(57)【要約】本発明は、腫瘍中のヌクレオシド輸送体のレベルを測定し、このレベルを特定の抗癌剤の投薬計画の前提となる効果と関連させるための方法と組成物、及び癌細胞でのｈＥＮＴ１の発現レベルが低い患者を、ゲムシタビン−５’−エライデートなどの親油性ゲムシタビン類似体で治療するための方法と組成物とともに対象の癌を治療する、さもなければ緩和するための方法及び組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルを検出し、該対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルをｈＥＮＴ１発現の対照レベルと比較する工程、及び
ｂ）低いｈＥＮＴ１の発現レベルを示している該対象の癌を緩和するために、２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲内の有効量のゲムシタビン−５’−エライデートを投与する工程を含む、癌の緩和方法。
【請求項２】
ｈＥＮＴ１発現の対照レベルが、該対象以外の提供源から前もって決定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｈＥＮＴ１発現の対照レベルが、該対象以外の提供源から同時に決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該対照レベルが、該対象から第二の非癌性試料を得ることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該対照レベルが、別の対象の非癌性試料を得ることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該対照レベルが、複数の対照提供源のｈＥＮＴ１の発現レベルを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該対照レベルが、ｈＥＮＴ１レベルの統計分布を得ることにより決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該対照レベルが、ｈＥＮＴ１を発現するように改変した培養細胞から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該対照レベルが、ｈＥＮＴ１を発現しないように改変した細胞から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該対照レベルが臨床上許容される参照レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該対象での該ｈＥＮＴ１の発現レベルがＨ−スコアに従って、高、中、又は低に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該Ｈ−スコアが全Ｈ−スコアの中央値以下である場合に、該対象での該ｈＥＮＴ１の発現レベルが低い試料であると分類される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該有効量のゲムシタビン−５’−エライデートが単回投与として又は複数回投与として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該有効量が、毎日、３日に１回、３日に１回を４回繰り返して、３日に１回を５回繰り返して、１日１回連続して１０日間、又は１週間に１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該有効量が、（ｉ）２５ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与される、（ｉｉ）６０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与される、（ｉｉｉ）８０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与される、（ｉｖ）４０ｍｇ／ｋｇが３日に１回、５回繰り返して投与される、（ｖ）４０ｍｇ／ｋｇが１週間に１回投与される、（ｖｉ）４０ｍｇ／ｋｇが１週間に１回２回繰り返して投与される又は３日に１回５回繰り返して投与される、（ｖｉｉ）７５ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回４回繰り返して投与される、（ｖｉｉｉ）７５ｍｇ／ｋｇが単回投与される又は１日１回連続して１０日間投与される、（ｉｘ）８０ｍｇ／ｋｇが腹腔内投与される、（ｘ）２０、２２．５、３０又は４０ｍｇ／ｋｇが３日に１回５回繰り返して、１日１回５回繰り返して又は１週間に１回２回繰り返して、経口投与される、及びその組み合わせ、から選択される計画に沿って投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該有効量が、静脈内に、皮下に、経口的に又はその組み合わせで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該対象が、化学療法薬を用いた治療に対して反応しない、反応が弱い、又は化学療法薬を用いた治療への反応が停止している、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該化学療法薬がゲムシタビンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該癌が、腎細胞癌を含む腎臓癌、膠芽腫、脳腫瘍、慢性又は急性白血病であって、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含むもの、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小開裂細胞型リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽球性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫及びＨＩＶに関連した体腔型リンパ腫を含む）、胎児性癌腫、鼻咽頭での未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症及びその他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼球内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮腫、扁平上皮癌、環境により誘発された癌であって、アスベストによって誘発された癌、例えば中皮腫を含むもの又は該癌の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肉腫、悪性黒色腫、前立腺癌、乳癌、膵癌、結腸腫瘍を含む結腸癌、神経膠腫、白血病、又は肝臓癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該ゲムシタビン−５’−エライデートが、１種以上のさらなる化学療法薬又は細胞毒性薬と併せて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該ゲムシタビン−５’−エライデートが、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの該範囲内の有効量で投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、２０１０年３月３０日に出願の米国仮特許出願第６１／３１９，１４９号及び２０１０年１０月１日に出願の米国仮特許出願第６１／３８８，７６３号の優先権を主張し、このそれぞれの内容は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]本発明は一般に、対象の癌を治療するか、さもなければ緩和するための方法及び組成物、腫瘍中のヌクレオシド輸送体のレベルを測定し、このレベルを、特定の抗癌剤の投薬計画の前提となる効果と関連させる方法及び組成物、並びに癌細胞でのｈＥＮＴ１の発現レベルが低い患者を、エライジン酸（５’）−ゲムシタビン（gemcitabine-5’-elaidate）のような親油性のゲムシタビン類似体で治療するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]ヌクレオシド輸送体は、生理的なヌクレオシドが原形質膜を横断して移動することを可能にする、一群の膜輸送タンパク質である。ヌクレオシド輸送体は、ヌクレオシドのデノボ合成経路を欠損している細胞でのヌクレオチド合成に必要であり、かつ、癌及びウイルスの化学療法に用いられる細胞毒性をもつヌクレオシド薬及びヌクレオシド類似薬の取り込みにもまた必要である。全てではないが、多くの癌細胞はヌクレオシド輸送体を発現している。
【０００４】
[0004]ヒトの細胞及び組織のヌクレオシド輸送体には主に、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）と濃縮型ヌクレオシド輸送体（ＣＮＴ）の２つのクラスがある。ＥＮＴファミリーはＳＬＣ２９としても知られている。ＥＮＴには、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３、及びＥＮＴ４と命名された４種類が知られている。ＥＮＴは、ジピリダモールやジラゼプのようなアデノシンの再取り込み阻害剤によって阻害される。ＣＮＴファミリーはまたＳＬＣ２８としても知られており、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２及びの３種類があり、ＣＮＴ３ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ２及びＳＬＣ２８Ａ３とも呼ばれている。
【０００５】
[0005]ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ｈＥＮＴ１）は、複数の癌細胞で発現しているヌクレオシド輸送体の一例である。ｈＥＮＴ１はＳＬＣ２９Ａ１遺伝子によってコードされている。この遺伝子は血漿やミトコンドリアの膜に局在している膜貫通型糖タンパク質をコードし、細胞による周囲の培地からのヌクレオシドの取り込みを仲介している。このタンパク質は、ニトロベンジルチオイノシン（ＮＢＭＰＲ）による阻害に感受性をもつ、受動拡散型（濃縮型とは別の）輸送体に分類される。
【０００６】
[0006]ヌクレオシド輸送体は、原形質膜を横切って親水性のヌクレオシド系抗癌剤を輸送することができる。これら薬剤のいくつかの例としては、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、及びゲムシタビンがある。ヌクレオシド輸送体は数多く存在し、それぞれが独自の動態により、これら薬剤の細胞膜を横切る輸送を担っていると考えられる。
【０００７】
[0007]エステル化したエライジン脂肪酸を５’位にもつ、親油性のゲムシタビン類似体ファミリーが製造されている。これら類似体は、ヌクレオシド輸送体に依存せずに原形質膜を通過することができる。そのためこの類似体は、癌細胞でのヌクレオシド輸送体の発現レベルは低いが腫瘍を有する患者に対してより効果が高いと考えられている。
【０００８】
[0008]このため、ゲムシタビンよりもゲムシタビン類似体に対して反応性の良い患者を同定するための方法及び治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
[0009]本発明は、腫瘍中のヌクレオシド輸送体のレベルを測定し、このレベルを特定の抗癌剤の投薬計画の前提となる効果と関連させる方法及び組成物を提供する。本発明の方法は、合理的に選択され、設計された投薬計画による癌の治療を可能にする。本発明のいくつかの側面では、癌細胞中のｈＥＮＴレベルを決定し、ｈＥＮＴ１レベルが低い患者を親油性ゲムシタビン類似体で治療する。
【００１０】
[0010]本発明は、対象、例えばヒト対象の癌を治療する、進行を遅らせる、再発を防止する、症状を軽減する、さもなければ緩和する方法を提供する。この方法は、対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルを決定し、対象のｈＥＮＴ１の発現レベルをｈＥＮＴ１発現の対照レベルと比較し、その後、低いレベルのｈＥＮＴ１発現を示している対象の癌を緩和するために、有効量のゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することによる。例えばゲムシタビン類似体はゲムシタビン−５’−エライデートであり、ゲムシタビン−５’−エライデートを、２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜９５ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、及び６０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇから選択される範囲で投与する。
【００１１】
[0011]例えばいくつかの態様では、対象（例えばヒト対象）の癌を治療する、進行を遅らせる、再発を防止する、症状を軽減する、さもなければ緩和する方法は、対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルを決定し、対象のｈＥＮＴ１の発現レベルをｈＥＮＴ１発現の対照レベルと比較し、その後、ｈＥＮＴ１発現レベルの減少を示す対象の癌を緩和するために、有効量のゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与する工程を含む。例えば、ゲムシタビン類似体はゲムシタビン−５’−エライデートであり、ゲムシタビン−５’−エライデートを、２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、及び６０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇから選択される範囲で投与する。
【００１２】
[0012]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１発現の対照レベルは、対象以外の提供源から既に決定されている。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１の対照レベルは、対象以外の提供源から同時期に決定される。これらの態様に適した提供源は、本明細書に記載されたいかなる提供源をも含む。
【００１３】
[0013]いくつかの態様では、対象から第二の非癌性試料を得ることによって対照レベルを決定する。いくつかの態様では、異なる対象から非癌性試料を得ることにより、対照レベルを決定する。適した試料には、対象から単離した組織、細胞、及び体液、並びに対象中に存在する組織、細胞、及び体液が挙げられる。本明細書で使用される、用語「生体試料」には、血液及び、血清や血漿を含む血液要素の画分、又はリンパ液が含まれる。
【００１４】
[0014]いくつかの態様では、複数の対照提供源でのｈＥＮＴ１の発現レベルから、対照レベルを決定する。適した対照提供源は、本明細書に記載したいかなる提供源をも含む。
[0015]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１レベルの統計分布を得ることにより、対照レベルを決定する。
【００１５】
[0016]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１を発現するように改変された培養細胞から、対照レベルを決定する。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１を発現しないように改変した細胞から、対照レベルを決定する。適した細胞型には、培養細胞に適していることが当該分野において知られている細胞株、及び／又は本明細書に記載された任意の細胞が含まれる。
【００１６】
[0017]いくつかの態様において対照レベルとは、臨床上許容可能な参照レベルである。
[0018]いくつかの態様では、対象のｈＥＮＴ１の発現レベルはＨ−スコアに従って、高、中、又は低に分類される。
【００１７】
[0019]いくつかの態様では、対象のＨ−スコアが、全体のＨ−スコアの中央値以下の場合に、ｈＥＮＴ１の発現レベルが低い試料に分類される。
[0020]いくつかの態様では、有効量のゲムシタビン−５’−エライデートが単回投与される。
【００１８】
[0021]いくつかの態様では、有効量のゲムシタビン−５’−エライデートが、複数回投与される。
[0022]いくつかの態様では、有効量を、毎日、３日に１回、３日に１回を４回繰り返して、３日に１回を５回繰り返して、１日１回連続して１０日間、又は１週間に１回、投与する。例えばいくつかの態様では、有効量を、単回投与で毎日、単回投与で３日に１回、単回投与で３日に１回を４回繰り返して、単回投与で３日に１回を５回繰り返して、単回投与で１日１回を連続して１０日間、又は単回投与で１週間に１回、投与する。例えば、いくつかの態様では、有効量を、反復投与で毎日、反復投与で３日に１回、反復投与で３日に１回を４回繰り返して、反復投与で３日に１回を５回繰り返して、反復投与で１日１回を連続して１０日間、又は反復投与で１週間に１回、投与する。
【００１９】
[0023]いくつかの態様では、有効量のゲムシタビン−５’−エライデートを、（ｉ）２５ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｉ）６０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｉｉ）８０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｖ）４ｍｇ／ｋｇを連続して５日間投与し、その後２日間休薬するという様式で投与する、（ｖ）３日に１回の４０ｍｇ／ｋｇ投与を５回繰り返す、（ｖｉ）１週間に１回、４０ｍｇ／ｋｇ投与する、（ｖｉｉ）４０ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇを、１週間に１回２回繰り返して投与する又は３日に１回を５回繰り返して投与する、（ｖｉｉｉ）７５ｍｇ／ｋｇの用量を、３日に１回、４回繰り返して投与する、（ｉｘ）５ｍｇ／ｋｇの用量を１日１回、５回繰り返して投与する、（ｘ）１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ又は７５ｍｇ／ｋｇを、単回投与する又は１日１回連続して１０日間投与する、（ｘｉ）８０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する、（ｘｉｉ）７．５、１５、２０、２２．５、３０又は４０ｍｇ／ｋｇを、３日に１回５回繰り返して、１日に１回を５回繰り返して、又は１週間に１回を２回繰り返して、経口投与する、及びその任意の組み合わせから選択される計画に沿って投与する。
【００２０】
[0024]いくつかの態様では、有効量を、静脈投与、皮下投与、経口投与又はその組み合わせによって投与する。
[0025]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１発現の対照レベルと比較した場合の対象のｈＥＮＴ１の発現レベルは、少なくとも１倍に、２分の１に、５分の１に、１０分の１に、あるいはそれよりも低下している。いくつかの態様では、対照のｈＥＮＴ１の発現レベルと比較した場合の対象のｈＥＮＴ１の発現レベルは、少なくとも１、％５％、１０％、１５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上低下している。
【００２１】
[0026]用語「対象」及び「患者」は、本明細書では、同じ意味で用いられる。好ましくは、対象はヒトである。
[0027]いくつかの態様において対象は、化学療法に反応しない、反応性が低い、又は化学療法を用いた治療に対する反応が停止した対象である。例えばいくつかの態様では、化学療法薬はゲムシタビンである。その他の適した化学療法薬には、当該分野で知られている化学療法薬及び／又は本明細書に記載したいかなる化学療法薬及び抗腫瘍薬が含まれる。
【００２２】
[0028]いくつかの態様において癌は、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、膠芽腫、脳腫瘍、慢性又は急性白血病（急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小開裂細胞型リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽球性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫及びＨＩＶに関連した体腔型リンパ腫を含む）、胎児性癌腫、鼻咽頭での未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症及びその他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼球内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮腫、扁平上皮癌、環境により誘発された癌（アスベストによって誘発された癌、例えば中皮腫を含む）、又は前記癌の組み合わせである。
【００２３】
[0029]いくつかの態様において癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肉腫、悪性黒色腫、前立腺癌、乳癌、膵癌、結腸癌（結腸腫瘍を含む）、神経膠腫、白血病、又は肝臓癌である。
【００２４】
[0030]いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライデートを、１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の有効量で投与する。いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライデートを、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、及び４０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇから選択される範囲の有効量で投与する。
【００２５】
[0031]本発明は、細胞増殖性疾患又は他の障害に罹患しているヒト、哺乳類、又は動物対象のその疾患又は障害を、治療する、進行を遅らせる、再発を防止する、症状を軽減する、さもなければ緩和する方法を提供する。
【００２６】
[0032]様々な検査結果又は臨床結果のいずれかが達成された場合に、細胞増殖性疾患又は障害に罹患している患者へのゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物の投与が有効であると見なされる。例えば、細胞増殖性疾患又は障害に関連した１種以上の症状が軽減、低下、阻害された場合、又は状態がさらに進行しなかった、すなわち悪化しなかった場合に、投与は有効であると見なされる。細胞増殖性障害、例えば癌又は他の腫瘍性疾患の寛解が見られた場合、及び／又は状態がさらに進行しなかった、すなわち悪化しなかった場合に、投与は有効であると見なされる。
【００２７】
[0033]いくつかの態様では、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物を、様々な既知の治療のいずれか、例えば化学療法及びその他の抗腫瘍薬、抗炎症性化合物及び／又は免疫抑制化合物と併用して投与する。いくつかの態様では、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物は、様々な既知の治療との併用した場合に有効であり、既知の治療の非限定的な例としては、外科治療及び手術、放射線治療、化学療法及び／又はホルモン若しくは他の内分泌療法が挙げられる。
【００２８】
[0034]いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライデートを、１種以上の化学療法薬及び／又は細胞毒性薬と併用して投与する。適した薬剤及び／又は細胞毒性薬には、当該分野で知られている薬剤、及び／又は本明細書で記載したいずれの化学療法薬、抗腫瘍薬及び／又は細胞毒性薬が含まれる。
【００２９】
[0035]これら「併用治療」は、連続して又は同時に投与することができる。ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物と別の薬剤を、対象に、好ましくはヒト対象に、同じ医薬組成物に加えて投与することができる。あるいは、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物と第二の薬剤を対象に、別個の医薬組成物に加えて、同時に、別々に又は連続して投与することができる。ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデート、及び／又はその医薬組成物と第二の治療を対象に、同じ又は別の投与経路で投与してもよい。
【００３０】
[0036]いくつかの態様では、本発明の併用治療は、有効量のゲムシタビン類似体及び／又はその医薬組成物と、有効量の少なくとも１つの他の治療（例えば、予防薬又は治療薬）を含み、ゲムシタビン類似体は例えばゲムシタビン−５’−エライデートであり、少なくとも１つの他の治療は、本明細書に記載したゲムシタビン類似体、例えば、ゲムシタビン−５’−エライデートとは異なる機序で作用する治療である。いくつかの態様では、本発明の併用治療は、相加効果又は相乗効果をもつように共に機能することにより、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートと第二の治療の予防効果又は治療効果を向上させる。いくつかの態様では、本発明の併用治療は、二次治療（例えば、予防薬又は治療薬）に関連する副作用を低減させる。
【００３１】
[0037]いくつかの態様では、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを、さらに別の薬剤と併用して投与する。本明細書中において用語「併用して」とは、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートとさらに別の薬剤を、実質的に同時期に、同時に又は連続してのいずれかで投与することを意味する。連続して投与する場合には、二番目の薬剤の投与開始時に、２種類の化合物のうちの最初に投与した化合物が、治療部位においてまだ有効な濃度で検出可能であることが好ましい。ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを最初に投与してもよく、その後別の薬剤を投与してもよい。あるいは、別の薬剤を最初に投与してもよく、その後、ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを投与してもよい。
【００３２】
[0038]いくつかの態様では、併用治療は、１種以上の別の薬剤と共に処方された１種以上のゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを含んでいてもよい。
【００３３】
[0039]ゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートと別の薬剤を、同じ又は別の投与経路で投与することができる。
[0040]いくつかの態様では、化合物、製品及び／又は医薬組成物で治療することが可能な疾患又は障害は、化合物の血中モル濃度が、少なくとも有効な程度に長い期間であり、かつ、有害となる期間よりは短い第一の連続した期間中、少なくとも有効な濃度であって、かつ、有害濃度未満となり得るものである。血中モル濃度は、第一の連続した期間の後には有効な濃度未満であってもよい。例えば、有効な期間は、約１時間、２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、又は当業者が有効であると判断した別の期間であってもよい。例えば、有害な期間とは、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約１４４時間、又は当業者が有害であると判断した別の期間であってもよい。
【００３４】
[0041]いくつかの態様では、治療上有効量の化合物、製品及び／又は医薬組成物は、血液濃度が腫瘍細胞のＩＣ５０よりは高くなり、かつ、正常細胞のＩＣ５０未満になるように選択される。いくつかの態様では、治療上有効量は、血液濃度が腫瘍細胞を殺すのに十分に高くなり、かつ、正常細胞のＩＣ５０未満になるように選択される。
【００３５】
[0042]いくつかの態様では、化合物、製品及び／又は医薬組成物を経口で、例えば、錠剤、丸薬、カプセル（硬若しくは軟）、カプレット、粉末、顆粒、懸濁液、溶液、ゲル、カシェ、トローチ、ロゼンジ、シロップ、エリキシール、乳液、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、及び／又は吸引の剤形で投与する。
【００３６】
[0043]本発明は、対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルを決定し、対象でのｈＥＮＴ１の発現レベルとｈＥＮＴ１発現の対照レベルを比較し、その後、低いｈＥＮＴ１の発現レベルを示している対象の癌が緩和するように、有効量のゲムシタビン類似体、例えばゲムシタビン−５’−エライデートを投与することにより、対象、例えばヒト対象の癌を治療する、進行を遅らせる、再発を防止する、症状を軽減する、さもなければ緩和する方法を提供し、ここで有効量のゲムシタビン−５’−エライデートは、（ｉ）２５ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｉ）６０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｉｉ）８０ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、（ｉｖ）４ｍｇ／ｋｇを連続して５日間投与し、その後２日間休薬するという様式で投与する、（ｖ）３日に１回の４０ｍｇ／ｋｇ投与を５回繰り返す、（ｖｉ）１週間に１回、４０ｍｇ／ｋｇ投与する、（ｖｉｉ）４０ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇを、１週間に１回２回繰り返して投与する又は３日に１回５回繰り返して投与する、（ｖｉｉｉ）７５ｍｇ／ｋｇの用量を、３日に１回、４回繰り返して投与する、（ｉｘ）５ｍｇ／ｋｇの用量を１日１回、５回繰り返して投与する、（ｘ）１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ又は７５ｍｇ／ｋｇを単回投与する、又は１日１回連続して１０日間投与する、（ｘｉ）８０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する、（ｘｉｉ）７．５、１５、２０、２２．５、３０又は４０ｍｇ／ｋｇを、３日に１回５回繰り返して、１日に１回を５回繰り返して、又は１週間に１回を２回繰り返して、経口投与する、及びその任意の組み合わせから選択される計画に沿って投与される。
【００３７】
[0044]一側面において本発明は、癌の治療を必要としている患者由来の試料のヌクレオシド輸送体レベルを決定し、その後、ヌクレオシド輸送体レベルに基づいて、治療上有効量の化学療法薬、すなわちヌクレオシド類似体の患者への投与に関する指示を出す医師に、ヌクレオシド輸送体レベルに関するデータを送信することにより、患者の癌を治療する方法を提供する。
【００３８】
[0045]本発明の一側面では、化学療法薬であるヌクレオシド類似体の量を、ヌクレオシド輸送体レベルに基づいて決定する。
[0046]本発明の一側面では、特定の化学療法薬であるヌクレオシド類似体を、ヌクレオシド輸送体レベルに基づいて投与する。
【００３９】
[0047]本発明の一側面では、癌は転移性膵癌である。
[0048]本発明の一側面では、試料は癌細胞を含む生検である。
[0049]本発明の一側面では、生検は膵癌細胞の細針吸引生検である。
【００４０】
[0050]本発明の一側面では、生検は腹腔鏡検査で得た膵癌細胞である。
[0051]本発明の一側面では、生検細胞をペレット状に整形し、固定し、その後パラフィンに包埋する。
【００４１】
[0052]本発明の一側面では、生検細胞を直ちに凍結する。
[0053]本発明の一側面では、生検細胞とヌクレオシド輸送体を認識する抗体を混合する。
【００４２】
[0054]本発明の一側面では、試料は血中を循環している転移性膵癌細胞を含む。
[0055]本発明の一側面では、血液から膵臓ＣＴＣを選別することにより、試料を得る。
[0056]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１、ｈＥＮＴ２、ｈＥＮＴ３、ｈＥＮＴ４、ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２、又はｈＣＮＴ３である。
【００４３】
[0057]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１である。
[0058]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１の抗体染色により、ｈＥＮＴ１レベルを決定する。
【００４４】
[0059]本発明の一側面では、抗体染色を１２時間未満行う。
[0060]本発明の一側面では、抗体染色を１２時間以上行う。
[0061]本発明の一側面では、ｍＲＮＡレベルにより、ｈＥＮＴ１レベルを決定する。
【００４５】
[0062]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体のレベルは、親水性の化学療法薬であるヌクレオシド類似体が癌細胞に侵入する能力の指標である。
[0063]本発明の一側面では、ＳＮＰ解析によりヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００４６】
[0064]本発明の一側面では、多型を同定することにより、ヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
[0065]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体の対照レベルは、試料以外の提供源から既に決定されたものである。
【００４７】
[0066]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体の対照レベルは、試料以外の提供源から、同時期に決定される。
[0067]本発明の一側面では、患者から第二の非癌性試料を得ることにより、対照レベルを決定する。
【００４８】
[0068]本発明の一側面では、異なる患者から非癌性試料を得ることにより、対照レベルを決定する。
[0069]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体レベルの統計分布を得ることにより、対照レベルを決定する。
【００４９】
[0070]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１を発現するように改変した培養細胞を用いて対照レベルを決定する。
[0071]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１を発現しないように改変した細胞を用いて対照レベルを決定する。
【００５０】
[0072]本発明の一側面では、５０％以上の細胞が抗体染色に対する強い反応を示さなかった場合に、その試料はヌクレオシド輸送体レベルが低い試料に分類される。
[0073]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１であり、抗体はｈＥＮＴ１抗体である。
【００５１】
[0074]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体の染色が見られなかった細胞の百分率が、染色を行った全細胞の百分率の中央値よりも高かった場合に、その試料はヌクレオシド輸送体が低い試料として分類される。
【００５２】
[0075]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１であり、抗体はｈＥＮＴ１抗体である。
[0076]本発明の一側面では、Ｈ−スコアに従って試料を分類する。
【００５３】
[0077]本発明の一側面では、試料のＨ−スコアが全体のＨ−スコアの中央値未満である場合に、その試料はヌクレオシド輸送体が低い試料に分類される。
[0078]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１であり、抗体はｈＥＮＴ１抗体である。
【００５４】
[0079]本発明の一側面では、５０％以上の細胞がｈＥＮＴ１抗体染色に対して強い反応性を示さない場合に、その試料はｈＥＮＴ１が低い試料に分類される。
[0080]本発明の一側面では、試料のｍＲＮＡレベルが、対象のｍＲＮＡレベルの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％未満の場合に、その試料はｈＥＮＴ１が低い試料に分類される。
【００５５】
[0081]本発明の一側面では、化学療法薬であるヌクレオシド類似体は、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、又はゲムシタビンである。
[0082]本発明の一側面では、化学療法薬であるヌクレオシド類似体は、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、又はゲムシタビンの疎水性の誘導体である。
【００５６】
[0083]本発明の一側面では、化学療法剤であるヌクレオシド類似体は、ゲムシタビン−５’−エライデートである。
[0084]本発明の一側面では、ゲムシタビン−５’−エライデートを、２５〜８０ｍｇ／ｋｇの用量で、３日に１回、皮下投与する。
【００５７】
[0085]本発明の一側面では、癌の治療を必要としている患者にゲムシタビン−５’−エライデートを投与し、かつ、ヌクレオシド輸送体阻害剤を患者に投与することにより、患者の転移性膵癌を治療する方法を提供し、ここで阻害剤は、癌細胞からのゲムシタビン−５’−エライデートの排出を防ぐ。
【００５８】
[0086]本発明の一側面では、ヌクレオシド輸送体阻害剤はジピリダモール又はＮＢＭＰＲである。
[0087]本発明の一側面では、転移性膵癌の治療は、癌の治療を必要としている患者にゲムシタビン−５’−エライデートを投与する工程を含み、ゲムシタビン−５’−エライデートの疎水性尾部は細胞外エステラーゼによって切断され、ゲムシタビンを生じる。
【００５９】
[0088]本発明の一側面では、ゲムシタビン−５’−エライデートをゲムシタビンと併用して投与する。
[0089]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１に陽性の細胞とｈＥＮＴ１に陰性の細胞を作出して、陽性及び陰性細胞に対するｈＥＮＴ１を認識する抗体の結合を比較することにより、ｈＥＮＴ１の発現が高いか或いは低いかを決定する方法を提供する。
【００６０】
[0090]本発明の一側面では、陰性細胞はノックダウンしたヒーラ細胞又はＣＥＮ陰性対照である。
[0091]本発明の一側面では、発現レベルは輸送体タンパク質の発現レベルである。
【００６１】
[0092]本発明の一側面では、発現レベルは輸送体ｍＲＮＡの発現レベルである。
[0093]本発明の一側面では、輸送体はｈＣＮＴ１である。
[0094]本発明の一側面では、患者はヒトである。
【００６２】
[0095]本発明の一側面では、化学療法薬であるヌクレオシド類似体は、脂質結合ゲムシタビンである。
[0096]本発明の一側面では、決定する工程は、試料の輸送体の発現レベルと対照試料の輸送体発現レベルを比較する工程を含む。
【００６３】
[0097]本発明の一側面では、この方法は患者へのヌクレオシド輸送体遮断薬の投与を指示する工程をさらに含む。
[0098]本発明の一側面では、ゲムシタビン類似体を投与した約２時間後に、患者に輸送体を投与する。
【００６４】
[0099]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１の発現レベルを決定するための薬剤を含むキットを提供する。
[0100]本発明の一側面では、このキットは対照試料をさらに含む。
【００６５】
[0101]本発明の一側面では、このキットは試料のｈＥＮＴ１の発現レベルを分類するための説明をさらに含む。
[0102]本発明の一側面では、説明はキット購入者に電子的に提供される。
【００６６】
[0103]本発明の一側面では、このキットはゲムシタビン−５’−エライデートをさらに含む。
[0104]本発明の一側面では、この方法はゲムシタビン−５’−エライデートを患者に有効にすることをさらに含む。
【００６７】
[0105]本発明の一側面では、ｈＥＮＴ１の機能レベルが低いと予想される試料中のｈＥＮＴ１レベルを決定するために試料を検査機関に送付し、既知のｈＥＮＴレベルを示す対照試料を準備し、ｈＥＮＴ１に対する抗体を準備し、試料と対照試料をこの抗体による結合に使用し、結合した抗体の相対量を検出して、試料でのｈＥＮＴ１の結合量が少ない場合に、患者がゲムシタビン−５’−エライデートの投与を受けるべきであると結論付けることによる、疾患の治療を指示する方法を提供する。
【００６８】
[0106]本発明の一側面では、この疾患の治療を指示する方法は、試料中のｈＥＮＴ１に関するデータを精査又は解析する工程と、データの精査又は解析に基づく結論を、患者、保護者、又は介助者に提供する工程をさらに含む。本発明の一側面では、結論は、ネットワークを介したデータの送信である。
【００６９】
参照による組み込み
[0107]本明細書中で言及した全ての出版物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、又は特許出願が具体的に及び個別に参照により組み込まれていることが示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
[0108]添付の請求項に、本発明の特徴を詳細に示す。実例となる態様を示している以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の特徴及び利点をより深く理解できる。態様には本発明の原理が用いられ、以下の図面が添付される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】[0109]図１は、本発明の様々な態様を説明する。腫瘍を有する患者１０１を同定する。装置１０３を用いて試料１０５を患者から抽出する。この試料を分析器１０７で解析し、１種以上の輸送体の状態を決定する。この解析結果を用いて、腫瘍がある場合には、腫瘍を治療するために、どの治療薬１０９を患者に投与すべきかを決定する。
【図２】[0110]図２は、親水性ヌクレオシドがそれらを介して脂質膜を通過することができる、特定のヌクレオシド輸送体を図示している。
【図３】[0111]図３は、ヌクレオシド輸送体の遮断にもかかわらず、ゲムシタビン−５’−エライデートが腫瘍細胞内に侵入することを示している。ゲムシタビン−５’−エライデートを投与した後に輸送体を遮断したにもかかわらず、ゲムシタビン三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）が細胞に蓄積している。
【図４】[0112]図４は、インビトロでは、輸送体を遮断してもゲムシタビン−５’−エライデートによる細胞死から細胞が保護されないことを図示している。Ｙ軸の数値は、ゲムシタビン及びゲムシタビン−５’−エライデートを投与した場合にジピリダモールによって保護される倍率である。この効果を、ＴＨＸ、Ｌｏｘ、ＭＯＬＴ４、及びＭＯＬＴ４／Ｃの４種の細胞株について表した。
【図５Ａ】[0113]図５Ａは、インビトロでは、ゲムシタビン−５’−エライデートがｈＥＮＴ１に依存せずに腫瘍細胞を殺すことを図示している。ＣＥＭ：Ｔ−リンパ芽球性白血病細胞株。ＣＥＭ−Ａｒａ−Ｃ／８：ｈＥＮＴ１輸送体を欠損している、ＣＥＭのクローン誘導体。
【図５Ｂ】図５Ｂは、インビトロでは、ゲムシタビン−５’−エライデートがｈＥＮＴ１に依存せずに腫瘍細胞を殺すことを図示している。ＣＥＭ：Ｔ−リンパ芽球性白血病細胞株。ＣＥＭ−Ａｒａ−Ｃ／８：ｈＥＮＴ１輸送体を欠損している、ＣＥＭのクローン誘導体。
【図６】[0114]図６は、異種稙片マウスモデルでの、ｈＥＮＴ１のｍＲＮＡレベルとゲムシタビンに対する感受性の相関を図示している。
【図７】[0115]図７は、その装置を用いて、本発明に関するデータの精査又は分析を行うことができる理論的な装置の代表例を示しているブロック図である。
【図８】[0116]図８は、ゲムシタビンの単剤投与を受けた患者の生存率に関する、仮想的なカプラン・マイヤープロットを図示している。同様のｈＥＮＴ１を発現している患者（破線）の面積は、ｈＥＮＴ１の発現レベルが低い患者の面積よりも大きい。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
Ｉ．序論
[0117]一側面において本発明は、癌患者の治療方法を提供する。この方法は、癌治療に対する患者（ヒト癌患者を含む）の反応を予測する工程を含む。予測される効果に基づいて特定の化学療法薬と特定の患者とを対応づける方法と、治療を指示し、患者及び医師に通知する方法もまた提供する。
【００７３】
[0118]癌患者を治療するために、本発明は、以下の一般的な側面を教示する。まず、癌患者を同定する。この患者の腫瘍から試料を採取して解析し、１種以上のヌクレオシド輸送体の発現レベルを決定する。次にこの情報を用いて、利用可能な抗癌剤のいずれをこの患者が使用すべきかを決定する。例えば、ヌクレオシド輸送体を欠損している又はヌクレオシド輸送体のレベルが低い患者には、親水性のヌクレオシド系抗癌剤は癌細胞に簡単には侵入しないと考えられるため、これらの抗癌剤が効果的ではないと考えられることを通知する。そのような患者には、輸送体に依存せずに癌細胞に侵入するように修飾された、これら薬剤の誘導体を投与することができる。本発明の典型的な態様を図１に図示する。腫瘍を有する患者１０１を同定する。装置１０３を用いて試料１０５を患者から抽出する。この試料を分析器１０７で解析し、１種以上の輸送体の状態を決定する。この解析結果を用いて、腫瘍がある場合には、腫瘍を治療するためにどの治療薬１０９を患者に投与すべきかを決定する。
【００７４】
ＩＩ．患者の同定
[0119]既知の診断方法のいずれかを用いて、本発明を実施するための患者を同定する。同定は医師が行ってもよい。患者の同定は、医師と、患者、健康管理会社、保険業者の面談によって、又は患者に関するデータを保管しているコンピューター上のデータベースから行うことができる。いくつかの態様では、患者の同定と試料試験を同時に実施する。いくつかの態様では、患者を同定した後に、試験を実施する。
【００７５】
[0120]いくつかの態様では、用語「患者」は、「個人」又は「対象」と同義である。いくつかの態様では、患者は癌を患っていると疑われる。いくつかの態様では、患者は癌であると診断されている。いくつかの態様では、患者は癌であることが証明されている。
【００７６】
[0121]いくつかの態様では、患者はヒトであるが、いくつかの態様では患者は非ヒト動物である。いくつかの態様において非ヒト動物は、癌に罹患している家畜である。
[0122]いくつかの態様では、本明細書に記載した方法は、患者の癌を緩和するのに有効である。緩和には、対象の癌の治療、抑制及び／又は予防が含まれるがこれらには限定されない。
【００７７】
[0123]本明細書に記載した方法は、様々な癌に関するものである。例えば、癌は転移性の癌であってもよい。本明細書に記載した方法に関する癌の例としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肉腫、悪性黒色腫、前立腺癌、乳癌、膵癌、結腸癌（結腸腫瘍など）、神経膠腫、白血病、肝臓癌、結腸癌（小腸癌を含む）、肺癌、乳癌、膵癌、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、急性骨髄性白血病、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、膠芽腫、脳腫瘍、慢性若しくは急性白血病（急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小開裂細胞型リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽球性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫及びＨＩＶに関連した体腔型リンパ腫）、胎児性癌腫、鼻咽頭での未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症及びその他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌腫、骨癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚若しくは眼球内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓若しくは尿管癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮腫、扁平上皮癌、又は環境により誘発された癌（アスベストによって誘発された癌、例えば中皮腫、を含む）が挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法は、併発している２種以上の癌の治療に有用な場合がある。いくつかの態様では、この方法は、癌であると診断された個々の患者を治療するのに有用である。
【００７８】
[0124]いくつかの態様では患者は、ある治療計画に沿って治療を受けている最中である。いくつかの態様では患者は、まだ治療を受けていない。いくつかの態様で患者は、癌細胞又は組織のｈＥＮＴ１又はｈＣＮＴ１などの輸送体レベルを同定するために、受けている治療計画の間の診断試験を受ける。
【００７９】
[0125]いくつかの態様では患者は、親水性ヌクレオシド薬を用いて治療する、癌以外の疾患を患っている。
ＩＩＩ．試料採取
[0126]診断試験を実施するためには通常、治療を必要としている患者から試料を採取する。本発明では、患者が同定されれば、本発明が患者から試料を採取する方法を提供する。いくつかの側面では、試料は腫瘍試料である。いくつかの側面では、試料は癌細胞を含む。いくつかの側面では、試料は、患者の癌細胞中の輸送体レベルと関係していると考えられる細胞を含む。
【００８０】
[0127]いくつかの態様では、組織、器官、細胞及び／又は腫瘍由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、血中循環腫瘍細胞のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、生検試料のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８１】
Ａ．血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
[0128]いくつかの態様では、体液試料のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、患者から体液試料を採取し、その体液試料からヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、体液試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体のレベルを決定する。
【００８２】
[0129]体液には、血液、リンパ液、唾液、精液、髄液、母乳、腹水、及び胸水が含まれるがこれらには限定されない。
[0130]いくつかの態様では血液試料を採取し、ヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、血液試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８３】
[0131]いくつかの態様では、患者からリンパ液試料を採取し、このリンパ液のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、リンパ液試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８４】
[0132]いくつかの態様では、患者から唾液試料を採取し、この唾液のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、唾液試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８５】
[0133]いくつかの態様では、患者から精液試料を採取し、この精液のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、精液試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８６】
[0134]いくつかの態様では、患者から髄液（ＣＳＦ）試料を採取し、このＣＳＦのヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、ＣＳＦ試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８７】
[0135]いくつかの態様では、患者から母乳試料を採取し、この母乳のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、母乳試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８８】
[0136]いくつかの態様では、患者から腹水試料を採取し、この腹水のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、腹水試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００８９】
[0137]いくつかの態様では、患者から胸水試料を採取し、この胸水のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、胸水試料から得た細胞集団のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。
【００９０】
[0138]いくつかの態様では、原発巣から離れて体液中を循環している細胞である血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、原発巣から離れて血流中を循環している細胞である血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。ＣＴＣはその後、他の組織でさらなる腫瘍（転移）を成長させる種を構成している場合がある。
【００９１】
[0139]特定の態様ではＣＴＣを、米国特許第５，４６６，５７４号、同第５，５１２，３３２号、同第５，５９７，５３１号、同第５，６９８，２７１号、同第５，９８５，１５３号、同第５，９９３，６６５号、同第６，１２０，８５６号、同第６，１３６，１８２号、同第６，３６５，３６２号、同第６，５５１，８４３号、同第６，６２０，６２７号、同第６，６２３，９８２号、同第６，６４５，７３１号、同第６，６６０，１５９号、同第６，７９０，３６６号、同第６，８６１，２５９号、同第６，８９０，４２６号、同第７，０１１，７９４号、同第７，２８２，３５０号、同第７，３３２，２８８号、同第５，８４９，５１７号及び同第５，４５９，０７３号に記載された方法により、回収する。
【００９２】
Ｂ．生検
[0140]いくつかの態様では、生検試料のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、試料は細針吸引腫瘍細胞である。いくつかの態様では、試料は腹腔鏡検査で得た腫瘍細胞である。いくつかの態様では、試料は外科的に得た腫瘍細胞である。いくつかの態様では、生検試料を採取し、患者が癌を患っているかどうかを判断し、その後、試料として本発明に使用する。
【００９３】
[0141]いくつかの態様では、生検試料のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。いくつかの態様では、試料は細針吸引した膵癌細胞である。いくつかの態様では、試料は腹腔鏡検査で得られた膵癌細胞である。
【００９４】
[0142]いくつかの態様では、試料はホルマリン固定した生検試料である。いくつかの態様では、試料は凍結している。いくつかの態様では、試料は一定期間保存されていたものである。
【００９５】
Ｃ．対照試料
[0143]いくつかの態様では、対象のヌクレオシド輸送体の発現レベルを、対照試料のヌクレオシド輸送体の発現レベルと比較する。いくつかの態様では、対象のヌクレオシド輸送体の発現レベルを、複数の対照試料のヌクレオシド輸送体の発現レベルと比較する。いくつかの態様では、複数の対照試料を用いて、癌を患っている患者のヌクレオシド輸送体の発現レベルを分類するのに使用する統計を生成する。
【００９６】
[0144]対照試料は、非対照試料と同じ提供源から、同じ方法により、得ることができる。
[0145]いくつかの態様では、患者以外のヒトから対照試料を得る。いくつかの態様では、複数の対照試料を複数のヒトから得る。いくつかの態様では、患者以外のヒトとは、患者の血縁である。いくつかの態様では、患者以外のヒトは、患者と遺伝的に類似したグループから、例えばアシュケナージから選ばれる。
【００９７】
[0146]いくつかの態様では、対象由来の試料のヌクレオシド輸送体の発現レベルを、別の患者由来の非癌性細胞のヌクレオシド輸送体の発現レベルと比較する。いくつかの態様では、患者の癌細胞由来の試料のヌクレオシド輸送体の発現レベルを、別の患者由来の非癌性細胞のヌクレオシド輸送体の発現レベルと比較する。いくつかの態様では、患者由来の試料のヌクレオシド輸送体の発現レベルを、別の患者由来の癌細胞のヌクレオシド輸送体の発現レベルと比較する。
【００９８】
[0147]いくつかの態様において対照試料は、健常者由来の、組織、細胞、又は器官である。
[0148]いくつかの態様において対照試料は、癌を患っている患者由来の組織、細胞、又は器官である。
【００９９】
[0149]いくつかの態様では、複数の対照試料を用いて、特定の組織、器官、又は細胞集団のヌクレオシド輸送体の発現の範囲を決定する。いくつかの態様では、複数の対照試料は多数の異なる患者由来である。いくつかの態様では、対照試料が採取された多数の患者は、癌を患っていない。いくつかの態様では、対照試料が採取された多数の患者は癌を患っている。いくつかの態様では、対照試料が採取された多数の患者の内の何人かは癌を患っていて、何人かは患っていないため、陽性及び陰性両方の対照試料となる。
【０１００】
[0150]場合によって対照試料は、試験を受ける患者以外から得られた試料である。場合によって対照試料は、それらを対照試料として使用する目的ではなく回収された。
[0151]場合によっては、妊産婦が死亡した後に対照試料を回収する。
【０１０１】
[0152]いくつかの態様では、対照試料は治療を必要としている患者由来である。いくつかの態様では、対照試料は治療を必要としている、同じ患者由来の正常な組織である。
[0153]いくつかの態様では対照試料は、対照として適切であることが判明している、培養組織又は培養細胞である。
【０１０２】
[0154]いくつかの態様で対照は、１種以上の輸送体遺伝子を発現していない細胞である（陰性対照）。そのような細胞は、当該分野で知られている方法、例えばＲＮＡｉにより、細胞の内生輸送体遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることによって得る。いくつかの態様で陰性対照細胞は、ｈＥＮＴ１及び／又はｈＣＮＴ１のような輸送体遺伝子の発現をノックアウト又はノックダウンしたヒーラ細胞である。
【０１０３】
[0155]いくつかの態様で対照細胞は、個人由来の培養細胞である。いくつかの態様で対照細胞は、患者由来の培養細胞である。
[0156]いくつかの態様で対照は、１種以上の輸送体遺伝子を発現している細胞である。大部分の細胞は輸送体遺伝子を発現しているため、陽性対照として使用することができる。
【０１０４】
[0157]いくつかの態様では、腫瘍試料中の発現レベルを決定するために、標準検査において正常レベルであると臨床的に許容された参照レベルを用いることができる。いくつかの態様では、患者以外の対照対象から得た対照試料を参照することにより、発現レベルが高いか或いは低いかを決定する。対照対象は、患者と類似する民族、年齢、及び性別の、健康であると見なされるヒトであってもよい。
【０１０５】
[0158]いくつかの態様では、対照試料について決定したヌクレオシド輸送体レベルとは、ｈＥＮＴ１、ｈＥＮＴ２、ｈＥＮＴ３、ｈＥＮＴ４、ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２、又はｈＣＮＴ３のレベルである。いくつかの態様では、対照試料について、複数のヌクレオシド輸送体レベルを決定する。全て又は一群のヌクレオシド輸送体レベルを、癌を患っている患者由来の試料のレベルと比較することができる。
【０１０６】
[0159]いくつかの態様では、対照試料を用いて決定したヌクレオシド輸送体のレベル又は対照試料は、ｈＥＮＴ１である。
ＩＶ．試料の保存及び輸送
[0160]いくつかの側面では、ヌクレオシド輸送体レベルを決定するのとは別の場所で試料を採取してもよい。そのような態様では試料を輸送する。いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体レベルの決定を行うのとは別の時点で試料を採取してもよい。そのような態様では試料を保存する。
【０１０７】
[0161]いくつかの態様では、患者由来の試料と比較する前に、対照試料は出荷され、販売され、又は輸送される。いくつかの態様では、対照細胞との比較を行う前に、癌患者由来の試料は出荷され、販売され、又は輸送される。
【０１０８】
[0162]いくつかの態様では、生体試料は固定された試料である。例えば、ホルマリン固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）試料、又は凍結試料である。
[0163]いくつかの態様では、試料の一部分のみが出荷される。出荷される部分の非限定的な例としては、選別した癌細胞又は単離した脂質膜が挙げられる。
【０１０９】
Ｖ．ヌクレオシド輸送体
[0164]いくつかの側面で本発明は、ヌクレオシド輸送体の検出を含む。いくつかの態様では、特定のヌクレオシド輸送体のレベルを決定する。いくつかの態様では、複数のヌクレオシド輸送体のレベルを決定する。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１のレベルを決定する。
【０１１０】
[0165]ヌクレオシド輸送体は、一群の膜内輸送タンパク質である。ヌクレオシド輸送体は、原形質膜を介して生理的なヌクレオシドを運ぶ。ヌクレオシド輸送体は、アデノシンなどのヌクレオシドの基質を、細胞及び／又は小胞の膜を横断して輸送する。ヌクレオシド輸送体はまた、ヌクレオシド系の抗癌剤及び抗ウイルス剤を、原形質膜を横断して運ぶことができる。
【０１１１】
[0166]ヒトの細胞及び組織に存在する主要な２群のヌクレオシド輸送体には、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）と濃縮型ヌクレオシド輸送体（ＣＮＴ）がある。
[0167]ＳＬＣ２９としても知られている受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）ファミリーは、アデノシンのようなヌクレオシドの基質を細胞内に輸送する、一群の原形質膜輸送体タンパク質である。４種類のＥＮＴが知られており、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３、及びＥＮＴ４と命名されている。ＥＮＴは、ジピリダモールやジラゼプのような、アデノシン再取り込み阻害剤によって遮断される。
【０１１２】
[0168]ＳＬＣ２８としても知られている濃縮型ヌクレオシド輸送体（ＣＮＴ）ファミリーには、ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ２及びＳＬＣ２８Ａ３の３つのメンバーがあり、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２及びＣＮＴ３とも呼ばれている。
【０１１３】
[0169]図２は、それらを介して親水性ヌクレオシドが細胞中に侵入することができる、いくつかのヌクレオシド輸送体を図示している。これらの輸送体は、ｈＥＮＴ１、ｈＥＮＴ２、ｈＥＮＴ３、ｈＥＮＴ４、ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２、及びｈＣＮＴ３を含んでいる。矢印は、いくつかの輸送体が原形質膜を横断して両方向に親水性ヌクレオシドを輸送することができることを示している。
【０１１４】
[0170]異なるヌクレオシド輸送体が原形質膜を通過して特定の化合物を運ぶ能力にはばらつきがある。例えばｈＥＮＴ２は、ヒポキサンチンや他のプリン核酸塩基をｈＥＮＴ１より輸送する。ｈＥＮＴ１は、他の既知のヌクレオシド輸送体よりも効率的にゲムシタビンを輸送する。
【０１１５】
[0171]ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ｈＥＮＴ１）は、ＳＬＣ２９Ａ１遺伝子によりコードされているタンパク質である。この遺伝子は、受動拡散型ヌクレオシド輸送体ファミリーのメンバーである。この遺伝子は、血漿及びミトコンドリアの膜に局在している膜貫通型の糖タンパク質をコードし、周囲の環境から細胞がヌクレオシドを取り込むのを仲介している。タンパク質は、ニトロベンジルチオイノシン（ＮＢＭＰＲ）による阻害に感受性のある、受動拡散型（濃縮型とは別の）輸送体として分類されている。ヌクレオシド輸送体は、ヌクレオシドのデノボ合成経路を欠損している細胞でのヌクレオチド合成に必要であり、かつ、癌やウイルスへの化学療法に用いられた細胞毒性をもつヌクレオシド薬及びヌクレオシド類似体薬の取り込みにもまた必要である。
【０１１６】
[0172]ｈＣＮＴ１（溶質担体ファミリー２８（ナトリウム結合型ヌクレオシド輸送体）、メンバー１）は、米国特許第６，１５３，７４０号に開示されている。
ＶＩ．輸送体の発現レベルを決定するための検定
[0173]さらに別の側面で本発明は、試料での１種以上のヌクレオシド輸送体のレベルを決定するための方法を提供する。いくつかの側面において「レベル」とは、試料中のヌクレオシド輸送体の活性レベルであり、活性レベルは、細胞、試料、又は腫瘍中で、ヌクレオシド輸送体が膜を介して運ぶ親水性ヌクレオシドの総量の測定値である。いくつかの側面においてこのレベルは、活性レベルと関連する発現レベルである。いくつかの側面で発現レベルは、細胞、試料、又は腫瘍に含まれるタンパク質の測定値である。いくつかの側面で発現レベルは、細胞、試料、又は腫瘍に含まれる核酸の測定値である。
【０１１７】
[0174]いくつかの側面において本発明は、バイオマーカーの発現レベルを決定するための方法を提供する。バイオマーカーは、試料又は対照試料でのヌクレオシド輸送体の発現レベルの指標である。バイオマーカーの発現レベルを、癌状態の又は健康な患者のいずれかの対象由来の試料について、本明細書で提供した、または当該分野で知られている検定の内の１つを実施することによって決定する。対照試料についても、非対照試料と同じ方法を用いて検定を行うことができる。
【０１１８】
[0175]いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体タンパク質である。いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体をコードしているＤＮＡである。いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体をコードしているｍＲＮＡである。いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体と相互作用するタンパク質をコードしているｍＲＮＡである。いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体の発現レベルと関連のある核酸である。いくつかの態様でバイオマーカーは、ヌクレオシド輸送体の発現レベルと関連のあるＳＮＰである。
【０１１９】
[0176]いくつかの態様でバイオマーカーは、原形質膜を介して化学療法薬を運ぶヌクレオシド輸送体の能力を変化させる変異と関連のある、核酸である。
[0177]いくつかの態様において本発明は、患者の輸送体レベルを決定するためのバイオマーカーを提供する。いくつかの態様において本発明は、患者由来の試料について、輸送体に関連のあるバイオマーカーのレベルを決定し、化学療法薬の投与が有効であるかどうかを決定するための方法を提供する。いくつかの態様において本発明は、患者由来の試料について、輸送体に関連のあるバイオマーカーのレベルを決定し、どの化学療法薬を投与すべきかどうかを決定するための方法を提供する。
【０１２０】
[0178]いくつかの側面では、問題となっている細胞、器官、腫瘍又は組織中の輸送体の発現は、患者間で差がある。いくつかの側面で発現の差とは、発現の欠損、発現の上昇又は、ある集団での多型領域の発現を含む。いくつかの側面で発現の差は、患者間のゲノムの差に基づいているか、或いは特定の患者、細胞、器官、腫瘍又は組織での特定の時点における遺伝子の発現制御に基づいている。
【０１２１】
Ａ．核酸
[0179]当該分野で一般的な方法によって試料から抽出したｍＲＮＡを用いて、遺伝子発現を評価することができる。ｍＲＮＡの解析方法としては、ハイブリダイゼーション法（例えばノザンブロット解析）、及び増幅法（例えばリアルタイムＰＣＲ）が挙げられるがこれらには限定されない。２つ以上の試料を処理するためには、処理能力の高い系を用いることができる。
【０１２２】
[0180]いくつかの態様では、核酸プローブを用いてｍＲＮＡを検出する。核酸プローブとは、試料へのハイブリダイゼーションを検出することが可能な、１種以上の核酸断片の回収を含むことを意図している。プローブの標的又は試料への結合が検出できるように、プローブを標識しなくても又は標識してもよい。プローブは、ゲノム（例えば１種以上のクローン）、単離した全クロモソーム若しくはクロモソーム断片、又は回収したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増副産物の、１種以上の特定の（予め選択した）部分の核酸源から作成することができる。核酸プローブは、アレイに含まれるように、固体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、水晶、シリカ処理したスライドグラス）に固定した、単離した核酸であってもよい。プローブは、核酸アレイのメンバーであってもよい。この目的のためには、高密度アレイを作成することができる技術もまた用いることができる（例えば、Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124；米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）。プローブの生成源となった同じ標的又は試料にプローブとして特異的に結合する（すなわち特異的にハイブリダイズする）能力を保持する限り、特定のプローブの正確な配列を、「実質的に相同」ではあるが、ある程度変更してもよいことを、当業者は分かっているであろう。用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖いずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。この用語は、核酸、すなわちオリゴヌクレオチド（天然のヌクレオチドと同様な又は改良された結合特性を有する既知の類似体を含む）を、必要な場合には参照核酸として、包含する。この用語は、天然に生じるヌクレオチドと同じ経路で代謝される、又は必要とされる目的のために代謝率を改善した核酸も含む。この用語はまた、合成骨格をもつ核酸様構造体を包含する。当業者は、試料中の癌細胞をスクリーニングするために核酸プローブをどのように使用するか分かっているであろう。
【０１２３】
[0181]増幅検定により、リアスタイムで遺伝子の発現レベルを検出することができる。一側面では、ＤＮＡに結合する蛍光試薬を用いて、増副産物を直接可視化することができる。蛍光試薬としては、ＤＮＡ挿入剤及びＤＮＡ溝結合剤が挙げられるがこれらには限定されない。二本鎖ＤＮＡ分子の組み込まれた挿入剤の量は、通常、増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するので、当該分野で一般的な光学系を用い、挿入された色素の蛍光を定量することにより、増幅産物の量を簡単に決定することができる。この用途に適した、ＤＮＡに結合する色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（fluorcoumanin）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジン類、アントラマイシンなどが挙げられる。
【０１２４】
[0182]別の側面では、増副産物の検出と定量が容易になるように、配列特異的プローブのような他の蛍光標識を増幅反応に使用することができる。プローブを用いた定量的な増幅は、所望の増副産物の配列特異的な検出に依存している。これには、蛍光、すなわち特異性と感受性を向上させる標識特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が使用される。プローブを用いた定量的増幅の実施方法は当該分野において十分に確立されており、かつ、米国特許第５，２１０，０１５号に教示されている。
【０１２５】
[0183]ハイブリダイゼーション検定を行っている間に形成された、プローブと標識の複合体を容易に検出するために、ヌクレオチドプローブを検出可能な標識と結合させることができる。本明細書に記載した方法及び組成物への使用に適している検出可能な標識には、光化学的、生化学的、分光器を用いた、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的な手段によって検出できる、いかなる組成物も含まれる。好適で多様な検出可能な標識が当該分野で知られており、これには、蛍光又は化学発光標識、放射性同位体標識、酵素的又は他のリガンドが含まれる。好ましい態様では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体のような、蛍光標識又は酵素タグを使用することが望ましいと考えられる。
【０１２６】
[0184]ハイブリダイゼーション強度を検出又は定量するために用いられる検出方法は、通常、そのために選択した標識に依存する。例えば、放射性標識は、写真用フィルム又はｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを使用することで検出することができる。蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検知器を用いることにより検出及び定量することができる。酵素標識は通常、酵素に基質に加え、基質に対する酵素の作用によって生成される反応産物を測定することにより、検出する。比色標識は、着色された標識を単に可視化することにより検出する。
【０１２７】
[0185]本明細書で提供した方法では、当業者に知られている、核酸の配列決定技術はいずれも用いることができる。ＤＮＡ配列決定の技術としては、標識したターミネーター又はプライマーと平板状のゲル又はキャピラリーを用いた古典的なジデオキシ配列決定反応（サンガー法）、可逆的ターミネーターを用い、標識したヌクレオチドを合成することによる配列決定、パイロシークエンシング、４５４シークエンシング、標識したオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーション、ライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーションにより標識したクローンを合成し、その後ライゲーションを行うことによる配列決定、重合化工程の間に取り込まれる標識されたヌクレオチドのリアルタイムモニタリング、ポロニーシークエンシング、及びＳＯＬｉＤシークエンシングが挙げられる。近年、ポリメラーゼとリガーゼを用い、連続して又は一回、伸長反応を行うことによって、又はプローブライブラリーを用い、一回又は連続してディファレンシャルハイブリダイゼーションを行うことによって、ばらばらにした分子の配列を決定する方法が示されてきた。多数のクローン配列についてのこれらの反応は並行して行われ、現行の市販されているアプリケーションでは１億以上の配列を並行して反応させることができる。これらの配列決定法を、試料中の核酸配列を決定するために用いる。
【０１２８】
Ｂ．タンパク質
[0186]本発明のいくつかの側面では、試料中のヌクレオシド輸送体発現レベルを決定するために、タンパク質レベルを決定する。
【０１２９】
[0187]タンパク質レベルの決定は通常、（ａ）癌細胞などの試料に含まれるタンパク質を、バイオマーカー特異的に結合する薬剤と接触させる工程（バイオマーカーの例としては、ｈＥＮＴ及びｈＣＮＴタンパク質が挙げられるがこれらには限定されない）、及び（ｂ）形成された、任意の薬剤とタンパク質の複合体を同定する工程、を含む。この態様の一側面では、癌関連タンパク質に特異的に結合する薬剤が抗体であり、かつ、タンパク質は、生検若しくは培養細胞に含まれているか又は対象の体内にある細胞上にある。
【０１３０】
[0188]薬剤とタンパク質の複合体は、薬剤とポリペプチド又は薬剤とペプチドの複合体であってもよい。
[0189]薬剤とタンパク質の複合体の形成は、当該分野で一般的な方法に従って、直接又は間接的に検出することができる。直接検出する方法では、薬剤は検出可能な標識と共に供給され、反応しなかった薬剤は複合体から除去することができ、残った標識の量が形成された複合体の量を示す。そのような方法では、ストリンジェントな洗浄条件でも薬剤に結合したまま維持される標識を選択することが好ましい。好ましくは、標識は結合反応を干渉しない。一方間接的な検出方法では、薬剤が、化学的又は酵素的のいずれかで導入された標識を含むことが要求される。所望の標識は通常、得られる薬剤とタンパク質の複合体の結合又は安定性を干渉しない。しかしながら、標識は通常、効果的に結合するように、抗体に近づきやすくなるように設計されるため、検出可能なシグナルが生成される。
【０１３１】
[0190]タンパク質レベルの検出に好適な様々な標識が当該分野で知られている。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。
【０１３２】
[0191]結合反応の間に形成された薬剤とタンパク質の複合体の量は、標準的な定量的検定により定量することができる。上述したように、薬剤とタンパク質の複合体の形成は、結合部位に維持される標識の量により、直接測定することができる。
【０１３３】
[0192]いくつかの態様では、特定の薬剤上の結合部位に対する、標識した類似体と競合する癌関連タンパク質の能力について試験する。この競合検定では、捕捉された標識の量は、試験試料中に含まれる癌関連タンパク質の量と反比例する。
【０１３４】
[0193]上で概要を示した一般的な原理に基づいている多数のタンパク質解析技術を使用することができる。それらには、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫放射定量測定、その場免疫測定（例えばコロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を用いた）、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、免疫蛍光測定、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれるがこれらには限定されない。
【０１３５】
[0194]当該分野で知られている、自動化された（コンピューター支援型の）画像解析システムは、腫瘍試料の可視化検査を増幅することができる。細胞又は組織を特定の生物学的マーカーに特異的な検出可能に標識された試薬に曝露し、その後、細胞の画像を、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）又はテレビ用カメラなどのカメラから受診した画像をコンピューターで拡大することができる。そのようなシステムは例えば、試料中のｈＥＮＴ１の発現や活性化、又は任意の別の診断マーカーを検出及び測定するために用いることができる。従って本明細書に記載した方法は、より正確な癌診断、及び組織学的に同定された癌細胞中での遺伝子発現のより優れた特徴付け、特に腫瘍マーカー遺伝子若しくは特定の癌型やサブタイプで発現することが知られている遺伝子又は化学療法薬の効果を変えることが知られている遺伝子の発現に関する特徴付け、を提供することができる。この情報により、情報に基づいた、より有効な投与計画が可能になる。なぜならば、特定の腫瘍型又はサブタイプに臨床上効果のある薬剤を、そうであると同定された細胞を有する患者に投与することができるからである。
【０１３６】
[0195]ポリペプチドの発現パターンを、当該分野で知られている方法を用いて検出及び定量することができる。例えばポリペプチドの発現パターンを、そのポリペプチドに特異的な生物学的検出試薬を用いて検出することができる。生物学的検出試薬は例えば、抗体であってよい。用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、非ヒト抗体、完全なヒト抗体、及び抗体断片を含むがこれらには限定されない、全ての形態の抗体を含む。修飾語「モノクローナル」とは、その抗体が、実質的に均質な抗体集団から得られたという特徴を表しており、かつ、いかなる特定の方法による抗体生産を必要としているとは見なされない。本明細書に記載した方法に有用なモノクローナル抗体は例えば、Ｋｏｈｌｅｒらによって最初に記載されたハイブリドーマ法（Nature, 256:495 (1975)）によって作出され、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）から作出することができる。「モノクローナル抗体」はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Nature, 352:624-628 (1991)）及びＭａｒｋｓら（J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)）によって記載された技術により、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。キメラ抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種由来の抗体中の対応する配列と同一又は相同であるか或いは、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しており、鎖の残りの部分が、別の種由来の抗体中の対応する配列と同一若しくは相同であるか或いは、別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片が、それらが所望の生物学的活性を示す限り含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。「抗体断片」には、完全な抗体の任意の一部分が含まれ、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直線状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられる。非ヒト（例えば齧歯類）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合ヒト化抗体は、受容側の超可変領域由来の残基が、非ヒト種（提供側抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、鳥類、他の哺乳動物若しくは非哺乳動物又は、所望の特異性、親和性、及び結合能をもつ非ヒト霊長類、の超可変領域由来の残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容側抗体又は提供側抗体に含まれない残基を含んでもよい。抗体の精度をさらに高めるために、これらの変更を行うことができる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 及び Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【０１３７】
[0196]目的の抗原に対する抗体の作出方法は、当該分野では知られている。例えば、関連する抗原及びアジュバントを皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注入することにより、ポリクローナル抗体を動物中で産生することができる。関連する抗原を、免疫した種での免疫原性をもつタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤と、二官能性物質又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を用いて結合させることも有用な場合がある。例えば、１００μｇ若しくは５μｇのタンパク質又は複合体（ウサギ又はマウスについてそれぞれ）と３倍量の完全フロイントアジュバントを混合し、その後この溶液を複数の部位に皮内注入することにより、抗原、免疫原性複合体、又は誘導体に対して、動物を免疫してもよい。一ヶ月後、最初に注入したペプチド又はコンジュゲートの完全フロイントアジュバント溶液の５分の１から１０分の１量を、複数の部位に皮下注入することにより、動物に追加免疫を行う。７日から１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価を測定する。力価がプラトーに達するまで動物に追加免疫を行う。好ましくは、同じ抗原のコンジュゲートではあるが、異なるタンパク質に結合している及び／又は異なる架橋剤を介して結合しているコンジュゲートを用いて動物を追加免疫する。コンジュゲートは、組換え細胞培養中で融合タンパク質として作出することもできる。また免疫反応を増強するために、硫酸アルミニウムのような凝集剤を適宜使用する。
【０１３８】
[0197]モノクローナル抗体の産生方法は当該分野で知られており、例えばハイブリドーマ法が挙げられる。ハイブリドーマ法では、免疫に用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘導するために、マウス又は他の適切な宿主動物、ハムスターやウサギなどを、上述したように免疫する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫することができる。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球と骨髄腫細胞とを融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。このように作製したハイブリドーマ細胞を、適切な培地、好ましくは融合していない、親骨髄腫細胞の成長と生存を阻害する１種以上の物質を含む培地に播種し、生育させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素であるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ又は他の同様なマーカー遺伝子）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培地は通常、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を阻害する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞を生育させた培地を試験する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生したモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又は、放射免疫測定（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロでの結合試験によって決定する。所望の特異性、親和性及び／又は活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法で生育させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、培地、腹水、又は血清から、標準的な抗体精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーにより、適宜分離する。標準的な方法により（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＣＲなどの技術と共に）、このモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡを容易に単離、配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい提供源として役立つ。一旦単離したら、ＤＮＡを発現ベクター中に組み込み、そうしなければ抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞のような宿主細胞に感染させ、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。配列修飾、キメラ化、ヒト化、構造モデリング、及び断片化に基づいた抗体のさらなる操作方法は、当該分野で知られている。
【０１３９】
[0198]ヒト化の代替えとして、ヒト抗体を生成することができる。例えば現在では、免疫した場合に、内生の免疫グロブリンを生産することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能な、トランスジェニック動物（例えばマウス）を作出することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系の変異マウスでの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失が、内生の抗体産生を完全に阻害することが記載された。ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン遺伝子アレイを、そのような生殖細胞系に変異をもつマウスに導入すると、抗原投与した場合にヒト抗体が生産される。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号及び同第５，５４５，８０７号を参照のこと。あるいは、免疫していない提供源由来の免疫グロブリンの可変（Ｖ）ドメイン遺伝子のレパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで生産するために、ファージディスプレイ法（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を用いることができる。この技術では、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１１３又はｆｄなどの繊維状バクテリオファージのメジャー或いはマイナー外被タンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、その後、ファージ粒子の表面上に、機能性抗体断片として提示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含むため、抗体を機能特性に基づいて選抜することは、それらの特性を示している抗体をコードしている遺伝子の選抜することにもなる。従ってファージは、Ｂ−細胞のいくつかの特徴を模倣する。ファージディスプレイは様々な形式で実施することができ、それらについては例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。複数の提供源からのＶ−遺伝子セグメントをファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Nature, 352:624-628 (1991)）は、免疫したマウスの脾臓由来の、Ｖ遺伝子の低分子無作為化コンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の様々なアレイを単離した。免疫化していないヒト提供者由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、かつ、様々な抗原アレイに対する抗体（自己抗原を含む）を、Ｍａｒｋｓら（J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）又はＧｒｉｆｆｉｔｈら（EMBO J. 12:725-734 (1993)）によって記載された方法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照のこと。ヒト抗体は、Ｂ細胞を生体内で活性化させることによっても生成することができる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１４０】
[0199]１種以上の抗原結合領域を含む抗体断片を生産するための様々な技術が開発されてきた。従来これらの断片は、完全な抗体をタンパク質分解することよって生成された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は現在では、組換え宿主細胞を用いて直接生産することができる。例えば抗体断片を、上で考察したような抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的に結合させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別の方法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明かであろう。その他の態様では、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が抗体として選択される。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号などに記載されているような「直線状抗体」であってもよい。そのような直線状抗体断片は単一特異性であっても二重特異性であってもよい。
【０１４１】
[0200]あるいは、生物学的な検出試薬はアプタマーであってもよい。アプタマーは、非核酸標的分子に結合する核酸又はペプチドである。従って、本明細書に記載した方法に適した結合剤には、アプタマーも含まれる。ヌクレオシド輸送体レベルを決定するためにアプタマーを標的に結合させる。これまでに知られている又はこれから見出されるいかなる手段によってアプタマーを選択してもよい。例えばアプタマーは、ｈＥＮＴ１に対するその結合能によって選択することができる。
【０１４２】
[0201]アプタマーをＳＥＬＥＸ、すなわちSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment過程によって選択することができる。本明細書で使用する場合、ＳＥＬＥＸとは、特定の標的に対する結合親和性をもつアプタマーを選択する過程である。簡単に説明すると、この過程は通常、（ａ）アプタマーオリゴヌクレオチドの大きなライブラリーを生成する工程（例えば、１０１５個程度の異なる配列を含む）、（ｂ）このライブラリーを目的の標的に曝す工程、（ｃ）標的に結合していないライブラリー中のメンバーを除去する工程、（ｄ）標的に結合したライブラリー中のメンバーの増幅し、標的に結合したアプタマーを濃縮したライブラリーを構築する工程、（ｅ）標的に最も強く結合するアプタマーを単離するために、工程（ｂ）から（ｄ）を１５回以上繰り返して行う工程、を含む。本明細書で使用する場合、ＳＥＬＥＸ過程は、現在知られている様々な変更（例えば、米国特許第５，４７２，８４１号、同第５，５０３，９７８号、同第５，５６７，５８８号、同第５，５８２，９８１号、同第５，６３７，４５９号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７０５，３３７号、同第５，７１２，３７５号及び同第６，０８３，６９６号を参照のこと）、或いは今後発見される様々な変更をも含む。選抜又はスクリーニングを繰り返す同様の過程を、ペプチド、ペプチド類似薬、タンパク質、低分子、及び抗体を含むがこれらには限定されない、他の潜在的な生物学的試薬を評価するために、同じように用いることができる。
【０１４３】
[0202]いくつかの態様では、バイオマーカーに対する適切な一次抗体を用いて直接、又は適切な二次抗体（マウス一次抗体を用いた場合にはウサギ抗マウスＩｇＧなど）及び／又は第三のアビジン（若しくはストレプトアビジン）とビオチンとの複合体用いて検出する（「ＡＢＣ」）画像解析により、ポリペプチドを定量する。バイオマーカーとしてはｈＥＮＴ又はｈＣＮＴが挙げられるがこれらには限定されない。
【０１４４】
[0203]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＥ（配列番号１）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）；アミノ酸配列ＩＤＰＥＴＧＡＩ（配列番号２）若しくはアミノ酸配列ＩＤＰＥＴＧＫＴ（配列番号３）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列ＴＲＥＦＴＹ（配列番号４）若しくはアミノ酸配列ＴＲＥＬＴＹ（配列番号５）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）を含む抗体である。
【０１４５】
[0204]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＥ（配列番号１）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）配列、アミノ酸配列ＩＤＰＥＴＧＡＩ（配列番号２）又はアミノ酸配列ＩＤＰＥＴＧＫＴ（配列番号３）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）配列、及びアミノ酸配列ＴＲＥＦＴＹ（配列番号４）又はアミノ酸配列ＴＲＥＬＴＹ（配列番号５）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）配列、を含む抗体である。
【０１４６】
[0205]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、アミノ酸配列ＱＳＬＬＦＳＮＧＫＴＹ（配列番号６）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）配列、アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号７）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）配列、及びアミノ酸配列ＶＱＧＴＨＦＰＷＴ（配列番号８）と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）配列、を含む抗体である。
【０１４７】
[0206]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、アミノ酸配列ＱＳＬＬＦＳＮＧＫＴＹ（配列番号２４）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）配列、アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号２５）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）配列、及びアミノ酸配列ＶＱＧＴＨＦＰＷＴ（配列番号２６）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）配列、を含む抗体である。
【０１４８】
[0207]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、以下に示す配列番号９又は配列番号１０と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む抗体である。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、以下に示す配列番号１１又は配列番号１２と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％９８％、９９％以上相同なアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体である。
【０１４９】
【化１】
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【０１５０】
[0208]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、以下に示す配列番号９又は配列番号１０アミノ酸配列を含む可変重鎖を含む抗体である。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１に対する抗体は、以下に示す配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体である。
【０１５１】
[0209]標的タンパク質の量は、染色された抗原の光学密度の平均を測定することにより定量することができる。同時に、染色された組織面積の合計の割合すなわち百分率を、例えば上で染色した面積を二番目の画像での対照レベル（抗体閾値レベルなど）として、容易に算出することができる。バイオマーカーを含む核を可視化した後、治療後の患者由来の組織におけるそのような細胞の百分率又は量を、未治療組織でのそのような細胞の百分率又は量と比較する。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの発現パターンを「決定する」とは、広義に、すなわち直接検査又は間接的な形式のいずれかによって、例えば受託診断サービスによって、そのようなポリペプチドに関する情報を単に得ることを意味すると理解される。
【０１５２】
[0210]患者から採取した癌組織切片を、ｈＥＮＴ又はｈＣＮＴのようなタンパク質の発現に対する免疫染色により解析することができる。いくつかの態様では、癌、腫瘍又は癌に冒されている若しくは腫瘍形成性であると予測されるいずれの組織も、ｈＥＮＴ１発現に対する免疫組織化学で解析される。いくつかの態様では、癌、腫瘍又は癌に冒されている若しくは腫瘍形成性であると予測されるいずれの組織も、免疫組織化学によりｈＥＮＴ１の発現について解析する。これらの測定は例えば、組織マイクロアレイを用いることによって達成することができる。組織マイクロアレイは、複数の組織試料を均一な染色及び点数化条件下で迅速にスクリーニングするための十分に確立された方法である（Hoos et al., 2001, Am J Pathol. 158: 1245-51）。染色されたアレイの点数化は、観察される染色を正確に定量する自動化された系によって行うことができる。この解析の結果によりバイオマーカーレベルが同定され、治療、すなわちゲムシタビン又はゲムシタビン−５’−エライデート治療など、を行った後の患者に対する成果を予測するために利用することができる。
【０１５３】
ＶＩＩ．癌を分類し、治療するための方法
[0211]本発明の別の側面は、ヌクレオシド輸送体の発現レベルに基づいて、試料を分類するために有用な方法を提供する。いくつかの態様では、この分類は、どの患者が本発明の特定の化合物が効果を示すかを決定するために有用である。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法は、ゲムシタビンが効果を示す癌の同定に有用である。いくつかの態様では、ゲムシタビンが効き目を現さない癌を同定するために、本発明の方法を用いることができる。さらなる態様では、本明細書に記載した方法は、ゲムシタビンを用いた治療を受けるべきでない癌を患っている対象を同定するために有用である。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法を、ゲムシタビン類似体を用いた治療を受けるべき癌を患っている対象を同定するために用いる。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法は、ゲムシタビン−５’−エライデートを用いた治療を受けるべき癌を患っている対象を同定するために有用である。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法はさらに、癌患者への投与計画を決定する工程を含む。
【０１５４】
[0212]いくつかの態様では、試料中のヌクレオシド輸送体レベルを決定し、分類する。試料の分類をその後、適切な治療と一致させる。この治療は、特定の投薬計画を含む。この投薬計画を患者に伝える。説明に従って、患者は適切な薬剤を摂取し、その結果、患者の癌の治療が成功する。
【０１５５】
Ａ．輸送体の発現レベル
[0213]数多くのヌクレオシド輸送体が存在し、それぞれが独自の動力学によって、膜を横断してヌクレオシド類似薬を運ぶと考えられる。ヌクレオシド輸送体レベルが低い癌細胞では、細胞中へのこれら薬剤の輸送が十分でないため、薬剤の効果が低くなると考えられる。例えば、ｈＥＮＴ１レベルの低い腫瘍は、ゲムシタビンを用いた治療への感受性が低い。図６は、異種稙片マウスモデルでのｈＥＮＴ１のｍＲＮＡレベルとゲムシタビンへの感受性の相関を図示している。
【０１５６】
[0214]いくつかの態様において本発明は、ヌクレオシド輸送体の発現レベルに基づいて試料を分類する又はランク付けするための方法を提供する。いくつかの態様では、試料のヌクレオシド輸送体レベルを「高い」、「正常」又は「低い」とランク付けする。いくつかの態様では、分類又はランクは、対照の発現レベルの統計分布と関連している。いくつかの態様では、分類又はランクは、対象由来の対照試料と関連している。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１の発現レベルを対照の発現レベルの統計分布と比較して分類又はランク付けする。いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１の発現レベルを対象から得た対照試料の発現レベルと比較して、分類又はランク付けする。
【０１５７】
[0215]ＥＮＴの異なるメンバー間での基質特異性が重複していることにより、いくつかの態様では、見込みのある患者を、ｈＥＮＴ１以外のｈＥＮＴファミリータンパク質のレベルが低いかについて試験してもよい。いくつかの態様では、１種以上のｈＥＮＴファミリータンパク質について、患者を試験してもよい。ｈＥＮＴファミリータンパク質とその類似体の例としては、ｈＥＮＴ２、ｈＥＮＴ２、ｈＥＮＴ３、及びｈＥＮＴ４が挙げられるがこれらには限定されない。
【０１５８】
[0216]１種以上のｈＣＮＴの発現レベルが低いかについて、患者を試験してもよい。いくつかの態様では、ＣＮＴ試験を、ＥＮＴレベルの測定と独立して又はＥＮＴレベルの測定に加えてのいずれかで実施する。ｈＣＮＴとその類似体の例としては、ｈＣＮＴ１、ｈＣＮＴ２、及びｈＣＮＴ３が挙げられるがこれらには限定されない。
【０１５９】
[0217]本明細書に記載した方法は、親水性ヌクレオシド類似体、例えばゲムシタビンの取り込み率が低い対象に有用である。本明細書で開示した方法は、ｈＥＮＴ又はｈＣＮＴのような既知のヌクレオシド輸送体に限らず、いずれか特定のヌクレオシド輸送体が、臨床上正常な発現レベルだと見なされるよりも低いことによって取り込み率が低くなっている見込みのある患者に適用可能である。
【０１６０】
[0218]いくつかの態様では、本明細書に記載した組成物を投与することが有効な患者を選択するために、薬剤の取り込みや代謝に影響を与えることが分かっている他の生物学的特徴を考慮する。他の生物学的特徴の非限定的な例としては、一塩基多型、鑑別血球計算を含む全血球計算、シトクロムｐ４５０イソ型の発現パターンと酵素活性、性別、人種、年齢、体重、家族歴又は前治療歴が挙げられる。
【０１６１】
[0219]いくつかの態様では、膜を横断するゲムシタビンの輸送が低いことに関連するヌクレオシド輸送体の多型又は遺伝的変異について、患者をスクリーニングする。
[0220]いくつかの態様では、臨床試験で、腫瘍組織中のｈＥＮＴ１の発現を測定する。本明細書に記載した方法、対照試料、及び比較試料に基づいて、患者を、ｈＥＮＴ１が高い群又はｈＥＮＴ１が低い群に分類する。臨床現場では、（１）膵臓腫瘍でのｈＥＮＴ１発現が低いことが、ゲムシタビン治療後の成果が低いことと関連しているか、及び（２）ｈＥＮＴ１が低い患者では、ゲムシタビンと比較してゲムシタビン−５’−エライデートが優れた効果を有するか、を確認するために試験を実施する。
【０１６２】
[0221]いくつかの態様では、「高い」又は「低い」などの呼称は、遺伝子の発現レベルを示すために用いられる。いくつかの態様では、遺伝子発現はｍＲＮＡレベルによって測定される。いくつかの態様では、患者試料、例えば腫瘍生検中の発現レベルが高いか或いは低いかの決定は、その患者から得た正常な組織試料を参照することにより行われる。いくつかの態様では、標準検査で正常なレベルであると臨床的に許容された参照レベルを、腫瘍試料での発現レベルを決定するために用いることができる。いくつかの態様では、発現レベルが高いか或いは低いかの決定は、患者以外の対照対象から得た対照試料を参照することにより行われる。対照対象は、患者と同様の人種、年齢、及び性別認識を共有する、健康であると思われる人物であってよい。いくつかの態様において「低い」発現とは、臨床上正常だと見なされるレベル又は対照組織から得た発現レベルの約１．１、１．２、１．３、１．５、１．７、２、２．２、２．５、２．７、３、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００、１０００倍未満又は１０００倍未満のｍＲＮＡレベルである。
【０１６３】
[0222]いくつかの態様では、「高い」又は「低い」などの呼称は、ヌクレオシド輸送体タンパク質の発現レベルを示すために用いられる。いくつかの態様では、タンパク質の発現を免疫組織化学により測定する。いくつかの態様では、患者試料、例えば腫瘍生検中の発現レベルが高いか或いは低いかの決定は、その患者から得た正常な組織試料を参照することにより行われる。いくつかの態様では、標準検査で正常なレベルであると臨床的に許容された参照レベルを、腫瘍試料の発現レベルを決定するために用いることができる。いくつかの態様では、発現レベルが高いか或いは低いかの決定は、患者以外の対照対象から得た対照試料を参照することにより行われる。対照対象は、患者と同様の人種、年齢、及び性別認識を共有する、健康であると思われる人物であってよい。いくつかの態様において「低い」発現とは、臨床上正常だと見なされるレベル又は対照組織から得た発現レベルの、約１．１、１．２、１．３、１．５、１．７、２、２．２、２．５、２．７、３、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００、１０００倍未満又は１０００倍未満のｍＲＮＡレベルである。
【０１６４】
[0223]いくつかの態様では、低いか或いは高いかを決定する基準は、陽性に染色されている細胞の数及び／又は染色の強度に基づいており、染色は、ヌクレオシド輸送体タンパク質の指標である。いくつかの態様では、陽性に染色された細胞が５０％未満であった場合にスコアが低い。いくつかの態様では、陽性に染色された細胞が１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満であった場合にスコアが低い。いくつかの態様では、陽性対照の染色よりも染色の強度が１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満であった場合にスコアが低い。
【０１６５】
[0224]いくつかの態様では、低いか或いは高いかを決定する基準は、陽性に染色されている細胞の数及び／又は染色の強度に基づいており、染色は、ヌクレオシド輸送体タンパク質の指標である。いくつかの態様では、陽性に染色された細胞が５０％を越える場合にスコアが高い。いくつかの態様では、陽性に染色された細胞が１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％を越える場合にスコアが高い。いくつかの態様では、陽性に染色された細胞が４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を越える場合にスコアが高い。いくつかの態様では、染色強度が陽性対照の染色と同程度であった場合にスコアが高い。いくつかの態様では、染色強度が、陽性対照の染色の８０％、８５％、又は９０％であった場合にスコアが高い。
【０１６６】
[0225]いくつかの態様では、点数化は「Ｈ−スコア」に基づいている。Ｈ−スコアは式、３×強く染色された細胞の百分率＋２×中程度に染色された細胞の百分率＋弱く染色された細胞の百分率、から求め、０〜３００までの範囲となる。
【０１６７】
[0226]いくつかの側面では、当該分野で良く知られている記述である。いくつかの側面では、強い染色、中程度の染色、及び弱い染色とは校正した染色のレベルであって範囲は確立されており、かつ、染色強度はその範囲内の瓶に振り分けられる。いくつかの態様では、強い染色は、強度範囲の７５パーセンタイルを越える染色であり、中程度の染色は強度範囲の２５〜７５パーセンタイルの染色であり、低い染色は、強度範囲の２５パーセンタイル未満の染色である。いくつかの側面では当業者、及び特定の染色技術に精通している技術者は、瓶の大きさを調整し、染色範囲を定義する。
【０１６８】
[0227]いくつかの態様では、染色した細胞の５０％より多くが強い反応を示した場合に、ｈＥＮＴ１染色が高いという名前が割り当てられ、染色した細胞の５０％未満に染色が見られなかった場合にはｈＥＮＴ１染色無しという名前が割り当てられ、その他の場合全てにｈＥＮＴ１染色が低いという名前が割り当てられる。
【０１６９】
[0228]いくつかの態様では、試料や患者などでのｈＥＮＴ１の発現レベルの評価及び点数化は、１人以上の熟練した医師、すなわちｈＥＮＴ１の発現とｈＥＮＴ１の染色パターンを熟知している医師によって行われる。例えばいくつかの態様では、評価及び点数化を行う試料や患者などについての臨床的な特徴及び成果は、医師には知らされない。
【０１７０】
[0229]本出願及び本明細書に記載したヌクレオシド輸送体レベルの検出方法の使用は、患者又は患者の癌若しくは腫瘍の診断又は病期の分類に有用な１種以上の結果を生じることができる。いくつかの態様において腫瘍を分類する方法は、試料中のヌクレオシド輸送体の有無及び／又は濃度レベルに関するデータを精査する又は解析する工程を含む。
【０１７１】
Ｂ．発現レベルと適切な治療を一致させる工程
[0230]本明細書では、ヒトである癌患者による反応を含む、癌治療に対する患者の反応を予測する方法を提供する。予測される効果に基づいて、特定の化学療法薬と特定の患者とを一致させる方法をさらに提供する。
【０１７２】
[0231]いくつかの態様では、低いｈＥＮＴ１レベルを示した対象、例えば正常な患者と比較して低いレベルを示した対象に、疎水性ゲムシタビン類似体を投与する。いくつかの態様では、低いｈＥＮＴ１レベルを示した対象に、ゲムシタビン類似体を投与する。いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルのようなゲムシタビン類似体を用いた治療の高い効果により、ｈＥＮＴ１レベルが低い対象の癌が緩和される。
【０１７３】
[0232]いくつかの態様では、ｈＥＮＴ１レベルが「低い」と分類された試料を提供した対象に、疎水性ゲムシタビン類似体を投与する。いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルのようなゲムシタビン類似体を用いた治療の高い効果により、その患者の癌が緩和される。
【０１７４】
[0233]いくつかの態様では、対象のｈＥＮＴ１レベルを測定し、その後治療上有効量のゲムシタビン類似体を対象に投与する方法により、対象の癌が大幅に緩和される。いくつかの態様では、患者に対するゲムシタビン類似体の効果を予測するために、対象のｈＥＮＴ１レベルを指標として用いる。いくつかの態様では、対象のｈＥＮＴ１レベルが低いかどうかの決定は、ゲムシタビン類似体を投与する前に行う。
【０１７５】
[0234]いくつかの態様では、保険会社又は介護者が、ヌクレオシド輸送体レベルに基づいた、許容可能な治療手順を決定する。
[0235]いくつかの態様では、本明細書に記載した様々な癌でのｈＥＮＴ１以外のｈＣＮＴ又はｈＥＮＴを測定する。いずれかの低い発現レベルが検出された場合、次に、そこで発現レベルが低いことが同定された癌型と関連づける。いくつかの態様では、本明細書に記載した方法及び組成物が効果を示す可能性のある患者群や腫瘍群を同定するために、関連づけたデータセットを使用する。いくつかの態様では、ゲムシタビン治療に対する反応性が低く、かつ、１種以上のｈＣＮＴやｈＥＮＴの発現レベルが低い患者群又は腫瘍群を同定するために、関連づけたデータとゲムシタビンに対する反応についての既知のデータに相互参照を付ける。
【０１７６】
[0236]いくつかの側面では、膵癌細胞でのｈＥＮＴ１の発現が低いことと、ゲムシタビン治療後の生存率が低いことを関連づける。さらに、ｈＥＮＴ１を欠損している腫瘍細胞は生体内で、ピリミジンヌクレオシド類似体に対して耐性をもつ。例えば、ｈＥＮＴ１のｍＲＮＡレベルは異種稙片マウスモデルのゲムシタビンに対する感受例と関連している。ｈＥＮＴ１のｍＲＮＡの発現レベルがより高いことは、ゲムシタビンに対するより良い反応性と関連している。
【０１７７】
[0237]膵臓癌及び肺癌患者では、腫瘍中のｈＥＮＴ１の発現レベルが低いことと、ゲムシタビン治療後の生存転帰の低さが関係していることが示されてきた。膵癌患者では、ｈＥＮＴ１の発現レベルが低いことと、ゲムシタビン治療の成果が低いことに関連があることが示されてきた。３分の２までの膵癌患者で、ｈＥＮＴ１の発現が欠損していることにより、細胞によるゲムシタビンの取り込みが限られている可能性がある。およそ５０％の膵癌患者で、腫瘍中のｈＥＮＴ１の発現が低いことが分かっている。ｈＥＮＴ１レベルはまた、ゲムシタビンを用いた化学療法で治療した肺癌患者における成果を予見する。
【０１７８】
Ｃ．ヌクレオシド輸送体レベルに関する情報の伝達
[0238]いくつかの態様では、患者又は個人のヌクレオシド輸送体レベル関する情報を、試料を試験した会社から、患者又は個人に直接伝達する。いくつかの態様では、患者又は個人のヌクレオシド輸送体レベルに関する情報は、患者又は個人に医師から伝達される。いくつかの態様では、患者又は個人のヌクレオシド輸送体レベルに関する情報は、安全なウェブサイトを介して患者又は個人に伝達される。いくつかの態様では、試料の分類についてのみ、又は推奨される薬剤と用量についてのみの情報が、患者又は個人に伝えられる。いくつかの態様では、能力不全を理由に患者又は個人には情報を伝えない。そのような場合には、家族又は法的保護者に情報を伝える。
【０１７９】
[0239]いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体レベルの情報と合わせて、適切な薬剤と用量についての情報も患者に伝えられる。いくつかの態様では、患者のヌクレオシド輸送体レベルを前提とした正確な用量を示す説明となるように、化学療法薬が表示される。
【０１８０】
[0240]データの精査又は解析に基づいた結論を、患者、保護者又は介護者に提供することができる。いくつかの態様では、この結論は、疾患の診断に関するデータの精査又は解析に基づくものである。いくつかの態様では、この結論は、対象を治療するために使用する薬剤に関するデータの精査又は解析に基づくものである。いくつかの態様では、患者、保護者又は介護者への結論の提供には、ネットワークを介したデータの伝達が含まれることが想定される。いくつかの態様では、未加工のデータ又は部分的に解釈されたデータが、ネットワークを経由したそのデータの伝達を介して共有される。従って、本明細書に記載した走査型検知システム及び方法を用いたシステム及び方法を提供する。
【０１８１】
[0241]本発明の一側面は、試料に関するデータを生成するために、生物学的なヌクレオシド輸送体の有無について患者の試料をスクリーニングする工程、試料のデータを回収する工程、患者、保護者又は介護者にそのデータを提供し、腫瘍分類に関するデータの精査又は解析に基づいて結論を出す工程、を含む方法である。いくつかの態様では、患者、保護者又は介護者への結論の提供には、ネットワークを経由したデータの伝達が含まれる。
【０１８２】
[0242]図７は、本発明に関するデータの精査又は解析を達成することができる、論理装置の代表例を示すブロック図である。そのようなデータは、患者の疾患、障害又は状態に関するものであってもよい。図７は、コンピューターシステム（デジタル素子）８００を示しており、これは装置８２０に接続されていて、走査型検知システム８２４と共に、例えば結果を生成するために使用する。コンピューターシステム８００は、メディア８１１及び／又はネットワークポート８０５からの指示を読み取ることができる論理装置として理解することもでき、一定のメディア８１２を含むサーバー８０９と任意に接続することができる。図７に示すシステムには、ＣＰＵ８０１、ディスクドライブ８０３、キーボード８１５及び／又はマウス８１６のような任意の入力装置及び任意のモニター８０７が含まれる。データを、指定された通信媒体を経由して、ローカル又は遠隔位置にあるサーバー８０９へ通信行することができる。通信媒体は、データを送信及び／又は受信できるいかなる手段も含み得る。通信媒体は例えば、ネットワーク接続、無線接続又はインターネット接続であってよい。そのような接続はワールドワイドウェブを経由した通信を提供することができる。本発明に関するデータがそのようなネットワーク又は接続を介して送信され、関係者８２２が受理及び／又は精査できることが想定される。受け取る関係者８２２は、患者、保護者又は介護者であってよいが、これらには限定されない。
【０１８３】
[0243]いくつかの態様では、コンピューターで読み取り可能なメディアには、環境試料又は生体試料の解析結果を伝達するのに適したメディアを含む。メディアには、本明細書に記載した方法により生成される、対象の病状又は病期に関する結果が含まれていてもよい。
【０１８４】
ＶＩＩＩ．本発明の化合物
[0244]ヌクレオシド輸送体レベルに基づいて癌を治療するための化合物を開示する。当業者は、本発明のいくつかの態様は、ヌクレオシド輸送体に依存して原形質膜を通過するいずれの化合物にも適用可能であることを理解するだろう。そのため、本発明のいくつかの態様は、患者への薬効に関する提案を含む。この場合、この薬剤がヌクレオシド輸送体を介して原形質膜を通過することが分かっており、かつ、前記ヌクレオシド輸送体のレベルが既に決定されている。
【０１８５】
[0245]いくつかの化学療法薬は、膜を通過する際の細胞輸送体への依存度が低くなるように改良されてきた。化学療法薬を、輸送体を介して関連する細胞膜を通過させる能力が低い患者には、輸送体を必要とする薬剤よりも、これらの改良された化学療法薬が有効である。
【０１８６】
[0246]化学療法薬の効果を向上させるために、輸送体を操作するための別の薬剤の使用方法をさらに開示する。
Ａ．親水性ヌクレオシド薬
[0247]親水性ヌクレオシドは、特定のチャネル又はヌクレオシド輸送体を通って原形質膜を通過する。これらの薬剤は、ヌクレオシド輸送体、特に、特定の薬剤が膜を通過することを可能にしている輸送体を発現している癌の治療に最も有効である。親水性ヌクレオシド薬の例としては、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、及びゲムシタビンがある。
【０１８７】
[0248]いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「高い」）に基づき、患者はカペシタビンを使用するように助言される。いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「低い」）に基づき、患者はカペシタビンを使用しないように助言される。
【０１８８】
[0249]カペシタビン（５’−デオキシ−５−Ｎ−[（ペントキシ）カルボニル］−シチジン）は、ピリミジンヌクレオシドである。カペシタビンは経口投与された後、カルボキシルエステラーゼによって５’−デオキシ−５−フルオロシチジンに代謝されるプロドラッグ（前駆薬）である。５’−デオキシ−５−フルオロシチジンは、シチジンデアミナーゼによって５’−デオキシ−５−フルオロウリジンへと脱アミノ化される。ｈＥＮＴ１は５’−デオキシ−５−フルオロウリジンの取り込みを仲介する。カペシタビンの代謝産物である５’−デオキシ−５−フルオロウリジン一リン酸はチミジル酸シンターゼを阻害し、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン三リン酸はＤＮＡに取り込まれる。５’−デオキシ−５−フルオロウリジンは５−フルオロウラシルへと変換される最終的な活性化工程はチミジンホスホリラーゼに触媒される。チミジンホスホリラーゼの腫瘍組織中での発現は高く、かつ、いくつかの胃腸腫瘍、具体的には結腸癌、での標準的な５−フルオロウラシル治療に対する抵抗性に関連している。カペシタビンは転移性結腸癌に対する活性を有し、これは５−フルオロウラシルとロイコボリンとの併用に匹敵する。カペシタビンは、ドセタキセル又はアントラサイクリンの後に進行した転移性乳癌に対する活性をもつ。
【０１８９】
[0250]いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「高い」）に基づき、患者はクラドリビンを使用するように助言される。いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「低い」）に基づき、患者はクラドリビンを使用しないように助言される。
【０１９０】
[0251]クラドリビン（２−ＣｄＡ、２−クロロ−２’−デオキシアデノシン）は、アデニン部分の２位に塩素置換を有する。クラドリビンは、アデノシンデアミナーゼによる脱アミノ化に対しての抵抗性を有する。クラドリビンはｈＥＮＴ１、ｈＥＮＴ２及びｈＣＮＴ３を介して細胞内に侵入し、その後、ｄＣＫと細胞内ヌクレオチドキナーゼの複合的な作用により、活性化形態の２−ＣｄＡＴＰに変換される。クラドリビンはＤＮＡの複製と修復、並びにリボヌクレオチド還元酵素を阻害し、それによってデオキシリボヌクレオチドの合成を減少させる。クラドリビンへの曝露は分裂途中の細胞にとって有害である。なぜならば、複製可能なＤＮＡ合成と、ＤＮＡ修復過程の阻害とミトコンドリアの機能や保全の変化による細胞の休止が阻害されるからである。クラドリビンが、悪性度の低いリンパ腫、すなわち慢性リンパ性白血病や有毛細胞白血病対して活性を示すことが分かっている。
【０１９１】
[0252]いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「高い」）に基づき、患者はクロファラビンを使用するように助言される。いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「低い」）に基づき、患者はクロファラビンを使用しないように助言される。
【０１９２】
[0253]クロファラビン（Ｃｌ−ＦａｒａＡ、２−クロロ−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノフラノシル）アデニン）は、上皮の及び血液学的な悪性疾患の両方に対して活性をもつ。２位の塩基をハロゲンで置換すると、脱アミノ化に対して抵抗性となる。アラビノシル糖のフッ素を置換すると、細菌性ホスホリラーゼによる分解が阻害され、経口投与が可能になる。クロファラビンはｈＥＮＴ１、ｈＥＮＴ２、ｈＣＮＴ２と、おそらくｈＣＮＴ３をも介して細胞内に侵入する。クロファラビンは、ｄＣＫ及びヌクレオチドキナーゼにより、一、二、及び三リン酸に代謝される。Ｃｌ−ＦａｒａＡＴＰは複製中のＤＮＡに取り込まれて鎖の伸長を停止させ、リボヌクレオチド還元酵素を阻害することによって細胞内に蓄えられるデオキシヌクレオチドを減少させる。
【０１９３】
[0254]いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「高い」）に基づき、患者はゲムシタビンを使用するように助言される。いくつかの態様では、患者由来の試料中のヌクレオシド輸送体レベル（例えば「低い」）に基づき、患者はゲムシタビンを使用しないように助言される。
【０１９４】
[0255]ゲムシタビン（２’２’−ジフルオロデオキシシチジン又はｄＦｄＣ）は、デオキシシチジン類似体である。ゲムシタビンはシタラビンの類似体であり、シタラビンの２つのフッ素原子のリボース環の２位が修飾されてゲムシタビンとなる。ゲムシタビンは親水性ヌクレオシド薬である。
【０１９５】
[0256]ゲムシタビンは細胞を死滅させることができる。ゲムシタビンは細胞周期特異性を示し、主に、ＤＮＡ合成を行っている（Ｓ期の）細胞を殺し、また、Ｇ１／Ｓ期移行の進行を遮断する。ゲムシタビンの細胞毒性作用は、ＤＮＡ合成の阻害を引き起こす二リン酸ヌクレオシドと三リン酸ヌクレオシドの２つの作用が組み合わさることに起因する。まず、ゲムシタビン二リン酸が、ＤＮＡ合成に必要とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の生成反応の触媒に関与するリボヌクレオチド還元酵素を阻害する。二リン酸ヌクレオシドによるこの酵素の阻害が、ｄＣＴＰなどのデオキシヌクレオチドの濃度低下を生じる。次にゲムシタビン三リン酸が、ＤＮＡへの組み込みをめぐってｄＣＴＰと競合する。ｄＣＴＰの細胞内濃度が低下すると（二リン酸の作用によって）、ＤＮＡへのゲムシタビン三リン酸の組み込みが増加する（自己活性化）。ゲムシタビンヌクレオチドがＤＮＡに組み込まれた後、伸長しているＤＮＡ鎖に、別のヌクレオチドが１つだけ付加される。この付加が起こるとＤＮＡ合成が阻害される。ＤＮＡポリメラーゼεはゲムシタビンヌクレオチドの除去や伸長しているＤＮＡ鎖の修復を行うことはできない（マスクされたＤＮＡ鎖終結）。
【０１９６】
[0257]ゲムシタビンは親水性の分子である。ゲムシタビンの細胞、例えば腫瘍細胞への侵入は、膜内輸送タンパク質の発現、特にヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ｈＥＮＴ１）の発現に依存している。Mackey et al Cancer Res (1998); Damaraju et al Nucl Acids (2009)。いくつかの態様では、患者由来の試料中のｈＥＮＴ１レベルを決定することが、ゲムシタビンを用いた患者の治療についての指示となる。
【０１９７】
[0258]ゲムシタビンは、進行した膵癌に対する現行の標準治療であり、かつ、卵巣癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌及び乳癌を含む他の癌の治療には、他の化学療法薬と併せて使用される。ゲムシタビンは転移性膀胱癌に対する活性を有し、転移性膀胱癌の治療にゲムシタビンは、シスプラチンと併用されてきた。
【０１９８】
[0259]いくつかの側面で本発明は、ｈＥＮＴ１レベルが低くない患者へのゲムシタビンの投与を提供する。いくつかの側面で本発明は、ｈＥＮＴ１レベルが低くない患者への、ゲムシタビン投与の推奨を提供する。いくつかの側面で本発明は、患者由来の試料中のｈＥＮＴ１レベルに基づいて、ゲムシタビンの用量に関する説明を患者に提供する。
【０１９９】
Ｂ．親油性ヌクレオシド類似体
[0260]別の側面では、親油性ヌクレオシド類似体を目的とする。なぜならば、脂質膜を横断する促進核酸により、これらがヌクレオシド輸送体に依存せずに細胞内に侵入する場合があるからである。エステル化されたエライジン脂肪酸を５’位に有する親油性のゲムシタビン類似体ファミリーが製造された。ゲムシタビン誘導体のいくつかの態様は、以下に図示する式（Ｉ）、又は活性成分としてのその薬学上許容可能な塩である。
【０２００】
【化２】
2013523712.tif 000003
【０２０１】
（Ｉ）
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、並びにＣ１８及びＣ２０の飽和及び単不飽和アシル基から独立して選択されるが、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の全てが水素となることはない。さらなるゲムシタビン誘導体が米国特許第６，３８４，０１９号に開示されている。
【０２０２】
[0261]いくつかの態様において式（Ｉ）のゲムシタビン誘導体におけるＲ１及びＲ３は水素であり、Ｒ２はＣ１８又はＣ２０飽和又は単飽和アシル基である。
[0262]ゲムシタビンは、３つの誘導体化可能な官能基、すなわち５’ヒドロキシル基と３’ヒドロキシル基、及びＮ４アミノ基を有する。各基を選択的にエステル又はアミド誘導体に変換することができるが、同時に二付加物（ジエステル又はエステルアミド）や三付加物が生成される場合がある。二付加物や三付加物の例では、アシル置換基が同じである必要はない。
【０２０３】
[0263]いくつかの態様では、モノアシル誘導体、すなわちＲ１、Ｒ２及びＲ３のうちの２つが水素である誘導体が、本医薬組成物の活性成分として好ましい。アシル基による一置換が糖部分の３’−Ｏ又は５’−Ｏ位にあるものが特に好ましく、５’−Ｏ置換が最も好ましい。
【０２０４】
[0264]単不飽和アシル基の二重結合は、シス又はトランス配座のいずれであってもよいが、どちらの配座が用いられるかによって治療効果は変わり得る。
[0265]単不飽和アシル基の二重結合の位置もまた活性に影響を及ぼすと考えられる。いくつかの態様では、ω−９位にその不飽和をもつエステル又はアミドを使用することが好ましい。ωシステムによる命名法では、単不飽和脂肪酸の二重結合のω位は、末端のメチル基から数える。そのため、例えば、エイコセン酸（Ｃ２０：１ω９）は鎖中に２０の炭素原子を含み、かつ、鎖のメチル末端から数えて９番目と１０番目の炭素の間に１つの二重結合が形成されている。いくつかの態様では、オレイン酸（Ｃ１８：１ω９、シス）、エライジン酸（Ｃ１８：１ω９、トランス）、エイコセン酸（Ｃ２０：１ω９、シス）及び（Ｃ２０：１ω９、トランス）から誘導したエステル、エステルアミド及びアミドの使用が好ましく、アミドと５’エステルが現在の最も好ましい誘導体である。
【０２０５】
[0266]いくつかの例では、ステアリン酸（Ｃ１８：０）及びエイコセン酸（Ｃ２０：０）から誘導したゲムシタビンのエステル、エステルアミド及びアミドが有利に使用される。
【０２０６】
[0267]中でも、エライジン酸（Ｎ４）ゲムシタビン−アミド、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル及びゲムシタビン−３’−エライジン酸エステルが最も好ましい誘導体であり、本発明の好ましい態様では、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルが医薬組成物の活性成分である。
【０２０７】
[0268]いくつかの態様では、ゲムシタビン誘導体はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（本明細書ではゲムシタビン−５’−エライデート、ＣＰ−４０５５、ＣＰ−４１２６、及びＣＯ−１０１とも呼ぶ）であり、式（ＩＩ）の構造を有する。
【０２０８】
【化３】
2013523712.tif 000004
【０２０９】
（ＩＩ）
[0269]式（Ｉ）の誘導体を先行技術で知られている方法に従って調製する。さらなる詳細については国際公開第９８／３２７６２号を参照のこと。国際公開第９８／３２７６２号には、式（Ｉ）の化合物が癌の治療に有用であることも開示されている。
【０２１０】
[0270]細胞による親油性ヌクレオシド類似体の取り込みは、ヌクレオシド輸送体に依存せずに起こる。
[0271]ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルは輸送体に依存しない方法で細胞内に侵入する。ゲムシタビン三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）は高い活性をもつゲムシタビンの代謝産物である。これは細胞内で、デオキシシチジンキナーゼによるゲムシタビン又はゲムシタビン−５’−エライデートのリン酸化によって生成される。図３は、ゲムシタビン−５’−エライデートを投与した場合ｄＦｄＣＴＰが、輸送体に依存せずに細胞内に蓄積することを示している。図４は、輸送体を遮断しても、生体内でのゲムシタビン−５’−エライデートによる細胞死から細胞が保護されないことを示している。図５Ａ及び５Ｂは、ゲムシタビン−５’−エライデートは生体内で、ｈＥＮＴ１に依存せずに腫瘍細胞を殺すことを示している。
【０２１１】
[0272]輸送体に依存しないゲムシタビン類似体は、ゲムシタビンに対して反応性の良くないいくつかの腫瘍細胞に有効である。
Ｃ．単剤治療
[0273]本明細書で提供した方法は、癌や他の腫瘍性疾患の治療に有用である。用語「治療」は本明細書で使用する場合、予防的には望ましくない状態を予防又は抑制するため、また治療的には病状の程度又は症状を解消する又は低減させるためにゲムシタビン類似体の投与を包含することを意図している。治療には、望ましくない状態の再発を予防すること、望ましくない状態の進行を遅延させること、それに望ましくない状態の発症を予防又は遅らせることも含まれる。本発明の治療は、そのような治療の必要性を作り出す疾患又は状態を患っているヒト又は他の哺乳類に対して行われる。さらに、治療にはゲムシタビン類似体を生体内で細胞や器官に使用することも含まれる。治療は全身投与であっても局所投与であってもよい。
【０２１２】
[0274]有効量とは、活性成分、例えばゲムシタビン類似体が、単回投与又は複数回の投与で、所望の薬理学的効果を発揮するために必要な量である。熟練した施術者は、それぞれの患者又はそれぞれの状態を治療するための有効量を、熟練した医師には良く知られている慣習的な実験及び用量設定により、決定・最適化することができる。組成物を他の薬剤と併用して投与するかどうかによって、或いは患者間での薬物動態、薬物の体内動態、及び代謝の違いにより、実際の用量及び投与計画は変わってもよい。同様に、生体内で使用する量は変わってもよい。必要以上の実験を行わずに特定の状況での必要性に従って用量を調整することは、当該分野の技術の範囲内である。本明細書で開示する場合の用量範囲は、特定の用途で認められるように、構成要素をより多く又は少なく使用することを排除しない。
【０２１３】
[0275]本明細書で提供する医薬組成物の記載には、ヒトへの投与に好適な医薬組成物が含まれる。本開示に基づけば、そのような組成物が通常、いかなる哺乳類又は他の動物への投与に適していることは、当業者には明らかであろう。様々な動物への投与に適している組成物の調製については十分に理解されており、獣医薬理学分野の当業者は、ヒトに投与するための医薬組成物に基づいて、慣習的な実験により、そのような変更を設計し、実施することができる。
【０２１４】
[0276]いくつかの態様では、開示した方法によってヌクレオシド輸送体の発現が低いと同定された対象に、単一のヌクレオシド類似体化学療法薬を単回で投与する。いくつかの態様では、対象由来の試料中の発現が低い。いくつかの態様では、癌細胞中の発現が低い。好ましい態様では、ヌクレオシド類似体化学療法薬はゲムシタビン−５’−エライデートである。
【０２１５】
[0277]いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体化学療法薬を単回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を１週間に１回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を３日に１回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を１日１回、５日間投与してもよい。１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間、投与を繰り返すことができる。
【０２１６】
[0278]いくつかの態様では、ゲムシタビン−５’−エライデートを単回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を１週間に１回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を３日に１回投与してもよい。いくつかの態様では、単回投与用の組成物を１日１回、５日間投与してもよい。１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間、投与を繰り返すことができる。
【０２１７】
[0279]いくつかの態様では、２５ｍｇ／ｋｇのヌクレオシド類似体化学療法薬を投与する。いくつかの態様では、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜５ｍｇ、１〜１０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、５０〜１５０ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、１５０〜３００ｍｇ、２５０〜５００ｍｇ、３００〜６００ｍｇ又は５００〜１０００ｍｇのヌクレオシド類似体化学療法薬を投与する。いくつかの態様では、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、又は５０ｍｇのヌクレオシド類似体化学療法薬を投与する。いくつかの態様では、約７５ｍｇ、７６ｍｇ、７７ｍｇ、７８ｍｇ、７９ｍｇ、８０ｍｇ、８１ｍｇ、８２ｍｇ、８３ｍｇ、８４ｍｇ、８５ｍｇ、８６ｍｇ、８７ｍｇ、８８ｍｇ、８９ｍｇ、９０ｍｇ、９１ｍｇ、９２ｍｇ、９３ｍｇ、９４ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、又は１６０ｍｇのヌクレオシド類似体化学療法薬を投与する。
【０２１８】
[0280]いくつかの態様では、２５ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン−５’−エライデートを投与する。いくつかの態様では、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜５ｍｇ、１〜１０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、５０〜１５０ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、１５０〜３００ｍｇ、２５０〜５００ｍｇ、３００〜６００ｍｇ又は５００〜１０００ｍｇのゲムシタビン−５’−エライデートを投与する。いくつかの態様では、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、又は５０ｍｇのゲムシタビン−５’−エライデートを投与する。いくつかの態様では、約７５ｍｇ、７６ｍｇ、７７ｍｇ、７８ｍｇ、７９ｍｇ、８０ｍｇ、８１ｍｇ、８２ｍｇ、８３ｍｇ、８４ｍｇ、８５ｍｇ、８６ｍｇ、８７ｍｇ、８８ｍｇ、８９ｍｇ、９０ｍｇ、９１ｍｇ、９２ｍｇ、９３ｍｇ、９４ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、又は１６０ｍｇのゲムシタビン−５’−エライデートを投与する。
【０２１９】
[0281]いくつかの態様において本発明の組成物は、１％〜８０重量％（例えば１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、２５％、２５．５％、２６％、２６．５％、２７％、２７．５％、２８％、２８．５％、２９％、２９．５％、３０％、３０．５％、３１％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．５％、３４％、３４．５％、３５％、３５．５％、３６％、３６．５％、３７％、３７．５％、３８％、３８．５％、３９％、３９．５％、４０％、４０．５％、４１％、４１．５％、４２％、４２．５％、４３％、４３．５％、４４％、４４．５％、４５％、４５．５％、４６％、４６．５％、４７％、４７．５％、４８％、４８．５％、４９％、４９．５％、５０％、５０．５％、５１％、５１．５％、５２％、５２．５％、５３％、５３．５％、５４％、５４．５％、５５％、５５．５％、５６％、５６．５％、５７％、５７．５％、５８％、５８．５％、５９％、５９．５％、６０％、６０．５％、６１％、６１．５％、６２％、６２．５％、６３％、６３．５％、６４％、６４．５％、６５％、６５．５％、６６％、６６．５％、６７％、６７．５％、６８％、６８．５％、６９％、６９．５％、７０％、７０．５％、７１％、７１．５％、７２％、７２．５％、７３％、７３．５％、７４％、７４．５％、７５％、７５．５％、７６％、７６．５％、７７％、７７．５％、７８％、７８．５％、７９％、７９．５％、又は８０％）の、ヌクレオシド類似体化学療法薬又はその薬学上許容可能な塩を含む。
【０２２０】
[0282]いくつかの態様において本発明の組成物は、１％〜８０重量％（例えば１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、２５％、２５．５％、２６％、２６．５％、２７％、２７．５％、２８％、２８．５％、２９％、２９．５％、３０％、３０．５％、３１％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．５％、３４％、３４．５％、３５％、３５．５％、３６％、３６．５％、３７％、３７．５％、３８％、３８．５％、３９％、３９．５％、４０％、４０．５％、４１％、４１．５％、４２％、４２．５％、４３％、４３．５％、４４％、４４．５％、４５％、４５．５％、４６％、４６．５％、４７％、４７．５％、４８％、４８．５％、４９％、４９．５％、５０％、５０．５％、５１％、５１．５％、５２％、５２．５％、５３％、５３．５％、５４％、５４．５％、５５％、５５．５％、５６％、５６．５％、５７％、５７．５％、５８％、５８．５％、５９％、５９．５％、６０％、６０．５％、６１％、６１．５％、６２％、６２．５％、６３％、６３．５％、６４％、６４．５％、６５％、６５．５％、６６％、６６．５％、６７％、６７．５％、６８％、６８．５％、６９％、６９．５％、７０％、７０．５％、７１％、７１．５％、７２％、７２．５％、７３％、７３．５％、７４％、７４．５％、７５％、７５．５％、７６％、７６．５％、７７％、７７．５％、７８％、７８．５％、７９％、７９．５％、又は８０％）の、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル又はその薬学上許容可能な塩を含む。
【０２２１】
Ｄ．併用療法
[0283]いくつかの態様では、試料中のヌクレオシド輸送体の発現レベルから、２種以上の治療薬の投与が指示される場合がある。
【０２２２】
[0284]いくつかの態様では、化学療法薬であるヌクレオシド類似体、ゲムシタビン類似体、又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを、治療計画の一部として別の治療薬と併用して投与してもよい。ヌクレオシド類似体、ゲムシタビン類似体、又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル化学療法薬を投与する前、それらの投与と同時に、又は投与後に、別の治療薬を投与することができる。ヌクレオシド類似体、ゲムシタビン類似体、又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル化学療法薬の投与中に投与する薬剤を単一の組成物として併用しても、別個の投与事象として、ほぼ同時に同じ方法によって投与してもよい。ゲムシタビン類似体の投与前後に投与する薬剤は、ゲムシタビン類似体投与前後の時間帯の内に投与することができ、この時間帯には、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、若しくは２２時間未満又はそれ以上；約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４日未満又はそれ以上；約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４週未満又はそれ以上；約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４ヶ月未満又はそれ以上；及び約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４年未満又はそれ以上が含まれるがこれらには限定されない。いくつかの態様では、ゲムシタビン類似体とオキサリプラチンを併用する。いくつかの態様では、別の治療薬をゲムシタビン類似体と結合させる。例えば、放射性同位元素、薬剤又は毒素の腫瘍部位に対する標的精度を上げ、それらの治療効果を向上させて副作用を最小限に抑えるために、放射性同位元素、薬剤、及び毒素を抗体又は抗体断片と結合させることが可能であることが分かっている。これらの薬剤及び方法の例は、Wawrzynczak and Thorpe (Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks and N. M. Teich, eds, Chapter 18, pp. 378-410, Oxford University Press, Oxford, 1986)、Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C.-W. Vogel, ed., 3-300, Oxford University Press, New York, 1987)、Dillman, R.O. (CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984)、Pastan et al.(Cell 47:641, 1986)、Vitetta et al. (Science 238:1098-1104, 1987)及びBrady et al. (Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 13:1535-1544, 1987)に概説されている。癌に対する免疫抱合体の使用、及び他の治療形態の他の例は、特に、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，４６０，４５９号、同第４，４６０，５６１号及び同第４，６２４，８４６号、Ｒｏｗｌａｎｄに付与された米国特許第４，０４６，７２２号、Ｒｏｄｗｅｌｌらに付与された米国特許第４，６７１，９５８号、並びにＳｈｉｈらに付与された米国特許第４，６９９，７８４号に開示されており、それらの全体は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
[0285]いくつかの態様では、ゲムシタビン類似体を投与する前、その投与と同時に又は投与後に、輸送体遮断薬を投与する。輸送体遮断薬は、ゲムシタビン類似体が細胞中に侵入したにもかかわらず腫瘍細胞によってゲムシタビン類似体が排出されることを防ぐ。なぜならば、細胞内に侵入した後、ゲムシタビン類似体はｈＥＮＴ１やｈＣＮＴ１などの１種以上の輸送体によって排出され得るゲムシタビンへと変換されるからである。
【０２２４】
[0286]いくつかの態様では、ゲムシタビンを投与する前、その投与と同時に又は投与後に、輸送体遮断薬を投与する。輸送体遮断薬は、ゲムシタビンが細胞中に侵入したとしても、腫瘍細胞によってゲムシタビンが排出されることを防ぐ。なぜならば、細胞内に侵入した後、ゲムシタビン類似体はｈＥＮＴ１やｈＣＮＴ１などの１種以上の輸送体によって排出され得るゲムシタビンへと変換されるからである。
【０２２５】
[0287]いくつかの態様では、輸送体遮断薬は、アカデシン、酢酸、バルビツール酸塩、ベンゾジアゼピン、カルシウムチャネル遮断薬、カルバマゼピン、カリソプロドール、シロスタゾール、シクロベンザプリン、ジラゼプ、ジピリダモール、エストラジオール、エタノール、フルマゼニル、ヘキソベンジン、ヒドロキシジン、インドメタシン、イノシン、ＫＦ２４３４５、メプロバメート、ニトロベンジルチオグアノシン、ニトロベンジルチオイノシン、パパベリン、ペントキシフィリン、フェノチアジン、フェニトイン、プロゲステロン、プロペントフィリン、プロポフォール、ピューロマイシン、Ｒ７５２３１、ＲＥ１０２ＢＳ、ソルフラジン、トヨカマイシン、トラカゾレート、及び三環系抗うつ薬からなる群より選択される。
【０２２６】
[0288]いくつかの態様では、ゲムシタビン又はゲムシタビン類似体を投与した２０分後、３０分後、１時間後、１．５時間後、２時間後、３時間後又はそれ以上後に輸送体遮断薬を投与する。
【０２２７】
[0289]いくつかの態様では、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの用量の輸送体遮断薬を投与する。いくつかの態様では、１〜５ｍｇ／ｋｇの用量の輸送体遮断薬を投与する。
[0290]いくつかの態様ではゲムシタビン類似体を、シクロパミン、ＧＡＮＴ５８及びＧＤＣ−０４４９からなる群より選択される、ヘッジホッグタンパク質阻害剤と併用する。
【０２２８】
[0291]いくつかの態様では、１種以上の化学療法薬を、腫瘍がそれ以上成長するのを低減させる又は予防することができる抗腫瘍薬又は抗癌剤と併用する。非限定的な例としては、化学療法薬、細胞毒性薬、及び非ペプチド低分子（グリベック（登録商標）（メシル酸イマチニブ）、ベルケード（登録商標）（ボルテゾミブ）、カソデックス（ブカルタミド）、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びアドリアマイシンなど）、アルキル化剤（チオテパ及びシクロホスファミド（シトキサン（商標）など）、スルホン酸アルキル（ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど）、アジリジン（ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレ、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド及びトリメチロールメラミンなど）、ナイトロジェンマスタード（クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど）、ニトロソウレア（カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど）、抗生物質（アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、カソデックス（商標）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど）、代謝拮抗薬（メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）、葉酸類似体（デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど）、プリン類似体（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど）、ピリミジン類似体（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、アンドロゲン（例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）など）、抗副腎皮質ステロイド剤（アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど）、葉酸補充薬（フォリン酸など）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビスアントレン、エダトレキサート、デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン、ジアジクオン、エルホミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２、２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキサン（例えばパクリタキセル（タキソール（商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、プリンストン、ニュージャージー）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）レチノイン酸、エスペラマイシン、カペシタビン、並びに上記いずれかの薬学上許容可能な塩、酸又は誘導体がある。また適切な化学療法細胞調整剤としては、抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、（ノルバデックス（商標）、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（フェアストン）を含む）や抗アンドロゲン剤（フルタミド、ニルタミド、ブカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなど）、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体（シスプラチン及びカルボプラチンなど）、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）などの、腫瘍に及ぼすホルモンの作用を制御又は阻害する抗ホルモン剤がある。必要であれば、本明細書に記載した化合物又は医薬組成物を、一般に処方されている抗癌剤（ハーセプチン（登録商標）、アバスチン（登録商標）、アービタックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、タキソール（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、タキソテレ（登録商標）、ＡＢＶＤ、ＡＶＩＣＩＮＥ、アバゴボマブ、アクリジン・カルボキサド、アデカツムマブ、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、アルファラジン、アルボシジブ、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン、アモナフィド、アントラセンジオン、抗ＣＤ２２免疫毒素、抗腫瘍薬、抗腫瘍活性をもつ植物、アパジコン、アチプリモド、アザチオプリン、ベロテカン、ベンダムスチン、ＢＩＢＷ２９９２、ビリコダル、ブロスタリシン、ブリオスタチン、ブチオニンスルホキシイミン、ＣＢＶ（化学療法）、カリクリン、細胞周期非依存性抗腫瘍薬、ジクロロ酢酸、ディスコデルモリド、エルサミトルシン、エノシタビン、エポチロン、エリブリン、エベロリムス、エキサテカン、エクシスリンド、フェルギノール、フォロデシン、ホスフェストロール、ＩＣＥ化学療法、ＩＴ−１０１、イメキソン、イミキモド、インドロカルバゾール、イロフルベン、ラニキダル、ラロタキセル、レナリドミド、ルカントン、ルートテカン（Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、マホスファミド、ミトゾロミド、ナフォキシジン、ネダプラチン、オラパリブ、オルタタキセル、ＰＡＣ−１、ポポー（Ｐａｗｐａｗ）、ピクサントロン、プロテアソーム阻害剤、レベッカマイシン、レシキモド、ルビテカン、ＳＮ−３８、サリノスポラミドＡ、サパシタビン、スタンフォードＶ、スワインソニン、タラポルフィン、タリキダル、テガフール・ウラシル、テモダール、テセタキセル、四硝酸トリプラチン、トリス（２−クロロエチル）アミン、トロキサシタビン、ウラムスチン、バジメザン、ビンフルニン、ＺＤ６１２６、及びゾスキダル、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドリアマイシン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、二メシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾ−ル、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、リシン−Ａ、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、破傷風トキソイド、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、塩酸トポテカン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネジピン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン、タキソール、チオセミカルバゾン誘導体、テロメラーゼ阻害剤、三酸化ヒ素、プラノマイシン、スリンダク硫化物、シクロパミン、プルモルファミン、γ−セクレターゼ阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、ＨＨシグナル伝達阻害剤、Ｂｍｉ−１阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、Ｎｏｔｃｈ−１阻害剤、ＤＮＡチェックポイントタンパク質阻害剤、ＡＢＣ輸送体阻害剤、有糸分裂阻害剤、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期調節剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体反応
調節剤、血管形成阻害剤、ＤＮＡ修復阻害剤、及び低分子Ｇタンパク質阻害剤など）と併用することができる。上に挙げた１種以上の薬剤と併用することができる。
【０２２９】
[0292]いくつかの側面では、低フルクトース食を摂取している対象に、ゲムシタビン又はゲムシタビン類似体を投与する。いくつかの態様では、低フルクトース食を摂取している対象に、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与する。いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体の発現が低く、低フルクトース食を摂取している対象に、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与する。
【０２３０】
[0293]いくつかの側面では、フルクトース代謝の阻害剤と併せて、ゲムシタビン又はゲムシタビン類似体を投与する。いくつかの態様では、フルクトース代謝の阻害剤と併せて、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与する。いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体の発現が低い対象に、フルクトース代謝の阻害剤と併せてゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与する。
【０２３１】
[0294]いくつかの態様では、膵癌と診断された患者に、ヌクレオシド化学療法薬と亜鉛を投与する。亜鉛は、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、から１００μＭの濃度で投与することができる。いくつかの態様では、その患者のヌクレオシド輸送体の発現レベルは高いことが確認されている。いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１である。
【０２３２】
[0295]いくつかの態様では、膵癌と診断された患者に、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルと亜鉛を投与する。亜鉛は、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、から１００μＭの濃度で投与することができる。いくつかの態様では、その患者のヌクレオシド輸送体の発現レベルは低いことが確認されている。いくつかの態様では、ヌクレオシド輸送体はｈＥＮＴ１である。
【０２３３】
Ｅ．医薬組成物
[0296]いくつかの態様では、本明細書に記載したヌクレオシド類似体化学療法薬、すなわちゲムシタビン類似体又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを、水性コロイド状懸濁液として処方する。懸濁液の濃度は、対象に注入するのに有用であることが知られているいかなる濃度であってもよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０又は２５ｍｇ／ｍＬである。
【０２３４】
[0297]様々な送達系が知られており、本明細書に記載した生物学的に活性な薬剤の投与に用いることができる。それらの非限定的な例としては、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体介在性エンドサイトーシス（例えばWu and Wu, (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての治療用核酸の構築、懸濁液、固形又は半固形組成物、アルミニウム沈降物などが挙げられる。いくつかの態様では、本明細書に記載した医薬組成物を治療が必要な部位に局所投与する。これは例えば、外科手術中の局所注入、点滴又はカテーテルを用いた方法により達成することができるが、方法はこれらには限定されない。特定の態様では薬剤を、癌組織を含んでいる対象の組織に送達する。
【０２３５】
[0298]選択された薬剤の投与は、単回投与、連続投与、又は治療経過中に断続的に投与することで行うことができる。最も有効な手段及び投与量を決定するための方法は当業者には十分知られており、治療に用いる組成物、治療目的、治療する標的細胞、及び治療を受ける対象によって変化する。治療を行う医師又は他の介護者が選択した投与量や計画に則って、単回又は複数回投与を行うことができる。病状の１つ以上の治療、診断、予後、又は治療と診断の両方（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）を生じるように、投与を調整することができる。
【０２３６】
[0299]上述した要因により異なるが、一般的な一日当たりの用量範囲は例えば、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、又は６０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇとなってよい。数日又はそれ以上にわたる反復投与には、状態にもよるが、疾患の所望される改善が生じるまで治療を維持する。この治療の進行は、標準的な技術や検定により、容易に監視される。
【０２３７】
[0300]本明細書に記載したように、癌の治療には様々な投与計画が用いられる。有用な投与計画には、２５ｍｇ／ｋｇの用量で３日に１回投与する、６０ｍｇ／ｋｇを３日に１回投与する、８０ｍｇ／ｋｇを３日に１回皮下投与する、４ｍｇ／ｋｇを連続して５日間投与し、その後２日間休薬するという様式で投与する、３日に１回の４０ｍｇ／ｋｇ投与を５回繰り返す、４０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回投与する、４０ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回２回繰り返して投与する又は３日に１回を５回繰り返して投与する、７５ｍｇ／ｋｇ用量を３日に１回４回繰り返して投与する、５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回５回繰り返して投与する、１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ若しくは７５ｍｇ／ｋｇを単回投与する又は１日１回連続して１０日間投与する、８０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する、７．５、１５、２０、２２．５、３０又は４０ｍｇ／ｋｇを３日に１回５回繰り返して、１日に１回を５回繰り返して、又は１週間に１回を２回繰り返して経口投与することが挙げられるがこれらには限定されない。
【０２３８】
[0301]別の側面において本明細書に記載した方法は、ａ）ヌクレオシド類似体化学療法薬、すなわちゲムシタビン類似体又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル、ｂ）抗癌剤、及びｃ）薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。結合剤及び抗癌剤の非限定的な例は上述した通りである。医薬組成物の調製は、医薬調整物を調製するために一般的に認可されている方法に従って行われる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition (May 1, 2005)を参照のこと。使用目的や投与方法により、医薬組成物の調製中に、活性成分はさらに加工される。適切な加工には、適した非毒性成分や非干渉成分との混合、滅菌、単位用量への分割、及び送達装置中への封入が挙げられるがこれらには限定されない。
【０２３９】
[0302]活性成分は、例えば液滴形成技術や界面重合によって調製された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルなどの微粒子それぞれに、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）として又はマクロエマルションとして封入することができる。そのような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition (May 1, 2005)に開示されている。
【０２４０】
[0303]経口、鼻腔内、又は局所投与用の医薬組成物は、固形、半固形又は液体の形状で供給することができ、それらには、錠剤、カプセル、粉末、液体及び懸濁液が含まれる。注入用組成物は、溶液や懸濁液として、乳液として、又は注入の前に溶解又は懸濁させるのに適した固体の形態で、供給することができる。経気道投与に適した組成物は、適切な噴霧装置と共に使用した場合に、固体、粉末、又はエアロゾルを提供するものである。
【０２４１】
[0304]例えば、本明細書で具体化したポリペプチドを、水、生理食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール、又はエタノールなどの液体賦形剤に溶解又は分散させることによって、薬学上許容可能な液状組成物を調製することができる。この組成物はまた、他の薬剤、医薬品、佐剤、担体、及び湿潤剤や乳化剤のような補助物質、並びにｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。
【０２４２】
[0305]いくつかの態様において組成物は、１種以上の賦形剤、増量剤、又は不活性成分を含む。いくつかの態様において組成物は、ゲムシタビン−５’−エライデートやその薬学上許容可能な塩の放出を補助する１種以上の賦形剤を含む。いくつかの態様において賦形剤は、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、トウモロコシデンプン、コロイド状シリカ、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ケイ化微結晶セルロース（例えば、Prosolve SMCC（ＨＤ９０））、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドンＮＦ、微結晶セルロース（例えば、Avicel PH200）、又はそのような賦形剤の組み合わせであってよい。いくつかの態様においてワックスは、直鎖炭化水素を含む、ポリアルカレン（polyalkalene）ワックスのような粉末ワックスである。いくつかの態様においてワックスは、セラックろう、微結晶ワックス、パラフィン型ワックス、ポリアルカレングリコール（polyalkalene glycol）、カルナバろう、鯨ろう、蜜ろう、カンデリラろう、ポリエチレンオキシド、水素化植物油、合成ポリエチレンワックス、及びその誘導体や混合物である。
【０２４３】
[0306]いくつかの態様では、経口、非経口、及び局所投与用の様々な剤形で、組成物を処方することができる。組成物はまた、短期間作用型、遅延放出型、持続放出性、徐放性、長時間作用型、パルス放出型、制御放出型、持続放出型、即効型、及び即時放出型、標的放出型、プログラム放出型並びに胃貯留剤形などの、放出調製製剤として処方することができる。これらの剤形は、既知の方法や技術に従って調製することができる（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra; Modified-Release Drug Delivery Technology, Rathbone et al., Eds., Drugs and the Pharmaceutical Science, Marcel Dekker, Inc.: New York, N.Y., 2002; Vol. 126、を参照のこと。これらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２４４】
[0307]当業者に十分知られている過程により、本明細書に記載した剤形を製造することができる。例えば錠剤を製造するためには、有効量のゲムシタビン−５’−エライデート又はその薬学上許容可能な塩を１種以上の賦形剤中に、例えば、高剪断造粒、低剪断造粒機、流動層造粒、又は混合して直接圧縮することによって、均一に分散させることができる。賦形剤としては、希釈剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、潤滑剤、流動促進剤、安定剤、界面活性剤及び色素が挙げられる。希釈剤は「増量剤」とも呼ばれ、圧縮するための実用的な大きさになるように、錠剤全体の大きさを増すために用いることができる。希釈剤の非限定的な例としては、乳糖、セルロース、微結晶セルロース、マンニトール、乾燥デンプン、加水分解デンプン、粉末糖、タルク、塩化ナトリウム、二酸化ケイ素、酸化チタン、二水和リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ及びカオリンがある。結合剤を使用することにより組成物を例えば錠剤としてまとめることができ、かつ、圧縮後に完全な形を維持するための補助として用いることができる。適した結合剤の非限定的な例としては、デンプン（トウモロコシデンプンやアルファデンプンなど）、ゼラチン、糖類（例えば、グルコース、デキストロース、ショ糖、乳糖及びソルビトール）、セルロース、ポリエチレングリコール、ワックス、天然及び合成ゴム（例えば、アカシアゴム、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム）及び合成重合体（ポリメタクリル酸及びポリビニルピロリドンなど）が挙げられる。滑沢剤もまた、錠剤の製造を容易にすることができ、その非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びポリエチレングリコールが挙げられる。崩壊剤は、投与後の錠剤の崩壊を促進することができ、その非限定的な例としては、デンプン、アルギン酸、架橋重合体（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸カリウム若しくはデンプングリコール酸ナトリウム、粘土、セルロース、デンプン、ゴムなどが挙げられる。適した流動促進剤の非限定的な例には、二酸化ケイ素、タルクなどがある。安定剤は、薬剤の分解反応（酸化反応など）を阻害する又は遅らせることができる。界面活性剤を含んでいてもよく、界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、両性、又は非イオン性であってよい。必要であれば、ｐＨ緩衝剤、保存剤、例えば、酸化防止剤、湿潤剤又は乳化剤、可溶化剤、被覆剤、香味剤などの、毒性をもたない補助物質もまた、錠剤に加えることができる。
【０２４５】
[0308]その他の態様では、本発明の組成物は適切な添加剤をさらに含んでもよく、適切な添加剤としては希釈剤、結合剤、界面活性剤、潤滑剤、流動促進剤、被覆剤、可塑剤、着色剤、香味剤、又は薬学上不活性な材料が挙げられるがこれらには限定されない。希釈剤の例としては例えば、セルロース、セルロース誘導体（例えば微結晶セルロースなど）、デンプン、デンプン誘導体（例えばトウモロコシデンプン、シクロデキストリンなど）、糖、糖アルコール（例えば乳糖、Ｄ−マンニトールなど）、無機希釈剤（例えば乾燥水酸化アルミニウムゲル、沈降炭酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウムなど）が挙げられる。
【０２４６】
[0309]結合剤の例としては例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルデンプン、ポリビニルアルコール、スカシア（ｓｃａｃｉａ）、寒天、ゼラチン、トラガカントゴム、マクロゴールなどが挙げられる。
【０２４７】
[0310]界面活性剤の例としては例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、三オレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリル、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどが挙げられる。
【０２４８】
[0311]滑沢剤の例としては例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどが挙げられる。
[0312]流動促進剤の例としては例えば、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０２４９】
[0313]被覆剤の例としては例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセタート、マクロゴール６０００、酸化チタンなどが挙げられる。可塑剤の例としては例えば、クエン酸トリエチル、トリアセチン、マクロゴール６０００などが挙げられる。
【０２５０】
[0314]薬学上許容可能な塩には、金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩、及びリチウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩など）、有機アミン塩（例えばトリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩など）、無機酸塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、有機酸塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩など、スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩など）、及びアミノ酸塩（例えばアルギン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）が含まれるがこれらには限定されない。
【０２５１】
[0315]さらなる薬学上許容可能な塩としては、酒石酸塩、酒石酸塩水和物、塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酒石酸塩五二水和物、ペンタフルオロプロピオン酸塩、臭化水素酸塩、粘液酸塩、オレイン酸塩、リン酸塩二ナトリウム、リン酸塩一ナトリウム、酢酸塩三水和物、ビス（ヘプタフルオロ酪酸塩）、ビス（ペンタフルオロプロピオン酸塩）、ビス（ピリジンカルボン酸塩）、ビス（トリフルオロ酢酸塩）、塩酸塩、硫酸塩五水和物、チオセミカルバゾン、ｐ−ニトロフェニルヒドラゾン、ｏ−メチルオキシム、セミカルバゾン、ビス（メチルカルバミン酸塩）、アムソナート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２−ジスルホン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩（clavulariate）、ジヒドロ塩化物、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、エシル酸塩、フィウナラート（fiunarate）、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオナート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸塩、ナプシル酸、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩（１，１−メテン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸、エインボナート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸、スラマート（suramate）、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、吉草酸塩及び水和物が含まれる。
【０２５２】
[0316]非経口投与用には、ゲムシタビン類似体を薬学上許容可能な非経口媒体と共に注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳液）の単位投与量として処方することができる。そのような媒体は本質的に非毒性であり、かつ、非治療用である。そのような媒体の例には、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンがある。固定油及びオレイン酸エチルのような非水媒体もまた使用できる。リポソームは単体として利用できる。媒体には、等張性や化学的な安定性を増強する物質などの添加剤、例えば緩衝液や保存剤を少量加えてもよい。そのような媒体には通常、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を処方する。
【０２５３】
[0317]必要であれば、医薬組成物を遅延放出型又は持続放出型に処方することができ、それにより長期間にわたって活性化合物が比較的一定のレベルで提供される。持続放出型製剤の適切な例としては、抗体を含む固形の疎水性重合体から成形した半透性のマトリックスがあり、このマトリックスは例えばフィルムやマイクロカプセルのような形である。持続放出型マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（例えばLUPRON DEPOT（登録商標）、乳酸とグリコール酸の共重合体及び酢酸ロイプロリドを含む注入可能な微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
【０２５４】
Ｆ．治療計画
[0318]治療する特定の病状や対象により、治療期間及び治療計画は変わる場合がある。例えば、ヌクレオシド類似体化学療法薬、ゲムシタビン類似体、又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを、少なくとも１、７、１４、３０、６０、９０日間、又は数ヶ月、数年の間、又は対象の生涯にわたって、対象方法により投与することができる。治療はまた、好適な陽性転帰を達成するために設計することができ、陽性転帰の非限定的な例としては、部分寛解、完全寛解、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の大きさの安定、腫瘍の成長速度の低下、転移頻度の低下、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約９ヶ月又は少なくとも約１２ヶ月を越える転移の予防、予測された平均余命の延長、癌の再発の予防、癌の再発に必要と予測された期間の延長、及び、疼痛、浮腫、など１つ以上の癌の続発症の頻度又は重篤度の低下、疾患の予防、が挙げられる。
【０２５５】
[0319]反復投与する場合には、上で挙げた非限定的な要因に基づいて当業者が決めることができる時間間隔で、ヌクレオシド類似体化学療法薬、すなわちゲムシタビン類似体又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与することもできる。例えばゲムシタビン類似体を、１日に１回、２回、３回、４回若しくは５回、隔日で、３日に１回、４日に１回、５日に１回、１週間に２、３、４、５若しくは６日間、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、又は５週間毎に投与することができる。固定用量或いは予め決めた必要量を、例えば、疾患が進行するまで、有害事象が生じるまで、又は医師若しくは他の介護者が決定した他の時点まで継続して投与することができる。例えば、約２、３、又は４種から最大約２０以上の固定用量を投与することができる。いくつかの態様では、１種以上の負荷用量の結合剤を投与し、その後１種以上の維持用量の結合剤を投与する。いくつかの態様では、複数の、同じ固定用量を対象に投与する。
【０２５６】
[0320]本明細書に記載した組成物の送達方法としては、動脈内、筋内、静脈内、鼻腔内、皮下、腹腔内、脳脊髄内、間接内、骨液嚢内、鞘内、腫瘍内、皮内、脳内、腫瘍周辺、経肛門、経膣、及び経口経路が挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様では、本明細書に記載した組成物を腹腔内に投与する。いくつかの態様では、本明細書に記載した組成物を静脈内に投与する。いくつかの態様では、本明細書に記載した組成物を経口投与する。
【０２５７】
[0321]用語「有効量」、「薬理学的有効量」、「生理学的有効量」又は「治療上有効量」は本明細書で使用する場合、治療する疾患又は状態の１つ以上の症状をある程度緩和するのに十分な量の、投与する治療薬又は化合物を指す。その結果は、徴候、症状、若しくは疾患の原因、又は他の所望される生態系いずれかの変化の低減及び／又は緩和である。例えば、治療に用いられる「有効量」は、治療を受ける対象の血流中又は作用部位（例えば、副鼻洞又は肺組織）で所望されるレベルを提供するための、本明細書で必要とされる治療薬を含み、それによって病徴の臨床上有意な低下をもたらす量の組成物である。正確な量は多くの要因、例えば、特定の治療薬、治療薬の活性、使用する送達装置、治療薬の物理的特徴、対象による使用目的（すなわち、１日当たりの投与回数）、対象の留意事項などに依存し、かつ、本明細書で提供された情報に基づいて、当業者が容易に決定することができる。場合により、任意の個別の症例における適切な「有効」量は、用量漸増試験のような技術を用いて決定される。
【０２５８】
Ｇ．癌の標的治療
[0322]生物学的有効量（ＢＥＤ）、すなわち、目的とする標的を最大限に阻害するが、それを越えて用量を増加させると利益ではなく毒性が強まると考えられる用量又は用量範囲の同定により、治療の改善が可能になる。さらに、多くの薬剤は、毒性が増すと耐容できなくなる可能性のある細胞毒性治療と併せて用いられるが、ＢＥＤに基づく用量によりさらに支持される。「標的治療」は、反応する可能性のある癌の存在を示し、それを同定することができる。
【０２５９】
[0323]ヌクレオシド輸送体タンパク質複合体の標的についての診断を成功させることにより、特定のゲムシタビン類似体により腫瘍成長或いは生存を緩和することができるか、どの投与計画が好ましいものであるか、また使用可能な併用療法が決定する。
【０２６０】
[0324]本明細書に記載した方法では、各患者に提示された治療薬（又は併用薬）についての予想される効果を、より正確に評価することができる。本明細書に記載した方法は、化学治療薬の投与計画の効果を評価するのに時間と費用の両面で有効であり、かつ、癌患者の心的外傷を最小限に抑えるという別の理由からも有用である。
【０２６１】
[0325]いくつかの態様においてゲムシタビン類似体の投与は、ｈＥＮＴ１の発現が低い患者に腫瘍の緩解のような、高い治療効果をもたらす。
ＩＸ．診断キット
[0326]一側面では、本明細書は上述した方法で使用することができるキットを提供する。いくつかの態様では、キットは、１つ以上の容器に入れた、本明細書に記載した組成物を含む。いくつかの態様では、本明細書は、ゲムシタビン類似体を含むキットを提供する。結合剤は、上述したもののいずれでもよいが、これらには限定されない。結合剤を上述した製剤及び／又は用量、これらには限定されないが、のいずれにさらに加えてもよい。キットは、上述した薬剤のような別の薬剤、又はゲムシタビン類似体と併用する抗癌剤をさらに含んでもよい。薬剤はいかなる適した容器に入って提供されてもよく、適した容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、アンプル、シリンジなどが挙げられるがこれらには限定されない。薬剤を、対象に直接投与する形態で提供しても、あるいは投与前の調整、例えば凍結乾燥した薬剤の再構成など、を必要とする形態で提供してもよい。薬剤を、少量ずつの単回投与用として、又はそこから複数回投与することができるストックとして提供することができる。
【０２６２】
[0327]本明細書で提供するキットは、哺乳類の腫瘍のゲムシタビン類似体治療への反応性を特徴付けるためのキットであり、このキットにはｈＥＮＴ１に結合する抗体が含まれる。さらにこのキットは、上述した抗体以外の別のさらなる成分を含む場合があり、それらには別の抗体が含まれるがこれには限定されない。そのようなキットは例えば、特定の患者、例えばゲムシタビン類似体を用いた標的治療を検討している癌患者にとって適切な治療を選択するための補助として、医師や有資格者が使用することができる。
【０２６３】
[0328]いくつかの態様では、患者の血縁者から得た又は血縁者の情報、例えばゲノム情報に基づいて、患者を治療する。いくつかの態様では、民族集団のデータに基づいて患者を治療する。いくつかの態様において本発明のキットは、家族からゲノム情報を回収する手段又は人種的な情報について質問するアンケートを含む。
【０２６４】
[0329]本明細書で引用した全ての出版物及び特許文献は、あたかもそのような出版物又は文献がそれぞれ具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。出版物や特許文献の引用は、そのいずれかが関連する先行技術であることを認めることを意図するものではなく、その内容又は日付に関するいかなる承認をも構成しない。本発明を書面による明細を通して記述しているが、本発明を様々な態様で実施することができること、及び前述の詳細や以下の実施例は説明することを目的としたものであり、以下の請求項を限定する目的ではないことが当業者には明らかである。
【実施例】
【０２６５】
[0330]代替態様を示し、本明細書に記載するが、そのような態様は事例を提供するだけであり、本発明を限定するものとは見なされないことが当業者には明らかである。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更及び置換を行うことができる。当然のことながら、本明細書に記載した本発明の態様の様々な代替法も、本発明の実施に用いることができる。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、これら請求項の範囲内にある方法と構造、及びその均等物が請求項に包含されることを目的とする。
【０２６６】
実施例１
ＴＡＸ−ＩＩ−１異種稙片における抗腫瘍活性のスケジュール依存
[0331]ゲムシタビンの抗腫瘍活性はスケジュール依存性である。３日間隔での非臨床治療が、１日１回又は１週間に１回の注入計画よりも有効である。そのため試験により、そのようなスケジュール依存性がゲムシタビン類似体やゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを用いた医薬製剤にもあるのかどうかを決定する。
【０２６７】
[0332]ヒト腫瘍異種稙片であるＴＡＸ−ＩＩ−１、すなわち悪性の繊維肉腫を、メスのＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下で成長させる。化合物を腹腔内投与する。主要な試験の前に、１日１回及び１週間に１回の計画での、ゲムシタビンとゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの最大耐量（１投与群当たりマウス３匹）を決定するための用量設定試験を行う。
【０２６８】
実施例２
２種のヒト膵臓腫瘍モデルにおける、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0333]１つのヒト膵臓癌細胞株ＭｉａＰａＣａ−２をＢａｌｂ／Ｃヌードマウスの皮下に移植し、別のヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１をメスのＮＣｒヌードマウスに、それぞれ移植する。腫瘍の平均直径が６ｍｍに達したら、治療を開始する。治療計画は、０、３、６、９、及び１２日目に、１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ用量のゲムシタビン又は８０及び４０ｍｇ／ｋｇ用量のゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを腹腔内投与するというものである。
【０２６９】
実施例３
皮下で成長したヒト神経膠腫Ｕ３７３に対するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
オスのＮＭＲＩマウスの皮下にヒト神経膠腫細胞Ｕ３７３を移植し（０日）、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル又はゲムシタビンを１０〜１４、１７〜２１、２４〜２８、及び３１〜３５日の間に１日１回腹腔内投与することにより治療する。シクロホスファミド（腹腔内投与、１０日目）を陽性対照として使用する。
【０２７０】
実施例４
脳内で成長したヒト神経膠腫Ｕ３７３に対するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0334]オスのＮＭＲＩマウスの脳に、ヒト神経膠腫細胞Ｕ３７３を播種する。注入部位の腫瘍（脳表面）と脳内腫瘍を評価する。１回の注入につき４ｍｇ／ｋｇで活性を有するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを、４〜８、１１〜１５、１８〜２２、及び２５〜２９日腹腔内投与する。腹腔内投与後、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルは脳内で活性を示す。
【０２７１】
実施例５
ヒト神経膠腫異種稙片モデルＵ３７３におけるゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル及びゲムシタビンの抗腫瘍活性
[0335]０日目に、ＮＣＲマウスの皮下にヒト神経膠腫細胞Ｕ３７３を播種する。３日に１回又は１週間に１回の治療（腹腔内投与）を７日目に開始する。７日目と１４日目に投与した場合、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの方がゲムシタビンよりも有効である。３日に１回の投与計画では、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルとゲムシタビンの効果は同等である。
【０２７２】
実施例６
ヒト結腸異種稙片モデルＣｏ５７７６及びＣｏ６０４４に対するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0336]ヒト結腸癌Ｃｏ５７７６及びＣｏ６０４４の断片をメスのＮＣＲマウスの皮下に移植する（１群当たりマウス７〜８匹）。ゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ）及びゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル（４０ｍｇ／ｋｇ）を、３日に１回、５回繰り返して腹腔内に投与する。腫瘍の平均容積が１００ｍｍ３に達する８日目に治療を開始する。ゲムシタビン又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを用いた治療後、両群の結腸癌で有意な抗腫瘍効果が認められ、また、両化合物の活性は同等である。
【０２７３】
実施例７
ヒト結腸癌異種稙片Ｃｏ５７７６におけるゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルのスケジュール依存性
[0337]メスのＮＣｒマウスの皮下にヒト結腸癌Ｃｏ５７７６の断片を移植し、腹腔内投与で治療する。１週間に１回を２回繰り返して（１１日目と１８日目）、又は３日に１回を５回繰り返して（１１日、１４日、１７日、２０日、及び２３日目）という２種の異なる計画に沿ってゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを投与する。ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性は、１５０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回２回繰り返しての投与と、４０ｍｇ／ｋｇを３日に１回５回繰り返しての投与で同等である。
【０２７４】
実施例８
Ｐ３８８マウス白血病モデルでのゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0338]メスのＢ６Ｄ２Ｆ１マウスにＰ３８８白血病細胞を腹腔内注入し、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル又はゲムシタビンを２種類の異なる計画に沿って腹腔内投与することにより治療する。化合物を、単回で、又は１日に１回連続して１０日間でのいずれかで投与する。白血球（ＷＢＣ）数と血小板数を４日目と１１日目に測定する。４日目の対照動物のＷＢＣ数と血小板数は腫瘍モデルよりも比較的低い。試験した全ての用量と計画で、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルは有意な抗腫瘍活性を誘導する。
【０２７５】
実施例９
Ｃｏ−２６肝臓転移モデルに対するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0339]脾臓に、マウスＣｏ−２６結腸癌細胞を注入したメスのＢａｌｂ／Ｃマウス（肝臓転移モデル）を用い、単回投与によるゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル又はゲムシタビンの抗腫瘍効果を試験する。生理食塩水で処理した対照動物と比較して、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルは７５ｍｇ／ｋｇの用量で、平均生存期間（日数）と平均生存率（治療／対照（Ｔ／Ｃ）、％）の両方を有意に向上させ、十分な抗腫瘍活性を示す。血液学的指標の中程度の低下が見られる。ゲムシタビンの活性も同様である。
【０２７６】
実施例１０
マウスルイス肺に対するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性
[0340]マウスのルイス肺細胞をＢＤＦ１マウスの静脈内に注入する。この試験の評価項目は、７２日目の平均生存と体重の変化、及び腫瘍を呈さなかった生存マウスである。シクロホスファミド（ＣＴＸ）と１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ）を対照として使用する。治療は、１〜４日と７〜１１日の間に１日１回腹腔内投与する。１日目に静脈内投与するＣＴＸは活性が高く、かつ、毒性がない。
【０２７７】
実施例１１
ヒト結腸癌Ｃｏ６０４４に対する抗腫瘍活性
[0341]ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル及びゲムシタビンの経口投与が抗腫瘍活性を示す可能性について、ＮＣｒ：ｎｕ／ｎｕマウスを用いて試験する。治療は、３日に１回を５回繰り返して行う。追跡実験では、この結腸癌モデル（Ｃｏ６０４４）を用いて経口投与と腹腔内投与の抗腫瘍活性を比較する。ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル及びゲムシタビンの経口治療の用量は、これまでの実験よりも低い（２０、３０、又は４０ｍｇ／ｋｇ）。
【０２７８】
実施例１２
Ｃｏ６０４４を有するマウスでのゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの経口活性とスケジュール依存性
[0342]この実験では、３種類の異なる投与計画に沿って経口投与するゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの抗腫瘍活性を比較する。投与計画は、３日に１回を５回繰り返す、１日に１回を５回繰り返す、及び１週間に１回を２回繰り返す、である。１つの投与計画につき、３種類の用量を試験する。試験した全ての計画で、高い抗腫瘍活性が得られる。活性は用量依存的に認められる。
【０２７９】
実施例１３
経口投与したゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの、ヒト非小細胞肺癌ＭＡＫＳＡＫ及びＥＫＶＸに対する抗腫瘍活性
[0343]ヒトＮＳＣＬＣ細胞系であるＭＡＫＳＡＫとＥＫＶＸの断片をメスのＢａｌｂ／Ｃマウスに移植し経口によるゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの活性を決定する。２〜３ｍｍの腫瘍断片をマウスの各脇腹の皮下に移植する。腫瘍の平均直径が６ｍｍに達した時点で（０日）、治療を開始する。最終投与量が０．１ｍＬ／１０ｇになるように、０．９％生理食塩水でゲムシタビン又はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを希釈する。ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル又はゲムシタビンを０、３、６、９、及び１２日目に、又は０〜４日の間に１日１回のいずれかで投与する。
【０２８０】
実施例１４
ヌクレオシド輸送体非依存性と細胞内での三リン酸レベル
[0344]ジピリダモール、ＮＢＭＰＲ、及びＮＢＩを含む様々な薬剤を用いて、生体外でｈＥＮＴ１を阻害することができる。ゲムシタビン−５’−エライデートの細胞への侵入が、ｈＥＮＴ１のようなヌクレオシド輸送体に依存していないかどうかを試験するために、ジピリダモールを使用してｈＥＮＴ１を遮断する。ジピリダモール（ＤＰ）を添加した又は添加しなかったＣＥＭ細胞中のｄＦｄＣＴＰの細胞内レベルを、ｄＦｄＣ又はゲムシタビン−５’−エライデートのいずれかに曝露して６０分後に決定する。投与する化合物の濃度は１０μＭであり、三リン酸をＨＰＬＣにより決定する。テトラヒドロウリジンを用いて脱アミノ化を遮断する。ＤＰを添加した場合、ゲムシタビンに曝露した後の三リン酸のレベルは検出限界以下である。ＤＰを加えなかった場合、ゲムシタビンを曝露した後の三リン酸レベルは時間経過と共に減少する。ゲムシタビン−５’−エライデートに曝露後、測定した最後の時点でｄＦｄＣＴＰ濃度の濃度は最大に達し、阻害剤（ＤＰ）を添加して得られたレベルは阻害無しで曝露した場合と比較しても尚高い。
【０２８１】
実施例１５
生体外でのゲムシタビン−５’−エライデートの併用試験
[0345]併用のための指標や、細胞周期に対するゲムシタビン−５’−エライデートの効果を決定するために、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９とヒト結腸癌ＷｉＤｒを使用する。スルホローダミンＢ比色検定により、７２時間後の成長阻害を決定する。ＭＴＴ検定により、ペメトレキセドとの併用を試験する。ペメトレキセドとの併用はＷｉＤｒ−ＬＦ細胞株でも試験し、この場合にはＷｉＤｒ細胞を低葉酸条件で培養する。ＩＣ２５値とＩＣ５０値（それぞれ、２５％又は５０％を阻害する濃度）を算出する。ＩＣ２５値はオキサリプラチン又はドセタキセルの連続希釈と共に使用し、ＩＣ５０値はペメトレキセドとの併用に使用する。半数影響解析を行う。
【０２８２】
[0346]ゲムシタビン−５’−エライデートとオキサリプラチンの併用は、両方の腫瘍細胞株で相乗的であり、一方、ドセタキセルとの併用は拮抗的である。ゲムシタビン−５’−エライデートとペメトレキセドの併用でも拮抗活性が認められるが、低葉酸条件により、拮抗活性は僅かに低下する。
【０２８３】
[0347]オキサリプラチン、又はオキサリプラチンとゲムシタビン−５’−エライデートの組み合わせ（２００μＭのオキサリプラチンと０．００４μＭのゲムシタビン−５’−エライデートの組み合わせ）に曝露した後の、ＤＮＡ中のＤＮＡ白金の蓄積に対する影響も決定する。ＷｉＤｒ細胞株では白金付加物の増加が認められたが、Ａ５４９では見られなかった。
【０２８４】
[0348]フローサイトメトリーとヨウ化プロピジウム染色を併用することにより、曝露して７２時間後の細胞周期に対する影響を決定する。細胞周期解析に用いた濃度範囲は、Ａ５４９細胞株では０．０００５μＭ〜０．０５μＭ、ＷｉＤｒ細胞株では０．００１μＭ〜０．１μＭである。試験した濃度では、Ａ５４９細胞株では細胞周期に対する影響は見られない。ＷｉＤｒ細胞株では、最も高い２種類の濃度のゲムシタビン−５’−エライデートがＳ期での停止を引き起こし、また、用量依存的なｓｕｂ−Ｇ１の蓄積が生じる。細胞周期に対する影響は、ペメトレキセドとの併用でも認められる。Ａ５４９細胞株では、Ｇ０／Ｇ１が８．８％〜１４．１％増加し、Ｓ期が２３．１％〜２８．５％増加する。ＷｉＤｒ細胞株では、Ｇ２／Ｍ期の僅かな増加のみが観察される。
【０２８５】
実施例１６
進行性膵癌に罹患している患者での、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステル生体内試験
[0349]膜内輸送体の発現により、腫瘍細胞による親水性ヌクレオシド類似体の取り込みを決定する。ゲムシタビンに対する臨床反応とヌクレオシド輸送体であるｈＥＮＴ１の発現には相関がある。ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルは、脂肪酸と結合しているため、輸送体に依存しない様式で細胞内に侵入することができる。この試験では、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルとゲムシタビンを比較し、活性と膵癌患者の腫瘍細胞でのｈＥＮＴ１発現とを関係づける。
【０２８６】
[0350]進行性又は転移性膵臓腺癌を患っている治療初回患者であって、ＥＣＯＧ全身状態が≦２、血液、腎臓及び肝臓の機能が十分な患者が適格である。試験を、患者全員がゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの投与を受ける第一段階と、その後、無作為化することによりゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルとゲムシタビンを比較する（１：１）、２段階を含むように設計する。薬剤は両方とも、４週間毎、１、８、１５日目に静脈注入で３０分かけて投与する。ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルとゲムシタビンの用量はそれぞれ、１２５０ｍｇ／ｍ２／日又は１０００ｍｇ／ｍ２／日である。免疫組織化学により、腫瘍細胞でのｈＥＮＴ１発現（原発巣又は転移巣由来の生検）を決定する。患者は、１〜６周期の範囲内で治療を受ける。固形癌臨床効果判定基準(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors = ＲＥＣＩＳＴ)により、患者全員を評価する。
【０２８７】
実施例１７
ゲムシタビン−５’−エライデートはｈＥＮＴ１に依存せずに腫瘍細胞に侵入する
[0351]薬剤：ゲムシタビン−５’−エライデートはClavis Pharma（オスロ、ノルウェイ）から、テトラヒドロウリジン（ＴＨＵ）はCalbiochem（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）から、ジピリダモールとａｒａ−ＣはSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ、米国）から、ｄＦｄＣはEli-Lilly（インディアナポリス、インディアナ、米国）から提供された。塩基の５−Ｃ位がトリチウムで放射性標識された薬剤はＭｏｒａｖｅｋ（ブレア、カリフォルニア、米国）から入手した。細胞に曝露するために、放射性標識した化合物と放射性標識していない化合物の混合物を作成した。ｄＦｄＣとＣＰ−４１２６は最終濃度８．９μＭで使用し、比活性はそれぞれ、５８６と３９１ｍＣｉ／ｍｍｏｌであった。
【０２８８】
[0352]細胞株：ＣＣＲＦ−ＣＥＭヒト白血病細胞株とそのｄＣＫ欠損変異体（ＣＥＭ／ｄＣＫ−）を実験に用いた。細胞株を１０％ウシ胎仔血清（PAA laboratories, Pasching、オーストリア）とＨＥＰＥＳ緩衝液（Bio Whittaker）を添加したＲＰＭＩ培地（Bio Whittaker、ヴェルヴィエ、ベルギー）中で培養した。ＣＥＭ細胞株は、ヌクレオシド輸送体のうち、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ｈＥＮＴ）のみを発現し、濃縮型ヌクレオシド輸送体（ｈＣＮＴ）は発現していない。Belt et al. Adv. Enzyme Regul., 1993, 33, 235-52。ｈＥＮＴによる薬剤の流入を阻害するためにジピリダモール（ＤＰ）を使用した。明瞭な画像を取得するために、ＴＨＵも添加してａｒａ−ＣとｄＦｄＣの脱アミノ化を阻害した。
【０２８９】
[0353]In situトレース：この方法は、既に記載されている方法に基づくものである。Peters et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1984, 20, 1425-31。簡単に説明すると、細胞を回収し、５ｘ１０６細胞／ｍｌになるように新しい培地中に再懸濁した。この細胞懸濁液の内の１００μｌを各実験に用いた。ＣＤＡによる脱アミノ化を阻害するために、最終濃度が１００μＭになるようにＴＨＵを加えた。Yusa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 206, 486-9。ｄＦｄＣ／ＣＰ−４１２６の最終濃度が８．９μＭに達するように、薬剤をそれぞれ添加した。細胞を、０、３０及び６０分間、３７℃でインキュベートした。薬剤滞留性を測定するために、６０分後に薬剤を含んでいる培地を取り替えて、薬剤を含まない培地中で細胞を６０分間インキュベートした。その後、遠心器を用いて細胞を沈殿させ（３０００ｇ、２分、４℃）、培地を細胞外画分として−２０℃で保存した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄した（１２０００ｇ、１分、４℃）。細胞のペレットを４５μｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、５μｌの過塩素酸（５Ｍ）を加えて抽出し、その後２０分間、氷上で冷却した。遠心器で沈殿させた後（１２０００ｇ、３分、４℃）、沈殿した核酸を含む過塩素酸のペレットを２００μｌのＮａＯＨ（１Ｍ）に再懸濁した。細胞質画分を含む上清を１０μｌのＫＨ２ＰＯ４（５Ｍ）で中和し、細胞内画分としてとして−２０℃で保存した。
【０２９０】
[0354]細胞外画分と及び細胞内の細胞質試料の内の５μｌを、プラスチック基板のシリカＴＬＣプレート（Merck KgaA、ダルムシュタット、ドイツ）にスポットした。クロロホルム／メタノール（３：２）を移動相としてクロマトグラフィーを行った。分離した後、ＵＶ光を用いてスポットを可視化し、切り取って個別のシンチレーション容器に入れ、その後一晩エタノール中でインキュベートすることにより放射性物質を溶出した。ＬＳＣ測定器を用いて、この試料と過塩素酸ペレット試料を共に測定した。
【０２９１】
[0355]細胞内局在：ProteoExtract（商標） Subcellular Proteome Extraction Kit（Calbiochem）を用いて、親油性類似体の細胞内局在を解析した。上述したように、８．９μＭの放射性薬剤と共に細胞をインキュベートし、１００μＭのＴＨＵにより、脱アミノ化を阻害した。試料を３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベートした後細胞を洗浄し、キットで提供された別々の試薬を加えた。試料を、細胞質、膜、核、及び細胞骨格画分の細胞内成分に分離した。
【０２９２】
[0356]三リン酸の蓄積：細胞を１及び１０μＭのｄＦｄＣで処理し、一方、親油性類似体については１０及び１００μＭを用いた。細胞を６０分間インキュベートし、三リン酸の滞留性を、薬剤を含まない培地でインキュベートした６０分後と１２０分後に解析した。ｈＥＮＴ輸送体による薬剤の流入を阻害するためにジピリダモールを添加した。インキュベートした後、細胞ペレットを氷冷したＰＢＳで再懸濁し、４０％のトリクロロ酢酸を加えて、４℃で２０分間インキュベートした。遠心分離した後（１０，０００ｇ、１０分、４℃）上清を、２倍量を越えるトリオクチルアミン／１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（１：４）で処理し、遠心器で沈殿させ（１０，０００ｇ、１分）、その後、既に記載のあるように、Whatman Partisphere SAX column（GE healthcare、Chalfont St. Giles、英国）を用いた勾配溶出（ｄＦｄＣ−ＴＰ）でのＨＰＬＣ解析を行うまで、水相を−２０℃で保存した。Noordhuis et al., Leuk. Res., 1996, 20, 127-34、Ruiz van Haperen, et al., Biochem. Pharmacol., 1994, 48, 1327-39。
【０２９３】
[0357]結果：過塩素酸の工程で、ＤＮＡに取り込まれたｄＦｄＣだけでなく、さらにＣＰ−４１２６も沈殿したため、ＣＰ−４１２６の曝露後の、ＤＮＡへのｄＦｄＣ取り込みを測定することが不可能になった。プロドラッグに由来する活性代謝物の形成についての理解を深めるために、三リン酸（とｄＦｄＣ−ＴＰ）の蓄積を決定した。それぞれ、ｄＦｄＣと共に６０分間インキュベートした後には、ＣＰ−４１２６と共にインキュベートするよりも多くの三リン酸が形成された（図５Ａ）。親化合物由来のｄＦｄＣ−ＴＰの濃度は、薬剤を洗浄した後には低下したが、ＣＰ−４１２６由来のｄＦｄＣ−ＴＰ濃度は同程度のレベルに維持された。ジピリダモールは親化合物の侵入を完全に阻止し、ｄＦｄＣ−ＴＰの蓄積が完全に阻害された。しかしながらジピリダモールは、薬剤を洗浄した後でさえも、プロドラッグ由来の三リン酸の濃度を上昇させた。
【０２９４】
実施例１８
ゲムシタビンの単剤治療を受けた膵臓患者の生存
[0358]膵癌に罹患している患者に、ゲムシタビンの単剤治療を行う。患者の腫瘍の死後解析により、腫瘍でのｈＥＮＴ１の発現レベルを決定する。図８は、ゲムシタビンの単剤治療を受けた患者の生存についてのカプラン・マイヤープロットを図示している。ｈＥＮＴ１の発現が高かった患者の面積（破線）は、腫瘍でのｈＥＮＴ１の発現が低かった患者の面積を上回っている。
【０２９５】
実施例１９
癌細胞でのｈＥＮＴ１レベルの決定に基づく、ゲムシタビン類似体を用いた膵癌患者の治療
[0359]患者が膵癌であると診断する。患者は試料を提供する。この試料は患者の癌細胞を含むものである。試料は、腫瘍の生検由来、血中循環腫瘍細胞由来、又は別の提供源由来である。
【０２９６】
[0360]腫瘍を試験し、ｈＥＮＴ１又は別のヌクレオシド輸送体の発現レベルを決定する。レベルを、免疫組織化学により、試料中のｈＥＮＴ１に関連するｍＲＮＡ量を決定することにより、又は他の既知の手段によって決定する。
【０２９７】
[0361]試料の試験は、試験施設で行われる。医師やその助手が試料をこの施設に運搬する。運搬するために、試料を固定又は凍結する。運搬前に試料と抗体を混合し、施設に到着してから解析するか、或いは運搬の前に試料に抗体を添加せずに運搬する。
【０２９８】
[0362]ヌクレオシド輸送体のレベルを対照と比較する。対照は、患者由来の非癌性細胞か、或いは別の集団由来の試料である。対照試料を試料と同時に解析するか、又は、それまでに回収し、特徴付けを行った対照のデータに基づいて一定の規則に則って解析を行う場合には、解析はコンピューターに保存したデータに基づく。この比較により、試料のヌクレオシド輸送体レベルに基づいて、試料を「高い」、「低い」又は「正常」に分類することができる。
【０２９９】
[0363]患者のヌクレオシド輸送体レベルに関する情報を医師に伝達する。この伝達には、どのヌクレオシド類似体化学療法薬で患者を治療すべきかに関する提案が含まれていてもよい。ｈＥＮＴ１の発現が低い患者は、ゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルのような疎水性ヌクレオシド類似体化学療法薬を使用するようにという提案を受ける。
【０３００】
[0364]ｈＥＮＴ１の発現が低い患者は、医師からゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルの処方箋を受け取る。そのゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルには、ｈＥＮＴ１のレベルが低いことに基づいた、患者への用量の指示が含まれる。そのゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルには、ｈＥＮＴ１のレベルが低いことに基づいた表示が含まれる。
【０３０１】
[0365]患者はゲムシタビン−５’−エライジン酸エステルを摂取し、治療に好ましく反応する。
[0366]本発明の好ましい態様を示し、本明細書に記載してきたが、そのような態様は例として提供されただけであることが、当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、当業者は数々の修正、変更、及び置換を思いつくだろう。当然のことながら、本発明の実施には、本明細書に記載した本発明の態様の様々な代替法を用いてもよい。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、これら請求項の範囲内の方法及び構造、並びにその均等物も請求項に包含されることを目的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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