(57)【要約】  本発明は、サンプル中の変異体ＢＲＡＦ配列を検出するために、特に、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、及びＶ６００Ｍ変異の存在を検出するために有用な方法、プライマー、及びプローブに関する。
2013501523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＤＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＤＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のＢＲＡＦ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項２】
サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＲＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＲＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のＢＲＡＦ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項３】
前記ＢＲＡＦ変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＡＦ変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＲＡＦ変異の存在が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｄ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｍ、及びＢＲＡＦ  Ｖ６００Ａ変異から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、血液、組織、又は細胞から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記の組織サンプルが、ホルマリン固定されたパラフィン包理組織である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ＢＲＡＦ核酸配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる前記の第二のプライマーが、配列番号１０である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
患者において、腫瘍を治療するための化学療法計画を決定するための方法であって、以下：（ａ）固定された腫瘍サンプルを得るために、腫瘍の組織サンプルを得て、サンプルを固定すること；（ｂ）固定された腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離すること；（ｃ）ＢＲＡＦ増幅産物を得るために、ＢＲＡＦ遺伝子の領域を増幅することができる一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｍＲＮＡを増幅に供すること；（ｄ）増幅されたサンプル中のＢＲＡＦｍＲＮＡの量を測定すること；（ｅ）ステップ（ｄ）からのＢＲＡＦｍＲＮＡの量を、内部対照遺伝子のｍＲＮＡの量と比較すること；及び（ｅ）増幅されたサンプル中のＢＲＡＦｍＲＮＡの量、及びＢＲＡＦ遺伝子発現についての閾値に基づいて化学療法計画を決定すること、を含む方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴヌクレオチドプライマー対：配列番号１及び配列番号１０、又は配列番号２及び配列番号１０、配列番号３及び配列番号１０、配列番号４及び配列番号１０、配列番号５及び配列番号１０、配列番号６及び配列番号１０、配列番号７及び配列番号１０、配列番号８及び配列番号１０、配列番号９及び配列番号１０、又は少なくともそれと８０％同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対から成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプライマー対：配列番号１及び配列番号１０、又は配列番号２及び配列番号１０、配列番号３及び配列番号１０、配列番号４及び配列番号１０、配列番号５及び配列番号１０、配列番号６及び配列番号１０、配列番号７及び配列番号１０、配列番号８及び配列番号１０、配列番号９及び配列番号１０、又は少なくともそれと８０％同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対を含む、ＢＲＡＦ遺伝子の発現を検出するためのキット。
【請求項１２】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号１１を含むプローブ。
【請求項１３】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号１２を含むプローブ。
【請求項１４】
プローブを添加することを含む、変異体ＢＲＡＦ核酸配列の存在を検出する方法であって、前記プローブが配列番号１１又は配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１５】
サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＤＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで、増幅反応は、サンプルのＤＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；（ｃ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号２である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｄ）前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項１６】
サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＲＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＲＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；（ｃ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号２である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｄ）前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の陽性指標である、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許出願６１／２３３，０５４（２００９年８月１１日出願）；同６１／２３７，０７８（２００９年８月２６日出願）、及び同６１／３０１，７９０（２０１０年２月５日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、サンプル中の変異ＢＲＡＦ配列の存在を検出するために、特に、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異の存在を検出するための方法、プライマー、及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
正常な細胞が腫瘍性形質転換を経て悪性細胞に成る場合、癌が生じる。形質転換された（悪性）細胞は、細胞表現型を明示する及び細胞増殖を抑制する、正常な生理学的制御を免れる。個人の体における形質転換された細胞は、それ故増殖し、腫瘍を形成する。腫瘍が見つけられた場合、臨床の目的は、個人が受ける治療において、正常細胞に対して引き起こされる何らかの害を軽減する一方で、悪性細胞を選択的に破壊することである。
【０００４】
Ｂ−ｒａｆ（又はＢＲＡＦ）は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼに属するタンパク質をコードする。ＢＲＡＦは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰシグナル伝達経路の一部であり、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路を調節する役割を果たす。この遺伝子における変異は、様々な癌、例えば結腸直腸癌（ＣＲＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、悪性メラノーマ、及び腺癌に関連している。そのほぼ全てがＶ６００Ｅ変異であるＢＲＡＦにおける発癌性の変異は、結腸癌において報告されている（Ｄａｖｉｅｓ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１７：９４９−５４；Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１８：９３４．）。Ｖ６００Ｅ変異は、マイクロサテライト不安定性の癌の半数以上で、及び安定性の結腸癌のごく一部で観察されている（Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：５２０９−１２）。Ｖ６００Ｅ（以前はＶ５９９Ｅ）変異は、Ｂ−ｒａｆ遺伝子（受託番号ＮＭ＿０４３３３．４）のエクソン１５の１８６０（コード配列の１７９９）番に位置する。コード配列の１７９９番において、チミジンがアデノシンに変更され、それは野生型／変異のないＢ−ｒａｇ遺伝子のバリン（Ｖ）から、変異された遺伝子におけるグルタミン（Ｅ）への変更をもたらす。加えて、まれな（＜１％）Ｖ６００Ｋ（１７９８‐１７９９ＧＴ＞ＡＡ）変異はまた、存在する。さらに、Ｖ６００Ｄ変異は実例の４．６％で存在し、Ｖ６００Ａ変異は実例の＜１％で存在し、Ｖ６００Ｍ変異は実例の＜１％で存在する。加えて、Ｖ６００Ｒ及びＫ６０１Ｅ  ＢＲＡＦ変異が存在する。
【０００５】
Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異は、以下：神経系、甲状腺、皮膚、胃腸管、大腸、胆管、卵巣、眼、前立腺、中枢神経系、肝臓、小腸、胸、膵臓、軟組織、上気道消化管、副腎、自律神経節、造血及びリンパ系組織、肺、食道、下垂体、及び胃を含む多数の組織／腫瘍種類で見つけられる。これらの任意の種類の組織のサンプルから抽出されるＤＮＡ又はＲＮＡは、本発明のアッセイに用いられることができる。
【０００６】
安定性及び不安定性癌の双方では、ＢＲＡＦ変異を伴う腫瘍の＞９０％は、ＣｐＧアイランドの広範囲のメチル化、又はＣｐＧアイランドメチル化因子表現型（ＣＩＭＰ）として知られているものを有する。散発性結腸癌におけるマイクロサテライト不安定性（ＭＩＳ）に関連する改善された生存率は報告されており（Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ＷＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００１；１０：９１７−２３；Ｈａｉｌｉｎｇ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９９；９１：１２９５−３０３）、散発性の不安定な腫瘍は一般的にＣＩＭＰ（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９９；９６：８６８１−６；Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０００；９７：７１０−５）及びＢＲＡＦ（Ｋａｍｂａｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ２００４；５３：ｌ  １３７−４４；Ｎａｇａｓａｋａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２：４５８４−９４）変異の双方を示すので、これらの特徴はまた、不安定性の腫瘍における改善された生存率と関連性を示すことを予測する。Ｓａｍｏｗｉｔｚは、マイクロサテライト安定性腫瘍におけるＣＩＭＰと生存率との関連性を研究しており、マイクロサテライト安定性結腸癌におけるＢＲＡＦ変異と生存率のとの関連性は評価されている。Ｓａｍｏｗｉｔｚ，Ｗａｄｅ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，６０６３−６０６９，Ｊｕｌｙ  １５，２００５．を参照のこと。Ｓａｍｏｗｉｔｚは、生存率及び他の臨床病理学的な変数とのその関連性を決定するために、結腸癌に罹患している大集団に基づく個人のサンプルを評価している。Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ変異は、マイクロサテライト安定性腫瘍の５％、及びマイクロサテライト不安定性腫瘍の５１．８％で見られた。マイクロサテライト安定性腫瘍では、この変異は、低い生存率、高ＣＩＭＰ、進行した対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）ステージ、及び結腸直腸癌の家族暦に関連した。低い生存率は、５年生存率の単変量解析（１６．７％対６０．０％）において；年齢、ステージ、及び腫瘍部位について調整された分析において；ステージ特異的な、ＡＪＣＣステージ２〜４について年齢で調整される分析において（それぞれＨＲＲ、４．８８、３．６０、及び２．０４）；及びＡＪＣＣステージ２〜４についてのカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存率評価において観察される。マイクロサテライト不安定性腫瘍は、Ｖ６００Ｅ変異が存在しようがしまいが、優れた５年生存率に関連した（それぞれ７６．２％及び７５．０％）。Ｓａｍｏｗｉｔｚは、マイクロサテライト不安定性結腸癌におけるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異は、ステージ２〜４の結腸癌における著しく低い生存率に関連するが、しかしマイクロサテライト不安定性腫瘍の優れた予後に対する効果はなかった、と結論付けた。
【０００７】
さらに、ＢＲＡＦ変異は、ＭＭＲ遺伝子ＭＬＨ１及びＭＳＨ２における胚性突然変異を伴う、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌症候群（ＨＮＰＣＣ）ファミリー由来の腫瘍に存在しないことを示した。これらのデータは、ＢＲＡＦの腫瘍形成の活性化が、散発性直腸結腸腫瘍形成にのみ関連することを示す。結腸直腸癌における陽性ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異の検出は、疾患の散発性起源、及びＭＬＨ１、ＭＳＨ２の、及びまたＭＳＨ６の胚性変化の不在を示す。これらの発見は、ＨＮＰＣＣ診断のための遺伝的検査に潜在的影響を与え、ＨＮＰＣＣのための除外基準として、又は散発性癌の分子マーカーとしてのＢＲＡＦの潜在的使用を提案する。Ｄｏｍｉｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，３９９５−３９９８．を参照のこと。
【０００８】
Ｓｏｌｉｔのグループは、ＭＥＫの小分子阻害剤、及び統合された遺伝的及び薬理学的分析を用いて、「野生型」細胞又はＲＡＳ変異を含む細胞と比較した場合、ＢＲＡＦの変異は、ＭＥＫ阻害に対する増幅された及び選択的な感受性に関連することを発見した。このＭＥＫ依存性は、組織系統にかかわらずＢＲＡＦ変異細胞で観察され、サイクリンＤ１タンパク質発現及びＧ１停止の誘導の双方の下方制御に相関した。ＲＡＳ変異腫瘍が部分的にのみ阻害されたのに対し、薬理学的なＭＥＫ阻害は、ＢＲＡＦ変異異種移植片において腫瘍成長を完全に抑制した。これらのデータは、ＢＲＡＦ変異腫瘍において、ＭＥＫ活性に関する非常に強い依存性を示唆し、この遺伝的に定義される腫瘍サブタイプについて合理的な治療戦略を提案する。Ｓｏｌｉｔ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９，３５８−３６２（１９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６）を参照のこと。
【０００９】
加えて、ヒトメラニン細胞形質転換のモデルは、遺伝学研究、細胞生物学、分子病理学、及びマウスモデリングの結果に基づいて生じる。研究は、塩基性線維芽細胞成長因子生産、ＥＲＫ活性化、及びメラノーマ組織において頻出するＢＲＡＦ変異を含む様々な因子の関与を特定している。ＢＲＡＦは、ＲＡＳの下流で作用し、研究は、ＲＡＳ及びＢＲＡＦにおいて同時に起こる変異が、メラノーマにおいて極めて希であることを示し、ＢＲＡＦ変異は、変異体ＲＡＳの少なくとも一部の腫瘍形成機能と置き換わることを示唆する。
【００１０】
転移するそれらのリスクについて、患者をさらに階層化するための腫瘍マーカーの開発は、盛んに調査されている。腫瘍マーカーの評価及び結果に基づく治療の選択は、ここ数年の結腸及び乳癌管理において、標準的な治療の一部であるが、そのようなマーカーは、メラノーマに存在しない。多くの研究は展望が示されているが、しかし開発の予備的ステージを通過して臨床的に有用なアッセイとなったものはない。
【００１１】
メラノーマ生物学の研究における近年の進歩を除いて、メラノーマに罹患した患者の診断及び／又は観察のための有用な分子ツールの開発は、まだ比較的新しい。いくつかの前進は、疾患の再発について患者を観察するために、又は転移の進行についての高いリスクにおける患者を選択するために、設計されたプロトコールにおいてなされている。腫瘍ステージ、メラノーマからの生存の優れた予測は、従来の臨床病理的な変数、例えば、原発腫瘍の厚さ及び潰瘍、及び所属リンパ節又は遠位部位における転移性疾患の存在に基づく。顕微鏡で同一に見える中程度の厚さの原発腫瘍を有する二人の患者は、しかしながら、劇的に異なる生存率を有し得る。そのような評価のための改良された予測ツールの不在は、主治医が最良な治療戦略を決定することを困難にする。
【００１２】
ＢＲＡＦ腫瘍遺伝子における変異は、メラノーマ組織の最大８０％で発見されており、この疾患において、頻度は他の分子変異よりも著しく高い。ＢＲＡＦ変異はまた、癌の他の種類から、腫瘍組織中で検出されている。実験的な研究は、いくつかのＢＲＡＦ変異、特に、メラノーマにおいてＢＲＡＦ変異の９０％をしめるＴ１７９９Ａ（以前にはＴ１７９６Ａと指定された）ホットスポット変異は、培養中に線維芽細胞に転換し得ることを示している。ごく最近、メラノーマ細胞培養における変異ＢＲＡＦの発現を阻止する実験は、細胞成長を阻害し、且つ細胞死を促進することを示し、ＢＲＡＦ阻害剤は、メラノーマ治療を著しく強化し得ることが示される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異を検出する方法を開示する。本発明は、サンプル中に存在するＶ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、又はＶ６００Ａ変異ＢＲＡＦ配列の増幅及び検出に用いられる、プライマー及びプローブ配列を含む組成物を開示する。本明細書に開示されるように、特定のプライマーの組み合わせは、特定のＢＲＡＦ変異を増幅することに用いられる。１７９８−１７９９ＧＴ＞ＡＡ二重変異に特異的なプライマーを設計することもまたできることは、当業者により評価される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＢＲＡＦ変異の増幅及び検出に用いられるプライマー及びプローブを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＢＲＡＦ変異の検出のために有用な方法、プライマー、プローブ及びキットを提供する。本発明の方法、プライマー、プローブ及びキットは、多数の様々な細胞種類において、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ及びＶ６００Ａ変異を検出するために用いられることができ、それ故、例えばメラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、及び甲状腺癌であるがこれに限定されない多数の様々な癌の診断に用いられることができる。本発明の方法は、癌患者についての、結果の予測として有用であり得る。何らかの疾患、及び特に癌に罹患した患者のための改善された転帰に寄与する重要な要因の一つは、その進行する侵襲的な性質のために、早期の正確な診断である。本発明の方法は、その存在が転移する疾患の陽性指標である、変異ＢＲＡＦ配列を検出するための迅速、非侵襲、且つ正確なスクリーニングアッセイのための切望される需要に対処する。そのようなものとして、それは、より積極的な治療計画で治療されることを必要するそれらの患者を同定する。さらに、本発明はＤＮＡ又はＲＮＡを用いることができ、サンプル調製は容易であるので、従って、サンプル調製に関連する検査技師の専門的レベルにおける違いからもたらされ得るアッセイ変動性は減少する。
【００１６】
非限定的な例として、本発明の方法は、進行した、転移性メラノーマ（ステージＩＩＩ／ＩＶ）に罹患した患者を観察するために用いられ得る。これらの患者は、疾患進行について最も高いリスクに存し、疾患活性における上昇の早期検出は、早期治療及びは転帰における改善を導く。本発明の方法はまた、それらの疾患の転移拡散のリスクがある疾患の初期のステージ（ステージＩ／ＩＩ）に罹患した患者を試験することが意図される。さらに、さらなる診断検査及び治療を伴う早期介入は、改善された患者の生存を導く。
【００１７】
本発明は、サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルは核酸配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記核酸配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる配列番号１０である第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルの配列が前記ＢＲＡＦ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在の陽性指標である、を含む方法、を提供する。
【００１８】
本発明は、サンプル中の転移性メラノーマの存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルは核酸配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記核酸配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる配列番号１０である第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルの配列が前記ＢＲＡＦ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、を含む方法、を提供する。
【００１９】
本発明の実施形態は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異体特異的プライマーを含む。典型的なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体特異的プライマー対は、配列番号１、配列番号２又は配列番号９、及び配列番号１０を含む。典型的なＢＲＡＦ  Ｖ６００  Ｄ変異体特異的プライマー対は、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号７、及び配列番号１０を含む。典型的なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異体特異的プライマー対は、配列番号１、配列番号４、配列番号５又は配列番号６、及び配列番号１０を含む。典型的なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｍ変異体特異的プライマー対は、配列番号６又は配列番号８、及び配列番号１０を含む。典型的なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ａ変異体特異的プライマー対は、配列番号３、及び配列番号１０を含む。これらのプライマーは、任意の知られているＢＲＡＦ多様性を避けて設計された。本明細書で記述されるように、そのようなオリゴヌクレオチドは、検出可能なように標識化されることができる。
【００２０】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異体特異的プライマー（配列番号１；配列番号２；配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０）、又は適切なＢＲＡＦ変異体特異的プライマー対は、生物学的に適合する塩溶液、及び／又は他のバッファ、又は成分を含む組成物の成分でもよい。
【００２１】
本発明の実施形態は、オリゴヌクレオチドプローブ配列である配列番号１１、及び配列番号１２を含み、ここでオリゴヌクレオチドは、ＢＲＡＦ変異体配列の検出のためのプローブとして用いられる。このプローブは、任意の知られているＢＲＡＦ多様性を避けて設計された。任意で、オリゴヌクレオチドは、検出可能であるように標識化される。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１〜１２の少なくとも一つを含むキットを提供する。
【００２３】
本発明の実施形態は、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ  ＢＲＡＦ変異を検出するために使用され得る。
【００２４】
サンプル
本方法は、対象（例えば哺乳動物）から組織または体液のサンプルを得ることを含み、ここでサンプルは核酸を含む。用いられ得る組織又は体液の非限定的な例は、血液、血漿、リンパ液、腫瘍生検標本、体組織を含む。一つの実施形態では、組織サンプルは、パラフィン包理組織標本を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、デオキシリリボ核酸（ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００２５】
本方法は、患者由来の任意の種類の組織に適用され得る。そのような組織の供給源は、神経系、甲状腺、皮膚、胃腸管、大腸、胆管、卵巣、眼、前立腺、中枢神経系、肝臓、小腸、胸、膵臓、軟組織、上気道消化管、副腎、自律神経節、造血及びリンパ系組織、肺、食道、下垂体、及び胃を含むがこれに限定されない。腫瘍組織の抵抗性の実験のために、腫瘍組織を調査することが好ましい。好ましい実施形態では、腫瘍が得られる患者由来の正常な組織の一部はまた、調査される。
【００２６】
本発明の方法は、幅広い範囲の腫瘍種類に亘って適用されることができる。これは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、又はＶ６００Ａ変異体配列の発現レベルが、個別の患者サンプルにおいて決定され、様々な化学療法に対する反応が予測される、個人の「腫瘍発現プロファイル」の作成を可能にする。特定の実施形態では、本発明の方法は、結腸癌又はメラノーマ腫瘍に適用される。
【００２７】
核酸の単離
本発明の実施形態では、当業者に知られているＤＮＡ単離の方法を用いる。一般的に、目的は、他の細胞成分から細胞の核に存在するＤＮＡを分離することである。ＤＮＡの単離は、通常、組織又は細胞の溶解又は分解と共に始まる。このプロセスは、タンパク質構造の破壊が必須であり、核からの核酸の放出を可能にする。溶解は、タンパク質を変性させる界面活性剤、又はプロテアーゼ（タンパク質を分解する酵素）、例えばプロテイナーゼＫ、場合により双方、を含む塩溶液中で行われる。それは、細胞の分解及び膜の溶解をもたらす。ＤＮＡ単離の方法は、フェノール：クロロホルム抽出、高塩析沈殿、アルカリ変性、イオン交換カラムクロマトグラフィー、樹脂結合、及び常磁性ビーズ結合を含むがこれに限定されない。
【００２８】
本発明の実施形態は、当業者に知られているＲＮＡ単離の方法を用いる。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）、及びグアニジンチオシアナート‐フェノール‐クロロホルム抽出を含むが、これに限定されない様々な方法により、ハイブリダイゼーションのために単離及び調製され得る。ＲＮＡ単離の原理は、細胞／組織溶解、その後の抽出、沈殿、及び洗浄に基づく。ＲＮＡ単離の選択は、サンプルの種類に依存することは、当業者により理解される。腫瘍遺伝子マーカー試験の一般的な供給源である、パラフィン包理組織からのＲＮＡ単離の方法を対象にするＵＳ１２／１４４，３８８は、参照により援用される。
【００２９】
増幅
本発明の実施形態は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び増幅難治性変異系（ＡＲＭＳ）を含むがこれに限定されない、熱及び等熱増幅方法を用いる。好ましい実施形態では、プライマー及びプローブはＡＲＭＳに用いられる。
【００３０】
検出
本発明の実施形態は、増幅産物が検出可能なマーカーで標識されるような、増幅ステップの間に用いられるプライマーを標識すること、及び増幅産物と検出可能なマーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブとがハイブリダイズさせることを含むが、これに限定されない検出方法を用いる。検出可能なマーカーは、化学発光タグ、蛍光タグ、及び放射性タグを含むがこれに限定されない。標識された増幅産物は、当業者に知られている方法に従って用いられる標識の種類に対応する方法を用いて直接測定され得る。標識されたプローブは、当業者に知られている方法により、増幅産物とハイブリダイズされ得る。
【００３１】
本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｅ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｅｄｉｃｔ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｄ変異体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｅｄｉｃｔ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｅｄｉｃｔ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｍ変異体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｅｄｉｃｔ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。本発明の方法の実施では、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ａ変異体発現レベルは、治療計画の有効性を予測（ｐｒｅｄｉｃｔ）するために、患者腫瘍サンプルにおいて評価される。
【００３２】
本発明のこの実施形態の方法を実施では、腫瘍細胞は、好ましくは、患者から単離される。固形又はリンパ系腫瘍又はその一部は、患者から手術で摘出される、又は日常的な生検により得られる。凍結又は新鮮なサンプルから単離されたＲＮＡは、当該技術分野において典型的な任意の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）．により細胞から抽出される。好ましくは、抽出プロセスの間、ＲＮＡの分解を避けるための注意が払われる。
【００３３】
【表１】
2013501523.tif 000003
【実施例】
【００３４】
実施例１：本発明のプライマーの試験
合成Ｖ６００Ｅ構築物は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を含む核酸を特異的に増幅するための、本発明のプライマー及びプローブの能力を試験するために作られた。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異のためのプライマー／プローブの２セットは、検証のために用いられた。Ｖ６００Ｅ合成構築物は、ｇＤＮＡのバックグラウンドにおいて、１７倍に段階的に希釈（１：２）された（０．６７ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／ＰＣＲ）。変異濃度は、１０ｆＭ〜０．１５ａＭに及んだ。それぞれの希釈されたサンプルは、対照（エクソン１３）及びＶ６００Ｅ変異について、二重に６回試験された（合計１２回）。
【００３５】
実施例２：Ｖ６００Ｋ  ＢＲＡＦ変異の検出
希なＶ６００Ｋ  ＢＲＡＦ変異は、Ｖ６００Ｅ変異のために設計されたプライマーの同じ対を用いることで検出され得る。Ｖ６００Ｋ変異は、１７９８−１７９９ＧＴ＞ＡＡ二重変異である。配列番号２は、一重１７９９Ｔ＞Ａ変異の存在下でのみ、増幅産物をもたらす非常に特異的なプライマーを含む。従って、プライマー対：配列番号１及び配列番号１０を用いる増幅反応、及びプライマー対：配列番号２及び配列番号１０を用いる同じサンプルに関する別の反応を行う場合、最初の反応は、増幅生成物を与える（陽性）一方で、第二の反応は、生成物を与えない（陰性）。陽性及び陰性の結果のこの組み合わせは、Ｖ６００Ｋ変異の存在を示す。
【００３６】
実施例３：ＢＲＡＦ  Ｔ１７９９Ａ／ＧＴ１７９８−１７９９ＡＡ／ＴＧ１７９９−１８００ＡＴ変異排他性試験
【００３７】
Ａ）試験材料
１．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｄ、Ｅ、及びＫ変異を含むＤＮＡ合成フラグメントは生成された。
ａ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｄ：
ＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ
ＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴ
ｂ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ
ｃ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ：
ＡＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣ
ＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＴ
【００３８】
２．ＢＲＡＦ変異Ｖ６００Ｄ、Ｅ、及びＫ変異について配列特異的なプライマー／プローブ配列（表１に列挙された配列）
ａ．１７９９Ａ＿１ＧＴ（１７９９ＴからＡの塩基対変化に特異的（Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、及びＶ６００Ｋ）
ｂ．Ｖ６００Ｄ＿２ＧＡ（Ｖ６００Ｄに特異的）
ｃ．Ｖ６００Ｋ＿２ＡＴ（Ｖ６００Ｋに特異的）
【００３９】
Ｂ．手順
１．３つの合成フラグメントのそれぞれを、０．６６７ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．‐ヒトゲノムＤＮＡ、１００μｇ）中２００ａＭの濃度に希釈する。
２．全ての３つのプライマーセット（それぞれの変異に特異的）で、それぞれの変異についての合成特異的フラグメントをＰＣＲ増幅する。
３．排他性を分析する。
【００４０】
Ｃ．排他性の分析
下記の二つのプライマー／プローブセットは、特定の変異を増幅するために設計されている。これらのプライマーは、排他性について試験するためにそれぞれの合成フラグメントで試験された。
ａ．１７９９Ａ＿１ＧＴ（Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ及びＶ６００Ｋを増幅）  このプライマー／プローブセットは、１７９９塩基におけるＴからＡの変化を増幅するために、アッセイ開発セクション（７）で記述されている。
ｂ．Ｖ６００Ｄ＿２ＧＡ（Ｖ６００Ｄに特異的）  このプライマー／プローブセットは、１７９９−１８００塩基において、ＴＡへのＴＧ変化を増幅するために、アッセイ開発セクション（７）で記述されている。
ｃ．Ｖ６００Ｋ＿２ＡＴ（Ｖ６００Ｋに特異的）  このプライマー／プローブセットは、１７９８−１７９９塩基において、ＡＡへのＣＴ変化を増幅するために、アッセイ開発セクション（７）で記述されている。
【００４１】
全てのプライマー及びプローブは、排他性試験に用いられた。
【００４２】
結果：下記の表は、特異的なプライマープローブセットで首尾よく増幅されたフラグメントを記載する。プラス（＋）は、特異的フラグメントが増幅されたことを表す。
【００４３】
表２：それぞれの変異体型を特定するためのプライマーの組み合わせは以下である。
【００４４】
【表２】
2013501523.tif 000004
【００４５】
結果：
本発明者らは、それぞれの合成及びプライマー／プローブ組み合わせについてのＣｔデータを回収した。
【００４６】
【表３】
2013501523.tif 000005
【００４７】
排他性は、それぞれの鋳型について特異的及び非特異的であるように設計されたプライマー／プローブセットを用いて、それぞれの鋳型のＰＣＲ増幅のＣｔｓを引き算することにより決定された。
【００４８】
【表４】
2013501523.tif 000006
【００４９】
デルタＣｔｓは以下：のように決定された：
例：
Ｖ６００Ｄ合成フラグメントについてのＶ６００Ｄ＿２ＧＡの排他性＝０
鋳型としてＶ６００Ｄフラグメントを用いて、増幅はＶ６００Ｄ＿２ＧＡプライマー／プローブで行われた。
ｄＣｔ＝３０．３９−３０．３９＝０（排他的）
鋳型としてＶ６００Ｄフラグメントを用いて、増幅は１７９９Ａ＿１ＧＴプライマー／プローブで行われた。
ｄＣＴ＝３０．３４−３０．３９＝−０．０５（排他的）
鋳型としてＶ６００Ｄフラグメントを用いて、増幅はＶ６００Ｋ＿２ＡＴプライマー／プローブで行われた。
ｄＣＴ＝３９．０６−３０．３９＝８．６７（非特異的）
【００５０】
合否基準
ｄＣＴ（フラグメントに特異的なプライマーを用いたＣｔ−フラグメントに非特異的なプライマーを用いたＣｔ）≦４
プリセット合否基準（アッセイ開発‐以下の表を参照のこと）は、プライマー／プローブ１７９９Ａ＿１ＧＴが１７９９におけるＴからＡ塩基対変化を検出し、それ故全ての変異を検出する、セクション７で記述された。
【００５１】
結果：
Ｖ６００Ｋ＿２ＡＴは、Ｖ６００Ｋ変異について排他的である。
Ｖ６００Ｄ＿２ＡＴは、Ｖ６００Ｄ変異について排他的である。
１７９９Ａ＿１ＧＴは、それは全ての３つの変異（Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｅ、及びＶ６００Ｋ）に含まれている、１７９９ＴからＡへの変化について、排他的である。
【００５２】
表３：それぞれの変異体型を定義するためのプライマーの組み合わせ
【００５３】
【表５】
2013501523.tif 000007
【配列表】
2013501523000001.app
【国際調査報告】
2013501523.tif 000008
2013501523.tif 000009
2013501523.tif 000010
2013501523.tif 000011
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