(57)【要約】【課題】生体細胞１分子の動態測定をスクリーニング測定が可能な程度に高速化、自動化された光学顕微鏡システムとスクリーニング装置を得る。【解決手段】蛍光性指標を励起発光させる励起光４３を測定対象物１に照射する光源２１と、励起光により励起された蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系３０と、拡大光学系で得られた測定対象物の光像４６を撮像して撮像画像データを得る撮像装置３１と、拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡２０と、撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の１分子の動態を計測する解析部５０とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の１分子の動態を計測する解析部とを備えた、光学顕微鏡システム。
【請求項２】
前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、
前記解析部が、前記遮蔽部材の光像に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を判断し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われる請求項１に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項３】
前記照射光学系が、全反射照明と対物レンズの光軸上からの落射照明との２つの照射方法での前記測定対象物の照射が可能であり、前記遮蔽物の光像に基づく前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作を前記対物レンズの光軸上からの落射照明下で行い、前記測定対象物の１つの蛍光指標の動態測定のための撮像画像の取得を、全反射照明下で行う、請求項２に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項４】
前記解析部が、前記撮像画像に対して二値化処理を行って前記撮像画像の二値化情報を取得し、前記フォーカス制御部によるフォーカス調整動作に伴う前記二値化情報の変化から前記拡大光学系におけるオートフォーカス動作が行われる、請求項２または３に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項５】
前記解析部が、前記二値化情報を用いて前記撮像画像における前記遮蔽部材の境界部分のコントラストを数値化し、前記数値化されたコントラスト値が最も大きくなる位置が前記拡大光学系におけるフォーカス位置であると判断する請求項４に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項６】
前記解析部が、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像した前記撮像画像から、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔を求め、得られた位置間隔の平均値を用いて前記撮像倍率情報を取得する請求項１〜５のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
【請求項７】
前記解析部が、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔から前記撮像画像における二次元の座標位置を特定し、前記特定された二次元の座標位置から、複数の撮像画像を並べて配置した撮像画像を取得する、請求項６に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項８】
前記光学顕微鏡は、光学的分光手段と前記光学的分光手段で分光されて得られた波長の異なる複数種類の光像それぞれからの撮像画像を取得可能な複数の撮像光学系を備え、
前記解析部は、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像して得られた前記複数の撮像光学系による撮像画像を用いて、各撮像光学系による前記撮像画像間の位置情報の誤差を補正する補正値を取得し、
前記補正値を用いて前記複数の撮像光学系により得られた撮像画像の誤差を補正する請求項１〜７のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
【請求項９】
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値／平均値画像であるＣＶ画像を作成し、得られた前記ＣＶ画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項１〜８のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項９に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項１１】
前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら２つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断する、請求項１〜１０のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
【請求項１２】
前記請求項１〜請求項１１のいずれかに記載された光学顕微鏡システムと、
それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、
前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞１分子の動態を計測するスクリーニング制御部とを備え、
各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞１分子の自動スクリーニングを可能とするスクリーニング装置。
【請求項１３】
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間の油浸オイルを供給するオイル供給装置をさらに備え、
前記オイル供給装置は、前記油浸オイルを供給する一系統のオイル供給系と、前記油浸オイルを排出する二系統のオイル排出系を有し、前記二系統のオイル排出系のうち少なくとも一系統が前記油浸オイルを吸引排出するオイル排出系である請求項１２に記載のスクリーニング装置。
【請求項１４】
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間に配置されるオイルアダプタをさらに備え、
前記オイルアダプタは、
前記油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給する前記オイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、
前記供給された油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出する前記オイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、
前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備えた、請求項１３に記載のスクリーニング装置。
【請求項１５】
前記スクリーニング制御部は、前記光学顕微鏡から得られる前記撮像画像に基づいて、前記ウェルプレートが有する複数のウェルの中心位置を予め認識してウェル中心情報を取得し、前記ウェル中心情報に基づいて前記ウェル移送手段を制御する請求項１２〜１４のいずれかに記載のスクリーニング装置。
【請求項１６】
前記ウェル内の前記測定対象物それぞれに、所定のタイミングで異なる刺激を与えることができる測定環境制御手段をさらに備える請求項１２〜１５のいずれかに記載のスクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、蛍光性指標を用いて生体細胞における１つの分子の動態計測が可能な光学顕微鏡システム、および、この光学顕微鏡システムを用いて複数のウェル内の生体細胞に対しての１分子動態計測を自動的に行い統計的なデータ処理が可能なスクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡とその周辺装置は、さまざまな分野での研究に貢献しているが、近年は特に測定対象物を撮像装置により撮像する機能を備え、撮像した静止画像や動画像の画像データをコンピュータや大型モニタなどの外部機器に送出して、画像解析や現象解析に供されるようになっている。また、光学顕微鏡により取得された画像を解析する解析手段が組み合わされることで、光学顕微鏡単体では把握不可能な、可視光域では数百ナノメートルオーダーである光の回折限界サイズ以下の微細な対象物を測定できる光学顕微鏡システムも実用化されている。
【０００３】
例えば、生命科学研究の分野では、高解像度の光学顕微鏡を用いて細胞内部の微細構造の変化や細胞分化パターンの解析など行うために、蛍光性物質を標識として用いて、その分布状況や位置の変化を測定することが行われている。生命科学研究分野における高解像度顕微鏡を用いた測定方法として、１分子蛍光追跡技術などが知られている。
【０００４】
１分子蛍光追跡技術は、モータータンパク質や膜タンパク分子の動態などを、細胞の１分子ずつ測定する方法である。測定対象の分子を蛍光性指標で標識し、全反射照明蛍光顕微鏡などの背景光の小さい顕微鏡法により測定することで、分子の輝点の動きを動画として把握することができる。また、動画として得られた各フレームの画像に対して、ガウスフィット法などを用いた画像処理を行って輝点の位置を特定する作業を経ることで、数ミリ〜数十ミリ秒の分解能で分子のナノメートルレベルでの動態を追跡することができる（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yildiz A el al. "Myosin V walks hand-over-hand: single fluorescent imaging with 1.5-nm localization" SCIENCE vol.300 2061-5 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方で、例えば新薬の開発に当たっては、測定対象試料としての生体細胞に所定の薬剤を供与して、このときに生じる細胞分子レベルの反応を統計的に把握し、その効果を確認するスクリーニング手法が用いられている。
【０００７】
細胞内では、数十〜数百分子の働きによって細胞機能が生まれたり制御されたりしているが、このときの分子一つ一つの動態は全く同一でなくばらついており、そのばらつきの程度や分布の仕方は細胞機能との関連を考えるうえで重要な情報となる。これらの情報は、分子を１個ずつ測定したデータを数多く集め、統計的な処理を行うスクリーニング手法を用いることで初めて得られるものである。
【０００８】
ところが、測定対象物である生体細胞内の１分子の動態を測定するには、高い解像度と撮像感度が必要であり、また、細胞膜上の測定対象物を観察するためには顕微鏡光学系の焦点位置を厳密に合わせる必要がある。さらに、複数ある蛍光性指標から、どの指標を選択してその動態を測定するかという選別が重要となる。生体細胞内の１分子の動態を測定することができる従来の１分子蛍光追跡技術では、これら測定に必要な各種の設定を手作業で行わざるを得ず、多大な時間と作業者の高い能力が求められていた。さらに、数十〜数百分子を測定対象とする生体細胞１分子のスクリーニング測定を行うには、多くの労力と時間が必要となり、十分な数の測定対象における測定結果を踏まえたスクリーニング測定を行うことは極めて困難であった。
【０００９】
そこで本願は、上記従来の課題を解決して、生体細胞内の１分子の動態のスクリーニング測定に対応できる、高速化かつ自動化された測定が可能な光学顕微鏡システムと、この光学顕微鏡システムを用いたスクリーニング装置を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本願で開示する光学顕微鏡システムは、蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の１分子の動態を計測する解析部とを備える。
【００１１】
また、本開示にかかるスクリーニング装置は、上記本開示にかかる光学顕微鏡システムと、それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞１分子の動態を計測するスクリーニング制御部とを備え、各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞１分子の自動スクリーニングを可能とする。
【発明の効果】
【００１２】
本願で開示する光学顕微鏡システムは、光学顕微鏡で撮像された測定対象物の撮像画像データから測定対象の細胞を選別し、選別された測定対象細胞に対して一つの蛍光性指標の観測を行って、生体細胞内の１分子の動態を計測する解析部を備えている。このため、人手に頼らずに高いスループットで、生体細胞１分子の動態を測定結果として出力することができる。
【００１３】
また、本願で開示するスクリーニング装置は、上記本開示にかかる光学顕微鏡システムと測定対象物が収容された複数個のウェルを移送する移送手段とを有する。このため、複数のウェル内に収容された測定対象物としての生体細胞１分子の動態を自動的にスクリーニング観測することができるスクリーニング装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態にかかる光学顕微鏡システムを備えたスクリーニング装置の全体構成を説明するためのブロック図。
【図２】全反射照明蛍光顕微鏡システムにおける測定原理を説明する図。
【図３】全反射照明蛍光顕微鏡システムにおける生体細胞の測定対象範囲を説明するためのモデル図。
【図４】全反射照明蛍光顕微鏡と落射照明顕微鏡における、撮像された光学画像の差異を説明する図。
【図５】本実施形態にかかる光学顕微鏡の照射光学系の構成を説明する図。
【図６】本実施形態にかかる光学顕微鏡における、視野絞りの像を用いて行う対物レンズのオートフォーカス動作を説明する図。
【図７】撮像画像の倍率を検出するための画像処理を説明する図。
【図８】２波長の発光色を同時計測する場合の画像間補正を説明する第１の図。
【図９】２波長の発光色を同時計測する場合の画像間補正を説明する第２の図。
【図１０】透過光像のＣＶ画像を用いて画像処理することの効果を説明するための図。
【図１１】透明な細胞のデフォーカス像を用いて測定対象の細胞を選別する状況を説明するための図。
【図１２】透過光像のＣＶ画像の二値化によって、測定対象となる細胞を選別する画像処理の手順を示すフローチャート。
【図１３】透過光像から、測定対象となる細胞を選別する課程における撮像画像の処理状態を示す図。
【図１４】透過光像から選別された、測定対象となる細胞の状態を説明するための図。
【図１５】発現度合いの高い細胞の判定結果を説明する図。
【図１６】発現度合いの低い細胞の判定結果を説明する図。
【図１７】複数のウェルの配置間隔の把握方法を説明する図。
【図１８】実施形態にかかるスクリーニング装置に用いられるオイルアダプタの構成を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願で開示する光学顕微鏡システムは、蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像と、透過光による前記測定対象物の光像とを得ることができる拡大光学系と、前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の１分子の動態を計測する解析部とを備えたものである。
【００１６】
本開示にかかる光学顕微鏡システムでは、上記構成を備えることで、生体細胞内の１分子の動態観察を自動的に行うことができ、人手に頼らずに高いスループットで測定結果を出力することができる。
【００１７】
上記本開示の蛍光顕微鏡システムにおいて、前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、前記解析部が、前記遮蔽部材の光像に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を判断し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われることが好ましい。このようにすることで、測定対象物を直接観測して行う場合と比較して、より正確で自動化に対応可能な対物レンズのオートフォーカス動作を行うことができる。
【００１８】
この場合において、前記照射光学系が、全反射照明と対物レンズの光軸上からの落射照明との２つの照射方法での前記測定対象物の照射が可能であり、前記遮蔽物の光像に基づく前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作を前記対物レンズの光軸上からの落射照明下で行い、前記測定対象物の１つの蛍光指標の動態測定のための撮像画像の取得を、全反射照明下で行うことが好ましい。このようにすることで、オートフォーカスを行うための遮蔽部材を良好に認識することができ、正確で迅速なオートフォーカス動作を行うことができる。
【００１９】
また、前記解析部が、前記撮像画像に対して二値化処理を行って前記撮像画像の二値化情報を取得し、前記フォーカス制御部によるフォーカス調整動作に伴う前記二値化情報の変化から前記拡大光学系におけるオートフォーカス動作が行われることが好ましい。さらに、前記解析部が、前記二値化情報を用いて前記撮像画像における前記遮蔽部材の境界部分のコントラストを数値化し、前記数値化されたコントラスト値が最も大きくなる位置が前記拡大光学系におけるフォーカス位置であると判断することが好ましい。このようにすることで、撮像画像を用いたオートフォーカス動作をより円滑に行うことができる。
【００２０】
また、本開示にかかる光学顕微鏡システムにおいて、前記解析部が、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像した前記撮像画像から、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔を求め、得られた位置間隔の平均値を用いて前記撮像倍率情報を取得することが好ましい。このようにすることで、撮像画像の正確な撮像倍率を検出することができる。
【００２１】
また、前記解析部が、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔から前記撮像画像における二次元の座標位置を特定し、前記特定された二次元の座標位置から、複数の撮像画像を並べて配置した撮像画像を取得することが好ましい。このようにすることで、より広い視野の撮像画像を容易に取得することかでできる。
【００２２】
さらに、前記光学顕微鏡は、光学的分光手段と前記光学的分光手段で分光されて得られた波長の異なる複数種類の光像それぞれからの撮像画像を取得可能な複数の撮像光学系を備え、前記解析部は、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像して得られた前記複数の撮像光学系による撮像画像を用いて、各撮像光学系による前記撮像画像間の位置情報の誤差を補正する補正値を取得し、前記補正値を用いて前記複数の撮像光学系により得られた撮像画像の誤差を補正することが好ましい。このようにすることで、高倍率の撮像画像における誤差を容易に補正することができ、複数種類の撮像画像について、共通した画像処理を適用することができる。
【００２３】
また、前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値／平均値画像であるＣＶ画像を作成し、得られた前記ＣＶ画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行うことが好ましい。このようにすることで、透過光像から、測定対象となりうる細胞の位置を、容易に検出することができる。
【００２４】
さらに、前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行うことが好ましい。
【００２５】
さらにまた、前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら２つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断することが好ましい。このようにすることで、測定対象の細胞分子が十分に発現しているか否かを容易に判別することができ、発現不十分な細胞分子を測定することによるロスを未然に防ぐことができる。
【００２６】
また、本開示にかかるスクリーニング装置は、前記本開示にかかるいずれかの光学顕微鏡システムと、それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞１分子の動態を計測するスクリーニング制御部とを備え、各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞１分子の自動スクリーニングを可能とする。
【００２７】
本開示にかかるスクリーニング装置は、上記した本開示にかかる光学顕微鏡システムにおける、生体細胞１分子の動態を自動的に測定できる機能を活かして、複数のウェル内に収容された測定対象物としての生体細胞１分子の動態を自動的にスクリーニング観測することができる。
【００２８】
本開示のスクリーニング装置において、前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間の油浸オイルを供給するオイル供給装置をさらに備え、前記オイル供給装置は、前記油浸オイルを供給する一系統のオイル供給系と、前記油浸オイルを排出する二系統のオイル排出系を有し、前記二系統のオイル排出系のうち少なくとも一系統が前記油浸オイルを吸引排出するオイル排出系であることが好ましい。このようにすることで、長時間の測定や、多数のウェルを順次測定する場合でも、光学顕微鏡の対物レンズを好ましい油浸状態に維持することができる。
【００２９】
また、前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間に配置されるオイルアダプタをさらに備え、前記オイルアダプタは、前記油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給する前記オイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、前記供給された油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出する前記オイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備えることが好ましい。このようなオイルアダプタを備えることで、簡単な構成ながら対物レンズの油浸状態を維持し続けることができる。
【００３０】
さらに、前記スクリーニング制御部は、前記光学顕微鏡から得られる前記撮像画像に基づいて、前記ウェルプレートが有する複数のウェルの中心位置を予め認識してウェル中心情報を取得し、前記ウェル中心情報に基づいて前記ウェル移送手段を制御することが好ましい。このようにすることで、それぞれのウェル内の測定対象物質を正確に切り替えて測定することができる。
【００３１】
また、前記ウェル内の前記測定対象物それぞれに、所定のタイミングで異なる刺激を与えることができる測定環境制御手段をさらに備えることが好ましい。このようにすることで、さまざまな条件おける生体細胞１分子の動態測定を行うことができ、より良好なスクリーニングを実現することができる。
【００３２】
（実施の形態）
以下、本開示にかかる光学顕微鏡システム、および、スクリーニング装置の実施の形態について図面を参照しながら説明する。本実施形態にかかるスクリーニング装置は、本開示にかかる光学顕微鏡システムを備え、複数ウェル内の測定対象試料について自動的、連続的に生体細胞内の１分子についての動態測定が可能なものである。
【００３３】
［スクリーニング装置］
図１は、本実施形態にかかるスクリーニング装置の概略構成を説明するためのブロック図である。
【００３４】
図１に示すスクリーニング装置は、ウェルプレート６０が備える複数のウェル６０ａ内にそれぞれ収容された、蛍光性指標が付された生体細胞に対して、本開示にかかる光学顕微鏡システム１０を用いて拡大光像を撮像した撮像画像を得、得られた撮像画像から測定対象である１つの蛍光性指標を選別してその動態の測定を行い、複数のウェル６０ａ内のそれぞれの生体細胞１分子における動態測定結果を統計的に処理するものである。
【００３５】
図１において、光学顕微鏡システム１０は、図１では図示しない測定対象物である試料の撮像画像を取得する光学顕微鏡２０と、光学顕微鏡２０により得られた撮像画像データを処理するデータ処理機能と、光学顕微鏡２０で試料の拡大された光学像を撮像するために、オートフォーカス動作などの光学顕微鏡２０の各部の動作を制御する制御機能とを兼ね備えた、解析部５０とから構成されている。
【００３６】
本実施形態にかかるスクリーニング装置に用いられる光学顕微鏡２０は、試料に標識されている蛍光性指標を励起発光させる光源２１として、第１の励起光４１を照射する第１の光源２１ａと、第２の励起光４２を照射する第２の光源２１ｂとの２つの光源２１を備えている。このように、２つの光源２１を備えることで、それぞれの光源２１ａ、２１ｂから照射される励起光４１、４２の波長や強度を異ならせることができ、異なる励起光４１、４２に対する蛍光性指標の反応を用いて測定を行うことができる。
【００３７】
光源２１としては、サファイヤレーザーやＹＡＧなどの固体レーザー、その他各種の半導体レーザーなどのレーザー光源を用いることができる。例えば第１の光源２１ａに波長４８５ｎｍのレーザー光源を、また、第２の光源２１ｂに波長５６１ｎｍのレーザー光源を用いることができる。なお、光源２１としては、上記例示したレーザー光源の他にも、水銀ランプ、キセノンランプといった高圧放電灯などの周知の発光光源を用いることができる。さらに、光源２１には、音響光学素子フィルタ（Acousto-Optic Tunable Filter:ＡＯＴＦ」などの光量調整手段を適宜備えることが好ましい。
【００３８】
第１の光源２１ａから照射された第１の励起光４１は、適宜配置されたレンズ、フィルタなどの第１の照射光学系２２ａ、第１の全反射ミラー２３を経て合成ミラー２４へと到達する。また、第２の光源２１ｂから照射された第２の励起光４２は、適宜配置されたレンズ、フィルタなどの第２の照射光学系２２ｂを経て合成ミラー２４に到達する。
【００３９】
合成ミラー２４は、ダイクロイックミラーまたはハーフミラーなどで構成されていて、２つの光源２１ａ、２１ｂから照射された２つの励起光４１、４２の合成光、または、いずれか一方の励起光を試料に照射して、試料に付された蛍光性指標を励起発光させる照射励起光４３とする。
【００４０】
照射励起光４３は、ダイクロイックミラーであるメインミラー２５で反射されて対物レンズ２６へと入射する。本実施形態にかかる光学顕微鏡２０では、後に詳述するように、細胞１分子の蛍光測定に有利なエバネッセント光を用いた全反射照明蛍光顕微鏡とするために、試料への入射光４４は光軸からシフトされた状態で対物レンズ２６に入射させることができるようになっている。なお、入射光を全反射照明光とするための手法としては、反射ミラー２５の位置を対物レンズ２６の光軸からずらす方法がある。また、光源としてファイバーレーザーを用いる場合には、励起光を照射する光ファイバの位置を対物レンズ２６の光軸からずらして、入射光とする方法などの従来公知の方法を適宜用いることができる。
【００４１】
また本実施形態にかかる光学顕微鏡２０は、後述するように、対物レンズ２６のオートフォーカス動作時などに適宜全反射照明以外の照照射光を用いて撮像された撮像画像を用いている。このため、本実施形態にかかる光学顕微鏡では、入射光４４の入射経路を調整可能な電動手段を備えることなどにより、対物レンズ２６の光軸に沿って入射する励起光と、全反射条件を満たした入射光４４とを切り替えて照射することができるようになっている。全反射条件を満たした入射光４４は、試料が配置されているウェル６０ａの底面ガラスプレートの表面で反射して反射光４５となる。
【００４２】
本実施形態にかかる光学顕微鏡２０では、対物レンズ２６は、一例として開口数ＮＡ＝１．４９以上、作動距離０．１２ｍｍ以下、倍率６０倍のものを用いることができる。
【００４３】
入射光４４によって生じたエバネッセント光によって励起発光した蛍光性指標の光像は、対物レンズ２６による拡大光像４６となってメインミラー２５を透過して第２の全反射ミラー２７を経て撮像光学系に入射する。
【００４４】
本実施形態にかかる光学顕微鏡２０では、第２のダイクロイックミラー２８を用いて蛍光性指標の拡大光像４６を、２つの異なる発光色に分解している。第１の発光色を備えた拡大光像４７は、ダイクロイックミラー２８を透過した後撮像光学系としての第１の撮像レンズ３０ａなどを透過して、第１の撮像装置３１ａにより撮像されて電子画像データに変換される。また、第２の発光色を備えた第２の拡大光像４８は、ダイクロイックミラー２８によって反射された後第３の全反射ミラー２９で反射され、その後撮像光学系としての第２の撮像レンズ３０ｂなどを透過して、第２の撮像装置３１ｂにより撮像されて電子画像に変換される。
【００４５】
このようにすることで、蛍光性指標として例えば４８５ｎｍの励起光によって５００ｎｍ近傍の発光帯域を持つＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と、５６１ｎｍの励起光によって５８０ｎｍ近傍の発光帯域を持つテトラメチルローダミンとの二種類の蛍光性指標を用いて、これらを同時に測定することができる。
【００４６】
本実施形態にかかる光学顕微鏡２０では、測定対象の細胞を探す際に用いる低倍率測定では一例として１０倍、また、一つの蛍光性指標を観察する高倍率測定ではトータル倍率が数百倍程度（一例として６０×４の２４０倍）となるように拡大された拡大光学画像が用いられる。また、第１の撮像装置３１ａおよび第２の撮像装置３１ｂとしては、高感度でかつ高倍率の電子像倍型ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ：Ｅｌｅｃｔｏｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ＣＣＤ）を用いることができる。より具体的には、最大量子効率が９０％以上、電子像倍ゲインが１２００倍以上の撮像装置を用いることが好ましい。
【００４７】
なお、試料に標識される蛍光性指標としては、上記したＧＦＰなどの蛍光タンパク質や、ＨａｌｏＴａｇ等のタンパク質タグに有機蛍光色素を標識したものなど、従来公知のものを使用することができる。また、光学顕微鏡における光源、照射光学系などの励起光を生成、照射する機構や、撮像光学系や撮像装置などの試料の光像を撮像画像に変換する機構を、用いられる蛍光性指標の発光波長や発光強度に応じたものに適宜変換するべきことは言うまでもない。
【００４８】
また、上記実施形態では、光学顕微鏡として２色の励起光を生成する光源と、光源により生成された励起光を試料に照射する２種類の照射光学系、対物レンズや撮像レンズを備えた拡大光学系と撮像装置により構成されて異なる２色の蛍光性指標の発光を測定可能な２種類の撮像光学系を用いたものを例示した。しかし、本開示にかかる光学顕微鏡システムの光学顕微鏡としては、照射光学系、撮像光学系共に２種類を備えたものに限られず、それぞれ、１種類もしくは３種類以上に対応した構成を備えることができる。さらに、照射光学系の数と撮像光学系の数とが異なる構成とすることもできる。
【００４９】
撮像装置３１（３１ａ、３１ｂ）により得られた試料の拡大光像の撮像画像は、画像データの処理機能を備えた解析部５０によって電子画像データとして試料測定の目的に応じて適宜処理される。この電子画像データの処理内容については、後に詳述する。
【００５０】
また、本実施形態の光学顕微鏡システム１０の解析部５０は、光学顕微鏡２０で得られた撮像画像を電子画像データとして各種の処理を行う処理部としての機能以外に、光源２１からの励起光４１、４２の照射タイミングや照射強度の制御、また、試料載置部分への入射光４４を干渉反射像観察もしくは散乱光観察の場合の照射光と全反射照明光との間で切り替える入射角度の制御、さらに、対物レンズ２６に付随して設けられている、測定対象物である試料と対物レンズ２６との距離を調整するオートフォーカス機構の制御、撮像視野内の特定の部分を撮像画像中心へと移動することができる観察ステージの位置制御、異なる倍率の対物レンズへと交換するレンズ交換制御など、光学顕微鏡２０において撮像画像を取得するための各種制御を行う制御部としての機能を備えている。
【００５１】
解析部５０は、上記のような撮像画像データの処理と、その他光学顕微鏡２０の動作制御を行うに十分なデータ処理能力を備えたコンピュータ装置、サーバー装置によって実現することができる。しかし、本願で開示する光学顕微鏡システムにおいて、撮像画像のデータ処理と光学顕微鏡の動作制御との両方を行う解析部を備えることは必須の要件ではない。撮像画像のデータ処理を行うデータ処理部と、光学顕微鏡の動作制御を行う制御部とをそれぞれ光学顕微鏡システムにおける別々の部材として構成し、２またはそれ以上のコンピータ装置、サーバー装置を備えることができる。また、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムは、撮像装置によって撮像された撮像画像やデータ処理された測定画像を表示する表示モニタ部や、光学顕微鏡の動作状態を表示するパネル部などを適宜備えることができる。
【００５２】
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、解析部によって、光学顕微鏡の制御と光学顕微鏡により得られた試料の光像の拡大された撮像画像のデータ処理が行われることで、対物レンズの測定視野に配置された測定対象物である生体細胞の１分子に標識された蛍光性指標それぞれについての動態を自動的に測定することができる。
【００５３】
また、本実施形態にかかるスクリーニング装置は、上記説明した本実施形態にかかる光学顕微鏡システムによって、測定対象である生体細胞内の１分子の自動的な動態測定が可能であるという特徴を利用して、多数の試料を測定対象として、それぞれの試料に適宜必要な条件による刺激を加えた際の反応を統計的に解析したデータを取得することを可能とするものである。
【００５４】
本実施形態にかかるスクリーニング装置は、例えば図１に示すように、それぞれのウェル６０ａ内に測定対象物を収容したウェルプレート６０を移送（矢印６１）して、各ウェル６０ａ内の試料に所定の薬剤を所定のタイミングで供給する薬剤供給部６２の所定位置に移送し、さらに薬剤供給部６２で所定の薬剤が加えられた状態の試料を測定できるように光学顕微鏡２０の対物レンズ２６の視野に順次配置（矢印６３）する移送手段と、上記した薬剤供給部６２などの測定環境制御手段とを備えている。
【００５５】
なお、移送手段は、ウェルプレート６０を所定の速度で動かして所定の位置に配置することができる、二次元（ｘ−ｙ）、または、三次元（ｘ−ｙ−ｚ）ステージとして実現することができる。また、図１では、各ウェル６０ａ内の試料に薬剤を供給する薬剤供給部６２のみを例示したが、薬剤供給部６２に付属する装置手段として、各ウェル６０ａへの薬剤注入後に都度注入ノズルを洗浄する洗浄手段を備えるなど、それぞれのウェル６０ａに対する薬剤供給条件を一定のものとする補助手段を適宜備えることができる。さらに、測定環境制御手段としては、上記例示した薬剤供給部６２の他に、所定のウェルを所定の温度として測定対象物である試料に温度的な刺激を与える手段や、所定のウェル内の試料に紫外線などの光線や電磁波を照射する手段など、測定対象物をスクリーニングする上で必要な適宜の環境変化としての刺激を与える手段を用いることができる。また、これらの測定環境制御手段を複数同時に用いて、より詳細かつ複雑な測定条件を設定することができる。
【００５６】
また、本実施形態にかかるスクリーニング装置として、測定環境制御手段としての薬剤供給部６２と、ウェルプレート６０、光学顕微鏡システム１０の少なくとも対物レンズ２６近傍の部分を、所定の温度、湿度、滅菌状態などの所定の環境下に維持し、さらに外部からの塵埃などがウェル６０ａ内に入り込むことを防ぐシールド部材など、スクリーニングを行う際に一定の条件を保つべき環境条件を維持確保できる各種の周辺手段を設けるべきことは言うまでもない。
【００５７】
また、図１に示した本実施形態にかかるスクリーニング装置では、ウェルプレートの移送や薬剤供給部６２の制御などのスクリーニング装置全体の制御を、光学顕微鏡システム１０の解析部５０が合わせて行う構成となっている。しかし、本願で開示するスクリーニング装置において、スクリーニング装置全体の制御を行う制御部と、光学顕微鏡システムの解析部とが同じであることは必須の要件ではなく、スクリーニング装置の制御部として、解析部とは別のコンピュータ装置やサーバー装置などの制御手段を備えることができる。
【００５８】
［エバネッセント照明］
次に、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける、測定対象物である生体細胞に標識した蛍光性指標を励起させる励起光の照射について説明する。上記したように、本実施形態の光学顕微鏡システムの光学顕微鏡は、生体細胞内の１分子計測に好適な全反射照明におけるエバネッセント光によって試料の蛍光性指標を励起発光させる、全反射蛍光顕微鏡としての動作が可能となっている。
【００５９】
図２は、全反射蛍光顕微鏡としての構成を説明するための図であり、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムの対物レンズ近傍を拡大した断面図である。
【００６０】
図２に示すように、全反射蛍光顕微鏡では、試料１に対して、対物レンズ２６の光軸７３に対して所定の距離７４離れた位置から励起光としての入射光４４を照射し、この際に励起された蛍光性指標の発光７５を測定する。入射光４４は、試料１と試料１が載置されているガラスプレート７１との界面で全反射して反射光４５となる。なお、全反射蛍光顕微鏡を構成する上では、対物レンズ２６とガラスプレート７１との間にカップリング剤としてのオイル７２が必要となる。
【００６１】
本実施形態にかかるスクリーニング装置の場合には、測定対象物としての試料１がウェルプレート６０のそれぞれのウェル６０ａ内に収容された蛍光性指標で標識された生体細胞であり、ウェル６０ａの底面プレートが図２におけるガラスプレート７１に相当する。また、本実施形態のスクリーニング装置では、ウェルプレート６０が適宜移送されて、試料１が収容されたウェル６０ａの底面が光学顕微鏡２０の対物レンズ２６上に順次位置するようになっている。なお、本実施形態にかかるスクリーニング装置では、対物レンズ２６のレンズ面周辺を覆うようにして後に詳述するオイルアダプタが配置され、ウェル６０ａの底面プレートと対物レンズ２６との間に、常に所定量のオイル７２を供給可能として光学的カップリングを維持することで、連続した複数ウェル６０ａ内の生体細胞内の１分子計測を可能としている。
【００６２】
図３は、励起光を全反射方式で照射した場合と、対物レンズの光軸に沿っていわゆる落射方式で照射した場合との、試料に対する励起光の照射度合いの違いを説明する図である。図３（ａ）が全反射方式で励起光を照射した状態を示し、図３（ｂ）が対物レンズの光軸に沿って落射方式で励起光を照射した場合を示す。
【００６３】
図３（ａ）として示す全反射方式では、ガラスプレート７１と試料１との界面近傍部分のみにエバネッセント場７７が生じ、測定対象試料１である生体細胞内のガラスプレートに近接した基底面の蛍光性指標１ａのみを励起発光させ、細胞深部に位置する蛍光性指標１ｂは励起しないようにすることができる。一方、図３（ｂ）として示す対物レンズの光軸に沿って照射された場合は、ガラスプレート７１を貫通して上方まで励起光７６が照射されるため、ガラスプレート７１上の試料１の全体部分にまで励起光７６が作用する領域７８が広がる。このため、ガラスプレート７１近傍ののみならず細胞深部に位置するものまで、細胞内の蛍光性指標１ｃ全てを励起発光させてしまう。さらに、細胞内に含まれる蛍光性発光物質によるいわゆる自家発光をも生じさせてしまい、これらの発光が背景光となって、細胞内の１分子を標識する蛍光性指標それぞれを光像として捉えることが困難となる。
【００６４】
図４は、励起光を全反射方式で照射した場合と落射方式で対物レンズの光軸に沿って照射した場合との、同じ細胞における蛍光性指標の発光度合いを撮像画像として取得して比較したものである。図４（ａ）が全反射方式で励起光を照射した状態の撮像画像を示し、図４（ｂ）が対物レンズ光軸に沿って落射方式で励起光を照射した場合の撮像画像を示している。
【００６５】
図４（ａ）に示す全反射方式で励起光を照射した場合には、細胞内での蛍光性指標の発光が、ガラスプレート７１に相当するウェル６０ａ底面近傍のエバネッセント場内に位置するものに限られているため、撮像画像内における蛍光性指標の輝点が少なく、それぞれの輝点を区別しやすい。一方、図４（ｂ）に示す対物レンズ光軸に沿って励起光を照射した場合には、細部内のウェル６０ａ底面近傍以外の深部の蛍光性指標の発光や、細胞自体が有する蛍光発光性物質の発光が観測され、細胞全体に多くの基点が重なり合った状態となっていて、この撮像画像から１つの蛍光性指標の発光を分離測定することは困難な状態となっている。
【００６６】
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像装置によって撮像された光像の撮像画像に基づいて解析部が蛍光性指標の光点を一つ一つ認識することが、解析部による撮像画像データ処理の前提となる。このため、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、撮像画像を自動的に処理して生体細胞内の１分子の蛍光観察を実現するためには、測定対象物である試料としての生体細胞において光像として得られる蛍光性指標の発光個数をある程度の個数以下に抑えることが重要となる。したがって、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける測定対象物である生体細胞への励起光の照射方法としては、上記した全反射方式を採用することが好ましい。
【００６７】
なお、一例を挙げると、蛍光性指標の発光中心波長が５８０ｎｍの場合には、生体分子１個に由来する輝点は６００ｎｍ程度の広がりを持ち、さらにその輝点が移動することになる。このため蛍光性指標の発光個数としては、一つの輝点を分解観察するためには、１〜数μｍ四方程度の空間に１個程度となる濃度が好ましいと判断できる。
【００６８】
また、蛍光性指標の動きとしては、計測の時間分解能内で半径にして数十ピクセル程度に収まることが基準となる。撮像素子１ピクセルのシグナルレベルが大きくないため、蛍光性指標の移動速度が速く広がりが大きい場合、一つの輝点として認識しづらくなる。このため、細胞膜近傍の蛍光性指標は、動きが遅いため比較的測定しやすいが、細胞質の蛍光性指標は認識しづらいものが多い。
【００６９】
なお、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける励起光の照射方法は、全反射方式には限定されない。例えば、測定対象物である生体細胞内の蛍光性指標の数がもともと一定数以下に限定されていて、さらに、細胞が自家発光性物質等を有していない場合など、細胞内全体の蛍光性指標の発光を光像として捉えた場合でもその輝点の個数が限定される条件下であれば、測定対象物への励起光の照射を対物レンズの光軸に沿って照射する方式で行うことも可能である。
【００７０】
［光学顕微鏡システムでの自動処理］
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像装置により撮像された試料に標識された蛍光性指標の拡大光像の撮像画像に基づいて、例えば測定対象である蛍光性指標の輝点について、経時的な位置変化から細胞分子の動きを求め、輝度変化から細胞分子の状態を判定することで、生体細胞内の１分子の動態を測定するものである。これら撮像画像データの具体的な処理・解析内容は、測定したい動態の種類によって異なるものである。例えば、分子が複数の拡散係数間を遷移するとして、各観測時刻にどの状態にあるか推定することができる。また、細胞膜（および膜タンパク質）に対して、結合解離するタンパク質を観測する場合には、結合から解離までの時間を統計的に調べることで、解離した分子がどの状態であったかを推定することができる。一方、輝度変化から細胞分子の状態を調べるケースとしては、分子の数が増えたことを検出すること、偏光計測やＦＲＥＴ計測によって細胞の構造変化を検出すること、環境感受性色素を使ったｐＨ等の環境変化の計測を行うことなどができる。
【００７１】
そこで、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、測定対象である輝点が存在する生体細胞部分への光学顕微鏡のオートフォーカス動作、拡大光像として得られた撮像画像の倍率の特定、異なる撮像光学系からの撮像画像を同様に処理するためのデータ補正、さらに、撮像画像データから解析対象となりうる細胞の認識と、測定対象細胞の選別を、いずれも自動的に行うことで生体細胞内の１分子の動態測定を容易に実現可能とするものである。
【００７２】
以下、それぞれの自動化処理の内容について、図面を用いて説明する。
【００７３】
［オートフォーカス動作］
まず、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける自動化処理としての、オートフォーカス動作について説明する。
【００７４】
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、照射光学系における対物レンズの焦点位置と共役の位置に視野絞りを配置し、落射照明光による表面反射干渉観察によってこの視野絞りの像を測定し、視野絞りの像のコントラストが最も高くなる時の対物位置を対物レンズのフォーカス位置としている。
【００７５】
図５は、本実施形態にかかる光学顕微鏡の照射光学系における照射光の光路を説明する図である。
【００７６】
本実施形態にかかる光学顕微鏡では、一例として、図５において両方向矢印で示した位置８２、８３、８５、８６に照射光学系のレンズが配置されている。これら位置８２〜８６に配置されたレンズは、図１において２２として示した照射光学系を構成するレンズである。また、対物レンズ２６は、光路に対する影響を与えるレンズという観点から、レンズ３０とともに撮像光学系のレンズとしても機能するとともに、照射光学系の最終段のレンズとして機能する。なお、図５において、点線で示す位置８４は、レンズ８３の焦点位置でありこの位置８４は、レンズ８５の焦点位置を兼ねている。また、位置８７は、レンズ８６の焦点位置に相当する。この位置８７は、対物レンズ２６の手前側の焦点位置に相当する。位置８８が対物レンズ２６の焦点位置、すなわち測定対象物である試料が配置されている位置である。また、図１に示したように、本実施形態の光学顕微鏡では、照射光学系から照射された励起光や照射光を、ダイクロイックミラー２５で反射させて試料に照射し、蛍光性指標の発光７６の対物レンズ２６による拡大光像４６を、ダイクロイックミラー２５を透過させて撮像光学系３０を介して撮像装置３１で撮像する。
【００７７】
図５に示す照射光学系では、試料を照射する光源をファイバービームとして例示していて、全反射照明で試料を照射する場合に実線で示す位置にレーザー光源２１が配置され、落射照明での反射干渉測定を行う場合は点線で示す位置８０に、ファイバー導入された水銀ランプからの照射光が配置される。同様に、図５では、全反射照明を行う場合の照射光を実線で、落射照明で反射干渉観察を行う場合の照射光を点線で、それぞれ示している。
【００７８】
なお、落射照明で反射干渉観察を行う場合の光源位置８０は、照射光学系の各レンズ８２〜８８に共通する光軸上に位置している。励起光の照射光源としてファイバービームを用いる場合には、マイクロメータなどの移動距離を測定可能な機構を用いてファイバービームの位置を、全反射照明位置である図５中の光源２１の位置と、干渉反射測定を行う場合の位置８０との間で移動可能とすることができる。
【００７９】
図５に示す照射光学系は、位置８０に水銀ランプからの照射光を導入して試料を照射する場合の光学系において、対物レンズ２６に対してその焦点である試料の配置位置８８の共役点の位置に、光源（２１、８０）からの照射光の照射範囲を規制する視野絞り８１が配置されている。共役点の位置に配置されている視野絞り８１は、試料面８８に像８１‘を結ぶことで、試料に対する光源からの照射光の照射範囲が調整可能となる。同時に、対物レンズ焦点の共役点の位置に配置された視野絞りは、照射光学系における迷光が試料に照射されないように遮る作用を果たす。
【００８０】
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、試料に対して落射照明で位置８０からの光を照射した際に、撮像光学系３０を介して撮像装置３１で撮像された撮像画像を測定しながら、撮像画像に映り込んでいる視野絞り８１の像８１’のコントラストが最大となるように対物レンズ２６の位置を調整することで、対物レンズ２６の焦点位置を試料の配置位置８８と一致させることができる。
【００８１】
図６は、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、落射照明における試料干渉反射光像を用いてオートフォーカス動作を行う手法を説明する図である。
【００８２】
図６（ａ）に示す試料の反射干渉画像は、上記図５を用いて説明した照射光学系において、位置８０に水銀ランプからの照射光を導入して試料を照射することで取得された撮像画像である。
【００８３】
この、図６（ａ）で示した撮像画像について、全てのピクセル（一例として５１２×５１２）における輝度の値を求め、これを横軸が輝度値とするヒストグラムに表したものが図６（ｂ）である。
【００８４】
図６（ｂ）に示すように、図６（ａ）の撮像画像の各ピクセルでの輝度分布は、図中左側、すなわち輝度の低い側に現れている比較的少量でかつ急峻な分布と、図中右側である輝度の高い側に現れている、輝度値に一定のばらつきがある比較的大きな分布との、大きく２つの分布として現れている。なお、これら２つの分布は共にガウス近似が可能な分布形状となっている。この２つの輝度分布うち、図６（ｂ）中に示した直線Ａを境界線として、左側に位置する輝度が低い部分の輝度分布が図６（ａ）において下側に見えている、視野絞り８１の像８１’部分のピクセルの輝度分布であり、直線Ａの右側に位置する輝度が高い部分の輝度分布が、視野絞りの像８１’以外の試料細胞を撮像している部分のピクセルの輝度分布であると考えることができる。
【００８５】
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、図６（ａ）に示す落射照明下における反射干渉画像において、視野絞り像８１’の境界部分に、一例として５０〜７０ピクセル角程度の境界領域Ｂを設定し、この境界領域Ｂ内におけるピクセル全てについて、図６（ａ）と同様に輝度値を横軸としてヒストグラムを作成する。このとき得られた、図６（ｃ）として示したヒストグラムは、図６（ｂ）に示した顕微鏡の視野全体のピクセルを対象としたヒストグラムと同じ位置に分布のピークを有している。
【００８６】
図６（ｂ）と図６（ｃ）とにおいて、同じ輝度値を示すピクセルは同様の部分を撮像したピクセルであると考えることができる。また、図６（ｃ）に示すヒストグラムは、視野絞り８１’と試料画像との境界部分の境界領域Ｂにおけるピクセルのみを選択して表したものであるため、視野絞り８１’部分の輝度を示す、左側の低輝度側のピークに対して、試料部分の輝度を示す右側の高輝度側のピークが相対的に低くなって、低輝度側と高輝度側のそれぞれのピクセルの数はほぼ等しい状態となる。なお、図６（ｃ）においても、輝度分布を示すヒストグラムの２つのピークは、いずれもガウス近似可能な形状となっている。また、図６（ｃ）に示す、境界領域Ｂにおける各ピクセルの輝度分布を示すヒストグラムにおいて、直線Ｃとして示す２つの輝度分布のピークの中間部分の分布値が最も小さくなる状態が、撮像画像における視野絞り部分のコントラストが最も大きくなった状態となる。
【００８７】
以上を踏まえて、本実施形態の光学顕微鏡システム１０では、図示しないフォーカス調整機構を動作させて対物レンズ２６と試料１との間隔を調整しながら試料の反射干渉画像を取得し、設定された境界領域Ｂの各ピクセルの輝度値のヒストグラムを作成して、視野絞り８１’部分と試料が撮像されている部分とのコントラストが最大となる対物レンズ２６位置を特定することで対物レンズ２６のオートフォーカス動作を行っている。
【００８８】
視野絞り８１’部分と試料が撮像されている部分とのコントラストが最大となることを検出する方法としては、例えば、図６（ｃ）に例示した境界領域Ｂの各ピクセルの輝度値のヒストグラムにおいて、視野絞り８１’部分の輝度分布と試料部分の輝度分布とをそれぞれガウス関数で近似し、フィッティングしたガウス関数の標準偏差の和が最小となる状態が、最大コントラストの状態として判別することができる。本実施形態の光学顕微鏡システム１０では、解析部５０において撮像画像の画像データ処理を行いながら対物レンズ２６の位置を変化させて、最大コントラスト状態であると判断された位置に対物レンズ２６を配置することでオートフォーカス動作を行っている。
【００８９】
なお、図６（ｄ）は、図６（ａ）において直線Ａとして示される部分よりも低輝度側の部分、すなわち、図６（ａ）における左側の輝度分布に相当する部分のみを２値化して明暗を反転させて示した図である。図６（ｄ）に示される図が、試料の配置位置に映った視野絞り８１の像８１’を示すことになる。
【００９０】
境界領域Ｂの撮像画像において視野絞り部分と試料撮像部分とのコントラストが最も高くなる対物レンズ位置の判別方法としては、上記した、ヒストグラムからガウス関数を求めて標準偏差が最小となる位置を求める方法以外にも、例えば、それぞれの輝度分布の平均値間の距離が最大となる状態をコントラストが最大として判定することなど、適宜の方法を使用することができる。
【００９１】
なお、上記実施形態では、撮像画像における視野絞り像を明瞭に判別するため、照射光源であるファイバーレーザーの位置、または、光源からの照射光を導入するファイバの配置位置を照射光学系の各レンズの光軸位置に一致させて、落射照明における反射干渉画像を取得したが、本実施形態の光学顕微鏡では図５で示した照射光学系を用いているため、視野絞り像は全反射射照明における試料測定画像上にも落射照明の場合と同様に現れる。このため、全反射照明におけるエバネッセント光を用いた試料撮像画像から視野絞り像を判別して、図６に例示したような撮像画像の輝度分布のヒストグラムを作成するデータ処理等を行うことで、全反射照明による撮像画像を用いて対物レンズのオートフォーカス動作を行うことも可能である。この場合、全反射照明下における撮像画像における視野絞り部分の判別は落射照明下の反射干渉画像を用いた場合における視野絞り像の判別よりも困難となり、撮像画像の画像処理に工夫が必要となるが、照射光学系のレンズ中心の位置に光源を位置させる必要が無くなるため、光学顕微鏡における照射照明系の機構を簡素化することができる。
【００９２】
このように、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、対物レンズの試料焦点位置に対する共役点の位置に視野絞りを配置し、対物レンズ位置を調整しながら視野絞りの撮像画像のコントラストが最大となる位置を検出して対物レンズのオートフォーカス動作を行う。エバネッセント照明の照射範囲は、ガラス界面から数百ｎｍ程度であるため、全反射方式の励起光による蛍光性指標の発光測定におけるフォーカス調整は一般に困難である。また、細胞膜上のタンパク質の動態観測は、膜近傍の領域（数十ｎｍ程度）の測定に限られるため、焦点範囲が狭い。このため、測定対象物である蛍光性指標の発光の撮像画像自体からは極めて困難である光学顕微鏡の対物レンズのオートフォーカス動作を、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、解析部を用いて自動的に行うことができる。
【００９３】
なお、上記オートフォーカス制御方法によって対物レンズのフォーカス位置調整を行った後は、従来光学顕微鏡システムに採用されている顕微鏡の拡大光学系におけるフォーカス位置を維持する各種方法を用いることで、上記方法で初期設定がされた対物レンズのフォーカス調整を、振動や温度条件の変化などの環境変化に関わらず維持することができる。
【００９４】
また、上記の実施形態では、オートフォーカス動作を行うために照射光学系における対物レンズの焦点位置と共役点の位置に、撮像範囲を規制する視野絞りを配置した例を示した。しかし、対物レンズの焦点位置と共役点の位置に配置する部材は、視野絞りには限られず、光学顕微鏡の照射光学系において照射光を遮る遮蔽部材として、その像が試料と同じ位置にあるとして撮像画像から認識することができるものであればよい。このような遮蔽部材としては、顕微鏡や望遠鏡の視野の傾きを示すために配置されるワイヤゲージなどを用いることができる。
【００９５】
［測定倍率（スケール）の検出］
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、光学顕微鏡の撮像光学系により得られた撮像画像を用いて、当該撮像画像の拡大倍率を見積もるアルゴリズムを採用している。以下、光学顕微鏡において顕微鏡の測定倍率である測定視野のスケール換算を行う方法について、図７を用いて説明する。
【００９６】
図７は、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、撮像画像から撮像視野の撮像倍率を求める手法を説明する図である。図７（ａ）が、撮像倍率を求める指標として用いたマイクロメータの撮像画像、図７（ｂ）が、図７（ａ）に示した撮像画像をトリミング処理後に２値化した処理画像、図７（ｃ）が、マイクロメータの撮像画像をデータ処理することで得られたマイクロメータの格子間の各部分のラベル化像を示している。
【００９７】
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、撮像画像の倍率検出のために規則化されたパターンを有する部材を実際に光学顕微鏡で撮像し、その撮像画像データのデータ処理を行っている。
【００９８】
撮像画像の倍率検出のための規則化されたパターンとしては、撮像画像の画像処理から位置検出を行いやすいという理由から、格子状のパターンを有するマイクロメータ画像を用いている。なお、撮像倍率の検出のためには、二方向、または少なくとも一方向に、規則性を持つ従来周知の各種パターンを用いることができ。このため、以下で例示する格子状パターン以外でも、例えば縦横等間隔に配置されたドットパターンなどを用いることができる。
【００９９】
図７（ａ）は、撮像画像の倍率検出操作に用いられるマイクロメータの撮像画像である。図７では、レンズ倍率１０倍の対物レンズを用いて、格子間隔が縦横いずれも１０μｍピッチのマイクロメータを透過光観察により撮像したものを示している。なお、６０倍の対物レンズにおいて拡大倍率の検出を行う場合には、例えば１μｍピッチのマイクロメータを用いることができる。なお、後述するように、本実施形態の光学顕微鏡における撮像倍率の検出では、それぞれの格子の中心位置を求めてこれを計測に使っているため、例えば部分部分で格子の太さが異なっていた場合でも測定結果に影響はない。
【０１００】
なお、上記のように、撮像画像の倍率を検出するためにマイクロメータの画像を撮像する際に、落射照明による散乱光を用いることも可能ではあるが、ダイクロイックミラーの代わりにハーフミラーを用いることとなるため、光学顕微鏡の照射撮像光学系が複雑となる。これに比べて、透過光を用いる場合には、落射光学系との共存が容易であり、光学顕微鏡の構成を簡素化できる。
【０１０１】
図７（ａ）に示すように、マイクロメータの格子状パターンの撮像画像は高いコントラストを備えた画像として取得される。このため、Ｏｔｓｕ法などの代表的な画像データ処理アルゴリズムに従って、好適に二値化された画像データを得ることができる。
【０１０２】
図７（ｂ）は、図７（ａ）に示したマイクロメータ画像をＯｔｓｕ法によって二値化処理を施した撮像画像データである。なお、マイクロメータの像面以外の像が結像する場合があるため、図７（ａ）においてＤとして表すようなマイクロメータの格子状パターン以外の異物等の写り込みが少ない部分を適宜選択（トリミング）した後に、二値化処理を行うことが好ましい。
【０１０３】
トリミングされた二値化処理後の画像データ図７（ｂ）を、例えばウォーターシェッド法（ｗａｔｅｒｓｈｅｄ法）などの領域分割手法を用いて画像データ上の領域を分割し、格子で囲まれた略正方形の部分を選択してラベル化する。なお、図７（ｂ）に示すように、撮像画像を二値化処理した画像データにおいて周辺部分に位置する格子は、格子もしくは格子で囲まれた略正方形部分の少なくとも一部が欠けた状態となるためにその中心位置を正確に求めることができないため統計には用いず、ラベル化の対象から除外している。
【０１０４】
図７（ｃ）は、ウォーターシェッド法による領域分割処理後にラベル化されたそれぞれの格子間部分を、ｘｙ座標上に配置して示した図である。
【０１０５】
図７（ｃ）においては、それぞれの格子間の略正方形部分をその推定中心位置の点として表しいている。そして、図中左下に位置する原点に最も近い格子の推定中心位置を基準点Ｏ（０，０）とし、基準点Ｏと、基準点Ｏからｘ方向の最近点ｘ１（１，０）と再遠点ｘｎ（ｎ，０）、さらに、ｙ方向への最近点ｙ１（０，１）と最遠点ｙｎ（０，ｙ）とから、ｘ軸方向とｙ軸方向の格子数と各方向への基本ベクトルとを決める。このようにすることで、基準点Ｏからラベル化された各格子の推定中心位置への移動ベクトルは、ｘ、ｙ二方向への基本ベクトルの整数線形和として表すことができ、これを用いて各格子に番地を割り振ることができる。
【０１０６】
さらに、求めた基本ベクトルを用いて各格子の推定中心位置を定め、推定中心位置の最近計測点を格子中心とする。また同時に、各格子の番地を基にそれぞれの格子間距離を求めて、格子間距離の統計を行う。一例として、データ処理から求められた各格子間距離の平均値を、撮像したマイクロメータの実際の格子間距離と対応付けて、撮像装置における１ピクセルあたりのスケールを求めることができる。
【０１０７】
このようにすることで、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、光学顕微鏡における設定上の各倍率の画像１ピクセルあたりの空間スケール［ｎｍ／ピクセル］と、１視野サイズの見積もりをマイクロメータなどの規則性パターンの撮像画像を用いて自動的に行うことができる。
【０１０８】
従来、光学顕微鏡の拡大視野スケールの見積は、サイズが既知の人工物を視野内に置いて特徴点間の距離を計測することで、たとえば、対物マイクロメータを用いる場合には、格子中心間の距離の計測より行われていた。このように特徴点の決定を目視で行った場合には、処理の煩雑性が大きく、また、作業者の癖などによって特徴点間距離が異なる場合が生じるなど、再現性の検証に困難を伴うことが多い。
【０１０９】
また、測定対象物である生体細胞内の１分子測定においては、測定対象物が蛍光性指標１つであるなど高倍率での観測が基本となるが、測定対象となる蛍光性指標を選別する際には、一旦低倍率での撮像画像を取得して高倍率で実際に測定する細胞の分子を特定する必要があるなど、測定画像に基づいて別の倍率での観測時の移動量を決定するといった幾つかの倍率を横断する計測が行われる場合がある。さらに、撮像画像と光学顕微鏡ステージの機械原点および現在位置との対応付けが必要とされる場合や、また、光学顕微鏡システムを用いてマルチウェルプレート等を用いたスクリーニングを行う際には、各観測チャンバーの中心等の情報を測定関係情報として統合的に扱う必要があるなど、測定された撮像画像の実際の倍率を検出してその後のデータ処理等に活用する機会が多くなる。
【０１１０】
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、上記説明した顕微鏡視野スケールの自動取得アルゴリズムを備えていることで、光学顕微鏡における各倍率の画像１ピクセルあたりの空間スケールと１視野サイズの見積もりが頻繁に行われる場合に、特に有用である。
【０１１１】
なお、１分子イメージングを行う上では、回折限界のために直径にして数ｎｍ程度の発光物でも、結像時は発光波長の半分程度の光の広がりを持つ。例えば、発光波長６００ｎｍの場合は、３００ｎｍ程度となる。このため、１分子測定を行うための測定装置の要件として、１ピクセルあたり数百ｎｍ程度のスケールの測定であれば１分子測定が可能であると判断できる。また、数十から数百ピクセルを使った輝点像の解析から回折限界による制限を超えて輝点の位置を求める事が可能である。
【０１１２】
５１２×５１２ピクセルの撮像装置を用いた場合、撮像視野内に１細胞（直径にして１０−２０μｍ）が収まる程度の撮像を考えると、１ピクセルあたりのスケールは数十ｎｍとなる。この場合には、実際に測定される１つの輝点は、数十ピクセルの像となる。一方、細胞の密度は比較的低い状態で測定する場合も多い。この場合、視野の中心に細胞の中心を合わせるステージ移動操作が必要になるが、高倍率で細胞の位置を探索することは効率が悪いため、たとえば、視野が２００×２００μｍ程度の低倍率画像から個々の細胞の中心を見積もり、ステージの移動量ベクトルを決めることが好ましい。そして、低倍率測定により測定対象となる細胞を決定した後、その細胞に対する１分子測定を行う高倍率測定に切り替えて動態測定を行うことになる。この場合には、低倍率測定を基に求めた移動ベクトルを使ってステージを移動させて、対物レンズ上に測定対象となる細胞を位置させた状態で、１分子測定を行うことになる。
【０１１３】
このように、測定対象となる細胞の位置を検出する場合など低倍率での観察を行う場合には、撮像された撮像画像を複数枚、一例として５×５の２５枚をタイル状に貼り合わせたより広視野角の画像を作成して、その広視野角の撮像画像に基づいて測定対象の細胞を検出するデータ処理を行うことがある。本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、マイクロメータなどの規則性パターンを実際に撮像した撮像画像を用いて撮像倍率の検出と、撮像画像内における規則性パターン位置のラベル化を行っているため、撮像画像データを貼り合わせてより広い観察対象範囲の画像データを作成する際にも、正しいタイリング処理が行われているか否かを、ラベル化された規則性パターンの配置位置を用いて検証することができる。
【０１１４】
以上のとおり本実施形態の光学顕微鏡では、低倍率撮像画像での観測と高倍率撮像画像での観測との切り替え頻繁に行われる場合であっても、極めて高い正確性を持った画像処理を行うことができる。
【０１１５】
［多波長同時測定時の相互補正］
図１に示したように、本実施形態にかかる光学顕微鏡では、撮像光学系と撮像装置を２系統備え、異なる発光色の蛍光性指標の発光を同時に観測することができる。このような２色の蛍光性指標を同時に観測することが可能な光学系を備えた光学顕微鏡では、拡大光像の波長選択を行うためのダイクロイックミラー等の測定波長分離手段、拡大レンズやミラーなどの拡大光学系を構成する光学部品の配置位置、さらに、撮像装置の取付けなどに極めて高い精度が要求される。また、実際の光学顕微鏡では、これらの光学部材それぞれについて、撮像画像を見ながら微調整が可能なようになっていて、異なる撮像画像系で得られた撮像画像相互のズレを解消することができる。
【０１１６】
しかし、本実施形態の光学顕微鏡システムで行われる生体細胞の１分子測定などの場合には、高い拡大倍率で撮像画像を取得することが必要となり、実際の光学顕微鏡における撮像光学系ごとの配置精度が必ずしも十分ではない場合があり、撮像画像に基づいた微調整ではその誤差の解消が困難な場合がある。
【０１１７】
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、上記説明した顕微鏡視野スケールの自動取得アルゴリズムを用いることで、異なる測定波長におけるマイクロメータの撮像画像において、同じ測定点に同じ番号でのラベル化を行うことができる。しかし、異なる測定波長により得られた撮像画像間の誤差が解消できない場合には、マイクロメータを撮像した画像から求めたラベル化後の各格子の推定中心位置のズレとなって現れてしまう。
【０１１８】
以下、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムが備える、２波長以上の多波長での同時測定を行う場合のラベル化された格子中心の推定位置の自動補正方法について、図８、図９を用いて説明する。
【０１１９】
図８および図９は、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、異なる撮像装置により撮像されたマイクロメータの撮像画像から求めた格子中心位置の補正の様子を示す図である。
【０１２０】
図８（ａ）は、異なる２つの撮像装置で撮像されたマイクロメータの撮像画像から、それぞれ推定して求めた格子中心位置を示している。
【０１２１】
図８（ａ）において、図中左側に位置するＣｈ１は、例えば図１において第１の撮像装置３１ａにより撮像された第１の測定波長における撮像光学系により得られたマイクロメータの格子状パターンから、各格子の中心位置を推定したデータに基づいて、適宜選択された３つの座標１（ｘ１，ｙ１）、２（ｘ２，ｙ２）、３（ｘ３，ｙ３）の位置を示したものである。また、図８（ａ）において、図中右側に位置するＣｈ２は、例えば図１において第２の撮像装置３１ｂにより撮像された第２の測定波長における撮像光学系により得られたマイクロメータの格子状パターンから、各格子の中心位置を推定したデータに基づいて、同様に選択された対応する３つの座標１（ｘ１，ｙ１）、２（ｘ２，ｙ２）、３（ｘ３，ｙ３）の位置を示したものである。
【０１２２】
Ｃｈ１、Ｃｈ２それぞれの撮像画像データから推定された格子中心点１、２、３は、例えば以下のような３次元行列ｐｋとして表すことができる。
【０１２３】
【数１】
2015227940.tif 000003
【０１２４】
図８（ｂ）は、Ｃｈ１として得られたマイクロメータの撮像画像データに基づいて得られた３つの格子中心位置ｐ１と、Ｃｈ２として得られたマイクロメータの撮像画像から求められた３つの格子中心位置ｐ２とをそのまま重ね合わせた状態を示している。図８（ｂ）において、Ｃｈ１では、Ｃｈ１で得られた格子中心位置ｐ１を実線で表し、Ｃｈ２で得られた格子中心位置ｐ２を点線で表している。一方、Ｃｈ２においては、Ｃｈ２で得られた格子中心位置ｐ２を実線で表し、これにＣｈ１で得られた格子中心位置ｐ１を点線で示して重ね合わせている。
【０１２５】
図８（ｂ）より、Ｃｈ１で得られた画像に基づいて推計した格子中心の位置が、Ｃｈ２で得られた画像に基づいて推計した格子中心の位置よりも左側にずれていることがわかる。また、Ｃｈ１で得られた格子中心位置とＣｈ２で得られた格子中心位置とを比較すると、それぞれの画像において３つの点１、２、３の間隔はほぼ同じとなっていて、Ｃｈ１とＣｈ２とから得られた格子中心位置間には、平行なズレと回転のズレのみが生じていて、各格子中心の推定位置間での線形の伸びによるズレは生じていないことがわかる。
【０１２６】
このような、２つの撮像装置において得られた格子間中心位置のズレを補正するために、まず図８（ｂ）に矢印Ｅ、Ｆで示すように、最も原点に近い格子中心位置である点１を重ね合わせるベクトルを選んで平行移動を行う。
【０１２７】
図９（ａ）は、Ｃｈ１として得られた第１の撮像装置による撮像画像から求められた格子中心位置と、Ｃｈ２として得られた第２の撮像装置による撮像画像から求められた格子中心位置の画像を、一つの格子中心（格子中心１）が一致するようにそれぞれベクトルＥ、Ｆを用いて平行移動した状態を示している。
【０１２８】
具体的には、Ｃｈ１において、Ｃｈ２のデータを格子中心１同士が重なるようなベクトルＥによって平行移動させ、Ｃｈ２において、Ｃｈ１のデータを格子中心１同士が重なるように逆向きのベクトルＦによって平行移動する。この平行移動は、平行移動行列Ｓｋｌに基づいて以下の行列Ｓを用いて表すことができる。
【０１２９】
【数２】
2015227940.tif 000004
【０１３０】
平行移動を完了した状態では、図９（ａ）に示すように、格子中心１の位置は一致しているが、２つめの格子中心２と３つめの格子中心３とがずれた状態となっている。次にこのズレを、格子中心１を回転軸とする回転移動で補正する。
【０１３１】
図９（ｂ）は、Ｃｈ１においてＣｈ２により得られた格子中心を矢印Ｇのように回転させ、Ｃｈ２においてＣｈ１により得られた格子中心を矢印Ｈのように回転させて、それぞれが一致した状態を示している。矢印Ｇと矢印Ｈとは互いに逆向きの同じ角度での回転を表している。回転補正における回転角の絶対値は内積より、また、回転方向は外積より求めることができる。
【０１３２】
Ｃｈ１におけるＣｈ２データの回転と、Ｃｈ２におけるＣｈ１により得られたデータの回転とは、いずれも回転行列Ｒｋｌとして表すことができ、補正後のそれぞれの座標は、以下の式による補正が行われたものとなる。
【０１３３】
【数３】
2015227940.tif 000005
【０１３４】
以上の変換に用いた行列を位置補正の行列として、それぞれのＣｈから得られた撮像画像から推定された格子中心点に適用することで、異なる画像撮像系により撮像されたマイクロメータの撮像画像を処理して得られた、全ての格子中心点をほぼ一致させることができ、測定波長が異なる２つの撮像装置により得られた撮像データの誤差を実質的に解消することができる。
【０１３５】
なお、上記説明では、説明の簡略化のために２つの撮像装置より得られたＣｈ１とＣｈ２との２つの画像が、平行移動と回転移動のみで補正できる状態について説明したが、例えば、３つの格子中心点同士の間隔が異なるなど倍率が変化するような線形のズレがある場合には、上記平行移動と回転移動による補正と同様に、アフィン変換によって補正することができる。また、像のズレがアフィン変換により補正しきれないような場合には、格子点を用いた補完方法などを使用して、異なる波長により観測された複数のデータ間相互のズレを補正することができる。
【０１３６】
このように、異なる撮像画造形により得られた複数の撮像画像間の相互の位置ずれを、撮像画像の倍率の検出時に用いた方法を応用して補正することで、撮像倍率の検出と相互間補正とを同じ撮像画像データを用いて同時に処理することができる。このような撮像画造形相互間の誤差補正を最初に行うことで、以後の画像処理において撮像画像系の差異を考慮することなく同様の処理で対応することができ、測定精度の向上とともに処理速度の迅速化を実現することができる。特に本実施形態の光学顕微鏡システムを用いたスクリーニング装置を構成して、多数の測定対象に対する統計的データ処理を行う場合には、撮像画像の段階で相互のズレを補正することができることによって、データ処理の共通化によるスクリーニング速度のさらなる迅速化が期待できる。
【０１３７】
［撮像画像のデータ処理］
上記の処理によって、撮像倍率を検出して撮像光学系間のデータ補正を行った後に、撮像画像データを用いて生体細胞内の１分子測定が行われる。
【０１３８】
画像処理を行う上では、撮像画面内に複数個存在する蛍光性指標を示す輝点を認識するために、まず二値化処理を行うことになる。本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像画像データから、それぞれのピクセルの時空間の偏差／平均であるＣＶ画像を求めた後その画像データを二値化処理している。より具体的には、撮像画像中の１つのピクセルについて、その周囲の例えば隣接する８つのピクセルでの輝度値全体の分散値と平均値を求め、分散値／平均値の値をそれぞれのピクセルのＣＶ値とし、このＣＶ値を用いて撮像画像のＣＶ画像を作成して、これを二値化処理の基準データとしている。なお、分散値と平均値を求める領域は、上記した隣接する８つのピクセルを用いる１ピクセル近傍の他に、２５ピクセルの値を用いる２ピクセル近傍とする場合や、格子状ではなく円形状近傍のデータを用いるなど、各種の方法を使用することかできる。
【０１３９】
図１０は、本実施形態の光学顕微鏡により撮像された試料の透過光像により得られた撮像画像について、二値化処理の差を説明する図である。
【０１４０】
図１０（ａ）が透過光像から得られたＣＶ画像（＝分散値／平均値画像）であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）で得たＣＶ画像に対し二値化処理を行ったものである。
【０１４１】
一方、図１０（ｃ）は、撮像装置により得られた透過光像そのままを示したものであり、図１０（ｄ）は、図１０（ｃ）の透過光像をそのまま用いて二値化処理を行ったものである。なお、二値化手段は、従来からの細胞測定に用いられている代表的な手法であるＯｔｓｕ法を用いて決定した閾値に基づいている。
【０１４２】
照射光による照明ムラがある場合や、位相差像のような特殊なコントラストを持つ場合は、図１０（ｄ）として示された画像のように、細胞と背景の切り分けがうまくいかず、測定対象である蛍光性指標の輝点のみを画像データとして分離できていない。
【０１４３】
これに対し、図１０（ｂ）として示される、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムで得られた細胞像は、二値化処理によって個々の細胞を正しく分離できていることがわかる。
【０１４４】
なお、測定対象物である細胞の種類によっては、その透明度が高く、焦点近傍での通常の透過光計測では細胞の形態を認識しにくい場合がある。これは画像処理においても同様であり、透明な細胞を撮像した画像データはラベル化しにくいという問題がある。
【０１４５】
そこで、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、透過光像による細胞像の撮像に際して、敢えて対物レンズの位置をシフトさせて焦点位置をずらした画像を複数種類撮像して、得られた複数枚の撮像画像データを重ね合わせて使用することで、細胞の形態を認識する手法を用いている。
【０１４６】
図１１は、対物レンズの焦点位置をずらして得られた複数枚の撮像画像を統合してデータ処理する状況を説明するための図である。
【０１４７】
図１１に示すように、上述したオートフォーカス判別手法により得られたフォーカス点での画像図１１（ｂ）に対し、手前側に焦点をシフトした画像図１１（ａ）と、奥側に焦点をシフトした画像図１１（ｃ）とを重ね合わせて処理することで、図１１（ｄ）として示した撮像画像を得ることができる。
【０１４８】
図１１（ｄ）の画像は、図１１（ａ）、図１１（ｂ）、図１１（ｃ）それぞれの画像と比べて、各細胞の境界領域が明確に現れていることがわかる。
【０１４９】
このように、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、撮像時における微妙な焦点ズレから細胞のコントラストが変化することを利用してその情報を重ね合わせて細胞像の画像処理を行うことで、測定対象試料である細胞の透明度が高い場合であっても、細胞の領域を良好に検出して、以降のデータ処理を行うことができる。
【０１５０】
なお、位相差照明等を用いてコントラストを上げた場合、人間の目では認識は容易になる。しかし、細胞の境界は特殊なコントラストを持つので、撮像画像を用いて二値化処理を行う手法においては、撮像画像から細胞だけを分解することに困難が伴う。本実施形態の光学顕微鏡システムでは、細胞のデフォーカス像と細胞のＣＶ画像とを用いて二値化処理を行うことで、撮像画像から測定対象となる細胞の切り分け処理を良好に行うことができる。
【０１５１】
［測定対象細胞の特定］
測定対象となる細胞の位置は、低倍率の透過光計測によって決定するため、透過光像を効率よく二値化するための画像解析技術が必要になる。
【０１５２】
以下、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける、透過光像から細胞を特定するための二値化処理について詳細に説明する。
【０１５３】
図１２は、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、得られた撮像画像を二値化処理する作業の流れを示すフローチャートである。また、図１３は、図１２に示したフローチャートによる二値化処理を行う課程での、データ処理された画像例を示すものである。
【０１５４】
図１２に示すように、本実施形態の光学顕微鏡システムでは、光学顕微鏡による透過光の拡大画像（図１３（ａ））から、各ピクセルでの輝度データに基づいてＣＶ画像（図１３（ｂ））を作成する（ステップＳ０１）。
【０１５５】
ＣＶ画像は、上記［撮像画像のデータ処理］欄で説明した方法と同じ方法で取得できる。
【０１５６】
得られたＣＶ画像について、Ｏｔｓｕ法（ステップＳ０２）、または、Ｇａｕｓｓ  ｆｉｔｔｉｎｇ法（ステップＳ０３）などの従来用いられている閾値決定方法によって、二値化処理の基準となる閾値を決定して、二値化処理を行う（ステップＳ０４）。
【０１５７】
図１３（ｂ）に示すＣＶ画像に対して、Ｏｔｓｕ法により得られた閾値で二値化処理（ステップＳ０４）が行われた画像を、図１３（ｃ）に示す。
【０１５８】
さらに、得られた二値化画像をより精度の高いものとするために、得られた画像データの状況に応じて適宜それぞれ必要な手法による処理が選択されて適用される。
【０１５９】
例えば、図１３（ｃ）のＯｔｓｕ法による二値化画像に対して、必要に応じて画像データ中に含まれる不所望なデータを微分フィルターによる判別除去するフィルタ処理（ステップＳ０５）を行い、さらに、例えば半径ｒの円を構造化要素として用いるクローズ処理などの、モフォロジー処理を行う（ステップＳ０６）。図１３（ｄ）は、図１３（ｃ）の画像に、ステップＳ０６のモフォロジー処理を行ったものである。
【０１６０】
また、明るいピクセルで囲まれた暗いピクセル部分（ホール：穴あき部分）の塗りつぶし処理（ステップＳ０７）を行った画像が、図１３（ｅ）である。
【０１６１】
また、撮像されたが細胞が、画像周囲の境界部分にある場合には、正確な観察対象とすることが困難となるおそれがあるため、これを除外する境界処理（ステップＳ０８）を行うと共に、観察対象の細胞の所定の大きさに満たない小さな光点を除外するため指定ピクセル以下のエリアを除去する処理（ステップＳ０９）を行って、図１３（ｆ）に示す、より正確な二値化画像を得る。
【０１６２】
なお、これらの二値化画像を得る一連の処理については、一例を示したものであり、これら全てを適用すべきであるというものではない。また、図１２を用いて説明した上記の各種画像処理以外の画像処理を適宜必要に応じて用いることも含め、細胞の透過光像から測定対象細胞を選別化する上で有用な各種のデータ処理を適宜選択して行うことが好ましい。
【０１６３】
次に、得られた二値化画像に対して、ウォーターシェッド（ｗａｔｅｒｓｈｅｄ）法などの領域分割のアルゴリズムを用いて、それぞれが細胞を示すと考えられる輝点領域を分割して、一つ一つの細胞を区別する（ステップＳ１０）。このようにして、細胞ごとに分割された画像を、図１３（ｇ）として示す。
【０１６４】
なお、繋がっている輝点領域を分割する手法としては、上記ウォーターシェッド（ｗａｔｅｒｓｈｅｄ）法以外の一般的な領域分割手法を用いることができる。
【０１６５】
最後に、それぞれの細胞ごとに分割された輝点情報を区分（ラベリング）する（ステップＳ１１）。それぞれの細胞について、異なる色を付与したカラリングによるラベル化を行ったものが、図１３（ｈ）である。
【０１６６】
図１４は、図１２に示したフローチャートによって、低倍率の透過光像から測定対象の細胞を選択した状態を示す図である。図１４では、測定対象となりうる細胞として認識されたものに、四角形の枠Ｉを付与してこれを認識可能としてする。
【０１６７】
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、上記のように低倍率の透過光像から、画像データ処理によって測定対象となる細胞の位置を特定することができる。そして、特定された細胞について、高倍率の全反射照明における蛍光観察を行うことで、生体細胞１分子の動態計測を行うことができる。
【０１６８】
なお、本実施形態の光学顕微鏡システムにおいては、撮像倍率の検出課程で、撮像画像内における規則性パターン位置のラベル化を行っているため、撮像画像データを貼り合わせてより広い観察対象範囲の画像データを作成するタイリング処理を正確に行うことができる。このため、例えば複数の高倍率画像をタイリングすることで低倍率画像を得、この低倍率画像を用いて測定対象となる細胞の位置を検出、特定することも可能である。
【０１６９】
［発現（データ取得細胞）の認識］
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、測定対象の細胞を選択して高倍率での全反射蛍光測定によって細胞１分子の動態測定を行う。このとき、測定対象の細胞は同じクローンであっても、タンパク質の発現率が異なる場合がある。このため、同じ条件で蛍光性指標を付与した場合でも、１分子観察が可能な場合と、そうでない場合とが生じうる。以下、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、測定対象の１分子細胞が、十分に発現して観察対象となるのか否かを判別する手法の一例について図１５および図１６を用いて説明する。
【０１７０】
図１５は、測定対象細胞が十分に発現している場合を、図１６は、測定対象細胞が十分に発現していない場合をそれぞれ示している。
【０１７１】
図１５および図１６において、それぞれの図中左側に示す（ａ）〜（ｄ）が、全反射蛍光観察による１分子の輝点の積算像であり、図中右側に示す（ｅ）〜（ｆ）が、落射照明における干渉反射像である。
【０１７２】
まず、それぞれの照明下において取得された細胞の拡大画像を図１５（ａ）、（ｅ）、図１６（ａ）、（ｅ）として示す。
【０１７３】
この画像を、上述した方法によってＣ／Ｖ画像としたものを、図１５（ｂ）、（ｆ）、図１６（ｂ）、（ｆ）と、さらにＯｔｓｕ法によって二値化した画像を、それぞれ図１５（ｃ）、（ｇ）、図１６（ｃ）、（ｇ）として示す。
【０１７４】
さらに、それぞれの二値化像について、図１２で示したモフォロジー処理（ステップＳ０６）、ホールの塗りつぶし（ステップＳ０７）を行ったものが、図１５（ｄ）、（ｈ）、図１６（ｄ）、（ｈ）である。なお、図１５（ａ）、図１６（ａ）は、全反射照明における細胞内の１分子細胞画像の時間平均ないしは積算画像に相当する。
【０１７５】
このとき、上記の画像処理の結果得られた画像同士の相関係数を求めると、図１５で示す細胞１分子の場合には０．５５８４という高い値が得られるのに対し、図１６で示す細胞１分子の場合には、相関係数が−０．０４２５と低い値となっている。
【０１７６】
このように、画像処理をした１分子細胞の画像について相関係数を算出することで、相関係数の大小から測定対象細胞が十分に発現しているか否かを判別することができる。
【０１７７】
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、１分子細胞の拡大光像を取得した段階で、その測定対象となる１分子細胞が十分に発現しているか否かを判断できるようにすることで、例えば、十分な発現が認められない観察対象については以降の動態測定を中止することで、もともと発現が不足しているために十分良好なデータを測定できない可能性がある観察対象物を長時間測定してしまうという時間のロスを事前に回避することも可能となる。特に、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムを、多数のウェル内の細胞について順次動態測定を行うスクリーニング装置に用いる場合には、測定開始の比較的早い段階で測定対象としている細胞が十分に発現しておらず不適切なものであることが判断できることにより、大きな時間的ロスが生じることを回避することができる。
【０１７８】
なお、測定対象の細胞１分子が十分に発現していると判断できるか否かの基準としては、例えば０．５以上の相関係数が得られた対象試料を引き続き測定可能な資料と判断するなど、得られる画像データに基づいて適宜設定することが好ましい。
【０１７９】
以上説明したように、本実施形態で説明した、本開示にかかる光学顕微鏡システムでは、測定対象物である生体細胞１分子の動態測定について、エバネッセント光を用いる全反射照明下における光学顕微鏡のオートフォーカス動作を行うことができ、また、拡大光像として得られた撮像画像の倍率の特定と撮像画像中の座標位置を特定することで、撮像画像の正確な倍率を検出可能とすると共に、複数の高倍率画像の貼り合わせから低倍率画像を生成して、これら高倍率画像と低倍率画像間に渡る画像データ処理を円滑、かつ、正確に行うことができるものである。
【０１８０】
また、多色照射光源下の場合に特に有効な、異なる発光色の蛍光指標を同時に観察可能とする複数の撮像光学系からの撮像画像を同様に処理するためのデータの相互補正を行い、さらに、撮像画像データから解析対象となりうる細胞を自動的に認識すると共に、測定対象である生体細胞１分子が十分に発現していて引き続き観察を続けることが好ましいもものか否かの選別を自動的に行うことができる。
【０１８１】
このように本開示にかかる光学顕微鏡システムでは、人手に頼らずに高いスループットで、生体細胞１分子の動態を測定結果として出力することができる。この結果、例えば、従来は場合によっては１−２日必要となっていた生体細胞１分子の動態観察を、数十分程度以下で行うことができるなど、測定時間の大幅な短縮を実現することができる。また従来は、測定データの取得を人手に頼らざるを得ないが故に、測定者に一定上の経験やスキルが必要となることや、測定者ごとの癖などによって取得されたデータの客観性が不十分となる場合も生じるなどしていた問題点を解決することができる。
【０１８２】
このような本開示にかかる光学顕微鏡は、大量のデータをより共通した条件下で取得して、得られたデータを統計的に処理するスクリーニング装置に適用することで、その特徴をさらに有効に活かすことができる。
【０１８３】
［スクリーニング装置］
以下、上記実施形態で説明した光学顕微鏡をスクリーニング装置として用いる場合に、光学顕微鏡システムに加えられる構成とデータ処理方法について、スクリーニング装置の実施形態として説明する。
【０１８４】
本実施形態で説明するスクリーニング装置では、上記説明した本実施形態の光学顕微鏡システムを用いて、例えば複数のウェルを備えたウェルプレートに対して、それぞれのウェル内の測定対象物である生体細胞の１分子動態測定を行うものである。
【０１８５】
上記説明したように、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、撮像画像データを用いて、生体細胞の１分子測定が可能である。このためスクリーニングを行う上では、光学顕微鏡システムに加えて、測定対象であるウェルプレートのそれぞれのウェルを、光学顕微鏡の対物レンズ上に自動的に載置し、測定を行う上でのシステムが必要となる。
【０１８６】
［ウェル中心位置の設定］
まず、本実施形態にかかるスクリーニング装置として、測定対象のウェルプレートにおける各ウェルの中心位置の設定を行う。なお、以下の説明において、スクリーン具装置全体の構成については、既に説明した図１を適宜参照する。
【０１８７】
図１７は、本実施形態にかかるスクリーニング装置における、ウェル中心位置の自動的な設定方法を説明する図面である。
【０１８８】
まず、図１７（ａ）に示すように、ウェル６０ａの中心に人工物の指標を配置する。具体的には、ウェルプレート６０の製造時に、それぞれのウェル６０ａの中心位置のガラス面に凹凸やマークを印刷したものを用意することができる。また、より簡易的には、予めペン等を用いてウェル６０ａの中心に点を描くなどの方法を用いることもできる。
【０１８９】
次に、光学顕微鏡システムで説明した、撮像画像から撮像倍率を検出した手法を応用して作成されたタイル画像である低倍率画像を用いて、光学顕微鏡で測定されたウェル６０ａ中央の人工物の指標をラベル化し、その中心点をウェルの中心点として制御部５０のメモリに登録する。例えば指標として、ペンを用いて直径が６００μｍ程度のマークを付けた場合には、図１７（ｂ）に示すように、５×５のタイル画像を用いることで、指標の一を正確に特定することができる。
【０１９０】
このように、タイル画像として得られた低倍率画像を用いて指標のラベル化を行う方法を採用することで、人工物の指標が、高倍率画像での一視野以上の大きさの場合でも対応することができる。なお、この、人工物の指標をラベル化する作業においても、タイル化して得られた低倍率画像を用いずに、対物レンズを交換して低倍率の画像を直接取得する方法を採用することも可能である。
【０１９１】
このようにして設定された各ウェル６０ａの中心位置の情報に基づいて、ウェルプレート６０を移送する（図１における矢印６３）。この場合において、図１７（ｃ）に示すように、例えば各ウェル６０ａの配置ピッチｐが７ｍｍの場合には、ウェルプレート６０の移送手段である二次元（ｘ−ｙ）、または、三次元（ｘ−ｙ−ｚ）ステージを、当該ピッチｐだけ移動させることで、それぞれのウェル６０ａのほぼ中心点近傍を光学顕微鏡２０の対物レンズ２６上部に配置することができる。
【０１９２】
次に、設定した中心周辺領域で測定対象となる細胞の探索をする。細胞の検索は、上記光学顕微鏡システムの実施形態で説明したように、透過光での撮像画像をタイル画像として用いることができる。
【０１９３】
一例として、９６ウェルプレートの場合各ウェルの直径は７ｍｍ程度であるため、低倍率での観察画像１視野が２００×２００μｍの光学顕微鏡２０の場合、１視野あたり直径２０μｍの細胞が１０％のコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）状態である場合でも、１つの視野内に１０個程度の細胞が存在すると考えることができる。このため、１視野が２００×２００μｍの場合には、５×５のタイル画像を作成して視野として１×１ｍｍの観測領域を設定することによって、数百の細胞を観測するが可能となる。例えば、膜上タンパク質の拡散を計測する場合は、１細胞上のタンパク質の動態を観測するために、数百から数千の膜タンパク質のサンプリングができる。このため、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムを用いたスクリーニング装置の場合では、上記の観察条件で数百の細胞が観察可能であるため、細胞１分子の動態測定を行う上で必要な数千から１万分子の観察を行うことができ、スクリーニングを行う統計解析のデータ量としては十分な量を取得することができる。
【０１９４】
なお、スクリーニング装置におけるウェルプレート６０の移送量の制御においては、隣り合うウェル６０ａを観察対象として順次対物レンズ２６上に配置するように制御する方法の他に、測定結果に基づいて、もしくは、予め設定された制御条件に基づいて、測定環境制御手段としての薬剤供給部６２で所定の薬剤が供給されたウェル６０ａの観察を行うなど、所定のウェル６０ａを適宜対物レンズ上に配置するような移送制御を行う場合がある。図１７（ｃ）は、一例としてウェル６０ａの配置位置として４行６列目のウェルＤ６から、８行１２列目のウェルＨ１２を対物レンズ上に移送する場合を示している。本実施形態にかかるスクリーニング装置の場合には、上記のように各ウェル６０ａの中心位置を予め観察設定しておくことによって、このように離れたウェル６０ａへの移動も正確に行うことができる。
【０１９５】
また、例えば測定対象として９６個のウェル６０ａを備えたウェルプレート等の多ウェルプレート６０を用いる計測の場合、ウェル６０ａの壁面周辺の底面は湾曲しているため、高倍率かつ高解像度での全反射蛍光観察による１分子動態測定には向かない。このため、本実施形態にかかるスクリーニング装置のように、多数あるウェル６０ａの中心位置を予めスクリーニング装置の制御部５０に自動的に登録して、ウェルプレートの移送時の移動距離の制御を正確に行うことで、各ウェル６０ａの中心近傍での計測を確実に行うことができる。なお、ウェル６０ａの中心位置の設定は、スクリーニング装置においてウェルプレート６０を交換する都度を行うこともでき、また、同じ種類のウェルプレートを連続して測定対象とする場合には、ウェルプレート６０に対する観察を所定回数行うごとに、ウェル６０ａの中心位置の設定を行ってもよい。いずれにしても、本実施形態のスクリーニング装置では、ウェル６０ａの中心位置の登録を自動的に行うことができるため、複数個のウェル６０ａを備えたウェルプレート６０を用いるスクリーニング測定を、容易、かつ、正確に、さらに短時間で行うことができる。
【０１９６】
［オイル自動供給］
本実施形態のスクリーニング装置では、大量の試料を網羅的に測定するためにマルチウェルプレートを使用する。また、上述したとおり、全反射照明での測定を行う際には、対物レンズと、試料が載置されたガラスプレートとしてのウェルの底面との間に光学的カップリング材としてのイマージョンオイルなどのオイル部材が充填された、油浸対物レンズが必要となる。
【０１９７】
このため、本実施形態のスクリーニング装置では、光学顕微鏡の対物レンズ上にオイルアダプタを設けて、複数のウェルを順次このアダプタの上に載置することによって、それぞれのウェル内に収容された測定対象試料としての生体細胞について、全反射照明における動態測定を可能としている。
【０１９８】
図１８は、本実施形態にかかるスクリーニング装置における、対物レンズ上に配置されたオイルアダプタの構成を説明する図である。図１８（ａ）がオイルアダプタの斜視図を、また、図１８（ｂ）が、オイルアダプタの対物レンズの光軸を通る面で切断した状態の断面図を示す。
【０１９９】
図１８（ａ）、図１８（ｂ）にその構成を示す、本実施形態にかかるスクリーニング装置に用いられるオイルアダプタ９０は、対物側を上方に向けて配置された対物レンズ２６の上面全体と側面の少なくとも上面側の端部を覆うレンズ被覆部９１と、対物レンズ２６の側面を覆うレンズ被覆部９１のさらに外周側に配置された周囲部９２とから構成され、対物レンズ２６の対物側を覆うカバー部材となっている。
【０２００】
また、オイルアダプタ９０のレンズ被覆部９１の中心には、対物レンズ２６のレンズ光軸と同軸となるように形成された開口部９４が形成されている。
【０２０１】
カバー部材９０のレンズ被覆部９１と対物レンズ２６との間には、所定の間隙部９３が形成されていて、この間隙部９３内に、オイル供給系としてのオイルケーブル９６から、図示しないペリスタルリティックポンプなどの所定量のオイル供給が可能なポンプを用いてオイルが供給される。オイルケーブル９６の先端は、カバー部材９０のレンズ被覆部９１を貫通して間隙部９３に到達しているため、図１８（ｂ）にドット部分として示すイマージョンオイル７２が、間隙部９３の全体に充填される。さらに、間隙部９３に充填されたイマージョンオイル７２は、オイルアダプタ９０の開口部９４から対物レンズ２６のレンズ前方側に染みだして、図１８（ｂ）では図示を省略しているウェル６０ａの底面プレートとの間に充填される。
【０２０２】
オイルアダプタ９０のレンズ被覆部９１の試料側には、レンズ被覆部９１の上部のイマージョンオイル７２を積極的に吸引する第１のオイル排出系としてのオイル吸引ケーブル９７が配置されている。なお、オイルの吸引にも、オイル供給と同様にペリスタティック方式のポンプなどの所定量のオイルを供給できる供給装置を、オイルアダプタ９０側をオイル供給元側として使用することができる。
【０２０３】
また、本実施形態のスクリーニング装置で用いられるオイルアダプタ９０では、レンズ被覆部９１とそのさらに外周側に配置された周囲部９２との間に溝部９５が形成されている。オイルアダプタ９０のレンズ被覆部９１における対物レンズ２６の上方側部分は、対物レンズ２６の上面の形状と同様に中央部が高く周辺部が低くなる湾曲面、もしくは傾斜面形状となっていて、オイル吸引ケーブル９７で吸引しきれなかった余剰分のオイルが、溝部９５に流れ込む構成となっている。溝部９５の底面には、溝部９５内のイマージョンオイル７２の量が一定量以上となってあふれ出すことを防止するための、第２のオイル排出系であるオイル排出ケーブル９８が配置されている。
【０２０４】
本実施形態のスクリーニング装置では、このように、オイルアダプタ９０と対物レンズ２６との間の間隙部９３にイマージョンオイルを供給すると共に、オイルアダプタ９０のレンズ被覆部９１上からイマージョンオイルを積極的に吸引することで、オイルアダプタ９０と対物レンズ２６との間の間隙部９３から、対物レンズ２６の前方に供給されるオイル量を一定に保つことができる。
【０２０５】
本実施形態のスクリーニング装置のオイルアダプタは、上記のようにオイルを供給する一系統のオイル供給系と、オイルを排出する二系統のオイル排出系を有し、そのうち一系統のオイル排出系であるオイル吸引ケーブルから積極的にオイルを排出する構成としているため、オイルアダプタ９０の開口部９４部分からガラスプレートに相当するウェル６０ａのウェルプレートとの間の部分に、常に略一定量のオイルを存在させることができる。
【０２０６】
このため、例えば光学顕微鏡システムにおける測定対象物である生体細胞の１分子計測に時間がかかった場合であっても、対物レンズ２６の油浸状態を維持することができる。また、本実施形態にかかるスクリーニング装置では、オイルアダプタ９０の間隙部９３に供給されたイマージョンオイル７２をレンズ被覆部９１の上面側から積極的に排出する構成としている。このため、複数のウェルを切り替えて対物レンズ上に配置して測定対象物の測定を行う際に、粘度の高いイマージョンオイルが測定が終了したウェルの底面に付着したままウェルプレートが移動してしまい、対物レンズ２６の上面部分のイマージョンオイル量が必要量よりも少なくなってしまうという不測の事態を回避することができる。
【０２０７】
このように、本実施形態にかかるスクリーニング装置に用いられる、油浸対物レンズを実現するためのオイル供給システムとしてのオイルアダプタでは、一つの測定が長時間にわたった場合や、また、数多くのウェル内の測定対象試料である生体細胞について連続して測定を行って統計的なスクリーニング処理を行う場合に対応可能なものである。このため、本実施形態のスクリーニング装置では、生体細胞１分子の自動的な動態測定が可能な本実施形態にかかる光学顕微鏡システムを用いた、長時間かつ多数の測定試料に対して統計的処理を行うスクリーニングを実現することができる。
【０２０８】
なお、本実施形態のスクリーニング装置では、オイルアダプタ９０の材料としては、耐オイル性の観点から真鍮性のものを使用しているが、ステンレスやアルミニウムなどのオイル耐性の高い、各種の金属材料または硬質樹脂材料等を用いることができる。
【０２０９】
また、オイル供給系およびオイル排出系としてのケーブル９６〜９８には、一例としてのシリコンチューブなど、オイル詰まりが生じ難い各種のチューブ部材を用いることができる。
【０２１０】
なお、本実施形態にかかるスクリーニング装置では、オイル供給系におけるオイル流量として、ポンプ流量の設定を一例として１ｍＬ／分、１０分間隔で１０秒間動作の繰り返しとすることができる。また、オイル排出系におけるオイル流量として、２ｍＬ／分の連続作動とすることができる。
【０２１１】
上記実施形態において、オイルアダプタ内にイマージョンオイルを供給するオイル供給ポンプとして、ペリスタルティク方式のようなチューブポンプを例示した。このようにチューブポンプを採用することで、オイルに異物が入りにくくなって光学顕微鏡のレンズ視野を確保する上で有利となる。ただし、本実施形態のスクリーニング装置において、オイルアダプタに油浸観測のためのオイルを供給するポンプとして特別な制約はなく、光学顕微鏡での測定の障害とならない清浄度を確保できる前提で、かつ、イマージョンオイルなどの粘度の高いオイルを所定の流量で供給または吸引することができる範囲において、羽根ポンプや軸ポンプなどの通常のオイルポンプを用いることもかのうである。
【０２１２】
以上、本実施形態のスクリーニング装置によって、複数のウェルを備えたウェルプレートを用いて、各ウェルに適宜異なる刺激を加えた異なる条件下の測定対象物細胞を配置し、その動態を自動的に順次測定することができる。また、対物レンズとウェル底面との間の油浸状態を維持することができるオイルアダプタを用いることで、自動的に測定対象のウエルを切り替えながら、長時間連続したスクリーニング測定を行うことができる。
【０２１３】
以上それぞれの実施形態について説明した、本開示にかかる光学顕微鏡システム、を用いることで、従来は自動測定が困難であった、自然免疫系シグナル伝達の可視化としてのリガンド、レセプタ、アダプタなどの１分子可視化や、細胞走性のメカニズム解明などの測定を自動的に行うことができる。
【０２１４】
また、上記生体細胞の１分子の動態測定が可能な光学顕微鏡システムを用いて、多数のウェルを備えたウェルプレートを用いたスクリーニングを自動的に行うことができ、これら自然免疫系シグナル伝達の可視化と細胞膜におけるシグナル伝達との解析を組み合わせることで、新薬の細胞１分子への働きかけ度合いについて、統計的なデータの取得と処理に基づく、広範囲のスクリーニングを行うことができ、新薬の特性検出を短時間で、かつ、正確に把握することができる。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本願で開示する光学顕微鏡システムは、測定対象物である生体細胞の拡大光像から、指標する蛍光性指標１つを選別してその動態を観測することができる。また、本開示にかかるスクリーニングシステムでは、本開示にかかる光学顕微鏡システムを用いて、複数のウェル内に収容された生体細胞の動態測定を比較することで、薬剤などの外部からの刺激に対する生体細胞１分子の反応を統計的に把握することができる。
【０２１６】
このため、従来は人手に頼らざるを得ず多大な時間と労力を必要としていた生体細胞の動態測定を簡易な操作で実現することができ、また、多量のサンプルの統計的処理を実現可能とする光学顕微鏡システム、および、スクリーニング装置として、生命科学分野をはじめとする各種分野での研究への貢献が期待できる。
【符号の説明】
【０２１７】
１    細胞（測定対象物）
１０    光学顕微鏡システム
２０    光学顕微鏡
２１（２１ａ、２１ｂ）    光源
３０（３０ａ、３０ｂ）    拡大光学系
３１（３１ａ、３１ｂ）    撮像装置
４３    励起光
４６    光像
５０    解析部
【図１】
2015227940.tif 000006
【図２】
2015227940.tif 000007
【図３】
2015227940.tif 000008
【図５】
2015227940.tif 000009
【図８】
2015227940.tif 000010
【図９】
2015227940.tif 000011
【図１２】
2015227940.tif 000012
【図１８】
2015227940.tif 000013
【図４】
2015227940.tif 000014
【図６】
2015227940.tif 000015
【図７】
2015227940.tif 000016
【図１０】
2015227940.tif 000017
【図１１】
2015227940.tif 000018
【図１３】
2015227940.tif 000019
【図１４】
2015227940.tif 000020
【図１５】
2015227940.tif 000021
【図１６】
2015227940.tif 000022
【図１７】
2015227940.tif 000023