(57)【要約】      （修正有）【課題】長期的にタンパク質の吸着抑制可能な化合物、さらに糖類・糖タンパク質を金属基板上で再現よく測定する方法を提供。【解決手段】チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖とポリエチレングリコール鎖を有し、前記ポリエチレングリコール鎖中にアミド結合を有する、ボロン酸化合物。タンパク質がボロン酸化合物に非特異的吸着することを長期間にわたって抑制できる。これにより、例えば、ボロン酸化合物を用いて、妨害物質条件下でも糖濃度を長期的に測定できる。【選択図】図１３
2015086146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（化４）で表される化合物。
【化４】
2015086146.tif 000013
ただし、ｍ≧３、ｎ≧１を満たす、ｍ、ｎの任意の整数の組み合わせから構造が形成されている。
【請求項２】
ｎ≧１１を満たす、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｍ≧６を満たす、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ｎ≧１６を満たす、請求項２または３に記載の化合物。
【請求項５】
ｍ＝６、ｎ＝１６を満たす、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物と、
金属部を備える基板と、
を有し、
前記化合物のチオール基が、前記金属部と結合されている、
センサ。
【請求項７】
下記の一般式（化１０）で表される化合物。
【化１０】
2015086146.tif 000014
ただし、ｍ≧６、ｎ≧１６を満たす、ｍ、ｎの任意の整数の組み合わせから構造が形成されている。
【請求項８】
ｍ＝６、ｎ＝１６を満たす、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の化合物と、
金属部を備える基板と、
を有し、
前記化合物のチオール基が、前記金属部と結合されている、
センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長期的にタンパク質の吸着抑制可能な化合物に関する。さらに糖類・糖タンパク質を金属基板上で再現よく測定する事に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類は身体の恒常性維持にとって非常に大切な物質の一つとして挙げられる。その糖類の代表例として、グルコース（Ｄ−グルコース、ブドウ糖）が挙げられる。このグルコースは、身体を構成する各種の組織細胞のエネルギー源として大切である。しかし、糖が過剰に血液に流れた状態が続くと生命の危険を伴う意識障害を促すケトアシドーシスが引き起こされかねない。そのため、生体のグルコース維持は、生体恒常性にとって非常に大切な現象である。
【０００３】
現在研究がよく進んでいるグルコース検出手段の一つとして、ボロン酸化合物を用いたグルコースセンサーが幅広く知られている。ここで示されるボロン酸化合物とは、例えば化１や化２で示されるようなボロン酸基を有する化合物を指す。
【０００４】
【化１】
2015086146.tif 000003
【０００５】
【化２】
2015086146.tif 000004
【０００６】
ボロン酸基は、グルコースの持つジオール基と加水分解結合できることがよく知られている。この反応過程を詳しく示したのが化３である。なお、ここではボロン酸化合物の代表としてフェニルボロン酸の反応過程について記載している。
【０００７】
【化３】
2015086146.tif 000005
【０００８】
ｐＨの低い状態では化３（Ａ）のようにボロン酸基はＢ（ＯＨ）2状態を大多数の分子はとっているものの、ｐＨが高い状態では、化３（Ｂ）のようにボロン酸基が遊離の水酸化物イオンと結合してＢ（ＯＨ）3-の状態をとりやすくなる。なお、二種類の分子の比が１：１になるｐＨを本発明ではｐＫａと定義することとする。そして、化３（Ｂ）のようにボロン酸基がＢ（ＯＨ）3-状態の時、グルコースなどが持つジオール基と結合し、化３（Ｃ）のような分子構造をとりやすいことがよく知られている。
【０００９】
こういったボロン酸基の性質を利用して、グルコース濃度を光学的に測定した系が特許文献１である。ボロン酸化合物をチオール基によって予め金基板と結合させた状態にしておく。彼らは、ボロン酸基がグルコースと加水分解結合することで、表面増強ラマン信号（ＳＥＲＳ）のピーク強度またはラマンシフトが一部変化することを発見し、これらの変化量を読み取ることで、グルコース濃度を測定できたと報告した。こういった金属基板の持つ特異な現象を利用してグルコース濃度を光学的に検出する手法は、近年確立されてきた非常に有力な手法の一つである。
【００１０】
また、非特許文献１には、ＰＥＧを導入した化合物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５３２４７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＯＬＬＯＩＤ  ＡＮＤ  ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  １８５，  ９４−１０３  （１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、化合物がタンパク質と非特異的に吸着することを長期的に抑制し続けることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
下記の一般式（化４）で表されるボロン酸化合物。なお、ｍはＰＥＧ鎖の鎖長を表し、ｍ≧３であり、ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１を満たすｍ、ｎの組み合わせから構造は形成される。
【００１５】
【化４】
2015086146.tif 000006
【００１６】
（チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖とポリエチレングリコール鎖を有し、前記ポリエチレングリコール鎖中にアミド結合を有する、ボロン酸化合物。）
【発明の効果】
【００１７】
本発明の手法によって、タンパク質が、例えば、ボロン酸化合物に非特異的吸着をすることを長期間にわたって抑制できる。これにより、例えば、ボロン酸化合物を妨害物質条件下でも糖濃度を長期的に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】金基板の二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図２】金基板の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図３】化１の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図４】化２の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図５】Ｃ６ＰＥＧ２ＯＨの二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図６】Ｃ１１ＰＥＧ６ＯＨの二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図７】Ｃ１６ＰＥＧ６ＯＨの二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図８】二ヶ月間ＰＢＳ溶液保存前後の２９２０／ｃｍ、１１３０／ｃｍのピーク強度解析グラフ
【図９】Ｃ６ＰＥＧ２ＯＨの二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１０】Ｃ１６ＰＥＧ３ＯＨの二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１１】Ｃ１６ＰＥＧ６ＯＨの二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１２】二ヶ月間ＰＢＳ溶液保存前後の２９２０／ｃｍ、１１３０／ｃｍのピーク強度解析のグラフ
【図１３】本発明に従うボロン酸化合物化５の合成概略図
【図１４】本発明に従うボロン酸化合物化５が金基板表面に結合できたことを示すＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１５】本発明に従うボロン酸化合物化９が金基板表面に結合できたことを示すＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１６】本発明に従うボロン酸化合物化５の二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１７】本発明に従うボロン酸化合物化５の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１８】本発明に従うボロン酸化合物化９の二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図１９】本発明に従うボロン酸化合物化９の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図２０】本発明に従うボロン酸化合物化９の二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図２１】本発明に従うボロン酸化合物化９の二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存前後のＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）変化を示すグラフ
【図２２】実施の形態２におけるセンサ１００を示す図
【図２３】実施の形態２におけるセンサ１００の使用例を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（実施の形態１）
まず、金属に直接結合した化合物がタンパク質と非特異的に吸着することを長期的に抑制し続けるという本発明の課題について、本発明者らは、以下を見出した。
【００２０】
特許文献１のような測定手法を用いて、基板上で例えば血液中の糖濃度を長期間測定し続けるためには、タンパク質等の共雑物が含まれる中で糖濃度を測定しなければならない。このような共雑物条件下では、タンパク質がボロン酸化合物に非特異的に吸着してしまい、正しい糖濃度をボロン酸化合物によって測定しにくくなる。しかしながら、長期間にわたって再現性よく糖濃度を測定するためには、ボロン酸化合物が基板上から解離したり状態変化したりするといったボロン酸化合物の劣化が重大な課題となる。しかしながら現状長期的に状態変化することなく、タンパク質の非特異的吸着を抑制できるような化合物は全く知られていなかった。
【００２１】
しかし、タンパク質の非特異的吸着を抑制するためには、ＰＥＧ鎖（ポリエチレングリコール鎖）に、ある程度の鎖長が必要である、ということを本発明者らは見出した。
【００２２】
これに基づけば、長期的にタンパク質の非特異的吸着を減らす一つの解決手段としては、ＰＥＧ鎖長を適切な長さにすることでタンパク質が表面に接近することを防止することである。
【００２３】
以上を踏まえて、本実施の形態１における化合物の例としては、上記の一般式（化４）で表されるボロン酸化合物である。
【００２４】
なお、ｍ、ｎは、各々ＰＥＧ鎖及びアルキル鎖の鎖長であり、ｍ≧３、ｎ≧１を満たす、ｍ、ｎの任意の整数の組み合わせから構造が形成されている。
【００２５】
以上のボロン酸化合物であれば、タンパク質がボロン酸化合物に非特異的吸着することを長期間にわたって抑制できる。これにより、例えば、ボロン酸化合物を用いて、妨害物質条件下でも糖濃度を長期的に測定できる。
【００２６】
なお、ＰＥＧ鎖の鎖長ｍが３以上、アルキル鎖の鎖長ｎは１以上であれば、後述するセンサ基板上に接着できうる限り、ｍ及びｎはどれ程大きくても本発明の範疇に含まれる。
【００２７】
アルキル鎖がない化１に示される４ＭＰＢＡが金属に直接繋がれたとしても、タンパク質水溶液中に長期間保存することによって金属基板から解離し、タンパク質の非特異的吸着が生じていた。これはアルキル鎖長がないために分子間力が弱く、ボロン酸化合物が金属基板上に稠密に結合できないことによるものだと本発明者らは見出した。
【００２８】
これに基づけば、長期的にタンパク質の非特異的吸着を減らす一つの解決手段としては、基板上での分子の稠密性を上昇させ分子の安定性を高めながら、ＰＥＧ鎖長を適切な長さにすることでタンパク質が表面に接近することを防止することである。
【００２９】
一例として、上述の例で示される化合物として、ｍ＝６，ｎ＝１６の化５が挙げられる。
【００３０】
【化５】
2015086146.tif 000007
【００３１】
ただし、本発明は、この例にのみ限定されるべきものではなく、ｍ≧３、ｎ≧１についてｍ、ｎの任意の整数の組み合わせに対しても含まれる。
【００３２】
例えば、ｍ≧３、ｎ≧１１を満たす、（化４）に示す化合物であっても良い。
【００３３】
または、ｍ≧６、ｎ≧１１を満たす、（化４）に示す化合物であっても良い。
【００３４】
または、ｍ≧６、ｎ≧１６を満たす、（化４）に示す化合物であっても良い。
【００３５】
また、ボロン酸基のベンゼン環上の置換配置は、ベンゼン環から向かってメタ位、オルト位、パラ位のいずれに配置されていても本発明の範疇に含まれる。
【００３６】
上述の例で示されるボロン酸化合物は、ベンゼン環が置換基を有していてもよく、そのような置換基（誘導体）付ボロン酸化合物も本発明に含まれる。置換基の例としては、メトキシ基、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基、アミノ基、フェニル基が挙げられる。一例として化６に示されるボロン酸化合物が挙げられる。
【００３７】
【化６】
2015086146.tif 000008
【００３８】
化６で示される置換基のフルオロ基は、電子吸引性の高い置換基である。従って、フルオロ基はボロン酸基の前記ｐＫａを下げさせる効果を持つ。前記ｐＫａが下がれば、ボロン酸基はＢ（ＯＨ）3-状態によりなりやすくなる。このＢ（ＯＨ）3-状態のボロン酸基が、グルコースと化学的に結合できる。そのため、化６のグルコースへの結合性が、フェニルボロン酸の結合性よりも高くなる。
【００３９】
このようにボロン酸基とジオール基との特異的結合性を高めさせる置換基を置くことは、糖ならびに糖タンパク質の効果的な検出においても非常に有用である。
【００４０】
上述の例で示されるボロン酸化合物は、ボロン酸基を有するベンゼン環の代わりに、ボロン酸基を有するベンゼン環群（複数のベンゼン環）を有していても良い。
【００４１】
ベンゼン環群の数は金属上に安定的に結合できる限り、いくつ連なっていても本発明の範疇に含まれる。ベンゼン環群数の例として、ベンゼンの代わりにナフタレン（化７）、アントラセン（化８）といった構造が挙げられる。
【００４２】
【化７】
2015086146.tif 000009
【００４３】
【化８】
2015086146.tif 000010
【００４４】
ボロン酸基の結合部位は、ベンゼン環群上の任意の位置で置換されていても本発明の範疇に含まれる。また、ボロン酸基が複数置換されていても本発明に含まれる。合わせて、この環上のどの位置にボロン酸基以外の置換基が含まれていても本発明の範疇に含まれる。
【００４５】
これらのベンゼン環の連なった化合物は、一般に蛍光特性を有するため、グルコース等の糖類が結合した際に、蛍光波長が変化する特性を持つ。そこで、この波長変化を読み取ることでグルコース濃度を定量化可能なため、有用である。
【００４６】
ボロン酸基を有するベンゼン環に一つ以上置換基を含むような化合物も本発明の範疇に含まれる。一例として、化１２が挙げられる。ただし本発明は化９にのみ限定されるべきものではなく、任意の置換基と結合部位について本発明の範疇に含まれる。
【００４７】
【化９】
2015086146.tif 000011
【００４８】
また、本実施の形態１における化合物の別の例は、下記の一般式（化１０）で表される化合物である。
【００４９】
【化１０】
2015086146.tif 000012
【００５０】
ただし、ｍ≧６、ｎ≧１６を満たす、ｍ、ｎの任意の整数の組み合わせから構造が形成されている。
【００５１】
以上の化合物であれば、タンパク質が化合物に非特異的吸着することを長期間にわたって抑制できる。これにより、例えば、化合物を用いて、妨害物質条件下でも糖濃度を長期的に測定できる。
【００５２】
本実施の形態１のチオール基は、金属Ｍと特異的に結合するため用いられている。金属Ｍの例として、金、銀、銅、アルミニウム、亜鉛といったものが挙げられる。ただし、金属Ｍの種類はこれらの金属にのみ限定されるものではなく、チオール基が結合可能な金属であれば、どのような金属の種類でも本発明の範疇に含まれる。
【００５３】
保存水溶液の種類も本発明化合物の構造が著しく変化してしまうような溶液を適用しない限り、任意の水溶液でも本発明の範疇に含まれる。
【００５４】
本実施の形態１の最大の特徴は、タンパク質などの共雑物が存在していたとしても、その共雑物が金属と結合したボロン酸化合物に特異的に吸着しないことである。従って、この化合物はボロン酸基の持つ単糖類の検出といった機能を共雑物が含まれていたとしても金属上で安定的に実施可能である。本発明利用上の利点は、従来の電気化学的手法のみならず、金属基板の特徴を活かした光学的手法でも、タンパク質といった共雑物が含まれても長期的に安定的な糖類検出が実施できる点である。後者の好例として特許文献１が挙げられる。特許文献１では、ボロン酸化合物を予め表面増強ラマン（ＳＥＲＳ）用金基板上に結合させておき、ボロン酸に結合したグルコース濃度をＳＥＲＳスペクトラム変化により定量化できると報告されている。以上のように、グルコース濃度を安定的に定量化するためには、ボロン酸基が金基板上に存在することが必要条件である。従って、本発明はこのようなグルコース濃度検出にも非常に有用である。
【００５５】
本発明は、生体を傷つけることなく体内における糖濃度を測定する技術に展開できる。一例として下記のような方法が検討できる。予め生体にボロン酸化合物を吸着させた光学センサを埋め込んでおく。このセンサを生体外部から適切な光を照射することによってボロン酸基と結合した糖の濃度を測定できる。このようにして得た体内の糖に関する情報を連続的にモニターすることによって臨床学的に有用なデータを取得することもできる。また、このようなセンサにより、糖尿病患者はいつでもどこでも自身の血糖値を容易に測定可能になる。さらに、患者のＱＯＬを高めることにも繋がりうる。また、ボロン酸基開裂を抑制する本発明手法は、所望の糖・糖タンパク質を測定可能な次世代バイオセンサにも多大な影響を与える。
【００５６】
（実施の形態２）
実施の形態２が、図２２および図２３を参照しながら説明される。
【００５７】
実施の形態２においては、実施の形態１で示されたボロン酸化合物または化合物を結合したセンサが提案される。
【００５８】
図２２は、実施の形態２におけるセンサ１００を示す図である。
【００５９】
実施の形態２におけるセンサ１００は、ボロン酸化合物１０１と、基板１０３とを有する。
【００６０】
ボロン酸化合物１０１は、実施の形態１において示されたボロン酸化合物である。
【００６１】
基板１０３は、金属部１０２を備える。
【００６２】
ボロン酸化合物１０１のチオール基は、金属部１０２と結合されている。
【００６３】
以上の構成によれば、タンパク質含有溶液条件下であってもボロン酸化合物がタンパク質と吸着することを抑制できる。これにより、例えば、タンパク質含有溶液条件下であってもセンサ上のボロン酸化合物がタンパク質と非特異的に吸着することを抑制できる。例えば、タンパク質含有糖水溶液中または被検体の内部において、センサのボロン酸化合物によって長期的かつ安定的に糖濃度を測定できる。
【００６４】
ボロン酸化合物１０１は、例えば、図２０（ａ）に示されるように、金属部１０２の上面に、膜状に設けられていても良い。
【００６５】
もしくは、ボロン酸化合物１０１は、例えば、図１７（ｂ）に示されるように、パターン化された金属部１０２（金属パターン）に近接するように設けられていても良い。
【００６６】
金属パターンとしては、例えば、粒子状に形成された金属部などが挙げられる。金属パターンとしては、表面増強ラマン散乱を生じさせる構造であっても良い。
【００６７】
なお、実施の形態２におけるセンサ１００は、実施の形態１において示された化合物（化１０）と、基板１０３とを有していても良い。
【００６８】
図２３は、実施の形態２におけるセンサ１００の使用例を示す図である。
【００６９】
実施の形態２におけるセンサ１００は、被検体の内部に埋め込まれる。
【００７０】
検出装置２００は、センサ１００を用いて、被検体の内部の被検物質を検出する検出装置である。
【００７１】
検出装置２００は、励起光を出射する発光手段２０１と、散乱光を検出する検出手段２０２と、演算手段２０３とを具備する。
【００７２】
検出装置２００は、発光手段２０１からの励起光を、被検体内部に埋め込まれたセンサーチップ１００に照射し、散乱光を発生させる。
【００７３】
ここで、散乱光としては、例えば、表面増強ラマン散乱光や、蛍光などが挙げられる。
【００７４】
検出装置２００は、発生した散乱光を検出手段２０２で検出し、散乱光の強度を得る。
【００７５】
検出装置２００は、得られた散乱光の強度に基づき、演算手段２０３により、被見物質の存在の有無を判定する。もしくは、検出装置２００は、得られた散乱光の強度に基づき、演算手段２０３により、被見物質の濃度を測定しても良い。
【００７６】
なお、実施の形態２においては、被検体は、人体や動物などの生体であっても良い。
【００７７】
もしくは、被検体は、無生物であっても良い。すなわち、センサ１００は、例えば、被検物質の中に配置されても良い。このとき、検出装置２００は、被検物質の中に含有される被検物質を検出しても良い。このとき、被検溶液は、生体から摘出された液であっても良い。例えば、被検溶液は、血液、汗、涙、尿、唾液などであっても良い。
【００７８】
なお、被検物質としては、例えば、グルコースなどの糖類または糖タンパク質などが挙げられる。
【００７９】
以下、本発明の特徴を一層明らかにするため実施例に沿って本発明を説明していく。
【００８０】
（実施例１）
＜自己集積膜吸着実験＞
本実施例ではチオール系化合物を金基板へ吸着させる方法について述べる。
【００８１】
ここで、チオール系化合物は以下の８種類の化合物を指す。
【００８２】
まず、ベンゼン環からのボロン酸基の開裂を再現できるか確認するために、化１の４ＭＰＢＡ及び、ボロン酸基のベンゼン環上の位置が開裂にどのような影響を与えるか検証するために、化２の３ＭＰＢＡの計二種類の化合物について構造安定性を検証することに決めた。そこで、まず本実施例では、前記の３ＭＰＢＡと４ＭＰＢＡ計二種類を金基板に吸着させる方法について記載する。
【００８３】
次に、二ヶ月間タンパク質の非特異的吸着を抑制する材料を特定するために、６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ  ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（Ｃ６ＰＥＧ２ＯＨ）、１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１１ＰＥＧ３ＯＨ）、１６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１６ＰＥＧ３ＯＨ）、  １６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（Ｃ１６ＰＥＧ６ＯＨ）の金基板への吸着方法も本実施例に併記した。
【００８４】
さらに、実施例４で使用される金基盤へのボロン酸化合物の固定化に使用する際の足場となるアルキル鎖として２０−（１６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｄｅｃａｎｙｌｏｘｙ）−３，６，９，１２，１５，１８−ｈｅｘａｏｘａｅｉｃｏｓａｎｅ−１−ａｍｉｎｅ（Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２と定義）の金基板への吸着方法も本実施例に併記した。
【００８５】
５ｎｍのチタンと１００ｎｍの金をＳｉウエハー上にスパッタリング法を用いて薄膜形成させた金基板を準備した。前記金基板を２−プロパノール（ＩＰＡ）溶液中で１０分間超音波洗浄した。その後、前記金基板をアセトン溶液中で１０分間超音波洗浄した。さらに前記金基板をアセトン溶液から取り出し、大量の超純水で洗浄した後、洗浄後の金基板を１００Ｗ、５分間の条件でＯ２プラズマ処理をした。このように洗浄された金基板を１ｍＭのエタノール溶液に溶かしたチオール系化合物と反応させた。以上の洗浄方法によって、金基板に自己集積膜（ＳＡＭ）を吸着させた。
【００８６】
（実施例２）
＜金基板及び４ＭＰＢＡと３ＭＰＢＡの長期保存によるタンパク質吸着実験＞
本実施例では、金基板そのものと実施例１で金基板上に固定化された化合物、すなわち４ＭＰＢＡと３ＭＰＢＡの計３種類について３７℃条件下で４０００ｍｇ／ｄｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含んだリン酸（１０ｍＭ）と塩化ナトリウム（１５４ｍＭ）を含有するリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（以下、ＨＳＡ溶液と定義する）に浸した状態で二ヶ月間保管して、ＨＳＡの吸着の有無について評価した。
【００８７】
予め金基板そのものと実施例１で得られた２種類のボロン酸化合物、すなわち４ＭＰＢＡ、３ＭＰＢＡが吸着された金基板の計３種類の表面状態をＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）の装置ＦＲＯＮＴＩＥＲ  ＦＴ−ＩＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって調べた。そして各々のサンプルをＨＳＡ溶液に浸した。二ヵ月保存後にその三種類の金基板を取り出して、超純水でその金基板表面をよく洗浄した後に、その金基板表面をＦＲＯＮＴＩＥＲ  ＦＴ−ＩＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって再び調べた。
【００８８】
得られたＦＴ−ＩＲの吸収ピーク強度変化を定量的に検証するために、得られたスペクトラムのうち、所望のピークを吸収強度が最大である波数からみて周辺３０／ｃｍ程度抽出した。抽出後のピークを一次直線でピークの傾きを補正した。その補正されたピークの強度を解析ソフトＯｒｉｇｉｎＰｒｏ９．０Ｊに含まれるローレンツ関数によって見積もった。なお、抽出ピークとローレンツ関数との相関係数がＲ2≧０．９であれば、正しくフィッティングなされていると判断した。その正しいフィッティングで示されるピーク強度値を本発明では解析データとして採用した。そして、初期サンプルのピーク強度に対するＰＢＳ溶液に浸けた時間毎のピーク強度比を算出してグラフ上にプロットした。なお、本発明ではこの解析手法を「ピーク強度解析手法」と定義する。
【００８９】
まず、金基板そのものを二ヶ月間保存した場合にどのような変化が見られるか明らかにするために、表面のＩＲスペクトラム変化を観察した。図１ではＰＢＳ溶液に二ヶ月保存前後のＩＲスペクトラム変化を示した。すると、新しいピークが顕著に生じることもなかったため、金基板表面が変化していないとみなせる。一方、図２ではＨＳＡ溶液に二ヶ月間保存前後のＩＲスペクトラム変化を示した。ＨＳＡ溶液保存後のＩＲスペクトラムでは１６５９／ｃｍのＣ＝Ｏ伸縮振動、１５４０／ｃｍのＮＨ変角振動といったタンパク質由来のピークが顕著に観察された。従って、ＨＳＡが金基板へ非特異的に吸着しているとわかった。
【００９０】
次に、４ＭＰＢＡについて二ヶ月間保存した場合にどのような変化が見られるか明らかにするために、表面のＩＲスペクトラム変化を観察した。１３５４／ｃｍという非特許文献１の結果からＢＯ伸縮振動だと帰属される。このピーク強度を観察すると、大きく減少していることがわかる。従って二ヶ月間ＨＳＡ溶液に浸すことによって、４ＭＰＢＡのボロン酸基が少なくとも減少している。次に、タンパク質の非特異的吸着が４ＭＰＢＡで生じているか確認するために、タンパク質由来の代表的なピークであるＣ＝Ｏ伸縮振動（１６５９／ｃｍ）について検証した。すると、ＨＳＡ溶液に保存する前では全く見られなかったＣ＝Ｏ伸縮振動のピークが二ヶ月保存後には生じていることが観察された。そこでタンパク質の吸着量を定量的に把握するために、ＨＳＡ溶液に二ヶ月保存前後の１６５８／ｃｍ（Ｃ＝Ｏ伸縮振動）のＩＲピーク強度変化を解析した（図１２）。なお、各々のサンプルのピーク強度変化比は金基板の吸光度を１００％として規格化して図示している。すると、１６５８／ｃｍに対する金基板のＩＲ強度変化に対して４ＭＰＢＡのＩＲ強度変化は７８％と高い数値をとった。この結果から、４ＭＰＢＡを二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存するとＨＳＡの非特異的吸着が生じているとみなせる。
【００９１】
ベンゼン環に対するボロン酸基の置換位置とボロン酸基開裂の関係を明らかにするために、３ＭＰＢＡのボロン酸基開裂の有無を確認した。図４に実施例１で吸着させた直後の初期状態と１日ＰＢＳ溶液に浸けた後の状態の計２種類についてＩＲスペクトラムを示した。まず、１３４８／ｃｍは図１で示される４ＭＰＢＡの帰属結果よりＢＯ伸縮振動だと帰属される。このＢＯ伸縮振動の吸収強度は二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存することによって激減していることが観察される。従って、ＨＳＡ溶液に保存することによって、少なくともボロン酸基の吸着数が減少している。次に、タンパク質の非特異的吸着が３ＭＰＢＡでも生じているか確認するために、タンパク質由来の代表的なピークであるＣ＝Ｏ伸縮振動（１６５９／ｃｍ）について検証した。すると、二ヶ月保存前には全く観察されなかったＣ＝Ｏ伸縮振動の吸収強度が二ヶ月保存後には生じていた。そこで、タンパク質の吸着量を定量的に把握するために、ＨＳＡ溶液に二ヶ月保存前後の１６５９／ｃｍ（Ｃ＝Ｏ伸縮振動）のＩＲピーク強度変化を解析した（図１２）。すると、金基板のＩＲ強度変化に対して３ＭＰＢＡのＩＲ強度変化は６１％であった。
【００９２】
従って、この結果から、３ＭＰＢＡもまた二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存するとＨＳＡの非特異的吸着が生じていた。さらに前記４ＭＰＢＡの実施例とあわせると、タンパク質の非特異的吸着現象が、ボロン酸基のベンゼン環上での置換位置には大きく依存しないことも明らかになった。
【００９３】
（実施例３）
＜タンパク質吸着の長期保存条件下での抑制可能化合物の構造特定＞
実施例３ではタンパク質吸着を長期的に抑制できる化合物の特徴を把握するために、アルキル鎖とＰＥＧ鎖を有する様々な化合物について長期タンパク質吸着実験を実施した。
【００９４】
まず、二ヶ月間保存しても構造が安定な化合物（ＳＡＭ安定性が確保されている化合物）を特定するために、様々なアルキル鎖長を有する化合物についてＰＢＳ溶液に二ヶ月保存した場合のＩＲスペクトラム変化を観察した。まず、図５で示されるＣ６ＰＥＧ２ＯＨでは初期スペクトルと比較すると、例えばピーク強度の比較的大きな１１３０／ｃｍ（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−伸縮振動）や２８４４／ｃｍ、２９２１／ｃｍ（ともにＣＨ伸縮振動）といったピーク値が二ヶ月保存によって大きく減少した。従ってＣ６ＰＥＧ２ＯＨの一部が金基板から解離している。次に図６で示されるＣ１１ＰＥＧ３ＯＨでは１１３０／ｃｍ（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−伸縮振動）や、２８４６／ｃｍ、２９１５／ｃｍ（ＣＨ伸縮振動）のピーク強度が二ヶ月保存により減少していた。最後に図７で示されるＣ１６ＰＥＧ３ＯＨでは、１１３０／ｃｍ  （−Ｃ−Ｏ−Ｃ−伸縮振動）や２８５０／ｃｍ、２９１８／ｃｍ（ＣＨ伸縮振動）のピーク強度が二ヶ月保存後でも大きくは変化せず、その他目立ったピークも現れていないこともわかった。
【００９５】
従ってＣ１６ＰＥＧ３ＯＨだと３７度で二ヶ月間保存することによってＳＡＭ安定性が確保されていると定性的に考えられる。
【００９６】
そこで、二ヶ月間ＳＡＭ安定性を有するアルキル鎖長がＣ１６ＰＥＧ６ＯＨであるかをより定量的に検証するために、各々２９２０／ｃｍ（図８（Ａ））と１１３０／ｃｍ（図８（Ｂ））について各々のＳＡＭのＰＢＳ溶液に二ヶ月保存前の初期ピーク強度を１００％とした時のピーク強度変化を解析した。１１３０／ｃｍの場合にはＣ６ＰＥＧ２ＯＨ、Ｃ１１ＰＥＧ３ＯＨ、Ｃ１６ＰＥＧ３ＯＨとアルキル鎖長を伸ばすにつれて２０％、３８％、１０２％と増加していった。一方、２９２０／ｃｍ（ＣＨ伸縮振動）の場合にはＣ６ＰＥＧ２ＯＨ、Ｃ１１ＰＥＧ３ＯＨ、Ｃ１６ＰＥＧ３ＯＨになるに従って凡そ１０％、３８％、８０％へとピーク強度が増加していった。
【００９７】
従って、これらの解析結果からＣ１６ＰＥＧ３ＯＨであれば３７度二ヶ月間保存に対してＳＡＭ安定性が高いと判断できる。
【００９８】
次に、ＳＡＭ安定性の高い材料についてタンパク質の非特異的吸着を二ヶ月保存後でも抑制可能な材料を特定するために、３７度ＨＳＡ溶液に二ヶ月保存した前後のＦＴ−ＩＲスペクトラム変化を観察した。
【００９９】
図９に示されるＣ６ＰＥＧ２ＯＨでは、１６５９／ｃｍや１５４０／ｃｍといったアミド結合由来のピークが観察されるため、ＨＳＡが非特異的に吸着を起こしていると見なせる。
【０１００】
一方、ＳＡＭ安定性の高い材料として知られるＣ１６ＰＥＧ３ＯＨやＣ１６ＰＥＧ６ＯＨ（各々図１０、１１）では、１６５９／ｃｍや１５４０／ｃｍといったアミド結合由来のピークが明確には観察されないため、ＨＳＡがＩＲで観察できる程には非特異的に吸着していないとみなすことができる。
【０１０１】
そこでより定量的にＨＳＡの非特異的吸着とＰＥＧ鎖長の関係を明らかにするために、１６５９／ｃｍの二ヶ月保存前後のピーク強度解析手法を実施した（図１２）。Ｃ６ＰＥＧ２ＯＨのピーク強度変化は、金基板のピーク強度変化に比べると凡そ３８％であった。また、Ｃ１１ＰＥＧ３ＯＨ及びＣ１１ＰＥＧ６ＯＨのピーク強度変化は金基板のピーク強度に対して各々約１１％、６．０％と減少していた。さらにアルキル鎖長を伸ばしたＣ１６ＰＥＧ３ＯＨ及びＣ１６ＰＥＧ６ＯＨのピーク強度変化は金基板のピーク強度の約２％であった。
【０１０２】
以上の結果から、ＰＥＧ鎖長が３以上であれば、３７度二ヶ月保存によって材料の構造が変化せずかつ、ＨＳＡの非特異的吸着を抑制し続けられるとわかった。
【０１０３】
さらに、以上の結果から、好ましくは、アルキル鎖長が１１以上でＰＥＧ鎖長が３以上であれば、３７度二ヶ月保存によって材料の構造が変化せずかつ、ＨＳＡの非特異的吸着を抑制し続けられるとわかった。
【０１０４】
（実施例４）
＜ＥＤＣ／ＮＨＳ法によるリンカー結合実験＞
本実施例では本発明に従うボロン酸化合物として前記の化合物、すなわち化５、化９を金基板上で作製する方法について以下に詳細を述べる。
【０１０５】
化５、化９を作製するための合成ルート概略図を図１３に示した。ただし化５と化９の合成方法はほぼ同じなので、図１３中では化５にのみ特化して記載してある。まず、図１３（Ａ）で示されるように３−カルボキシ−フェニルボロン酸（３ＣＰＢＡ）を購入し、準備した。
【０１０６】
次に１００ｍＭ  ＭＥＳと０．１％塩化ナトリウムを加えたｐＨ４．７の溶液中に２５℃において、１ｍＭ  ３ＣＰＢＡを溶かした。Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）  カルボジイミド（ＥＤＣ）と２時間室温条件下で反応させた（経路（ｉ））。前記反応溶液のｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウム溶液によって７．０まで上昇させた。その後、実施例１で示されるＣ１６ＰＥＧ６ＮＨ２を吸着させた金基板に、前記反応溶液を加えた（経路（ｉｉ））。前記反応溶液に４時間浸けた後に、前記金基板を前記反応溶液から取り出した。未反応成分を前記金基板表面から除去するために、前記金基板表面を超純水でよく洗浄した。そして、前記金基板上に図１３（Ｃ）で示される化合物を作製した。ここで便宜上、化５で示される化合物の名称をＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡ、化９で示される化合物の名称をＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡと定義する。
【０１０７】
化５、化９の化合物が金基板上で作製できていることをＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって同定した。この同定に使用したグラフが、化５、化９の各々に対して図１４、図１５である。
【０１０８】
（実施例５）
＜Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡの構造安定性及びタンパク質非特異的吸着評価試験＞
まず、本発明に従う化５で示されるＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡの３７度二ヶ月間ＰＢＳ溶液保存することによるＳＡＭ安定性を評価した。
【０１０９】
化５をＰＢＳ溶液保存する前と二ヶ月間保存後の計二種類のＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図１６に示す。ほぼ全ての種類のピーク強度がＰＢＳ溶液保存前後で大きく変化せず、新しいピークも現れていないように観察される。そこで、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡが構造変化していないかを定量的に判断するために、ここでは２つのピークにのみ絞って、実施例３と同様のピーク強度解析手法を実施した。一つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動だと帰属される１３９０／ｃｍに注目した。すると、ボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸す前の状態と二ヶ月間保存後の状態とを比較して、最大で１２％しか変わらなかった。二つ目のピークとして、ボロン酸を架橋するアミド結合由来のＣ＝Ｏ伸縮振動と帰属される１６５８／ｃｍに着目した。すると、アミド結合由来のピーク強度もまた二ヵ月保存によって１０％しか変化していなかった。
【０１１０】
以上の解析結果から、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡは二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存しても、実施例１に見られるような顕著な構造変化をしないとわかった。
【０１１１】
次に、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡがタンパク質と非特異的に吸着するか検証するために、３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存してその金基板表面をＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって計測した。
【０１１２】
３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存したＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡは保存前と比べると１６５９／ｃｍ  （Ｃ＝Ｏ伸縮振動）、  １５４０／ｃｍ  （ＮＨ変角振動）といったアミノ酸由来のピーク強度がわずかに上昇していた（図１７）。この結果をより定量的に捉えるために、ピーク強度変化が最も観察しやすい１６５９／ｃｍのピーク強度解析を実施した。その解析結果を図１２に示した。なお、タンパク質溶液に添加せずとも１６５９／ｃｍのピークが元々観察されているために、元々観察されている分のピーク強度値を減算して表記している。すると、金基板上への非特異的吸着量と比較して、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡはわずか４．５％という結果を得た。
【０１１３】
この解析結果から本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＰＢＡはタンパク質の非特異的吸着を長期間に渡って抑制し続けられる。
【０１１４】
（実施例６）
＜Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡの構造安定性及びタンパク質非特異的吸着評価試験＞
まず、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡもまた３７度二ヶ月間ＰＢＳ溶液保存してもＳＡＭ安定性を保てるかどうか評価した。
【０１１５】
Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡをＰＢＳ溶液保存する前と二ヶ月間保存後の計二種類のＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図１８に示す。ほぼ全ての種類のピーク強度がＰＢＳ溶液保存前後で大きく変化せず、新しいピークもＩＲスペクトラム上に現れていないように観察される。そこで、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡが構造変化しているかを定量的に判断するために、ここでは二種類のピークのみに絞って、実施例５と同様のピーク強度解析手法を実施した。一つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動だと帰属される１３９０／ｃｍに注目した。すると、ボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸す前の状態と二ヶ月間保存後の状態とを比較して、最大で５％しか変わらなかった。二つ目のピークとして、ボロン酸を架橋するアミド結合由来のＣ＝Ｏ伸縮振動と帰属される１６６２／ｃｍに着目した。すると、アミド結合由来のＩＲ吸収強度もまた二ヵ月保存によって８％と大きく変化していなかった。
【０１１６】
以上の解析結果から、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡは二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存しても実施例１に見られるような顕著な構造変化をしないとわかった。
【０１１７】
次に、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡがタンパク質と非特異的に吸着することを抑制できるか検証するために、３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存してその金基板表面をＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって計測した。
【０１１８】
図１９によれば、３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存したＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡは１６５９／ｃｍ（Ｃ＝Ｏ伸縮振動）、１５４０／ｃｍ（ＮＨ変角振動）といったアミノ酸由来のピーク強度が上昇していた。このピーク強度変化をより定量的に捉えるために、実施例５と同様に１６５９／ｃｍのピーク強度解析を実施した。その解析結果を図１２に示す。なお、アミド結合がもともと見えている化合物ではそのピーク強度を減算して表記している。金基板上への非特異的吸着量と比較して、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡはわずか４．４％という結果を得た。
【０１１９】
この解析結果から本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨＣＯＭＰＢＡもまたタンパク質の非特異的吸着を長期間に渡って抑制し続けられる。
【０１２０】
（実施例７）
＜Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２の構造安定性及びタンパク質非特異的吸着評価試験＞
まず、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨ２が３７度二ヶ月間ＰＢＳ溶液保存してもＳＡＭ安定性を保てるかどうか評価した。
【０１２１】
Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２をＰＢＳ溶液保存する前と二ヶ月間保存後の計二種類のＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図２０に示す。ほぼ全ての種類のピーク強度がＰＢＳ溶液保存前後で大きく変化せず、新しいピークもＩＲスペクトラム上に現れていないように観察される。そこで、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２が構造変化しているかを定量的に判断するために、ここでは二種類のピークのみに絞って、実施例５と同様のピーク強度解析手法を実施した。一つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動だと帰属される１３９０／ｃｍに注目した。すると、ボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸す前の状態と二ヶ月間保存後の状態とを比較して、最大で５％しか変わらなかった。二つ目のピークとして、ボロン酸を架橋するアミド結合由来のＣ＝Ｏ伸縮振動と帰属される１６６２／ｃｍに着目した。すると、アミド結合由来のＩＲ吸収強度もまた二ヵ月保存によって８％と大きく変化していなかった。
【０１２２】
以上の解析結果から、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２は二ヶ月間ＰＢＳ溶液に保存しても実施例１に見られるような顕著な構造変化をしないとわかった。
【０１２３】
次に、本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨ２がタンパク質と非特異的に吸着することを抑制できるか検証するために、３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存してその金基板表面をＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって計測した。
【０１２４】
図２１によれば、３７度二ヶ月間ＨＳＡ溶液に保存したＣ１６ＰＥＧ６ＮＨ２は１６５９／ｃｍ（Ｃ＝Ｏ伸縮振動）、１５４０／ｃｍ（ＮＨ変角振動）といったアミノ酸由来のピーク強度が上昇していた。このピーク強度変化をより定量的に捉えるために、実施例５と同様に１６５９／ｃｍのピーク強度解析を実施した。その解析結果を図１２に示す。なお、アミド結合がもともと見えている化合物ではそのピーク強度を減算して表記している。金基板上への非特異的吸着量と比較して、Ｃ１６ＰＥＧ６ＮＨ２はわずか３．７％という結果を得た。
【０１２５】
この解析結果から本発明に従うＣ１６ＰＥＧ６ＮＨ２もまたタンパク質の非特異的吸着を長期間に渡って抑制し続けられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明は、例えば、ボロン酸化合物に対する妨害分子の吸着を長期的に抑制し続けられることで糖・糖タンパク質を再現よく測定可能なセンサ作製に利用できる。
【０１２７】
本発明は、多くの用途が考えられるものの、例えば、タンパク質共雑物条件下において金属上でのボロン酸化合物を用いた糖類・糖タンパク質の再現性ある検出に好適であり、さらにはバイオセンサにも応用可能な技術である。
【符号の説明】
【０１２８】
１００  センサ
２００  検出装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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