(57)【要約】  脂肪生成活性についての、試験薬剤の迅速且つ堅固なスクリーニングのための方法が、提供される。このアッセイにおける試験の結果陽性とされた薬剤は、しわの低減、再建外科処置または美容外科処置、例えば火傷患者への組織の移植後の皮膚の外観の正常化、創傷治癒中および創傷治癒後の皮膚の外観の正常化等のための、良好な候補薬剤である。ある特定の実施形態では、前記方法は、脂肪生成能を有する哺乳動物の試験細胞を準備する工程であって、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、工程；前記細胞を、前記試験薬剤（複数の場合もある）と接触させる工程；および、前記試験細胞を、脂肪細胞の表現型についてスクリーニングする工程であって、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である、工程を伴う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングする方法であって、
脂肪生成能を有する哺乳動物の試験細胞を準備する工程であって、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、工程；
前記細胞を、前記試験薬剤と接触させる工程；および
前記試験細胞を、脂肪細胞の表現型についてスクリーニングする工程であって、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である、工程
を含む、方法。
【請求項２】
脂肪生成能を有する前記細胞が、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞／間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉からなる群から選択される細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂肪生成能を有する前記細胞が、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脂肪生成能を有する前記細胞が、内臓の前脂肪細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記前脂肪細胞が、褐色前脂肪細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記前脂肪細胞が、白色前脂肪細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記前脂肪細胞が、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
脂肪生成能を有する前記細胞が、皮下の前脂肪細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞、１２４６細胞、Ｏｂ１７７１細胞、ＴＡ１細胞および３０Ａ５細胞からなる群から選択される細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、肥満または痩身の傾向のある動物由来の細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記準備する工程が、前記細胞を、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも１つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させる工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪細胞分化混合物が、インスリン、ＩＧＦ−１、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤を含まない、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂肪細胞分化混合物が、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含まない、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂肪細胞分化混合物が、抗ウイルス薬を含まない、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記スクリーニングする工程が、脂肪細胞によって特異的に発現されるタンパク質を検出または定量する工程を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および、脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記スクリーニングする工程が、前記細胞における脂質の蓄積を検出または定量する工程を含み、脂質の蓄積が、前記細胞が、脂肪細胞の特徴を獲得したことを示す、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂質の蓄積を検出または定量する工程が、脂質の染色を検出または定量する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記スクリーニングする工程が、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、完全な脂肪細胞分化混合物と接触した同じ細胞種を含む陽性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陽性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記完全な脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、デキサメタゾンおよびインスリンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記スクリーニングする工程が、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陰性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有しないことの指標である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験細胞が、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
複数の試験薬剤が、アッセイされ、異なる試験薬剤が、異なる容器またはウェルに配列される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の試験薬剤が、単一のウェルまたは容器に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
試験薬剤を含有する各々のウェルまたは容器が、単一の試験薬剤を含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
１つまたは複数の容器またはウェルが、陽性対照細胞を含有する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
１つまたは複数の容器またはウェルが、陰性対照細胞を含有する、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アッセイが、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式または１５３６ウェル形式で実施される、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、２Ｄ細胞培養で培養される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、３Ｄ細胞培養で培養される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、集密状態まで増殖する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験細胞が、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含み、
前記スクリーニングする工程が、皮下の前脂肪細胞において、脂肪生成を誘導し、且つ、内臓の前脂肪細胞において、より少ない量の脂肪生成を誘導するか、または脂肪生成を誘導しない試験薬剤を、陽性と判定する工程を含む、
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
線維芽細胞を、前記試験薬剤と接触させる工程；および
前記線維芽細胞を、筋線維芽細胞の活性の変化についてスクリーニングする工程
をさらに含み、脂肪生成活性と筋線維芽細胞の活性の阻害とを示す試験薬剤が、セルライトの治療または予防のための候補薬剤である、
請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、ハイスループット形式で行われる、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
陽性であるとスクリーニングされた試験薬剤が、非ヒト哺乳動物における皮下注射によってさらに検証される、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングするための細胞培養システムであって、
脂肪生成能を有する哺乳動物細胞を含有する、１つまたは複数の細胞培養容器を含み、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、
細胞培養システム。
【請求項３９】
脂肪生成能を有する前記細胞が、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞／間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉からなる群から選択される細胞である、請求項３８に記載の細胞培養システム。
【請求項４０】
脂肪生成能を有する前記細胞が、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である、請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４１】
脂肪生成能を有する前記細胞が、内臓の前脂肪細胞である、請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４２】
前記前脂肪細胞が、褐色前脂肪細胞である、請求項４１に記載の細胞培養システム。
【請求項４３】
前記前脂肪細胞が、白色前脂肪細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記前脂肪細胞が、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である、請求項４１に記載の細胞培養システム。
【請求項４５】
脂肪生成能を有する前記細胞が、皮下の前脂肪細胞である、請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４６】
前記細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞、１２４６細胞、Ｏｂ１７７１細胞、ＴＡ１細胞および３０Ａ５細胞からなる群から選択される細胞である、請求項３８に記載の細胞培養システム。
【請求項４７】
前記細胞が、肥満または痩身の傾向のある動物由来の細胞である、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項４８】
前記細胞が、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも１つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物において培養される、請求項３８から４７のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項４９】
前記脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む、請求項４８に記載の細胞培養システム。
【請求項５０】
前記脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む、請求項４８に記載の細胞培養システム。
【請求項５１】
前記脂肪細胞分化混合物が、以下：インスリン、ＩＧＦ−１、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物のうち１つまたは複数を含まない、請求項４８から５０のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５２】
前記脂肪細胞分化混合物が、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含まない、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５３】
前記脂肪細胞分化混合物が、抗ウイルス薬を含まない、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５４】
前記細胞が、脂肪細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質の存在を示す指示物と接触する、請求項３８から５３のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５５】
前記指示物が、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および、脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子からなる群から選択されるタンパク質と結合する抗体を含む、請求項５４に記載の細胞培養システム。
【請求項５６】
前記細胞が、脂質の存在を示す指示物と接触する、請求項３８から５５のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５７】
前記細胞培養システムが、完全な脂肪細胞分化混合物と接触した同じ細胞種を含む陽性対照細胞をさらに含む、請求項３８から５６のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５８】
前記脂肪細胞分化混合物が、ＩＢＭＸ、デキサメタゾンおよびインスリンを含む、請求項５７に記載の細胞培養システム。
【請求項５９】
前記細胞培養システムが、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照細胞をさらに含む、請求項３８から５８のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６０】
前記試験細胞が、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される、請求項３８から５９のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６１】
異なる試験薬剤が、異なる容器またはウェルに存在する、請求項６０に記載の細胞培養システム。
【請求項６２】
複数の試験薬剤が、単一のウェルに存在する、請求項６０に記載の細胞培養システム。
【請求項６３】
試験薬剤を含有する各々のウェルが、単一の試験薬剤を含有する、請求項６０に記載の細胞培養システム。
【請求項６４】
１つまたは複数の容器またはウェルが、陽性対照細胞を含有する、請求項３８から６３のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６５】
１つまたは複数の容器またはウェルが、陰性対照細胞を含有する、請求項６０から６４のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６６】
前記培養システムを構成する細胞が、１２ウェル形式、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式または１５３６ウェル形式で存在する、請求項６０から６５のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６７】
前記細胞が、２Ｄ細胞培養で培養される、請求項３８から６６のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６８】
前記細胞が、３Ｄ細胞培養で培養される、請求項３８から６６のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６９】
前記細胞が、集密状態まで増殖する、請求項６７または６８に記載の細胞培養システム。
【請求項７０】
前記試験細胞が、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含む、請求項３８から６９のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項７１】
線維芽細胞をさらに含む、請求項３８から７０のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項７２】
前記システムが、ハイスループットスクリーニングのために構成される、請求項３８から７１のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年９月３日に出願された米国特許出願第６１／３８０，１２５号、および２０１０年９月１日に出願された米国特許出願第６１／３７９，２６５号に基づく優先権、およびこれらの出願の利益を主張し、前記出願の両方のその全体が、全ての目的のために、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
政府の支援に関する記載
本発明は、エネルギー省によって与えられた、協定（Agreement）番号ＬＢ０９００５０６０および契約番号ＤＥ−ＡＣ０２−０５ＣＨ１１２３１に基づき、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、薬理学的アッセイの分野に関する。特に、例えば皮下の前脂肪細胞における、脂肪生成を誘導する試薬の同定を容易化するアッセイが提供される。
【背景技術】
【０００４】
ＲＨＡＭＭ（ヒアルロナン媒介性の運動性に関する受容体）は、正常な組織においては発現が限定的であり、進行したがんにおいては強く発現される、ヒアルロナン結合タンパク質である。ＲＨＡＭＭの遺伝的欠失が、皮下脂肪の沈着の増大、および内臓脂肪の沈着の減少をもたらすことが観察された。ＲＨＡＭＭを遮断する薬剤を、皮下の脂肪生成を促進し、それによって、脂肪細胞（fat cells）の産生を選択的に誘導し、老化の過程で失われる脂肪細胞を置き換えるために、使用することができることが仮定された。このアプローチは、再建外科処置後に皮膚の外観を正常化するための、しわの低減のための、およびフェイスリフトのための非外科的アプローチを提供する手段として、使用できると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，２６４，３１４号公報
【特許文献２】米国特許第７，１７３，００５号公報
【特許文献３】米国特許第５，０１０，１７５号公報
【特許文献４】国際公開第９１／１９７３５号公報
【特許文献５】国際公開第９３／２０２４２号公報
【特許文献６】国際公開第９２／０００９１号公報
【特許文献７】米国特許第５，２８８，５１４号公報
【特許文献８】米国特許第５，５３９，０８３号公報
【特許文献９】ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号公報
【特許文献１０】米国特許第５，５９３，８５３号公報
【特許文献１１】米国特許第５，５６９，５８８号公報
【特許文献１２】米国特許第５，５４９，９７４号公報
【特許文献１３】米国特許第５，５２５，７３５号公報
【特許文献１４】米国特許第５，５１９，１３４号公報
【特許文献１５】米国特許第５，５０６，３３７号公報
【非特許文献】
【０００６】
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【非特許文献８】Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotethnol., 26: 101-106
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【発明の概要】
【０００７】
試験薬剤（例えば、推定ＲＨＡＭＭ阻害剤）を、適切な細胞の脂肪生成を促進する能力について、迅速且つ効率的にスクリーニングするための、および、これらの試験薬剤に対する、皮膚中の脂肪生成応答を予測するための方法が、本明細書において提供される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングするための方法が提供される。前記方法は、典型的には、脂肪生成能を有する哺乳動物の試験細胞を準備する工程であって、前記細胞は、脂肪細胞（adipocytes）への分化のために予備刺激されるが、分化していない、工程；前記細胞を、前記試験薬剤と接触させる工程；前記試験細胞を、脂肪細胞の表現型についてスクリーニングする工程であって、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有する（adipogenic）ことの指標である、工程を伴う。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞／間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および／または脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、内臓の前脂肪細胞（例えば、褐色前脂肪細胞、白色前脂肪細胞）である。ある特定の実施形態では、前記内臓の前脂肪細胞は、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、皮下の前脂肪細胞を含む。例示的な好適な前脂肪細胞は、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞、１２４６細胞、Ｏｂ１７７１細胞、ＴＡ１細胞および３０Ａ５細胞からなる群から選択される細胞、ならびに／または肥満もしくは痩身の傾向のある動物由来の細胞を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、前記準備する工程は、前記細胞を、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも１つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させる工程を含む。様々な実施形態において、前記脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む。典型的には、脂肪細胞予備刺激混合物は、以下：インスリン、ＩＧＦ−１、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物のうち１つまたは複数を含まない。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含まない。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、抗ウイルス薬を含まない。多数のスクリーニング方法のうちのいずれかが好適である。ある特定の実施形態では、前記スクリーニングする工程は、脂肪細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質（例えば、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子）を検出または定量する工程を含む。ある特定の実施形態では、前記スクリーニングする工程は、前記細胞における脂質の蓄積を検出または定量する工程を含み、脂質の蓄積が、���記細胞が、脂肪細胞の特徴を獲得したことを示す。脂質の蓄積は、当業者に既知の多数の方法のいずれかによって検出および／または定量することができ、例えば、脂質の蓄積を検出または定量する工程は、脂質の染色を検出または定量する工程を含む。様々な実施形態において、前記スクリーニングする工程は、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、完全な脂肪細胞分化混合物（脂肪生成能を有する細胞を、脂肪細胞へと分化させる混合物）と接触した同じ細胞種を含む陽性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陽性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である。ある特定の実施形態では、前記完全な脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、およびインスリンまたはＩＧＦ−１を含む。ある特定の実施形態では、前記スクリーニングする工程は、前記細胞に対する前記試験薬剤によって得られる結果を、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照と、比較する工程を含み、前記試験細胞と前記陰性対照との間に有意差が存在しないことが、前記試験薬剤が脂肪生成性を有しないことの指標である。ある特定の実施形態では、前記試験細胞は、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される。
【０００９】
このアッセイは、多数の形式をとり得る。例えば、ある特定の実施形態では、複数の試験薬剤が、アッセイされ、異なる試験薬剤が、異なる容器またはウェルに配列される。ある特定の実施形態では、複数の試験薬剤が、単一のウェルまたは容器に存在する。ある特定の実施形態では、試験薬剤を含有する各々のウェルまたは容器が、単一の試験薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の容器もしくはウェルが、陽性対照細胞を含有する、および／または、１つもしくは複数の容器もしくはウェルが、陰性対照細胞を含有する。ある特定の実施形態では、前記アッセイは、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式または１５３６ウェル形式で実施される。前記細胞培養は、２Ｄ細胞培養または３Ｄ細胞培養であり得る。典型的には、前記細胞は、集密状態まで増殖する。ある特定の実施形態では、前記試験細胞は、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含み、前記スクリーニングする工程が、皮下の前脂肪細胞において、脂肪生成を誘導し、且つ、内臓の前脂肪細胞において、より少ない量の脂肪生成を誘導するか、または脂肪生成を誘導しない試験薬剤を、陽性と判定する工程（scoring）を含む。ある特定の実施形態では、前記アッセイは、線維芽細胞を、前記試験薬剤（複数の場合もある）と接触させる工程；および、前記線維芽細胞を、筋線維芽細胞の活性の変化についてスクリーニングする工程をさらに伴い、脂肪生成活性と筋線維芽細胞の活性の阻害とを示す試験薬剤が、セルライトの治療または予防のための候補薬剤である。様々な実施形態において、前記方法は、ハイスループット形式で行われる。
【００１０】
また、試験薬剤を、脂肪生成活性についてスクリーニングするための細胞培養システムが提供される。前記細胞培養システムは、典型的には、脂肪生成能を有する哺乳動物細胞を含有する、１つまたは複数の細胞培養容器を含み、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞／間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、脂肪生成能を有する筋原性前駆体、血管細胞、胚性外胚葉、ならびに胚性中胚葉を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、皮膚由来の前脂肪細胞、脂肪吸引由来の前脂肪細胞、毛包、および／または脂肪肉腫由来の前脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、内臓の前脂肪細胞（例えば、褐色前脂肪細胞、白色前脂肪細胞）である。ある特定の実施形態では、前記内臓の前脂肪細胞は、大綱または腸間膜の前脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、脂肪生成能を有する前記細胞は、皮下の前脂肪細胞を含む。例示的な好適な前脂肪細胞は、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞、１２４６細胞、Ｏｂ１７７１細胞、ＴＡ１細胞および３０Ａ５細胞からなる群から選択される細胞、ならびに／または肥満もしくは痩身の傾向のある動物由来の細胞を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、前記細胞は、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも１つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触する／前記脂肪細胞分化混合物において培養される。様々な実施形態において 前記脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、レプチン、アディポネクチン、グルコース、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成植物、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ＩＧＦ−１およびインスリンからなる群から選択される１つまたは複数の因子を含む。典型的には、脂肪細胞予備刺激混合物は、以下：インスリン、ＩＧＦ−１、抗ウイルス薬、脂肪生成サイトカイン、脂肪生成因子および脂肪生成植物のうち１つまたは複数を含まない。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含まない。ある特定の実施形態では、前記脂肪細胞分化混合物は、抗ウイルス薬を含まない。ある特定の実施形態では、前記細胞は、脂肪細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質（例えば、アディポネクチン、脂質結合タンパク質、および、脂肪生成トランスクリプトームを促進する転写因子等）の存在を示す指示物と接触する（前記指示物と共に培養される）。ある特定の実施形態では、前記細胞は、脂質の存在を示す指示物と接触する（前記指示物において培養される）。ある特定の実施形態では、前記細胞培養システムは、完全な脂肪細胞分化混合物と接触した同じ細胞種を含む陽性対照細胞をさらに含む。ある特定の実施形態では、前記完全な脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ならびにインスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含む。ある特定の��施形態では、前記細胞培養システムは、分化混合物に曝露されなかった同じ細胞種を含む陰性対照細胞をさらに含む。様々な実施形態において、前記試験細胞は、多ウェル器具または多容器器具における複数の異なる容器またはウェルに配置される。ある特定の実施形態では、異なる試験薬剤は、異なる容器またはウェルに存在する。ある特定の実施形態では、複数の試験薬剤が、単一のウェルに存在し、または、試験薬剤を含有する各々のウェルが、単一の試験薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の容器もしくはウェルが、陽性対照細胞を含有する、および／または、１つもしくは複数の容器もしくはウェルが、陰性対照細胞を含有する。ある特定の実施形態では、前記細胞培養システムは、１２ウェル形式、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式または１５３６ウェル形式で配置される細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記細胞は、２Ｄ細胞培養で、または３Ｄ培養で培養される。様々な実施形態において、前記細胞は、集密状態まで増殖する。ある特定の実施形態では、前記細胞培養システムを構成する前記試験細胞は、皮下の前脂肪細胞、および内臓の前脂肪細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞培養システムは、任意に、線維芽細胞を含む。前記細胞培養システムは、ハイスループットスクリーニングに適合性を有する形式で、提供することができる。
【００１１】
定義
「脂肪生成活性」という用語は、脂肪生成、すなわち脂肪生成能を有する細胞の脂肪細胞への分化を誘導する、薬剤の能力を指す。
【００１２】
「試験薬剤」という用語は、本明細書において記載される１つまたは複数のアッセイにおいて（例えば、脂肪生成活性について）スクリーニングされる薬剤を指す。前記薬剤は、実際上、任意の化学的化合物であり得る。前記薬剤は、単一の単離化合物として存在していても良く、または、化学（例えば、コンビナトリアル）ライブラリの成員であっても良い。ある特定の実施形態では、前記「試験薬剤」は、抗体または核酸ではない。ある特定の好ましい実施形態では、前記試験薬剤は、小有機分子であろう。
【００１３】
「小有機分子」という用語は、医薬品に一般的に使用される有機分子と同等の大きさの分子を指す。この用語は、生物学的な高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を除外する。ある特定の実施形態では、好ましい小有機分子の大きさは、最大で約５０００Ｄａ、より好ましくは最大で２０００Ｄａ、最も好ましくは最大で約１０００Ｄａに及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ラットの間葉系幹細胞が、抗ＲＨＡＭＭ抗体によって、脂肪生成を起こすように誘導されることを示す図である。
【図２】ラット間葉系幹細胞に対する、ＲＨＡＭＭペプチド模倣物（１５−１）およびスクランブルペプチド（scrambled peptide）対照の脂肪生成効果を示す図である。
【図３】ＲＨＡＭＭの機能を遮断する試薬の注射によってもたらされる、皮下の脂肪体の形成を示す図である。
【図４】本明細書において記載される培養方法を使用する、ヒト細胞の脂肪生成を例示する図である。
【図５】試験ペプチドおよびその様々な断片の、増大した脂肪生成効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
適切な細胞の脂肪生成を促進する能力についての、１つまたは複数の試験薬剤の評価を容易化し、これらの試験薬剤（複数の場合もある）に対する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの（例えば、皮膚または他の組織における）脂肪生成応答を予測する方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、このアッセイは、皮膚において見出される細胞（例えば、皮下の脂肪細胞）においては、脂肪生成性を有するが、内臓において見出される細胞（例えば、内臓の前脂肪細胞）においては、脂肪生成性がより低いか、または脂肪生成性を全く有しない試験薬剤を同定する。そのような試験薬剤は、内臓脂肪の産生の増大によって引き起こされる悪影響を回避しながら、しわを低減するのに、再建外科処置または美容外科処置、例えば火傷患者への組織の移植後の皮膚の外観を正常化するのに、創傷治癒中および創傷治癒後の皮膚の外観を正常化するのに有用であることが期待される。美容の用途においては、定期的に注射しなければならない神経毒薬剤とは異なり、本明細書において記載されるアッセイを使用して同定される脂肪生成剤の局所的な注射は、筋肉の麻痺を伴わない、長く持続する皮膚のボリュームを出す効果をもたらすはずであり、このことは、これらを顔に注射した場合に、動きおよび表情の喪失が存在しないであろうことを意味する。
【００１６】
様々な実施形態において、前記スクリーニングの方法は、典型的には、脂肪生成能を有する哺乳動物の試験細胞を準備する工程であって、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない、工程を伴う。前記細胞は、対象の試験薬剤（複数の場合もある）と接触し、引き続き、脂肪細胞に特徴的な１つまたは複数の特質についてスクリーニングされる。そのような特質の存在が、前記試験薬剤（複数の場合もある）が、脂肪生成性を有することの指標である。脂肪細胞に特徴的な一つの例示的な特質は、脂質の蓄積であり、これは、容易に検出される。
【００１７】
このアッセイにおける陽性の結果が、前記試験薬剤（複数の場合もある）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、ラットの皮膚モデルにおいて、ヒト等において）同様の活性を有すると考えられることの良好な指標であることが実証された（例えば、実施例１を参照されたい）。したがって、脂肪生成活性についてのこの基本アッセイは、再建外科処置後の皮膚の外観の正常化に使用するための、創傷治癒に使用するための、しわの低減のための、フェイスリフト、または他の美容処置等のための、良好な候補薬剤を同定する。
【００１８】
試験細胞（例えば、皮下の前脂肪細胞）に対する陽性の脂肪生成活性についてのスクリーニングに加えて、本明細書において記載されるアッセイは、また、そのような活性が存在しないことについて（または、他の細胞に対する脂肪生成活性の低減について）スクリーニングするために使用することができる。したがって、例えば、試験薬剤を、皮膚において典型的に見出される細胞（例えば、皮下の前脂肪細胞）に対する、および内臓に（例えば、内臓の前脂肪細胞として）典型的に見出される細胞に対する脂肪生成活性についてスクリーニングすることができる。皮下由来の細胞、および内臓由来の細胞は、脂肪生成の表現型の１つまたは複数の特徴についてスクリーニングされる。皮膚において見出される細胞に対して陽性の活性、および内臓の細胞に対してより低い活性（または、活性がないこと）を示す試験薬剤が、特に望ましい。そのような試験薬剤は、内臓脂肪の産生の増大によって引き起こされる悪影響を回避しながら、しわを低減するのに、再建外科処置または美容外科処置後の皮膚の外観を正常化するのに、創傷治癒中および創傷治癒後の皮膚の外観を正常化するのに、有益な効果を有することが期待される。前記試験薬剤が、内臓脂肪の産生を抑制する場合、前記試験薬剤は、肥満と関連する悪影響（例えば、高血圧、心疾患、肥満症）を低減することが期待される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、前記試験薬剤を、また、線維芽細胞を筋線維芽細胞へと分化するように活性化することに対する、それらの効果についてスクリーニングすることができる。セルライトは、脂肪の沈着と、筋線維芽細胞によって引き起こされる細胞収縮とを特徴とする。
【００２０】
したがって、ある特定のアッセイにおいては、試験薬剤は、例えば皮下の前脂肪細胞の、脂肪生成を誘導する、それらの能力についてスクリーニングされる。前記薬剤は、また、線維芽細胞に対する活性についてスクリーニングされる。薬剤は、これが、脂肪生成能を有する前記試験細胞において脂肪生成を誘導するが、線維芽細胞に対して低い効果を有するもしくは効果を有しないか、または線維芽細胞の、筋線維芽細胞への分化を抑制する場合、陽性と判定される。
【００２１】
筋線維芽細胞の表現型への分化についてのアッセイは、当業者に周知であり、例えば、平滑筋アクチンの発現について細胞をアッセイすることを含む。そのようなアッセイは、平滑筋アクチンについての免疫組織化学アッセイ、平滑筋アクチンプロモーターと操作可能に連結されたレポーター遺伝子、収縮力アッセイ等を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
線維芽細胞における平滑筋アクチンについての、一つの例示的であるが限定的ではないアッセイは、非特許文献１に記載されている。前記アッセイは、微量培養された線維芽細胞におけるαＳＭＡについての、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に基づくものであった。産生された前記αＳＭＡは、標識され、アルカリホスファターゼを使用する間接酵素免疫アッセイに供され、光学密度が測定された。
【００２３】
様々な実施形態において、陰性対照細胞および／または陽性対照細胞が含まれる。陽性対照細胞は、前記試験薬剤と接触さられる細胞と同種の細胞を、脂肪生成能を有する細胞の、脂肪細胞への最終的な分化を誘導する試薬（例えば、ＩＢＭＸ、デキサメタゾンおよびインスリンの組合せ）に曝露することによって、準備される。
【００２４】
様々な実施形態において、陰性対照が、前記試験薬剤と接触する細胞と同種の細胞を、脂肪細胞への分化を誘導しない培養培地において培養して、準備される。
【００２５】
脂肪生成能を有する細胞。
本明細書において記載されるアッセイにおいて、試験薬剤（複数の場合もある）の脂肪生成活性を評価するために使用される細胞は、典型的には、脂肪生成能を有する細胞である。この文脈において、脂肪生成能は、適切な条件下で、脂肪細胞の表現型を実質的にまたは完全に獲得する（例えば、脂肪細胞へと実質的にまたは完全に分化する）、前記細胞の能力を指す。分化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こるものであっても良く、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こるものであっても良い（例えば、適切な試薬の投与によって）。
【００２６】
脂肪生成能を有する細胞は、幹細胞（胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）等）、線維芽細胞および前脂肪細胞を含むが、これらに限定されない。例示的な多能性線維芽細胞は、例えば、１０Ｔ１／２、Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３、１２４６、ＲＣＪ３．１およびＣＨＥＦ／１８線維芽細胞を含む。前脂肪細胞は、典型的には単能性であり（脂肪細胞系列への決定を受けており、拘束されている）、前脂肪細胞のまま留まる場合があり、または脂肪細胞への転換（conversion）／分化を起こす場合がある。例示的な前脂肪細胞は、３Ｔ３−Ｌ１細胞株、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞株、１２４６細胞株、Ｏｂ１７７１細胞株、ＴＡ１細胞株および３０Ａ５細胞株を含むが、これらに限定されない。他の好適な細胞種は、骨髄前駆体、および脂肪生成能を有する血管細胞を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
様々な実施形態において、前記細胞は、生物の特定の領域（例えば、皮膚、内臓等）に特徴的である、および／または、特定の脂肪細胞（例えば、褐色脂肪細胞または白色脂肪細胞）へと特徴的に分化する細胞である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、前記幹細胞、前記線維芽細胞および前記前脂肪細胞は、当業者に周知の方法によって、組織（例えば、皮膚由来のもの、脂肪吸引由来のもの、脂肪肉腫由来のもの、および脂肪由来の幹細胞／間質細胞）から、直接得ることができる。例えば、脂肪組織由来の前脂肪細胞の初代培養物を調製する方法は、非特許文献２、非特許文献３等に記載されている。幹細胞、ＩＳＰＣおよび線維芽細胞を入手および培養する同様の方法が、当業者に周知である。
【００２９】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、身体の体細胞を再プログラム化することによって得られる。ＩＰＳＣを作製する方法は、当業者に周知である（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５を参照されたい）。
【００３０】
加えて、幹細胞、線維芽細胞および前脂肪細胞は、多数の供給業者のうちのいずれかから商業的に入手することができる。例えば、大綱の前脂肪細胞、腸間膜の前脂肪細胞、および腎周囲の前脂肪細胞を含む内臓の前脂肪細胞は、Tebu-Bio（Ile de France, France）（www.tebu-bio.comを参照されたい）から入手可能である。皮下の前脂肪細胞、および前脂肪細胞の培地は、また、Tebu-BioおよびZenBio（Research Triangle Park, NC）から入手可能である。間葉系線維芽細胞および真皮線維芽細胞は、PromoCell Gmbh（Heidelberg, Germany）から市販されている。これらの細胞の供給源は、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。
【００３１】
様々な実施形態において、前記細胞（例えば、間葉系幹細胞、皮膚の前脂肪細胞、および脂肪生成能を有する他の細胞種）は、好ましくは継代回数が少なく、集密状態に達しない培養物として維持されており、継代する場合、好ましくは１：６の希釈率を超えない。
【００３２】
脂肪生成能を有する細胞の予備刺激。
本明細書において記載されるアッセイは、「試験」細胞を、脂肪生成のために予備刺激するが、前記細胞に、脂肪細胞への最終的な分化を行わせないことを伴う。これは、前記細胞を、脂肪細胞への最終的な分化を誘導するために必要とされる１つまたは複数の因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させること（例えば、前記細胞を、前記脂肪細胞分化混合物において培養すること）によって、達成することができる。
【００３３】
前記試験細胞とは対照的に、陽性対照細胞は、完全な脂肪細胞分化混合物と接触し（例えば、前記完全な脂肪細胞分化混合物においてインキュベートされ）、それによって、脂肪細胞への分化が誘導される。
【００３４】
典型的には、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、またはそれ以上、前記試験細胞は、予備刺激混合物に曝露され、陽性対照を利用する場合、陽性対照は、前記完全な分化混合物に曝露される。一般的に、前記試験薬剤（複数の場合もある）が、脂肪生成活性を有する場合、前記曝露の期間は、前記細胞の分化を誘導するのに十分となるように選択される。
【００３５】
脂肪生成混合物／カクテル。
集密状態にある前脂肪細胞を、所定の脂肪細胞分化混合物（脂肪生成カクテル）によって、同調的に分化させることができる。様々な実施形態において、最大の分化が、インスリン、グルココルチコイド（グルココルチコイドアゴニスト）、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる薬剤、および適切な培養培地（例えば、ウシ胎児血清を含む培地）の組合せを用いる処理によって、達成される。インスリンは、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）受容体を介して作用することが知られており、ＩＧＦ−１を、前記脂肪生成カクテルにおいて、インスリンの代わりに用いることができる（非特許文献１６）。
【００３６】
合成グルココルチコイドアゴニストであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）は、伝統的に、グルココルチコイド受容体経路を刺激するために使用される。好適であると考えられている他のグルココルチコイドアゴニストは、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、酢酸デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、デキサメタゾンジエチルアミノアセテート、デキサメタゾンイソニコチネート、デキサメタゾンｔｅｒｔ−ブチルアセテート、デキサメタゾンテトラヒドロフタレート等を含むが、これらに限定されない。他の例示的なグルココルチコイド受容体アゴニストは、特許文献１に記載されている。これらのグルココルチコイドアゴニストは、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。本明細書において提示される教示を使用すると、当業者は、他の好適なグルココルチコイドアゴニストを認識するであろう。
【００３７】
メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）および３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ経路を刺激して、細胞内ＣＡＭＰを増大させるために伝統的に使用される、ｃＡＭＰ−ホスホジエステラーゼ阻害剤である。細胞内ＣＡＭＰを増大させることが知られている他の薬剤（例えば、特許文献２）を、また、使用することができる。一つの例示的な試薬は、インスリンを加えた血清置換培地（例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（Invitrogenのカタログ番号１０８２８−０２８））；ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳおよびオレエート（非特許文献１７）等を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、脂肪生成因子は、また、インドメタシン、ＰＰＡＲＧγアゴニスト、ビオチン、パントテネート（panthothenate）、トランスフェリン、コルチゾール、トリヨードチロニン（Ｔ３）、トログリタゾンおよび／またはロシグリタゾンの任意の組合せを含んでいても良い。ある特定の実施形態では、ＲＨＡＭＭアンタゴニストは、これらの試薬の脂肪生成効果を補償することができるか、またはこれを増大させることができる。
【００３９】
最も標準的な脂肪細胞分化混合物は、ＩＢＭＸ、デキサメタゾンおよびインスリンを含む。ＩＢＭＸは、細胞内ｃＡＭＰを増大させ、デキサメタゾンは、グルココルチコイド受容体と結合し、インスリンは、インスリン受容体および／またはＩＧＦ−１受容体と結合する。これらの３つの経路は、最終的に、分泌因子、インスリン受容体、および細胞内の脂質滴を形成する脂肪酸の合成および結合に関与するタンパク質をコードする、脂肪細胞に特異的な遺伝子を活性化する、ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰファミリー遺伝子の活性化に至る。
【００４０】
予備刺激混合物／カクテル。
脂肪生成能を有する細胞は、前記細胞を、脂肪細胞への最終的な分化に必要とされる１つまたは複数の因子を欠く、脂肪細胞分化混合物と接触させること（例えば、前記細胞を、前記脂肪細胞分化混合物において培養すること）によって、予備刺激するが、脂肪細胞への分化を行わせないことができる。一つの例示的な実施形態では、予備刺激混合物／カクテルは、インスリンを含有しない（および、好ましくは、インスリン受容体および／またはＩＧＦ−１受容体と結合する薬剤を含有しない）。したがって、一つの例示的な実施形態では、前記予備刺激カクテルは、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、前記予備刺激混合物は、グルココルチコイドアゴニスト（例えば、デキサメタゾン）、または細胞内ＣＡＭＰを刺激する薬剤（複数の場合もある）を除外していても良い。
【００４２】
これらの予備刺激カクテルは、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。本明細書において提示される教示を使用すると、細胞を、脂肪細胞への分化のために予備刺激するが、最終的な分化は行わせない他のカクテルが、当業者には利用可能であろう。
【００４３】
「分化した」脂肪細胞の１つまたは複数の特徴についての、細胞に対するスクリーニング。
前記細胞を、上で記載されるような１つまたは複数の試験薬剤と接触させ、前記細胞を、脂肪細胞への分化を行わせるのに十分な時間培養した後、前記細胞は、脂肪細胞の表現型および／または遺伝子型についてスクリーニングされ、ここで、脂肪細胞に特徴的な特質の存在が、前記試験薬剤が脂肪生成性を有することの指標である。
【００４４】
脂質細胞および脂肪細胞としても知られる、分化した脂肪細胞は、脂肪としてのエネルギーの貯蔵に専門化した、脂肪組織を主に構成する細胞である。２種類の脂肪組織、すなわち白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）が存在し、これらは、また、それぞれ白色脂肪および褐色脂肪として知られ、２種類の脂肪細胞を含む。
【００４５】
分化した白色脂肪細胞または単胞（monovacuolar）細胞は、細胞質の層によって取り囲まれた大きな脂質滴を含有する。核は、平坦であり、周辺部に位置する。貯蔵される脂肪は、半液体状態であり、トリグリセリドおよびコレステリルエステルから主に構成される。白色脂肪細胞は、レジスチン、アディポネクチンおよびレプチンを分泌する。したがって、ある特定の実施形態では、白色脂肪細胞分化を示す、検出することができる特徴は、脂質滴の蓄積、細胞核の周辺部の配置、レジスチン分泌、アディポネクチン分泌、レプチン分泌、および／または、分化した脂肪細胞に特徴的な様々な他の遺伝子の上方調節もしくは下方調節を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
褐色脂肪細胞または複胞（plurivacuolar）細胞は、多角形の形状を有する。白色脂肪細胞とは異なり、これらの細胞は、相当な大きさの細胞質を有し、脂質滴が全体にわたって分散している。核は円形であり、偏在しているが、細胞の周辺部には存在しない。褐色の色は、大量のミトコンドリアに由来する。脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）のタンパク質発現は、また、褐色脂肪細胞の、高度に特異的なマーカーである。したがって、ある特定の実施形態では、褐色脂肪細胞分化を示す、検出することができる特徴は、脂質滴の蓄積、褐色細胞の色（ミトコンドリア蓄積）、ＵＣＰ−１の上方調節、および／または、分化した脂肪細胞に特徴的な様々な他の遺伝子の上方調節もしくは下方調節を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
より一般的には、脂質滴の形成および代謝の工程は、脂質滴と会合するタンパク質によって調節または影響されることが認識される。ＰＡＴタンパク質（ペリリピン、脂肪分化関連タンパク質（ＡＤＦＰ／アディポフィリン／ペリリピン２）およびＴＩＰ４７である、ファミリーの初期の（founding）成員にちなんで命名された）は、共通して、脂質滴と会合し、それらの形成および成熟を調整する。ＰＡＴタンパク質は、組織特異的に発現され、ペリリピン発現は、脂肪細胞およびステロイド産生細胞に限定されている。さらに、これらのタンパク質のいずれかを、脂肪生成のマーカーとして使用することができる。
【００４８】
脂肪細胞に特徴的な遺伝子の調節、発現の特徴的なパターン、または特定のタンパク質を検出する方法は、当業者に周知である。したがって、例えば、非特許文献１８は、ＵＣＰ−１タンパク質の組織化学的検出を記載するものであった。
【００４９】
同様に、様々な免疫アッセイのいずれかを、レジスチン、アディポネクチン、レプチン、または脂肪細胞分化に特徴的な他のタンパク質マーカーを検出／定量するために使用することができる。多数の方法が、また、遺伝子発現の変化の検出について知られている。そのような方法は、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムＱＰＣＲ等を含む。
【００５０】
しかしながら、最も典型的には、検出および／または定量するための最も容易な特徴は、脂質および／または脂質滴の形成である。脂肪細胞を、親油性の色素（例えば、オイルレッドＯ）で染色した場合、染色の程度は、脂質の量に、および、示唆的に細胞の分化の程度に比例する。したがって、ある特定の実施形態では、前記細胞を、親油性色素（例えば、オイルレッドＯ）を用いて染色することができ、色素の量は、分光光度法（例えば、５１０ｎｍでの吸光度）によって検出される。親油性染料オイルレッドＯは、トリグリセリドおよびコレステリルオレエートを特異的に染色するが、他の脂質を染色せず、脂肪細胞分化の良好な尺度を提供する（例えば、非特許文献１９を参照されたい）。他の好適なマーカーは、ＦＩＴＣもしくはＲＩＴＣと共に、蛍光顕微鏡法を用いて、または蛍光光度計を使用して検出することができる親油性色素ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）１２  ｃａｒｂｏｎ  ｒｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ（Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies；カタログ番号Ｄ３８２２））を含むが、これらに限定されない。トリグリセリドを測定するための別の一般的な方法は、比色定量用ＴＡＧ検出試薬（Thermo Electron Corp.（Melbourne Australia）、カタログ番号２７８０−４００Ｈ）である。
【００５１】
細胞における脂質の蓄積の迅速な定量のための試薬およびシステムは、市販されていることが注記される。例えば、Vala Sciences, Inc.は、脂質滴を染色および検出するための試薬を含有する、商業的な脂質滴分析キットを提供する。Vala Sciences Inc.は、また、脂質滴の検出および定量の自動化のための、ソフトウェア（ＣＹＴＥＳＥＥＲ（登録商標）画像解析ソフトウェア）を提供する。Vala ScienceのＣＹＴＥＳＥＥＲ（登録商標）画像解析プラットフォームプログラムにおける脂質滴アルゴリズムは、視野における各々の細胞と会合した脂質滴を定量するために、核および脂質の画像を使用する。
【００５２】
このシステムの使用の例示的な説明は、例えば、非特許文献２０に見出すことができ、これは、分化する脂肪細胞における脂質滴ならびにペリリピンおよび他のマーカーの検出および定量を記載している。
【００５３】
前述の検出方法は、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。本明細書において提示される教示を使用すると、脂肪細胞分化を検出する他の方法は、当業者に利用可能であろう。
【００５４】
試験薬剤
前記薬剤は、実際上、任意の化学的化合物であり得る。前記薬剤は、単一の単離化合物として存在していも良く、または、化学（例えば、コンビナトリアル）ライブラリの成員であっても良い。例示的な試験薬剤は、タンパク質、ペプチド模倣物、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、レクチン、抗体、小有機分子等を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
ある特定の実施形態では、前記試験薬剤は、脂肪生成活性を有すると考えられているか、またはそのように推定されている化合物を含む。そのような化合物は、例えば、ＣＡＭＰの上方調節因子、グルココルチコイド類似体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）結合因子等を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
ある特定の実施形態では、前記試験薬剤は、ＲＨＡＭＭの発現および／または活性の阻害剤であると考えられている化合物を含む。そのような薬剤は、抗ＲＨＡＭＭ抗体、ＲＨＡＭＭ結合レクチン、ＲＨＡＭＭ  ｓｉＲＮＡ、ＲＨＡＭＭイントラボディ（intrabodies）、ＲＨＡＭＭリボザイム、ＲＨＡＭＭ合成ペプチド、ＲＨＡＭＭ模倣ペプチド、ヒアルロナン模倣ペプチド等を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
ある特定の実施形態では、前記試験薬剤は、経験的に（a priori）知られているか、または推定されている活性を有しない分子を含む。
【００５８】
アッセイ形式。
本明細書において記載されるアッセイは、多数の形式のいずれかで行うことができる。ある特定の実施形態では、前記細胞は、２次元（２Ｄ）細胞培養として、多ウェルプレート（例えば、１２ウェル形式、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式、１５３６ウェル形式等）で培養される。２次元培養システムは、（３Ｄシステムより）単純であり、手動による介入をあまり必要とせず、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムに十分に適する。
【００５９】
様々な実施形態において、１つまたは複数の異なる試験薬剤が、同時にアッセイされる。様々な実施形態において、単一の試験薬剤が、各々のウェルに配列される。任意に、さらなるウェルが、陽性対照（脂肪細胞分化混合物で処理された細胞）として機能し得る。任意に、さらなるウェルが、陰性対照（例えば、分化混合物と接触しない細胞）として機能し得る。加えて、複数の細胞種（例えば、内臓の脂肪細胞、皮下の脂肪細胞等）を、異なるウェルにおいて、異なる細胞種と同時にスクリーニングすることができる。
【００６０】
加えて、異なるウェルが、異なるアッセイを提供しても良い。したがって、例えば、ある特定のウェルを、脂質の蓄積をアッセイするために使用することができ、それと同時に、他のウェルが、ペリリピンまたはアクチンの産生をアッセイするために使用される。また、単一のウェルから複数の読み取り値を得ることが可能である。したがって、例えば異なる指示試薬を使用して、単一のウェルにおいて、脂質の蓄積、ペリリピンの共局在化、アクチンの発現、および他のパラメータをアッセイすることが可能である。
【００６１】
多数の試験薬剤のスクリーニングを容易化するために、ある特定の実施形態では、多重アッセイが行われる。そのようなアッセイにおいては、複数の試験薬剤が、各々のウェルに配列される。陽性の結果を示すウェルにおいて使用された前記薬剤（複数の場合もある）が、前記複数の試験薬剤のうちのどれが所望の効果をもたらしたのかを決定するために、個別にまたはサブコンビネーションとして、引き続き試験される。
【００６２】
具体的なアッセイ形式を、例えば、アッセイ対象の細胞種、所望の読み取り値、および試験薬剤の数によって、決定することができる。
【００６３】
これらのアッセイ形式は、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。本明細書において提示される教示を使用すると、多数のアッセイ形式が、当業者に利用可能であろう。
【００６４】
判定（Scoring）。
様々な実施形態において、本明細書において記載されるアッセイは、前記試験薬剤（複数の場合もある）への曝露が、前記試験細胞において、脂肪細胞の表現型の１つまたは複数の特徴をもたらす場合、陽性の結果を示すと判断される。ある特定の実施形態では、前記アッセイは、前記試験薬剤（複数の場合もある）への曝露が、皮膚に特徴的な試験細胞（例えば、皮下の前脂肪細胞）において、脂肪細胞の表現型の１つまたは複数の特徴（例えば、脂質の蓄積）をもたらし、内臓の組織由来の試験細胞（例えば、内臓の前脂肪細胞）において、より低い効果をもたらすか、または効果をもたらさない場合、陽性の結果を示すと判断される。
【００６５】
ある特定の実施形態では、これは、陽性対照（例えば、完全な脂肪生成混合物／カクテルに曝露される細胞）および／または陰性対照（例えば、脂肪生成混合物／カクテルまたは予備刺激混合物／カクテルに曝露されない細胞）について測定されるまたは知られるレベルとの関係で、決定される。一つの実施形態では、前記アッセイは、試料と陰性「対照」との間の差異が、統計的に有意である（例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％もしくは９９％以上の信頼水準で）場合、および／または試料と陽性対照との間の差異が、統計的に有意でない場合、陽性の結果（例えば、試験薬剤の脂肪生成活性）を示すと判断される。
【００６６】
ハイスループットスクリーニング。
本明細書において記載されるアッセイは、「ハイスループット」様式に適している。従来的には、有用な特性（例えば、皮下の前脂肪細胞に対する脂肪生成活性）を有する新たな化学的実体は、望ましい特性または活性（例えば、ＲＨＡＭＭの発現および／または活性の阻害）を有する化学的化合物（「リード化合物」と称される）を同定すること、前記リード化合物の変異体を創出すること、ならびにこれらの変異体化合物の特性および活性を評価することによって、作製される。しかしながら、現在の傾向は、薬剤発見の全ての局面についてのタイムスケールを短縮することである。多数のものを迅速且つ効率的に試験することができるため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法は、従来のリード化合物同定方法に取って代わりつつある。
【００６７】
一つの実施形態では、ハイスループットスクリーニング方法は、所望の（脂肪生成の）活性を潜在的に有する多数の化合物（候補化合物）を含有する、ライブラリを準備する工程を伴う。そのような「コンビナトリアル化学ライブラリ」が、所望の特徴的な活性を示すこれらのライブラリの成員（特定の化学物質の種または小分類）を同定するために、本明細書において記載されるように、１つまたは複数のアッセイにおいて、引き続きスクリーニングされる。そのようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」の役割を果たすことができ、またはそれ自体を、有望なもしくは実際の治療薬として使用することができる。
【００６８】
コンビナトリアル化学ライブラリ
ある特定の実施形態では、コンビナトリアル化学ライブラリを、新たなリード化学的化合物の作製において支援するために使用することができる。コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬等の多数の化学的な「構成要素」を組み合わせることによる、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって作製された、多様な化学的化合物の収集物である。例えば、線形（linear）コンビナトリアル化学ライブラリ、例えばポリペプチドライブラリは、所与の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に対して、考え得るあらゆる方法で、アミノ酸と呼ばれる一組の化学的構成要素を組み合わせることによって、形成される。何百万種類の化学的化合物を、化学的構成要素の、そのようなコンビナトリアル混合を介して、合成することができる。例えば、一人の評論家が、１００種類の互換的な化学的構成要素の体系的なコンビナトリアル混合が、１億種類の四量体化合物または１００億種類の五量体化合物の理論的合成をもたらすことを観察した（非特許文献２１）。
【００６９】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリは、ペプチドライブラリ（例えば、特許文献３、非特許文献２２、非特許文献２３を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。ペプチド合成は、本明細書において記載されるアッセイによる使用のために想定および意図される、唯一のアプローチでは決してない。化学的多様性ライブラリを作製するための他の化学的手段を、また、使用することができる。そのような化学的手段は、以下のものを含むが、これらに限定されない：ペプトイド（ＰＣＴの出願公開公報（特許文献４））、コードされるペプチド（ＰＣＴの出願公開公報（特許文献５））、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴの出願公開公報（特許文献６））、ベンゾジアゼピン（特許文献７）、ディバーソマー（diversomers）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（非特許文献２４）、ビニログ性（vinylogous）ポリペプチド（非特許文献２５）、β−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣物（非特許文献２６）、小化合物ライブラリの類似の有機合成（非特許文献２７）、オリゴカルバメート（非特許文献２８）、および／またはペプチジルホスホネート（非特許文献２９）。以下を参照されたい：包括的に非特許文献３０、核酸ライブラリ（例えば、Strategene, Corp.を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、特許文献８を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、非特許文献３１および特許文献９を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、非特許文献３２および特許文献１０を参照されたい）、ＰＰＡＲ阻害剤ライブラリ（例えば、Eanamine, Ltd.を参照されたい）、および小有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピンについては非特許文献３３、イソプレノイドについては特許文献１１、チアゾリジノンおよびメタチアザノンについては特許文献１２、ピロリジンについては特許文献１３および特許文献１４、モルホリノ化合物については特許文献１５、ベンゾジアゼピンについては特許文献７等を参照されたい）。
【００７０】
コンビナトリアルライブラリを調製するための器具は、市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech, Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin, Woburn, MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems, Foster City, CA）、９０５０Ｐｌｕｓ（Millipore, Bedford, MA）を参照されたい）。
【００７１】
多数の周知のロボットシステムが、また、溶液相化学のために開発されている。これらのシステムは、Takeda Chemical Industries, LTD.（Osaka, Japan）によって開発された自動化合成装置等の、自動化ワークステーション、および化学者が行う手技による合成操作を模倣する、ロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ（Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.）、Ｏｒｃａ（Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.））を含む。上記の器具のうちのいずれかが、本明細書において記載される方法による使用に好適である。本明細書において論じられるように作動することができるような、これらの器具に対する改良（存在する場合）の性質および実行は、当業者には明らかであろう。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリそれ自体が、市販されている（例えば、ComGenex（Princeton, N.J.）、Asinex（Moscow, Ru）、Tripos, Inc.（St. Louis, MO）、ChemStar, Ltd（Moscow, RU）、3D Pharmaceuticals（Exton, PA）、Martek Biosciences（Columbia, MD）等を参照されたい）。
【００７２】
化学ライブラリのハイスループットアッセイ。
本明細書において記載される脂肪生成活性についてのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。ある特定の好ましいアッセイは、前記試験薬剤（複数の場合もある）との接触によってもたらされる、脂質の蓄積の検出によって、および／または特徴的なタンパク質マーカーの上方調節によって、脂肪細胞の分化の増大を検出する。
【００７３】
ハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）は、候補医薬品またはゲノム（例えば、ＲＮＡｉもしくはｃＤＮＡ）ライブラリまたは抗体ライブラリまたはペプチドライブラリ等を、マイクロタイタープレート上で培養した細胞に対して行うアッセイを介して、可能性のある有益な効果について試験する技術である（例えば、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７を参照されたい）。前記細胞を、引き続き、構造またはタンパク質を可視化するために、染色または標識することができ、ロボットデジタル顕微鏡ワークステーションによって、撮影することができる。
【００７４】
画像は、特定の細胞／疾患モデルに関連する情報を特定および抽出するために設計されたアルゴリズムによって、情報について解析される（例えば、非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０等を参照されたい）。自動的な取得、測定、比較、およびパターン分類の進歩が、形態学的パラメータ、タンパク質レベル、遺伝子発現等を含むがこれらに限定されない、多数の細胞パラメータの検出および／または定量を容易化している。従来の共焦点顕微鏡法によるデジタル画像を、顕微鏡法に基づく細胞の表現型の特徴付けに対する定量的アプローチを可能とする、洗練された画像解析アルゴリズムによって、解析することができる（例えば、非特許文献５１、非特許文献５２を参照されたい）。数十万個の個々の細胞を表す数千個の画像を、単一の実験セッションにおいて、ＨＣＡワークステーションを介して、取得することができ、数十万種類の化合物の迅速なスクリーニングを可能とする。
【００７５】
多数の販売者が、マイクロタイタープレートにおいて増殖した細胞の、蛍光標識された成分の画像を生成することが可能な、顕微鏡に基づく機器を提供している。これらの機器は、典型的には、細胞ごとの複数の蛍光マーカーの相対分布を規定することが可能な解析ソフトウェアと併せて販売されている。読み取り装置が改良されており、画像の取得および解析の時間が低減されているため、より大きな化合物ライブラリをスクリーニングする可能性が出てきている。したがって、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）、すなわち単一のウェルからの複数のパラメータのデータの生成は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の研究室における重要なツールとなっている。
【００７６】
脂肪細胞分化の特定のマーカーについてのＨＣＡ解析が、当業者に知られている。例えば非特許文献２０は、Vala Sciences, Inc.の市販の、脂質滴を染色および検出するための試薬を含有する脂質滴解析キット、ならびに脂質滴の検出および算出を自動化するためのＣＹＴＥＳＥＥＲ（登録商標）画像解析ソフトウェアを使用する、脂肪細胞分化についてのＨＣＡスクリーニングを記載するものであった。そこで記載される一つの実験において、同じ視野が、核、脂質滴およびタンパク質を選択的に可視化するために、３つの別々の光学チャネルにおいて画像化された。脂質滴が、ＣＹＢＥＲＳＥＥＲ（登録商標）ソフトウェアを使用して、定量された。加えて、タンパク質（ペリリピン）の共局在化が、また、決定された。
【００７７】
多数のハイスループットスクリーニングシステムが、市販されている（例えば、Zymark Corp.（Hopkinton, MA）、Air Technical Industries（Mentor, OH）、Beckman Instruments, Inc.（Fullerton, CA）、Precision Systems, Inc.（Natick, MA）等を参照されたい。これらのシステムは、典型的には、全ての試料および試薬のピペッティング、液体の分注、時限的インキュベーション、ならびに、アッセイに適切な検出器（複数の場合もある）におけるマイクロプレートの最後の読み取りを含む、全手順を自動化する。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速な開始、ならびに高度の柔軟性およびカスタマイゼーションをもたらす。そのようなシステムの製造業者は、様々なハイスループットの詳細なプロトコルを提供している。したがって、例えばZymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合等の変調を検出するためのスクリーニングシステムを記載する、技術的報告書を提供している。
【００７８】
これらのハイスループットシステムおよび例は、例示的なものであり、限定的なものでないことが意図される。本明細書において提示される教示を使用すると、本明細書において記載されるアッセイは、多数の他のＨＴＳ／ＨＣＡ解析システムにおいて、容易に実行することができる。
【００７９】
細胞培養システム。
様々な実施形態において、本明細書において記載されるアッセイを行うための細胞培養システムが、提供される。ある特定の実施形態では、前記細胞培養システムは、脂肪生成能を有する哺乳動物細胞を含有する、１つまたは複数の細胞培養容器を含み、前記細胞は、脂肪細胞への分化のために予備刺激されるが、分化していない。様々な実施形態において、前記細胞は、急性の（acute）培養物中に存在するが、他の実施形態においては、前記細胞は、多数回継代された樹立細胞株である。例示的な細胞は、間葉系幹細胞、乳頭状および網状真皮線維芽細胞、脂肪由来の幹細胞／間質細胞、前脂肪細胞、骨髄前駆体、血管の脂肪細胞前駆体等を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、前記細胞は、脂肪細胞への分化に必要とされる少なくとも１つの因子を欠く、脂肪細胞分化混合物中において、準備される。
【００８０】
前記細胞培養システムは、多数の形式で、提供することができる。例えば、ある特定の実施形態では、前記システムは、多ウェル器具または多容器器具（例えば、１２ウェル形式、２４ウェル形式、９６ウェル形式、３８４ウェル形式または１５３６ウェル形式等で）で提供される。ある特定の実施形態では、前記培養システムは、特定のＨＴＳおよび／またはＨＣＡシステムに適合性を有する形式で提供される。
【００８１】
スクリーニングのための動物モデル。
ある特定の実施形態では、上で記載される、細胞に基づく（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの）アッセイにおいて、陽性の結果を示す試験薬剤（複数の場合もある）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、さらに検証される。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの脂肪生成の効果的な促進因子である試薬を同定するための、前記スクリーニングのフィデリティを、前記試験薬剤（複数の場合もある）を、動物モデルにおいて（例えば、７月齢の雌のラットの皮膚の下に注射した場合に）、皮下脂肪の蓄積を促進するそれらの能力について、スクリーニングすることによって、試験することができる。ある特定の実施形態では、外耳における注射が行われる。この部位における注射が良好なデータをもたらすことが観察されている。間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する、試験薬剤（複数の場合もある）の能力が、ｉｎ  ｖｉｖｏでラットの皮膚（または、他の動物モデル）における皮下脂肪の蓄積を促進する、これらの試薬の能力と非常に密接に対応することが見出されている。
【００８２】
キット。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるアッセイを実施するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、前記キットは、脂肪生成能を有する１つまたは複数の細胞種（例えば、前脂肪細胞）を含有する。前記キットは、前記細胞を、脂肪生成のために予備刺激するが、前記細胞に、脂肪細胞への最終的な分化を行わせないための試薬混合物をさらに含み得る。前記キットは、前記細胞を増殖および／または維持するための培地をさらに含有していても良い。前記キットは、分化した脂肪細胞を検出するための、１つもしくは複数の試薬、および／またはそのような検出を容易化するためのソフトウェアをさらに含んでいても良い。前記キットは、本明細書において記載されるアッセイの実施を容易化するための、任意の試薬および／または装置を任意に含んでいても良い。そのような試薬は、緩衝剤、標識、標識された抗体、標識された核酸、蛍光標識の可視化のためのフィルターセット、ブロッティング膜等を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
加えて、前記キットは、本発明のアッセイ方法の実施のための指示（すなわち、プロトコル）を含有する取扱説明資料を任意に含んでいても良い。前記取扱説明資料は典型的には、記載または印刷された資料を含むが、前記取扱説明資料は、そのようなものに限定されない。そのような取扱説明書を保存し、それらをエンドユーザーに伝達することが可能な任意の媒体が、本発明によって意図される。そのような媒体は、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）等を含むが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような取扱説明資料を提供する、インターネットサイトのアドレスを含んでいても良い。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、特許請求される発明を例示するために提供するものであり、前記発明を限定するために提供するものではない。
【００８５】
実施例１
脂肪生成アッセイ
細胞種：
ある特定の実施形態では、任意の前脂肪生成細胞、真皮線維芽細胞、多能性線維芽細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ細胞）または間葉系幹細胞が、このアッセイに好適である。
【００８６】
材料
細胞は、９６ウェルまたは他の多ウェル組織培養プレートにおいて、培養することができる。
【００８７】
脂肪生成開始／予備刺激培地：
脂肪生成開始／予備刺激培地を調製するために、ＩＢＭＸ標準溶液（０．５ｍＭ）を、１：１０００で希釈し、デキサメタゾン標準溶液（１μＭデキサメタゾン標準溶液（ＤＭＳＯ中））を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて１：１００００で希釈する。抗生物質の典型的なカクテルを、微生物の増殖を制限するために添加することができる。この開始培地は、４℃で最大６週間保存することができる。
【００８８】
脂肪生成進行培地：
陽性対照進行培地を調製するために、標準インスリン溶液（１０μｇ／ｍｌのインスリン）を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて１：１０００で希釈する。最適な抗生物質を、微生物の増殖を制御するために添加する。この対照進行培地は、４℃で最大６週間保存することができる。
【００８９】
実験／試験（例えば、ＲＨＡＭＭ遮断試薬、または他の実験的脂肪生成促進試薬）進行培地を調製するために、試験薬剤を、標準溶液において準備する（例えば０．００１から１０μｇのＲＨＡＭＭ抗体、ペプチド模倣物（複数の場合もある）、または他の試験薬剤（複数の場合もある））。試験薬剤溶液を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて所望の濃度（例えば１ｎｇから１０μｇのＲＨＡＭＭペプチド）まで希釈する。
【００９０】
脂肪維持培地は、以下を含み得る：陽性対照としてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、陰性対照としてＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清（ＣＳ）、および実験／試験培地としてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋脂肪生成試薬（例えば、ＲＨＡＭＭ抗体、ペプチド、他の試験薬剤（複数の場合もある）等）。
【００９１】
３Ｄ培養アッセイ
一つの好適な３Ｄ脂肪生成アッセイは、非特許文献５３に記載されるアッセイの変法である。ヒトの皮膚の前脂肪細胞を含む前脂肪細胞、網状線維芽細胞、間葉系幹細胞、および脂肪生成能を有する他の細胞種を、ＤＭＥＭ（低グルコース）＋１０％ウシ胎児血清添加物において、組織培養プラスチック表面上で集密状態まで培養する。細胞を、脂肪細胞へと分化するまで、脂肪生成を促進する因子のカクテルに曝露する。分化した脂肪細胞を、ＤＭＥＭ（低グルコース）＋１０％ＦＣＳにおいて維持し、マトリゲルを、脂肪細胞の単層の最上部に重層する。網状および乳頭状線維芽細胞を、重合したマトリゲル層の表面上に、低密度（例えば、１ｍｌ当たりの細胞数５×１０３個）で播種し、マトリゲル中に浸潤させる。ケラチノサイト（初代または細胞株）を、マトリゲルの表面上に播種し、引き続き、上清培養培地を除去し、それによって、ケラチノサイトが、マトリゲル層の表面上に拡散し、角質化する。このアッセイは、皮膚に典型的な３層の形成をもたらす：分化した皮下脂肪層、線維芽細胞を含有する真皮層、および分化したケラチノサイトの表面層。このアッセイは、無傷の皮膚の条件に類似するまたはこれのモデルとなる条件下で、ヒト前脂肪細胞の分化に影響を及ぼす因子を評価するのに、特に有用である。
【００９２】
ラットおよびヌードモルモットへのペプチドの注射。
ヌードモルモットにおける皮下の脂肪生成に対する、ＲＨＡＭＭの機能を遮断する抗体（Ｒ−６８３６−Ｂ）、およびＲＨＡＭＭ合成ペプチドＢの効果を、以下の試薬を使用して、評価した：１）抗ＲＨＡＭＭ抗体（Ｒ−６８３６−Ｂ）（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）、２）ＲＨＡＭＭ合成ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）、３）ラット尾Ｉ型コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、および４）重炭酸ナトリウム。ある特定の実施形態では、ＲＨＡＭＭペプチドおよび抗体の量は、約０．１から約２５０μｇ／ｍｌまで、より好ましくは約０．２５から約１００μｇ／ｍｌまでの範囲である。
【００９３】
試料調製：
コラーゲン溶液のｐＨは、重炭酸ナトリウム溶液を添加することによって、７から８に調節した（１ｍｌのコラーゲン溶液に対して３０μｌの重炭酸ナトリウムを添加する）。その処理中、コラーゲン溶液は氷上に維持した。
【００９４】
抗ＲＨＡＭＭ抗体を、コラーゲン溶液に添加して、異なる濃度（溶液１ｍｌ当たり抗体０．２５μｇおよび２．５μｇ）を調製した。また、ＲＨＡＭＭ合成ペプチドＢを、コラーゲンに添加して、溶液１ｍｌ当たりペプチドＢ  １０μｇおよび１００μｇを調製した。
【００９５】
注射処置：
各々の条件について１匹の動物を使用した（合計４匹のヌードモルモットおよび２匹のスプラーグドーリーラット）。各々のヌードモルモットの５つの位置（背中の２箇所、乳腺の脂肪体の近くの胃の２箇所、および頸部の背部の１箇所）に、試薬を注射した。Ｇ２０からＧ２２の皮下用注射針を有する１ｍｌのシリンジを、注射に使用した。動物を、イソフルランガス（レベル１から１．５。Ｏ２と混合）を用いて鎮静化した。動物の注射部位を、アルコールワイプを用いて清浄化した（スプラーグドーリーラット上の注射部位は、注射の前に剪毛した）。０．２５μｇの抗体を含有するコラーゲン溶液１ｍｌを、動物の背中または胃において、皮膚の下に、非常にゆっくりと注射した。各々の注射の後、各々の動物を、最大５分間、同じ姿勢で留まらせた。注射部位に、油性シャーピーペンを用いて、マークを付した。
【００９６】
同じ手順を、２．５μｇ／ｍｌの抗体、ならびに１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＲＨＡＭＭペプチドＢを用いて、行った。
【００９７】
対照のために、（各々の注射に対して）１ｍｌのコラーゲンのみを（ＲＨＡＭＭ試薬なしで）、反対側の部位に注射した。
【００９８】
２匹のラットを、陽性対照として使用した：１匹には、既知の最適用量のＲＨＡＭＭ抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を注射し、もう１匹には、既知の最適用量のＲＨＡＭＭ合成ペプチドＢ（１００μｇ／ｍｌ）を注射した。動物を、通常通りに７日間収容した。
【００９９】
培養スクリーニングアッセイ
細胞の維持
細胞株の供給業者からの取扱説明書の通りに、細胞ストックを維持する。最良の結果のために、ＤＭＥＭ＋１０％ＣＳ（ＦＣＳではなく）において細胞を維持する。細胞を、培養の集密によって起こるバックグラウンドの脂肪生成を低減するために、低い培養密度（例えば、ディッシュ１００ｍｍ当たり４×１０５個の細胞）に常に維持する。
【０１００】
多ウェルアッセイ
脂肪生成スクリーニングのための細胞は、以下の通りに蒔くことができる：細胞を、トリプシン処理し、引き続き、１ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＣＳに再懸濁して、トリプシンを中和する。細胞を引き続き計数する。ある特定の実施形態では、ＤＭＥＭ＋１０％ＣＳ  １ｍｌ当たり約３００００個の細胞を蒔く。細胞を、１から２日間、この培地中に放置する。ある特定のウェル、例えば、細胞を含まない１行のウェルを、ブランク（複数の場合もある）をもたらすために、維持することができる。
【０１０１】
ＤＭＥＭ＋１０％ＣＳを除去し、適切な量（多ウェルディッシュの大きさに対して）の開始培地に置き換える。陰性対照については、陰性対照培地（例えば、陰性対照として上で記載されるＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清（ＣＳ））を、使用することができる。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【０１０２】
脂肪生成アッセイを、培養物から除去し、陽性対照または実験試薬進行培地を添加する。細胞を、上記と同様に４８時間インキュベートする。
【０１０３】
進行培地を、引き続き、除去し、維持培地に置き換える。陰性対照は、陰性対照維持培地において維持するべきである。
【０１０４】
細胞を、引き続き、例えば５から７日間放置しても良く、引き続き、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（２５μＭ）または１％オイルレッドＯのいずれかを、１５分間添加する。引き続き、細胞を、リン酸緩衝食塩水で穏やかに洗浄する。
【０１０５】
色素を、メタノール：エタノール（１：１）混合物を用いて抽出することができ、オイルレッドＯについては、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５２０ｎｍで、またはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）については、ＦＩＴＣを検出する蛍光光度計を使用して、読み取ることができる。
【０１０６】
この方法を、平滑筋アクチン（標識された抗平滑筋アクチン抗体によって検出される）等の他の分子について共染色するように、適合させることができる。第二または第三の分子についての染色は、脂質と同時に行うことが考えられ、または抽出後の細胞に対して、実施することができる。後者の方法を使用する場合、脂質抽出後、細胞を、ＰＢＳ中、３％の新たに調製されたパラホルムアルデヒドに固定するべきである。さらなる分子についての染色を、引き続き、抗体製造業者の方法に従って、実施する。
【０１０７】
脂肪生成アッセイの様々な実施形態において、脂肪生成能を有する細胞の単層を、脂肪生成カクテルを含有するアガロース（０．３％から１％、培養培地に溶解させた低融点アガロース、例えばＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（Lonza））の層で被覆する。１５％ウシ胎児血清添加物を添加した培養培地（例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ培地混合物）を、重合アガロースの最上部上に重層する。この方法は、アガロースが、脂肪生成因子の持続的な緩慢な放出を可能とし、ハイスループット解析のためのアッセイの使用を妨げる可能性がある細胞単層の巻き上がり（rolling up）を妨げるため、脂肪生成を促進する。
【０１０８】
加えて、前脂肪細胞を、単層の脱離（巻き上がり）を低減し、脂肪生成を促進するために、カバーガラス、またはフィブロネクチン等の接着性タンパク質上に置くことができる。
【０１０９】
結果。
ラット間葉系細胞およびマウス胚性前脂肪生成線維芽細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ細胞）が、進行培地においてインスリンに曝露すると、脂肪生成を起こした（ラット間葉系幹細胞が図１に示される）。脂質の蓄積の程度を、５２０ｎｍで検出されるオイルレッドＯの量を測定することによって、定量した。この程度を、１００％として示す。脂肪生成に対するＲＨＡＭＭ機能を遮断する抗体（抗ペプチドＢ抗体）の効果を、図１の上パネルに示し、ＥＬＩＳＡにおいて、ＲＨＡＭＭペプチドＢおよびＲＨＡＭＭ模倣ペプチドＰ１５の効果と併せて定量する（結果を、図１の下パネルに示す）。ＲＨＡＭＭ抗ペプチドＢ抗体の効果は、インスリンの５倍の大きさであり、ＲＨＡＭＭペプチド配列Ｂおよび模倣ペプチドは、それぞれ３倍および２倍の大きさである。陰性対照の細胞は、ＤＭＥＭ＋ＣＳ中で増殖させ、開始培地または進行培地のいずれにも曝露しなかった。
【０１１０】
先のスクリーニングにおいて、２０種類のペプチド、およびＲＨＡＭＭに対する抗体の組合せを試験した。このスクリーニングにおいて、３種類の試験薬剤（抗ペプチドＢ、ペプチドＢおよびペプチドＰ−１）が、脂肪生成性を有しており、このスクリーニングにおいてこれらの試験薬剤が脂肪生成性を有する程度は、３Ｄおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて再現された。加えて、ラットおよびヒトの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの脂肪生成を予測する上で、等しく良好であった。
【０１１１】
図２は、この事例では１５−１のスクランブルペプチド配列である、ＲＨＡＭＭ試薬についての対照を使用する、ラット間葉系幹細胞の脂肪生成に対する、ＲＨＡＭＭペプチド模倣物Ｐ１５−１の効果を示す。ホフマン・オプティクスは、細胞単層の存在を明らかにする。脂質滴を、多数の細胞において見ることができ、脂質滴が、ｂｏｄｉｐｙの取込み（緑色蛍光色素、矢印）、およびオイルレッドＯの取込み（赤色の液滴、矢印）によって、示される。
【０１１２】
グラフは、偏りのない（unbiased）スクリーニングを使用して単離されたＰ−１ペプチド、ＲＨＡＭＭとそのリガンドとの間の既知の分子の相互作用に基づき合理的に設計されたＢ−１ペプチド、およびＲＨＡＭＭ抗体が、培養物中における、および老化ラットの真皮中に注射した場合の、前脂肪細胞性の幹細胞（pre-adipocyte stem cells）、および線維芽細胞に対するそれらの効果についてアッセイされたことについての用量応答曲線を示す。試薬は、０から５の尺度で順位付けされ、５は、考え得る最高のスコアを表した。
【０１１３】
【表１】
2013536693.tif 000002
【０１１４】
脂質を検出するために、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素の取込みを使用する、ＲＨＡＭＭ模倣ペプチド１５−１の脂肪生成効果。
ｉｎ  ｖｉｖｏでの脂肪生成の効果的な促進因子である試薬を同定するための、スクリーニングのフィデリティを、培養スクリーニングにおける試薬の順位付けを、７月齢の雌のラットの皮膚の下に注射した場合に、皮下脂肪の蓄積を促進する、それらの相対的な能力と比較することによって、試験した。ラットにおけるＲＨＡＭＭの機能を遮断する試薬の注射によってもたらされる、皮下の脂肪体の蓄積を、図３に示す。間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を促進する、試薬の能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのラットの皮膚における皮下脂肪の蓄積を促進する、これらの試薬の能力と非常に密接に対応する。
【０１１５】
培養スクリーニング方法を使用して、我々は、複数のヒトの皮膚の前脂肪細胞株、および網状の真皮線維芽細胞が、脂肪生成の制御を示すことを示した。一般的なヒト線維芽細胞（包皮由来）、および皮膚の乳頭状線維芽細胞は、このアッセイにおいて、脂肪生成能を示さなかった。したがって、このスクリーニング方法は、また、脂肪細胞性の幹細胞（adipocyte stem cell）集団を選択的に同定するために、使用することができる。
【０１１６】
上で記載される培養スクリーニングによって同定されたＲＨＡＭＭ試薬を、また、培養スクリーニングの２Ｄ方法において増殖させた、および、また、３Ｄにおいて増殖させた、ヒト皮膚細胞における脂肪生成を促進する、それらの能力について試験した（図４）。図４の結果は、ＲＨＡＭＭペプチドＢが、培養スクリーニング方法を使用して増殖させると、または、コラーゲンＩ型ゲルを使用する３次元培養環境において増殖させると、ヒト前脂肪細胞株において、脂肪生成を促進することを示す。培養スクリーニングによって、前脂肪生成性を有するとして同定されたＲＨＡＭＭ試薬を、ヌードモルモットモデルにおいて試験した。このモデルは、毛髪が存在せず、（ラットおよびマウスの、まさにその表皮層とは異なり）ケラチノサイト層が複数重層されており、皮下脂肪層が非常に薄いという点でヒトの顔の皮膚に類似するため、ヒトの皮膚のモデルとして、使用されることが多くなっている。このモデルでは、本明細書において記載されるアッセイにおいて、前脂肪生成性を有するとして同定されたＲＨＡＭＭ薬剤が、動物モデルにおいて、皮下脂肪を増大させた。
【０１１７】
図５のグラフに示される結果は、ラット間葉系幹細胞を、インドメタシン（１００μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）によって誘導した際の、試験ペプチドの、増大した脂肪生成効果を示す。このグラフは、また、このペプチドのある特定の断片が、試験ペプチドの全体と、同様の活性を有する、または、より高い活性を有することを示す。
【０１１８】
実施例２
前脂肪細胞の、２Ｄ脂肪生成分化。
前脂肪細胞、または脂肪由来の幹細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分化させるための、GIBCOから市販されているキット（ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化キット）。
【０１１９】
脂肪生成分化
継代回数の少ない脂肪由来の幹細胞およびＭＳＣ（継代回数８から１０回未満）は、より強い多能性を示す。培養が、６０から８０％の集密度に到達した時に、継代を行うべきである（集密状態は、また、多能性を低減する可能性がある）。
【０１２０】
細胞を、標準的な増殖培地において培養し、中期対数増殖期の集密度（６０から８０％）を確保する。好適な増殖培地は、１０％ＦＣＳ（ＭＳＣ用）、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを添加した、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１：１）である。
【０１２１】
培地および浮遊細胞を、引き続き、培養フラスコから吸引し、廃棄する。５から１０ｍＬのＤＰＢＳを添加し、細胞単層を穏やかにリンスする。
【０１２２】
ＤＰＢＳを除去し、１から２ｍＬの予め加温したトリプシン（％０．２５）を添加する。細胞を、３７℃で２分間、または細胞が完全に脱離するまでインキュベートする。引き続き、４ｍｌの増殖培地を添加して、トリプシンを中和する。脱離した細胞を、穏やかにピペッティングして、単一の細胞の溶液にすることができる。
【０１２３】
細胞懸濁物を、容器（例えば、フラスコ）から取り出し、遠心分離用チューブに移す。細胞を、１００×ｇ、５から１０分間の処理で、ペレットとする。
【０１２４】
細胞の生存度および総細胞密度は、例えば、トリパンブルー染色、および手動または自動での血球板による細胞計数方法を使用して、決定することができる。
【０１２５】
ペレットを、引き続き、適切な体積の予め加温した増殖培地において再懸濁する。細胞を、引き続き、例えば１ｃｍ２当たりの細胞数１×１０４個で、播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、最低で２時間、最大で４日間、増殖培地においてインキュベートする。
【０１２６】
培地を、引き続き、予め加温した脂肪生成分化培地に置き換え、インキュベーションを継続する。細胞は、脂肪生成条件下で分化するため、限定的な増殖をし続けるであろう。培養物に、３から４日ごとに、再供給することができる。
【０１２７】
脂肪生成分化培地について、GibcoまたはZenBioから市販される培地を使用することができ、または、脂肪生成カクテルを、以下の通りに処方することができる：ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１：１）に、３％  ＦＣＳ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、（１００ｎＭ）インスリン、０．２ｎＭ  Ｔ３、１μＭ  デキサメタゾン、０．２５ｍＭ  ＩＢＭＸ、および１μＭ  ロシグリタゾンを添加する。
【０１２８】
７から１４日後に、脂肪生成培養物を、遺伝子解析、またはオイルレッドＯもしくは例えばＢＯＤＩＰＹ（登録商標）による染色のために、処理することができる。
【０１２９】
実施例３
前脂肪細胞の３Ｄ培養および脂肪分化
以下の表２に従って、好ましくは使用の前日、１週間前以後に、プレミクス溶液を調製する。この溶液は氷上で調製し、使用前に０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌ろ過し、１Ｎ  ＨＣｌ溶液を用いてｐＨを７．５に調節する。
【０１３０】
【表２】
2013536693.tif 000003
【０１３１】
３Ｄコラーゲンシステムにおける前脂肪細胞の培養
全ての試薬を予め冷却する。ヒト前脂肪細胞を、８０％未満の集密度で回収し、細胞数を決定する。脂肪生成分化培地を、引き続き、細胞に添加し、細胞濃度を、例えば培地１ｍｌ当たり細胞数２×１０５個の播種密度に、調節する。
【０１３２】
５０ｍｌ容ファルコンチューブに、ウシ尾コラーゲン（１．１ｍｇ／ｍｌ）を、プレミクス溶液と混合し、氷上でかき混ぜ、十分に混合する。脂肪分化培地中の細胞を、コラーゲン混合物中に添加し、穏やかにかき混ぜ、気泡発生を回避する。
【０１３３】
脂肪生成分化培地について、GIBCOまたはZenBioから市販されている商品を、使用することができるか、または、以下の成分を有する分化培地を使用することができる：ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１：１）、３％  ＦＣＳ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、（１００ｎＭ）インスリン、０．２ｎＭ  Ｔ３、１μＭ  デキサメタゾン、０．２５ｍＭ  ＩＢＭＸ、および１μＭ  ロシグリタゾン。
【０１３４】
３ｍｌのこの混合物を、各々のウェル中にピペッティングする。ゲルを、３７℃のインキュベーター中で３０分間、重合させる。ゲルが重合したら、２ｍｌの脂肪生成分化培地を、ゲルのみの最上部に添加する。
【０１３５】
【表３】
2013536693.tif 000004
【０１３６】
培地を、その後３週間、２から３日ごとに交換する。
【０１３７】
本明細書において記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのものにすぎないこと、ならびに、それに鑑みて、様々な修正または変更が、当業者に対して示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の内に含まれるべきであることが理解される。本明細書において引用される全ての出版物、特許および特許出願は、全ての目的に対して、その全体が参照により本明細書によって援用される。
【図１】
2013536693.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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