(57)【要約】  本明細書は、心収縮機能を調整するため、心疾患を予防および／または治療するためのＲＦＲＰ−１ポリペプチドを対象とした方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであり、前記ペプチドが、脊椎動物の心機能を調整する単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項２】
アミノ酸配列、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであるが、
但し、
前記ペプチドが、ペンタペプチドで構成されるとき、前記ペンタペプチドのアミノ酸配列は、ＬＰＬＲＦ（配列番号３）ではなく、かつ
前記ペプチドが、ドデカペプチドで構成され、かつＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１が、それぞれＡ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、ＬおよびＲであるとき、Ｘ４がＳまたはＰではない単離ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、脊椎動物の心機能を調整する請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がＭ、Ｖ、またはＳ以外のアミノ酸であり、Ｘ５がＦまたはＶ以外であり、Ｘ７がＮ以外であり、Ｘ９がＰ以外であり、Ｘ１１がＲ以外であり、Ｘ１、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、およびＸ１１のそれぞれが、互いに独立して選択される請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１１が、Ｒ以外のアミノ酸である請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、およびＸ１１のうちの少なくとも１つがＡである請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ８が存在する請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ８がＡ、Ｖ、またはＬであり、Ｘ９がＰまたはＦである請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘ２がＰであり、Ｘ４がＳであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、およびＸ９が、それぞれＡ、Ｎ、Ｌ、およびＰである請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ３およびＸ７のうちの少なくとも１つが、ヒスチジン以外のアミノ酸である請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ１およびＸ２が存在しない請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
Ｘ７がＡである請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ｈ−ＲＦＲＰ１の逆作動薬である請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１４】
Ｘ３がＢｐａである請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
Ｎ末端チロシル残基をさらに含む請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、ｈ−ＲＦＲＰ１作動薬である請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ｈ−ＲＦＲＰ１拮抗薬である請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項１８】
Ｘ１およびＸ２が存在せず、Ｘ４がＤ以外のアミノ酸である請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項１９】
Ｘ４がＢｐａである請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
薬学的に許容される担体およびアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであり、単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを含む医薬組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容される担体および請求項１〜１９および３４のいずれか１項に記載の単離ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２２】
障害の治療での請求項１〜１９および３４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項２０もしくは２１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
前記障害が心障害である請求項１７に記載の使用。
【請求項２４】
心障害の治療のための薬剤を製造するための請求項１〜１９および３４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２５】
哺乳動物を含む脊椎動物において心障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜１９および３４のいずれか１項に記載のペプチドを、前記脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項２６】
ａ）第１の群の１つまたは複数の筋細胞を、
ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号２）、ＭＰＰＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１４）、ＶＰＮＳＶＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１５）、ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１６）、ＭＰＰＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１７）、ＳＬＫＰＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１８）、ＬＰＬＲＦ（配列番号３）、ＰＬＲＦ、ＰＱＲＦ、ＦＬＲＦ、ＦＱＲＦ、ＡＰＬＲＦ（配列番号１９）、ＡＰＱＲＦ（配列番号２０）、ＡＦＬＲＦ（配列番号２１）、ＡＦＱＲＦ（配列番号２２）、ＶＰＬＲＦ（配列番号２３）、ＶＰＱＲＦ（配列番号２４）、ＶＦＬＲＦ（配列番号２５）、およびＶＦＱＲＦ（配列番号２６）から成る群から選択される配列を含む単離ペプチドであって、式中、Ｆがアミド化される単離ペプチドと接触させること、
ｂ）ａ）に記載される前記第１の群、または第２の群の１つまたは複数の筋細胞を、試験薬と接触させ、前記試験薬との接触後の効果を測定すること、および
ｃ）ステップａ）の測定値を、ステップｂ）の測定値と比較して、前記試験薬が、脊椎動物の心機能を調整するか否かを明らかにすることを含む、
脊椎動物の心機能を調整する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
ステップａ）の前記ペプチドが、
ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号２）、ＭＰＰＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１４）、ＶＰＮＳＶＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１５）、ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１６）、ＭＰＰＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１７）、ＬＰＬＲＦ（配列番号３）、ＰＬＲＦ、ＰＱＲＦ、ＦＬＲＦ、およびＦＱＲＦから成る群から選択され、
式中、Ｆがアミド化され、前記脊椎動物が哺乳動物である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試験薬が、請求項１または２に記載のペプチドである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップａ）における前記ペプチドが、Ｎ末端チロシンをさらに含み、前記チロシンが、測定可能に標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたは複数の筋細胞の群を、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および前記接触に起因する前記群の心機能を示す効果を測定することを含む脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３１】
アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを、脊椎動物の心機能を調整するのに有効な量で、哺乳動物を含む脊椎動物に投与することを含む前記脊椎動物の心機能を調整する方法。
【請求項３２】
哺乳動物を含む脊椎動物の細胞または組織を、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のうちのいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであり、単離ペプチド、または塩、アミド、もしくはエステルと接触させることを含む前記細胞または組織内のＰＫＣ媒介のシグナル伝達を調整する方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが、請求項１〜１９および３４のいずれか１項に記載のペプチドである請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸残基ＦがＦアミドである請求項１〜１９のいずれか１項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、２０１０年４月２日に出願した米国特許仮出願第６１／３２０，５０５号の優先権の利益を主張し、この開示は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援の調査または開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられたＲ２１ＨＬ０９３６２７の下、政府支援により行われた。政府には本発明に一定の権利がある。
【背景技術】
【０００３】
心不全は、主な死因であるが、心不全に関与するペプチド作動性機構は完全に理解されていない（Jessup,M.,and Brozena S.（2003））。小さな心制御ペプチドを同定することは、心不全に対処するための薬剤開発および治療戦略のための潜在的な標的分子を提供することができるため、有意義である。脊椎動物のＦＭＲＦアミド関連ペプチド（ＦａＲＰｓ）は、心制御に関与する中枢神経系の領域で発現されるが（Fukusumi et al.(2001),Ukena et al.（2001）、Yano et al.（2003））、その機能についてはほとんど知られていない。発見された第１のＲＦアミド含有ペプチドは、無脊椎動物テトラペプチド、ＦＭＲＦアミドであった（Price,D.A.,and Greenberg,M.J.（1977））。ＦＭＲＦアミドを二枚貝神経節から心制御ペプチドとして単離することによって、無脊椎動物および脊椎動物に、動物界全体に構造的に関連する生物活性および心活性ペプチドの後次同定をもたらした（Fukusumi,S.et al.（2006）、Nichols,R.（2003））。
【０００４】
ＦＭＲＦアミド関連ペプチドのＦａＲＰスーパーファミリーは、ＸＲＦアミドモチーフに基づいてより小さい群に分割され、Ｘはサブグループを定義する。無脊椎動物のミオサプレッシンペプチドは、ＬＲＦアミドサブグループに属する。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ミオサプレッシン、ドロミオサプレッシン（ＤＭＳ）の構造は、ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号１）である（Nichols,R.（1992））。ミオサプレッシンは、心拍数および駆出の振幅を減少させる筋阻害性ペプチドとして、無脊椎動物に広く研究されている（Robb,S. et al.(1989)、Robb,S.,and Evans,P.（1994）、Wasielewski，O., and Skonieczna, M.（2008）、Stevens，J.S. et al.（2009）、Angioy, A.M. et al.（2007））。
【０００５】
大半のＦａＲＰ関連心血管研究は、無脊椎動物に対して行われているが、哺乳動物の心制御ペプチド族の機能についてはほとんど知られていない。しかしながら、哺乳動物ＲＦアミド関連ペプチド（ＲＦＲＰ）遺伝子は、Ｃ末端ＬＲＦアミドを含有するＲＦＲＰ−１をコードする（Hinuma,S.Et al.(2000)、Liu,Q.Et al.（2001））。ヒトＲＦＲＰ−１（ｈＲＦＲＰ−１）ペプチドの構造は、ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号２）である（Ubuka T.et al.（2009）PLoS One4(22):e8400;pages 1-7）。ｈＲＦＲＰ−１に対して構造同一性が高い内因性ペプチドは、ウシ視床下部から単離した（Fukusumi,S.Et al.（2001））。その他、ｈＲＦＲＰ−１免疫反応性ニューロンおよび線維のクラスターが、哺乳動物の視床下部および孤束核（ＮＴＳ）と心血管系の統合的制御のために重要な部位に認められる（Fukusumi,S.et al.（2001）、Ukena,K.,and Tsutsui,K.(2001)、Yano,T.et al.（2003））。
【０００６】
米国特許第７，１９２，７２３号および同第７，２１７，８０８号は、プロラクチン分泌を伴う用途および他の治療用途のための特定ＲＦアミド関連ペプチドを開示する。国際公開第２００７／０４５９０６号および国際公開第２００４／０２６９０４号は、特定のＲＦアミド関連ペプチドＩＮＳＰ２０７、ＩＮＴＰ０２６、ＩＮＴＰ０２７、およびＩＮＴＰ０２８を開示する。米国特許第７，３５４，７２４号は、キイロショウジョウバエＧタンパク質結合受容体に関連する開示をする。非脊椎動物ＲＦアミド関連ペプチドホルモンの特定の心作用が、Stevens JS et al.2009,J Exp Biol:212(Pt24):3961-76に論じられている。Fang Q ら（Eur J Pharmacol 2009 621:(1-3):61-66））は、ＲＦアミド関連ペプチド２６ＲＦａの心血管作用を論じている。
【０００７】
以下でさらに詳述するように、ＲＦＲＰ−１ポリペプチドを対象とする方法および組成物は、心収縮機能を調整するため、心障害を予防および／または治療するため、ならびに心機能を調整することができる薬剤を発見するためのツール、ＲＦＲＰ−１の受容体を同定するためのツール、および心不全に関連する疾患を同定するためのツールとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）生体内心収縮の頻度への一連のＤＭＳ濃度の用量依存性。１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、または１０−６Ｍ  ＤＭＳの微量注入または生理食塩水単独の対照、に先行して測定された基礎収縮率と比較して、微量注入から１分後に観察された最大作用は結果である（ｎ＝１８）。１０−１２Ｍでのデータ点は、生理食塩水の作用を表す。複数の動物（ｎ≧１０）から得たデータ（平均±ＳＥＭ）を平均し、各動物に対して測定された基礎収縮率に関連して報告した。ペプチドまたは対照のいずれかの１回の微量注入に単一の動物を使用した。１０−１０Ｍ（ｎ＝１６）ＤＭＳが心拍数に及ぼす作用は、生理食塩水とは統計的に差がなかったが、１０−９Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、または１０−６Ｍ  ＤＭＳ（それぞれｎ＝１６、１８、１４、１６）は、対照と比較して統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、有意差ありとした。最良適合ＥＣ５０値は、３×１０−９Ｍとなるように算出した。
【図２】１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍの範囲で１０倍間隔、３７℃、０．２Ｈｚのペースで１５分間のｈＲＦＲＰ−１の潅流に応答したときの成体ラット心筋細胞収縮機能。１５分のペプチドの潅流中のベースラインサルコメア長（μｍ）の結果を示す（図１Ａ、表１）。サルコメア静止長は、１．７６±０．０１μｍ（Ｃ）、１．７６±０．０１μｍ（１分）、１．７６±０．０１μｍ（３分）、１．７６±０．０１μｍ（５分）、１．７５±０．０１μｍ（１０分）、および１．７５±０．０１μｍ（１５分）であった。図２Ｂ、表１は、ペプチドによる１５分間の潅流中の出発速度、ピーク高、および回復速度の変化率（％）である。各濃度に対する値（ｙ軸、ｈＲＦＲＰ−１（ログ［］）を、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ダネット多重比較試験によって培地対照（Ｃ）と比較し、統計的に有意であるとした（ｐ＜０．０５）。（＊、表１）。最良適合ＥＣ５０値は、５×１０−１１Ｍ（短縮率）、５×１０−１０Ｍ（短縮振幅）、および５×１０−１１Ｍ（再延長率）となるように算出した。ｎ＝２〜３の心臓から単離後１日および２日の筋細胞７〜２０例から記録した。
【図３】単離した成体ラット心筋細胞内の１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１、および対照（培地のみ）に応答したときの１５分間にわたるベースラインサルコメア長（ＳＬ）、出発速度、ピーク高、および回復速度の変化率（％）（表３）。ベースラインサルコメア長に有意な変化はなかった。１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１および１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１が出発時間に及ぼす影響および回復速度の影響は、対照の値と比較することができ、有意差があったが、１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１では、１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１を用いて観察したピーク短縮が有意に減少せず、媒体対照の反応とは有意差はなかった。一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ダネット多重比較試験を使用して、データを分析し、統計的に有意であるとした（ｐ＜０．０５）（＊、表３）。
【図４】単離した成体ラット心筋細胞内で、１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（８−２６）、１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（１９−２６）、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１、または対照（培地のみ）の１５分間の潅流に応答したときのベースラインサルコメア長（ＳＬ）、出発速度、ピーク高、および回復速度の変化率（％）（表４）。ベースラインサルコメア長に有意な変化はなかった。１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（８−２６）、ｎ＝１７または１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（１９−２６）、ｎ＝２０のいずれかに応答したときの出発速度、ピーク高、および回復速度に対する有意な作用はなかった。一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ダネット多重比較試験を使用して、データを分析し、統計的に有意であるとした（ｐ＜０．０５）（＊、表４）。
【図５】マウス心臓上のｈＲＦＲＰ−１および生理食塩水に応答したときの代表的なＭモード画像。５μｍｏｌ／ｋｇ（体重）（ｎ＝５）へのｈＲＦＲＰ−１の静脈内投与は、心機能に急激かつ劇的に作用した（パネルＡ＝注入前、パネルＢ＝注入後５分）。心電図試験の複合結果を表５に示す。しかしながら、生理食塩水（ｎ＝４）は、心機能に劇的かつ有意な変化は認められなかった（パネルＣ＝注入前、パネルＤ＝注入後５分）。一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ダネット多重比較試験を使用して、データを分析し、統計的に有意であるとした（ｐ＜０．０５）（＊、表５）。
【図６】５００ηＭ  ビス−１の存在下、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１の１５分間の潅流に応答したときの成体ラット心筋細胞の収縮機能。１５分間にわたるペプチドの潅流中の（表６）ベースラインサルコメア長（μｍ）の結果を示す。サルコメア静止長は、１．７６±０．０１μｍ（Ｃ）、１．７６±０．０１μｍ（１分）、１．７６±０．０１μｍ（３分）、１．７６±０．０１μｍ（５分）、１．７５±０．０１μｍ（１０分）、および１．７５±０．０１μｍ（１５分）であった。表１は、１５分間わたるペプチドの潅流中の短縮率、短縮振幅、および再延長率の変化率（％）を示す。各濃度に対する値（ｙ軸、ｈＲＦＲＰ−１（ログ［］）を、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ダネット多重比較試験によって培地対照（Ｃ）と比較し、統計的に有意であるとした（ｐ＜０．０５）（＊、表６）。最良適合ＥＣ５０値は、５×１０−１１Ｍ（短縮率）、５×１０−１０Ｍ（短縮振幅）、および５×１０−１１Ｍ（再延長率）となるように算出した。ｎ＝２〜３の心臓から単離後１日および２日の筋細胞の７〜２０例から記録した。
【図７】Ａ．単離した成体ウサギ心筋細胞内の代表的なサルコメア短縮の０．５Ｈｚのペースでトレースした結果。１０回のトレースから得たシグナル平均化記録は、単離後１日の筋細胞で作製した（ｎ＝３）。記録は、１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１または培地（対照）の潅流を３７℃で開始前、および開始から１５分後の短縮を示す。Ｂ．図７Ａに表される実験についてのピーク短縮の変化ならびに短縮率および再延長率の要約。Ｃ．対照、ペプチドなし（左レーン）、および１０−７Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（右レーン）に応答したときのウサギ心筋細胞タンパク質の３２Ｐ標識化。筋細胞を１時間、３２Ｐ−オルトリン酸塩中で標識化した後、放射標識遊離媒体中のｈＲＦＲＰ−１（１０−７Ｍ）を用いて１５４分間処理した。仮定のリン酸化標的には、トロポニンＩ（２４ｋＤａ）、トロポニンＴ（３５ｋＤａ）、およびミオシン軽鎖２（１５ｋＤａ）が挙げられる。タンパク質の負荷を示すために、銀染色画像を下に示す。
【図８】Ｙ−［Ｂｐａ２］ＤＭＳは、キイロショウジョウバエの心拍数に作用する。Ｙ−［Ｂｐａ２］ＤＭＳは、用量依存的に心拍数を減少させた（ＥＣ５０＝１．３×１０−１０Ｍ（ｎ≧１６）。
【図９Ａ】ピーク短縮および弛緩に関する１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１とＹ−ｈＲＦＲＰ−１の比較。単離したラット筋細胞内のピーク短縮（ピーク高）および弛緩（回復速度）の変化率（％）を示す（ｎ≧１４）。
【図９Ｂ】ピーク短縮および弛緩に関する１０−７Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１と［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の比較。単離したラット筋細胞内のピーク短縮（ピーク高）および弛緩（回復速度）の変化率（％）を示す（ｎ≧１６）。
【図１０】１０−８Ｍアラニン類似体がピーク短縮および弛緩に及ぼす作用。ラット心筋細胞内のピーク高および回復速度の変化率％を示す。類似体は、Ａ＃によって示され、＃は、アラニンで置換された残基、ｈＲＦＲＰ−１（空白）を示す。アスタリスク（＊）は、統計的な有意性を示す。ｐ＜０．０５（ｎ≧２０）。
【図１１】１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（垂直線）存在下の１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（塗りつぶし）、１０−７Ｍ［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１（点状）１０−７Ｍ［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の作用。［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１が、ラット筋細胞内のピーク高および回復速度の変化率（％）についてｈＲＦＲＰ−１拮抗薬であることを示す（ｎ≧１４）。
【図１２】１０−７Ｍ［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１（チェック模様）存在下の１０−７Ｍ［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１（塗りつぶし）、１０−７Ｍ［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１（空白）、および１０−７Ｍ［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の作用。［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１は、ラット心筋細胞内のピーク高および回復速度に対する［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の作用を減衰させる（ｎ≧１２）。
【図１３】対照、無ペプチドなし（レーン１）、ホスファターゼ阻害剤、カリクリンＡを含む１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（レーン２）に応答したときの（左）３２Ｐ標識ラット筋細胞タンパク質。銀染色タンパク質は、レーン３（対照）およびレーン４（１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１）に示す。レーンは、左から右に１、２、３、および４と付番する。
【図１４】尾静脈注入に応答するマウスの心電図結果。２次元Ｍモード画像、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（左、上、注入前、ｔ＝０；下、ｔ＝注入１０分後）、生理食塩水（右）、注入前（上、ｔ＝０）、および注入後（下、ｔ＝１０分）。
【図１５】対照（培地のみ）、ｈＲＦＲＰ−１、および切断ｈＲＦＲＰ−１ペプチドが、単離した成体ラット心筋細胞上の出発速度、ピーク高、および回復速度に及ぼす作用。
【図１６】１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１および対照（培地のみ）と比較した単離成体ラット心筋細胞に対する１０−８Ｍ  ＰＱＲＦアミドの作用。
【図１７】１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（塗りつぶし、ｎ＝２０）、対照、培地、ペプチドなし（空白、ｎ＝１２）が、単離したウサギ心筋細胞内の心機能に対して及ぼす作用。平均値±標準誤差、ｐ＜０．０５（＊）から対照と有意差があるとした。
【図１８】１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（塗りつぶし）、１０−８Ｍ  ＬＰＬＲＦアミド（配列番号３）（格子状）、１０−８Ｍ  ＬＰＬＡＦアミド（垂直線）、ならびに１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１および１０−８Ｍ  ＬＰＬＡＦアミド（水平線）が、単離したラット心筋細胞内のピーク短縮、出発速度、および回復速度に及ぼす作用。変化率（％）で示す。データは、ＬＰＬＡＦアミドがｈＲＦＲＰ−１拮抗薬であることを証明する。
【図１９】１０−８Ｍ［Ｄ−Ｈ３］ｈＲＦＲＰ−１（水平線）、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（塗りつぶし）、および対照（空白、ペプチドなしまたはペプチド類似体、媒体のみ）が、単離したラット心筋細胞内のピーク短縮、出発速度、および回復速度に及ぼす作用の比較。変化率（％）で示す。データは、１０−８Ｍ［Ｄ−Ｈ３］ｈＲＦＲＰ−１がｈＲＦＲＰ−１逆作動薬であることを証明する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＲＦＲＰ−１ペプチド、哺乳動物のＤＭＳの相同分子種が、哺乳動物ｎｏ心筋細胞および生体内心性能に対して極めて特異的かつ劇的な抑制作用をもたらすという発見に関する。より具体的には、本発明は、単離または合成ペプチド組成物に関し、そのペプチド構造は、ヒトＲＦＲＰ−１（ｈＲＦＲＰ−１）配列：ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号２）およびその相同分子種の修飾に基づく。ｈＲＦＲＰ−１および本明細書に記載されるＦＭＲＦアミド関連ペプチドの他のメンバーに関する構造機能試験は、本発明の特定の修飾ペプチド、ならびにｈＲＦＲＰ−１が、哺乳動物の心機能を同様に調整することができることをさらに示す。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、上記のｈＲＦＲＰ−１のアミノ酸配列の修飾であるアミノ酸配列を含む単離または合成ペプチド、およびその方法を対象とする。一実施形態では、本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１配列は、アミノ酸配列Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆによって表されるテトラペプチドを含み、式中、Ｘ１０はＬまたはＱであり、Ｘ９およびＸ１１は、それぞれ独立して天然または修飾アミノ酸である。別の実施形態では、配列ＬＰＬＲＦ（配列番号３）またはＰＱＲＦモチーフは、本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１配列のＣ末端アミノ酸として保持される。別の実施形態では、Ｆによって表されるＣ末端フェニルアラニンはアミド化されるか、ないしは別の方法で修飾されるか、またはＬ−フェニルアラニンもしくはＤ−フェニルアラニンから選択される。本明細書に記載の本発明のあらゆる態様では、実施形態は、Ｃ末端フェニルアラニンを含むＣ末端残基がアミド化される発明のペプチドを包含する。したがって、本明細書に開示される発明のペプチドのいずれかは、Ｃ末端Ｆアミドを有するものから選択することができる。したがって、明記されるか否かに関わらず、Ｃ末端「Ｆ」またはフェニルアラニンは、Ｆアミドまたは遊離酸形態のフェニルアラニンのいずれかの表現を含む。本発明では、Ｃ末端テトラペプチドアミノ酸Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆは、上述されるように、心機能を調整することが認識される。
【００１１】
「心機能を調整する」とは、本明細書に記載される１つまたは複数のペプチドが、心収縮機能に対して明らかに陽性または陰性作用を及ぼすことを意味する。この陽性または陰性作用は、当業者に知られる生体内または生体外方法によって、またそうでなければ本明細書に記載されるように明らかである。したがって、本明細書に記載される方法を含む心拍数、拍出量、駆出率、および／または心拍出量を測定することを対象とする方法を生体内で利用することによって、本明細書に記載の１つまたは複数のペプチドが、脊椎動物または哺乳動物の心臓を含む心臓に対して、陽性または陰性の変時性、変力性、および拡張作用を呈するか否かを明らかにすることができる。さらに、本明細書に記載の方法を含む単離した筋細胞のサルコメア短縮および／または弛緩のパラメータを測定することを対象とする方法を生体内で利用することによって、本明細書に記載される１つまたは複数のペプチドが、心収縮機能に対して陽性または陰性作用を呈するか否かを明らかにすることができ、したがって、心機能を調整することができる。このパラメータは、ピーク高、出発速度、および／または回復速度の少なくとも１つを含む。生体内方法または生体外方法を使用するかに関わらず、当業者は、心収縮機能に対する観察された陽性または陰性作用が、本発明の１つまたは複数のペプチドの作用に起因することを確かめるために、適切な対照、基準対象、および／または試料を含むことを認識する。本明細書に記載される発明のペプチドは、ｈＲＦＲＰ−１を含むＲＦアミド含有ペプチドのシグナル伝達作用を遮断することによって、心機能に影響し得ることが認識される。
【００１２】
以下で説明および例証されるように、出願人は、ｈＲＦＲＰ−１を哺乳動物に生体内投与すること、および哺乳動物由来の筋細胞に生体外投与することによって、ｈＲＦＲＰ−１が明らかに心収縮機能を減少させることができ、心機能を調整することを発見した。親ｈＲＦＲＰ−１ペプチド配列から派生した修飾ペプチドである明細書に記載の発明のペプチドは、心収縮性に対するｈＲＦＲＰ−１の１つまたは複数の作用の作動薬（逆作動薬および超作動薬を含む）および拮抗薬を含む。この点で、本発明の目的で、「ｈＲＦＲＰ−１の作動薬」または「ｈＲＦＲＰ−１作動薬」とは、発明のペプチドが、ｈＲＦＲＰ−１と比較して、心収縮機能を明らかに減少させることもできることを意味するものとする。「ｈＲＦＲＰ−１の超作動薬」または「ｈＲＦＲＰ−１超作動薬」とは、発明のペプチドが、ｈＲＦＲＰ−１と比較して、明らかに心収縮機能を減少させることができ、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチドよりも能力が高いことを意味するものとする。本発明の超作動薬ペプチドの例に、１１ｍｅｒペプチド：ＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４）があり、ペプチドは、本発明の特定実施形態として提供される。「ｈＲＦＲＰ−１の逆作動薬」または「ｈＲＦＲＰ−１逆作動薬」は、発明のペプチドが、ｈＲＦＲＰ−１と比較して、明らかに心収縮機能を増加させることができることを意味するものである。「ｈＲＦＲＰ−１の拮抗薬」または「ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬」とは、発明のペプチドが、心収縮機能に対するｈＲＦＲＰ−１の作用を明らかに減衰させ得ることを意味するものである。この点で、「減衰する」とは、心収縮機能に対するｈＲＦＲＰ−１の作用の減少または排除を意味するものである。本発明は、心収縮に対するｈＲＦＲＰ−１の１つまたは複数の作用の作動薬（逆作動薬および超作動薬を含む）、および拮抗薬である化合物をスクリーニングする方法を提供する。本明細書に記載の方法の工程の特定の順序は、心収縮機能に対するｈＲＦＲＰ−１の作用と比較して、本明細書に記載される１つまたは複数の発明のペプチドの作用容易に明らかにする限り、限定されないことが認識される。例えば、本明細書に記載される発明のペプチドが、本明細書に示される教示に基づいて、単離した筋細胞内のサルコメア短縮の１つまたは複数のパラメータを測定することによって明らかになるように、心収縮機能に対するｈＲＦＲＰ−１の作用を減衰させ得るか否かを明らかにするために、当業者は、１つまたは複数の筋細胞をｈＲＦＲＰ−１で事前にインキュベートし、心収縮の測定を行った後、本明細書に記載される発明のペプチドを試験薬として事前にインキュベートした試料に添加し、続いてパラメータを測定するステップを含めることができる。この方法で、ｈＲＦＲＰ−１および試験薬の筋細胞の共インキュベーションが、ｈＲＦＲＰ−１単独でインキュベーションした後に見られる作用を減少させるか否かを明らかにすることができる。あるいは、例えば、１つまたは複数の筋細胞がｈＲＦＲＰ−１単独でインキュベートされる参照試料、およびｈＲＦＲＰ−１、試験薬、および１つまたは複数の筋細胞が参照試料と同じ期間だけ共インキュベートされる第２の試料をステップに含めることができる。続いて、特定のエンドポイント測定値を試験試料および参照試料から取り、適切な比較を行う。再度、比較から、試験薬が心収縮に対するｈＲＦＲＰ−１の作用を減衰させるか否かを明らかにする。当業者によって容易に変えることができる特定の検定設計を変更することは、本発明の方法によって包含される。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載されるように、発明のペプチドまたはペプチドを含む薬理学的組成物の１つまたは複数を用いる治療方法を包含する。特定の障害を治療するための特定の発明のペプチドまたは組成物の選択は、ペプチドがそれを必要とする対象に投与されるとき、心収縮機能を減少または増加させるペプチドの能力に応じて、心収縮機能を増加または減少させることによって、特定障害を治療することに互恵的であるか否かを考慮して、当業者によってなされ得ることが認識される。本明細書に記載される発明のペプチドは、ｈＲＦＲＰ−１を含む、ＲＦアミド含有ペプチドのシグナル伝達作用を遮断することによって、心機能に作用し得ることも認識される。
【００１４】
当業者は、本明細書に記載されるｈＲＦＲＰ−１作動薬および拮抗薬の中から選択することができる。例えば、非代償性鬱血性心不全を含む、心不全の場合、陽性イオンチャネル型作用を誘起して、心収縮機能を増加させることが望ましいことが想定される。したがって、この場合、ｈＲＦＲＰ−１の逆作動薬または拮抗薬を選択することが望ましい。一方、他の特定の障害の場合、例えば、ある外科的状況、不整脈、および細動、例えば、薬物誘発性不整脈を含む状況では、心収縮機能を減少させることが望ましいことが認識される。この点で、「心障害」とは、心臓に作用する急性または慢性の病的状態であって、心臓の異常な収縮機能と関連付けられる状態を意味するものとする。異常な収縮機能とは、対象の原発性疾患であり得るか、または別の急性または慢性の初期の病態の兆候であると認識される。特定の実施形態では、発明のペプチドの１つまたは複数を心細胞または組織に投与すると、不整脈後の心細胞または組織において、検出可能に律動を確立する。関連の実施形態では、投与は生体内または生体外である。
【００１５】
したがって、親ペプチドＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号２）を参照して（以降「ｈＲＦＲＰ−１」と呼ぶ）、本発明は、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチド配列から派生した修飾ペプチドであるペプチドを包含する。特定の実施形態では、発明のペプチドは、ＬＰＬＲＦ（配列番号３）、ＰＱＲＦ、またはＰＬＡＦアミノ酸をそのＣ末端に保持する。修飾には、ｈＲＦＲＰ−１アミノ酸の切断、置換、削除、および挿入、ならびにアミノ酸の化学修飾が含まれる。特定の実施形態では、本発明は、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチド配列から派生した修飾ペプチドであるペプチドを包含し、アミノ酸ＰＬＸＦ、ＰＱＸＦ、ＦＬＸＦ、ＦＱＸＦ、ＡＰＬＸＦ（配列番号５）、ＡＰＱＸＦ（配列番号６）、ＡＦＬＸＦ（配列番号７）、ＡＦＱＸＦ（配列番号８）、ＶＰＬＸＦ（配列番号９）、ＶＰＱＸＦ（配列番号１０）、ＶＦＬＸＦ（配列番号１１）、またはＶＦＱＸＦ（配列番号１２）アミノ酸をそれらのＣ末端に保持し、式中、Ｘは、Ｌ−アルギニン以外の任意の天然または修飾アミノ酸である。一実施形態では、Ｆによって表されるＣ末端フェニルアラニンはアミド化される。
【００１６】
より具体的に、一態様では、本発明は、アミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドを提供し、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つは存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１は存在し、Ｘ１０はＬまたはＱであり、当該ペプチドは、脊椎動物の心機能を調整し、またはその塩、アミドもしくはエステルを提供する。本明細書に記載される本発明の態様ではいずれも、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１という名称は、親ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミドペプチド（配列番号２）に含有されるアミノ酸の位置に対応する。本発明は、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１のいずれか１つが、親ペプチドの対応する位置に含有されるアミノ酸として、独立して選択されるペプチドを包含する。したがって、本発明の特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１は、それぞれ独立して、Ｍ、Ｐ、Ｈ、Ｓ、Ｆ、Ａ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、Ｌ、およびＲからそれぞれ選択される。
【００１７】
本発明の目的で、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、「Ｘ４」、「Ｘ５」、「Ｘ６」、「Ｘ７」、「Ｘ８」、「Ｘ９」、「Ｘ１０」、「Ｘ１１」によって表されるものを含む本発明のペプチドによって構成されるアミノ酸のいずれかは、天然または修飾アミノ酸である。本発明の目的で、「天然アミノ酸」という用語は、自然発生するアミノ酸の十分に知られたＬ−異性体を意味するものとする。「修飾アミノ酸」という用語は、自然発生するアミノ酸の十分に知られたＬ−異性体以外のアミノ酸を意味するものとする。本発明の目的で、本明細書で使用する「修飾アミノ酸」という用語は、化学的または変換後に修飾されるアミノ酸、ならびに自然発生するアミノ酸のＬ−異性体のＤ−対応物、およびペプチド模倣の化合物の合成にアミノ酸の代替として使用される化合物を含む。化合物は、当業者によく知られており、典型的に、非天然置換のあるペプチドにあるＲ基またはアミノ酸の置換によって生成される。その置換は、安定性、可溶性、透過性（血液−脳障壁透過性）、バイオアベイラビリティ、または得られるペプチドの活性を増加させ得る。
【００１８】
したがって、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチド配列から派生した修飾ペプチドは、自然発生するｈＲＦＲＰ−１内の１つまたは複数のアミノ酸が、別の天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、合成アミノ酸、アミノ酸類似体、または非天然アミノ酸と置換されるときに生成される。修飾には、心機能を調整する発明のペプチドを産出する１つまたは複数の保存性または非保存性アミノ酸置換、削除、または挿入が含まれる。修飾は、発明のペプチドを使用するときに、能力、可溶性、透過性（血液−脳障壁透過性を含む）、バイオアベイラビリティ、安定性の増加、毒性の減少、または生理学的条件下での分解等の利点を提供することができる。
【００１９】
保存性置換は、典型的に、１つのアミノ酸を、以下の群、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換等の類似する特性を持つ別のアミノ酸に置換することを含む。非極性（疎水性）群のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性群のアミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正電荷（塩基性）群のアミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負電荷（酸性）群のアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００２０】
低保存性または非保存性置換を利用することによって、例えば、電荷、構造、および他の生物学的特性に望ましい変化を引き起こすことによって、特に所望される本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１をもたらすことができる。置換には、例えば、親水性残基を疎水性残基に置換すること、システインまたはプロリンを別の残基に置換すること、小側鎖のある残基を巨大側鎖のある残基に置換すること、または純正電荷の残基を純負電荷の残基に置換することを含む。所与の置換の結果を確実に予測できないとき、本明細書に開示される方法に従って、誘導体を容易に分析し、例えば、心機能の調整、およびｈＲＦＲＰ−１の作動薬または拮抗薬として作用する能力を含む所望の特性の存在または非存在を明らかにしてもよい。
【００２１】
ペプチド骨格の置換基を置換することができるように、同様の特徴によって特徴づけられる基のある骨格を修飾する感応基を置換することもできる（すなわち、各アミノ酸の一部であるＲ基）。ｈＲＦＲＰ−１の作動薬が所望される場合、この置換は、典型的に保存性であり、すなわち、置換基には、元の基とほぼ同じ寸法、形状、疎水性、および電荷がある。非配列修飾は、本明細書に記載される親または発明のペプチドの一部分の化学誘導体化を含んでもよい。
【００２２】
本発明の特定実施形態では、発明のペプチドは、ヨード化、アミド化、硫酸化、単一または複数ハロゲン化、アルキル化、カルボキシル化、またはリン酸化される化学的に修飾されたペプチドを含む。ペプチドは、例えば、アセチル基、ファルネシル部分、または脂肪酸で、単一または複数アシル化することができ、飽和、一価不飽和、または多価不飽和となり得る。脂肪酸は、単一または複数フッ素化されてもよい。本発明はまた、ｈＲＦＲＰ−１のメチオニン類似体、例えば、メチオニンスルホンおよびメチオニンスルホキシド類似体を包含する。本発明はまた、アルキルまたはアリールアンモニウム塩を含むアンモニウム塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、チオ硫酸塩、カルボン酸塩、重炭酸塩、安息香酸、スルホン酸塩、チオスルホン酸塩、メシル酸塩、エチルスルホン酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩等のｈＲＦＲＰ−１の塩も含む。
【００２３】
本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１ペプチドは、ｈＲＦＲＰ−１から派生したペプチド模倣化合物も含む。ペプチド模倣化合物の合成は、当業者に良く知られており、化合物は、ペプチド内のあるＲ基またはアミノ酸を非天然部分と置換することによって生成される。置換を使用して、安定性、可溶性、透過性（血液−脳障壁透過性を含む）、バイオアベイラビリティ、または本明細書に記載されるｈＲＦＲＰ−１の特定の所望の活性を増加させるか、またはｈＲＦＲＰ−１の心機能調整能力を保持する。適切なペプチド模倣体の例には、対応するＬアミノ酸、テトラゾールのＤアミノ酸（Zabrocki et al.,J.Am.Chem.Soc.110:5875-5880(1988))、アミド結合の等量式(Jones et al.,Tetrahedron Lett.29:3853-3856（1988））、ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸（ＬＬ−Ａｃｐ）（Kemp et al.,J.Org.Chem.50:5834-5838(1985))が含まれる。同様の類似体は、Kemp et al.,Tetrahedron Lett.29:5081-5082（1988）ならびにKemp et al.,Tetrahedron Lett.29:5057-5060（1988）、Kemp et al.,Tetrahedron Lett.29:4935-4938（1988）、およびKemp et al.,J.Org.Chem.54:109-115（1987）に示される。他の適切なペプチド模倣体は、Nagai and Sato,Tetrahedron Lett.26:647-650(1985)、Di Maio et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1687(1985)、Kahn et al.,Tetrahedron Lett.30:2317(1989)、Olson et al.,J.Am.Chem.Soc.112:323-333(1990)、Garvey et al.,J.Org.Chem.56:436(1990)に示される。さらに適切なペプチド模倣体には、ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸塩（Miyake et al.,J.Takeda Res.Labs 43:53-76(1989))、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸塩(Kazmierski et al.,J.Am.Chem.Soc.133:2275-2283（1991））、ヒスチジンイソキノロンカルボン酸（ＨＩＣ）（Zechel etal.,Int.J.Pep.Protein Res.43(1991))、（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、および（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン(Kazmierski and Hruby,Tetrahedron Lett.(1991))が含まれる。
【００２４】
本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１ペプチドはまた、ｈＲＦＲＰ−１から派生したペプチドを含むこともでき、親ｈＲＦＲＰ−１に結合された少なくとも１つのペプチド骨格は、非自然発生ペプチド骨格結合に化学的に修飾または改変される。言い換えれば、１つのアミノ酸残基の窒素原子と次の炭素原子との間に自然に発生するペプチド結合は、窒素原子上の還元、アルキル化（例えば、メチル化）によって、非自然発生結合に改変されているか、または結合が、アミン、尿素結合、またはスルホンアミド結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合等の還元結合によって置換されている。この点に、残基の側鎖を骨格窒素にシフトして、Ｎ−アルキル化−グリシンを得てもよいことが認識される。ペプチド模倣部分の使用および非自然発生ペプチド骨格の合成、ならびにペプチドの他の化学修飾には、米国特許第７，２１７，８０８号、同第７，１９２，７２３号、および同第７，６８３，０３１号に記載されるものを含み、全体的な内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１ペプチドはまた、環状分子であるか、または環化されるペプチドを含むこともできる。本発明の目的で、「環状分子」は、一例において、本発明のペプチドを指し、Ｎ末端の窒素原子と、Ｃ末端のカルボニル炭素との間のペプチド結合の形成によって環が形成される。「環化」とは、化合物のＮ末端の窒素と、その中に存在する配列の適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、Ｃ末端アミノ酸の側鎖との間の共有結合による環の形成を指す。例えば、アミドは、Ｎ末端の窒素原子と、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖のカルボニル炭素との間に形成することができる。あるいは、化合物のＣ末端のカルボニルと、その中に含まれる配列の適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸の側鎖との間に共有結合を形成することによって、化合物を環化することができる。例えば、Ｃ末端におけるカルボニル炭素と、リシンまたはオリニチンの側鎖内のアミノ窒素原子との間にアミドを形成することができる。加えて、化合物はＣ末端のカルボニル炭素と、セリンまたはトレオニンの側鎖内のヒドロキシル酸素との間にエステルを形成することによって、環化され得る。「環化」とは、化合物内に存在する配列の２つの適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、２つの末端アミノ酸の側鎖の間の共有結合によって環を形成することも指す。例えば、２つのシステインの側鎖内の硫黄原子の間にジスルフィドを形成することができる。あるいは、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖内のカルボニル炭素と、例えば、セリンまたはトレオニンの側鎖内の酸素原子との間にエステルを形成することができる。例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖内のカルボニル炭素と、例えば、リシンまたはオルニチンの側鎖内のアミノ窒素との間にアミドを形成することができる。ペプチドから派生した環化分子、または環化ペプチドを調製する方法は、例えば、米国特許第７，６８３，０３１号において開示され、全体的な内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２６】
さらに、２つの末端の間、１つの末端と化合物中のアミノ酸の側鎖との間、またはペプチドもしくはペプチド誘導体内の２つのアミノ酸の側鎖の間の結合基を用いて、化合物を環化することができる。適切な結合基は、Ｌｏｂｌら、国際公開第９２／００９９５号およびＣｈｉａｎｇら、国際公開第９４／１５９５８号に開示され、その教示は、参照することによって本出願に組み込まれる。
【００２７】
また以下で更に詳述するように、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）の化学的修飾またはペプチド模倣誘導体を含む本発明の特定のペプチドは、「［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１」であり、１２量体親ｈＲＦＲＰ−１（ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド）（配列番号２）の第３のアミノ酸が、ｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン部分と置換される（以降、「Ｂｐａ」と呼ぶ）。出願人は、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１がｈＲＦＲＰ−１の逆作動薬であるという発明的発見をした。特定の実施形態では、本発明の修飾ｈＲＦＲＰ−１ペプチドは、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチドの内部ヒスチジンが、Ｂｐａで置換されるものを含む。理論に制限されないが、Ｂｐａは、心機能に対するｈＲＦＲＰ−１の調整作用の方向を心機能の減少から心機能の増加へ逆転させるために十分な立体障害を示す置換であると想定する。本発明は、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１、および本明細書に記載される他の発明的ペプチドの使用をさらに包含する。
【００２８】
本明細書に記載される配列を含むペプチドは、固相ペプチド合成（例えば、ｔ−ＢＯＣまたはＦ−ＭＯＣ）法を用いるよく知られた手動または自動配列決定によって、液相合成によって、または前述の方法の複合を含む他の十分に適切な手法によって、合成することができる。周知で、広く使用されているｔ−ＢＯＣおよびＦ−ＭＯＣ法は、例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,88:2149(1963)、Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,C.H.Li,Ed.,Academic Press,1983,pp.48-267、およびBarany and Merrifield,in The Peptides,E.Gross and J.Meienhofer,Eds.,Academic Press,New York,1980,pp.3-285に説明がある。固相ペプチド合成の方法は、Merrifield,R.B.,Science,232:341(1986)、Carpino,L.A.and Han,G.Y.,J.Org.Chem.,37:3404(1972)、およびGauspohl,H.et al.,Synthesis 5:315(1992))に説明がある。この参照文献の教示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に記載される本発明の様々な態様および実施形態による任意およびすべてのペプチドは、合成ペプチドとして提供することができ、本発明は、本明細書に記載される配列を含む合成ペプチドを提供することを含む。
【００２９】
化学合成法の代替として、本発明の特定ペプチドは、タンパク質およびペプチドの大規模生成のために適合されたものを含むよく知られた組み換え手法によって生成することができる。この点に、例えば、Molecular Cloning,″2nd Ed.(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載されるものを含む標準的な分子生物学的手法を利用することによって、本発明のペプチドの１つまたは複数をコードする核酸を、宿主細胞内で発現させることができ、続いてよく知られている方法を利用して、ペプチドを宿主細胞から単離および精製する。宿主細胞には、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞系が挙げられ、例えば、ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞、およびＳｆ９細胞が含まれる。その方法には、所望の発現ペプチドの単離および精製を容易にするために、よく知られている潅流タンパク質タグの使用を含み得る。典型的に、タグは、制限タンパク質分解によって、便宜的に除去可能である。さらに、組み換え手法によって生成された発明のペプチドは、本明細書に記載される化学的手段によってさらに修飾できることが認識される。したがって、組み換え手法を利用することによって、内因性ＲＦＲＰ−１ペプチドを修飾して、アミノ酸挿入、削除、置換、および切断を含む１つまたは複数の修飾を含めることができる。したがって、本発明のペプチドは、化学合成後に単離されるか、または組み換え法による生成後に単離される本明細書に記載の発明的ペプチドを包含する。
【００３０】
ペプチド、アミノ酸等を説明する際に本出願の明細書および図面全体に使用する省略形は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会生化学命名法によって推奨されるものであるか、または当該技術分野に慣習的に使用されるものであり、以下のアミノ酸省略形が含まれる。
ＧｌｙまたはＧ：グリシン、ＡｌａまたはＡ：アラニン、ＶａｌまたはＶ：バリン、ＬｅｕまたはＬ：ロイシン、ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン、ＳｅｒまたはＳ：セリン、ＴｈｒまたはＴ：トレオニン、ＣｙｓまたはＣ：システイン、ＭｅｔまたはＭ：メチオニン、ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸、ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸、ＬｙｓまたはＫ：リシン、ＡｒｇまたはＲ：アルギニン、ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン、ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン、ＴｒｙまたはＹ：チロシン、ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン、ＰｒｏまたはＰ：プロリン、ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン、ＧｌｎまたはＱ：グルタミン。特別の定めのない限り、光学異性体のあるアミノ酸は、Ｌ−異性体を表すものとし、ペプチドは、当該技術分野に慣習的に理解されるように、Ｎ末端からＣ末端の方向で示される。以下に、本発明の特定の態様および実施形態をさらに詳細に示す。
【００３１】
一態様において、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであり、当該ペプチドは、脊椎動物において心機能を調整し、またはその塩、アミドもしくはエステルを提供する。
【００３２】
第２の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱであるが、但し、
該ペプチドがペンタペプチドで構成されるとき、該ペンタペプチドのアミノ酸配列はＬＰＬＲＦ（配列番号３）ではなく、かつ
前記ペプチドが、ドデカペプチドで構成され、かつＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１が、それぞれＡ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、Ｌ、およびＲであるとき、Ｘ４はＳまたはＰでない。第２の態様の一実施形態では、ペプチドは、脊椎動物において心機能を調整する。
【００３３】
上述される本発明の態様のいずれかの一実施形態では、式中、Ｘ１はＭ、Ｖ、またはＳ以外のアミノ酸であり、Ｘ５はＦまたはＶ以外であり、Ｘ７はＮ以外であり、Ｘ９はＰ以外であり、Ｘ１１がＲ以外であり、Ｘ１、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、およびＸ１１はそれぞれ互いに独立して選択される。別の実施形態では、Ｘ１１は、Ｒ以外のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ１、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、およびＸ１１の少なくとも１つはＡである。
【００３４】
別の実施形態では、Ｘ８は存在する。別の実施形態では、Ｘ８はＡ、Ｖ、またはＬであり、Ｘ９はＰまたはＦである。別の実施形態では、Ｘ２はＰであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、およびＸ９はそれぞれＡ、Ｎ、Ｌ、およびＰである。
【００３５】
別の実施形態では、Ｘ３およびＸ７のうちの少なくとも１つは、ヒスチジン以外のアミノ酸である。関連の実施形態では、本明細書に記載される発明のペプチドは、内部ヒスチジン残基を含有しない。
【００３６】
別の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は存在しない。別の実施形態では、Ｘ１およびＸ２が存在しない場合Ｘ７はＡである。別の実施形態では、Ｘ１およびＸ２が存在せず、Ｘ７がＡである場合、該ペプチドは、ｈ−ＲＦＲＰ１の逆作動薬である。
【００３７】
別の実施形態では、Ｘ３はＢｐａである。関連の実施形態では、本明細書に記載されるＬＲＦアミドから成るＣ末端配列の任意の自然発生する１０量体または１２量体ペプチドの内部ヒスチジン残基は、Ｂｐａに置換される。
【００３８】
別の実施形態では、本発明の態様のいずれかによる発明のペプチドは、チロシル残基を含む。別の実施形態では、チロシル残基は、Ｎ末端チロシル残基である。別の実施形態では、チロシル残基は、検出可能に標識される。
【００３９】
別の実施形態では、発明のペプチドは、ｈ−ＲＦＲＰ１作動薬、拮抗薬、または逆作動薬である。
【００４０】
別の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は存在せず、Ｘ４はＤ以外のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は存在せず、Ｘ４はＢｐａである。
【００４１】
第３の態様では、本発明は、薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物、およびアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを提供する。
【００４２】
第４の態様では、本発明は、薬理学的に許容される担体、および本発明の第１または第２の態様、および上述されるようなその任意の実施形態による単離ペプチドを提供する。
【００４３】
第５の態様では、本発明は、障害の治療に、本明細書に記載される医薬組成物を使用することを提供する。一実施形態では、障害は心障害である。本発明は、手術前、手術中、または手術後に心機能を増加または減少させるための発明のペプチドの使用をさらに提供する。
【００４４】
第６の態様では、本発明は、心障害の治療のための薬剤の製造に、本明細書に記載される発明のペプチドのいずれかを使用すること提供する。
【００４５】
第７の態様では、本発明は、哺乳動物を含む脊椎動物の心障害を治療する方法を提供し、本方法は、本発明の第１および第２の態様、ならびに上述されるような任意の実施形態に記載される治療有効量の発明のペプチド、または上述の医薬組成物を該脊椎動物に投与することを含む。
【００４６】
第８の態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する薬剤をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
ａ）１つまたは複数の筋細胞の第１の群を、
ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号２）、ＭＰＰＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１４）、ＶＰＮＳＶＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１５）、ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１６）、ＭＰＰＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１７）、ＳＬＫＰＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１８）、ＰＬＲＦ、ＰＱＲＦ、ＦＬＲＦ、ＦＱＲＦ、ＡＰＬＲＦ（配列番号１９）、ＡＰＱＲＦ（配列番号２０）、ＡＦＬＲＦ（配列番号２１）、ＡＦＱＲＦ（配列番号２２）、ＶＰＬＲＦ（配列番号２３）、ＶＰＱＲＦ（配列番号２４）、ＶＦＬＲＦ（配列番号２５）、およびＶＦＱＲＦ（配列番号２６）から成る群から選択される配列を含む単離ペプチドと接触させ、式中、Ｆはアミド化されること、
ｂ）ａ）に記載される第１の群、または１つもしくは複数の筋細胞の第２の群を、試験薬と接触させ、試験薬と接触した後の作用を測定すること、および
ｃ）ステップａ）の測定値をステップｂ）の測定値と比較することから、試験薬が脊椎動物の心機能を調整するか否かを決定すること、
を含む。
【００４７】
一実施形態では、ステップａ）のペプチドは、
ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号２）、ＭＰＰＳＦＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１４）、ＶＰＮＳＶＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１５）、ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１６）、ＭＰＰＳＡＡＮＬＰＬＲＦ（配列番号１７）、ＰＬＲＦ、ＰＱＲＦ、ＦＬＲＦ、およびＦＱＲＦから成る群から選択され、式中、Ｆはアミド化され、該脊椎動物は哺乳動物である。
【００４８】
別の実施形態では、試験薬は、本発明の第１または第２の態様によるペプチドである。別の実施形態において、ステップａ）のペプチドは、Ｎ末端チロシンをさらに含み、該チロシンは、測定可能に標識される。
【００４９】
第９の態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
１つまたは複数の筋細胞の群を、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および該ポリペプチドが、該接触に起因して、該第１の群において心機能を調整するか否かを決定することを含む。
【００５０】
別の関連態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
心細胞または組織を、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および該ポリペプチドが、該接触に起因して、該第１の群の心機能を調整するか否かを明らかにすることを含む。本明細書で使用する「心細胞または組織を接触させる」とは、本発明の目的で、筋細胞を含む細胞または心臓由来の細胞集団を結合および／または心収縮性に１つまたは複数の陽性または陰性作用を促進する条件下で、ペプチドと接触されることを意味する。心細胞または組織を接触させることは、例えば本明細書に記載される生体外方法によって生体外で、または１つもしくは複数のペプチドを動物の全身に投与することによって、例えば、尾静脈注入および本明細書に記載される生体内投与方法によって、生体内で行うことができることが認識される。
【００５１】
第１０の態様では、本発明は、哺乳動物を含む脊椎動物の心機能を調整する方法を提供し、該方法は、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｆ（配列番号１３）を含む単離ペプチドであって、
式中、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ８のいずれか１つが存在するかまたは存在せず、Ｘ９およびＸ１１が存在し、Ｘ１０がＬまたはＱである、単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを、該脊椎動物の心機能を調整するために有効な量で、該脊椎動物に投与することを含む。
【００５２】
本発明の第９または第１０の態様の一実施形態では、ペプチドは、本発明の第１または第２の態様、および上述されるような任意の実施形態に記載の発明のペプチドである。
【００５３】
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載される発明のペプチドおよび薬理学的に許容される担体を利用する方法または組成物を対象とする。本明細書で使用する、「薬理学的に許容される担体」という用語は、標準の薬理学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水乳剤またはトリグリセリド乳剤等の乳剤、様々な種類の湿潤剤、錠剤、コーティング錠剤およびカプセルのいずれかを包含する。典型的に、担体は、スターチ、ミルク、砂糖、ある種類の粘度、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油脂、ガム、グリコール等の賦形剤、または他の既知の賦形剤を含有する。担体は、香味および着色添加剤または他の成分を含んでもよい。
【００５４】
滴定等のよく知られた手法によって、および個別の対象において観察される投与ペプチドの薬物動態特性を考慮することによって、当業者は、本発明の治療方法に適切な用量を判断することができる。
【００５５】
本明細書に引用される特許、特許出願、政府刊行物、政府規制、および参考文献はいずれも、参照することによって全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本記述が優先される。
【００５６】
本開示の追加の特徴は、図面、実施例、および添付の請求項と併せて、本明細書に記載の詳細な説明のレビューから当業者に明らかとなり得る。
【００５７】
本発明は、例示の実施形態を参照して本明細書に記載されるが、本発明はそれに限定されないことを理解されたい。当該技術分野に通常の技術があり本明細書の教示にアクセスできる者であれば、追加の修正および実施形態がその範囲内に含まれることを認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付される請求項によってのみ限定される。本発明の目的で、「〜を含む」という用語は、「〜から成る」という用語を包含することが理解される。
【実施例】
【００５８】
実施例Ａ：
ｈＲＦＲＰ−１は心筋細胞内でＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と結合するという仮説を試験するｈＲＦＲＰ−１心受容体の特徴付け
ｈＲＦＲＰ−１受容体は、検出可能なｈＲＦＲＰ−１作動薬または拮抗薬をラット心筋細胞に結合することによって特徴付けられる。検出可能な類似体結合は、ｈＲＦＲＰ−１に競合し、受容体の同一性および特異性を確認するのを助ける。出願人は、心機能を増加させる［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が、ｈＲＦＲＰ−１受容体に結合するか否かを調べる。ｈＲＦＲＰ−１受容体の発現は、同定された受容体に対して生成された抗血清を使用することによって、免疫学的局在決定により検討する。心ストレス因子、心筋梗塞（ＭＩ）に応答する受容体発現が特徴付けられる。受容体はまた、周知の生物分子学的手法、例えばノーザンおよびサザンプロット、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等を使用することによって、ヌクレオチドレベルで検討する。
【００５９】
検出可能なｈＲＦＲＰ−１類似体を心筋細胞膜に結合して、その受容体に対するペプチドの高親和性結合を特徴付ける。検出可能な類似体は、ＲＦＲＰ−１作動薬、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１のヨード化によって生成され得る。チロシルｈＲＦＲＰ−１類似体もまた、ｈＲＦＲＰ−１ペプチドとほぼ同じく心機能を減少させ、同一の受容体に結合することを示唆する。Ｉ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１類似体を心筋細胞内で試験し、受容体を「タグ付け」するために使用する前に、当該類似体がｈＲＦＲＰ−１心機能の作動薬または拮抗薬であることを確認する。Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１がｈＲＦＲＰ−１作動薬であるため、標識類似体は、心筋細胞タンパク質を結合することが予測される。加えて、１２５Ｉ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１類似体は、発現したｒｆｒ−２、候補ｈＲＦＲＰ−１心受容体を密接かつ特異的に結合する（Gouarderes et al.2007,Neuropharmacology 2:376-86）。代替の検出可能な類似体は、３Ｈ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１類似体である（Talmont et al.August 12,2009,Neurochem Int.EPUB ahead of print,PUBMED PMID 19682524))。結合の特異性をｈＲＦＲＰ−１との競合によって試験する。また、親ペプチドおよび類似体が同一の受容体に結合するか否かを明らかにする間接的な方法として、アッセイを使用して［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１との結合を競合する。［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１受容体との同一性は、心筋細胞を［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１で探索することによって証明され、結合するタンパク質を特徴付ける。
【００６０】
確立した方法に基づいて、膜を調製する。要約すると、本明細書に記載される方法によって調製した単離心筋細胞を、検出可能なｈＲＦＲＰ−１類似体（０．１μＭ）を用いて、軌道攪拌器上に一晩インキュベートし、洗浄して遊離類似体を除去し、遠心分離して、非変性状態下でペレットを可溶化し、ペプチド受容体の結合の完全性を維持する。Ｂｐａ含有ｈＲＦＲＰ−１類似体の光活性化は、インキュベーション後、紫外線（３６５ｎｍ）によって１５分間行う。非変性２次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）によって試料を分離し、標識タンパク質を特異的に同定するように処理する。例えば、ＭＷまたはｐＩ勾配および／もしくは緩衝液条件の変化等のいくつかのゲルパラメータ下の単一タンパク質、ならびに／または単一Ｎ末端によって規定する標識２ＤＧＥ「スポット」を精製して均質にする。一旦均質に精製されると、ＭＷおよびｐＩを明らかにし、トリプシンマップおよび質量分析に基づいてアミノ酸配列を得る。受容体に結合した類似体は、タンパク質のアミノ酸配列分析に干渉しない。
【００６１】
データはｒｆｒ−２（受入番号＃ＡＦ２６８８９８、ＭＷ＝４８ｋＤａ、ｐＩ９．５）と比較して、このタンパク質がｈＲＦＲＰ−１受容体であるか否かを明らかにする。適合するものがない場合、データベースを検索する。追加の配列データが、得られたアミノ酸配列に対して設計されたプライマーを使用して、筋細胞の転写産物を増幅させることから得られる。配列が新規である場合、予測タンパク質は分析され、ＧＰＣＲの構造特徴を同定する。対照試験は、過剰な非標識類似体またはｈＲＦＲＰ−１の存在下、検出可能なｈＲＦＲＰ−１を用いてインキュベートされた心筋細胞、遊離１２５Ｉ（または３Ｈ）を用いるインキュベーション、ペプチドを用いないインキュベーションによる心筋細胞を含む。ｈＲＦＲＰ−１受容体を特徴付けるための実験はさらに、ＳＡＲ（Structure-Activity Relationship）を描写するためのリガンド−タンパク質結合研究を含み、アラニン走査およびＮ末端切断のデータと一致するはずである。
【００６２】
放射性標識Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１がｈＲＦＲＰ−１作動薬でない場合、既にｈＲＦＲＰ−１作動薬であると同定されている非標識Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１は、２ＤＧＥ内のｐＩ移行に基づいて、受容体に結合された状態で検出され得る。受容体タンパク質のＹ−ｈＲＦＲＰ−１の有無、結合および未結合はｐＩにより異なり、検出するのに十分に有意なｐＩシフトを介して類似体結合を検出する。
【００６３】
受容体タンパク質に結合するＹ−ｈＲＦＲＰ−１は、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１に対する抗血清によって検出することもできる。
【００６４】
非変性条件を使用して、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１受容体結合を維持するが、結合定数は、受容体タンパク質をタグ付けするための別の手段が用いられる場合には適切でないことがある。代替例に、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１がある。上記のアプローチによって一旦同定されると、受容体タンパク質がｈＲＦＲＰ−１、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１（拮抗薬）、および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１（刺激類似体）に結合する能力を、心筋細胞膜にて、最終的には発現タンパク質を使用して検討する。［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が結合する受容体を同定するために、追加の独立した実験としてＹ−ｈＲＦＲＰ−１を使用する。
【００６５】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の発現
単離したラットの心筋細胞およびラットの心組織内での発現を探索するために、同定された受容体に対するポリクローナル抗血清を生育した。受容体タンパク質はｒｆｒ−２であると同定される場合、受容体発現について探索するためにｒｆｒ−２抗血清を使用する。いくつかのｒｆｒ−２抗血清は市販されており、それぞれタンパク質配列から予測される抗原に対して生成される。標準プロトコルを間接免疫蛍光法に使用し、ラット筋細胞および心組織切片を探索する。
【００６６】
ラットの心臓内でＲＦＲＰ−１が発現することを示した完了した研究に対して、データを評価する。ラットの心室筋細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成した（配列番号２７、アミノ酸配列−配列番号２８）。シークエンシングは、ＲＦＲＰ−１転写が発現することを示し、ＲＦＲＰ−１が心シグナル伝達分子であることを証明した。この実験はまた、ヒトの心室組織を使用して実行したが、ラットの組織と同様に、ヒトの心臓内でＲＦＲＰ−１  ｍＲＮＡが発現した（配列番号２９、アミノ酸配列−配列番号３０）。このデータは、ＲＦアミド関連ペプチドの発現を確立したラットの心筋細胞上に免疫組織化学的染色を行うことよってさらに支持された。
【００６７】
心筋細胞および心切片における免疫蛍光試験のプロトコルは、概して以下のとおりである。McCormick and Nichols (1993)に基づいて、間接免疫蛍光法のために脊椎動物単離心筋細胞を処理する。脊椎動物の心臓を、クリオスタット切片法のために処理する。固定した細胞を、ウサギポリクローナルｈＲＦＲＰ−１受容体抗血清（約１：１０００）を用いて一晩インキュベートし、続いて洗浄し、ヤギ抗ウサギシアニン系蛍光二次抗体（約１：５００）を用いてインキュベートした後、洗浄して撮像処理する。条件は、McCormick and Nichols (1993)に使用されるプロトコルに従う。非特異的結合は、抗原吸着性一次抗血清を用いてインキュベートすることによって、および二次抗体だけの一次抗血清の非存在下で明らかにされる。一次抗血清および二次抗体の正確な希釈は、実験条件下で最適化され、所与の値は、前述の間接免疫蛍光プロトコルの典型である。
【００６８】
単離されたラット心筋細胞のＲＦアミド免疫学的局在決定のデータ、吸着前抗血清を用いる対照、および一次抗血清を用いない対照により、染色はＲＦアミド含有ペプチド、例えばＲＦＲＰ−１に特異的であることがわかる。
【００６９】
さらに、ラットに誘発した心筋梗塞（ＭＩ）に応答して、受容体タンパク質の発現を検討する。左前下行枝（ＬＡＤ）冠動脈結紮に起因するラットの誘発ＭＩは、ＵＭ  ＣＩＧの再充電方式で提供される確立された手法である。この分析方法は、ｈＲＦＲＰ−１が心機能に劇的に影響を及ぼすため、心不全下の心機能を増加させるために、ｈＲＦＲＰ−１類似体がどのように作用し得るかをより良く理解するために遂行される。つまり、鎮静状態のラットに経口挿管し、１００％酸素中０．５〜１％のイソフルランと共に調圧した人工呼吸器を介して、ピーク呼吸圧力１５ｃｍのＨ２Ｏおよび１分当たりの呼吸数６０で人工呼吸をおこなった。解剖顕微鏡を使用して、左開胸を経由して心臓を開き、７−０シルク縫合糸でＬＡＤの近位部分の周囲を左心房から１〜２ｍｍ縫い付ける。胸部を温かい無菌食塩水で満たして空気を抜き、５−０シルク縫合糸を使用して層状に閉合する。対照は、ＬＡＤ結紮なしに同一の開胸プロトコルを経たラットである。この手法は、マウスにも用いる。ＭＩ心臓内のｈＲＦＲＰ−１受容体タンパク質の発現は、生理学的条件（上述）下で発現を明らかにするために使用される方法に従う。
【００７０】
検出可能なｈＲＦＲＰ−１類似体は、心筋細胞タンパク質に結合して受容体を同定すると想定される。ＭＷ、ｐＩ、およびアミノ酸配列に基づいて、受容体が同定され、有力な候補は、ｒｆｒ−２またはＧＰＣＲタンパク質である。ヒトＲＦＲＰ−１は、発現したｒｆｒ−２タンパク質、推定のＧＰＣＲに結合する。したがって、ｈＲＦＲＰ−１心受容体は、ｒｆｒ−２であり得るが、受容体の同一性およびタンパク質構造を独立して確立することが重要となる。ラットおよびヒトｒｆｒ−２  ｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列は、それぞれ４３２および４３０残基の長さであり、同一性が８６％であるため（Hinuma S et al.,2000,Nat Cell Biol 2:703-708）、ラットＲＦＲＰ受容体を同定することにより、重要な情報をヒト受容体にもたらす可能性が高い。
【００７１】
検出可能なｈＲＦＲＰ−１類似体は、受容体タンパク質を同定し、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１を使用して、受容体タンパク質を独立して同定する。検出可能な類似体の例には、１２５Ｉ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１、３Ｈ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１、蛍光標識ｈＲＦＲＰ−１、およびビオチニル化ｈＲＦＲＰ−１がある。
【００７２】
出願人は、ラットおよびマウスＭＩモデル内で行われたＭＩに反応して、受容体発現が変化するか否かを検討する。
【００７３】
代替アプローチ
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定：少量のｈＲＦＲＰ−１心受容体
受容体が少量である場合、親和性精製ステップを含めることによって、受容体を増やすことができる。出願人のポリクローナルｈＲＦＲＰ−１抗血清は、タンパク質に結合した類似体を認識し、それを使用してリガンド−受容体タンパク質複合体を増やすことができる。類似体は構造的な特徴付けに干渉しないため、類似体結合タンパク質を、緩衝液ｐＨまたは塩の変化によって抗血清から解放することができる。あるいは、ビオチニル化ｈＲＦＲＰ−１類似体は、アビジンによって同定される親和性リガンドであり、膜調製から受容体タンパク質を増やすことができる。さらに、２ＤＧＥ単離スポットに対するポリクローナル抗血清は、高親和性受容体を構造に特徴付けるために生成することができる。
【００７４】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定：多重体受容体
出願人の知る限り、これまでｒｆｒ−２を含むＲＦＮＨ２含有ペプチド受容体はいずれも、単一タンパク質である。ｈＲＦＲＰ−１心受容体が多量体タンパク質である場合、出願人がとるアプローチは、ｈＲＦＲＰ−１に結合するサブユニットを同定し、受容体複合体全体を同定するための分子ツールを生成することである。
【００７５】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定：非ＧＰＣＲシグナル伝達
拮抗薬を使用して受容体を同定し、タンパク質にタグを付ける出願人がとるアプローチは、作用する分子ｈＲＦＲＰ−１の種類と無関係である。これまでのデータは、ｈＲＦＲＰ−１受容体がＧＰＣＲであることを示唆し、ＲＦＮＨ２含有ペプチドは、典型的に、ＧＰＣＲによって作用する。しかしながら、２つのイオンチャネル型受容体もまた、ペプチドについて同定された。いずれも、上皮アミロリド感受性のＮａ＋チャネルおよびデジェネリン系のイオンチャネルのメンバーである（Lingueglia et al.2006,Peptides,27:1138-52のレビューを参照)。無脊椎動物のＦＭＲＦＮＨ２依存性Ｎａ＋チャネル（ＦａＮａＣ）は、ペプチドによって直接開閉される。哺乳動物の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）は開閉されないというデータがあり、ＦＭＲＦＮＨ２および関連のペプチドによって調整される。上述のアプローチを使用してｈＲＦＲＰ−１  ＧＰＣＲが同定されない場合は、次にＦａＮａＣまたはＡＳＩＣ様転写産物またはタンパク質について心筋細胞を検索する。
【００７６】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定：代替類似体
１２５Ｉ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１は、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１がｈＲＦＲＰ−１作動薬であるため、受容体に結合すると予想される。ヨード化類似体が結合しない場合、別の検出可能な類似体を検討する。しかしながら、放射性標識または化学的に検出可能な類似体を必要としない。結合するが、化学的、異性体的、または視覚的に検出可能でない類似体を使用して、受容体を同定することができ、非変性２ＤＧＥは、０．０１未満の等電点（ｐＩ）移動によって、結合タンパク質と未結合タンパク質とを区別する。ｈＲＦＲＰ−１に対する低親和性結合定数もまた、発現したｒｆｒ−２タンパク質に特異的かつ緊密にペプチドが結合するため、問題となることは予想されないが、類似体を受容体に共有結合するためにＢｐａを組み込むことによって、この問題に対処する。２ＤＧＥは、多数の標識タンパク質を同定することができ、対照実験を行って（遊離１２５Ｉ、非標識ｈＲＦＲＰ−１と競合する類似体等）、背景の同定を助け、非特異的類似体結合を排除または同定する。特異的であると同定され、候補受容体となるべく寸法が適切なある標識タンパク質を特徴付ける。
【００７７】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定：関連受容体からの分化
ｈＲＦＲＰ−１受容体を、構造的に関連するタンパク質と区別するのに、多数の独立パラメータに基づいて、筋細胞タンパク質の分離を利用する。均質性は、３つの独立パラメータ、ＭＷ、ｐＩ、およびＮ末端に基づく。構造的に関連するタンパク質ｒｆｒ−２（ＭＷ＝４８ｋＤａ、ｐＩ９．５）およびｒｆｒ−１（ＭＷ＝６０ｋＤａ、ｐＩ９．４）は、出願人が使用を提案している手法を用いて、互いに明確に区別される［Bonini et al.2000、Fukusumi et al.2006]。
【００７８】
ｈＲＦＲＰ−１心受容体の同定
同定された受容体に対してポリクローナル抗血清が生成され、または受容体がｒｆｒ−２である場合、ｒｆｒ−２に対して抗血清が生成され、ｈＲＦＲＰ−１受容体タンパク質に結合し、発現を明らかにする。あるいは、筋細胞に対する３Ｈ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１結合を使用し、オートラジオグラフィを介して、標識受容体タンパク質の発現を明らかにする。最初に、３Ｈ−Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１が作動薬または拮抗薬であり、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１は作動薬であることを確認する。対照は、過剰な非標識ペプチドのある標識ペプチドと競合させるか、または遊離標識を単独で使用することを含む。代替例は、蛍光標識ｈＲＦＲＰ−１を使用して、ペプチド受容体タンパク質複合体を検出し、受容体タンパク質に結合されたｈＲＦＲＰ−１を認識することである。対照は、ペプチドリガンドの非存在下で、標識抗血清を含む。ｈＲＦＲＰ−１の直接蛍光標識を使用して、ペプチドが結合するタンパク質を検出することができ、非標識ｈＲＦＲＰ−１を用いて対照を蛍光と競合させる。
【００７９】
実施例Ｂ：
ｈＲＦＲＰ−１がＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼによって媒介される収縮性およびリン酸化反応に及ぼす作用／タンパク質のリン酸化反応を伴う、ｈＲＦＲＰ−１が筋細胞内の収縮機能を減少させる機構（複数可）
ｈＲＦＲＰ−１がサルコメア短縮および弛緩に及ぼす影響は、ビスインドリルマレイミド−１（ビス−１、５００ｎＭ）、ＰＫＣ阻害剤および／またはＨ−８９（１マイクロモル）、ＰＫＡ阻害剤の非存在下および存在下で測定する。対照には、阻害剤の非存在下で、ｈＲＦＲＰ−１が心機能に及ぼす影響を測定すること、および阻害剤の非存在下および存在下、ペプチドを用いない実験条件下で機能を測定することを含む。ｈＲＦＲＰ−１作動薬でも拮抗薬でもないＲＦＮＨ２含有ペプチド類似体に反応する収縮性もまた、阻害剤の存在下および非存在下で測定する。まとめると、このデータにより、弛緩時にｈＲＦＲＰ−１の影響に関与する主要なシグナル伝達経路を同定する。どのＣａ２＋循環／筋フィラメントタンパク質が、単離ラット心筋細胞に適用されたｈＲＦＲＰ−１に反応してリン酸化されるかを検討し、研究をヒト組織にまで拡大する。
【００８０】
ペプチドが筋細胞に及ぼす影響は、ペプチド処理した筋細胞内のＣａ２＋過渡および等尺性力発生を測定することによって検討する。一群の試験では、１０−７〜１０−９Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１の影響をＦｕｒａ−２ＡＭ負荷筋細胞内で１５分にわたって測定し、Westfallら（2005）のプロトコルに従って、ペプチドが細胞性Ｃａ２＋過渡に及ぼす影響を明らかにする。他の試験では、ペプチド処理に続いて透過処理された筋細胞内で等尺性力発生を測定する。一連のＣａ２＋濃度で力を測定し、試験結果は、筋フィラメントがｈＲＦＲＰ−１シグナル伝達の直接の標的であるか否か、および低負荷下での筋細胞内の短縮に対する影響が、ピーク張力および筋フィラメントＣａ２＋感受性の同等の減少に転じる否かを明らかにする。ペプチドは、我々の予備の生体内試験に基づいて、両ピーク張力を著しく減少させ、筋フィラメントＣａ２＋感受性を増加させると予想される。
【００８１】
キナーゼ阻害剤が弛緩時にｈＲＦＲＰ−１の影響に及ぼす作用
成体ラット心筋細胞を、確立されたプロトコルに基づいて単離する［Westfall et al.1997,Meth Cell Biol,52:307-322、Westfall and Borton 2003]。サルコメア短縮および弛緩を筋細胞内で測定し、ｈＲＦＲＰ−１を用いる場合と用いない場合の基礎レベルデータを得る(10−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１）。次に、ＰＫＣ阻害剤、ビス−１（５００ηＭ）（Green et al.2006 J Mol Cell Cardiol,41:350-359)、もしくはＰＫＡ阻害剤、Ｈ−８９（１００ηＭ）もしくはＰＫＩ類似体（ＰＫＩ−（Ｍｙｒ−１４−２２）−アミド、１μＭ）（Xaio B et al.2006,Biochem J 396:7-16、Murray AJ et al.2008,Sci Signal1:re4）またはＰＫＣおよびＰＫＡ阻害剤の両方を含有する媒体を、１分間潅流させた後、ｈＲＦＲＰ−１を添加し、ペプチドなし、または作動薬でも拮抗薬でもないＲＦＮＨ２含有ペプチド類似体を添加して、阻害剤がｈＲＦＲＰ−１活性に及ぼす影響を明らかにする。さらに、対照は、阻害剤なし、ペプチドなし、またはペプチド類似体なしの同一条件下で、心機能を測定することを含む（ＲＦＮＨ２、構造的にｈＲＦＲＰ−１に類似するが、ｈＲＦＲＰ−１作動薬でも拮抗薬でもない）。
【００８２】
ウェスタンブロット分析によるリン酸検出
リン酸化標的を同定するために、筋細胞を収集し、試験して、ｈＲＦＲＰ−１活性を確認し、キナーゼ活性に相関するタンパク質発現を分析する。成体ラットの心筋細胞を、説明［Westfall et al.2005]されるように、カバースリップから擦り取って試料緩衝液に入れる。タンパク質を、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に電気泳動的に分離し、ＰＶＤＦ膜上にトランスブロットする［Westfall and Borton 2003、Westfall et al.2005]。
【００８３】
抗体に、ＭＡＢ１６９１、トロポニンＩ（ＴｎＩ）異性体を認識するモノクローナル抗体、抗リン酸Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ＰＫＡ基質抗体（ＰＫＡに対して感受性がある部位において、リン酸化の変化を示すタンパク質の分子量を同定するため）、抗リン酸ＰＫＣα／ＢＩＩ、抗リン酸ＰＫＣδ、抗リン酸ＰＫＣパン、抗リン酸ＴｎＩ、Ｓｅｒ２３／２４、および抗リン酸ＰＬＢが挙げられる。Ｓｅｒ１６（ＰＫＡ依存性部位）および／またはＴｈｒ１７（ＣａＭＫ  ＩＩ依存性部位）におけるＰＬＢ、ならびにＳｅｒ２３／２４部位（ＰＫＡおよびＰＫＣ依存性）におけるＴｎＩのリン酸化は、前述のように検出される（Braz et al.2004 Nat Med 10:248-54、Westfall et al.2005)。
【００８４】
キナーゼ活性および放射性標識の試験
この試験に関して、非放射性ＰＫＡおよびＰＫＣ活性の分析（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社，アナーバー，ミシガン州）も行い、キナーゼの一方または両方が活性化されるか否かを明らかにする。ＴｎＩが主標的であると思われるイベントでは、ＭＡＢ１６９１により免疫沈澱されたＴｎＩの２次元分離を行った後、液体クロマトグラフィ同定を行って、リン酸種が関与したことを明らかにする。この戦略は、ＰＫＣが主要シグナル伝達経路である場合、ＰＫＣがＴｎＩ上の５つの残基をリン酸化するため、必須であり得る（Noland et al.1989 J Biol Chem 264:20778-85)。他の潜在的な標的のリン酸化が懸念される場合(例えば、Ｌ型Ｃａ２＋チャネル、リアノジン受容体、ミオシン軽鎖２、ミオシン結合タンパク質Ｃ、トロポニンＴ）、Ｈ−８９もしくはＰＫＩもしくはビス−１を用いる場合および用いない場合、ｈＲＦＲＰ−１に応答して、筋細胞内の３２Ｐ−オルトリン酸塩標識および統合を測定し、タンパク質分子量に基づいて、最初に同定を行う。次に、特定のタンパク質を対象とする抗リン酸抗体（使用可能な場合）および／または上述の２次元分離を使用して、各標的タンパク質内でリン酸化された残基をさらに同定する。
【００８５】
リン酸化の検出のために回収された筋細胞を、ｈＲＦＲＰ−１（１０−１０Ｍ）およびカリクリンＡ、タンパク質ホスファターゼタイプ１および２ａの存在下および非存在下でインキュベートする。さらに、Ｈ−８９（１００μＭ）またはＰＫＩ類似体（１μＭ）ＰＫＡ阻害剤またはＰＫＣ阻害剤、ビス−１（５００ηＭ）の存在下および非存在下でｈＲＦＲＰ−１を適用する。対照は、ペプチドを含まず、ｈＲＦＲＰ−１作動薬でも拮抗薬でもないペプチド類似体を含む。インキュベーション時間および濃度は、以前に使用されたものに従う（例えば、Westfall et al.2005)。研究によってホスファターゼが潜在的かつ重要な標的であることが示唆される場合、カリクリンＡの非存在下でも試験を行う。
【００８６】
サルコメア短縮
心機能を増加させる、ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１（拮抗薬）および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の影響を測定する。心筋細胞内のサルコメア短縮および弛緩の長さを、ビデオに基づくＩｏｎＯｐｔｉｘ検出システムを使用して、そうでなければ本明細書に記載されるように検出する。シグナル平均データを分析して、サルコメア静止長、サルコメア静止長に対して正規化したピーク短縮（％ピーク高）、ピーク短縮までの時間（ＴＴＰ）および２５、５０、７５％弛緩までの時間（それぞれＴＴＲ２５、ＴＴＲ５０、ＴＴＲ７５）を明らかにする。Ｆｕｒａ−２ＡＭ負荷筋細胞を使用してＣａ２＋過渡を測定する試験は、１５分間１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１、または［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１で監視し、ビス−Ｉおよび／またはＨ−８９は、短縮／弛緩に対する作用と連携して、Ｃａ２＋過渡の変化を阻害すると予測される。シグナル伝達は、Ｃａ２＋過渡および筋フィラメントの両方を標的として、ピーク短縮の減少および弛緩の遅延をもたらすことが予想される。
【００８７】
等尺性力の測定
ｈＲＦＲＰ−１ならびにその作動薬および拮抗薬が力の発生に及ぼす作用を測定する。等尺性力の測定は、Ｗｅｓｔｆａｌｌ研究室におけるプロトコルに従って行う（Westfall et al.1997 Methods Cell Biol,52:307-22、Westfall et al.2005)。単離されたラット心筋細胞を、ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１、および/または［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１で処理し、ペプチド、受容体遮断、および心機能を増加させる類似体の作用を研究する。一連の濃度を分析する。正常な筋細胞を15分間処理し、その後、モーターおよび力変換器に取り付ける。続いて、ホスファターゼ阻害剤カリクリンＡを添加し、細胞を透過処理する。ｐＣａ９．０〜４．５にわたって力を測定した後、アルカリンホスファターゼを用いて脱リン酸化し、力／ｐＣａ曲線を反復して、確実にピーク力が元のピークの８０％以下に降下しないようにする。試験の目的は、筋フィラメントが、ｈＲＦＲＰ−１およびｈＲＦＲＰ−１類似体の主標的であるか否かを評価することである。
【００８８】
代替Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ
ｈＲＦＲＰ−１に対する急速かつ劇的な反応は、ペプチドが、転写調節を介する調整ではなく、標的タンパク質に対する直接的な影響によって作用することを示唆する。したがって、代替アプローチには、心不全に関与することが知られている他のキナーゼまたは分子がｈＲＦＲＰ−１活性に及ぼす影響を検討することを含む。追加のキナーゼにはＲｈｏキナーゼが挙げられ、筋フィラメントカルシウム感受性に影響して、不全を起こしている心臓内の弛緩を延長する［Vahebi et al.2005 Circ Re.96:740-747、Lin et al.2007 Cardiovasc Res 75:51-58]。他の代替例には、ＣａＭＫ  ＩＩ、ホスホランバン、ホスファターゼ活性およびカルシネウリン活性を標的とするＭＡＰＫを標的とすることの役割、ならびに他のタンパク質ホスファターゼが直接標的される可能性が挙げられる。
【００８９】
他のシグナル伝達カスケード
主要なシグナル伝達経路は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの活性を伴うことが予測されるが、他のシグナル伝達カスケードもまた、筋細胞内の機能的反応に寄与する可能性がある。潜在的なシグナル伝達カスケードは、他のキナーゼ、例えば、Ｒｈｏ、ＣａＭＫ  ＩＩ、およびＭＡＰＫキナーゼを含むことができる。２次元電気泳動および／またはポリメラーゼ鎖反応は、ｈＲＦＲＰ−１の適用時における筋細胞内の分子変化についてより広範に調査する。タンパク質負荷は、ポリアクリルアミドゲルの銀染色部分から得たタンパク質を使用して正規化する［Green et al.2006 J Mol Cell Cardiol 41:350-359]。
【００９０】
化学阻害剤の代替例
タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）ペプチドは、ＰＫＡ活性を規制する内因性分子であり、Ｈ８９の代替例である。ＰＫＩ類似体は市販されている（Ｓｉｇｍａ、Ｔｏｒｃｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、およびＥＭＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。ＰＫＩがｈＲＦＲＰ−１活性に及ぼす影響は、それぞれＰＫＡの役割に関する間接的な証拠である。ＰＫＣもしくはＰＫＡ、または両方の役割を検討することは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または非機能性ＰＫＣ（またはＰＫＡ）突然変異を使用する薬学的および分子的アプローチを複合して、機能的反応のシグナル伝達カスケードの重要性を証明する。
【００９１】
実施例Ｃ：心臓に対する生体内影響
単離された筋細胞内でｈＲＦＲＰ−１に反応して認められる収縮機能およびリン酸化の減少は、ほぼ同じパターンの収縮性およびリン酸化の減少に加えて、生体内の収縮期および／または拡張期不全の減少となる。
【００９２】
マウスの尾静脈を介する１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１の静脈内送達が心不全を引き起こし、励起−収縮の結合に関与するタンパク質のリン酸化を必要とする心反応を検討した。
【００９３】
ｈＲＦＲＰ−１用量反応の試験により、生体内の心機能に影響する濃度の範囲が理解される。出願人は、拮抗薬、例えば、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１単独の作用、ならびに生体内のｈＲＦＲＰ−１の作用および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１に対する影響を検討する。逆作動薬、例えば、類似体［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が、心機能を増加させ、ｈＲＦＲＰ−１誘発性心不全の作用および心臓ストレスにおけるｈＲＦＲＰ−１および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の作用に対抗するか否かを明らかにする。
【００９４】
出願人は、マウス心臓内のｈＲＦＲＰ−１に反応して、および心機能を増加させるｈＲＦＲＰ−１類似体に反応して、生体内のリン酸化のための標的分子を監視する。ｈＲＦＲＰ−１の存在下および非存在下でのｈＲＦＲＰ−１単独、および拮抗薬、例えば、ＬＰＬＡＦアミドおよび［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の作用、および心筋梗塞を含む心臓ストレス下で、生体内で逆作動薬、例えば、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が心機能に及ぼす作用についてさらに探求する。心エコー検査は、本明細書に記載されるように行う。
【００９５】
第１の試験群には、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（ｎ＝３）および生理食塩水（ｎ＝３）が含まれていた。結果に基づいて、パワー分析は、データに関してｎ＝４で９５％信頼水準が得られることを示す。１０−８Ｍ類似体は、注入液に含まれるが、濃度は、結合状態または変性に起因して変動し得る。ｈＲＦＲＰ−１類似体の作用ならびにＨＲ、ＬＶＤ、ＳＶ、ＥＦ％、およびＣＯを含む心パラメータ上の親ペプチド、ｈＲＦＲＰ−１、および類似体の間の競合を探索する。さらに、左前下行枝（ＬＡＤ）冠動脈結紮モデルに起因する心的ストレス因子心筋梗塞に反応して、ｈＲＦＲＰ−１および類似体が生体内の心機能に及ぼす作用を探索する。
【００９６】
生体外のシグナル伝達経路の分子成分を同定するために、出願人は、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学を介して、心組織を分析し、ポリメラーゼ鎖反応を分析して、ｈＲＦＲＰ−１受容体発現になんらかの変化があるか、および心的ストレス因子ＭＩへの反応に変化があるかを明らかにする。加えて、記載されるように、「逆リン酸化」分析を行うために、心臓を単離および処理することができる（Michele et al.2002 Circ Res 91:255-262）。ＰＫＣおよび／またはＰＫＡを利用して、逆リン酸化することができる。
【００９７】
代替アプローチ
いくつかの類似体は、静脈内送達されると、分解の影響を受けやすくなる。血リンパ内で、「トレーサー」を類似体上に含む検出可能な類似体（複数可）の存在を監視することによって、ペプチドの寿命、分解の手段を比較することができる。代替アプローチは、典型的に、Ｌ−アミノ酸よりもペプチドまたは類似体への分解の影響を受けにくいＤアミノ酸を統合すること、またはプロテアーゼ阻害剤を注入剤に含めることを含む（対照はプロテアーゼ阻害剤単独である）。
【００９８】
実験手順
キイロショウジョウバエの心拍数−Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒオレゴンＲ野生型系ハエを、１２時間の明暗周期下、２４℃で、コーンミール糖蜜培地上で維持した。分析のために選択した動物は、幼虫、前蛹、または成虫であり、雄雌両方を分析したところ、反応に差は認められなかった。顕微鏡台に接着された二重粘着テープの上に動物を配置し、前述されるように、生理食塩水（対照）またはペプチドを送達する前に２分間、および送達後に１０分間監視した（Nichols,R.Et al.(1999)、Zornik,E.et al.(1999)）。引き延ばされたマイクロピペットを使用して、生理食塩水またはペプチド（４０ηＬ）を、脳の前方部位で血リンパ（血液）中に送達し、中枢神経系および背脈管（大動脈および心臓）に対する組織の損傷を回避する。各動物は、生理食塩水またはペプチドの微量注入を１回だけ受けた。場合によっては、記録を１時間まで延長し、ベースラインへの回復を確立する。いくつかの動物から得たデータを平均化し（ｎ≧１０）、基礎心拍数に対して報告した。
【００９９】
筋細胞単離および単一筋細胞のサルコメア長短縮の測定−成体ラットおよびウサギ心室の心筋細胞を、前述のとおり単離した（Westfall,M.V.Et al.(1997)、Westfall,M.V.and Borton,A.R.(2003))。ＳＤラットおよびニュージーランド白ウサギから得た心臓を潅流し、酵素的に消化して、筋細胞を単離した。プロトコルは、ミシガン大学ＵＣＵＣＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ）によって、大学および連邦規制ガイドラインに従って承認された。単離心室筋細胞のアリコートを、５％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、および５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）で補充された血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）中のラミニンコーティングしたガラスカバースリップ上に置いた。２時間後、培地を、１．８ｍＭ  Ｃａ２＋、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルタチオン、およびペニシリン／ストレプトマイシンで補充された無血清Ｍ１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換した。ラット筋細胞を刺激チャンバに移し、単離した翌日に電気的にペーシングした（Zornik,E.Et al.(1999)、Westfall,M.V.Etal.(1997)）。筋細胞調製について残らず、培地を毎日交換した。
【０１００】
サルコメア短縮は、前述されるように、ビデオに基づく検出システム（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社、米国マサチューセッツ州）を使用して検出した（Westfall,M.V.and Borton,A.R.(2003))。この試験に対して、ラット筋細胞を０．２Ｈｚでペーシングし、ウサギ筋細胞を０．５Ｈｚまたは１．０Ｈｚでペーシングした。各ペプチド濃度、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤ビスインドリルマレイミド−１（ビス−１、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ社、米国ニュージャージー州）、または培地のみ（対照、Ｃ）を適用する前、およびペプチド、ビス−１、または培地の適用から１、３、５、１０、および１５分後に記録をした。シグナルの平均データを分析して、前述されるように（Westfall,M.V.Et al.(1997)Westfall,M.V.and Borton,A.R.(2003))、各ペプチド濃度、ビス−１、および培地に対して、３〜４匹のラットから得た７〜２０筋細胞のサルコメア静止長、短縮振幅（ピーク短縮）短縮率（出発速度）、および再延長率（回復速度）を明らかにした。
【０１０１】
ペプチド合成−ペプチドは、標準Ｆｍｏｃプロトコルによって合成した。構造ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（ＤＭＳ）（配列番号１）、ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（ｈＲＦＲＰ−１）（配列番号２）、ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦアミド（ラットＲＦＲＰ−１、ｒＲＦＲＰ−１）（配列番号１６）、ＬＡＥＥＬＳＳＹＳＲＲＫＧＧＦＳＦＲＦアミド（２６ＲＦａ（８−２６））（配列番号３１）、およびＫＧＧＦＳＦＲＦアミド（２６ＲＦａ（１９−２６））（配列番号３２）を、アミノ酸分析および質量分析によって確認した。
【０１０２】
ｈＲＦＲＰ−１に反応する筋細胞タンパク質リン酸化の分析−単離したウサギ心筋細胞に、１時間、３７℃で、ペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＭ１９９培地中で１００μＣｉ３２Ｐオルトリン酸塩を負荷した。放射活性培地を、ホスファターゼ阻害剤、カリクリンＡ（１０ηＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）単独を含有する培地に交換し、または１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１１５分間３７℃で加えた。リン酸化反応は、氷冷弛緩溶液（ＲＳ：７ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０、１ｍＭ遊離Ｍｇ２＋、１４．５ｍＭクレアチンリン酸塩、および４ｍＭ  ＭｇＡＴＰならびに１８０ｍＭのイオン強度を生じるために十分なＫＣｌ、ｐＨ７．０）、続いて氷冷ＲＳ＋０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でカバースリップを短時間洗浄した後、氷冷ＲＳ単独中に数回洗浄することによって終了した。細胞を試料緩衝液中に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離して、前述されるように、銀染色によって検出した（Westfall,M.V.,Lee,A.M.,and Robinson,D.A.(2005))。リン酸化は、乾燥ゲルを蛍光画像カセットに曝露した後、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州）を使用して定量した。
【０１０３】
心エコー−前述されるように（Boluyt,M.O.Et al.(2004))、米国心エコー図学会の推奨に従って、心エコーを行った。すべての心エコーは、登録された心エコー技師によって行われた。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを計量し、体重１ｋｇ当たりの送達されるペプチド量（ｋｇ（体重））を正確に算出した。心エコーに動物を使用することは、ミシガン大学ＵＣＵＣＡによって、大学および連邦規制ガイドラインに従って承認された。生理食塩水またはペプチドを、尾静脈注入を介して総量１５０μＬまで静脈内送達し、５μｍｏｌまたは５００ηｍｏｌのｈＲＦＲＰ−１／ｋｇ（体重）を得た。各動物は、生理食塩水またはペプチドのいずれかの注入剤について１回だけ使用した（ｎ＝４〜５）。つまり、マウスを誘導チャンバに入れ、１００％酸素と混合した４％イソフルランで軽く鎮静化した後、心電図コンタクトパッドを備える加熱プラットフォーム上に仰臥位で配置し（ＶＥＶＯ（商標）マウス処理プラットフォーム、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社、オンタリオ州、カリフォルニア州）、その鼻を１００％酸素中の１％イソフルランを含むコーンに入れた。振幅および運動率の高解像度、二次元ガイドされる記録（Ｍモード）は、Ｖｅｖｏ７７０（商標）生体内微小撮像システム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）と連動する、リアルタイム３０ＭＨｚ微小可視化スキャンヘッドを用いて得られた。収縮末期および拡張末期の左心室寸法に伴う心拍数を、米国心エコー図協会の慣例を使用して、胸骨傍長軸および心尖部の４つの室のビューから得られた２次元セクター走査から測定した。各Ｍモード測定に対して、少なくとも３つの連続心周期をサンプリングした。左心室体積を、収縮末期（Ｖｏｌｓ）および拡張末期（Ｖｏｌｄ）において測定し、それを使用して拍出量（ＳＶ＝Ｖｏｌｄ−Ｖｏｌｓ）および駆出率（ＥＦ％＝心内ＳＶ／心内Ｖｏｌｄ×１００）を算出した。心拍出量（ＣＯ＝心内ＳＶ×心拍数）は、拍出量および心拍数から算出した。
【０１０４】
統計解析−報告された値はすべて、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。データは、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析し、事後試験としてダネットの多重比較試験を行った。統計的有意性は、ｐ値＜０．０５において確立された。半最大有効濃度（ＥＣ５０）値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ＸＰまたはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、米国カリフォルニア州）のいずれかを使用して、最良適合曲線から算出した。
【０１０５】
実施例１：
ＤＭＳ（ドロミオサプレッシンペプチド）の心血管作用
ＤＭＳはキイロショウジョウバエの心拍数を減少させる。ＤＭＳ（ドロミオサプレッシンペプチド、ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド−配列番号１）がキイロショウジョウバエにおいて、ＭＳ（ドロミオサプレッシンペプチド、ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド−配列番号１）が生体内心拍数に及ぼす影響を、生理食塩水と比較して、分子遺伝学の影響を受けやすいモデルに、心機能内のミオサプレッシンの用量依存的影響を評価する。キイロショウジョウバエのミオサプレッシンは、用量依存的方法で、蛹の自発的な心収縮の生体内頻度を劇的に減少させた（図１）。報告されたドロミオサプレッシンの用量依存的な影響は、蛹は不動であり、したがって発達段階は、心収縮を観察および記録することが最も容易であるため、蛹の状態で評価した。ＤＭＳの作用を、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍの１０倍濃度の範囲にわたって測定し、生理食塩水の影響と比較した（平均±ＳＥＭ、１分の９１±３％基礎収縮率、ｎ＝１８）。サブナノモル１０−１０Ｍ  ＤＭＳの最大作用（図１）を１分以内に観察したところ、心拍数が基礎収縮率の７７±４％まで減少したが（ｎ＝１６）、心拍数の減少は、生理食塩水の対照反応と統計的に差はなかった（ｐ＞０．０５）。心拍数の有意な減少は、１０−９Ｍおよびそれ以上のＤＭＳ濃度に反応して検出され、ピーク反応は、ペプチドの微小注入から１分以内に観察された。ＤＭＳ誘導性作用は、典型的に、２〜３分にわたって観察され、可逆的であって、１０−８Ｍおよび１０−９Ｍに反応して、約５分以内にほぼ基礎収縮率レベルに戻った。試験した最高濃度、１０−６Ｍおよび１０−７Ｍで、ＤＭＳは、１分以内にそれぞれ２５±１１％（ｎ＝１４）および２５±７％（ｎ＝１６）まで心拍数を減少させた。ＤＭＳ誘導性作用は、３０分以内にほぼ基礎収縮率レベルに戻る前に、３〜５分間持続した。最良適合ＥＣ５０値は、３×１０−９Ｍであった。
【０１０６】
同様の範囲のＤＭＳ濃度が、幼虫および成虫の心収縮に強くはないが、有意な反応をもたらした。ＤＭＳが心拍数に及ぼす影響は、振幅が変動し、加齢と共に複雑化した（データは図示せず）。その結果、ナノモルＤＭＳ濃度に対する用量依存的な心反応を示し、ペプチドが高親和性のシグナル伝達経路を活性化することを示す。
【０１０７】
単一置換したアラニン類似体およびＮ末端切断したＤＭＳ類似体をさらに分析することにより、ＤＭＳ活性および結合コア、ＤＭＳ拮抗薬、およびＤＭＳの反対作用を有するＤＭＳ類似体（逆作動薬）を同定した。この分析では、ＤＭＳがハエの心臓に及ぼす作用に対する活性コアは、親ＤＭＳペプチドに類似する活性を達成するために、１つまたは複数の収縮性測定によって明らかにされるように、ＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号３３）であることを同定した。この分析では、結合コアは、ＦＬＲＦアミドとして同定された。結合コアは、ＤＭＳ拮抗薬である。アラニル置換ＤＭＳ類似体［Ａ５］ＤＭＳ（すなわち、ＴＤＶＤＡＶＦＬＲＦアミド−配列番号３４）および［Ａ６］ＤＭＳ（すなわち、ＴＤＶＤＨＡＦＬＲＦアミド−配列番号３５）は、心拍数を増加させ、ＤＭＳ、すなわち親ペプチド（ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド−配列番号１）の反対の作用となる。ハエの実験ではさらに、切断したペプチドＡＦＬＲＦアミド（配列番号２１）またはＶＦＬＲＦアミド（配列番号２５）は、結合できるだけでなく、心収縮性に作用することが明らかとなった。つまり、両方の切断ペプチドは、生体内に投与されると、それぞれ個別に結合および活性化する。この点で、収縮性に対する１つまたは複数の作用は、収縮頻度、収縮振幅、駆出率、および心拍出量を評価することによって明らかにすることができる。
【０１０８】
ＤＭＳが大型の無脊椎動物の心停止に及ぼす影響を明らかにするために、様々なＤＭＳ濃度を正常なクロバエ（Protophormia terraenovae）に適用し、心電図を連続的に記録した［Angioy et al.2007]。１０μＭ、１μＭ、および０．１ηＭのＤＭＳに、動物の１００％の心停止が認められ（各濃度でｎ＝１０）、より低い濃度では、動物の約５０％に心停止が認められた。動物のシグナルが再開し、回復時間はより低いＤＭＳ濃度で短縮した。生理食塩水は、心停止をもたらさなかった（ｎ＝１０）。
【０１０９】
ＤＭＳは、脳および心臓に発現する。抗血清はＴＤＶＤＨＶ（配列番号３６）に生成したが、ＤＭＳのＮ末端部分は、他のＲＦＮＨ２含有ペプチドに存在する構造であるＣ末端ＲＦアミド（ＲＦ−ＮＨ２）を含まなかった。ペプチド特異的抗血清による染色を使用して、ＤＭＳの空間的かつ一時的な分布を確立した［McCormick and Nichols 1993]。ＤＭＳは、発達全体にわたりＣＮＳ内に存在する。発現は、胚後期に始まり、成虫への発達全体にわたり続く。一般に、細胞は、発達早期および動物の寿命の全段階においてＤＭＳを生成する。比較的少数の細胞がＤＭＳを生成するが、突起の拡張樹状ネットワークを通じて、脳内の多くの標的に送達される。ＤＭＳの合成および放出が広範な調節および感覚入力下になされ得る。
【０１１０】
ＤＭＳ免疫反応性線維は、脳から突出して心臓を神経支配する。出願人のデータによると、ペプチドが脳内で合成され、心臓に送達される。ＤＭＳ免疫反応性プロセスは脳内の上前大脳神経から突出し、背脈管、大動脈および心臓の前方領域（右矢印）、つまり心臓ペースメーカーを含む領域を神経支配する。このプロセスは、発達の全段階に存在する［McCormick and Nichols 1993]。ペースメーカーを含むキイロショウジョウバエの心臓の領域の発達の全体にわたってＤＭＳが存在すること、およびＤＭＳの活性は、神経ＤＭＳが心血管生理学に重要な役割（複数可）を果たすという仮説を支持する。
【０１１１】
ＤＭＳ作動薬：ハエ心臓に対するＤＭＳ活性についての出願人によるＳＡＲ分析は、アミノ酸Ｖ６、Ｆ７、およびＦ１０（親ＤＭＳペプチド：ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号１）において対応する位置にあるアミノ酸を参照する）が、アラニル置換およびＮ末端切断した類似体の分析に基づいて、活性および結合に必須であることを示す。このデータを使用して、出願人は、Ｙ−［Ｂｐａ２］ＤＭＳ、光活性化可能な架橋剤ｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン、Ｂｐａ［Shoelson et al.1993]およびチロシル、Ｙ、標識部位を有する検出可能なＤＭＳ類似体を設計した（ＥＣ５０＝１．３×１０−１０Ｍ、図８）。出願人は、このＢｐａ含有類似体を使用して、ＤＭＳ受容体を同定した［Egerod et al.2003］。最初に、置換類似体がＤＭＳ作動薬であることを確認した（図８を参照）。このＹ類似体を用いて得られたデータを使用して、哺乳動物の筋細胞を用いる実験のために、同様の類似体を生成した。Ｙ−［Ｂｐａ２］ＤＭＳは、修飾ペプチド：ＹＴ（Ｂｐａ）ＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号３７）を指す。
【０１１２】
つまり、親ペプチド：ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号１）を参照して、第２のアミノ酸（Ｄ）は、Ｂｐａに置換され、チロシル残基は、第１のアミノ酸（Ｔ）のＮ末端に追加される。
【０１１３】
実施例２：
ヒトＲＦＲＰ−１は、ラット心筋細胞の収縮機能に対して用量依存的な作用を及ぼす
ｈＲＦＲＰ−１が心機能に及ぼす影響を単離した成体ラット心筋細胞内で測定し、脊椎動物ＦａＲＰが哺乳動物のミオサプレッシン様ペプチドであるという出願人の仮説を試験した。短縮の急激な用量依存的変化を、１５分にわたって、単離した成体ラット筋細胞内の１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１に反応して測定した。ヒトＲＦＲＰ−１ペプチドは、単離した心筋細胞に、短縮振幅、ならびに短縮および再延長率を劇的に減少させた（図２Ｂ、表１）。対照と比較して、１０−１１Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１の有意な作用はなく、静止長は、どのペプチド濃度でも変化しなかった。短縮および再延長率の著しい減少は、１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１およびそれ以上の濃度に反応したときに検出された（図２Ｂ、表１）。短縮振幅の著しい減少を検出するために、１０−９Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１を１０倍およびそれ以上増加させる必要があった（図２Ｂ、表１）。最良適合ＥＣ５０値は、短縮および再延長率、ならびに短縮振幅に対して、それぞれ５×１０−１１Ｍ、５×１０−１１Ｍ、および５×１０−１０Ｍであった。その結果、ｈＲＦＲＰ−１が哺乳動物心筋細胞に直接作用することによって、細胞レベルで収縮機能を急激に調整し、ＤＭＳに対するキイロショウジョウバエの変時性の反応に見られる同様の用量依存性に従うことを示す。
【表１】
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【０１１４】
実施例３：
ラットＲＦＲＰ−１は、ラット心筋細胞の収縮機能に及ぼすｈＲＦＲＰ−１の影響を模倣する
ラットＲＦＲＰ−１（ＶＰＨＳＡＡＮＬＰＬＲＦアミド−配列番号１６）は、Ｎ末端アミノ酸延長の２つのアミノ酸だけｈＲＦＲＰ−１（ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド−配列番号２）とは異なる（Ｍ１→Ｖ１およびＦ５→Ａ５（表２）。単離した成体ラット心筋細胞での１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１の影響を、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１と対照（媒体のみ）を比較して（図３、表３）、収縮機能に対するＲＦＲＰ−１の構造特異性の検討を開始した。ラットＲＦＲＰ−１ペプチドは、短縮振幅、短縮および再延長率（それぞれ−１７．７±４．３％、−２２．１±６．０％、−２５．５±３．９％、ｎ＝１２）を、サルコメア静止長を著しく変化させずに減少させた。したがって、１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１および１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１を用いる場合、短縮および再延長率に同様の変化が認められた。しかしながら、１０−８Ｍ  ｒＲＦＲＰ−１より、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１が短縮振幅に及ぼす影響が大きいこと、およびｈＲＦＲＰ−１対ｒＲＦＲＰ−１の大きさの点で２つのペプチド間のアミノ酸の差が短縮振幅に与える影響から、２つのペプチドのＮ末端延長の構造差が、リガンド結合および今後のＲＦＲＰ−１受容体（複数可）の特性化に関与する構造特異性に対する重要な手掛かりを提供し得ることを示唆する。
【表２】
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【表３】
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【０１１５】
実施例４：
脊椎動物ＦａＲＰ、２６ＲＦａは、ラット心筋細胞の収縮機能に対するＲＦＲＰ−１の影響を模倣しない
ＲＦＲＰ−１の構造特異性は、単離した成体ラット心筋細胞上で２６ＲＦａを使用してさらに検討した。ラット２６ＲＦａペプチドはＦａＲＰであり、したがって、ＲＦＲＰ−１と同一のＲＦアミドＣ末端を含有するが、ＲＦＲＰ−１と比較して、２６ＲＦａ  Ｎ末端延長の構造または長さに類似性はない。１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（８−２６）（ＬＡＥＥＬＳＳＹＳＲＲＫＧＧＦＳＦＲＦアミド−配列番号３１）および１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（１９−２６）（ＫＧＧＦＳＦＲＦアミド−配列番号３２）の作用を、単離したラット心筋細胞内で測定した（図４、表４）。１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（８−２６）および１０−８Ｍ  ２６ＲＦａ（１９−２６）に反応する短縮振幅、ならびに短縮および再延長率の減少は中度であり、すべて１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１とは統計的に異なる（図４、表４、ｐ＜０．０５）。２６ＲＦａペプチドに対する反応は、対照とは統計的に異なっていなかった（図４、表４）。この結果は、ＲＦＲＰ−１内のＮ末端延長が、心収縮機能に対する影響に必要であるという直接的な証拠を提供する。言い換えれば、２６ＲＦａペプチドを含むＦａＲＰスーパーファミリーの全メンバーにある緊密に保存されたＣ末端ＲＦアミドは、哺乳動物心筋細胞機能に関して、ＲＦＲＰ−１によって引き起こされる反応を誘発するのに十分でない。この結果は、２６ＲＦａペプチドが、心筋細胞のＲＦＲＰ−１様反応を誘発しないことを示すが、２６ＲＦａペプチドがＲＦＲＰ−１受容体に結合するか否かを証明していない。
【表４】
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【０１１６】
実施例５：
マウス尾静脈を介するｈＲＦＲＰ−１の静脈内注入は生体内で心不全を引き起こした
マウスにおけるｈＲＦＲＰ−１の生体内作用を検討した。心エコー（ＥＣＨＯ）を使用して、尾静脈注入を介して１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（ｎ＝３）および対照（生理食塩水、ｎ＝３）が心機能に及ぼす影響を評価した（６Ｃ５７ＢＬ／６同腹子、雌、≒２０グラム、および約４週齢）。盲検試験を行い、尾静脈注入は、動物研究所の登録技術者によって行われた。ＥＣＨＯ測定は、登録心エコー技師によって行われた。データは、ｔ＝０分、注入前の値と比較して、ｔ＝１０分、注入後のパラメータの変化率である（図１４）。データは、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（１００μＬの１０−７Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１注入）に反応して１分当たりの心拍数（ＨＲ、ｂｐｍ）が劇的に減少することを示す。収縮時心内領域（ＬＶＤ）は、劇的かつ反対の反応を示した[１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（＋３６％）対生理食塩水（−３１％）]。また心内拍出量（ＳＶ）も異なっていた[１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（−７５％）対生理食塩水（＋２２％）]。心内駆出率（ＥＦ％）は、劇的な反応を示した[１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（−６０％）対生理食塩水（＋２５％）]。興味深い発見は、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１に反応して、ＥＦ値が心不全を示すことであり、５０％以下に落ちる。心拍出量（ＣＯ）もまた、劇的かつ反対の反応を示した[１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（−９１％）対生理食塩水（＋９％）]。Ｍモード画像は、ｈＲＦＲＰ−１の影響を示し、収縮性が減少し、注入から１０分後、実質的な回復が発生した生理食塩水の注入後と大きく異なり、心機能は回復しなかった。データのパワー分析は、ｎ＝４で９５％信頼水準を示す。
【０１１７】
ヒトＲＦＲＰ−１は、マウスの心抑制作用を引き起こす。ｈＲＦＲＰ−１が生体内で心血管機能に及ぼす影響をさらに試験し、ほぼ同じ細胞性および統合反応が哺乳動物に観察されるか否かを明らかにした。マウスの静脈内尾静脈注入を介して、ペプチドまたは生理食塩水（対照）を送達した後、心機能を心エコーによって測定した。代表的な２次元Ｍモード記録（図５）は、対照と比較して、５μｍｏｌ／ｋｇ（体重）のｈＲＦＲＰ−１に反応して、心機能の低下を示す。両濃度で（５μｍｏｌおよび５００ηｍｏｌ／ｋｇ（体重））、注入後５分でピーク作用を生じ、１５分までに心機能の部分的回復をもたらした。ｈＲＦＲＰ−１の用量が多いほど、生理食塩水の対照群（ｎ＝４、図５Ｃ注入前、図５Ｄ注入５分後、表５）に見られる中度の変動と比較して、心血管機能に対して急激かつ劇的な影響をもたらした（ｎ＝５、図５Ａ注入前、図５Ｂ注入５分後、表５）。興味深いことに、低用量のｈＲＦＲＰ−１（５００ηｍｏｌ／ｋｇ（体重））の陰性変時作用は存在せず、この用量は、拍出量、駆出率、および心拍出量を著しく減少させたが、高用量と比較して、比較的振幅は減衰した（表５）。この生体内データは、単離したラット心筋細胞において見られるｈＲＦＲＰ−１の影響と一致して、心筋に対する直接的な用量依存的な影響と一致する。
【表５】
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【０１１８】
尾静脈注入を介するマウスのｈＲＦＲＰ−１、ｈＲＦＲＰ−１およびＬＰＬＡＦアミド、ＬＰＬＡＦアミド単独、ならびにＤ−Ｈ３−ｈＲＦＲＰ−１の心エコー分析は、薬剤を単離したラットおよびウサギ心筋細胞に適用したとき、その生体内作用が、以前の観察と一致しすることを示した。心拍数（ＨＲ）拍出量（ＳＶ）、駆出率（ＥＦ）、僧帽弁（ＭＶ）ＥおよびＡ波、その振幅および比率（Ｅ／Ａ）、ならびに心拍出量（ＣＯ）を含む心エコーパラメータを使用して評価を行った。
【０１１９】
例えば、単離した細胞および全動物に対するｈＲＦＲＰ−１の適用の結果、収縮性能の劇的な減少は、ＬＰＬＡＦアミドによって生体内で遮断され、Ｃ末端ｈＲＦＲＰ−１ペンタペプチドは、単離した細胞内でｈＲＦＲＰ−１の影響を遮断することが以前に示した。単独で適用されるＬＰＬＡＦアミドは、生体内で心機能をわずかに増加させることが示され、内因性ｈＲＦＲＰ−１の影響の遮断に起因し得る。さらに、以前に出願人が単離したラット心筋細胞内のｈＲＦＲＰ−１の逆作動薬であることを示したＤ−Ｈ３−ｈＲＦＲＰ−１は、心エコーパラメータによって測定されるように、生体内で心機能の増加を示した。
【０１２０】
実施例６：
単離したラット心筋細胞内のｈＲＦＲＰ−１に反応するタンパク質のリン酸化
ヒトＲＦＲＰ−１は、発現したｒｆｒ−２タンパク質、仮定ＧＰＣＲに結合することが報告され、ｈＲＦＲＰ−１結合に反応する標的分子リン酸化について説明する報告はない。タンパク質キナーゼの活性化は、心収縮機能を調整することに関与する重要な経路である。励起−収縮カップリングに関与する多数の末端標的タンパク質は、筋フィラメントタンパク質心トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心トロポニンＴ（ＴｎＴ）、およびミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）を含むＰＫＣおよび／またはＰＫＡ活性化に反応してリン酸化される。出願人のデータは、Westfall et al.2003に記載されるプロトコルに従って、ラット心筋細胞上の10−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１に反応する（図１３）、筋フィラメントタンパク質、例えば、ｃＴｎＩ、ＴｎＴ、ＭＬＣ２のリン酸化と一致する。
【０１２１】
ＰＫＩ、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤が、単離した血管心筋細胞上のｈＲＦＲＰ−１の活性を修飾することを示した。
【０１２２】
ヒトＲＦＲＰ−１は、ビス−１、ＰＫＣ阻害剤の存在下で、ラット心筋細胞の収縮機能に影響する
ｈＲＦＲＰ−１が心機能に及ぼす影響に関与する機構の研究を開始するために、ＰＫＣ阻害剤ビス−１を使用した。１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１が短縮および弛緩に及ぼす影響に対するＰＫＣ阻害剤ビス−１（５００ηＭ）の影響を、単離した成体ラット心筋細胞内で１５分にわたり測定した（図６、表６）。ＰＫＣ阻害剤ビス−１は、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１が短縮振幅、ならびに短縮および再延長率（それぞれ−０．５８±４．８％、−１２．３±４．６％、−５．６±４．７％、ｎ＝２３）に及ぼす影響を、サルコメア静止長が有意に変化することなく、大幅に遮断した。ビス−１がｈＲＦＲＰ−１活性に及ぼす影響は、ＰＫＣ阻害剤の不在下、ペプチドとは統計的に異なっていた。この結果は、ＲＦＲＰ−１が、ＰＫＣシグナル伝達経路の活性化を介して、収縮機能を早急に調整するという結論を支持する直接的な証拠を提供する。
【表６】
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【０１２３】
実施例７：
ヒトＲＦＲＰ−１は、ウサギ心筋細胞の収縮機能を減衰させる
保存されたＲＦＲＰ−１ペプチドが心機能に及ぼす影響をさらに評価するために、ウサギ心筋細胞を利用した。心拍数がヒトと比較してほぼ同じであるため、単離した成体ウサギ心筋細胞内でヒトＲＦＲＰ−１を検討した。興味深いことに、サブナノモル濃度のｈＲＦＲＰ−１は、哺乳動物心機能を著しく減少させた。媒体のみ（対照）と比較して、１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１は、単離した成体ウサギ心筋細胞内で、短縮振幅および再延長率を劇的に減少させた（図７Ａおよび７Ｂ）。短縮率も１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１に反応して減少したが、試験した筋細胞内では有意でなかった。０．５Ｈｚ（図７Ａおよび７Ｂ）および１Ｈｚ（結果は示せず）で記録し、短縮および不整脈収縮を開始する能力の両方を評価した。異常心拍および後収縮は、いずれのペーシング頻度でもｈＲＦＲＰ−１に反応して認められなかった。さらに、筋細胞タンパク質の放射性標識は、ｈＲＦＲＰ−１に反応して著しく増加した（図７Ｃ）。特に、２４ｋＤａに検出されたバンドに対して、基準値を超えて、４．０±１．４倍のリン酸化の増加が認められた。蛍光体画像は、ｈＲＦＲＰ−１に反応して、多数のタンパク質のリン酸化が複製可能に増加することを示す。ビス−１の存在下、ｈＲＦＲＰ−１に反応するリン酸化の減少は、ＰＫＣを活性化するペプチドと一致する（データは示せず）。まとめると、機能的およびリン酸化結果は、生理学的に関連する濃度のｈＲＦＲＰ−１が、ＤＭＳ相当分子種であるＲＦＲＰ−１と一致するラットおよびウサギ心筋細胞の両方における収縮機能を劇的に減少させたことを証明し、ｈＲＦＲＰ−１が哺乳動物心機能を調整する際に直接的な役割を果たし得ることを示唆する。この結果は、ＲＦＲＰ−１が、影響がＰＫＣによる筋細胞タンパク質のリン酸化によって媒介される、内因性シグナル伝達分子であることを示唆する。
【０１２４】
別の一連の研究では、出願人は、サブピコモル濃度のｈＲＦＲＰ−１が、哺乳動物心機能を調整することをさらに検討した。１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１を、Westfall  et al.2005に記載の方法に従って、単離したウサギ心筋細胞に適用したところ、ペプチドは、サルコメア短縮振幅を減少させ、弛緩を減速させた。１０−１０Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１（ｎ＝２０）の影響は、ピーク短縮、回復速度、およびピークから５０％再延長（ＴＴＲ５０％）までの時間に関して、対照、無ペプチド、媒体のみ（ｎ＝１２）とは統計的に異なった。静止長およびピークまでの時間（ＴＴＰ５０％）は、有意差がなかった。対照と有意差があるとした（ｐ＜０．０５（＊））（図１７）。
【０１２５】
実施例８：
チロシルＮ末端を延長した類似体Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１は、ｈＲＦＲＰ−１作動薬である
出願人は、Ｙ−ｈＲＦＲＰ−１を合成し（ペプチド：ＹＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド−配列番号４０）、単離したラット心筋細胞内でｈＲＦＲＰ−１作動薬であることをあきらかにした（図９Ａ）。チロシル延長した類似体は、受容体のための検出可能な「タグ」を生成し、その処理、発現、およびリガンド結合要件を検討するための重要な分子ツールである。チロシル基（Ｙ）は、検出可能に標識して、例えば、ヨード化、トリチウム化、またはビオチニル化して、検出可能な作動薬を生成することができ、ｈＲＦＲＰ−１は、Ｙを含有しないため、ペプチド−受容体結合を阻害し得る巨大な群の内部に追加することを回避する。
【０１２６】
実施例９：
ｈＲＦＲＰ−１の構造類似体、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１には、心機能に対してｈＲＦＲＰ−１の反対作用がある−心収縮機能を増加させる逆作動薬の発見
［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１、ｈＲＦＲＰ−１の構造類似体（修飾ペプチド：ＭＰ（Ｂｐａ）ＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド−配列番号４１）には、ｈＲＦＲＰ−１の反対作用があり、心機能を増加させる（図９Ｂ）。［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の構造は、第３のアミノ酸（ヒスチジン）がｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン（Ｂｐａ）に置換されることを除いて、親ペプチドＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号２）に対応する。Ｂｐａは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）の誘導体および光活性化可能な架橋剤である。このデータは、ＥＣＨＯデータ画像から確認され、Ｄ−Ｈ３  ｈＲＦＲＰ−１もまた心機能を増加させることを示した。Ｄ−Ｈ３  ｈＲＦＲＰ−１活性の確認はさらに、類似体を尾静脈注入によって投与したときに心パラメータの心エコー分析によって示され、その後心機能が向上したことが認められた。
【０１２７】
これは、ｈＲＦＲＰ−１、自然発生ペプチドと関連付けられる機序を標的として、心機能を増加し心不全に対抗できることを示唆するため、刺激的な発見である。発見は心機能を増加させる類似体を同定するだけでなく、類似体は、その受容体に共有結合により架橋されて、受容体タンパク質を同定することもできる。したがって、本発明は、ｈＲＦＲＰ−１および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が結合する受容体を同定する方法を包含する。ｈＲＦＲＰ−１および［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が結合する受容体の同定を使用してさらに、心機能の減少および増加のそれぞれに関連する機序を特徴付けることができる。ＢｐａをｈＲＦＲＰ−１内の異なる位置にあるＢｐａと共に、Ｂｐａを含有するｈＲＦＲＰ−１類似体を使用して、他の有益な作動薬および拮抗薬を製造することができる。
【０１２８】
実施例１０：
アラニン走査は、ｈＲＦＲＰ−１がサルコメア短縮および弛緩に及ぼす作用に重要な残基を同定する
種（表７）をまたがってＲＦＲＰ−１配列の同一性が高いことは、心機能に対する劇的な影響および脳幹に存在することと併せて、生理学的に重要であることを示唆する。ペプチドは、結合およびシグナル伝達の活性化に必要な構造を含有する可能性がある。結合および活性化コアの構造は、作動薬および拮抗薬を設計するために重要なデータを提供する。出願人は、ペプチド内の各残基をＬ−アラニンと組織的に単一交換することによって、ｈＲＦＲＰ−１内の各アミノ酸の側鎖の活性化に対する寄与を分析した［Beck-Sickinger et al.1993、Doherty et al.1993］。
【表７】
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配列および構造データは、Dardente et al.2008、および引用における参考文献、Ubuka T.et al.(2009)PLoS One4(22):e8400;pages1-7から出典。
【０１２９】
アラニン走査を行って、受容体活性化に欠かせない残基を同定した。出願人は、個別にアミノ酸残基＃６、Ｇに置換されるＡを除いて、各アミノ酸を置換した一連の類似体を合成した。出願人は、類似体が単離したラット心筋細胞に及ぼす影響を試験した（図１０、ｎ＝２０）。アラニン類似体［Ａ１］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ５］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ７］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ９］ｈＲＦＲＰ−１、および［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１は、ピーク短縮（ピークｈ）および弛緩（ｒｅｔ  ｖ）について、非置換親ペプチド、ｈＲＦＲＰ−１と著しく異なった。Ｒ１１からＡへの置換は、ｈＲＦＲＰ−１とは劇的に異なり、対照に類似していた。切断類似体走査を行って、その他のｈＲＦＲＰ−１作動薬および拮抗薬を同定する。
【０１３０】
［Ａ１］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ５］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ７］ｈＲＦＲＰ−１、［Ａ９］ｈＲＦＲＰ−１、および［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１という名称は、親ｈＲＦＲＰ−１ペプチド（ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド−配列番号２）に対応し、第１、第５、第７、第９、または第１１アミノ酸は、それぞれアラニル残基（Ａ）に置換され、５つのペプチドのそれぞれの残りの１１アミノ酸は、親ペプチドと同一である。例えば、［Ａ１］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＡＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４２）を示し、［Ａ７］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＭＰＨＳＦＡＡＬＰＬＲＦアミド（配列番号４３）を示す。
【０１３１】
実施例１１：
アラニン含有類似体［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１は、ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬である
出願人によるアラニン走査で同定された不活性類似体は、ｈＲＦＲＰ−１の結合を遮断するが、シグナル伝達を活性化しないｈＲＦＲＰ−１拮抗薬であってもよい。機能的拮抗薬を同定するために、出願人は、不活性類似体の存在下、単離した筋細胞上のｈＲＦＲＰ−１を試験した。［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の存在下でのｈＲＦＲＰ−１の影響を、ｈＲＦＲＰ−１単独の場合、および［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１単独の場合と比較した。１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１の影響は、１０−８Ｍ  ｈＲＦＲＰ−１単独の場合と比較して、１０−７Ｍ  ［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の存在下で劇的に減少した（図１１）。
【０１３２】
生体内のｈＲＦＲＰ−１拮抗薬の同定は、ｈＲＦＲＰ−１機能を減衰させるための強力な分子ツールである。さらに、拮抗薬は、リガンド−受容体結合およびシグナル経路の活性化を描写する際に重要である。他の不活性類似体を試験して、その他のの拮抗薬を同定する。実験ではさらに、ペプチドＬＰＬＡＦアミドはｈＲＦＲＰ−１拮抗薬として同定した（図１８）。心エコーデータは、ＬＰＬＡＦアミドがｈＲＦＲＰ−１の影響を遮断し、ＬＰＬＡＦアミド単独で心機能を強化することを示した。
【０１３３】
実施例１２：
ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬、［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１は、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１の影響を遮断する
［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１が結合する受容体に関する洞察を得るために、出願人は、単独で心筋細胞に投与したとき、心機能に影響しない不活性アラニル置換ｈＲＦＲＰ−１類似体である［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１の存在下での影響を明らかにした。［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１は、ｈＲＦＲＰ−１の作用を減衰させ（図１１）、ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬であることを示唆する。［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１はまた、［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１（図１２）の影響も減少させ、これは［Ａ１１］ｈＲＦＲＰ−１が［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬であることを示唆すると解釈することができる。このデータは、同一の受容体に結合する［Ｂｐａ３］ｈＲＦＲＰ−１およびｈＲＦＲＰ−１とも一致する。
【０１３４】
実施例１３：
切断ｈＲＦＲＰ−１ペプチド
対照（媒体のみ）、ｈＲＦＲＰ−１、および切断ｈＲＦＲＰ−１ペプチドが、単離した成体ラット心筋細胞に関する出発速度、ピーク高、および回復速度に及ぼす影響を検討した（図１５）。テトラペプチドＰＱＲＦアミドも同様に検討した（図１６）。実験プロトコルは、上述のとおりであった。全ペプチドは、１０−８Ｍの濃度で投与した。以下の慣例を使用して、図１５の各切断を示す。
ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＭＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号２）のことを言う。
［２−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＰＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４）のことを言う。
［３−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＨＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４４）のことを言う。
［４−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＳＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４５）のことを言う。
［５−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４６）のことを言う。
［６−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４７）のことを言う。
［７−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４８）のことを言う。
［８−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＬＰＬＲＦアミド（配列番号３）のことを言う。
［９−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＰＬＲＦアミドのことを言う。
［１０−１２］ｈＲＦＲＰ−１は、ペプチド：ＬＲＦアミドのことを言う。
【０１３５】
一連の実験で、ペプチドＬＰＬＲＦアミド（配列番号３）、ＦＡＮＬＰＬＲＦアミド（配列番号４６）、およびＰＱＲＦアミドが、心筋細胞に個別に投与されたとき、心筋収縮機能を、親ペプチドｈＲＦＲＰ−１とほぼ同じ方法で結合および影響する能力を示した。
【０１３６】
本実施例に記載される切断ペプチドをいずれも、生体内で心機能を調整する能力（例えば、本明細書に記載されるように、マウス尾静脈注入によって）、および／または単離した筋細胞上でｈＲＦＲＰ−１の結合または活性に影響する能力について、実施例１１および１２に記載されるものとほぼ同じ実験プロトコルまたは発現した受容体タンパク質を使用して試験する。したがって、不活性切断ペプチドのいずれも、候補ｈＲＦＲＰ−１拮抗薬として、生体内または生体外で容易に試験することができる。
【０１３７】
ペプチドは、心不全に影響を及ぼすが、収縮性能のペプチド作動性調整は、特徴付けが比較的なされていない。ここで出願人は、哺乳動物の収縮性能を調整するヒトペプチドを同定した。ＦＭＲＦアミド関連ペプチド（ＦａＲＰ）族のメンバーは、Ｃ末端ｈＲＦアミドであるが構造的に変異しているＮ末端延長を含有する。上記の実施例は、無脊椎のＦａＲＰであるドロミオサプレッシン（ＤＭＳ）が用量依存的に生体内でキイロショウジョウバエの心機能を直接調整したことを示す。ＤＭＳ相同分子種のヒトＲＦアミド関連ペプチド−１（ｈＲＦＲＰ−１）およびラットＲＦＲＰ−１は、単離した哺乳動物心筋細胞内で、用量依存的に短縮および弛緩を急速かつ可逆的に減少させた。この機能的作用は、筋細胞タンパク質のタンパク質リン酸化の増加と一致した。タンパク質キナーゼ（ＰＫＣ）阻害剤ビスインドリルマレイミド−１は、ｈＲＦＲＰ−１活性を遮断した。さらに、ｈＲＦＲＰ−１をマウスに静脈内注入することによって、心拍数、拍出量、駆出率、および心拍出量を減少させる心抑制作用を生じた。この発見はまとめると、ＲＦＲＰ−１が、ＰＫＣを活性化する内因性心シグナル伝達分子であることを示唆する。ＲＦＲＰ−１の特異性および構造要件は、ＲＦアミドのみによってＲＦＲＰ−１に関連する哺乳動物ＦａＲＰ、２６ＲＦａを使用して示され、２６ＲＦａは、筋細胞収縮機能を変えなかった。まとめると、ｈＲＦＲＰ−１の陰性の変時性、変力性、および拡張性の影響を発見したことは重要であり、哺乳動物の心臓内で、直接的な急性細胞および器官レベルの反応を示す。この発見は、哺乳動物において劇的な心抑制作用のあるＦａＲＰを最初に同定したことになり、収縮性能のペプチド作動性調整の分野に新たな領域を提供する。
【０１３８】
上記の実施例は、無脊椎動物および哺乳動物両方のＦａＲＰ筋サプレッシン相同分子種の特定の心作用を示す。用量依存的な心作用は、無脊椎動物（図１）および哺乳動物（図５）の両方で、器官系レベルで、および２つの哺乳動物モデルと２つの哺乳動物相同分子種を使用した細胞レベルで認められる（図２〜４、６、７）。この心反応は、濃度範囲にわたって発生し、心血管機能の神経ホルモン調整因子としてペプチドが放出される場合に予想される。多数の哺乳動物モデルおよび２つの哺乳動物相同分子種の心抑制作用の一貫性は、ペプチド群が、心の性能を調整する機能的に保存された役割を果たすことを示唆する。２６ＲＦａペプチド（図４）を用いる研究は、ＦａＲＰ族の保存されたＲＦアミドＣ末端が、この反応を生じるのに十分でないことを証明する。むしろ、内因性脊椎動物ＲＦＲＰ−１の活性に対して、脊椎動物ＲＦＲＰ−１に多く見られるＮ末端アミノ酸延長が必要とされる。全体として、上記実施例に記載される結果は、筋サプレッシンペプチド族が、心機能を調整する新規の経路であることを証明する。出願人は、ここで高度に保存された哺乳動物相同分子種が、哺乳動物の心血管生理学に及ぼす作用を発見した。哺乳動物相同分子種としては、Ubuka et al.2009、Fukusumi et al.2001、Hinuma et al.2000、およびLin et al.2001に記載されるものを含む。
【０１３９】
ＦａＲＰサブグループのメンバーは、概して、機能的活性はほぼ同じであるが、ＲＦアミドスーパーファミリー内の他のサブグループとは異なる。本試験では、無脊椎動物（図１）および哺乳動物（図２〜４、６、７）の両方に、心抑制剤として作用するＬＲＦアミドサブグループの作用を示す。活性の保存は、ＬＲＦアミドが心臓内に多く見られる機序を通じて作用する可能性があることを示す。近年、別の脊椎動物ＦａＲＰ、２６ＲＦａが、ラットの心拍数および血圧を増加させることが報告された（Fang et al.,2009）。上述されるように、本明細書に記載される試験は、ＦａＲＰの単離した心筋細胞の短縮または弛緩に有意な影響を示さない（図５）。哺乳動物ＲＦＲＰ−１に対する構造特異的、高親和性の反応は、新規のペプチド作動性受容体と一致し、１つまたは複数の細胞性シグナル伝達経路に結合する可能性が最も高い。さらに、ナノモルＲＦＲＰ−１（図２〜４、７）に対する実質的に機能的な反応は、親和性の高い受容体を利用する経路と一致する。ＲＦＲＰ−１心受容体および分子シグナル伝達機序の同定は、未だに知られていない。しかしながら、他のＦａＲＰは、Ｇタンパク質結合受容体によって作用し得る（Liu,Q.Et al.(2001)、Fukusumi,S.Et al.(2001)、Ukena,K.,and Tsutsui,K.(2001)）。
【０１４０】
本明細書の実施例に記載される結果は、正常なマウスの心機能と比較して、単離した哺乳動物心筋細胞に対するＲＦＲＰの機能的な影響のいくつかの差も示す（図２〜４、６、７対図５）。心拍数の著明な減少は、単離した筋細胞内で検出された律動障害に反映されなかった。この差は、生体内試験で示された神経標的に対する影響に起因し得る。０．２、０．５、および１Ｈｚの単離筋細胞の試験では、０．２〜１Ｈｚの範囲のペーシング頻度で律動障害は検出されなかったが、依然としてこの反応の側面は単離筋細胞の機能試験に使用された低ペーシング頻度で明らかになっていない可能性がある。生体内で観察される収縮機能のｈＲＦＲＰ−１誘導性の減少は、細胞応答と一致し、生体内影響が、心筋細胞収縮機能の直接の抑制に少なくとも部分的に起因することを示す。しかしながら、単離した成体筋細胞内に観察された弛緩の減速は、生体内で検出されなかった。この生体外再延長の減速、および生体内拡張性能の変化の欠失は、拡張性能の非侵襲性評価の変動性、機能の速度に関連する変化に起因する減衰した検出（Dias FA et al.,J Mol Cell Cardiol 41:330;2006)、および／または全動物モデル内の負荷および代償性反応等の因子の影響を反映し得る。
【０１４１】
本結果はまた、非脊椎動物の相同分子種を哺乳動物モデルに使用した以前の研究と対照的である。鳥類または無脊椎動物相同分子種（Mues et al,(1982)、Barnard,C.S.,and Dockray G.J.(1984)、Dockray,G.J.et al.(1983))は、高血圧を生じることが報告されているが、１５分間の記録全体で明らかではなかった（図５）。無脊椎動物および鳥類相同分子種には、哺乳動物モデルに適用されるとき、ｈＲＦＲＰ−１と比較して、哺乳動物の心血管機能に複数の作用をもたらす構造的な差はない。あるいは、多岐にわたる応答は、プロトコル差に起因し得る。以前の研究では、ここで使用される非侵襲性心エコー検査と対照的に、侵襲性血圧測定を使用した。この異種、非内因性、非脊椎動物ＦａＲＰは、哺乳動物モデルに適用されるとき、異なる器官および／または細胞経路を標的とし得る。
【０１４２】
神経ホルモンは、生理学的ならびに急性および慢性病態生理学的条件下で、心機能を調整するのに重要な役割を果たす。β−アドレナリン作動性シグナル伝達は、生理学的および病態生理学的条件下で集中的に研究され（Fang,Q.Et al.(2009)）、他の神経媒介性シグナル伝達経路は、心機能の規制において重要な役割を果たし得る（Brodde DE(1996)、Lymperop A.et al.(2007)）。心規制特性を有する小ペプチド作動性シグナル伝達分子は、特に興味深い。本明細書に記載される試験は、既知の無脊椎ペプチドの心特定作用を同定し、同一のペプチド族に属する新規の哺乳動物相同分子種が、哺乳動物心筋細胞および生体内心性能に対して極めて特異的かつ劇的な抑制作用をもたらすことを示す。本試験は、新規の哺乳動物ＦａＲＰに実質的かつ一定の心反応を説明し、診断的および／または治療的処置の標的を提供する。ｈＲＦＲＰ−１合成、放出、およびシグナル伝達の今後の洞察は、心不全を予防または減衰するための治療戦略の開発に有用である。
【０１４３】
実施例１４：
ＲＦＲＰ＿１受容体の同定
ＮＰＦＦＲ２  ｍＲＮＡは、単離したラット心血管筋細胞から単離し、ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡを配列決定して（配列番号４９、アミノ酸配列−配列番号５０）、ＮＰＦＦＲ２転写がラットの心臓に存在することを示した。ＮＰＦＦＲ２は、発現した受容体タンパク質を使用する生体外結合試験で、ＲＦＲＰ−１が結合する受容体である。データは、単離した心筋細胞内に存在する仮定Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）によって作用するＲＦＲＰ−１シグナル伝達経路の存在を示し、論じる。
【０１４４】
ＮＰＦＦＲ２  ｍＲＮＡはまた、ヒト心血管組織から単離され、ｃＤＮＡが生成および配列決定されて（配列番号５１、アミノ酸配列−配列番号５２）、ヒト心臓に存在するＮＰＦＦＲ２転写を確立する。このデータは、単離した心筋細胞内に存在する仮定ＧＰＣＲを通じて作用するＲＦＲＰ−１シグナル伝達経路の存在をさらに示し、論じる。
【０１４５】
実施例１５：
シグナル伝達経路の評価
単離したラット心血管筋細胞からの２６ＲＦａ  ｍＲＮＡの増幅は成功しなかったが、２６ＲＦａ  ｃＤＮＡ（配列番号５３、アミノ酸配列−配列番号５４）を脳ｍＲＮＡから単離し（ＰＣＲプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内で２６ＲＦａ転写を増幅させることができることを示すための対照）、したがって、ＲＦＲＰ−１が、血管筋細胞内に存在する自然発生ＲＦアミドシグナル伝達分子であることのデータをさらに提供する。
【０１４６】
単離したラット心血管筋細胞からのＧＰＲ１０３（推定２６ＲＦａ受容体）ｍＲＮＡの増幅も成功しなかったが、ラット脳ｍＲＮＡ（配列番号５５、アミノ酸配列−配列番号５６）からのＧＰＲ１０３  ｃＤＮＡ（ＰＣＲプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内でＧＰＲ１０３転写を増幅させることができることを示すための対照）が生成され、したがって、ＲＦＲＰ−１が、血管筋細胞内に存在する自然発生ＲＦアミドシグナル伝達分子であることのデータをさらに提供する。
【０１４７】
単離したラット心血管筋細胞からのＮＰＦＦＲ１（推定ＮＰＦＦ受容体）ｍＲＮＡは成功しなかったが、脳ｍＲＮＡからのＮＰＦＦＲ１  ｃＤＮＡが生成され（配列番号５７、アミノ酸配列５８）、（ＰＣＲプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内でＮＰＦＦＲ１転写を増幅させることができることを示すための対照）、したがって、ＲＦＲＰ−１が、血管筋細胞内に存在する自然発生ＲＦアミドシグナル伝達分子であり、ＮＰＦＦＲ２によってシグナル伝達することのデータをさらに提供する。
【０１４８】
実施例１６：
ｈＲＦＲＰ−１抗血清
モノクローナル抗血清およびポリクローナル抗血清はいずれも、疾患を診断および治療することを立証した試薬である。モノクローナル抗血清（抗体または抗血清を意味する）は、ポリクローナルを上回るある利点を有するが（例えば、安価に大量生産でき、あるペプチド作動性エピトープに特異性がある）、複数のエピトープを認識するポリクローナル抗血清は、特に以前に知られていない異常な構造形態のｈＲＦＲＰ−１が患者に存在するかどうかを診断する場合に有利な場合があり、変異形態の親和性および検出は、モノクローナル抗体よりもポリクローナル抗血清を使用するときに高くなる可能性が高い。
【０１４９】
診断薬として、ｈＲＦＲＰ−１に特異的な抗血清は、ペプチドの過剰または過少発現を同定するか、または異常なｈＲＦＲＰ−１構造を同定し、心血管疾患の危険性がある患者を同定する。したがって、本開示の方法は、試験試料をｈＲＦＲＰ−１抗血清と接触させるステップと、ｈＲＦＲＰ−１の発現レベルを明らかにするステップを含む方法を含む。発現が閾値正常レベルを超える方法は、正常な心機能の１人以上の個人に特定されるように、ｈＲＦＲＰ−１の過剰発現を示す。様々な態様では、過剰発現は、試験試料を採取した個人に、心疾患の存在または可能性を示す。
【０１５０】
ｈＲＦＲＰ−１の過剰発現（過剰ペプチド）は、心機能を正常以下に減少させる場合があるため、ｈＲＦＲＰ−１に対する抗血清を治療戦略に使用して異常に対処し、生理学的機能を正常に戻す。したがって、本開示は、試験試料をｈＲＦＲＰ−１抗血清と接触させて、ｈＲＦＲＰ−１発現を明らかにするステップを含む方法を提供し、正常な心機能の個人から特定された閾値正常値を超える発現は、心異常の存在または可能性を示す。
【０１５１】
ｈＲＦＲＰ−１の過少発現（ペプチドが過少）は、正常を超えて心機能を増加させる場合があるため、治療戦略を例えば、ｈＲＦＲＰ−１超作動薬に据え、異常に対処し、生理学的機能を正常に戻す。したがって、本開示は、試験試料をｈＲＦＲＰ−１抗血清と接触させて、ｈＲＦＲＰ−１発現を明らかにするステップを含む方法を提供し、正常な心機能の個人から特定された閾値正常値を下回る発現は、心異常の存在または可能性を示す。
【０１５２】
異常なｈＲＦＲＰ−１構造は、構造の差が自然発生するペプチドのより強い変異型、または弱い変異型に依存して心機能を増加または減少し、正常な生理学的機能の不均衡をもたらし得る。ｈＲＦＲＰ−１に対する抗血清を治療戦略に使用して、増加または減少した心機能に対処し、生理学的機能を正常に戻す。治療薬として、ｈＲＦＲＰ−１抗血清の使用は、存在するペプチドの量を減少させ得るため、心不全または低下した心機能に関連する症状を軽減し得る。したがって、本開示は、心状態を治療するのに有効量のｈＲＦＲＰ−１抗血清を投与するステップを含む心状態を治療する方法を提供する。
【０１５３】
参考文献
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【図１】
2013523768.tif 000009
【図２】
2013523768.tif 000010
【図５Ａ】
2013523768.tif 000011
【図５Ｂ】
2013523768.tif 000012
【図５Ｃ】
2013523768.tif 000013
【図５Ｄ】
2013523768.tif 000014
【図８】
2013523768.tif 000015
【図９Ａ】
2013523768.tif 000016
【図９Ｂ】
2013523768.tif 000017
【図１０】
2013523768.tif 000018
【図１１】
2013523768.tif 000019
【図１２】
2013523768.tif 000020
【図１３】
2013523768.tif 000021
【図１７】
2013523768.tif 000022
【図３】
2013523768.tif 000023
【図４】
2013523768.tif 000024
【図６】
2013523768.tif 000025
【図７】
2013523768.tif 000026
【図１４】
2013523768.tif 000027
【図１５】
2013523768.tif 000028
【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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