(57)【要約】  清澄化DAS含有発酵培地又は清澄化MAS含有発酵培地のいずれかからSAを生産する方法であり当該方法は、水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、培地を、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度を達成するために、底部を冷却し、液体部分から固体部分を分離することを含む。また、アンモニア分離及び/又は水共沸溶媒を培地に添加することにより培地を蒸留する温度及び圧力を低下させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
清澄化ＤＡＳ含有発酵培地からSAを生産する方法であって、
（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、培地を、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記液体底部が少なくとも幾らかのMASを含有し、及び/又は前記固体部分が実質的にスクシンアミド酸、スクシンアミド及びスクシンイミドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、液体底部から、SA及び水、並びに任意でMASを再利用して清澄した培地に戻すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、液体下部中のSAの濃度を増大させるために、液体下部から水を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガンマブチロラクトン、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１のアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１の水共沸溶媒の存在下行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
清澄化ＤＡＳ含有発酵培地からＳＡを製造する方法であって、
（ａ）アンモニア分離及び/または水共沸（azeotroping）溶媒を前記培地に添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、SA及び少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するのに十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離し、
（ｅ）固体部分を回収する
ことを含む方法。
【請求項７】
前記液体底部が少なくとも幾らかのMASを含有し、及び/または前記固体部分が実質的にスクシンアミド酸、スクシンアミド及びスクシンイミドを含有しない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
更に、液体底部から、SA、水、及び溶媒並びに任意でMASを再利用して、清澄化した培地に戻すことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記培地及び／又は前記ＭＡＳ溶液の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガンマブチロラクトン、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１のアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１の水共沸溶媒の存在下行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
更に、液体下部中のSAの濃度を増大させるために、液体下部から水を除去することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
清澄化MAS含有発酵培地からSAを生産する方法であり、
（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、培地を、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離する
ことを含む方法。
【請求項１２】
前記液体底部が、少なくとも幾らかのMASを含有し、及び/又は前記固体部分が実質的にスクシンアミド酸、スクシンアミド及びスクシンイミドを含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
更に、液体底部から、SA及び水、並びに任意でMASを再利用して、清澄化した培地に戻すことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
更に、液体下部中のSAの濃度を増大させるために、液体下部から水を除去することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガンマブチロラクトン、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１のアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１の水共沸溶媒の存在下行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
清澄化MＡＳ含有発酵培地からＳＡを製造する方法であって、
（ａ）アンモニア分離及び/または水共沸（azeotroping）溶媒を前記培地に添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、SA及び少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するのに十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離する
ことを含む方法。
【請求項１７】
前記液体底部が、少なくとも幾らかのMASを含有し、及び/又は前記固体部分が実質的にスクシンアミド酸、スクシンアミド及びスクシンイミドを含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
更に、液体底部からSA、水、及び溶媒、並びに任意でMASを再利用して、清澄化した培地に戻すことを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガンマブチロラクトン、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１のアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１の水共沸溶媒の存在下行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
更に、液体下部中のMASの濃度を増大させるために、液体下部から水を除去することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月１日に出願した米国仮出願番号６１／３２０，０６３、２０１０年４月２６日に出願した米国仮出願番号６１／３２７，７８９の利益を主張する。これらの出願の主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示発明は、コハク酸二アンモニウム（ＤＡＳ）、コハク酸一アンモニウム（ＭＡＳ）及び／又はSAを含む発酵培地からのコハク酸（SA）の直接製造法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖発酵の炭素質産物の中には、炭素含有化学物質の製造原料として使用される石油由来材料の代替品と見做されているものがある。そのような産物の一つがSAである。
【０００４】
コハク酸は、出発材料として発酵性炭素源、例えば糖を用い、微生物により製造できる。しかし、文献記載の商業化可能なコハク酸産生微生物の多くは、生育、変換及び生産性を最大化するべく最適ｐＨを維持するために、発酵培地を中和する。典型的には、培地への水酸化アンモニウムの添加により、発酵培地のｐＨはｐＨ７又はその付近に維持され、これによりコハク酸がＤＡＳに変換される。
【０００５】
櫛来（特開２００５−１３９１５６号公報）は、カウンターイオンとしてアンモニウム塩を加えた発酵培地から得られるＤＡＳ水溶液から、ＭＡＳを取得する方法を記載する。具体的に、ＤＡＳ水溶液からのＭＡＳの結晶化は、当該溶液に酢酸を加えてそのｐＨを４．６〜６．３に調整し、不純物を含むＭＡＳの結晶化を促すことにより行われる。
【０００６】
増田（特開２００７−２５４３５４号公報、２００７年１０月４日公開）は、式Ｈ4ＮＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＮＨ4の「コハク酸アンモニウム」の希釈水溶液の部分的脱アンモニアを記載する。開示された分子式からは、この「コハク酸アンモニウム」がコハク酸二アンモニウムであることが分かる。増田によれば、コハク酸アンモニウム溶液を加熱することにより水及びアンモニアを除去し、コハク酸アンモニウムに加えて、コハク酸一アンモニウム、コハク酸、コハク酸モノアミド、コハク酸イミド、コハク酸アミド、又はコハク酸エステルのうち少なくとも１を含む固体コハク酸系組成物を回収する。ここから、櫛来と同様に、増田が記載する方法も、産生されるＭＡＳ産物は不純物を含むものと推測される。櫛来及び増田の何れの方法も、高純度ＭＡＳを得るためには、得られる物質に対して種々の精製法を施す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＡＳ、ＭＡＳ、及び／又はＳＡを含む発酵培地から、実質的に純粋なSAを直接製造する方法を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、清澄化ＤＡＳ含有発酵培地から、SAを製造するための方法を提供する。この方法は、（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、培地を、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離することを含む。
【０００９】
本発明者等は、また、清澄化ＤＡＳ含有発酵培地から、SAを製造するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）アンモニア分離及び/または水共沸（azeotroping）溶媒を前記培地に添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、SA及び少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するのに十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離することを含む。
【００１０】
本発明者等は、更に、清澄化MＡＳ含有発酵培地から、SAを製造するための方法を提供する。この方法は、（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、培地を、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離することを含む。
【００１１】
本発明者等は、更に、清澄化MＡＳ含有発酵培地から、SAを製造するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）アンモニア分離及び/または水共沸（azeotroping）溶媒を前記培地に添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、SA及び少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するのに十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＤＡＳ含有培地からSAを製造するための方法の一例のブロック図である。
【００１３】
【図２】図２は、水及び２０％MＡＳ水溶液の各々に対するSAの溶解性を、温度の関数として表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
当然のことではあるが、以下の説明のうち少なくとも一部は、図における例示のために選択された方法の代表例を指すことを意図したものであり、添付の特許請求の範囲を除いて、本開示発明を定義又は限定することを意図したものではない。
【００１５】
本発明の方法は、例えば図１を参照することにより理解される。図１は、本発明の方法の代表例１０をブロック図として表したものである。
【００１６】
生育槽１２は、通常は備え付けの蒸気滅菌可能な発酵槽であって、ＤＡＳ、ＭＡＳ、及び／又はＳＡ含有発酵培地の製造に用いられる微生物培養物（未記載）の培養に使用し得る。そのような生育槽は本技術分野で公知であり、更に言及しない。
【００１７】
この微生物培養物は、炭水化物糖等の発酵性炭素源からＳＡを産生し得る微生物を含んでいてもよい。微生物の代表例としては、これらに限定される訳ではないが、大腸菌（Escherichia coli）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（また、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum））、エンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）、ベイヨネラ パルビュラ（Veillonella parvula）、アクチノバチルス スクシノゲネス（Atinobacillus succinogenes）、マンヘイミア スクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）、アネロビオスピリルム スクシニシプロデューセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、ペシロマイセス バリオッティ（Paecilomyces Varioti）、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バクテロイデス フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）、バクテロイデス アミロフィラス（Bacteroides amylophilus）、アルカリゲネス ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、カンジダ ブルンプチイ（Candida brumptii）、カンジダ カテヌラタ（Candida catenulate）、カンジダ ミコデルマ（Candida mycoderma）、カンジダ ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、カンジダ パルディゲナ（Candida paludigena）、カンジダ ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ ユチリス（Candida utilis）、デバリオマイセス ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、フサリウム オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒュミコラ ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、クロエケラ・アピキュラータ（Kloeckera apiculata）、クルイベロマイセス ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス ウィッケルハミ（Kluyveromyces wickerhamii）、ペニシリウム シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）、ピキア アノマーラ（Pichia anomala）、ピキア ベッセイ（Pichia besseyi）、ピキア メディア（Pichia media）、ピキア ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii）、ピキア イノシトヴォラ（Pichia inositovora）、ピキア スティピディス（Pichia stipidis）、サッカロミセス バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）、ヤロウィア リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、それらの混合物等が挙げられる。
【００１８】
好ましい微生物は、受託番号ＰＴＡ−５１３２としてＡＴＣＣに供託された大腸菌株である。より好ましくは、この株から３つの抗生物質耐性遺伝子（ｃａｔ、ａｍｐｈｌ、ｔｅｔＡ）を除去したものである。抗生物質耐性遺伝子ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性をコードする）及びａｍｐｈｌ（カナマイシン耐性をコードする）の除去は、Datsenko KA and Wanner BL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Jun 6, 97(12), 6640-5に記載のいわゆる「ラムダ−レッド」（“Lamda-red (λ-red)”）法により行うことができる。本文献の主題は引用により本明細書に組み込まれる。テトラサイクリン耐性遺伝子tetAは、Bochner al., J Bacteriol., 1980, August; 143(2), 926-933により初めて報告された方法を用いて除去することができる。本文献の主題は引用により本明細書に組み込まれる。グルコースが本微生物の発酵性炭素源として好ましい。
【００１９】
発酵性炭素源（例えば炭水化物及び糖）を、任意により窒素源及び複合栄養素（例えばコーンスティープリカー）、ビタミン、塩、細胞成長及び／又は産物生成を改善し得る他の材料等の追加培地成分、並びに水と共に、微生物培養物の生育及び維持のために生育槽１２に供給してもよい。一般的には、微生物培養物は、酸素富化ガス（例えば空気）の散布により提供される好気性条件下で培養される。一般的には、微生物培養物の培養の間、ｐＨ調節のために酸（例えば硫酸）及び水酸化アンモニウムを供給する。
【００２０】
ある例（未記載）によれば、酸素富化ガスを酸素欠乏ガス（例えば、ＣＯ2等）に変えることにより、生育槽１２内の（酸素富化ガス散布により提供される）好気性条件を、嫌気性条件に変更する。嫌気性環境により、生育槽１２ではインサイチュ（in situ）で、発酵性炭素源からコハク酸への生物変換が生じる。発酵性炭素源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために、水酸化アンモニウムを供給してもよい。水酸化アンモニウムの存在により、産生されたＳＡの少なくとも一部は中和されてＤＡＳとなり、ＤＡＳを含有する培地が産生される。ＣＯ2は、ＳＡ産生のための更なる炭素源を提供する。
【００２１】
他の例によれば、生育槽１２の内容物を、ストリーム（stream）１４を経由して、炭水化物源からＳＡへの生物変換用の別の生物変換槽１６に移送してもよい。ＳＡ産生を生じさせる嫌気性条件を提供するために、生物変換槽１６には酸素欠乏ガス（例えばＣＯ2）を散布する。炭水化物源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために水酸化アンモニウムを供給する。水酸化アンモニウムの存在により、産生されたＳＡの少なくとも一部は中和されてＤＡＳとなり、ＤＡＳを含有する培地が産生される。ＣＯ2は、ＳＡ産生のための更なる炭素源を提供する。
【００２２】
他の例によれば、生物変換を比較的低いｐＨ（例えば３〜６）で行ってもよい。炭水化物源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために塩基（水酸化アンモニウム又はアンモニア）を供給してもよい。所望のｐＨに応じて、水酸化アンモニウムの存在又は不在により、ＳＡが産生されるか、或いは産生されたＳＡの少なくとも一部が中和されて、ＭＡＳ、ＤＡＳ、又はＳＡ、ＭＡＳ及び／又はＤＡＳを含む混合物となる。即ち、生物変換時に産生されたＳＡは、任意により追加工程としてアンモニア又は水酸化アンモニウムを供給することにより、その後に中和されて、ＤＡＳを含有する培地が産生される。従って、「ＤＡＳ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＤＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＭＡＳ及び／又はＳＡを含むことを意味する。同様に、「ＭＡＳ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＭＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＳ及び／又はＳＡを含むことを意味する。
【００２３】
発酵性炭素源の生物変換の結果として（生物変換を行う場所に応じて槽１２又は槽１６で）生じる培地は、通常は不溶性固体、例えば細胞性バイオマスや他の懸濁物等を含む。そこで、蒸留前にストリーム１８を経由して清澄化装置２０に移送し、不溶性固体を除去して培地を清澄化する。これによって後の蒸留装置の汚損を低減し又は予防する。不溶性固体の除去は、数種の固液分離技術の何れかを単独又は組合せで用いて行うことができる。固液分離技術としては、限定されるものではないが、遠心分離や濾過（限定されるものではないが、限外濾過、精密濾過又は深層濾過が挙げられる。）が挙げられる。濾過技術は公知技術に基づいて選択し得る。可溶性無機化合物は、複数の公知の方法により除去することができる。例としては、限定されるものではないが、イオン交換、物理吸着等が挙げられる。
【００２４】
遠心分離の例として、連続ディスクスタック遠心分離が挙げられる。場合によっては、遠心分離後に、デッドエンド濾過やクロスフロー濾過等の研磨濾過（polishing filtration）工程を追加すると有益である。斯かる濾過には、珪藻土等の濾過助剤を使用してもよい。研磨濾過として、より好ましくは限外濾過又は精密濾過である。限外濾過及び精密濾過膜は、例えばセラミックやポリマー等からなる。ポリマー膜の一例として、Koch Membrane System（850 Main Street, Wilmington, MA, USA）製SelRO MPS-U20P（ｐＨ安定限外濾過膜）が挙げられる。これは分子量カットオフ２５０００ダルトンの市販ポリエーテルスルホン膜であって、通常は圧力０．３５〜１．３８ＭＰａ（最大圧力１．５５Ｍｐａ）、最高温度５０℃で使用できる。遠心分離と研磨濾過とを組み合わせて使用する代わりに、限外又は精密濾過膜を用いたクロスフロー濾過を単独で実施してもよい。
【００２５】
こうして清澄化された、実質的に微生物培養物や他の固体を含まないＤＡＳ含有培地又はＭＡＳ含有培地を、ストリーム２２を経由して蒸留装置２４に移送する。
【００２６】
清澄化培地は、ＤＡＳ及び／又はＭＡＳを、培地中の全ジカルボン酸アンモニウム塩の少なくとも大部分、好ましくは少なくとも約７０ｗｔ％、より好ましくは８０ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％の量で含むべきである。ＤＡＳ及び／又はＭＡＳの濃度は、発酵培地中の全ジカルボン酸塩に対する重量パーセント（ｗｔ％）として、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やその他の公知法により容易に決定できる。
【００２７】
蒸留装置２４から水及びアンモニアが上部（overhead）として除去されるとともに、任意により、少なくとも一部がストリーム２６を経由して生物変換槽１６（或いは嫌気性モードで操作の場合、生育槽１２）で再利用（recycle）される。蒸留温度及び圧力は重要ではなく、少なくとも蒸留上部が水及びアンモニアを含み、蒸留底部（bottoms）が好ましくは少なくとも幾らかのＤＡＳと少なくとも約２０ｗｔ％との水を含むように、蒸留を実施すればよい。水の量は少なくとも約３０ｗｔ％がより好ましく、少なくとも約４０ｗｔ％が更に好ましい。蒸留工程からのアンモニア除去率は、温度を上昇させるに従って増加し、また、蒸留時に蒸気を注入することにより（未記載）増加させることができる。蒸留時のアンモニア除去率は、真空下、加圧下で蒸留を行い、或いは蒸留装置に空気、窒素等の不活性ガスを散布することによっても増加させることができる。
【００２８】
蒸留工程時の水の除去は、底部が少なくとも約２０％の水を含む限りにおいて、トルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサン、ヘプタン等の有機共沸剤の使用により促進することができる。水と共沸混合物を形成し得る有機剤の存在下で蒸留を行うと、蒸留によって水相及び有機相を含む二相性底部が生じる。この場合、水相を有機相から分離し、蒸留底部として使用することができる。底部における水のレベルを少なくとも約３０ｗｔ％に維持すれば、コハク酸アミドやコハク酸イミド等の副生物を実質的に避けることができる。
【００２９】
蒸留工程の好ましい温度は、圧力にもよるが、約５０〜約３００℃の範囲である。より好ましい温度範囲は、圧力にもよるが、約１５０〜約２４０℃である。約１７０〜約２３０℃の蒸留温度が好適である。「蒸留温度」とは底部の温度を指す（バッチ蒸留の場合は、最終的に所望量の上部が得られた時点の温度でもよい。）。
【００３０】
水混和性有機溶媒又はアンモニア分離溶媒を添加することにより、上述した範囲の蒸留温度及び圧力において、脱アンモニアが容易になる場合がある。斯かる溶媒としては、受動的水素結合を形成し得る非プロトン性、双極性、酸素含有溶媒が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルアセトアミド等のアミド、ジメチルスルホン、ガンマブチロラクトン、スルホラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等のスルホン、ジオキサン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）等のエーテル等が挙げられる。そのような溶媒は、清澄化培地中のＤＡＳ又はＭＡＳからアンモニアの除去に役立つ。蒸留法によらず、蒸留は、底部に少なくとも幾らかのMＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％、より有利には少なくとも約３０ｗｔ％の水とが保持されるように行うことが好ましい。蒸留は、常圧下、減圧下又は加圧下で行うことができる。
【００３１】
蒸留が共沸剤又はアンモニア分離溶媒の非存在下で実施される場合等の他の条件において、当該蒸留は、水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、SAと、少なくとも約２０wt％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、加圧下、１００℃超〜約３００℃の温度で実施される。与圧とは、典型的には、大気圧超〜約２５気圧である。有利な水の量は、約３０wt％である。
【００３２】
蒸留としては、一段フラッシュ（one stage flash）、多段式蒸留（即ち、多段式カラム蒸留）、複式カラム等が挙げられる。一段フラッシュは、任意の種類のフラッシャー（例えば塗膜エバポレーター、薄膜エバポレーター、サーモサイフォンフラッシャー、強制循環フラッシャー等）で行うことができる。多段蒸留カラムは、トレー、充填物（packing）等を用いて達成することができる。充填物は、不規則充填物（例えばラシヒ（Raschig）リング、ポール（Pall）リング、バール（Berl）サドル等）でも、規則充填物（例えばコークスルザー（Koch Sulzer）充填物、インタロックス（Intalox）充填物、メラパック（Mellapak）等）でもよい。トレーは、任意のデザイン（例えばシーブトレー、バルブトレー、バブルカップトレー等）でもよい。蒸留は任意の理論段数で行うことができる。
【００３３】
蒸留装置がカラムの場合、その構成は特に重要ではなく、周知の基準に基づいて設計することができる。カラムは、ストリッピングモード、精留（rectifying）モード、又は分留（fractionation）モードの何れかで操作することができる。蒸留は、バッチモード、半連続モード、又は連続モードで行ってもよい。連続モードでは、培地を蒸留装置に連続的に注入してもよく、また、上部及び底部の形成に伴いこれらを連続的に装置から除去してもよい。蒸留により得られる蒸留物はアンモニア水溶液であり、蒸留底部はＭＡＳ及びSAの液体状の水溶液である。これらは更に、他の発酵副生物の塩（即ち、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、乳酸アンモニウム等）や、色素体を含んでもよい。
【００３４】
蒸留底部を、ストリーム２８を経由して冷却装置３０に移送し、常法により冷却してもよい。冷却法は重要ではないが、好ましい技術を以下に記載する。熱交換機（熱回収型）を使用することができる。フラッシュ気化冷却器を用いて底部を約１５℃まで冷却してもよい。０℃までの冷却には、通常は冷蔵冷却剤を用いる。例としてはグリコール溶液や、それほど好ましくはないが、塩水等が挙げられる。収量の更なる増大を図る目的で、冷却の前に濃縮工程を組み入れてもよい。更に、公知の方法、例えば、真空エバポレーションと共に、一体型冷却ジャケット及び／又は外部熱交換器を用いた徐熱等を用いて、濃縮及び冷却の両方を組み合わせてもよい。
【００３５】
本発明者等は、液体底部に幾らかのMＡＳが存在することで、液体状の水溶液たるMＡＳ含有底部に対するSAの溶解性が低下し、これによって底部が容易に、少なくともSA「から実質的になる」（consisting essentially of）（固体部分が少なくとも実質的に純粋な結晶SAであることを意味する）固体部分と、これに接する液体部分とに冷却誘導分離されることを見出した。図２は、５〜４５℃の範囲内の様々な温度における、２０ｗｔ％MＡＳ水溶液に対するSAの溶解性の低下を示す。本発明者等は、SA水溶液に幾らかのMＡＳが含まれている方が、水溶液からSAをより完全に結晶化できることを見出した。斯かる溶液中のMＡＳの好ましい濃度は、約２０ｗｔ％までの範囲である。これによって、MＡＳが存在しない場合に必要な温度よりも高い温度で、SAを結晶化する（即ち、蒸留底部の固体部分を形成する）ことが可能となる。
【００３６】
蒸留底部を冷却した後、固体部分を液体部分から分離するために、ストリーム３２を経由して分離器３４に導入する。分離は、加圧濾過（例えば、Nutsche又はRosenmond型加圧濾過器）、遠心分離等により達成できる。生じた固体産物を産物３６として回収し、所望により標準法で乾燥してもよい。
【００３７】
分離後、固体部分の（１又は２以上の）表面に液体部分が残存することのないように、固体部分を処理することが望ましい。固体部分の表面に残る液体部分の量を最小化するための一つの方法は、分離した固体部分を水洗し、洗浄後の固体部分を乾燥することである（未記載）。固体部分を洗浄するための簡便な方法としては、いわゆる「バスケット遠心分離」の使用が挙げられる（未記載）。適切なバスケット遠心分離機は、The Western States Machine Company（Hamilton, OH, USA）から入手できる。
【００３８】
分離器３４の液体部分（即ち母液）は、残存する溶解SA、任意の非変換MAS、酢酸アンモニウム、乳酸類（lactate）、ギ酸類（formate）等の任意の発酵副生物、その他の微量不純物を含む場合がある。この液体部分を、ストリーム３８を経由して下流装置４０に導入する。一例によれば、装置４０は、混合物を適量の水酸化カリウムで処理することにより、例えばアンモニウム塩をカリウム塩に変換し、解氷剤（de-icer）を作製する手段であってもよい。この反応で生じたアンモニアを回収し、生物変換槽１６（又は嫌気性モードで操作する生育槽１２）で再利用してもよい。得られたカリウム塩混合物は、解氷剤及び防氷剤（anti-icer）として有用である。
【００３９】
SAの回収を促進し、更にはMASからSAへの変換を推進するために、固体分離工程３４由来の母液を、ストリーム４２を経由して、蒸留装置２４で再利用（又はその一部を再利用）してもよい。
【００４０】
冷却誘導結晶化の固体部分は、実質的に純粋なSAであり、ひいてはSAの公知用途に有用である。
【００４１】
ＨＰＬＣを用いて、コハク酸アミドやコハク酸イミド等の窒素含有不純物の存在を検出してもよい。SAの純度は元素炭素及び窒素分析により決定できる。アンモニア電極を用いてSA純度の粗近似値を決定することも可能である。
【００４２】
状況や種々の操作入力によっては、発酵培地が清澄化ＭＡＳ含有発酵培地又は清澄化ＳＡ含有発酵培地である場合がある。斯かる状況では、実質的に純粋なSAの産生を容易にするために、これらの発酵培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、及び／又はＳＡ、及び任意でアンモニアを添加するのが有利な場合もある。例えば、培地がＭＡＳ含有培地又はＳＡ含有培地となるような方向に、発酵培地のｐＨを操作してもよい。上述した実質的に純粋なＭＡＳの製造を容易にするために、任意によりこれらの発酵培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ、アンモニア及び／又は水酸化アンモニウムを添加し、培地のｐＨを好ましくは＜６に調整してもよい。また、所望により、他の物質由来のＭＡＳ、ＤＡＳ及び／又はＳＡを添加してもよい。ある特定の形態によれば、蒸留工程２４で得られる液体底部、及び／又は、分離器３４由来の固体部分から、SA、MAS及び水を発酵培地及び／又は清澄した発酵培地に再導入（recycle）するのが特に有利である。ＭＡＳ含有培地については、そのような培地は通常、発酵培地がＭＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＳ及び／又はＳＡ等を含むことを意味する。
【実施例】
【００４３】
本発明の方法を、以下の非限定的な代表例により説明する。最初の２つの例においては、実際の清澄化ＤＡＳ含有発酵培地の代わりに、合成ＤＡＳ水溶液を使用した。他の例では実際の清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を使用した。
【００４４】
実際の培地に見られる典型的な発酵副生物の溶解性ゆえに、合成ＤＡＳ溶液の使用は、最初の２つの例における実際の培地の挙動を表す良いモデルであると考えられる。発酵時に産生される主な副生物は、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム及びギ酸アンモニウムである。酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム、及びギ酸アンモニウムは、SAよりも有意に高い水溶性を示し、各々の培地中の濃度はＤＡＳ濃度の１０％未満である。加えて、たとえ蒸留工程時に酸（酢酸、ギ酸及び乳酸）が形成されたとしても、これらは水と混和性であり、水から結晶化しないであろう。これは、母液（即ち液体部分）に溶解した酸不純物を残したまま、SAが飽和に達し、溶液から結晶化する（即ち固体部分を形成する）ことを意味する。
【００４５】
実施例１
本実施例は、水性溶媒中でのDASからSAへの変換を示す。
【００４６】
実験は、１５％（１．０M）合成DAS溶液を使用して、３００ml Hastelloy C攪拌Parr反応器中で実施された。当該反応器に２００gの溶液を導入し、200 psigに与圧した。内容物を加熱して蒸留を開始し、温度を約２００℃まで上げた。アンモニア及び水蒸気は冷却水を用いて上部に濃縮され、リザーバーに回収された。新鮮な水が、定常的なコハク酸塩濃度及び材料の体積を維持する速度（約２g/分）と等しい速度で系に引き戻された。当該反応は、７時間続行された。反応の最後に、母液の解析により、５９％がSAに変換され、２．４％がスクシンアミド酸に変換され、そして２．９％がスクシンイミドに変換されたことが判明した。母液の冷却は、液体部分と、実質的に純粋なSAである固体部分をもたらす。
【００４７】
実施例２
本実施例は、ＤＡＳ水溶液からのアンモニア生成に対する溶媒の影響を示す。実験１０は、溶媒を使用しない対照実験である。
【００４８】
３つ口１Ｌ丸底フラスコの外側の口に、温度計及びストッパーを取り付けた。中央の口に、５トレー１”オールダーショウ（Oldershaw）セクションを取り付けた。オールダーショウセクションに、蒸留ヘッドを装着した。氷冷５００ｍＬ丸底フラスコを、蒸留ヘッド用のレシーバとして使用した。１Ｌ丸底フラスコに、蒸留水、試験対象溶媒、ＳＡ及び濃縮水酸化アンモニウム溶液を入れた。内容物をマグネチックスターラーで攪拌し、すべての固体を溶解させた。固体が溶解した後、内容物を加熱マントルで加熱し、蒸留物３５０ｇを蒸留した。蒸留物を氷冷５００ｍｌ丸底フラスコに採取した。蒸留物の最後の液滴を採取した時に、ポットの温度を記録した。ポットの内容物を室温まで冷却し、残留物の量及び蒸留物の量を記録した。その後、蒸留物のアンモニア含量を滴定により決定した。結果を表１及び２に記録した。
【００４９】
【表１】
2013523123.tif 000003
【００５０】
【表２】
2013523123.tif 000004
【００５１】
実施例３
本実施例は、E. coli株ATCC PTA-5132を含む発酵培地に由来する、DAS含有清澄化発酵培地を使用した。
【００５２】
最初の発酵培地が清澄化されて、〜４．５％のコハク酸二アンモニウム（DAS）を含有する清澄発酵培地を得た。当該清澄化培地は、以下の結晶SAの生産に使用された。前記培地は、RO膜を使用して最初に約９％まで濃縮され、更に４０％程度まで濃縮するように、大気圧下で蒸留された。
【００５３】
前記濃縮された培地を出発材料として、３００ｍｌParr反応器中で、DASをSAに変換する反応を行った。２００gの前記溶液を、２００℃/200psigで１１時間反応させた。反応の進行につれて、DASから解離したアンモニア及び水蒸気が濃縮され、上部に回収された。濃縮物は約2g/分で回収され、同程度の速度で水が系に引き戻された。
【００５４】
この実験を通して、複数の試料が得られた。反応の早期に得られた試料は、スクシンアミド、スクシンアミド酸及びスクシンイミドの存在を示唆した。しかしながら、これらの窒素含有産物は、実験を通じて減少した。SAへの変換は５５％に上り、底部に観察された。最終的な溶液は、蒸留により濃縮され、４℃に冷却された。得られた結晶の固体を真空濾過により単離し、氷水で洗浄し、真空下で乾燥させた。産物（７g）は、HPLCで判定したところ、実質的に純粋なSAであった。
【００５５】
実施例４
５００ｍＬ丸底フラスコに、８０ｇの３６％DAS水溶液及びトリグリム８０ｇを充填した。フラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”ガラスオールダーショウカラムセクションを取り付けた。また、水３３００ｇを含む滴下ロートをフラスコに連結した。フラスコをマグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。蒸留物が変化し始めたところで、蒸留物を取得するのと同じ速度で、滴下ロートの水をフラスコに添加した。合計３３１３ｇの蒸留物を取得した。滴定により決定したところ、蒸留物はアンモニア４．４ｇを含んでいた。DＡＳからＳＡへの変換率に換算するとから３７％となる。残りはMASに変換された。その後、フラスコの残留物を三角フラスコに移し、攪拌しつつ−５℃まで冷却した。３０分間攪拌後、スラリーを冷たいうちに濾過し、固体１５．３ｇを回収した。固体を熱水７．１ｇに溶解した後、攪拌しながらアイスバスで冷却した。冷却スラリーを濾過し、固体を１００℃で２時間、真空オーブンで乾燥し、コハク酸３．９ｇを回収した。ＨＰＬＣ分析によれば、この固体は、０．０９９％スクシンアミド酸を含むＳＡであることが分かった。
【００５６】
実施例５
316SS Propak充填物を充填した長さ８フィートの１．５”３１６ＳＳスケジュール４０管を用いて圧力蒸留カラムを作製した。カラムの底部にはリボイラーとして投入電熱器を設けた。ニードル弁を介して窒素をリボイラー内に注入し、加圧した。カラムの上部は全除去ラインを設け、これをレシーバ付の３１６ＳＳ多管冷却器（shell and tube condenser）に連結した。レシーバには圧力計及び背圧調整弁を装着した。上部レシーバからの物質の除去は、ニードル弁を通じて、ブローケースを介して行った。予熱したフィードを、０．４％水酸化ナトリウム希釈剤と共に、ポンプを介して充填物の上部からカラムに注入した。また、予熱した水を、ポンプを介してリボイラーに注入した。このカラムを最初５０ｐｓｉｇで操作した。カラム温度は１５０℃となった。カラム上部に、８ｍＬ／分の速度で４．７％ＤＡＳ含有培地を、そして0.15ml/分の速度で０．４％水酸化ナトリウム溶液を注入した。水は、４ml/分の速度でリボイラーに注入された。上部の蒸留物は８mL/分の速度で取られ、残留物は４mL/分の速度で取られた。全部で2565gの培地と53gの0.4％水酸化ナトリウム溶液がカラムに注入された。実験の過程で、全部で2750gの蒸留物が取られ、1269gの残留物が取られた。蒸留物の滴定は、DAS中に含有される全アンモニアの〜71％が除去された（すなわち残留物は、SA/MASの42/58混合物であった）。この複合残留物を、圧力100psg、温度173℃の条件で翌日同じカラムに戻した。当該複合残留物を、４ｍL/分の速度で、0.15mL/分の0.4%水酸化ナトリウム溶液と共に、カラムの上部に注入した。リボイラーに、0.2mL/分で水を注入した。前日から全部で1240gの残留物が、58gの水酸化ナトリウム溶液及び2890gの水と共にカラムに注入された。実験の過程で、全部で３１８３ｇの蒸留物が、１１３２ｇの残留物と共に回収された。蒸留物の滴定により、更に〜14％のアンモニアが除去され、蒸留物中、SA/MASの70/30の混合物が取得されることが明らかになった。
【００５７】
その他
本発明の方法をその具体的な工程及び態様に即して記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本開示発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の具体的な要素及び工程に代えて、広範な範囲から選択される均等物を用いてもよい。
【図１】
2013523123.tif 000005
【図２】
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【国際調査報告】
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