(57)【要約】【課題】組み合わせＧＡＳワクチンおよび治療法の提供。【解決手段】ＧＡＳ抗原、前記抗原をコードする核酸分子、または前記抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）感染のリスクを減少させる、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）感染を予防する、および／またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）感染を処置するのに有用な組成物。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、子供においてＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染により引き起こされる咽頭炎に対して効果的な予防を提供するワクチン組成物である。【選択図】図１
2015038156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学およびワクチン学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ａ群連鎖球菌（「ＧＡＳ」、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）はよく見られるヒト病原体であり、疾患の徴候なく、正常な個人の５〜１５％間に存在すると推定されている。しかし、宿主防衛が損なわれる場合、その生物が毒力を発現することができる場合、またはその生物が脆弱な組織もしくは宿主に導入される場合、急性感染症が生じる。関連する疾患には、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽喉炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌毒素ショック症候群が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＧＡＳに対して使用するための予防ワクチンを開発する努力が何十年と継続されている。しかし、現在一般に入手可能なＧＡＳワクチンはない。当技術分野にはかかるワクチンの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を処置する、前記感染のリスクを軽減するおよび／または前記感染を予防するのに有用な多成分組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、子供においてＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染により引き起こされる咽頭炎に対して効果的な予防を提供するワクチン組成物である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）（１）Ｓｐｙ０１６７；
（２）Ｓｐｙ０２６９；
（３）Ｓｐｙ０４１６；
（４）Ｓｐｙ０７１４；
（５）Ｓｐｙ１３９０；
（６）Ｓｐｙ２０００；
（７）アミノ酸Ｐ４２７、Ｗ５３５、Ｃ５３０、Ａ２４８、およびＤ４８２からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号１０７に従って番号付けされ、前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質の溶血活性が、野生型Ｓｐｙ０１６７に対して少なくとも５０％低下している、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；ならびに
（８）アミノ酸Ｄ１５１、Ｈ２７９、およびＳ６１７からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号１に従って番号付けされ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＥＬＩＳＡアッセイにより検出される場合、インターロイキン８（ＩＬ−８）に対する精製された変異体Ｓｐｙ０４１６抗原のタンパク質分解活性が、野生型Ｓｐｙ０４１６に対して少なくとも５０％低下している、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質
からなる群より選択される３つまたはそれを超える異なるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）タンパク質抗原の組み合わせ、
（ｂ）（１）〜（８）をコードする１つまたは複数の核酸分子、または
（ｃ）各抗体が、（１）〜（８）からなる群より選択されるＧＡＳタンパク質抗原に選択的に結合し、各ＧＡＳタンパク質抗原が異なっている、３つまたはそれを超える異なる抗体
を含む、組成物。
（項目２）
前記３つのＧＡＳタンパク質抗原が、
Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６；
Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６；
Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；または
Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ
である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
組成物であって、
（ａ）２つだけのＧＡＳタンパク質抗原であって、前記組成物は
（１）Ｓｐｙ０１６７ならびに、Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；アミノ酸Ｐ４２７、Ｗ５３５、Ｃ５３０、Ａ２４８、およびＤ４８２からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号１０７に従って番号付けされ、前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質の溶血活性が、野生型Ｓｐｙ０１６７に対して少なくとも５０％低下している、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；アミノ酸Ｄ１５１、Ｈ２７９、およびＳ６１７からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸変化を含む変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質であって、前記アミノ酸位置が配列番号１に従って番号付けされ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはＥＬＩＳＡアッセイにより検出される場合、インターロイキン８（ＩＬ−８）に対する精製された変異体Ｓｐｙ０４１６抗原のタンパク質分解活性が、野生型Ｓｐｙ０４１６に対して、少なくとも５０％低下している、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（２）Ｓｐｙ０２６９ならびに、Ｓｐｙ０１６７；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（３）Ｓｐｙ０４１６ならびに、Ｓｐｙ０１６７；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（４）前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質ならびに、Ｓｐｙ０１６７；Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（５）前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質ならびに、Ｓｐｙ０１６７；Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（６）Ｓｐｙ０７１４ならびに、Ｓｐｙ０１６７；Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；
（７）Ｓｐｙ１３９０ならびに、Ｓｐｙ０１６７；Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原；ならびに
（８）Ｓｐｙ２０００ならびに、Ｓｐｙ０１６７；Ｓｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；前記変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；前記変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；およびＳｐｙ１３９０からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原
を含む、２つだけのＧＡＳタンパク質抗原；
（ｂ）前記２つのＧＡＳタンパク質抗原をコードする１つまたは複数の核酸分子；ならびに
（ｃ）各抗体が、前記２つのＧＡＳタンパク質抗原のうちの１つに選択的に結合する、２つまたはそれを超える異なる抗体
を含む、組成物。
（項目４）
前記２つのＧＡＳタンパク質抗原が、
Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０２６９；
Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０４１６；
Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０２６９；
Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０４１６；
Ｓｐｙ０２６９およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；
Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；または
Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ
である、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記変異体Ｓｐｙ０４１６抗原を含む、項目１から４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
前記変異体Ｓｐｙ０４１６抗原が、Ｄ１５１ＡおよびＳ６１７Ａからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記変異体Ｓｐｙ０４１６抗原が、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１９８を含む、項目５に記載の組成物。
（項目８）
前記Ｓｐｙ０２６９抗原が配列番号１７７を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記変異体Ｓｐｙ０４１６抗原が、第２のＧＡＳ抗原を含む融合タンパク質である、項目５に記載の組成物。
（項目１０）
前記変異体Ｓｐｙ０１６７抗原を含む、項目１から４のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記変異体Ｓｐｙ０１６７抗原が、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、および配列番号１２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記ＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが担体タンパク質にカップリングされている、項目１から１１のいずれかに記載の組成物。
（項目１３）
前記担体タンパク質が、細菌毒素、細菌トキソイド、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ、および鉄取り込みタンパク質からなる群より選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖ分子、非共有結合性ヘテロ二量体単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）、二量体抗体フラグメント構築物、三量体抗体フラグメント構築物、ミニボディ、またはその混合物である前記３つまたはそれを超える異なる抗体を含む、項目１または項目３に記載の組成物。
（項目１５）
前記抗体の１つが野生型Ｓｐｙ０４１６に特異的に結合し、ヒトＩＬ−８を切断する前記野生型Ｓｐｙ０４１６の能力を阻害する、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記抗体が、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１β、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１γ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＸＣＬ１６からなる群より選択されるヒトケモカインを切断する野生型Ｓｐｙ０４１６の能力を阻害する、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記１つまたは複数の核酸分子を含む、項目１または項目３に記載の組成物。
（項目１８）
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目１から１７のいずれかに記載の組成物。
（項目１９）
小児用ワクチンで有用である活性剤をさらに含む、項目１から１３、１７、または１８のいずれかに記載の組成物。
（項目２０）
前記活性剤が、
（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｈｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ、呼吸器合胞体ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、およびロタウイルスのポリペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原、ならびに
（ｂ）前記ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群より選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
高齢者または免疫無防備状態の個体のためのワクチンで有用な第２の活性剤をさらに含む、項目１から１３、１７、または１８のいずれかに記載の組成物。
（項目２２）
前記第２の活性剤が、
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、インフルエンザウイルス、およびパラインフルエンザウイルスのポリペプチド抗原からなる群より選択されるポリペプチド抗原；ならびに
（ｂ）前記ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群より選択される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
式：
【化１４】
2015038156.tif 000003
のＡ群多糖であって、式中、Ｒは末端還元Ｌ−ラムノースまたはＤ−ＧｌｃｐＮＡｃであり、ｎは約３から約３０までの数である、Ａ群多糖をさらに含む、項目１から１３または７６から２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）
アジュバントをさらに含む項目１から１３または１７から２３のいずれかに記載の組成物。
（項目２５）
前記アジュバントがミョウバンである、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
項目１から１３または１７から２５のいずれかに記載の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる感染のリスクを減少させる、方法。
（項目２７）
項目１、４、１４から１６、または１８のいずれかに記載の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる感染を処置する、方法。
（項目２８）
（ａ）項目１から２５のいずれかに記載の組成物を含む容器；および
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる感染を処置するかまたは感染のリスクを減少させる組成物を使用するための説明書
を含む、キット。
（項目２９）
（ａ）項目１から１３または１７から２５のいずれかに記載の組成物；および
（ｂ）薬学的に許容可能な担体
を組み合わせることを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる感染のリスクを減少させるためのワクチンを作製する、方法。
（項目３０）
（ａ）項目１から４、１４から１６、または１８のいずれかに記載の組成物；および（ｂ）薬学的に許容可能な担体
を組み合わせることを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を処置するための治療薬を作製する、方法。
（項目３１）
ワクチンとして使用するための項目１から１３または１７から２５のいずれかに記載の組成物。
（項目３２）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染の処置に使用するための項目１から４、１４から１６、または１８のいずれかに記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、皮下チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）マウスモデルにおけるＧＡＳ抗原組み合わせの防御能を示すグラフである。「ＧＡＳ５７」、Ｓｐｙ０４１６；「ＧＡＳ２５」、Ｓｐｙ０１６７；「ＧＡＳ４０」、Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）；「ｄＧＡＳ５７」、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）；「ｄＧＡＳ２５」、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）。
【図２】図２は、Ｓｐｙ０４１６点変異体Ｄ１５１ＡがＩＬ−８を切断する能力を失っていることを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真（ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）である。「５７」、Ｓｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７）。
【図３】図３は、Ｓｐｙ０４１６点変異体Ｄ１５１ＡがＩＬ−８を切断する能力を失っていることを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、Ｓｐｙ０４１６単一変異体Ｄ１５１ＡおよびＳ６１７Ａならびに変異体Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７ＡがＳｐｙ０４１６タンパク質分解活性を失っていることを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、単一変異体Ｄ１５１ＡおよびＳ６１７ＡならびにＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７ＡがＳｐｙ０４１６（「５７」）タンパク質分解活性を失っていることを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、野生型Ｓｐｙ０４１６が、翻訳後修飾されて１５０．５ｋＤａおよび２３．４ｋＤａの２つのポリペプチドフラグメントになることを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。
【図７】図７は、野生型（黒色矢印）と比べて、Ｓｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ、Ｓ６１７Ａ、およびＤ１５１Ａ＋Ｓ６１７Ａが翻訳後修飾されて１５０．５ｋＤａおよび２３．４ｋＤａの２つのポリペプチドフラグメントにはならないことを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。プロセシングされていないタンパク質に対応する１７４ｋＤａの主要バンドが、代わりに、不活性変異株（灰色矢印）に対応するレーンに存在する。「５７」、Ｓｐｙ０４１６。
【図８】図８は、２つの異なる実験条件における、Ｓｐｙ０４１６（「５７」）に対するポリクローナル抗血清によるＳｐｙ０４１６媒介ＩＬ−８切断の用量依存的阻害を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果である。図８Ａ、８時間インキュベーション、０．１μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６。図８Ｂ、２４時間インキュベーション、０．０５μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６。
【図９】図９は、野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを含むＥ．ｃｏｌｉ抽出物を用いる溶血アッセイの結果を示すグラフである。
【図１０−１】図１０は、精製Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。
【図１０−２】図１０は、精製Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。
【図１１−１】図１１は、精製野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを用いる溶血アッセイの結果を示すグラフである。
【図１１−２】図１１は、精製野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを用いる溶血アッセイの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの顕微鏡写真である。レーンＡ、Ｅ．ｃｏｌｉネガティブコントロール；レーンＢ、タグなしのｒＳｐｙ０１６７野生型；レーンＣ、タグなしのｒＳｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ；およびレーンＤ、タグなしの精製ｒＳｐｙ０１６７野生型（５ｍｇ）。
【図１３】図１３は、同一条件下では、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌが野生型Ｓｐｙ０１６７の１０００分の１の溶血性であることを示すグラフである。
【図１４】図１４は、野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌによる溶血へのコレステロールの効果を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５は、細胞抽出物におけるタグなし全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。図１５Ａ、Ｓｐｙ０１６７野生型およびＰ４２７Ｌタグなしタンパク質の発現；図１５Ｂ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５、Ｐ４２７Ｌ＋Ｃ５３０Ｇ、およびＰ４２７Ｌ＋Ｃ５３０Ｇ＋Ｗ５３５Ｆタグなしタンパク質の発現。
【図１５Ｂ】図１５は、細胞抽出物におけるタグなし全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。図１５Ａ、Ｓｐｙ０１６７野生型およびＰ４２７Ｌタグなしタンパク質の発現；図１５Ｂ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５、Ｐ４２７Ｌ＋Ｃ５３０Ｇ、およびＰ４２７Ｌ＋Ｃ５３０Ｇ＋Ｗ５３５Ｆタグなしタンパク質の発現。
【図１６】図１６は、細胞抽出物におけるＨｉｓタグ付き全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、精製されたＨｉｓタグ付きタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。
【図１８Ａ】図１８は、精製されたタグなしタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。図１８Ａ、レーン：Ａ、Ｓｐｙ０１６７野生型タグなし；Ｂ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌタグなし；分子量マーカー（１１６−６６．２−４５−３５−２５−１８．４−１４．４）；黒色矢印は、変異体クローンおよび野生型クローンから精製されたＳｐｙ０１６７タンパク質を示している。図１８Ｂ、レーンＡ、Ｓｐｙ０１６７野生型タグなし（３μｇ）、レーンＢ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆタグなし（３μｇ）；分子量マーカー（１１６−６６．２−４５−３５−２５−１８．４−１４．４）；黒色矢印は、変異体クローンおよび野生型クローンから精製されたＳｐｙ０１６７タンパク質を示している。
【図１８Ｂ】図１８は、精製されたタグなしタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。図１８Ａ、レーン：Ａ、Ｓｐｙ０１６７野生型タグなし；Ｂ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌタグなし；分子量マーカー（１１６−６６．２−４５−３５−２５−１８．４−１４．４）；黒色矢印は、変異体クローンおよび野生型クローンから精製されたＳｐｙ０１６７タンパク質を示している。図１８Ｂ、レーンＡ、Ｓｐｙ０１６７野生型タグなし（３μｇ）、レーンＢ、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆタグなし（３μｇ）；分子量マーカー（１１６−６６．２−４５−３５−２５−１８．４−１４．４）；黒色矢印は、変異体クローンおよび野生型クローンから精製されたＳｐｙ０１６７タンパク質を示している。
【図１９】図１９は、精製されたタグなしＳｐｙ０１６７（「ＧＡＳ２５」）野生型タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の顕微鏡写真である。野生型Ｓｐｙ０１６７の様々な精製ロットの試料を、還元条件下および非還元条件下で分析した。
【図２０】図２０は、Ｈｉｓタグ付きＳｐｙ０１６７変異体の溶血試験の結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、抗Ｓｐｙ０１６７抗血清によるＳｐｙ０１６７誘導溶血活性の阻害を示すグラフである。
【図２２】図２２は、Ｓｐｙ０１６７溶血の抗Ｓｐｙ０１６７抗血清阻害の力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を示すグラフである。
【図２３】図２３は、Ｓｐｙ０１６７溶血活性の力価測定を示すグラフである。
【図２４】図２４は、野生型Ｓｐｙ０１６７、化学的に解毒された野生型Ｓｐｙ０１６７、およびＳｐｙ０１６７変異体（Ｐ４２７Ｌ；Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５Ｆ）の溶血活性の力価測定を示すグラフである。
【図２５】図２５は、野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体（Ｐ４２７Ｌ；Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５Ｆ）の溶血活性の力価測定を示すグラフである。
【図２６】図２６は、野生型Ｓｐｙ０１６７および化学的に解毒された野生型Ｓｐｙ０１６７の溶血活性の力価測定を示すグラフである。
【図２７】図２７は、Ｓｐｙ０１６７溶血活性の５０％低下を得るのに必要とされるＳｐｙ０１６７（「ｇａｓ２５」）変異体Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５Ｆに対する抗血清の希釈度を示すグラフである（５０ｎｇ／ｍｌ  Ｓｐｙ０１６７）。
【図２８】図２８は、Ｓｐｙ０１６７溶血活性の５０％低下を得るのに必要とされるＳｐｙ０１６７（「ｇａｓ２５」）変異体Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５Ｆに対する抗血清の希釈度を示すグラフである（１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｐｙ０１６７）。
【図２９】図２９は、溶血阻害アッセイが、１００％溶血を可能にする毒素濃度で行われたことを示す力価測定曲線である。
【図３０】記載なし
【図３１Ａ】図３１Ａ〜ＧＧは、異なる株／Ｍ型由来のＳｐｙ０４１６（「ｇａｓ５７」）抗原のアラインメントを示す。トライアド触媒（Ｄ、Ｈ、Ｓ）は太黒色文字である。図３１Ａ、アミノ酸１〜５０（アミノ酸番号は各図の上に示されている。１０Ａ〜ＧＧは、Ｓｐｙ０４１６Ｍ１＿ＳＦ３７０のアミノ酸配列、配列番号１のことである）。
【図３１Ｂ】図３１Ｂ、アミノ酸５１−１００。
【図３１Ｃ】図３１Ｃ、アミノ酸１０１−１５０。
【図３１Ｄ】図３１Ｄ、アミノ酸１５１−２００。
【図３１Ｅ】図３１Ｅ、アミノ酸２０１−２５０。
【図３１Ｆ】図３１Ｆ、アミノ酸２５１−３００。
【図３１Ｇ】図３１Ｇ、アミノ酸３０１−３５０。
【図３１Ｈ】図３１Ｈ、アミノ酸３５１−４００。
【図３１Ｉ】図３１Ｉ、アミノ酸４０１−４５０。
【図３１Ｊ】図３１Ｊ、アミノ酸４５１−５００。
【図３１Ｋ】図３１Ｋ、アミノ酸５０１−５５０。
【図３１Ｌ】図３１Ｌ、アミノ酸５５１−６００。
【図３１Ｍ】図３１Ｍ、アミノ酸６０１−６５０。
【図３１Ｎ】図３１Ｎ、アミノ酸６５１−７００。
【図３１Ｏ】図３１Ｏ、アミノ酸７０１−７５０。
【図３１Ｐ】図３１Ｐ、アミノ酸７５１−８００。
【図３１Ｑ】図３１Ｑ、アミノ酸８０１−８５０。
【図３１Ｒ】図３１Ｒ、アミノ酸８５１−９００。
【図３１Ｓ】図３１Ｓ、アミノ酸９０１−９５０。
【図３１Ｔ】図３１Ｔ、アミノ酸９５１−１０００。
【図３１Ｕ】図３１Ｕ、アミノ酸１００１−１０５０。
【図３１Ｖ】図３１Ｖ、アミノ酸１０５１−１１００。
【図３１Ｗ】図３１Ｗ、アミノ酸１１０１−１１５０。
【図３１Ｘ】図３１Ｘ、アミノ酸１１５１−１２００。
【図３１Ｙ】図３１Ｙ、アミノ酸１２０１−１２５０。
【図３１Ｚ】図３１Ｚ、アミノ酸１２５１−１３００。
【図３１ＡＡ】図３１ＡＡ、アミノ酸１３０１−１３５０。
【図３１ＢＢ】図３１ＢＢ、アミノ酸１３５１−１４００。
【図３１ＣＣ】図３１ＣＣ、アミノ酸１４０１−１４５０。
【図３１ＤＤ】図３１ＤＤ、アミノ酸１４５１−１５００。
【図３１ＥＥ】図３１ＥＥ、アミノ酸１５０１−１５５０。
【図３１ＦＦ】図３１ＦＦ、アミノ酸１５５１−１６００。
【図３１ＧＧ】図３１ＧＧ、アミノ酸１６０１−１６５０。Ｍ１＿ＳＦ３７０、配列番号１；Ｍ１＿３１０７５、配列番号２；Ｍ１＿３１２３７、配列番号３；Ｍ１＿３３４８、配列番号４；Ｍ２＿３４５８５、配列番号５；Ｍ３，１＿２１３９８、配列番号６；Ｍ４４−６１＿２０８３９、配列番号７；Ｍ６，３１＿２００２２、配列番号８；Ｍ１１＿２０６４８、配列番号９；Ｍ２３＿２０７１、配列番号１０；Ｍ１８，３＿４０１２８、配列番号１１；Ｍ４＿１００９２、配列番号１２；Ｍ４＿３０９６８、配列番号１３；Ｍ６，３１＿２２６９２、配列番号１４；Ｍ６８，５＿２２８１４、配列番号１５；Ｍ６８＿２３６２３、配列番号１６；Ｍ２＿１００６４、配列番号１７；Ｍ２＿１００６５、配列番号１８；Ｍ７７＿１０２５１、配列番号１９；Ｍ７７＿１０５２７、配列番号２０；Ｍ７７＿２０６９６、配列番号２１；Ｍ８９＿２１９１５、配列番号２２；Ｍ８９＿２３７１７、配列番号２３；Ｍ９４＿１０１３４、配列番号２４；Ｍ２８＿１０１６４、配列番号２５；Ｍ２８＿１０２１８、配列番号２６；Ｍ２９＿１０２６６、配列番号２７；Ｍ２８＿１０２９９、配列番号２８；Ｍ２８＿３０１７６、配列番号２９；Ｍ２８＿３０５７４、配列番号３０；Ｍ６，９＿２１８０２、配列番号３１；Ｍ７５＿１００１２、配列番号３２；Ｍ７５＿２０６７１、配列番号３３；Ｍ７５＿３０６０３、配列番号３４；Ｍ７５＿３０２０７、配列番号３５；Ｍ２２＿２０６４１、配列番号３６；Ｍ２２＿２３４６５、配列番号３７；Ｍ３，１＿３０６１０、配列番号３８；Ｍ３，１＿４０６０３、配列番号３９；Ｍ３，２８＿２４２１４、配列番号４０；Ｍ３，３４＿１０３０７、配列番号４１；Ｍ４＿４０４２７、配列番号４２；Ｍ３＿２７２１、配列番号４３；Ｍ１２＿１０２９６、配列番号４４；Ｍ１２＿１００３５、配列番号４５；Ｍ１２＿２００６９、配列番号４６；Ｍ１２＿２２４３２、配列番号４７；Ｍ４＿４０４９９、配列番号４８；およびＭ６，１＿２１２５９、配列番号４９。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜ＧＧは、異なる株／Ｍ型由来のＳｐｙ０２６９（「ｇａｓ４０」）抗原のアラインメントを示す。図３２Ａ、アミノ酸１〜５０（アミノ酸番号は各図の上に示されている。１０Ａ〜ＧＧは、Ｓｐｙ０２６９Ｍ１＿ＳＦ３７０のアミノ酸配列、配列番号５０のことである）。
【図３２Ｂ】図３２Ｂ、アミノ酸５１−１００。
【図３２Ｃ】図３２Ｃ、アミノ酸１０１−１５０。
【図３２Ｄ】図３２Ｄ、アミノ酸１５１−２００。
【図３２Ｅ】図３２Ｅ、アミノ酸２０１−２５０。
【図３２Ｆ】図３２Ｆ、アミノ酸２５１−３００。
【図３２Ｇ】図３２Ｇ、アミノ酸３０１−３５０。
【図３２Ｈ】図３２Ｈ、アミノ酸３５１−４００。
【図３２Ｉ】図３２Ｉ、アミノ酸４０１−４５０。
【図３２Ｊ】図３２Ｊ、アミノ酸４５１−５００。
【図３２Ｋ】図３２Ｋ、アミノ酸５０１−５５０。
【図３２Ｌ】図３２Ｌ、アミノ酸５５１−６００。
【図３２Ｍ】図３２Ｍ、アミノ酸６０１−６５０。
【図３２Ｎ】図３２Ｎ、アミノ酸６５１−７００。
【図３２Ｏ】図３２Ｏ、アミノ酸７０１−７５０。
【図３２Ｐ】図３２Ｐ、アミノ酸７５１−８００。
【図３２Ｑ】図３２Ｑ、アミノ酸８０１−８５０。
【図３２Ｒ】図３２Ｒ、アミノ酸８５１−８７４。Ｍ１＿ＳＦ３７０、配列番号５０；臨床単離物＿４０ｓ８８、配列番号５１；Ｍ１１＿２７２７、配列番号５２；Ｍ２２＿２０６４１、配列番号５３；Ｍ２２＿２３４６５、配列番号５４；Ｍ２２＿２３６２１、配列番号５５；Ｍ３．１＿３０６１０、配列番号５６；Ｍ３．１＿４０６０３、配列番号５７；Ｍ３．３４＿１０３０７、配列番号５８；Ｍ３＿ＭＧＡＳ３１５、配列番号５９；Ｍ４＿４０４２７、配列番号６０；Ｍ３＿２７２１、配列番号６１；Ｍ３＿３０４０、配列番号６２；Ｍ３＿３１３５、配列番号６３；Ｍ１２＿１００３５、配列番号６４；Ｍ１２＿２２４３２、配列番号６５；Ｍ４＿４０４９９、配列番号６６；Ｍ７８＿３７８９、配列番号６７；Ｍ８９＿１００７０、配列番号６８；Ｍ８９＿２１９１５、配列番号６９；Ｍ８９＿２３７１７、配列番号７０；Ｍ８９＿５４７６、配列番号７１；Ｍ２３＿ＤＳＭ２０７１、配列番号７２；Ｍ４＿２７２２、配列番号７３；Ｍ４＿１００９２、配列番号７４；Ｍ４＿３０９６８、配列番号７５；Ｍ４＿２６３４、配列番号７６；Ｍ２８＿１０１６４、配列番号７７；Ｍ２８＿１０２１８、配列番号７８；Ｍ２８＿１０２６６、配列番号７９；Ｍ２８＿１０２９９、配列番号８０；Ｍ２８＿３０１７６、配列番号８１；Ｍ２８＿４４３６、配列番号８２；Ｍ８＿２７２５、配列番号８３；Ｍ４４＿３７７６、配列番号８４；Ｍ６＿２７２４、配列番号８５；Ｍ６＿２８９４、配列番号８６；Ｍ６＿３６５０、配列番号８７；Ｍ６＿５５２９、配列番号８８；Ｍ５、配列番号８９；Ｍ７７＿４９５９、配列番号９０；Ｍ２＿１００６４、配列番号９１；Ｍ２＿１００６５、配列番号９２；Ｍ７５＿５５３１、配列番号９３；Ｍ５０＿４５３８、配列番号９４；Ｍ６２＿５４５５、配列番号９５；Ｍ４４＿５４８１、配列番号９６；Ｍ５＿４８８３、配列番号９７；Ｍ９？＿２７２０、配列番号９８；Ｍ２＿２７２６、配列番号９９；Ｍ１２＿２０２９６、配列番号１００；Ｍ１＿２５８０、配列番号１０１；Ｍ１＿２９１３、配列番号１０２；Ｍ１＿３２８０、配列番号１０３；Ｍ１＿３３４８、配列番号１０４；Ｍ７８＿３７８９、配列番号１０５；Ｍ？＿２７１９、配列番号１０６。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜Ｃは、異なる株／Ｍ型由来のＳｐｙ０１６７（「ｇａｓ２５」）抗原のアラインメントを示す。図３３Ａ、アミノ酸１〜１５０（アミノ酸番号は各図の上に示されている。１０Ａ〜ＧＧは、Ｓｐｙ０１６７Ｍ１＿ＳＦ３７０のアミノ酸配列、配列番号１０７のことである）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂ、アミノ酸１５１−３００
【図３３Ｃ】図３３Ｃ、アミノ酸３０１−５００。Ｍ１２＿２０９６、配列番号１０８；Ｍ１２＿９４２９、配列番号１０９；Ｍ１＿５００５、配列番号１１０；Ｍ１＿３３４８、配列番号１１１；Ｍ２＿１０２７０、配列番号１１２；Ｍ２８＿６１８０、配列番号１３；Ｍ６＿１０３９４、配列番号１１４；Ｍ１８＿８２３２、配列番号１１５；Ｍ５＿Ｍａｎｆｒｅｄｏ、配列番号１１６；Ｍ３＿３１５、配列番号１１７；Ｍ３＿ＳＳＩ、配列番号１１９；Ｍ４＿１０７５０、配列番号１１９。
【図３４】図３４は、抗複合糖質（ＧＣ）抗体がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの死滅を媒介することを示す全血殺菌アッセイの結果を示すグラフである。
【図３５】図３５は、抗複合糖質（ＧＣ）抗体とＧＡＳ抗原組み合わせに対して産生された抗体の組み合わせがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの死滅を増強することを示す全血殺菌アッセイの結果を示すグラフである。「フロイント」、フロイントアジュバント；「Ｍ１」、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１タンパク質；「ＣＯＭＢＯ」、Ｓｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ５、および野生型Ｓｐｙ０２６９；「ＧＣ」、ＣＲＭ１９７に結合体化されたＧＡＳ多糖抗原。
【図３６】図３６Ａ〜Ｄは、様々な抗原をポジティブ（腫瘍壊死因子α、ＴＮＦ−α）およびネガティブ（ＮＴ、無処理）コントロールと比較する細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。図３６Ａ、Ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０、配列番号１７７）；図３６Ｂ、Ｓｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７）およびＧＡＳ５７変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（ＧＡＳ５７  ＤＭ、配列番号１９８）；図３６Ｃ、Ｓｐｙ０１６７（ＧＡＳ２５）およびＧＡＳ２５変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（ＧＡＳ２５  ＤＭ、配列番号１２５）；図３６Ｄ、複合糖質（ＧＣ）。
【図３７】図３７Ａ〜Ｄは、ＥＬＩＳＡアッセイの妥当性確認を示すグラフである。図３７Ａ、Ｓｐｙ０１６７（ＧＡＳ２５）；図３７Ｂ、Ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０）；図３７Ｃ、Ｓｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７）；図３７Ｄ、複合糖質（ＧＣ）。
【図３８】図３８Ａ〜Ｆは、個々の抗原の用量を試験するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。図３８Ａ、３８Ｄ、Ｓｐｙ０１６７（ＧＡＳ２５）の２実験；図３８Ｂ、３８Ｅ、Ｓｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７）（２実験）；図３８Ｃ、３８Ｆ、Ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０）（２実験）。「ＧＭＴ」、幾何平均力価。
【図３９】図３９は、ミョウバン中でのＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（ＧＡＳ５７）、野生型Ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０）、およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（ＧＡＳ２５）の用量範囲の組み合わせを試験するＥＬＩＳＡおよびチャレンジアッセイの結果を示すグラフである。
【図４０】図４０は、平均生存時間（ＭＳＴ；Ｍｕ）分析の第１近似として採用される対数正規モデルの分析であり、ＭｕがＳｐｙ０１６７（ＧＡＳ２５）の用量の減少と共に減少することを示している。
【図４１】図４１Ａ〜Ｂは、Ｓｐｙ０４１９およびＳｐｙ０１６７に対する抗体が毒性活性を遮断することを示す棒グラフである。図４１Ａ、Ｓｐｙ０４１９（ＧＡＳ５７）。図４１Ｂ、Ｓｐｙ０１６７（ｇａｓ２５）。力価は最大溶血の５０％を中和するのに必要とされる希釈率として定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の組成物は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を予防および／または処置するのに有用である。本発明の組成物は、ＧＡＳ抗原の組み合わせ、ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子の組み合わせ、またはＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む。本発明の組成物は、２つまたはそれを超えるＧＡＳ抗原の組み合わせ、ＧＡＳ抗原をコードする１つもしくは複数の核酸分子の組み合わせ、またはＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む。ＧＡＳ抗原はＧＡＳタンパク質抗原である。「ＧＡＳタンパク質抗原」は、異なって定義されない限り、完全長ＧＡＳタンパク質の他に下に記載されるＧＡＳタンパク質のフラグメント、融合体および変異体を包含する。いくつかの組成物は、下に定義されるＡ群多糖抗原をさらに含む。本発明は、ＧＡＳ抗原の組み合わせ、ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子の組み合わせ、およびＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせの混合物を含む組成物も含む。
【０００７】
本発明の組成物は、好ましくは、以下の特性：すなわち、
・１つまたは複数のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株（例えば、Ｍ１  ３３４８、Ｍ１２ＥＭ５、Ｍ２３  ２０７１、Ｍ６  Ｓ４３）に対する統計的に有意な防御を与える；
・インビトロの細菌死滅（オプソニン作用性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）死滅）を媒介する抗体を誘発する；
・ストレプトリジンＯ溶血活性を不活化する抗体を誘発する；
・Ｓｐｙ０４１６プロテアーゼ活性を遮断する抗体を誘発する；ならびに／または
・細胞接着および／もしくは細胞分裂を妨げる抗体を誘発する；
のうちの１つまたは複数を有する。
【０００８】
下の実施例に記載されているように、本発明の組成物は、致死的チャレンジモデルにおいて異なるマウス適応Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株に対する防御を提供し；大多数のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株により発現される強力な毒素を中和する機能的抗体を誘発し；インビトロで細菌死滅を媒介する。
【０００９】
本発明のいくつかの組成物は、Ｓｐｙ０１６７（ストレプトリジンＯ、Ｓｐｙ０１６７、または「ＧＡＳ２５」とも呼ばれる）；Ｓｐｙ０２６９（「ＧＡＳ４０」とも呼ばれる）；Ｓｐｙ０４１６（「ＧＡＳ５７」とも呼ばれる）；Ｓｐｙ０７１４（「ＧＡＳ６７」とも呼ばれる）；Ｓｐｙ１３９０（「ＧＡＳ８９」とも呼ばれる）；Ｓｐｙ２０００（「ＧＡＳ１００」とも呼ばれる）；下に定義される変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；および下に定義される変異体Ｓｐｙ０４１６から選択される３つまたはそれを超える異なるＧＡＳ抗原の組み合わせを含む。
【００１０】
他の実施形態では、本発明の組成物は、２つのＧＡＳ抗原のみを含むが、前記組成物は、下に記載されるような、他の生物および他の成分由来の抗原を含みうる。いくつかの組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ０１６７ならびにＳｐｙ０２６９；Ｓｐｙ０４１６；下に記載されている変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質；下に記載されている変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質；Ｓｐｙ０７１４；Ｓｐｙ１３９０；およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１１】
他の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ０２６９ならびにＳｐｙ０１６７、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１２】
一部の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ０４１６ならびにＳｐｙ０１６７、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１３】
他の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質ならびにＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１４】
他の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質ならびにＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１５】
一部の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ０７１４ならびにＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１６】
一部の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ１３９０ならびにＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、およびＳｐｙ２０００からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１７】
他の組成物は、前記２つのＧＡＳ抗原として、Ｓｐｙ２０００ならびにＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質、変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質、Ｓｐｙ０７１４、およびＳｐｙ１３９０からなる群より選択される第２のＧＡＳ抗原を含む。
【００１８】
本発明の組成物に含めることが可能な他のＧＡＳ抗原には
【００１９】
【化１】
2015038156.tif 000004
が挙げられる。
【００２０】
ＧＡＳ抗原の好ましい組み合わせには以下の
ｉ．Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０２６９；
ｉｉ．Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６；
ｉｉｉ．Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０４１６；
ｉｖ．Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０２６９；
ｖ．Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６；
ｖｉ．Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０４１６；
ｖｉｉ．Ｓｐｙ０２６９およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；
ｖｉｉｉ．Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；
ｉｘ．Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；
ｘ．Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ；および
ｘｉ．Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ
が挙げられ、そのそれぞれが、下に記載されるＧＡＳ多糖抗原および／またはミョウバンなどのアジュバントも含み得る。
【００２１】
組成物は、例えば、薬学的に許容されるビヒクル、他の微生物の抗原、アジュバントなどの他の成分を含有することができる。特に、本明細書に記載される組成物はいずれも、下に記載されるＡ群多糖抗原および／またはミョウバンなどのアジュバントもさらに含み得る。
【００２２】
ＧＡＳ  Ｍ型とＧＡＳ株単離物との間で、野生型ＧＡＳ抗原中で変動が存在するために、本明細書におけるＧＡＳアミノ酸またはポリヌクレオチド配列への言及は、典型的には保存的アミノ酸置換により、それとある程度の配列同一性を有する対応するアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を含む（実施例３０および図３１〜３３参照）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、Ｓｐｙ２０００の改変体および開示されたその変異体は、それぞれ本明細書において開示されているＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、Ｓｐｙ２０００アミノ酸配列の任意のものと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。典型的には、ＧＡＳ抗原のアミノ酸配列とＧＡＳ抗原の改変体のアミノ酸配列との間のどの相違も１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によるものである。例えば、図３１に示されるように、１つ、２つ、または３つのアミノ酸欠失もありうる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は化学的特性に基づいており、正電荷のアミノ酸での別の正電荷のアミノ酸の（例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒ）；負電荷のアミノ酸での別の負電荷のアミノ酸の（例えば、Ｄ、Ｅ）；非常に疎水性のアミノ酸での別の非常に疎水性のアミノ酸の（例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ）；疎水性が低いアミノ酸での別の疎水性が低いアミノ酸の（例えば、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）；部分的に疎水性のアミノ酸での別の部分的に疎水性のアミノ酸の（例えば、Ｋ、Ｒ）；脂肪族アミノ酸での別の脂肪族アミノ酸の（例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ）；極性アミノ酸での別の極性アミノ酸の（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）；芳香族アミノ酸での別の芳香族アミノ酸の（例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）；および小アミノ酸での別の小アミノ酸の（例えば、Ｄ、Ｎ、Ｔ）置換が含まれる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルを使用して決定される。ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルは、タンパク質配列セグメントの約２０００の局所的マルチプルアラインメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであり、関連するタンパク質の５００を超える群の高度に保存された領域を表す（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５、１９９２年）。ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を使用して、Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００抗原のアミノ酸配列に導入されうる保存的アミノ酸置換を定義することができる。これらの実施形態では、保存的置換とは、好ましくは−１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換のことである。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられるならば、保存的である。このシステムに従えば、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも１（例えば、１、２、または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられ、さらに好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられる。
【００２６】
特定のアミノ酸置換または変化は、野生型Ｓｐｙ０４１６では図３１、野生型Ｓｐｙ０２６９では図３２、および野生型Ｓｐｙ０１６７では図３３に示されているように様々なＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、Ｓｐｙ０７１４、Ｓｐｙ１３９０、およびＳｐｙ２０００アミノ酸配列を整列させることにより同定することができる。例えば、図３１のアラインメントに基づいて、表１は、配列番号１に示されるＳｐｙ０４１６アミノ酸配列に関して特定のアミノ酸位置でのいくつかの特定の選択肢を示している。同様に、Ｓｐｙ０２６９およびＳｐｙ０１６７のアミノ酸配列におけるアミノ酸バリエーションの選択肢は、それぞれ図３２および３３を精査することにより同定することができる。
【００２７】
【表１】
2015038156.tif 000005
下に記載されるＧＡＳ抗原の改変体は、好ましくは免疫原性であり、マウスモデルにおけるＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与える（下の実施例参照）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、上に開示されているＧＡＳタンパク質抗原をコードする１つまたは複数の核酸分子を含む。他の実施形態では、組成物は、２つのＧＡＳタンパク質抗原をコードする２以下の核酸分子を含む。他の実施形態では、組成物は、抗体の組み合わせを含み、各抗体は上に開示されるＧＡＳタンパク質抗原から選択されるＧＡＳ抗原に選択的に結合する。
【００２９】
Ｓｐｙ０１６７およびその免疫原性変異体
Ｓｐｙ０１６７（ストレプトリジン、ＳＬＯ、ＧＡＳ２５）は、宿主細胞溶解を誘導する強力なポア形成毒素であり、なかでもＷＯ０２／３４７７１に記載されている。野生型Ｓｐｙ０１６７のアミノ酸配列は配列番号１０７〜１１９に示されている。異なって定義されない限り、「Ｓｐｙ０１６７抗原」は、下に記載されるように完全長Ｓｐｙ０１６７ならびにＳｐｙ０１６７変異体、フラグメントおよび融合体を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、基本的にアミノ酸配列配列番号１７４（「ペプチド１」）、アミノ酸配列配列番号１７５（「ペプチド２」）、またはアミノ酸配列配列番号１７６（「ペプチド３」）からなる。いくつかの実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、基本的にＮからＣ末端まで、アミノ酸配列配列番号１７５（「ペプチド２」）およびアミノ酸配列配列番号１７５に共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７６（「ペプチド３」）からなる。本明細書で使用される「共有結合している」は、直接共有結合および１つまたは複数の追加のアミノ酸を介する結合を含む。他の実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、基本的にＮからＣ末端まで、アミノ酸配列配列番号１７４；アミノ酸配列配列番号１７４に共有結合しているグリシン残基；前記グリシンに共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７５；およびアミノ酸配列配列番号１７５に共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７６からなる。
【００３１】
他のＳｐｙ０１６７抗原は、完全長Ｓｐｙ０１６７より少なくとも１アミノ酸少ないＳｐｙ０１６７のフラグメントである。好ましくは、前記フラグメントは、特異的抗体に結合する能力などの抗原の免疫学的特性を保持している。好ましいアミノ酸フラグメントは、７つまたはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上）のアミノ酸を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、アミノ酸配列配列番号１７４を含むモノマーである。他の実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、ＮからＣ末端まで、アミノ酸配列配列番号１７５およびアミノ酸配列配列番号１７５に共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７６を含むモノマーである。他の実施形態では、Ｓｐｙ０１６７抗原は、ＮからＣ末端まで、アミノ酸配列配列番号１７４；アミノ酸配列配列番号１７４に共有結合しているグリシン残基；前記グリシンに共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７５、およびアミノ酸配列配列番号１７５に共有結合しているアミノ酸配列配列番号１７６を含むモノマーである。
【００３３】
融合タンパク質
上で開示されるように、本発明で使用されるＳｐｙ０１６７抗原は、個々の別々のポリペプチド（例えば、「ペプチド１」、「ペプチド２」、「ペプチド３」、「ペプチド１＋２＋３」、「ペプチド２＋３」）として組成物中に存在してよいが、少なくとも２つ（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の抗原が単一のポリペプチド鎖（「融合タンパク質」または「ハイブリッドポリペプチド」）として発現される実施形態もある。ハイブリッドポリペプチドは２つの主要な利点を提供する。第１に、それだけでは不安定かまたは発現が不十分であり得るポリペプチドを、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを加えることにより支援することができる。第２に、両方とも抗原的に有用である２つのポリペプチドを作製するために１つの発現および精製のみを用いればよいので、商業的生産は簡素化される。
【００３４】
Ｓｐｙ０１６７の変異体形態
変異体形態のＳｐｙ０１６７は、溶血アッセイにより決定される場合、野生型Ｓｐｙ０１６７と比べて、野生型Ｓｐｙ０１６７より溶血活性が少なくとも５０％（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）低い（例えば、実施例１参照）が、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を提供する（実施例４、７、８参照）。Ｓｐｙ０１６７変異体は、配列番号１０７に示される野生型Ｓｐｙ０１６７配列に従って番号付けされたアミノ酸Ｐ４２７、Ｗ５３５、Ｃ５３０、Ａ２４８、およびＤ４８２のうちの１つまたは複数にアミノ酸変化（すなわち、置換、欠失、または挿入）を有する変異体を含む。かかる変異体の例にはＰ４２７Ｌ（配列番号１２０）、Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２１）、Ｃ５３０Ｇ（配列番号１２２）、ΔＡ２４８（配列番号１２３）、Ｗ５３５Ｆ／Ｄ４８２Ｎ（配列番号１２４）、Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、Ｐ４２７Ｌ／Ｃ５３０Ｇ（配列番号１２６）、およびＰ４２７Ｌ／Ｃ５３０Ｇ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２７）が挙げられる。
【００３５】
本発明において使用するためのＳｐｙ０１６７変異体は、Ｐ４２７位、Ｗ５３５位、Ｃ５３０位、Ａ２４８位、および／またはＤ４８２位に単一、二重、または三重アミノ酸変化を含む（「単一変異体」、「二重変異体」、「三重変異体」）。したがって、Ｓｐｙ０１６７変異体は、以下の：
【００３６】
【化２】
2015038156.tif 000006
【００３７】
【化３】
2015038156.tif 000007
などのその組み合わせを、含むことができる。
【００３８】
変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質は、上で開示される変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質および別のＧＡＳ抗原を含む融合ポリペプチドも含む。ＧＡＳ抗原は、例えば、ＷＯ０２／３４７７１に開示されており、
【００３９】
【化４】
2015038156.tif 000008
ならびに下の表Ａ〜Ｄに収載されている他の抗原を含むが、これらに限定されない。これらの抗原についてのｇｉ数は、利用可能な場合は、Ｍ１株に関するものであるが、他のＭ株由来の等価のタンパク質も使用してよいことは認識される。
【００４０】
本発明に従う好ましいＳｐｙ０１６７抗原は免疫原性であるが毒性はない。本明細書で使用される「毒性はない」は、Ｓｐｙ０１６７抗原がコレステロールに結合することができない、またはオリゴマーを形成することができない、さらに一般的には、コレステロール含有膜の溶解を促進しないことを意味する。Ｓｐｙ０１６７タンパク質は、例えば、チオール活性化細胞溶解毒についてのサインパターン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐａｔｔｅｒｎ）として使用することが可能なＳｐｙ０１６７のＣ末端部分の高度に保存された領域に位置する、少なくとも単一のシステイン残基を欠失させることにより非毒性にすることができる。
【００４１】
本発明の組成物は、単一のポリペプチドであり、溶血アッセイにより決定される場合、野生型Ｓｐｙ０１６７と比べて、溶血活性が野生型Ｓｐｙ０１６７よりも少なくとも５０％（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）低く、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与えるＳｐｙ０１６７変異体の等価物も含むことができる。かかる等価物は、ＮまたはＣ末端での最大約４０個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸）の欠失を含む、Ｐ４２７、Ｗ５３５、Ｃ５３０、Ａ２４８、およびＤ４８２以外の位置にアミノ酸欠失、挿入、および／または置換のある変異体Ｓｐｙ０１６７抗原を含み得る。
【００４２】
Ｓｐｙ０２６９
ＧＡＳ４０は、「Ｓｐｙ０２６９」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０１９７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２５６」（Ｍ１８）および「ｐｒｇＡ」としても知られるが、例えば、ＷＯ０２／３４７７１におよびＷＯ２００５／０３２５８２に記載されている。野生型Ｓｐｙ０２６９のアミノ酸配列は、配列番号５０〜１０６および１２８〜１３０に提供されている。Ｓｐｙ０２６９抗原は、Ｓｐｙ０２６９タンパク質が多くのＭ型でもこれらのＭ型の複数の株でも高度に保存されているために本発明の組成物において特に有用である（ＷＯ２００６／０４２０２７参照）。Ｓｐｙ０２６９は、全身免疫化およびチャレンジおよび殺菌抗体の誘導の動物モデルにおいて一貫して防御を与える。
【００４３】
Ｓｐｙ０２６９タンパク質は、典型的にはリーダーペプチド配列（例えば、配列番号５０のアミノ酸１〜２６）、第１コイルドコイル領域（例えば、配列番号５０のアミノ酸５８〜２６１）、第２コイルドコイル領域（例えば、配列番号５０のアミノ酸５５６〜７３３）、ロイシンジッパー領域（例えば、配列番号５０のアミノ酸６７３〜７０１）および膜貫通領域（例えば、配列番号５０のアミノ酸８５５〜８６６）を含有する。いくつかの実施形態では、リーダー配列は除かれる（例えば、配列番号１７７）。
【００４４】
本発明の組成物は、Ｓｐｙ０２６９の等価物（これは、単一のポリペプチドであり、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を提供する）も含むことができる（例えば、実施例４、７、８）。
【００４５】
Ｓｐｙ０４１６およびその免疫原性変異体
Ｓｐｙ０４１６（Ｍ１）は、「ＧＡＳ５７」、「ＳｐｙＭ３＿０２９８」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０４６４」（Ｍ１８）、および「ｐｒｔＳ」とも呼ばれる。Ｓｐｙ０４１６は推定上の細胞エンベローププロテイナーゼとして同定された。ＷＯ０２／３４７７１およびＵＳ２００６／０２５８８４９を参照のこと。１７の異なるＭ型（１、２、３、４、６、１１、１２、１８、２２、２３、２８、４４／６１、６８、７５、７７、８９、９４）由来の４９のＳｐｙ０４１６配列があり、疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）によれば、１７の異なるＭ型が米国での咽頭炎症例の９５％超を占め、侵襲性ＧＡＳ単離物の約６８％を占める。様々なＭ型由来の野生型Ｓｐｙ０４１６抗原のアミノ酸配列は、配列番号１〜４９として配列表に記載されている。本発明の組成物は、Ｓｐｙ０４１６の等価物（これは、単一のポリペプチドであり、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与える）も含むことができる。
【００４６】
本発明に従う変異体Ｓｐｙ０４１６抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡのどちらかにより決定される場合、野生型Ｓｐｙ０４１６に比べて、インターロイキン８（ＩＬ−８）に対して少なくとも５０％（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）低下したタンパク質分解活性を有する（実施例３参照）が、免疫原性であり、例えば、マウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与える。好ましくは、本発明の変異体Ｓｐｙ０４１６はまた、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα（例えば、配列番号１３１）、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ（例えば、配列番号１３２）、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ（例えば、配列番号１３３）、ＣＸＣＬ４（例えば、配列番号１３４）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α（例えば、配列番号１３５）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１β（例えば、配列番号１３６）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１γ（例えば、配列番号１３７）、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ７８（例えば、配列番号１３８）、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２（例えば、配列番号１３９）、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２（例えば、配列番号１４０）、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（例えば、配列番号１４１）、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０（例えば、配列番号１４２）、ＣＸＣＬ１１（例えば、配列番号１４３）、ＣＸＣＬ１３（例えば、配列番号１４４）、ＣＸＣＬ１４（例えば、配列番号１４５）、およびＣＸＣＬ１６（例えば、配列番号１４６）などの他のヒトサイトカインも切断しない。
【００４７】
本発明に有用なＳｐｙ０４１６変異体は、Ｄ１５１位、Ｈ２７９位、および／またはＳ６１７位に単一、二重、または三重アミノ酸変化（「単一変異体」、「二重変異体」、「三重変異体」）を含む、配列番号１に示される野生型Ｓｐｙ０４１６配列に従って番号付けされたアミノ酸Ｄ１５１、Ｈ２７９、またはＳ６１７のうちの１つまたは複数にアミノ酸変化（すなわち、置換、欠失または挿入）のある変異体を含む。したがって、Ｓｐｙ０４１６変異体は、以下の
【００４８】
【化５】
2015038156.tif 000009
などのその組み合わせ、を含むことができる。
【００４９】
本発明のＳｐｙ０４１６変異体抗原は、上に開示されるＳｐｙ０４１６変異体抗原および別のＧＡＳ抗原を含む融合ポリペプチドも含む。ＧＡＳ抗原は、例えばＷＯ０２／３４７７１に開示されており、
【００５０】
【化６】
2015038156.tif 000010
【００５１】
【化７】
2015038156.tif 000011
、または下の表Ａ〜Ｄに開示されている他の抗原のすべてもしくは一部を含むが、これらに限定されない。これらの抗原についてのｇｉ数は、利用可能な場合は、Ｍ１株に関するものであるが、他のＭ株由来の等価のタンパク質も使用してよいことは認識される。
【００５２】
本発明は、Ｓｐｙ０４１６変異体の等価物（これは、単一のポリペプチドであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡにより決定される場合ＩＬ−８を切断せず、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与える）も含む（例えば、実施例４、７，８）。かかる等価物は、Ｄ１５１、Ｈ２７９、またはＳ６１７以外の位置に、ＮまたはＣ末端での最大約４０個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸）の欠失を含む、アミノ酸欠失、挿入、および／または置換のある変異体Ｓｐｙ０４１６抗原を含み得る。
【００５３】
他のＧＡＳ抗原
１つまたは複数の他のＧＡＳ抗原は、本発明の組成物に含めることができる。ＧＡＳ抗原は、例えば、ＷＯ０２／３４７７１に開示されている。有用なＧＡＳ抗原は、
【００５４】
【化８】
2015038156.tif 000012
のすべてまたは一部を含む。本発明の組成物は、これらのＧＡＳ抗原の等価物（これは、単一のポリペプチドであり、免疫原性であり、好ましくはマウスモデルにおいてＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与える）も含むことができる（例えば、実施例４、７、８）。例えば、Ｓｐｙ０７６３（ＧＡＳ１４６）およびＳｐｙ１１３４（ＧＡＳ５６１）のそれぞれが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１  ３３４８を用いたチャレンジからマウスを防御する（ネガティブコントロールの２０％生存と比べて７０％生存；ｎ＝２０）。下の表Ａ〜Ｄも参照のこと。
【表Ａ】
2015038156.tif 000013
【００５５】
【表Ｂ】
2015038156.tif 000014
【００５６】
【表Ｃ】
2015038156.tif 000015
【００５７】
【表Ｄ】
2015038156.tif 000016
【００５８】
フラグメント
上に記載される野生型または変異体ＧＡＳタンパク質のフラグメントの長さは、特定のＧＡＳ抗原またはその変異体のアミノ酸配列に応じて変わり得るが、前記フラグメントは、好ましくは少なくとも７個の連続アミノ酸、例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００個またはそれを超える連続アミノ酸であり、完全長野生型または変異体ＧＡＳタンパク質よりアミノ酸１個が少ないものまでである。好ましくは、前記フラグメントは免疫原性であり、前記配列由来の１つまたは複数のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントには、（１）各同定されたＧＡＳタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、（２）そのＮ末端シグナルペプチドがない同定されたＧＡＳタンパク質、および（３）最大１０個のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれを超える）がＮ末端および／またはＣ末端から欠失している（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基が欠失し得る）各同定されたＧＡＳタンパク質が挙げられる。他のフラグメントは、前記タンパク質の１つまたは複数のドメインを脱落させている（例えば、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの脱落）。いくつかの実施形態では、前記フラグメントは、Ｓｐｙ０２６９のアミノ酸３３〜３２４である。
【００５９】
ＧＡＳ多糖抗原
ＧＡＳ多糖（ＰＳ）は、すべてのＧＡＳ菌株に存在する細胞壁多糖である。ＰＳに対する抗体力価は、子供において疾患およびコロニー形成に逆相関する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はＧＡＳ多糖抗原を含む。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＧＡＳ炭水化物は、典型的には、交互のアルファ（１→２）およびアルファ（１→３）結合からなるＬ−ラムノピラノース（Ｒｈａｐ）骨格ならびに一つおきのラムノース環にベータ（１→３）結合しているＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃｐＮＡｃ）残基を有する分岐構造を特色とする（Ｋｒｅｉｓら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １７巻、１１７〜３０頁、１９９５年）。本発明の組成物に有用なＧＡＳ多糖抗原は、式：
【００６０】
【化９】
2015038156.tif 000017
を有し、式中、Ｒは末端還元Ｌ−ラムノースまたはＤ−ＧｌｃｐＮＡｃであり、ｎは約３から約３０までの数である。
【００６１】
本発明に従って使用されるＧＡＳ多糖抗原は、天然に存在する実質的に完全長のＧＡＳ炭水化物でもよく、天然の長さよりも短くてもよい。完全長多糖を、例えば、弱酸性での加水分解により、加熱により、サイジングクロマトグラフィーにより、等で脱重合して、本発明で使用のためのより短フラグメントを与えることができる。しかし、実質的に完全長の糖類を使用するのが好ましい。特に、約１０ｋＤａの分子量を有する糖類を使用するのが好ましい。分子量は、デキストラン標準と比べてゲル濾過により測定することができる。
【００６２】
糖類は天然に存在するＧＡＳ炭水化物と比べて化学的に修飾され得る。例えば、脱Ｎアセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎプロピオネート化（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的にまたは完全に）等をされ得る。例えば、免疫原性に対する脱アセチル化、等の効果は、常用のアッセイにより評価することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＧＡＳ多糖抗原は、変異させたジフテリア毒素ＣＲＭ１９７などの担体（および下に記載される他の担体）に結合体化される。下の実施例に記載されているように、ＣＲＭ１９７（「ＧＣ」）と結合体化されたＰＳに対する抗体は、ＧＡＳオプソニン作用性死滅を誘導する。
【００６４】
ＧＡＳタンパク質抗原の生成
組換え産生
遺伝暗号の重複性は周知である。したがって、本明細書に記載されるＧＡＳ抗原のうちの１つをコードする任意の核酸分子（ポリヌクレオチド）を用いて、そのタンパク質を組換えで産生することができる。野生型ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子はまた、標準核酸精製技術を用いて適当なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌から単離することができ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅技術を用いて、もしくは自動合成機を用いることによって、合成することができる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．２１５巻、２２３頁、１９８０年；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．２２５巻、２３２頁、１９８０年；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｕｒｅ  ３１０巻、１０５〜１１頁、１９８４年；Ｇｒａｎｔｈａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９巻、ｒ４３〜ｒ７４頁、１９８１年参照。
【００６５】
ｃＤＮＡ分子を、テンプレートとしてｍＲＮＡを使用した標準的な分子生物学技術を使用して作製することができる。その後、ｃＤＮＡ分子を、当該分野で周知の分子生物学技術を使用して複製することができる。テンプレートとしてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを使用したＰＣＲなどの増幅技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドの更なる複製を得ることができる。
【００６６】
所望により、当該分野で一般的に知られている方法を使用してポリヌクレオチドを操作して、種々の理由で抗原コード配列を変化させることができる（ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変更が含まれるが、これらに限定されない）。遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化およびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャフリングを使用して、ヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、部位特異的変異誘発を使用して、新規の制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先度の変化、スプライス改変体の産生、および変異の導入などを行うことができる。
【００６７】
配列修飾（精製タグ配列の付加またはコドン至適化など）を使用して、発現を容易にすることができる。例えば、Ｎ末端リーダー配列を、タグタンパク質（ポリヒスチジン（「ＨＩＳ」）またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）など）をコードする配列と置換することができる。かかるタグタンパク質を使用して、発現タンパク質の精製、検出、および安定性を促進することができる。特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを選択して、タンパク質発現率を増大させ、または所望の性質（天然に存在する配列から生成した転写物よりも長い半減期など）を有するＲＮＡ転写物を産生することができる。これらの方法は当該分野で周知であり、ＷＯ０５／０３２５８２号にさらに記載されている。
【００６８】
発現ベクター
本発明で使用するためのＧＡＳ抗原をコードする核酸分子を、挿入するコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、コード配列ならびに適切な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。
【００６９】
宿主細胞
ＧＡＳ抗原を産生するための宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。大腸菌は好ましい宿主細胞であるが、他の適切な宿主には、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、枯草菌、コレラ菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・シネレア、マイコバクテリア属（例えば、結核菌）、酵母、バキュロウイルス、哺乳動物細胞などが含まれる。
【００７０】
宿主細胞株を、所望の様式で挿入配列の発現を調整する、または発現ポリペプチドをプロセシングする能力について選択することができる。かかるポリペプチド修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入、折り畳み、および／または機能を促進することもできる。翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有する異なる宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から利用可能であり、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングが確実になるように選択することができる。ＷＯ０１／９８３４０号を参照のこと。
【００７１】
十分に確立された技術（トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸またはカプセル化した核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡコーティングラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」法、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウム媒介トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、発現構築物を宿主細胞に導入することができる。
【００７２】
発現ベクターを使用して形質転換された宿主細胞を、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養することができる。形質転換された細胞によって産生されたタンパク質を、使用したヌクレオチド配列および／または発現ベクターに応じて分泌し、または細胞内に含めることができる。当業者は、原核細胞膜または真核細胞膜を介した可溶性抗原の分泌を指示するシグナル配列を含むように発現ベクターをデザインすることができることを理解している。
【００７３】
精製
シグナル輸出（ｅｘｐｏｒｔ）配列は、組換え産生されるＧＡＳ抗原に含められ得、その結果、抗原は、公知の方法を使用して細胞培養培地から精製され得る。あるいは、組換え産生されるＧＡＳ抗原を、操作した宿主細胞から単離することができ、当該分野で周知の方法を使用して、細胞中の他の成分（タンパク質、炭水化物、または脂質など）から分離し得る。かかる方法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製ＧＡＳ抗原の調製物の純度は少なくとも８０％であり、好ましくは、調製物の純度は、９０％、９５％、または９９％である。調製物の純度を、当該分野で公知の任意の手段（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＲＰ−ＨＰＬＣ分析など）によって評価することができる。適切な場合には、変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質を、例えば、尿素を使用して可溶化することができる。
【００７４】
化学合成
ＧＡＳ抗原を、例えば、固相技術を使用して合成することができる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９  ５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，２０２  ０４，１９９５を参照のこと。手動技術の使用または自動化によりタンパク質合成を行うことができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化された合成を行うことができる。任意選択的に、ＧＡＳ抗原のフラグメントを個別に合成し、化学的方法を使用して合わせて全長分子を産生することができる。
【００７５】
抗体
本発明のいくつかの組成物は、本明細書に記載されるＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体の組み合わせを含む。抗体は、免疫化学的アッセイにおいて使用したときに、別のタンパク質による検出シグナルの少なくとも５倍、１０倍または２０倍の高い検出シグナルを与える場合、ＧＡＳ抗原に「特異的に結合する」。好ましくは、ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、溶液からＧＡＳ抗原を免疫沈降することができる。
【００７６】
用語「抗体」には、インタクトな免疫グロブリン分子、および抗原に結合することができるそのフラグメントが含まれる。これらには、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−９９，１９９１；米国特許第４，８１６，５６７号）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメントならびにＦｖ分子；非共有結合性ヘテロ二量体（例えば、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９，２６５９−６２，１９７２；Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９，４０９１−９６，１９８０）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，５８９７−８３，１９８８）；二量体および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（例えば、Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１，１５７９−８４，１９９２；Ｃｕｍｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ，１２０−２６，１９９２）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−３６，１９８８；および１９９４年９月２１日公開の英国特許出願番号ＧＢ２，２７６，１６９号）；およびかかる分子から得た任意の機能的フラグメントならびにファージディスプレイなどの従来にない過程によって得た抗体が含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当該分野で周知である。
【００７７】
典型的には、エピトープを形成するのに少なくとも６、７、８、１０、または１２個の連続するアミノ酸が必要である。しかし、不連続アミノ酸を含むエピトープは、より多数（例えば、少なくとも１５、２５、または５０個のアミノ酸）を必要とし得る。種々の免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降、または当該分野で公知の他の免疫化学アッセイ）を使用して、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競合結合または免疫放射線測定法についての多数のプロトコールが当該分野で周知である。かかる免疫アッセイは、典型的には、免疫原と免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を含む。ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体の調製物から、典型的には、免疫化学アッセイで使用した場合に他のタンパク質を使用して得られる検出シグナルの少なくとも５倍、１０倍、または２０倍の検出シグナルが得られ、かつ「無関係な」タンパク質と接触させた場合に、検出可能なシグナルは提供しない。好ましくは、抗体は、免疫化学アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、溶液由来の特定の抗原を免疫沈降することができる。
【００７８】
野生型Ｓｐｙ０１６７に特異的に結合する抗体は、その溶血活性を実質的に（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％）低下させるかまたは除去する。いくつかの抗体は、上に記載される変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質にも特異的に結合する。
【００７９】
野生型Ｓｐｙ０４１６に特異的に結合する抗体は、ＩＬ−８を切断するＳｐｙ０４１６の能力を実質的に（例えば、少なくとも５０％）低下させるかまたは除去する（実施例５）。抗体は、ＩＬ−８を切断するＳｐｙ０４１６の能力を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％低下し得る。いくつかの抗体は、上に記載される変異体Ｓｐｙ０４１６タンパク質にも特異的に結合する。好ましい抗体は、ＩＬ−８の相同体（例えば、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１β、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１γ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ  ７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＸＣＬ１６）などの他の基質を切断するＳｐｙ０４１６の能力も低下させるかまたは除去する。いくつかの抗体は、野生型または変異体Ｓｐｙ０４１６組換え抗原で免疫化され、ＧＡＳでチャレンジされる動物において壊死病変の進行を遮断する。
【００８０】
Ｓｐｙ０２６９に特異的に結合する抗体は、実施例２５に記載される細胞結合アッセイにより測定される場合、上皮細胞へのＳｐｙ０２６９の結合を実質的に（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％）減少させるかまたは除去する。
【００８１】
抗体の生成
ＧＡＳ抗原を使用して哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなど）を免疫化して、ポリクローナル抗体を産生することができる。必要に応じて、抗原を、担体タンパク質（ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンなど）に接合することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させることができる。かかるアジュバントには、フロイントアジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトで使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムが特に有用である。
【００８２】
抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を、培養物中の連続的な細胞株によって抗体分子を産生する任意の技術を使用して調製することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５  ４９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１，３１  ４２，１９８５；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６
２０３０，１９８３；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２，１０９  １２０，１９８４）。
【００８３】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得る技術）を使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１  ６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４  ６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２  ４５４，１９８５）。モノクローナル抗体および他の抗体を「ヒト化」して、治療で使用する場合に抗体に対する患者の免疫応答の開始を防止するかまたはそのリスクを低減することもできる。かかる抗体は、療法で直接使用するのに配列が十分にヒト抗体と類似し得るか、少数の重要な残基を変化させる必要があり得る。げっ歯類抗体配列とヒト抗体配列との間の相違を、各残基の部位特異的変異誘発または相補性決定領域全体のグラフティング（ｇｒａｔｉｎｇ）によるヒト配列中の残基と異なる残基の置換によって最小にすることができる。
【００８４】
あるいは、下記の組換え方法を使用してヒト化抗体を産生することができる。米国特許第５，５６５，３３２号に開示のように、特定の抗原に特異的に結合する抗体は、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含むことができる。
【００８５】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載した技術を、当該分野公知の方法を使用して適合させて、特定の抗原に特異的に結合する単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成の抗体を、ランダム組み合わせ免疫グロブリンライブラリー由来のチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって生成することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０  ２３，１９９１）。
【００８６】
単鎖抗体を、テンプレートとしてハイブリドーマｃＤＮＡを使用したＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲなど）を使用して構築することができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５０７−１１）。単鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であり得、２価または４価であり得る。４価の二重特異性単鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−６３に教示されている。２価の二重特異性単鎖抗体は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ＆  Ｖｏｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８７】
下記のように、単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を、手作業または自動化されたヌクレオチド合成によって構築し、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して発現構築物にクローニングし、細胞に導入してコード配列を発現させることができる。あるいは、単鎖抗体を、例えば、繊維状ファージテクノロジーを使用して直接産生することができる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１，４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１−９１）。
【００８８】
特定の抗原に特異的に結合する抗体を、文献に開示のリンパ球集団におけるインビボ産生の誘導または免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングによって産生することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３  ３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３  ２９９，１９９１）。
【００８９】
キメラ抗体を、ＷＯ９３／０３１５１号に開示のように構築することができる。免疫グロブリンに由来し、多価または多重特異性の結合タンパク質（ＷＯ９４／１３８０４号に記載の「二特異性抗体」など）を調製することもできる。
【００９０】
抗体を、当該分野で周知の方法によって精製することができる。例えば、抗体を、関連抗原が結合するカラムの通過によってアフィニティ精製することができる。次いで、結合した抗体を、高塩濃度の緩衝剤を使用して、カラムから溶離することができる。
【００９１】
薬学的組成物
本発明はまた、薬物として（例えば、免疫原性組成物またはワクチンとして）用いる組成物を提供する。本発明の組成物は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を予防するか、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染のリスクを低減するか、および／またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染の結果として引き起こされる疾患（例えば、菌血症、髄膜炎、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、または毒素性ショック症候群）を処置するのに有用である。
【００９２】
ＧＡＳ抗原を含む組成物は、好ましくは、免疫原性組成物であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。かかる組成物のｐＨは、好ましくは、ｐＨ６とｐＨ８との間、好ましくは、約ｐＨ７である。ｐＨを緩衝剤の使用によって維持することができる。組成物は、無菌でありおよび／または発熱物質を含まなくあり得る。組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００９３】
本発明のワクチンを、予防的または治療的に使用することができるが、典型的には、予防的であろう。したがって、本発明は、化膿連鎖球菌感染の治療的または予防的処置のための方法を含む。動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。方法は、治療量または予防量の本発明の免疫原性組成物を動物に投与する工程を含む。本発明はまた、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を処置するか、そのリスクを低減するか、および／またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を予防するための本発明の免疫原性組成物を提供する。
【００９４】
いくつかの本発明の組成物は、先に記載されるように、２種の異なるＧＡＳ抗原を含む。他の本発明の組成物は、この２種の異なる抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９：４７１−４８０；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２：４４１−４４７；Ｉｌａｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：１１６−１２０；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｐｅｒｔｍｅｒ（２０００）Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：１−７４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４  Ｐｔ  ２）：Ｓ１９０−１９３；Ｄａｖｉｓ（１９９９）Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．６６：８４−９０を参照のこと。典型的には、核酸分子は、例えば、プラスミド形態のＤＮＡ分子である。
【００９５】
治療上有用な、本発明の他の組成物は、２種の異なる抗体を含み、その各々は、２種の異なるＧＡＳ抗原の一方に特異的に結合する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のさらなる活性剤を含むことができる。かかる薬剤には、（ａ）小児ワクチンで有用なポリペプチド抗原、（ｂ）高齢者または免疫無防備状態の個体のためのワクチンで有用なポリペプチド抗原、（ｃ）（ａ）または（ｂ）をコードする核酸分子および（ｄ）（ａ）または（ｂ）に特異的に結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
さらなる抗原
本発明の組成物を、本発明の治療方法、または予防方法で使用するための１つまたは複数の追加の抗原と組み合わせて投与することができる。適切な抗原には、以下に列挙した抗原が含まれる。さらに、本発明の組成物を使用して、任意の以下に列挙の病原体に起因する感染を処置するか、そのリスクを低減するかまたは防止することができる。下記の抗原との組み合わせに加えて、本発明の組成物を、本明細書中に記載のアジュバントと組み合わせることもできる。
【００９８】
本発明と共に使用するためのさらなる抗原には、下記の１つまたは複数の抗原または下記の１つまたは複数の病原体由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
Ａ．細菌抗原
本発明での使用に適切な細菌抗原には、細菌から単離、精製、または由来することができるタンパク質、多糖類、リポ多糖類、外膜小胞が含まれる。さらに、細菌抗原には、細菌溶解物および不活化細菌処方物が含まれ得る。細菌抗原を、組換え発現によって産生することができる。細菌抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１段階に細菌表面に曝露されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型で保存される。細菌抗原には、下記の１つまたは複数の細菌由来の抗原および以下で同定した特定の抗原例が含まれる。
【０１００】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）：メニンギティディス抗原には、Ｎ．メニンギティディス血清群（Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、および／またはＢなど）から精製または由来したタンパク質（参考文献１〜７で同定されたタンパク質など）、糖類（多糖類、オリゴ糖、またはリポ多糖類が含まれる）、または外膜小胞（参考文献８、９、１０、１１）が含まれ得る。メニンギティディスタンパク質抗原を、接着剤、オートトランスポータ、毒素、Ｆｅ獲得タンパク質、および膜結合タンパク質（好ましくは、外膜内在性タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ））から選択することができる。
【０１０１】
肺炎連鎖球菌：肺炎連鎖球菌抗原には、肺炎連鎖球菌由来の糖類（多糖類またはオリゴ糖が含まれる）および／またはタンパク質が含まれ得る。糖類抗原を、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択することができる。タンパク質抗原を、ＷＯ９８／１８９３１号、ＷＯ９８／１８９３０号、米国特許第６，６９９，７０３号、米国特許第６，８００，７４４号、ＷＯ９７／４３３０３号、およびＷＯ９７／３７０２６号で同定されたタンパク質から選択することができる。肺炎連鎖球菌タンパク質を、ポリヒスチジントリアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ短縮物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ短縮物、ＣｂｐＸ短縮物−ＬｙｔＸ短縮物キメラタンパク質、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、またはＳｐ１３３から選択することができる。
【０１０２】
化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）：Ａ群連鎖球菌抗原には、ＷＯ０２／３４７７１号またはＷＯ２００５／０３２５８２号で同定されたタンパク質が含まれ得る
【０１０３】
【化１０】
2015038156.tif 000018
先に記載されかつ表Ａ〜Ｄに記載される他のＧＡＳ抗原、ＧＡＳ  Ｍタンパク質のフラグメントの融合物（ＷＯ０２／０９４８５１号およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：１９３−２００およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１０）：９４４−９４８に記載のものが含まれる）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂ１）、連鎖球菌ヘム結合タンパク質（Ｓｈｐ）、およびストレプトリジンＳ（ＳａｇＡ）を含むが、これらに限定されない）。
【０１０４】
カタル球菌：モラクセラ抗原には、ＷＯ０２／１８５９５号およびＷＯ９９／５８５６２号で同定された抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ抗原、および／またはＬＰＳが含まれる。
【０１０５】
百日咳菌：百日咳抗原には、百日咳ホロトキシン（ｐｅｔｕｓｓｉｓ  ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および百日咳菌由来の繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）が含まれ、任意選択的に、パータクチンおよび／または凝集原２および３抗原との組み合わせも含まれる。
【０１０６】
黄色ブドウ球菌：黄色ブドウ球菌抗原には、非毒性組換え緑膿菌外毒素Ａと任意選択的に接合した黄色ブドウ球菌５型および８型莢膜多糖類（ＳｔａｐｈＶＡＸ（商標）など）または表面タンパク質由来の抗原、インベイシン（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の貪食を阻害する表面因子（莢膜、プロテインＡ）、カロテノイド、カタラーゼ産物、プロテインＡ、凝固酵素、凝固因子、および／または真核生物細胞膜を溶解する膜損傷毒素（任意選択的に解毒した）（ヘモリシン、ロイコトキシン、ロイコシジン）が含まれる。
【０１０７】
表皮ブドウ球菌：表皮ブドウ球菌抗原には、粘液結合抗原（ＳＡＡ）が含まれる。
【０１０８】
破傷風菌（破傷風）：破傷風抗原には、本発明の組成物と接合した担体タンパク質として使用されることが好ましい破傷風トキソイド（ＴＴ）が含まれる。
【０１０９】
ジフテリア菌（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）：ジフテリア抗原には、好ましくは解毒されたジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７など）が含まれる。さらに、ＡＤＰリボシル化を調整するか、阻害するか、これに関連することができる抗原は、本発明の組成物との組み合わせ／同時投与／接合が意図される。担体タンパク質としてジフテリアトキソイドを使用することができる。
【０１１０】
インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）：Ｈｉｂ抗原には、Ｈｉｂ糖類抗原が含まれる。
【０１１１】
緑膿菌：シュードモナス抗原には、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、緑膿菌ＬＰＳ、より詳細にはＰＡＯ１から単離したＬＰＳ（Ｏ５血清型）、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）が含まれる）（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３５１０−３５１５）が含まれる。
【０１１２】
レジオネラ・ニューモフィラ。細菌毒素は、レジオネラ・ニューモフィラに由来し得る。
【０１１３】
ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）：Ｂ群連鎖球菌抗原には、ＷＯ０２／３４７７１号、ＷＯ０３／０９３３０６号、ＷＯ０４／０４１１５７号、またはＷＯ２００５／００２６１９号で同定されたタンパク質抗原または糖類抗原（タンパク質ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ２７６、およびＧＢＳ３２２、ならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩ由来の糖類抗原が含まれる）が含まれる。
【０１１４】
淋菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）：ゴノレー抗原には、Ｐｏｒ（すなわち、ポリン）タンパク質（ＰｏｒＢ（Ｚｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０−６６９を参照のこと）など）、トランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７−２８３を参照のこと）など）、混濁タンパク質（ｏｐａｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｏｐａなど）、還元修飾性タンパク質（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（Ｐｌａｎｔｅら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１８２：８４８−５５（２０００）を参照のこと、例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ０２／０７９２４３も参照のこと）が含まれる。
【０１１５】
トラコーマクラミジア：トラコーマクラミジア抗原には、血清型Ａ、Ｂ、Ｂａ、およびＣ由来の抗原（トラコーマの作用因子、盲目の原因）、血清型Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３由来の抗原（性病性リンパ肉芽腫症に関連）、および血清型ＤからＫ由来の抗原が含まれる。トラコーマクラミジア抗原には、ＷＯ００／３７４９４号、ＷＯ０３／０４９７６２号、ＷＯ０３／０６８８１１号、またはＷＯ０５／００２６ｆ１９号で同定された抗原（ＰｅｐＡ（ＣＴ０４５）、ＬｃｒＥ（ＣＴ０８９）、ＡｒｔＪ（ＣＴ３８１）、ＤｎａＫ（ＣＴ３９６）、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ−ｌｉｋｅ（ＣＴ２４２）、Ｌ７／Ｌ１２（ＣＴ３１６）、ＯｍｃＡ（ＣＴ４４４）、ＡｔｏｓＳ（ＣＴ４６７）、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ（ＣＴ５８７）、ＨｒｔＡ（ＣＴ８２３）、およびＭｕｒＧ（ＣＴ７６１）が含まれる）も含まれ得る。
【０１１６】
梅毒トレポネーマ（梅毒）：梅毒抗原には、ＴｍｐＡ抗原が含まれる。
【０１１７】
軟性下疳菌（軟性下疳の原因菌）：デュクレイ抗原には、外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が含まれる。
【０１１８】
フェカリス菌またはフェシウム菌：抗原には、米国特許第６，７５６，３６１号に記載の三糖類反復または他の腸球菌由来の抗原が含まれる。
【０１１９】
ピロリ菌：ピロリ菌抗原には、Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ、および／またはウレアーゼ抗原が含まれる。
【０１２０】
腐性ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）：抗原には、腐性ブドウ球菌抗原の１６０ｋＤａ血球凝集素が含まれる。
【０１２１】
エンテロコリチカ菌抗原には、ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  Ａｕｇｕｓｔ；７０（８）：４４１４）が含まれる。
【０１２２】
大腸菌：大腸菌抗原は、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、びまん付着性大腸菌（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来し得る。
【０１２３】
炭疽菌（炭疽病）：炭疽菌抗原は任意選択的に解毒されており、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））から選択することができ、その両方が、防御抗原（ＰＡ）として公知のＢ成分を共有することができる。
【０１２４】
ペスト菌（ペスト）：ペスト抗原には、Ｆ１莢膜抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｊａｎ；７１（１））：３７４−３８３，ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  Ｏｃｔ；６７（１０）：５３９５）、ペスト菌Ｖ抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｎｏｖ；６５（１１）：４４７６−４４８２）が含まれる。
【０１２５】
結核菌：結核抗原には、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂの融合タンパク質（Ａｇ８５Ｂ）および／または任意選択的にカチオン性脂質小胞中に配合されたＥＳＡＴ−６（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｏｃｔｏｂｅｒ；７２（１０）：６１４８）、結核菌（Ｍｔｂ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４  Ａｕｇ  ２４；１０１（３４）：１２６５２）、および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｊｕｌｙ；７２（７）：３８２９）が含まれる。
【０１２６】
リケッチア属：抗原には、外膜タンパク質（外膜プロテインＡおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）が含まれる）（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００４  Ｎｏｖ  １；１７０２（２）：１４５）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）（Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９  Ｊｕｎ；２  Ｓｕｐｐｌ：８１）が含まれる。
【０１２７】
リステリア菌。細菌抗原は、リステリア菌に由来し得る。
【０１２８】
クラミジア・ニューモニエ：抗原には、ＷＯ０２／０２６０６号で同定された抗原が含まれる。
【０１２９】
コレラ菌：抗原には、プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ（特に、コレラ菌ＩＩのリポ多糖類）、Ｏ１  Ｉｎａｂａ  Ｏ−特異的多糖類、コレラ菌Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｏｃｔ；７１（１０）：５４９８−５０４）、および／または閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が含まれる。
【０１３０】
チフス菌（チフス熱）：抗原には、莢膜多糖類、好ましくは抱合体（Ｖｉ、すなわち、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）が含まれる。
【０１３１】
ライム病ボレリア（ライム病）：抗原には、リポタンパク質（ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、およびＯｓｐＤなど）、他の表面タンパク質（ＯｓｐＥ関連タンパク質（Ｅｒｐｓ）など）、デコリン結合タンパク質（ＤｂｐＡなど）、および抗原的に可変のＶＩタンパク質（Ｐ３９およびＰ１３に結合するタンパク質）（膜内在性タンパク質、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３３２３−３３３４）、ＶｌｓＥ抗原変異タンパク質（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ｄｅｃ；３７（１２）：３９９７）など）が含まれる。
【０１３２】
ジンジバリス菌：抗原には、ジンジバリス菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）が含まれる。
【０１３３】
クレブシエラ属：抗原には、ＯＭＰ（ＯＭＰ  Ａが含まれる）または破傷風トキソイド任意選択的に接合した多糖類が含まれる。
【０１３４】
さらなる本発明の細菌抗原は、上記のいずれかの莢膜抗原、多糖類抗原、またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含まれ得る。さらに、抗原には、上記細菌のいずれかの生きたバージョン、弱毒化バージョン、および／または精製バージョンが含まれる。本発明の抗原は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌に由来し得る。本発明の抗原は、好気性菌または嫌気性菌に由来し得る。
【０１３５】
さらに、上記細菌由来糖類のいずれか（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳ、またはオリゴ糖）を、別の作用因子または抗原（担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７など））と接合することができる。かかる接合は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に記載のタンパク質上のアミノ基への糖類上のカルボニル部分の還元的アミド化によって生じる直接的接合であり得る。あるいは、糖類を、リンカーを介して、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３に記載のスクシンアミドまたは他の結合などを介して接合することができる。
【０１３６】
Ｂ．ウイルス抗原
本発明での使用に適切なウイルス抗原には、不活化（または死滅）ウイルス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス処方物、精製サブユニット処方物、ウイルスから単離、精製、または由来することができるウイルスタンパク質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれる。ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質上に増殖したウイルスに由来し得る。あるいは、ウイルス抗原を、組換え的に発現することができる。ウイルス抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１段階に細菌表面に曝露されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型または単離物で保存される。細菌抗原には、下記の１つまたは複数の細菌由来の抗原および以下で同定した特定の抗原例が含まれる。
【０１３７】
オルソミクソウイルス：ウイルス抗原は、オルソミクソウイルス（インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型など）に由来し得る。オルソミクソウイルス抗原を、１つまたは複数のウイルスタンパク質（血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１つまたは複数の転写酵素成分（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）が含まれる）から選択することができる。好ましい抗原には、ＨＡおよびＮＡが含まれる。
【０１３８】
インフルエンザ抗原は、世界的流行間期の（年間流行性）インフルエンザ株に由来し得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、世界的流行およびその発生を引き起こす可能性のある株（すなわち、現在広まっている株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、トリ被験体中で病原性を示し、且つヒト集団において水平伝播する可能性があるインフルエンザ株、またはヒトに病原性を示すインフルエンザ株）に由来し得る。
【０１３９】
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス科のウイルス（ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、およびモルビリウイルス（麻疹）など）に由来し得る。
【０１４０】
ニューモウイルス：ウイルス抗原は、ニューモウイルス（ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスなど）に由来し得る。好ましくは、ニューモウイルスはＲＳＶである。ニューモウイルス抗原を、１つまたは複数の以下のタンパク質（表面タンパク質（融合物（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）、および小疎水性タンパク質（ＳＨ））、基質タンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、およびＬならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２が含まれる）から選択することができる。好ましいニューモウイルス抗原には、Ｆ、Ｇ、およびＭが含まれる。例えば、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；８５（Ｐｔ１１）：３２２９）を参照のこと。ニューモウイルス抗原を、キメラウイルス中に配合するか、これに由来することができる。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含むことができる。
【０１４１】
パラミクソウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１型〜４型（ＰＩＶ）、ムンプス、センダイウイルス、サルウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど）に由来し得る。好ましくは、パラミクソウイルスはＰＩＶまたはムンプスである。パラミクソウイルス抗原を、１つまたは複数の以下のタンパク質から選択することができる：血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、および基質タンパク質（Ｍ）。好ましいパラミクソウイルスタンパク質には、ＨＮ、Ｆ１、およびＦ２が含まれる。パラミクソウイルス抗原を、キメラウイルス中に配合するか、これに由来することができる。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含むことができる。市販のムンプスワクチンには、１価の形態または麻疹ワクチンおよび風疹ワクチン（ＭＭＲ）と組み合わせた弱毒化生ムンプスウイルスが含まれる。
【０１４２】
モルビリウイルス：ウイルス抗原は、モルビリウイルス（麻疹ウイルスなど）に由来し得る。モルビリウイルス抗原を、１つまたは複数の以下のタンパク質から選択することができる：血球凝集素（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、巨大タンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）、および基質（Ｍ）。市販の麻疹ワクチンには、典型的にはムンプスおよび風疹（ＭＭＲ）と組み合わせた弱毒化生麻疹ウイルスが含まれる。
【０１４３】
ピコルナウイルス：ウイルス抗原は、ピコルナウイルス（エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなど）に由来し得る。エンテロウイルス（ポリオウイルスなど）由来の抗原が好ましい。
【０１４４】
エンテロウイルス：ウイルス抗原は、エンテロウイルス（ポリオウイルス１型１、２型、または３型）、コクサッキーＡウイルス１〜２２型および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）１〜９型、１１〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１など）に由来し得る。好ましくは、エンテロウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは、１つまたは複数の以下のキャプシドタンパク質から選択される：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４。市販のポリオワクチンには、不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）が含まれる。
【０１４５】
ヘパルナウイルス：ウイルス抗原は、ヘパルナウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）など）に由来し得る。市販のＨＡＶワクチンには、不活化ＨＡＶワクチンが含まれる。
【０１４６】
トガウイルス：ウイルス抗原は、トガウイルス（ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなど）に由来し得る。ルビウイルス（風疹ウイルスなど）由来の抗原が好ましい。トガウイルス抗原を、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−１、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３、またはＮＳＰ−４から選択することができる。トガウイルス抗原を、好ましくは、Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３から選択する。市販の風疹ワクチンには、典型的にはムンプスワクチンおよび麻疹ワクチン（ＭＭＲ）と組み合わせた低温適応の生きたウイルスが含まれる。
【０１４７】
フラビウイルス：ウイルス抗原は、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）、デング熱（１、２、３、または４型）、黄熱病、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎など）に由来し得る。フラビウイルス抗原を、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択することができる。フラビウイルス抗原を、好ましくは、ＰｒＭ、Ｍ、およびＥから選択する。市販のＴＢＥワクチンには、不活化ウイルスワクチンが含まれる。
【０１４８】
ペスチウイルス：ウイルス抗原は、ペスチウイルス（ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）など）に由来し得る。
【０１４９】
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）に由来し得る。ヘパドナウイルス抗原を、表面抗原（Ｌ、Ｍ、およびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択することができる。市販のＨＢＶワクチンには、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンが含まれる。
【０１５０】
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し得る。ＨＣＶ抗原を、１つまたは複数のＥ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域由来のペプチド（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１）から選択することができる。
【０１５１】
ラブドウイルス：ウイルス抗原は、ラブドウイルス（リッサウイルス（狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）など）に由来し得る。ラブドウイルス抗原を、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、巨大タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択することができる。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト二倍体細胞またはアカゲザル胎児肺細胞で成長した死滅ウイルスを含む。
【０１５２】
カリシウイルス科；ウイルス抗原は、カルシウイルス科（ノーウォークウイルスおよびノーウォーク様ウイルス（ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど）など）に由来し得る。
【０１５３】
コロナウイルス：ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来し得る。コロナウイルス抗原を、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、基質（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、および血球凝集素−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択することができる。好ましくは、コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳウイルスに由来する。ＳＡＲＳウイルス抗原は、ＷＯ０４／９２３６０号に記載されている。
【０１５４】
レトロウイルス：ウイルス抗原は、レトロウイルス（オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプーマウイルスなど）に由来し得る。オンコウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−５に由来し得る。レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来し得る。レトロウイルス抗原を、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択することができる。ＨＩＶ抗原を、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕ、ミニタンパク質（好ましくは、ｐ５５  ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ欠失）から選択することができる。ＨＩＶ抗原は、１つまたは複数の以下の株に由来し得る：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４。
【０１５５】
レオウイルス：ウイルス抗原は、レオウイルス（オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルティウイルスなど）に由来し得る。レオウイルス抗原を、構造タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、σ１、σ２、もしくはσ３、または非構造タンパク質σＮＳ、μＮＳ、もしくはσ１ｓから選択することができる。好ましいレオウイルス抗原は、ロタウイルスに由来し得る。ロタウイルス抗原を、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４、またはＮＳＰ５から選択することができる。好ましいロタウイルス抗原には、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、およびＶＰ７が含まれる。
【０１５６】
パルボウイルス：ウイルス抗原は、パルボウイルス（パルボウイルスＢ１９など）に由来し得る。パルボウイルス抗原を、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１、およびＮＳ−２から選択することができる。好ましくは、パルボウイルス抗原は、キャプシドタンパク質ＶＰ−２である。
【０１５７】
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原は、ＨＤＶ、特に、ＨＤＶ由来のδ−抗原（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）に由来し得る。
【０１５８】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原は、ＨＥＶに由来し得る。
【０１５９】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原は、ＨＧＶに由来し得る。
【０１６０】
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）など）に由来し得る。ヒトヘルペスウイルス抗原を、最初期タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、および後期タンパク質（γ）から選択することができる。ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１株またはＨＳＶ−２株に由来し得る。ＨＳＶ抗原を、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＨ、融合タンパク質（ｇＢ）、または免疫回避タンパク質（ｇＣ、ｇＥ、またはｇＩ）から選択することができる。ＶＺＶ抗原を、コアタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、またはエンベロープタンパク質から選択することができる。弱毒化生ＶＺＶワクチンは市販されている。ＥＢＶ抗原を、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）、および膜抗原（ＭＡ）の糖タンパク質から選択することができる。ＣＭＶ抗原を、キャプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（ｇＢおよびｇＨなど）、およびテグメントタンパク質から選択することができる。
【０１６１】
パポーバウイルス：抗原は、パポーバウイルス（パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど）に由来し得る。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、および６５が含まれる。好ましくは、ＨＰＶ抗原は、血清型６、１１、１６、または１８に由来する。ＨＰＶ抗原を、キャプシドタンパク質（Ｌ１）および（Ｌ２）またはＥ１〜Ｅ７、またはその融合物から選択することができる。ＨＰＶ抗原を、好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に配合する。ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍｙａｖｉｒｕｓ）には、ＢＫウイルスおよびＪＫウイルスが含まれる。ポリオーマウイルス抗原を、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３から選択することができる。
【０１６２】
Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｕｒｒａｙら、ｅｄ．２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）（本発明の組成物と併せて意図される）に含まれる抗原、組成物、方法、および微生物がさらに提供される。
【０１６３】
Ｃ．真菌抗原
本発明で用いる真菌抗原は、１つまたは複数の下記の真菌に由来し得る。
【０１６４】
真菌抗原は、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（エピデルモフィトン・フロッコーサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポルム・オドウィニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・ディストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ジプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリネ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ジプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・キンケアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルコスム・アルブム変種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ  ｖａｒ．ａｌｂｕｍ）、ジスコイデス変種（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、オクラセイム変種（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、および／またはトリコフィトン・ファビホルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）が含まれる）に由来し得る。
【０１６５】
真菌病原体は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾマイセス・カピタタス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクエセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ゲオトリクム・クラバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、肺炎桿菌、南アメリカ分芽菌、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、ピシウムン・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポルム・オバール（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅ）、酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、スケドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリクス・シェンキ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属菌種、フォンセケア（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ）属菌種、ワンギエラ（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）属菌種、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属菌種、バシジオボラス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属菌種、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属菌種、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌種、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属菌種、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属菌種、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属菌種、クニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属菌種、サクセネア（Ｓａｋｓｅｎａｅａ）属菌種、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属菌種、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属菌種、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）属菌種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌種、アモノリニア（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ）属菌種、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属菌種、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ピトマイセス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ）属菌種、およびクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属菌種に由来し得る。
【０１６６】
真菌抗原の産生プロセスは、当該分野で周知である（米国特許第６，３３３，１６４号を参照のこと）。好ましい方法では、その細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去された真菌細胞から得ることができる不溶性画分から抽出および分離した可溶化画分を、プロセスが、生きた真菌細胞を得る工程；その細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去された真菌細胞を得る工程；その細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去された真菌細胞を破裂させる工程；不溶性画分を得る工程；ならびに不溶性画分から可溶化画分を抽出および分離する工程を含むという点で特徴づけた。
【０１６７】
Ｄ．ＳＴＤ抗原
本発明の組成物は、１つまたは複数の性感染症（ＳＴＤ）由来の抗原を含むことができる。かかる抗原は、ＳＴＤ（クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病、梅毒、および／または軟性下疳など）を予防または治療することができる（ＷＯ００／１５２５５号を参照のこと）。抗原は、１つまたは複数のウイルスまたは細菌のＳＴＤに由来し得る。本発明で用いるウイルスＳＴＤ抗原は、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および肝炎（ＨＣＶ）に由来し得る。本発明で用いる細菌ＳＴＤ抗原は、例えば、淋菌、トラコーマクラミジア、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、大腸菌、およびストレプトコッカス・アガラクチアに由来し得る。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
【０１６８】
Ｅ．呼吸器抗原
本発明の組成物は、呼吸器疾患を引き起こす病原体由来の１つまたは複数の抗原を含むことができる。例えば、呼吸器抗原は、呼吸器ウイルス（オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）など）に由来し得る。呼吸器抗原は、呼吸器疾患を引き起こす細菌（肺炎連鎖球菌、緑膿菌、百日咳菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・ニューモニエ、炭疽菌、およびカタル球菌など）に由来し得る。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
【０１６９】
Ｆ．小児ワクチン抗原
本発明の組成物は、小児被験体での使用に適切な１つまたは複数の抗原を含むことができる。小児被験体は、典型的には、約３歳未満、約２歳未満、または約１歳未満である。小児抗原を、６ヶ月、１年、２年、または３年にわたって複数回投与することができる。小児抗原は、小児集団を標的にすることができるウイルスおよび／または小児集団が感染に感受性を示すウイルスに由来し得る。小児ウイルス抗原には、１つまたは複数のオルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原が含まれる。小児細菌抗原には、１つまたは複数の肺炎連鎖球菌、ナイセリア・メニンギティディス、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、ジフテリア菌（ジフテリア）、インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）、緑膿菌、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）、および大腸菌由来の抗原が含まれる。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
【０１７０】
Ｇ．高齢者または免疫無防備状態の個体での使用に適切な抗原
本発明の組成物は、高齢者または免疫無防備状態の個体での使用に適切な１つまたは複数の抗原を含むことができる。かかる個体に、より頻繁に、標的化抗原に対するその免疫応答を改良するためにより高い用量またはアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）処方物でワクチン接種することが必要であり得る。高齢者または免疫無防備状態の個体での使用のために標的化することができる抗原には、１つまたは複数の以下の病原体由来の抗原が含まれる：ナイセリア・メニンギティディス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、ジフテリア菌（ジフテリア）、インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）、緑膿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）、フェカリス菌、ピロリ菌、肺炎クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。これらの病原体由来の特異的抗原の例は、上に記載している。
【０１７１】
Ｈ．青年期ワクチンでの使用に適切な抗原
本発明の組成物は、青年期被験体での使用に適切な１つまたは複数の抗原を含むことができる。青年期は、以前に投与した小児ワクチンの追加免疫が必要であり得る。青年期での使用に適切であり得る小児抗原は、上に記載されている。さらに、性行為の開始前に防御免疫または治療的免疫を確実にするために、ＳＴＤ病原体由来の抗原を投与するために青年期を標的化することができる。青年期での使用に適切であり得るＳＴＤ抗原は、上に記載されている。
【０１７２】
Ｉ．抗原処方物
本発明の他の態様では、吸着抗原を有する微粒子の生成方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）界面活性剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、および（ｉｖ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、およびポリシアノアクリラートからなる群より選択される生分解性ポリマーを含む混合物の分散によって乳濁液を準備する工程を含む。ポリマーは、典型的には、有機溶媒と比較して約１％〜約３％の濃度の混合物で存在する一方で、界面活性剤は、典型的には、約０．００００１：１〜約０．１：１（より典型的には、約０．０００１：１〜約０．１：１、約０．００１：１〜約０．１：１、または約０．００５：１〜約０．１：１）の水：水、界面活性剤：ポリマー比で混合物中に存在する、準備する工程、（ｂ）乳濁液から有機溶媒を除去する工程、および（ｃ）微粒子表面上に抗原を吸着させる工程を含む。一定の実施形態では、生分解性ポリマーは、有機溶媒と比較して約３％〜約１０％の濃度で存在する。
【０１７３】
本明細書中で使用するための微粒子を、滅菌可能で、非毒性を示し、生分解性を示す材料から形成するであろう。かかる材料には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリラートが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明と共に使用するための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸とのコポリマー（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドなど）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーに由来する。微粒子は、種々の分子量、ＰＬＧなどのコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する任意の種々の重合開始材料に由来し得、その選択は、同時投与される高分子に一部依存して、多くの選択肢があるであろう。これらのパラメータは、以下により完全に考察されている。
【０１７４】
さらなる抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含まれ得る。
【０１７５】
さらなる処方方法および抗原（特に、腫瘍抗原）は、米国特許出願番号０９／５８１，７７２号に記載されている。
【０１７６】
Ｊ．抗原についての参考文献
以下の参考文献は、本発明の組成物と併せて有用な抗原を含む。
【０１７７】
【数１】
2015038156.tif 000019
【０１７８】
【数２】
2015038156.tif 000020
上記で引用した全ての特許、特許出願、および学術論文の内容は、本明細書中で完全に記載されているかのように参考として援用される。
【０１７９】
糖類抗原または炭水化物抗原を使用する場合、好ましくは、この抗原を担体タンパク質と接合して免疫原性を増強する。Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２８−３６；Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ（２０００）Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４：１６３−１６８；Ａｈｍａｄ  ＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １３：１１３−１３３，ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７；欧州特許第０４７７５０８号；米国特許第５，３０６，４９２号；ＷＯ９８／４２７２１号；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ｅｄｓ．Ｃｒｕｓｅら）ＩＳＢＮ  ３８０５５４９３２６、特に、ｖｏｌ．１０：４８−１１４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８  ｏｒ  ０１２３４２３３５Ｘを参照のこと。好ましい担体タンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなど）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。
【０１８０】
他の担体ポリペプチドには、髄膜炎菌外膜タンパク質（ＥＰ−Ａ−０３７２５０１号）、合成ペプチド（ＥＰ−Ａ−０３７８８８１号およびＥＰ−Ａ０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２号およびＷＯ９４／０３２０８号）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８号およびＥＰ  Ａ  ０４７１１７７号）、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ（ＷＯ００／５６３６０号）、サイトカイン（ＷＯ９１／０１１４６号）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１号）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７号）などが含まれる。混合物がセリグラフ（ｓｅｒｉｇｒａｐｈ）ＡおよびＣの両方由来の莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比（ｗ／ｗ）は１を超える（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれを超える）ことが好ましい場合がある。異なる糖類を、同型または異なる型の担体タンパク質に接合することができる。必要に応じて任意の適切なリンカーを使用した任意の適切な接合反応を使用することができる。
【０１８１】
必要に応じて、有毒タンパク質抗原を解毒することができる（例えば、化学的手段および／または遺伝子手段による百日咳毒素の解毒）。
【０１８２】
薬学的に許容可能な担体
本発明の組成物は、典型的には、上記成分に加えて、１つまたは複数の「薬学的に許容可能な担体」を含むであろう。これらには、担体自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体が含まれる。適切な担体は、典型的には、巨大でゆっくり代謝される高分子（タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）など）である。かかる担体は、当業者に周知である。組成物はまた、希釈剤（水、生理食塩水、グリセロールなど）を含むことができる。さらに、補助剤（湿潤剤または乳化剤およびｐＨ緩衝物質など）が存在し得る。薬学的に許容可能な成分の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で得られる。
【０１８３】
免疫調節薬
アジュバント
本発明のワクチンを、他の免疫調節薬と併せて投与することができる。特に、組成物は、通常、アジュバントを含むであろう。本発明と共に使用するためのアジュバントには、１つまたは複数の下記のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８４】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物は、ミネラル塩（アルミニウム塩およびカルシウム塩など）を含む。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩などのミネラル塩（例えば、ｃｈａｐｔｅｒｓ８  ＆  ９  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ…（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．Ｐｒｅｓｓ）または異なるミネラル化合物の混合物（例えば、リン酸塩アジュバントと水酸化物アジュバントとの混合物（任意選択的にリン酸塩が過剰））を含み、この化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、血漿、無定形など）をとり、塩に吸着していることが好ましい。ミネラル含有組成物を、金属塩の粒子として処方することもできる（ＷＯ００／２３１０５号）。
【０１８５】
アルミニウム塩を、Ａｌ３＋の用量が０．２ｍｇ／用量と１．０ｍｇ／用量との間であるように本発明のワクチン中に含めることができる。
【０１８６】
１つの実施形態では、本発明で用いるアルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））またはミョウバン誘導体（リン酸緩衝剤中で抗原とミョウバンとを混合し、その後に滴定し、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基で沈殿させることによってインサイチュで形成したミョウバン誘導体など）である。
【０１８７】
本発明のワクチン処方で用いる別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）（優れた吸着剤であり、表面積が約５００ｍ２／ｇである）である。あるいは、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウム（水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたは全てのヒドロキシル基の代わりにリン酸基を含む）を提供する。本明細書中で提供する好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは無定形であり、酸性、塩基性、および中性の媒質中に可溶である。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明のアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのより特定の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムよりも大量のリン酸アルミニウムを有する（２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または９：１超などのリン酸アルミニウム：水酸化アルミニウムの重量比）。さらにより詳細には、ワクチン中のアルミニウム塩は、０．４〜１．０ｍｇ／ワクチン用量、０．４〜０．８ｍｇ／ワクチン用量、０．５〜０．７ｍｇ／ワクチン用量、または約０．６ｍｇ／ワクチン用量で存在する。
【０１８９】
一般に、好ましいアルミニウムベースのアジュバントまたは複数のアルミニウムベースのアジュバントの比率（リン酸アルミニウム：水酸化アルミニウムなど）を、抗原が所望のｐＨでアジュバントとして逆の電荷を有するように分子間の静電気引力を至適化することによって選択する。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（等電点＝４）はリゾチームを吸着するが、ｐＨ７．４でアルブミンを吸着しない。アルブミンが標的である場合、水酸化アルミニウムアジュバントを選択するであろう（ｉｅｐ  １１．４）。あるいは、リン酸塩での水酸化アルミニウムの前処理によってその等電点が低下し、より塩基性の高い抗原に好ましいアジュバントとなる。
【０１９０】
Ｂ．油性乳濁液
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な油性乳濁液組成物には、スクアレン−水乳濁液（ＭＦ５９（ミクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用して、５％スクアレン、０．５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５をサブミクロン粒子に処方したもの）など）が含まれる。ＷＯ９０／１４８３７号を参照のこと。Ｐｏｄｄａ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照のこと。ＭＦ５９を、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用する。
【０１９１】
組成物中での使用に特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油型乳濁液である。本明細書中での使用に好ましいサブミクロン水中油型乳濁液は、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを任意選択的に含むスクアレン／水乳濁液（４〜５％  ｗ／ｖ  スクアレン、０．２５〜１．０％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０□（ポリオキシエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ）モノオレアート、および／または０．２５〜１．０％  ＳＰＡＮ  ８５（商標）（ソルビタントリオレアート）、および任意選択的にＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−ヒドロキシホスホホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン水中油型乳濁液（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油型乳濁液（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号、およびＯｔｔら、ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６））など）である。ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖ  スクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ  ８５（商標）を含み、任意選択的に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、これがＭｏｄｅｌ  １１０Ｙミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのミクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方されている。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量、最も好ましくは０〜１００μｇ／用量で存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記サブミクロン水中油型乳濁液いう一方で、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、１００μｇ  ＭＴＰ−ＰＥ／用量などを含む。ＭＦ６９（本明細書中で用いる別のサブミクロン水中油型乳濁液）は、４．３％  ｗ／ｖ  スクアレン、０．２５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．７５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ  ８５（商標）、および任意選択的にＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油型乳濁液は、ＳＡＦとしても公知のＭＦ７５であり、これは１０％スクアレン、０．４％  ＴＷＥＥＮ（商標）８０、５％プルロニックブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液にミクロ流体化もされている。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰ（１００〜４００μｇ  ＭＴＰ−ＰＥ／用量など）を含むＭＦ７５処方物を示す。
【０１９２】
組成物で用いるサブミクロン水中油型乳濁液、その作製方法、および免疫賦活剤（ムラミルペプチドなど）は、ＷＯ９０／１４８３７号および米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号に詳述されている。
【０１９３】
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。
【０１９４】
Ｃ．サポニン処方物
サポニン処方物を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。サポニンは、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であり、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、さらに花弁中で見出される。キラヤサポナリア  モリナ（Ｑｕｉｌｌａｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離したサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））由来のサポニンを購入することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物（ＱＳ２１など）および脂質処方物（ＩＳＣＯＭなど）が含まれる。
【０１９５】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィ（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製画分（ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる）が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールを含むこともできる（ＷＯ９６／３３７３９号を参照のこと）。
【０１９６】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭで使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、１つまたは複数のＱｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣを含む。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２号、ＷＯ９６／１１７１１号、およびＷＯ９６／３３７３９号にさらに記載されている。任意選択的に、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を欠いていてもよい。ＷＯ００／０７６２１号を参照のこと。
【０１９７】
サポニンベースのアジュバント開発の概説を、Ｂａｒｒ，ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見出すことができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照のこと。
【０１９８】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。これらの構造物は、一般に、任意選択的にリン脂質と組み合わせた、またはこれを用いて処方したウイルス由来の１つまたは複数のタンパク質を含む。これらは、一般に、非病原性で複製せず、一般に、任意の未変性のウイルスゲノムを含まない。ウイルスタンパク質を、組換え的に産生し、または全ウイルスから単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰでの使用に適切なこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビス・ウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）由来のタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０号、ＷＯ０３／０２４４８１号、Ｎｉｉｋｕｒａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ，ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０でさらに考察されている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６でさらに考察されている。免疫増強する再構築されたインフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）を、鼻腔内３価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ＆  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｂ１７−２３）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳ（商標）製品におけるサブユニット抗原送達系として使用する。
【０１９９】
Ｅ．細菌または微生物誘導体
本発明での使用に適切なアジュバントには、以下などの細菌または微生物誘導体が含まれる。
【０２００】
（１）腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
かかる誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５、または６アシル化鎖との混合物である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、ＥＰ０６８９４５４号に開示されている。かかる３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２ミクロン膜で濾過滅菌するのに十分に小さい（ＥＰ０６８９４５４号）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ模倣物（アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ５２９）など）が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８を参照のこと。
【０２０１】
（２）脂質Ａ誘導体
脂質Ａ誘導体には、大腸菌（ＯＭ−１７４）由来の脂質Ａ誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１およびＰａｊａｋ，ら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０２０２】
（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンの後にグアノシンを含み、リン酸結合によって結合した配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。回分配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む細菌二本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも免疫刺激性を示すことが示されている。
【０２０３】
ＣｐＧは、ホスホロチオアート修飾物などのヌクレオチド修飾物／アナログが含まれ得、二本鎖または一本鎖であり得る。任意選択的に、グアノシンを、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどのアナログと置換することができる。可能なアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７号およびＷＯ９９／６２９２３号を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号および米国特許第６，４２９，１９９号でさらに考察されている。
【０２０４】
ＣｐＧ配列を、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）に指向することができる。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８を参照のこと。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど）、Ｂ細胞応答の誘導により特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５号で考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０２０５】
好ましくは、５’末端が受容体認識のために接近することができるようにＣｐＧオリゴヌクレオチドを構築する。任意選択的に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合して、「イムノマー」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら、ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら、ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１、およびＷＯ０３／０３５８３６号を参照のこと。
【０２０６】
（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（すなわち、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または百日咳菌（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、ＷＯ９５／１７２１１号に記載されており、非経口アジュバントとしてはＷＯ９８／４２３７５号に記載されている。好ましくは、アジュバントは、解毒ＬＴ変異体（ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなど）である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用を、以下の参考文献で見出すことができる：Ｂｅｉｇｎｏｎ，ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，ら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換についての数値の基準は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０２０７】
Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。適切な生体接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）または粘膜接着剤（ポリアクリル酸の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、およびカルボキシメチルセルロースなど）が含まれる。キトサンおよびその誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。ＷＯ９９／２７９６０を参照のこと。
【０２０８】
Ｇ．微粒子
微粒子を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）を、生分解性且つ非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）（ポリ（ラクチドコグリコリド）が好ましい）から形成し、任意選択的に、負電荷の表面（例えば、ＳＤＳ）または正電荷の表面（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性剤）を有するように処理する。
【０２０９】
Ｈ．リポソーム
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号、および欧州特許第０６２６１６９号に記載されている。
【０２１０】
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明での使用に適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる。ＷＯ９９／５２５４９号。かかる処方物には、さらに、オクトキシノール（ＷＯ０１／２１２０７）と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤および少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２号）が含まれる。
【０２１１】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０２１２】
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１−３）：１０９−１１５  ａｎｄ  Ｐａｙｎｅら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０２１３】
Ｋ．ムラミルペプチド
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮアセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０２１４】
Ｌ．イミダゾキノリン化合物
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノリン化合物の例には、イミキモドおよびそのアナログが含まれ、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号、および同第５，５２５，６１２号にさらに記載されている。
【０２１５】
Ｍ．チオセミカルバゾン化合物
チオセミカルバゾン化合物、ならびに本発明でのアジュバントとしての使用に適切な全ての化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法の例には、ＷＯ０４／６０３０８号に記載のものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０２１６】
Ｎ．トリプタントリン化合物
トリプタントリン化合物、ならびに本発明でのアジュバントとしての使用に適切な全ての化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法の例には、ＷＯ０４／６４７５９号に記載のものが含まれる。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０２１７】
本発明はまた、上記で同定した１つまたは複数のアジュバントの態様の組み合わせを含むこともできる。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明で使用することができる。
【０２１８】
（１）サポニンおよび水中油型乳濁液（ＷＯ９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３号を参照のこと）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ１２（任意選択的に、＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９号）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳濁液との組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、０７３５８９８号、および０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プロニック−ブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液にミクロ流体化されているか、ボルテックスしてより大きな粒子サイズの乳濁液を生成したＳＡＦ。
【０２１９】
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））からなる群より選択される１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および
（８）１つまたは複数のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＰＭＬなど）。
【０２２０】
（９）１つまたは複数のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列など）。
【０２２１】
Ｏ．ヒト免疫調節薬
本発明でアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節薬には、サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子など）が含まれる。
【０２２２】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用インフルエンザワクチンとの使用に好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着剤は、粘膜由来ワクチン（経鼻用ワクチンなど）との使用に好ましいアジュバントである。
【０２２３】
上記で引用した全ての特許、特許出願、および学術論文の内容は、本明細書中で完全に記載されているかのように参考により組み込まれる。
【０２２４】
治療方法
本発明は、上記組成物を使用して化膿連鎖球菌に対する免疫応答を誘導または増大させる方法を提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、抗体および／または細胞−媒介性免疫（全身免疫および粘膜免疫が含まれる）が含まれ得る。免疫応答には、ブースター応答が含まれる。
【０２２５】
上に記載されるＧＡＳ抗原、核酸分子または抗体の組み合わせは、同時投与のための単一組成物に含まれ得る。代わりに、ＧＡＳ抗原、核酸分子または抗体の組み合わせは、順次投与し得る。例えば、組み合わせがＳｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６またはその変異体もしくはフラグメントを含む場合、これら３つの抗原は、単一組成物で同時にまたは別々の組成物で順次投与し得る。この状況では、本発明は、既にＳｐｙ０２６９および／またはＳｐｙ４１６を受けている動物への投与のためにＳｐｙ０１６７；既にＳｐｙ０１６７および／またはＳｐｙ０４１６を受けている動物への投与のためにＳｐｙ０２６９；ならびに既にＳｐｙ０１６７および／またはＳｐｙ０２６９を受けている動物への投与のためにＳｐｙ０４１６を提供する。
【０２２６】
十代および小児（よちよち歩きの子供および乳児が含まれる）は、予防的用途のためにワクチンを受けることが可能であり、治療ワクチンは典型的には十代の若者または成人に投与される。小児への使用を意図するワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人にも投与し得る。
【０２２７】
本発明の組成物によってそのリスクを低減するか、防止するかまたは処置することができる、化膿連鎖球菌によって引き起こされる疾患には、咽頭炎（連鎖球菌性咽喉痛など）、猩紅熱、膿痂疹、丹毒、蜂巣炎、敗血、中毒性ショック症候群、壊死性筋膜炎、および後遺症（リウマチ熱および急性糸球体腎炎など）が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、他の連鎖球菌（例えば、ＧＢＳ）に対しても有効であり得る。
【０２２８】
免疫応答の有効性を決定する試験
治療上の処置の有効性を評価する１つの方法は、本発明の組成物の投与後にＧＡＳ感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を評価する１つの方法は、組成物の投与後に本発明の組成物におけるＧＡＳ抗原に対する免疫応答をモニタリングすることを含む。
【０２２９】
本発明の免疫原性組成物の成分タンパク質の免疫原性を評価する別の方法は、組換え的にＧＡＳ抗原を発現し、免疫ブロットによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングすることである。タンパク質と患者の血清との間の陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を事前に開始していることを示す（すなわち、タンパク質が免疫原である）。この方法を使用して、免疫優性タンパク質および／またはエピトープを同定することもできる。
【０２３０】
治療上の処置の有効性の別のチェック方法は、本発明の組成物の投与後のＧＡＳ感染のモニタリングを含む。予防的処置の有効性の１つのチェック方法は、組成物の投与後にＧＡＳチャレンジに対する全身（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生レベルのモニタリングなど）および粘膜（ＩｇＡ産生レベルのモニタリングなど）の両方の免疫応答をモニタリングすることを含む。典型的には、血清特異的抗体応答を免疫化後であるがチャレンジ前に決定するのに対して、粘膜特異的抗体応答を免疫後且つチャレンジ後に決定する。
【０２３１】
本発明のワクチン組成物を、宿主（例えば、ヒト）投与前にインビトロおよびインビボ動物モデルで評価することができる。特に有用なマウスモデルには、腹腔内免疫化後に腹腔内チャレンジまたは鼻腔内チャレンジを行うマウスモデルが含まれる。
【０２３２】
本発明の免疫原性組成物の有効性を、動物モデル（例えば、モルモットまたはマウス）を免疫原性組成物で免疫化し、ＧＡＳによるチャレンジ後に得られた保護のレベルを確認することによってインビボで決定することもできる。
【０２３３】
インビボ有効性モデルには、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ｉ）ヒトＧＡＳ血清型を使用したマウス感染モデル、（ｉｉ）マウス適合ＧＡＳ株（特にマウスに病原性を示すＭ２３株など）を使用したマウスモデルであるマウス疾患モデル、および（ｉｉｉ）ヒトＧＡＳ単離物を使用した霊長類モデル。
【０２３４】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の一方または両方であり得る。免疫応答は、免疫応答の改良、増強、または変化であり得る。免疫応答は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、全身および／または粘膜の応答の増強である。
【０２３５】
全身免疫および／または粘膜免疫の増強は、ＴＨ１免疫応答および／またはＴＨ２免疫応答の増強を反映している。好ましくは、免疫応答の増強には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡ産生の増加が含まれる。
【０２３６】
好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答には、ＩｇＡ産生の増加が含まれる。
【０２３７】
活性化ＴＨ２細胞は抗体産生を増強し、それにより、細胞外感染に対する応答で有益である。活性化ＴＨ２細胞は、１つまたは複数のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を分泌することができる。ＴＨ２免疫応答により、さらなる防御のためにＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞を産生することができる。
【０２３８】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答に関連する１つまたは複数のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０など）の増加またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞産生の増加の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増強には、ＩｇＧ１産生の増加が含まれるであろう。
【０２３９】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬｌの増加、ＴＨ１免疫応答に関連する１つまたは複数のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦβなど）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａ産生の増加の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増強には、ＩｇＧ２ａ産生の増加が含まれるであろう。
【０２４０】
本発明の免疫原性組成物を、任意選択的にＴｈ１および／またはＴｈ２応答を誘発することができる免疫調節薬と共に、単独または他のＧＡＳ抗原と組み合わせて使用することができる。
【０２４１】
本発明はまた、１つまたは複数の免疫調節薬（ミネラル塩（アルミニウム塩など）など）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物を含む。最も好ましくは、免疫原性組成物には、アルミニウム塩およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの両方を含む。あるいは、免疫原性組成物は、ＡＤＰリボシル化毒素（解毒ＡＤＰリボシル化毒素など）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、１つまたは複数の免疫調節薬は、アジュバントを含む。アジュバントを、ＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１つまたは複数から選択することができる。
【０２４２】
本発明の組成物は、好ましくは、ＧＡＳ感染に有効に対処するために、細胞媒介性免疫および体液性免疫応答の両方を誘発するであろう。この免疫応答は、好ましくは、長期継続（例えば、中和）抗体および１つまたは複数のＧＡＳ抗原に曝露した場合に迅速に応答することができる細胞媒介性免疫を惹起するであろう。
【０２４３】
１つの特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、中和抗体応答を誘発する１つまたは複数のＧＡＳ抗原および細胞媒介性免疫応答を誘発する１つまたは複数のＧＡＳ抗原を含む。このようにして、中和抗体応答は、最初のＧＡＳ感染を防止または阻害する一方で、増強されたＴｈ１細胞応答を誘発することができる細胞媒介性免疫応答はＧＡＳ感染のさらなる拡大を防止する。
【０２４４】
本発明の組成物を、一般に、患者に直接投与するであろう。本発明の組成物を、種々の異なる経路を介して単独または組成物の一部として投与することができる。一定の組成物は、より有効な免疫応答、好ましくはＣＭＩ応答が得られるか、副作用を誘導する可能性が低いか、投与がより容易になるように一定の経路を好み得る。
【０２４５】
送達方法には、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または間質注射）、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、膣、局所、経皮（例えば、ＷＯ９９／２７９６１号を参照のこと）、経皮（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４号およびＷＯ０２／０６４１６２号を参照のこと）、鼻腔内（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０号を参照のこと）、眼球、耳、および肺、または他の粘膜投与が含まれる。
【０２４６】
一例として、本発明の組成物を、全身経路、粘膜経路、または経皮経路を開始して投与することができるか、特定の組織に直接投与することができる。本明細書中で使用される場合、用語「全身投与」には、任意の非経口投与経路が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、または胸骨内注射、静脈内、動脈内、または腎臓透析注入技術が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、全身非経口投与は筋肉内注射である。本明細書中で使用される場合、用語「粘膜投与」には、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸、および眼投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４７】
投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与を、初回免疫計画および／または追加免疫計画で使用することができる。複数回投与計画では、同一または異なる経路（例えば、非経口初回刺激および粘膜追加免疫、粘膜初回刺激および非経口追加免疫など）によって種々の回収で投与することができる。
【０２４８】
本発明の組成物を、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物を、溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能な組成物として調製することができる。注射前に溶液、懸濁物、または液体ビヒクルにするのに適切な固体形態（例えば、凍結乾燥組成物）を調製することもできる。経口投与のための組成物（錠剤もしくはカプセル、スプレーとして、またはシロップ（任意選択的に、風味づけする）としてなど）を調製することができる。肺投与のための組成物を、例えば、微粉またはスプレーを使用した吸入器として調製することができる。組成物を、坐剤またはペッサリーとして調製することができる。鼻、耳、または眼への投与のための組成物を、例えば、点滴薬として調製することができる。組成物は、患者への投与直前に組み合わせた組成物を再構成するようにデザインされたキット形態であり得る。かかるキットは、液体形態の１つまたは複数の変異体Ｓｐｙ０１６７または他の抗原および１つまたは複数の凍結乾燥抗原を含むことができる。
【０２４９】
ワクチンとして使用した免疫原性組成物は、免疫学的有効量のＧＡＳ抗原または他の抗原、ならびに、必要に応じて、抗生物質などの任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」は、単回用量または一連の投与の一部として個体に投与した場合に測定可能な免疫応答を増加させるか臨床症状を防止または減少させる量である。
【０２５０】
本発明の免疫原性組成物を、抗生物質処置計画と組み合わせて投与することができる。１つの実施形態では、抗生物質を、本発明の組成物の投与前に投与する。別の実施形態では、抗生物質を、本発明の組成物の投与後に投与する。ＧＡＳ感染処置での使用に適切な抗生物質の例には、ペニシリンもしくはその誘導体またはクリンダマイシン、セファロスポリン、糖ペプチド（例えば、バンコマイシン）、およびシクロセリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５１】
組成物中の活性剤の量は、処置を受ける個体の健康状態および生理的状態、年齢、処置を受ける個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置を行う医師の医学的状況の評価、および他の関連要因に応じて変化する。この量は比較的広範であり、日常的試験によって決定することができる。
【０２５２】
キット
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の容器を含むキットを提供する。組成物は、個別の抗原と同様に、液体形態であり得るか凍結乾燥させることができる。組成物に適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器を、種々の材料（ガラスまたはプラスチックが含まれる）から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内注射用溶液のバッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができるストッパを有するバイアルであり得る）。
【０２５３】
キットは、さらに、薬学的に許容可能な緩衝剤（リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など）を含む第２の容器を含む。キットはまた、末端利用者に有用な他の材料（他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジが含まれる）を含むことができる。キットはまた、別の活性剤（例えば、抗生物質）を含む第２または第３の容器を含むことができる。
【０２５４】
キットはまた、化膿連鎖球菌に対する免疫の誘導方法または化膿連鎖球菌感染の処置方法についての書面での指示を含む添付文書を含むことができる。添付文書は、未承認の添付文書であり得るか、食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認された添付文書であり得る。
【０２５５】
本開示で引用した全ての特許、特許出願、および参考文献は、特に、本明細書中で参考として援用される。上記開示は、一般に、本発明を説明する。以下の特定の実施例を参照して、本発明をより完全に理解することができる。これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０２５６】
（実施例１）
溶血アッセイ
Ｓｐｙ０１６７またはＳｐｙ０１６７変異体の段階希釈物を、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを用いて、Ｕ字形底の９６ウェルプレートに調製する。１ｍｌのヒツジ血液を、ＰＢＳ中で３回洗浄し（３０００×ｇの遠心分離で）、血球を５ｍｌのＰＢＳに懸濁する。等容積の懸濁物を、５０μｌの各毒素希釈物に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。Ｔｒｉｔｏｎ（２％）水溶液を用いて１００％溶血を得、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用する。その後、プレートを１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を９６ウェル平底プレートに慎重に移す。吸光度を５４０ｎｍで読み取る。１溶血単位（ＨＵ）は、血球を２％Ｔｒｉｔｏｎを用いて処理して得られる最大溶解の５０％を得るのに必要とされるＳｐｙ０１６７またはＳｐｙ０１６７変異体の量と定義される。
【０２５７】
（実施例２）
Ｓｐｙ０１６７変異体抗原のインビボ毒性の評価
抗原の静脈内注射。ＰＢＳ中の野生型または変異体Ｓｐｙ０１６７抗原のどちらかの溶液を、ＰＢＳ＋２ｍＭ  ＤＴＴの溶液に希釈し、次に１００ｍｌをマウスの尾静脈に注射する。マウスを２〜３日間観察する。野生型Ｓｐｙ０１６７を注射すると、典型的には数分以内に死亡する。
【０２５８】
インビボの致死性阻害アッセイ。免疫血清により媒介される致死性阻害のために、１０μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＤＴＴ中１００μｇ／ｍｌの溶液）を、抗Ｓｐｙ０１６７血清またはコントロール血清（アジュバントのみで免疫されたマウスから得られる）のいずれかと共に室温で「転倒」回転させながら２０分間インキュベートする。インキュベーション後、試料を尾静脈への静脈内注射によってマウスに接種する。マウスを２〜３日間観察する。
【０２５９】
インビボの急性毒性。インビボの急性毒性は、ポジティブコントロールとして１０μｇ／マウスの用量の野生型Ｓｐｙ０１６７、ネガティブコントロールとしてフロイントアジュバントのみの注射を用いて評価する。１０μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７を、野生型Ｓｐｙ０１６７抗血清かまたはコントロール血清のいずれかと共にインキュベートし、上記のようにマウスに接種する。
【０２６０】
（実施例３）
Ｓｐｙ０４１６タンパク質分解活性の不活化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＩＬ−８を野生型Ｓｐｙ０４１６またはＳｐｙ０４１６変異体と共にインキュベートする。インキュベーション混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、銀染色により顕色化する。野生型Ｓｐｙ０４１６は２つのバンド：８ｋＤａ（活性型）および６ｋＤａ（不活性切断ＩＬ−８）を放出する。Ｓｐｙ０４１６変異体は１バンドのみを放出し、このバンドは、コントロール反応（酵素なし）と同じく、切断されていないＩＬ−８に対応する。
【０２６１】
ＥＬＩＳＡ。ＩＬ−８を、３つの異なる濃度で、野生型Ｓｐｙ０４１６またはＳｐｙ０４１６変異体と共にインキュベートし、インキュベーション混合物を、サイトカインに特異的であるが、切断された不活性型を認識することはできない抗体を使用して、切断されていないＩＬ−８の存在について試験する。その結果は、０時間、８時間および２４時間反応後の切断されていないＩＬ−８の割合として表され、以下の通りに計算した。
【０２６２】
【化１１】
2015038156.tif 000021
式中、「コントロール混合物」は、時点０での酵素を含まない反応混合物である。
【０２６３】
（実施例４）
ＧＡＳ抗原の防御能力
ＧＡＳ抗原を使用して、マウスを免疫化し、ＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を与えるその能力を試験する。抗原を、０日目、２１日目、および３５日目に、任意選択でアジュバントと共に、腹腔内投与する。血液試料を、３回目の免疫化の２週間後に採取する。次に、マウスをＧＡＳ菌株（例えば、５０μｌ中ＧＡＳ菌株３３４８  Ｍ１の１０８ｃｆｕ）を用いて鼻腔内チャレンジする。生存を１０〜１４日間モニターする。
【０２６４】
（実施例５）
Ｓｐｙ０４１６抗体によるＳｐｙ０４１６媒介ＩＬ−８切断の用量依存的阻害
Ｓｐｙ０４１６の野生型および不活性変異体に特異的な抗血清は、ＣＤ１マウスを精製された組換えタンパク質で免疫化することにより作製する。ＩＬ−８（１０μｇ／ｍｌ）を、Ｓｐｙ０４１６抗血清と共にもしくはそれなしで（１対５０および１対５０００）、または野生型Ｓｐｙ０４１６に対して産生されたモノクローナル抗体と共に、野生型Ｓｐｙ０４１６と２つの異なる条件：（１）８時間インキュベーション、０．１μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６、および（２）２４時間インキュベーション、０．０５μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６でインキュベートする。次に、インキュベーション混合物を、ＥＬＩＳＡにより切断されていないＩＬ−８の存在について試験する。結果は、Ｓｐｙ０４１６抗血清またはモノクローナル抗体によるＳｐｙ０４１６媒介ＩＬ−８切断の用量依存的阻害を実証している。
【０２６５】
（実施例６）
野生型または変異体Ｓｐｙ０１６７（Ｓｐｙ０１６７）に対する抗体によるＳｐｙ０１６７溶血の阻害
５０ｎｇ／ｍｌ（３．５ＨＵ）の毒素を使用して、Ｓｐｙ０１６７溶血活性の５０％減少を得るのに必要とされる抗体力価をアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、ミョウバン、またはＭＦ５９（商標））を使用して試験する。アジュバントのみはネガティブコントロールとして使用する。
【０２６６】
（実施例７）
皮下チャレンジモデルにおけるＧＡＳ抗原の組み合わせの防御能力
マウスを、単一ＧＡＳ抗原（Ｓｐｙ０１６７、Ｓｐｙ０４１６、もしくはＳｐｙ０２６９）を用いてまたはＧＡＳ抗原ＧＡＳの組み合わせ（Ｓｐｙ０１６７＋Ｓｐｙ０４１６＋Ｓｐｙ０２６９；もしくはＳｐｙ０４１６＋Ｓｐｙ０２６９）を用いて免疫化した。次に、マウスを、皮膚病変を引き起こすＧＡＳのＳＦ３７０  Ｍ１株に皮下感染させた。ＧＡＳ抗原または抗原組み合わせの防御効果は、病変のサイズを測定することにより決定した。
【０２６７】
このモデルでは、これらのＧＡＳ抗原のいずれかを単独で使用することにより得られる防御効果と比べて、Ｓｐｙ０１６７＋Ｓｐｙ０４１６＋Ｓｐｙ０２６９の組み合わせまたはＳｐｙ０４１６＋Ｓｐｙ０２６９の組み合わせを使用することにより相乗的防御効果が得られる。実際、試験された組み合わせにより与えられる防御効果は、ＧＡＳ  Ｍ１タンパク質を使用して与えられる防御効果に匹敵する。図１を参照のこと。
【０２６８】
（実施例８）
変異体ＧＡＳ抗原の組み合わせの防御能力
ＧＡＳの様々な株を用いた鼻腔内チャレンジに対するＧＡＳ変異体抗原（Ｓｐｙ０１６７変異体抗原Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦおよびＳｐｙ０４１６変異体抗原Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ）の組み合わせの防御能力を、基本的に実施例４に記載される通りに試験した。結果は表２に示している。
【０２６９】
【表２−１】
2015038156.tif 000022
（実施例９）
Ｓｐｙ０４１６変異体の調製
Ｃ５ａプロテアーゼとの比較により、推定的にプロテアーゼの触媒部位の構成要素となるＳｐｙ０４１６中の３つのアミノ酸：Ｄ１５１、Ｈ２７９およびＳ６１７を同定した。前記酵素の不活型を得るために、アミノ酸変化Ｄ１５１Ａおよび／またはＳ６１７Ａをもたらすヌクレオチド置換を、オーバーラッピング伸張ＰＣＲによるスプライシング（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によりＳｐｙ０４１６コード配列に導入した。
【０２７０】
置換体Ｄ１５１Ａ
３つのＰＣＲ反応を実施した。
【０２７１】
【表２−２】
2015038156.tif 000023
次に、ＰＣＲ産物３を、Ｎｄｅ−ＳａＩで消化し、その同じ酵素で消化されたｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓに導入した。正確なインフレーム置換体（ｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓ＿Ｄ１５１Ａ）を含有するクローンをＤＮＡシーケンシングにより選択した。
【０２７２】
置換体Ｓ６１７Ａ
３つのＰＣＲ反応を実施した。
【０２７３】
【表２−３】
2015038156.tif 000024
次に、ＰＣＲ産物６をＳａＩ−Ｘｈｏで消化し、その同じ酵素で消化されたｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓに導入した。正確なインフレーム置換体（ｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓ＿Ｓ６１７Ａ）を含有するクローンを、ＤＮＡシーケンシングにより選択した。
【０２７４】
置換体Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７Ａ
ＰＣＲ産物６をＳａＩ−Ｘｈｏで消化し、その同じ酵素で消化されたｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓ＿Ｄ１５１Ａに導入した。ＤＮＡシーケンシングにより、正確なインフレーム置換体（ｐＥＴ２１＿５７ｈｉｓ＿Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７Ａ）を含有するクローンを選択した。
【０２７５】
単一変異タンパク質および二重変異タンパク質を発現させ、３つのクロマトグラフィー工程：イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して精製した。
【０２７６】
（実施例１０）
点変異Ｄ１５１Ａは、Ｓｐｙ０４１６タンパク質分解活性を不活化する
Ｓｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａを、組換えＨｉｓタグ付きタンパク質として発現させた。２種類のアッセイは、この変異体がＩＬ−８を切断する能力を失っていることを実証した。
【０２７７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＩＬ−８を、野生型Ｓｐｙ０４１６またはＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａと共にインキュベートした。インキュベーション混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、銀染色により顕色化した。結果は図１２に示している。野生型Ｓｐｙ０４１６（レーン２および３）は、２つのバンド：８ｋＤａ（活性型）および６ｋＤａ（不活性切断ＩＬ−８）を放出した。これとは対照的に、Ｓｐｙ０４１６  Ｄ１５１Ａ変異体は１つのバンドのみを放出し、このバンドはコントロール反応（酵素なし）の場合と同様に、切断されていないＩＬ−８に対応していた。
【０２７８】
ＥＬＩＳＡ
ＩＬ−８を、３つの異なる濃度で野生型Ｓｐｙ０４１６またはＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａと共にインキュベートし、インキュベーション混合物を、サイトカインに特異的であるが切断された不活性型を認識することはできない抗体を使用して、切断されていないＩＬ−８の存在について試験した。その結果は図４に示しており、０時間、８時間および２４時間反応後の切断されていないＩＬ−８の割合として表され、以下の通りに計算した。
【０２７９】
【化１２】
2015038156.tif 000025
「コントロール混合物」は、時点０での酵素のない反応混合物である。
【０２８０】
図３に示しているように、野生型Ｓｐｙ０４１６は、低濃度でも８時間後にはＩＬ−８をほぼ完全に不活化したが、変異酵素で処理されたＩＬ−８では不活化は観察されなかった。
【０２８１】
（実施例１１）
Ｓｐｙ０４１６変異体Ｓ６１７ＡおよびＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７ＡはＩＬ−８を切断しない
Ｓｐｙ０４１６変異体Ｓ６１７ＡおよびＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ＋Ｓ６１７ＡをＨｉｓタグ付きタンパク質として発現させ、実施例２に記載される通りにＩＬ−８不活化実験において試験した。
【０２８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＩＬ−８を、野生型Ｓｐｙ０４１６（Ｈｉｓタグ付きもしくはタグなし）、またはＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ、Ｓ６１７ＡおよびＤ１５１ＡＳ＋Ｓ６１７Ａのそれぞれと共に２４時間インキュベートした。インキュベーション混合物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、銀染色により顕色化した。２つの実験の結果は図４Ａおよび４Ｂに示している。Ｓｐｙ０４１６  Ｓ６１７Ａ変異体とＧＡＳ  Ｄ１５１＋Ｓ６１７Ａ変異体いずれも、野生型Ｓｐｙ０４１６の１００倍の濃度でも、ＩＬ−８を切断することはできない。
【０２８３】
ＥＬＩＳＡ
同じ試料を使用してＥＬＩＳＡアッセイを実施し、単一アミノ酸置換および二重アミノ酸置換がＩＬ−８を切断するＳｐｙ０４１６の能力を除去することを確認した。結果は、図５に示しているが、野生型Ｓｐｙ０４１６により放出される２０〜４０％に比べて、変異体が２４時間インキュベーション後切断されていないＩＬ−８を１００％放出することを実証している。
【０２８４】
（実施例１２）
Ｓｐｙ０４１６変異体の防御能力は野生型Ｓｐｙ０４１６を用いて得られる防御能力に類似している
Ｓｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１ＡおよびＤ１５１Ａ＋Ｓ６１７Ａを使用してマウスを免疫化し、野生型Ｓｐｙ０４１６と比べた、ＧＡＳの致死的チャレンジに対する防御を提供するその能力を試験した。２つの実験（それぞれ２０マウス）の結果を下に要約しており平均生存率（％）として表している。
【０２８５】
【表３】
2015038156.tif 000026
（実施例１３）
精製された不活性変異体は、２つの非共有結合タンパク質フラグメントの形態でのみ存在する野生型Ｓｐｙ０４１６と比べると単一ペプチドとして出現する
野生型Ｓｐｙ０４１６は、主に２つのフラグメント、すなわち約２３ｋＤａのフラグメントおよび１５０ｋＤａのフラグメントの形態で得られる。前記２つのフラグメントは、Ｎｉキレートアフィニティ精製においてまたはゲル濾過により分離されることはないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では２つの異なるバンドとして出現する（図６）。Ｎ末端シーケンシングによれば、２３ｋＤａフラグメントはＳｐｙ０４１６のＮ末端部分（配列番号５０のアミノ酸３４〜２４４）であり、１５０ｋＤａフラグメントはＣ末端領域（配列番号５０のアミノ酸２４５〜１６０３）であることが確証された。
【０２８６】
野生型Ｓｐｙ０４１６とは対照的に、本発明のＳｐｙ０４１６変異体は、さらに高分子量（１７４ｋＤａ）のタンパク質として得られ、２３ｋＤａのバンドは存在しない（図７参照、部分的に精製された野生型Ｓｐｙ０４１６およびＳｐｙ０４１６変異体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした実験の結果が示している）。
【０２８７】
（実施例１４）
ポリクローナル抗血清によるＳｐｙ０４１６媒介ＩＬ−８切断の用量依存的阻害
Ｓｐｙ０４１６の野生型および不活性変異体に特異的なマウス抗血清を、ＣＤ１マウスを精製された組換えタンパク質で免疫化することにより作製した。
【０２８８】
ＩＬ−８（１０μｇ／ｍｌ）を、Ｓｐｙ０４１６抗血清と共にまたはそれなしで（１対５０および１対５０００）野生型Ｓｐｙ０４１６と、２つの異なる条件：（１）８時間インキュベーション、０．１μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６、および（２）２４時間インキュベーション、０．０５μｇ／ｍｌのＳｐｙ０４１６でインキュベートした。次に、インキュベーション混合物を、ＥＬＩＳＡにより切断されていないＩＬ−８の存在について試験した。図８Ａおよび８Ｂに示される結果は、マウス抗血清によるＳｐｙ０４１６媒介ＩＬ−８切断の用量依存的阻害を実証した。
【０２８９】
（実施例１５）
野生型および変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質のクローニング
野生型および変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質をコードする遺伝子を、表４に示されるＳＦ３７０ゲノム由来のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅した。
【０２９０】
ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩで消化し、その同じ酵素で切断されたｐｅｔ２４ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターとライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αエレクトロコンピテント細胞を前記ライゲーション反応物で形質転換した。ＬＢＰＴＫ培地を添加し、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベーションした後、細菌を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢＰＴＫプレート上に蒔いた。ポジティブコロニーをコロニーＰＣＲにより同定した。
【０２９１】
ポジティブコロニー由来のプラスミドを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢＰＴＫ培地での一晩の培養から調製し、ＤＮＡシーケンシングにより分析し、それによってＴ７ポリメラーゼプロモーター下の予想される挿入遺伝子を確認した。クローニングされた遺伝子の最終のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は配列表に示している。表５を参照のこと。
【０２９２】
【表４−１】
2015038156.tif 000027
【０２９３】
【表４−２】
2015038156.tif 000028
【０２９４】
【表４−３】
2015038156.tif 000029
【０２９５】
【表５】
2015038156.tif 000030
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）コンピテント細胞を、正確な構築物で形質転換した。ＬＢＰＴＫ培地を添加し、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで撹拌しながらのインキュベーション後、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢＰＴＫプレート上に細菌を蒔いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｅｔ２４ｂ＋Ｓｐｙ０１６７野生型タグなし細胞を２５℃で増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。クローン発現を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより検証した（タグなし、図１５Ａおよび１５Ｂ；Ｈｉｓタグ付き、図１６）。
【０２９６】
（実施例１６）
Ｈｉｓタグ付きタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉペレットを溶解緩衝液に懸濁し、室温で３０〜４０分間混合した。溶解物を、３０〜４００００×ｇで２０〜２５分間遠心分離し、上清を洗浄緩衝液Ａで平衡化したカラムにロードした（１ｍｌのＮｉ活性化キレートセファロースファストフロー樹脂を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ）。ロードされた樹脂を、洗浄緩衝液Ａで３回、洗浄緩衝液Ｂで３回洗浄した。最終２ｍＭのＤＴＴを含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて溶出緩衝液でタンパク質を溶出した。全溶出タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で定量し、その後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する（図１５および１６）。
【０２９７】
緩衝液
溶解緩衝液
１０ｍｌのＢ−ＰＥＲ（商標）（細菌タンパク質抽出試薬、Ｐｉｅｒｃｅカタログ７８２６６）
ＭｇＣｌ２  ０．１ｍＭの最終濃度
ＤＮＡｓｉ  Ｉ（ＳｉｇｍａカタログＤ−４２６３）１００ユニット
リゾチーム（ＳｉｇｍａカタログＬ−７６５１）１ｍｇ／ｍｌの最終濃度
洗浄緩衝液Ａ：５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液Ｂ：２０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
溶出緩衝液：２５０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０。
【０２９８】
（実施例１７）
タグなしタンパク質の精製
溶解物調製
約８０〜１１０ｇの細菌培養ペレットを、６錠のＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼインヒビター、１０ｍｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５（５ｍＭの最終濃度）、１０ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、８ｍｌの１００００Ｋユニット／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ溶液および１ｍｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液を追加した２００〜２８０ｍｌ  Ｂ−ＰＥＲ（商標）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）に懸濁した。細菌懸濁物を６０分間、均一な懸濁物が得られるまで振盪することによって細菌溶解を達成した。
【０２９９】
１３０００ｒｐｍ（２５４００×ｇ）での６０分間の遠心分離後、上清を０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、１．８〜１．９ｍＳ伝導率が得られるまでＨ２Ｏで希釈する。ｐＨを８．０に調整した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により決定した。
【０３００】
陰イオン交換クロマトグラフィー
上記のように処理された溶解物由来の上清を、３０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０であらかじめ平衡化したＨＰ５０／１０Ｑセファロースカラム（約２００ｍｌ）にロードした。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集した。Ｓｐｙ０１６７タンパク質を含有する画分をプールし、１０ｍＭのＮａホスフェート、ｐＨ６．８に対して透析した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により決定した。
【０３０１】
緩衝液Ａ：３０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０
緩衝液Ｂ：３０ｍＭのＴＲＩＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
平衡およびローディング：０％Ｂ
勾配：０〜２５％Ｂの５ＣＶ−２５％Ｂの２ＣＶ
洗浄：１００％Ｂ  ２ＣＶ＋３ＣＶ
流量：２０ｍｌ／分
画分容積：１４ｍｌ。
【０３０２】
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
前に得たプールを、１０ｍＭのＮａホスフェート、ｐＨ６．８であらかじめ平衡化したＣＨＴ２０カラムにロードした。フロースルーを収集した。
【０３０３】
緩衝液Ａ：１０ｍＭのＮａホスフェート、ｐＨ６．８
緩衝液Ｂ：５００ｍＭのＮａホスフェート、ｐＨ６．８
洗浄：８ＣＶ
洗浄：３０％Ｂの６ＣＶ
勾配：３０〜１００％Ｂ（１０ＣＶ）
洗浄：１００％Ｂ
流量：５ｍｌ／分
画分容積：５ｍｌ。
【０３０４】
画分アリコートを、還元条件および非還元条件下で１２％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルにロードした。Ｓｐｙ０１６７タンパク質を含む画分をプールし、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により決定した。
【０３０５】
ゲル濾過クロマトグラフィー
収集されたプールを、１０ｍｌ未満の容積を得るためのＡｍｉｃｏｎフィルターを用いて濃縮した。濃縮した材料を、少なくとも３〜４カラム容積のＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０にロードした。
【０３０６】
緩衝液：ＰＢＳ
溶出：アイソクラチック（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
流量：２．５ｍｌ／分
画分容積：５ｍｌ。
【０３０７】
Ｓｐｙ０１６７タンパク質を含む画分をプールし、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄにより決定した。タンパク質濃度のさらなる推定を、Ａｂｓ０．１％（＝１ｇ／ｌ）を１．１１９とみなすＵＶ測定により行った。タンパク質純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する（図１８）。
【０３０８】
（実施例１８）
溶血アッセイ
定量的溶血アッセイについてのプロトコール
毒素の段階希釈物を、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを使用して、Ｕ字形底の９６ウェルプレートに調製した。１ｍｌのヒツジ血液をＰＢＳ中で３回洗浄し（３０００×ｇで遠心分離して）、血球細胞を５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。等容積の懸濁物を５０μｌの各毒素希釈物に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｔｒｉｔｏｎ（２％）水溶液を使用して１００％溶血を得、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。次に、プレートを１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を９６ウェル平底プレートに慎重に移した。吸光度は５４０ｎｍで読み取った。
【０３０９】
野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを含むＥ．ｃｏｌｉ抽出物の比較
Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌをコードする遺伝子を、ＳＦ３７０  Ｍ１ゲノムからＰＣＲを使用して増幅し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥ３における発現を可能にするベクターｐＥＴ２１ｂ＋へクローニングした。類似した量の野生型および変異型ストレプトリジンＯタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉの可溶性抽出物（図１２参照）を使用して、溶血アッセイを実施し、その２つの抗原の細胞溶解特性を比較した。アッセイの結果は図９に示しており、変異型タンパク質は、毒性が野生型の多くとも１００分の１であることを実証している。
【０３１０】
精製された野生型Ｓｐｙ０１６７とＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌの比較
Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ変異体を、Ｈｉｓタグ付き組換えタンパク質についての精製標準手順に従って精製した（図１０）。様々な濃度の精製されたｗｔおよび変異型タンパク質を使用して、溶血アッセイを繰り返し、これにより細胞溶解活性の減少を確認した（図１１）。
【０３１１】
Ｈｉｓタグ付きおよびタグなし野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌを含むＥ．ｃｏｌｉ抽出物の溶血活性
本発明者らは、Ｈｉｓタグなしの野生型組換えＳｐｙ０１６７（ｒＳｐｙ０１６７）（ＢＬ２１  ＤＥ３、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｎｏ．７１３８２−ｐＥＴ２４）およびＨｉｓタグなしＰ４２７Ｌ変異体ｒＳｐｙ０１６７（ＢＬ２１  ＤＥ３、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｎｏ．７１３８２−ｐＥＴ２４）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ溶解物の溶血活性を比較した。挿入なしのｐＥＴ２４で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ
Ｎｏ．７１３８２）をネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールは、水中２％Ｔｒｉｔｏｎを含む低張性液であった。ネガティブコントロールはタンパク質希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）であった。
【０３１２】
溶血については、上清の５４０ｎｍ（Ａ５４０ｎｍ）における吸光度を測定することにより決定した。力価を、最大Ａ５４０ｎｍの５０％を有する希釈度（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として計算した。
【０３１３】
結果は、表６および７にならびに図１３に示している。これらのデータから、同じ条件下で、変異体Ｐ４２７Ｌが野生型Ｓｐｙ０１６７の１０００分の１の溶血性であることが実証される。
【０３１４】
【表６】
2015038156.tif 000031
【０３１５】
【表７】
2015038156.tif 000032
野生型Ｓｐｙ０１６７と様々なＳｐｙ０１６７変異体の比較
野生型Ｓｐｙ０１６７の溶血活性を、いくつかの異なるＳｐｙ０１６７変異体の溶血活性と比較した。結果は図２０および下の表８に示している。１溶血単位（ＨＵ）は、血球を２％Ｔｒｉｔｏｎで処理して得られた最大溶解の５０％を得るために必要とされる毒素量として定義される。
【０３１６】
【表８】
2015038156.tif 000033
タンパク質純度の違いによって、太字で示される変異体の溶血単位／ｍｇは過剰に見積もられている（ｏｖｅｒｅｓｔｉｍａｔｅ）；しかしながら、（１）変異体Ｗ５３５Ｆは変異体Ｃ５３０Ｇよりも溶血性が低いこと；（２）変異体Ｐ４２７Ｌは野生型の約１０００分の１の溶血性であり、他の２つの変異体Ｗ５３５ＦおよびＣ５３０Ｇの約６分の１〜２５分の１の溶血性であること；ならびに（３）変異体Δ２４８は野生型よりも確実に溶血性が低いことは明らかである。
【０３１７】
コレステロールの効果
３０℃での細胞増殖、および２５℃での１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導、およびＯＤ６００ｎｍ約０．４〜０．６の後に得られた、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物またはコレステロール２００ｍｇ／ｍｌを含むＥ．ｃｏｌｉ溶解物のＰＢＳ−ＢＳＡ０．５％における２〜５倍段階希釈物を、それらの溶血活性についてアッセイした。誘導の３時間後、溶解緩衝液（Ｂ−ＰＥＲ溶液−ＰＩＥＲＣＥ）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００Ｋユニット／ｍｌのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）およびリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）で３０〜４０分間細菌を溶解することにより得られた等容積のタンパク質調製物で、ＰＢＳ中２％ヒツジ赤血球溶液の５０マイクロリットルを処理した。その後、不溶性画分を遠心分離し（１５分間、２１０００×ｇ、４℃）、上清（Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物）を、最終濃度５ｍＭでＤＴＴを含有する新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。
【０３１８】
この条件下で、コレステロールは、１００倍希釈率が使用されるまで、野生型Ｓｐｙ０１６７も変異体Ｓｐｙ０１６７も阻害しなかった。したがって、変異体誘導溶解への効果は全くなかった。対照的に、野生型誘導溶解は大幅に低下した。ネガティブコントロールによって誘導された溶解はコレステロールの影響を受けず、そのことにより、コレステロール誘導性阻害が特異的であることが示唆される。表９および図１４を参照のこと。
【０３１９】
【表９】
2015038156.tif 000034
（実施例１９）
溶血の阻害
プロトコール
（アジュバントを含まない、またはアジュバントとしてミョウバンもしくはＭＦ５９（商標）を含む）野生型または変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質で免疫化したマウス由来の血清の段階２倍希釈物を、Ｕ字形底の９６ウェルプレートでＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを用いて、調製した。必要に応じて、ＰＢＳでまたはアジュバントのみで免疫化したマウスの血清をネガティブコントロールとして使用した。ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中の５０〜１００ｎｇ／ｍｌ（３．５〜７  ＨＵ）の毒素溶液を等容積加え、プレートを撹拌（８００ｒｐｍ）しながら、室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、この溶液の５０ｍｌを新しい９６ウェルプレートに移し、（ＰＢＳで３回洗浄した）等容積のヒツジ赤血球懸濁物を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートを１０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を９６ウェル平底プレートに慎重に移し、吸光度を５４０ｎｍで読み取った。下記の結果では、阻害力価は、Ｔｒｉｔｏｎ誘導溶血を５０％低下させた血清希釈度として表される。
【０３２０】
野生型Ｓｐｙ０１６７抗血清によるＳｐｙ０１６７溶血の阻害
抗野生型Ｓｐｙ０１６７抗血清によるＳｐｙ０１６７溶血の阻害は、図２１〜２３および表１０〜１２に示している。抗Ｓｐｙ０１６７血清力価は、１／７，０００〜１／１４，０００の間に含まれる（相加平均、１／１２，１６７±２，７１４）。ネガティブコントロール血清（フロイントアジュバント）力価は、１／３７５と１／４，０００との間に含まれる（相加平均、１／１，８５４±１，３８４）。
【０３２１】
【表１０】
2015038156.tif 000035
【０３２２】
【表１１】
2015038156.tif 000036
【０３２３】
【表１２】
2015038156.tif 000037
野生型Ｓｐｙ０１６７、化学的に解毒された野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体の溶血活性の力価測定
野生型Ｓｐｙ０１６７、化学的に解毒された野生型Ｓｐｙ０１６７およびＳｐｙ０１６７変異体（Ｐ４２７Ｌ；Ｐ４２７Ｌ＋Ｗ５３５Ｆ）の溶血活性の力価測定は表１３に示している。
【０３２４】
【表１３】
2015038156.tif 000038
変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質に対する抗血清によるＳｐｙ０１６７溶血の阻害
変異体Ｓｐｙ０１６７タンパク質に対する抗血清によるＳｐｙ０１６７溶血の阻害は、図２７〜２９および表１４〜１６に示している。５０ｎｇ／ｍｌ（３．５  ＨＵ）の毒素を使用して、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｗ５３５−Ｐ４２７ＬについてのＳｐｙ０１６７溶血活性の５０％低下を得るために必要とされる血清希釈度は、ミョウバンアジュバントを使用して１／１７，８６０であり、ＭＦ５９（商標）アジュバントを使用して１／７９９１である。ネガティブコントロール（アジュバントのみ）力価は１／１，０００（ミョウバン）および１／１２５（ＭＦ５９（商標））である。
【０３２５】
【表１４】
2015038156.tif 000039
【０３２６】
【表１５】
2015038156.tif 000040
【０３２７】
【表１６】
2015038156.tif 000041
（実施例２０）
インビボ防御実験
精製されたＳｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌタンパク質を、フロイントアジュバントと共に、４０匹のマウスへ腹腔内投与した。その後、３３４８Ｍ１  ＧＡＳ菌株でマウスを鼻腔内でチャレンジした。表１７は３つの別々の実験で得られたデータを報告し、１００％防御がすべての実験で一貫して達成されたことを示している。
【０３２８】
【表１７】
2015038156.tif 000042
１０〜２０匹のマウスの群を２０μｇの組換えタンパク質で、０日目、２１日目および３５日目に免疫化した。ネガティブコントロール群のマウスについては、使用されるＧＡＳ組換えタンパク質のバージョンに依存して、ＧＳＴのみかまたはＥ．ｃｏｌｉ夾雑物かのいずれかで免疫化した。３回目の免疫化の２週間後、血液試料を採取した。２〜３日後、免疫化マウスを、１０８ｃｆｕ（５０μｌ）のＭ１  ３３４８ＧＡＳ菌株で鼻腔内でチャレンジした。マウスの生存を１０〜１４日間モニターした。異なる群から得られた免疫血清を、Ｓｐｙ０１６７組換えタンパク質全体に対する免疫原性について試験した（ウェスタンブロット分析）。結果は表１８および１９に示している。
【０３２９】
【表１８】
2015038156.tif 000043
【０３３０】
【表１９】
2015038156.tif 000044
（実施例２１）
インビボの毒性試験
プロトコール
Ｓｐｙ０１６７の静脈内注射。野生型または変異体Ｓｐｙ０１６７のいずれかのＰＢＳ中の溶液を、ＰＢＳ＋２ｍＭ  ＤＴＴの溶液中に希釈し、その後、マウスの尾静脈に１００ｍｌを注射する。マウスを２〜３日間観察する。野生型Ｓｐｙ０１６７の注射は、典型的には数分以内で死をもたらす。
【０３３１】
インビボの致死性阻害アッセイ。免疫血清により媒介される致死性阻害のために、１０μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７（ＰＢＳ、２ｍＭのＤＴＴ中１００μｇ／ｍｌの溶液）を、抗Ｓｐｙ０１６７血清か、またはコントロール血清（アジュバントのみで免疫化したマウスから得られる）のいずれかと共に室温で２０分間、撹拌しながらインキュベートする。インキュベーション後、その試料を尾静脈への静脈内注射によりマウスに接種する。マウスを２〜３日間観察する。
【０３３２】
野生型Ｓｐｙ０１６７および変異体Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆの結果は表２０に示している。
【０３３３】
【表２０】
2015038156.tif 000045
急性のインビボの急性毒性を、ポジティブコントロールとして１０μｇ／マウスの用量の野生型Ｓｐｙ０１６７およびネガティブコントロールとしてフロイントアジュバントのみの注射を使用して評価した。１０μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７を、野生型Ｓｐｙ０１６７抗血清かまたはコントロール血清のいずれかと共にインキュベートし、上記のようにマウスに接種した。結果は表２１に示している。
【０３３４】
【表２１】
2015038156.tif 000046
上記の通りに実施されたもう一組の実験結果は表２２および２３に示す。インビボの急性毒性を、５μｇ／マウスまたは１０μｇ／マウスのいずれかの野生型Ｓｐｙ０１６７を使用して評価した。特に、１０μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７については、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆで免疫化したマウス由来の血清かまたはＰＢＳのみ（血清なし）のいずれかとあらかじめインキュベートした。加えて、５μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７については、Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆで免疫化されたマウス由来の血清またはネガティブコントロール血清としてＰＢＳプラスアジュバント（ミョウバン）で免疫化したマウス由来の血清のいずれかとあらかじめインキュベートした。
【０３３５】
結果は、野生型Ｓｐｙ０１６７の致死用量は、抗Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆ血清により中和されるが、同じ希釈度でのネガティブコントロール血清によっては中和されないことを示している。
【０３３６】
【表２２】
2015038156.tif 000047
【０３３７】
【表２３】
2015038156.tif 000048
（実施例２２）
Ｓｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆでの免疫化は野生型Ｓｐｙ０１６７の静脈内注射からマウスを防御する
マウスに、野生型Ｓｐｙ０１６７かまたはＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆのいずれかで、アジュバントとしてミョウバンを使用して（２ｍｇ／ｍｌ水酸化アルミニウム中２０μｇのタンパク質）、腹腔内に３回（０日目、２１日目および３５日目）免疫処置を行った。アジュバントのみで免疫化したマウスをネガティブコントロールとして使用した。５５日目に、マウスに、ＰＢＳ、２ｍＭ  ＤＴＴ中の様々な濃度の野生型Ｓｐｙ０１６７の溶液を静脈内注射し、少なくとも７２時間モニターした。結果は表２４に示している。
【０３３８】
【表２４】
2015038156.tif 000049
５μｇ／マウスの野生型Ｓｐｙ０１６７は、アジュバントのみで免疫化したマウスには致死的であり、これらのマウスはＳｐｙ０１６７注射から数分以内に死亡した。しかし、２０μｇ／マウスの同じ野生型Ｓｐｙ０１６７調製物においてさえ、野生型Ｓｐｙ０１６７またはＰ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆ  Ｓｐｙ０１６７変異体のいずれかで免疫化されたマウスは死亡しなかった。
【０３３９】
（実施例２３）
ＧＡＳ  Ｍ１株を用いた鼻腔内チャレンジに対するＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆによる防御
３０匹のマウスを、Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆで、アジュバントとしてのミョウバンまたはＭＦ５９のいずれかと共に、腹腔内で免疫化し、ＧＡＳ  Ｍ１株で鼻腔内チャレンジした。結果は図３０に示している。Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５Ｆとミョウバンで免疫化されたマウスの７７％は、ネガティブコントロールマウス（アジュバントのみで免疫化された）の３％と比べて、ＧＡＳ  Ｍ１株での鼻腔内チャレンジから防御された。Ｓｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ−Ｗ５３５ＦとＭＦ５９で免疫化されたマウスの９０％は、ネガティブコントロールマウス（アジュバントのみで免疫化された）の１０％と比べて、ＧＡＳ  Ｍ１株での鼻腔内チャレンジから防御された。これらの防御レベルは、野生型Ｓｐｙ０１６７でマウスを免疫化することにより得られる防御レベルに匹敵する。
【０３４０】
（実施例２４）
ＧＡＳ抗原で免疫されたマウスのインビボ防御研究
本実施例は、異なるＭ型のＧＡＳ菌株を用いたチャレンジが続く、ＧＡＳ抗原の様々な組み合わせおよび／またはＣＲＭ１９７（ＧＣ）と結合体化されたＧＡＳ特異的多糖を用いて実施した免疫原性／防御試験の結果を提供する。ＧＡＳタンパク質およびＧＣは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、またはＭＦ５９のいずれかと共に処方した。タンパク質抗原の用量は、単独で使用される場合は２０μｇであり、タンパク質組み合わせ処方物は、野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）およびＳｐｙ０４１６  Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）をそれぞれ２０μｇならびにＳｐｙ０６１７  Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）を１０μｇ含有していた。ＧＣ用量は表に示している。
【０３４１】
免疫スケジュールは、０日目、２１日目および３５日目の３用量を含んだ。放血は最初の免疫化前および３回目の免疫化の２週間後に行った。ネガティブコントロール群はアジュバントのみで免疫化した。ポジティブコントロール群は、チャレンジ株に相同なＭタンパク質で免疫化した。
【０３４２】
３回目の免疫化の２週間後、マウスを、使用されるチャレンジ株に応じて、２．５×１０６から２．５×１０８（鼻腔内感染）または２０から２．５×１０６（腹腔内感染）の範囲の致死的用量に感染させた。生存率を決定し、表２５および２６に報告している。ｐ値はフィッシャー検定を用いて計算した。
【０３４３】
免疫原性はＥＬＩＳＡにより試験した。
【０３４４】
Ｍ１、Ｍ１２、およびＭ２３での鼻腔内感染に対するフロイントアジュバント中の単一抗原およびその組み合わせによる防御
表２５は、マウスを、フロイントアジュバントと共に処方したＳｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０４１６  Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）、もしくはＳｐｙ０６１７  Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、またはこれらの抗原の組み合わせ（「コンボ」）で免疫化し、次に、Ｍ１、Ｍ１２およびＭ２３株で鼻腔内でチャレンジした実験の結果を報告している。結果は、
ａ．Ｓｐｙ０２６９は、Ｍ１、Ｍ１２およびＭ２３感染に対して統計的に有意な防御を与える；
ｂ．Ｓｐｙ０４１６  Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７ＡおよびＳｐｙ０６１７  Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５ＦはＭ１血清型での鼻腔内感染に対して顕著な防御を与える、ならびに、
ｃ．Ｓｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６  Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７ＡおよびＳｐｙ０６１７  Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆの組み合わせは、Ｍ１、Ｍ１２およびＭ２３ＧＡＳ血清型に対して４０％を超える防御を与える
ことを示している。
【０３４５】
【表２５】
2015038156.tif 000050
Ｍ１での腹腔内感染に対するミョウバンと共に処方したＧＡＳ２５、ＧＡＳ４０、およびＧＡＳ５７抗原プラスＧＣの組み合わせによる防御
表２６は、マウスを、ミョウバンと共に処方したＧＣを伴なうかまたはそれなしでのＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ、野生型Ｓｐｙ０２６９、およびＳｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａの組み合わせ（「コンボ」）で免疫化し、次に、Ｍ１で腹腔内チャレンジした実験の結果を報告している。結果は、タンパク質の組み合わせだけでもタンパク質の組み合わせプラスＧＣでも統計的に有意な防御が得られたことを示している。したがって、組み合わせにおいてでさえ、これらのＧＡＳ抗原の並はずれた免疫原性が維持されている。
【０３４６】
【表２６−１】
2015038156.tif 000051
（実施例２５）
細胞結合アッセイ
ヒト（Ａ５４９、ＨｅＬａ、２９３、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＥ１８０）またはサル（ＬＬＣＭＫ２）上皮細胞系統を、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を使用してその担体から非酵素的に引き離し、収集し、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁する。ほぼ２×１０５細胞を、Ｕ字形底の９６ウェルプレートで、培地のみと、または様々なＳｐｙ０２６９組換えタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の培地と２００ｍｌの全容積で混合する。４℃でのインキュベーションを１時間実施する。ＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞をＳｐｙ０２６９抗体または抗血清（例えば、抗血清は；ＰＢＳ／ＢＳＡ１％中１対２００）と共に４℃で１時間インキュベートする。２回の洗浄後、試料を、二次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする（例えば、マウスＳｐｙ０２６９抗血清では、二次抗体は、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％中１対１００に希釈されたマウス免疫グロブリンに特異的なＲ−フィコエリトリン−結合体化ヤギＦ（ａｂ）２抗体であり得る）。結合反応はフローサイトメトリーにより分析する。集団ごとの平均蛍光強度を計算する。
【０３４７】
（実施例２６）
オプソニン作用アッセイ
本実施例は、下の実施例において使用されるオプソニン作用アッセイを記載している。手短に言えば、細菌（１０〜５０コロニー形成ユニット、ＣＦＵ、ＰＢＳ中２５μｌ）を、アジュバントだけでまたは試験される抗原（単数または複数）でのいずれかで免疫化したウサギ由来の全血２２５μｌと共にインキュベートする。試料を３７℃で５時間、転倒回転させながらインキュベートする。希釈に続いて、試料を血液寒天プレート上に蒔き、ＣＦＵ数を評価する。
【０３４８】
このアッセイでは、アジュバントだけで免疫化した動物由来の血清によるバックグラウンド死滅は７〜３６％の範囲である。抗原による死滅活性は様々であるが、一貫してポジティブである（例えば、Ｍ１抗体では７２〜９７％、ＧＣ抗体では４７〜６４％、ならびに野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）およびＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）の組み合わせに対して産生された抗体では７６〜８５％）。
【０３４９】
（実施例２７）
抗複合糖質（ＧＣ）抗体がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの死滅を媒介することを実証する全血殺菌アッセイ
実施例２６に記載されるアッセイは、１００μｇＧＣで免疫化したウサギから得られた全血を使用して実施した。その結果は、図３４に示しているが、抗ＧＣ抗体がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの死滅を媒介することを実証している。
【０３５０】
（実施例２８）
抗複合糖質（ＧＣ）抗体とＧＡＳ抗原組み合わせに対して産生された抗体との組み合わせがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの死滅を増強することを実証する全血殺菌アッセイ
実施例２６に記載されるアッセイは、（ａ）フロイントアジュバント、（ｂ）Ｍ１タンパク質、（ｃ）野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）およびＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）（それぞれ１００μｇ）の組み合わせ、（ｄ）ＧＣ、ならびに（ｅ）野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、Ｓｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）およびＧＣの組み合わせで免疫化されたウサギから得られた全血を用いて実施した。結果は図３５に示している。
【０３５１】
ＧＡＳワクチンは殺菌性および免疫原性であることが望ましい。これらの結果は、組み合わせにおいてさえ、これらのＧＡＳ抗原が殺菌活性を有することを実証している。前記結果はまた、ＧＡＳ抗原組み合わせまたはＧＣ抗原だけのどちらの殺菌効果と比べても、ＧＡＳ抗原とＧＣ抗原との組み合わせの殺菌効果のほうが高いことも実証している。
【０３５２】
（実施例２９）
ＧＡＳ抗原の細胞毒性の欠如を実証する実験
ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）を、ＲＰＭ１  １６４０培地において様々な濃度の組換えＧＡＳ抗原を用いてインビトロで２４時間処理した。ネガティブコントロールは無処置であり（「ＮＴ」）、ＴＮＦα  １μｇ／ｍｌで処理した細胞をポジティブコントロールとして使用した。アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色を使用して、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞の割合を測定した。これらの実施例において使用された野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、Ｓｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）および複合糖質（「ＧＡＳ  ＧＣ」）の濃度では顕著な毒性はないことを結果は示している。図３６Ａ〜Ｄを参照のこと。
【０３５３】
（実施例３０）
タンパク質抗原保存および発現
下の表は、５７、４９、および１３Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株間のそれぞれＳｐｙ０２６９、Ｓｐｙ０４１６、Ｓｐｙ０１６７ごとの平均同一性割合を示している。
【０３５４】
【表２６−２】
2015038156.tif 000052
（実施例３１）
ＥＬＩＳＡアッセイ
簡単に述べると、プレートを抗原（０．１〜０．３μｇ／ウェル）でコーティングし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。試験される血清の２倍段階希釈物とのインキュベーション後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）で洗浄し、アルカリホスファターゼに結合体化された二次抗体（抗全ＩｇＧ、１対２０００）と共にインキュベートする。基質のｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ、３μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、吸光度を４０５ｎｍで測定する。血清力価を、標準曲線からＯＤを内挿することにより計算する。図３７Ａ〜Ｄに示されるように、このアッセイは線形であり再現性がある。
【０３５５】
（実施例３２）
インビボチャレンジ実験
５〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、０日目、２１日目、および３５日目に３回、ＰＢＳ中のミョウバンをアジュバントとする様々な用量のＧＡＳ抗原で腹腔内で免疫化し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの様々な菌株で、鼻腔内（ＬＤ９０細菌量を含有する５０ｍｌ  Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ）または腹腔内（ＬＤ９０細菌量を含有する２００μｌ  Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ）のいずれかでチャレンジした。結果は表２７および２８に示している。表２７および２８では、「４０」、「２５」、および「５７」はそれぞれ野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、およびＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）である。
【０３５６】
【表２７】
2015038156.tif 000053
【０３５７】
【表２８】
2015038156.tif 000054
（実施例３３）
ミョウバンの含有は菌株Ｍ１  ３３４８に対する防御を与える
本実施例は、Ｓｐｙ０１６７と組み合わせ処方物の両方におけるミョウバンの含有がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株Ｍ１  ３３４８に対する防御を与えることを実証している。
【０３５８】
５〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、Ｓｐｙ０１６７（ＧＡＳ２５）１０μｇでまたはＳｐｙ０１６７（１０μｇ）をＳｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０、２０μｇ）およびＳｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７、２０μｇ）と共に組み合わせて（「組み合わせ」）、ミョウバンと共にまたはそれなしで、免疫化した。動物は０日目、２１日目および３５日目の３用量で腹腔内で免疫化した。Ｍ１  ３３４８を用いた鼻腔内チャレンジは、基本的に実施例４に記載された通りに実施した。結果は表２９に示している。
【０３５９】
【表２９】
2015038156.tif 000055
（実施例３４）
ＧＡＳ抗原処方物の安定性
１００μｇ／ｍｌ  Ｓｐｙ０２６９（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ溶液）、１００μｇ  Ｓｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ溶液）、５０μｇ
Ｓｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ溶液）、２ｍｇ／ｍｌ水酸化アルミニウム、１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．０）、９ｇ／ｌ
塩化ナトリウムを含有する組み合わせＧＡＳ抗原処方物のｐＨ７．０＋／−０．３、重量オスモル濃度３００＋／−２０  ｍＯｓｍ／ｋｇでの安定性およびインビボでの効力は、抗原完全性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により試験した。処方物は４℃で１年まで安定である。抗原の安定性を、１年の期間にわたり２〜８℃でインキュベートすることにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合、３種のタンパク質成分すべてが１年後極めて安定であることが分かった。タンパク質抗原は、２〜８℃で少なくとも３６週間の間、ミョウバンに吸着されたままである（＞９７．５％）。
【０３６０】
（実施例３５）
Ｓｐｙ０４１６抗体およびＳｐｙ０１６７抗体の効果
本実施例は、Ｓｐｙ０４１６およびＳｐｙ０１６７に対する抗体が毒性活性をブロックすることを実証している。
【０３６１】
Ｓｐｙ０４１６：Ｓｐｙ０４１６を、Ｓｐｙ０４１６に対して高いＥＬＩＳＡ力価を有するマウス特異的血清のプールと共にまたはヒト血清と共にあらかじめインキュベートした。次に、混合物をＩＬ−８（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、次に、サイトカインに特異的であるが切断された不活型を認識することができない抗体を使用して、切断されていないＩＬ−８の存在について試験した。結果は、以下の通りに計算された切断されていないＩＬ−８の割合として表している。
【０３６２】
【化１３】
2015038156.tif 000056
「コントロール混合物」は時点０で酵素のない反応混合物である。
【０３６３】
Ｓｐｙ０１６７：野生型Ｓｐｙ０１６７を、２０μｇのＳｐｙ０１６７  Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆまたはアジュバントのみのどちらかで免疫化したマウス由来の血清のプールと共に、ならびにレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）およびノンレスポンダー（ｎｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）由来のヒト血清と共にあらかじめインキュベートした。混合物をヒツジ血球懸濁物に添加し、反応上清のＯＤ５４０ｎｍの低下を決定した。阻害力価は、Ｓｐｙ０１６７誘導溶血を５０％低下させるのに必要とされる血清希釈度として表している。
【０３６４】
結果は、図４１Ａ〜Ｂに示している。
【０３６５】
（実施例３６）
用量範囲実験
５週間齢の雌性ＣＤ１マウスを、０日目、２１日目、および３５日目に、野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、Ｓｐｙ０４１６変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）、およびＳｐｙ０１６７変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）の様々な用量で免疫化した。マウスにおける用量依存性ＩｇＧ応答を、実施例３１に記載される通りに、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、図３８Ａ〜Ｃに示している。
【０３６６】
マウスを様々な濃度の個々のＧＡＳタンパク質抗原で免疫化し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
Ｍ１を用いて鼻腔内でチャレンジした。結果は、表３０に示している。
【０３６７】
【表３０】
2015038156.tif 000057
表３０に示されるように、明確な用量依存性防御は存在せず、様々な濃度のこれらの抗原がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓチャレンジに対する防御を達成するのに有用であることを示している。
【０３６８】
マウスを、様々な濃度の、２０μｇの野生型Ｓｐｙ０２６９（配列番号１７７）、１０μｇのＳｐｙ０１６７二重変異体Ｐ４２７Ｌ／Ｗ５３５Ｆ（配列番号１２５）、および２０μｇのＳｐｙ０４１６二重変異体Ｄ１５１Ａ／Ｓ６１７Ａ（配列番号１９８）の組み合わせで免疫化し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１を用いて鼻腔内でチャレンジした。結果は、表３１に示している。
【０３６９】
【表３１】
2015038156.tif 000058
上に記載される単一抗原用量実験の場合と同様に、明確な用量依存性防御は存在せず、組み合わせでも、様々な濃度のこれらの抗原がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓチャレンジに対する防御を達成するのに有用であることを示している。
【０３７０】
結果は図３９にまとめている。図４０は、平均生存時間（ＭＳＴ；Ｍｕ）の第１近似として採用された対数正規モデルの分析を示している。
【図６】
2015038156.tif 000059
【図７】
2015038156.tif 000060
【図１２】
2015038156.tif 000061
【図１８Ａ】
2015038156.tif 000062
【図１８Ｂ】
2015038156.tif 000063
【図３１Ａ】
2015038156.tif 000064
【図３１Ｂ】
2015038156.tif 000065
【図３１Ｃ】
2015038156.tif 000066
【図３１Ｄ】
2015038156.tif 000067
【図３１Ｅ】
2015038156.tif 000068
【図３１Ｆ】
2015038156.tif 000069
【図３１Ｇ】
2015038156.tif 000070
【図３１Ｈ】
2015038156.tif 000071
【図３１Ｉ】
2015038156.tif 000072
【図３１Ｊ】
2015038156.tif 000073
【図３１Ｋ】
2015038156.tif 000074
【図３１Ｌ】
2015038156.tif 000075
【図３１Ｍ】
2015038156.tif 000076
【図３１Ｎ】
2015038156.tif 000077
【図３１Ｏ】
2015038156.tif 000078
【図３１Ｐ】
2015038156.tif 000079
【図３１Ｑ】
2015038156.tif 000080
【図３１Ｒ】
2015038156.tif 000081
【図３１Ｓ】
2015038156.tif 000082
【図３１Ｔ】
2015038156.tif 000083
【図３１Ｕ】
2015038156.tif 000084
【図３１Ｖ】
2015038156.tif 000085
【図３１Ｗ】
2015038156.tif 000086
【図３１Ｘ】
2015038156.tif 000087
【図３１Ｙ】
2015038156.tif 000088
【図３１Ｚ】
2015038156.tif 000089
【図３１ＡＡ】
2015038156.tif 000090
【図３１ＢＢ】
2015038156.tif 000091
【図３１ＣＣ】
2015038156.tif 000092
【図３１ＤＤ】
2015038156.tif 000093
【図３１ＥＥ】
2015038156.tif 000094
【図３１ＦＦ】
2015038156.tif 000095
【図３１ＧＧ】
2015038156.tif 000096
【図３３Ａ】
2015038156.tif 000097
【図３３Ｂ】
2015038156.tif 000098
【図３３Ｃ】
2015038156.tif 000099
【図３６】
2015038156.tif 000100
【図１】
2015038156.tif 000101
【図２】
2015038156.tif 000102
【図３】
2015038156.tif 000103
【図４】
2015038156.tif 000104
【図５】
2015038156.tif 000105
【図８】
2015038156.tif 000106
【図９】
2015038156.tif 000107
【図１０−１】
2015038156.tif 000108
【図１０−２】
2015038156.tif 000109
【図１１−１】
2015038156.tif 000110
【図１１−２】
2015038156.tif 000111
【図１３】
2015038156.tif 000112
【図１４】
2015038156.tif 000113
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2015038156.tif 000115
【図１６】
2015038156.tif 000116
【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2015038156.tif 000124
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2015038156.tif 000127
【図２９】
2015038156.tif 000128
【図３０】
2015038156.tif 000129
【図３２Ａ】
2015038156.tif 000130
【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
2015038156.tif 000132
【図３２Ｄ】
2015038156.tif 000133
【図３２Ｅ】
2015038156.tif 000134
【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
2015038156.tif 000137
【図３２Ｉ】
2015038156.tif 000138
【図３２Ｊ】
2015038156.tif 000139
【図３２Ｋ】
2015038156.tif 000140
【図３２Ｌ】
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【図３２Ｍ】
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【図３２Ｎ】
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【図３２Ｏ】
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【図３２Ｐ】
2015038156.tif 000145
【図３２Ｑ】
2015038156.tif 000146
【図３２Ｒ】
2015038156.tif 000147
【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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