(57)【要約】小麦粉害虫を含む昆虫に由来するグルテン分解プロテアーゼが単離された。その精製された形態および組換えられた形態を用いて、グルテン含有食品を、グルテン不耐性を患う患者にとって安全なものにすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された形態、精製された形態、または組換えられた形態の、グルテンを含有する乾燥穀物製品を食する昆虫由来のグルテン分解プロテアーゼ。
【請求項２】
前記昆虫が小麦粉害虫(flour beetle)である、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
前記小麦粉害虫がコクヌストモドキ(Tribolium castaneum)である、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項４】
表1に記載されるプロテアーゼ、またはそのホモログ、オルソログ、もしくはバリアントである、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項５】
前記ホモログ、オルソログ、もしくはバリアントが、表1に記載されるプロテアーゼに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項4記載のプロテアーゼ。
【請求項６】
食料中のグルテンを8アミノ酸よりも短い断片に分解する、請求項4記載のプロテアーゼ。
【請求項７】
正常な消化酵素に耐性があるグルテン断片を消化する、請求項4記載のプロテアーゼ。
【請求項８】
薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項９】
食品と混合される、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項１０】
酸条件に対して安定である、請求項1記載のプロテアーゼ。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載のプロテアーゼのコード配列と、適切な宿主細胞中での該プロテアーゼの発現を駆動するプロモーターとを含む、グルテン分解プロテアーゼのための組換え発現ベクター。
【請求項１２】
グルテン含有食品を請求項1〜10のいずれか一項記載のプロテアーゼの1つまたは複数と接触させる段階を含む、食品中のグルテンを分解するための方法。
【請求項１３】
1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と混合された請求項1〜10のいずれか一項記載のプロテアーゼを含む、経口投与に適した薬学的製剤。
【請求項１４】
1つまたは複数の非昆虫プロテアーゼをさらに含む、請求項13記載の薬学的製剤。
【請求項１５】
前記非昆虫プロテアーゼが、オオムギ(Hordeum vulgare)のエンドプロテアーゼ(GenbankアクセッションU19384); アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)由来のX-Proジペプチダーゼ(GenBank ID# BD191984); アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)由来のカルボキシペプチダーゼ(GenBank ID# D25288); フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)のPEP (Genbank ID # D10980); スフィンゴモナス・カプスラータのPEP (Genbank ID# AB010298); ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)のPEP (Genbank ID# D25535); ラクトバチルス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)のPEP (Genbank ID# 321529); およびミクソコックス・クサントス(Myxococcus xanthus)のPEP (Genbank ID# AF127082)のうちの1つまたは複数である、請求項14記載の薬学的製剤。
【請求項１６】
以下の段階を含む、それを必要とする患者においてグルテン不耐性を処置するための方法であって、該処置によって免疫原性グルテンペプチドへの患者の曝露が低減する、方法：
グルテンを含有している可能性のある食品の摂取と同時に、請求項1〜10のいずれか一項記載のプロテアーゼの1つもしくは複数またはその薬学的製剤の治療的に有効な用量を、該患者に経口投与する段階。
【請求項１７】
1つまたは複数の非昆虫プロテアーゼの治療的に有効な用量を前記患者に経口投与する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記非昆虫プロテアーゼが、オオムギのエンドプロテアーゼ(GenbankアクセッションU19384); アスペルギルス・オリゼー由来のX-Proジペプチダーゼ(GenBank ID# BD191984); アスペルギルス・サイトイ由来のカルボキシペプチダーゼ(GenBank ID# D25288); フラボバクテリウム・メニンゴセプチカムのPEP (Genbank ID # D10980); スフィンゴモナス・カプスラータのPEP (Genbank ID# AB010298); ペニシリウム・シトリナムのPEP (Genbank ID# D25535); ラクトバチルス・ヘルベティクスのPEP (Genbank ID# 321529); およびミクソコックス・クサントスのPEP (Genbank ID# AF127082)のうちの1つまたは複数である、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、単離された形態、精製された形態、および組換えられた形態のグルテン分解プロテアーゼを提供し、食品中のグルテンの分解におけるその使用方法を提供する。したがって本発明は、生物学、食品調製、医学、および分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連する開示の説明
セリアックスプルーとしても公知のセリアック病、および疱疹状皮膚炎(「DH」)は、自己免疫疾患であり(かつこれらは同一疾患の異なる兆候である可能性がある)、グルテン感受性は、コムギおよび他の穀類において見られる貯蔵タンパク質である食事性グルテンによって引き起こされる状態(本明細書において、セリアック病、DH、およびグルテン感受性を「グルテン不耐性」と総称する)である。グルテン不耐性と診断された患者は、グルテン摂取量をゼロにすることを助言されるか、または自ら選択する。しかしながら、グルテンは食品中に多く見られるタンパク質であるため、患者はグルテンを避けることが非常に困難であり、不注意による暴露によって頻繁に再発をきたす。
【０００３】
米国特許第7,303,871号（特許文献1）には、プロテアーゼによるグルテン含有食品の前処理と、グルテンをその摂取と同時に分解するために経口投与されるプロテアーゼの使用とを伴うグルテン不耐性の治療が記載されている。米国特許第7,320,788号（特許文献2）には、スフィンゴモナス・カプスラータ(Sphingomonas capsulata)のプロリルエンドペプチダーゼ(PEP)などのPEP、およびオオムギ由来EPB2などのグルタミンエンドプロテアーゼの混合物を含む、これらの治療において有用なプロテアーゼの混合物が記載されている。経口投与のために製剤化された、オオムギEPB2およびS.カプスラータPEP (それぞれ、ALV001およびALV002と名付けた; PCT公開番号第2008/1115411号（特許文献3）および同第2008/115428号（特許文献4）を参照のこと)の組換え型で構成されるそのような混合物の1つが、現在、臨床試験中である。上記の特許および特許公報の各々は参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０００４】
プロテアーゼが経口投与の際に有効であるためには、活性でなければならないか、または、チモーゲン形態である場合、活性化しなければならず、かつ、存在する全てのグルテンを非免疫原性断片へと分解するのに十分な期間活性であり続けなければならない。免疫原性ペプチドは比較的小さい(およそ10アミノ酸)ものであり得るが、多くの場合には複数のコピーで、非常に大きなタンパク質の中に含まれる。消化管内の条件は厳しく、外因的に添加される全てのプロテアーゼが通常は分解され、よって、すぐに不活性となる。したがって、グルテン不耐性の処置において有用なプロテアーゼが当技術分野において依然として必要とされている。本発明はその需要を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第7,303,871号
【特許文献２】米国特許第7,320,788号
【特許文献３】PCT公開番号第2008/1115411号
【特許文献４】PCT公開番号第2008/115428号
【発明の概要】
【０００６】
第1の局面では、本発明は、乾燥穀物製品からタンパク質をもたらす昆虫由来のプロテアーゼを含むがこれに限定されない、昆虫細胞を含むがこれに限定されない真核細胞に由来するグルテン分解性のプロリン特異的プロテアーゼを提供する。そのような昆虫は非限定的に、小麦粉害虫(flour beetle)、例えばゴミムシダマシのトリボリウム(Tribolium)属またはテネブリオ(Tenebrio)属のメンバーを含み、これらは穀物サイロの害虫である。本発明の方法および組成物において有用なグルテン分解プロテアーゼを得るための関心対象の種は、コクヌストモドキ(Tribolium castaneum; red flour beetle)、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor; yellow meal worm)、ならびに、単離された形態、精製された形態、および組換えられた形態の、乾燥穀物製品由来、特にグルテン含有製品由来のタンパク質をその発育中に摂取する、他の生物を含む。本発明のプロテアーゼはまた、いくつかの態様では、PEG化型で提供される; 参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号2007/047303を参照されたい。
【０００７】
第2の局面では、本発明は、本発明のプロテアーゼのための組換え発現ベクター、およびコードするプロテアーゼを産生するためにそのようなベクターを使用するための方法を提供する。
【０００８】
第3の局面では、本発明は、単離された形態、精製された形態、または組換えられた形態の本発明のプロテアーゼとグルテン含有食品を接触させる段階を含む、食品中のグルテンを分解するための方法を提供する。そのような方法はまた、昆虫細胞に由来する2つまたはそれ以上のプロテアーゼの組み合わせを含む、組み合わされたプロテアーゼの使用を含む。他の態様では、昆虫由来プロテアーゼを非昆虫プロテアーゼと、例えばオオムギ(Hordeum vulgarum)のエンドペプチダーゼC、スフィンゴモナス・カプスラータのプロリルエンドペプチダーゼなどと組み合わせることができ、例えば本明細書において記載されるプロリン特異的プロテアーゼをオオムギのエンドペプチダーゼB (EPB2)と組み合わせることができる。本明細書において用いられる「組み合わせ」とは、別個の製剤中で同時に投与されうるか、または本発明によって共製剤化されうる2つまたはそれ以上のプロテアーゼを指す。いくつかの態様では、個人が、プロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを、食料と同時に、例えば食事の時間に摂取する。
【０００９】
第4の局面では、本発明は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と混合された、本発明によって提供されるプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを、単離された形態、精製された形態、または組換えられた形態で含む、経口投与に適した薬学的製剤および単位投与形態を提供する。適当な賦形剤には、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号2007/044906; 2008/115411; 2010/021752; および2010/042203に開示されているものが含まれる。
【００１０】
第5の局面では、本発明は、そのような処置を必要としている患者においてグルテン不耐性を処置するための方法を提供し、該処置により免疫原性グルテンペプチドへの患者の曝露が低減し、該方法は、単離された形態、精製された形態、もしくは組換えられた形態の本発明のプロテアーゼ、もしくは本発明の少なくとも1つのプロテアーゼを含むプロテアーゼの組み合わせ、またはその薬学的製剤を、治療的に有効な用量で、グルテンを含有している可能性のある食品の摂取と同時に該患者に経口投与する段階を含む。1つの態様では、患者はセリアック病を有する。他の態様では、患者は疱疹状皮膚炎を有する。別の態様では、患者は、グルテン不耐性を有すると診断されたことはないが、グルテンを摂取しないことが単純に好ましいかまたはグルテン感受性を有する。
【００１１】
本発明のこれらのおよびその他の局面および態様は、以下でさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】配列のアライメントおよびコンセンサス配列の決定。星印は厳密に保存された位置およびコドンを示し、ピリオドは、それぞれ多重配列アライメントの下で、強弱群の完全保存を示す。アライメントされた配列は、(SEQ ID NO:7) ヘモンカス・コントリウス(Haemonchus contortus)由来A5CG76；(SEQ ID NO:8) 線虫(Caenorhabditis elegans)由来NP_501599.1；(SEQ ID NO:9) カンポノタス・フロリダヌス(Camponotus floridanus)由来EFN71004；(SEQ ID NO:10) ハルペグナトス・サルテータ(Harpegnathos saltator)由来EFN78125；(SEQ ID NO:3) XP_972061；(SEQ ID NO:11) ギボシムシ(Saccoglossus kowalevskii)由来XP_002740665；(SEQ ID NO:1) XP_971305；(SEQ ID NO:2) XP_972807である。
【図１−２】図1-1の続きの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
態様の詳細な説明
本発明は、単離された形態、精製された形態、および/または組換えられた形態のグルテン分解プロテアーゼを提供する。消化管中でのグルテンの分解に関するこれらのプロテアーゼの好ましい特性の一部には、以下が含まれる：消化(GI)管中でのいっそう長い活性持続時間をもたらすGI管中でのプロテアーゼによる分解に対する耐性; 位置しうるペプチドまたはタンパク質のサイズにかかわらず免疫原性グルテンペプチドの分解を可能にする広い基質サイズ寛容性; グルテン分解活性におけるプロテアーゼによる相乗効果; 胃の酸性条件下での最適活性を促進する広いpH安定性および活性範囲; 胃内容排出が起きる前にグルテンの分解を可能にする好ましい動態; ならびに低グルテン濃度でさえもグルテン分解を可能にする、グルテンに対する低いKm。
【００１４】
本発明のいくつかの態様では、本発明のグルテナーゼは小麦粉害虫に、例えば、ゴミムシダマシのトリボリウム(Tribolium)属またはテネブリオ属のメンバーに由来し、これらは穀物サイロの害虫である。関心対象の小麦粉害虫は、非限定的に、コクヌストモドキ; ヒラタコクヌストモドキ(Tribolium confusum; confused flour beetle); クロヒラタコクヌストモドキ(Tribolium destructor; destructive flour beetle); チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor; mealworm beetle); コメノゴミムシダマシ(Tenebrio obscurus)などを含む。小麦粉害虫プロテアーゼの記載、例えばVinokurov et al. (2009) Arch Insect Biochem Physiol. 70(4):254-79; Goptar et al. (2008) Bioorg Khim. 34(3):310-6; Oppert et al. (2006) Bull Entomol Res. 96(2):167-72; Oppert et al. (2005) Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol.; およびLiang et al. (1991) FEBS Lett. 278(2):139-42を参照することができ、これらは参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【００１５】
例示的なプロテアーゼのアミノ酸配列は表1中のSEQ ID NOおよび他の識別情報を参照することにより、ならびにタンパク質(SEQ ID NO:1〜3)およびコードヌクレオチド配列(SEQ ID NO:4〜6)として配列表に記載されている。配列表はプロテアーゼのアミノ酸配列を提供し、さらに、6個のヒスチジンから構成される配列(6×hisタグ)およびトロンビン切断部位(LVPRGS)が、本発明の組換えプロテアーゼ型の1例を例証するために各プロテアーゼのC末端に示されている。この任意的な付加配列は、それを含む組換えプロテアーゼの金属アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製を容易にする。ヌクレオチド配列はピキア・パストリス(Pichia pastoris) (SEQ ID NO:4〜6)および大腸菌(Escherichia coli) (SEQ ID NO: 15、16)での発現のために最適化されるように天然配列から改変された。配列の領域は、SEQ ID NO 4〜6においてピキア・パストリス発現ベクターへのクローニングを容易にするために組換えDNA技術により導入された制限部位(5'末端のXhoIおよび3'末端のKpnI)またはSEQ ID NO 15〜16において大腸菌発現ベクターへのクローニングを容易にするために組換えDNA技術により導入された制限部位(5'末端のNcoIおよび3'末端のBamHI)を含む。
【００１６】
（表１）昆虫由来のプロリン特異的プロテアーゼの例
2013523133.tif 000002
【００１７】
本明細書において用いられる場合、プロリン特異的プロテアーゼとは、表1に示されるプロテアーゼもしくは表1に示されるプロテアーゼとの相同性を有する真核細胞由来のプロテアーゼ、またはどちらかのバリアントである。SEQ ID NO:9〜11に記載されるプロテアーゼも任意で含まれる。1つの態様では、プロテアーゼは昆虫由来プロテアーゼ、例えば小麦粉害虫のプロテアーゼである。したがって、本発明は、表1に記載される特異的配列に加えて、提供される配列のバリアント、ホモログおよびオルソログを提供する。バリアントは天然配列と実質的に類似であり、すなわち少なくとも1アミノ酸異なることができ、少なくとも2アミノ酸、しかし通常は約10アミノ酸以下異なることができる(相違の数は天然配列のサイズに依る)。配列変化は置換、挿入または欠失でありうる。アラニン、または他の残基を系統的に導入する系統的突然変異を用いて、バリアント配列において維持されるべき重要なアミノ酸を判定することができる。提供される配列のホモログまたはオルソログは、小麦粉害虫のいずれかにおける対応プロテアーゼを含み、かつ通常、アミノ酸レベルで少なくとも約50%の配列同一性、少なくとも約75%の配列同一性、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約85%の配列同一性、少なくとも約90%の配列同一性、少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも約99%の配列同一性、またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。種々の態様では、本発明のプロテアーゼは、いくつかのホモログの多重アライメントに基づくコンセンサス配列によって規定される任意のプロテアーゼであり、以下に提供される。多重配列アライメントは汎用の多重配列アライメントプログラムClustalW2を用いて行った。これは図1に示されており、ここでコンセンサス残基にはアライメントの下部に印が付けられている。
【００１８】
本発明のバリアント配列を提供するために使用できる保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下のグループ内における置換を含む: (グリシン、アラニン); (バリン、イソロイシン、ロイシン); (アスパラギン酸、グルタミン酸); (アスパラギン、グルタミン); (セリン、スレオニン); (リジン、アルギニン); および(フェニルアラニン、チロシン)。提供される配列のホモログまたはオルソログは、小麦粉害虫のいずれかにおける対応プロテアーゼを含み、通常、アミノ酸レベルで少なくとも約50%の配列類似性、少なくとも約75%の配列類似性、少なくとも約80%の配列類似性、少なくとも約85%の配列類似性、少なくとも約90%の配列類似性、少なくとも約95%の配列類似性、少なくとも約99%の配列類似性、またはそれ以上の配列類似性を有するであろう。
【００１９】
天然に存在するプロテアーゼのアミノ酸配列を、当技術分野において公知のさまざまな方法で改変でき、標的とする配列変化を生じることができ、よって本発明の異種配列を提供することができる。そのようなバリアントは、典型的には、機能的に保存されたバリアントであり、これは、通常は配列の点で、対応する天然タンパク質または親タンパク質とは異なるが、それでも、所望の生物学的活性および/もしくは機能を保持するか、または生物学的活性および/もしくは機能の増強を示す。当技術分野において公知のさまざまな方法、例えばランダム変異および標的変異と組み合わせたファージディスプレイ、走査変異の導入などを用いて、標的変化をもたらし、本発明の異種配列を提供することができる。本明細書において例示されるように、精製を補助するためのHisまたはエピトープタグの付加が含まれる。関心対象の特定の特徴を提供するように修飾された酵素を、酵素の活性を最適化するか、または例えば野生型のレベルに回復させるために、例えば当技術分野において公知のように、例えば、変異誘発、エクソンシャッフリングなどと、これに続くスクリーニングまたは選択によってさらに修飾し、そうして本発明の他の異種配列を提供することができる。
【００２０】
「プロテアーゼ」という用語はまた、生物学的に活性な断片を含む。関心対象の断片は、少なくとも約20個の隣接アミノ酸、より一般的には少なくとも約50個の隣接アミノ酸の断片を含み、100個またはそれ以上のアミノ酸、最大で完全なタンパク質を含むこともあり、さらなる配列を含むようにさらに伸長されることもある。いずれの場合でも、重要な基準は、断片がグルテンオリゴペプチドを消化する能力を保持しているかどうかである。
【００２１】
一次配列を変化させないが本発明の他の異種プロテアーゼを提供する、プロテアーゼに対する関心対象の修飾には、タンパク質の化学的誘導体化、例えば、例えばラウリル基、ステアリル基、ミリスチル(myrsityl)基、デシル基もしくは他の基による、アシル化; PEG化、エステル化; および/またはアミド化が含まれる。そのような修飾を用いて、例えばPEG側鎖またはラウリル基を表面のリジンに結合させることによって、タンパク質分解に対する酵素の耐性を高めることができる。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセッシングの際にまたはさらなるプロセッシング段階でタンパク質のグリコシル化パターンを修飾することにより行われる; 例えばタンパク質を、哺乳類のグリコシル化酵素もしくは脱グリコシル化酵素などの、グリコシル化に影響する酵素に曝露することにより行われる、グリコシル化の修飾も含まれる。リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も含まれる。
【００２２】
一次配列に影響しない別の形の修飾は、活性に必要とされない配列の切断または除去、および、プロテアーゼが活性となる前に除去されなければならない配列の除去である。後者のタイプの修飾の周知の例はチモーゲンの活性化である。チモーゲンは、タンパク質分解的切断によって活性なプロテアーゼに変換される不活性型のプロテアーゼである。したがって、本発明によれば、プロテアーゼは、チモーゲンが作用部位で(すなわち、唾液もしくは胃の中で)活性化されるか、または、それらをグルテン含有食品と接触させる前にもしくはその前に同時に前活性化される限り、チモーゲンとして用いることができる。例えば、産生またはプロセッシングを促進するためにチモーゲン型のプロテアーゼとして用い、その後、使用前に、チモーゲンのプロペプチド領域が切断され(および任意で該活性プロテアーゼから精製して除去され)るような処理に供してもよい。チモーゲン型のそのような前活性化を利用して、例えば、製剤の投薬を簡単にし、および/または作用部位での活性化の必要性を低減してもよい。
【００２３】
タンパク質分解に対する耐性、および/または胃内に見られるような酸性条件に対する耐性を改善するために、ならびに可溶性の特性を最適化するために、もしくは治療剤としてより適切なものとするために、分子生物学的手法および/または化学的手法によって修飾されたタンパク質も、本発明の実践および本発明によって提供される実践において有用である。例えば、ペプチダーゼの主鎖を環状化して、安定性を高めることができる(Friedler et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:23783-23789を参照のこと)。このようなタンパク質の類似体は、天然のL-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または非天然の合成アミノ酸を含有するものを含む。
【００２４】
本発明のプロリン特異的プロテアーゼは、任意の真核生物酵素を含み、例えば、セリアック病患者に対して免疫原性であるグルテンオリゴペプチドの切断に関して、特に、比較的長い、生理学的に作出されたペプチド、例えばα-グリアジン由来の33-mer
2013523133.tif 000003
およびγ-グリアジン由来の26-mer
2013523133.tif 000004
の切断に関して、少なくとも約2.5 s-1 M-1、通常は少なくとも約250 s-1 M-1、および好ましくは少なくとも約25000 s-1 M-1のkcat/Kmを有する、組換え型または精製型の昆虫プロテアーゼ、例えば小麦粉害虫のプロテアーゼを含むが、これらに限定されない。本発明のプロテアーゼは、消光された蛍光発生基質
2013523133.tif 000005
に対する特異性kcat/Kmが2 mM-1 s-1を上回るペプチダーゼまたはプロテアーゼを含む。これらのアッセイ法は、HPLCまたは蛍光分光法によりモニタリングすることができる。後者のアッセイ法の場合、適当なフルオロフォアを、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に結合させることができる。
【００２５】
本発明の実践において有用なプロテアーゼは、前処理した基質を切断して毒性(本明細書において用いられる「毒性」とは、セリアック病患者において有害な免疫反応を生み出しうることを意味する)グルテンオリゴペプチドを除去するその能力によって特定することができ、ここで「前処理した基質」とは、ペプシン(1:100質量比)、トリプシン(1:100)、キモトリプシン(1:100)、エラスターゼ(1:500)、ならびにカルボキシペプチダーゼAおよびB(1:100)を含む、生理学的量の胃および膵臓のプロテアーゼで処理されたグリアジン、ホルデイン、セカリンまたはアベニンタンパク質である。ペプシンによる消化は、胃内における消化を再現したpH 2における20分間の処理によって実施することができ、続いて反応混合物を十二指腸における分泌型の膵臓酵素による消化を再現した、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼによるpH 7における1時間のさらなる処理に供する。前処理した基質は、例えば生理学的条件の下で消化に耐性を示すオリゴペプチドを含む。グルテナーゼは、PQPQLPYPQより長いのが産物の10%未満となるように(A215でモニタリングされるC18逆相HPLCカラム上での比較的長い保持時間によって判断される)、ペプシン-トリプシン-キモトリプシン-エラスターゼ-カルボキシペプチダーゼ(PTCEC)で処理されたグルテンの切断を触媒しうる。本発明のプロテアーゼを特徴付けるのに適したグルテナーゼアッセイ法はまた、米国特許第7,303,871号; 同第7,320,788号; および同第7,534,426号に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
前処理した基質をプロテアーゼが切断する能力は、37℃で1時間インキュベートされた、1 mg/mlの前処理基質および10 μg/mlのペプチダーゼまたはプロテアーゼを含有する反応混合物中で、酵素が遊離NH2末端の濃度を上昇させる能力を測定することによって決定することができる。本発明の実践において有用なプロテアーゼは、このような条件の下で、遊離アミノ末端の濃度を、一般的には少なくとも約25%、より一般的には少なくとも約50%、および好ましくは少なくとも約100%上昇させる。プロテアーゼには、10 μg/mlの酵素との1時間のインキュベーション後に、1 mg/mlの「前処理した基質」中で約1000 Da超のオリゴペプチドの残存モル濃度を少なくとも約1/2、一般的には少なくとも約1/5、および好ましくは少なくとも約1/10に低下させる能力を有する酵素が含まれる。このようなオリゴペプチドの濃度は、当技術分野において公知の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー法などによって推定することができる。
【００２７】
本発明のプロテアーゼは、セリアック病患者の腸生検に由来するポリクローナルT細胞株によってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができ; LC-MS-MSによってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができ; かつ/または、グリアジンに特異的な配列を認識する能力を有するモノクローナル抗体を使用するELISA法によってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができる、酵素を含む。本発明のプロテアーゼはまた、セリアック病患者における「グルテン負荷試験食」に対する抗tTG抗体応答を、少なくとも約1/2、より一般的には少なくとも約1/5、および好ましくは少なくとも約1/10に低下させる酵素を含むことができる。「グルテン負荷試験食」は、直前までグルテン非含有食を摂取していたセリアック病の成人患者による3日間のパン100 g/日の摂取と定義される。抗tTG抗体応答は、当技術分野において公知のように、標準的な臨床診断手順を用いて末梢血中で測定することができる。
【００２８】
本発明の実践において有用なプロテアーゼはまた、組換え産生系からおよび天然源から、従来の方法にしたがって単離および精製することができる。プロテアーゼの産生は、大腸菌、出芽酵母(S. cerevisiae)、ピキア・パストリス(P. pastoris)、ラクトバチルス(Lactobacilli)、バチルス(Bacilli)およびアスペルギルス(Aspergilli)などの生物における、確立された宿主-ベクター系を用いて達成することができる。組込み型または自己複製型のベクターをこの目的で用いることができる。このような宿主の一部では、プロテアーゼが細胞内タンパク質として発現され、その後、精製されるが、他の宿主では、酵素が細胞外培地中に分泌される。タンパク質の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、Ni-アフィニティークロマトグラフィー(もしくはいくつかの代替的なクロマトグラフィー法)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および/または他の精製法の組み合わせにより行うことができる。典型的には、本発明の実践において用いられる組成物は、所望の産物の少なくとも20重量%、より一般的には少なくとも約50重量%、好ましくは少なくとも約85重量%、少なくとも約90%を含み、および治療目的では、産物の調製およびその精製法に関連する混入物に関して少なくとも約95重量%である場合がある。一般的には、これらの百分率は全タンパク質に基づく。このような組成物中のタンパク質は、少なくとも約500 μg/ml; 少なくとも約1 mg/mg; 少なくとも約5 mg/ml; 少なくとも約10 mg/mlまたはそれ以上の濃度で存在する場合がある。適当な方法には、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号2008/115428に記載されているものが含まれる。
【００２９】
1つの局面では、本発明は昆虫由来プロテアーゼの精製された調製物を提供する。このような酵素は天然源から単離されうるが、本発明は組換え法によってそれらを産生可能にする。1つの態様では、このような方法では発現用に細菌宿主を利用するが、一部の目的には、昆虫系を含む、真菌系および真核系が有用である。シグナル配列を含むコード配列、またはシグナル配列を含むように人工的に作られたコード配列を、細菌宿主の細胞周辺腔中に分泌させることができる。次に浸透圧ショックプロトコルを用いて、細胞周辺腔のタンパク質を上清中に放出させることができる。
【００３０】
酵素が細胞質酵素である場合、周辺質分泌のためにシグナル配列を導入してもよく、または酵素を細胞質溶解物から単離してもよい。精製方法は、例えばヒスチジンタグの導入と組み合わせる、Ni-NTAアフィニティー精製; および当技術分野において公知のクロマトグラフィー法、例えば陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、HPLC、FPLCなどを含む。
【００３１】
安定な保存などのさまざまな目的のために、酵素を凍結乾燥させることができる。凍結乾燥は好ましくは、例えば少なくとも約1 mg/mlの、最初に濃縮された調製物に対して行われる。Pegを加えて酵素の安定性を高めることができる。MX PEPを、比活性を損なうことなく凍結乾燥できることが分かっている。凍結乾燥した酵素および賦形剤は、腸溶コーティングが施されたカプセル剤または錠剤の製造において有用であり、例えば1個のカプセル剤または錠剤は少なくとも約1 mgの酵素、一般的には少なくとも約10 mgの酵素を含んでよく、少なくとも100 mgの酵素、少なくとも約500 mgの酵素、またはそれ以上を含んでよい。かなりの割合の活性が保持され、かつ少なくとも約1ヶ月間にわたり4℃で安定となる、コーティングを施すことができる。
【００３２】
酵素の組み合わせの目的に関して、以下の非限定的なプロテアーゼの一覧が関心対象となる: オオムギ(Hordeum vulgare)のエンドプロテアーゼ(GenbankアクセッションU19384); アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)由来のX-Proジペプチダーゼ(GenBank ID# BD191984); アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)由来のカルボキシペプチダーゼ(GenBank ID# D25288); フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)のPEP (Genbank ID # D10980); スフィンゴモナス・カプスラータのPEP (Genbank ID# AB010298); ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)のPEP (Genbank ID# D25535); ラクトバチルス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)のPEP (Genbank ID# 321529); およびミクソコックス・クサントス(Myxococcus xanthus)のPEP (Genbank ID# AF127082)。関心対象の組み合わせには、2つまたはそれ以上の昆虫由来プロテアーゼが含まれる。他の態様では、昆虫由来プロテアーゼを非昆虫由来プロテアーゼ、例えばオオムギのエンドペプチダーゼC、スフィンゴモナス・カプスラータのプロリルエンドペプチダーゼなどと組み合わせることができ、例えば本明細書において記載されるプロリン特異的プロテアーゼをオオムギのエンドペプチダーゼB (EPB2)などと組み合わせることができる。組み合わせにより、複数のプロテアーゼが別個の製剤中で同時に投与されるか、または共製剤化されることが意図される。いくつかの態様では、プロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせが個体によって食料と同時に、例えば食事の時間に摂取される。各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,303,871号および同第7,320,788号ならびにPCT公開番号2010/047733、2009/075816および2008/115411に記載されているプロリン特異的プロテアーゼおよびグルタミン特異的プロテアーゼは、そのような組み合わせで用いるのにとりわけ適している。本発明の組み合わせ製剤で用いるのに適した他のグルタミン特異的プロテアーゼは、発明者Pawan Kumarによって本発明と同日付で出願され、「Proteases for Degrading Gluten」(代理人整理番号ALVN-010PRV2)という名称を付され、参照により本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国仮特許出願に記載されている。
【００３３】
本発明のプロリン特異的なグルテン分解プロテアーゼは、ある種の利点を提供する。それらは、昆虫消化系の酸性部分において天然に存在するプロテアーゼに由来し、またはそのプロテアーゼと極めて相同であり、そのため、その機能的pH範囲は酸性範囲内であり、このことにより、ヒト胃内でグルテンを分解するのに理想的となる。プロテアーゼは他の昆虫消化プロテアーゼのタンパク質分解に対する安定性を有し、多くの昆虫消化プロテアーゼはヒト消化プロテアーゼと相同であるため、タンパク質分解耐性のこの特性はヒト消化プロテアーゼに当てはまる。プロテアーゼは、その天然環境において、食事が排泄される前にタンパク質を分解しなければならず、そのため、食事の消化に好ましい動態を有する。多くの穀物ではグルテンを貯蔵タンパク質として用いるので、本発明のプロテアーゼはグルテンを特異的に分解するように進化させた。グルテンはグルタミンおよびプロリン残基に富んでおり、本発明のプロテアーゼのある種のものはプロリン特異的である。これらのプロリン特異的プロテアーゼは、本発明によれば、オオムギEPB2プロテアーゼまたはその組換え型ALV001などのグルタミン特異的プロテアーゼと組み合わせて、極めて強力な、グルテン分解性のプロテアーゼ混合物を作出することができる。
【００３４】
本発明の方法ならびに特定の患者または用途におけるその有効性を判定するための検査は、本明細書における教示にしたがい、当技術分野において標準的な手順を用いて行うことができる。したがって、本発明の実践では、当業者の技術の範囲内の分子生物学(組換え法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来法を利用することができる。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、second edition (Sambrook et al., 1989); 「Oligonucleotide Synthesis」 (M.J. Gait, ed., 1984); 「Animal Cell Culture」 (R.I. Freshney, ed., 1987); 「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.); 「Handbook of Experimental Immunology」(D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); 「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); 「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M. Ausubel et al., eds., 1987); 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis et al., eds., 1994); および「Current Protocols in Immunology」(J.E. Coligan et al., eds., 1991)などの文献、ならびにこれらの全ての最新版または改訂版に詳しく説明されている。
【００３５】
本発明の目的に関して、毒性グリアジンオリゴペプチドとは、食用穀物、例えばコムギ、ライムギ、オオムギなどに由来するグリアジンおよび関連する保存タンパク質の正常ヒト消化に際して誘導されるペプチドであり、これらはセリアック病患者において免疫原性である、例えば、T細胞に対する抗原として作用する。免疫原性ペプチドは一般的に、約8〜20アミノ酸長であり、より一般的には約10〜18アミノ酸またはそれ以上である。そのようなペプチドはPXPモチーフを含むことができる。オリゴペプチドが特定の患者に対して免疫原性であるかどうかの判定は、当業者に公知の標準的なT細胞活性化および他のアッセイ法によって容易に下される。候補酵素が毒性グルテンオリゴペプチドを消化するかどうかの判定は、経験的に下すことができる。例えば、候補をオリゴペプチドと混合してもよく、または、生理学的量の胃および膵臓のプロテアーゼで処理されたグリアジン、ホルデイン、セカリンもしくはアベニンタンパク質の1つもしくは複数を含む前処理した基質と混合してもよい。各場合において、酵素がオリゴペプチドを切断できるかどうかが判定される。そのようなアッセイ法のためのオリゴペプチドまたはタンパク質の基質は合成、組換え法、天然源からの単離などの従来の技法にしたがって調製することができる。例えば、固相ペプチド合成では、アミノ酸の連続的付加を伴って、直線状のペプチド鎖を作出する(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154を参照のこと)。組換えDNA技術を用いてペプチドを作出することもできる。
【００３６】
毒性オリゴペプチドの消化のレベルをベースライン値と比較することができる。グルテンを、10アミノ酸長未満のペプチド、例えば8アミノ酸のペプチド、6アミノ酸のペプチド、またはさらに短いペプチドに分解すると、毒性がかなり低くなる。出発物質の消失および/または消化産物の存在は、インビトロおよびインビボアッセイ系を含むモデル系において、従来の方法によりモニタリングすることができる。例えば、検出可能なマーカーをペプチドに結合させることができ、次に、例えば酸沈殿法、分子量排除などで、マーカーと関連する分子量の変化を判定する。ベースライン値は、対照試料の値、または対照集団を代表する統計値であることができる。観察された活性が信頼できるものであることを確実とするために、同時に行われる平行反応、陽性および陰性の対照、ならびに用量反応などを含む、さまざまな対照を実施することができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明の組換えプロテアーゼのコード配列を含む組換え核酸を提供する。これらの組換え核酸には、ピキア・パストリス、大腸菌、または、そのようなタンパク質（またはそのバリアント）が天然で産生される細胞にとっては異種である、他の宿主細胞における発現のために最適化された1つまたは複数のコドンを含むヌクレオチド配列を有するものが含まれる。最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列表の中にSEQ ID NO:4〜6として提供されている。
【００３８】
本発明はまた、宿主細胞におけるコード配列の発現を駆動するように位置付けられたプロモーターに機能的に連結されている本発明のプロテアーゼをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明はまた、プロテアーゼの発現に適した条件の下で本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を培養する段階を含む、本発明のプロテアーゼを産生するための方法を提供する。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「市販の」化合物は、Acros Organics (Pittsburgh PA)、Aldrich Chemical (Milwaukee WI, Sigma ChemicalおよびFlukaを含む)、Apin Chemicals Ltd. (Milton Park, UK)、Avocado Research (Lancashire, U.K.)、BDH Inc. (Toronto, Canada)、Bionet (Cornwall, U.K.)、Chemservice Inc. (West Chester, PA)、Crescent Chemical Co. (Hauppauge, NY)、Eastman Organic Chemicals、Eastman Kodak Company (Rochester, NY)、Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, PA)、Fisons Chemicals (Leicestershire, UK)、Frontier Scientific (Logan, UT)、ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA)、Key Organics (Cornwall, U.K.)、Lancaster Synthesis (Windham, NH)、Maybridge Chemical Co. Ltd. (Cornwall, U.K.)、Parish Chemical Co. (Orem, UT)、Pfaltz & Bauer, Inc. (Waterbury, CN)、Polyorganix (Houston, TX)、Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)、Riedel de Haen AG (Hannover, Germany)、Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, NJ)、TCI America (Portland, OR)、Trans World Chemicals, Inc. (Rockville, MD)、Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, VA)、NovabiochemならびにArgonaut Technologyを含むがこれらに限定されない、商業的供給源から得ることができる。
【００４０】
本発明のプロテアーゼおよび処理済の食品との同時投与に有用な化合物は、当業者に公知の方法によって作出することもできる。本明細書において用いられる場合、「当業者に公知の方法」は、さまざまな参考文献およびデータベースを通じて特定することができる。本発明の化合物の調製において有用な反応物の合成について詳述した適当な参考書および専門書、または調製に関して記載された記事の参考文献は、例えば、「Synthetic Organic Chemistry」, John Wiley & Sons, Inc., New York; S. R. Sandler et al.,「Organic Functional Group Preparations」, 2nd Ed., Academic Press,, New York, 1983; H. O. House, 「Modern Synthetic Reactions」, 2nd Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif. 1972; T. L. Gilchrist, 「Heterocyclic Chemistry」, 2nd Ed.,  John Wiley & Sons, New York, 1992; J. March, 「Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure」, 4th Ed., Wiley-Interscience, New York, 1992を含む。特異的かつ類似の反応物は、大半の公共図書館および大学図書館で、ならびにオンラインデータベース(the American Chemical Society, Washington, D.C., 詳細については連絡可能)を通じて利用可能な、米国化学会のケミカルアブストラクトサービス(Chemical Abstract Service)によって調製された既知化合物のインデックスによって特定することもできる。公知ではあるがカタログにて市販されていない化合物はカスタム化学合成業者によって調製することができ、多くの標準的な化合物供給業者(例えば上記の業者)がカスタム合成サービスを提供している。
【００４１】
本発明のプロテアーゼ、ならびに/または、それとともに投与される化合物および酵素の組み合わせは、治療的投与のためにさまざまな製剤中に組み入れられる。1つの局面では、このような剤は、薬学的に許容される適切な担体または希釈剤との組み合わせにより薬学的組成物に製剤化され、かつ、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル、微粒子、およびエアロゾルなどの、固体、半固体、液体または気体の形態で調製物に製剤化される。したがって、プロテアーゼおよび/または他の化合物の投与はさまざまな方法で、一般的には経口投与により達成することができる。プロテアーゼおよび/または他の化合物は、投与後に全身移行性であってもよく、または、製剤化によって、もしくは活性用量を移植部位に保持するように作用する移植片の使用により、局所性であってもよい。
【００４２】
薬学的投与形態では、プロテアーゼおよび/または他の化合物を、その薬学的に許容される塩の形態で投与することができ、または、単独でもしくは適切な関係で、ならびに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて、使用することもできる。剤を、既述のように組み合わせて、タンパク質分解活性のカクテルを提供することができる。以下の方法および賦形剤は例示的であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４３】
経口調製物の場合、剤は単独で、または、錠剤、粉末剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製するための適切な添加物と組み合わせて、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチもしくはポテトスターチなどの従来の添加物と; 結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチンなどの結合剤と; コーンスターチ、ポテトスターチもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と; タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と; および、望ましいならば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および着香剤とともに、用いることができる。
【００４４】
グルテン感受性を有する個体のためのグルテンの無毒化は、食物が胃に入ると直ちに始まりうる。というのは、胃の酸性環境(およそpH 2〜4)はグルテンの可溶化に有利に働くからである。プロテアーゼの胃内への導入は、ペプシンの作用と相乗的に作用し、これにより、セリアック病患者の小腸内へのグルテン侵入の際の毒性ペプチドの崩壊の加速がもたらされる。そのようなプロテアーゼは、腸溶性の製剤化を必要としえない。
【００４５】
別の態様では、プロテアーゼを食品と混合するか、または、グルテンを含有する食品を前処理するために用いる。食品中で混合されるプロテアーゼは、摂取前または摂取中に酵素的に活性であることができ、活性のタイミングを制御するためにカプセルに充填するか、または別の方法で処理することができる。あるいは、プロテアーゼをカプセルに充填して、摂取後の、例えば摂取から一定時間後のおよび/または腸管内の所定の位置での持続放出を達成することができる。
【００４６】
製剤は典型的には、単位投与形態で提供され、ここで「単位投与形態」という用語は、ヒト対象への単位投与量として適した物理的に不連続な単位であって、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体または媒体と関連して所望の効果を十分に生じると算出された量で、所定量のプロテアーゼを含有する。本発明の単位投与形態の仕様は、利用される特定の複合体、および達成されるべき作用、ならびに宿主における各複合体と関連する薬物動態に依る。
【００４７】
媒体、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤が市販されている。さらに、pH調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も市販されている。本発明の方法および組成物において有用な任意の化合物は、薬学的に許容される塩基付加塩として提供され得る。「薬学的に許容される塩基付加塩」とは、遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持している塩を指し、これは、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない。このような塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することで調製される。無機塩基に由来する塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などを含むがこれらに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩である。有機塩基に由来する塩は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの、一級、二級、および三級のアミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂を含むがこれらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。
【００４８】
処置される患者および条件に応じて、ならびに投与経路に応じて、プロテアーゼを0.01 mg〜500 mg/kg体重/日の投与量、例えば約1〜100 mg/kg体重/日の投与量、例えば、平均的な人では20 mg/kg体重/日の投与量で、投与することができる。成人のインビボにおけるグルテンの効率的なタンパク質分解では、治療的に有効な酵素が少なくとも約500単位、もしくは少なくとも約5000単位、もしくは少なくとも約50,000単位、少なくとも約500,000単位、またはそれ以上、例えば、約5×106単位もしくはそれ以上必要であり得、ここで1単位は、指定の条件下で選択した基質を1分間あたり1 μmol加水分解するのに必要な酵素の量と定義される。用量は増加可能であるが、有用な投与量を超えてもさらなる利益は得られない場合があることを、当業者は理解するであろう。経口的に投与される本発明のプロテアーゼは無毒性であり、従って投与されるプロテアーゼの量は、一緒に摂取される食品中のグルテンの相当量(例えば、50%もしくはそれ以上、例えば90%もしくは99%)または全てを分解するのに十分な用量を超えうることを当業者は理解するであろう。小児用製剤の場合、投与量は適切に調節される。小児では、有効な用量はもっと低くなりうる。併用療法では、同等の用量の2種類の酵素が投与されうる; しかしながら、その比は例えば、2種類の酵素の、活性の相乗効果ならびに/または胃および十二指腸での不活性化に対する相対的安定性の影響を受けうる。
【００４９】
セリアック病または他の形態のグルテン不耐性のプロテアーゼ処置は、食事前または食事とともに施される場合に最も有効であると予想される。しかし、食品は胃内に0.5〜2時間留まりうるので、プロテアーゼは食後1時間以内までに投与することもできよう。本発明のいくつかの態様では、製剤は、選択されたプロテアーゼのカクテル、例えば本発明のプロテアーゼとスフィンゴモナス・カプスラータのPEP、オオムギのシステインエンドプロテアーゼBなどのうちの1つまたは複数との組み合わせを含む。そのような組み合わせによって、さらに大きな治療効果を達成することができる。
【００５０】
特定の酵素、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性に応じて用量レベルが変わりうることを、当業者は容易に理解するであろう。一部のプロテアーゼは、他のものよりも強力である。所与の酵素に関して好ましい投与量は、当業者によってさまざまな手段で容易に判定可能である。好ましい手段は、所与の化合物の生理学的な効力を測定することである。
【００５１】
本発明の組成物は、治療目的だけでなく予防目的でも使用することができる。本明細書において用いられる場合、「処置する」という用語は、疾患の予防および疾患または既存の状態の処置の両方を指し、より一般的には、グルテン摂取が患者に毒性効果を及ぼすことの予防、またはプロテアーゼ治療の非存在下での同量のグルテンの摂取の毒性効果と比べた、毒性の低減を指す。本発明は、進行中の疾患の処置における重大な進歩をもたらし、かつ、患者の臨床症状の安定化および/または改善に役立つ。そのような処置は望ましくは、罹患組織の機能喪失の前に実施されるが、失われた機能を回復させるのに、またはさらなる機能喪失を防ぐのにも役立ちうる。治療効果の証拠は、疲労、慢性の下痢、栄養吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血、皮膚発疹などの症状、ならびにセリアック病および/または疱疹状皮膚炎および/またはグルテン感受性の他の症状の重症度によって特に測定される、疾患の重症度の何らかの減少でありうる。他の疾患の兆候は、グルテンに特異的な抗体の存在、組織トランスグルタミナーゼに特異的な抗体の存在、炎症促進性T細胞およびサイトカインの存在、組織学的検査または他の検査によって明らかとなる小腸の絨毛構造の損傷、腸の透過性の昂進などを含む。
【００５２】
本発明の方法により処置されうる患者には、1回もしくは複数回の血清学的検査、例えば抗グリアジン抗体、抗トランスグルタミナーゼ抗体、抗筋肉膜抗体; 例えばセリアック病変を特定するための内視鏡による評価; 例えば、繊毛萎縮、陰窩過形成、上皮内リンパ球の浸潤を検出するための小腸粘膜の組織学的評価; およびグルテンの食事への含有に依る任意のGI症状によって、セリアック病または他のグルテン不耐性と診断された患者が含まれる。
【００５３】
経口プロテアーゼの安全性を考慮すれば、これらを、I型糖尿病、セリアック病患者、疱疹状皮膚炎患者であると診断された者の家族、HLA-DQ2陽性の者、および/または正式な診断は未だ下されていないグルテン関連症状が見られる患者などの高リスク集団において、予防的に使用することもできる。このような患者は、通常用量または低用量(通常用量の10〜50%)の酵素によって治療される可能性がある。同様に、このような剤の一時的な高用量での使用もまた、例えば便中脂肪排泄アッセイ法で判断されるような、腸の機能が未だ正常に戻っていないグルテン媒介性腸疾患から回復中の患者に対して予想される。
【００５４】
本発明から利益を得る可能性のある患者は、任意の年齢であってよく、成人および小児を含んでよい。特に小児は予防的治療による利益を得る。というのは、毒性グルテンペプチドに対する早期曝露の予防により、該疾患の初回発生を防ぐことが可能であるからである。予防に適した小児は、素因の遺伝的検査によって、例えばHLA分類よって、家族歴によって、T細胞アッセイ法によって、または他の医学的手段によって特定することができる。当技術分野において公知のように、小児使用の際には、投与量を調節することができる。
【００５５】
治療効果は、臨床転帰に関して測定してもよく、または免疫学的もしくは生化学的な検査によって判定してもよい。有害なT細胞活性の抑制は、反応性Th1細胞の計数によって、病変部位におけるサイトカインの放出の定量によって、または、自己免疫性T細胞の存在についての当技術分野で公知の他のアッセイ法を用いて測定することができる。あるいは、疾患の症状の緩和を調べることができる。
【００５６】
さまざまな投与法を利用することができ、好ましくは、例えば食事を用いる経口投与が使用される。治療用製剤の投与量は、疾患の性質、投与頻度、投与様式、宿主からの剤のクリアランスなどに応じて大きく変動する。初回用量を多くして、その後、より少量の維持用量を続けることができる。用量は、週に1回もしくは2週に1回という低頻度で投与することができ、または、より少量に分けてより頻繁に、食事と共に毎日、週2回、もしくはそれ以外で、有効投与量レベルを維持するための必要に応じて、投与することができる。
【００５７】
本発明のさまざまな局面および態様は、以下の実施例において非限定的に例証される。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、当業者に提供する目的で、本発明の作製法および使用法の完全な開示および説明とともに記載し、かつ本発明の範囲を制限するか、または以下に示す実験が全てであるか、もしくは実施された唯一の実験であることを意味する意図はない。使用される数値(例えば量、温度など)に関して精度を高めるための取り組みが成されているが、ある程度の実験誤差および偏差が存在する可能性はある。特に明記された部分を除き、割合(part)は重量の割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、および圧力は大気圧または大気圧の近傍である。
【００５９】
消化環境においてグルテンを分解するのに好ましいプロテアーゼの特性には、以下が含まれる：酵素の持続時間をより長くするための、消化管に存在する他のプロテアーゼに対する耐性; 可能性のある最も小さな断片へとグルテンを分解するための、およびまた、酵素の組み合わせが用いられる場合には2つのプロテアーゼの相乗効果を促進するための、ペプチドサイズに対する広い特異性; 胃の酸性条件下で酵素を機能させるための広いpH安定性および動作範囲; 胃内容排出前にグルテンの大部分を分解するために好ましい動態; ならびに、低グルテン濃度でのグルテン分解速度を顕著に低下させることなくグルテンの分解を可能にするための、グルテンに対する低いKm。
【００６０】
乾燥穀物製品からタンパク質をもたらす昆虫、例えば小麦粉害虫を含むいくつかの天然供給源において、酵素は上記の特徴とともに進化してきた。小麦粉害虫は、コクヌストモドキ、ヒラタコクヌストモドキ; クロヒラタコクヌストモドキ; チャイロコメノゴミムシダマシ; コメノゴミムシダマシなどを含む。小麦粉害虫のグルテン分解酵素は以下の利点のうちの1つまたは複数を有する: それが作用する昆虫消化系の部分は酸性であり、それゆえ、消化酵素の機能的なpH範囲は酸性である; 他のプロテアーゼと比べて、該酵素は、他の酵素消化プロテアーゼに対してタンパク質分解に対する安定性を有する。というのは、これらが互いの存在下で機能するように進化してきたからである。昆虫の消化プロテアーゼの多くはヒト消化プロテアーゼと相同であるので、タンパク質分解耐性はヒトでの消化環境に引き継ぐことができる。消化プロテアーゼは、食事が排泄される前にタンパク質を素早く分解しておかなければならないので、酵素は食事の消化に好ましい動態を有する。多くの穀物は貯蔵タンパク質としてグルテンを有しており、それゆえ、消化酵素は、グルテンの分解が昆虫にとって好都合な環境において進化してきた。グルテンはグルタミンおよびプロリン残基に富んでいるため、これらの消化酵素プロテアーゼは、グルタミンおよび/またはプロリンに富むタンパク質の切断において効率的である。
【００６１】
コクヌストモドキのゲノムが最近になって公表され(Nature, 452(7190):949-55, 2008)、200種超の推定プロテアーゼがゲノムにおいて特定された。プロテアーゼ配列が分類され、機能が既知のプロテアーゼとの比較に基づき推定機能が割り当てられている。同様に、チャイロコメノゴミムシダマシ(T. molitor)の場合、幼虫期中腸cDNA転写産物が分析され、幼虫期中腸において発現されるプロテアーゼが特定され分類された(Insect Molecular Biology (2007) 16 (4), 455-468)。本発明によれば、これらのプロテアーゼのいくつかがプロリン特異的プロテアーゼとの相同性によりプロリン特異的グルテナーゼとして選択された。これらのプロテアーゼは上記の表1に、および配列表に記載されている。
【００６２】
ピキア・パストリスにおけるプロリン特異的プロテアーゼのクローニングおよび発現:
コドン最適化したヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 4〜6)を合成し、PichiaPINK(登録商標)キット(Invitrogen)を用いたピキア・パストリス菌株1での分泌発現のために各プロテアーゼのN末端にα-接合因子配列を付加して、pPINK-HCベクター(Invitrogen)のXhoIとKpnIとの間にクローニングした。α-接合因子分泌シグナルはタンパク質の分泌によって除去される。エレクトロコンピテント細胞を調製し、発現プラスミドで形質転換した。PichiaPinkキット中の菌株はade2栄養要求株であった。発現プラスミドはADE2遺伝子を含んでおり、これがアデニン栄養要求株を補完した。発現プラスミドでのPichiaPink菌株の形質転換により、アデニンを欠く培地(Adeドロップアウト培地または最少培地)上で菌株が増殖できるようになる。形質転換体をAdeドロップアウトプレート上で選択し、プロテアーゼの発現についてスクリーニングした。
【００６３】
タンパク質発現のため、10 mLの開始培養物を50 mLのFalcon(登録商標)試験管に入れた緩衝化グリセロール複合培地(Buffered Glycerol-complex Medium; BMGY)中にて48時間24〜28℃で増殖させた。開始培養物を用いて、2 Lの振盪フラスコ中のBMGY 500 mLに接種した。細胞を250 rpmで振盪させながら24〜28℃で48時間増殖させた。細胞を遠心分離し、1%メタノールと複合された緩衝化メタノール複合培地(Buffered Methanol-complex Medium; BMMY) 100 mL中に再懸濁して、メタノール誘導性AOX1プロモーターの制御下でタンパク質の発現を誘導した。250 rpmで振盪させながら、24時間後に0.5%のメタノールを補完して、24〜28℃で48時間タンパク質を発現させた。
【００６４】
プロテアーゼXP_972061はこの発現系において十分に発現した。発酵収量は精製後のタンパク質の量に基づき、およそ50〜100 mg/Lのプロテアーゼであった。
【００６５】
ピキア・パストリス由来のプロリン特異的プロテアーゼの精製:
タンパク質の発現後、細胞を遠心分離によって除去し、上清を2〜8℃に冷却した。上清30 mLへの1 M Tris (pH 8.5) 3 mLの添加により、上清のpHを8.5に調整した。さらに、モノチオグリセロール(MTG)を上清に終濃度2 mMまで加えた。50 mM Tris, 2 mM MTG (pH 8.5)の中で予め平衡化されたNi-セファロースFF (GE HealthCare) 3 mLを上清に加えた。樹脂へのタンパク質のバッチ結合のために上清を2〜8℃で2時間振盪させた。スラリーをKontes重力流カラムの中に充填した。樹脂床を50 mM Tris, 2 mM MTG (pH 8.5) 10 mLで洗浄した。タンパク質を100 mMリン酸カリウム、2 mM MTGおよび250 mMイミダゾール(pH 5.9) 10 mL中で溶出させた。プロテアーゼを100 mMリン酸カリウム、2 mM MTG (pH 5.9)中で透析して、イミダゾールを除去した。グリセロールを20%の終濃度まで加えた。タンパク質を100 μLのアリコートとして液体窒素中で急速冷凍した。純度およびタンパク質濃度をSDS-PAGE分析によって推定した。XP_972061タンパク質はSDS-PAGE分析に基づき90%超の純度であると推定された。
【００６６】
XP_972061の産生プロセスの規模拡大
発酵および精製プロセスを30 Lの流加発酵まで規模拡大した。XP_972061の発現プラスミドを含有するピキア・パストリスの培養プレートから細胞バンクを作出した。
【００６７】
BMGY培地を含有する2つのフラスコに、細胞バンクのグリセロールストックのアリコート1 mL 2つを接種した。フラスコを48時間28℃で振盪した。振盪フラスコ培養物をOD 54.3に到達させ、その後これを用いて、BMGY培地を含有する30 Lの発酵槽に接種した。発酵は400〜800 rpmの撹拌速度および空気20 lpmの通気速度により28℃で行った。水酸化アンモニウムおよび硫酸を用いてpHを5.5に制御した。溶存酸素のレベルを30%に維持した。増殖を1時間ごとにモニタリングし、グリセロール濃度が1%未満に下がり、溶存酸素の突然の急上昇が観察された時点でグリセロールの供給を開始した。グリセロールの供給は5 mL/分で開始し、5時間の間に0 mL/分にまで徐々に減らした。メタノールの供給を1.5 mL/分で開始することによってタンパク質発現を誘導し、これを5時間の間に5 mL/分にまで増やし、発酵の終わりまで継続した。発酵を誘導48時間後に停止し、細胞を遠心分離によって除去した。およそ19 Lの上清を回収し、さらなる処理のために-80℃で凍結した。
【００６８】
BPG 100カラム(GE)に1.4 LのHIS Select Nickel Affinity樹脂(床高さ18.8 cm)を充填した。カラムを2カラム体積(CV)の水で洗浄し、その後、Akta Pilotクロマトグラフィー系を用い130 mL/分の流速にて4 CVの平衡化/洗浄緩衝液(2 mM MTGを含有する50 mM Tris, pH 8.5)で平衡化した。30 L発酵物からの上清のpHを1 M Tris (pH 8.5)によって8.5に調整し、130 mL/分でカラムに負荷した。カラムを2 CVの平衡化/洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を次に、溶出緩衝液(100 mMリン酸カリウム、250 mMイミダゾール、2 mM MTG、pH 5.6)を用いて溶出させた。溶出画分(1.5 L)を限外ろ過して、凍結乾燥緩衝液(100 mMリン酸カリウム、5 mM EDTA、2.5%マンニトール、2 mM MTG, pH 5.6)に入れた。限外ろ過の後に、産物を、0.2ミクロンのフィルタを通してろ過し、-80℃で貯蔵した。凍結されたXP_972061の濃度は7.4 mg/mLであった。精製後、産物を凍結乾燥し、30 mLの容器中に250 mgのアリコートとして分注し、使用するまで2〜8℃で貯蔵した。グルテン分解試験での使用の前に、産物を水中で新たに再構成し、タンパク質濃度10 mg/mLとした。
【００６９】
大腸菌（E. coli）におけるプロリン特異的プロテアーゼのクローニングおよび発現:
コドン最適化したヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 15〜16)を合成し、大腸菌株BL21 (DE3)での細胞質発現のためにpET28bベクター(Novagen)のNcoI部位とBamHI部位との間へクローニングした。大腸菌発現ベクターへのサブクローニングにより、添付のタンパク質配列(SEQ ID NO: 1、2)における2つのN末端残基「Met Gly」の付加が起こる。化学コンピテント細胞を調製し、発現プラスミドで形質転換した。発現プラスミドはkan+遺伝子を含み、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えた。発現プラスミドを用いた大腸菌株の形質転換によって、菌株は、カナマイシンを含有する培地上で増殖することが可能になった。形質転換体を、カナマイシンを含有するプレート上で選択し、プロテアーゼの発現についてスクリーニングした。
【００７０】
タンパク質発現のため、10 mLの開始培養物を、50 mLのFalcon試験管内のLuria Broth (LB)中で、250 rpmで振盪させながら37℃で12時間増殖させた。開始培養物を用いて、2 Lの振盪フラスコ中のLB 1000 mLに接種した。細胞を、600 nmでの吸光度により測定した光学密度(OD600) 0.6〜0.8となるまで、250 rpmで振盪させながら37℃で増殖させた。細胞を30℃未満に冷却し、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.2〜1 mMの濃度まで加えて、IPTG誘導性T7プロモーターの制御下でタンパク質の発現を誘導した。タンパク質を、250 rpmで振盪させながら30℃で12時間発現させた。
【００７１】
プロテアーゼはこの発現系において封入体(IB)として十分に発現した。発酵収量はおよそ50 mg/Lのプロテアーゼであった。
【００７２】
大腸菌から得られたプロリン特異的プロテアーゼの再折り畳み:
細胞を15分間5000×gでの遠心分離によって収集する。収集した細胞を溶解緩衝液(50 mM Tris, pH 8.5, 2 mM MTG)に再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解し、封入体を30分間10,000×gでの遠心分離によって可溶物から分離する。洗浄のため、封入体を当初容量の2分の1まで水に再懸濁する。封入体を30分間10,000×gでの遠心分離によって回収する。封入体の洗浄過程を1回繰り返す。洗浄された封入体を当初容量の2分の1で室温にて4〜6時間、可溶化緩衝液(50 mM Tris, pH 8.5, 2 mM MTG, 7 M尿素)に可溶化する。可溶化の後、不溶物を30分間10,000×gでの遠心分離によって除去する。タンパク質を4℃で10 mMリン酸ナトリウム, pH 8.2、880 mMアルギニン、1 mM GSH (還元型グルタチオン)および1 mM GSSG (酸化型グルタチオン)に1〜20倍希釈し、一晩インキュベートすることによってタンパク質の再折り畳みを行う。
【００７３】
プロリン特異的プロテアーゼによるセリアック病関連ペプチドの分解:
50 μg/mLのさまざまなセリアック病関連ペプチドをpH 4.5、37℃で25 μg/mLのXP_972061とともに1時間インキュベートした。この研究において、用いた3つのペプチドは
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であった。ペプチドの分解を逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)によって分析した。酵素なしの対照反応と比較したペプチドピークの消失によって認められるように、XP_972061により3つのペプチドの各々が完全にタンパク質分解された。このことは、活性なプロテアーゼが精製されたこと、および該プロテアーゼが低pHでセリアック病関連ペプチドを分解できたことを示唆している。
【００７４】
低pH条件下でのプロテアーゼのペプシン安定性:
0.5 mg/mLのXP_972061を0.4 mg/mLのペプシンおよび1 mg/mLのBSAとともに37℃、pH 3.0でインキュベートした。XP_972061 10 μLを種々の時点で採取し、発色基質H-Ala-Phe-Pro-pNA (20 mMリン酸ナトリウム pH 7.0, 10% DMSO中0.2 mMの基質) 990 μLに加え、XP_972061のタンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410 nmにおける活性をモニタリングした。このデータは初期活性(上記のアッセイ条件ではおよそ5500 U/mg)に対する百分率として以下に示されており、XP_972061がおよそ3分の半減期を有することを示し、XP_972061が低pH環境における高濃縮ペプシンへの短時間曝露に対して適度な安定性を有することを実証している。低pH環境でのペプシンに対する耐性は、多様な胃環境でのこのプロテアーゼの持続的活性に有益である。
【００７５】
（表３）pH 3.0でのペプシンによるタンパク質分解に対するXP_972061の安定性
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【００７６】
酸化条件下でのプロテアーゼの安定性:
バナナ1本、およそ335 mLの40 mM HCl、およびAmy's Gluten Free Korma 1食分を混合し、室温で30分間インキュベートした。固形物を遠心分離によって除去し、上清（これは特定のシステインプロテアーゼを酸化的に不活性化する）を、以下の実験に用いた。0.5 mg/mLのXP_972061を70%の酸化性の食事上清とともにpH 4.0、37℃でインキュベートした。XP_972061 10 μLを種々の時点で採取し、発色基質H-Ala-Phe-Pro-pNAに加え、タンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410 nmにおける活性をモニタリングした。このデータは以下に示されており、XP_972061が30分超の半減期を有することを示し、XP_972061が酸化条件への曝露に対して非常に高い安定性を有することを実証している。酸化に対する耐性は、多様な胃環境での持続的活性に有益である。
【００７７】
（表４）酸化条件下でのXP_972061の安定性
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【００７８】
XP_972061の高いpH安定性:
0.5 mg/mLのXP_972061を250 mM TrisとともにpH 7.5、37℃でインキュベートした。XP_972061 10 μLを種々の時点で採取し、発色基質H-Ala-Phe-Pro-pNAに加え、タンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410 nmにおける活性をモニタリングした。このデータは以下に示されており、XP_972061が30分超の半減期を有することを示し、高いpH条件への曝露に対する非常に高い安定性を実証している。高いpH条件に対する耐性は、多様な胃環境でのこれらのプロテアーゼの持続的活性に有益である。
【００７９】
（表５）高いpH条件でのXP_972061の安定性
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【００８０】
ペプシン消化グルテンの分解:
6 mg/mL (0.6 mg)のペプシン消化グルテンを、25〜100 μg/mLのALV001 (EP-B2)、つまりグルテン中のグルタミン残基に対する特異性を有するグルテナーゼ、100 μg/mLのXP_972061または2つのプロテアーゼの組み合わせとともに100 μLの反応液中にて10分間pH 3.0および37℃でインキュベートした。グルテン分解をRPLCによって定性的に分析し、かつ、セリアック病に関連する免疫刺激エピトープの1つを測定するELISA (以下に一覧化したデータ)によって、定量的に分析した。RPLCデータから、XP_972061単独でグルテンを分解できること、ならびにXP_972061およびALV001の組み合わせではプロテアーゼ単独のどちらか一方を超える程度までグルテンが分解されたことが、定性的に示された。同様に、ELISAデータから、2つのプロテアーゼの組み合わせはプロテアーゼ単独のどちらか一方よりも効果的であることが定量的に示された。2つのプロテアーゼの組み合わせによってALV001の場合の量を2倍超上回って効果的にグルテンが分解されたという所見は、2つのプロテアーゼの間でのグルテン分解の相乗効果を実証している。
【００８１】
（表６）ALV001およびXP_972061によるペプシン消化グルテンにおける免疫刺激エピトープの分解の定量分析
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【００８２】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
本発明を、本発明の実践に好ましい様式を含むように、本発明者によって見出された、または提案された特定の態様に関して記載した。本開示に照らして、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様に対して数多くの修正および変更がなされうることが、当業者に理解されよう。さらに、生物学的な機能等価性により、方法、構造、および化合物に関して、生物学的作用の種類または量に影響を及ぼすことなく変更がなされうる。そのような全ての修正は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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