(57)【要約】  １実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物。
【請求項２】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している請求項１に記載のモジュラー組成物。
【請求項３】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している請求項１に記載のモジュラー組成物。
【請求項４】
１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物。
【請求項５】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している請求項４に記載のモジュラー組成物。
【請求項６】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している請求項４に記載のモジュラー組成物。
【請求項７】
１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物。
【請求項８】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している請求項７に記載のモジュラー組成物。
【請求項９】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している請求項７に記載のモジュラー組成物。
【請求項１０】
１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している請求項１０に記載のモジュラー組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが３′末端および／または５′末端で前記ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している請求項１０に記載のモジュラー組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
治療を目的とした全身的なオリゴヌクレオチドの送達に重点を置いた科学的努力が続けられている。オリゴヌクレオチド送達への３つの注目される手法には、１）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）カプセル封入、２）ポリマー接合、および３）単一化学接合などがある。単一化学接合では代表的には、ターゲティングリガンドまたは脂質もしくは可溶化基またはエンドソーム分解性ペプチドもしくは細胞透過性ペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチドに結合した２種類もしくは４種類全ての組み合わせが用いられる。接合体にはリンカーが存在しても良く、他の官能基が存在しても良い。単一化学接合体が知られており、オリゴヌクレオチドの結合は、オリゴヌクレオチドの５′末端もしくは３′末端、両末端、または内部で起こる。ＷＯ２００５／０４１８５９;ＷＯ２００８／０３６８２５およびＷＯ２００９／１２６９３３を参照する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０４１８５９
【特許文献２】ＷＯ２００８／０３６８２５
【特許文献３】ＷＯ２００９／１２６９３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の単一化学接合体は、オリゴヌクレオチドの５′末端および／または３′末端にペプチドを含むものでなければならず、それはエンドソーム分解性成分、細胞透過性ペプチドおよび／または融合性ペプチドであると考えられる。ペプチドとオリゴヌクレオチドの間にはリンカーも存在しなければならない。ターゲティングリガンド、可溶化剤、脂質および／またはマスキング剤などの他の官能基が存在しても良い。代表的には、そのオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡである。さらに、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖またはガイド鎖である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【０００５】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【０００６】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【０００７】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【０００８】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【０００９】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、に結合しているオリゴヌクレオチドいずれかの３′末端および／または５′末端で；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００１０】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１１】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１２】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１３】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１４】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００１５】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１６】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１７】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１８】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００１９】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合している１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００２０】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２１】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２２】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２３】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ペプチド：ＷＨＨＷＷＨＷＷＨＨＷＷＨＨＷ（配列番号２）のｐＨ５．４および７．５での溶血パーセントを示す図である。
【図２】ペプチドＡｃＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＧＧＧＲＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号５７）のｐＨ５．４および７．５での溶血パーセントを示す図である。
【図３】ペプチドｍ（Ｐｅｇ）４４ＨＬＬＨＬＬＬＨＬＷＬＨＬＬＨＬＬＬＦＩＬＬＣ（配列番号３３）のｐＨ５．４および７．５での溶血パーセントを示す図である。
【図４】化合物３−６で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図５】化合物６−６で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図６】化合物８−５で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図７】化合物８−９で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図８】化合物９−７で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図９】化合物８−７で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図１０】化合物１３−４で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図１１】化合物１２−３で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図１２】化合物１３−５で処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（ｂ−ＤＮＡプロトコール）を示す図である。
【図１３】化合物３−８で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（二重ルシフェラーゼプロトコール）を示す図である。
【図１４】化合物１５−１で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル（二重ルシフェラーゼプロトコール）を示す図である。
【図１５】指定化合物の単回硝子体内投与から３日後におけるラット網膜組織におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡの相対レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００２６】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２７】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２８】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００２９】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３０】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、に結合しているオリゴヌクレオチドいずれかの３′末端および／または５′末端で；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００３１】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３２】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３３】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３４】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号１から５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３５】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合した１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００３６】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３７】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーはいずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３８】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００３９】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表１から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００４０】
１実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）；および適宜にオリゴヌクレオチドに結合している１以上の脂質、可溶化基および／またはターゲティングリガンドを含むモジュラー組成物を開示する。
【００４１】
別の実施形態において本発明は、１）オリゴヌクレオチド；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でオリゴヌクレオチドに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００４２】
別の実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、いずれかの３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡに結合している）；および３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００４３】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのガイド鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００４４】
１実施形態において本発明は、１）ｓｉＲＮＡ；２）表２から選択される同一でも異なっていても良い１以上のリンカー（そのリンカーは、３′末端および／または５′末端でｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に結合している）；３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される同一でも異なっていても良い１以上のペプチド（そのペプチドはリンカーに結合している）を含むモジュラー組成物を開示する。
【００４５】
模式図によって本発明を説明すると、本発明は、オリゴヌクレオチド（Ｏ）、リンカー（Ｌ）、ペプチド（Ｐ）および適宜の脂質（Ｘ）、ターゲティングリガンド（Ｘ）および／または可溶化基（Ｘ）を含むモジュラー組成物を特徴とする。
【００４６】
そのモジュラー組成物は、下記式：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ｌ−Ｐ
を有することができる。
【００４７】
そのモジュラー組成物は、下記式：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ｘ
を有することができる。
【００４８】
そのモジュラー組成物は、下記式：
Ｐ−Ｌ−Ｏ
を有することができる。
【００４９】
モジュラー組成物の１例は、ｓｉＲＮＡである。
【００５０】
【化１】
2013523149.tif 000003
この例を手引きとして用いる。当業者には、パッセンジャーおよびガイド鎖上に所望の成分を配置する上での多様な順列が存在することは明らかであろう。
【００５１】
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は、同一鎖または異なる鎖上に位置し得る。
【００５２】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は同一鎖上にある。
【００５３】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基はパッセンジャー鎖上にある。
【００５４】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。
【００５５】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上にある。
【００５６】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」はパッセンジャー鎖上にあり、脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。
【００５７】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上にあるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ終端上にある。
【００５８】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」および脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上にあり、二本鎖オリゴヌクレオチドの相反する終端上にある。
【００５９】
一部の実施形態において、同一もしくは異なる性質の別の「Ｐ−Ｌ」を、上記の実施形態で示した脂質、ターゲティングリガンド、および／または可溶化基に代えて用いることができる。
【００６０】
一部の実施形態において、「Ｐ−Ｌ」は、パッセンジャーまたはガイド鎖のいずれかの複数の終端上に位置することができ、脂質、ターゲティングリガンド、および／または可溶化基はパッセンジャーおよびガイド鎖の残りの終端上に位置していることができる。
【００６１】
一部の実施形態において、一つの「Ｐ−Ｌ」および２以上の脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基がオリゴヌクレオチドに存在する。
【００６２】
一部の実施形態において、２以上の「Ｐ−Ｌ」および２以上の脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基がオリゴヌクレオチドに存在している。
【００６３】
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、複数の「Ｐ−Ｌ」成分および／または脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基が存在する場合、そのような複数の「Ｐ−Ｌ」成分および／または脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基は全て、２本鎖オリゴヌクレオチドの１本の鎖または両方の鎖に存在することができる。
【００６４】
複数の「Ｐ−Ｌ」成分および／または脂質、ターゲティングリガンドおよび／または可溶化基が存在する場合、それらは全て同一であっても異なっていても良い。
【００６５】
別の態様において本発明は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法を含む。その方法は、（ａ）本発明のモジュラー組成物を提供もしくは得る段階；（ｂ）細胞をそのモジュラー組成物と接触させる段階；および（ｃ）その細胞に前記モジュラー組成物を取り込ませる段階を含む。
【００６６】
その方法は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボで行って、例えばオリゴヌクレオチドが必要と確認される対象者を治療することができる。前記オリゴヌクレオチドが必要な対象者とは、遺伝子もしくは複数の遺伝子、例えば障害に関係する遺伝子の発現を低下または停止させることを必要とする対象者、例えばヒトである。
【００６７】
１態様において本発明は、１以上の遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。１以上の細胞を有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを接触させる段階を有し、その有効量とは１以上の遺伝子の発現を抑制する量である。その方法は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボで行うことができる。
【００６８】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載のモジュラー組成物を、当業界で公知のオリゴヌクレオチドとともに用いることができる。さらに、本発明の方法および組成物は、当業界で知られている疾患もしくは障害の治療に、そして動物、ヒトなどの哺乳動物などの対象者の治療に用いることができる。当業者には、本発明の方法および組成物を、遺伝子または複数遺伝子の低下もしくは不活性化が有効であると考えられる疾患の治療に用いることができることも明らかであろう。
【００６９】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載のモジュラー組成物は、本明細書に記載の用量および／または製剤、または当業界で公知の用量または製剤とともに用いることができる。本明細書に記載の投与経路に加えて、他の投与経路を本発明のモジュラー組成物の投与に用いることが可能であることは、当業者には明らかであろう。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは、２本鎖または１本鎖の未修飾もしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾ＲＮＡの例には、未修飾ＲＮＡと比較してヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が大きいものなどがある。さらに別の例には、２′糖修飾、塩基修飾、１本鎖突出における修飾、例えば３′の１本鎖突出、または特に１本鎖の場合に、１以上のリン酸基もしくは１以上のリン酸基類縁体を含む５′修飾を有するものなどがある。オリゴヌクレオチドの例およびさらなる説明については、ＷＯ２００９／１２６９３３に記載があり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７１】
１実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスのｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の好ましいオリゴヌク例チドは、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。別の好ましいオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
【００７２】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されるプロセスによるｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングに向かわせるものである。そのプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物などの非常に多様な生物で起こるものである。ｓｉＲＮＡの製造方法および投与方法ならびに特異的に遺伝子機能を失活させる上でのそれの使用が知られている。ｓｉＲＮＡには、修飾および未修飾ｓｉＲＮＡなどがある。ｓｉＲＮＡの例およびそれのさらなる説明がＷＯ２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７３】
ｓｉＲＮＡを対象者に投与するのに用いることができる多くの送達経路例が知られている。さらに、ｓｉＲＮＡは、当業界で公知のいずれかの方法例に従って製剤することができる。ｓｉＲＮＡの製剤および投与の例およびそれについてのさらなる説明がＷＯ２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７４】
ペプチド
二分子膜を容易には通過できない高分子薬物および親水性薬物分子の場合、細胞のエンドソーム／リソソーム画分における取り込みが、それらの作用部位への効果的送達のための最大の障害であると考えられる。理論に拘束されることを望むものではないが、ペプチドの使用が、これらのエンドソーム／リソソーム画分からのオリゴヌクレオチドの逃避または細胞膜を通るオリゴヌクレオチド転位および細胞質画分への放出を促進するものと考えられている。ある種の実施形態において、本発明のペプチドは、ｐＨ依存性の膜活性および／または膜融合性を示すポリカチオン性もしくは両染性またはポリアニオン性のペプチドもしくはペプチド模倣薬であることができる。ペプチド模倣薬は、ペプチドを模倣するよう設計された低分子タンパク質様鎖であることができる。
【００７５】
一部の実施形態において、ペプチドは細胞透過剤、好ましくはらせん形細胞透過剤である。これらのペプチドは一般に、細胞透過性ペプチドと称されている。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」  Ｅｄ．  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｕ．；  ２００７，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａを参照する。好ましくは、前記成分は両親媒性である。前記らせん形剤は好ましくはα−へリックス剤であり、それは好ましくは親油性および疎油性相を有する。細胞透過剤は例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主としてＴｙｒ、ＴｒｐおよびＰｈｅからなる）、デンドリマーペプチド、コンストレインドペプチドまたは架橋ペプチドであることができる。細胞透過性ペプチドの例には、Ｔａｔ、ペネトラチンおよびＰＧなどがある。本発明に関しては、細胞透過性ペプチドは、細胞膜を横断するペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質などの大型の極性分子を運ぶことができる「送達」ペプチドであることができると考えられる。細胞透過ペプチドは直鎖または環状であることができ、それにはＤ−アミノ酸、「レトロ−インベルソ」配列、非ペプチドまたは擬似ペプチド連結、ペプチドミミックなどがある。さらに、ペプチドおよびペプチドミミックは修飾することができ、例えばグリコシル化、ｐｅｇ化またはメチル化することができる。ペプチドの例およびさらなる説明についてはＷＯ２００９／１２６９３３に記載されており、それは参照によって本明細書に組み込まれる。ペプチドの合成については当業界では公知である。
【００７６】
ペプチドは、システインその他のチオール含有部分のＣ末端またはＮ末端への付加によっていずれかの末端または両末端で接合していることができる。Ｎ末端上で官能化されていない場合、ペプチドは、アセチル基によってキャッピングすることができるか、脂質、ＰＥＧまたはターゲティング部分でキャッピングすることができる。ペプチドのＣ末端が未接合であるか官能化されていない場合、それはアミドとしてキャッピングすることができるか、脂質、ＰＥＧまたはターゲティング部分でキャッピングすることができる。
【００７７】
本発明のペプチドは以下の通りである。
【００７８】
ＨＦＨＨＦＦＨＨＦＦＨＦＦＨＨＦＦＨＨＦ（配列番号１）；
ＷＨＨＷＷＨＷＷＨＨＷＷＨＨＷ（配列番号２）；
ＨＷＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号３）；
ＨＬＨＨＷＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号４）；
ＨＬＨＨＬＷＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号５）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＷＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号６）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＷＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号７）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＷＬＨＨＬ（配列番号８）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＷＨＨＬ（配列番号９）；
ＨＰＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号１０）；
ＨＬＨＨＰＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号１１）；
ＨＬＨＨＬＰＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号１２）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＰＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号１３）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＰＨＨＬ（配列番号１４）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＰ（配列番号１５）；
ＥＬＥＥＬＬＥＥＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号１６）；
ＥＬＨＨＬＬＨＥＬＬＨＬＬＨＥＬＬＨＨＬ（配列番号１７）；
ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＣ（配列番号１８）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１９）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号２０）；
ＨＷＨＨＷＷＨＨＷＷＨＷＷＨＨＷＷＨＨＷ（配列番号２１）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＷＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号２２）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＷＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号２３）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＷ（配列番号２４）；
ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ（配列番号２５）；
ＨＨＨＨＨＨＨＬＬＬＬＬＬＬ（配列番号２６）；
ＬＴＴＬＬＴＬＬＴＴＬＬＴＴＬ（配列番号２７）；
ＫＬＬＫＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ（配列番号２８）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号２９）；
ＦＬＧＧＩＩＳＦＦＫＲＬＦ（配列番号３０）；
ＦＩＧＧＩＩＳＦＩＫＫＬＦ（配列番号３１）；
ＦＩＧＧＩＩＳＬＩＫＫＬＦ（配列番号３２）；
ＨＬＬＨＬＬＬＨＬＷＬＨＬＬＨＬＬＬＨＬＬ（配列番号３３）；
ＧＩＧＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号３４）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（配列番号３５）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３６）；
ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３７）；
ＧＧＧＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＫ（配列番号３８）；
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３９）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４０）；
ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＩＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号４１）；
ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＥＡＬＥＡＬＡＡ（配列番号４２）；
Ｄ（ＮＨＣ１２Ｈ２５）ＮｌｅＫＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅ（配列番号４３）；
ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ（配列番号４４）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（配列番号４５）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧ（配列番号４６）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧ（配列番号４７）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（配列番号４８）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧ（配列番号４９）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（配列番号５１）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５２）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧＹＧＲＫＲＲＱＲＲ（配列番号５３）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５４）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５５）；
ＧＦＦＡＬＩＰＫＩＩＳＳＰＬＦＫＴＬＬＳＡＶＧＳＡＬＳＳＳＧＥＱＥ（配列番号５６）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５７）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号５８）；および
ＬＩＲＬＷＳＨＩＨＩＷＦＱＷＲＲＬＫＷＫＫＫ（配列番号５９）。
【００７９】
以上において、ペプチドは、システインその他のチオール含有部分のＣ末端またはＮ末端への付加によっていずれかの末端で接合していても良く；または、
Ｎ末端上で官能化されていない場合、ペプチドは、アセチル基、脂質、ｐｅｇまたはターゲティング部分でキャッピングすることができ；または
Ｃ末端で官能化されていない場合、ペプチドはアミド、脂質、ｐｅｇまたはターゲティング部分によってキャッピングしても良い。
【００８０】
好ましいペプチドは以下の通りである。
【００８１】
ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ（配列番号２８）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号２９）；
ＨＬＬＨＬＬＬＨＬＷＬＨＬＬＨＬＬＬＨＬＬ（配列番号３３）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３６）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（配列番号４０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（配列番号５１）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５２）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５３）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５４）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧＹＧＲＫＲＲＱＲＲ（配列番号５５）；
ＧＦＦＡＬＩＰＫＩＩＳＳＰＬＦＫＴＬＬＳＡＶＧＳＡＬＳＳＳＧＥＱＥ（配列番号５６）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５７）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ（配列番号５８）；および
ＬＩＲＬＷＳＨＩＨＩＷＦＱＷＲＲＬＫＷＫＫＫ（配列番号５９）。
【００８２】
以上において、ペプチドは、システインその他のチオール含有部分のＣ末端またはＮ末端への付加によっていずれかの末端で接合していても良く；または、
Ｎ末端上で官能化されていない場合、ペプチドは、アセチル基、脂質、ｐｅｇまたはターゲティング部分でキャッピングすることができ；または
Ｃ末端で官能化されていない場合、ペプチドはアミド、脂質、ｐｅｇまたはターゲティング部分によってキャッピングしても良い。
【００８３】
リンカー
本発明のモジュラー組成物のペプチドとオリゴヌクレオチドの間の共有結合連結には、リンカーが介在している。このリンカーは、用途に応じて開裂可能であるか非開裂性であることができる。ある種の実施形態において、開裂可能なリンカーを用いて、エンドソームから細胞質への輸送後にオリゴヌクレオチドを放出することができる。接合もしくはカップリング相互作用の所期の性質、または所望の生理的効果によって、リンカー基の選択が決定される。リンカー基を組み合わせたり、分岐することで、より複雑な構築物を提供することができる。リンカーの例およびさらなる説明がＷＯ２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８４】
本発明のリンカーを表１に示してある。
【００８５】
表１
【００８６】
【化２】
2013523149.tif 000004
好ましいリンカーを表２に示す。
【００８７】
表２
【００８８】
【化３】
2013523149.tif 000005
市販のリンカーがＰｉｅｒｃｅまたはＱｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎなどの各種供給業者から入手可能であり、そのリンカーの組み合わせも含まれる。リンカーを組み合わせて、下記に１例を示したような１から８個のペプチドを収容したより複雑な分岐構造を作ることも可能である。
【００８９】
【化４】
2013523149.tif 000006
ターゲティングリガンド
本発明のモジュラー組成物はターゲティングリガンドを含むことができる。一部の実施形態において、このターゲティングリガンドはモジュラー組成物を特定の細胞に向かわせることができる。例えば、ターゲティングリガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合することができる。ターゲティング部分は、標的細胞に対して特異親和性を有する分子であることができる。ターゲティング部分には、標的細胞表面上に認められるタンパク質に対する抗体、または標的細胞表面上に認められる分子へのリガンドもしくはリガンドの受容体結合部分などがあり得る。ターゲティングリガンドの例およびさらなる説明がＷＯ２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ターゲティングリガンドは、抗体、受容体のリガンド結合部分、受容体に対するリガンド、アプタマー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−アセチル（ａｃｙｔｙｌ）−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、葉酸、サイロトロピン、メラノトロピン、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガタクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フルクトース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、血漿タンパク質結合を促進する親油性部分、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣剤、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、葉酸ならびにこれらの類縁体および誘導体からなる群から選択される。
【００９１】
好ましいターゲティングリガンドは、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、葉酸ならびにこれらの類縁体および誘導体からなる群から選択される。
【００９２】
脂質
コレステロールまたは脂肪酸などの親油性部分は、核酸などの高度に親水性の分子に結合すると、血漿タンパク質結合を大きく促進し、結果的に循環半減期を大きく高めることができる。さらに、親油性基は細胞取り込みを高めることができる。例えば、脂質は、リポタンパク質などのある種の血漿タンパク質に結合することができ、それは結果的に相当するリポタンパク質受容体（例えば、ＬＤＬ−受容体またはスカベンジャー受容体ＳＲ−Ｂ１）を発現する特異的組織での取り込みを増加させることが明らかになっている。親油性接合体は標的送達手法と見なすこともでき、それらの細胞内輸送はエンドソーム分解剤との組み合わせによってさらに改善される可能性があると考えられる。
【００９３】
血漿タンパク質結合を高める親油性部分の例には、ステロール類、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド類、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン（ｃｈｏｌｅｎｉｃ）酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥおよびビオチオンなどがあるが、これらに限定されるものではない。脂質の例およびさらなる説明がＷ０２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９４】
好ましい脂質はコレステロールである。
【００９５】
可溶化剤
モジュラー組成物は、水溶解度、循環半減期および／または細胞取り込みを高めることができる１以上の他の部分／リガンドを含むことができる。それには、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはグロブリン）；または炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）などの天然物質などがある。これらの部分は、合成ポリマーまたは合成ポリアミノ酸などの組換えもしくは合成分子であることもできる。例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコール化）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−０．５Ｋ、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、メチル−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、［ｍＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンなどがある。可溶化剤の例およびさらなる説明がＷＯ２００９／１２６９３３にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９６】
好ましい可溶化基はＰＥＧ０．５Ｋから３０Ｋである。
【００９７】
治療方法
１態様において本発明は、本発明のモジュラー組成物投与が有効となり得る疾患のリスクを有するまたはその疾患に罹患した対象者の治療方法を特徴とする。その方法は、投与を必要とする対象者に対して本発明のモジュラー組成物を投与することで当該対象者を治療する段階を有する。投与されるオリゴヌクレオチドは、治療される疾患によって決まる。具体的な適応症の治療方法に関してのさらなる詳細についてはＷＯ２００９／１２６９３３を参照する。
【００９８】
製剤
オリゴヌクレオチド化合物接合体の製造方法は多くある。それらの技術は当業者であれば習熟しているはずである。そのような反応についての有用な文献として、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６がある。他の参考文献には、ＷＯ２００５／０４１８５９；ＷＯ２００８／０３６８２５およびＷＯ２００９／１２６９３３などがある。
【実施例】
【００９９】
下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、これら実施例はさらなる制限を加えるものと解釈すべきではない。本願を通じて引用される全ての参考文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照によって明瞭に本明細書に組み込まれるものである。本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、普遍的に発現される遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）を標的とするよう設計されたものである。
【０１００】
リンカー基は、連結結合点（ＬＡＰ）でオリゴヌクレオチド鎖に連結されていることができ、いずれかの炭素含有部分を含むことができ、一部の実施形態では少なくとも１個の酸素原子、少なくとも１個のリン原子および／または少なくとも１個の窒素原子を含む。一部の実施形態において、リン原子が、オリゴヌクレオチド鎖への連結箇所として機能し得る末端リン酸またはリンカー基上のホスホロチオエート基の一部を形成している。ある種の実施形態において、窒素原子が、対象リンカー、エンドソーム分解性単位、細胞透過性ペプチド、可溶化基、脂質、ターゲティング基または別の対象リンカーへの連結箇所として機能し得るリンカー基上の末端エーテル、エステル、アミノまたはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成している。これらの末端リンカー基には、Ｃ６ヘキシル、Ｃ５２級−ヒドロキシ、Ｃ３チオールまたはＣ６チオール部分などがあるが、これらに限定されるものではない。下記に記載のＲＮＡ配列からの例は、Ｃ６ヘキシル：［（ＣＨ２）６ＮＨ２］である。
【０１０１】
本明細書の実施例に記載のｓｉＲＮＡ配列は以下の通りである。
【０１０２】
Ｒ１
Ｒ１ｐパッセンジャー
［ｏｍｅＧ］［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ａ［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＣ］Ａ［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＣ］ＡＡＡ［（ＣＨ２）６ＮＨ２］
Ｒ１ｇガイド
［ｐ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＧＡ［ｆｌｕＵ］ＧＡ［ｆｌｕＣ］ＡＧＡ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＧＧ［ｆｌｕＣｓ］［ｒＵｓ］Ｕ
Ｒ１ｃｇコレステロールガイド
［ｐ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＧＡ［ｆｌｕＵ］ＧＡ［ｆｌｕＣ］ＡＧＡ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＧＧ［ｆｌｕＣｓ］［ｒＵｓ］Ｕ［５Ｃｈｏｌ］
Ｒ２
Ｒ２ｐパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｉＢ］［ｄＡ］［ｆｌｕＣ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｆｌｕＣ］［ｄＡ］［ｄＧ］［ｄＡ］［ｆｌｕＣ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｆｌｕＵ］［ｄＧ］［ｆｌｕＵ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＴｓ］ｄＴ［ｉＢ］
Ｒ２ｇガイド
［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］Ａ［ｆｌｕＣ］［ｏｍｅＡ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＧ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＣ］［ｆｌｕ］［ｏｍｅＧ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＧ］［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＵｓ］［ｏｍｅＵ］
Ｒ３
Ｒ３ｐパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｉＢ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＣ］［ｄＡ］［ｆｌｕＵ］［ｄＧ］［ｄＧ］［ｆｌｕＵ］［ｄＧ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｆｌｕ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＡ］［ｄＴｓ］ｄＴ［ｉＢ］
Ｒ３ｇガイド
ＵＵＵ［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＡ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＣ］［ｏｍｅＡ］［ｆｌｕＣ］［ｆｌｕＣ］［ｏｍｅＡ］［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＧ］［ｏｍｅＡ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＵｓ］［ｏｍｅＵ］
Ｒ４
Ｒ４ｐパッセンジャー
［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］ＧＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅＵ］ＡＡ［（ＣＨ２）６ＮＨ２］
Ｒ４ｇガイド
［ｐ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］Ａ［ｆｌｕＣ］Ａ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＡＡＡＧ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＣ］［ｆｌｕＵ］Ｇ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］Ｇ［ｆｌｕＵｓ］［ｒＵｓ］Ｕ
Ｒ４ｃｇコレステロールガイド
［ｐ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］Ａ［ｆｌｕＣ］Ａ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］ＡＡＡＧ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＣ］［ｆｌｕＵ］Ｇ［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＵ］Ｇ［ｆｌｕＵｓ］［ｒＵｓ］Ｕ［５Ｃｈｏｌ］
Ｒ５
Ｒ５ｃｐコレステロールパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］ＧＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅ］ＡＡ［５Ｃｈｏｌ］
Ｒ６
Ｒ６ｐパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］ＧＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅ］ＡＡ［Ｃ３ＳＨ］
Ｒ７
Ｒ７ｐパッセンジャー
［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］ＧＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅＵ］ＡＡ［Ｃ３ＳＨ］
Ｒ８
Ｒ８ｐパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］ＡＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］ＧＡ［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］ＡＡ［ｏｍｅＵ］Ｇ［ｏｍｅＵ］ＡＡ［（ＣＨ２）６ＮＨ２］
Ｒ９
Ｒ９ｃｐパッセンジャー
［（ＣＨ２）６ＮＨ２］［ｉＢ］［ｆｌｕＡ］［ｏｍｅＣ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＡ］［ｏｍｅＣ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＧ］［ｆｌｕＡ］［ｏｍｅＣ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＡ］［ｏｍｅＵ］［ｆｌｕＧ］［ｏｍｅＵ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＡ］［ｄＴｓ］ｄＴ［ｉＢ］［５Ｃｈｏｌ］
Ｒ９ｇガイド
［ｐ］ｄＴ［ｆｌｕＵ］［ｏｍｅＡ］［ｏｍｅＣ］［ｆｌｕＡ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＡ］［ｆｌｕＧ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＣ］［ｆｌｕＵ］［ｆｌｕＧ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵ］［ｆｌｕＧ］［ｏｍｅＵ］［ｏｍｅＵｓ］［ｏｍｅＵ］。
【０１０３】
本明細書における実施例に記載のペプチドは次の通りである。
【０１０４】
Ｐ１：ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧＮＨ２（配列番号３５）；
Ｐ２：Ｄ（ＮＨＣ１２Ｈ２５）ＮｌｅＫＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＣＮＨ２（配列番号４３）；
Ｐ３：ＣＤ（ＮＨＣ１２Ｈ２５）ＮｌｅＫＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＮＨ２（配列番号４３）；
Ｐ４：［ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯ］ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＮＨ２（配列番号２８）；
Ｐ５：ｍ（Ｐｅｇ）４４ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＣＮＨ２（配列番号２９）；
Ｐ６：ＣＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＮＨ２（配列番号３６）；
Ｐ７：ＣＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＮＨ２（配列番号２９）；
Ｐ８：ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（Ｐｅｇ）２７ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＮＨ２（配列番号２９）；および
Ｐ９：ＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＮＨ２（配列番号５４）。
【０１０５】
実施例１
【０１０６】
【化５】
2013523149.tif 000007
段階１
Ｒ１ｐ  １５．２ｍｇ（２．４０μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（１．５ｍＬ）中溶液を冷却して０℃とし、１−１  ７．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）中溶液を滴下した。得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応を水１８ｍＬで希釈し、ｐＨを酢酸で調節して６．０とした。得られた溶液を、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液（ｄｉａｌｙｔｅ）を凍結乾燥して、所望の生成物１−２  １３．５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝６６３５。
【０１０７】
段階２
１−２  ３ｍｇ（０．４５２μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（５７０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（３０μＬ）中溶液をＰ１  ２．２３ｍｇ（０．９０４μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（６００μＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で１．５時間撹拌した。６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび７０：３０から０：８０％Ａ：Ｂの直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８；Ｂ＝２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって、粗反応液を精製した。生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１−３  ０．７ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。ｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液中での再構成凍結乾燥品のＵＶアッセイ（２６０ｎｍ）によって、生成物収率の評価を行った。
【０１０８】
段階３
再構成１−３  ０．７ｍｇ（０．０７７μｍｏｌ）の溶液をＲ１ｇ  ０．６３ｍｇ（０．０９２μｍｏｌ）のｐＨ７．４ＰＢＳ緩衝液（６５μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を加熱して９５℃として１分間経過させ、冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物１−４  １．５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。ＭＳによって二本鎖を確認した。測定質量＝パッセンジャー鎖：９０９８、ガイド鎖：６７８６。
【０１０９】
１−４の合成について上述した方法と同様にして、下記化合物を製造した。
【０１１０】
【化６】
2013523149.tif 000008
2013523149.tif 000009
実施例２
【０１１１】
【化７】
2013523149.tif 000010
段階１
Ｒ３ｐ  １５．００ｍｇ（２．１４μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（１ｍＬ）中溶液を２−１  ６．３８ｍｇ（１５．００μｍｏｌ）の（１ｍＬ）アセトニトリル中溶液で処理した。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、粗反応液をアニオン交換分取ＬＣ（６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱアニオン交換カラム；Ａ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ／５０％ホルムアミド；Ｂ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−４００ｍｍｏｌ  ＮａＯＣｌ４／５０％ホルムアミドで３０分間かけて３０％から１００％Ａ：Ｂ勾配、１０ｍＬ／分流量）によって精製した。純粋な分画を合わせ、水で希釈し、ＭＷ３００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。合わせた水系取得物を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物２−２  ７．３１ｍｇを非晶質白色粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：測定質量＝７３８７；純度＝＞９９％。
【０１１２】
段階２
２−２  ５．００ｍｇ（０．６７３μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）をＴＥＡＡ溶液５０μＬで処理し、溶液をＰ１  ３．３２ｍｇ（１．３４７μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１０００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を１８時間撹拌し、粗反応液をアニオン交換分取ＬＣ（６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱアニオン交換カラム；Ａ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ／５０％ホルムアミド；Ｂ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−４００ｍｍｏｌ  ＮａＯＣｌ４／５０％ホルムアミドで３０分間かけて３０％から１００％Ａ：Ｂ勾配、１０ｍＬ／分流量）によって精製した。精製した分画を合わせ、水で希釈し、水に対して３回遠心透析した。合わせた水系取得物を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物２−３  ５．１８ｍｇを白色非晶質粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：測定質量＝９７３７；純度＝＞９９％、ＨＰＬＣおよびＭＳによる測定で過剰のペプチドは存在しなかった。
【０１１３】
段階３
２−３  ５．００ｍｇ（０．５１１μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（２００μＬ）中溶液をＲ３ｇ  ３．３９ｍｇ（０．５１１μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（１００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を９５℃で１分間加熱し、冷却して室温とした。溶液を水で希釈し、水に対して３回透析した。水系取得物を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物２−４  ３．２２ｍｇを白色非晶質粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：測定質量パッセンジャー＝９７３７、ガイド＝６６３１。
【０１１４】
２−４の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１１５】
【化８】
2013523149.tif 000011
実施例３
【０１１６】
【化９】
2013523149.tif 000012
2013523149.tif 000013
段階１
３−２  ６３ｍｇ（０．２８３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）中溶液をジイソプロピルエチルアミン４３．９ｍｇ（０．３３９ｍｍｏｌ）で処理した。得られた溶液を３−１  ３００ｍｇ（０．５６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）中溶液にゆっくり滴下した。得られた溶液を室温で１８時間撹拌し、減圧下に濃縮した。得られた油状物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラムを用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで分離して、所望の生成物３−３  ６０ｍｇ（３５％）を透明油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．５４（ｔ、２Ｈ）、２．８３（ｍ、４Ｈ）、２．９０（ｔ、２Ｈ）、２．９６（ｔ、２Ｈ）、３．５８（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｍ、１０Ｈ）、３．７２（ｂｒｍ、６Ｈ）、（ｔ、２Ｈ）、３．８４（ｔ、２Ｈ）、７．２１（ｍ、１Ｈ）５７．７２（ｍ、２Ｈ）、８．５４（ｄ、１Ｈ）。
【０１１７】
段階２
３−３  ５４．９ｍｇ（０．０９１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）中溶液を、Ｒ５ｃｐ  ９０ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のｐＨ８．３水（１０ｍＬ）中溶液に加えた。得られた溶液を室温で１８時間撹拌した。反応液を減圧下に濃縮してアセトニトリルを除去し、水５０ｍＬで希釈した。得られた溶液をＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して所望の生成物３−４  ９０ｍｇ（９４％）を綿毛状白色非晶質粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ測定質量＝７４１７；純度＝９０％。
【０１１８】
段階３
３−４  ４．００ｍｇ（０．５３９μｍｏｌ）の３：１：１ホルムアミド：水：ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液をＰ１  ４．００ｍｇ（１．６３５μｍｏｌ）の３：１：１ホルムアミド：水：ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で５時間撹拌した。粗反応液を、ＤＮＡ  Ｐａｃ１００カラムおよび７０：３０−Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝５０％ホルムアミド／５０％  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／ｐＨ７．４；Ｂ＝５０％ホルムアミド／５０％２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／４００ｍＭ  ＮａＯＣｌ４／ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体３−５  ２ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：測定質量＝９７６９、純度＝９５％、残留ペプチドは存在しなかった。
【０１１９】
段階４
３−５  ２．００ｍｇ（０．２０５μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）中溶液をＲ４ｇ  １．３８ｍｇ（０．２０５μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液（０．２５ｍＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を加熱して９５℃として１分間経過させ、冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖３−６  １．２ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖をＭＳによって確認した。測定質量＝パッセンジャー鎖９７７０、ガイド鎖６７３３。
【０１２０】
３−５の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１２１】
【化１０】
2013523149.tif 000014
３−６の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１２２】
【化１１】
2013523149.tif 000015
実施例４
【０１２３】
【化１２】
2013523149.tif 000016
2013523149.tif 000017
2013523149.tif 000018
段階１
窒素パージした丸底フラスコに入った４−１  ３．１３ｍＬ（２９．１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  １５．２４ｍＬ（８７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中溶液を冷却して０℃とし、４−２  １４．３ｇ（５８．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）中溶液を滴下した。得られた溶液を０℃で１時間撹拌し、昇温させて室温とした。粗反応液をＤＣＭ  ３００ｍＬで希釈し、１Ｎ  ＮａＯＨ  １５０ｍＬで洗浄した。有機層を分離し、減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（９：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製して、４−３  ６．８４ｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１−４５（ｓ、１８Ｈ）、２．７３（ｂｔ、４Ｈ）、３．２１（ｍ、４Ｈ）、４．８９（ｂｓ、２Ｈ）。
【０１２４】
段階２
４−３  ５．４４ｇ（１７．９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５５ｍＬ）中溶液に、４−４  ２．７７ｇ（１７．９３ｍｍｏｌ）を１回で加えた。得られた溶液を０．５時間撹拌し、その後に粗反応混合物を減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝ヘキサン、Ｂ＝酢酸エチル］）によって精製して、４−５  ７．２ｇを白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４４（ｓｄ、１８Ｈ）、３．２５−３．４０（ｍ、６Ｈ）、３．５２（ｂｔ、２Ｈ）、４．１９（ｓ、２Ｈ）、４．４２（ｓ、２Ｈ）、４．８８（ｂｔ、１Ｈ）、５．３３（ｂｓ、１Ｈ）。測定質量＝４２０．５（Ｍ＋１）。
【０１２５】
段階３
４−５  １．０ｇ（２．３８ｍｍｏｌ）を４Ｍ無水ＨＣｌ／ジオキサン３２．５ｍＬで処理したところ、ガス発生および１５分後に白色沈殿が生じた。得られたスラリーを濾過し、非晶質固体を水に溶かし、次に凍結乾燥して、４−６  ３８０ｍｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．９−３．１（ｍ、４Ｈ）、３．５３（ｂｑ、４Ｈ）、４．１５（ｓ、２Ｈ）、４．３３（ｓ、２Ｈ）、８．１４（ｄｓ、６Ｈ）。測定質量＝２２０．３（Ｍ＋１）。
【０１２６】
段階４
４−６  ３０ｍｇ（０．０８７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  ７６μＬ（０．４３６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３００μＬ）中スラリーを２−１  ７６．７５ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３００μＬ）中溶液で処理した。得られたスラリーを、間欠的に超音波処理しながら５０℃で４０分間加熱して均質とした。粗反応液をＤＭＳＯ  １．５ｍＬで希釈し、０．１％ＴＦＡ水溶液１．６ｍＬで酸性とした。溶液をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝０．１％ＴＦＡ含有水、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製して、４−７  ４３．４０ｍｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．２０（ｍ、２Ｈ）、１．３−１．５（ｍ、８Ｈ）、２．０３（ｂｑ、４Ｈ）、３．０１（ｍ、８Ｈ）、３．１−３．３（ｍ、８Ｈ）、４．０９（ｓ、２Ｈ）、４．２４（ｓ、２Ｈ）、７．２５（ｍ、２Ｈ）、７．７−７．９５（ｍ、８Ｈ）、８．４５（ｍ、２Ｈ）。測定質量＝４２１．０（Ｍ＋２）。
【０１２７】
段階５
Ｒ１ｐ  ５０ｍｇ（７．９１μｍｏｌ）を、ＭＷ３０００透析膜を用いて２５０ｍＭ  ＴＥＡＡに対して３回、次に水に対して２回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、トリエチルアンモニウム付加物４−８を綿毛状白色非晶質粉末として得た。
【０１２８】
段階６
４−７  ３９．９ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ  １８．０４ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（６５０μＬ）中溶液をＤＩＰＥＡ  １２．２μＬ（０．０７１ｍｍｏｌ）で処理した。２０分後、得られた溶液を４−８  ５０ｍｇ（７．９１μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  １２．２μＬ（０．０７１ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２．６５ｍＬ）中溶液に加えた。得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）フェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体４−９  ３４ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝７１４７。
【０１２９】
段階７
４−９  ５ｍｇ（０．７００μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（５０μＬ）中溶液をＰ１  ３．４５ｍｇ（１．４０μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。追加のＰ１  １．７２ｍｇ（０．７μｍｏｌ）を反応液に加えた。粗反応液を、６ｍＬ  ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体４−１０を非晶質固体として得て、それを直接次の段階で用いた。
【０１３０】
段階８
４−１０のｐＨ７．４  ＰＢＳ（２．０ｍＬ）中スラリーを、Ｒ１ｇ  ２．３７ｍｇ（０．３５０μｍｏｌ）の溶液に１回で加えた。得られたスラリーを加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。若干不均一性が認められたことから、Ｒ１ｇ  ２．３７ｍｇ（０．３５μｍｏｌ）を加え、間欠的に超音波処理しながら加熱プロセスを繰り返した。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物を綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖をＭＳによって確認した。測定質量＝１８６３６。
【０１３１】
４−１１の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１３２】
【化１３】
2013523149.tif 000019
実施例５
【０１３３】
【化１４】
2013523149.tif 000020
2013523149.tif 000021
2013523149.tif 000022
段階１
４−６  ６０ｍｇ（０．１７４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  １５２．４μＬ（０．８７２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（６００μＬ）中スラリーを１−１  １５６ｍｇ（０．３６６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（６００μＬ）中溶液で処理した。得られたスラリーを、撹拌下に５０℃で１．５時間加熱した。粗反応液をＤＭＳＯ  １．５ｍＬで希釈し、０．１％ＴＦＡ水溶液１．６ｍＬで酸性とした。溶液を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝０．１％ＴＦＡ含有水、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製して、５−１  １１０．１５ｍｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．２５−２．３５（ｍ、８Ｈ）、３．１−３．４（ｍ、１６Ｈ）；３．４６（ｓ、８Ｈ）、３．５５−３．６５（ｍ、８Ｈ）、４．０９（ｓ、２Ｈ）、４．２４（ｓ、２Ｈ）、７．００３（ｓ、４Ｈ）、７．９１（ｂｔ、１Ｈ）、８．０１（ｓ、２Ｈ）。測定質量＝４２１．０（Ｍ＋２）。
【０１３４】
段階２
５−１  ５５．８ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ  １８．９４ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５８５μＬ）中溶液をＤＩＰＥＡ  １１．１９μＬ（０．０６４ｍｍｏｌ）で処理した。１０分後、得られた溶液を４−８  ４５ｍｇ（７．１２μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  １１．１９μＬ（０．０６４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２．６５ｍＬ）中溶液に加えた。得られた溶液を室温で１５分間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズフェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体５−２  ２３．５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝７１４６。
【０１３５】
段階３
５−２  ５ｍｇ（０．７００μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（５０μＬ）中溶液をＰ１  ３．４５ｍｇ（１．４０μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。追加のＰ１  １．７２ｍｇ（０．７μｍｏｌ）を反応液に加えた。粗反応液を、６ｍＬ  ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ６．８）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して所望の接合体５−３を非晶質固体として得たが、その形は収率評価から除外した。測定質量＝１２０９０。
【０１３６】
段階４
５−３のｐＨ７．４ＰＢＳ（３００μＬ）中スラリーを、Ｒ１ｇ  ２．０２ｍｇ（０．２９８μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（２００μＬ）中溶液に１回で加えた。得られたスラリーを加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。Ｒ１ｇ  １．１５ｍｇ（０．１６９μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（１１５μＬ）中溶液を加え、加熱プロセスを繰り返した。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物５−４を綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖がＭＤによって確認された。測定質量＝１８８５９。
【０１３７】
５−４の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１３８】
【化１５】
2013523149.tif 000023
実施例６
【０１３９】
【化１６】
2013523149.tif 000024
2013523149.tif 000025
段階１
６−２（５８．６ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアミン（５２．８μＬ、０．３０３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）中溶液に０℃でＥＤＣＩ（３９．２ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を１０分間撹拌した。１０分後、固体６−１（１００ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）を反応容器に１回で加え、次にジイソプロピルアミン（２６．５μＬ、０．１５２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３０分間かけてゆっくり昇温させて室温とした。ＬＣ−ＭＳ分析で原料が完全に消費されたことが示され、反応混合物をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ  １／１で希釈して２．５ｍＬとし、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（１５分間かけて１０％から５５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。回収した分画を合わせ、凍結乾燥して、６−３を白色粉末として得た（収率４０％から７０％）。ＭＳ：８３７。
【０１４０】
上記の方法に従って、下記の化合物を製造した。
【０１４１】
【化１７】
2013523149.tif 000026
段階２
６−３（１．５０ｍｇ、１．７９μｍｏｌ）のホルムアミド／Ｈ２Ｏ／２Ｍ  ＴＥＡＡ＝３／１／０．１（４００μＬ）中溶液をペプチドＰ１（１１．０ｍｇ、４．４７μｍｏｌ）のホルムアミド／Ｈ２Ｏ／２Ｍ  ＴＥＡＡ＝３／１／０．１（２００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。６−３が完全に消費された時点で、ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（５．１２ｍｇ、１７．９μｍｏｌ）を加え、反応混合物を加熱して３７℃とした。３０分後、ＬＣ−ＭＳ分析でジスルフィド結合の完全な還元が示され、反応混合物をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ  １／１で希釈して２．５ｍＬとした。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（１５分かけて１０％から６０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）および凍結乾燥による精製によって、６−４を白色固体として得た。ＭＳ：５６７２。
【０１４２】
段階３
１−２（３．００ｍｇ、０．４５２μｍｏｌ）のホルムアミド／ｐＨ＝６．８Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液＝３／１（４００μＬ）中溶液を６−６（３．０８ｍｇ、０．５４３μｍｏｌ）のホルムアミド／ｐＨ＝６．８Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液＝３／１（４００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。１−２が完全に消費された時点で、反応混合物をアニオン交換ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（５０％から１００％Ｂ／Ａ、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ  １／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）によって精製した。合わせた生成物分画を水で希釈し、ＭＷ３０００カットオフ膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、６−５を白色固体として得た。質量＝１２３１３。
【０１４３】
段階４
６−５（０．９０ｍｇ、０．０７３μｍｏｌ）のＰＢＳ１倍緩衝液（４００μＬ）中溶液に、Ｒ１ｇ（０．５１ｍｇ、０．０７５μｍｏｌ）のＰＢＳ１倍緩衝液（４００μＬ）中溶液を加えた。得られた溶液を９０℃で１分間加熱し、冷却して室温とした。アニーリング反応混合物を水で希釈し、ＭＷ３０００カットオフ膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、６−６を白色固体として得た。パッセンジャー鎖質量＝１２３１３、ガイド鎖＝６８６５。
【０１４４】
上記の方法に従って、下記の化合物を製造した。
【０１４５】
【化１８】
2013523149.tif 000027
パッセンジャー鎖質量＝１２３１３、ガイド鎖＝７３８０。
【０１４６】
実施例７
【０１４７】
【化１９】
2013523149.tif 000028
2013523149.tif 000029
2013523149.tif 000030
段階１
Ｒ６ｐ  １０ｍｇ（１．５４μｍｏｌ）の水（１．４６ｍＬ）中溶液を２Ｍ  ＴＥＡＡ  ３７．５μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ／水１５μＬ（０．０１５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ１５μＬ（０．１０８ｍｍｏｌ）で処理した。得られた溶液を０．５時間撹拌し、次にＤＩ水２．５ｍＬで溶離を行うＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩して、７−１を得た。生成物を直接次の段階に用いた。
【０１４８】
段階２
前段階からの７−１のＤＩ水（２．５ｍＬ）中溶液に、７−２  １．８ｍｇ（５．０２μｍｏｌ）を１回で加えた。得られた溶液を１０分間撹拌し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、７−３  ９．５５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得て、それをそれ以上精製せずに次に用いた。
【０１４９】
段階３
４−８  ２．３７ｍｇ（２．８２μｍｏｌ）およびＨＡＴＵ  １．０７ｍｇ（２．８２μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１３０μＬ）中溶液をＤＩＰＥＡ  ０．５０μＬ（２．８２μｍｏｌ）で処理した。１０分後、得られた溶液を７−３  ９．５５ｍｇ（１．４１μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ  ２．４６μＬ（０．０１４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５３０μＬ）中溶液に加えた。得られた溶液を室温で１０分間撹拌した。粗反応液を、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、１７−４  １０．２５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得て、それをそれ以上精製せずに次で用いた。
【０１５０】
段階４
７−４  ５ｍｇ（０．６５２μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（５０μＬ）中溶液を、Ｐ６  ２．３２ｍｇ（１．３２μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。追加の１−４  １．１６ｍｇ（０．６５２μｍｏｌ）を反応液に加えた。粗反応液を、６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４；５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体７−５  ２．７７ｍｇを得た。測定質量＝１０９７６。
【０１５１】
段階５
７−５  １ｍｇ（０．０９２μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（１００μＬ）中スラリーに、Ｒ４ｇ  ０．５ｍｇ（０．０７４μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（１００μＬ）中溶液を１回で加えた。得られたスラリーを加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物７−６  １．５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖をＭＳによって確認した。測定質量＝１７７１１。
【０１５２】
７−６の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１５３】
【化２０】
2013523149.tif 000031
2013523149.tif 000032
2013523149.tif 000033
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実施例８
【０１５４】
【化２１】
2013523149.tif 000035
2013523149.tif 000036
段階１
Ｒ４ｐ  ５０ｍｇ（７．８９μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（３．６ｍＬ）中溶液を８−１  ３０．９ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を１０分間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズフェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体８−２  ３２．３ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝６７７８。
【０１５５】
段階２
８−２  ５ｍｇ（０．７０９μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）中溶液を８−３（実施例６段階１および２に記載のものと同じ方法で合成）８．２０１ｍｇ（１．４７５μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応液を、６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して所望の接合体８−４を非晶質固体として得て、そえを直接次の段階で用いた。
【０１５６】
段階３
８−４のｐＨ７．４  ＰＢＳ中スラリーに、Ｒ４ｇ  １．２５ｍｇの溶液（０．１８６μｍｏｌ）を１回で加えた。得られたスラリーを加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物８−５  ３．６８ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖をＭＳによって確認した。測定質量＝パッセンジャー鎖１２２３０、ガイド鎖６７３３。
【０１５７】
８−５の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１５８】
【化２２】
2013523149.tif 000037
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実施例９
【０１５９】
【化２３】
2013523149.tif 000040
2013523149.tif 000041
2013523149.tif 000042
段階１
Ｒ６ｐ  ５０ｍｇ（７．６９μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（４ｍＬ）中溶液に、９−１  １０８ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を１回で加えた。得られた溶液を１０分間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズフェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体９−２  ４７．３９ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝８４００当たりの分布。
【０１６０】
段階２
９−２  ５１ｍｇ（６μｍｏｌ）の水（５．８５ｍＬ）中溶液を２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）、１Ｍ  ＤＴＴ／水（６０μＬ、０．０６０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ  ６０μＬ（０．４３０ｍｍｏｌ）で処理した。得られた溶液を０．５時間撹拌し、それぞれＤＩ水３．０ｍＬで溶離を行う３回のＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩して９−３を得た。生成物を直接次の段階に用いた。
【０１６１】
段階３
９−４  ８．８９ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（９ｍＬ）中溶液に、前段階からの９−３のＤＩ水（４．５ｍＬ）中溶液を滴下した。得られた溶液を１５分間撹拌し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、９−５  １９．０７ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得て、それをそれ以上精製せずに次に用いた。
【０１６２】
段階４
９−５  ５ｍｇ（０．５６２μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）中溶液を８−３  ６．２５ｍｇ（１．１２３μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応液を、６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体９−６  ３．６ｍｇを非晶質固体として得た。
【０１６３】
段階５
９−６  １．５８ｍｇ（０．１０９μｍｏｌ）のｐＨ７．４ＰＢＳ中溶液に、Ｒ４ｇ溶液０．８８２ｍｇ（０．１３１μｍｏｌ）を１回で加えた。得られた溶液を加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物９−７  ２．３５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖をＭＳによって確認した。測定質量＝パッセンジャー鎖１４．５ｋＤ付近の分布、ガイド鎖６７３２。
【０１６４】
９−７の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１６５】
【化２４】
2013523149.tif 000043
2013523149.tif 000044
2013523149.tif 000045
2013523149.tif 000046
実施例１０
【０１６６】
【化２５】
2013523149.tif 000047
2013523149.tif 000048
2013523149.tif 000049
段階１
Ｒ７ｐ（１０．０ｍｇ、１．５４μｍｏｌ）のＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８．０）（０．５ｍＬ）中溶液に、ＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）中の多分散ＰＥＧ１０００−Ｍａｌ  １０−２（３．０８ｍｇ、３．０８μｍｏｌ）を室温で加え、得られた反応混合物を１５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析で原料Ｒ７ｐが完全に消費されたことが示された時点で、ＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）中のＳＭＰＥＧ２４  １０−１（１０．８ｍｇ、７．７１μｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに２時間撹拌した。水を加えることで反応停止し、Ｍ３０００カットオフ膜で水に対して５回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して粗１０−３を白色固体として得て、それをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。ＭＳ約９０００（多分散ＰＥＧユニット含有）。
【０１６７】
段階２
６−５′（１．７０ｍｇ、２．３５μｍｏｌ）のホルムアミド／Ｈ２Ｏ／２Ｍ  ＴＥＡＡ＝３／１／０．１（５００μＬ）中溶液を、ペプチドＰ７（１９．６ｍｇ、５．１７μｍｏｌ）のホルムアミド／Ｈ２Ｏ／２Ｍ  ＴＥＡＡ＝３／１／０．１（５００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。６−５′が完全に消費された時点で、ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（６．８０ｍｇ、２３．５μｍｏｌ）を加え、反応混合物を加熱して３７℃とした。２時間後、ＬＣ−ＭＳ分析でジスルフィド結合の完全な還元が示され、反応混合物をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ  １／１で希釈して２．５ｍＬとした。Ｃ３逆相ＨＰＬＣ（１５分間かけて４０％から９０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）および凍結乾燥による精製によって、１０−４を白色固体として得た。ＭＳ：８１８９。
【０１６８】
１０−４の製造について上述した方法と同じ方法で、下記の化合物を製造した。
【０１６９】
【化２６】
2013523149.tif 000050
段階３
１０−３（６．００ｍｇ、０．６８２μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４００μＬ）中溶液をペプチド１０−４（５．６７ｍｇ、０．６８２μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を室温で終夜撹拌した。生成物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標名）７５  １０／３００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（２００ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）によって精製した。合わせた生成物分画を水で希釈し、ＭＷ１００００カットオフ膜を用いて水に対して５回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、１０−５を白色固体として得た。質量約１７２００（多分散ＰＥＧ単位含有）。
【０１７０】
段階４
１０−５（１．９０ｍｇ、０．１１１μｍｏｌ）のＰＢＳ１倍緩衝液（４００μＬ）中溶液に、Ｒ４ｇ（０．８４５ｍｇ、０．１２２μｍｏｌ）の（４００μＬ）ＰＢＳ１倍緩衝液中溶液を加えた。得られた溶液を９０℃で１分間加熱し、冷却して室温とした。アニーリング反応混合物を水で希釈し、ＭＷ３０００カットオフ膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、１０−６を白色固体として得た。パッセンジャー鎖質量約１７２００（多分散ＰＥＧユニット含有）、ガイド鎖＝６７３２。
【０１７１】
下記の化合物を上記の方法に従って製造した。
【０１７２】
【化２７】
2013523149.tif 000051
実施例１１
【０１７３】
【化２８】
2013523149.tif 000052
2013523149.tif 000053
段階１
Ｒ６ｐ  ２５ｍｇ（３．９５μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（２．５ｍＬ）中溶液を１１−１  ２３．９２ｍｇ（０，０２８ｍｍｏｌ）アセトニトリルの（５００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を１０分間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズフェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１１−２  １２．５７ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝７０８５。
【０１７４】
段階２
１１−２  ５ｍｇ（０．７０６μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）中溶液を８−４  ７．８５ｍｇ（１．４１１μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応液を、６ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１１−３  ５．４ｍｇを非晶質固体として得た。
【０１７５】
段階３
１１−３  ５．１ｍｇ（０．４０３μｍｏｌ）のｐＨ７．４ＰＢＳ（５００μＬ）中スラリーに、Ｒ４ｇ溶液３．２６ｍｇ（０．４８４μｍｏｌ）を１回で加えた。得られた懸濁液を加熱して９５℃とし、放冷して室温とした。得られた溶液を冷却し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物１１−４  ７．５５ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖がＭＳによって確認された。測定質量＝１９３７８。
【０１７６】
１１−４の合成について上述した方法と同様にして下記の化合物を製造した。
【０１７７】
【化２９】
2013523149.tif 000054
実施例１２
【０１７８】
【化３０】
2013523149.tif 000055
段階１
Ｒ４ｐ  ５０．００ｍｇ（７．８９μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（３６００μＬ）中溶液を、８−１  ３０．９０ｍｇ（５５．００μｍｏｌ）のアセトニトリル（４００μＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。粗反応液を、逆相分取ＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ；５％から９５％Ｂ勾配；Ａ＝２００ｍＭ  ＴＥＡＡ、Ｂ＝ＡＣＮ；２０分。勾配；ウォーターズフェニルＸＢｒｉｄｇｅカラム）によって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物１２−１  ３２ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として単離した。１０７４７。
【０１７９】
段階２
１２−１  ２．３５ｍｇ（０．３４７μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（５００μＬ）中溶液を、Ｐ９  ２．８３ｍｇ（０．６９３μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（４５０μＬ）中溶液で処理し、ＴＥＡＡ  ５０μＬを加えた。反応液を室温で１８時間撹拌し、粗反応液を、アニオン交換分取クロマトグラフィー（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム；１０％から１００％Ｂ勾配；Ａ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ／５０％ホルムアミド；Ｂ＝５０％  ０．０２ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−４００ｍｍｏｌＮａＯＣｌ４／５０％ホルムアミド  ３０分間かけて３０％から１００％Ａ：Ｂ勾配、１０ｍＬ／分流量）によって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、水に対して３回透析した。水系透析液を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物１２−２  １．３７ｍｇをガラス状固体として得た。ＬＣ／ＭＳ測定質量＝１０７４７；純度＝９６％。残留ペプチドは存在しない。
【０１８０】
段階３
１２−２  １．３７ｍｇ（０．１３１μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（５００μＬ）中溶液をＲ４ｇ  ０．７９２ｍｇ（０．１１８μｍｏｌ）のｐＨ７．４  ＰＢＳ（５００μＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を９５℃で１分間加熱した。得られた溶液を冷却して室温とし、水で希釈し、水に対して３回透析した（ＭＷ３０００遠心透析膜）。水系透析液を冷凍し、終夜凍結乾燥して、所望の生成物１２−３  １．４５ｍｇを白色非晶質粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ測定質量パッセンジャー＝１０７４７、ガイド＝６７３３、二本鎖＝１７４８１。
【０１８１】
実施例１３
【０１８２】
【化３１】
2013523149.tif 000056
2013523149.tif 000057
段階１
Ｒ４ｐ（２０．０ｍｇ、３．１６μｍｏｌ）のＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８．０）（１．０ｍＬ）中溶液に、ＭｅＣＮ（１．０ｍＬ）中の１３−１（１３．６５ｍｇ、９．４７μｍｏｌ）を室温で加え、得られた反応混合物を４５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析で原料のＲ４ｐが完全に消費されたことが示された時点で、反応混合物をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１／１で希釈して２．５ｍＬとした。Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ（商標名）逆相ＨＰＬＣ（１５分かけて１０％から６０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）および凍結乾燥による精製によって、１３−２を白色固体として得た。ＭＳ：７６５９。
【０１８３】
段階２
１３−２（２．００ｍｇ、０．２６１μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４００μＬ）中溶液をペプチド１０−４（２．５７ｍｇ、０．３１３μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４００μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を室温で終夜撹拌した。生成物を、ＤＮＡｐａｃｋ２００カラムでのアニオン交換クロマトグラフィー（５０％から１００％Ｂ／Ａ、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）によって精製した。合わせた生成物分画を水で希釈し、ＭＷ１００００カットオフ膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、１３−３を白色固体として得た。質量＝１５７４５。
【０１８４】
段階３
１３−３（０．７０ｍｇ、０．０４４μｍｏｌ）のＰＢＳ１倍緩衝液（４００μＬ）中溶液に、Ｒ４ｇ（０．３３ｍｇ、０．０４９μｍｏｌ）の（４００μＬ）ＰＢＳ１倍緩衝液中溶液を加えた。得られた溶液を９０℃で１分間加熱し、冷却して室温とした。アニーリング反応混合物を水で希釈し、ＭＷ１００００カットオフ膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、１３−４を白色固体として得た。パッセンジャー鎖質量＝１５７４５、ガイド鎖＝６７３２。
【０１８５】
１３−４の製造について上述の方法と同様にして、下記の化合物を製造した。
【０１８６】
【化３２】
2013523149.tif 000058
実施例１４
【０１８７】
【化３３】
2013523149.tif 000059
2013523149.tif 000060
2013523149.tif 000061
段階１
Ｒ８ｐ  ２０ｍｇ（３．０７μｍｏｌ）のｐＨ８．３水（１．４４ｍＬ）中溶液を１４−１  １９．６０ｍｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１６０μＬ）中溶液で処理した。得られた溶液を１５分間撹拌した。粗反応液を、ウォーターズフェニルＸｂｒｉｄｇｅカラム（９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配［Ａ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有水、Ｂ＝２５０ｍＭ  ＴＥＡＡ含有アセトニトリル］）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での逆相分取ＬＣで精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１４−２  ２１．６０ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。測定質量＝８１０６。
【０１８８】
段階２
１４−２  ５ｍｇ（０．６１７μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）および２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）中溶液を、８−３  １３．７２ｍｇ（２．４６７μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１．０ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。粗反応液を、６ｍＬ  ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび１００：０から０：１００％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１４−３  ４．５ｍｇを非晶質固体として得た。
【０１８９】
段階３
１１−３  １．５ｍｇ（０．０７９μｍｏｌ）の水（７００μＬ）中スラリーに、７−７の溶液０．５８４ｍｇ（０．０８７μｍｏｌ）を１回で加えた。得られた懸濁液を加熱して９５℃とし、放冷して室温とし、ＭＷ３０００透析膜に傾斜法で入れた。残った固体を１：１ホルムアミド：水を用いて溶解させ、透析膜で傾斜法で得られた取得物と合わせた。得られた溶液をＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して３回遠心透析した、透析液を凍結乾燥して、所望の二本鎖生成物１４−４  １．２６ｍｇを綿毛状白色非晶質粉末として得た。二本鎖がＭＳによって確認された。測定質量＝２５７４０。
【０１９０】
実施例１５
【０１９１】
【化３４】
2013523149.tif 000062
２Ｍ  ＴＥＡＡ（１５０μＬ）を含む３−５ａ  ５．００ｍｇ（０．５７３μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（９５０μＬ）中溶液を、１０−４ａ  １０．０７ｍｇ（１．１４５μｍｏｌ）の３：１ホルムアミド：水（１ｍＬ）中溶液で処理し、得られた溶液を室温で１５分間撹拌した。粗反応液をＲ９ｇ  ７．７７ｍｇ（１．１４５μｍｏｌ）で処理し、二本鎖を、６ｍＬ  ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムおよび９５：５から５：９５％Ａ：Ｂ直線勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．４）を用いるＧｉｌｓｏｎ装置での分取アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。予想される生成物ピークを水で希釈し、ＭＷ３０００透析膜を用いて水に対して４回遠心透析した。透析液を凍結乾燥して、所望の接合体１５−１  ３．９３ｍｇを綿毛状白色非晶質固体として得た。測定質量＝２４２５３（二本鎖）。
【０１９２】
ＲＢＣ溶解アッセイプロトコール
２から３本の採血管分の血液を、１０ｍＬ  ＥＤＴＡバキュテイナー管に採取する。１から２００μＬのサンプルを微量遠心管に抜き取り、微量遠心装置で最大速度で２分間遠心することによって、サンプルについて溶血を調べる。上清について、溶血の証拠を観察し、溶血したサンプルは廃棄する。残りのサンプルを蓄積する。蓄積サンプル５ｍＬを５０ｍＬ遠心管に抜き取り、適切な緩衝液：ｐＨ５．４または７．５のいずれかの１００ｍＭ第二リン酸約３５ｍＬで処理する。リン酸緩衝液中では溶解度の問題を有する可能性があるサンプルの場合、次のように代える。すなわちｐＨ７．５緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含み；ｐＨ５．４緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳを含む。サンプルを反転混合し、３０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を吸引によって取り、そのプロセスを２回繰り返す。ＲＢＣを総量５０ｍＬの所望のｐＨ緩衝液に再懸濁させ、氷上で保存する。被験化合物の連続希釈液を、Ｖ字底またはＥａｓｙ−Ｗａｓｈ９６ウェルプレートにおいて、適宜に緩衝液または水中で調製する。標準的なアッセイでは、１０点２倍希釈シリーズを用いる。化合物希釈液は代表的には、２５μＬ最終容量で１０倍濃度で調製する。調べる最高濃度は、材料およびそれの個々の溶解度によって決まる。代表的な濃度は１００μＭである。緩衝液単独および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳを、それぞれ陰性対照および陽性対照として含める。希釈液は、試験を行うサンプル数および試験に使用可能な材料の量に応じて、二連または単一のウェルのいずれかとして調製することができる。適切なｐＨ緩衝液１７５μＬを各ウェルに加える。広口径ピペット先端を手動で用いて、洗浄したＲＢＣ懸濁液５０μＬを加える。サンプルを約６から８回磨砕して混合し、３７℃の温かい部屋もしくはインキュベータで３０分間インキュベートする。このプロセス中、低蒸発蓋でプレートを覆う。プレートを温かい部屋またはインキュベータから取り出し、約３０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清１５０μＬを透明底９６ウェル白色プレートに移し、５４１ｎＭで吸光度を読み取る。計算には、バックグラウンド吸光度を全てのサンプルから引き、各ｐＨ群を別個に処理する。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００サンプル（１００％溶血）の％として、溶血％を各サンプルについて計算する。データをプロットし、サンプル曲線を図１から３で下記に示す。正方形のグラフ線はｐＨ５．４での溶血％を表し、菱形グラフ線はｐＨ７．５での溶血％を表す。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡ  ｂＤＮＡアッセイ一般プロトコール
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ類を、遍在的に発現した遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）を標的とするよう設計した。使用したｓｉＲＮＡの配列は、ヒト、マウスおよびラットの転写物で相同である。ｓｉＲＮＡ接合体のサイレンシング活性を調べるため、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞系）細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した培地（ＤＭＥＭ）に蒔き、終夜培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、培地を１０から０．００１５μＭの範囲の濃度でｓｉＲＮＡ接合体を含む血清を含まない培地と置き換え、合計７２時間にわたって細胞上に置いた（３７℃、５％ＣＯ２）。供給者による説明（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  １．０ｂＤＮＡキット番号ＱＧ０００２）に従って分岐ＤＮＡ全体アッセイを用いて、ＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを分析した。ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＴＢ２４５）を用いて細胞生存度を評価し、全てのデータを未処理細胞からのレベルに正規化した。
【０１９４】
図４から１１に示したように、ＨｅＬａ細胞を、示された化合物で用量依存的に７２時間処理し、ＳＳＢ  ｍＲＮＡのレベルをｂ−ＤＮＡアッセイによって分析した。
【０１９５】
ｓｉＲＮＡ二重ルシフェラーゼアッセイの一般的プロトコール
ｓｉＲＮＡ接合体のサイレンシング活性を調べるため、ルシフェラーゼベクターで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補給した培地（ＤＭＥＭ）に蒔き、終夜培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。このレポーター細胞系は、ウミシイタケ−ホタル二重ルシフェラーゼ構築物を含み、ウミシイタケルシフェラーゼの３′ＵＴＲに組み込まれたＳＳＢ標的部位を有する。翌日、培地を１０から０．０１μＭの範囲の濃度でｓｉＲＮＡ接合体を含む血清を含まない培地と置き換え、合計２４時間にわたって細胞上に置いた（３７℃、５％ＣＯ２）。ホタルおよびウミシイタケタンパク質レベルを、供給者による説明（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２９２０）に従ってＰｒｏｍｅｇａからの二重Ｇｌｏアッセイを用いて分析した。ホタルシグナルを細胞生存度についての対照として用い、ウミシイタケ／ホタルルシフェラーゼ活性を特異的ｍＲＮＡノックダウンに用いた。データは全て、未処理細胞からのレベルに対して正規化した。
【０１９６】
図１２から１４に示したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、用量依存的に２４時間にわたって指定された化合物で処理し、ＳＳＢ  ｍＲＮＡのレベルのｂ−ＤＮＡアッセイによって分析した。
【０１９７】
眼球スクリーニングプロトコール
動物が関与する手順はいずれも、眼科および視力研究における動物使用に関するＡＲＶＯ声明（ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って実施し、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，  ＰＡの社内動物ケアおよび使用委員会（ＩＡＣＵＣ）による承認を受けた。雄ブラウンノルウェーラット（６から８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｓｉＲＮＡは無菌的に得て、感染のリスクを最小とした。硝子体内投与の場合、ケタミン／キシラジン（４０から９０／５から１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）でラットに麻酔を施し、１％塩酸プロパラカイン（１から２滴）を、局所麻酔薬として点眼した。硝子体内注射の場合、一対の清潔なピンセットを用いて眼球をやさしく開き（ｐｒｏｃｔｏｓｅ）、適切な位置に保持し、３０Ｇシャープ針注射器を用いて、角膜輪部のちょうど後方の硝子体にｉＲＮＡまたは対照媒体５μＬを注射した。屠殺当日、ペントバルビタールナトリウム（１５０から２００ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）でラットを屠殺した。眼球摘出後、硝子体、網膜およびＲＰＥ／脈絡膜を切開し、冷凍した。網膜組織をＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｕａｉｇｅｎカタログ番号７９２１６）中で均質化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  ９６キット（カタログ番号７４１８１）を用いて総ＲＮＡを精製した。定量ＰＣＲによって総ＲＮＡノックダウンを分析して、ＧＡＰＤＨおよびＰＰＩＢなどのハウスキーピング遺伝子を有する標的遺伝子ＳＳＢの相対ｍＲＮＡレベルを求めた。図１５では、指定化合物の単回硝子体内投与から３日後におけるラット網膜組織でのＳＳＢ  ｍＲＮＡの相対レベルを詳細に説明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013523149.tif 000078