(57)【要約】【課題】Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＳＰ７８複合体形成およびシグナル伝達を阻害するための組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、過剰増殖性細胞中のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を妨害することを含む、過剰増殖性疾患を処置するための方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、場合によって他の癌療法と併用して、抗体および／またはｓｉＲＮＡを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合を阻害することができる。Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合を選択的に阻害することができる治療用化合物を同定するための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１１月７日に出願された米国仮出願第６１／１１２，５７９号（この出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって付与されたＲ０１ＣＡ１０７４２０の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に分子生物学および医学の分野に関する。より詳細には本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＳＰ７８シグナル伝達の妨害を含む、過剰増殖性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｃｒｉｐｔｏ（Ｃｒｉｐｔｏ−１、ＴＤＧＦ１）は、胚発生中に必要不可欠な生理的役割を有する、低分子の、ＧＰＩアンカー型シグナル伝達タンパク質である。それはさらにヒト腫瘍において高レベルで発現され、増大した細胞増殖、移動、浸潤、腫瘍血管新生および上皮間葉移行（ＥＭＴ）を含めた腫瘍発生および進行のいくつかの態様と関連している（非特許文献１）。
【０００５】
その発癌機能の根底にあると考えられる多数の作用機構がＣｒｉｐｔｏに起因している（非特許文献１）。例えばそれは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を、いくつかのこれらのリガンドおよびそれらの個々のシグナル伝達受容体と複合体を形成することによって調節する。この文脈においてＣｒｉｐｔｏは、アクチビン（非特許文献２、非特許文献３）およびＴＧＦ−β１（非特許文献４）によるシグナル伝達を阻害しながら、ノーダルなどの特定リガンド（Ｓｃｈｉｅｒ、２００３年、ＳｈｅｎおよびＳｃｈｉｅｒ、２０００年）によるシグナル伝達を促進する必須の役割（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ）を有する。アクチビンおよびＴＧＦ−βは腫瘍抑制機能を有するので（ＰａｒｄａｌｉおよびＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７年）、Ｃｒｉｐｔｏによるそれらのシグナル伝達の阻害は、腫瘍増殖を促進するＣｒｉｐｔｏの能力を少なくとも部分的に説明することができる機構をもたらす（非特許文献２、非特許文献３、Ｇｒａｙら、２００６年）。逆に、Ｃｒｉｐｔｏ依存性のノーダルシグナル伝達は、細胞がＴＧＦ−βリガンドの増殖阻害影響を受けにくい状態である条件下で、腫瘍増殖および転移の後期段階に貢献する可能性がある（ＰａｒｄａｌｉおよびＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７年、Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａら、２００６年）。
【０００６】
Ｃｒｉｐｔｏは細胞から可溶形で放出され、分泌された増殖因子のそれと似た形式で作用する可能性もある（非特許文献１）。この点において、ＣｒｉｐｔｏおよびアフリカツメガエルのＣｒｉｐｔｏオルソログＦＲＬ−１は、それぞれｅｒｂＢ−４（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９年）およびＦＧＦＲ−１（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、１９９５年）のリン酸化を引き起こすことが報告された。Ｃｒｉｐｔｏは直接これらのタンパク質と結合しないが、しかし、これらのリン酸化事象を仲介する推定Ｃｒｉｐｔｏ受容体は未だに発見されていない（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９年、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、１９９５年）。この点において、ＣｒｉｐｔｏはＥＧＦ様ドメインを有しＥＧＦ受容体リガンドと類似しているが、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのいずれとも直接結合しない（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９年）。さらに、Ｃｒｉｐｔｏは細胞外ＧＰＩアンカー型プロテオグリカングリピカン−１と結合してｃ−Ｓｒｃを介したＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の活性化を引き起こすが、この作用を仲介する膜貫通タンパク質は未だに同定されていない（Ｂｉａｎｃｏら、２００３年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｚｚｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４：５７３１〜５７４１
【非特許文献２】Ａｄｋｉｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００３）１１２：５７５〜８７
【非特許文献３】Ｇｒａｙｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：５１９３〜５１９８
【非特許文献４】Ｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８：２０９１５〜２０９２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、Ｃｒｉｐｔｏは腫瘍増殖の一因となり得る多数のシグナル伝達機構を有するが、その公知の細胞表面結合パートナーがその報告された発癌機能を完全に説明することはないようである。過剰増殖性疾患の顕著な社会的および経済的影響を鑑みて、過剰増殖性疾患のための改善された療法に関する必要性が存在し、それによってＣｒｉｐｔｏがこれらの影響を引き起こす機構の詳細な描写は、改善された療法およびスクリーニング法をもたらす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏがグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）と結合し、過剰増殖性細胞の増殖を促進する下流のシグナル伝達をもたらすことができることを決定することによって、従来技術の制約を克服する。したがって本発明は、癌などの疾患を治療するために使用することができる、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用の阻害剤を提供する。他の態様では本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成のモジュレーターをスクリーニングするための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、細胞表面ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏの結合パートナーであり、ヒト腫瘍細胞、ヒト胚幹細胞および正常ヒト乳腺上皮細胞におけるＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達に必要不可欠であるという驚くべき発見に、少なくとも一部分は基づく。したがって、細胞表面のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体は、治療によって標的化することができる幹細胞および腫瘍細胞中の新規かつ望ましい標的を表す。本発明者らは、細胞表面のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用が、Ｃｒｉｐｔｏ共受容体の機能および腫瘍増殖因子の活性に必要とされることを以下でさらに示している。これらの結果は、細胞表面ＧＲＰ７８のノックダウンまたは免疫中和反応がアクチビン、ノーダルおよびＴＧＦ−βシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ調節を遮断し、Ｃｒｉｐｔｏ活性化ｃ−Ｓｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路を妨げることを実証する。したがってデータは、ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達に必要不可欠なＣｒｉｐｔｏの受容体／共因子であるという考えを支持する。重要なことに、本発明者らは、ＧＲＰ７８はヒトＥＳ細胞の表面に存在し、そこでそれはＣｒｉｐｔｏと共局在化し、アクチビンおよびノーダルのシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの拮抗作用を仲介するという最初の実証を与えている。細胞表面ＧＲＰ７８とのＣｒｉｐｔｏ結合は、細胞増殖を増大させＥ−カドヘリンの発現および細胞接着を低下させるＣｒｉｐｔｏの能力にも必要とされ、これらのタンパク質は一緒に働いて腫瘍増殖および転移を促進する可能性があることを示した。本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の存在下ではアクチビン−Ａおよびノーダルが細胞分裂促進性であり、一方アクチビン−Ａは細胞静止作用を有しており、ノーダルはそれらの不在下では増殖に全く影響がなかったことを発見した。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、この結果は、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体が、ＭＡＰＫ／ＰＩ３ＫとＳｍａｄ２／３経路の間のクロストークを調整することによって細胞増殖を制御するという考えを支持する。
【００１１】
本発明の一態様は、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の複合体の形成を阻害するステップを含む、細胞中のＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を阻害するための方法に関する。この方法は少なくとも前記細胞の表面と選択的ＧＲＰ７８標的化合物を接触させることを含むことができ、前記阻害はほぼ細胞の表面でのＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成の阻害を含む。前記複合体の形成は抗ＧＲＰ７８抗体によって阻害することができ、抗ＧＲＰ７８抗体はＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープと結合することができる。特定の実施形態では、抗ＧＲＰ７８抗体はヒト化モノクローナル抗体である。抗体は放射リガンドまたは蛍光標識などのレポーター分子と結合体化させることが可能である。前記複合体の形成は抗ＧＲＰ７８Ｆ（ａｂ）もしくは（ａｂ）２、またはＧＲＰ７８標的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｉＮＡ（例えば、配列番号５を含むＧＲＰ７８標的ｓｈＲＮＡ）によって阻害することができる。投与は全身、局部（ｌｏｃａｌ）、局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）、非経口、静脈内、腹腔内、吸入によるもの、または腫瘍内であってよい。
【００１２】
特定の実施形態では、方法は、ＧＲＰ−７８と優先的に結合しＣｒｉｐｔｏと結合するＧＲＰ−７８の能力を阻害しノーダルシグナル伝達を引き起こす有効量のＧＲＰ７８標的化合物と細胞を接触させることを含む、細胞増殖を低下させる方法としてさらに定義する。この方法は少なくとも前記細胞の表面とＣｒｉｐｔｏ標的化合物を接触させることを含むことができ、Ｃｒｉｐｔｏ標的化合物はＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインまたはＧＲＰ７８結合ドメイン中のエピトープと選択的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の複合体の形成を阻害する。Ｃｒｉｐｔｏ標的化合物は、ＣｒｉｐｔｏのＧＲＰ７８結合ドメインまたはＣＦＣドメイン中のエピトープと結合する抗体であってよい。方法は、少なくとも前記細胞の表面と配列番号４を含むｓｈＲＮＡを接触させることを含むことができる。標的化合物は、Ｃｒｉｐｔｏと結合しないまたは実質的に結合しないＧＲＰ７８変異体であってよい。ＧＲＰ７８変異体は、Δ１９〜６８ＧＲＰ７８などの天然ＧＲＰ７８のアミノ酸１９〜６８を欠くＧＲＰ７８変異体であってよい。他の実施形態では、ＧＲＰ７８をＧＲＰ７８の１９〜６８アミノ酸領域中の１つまたは複数の置換または挿入変異（複数可）によって変異させて、Ｃｒｉｐｔｏと結合しないまたは実質的に結合しないＧＲＰ７８変異体を生成することが可能である。前記細胞は、乳房、結腸、胃、膵臓、肺、卵巣、子宮内膜、精巣、膀胱、前立腺、頭部、首、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、胃腸（ｇａｓｔｒｉｃ）、胆嚢および副腎皮質からなる群から選択される器官に由来してよい。細胞は癌性、前癌性、または悪性細胞であってよく、この場合方法は癌などの過剰増殖性疾患を治療する方法としてさらに定義する。癌は乳癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、精巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、胆嚢癌および副腎皮質癌からなる群から選択することができる。
【００１３】
特定の実施形態では、方法は、細胞増殖を低下させるための方法としてさらに定義する。方法は、細胞中でＣｒｉｐｔｏによりノーダルシグナル伝達、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナル伝達またはｃ−Ｓｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達を低下させる方法を含むことができる。方法は、化学療法（例えばタキソール、シスプラチン、またはカルボプラチン）など第二の癌療法を被験体に施すこと、放射線療法、遺伝子療法、免疫療法または外科手術を含むことができる。
【００１４】
方法は、ニューロン細胞への幹細胞の分化を促進する方法としてさらに定義することができ、この場合細胞は幹細胞であり、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の複合体の形成の阻害はニューロン細胞への細胞の分化を促進する。細胞はヒト胚幹細胞（例えばＨ９またはＢＧ０２）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、候補モジュレーターを得ること、候補モジュレーターとＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８を接触させること、ならびにＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成を測定することを含み、候補モジュレーターの存在下でのＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成の低下またはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体シグナル伝達の低下が、候補モジュレーターがＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害剤であることを示す、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害剤をスクリーニングするための方法に関する。ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は細胞によって発現される可能性がある。特定の実施形態では、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は細胞によってトランスジェニック過剰発現される。細胞は癌性または前癌性細胞であってよい。方法はＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８シグナル伝達を測定することを含むことができ、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８シグナル伝達は、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナル伝達、ｃ−Ｓｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達、またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３βシグナル伝達を含む。方法はＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の結合を測定することを含むことができ、候補モジュレーターの存在下でのＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合の低下は、候補モジュレーターがＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を阻害することを示す。前記結合の測定は、（例えば、Ｓｈａｎｉら、２００８年中に記載されたような）細胞表面ビオチン化／Ｃｏ−ＩＰアッセイ、（例えば、無傷細胞における）１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏ結合アッセイ、（例えば、マルチウエルプレート中での）固定ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合の測定を含むアッセイ、または可溶性Ｃｒｉｐｔｏの結合を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを含むことができる。様々な実施形態において、フルオロフォアまたはクエンチャーを用いたＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８のタグ化、および例えばＦＡＣＳを使用した蛍光の測定を含む蛍光アッセイを、本発明と共に使用することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の態様はヒト化モノクローナル抗ＧＲＰ７８抗体に関するものであり、この抗体はＧＲＰ７８中のＮ−２０エピトープと結合し、前記結合はＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成を阻害する。抗体は医薬組成物中に含まれる可能性があり、医薬組成物は非経口、静脈内、または腫瘍内投与用に製剤化することができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞中のＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を阻害して前記細胞の増殖を低減するための方法であって、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の複合体の形成を阻害するのに有効である量の選択的ＧＲＰ７８／Ｃｒｉｐｔｏ標的化合物と前記細胞とを接触させて、それによって前記細胞の増殖を低減することを含む方法。
（項目２）
前記複合体の形成が、ａ）抗ＧＲＰ７８抗体、ｂ）ＣｒｉｐｔｏのＧＲＰ７８結合ドメインまたはＣＦＣドメイン中のエピトープと結合する抗体、またはｃ）天然ＧＲＰ７８のアミノ酸１９〜６８を欠くＧＲＰ７８変異体によって阻害される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抗体が前記ＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープと結合する抗ＧＲＰ７８抗体である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記抗体がヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が二重特異性抗体である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記抗体をレポーター分子と結合体化させる、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記レポーター分子が放射リガンドまたは蛍光標識である、項目６に記載の方法。
（項目８）
抗体が抗ＧＲＰ７８ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２である、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記標的化合物がｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記標的化合物が配列番号５または配列番号４を含むｓｈＲＮＡである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記標的化合物が天然ＧＲＰ７８のアミノ酸１９〜６８を欠くＧＲＰ７８変異体である、項目２に記載の方法。
（項目１２）
天然ＧＲＰ７８のアミノ酸１９〜６８を欠く前記ＧＲＰ７８変異体がΔ１９〜６８ＧＲＰ７８である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記投与が全身、局部、局所、非経口、静脈内、腹腔内、吸入によるもの、または腫瘍内である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞が乳房、結腸、胃、膵臓、肺、卵巣、子宮内膜、精巣、膀胱、前立腺、頭部、首、子宮頸部、胃腸、胆嚢または副腎皮質の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が癌性、前癌性、または悪性細胞であり、前記方法が被験体中の過剰増殖性疾患を処置する方法としてさらに定義される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記過剰増殖性疾患が癌である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記癌が乳癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、精巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、胆嚢癌または副腎皮質癌からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記被験体に第二の癌療法を施すことを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記第二の癌療法が化学療法、放射線療法、遺伝子療法、免疫療法または外科手術である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第二の癌療法が化学療法である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記化学療法がタキソール、シスプラチン、またはカルボプラチンである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ニューロン細胞への幹細胞の分化を促進する方法としてさらに定義され、前記細胞が幹細胞であり、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の前記複合体の形成の阻害がニューロン細胞への前記細胞の分化を促進する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞がヒト胚幹細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ヒト胚幹細胞がＨ９またはＢＧ０２である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記幹細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）候補モジュレーターを得ること、
ｂ）前記候補モジュレーターとＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８とを接触させること、ならびに
ｃ）Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成を測定することを含み、前記候補モジュレーターの存在下でのＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成の低下またはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体シグナル伝達の低下が、前記候補モジュレーターがＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害剤であることを示す方法。
（項目２７）
ヒト化モノクローナル抗ＧＲＰ７８抗体であって、前記抗体がＧＲＰ７８中のＮ−２０エピトープと結合し、前記結合がＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成を阻害する、抗体。
（項目２８）
前記抗体が医薬組成物中に含まれる、項目２６に記載の抗体。
（項目２９）
前記医薬組成物が非経口、静脈内、または腫瘍内投与用に製剤化される、項目２８に記載の組成物。
【００１７】
用語「阻害」、「低減」、または「予防」、またはこれらの用語の任意の変形は、特許請求の範囲および／または本明細書中で使用するとき、望ましい結果を得るための任意の測定可能な低下または完全な阻害を含む。
【００１８】
用語「有効」は、この用語を本明細書および／または特許請求の範囲中で使用するとき、望ましい、予想される、または目的とする結果を達成するのに適していることを意味する。
【００１９】
語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書中で用語「含む」と共に使用するとき、「１つ」を意味することができるが、それは「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【００２０】
本明細書中で論じる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆も同様であると企図される。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を実施することができる。
【００２１】
本明細書を通じて、用語「約」を使用して、値がデバイスに関する固有誤差の変動を含むこと、値を決定するために利用する方法、または試験被験体間に存在する変動を示す。
【００２２】
特許請求の範囲中の用語「または」の使用を使用して「および／または」を意味し、明確に示さない限り、代替のみまたは代替が相互排他的であることを指すが、本開示は代替のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲（複数可）中で使用するとき、語句「含む」（および含むの任意の形、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」など）、「有する」（および有するの任意の形、「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」など）、「含む」（および含むの任意の形、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」など）、または「含有する」（および含有するの任意の形、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」など）が含まれ、または制約がなく、追加の、列挙されていない要素もしくは方法ステップを排除しない。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるはずである。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な実施形態を示しながら、単なる例示によって与えられることは理解されるはずである。本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【００２５】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含める。本発明は、本明細書で示す具体的な実施形態の詳細な記載と組合せて、１つまたは複数のこれらの図面を参照することによってさらによく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、新規なＣｒｉｐｔｏ結合タンパク質の同定を示す図である。２９３Ｔ細胞を空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇでトランスフェクトし、抗Ｆｌａｇビーズで免疫沈降を施し、次いでＦｌａｇペプチドと溶出させた。材料および方法で記載したように、Ｃｒｉｐｔｏ関連タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで銀染色（Ａ）、またはニトロセルロースにブロッティング、抗ＧＲＰ７８または抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を用いたプローブ処理（Ｃ）のいずれかを施した。（Ａ）においてａおよびｂとして示すバンドは、材料および方法で記載したように摘出し質量分光分析に施した。ＧＲＰ７８として同定したバンドａに相当するマスフィンガープリントデータは（Ｂ）中に示す。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、Ｃｒｉｐｔｏが細胞表面でＧＲＰ７８と結合することを示す図である。示した構築物（Ａ〜Ｄ）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞およびＰ１９細胞（Ｄ）を、細胞不透過性ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンで標識した。細胞溶解物は示した抗体を使用して免疫沈降を施し、次いでＦｌａｇペプチドと溶出させ（ペプチド溶出）、またはサンプルバッファー中でビーズを加熱することによって免疫沈降を施した。材料および方法で記載したように、サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、アビジン−ＨＲＰまたは示した抗体でブロッティングした。いくつかの場合（ＢおよびＣ）、ＧＲＰ７８を過剰発現した２９３Ｔ細胞は細胞表面ビオチン化を受け、次いで生成した細胞溶解物はベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇビーズとインキュベートした。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ＲＮＡ干渉を使用したＧＲＰ７８発現の標的化低減を示す図である。ＨｅＬａ細胞にＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡ（Ｇ１）または空ベクターのいずれかを含有するレンチウイルスを感染させ、示したように未処理のままとするか、またはタプシガルギンで処置した。（Ａ）材料および方法で記載したように、抗ＧＲＰ７８または抗アクチン抗体を使用してウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析した。（Ｂ）材料および方法で記載したように、棒線は１００個のＧＦＰ陽性細胞当たりのアポトーシス細胞の数を表す。（Ｃ）ベクターまたはＧ１ｓｈＲＮＡウイルスを感染させた細胞に、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇを含有するウイルスを再度感染させた。これらの細胞からの溶解物に抗Ｆｌａｇビーズを使用して免疫沈降を施し、次いでＦｌａｇペプチドと溶出させた。材料および方法で記載したように、溶出タンパク質にアビジン−ＨＲＰ、抗ＧＲＰ７８および抗Ｃｒｉｐｔｏを使用してウエスタンブロットを施した。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、内因性ＧＲＰ７８発現の阻害がＴＧＦ−β誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化を高めることを示す図である。ＨｅＬａ細胞にＧＲＰ７８を標的化するｓｈＲＮＡ（Ｇ１）または空ベクターのいずれかを含有するレンチウイルスを感染させ、次いで示したように未処理のままとするか、または５μＭのタプシガルギンで処置した。一晩のタプシガルギン処置後、細胞を示した用量のＴＧＦ−β１（ＡおよびＢ）で処置し、次いで材料および方法で記載したように、ホスホ−Ｓｍａｄ２および全Ｓｍａｄ２のレベルをウエスタンブロットによって決定した。あるいは、示したように処置した同じ細胞を細胞不透過性ビオチンで標識し、生成した溶解物は抗ＧＲＰ７８抗体（抗ＫＤＥＬ）を用いた免疫沈降を施し、次にアビジン−ＨＲＰを使用してウエスタンブロッティングし（Ｃ）、または、材料および方法で記載したように、抗ＴβＲＩ、抗ＴβＲＩＩまたは抗アクチン抗体を使用して（Ｄ）、溶解物に直接ウエスタンブロッティングを施した。
【図５】図５は、ＧＲＰ７８はＴＧＦ−βＩ型およびＩＩ型受容体と直接結合しないことを示す図である。２９３Ｔ細胞をｐ２６−Ｆｌａｇ、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ、ＴβＲＩ−ＨＡまたはＴβＲＩＩ−Ｈｉｓでトランスフェクトし、次に示したように抗Ｆｌａｇ、抗ＨＡまたは抗Ｈｉｓ抗体を使用して免疫沈降を施した。材料および方法で記載したように、アビジン−ＨＲＰまたは示した抗体を使用してウエスタンブロッティングによって沈降したタンパク質を分析した。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することを示す図である。（Ａ）空ベクター、ＧＲＰ７８、Ｃｒｉｐｔｏまたは両方を感染させたＰＣ３細胞は、示したように未処理のままとするか、またはＴＧＦ−β１（１０ｐＭ）で処置した。ホスホ−Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）および全Ｓｍａｄ２（Ｓｍａｄ２）のレベルを、材料および方法で記載したようにウエスタンブロットによって決定した。（Ｂ）材料および方法で記載したように、（Ａ）からのホスホ−Ｓｍａｄ２のバンドを濃度測定を使用して定量化し、相当するＳｍａｄ２のバンドと比較して標準化した。（Ｃ）材料および方法で記載したように、ＰＣ３細胞溶解物を、抗ＴβＲＩＩ、抗ＴβＲＩおよび抗アクチンを示したように使用してウエスタンブロッティングに施した。（Ｄ）材料および方法で記載したように、細胞を９６ウエルプレート上に平板培養し、次いで８日後に細胞増殖を測定した。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは協同して、前立腺癌細胞の足場非依存性増殖に対するＴＧＦ−βの抗増殖効果を阻害することを示す図である。ベクター、ＧＲＰ７８、Ｃｒｉｐｔｏまたは両方を感染させたＰＣ３細胞を、材料および方法で記載したように、賦形剤または漸増用量のＴＧＦ−β１のいずれかの存在下において軟寒天中で、足場非依存性条件下で１５日間増殖させた。データは、示した用量のＴＧＦ−β１の有無の下において一視野内で計数したコロニーの数として（Ａ）、またはＴＧＦ−β１処置の不在下において計数したコロニーの数で割った、示したＴＧＦ−β１濃度の存在下において計数したコロニーの数として表す（基本率）（Ｂ）。（Ｃ）１００ｐＭのＴＧＦ−β１の存在下またはその不在下のいずれかで示した視野から得た写真。（Ｄ）Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の発癌機能を示すモデル。ＴＧＦ−βはＳｍａｄ２／３経路を介したシグナル伝達によって多くの細胞型の増殖を強く阻害する（左側）。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は相互作用して複合体を形成して、協同作用してＴＧＦ−β依存性Ｓｍａｄシグナル伝達および増殖阻害を弱める。さらに、それらは細胞増殖／生存を独立して増大させる。ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８の存在下で、ＴＧＦ−βはさらに細胞増殖を増大することができる（破線矢印）。
【図８】図８Ａ〜Ｇは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同してアクチビン、ノーダルおよびＴＧＦ−βシグナル伝達を制御することを示す図である。Ｃｒｉｐｔおよび／またはＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡを安定的に発現するＮＣＣＩＴ細胞を、示した抗体を使用してウエスタンブロット（Ａ）または無傷細胞表面ＥＬＩＳＡ（Ｂ）によって分析した。同じ細胞をアクチビン−Ａ（Ｃ）またはノーダル（Ｄ）で処置して、ホスホ−Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）およびＳｍａｄ２の生成したレベルはｐＳｍａｄ２およびＳｍａｄ２抗体を使用してウエスタンブロットによって測定した。示したタンパク質および／またはｓｈＲＮＡを過剰発現するＮＣＣＩＴ細胞（Ｅ）および２９３Ｔ細胞（Ｆ、Ｇ）はＳｍａｄ２応答性ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトし、示した用量のＴＧＦ−βリガンドで処置した。生成したルシフェラーゼ活性を標準化し、未処理サンプルに対する誘導倍数として表す。
【図９】図９Ａ〜Ｇは、細胞表面ＧＲＰ７８はヒトＥＳ細胞中でＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介することを示す図である。Ｈ９ヒトＥＳ細胞を、示した抗体を使用して無傷細胞ＥＬＩＳＡ（Ａ）または免疫蛍光（Ｂ）に施した。（Ｂ）中、抗Ｃｒｉｐｔｏ染色は緑色であり、抗ＧＲＰ７８染色は赤色である。（Ｃ）Ｈ９ＥＳ細胞を示したようにアクチビン−Ａまたはノーダルで処置し、ホスホ−Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）およびＳｍａｄ２の生成したレベルはｐＳｍａｄ２およびＳｍａｄ２抗体を使用してウエスタンブロットによって測定した。空ベクター（Ｄ）またはＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡ（Ｅ）を安定的に感染させたＮＣＣＩＴ細胞はＳｍａｄ２応答性ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトし、示したようにＮ−２０抗体の有無の下で示した用量のＴＧＦ−βリガンドで処置した。生成したルシフェラーゼ活性を標準化し、未処理サンプルに対する誘導倍数として表す。（Ｆ）野生型ＧＲＰ７８およびＮ−２０エピトープを欠くΔ１９〜６８ＧＲＰ７８構築物を示すダイアグラム。（Ｆ、Ｇ）示した構築物でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの溶解物は、示した抗ＨＡ、抗Ｆｌａｇおよび抗ＧＲＰ７８抗体を使用して免疫沈降およびウエスタンブロッティングに施した。＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０】図１０Ａ〜Ｆは、Ｃｒｉｐｔｏは、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路を活性化しＮＣＣＩＴ細胞の増殖を促進するために、ＧＲＰ７８受容体機能を必要とすることを示す図である。示したｓｈＲＮＡを安定的に発現するＮＣＣＩＴ細胞は血清飢餓状態であり、次いで示した用量の可溶性Ｃｒｉｐｔｏおよび示したようにＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４０００２）（Ａ）またはＭＥＫ１／２阻害剤（ＰＤ９８０５９）（Ｂ）のいずれかで処置した。細胞溶解物を、示したように抗ホスホＡｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ａｋｔ、ホスホ−ＧＳＫ３β（ｐＧＳＫ３β）およびアクチン抗体（Ａ）またはホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）およびＥＲＫ１／２抗体（Ｂ）を使用してウエスタンブロッティングに施した。（Ｃ）同じＮＣＣＩＴ細胞を示したようにＣｒｉｐｔｏで処置し、８日間増殖させ、次いでＣｙＱｕａｎｔ増殖アッセイキットを使用して増殖を測定した。（Ｄ）ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡを感染させたＮＣＣＩＴ細胞に、一定範囲用量のＮ−２０抗体またはＩｇＧ対照の存在下で１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏ結合を施した。Ｃｒｉｐｔｏ特異的結合は、過剰な非標識可溶性Ｃｒｉｐｔｏによって遮断される１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏ結合の量を表す。ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡを感染させたＮＣＣＩＴ細胞は、（Ｅ）血清飢餓状態であり、したがって示した用量のＩｇＧまたは抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０）による前処置後に示した用量の可溶性Ｃｒｉｐｔｏで処置し、または（Ｆ）示したようにＩｇＧまたは抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０）抗体による前処置後に可溶性Ｃｒｉｐｔｏで処置した。細胞はさらに８日間増殖させ、ＣｙＱｕａｎｔ増殖アッセイキットを使用して増殖を測定した。＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１Ａ〜Ｉは、細胞表面ＧＲＰ７８の免疫中和は、ヒト乳腺上皮細胞中のＣｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子の活性を遮断することを示す図である。空ベクターを感染させたヒト乳腺上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞に、ＩｇＧまたはＮ−２０抗体を使用した無傷細胞ＥＬＩＳＡ（Ａ）、または示したように一定範囲用量のＮ−２０抗体または対照ＩｇＧ抗体の存在下で１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏ結合（Ｂ）を施した。（Ｃ）空ベクターを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞は血清飢餓状態であり、次いで示したように、示した用量の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ、Ｎ−２０抗体および／またはＩｇＧで処置した。生成した細胞溶解物を、抗ホスホＴｙｒ（ｐＴｙｒ）抗体を用いた免疫沈降、および示したように抗ホスホＳｒｃ（ｐＳｒｃ、Ｙ４１６）または抗Ｓｒｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングに施した。（Ｄ）空ベクターを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞は血清飢餓状態であり、示した用量の可溶性Ｃｒｉｐｔｏで処置し、次いで細胞溶解物を、示したようにホスホＡｋｔ（ｐＡｋｔ）およびＡｋｔ抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。（Ｅ）空ベクター感染またはＣｒｉｐｔｏ感染ＭＣＦ１０Ａ細胞からの細胞溶解物を、示したようにＣｒｉｐｔｏおよびアクチン抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。空ベクターもしくはＣｒｉｐｔｏ（Ｆ）または空ベクター（Ｇ）のいずれかを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞を、示したように可溶性Ｃｒｉｐｔｏ、ＩｇＧおよび／またはＮ−２０抗体で処置した。細胞は８日間増殖させ、ＣｙＱｕａｎｔ増殖アッセイキットを使用して増殖を測定した。（Ｈ）空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞を、示したようにＩｇＧまたはＮ−２０抗体による前処置後に可溶性Ｃｒｉｐｔｏで処置した。Ｅ−カドヘリンおよびアクチン抗体を使用してウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析した。（Ｉ）空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞をＩｇＧまたはＮ−２０抗体で前処置し、平板培養して接着させた。生成した細胞の接着はＣｙＱｕａｎｔ接着アッセイを使用して定量化した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は、ＮＣＣＩＴおよびＭＣＦ１０Ａ細胞中のアクチビン−Ａおよびノーダルの増殖促進効果に必要とされることを示す図である。空ベクター、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡを感染させたＮＣＣＩＴ細胞（Ａ、Ｂ）、および空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞（Ｃ）は、示したように未処理のままとするか、またはＩｇＧもしくはＮ−２０抗体の有無の下においてアクチビン−Ａもしくはノーダルで処置した。細胞はさらに８日間増殖させ、ＣｙＱｕａｎｔ増殖アッセイキットを使用して増殖を測定した。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．００５；＊ｐ＜０．０１。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８が、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４およびＰＩ３Ｋを介したＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を阻害することを示す図である。２９３Ｔ細胞を、グルコース−６−ホスファターゼ−ルシフェラーゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ−Ｌｕｘ）およびｂ−ガラクトシダーゼ構築物と共に、空ベクター、ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ４発現ベクターで示したようにトランスフェクトした。さらに、細胞は（Ａ）空ベクター、（Ｂ）ＧＲＰ７８または（Ｃ）ＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８でトランスフェクトした。細胞は未処理のままとするか、または示したようにＣｒｉｐｔｏ（４００ｎｇ／ｍｌ）および／またはＬＹ２９４００２で処置した状態にした（ＬＹ）。生成したルシフェラーゼ活性をｂ−ガラクトシダーゼ発現に対して標準化し、未処理サンプルに対する変化倍数として表す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８のシグナル伝達およびアンタゴニズムの提案された機構を示すモデルの図である。（Ａ）細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体は、ＭＡＰＫ／ＰＩ３ＫおよびＳｍａｄ２／３経路を介した発癌性Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達に必要である。細胞表面ＧＲＰ７８とのＣｒｉｐｔｏの結合は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４を介したｃＳｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路の活性化をもたらす。細胞表面ＧＲＰ７８とのＣｒｉｐｔｏの結合は、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βリガンドによるシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの影響も助長し、低レベルのＳｍａｄ２／３活性化をもたらす。（Ｂ）細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の発癌機能を妨げる試薬には、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体、ＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８変異体およびｓＡＬＫ４−Ｌ７５Ａ−Ｆｃがある。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を阻害するための方法、および推定Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターをスクリーニングするための方法を提供することによって、従来技術の制約を克服する。Ｃｒｉｐｔｏは、脊椎動物胚発生およびヒト腫瘍の進行において重要な役割を有する、多機能細胞表面タンパク質である。それが多数のシグナル伝達経路を調節することは示されているが、その以前に同定された結合パートナーはその分子作用を完全には説明していない。本発明者らは、新規なＣｒｉｐｔｏ相互作用タンパク質の同定を目的とするスクリーニングを実施して、腫瘍細胞の表面でも発現されるグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、ＥＲシャペロンの同定に至った。以下の実施例中に示すように、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は多数の細胞系と細胞表面で相互作用し、それらの相互作用はＥＲ内の事前の結合と無関係である。内因性ＧＲＰ７８のｓｈＲＮＡノックダウンは高いＴＧＦ−βシグナル伝達をもたらし、Ｃｒｉｐｔｏと同様に、ＧＲＰ７８がこの経路を阻害することを示した。同時に発現すると、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは協同して、足場依存性または非依存性条件下で増殖する前立腺癌細胞のＳｍａｄリン酸化および増殖抑制を含めたＴＧＦ−β応答をアンタゴナイズする。以下の実施例は、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏを同時発現する細胞が、個々に１つのタンパク質を発現する細胞より、軟寒天中で一層より迅速に増殖する証拠をさらに与える。
【００２８】
ＧＲＰ７８／Ｃｒｉｐｔｏ複合体形成の阻害は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の妨害および細胞増殖の低下を可能にする。細胞表面ＧＲＰ７８の消失または免疫中和反応は、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ノーダルシグナル伝達、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナル伝達とＥＲＫ／ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３β経路の活性化のアンタゴニズムを遮断する。本発明者らは、ＧＲＰ７８はヒトＥＳ細胞の表面に存在し、そこでそれはＣｒｉｐｔｏと共局在化し、アクチビンおよびノーダルのシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの拮抗作用を仲介することを示している。さらに、細胞表面ＧＲＰ７８のノックダウンまたは免疫中和反応は、増大した細胞増殖、低下したＥ−カドヘリン発現および低下した細胞接着を引き起こすＣｒｉｐｔｏの能力を遮断する。本発明者らは、アクチビン−Ａは細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の不在下において細胞静止作用であった一方で、アクチビン−Ａとノーダルはいずれもそれらの存在下において細胞増殖を増大したことを発見した。総合すると、これらのデータは、細胞表面ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏシグナル伝達に必要とされることを示し、正常な胚発生および腫瘍形成中にＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏの機能を仲介するという考えを示唆する。
【００２９】
Ｉ．ＣＲＩＰＴＯ
Ｃｒｉｐｔｏは、発生および癌進行中に重要な役割を有するＧＰＩアンカー型シグナル伝達タンパク質である（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。発生中のマウス胚では、Ｃｒｉｐｔｏは前後軸の正確な確立および胚葉形成および心臓発生に必要とされる。Ｃｒｉｐｔｏは、多能性の維持および分化において重要な役割を有する、胚幹細胞のマーカーとしても認識されている（Ａｄｅｗｕｍｉら、２００７年、Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。Ｃｒｉｐｔｏの発現は正常成体組織において一般に低いまたは存在せず、多くのヒト固形腫瘍中では高レベルで、その過剰発現は足場非依存性成長、増殖、生存、移動、浸潤、血管新生およびＥＭＴを促進することが分かっている（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。ＭＭＴＶ−ＣｒｉｐｔｏおよびＷＡＰ−Ｃｒｉｐｔｏマウスは乳腺腫瘍を発症し（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年、Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００４年、Ｓｕｎら、２００５年、Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒら、２００５年）、Ｃｒｉｐｔｏを標的化するモノクローナル抗体はヌードマウス中で腫瘍異種移植片の増殖を低減するので、Ｃｒｉｐｔｏはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖も促進する（Ａｄｋｉｎｓら、２００３年、Ｘｉｎｇら、２００４年）。
【００３０】
他の増殖因子と同様に、ＣｒｉｐｔｏはそのＧＰＩアンカーの切断後に細胞から放出される可能性があり、可溶形のＣｒｉｐｔｏは細胞分裂促進性ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化することが示されている（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。Ｃｒｉｐｔｏは、ノーダル（Ｓｃｈｉｅｒ、２００３年、Ｓｈｅｎ、２００７年）、ＧＤＦ１（Ｃｈｅｎｇら、２００３年）およびＧＤＦ３（Ｃｈｅｎら、２００６年）などのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーに必要な共受容体としても働く。この共受容体の機能は胚発生中に必要不可欠であり（Ｓｃｈｉｅｒ、２００３年、Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）、Ｃｒｉｐｔｏとノーダルが妊娠および授乳中に乳腺において同時発現される事実（Ｂｉａｎｃｏら、２００２ａ）によって示されるように、成体中の正常組織の増殖およびリモデリングを制御することができる。Ｃｒｉｐｔｏ共受容体の機能は腫瘍増殖も促進することができる。ノーダルシグナル伝達は、ヒトメラノーマおよび乳癌細胞の可塑性および腫瘍形成を促進する際に重要な役割を果たすことが近年示されたからである（Ｐｏｓｔｏｖｉｔら、２００８年、Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａら、２００６年）。さらにＣｒｉｐｔｏは、アクチビン（Ａｄｋｉｎｓ）（Ｇｒａｙら、２００３年、Ｋｅｌｂｅｒら、２００８年）およびＴＧＦ−β１（Ｇｒａｙら、２００６年）によるシグナル伝達を阻害し、ヒト乳腺上皮細胞および前立腺癌細胞に対するＴＧＦ−β１依存性抗増殖効果を阻害する（Ｇｒａｙら、２００６年、Ｓｈａｎｉら、２００８年）。したがってＣｒｉｐｔｏは、増殖／生存経路を活性化すること、および腫瘍抑制経路を阻害することによって腫瘍形成を促進することができる（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。
【００３１】
ＩＩ．ＧＲＰ７８
本発明者らは、新規なＣｒｉｐｔｏの結合パートナーとしてのＧＲＰ７８を同定しており、この２つのタンパク質は、細胞静止ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害し腫瘍細胞増殖を促進する細胞表面複合体を形成することを示している。タンパク質フォールディング、成熟および集合を助長し小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）も調節するＥＲシャペロンとして、ＧＲＰ７８は大々的に特徴付けられている（Ｂｅｒｎａｌｅｓら、２００６年、Ｌｅｅ、２００５年、Ｌｅｅ、２００１年）。ＧＲＰ７８は低酸素症および栄養枯渇の条件下で誘導され、腫瘍細胞において高レベルで発見される（Ｌｅｅ、２００７年）。腫瘍進行中ＧＲＰ７８に必要な役割に関する証拠は、アンチセンスを用いた線維肉腫細胞中でのＧＲＰ７８誘導の阻害によって、それらはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのその増殖に影響を与えずにヌードマウス中で腫瘍を形成することが完全にできなくなったという実証から最初に浮上した（Ｊａｍｏｒａら、１９９６年）。さらに、ＧＲＰ７８プロモーターによって誘導された、線維肉腫および乳癌腫瘍細胞への自殺トランス遺伝子の送達は、マウス中の大きな腫瘍の完全な撲滅を引き起こした（Ｃｈｅｎら、２０００年、Ｄｏｎｇら、２００４年、Ｇａｚｉｔら、１９９９年）。したがって、固形腫瘍内で見られる環境はＧＲＰ７８の誘導を引き起こし、その発現は腫瘍増殖を容易にする。
【００３２】
ＧＲＰ７８はＥＲ内に主に存在するが、それは膜貫通タンパク質として存在する可能性があり（Ｒｅｄｄｙら、２００３年）、タプシガルギンによる処置後にヒト横紋筋肉腫細胞中で最初に実証されたように、腫瘍細胞中では原形質膜に局在する（ＤｅｌｐｉｎｏおよびＣａｓｔｅｌｌｉ、２００２年、Ｄｅｌｐｉｎｏら、１９９８年）。後に、細胞表面プロテオームの全体プロファイリングによって、ＧＲＰ７８は腫瘍細胞において表面に露出していることを確認している（Ｓｈｉｎら、２００３年）。実際ＧＲＰ７８は、ウイルスの共受容体として細胞表面でＭＨＣクラスＩと一緒に機能すること（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕら、２００２年）、およびプラスミノゲン由来Ｋｒｉｎｇｌｅ５ドメイン（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００５年）および活性化α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（Ｍｉｓｒａら、２００２年、Ｍｉｓｒａら、２００４年）の受容体として作用することが示されている。特に、ＧＲＰ７８受容体の機能は、増大した細胞増殖および抗アポトーシス挙動をもたらす増殖経路の活性化を引き起こすことが示された（Ｍｉｓｒａら、２００６年、Ｍｉｓｒａら、２００５年、Ｍｉｓｒａら、２００４年）。このようなＧＲＰ７８受容体の機能は、ＧＲＰ７８に対する自己抗体の存在は増大した前立腺癌進行および低下した患者の生存率と関連しているという観察結果から癌関連の妥当性を導く（Ｍｉｎｔｚら、２００３年）。さらに、癌の進行中のＧＲＰ７８に関する因果的役割は、原形質膜におけるＧＲＰ７８を標的化する自殺ペプチドが、腫瘍細胞を選択的に殺傷することが実証された発見によって支持される（Ａｒａｐら、２００４年）。重要なことに、これらの発見は癌療法のための推定標的としての細胞表面ＧＲＰ７８を確認する。
【００３３】
ＩＩＩ．ＣＲＩＰＴＯとＧＲＰ７８は結合して、細胞増殖を促進する細胞内シグナル伝達を引き起こす
Ｃｒｉｐｔｏが腫瘍細胞の表面でＧＲＰ７８と結合するという証拠に基づいて、本発明者らは、ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏ受容体として機能する可能性を評価した。この仮説と一致して、以下の実施例中に示すように、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、腫瘍細胞、ＥＳ細胞および乳腺上皮細胞中のＣｒｉｐｔｏシグナル伝達に必要とされる。
【００３４】
ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、いくつかの下流細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。例えば、以下の実施例中に示すように、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、必須ノーダル共受容体およびアクチビンとＴＧＦ−βシグナル伝達のアンタゴニストとしてのＣｒｉｐｔｏ機能に必要である。ＧＲＰ７８受容体の機能は、ｃ−Ｓｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路の活性化を含めた可溶性Ｃｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子の活性、増大した細胞増殖、低下したＥ−カドヘリン発現および低下した細胞接着を仲介する。アクチビン−ＡおよびノーダルにはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の存在下で増殖促進効果があり、一方アクチビン−Ａは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体が妨害されるとき抗増殖性である。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、これらの発見は、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βおよびＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に対するＣｒｉｐｔｏの発生および発癌効果に必要とされる細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ受容体／共因子としてＧＲＰ７８が機能することを示す。
【００３５】
Ａ．ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏはＥＲ内の事前の結合を必要とせずに細胞表面で複合体を形成する
以下の実施例中に示すように、ＧＲＰ７８は細胞表面でＣｒｉｐｔｏと複合体を形成する。これは、機能的および潜在的な治療との関連を有する発見である。この相互作用は特異的および排他的であったようである。ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏと同時精製することを観察したわずか２つの細胞表面タンパク質の１つであったからであり、Ｃｒｉｐｔｏと大きさが類似した無関係な膜貫通タンパク質はＧＲＰ７８と同時精製しなかったからである。同様に、Ｉ型とＩＩ型両方のＴＧＦ−β受容体が同じ条件下でＧＲＰ７８を免疫沈降することができなかった。さらにこれらの結果は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合はＧＲＰ７８ＥＲシャペロンの機能に依存しないことを示す。それらの相互作用は、個別の細胞集団内でのこれらのタンパク質の成熟およびプロセシング後に無細胞環境中で観察されたからである。さらにこれらの結果は、細胞表面におけるこの複合体の存在を支持する。これらの条件下でＣｒｉｐｔｏと結合することが示されたＧＲＰ７８は原形質膜に由来したからである。さらにこの結果は、この特異的結合相互作用に必要とされる情報はこの２つのタンパク質の三次構造内に完全に含有され得ることを示唆し、それらの相互作用を特異的に妨害する分子を使用して腫瘍細胞を標的化することができると予想される。
【００３６】
本発明者らは、内因性Ｃｒｉｐｔｏおよび内因性ＧＲＰ７８は、マウス胚癌細胞の表面に由来する複合体として単離することができたことを発見した。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、この発見は、原形質膜におけるシグナル伝達共因子としてのそれらの相互作用に関する固有の役割をさらに支持し、ＧＲＰ７８は単にＥＲ中の過剰発現Ｃｒｉｐｔｏのフォールディングにおいて役割を果たす可能性を再度論じる。本発明者らは、免疫細胞化学により同じ細胞中のＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の局在化も調べており、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は、その一部分が細胞表面に存在した点状構造中に主に共局在化したことを発見している。これらの発見はＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は原形質膜で一緒に働くという結論を支持するが、シグナル伝達タンパク質に一般的であるように小胞輸送中にそれらが結合することも示す。さらに、細胞表面染色の点状性は、この２つのタンパク質が脂質ラフトと結合することを示す以前の報告と一致する（ＴｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕおよびＴｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ、２００３年、Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年）。
【００３７】
Ｂ．ＧＲＰ７８は細胞表面受容体として機能する
ＧＲＰ７８はＵＰＲのシャペロンおよびコーディネーターとしてＥＲにおいて保護的役割を有するが、それはその機能があまり理解されていない細胞表面で発現される可能性もある。細胞表面ＧＲＰ７８は原発性ヒト乳癌サンプルにおける腫瘍特異的抗原として同定されており、ＧＲＰ７８を標的化する自己抗体は前立腺癌患者の血清中に見られ、増大した癌悪性度のバイオマーカーとして働くことが示された（Ａｒａｐら、２００４年、Ｍｉｎｔｚら、２００３年）。さらに、アポトーシス誘導型配列と融合したＧＲＰ７８結合モチーフで構成されるキメラペプチドは、前立腺および乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害した（Ａｒａｐら、２００４年、Ｌｉｕら、２００７年）。このデータは、ＧＲＰ７８は腫瘍細胞の選択的細胞表面マーカーであるだけでなく、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βおよびＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの影響を仲介する受容体／共因子でもあることを実証する。ＧＲＰ７８とアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達の間の機能的関連の発見は特有であるようであるが、以前の試験は、細胞表面ＧＲＰ７８は受容体活性を有し、増殖／生存シグナル伝達を仲介することができることを示している。例えば、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）は細胞表面ＧＲＰ７８を介してシグナル伝達して、１−ＬＮ前立腺癌細胞中でＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の活性化を引き起こし、増殖促進および抗アポトーシス挙動をもたらす（Ｍｉｓｒａら、２００６年、Ｍｉｓｒａら、２００４年）。ＧＲＰ７８を標的化する前立腺癌患者の血清由来の抗体は、ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路を活性化し、細胞増殖を増大することが同様に示された。興味深いことに、細胞表面ＧＲＰ７８は、内皮細胞中でＡｋｔを介したＧＰＩアンカー型Ｔ−カドヘリン依存性の生存シグナル伝達を仲介する際に必要な役割を有することも示された（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａら、２００８年）。Ｃｒｉｐｔｏ、Ｔ−カドヘリンおよびＧＲＰ７８は脂質ラフトにそれぞれ局在し、ＧＲＰ７８受容体機能はこれらの原形質膜ミクロドメインに限られる可能性があることを示唆した。
【００３８】
以下の結果は、ＴＧＦ−βリガンドおよびそれらの受容体と機能的に相互作用するＣｒｉｐｔｏの能力に、ＧＲＰ７８が必要とされることを示す。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、本発明者らは、ＧＲＰ７８は、Ｃｒｉｐｔｏがそれに必要とされる立体配座または配向をとり、ＴＧＦ−βリガンドおよびそれらの受容体と複合体を形成し、それらのシグナル伝達性を変えることを可能にするアンカーまたは足場として、原形質膜で働くことができると予想する。ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣはＧＲＰ７８との結合、およびＩ型シグナル伝達受容体ＡＬＫ４およびＡＬＫ７との結合も仲介する。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８またはＡＬＫ４／７の間の結合相互作用は相互排他的ではないが、ＧＲＰ７８は、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４／７とノーダルおよびアクチビンなどのリガンドの間の複合体形成を容易にすることができると予想する。ＴＧＦ−βリガンドシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの影響の必須メディエーターとしてのその役割以外に、これらの結果は、ＧＲＰ７８は可溶性Ｃｒｉｐｔｏと結合してＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路を活性化することも示す。この発見は、ＧＲＰ７８は膜貫通型受容体として作用するか、または一方もしくは両方と結合するかのいずれかであることを示唆する。ＧＲＰ７８は一般にＥＲ内腔限定の可溶性タンパク質であると考えられているが、大部分のＧＲＰ７８は２つの推定膜貫通型αらせんを有する内在性膜タンパク質として存在することが示された（Ｒｅｄｄｙら、２００３年）。ＲｅｄｄｙらはＥＲマイクロソームの限られたトリプシン消化を使用して、膜結合ＧＲＰ７８のＮ−およびＣ−末端領域はＥＲ内腔／細胞外性であり、一方中央の第三のタンパク質は細胞質であることを示した（Ｒｅｄｄｙら、２００３年）。この非通常型の膜貫通形状は、細胞外タンパク質がそのＮ−またはＣ−末端付近でＧＲＰ７８と結合することが示されている事実と一致する（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００５年、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗら、２００６年、Ｊａｋｏｂｓｅｎら、２００７年、Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａら、２００８年）。
【００３９】
Ｃ．ＣｒｉｐｔｏはＧＲＰ７８のＮ末端付近に結合する
以下のデータは、ＣｒｉｐｔｏがＧＲＰ７８のＮ−末端の最末端と結合することを示す。いずれのＮ−末端Ｎ−２０抗体も結合を遮断し、Ｎ−２０エピトープを欠くＧＲＰ７８欠失変異体はＣｒｉｐｔｏと結合することができなかったからである。Ｎ−２０抗体はＫｒｉｎｇｌｅ５（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００５年）およびＴ−カドヘリン（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａら、２００８年）の細胞効果を競合的に遮断することも示されており、これらのタンパク質はＧＲＰ７８のＮ−末端と結合することが示された。さらに、α２−Ｍおよび増殖促進性前立腺癌患者由来の自己抗体は、Ｎ−２０エピトープと隣接したＧＲＰ７８のＮ−末端に局在した部位に結合する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗら、２００６年）。これらの細胞外タンパク質のそれぞれがＧＲＰ７８のＮ−末端の最末端と結合するという事実は、それらがＧＲＰ７８受容体機能を活性化する類似した形態を有し得ること、およびさらにそれらがＧＲＰ７８結合に関して互いに競合する可能性があることを示唆する。
【００４０】
Ｄ．ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインと結合する
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の相互作用の特異性は、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインはＧＲＰ７８の結合に必要かつ十分であったようであるという実証によってさらに支持された。この発見はさらに注目に値する。本発明者らが以前に示したように（Ｇｒａｙら、２００６年）、そのＣＦＣドメインを介してＧＲＰ７８と同時に結合しながら、ＣｒｉｐｔｏがそのＥＧＦ様ドメインを介してＴＧＦ−βと結合する可能性があることを、それが示唆するからである。本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏ、ＧＲＰ７８、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β受容体を含有する高次タンパク質複合体はさらに、低減および／または改変型ＴＧＦ−βシグナル伝達を形成しもたらす可能性があると推測する。さらに、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインがＧＲＰ７８と結合するという観察結果は、ノーダルおよびアクチビンなどの他のＴＧＦ−βリガンドによるシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ調節に対するＧＲＰ７８の考えられる影響に関してさらに適合性がある。例えば、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインはアクチビン／ノーダルＩ型受容体ＡＬＫ４と特異的に結合し（ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１年）、したがってＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏの結合に関してＡＬＫ４と競合し得ることは以前に示されている。あるいは、ＧＲＰ７８はＡＬＫ４、Ｃｒｉｐｔｏおよびアクチビン／ノーダルを含有するタンパク質複合体に関与し得る。
【００４１】
Ｅ．Ｃｒｉｐｔｏ結合ＧＲＰ７８の標的化ノックダウンはＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する
多系統の証拠が、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はそれぞれ腫瘍形成を促進し、両方のタンパク質は癌細胞の細胞表面で選択的に発現されることを示している。本明細書に記載するように、いずれも腫瘍増殖の促進に以前から関与するこの２つのタンパク質は、細胞表面で複合体を形成することが現在発見された。この発見は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害によって物理的およびさらに機械的にこれらのタンパク質と関係がある。
【００４２】
当初、ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＧＲＰ７８の役割は、原形質膜でＣｒｉｐｔｏと結合したＧＲＰ７８のレベルを低減することができるｓｈＲＮＡを開発することによって評価した。このｓｈＲＮＡ（配列番号５）はＴＧＦ−β依存性のＳｍａｄ２リン酸化を高め、内因性ＧＲＰ７８はＴＧＦ−βシグナル伝達を制限することができる証拠を与えた。本発明者らの知識によれば、この発見は、ＧＲＰ７８がＴＧＦ−βシグナル伝達に影響を与え、および、有意にはそれは、細胞表面ＧＲＰ７８がその発癌性メッセージを伝え得る新規な機構を構成する最初の実証となる。この結果は、内因性Ｃｒｉｐｔｏはこれらの細胞中で同様の役割を有するという以前の実証（Ｇｒａｙら、２００６年）にも適合し、ＧＲＰ７８は細胞表面でＣｒｉｐｔｏと結合して増殖−阻害ＴＧＦ−βシグナル伝達をアンタゴナイズするという仮説と一致する。
【００４３】
Ｆ．ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは、協同してヒト前立腺癌細胞中で細胞静止ＴＧＦ−βシグナル伝達を弱め増殖を高める
ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは、一緒に発現するとき別々に発現するときより高い程度で、ＴＧＦ−β依存性のＳｍａｄ２リン酸化を阻害するという実証は、それらは一緒に機能してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することを示す。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、Ｓｍａｄリン酸化のレベルは受容体活性化の程度に直接依存するので、この結果は、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は、その受容体を活性化するＴＧＦ−βの能力を低減させることによってそれらの阻害効果を発揮することを示唆する。このような解釈は、これらの細胞中でのＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８の過剰発現が、ＴＧＦ−β受容体レベルを変えることはないという事実によってさらに支持される。さらに、ＧＲＰ７８とＩ型またはＩＩ型いずれかの受容体ＴＧＦ−βの間の直接相互作用を検出できないことは、ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏとの結合またはＴＧＦ−βもしくは両方との直接結合によって、ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するその阻害効果を発揮し得ることを示唆する。
【００４４】
本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同的に機能して細胞増殖を高め、ＴＧＦ−βの細胞静止効果を阻害することをさらに示している。細胞は足場依存性条件下で増殖すると、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はＴＧＦ−βの増殖阻害効果をそれぞれ弱め、および興味深いことに、これらの同時発現はＴＧＦ−βを抗増殖性から増殖促進性に変えた。ＴＧＦ−βへの細胞の増殖応答に対するＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８のこの結合効果の根底にある機構は依然決定されていないが、ＴＧＦ−βはその細胞静止効果が消失した条件下で増殖／生存を増大することが示された（ＰａｒａｄａｌｉおよびＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７年）。同様に本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が、足場非依存性条件下でＴＧＦ−βの細胞静止効果を遮断する協同能力を有したことを発見した。しかし、単層中で観察したことと異なり、ＴＧＦ−β処置は軟寒天中でＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８を同時発現する細胞の増殖を高めなかった。別の違いは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏが、別々に発現したとき、およびより顕著には、同時発現したときの両方で、ＴＧＦ−β処置の不在下において、軟寒天中でコロニー増殖を増大したことであった。
【００４５】
したがって、これらの結果は、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏが、具体的な増殖条件に応じて変わる形式で、細胞増殖およびＴＧＦ−βの応答性に影響を与えることを示す。異なるシグナル伝達経路が、足場非依存性条件ではなく足場依存性条件下で増殖した細胞中の環境に応答して活性化される可能性がある。例えば、腫瘍細胞はＦＡＫおよびＳｒｃなどのシグナル伝達経路を利用して、足場非依存性増殖を容易にし、アノイキスを回避する（ＭｉｔｒａおよびＳｃｈｌａｅｐｆｅｒ、２００６年）。したがって、具体的な機構は依然として解明されていないが、特定の増殖設定と具体的に関係があるシグナル伝達経路を有するＴＧＦ−βからのシグナルの収束は、増殖効果の微妙な差をもたらす可能性がある。しかし、これらの差にもかかわらず、本発明者らは、ＴＧＦ−β応答性に対するＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の影響は、両方のタンパク質が個別に発現されたときより一緒に発現されたときに大きかったことを観察し、一貫して発見している。したがって、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ−ＧＲＰ７８複合体は、足場依存性と足場非依存性増殖条件の両方の下において、細胞静止ＴＧＦ−β応答を阻害する際に明らかで一貫した役割を示した。
【００４６】
ＴＧＦ−βは主な腫瘍抑制因子であり、その細胞静止機能の消失は腫瘍の発生および進行と関係がある（ＰａｒｄａｌｉおよびＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７年）。増殖阻害ＴＧＦ−βシグナル伝達のこの消失は、受容体シグナル伝達の低減、低下したＳｍａｄ機能、または細胞静止プログラムを一緒に構成する転写制御因子もしくはそれらの標的の妨害に原因がある可能性がある（ＳｉｅｇｅｌおよびＭａｓｓａｇｕｅ、２００３年）。実際、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、その抗増殖効果に耐性がある腫瘍の増殖および蔓延を悪化させることが多い（ＰａｒｄａｌｉおよびＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７年）。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はそれぞれ別々にヒトの癌進行に関与しており、これらのタンパク質のそれぞれが腫瘍細胞の表面上で選択的に発現される。ここで本発明者らは、この２つのタンパク質が細胞表面で物理的に相互作用する証拠を与えている。本発明者らは、それらが協同して腫瘍細胞の増殖を高め、ＴＧＦ−βの腫瘍抑制効果を逆行させる実証をさらに与えている。いかなる理論によっても縛られることは望まずに、これらの結果は、この複合体は増大した悪性をもたらし、それは受容体レベルでのＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害によって腫瘍細胞に対する競合増殖利点を与えるという考えを支持する。これらの発見を鑑みて、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ−ＧＲＰ７８複合体は、それらの正常組織細胞ではなく癌細胞のみに影響を与える、その固有の選択的利点のため、有意な治療可能性を有する望ましい標的を表すと予想される。
【００４７】
Ｇ．ＧＲＰ７８／Ｃｒｉｐｔｏ／ＴＧＦ−βリガンド
これらの結果は、ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏ共受容体機能を仲介し、胚形成および幹細胞制御中の細胞表面ＧＲＰ７８に関する新規で必須の役割を示すことを明らかにする。Ｃｒｉｐｔｏは胚発生中にノーダルおよび関連ＴＧＦ−βリガンドの共受容体として重要な役割を果たし、ゼブラフィッシュおよびマウスにおける遺伝学的研究は、Ｃｒｉｐｔｏおよび関連ＥＧＦ−ＣＦＣタンパク質が、中胚葉および内胚葉形成、心臓発生、および左／右非対称性の確立に必要とされることを示している。Ｃｒｉｐｔｏは胚幹細胞のマーカーとしても認識されており、幹細胞の維持および分化において重要な役割を果たす。Ｃｒｉｐｔｏを含まないマウスから生じたＥＳＣは心筋形成を経て、自然にニューロンに分化することができない。以下の実施例中に示すように、内因性ＧＲＰ７８は、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ノーダルシグナル伝達を含めたＣｒｉｐｔｏシグナル伝達の必須メディエーターである。さらに本発明者らは、ＧＲＰ７８はヒトＥＳ細胞の表面に存在し、そこでそれはＣｒｉｐｔｏと共局在化するという実証を与えている。ｈＥＳ細胞上でのＧＲＰ７８の抗体遮断はノーダルシグナル伝達を遮断し、ＧＲＰ７８がこれらの細胞中でノーダルシグナル伝達に必要であることが示された。これらの結果は、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の界面の標的化は、ニューロンへのｈＥＳ細胞の優先的分化を必要とする神経変性疾患用の細胞ベースの療法を手助けすることができることを支持する。
【００４８】
いくつかの研究も、腫瘍表現型を促進する際のアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ調節に関する役割を支持する（Ａｄｋｉｎｓら、２００３年、Ｇｒａｙら、２００３年、Ｇｒａｙら、２００６年、Ｓａｌｏｍｏｎ、２００６年、Ｓｈａｎｉら、２００８年、Ｓｈｅｎ、２００３年、Ｓｈｕｋｌａら、２００８年、Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａら、２００６年）。ＣｒｉｐｔｏはＴＧＦ−βシグナル伝達、ならびに乳腺上皮細胞（Ｇｒａｙら、２００６年）および初代ケラチン生成細胞（Ｓｈｕｋｌａら、２００８年）に対するＴＧＦ−βの細胞静止効果を阻害する。Ｃｒｉｐｔｏは、前立腺癌細胞に対するＴＧＦ−βの抗増殖効果、ＧＲＰ７８の過剰発現によって高められた効果も阻害した（Ｓｈａｎｉら、２００８年）。ＴＧＦ−βと同様に、アクチビン−Ａは大部分の上皮細胞の増殖を阻害し、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナル伝達のアンタゴニズムは発癌性のＣｒｉｐｔｏの機構として提案されている。対照的に、ノーダルはメラノーマおよび乳癌の可塑性および腫瘍形成を促進することが示されており（Ｈｅｎｄｒｉｘら、２００７年、Ｐｏｓｔｏｖｉｔら、２００８年、Ｓａｌｏｍｏｎ、２００６年、Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａら、２００６年）、これらの結果は、これがＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８を介したシグナル伝達を必要とする可能性があることを示唆する。本発明の試験において、本発明者らは、ｓｈＲＮＡまたはＮ−２０ＧＲＰ７８遮断抗体を使用したＮＣＣＩＴ細胞上の細胞表面ＧＲＰ７８の標的化によって、アクチビン、ＴＧＦ−βおよびノーダルによるシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの影響が消失したことを示している。この影響はＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の相互作用によっておそらく仲介された。両タンパク質一緒のノックダウンには、いずれかのタンパク質のみのノックダウンより一層顕著な影響があったからである。重要なことに、これは、内因性Ｃｒｉｐｔｏがアクチビン−Ａおよびアクチビン−Ｂシグナル伝達を阻害する最初の実証となり、内因性ＣｒｉｐｔｏがＴＧＦ−βによるシグナル伝達を遮断するという以前の実証を確認する。さらにこれらの発見は、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏの、これらのおそらく発癌性である影響に必要とされるＣｒｉｐｔｏ共因子としてのＧＲＰ７８に関する新規な役割を支持する。
【００４９】
Ｈ．ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏ増殖因子活性を仲介する
アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するその影響以外に、Ｃｒｉｐｔｏは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路も活性化する（Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓら、１９９７年、Ｅｂｅｒｔら、１９９９年、Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。これらの経路は大部分のヒトの癌において異常に活性化され、増大した腫瘍細胞の生存および増殖を含めた多数の腫瘍形成結果を促進するそれらの能力は広く認められている（Ｄｈｉｌｌｏｎら、２００７年、ＳｈａｗおよびＣａｎｔｌｅｙ、２００６年）。可溶性Ｃｒｉｐｔｏを用いたＨＣ−１１乳腺上皮細胞の処置は、ＳＨ２−アダプタータンパク質Ｓｈｃのチロシンリン酸化、Ｇｒｂ２とＳｈｃの結合、およびｐ４２／４４Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路の活性化をもたらすことが示された（Ｋａｎｎａｎら、１９９７年）。可溶性ＣｒｉｐｔｏはＰＩ３Ｋのｐ８５制御サブユニットのリン酸化も引き起こし、ＳｉＨａ子宮頸癌細胞中でＡｋｔのリン酸化および活性化をもたらした（Ｅｂｅｒｔら、１９９９年）。ＣｒｉｐｔｏはＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーと結合せず（Ｋａｎｎａｎら、１９９７年）、可溶性ＣｒｉｐｔｏによるＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路の活性化はＡＬＫ４非依存性であることが報告された（Ｂｉａｎｃｏら、２００２ｂ）。ｃ−Ｓｒｃは可溶性Ｃｒｉｐｔｏを用いた細胞の処置後に活性化され、ｃ−Ｓｒｃの活性化はＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路のＣｒｉｐｔｏ依存性活性化に必要である（Ｂｉａｎｃｏら、２００３年）。さらに、ＧＰＩアンカー型プロテオグリカングリピカン−１はＣｒｉｐｔｏと結合し、Ｃｒｉｐｔｏ依存性のｃ−Ｓｒｃ活性化を容易にすることが報告された（Ｂｉａｎｃｏら、２００３年）。しかし、ｃ−Ｓｒｃ活性化およびＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達を仲介する膜貫通型Ｃｒｉｐｔｏ受容体は依然同定されていない。以下のデータは、細胞表面ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子活性を仲介することを実証する。
【００５０】
Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体はＡｋｔ／Ｅｒｋシグナル伝達にも影響を与える。ＮＣＣＩＴ細胞におけるＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体のノックダウンまたは抗体による妨害は、Ａｋｔ、ＧＳＫ３ｂおよびｐ４２／４４の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ誘導型リン酸化を遮断した。
【００５１】
Ｉ．Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体はアクチビン−Ａおよびノーダルの増殖効果を変える
アクチビン、ノーダルおよびＴＧＦ−βリガンドに応答したＳｍａｄ２／３シグナル伝達は、細胞型および細胞状態に応じて細胞増殖、アポトーシスおよび分化に対して変動的およびさらに拮抗作用を有する可能性がある。Ｓｍａｄ２／３経路の腫瘍抑制機能は十分特徴付けられており、多数の細胞型の細胞増殖を阻害する、およびいくつかの場合末期分化またはアポトーシスを引き起こすその能力に由来する。Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達下流の細胞静止転写プログラムは正常組織の恒常性に重要であり、腫瘍抑制およびこの経路中の妨害または変化が乳癌を含めたいくつかの型のヒトの癌において観察されていることは現在十分確定している。しかし、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βリガンドが、腫瘍細胞がＳｍａｄ２／３経路の抗増殖効果に耐性がある状態である条件下で腫瘍表現型を悪化させる可能性もある。腫瘍細胞は一般に、間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞を含めた腫瘍微小環境内の腫瘍細胞および他の細胞型に作用する高レベルのこれらのリガンドを分泌する。この文脈におけるＳｍａｄ２／３経路の活性化は、腫瘍細胞の増大した増殖、運動性、浸潤および上皮間葉移行（ＥＭＴ）、ならびに増大した血管新生および低下した免疫学的監視を引き起こす可能性がある。集合的に、これらの影響は増大した腫瘍増殖および転移をもたらす可能性があり、ヒトの癌中のＴＧＦ−βシグナル伝達の遮断を目的とする治療効果をもたらしている。
【００５２】
本発明者らは、アクチビン−Ａは、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の有無に応じて、細胞増殖に対して拮抗作用を有することも示している。アクチビン−Ａは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体が完全であった空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞およびＣｒｉｐｔｏ過剰発現ＭＣＦ１０Ａ細胞に対して増殖促進効果を有していた。対照的に、アクチビン−Ａは、これらの細胞中のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体がノックダウンまたはＮ−２０抗体遮断により破壊されたとき、抗増殖効果を有していた。アクチビン−Ａと同様に、ノーダルは、それらが完全Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体を発現したときこれらの細胞中で増殖を増大させた。しかし、アクチビン−Ａと異なり、ノーダルは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体が破壊された細胞の増殖に対しては全く効果がなかった。アクチビン−Ａとノーダルの間のこの違いは、Ｃｒｉｐｔｏはアクチビン−Ａシグナル伝達ではなくノーダルシグナル伝達に必要とされるという事実をおそらく反映する。これらのデータは、細胞表面上のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体は、ノーダルの細胞分裂促進効果を助長し、アクチビン−Ａの細胞静止性から増殖促進性への変化を引き起こすことによって腫瘍増殖を促進することができることを示す。したがって、Ｃｒｉｐｔｏは細胞応答を引き起こし上皮細胞静止性から間葉増殖促進性に変化させ、これは腫瘍細胞がＳｍａｄ２／３の細胞静止効果に耐性がある状態になるときに見られるのと似ている。これらの結果は、それによってアクチビンおよびノーダルが腫瘍形成促進状態になる機構を示唆し、この効果はＧＲＰ７８依存性であるようである。興味深いことに本発明者らは、アクチビン−ＡおよびノーダルはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の存在下で細胞分裂促進性であり、一方アクチビン−Ａは細胞静止作用を有しており、ノーダルはこれらの複合体の不在下では増殖に全く効果がなかったことを発見した。したがって、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体は、細胞静止性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達を引き起こして増殖促進性の状態にするＭＡＰＫ／ＰＩ３ＫとＳｍａｄ２／３経路の間のクロストークを促進することができる。したがって、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体は、細胞シグナル伝達の中心点として機能して多数の腫瘍および幹細胞の挙動を制御する。
【００５３】
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の相互作用の生物学的関連性は、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は重複した分布および機能を有するという事実によって支持される。Ｃｒｉｐｔｏ（Ｄｉｎｇら、１９９８年）およびＧＲＰ７８（Ｌｕｏら、２００６年）ノックアウトマウスはいずれも初期胚致死となる。Ｃｒｉｐｔｏは胚幹細胞の挙動を制御することもでき（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ、２００５年）、本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が幹細胞中に共局在化し、アクチビンおよびノーダルシグナル伝達を協同して制御することをここで示している。この点において、ＧＲＰ７８は、多能性幹細胞の前駆体である胚内部細胞塊細胞の増殖および生存に必要とされることが分かった（Ｌｕｏら、２００６年）。さらに、Ｃｒｉｐｔｏ（Ｘｕら、１９９８年、Ｘｕら、１９９９年）およびＧＲＰ７８（Ｍａｏら、２００６年）は発生中の心臓において主に発現され、それらは心臓発生にそれぞれ関与している。最後に、Ｃｒｉｐｔｏと同様に（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）、ＧＲＰ７８は悪性を増大し、腫瘍細胞の生存、増殖および血管新生を増大することによって腫瘍細胞に対する競合増殖利点を与える（Ｄｏｎｇら、２００８年、Ｌｅｅ、２００７年）。重要なことに、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はいずれも、それらの正常組織細胞ではなくヒト腫瘍細胞の原形質膜で選択的に発現され、それらはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍特異的治療標的としてそれぞれ別々に確認されている。したがって、Ｃｒｉｐｔｏ−ＧＲＰ７８複合体は有意な治療可能性を有する新規な望ましい標的となる。
【００５４】
ＩＶ．Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用の阻害剤
Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／または機能を阻害するＣｒｉｐｔｏ標的化合物および／またはＧＲＰ７８標的化合物によって選択的に阻害することができる。特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏ標的またはＧＲＰ７８標的化合物は抗体、二重機能性抗体、アプタマー、ｆ（ａｂ）またはｆ（ａｂ）２領域などの抗体断片、阻害ペプチド、小分子、アンチセンス分子、またはｓｉＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）であってよい。これらの化合物は、候補化合物によりＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／または下流シグナル伝達の変化を試験するスクリーニングを使用して、当業者によって生成することができる。特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏ標的化合物は、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインに特異的に影響を与えるまたは結合する、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合および／またはシグナル伝達を阻害することができる。他の実施形態では、ＧＲＰ７８標的化合物は、ＧＲＰ７８のＮ−２０抗体エピトープなどのＧＲＰ７８のＮ末端領域もしくはＮ末端の最末端領域と、結合または相互作用することができる。
【００５５】
Ａ．抗体
本発明の特定の態様は、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８と選択的に結合する１つまたは複数の抗体に関する。これらの抗体を使用して、癌（例えば、メラノーマ、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭頸部癌）を処置することができる。さらに、これらの抗体を使用して、癌性または前癌性組織などの組織中のＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８の発現を評価することができる。特定の実施形態では、Ｎ−２０抗体またはＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープと結合する抗体を使用してＧＲＰ７８を標的化し、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成を妨害することができる。
【００５６】
特定の実施形態では、同定した標的ペプチドまたはそれらの受容体に対する抗体を作製することが望ましい可能性がある。適切な標的ペプチドまたは受容体、またはその一部分は、リンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって１つまたは複数の作用物質とカップリング、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、コンジュゲート、または化学的に連結させることが可能である。二重特異性または多価組成物またはワクチンが生成するように、これを実施することができる。これらの組成物の調製において使用する方法は当業者には熟知されており、ヒトへの投与に適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないことがさらに想定される。好ましい作用物質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である担体である。
【００５７】
用語「抗体」を使用して、抗原結合領域を有し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体断片を含む任意の抗体様分子を指す。様々な抗体ベースの構築物および断片を調製および使用するための技法は、当技術分野では周知である。抗体を調製および特徴付けするための手段も当技術分野では周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年を参照）。
【００５８】
本発明の様々な実施形態では、病状を有する１つまたは複数の個体由来の循環抗体を得て、ファージディスプレーライブラリーでスクリーニングすることができる。循環抗体と結合する標的ペプチドは、標的組織の内皮細胞表面上に位置する受容体タンパク質などの、天然抗原のミメオトープとして作用することができる。例えば、前立腺癌を有する個体中の循環抗体は、前立腺腫瘍中に特異的または選択的に局在する抗原と結合することができる。以下でより詳細に論じるように、このような抗体に対する標的ペプチドは、ファージディスプレーによって同定することができる。このような標的ペプチドを使用して、例えば、免疫親和性精製、ウエスタンブロッティング、電気泳動、次にバンド切除およびタンパク質／ペプチド配列決定および／またはコンピュータによる相同性検索などの公知の技法を使用することによって、抗体によって認識される天然抗原を同定することができる。当業者は、疾患特異的もしくは選択的抗原に対する抗体は、疾患状態の検出、診断および／または予後、疾患組織のイメージング、および／または治療剤の標的送達などの様々な用途に有用である可能性があることを理解している。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は特定の利点、例えば再現性および大規模生成を有することが認められており、それらの使用が一般に好ましい。したがって本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。調製し易さおよび試薬の入手が容易であるため、マウスモノクローナル抗体が好ましいことが多い。
【００６０】
「ヒト化」抗体を、マウス、ラット、または他種由来の、ヒト定常および／または可変領域ドメインを有するキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作抗体およびそれらの断片と同様に、本発明において具体的に企図する。患者の疾患に対して「特注した」抗体を開発するための方法も同様に公知であり、このような特注抗体も企図される。
【００６１】
１．抗体産生のための方法
Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８選択的抗体は、当技術分野で周知である技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製するための方法は、一般にポリクローナル抗体を調製するのと同系で始まる。簡単に言うと、本発明に従いＬＥＥまたはＣＥＥ組成物で動物を免疫処置し、その免疫処置した動物から抗血清を回収することによって、ポリクローナル抗体を調製する。
【００６２】
広範囲の動物種を抗血清の生成に使用することができる。典型的には、抗血清の生成に使用する動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。動物の選択は、当業者には公知であるように、操作のし易さ、コストまたは所望の血清量によって決定することができる。
【００６３】
より活発な免疫応答を生成し抗血清の生成を手助けするために、特定の免疫原性組成物の免疫原性を、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって高めることができる。適切なアジュバントには、サイトカイン、ケモカイン、共因子、毒素、プラスモジア、このようなアジュバントをコードする合成組成物またはＬＥＥまたはＣＥＥなどの、すべての許容可能な免疫刺激化合物がある。
【００６４】
使用することができるアジュバントには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、脂質Ａ、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）がある。２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に細菌から抽出した３成分、ＭＰＬ、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩも企図される。ＭＨＣ抗原をさらに使用することができる。例示的な、しばしば好ましいアジュバントには、フロイント完全アジュバント（死滅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、フロイント不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントがある。
【００６５】
アジュバント以外に、Ｔ細胞免疫を上方制御するまたは細胞抑制活性を下方制御することが示されている、生物学的応答調節剤（ＢＲＭ）を同時投与することが望ましい可能性がある。このようなＢＲＭには、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ）；低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ）、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２などのサイトカイン、またはＢ−７などの免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子があるが、これらだけには限られない。
【００６６】
ポリクローナル抗体の産生において使用する免疫原性組成物の量は、免疫原の性質および免疫処置に使用する動物によって変わる。皮下、筋肉内、皮内、表皮内、静脈内および腹腔内だけには限られないが、これらを含めた様々な経路を使用して免疫原を投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫処置後の様々な地点で免疫処置動物の血液をサンプリングすることによってモニタリングすることができる。
【００６７】
（例えば、注射で与える）第二の、追加抗原投与量を与えることもできる。適切な力価を得るまで、追加抗原投与と力価測定のプロセスを繰り返す。望ましいレベルの免疫原性を得たとき、免疫処置動物を出血させ、血清を単離し保存することができ、および／または動物を使用してＭＡｂを作製することができる。
【００６８】
ウサギポリクローナル抗体を産生するために、耳静脈を介して、または代替的に心臓穿刺によって、動物を出血させることが可能である。除去した血液を凝固させ、次いで遠心分離して全細胞および血塊から血清成分を分離する。血清を様々な用途と同様に使用することができ、またはそれ以外は望ましい抗体分画を、別の抗体、固体マトリックスと結合したペプチドを使用する親和性クロマトグラフィーなどの周知の方法によって、または例えばプロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーを使用することによって精製することができる。
【００６９】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，１９６，２６５号中に例示された技法などの、周知の技法の使用によって、ＭＡｂを容易に調製することができる。典型的には、この技法は、それが野生型または変異体組成物であれ、選択した免疫原性組成物、例えば、精製または部分的に精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはドメインで適切な動物を免疫処置することを含む。免疫処置組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な形式で投与する。
【００７０】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製するための方法は、一般にポリクローナル抗体を調製するのと同系で始まる。マウスおよびラットなどのげっ歯類は好ましい動物であるが、しかし、ウサギ、ヒツジまたはカエル細胞の使用も可能である。ラットの使用はいくつかの利点を与えることができるが（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年、６０〜６１頁）、マウスが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好ましい。これは最も日常的に使用され、一般に高い割合の安定した融合を与えるからである。
【００７１】
前に記載したように、一般的に抗原を動物に注射する。フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと、抗原を混合することができる。同じ抗原またはその抗原をコードするＤＮＡの追加抗原投与は、約２週間間隔で行われ得る。
【００７２】
免疫処置後、抗体、具体的にはＢリンパ球を産生する能力を有する体細胞（Ｂ細胞）を、ＭＡｂ生成プロトコルにおいて使用するために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃腺またはリンパ節から、または末梢血サンプルから得ることができる。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい、前者はそれらが分裂プラズマブラスト段階である抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は末梢血が容易に入手可能であるからである。
【００７３】
しばしば、動物の集団に免疫処置し、最高抗体力価を有する動物の脾臓を除去し、脾臓リンパ球はシリンジで脾臓を均質化することによって得る。典型的には、免疫処置マウス由来の脾臓は約５×１０７〜２×１０８個のリンパ球を含有する。
【００７４】
その後、免疫処置動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、不死化ミエローマ細胞、一般に免疫処置した動物と同種の１つの細胞と融合することができる。ハイブリドーマ産生融合手順中の使用に適したミエローマ細胞系は、高い融合効率、および望ましい融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定選択培地においてそれらが増殖するのを不可能にする酵素欠損を有する非抗体産生細胞系であることが好ましい。
【００７５】
当業者には公知であるように、多数のミエローマ細胞のうちのいずれか１つを使用することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、６５〜６６頁、１９８６年、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、７５〜８３頁、１９８４年）。引用）。例えば、免疫処置動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌを使用することができ、ラットに関しては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０；およびＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６を使用することができ、これらはすべてヒト細胞融合に関して有用である。
【００７６】
１つの好ましいマウスミエローマ細胞は、細胞系収納番号ＧＭ３５７３をリクエストすることによってＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手可能である、（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも呼ばれる）ＮＳ−１ミエローマ細胞系である。使用することができる別のマウスミエローマ細胞系は、８−アザグアニン耐性マウスのマウスミエローマＳＰ２／０非生産者細胞系である。
【００７７】
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞とミエローマ細胞のハイブリッドを作製するための方法は、２：１の比率で体細胞とミエローマ細胞を混合することを通常含むが、この比率は、細胞膜の融合を促進する１つまたは複数の（化学的または電気的）作用物質の存在下で、それぞれ約２０：１〜約１：１まで変わる可能性がある。センダイウイルスを使用する融合法はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年、１９７６年）によって記載されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどを使用する融合法はＧｅｆｔｅｒら、（１９７７年）によって記載されている。電気的に誘導する融合法の使用も適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、７１〜７４頁、１９８６年）。
【００７８】
融合手順は、低頻度、約１×１０−６〜１×１０−８で、生存能力があるハイブリッドを一般に生成する。しかし、これが問題を引き起こすわけではない。生存能力がある融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって親の非融合細胞（特に、通常無限に分裂し続けるであろう非融合ミエローマ細胞）から分化するからである。選択培地は一般に、組織培養培地中のヌクレオチドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を遮断する作用物質を含有する培地である。例示的な好ましい作用物質は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートはプリンとピリミジン両方のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を遮断し、一方アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンで培地を補充する（ＨＡＴ培地）。アザセリンを使用する場合、ヒポキサンチンで培地を補充する。
【００７９】
好ましい選択培地はＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作することができる細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存することができる。ミエローマ細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が欠損しており、それらは生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を操作することができるが、それらは培養中に限られた寿命を有し、一般に約２週間以内に死滅する。したがって、選択培地中で生存することができる細胞のみが、ミエローマおよびＢ細胞から形成されるハイブリッドである。
【００８０】
この培養は、そこから特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団をもたらす。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単回クローン希釈による細胞の培養、次に（約２〜３週間後に）所望の反応性に関して個々のクローン上清を試験することによって実施する。例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノバインディングアッセイなど、アッセイは高感度、簡潔および迅速でなければならない。
【００８１】
選択したハイブリドーマは次いで連続希釈され、個々の抗体産生細胞系にクローニングされ、次いでそれらのクローンを無限に増殖してＭＡｂを与えることができる。細胞系は２つの基本的な方法でＭＡｂ産生に利用することができる。第一に、ハイブリドーマのサンプルを、体細胞とミエローマ細胞を原型融合させるために使用した型の組織適合動物（例えば、同系マウス）に注射することができる（腹膜腔中が多い）。場合によっては、動物を注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で初回抗原刺激する。注射した動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで血清または腹水などの動物の体液を得て、高濃度のＭＡｂを与えることができる。第二に、個々の細胞系をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができ、この場合ＭＡｂは培養培地に自然に分泌され、そこからＭＡｂは高濃度で容易に得ることができる。
【００８２】
いずれかの手段によって産生されるＭＡｂは、望む場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣもしくは親和性クロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を使用して、さらに精製することができる。本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、このように産生したモノクローナル抗体から得ることができる。あるいは、本発明によって包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。
【００８３】
分子クローニング手法を使用して、モノクローナル抗体を作製することができることも企図される。一実施形態では、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを免疫処置動物の脾臓から単離したＲＮＡから調製し、適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞および対照細胞を使用したパニングによって選択される。従来のハイブリドーマ技法に優るこの手法の利点は、約１０４倍多くの抗体を１ラウンドで産生およびスクリーニングすることができること、および新たな特異性がＨ鎖とＬ鎖の組合せによって生じ、これによって適切な抗体を発見する機会がさらに増大することである。別の例では、ＬＥＥまたはＣＥＥを使用して、無細胞系でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗原を産生することができる。これらは、単鎖抗体ライブラリーをスキャンするための標的として使用することができる。これによって、動物を使用せずに非常に迅速に、多くの異なる抗体を同定することが可能となる。
【００８４】
あるいは、本発明によって包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチド合成装置を使用して、またはＥ．ｃｏｌｉにおける完全長遺伝子または遺伝子断片の発現によって合成することができる。
【００８５】
モノクローナル完全ヒト抗体を、ヒトＩｇＨおよびＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の一部分を有し、大部分の可変領域レパートリー、Ｃｍｉｃｒｏ、ＣｄｅｌｔａおよびＣｇａｍｍａ１、Ｃｇａｍｍａ２、もしくはＣｇａｍｍａ４のいずれかの遺伝子、ならびにそれらの機能に必要とされるシスエレメント（Ｇｒｅｅｎ、１９９９年）を含む、生殖系列を構成する、メガ塩基対サイズのＹＡＣを含むＸｅｎｏＭｏｕｓｅなどの、トランスジェニック動物を使用して産生することができる。ＩｇＨおよびＩｇｋａｐｐａトランス遺伝子を、マウス免疫グロブリンの産生に欠陥がある遺伝的背景で交配させた。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統中でＩｇトランス遺伝子においてコードされる巨大および複合ヒト可変領域レパートリーは、巨大末梢Ｂ細胞区画の発生、およびヒト成体由来のそれと類似した多様な一次免疫レパートリーの生成を支持する。ヒト抗原を用いたＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの免疫処置は、確固たる二次免疫応答を通常もたらし、これは最終的にナノモル以下の親和性の抗原特異的完全ヒトＩｇＧｋａｐｐａｍＡｂの大群として捉えることができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物由来のモノクローナル抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で治療有効性を有することが示されており、ヒト臨床試験に基づいて正常ヒト抗体の薬物動態を有するようである。
【００８６】
２．抗体コンジュゲート
本発明は、少なくとも１つの作用物質と連結して抗体コンジュゲートを形成する、一般にモノクローナル型の、ＣｒｉｐｔｏまたはＧＲＰ７８と選択的に結合する抗体をさらに提供する。診断または治療剤としての抗体分子の有効性を増大するために、抗体は少なくとも１つの望ましい分子または成分と共有結合または複合体形成することができる。このような分子または成分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子だけには限られないが、これらであってよい。エフェクター分子は、望ましい活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体と結合しているエフェクター分子の非制限的な例には、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドがある。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の成分として定義する。抗体と結合しているレポーター分子の非制限的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチンなどのリガンドがある。
【００８７】
Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８抗体は、抗体コンジュゲートのベースとして利用することができる。抗原結合部位以外の、抗体分子中の生物活性分子と結合するための部位には、病原体、Ｂ細胞超抗原、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４およびＨＩＶ−１エンベロープと結合することができる可変ドメイン中に存在する部位がある（Ｓａｓｓｏら、１９８９年、Ｓｈｏｒｋｉら、１９９１年、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎｎら、１９９５年、Ｃｌｅａｒｙら、１９９４年、Ｌｅｎｅｒｔら、１９９０年、Ｂｅｒｂｅｒｉａｎら、１９９３年、Ｋｒｅｉｅｒら、１９９１年）。さらに、可変ドメインは抗体の自己結合に関与し（Ｋａｎｇら、１９８８年）、抗抗体によって認識されるエピトープ（イジオトープ）を含有する（Ｋｏｈｌｅｒら、１９８９年）。
【００８８】
抗体コンジュゲートの特定の例は、その中で抗体が検出可能な標識と連結したコンジュゲートである。「検出可能な標識」は、それらの特異的機能性、および／または化学特性のために検出することができる化合物および／またはエレメントであり、その使用によって、それらが結合する抗体の検出、および／または望む場合さらなる定量化を可能にする。別のこのような例は、細胞傷害性または抗細胞剤と連結した抗体を含むコンジュゲートの形成であり、「イムノトキシン」と呼ぶことができる。
【００８９】
抗体コンジュゲートは、一般に診断剤として使用するのに好ましい。抗体診断剤には一般に、２クラス、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断中、様々なイムノアッセイ中などで使用するための診断剤、および／または一般に「抗体誘導型イメージング」として公知であるｉｎ  ｖｉｖｏ診断プロトコル中で使用するための診断剤の範囲内にある。
【００９０】
多くの適切な造影剤が、抗体とそれらを結合させるための方法と同様に、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号、および同第４，４７２，５０９号を参照）。使用する造影成分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、Ｘ線造影剤であってよい。
【００９１】
常磁性イオンの場合、例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジミウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）および／またはエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンを言及することができ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影などの他の状況で有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）があるが、これらだけには限られない。
【００９２】
治療および／または診断用途の放射性同位体には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５イオウ、テクニシウム９９ｍおよび／またはイットリウム９０がある。１２５Ｉは特定の実施形態中で使用するのに好ましい可能性があり、テクニシウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１も、それらの低エネルギーおよび広範囲の検出に関する適合性のため好ましいことが多い。本発明の放射標識モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウムと次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤の接触によってヨウ素化することができる。本発明によるモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスによって、例えばスズ溶液でペルテクネートを還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに還元テクニシウムをキレート化し、このカラムに抗体を施すことによって、テクニシウム９９ｍで標識することができる。あるいは、例えばペルテクネート、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−フタル酸カリウム溶液などのバッファー溶液、および抗体をインキュベートすることによって、直接的な標識技法を使用することができる。金属イオンとして存在する放射性同位体と抗体を結合させるために使用されることが多い中間体官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００９３】
コンジュゲートとしての使用が企図される蛍光標識の中には、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドがある。
【００９４】
本発明において企図される別の型の抗体コンジュゲートはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用を主に目的とするコンジュゲートであり、この場合抗体は、発色基質との接触によって着色産物を生成する第二の結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）と連結している。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）ハイドロゲンペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼがある。好ましい第二の結合リガンドは、ビオチンおよび／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当業者には周知であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号中に記載されている。
【００９５】
抗体と分子の部位特異的結合のさらに別の公知の方法は、ハプテンベースの親和性標識と抗体の反応を含む。本質的に、ハプテンベースの親和性標識は抗原結合部位でアミノ酸と反応し、それによってこの部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかし、これは有利ではない可能性がある。それは抗体コンジュゲートによる抗原結合の消失をもたらすからである。
【００９６】
アジド基を含有する分子を使用して、低強度の紫外線光によって生成する反応性ニトレン中間体を介したタンパク質との共有結合を形成することができる（Ｐｏｔｔｅｒ  ＆  Ｈａｌｅｙ、１９８３年）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジドアナログは、粗製細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして使用されている（Ｏｗｅｎｓ  ＆  Ｈａｌｅｙ、１９８７年、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５年）。２−および８−アジドヌクレオチドも精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９年、Ｋｉｎｇら、１９８９年、およびＤｈｏｌａｋｉａら、１９８９年）、抗体結合物質として使用することができる。
【００９７】
抗体とそのコンジュゲート成分の結合またはコンジュゲーションのための、いくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの結合法は、例えば抗体と結合した、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル−３などの有機系キレート剤を利用する、金属キレート錯体の使用を含む（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４７２，５０９号、米国特許第４，９３８，９４８号）。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたはペリオデートなどのカップリング剤の存在下で酵素と反応させることも可能である。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。米国特許第４，９３８，９４８号中では、乳房腫瘍の造影をモノクローナル抗体を使用して得て、検出可能な造影成分は、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを使用して抗体と結合させる。
【００９８】
他の実施形態では、抗体結合部位を変えない反応条件を使用した、免疫グロブリンのＦｃ領域中にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化を企図する。この方法によって生成する抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感度を示すために開示される（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９６，０６６号）。レポーターまたはエフェクター分子がＦｃ領域中の炭水化物残基と結合した、エフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合も文献中に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、１９８７年）。この手法は、現在臨床評価段階にある診断上および治療上有望な抗体を産生することが報告されている。
【００９９】
３．二重機能性抗体
特定の実施形態では、二重機能性抗体を使用してＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８を標的化することができる。例えば、二重特異性Ｆｃ二量体を使用して、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方を標的化および結合することができ、この結合は、ノーダルシグナル伝達、アクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達、および／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３βシグナル伝達などの、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体による後のシグナル伝達を阻害する可能性があることが想定される。特定の実施形態では、二重機能性または二重特異性抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様領域、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメイン、ＧＲＰ７８のアミノ酸１９〜６８、および／またはＧＲＰ７８のＮ−２０領域の少なくとも一部分と結合することができる。あるいは、多数のｓｃＦｖ分子を含有するダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディを使用して、例えば増大した親和性でＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８と結合することができる。
【０１００】
二重特異性抗体中のＶ−ドメイン間の様々な長さのリンカーを使用して、望ましい個々の用途、例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ造影または療法に応じて、大きさ、柔軟性および価数を最適化するのに望ましい、ダイアボディ（例えば、約６０ｋＤａ）、トリアボディ（例えば、約９０ｋＤａ）またはテトラボディ（例えば、約１２０ｋＤａ）のいずれかの形成を誘導することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００８年、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１年）。多重機能性抗体はこれらのｓｃＦｖ多量体の増大した結合価数を示し、高い親和力および低下したオフレートをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、多重機能性抗体を腫瘍標的化に有利に使用することができる。約６０〜１００ｋＤａの特定の分子は、親Ｉｇ（例えば、約１５０ｋＤａ）と比較して増大した腫瘍浸潤および速いクリアランス速度を示すことができるからである。
【０１０１】
特定の実施形態では、多重特異性Ｆｖモジュールを設計して２つ以上の異なる標的抗原を架橋させる。これらの二重および三重特異性多量体は、異なるｓｃＦｖ分子の結合によって形成することができる（ＤｕｔｅｒｔｒｅおよびＴｅｉｌｌａｕｄ、２００６年、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎら、１９９７年、Ｋｏｒｔｔら、２００１年、Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９年、Ａｔｗｅｌｌら、１９９６年）。
【０１０２】
Ｂ．Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８標的ペプチド
Ｃｒｉｐｔｏ標的またはＧＲＰ７８標的タンパク質またはペプチドを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成および／または機能を阻害することができる。例えば、ペプチドのライブラリーを、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞におけるファージディスプレーを使用してスクリーニングして、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８と結合してＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を阻害することができるペプチドまたはタンパク質を同定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｎｔｚ  ＰＪら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３年２１巻（１）５７〜６３頁、Ｋｉｍ  Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５巻（３１）９４３４〜４４頁、Ｊａｋｏｂｓｅｎ  ＣＧら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００７年６７巻（１９）９５０７〜１７頁、およびＧｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗ  Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００６年６６巻（２３）１１４２４〜３１頁中に記載された方法を含めて、様々な方法をこの目的に使用することができる。本明細書で使用するタンパク質またはペプチドは、約２００アミノ酸超から遺伝子から翻訳された完全長配列までのタンパク質、約１００〜２００アミノ酸のポリペプチド、および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドを一般に指すが、これらだけには限られない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は本明細書では交互に使用する。
【０１０３】
特定の実施形態では、ＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープを含むペプチドを使用して、Ｃｒｉｐｔｏと結合し、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を阻害することができる。本明細書で示すように、ＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合に重要であり、したがって、ＧＲＰ７８のＮ−２０エピトープを含むペプチドを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を競合的にアンタゴナイズすることができる。Ｎ−２０エピトープは、ＧＲＰ７８シグナルペプチドから下流の最初の５０残基内の２０アミノ酸残基からなる。Ｎ−２０抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入することができる。同様に、他の実施形態では、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインを含むペプチドを使用して、ＧＲＰ７８と結合し、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を阻害することができる。以下の実施例中に示すように、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合に重要であり、したがって、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインを含むペプチドを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を競合的にアンタゴナイズすることができる。
【０１０４】
Ｋｅｌｂｅｒらの中に記載されたアッセイなどの１２５Ｉ標識可溶性Ｃｒｉｐｔｏを使用する結合アッセイを、本発明と共に使用することができる。例えば、無傷ＭＣＦ１０ＡまたはＮＣＣＩＴ細胞とＣｒｉｐｔｏの結合は、非標識Ｃｒｉｐｔｏによって、および重要なことに、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体によって競合的に遮断することができる。このアッセイまたはその改変型を使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合を妨害することができるペプチドをスクリーニングすることができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドの大きさは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００またはより多量のアミノ酸残基だけには限られないが、これらを含むことができる。
【０１０６】
本明細書で使用する「アミノ酸残基」は、当技術分野で公知である、任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体もしくは任意のアミノ酸模倣体を指す。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列に割り込むいかなる非アミノ酸も存在せず連続的である。他の実施形態では、配列は１つまたは複数の非アミノ酸成分を含むことができる。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つまたは複数の非アミノ酸成分によって割り込むことができる。
【０１０７】
したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然に存在するタンパク質において見られる２０の一般的アミノ酸の少なくとも１つ、または表２において示すアミノ酸だけには限られないがこれらを含めた、少なくとも１つの修飾または非通常型アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０１０８】
【表２】
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タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学の技法によるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質またはペプチドの単離、またはタンパク質またはペプチドの化学合成を含めた、当業者に公知である任意の技法によって作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示されており、当業者に公知であるコンピュータ化データベースにおいて見ることができる。１つのこのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）である。公知である遺伝子のコード領域は、本明細書で開示する技法を使用して、または当業者に公知であるように増幅および／または発現することができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの様々な市販の調製物が当業者に公知である。
【０１０９】
１．ペプチド模倣体
本発明によるポリペプチドの調製に関する別の実施形態は、ペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３年）を参照。ペプチド模倣体の使用の根底にある原理は、タンパク質のペプチド骨格は主として、抗体と抗原の相互作用などの分子相互作用を容易にするような形式で、アミノ酸側鎖を配向するように存在することである。ペプチド模倣体は、天然分子と類似した分子相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を使用して、本明細書に開示する標的ペプチドの多くの本来の性質、ただし改変およびさらに改善された特徴を有する第二世代の分子を操作することができる。
【０１１０】
２．融合タンパク質
本発明の他の実施形態は融合タンパク質に関する。これらの分子は一般に、Ｎ−またはＣ−末端、第二ポリペプチドまたはタンパク質のすべてまたは一部分と連結した、標的ペプチドのすべてまたは相当部分を有する。例えば、融合体は他種由来のリーダー配列を利用して、異種宿主中のタンパク質の組換え発現を可能にすることができる。別の有用な融合は抗体エピトープなどの免疫活性ドメインの追加を含み、融合タンパク質の精製を容易にする。融合接合部またはその近辺への切断部位の封入は、精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にし得る。他の有用な融合は、酵素由来活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的シグナルまたは膜貫通領域などの機能性ドメインの連結を含む。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、治療用タンパク質またはペプチドと連結した標的ペプチドを含む。融合タンパク質中に取り込むことができるタンパク質またはペプチドの例には、細胞増殖抑制タンパク質、細胞破壊タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬剤、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質および結合タンパク質がある。これらの例は制限的であることは意味せず、本発明の範囲内では事実上、タンパク質またはペプチドを、標的ペプチドを含む融合タンパク質中に取り込むことができると企図される。融合タンパク質を作製する方法は当業者には周知である。このようなタンパク質は、例えば、二官能性架橋試薬を使用した化学結合によって、完全融合タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって、または、標的ペプチドをコードするＤＮＡ配列と第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の結合、その後の無傷融合タンパク質の発現によって生成することができる。
【０１１１】
３．タンパク質の精製
特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドを単離または精製することができる。一実施形態では、これらのタンパク質を使用して、任意の示したバーコード（例えば、ポリマーラマン標識）を用いたタグ化用の抗体を作製することができる。タンパク質の精製技法は当業者には周知である。これらの技法は、１レベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への細胞、組織または器官の均質化および粗製分画化を含む。対象のタンパク質またはポリペプチドはクロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質状態までの精製）を得ることができる。純ペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）ＦＰＬＣ（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動法である。親和性クロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の一例は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０６，３４７号中に開示される。ペプチドを精製するより有効な方法の１つは迅速な高性能液体クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ）であり、またはさらに精製タンパク質もしくはペプチドは他の要素から単離可能な組成物を指すものとし、タンパク質もしくはペプチドはその本来得られる状態と比較して任意の程度に精製される。単離または精製したタンパク質もしくはペプチドは、したがって、それが本来存在し得る環境から遊離したタンパク質もしくはペプチドも指す。一般に「精製」は、様々な他の要素を除去するための分画に施したタンパク質もしくはペプチド組成を指し、その組成はその発現される生物活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この表示は、タンパク質もしくはペプチドが組成の主要成分を形成する組成、例えば組成中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはより多くのタンパク質の構成などを指す。
【０１１２】
タンパク質もしくはペプチドの精製度を定量化するための様々な方法が、本開示に鑑みて当業者には公知である。これらは、例えば、活性分画の比活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による分画内のポリペプチドの量の評価を含む。分画の純度を評価するのに好ましい方法は、分画の比活性を計算すること、それを初回抽出物の比活性と比較すること、およびそうして「精製倍数」によって評価したその中の純度を計算することである。活性の量を表すために使用する実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択する個々のアッセイ技法、および発現されるタンパク質もしくはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存し得る。
【０１１３】
タンパク質の精製において使用するのに適した様々な技法は、当業者には周知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた、または熱変性による沈殿、次に遠心分離、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよび親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動法、およびこれらと他の技法の組合せを含む。当技術分野で一般に公知であるように、様々な精製ステップを実施する順序は変えることができ、または特定のステップは省略することができ、およびさらに実質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドを調製するのに適した方法をもたらすと考えられる。
【０１１４】
タンパク質もしくはペプチドは常にその最も精製された状態で提供されなければならないという、一般的な必要性は存在しない。実際、実質的にあまり精製されていない産物が、特定の実施形態において有用性があると企図される。部分的な精製は、組合せでより少ない精製ステップを使用することによって、または異なる形の同じ一般的な精製スキームを利用することによって実施することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施するカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技法より高い「倍数の」精製を一般にもたらすと理解される。低度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的回収において、または発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有し得る。
【０１１５】
親和性クロマトグラフィーは、単離する物質とそれが特異的に結合することができる分子の間の特異的親和性に頼るクロマトグラフィー手順である。これは受容体−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの１つと不溶性マトリックスの共有結合によって合成する。したがってカラム材料は、溶液由来の物質に特異的に吸着することができる。溶出は結合が起こらないこれらに対する条件を変えること（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変更）によって起こる。マトリックスは、それ自体はいかなる有意な程度でも分子と吸着せず、広範囲の化学的、物理的および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合性に影響を与えないような形式で結合しなければならない。さらにリガンドは、比較的強い結合を与えなければならない。さらに、サンプルまたはリガンドを破壊せずに物質を溶出することができるはずである。
【０１１６】
４．合成ペプチド
それらの比較的小さなサイズのため、本発明の標的ペプチドは、従来の技法に従い溶液中または固形支持体上で合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコルに従い使用することができる。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、１９８４年、Ｔａｍら、１９８３年、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９８６年、およびＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９７９年を参照。低分子ペプチド配列、通常約６個から最大約３５〜５０個のアミノ酸は、このような方法によって容易に合成することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する、組換えＤＮＡ技術を利用することができる。
【０１１７】
Ｃ．低分子干渉核酸
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８の発現を下方制御する低分子干渉核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を提供する。これらのＣｒｉｐｔｏ標的およびＧＲＰ７８標的ｓｉＮＡは、医薬組成物で被験体に（例えば、非経口、静脈内、または腫瘍内）投与して癌を治療することができる。例えば、以下の実施例中に示すように、ｓｈＲＮＡを有効に使用して、ＧＲＰ７８（配列番号５）またはＣｒｉｐｔｏ（配列番号４）のシグナル伝達をノックダウンすること、およびＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を妨害することができる。
【０１１８】
本明細書で使用する「ｓｉＮＡ」は、低分子干渉核酸として定義する。ｓｉＮＡの例には、ＲＮＡｉ、二本鎖ＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡがあるが、これらだけには限られない。ｓｉＮＡは細胞中の遺伝子の転写を阻害することができる。ｓｉＮＡは１６〜５０以上のヌクレオチド長であってよい。特定の実施形態では、ｓｉＮＡは１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長であってよい。ｓｉＮＡは核酸および／または核酸アナログを含むことができる。典型的には、ｓｉＮＡは細胞内の一遺伝子の翻訳を阻害するが、しかし、特定の実施形態では、ｓｉＮＡは細胞内の２個以上の遺伝子の翻訳を阻害する。特定の実施形態では、ｓｉＮＡを使用してＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用を妨害することができる一方で、他の実施形態では、アンチセンスを使用してＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８を標的化し、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用を妨害することができる。
【０１１９】
ｓｉＮＡ内では、核酸は同じ型である必要はない（例えば、ｓｉＮＡはヌクレオチドおよび核酸アナログを含むことができる）。ｓｉＮＡは二本鎖構造を形成し、その二本鎖構造は、部分的または完全に相補的である２つの別個の核酸から生じる可能性がある。本発明の特定の実施形態では、ｓｉＮＡはただ１つの核酸または核酸アナログを含むことができ、それ自体が相補すること（例えば、ヘアピンループを形成すること）によって二本鎖構造を形成することができる。ｓｉＮＡの二本鎖構造は１６〜５００以上の隣接核酸塩基を含むことができる。ｓｉＮＡは、（同じ核酸の別の部分または別の相補的核酸であってよい）相補的核酸とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、１７〜３５の隣接核酸塩基、より好ましくは１８〜３０の隣接核酸塩基、より好ましくは１９〜２５の核酸塩基、より好ましくは２０〜２３の隣接核酸塩基、または２０〜２２の隣接核酸塩基、または２１の隣接核酸塩基を含むことができる。
【０１２０】
ｓｉＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は当技術分野では周知である。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、そのすべてがその全容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号中、ならびに米国出願２００３／００５１２６３号、同２００３／００５５０２０号、同２００４／０２６５８３９号、同２００２／０１６８７０７号、同２００３／０１５９１６１号、同２００４／００６４８４２号中に記載されている。
【０１２１】
１．核酸
本発明は、中性リポソームを介してｓｉＮＡを送達するための方法および組成物を提供する。ｓｉＮＡは核酸で構成されているので、核酸（例えば、核酸の生成、核酸の修飾など）と関係がある方法はｓｉＮＡに関して使用することもできる。
【０１２２】
用語「核酸」は当技術分野では周知である。本明細書で使用する「核酸」は、核酸塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（すなわち鎖）を一般的に指す。核酸塩基は、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）において見られる、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基を含む。用語「核酸」は、それぞれ用語「核酸」の亜属として用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、３〜約１００核酸塩基長の分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」は、約１００核酸塩基長を超える少なくとも１つの分子を指す。
【０１２３】
これらの定義は、一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。二本鎖核酸は完全に相補的な結合によって形成されるが、いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は部分的または相当相補的な結合によって形成される可能性がある。したがって、核酸は１つまたは複数の相補鎖（複数可）、または典型的には分子を含む個々の配列の「相補体」（複数可）を含む二本鎖分子を含有することができる。本明細書で使用するように、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」により示すことができ、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」により示すことができる。
【０１２４】
２．核酸塩基
本明細書で使用する「核酸塩基」は、複素環塩基、例えば少なくとも１つの天然に存在する核酸（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）において見られる天然に存在する核酸塩基（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）、およびこのような核酸塩基の天然に存在するまたは天然に存在しない誘導体（複数可）およびアナログなどを指す。一般に核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基対を置換することができる形式で少なくとも１つの天然に存在する核酸塩基と１つまたは複数の水素結合を形成する（「アニーリングする」または「ハイブリダイズする」）ことができる（例えば、ＡとＴの間、ＧとＣの間、およびＡとＵの間の水素結合）。
【０１２５】
「プリン」および／または「ピリミジン」核酸塩基（複数可）は、天然に存在するプリンおよび／またはピリミジン核酸塩基、ならびにさらに、１つまたは複数のアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオールまたはアルキルチオール成分によって置換されたプリンまたはピリミジンだけには限られないが、これらを含めた、その誘導体（複数可）およびアナログ（複数可）を包含する。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなどの）成分は約１、約２、約３、約４、約５〜約６個の炭素原子を含む。プリンまたはピリミジンの他の非制限的な例には、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などがある。非制限的な、プリンおよびピリミジン誘導体およびアナログの表を、本明細書において以下にさらに与える。
【０１２６】
【表１−１】
2015133984.tif 000003
【０１２７】
【表１−２】
2015133984.tif 000004
核酸塩基は、本明細書に記載するかまたは当業者に公知である任意の化学または天然合成法を使用して、ヌクレオシドまたはヌクレオチド中に含めることができる。
【０１２８】
３．ヌクレオシド
本明細書で使用する「ヌクレオシド」は、核酸塩基のリンカー成分と共有結合した核酸塩基を含む個々の化学単位を指す。「核酸塩基のリンカー成分」の非制限的な一例は、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または５−炭素糖の誘導体もしくはアナログだけには限られないが、これらを含めた、５−炭素原子（すなわち、５−炭素糖）を含む糖である。５−炭素糖の誘導体もしくはアナログの非制限的な例には、糖環中で炭素が酸素原子と置換された２’−フルオロ−２’−デオキシリボースまたはカルボン酸糖がある。
【０１２９】
核酸塩基と核酸塩基のリンカー成分の異なる型の共有結合（複数可）は当技術分野で公知である。非制限的な例として、プリン（すなわち、ＡもしくはＧ）または７−デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、プリンまたは７−デアザプリンの第９位と５−炭素糖の第１’位を典型的に共有結合させる。別の非制限的な例では、ピリミジン核酸塩基（すなわち、Ｃ、ＴまたはＵ）を含むヌクレオシドは、ピリミジンの第１位と５−炭素糖の第１’位を典型的に共有結合させる（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２年）。
【０１３０】
４．ヌクレオチド
本明細書で使用する「ヌクレオチド」は、「骨格成分」をさらに含むヌクレオシドを指す。一般に骨格成分は、ヌクレオチドとヌクレオチドを含む別の分子、またはヌクレオチドと別のヌクレオチドを共有結合させて核酸を形成する。天然に存在するヌクレオチド中の「骨格成分」は、５−炭素糖と共有結合するリン成分を典型的に含む。骨格成分の結合は、典型的には５−炭素糖の３’または５’位置のいずれかで起こる。しかし、特にヌクレオチドが天然に存在する５−炭素糖またはリン成分の誘導体またはアナログを含むとき、他の型の結合が当技術分野で公知である。
【０１３１】
５．核酸アナログ
核酸は、核酸塩基の誘導体またはアナログ、天然に存在する核酸中に存在する可能性がある核酸塩基リンカー成分および／または骨格成分を含んでよく、またはそれらで完全に構成されてよい。本明細書で使用する「誘導体」は化学的に修飾または改変された形の天然に存在する分子を指し、一方で用語「模倣体」または「アナログ」は、天然に存在する分子または成分と構造上似ている可能性があるまたはないが、類似した機能を有する分子を指す。本明細書で使用する「成分」は、大きな化学または分子構造の小さな化学または分子要素を一般的に指す。核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログまたは誘導体は当技術分野では周知であり、記載されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｅｉｔ、１９８０年を参照）。
【０１３２】
５−炭素糖および／または骨格成分誘導体またはアナログを含むヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸の他の非制限的な例には、ｄｓＤＮＡと三重らせんを形成するおよび／またはｄｓＤＮＡの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６８１，９４７号、特に蛍光核酸プローブとして使用するための、ＤＮＡまたはＲＮＡ中で見られるヌクレオシドの蛍光アナログを取り込んだ核酸を記載する米国特許第５，６５２，０９９号および同第５，７６３，１６７号、高いヌクレアーゼ安定性を有するピリミジン環上に置換を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第５，６１４，６１７号、核酸検出において使用する修飾５−炭素糖（すなわち、修飾２’−デオキシフラノシル成分）を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第５，６７０，６６３号、同第５，８７２，２３２号および同第５，８５９，２２１号、ハイブリダイゼーションアッセイ中で使用することができる水素以外の置換基と４’位置で置換された少なくとも１つの５−炭素糖成分を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，４４６，１３７号、３’−５’ヌクレオチド間結合でのデオキシリボヌクレオチドと２’−５’ヌクレオチド間結合でのリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，８８６，１６５号、ヌクレオチド間結合の３’位置酸素が炭素によって置換されて核酸のヌクレアーゼ耐性が増大した修飾ヌクレオチド間結合を記載する米国特許第５，７１４，６０６号、ヌクレアーゼ耐性を増大する１つまたは複数の５’メチレンホスホネートヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６７２，６９７号、オリゴヌクレオチドの２’炭素に薬剤または標識を含み、高いヌクレアーゼ安定性および薬剤または検出成分を送達する能力をもたらすことができる置換基成分の結合を記載する米国特許第５，４６６，７８６号および同第５，７９２，８４７号、隣接５−炭素糖成分の４’位置および３’位置と結合して細胞の取込み、ヌクレアーゼに対する耐性、および標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが増大して２または３の炭素骨格結合を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第５，２２３，６１８号、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である少なくとも１つのスルファメートまたはスルファミドヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，４７０，９６７号、改善されたヌクレアーゼ耐性、細胞の取込みおよびＲＮＡ発現の制御に使用する３または４の原子リンカー成分置換ホスホジエステル骨格成分を有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，７７７，０９２号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６１０，２８９号および同第５，６０２，２４０号、オリゴヌクレオチドの２’−Ｏ位置と結合してそれらの膜透過性および安定性を増大する疎水性担体作用物質を記載する米国特許第５，８５８，９８８号、ＤＮＡまたはＲＮＡとの高いハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼに対する高い安定性を有する５’末端でアントラキノンと結合したオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，２１４，１３６号、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性、およびＲＮａｓｅＨを活性化する能力を増大するＤＮＡが２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドを含むＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラを記載する米国特許第５，７００，９２２号、およびＤＮＡと連結してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを記載する米国特許第５，７０８，１５４号中に記載された例がある。
【０１３３】
６．ポリエーテルおよびペプチド核酸
特定の実施形態では、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの誘導体またはアナログを含む核酸を、本発明の方法および組成物において使用することができると企図される。非制限的な例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９０８，８４５号中に記載される「ポリエーテル核酸」である。ポリエーテル核酸中では、１つまたは複数の核酸塩基がポリエーテル骨格中のキラル炭素原子と連結している。
【０１３４】
別の非制限的な例は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８６，４６１号、同第５８９１，６２５号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７１９，２６２号、同第５，７１４，３３１号、同第５，５３９，０８２号、およびＷＯ９２／２０７０２中に記載される、「ＰＮＡ」、「ペプチドベースの核酸アナログ」または「ＰＥＮＡＭ」としても公知である「ペプチド核酸」である。ペプチド核酸は一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの分子と比較して、高い配列特異性、結合性、および酵素分解に対する耐性を有する（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３年、ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９）。ペプチド核酸は一般に、核酸塩基成分、５−炭素糖ではない核酸塩基リンカー成分、および／またはリン酸骨格成分ではない骨格成分を含む１つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。ＰＮＡに関して記載される核酸塩基リンカー成分の例には、アザ窒素原子、アミドおよび／またはウレイド結合がある（例えば、米国特許第５，５３９，０８２号を参照）。ＰＮＡに関して記載される骨格成分の例には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミドまたはポリスルホンアミド骨格成分がある。
【０１３５】
特定の実施形態では、米国特許第５，８９１，６２５号中に記載されたように、ペプチド核酸などの核酸アナログを使用して、ＰＣＲ（商標）中などで核酸増幅を阻害し、偽陽性を低減し、一塩基突然変異を識別することができる。核酸アナログの他の修飾および使用は当技術分野で公知であり、これらの技法および核酸アナログ型は本発明で使用することができると予想される。非制限的な例では、米国特許第５，７８６，４６１号は、ＰＮＡ骨格と結合して分子の可溶性を高めるアミノ酸側鎖を有するＰＮＡを記載する。別の例では、ＰＮＡの細胞摂取性を新油性基の結合によって増大させる。米国出願第１１７，３６３号は、ＰＮＡの細胞摂取を高めるために使用するいくつかのアルキルアミノ成分を記載する。別の例は、天然に存在する核酸と比較して配列特異性、可溶性および／または結合親和性の改善をもたらす天然および天然に存在しない核酸塩基ならびにアルキルアミン側鎖を含むＰＮＡを記載する、米国特許第５，７６６，８５５号、同第５，７１９，２６２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７３６，３３６号中に記載される。
【０１３６】
７．核酸の調製
例えば化学合成、酵素的生成または生物学的生成などの、当業者に公知である任意の技法によって核酸を作製することができる。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非制限的な例には、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホアミダイト化学物質を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学的合成、および参照により本明細書に組み込まれるＥＰ２６６，０３２中に記載された技法などの固相技法、またはそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６年および米国特許第５，７０５，６２９号によって記載されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体によって作製された核酸がある。本発明の方法中では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用することができる。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機構は、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号中に開示されている。
【０１３７】
酵素によって生成する核酸の非制限的な例には、ＰＣＲ（商標）などの増幅反応中で酵素により（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８２，１９５号を参照）、または参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６４５，８９７号中に記載されたオリゴヌクレオチドの合成により生成する核酸がある。生物学的に生成する核酸の非制限的な例には、細菌中で複製する組換えＤＮＡベクター（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年を参照）などの、生存細胞中で生成する（すなわち複製する）組換え核酸がある。
【０１３８】
８．核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム密度遠心分離勾配で、または当業者に公知である任意の他の手段によって精製することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年を参照）。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明は単離核酸である核酸に関する。本明細書で使用する用語「単離核酸」は、１つまたは複数の細胞の全ゲノムおよび転写核酸を含まない、または他の場合はその大部分を含まない、単離された状態の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指す。特定の実施形態では、「単離核酸」は、例えば脂質またはタンパク質などのマクロ分子、小さな生物分子などの、細胞成分またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応成分を含まない、または他の場合はその大部分を含まない、単離された状態の核酸を指す。
【０１４０】
９．ハイブリダイゼーション
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二重もしくは三重鎖分子、または部分的な二重もしくは三重鎖性を有する分子の形成を意味すると理解される。本明細書で使用する用語「アニールする」は「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする（複数可）」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」を包含する。
【０１４１】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補配列（複数可）を含有する１つまたは複数の核酸鎖（複数可）間または内部のハイブリダイゼーションを可能にする条件であるが、ランダムな配列のハイブリダイゼーションは除外する。核酸と標的鎖の間のストリンジェントな条件は、存在する場合でも、ミスマッチをほとんど許容しない。このような条件は当業者には周知であり、高い選択性を必要とする用途に好ましい。非制限的な用途には、遺伝子またはその核酸セグメントなどの核酸の単離、または少なくとも１つの特異的ｍＲＮＡ転写産物またはその核酸セグメントの検出などがある。
【０１４２】
ストリンジェントな条件は、約５０℃〜約７０℃の温度での約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによって与えられる条件などの、低塩および／または高温条件を含むことができる。望ましいストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在および濃度によって一部分は決定されることは理解される。
【０１４３】
ハイブリダイゼーションに関するこれらの範囲、組成および条件は、非制限的な例のみによって言及すること、および特定のハイブリダイゼーション反応に関する望ましいストリンジェンシーは、１つまたは複数の陽性もしくは陰性対照との比較によって経験的に決定されることが多いことも理解される。想定する用途に応じて、様々なハイブリダイゼーション条件を利用して、標的配列に対する様々な程度の核酸の選択性を得ることが好ましい。非制限的な例では、ストリンジェントな条件下で核酸とハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度でのハイブリダイゼーションによって実施することができる。このような条件は「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非制限的な例は、約２０℃〜約５０℃の温度範囲において約０．１５Ｍ〜約０．９ＭのＮａＣｌで実施するハイブリダイゼーションを含む。当然ながら、低または高ストリンジェンシー条件をさらに改変して個々の用途に適合させることは、当業者の技術の範囲内にある。
【０１４４】
Ｄ．アプタマー
アプタマーを使用してＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／またはシグナル伝達を阻害することができる。アプタマーは、タンパク質などの分子標的と選択的に結合する一本鎖核酸である。アプタマーはＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または修飾ヌクレオチドを含むことができるが、特定の実施形態では、酵素分解に耐性があるＤＮＡアプタマーまたは修飾ヌクレオチドを含むアプタマーを使用して、被験体にｉｎ  ｖｉｖｏ投与したとき半減期を増大することが望ましい可能性がある。
【０１４５】
タンパク質親和性分子として一本鎖核酸（アプタマー）を使用するアイデアは適度な進歩を示している。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、（１９９０年）、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０年）、およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９２年）を参照。この概念は、標的の存在下において、高親和性および特異性で標的と結合する特有３次元構造に、フォールディングする短いオリゴマー（２０〜８０量体）配列の能力に基づく。アプタマーは、コンビナトリアルケミストリーと、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として一般に公知であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化を組合せたプロセスによって作製される。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のライブラリー（典型的には複合体中に約１０１４個の分子）とタンパク質のインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を単離し、ＤＮＡを増幅し、対象のタンパク質に対して高い親和性を示す配列でサンプルが豊富になるまで、このプロセスを繰り返す。選択圧は標的に対する高い親和性であるので、低いナノモル親和性を有するアプタマーを得ることができる。アプタマーはタンパク質ベースの親和性試薬に優る利点を与える。核酸には、増大した安定性、再生のし易さ（ＰＣＲまたはオリゴヌクレオチド合成）、ならびに検出および固定に関する簡単な修飾があるからである。ロボットを利用するアプタマー生成のためのハイスループット法を本発明と共に使用することもできる（Ｃｏｘら、２００２年）。
【０１４６】
アプタマー生成プロトコルのいくつかの変形（例えば、様々な標的区分）を本発明と共に使用することができる。非結合ＤＮＡ分子は、１）膜上での濾過（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９２年）；２）共有結合または親和性タグを使用してセファロースなどのマトリックスと標的を結合させる、カラムクロマトグラフィー（Ｙｌｅｒａら、２００２年）、および３）マイクロタイタープレートのウエルとタンパク質の結合によって標的タンパク質から除去することができる（Ｄｒｏｌｅｔら、１９９９年）。本発明と共に使用することができるアプタマー生成のための方法は、例えば米国特許第６，４２３，４９３号、米国特許第６，５１５，１２０号、米国特許第６，１８０，３４８号、米国特許第５，７５６，２９１号、および米国特許第７，３２９，７４２号中にも記載されている。
【０１４７】
Ｅ．小分子
小分子を使用してＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／またはシグナル伝達を阻害することもできる。様々な実施形態において、１つまたは複数の小分子ケミカルライブラリーをスクリーニングして、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用に選択的に影響を与える可能性がある小分子を同定することができる。例えば、ハイスループットスクリーニングをロボットによって自動化して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／またはシグナル伝達を阻害することができる小分子を評価および／または同定することができる。特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合のコンピュータモデリングを使用して、試験の候補小分子を選択することができる。
【０１４８】
いかなる理論によっても縛られることは望まずに、本発明者らは、ＧＲＰ７８はシャペロンとしてのその能力で細胞表面においてＣｒｉｐｔｏと結合することができると想定する。この場合、ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏ分子を安定化する、またはシグナル伝達に必要とされるＣｒｉｐｔｏの立体配座を助長することができ、したがってＧＲＰ７８は、いくつかの癌遺伝子の活性に必要とされるシャペロン機能を有するＨＳＰ９０と似ている可能性がある。そのＡＴＰ結合部位を遮断するＨＳＰ９０アンタゴニストは臨床試験段階である。ＧＲＰ７８の古典的シャペロン機能が、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達のメディエーターとしてのその役割に必要とされる場合、ＧＲＰ７８ＡＴＰ結合ドメインを標的化する小分子を臨床上利用することが可能である。例えば、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、いくつかの抗癌性を有する緑茶の主要成分である。ＥＧＣＧはＧＲＰ７８と特異的に結合し、ＡＴＰと結合するその能力を阻害することによってそのシャペロン機能を阻害することが示されている（Ｓｖｅｔｌａｎａ  Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６年、６６巻（１８）９２６０〜６９頁）。したがって、ＥＧＣＧの誘導体をスクリーニングして、これらの化合物がＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を妨害することができるかどうか決定することができた。
【０１４９】
Ｖ．医薬調製物
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した、有効量の１つまたは複数のＣｒｉｐｔｏ−および／またはＧＲＰ７８−標的作用物質または他の作用物質を含む。語句「薬学的にまたは薬理学的に許容される」は、例えばヒトなどの動物に適切に投与したとき、有害な、アレルギーまたは他の厄介な反応をもたらさない分子体および組成物を指す。少なくとも１つのＣｒｉｐｔｏ−および／またはＧＲＰ７８−標的作用物質または他の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版によって例証されたように、本開示を鑑みて当業者には公知であろう。さらに、動物（例えばヒト）への投与のために、調製物はＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度標準を満たさなければならないことは理解されよう。
【０１５０】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、当業者には公知であるように、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、これらと同様の物質、およびこれらの組合せを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年、１２８９〜１３２９頁を参照）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合以外は、治療または医薬組成物中のその使用が企図される。
【０１５１】
Ｃｒｉｐｔｏ−および／またはＧＲＰ７８−標的作用物質は、それが固体、液体またはエアロゾル型で投与されるかどうか、および注射などの投与経路のために無菌状態であることが必要とされるかどうかに応じて異なる型の担体を含むことができる。本発明は、当業者には公知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局部、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、直接標的細胞を注入する局所かん流、カテーテルによる、洗浄による、クリーム中、液体組成物（例えば、リポソーム）中、または他の方法もしくは前述の任意の組合せによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照）。
【０１５２】
動物患者に投与する本発明の組成物の実際の投与量は、体重、状態の重度、治療する疾患の型、事前もしくは併用治療介入、患者の突発性疾患、および投与の経路などの、身体的および生理的要因によって決定することができる。投与の責任がある施術者は、いかなる場合でも、組成物中の活性成分（複数可）の濃度、および個々の被験体に適した用量（複数可）を決定する。
【０１５３】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態では、活性化合物は、約２％と約７５％の間の重量単位、または約２５％と約６０％の間、例えば、およびその中で誘導される任意の範囲を含むことができる。他の非制限的な例では、用量は、投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上まで、およびその中で誘導される任意の範囲も含むことができる。本明細書で列挙する数字から誘導される範囲の非制限的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を、前に記載した数字に基づいて投与することができる。
【０１５４】
特定の実施形態では、モノクローナル抗体を、１〜３週間毎に約１〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で被験体（例えば、ヒト患者）に投与することができる。特定の実施形態では、ｓｉＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を、ほぼ１日１回〜ほぼ１週間に１回の間隔で、約１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができる。
【０１５５】
任意の場合において、組成物は１つまたは複数の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含むことができる。さらに、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組合せだけには限られないが、これらを含めた様々な抗菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によって、微生物作用の予防をもたらすことができる。
【０１５６】
Ｃｒｉｐｔｏ−および／またはＧＲＰ７８−標的作用物質は、遊離塩基、中性または塩形で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成される塩、または例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸などの有機酸で形成される塩を含む。遊離カルボキシル基で形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０１５７】
組成物が液体形である実施形態では、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびこれらの組合せだけには限られないが、これらを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、例えば液体ポリオールもしくは脂質などの担体中の分散による必要とされる粒径の維持によって、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、またはこのような方法の組合せによって維持することができる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組合せなどの等張剤を含むことが好ましいと思われる。
【０１５８】
他の実施形態では、本発明中の点眼剤、点鼻液もしくはスプレー、エアロゾルもしくは吸入剤を使用することができる。このような組成物は一般に、標的組織型に適合するように設計する。非制限的な例では、点鼻液は通常、滴もしくはスプレーで鼻腔に投与するように設計された水溶液である。点鼻液は、それらが多くの点で鼻汁と類似し、したがって正常な繊毛作用が維持されるように調製する。したがって、好ましい実施形態では、水性点鼻液を通常等張または若干緩衝処理して、約５．５〜約６．５のｐＨを維持する。さらに、点眼剤調製物、薬剤、または適切な薬剤安定剤において使用するのと同様の抗菌防腐剤を、必要な場合、製剤中に含めることが可能である。例えば、様々な市販の点鼻液調製物が公知であり、抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬剤を含む。
【０１５９】
特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏ−および／またはＧＲＰ７８−標的作用物質は、経口摂取などの経路による投与用に調製する。これらの実施形態では、固体組成物は、例えば、溶液、縣濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル（例えば、硬質または軟質殻ゼラチンカプセル）、徐放製剤、口腔組成物、トローチ、エリキシル剤、縣濁液、シロップ、ウエハ剤、またはこれらの組合せを含むことができる。経口組成物は、食用の食品で直接取り込むことができる。経口投与に好ましい担体は、不活性希釈剤、吸収性食用担体、またはこれらの組合せを含む。本発明の他の態様では、経口組成物はシロップまたはエリキシル剤として調製することができる。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性剤、甘味剤、防腐剤、香味剤、色素、防腐剤、またはこれらの組合せを含むことができる。
【０１６０】
特定の好ましい実施形態では、経口組成物は、１つまたは複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香味剤、およびこれらの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、組成物は、以下の：例えばトラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはこれらの組合せなどの結合剤、例えば第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの組合せなどの賦形剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、またはこれらの組合せなどの崩壊剤、例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、例えばスクロース、ラクトース、サッカリンまたはこれらの組合せなどの甘味剤、例えばペパーミント、冬緑油、チェリー香料、オレンジ香料などの香味剤、または前述のそれらの組合せの１つまたは複数を含むことができる。単位剤形がカプセルであるとき、それは前述の型の物質以外に、液状担体などの担体を含有することができる。様々な他の物質が、コーティングとして、または他の場合は単位剤形の物理的形状を改変するために存在する可能性がある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、シェラック、糖または両方でコーティングすることができる。
【０１６１】
他の投与形態に適した別の製剤には座薬がある。座薬は様々な重量および形状の固体剤形であり、直腸、膣または尿道への挿入のために通常施される。挿入後、座薬は体腔液中で軟化、溶融または溶解する。一般に、座薬に関して、従来の担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはこれらの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、例えば約０．５％〜約１０％、および好ましくは約１％〜約２％の範囲で活性成分を含有する混合物から座薬を形成することができる。
【０１６２】
滅菌注射溶液は、必要に応じて前に列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を取り込ませ、次に濾過滅菌によって調製する。一般に分散液は、基本分散媒および／または他の成分を含有する滅菌媒体中に、様々な滅菌済み活性成分を取り込ませることによって調製する。滅菌注射溶液、縣濁液またはエマルジョンの調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、事前に滅菌濾過したその液体培地から活性成分および任意の他の望ましい成分の粉末を生成する、真空乾燥または凍結乾燥技法である。液体培地は必要な場合適切に緩衝調節しなければならず、液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースの注射前に最初に等張にする。直接注射用の高濃度組成物の調製も企図され、この場合、小領域への非常に迅速な浸透、高濃度の活性剤の送達をもたらすために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。
【０１６３】
組成物は製造および保存条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存しなければならない。エンドトキシン汚染は、安全レベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小に維持しなければならないことは理解されよう。
【０１６４】
特定の実施形態では、注射用組成物の長期の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組合せなどの、吸収を遅延する物質を組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【０１６５】
ＶＩ．過剰増殖性疾患
Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用を妨害する化合物を使用して、癌などの過剰増殖性疾患を治療することができる。癌以外に、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用を妨害する化合物を使用して、乾癬、線維症、腫瘍血管新生、皮膚皮下増殖／瘢痕、アテローム、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症および自己免疫障害を含めた他の過剰増殖性疾患を治療することができる。本明細書中で使用する「過剰増殖性疾患」は、細胞の異常増殖または繁殖をもたらすかまたはそれによって特徴付けられる疾患を指す。過剰増殖性疾患は、例えば前癌病変、良性腫瘍、および癌などの病変を被験体において示す可能性がある。
【０１６６】
様々な癌を、癌細胞中のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／または相互作用の妨害によって、例えば少なくともいくつかの癌細胞とＣｒｉｐｔｏ標的および／またはＧＲＰ７８標的化合物を接触させることによって治療することができる。本発明の方法によって同定した化合物によって治療することができる癌には、固形腫瘍、転移性癌、および／または非転移性癌がある。癌は膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に由来してよい。様々な実施形態において、癌は、新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨大および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮細胞癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；ピロマトリックス癌；移行細胞癌；乳頭状移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；複合肝細胞癌と胆管癌；策状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素細胞癌；好酸性癌；好酸性腺腫；塩基性癌；明細胞腺腫；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭状または濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；ページェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロマンギオサルコーマ；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑中の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合型腫瘍、悪性；ミュラー管混合型腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛腫；中腎、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮繊維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽細胞腫；乏突起グリオーマ；乏突起膠腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽腫；嗅覚神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、巨大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；または有毛細胞白血病として組織学的に分類することができる。
【０１６７】
ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は多くのヒト腫瘍中で広く発現される。それにもかかわらず、乳癌および前立腺癌は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害による細胞増殖の阻害に特に敏感である可能性があると予想される。
【０１６８】
Ａ．併用療法
Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質の有効性を増大するために、本発明のこれらの組成物および方法と、例えば抗癌剤などの過剰増殖性疾患の治療において有効な作用物質を併用することが望ましい可能性がある。「抗癌」剤は、例えば、１つまたは複数の癌細胞を殺傷すること、１つまたは複数の癌細胞中のアポトーシスおよび／または壊死を誘導すること、１つまたは複数の癌細胞の増殖率を低下させること、転移の発生または数を低下させること、腫瘍の大きさを低下させること、腫瘍の増殖を阻害すること、腫瘍または１つまたは複数の癌細胞への血液供給を低下させること、腫瘍間質微小環境を変えること、１つまたは複数の癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を予防または阻害すること、または癌を有する被験体の寿命を増大させることによって、被験体中の癌に悪影響を与えることができる。抗癌剤には、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線療法剤（放射線療法）、外科手術手順（外科手術）、免疫療法剤（免疫療法）、遺伝子療法剤（遺伝子療法）、ホルモン療法、他の生物学的作用物質（生物療法）および／または代替療法がある。
【０１６９】
より一般的に、このような作用物質は、癌細胞を殺傷するまたは癌細胞の増殖を阻害するのに有効な、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質と組合せた量で提供され得る。この方法は、細胞（複数可）と作用物質（複数可）およびＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質を、同時または一定時間内接触させることを含むことができ、この場合、細胞、組織または生物へのＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および作用物質の別個の投与は望ましい治療利点をもたらす。これは、細胞、組織または生物と、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質と１つまたは複数の作用物質の両方を含む１つの組成物または薬理製剤を接触させること、または細胞と、２つ以上の異なる組成物または製剤を接触させることによって実施することができ、この場合、１つの組成物はＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質を含み、他方は１つまたは複数の作用物質を含む。
【０１７０】
用語「接触」および「露出」は、細胞、組織または生物に適用するとき、それによってＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および／または別の作用物質、例えば化学療法剤または放射線療法剤などの治療用構築物が、標的細胞、組織または生物に送達される、または標的細胞、組織または生物と直接並列して配置されるプロセスを記載するために本明細書では使用する。細胞の殺傷または静止状態を得るために、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および／または追加的作用物質（複数可）を、細胞（複数可）を殺傷するまたはそれらが分裂するのを妨げるのに有効な併用量で、１つまたは複数の細胞に送達する。
【０１７１】
Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質は、数分間から数週間の範囲の間隔で、他の作用物質（複数可）より前、それらと併用、および／またはそれらの後であってよい。Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質、および他の作用物質（複数可）を細胞、組織または生物に別々に施す実施形態では、それぞれの送達時間の間の有意な時間期間が失われないことを一般に確実にし、したがってＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および作用物質（複数可）は、細胞、組織または生物に対して有利に組合せた効果を発揮することが依然として可能であろう。例えば、このような場合、細胞、組織または生物と、２、３、４またはそれより多くのモダリティーを、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質とほぼ同時（すなわち、約１分未満以内）に接触させることが可能であることが企図される。他の態様では、１つまたは複数の作用物質を、ほぼ同時、またはＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質の投与前および／または後に、約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８週間以上、およびその中で誘導される任意の範囲以内で投与することができる。
【０１７２】
Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質と１つまたは複数の作用物質の様々な併用レジメンを利用することができる。このような組合せの非制限的な例、「Ａ」であるＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および「Ｂ」である作用物質を含む組成物を以下に示す。
【０１７３】
【化１】
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細胞、組織または生物へのＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質の投与は、存在する場合毒性を考慮に入れた、化学療法剤の投与に関する一般的なプロトコルに従うことができる。治療サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。特定の実施形態では、様々な追加的作用物質を、本発明と任意の組合せで施用することができると企図される。
【０１７４】
１．化学療法剤
用語「化学療法」は癌を治療するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」を使用して、癌の治療中に投与される化合物または組成物を意味する。生化学療法として公知である化学療法の１つの亜型は、生物療法と化学療法の併用を含む。
【０１７５】
化学療法剤には、５−フルオロウラシル、ベロマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性型）、トランスプラチナム、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、ビンクリスチン、または前述の任意のアナログもしくは誘導変異体があるが、これらだけには限られない。これらの作用物質または薬剤は、細胞内でのそれらの活性形態、例えばどの段階でそれらが細胞周期に影響を与えるかどうかによって分類される。あるいは、ＤＮＡと直接架橋する、ＤＮＡ中に挿入する、または核酸合成に影響を与えることによって染色体および分裂異常を誘導する、その能力に基づいて、作用物質を特徴付けることができる。大部分の化学療法剤は、以下のカテゴリー、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗体、コルチコステロイドホルモン、分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン剤、混合型作用物質、またはそれらの任意のアナログもしくは誘導変異体の範囲内にある。
【０１７６】
化学療法剤および投与法、用量などは、当業者には周知であり（例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、および「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」を参照）、本明細書の開示を鑑みて本発明と組合せることができる。用量のある程度の変更は、治療する被験体の状態に応じて必然的に起こる。投与の責任がある人は、いかなる場合でも、個々の被験体に適した用量を決定する。具体的な化学療法剤および用量レジメの例は、本明細書でさらに記載する。当然ながら、本明細書で記載するこれらの用量および作用物質のすべては制限的ではなく例示的であり、当業者によって、他の用量および作用物質を具体的な患者または用途に使用することができる。これらのポイント、またはその中で誘導される範囲内−間の任意の用量も、本発明において有用であると予想される。
【０１７７】
２．放射線療法剤
放射線療法剤には、ＤＮＡの損傷を誘導する放射線および波長、例えばγ線照射、Ｘ線、陽子ビーム療法（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体などがある。前に記載した型の放射線で局所腫瘍部位を照射することによって、療法を実施することができる。すべてのこれらの作用物質が、広範囲の損傷ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に影響を与える可能性が最も高い。
【０１７８】
放射線療法剤および投与法、用量などは、当業者には周知であり、本明細書の開示を鑑みて本発明と組合せることができる。例えば、Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の間の５０〜２００レントゲンの一日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一線量の範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変化し、同位体の半減期、放出される放射線の強度および型、および新生腫瘍細胞による取込みに依存する。
【０１７９】
３．外科手術
癌を有する約６０％の人がいくつかの型の外科手術を受けており、それは例えば、予防的、診断的または段階的、根治目的および症状緩和目的の外科手術を含む。外科手術、および特に根治目的の外科手術は、本発明の療法などの他の療法、および１つまたは複数の他の作用物質と併用して使用することができる。
【０１８０】
根治目的の外科手術は、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、摘出および／または破壊する切除術を含む。外科手術は、表在性癌、前癌性、または偶発量の正常組織を除去、摘出または破壊することができるとさらに企図される。外科手術による治療には、例えば、腫瘍切除術、レーザー外科手術、凍結外科手術、電気外科手術、および顕微鏡制御型外科手術（モーの外科手術）がある。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的除去を指す。癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の摘出によって、身体中に腔が形成され得る。
【０１８１】
外科手術の腫瘍もしくは領域のさらなる治療は、追加的な抗癌剤を用いた、領域のかん流、直接注射もしくは局所施用によって実施することができる。このような治療は、例えば、約１日毎、約２日毎、約３日毎、約４日毎、約５日毎、約６日毎、または約７日毎、または約１週毎、約２週毎、約３週毎、約４週毎、または約５週毎、または約１カ月毎、約２カ月毎、約３カ月毎、約４カ月毎、約５カ月毎、約６カ月毎、約７カ月毎、約８カ月毎、約９カ月毎、約１０カ月毎、約１１カ月毎、または約１２カ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、様々な用量であってもよい。
【０１８２】
４．免疫療法剤
免疫療法剤は一般に、免疫エフェクター細胞および分子を使用して、癌細胞を標的化および破壊することによるものである。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体単独で療法のエフェクターとして働くことができ、またはそれは他の細胞を動員して、細胞殺傷に実際に影響を与えることができる。抗体は薬剤または毒素（例えば、化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合することができ、標的作用物質として単独で働くこともできる。このような抗体コンジュゲートはイムノトキシンと呼ばれ、当技術分野では周知である（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６８６，０７２号、米国特許第５，５７８，７０６号、米国特許第４，７９２，４４７号、米国特許第５，０４５，４５１号、米国特許第４，６６４，９１１号、および米国特許第５，７６７，０７２号）。あるいはエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞がある。
【０１８３】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化の影響を受け易い、すなわち大部分の他の細胞上に存在しない、いくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも本発明の文脈での標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐ１５５がある。
【０１８４】
５．遺伝子療法剤
化学療法剤および放射線療法剤などの作用物質に耐性がある腫瘍細胞は、臨床腫瘍学において重大な問題となる。現在の癌研究の１つの目的は、このような作用物質と遺伝子療法を組合せることによって、１つまたは複数の抗癌剤の有効性を改善するための方法を見つけることである。例えば、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達すると、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘導した（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２年）。本発明の文脈では、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８標的作用物質および／または他の作用物質と併用して、遺伝子療法を同様に使用することができることが企図される。
【０１８５】
６．分子標的療法
「標的作用物質」という用語は、標的特異的分子またはシグナル伝達経路によって疾患を治療するために使用される、任意の作用物質（例えば、抗体を含めた小分子およびポリペプチド）を意味する。抗Ｃｒｉｐｔｏおよび／または抗ＧＲＰ７８作用物質と１つまたは複数の他の標的作用物質の組合せは、癌細胞に重要な多数の経路を標的化することによって癌の治療を改善することができる。
【０１８６】
ＶＩＩ．ＣＲＩＰＴＯ／ＧＲＰ７８複合体形成の阻害による神経分化の促進
本発明によるＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／または機能の阻害を利用して、幹細胞の神経分化を促進することもできる。ほぼ任意の多能性幹細胞または細胞系、例えばヒト胚幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の分化が、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／またはシグナル伝達の妨害によって影響を受ける可能性があると予想される。例えば、ヒト胚幹細胞系Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、および／またはＨ１４などを本発明と共に使用することができる。後に利用可能な状態になる幹細胞系も、本発明と共に使用することができることがさらに予想される。例えば哺乳動物、マウス、霊長類などの他の胚幹細胞も、本発明と共に使用することができる。
【０１８７】
当業者によって理解されるように、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと一般に略される誘導多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、典型的には成人体細胞から人工的に誘導した型の多能性幹細胞である。誘導多能性幹細胞は、特定幹細胞の遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、テラトーマ形成、生存キメラ形成、ならびに有効性および分化性を含めた多くの点で、胚幹細胞などの天然多能性幹細胞と同一であると考えられるが、天然多能性幹細胞とそれらの関係の完全な程度は依然として評価中である。ＩＰＳ細胞は以前から記載されている（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年、Ｙｕら、２００７年を参照）。
【０１８８】
ＶＩＩＩ．ＣＲＩＰＴＯ／ＧＲＰ７８複合体形成および機能のモジュレーターを求めたスクリーニング
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８相互作用の機能、例えば、結合し下流シグナル伝達をもたらすＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８の能力のモジュレーターを同定するための方法をさらに含む。これらのアッセイは、候補物質の巨大なライブラリーのランダムなスクリーニングを含むことができ、あるいはアッセイを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成の機能をそれらが調節する可能性がより高くなると考えられる、構造属性に対する見地で選択した特定クラスの化合物に焦点を当てることができる。
【０１８９】
機能によって、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の結合、および／またはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の形成に起因する１つまたは複数の下流シグナル伝達経路（例えば、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達）の評価をアッセイすることができることを意味する。例えば、候補モジュレーターの有無の下でのＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ結合をアッセイすることができる。
【０１９０】
Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターを同定するために、一般に候補物質、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の機能または形成を変える任意の物質として定義されるモジュレーターの有無の下でのＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８の機能が決定される。例えば、方法は一般に、
（ａ）候補モジュレーターを提供すること、
（ｂ）候補モジュレーターと単離化合物または細胞、または適切な実験動物を混合すること、
（ｃ）候補モジュレーターが、ステップ（ｃ）における細胞または動物中のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／または下流シグナル伝達を改変または妨害することができるかどうか測定すること、および
（ｄ）前記候補モジュレーターの不在下において、ステップ（ｃ）中で測定した特徴と化合物、細胞、または動物の特徴を比較することを含み、
測定した特徴間の差は、前記候補モジュレーターが実際に、化合物、細胞、または動物のモジュレーターであることを示す。
【０１９１】
特定の実施形態では、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８結合および／またはシグナル伝達を選択的に妨害する候補モジュレーターを使用して、過剰増殖性疾患を治療することができる。アッセイは無細胞系中、単離細胞中、またはトランスジェニック動物を含めた生物中で実施することができる。
【０１９２】
当然ながら、有効な候補を発見することができないという事実にもかかわらず、本発明のすべてのスクリーニング法は、それら自体は有用であることは理解されよう。本発明は、単に候補を発見するための方法ではなく、このような候補をスクリーニングするための方法を提供する。
【０１９３】
１．モジュレーター
本明細書で使用する用語「候補物質」は、おそらくＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成または活性を阻害または増大する可能性がある任意の分子を指す。候補物質は、タンパク質またはその断片、小分子、またはさらに核酸分子であってよい。大部分の有用な薬理化合物は、Ｎ−２０抗体と構造上関連がある化合物、ＧＲＰ７８（例えば、配列番号５）またはＣｒｉｐｔｏ（例えば、配列番号４）を標的化するｓｈＲＮＡ、ＣｒｉｐｔｏまたはＧＲＰ７８由来のペプチド、Ｃｒｉｐｔｏの合成ＣＦＣドメイン、可溶性ＡＬＫ４ＥＣＤまたはその変異体（１７０Ａ、Ｌ７５Ａ、Ｐ７７Ａ）、ＥＣＧＣ、またはＣＦＣドメイン上のＧＲＰ７８結合部位を標的化するＣｒｉｐｔｏ抗体と構造上関連がある化合物であろうことを立証することができる。改良型化合物の開発を手助けするリード化合物の使用は「合理的薬剤設計」として公知であり、公知の阻害剤と活性剤の比較だけでなく、標的分子の構造に関する予想を含む。
【０１９４】
合理的薬剤設計の目的は、生物活性ポリペプチドまたは標的化合物の構造アナログを生成することである。このようなアナログを作製することによって、天然分子より活性があるまたは安定性がある、変化に対して異なる感受性を有する、または様々な他の分子の機能に影響を与えることができる薬剤を形成することができる。一手法では、標的分子、またはその断片の三次元構造を作製することが可能である。これはｘ線結晶学的技法、コンピュータモデリングによって、または両手法の組合せによって実施することが可能である。
【０１９５】
抗体を使用して、標的化合物活性剤または阻害剤の構造を確認することもできる。原則として、この手法はファーマコアを生成し、後の薬剤設計はそれに基づくことができる。機能的、薬理的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶学的技法を完全に回避することができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は原型抗原のアナログであると予想され得る。したがって抗イディオタイプを使用して、化学的または生物学的に生成したペプチドの集団からペプチドを同定および単離することができる。選択したペプチドは、その後ファーマコアとして働き得る。抗イディオタイプは、抗体を産生するための本明細書に記載する方法を使用して、抗原として抗体を使用して作製することができる。
【０１９６】
他方で、様々な市販の供給源から、有用な化合物の同定を「強引に行う」ための努力で、有用な薬剤に関する基本的基準に見合うと考えられる小分子ライブラリーを簡単に得ることができる。コンビナトリアルによって作製したライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含めた、このようなライブラリーのスクリーニングは、活性に関して多数の関連（および無関連）化合物をスクリーニングするための迅速で有効な方法である。コンビナトリアル手法は、活性モデルの第二、第三および第四世代の化合物、ただし他の場合は望ましくない化合物の作製によって潜在的薬剤の急速な進化にも役立つ。
【０１９７】
候補化合物は天然に存在する化合物の断片もしくは一部分を含むことができ、または活性がある公知の化合物の組合せとして発見することができるが、他の場合は不活性である。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含めた植物供給源、および海洋試料などの天然供給源から単離した化合物は、おそらく有用な薬剤の存在に関する候補としてアッセイすることができることが提案される。スクリーニングする薬剤は、化学組成物もしくは人工化合物に由来する可能性がある、またはそこから合成することができることは理解されよう。したがって、本発明によって同定する候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または公知の阻害剤もしくは刺激剤から始まる合理的薬剤設計によって設計することができる、任意の他の化合物であってよいことは理解される。
【０１９８】
他の適切なモジュレーターには、そのそれぞれが標的分子に特異的であり得る、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体（単鎖抗体含む）がある。このような化合物は、本文書の他の箇所でさらに詳細に記載する。例えば、翻訳もしくは転写開始部位、またはスプライシング接合部と結合するアンチセンス分子は、理想的な候補阻害剤であり得る。
【０１９９】
初期に同定したモジュレーター化合物以外に、本発明者らは、他の立体的に類似した化合物を製剤化して、モジュレーターの構造の重要部分を模倣することができることも企図する。ペプチドモジュレーターのペプチド模倣体を含むことができるこのような化合物は、初期モジュレーターと同じ方法で使用することができる。
【０２００】
本発明による阻害剤は、上流、下流、またはＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体に直接、その阻害または活性効果を発揮する阻害剤であってよい。本発明のスクリーニング法によって同定する阻害剤または活性化剤の型とは無関係に、このような化合物による阻害または活性の影響は、追加的候補物質の不在下で観察したものと比較して、低下または阻害されたＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成または活性をもたらす。
【０２０１】
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
迅速、安価、および実施するのが容易なアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。このようなアッセイは一般に単離分子を使用し、迅速および多数で実施することができ、したがって短期間で得られる情報量を増大することができる。試験管、プレート、皿、およびディップスティックまたはビーズなどの他の表面を含めた、様々な容器を使用してアッセイを実施することができる。
【０２０２】
無細胞アッセイの一例は結合アッセイである。直接機能を果たすわけではないが、特異的形式で標的分子と結合するモジュレーターの能力は、関連する生物学的影響の強力な証拠である。例えば、分子と標的の結合は、立体的、アロステリックまたは電荷間相互作用のため、それ自体が阻害的である可能性がある。標的は、溶液中に遊離した状態、支持体に固定された状態、細胞の表面中もしくは上で発現された状態のいずれかであってよい。標的または化合物のいずれかを標識し、それによって結合の決定を可能にすることができる。通常、標的は標識種であり、標識が結合に干渉するまたはそれを増大する確率は低下する。作用物質の１つを標識する競合結合形式を実施することができ、遊離標識と結合標識の量を測定して、結合に対する影響を決定することができる。
【０２０３】
化合物のハイスループットスクリーニングのための技法はＷＯ８４／０３５６４中に記載される。多数の小分子ペプチド試験化合物が、プラスチックピンなどの固形支持体上またはいくつか他の表面上で合成される。結合したポリペプチドは様々な方法によって検出される。
【０２０４】
３．ｉｎ  ｃｙｔｏアッセイ
本発明は、細胞中のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／または機能を調節するそれらの能力に関する、化合物のスクリーニングも企図する。この目的用に具体的に操作した細胞を含めた様々な細胞系を、このようなスクリーニングアッセイに利用することができる。例えば、本明細書に記載する観察に基づいて、癌細胞および／または幹細胞を候補Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターと接触させることが可能である。他の実施形態では、細胞系を操作してＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８を過剰発現させ、推定Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターのスクリーニングを容易にすることが可能である。ＧＲＰ７８タンパク質は市販されており、マルチウエルプレートの表面上に固定して、可溶性Ｃｒｉｐｔｏの結合およびＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターの影響を測定するための、ＥＬＩＳＡベースのアッセイの開発を可能にすることができる。あるいは本発明者らは、その表面でＧＲＰ７８を発現する無傷細胞との可溶性１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏの結合は、測定することができることを示している（例えば、Ｋｅｌｂｅｒら参照）。Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体モジュレーターをこのアッセイ中でスクリーニングして、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合およびシグナル伝達に影響を与えるそれらの能力を測定することもできる。
【０２０５】
アッセイに応じて、培養が必要とされる可能性がある。いくつかの異なる生理的アッセイのいずれかを使用して細胞を調べる。あるいは、分子学的分析、例えばタンパク質発現、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ含む）およびその他の調査を実施することができる。
【０２０６】
４．ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、特異的欠陥を有する、または生物内の異なる細胞に到達し影響を与える候補物質の能力を測定するために使用することができるマーカーを保持するように操作した、トランスジェニック動物を含めた様々な動物モデルの使用を含む。それらの大きさ、取り扱い易さ、およびそれらの生理的および遺伝子構成に関する情報のため、マウス、特にトランスジェニックマウスは好ましい実施形態である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマおよびサル（チンパンジー、テナガザルおよびヒヒ含む）を含めた、他の動物も適切である。モジュレーターのアッセイは、これらの種のいずれかに由来する動物モデルを使用して実施することができる。
【０２０７】
このようなアッセイでは、１つまたは複数の候補物質を動物に投与し、候補物質（複数可）で処理しなかった同様の動物と比較した、１つまたは複数の特徴を変える候補物質（複数可）の能力は、モジュレーターを同定する。特徴は、個々の化合物（例えば酵素、受容体、ホルモン）または細胞（例えば増殖、腫瘍形成、生存）の機能に関して前に論じた特徴のいずれか、または代わりに例えば挙動、貧血、免疫応答などの広範囲の兆候であってよい。
【０２０８】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／または機能に影響を与える候補物質のスクリーニング法を提供する。これらの実施形態において、本発明は、候補物質を動物に投与するステップ、および細胞増殖、過剰増殖性疾患の発生または阻害、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／またはシグナル伝達の１つまたは複数の特徴を低減する候補物質の能力を決定するステップを一般に含む、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成および／または機能を阻害する候補物質の能力を決定するための方法を対象とする。
【０２０９】
試験化合物を用いたこれらの動物の治療は、動物への適切な形での化合物の投与を含み得る。投与は、経口、鼻腔、頬側、またはさらに局所だけには限られないが、これらを含めた、臨床または非臨床目的に利用可能である任意の経路であってよい。あるいは投与は、気管内注入、気管支注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であってよい。具体的に企図される経路は、全身静脈注射、血液もしくはリンパ供給を介した局部投与、または患部への直接投与である。
【０２１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の有効性の決定は、様々な異なる基準を含み得る。さらに、毒性および用量応答性の測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｃｙｔｏアッセイ中より有意義な形式で動物において実施することができる。
【実施例】
【０２１１】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。以下の実施例中に開示する技法は、本発明者らによって発見された本発明を実施する際に十分機能する技法であり、したがって本発明を実施するのに好ましい形態を構成すると考えることができることは、当業者によって理解されるはずである。しかし当業者は、本開示を鑑みて、多くの変更を開示する具体的な実施形態に施すことができ、本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様もしくは類似の結果をさらに得ることができることを理解しているはずである。
【０２１２】
（実施例１）
材料および方法
材料。ＮｕＰＡＧＥゲル、分子量標準およびＣｙｑｕａｎｔ細胞増殖アッセイキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのものであった。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。ＴＧＦ−β１はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）、抗ＨＡ（ＨＡ−７）、抗Ｈｉｓ（Ｈｉｓ−１）および抗パンカドヘリン抗体ならびに抗ＦｌａｇＭ２ゲルビーズ、Ｆｌａｇペプチドおよびタプシガルギンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０および７６−Ｅ６）、抗ＴβＲＩＩ（Ｃ１６）およびタンパク質Ｇ−ＰＬＵＳ−アガロースビーズは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。抗ＧＲＰ７８（ＫＤＥＬ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｎｎ
Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのものであった。抗ホスホＳｍａｄ２、抗ＴβＲＩおよび抗パンアクチンは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。ｐ２６−Ｆｌａｇ発現構築物は、Ｋｕｏ  Ｆｅｎ  Ｌｅｅ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの寛大な贈答品であった。Ｃｒｉｐｔｏ（６９００）に対する抗体を、マウスＣｒｉｐｔｏアミノ酸８１〜９７に及ぶＣｙｓ８１とＣｙｓ９０の間で環化したペプチドに対して産生した。Ｓｍａｄ２抗血清を、ヒトＳｍａｄ３のアミノ酸１５９〜１７５に及ぶＳｍａｄ２とＳｍａｄ３の間で保存されたペプチドに対して産生した。Ｆｌａｇエピトープ（６６４３）を標的化するポリクローナル抗血清を、２×Ｆｌａｇペプチドに対して産生した。ウサギポリクローナル抗Ｃｒｉｐｔｏ、抗Ｓｍａｄ２／３および抗Ｆｌａｇ抗血清は、Ｊｏａｎ  Ｖａｕｇｈａｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって生成された。
【０２１３】
組換えヒトアクチビン−Ａは、Ｄｒ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｒ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）によって寛大に与えられた安定状態のアクチビン−Ａを発現する細胞系を使用して作製し、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｌｋ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって精製された。組換えマウスノーダル、ヒトＴＧＦ−β１、ヒトアクチビン−ＢおよびマウスＣｒｉｐｔｏは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。タンパク質Ａ−およびＧ−アガロースおよびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）およびＭＡＰＫまたはＥｒｋキナーゼ（ＰＤ９８０５９）阻害剤は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏは、以前に記載されたように（Ｖａｕｇｈａｎ、１９９３年）クロラミンＴ法を使用して調製した。ポリクローナル抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体（６９００）は、Ｃｒｉｐｔｏ（８２ＣＰＰＳＦＹＧＲＮＣＥＨＤＶＲＫＥ９８（配列番号１））の表皮増殖因子様ドメイン由来のペプチドで免疫処置したウサギにおいて産生した。ヤギＩｇＧ、抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０）および抗ホスホチロシン（ＰＹ９９）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。抗ホスホＳｍａｄ２、抗Ｓｍａｄ２／３、抗パンアクチン、抗ホスホＡｋｔ、抗Ａｋｔ、抗ホスホＧＳＫ３ｂ、抗ホスホＥｒｋ１／２、抗Ｅｒｋ１／２、抗ホスホＳｒｃ（Ｙ４１６）、および抗Ｓｒｃは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。抗ＨＡ、抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）および抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）アガロースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス、抗ヤギ、抗ウサギＩｇＧ、３，３’，５’５−テトラメチルベンジジン基質、化学発光基質（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標））、およびＢＣＡタンパク質アッセイキットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から得た。
【０２１４】
発現構築物、細胞系および一過性トランスフェクション。野生型および変異体マウスＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ発現構築物は以前に記載されている（Ｇｒａｙら、２００６年）。Ｃｒｉｐｔｏ構築物はレンチウイルスの生成用のレンチウイルスベクターｐＣＳＣ（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９８年）においても作製した。この試験で使用したレンチウイルスベクターは、Ｉｎｄｅｒ  Ｖｅｒｍａ（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの寛大な贈答品であった。ＴβＲＩ−ＨＡおよびＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ発現構築物は、Ｊｏａｎ  Ｍａｓｓａｇｕｅ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からの贈答品であった。標準的なＰＣＲ技法を使用して、そのＣ末端にヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープを有するヒトＧＲＰ７８構築物を作製した。２９３Ｔ細胞、Ｐ１９細胞およびＨｅＬａ細胞はＤＭＥＭ中で増殖し、ＰＣ３細胞はΦ−Ｋ１２培地中で増殖した。培地には１０％ウシ胎児血清（２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＰＣ３）または７．５％ウシ胎児血清（Ｐ１９）およびペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充した。一過性トランスフェクション用に、２９３Ｔ細胞をポリリシンコーティングした１５ｃｍプレート上に平板培養し（約１０７細胞／プレート）、次いで以前に記載されたように（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、２００４年）ＰＥＩトランスフェクション試薬を使用して、翌日約４０〜６０％の集合状態でトランスフェクトした。
【０２１５】
以下の培養プロトコールを実施例３中で使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はダルベッコ改変イーグル培地中で増殖し、ＮＣＣＩＴ細胞はＲＰＭＩ１６４０中で増殖した。両方の培地に１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充した。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、５％のドナーウマ血清、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０μｇ／ｍＬのインスリン、０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、および１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒を補充したダルベッコ改変イーグル培地−Ｆ−１２（５０：５０）中で増殖した。
【０２１６】
一過性トランスフェクション用に、細胞を４０〜６０％の集合状態の密度で平板培養し、製造者の説明書に従い、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＮＣＣＩＴ細胞に使用し、パーフェクチン（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は２９３Ｔ細胞に使用した。ウイルス形質導入用に、レンチウイルスを以前に記載されたように（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９８年）生成した。３〜５の感染多重度を得るのに適した希釈のウイルス含有培地を使用して、送達ベクターを含有する細胞のプールを作製し、感染の有効度は、蛍光顕微鏡の使用により感染細胞中の緑色蛍光タンパク質発現をモニタリングすることによって決定した。
【０２１７】
質量分光分析。質量特異的バンドをクマシーブルー染色ゲルから切除した。ゲル切片は、４０％水性ｎ−プロパノールおよび５０％水性アセトニトリルを用いた処置によってさらに脱色した。脱色したゲル切片に、１０μｌの重炭酸アンモニウム溶液（２０ｍＭ）に溶かした１００ｎｇのトリプシンを加えた。消化は３７℃で１６時間進行させた。１マイクロリットルの上清をＭＡＬＤＩ標的上にスポットし、アルファ−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸の１μｌ飽和溶液と混合した。乾燥後、サンプルはポジティブリフレクションＴＯＦモードにおいてＢｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で分析した。マスフィンガープリントデータは、Ｍａｓｃｏｔアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を使用して分析した。
【０２１８】
蛍光イメージング。２９３Ｔ細胞（ウエル当たり３５，０００）およびＰ１９細胞（ウエル当たり５００，０００）を１２ウエルプレートに平板培養し、ポリリシンで予め処置したカバーガラス上で一晩増殖した。細胞はＫＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次いでバッファーＡ（２％ロバ血清および０．２％トリトンＸ−１００を補充したＫＰＢＳ）中で浸透処置した。２９３Ｔ細胞はウサギ抗Ｃｒｉｐｔｏ（６９００；１：６００）およびヤギ抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０ｓｃ−１０５０；１：４００）で処置し、一方Ｐ１９細胞は、４℃で４８時間バッファーＡ中において、同じ抗Ｃｒｉｐｔｏ（６９００；１：６００）および抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０ｓｃ−１０５０１：１２５）抗体およびマウス抗パンカドヘリン（Ｃ１８２１、Ｓｉｇｍａ、１／１２５）で処置した。細胞はＫＰＢＳで洗浄し、次いでバッファーＡ中において室温で１時間、それぞれ抗ウサギ、抗ヤギおよび抗マウスで処置した。ＫＰＢＳ中でさらに洗浄した後、ＤＡＰＩの存在下でカバーガラスを載せ、次いで蛍光可視状態にした。共焦点像用に、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ共焦点システム（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。イメージはそれぞれの励起波長の連続スキャニングを使用して回収し、フルオロフォア間のいかなるブリードスルーも回避した。
【０２１９】
レンチウイルスｓｈＲＮＡベクターの設計および細胞系の感染。ヒトＧＲＰ７８遺伝子内の標的配列は、Ｓフォールドプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｆｏｌｄ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈ．ｏｒｇ／ｓｉｒｎａ．ｐｌ）を使用して同定および選択した。低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の設計およびレンチウイルスｓｈＲＮＡベクターの生成は以前に記載されたように実施した（Ｓｉｎｇｅｒら、２００５年）。ＧＲＰ７８１（Ｇ１）ｓｈＲＮＡを作製するために使用した８３−ｍｅｒは以下の通りであった：５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡ  ＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡ  −３’（配列番号２）。ウイルス形質導入用に、レンチウイルスを以前に記載されたように（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９８年）生成した。
【０２２０】
野生型Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ発現構築物は以前に記載されている（Ｇｒａｙら、２００６年）。標準的なＰＣＲ技法を使用して、そのＣ末端にＨＡエピトープを有するヒトＧＲＰ７８構築物を作製した。Δ１９〜６８ＧＲＰ７８−ＨＡ構築物は、以前に記載されたように（Ｈａｒｒｉｓｏｎ、ＣＡ２００３年ＪＢＣ）ＰＣＲ技法を使用して作製した。Ｃｒｉｐｔｏ構築物も、レンチウイルスの生成および細胞系の感染用に、レンチウイルスベクターｐＣＳＣ（ＭｉｙｏｓｈｉＨＵ１９９８年ＪＶｉｒｏｌ）において作製した。ヒトＣｒｉｐｔｏまたはＧＲＰ７８遺伝子内の標的配列は、Ｓフォールドプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｆｏｌｄ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈ．ｏｒｇ／ｓｉｒｎａ．ｐｌ）を使用して同定および選択した。低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の設計およびレンチウイルスｓｈＲＮＡベクターの生成は本質的に以前に記載されたように実施した（Ｓｉｎｇｅｒ  Ｏ
２００５年  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏ）。簡単に言うと、ヒトＣｒｉｐｔｏまたはＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡ配列を含有する８３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、およびＴ３オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３））を使用して断片をＰＣＲ増幅し、次いでそれを、その中でｓｈＲＮＡ発現がＨ１プロモーターによって誘導されるレンチウイルスベクターにサブクローニングした（Ｓｉｎｇｅｒ  Ｏ  ２００５年  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏ）。ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡおよびＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡベクターを作製するために使用した８３−ｍｅｒは、それぞれ５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡ−３’（配列番号４）および５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧ  Ａ  ＡＴＧＴＡＴＧＧＴＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡ−３’（配列番号５）であり、これらは以前に確認されている（Ｇｒａｙら、２００６年、Ｓｈａｎｉら、２００８年）。
【０２２１】
細胞溶解物および免疫沈降。細胞溶解物は以前に記載されたように（Ｇｒａｙら、２００６年）ＲＩＰＡバッファー中で調製した。免疫沈降実験用に、１〜５ｍｇのタンパク質抽出物を、４℃で２時間タンパク質Ｇ−ＰＬＵＳ−アガロースビーズによって予め精製した。予め精製した抽出物は、４℃で２時間、１５μｌの抗ＧＲＰ７８（ＫＤＥＬ）、１０μｌの抗ＨＡ、または２５μｌの抗Ｈｉｓとプレインキュベートした４０μｌの抗ＦＬＡＧＭ２ゲルビーズまたは２０μｌのＧ−ＰＬＵＳ−アガロースと共に、示したようにインキュベートした。後に免疫沈降物を、ＲＩＰＡバッファーで４回および５４Ｋバッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７．９、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のトリトンＸ−１００）で２回洗浄した。次いでタンパク質を、サンプルバッファーにおいて９５℃でビーズを加熱すること、または５０μｌのＦｌａｇペプチド（１μｇ／μｌ）を加え、次にサンプルバッファー中での加熱によって任意の残りの結合タンパク質を除去することのいずれかによって溶出した。ウエスタンブロッティング
細胞表面ビオチン化。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをＨＤＢ中に０．５ｍｇ／ｍｌで新たに調製し、次いで使用するまで氷上に保存した。接着性の、無傷細胞を氷冷ＨＤＢで２回すすぎ、次いで細胞を完全に含むのに十分な体積（例えば、６ウエルプレートに関して１ｍｌ／ウエル）を使用して、氷上で３０分間ビオチン溶液とインキュベートした。次いでビオチン化反応を１ＭのトリスｐＨ７．５を加えた後に停止させて、ビオチン／ＨＤＢ溶液を５０ｍＭトリスの最終濃度にした。生成した溶液を除去し、５０ｍＭトリスを含有するＨＤＢ中で細胞を１回すすいだ。次いで細胞を、標準的なプロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１％のＮＰ４０／０．５％のデオキシコレート／０．１％のＳＤＳ）中で溶かした。ビオチン化タンパク質はＳＤＳＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースにブロッティングし、次いでアビジン−ＨＲＰおよびＥＣＬを用いた処置後に目に見える状態にした。
【０２２２】
細胞死アッセイ。それぞれの細胞集団に関して、それぞれ少なくとも１００個のＧＦＰ陽性細胞からなる３つの視野を、それらの形状に応じてアポトーシス細胞に関して記録した。アポトーシス性であると決定した細胞数を視野中のＧＦＰ陽性細胞の全数で割って、アポトーシス細胞の割合を得た。
【０２２３】
タンパク質リン酸化。細胞を２４ウエルプレート中で集合状態まで増殖させて、無血清培地および血清飢餓培地で４時間すすいだ。適切な阻害剤または遮断抗体を１時間示したように加えた。細胞は示した用量のＴＧＦ−βリガンドで６０分間、または可溶性Ｃｒｉｐｔｏで１０分間刺激した。細胞は、２０ｍＭのＮａＦ、５００μＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＯｒｔｈｏｔｈａｎｉｔａｔｅ、および標準的なプロテアーゼ阻害剤を補充した、５０μＬの氷冷放射線免疫沈降（ＲＩＰＡ）バッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％のデオキシコレート、および０．１％のＳＤＳ）を加えることによって採取した。１５ｍＬの４ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（ジチオスレイトール含む）を次いでそれぞれのサンプルに加え、タンパク質はＳＤＳＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースにブロッティングした。ブロットは、抗ホスホＳｍａｄ２（１：５００）、抗Ｓｍａｄ２／３（１：１０００）、抗ホスホＡｋｔ（１：５００）、抗Ａｋｔ（１：５００）、抗ホスホＧＳＫ３β（１：５００）、抗パンアクチン（１：５００）、抗ホスホＥｒｋ１／２（１：５００）、または抗Ｅｒｋ１／２（１：５００）抗体、次にホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した抗ウサギまたはマウスＩｇＧで処置し、増大した化学発光を使用してバンドを検出した。
【０２２４】
Ｓｍａｄ２のリン酸化およびウエスタンブロッティングは以下のように実施した。レンチウイルスを安定的に感染させたＨｅＬａ細胞またはＰＣ３細胞を、ウエル当たり２００，０００個の細胞の密度で６ウエルプレート上に平板培養した。平板培養後４８時間で、細胞をＨＤＢで１回洗浄し、無添加培地中で４時間飢餓状態にし、次いで未処置のままとするか、または３０分間ＴＧＦ−β１で処置した。細胞を溶解し、Ｓｍａｄ２リン酸化のアッセイは以前に記載されたように（Ｇｒａｙら、２００６年）ウエスタンブロッティングによって実施した。
【０２２５】
軟寒天中での細胞増殖アッセイおよびコロニー形成。ＰＣ３細胞は前に記載したようにｐＣＳＣレンチウイルス構築物を安定的に感染させた。細胞は５００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレート上に平板培養し、２４時間後、細胞を１０ｐＭのＴＧＦ−β１で処置するか、または未処置のままとした。処置後８日で、製造者の説明書に従いＣｙｑｕａｎｔ細胞増殖キットを使用して細胞増殖を測定した。軟寒天中でのコロニー形成を測定するために、９６ウエルプレートを５０μｌ／ウエル、ＰＣ３増殖培地中に再縣濁した０．６％寒天（Ｎｏｂｅｌ）からなる表面層で調製した。１，０００個の安定的に感染させたＰＣ３細胞を含有する、追加的な７５μｌ／ウエルの０．３３％寒天／ＰＣ３増殖培地を次いでそれぞれのウエルに加え、次に寒天が凝固する前に特定最終濃度を得るために様々な量で含めたＴＧＦ−β１を加えた。１５日間ＴＧＦ−β１有りまたは無しの１００μｌのＰＣ３増殖培地をウエルに再度与え、次いでコロニーを顕微鏡によって目視し計数した。特定ウエルの写真を、最低倍率に設定した倒立Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ４０顕微鏡に据え付けられたＣａｎｏｎ  ＥＯＳ  ４００Ｄカメラを使用して撮った。
【０２２６】
細胞表面タンパク質の検出。２４ウエルプレート中に三連で平板培養した無傷細胞をＨｅｐｅｓ解離バッファー（ＨＤＢ）で洗浄し、３％ウシ血清アルブミン／ＨＤＢでブロッキングし、３％ウシ血清アルブミン／ＨＤＢ中で室温において２時間、抗Ｃｒｉｐｔｏ（６９００；１：２００）、抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０；１：２００）または適切な陰性対照一次抗体とインキュベートした。細胞はＨＤＢで洗浄し、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートした。特異的抗体の染色は、以前に記載されたように（Ｇｒａｙら、２０００年、Ｋｅｌｂｅｒ  ＪＡら、２００８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（８巻）４４９０〜５００頁）、３，３’，５’５−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質を使用して測定した。
【０２２７】
Ｓｍａｄ２依存性ルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼアッセイを以前に記載されたように（Ｇｒａｙら、２００３年）、Ａ３−ルシフェラーゼレポーターを使用して実施した。Ａ３−ルシフェラーゼレポーター構築物は、基本ＴＡＴＡボックスおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子と連結したＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｍｉｘ．２プロモーター由来の、アクチビン応答エレメントの３コピーを含有する。ＮＣＣＩＴ細胞はポリ−Ｄ−リシンコーティング２４ウエルプレート上に１×１０５細胞／ウエルで平板培養し、２００ｎｇのＡ３−ルシフェラーゼ、４００ｎｇのＦＡＳＴ２（ＦｏｘＨ１）、４００ｎｇのＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ、および２００ｎｇの空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．０）を使用し、１．２μｇのＤＮＡ／ウエルを用いて約２４時間後三連でトランスフェクトした（リポフェクタミン２０００）。細胞はトランスフェクション後約２４時間処置し、処置後約１６時間で採取した。細胞は氷上において３０分間、可溶化バッファー（１％のトリトン−Ｘ−１００、２５ｍＭのグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、４ｍＭのＥＧＴＡ、および１ｍＭのジチオスレイトール）中でインキュベートし、ルシフェラーゼレポーター活性を測定し、ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼと比較して標準化した。
【０２２８】
同時免疫沈降。１×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに平板培養した。２４時間後、細胞はパーフェクチンを使用して、１２μｇのＤＮＡ／プレート（６μｇのベクターおよび６μｇのＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ、野生型ＧＲＰ７８−ＨＡ、Δ１９〜６８ＧＲＰ７８−ＨＡまたは６μｇのＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇおよび６μｇの野生型ＧＲＰ７８−ＨＡまたはΔ１９〜６８ＧＲＰ７８−ＨＡ）でトランスフェクトし、細胞は採取前にさらに４８時間インキュベートした。細胞を溶解し、標準的なプロテアーゼ阻害剤を含有する０．８ｍＬの氷冷ＲＩＰＡバッファー中に氷上で擦り取った。細胞溶解物は遠心分離によって予め精製し、７５μＬの全溶解物を加熱し、４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（ジチオスレイトール含む）中に凍結し、一方残りの溶解物はＨＡ−またはＦｌａｇ（Ｍ２）−アガロースと共に４℃で一晩インキュベートした。沈降した複合体は１時間毎に氷冷ＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、ビーズから溶出させ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ニトロセルロースに電気泳動によって移動させ、次に抗Ｆｌａｇ、ＨＡまたはＧＲＰ７８（Ｎ−２０）抗体を使用してウエスタンブロッティングした。
【０２２９】
細胞増殖。細胞は９６ウエルプレート上に５００（ＮＣＣＩＴ）または２００（ＭＣＦ１０Ａ）細胞／ウエルの密度で平板培養した。２４時間後、細胞は四連で、ブロッキング剤（ヤギＩｇＧまたは抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０））と増殖因子の示した組合せで処置するか、または未処置状態のままとした。処置後８日で、製造者の説明書に従いＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖キットを使用して細胞増殖を測定した。
【０２３０】
細胞表面のＣｒｉｐｔｏ結合。細胞はポリ−Ｄ−リシンでコーティングした２４ウエルプレートに４×１０５個細胞／ウエルで平板培養した。細胞を平板培養した後１６時間で、室温においてウエル中で無傷細胞に結合を実施した。細胞はＨｅｐｅｓ解離バッファー（ＨＤＢ）（１２．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＫＣｌ）中で洗浄し、次いで２００μｌ、２００μｌの結合バッファー（０．１％のウシ血清アルブミン、５ｍＭのＭｇＳＯ４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＤＢ）、結合バッファー中に様々に希釈した１０μｌの非標識競合剤（２５．０μｇ／ｍＬの可溶性Ｃｒｉｐｔｏ）および４０μｌの１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏ（１×１０６ｃｐｍ／ウエル）をそれぞれのウエルに加えた。プレートは室温で２時間インキュベートし、次いでウエルはＨＤＢ中ですすぎ、細胞は１％ＳＤＳ中に溶かし、それぞれのウエルからの１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏはγ線カウンターを使用して数えた。
【０２３１】
Ｅ−カドヘリン発現および細胞接着。ＭＣＦ１０Ａ細胞を６ウエルプレート中に４×１０５個細胞／ウエルで平板培養した。２４時間後、細胞を１時間ヤギＩｇＧまたは抗ＧＲＰ７８（Ｎ−２０）で予め処置し、次いで４００ｎｇ／ｍＬの可溶性Ｃｒｉｐｔｏで処置するか、または未処置のままとした。処置後４８時間で、細胞は標準的なプロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷ＲＩＰＡバッファー中に溶かし、あるいは細胞接着性に関して分析した。細胞溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ニトロセルロースに電気泳動によって移動させ、次に抗Ｅ−カドヘリンまたはパンアクチン抗体を使用してウエスタンブロッティングした。細胞接着を定量化するために、約２×１０５個細胞／ウエルを四連で９６ウエルプレートに平板培養し、３７℃で１時間インキュベートした。平板培養した全数の細胞を分析するために、培地をそれぞれのウエルから除去し、相対細胞数は製造者の説明書に従いＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖キットを使用して細胞増殖を測定した。接着率は、すすいだプレートから（ＣｙＱＵＡＮＴによって）測定した相対細胞数を使用して計算した。
【０２３２】
（実施例２）
ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは細胞表面で複合体を形成し、協同してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害し細胞増殖を高める
ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は胚発生中に重要な役割を果たし、腫瘍表現型を促進する。腫瘍の進行におけるこれらのタンパク質の重要性は、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで細胞表面腫瘍特異的治療剤としてそれぞれ別々に確認されたという事実によって強調される。新規なＣｒｉｐｔｏ相互作用タンパク質を同定するために、おとりとして完全長、膜アンカー型を使用して、タンパク質相互作用のスクリーニングを実施した。このスクリーニングは、ＧＲＰ７８、癌とも非常に関連しているＥＲ恒常性の多機能制御物質の同定に至った。興味深いことに、一般にＥＲに局在するが、ＧＲＰ７８は腫瘍細胞中の原形質膜でも選択的に発現され、本明細書で示すデータは、Ｃｒｉｐｔｏは細胞表面でＧＲＰ７８と結合することを示す。このデータは、それらがＥＲ内でのその結合を必要としない形式で、無細胞系で相互作用することを示す。最後にデータは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは協同してＴＧＦ−β依存性増殖阻害効果を弱め、軟寒天中での前立腺癌細胞のコロニー増殖を増大することを示す。総合すると、これらの結果は、これら２つのタンパク質は細胞表面で複合体を形成し、したがってＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害によって腫瘍細胞に増殖利点を与えることを示す。
【０２３３】
グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、タンパク質フォールディングおよび集合を助長し小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を調節するＥＲシャペロンの同定に至った、新規なＣｒｉｐｔｏ結合タンパク質の同定を目的としたスクリーニング。ＧＲＰ７８はグルコース枯渇および低酸素症などのＥＲストレスの条件下で強く誘導され、これらの条件が蔓延する腫瘍微少環境中で高度に発現される（Ｌｅｅ、２００１年、Ｌｅｅ、２００７年、ＬｉおよびＬｅｅ、２００６年）。ＧＲＰ７８プロモーターによって誘導されたＨＳＶＴＫ自殺トランス遺伝子の乳癌腫瘍細胞への送達は、マウス中の大きな腫瘍の完全な撲滅を引き起こした（Ｄｏｎｇら、２００４年）。ＧＲＰ７８は腫瘍細胞生存、化学的耐性および悪性の促進とも非常に関連している（Ｌｅｅ、２００７年、ＬｉおよびＬｅｅ、２００６年）。アンチセンスを使用した線維肉腫Ｂ／Ｃ１０ＭＥ細胞中でのＧＲＰ７８誘導の阻害は、ヌードマウスにおいてこれらの細胞が腫瘍を形成するのを妨げた（Ｊａｍｏｒａら、１９９６年）。さらに、ＧＲＰ７８異種マウスは正常に発育する一方で、それらは低下したＧＲＰ７８レベルのためトランス遺伝子誘導型の乳癌腫瘍増殖に耐性があったことが示された（Ｄｏｎｇら、２００８年）。それは一般にＥＲの腔に限られるが、ＧＲＰ７８は腫瘍細胞の原形質膜に局在し、そこでそれは、増大した細胞増殖、運動性および生存と関連がある受容体機能を有する（Ｐｉｚｚｏの参照文献）（Ｌｅｅ、２００７年、ＬｉおよびＬｅｅ、２００６年）。
【０２３４】
新規なＣｒｉｐｔｏ結合タンパク質としてのＧＲＰ７８の同定。新たなＣｒｉｐｔｏ結合タンパク質を同定するために、本発明者らは、細胞膜におけるその結合パートナーを「引き離す」ために、おとりとしてＣｒｉｐｔｏを使用した戦略を利用している。本発明者らは、空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の溶解物を抗Ｆｌａｇ免疫沈降に施し、次にＦｌａｇペプチドで結合タンパク質を特異的に溶出させた。それは適度な条件下で実施したので、この溶出によって追加的な精製ステップが可能であった。銀染色後に見られたように、２つのタンパク質は約７２ｋＤａおよび約５０ｋＤａで移動し、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇと特異的に同時沈降した（それぞれ、図１Ａ、標識ａおよびｂ）。
【０２３５】
本発明者らは次に、質量分析法を使用してこれらのＣｒｉｐｔｏ結合タンパク質を同定しようと努めた。約７２ｋＤａおよび約５０ｋＤａのバンドをゲルから摘出し、さらに脱色し、ゲル内トリプシン消化に施した。次いでサンプルをＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによって分析し、マスフィンガープリントデータはＭａｓｃｏｔアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を使用して特徴付けた。約７２ｋＤａでのバンドに関する５５の最高ヒットスコアはＧＲＰ７８に関するものであり、ＢｉＰとしても公知であり、合計７個のペプチドに、０．１Ｄａ未満のペプチド質量許容誤差でマスフィンガープリントを割り当てることができた（図１Ｂ）。約５０ｋＤａでのバンド（タンパク質ｂ）は依然として結果的に同定されていない。
【０２３６】
ＧＲＰ７８は、ＥＲ中のタンパク質フォールディングおよびストレス応答を仲介する際の顕著な役割を含めた、多数の機能を有する（Ｌｅｅ、２００１年）。ＧＲＰ７８は腫瘍形成とも非常に関連しており（Ｌｅｅ、２００７年）、本試験において本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏとの結合およびその機能の調節の際の、その潜在的役割に焦点を当てた。特異的Ｃｒｉｐｔｏ結合パートナーとしてのＧＲＰ７８のアイデンティティーを明確に確認するために、本発明者らは、前に記載した同時免疫沈降手順を繰り返し、沈降したタンパク質は特異的抗ＧＲＰ７８または抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を使用したウエスタンブロッティングに施した。図１Ｃ中に示すように、ＧＲＰ７８はＦｌａｇペプチド溶出物中に存在し、それがＣｒｉｐｔｏと特異的に同時免疫沈降することを示す。
【０２３７】
ＧＲＰ７８は細胞表面でＣｒｉｐｔｏと結合する。ＧＲＰ７８は主にＥＲ結合タンパク質として機能すると考えられているが（Ｌｅｅ、２００１年）、いくつかの近年の試験は、ＧＲＰ７８は特定条件下において癌細胞の原形質膜でも発現されることを実証している（Ｌｅｅ、２００７年）。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が細胞表面で相互作用するかどうか試験するために、本発明者らは細胞不透過性ビオチン試薬で無傷細胞を標識し、生成した溶解物を抗Ｆｌａｇ免疫沈降に施し、次にＦｌａｇペプチドで溶出し、アビジンでビオチン化タンパク質を検出した。陰性対照として、本発明者らは、ｐ２６−Ｆｌａｇと呼ばれるｐ７５ニューロトロフィン受容体の約２６ｋＤａの膜貫通型断片を使用した。この無関連タンパク質はＣｒｉｐｔｏと大きさが類似しており、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇと平行して同じ手順を施した。図２Ａ中に示すように、ビオチン化型のＧＲＰ７８とタンパク質ｂはｐ２６ではなくＣｒｉｐｔｏと同時免疫沈降し、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８とタンパク質ｂの結合は特異的であることが示唆された。ＧＲＰ７８およびＣｒｉｐｔｏがビオチン化であったという事実は、それらが細胞表面で相互作用することを示し、それらの結合がＧＲＰ７８のシャペロン活性に依存する可能性を低減する。
【０２３８】
細胞表面ＧＲＰ７８と結合するＣｒｉｐｔｏの能力をさらに特徴付けるために、本発明者らは、１つの細胞集団由来のＧＲＰ７８が無細胞系において、別の細胞集団から単離した成熟Ｃｒｉｐｔｏと結合することができるかどうか試験した。２９３Ｔ細胞にはベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇを感染させ、次いで抗Ｆｌａｇ免疫沈降に施し、次にビーズを大々的に洗浄した。平行して、ＧＲＰ７８を感染させた２９３Ｔ細胞の別集団に細胞表面ビオチン化を施し、これらの細胞由来の溶解物は、ベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ溶解物と事前にインキュベートしたビーズとインキュベートした。次いでビーズを再度洗浄し、結合したタンパク質はＦｌａｇペプチドで溶出し、アビジン−ＨＲＰ、抗ＧＲＰ７８または抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を使用したウエスタンブロッティングに施した。図２Ｂ中に示すように、Ｆｌａｇペプチドは、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇおよび大部分の結合ＧＲＰ７８を特異的に溶出した。さらに、ビオチン化（すなわち、細胞表面標識）ＧＲＰ７８は、ベクター溶解物に曝したビーズからではなく、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ溶解物に事前に曝したビーズから特異的に溶出した。これらの結果は、細胞表面由来ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの間の相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは細胞または膜の状態とは無関係である形式で起こることを実証する。さらに、ビオチン化ＧＲＰ７８およびＣｒｉｐｔｏは別の細胞集団に由来したので、それらの相互作用は、ＥＲにおける事前の結合、ＧＲＰ７８の翻訳機構または任意のシャペロン機能には依存しない。
【０２３９】
Ｃｒｉｐｔｏは、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介する２つのモジュラードメイン、ＥＧＦ様ドメインおよびシステイン多量ＣＦＣドメインを有する（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の相互作用をさらに調べるために、本発明者らは前に記載した方法（図２Ｂ）を使用して、細胞表面標識ＧＲＰ７８が、ＥＧＦ様ドメイン（ΔＥＧＦ）またはＣＦＣドメイン（ΔＣＦＣ）のいずれかを欠くＣｒｉｐｔｏ変異体と結合するかどうか試験した。この実験では、本発明者らは、別の細胞集団由来の野生型および変異型のＣｒｉｐｔｏと結合する、１つの細胞集団由来のビオチン化、ＨＡタグＧＲＰ７８の能力を評価した。図２Ｃ中に示すように、細胞表面ＧＲＰ７８は野生型ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｏΔＥＧＦ変異体と同程度で結合したが、ＣｒｉｐｔｏΔＣＦＣ変異体とは結合しなかった。したがって、この結果は、細胞表面由来のＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインと結合することを示す。
【０２４０】
過剰発現ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は、ＣｒｉｐｔｏのＣＦＣドメインに依存する特異的な形式で細胞表面で結合することが示されたので、本発明者らは次に、これら２つのタンパク質が内因性状態で結合するかどうか試験した。胚性癌細胞系は高レベルのＣｒｉｐｔｏタンパク質を発現することが報告され、本発明者らは、内因性Ｃｒｉｐｔｏと内因性ＧＲＰ７８がマウス胚性癌Ｐ１９細胞中で相互作用するかどうか試験した。本発明者らは、前に記載したように膜不透過性ビオチンでこれらの細胞を処置し、陰性対照として抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体またはウサギＩｇＧを用いた免疫沈降に溶解物を施した。免疫沈降の陽性対照として、本発明者らは、空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇを感染させた２９３Ｔ細胞を使用した。図２Ｄ中に示すように、Ｐ１９細胞からの抗Ｃｒｉｐｔｏの免疫沈降、次に抗ＧＲＰ７８ウエスタンブロッティングによってＧＲＰ７８に対応するバンドの検出に至ったが、一方非免疫ＩｇＧによる免疫沈降ではそうすることはできなかった。さらに、沈降したＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８タンパク質は、アビジン−ＨＲＰを用いたそれらの検出によって示されたようにビオチン化状態であり、それらが細胞表面に由来したことが示された。同様の結果を、空ベクター細胞ではなくＣｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇを過剰発現する２９３Ｔ細胞によって得て（図２Ｄ、右図）、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の特異性を確認した。したがって、内因性Ｃｒｉｐｔｏと内因性ＧＲＰ７８はマウス胚性癌Ｐ１９細胞の細胞表面で特異的に相互作用性し、それらの相互作用はいずれかのタンパク質の過剰発現を必要としない。
【０２４１】
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は細胞表面に共局在化する。細胞におけるこれらのタンパク質の局在化を、免疫蛍光および共焦点顕微鏡によって評価した。最初に、空ベクターを感染またはＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８を同時感染させた２９３Ｔ細胞を、抗Ｃｒｉｐｔｏおよび抗ＧＲＰ７８抗体で染色した。これらの試験では、ベクター細胞は、内因性タンパク質の存在に起因する、最小の、バックグラウンドレベルのＣｒｉｐｔｏ染色およびわずかなＧＲＰ７８染色を示した。対照的に、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８を過剰発現した２９３Ｔ細胞は、両タンパク質の顕著な、点状の染色および細胞表面での著しい共局在化をもたらした。点状構造の有意性は依然として決定されていないが、この結果は明らかに、無傷２９３Ｔ細胞の原形質膜での過剰発現ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の結合を実証する。
【０２４２】
次に本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は、Ｐ１９細胞において内因性レベルで発現したとき、細胞表面で同様に結合するかどうか試験した。ここでは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方を天然Ｐ１９細胞中で容易に検出した。これらの細胞は、原形質膜のマーカーとして使用した抗パンカドヘリン抗体でも染色した。全体として、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８に関する染色は主に点状／小胞性であり、部分的ただし実質的な共局在化であるようであった。重要なことに、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方を含有したいくつかの点状構造はパンカドヘリンと重複した染色を示し、それらはこれらの細胞の原形質膜に存在した。膜上と小胞構造内の両方でのＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の共局在化は、それらが原形質膜上だけでなく、エンドソーム／リソソーム輸送および一般に結合する細胞表面シグナル伝達タンパク質の循環中も結合することを示唆する。
【０２４３】
Ｃｒｉｐｔｏ結合ＧＲＰ７８はｓｈＲＮＡを使用して標的化することができる。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は細胞表面で結合する共因子であることを実証したので、本発明者らは次に、ＧＲＰ７８が公知のＣｒｉｐｔｏ機能を調節するかどうか決定することを目的とした。この目的のため、本発明者らは、内因性ＧＲＰ７８発現を低減することができる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を開発した。ＧＲＰ７８は、タプシガルギン、サイトゾルのカルシウムレベルを上昇させ、ＥＲストレスを引き起こし、アポトーシスを誘発する化合物によって誘導される。タプシガルギン処置後、ＧＲＰ７８の誘導はＥＲストレスを緩和し、細胞アポトーシス応答を遅らせる（Ｊａｍｏｒａら、１９９６年）。したがって、本発明者らは、タプシガルギン処置後に、ＧＲＰ７８（Ｇ１）を標的化してＧＲＰ７８の誘導および機能を妨げるｓｈＲＮＡの能力を最初に試験した。抗ＧＲＰ７８抗体を使用するウエスタンブロットによって示されたように、タプシガルギンはＨｅＬａ細胞中でＧＲＰ７８発現を明らかに誘導し、この誘導はＧ１ｓｈＲＮＡによって遮断された（図３Ａ）。さらに、図３Ｂ中に示すように、Ｇ１感染ＨｅＬａ細胞は、ベクター細胞と比較してタプシガルギン誘導型アポトーシスの顕著な増大を示し、このｓｈＲＮＡによるＧＲＰ７８ノックダウンの機能的結果が実証された。
【０２４４】
本発明者らは次に、Ｇ１ｓｈＲＮＡが、Ｃｒｉｐｔｏと結合したＧＲＰ７８の細胞表面プールを同様に標的化することができるかどうか、調べることを目的とした。空ベクターまたはＧ１ｓｈＲＮＡを感染させたＨｅＬａ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇを後に感染させた。次いでこれらの細胞を、前に記載したように、細胞表面ビオチン化、次に抗Ｆｌａｇ免疫沈降およびＦｌａｇペプチドによる特異的溶出に施した。溶出タンパク質は、アビジン−ＨＲＰ、抗ＧＲＰ７８または抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を使用してウエスタンブロットによって後に分析した。図３Ｃ中に示すように、Ｃｒｉｐｔｏと同時免疫沈降した細胞表面ビオチン化ＧＲＰ７８の量は、Ｇ１ｓｈＲＮＡ構築物の存在下で大幅に低減した。重要なことに、この結果は、Ｇ１ｓｈＲＮＡは細胞表面でＧＲＰ７８−Ｃｒｉｐｔｏ複合体の機能を妨害することができることを示す。
【０２４５】
ＧＲＰ７８発現の標的化低減はＴＧＦ−β依存性Ｓｍａｄ２リン酸化を高める。本発明者らは、ＨｅＬａ細胞中でのｓｈＲＮＡによる内因性Ｃｒｉｐｔｏのノックダウンは、ＴＧＦ−β誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化の増大を引き起こすことを以前に実証している（Ｇｒａｙら、２００６年）。ここで本発明者らは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは細胞表面で相互作用し、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同作用してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する可能性が生じることを示している。Ｇ１ｓｈＲＮＡは原形質膜でＧＲＰ７８のＣｒｉｐｔｏ結合プールを効率よく標的化することを実証したので、本発明者らは次に、それがＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡと同様に、ＴＧＦ−βシグナル伝達を高めることができたかどうか試験した。再度、空ベクターまたはＧ１を感染させた同じＨｅＬａ細胞を、５μＭのタプシガルギンの不在下（図４Ａ）または存在下（図Ｂ）で試験した。それぞれの場合、細胞は一定範囲のＴＧＦ−β１用量で処置し、ホスホ−Ｓｍａｄ２および全Ｓｍａｄ２の生成レベルをモニタリングした。図４Ａ中に示すように、Ｇ１ｓｈＲＮＡ細胞は、低用量（例えば、１ｐＭのＴＧＦ−β１）において、ベクター感染細胞よりＴＧＦ−βに対して応答性があった。タプシガルギン処置後、ＴＧＦ−βの用量応答関係は実質的に右側に移動した（図４Ｂ）。再び、Ｇ１を感染させた細胞はＴＧＦ−βに対して高い感度を有しており、顕著なホスホ−Ｓｍａｄ２バンドは１０ｐＭのＴＧＦ−β１で検出した。興味深いことに、ＴＧＦ−βに対する感度を細胞に与えるＧ１ｓｈＲＮＡの影響は、タプシガルギンの不在下よりタプシガルギンの存在下で顕著であった。これは、タプシガルギンによる細胞表面ＧＲＰ７８の誘導が、Ｇ１ｓｈＲＮＡ構築物によって遮断され得るＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害を引き起こすことを示唆する。
【０２４６】
タプシガルギンが、Ｇ１によって標的化される細胞表面ＧＲＰ７８の誘導を引き起こすかどうか試験するために、ベクターまたはＧ１を感染させた同じＨｅＬａ細胞を賦形剤またはタプシガルギンで処置し、次いで細胞表面ビオチン化を施した。ビオチン化ＧＲＰ７８を可視化するために、細胞溶解物は、抗ＧＲＰ７８抗体を用いた免疫沈降、次にアビジン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングに施した。図４Ｃ中に示すように、タプシガルギン処置は細胞表面でＧＲＰ７８を誘導し、この誘導はＧ１ｓｈＲＮＡ構築物によって遮断された。最後に、追加対照として、本発明者らは、ＧＲＰ７８のノックダウンまたは誘導が、Ｉ型および／またはＩＩ型ＴＧＦ−βシグナル伝達受容体のレベルの変化をもたらすかどうか試験した。図４Ｄ中に示すように、Ｇ１ｓｈＲＮＡの存在もタプシガルギン処置も受容体のレベルに有意に影響を与えることはなく、１つの例外は、ＴβＲＩレベルがタプシガルギンの不在下で、Ｇ１細胞中よりベクター細胞中で若干高かったことであった。しかし、ホスホ−Ｓｍａｄ２レベルはベクター細胞中よりＧ１細胞中で高かったので（図４Ａ）、この不一致はＴＧＦ−βシグナル伝達と関係はなかった。したがって、ＧＲＰ７８は、これらの受容体のレベルを変えることによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達に影響を与えることはないようである。要約すると、これらのデータは、内因性Ｃｒｉｐｔｏと同様に、内因性ＧＲＰ７８がＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することを初めて示す。さらに、これらの発見は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の遮断における細胞表面ＧＲＰ７８−Ｃｒｉｐｔｏ複合体に関する新規の役割と一致する。
【０２４７】
ＧＲＰ７８はＴＧＦ−βシグナル伝達受容体と直接結合しない。ＧＲＰ７８はＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害するという発見によって、それはＩ型および／またはＩＩ型ＴＧＦ−βシグナル伝達受容体と直接結合することによって結合する可能性が生じた。本発明者らは、内因性細胞表面ＧＲＰ７８は、Ｃｒｉｐｔｏが２９３Ｔ細胞中で過剰発現されるときＣｒｉｐｔｏと、およびＰ１９細胞中では内因性Ｃｒｉｐｔｏと同時免疫沈降することを前で示している。ここで本発明者らは、ＧＲＰ７８が同様にＴβＲＩおよびＴβＲＩＩと同時免疫沈降するかどうかをさらに試験している。２９３Ｔ細胞をｐ２６−Ｆｌａｇ、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｌａｇ、ＴβＲＩ−ＨＡまたはＴβＲＩＩ−Ｈｉｓでトランスフェクトし、表面タンパク質は前と同様にビオチン化した。これらのタンパク質のそれぞれはおとりとして免疫沈降させ、次いで免疫複合体をＧＲＰ７８の存在に関して評価した。図５中に示すように、アビジン−ＨＲＰ群は、同量のこれらの異なる細胞表面おとりタンパク質が、これらの沈降において沈降した事実を反映する。しかし、アビジン−ＨＲＰと抗ＧＲＰ７８抗体の両方によって検出したように、Ｃｒｉｐｔｏのみが内因性ＧＲＰ７８を沈降させた（図５）。したがって、これらの条件下では、細胞表面ＧＲＰ７８はＴβＲＩまたはＴβＲＩＩと結合せず、そうではなくてＣｒｉｐｔｏのみと結合するようである。この結果は、ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するＧＲＰ７８の影響は、いずれかのシグナル伝達受容体との、その直接的、独立的結合によって引き起こされる可能性がないことを示唆する。
【０２４８】
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する。ＴＧＦ−βは、ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞の足場依存性増殖と足場非依存性増殖の両方を阻害することが示されている（Ｗｉｌｄｉｎｇら、１９８９年）。したがって本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が一緒に働いて、これらの細胞中のＴＧＦ−βの影響を変えるかどうか試験した。最初に本発明者らは、ＴＧＦ−β依存性Ｓｍａｄ２リン酸化に対するＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８の影響を試験した。図６Ａ中に示すように、１０ｐＭのＴＧＦ−β１を用いたベクター感染細胞の処置はＳｍａｄ２のリン酸化をもたらし、ＧＲＰ７８またはＣｒｉｐｔｏが別々に過剰発現すると、この影響は適度に弱まった。しかし、細胞にＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方が感染すると、ＴＧＦ−βの影響は一層高い程度まで阻害された。図６Ａ中に示すホスホ−Ｓｍａｄ２バンドの強度を次いで定量化し、対応する全Ｓｍａｄ２レベルに標準化した（図６Ｂ）。この定量化は、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、それぞれ約４０％および約４３％、ＧＲＰ７８またはＣｒｉｐｔｏを発現する細胞中で阻害されたことを示す。対照的に、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏを同時発現した細胞は、ＴＧＦ−β誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化の約７４％の低減を一緒に示した。次に本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８の過剰発現が、これらの細胞中のＴＧＦ−βシグナル伝達受容体のレベルに影響を与えたかどうか試験した。図６Ｃ中に示すように、これらの受容体のレベルが有意に変わることはなかった（図６Ｃ）。総合すると、これらのデータはＴＧＦ−βアンタゴニストとしてのＧＲＰ７８の新規な役割をさらに支持し、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は協同的に働いてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することを示す。
【０２４９】
次に本発明者らは、１０ｐＭのＴＧＦ−β１の有無の下での感染ＰＣ３細胞集団の相対的増殖率を測定した。図６Ｄ中に示すように、ベクター感染細胞のＴＧＦ−β１処置によって約５８％増殖が低減し、一方ＧＲＰ７８またはＣｒｉｐｔｏのみを発現する細胞の処置によって、それぞれ約４２％および約１９％増殖が低減した。再度、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏがこれらの細胞中で一緒に発現すると、それらはさらに強い影響を有していた。興味深いことに、ＴＧＦ−β１処置は、この場合、約３１％の細胞増殖の増大を実際にもたらした（図６Ｃ）。重要なことに、ここに示すデータは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏはそれぞれＴＧＦ−βの抗増殖効果を弱める一方で、それらの同時発現はその物理的相互作用を可能にし、ＴＧＦ−βが細胞増殖の増大を引き起こす状態を生成することを実証する。
【０２５０】
ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは協同してＴＧＦ−βの抗増殖効果を遮断する。最後に本発明者らは、ＴＧＦ−β１の有無の下での足場非依存性増殖に対するＧＲＰ７８およびＣｒｉｐｔｏの影響を試験した。空ベクター、ＧＲＰ７８、Ｃｒｉｐｔｏまたは両方を感染させた同じＰＣ３細胞は、漸増用量のＴＧＦ−β１の存在下において軟寒天中に接種し、コロニーは１５日間増殖させた。図７Ａ中に示すように、ＴＧＦ−β１は用量依存式にコロニー形成を阻害した。それぞれの細胞集団に対するＴＧＦ−βの相対的影響を強調するために、同じデータを、ＴＧＦ−β１の不在下でのコロニー数に標準化したＴＧＦ−β１の存在下でのコロニー数としても表す（図７Ｂ）。２つの主な結論をこれらのデータから導くことができる。第一に、ＴＧＦ−β処置の不在下では、ＧＲＰ７８またはＣｒｉｐｔｏのいずれかを発現する細胞はベクター細胞より多数のコロニーを形成し、この増大はＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの両方を発現する細胞中で主に高まった（図７Ａ）。第二に、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏは、個別にＴＧＦ−βの増殖阻害効果を遮断するある程度の能力をそれぞれ有する一方で、それらは一緒に発現するとき、それを実施する一層高い能力を有する（図７Ｂ）。ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの同時発現がＴＧＦ−βの増殖阻害効果を弱める程度は、これらのコロニーの写真によってさらに例証する。図７Ｃ中に示すように、１００ｐＭのＴＧＦ−β１はベクター感染細胞のコロニー形成を劇的に低減するのに十分であり、個別にＣｒｉｐｔｏまたはＧＲＰ７８のいずれかを発現する細胞に対して同様の、ただしより弱い阻害効果を有していた。対照的に、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの両方を一緒に発現する細胞は、コロニーの数と大きさの両方によって例証されるように、ＴＧＦ−βの細胞静止作用に対してより耐性があるようであった。再度、これらのデータは、足場非依存性増殖のＴＧＦ−β阻害を遮断する際のＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏに関する協同機能を支持する。
【０２５１】
図７Ｄは、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏが細胞表面結合パートナーとして機能して、ＴＧＦ−β依存性増殖阻害を制限し細胞増殖を促進するモデルを示す。データは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は、おそらく複合体として、協同形式でこれらの機能を実行することを示す。それらは物理的に相互作用し、それらの影響は協同的に高まるからである。しかし、データは、これらのタンパク質がＴＧＦ−βシグナル伝達を部分的に阻害することができ、高い増殖を自力で引き起こすことができる可能性を完全に排除するわけではない。最後に、細胞静止シグナル伝達を活性化するその能力以外に、ＴＧＦ−β自体が、特定条件下で生存経路を活性化することが報告されている。これは、それらがＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方を同時発現するときのみ、ＴＧＦ−βがＰＣ３細胞の高い増殖を引き起こす観察結果と一致する（図７Ｄ、破線矢印）。
【０２５２】
（実施例３）
細胞表面ＧＲＰ７８は、幹細胞および腫瘍細胞中では、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βおよびＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路を介してＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介する
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達を協同して制御する
ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は胚発生中にそれぞれ必要な役割を果たし、両タンパク質共に腫瘍細胞増殖、生存および転移を促進する。Ｃｒｉｐｔｏ結合パートナーとしての細胞表面ＧＲＰ７８の前述の同定は、これらのタンパク質は、正常胚発生および腫瘍進行中に協同して機能することを示唆した。前述の例は、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８はＰ１９細胞中で細胞表面複合体を形成することを示す（Ｓｈａｎｉら、２００８年）。ここで本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の相互作用が、ＮＣＣＩＴ細胞中でのアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ調節に必要とされるかどうか試験している。ＮＣＣＩＴ集団は、空ベクターまたはＣｒｉｐｔおよび／またはＧＲＰ７８を標的化するｓｈＲＮＡを安定的に発現するベクターを感染させて作製した。これらのｓｈＲＮＡは、細胞表面でのタンパク質のレベルを測定するウエスタンブロット（図８Ａ）または無傷細胞表面ＥＬＩＳＡ（図８Ｂ）により測定して、ＮＣＣＩＴ細胞中でのＣｒｉｐｔおよびＧＲＰ７８タンパク質のレベルを実質的に低減した。重要なことに、ＣｒｉｐｔｏのノックダウンはＧＲＰ７８の細胞表面レベルに影響を与えず、逆も然りである（図８Ｂ）。
【０２５３】
本発明者らは、これらの細胞を使用して、Ｃｒｉｐｔおよび／またはＧＲＰ７８のノックダウンが、これらの細胞中でアクチビン−Ａおよびノーダル誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化に影響を与えるかどうか試験した。図１Ｃ中に示すように、アクチビン−Ａ誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化はＣｒｉｐｔｏのノックダウンによって増大した。これは、Ｃｒｉｐｔｏがアクチビン−Ａシグナル伝達を阻害するという以前の実証と一致し（Ｇｒａｙら、２００３年、Ｋｅｌｂｅｒら、２００８年）、内因性Ｃｒｉｐｔｏがアクチビンアンタゴニストとして機能するという初めての実証を与える。興味深いことに、アクチビン−Ａ依存型Ｓｍａｄ２リン酸化は、ＧＲＰ７８ノックダウン細胞中およびＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方がノックダウンされた細胞中で同様に高まり、アクチビン−Ａシグナル伝達を調節する際の、これらのタンパク質の両方に関する役割と一致した。アクチビン−Ａに関して観察したのと対照的に、Ｃｒｉｐｔｏノックダウンはノーダル誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化を劇的に低減し、一方ＧＲＰ７８ノックダウンはノーダルシグナル伝達を適度に低減した（図８Ｄ）。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８両方のノックダウンは、Ｃｒｉｐｔｏノックダウン単独のそれより低いノーダル誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化をもたらした（図８Ｄ）。総合すると、これらの結果は、アクチビン−Ａおよびノーダルシグナル伝達に対する内因性Ｃｒｉｐｔｏの拮抗作用を、ＧＲＰ７８が容易にすることを示唆する。
【０２５４】
次に、本発明者らは同じ細胞を使用して、Ｃｒｉｐｔおよび／またはＧＲＰ７８のノックダウンが、Ｓｍａｄ２応答性ルシフェラーゼレポーター構築物のアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−β誘導に影響を与えるかどうか試験した。図８Ｅ中に示すように、アクチビン−Ａ、アクチビン−Ｂ、ＴＧＦ−β１またはノーダルを用いた空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞の処置は、類似した低レベルのルシフェラーゼ誘導をもたらした。Ｃｒｉｐｔｏのノックダウンは、高いアクチビン−Ａ、アクチビン−ＢおよびＴＧＦ−β１シグナル伝達、および低いノーダルシグナル伝達をもたらした。類似した結果はＧＲＰ７８ｓｈＲＮＡを安定的に発現する細胞中で観察し、これらのリガンドによるシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ依存性調節におけるＧＲＰ７８に関する役割と一致した。対照的に、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８両方のノックダウンは、アクチビン−Ａ、アクチビン−ＢおよびＴＧＦ−β１に対する劇的に増大した応答、ならびに検出可能なノーダルシグナル伝達の消失をもたらした（図８Ｅ）。本発明者らは、２９３Ｔ細胞中で同じＳｍａｄ２依存性ルシフェラーゼレポーターを使用して、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ノーダルシグナル伝達に関するＧＲＰ７８の要件をさらに調べた。図８Ｆ中に示すように、Ｃｒｉｐｔｏの過剰発現はこれらの細胞中でのノーダルシグナル伝達を容易にし、このシグナル伝達は過剰発現ＧＲＰ７８の存在下で増大する。さらに、図８Ｇ中に示すように、内因性ＧＲＰ７８がノックダウンすると、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ノーダルシグナル伝達はこれらの細胞中で弱まる。前述のＳｍａｄ２リン酸化データと総合すると、これらの結果はアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達を制御する際のＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８に関する協同的役割を強く支持する。
【０２５５】
ＧＲＰ７８はヒトＥＳ細胞中でＣｒｉｐｔｏと共局在化し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介する
Ｃｒｉｐｔｏはヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）中で発現され、そこでそれは増殖、分化および多能性を制御する際に重要な役割を有することが示されている。ここで本発明者らは、ＧＲＰ７８がｈＥＳ細胞中にＣｒｉｐｔｏと共局在化し、Ｃｒｉｐｔｏ機能を制御するかどうか試験した。図９Ａ中に示すように、細胞表面ＥＬＩＳＡにより測定して、ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏはいずれもＨ９ｈＥＳ細胞の表面で発現された。本発明者らは、Ｈ９細胞にＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８抗体を用いた免疫染色を施し、これらのタンパク質が原形質膜上に共局在化するかどうか試験し、図９Ｂ中に示すように、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８は、細胞の末端近辺で点状染色をそれぞれ示した。重要なことに、これらのタンパク質に関する染色は高度の重複を示し、それらが細胞表面に共局在化することを示した（図９Ｂ）。次に本発明者らは、抗ＧＲＰ７８抗体が、アクチビン−Ａおよびノーダルシグナル伝達に対するＣｒｉｐｔｏ依存性効果を遮断することができたかどうか試験した。この抗体（Ｎ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）はＨ９細胞中で細胞表面ＧＲＰ７８と結合し（図９Ａ）、ＧＲＰ７８受容体機能を遮断することが報告されている（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００５年、Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａら、２００８年）。図９Ｃ中に示すように、Ｎ−２０抗体を用いたＨ９細胞の処置はアクチビン−Ａ誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化を増大し、ノーダル誘導型Ｓｍａｄ２リン酸化を低下させ、それがこれらのリガンドによるシグナル伝達に影響を与えるＣｒｉｐｔｏの能力を遮断したことを示唆した。これと一致して、Ｎ−２０抗体を用いた空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞の処置はアクチビン−Ａ、アクチビン−ＢおよびＴＧＦ−β１シグナル伝達を増大し、ノーダルシグナル伝達は低下させ（図９Ｄ）、Ｃｒｉｐｔｏノックダウン細胞の抗体処置はこれらのリガンドのシグナル伝達に対して影響がなかった（図９Ｅ）。総合すると、これらの結果は、細胞表面ＧＲＰ７８はｈＥＳ細胞においてＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介すること、およびＧＲＰ７８ノックダウンと同様に、Ｎ−２０抗体を用いたＧＲＰ７８の標的化は、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達のＣｒｉｐｔｏ依存性制御を遮断することを実証する。
【０２５６】
これらの結果によって、ＣｒｉｐｔｏとＮ−２０抗体がＧＲＰ７８との結合に関して競合する可能性が生じる。Ｎ−２０抗体はＧＲＰ７８の最初の５０アミノ酸内のエピトープを標的化するので、本発明者らはこの領域を欠くＧＲＰ７８変異体（Δ１９〜６８ＧＲＰ７８）を作製し、Ｃｒｉｐｔｏと結合するその能力を試験した。図９Ｆは、Ｎ−２０エピトープおよびそれが欠失したΔ１９〜６８ＧＲＰ７８変異体の位置を示す。これらのタンパク質を過剰発現した２９３Ｔ細胞由来の溶解物を、Ｎ−２０またはＨＡ抗体を使用したウエスタンブロッティングに施すと、Ｎ−２０抗体は、Ｎ−２０エピトープが欠失したΔ１９〜６８ＧＲＰ７８変異体ではなく、野生型ＧＲＰ７８を検出した（図９Ｆ）。重要なことに、図９Ｇ中に示すように、野生型ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏと同時免疫沈降するが、Δ１９〜６８ＧＲＰ７８変異体は沈降せず、Ｎ−２０抗体とＣｒｉｐｔｏはＧＲＰ７８上で結合部位を共有することが示され、それらはＧＲＰ７８との結合に関して競合することが示唆される。
【０２５７】
ＧＲＰ７８受容体機能の標的化は、ＮＣＣＩＴ細胞中でＣｒｉｐｔｏ依存性ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達および有糸分裂誘発を遮断する
次に本発明者らは、細胞表面ＧＲＰ７８が、ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性活性化を仲介するかどうか試験した。最初に本発明者らは、ＮＣＣＩＴ細胞中のＡｋｔ、ＧＳＫ３βおよびＥＲＫ１／２の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性リン酸化に対するＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８ノックダウンの影響を試験した。図１０Ａ中に示すように、空ベクター感染細胞は、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ用量の増大によって影響を受けない高い基礎ホスホ−Ａｋｔレベルを有していた。対照的に、基礎ホスホ−ＡｋｔレベルはＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡを発現する細胞中では検出不能であり、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置によって用量依存形式でこれらの細胞中のＡｋｔリン酸化が増大した（図１０Ａ）。対照的に、ＧＲＰ７８がノックダウンされたとき、および特にＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が一緒にノックダウンされたとき、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性Ａｋｔリン酸化は遮断された。可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＧＳＫ３βリン酸化はＡｋｔリン酸化に関して観察したのと同じパターンをたどり、これもＧＲＰ７８のノックダウンによって急激に低下した（図１０Ａ）。最後に、ＡｋｔおよびＧＳＫ３βのＣｒｉｐｔｏ誘導型リン酸化はＬＹ２９４０００２によって遮断され、したがってＰＩ３Ｋ活性化に依存した（図１０Ａ）。
【０２５８】
本発明者らは、ＥＲＫ１／２の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性リン酸化に対するＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８ノックダウンの影響をさらに試験した。図１０Ｂ中に示すように、ホスホ−ＥＲＫ１／２の基礎レベルは空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞中で比較的高く、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置はこれらの細胞中のＥＲＫリン酸化を増大しなかった。対照的に、リン酸化ＥＲＫ１／２は未処置ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡ細胞中で検出不能であったが、可溶性Ｃｒｉｐｔｏを用いたこれらの細胞の処置はＥＲＫ２（ｐ４２）の顕著なリン酸化を引き起こした。これは、可溶性ＣｒｉｐｔｏがＥＲＫ２リン酸化を誘発することを実証した以前の結果（Ｋａｎｎａｎら、１９９７年）と一致する。ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡ細胞と同様に、基礎ホスホ−ＥＲＫレベルは、ＧＲＰ７８ノックダウン細胞中、およびＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の両方がノックダウンされた細胞中でも、低いまたは検出不能であった（図１０Ｂ）。しかし、これらの細胞のＣｒｉｐｔｏ処置はＥＲＫリン酸化を刺激することはできず、ＧＲＰ７８がＭＡＰＫ経路のＣｒｉｐｔｏ依存性活性化およびＥＲＫ２リン酸化に必要とされることを示唆した。これらの結果は、ＡｋｔおよびＧＳＫ３βの可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性リン酸化に関して観察した結果と類似し、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性活性化を仲介する際に、ＧＲＰ７８が類似した役割を果たすことを示す。
【０２５９】
Ｃｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子活性は増大した細胞増殖と関係があり（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）、本発明者らは、可溶性ＣｒｉｐｔｏがＧＲＰ７８依存式にＮＣＣＩＴ細胞の増殖を促進するかどうか試験した。図１０Ｃ中に示すように、空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞は、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置によって影響を受けない高い基礎増殖率を有していた。対照的に、Ｃｒｉｐｔｏノックダウンは、単独またはＧＲＰ７８ノックダウンとの組合せのいずれかで、ＮＣＣＩＴ細胞の増殖率を大幅に低下させた。重要なことに、可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置によってＣｒｉｐｔｏノックダウン細胞の増殖は大幅に増大したが、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８が両方ノックダウンされた細胞に対しては影響がなかった。この結果は、Ｃｒｉｐｔｏ誘導型ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達と同様に、Ｃｒｉｐｔｏの増殖促進効果はＧＲＰ７８依存性であることを示す。
【０２６０】
本発明者らはＮ−２０抗体を使用して、Ｃｒｉｐｔｏ増殖因子活性を仲介する際の細胞表面ＧＲＰ７８の役割を直接評価した。最初に本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡを安定的に発現するＮＣＣＩＴ細胞との結合に関して可溶性Ｃｒｉｐｔｏと競合する、この抗体の能力を試験した。図１０Ｄ中に示すように、１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏはこれらの細胞と特異的に結合し、対照ＩｇＧではなくＮ−２０抗体によって用量依存式に置換された。図９Ｇ中に示した結果と総合すると、これらのデータは、ＣｒｉｐｔｏとＮ−２０抗体は、ＧＲＰ７８上の同じＮ末端部位との結合に関して直接競合することを示す。本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏｓｈＲＮＡを発現するＮＣＣＩＴ細胞中でＣｒｉｐｔｏ依存性Ａｋｔリン酸化を遮断する、Ｎ−２０抗体の能力の試験を継続した。図１０Ｅ中に示すように、これらの細胞中の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性Ａｋｔリン酸化は、Ｎ−２０抗体によってほぼ完全に遮断された。本発明者らは、Ｃｒｉｐｔｏノックダウン細胞のＣｒｉｐｔｏ依存性増殖は、Ｎ−２０抗体を用いて遮断することができるかどうかさらに調べた。実際、図１０Ｆ中に示すように、Ｎ−２０抗体はこれらの細胞の基礎増殖率を低下させ、および顕著なことに、それは可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置の増殖促進効果を完全に遮断した。総合すると、これらのデータは、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、ＮＣＣＩＴ細胞中での可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達および有糸分裂効果に必要とされることを示す。
【０２６１】
細胞表面ＧＲＰ７８は乳腺上皮細胞中でＣｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子活性を仲介する
Ｃｒｉｐｔｏは約８０％のヒト乳癌中で過剰発現され、乳腺上皮細胞において腫瘍表現型を促進する（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００５年）。ここで本発明者らは、内因性Ｃｒｉｐｔｏ発現がないＭＣＦ１０Ａ細胞、ヒト乳腺上皮細胞系中で発癌性Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介する際のＧＲＰ７８の役割を試験している。これらの試験を実施するために、本発明者らは、空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏを安定的に感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞クローンを作製した。図１１Ａ中に示すように、細胞表面ＥＬＩＳＡにより測定して、ＧＲＰ７８は空ベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞の表面で発現される。さらに、図１１Ｂ中に示すように、１２５Ｉ−Ｃｒｉｐｔｏは空ベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞と特異的に結合し、Ｎ−２０抗体によって用量依存式に置換された。ＥＲＫ／ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ依存性活性化はｃ−Ｓｒｃの上流活性化を必要とし（Ｂｉａｎｃｏら、２００３年）、本発明者らは、Ｎ−２０抗体がＣｒｉｐｔｏ依存性ｃ−Ｓｒｃ活性化を遮断するかどうか試験した。図１１Ｃ中に示すように、可溶性Ｃｒｉｐｔｏはベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞においてＹ４１６上でのｃ−Ｓｒｃのリン酸化を引き起こし、これはＮ−２０抗体と細胞のプレインキュベーションによって遮断された。これらの細胞の可溶性Ｃｒｉｐｔｏ処置はＡｋｔリン酸化も引き起こした（図１１Ｄ）。総合すると、これらのデータは、ＭＣＦ１０Ａ細胞上での細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、ｃ−Ｓｒｃ／ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路を活性化するその能力に必要とされることを示す。
【０２６２】
次に本発明者らは、ＭＣＦ１０Ａ細胞において腫瘍表現型を促進するＣｒｉｐｔｏの能力が、細胞表面ＧＲＰ７８と結合するその能力に依存するかどうか試験した。前述のように、Ｃｒｉｐｔｏはベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞中では検出可能なレベルで発現されないが、Ｃｒｉｐｔｏ感染細胞中では高度に発現される（図１１Ｅ）。図１１Ｆ中に示すように、ＭＣＦ１０Ａ細胞中でのＣｒｉｐｔｏ過剰表現は、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体を用いた処置により大幅に阻害された細胞増殖の劇的な増大を引き起こした。さらに、図１１Ｇ中に示すように、可溶性Ｃｒｉｐｔｏを用いた空ベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞の処置は、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体との同時処置により完全に遮断された形式で、それらの増殖を増大した。これらのデータは、ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するＣｒｉｐｔｏの増殖促進効果は、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合を必要とすることを示す。
【０２６３】
Ｃｒｉｐｔｏの過剰発現は乳腺上皮細胞の移動および浸潤を引き起こし、ＥＭＴを促進する（Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００４年）。Ｅ−カドヘリン発現の消失はＥＭＴの特徴であり、本発明者らは、細胞表面ＧＲＰ７８が、ヒト乳腺上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞中でＥ−カドヘリンのＣｒｉｐｔｏ依存性下方制御を仲介するかどうか試験している。図１１Ｈ中に示すように、Ｅ−カドヘリン発現は、可溶性Ｃｒｉｐｔｏを用いた空ベクター感染ＭＣＦ１０Ａ細胞の処置後に低減し、Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現細胞中では検出不能であった。しかし、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体を用いた処置はベクター細胞中でのＥ−カドヘリンレベルに対する可溶性Ｃｒｉｐｔｏ効果を逆行させ、Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現細胞中でＥ−カドヘリン発現を劇的に回復した（図１１Ｈ）。重要なことに、Ｎ−２０ＧＲＰ７８抗体によるＣｒｉｐｔｏ過剰発現細胞中でのＥ−カドヘリン発現の回復は可溶性Ｃｒｉｐｔｏによってほぼ完全に遮断され、ＣｒｉｐｔｏとＮ−２０抗体は、細胞表面ＧＲＰ７８との結合に関して機能上競合することが示された。Ｅ−カドヘリンは上皮細胞中の細胞間接着を仲介し、その消失は浸潤性、転移性癌と関係がある。したがって本発明者らは、空ベクターまたはＣｒｉｐｔｏを安定的に感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞中の細胞接着を測定し、Ｎ−２０抗体の影響に関して試験した。図１１Ｉ中に示すように、細胞接着はベクター細胞と比較してＣｒｉｐｔｏ過剰発現細胞中で約５０％低下し、Ｅ−カドヘリンの下方制御を引き起こすＣｒｉｐｔｏの能力と一致した。Ｎ−２０抗体はベクター感染細胞の接着に対して影響はなかったが、それはこの影響でＧＲＰ７８に関与する細胞接着のＣｒｉｐｔｏ依存性の低下を完全に遮断した（図１１Ｉ）。総合すると、これらのデータは、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、細胞増殖を促進するその能力を含めたＣｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子活性を仲介し、Ｅ−カドヘリン発現を低下させ、細胞接着を低下させることを実証する。
【０２６４】
ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の細胞表面相互作用はアクチビンおよびノーダルの増殖促進効果を仲介する
本発明者らは、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体がアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βシグナル伝達を制御する証拠を与えており、ここで本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８がどのように協同して、細胞増殖に対するアクチビン−Ａおよびノーダル誘導効果に影響を与えるかを試験した。図１２Ａ中に示すように、アクチビン−Ａとノーダルはいずれも空ベクター感染ＮＣＣＩＴ細胞の増殖を増大する。Ｃｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８のノックダウンはこれらのリガンドの増殖促進効果を遮断し、および興味深いことに、ノーダルではなくアクチビン−Ａに細胞増殖を阻害させた。本発明者らは、Ｎ−２０抗体がＣｒｉｐｔｏおよび／またはＧＲＰ７８のノックダウンの効果と同様の効果を有するかどうか試験した。実際、図１２Ｂ中に示すように、アクチビン−Ａおよびノーダルの増殖促進効果はＮ−２０抗体の存在下で遮断され、アクチビン−Ａは再度、増殖促進効果を有する状態から細胞静止作用を有する状態に変化した。次に本発明者らは、ＣｒｉｐｔｏおよびＧＲＰ７８が、ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するアクチビン−Ａおよびノーダルの増殖促進効果に同様に影響を与えるかどうか試験した。図１２Ｃ中に示すように、アクチビン−Ａは空ベクターを安定的に感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞の増殖を大幅に阻害し、一方ノーダルは影響を有していなかった。Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は空ベクター細胞と比較して高い増殖率を有しており、もはやアクチビン−Ａによる増殖阻害はなかった。そうではなくて、アクチビン−Ａとノーダルはそれぞれこれらの細胞の増殖を増大した（図１２Ｃ）。図１２Ｄ中に示すように、アクチビン−Ａとノーダルに対する増殖促進応答を引き起こすＣｒｉｐｔｏ過剰発現の能力は、Ｎ−２０抗体を用いた細胞の処置によって完全に遮断され、さらにこの処置によってアクチビン−ＡがＭＣＦ１０Ａ細胞の増殖を阻害するのを引き起こした。したがって、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の細胞表面相互作用はアクチビン−Ａおよびノーダルを増殖促進サイトカインに変換し、アクチビン−Ａの細胞静止作用を逆行させた。
【０２６５】
Ｃｒｉｐｔｏ結合を欠くＧＲＰ７８変異体は、ＥＧＦ受容体およびＰＩ３Ｋを介したＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を阻害する
本発明者らは、細胞表面ＧＲＰ７８がＥＧＦ受容体を介したＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を容易にすると仮定し、ＰＩ３ＫのＣｒｉｐｔｏ依存性活性化を仲介する際のＧＲＰ７８、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ２の役割を試験した。この仮説を調べるために、本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子と結合したグルコース−６−ホスファターゼプロモーター（Ｇ６Ｐａｓｅ−Ｌｕｘ）からなるＰＩ３Ｋ抑制レポーター構築物を使用した。Ｃｒｉｐｔｏ処置は、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ４のいずれかでトランスフェクトした細胞中で、このレポーター構築物の活性に対してほとんどまたは全く影響がなかったが、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ４の両方でトランスフェクトした細胞中では約５０％ルシフェラーゼ発現を低減した（図１３Ａ）。対照的に、トランスフェクトＧＲＰ７８の存在下では、ＣｒｉｐｔｏはＥｒｂＢ４でトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ発現の約３０％の低減を引き起こし、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ４の両方でトランスフェクトした細胞中ではルシフェラーゼ発現をほぼ完全に遮断した（図１３Ｂ）。この結果は、ＧＲＰ７８がＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ４の下流のＰＩ３Ｋ経路のＣｒｉｐｔｏ活性化を容易にすることを示し、細胞表面ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏ依存性Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達を仲介することを実証する以前のデータと一致する。ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８の間の複合体形成はこの影響に必要であるようである。Ｃｒｉｐｔｏ結合に欠陥があるＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８変異体は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４を介したシグナル伝達を促進しなかったからである（図１３Ｃ）。そうではなくて、ＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８変異体は、トランスフェクトしたＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４の存在下でＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を完全に遮断した（図１３Ａと１３Ｃを比較）。この結果は、ＧＲＰ７８Ｄ１９〜６８変異体がドミナントネガティブ形式で作用して、内因性ＧＲＰ７８がＣｒｉｐｔｏ応答を促進するのを妨げることを示唆し、治療可能性を有するＣｒｉｐｔｏアンタゴニストとしての、このＧＲＰ７８変異体に関して考えられる役割を指摘する。最後に、予想通り、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は基礎ルシフェラーゼレベルの増大を引き起こし（約２倍）、ルシフェラーゼレベルのＣｒｉｐｔｏ誘導型の低下を完全に遮断した（図１３Ａ〜１３Ｃ）。
【０２６６】
細胞表面ＧＲＰ７８はＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を仲介する
全体としてデータは、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体が、腫瘍抑制機能を阻害し増殖／生存経路を活性化する、増殖制御の中心として作用するモデル（図１４）を支持する。他方で、ＣｒｉｐｔｏとＧＲＰ７８は、アクチビンおよびＴＧＦ−βに応答する細胞静止Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達を協同して阻害し、これらのリガンドを増殖促進効果を有する状態にする。細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、腫瘍細胞可塑性および腫瘍形成と関連しているＣｒｉｐｔｏ依存性ノーダルシグナル伝達にも必要である。他方で、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、Ｓｒｃ、ＥＲＫおよびＡｋｔリン酸化を引き起こす、および増殖、ＥＭＴおよび移動を促進するその能力を含めた、Ｃｒｉｐｔｏ腫瘍増殖因子活性に必要とされる。このモデルは、腫瘍表現型を促進する際のＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体の二重の役割、およびＣｒｉｐｔｏと細胞表面ＧＲＰ７８の間の相互作用を標的化する潜在的治療利点を強調する。このモデルは、本発明者らは、細胞表面ＧＲＰ７８とＣｒｉｐｔｏの結合は、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４またはアクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−β／受容体複合体のいずれかとの後のＣｒｉｐｔｏ相互作用に必要であることを理解していることも示す（図１４Ａ）。データは、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８の結合はこれらのＣｒｉｐｔｏシグナル伝達「アーム」のそれぞれの上流で起こり、したがって、Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８複合体形成を妨害する試薬は、Ｓｍａｄ２／３とＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋの両方のシグナル伝達に対する発癌性Ｃｒｉｐｔｏ効果を阻害し得ることを示す（図１４Ｂ）。
【０２６７】
本明細書で開示し特許請求するすべての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験無しで作製および実施することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態の観点で記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、本明細書に記載する方法のステップまたはステップの順序で、これらの組成物および方法に変更を施すことができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的と生理的の両方で関係がある特定の作用物質を、同じまたは同等の結果を得ながら、本明細書に記載する作用物質に置換することができることは明らかであろう。当業者には明らかであるすべてのこのような同等な置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の精神、範囲および概念内にあると考えられる。
【０２６８】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書で言及する詳細を補足する例示的手順または他の詳細をそれらが与える程度で、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
【数１】
2015133984.tif 000006
【０２７０】
【数２】
2015133984.tif 000007
【０２７１】
【数３】
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【０２７２】
【数４】
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【０２７３】
【数５】
2015133984.tif 000010
【０２７４】
【数６】
2015133984.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2015133984000001.app
【外国語明細書】
2015133984000001.pdf