(57)【要約】各ＭＢが検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基を有する、複数の分子ビーコン（ＭＢ）を含むライブラリを本明細書に提供する。本ライブラリは、核酸のナノ細孔解離（ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ）依存配列決定と併せて使用される。
2013523131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリであって、複数のＭＢを含み、各ＭＢが、
（１）検出可能な標識と、
（２）検出可能な標識ブロッカーと、
（３）修飾基と、
を含む、オリゴヌクレオチドを含み、
前記ＭＢは、２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するための、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である、ライブラリ。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、４〜６０のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項３】
前記ＭＢの前記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯまたはモルホリノ）から成る群から選択される核酸を含む、請求項１または２に記載のライブラリ。
【請求項４】
前記検出可能な標識は、前記オリゴヌクレオチドの一端上で結合され、かつ前記ライブラリ中の全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、前記検出可能な標識が前記ブロッカーによって阻害されないとき、前記検出可能な標識は、検出および／または測定され得るシグナルを発する、請求項１〜３のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項５】
前記ＭＢは、固相担体に結合されない、請求項１〜４のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識、前記検出可能な標識ブロッカー、および前記修飾基は、ＭＢの、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される前記定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない、請求項１〜５のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項７】
前記検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される、請求項１〜６のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項８】
前記検出可能な基は、フルオロフォアであり、前記シグナルは、蛍光である、請求項１〜７のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項９】
前記検出可能な標識ブロッカーは、前記フルオロフォアのクエンチャーである、請求項１〜８のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１０】
前記検出可能な標識ブロッカーは、前記修飾基でもある、請求項１〜９のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１１】
前記修飾基は、前記オリゴヌクレオチドの５’端または３’端に位置する、請求項１〜１０のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１２】
前記修飾基は、前記修飾基の前記オリゴヌクレオチドへの結合点で、ｄｓ核酸の幅を２．０ナノメートル（ｎｍ）超に増加させ、前記ｄｓ核酸が、前記ＭＢの、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される前記定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される、請求項１〜１１のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１３】
前記修飾基の前記オリゴヌクレオチドへの結合点での、前記ｄｓ核酸の前記幅は、約３〜７ｎｍである、請求項１２に記載のライブラリ。
【請求項１４】
前記修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１５】
前記修飾基は、３〜５ｎｍである、請求項１〜１４のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１６】
前記修飾基は、前記ｄｓ核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、前記ｄｓ核酸の前記解離を容易にする、請求項１〜１５のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１７】
ＭＢの２つ以上の種が存在し、ＭＢの各種は、別々の検出可能な標識を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項１８】
核酸のナノ細孔解離依存配列決定のために２本鎖（ｄｓ）核酸を解離する方法であって、
ａ．請求項１〜１７に記載の分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、前記修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成することと、
ｂ．ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３はＤ１より大きい、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、
ｃ．配列決定される前記１本鎖核酸から前記ハイブリッド形成された分子ビーコンを解離するために、前記ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む、方法。
【請求項１９】
前記ナノ細孔径は、配列決定される１本鎖核酸に前記細孔を通過させるが、前記ｄｓ核酸に前記細孔を通過させない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｄ１は、２ｎｍより大きい、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｄ１は、３〜６ｎｍである、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
Ｄ３は、２ｎｍより大きい、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
Ｄ３は、約３〜７ｎｍである、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、前記修飾基と前記ＭＢのオリゴヌクレオチドとの前記結合親和性より低く、そのため、前記ｄｓ核酸が電位の影響下で前記ナノ細孔の前記開口部を通過しようとするとき、前記１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、前記修飾基と前記ＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
配列決定される前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ａ．請求項１〜１７に記載の分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、前記修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するステップと、
ｂ．ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップであって、Ｄ３がＤ１より大きい、ステップと、
ｃ．配列決定される前記１本鎖核酸から前記ハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、前記ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、
ｄ．それが前記細孔で生じるときに、前記ＭＢが前記ｄｓ核酸から分離する際に、各ＭＢからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記検出されたシグナルの配列を前記核酸の前記ヌクレオチド塩基配列に解読することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ細孔径は、配列決定される前記１本鎖核酸に前記細孔を通過させるが、前記ｄｓ核酸に前記細孔を通過させない、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｄ１は、２ｎｍより大きい、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
Ｄ１は、約３〜６ｎｍである、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
Ｄ３は、２ｎｍより大きい、請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
Ｄ３は、約３〜７ｎｍである、請求項２６〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、前記修飾基と前記ＭＢのオリゴヌクレオチドの前記結合親和性より低く、そのため、前記ｄｓ核酸が電位の影響下で前記ナノ細孔の前記開口部を通過しようとするとき、前記１本鎖核酸とＭＢとの間の前記結合は壊れるが、前記修飾基と前記ＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の前記結合は壊れない、請求項２６〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記配列決定される前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２６〜３３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもとに２０１０年３月３０日に出願された米国仮出願第６１／３１８，８７２号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により裁定された受託番号ＲＯｌ−ＨＧ００４１２８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ナノ細孔配列決定は、従来のサンガー配列決定法の安価で速い代替として開発された、期待できる技術である。ナノ細孔配列決定法は、従来のサンガー配列決定法に対していくつかの利点を提供することができる：それらは、単一分子分析が可能である、酵素依存ではない（例えば、ポリメラーゼ酵素は、鎖伸長に必要ではない）、および必要とされる試薬が非常に少ない。
【０００４】
いくつかのナノ細孔に基づくＤＮＡ配列決定法が近年提案され１４、主要な課題を２つ強調する１５：１）個別のヌクレオチド（ｎｔ）を識別する能力、例えば、系は、単一分子レベルで４つの塩基を区別することが可能でなければならない、および２）方法は、平行読み出しが可能でなければならない。
【０００５】
ナノ細孔に基づくＤＮＡ配列決定法において、主にＤＮＡを構成する４つのヌクレオチド間の比較的小さい相違により、および単一分子探索における固有ノイズにより、以前はＤＮＡ分析を単一分子レベルに縮小することは困難であった。これらの問題を回避するために一部によって取られたアプローチは、ＤＮＡの個別の塩基のそれぞれを、背景ノイズレベルより著しく大きい測定可能なシグナルを生成し、それによってシグナル対ノイズ比を増加させる別々の存在に拡大することである。これは、「デザインポリマー」１７、２９、３０と名付けられた、分析されるＤＮＡ分子を、より長くて周期的に構造化されたＤＮＡ分子に変換する、初期の調製ステップによって達成される。
【０００６】
現在、ＤＮＡの個別の塩基を「検出」または測定するための、ナノ細孔に基づくＤＮＡ配列決定法に使用される一般的なアプローチが２つある：１）ＤＮＡが細孔に入り、通過するとき、細孔の伝導性の変化を監視することであり、細孔の伝導性の変化は、例えば電位計を使用して直接測定され得る、および２）それらは、２本鎖ＤＮＡを排除するのに十分に小さくなければならないが、それでも１本鎖ＤＮＡの侵入および転位を可能にするナノ細孔によって解離されるとき、別々の分子ビーコンを光学的に検出することである。最初のアプローチでは、２本鎖ＤＮＡがナノ細孔を通して転位するとき、大きい基は、ヌクレオチドの塩基に結合され、検出のために生成された電子遮断シグナルを増加させ、それを明瞭化する３２。第２のアプローチでは、ＤＮＡは、最初に、ＤＮＡ配列中のありとあらゆる塩基を、特定の順序の連結オリゴヌクレオチドの対と系統的に置換することによって、伸長した、数字化形態に変換される２９、３１（図１）。異なる塩基のそれぞれを表す特異的なオリゴヌクレオチドの種、例えば、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、またはＣが存在する。変換されたＤＮＡは、相補的分子ビーコンとハイブリッド形成され、２本鎖ＤＮＡを形成する。異なる塩基のそれぞれを表す別々の分子ビーコン相補的オリゴヌクレオチドの種、例えば、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、またはＣが存在する。これらの異なる分子ビーコンの種は、識別目的のため、例えば、４つの分子ビーコンの種に４つの異なるフルオロフォアで、明確に標識される。ＤＮＡの配列を検出するために、次いで、分子ビーコンを含む２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）からビーコンを順次解離するために、２ｎｍ未満のナノ細孔を使用する。各解離事象により、新しいフルオロフォアは消光されず、異なる色で一連のフォトンの閃光を生じさせ、これがＣＣＤカメラによって記録される（図２）。解離プロセスは、電圧依存様式で細孔を通るＤＮＡの転位を、光学的記録に対応する速度に減速する。
【０００７】
標識されたｄｓＤＮＡのナノ細孔解離に依存するＤＮＡ配列決定の制限因子の１つは、ナノ細孔の細孔が２本鎖構造をこじ開けるのに十分に小さい、通常、直径が２ｎｍ未満でなければならないことである。現在、核酸分析のためのナノ細孔を調製するための一般的なアプローチが２つある：（１）α溶血素細孔等の天然分子から調製される有機ナノ細孔。有機ナノ細孔は、一般に、ＤＮＡ分析に使用されるが、有機ナノ細孔は、単一ＤＮＡ配列決定には大きく、同時に非常に多くのナノ細孔を必要とする高処理ＤＮＡ配列決定に適応させるのは容易ではない。（２）様々な既存および特殊製作技法によって作製される合成の固体状態のナノ細孔。合成的に製作されたナノ細孔は、同時に非常に多くのナノ細孔を必要とする高処理ＤＮＡ配列決定により大きな可能性を持つ。
【０００８】
標識されたｄｓＤＮＡのナノ細孔解離に依存するＤＮＡ配列決定の別の制限因子は、単一ナノ細孔が、１度に単一分子しか探索できないことである。ナノ細孔塩基配列決定法を使用する速く、高処理のゲノム配列決定の開発は、多くのナノ細孔およびナノ細孔の同時監視を伴う。ナノ細孔の製作は、多くの合成ナノ細孔を生成することができるが、非常に小さい細孔を有するナノ細孔の均一で一定の品質製造は、困難である。僅かに大きな細孔径のナノ細孔の使用を可能にするナノ細孔に基づく解離配列決定法における代替戦略が、望ましい。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、修飾基を、核酸のナノ細孔解離依存配列決定に使用される分子ビーコン（ＭＢ）等の部分に連結することによって、標準的な２本鎖（ｄｓ）核酸の幅より大きい細孔の使用（約２．２ｎｍ）を可能にする発見に基づく。ナノ細孔解離依存配列決定において、約１．５〜２．０ｎｍの細孔径は、１本鎖核酸のみが、電界の細孔の開口部を通って転位することを可能にする。これは、基本的に、ナノ細孔と接触するｄｓ核酸の鎖分離を余儀なくさせ、このプロセスは、一般的に、「解離」と呼ばれる。この従来の方法による問題は、ナノ細孔径がｄｓ核酸の幅より小さい細孔径に制限されることである。均一の細孔径を有する小さいサイズのナノ細孔の大規模製造は、困難である。ＭＢに連結される修飾基は、ＭＢに大きさを加え、従来の方法をより大きな細孔径のナノ細孔の使用に適応させる。ｄｓ核酸は、１本鎖核酸と、それぞれがその上に連結される大きい修飾基を有する複数のＭＢのハイブリッド形成により形成される。ＭＢ上の大きい修飾基の存在は、大きい基がＭＢに結合する点で、ｄｓ核酸の幅を標準的な２本鎖ｄｓ核酸の幅より大きい幅に増加する働きをする（図９を参照）。２．０ｎｍより大きいが、大きい基がＭＢに結合する点で、ｄｓ核酸の幅未満であるより大きな細孔は、配列決定プロセスにおいて、ＭＢに連結された大きい基を含むｄｓ核酸を解離するために使用され得る。より大きなそのような構造の細孔は、それでも、１本鎖核酸のみが電界の細孔の開口部を通して転位することを可能にすることができる。細孔は、大きい基がＭＢに結合する点でｄｓ核酸より小さいため、より大きなそのような構造の細孔は、連結した大きい基のＭＢが電界の細孔の開口部を通して転位することを防止することによって、これを達成する（Ｄ３、図９を参照）。これは、鎖分離が標準的な、すなわち、ＭＢに連結される大きい基なしのｄｓ核酸および約１．５〜２．０ｎｍのナノ細孔径で起こるのと同様に、ｄｓ核酸の鎖分離をもたらす。その上に連結される大きい修飾基を有さない標準的なｄｓ核酸は、約２．２ｎｍの幅を有する。
【００１０】
特に記載されない限り、本明細書で使用される以下の用語のそれぞれは、以下に記述される定義を有するものとする。
【００１１】
「ナノ細孔」は、例えば、（ａ）バリアが、例えば、約１〜１０ｎｍの直径を有する少なくとも１つの細孔を有する物理的バリアで分離される第１および第２のコンパートメントと、（ｂ）ＤＮＡ等の荷電分子が第１のコンパートメントから細孔を通って第２のコンパートメントに通過できるように、バリア全体に電界を適用するための手段と、を含む構造を含む。ナノ細孔は、理想的には、そのバリアを通過する分子の電子サインを測定するための手段をさらに含む。一実施形態では、ナノ細孔バリアは、合成である、すなわち、合成材料で作製されるか、または合成的に作製されたナノ細孔である。一実施形態では、ナノ細孔バリアは、一部、合成的に生じる。一実施形態では、ナノ細孔バリアは、天然である、すなわち、天然材料で作製されるか、または天然に存在するバリアである。一実施形態では、ナノ細孔バリアは、一部、天然に生じる。バリアは、例えば、α溶血素、ポーリン等のオリゴマータンパク質チャネル、および合成ペプチド等をその中に有する脂質バリアを含むことができる。一実施形態では、ナノ細孔バリアは、適切なサイズの１つ以上の穴を有する無機プレートも含むことができる。一部の実施形態では、ナノ細孔バリアは、有機および／または無機材料を含む。一部の実施形態では、ナノ細孔バリアは、有機および／もしくは無機材料、または合成もしくは天然の材料の修飾を含む。本明細書において、ナノ細孔バリアにおける「ナノ細孔」および「細孔」は、互換的に使用される。
【００１２】
本明細書で使用される「含む」という用語は、提示される定義される要素に加え、他の要素も存在することができることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなくむしろ包含を示す。
【００１３】
本明細書に記載されるライブラリ、方法、およびそのそれぞれの構成要素に関して、「〜から成る」という用語は、実施形態のその説明に列挙されないあらゆる要素または構成要素を除外することを意味する。
【００１４】
本明細書で使用される「基本的に〜から成る」という用語は、所与の実施形態に必要であるそれらの要素を指す。本用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規または機能的特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を容認する。
【００１５】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドまたは類似体を含むが、これらに限定されないあらゆる核酸分子を意味するものとする。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、ならびにそれらの誘導体であり得る。それらの塩基の誘導体は、当該技術分野において周知である。核酸は、モノマーヌクレオチドの鎖から構成される巨大分子である。一部の実施形態では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。他の実施形態では、核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）等の人工核酸である。これらのそれぞれは、分子の骨格に対する変化により、天然のＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。
【００１６】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態である。一般に、ヌクレオチド単位の数は、約２〜１００、好ましくは２〜３０、または５０〜８０の範囲であり得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＭＢのオリゴヌクレオチドは、長さが４〜２５ヌクレオチドである。本明細書に記載されるＭＢのライブラリおよび方法に関して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ／モルホリノ）等の特異的配列において一緒に結合される複数の天然、非天然、一般的に知られる、または合成のヌクレオチドを指す。それらは、あらゆる長さであってもよく、それらの３’端および／もしくは５’端で修飾または非修飾され得る。一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００１７】
本明細書で使用される「Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマー」という用語は、本明細書に記載される方法に関して使用されるとき、「ブロック配列」を含むポリマーを指し、各ブロック配列は、個別に、または組み合わせて、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧを表す。一実施形態では、「Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列」とは、「ブロック配列」を含むポリマーを指し、各ブロック配列は、個別に、または組み合わせて、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧを表す。
【００１８】
本明細書で使用される「ブロック配列」とは、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーに関して使用されるとき、個別に、または別のブロック配列と組み合わせて、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧのいずれかで表される、特異的配列の４〜３５ヌクレオチドの短い核酸を指す。例えば、ＡＴＴＴＧＧＡＡＴは、ブロック−０であり、ＴＴＣＣＧＡＧＧＴは、別のブロック−１である。ブロック０１の組み合わせは、ＡＴＴＴＧＧＡＡＴ−ＴＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号１）であり、それは、ヌクレオチド塩基Ａを表す。
【００１９】
本明細書に記載される発明の実施形態の実践において、いずれの部分に結合される修飾基を使用することができる。代表的な部分は、分子ビーコンである。他の部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびペプチドを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載される発明の実施形態の用途は、アプタマーを使用するタンパク質アッセイ、または検出を含むが、これらに限定されない。タンパク質検出における用途において、ナノ細孔は、特定のタンパク質分析用の部分、例えば、特定のタンパク質結合部分と組み合わされ得る。しかしながら、本発明を図示する目的において、本明細書に記載される部分は、ＭＢである。この図示は、部分がＭＢのみに限定されると決して解釈されるべきではない。
【００２０】
したがって、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを本明細書において提供し、本ライブラリは、各ＭＢが、（１）検出可能な標識、（２）検出可能な標識ブロッカー、および（３）修飾基を含むオリゴヌクレオチドを含む、複数のＭＢを含み、ＭＢは、２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するための、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列と配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である。
【００２１】
一実施形態では、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のために２本鎖（ｄｓ）核酸を解離する方法が、本明細書において提供され、本方法は、（ａ）本明細書に記載される分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、ＭＢ上の修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成することと、（ｂ）ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３がＤ１より大きい、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、（ｃ）配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む。ナノ細孔全体に電位によって生成された電界は、ナノ細孔を通して、ｄｓ核酸をナノ細孔の１つのコンパートメントからもう一方に転位させる。転位プロセスの間、大きい基に連結したＭＢは、相補的にハイブリッド形成された１本鎖核酸と一緒に細孔を通って転位するには非常に大きい（すなわち、非常に幅がある）ため、ＭＢは、ナノ細孔の入口でｄｓ核酸を剥離する。
【００２２】
別の実施形態では、（ａ）本明細書に記載される分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、ＭＢ上の修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するステップと、（ｂ）ステップａ）で形成された２本鎖核酸を、Ｄ３がＤ１より大きいＤ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップと、（ｃ）配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、（ｄ）ＭＢが細孔でｄｓ核酸から分離するとき、各ＭＢからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を本明細書に提供する。電位によってナノ細孔全体にわたって生成された電界は、ナノ細孔を通して、ｄｓ核酸をナノ細孔の１つのコンパートメントからもう一方に転位させる。転位プロセスの間、大きい基に連結したＭＢは、相補的にハイブリッド形成された１本鎖核酸と一緒に細孔を通って転位するには非常に大きい（すなわち、非常に幅がある）ため、ＭＢは、ナノ細孔の入口でｄｓ核酸を剥離する。
【００２３】
一実施形態では、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法は、検出されたシグナルの配列を、配列決定される核酸のヌクレオチド塩基配列に解読することをさらに含む。
【００２４】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、２つの親和性アーム（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｒｍｓ）を含む。一部の実施形態では、ＭＢオリゴヌクレオチドは、５’親和性アームと、３’親和性アームと、を含む。親和性アームは、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドの一部であり、条件がハイブリッド形成に好適なときに、ハイブリッド形成することができる。
【００２５】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、４〜６０のヌクレオチドを含む。
【００２６】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリマーである。一実施形態では、ポリマーは、４〜６０のヌクレオチド、ヌクレオ塩基、またはモノマーを含む。一実施形態では、モノマーは、ヌクレオチドおよびその類似体、例えば、ジダノシン、ビダラビン、シタラビン、エムトリシタビン、ラミブジン、ザルシタビン、アバカビル、エンテカビル、スタブジン、テルビブジン、ジドブジン、イドクスウリジン、およびトリフルリジンである。一実施形態では、ヌクレオチド、ヌクレオ塩基、またはモノマーの一部は、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、修飾基、例えばチオール−ｄＴと結合する目的で修飾され得る。
【００２７】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ／モルホリノ）から成る群から選択される核酸を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドのモノマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、および（ＰＭＯ／モルホリノ）から成る群から選択される。別の実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＴＮＡ、およびモルホリノの混合物または組み合わせ、例えば、（ＤＮＡ＋ＲＮＡ）、（ＧＮＡ＋ＲＮＡ）、（ＬＮＡ＋ＤＮＡ）、（ＰＮＡ＋ＤＮＡ＋ＲＮＡ）等を含む。
【００２８】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、一対の「アーム」を含む。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、５’アームおよび３’アーム、好ましくは５’フルオロフォアアームおよび３’クエンチャーアームを含む。この実施形態では、検出可能な標識は、５’フルオロフォアアーム上に見られるフルオロフォアであり、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢの３’クエンチャーアーム上に見られるクエンチャーである。
【００２９】
一実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの一端上に連結され、ライブラリのＭＢの全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在する。一実施形態では、検出可能な標識がブロッカーによって阻害されないとき、検出可能な標識は、検出および／または測定されるシグナルを発する。
【００３０】
一実施形態では、ライブラリのＭＢは、固相担体に結合されない。
一実施形態では、ライブラリのＭＢは、溶液中で遊離である。
【００３１】
一実施形態では、ライブラリのＭＢのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、ＭＢの、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない。
【００３２】
一実施形態では、検出可能な基のシグナルは、例えば、光度、発せられる光の色、または蛍光等によって、光学的に検出される。
【００３３】
一実施形態では、検出可能な基は、フルオロフォアであり、シグナルは、蛍光である。
【００３４】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、フルオロフォアのクエンチャーである。
【００３５】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、修飾基でもある。換言すれば、ＭＢ上の検出可能な標識ブロッカーおよび修飾基は、同じ分子である。換言すれば、ＭＢ上の検出可能な標識ブロッカーは、修飾基としても機能する。
【００３６】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドと結合する点で、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸の幅を２．０ナノメートル（ｎｍ）超に増加させ、ｄｓ核酸は、ＭＢの、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される（図９を参照）。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドと結合する点で、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸の幅を２．２ｎｍ超に増加させ、ｄｓ核酸は、ＭＢの、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸のＤ２を２．０ｎｍ超に増加する（図９を参照）。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸のＤ２を２．２ｎｍ超に増加する（図９を参照）。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸の幅を２．０ｎｍ超に増加する。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、それ故にそれと形成されるｄｓ核酸の幅を２．２ｎｍ超に増加する。
【００３７】
一実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’端または３’端で結合される。一実施形態では、修飾基は、本明細書に記載されるライブラリのＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端または５’端から３〜７ヌクレオチド内で結合される。別の実施形態では、修飾基は、本明細書に記載されるライブラリのＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端または５’端から１〜７ヌクレオチド内で結合される。
【００３８】
一実施形態では、修飾基が本明細書に記載されるライブラリのＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点のｄｓ核酸の幅は、約３〜７ｎｍである。別の実施形態では、修飾基がＭＢオリゴヌクレオチドに結合する点のｄｓ核酸の幅は、約３〜５ｎｍである。
【００３９】
一実施形態では、ライブラリのＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子．から成る群から選択されるが、これらに限定されない。別の実施形態では、修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、または半導体粒子ではない、２ｎｍより大きいあらゆる分子である。
【００４０】
一実施形態では、修飾基は、３〜５ｎｍである。
【００４１】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、核酸がナノ細孔配列決定を受け、ｄｓ核酸が本明細書に記載されるライブラリのＭＢを含むとき、ｄｓ核酸の解離を容易にする。
【００４２】
一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、ＭＢの２つ以上の種を含み、ＭＢの各種は、別々の検出可能な標識を有する。一実施形態では、ＭＢの各種は、相補的に、固有の核酸配列とハイブリッド形成される。
【００４３】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔径は、配列決定される１本鎖核酸に細孔を通過させるが、本明細書に記載されるライブラリのＭＢを含むｄｓ核酸に細孔を通過させない。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔径は、１本鎖核酸に細孔を通して転位させるが、本明細書に記載されるライブラリのＭＢを含むｄｓ核酸に転位させない。
【００４４】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、細孔は、２ｎｍより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、細孔は、２．２ｎｍより大きい。
【００４５】
一実施形態では、細孔は、２ｎｍより大きいが、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点では、ｄｓ核酸の幅（Ｄ３）より小さい。別の実施形態では、細孔は、２．２ｎｍより大きいが、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点では、ｄｓ核酸の幅（Ｄ３）より小さい。
【００４６】
本明細書に記載される方法の別の実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、２．２ｎｍより大きい。
【００４７】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ１（細孔の幅）は、２ｎｍより大きい。別の実施形態では、Ｄ１は、２．２ｎｍより大きい。
【００４８】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ１は、３〜６ｎｍである。
【００４９】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅であるＤ３は、２ｎｍより大きい。別の実施形態では、Ｄ３は、２．２ｎｍより大きい。
【００５０】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ３は、約３〜７ｎｍである。
【００５１】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、約３〜５ｎｍである。
【００５２】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、ナノ細孔の開口部の幅（Ｄ１）より大きく、そのため、ｄｓ核酸が電界の影響下でナノ細孔開口部を通過しようとするとき、修飾基は、ｄｓ核酸上のＭＢオリゴヌクレオチドが開口部に侵入するのを阻止することにより鎖分離をもたらし、１本鎖核酸が細孔を通過する一方で、ＭＢのオリゴヌクレオチドはｄｓ核酸から解離される。
【００５３】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドの結合親和性より低く、そのため、ｄｓ核酸が電界の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない。一実施形態では、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は、非共有水素結合である。一実施形態では、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、共有結合である。一実施形態では、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は、非共有水素結合であり、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、イオン性および疎水性相互作用等の非共有結合である。一実施形態では、ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の水素結合は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間のイオン性および／または疎水性相互作用より弱い。
【００５４】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、配列決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１ａ】ＤＮＡ解離依存配列決定方法論における２つのステップの略図である。最初に、標的ＤＮＡ配列の各ヌクレオチドの、既知の配列を有する既知のオリゴヌクレオチドへの大量生化学変換後、分子ビーコンとハイブリッド形成する。ＤＮＡ／ビーコン複合体をナノ細孔に通すことにより、標的ＤＮＡ配列の光学検出を可能にする。
【図ｌｂ】平行読み出しスキームの略図である。各細孔は、ＥＭ−ＣＣＤの視野に特定の位置を有し、したがって、多くのナノ細孔の同時読み出しを可能にする。
【図２ａ】環状ＤＮＡ変換手順（ＣＤＣ）の３つのステップを示す。５’鋳型末端ヌクレオチドおよびそのコードは、「Ｃ」−紫、「Ａ」−灰色、「Ｔ」−赤、および「Ｇ」−青に色分けされる。色は、ここでは、グレースケールに変更されている。
【図２ｂ】ＣＤＣ手順後の変換されたＤＮＡの分析を示す。左側パネル：４つの全ての鋳型へのプローブの良好な連結を示す変性ゲル。列Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧは、４つの鋳型のそれぞれの５端ヌクレオチドを示し、一方、Ｒは、長さが１００−ｎｔおよび１５０−ｎｔの２つのｓｓＤＮＡ分子を含有する参照列である。右側パネル：配列特異的蛍光オリゴヌクレオチドを使用することにより、ゲルは、４つ全ての鋳型の最初のヌクレオチドが良好に変換され、このプロセスから副産物が生じなかったことを示す。
【図３ａ】大きい基の解離実験の電子／光学検出において５ｎｍ未満の細孔を使用した、１ビットおよび２ビット複合体の解離の代表的な事象を示す。電流は、各パネルの上部の黒い跡であり、一方、光学シグナルは、各パネルにおいて薄灰色の下方の跡であり、それぞれ、上のパネルは、１ビットの試料の跡を示し、下方のパネルは、２ビッドの試料跡を示す。
【図３ｂ】１ビットの試料（濃い灰色）の大半の複合体は、フォトンバーストを１つ生成し、一方、２ビットの試料（薄灰色）の大半の複合体は、フォトンバーストを２つ生成することを示すヒストグラム（各試料においてｎ＞６００）を示す。
【図３ｃ】図３ｂのそれらに類似する実験のヒストグラムを示すが、１つのバーストパルス、２つのバーストパルス、３＋のバーストパルスにまとめられる。
【図４ａ】Ａ６４７（赤）およびＡ６８０（青）フルオロフォアを用いた２色解離実験で得た、集積されたフォトン強度を示す。データの色は、ここでは、グレースケールに変更されている。各チャネルにおいて、単一の明瞭なピークが観察され、ＥＭ−ＣＣＤ上に撮像されるように、細孔位置を示す。チャネル１対チャネル２で測定された蛍光強度の比率であるＲ値は、２つのフルオロフォアにおいて、０．２および０．４である。
【図４ｂ】Ａ６４７（上）およびＡ６８０（下）を用いた、代表的な解離事象の電子／光学シグナルを示す。
【図４ｃ】Ａ６４７およびＡ６８０において、それぞれ、Ｒ＝０．２０±０．０６および０．４０±０．０５をもたらした各試料の数百の集積跡を示す。
【図５ａ】２つのフルオロフォアを使用した光学ナノ細孔ヌクレオ塩基の識別を示す。４つ全てのＤＮＡヌクレオ塩基に対応する、２ビットの試料の構築を可能にするために、２つの異なる色を使用した。データの色は、ここでは、グレースケールに変更されている。
【図５ｂ】それぞれ、Ａ６４７およびＡ６８０フルオロフォアに対応する、＞２０００の事象を用いて生成されたＲ分布が、０．２１±０．０５および０．４１±０．０６で、対照試験と良好に一致する２つのモードを明らかにすることを示す。
【図５ｃ】個別の２色の２ビットの解離事象の代表的な強度補正された蛍光跡を示し、対応する呼ばれたビット、呼ばれた塩基、および確実性スコアが事象の上に示される。２つのチャネルの強度は、各ビットが一定の閾値であるＲ値を使用して呼ばれた後、コンピュータコードによって、自動的に補正された。
【図６ａ】ＤＮＡ解離事象の多重細孔検出の実行可能性を示す。集積された光学強度を示す表面プロットは、ＥＭ−ＣＣＤによって撮像されるように、１つ（左）、２つ（中央）、および３つ（右）のナノ細孔の位置を明確に示す。
【図６ｂ】４つの代表的な跡が２つの異なる細孔での同時解離を表すことを示す。電流跡（黒、上の跡）は、細孔位置の情報を含まず、一方、光学跡（３つの下方の跡）は、解離事象の位置の確立を可能にする。
【図７】ＤＮＡ鋳型分子（５’端でＣを伴う）の変換を示す変性ゲルの画像である。画像は、環状変換生成物（列Ｅ）ならびに線形化生成物（列Ｄ）の両方を示す。列Ａは、変換前のＤＮＡ鋳型である。２つの基準分子である直鎖状１５０ｍｅｒおよび環状１５０ｍｅｒ（それぞれ、列ＢおよびＣ）が、ゲルに含まれる。
【図８ａ】ＡＴＴＯ６４７Ｎ染料を含有する２つの複合体の発光スペクトルを示す。上の曲線は、ハイブリッド形成されたＡＴＴＯ６４７Ｎビーコンを含有する分子の測定された、基準化スペクトルであり、一方、下の曲線は、ハイブリッド形成されたＡＴＴＯ６４７ＮビーコンならびにＢＨＱ−２クエンチャービーコンの両方を含有する分子の測定されたスペクトルである。図の差し込みは、使用された複合体を模式的に示す。
【図８ｂ】ＡＴＴＯ６８０染料を含有する２つの複合体の発光スペクトルを示す。上の曲線は、ハイブリッド形成されたＡＴＴＯ６８０ビーコンを含有する分子の測定されたスペクトルであり、一方、下の曲線は、ハイブリッド形成されたＡＴＴＯ６８０ビーコンならびにＢＨＱ−２クエンチャービーコンの両方を含有する分子の測定されたスペクトルである。図の差し込みは、使用された複合体を模式的に示す。
【図９】その上で連結される修飾基／大きい基を有する修飾された分子ビーコンを伴う２本鎖核酸のナノ細孔解離の概略図を示す。
【図１０】溶液中の、標的核酸と相補的にハイブリッド形成されない分子ビーコンの一実施形態の一般的な特色を示す。標的核酸は、配列決定される核酸からの変換された核酸である。
【図１１Ａ−１１Ｃ】ペプチドを分子ビーコンに連結するための代表的な３つの異なる結合スキームを示す。
【図１１Ａ】分子ビーコンが炭素−１２スペーサーを通してビオチン−ｄＴをステムのクエンチャーアームに導入することにより修飾される、ストレプトアビジン−ビオチン連結を示す。ビオチン修飾されたペプチドは、４つのビオチン結合部位を有するストレプトアビジン分子を通して、修飾された分子ビーコンに連結される。
【図１１Ｂ】分子ビーコンステムのクエンチャーアームが、直接的な安定した連結を形成するように、ペプチドのＣ末端に配置されるマレイミド基と反応できるチオール基を加えることにより修飾される、チオール−マレイミド連結を示す。
【図１１Ｃ】ペプチドが、チオール修飾された分子ビーコンとジスルフィド架橋を形成するＣ末端で、システイン残基を加えることにより修飾される、切断可能なジスルフィド架橋を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
特に説明のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５７】
特に記載のない限り、本発明は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載される当該技術分野に公知の標準的な手順を使用して実施され、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に制限されず、そのようなものとして変動し得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語は、単に、特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明の範囲を制限することを意図せず、これは、特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００５９】
操作例または別に示される場合を除き、本明細書に使用される成分の量また反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されるものと理解するべきである。「約」という用語は、パーセンテージに関して使用されるとき、±１％を意味することができる。
【００６０】
「ａ」、［ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数用語は、特に明確に文脈に記載されない限り、複数対象物を含む。同様に、「または」という用語は、特に明確に文脈に記載されない限り、「および」を含むことが意図される。核酸に与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、近似であり、説明のために提供されることをさらに理解するべきである。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本開示の実践または試験に使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。「ｅ．ｇ．」という略記は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書において、非限定的な例を示すために使用される。よって、「ｅ．ｇ．」という略記は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義語である。
【００６１】
特定される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論の説明および開示の目的のため、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の提出日前に、単にそれらの開示について提供される。この点におけるいずれも、発明者が従来の発明のため、またはいかなる他の理由のために、そのような開示に先行する権利がないと承認するものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述、またはこれらの資料の内容に関する説明は、出願人に利用可能な情報に基づき、これらの資料の日付および内容の正確性に関していかなる承認も制定しない。
【００６２】
本発明の実施形態は、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸のナノ細孔解離依存配列決定と共に使用される分子ビーコン（ＭＢ）に対する修飾の例示的な実例に基づく。
【００６３】
核酸のナノ細孔解離依存配列決定において、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの解離は、ｄｓＤＮＡを含むＭＢからのシグナルを顕在化するために必要である。ＭＢからの顕在化されたシグナルの時間的配列は、配列決定される核酸の配列に対応する。ｄｓＤＮＡを解離するために使用されるナノ細孔のサイズは、いずれの外来性分子に付着されないまたは結合されない標準的なｄｓＤＮＡの幅未満に限定され、その幅は、約２．２ｎｍである。約１．５であるが、２．２ｎｍ未満である細孔径は、ｄｓＤＮＡが電界の影響下、細孔を通過しようとするとき、ｄｓＤＮＡを解離することができる、すなわち、ＤＮＡの２本の鎖が分離し、１本の鎖が細孔を通過し、一方、複数の非共有結合的に連結されたＭＢを含むもう一方の相補鎖は、経時的かつ時間的に検出され、後に残される（図１ａを参照）。２．２ｎｍより大きいあらゆる細孔経は、ＭＢからのシグナルを顕在化するために必要である解離事象を促進せず、顕在化されたシグナルは、配列決定されるＤＮＡの配列に対応する。２．２ｎｍより大きいあらゆる細孔径は、単純に、いかなる鎖分離なしにｄｓＤＮＡに細孔を通過させる。ｄｓＤＮＡ構造において、ハイブリッド形成されたＭＢは、いかなるシグナルも顕在化しない。
【００６４】
発明者は、配列決定中にナノ細孔を通過しようとするｄｓＤＮＡの幅を増加することによって、特に、ＭＢに修飾基を結合することによって、この細孔径の制限を回避した。図９に模式的に示されるように、修飾基１０３は、修飾されたＭＢ１１１を伴う１本鎖核酸ｄｓ核酸１０９によって形成されたｄｓ核酸が、修飾されないＭＢで形成されたｄｓ核酸の幅Ｄ２１１３と比較したとき、より大きな幅Ｄ３１１５を有するように、ＭＢ１１１に大きさを付加する。結果として、細孔幅Ｄ１１０１が、ＭＢ上の大きい修飾基の結合点でｄｓＤＮＡの幅（Ｄ３１１５）より小さい限り、約２．２ｎｍより大きい細孔幅Ｄ１１０１は、解離事象、したがって配列決定に使用され得る。概念の証として、発明者は、ＭＢをビオチン化し、ビオチン化ＭＢにアビジン（４．０×５．５×６．０ｎｍ）２０を結合した。それらは、アビジン−ビオチン化ＭＢを含むｄｓＤＮＡを解離し、これらのアビジン−ビオチン化ＭＢからのシグナルを顕在化するために、３〜６ｎｍのナノ細孔を正常に使用した（図３ａ）。さらに、発明者は、「２ビット」の実験に示されるように、そのような修飾が、２つの異なるＭＢの種を含むｄｓＤＮＡの解離に適用され得ることも示し（図３ａ）、ここで、２つのＭＢの種は、例えば、１つのＭＢの種が赤い蛍光を発光するフルオロフォアで標識され、第２のＭＢの種が青い蛍光を発光するフルオロフォアで標識される、異なるフルオロフォアで標識される。
【００６５】
特に大量生産製作において約２ｎｍ以下のサイズのナノ細孔を製作するとき、一貫性のある結果を得ることが困難であるため、開示される修飾の利点の１つは、より大きい細孔径がｄｓＤＮＡの解離に依存するナノ細孔に基づくＤＮＡ配列決定に使用され得ることである。この修飾は、同時に、多重細孔検出の簡単な方法を導くナノ細孔アレイの大規模な製作を容易にする。別の利点は、より大きい細孔径がｄｓＤＮＡの捕獲速度を少なくとも１０倍増加させ、これもアレイにおける多重細孔検出に有利に働く１３。
【００６６】
したがって、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを本明細書において開示し、本ライブラリは、各ＭＢが、（１）検出可能な標識、（２）検出可能な標識ブロッカー、および３）修飾基を含むオリゴヌクレオチドを含む、複数のＭＢを含み、ＭＢは、２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するための、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列と配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である。一実施形態の典型的なＭＢの概略図を図１０に示す。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、２つの親和性アームを含む。一実施形態では、ＭＢの  オリゴヌクレオチドは、５’親和性アームと、３’親和性アームと、を含む。好適な一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、５’フルオロフォアアームと、３’クエンチャーアームと、を含む。一実施形態では、修飾基は、４本鎖ＤＮＡである。一実施形態では、４本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの一部、またはその内にある。
【００６７】
一実施形態では、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための２本鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを解離する方法を本明細書において提供し、本方法は、（ａ）本明細書に記載される分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、ＭＢ上の修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成することと、（ｂ）ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３がＤ１より大きい、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、（ｃ）配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む。
【００６８】
別の実施形態では、（ａ）本明細書に記載される分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するステップと、（ｂ）ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３がＤ１より大きいＤ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップと、（ｃ）配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、（ｄ）それが生じるとき、ＭＢがｄｓ核酸から分離する細孔で各ＭＢからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を本明細書に提供する。発せられるシグナルの時間的配列は、１本鎖核酸の配列に対応する。
【００６９】
核酸のヌクレオチド配列を決定するこの方法の一実施形態では、方法は、配列決定される核酸を、ＭＢのライブラリによってハイブリッド形成される代表的な１本鎖核酸に変換することを含む。
【００７０】
一実施形態では、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法は、核酸の実際のヌクレオチド塩基配列を引き出すために、検出されたシグナルの配列を解読することをさらに含む。
【００７１】
本明細書に記載されるライブラリおよび方法は、あらゆる核酸またはオリゴヌクレオチドの配列、例えば、突然変異の検出、ＤＮＡ指紋法、単一ヌクレオチド多型、および生物の全ゲノム配列決定が所望されるあらゆる状況で使用され得ることを包含する。
【００７２】
一般に、当該技術分野に知られるＭＢは、ステム−ループ構造（図１０を参照）を形成し、溶液中の特定の核酸の存在を報告するために使用される、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブである。ステム−ループ構造は、ヘアピンまたはヘアピンループとしても、当該技術分野において知られる。ＭＢは、分子ビーコンプローブとも称される。例として、また制限するものと解釈されるべきではないが、典型的なＭＢオリゴヌクレオチドプローブの一般的な設計および特色は、以下の通りである（図１０を参照）：ＭＢは、様々な長さ、例えば、１５〜３５ヌクレオチドの長さのものであり得る。ＭＢ内にＤＮＡの４本鎖部分が存在する実施形態では、ＭＢの長さは、より長く、例えば、最大６０ヌクレオチドの長さであり得る。一実施形態では、中間部分は、特定の標的ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドに相補的である５〜２５ヌクレオチドを含む、「ループ」を形成する。ＭＢに関して使用される、「標的核酸」、「標的ＤＮＡ」、「標的配列」、「標的ＲＮＡ」、または「標的オリゴヌクレオチド」は、ＭＢがワトソン−クリック型のハイブリッド形成において、塩基と相補的にハイブリッド形成する、すなわち、それと「塩基対合」することができる核酸である。一実施形態では、相互に相補的である、すなわち、相互に「塩基対合」することができるＭＢの各端に、少なくとも２つのヌクレオチドが存在する。ＭＢの各端または「親和性アーム」のこれらの２つのヌクレオチドは、一緒にアニールされ、ＭＢの「ステム」を形成し、ＭＢがその標的核酸とハイブリッド形成されないとき、ステム−ループ構造を生成する。ステム−ループ構造は、典型的に、両端が相互に相補的である配列で、２〜７ヌクレオチドの長さである。
【００７３】
一実施形態では、染料または検出可能な標識は、ＭＢの５’端／アームに向かって結合され、一般に、相補的標的の存在下で蛍光を発する５’フルオロフォアと呼ばれる。一実施形態では、クエンチャー染料または検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢの３’端／アームに共有結合され、一般に、３’クエンチャーと呼ばれる。ビーコンが閉ループ形状であるとき、クエンチャーは、フルオロフォアが光を発するのを防止する。一般に、ＭＢは、それらが標的核酸配列に結合するとき、蛍光が復元される内部的に消光されたフルオロフォアとステム−ループ形状の分子を形成する。以下はＭＢの例である。
５’端のフルオロフォア、５’−ＧＣＧＡＧＣＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＣＧＣ−３’−ＤＡＢＣＹＬ（配列番号２）。非蛍光発色団であるＤＡＢＣＹＬは、ＭＢ中のあらゆるフルオロフォアの汎用クエンチャーとしての機能を果たす。
【００７４】
別の実施形態では、ＭＢは、非ステム−ループ構造を有する。ＭＢの各端に相互に相補的であるヌクレオチドは存在せず、したがって、ステム−ループ構造は形成されない。一実施形態では、ライブラリのＭＢは、ステム−ループ構造を形成しない。
【００７５】
一実施形態では、ＭＢは、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ＭＢは、検出可能な標識および検出可能な標識ブロッカーを有するオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
一実施形態では、ＭＢは、それらが適切な温度およびイオン強度の条件下（例えば、ステム−ループ構造のＴｍを下回る）の溶液中で遊離であるとき、蛍光を発しない。ＭＢがＭＢプローブまたはループ領域に相補的である核酸とハイブリッド形成されるとき、ＭＢは、それらが明るく蛍光を発することができる立体構造変化を受ける。相補的核酸の不在下では、ステムは、フルオロフォアおよびクエンチャーが過渡的に電子を共有し、フルオロフォアが蛍光を発する能力を排除する蛍光クエンチャーに非常に近くにフルオロフォアを配置するため、プローブは、暗い。プローブが適切な相補的核酸分子に衝突するとき、ステムハイブリッドより長く、かつ安定したプローブ−標的ハイブリッドを形成する。プローブ−標的ハイブリッドの強剛性および長さは、ステムハイブリッドの同時現存を不可能にする。その結果として、ＭＢは、ステムハイブリッドを分離させ、フルオロフォアおよびクエンチャーを相互から離れさせる自発的な立体構造の再構築を受け、それによって、適切な光源を用いた励起により、フルオロフォアに蛍光を発することを可能にする。
【００７７】
一実施形態では、ＭＢの全オリゴヌクレオチドが、標的核酸に相補的である。ＤＮＡナノ細孔解離方法において、標的核酸は、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される、特異的核酸配列またはポリマーであるだろう。
【００７８】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’および５’親和性アームは、標的核酸の不在下で、相互に相補的である。標的核酸の存在下では、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’および５’親和性アームは、標的核酸に相補的である。本明細書に記載されるライブラリのＭＢの標的核酸は、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される、核酸配列またはポリマーである。標的核酸配列の不在下では、ＭＢの３’および５’親和性アームは、アニールされ、ＭＢステム−ループ構造のステムを形成する。
【００７９】
一部の実施形態では、ＭＢの全オリゴヌクレオチドは、４〜６０ヌクレオチドを有する配列である。他の実施形態では、ＭＢの全オリゴヌクレオチドは、８〜３２ヌクレオチドを有する配列である。例えば、ＭＢのライブラリは、全てのＭＢが８ヌクレオチドの長さのものであり得る。他の場合において、ＭＢのライブラリは、全てのＭＢが１６ヌクレオチドの長さ、３２ヌクレオチドの長さ、４５または６０ヌクレオチドの長さのものであり得る。一実施形態では、ＭＢのライブラリは、少なくとも２つのＭＢの種を含み、２つの種は、ＭＢの異なる長さのオリゴヌクレオチドを有する。例えば、２つの種しか含まないライブラリにおいて、一方の種は、８ヌクレオチドの長さであり、もう一方は、１６ヌクレオチドの長さである。
【００８０】
特定の実施形態では、「ループ」領域は、標的核酸、例えば、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される核酸配列またはポリマーと相補的にハイブリッド形成される。特定の実施形態では、「ループ」領域は、標的核酸上に４〜３２ヌクレオチドを有する配列と相補的にハイブリッド形成される。
【００８１】
特定の実施形態では、ＭＢのステムの親和性アームは、４〜２５ヌクレオチドを有する標的配列とも相補的にハイブリッド形成される。
【００８２】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、４本鎖部分を含む。Ｇ４本鎖は、水素結合されたグアニン塩基の４分子の周りに構築されるＧ豊富配列から形成される、高次ＤＮＡおよびＲＮＡ構造である。そのような４本鎖配列は、例えば、Ｂｕｒｇｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：５４０２−５４１５、Ｂｏｒｍａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，２００７，８５：１２−１７、Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ  ａｎｄ  Ｋ．Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，ＦＥＢｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９２，３０１：７９−８２、およびＣｈｅｎ  ＣＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．，２００８，８４：２７３−６等に記載されるように、当該技術分野において周知である。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、当業者は、４本鎖を設計し、それをライブラリのＭＢの中に組み込むことができる。一実施形態では、４本鎖部分は、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される標的核酸配列またはポリマーと相補的にハイブリッド形成されない。一実施形態では、４本鎖部分は、大きい修飾基としての機能を果たす。一実施形態では、ＭＢの４本鎖部分は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’または５’端で見られる。一実施形態では、ＭＢの４本鎖部分は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’または５’端から２〜７ヌクレオチドに位置する。別の実施形態では、ＭＢの４本鎖部分は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’または５’端から１〜７ヌクレオチドに位置する。
【００８３】
オリゴヌクレオチドに関して、配列特異的相補的ハイブリッド形成ができる、または配列に相補的とは、オリゴヌクレオチドが、配列との水素結合により標準的なワトソン−クリックヌクレオチド塩基対合を形成することを意味し、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と塩基対を形成し、同様に、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡにおいて、チミンは、ウラシル（Ｕ）に置換される。
【００８４】
ナノ細孔解離依存配列決定の目的における特定の実施形態では、配列決定される核酸は、最初に代表的な配列に変換される。代表的な配列は、配列決定される核酸中の各単一塩基をより大きい配列に拡大するための機能である。より大きい代表的な配列は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵの各塩基について定義され、固有で、固定される、配列のブロックにより構成され、コードまたはブロック配列とも呼ばれる。例えば、配列決定される核酸中の「Ａ」は、ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号３）の伸長された１０−ｍｅｒブロック配列によって表され、「Ｔ」は、ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号４）の伸長された１０−ｍｅｒブロック配列によって表され、「Ｃ」は、ＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡ（配列番号５）の伸長された１０−ｍｅｒブロック配列によって表され、「Ｇ」は、ＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣ（配列番号６）の伸長された１０−ｍｅｒブロック配列によって表される。結果として、「ＴＧＧＣＡ」を有する核酸は、５つの１０−ｍｅｒブロック配列を有するＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣ−ＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣ−ＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号７）の代表的な配列に変換される。塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇは、この例において、４つの固有の１０−ｍｅｒブロック配列によって表されるため、これは、ユニコードまたは単一コード方式の配列変換である。塩基が一対のブロック配列によって表されるとき、バイナリコード方式の配列変換である。例えば、バイナリコードは、２つの固有のブロック配列：ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号３）およびＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号４）であり、それらは、それぞれ、コード「０」および「１」と称され得る。各塩基は、一対のブロック配列、例えば、「Ａ」は、「０，１」または「ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号８）によって表され、「Ｔ」は、「０，０」またはＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号９）によって表され、「Ｃ」は、「１，０」または「ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号１０）によって表され、「Ｇ」は、「１，１」または「ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号１１）によって表される。一対のブロック配列またはコードの連鎖配置は、重要であり、上記の例において、「０，１」は、Ａをコードし、一方で、「１，０」は、［Ｃ」をコードするため、「０，１」は、「１，０」と同じではないことを意味する。したがって、本明細書に記載されるバイナリコード方式を使用するとき、「ＧＡＴＧＧＣＡ」配列を有する核酸は、（１１）−（０１）−（００）−（１１）−（１１）−（１０）−（０１）のバイナリコード、または代表的な配列である（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）（配列番号１２）に変換される。配列決定される核酸の変換および変換のためのコード方式のより詳細な説明は、Ｓｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ（２００７）２９，Ｍｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号）およびＭｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇ（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／０３４２９６号）に見出され得る。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８５】
一実施形態では、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列は、ブロック配列を含み、ブロック配列は、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、または、Ｇで表される。
【００８６】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列のブロック配列に相補的である。
【００８７】
一実施形態では、ライブラリは、いくつかのＭＢの種を含み、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される各ブロック配列に少なくとも１つのＭＢの種が存在する。各種は、ライブラリ中の他の種と異なる別々の検出可能な標識を有する。例えば、ライブラリ中に４つのＭＢの種が存在する場合、検出可能な標識としてのフルオロフォアにおいて、４つの別々の検出可能な標識、例えば、赤、緑、青、および黄が存在する。各種は、ライブラリ中のＭＢの他の種と異なる別々のオリゴヌクレオチド配列も有する。例えば、ライブラリ中に４つのＭＢの種が存在する場合、ライブラリのＭＢに４つの別々のオリゴヌクレオチド配列、例えば、ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号３）、ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号４）、ＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡ（配列番号５）、およびＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣ（配列番号６）が存在する。
【００８８】
ユニコードまたは単一コード方式の配列変換が利用される実施形態では、ライブラリは、少なくとも４つのＭＢの種を含む。一実施形態では、ライブラリは、少なくとも２つのＭＢの種と、最大４つのＭＢの種と、を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、少なくとも２つのＭＢの種と、最大６つのＭＢの種と、を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、最大８つのＭＢの種を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、４つのＭＢの種、例えば、各種類が異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する、４つの異なる種類のＭＢを含む。
【００８９】
バイナリコード方式の配列変換が利用される実施形態では、ライブラリは、少なくとも２つのＭＢの種、例えば、１つの種類がフルオロフォアおよびコード「０」の固有の配列を有し、もう一方の種類のＭＢが、異なるフルオロフォアおよびコード「１」の固有の配列を有する、２つの異なる種類のＭＢを含む。一実施形態では、ライブラリは、２つのＭＢの種を含む。各ＭＢの種は、その特異的ブロック配列と相補的にハイブリッド形成することができるそれ自身の固有のオリゴヌクレオチド配列を有する。
【００９０】
一実施形態では、各ＭＢの種は、別々の検出可能な標識を有する。一実施形態では、各ＭＢの種は、同じ検出可能な標識ブロッカーを有する。別の実施形態では、各ＭＢの種は、同じ修飾基を有する。
【００９１】
一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのＭＢ上に少なくとも２つの別々の検出可能な標識を含み、１つの検出可能な標識のみが各ＭＢ上に存在する。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのＭＢ上に２つの別々の検出可能な標識を含み、１つの検出可能な標識のみが各ＭＢ上に存在する。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのＭＢ上に４つの別々の検出可能な標識を含み、１つの検出可能な標識のみが各ＭＢ上に存在する。例えば、本明細書に記載されるバイナリコード方式において、ライブラリは、２つのＭＢの種を有し、最初の１つのＭＢの種は、ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ（配列番号３）を有する「０」コードを補完することができる配列を有し、ライブラリの第２のＭＢの種は、ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ（配列番号４）の配列を有する「１」コードを補完することができる配列を有する。一実施形態では、２つ以上のＭＢの種が存在し、各ＭＢの種は、別々の検出可能な標識を有する。例えば、ライブラリは、２つのＭＢの種を含み、最初の１つのＭＢの種は、検出可能な基としてＡＴＴＯ６４７Ｎフルオロフォアを有し、ライブラリの第２のＭＢの種は、検出可能な基としてＡＴＴＯ４８８フルオロフォアを有する（実施例のセクションを参照）。ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＭＢおよびＡＴＴＯ４８８−ＭＢの両方とも、同じ検出可能な標識ブロッカーである、クエンチャーＢＨＱ−２を有する。加えて、ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＭＢおよびＡＴＴＯ４８８−ＭＢの両方とも、同じ修飾基であるアビジン−ビオチンを有する。
【００９２】
ナノ細孔解離依存配列決定において、複数のＭＢが、直列配置で、ｄｓポリマーを形成する配列に結合される。例えば、本明細書に記載されるバイナリコード方式を使用することにより、（１１）−（０１）−（００）−（１１）−（１１）−（１０）−（０１）のバイナリコードを有する配列、または代表的な配列（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）−（ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ−ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ）−（ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−ＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡ）（配列番号１２）は、ｄｓポリマーを形成するために、直列配置で配列と相補的にハイブリッド形成される１４のＭＢを有する。ＭＢの直列配置は、前のＭＢの３’クエンチャーが、後続のＭＢの５’フルオロフォアの蛍光によって消光されるものである（図１を参照）。ＭＢを使用するナノ細孔解離依存配列決定のより詳細な開示は、Ｓｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ（２００７）２９および米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号に記載されており、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９３】
一実施形態では、ＭＢは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、ＭＢは、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびモルホリノ等のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ／モルホリノ）から成る群から選択される核酸を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、ＭＢは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＴＮＡ、およびモルホリノの混合物または組み合わせを含む、キメラオリゴヌクレオチドである。例としては、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラＭＢ、ＤＮＡ／ＬＮＡキメラＭＢ、およびＲＮＡ／ＰＮＡキメラＭＢを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、４〜６０のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、７〜３２のヌクレオチド、４〜２５のヌクレオチド、４〜１６のヌクレオチド、４〜３２のヌクレオチド、７〜１６のヌクレオチド、または７〜２５のヌクレオチドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８〜１６のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７、８、１６、または３２のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ライブラリ中の全てのＭＢの種は、同じ数のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを有する。別の実施形態では、ライブラリ中のＭＢの種は、いくつかのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを有する。一実施形態では、ヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ／モルホリノ）から成る群から選択される。オリゴヌクレオチドは、一般に、長さが少なくとも約６〜約２５ヌクレオチド、時折、少なくとも約１０〜約２０ヌクレオチド、頻繁に、少なくとも約１１〜約１６ヌクレオチドである。本明細書に記載される１６−ｍｅｒおよび３２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＢは、例であり、決して制限されるものではない。一部の実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオ塩基、またはモノマーのポリマーである。
【００９５】
ＧＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡと類似するポリマーであるが、その「骨格」の組成が異なる。ＧＮＡは、天然に生じることが知られていない。ＤＮＡおよびＲＮＡは、デオキシリボースおよびリボース糖骨格を有するが、ＧＮＡの骨格は、リン酸ジエステル結合によって連結される反復グリセロール単位から構成される。グリセロール分子は、ちょうど３個の炭素原子を有し、ワトソン−クリック塩基対合を可能にする。ワトソン−クリック塩基対合は、ＧＮＡの２本鎖を融解するのに高温を必要とするため、その天然の対応物であるＤＮＡおよびＲＮＡより、ＧＮＡにおいて非常により安定している。ＧＮＡの例としては、Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８（５），８２７−９により最初に調製された、２，３−ジヒドロキシプロピルヌクレオシド類似体である。他のＧＮＡポリマーおよびそれらの調製物および特性は、Ｓｅｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｄｉｅ  Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１５４：２５５−２６１、Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９５１８８２０，１２６ｐｐ．、米国特許第５８８６１７７号、Ａｃｅｖｅｄｏ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗｓ（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３７（２３）：３９３１−３９３４、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（１２）：４１７４−５に開示されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
ＴＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡと類似するポリマーであるが、その「骨格」の組成が異なる。ＴＮＡは、天然に生じることが知られていない。それぞれデオキシリボースおよびリボース糖骨格を有するＤＮＡおよびＲＮＡと違い、ＴＮＡの骨格は、リン酸ジエステル結合によって連結される反復トレオース単位から構成される。トレオース分子は、リボースより組み立てが容易である。ＴＮＡは、特異的に、ＲＮＡおよびＤＮＡと塩基対合する。Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５，１２７：２８０２−３。ＴＮＡの例は、（３’−２’）−α−ｌ−トレオース核酸である。他のＴＮＡは、Ｏｒｇｅｌ，Ｌｅｓｌｉｅ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０（５４９５）：１３０６−１３０７、Ｗａｔｔ，Ｇｒｅｇｏｒｙ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、およびＳｃｈｏｎｉｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１３４７によって説明されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９７】
ＰＮＡは、１９９１年に、Ｐｅｔｅｒ  Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎと共同研究者（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７）によって発明された、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似する人工の合成ポリマーである。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結される反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成される。様々なプリンおよびピリミジン塩基が、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。ＰＮＡは、ペプチドのように示され、Ｎ末端が最初（左）の位置で、Ｃ末端が右である。したがって、ＰＮＡは、偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ模倣物である。ＰＮＡは、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の非常に良好な構造模倣物である。ＰＮＡの骨格は、荷電リン酸基を含有しないため、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は、静電気反発の欠如によりＤＮＡ／ＤＮＡ鎖間より強い。ＰＮＡオリゴマーは、ワトソン−クリック相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＰＮＡ）オリゴマーと非常に安定した２本鎖構造を形成することができ、それらは、らせん体侵入により２本鎖ＤＮＡ中の標的と結合することもできる。（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５，５６６−５６８、Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，３６８，５６１−５６３を参照。）これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９８】
ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を結合する余分な架橋で修飾される。架橋は、リボースを３’エンド（北）立体構造に「固定」し、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡのＡ形態に見られることが多い。ＬＮＡヌクレオチドは、所望される場合、いつでもオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合され得る。固定されたリボース立体構造は、塩基積重ね、および骨格の前組織化を強化する。これは、オリゴヌクレオチドの熱安定性（融解温度）を大幅に増加する（Ｋａｕｒ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５  （２３）：７３４７−５５）。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに基づく、ＤＮＡマイクロアレイ、ＦＩＳＨプローブ、リアルタイムＰＣＲプローブ、および他の分子生物学技法における発現の感度および特異性を増加するために使用されてきた。ＬＮＡの合成およびそれらのハイブリッド形成特性は、Ａｌｅｘｅｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ５４（１４）：３６０７−３０、Ｙｏｕ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４（８）：ｅ６０によって説明されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
モルホリノは、標準的な核酸塩基対合により相補的配列とハイブリッド形成することができる合成分子である。モルホリノは、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合され、リン酸の代わりにホスホロジアミデート基を通して連結されるヌクレオチド塩基を有する。アニオンリン酸の非荷電ホスホロジアミデート基との置換は、通常の生理的ｐＨ範囲でのイオン化を排除し、そのため、モルホリノは、一般に非荷電分子である。モルホリノの全骨格は、これらの修飾されたサブユニットから作製される。モルホリノは、１本鎖オリゴヌクレオチドとして最も一般的に使用されるが、モルホリノ鎖および相補的ＤＮＡ鎖のヘテロ２本鎖が、カチオン性細胞基質送達試薬と組み合わせて使用され得る。
【０１００】
モルホリノはまた、細菌またはウイルス等の病原生物を標的とする薬学的治療薬として、および遺伝的疾患の寛解のために、開発中である。例えば、アンチセンス技術における、遺伝子発現の抑制である（Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｊｏｎ（２００７）．“Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｕｎｉｔ  ４．３０）”  ｉｎ  Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓｅｒｇｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ。この参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その完全に非天然骨格のため、モルホリノは、細胞タンパク質によって認識されない。ヌクレアーゼは、モルホリノを分解せず、またそれらは、血清また細胞中にも分解されない。モルホリノは、ｔｏｌｌ様受容体を活性化せず、そのため、それらは、インターフェロン誘発またはＮＦ−κΒ媒介炎症応答等の先天性免疫応答を活性化しない。モルホリノがＤＮＡのメチル化を修飾することは知られていない。
【０１０１】
一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのＭＢは、ガラススライドまたはミクロビーズ等の固相担体に結合されない。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのＭＢは、溶液中で遊離である。別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのＭＢは、溶液中で遊離であるとき、検出可能な標識基ブロッカーが、ＭＢをアニールするために、標的核酸の不在下で、検出可能な基がシグナルを発することを遮断できるようにする「ループーステム」立体構造を取る。別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのＭＢは、溶液中で遊離であるとき、検出可能な標識基ブロッカーが、ＭＢをアニールするために、標的核酸の不在下で、検出可能な基がシグナルを発することを遮断できるようにする立体構造を取る。また別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのＭＢは、溶液中で遊離であるとき、「ループ−ステム」立体構造を取らない。一実施形態では、ＭＢは、それらが適切な温度およびイオン強度の条件下（例えば、ステム−ループ構造のＴｍを下回る）の溶液中で遊離であるとき、蛍光を発しない。
【０１０２】
一実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの一端上に位置し、かつライブラリ中のＭＢの全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、検出可能な標識がブロッカーによって阻害されないとき、検出可能な標識は、検出および／または測定され得るシグナルを発する。一実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、ライブラリ中のＭＢの全てのオリゴヌクレオチドの５’端に位置する。別の実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、ライブラリ中のＭＢの全てのオリゴヌクレオチドの３’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの１つのアームの端、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結される。
【０１０３】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、ＭＢの、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない。
【０１０４】
一実施形態では、検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される。検出可能な基のシグナルに関して、本明細書で使用される「光学的に検出される」とは、検出可能な基によって発せられた光エネルギーの測定値を指す。一実施形態では、光エネルギーは、３８０〜７６０ｎｍの範囲の波長を有する。別の実施形態では、発せられる光エネルギーは、７００ｎｍ〜１４００ｎｍの範囲の波長を有する。別の実施形態では、検出可能な基のシグナルは、光学的に検出されない。
【０１０５】
一実施形態では、検出可能な基は、フルオロフォアであり、シグナルは、蛍光である。ＭＢは、広範なフルオロフォアを利用することによって、多くの異なる色で作製され得る（Ｔｙａｇｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９８；１６：４９−５３）。ＭＢと一緒に使用するためのフルオロフォアの例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ａｔｔｏ３９０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ａｔｔｏ４２５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｔｔｏ４６５、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＤＹ−４７５ＸＬ、ＦＡＭ（登録商標）４９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤＹ−４９５−０５、Ａｔｔｏ  ４９５、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、ＤＹ−４８０ＸＬ５００、Ａｔｔｏ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＤＹ−５０５−０５、ＤＹ−５００ＸＬ、ＤＹ−５１０ＸＬ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、ＪＯＥ  ５２０（登録商標）ＴＥＴ．ＴＭ．５２１、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０、ＤＹ−５２１ＸＬ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）５２６、Ａｔｔｏ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＨＥＸ  ５３５、ＶＩＣ  ５３８、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＤＹ−５３０、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｃｙ３（商標）５５０、ＮＥＤ．ＴＭ．、ＤＹ−５５０、Ａｔｔｏ５５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＤＹ−５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＢＭＮ（商標）−３、ＤＹ−５４７、ＰＥＴ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ａｔｔｏ５６５、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ＲＥＤ５９０、ＲＯＸ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６１０、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、ＤＹ−６００ＸＬ、ＤＹ−６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６３５（登録商標）、Ａｔｔｏ６２０、ＤＹ−６１５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３１、ＬＩＺ６３８、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、ＢＭＮ（商標）−５、Ｑｕａｓａｒ６７０、ＤＹ−６３５、Ｃｙ５（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＣＥＱ８０００  Ｄ４、ＬＣ  Ｒｅｄ６７０、ＤＹ−６４７  ６５２、ＤＹ−６５１、Ａｔｔｏ６５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、Ｃｙ５．５（商標）６７５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、ＬＣ  Ｒｅｄ７０５、ＢＭＮ（商標）−６、ＣＥＱ８０００  Ｄ３、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ６８９、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＣＥＱ８０００Ｄ２、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７８０、ＤＹ−７７６、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＤＹ−７８２、およびＤＹ−７８１、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）５５６、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６４５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ４、ＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ３、ＷｅｌｌＲＥＤ  Ｄ２  Ｄｙｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（商標）、フルオレセイン、ＭＡＸ  ５５０  ５３１  ５６０  ＪＯＥ  ＮＨＳエステル（Ｖｉｃ様）、ＴＹＥ（登録商標）５６３、ＴＥＸ  ６１５、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ７０５、ＯＤＩＰＹ４９３／５０３（商標）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（商標）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（商標）、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９（商標）、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１（商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ（商標）、ＢＯＤＩＰＹ−５３０／５５０（商標）、ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（商標）、カルボキシナフトフルオレセイン、ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、７−メトキシクマリン、６−ＪＯＥ、７−アミノクマリン−Ｘ、ならびに２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセインシアニン染料が挙げられるがこれらに限定されず、チアゾールオレンジ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミンｘ（ＲＯＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（登録商標）、およびＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能なフルオロフォアである。
【０１０６】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、フルオロフォアのクエンチャーである。ＭＢと一緒に使用するためのフルオロフォアのクエンチャーの例としては、３’ＩＯＷＡ  ＢＬＡＣＫ（商標）ＦＱ、３’ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）−１、および３’Ｄａｂｃｙｌ、ＢＨＱ−１（登録商標）、ＢＨＱ−２（登録商標）、ＢＢＱ−６５０、ＤＤＱ−１、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ（商標）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ（商標）、ＱＳＹ−２１（登録商標）、ＱＳＹ−３５（登録商標）、ＱＳＹ−７（登録商標）、ＱＳＹ−９（登録商標）、ＱＸＬ（商標）４９０、ＱＸＬ（商標）５７０、ＱＸＬ（商標）６１０、ＱＸＬ（商標）６７０、ＱＸＬ（商標）６８０、ＤＮＰ、ならびにＥＤＡＮＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
多くのクエンチャー−フルオロフォアの組み合わせが存在し、それぞれ固有の色または蛍光発光プロファイルを生成する（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇのウェブサイトおよびそこに引用される参考文献を参照）。当業者は、個別のフルオロフォアおよびクエンチャーが、それぞれ、特定の波長または波長の範囲で光学的に活性であることを認識する。したがって、当業者は、フルオロフォアの最適な励起および発光スペクトルがクエンチャーの効率的な範囲に一致するように、フルオロフォアおよびクエンチャー対を選択することが分かっている。想定されるクエンチャー−フルオロフォア対の例は、３’−ダブシルを伴う６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、またはＴＥＴ、３’−ダブシルを伴う５’−クマリンまたはエオシン、３’−ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）を伴う５’−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄまたはテトラメチルローダミン、およびＥＤＡＮＳおよび３’−ＤＡＢＣＹＬである。
【０１０８】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーおよび検出可能な標識の両方とも、ＭＢのオリゴヌクレオチドの同じ端、すなわち、両方ともＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端、または両方ともその５’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識のすぐ隣に位置しない。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーおよび検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチド上で少なくとも３ヌクレオチドもしくはモノマー、ＭＢのオリゴヌクレオチド上で、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチドもしくはモノマーによって分離される。
【０１０９】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの一端に位置し、一方、検出可能な標識は、ＭＢのオリゴヌクレオチドのもう一端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの１つのアーム、好ましくは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結される。別の実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結される。
【０１１０】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識の対向する端に位置する。例えば、検出可能な標識ブロッカーがＭＢのオリゴヌクレオチドの５’端に位置する場合、検出可能な標識は、同じＭＢのオリゴヌクレオチド上の３’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの１つのアームの端に共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドのもう一方のアームの端に共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、フルオロフォアは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの１つのアームの端に共有結合的に連結され、蛍光クエンチャーは、同じオリゴヌクレオチドのもう一方のアームの端に共有結合的に連結される。好ましい一実施形態では、蛍光クエンチャーは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームに共有結合的に連結され、フルオロフォアは、同じオリゴヌクレオチドの５’アームに共有結合的に連結される。別の好ましい実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’アームは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端を指し、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’アームは、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’端を指す。
【０１１１】
特定の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、共有結合連結によって、ＭＢのオリゴヌクレオチドに結合される。一実施形態では、共有結合連結は、スペーサー、好ましくは直鎖状アルキルスペーサーを含む。「結合」とは、少なくとも２つの分子の共有結合連結を意味する。スペーサーの性質は、重要ではない。例えば、ＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ等の蛍光クエンチャーは、当該技術分野において周知であり、一般的に使用される６炭素長アルキルスペーサーを介して連結され得る。アルキルスペーサーは、検出可能な標識および検出可能な標識ブロッカーに、効率的な蛍光共鳴エネルギー転移、したがって、効率的な消光のために相互に相互作用するのに十分な柔軟性を与える。適切なスペーサーの化学成分は、当業者に理解される。炭素鎖スペーサーの長さは、かなり変動することができ、例えば、少なくとも１〜最大１５炭素、または３０炭素長アルキルスペーサーである。
【０１１２】
一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、修飾基でもある。そのような修飾基の非限定的な例は、金である。金ナノ粒子は、フルオロフォアを消光することが示されており、例えば、Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，３９５：３６６−３７２、Ｄｕｌｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００５，５：５８５−５８９、Ｍａｙｉｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００９，９：４５５８−４５６３、Ｄｕｌｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，８９：２０３００２、Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，２００３，１００：６２９７−６３０１に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
修飾基の主な機能は、ＭＢのオリゴヌクレオチドに大きさを付加することであり、そうすることにより、複数のＭＢが、ｄｓ核酸を形成するために１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列とハイブリッド形成されるときに形成されるｄｓ核酸に大きさを付加する。ｄｓ核酸上の付加された大きさは、（１）ｄｓ核酸が２．２ｎｍより大きい直径開口部を有する細孔を通過するのを阻止する、（２）ナノ細孔解離依存核酸配列決定のためのより大きい細孔径のナノ細孔の使用を容易にする、および（３）ナノ細孔解離依存核酸配列決定中、１本鎖核酸上でハイブリッド形成される複数のＭＢの解離に役立つ働きをする。解離は、順次プロセスである。１本の鎖がナノ細孔１２０通って転位するときに、ｄｓ核酸が解離プロセスを受けることが、図９に示される。Ｄ１（１０１）の細孔幅を有するナノ細孔１２０を通って転位する１本鎖核酸１０９は、配列決定される核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列である。配列決定される核酸は、このナノ細孔解離ＤＮＡ配列決定法で使用するために、１本鎖１０９の代表的な定義された配列に変換されている。ｄｓ核酸は、１本鎖配列１０９と、その上に相補的にハイブリッド形成された複数のＭＢ１１１と、を含む。各ＭＢは、末端フルオロフォア１０５およびフルオロフォアクエンチャー１０７を伴うオリゴヌクレオチド１１７と、修飾基１０３と、を含む。図９に示されるＭＢは、別個および別々のブロッカーならびに修飾基を有する。図９に示される、大きい修飾基を含まないｄｓ核酸の幅は、Ｄ２（１１３）である。Ｄ１がＤ２より大きいとき、大きい修飾基を含まないｄｓ核酸は、Ｄ１幅のナノ細孔を通って転位することができる。修飾基１０３の存在は、大きい修飾基を有するｄｓ核酸の幅を、Ｄ１（１０１）より大きいＤ３（１１５）に増加する。ナノ細孔１２０への入口で、修飾基を有するＭＢ１１１は、ＭＢ１１１と１本鎖核酸１０９との間の親和性が、ＭＢ１１１に対する修飾基１０３の親和性よりも弱いため、１本鎖核酸１０９から「落とされる」。
【０１１４】
ＭＢ  １１１の１本鎖核酸１０９との相補的ハイブリッド形成は、ＭＢ上のヌクレオ塩基と１本鎖核酸との間の弱い非共有水素結合による。一部の実施形態では、修飾基１０３は、ＭＢ１１１に共有結合的に連結される。共有結合は、水素結合より強いため、ｄｓ核酸が電界にある間にナノ細孔を転位しようとするとき、より弱い水素結合が壊れ、ＭＢ１１１がｄｓ核酸から解放される。他の実施形態では、修飾基１０３は、ＭＢ１１１に非共有結合的に連結されるが、この非共有結合連結は、水素結合より強い。水素結合より強い非共有結合連結は、イオン性相互作用および疎水性相互作用である。そのような非共有結合連結の例は、当該技術分野において周知であるアビジン−ビオチン連結のものであるが、これに限定されない。アビジンの解離定数は、Ｋｄ≒１０−１５Ｍであると測定され、最も強い公知の非共有結合のうちの１つである。一実施形態では、ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドの結合親和性より低く、そのため、ｄｓ核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない。一実施形態では、ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の水素結合は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間のイオン性および／または疎水性相互作用より弱い。
【０１１５】
一実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。別の実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドに非共有結合的に連結される。
【０１１６】
一実施形態では、修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択されるが、これらに限定されない。以下は、本明細書において想定される修飾基の種類の非限定的な例である。ＭＢに連結されたときに、ＭＢに大きさを付加することができるが、相補的塩基対合に干渉しないあらゆる分子が修飾基として使用され得ることが想定される。
【０１１７】
ナノスケール粒子：１０００ｎｍを下回るあらゆる粒径、例えば、ＴｉＯ２、金、銀、またはラテックスビーズ、フラーレン（ｂｕｃｋｙｂａｌｌ）、リポソーム、シリカ−金ナノシェル、および量子ドット。例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ、ＰＲＯＭＥＧＡのＭＡＧＮＥＳＰＨＥＲＥ、およびＢＩＯＣＬＯＮＥの磁気ビーズ等の、きわめて多様なナノ粒子が市販されている。ポリスチレンラテックスナノビーズのＤＮＡへの結合が、ＨｕａｎｇらによってＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６，２３７：１１５−１２２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
タンパク質分子：ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｚｎフィンガータンパク質およびヒストン、ｔａｔペプチド、核移行シグナル（ＮＬＳ）ペプチド、ストレプトアビジン、アビジン、ならびにアビジンの様々な修飾形態、例えば、ニュートラアビジン。ＤＮＡ結合タンパク質は、自然にＤＮＡに結合する。一実施形態では、１〜２０ｎｍの範囲のタンパク質粒径が使用され得る。４〜２０ｎｍの範囲の他のタンパク質粒径は、アミド結合形成を通してタンパク質に共有結合的に連結され得、これは、Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｌ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，７２：１９７９−１９８６、Ｐａｇｒａｔｉｓ，Ｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６，２４：３６４５−３６４６、Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．  ｅｌ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９，２７：４５５３−４５６１、Ｓｔａｈｌ，Ｓ．ｅｌ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８８，１６：３０２５−３０３８、Ｓｕｎ，Ｈ．ｅｌ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２００９，２４：１４０５−１４１０に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
有機金属粒子：ジメトキシトリチルヌクレオシドホスホラミダイトカップリングによって結合され得るフェロセン（０．５  ｎｍ）、Ｉｈａｒａ，ＴらによってＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６，２４：４２７３−４２８０、およびＮａｖａｒｒｏ，Ａ．−Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２００４，１４：２４３９−２４４１に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
金属粒子：金および銀で被覆された金（サイズは１．４〜１００ｎｍの範囲である）、および銀（２５〜３０ｎｍ）。これらは、環式ジスルフィド、ジスルフィド、チオール（スルフヒドリル）、およびアミン官能基を介して、ならびにビオチンによって、ＭＢオリゴヌクレオチドに結合され得る。これらの方法は、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．ｅｌ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：６０７−６０９、Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ａ．ｅｌ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：６０９−６１１、Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０：２６７４−１２６７５、Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｌ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８９：１７５７−１７６０、Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３：５１６４−５１６５、Ｓｅｇｏｎｄ  ｖｏｎ  Ｂａｎｃｈｅｔ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｈｅｐｐｅｌｍａｎ，Ｂ．：Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，４３，８２１（１９９５））、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ  ｅｌ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，１１：２８９−２９１、Ｔｏｋａｒｅｖａ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈｕｔｔｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１５７８４−１５７８９、Ｌｅｅ，Ｊ．−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００７，７：２１１２−２１１５、Ｓｕｎ，Ｈ．ｅｌ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２００９，２４：１４０５−１４１０により詳細に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
半導体粒子：量子ドットおよびＺｎＳ。例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）を通して、様々な半導体種類のナノ粒子が市販されている。一実施形態では、１５〜２０ｎｍの範囲のサイズを有する半導体粒子が使用され得る。これらの粒子は、ビオチン、金属−チオール相互作用、グリコシド結合、静電的相互作用、または粒子のシステインキャッピングを介してＭＢオリゴヌクレオチドに連結され得る。本方法は、Ｗｕ，Ｓ．−Ｍ．ｅｌ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２００６，７：１０６２−１０６７、Ｘｉａｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｂａｒｋｅｒ，Ｐ．Ｅ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４，３２：ｅ２８、Ｙｕ，Ｗ．Ｗ．ｅｌ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２００６，３４８：７８１−７８６、Ａｒｔｅｍｙｅｖ，Ｍ．ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１０５９４−１０５９７、Ｌｉ，Ｙ．ｅｌ  ａｌ．，Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ２００４，６０：１７１９−１７２４によって説明されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
一実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの５’端または３’端に位置する。別の実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端または５’端のいずれかから２〜７ヌクレオチド内に位置する。修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの３’端または５’端のいずれかから第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、または第７ヌクレオチドに位置し得る。一実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドの骨格に連結される。核酸の基本構造および構成要素は、当該技術分野において公知である。核酸は、骨格およびヌクレオ塩基から構成されるポリマーであり、骨格は、代替糖およびリン酸または、モルホリノを含む。別の実施形態では、修飾基は、ＭＢのオリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基に連結される。一部の実施形態では、修飾基は、炭素リンカーによって、ＭＢのオリゴヌクレオチドに連結される。一部の実施形態では、炭素リンカーは、１〜３０炭素（アルキル）残基を有する。
【０１２３】
一実施形態では、修飾基は、修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点（Ｄ３）で、ｄｓ核酸の幅を２．０ナノメートル（ｎｍ）超に増加させ、ｄｓ核酸が、ＭＢの、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される。一実施形態では、修飾基は、幅Ｄ３を２．２ｎｍ超に増加する。さらなる実施形態では、修飾基は、幅Ｄ３を３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５，８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６，６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０ｎｍ超に増加する。
【０１２４】
一実施形態では、修飾基のＭＢのオリゴヌクレオチドへの結合点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、約３〜７ｎｍである。一実施形態では、幅Ｄ３は、約３〜７ｎｍである。一実施形態では、修飾基の１本鎖核酸への結合点でのｄｓ核酸の幅は、サイドリンカー、例えば、Ｃ２０、Ｃ１５、Ｃ１２、Ｃ９、Ｃ８、Ｃ６、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、およびＣ２リンカーによってさらに増加され得る。
【０１２５】
一実施形態では、ＭＢのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、３〜５ｎｍである。一実施形態では、修飾基は、０．５ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、９０〜９４４ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、４〜２０ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、１．４〜１００ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、２５〜３０ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、１５〜２０ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、１５〜３０ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、１５０〜３００ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、９〜５０ｎｍの範囲である。一実施形態では、修飾基は、１０〜１００ｎｍの範囲である。他の実施形態では、修飾基は、３〜１０００ｎｍ、３〜９４４ｎｍ、３〜３０ｎｍ、３〜１００ｎｍ、３〜２５ｎｍ、３〜５０ｎｍ、３〜３００ｎｍ、３〜９０ｎｍ、３〜１５ｎｍ、３〜９ｎｍ、および３〜４ｎｍの範囲であり、３〜１０００ｎｍの小数点以下２桁までの全ての数字を含む。
【０１２６】
一実施形態では、修飾基は、ｄｓ核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、ｄｓ核酸の解離を容易にする。
【０１２７】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔径は、配列決定される１本鎖核酸に細孔を通過させるが、ｄｓ核酸に細孔を通過させず、ｄｓ核酸は、本明細書に記載されるＭＢの、１本鎖核酸またはＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、もしくはＵを代表とする定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される。
【０１２８】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔の開口部は、２ｎｍより大きいが、１０００ｎｍより小さい。一実施形態では、ナノ細孔の開口部は、２ｎｍより大きいが、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点では、ｄｓ核酸の幅より小さい。
【０１２９】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、細孔（Ｄ１）は、約３ｎｍ〜約６ｎｍの開口径を有する。本明細書に記載される方法のさらなる実施形態では、細孔は、約３ｎｍから、ＭＢのオリゴヌクレオチドに連結される修飾基の幅の最大７５％までの開口径を有する。本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、細孔は、約２．２ｎｍ〜１０ｎｍ、約２．２ｎｍ〜７５ｎｍ、または約２．２ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有する。さらなる実施形態では、細孔（Ｄ１）は、例えば、直径が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５，８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６，６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０ｎｍの直径を有する。
【０１３０】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、２ｎｍより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、２．２ｎｍより大きい。本明細書に記載される方法のさらなる実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、直径が約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５，８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６，６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０ｎｍより大きく、Ｄ３は、常に、Ｄ１より大きい。
【０１３１】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、約３〜５ｎｍである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がＭＢのオリゴヌクレオチドに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、約３〜６ｎｍである。他の実施形態では、Ｄ３は、約３〜７ｎｍ、３〜８ｎｍ、３〜９ｎｍ、３〜１０ｎｍ、３〜１２ｎｍ、３〜１５ｎｍ、３〜１７ｎｍ、または３〜２０ｎｍである。
【０１３２】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ３は、２ｎｍより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、Ｄ３は、２．２ｎｍより大きい。一実施形態では、Ｄ３は、約３〜７ｎｍである。
【０１３３】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ１は、２ｎｍより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、Ｄ１は、２．２ｎｍより大きい。一実施形態では、Ｄ１は、約３〜６ｎｍである。
【０１３４】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がポリマーに結合する点でのｄｓ核酸の幅（Ｄ３）は、ナノ細孔の開口部の幅（Ｄ１）より大きく、そのため、ｄｓ核酸が電位の影響下でナノ細孔開口部を通過しようとするとき、修飾基は、ｄｓ核酸上のＭＢが開口部に侵入するのを阻止し、ＭＢがｄｓ核酸から解離される。
【０１３５】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、Ｄ３は、Ｄ１より大きい。一実施形態では、Ｄ１は、Ｄ３の幅の最大７５％である。
【０１３６】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドの結合親和性より低く、そのため、ｄｓ核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない。一実施形態では、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は、非共有水素結合である。一実施形態では、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、共有結合である。一実施形態では、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は、非共有水素結合であり、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、イオン性および疎水性相互作用等の非共有結合である。
【０１３７】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ｄｓ核酸が電位の影響下で開口部を通過しようとするとき、修飾基は、ｄｓ核酸上のＭＢオリゴヌクレオチドが開口部に侵入するのを阻止し、１本鎖核酸とＭＢオリゴヌクレオチドとの間の非共有水素結合が壊れる。ＭＢオリゴヌクレオチドは１つずつ、経時的かつ時間的に分離され、ナノ細孔の入口で１本鎖核酸から解放され、１本鎖核酸はナノ細孔に侵入し、一方、分離されたＭＢは侵入しない。
【０１３８】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、配列決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１３９】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、単一細孔が利用される。別の実施形態では、複数の細孔が利用される。
【０１４０】
ＭＢの合成および外来性基のオリゴヌクレオチドとの結合の方法は、当業者に公知である。所望の官能基を伴う分子ビーコンは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して合成されるか、または購入（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）することができる。当業者は、多くのさらなる分子ビーコン配列が市販されており、さらなる分子ビーコン配列が本発明の方法に使用するために設計され得ることを認識する。効果的な分子ビーコンヌクレオチド配列を設計するための基準のより詳細な考察は、分子−ビーコン組織団体のウェブサイトおよびＭａｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）"Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ．"（Ｉｎ  Ｋｗｏｋ，Ｐ．Ｙ．（ｅｄ．），Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，Ｖｏｌ．２１２，ｐｐ．１１１−１２８）、およびＶｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）"Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．"（Ｉｎ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，Ｖｏｌ．２８８，ｐｐ．２７３−２９０）に見出すことができ、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。分子ビーコンは、Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている「Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ」と呼ばれる専用ソフトウェア等を使用することによっても設計され得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
ヌクレオシドへの組み込みに適した多くの修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基が、ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，  Ｍｄ．）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標），Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびに当業者に公知の他の多くの市販供給源を含む様々な製造業者から市販されている。塩基を糖部分に結合して、ヌクレオシドを形成する方法が知られている。例えば、Ｌｕｋｅｖｉｃｓ  ａｎｄ  Ｚａｂｌｏｃｋａ（１９９１），Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｏｒｇａｎｏｓｉｌｉｃｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄおよびその中の参考文献を参照されたい。ヌクレオシドをリン酸化してヌクレオチドを形成し、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに組み込む方法も知られている。例えば、Ａｇｒａｗａｌ（ｅｄ）（１９９３）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗｏｔａ，Ｎ．Ｊ．およびその中の参考文献を参照されたい。加えて、例えば、モルホリノ用のＧＥＮＥ  ＴＯＯＬ  ＬＬＣ、ＰＮＡおよびキメラＰＮＡ用のＢＩＯ−ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  Ｉｎｃ．、ならびにＬＮＡ用のＥＸＩＱＯＮ等の特注設計のＭＢも、市販されている。
【０１４２】
修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基は、本明細書に記載される検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基を連結するための適切なリンカーを提供する。リンカーは、ＭＢオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端、またはその内部に配置され得る。当業者は、適切なリンカーを選択し、ＭＢの合成中にそれらを組み込むことができるだろう。アミノリンカーの非限定的な例は、２’−デオキシアデノシン−８−Ｃ６アミノリンカー、２’−デオキシシチジン−５−Ｃ６アミノリンカー、２’−デオキシシチジン−５−Ｃ６アミノリンカー、２’−デオキシグアノシン−８−Ｃ６アミノリンカー、３’Ｃ３アミノリンカー、３’Ｃ６アミノリンカー、３’Ｃ７アミノリンカー、５’Ｃ１２アミノリンカー、５’Ｃ６アミノリンカー、Ｃ７内部アミノリンカー、チミジン−５−Ｃ２およびＣ６アミノリンカー、チミジン−５−Ｃ６アミノリンカーである。可逆的ジスルフィド結合、またはマレイミドを用いた安定したチオールエーテル連結のいずれかを形成するために、チオールリンカーが使用され得る。チオールリンカーの非限定的な例は、３’Ｃ３ジスルフィドリンカー、３’Ｃ６ジスルフィドリンカー、および５’Ｃ６ジスルフィドリンカーである。他のリンカーは、３’用のアルデヒドリンカー、５’端用のアルデヒドリンカー、ビオチン化ｄＴ、カルボキシｄＴ、およびＤＡＤＥリンカーを含むが、これらに限定されない。外来性基の結合のための修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基は、例えば、ＴｒｉＬＩＮＫ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから市販されている。
【０１４３】
一部の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、スペーサー、好ましくは直鎖状アルキルスペーサーを通して共有結合連結によって、ＭＢオリゴヌクレオチドに結合される。 適切なスペーサーの化学成分は、当業者に理解される。炭素鎖スペーサーの長さは、かなり変動することができ、少なくとも１〜３０炭素である。
【０１４４】
一部の実施形態では、ＭＢオリゴヌクレオチドは、それに連結される外来性基（複数可）を有する。例えば、基は、負に電荷されたリン酸骨格との静電的相互作用により、または主溝もしくは副溝での水素結合相互作用を通して２本鎖を安定化することができるヌクレオシド糖環上、またはプリン環もしくはピリジン環上の様々な位置に連結され得る。例えば、アデノシンおよびグアノシンヌクレオチドは、Ｎ２位置で、イミダゾリルプロピル基で任意に置換され、２本鎖安定性を増加する。塩基の積重ね相互作用を通して２本鎖の安定性を向上するために、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドール等の一般的な塩基類似体が、オリゴヌクレオチドプローブに含まれる。
【０１４５】
特定の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基の連結は、Ｍｂオリゴヌクレオチドおよび標識／ブロッカーもしくは修飾基上の利用可能な一級アミン（−ＮＨ２）もしくは二級アミン、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル／チオール（−ＳＨ）、一級もしくは二級ヒドロキシル基、およびカルボニル（−ＣＨＯ）官能基により生じる。当業者は、本明細書に記載される利用可能な官能基を認識するか、または結合の目的で、所望の官能基を用いて、ＭＢオリゴヌクレオチドまたは標識／ブロッカーもしくは修飾基を設計し、合成することができるだろう。例えば、ペプチドが化学的架橋のための利用可能な反応性チオール基を含有しない場合において、内在性ジスルフィドの還元ならびにアミンまたはカルボン酸基のチオール基への変換を含むがこれらに限定されない、チオール基のタンパク質およびペプチドへの導入のためのいくつかの方法が利用可能である。そのような方法は、当業者に公知であり、その目的のために、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）Ｉｎｃ．の分子プローブ部門およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ等からの多くの市販のキットが存在する。一実施形態では、結合は、ＭＢオリゴヌクレオチド上のアミノリンカー上のタンパク質のカルボキシル基とアミン基との間で生じることができる。アミノリンカーは、ＭＢオリゴヌクレオチドの３’、５’、または内部に位置することができる。
【０１４６】
化学架橋剤を使用したいくつかの分子の結合が当該技術分野におい周知である。架橋試薬は、市販されているか、または容易に合成することができる。当業者は、例えば、結合に利用可能であるタンパク質中のシステインアミノ酸残基間のジスルフィド結合等の、官能基に基づき適切な架橋剤を選択することができる。制限するものと解釈されるべきではないが、架橋剤の例は、グルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネート、および塩化二酸である。化学架橋剤の広範なデータは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ’ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅのセクション５．２に見出すことができる。
【０１４７】
図１１Ａ〜Ｃは、ペプチドを分子ビーコンに連結するための３つの異なる結合戦略の例である。結合戦略は、選択されたあらゆる修飾基に適用することができる。図１１Ａは、分子ビーコンが炭素−１２スペーサーを通してビオチン−ｄＴをステムのクエンチャーアームに導入することにより修飾される、ストレプトアビジン−ビオチン連結を示す。ビオチン修飾されたペプチドは、４つのビオチン結合部位を有するストレプトアビジン分子を通して、修飾された分子ビーコンに連結される。選択されたビオチン−ｄＴは、０個の炭素から最大１８個の炭素まで、様々な長さのスペーサーを有することができる。
【０１４８】
図１１Ｂは、分子ビーコンステムのクエンチャーアームが、直接的な安定した連結を形成するように、ペプチドのＣ末端に配置されるマレイミド基と反応できるチオール基を加えることにより修飾される、チオール−マレイミド連結を示す。図１１Ｃは、ペプチドが、チオール修飾された分子ビーコンとジスルフィド架橋を形成するＣ末端で、システイン残基を加えることにより修飾される、切断可能なジスルフィド架橋を示す。チオール−ｄＴは、チオール基をオリゴヌクレオチドに加える最も一般的な方法である。チオール−ｄＴは、０個の炭素から最大１８個の炭素まで、様々な長さのスペーサーを有することができる。
【０１４９】
一実施形態では、修飾基は、ＭＢオリゴヌクレオチドの検出可能な標識アームに連結される。一実施形態では、修飾基は、ＭＢオリゴヌクレオチドのフルオロフォアアームに連結される。一実施形態では、修飾基は、ＭＢオリゴヌクレオチドの検出可能な標識ブロッカーアームに連結される。一実施形態では、修飾基は、ＭＢオリゴヌクレオチドのフルオロフォアクエンチャーアームに連結される。
【０１５０】
一実施形態では、検出可能な基によって発せられるシグナルは蛍光である。蛍光を検出し、測定する方法は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，１９１，８５２号および米国特許出願公開第２００９００５６９４９号に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
合成または天然のナノ細孔を含むナノ細孔デバイスは、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。例えば、Ｈｅｎｇ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６，９０，１０９８−１１０６、Ｆｏｌｏｇｅａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２００５  ５（１０），１９０５−１９０９、Ｈｅｎｇ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００５  ５（１０），１８８３−１８８８、Ｆｏｌｏｇｅａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００５  ５（９），１７３４−１７３７、Ｂｏｋｈａｒｉ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００５  ２１（７），８８９−８９６、Ｍａｔｈｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００４  ８７，３２０５−３２１２、Ａｋｓｉｍｅｎｔｉｅｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００４  ８７，２０８６−２０９７、Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１（３７），１３４７２−１３４７７、Ｓａｕｅｒ−Ｂｕｄｇｅ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００３  ９０（２３），２３８１０１−１−２３８１０１−４、Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３  ３１（４），１３１１−１３１８、Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００２  ２３，２５８３−２５９１を参照されたい。ナノ細孔およびそれらを利用する方法は、米国特許第７，００５，２６４  Ｂ２号および第６，６１７，１１３号、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号および第２００９０２９８０７２号、ならびにＳｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００７，５３：１１に開示されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
本発明は、以下のアルファベット順のパラグラフのいずれかにおいて定義され得る。
［Ａ］核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリであって、本ライブラリは、各ＭＢが、（１）検出可能な標識、（２）検出可能な標識ブロッカー、および３）修飾基を含むオリゴヌクレオチドを含む、複数のＭＢを含み、ＭＢは、２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するための１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列と配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である。
［Ｂ］オリゴヌクレオチドは、４〜６０のヌクレオチドを含む、パラグラフ［Ａ］に記載のライブラリ。
［Ｃ］ＭＢのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯまたはモルホリノ）から成る群から選択される核酸を含む、パラグラフ［Ａ］または［Ｂ］に記載のライブラリ。
［Ｄ］検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドの一端上で結合され、かつライブラリ中の全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、検出可能な標識がブロッカーによって阻害されないとき、検出可能な標識は、検出および／または測定され得るシグナルを発する、パラグラフ［Ａ］〜［Ｃ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｅ］ＭＢは、固相担体に結合されない、パラグラフ［Ａ］〜［Ｄ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｆ］オリゴヌクレオチド上の検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、ＭＢの、１本鎖核酸中のＡ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない、パラグラフ［Ａ］〜［Ｅ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｇ］検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される、パラグラフ［Ａ］〜［Ｆ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｈ］  検出可能な基は、フルオロフォアであり、シグナルは、蛍光である、パラグラフ［Ａ］〜［Ｇ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｉ］  検出可能な標識ブロッカーは、フルオロフォアのクエンチャーである、請求項［Ａ］〜［Ｈ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｊ］  検出可能な標識ブロッカーは、修飾基でもある、パラグラフ［Ａ］〜［Ｉ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｋ］  修飾基は、オリゴヌクレオチドの５’端または３’端に位置する、パラグラフ［Ａ］〜［Ｊ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｌ］  修飾基は、修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点で、ｄｓ核酸の幅を２．０ナノメートル（ｎｍ）超に増加させ、ｄｓ核酸が、ＭＢの、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される、パラグラフ［Ａ］〜［Ｋ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｍ］修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点での、ｄｓ核酸の幅は、約３〜７ｎｍである、パラグラフ［Ｌ］に記載のライブラリ。
［Ｎ］修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択される、請求項［Ａ］〜［Ｍ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｏ］修飾基は、３〜５ｎｍである、パラグラフ［Ａ］〜［Ｎ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｐ］修飾基は、ｄｓ核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、ｄｓ核酸の解離を容易にする、パラグラフ［Ａ］〜［Ｏ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｑ］ＭＢの２つ以上の種が存在し、ＭＢの各種は、独特の検出可能な標識を有する、パラグラフ［Ａ］〜［Ｐ］のいずれかに記載のライブラリ。
［Ｒ］核酸のナノ細孔解離依存配列決定のために２本鎖（ｄｓ）核酸を解離する方法であって、
ａ．請求項［Ａ］〜［Ｑ］の分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成することと、
ｂ．ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３がＤ１より大きい、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、
ｃ．配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成された分子ビーコンを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む、方法。
［Ｓ］ナノ細孔径は、配列決定される１本鎖核酸に細孔を通過させるが、ｄｓ核酸に細孔を通過させない、パラグラフ［Ｒ］に記載の方法。
［Ｔ］Ｄ１は、２ｎｍより大きい、パラグラフ［Ｒ］または［Ｓ］に記載の方法。
［Ｕ］Ｄ１は、３〜６ｎｍである、パラグラフ［Ｒ］〜［Ｔ］のいずれかに記載の方法。
［Ｖ］Ｄ３は、２ｎｍより大きい、パラグラフ［Ｒ］〜［Ｕ］のいずれかに記載の方法。
［Ｗ］Ｄ３は、約３〜７ｎｍである、パラグラフ［Ｒ］〜［Ｖ］のいずれかに記載の方法。
［Ｘ］ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの結合親和性より低く、そのため、ｄｓ核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、パラグラフ［Ｒ］〜［Ｗ］のいずれかに記載の方法。
［Ｙ］配列決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、パラグラフ［Ｒ］〜［Ｘ］のいずれかに記載の方法。
［Ｚ］核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ａ．請求項［Ａ］〜［Ｑ］の分子ビーコン（ＭＢ）のライブラリを、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、またはＧで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される１本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるＤ３の幅の２本鎖（ｄｓ）核酸を形成するステップと、
ｂ．ステップａ）で形成されたｄｓ核酸を、Ｄ３がＤ１より大きい、Ｄ１の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップと、
ｃ．配列決定される１本鎖核酸からハイブリッド形成されたＭＢを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、
ｄ．それが細孔で生じるときに、ＭＢがｄｓ核酸から分離する際に、各ＭＢからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、方法。
［ＡＡ］検出されたシグナルの配列を核酸のヌクレオチド塩基配列に解読することをさらに含む、パラグラフ［Ｚ］に記載の方法。
［ＢＢ］ナノ細孔径は、配列決定される１本鎖核酸に細孔を通過させるが、ｄｓ核酸に細孔を通過させない、パラグラフ［Ｚ］または［ＡＡ］に記載の方法。
［ＣＣ］Ｄ１は、２ｎｍより大きい、パラグラフ［Ｚ］〜［ＢＢ］のいずれかに記載の方法。
［ＤＤ］Ｄ１は、約３〜６ｎｍである、パラグラフ［Ｚ］〜［ＣＣ］のいずれかに記載の方法。
［ＥＥ］Ｄ３は、２ｎｍより大きい、パラグラフ［Ｚ］〜［ＤＤ］のいずれかに記載の方法。
［ＦＦ］Ｄ３は、約３〜７ｎｍである、パラグラフ［Ｚ］〜［ＥＥ］のいずれかに記載の方法。
［ＧＧ］ハイブリッド形成された１本鎖核酸とＭＢとの間の結合親和性は、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの結合親和性より低く、そのため、ｄｓ核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、１本鎖核酸とＭＢとの間の結合は壊れるが、修飾基とＭＢのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、パラグラフ［Ｚ］〜［ＦＦ］のいずれかに記載の方法。
［ＨＨ］配列決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、パラグラフ［Ｚ］〜［ＧＧ］のいずれかに記載の方法。
【０１５３】
本発明は、制限するものとは解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに図示される。本出願全体を通して引用される全ての参考文献の内容および図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５４】
ナノ細孔アレイを用いた単一分子ＤＮＡ配列決定のための個別のヌクレオ塩基の光学認識
はじめに
高処理ＤＮＡ配列決定技術は、比較ゲノム学、生物医学研究、および個別化医療に大きく影響を与えている１。特に、単一分子ＤＮＡ配列決定技法は、必要とされるＤＮＡ材料の量を最小に抑え、したがって、広範なＤＮＡ読み取りの長さを標的とする、低コストで高処理の配列決定を供給するための優れた候補であると考えられている１〜４。固体状態のナノ細孔は、ＤＮＡ構造およびＤＮＡ薬物またはＤＮＡタンパク質相互作用の特徴付けを含む、広い用途を有する単一分子プローブ技術の１クラスである５−１２。他の単一分子技法と違い、ナノ細孔を用いた検出は、表面上への巨大分子の固定化を必要とせず、よって試料の調製が単純化される。さらに、固体状態のナノ細孔は、大量の平行検出の開発を可能にする、高密度形式で製作され得る。
【０１５５】
ナノ細孔は、イオン溶液を含有する２つのチャンバを分離する超薄膜のナノメートルサイズの細孔である。膜全体に適用される外電界は、単一ファイル様式でバイオポリマーを引き込み、それに細孔を通過させる、細孔付近にイオン電流および局所電位勾配を作り出す６、１３。バイオポリマーが細孔に入ると、電解質の画分が移動し、電位計を使用して直接測定され得る細孔の伝導性の変化を引き起こす。いくつかのナノ細孔に基づくＤＮＡ配列決定法が、最近提案されており１４、主要な課題を２つ強調する：１５１）個別のヌクレオチド（ｎｔ）内で識別する能力。系は、単一分子レベルで４つの塩基を区別することが可能でなければならない。２）方法は、平行読み出しが可能でなければならない。単一のナノ細孔が１度に単一の分子しか探索できないため、多くのナノ細孔を製造し、かつそれらを同時に監視するための戦略が必要である。最近、ＤＮＡ塩基をエキソヌクレアーゼで切断した後に修飾されたα溶血素タンパク質細孔を使用して、個別のヌクレオチドが識別され得ることが示された１６。酵素活性の動態は、しかしながら、読み出しにおいて律速段階のままである。さらに、読み取り段階で酵素を伴うこの方法ならびに他の単一分子法の処理量は、分子毎に大きく変動する酵素の処理能力により制限される。今まで、いずれかのナノ細孔に基づく方法による平行読み出しは、まだ示されていない。
【０１５６】
発明者は、読み出し段階中の酵素の必要性を除去し、多重細孔検出のための簡単な方法を提供する、高処理塩基認識のための新規ナノ細孔に基づく方法を提示する。標的ＤＮＡ分子の生化学調製は、未修飾固体状態のナノ細孔を使用して、直接読み取ることができる形態に各塩基を変換する。読み出し速度および長さは、したがって、酵素限定されない。以前の発表では、ナノ細孔の生体分子を探索するために電気シグナルを利用したが、ここで、発明者は、ＤＮＡ配列を検出するために光学感知を使用する。発明者は、ナノ細孔を通した個別のＤＮＡ分子転位の高空間時間的解析広視野光学検出を可能にする、特注の全内反射（ＴＩＲ）法を開発した１７。ここで、発明者は、複数のナノ細孔からの同時光学検出を達成するために、この系を使用する。よって、発明者は、ナノ細孔に基づく単一分子配列決定法の主要な構成要素の全ての原理の検証を示す。
方法
【０１５７】
電気計測：ＬＰＣＶＤを使用して、３０ｎｍの厚さの低応力ＳｉＮで被覆された両面が研磨されたシリコンウェハから開始して、自社でナノチップを製作した。標準的な手順を使用して、ＳｉＮ窓（３０×３０μｍ２）を作製した。前述２８される集束電子ビームを使用して、ナノ細孔（直径３〜５ｎｍ）を製作した。穴をあけたナノチップを清浄し、制御された湿度および温度下で、ガラスカバースリップ底を組み込んだ特注設計のＣＴＦＥセル上に取り付けた（詳細は参考文献１７を参照）。以下に説明するトランスチャンバを通した全内反射（ＴＩＲ）撮像を容易にするために、脱気し、濾過した１ＭのＫＣ１電解質をシスチャンバに加え、８．６Ｍの尿素を含む１ＭのＫＣ１をトランスチャンバに加えることにより、ナノ細孔を水和した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用して、全ての電解質をｐＨ８．５に調節した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極をセルの各チャンバに浸漬し、膜全体に固定電圧（全ての実験において３００ｍＶ）を適用し、必要なときにイオン電流を測定するために使用される、Ａｘｏｎ２００Ｂヘッドステージに接続した。ノイズ拾得を削減するために、改良した倒立顕微鏡上に載置された特注のファラデー箱の中に液体セルを設置した。５０ｋＨｚの低域Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈフィルタを使用して、ナノ細孔の電流をフィルタにかけ、２５０ｋＨｚ／１６ビットのＤＡＱボード（ＰＣＩ−６  １５４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＴＸ）を使用してサンプリングした。前述９される特注のＬａｂ  Ｖｉｅｗプログラムを使用して、シグナルを取得した。
【０１５８】
電気／光学検出およびシグナルの同期化：懸濁されたＳｉＮ膜付近の個別のフルオロフォアの高速単一分子検出を達成するために、蛍光背景を大幅に低減する特注のＴＩＲ撮像を開発した１７。ＴＩＲがＳｉＮ膜で作製され、光がシスチャンバの中に進行するのを防止し、よってさらなる背景を低減し得るように、トランスチャンバ溶液の屈折率を調節した。高ＮＡ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ６０Ｘ／１．４５）上にセルを載置し、６４０ｎｍレーザー（２０ｍＷ，ｉＦｌｅｘ２０００，Ｐｏｉｎｔ−Ｓｏｕｒｃｅ  ＵＫ）の入射レーザービームをその背面焦点面の軸外点に集束し、それによって入射角を制御することにより、ＴＩＲを最適化した。Ｓｅｍｒｏｃｋ（ＦＦ６８５Ｄｉ０１）ダイクロイックミラーを使用して、蛍光発光を２つの別個の光路に分け、２つの像をＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ，ｉＸｏｎ  ＤＵ−８６０）上に並べて映し出した。最大利得および１ｍｓの積分時間でＥＭ−ＣＣＤを作動した。電気シグナルと光学シグナルとの間の同期は、主ＤＡＱボードと同じように、同じサンプリング・クロックおよび開始トリガを使用する、カウンタボード（ＰＣＩ−６６０２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＴＸ）にカメラの「発射」パルスを接続することにより達成された。混合されたデータストリームは、イオン電流サンプリングと同期した、各ＣＣＤフレームの最初の固有の時間スタンプを含む。各事象を分類するために、２つの別個の基準を使用した。最初に、イオン電流は、ユーザ定義閾値レベルより下に突然降下し、元の状態に戻る前に、少なくとも１００μｓの間、そのレベルに留まらなければならない。第２に、事象滞留時間中（シグナルが閾値より下に留まる時間）、対応するＣＣＤフレームは、細孔の領域でのみ、フォトン計数の増加を示さなければならない。２色強度分析は、細孔位置に中心がある３×３ピクセル領域での強度を読み取ることにより実施された（図４ａの例を参照）。２つのチャネルにおける強度の生データは、２つのビット間を区別するために使用された、Ｒ＝Ｃｈ２／Ｃｈｌの比率を計算するために使用された。区別は、較正データを使用して、特注のＬａｂ  Ｖｉｅｗコードで自動的に行われた（図４ｃ）。データ分析は、ＩＧＯＲ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して実施され、適合は、カイ二乗を最適化するために行われた。
アビジンビオチン化分子ビーコンの調製
【０１５９】
アビジン／ストレプトアビジン分子は４つの結合部位を含有するため、単一分子ビーコンのみが１つのアビジンタンパク質分子に結合することが必須であった。そのようなものとして、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中の遊離ビオチンのアビジン／ストレプトアビジンに対するモル比が３：１の３０分の前保温が、非常に適したプライミングステップとしての機能を果たしたことが分かった。その後、ビーコンのアビジン／ストレプトアビジンに対する比率が５：１であるように、ビオチン化ＤＮＡビーコンが溶液に添加された。これは、１つのビーコンのみが１つのアビジンタンパク質分子に結合することを確実にした。
結果
【０１６０】
アプローチは２つのステップを含む（図１ａ）：最初に、標的ＤＮＡ、すなわち配列決定されるＤＮＡ中の４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のそれぞれが、特定のフルオロフォアを保有する分子ビーコンとハイブリッド形成される予め定義されたオリゴヌクレオチドの配列に変換される。２色読み出し（すなわち、２種類のフルオロフォア）において、４つの配列は、Ａが「１，１」、Ｇが「１．０」、Ｔが「０，１」、および最後にＣが「０，０」であるような、２つの予め定義された固有の配列ビッド「０」およびビット「１」の組み合わせである（図１ａ、左側パネル）。２種類のフルオロフォアを保有する２種類の分子ビーコンは、「０」および「１」の配列と特異的にハイブリッド形成される。第２に、変換されたＤＮＡおよびハイブリッド形成された分子ビーコンは、ビーコンが順次剥離される固体状態の細孔に電気泳動的に通される。ビーコンが剥離されるごとに、新しいフルオロフォアは消光されず、フォトンのバーストを引き起こし、細孔の位置で記録される（図１ａ、右側パネル）。各細孔位置での一連の２色のフォトンバースト（色は、図１において異なる灰色の色相に変換されている）は、標的ＤＮＡ配列のバイナリコードである。発明者のアプローチは、ナノ細孔配列決定に直面している２つの課題に対処する：１）個別の塩基を検出するための必要性を解決し、酵素を含まない読み出しを容易にする、ならびに２）広視野撮像および空間的に固定された細孔は、電子増倍型電荷結合素子（ＥＭ−ＣＣＤ）カメラを用いた複数の細孔の同時検出への簡単な適応を可能にする（図１ｂに模式的に図示される）。
【０１６１】
図２は、環状ＤＮＡ分子が各変換サイクル中に形成されるため、環状ＤＮＡ変換（ＣＤＣ）と呼ばれるプロセスとしての標的ＤＮＡの変換を図示する。図２ａは、３つのＣＤＣステップを模式的に表し、図２ｂは、単一変換サイクルの結果を表す。原理の検証のために、４つの１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型が合成され、４つ全ての鋳型は１００−ｎｔの長さであり、それらはそれらの５’端ヌクレオチドでのみ異なる。これらの鋳型は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ上に固定するための、ビオチン部分を含有する。最初のステップにおいて、これらの鋳型は、それぞれ、２本鎖中央部分と、２つの１本鎖オーバーハングを有するＤＮＡ分子（プローブと呼ばれる）のライブラリとハイブリッド形成される。２本鎖部分は、鋳型分子の５’端ヌクレオチドと一致する予め定義されたオリゴヌクレオチドコードを含有する。３’オーバーハングが鋳型の５’端と完全に補完するそれらのプローブのみが、鋳型とハイブリッド形成することができる。プローブの５’オーバーハングは、同じ鋳型の３’端とハイブリッド形成して、環状分子を形成する。変換の第２ステップにおいて、プローブの両端を鋳型と連結するために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが使用される（２つの連結位置は、図２ａの赤いドットによって示される）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、他の酵素と比較して、その非常に高度な忠実度により、他のＤＮＡ配列決定法で使用されている１８。最後に、プローブの２本鎖部分は、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位（「Ｒ」で標識される）を含有し、鋳型の５’端ヌクレオチドの直後で切断されるようにそれを位置付ける。短時間の熱的に誘発された融解、それに続く洗浄後、新しく形成されたｓｓＤＮＡは、その３’端で、バイナリコード、続いて元の鋳型の５’端ヌクレオチドを含有する。このプロセスは、必要に応じて何度でも繰り返すことができ、対応するコードと互いにかみ合わされた鋳型の５’端から３’端にヌクレオチドを移送する。異なる鋳型分子の変換は、同期化される必要がなく、非生産的なハイブリッド形成は、連結および切断が後に続かない限り、誤差を生じない。
環状ＤＮＡ変換（ＣＤＣ）
【０１６２】
変換プロセスの目的は、ＤＮＡ鋳型中の各個別の塩基がより長い予め定義された配列によって表されることである。概念目的の検証のため、各鋳型が末端５’塩基の同一性だけ異なる、４つのＤＮＡ鋳型分子（それぞれ１００−ｍｅｒ）が合成された。これらの鋳型は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ＭＹＯＮＥ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１）上に鋳型を固定するためのビオチン部分を含有する。この固定ステップは、ＤＮＡ試料の損失を最小限にしならが、変換プロセスの異なる段階中の緩衝溶液の迅速な除去および交換を可能にする。鋳型分子は、１０分間、緩衝溶液（２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）中のビーズと最初に懸濁され、固定を生じさせる。この後に洗浄ステップが続き、固定緩衝溶液が除去される。次いで、被覆されたビーズは、本明細書においてプローブと称されるＤＮＡ分子のライブラリを含有する溶液に再懸濁される。各プローブは、図２ａに示すように、特定の塩基について予め定義されたオリゴヌクレオチドコードを含有する付着末端２本鎖分子である。３’オーバーハングが鋳型の５’端と完全に補完するそれらのプローブのみが、鋳型とハイブリッド形成することができる。ライブラリプローブは、鋳型分子の３’端がプローブの５’端オーバーハングとハイブリッド形成するのを可能にするように設計される。次いで、試料は、徐冷プロセスを通して、ライブラリプローブをそれらの相補的鋳型分子とハイブリッド形成させる。このプロセスは、ハイブリッド形成を促進するために、高食塩（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で実行される。プロセスのこの段階で、環状分子が作製された。次いで、試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝溶液で洗浄し、固定された鋳型分子とハイブリッド形成しなかったいくらかの過剰なライブラリプローブを除去する。その後、試料を連結緩衝溶液に再懸濁し、新しくハイブリッド形成された分子を一緒に連結させる。連結緩衝溶液は、Ｑｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）とを含有する。連結は、室温で５分間実行された。このステップの後、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝溶液でさらに洗浄を行い、リガーゼおよび連結緩衝溶液を除去した。変換プロセスの最後から２番目のステップは、ＢｓｅＧｌ制限酵素と、ＦＡＳＴＤＩＧＥＳＴ緩衝液（両方ともＦｅｒｍａｎｔｅｓから）とを含有する緩衝溶液中に、新しく環状化され、かつ固定された分子を再懸濁することである。このプロセスは、予め定義されたコードと、さらにそれが表す塩基が、この時点で鋳型分子の３’端に存在し、新しい塩基がこの時点で５’端に位置し、変換のプロセスを受けられる状態にあるように環状化分子を再度直線化する。試料がこの分解緩衝液に懸濁されたら、３７°Ｃで１５分間放置し、分解を起こさせる。
【０１６３】
ナノ細孔またはゲルを使用して分子を分析するために、変換されたＤＮＡをビーズから除去する。これは、固定された試料を９５％のホルムアミド緩衝液に懸濁し、９５°Ｃで１０分間加熱することによって行われる。次いで、試料は、変換を検証するために、変性ゲル（図２ｂおよび図７）にかけられる。図７は、プロセスの主要な段階のうちのいくつかの変性ゲルを表す（ここでは、Ｃ末端鋳型のみが明確化のために示される）。このゲルは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して染色された。ゲルは、Ａ．元のＤＮＡ鋳型分子、Ｂ．参照として示される直鎖状の１５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ、Ｃ．参照として示される環状１５０ｍｅｒ  ＤＮＡ、Ｄ．ＢｓｅＧｌを使用した、直線化後の変換された生成物、Ｅ．直線化前の変換された環状化生成物を示す。これらは、ハイブリッド形成、連結、および分解ステップ後の分子の伸長された長さを表す。
環状ＤＮＡ変換（ＣＤＣ）の原理の検証のために使用されたＤＮＡ配列
【０１６４】
以下は、実施例で前述される変換された生成物の同一性を検証するために使用された分子ビーコンの配列である。以下の全てのビーコン配列は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＮＡ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏによって合成された。
【０１６５】
Ａ．「１」ビットに相補的である１６−ｍｅｒ。５’−ＴＡＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号１３）。
【０１６６】
この配列は、５’アミン修飾を有し、ＡＴＴＯ６４７Ｎ（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）染料は、５’端で結合された。ナノ細孔光学読み出し実験において、同じオリゴヌクレオチド（分子ビーコン）は、３’端のクエンチャー（ＢＨＱ−２，Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成された。
【０１６７】
Ｂ．「０」ビットに相補的な１６ｍｅｒ：５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１４）。この配列は、５’アミン修飾を有し、ＡＴＴＯ４８８（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）染料は、５’端で結合された。ナノ細孔光学読み出し実験において、同じオリゴは、３’端のクエンチャー（ＢＨＱ−２，Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成され、ＡＴＴＯ６８０（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）染料は、５’端で結合された。
【０１６８】
Ｃ．「０１」配列に相補的な３２ｍｅｒ：５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号１５）。この配列は、５’アミン修飾を有し、ＡＴＴＯ６４７Ｎ（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）染料は、５’端で結合された。
【０１６９】
Ｄ．「１０」配列に相補的な３２ｍｅｒ：５’−ＴＡＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１６）。この配列は、５’アミン修飾を有し、ＴＭ  Ｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））染料は、５’端で結合された。
【０１７０】
発明者は、磁気ビーズからそれらを除去した後の反応生成物を分析することによって、ＣＤＣの実行可能性を広く試験した。図２ｂの左側パネルは、変換を１回実行した後の生成物を含有する変性ゲル（８Ｍの尿素）を表す。４つの異なる鋳型のそれぞれの＞５０％が約５０ｎｔ（１００から約１５０ｎｔへ）伸長したことが観察され、鋳型のプローブとの良好な連結を示す。正しいプローブが各例で使用されたことを証明するために、分子ビーコンとしても知られる４種類のオリゴヌクレオチドが以下の通りに合成された：１）赤いフルオロフォアを用いた、「１」ビットに相補的な１６−ｍｅｒ、２）青いフルオロフォアを用いた「０」ビットに相補的な１６−ｍｅｒ、３）緑のフルオロフォアを用いた「１０」２ビット配列に相補的な３２−ｍｅｒ、および４）赤いフルオロフォアを用いた「０１」に相補的な３２−ｍｅｒ。最初の２つのオリゴヌクレオチドの混合物は、各ＣＤＣ生成物とハイブリッド形成され、かつ対照として、４つ全ての初期鋳型とハイブリッド形成された。ゲル分離後、３色レーザースキャナを使用して、画像分析を実行し、それを図２ｃに表す。色は、図においてグレースケールに変換された。それぞれ、「１１」および「００」とコードされる（列２および３）、［Ａ」生成物の赤いバンドが１つだけ観察され、「Ｃ」生成物の青いバンドが１つだけ観察された。それらがそれぞれ「１０」および「０１」でコードされる（列４および５）とき、他の２つの生成物である「Ｇ」および「Ｔ」は、赤と青のバンドの両方を示す。変換された「Ｇ」と「Ｔ」を区別するために、それらは、前述の２つの３２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成された。「Ｇ」のみが、「１０」コードに対応する、緑のフルオロフォアで標識されたバンド（列６）を示し、「Ｔ」のみが、「０１」コードに対応する、赤いフルオロフォアで標識されたバンド（列７）を示す。対照群は、鋳型自体が標識された分子ビーコンのいずれともハイブリッド形成せず、標識された分子ビーコン自体は、約１５０ｎｔ生成物と比較して非常に短いため、ゲル中に示されないことを示す（列１、８、および９）。これらの結果は、単一ＣＤＣサイクルが正しい変換コードを用いて純粋な生成物を生成するという結論を示す。
【０１７１】
発明者のアプローチの第２のステップは、ハイブリッド形成された分子ビーコンを変換されたｓｓＤＮＡから剥離するために、固体状態のナノ細孔を使用する。２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の断面直径が２．２ｎｍであるため、これは、２ｎｍ未満範囲の細孔の使用を必要とする１９。ＤＮＡ分子のそのような小さい細孔への侵入の確率は、より大きい細孔へのそれらの侵入より非常に小さく９，１３、より大量のＤＮＡの使用を余儀なくする。さらに、小さい細孔の製造は、誤差の公差がほとんどなく、高密度ナノ細孔アレイについての問題が増大するため、多くの技術的な課題を提起する。３〜５ｎｍの大きさの「大きな」基（例えば、タンパク質またはナノ粒子）を分子ビーコンに共有結合的に結合することにより、複合体の分子断面を５〜７ｎｍに効果的に増加させ、３〜６ｎｍの範囲のサイズのナノ細孔の使用を可能にすることが分かった。これは、ＤＮＡ分子の捕獲率を１０倍以上に増加させ、ナノ細孔アレイの製作プロセスを大幅に容易にする。
【０１７２】
概念の検証のため、アビジン（４．０×５．５×６．０ｎｍ）２０分子を、フルオロフォア−クエンチャー対（ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＢＨＱ２、「Ａ６４７−ＢＨＱ」と略される）を含有するビオチン化分子ビーコンに結合した。このビーコンと、１端にクエンチャーを含有し、もう１端にフルオロフォアを含有しない、同様に構築された分子ビーコンの両方が、標的ｓｓＤＮＡ（「１」ビット試料）とハイブリッド形成された。図３ａに模式的に示されるように、２つのビーコン分子（「２」ビット試料）を含有する同様の複合体を合成した。
バルク蛍光試験
【０１７３】
ＢＨＱ−２の消光プロセスの効率を試験するために、バルク蛍光実験を実行した。各フルオロフォアにおいて、２つの分子を設計した（図８（ａ）および（ｂ）の差し込みを参照）。その５’端に蛍光染色を含有する１６ｍｅｒから成る分子の１つを６６ｍｅｒとハイブリッド形成した。第２の分子は、同様に、同じ１６ｍｅｒと、さらにその３’端にＢＨＱ−２クエンチャーを含有する第２の１６ｍｅｒを含有した。これらの２つの１６ｍｅｒは、６６ｍｅｒとハイブリッド形成された。２つの１６ｍｅｒ分子は、１つの５’端上の蛍光プローブが他方の３’端上のＢＨＱ−２クエンチャーに近接するようにハイブリッド形成された。使用された２つのフルオロフォアは、ＡＴＴＯ６４７Ｎ（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）およびＡＴＴＯ６８０（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ）であった。ＡＴＴＯ６４７Ｎは、６４４ｎｍで最大吸収ピークを、そして６６９ｎｍで励起ピークを有し、一方、ＡＴＴＯ６８０は、６８０ｎｍで最大吸収ピークを、そして７００ｎｍで励起ピークを有する。各分子において、我々は、複合体の蛍光発光を測定するために、蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００）を使用した。最初に、分子の発光スペクトルは、非消光フルオロフォアで測定された（図８の（ａ）および（ｂ）の上の跡）。その後、クエンチャー−フルオロフォア対の分子の発光スペクトル（図８の（ａ）および（ｂ）の下の跡）が測定された。各実験は、約１００ｎΜのハイブリッド形成された試料を含有した。これらの実験は、図８に示されるように、これらの大きい分子で生じる消光が９５〜９７％あることを測定した。
【０１７４】
したがって、バルク試験は、そのハイブリッド形成状態にあるとき、分子ビーコン上のＡ６４７フルオロフォアが隣接するＢＨＱクエンチャーにより約９５％消光されることを示した。この非常に高い消光効率を考えると、蛍光バーストは、鎖分離が、フルオロフォアがハイブリッド形成された２本鎖状態の隣接するクエンチャーに隣接しないときに生じる場合のみ、単一分子レベルで検出され得る。
【０１７５】
１ビットおよび２ビット試料の両方のナノ細孔実験は、６４０ｎｍレーザーを使用して実行され、ＥＭ−ＣＣＤカメラを使用して１秒当り１，０００フレームで撮像された。図３ａは、１ビット試料において複合体当り１つのビーコン、２ビット試料において複合体当り２つのビーコンでの、２つの試料の典型的な解離事象を表す。電気シグナルは、黒で示され、細孔位置で電気シグナルと同期的に測定された光学シグナル１７は、薄灰色または濃灰色の跡で示される。電流の急激な減少は、分子の細孔への侵入を意味し、細孔が空くと、電気シグナルは、開細孔の上側の状態に戻る１９。光学シグナルは、１ビットおよび２ビットの試料の解離事象の大多数において、それぞれ、１つまたは２つのフォトンバーストを明らかに示す。これは、フルオロフォアが細孔に到達する前に消光され、ビーコンが鋳型から解離された直後に再度自己消光するため、予想される２１。電気シグナルによって定義される各解離事象中の光学強度を合計して２つの試料のポアソン分布（図３ｂの実線）を得、１ビット試料において、平均値は１．３０±０．０６であり、２ビット試料において、２倍の値（２．６５±０．０８）であった（各例においてｎ＞６００の事象、誤差は標準を表す）。これは、フォトンバーストを定義するために使用されたモデルに関わらず、平均して、単一解離事象が１ビット試料の各複合体で生じ、２つの解離事象が２ビット試料で生じたことを証明する。さらに、強度閾値分析の使用により（平均強度＋２標準で選択される）、１ビット試料の収集された事象のほぼ９０％が、単一蛍光バーストを含有し、一方、２ビット試料において、収集された事象の約８０％が２つのそのようなバーストを示したことが観察された（図３ｃ）。このデータは、３〜５ｎｍ細孔を使用して実施された個別の解離事象において、１ビットと２ビットの試料を光学的に区別することが可能であることを示す。
【０１７６】
４つ全てのヌクレオチドを区別するために、同じ６４０ｎｍレーザーにより同時に励起される、Ａ６４７（ＡＴＴＯ６４７Ｎ）およびＡ６８０（ＡＴＴＯ６８０）の２つの高量子収率フルオロフォアを使用して、現行の系を１色から２色のコードスキームに拡張した。ダイクロイックミラーを使用して、光学発光シグナルをチャネル１および２に分け、同じＥＭ−ＣＣＤカメラ上に並べて映し出した。２つのフルオロフォアの発光スペクトルが重複するとき、Ａ６４７発光の画分は、チャネル２に「漏れ」、Ａ６８０の画分は、チャネル１に「漏れる」。２つの較正測定値は、Ａ６４７またはＡ６８０フルオロフォアで標識された１ビット複合体を使用して実施された（図４ａ）。各例の＞５００解離事象の集積後、ナノ細孔の位置に対応する、各チャネルでの単一の別々のピークが明らかに見られる。チャネル２対チャネル１（Ｒ）の蛍光強度の比率は、Ａ６４７の試料で０．２、Ａ６８０の試料で０．４である。
【０１７７】
２つの試料のそれぞれの代表的な事象（＞５００のうち）、および対応するＲの分布は、それぞれ、図４ｂおよび４ｃに示される。単一の明瞭な蛍光ピークは、各転位事象中に観察され（電流跡は黒で示される）、強度は、ベースラインの蛍光変動より＞３倍大きかった。全ての検出された事象を集計すると、Ａ６４７およびＡ６８０において、それぞれ、Ｒ＝０．２０±０．０６および０．４０±０．０５（平均±標準）となり、図４ａに示される集積された蛍光（全ての事象において）の比率と完全に一致する。図４ｃに一致する実線によって与えられるＲは、ガウス分布をとる。これらの対照測定値は、Ｒが個別のフルオロフォアの同一性を決定するために使用され得ることを示す。
【０１７８】
図４ｃに与えられる較正分布を使用することにより、４つの２ビットの組み合わせ、つまり、「０」および「１」が、それぞれ、Ａ６４７およびＡ６８０ビーコンに対応する、１１（Ａ）、００（Ｃ）、０１（Ｔ）および１０（Ｇ）を含有するＣＤＣから生成物を識別する能力が試験された。＞２０００の解離事象の分析は、０．２１±０．０５および０．４１±０．０６の２つのモードのＲの二峰性分布を明らかにし（図５ｂ）、較正測定値と完全に一致した（図４ｃ）。Ｒ＜０．３０の全てのフォトンバーストは、「０」と分類され、Ｒ＞０３０のものは、「１」と分類された（０．３０は、図５ｂにおいて、分布の局所最小である）。Ｒの分布は、誤分類の確率を算出するためにも使用された。これは、２つのフルオロフォアの間の最適な識別のために、２つのチャネルを較正するための統計的平均をさらに提供する。図５ｃは、４つ全てのＤＮＡ塩基の単一分子識別を示す、代表的な２色蛍光強度事象を表す。
【０１７９】
２色識別の頑健性は、主に、フォトンバーストの優れたシグナル対ノイズ比と、２つのチャネルのフルオロフォア強度比間の分離とに起因する。蛍光シグナルの自動ピーク識別を実施するために、コンピュータアルゴリズムを開発した。アルゴリズムは、蛍光シグナル中のランダムなノイズ（例えば、偽スパイク）を除去し、較正分布（図４ｃ）を使用してビット配列を識別し、その後、塩基呼び出しを実施する。アルゴリズムは、１つがビット呼び出し、そしてもう一方が塩基呼び出しの、２つの確実度スコアを出力する。典型的な結果を図５ｃに示す。強度の生データから自動的に抽出された各塩基の確実度値（０と１の間の範囲）は、括弧で表される。
【０１８０】
現在の広視野光学に基づく検出スキームの主な利点の１つは、複数の細孔を平行して探索することができる単純さにあり、最終的に高処理読み出しを可能にする。平行読み出しの概念の検証として、同じＳｉＮ膜上の３〜５ｎｍのサイズのナノ細孔を、数ミクロン離して製作した。図６ａでは、１つ、２つ、または３つのナノ細孔を含有する膜を使用して、３つの別個の実験で得た、集積された蛍光強度画像を示す。単一細孔実験と同様、膜の全ての細孔からの蛍光バーストが記録された。各実験の数千の解離事象からの集積フォトン計数から、各ピクセルでのフォトン強度の表面地図が得られた（図６ａ）。図に反映されるように、検出されたピークの数は、各膜に製作された細孔の数と等しい。２細孔膜の２つのピーク間の距離は、１．８μｍであり、３細孔膜の３つのピーク間の距離は、１．８μｍおよび７．７μｍであり、製作プロセス中に測定された細孔間の距離と完全に一致する。このデータは、広視野光学検出スキームの実行可能性の直接的な証拠を提供する。
【０１８１】
図６ｂは、系が単一膜の複数のナノ細孔からフォトンバーストを同時に探索する能力を示した。４つの代表的な跡は、電流（黒）および３つのナノ細孔から探索された１ビット試料を使用した光学シグナル（それぞれ、緑、赤、および青のマーカー）を示す。各細孔での各分子の侵入および解離は、確率プロセスである。この実験で使用された条件下において、＞３，０００の解離事象のうちの約５０は、分子が２つの細孔に同時に侵入することを伴った。全ての細孔から集積した電流跡は、はっきりとした２つの遮断レベルを表し、細孔が占有されたかの情報は含まない、特定の時点での占有された細孔の総数を示す。一方、光学跡は、明確に占有された細孔を示す。これは、方法がより大きなアレイに拡張するとき、電流測定値の必要性を最終的に排除し、光学測定値にのみ依存し、計装要求を単純化する。
考察および結論
【０１８２】
単一分子ＤＮＡ配列決定法は、既に、遺伝子研究を転換し始めており、費用および処理に高い制約を設定している３、２２、２３。配列決定の費用は、さらに減少し、ヒトゲノム再配列決定は、幅広く、かつ手頃な医療診断ツールとなることが予想される１。ここで、低費用で超高処理の可能性を有する、新しい単一分子ＤＮＡ配列決定の概念の実行可能性を示してきた。その最も単純な形態において、２つのフルオロフォアと結合され、光学検出系により読み取られるＤＮＡ配列を表すために、バイナリコード（塩基当り２ビット）が使用された。その現段階で、現在の系は、他の単一分子アプローチに引けを取らない、ナノ細孔当り１秒で５０〜２５０の塩基を読み取ることができる２、３。４色の単純な適応および最適化した試薬の使用は、系がナノ細孔当り１秒に＞５００塩基を達成することを可能にすることが予想される。最も重要なことは、多重細孔読み出しの実行可能性が、ナノ細孔に基づく方法について始めて示された。ナノ細孔アレイからの光学検出は、統計的占有に依存する酵素法とは異なり、効率的に細孔の数に対応する。
【０１８３】
発明者のアプローチは、標的ＤＮＡを、標準的な固体状態のナノ細孔を用いて直接探索され得るより長いＤＮＡ分子に変換する準備的なステップを含む。時間および複雑性の追加にも関わらず、このステップは、以下の利点をもたらす：１）他の配列決定プラットホームと異なり２４、このアプローチは、誤りを起こしやすい可能性があるＰＣＲに基づく増幅ステップを必要としない２。２）読み出し段階は、ポリメラーゼ、リガーゼ、またはエキソヌクレアーゼ等のいずれの酵素も使用せず、したがって、読み出しの長さ、速度、および忠実度は、酵素限定されない４。３）読み出しの速度は、ナノ細孔全体にわたる電圧、または２つのチャンバ内のイオン強度等の物理的パラメータを調節することにより、個別の配列決定反応について容易に調節され得る。酵素依存法は、関与する酵素の生体工学を必要とするだろう。４）変換されたＤＮＡは、二次構造をほとんど保有しないように設計され得、これは、ゲノムの高度に構成された領域および／または反復領域の配列決定を非常に容易にすることができ、読み出しステップにおいて強い変性剤の必要性を回避する。５）読み出し系は、一斉に製造され得る、サイズが３〜６ｎｍの範囲の標準的な固体状態のナノ細孔アレイを使用する。
【０１８４】
本明細書における発明者の結果は、最初に、全ての固体状態のＤＮＡ配列の読み出し、および大きな基の組み込みが３〜６ｎｍ細孔の使用を可能にすることを示す。これらの結果は、ＤＮＡ配列決定のための、固体状態のナノ細孔の使用の実行可能性を強く示す。近年、いくつかの刊行物が、固体状態の材料で、同様の規模のアレイの製作を示している２５、２６。
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１２．Ｌｉｕ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９６１），６４−６７（２０１０）。
１３．Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｐｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓａｌｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，１６０−１６５（２００９）。
１４．Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，Ｗ．＆Ａｋｅｓｏｎ，Ｍ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．６（６），８１６−８２２（２００２）。
１５．Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（１０），１１４６−１１５３（２００８）。
１６．Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｂａｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４（４），２６５−２７０（２００９）。
１７．Ｓｏｎｉ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｉｎｓｔｒｕ．８１（１），０１４３０１−０１４３０７（２０１０）。
１８．Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｏｎｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９（５７４１），１７２８−１７３２（２００５）。
１９．ＭｃＮａｌｌｙ，Ｂ．，Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．，＆Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｕｂ−２ｎｍ  ｐｏｒｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８（１０），３４１８−３４２２（２００８）。
２０．Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｍ．＆Ｊｏｙｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉｄｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １１８（１），７１−７２（１９７０）。
２１．Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．，Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｏ．，＆Ｌｉｂｃｈａｂｅｒ，Ａ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎ−ｌｏｏｐｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５（１５），８６０２−８６０６（１９９８）。
２２．Ｌｉｐｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７），６５２−Ｕ１０５  ２００９）。
２３．Ｐｕｓｈｋａｒｅｖ，Ｄ．，Ｎｅｆｆ，Ｎ．Ｆ．，＆Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（９），８４７−Ｕ１０１（２００９）。
２４．Ｌｉ，Ｙ．＆Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｆａｓｔｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｎｅｗｓ  ａｎｄ  Ｖｉｅｗｓ）．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（９），８２０−８２１（２００９）。
２５．Ｔｏｎｇ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｎｉｔｒｉｄｅ  ｎａｎｏｓｉｅｖｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４（２），２８３−２８７（２００４）。
２６．Ｈｏｐｍａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓｅｄ  ｉｏｎ  ｂｅａｍ  ｓｃａｎ  ｒｏｕｔｉｎｅ，  ｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｄｏｓｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｒｅ  ｐｅｒｉｏｄ  ｐｌａｎａｒ  ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｔａｍｐｓ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８（１９），１９５３０５−１９５３１１（２００７）。
２７．Ｐｉｐｐｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｔｃｈｉｎｇ  ｂｉｒｄ  ｆｌｕ  ｉｎ  ａ  ｄｒｏｐｌｅｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（１０），１２５９−１２６３（２００７）。
２８．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ｃ．，＆Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．，Ｒａｐｉｄ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ  ｓｉｚｅｄ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８（２３），３１４９−３１５３（２００６）。
２９．Ｓｏｎｉ  Ｇ．Ｖ．ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，１１（２００７）。
３０．Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｏｐｔｉ−ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．米国特許出願第ＵＳ２００９／００２９４７７号。
３１．Ｐｒｅｂｅｎ  Ｌｅｘｏｎ，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ  ｔａｇｓ．米国特許第６，７２３，５１３号。
３２．Ｊｕ，Ｊｉｎｇｙｕｅ，Ｄｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．米国特許出願第ＵＳ２００９／０２９８０７２号
【図１ａ】
2013523131.tif 000003
【図１ｂ】
2013523131.tif 000004
【図２ａ】
2013523131.tif 000005
【図２ｂ】
2013523131.tif 000006
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2013523131.tif 000009
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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