Ｒfは、水素、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールであり；Ｒgは、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリール；そしてＲhは、水素、−ＣＮ、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールである］より、独立して選択される、１〜４個の置換基で置換されているかのどちらかであることを意味する。置換基は、任意の利用可能な炭素又は窒素原子上に存在することができる。例示的な置換されたヘテロシクロ基としては、以下：
【化３２】
2013523820.tif 000033
などが挙げられる。場合により置換されていることもあるヘテロシクロは、アリール基と縮合し、上記に述べられている、場合により置換されていることもあるアリールを提供する。
【０１３８】
用語“アルコキシ（alkoxy）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、末端の酸素原子に結合しているハロアルキル、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、又は場合により置換されていることもあるアルキニルを意味する。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、−ＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2などが挙げられる。
【０１３９】
用語“アリールオキシ（aryloxy）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、末端の酸素原子に結合している場合により置換されていることもあるアリールを意味する。例示的なアリールオキシ基としては、フェノキシなどが挙げられる。
【０１４０】
用語“アラルキルオキシ（aralkyloxy）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、末端の酸素原子に結合しているアラルキルを意味する。例示的なアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシが挙げられる。
【０１４１】
用語“アルキルチオ（alkylthio）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、末端の硫黄原子に結合しているハロアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるアルケニル、又は場合により置換されていることもあるアルキニルを意味する。例示的なアルキルチオ基（alkyl groups）としては、−ＳＣＨ3などが挙げられる。
【０１４２】
用語“ハロ（halo）”又は“ハロゲン（halogen）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。一実施形態では、ハロは、フルオロ又はクロロである。
【０１４３】
用語“アミノ（amino）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、式−ＮＲaＲb［式中、Ｒa及びＲbは、独立して水素、ハロアルキル、アラルキル、場合により置換されていることもあるアルキル、場合により置換されていることもあるシクロアルキル、場合により置換されていることもあるヘテロシクロ、場合により置換されていることもあるアリール、又は場合により置換されていることもあるヘテロアリールであるか；又はＲa及びＲbは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、４員〜７員の、場合により置換されていることもあるヘテロシクロを形成する］のラジカルを意味する。例示的なアミノ基としては、−ＮＨ2、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ2ＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ2Ｐｈなどが挙げられる。
【０１４４】
用語“カルボキサミド（carboxamido）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、式−ＣＯ−アミノのラジカルを意味する。例示的なカルボキサミド基としては、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮ（Ｈ）ＣＨ3、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｐｈ、−ＣＯＮ（Ｈ）ＣＨ2ＣＨ2Ｐｈ、−ＣＯＮ（ＣＨ3）2、−ＣＯＮ（Ｈ）ＣＨＰｈ2などが挙げられる。
【０１４５】
用語“スルホンアミド（sulfonamido）”とは、本明細書中でそれ自身単独で、あるいは別の基の一部分として使用される際には、式−ＳＯ2−アミノのラジカルを意味する。例示的なスルホンアミド基としては、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＳＯ2Ｎ（Ｈ）ＣＨ3、−ＳＯ2Ｎ（Ｈ）Ｐｈなどが挙げられる。
【０１４６】
本明細書中で使用される際には、用語“約（about）”とは、記載の数値±１０％を含む。すなわち、“約１０（about 10）”は、９〜１１を意味する。
【０１４７】
いくつかのＭＤＭ２阻害剤は、光学異性体を含む立体異性体として存在しうる。本明細書中で提供される方法及び組成物は、純粋な個々の立体異性体調製物及びそれぞれの濃縮調製物の双方、そしてこうした立体異性体のラセミ体混合物並びに当技術分野の当業者に周知である方法に従って分離することができる個々のジアステレオマー及びエンンチオマーの双方、すべての立体異性体の使用を含む。
【０１４８】
本明細書中で使用される際には、用語“実質的にフリーの（substantially free of）”とは、当技術分野の当業者によって定常的に使用されている従来から行なわれている解析方法を用いて確立しているように、化合物が約２５％未満の他の立体異性体、例えば、ジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含むことを意味している。いくつかの実施形態では、他の立体異性体の量は、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、又は約０．５％未満である。
【０１４９】
対象の細胞がＦＬＴ３の活性化変異を含んでいるかどうか、すなわち、こうした変異に検査で陽性であるかどうかを決定する方法は当技術分野の当業者に周知である。例えば、Kiyoi et al., 米国特許番号第7,125,659号; Kottaridis, P.D. et al., Blood 98: 1752
(2010); Sawyers, C.L., Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology LXX:
479 (2005); 及び Vande Woude, G.F. et al., Clinical Cancer Research 10: 3897 (2004）参照。
【０１５０】
対象の細胞がｐ５３遺伝子中に少なくとも１つの変異を含んでいるか否か、すなわち、こうした変異（複数を含む）に陽性であるかどうかを決定する方法もまた当技術分野の当業者に周知である。例えば、Flaman, J.-M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3963-3967 (1995）参照。一実施形態では、この変異（複数を含む）は、遺伝子の直接シークエンスによって検出される。別の実施形態では、この変異（複数を含む）は、ＰＣＲによって検出される。
【０１５１】
対象の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ又はｐ５３遺伝子変異のような活性化変異を有するＦＬＴ３を含むかどうかを決定する当事者は、白血病の処置のための対象を選択する当事者と同じであってもよいし、同じでなくてもよい。一実施形態では、１つの当事者が対象の細胞がＦＬＴ３又はｐ５３遺伝子変異を含んでいるかどうかを決定し、そして白血病の処置のための対象を選択する。別の実施形態では、単一の当事者、例えば、解析アッセイサービス（analytical assay service）が対象の細胞がＦＬＴ３−ＩＴＤ又はｐ５３遺伝子変異を含んでいるかどうかを決定し、別の当事者、例えば、医師又はヘルスケア専門家が、解析アッセイサービスによって提供された結果をレビューすることによって白血病の処置のための対象を選択する。
【０１５２】
本明細書中で使用される際には、用語“抗がん剤（anticancer agent）”とは、がん（例えば、哺乳類、例えば、ヒト）の処置に使用されるあらゆる治療剤（例えば、化学療法化合物及び／又は分子治療化合物）、アンチセンス療法、放射線療法、又は外科的介入を意味する。白血病の処置のための抗がん剤としては、リン酸フルダラビン、クラドリビン、クロファラビン（clofarbine）、ラロムスチン、及びａｒａ−Ｃが挙げられるが、これらに限定されない（Grant, S., Best Pract. Res. Clin. Haematol. 22:501-507 (2009））。抗がん剤は当技術分野の当業者に周知である（参照：the Physician's Desk Reference and Goodman and Gilman's “Pharmaceutical Basis of Therapeutics” tenth edition(第10版), Eds. Hardman et al., 2002を含む様々な教育マニュアルを含むが、これに限定されない）。
【０１５３】
一実施形態では、白血病は、ＭＤＭ２阻害剤及び少なくとも１つの他の抗がん剤を投与することによって処置される。一実施形態では、他の抗がん剤は、ＦＬＴ３阻害剤である。別の実施形態では、ＦＬＴ３阻害剤は、ＦＩ−７００である。別の実施形態では、ＦＬＴ３阻害剤は、セマキシニブ、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ソラフェニブ、タンヅチニブ、ＫＷ−２４４９、ＡＣ２２０、ＡＧ１２９５、ＡＧ１２９６、ＡＧＬ２０４３、Ｄ６４４０６、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＧＴＰ−１４５６４、Ｋｉ２３８１９、及びＣＨＩＲ−２５８である（例えば、Small, D., Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program 178-84 (2006) 及び Grant, S., Best Pract. Res. Clin. Haematol. 22:501-507 (2009）参照）。
【０１５４】
１０９人の患者由来のＡＭＬ芽球におけるＭＤＭ２阻害剤ＭＩ−２１９を用いるエクソビボ（ex vivo）での処置に対する感受性及び抵抗性の詳細な特性解析（characterization）が本明細書中に提供されている。以前の観察と合致して、ｐ５３変異を伴うＡＭＬ症例では全て、ＭＩ−２１９に抵抗性があった。重要なことには、変異のないｐ５３の場合でも約３０％のＡＭＬ症例で、ＭＩ−２１９に対して一次性抵抗性（primary resistance）を示したことである。野生型ｐ５３を用いる、ＡＭＬ芽球におけるＭＩ−２１９抵抗性に関連する可能性のあるメカニズムの解析によると、ＭＤＭ２阻害剤処置あるいは外部放射線処理の後の低いか、あるいは存在しないｐ５３タンパク質の誘導を含めて、はっきりと識別できる分子欠損が明らかとなった。更に、抵抗性芽球の別々のサブセットは、ＭＩ−２１９処置の後、強いｐ５３タンパク質の誘導を示し、ｐ５３タンパク質機能の欠陥又はアポトーシスｐ５３ネットワークの欠陥を示した。最後に、極めて感受性のあるＡＭＬ症例解析では、変異したＦｌｔ３状態（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）との強い、かつ顕著な関連が明らかとなり、これによってとりわけＭＤＭ２阻害剤処置の利益を享受しうる臨床的にハイリスクのあるＡＭＬ群がはじめて特定された。
【０１５５】
本明細書中で提供されうる方法の一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤及び所望による１つ又は複数の他の抗がん剤が、１つ又は複数の下記の条件下の対象に投与される：種々の周期で、種々の期間で、種々の濃度で、種々の投与ルートによってなど。別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、他の抗がん剤の前、例えば、他の抗がん剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、又は１８時間前、１、２、３、４、５、又は６日前、あるいは１、２、３、又は４週間前に投与される。別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、他の抗がん剤の後、例えば、他の抗がん剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、又は１８時間後、１、２、３、４、５、又は６日後、あるいは１、２、３、又は４週間後に投与される。
【０１５６】
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤及び所望による別の抗がん剤は、同時に投与されるが、異なるスケジュールで投与され、例えば、ＭＤＭ２阻害剤は、他の抗がん剤が、１週間に一度、２週間に一度、３週間に一度、又は４週間に一度投与される間、毎日投与される。別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、他の抗がん剤が、毎日、１週間に一度、２週間に一度、３週間に一度、又は４週間に一度投与される間、１週間に一度投与される。
【０１５７】
本明細書中で提供される組成物は、本明細書中で提供される化合物がその意図する目的を達成するのに有効である量で存在するすべての組成物を含む。個々の必要性によって異なるけれども、それぞれの成分の有効な量の最適な範囲の決定は、本明細書の記載の通り決定することができる。通例、ＭＤＭ２阻害剤は、哺乳類、例えば、ヒトに、アポトーシスの誘導に応答する障害の場合に処置される哺乳類の体重当たり、１日、経口的に０．００２５〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、あるいはその製薬学的に許容される塩の等価の量で投与することができる。一実施形態では、約０．０１〜から約２５ｍｇ／ｋｇが、こうした障害を処置し、改善し、又は防止するために経口的に投与される。筋肉内注入の場合には、一般的に、投与量は経口での投与量の約半分である。例えば、適切な筋肉内での投与量は、約０．００２５〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇであろう。
【０１５８】
単位経口投与量は、約０．０１〜約１０００ｍｇ、例えば、約０．１〜約１００ｍｇのＭＤＭ２阻害剤を含みうる。この単位投与量は、それぞれ化合物又はその溶媒和物の約０．１〜約１０ｍｇ、好都合には約０．２５〜５０ｍｇを含む１つ又は複数の錠剤又はカプセルとして、１日、１回又は複数回投与しうる。
【０１５９】
局所製剤では、ＭＤＭ２阻害剤は、担体１グラムあたり約０．０１〜１００ｍｇの濃度で存在することができる。一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、約０．０７〜１．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ、そして一実施形態では、約０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１６０】
原材料のままの化学製品としてのＭＤＭ２阻害剤を投与することのほかに、ＭＤＭ２阻害剤は、医薬的に使用することができる製剤にこうした化合物を処理することを容易にする賦形剤及び補助剤を含んでいる適切な製薬学的に許容される担体を含む医薬製剤の一部分として投与することができる。こうした製剤、とりわけ、経口的又は局所的に投与することができ、そして錠剤、糖衣錠、徐放性ロゼンジ及びカプセル、口腔すすぎ剤及び口内洗浄剤、ゲル、液体懸濁液、ヘアリンス、ヘアゲル、シャンプーなどの投与の１つのタイプの場合に使用することができるそうした製剤、及び更に、坐剤などの直腸的に投与することができる製剤、並びに静脈内注入、注射による、局所的又は経口的な投与に適した液剤は、約０．０１〜９９パーセント、一実施形態では約０．２５〜７５パーセントの活性化合物（複数を含む）を、賦形剤と共に含む。
【０１６１】
本明細書中で開示されている化合物及び医薬組成物は、この化合物の有益な作用を受けることができる任意の患者に投与することができる。こうした患者のうちで第一に重要であるのは、哺乳動物、例えば、ヒトであるが、本明細書中で提供される方法及び組成物については、そのように限定されることを意図していない。他の患者には、獣医学的な動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）が含まれる。
【０１６２】
この化合物及びその医薬組成物は、それらの意図する目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は、非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口腔内、くも膜下腔内、頭蓋内、鼻腔内または局所的なルートによるものでありうる。あるいは、または同時に、投与は、経口ルートによるものでありうる。投薬量は、レシピエントの年齢、健康、及び体重、もしあれば同時処置の種類、処置頻度、並びに所望の作用の特性に依存している。
【０１６３】
本明細書中で提供されている医薬製剤は、それ自体公知である方法、例えば、従来から行なわれている、混合、顆粒化、糖衣形成、溶解、又は凍結乾燥処理で製造される。従って、経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と混合させること、場合により結果として生じる混合物を粉砕すること、及び適切な補助剤を加えた後、所望に応じて又は必要に応じて、錠剤又は糖衣錠のコアを得るために顆粒の混合物を処理することによって得ることができる。
【０１６４】
適切な賦形剤には、特に、糖類、例えば、乳糖又はショ糖、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウムなどの充填剤、並びに、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンを使用するデンプンペーストなどの結合剤がある。所望であれば、上述のデンプン、更にはカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を加えることができる。補助剤には、とりわけ、流動調節剤及び滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸又はその塩、及び／又はポリエチレングリコールがある。糖衣錠コアには、適切なコーティングが提供され、所望に応じて、該コーティングは、胃液に対して抵抗性がある。この目的のために、濃縮サッカリド溶液を使用することができ、これは、所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる。胃液に対して抵抗性があるコーティングを生成するために、フタル酸アセチルセルロース又はフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの、適切なセルロース調製物の溶液が用いられる。染料又は色素を、例えば、同定のため、又は活性化合物用量の組み合わせを特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに加えてもよい。
【０１６５】
経口的に使用することができる他の医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュ−フィットカプセル、並びに、ゼラチン製及びグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製のソフト封入カプセルを含む。プッシュ−フィットカプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに、所望により安定剤と混合することができる顆粒の形で、活性化合物を含むことができる。一実施形態では、ソフトカプセルでは、活性化合物は脂肪油又は流動パラフィンなどの適切な液体で溶解又は懸濁される。更に、安定剤を加えることができる。
【０１６６】
直腸的に使用されうる可能な医薬製剤は、例えば、１つ又は複数の活性化合物と坐剤基剤の組み合わせから成る坐剤を含む。適切な坐剤基剤には、例えば、天然又は合成トリグリセリド、又はパラフィン炭化水素がある。これに加えて、活性化合物と基剤との組み合わせから成るゼラチン直腸カプセルを使用することも更に可能である。可能な基剤材料には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、又はパラフィン炭化水素が含まれる。
【０１６７】
非経口的投与の場合に適切な製剤は、水溶性の形の活性化合物の水溶液、例えば、水溶性塩及びアルカリ溶液を含む。これに加えて、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリド又はポリエチレングリコール４００が含まれる。水性注入懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質を含むことができる。所望により、懸濁液は、更に安定剤を含むことができる。
【０１６８】
本明細書中で提供されている局所用組成物は、一実施形態では、適切な担体の選択によって、オイル、クリーム、ローション、軟膏などとして製剤化される。適切な担体には、植物油又は鉱油、白色ワセリン（白色ソフトパラフィン）、分岐鎖脂肪又はオイル、動物脂肪および高分子量アルコール（Ｃ12より大きい）が含まれる。担体は、活性成分が可溶性であるものであってもよい。所望に応じて、乳化剤、安定剤、保湿剤、及び抗酸化剤もまた、色又は香りを付与する薬剤と同様に含まれていてもよい。これに加えて、経皮的浸透促進剤が、こうした局所製剤において使用することができる。こうした促進剤の例は、米国特許第３，９８９，８１６号及び同第４，４４４，７６２号において見出すことができる。
【０１６９】
軟膏は、アーモンド油などの植物油中の活性成分の溶液を温めたソフトパラフィンと混合し、そしてこの混合物を冷却させることにより製剤化することができる。こうした軟膏の代表的な例は、約３０重量％のアーモンド油と約７０重量％を含む白色ソフトパラフィンを含むものである。ローションは、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどの適切な高分子量アルコール中に、活性成分を溶解させることによって好都合に調製することができる。
【０１７０】
以下の実施例は、本明細書中で提供されている方法及び組成物を例示しているものであって限定するものではない。臨床的療法において通例直面する、そして当技術分野の当業者にとって自明である種々の条件及びパラメーターの他の適切な修正及び適合は、本明細書中で提供されている方法及び組成物の趣旨及び範囲内にある。
【０１７１】
血液悪性疾患（通例、これはｐ５３の変異を伴う症例のほんの一部によって特徴付けられる）におけるＭＤＭ２阻害剤の治療的可能性を検討するための広範囲の取り組みの一環として、１００を超えるヒトＡＭＬ試料においてエクソビボでのアポトーシス誘導が検討された。下記に詳述した検討を通して、野生型ｐ５３エクソン５−９遺伝子状態にもかかわらず、ＭＤＭ２阻害剤に対して一次性抵抗性を示した一次ヒトＡＭＬ試料の以前には考えられないようなかなりの部分が特定された。この現象に対する最初の検討によって、抵抗性についての複数の明瞭に識別できるメカニズムの根拠が提供される：不十分なｐ５３タンパク質の誘導に基づくもの、及び欠陥のあるｐ５３タンパク質又は欠陥のあるｐ５３制御エフェクター経路に基づく別のもの。こうした新規な知見は、ＭＤＭ２阻害剤を臨床的なＡＭＬ適用への移行を実質的に複雑にし、そして臨床現場におけるこうした薬物の最適な有効性を達成する更なる検討の動機付けになる。最後に、相関解析を通して、変異したＦｌｔ３状態（ＦＬＴ３−ＩＴＤの存在）とＭＤＭ２阻害剤に対する高められた感受性の間の有意であり、かつ強い関連性がはじめて確認され、それ故、ＭＤＭ２阻害剤試験の設計に対する新規で、かつ実際的な論理的根拠、ＡＭＬにおける患者のサブグループ選択及び試験データ解釈が提供された。
【０１７２】
実施例１
方法
患者
ミシガン大学総合がんセンター（the University of Michigan Comprehensive Cancer Center）で２００５年３月〜２００９年１０月の間に、この試験で解析される１０９例のＡＭＬの症例が登録された。この試験はミシガン大学治療審査委員会（the University of Michigan Institutional Review Board (IRBMED #2004-1022））によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが登録前に全ての患者から得られた。
【０１７３】
細胞精製
ＡＭＬ患者から末梢血単核細胞がフィコールグラジエント遠心法（Ficoll gradient centrifugation）（GE Healthcare）によって単離され、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳにアリコートし、そして液体窒素中に凍結保存した。ネガティブ選択を用いてＡＭＬ芽球の精製のために、ＡＭＬ患者由来の凍結保存したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を洗浄し、そして遠心分離によって回収し、次いで製造業者の推奨に従って、抗ヒトＣＤ３（Miltenyi Biotec #130-050-101）、抗ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（芽球がＣＤ１４発現に対して陰性であった場合；Miltenyi Biotec #130-050-201）、抗ヒトＣＤ１９（芽球がＣＤ１９発現に対して陰性であった場合；Miltenyi Biotec #130-050-301）及び抗ヒトＣＤ２３５ａ（Miltenyi Biotec #130-050-501）で処理をした。細胞懸濁液をＡＭＬ芽球での負の濃縮をするためにMiltenyi MACS分離ＬＳカラム（#130-042-401）に通した。すべての芽球プレップ（blast preps）を純度のためにサイトスピン分析した。このスキーマでは、常に９０％より高い純度の芽球になった。
【０１７４】
ＳＮＰ６．０ プロファイリングに使用されるＡＭＬ芽球ＤＮＡを、更に次のように精製した試料から抽出した：ポストミルテニーカラム（post-Miltenyi column）試料を洗浄し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３３、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１３、及びＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４５（すべての抗体：eBioscience, San Diego, CA）を用いて染色した。最終洗浄の後、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を１μｇ／ｍｌの濃度まで加え、死細胞を識別した。細胞ソーティングをＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ高速フローサイトメーター（FACS-ARIA high-speed flow cytometer）（Becton Dickinson, Mountain View, CA）によって行なった。生きている細胞（ＰＩ−ネガティブ）を、ＣＤ４５の中程度強度染色、及び低〜中強度側方散乱（Borowitz, M.J. et al., Am. J. Clin. Pathol.100: 534-540 (1993））を用いてこうした細胞を識別することによって芽球をゲーティングした。次いでＣＤ３３及びＣＤ１３を、更に赤血球系統及び成熟骨髄系細胞に対して芽球を区別するために使用した。
【０１７５】
エクソビボにおけるＡＭＬ芽球ＭＤＭ２阻害剤アポトーシスアッセイ
上記に述べられている方法を用いて＞９０％純度に濃縮した芽球を、２．５×１０5細胞において、血清補充ＲＰＭＩ培地中、ＭＤＭ２阻害剤ＭＩ−２１９及びＭＩ−６３の種々の濃度（０．６２５〜２０μＭの範囲）の存在下、最終容量１００μｌで４０時間にわたってインキュベートした。アポトーシス及びネクローシスを、アネキシンＶ／ＰＩ ＦＡＣＳベースでの読み出し及びその後、未処理並列培地における自然死滅率に正規化した値を用いて、式［％（生存）＝％（処理試料の平均生存）／％（対の非処理試料の平均生存）］に従って、それぞれの処理芽球アリコートに対して測定した。
【０１７６】
エクソビボにおけるＡＭＬ芽球エピジェネティック（epigenetic）及びＭＤＭ２阻害剤アポトーシスアッセイ
上記に述べられている方法を用いて＞９０％純度に濃縮した芽球を、ＤＭＳＯ、又は０．５μＭ ５−アザシチジン（A2385, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO）を用いて４８時間にわたってインキュベートした（５−アザシチジンは２４時間ごとに補充した）。インキュベーションの最後の１２時間の間、芽球を更にアリコートし、０．３μＭ トリコスタチンＡ（#9950, Cell Signaling Technology, Danvers, MA）、又はＤＭＳＯで処理した。４８時間のインキュベーションの最後に、それぞれの４つの別個に処理した芽球のサブグループを、ＭＩ−２１９（０、２．５、５及び１０μＭの終濃度）で４０時間にわたって処理し、引き続いてアポトーシスのアネキシンＶ／ＰＩ ＦＡＣＳベース解析を行なった。並列して芽球アリコートを、４８ウェルプレートのウェルあたり１ｍｌの培地中に１０6細胞にて培養し、そして１０μＭ ＭＩ−２１９又は溶媒で８時間処理した。芽球を回収し、溶解し、そしてタンパク質をイムノブロッティングのために記載のように調製した。
【０１７７】
Ｑ−ＰＣＲを用いるｐ５３、ＭＤＭ２及びＭＤＭＸ ｍＲＮＡ発現の測定
ＲＮＡを、トリゾル試薬を用いてＡＭＬ症例由来のＦＡＣＳによりソーティングした芽球から調製し、そして５０μｌ ＤＥＰＣ処理水中で再懸濁した。２０μｌの相補的ＤＮＡは、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成キット（Superscript III first strand synthesis kit）(Invitrogen）及びランダムプライミング法を用いて約５０ｎｇのＲＮＡから作成された。プライマー及びＴａｑＭａｎベースプローブは、アプライドバイオシステムズ（Applied Bio-systems）から購入した（応需型プライマー：Primers-on-demand）。プライマー／プローブ混合物には以下が含まれる：ｐ５３（Hs_00153349_m1）、ＭＤＭ２（Hs_01066930_m1）、ＭＤＭ４（Hs_00159092_m1）及びＨｕ ＰＧＫ１。
【０１７８】
複製増幅反応（Duplicate amplification reactions）では、プライマー／プローブ、タックマン（登録商標）２×ユニバーサルＰＣＲマスターミックス，No AmpErase UNG）（TaqMan（登録商標）2× Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG）、及び１μｌのｃＤＮＡが包含された（２０μｌの反応容量中）。反応は、ＡＢＩ ７９００ＨＴマシン（ABI 7900HT machine）によって行なわれた。目的遺伝子のｍＲＮＡの相対的コピー数の推定値の正規化が、レファレンスとしてＰＧＫ１のＣｔ値を用いて行なわれた［Ｃｔ平均値（目的遺伝子）からＣｔ平均値（ＰＧＫ１）を差引く（Ct mean gene of interest−Ct mean PGK1）］。ＡＭＬサブグループ間の比較は正規化されたＣｔ値の平均値を差し引くことによって行なわれた。
【０１７９】
エクソビボにおけるＡＭＬ芽球処理及びイムノブロッティング手順
野生型ｐ５３エクソン５−９を持つ原発性ＡＭＬ症例を、ＭＩ−２１９に対するＩＣ50値に従って位置づけし、高いＩＣ50値（ＩＣ50＞１０μＭ）を有する１５症例、及び低いＩＣ50値（ＩＣ50値＜２μＭ）を有する１５症例が更なる解析のために選択された。芽球を上記に説明されている如く精製し、次に、１０μＭ ＭＩ−２１９、１０μＭ ヌトリン−３、溶媒を加えて８時間培養するか、あるいは５グレイの電離放射線で処理した。細胞を処理後回収し、洗浄・溶解緩衝液（detergent lysis buffer）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＥＧＴＡ，１％ Triton X−１００，２０ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム（#13721-39-6 Alfa Aesar），１ｍＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド（Pierce）、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ（P2850, Sigma-Aldrich）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（P8340, Sigma-Aldrich））中に溶解し、タンパク質を分画し、そしてｐ５３に対する抗体（Ab-6, clone DO-1、 Calbiochem）及びアクチン（AC-15, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO）でイムノブロッティングのために調製をした。ポジティブコントロールライセートを、１０μＭにて８時間、ＭＩ−２１９で処理したＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ−１３から作成し、そしてこうしたライセートのアリコートをあらゆるイムノブロットで原発性症例のライセートと同時に作動させた。従って、こうしたＭＯＬＭ−１３ライセートは、ブロット間のバンド強度比較（blot-to-blot band intensity comparisons）の内部標準として機能した。次に、こうした実験からの残りのライセートは、ヒトＭＤＭＸ（A300-287A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）、ＭＤＭ２（Ab-1, clone IF2, Calbiochem）、ｐ２１（clone SX118, BD Biosciences）及びアクチンに対する抗体を用いてイムノブロッティングのために調製をした。
【０１８０】
ＡＭＬ芽球ＤＮＡ及び対の口腔内ＤＮＡのＳＮＰ６．０アレイ解析
ＳＮＰ６．０アッセイが製造業者の推奨プロトコールに従って行なわれた。それぞれの芽球及び口腔内試料のアフィメトリクスＣＥＬファイル（Affymetrix CEL files）が、イニシャルクオリティーコントロールのためのアフィメトリクスジェノタイピングコンソールソフトウェア（Affymetrix Genotyping Console software）を用いて解析され、引き続いて、アフィメトリクス“Birdseed”アルゴリズムを使用して、テキスト形式でtab-delimited ＳＮＰコールファイル（tab-delimited SNP call files）を作成した。このレポートに含まれている試料の全群のコール率は、９４．９３％〜９９．４５％であり、平均コール率は９８．３３％であった。試料コピー数ヒートマップディスプレイは、６４ビットオペレーティングシステム環境（64-bit operating system environment）に適合したフリーに利用可能であるソフトウェアdChipの使用によってＣＥＬファイルから得られた（Lin, M., Bioinformatics 20:1233-1240 (2004)）。ＬＯＨの機能的、かつ実際的なディスプレーを作成するために、二段階の内部で開発されたＪａｖａべースのソフトウェア解析システムが使用された。プレ−ＬＯＨユニフィケーションツール（Pre-LOH Unification Tool）（ＰＬＵＴ）は、Ａｆｆｙ６．０ＳＮＰアレイデータ（Ross, C.W. et al., Clin. Cancer Res.13: 4777-4785 (2007）に適応することができるＬＯＨツールバージョン２（LOH tool version 2）、ＬＯＨツールの最新バージョン（updated version of the LOH tool）に組み込む前に、すべての各患者ＳＮＰコールをそれらのそれぞれのｄｂＳＮＰ ｒｓ ＩＤ番号及びゲノムの物理的位置に合せるのに役立った。対の試料間のＬＯＨ解析の場合には、ＬＯＨツールバージョン２内のフィルターセッティングが使用され、それが３０００塩基対の別のそうしたコール内に存在する場合に限り、ＬＯＨとしてそれぞれの対のＳＮＰコールの可視化が可能となった。このステップでは、多くの正しくない、散発的に分布したシングルＬＯＨコール（single LOH calls）はプラットフォームノイズのため除去された。
【０１８１】
ＮＰＭ１、Ｆｌｔ３、ｐ５３、Ｎ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓのエクソン再シーケンシング
増幅及びヒトＮＰＭ１のエクソン１２、ヒトＦｌｔ３のエクソン１３−１５及び２０、Ｎ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓのエクソン２及び３、及びヒトｐ５３のエクソン５−９及び隣接するイントロン配列をシーケンシングするためのプライマーが、プライマー３プログラムを用いて設計された（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）。ＰＣＲ産物が、テンプレートとして高純度の芽球細胞からRepli-g(Qiagen)-amplified DNAを用いて生成された。増幅は、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行なわれた。ＰＣＲアンプリコンが、エキソヌクレアーゼ／シュリンプ由来アルカリホスファターゼ法（ＵＳＢ）を用いて、インターナルネスティドシーケンシングプライマー（internal nested sequencing primers）で直接シーケンシングのために調製された。変異検出（SoftGenetics LLC, State College, PA）ソフトウェアが実験配列とRefseq GenBank又はゲノム配列とを比較するため、そしてシーケンストレーシングを目視による検査によって比較するために使用された。変異は、テンプレートとして対の患者の口腔内ＤＮＡを用いて確認された。
【０１８２】
統計的方法
二項分類（例えば、薬物感受性と遺伝子変異状態）の関連を、対数オッズ比を用いて評価した。平均ＩＣ50値を、２標本ｔ検定を用いて試料グループ間で比較した。すべての統計検定の結果がＺスコア及び両側ｐ値として報告された。
【０１８３】
実施例２
患者特性
この試験で解析された１０９人のＡＭＬ患者の特性が表１にまとめられている。解析された１０９人のＡＭＬ症例のうちで、９０人（８３％）は、以前は処置を施されておらず、１９人（１７％）は、試験登録において以前にも処置が施されていた（再発）。７０％、１４％、及び１６％が、原発性、二次性、又は処置関連ＡＭＬ（ｔＡＭＬ）であり、そして１２症例では、ｐ５３エクソン５−９変異を有していた。
【０１８４】
【表１】
2013523820.tif 000034
【０１８５】
【表２】
2013523820.tif 000035
【０１８６】
実施例３
ＭＤＭ２阻害剤処置に対する一次性抵抗性は成人ＡＭＬに共通である
エクソビボにおけるＡＭＬ芽球でのＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシス細胞死の有効性を評価するために、１０９のＡＭＬ標本（エクソン５−９のエクソン配列解析により野生型ｐ５３を有する９７及びｐ５３変異を有する１２）からの芽球を＞９０％純度に精製し、そして細胞アリコートをＭＤＭ２阻害剤ＭＩ−２１９（Ｎ＝１０９）及びＭＩ−６３（Ｎ＝６０）の増加する濃度で４０時間インキュベートした。次に処理試料のアポトーシス細胞分画をアネキシンＶ−ＰＩ−ベースＦＡＣＳ解析によって定量化し、そして対の未処理細胞の測定値に対して正規化した。図１Ａ及び１Ｂから理解できるように、変異したｐ５３エクソン５−９のｍＲＮＡ発現（赤）又は存在しないｐ５３ｍＲＮＡ発現（absent p53 mRNA expression）（緑）を有するすべてのＡＭＬ症例において、ＭＤＭ２−阻害剤処置に対して抵抗性が示され、以前の知見と合致した（Kojima, K. et al, Blood 106: 3150-3159 (2005); Saddler, C. et al., Blood 111: 1584-1593 (2008））。
【０１８７】
野生型ｐ５３エクソン５−９（黒）を有する多くのＡＭＬ症例は、ＭＩ−２１９又はＭＩ−６３に極めて感受性がある（ＩＣ50＜２μＭ；３２／９７＝３３％）か、あるいは感受性がある（ＩＣ50≧２μＭ〜＜５μＭ；３３／９７＝３４％）けれども、野生型ｐ５３を有する症例のかなりの部分では、様々な抵抗性レベル（症例において、それぞれ、ＭＩ−２１９ＩＣ50＞５μＭ；３２／９７＝３３％及びＩＣ50＞１０μＭ；２１／９７＝２２％）を示した。従って、ＣＬＬにおける状況とは異なり、こうしたデータによって、野生型ｐ５３エクソン５−９配列を有するかなりのサブセットのＡＭＬ症例がエクソビボにおいてＭＤＭ２阻害剤に対して一次性抵抗性を示すことが立証された。
【０１８８】
更に、ＭＩ−２１９に対する原発性ＡＭＬ、二次性ＡＭＬ及びｔＡＭＬ（ｐ５３エクソン５−９変異を有する症例を除く）の平均ＩＣ50値は、それぞれ、６．１μＭ、７．９μＭ及び４．８μＭであった。再発したＡＭＬ症例に対する事前には未処置のＡＭＬ症例（ｐ５３エクソン５−９変異を有する症例を除く）のＭＩ−２１９に対する平均ＩＣ50値は、それぞれ、４．４μＭに対し６．６μＭであった。
【０１８９】
実施例４
ＡＭＬ細胞株でのＭＤＭ２阻害剤に対する感受性及び抵抗性の様々な程度
次に、ＭＩ−２１９の１９ＡＭＬにより誘導された細胞株でのアポトーシスを誘導する能力が評価された。データは、図２及び表２にまとめられている。
【０１９０】
図２から理解できるように、変異ｐ５３を有するすべてのＡＭＬ細胞株（赤）は、ＭＩ−２１９に抵抗性があり、一方、野生型ｐ５３を有する細胞株（黒）は、様々な程度のＭＩ−２１９に対する感受性／抵抗性を示し、上記に提示した初代ＡＭＬ芽球での知見を思い起こさせた。
【０１９１】
【表３】
2013523820.tif 000036
【０１９２】
実施例５
野生型ｐ５３エクソン５−９を有するＡＭＬにおけるＭＤＭ２阻害剤に対する一次性抵抗性の明確なメカニズムの根拠
損なわれていないｐ５３がＭＤＭ２阻害剤感受性にとって極めて重要であることを考慮して、初代ＡＭＬ芽球におけるｐ５３タンパク質発現レベル解析が行なわれた。野生型ｐ５３エクソン５−９を有している原発性ＡＭＬ症例を、ＭＩ−２１９に対するＩＣ50値に従って位置付けし、高いＩＣ50値（ＩＣ50＞１０μＭ）を有している１５症例、及び低いＩＣ50値（ＩＣ50値＜２μＭ）を有している１５症例が更なる解析のために選択された。精製した芽球を未処置のままにするか、あるいはＭＩ−２１９（１０μＭ）、ヌトリン３（１０μＭ）、又は１回の５グレイ線量の外部照射によって８時間処置した。こうした芽球から作成した細胞ライセートを抗ｐ５３抗体及び抗アクチン抗体を用いるイムノブロッティングのために調製した。更に、ＭＩ−２１９処理ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１３に由来するライセートのアリコートを各ブロットで解析して、バンド強度のブロット間の比較（blot-to-blot comparisons）を可能にした。
【０１９３】
図３Ａから理解できるように、すべての感受性ＡＭＬ芽球について、ＭＤＭ２阻害剤処置又は外部照射の後、種々の異なる絶対レベルであるが、ｐ５３タンパク質の誘導が立証された。重要なことは、抵抗性芽球（図３Ｂ）のｐ５３タンパク質レベルの解析によって下記の２つのサブセットが明らかにされたことである：ｉ）ＭＤＭ２阻害剤処置又は外部照射の後、存在しない又は極めて低いｐ５３発現を有している芽球、及びｉｉ）感受性芽球において測定されるレベルに本質的に等しいベースライン及び誘導ｐ５３レベルを有する芽球。すなわち、野生型ｐ５３エクソン５−９を有するＡＭＬにおいてＭＤＭ２阻害剤に対する抵抗性は、少なくとも以下の２つの明瞭に区別できる分子欠陥に関連している：ｉ）低い／存在しないｐ５３タンパク質発現、又はｉｉ）正常なｐ５３タンパク質レベルのセッティングにおけるアポトーシスｐ５３ネットワーク欠陥（異常なｐ５３タンパク質の可能性を含む）。
【０１９４】
抵抗性ＡＭＬ芽球における低い／存在しないｐ５３タンパク質発現（low/absent p53 expression）のメカニズムの更なる洞察を得るために、ＦＡＣＳによってソーティングされたＡＭＬ芽球試料から精製した全ＲＮＡにおける正規化されたｐ５３ｍＲＮＡレベルが測定された。この解析によれば、ベースラインでの少しのＡＭＬ症例が存在しないｐ５３ｍＲＮＡ（absent p53 mRNA）（図５Ｅ；ＡＭＬ症例＃７、８０及び１２０）を示していることを開示していた。すなわち、ＡＭＬ芽球のごく一部におけるＭＤＭ２阻害剤に対する抵抗性は、存在しないｐ５３の転写に起因しており、後天性ｐ５３遺伝子欠陥を示唆している。しかしながら、低い／存在しないｐ５３タンパク質を持っている大部分の抵抗性ＡＭＬ芽球は、ｐ５３ｍＲＮＡを発現しており（ＡＭＬ症例＃９８、１３８、１９１、３６、４０、１０１及び１００）、従って低レベルのｐ５３タンパク質の転写後のメカニズムを暗示している。
【０１９５】
実施例６
トリコスタチンＡ及びアザシチジンを用いることによる、存在しないｐ５３（Absent p53）発現を有する抵抗性芽球の処置はｐ５３発現を誘導しない
存在しないｐ５３ｍＲＮＡ発現を有しているＡＭＬにおけるエピジェネティックなｐ５３遺伝子サイレンシングの根拠を得ようとする試みで、更なる解析のために存在しないか、あるいは極めて低レベルのｐ５３ ｍＲＮＡを含む凍結保存細胞の利用可能性に基づいて、４つのＡＭＬ症例が選択され、そして精製芽球をトリコスタチンＡ及びアザシチジン（単独又は組み合わせて）で処置し、引き続いてＭＩ−２１９で処置した。こうした実験の読み取りは、アポトーシスを受ける芽球部分であり、そして処置後のｐ５３タンパク質レベルであった。図１に詳述した如く、こうした芽球における可逆的なエピジェネティックなｐ５３遺伝子サイレンシングの根拠は見出せなかった。
【０１９６】
実施例７
ＭＤＭ２及びＭＤＭＸの様々な発現レベルは、ＡＭＬにおけるＭＤＭ２阻害剤に対する抵抗性の説明とはならない
ｐ５３タンパク質の２つの重要なレギュレーターであるＭＤＭ２及びＭＤＭＸの発現レベルでは、野生型ｐ５３エクソン５−９を持っている、ＡＭＬ症例におけるＭＤＭ２阻害剤処置に対するＩＣ50値の観察された差異及びｐ５３タンパク質レベルの観察された差異を説明できた。こうした仮説を試験するために、全ＡＭＬコホート中の正規化されたＭＤＭ２及びＭＤＭＸ ｍＲＮＡレベルを最初に測定した。次に、こうしたｍＲＮＡレベルを、野生型ｐ５３エクソン５−９を持っている全てのＡＭＬ症例におけるＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシスに対するＩＣ50値と相互に関連させた（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１９７】
図４Ａ及び４Ｂ中から理解できるように、ＭＤＭＸレベルも、ＭＤＭ２レベルも、ＭＩ−２１９ ＩＣ50値と相関していなかった。例えば、平均デルタＣｔ（平均のＭＤＭＸ−ＰＧＫ１）値は、野生型ｐ５３及びＭＩ−２１９ ＩＣ50値＞１０μＭを有するＡＭＬ症例では５．２であり、そして野生型ｐ５３及びＭＩ−２１９ ＩＣ50値＜１０μＭを有するＡＭＬ症例では４．４であり、このことは、より小さい抵抗性又は感受性の芽球と比較して抵抗性において少し低い（約１．７倍）ＭＤＭＸレベルを示していた。
【０１９８】
ＭＤＭ２に焦点をあてると、平均デルタＣｔ（平均のＭＤＭ２−ＰＧＫ１）値は、野生型ｐ５３及びＭＩ−２１９ ＩＣ50値＞１０μＭを有するＡＭＬ症例では、３．１であり、そして野生型ｐ５３及びＭＩ−２１９ ＩＣ50値＜１０μＭを有するＡＭＬ症例では、３．２であり、このことは、より小さい抵抗性及び感受性の芽球と比較して抵抗性において等しいＭＤＭ２ ｍＲＮＡレベルを示していた。
【０１９９】
次に、ＭＤＭＸタンパク質レベル、ＭＤＭ２タンパク質レベル及びｐ２１タンパク質レベルを、図３で説明されている実験から誘導されたライセート中で測定した。図２及び３から理解できるように、ＭＤＭＸタンパク質レベルも、ＭＤＭ２タンパク質レベルも、ｐ２１タンパク質レベルも、ＭＩ−２１９ ＩＣ50値との明瞭な関連を示さなかった。
【０２００】
実施例８
後天性片親性ダイソミー（コピーニュートラルＬＯＨ）はＡＭＬにおいてよく起こることであり、そしてｐ５３変異又は存在しないｐ５３の発現にしばしば関連している
ＡＭＬにおけるｐ５３遺伝子状態に関する追加の情報を得るために、１１０のＡＭＬ症例からの超高純度のＡＭＬ芽球集団起源のＤＮＡ試料を解析し、そして超高密度アフィメトリクス６．０ＳＮＰアレイ（ultra high density Affymetrix 6.0 SNP arrays）を用いて、後天性染色体コピー数変化及びＬＯＨのために口腔内ＤＮＡのペアリングをした。
【０２０１】
図５では、１７ｐでのサブ染色体コピー数状態（sub-chromosomal copy number status）［パネルＡ 口腔内ＤＮＡ、パネルＢ ＡＭＬ芽球誘導ＤＮＡ；ｐ５３は、１７ｐで約７．５Ｍｂ物理的位置に位置している］、ＬＯＨ（１７ｐ）（パネルＣ）、ｐ５３エクソン５−９配列データ（パネルＤ）及び正規化されたｐ５３ ｍＲＮＡデータ（パネルＥ）が示されている。理解できるように、ＡＭＬ症例のうち、１７／１１０＝１５％では、ＬＯＨを包含する部分又はｐ５３ローカス（p53 locus）に及んでいるすべての１７ｐが示された。重要なことは、こうした症例のうちのほぼ半分（８例）の場合のコピー欠損アンカバード・２Ｎ状態（uncovered 2N status）のためのペア解析（paired analysis）（ナンバリング（赤））：１７ｐでのコピーニュートラルＬＯＨ又は後天性片親性ダイソミー（ａＵＰＤ）の例。注目すべきことは、コピーニュートラルＬＯＨは従来から行なわれているカリオタイピング又はＣＧＨを用いることによっては検出不可能であり、従って定常的に行われている臨床プラクティスでは見落とすことになる。コピーニュートラルＬＯＨは、しばしば遺伝子変異に関連していることを考慮して、ＬＯＨデータを、ｐ５３配列データ及びｐ５３ ｍＲＮＡデータと比較し、そしてこうした１７ｐ関連のａＵＰＤ症例（赤）のうちの６／８がホモ接合ｐ５３変異を示すことを見出し（ＡＭＬ＃１２、４１、８８、１１７、１５３及び１５７、パネルＤ）、そして１／８（＃１２０）の症例は、ほんの少しのｐ５３ ｍＲＮＡ発現を有した。従って、後天性コピーニュートラルＬＯＨはｐ５３ローカスにおいてよく起こることであり、大部分の症例においてｐ５３ヌル状態（p53 null state）に関連しており、そしてＭＤＭ２阻害剤処置に対する抵抗性に関連している。ｐ５３遺伝子及びｐ５３プロモーターの高分解能コピー数解析（High resolution copy number analysis）では、ＡＭＬにおけるホモ接合欠失は特定されなかった。
【０２０２】
実施例９
ＦＬＴ３−ＩＴＤは、ＡＭＬにおけるＭＤＭ２阻害剤処置に対する感受性増強に関連している
上記に説明されているＭＤＭ２阻害剤に対するエクソビボにおける感受性の解析によって、ＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシスに極めて感受性のある多くの症例が明らかとなった。ＭＤＭ２阻害剤感受性の増大に相関しているであろうマーカーの特定が追跡された。Ｆｌｔ３及びＮＰＭ１（ＡＭＬにおいて、この２つは最もよく起こる変異遺伝子）に焦点をあてると、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ又はＮＰＭ１エクソン１２変異の存在又は不存在は、野生型ｐ５３エクソン５−９を持つ全てのＡＭＬにおいて最初はＭＩ−２１９ ＩＣ50値と相関していた。このＡＭＬコホートは、２５パーセンタイル、又は５０パーセンタイルのどちらかで繰り返して二分され（それぞれ、１．７８μＭ及び３．２μＭの閾値 ＩＣ50値の相当する）、そしてそれぞれ、変異したＦｌｔ３（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）又はＮＰＭ１の存在の場合にＺスコアを決定した。この解析から、Ｆｌｔ３−ＩＴＤは、感受性のあるＡＭＬ症例において有意に多発して表面化し、２５パーセンタイル及び５０パーセンタイル解析に対し、それぞれ、１．９１（ｐ＝０．０６）及びＺ＝２．２６（ｐ＝０．０２）のＺスコアであった。１９のＦｌｔ３−ＩＴＤ変異ＡＭＬ症例のうちで１１例（５８％）及び１９のＦｌｔ３−ＩＴＤ変異ＡＭＬ症例のうちで１３例（６８％）が、ＭＤＭ２阻害剤に対して、それぞれ、＜２μＭ及び＜２．２５μＭのＩＣ50値を有していた。
【０２０３】
他のすべての症例（Ｎ＝９０；ｐ５３エクソン５−９変異症例を含む）に対するＦＬＴ３−ＩＴＤポジティブ症例の比較のための同様な解析が行なわれた。この解析から、Ｆｌｔ３−ＩＴＤが再び、感受性のあるＡＭＬ症例において有意に強化されて表面化し、２５パーセンタイル及び５０パーセンタイル解析に対し、それぞれ、２．４２（ｐ＝０．０２）及びＺ＝（ｐ＝０．０１）のＺスコアであった。
【０２０４】
すべての１０９のＡＭＬ症例の場合のＩＣ50値を、以下の３つの相互に排他的なカテゴリーでグラフを使用して示した：１）ｐ５３エクソン５−９変異の存在、２）Ｆｌｔ３−ＩＴＤの存在、及び３）その他すべて（図６参照）。図６で理解することができるように、大部分のＦｌｔ３−ＩＴＤポジティブＡＭＬ症例は、Ｆｌｔ３野生型（wt）及びｐ５３野生型（wt）群（Ｐ＝０．０２）と比較して、極めて低いＩＣ50値、有意に低い平均ＩＣ50値を示した。従って、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ変異を有している大部分のＡＭＬ芽球は、ＭＤＭ２阻害剤処置に対して高い感受性がある。それ故、この解析によって、ＭＤＭ２阻害剤感受性に対する臨床的に適切なゲノムバイオマーカーが初めて特定された。
【０２０５】
このレポートで、初代ＡＭＬ芽球（Ｎ＝１０９）における分子決定因子の詳細な試験、及びエクソビボにおけるＭＤＭ２阻害剤処置に対する感受性又は抵抗性に対するそれらの影響がまとめられている。この試験の１つの知見には、ＡＭＬにおいてＭＤＭ２阻害剤に対する一次性抵抗性の説明及び定量的分析がある。この関連で、ｉ）ｐ５３変異は、予測したごとく、ＭＩ−２１９に対する抵抗性を付与する、ｉｉ）ｐ５３エクソン５−９変異の不存在下において、低いか、あるいは存在しないｐ５３発現は、ＡＭＬ芽球のサブセットに存在し、ＭＤＭ２阻害剤抵抗性に関連している、そしてｉｉｉ）ＭＤＭ２阻害剤抵抗性は、野生型ｐ５３及びロバストｐ５３タンパク質誘導（robust p53 protein induction）にもかかわらず、ＭＤＭ２阻害剤処置又は照射後の、ＡＭＬのサブセットに存在し、この結果、アポトーシスｐ５３ネットワーク又はｐ５３タンパク質における欠陥を暗示していることが立証された。全体として、こうした様々なＡＭＬ芽球に内在する欠陥は、すべてのＡＭＬ症例のうちでおよそ３分の１においてＭＤＭ２阻害剤に対する一次性抵抗性をもたらす；これは、以前の理解と比較してずっと大きい部分を占めている。
【０２０６】
抵抗性のあるＡＭＬ芽球のｐ５３遺伝子状態に関して、次の複数の知見が浮上した：ｉ）ｐ５３エクソン５−９変異の高い頻度は１０％であり、これは以前の推定値と合致しており（Fenaux, P. et al., Blood 78: 1652-1657 (1991); Stirewalt, D.L. et al., Blood 97: 3589-3595 (2001））、そして大部分のＡＭＬ症例におけるＭＤＭ２阻害剤抵抗性を説明するのには不十分である、ｉｉ）ｐ５３変異は、ＡＭＬにおいで、１７ｐの位置で後天性ＵＰＤのセッティングでしばしば発生し（全てのｐ５３変異の約５０％）、ｉｉｉ）ｐ５３に及んでいる１７ｐ欠失を持つある種のＡＭＬ症例では、野生型ｐ５３が担持され、そしてＭＩ−２１９に対して感受性があり、そして、ｉｖ）ｐ５３に及んでいる１７ｐ欠失を持つある種のＡＭＬ症例では、ｐ５３ｍＲＮＡ発現が欠如しており、従って、ＭＩ−２１９に抵抗性があった。それ故、ＭＤＭ２阻害剤がアポトーシスによるＡＭＬ芽球死をもたらす能力に対して直接的に作用するＡＭＬにおいて、実質のあるコンビナトリアル分子多様性（substantial combinatorial molecular diversity）が、ｐ５３遺伝子状態に認められる（Kojima, K. et al., Blood 106: 3150-3159 (2005); Seifert, H. et al., Leukemia 23: 656-663 (2009））。
【０２０７】
野生型ｐ５３エクソン５−９及びｐ５３ ｍＲＮＡの存在を有する抵抗性のあるＡＭＬ症例に焦点をあてると、下記のどちらかを示す２つのサブセットが浮上した：ｉ）低いか、あるいは存在しないｐ５３タンパク質、あるいは、ｉｉ）保存されているｐ５３タンパク質レベル。ＡＭＬ芽球サブセットにおける低いｐ５３タンパク質に対する分子基盤に関して、最初の解析によれば、可逆的なエピジェネティックな変化の裏づけとなる根拠が特定されなかった。欠陥のあるｐ５３遺伝子（薬理学的試みを逆方向に挑む、プロモーターの変化又はエピジェネティックな変化を含む）、ＭＤＭ２又はＭＤＭＸレベルとは無関係の損なわれたｐ５３ ｍＲＮＡ翻訳、又はｐ５３タンパク質安定性の減少がありうる(Naski, N. et al., Cell Cycle 8: 31-34 (2009); Ofir-Rosenfeld, Y. et al., Mol. Cell. 32: 180-189 (2008); MacInnes, A.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 10408-10413 (2008); Takagi, M. et al., Cell 123: 49-63 (2005); Asher, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 3099-3104 (2002); Leng. R.P. et al., Cell 112: 779-791 (2003); Dornan, D. et al., Nature 429: 86-92 (2004））。
【０２０８】
主要な供給源が不足していることを考慮すると、以下は更に検討されなかったが、将来の検討として評価されるべきｐ５３状態とｐ５３タンパク質レベルの間の相互関係に関する課題が挙げられる。ＭＤＭ２阻害剤処置又は外部照射の後に、ｐ５３タンパク質のロバストな誘導を持つＡＭＬ芽球に関して、２つの主たる分子欠陥は以下である：ｉ）おそらく、ｐ５３の翻訳後の異常な修飾が要因である欠陥のあるｐ５３タンパク質が、活性化されたアポトーシスシグナル伝達経路に対してｐ５３の能力の変化をもたらす（Knights, C.D. et al., J. Cell. Biol. 173: 533-544 (2006); Di Giovanni, S. et al., EMBO J. 25: 4084-4096 (2006); Murray-Zmijewski, F. et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9:
702-712 (2008））、又はｉｉ）ｐ５３によって制御されるアポトーシスネットワークの欠陥。ｐ５３アポトーシスネットワークの欠陥の後者の起こりうる可能性に関しては、ｐ５３誘導後の、アポトーシス応答に関連する様々なｐ５３誘導性遺伝子に対して相対的に重要な定量分析が利用可能ではないことに注目することが重要である。細胞のＲＩＴＡ処置（但し、ヌトリン処置ではない）のセッティングでは、最近、ｐ２１のダウンレギュレーションにより、ｐ５３によって誘導されるアポトーシスと細胞周期停止の間の切り替えが可能となることが証明されている（Enge, M. et al., Cancer Cell 15: 171-183 (2009））。
【０２０９】
ヌトリン又はＭＩ−２１９処置の前後のｐ２１タンパク質レベルの解析ではまた、ＭＤＭ２阻害剤処置後のＡＭＬ芽球の運命の決定においてｐ２１のユニークな役割の明瞭な根拠は提供されていない。ＭＩ−２１９（示されていない）を用いる処置後の抵抗性芽球に対する感受性芽球の遺伝子発現変化の第一の解析では、古典的なｐ５３応答性遺伝子のサブセットの分化誘導が特定されたが、このデータの解釈は、白血病におけるｐ５３媒介性アポトーシスに重要性を持つ決定的な遺伝子が知られていないという事実によって妨げられている。すなわち、古典的なｐ５３応答性遺伝子以外の遺伝子は、ＭＤＭ２阻害剤に対する抵抗性を付与することに関与しており、こうした遺伝子の将来の解析は、骨髄性白血病芽球に対するＭＤＭ２阻害剤の有効性の包括的な理解に重要である。
【０２１０】
この解析からの結果の１つは、エクソビボにおけるＭＩ−２１９に極めて感受性のあるＡＭＬ芽球の特定であった。ＡＭＬ症例のおよそ１／３は、ＭＩ−２１９に対して＜２μＭのＩＣ50値を示した。こうした感受性の増加の決定因子を特定しようとする試みは、変異したＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＩＴＤの存在）との頻繁な、かつ有意な関連を明らかにした。例えば、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（Ｎ＝１９）を持つすべてのＡＭＬ試料のうちの５８％及び８４％が、それぞれ、＜２μＭ及び＜５μＭのＭＩ−２１９ ＩＣ50値を示した。それ故、活性化したＦｌｔ３は、ＡＭＬ芽球をＭＤＭ２阻害剤媒介性アポトーシスに対して高感度にするようにみえ、こうした知見によれば、ＡＭＬにおけるＭＤＭ２阻害剤の臨床的応用に利用されうる。
【０２１１】
要約すれば、＞１００の原発性ＡＭＬ症例の解析に基づくこのユニークなデータセットによって、ＡＭＬにおけるＭＤＭ２阻害剤に対する一次性抵抗性が定量的に述べられており、そして複数の明瞭に識別できる分子メカニズムの根拠が提供されている。従って、こうした予期せぬ知見によって、ＭＤＭ２阻害剤をＡＭＬ治療に移行させることが実質的に複雑化され、ＡＭＬにおける抵抗性メカニズムに関して更に綿密な前臨床試験の理論的根拠が提供されている。こうした試験はまた、抵抗性を克服しようとするために、ＭＤＭ２阻害剤に対して一次性抵抗性を持つＡＭＬにおける併用標的治療の理論的根拠も提供している（Kojima, K. et al., Leukemia 22: 1728-1736 (2008））。
【０２１２】
反対に、変異したＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）とＭＤＭ２阻害剤に対する感受性の増大の関連に関する知見は、公表されている知見（Kojima, K. et  al., Leukemia 24: 33-43 (2010））に基づいて予測していなかったことであり、そして以下がＡＭＬ治療法にとって重要でありうる：ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ ＡＭＬ症例は、短い寛解持続時間を有する傾向にある、ｉｉ）ＦＬＴ３阻害剤単剤治療を用いるＦＬＴ３の治療的遮断が患者に実質のある臨床的有益性を未だもたらしていない、及びｉｉｉ）ＭＤＭ２阻害剤を、変異したＦｌｔ３及び損なわれていないｐ５３を持つＡＭＬに適用することが、臨床的有益性を提供することになる（Bacher, U. et al., Blood 111: 2527-2537 (2008））。すなわち、ＭＤＭ２阻害剤感受性に対するゲノムバイオマーカーのこの説明によって、“ＭＤＭ２阻害剤感受性増強剤遺伝子変異（MDM2 inhibitor sensitizer gene mutations）”のコンセプトが紹介されており、そして同様な作用を有する更なる遺伝子の進行しているサーチが正当化されている。最後に、こうしたＭＤＭ２阻害剤感受性増強変異はまた、腫瘍性の細胞のＭＤＭ２阻害剤処置に対する感受性の増強のための説明を提供することになる。
【０２１３】
実施例１０
ＭＶ４−１１及びＭＯＬＭ−１３ＡＭＬ細胞株に対する細胞増殖抑制及び細胞毒性作用
チャート３の化合物を２つのＡＭＬ細胞株：ＭＶ４−１１及びＭＯＬＭ−１３（供給源：The DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，それぞれ、レファレンス DSMZ ACC554及びDSMZ ACC102）に対するそれらの細胞増殖抑制及び細胞毒性作用を評価した。こうした細胞株の双方は、ＦＬＴ３ ＩＴＤ変異を有している。（Quentmeier, H. et al. Leukemia 17:120-124 (2003））。増殖阻害アッセイの場合、細胞を９６ウェルフォーマットでチャート２の化合物と共に９６時間インキュベートした。細胞播種条件をこのアッセイフォーマットにおける有意な細胞増殖が得られるように適合させた。増殖阻害アッセイをセルタイター−グロ蛍光キット（Celltiter-Glo Luminescent kit）（Promega）を用いて行なった。ＩＣ50値（増殖阻害パーセントが試験化合物の最大阻害作用の半分に等しい濃度）を算出し、そして双方の化合物の場合、２つのＡＭＬ細胞株において１０ｎＭと１００ｎＭの間の範囲であった。
【０２１４】
細胞毒性アッセイのために、細胞を６ウェルフォーマットでチャート２の化合物と共に、９６時間インキュベートした。細胞播種条件をこのアッセイフォーマットにおける有意な細胞増殖が得られるように適合させた。細胞毒性作用を、トリパンブルー染色法を用いて行なった。浮遊性細胞と接着性細胞の双方をトリパンブルーで染色した。数量化は、細胞濃度及び生存細胞のパーセントの双方を決定するＶｉ−ＣＥＬＬ（登録商標）生死細胞アナライザー（Vi-CELL（登録商標）Cell Viability Analyzer）（Beckmann-Coulter）によって行なった。ＩＣ90濃度（増殖阻害パーセントが試験化合物の最大阻害作用の９０パーセントに等しい濃度）に近い濃度においてチャート２の化合物の双方の場合、未処理細胞と比較して生存細胞のパーセントは有意に減少しており、ＭＶ４−１１細胞株で、よくても５０％と７０％の間、そしてＭＯＬＭ−１３細胞株の場合には５０％未満であった。
【０２１５】
本明細書中に提供されている本方法及び組成物の広さ及び範囲は、あらゆる上記に述べられている例示的な実施形態によって限定されるべきではないが、下記の請求項及びそれらの均等物による場合に限り明確にされるべきである。
【０２１６】
特定の実施形態に関する上記の説明は、他人が、過度の実験をすることなく、本明細書中に提供されている方法及び組成物の全体としての概念から逸脱することなく、当技術分野の技能内の知識を応用することによって、こうした特定の実施形態を容易に変更し、及び／又は様々な適用に適合させることができるように、本明細書中に提供されている方法及び組成物の全体としての本質を十分明らかにするものである。それ故、こうした適合及び変更は、本明細書中に提供されている教示及び指針に基づいて、開示されている実施形態の意味及び均等な範囲内にあることを意図している。本明細書中の表現又は使用語句は説明の目的のためであって、限定の目的ではないことが理解されるべきであり、その結果、この明細書の使用語句又は表現は、教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきである。
【０２１７】
本明細書中に引用されている、特許、特許出願、及び公表はすべて、引用によって全体として本明細書中に完全に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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