(57)【要約】  本発明は高分子微小球の製造方法及びその方法により製造された高分子微小球に関するもので、具体的には水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階、高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒と同一の水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階、分散相を水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合して、乳剤を製造する段階及び製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階を含む高分子微小球の製造方法、その製造方法により製造された高分子微小球及び高分子微小球を含む薬剤伝達用組成物に関するものである。本発明は水不溶性有機溶媒を塩基又は酸を利用して乳剤より除去する新たな高分子微小球の製造方法、前記製造方法により製造された高分子微小球及び前記高分子微小球を含む薬剤伝達用組成物を提供する。従って、本発明の製造方法は既存の溶媒蒸発又は溶媒抽出工程とは別に、少量の水を使用して廃水発生を最小化しながら早い時間内に簡便に目的とする薬剤含有高分子微小球の製造に使用することができる。
2013531061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；
（ｂ）高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の分散相を前記（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ型、Ｏ／Ｏ型又はＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造する段階；及び
（ｄ）前記（ｃ）段階で製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階
を含む高分子微小球の製造方法。
【請求項２】
（ａ）水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；
（ｂ）高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の分散相を前記（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ型、Ｏ／Ｏ型又はＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造する段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階で製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階；及び
（ｅ）前記（ｄ）段階で製造した水不溶性有機溶媒が除去された高分子微小球を収得して加温された分散溶媒に再分散する段階
を含む高分子微小球の製造方法。
【請求項３】
前記（ｂ）段階の水不溶性有機溶媒は、前記（ａ）段階の水不溶性有機溶媒と同一のものであることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項４】
前記（ｃ）段階における（ｂ）段階の分散相と（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒の比が、１：３〜１００であることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項５】
前記（ｃ）段階における（ｂ）段階の分散相と（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒の比が、１：４〜２０であることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項６】
前記（ｅ）段階の加温された分散溶媒の温度は、20℃〜80℃であることを特徴とする第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項７】
前記（ｅ）段階の加温された分散溶媒の温度は、30℃〜50℃であることを特徴とする第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項８】
前記（ｃ）段階及び（ｄ）段階の乳剤の温度は、0℃〜35℃であることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項９】
前記高分子化合物は、ポリラクト酸、ポリラクチド、ポリラクチックコグリコール酸、ポリラクチドコグリコライド(PLGA)、ポリホスファジン、ポリイミノカボネート、ポリホスホエステル、ポリアンハイドライド、ポリオールソエステル、ラクト酸とカプロラクトンの共重合体、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシバレート、ポリヒドロキシブチレート、ポリアミノ酸、ラクト酸とアミノ酸の共重合体及びこれらの混合物からなる群より選ばれたことを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１０】
前記高分子化合物は、ポリラクチドコグリコライドであることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１１】
前記薬剤は、プロゲストローン(progesterone)、ハロペリドール(haloperidol)、チオテキセン(thiothixene)、オランザピン(olanzapine)、クロザピン(clozapine)、ブロムペリドール(bromperidol)、ピモザイド(pimozide)、リスペリドーン(risperidone)、ジプラシドーン(ziprasidone)、ジアゼプマ(diazepma)、エチルロフラゼペート(ethyl  loflazepate)、アルプラゾラム(alprazolam)、ネモナプライド(nemonapride)、フルオキセチン(fluoxetine)、セルトラリン(sertraline)、ベノラファキシン(venalafaxine)、ドネペジル(donepezil)、タクリン(tacrine)、ガランタミン(galantamine)、リバスチグミン(rivastigmine)、セレギリン(selegiline)、ロピニロール(ropinirole)、ペルゴライド(pergolide)、トリヘキシフェニジル(trihexyphenidyl)、ブロモクリプチン(bromocriptine)、ベンズトロピン(benztropine)、コルヒチン(colchicine)、ノルダーゼパム(nordazepam)、エチゾラム(etizolam)、ブロマーゼパム(bromazepam)、クロチアゼパム(clotiazepam)、メキサゾルム(mexazolum)、ブスピロン(buspirone)、ゴセレリンアセテート(goserelin  acetate)、ソマトトロピン(somatotropin)、ルプロライドアセテート(ieuprolide  acetate)、オクトレオチド(octreotide)、セトロレリキス(cetrorelix)、サンドスタチンアセテート(sandostatine  acetate)、ゴナドトロピン(gonadotropin)、フルコナゾール(fluconazole)、イトラコナゾール(itraconazole)、ミゾリビン(mizoribine)、シクロスポリン(cyclosporin)、タクロリムス(tacrolimus)、ナロキソン(naloxone)、クロラムブシル(chlorambucil)、トレチノイン(tretinoin)、カルムシチン(carmusitine)、アナグレライド(anagrelide)、ドキソルビシン(doxorubicin)、アナストロゾール(anastrozole)、イダルビシン(idarubicin)、シスプラチン(cisplatin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ドセタキセール(docetaxel)、パクリタキセール(paclitaxel)、ラルチタキセール(raltitaxel)、エピルビシン(epirubicin)、レトロゾール(letrozole)、メフロクイン(mefloquine)、プリマクイン(primaquine)、オキシブチニン(oxybutynin)、トルテロジン(tolterodine)、アリルエストレノール(allylestrenol)、ロボスタチン(lovostatin)、シンバスタチン(simvastatin)、プロバスタチン(provastatin)、アトロバスタチン(atrovastatin)、アレンドロナート(alendronate)、サルカトニン(salcatonin)、ラロキシフェン(raloxifene)、オキサドローロン(oxadrolone)、コンジュゲドエストロゲン(conjugated  estrogen)、エストラジオール(estradiol)、エストラジオールバレラート(estradiol  vaierate)、エストラジオールベンゾエート(estradiol  benzoate)、エチニルエストラジオール(ethinylesestradiol)、エトノゲストレル(etonogestrel)、レボノルゲストレル(levonoretonogestrel)、チボローン(tibolone)、ピロキシカム(piroxicam)及びノルエチステロン(norethisterone)からなる群より選ばれた一つ又は二つ以上であることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１２】
前記水不溶性有機溶媒は、ハロゲン酸、アンハイドライド、エステル、カルボキシエステル(carboxylic  esters)、ホスホエステル(phosphoric  esters)、硫酸エステル、硝酸エステル、硼酸エステル、アミド及びカルボキシルアミド(carboxylic  amides)、からなる群より選ばれたいずれか一つの構造を有する水不溶性有機溶媒であることを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１３】
前記水不溶性有機溶媒は、メチルアセテート、エメチルアセテート、プロピルアセテート、イソプロピルアセテート、ブチルアセテート、メチルホルメート、エチルホルメート、イソプロピルホルメート、プロピルホルメート、ブチルホルメート、メチルジクロロアセテート、メチルクロロアセテート、エチルクロロアセテート、エチルジクロロアセテート、メチルフルオロアセテート、メチルジフルオロアセテート、エチルフルオロアセテート、エチルジフルオロアセテート、マレインアンハイドライド(maleic  anhydride)アセトアンハイドライド、プロピオンアンハイドライド(propionic  anhydride)、ホスホアンハイドライド(phosphoric  anhydride)、アセトアミド、プロピオンアミド、ブチルアミド及びカルボキシルアミドからなる群より選ばれたことを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１４】
前記分散溶媒が、ポリビニルアルコール水溶液、ポリソベート系の水溶液又はこれの共溶媒である水性分散溶媒か又はグリセリン脂肪酸エステル(Glycerin  Esters  of  Fatty  Acids)、レシチンのような乳化剤を含有するシリコンオイル、野菜油、トルエン及びキシレンからなる群より選ばれたことを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１５】
前記塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化銅及び水酸化鉄からなる群より選ばれたことを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１６】
前記酸は、塩酸、硝酸、硫酸、アセトと酸、硼酸及び炭酸からなる群より選ばれたことを特徴とする第１項又は第２項記載の高分子微小球の製造方法。
【請求項１７】
第１項又は第２項の方法により製造された高分子微小球。
【請求項１８】
第１７項の高分子微小球を有効成分として含む薬剤伝達用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高分子微小球の製造方法及びその方法により製造された高分子微小球に関する、具体的には水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階、高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階、分散相を水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合して乳剤を製造する段階及び製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤から水不溶性有機溶媒を除去する段階を含む高分子微小球の製造方法、その方法により製造された高分子微小球及び前記微小球を含む薬剤伝達用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水液剤、懸濁剤及び乳剤のような従来注射剤形らは筋肉や皮下投与後、速やかに体内で除去されるので慢性疾患治療の際には、頻繁な注射投与が必須的であった。このような問題点を解決するために考案されたマイクロカプセル化(microencapsulation)は高分子化合物で構成された微小球（microsphere、以下の記載において微小球は超微小球(nanosphere)を含む）剤形に薬剤を封入させる製造工程を意味するが、微小球は普通μm単位の大きさを有することにより、人体や動物に筋肉又は皮下注射で投与可能であって、多様な薬剤放出速度を有するように製造することができて薬剤伝達期間を制御することができる。そこで、ただ一度の投与だけでも長時間有効な治療薬物濃度を維持することができて、治療に必要な薬剤の総投与量を極小化することができ、患者の薬剤治療の順応度を高めることができて、現在有数の全世界の製薬会社で薬剤含有高分子微小球製造に至大な関心を示している。
【０００３】
マイクロカプセル化を通じて高分子微小球を製造するにはポリ-d,1-ラクチドコグリコライド(poly-d,l-lactideco-glycolide,  PLGA)が高分子化合物として最も広く使用される。PLGAは生体内で加水分解されて無毒性の乳酸とグリコール酸に変化される生体親和的な高分子化合物である。そこで、製薬産業界はPLGAを使用した医薬品剤形の開発に多大な努力を注いでいるが、現在市販されるPLGAで作った微小球製品の例には、リスパーダルコンスタ(Risperdal  Consta)、サンドスタチン(Sandostatin)LAR,ビビトロール(Vivitrol)、さらに、ルプロンデポート(Lupron  Depot)等が挙げられる。これらのそれぞれは、患者に１回注射投与されてリスペリドン(risperidone)、オクトレオチドアセテート(octreotide  acetate)、ナルトレキソン(naltrexone)及びルプロライドアセテート(Leuprolide  acetate)の放出を２週から４か月まで調節する。
【０００４】
このような薬剤含有高分子微小球はメチレンクロライド及びエチルアセテートのような有機溶媒を使用する溶媒蒸発法又は溶媒抽出法により一般的に製造される。
【０００５】
先ず、溶媒蒸発法について簡略に説明すれば（米国特許第6,471,996号、第5,985,309号、第5,271,945号参照）、高分子化合物を溶かした有機溶媒上に薬剤を分散又は溶かした後、水のような分散媒に乳化させ、水中油型（Ｏ／Ｗ，Oil-in-water）乳剤を製造して乳剤にある有機溶媒を分散媒で拡散させ、空気／水界面を通じて有機溶媒を蒸発させることにより、薬剤含有高分子微小球を形成する。この時、有機溶媒の分散媒への拡散を促進するために、減圧、温度上昇、過量の水を使用した有機溶媒抽出等の技法を活用する。PLGA高分子化合物を溶かすため、一般的に使用される分散有機溶媒はメチレンクロライドであり、このメチレンクロライドが多様な分子量とラクチド：グリコライド比を有するPLGA共重合体をよく溶解することができ、水溶解度が1.32重量％と低く水とよく混ざらないので、水中油型形態の乳剤製造に適合しているからである。さらに、39.8℃の低い沸点に起因して乳剤液体滴から水に拡散した少量のメチレンクロライド分子等が水と空気界面を通じてよく蒸発される。このような過程が持続的に繰り返されると乳剤滴からメチレンクロライドが除去されるにつれて微小球が作られる。最後に低い沸点により微小球に存在する残留メチレンクロライドを乾燥して除去するのが極めて容易である長所を有する。
【０００６】
このように、メチレンクロライドは強い揮発性を有し、水とよく混ざらず水より遥かに低い沸点を有する等、乳剤を作るための最適な有機溶媒であるにもかかわらず、次のような深刻な問題点等を有する：（ａ）実験的に確認された発癌物質である；（ｂ）大気のオーゾン層を破壊させ環境毒性を引き起こし、このような結果により人体の皮膚癌発生を増加させる。（ｃ）米国保険福祉部所属の毒性物質及び疾病担当部署（Agency  for  Toxic  Substances  and  Disease  Registry）で規定している最も危険な38種の毒性有害物質中の一つに属する。（ｄ）水溶解度が約1.32重量％と低く、使用された総量のメチレンクロライドの内、極めて一部だけが水に溶解されて蒸発されるので、乳剤滴にあるメチレンクロライドが完全に除去されるには、相当な時間が所要される。例を挙げれば第6,884,435号では乳剤からメチレンクロライドを除去するために、夜通しで乳剤を撹拌しており微小球製造時間を短縮するために、反応槽(reactor)の温度を上昇させるか又は減圧条件を導入することもある（米国特許第3,691,090号、第3,891,570号、第6,270,700号及び第6,572,894号参照）。
【０００７】
一方、薬剤含有高分子微小球の製造に使用される溶媒抽出法は、乳剤滴にある有機溶媒を大量の可溶化溶媒を使用して効果的に抽出する方法である。有機溶媒が乳剤滴から抽出されると、溶けていた高分子化合物が硬化され乳剤滴が微小球に転換される。一般的に、使用される可溶化溶媒は水であるところ、有機溶媒の水溶解度程度を必要とする水の量に大きな影響を及ぼす。例えば、メチレンクロライドの場合、水溶解度が1.32重量％であるので、極めて大量の水を使用しないと乳剤にあるメチレンクロライドを抽出することができない。しかし、この場合、メチレンクロライドを含有する廃水が大量生成され、このような廃水の処理がさらに問題になるので、溶媒抽出法にはメチレンクロライドに比べて水溶解度が高いエチルアセテートが主に使用される。エチルアセテートは水溶解度が8.7重量％に達して、メチレンクロライドに比べて相対的に少ない量の水でも抽出が可能で、さらに、非ハロゲン化有機溶媒と言う長所を有する。しかし、エチルアセテートの沸点は77℃にして、メチレンクロライドの沸点である39.8℃よりはるかに高く、乾燥時残留溶媒を除去するのが相対的に難しい短所を有する。さらに、特定分子量とラクチド：グリコライド比を有するPLGA高分子化合物がエチルアセテートによく溶けない物性を示す。
【０００８】
ここで、米国特許第4,389,840号、第4,530,840号、第6,544,559号、第6,368,632号及び第6,572,894号等は溶媒蒸発法と溶媒抽出法を同時に活用する技術を開示する。
【０００９】
つまり、乳剤を製造後一部有機溶媒は蒸発過程で除去して残存する有機溶媒は溶媒抽出法を使用して除去する。例えば、米国特許第4,389,840号の場合、薬剤とPLAG高分子化合物をメチレンクロライドに溶かした後、水に乳化させ水中油型乳剤を製造し、40〜60重量％のメチレンクロライドを蒸発過程を通じて除去して残存するメチレンクロライドを多量の水で抽出することにより微小球を製造する方法を開示している。
【００１０】
しかし、これら既存の方法は全て使用された有機溶媒の水溶解度が十分に高くないので、極めて過量の水（有機溶媒の水溶解度×10倍以上）を使用しなければならない。従って、このため、極めて大容量の反応槽が必要となり、有機溶媒を含有する廃水が多量生成されて廃水処理のための付帯費用が増加する非効率性問題に直面するようになる。さらに、微小球内に残存する有機溶媒を効果的に除去することも容易でない問題点を有する。
【００１１】
本発明者等は大韓民国登録特許第10-0918092号ではアンモニア溶液を添加して水不溶性有機溶媒を水溶性有機溶媒に変換させる段階を含む薬剤含有高分子微小球の製造方法を開示した。前記方法により廃水発生を最小化しながら簡便で迅速に高分子微小球を製造することができる。しかし、このような方法による場合でも高分子微小球内の残存有機溶媒の量が１％以上を占めている問題がある。
【００１２】
微小球に顕著な量の有機溶媒が残留する場合、乾燥途中発生する微小球間の凝集現象が際立つ。そこで、乾燥後微小球が個別的に分散されないので注射過程に問題が発生する素地が大きくなり、薬剤放出再現性が劣り、かつ、残留溶媒の量が許可限界値を超過して規制当局から製品許可を受け難くなる問題点が発生する。
【００１３】
従って、高分子微小球内の残存有機溶媒を極小化することができる新たな製造方法の至急の開発が求められているという実情がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明者等は水不溶性有機溶媒を酸や塩基を利用して除去する高分子微小球製造方法において、製造された高分子微小球の残留有機溶媒の量を減らす方法に関して研究する中で、分散相製造に使用される水不溶性有機溶媒を分散溶媒にあらかじめ追加する場合、製造された高分子微小球の残留有機溶媒の濃度が、さらに、減少することを見出して本発明を完成した。
【００１５】
従って、本発明の目的は、水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；前記分散相を前記水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ(oil-in-water)型、Ｏ／Ｏ(oil-in-oil)型又はＷ／Ｏ／Ｗ(water-in  oil-in-water)型乳剤を製造する段階；及び前記製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階を含む高分子微小球の製造方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明の他の目的は水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；前記分散相を前記水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合して、Ｏ／Ｗ(oil-in-water)型、Ｏ／Ｏ(oil-in-oil)型又はＷ／Ｏ／Ｗ(water-in  oil-in-water)型乳剤を製造する段階；前記製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階；及び製造した水不溶性有機溶媒が除去された高分子微小球を収得して、加温された分散溶媒に再分散する段階を含む高分子微小球の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の目的は前記方法により製造された高分子微小球を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は前記方法により製造された高分子微小球を有効成分として含む薬剤伝達用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記のような目的を達成するために、本発明は水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；前記分散相を前記水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ(oil-in-water)型、Ｏ／Ｏ(oil-in-oil)型又はＷ／Ｏ／Ｗ(water-in  oil-in-water)型乳剤を製造する段階；及び前記乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階を含む高分子微小球の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；前記分散相を前記水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ(oil-in-water)型、Ｏ／Ｏ(oil-in-oil)型又はＷ／Ｏ／Ｗ(water-in  oil-in-water)型乳剤を製造する段階；前記乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階；及び製造した水不溶性有機溶媒が除去された高分子微小球を収得して加温された分散溶媒に再分散する段階を含む高分子微小球の製造方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記方法により製造された高分子微小球を提供する。
【００２２】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記方法により製造された高分子微小球を有効成分として含む薬剤伝達用組成物を提供する。
【００２３】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
【００２４】
本発明の高分子微小球製造方法は
（ａ）水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；
（ｂ）高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の分散相を前記（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ(oil-in-water)型、Ｏ／Ｏ(oil-in-oil)型又はＷ／Ｏ／Ｗ(water-in  oil-in-water)型乳剤を製造する段階；及び
（ｄ）前記（ｃ）段階で製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤より水不溶性有機溶媒を除去する段階
を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明の高分子微小球の製造方法を段階別に分けて具体的に説明すれば下記の通りである。
【００２６】
（ａ）段階では水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する。
【００２７】
本発明の水不溶性有機溶媒は当業界に公知の高分子微小球の製造のために使用される高分子化合物を溶解することができ、酸や塩基により加水分解され、加水分解産物が全て水によく溶ける成分であれば、制限なく使用することができる。一般的に、アミド、エステル、アンハイドライド及びハロゲン酸構造を有する化合物は酸／塩基により加水分解されるものとして知られている。アンハイドライド構造を有する化合物は加水分解反応を経て水溶性であるカルボキシ酸が生成され、エステル構造を有する化合物は水溶性であるカルボキシ酸とアルコールで加水分解される。ハロゲン酸構造を有する化合物は水溶性であるカルボキシ酸とハロゲン構造を有する化合物は水溶性であるカルボキシ酸とハロゲン酸(HF,  HCl,  HBr,  HI)で加水分解される。アミド構造を有する化合物の場合、カルボキシ酸とアミンで加水分解されるので、この際、生成されるアミンが水に溶解される産物の場合、前記アミドは本発明の水不溶性有機溶媒に含まれる。
【００２８】
本発明における水不溶性有機溶媒は、ハロゲン酸構造を有する化合物、アンハイドライド構造を有する化合物、ホスホリックアンハイドライド化合物、エステル構造を有する化合物、カルボキシルエステル化合物、ホスホリックエステル化合物、硫酸エステル化合物、硝酸エステル化合物、硼酸エステル化合物、アミド構造を有する化合物及びカルボキシルアミド化合物でもあり、好ましくはメチルアセテート、エチルアセテート、プロピルアセテート、イソプロピルアセテート、ブチルアセテート、メチルホルメート、エチルホルメート、イソプロピルホルメート、プロピルホルメート、ブチルホルメート、メチルジクロロアセテート、メチルクロロアセテート、エチルクロロアセテート、エチルジクロロアセテート、メチルフルオロアセテート、メチルジフルオロアセテート、エチルフルオロアセテート、エチルジフルオロアセテート、マレイン酸アンハイドライド(maleic  anhydride)、アセトアンハイドライド、プロピオンアンハイドライド、ホスホリックアンハイドライド、アセテートアミド、プロピオンアミド、ブチルアミド及びカルボキシルアミドでもあり得る。
【００２９】
より好ましくはエチルアセテート、メチルアセテート、メチルホルメート、エチルホルメート、イソプロピルホルメート、プロピルホルメート、アセトアンハイドライド又はプロピオニックアンハイドライドでもあり得る。
【００３０】
本発明に使用される分散溶媒は、乳化剤を含有する水性分散溶媒又は非水性分散溶媒を含み、Ｏ／Ｗ型及びＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造の際には水性分散溶媒が、Ｏ／Ｏ型乳剤製造の際には非水性分散溶媒が使用されることもある。水性分散溶媒には親水性乳化剤、例えば、ポリビニルアルコール及びポリソルベート系（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート65、ポリソルベート80、ポリソルベート85）のような乳化剤を含有する水溶液又はこれの共用媒を使用することができる。非水性分散溶媒には親油性乳化剤、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、レシチンのような乳化剤を含有するシリコンオイル、野菜油、トルエン又はザイレンを使用することもできる。前記分散溶媒に含有されている乳化剤の濃度は0.05〜15％（W/V）でもあり得る。
【００３１】
前記分散溶媒に混合される有機溶媒の量は、高分子微小球製造に使用される高分子化合物の種類、封入された薬剤の種類及び分散溶媒の種類によって異なることもあるので、水性分散溶媒の水溶解度以下で添加することができる。少な過ぎる量を混合する場合、有機溶媒除去がし難くなり残留有機溶媒の濃度が増加される。
【００３２】
（ｂ）段階では高分子化合物、薬剤及び水性分散溶媒を混合して分散相を作る。
【００３３】
本発明の“分散相”とは高分子化合物及び薬剤の水性分散溶媒に溶解混合されていることを意味する。
【００３４】
（ｂ）段階の水性分散溶媒の例は前記（ａ）段階で前述した通りである。
【００３５】
（ｃ）段階の水性分散溶媒は好ましくは前記（ａ）段階で使用されたのと同一の種類の有機溶媒でもあり、必要に応じて水性分散溶媒は１種以上の異なる有機溶媒が混合された共用媒を使用することにより、微小球に封入しようとする薬剤の溶解度を調節するか、又は乳剤滴の硬化速度を望み通りに制御することができる。
【００３６】
本発明の製造方法に使用される高分子化合物は、当業界に公知の高分子化合物であれば、制限なく使用できるものの、好ましくはポリラクト酸、ポリラクチド、ポリラクチックコグリコール酸、ポリラクチドコグリコライド(PLGA)、ホリホスファゼン、ポリイミノカボーネート、ポリフォスホエステル、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ラクト酸とカプロラクトンの共重合体、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシバレート、ポリヒドロキシブチレート、ポリアミノ酸、ラクト酸とアミノ酸の共重合体及びこれらの混合物でもあり、より好ましくはポリラクチドコグリコライド(PLGA)でもある。
【００３７】
さらに、好ましくは本発明の製造方法に使用される高分子化合物は、末端が酸又は塩基による加水分解が起こらないように処理された高分子化合物でもあり、例えば、末端がエステル化されたPLGA、エステル化されたPCL(ポリカプロラクタム）、エステル化されたポリアンハイドライドでもある。
【００３８】
本発明の製造方法に使用される薬剤は、親水性薬剤と疎水性薬剤を全て含み、高分子微小球に封入できれば制限なく使用することができ、好ましくはプロゲストロン(progesterone)、ハロペリドール(haloperidol)、チオテキセン(thiothixene)、オランザピン(olanzapine)、クロザピン(clozapine)、ブロムペリドール(bromperidol)、ピモジド(pimozide)、リスペリドーン(risperidone)、ジプラシドーン(ziprasidone)、ジアゼプマ(diazepma)、エチルロフラーゼペート(ethyl  loflazepate)、アルプラゾーラム(alprazolam)、ネモナプライド(nemonapride)、フルオキセチン(fluoxetine)、セルトラリン(sertraline)、ベノラファキシン(venalafaxine)、ドネペジル(donepezil)、タクリン(tacrine)、ガランタミン(galantamine)、リバスチグミン(rivastigmine)、セレギリン(selegiline)、ロピニロール(ropinirole)、ペルゴライド(pergolide)、トリヘキシフェニジル(trihexyphenidyl)、ブロモクリプチン(bromocriptine)、ベンズトロピン(benztropine)、コルヒチン(colchicine)、ノルダーゼパム(nordazepam)、エチゾーラム(etizolam)、ブロマゼパム(bromazepam)、クロチアーゼパム(clotiazepam)、メキサゾールム(mexazolum)、ブスピロン(buspirone)、ゴセレリンアセテート(goserelin  acetate)、ソマトトロピン(somatotropin)、ルプローライドアセテート(ieuprolide  acetate)、オクトレオチド(octreotide)、セトロレリキス(cetrorelix)、サンドスタチンアセテート(sandostatine  acetate)、ゴナドトロピン(gonadotropin)、フルコナゾール(fluconazole)、イトラコナゾール(itraconazole)、ミゾリビン(mizoribine)、シクロスポリン(cyclosporin)、タクロリムス(tacrolimus)、ナロキソン(naloxone)、クロラムブシル(chlorambucil)、トレチノイン(tretinoin)、カルムシチン(carmusitine)、アナグレライド(anagrelide)、ドキソルビシン(doxorubicin)、アナストロゾール(anastrozole)、イダルビシン(idarubicin)、シスプラチン(cisplatin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ドセタキセール(docetaxel)、パクリタキセール(paclitaxel)、ラルチタキセール(raltitaxel)、エピルビシン(epirubicin)、レトロゾール(letrozole)、メフロクイン(mefloquine)、プリマクイン(primaquine)、オキシブチニン(oxybutynin)、トルテロジン(tolterodine)、アリルエストレノール(allylestrenol)、ロボスタチン(lovostatin)、シンバスタチン(simvastatin)、プロバスタチン(provastatin)、アトロバスタチン(atrovastatin)、アレンドロナート(alendronate)、サルカトニン(salcatonin)、ラロキシフェン(raloxifene)、オキサドローロン(oxadrolone)、コンジュゲートエストロゲン(conjugated  estrogen)、エストラジオール(estradiol)、エストラジオールバレート(estradiol  vaierate)、エストラジオールベンゾエート(estradiol  benzoate)、エチニルエストラジオール(ethinylesestradiol)、エトノゲストレル(etonogestrel)、レボノルゲストレル(levonoretonogestrel)、チボローン(tibolone)、ピロキシカム(piroxicam)及びノルエチステロン(norethisterone)でもあって、蛋白質、核酸等のような高分子物質でもあり得る。
【００３９】
前記高分子化合物は薬剤１重量部を基準に１〜500重量部、好ましくは１〜50重量部の量で使用することができる。
【００４０】
（ｃ）段階では前記（ｂ）段階の分散相を前記（ａ）段階の水性分散溶媒が混合された分散溶媒に混合して、Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｏ型又はＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造する。
【００４１】
乳剤の製造は、Ｏ／Ｗ型乳剤の製造のためには、高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作り、これを水不溶性有機溶媒が添加された分散溶媒に混合して製造することができ、Ｏ／Ｏ型乳剤の製造のためには、高分子化合物、薬剤及び有機溶媒を混合して分散相を作り、これを先に使用した有機溶媒と混合されない有機溶媒を使用した分散溶媒に混合して製造することができ、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造のためには薬剤が溶けている水溶液を高分子化合物が溶けている水不溶性有機溶媒に乳化させ、Ｗ／Ｏ型乳剤を製造した後、これをさらに、水不溶性有機溶媒が添加された分散溶媒に混合してＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造することができる。
【００４２】
（ｃ）段階で混合される分散相と、水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒の嵩は好ましくは１：３〜100でもあり、最も好ましくは１：４〜20でもあり得る。
【００４３】
分散溶媒の比率が前記範囲より小さいとエマルジョン形成がよくなされず、前記範囲より大きいと廃溶液が過度に増加する問題がある。
【００４４】
（ｄ）段階では前記（ｃ）段階で製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤から水不溶性有機溶媒を除去する。
【００４５】
本発明で塩基又は酸溶液を添加して乳剤から水不溶性有機溶媒を除去する段階は、好ましくは、加水分解反応によりなされる。加水分解反応は、水が添加されて２種の物質に分解される反応で、エステル構造を有する化合物の場合には、カルボキシ酸とアルコールに加水分解され、アンハイドライド構造を有する化合物の場合には、カルボキシ酸で加水分解物され、アミド構造を有する化合物の場合には、カルボキシ酸とアミンで加水分解物され、ハロゲン酸構造を有する化合物の場合には、カルボキシ酸とハロゲン酸(HF,  HCl,  HBr,  HI等)で加水分解物される反応を言う。これを通じて一つの層（例えば、水層(water  phase))に少量で拡散されている（又は溶けている）前記水不溶性有機溶媒を水に完全に溶解される水溶性有機溶媒に変換させ、変換された分、水不溶性有機溶媒が水層に拡散されるようにする。このような過程が継続的に進行されて乳剤内に水不溶性有機溶媒が除去されて、乳剤滴を微小球に硬化させることにより、目的とする薬剤含有高分子微小球を製造することができる。前記において、乳剤内での水不溶性有機溶媒の除去は水不溶性有機溶媒を完全に又は実質的に（検出されない水準に）無くすばかりでなく、水不溶性有機溶媒を酸又は塩基投入前の初期水準に比べて減少させることを含む。この時、乳剤滴の早い硬化に起因して乳剤滴粒子間の相互作用が抑制されて、凝集せずに目的とする高分子微小球を得ることができる。この際、酸を前記反応を触媒して塩基は反応に消耗され、一旦添加されると、その量が水不溶性有機溶媒に比べて少ないか、又は多くても前記反応が起こるには大きく支障がない。ただ、多過ぎるモル数の酸又は塩基を添加すれば薬剤と高分子化合物の安定性に問題があり得て適切な量を考慮しなければならない。
【００４６】
好ましくは塩基溶液は水不溶性有機溶媒のモル数と塩基溶液のモル数比が1:0.1〜10になるように添加することができ、より好ましくは1:0.2〜5,さらに好ましくは1:0.3〜3、最も好ましくは1:0.5〜1.5になるように添加することができる。
【００４７】
前記（ｃ）段階及び（ｄ）段階の乳剤の温度は高分子化合物、薬剤、水不溶性有機溶媒、塩基又は酸の種類によって異なることがあるものの、好ましくは０℃〜35℃でもあり得る。
【００４８】
乳剤の温度が35℃を超える場合、薬剤、高分子化合物、塩基又は酸の種類によって薬剤及び高分子化合物の分解が起こることがあり、０℃未満の場合には水性分散溶媒が凍るので、乳剤形成がよくなされ難いこともあり得る。
【００４９】
塩基は好ましくは水酸化ナトリウム（NsOH）、水酸化リチゥム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化アンモニウム(NH4OH)、水酸化銅(Cu(OH)2)及び水酸化鉄(Fe(OH)3)でもあり、酸は好ましくは塩酸(HCl)、硝酸(NHO3)硫酸(H2SO4)、アセト酸(CH3COOH)、硼酸(H3BO3)及び炭酸(H2CO3)でもありうる。
【００５０】
このように本発明の方法によれば既存の溶媒蒸発又は溶媒抽出工程を必要とせず、少量の水を使用して廃水発生を最小化しながら、早い時間内に簡便に薬剤含有高分子微小球を製造することができる。さらに、本発明の高分子微小球製造方法によれば高分子微小球内の残留有機溶媒濃度が低い高分子微小球を製造することができる。
【００５１】
一方、本発明は（ａ）水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階；
（ｂ）高分子化合物、薬剤及び水不溶性有機溶媒を混合して分散相を作る段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の分散相を前記（ａ）段階の水不溶性有機溶媒が混合された分散溶媒に混合してＯ／Ｗ型、Ｏ／Ｏ型又はＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造する段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階で製造した乳剤に塩基又は酸を添加して乳剤から水不溶性有機溶媒を除去する段階；
（ｅ）前記（ｄ）段階で製造した水不溶性有機溶媒が除去された高分子微小球を収得して加温された分散溶媒に再分散する段階
を含む高分子微小球の製造方法を提供する。
【００５２】
本発明の高分子微小球の製造方法を段階別に分けて具体的に説明すれば下記の通りである。
【００５３】
（ａ）段階〜（ｄ）段階は叙述した通りである。
【００５４】
（ｅ）段階では前記（ｄ）段階で製造した水不溶性有機溶媒が除去された高分子微小球を収得して加温された分散溶媒に再分散する。
【００５５】
本発明の再分散過程に使用される分散溶媒は乳化剤を含有する水性分散溶媒又は非水性分散溶媒を含み、Ｏ／Ｗ型及びＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤を製造の際には水性分散溶媒が、Ｏ／Ｏ型乳剤製造の際には、非水性再分散溶媒が使用できる。水性分散溶媒には親水性乳化剤、例えば、ポリビニルアルコール及びポリソルベート(Polysorbate)系（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート65、ポリソルベート80、ポリソルベート85）のような乳化剤を含有する水溶液又はこれの共用媒を使用することができる。非水性分散溶媒には、親油性乳化剤、例えば、グリセリン脂肪酸エステル(Glycerin  Esters  of  Fatty  Acids)、レシチンのような乳化剤を含有するシリコンオイル、野菜油、トルエン又はキシレンを使用することができる。前記分散溶媒に含有されている乳化剤の濃度は0.05〜15%(w/v)でもあり得る。
【００５６】
加温された分散溶媒の温度は薬剤、水不溶性有機溶媒及び高分子化合物の種類及び量によって異なり得るが、好ましくは20℃〜80℃でもあり、さらに、好ましくは30℃〜50℃でもあって、最も好ましくは30℃〜40℃でもあり得る。前記分散溶媒の温度が20℃未満に下がれば残留有機溶媒の量が増加することもあって、80℃を超える場合、高分子微小球の変形が起こり得る。
【００５７】
加温された分散溶媒に再分散された高分子微小球は微小球内の有機溶媒濃度がさらに減少する。
【００５８】
このように本発明の方法によれば、既存の溶媒蒸発又は溶媒抽出工程を必要とせずに、少量の水を使用して廃水発生を最小化しながら、早い時間内に簡便に薬剤含有高分子微小球を製造することができ、製造された高分子微小球内の残留有機溶媒の濃度を減少させることができる。
【００５９】
一方、本発明では前記本発明の方法により製造された高分子微小球を提供する。
【００６０】
本発明の方法により製造された高分子微小球は残留有機溶媒濃度が低く、薬剤の体内放出速度を調節することができる。
【００６１】
このような本発明の方法により製造された高分子微小球は0.1〜1000μm、好ましくは10〜100μmの平均粒径を有し、望みによって多様な重量の薬剤を含有することができる。
【００６２】
さらに、本発明の高分子微小球を使用する場合、高分子微小球に含まれる薬剤を効果的に伝達できるので、本発明は本発明の製造方法により製造された高分子微小球を有効成分として含む薬剤伝達用組成物を提供する。
【００６３】
本発明の薬剤伝達用組成物は含まれる薬剤によって対象疾患が異なることもあって、これは当業者が容易に理解することができる。
【００６４】
本発明の一実施例では、分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒の濃度を異にして、高分子微小球を製造した後、これに伴う残留溶媒の濃度を測定した。その結果、薬剤が含まれるか、否かに関わり無く分散溶媒に有機溶媒が予め添加される場合、残留有機溶媒の濃度が最高25%水準まで下がることを確認した（実施例１参照）。
【００６５】
本発明の他の一実施例では再分散段階の分散溶媒温度に伴う残留溶媒濃度を比較した。微小球製造過程で塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる時点までを１段階；反応終結後濾過を通じて分離した高分子微小球をPVA溶液に再分散させて、撹拌を終結する時点までを２段階に定義して、オランザピン60mgを含有した高分子微小球を製造の際、１，２段階全て33℃に加温、維持して製造した高分子微小球と１段階又は２段階だけを33℃に加温、維持して製造した高分子微小球を対象に残留溶媒を測定した。その結果、１段階加温の可否とは関係無く、２段階を加温した二つの群の高分子微小球が２段階を加温しない高分子微小球に比べて残留溶媒の濃度がはるかに低いことを確認した（実施例２−１参照）。      
【００６６】
このような結果は、PLGAの種類を異にして繰り返し実験した場合にも同一であった（実施例２−２参照）。
【００６７】
本発明の他の一実施例では使用される高分子の容量及び薬剤の量を増加させ、高分子微小球を製造して、残留溶媒の量を測定した。その結果、再分散段階（２段階）を加温する場合、残留溶媒の量を低く維持できることを確認した（実施例２−３参照）。
【００６８】
本発明の他の一実施例では分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒濃度に伴う残留溶媒濃度と比較した。高分子化合物をエチルホルメートに溶解させて分散相を作り、0,1,2又は4mlのエチルホルメートが予め添加された20mlの0.5%ＰＶＡ水溶液にそれぞれ乳化させ、乳剤を作り塩基を添加して水不溶性有機溶媒を除去する方法で高分子微小球を製造した後、残留溶媒の量を測定して高分子微小球を撮影した。
【００６９】
その結果、分散溶媒に予め添加された有機溶媒の濃度が増加するほど、高分子微小球に残留する溶媒の濃度が低くなることを確認した。さらに、分散溶媒に有機溶媒が予め添加されても球形の高分子微小球が安定的に製造されることを確認した（実施例３参照）。
【００７０】
本発明の他の一実施例では本発明の分散溶媒に水不溶性有機溶媒を予め混合する段階を経ずに、分散相と分散溶媒の比率を異にして高分子微小球を製造し、これに伴う残留溶媒の濃度変化を測定した。分散相と分散溶媒の比率を1:10、1:6又は1:4に調節してそれぞれ高分子微小球を製造して残留溶媒の量を測定した。
【００７１】
その結果、分散相と分散溶媒の比率が1:4又は1:6の場合には、1:10の場合に比べて使用溶媒（ＥＡ又はＥＦ）の残留量が減るものの、エタノールの残留量が増加することを確認した。従って、分散相と分散溶媒の比率調節を通じて高分子微小球の残留溶媒の濃度調節が可能なことを確認した。さらに、分散相と分散溶媒の比率調節が分散相の量及び分散溶媒の量の内、いずれを調節したかによる差はないことを確認した（実施例４参照）。
【００７２】
本発明の他の一実施例では、分散相と分散溶媒の比率及び分散溶媒に予め混合される有機溶媒の量を異にして、再分散段階の温度を40℃に維持して高分子微小球を製造してこれによる特性変化を測定した。分散相を250mgの高分子化合物が溶けている4mlのエチルホルメートで固定して、分散溶媒の量を20ml、30ml及び40mlにし、分散溶媒対比分散溶媒に予め添加される有機溶媒の量を0%から10%まで増加させ、それぞれ高分子微小球を製造した。
【００７３】
残留溶媒の量を測定した結果、分散溶媒にエチルアセテートを全く添加しない場合に比べて、添加する場合残留溶媒の濃度が減少することを確認し、特に、分散相と分散溶媒の比率が  1:10であり（分散溶媒ＰＶＡ量が40ml）分散溶媒に有機溶媒が予め添加されない場合、残留溶媒の量が大きく増加することを確認した（実施例５−１参照）。
【００７４】
製造された高分子微小球の収得率を測定した結果、高分子微小球収得には問題がないことを確認した（実施例５−２参照）。
【００７５】
高分子微小球製造に使用された高分子化合物の製造前後の分子量変化を測定した結果、製造前後に高分子化合物の分子量には有意的な変化がないことを確認した（実施例５−３参照）。
【００７６】
本発明の他の一実施例では薬剤含有高分子微小球製造前後に高分子化合物の分子量変化を測定した。高分子化合物の種類、薬剤の種類、含量及び１段階、２段階温度を異にして高分子微小球を製造した後、その製造前後に高分子化合物の分子量を測定した。
【００７７】
その結果、高分子微小球の高分子化合物の分子量がよく保存されることを確認した。これで本発明の製造方法は薬剤の種類、反応温度等の条件に関係なく高分子化合物の分子量がよく保存されることを確認した（実施例６参照）。
【００７８】
本発明の他の一実施例では本発明の方法によりオランザピン含有高分子微小球を製造した。
【００７９】
製造されたオランザピン含有高分子微小球の残留溶媒の量、オランザピンの封入率及び高分子微小球収得率を測定した結果、残留溶媒の濃度は低く維持され、封入率及び収得率は70%以上に良好であることを確認した（実施例７−２参照）。
【００８０】
本発明の他の一実施例では、実施例１〜７で使用したものとは別の水不溶性有機溶媒を使用して高分子微小球を製造した。
【００８１】
エチルアセテートを水不溶性有機溶媒にして高分子微小球を製造し、残留溶媒の量、オランザピン封入率及び高分子微小球収得率を測定した結果、残留溶媒の量は低く維持され、封入率は大部分85%以上、収得率は大部分70%以上に良好であることを確認した（実施例８−２参照）。
【００８２】
本発明の他の一実施例ではオランザピン含有高分子微小球を製造して、分散性と注射性を試験したあと、ラットに注射し、血中オランザピンの濃度を測定する方法で薬剤動力学的試験を行った。
【００８３】
その結果、本発明のオランザピン含有高分子微小球を含む組成物は、分散性及び注射性が良好で注射剤として使用が可能であることを確認し、ラットに注射の際、血中のオランザピンが80%まで持続的に放出されることを確認した（実施例９参照）。
【００８４】
本発明の一実施例では、オランザピンでないアナストローゾルが含有された高分子微小球を製造した。
【００８５】
製造された高分子微小球の収得率及び封入率は殆ど80%以上で、PLGA種類に関係なく適切であり、平均粒子の大きさは30〜60μm水準で適切であることを確認した。残留溶媒の濃度も極めて低い数値で、試料の種類に関係なく適合していることを確認した。さらに、電子顕微鏡撮影結果、PLGAの種類に関係なく全般的に滑らかな球形で製造され、特に、薬剤含量を40%に高めた場合でも、表面に薬剤の結晶が観察されなかったのでよく封入されたことを確認した（実施例10−２参照）。
【００８６】
製造された高分子微小球のゲル透過分析(GPC)を通じて分子量変化を測定した結果、大部分の場合、分子量の変化がないことを確認した。
【００８７】
製造された高分子微小球内の柔軟物質を分析するために前記製造されたアナストローゾル含有高分子微小球を対象に、超高性能液体クロマトグラフィー分析を実施した。その結果、本発明の高分子微小球の平均柔軟物質は0.17%でかなり低いことを確認した。
【００８８】
さらに、過酷条件で２か月まで安定性試験を行った結果、柔軟物質含量は0.23%未満であり、薬剤含量変化は10%未満に示され、本発明の製造方法により製造された高分子微小球の安定性が優れていることを確認した（実施例10−３参照）。
【００８９】
本発明の他の一実施例では前記製造された高分子微小球の持続性試験を透析用膜に本発明の高分子微小球を入れてバッファーを一定時間毎に代える方法で測定した。
【００９０】
その結果、全ての剤形の高分子微小球より残留薬剤が殆どなく、放出されることを確認した。さらに、使用される高分子化合物の種類により、ラクチドの比率が高くなる程薬剤が徐々に放出されることを確認し、薬剤含量が高くなるほど放出速度が早くなることを確認した。これで高分子微小球製造に使用される高分子化合物の種類及び封入される薬剤の量を調節して、放出速度調節が可能であることを確認した（実施例10−４参照）。
【００９１】
本発明の他の一実施例では前記製造された高分子微小球の持続性試験を動物試験を通じて測定した。
【００９２】
前記製造されたアナストローゾル含有高分子微小球をラットの筋肉に20mg/kg注射した後血中アナストローゾルの濃度を測定した。
【００９３】
その結果、本発明の方法により製造された高分子微小球を投与する場合、製造された高分子微小球の種類により最高120日まで薬剤を持続的に放出することを確認した（実施例10−５参照）。
【発明の効果】
【００９４】
以上説明した通り、本発明は水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階及び水不溶性有機溶媒を塩基又は酸を利用して乳剤より除去する段階を含む新たな高分子微小球の製造方法、前記製造方法により製造された高分子微小球及び前記高分子微小球を含む薬剤伝達用組成物を提供する。本発明の製造方法を既存の溶媒蒸発又は溶媒抽出工程を必要とせずに、少量の水を使用して廃水発生を最小化しながら早い時間内に簡便に目的とする薬剤含有高分子微小球を製造することができ、製造された高分子微小球内の残留溶媒の濃度を低く維持することができて、持続放出型医薬品製造に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は分散溶媒に水不溶性有機溶媒を予め添加せずに製造した高分子微小球の残留溶媒測定結果のグラフである。
【図２】図２及びを含有する高分子微小球の電子顕微鏡の写真。図２Ａは製造過程で温度を33℃に維持して製造された高分子微小球の写真であり、図２Ｂは加温段階なしで製造した高分子微小球の写真である。二つの場合全て高分子微小球が球形に製造され、オランザピンが高分子微小球内に封入されていることを確認した。
【図３】図３は２段階温度を40℃に維持して薬剤及び高分子化合物の量を増加させて製造した高分子微小球の電子顕微鏡写真である。図３Ａは薬剤量が60mgの場合の高分子微小球の写真であり、図３Ｂは薬剤の量が80mgの場合の高分子微小球の写真である。
【図４】図４は分散溶媒に予め添加された有機溶媒の濃度に伴う高分子微小球内の残留溶媒の濃度を示すグラフである。
【図５】図５は分散溶媒に予め添加された有機溶媒の濃度を異にして製造した高分子微小球の電子顕微鏡の写真である（Add:分散溶媒に予め添加された水不溶性有機溶媒（エチルホルメート））の量(ml))。
【図６】図６は高分子微小球製造前後の高分子化合物の分子量を測定するために作成した標準検量曲線である。
【図７】図７はオランザピンが含有された高分子微小球の電子顕微鏡の写真である（製造番号は実施例のオランザピン含有高分子微小球の製造番号である）。
【図８】図８はオランザピン含有高分子微小球を含む組成物をラットに注射して血中オランザピンの濃度変化を測定した結果のグラフである（製造番号は実施例９のオランザピン含有高分子微小球の製造番号である）。
【図９】図９はアナストローゾルが含有された高分子微小球の電子顕微鏡の写真である（写真の番号は実施例10の製造番号を意味し、該製造番号の組成で製造されたアナストローゾル含有高分子微小球を撮影したものである）。
【図１０】図10は本発明の方法により製造されたアナストローゾルが含有された高分子微小球の試験管内放出試験結果のグラフである。
【図１１】図11は本発明の方法により製造されたアナストローゾルが含有された高分子微小球の持続性動物実験結果のグラフである。各組成の本発明の方法により製造されたアナストローゾル含有高分子微小球をラットに筋肉注射して血中アナストローゾル濃度を測定した結果のグラフである（全て20mg/kgの容量で注射した）。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００９７】
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００９８】
<実施例１>
分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒濃度に伴う残留溶媒濃度比較実験
<１−１>  既存の方法による高分子微小球製造の際、残留溶媒測定
7525  2.5E  PLGA高分子0.25gをエチルホルメート4mlに溶かした後、0.5%ポリビニルアルコール(PVA)40mlに乳化させて乳剤を作った。以後28%NH3溶液3.4mlを乳剤に添加して30分間反応させ、蒸留水を添加して濾過した。微小球を分離してさらに、0.1%PVA80mlに再分散して撹拌した。本実験のために使用した7525  2.5E  PLGA高分子の情報は下記の通りである。
【００９９】
【表１】
2013531061.tif 000003
【０１００】
微小球残留溶媒分析は下記の通りのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法を使用した。ＧＣ機器はshimadzu（日本国）のＧＣ-2010を使用し、コラムの場合、phenomenex社（米国）のＺＢ-624を使用した。SPLの温度は  200℃を維持し、サンプルのsplit  ratioは15であった。Carrier  gasは高純度窒素ガスを使用した。圧力は54.3kPa（流速1.3ml/min)で２分間維持してー50℃のrateで40kPaで３分間を維持した。その後rate80で100kPaまで圧力を上げて２分間維持した、Columnの温度は80℃で5.1分を維持して、分当たり200℃の速度で180℃まで上げて２分間維持した。検出器に火炎イオン化検出器(FID、fl)ame  ionization  detector)を使用し、温度は220℃であった。高分子微小球のサンプル50mg程度を採り、重さを正確に計り2mlテトラヒドロフランに完全に溶かした。これをペンタノールを利用して４倍に希釈して沈澱された高分子をフイルターで漉してＧＣに注入した。
【０１０１】
その結果、図１に示した通り残留溶媒が1.5%以上でて来ることを確認した。
【０１０２】
<１−２>  分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒濃度に伴う残留溶媒濃度
分散溶媒に水不溶性有機溶媒を予め混合するか否かによって高分子微小球に残っている残留溶媒濃度を測定した。
【０１０３】
下記表２のような高分子微小球製造条件により高分子微小球を製造した。
【０１０４】
【表２】
2013531061.tif 000004
【０１０５】
先ず、7525  2.5Eポリラクチドーコーグリコライド(PLGA)高分子0.35g及び表１に伴うオランザピンをエチルホルメート4mlに溶かして、表１に伴う有機溶媒が予め添加された0.5%ポリ（ビニルアルコール）20mlに乳化させて乳剤を作った。10NNaOHを乳剤に添加して30分間反応させ蒸留水を添加して濾過した。微小球を分離してさらに、0.1%  PVA  80ml再分散して撹拌した。
【０１０６】
その結果、前記表２に示した通り、分散溶媒に有機溶媒を添加する場合、有機溶媒の濃度が低くなることを確認した。
【０１０７】
<実施例２>
再分散段階濃度分散溶媒濃度による残留溶媒濃度比較実験
高分子微小球製造の際、水不溶性有機溶媒除去のための酸又は塩基の反応を通じて水相の温度変化をもたらし、これは残留溶媒の量に影響を及ぼすものと予想した。従って、高分子微小球製造過程を分けて、塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる時点までを１段階、反応終結後濾過を通じて分離された微小球をPVA溶液に再分散させて、撹拌を終結する時点までを２段階に定義した。この内、いずれの段階での温度が残留溶媒を減少させることに重要な役割をするかを調べた。
【０１０８】
<２−１>7525  2.5E  PLGAを利用した高分子微小球製造の際、再分散段階の分散溶媒温度による残留溶媒濃度比較実験
高分子微小球製造過程は下記の通りである。60mgオランザピンと250mgの7525  2.5EPLGAを4mlのエチルホルメートに溶かした。この分散相を1mlのエチルホルメートを予め溶かした20mlの0.5%PVA水溶液に乳化させて乳剤を作った。以降、10N  NaOH  6.2mlを添加して30分間反応を誘導して高分子微小球を製造した。高分子微小球を分離して0.1%PVA80mlに再分散して撹拌した後、高分子微小球を分離して真空乾燥した。
【０１０９】
前記の過程で１段階と２段階を下記表３の温度条件下でそれぞれ行い、実施例１での通りの方法で残留溶媒を測定した。
【０１１０】
【表３】
2013531061.tif 000005
【０１１１】
その結果、表３に示した通り、２段階を加熱しない場合、高分子微小球内のエタノールの残留量は0.5%を上回るものの、２段階で水相温度を33℃に維持する場合、エタノールの量が0.5%以下に減少することを確認した。さらに、１段階の温度を33℃に維持した場合と、そうでない場合は、２段階の水相温度を33℃に維持する限り、残留溶媒の濃度には大きな差がないことを確認した。
【０１１２】
これで２段階の水相温度調節が残留溶媒除去に重要な役割をすることを確認した。
【０１１３】
<２−２>6535  4.5APLGAを利用した高分子微小球製造の際、再分散段階の分散溶媒温度による残留溶媒濃度比較実験
一般的に、PLGA分子量が大きくなるほど高分子微小球に残留する有機溶媒の量が増加される。従って、本発明の方法が分子量が大きい6535  4.5E  PLGAを使用しても残留有機溶媒問題を克服できるかを試験した。
【０１１４】
使用したPLGA高分子情報は表４の通りである。
【０１１５】
【表４】
2013531061.tif 000006
【０１１６】
高分子微小球製造過程は実施例２−１と同一であって、使用された高分子だけが7525  2.5E  PLGAで6535  4.5A  PLGAをに変更された。
【０１１７】
前記過程で１段階と２段階を下記表５の温度条件下でそれぞれ行い、実施例１での通りの方法で残留溶媒を測定した。
【０１１８】
さらに、製造された高分子微小球の状態を電子顕微鏡撮影を通じて確認した。
【０１１９】
【表５】
2013531061.tif 000007
【０１２０】
その結果、表５に示した通り、6535  4.5Aを使用した場合でも、２段階の水相温度を33℃で維持する場合、エチルホルメート及びエタノールの残留量が著しく減少することを確認した。
【０１２１】
さらに、電子顕微鏡で高分子微小球を撮影した結果、60mgのオランザピンが高分子微小球内によく封入されている高分子微小球が製造されることを確認した（図２参照）。
【０１２２】
<２−３>高分子使用量増加の際再分散段階の分散溶媒温度による残留溶媒濃度比較実験
分散相のPLGA濃度を増加させる場合でも、高分子微小球内の残留溶媒濃度を分散溶媒温度変化により減少できるかを調べた。
【０１２３】
60mg又は80mgのオランザピン400mgの6535  4.5A  PLGAをを4mlのエチルホルメートに溶かして分散相を作った。以降、実施例２−１と同一の方法で高分子微小球を製造して実施例１での通りの方法で残留溶媒濃度を測定した。
【０１２４】
前記過程で２段階温度は表６に記載の通りである。
【０１２５】
【表６】
2013531061.tif 000008
【０１２６】
その結果、表６に示した通り、PLGA量を400mgに増加させた場合にも２段階温度を40℃以上に維持する場合、残留溶媒の濃度を低く維持できることを確認した。
【０１２７】
さらに、前記表６の排取の高分子微小球の状態を電子顕微鏡撮影を通じて確認した。
【０１２８】
その結果、投与されたオランザピンが封入された高分子微小球が製造されることを確認した（図３参照）。
【０１２９】
<実施例３>
分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒濃度による残留溶媒濃度比較実験１
前記実施例１で分散溶媒に有機溶媒を予め添加する場合、残留有機溶媒の濃度が低くなることを確認した。ここに、再分散段階の分散溶媒温度を高く維持しながら分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒の量を異にして、これに伴う残留溶媒の量を測定して比較した。
【０１３０】
500mgの4.5APLGA(Lactide:Glycolide-85:15、0.45  dL/g、SurModics  Phamaceuticals  Co.,米国)を4mlのエチルホルメートに溶かして分散相を作り、この分散相を0,1,2又は4mlのエチルホルメートが予め添加された20mlの0.5%  PVA水溶液にそれぞれ乳化させて乳剤を作った。以降、10N  NaOH  6.2mlを添加して30分間反応を誘導して高分子微小球を製造した。高分子微小球を分離して40℃の0.1%  PVA  80mlに再分散して撹拌後、高分子微小球を分離して真空乾燥した。
【０１３１】
高分子微小球の製造後、実施例１と同一の方法で残留溶媒を測定して、実施例２と同一の方法で製造された高分子微小球を撮影した。
【０１３２】
その結果、図４に示した通り、分散溶媒に予め添加された有機溶媒の濃度が増加するにつれて、高分子微小球に残留する溶媒の濃度が低くなることを確認した。さらに、図５に示した通り、分散溶媒に有機溶媒が予め添加されても球形の高分子微小球が安定的に製造され、分散溶媒に予め添加された有機溶媒の濃度が増加するほど、製造される高分子微小球の大きさも小さくなることを確認した。
【０１３３】
<実施例４>
分散相と分散溶媒の比率に伴う残留溶媒濃度比較実験
<４−１>分散相と分散溶媒の比率を異にして高分子微小球製造
分散相と分散溶媒の比率を変化させることによる、残留溶媒の量の変化を調べるために、表７の通り分散相（Ｏ）と分散溶媒（Ｗ）の比率を1:10、1:6又は1:4に調節してそれぞれ高分子微小球を製造した．分散相と分散溶媒の比率調節は分散相の量又は分散溶媒量をそれぞれ調節した。さらに、分散相を構成する有機溶媒の種類もエチルアセテートとエチルホルメートをそれぞれ使用して試験し、溶媒分解試薬もNaOHとアンモニアをそれぞれ使用して試験した。
【０１３４】
【表７】
2013531061.tif 000009
【０１３５】
高分子化合物ブランド1g(4A:2A=6:4)とオランザピン0.333gを入れて、エチルアセテート、又はエチルホルメートを該等量入れた後、徐々に溶解させ、0.5%PVAを該等量入れて常温で撹拌した。当量の10M  のNaOH又はアンモニア溶液を入れて30分間撹拌して高分子微小球を製造した。製造された高分子微小球は濾過して収得し、これを0.1%  PVAに再分散して撹拌後蒸留水で洗浄凍結乾燥させた。
【０１３６】
<４−２>製造された高分子微小球の収率及び残留溶媒測定
前記実施例４−１で製造された高分子微小球の残留溶媒を実施例１と同一の方法で測定した。
【０１３７】
高分子微小球の収率は予め重さを測定した皿に回収した高分子微小球を載せて真空乾燥後重さを測定して回収した高分子微小球の重さを求めて下記式により求める。
【０１３８】
収率（％）＝（回収した高分子微小球の重さ）／（製造時使用した高分子と薬剤の重さの合計）×100
【０１３９】
【表８】
2013531061.tif 000010
【０１４０】
その結果、表８に示した通り、分散相と分散溶媒の比率が1:4又は1:6の場合には1:10の場合に比べて使用溶媒(EA  又はEF)の残留量が減少するが、エタノールの残留量が増加することを確認した。分散相と分散溶媒の比率調節が分散相の量及び分散溶媒の量の内、いずれを調節したかによる差はないことを確認した。
【０１４１】
<実施例５>
分散相と分散溶媒の比率、予め添加された有機溶媒濃度及び再分散段階の温度変化に伴う高分子微小球変化
<５−１>高分子微小球製造及び残留溶媒測定
前記実施例１〜実施例４で分散溶媒に混合された水不溶性有機溶媒濃度変化、再分散段階（第２段階）の分散溶媒温度変化及び分散相と分散溶媒の比率変化に伴う残留溶媒の濃度を測定した。
【０１４２】
このような要素等を全て反映して高分子微小球を製造し、残留溶媒の濃度を測定した。
【０１４３】
分散相は250mgの4.5A  PLGAを4mlのエチルホルメートに溶かした溶液を使用した。分散溶媒は20,30,40mlの0.5%  PVAを使用し、分散溶媒に予め添加された水不溶性有機溶媒（エチルホルメート）は分散溶媒量によって0mlから4mlまで添加した。溶媒分解は10N  NaOHを利用し、これは添加された総エチルホルメートの量を考慮して1:1当量になるように計算して添加した。高分子微小球製造の際塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる段階（１段階）までは室温で進行し、反応終結後濾過して分離した高分子微小球をPVA溶液に再分散させて撹拌を終結する段階（２段階）までは40℃を維持した。
【０１４４】
製造された高分子微小球の残留溶媒分析は実施例１と同じ方法で測定した。同一の製造工程及び残留溶媒分析を２回繰返してその数値を全て表示した。
【０１４５】
【表９】
2013531061.tif 000011
【０１４６】
その結果、表９に示した通り、分散溶媒にエチルホルメートを全く添加しない場合に比べて添加した場合、残留溶媒の濃度が減少することを確認し、特に、分散相と分散溶媒の比率が1:10であり（分散溶媒にPVA量が40ml）分散溶媒にFEが予め添加されない場合、残留溶媒の量が増加することを確認した。
【０１４７】
<５−２>高分子微小球の収得率測定
前記実施例５−１で製造した高分子微小球の収得率を測定した。測定は実施例４−２と同じ方法で行った。
【０１４８】
その結果、表10に示した通り、全ての条件において高分子微小球の収得率には問題がないことを確認した。
【０１４９】
【表１０】
2013531061.tif 000012
【０１５０】
<５−３>高分子微小球製造前、後4.5A    PLGAの分子量変化測定(GPC)
前記実施例５−１で実施した高分子微小球製造過程で、PLGAの分子量変化の可否を測定するために、高分子微小球製造の前後に4.5APLGAの分子量をゲル透過分析(gel  permeation  chromatography,GPC)を通じて測定した。
【０１５１】
ＧＰＣの場合、Agilent1100(Agilent  Technologics,Inc,米国）を使用し、移動相にはテトラヒドロフランを使用した。分析コラムはAgilent社のPLgel  5μm100Å  79911GP-504を使用し、流速は1ml/minに維持した。標準検量曲線作成のため、Pplymer  Laboratories社の標準品（分子量:  3390000,1290000,426600,151700,28500,9860,4950,1300)を使用した。分析サンプルは高分子微小球8mgをテトラヒドロフラン2mlに溶かして濾過して使用した。GPC注入量は5μlであった。
【０１５２】
標準品を利用して図６と同じ標準検量曲線を求めた。これを基に製造された4.5A  PLGAと製造された高分子微小球の4.5A  PLGAの分子量を求めた。その結果、表11に示した通り、本発明の方法により製造された高分子微小球の4.5A  PLGAの分子量は55421〜58409で製造前、4.5A分子量である57542と比較して有意的な変化はなかったことを確認した。
【０１５３】
これで本発明の高分子微小球製造方法は4.5A  PLGA高分子を分解しないことを確認した。
【０１５４】
【表１１】
2013531061.tif 000013
【０１５５】
<実施例６>
薬剤含有高分子微小球の高分子化合物の分子量変化測定
実施例５−３で薬剤が含有されない場合、高分子微小球の分子量変化がないことを確認した。薬剤が含有された高分子微小球を多様な条件で製造して高分子化合物の分子量を測定した。
【０１５６】
【表１２】
2013531061.tif 000014
【０１５７】
前記表12により分散相を作った後、0.5%PVAに入れて乳化させ乳剤を作った。以降、10N  NaOH溶液を添加して3o分間反応を誘発して蒸留水を添加した後、高分子微小球を濾過して分離した。分離された高分子微小球を0.1%  PVA溶液に再分散させて真空乾燥した。高分子微小球製造の際、塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる段階を１段階に、反応終結後濾過を通じて分離した高分子微小球をPVA溶液に再分散させて撹拌を終結する段階を２段階にして各段階の温度を前記表12により維持した。
【０１５８】
前記製造された高分子微小球の高分子化合物の分子量を実施例５−３で測定したのと同一の方法で測定した。
【０１５９】
その結果、表13に示した通り、全ての高分子微小球の高分子化合物の分子量がよく保存されることを確認した。これで本発明の製造方法は薬剤の種類、反応温度等の条件に関係なく高分子化合物の分子量がよく保存されることを確認した。
【０１６０】
【表１３】
2013531061.tif 000015
【０１６１】
<実施例７>
オランザピン含有高分子微小球製造
<７−１>オランザピン含有高分子微小球製造
本発明の高分子微小球製造方法により、表14による条件でオランザピン含有高分子微小球を製造した。
【０１６２】
60mgのオランザピンと250mgの6535  4.5A  PLGAを4mlのエチルホルメートに溶かした後、この分散相を表14によるエチルホルメートが予め添加された分散溶媒(0.5%  PVA)に入れ、乳化させて乳剤を作った。以降、10N  NaOH溶液を添加して30分間反応を誘発し、蒸留水を添加して高分子微小球を濾過分離した。分離された高分子微小球を0.1%  PVA溶液に再分散させて真空乾燥した。高分子微小球製造の際塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる段階（１段階）までは室温で進行し、反応終結後濾過を通じて分離した高分子微小球をPVA溶液に再分散させ、撹拌を終結する段階（２段階）までは40℃を維持した。
【０１６３】
【表１４】
2013531061.tif 000016
【０１６４】
<７−２>残留溶媒の量、オランザピン封入率及び高分子微小球収得率測定
実施例７−１で製造された高分子微小球の残留溶媒の量を実施例１と同一の方法で測定した。
【０１６５】
製造された高分子微小球の収得率は、乾燥容器に製造した高分子微小球を入れて凍結乾燥して重さを測定して下記の式により計算した。
【０１６６】
収得率（％）＝（高分子微小球の重さ）／（製造時に使用した高分子と薬剤の重さの合計）×100
【０１６７】
オランザピン封入率は、製造された高分子微小球の封入量と封入率は下記の通り測定した。
【０１６８】
乾燥された高分子微小球10mgをアセトニトリル：水＝50:50(v/v)溶液に溶かして適当な倍数で希釈した。この溶液を濾過した後、UPLC(Ultra  Performance  Liquid  Chromatography)で分析して封入量及び封入率を計算した。UPLC分析器はWaters社（ドイツ）のACQUITYを使用し、コラムはHSSC18(Waters  ACQUITY  UPLC、ドイツ）を使用した。移動相の条件はアンモニウムアセテートバッファーとアセトニトリルが50:50に混合されたものを使用し、希釈液はアセトニトリルと水が50:50に混合されたものを使用した。
【０１６９】
封入量（％）＝（検出された薬剤の重さ／マイクロスフェアーの重さ）×100
【０１７０】
封入率（％）＝封入量／（理論的封入量）×100
【０１７１】
理論的封入量（％）＝（製造時に使用した薬剤の重さ）／（製造時に使用した高分子と薬剤の重さの合計）×100
【０１７２】
その結果、残留溶媒の量は表15に示した通り低く維持され、封入率及び収得率は表16に示した通り大部分70%以上に良好であることを確認した。
【０１７３】
【表１５】
2013531061.tif 000017
【０１７４】
【表１６】
2013531061.tif 000018
【０１７５】
<実施例８>
エチルアセテートを水不溶性有機溶媒にしたオランザピン含有高分子微小球製造
<８−１>オランザピン含有高分子微小球製造
前記実施例７で使用した水不溶性有機溶媒（エチルホルメート）と異なる水不溶性有機溶媒を利用してオランザピン含有高分子微小球を製造した。
【０１７６】
使用された水不溶性有機溶媒はエチルアセテート(EA)であり、製造条件は表17に示してある条件で製造した。
【０１７７】
60mgのオランザピンと250mgの  4.5APLGAを、4mlのエチルアセテートに溶かしてこの分散相を表17による、製造されたエチルアセテートが予め添加された分散溶媒(0.5%  PVA)に入れて乳化させて乳剤を作った。以降、10N  NaOH溶液を添加して30分間反応を誘発して蒸留水を加え、高分子微小球を濾過して分離した。分離された高分子微小球を0.1  PVA溶液に再分散させて真空乾燥した。高分子微小球製造の際塩基又は酸溶液を添加して反応を終結させる段階（１段階）までは  4℃で進行し、反応終結後濾過を通じて分離した高分子微小球をPVA溶液に再分散させて撹拌を終結する段階（２段階）までは40℃に維持した。
【０１７８】
【表１７】
2013531061.tif 000019
【０１７９】
<８−２>残留溶媒量、オランザピン封入率及び高分子微小球収得率測定
実施例８−１で製造された高分子微小球の残留溶媒量を実施例１と同一の方法で測定した。
【０１８０】
その結果、残留溶媒の量は表18に示した通り、低く維持され封入率、収得率は表19に示した通り、封入率は大部分85%以上、収得率は大部分70%以上に良好であることを確認した。
【０１８１】
【表１８】
2013531061.tif 000020
【０１８２】
【表１９】
2013531061.tif 000021
【０１８３】
<実施例９>
オランザピン含有高分子微小球薬剤動力学的試験
<９−１>オランザピン含有高分子微小球製造
表20の組成により多様なPLGAを利用してオランザピン含有高分子微小球を製造した。
【０１８４】
PLGA及びオランザピンを有機溶媒（エチルホルメート）に溶かして分散相を製造した。分散相と分散溶媒の比は1:5になるようにし、分散溶媒は0.5%  PVAにエチルホルメートを10:1の比率で混合して使用した。4℃に冷却された分散溶媒に分散相を入れて乳化させ乳剤を製造し、10N  NaOHを表20により投与、30分間反応を誘導して高分子微小球を製造した。生成された高分子微小球を蒸留水で洗滌して40℃の0.1%  PVA溶液に再分散して撹拌後に、高分子微小球を分離して真空乾燥した。
【０１８５】
製造された高分子微小球の状態を電子顕微鏡撮影を通じて確認した。
【０１８６】
【表２０】
2013531061.tif 000022
【０１８７】
電子顕微鏡観察結果、オランザピンが高分子微小球内によく封入されていて、全ての高分子微小球が球形に良く製造されたされたことを確認した（図７参照）。
【０１８８】
<９−２>注射性及び分散相試験
実施例９−１で製造されたオランザピン含有高分子微小球をカルボキシメチルセルロース(CMC)及びツイーン20が含有された生理食塩水に30%(w/v)濃度に懸濁し、19G針の注射器を使用して1mlを注射器に吸い入れ、さらに押出して注射が可能の可否を調べた。
【０１８９】
その結果、表21に示した通り、本発明のオランザピン含有高分子微小球は注射性及び分散性が良好であることを確認した。
【０１９０】
【表２１】
2013531061.tif 000023
【０１９１】
<９−３>オランザピン含有高分子微小球の持続性評価
実施例９−１で製造されたオランザピン含有高分子微小球を賦形剤溶液（カルボキシメチルセルロース及びツイーン20が含まれた生理食塩水）に懸濁して９週令の雌SDラットに40mg/kgで筋肉注射して投与した。以降、定められた時間毎に血液を採取して血中オランザピンの濃度を測定した。
【０１９２】
その結果、図８に示した通り、本発明のオランザピン含有高分子微小球は最高80日までオランザピンを放出することを確認した。
【０１９３】
<実施例10>
アナストローゾル含有高分子微小球製造
本発明の高分子微小球製造方法により、前記実施例で使用されたものと高分子の種類、薬剤及び封入量を異にして使用して高分子微小球を製造した。
【０１９４】
<10-1>アナストローゾル含有高分子微小球製造
表22によるフォームレーションで多様な条件のアナストローゾル含有高分子微小球を製造した。
【０１９５】
【表２２】
2013531061.tif 000024
【０１９６】
アナストローゾルとPLGA1000mgを19mlのエチルホルメートに入れ完全に溶かして分散相を作り、8mlのエチルホルメートが添加され4℃に冷却した0.5%  PVA（分散溶媒）に入れ、撹拌して乳剤を製造した。10N  NaOH  34mlを添加して30分間撹拌した。生成された高分子微小球を蒸留水で洗滌後33℃の0.1%PVAに再分散して撹拌後濾過凍結乾燥して高分子微小球を製造した。
【０１９７】
<10-2>製造されたアナストローゾル含有高分子微小球の基本特性評価
製造された高分子微小球の収率は乾燥容器に製造した高分子微小球を載せ、凍結乾燥して重さを測定した後、下記式により計算した。
【０１９８】
収率(%)＝（高分子微小球の重さ）／（製造時に使用された高分子と薬剤の重さの合計）×100
【０１９９】
製造された高分子微小球の封入量と封入率は下記の通り測定した。
【０２００】
製造された高分子微小球100mgをアセトニトリル：水＝50:50(v/v)溶液に溶かして適当な倍数で希釈した。この溶液を濾過してUPLCで分析し封入量及び封入率を計算した。UPLC(Ultra  Performance  Liquid  Chromatography)分析器はWaters社（ドイツ）のACQUTTYを使用し、コラムはHSS  C18（Waters  ACQUTTY  UPLC、ドイツ）を使用した。移動相の条件はアンモニウムアセテートバッファーとアセトニトリルが50:50で混合されたものを使用し、希釈液はアセトニトリルと水が50:50に混合したものを使用した。
【０２０１】
封入量(%)＝（検出された薬剤の重さ／マイクロスフェアーの重さ）×100
【０２０２】
封入率(%)＝封入量／（理論的封入量）×100
【０２０３】
理論的封入量(%)＝（製造時使用した薬剤の重さ）／（製造時使用した高分子と薬剤の重さ）×100
【０２０４】
粒度分析はMalvern  mastersizer(Malvern  Instruments  Ltd、英国)を使用して測定した。
【０２０５】
残留溶媒の量は実施例１と同一の方法で測定し、高分子微小球の形状は実施例２−２と同じ方法で撮影した。
【０２０６】
【表２３】
2013531061.tif 000025
【０２０７】
その結果、表23に示した通り、収得率及び封入率は殆ど80%以上でPLGA種類に関係なく適切であり、平均粒子の大きさは30〜60μm水準で適切であることを確認した。水分含量は0.5%水準であり、残留溶媒は極めて低い数値で試料種類に関係なく適合していることを確認した。
【０２０８】
さらに、電子顕微鏡撮影結果、図９に示した通り、高分子微小球が使用されたPLGAの種類に関係なく全般的に滑らかな球形に製造され、特に、薬剤含量は40%と高い場合でも表面に薬剤の結晶が観察されず良く封入されたことを確認した。
【０２０９】
<10-3>製造されたアナストローゾル含有高分子微小球の安定性評価
製造された高分子微小球内の柔軟物質分析は製造番号８番を対象になされた。高分子微小球に封入された封入量を基準にAPI(Active  Phamaceutical  Ingredients)アナストローゾルが  250μg/mlになるように高分子微小球を秤量してacetpnitrile:DW＝50:50溶液に希釈してUPLCで分析した。
【０２１０】
GPC分析のため、製造された高分子微小球30mgを3ml(o-CP:chloroform=1:3)に溶かしてPLgel  5μm  Mixed-D*2eaコラムを利用して40℃条件で0.7ml/minにしてRI  detectorでGPC分析した。
【０２１１】
in  vivo安定性シミュレーション試験のため、底に水を入れて湿度100%に作り、デシケータに高分子微小球（製造番号８番）をチューブに入れて、40℃安定性試験器に入れた。一定間隔（４週、２か月）でｎ＝３でサンプルを採りアセトニトリルで溶かしてメタノールで希釈して薬剤含量と柔軟物質の変化を分析した。
【０２１２】
その結果、表24に示した通り、本発明の高分子微小球は平均0.17%の柔軟物質を有することを確認した。一般的に、薬剤原料に対する柔軟物質基準が総柔軟物質１％以下、個別柔軟物質0.1%以下に管理するのと比較するに、本発明の高分子微小球製造過程は安定性が確保されたことを確認した。
【０２１３】
【表２４】
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【０２１４】
さらに、GPC分析を通じて、製造前後のPLGAの分子量を測定した結果、表25に示した通り、大部分分子量の変化がないことを確認した。
【０２１５】
【表２５】
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【０２１６】
in  vivo安定性シミュレーション結果、表26に示した通り、全体期間内期間別平均総柔軟物質含量(%)は0.23以下に示され、薬剤含量はその変化が10%未満に示されて本発明の製造方法は安定性が優れたことを確認した。
【０２１７】
【表２６】
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【０２１８】
<10-4>製造されたアナストローゾル含有高分子微小球の持続性評価-試験管内(in  vitro)放出試験
本発明の方法により製造された高分子微小球の薬剤放出の持続性を確認するために、試験管内薬剤放出実験を行った。
【０２１９】
透析用膜(Dialysis  membrane,MWCO  =12〜14KD)に高分子微小球を入れて透析用膜をPBSで満して、予め温度平衡を合わせたPBSに入れ、37℃恒温機で持続的に掻き回しながら予め定めた時間間隔毎に放出された薬剤の量を測定した。薬剤放出が終了すれば残りの高分子微小球を真空乾燥して残りの薬剤の量を測定した。
【０２２０】
その結果、図10に示した通り、全ての剤形の高分子微小球で残留薬剤が殆どなく放出されることを確認した。さらに、使用される高分子化合物の種類により、lactideの比率が高くなるほど薬剤が徐々に放出されることを確認し、薬剤含量が高くなるほど放出速度が早くなることを確認した。これにより、高分子微小球製造に使用される高分子化合物の種類及び封入される薬剤の量を調節して放出速度調節が可能であることを確認した。
【０２２１】
<10-5>製造されたアナストローゾル含有高分子微小球の持続性評価２−動物実験
分散性及び注射性判断のため、製造された高分子微小球に、カルボキシメチルセルロース及びツイーン20が含まれた生理食塩水を添加して懸濁液を作った。この懸濁液を19G又は20Gの針を利用して1ml注射器に吸込んだりさらに、押出して注射が可能か否かを調べた。高分子微小球／懸濁液(w/v)の10%濃度で結果を判別した。
【０２２２】
ラットに注射で投与する場合には、各製剤を賦形剤溶液が含まれた生理食塩水に懸濁して投与した。雌９週令のSDラットを使用して筋肉に20mg/kgで注射した。以降、定められた時間毎に血液を採取して血中アナストローゾル濃度を測定した。
【０２２３】
その結果、図11に示した通り、本発明の方法により製造された高分子微小球は最高120日まで薬剤を放出することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
従って、本発明は水不溶性有機溶媒と分散溶媒を混合する段階、及び水不溶性有機溶媒を塩基又は酸を利用して乳剤より除去する段階を含む新たな高分子微小球の製造方法、前記製造方法により製造された微小球及び前記高分子微小球を含む薬剤伝達用組成物を提供する。本発明の製造方法は既存の溶媒蒸発又は溶媒抽出工程を必要とせず、少量の水を使用して廃水発生を最小化しながら早い時間内に簡便に目的とする薬剤含有高分子微小球を製造することができ、製造された高分子微小球内の残留溶媒の濃度を低く維持することができて、持続放出型医薬品製造に効果的であるため産業上利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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