(57)【要約】【課題】個人ごとに肝臓の代謝性能の定量化を可能にする方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、生物、特にヒトの肝臓の働きを測定する方法である。この方法は、少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物を放出するように肝臓で変換される、少なくとも１種の１３Ｃで標識された基質を投与する過程と、少なくとも１つの評価部を有する少なくとも１つの測定装置を用いて、所定の時間間隔のあいだに呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量を測定する過程とを含む。さらに、呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量に関して、その測定された初期増加を一階の微分方程式で表し、この一階の微分方程式の解から、１３Ｃで標識された代謝産物の最大濃度の数値Ａｍａｘおよび１３Ｃで標識された代謝産物の増加の時定数ｔａｕを決定することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の肝臓の働き、特にヒトの肝臓の働きを測定する方法であって、
−少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物を放出するように肝臓で変換される、少なくとも１種の１３Ｃで標識された基質を投与する過程と、
−少なくとも１つの評価部を有する少なくとも１つの測定装置を用いて、所定の時間に呼気に含まれる前記少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量を測定する過程と、  を含む、肝臓の働きの測定方法であって、
前記呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量に関して、その測定された初期増加を一階の微分方程式で表し、この一階の微分方程式の解から、前記１３Ｃで標識された代謝産物の最大濃度の数値Ａｍａｘおよび前記１３Ｃで標識された代謝産物の増加の時定数ｔａｕを決定することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物が１３ＣＯ２であることを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記呼気に含まれる１３Ｃ代謝産物の１３ＣＯ２の増加を、一階の微分方程式により、前記１３Ｃで標識された代謝産物の最大値の７０％の数値まで、特に、前記１３Ｃで標識された代謝産物の最大値まで表すことを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、形成される前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の量が、前記少なくとも１種の投与される基質の量に比例することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記一階の微分方程式の解として、
【数１】
2013515951.tif 000011
式中、ｙ（ｔ）は前記少なくとも１種の基質の代謝動態を表し、Ａｍａｘはフィッティング関数の最大値または前記代謝産物の最大濃度であり、Ａ０は前記代謝産物の開始濃度であり、ｔａｕは時定数であり、ｔ０は代謝の開始時を表し、ｔは測定時間で表される式を使用することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記指数関数に前記呼気中の前記少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量の前記初期増加の測定データを当て嵌めて、この当て嵌めから、前記最大値Ａｍａｘおよび前記時定数ｔａｕを決定することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記数値Ａｍａｘに基づいて、前記肝臓における前記少なくとも１種の基質の最大変換率を、
【数２】
2013515951.tif 000012
で表し、式中、ＲＰＢＤはＰｅｅ−Ｄｅｅ−Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ標準の１３ＣＯ２／１２ＣＯ２比として０．０１１２３７に相当し、ＰはＣＯ２生成量に相当し、Ｍは前記投与される基質のモル質量に相当し、ＢＷはヒトの体重に相当し、この式によって決定することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記１３Ｃで標識された基質を濃度０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、１３Ｃで標識された基質として、アルコキシ基、特にメトキシ基の脱アルキル反応によって１３ＣＯ２を放出する基質を使用することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、基質として、１３Ｃで標識されたメタセチンおよび／またはフェナセチンおよび／またはアミノピリンおよび／またはカフェインおよび／またはエリスロマイシンおよび／またはエトキシクマリンを使用することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記呼気に含まれる前記１３Ｃで標識された代謝産物の絶対量、特に１３ＣＯ２の絶対量を測定することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、形成される前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の測定をリアルタイムで実行することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記呼気に含まれる、形成される前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の量を、前記測定装置を用いて連続的に測定することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、前記呼気の一部または全部を、呼吸マスクおよび連結管を介して前記測定装置に連続的に移送することを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の肝臓の働きの測定方法において、当該測定方法を、他の解析方法、特に、ＣＴ容積測定法または核磁気共鳴画像法と組み合わせることを特徴とする、肝臓の働きの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前提部に記載のとおり、生物の肝臓の働きを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、生物（特にヒト）が機能するうえで必要不可欠な臓器である。というのも、大量の物質（例えば、薬剤など）が肝臓内で酵素分解されるからである。このような物質分解の大半は、シトクロムファミリー（特に、Ｐ４５０−オキシゲナーゼ類）によって触媒作用が及ぼされる。種々のシトクロムがさまざまな物質を代謝することは良く知られている。また、代謝物質濃度を測定することによって肝機能を予測できることも知られている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、健全な患者および肝臓に障害を有する患者の双方に１３Ｃ−メタセチンを経口投与することが記載されており、１３Ｃ−メタセチンは肝臓で変換されることによって１３ＣＯ２を放出する。呼気に含まれる１３ＣＯ２の量を測定することにより、肝臓障害の程度について述べることができる。
【０００４】
非特許文献２には、１３Ｃ−メタセチンを経口投与された個人の呼気に含まれる１３ＣＯ２／１２ＣＯ２比を測定することが記載されている。この方法では、最大酵素活性を判定したい場合、測定を６０分間連続で実行するのが望ましいとされる。
【０００５】
しかし、上記の方法では、臨床現場に応用するには不十分である。というのも、１３Ｃ−メタセチンの経口投与からは、肝機能が良好であるか、あるいは、今のところ肝機能は良好であるという情報しか得られないからである。つまり、医者の治療方針を直接導き出すことができない。
【０００６】
さらに、従来の肝臓診断方法は個人に特化したものではなく、複数の患者に対して統計学的な見解を下すだけのものであった。つまり、前述した測定方法では、特定の測定結果に基づいて、診断結果が望ましくないものとなる可能性が高まるか、それとも低くなるかを述べることしかできない。また、個人ごとに測定結果から肝臓の働きについて結論を下すことができない。
【０００７】
したがって、肝臓細胞組織の残存機能についての予後的な見解を下すことを可能にする簡便な試験法の開発が望まれている。従来の臨床検査項目では、肝臓内の複雑な生物学的プロセスおよび疾患時の当該プロセスの変化を高い信頼性で評価するには精度が不十分である。
【０００８】
特許文献１には、肝機能の定量的測定を可能にする解析方法が記載されている。この方法では、肝臓内で代謝される基質の流入および当該基質の最大変換率の測定値に基づき、患者の肝機能容量について見解を下すことができる。
【０００９】
個人ごとに臓器（特に、肝臓）の代謝性能の定量化を可能にする方法は、実施形態の違いに関係なく、以下の特徴を有する：
１）患者の肝臓における基質の代謝動態をリアルタイムかつ高分解能で測定することができる。ただし、これは代謝開始が代謝増加よりも高速で生じることを条件とする。すなわち、代謝開始の７０％が少なくとも２倍の速度で生じるのが望ましい。
２）代謝を直接測定することができる。すなわち、代謝産物を直接的に測定値とすることができるか、あるいは、代謝産物に対して一定の比例関係を有する他の数値を直接測定することができる。つまり、例えば呼吸気試験の場合、１分間あたり少なくとも２回の呼吸（好ましくは全呼吸）を測定することができる。これにより、呼吸気試料の中間的貯蔵または呼吸気の部分消失がなくなるので、生じる可能性がある手順ミスを回避できる。
３）生理学的なファクタによる測定値の変化が約２０％以下である。すなわち、生理学的なファクタ（例えば、血液による体内での基質の分配など）の影響が低いほど、代謝産物の定量的な測定結果の精度が高まる。
４）投与される基質の代謝プロセスが明確であり、かつ、それが肝臓細胞内でのみ生じるか、あるいは、その９０％超が肝臓細胞内で生じるものであり、体内の他の箇所では全く生じない。
５）代謝プロセスの反応効率に個人差がない。というのも、個人差があると、個人ごとの定量的な測定を妨げる。したがって、遺伝的変異（遺伝子間の差）が大きい代謝プロセスは除外される。しかし、万が一遺伝的変異のある代謝プロセスを利用する場合には、少なくとも遺伝的に変わらない代謝プロセスの変化の大きさを把握すべきである。
６）代謝プロセスは、肝臓内の全ての肝臓細胞に均等に分布した肝臓酵素または肝臓補酵素によって生じるものであるのが最も望ましい。もし肝臓の特定の領域に肝臓酵素または肝臓補酵素が集中していると、それらの部位における肝臓の働きについて述べることしかできない。また、肝臓酵素または肝臓補酵素は、他の代謝反応の負荷による代謝プロセスの変化規模が３０％を超えるものであってはいけない。つまり、肝臓酵素または肝臓補酵素は、代謝動態の変動が３０％を超えるものであってはいけない。
【００１０】
従来知られている方法では、前記の特徴を実現することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００７／０００１４５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Matsumoto et al. Digestive Diseases Science, 1987, Vol. 32, p. 344 - 348
【非特許文献２】Braden et al. Aliment Pharmacol. Ther.,2005, Vol. 21 , p. 179 - 185
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上を踏まえて、本発明の目的は、個人ごとに肝臓の代謝性能の定量化を可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の目的は、請求項１に記載された、生物の肝臓の働き、特にヒトの肝臓の働きを測定する方法によって達成される。
【００１５】
本発明にかかる上記の方法は、少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２を放出するように肝臓で変換される、少なくとも１種の１３Ｃで標識された基質を投与する過程と、少なくとも１つの評価部を有する少なくとも１つの測定装置を用いて、所定の時間間隔のあいだに呼気に含まれる、形成される前記少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の量を測定する過程と、を含む。好ましくは、前記呼気に含まれる、形成される前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の量は、前記少なくとも１種の投与される基質の量に比例する。本発明にかかる方法は、測定された測定ポイントに基づいて、前記呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の量に関して、その測定された初期増加を一階の微分方程式で表すことを特徴とする。この一階の微分方程式の解から、前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の最大値Ａｍａｘ（ＤＯＢｍａｘとも称される（ＤＯＢは「ベースラインを超えるΔ値」を意味する））および前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の増加の時定数ｔａｕを決定する。
【００１６】
最大値ＡｍａｘまたはＤＯＢｍａｘは最大時の代謝動態に相当し、時定数ｔａｕは代謝動態の増加の時定数に相当する。本発明により、１３Ｃの量の経時変化について実際に測定した測定値を、少なくとも２種類の数値（すなわち、最大値Ａｍａｘおよび時定数τ（ｔａｕ））を有する一階の微分方程式の解を表した曲線に当て嵌める（いわゆるフィッティング）ことができる。特に、この微分方程式の解は、呼気に含まれる少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量の初期増加を近似的に表した指数関数とされる。前記微分方程式の解における数値Ａｍａｘおよび時定数ｔａｕは、増加の初期挙動を特徴付ける特性パラメータである。したがって、本発明は、測定された初期増加における２つのパラメータを決定することにより、肝臓の臨床像の極めて精密でかつ高分解能な解析を可能にする。詳細には、パラメータｔａｕおよび最大値を分析することにより、そのような極めて精密な評価が可能となる。このようにして、本発明は、医者が診断を行う際に用いられる生データを改良することができる。
【００１７】
代謝される前記基質は肝臓細胞に移送される。肝臓細胞への基質の移送を表した微分方程式は、以下のように表される：
【００１８】
【数１】
2013515951.tif 000002
【００１９】
三次元で表すと、以下のようになる：
【００２０】
【数２】
2013515951.tif 000003
【００２１】
式中、Ｘは代謝される基質の濃度を表し、Ｃは拡散係数を表す。
【００２２】
拡散係数Ｃは、第一近似で、位置に依存しないと仮定する。代謝動態を評価するにあたっては、特定の位置についてのみ分解を実行したり、全位置の平均を取ったりしないので、位置依存性を見かけの拡散係数Ｃａｖｅに書き換えることができる。これにより、以下の式が得られる：
【００２３】
【数３】
2013515951.tif 000004
【００２４】
なお、酵素による代謝過程が拡散動態に比べて高速（少なくとも２倍の速度）で進行することが重要である。そのため、例えば、シトクロムＣＹＰ  Ｐ４５０  １Ａ２による代謝は平均１ミリ秒以内である。
【００２５】
基質が代謝で肝臓に取り込まれることにより、基質の濃度Ｘは低下する。基質が完全に分解されるまでの間、細胞内部と細胞外部との間の濃度勾配は維持される。
【００２６】
長時間スケールに関する因子は、関数ｆ（Ｘ，Ｙ，Ｚ，．．）によって与えられる。この影響因子は、代謝動態の開始時において当該代謝動態の２０％未満となるのが望ましい。これにより、以下のような一階の微分方程式（ＤＥ）を表すことができる：
【００２７】
【数４】
2013515951.tif 000005
【００２８】
この微分方程式（ＤＥ）の解は、以下の方程式に相当する：
【００２９】
【数５】
2013515951.tif 000006
【００３０】
式中、Ｃａｖｅは変換の時定数ｔａｕを表し、Ｘは投与される基質の濃度を表す。
【００３１】
時間ポイントｔ＝０は、動態の当て嵌めによって導き出されるものであり、すなわち、代謝の開始時である。１３Ｃで標識された代謝産物（例えば１３ＣＯ２）が測定されると、代謝産物の濃度Ａの増加は投与される基質Ｘの減少に比例する。したがって、以下の式で表すように、基質の指数関数的減少を代謝産物の指数関数的増加に変換することができる：
【００３２】
【数６】
2013515951.tif 000007
【００３３】
式中、Ａｍａｘはフィッティング関数の最大値であり、代謝産物の最大濃度または最大量を意味する。ｔａｕは変換の時定数である。このようにして、増加を示す指数曲線が得られる。
【００３４】
好ましい一実施形態において、前記一階の微分方程式の解は以下の式に相当する：
【数７】
2013515951.tif 000008
【００３５】
式中、ｙ（ｔ）は少なくとも１種の基質の代謝動態を意味し、ｔは測定時間を意味し、ｔ０は代謝の開始時を意味し、ｔａｕは変換の時定数を意味し、Ａｍａｘはフィッティング関数の最大値または代謝産物の最大濃度を意味し、Ａ０は代謝産物の開始濃度を意味する。このようにして、上記の式からＡｍａｘおよび時定数ｔａｕを決定することができる。
【００３６】
好ましくは、上記の指数関数に、前記呼気に含まれる前記少なくとも１種の１３Ｃで標識された代謝産物の量の前記初期増加の数値を当て嵌める。その後、この当て嵌めから、前記最大値Ａｍａｘおよび前記時定数ｔａｕを導き出す。
【００３７】
生物の肝臓の働きを定量的に決定するために重要なのは、数値Ａｍａｘが、代謝に関わる肝臓細胞の数に比例すること、そして、時定数ｔａｕにより、代謝される基質の肝臓酵素または肝臓補酵素に対する到達可能性についての情報が与えられることである。
【００３８】
本発明の一実施形態において、前記呼気に含まれる１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の増加は、一階の微分方程式により、前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の増加の最大値の７０％の数値まで、好ましくは、前記１３Ｃで標識された代謝産物、特に１３ＣＯ２の増加の最大値まで表される。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、数値ＡｍａｘまたはＤＯＢｍａｘに基づいて、前記肝臓における前記少なくとも１種の基質の最大変換が、以下の式によって決定される：
【００４０】
【数８】
2013515951.tif 000009
【００４１】
式中、ＲＰＤＢは０．０１１２３７（Ｐｅｅ−Ｄｅｅ−Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ標準の１３ＣＯ２／１２ＣＯ２比）に相当し、ＰはＣＯ２生成量に相当し、Ｍは前記投与される基質のモル質量に相当し、ＢＷはヒトの体重に相当する。
【００４２】
本発明にかかる肝臓の働きの測定する方法を適用した際に、時定数ｔａｕが大きいと、代謝プロセスまたは代謝動態の直接読み取り可能な最大値が、前記一階の微分方程式から決定される最大値ＡｍａｘまたはＤＯＢｍａｘと異なる場合があることに留意されたい。これは、代謝量の増加が低速であると、他の因子（例えば、基質の体内分配など）の影響が増大し得るという事実に基づいている。そのため、代謝は素早く開始するのが望ましく、これは例えば代謝される基質の静脈内投与などによって達成することができる。基質を静脈内投与することにより、基質を肝臓に素早く供給することができ、かつ、それに伴って基質の代謝を確実に素早く開始させることができる。また、静脈内投与により、肝臓細胞と血液との間の基質勾配を十分に高く設定できるので、代謝動態の開始後の基質の代謝回転速度を最大にすることができる。
【００４３】
さらに好ましくは、代謝される基質は、図１に示す構造に相当する構造単位を含む。特には、１３Ｃで標識された基質として使用される化合物は、アルコキシ基Ｒ１、特にメトキシ基の脱アルキル反応によって１３ＣＯ２を放出可能な化合物であるのが望ましい。一般的に、使用される基質は、アルコキシ基を有する炭素原子または炭素同位体の六員環を含む、小分子または大分子であってもよい。まず、アルコキシ基が肝臓内に存在するＰ４５０−シトクロム類によってヒドロキシ化された後、１３ＣＯ２が分離される。好適な基質の例として、１３Ｃ−メタセチンおよび／またはフェナセチンおよび／またはエトキシクマリンおよび／またはカフェインおよび／またはエリスロマイシンおよび／またはアミノピリンが挙げられる。また、炭素原子が例えば窒素、硫黄などの他の原子に置き換えられてもよい。さらに、使用される基質を、少なくとも１つのアルコキシ基Ｒ１で置換された五員環を含む化合物に基づくものとしてもよい。当然ながら、その五員環の１つまたは２つの炭素原子を、例えば窒素、硫黄などの他の原子に置き換えてもよい。また、当然ながら、使用される基質を、複数の異なる置換基を有するものとしてもよい。つまり、図１に示す部位Ｒ２、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６は、ハロゲン、アルキル基、カルボキシ基、エーテル基およびシラン基からなる群から選択されたものであってもよい。当然ながら、想定される置換基のリストは上記のみに限定されず、当業者に知られた他の置換基にも拡張可能である。
【００４４】
好ましくは、前記１３Ｃで標識された基質は、濃度０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。代謝される基質の濃度は、直線範囲内の代謝動態が飽和域から十分に離れるように選択されるのが望ましい。基質の濃度が特定の数値を超えると、呼気に含まれる１３Ｃで標識された代謝産物の量の増加、特に１３ＣＯ２の増加を、一階の微分方程式で表すことができなくなる。そのため、代謝される基質として１３Ｃ−メタセチンを使用する場合、投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重以下が望ましい。
【００４５】
本発明にかかる方法では、好ましくは、前記呼気に含まれる前記１３Ｃで標識された代謝産物の絶対量、特に１３ＣＯ２の絶対量が測定される。したがって、前記呼気に含まれる前記１３Ｃで標識された代謝産物の量、特に１３ＣＯ２の量の測定は、リアルタイムかつ連続的に実行される。前記呼気に含まれる前記１３Ｃで標識された代謝産物の濃度、特に１３ＣＯ２の濃度を、測定装置を用いて連続的に測定することにより、より多くのデータポイントの測定になり、当該測定されたデータポイントによって形成される測定曲線の分解能および精度が向上する。最大値ＡｍａｘまたはＤＯＢｍａｘと時定数ｔａｕとを、高い信頼性をもって決定したいのであれば、少なくとも５つの測定ポイント、好ましくは少なくとも７つの測定ポイントに基づくのが望ましい。
【００４６】
特に好ましい実施形態において、本発明にかかる方法は、さらなる解析方法、特に、ＣＴ容積測定法（ＣＴｖｏｌｕｍｅｔｒｙ法、ＣＴ画像を用いた検索法）と組み合わされる。これにより、患者の健康状態について詳細に述べることができ、また、例えば腫瘍発生などの場合に具体的な手術戦略を立てることができる。
【００４７】
さらに他の実施形態において、本発明にかかる方法は、さらなる解析方法、特に核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と組み合わされる。これにより、代謝対象の１３Ｃで標識された基質の位置を、ＭＲＩ画像によって特定することができる。また、本発明にかかる方法で測定される代謝動態を、時間分解されたＭＲＩと比較することができる。双方の方法を組み合せることにより、（特に肝臓内の）各酵素による代謝を空間的および時間的に分析して解析することができる。一般的に、ＭＲＩの時間分解は低速なので、代謝動態を監視するには不十分である。しかし、ＭＲＩ画像のデータと本発明にかかる方法の代謝動態とを同期させることにより、例えば、ＭＲＩ画像のデータに対して複数の時間ポイントで重み付けを行うことにより、代謝像がを向上させることができる。
【００４８】
また、一変形例では、代謝対象の１３Ｃで標識された基質として、肝臓全体に均質に分布せずに特定の領域に集中して存在する酵素または補酵素によって代謝される基質を選択してもよい。これにより、肝臓における特定の部位の代謝性能を測定することができる。
【００４９】
肝臓内に均質に分布した酵素または補酵素による代謝動態および代謝プロセスの空間画像を得るためには、基質が肝臓細胞に極めて迅速に到達すること、そして、当該基質を、ＭＲＩを用いて歪みなく捉えると同時に本発明にかかる方法によって代謝動態を測定すること、の両方を確実に達成する必要がある。
【００５０】
一実施形態は、１３Ｃで標識されたメタセチンである。１３Ｃで標識されたメタセチンは、可溶化剤としてのプロピレングリコールを用いることにより、十分に高い濃度で水溶液に溶解させることができる。濃度１０〜１００ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールにより、メタセチン０．２〜０．６％の濃度のメタセチン溶液を得ることができる。このような１３Ｃで標識された基質（メタセチン）と可溶化剤としてのプロピレングリコールとの特定の組合せに基づく水溶液により、１３Ｃで標識されたメタセチンについての、ほぼバックグラウンドのないＭＲＩ測定が可能となる。ＭＲＩ測定は、１３Ｃの天然同位体比による悪影響を強く受ける場合がある。メタセチン、可溶化剤および肝臓細胞内の残りの有機物質における全ての炭素原子が、強大かつ邪魔なバックグラウンド信号の原因となる。メタセチンにエーテル基を介して結合したメチル基（つまり、メトキシ基）に１３Ｃで標識を施すという特定の選択により、メタセチン中の１３Ｃで標識された同位体シフトは可溶化剤の炭素原子のＭＲＩ信号およびアミノ酸の炭素原子のＭＲＩ信号と差別化することができ、すなわち、肝臓細胞内の残りのほとんどの有機物質のＭＲＩ信号と差別化することができる。他の位置に１３Ｃで標識を施した場合には、このような利点は得られず、有益なＭＲＩ測定の邪魔になるだけである。また、カップリング効果（例えば、ＮＯＥ、ＤＥＰＴなど）を利用してパルスを賢く選択することにより、ＭＲＩ画像のコントラストを向上することができる。
【００５１】
特に、肝臓の働きが極めて悪い場合に、上述したように複数の方法を組み合わせることで、有意な相乗効果がもたらされる。また、このような組合せにより、肝臓内の微小循環の空間分解を得ることもできる。
【００５２】
本発明にかかる方法で決定される数値Ａｍａｘおよび時定数ｔａｕは、数多くの用途に利用することができる。特に重要な用途として、次に述べる利用法および用途を挙げる：肝臓の働きの測定、術後における肝臓再生の経過観察、（特に、障害のある肝臓についての）手術計画の組立て、移植肝臓の肝機能の測定、（特に、集中治療患者の）敗血症の評価、新薬承認過程での薬剤による肝臓障害の判定、肝臓の長期的な障害の観察、遺伝子組換え食品による肝臓障害の判定、化学産業での操業安全性の分野、職場健康管理、肝臓ガン予防の健康診断、肝臓疾患の監視、薬剤の投与量の調節、動物における肝臓障害の判定、環境医学、肝機能のルーチン検査など。
【００５３】
本発明を、図面を参照しながら下記の例を用いて説明する。なお、下記の例は、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明にかかる方法を実施するのに適した物質を示す概略図である。
【図２】本発明にかかる測定方法の流れを示す概略図である。
【図３】測定時間に対するＤＯＢ測定値の増加変化を示すグラフである。
【図４Ａ】正常な肝臓の働きの場合の前記増加変化を示すグラフである。
【図４Ｂ】肝硬変の場合の前記増加変化を示すグラフである。
【図４Ｃ】重度の肝臓障害の場合の前記増加変化を示すグラフである。
【図４Ｄ】肝不全の場合の前記増加変化を示すグラフである。
【図５】正常な肝臓の働きの場合、低下した肝臓の働きの場合、および肝不全の場合のそれぞれについて、最大変換率ＬｉＭＡｘの対時間変化を示すグラフである。
【図６】投与された基質の、肝臓への移送を示す概略図である。
【図７】最大値Ａｍａｘおよび時定数ｔａｕのデータを決定するための上昇変化を示すグラフである。
【図８】代謝対象基質の濃度の低下および代謝産物の血中濃度の増加を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明にかかる方法の好ましい一実施形態において、ヒトの肝臓の働きの測定は、図２に示す様式で行われる。この測定過程では、代謝対象基質（特に、１３Ｃメタセチン１）と生理食塩液１ａとの組合せの静脈内投与により、代謝が開始する。
【００５６】
静脈内投与により、解析を行うにあたって必要な、基質の迅速な流入および基質代謝の素早い開始の両方を確実に達成することができる。したがって、肝臓内の基質の酵素変換によって生じる基質代謝は、呼吸リズムよりも早く開始する。
【００５７】
図６に、投与される基質の、肝臓への移送および肝臓内での変換又は分解を概略的に分かり易く示す。投与される基質（網目模様の入った円）（例えば、１３Ｃメタセチンなど）は、特定の移送定数で肝臓細胞に移送され、対応する酵素（斜線の入った六角形）（特に、Ｐ４５０オキシゲナーゼ類）により、例えば特定の反応定数の脱アルキル化反応を経て変換され、脱アルキル化生成物（斜線の入った円）（例えば、パラセタモールなど）が特定の移送定数で移送されるとともに、１３Ｃで標識された代謝産物（斜線の入った円）（例えば、１３ＣＯ２など）が特定の移送定数で肝臓細胞から血液に移送される。
【００５８】
酵素（特に、Ｐ４５０オキシゲナーゼ類）による基質の活性化のほかにも、照射または他の高速なプロセスによる基質の放出または活性化も考えられ得る。放出された代謝産物（例えば、１３ＣＯ２など）は血液を介して肺に移送されて、肺から呼出される。呼気は、（好ましくは、呼吸マスクおよび連結管を介して）測定装置２に連続的に移送され、コンピュータ３によって解析される（Stockmann et al., Annals of Surgery, 2009, 250: col. 119-125）。本発明にかかる方法に適した測定装置は、例えば国際公開第２００７／１０７３６６号に記載されている。
【００５９】
特定の測定装置を適用することにより、各呼吸ごとの基質の代謝をリアルタイムで観察することができる。このことは、図３に明確に示されている。図３には、呼気中の１３ＣＯ２濃度の増加がＤＯＢ値で表されており、この増加が一階の微分方程式に相当する。ここで、ＤＯＢ値が１つ変化することは、１２ＣＯ２に対する１３ＣＯ２の比が、１３ＣＯ２／１２ＣＯ２の天然比から、約千分の一に変化することを意味する。また、前述したように、前記ＤＯＢ値の増加から、ＡｍａｘまたはＤＯＢｍａｘと時定数ｔａｕとを導き出すことが可能である。１３ＣＯ２の増加が最大値に達すると１３ＣＯ２濃度の低下が始まるが、これは体内の別の動的プロセスが原因と考えられる。そのような動的プロセスは測定信号の質を低下させる。
【００６０】
上記の代謝動態により、投与される基質の、肝臓内に存在する酵素による代謝を直接かつ即座に観察することができる。投与される基質として好ましいメタセチンは、酵素ＣＹＰ１Ａ２によって脱メチル化される。一階の微分方程式に相当する、投与されるメタセチンの増減変化を解析し、パラメータＡｍａｘおよびｔａｕを導き出すことにより、肝臓の働きを直接測定することができる。この最大値Ａｍａｘから、代謝に利用可能である健全な肝臓細胞の数および肝容積について述べることができる。他方、時定数ｔａｕの形態の増加変化から、肝臓細胞への基質の到達率について述べることができる。詳細には、時定数ｔａｕから、肝臓が実際に基質を取り込むことができるか否かについて述べることができる。
【００６１】
図７に、１３Ｃで標識されたメタセチンを与えられた後の呼吸気中の１３ＣＯ２の増加を表す曲線に基づき、関係パラメータを決定する一例を示す。なお、図３に関する説明も参照されたい。最大測定値Ａ：２２．０１ＤＯＢを含む複数の測定データポイント（曲線Ａ）に基づき、前述のとおり、一階の微分方程式の解（曲線Ｂ）を当て嵌める（フィッティングさせる）。この微分方程式の解：
【００６２】
【数９】
2013515951.tif 000010
【００６３】
に基づき、フィッティング関数の最大値Ａｍａｘ：２２．０９ＤＯＢおよび変換の時定数ｔａｕ：２．４２分が決定される。２．４２分といった小さい時定数は、肝臓透過性が良好なことを示す。他方、複数の測定ポイントに基づく曲線の緩やかな増加は、時定数が５分を超える範囲にあることを示し、これは肝臓細胞の硬化およびそれに伴う肝臓透過性の悪化を意味する。
【００６４】
肝臓の働きを推定するうえで、呼気に含まれる１３Ｃで標識された代謝産物（例えば、１３ＣＯ２など）の量を測定する構成の変形例として、あるいは、この構成に加えて、血液中の脱アルキル化生成物の濃度低下を観察し、その増加変化から時定数ｔａｕを導き出すことも考えられる。
【００６５】
図８に、上記の変形例に基づく方法を示す。投与される１３Ｃで標識された基質（例えば、１３Ｃメタセチンなど）の濃度変化、および肝臓内で形成された脱アルキル化生成物（例えば、パラセタモールなど）の濃度変化を、適切な分析方法（例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）など）を用いて観察する。１３Ｃメタセチンの濃度は、代謝を経て低下する（指数関数的に減少する曲線の開始濃度は、１３Ｃメタセチン２０μｇ／ｍｌである）。逆に、パラセタモールの濃度は増加する（図８の下側の曲線）。ここでも、濃度の初期変化を、一階の微分方程式で表すことができる。このようにして表した一階の微分方程式の解から、パラセタモールの初期の高速な濃度増加の時定数τ１：１．３分と、その後の、血液中へのさらなる分配に起因する減速した濃度増加の時定数τ２：１６分とを導き出すことができる。
【００６６】
肝臓の働きを測定する本発明にかかる方法は、数多くの用途に適用可能である。
【００６７】
例えば、本発明にかかる方法により、患者の総合的な健康状態（特に、患者の肝臓の働き）を推定することが可能になる。図４Ａ〜図４Ｄに、代謝の増加を時間の関数として示す。異なる臨床像ごとに、それぞれ異なる最大値Ａｍａｘおよび時定数τを有する増加変化が得られる。前述したように、数値Ａから、肝臓の働きに直接比例する最大変換率ＬｉＭＡｘを決定することができる。図４Ａには、最大変換率：５０４μｇ／ｈ／ｋｇの正常な肝臓の働きが示されている。他方、図４Ｂ〜図４Ｄには、それとは異なる臨床像が示されている。肝硬変の場合、投与される基質の代謝が低下し、最大変換率ＬｉＭＡｘも３０７μｇ／ｈ／ｋｇにしか達しない。さらに重度な肝臓障害ないし肝不全の場合、投与される基質の最大変換率は、それぞれ１４４μｇ／ｈ／ｋｇ（図４Ｃ）、５５μｇ／ｈ／ｋｇ（図４Ｄ）にまで低下する。
【００６８】
また、本発明にかかる方法により、術後（例えば、肝切除後）の肝臓再生の予測または経過観察、さらには、肝臓状態の検査が可能となる。つまり、本発明にかかる方法により、肝臓手術後数分も経たないうちに、さらには、手術の最中に、肝臓が働いているか否か及び肝臓の働きの程度を調べることが可能になる。
【００６９】
図５に、肝臓手術後の各肝臓の働きを示す。最大変換率ＬｉＭＡｘは、健全かつ正常な肝臓、弱った肝臓、および重度の障害を有する肝臓の間で大きく異なる。通常、肝臓が再生するまでに術後数日はかかる。したがって、術後の時点で既に最大変換率ＬｉＭＡｘ、すなわち、肝臓の働きが極めて低い場合には、肝臓が回復しないまま患者が死亡する可能性が高いと予測することができる。しかしながら、本発明にかかる方法では、重篤な症状を迅速に認識することができるので、症状の重い患者を、例えば肝臓移植などの代替的な方法で治療することによって助けることもできる。
【００７０】
また、本発明にかかる方法により、術前に手術結果の予測を行うことができるので、適切な手術計画を立てることが可能になる。例えば、ＣＴ容積測定法（ＣＴｖｏｌｕｍｅｔｒｙ法）と組み合せることにより、障害のある組織（例えば、腫瘍組織など）のみならず、切除が必要になるであろう組織を、手術前に決定することができる。例えば腫瘍治療の場合、腫瘍周辺の組織をできる限り切除して腫瘍の拡散リスクを抑えなければならないため、上記のような切断作業は必要である。しかしながら、切除される肝容積が多すぎると、患者が死亡する可能性が生じる。切除すべき肝容積のサイズは、切除後の肝容積による肝臓の働きに依存する。既存の肝容積による肝臓の働きを正確に測定することができるので、細部に至るまで精密に手術計画を立てることができ、患者の生存および回復の機会が最適化される。
【００７１】
これを、以下の例を用いて詳細に説明する。例えば腫瘍の容積を１５３ｍｌとすると、腫瘍以外にトータルで約５９９ｍｌの肝容積を切除するのが妥当である。肝容積が全部で１，４５０ｍｌであるとすると、残存容積は６９８ｍｌとなり、患者の生存は保証される。ここで、投与される１３Ｃメタセチンの術前の最大変換率ＬｉＭＡｘを３０７μｇ／ｈ／ｋｇとする。なお、所望の残存容積：６９８ｍｌは最大変換率ＬｉＭＡｘ：１６５μｇ／ｈ／ｋｇに相当する。本発明にかかる方法によって手術中に変換率を連続的に測定するので、生存に必要な残存容積：６９８ｍｌに達することが保証される。実際には、術後の肝臓の残存容積６２５ｍｌで、最大変換率１６９μｇ／ｈ／ｋｇが得られる。健全な肝臓の肝容積とそのＬｉＭＡｘの数値とを直接対比させたうえで、三の法則（the rule of three）を用いることにより、目的のＬｉＭＡｘ数値を得るための切除後の肝容積を決定することができる。
【００７２】
また、本発明にかかる方法により、移植された肝臓について、その機能または術後の機能不全（ＰＮＳ）を判定することができる。肝臓移植のうち約５％において、例えば不十分な血液循環などが原因で、移植された肝臓が機能しない場合がある。従来、このような症状は、数日経った後でしか検出できなかった。しかし、本発明にかかる方法により、時定数τが投与される基質の肝臓に対する到達性についての情報を提供するので、数分後には肝臓の機能不良を検出することが可能になる。これにより、それに応じて患者を治療し、例えば、移植を新たに実行することができる。
【００７３】
また、本発明にかかる方法により、肝臓移植後の手術成功の測定および今後の治療方針の決定が可能になる。つまり、本発明にかかる方法により、肝臓移植後に直接かつ迅速に肝臓の働きを測定することができ、患者ごとに今後の治療を最適化することができる。
【００７４】
また、本発明にかかる方法により、集中治療患者の敗血症リスクの評価が可能になる。集中治療医療において敗血症で死亡するリスクが極めて高いことは既知のとおりである。そこで、本発明にかかる測定方法により、入院時および治療時に、肝臓細胞に障害があるか、それとも正常に機能しているかを直接判定することができる。
【００７５】
肝臓障害の有無の判定は、特に、新薬承認において重要である。すなわち、本発明にかかる方法の最も重要な用途の一つは、新薬承認過程で薬品および薬剤によって引き起こされる肝臓障害の検査方法としての用途である。新薬承認過程では、承認を請求する薬剤が、肝臓に障害を引き起こさないことが毒性試験で証明されなければならない。通常、そのようなリスク評価は、一連の各種動物試験から導き出される。しかし、ヒトに対して予測不可能な副作用が生じる場合があり、これは動物試験のみでは検出が困難である。対照的に、本発明にかかる方法を用いると、動物およびヒトの双方に対する毒性作用を正確にかつ定量的に測定することができる。本発明にかかる方法は肝臓の働きについての定量的な測定を高い信頼性を持って行うことができるので、薬剤の投与量試験をより迅速にかつ正確に実行することが可能になる。
【００７６】
また、本発明にかかる方法により、薬品（例えば、避妊薬など）に起因する肝臓置換に関連した長期的な障害を観察することが可能になる。定期的に接種される薬品（例えば、避妊薬など）の場合、肝臓に変化が発生し、まず肝臓細胞への到達性に影響が生じた後に、肝臓の働きが低下する可能性がある。このような肝臓の変化は、肝臓細胞への物質の到達率を決定することのできる増加時間τ、および健全な肝臓細胞の数について述べることのできる最大値Ａによって判定可能である。つまり、本発明にかかる測定方法を用いて定期的に検査することにより、上記のような肝臓の変化を検出することができる。医者は、測定データに基づき、さらなる肝臓の変化が生じないように投薬を変更することができる。
【００７７】
現在、生物、特にヒト、に対する遺伝子組換え物質及び食品の影響を検出することは困難である。その理由として、特に、有害な生体物質の濃度が検出限界未満または検出限界のほんの僅か下であったり、あるいは、そのような物質の有害性が今日まで判明していない等が挙げられる。本発明にかかる方法により、遺伝子組換え食品による肝臓障害を明確に検出することが可能になる。
【００７８】
また、本発明にかかる方法により、化学産業または製薬産業における化学物質の影響を観察、監視および特定することが可能になる。これにより、職場でのヒトの健康診断を高い信頼性を持って行うことが可能になる。
【００７９】
本発明にかかる方法のさらなる用途として、職場での健康リスクを推定するための職場医療の分野、肝臓ガンのスクリーニング検査、肝臓疾患（例えば、肝炎など）のモニタリング、動物の肝臓障害（例えば、植物Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｊａｃｏｂａｅａ  Ｉの接種によって引き起こされる馬の肝臓障害など）の検出、中毒、土壌および／または食品および／または飲み水に含まれる肝臓に障害を引き起こす物質を探し出すための環境医学などが挙げられる。
【００８０】
本発明にかかる方法の特に好ましい用途として、薬剤の調節が挙げられる。投与された薬剤は全て肝臓によって代謝されるので、肝臓の働きが良好な場合、それらの薬剤の大半を代謝することができる。他方、肝臓の働きが悪い場合、少量の薬剤しか代謝することができない。しかし、このことは、肝臓の働きによって患者の体内の薬剤用量が異なること、すなわち、同じ投薬量であっても効果が異なることを意味する。そのため、薬剤の最適な効果は、肝臓の働きに合わせて調節されるのが望ましい。一例として、臓器移植後の拒絶反応を抑える免疫抑制剤であるタクロリムスの投与を挙げる。タクロリムスは、投与量が多過ぎると毒性を示し、反対に投与量が少な過ぎると効果がないので、タクロリムスの投与量の正確な調節は極めて重要である。肝臓の働きを正確に把握できるので、投薬量を正確に調節し、薬剤の効果を最適化することができる。
【００８１】
さらに、本発明にかかる方法は、簡便かつ迅速なので、主治医が健康状態の一項目として肝臓の働きを調べる肝臓の定期検査に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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