(57)【要約】  ジヒドロミリセチンの投与を含む、アルコール中毒、アルコール使用障害およびアルコール乱用の治療方法を本明細書に開示する。本明細書に開示するとおり、ジヒドロミリセチンは、エタノールの作用に関連する、α４βδサブユニットを有するＧＡＢＡＡＲの活性を増強し、ＧＡＢＡＡＲに対するエタノールの作用に拮抗し、ＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン部位に作用し、エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を一部または全部抑制する、低減するおよび／または逆転させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性に関連するアルコール中毒およびアルコール使用障害を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる方法であって、エタノールに暴露される、暴露されているおよび／または暴露されたＧＡＢＡＡ受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。
【請求項２】
ＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強する方法であって、前記ＧＡＢＡＡ受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。
【請求項３】
ＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法であって、前記エタノールへの暴露前、暴露中および／または暴露後に前記ＧＡＢＡＡ受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。
【請求項４】
対象のエタノール中毒、アルコール離脱症候群の症候、アルコール使用障害および／またはアルコール乱用を治療する、抑制するおよび／または低減する方法であって、請求項１に記載の前記対象のＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる方法、請求項２に記載の前記対象のＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強する方法、および／または請求項３に記載の前記対象のＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法を含む方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記アルコール離脱症候群の症候が、エタノールに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、前記治療が、前記エタノールへの暴露によって起こる前記対象の注意力の低下を低減するまたは抑制することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが有効量投与されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが前記エタノールへの暴露前、暴露中および／または暴露後に投与されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが飲料などの食品の形態で投与され、前記食品がエタノールを含有しても含有しなくてもよいことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンがエタノールと併用投与されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
本明細書に開示される本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１０年８月２４日に出願された米国特許出願第６１／３７６，５２８号明細書の利益を主張し、参照によりその内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援についての謝辞
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金番号ＡＡ００７６８０、ＡＡ０１６１００、およびＡＡ００１７９９１の下、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、一般に、ジヒドロミリセチンを使用して、エタノールによって誘発されるγ−アミノ酪酸（Ａ）受容体の可塑性を調節する方法に関する。本発明はまた、ジヒドロミリセチンを使用して、エタノール中毒、アルコール使用障害およびアルコール乱用を治療する方法にも関する。
【０００４】
アルコール依存症は、米国における予防可能な病因および死因の第３位に列挙されている。事故や殺人を除く、アルコールによって誘発される死亡は米国で毎年２０，０００件を超える。２００８年には、１１，７７３人がアルコール障害による衝突事故で死亡したが、これは米国における交通関連死亡全体の３分の１近くになる。疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によれば、アルコール関連の衝突事故の年間費用は、合計５１０億ドルを超える。
【０００５】
アルコール（エタノール、ＥｔＯＨ）とγ−アミノ酪酸（Ａ）受容体（ＧＡＢＡＡＲ）との相互作用は、アルコール離脱症候群（ＡＷＳ）に関与する。Ｂｅｃｋｅｒ  ＨＣ（１９９８）Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｗｏｒｌｄ  ２２（１）：２５−３３；Ｂｏｅｈｍ  ＳＬ，２ｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６８（８）：１５８１−１６０２；Ｋｏｏｂ  ＧＦ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６８：１５１５−１５２５；Ａｎａｃｋｅｒ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｒｙａｂｉｎｉｎ  ＡＥ（２０１０）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｒｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ７（２）：４７３−４９３；およびＤｏｐｉｃｏ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｌｏｖｉｎｇｅｒ  ＤＭ（２００９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ６１（１）：９８−１１４を参照されたい。
【０００６】
シナプスのＧＡＢＡＡＲは、エタノールに対する感受性が低いαβγサブユニットで形成されているが；α４βδサブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲは、低いエタノール濃度に対して感受性が高い。Ｌｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ３２（１）：１９−２６；Ｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｌｃｏｈｏｌ  ４１（３）：２１１−２２１；およびＪｉａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ９４（６）：４４９１−４５０１を参照されたい。ＧＡＢＡＡＲは、エタノール、一般的な麻酔薬であるベンゾジアゼピンおよび神経ステロイドによりアロステリック調節を受けることが知られている。Ｏｌｓｅｎ  ＲＷ  ａｎｄ  Ｈｏｍａｎｉｃｓ  ＧＥ（２０００）ＧＡＢＡ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＮＥＲＶＯＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ：ＴＨＥ  ＶＩＥＷ  ＡＴ  ＦＩＦＴＹ  ＹＥＡＲＳ（Ｍａｒｔｉｎ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ  ＲＷ  ｅｄｓ）ｐｐ  ８１−９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；およびＷａｌｌｎｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００（２５）：１５２１８−１５２２３を参照されたい。ＡＷＳの根底にある機構は、エタノールの過度の乱用によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性であり、これは、ＧＡＢＡＡＲ活性化の全体的な低下およびサブユニット発現の特異的変化に関連していることが研究から分かる。Ｏｌｓｅｎ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ３０：１５７９−１５８８；Ｌｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１７４９−１７５８；およびＬｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：１２３６７−１２３７７を参照されたい。シナプス外α４βδサブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでエタノール中毒後直ぐに内在化する。Ｓｈｅｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７９（３）：４３２−４４２；およびＬｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）を参照されたい。シナプス外α４βδサブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲは、エタノール中毒および他の鎮静−催眠−麻酔薬によって誘発される正向反射の行動消失（ＬＯＲＲ）と顕著な直線関係を示す。Ｌｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  １０２：２２４−２３３を参照されたい。換言すれば、シナプス外α４βδを含有するＧＡＢＡＡＲの特性変化が、アルコールによって誘発される行動変化の根底にある。従って、ＧＡＢＡＡＲは、アルコール依存症の治療の神経薬理学的標的となり得ることが分かった。Ｏｌｓｅｎ  ＲＷ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｈａｒｔ  Ｗ（２００９）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５６：１４１−１４８を参照されたい。残念ながら、エタノールへの慢性的暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制するおよび／または逆転させる方法または組成物は知られていない。
【０００７】
ベンゾジアゼピン（例えば、ジアゼパム）は、ＡＷＳの症候を低減する従来の薬剤である。しかし、ベンゾジアゼピンは、アルコール感受性および非感受性α４βδサブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲに対して不活性である。さらに、ベンゾジアゼピンは、エタノールに対する交叉耐性を生じさせる。さらに、主な副作用として、ベンゾジアゼピンを頻繁に使用すると依存症になるおそれがある。実際、ベンゾジアゼピンとアルコールの組み合わせにより、アルコール依存症自体と比較して克服がより困難な、さらに大きい物質耽溺問題も起こる。
【０００８】
ベンゾジアゼピンの他に、現在、アルコール依存症の治療用に米国ＦＤＡが認可しているのは３種類の薬剤、即ち、ナルトレキソン、アカンプロセート、およびジスルフィラムだけである。ナルトレキソンはオピオイド受容体を阻害し、それはまた思考および反応時間に悪影響を及ぼし、不安や他の不幸な感情を生じさせる場合がある。アカンプロセートは、頭痛、下痢、膨満および悪心を含む副作用を引き起こし、２つの大規模な米国臨床試験ではその有効性を確認できなかった。ジスルフィラムはアルコールの代謝を阻害するためのものであり、それによりアルコール摂取に対する負の反応が起こり、その副作用としては、潮紅、心拍数の上昇、息切れ、悪心、嘔吐、頭痛、視覚障害、精神錯乱、および循環虚脱が挙げられる。ジスルフィラムはまた、末梢神経障害を引き起こす場合もある。
【０００９】
従って、エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を一部または全部治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明は、エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる方法を提供し、本方法は、エタノールに暴露される、暴露されている、および／または暴露されたＧＡＢＡＡ受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む。幾つかの実施形態では、本発明はＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強する方法を提供し、本方法はＧＡＢＡＡ受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む。幾つかの実施形態では、本発明はＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法を提供し、本方法は、エタノールへの暴露前、暴露中、および／または暴露後に、中枢神経系ＧＡＢＡＡ受容体に作用するジヒドロミリセチンを脳組織に投与するステップを含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本発明は、対象のエタノール中毒、アルコール離脱症候群の少なくとも１つの症候、アルコール使用障害および／またはアルコール乱用を治療する、抑制する、および／または低減する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示するとおり、ＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる方法、ＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強する方法、および／またはＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法を含む。幾つかの実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。幾つかの実施形態では、アルコール離脱症候群の症候は、エタノールに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、本治療は、エタノールへの暴露によって起こる、対象の注意力の低下を低減するまたは抑制する。幾つかの実施形態では、アルコール乱用は、アルコール暴露によって誘発される高いアルコール消費である。
【００１２】
本明細書に開示する実施形態では、エタノールへの暴露前、暴露中および／また暴露後にジヒドロミリセチンを投与することができる。幾つかの実施形態では、エタノールへの暴露の約３０分前〜暴露直前の範囲の時間にジヒドロミリセチンを投与する。幾つかの実施形態では、エタノールへの暴露直後〜エタノールへの暴露の約３０分後の範囲の時間にジヒドロミリセチンを投与する。幾つかの実施形態では、ジヒドロミリセチンを飲料などの食品の形態で投与することができ、それはエタノールを含有しても含有しなくてもよい。幾つかの実施形態では、ジヒドロミリセチンは医薬製剤の形態で投与することができる。幾つかの実施形態では、ジヒドロミリセチンはエタノールと同時投与される。本明細書に開示する実施形態では、ジヒドロミリセチンを有効量で投与することができる。幾つかの実施形態では、ジヒドロミリセチンは治療有効量で投与される。幾つかの実施形態では、ジヒドロミリセチンは単位剤形で投与される。状況によっては、ヒトに対する単位剤形中のジヒドロミリセチンの量は約５０〜７０ｍｇである。
【００１３】
前述の概略的な説明と以下の詳細な説明は共に、単に例示し、説明するためのものであり、請求する本発明をより詳細に説明することを目的としている。添付の図面は、本発明がさらによく理解されるように記載されており、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明の幾つかの実施形態を図示し、詳細な説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明は、図面を参照することにより、さらによく理解される。
【００１５】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、ＤＨＭが急性ＥｔＯＨ中毒を防止し、ＥｔＯＨ離脱症候を予防することを示すグラフである。ＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｎ＝ラット５〜７匹／群）での前処置（図１Ａ）、後処置（図１Ｂ）および併用（図１Ｃ）処置による、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって誘発されるＬＯＲＲの持続時間の低減。溶媒ラットには生理食塩水（２０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。結果から、ＤＨＭは単独ではＬＯＲＲを誘発せず（図１Ｃ）、ＥｔＯＨの３０分後（破線）に注射した場合でも、ＤＨＭはＬＯＲＲ持続時間を有意に低減することが分かる。図１Ｄは、別々の実験の結果を示すグラフである。図１Ｄに示すとおり、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ）とＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を同時にｉ．ｐ．注射すると、離脱（４８時間）によって誘発されるＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対する耐性によって誘発されるＬＯＲＲが無くなる（ｎ＝７／群）。ＤＨＭ＋ＥｔＯＨを同時投与すると、単一用量ＥｔＯＨ中毒からの離脱（２４時間）によって誘発されるＰＴＺ誘発性発作の持続時間（図１Ｅ）と発生率（図１Ｆ）の増加が予防される（図１Ｂと同じ動物）。＊、ｐ＜０．０１、対溶媒処置、一元配置分散分析法。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ＤＨＭが単一用量のＥｔＯＨへの暴露／離脱によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性を予防することを示すグラフである。ラットを４群に分け、溶媒、ＥｔＯＨ（５ｇ／ｋｇ、Ｅ）、ＥｔＯＨとＤＨＭの組み合わせ（１ｍｇ／Ｋｇ、Ｅ＋Ｄ）、またはＤＨＭ（Ｄ）を強制経口投与した。４８時間離脱した後、海馬薄片中のＤＧＣでパッチクランプ記録を行った。Ｉｔｏｎｉｃの変化を図２Ａに示し、ｍＩＰＳＣの変化を図２Ｂに示す（％対照）。ｎ＝ラット４〜７匹／群。＊、ｐ＜０．０５、対０；†、ｐ＜０．０５、対溶媒処置、二元配置ＲＭ分散分析法。
【図３】図３は、ＤＨＭが、未処置ラットのＤＧＣで、ＧＡＢＡＡＲ媒介電流を増大させ、急性ＥｔＯＨによるその増強に拮抗することを示すグラフである。パネル−ａは、Ｉｔｏｎｉｃの大きさおよびｍＩＰＳＣ電荷移動（ｍＩＰＳＣ面積）に対するＤＨＭの効果を示す連続的電流トレースである。全電荷移動は、ＤＨＭ（１．０μＭ）により僅かに増大する。Ｉｔｏｎｉｃ（パネルａ−１）およびｍＩＰＳＣ（パネルａ−２）のＤＨＭ濃度依存的増強。ｎ＝ニューロン６個／群。＊、ｐ＜０．０５、対薬物投与前（ｐｒｅ−ｄｒｕｇ）、一元配置分散分析法。パネルＢは、ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）投与中、続いてＥｔＯＨとＤＨＭ（０．３および１μＭ）の同時投与中のＤＧＣのサンプルトレース記録である。パネルｂ−１は、ＥｔＯＨによりＩｔｏｎｉｃの大きさが有意に増大し；この増大はＤＨＭの同時投与により濃度依存的に低減することが分かる。ｎ＝ニューロン６個／群。パネルｂ−２から、ｍＩＰＳＣ全電荷移動も同様にＥｔＯＨ−ＤＨＭの影響を受けるが、ＥｔＯＨとＤＨＭのどちらに対してもｍＩＰＳＣの感受性は低いため、その効果は有意ではないことが分かる。ｎ＝ニューロン５〜７個／群。パネルｃは、ＤＨＭ（０．３μＭ）の投与中、続いてＤＨＭとＥｔＯＨ（１０および６０ｍＭ）の同時投与中のＤＧＣのサンプルトレース記録を示す。パネルｃ−１から、ＥｔＯＨは、ＤＨＭによるＩｔｏｎｉｃの増強に影響を及ぼさないことが分かる。パネルｃ−２から、ｍＩＰＳＣ全電荷移動も同様にＤＨＭ−ＥｔＯＨの影響を受けるが、その効果は有意ではないことが分かる。ｎ＝ニューロン５〜７個／群。＊、ｐ＜０．０１、ＤＨＭ投与後対薬物投与前、一元配置分散分析法。
【図４】図４Ａ〜４Ｂから、ＤＨＭ＋&#61483;ＥｔＯＨを同時投与すると、ＥｔＯＨ中毒によって誘発されるＤＩＶ１４初代培養海馬ニューロンのＧＡＢＡＡＲの機能的可塑性が予防されることが分かる。図４ＡはＩｔｏｎｉｃの大きさの概要であり、図４Ｂは、溶媒処置、ＥｔＯＨ処置、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ処置、およびＤＨＭ処置ニューロンの、急性ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）に反応したｍＩＰＳＣ電荷移動（％薬物投与前）の変化を示す。ｎ＝ニューロン８〜９個／群。＊、ｐ＜０．０５、対ＥｔＯＨ投与前；†、ｐ＜０．０５、薬物処置対溶媒処置、二元配置ＲＭ分散分析法。
【図５】図５Ａ〜５Ｄから、ＤＨＭは、対照とＥｔＯＨ暴露／離脱ニューロンの両方でＧＡＢＡＡＲ機能を増強することが分かる。ＤＨＭは、ＤＩＶ１４ニューロンのＧＡＢＡＡＲ媒介Ｉｔｏｎｉｃ（図５Ａ）およびｍＩＰＳＣ（図５Ｂ）を濃度依存的に増大した。反応は、ＥｔＯＨ暴露（黒丸）後、対照（白丸）と比較してやや減少した。ＥｔＯＨ暴露／離脱後、Ｉｔｏｎｉｃの大きさに僅かな右側へのシフトがあるが、ｍＩＰＳＣ全電荷移動にはない（ｎ＝ニューロン５〜９個／群）。図５Ｃは、誘発されたＧＡＢＡＡＲ媒介電流のサンプルトレースを示す。図５Ｄは、ＧＡＢＡ濃度反応曲線に対するＤＨＭの影響を示す。ＤＨＭの非存在下で３００μＭ  ＧＡＢＡにより活性化されたピーク電流に対して振幅を正規化する。各データポイントは、５〜９個のニューロンの平均振幅である。ＤＨＭはＧＡＢＡと同時投与された。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＤＨＭがＥｔＯＨ中毒を打ち消し、ＤＨＭの効果がフルマゼニルにより拮抗されることを示すグラフである。図６Ａから、ＥｔＯＨ（Ｅ、３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．注射）により正向反射の消失（ＬＯＲＲ）が誘発されたが、ＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とＥｔＯＨを同時注射（Ｅ＋Ｄ１）するとＬＯＲＲの持続時間が大きく低減したことが分かる。ＤＨＭ（Ｄ１）は、生理食塩水注射と同様に、ＬＯＲＲを誘発しなかった（ｎ＝ラット８〜２０匹／群）。図６Ｂから、ＥｔＯＨ注射の３０分前にＤＨＭを投与すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲが打ち消されたが；ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲの３０分後（黒色の線として示す）、ＤＨＭ注射によりＬＯＲＲの残りが低減した（ｎ＝ラット５〜１０匹／群）ことが分かる。図６Ｃから、ＥｔＯＨとＤＨＭを同時注射（３ｍｇ／ｋｇ、Ｅ＋Ｄ３）すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲが大きく低減したことが分かる。フルマゼニル（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｆ１０）、ＥｔＯＨおよびＤＨＭを同時注射（Ｅ＋Ｄ３＋Ｆ１０）すると、ＤＨＭの効果が逆転された。ＤＨＭの用量を１０ｍｇ／ｋｇ（Ｅ＋Ｄ１０＋Ｆ１０）に増加した場合、フルマゼニルはＤＨＭの効果を部分的に逆転させた。フルマゼニルの用量を３０ｍｇ／ｋｇ（Ｅ＋Ｄ３＋Ｆ３０）に増加すると、より強いＤＨＭ拮抗作用が観察された。フルマゼニルとＥｔＯＨを同時注射（Ｅ＋Ｆ１０）してもＬＯＲＲ持続時間は変化しなかった（ｎ＝ラット５〜６匹／群、†、ｐ＜０．０５、対生理食塩水群、＊、ｐ＜０．０５、対ＥｔＯＨ群）。
【図７】図７は、ラットでのＬＯＲＲに対する高用量のＤＨＭおよびフルマゼニルの効果を示す。１００または３００ｍｇ／ｋｇ  ＤＨＭ（ｉ．ｐ．注射）により非常に短いＬＯＲＲ持続時間が誘発された。３０および２００ｍｇ／ｋｇのフルマゼニルをｉ．ｐ．注射してもＬＯＲＲは誘発されなかった。
【図８】図８は、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲ中の血漿中［ＥｔＯＨ］アッセイの結果を示す。Ｘ軸は、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射またはＤＨＭ（１および１０ｍｇ／ｋｇ）とＥｔＯＨの同時投与（Ｅ＋Ｄ）後の採血時点を示す（ｎ＝ラット３〜４匹／群、＊、ｐ＜０．０５、対ＥｔＯＨ群、二元配置ＲＭ分散分析法）。
【図９】図９から、ＤＨＭは、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲの増強に拮抗し、その効果はフルマゼニルにより阻害されることが分かる。パネルＡは、ラット海馬ＤＧＣのホールセル電位固定（−７０ｍＶ）記録（左）および重畳平均（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ  ａｖｅｒａｇｅｄ）ｍＩＰＳＣ（右）を示す。灰色の破線は、ＧＡＢＡＡＲ媒介Ｉｔｏｎｉｃの大きさを算出するためのベースラインとしての、ピクロトキシン（ＰＴＸ、ＧＡＢＡＡＲアンタゴニスト、１００μＭ）で全ＧＡＢＡＡＲ電流を完全に遮断した後の平均電流を表す。ＥｔＯＨ（６０Ｍｍ、Ｅ）の灌流液中投与（Ｂａｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）により、ＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣが増加した。ＤＨＭ（０．３および１．０μＭ）は、これらのＥｔＯＨ効果に拮抗した。パネルＢは、ＥｔＯＨおよびＤＨＭに反応したＩｔｏｎｉｃ面積の概要を示す。パネルＣは、ＥｔＯＨおよびＤＨＭに反応したｍＩＰＳＣ面積を示す。パネルＤは、ＤＧＣから記録したサンプルトレース（左）および重畳平均ｍＩＰＳＣ（右）である。急性ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲの増強に対するＤＨＭ（３μＭ）の拮抗作用は、１０μＭフルマゼニルにより逆転された。パネルＥは、ＥｔＯＨ、ＤＨＭおよびフルマゼニルに反応したＩｔｏｎｉｃ面積の概要である。パネルＦは、ＥｔＯＨ、ＤＨＭおよびフルマゼニルに反応したｍＩＰＳＣ面積の概要である。ｎ＝４〜６／群。＊、ｐ＜０．０５、対薬物０；†、ｐ＜０．０５、対ＥｔＯＨ、二元配置ＲＭ分散分析法。
【図１０】図１０から、ＤＨＭは、ベンゾジアゼピン部位におけるＧＡＢＡＡＲの正の調節物質であることが分かる。パネルＡは、ラットの海馬ＤＧＣのホールセル電位固定（−７０ｍＶ）記録（左）および重畳平均ｍＩＰＳＣ（右）を示す。パネルＢは、０．１〜３０μＭのＤＨＭにより増強されたＩｔｏｎｉｃの概要である（ｎ＝４〜５。＊、ｐ＜０．０５、対薬物０、一元配置ＲＭ分散分析法）。パネルＣは、０．１〜３０μＭのＤＨＭにより増強されたｍＩＰＳＣ面積の概要である（ｎ＝４〜５。＊、ｐ＜０．０５、対薬物０、一元配置ＲＭ分散分析法）。パネルＤは、ＤＩＶ１４（ＤＩＶ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数）での培養海馬ニューロンのホールセル電位固定（−７０ｍＶ）記録を示す。ＤＨＭ（１μＭ、Ｄ１）により増大したＧＡＢＡＡＲ媒介ＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣは、フルマゼニル（Ｆ、１０および１００μＭ）により逆転された。全ＧＡＢＡＡＲ電流は、ビククリン（ＧＡＢＡＡＲアンタゴニスト、Ｂｉｃ、１０μＭ、灰色の破線）により遮断される。ＤＨＭ（１μＭ、Ｄ１）によるＩｔｏｎｉｃ（パネルＥ）およびｍＩＰＳＣ（パネルＦ）の増大の概要（薬物投与前（０）の％）、フルマゼニルはそれらを濃度依存的に抑制した（ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５、対薬物０、一元配置ＲＭ分散分析法）。パネルＧから、ＤＨＭがラット皮質膜ホモジネート中で［３Ｈ］フルニトラゼパム（ｆｌｕ）結合を抑制したことが分かる。ＤＨＭの最終濃度を増加させると（０．０３〜１００μＭ）、その結果、皮質結合部位で［３Ｈ］フルニトラゼパム（最終濃度１ｎＭ）の置換が起こる。結果をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０でグラフ表示し、トリプリケートで行った各点に関する２つの実験の平均として表す（ｎ＝２）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄから、ＤＨＭがラットのＤＩＶ１４初代培養海馬ニューロン中でＧＡＢＡＡＲ媒介抑制を濃度依存的に増強することが分かる。ＤＨＭは、ＧＡＢＡＡＲ媒介抑制を濃度依存的に増強する。ＤＩＶ１４の培養ニューロンは、−７０ｍＶでホールセル電位固定を行った。Ｉｔｏｎｉｃ（図１１Ａ）およびｍＩＰＳＣ（図１１Ｂ）に対するＤＨＭの用量反応曲線（ｎ＝ニューロン９〜１０個／群）。図１１Ｃは、培養海馬ニューロンのサンプルトレースを示し、ＤＨＭ（１μＭ）が１０および３００μＭ  ＧＡＢＡの局所パフ投与（ｆｏｃａｌ  ｐｕｆｆｓ）によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ電流を増大させたことを示す。図１１Ｄから、ＧＡＢＡの局所パフ投与によって誘発されたＧＡＢＡＡＲ電流の濃度−反応曲線がＤＨＭにより左側にシフトした（０．３および１μＭ、ｎ＝ニューロン５〜９個／群、＊、ｐ＜０．０５、対ＤＨＭ０、一元配置分散分析法）ことが分かる。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅから、ＤＨＭはＥｔＯＨ離脱症候を予防し、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されるラット海馬中でのＧＡＢＡＡＲα４サブユニット発現の変化に拮抗することが分かる。４群のラットに単一用量の溶媒、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、Ｅ）、ＥｔＯＨプラスＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、Ｅ＋Ｄ）、またはＤＨＭ単独（図１２Ｄ）を注射（ｉ．ｐ．）した。４８時間離脱した後：図１２Ａの不安を高架十字迷路（ＥＰＭ）で測定した。Ｅ群は、オープンアームでの滞在時間が比較的短く、クローズドアームでの滞在時間が比較的長かった。Ｅ＋Ｄ群は、オープンアームとクローズドアームでの滞在時間は両方とも溶媒群と類似していた；図１２ＢはＬＯＲＲで測定した耐性を示す。Ｅ群では、急性ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲの持続時間が有意に短縮した。Ｅ＋Ｄ群は、溶媒群と比較して、ＬＯＲＲに差が見られなかった；図１２Ｃから、Ｅ群ではＰＴＺ誘発性発作の持続時間が増加したことが分かる。Ｅ＋Ｄ群は、溶媒群と類似のＰＴＺ誘発性発作を示した。３つの全てのアッセイで、Ｄ群は、溶媒群と比較して差が見られなかった（ｎ＝ラット５〜１３匹／群）。図１２Ｄは、溶媒、ＥｔＯＨ、Ｅ＋ＤまたはＤＨＭを強制経口投与したラットの、４８時間離脱した後の海馬組織ＧＡＢＡＡＲα４サブユニットのウエスタンブロットを示す。β−アクチンは、添加対照（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として示されている。図１２Ｅは、図１２Ｄの実験の全α４サブユニットタンパク質の定量化を示す。ＥｔＯＨ離脱によってα４ＧＡＢＡＡＲサブユニットの増加が誘発されたが、Ｅ＋Ｄ処置を行うとこの増加は予防された。ＤＨＭにより、α４ＧＡＢＡＡＲサブユニットタンパク質に変化は生じなかった（ｎ＝ラット３匹／群、＊、ｐ＜０．０５、対溶媒処置、一元配置分散分析法）。白＝溶媒、濃いグレー＝ＥｔＯＨ、グレー＝ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ、薄いグレー＝ＤＨＭ
【図１３】図１３から、ＤＨＭは、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されるラットの海馬ＤＧＣのＧＡＢＡＡＲの機能的可塑性を抑制することが分かる。ラットを４群に分けて、溶媒、ＥｔＯＨ（５ｇ／ｋｇ、Ｅ）、ＥｔＯＨとＤＨＭの組み合わせ（１ｍｇ／Ｋｇ、Ｅ＋Ｄ）またはＤＨＭ（パネルＤ）を強制経口投与した。４８時間離脱した後、海馬薄片中のＤＧＣでパッチクランプ記録を行った。パネルＡは、溶媒処置されたラットでの、急性ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）により増大したＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣを示す。パネルＢから、ＥｔＯＨ／離脱群では、ＥｔＯＨによりＩｔｏｎｉｃは増加しなかったが、ｍＩＰＳＣ面積は大きく増大したことが分かる。パネルＣから、Ｅ＋Ｄ群では、ＥｔＯＨにより、溶媒群のものと同様にＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣが増加したことが分かる。パネルＤから、ＤＨＭ群のＥｔＯＨに対するＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣの反応は、溶媒群のものと類似していたことが分かる。パネルＥおよびＦから、ゾルピデム（ＺＰ、ベンゾジアゼピンアゴニスト、０．３μＭ）は、溶媒群と同様にＤＨＭ群でもＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣを増強したが；ＥｔＯＨ群ではＧＡＢＡＡＲ電流に影響を及ぼさなかったことが分かる。パネルＧは、４群でのＩｔｏｎｉｃに対するＥｔＯＨの効果の概要を示す。パネルＨは、４群でのｍＩＰＳＣに対するＥｔＯＨの効果の概要を示す。パネルＩはＩｔｏｎｉｃに対するゾルピデムの効果の概要を示し、パネルＪは４群でのｍＩＰＳＣ面積の概要を示す（ｎ＝ラット４〜７匹／群、＊、ｐ＜０．０５、対薬物０；†、ｐ＜０．０５、対溶媒群、二元配置ＲＭ分散分析法）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄから、ＤＨＭはＥｔＯＨに予め暴露された培養海馬ニューロンでのＧＡＢＡＡＲ媒介抑制を増強し；ＤＨＭとＥｔＯＨを同時投与すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性が予防されることが分かる。ＥｔＯＨ暴露（６０ｍＭ、３０分）の２４時間後、培養海馬ニューロン（ＤＩＶ１３〜１４）で、ＤＨＭは、図１１Ａおよび図１１Ｂと比較して耐性を生じることなく、依然としてＧＡＢＡＡＲ媒介Ｉｔｏｎｉｃ（図１４Ａ）とｍＩＰＳＣ面積（図１４Ｂ）を両方とも濃度依存的に増大させることができた（ｎ＝ニューロン８〜９個／群、＊、ｐ＜０．０５、対薬物０、一元配置分散分析法）。図１４Ｃから、ＥｔＯＨとＤＨＭを同時投与すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性が予防されることが分かる。代表的なウエスタンブロットは、溶媒、ＥｔＯＨ、Ｅ＋ＤおよびＤＨＭの４つの処置の２４時間後に検出された培養海馬ニューロン（ＤＩＶ１３〜１４）中でのＧＡＢＡＡＲα４サブユニットの細胞表面発現（ｓｕｒ）対全（ｔｏｔ）発現を示す。β−アクチンは、添加対照として示されており、細胞表面に検出できなかった。図１４Ｄは、表面ＧＡＢＡＡＲα４タンパク質の定量化を示す（溶媒の％）。表面シグナルは各β−アクチンシグナルに対して正規化された（溶媒＝１００％）。ＥｔＯＨはＧＡＢＡＡＲα４タンパク質の表面発現の１．５倍の増加を誘発したが、この増加はＥ＋Ｄにより予防された（ｎ＝５／群、＊、ｐ＜０．０５、対溶媒、一元配置分散分析法）。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂから、ＤＨＭを添加することにより、２瓶選択パラダイムにおけるＥｔＯＨ消費の増大が完全に予防されることが分かる。図１５Ａから、ＥｔＯＨ／水に暴露された群では、ＥｔＯＨの消費により２０％ＥｔＯＨへの間欠的アクセスが急速に増加した。ＤＨＭ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）とＥｔＯＨ（Ｅ＋Ｄ／水）を同時投与すると、この増加は打ち消された。記号は、平均ＥｔＯＨ摂取（ｇ／ｋｇ／２４時間）±ＳＥＭである。４週間後、Ｅ／水群を２つの部分群に分けた；一方はＥｔＯＨへの間欠的アクセスを継続し、他方はＥ＋Ｄに間欠的にアクセスさせた。Ｅ／水群は高レベルのＥｔＯＨ消費を維持したが、Ｅ＋Ｄ／水群では、３用量以内のＤＨＭでＥｔＯＨ消費の大きな低減が見られ、４回目の用量のＤＨＭでＥｔＯＨ消費が同様になった。水／水群とＤ／水群の間には、溶液消費に有意差がないことに留意されたい（ｎ＝ラット６〜８匹／群。＊、ｐ＜０．０５、Ｅ＋Ｄ／水群対Ｅ／水群；†、ｐ＜０．０５、Ｅ＋Ｄ／水（第５週以降）対Ｅ／水群（第５、６および７週）；二元配置ＲＭ分散分析法の後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定）。図１５Ｂは、第５週に測定した血漿中［ＥｔＯＨ］を示す（ｎ＝ラット２〜５匹／群、＊、ｐ＜０．０５、対ＥｔＯＨ群、スチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）の投与を含む、アルコール（エタノール、ＥｔＯＨ）中毒、アルコール暴露からの離脱およびアルコール乱用を治療する、抑制するおよび／または低減する方法および組成物に関する。
【００１７】
ＤＨＭは、玄圃梨（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｒａｉｓｉｎ  Ｔｒｅｅ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）から得ることができる。ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）抽出物および精製されたＤＨＭを含有する薬草療法薬は、アルコールおよび他の化学物質によって誘発された肝障害を緩和する、アルコール二日酔いの症候を緩和する、およびアルコール中毒を軽減するのに使用されてきた。Ｋａｗａｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ３３（１１）：１４５４；Ｈａｓｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２０：３８１−３８５；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｓａｓｓｈｉ  １１７（２）：１０８−１１８；Ｊｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｃａｉ  ２４：１２６−１２８；Ｊｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｃａｉ  ２５：１９０−１９１；Ｃｈｅｎ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ３１：１０９４−１０９６；Ｌｉｕ  ＸＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ３１：１０９７−１１００；Ｆａｎｇ  ＨＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ  Ｊ  Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  ３５：６９３−７０３；Ｈｕｓｓａｉｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２８（１）：１０３−１１５；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１４３１−１４３３；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）４４：１４５４−１４６４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｈｉｎａ  Ｔｒａｄ  Ｈｅｒｂａｌ  Ｄｒｕｇｓ  ２５：３０６−３０７；およびＫｉｍ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ  ８：２２５−２３３を参照されたい。
【００１８】
しかし、本発明以前は、ＤＨＭおよび／またはケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）抽出物がアルコール暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を調節できるかどうかは不明であった。実際、本発明以前は、ＤＨＭおよび／またはケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）抽出物のＧＡＢＡＡＲに対する影響を調べた研究はなかった。さらに、従来技術の研究には、従来技術の研究がアルコール暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を一部または全部治療する、抑制するおよび／または逆転させるためにＤＨＭおよび／またはケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）抽出物を投与することを本質的に教示しているまたは示唆していると言えるような、慢性的アルコール暴露の状況が必ずしも含まれていない。
【００１９】
様々な症状のための薬草療法に使用されるケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）および他の植物、例えば、クズ（Ｋｕｄｚｕ）およびその抽出物中には、ジヒドロミリセチンの他に、ミリセチン、ケルシチン（ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）、ホベニチン（ｈｏｖｅｎｉｔｉｎ）、ラリシトリン、アピゲニンなどの様々なフラボノイドが存在する。アルコール暴露に関するフラボノイドの有益な効果の多くは、それらの抗酸化特性によるものである。従って、ＤＨＭ、またはケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）の調合物もしくは抽出物が慢性的アルコール暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性に対する効果を有するかどうか、またはＤＨＭおよびケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）の抽出物の有益な効果が単に抗酸化作用によるものであるかどうかは不明であった。さらに、本発明者らは幾らかの量のＤＨＭが血液脳関門を通過できると考えたが、多くのフラベノイド（ｆｌａｖｅｎｏｉｄｓ）および抗酸化物質は影響を及ぼさないため、このような量でＧＡＢＡＡＲに何らかの影響を及ぼすかどうかは不明であった。従って、本明細書に記載のとおり様々な実験を行った。本明細書に記載のとおり、実験から以下のことが分かる。
【００２０】
１）ＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ）は、ＥｔＯＨ中毒を強力に打ち消す。従って、本発明は、必要とする対象にＤＨＭを投与するステップを含む、対象のＥｔＯＨ中毒を治療する、抑制する、低減する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ＤＨＭはＥｔＯＨへの暴露前、暴露中および／または暴露後に投与される。幾つかの実施形態では、ＤＨＭはＥｔＯＨと共に投与される。例えば、ＥｔＯＨを含む組成物、例えば、飲料などの食品にＤＭＨを添加した後、その組成物を対象に投与する。幾つかの実施形態では、ＥｔＯＨ中毒は急性ＥｔＯＨ中毒である。
【００２１】
２）ＤＨＭは、ａ）ＥｔＯＨに対する耐性；ｂ）基礎不安の増加、およびｃ）ＰＴＺ誘発性発作に対する過敏性（過剰興奮性）を含む、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発される行動変化を緩和する。従って、本発明は、必要とする対象にＤＨＭを投与するステップを含む、ＥｔＯＨ暴露からの離脱によって起こる症候を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ＤＨＭはＥｔＯＨへの暴露前、暴露中および／または暴露を停止した後に投与される。幾つかの実施形態では、症候は、ＥｔＯＨに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択される。
【００２２】
３）ＤＨＭは、対象のＥｔＯＨ消費の増大を予防する。従って、本発明は、対象にＤＨＭを投与するステップを含む、対象がより多くのＥｔＯＨを随意に消費することを抑制する、低減するまたは予防する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ＤＨＭは、ＥｔＯＨの消費前、消費中、および／または消費後に投与される。幾つかの実施形態では、ＤＨＭは、消費されるＥｔＯＨと共に投与される。例えば、ＥｔＯＨを含む組成物、例えば、飲料などの食品にＤＭＨを添加した後、その組成物を対象に投与する。
【００２３】
４）ＤＨＭは、中毒、鎮静作用または感覚脱出を引き起こさない。従って、本発明は、対象にＤＨＭを投与するステップを含む、ＥｔＯＨへの暴露によって起こる対象の注意力の低下を治療する、低減するまたは予防する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ＤＨＭは、ＥｔＯＨへの暴露前、暴露中および／または暴露後に投与される。幾つかの実施形態では、ＤＨＭはＥｔＯＨと共に投与される。例えば、ＥｔＯＨを含む組成物、例えば、飲料などの食品にＤＭＨを添加した後、組成物を対象に投与する。
【００２４】
また、本明細書に開示される実験から次のことも分かる、すなわち、ａ）ＤＨＭの打ち消し効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでフルマゼニルにより拮抗され、ＤＨＭは、ＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン部位への［３Ｈ］フルニトラゼパムの結合を競合的に抑制する；ｂ）ＤＨＭは、急性ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲの増強に拮抗する；ｃ）ＤＨＭは、ＥｔＯＨによって誘発される、急性ＥｔＯＨに対するＧＡＢＡＡＲの反応性の変化（Ｉｔｏｎｉｃ調節の消失およびｍＩＰＳＣ感受性の増加を含む）に拮抗する；ｄ）ＤＨＭは、海馬薄片および培養ニューロンのＧＡＢＡＡＲを増強し、ＥｔＯＨに対する耐性を誘発するＥｔＯＨ暴露／離脱後でもＧＡＢＡＡＲを増強する効力を維持する；およびｅ）ＤＨＭは、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されるラット海馬のＧＡＢＡＡＲα４サブユニットの量の増加を阻害する。換言すれば、ＤＨＭは、ＥｔＯＨ暴露に伴うＧＡＢＡＡＲの活性を増強し、各ＧＡＢＡＡＲに対するＥｔＯＨの作用に拮抗し、ＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン部位に結合する。本明細書で使用する場合、「増強する」とは、ＧＡＢＡＡＲの活性および／または有効性の増加を引き起こすことを意味する。
【００２５】
驚くべきことに、本明細書の実験から、ＤＨＭが、ＥｔＯＨへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲの可塑性を抑制する、低減する、およびさらには逆転させることも分かる。本明細書で使用する場合、受容体の「可塑性」とは、受容体のサブユニット構成の変化を意味する。本発明に関して、本明細書で使用する場合、「ＧＡＢＡＡＲ可塑性」とは、ＧＡＢＡＡＲのサブユニット構成の変化を指す。ＥｔＯＨへの暴露により、α４βδサブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲが内在化される。α４サブユニットがシナプス後膜に戻るとき、δサブユニットがもはやα４サブユニットと結合しないように、δサブユニットの位置が変化し、それにより、ＧＡＢＡＡＲ可塑性が生じる、即ち、ＥｔＯＨ暴露前と比較してシナプス後膜でα４サブユニットが増加する。本明細書に示すとおり、ＤＨＭは、ＥｔＯＨへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制する、低減する、逆転させるおよび／または予防する。本発明以前は、ＥｔＯＨ暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制する、低減する、逆転させるおよび／または予防する化合物または組成物は知られていないため、これらの結果は驚くべきものである。ＤＨＭと類似の他のフラボノイド、例えば、ダイジンおよびケルセチンは、ＤＨＭと同じまたはＤＨＭと類似の活性を示さない、即ち、ＧＡＢＡＡＲを増強しない、ＥｔＯＨ作用に拮抗しない、およびＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン部位に結合しにないということに鑑みて、本明細書の実験の結果はとりわけ驚くべきことである。
【００２６】
従って、本発明は、脳組織にＧＡＢＡＡＲに作用するＤＨＭを投与するステップを含む、ＥｔＯＨへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減する、逆転させるおよび／または予防する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「ＥｔＯＨ暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性」とは、Ｌｉａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７（４５）：１２３６７−７７；Ｚｕｃｃａ  Ｓ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ＣＦ（２０１０）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（１９）：６７７６−８１；およびＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９（３）：４３２−４２によって記載されているようなＧＡＢＡＡＲ可塑性を指す。本発明の実施形態の幾つかでは、投与されるＤＨＭの量は有効量である。本明細書で使用する場合、ＤＨＭの「有効量」とは、対照と比較して所望の効果が得られる量、即ち、エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させる、またはＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強する、またはＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗する量である。例えば、ＥｔＯＨへの暴露（慢性的間欠的暴露および単一用量暴露を含む）によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を一部または全部逆転させるＤＨＭの有効量とは、対応する未処置ＧＡＢＡＡＲと実質的に類似のまたは同じ構成および／または活性を有するＧＡＢＡＡＲの量を増加させる量である。
【００２７】
ＤＨＭの「治療有効量」とは、対象に投与したとき、対象の症状が、処置前の対象の症状と比較してまたは対照の対象と比較して、目に見えるほど改善するように、ＥｔＯＨへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させるのに、またはＧＡＢＡＡＲの活性を増強するのに、または対象のＧＡＢＡＡＲに対するエタノールの作用に拮抗するのに十分な量である。また、本明細書で使用する場合、ＤＨＭの「治療有効量」とは、対象に投与したとき、対照と比較して、対象の所与の臨床症状、例えば、エタノール中毒、アルコール離脱症候群の少なくとも１つの症候、アルコール使用障害、またはアルコール乱用を治療する量である。通常、ＤＨＭの治療有効量を、毎日、約０．００２〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で経口または静脈内投与することができる。
【００２８】
通常、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を１日１〜４回に分割して、または徐放性製剤として投与すると、所望の薬理学的効果を得るのに有効である。しかし、特定の対象に対する具体的な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、併用する薬物（ｄｒｕｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）および特定の疾患および／または症状の重症度を含む様々な要因に依存することを理解されたい。また、投与頻度も治療される特定の疾患および／または症状に応じて変わり得る。また、治療に有効な投与量は、特定の治療を行う過程で増減し得ることも分かるであろう。当該技術分野で公知の臨床的方法での標準的な診断アッセイの結果、投与量の変更が行われ、明らかになり得る。場合によっては、慢性的投与が必要なこともある。ＤＨＭの有効量および治療有効量は、当該技術分野で公知の通常の方法で当業者が容易に決定できる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、有効量のＤＨＭを飲料などの食品の形態で投与することができる。幾つかの実施形態では、飲料は、発酵した穀類（例えば、ウィスキー、バーボン、ライウィスキー、ウォッカ、ジンおよび／またはビール）、発酵した果物（例えば、ワイン、ブランデー、シェリーおよびコニャック）、サトウキビおよび／またはテンサイ（例えば、ラム）、および／または発酵したリュウゼツランの頭部（テキーラ）から製造できるアルコールを含有する。幾つかの実施形態では、有効量のＤＨＭをチューインガム組成物の形態で投与することができる。
【００３０】
本発明の医薬製剤は、分割された用量または単一用量のＤＨＭを含み、単位剤形および／または所望の投与形態に適切な包装で調製することができる。本発明の医薬製剤は、経口、経直腸、経鼻、局所（経口腔粘膜および舌下を含む）、経皮、経粘膜、経膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）を含む任意の好適な経路で治療のために投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの症状および年齢、治療される症状の性質によって変わることが分かるであろう。例えば、幾つかの実施形態では、治療有効量のＤＨＭを対象に経皮パッチまたは沸騰錠（例えば、水などの液体に溶解させると泡立ちを生じる、有効量のＤＨＭ、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、およびクエン酸などの酸性材料を含む錠剤）の形態で投与することができる。
【００３１】
幾つかの実施形態では、ヒト対象用のＤＨＭの単位用量は約５０〜７０ｍｇである。従って、幾つかの実施形態では、本発明の食品、経皮パッチ、チューインガムおよび／または沸騰錠は、単位当たり約５０〜７０ｍｇを含む。
【実施例】
【００３２】
実験
動物および材料
動物実験は全て動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可された。雄性および雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（２５０〜３００ｇ）は飼育室内にて１２時間の明暗サイクルで飼育し、飼料と水に自由にアクセスさせた。
【００３３】
ジヒドロミリセチン（ＤＨＭ、（２Ｒ，３Ｒ）−３，５，７−トリヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロクロメン−４−オン）は、ＺＲ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から購入した（ＣＡＳ  Ｎｏ．２７２００−１２−０、ＨＰＬＣで９８％精製）。フルマゼニル、ピクロトキシンおよびビククリンはＳｉｇｍａから購入した。
【００３４】
統計解析
データは、前述のニューロン培養および／またはラットの少なくとも３つの独立した標本から得た。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）およびＳｉｇｍａＳｔａｔ（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５）をデータ表示および統計解析に使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表した。一元配置または二元配置反復測定（ＲＭ）分散分析と、ＤｕｎｎｅｔｔまたはＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓに基づく事後比較分析およびスチューデントｔ検定を使用して、処置群と溶媒群との有意差を判定した。
【００３５】
ＤＨＭは急性ＥＴＯＨ中毒を防止し、ＥＴＯＨ離脱症候を予防する
ラットで行った代謝試験から、ＤＨＭ（経口投与、１ｍｇ／ｋｇ）の投与により代謝の変化（飼料および水の摂取、尿量および便量）は誘発されないことが分かった（データは示していない）。
【００３６】
当該技術分野で公知の標準的ＬＯＲＲアッセイを使用して、ラットでのＥｔＯＨ誘発性ＬＯＲＲに対するＤＨＭの効果を調べた。Ｋａｋｉｈａｎａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４（７５６）：１５７４−１５７５）を参照されたい。簡潔に言えば、薬物を注射した後、ラットをＶ字形の支持物に仰臥位で置いた。ＬＯＲＲ発生時間は薬物注射（ｉ．ｐ．）の終点から測定した。動物が３０秒以内に３回反転できたとき、ＬＯＲＲ持続時間は終了した。ＬＯＲＲアッセイは盲検的に行った。ＬＯＲＲ持続時間は、平均（分）±ＳＥＭとして報告した。
【００３７】
対照群（ＥｔＯＨ注射の３０分前に生理食塩水、２０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．で前処置）では、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）により、７２±２分のＬＯＲＲが誘発された。ＤＨＭで前処置（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＥｔＯＨ注射の３０分前）すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲは８±４ＬＯＲＲに低減した（対照の１０．６±５．９％、図１Ａ、ｐ＜０．０５）。ＥｔＯＨ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与の３０分後にＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置すると、ＬＯＲＲは７９±２から４９±２に低減した（図１Ｂ）。特に、ＤＨＭ注射（図１Ｂの赤い破線）以降、ＬＯＲＲ持続時間は５１±２から２１±２分に低減した（対照の４１．２±３．８％、ｐ＜０．０５）。ＥｔＯＨ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を同時投与すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲの持続時間は０．７±０．４に有意に低減した（対照の１．２±０．６％、図１Ｃ、ｐ＜０．０５）。ＤＨＭは単独ではＬＯＲＲを誘発しなかった（図１Ｃ）。これらの結果から、ＤＨＭは、ＥｔＯＨの投与前、投与中および／または投与後に投与されると、急性ＥｔＯＨ中毒に拮抗することが示唆される。
【００３８】
次いで、単一用量ＥｔＯＨ中毒および離脱に対するＤＨＭの効果を調べた。ラットに生理食塩水（２０ｍｌ／ｋｇ、溶媒）、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ）、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ（ＥｔＯＨの３０分後、１ｍｇ／ｋｇ）、またはＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ）単独をｉ．ｐ．注射した。４８時間の離脱時間後、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲのアッセイ（ＥｔＯＨ、３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を行った。ＬＯＲＲ持続時間は、単一用量ＥｔＯＨ中毒／離脱により有意に低減した、即ち、９±３対５８±５分（溶媒）となった。このことから、ＥｔＯＨ離脱によりＥｔＯＨ耐性が誘導されることが示唆される。ＤＨＭとＥｔＯＨで後処置すると、ＥｔＯＨ離脱によるＬＯＲＲ持続時間の減少が有意に抑制、低減および／または予防された（図１Ｄ、ｐ＜０．０５）。ＬＯＲＲ持続時間（分）：それぞれ、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ６１±４およびＤＨＭ６１±４。このことから、ＤＨＭがＥｔＯＨ離脱によって誘発されるＥｔＯＨ耐性を抑制、低減および／または予防することが示唆される。
【００３９】
また、ラットでペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）によって誘発される発作も測定した。溶媒（生理食塩水、２０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、ＤＨＭ＋ＥｔＯＨ（１ｍｇ／ｋｇ＋３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）処置から２４時間離脱した後、ＰＴＺ誘発性発作に関してラットを試験した。この試験に使用したＰＴＺの用量（４２ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水中）は、７５％の未処置ラットで発作を誘発する用量として決定された。簡潔に言えば、ＰＴＺのｉ．ｐ．注射後、強直−間代発作の発生時間と持続時間を前述のとおり測定した。動物行動実験を行った研究者らは、処置群に対して盲検化された。動物はどの測定でも１回だけ使用した。
【００４０】
ＥｔＯＨ離脱により、ＰＴＺ発作の持続時間は１．７±０．８（溶媒）から８．１±１．２分に著しく増加した（図１Ｅ、ｐ＜０．０５）。このことから、ＥｔＯＨ離脱により発作感受性か増加することが示唆される。ＤＨＭとＥｔＯＨを同時投与すると、ＰＴＺ発作の持続時間の増加が有意に無くなった、低減した、および／または抑制された（０．９±０．２分に減少）。ＤＨＭ前処置単独では、発作の持続時間に有意なまたは目に見える変化は誘発されなかった。またＤＨＭにより、発作の発生率の増加も有意に無くなった、低減した、および／または抑制された（図１Ｆ）。ＥｔＯＨ離脱により、発作の発生率は溶媒（８５％）と比較して増加し１００％になったが、ＤＨＭはこのような増加を抑制、低減、および／または予防した（８５％）。これらの結果から、ＤＨＭはＥｔＯＨ離脱によって誘発される発作感受性と過剰興奮性の増加を緩和することが示唆される。
【００４１】
これらの知見から、ＤＨＭは、急性ＥｔＯＨ中毒、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されるＥｔＯＨ耐性、およびＥｔＯＨ離脱によって誘発される過剰興奮性を有効に抑制、低減および／または予防することが示唆される。
【００４２】
ＤＨＭは単一用量ＥＴＯＨ中毒によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性を予防する
ＤＨＭがＥｔＯＨ中毒によって誘発される急性ＥｔＯＨに対するＧＡＢＡＡＲの感受性の変化を予防するかどうかを判定するために、ＥｔＯＨ離脱によって誘発されるＧＡＢＡＡＲの機能的変化に対するＤＨＭの効果を、４８時間の離脱でのラット海馬薄片中の歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）のホールセルパッチクランプ記録で調べた。
【００４３】
背側海馬の横断薄片（４００μｍ）をＶｉｂｒａｔｏｍｅ（ＶＴ  １００，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および当該技術分野で公知の標準的方法で得た。薄片を人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で連続的に灌流した。Ｌｉａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：１２３６７−１２３７７を参照されたい。
【００４４】
人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、および１０ｍＭ  Ｄ−グルコース）で灌流中に−７０ｍＶの保持電位で３４±０．５℃にて、ＤＧ層にある細胞からホールセルパッチクランプ記録を得た。確実に薄片が十分酸素化され、ｐＨが７．４になるように、ＡＣＳＦに９５％Ｏ２−５％ＣＯ２を連続的に通気した。抵抗７．５〜９ＭΩの薄肉のホウケイ酸ガラスピペットからパッチ電極を引き、ピペット溶液（即ち、１３７ｍＭ  ＣｓＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣｓＯＨでｐＨ７．３０に調節）を充填した。シグナルは、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ７００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、電位固定モードで記録した。約７０％電気補償を行う前に、ホールセルアクセス抵抗は＜２５ＭΩの範囲であった。電位固定記録中、５ｍＶステップコマンド（ｓｔｅｐ  ｃｏｍｍａｎｄ）に反応した容量性過渡変化（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の大きさを測定することによりアクセス抵抗を監視し、＞２０％の変化が生じた場合、データは破棄した。ｍＩＰＳＣ記録を開始する前に、少なくとも１０分間、ピペット溶液を細胞内環境と平衡化させた。細胞内シグナルを３ｋＨｚでローパスフィルタリングし、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０ＡおよびソフトウェアＣＬＡＭＰＥＸ  １０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、２０ｋＨｚのサンプリング周波数でデータを取得した。
【００４５】
薬理学的に分離されたＧＡＢＡＡＲ媒介ｍＩＰＳＣを前述（Ｌｉａｎｇ（２００７）およびＳｈｅｎ（２０１１））のとおり記録した。ＧＡＢＡ濃度−反応曲線では、Ｖａｌｖｅｌｉｎｋ  ８．０２高速交換灌流システム（ＡｕｔｏＭａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用し、取り外し可能なピペット先端部を通してＧＡＢＡ、ＤＨＭ、またはジアゼパムをニューロンに急性投与する間、誘発されたＧＡＢＡＡＲ−電流を記録した。データは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎｓ  ６．０．７，Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して解析した。
【００４６】
ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、ｍＩＰＳＣを解析した。Ｉｔｏｎｉｃは、所与の記録時間の平均ベースライン電流である。Ｉｔｏｎｉｃの振幅は、ピクロトキシン（１００μＭ）またはビククリン（１０μＭ）の前後に測定した保持電流の差として算出した。Ｗｅｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４，８３７９−８３８２；Ｌｉａｎｇ（２００７）；およびＳｈｅｎ（２０１１）を参照されたい。簡潔に言えば、記録は、オフラインで（Ｃｌａｍｐｆｉｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）、２ｋＨｚでローパスフィルタリングされた。ｍＩＰＳＣは、振幅８ｐＡおよび電荷移動２０ｐＡ＊ｍｓの閾値基準で検出した（Ｍｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０．７）。所与の１００秒間の記録時間中に自動検出された全ての事象からｍＩＰＳＣの頻度を測定した。動態分析では、記録トレースの目視検査中に安定なベースライン、急な上昇期（１０〜９０％上昇時間）、および指数関数的減衰を有する単一事象ｍＩＰＳＣだけを選択した。二重および多重ピークｍＩＰＳＣは排除した。各実験条件で少なくとも１００の個々のｍＩＰＳＣ事象を記録した。各細胞中の半上昇時間に合致する選択された平均単一事象の解析からｍＩＰＳＣ動態を得た。二重指数関数を平均ｍＩＰＳＣの下降期に適合させることにより、減衰時定数を得た。所与の記録時間の平均ベースライン電流から、Ｉｔｏｎｉｃの大きさを得た。Ｉｔｏｎｉｃの振幅は、ピクロトキシン（５０μＭ）またはビククリン（１０μＭ）の投与前後に測定された保持電流の差として算出された。Ｌｉａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（２００７）；Ｓｈｅｎ（２０１１）；Ｈａｍａｎｎ（２００２）；およびＭａｎｇａｎ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６７（３）：７７５−７８８を参照されたい。記録およびｍＩＰＳＣ解析を行う研究者らは、ラットが受ける処置（溶媒、ＥｔＯＨ、Ｅ＋Ｄ、またはＤ）に関して盲検化された。
【００４７】
ＥｔＯＨ処置ラットのニューロンの記録から、急性ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）投与によるＩｔｏｎｉｃ増強の消失（図１３Ａ、図３Ｂ、図１３Ｇ）（Ｉｔｏｎｉｃが１４．０±２．１から１４．３±２．８ｐＡになったのに対し、溶媒では：２８．２±４．５から６２．１±３．０ｐＡになった；図２Ａ、ｐ＜０．０５）、およびｍＩＰＳＣのＥｔＯＨ感受性の増加（５８．５±２０．０％増加したのに対し、溶媒対照では：１６．９±４．１％の増加であった（図１３Ｈ、図２Ｂ、ｐ＜０．０５）が明らかになった。対照的に、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ処置ラットのニューロンの記録から、急性ＥｔＯＨに対する反応性は溶媒処置ラットのものと区別不可能であることが分かった（図１３Ｃ）（Ｉｔｏｎｉｃは２７．９±３．０から６１．３±２．３ｐＡに増加し、ｍＩＰＳＣは１８．０±５．９％増加した、図１３Ｇ、図１３Ｈ、図２Ａ、図２Ｂ）。
【００４８】
ＥｔＯＨがＧＡＢＡＡＲα４サブユニットの全タンパク質の変化を誘発するかどうかを判定するために、ラット海馬の並行ウエスタンブロットを行った。ラットの海馬組織を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭピロ硫酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。溶解物を１５分間（１４，０００×ｇ、４℃）遠心分離し、上清を回収してウエスタンブロット分析を行った。ウサギ抗ＧＡＢＡＡＲα４（ａａ  ３７９−４２１）およびマウス抗−β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）の後、ＨＲＰ結合二次抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してバンドを検出し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ５．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して濃度測定により分析した。６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび２％ＳＤＳ（ｐＨ６．７）を含有する緩衝液でバンドをストリッピングし、数回再検査した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造業者の指示に従って測定した。
【００４９】
溶媒、ＥｔＯＨ、Ｅ＋ＤまたはＤＨＭを強制経口投与したラットの、４８時間離脱した後の海馬組織ＧＡＢＡＡＲα４サブユニットのウエスタンブロットを図１２Ｄに示す。ＥｔＯＨ暴露／離脱によりα４ＧＡＢＡＡＲサブユニットの増加が誘発されたが、Ｅ＋Ｄ処置によりこの増加は予防された。ＤＨＭ単独ではα４ＧＡＢＡＡＲサブユニットに変化は生じなかった（図１２Ｄ）。図１２Ｅは、図１２Ｄの実験の全α４サブユニットタンパク質の定量化を示す。これらの結果から、ＤＨＭとＥｔＯＨを併用して処置すると、ＥｔＯＨ離脱によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性を全部または一部抑制、低減および／または予防できることが分かる。従って、本発明は、対象にＤＨＭを投与するステップを含む、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発される対象のＧＡＢＡＡＲ可塑性を治療する、抑制する、低減するおよびまたは予防する方法を提供する。
【００５０】
ＤＨＭは、未処置ラットのＤＧＣのＧＡＢＡＡＲ媒介電流を増大させ、急性ＥＴＯＨによるその増強に拮抗する
ＤＨＭの抗アルコール効果がアルコール作用の主な標的であるＧＡＢＡＡＲとの相互作用によるものであるかどうかを判定するために、未処置ラットの海馬薄片中のＤＧＣのＧＡＢＡＡＲ機能に対する急性ＤＨＭの効果を前述のとおり調べた。急性ＤＨＭ（０．３μＭ）によりＤＧＣ中でのＧＡＢＡＡＲ媒介Ｉｔｏｎｉｃは１７．５±４．９から２９．０±６．７ｐＡに増大し、ｍＩＰＳＣ減衰時間は長くなり、ｍＩＰＳＣ全電荷移動（面積）は濃度依存的に増大した（面積が５７１±６１から６１５±２２ｆＣに増加した）（図３、パネルａ、ａ−１、ａ−２）。
【００５１】
別々に投与したとき、ＥｔＯＨとＤＨＭは両方ともＧＡＢＡＡＲ媒介電流を増強する。しかし、ＥｔＯＨによって誘発されるＩｔｏｎｉｃの増強は、ＥｔＯＨの存在下でＤＨＭにより濃度依存的に減少した（１μＭ  ＤＨＭにより４３．８±１．８から３２．０±２．０ｐＡに減少した、図３、パネルｂ、ｂ−１、ｐ＜０．０５）。しかし、ＤＨＭの存在下でＥｔＯＨを投与しても、Ｉｔｏｎｉｃのそれ以上の増強はなかった（６０ｍＭ  ＥｔＯＨにより、４１．１±２．２から４４．４±３．６ｐＡになった、図３、パネルｃ、ｃ−１）。
【００５２】
これらのデータから、ＤＨＭは、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲの増強を阻害することにより、ＥｔＯＨ中毒によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性に拮抗することが分かる。従って、本発明は、ＤＨＭとＥｔＯＨを同時投与することにより、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性に拮抗する方法を提供する。本発明はまた、ＥｔＯＨに暴露する前にＤＨＭを投与することにより、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性に拮抗する方法も提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、ＤＨＭを投与するステップを含む、ＧＡＢＡＡＲ媒介電流を増強する方法を提供する。
【００５３】
ＤＨＭ＋ＥＴＯＨを同時投与すると、ＥＴＯＨ中毒によって誘発される初代培養海馬ニューロンのＧＡＢＡＡＲ可塑性が予防される
ＤＨＭがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｔＯＨによって誘発される培養ニューロンのＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制するおよび／または予防するかどうかを判定するために、次の実験を行った。
【００５４】
パパイン解離（ｐａｐａｉｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）により、胎生１８日目のラットの海馬ニューロンを準備し、神経細胞用基礎培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）およびＢ２７サプリメント（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。培養は、前述のとおり５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃に維持した。Ｓｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７９：４３２−４４２を参照されたい。
【００５５】
パパイン解離（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）により、胎生１８日目のＳＤラットの海馬ニューロンを準備し、前述のとおり神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＢ２７サプリメント中で培養した。Ｓｔｏｗｅｌｌ  ＪＮ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ  ＡＭ（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２２（３）：５２５−５３６を参照されたい。簡潔に言えば、イソフルランで麻酔し、断頭することにより安楽死させた母親ラットから胚を取り出した。海馬を切除し、Ｃａ２＋−およびＭｇ２＋−非含有ＨＥＰＥＳ緩衝Ｈａｎｋ緩衝塩溶液（ｐＨ７．４５）に入れた。パパイン消化した後、Ｐａｓｔｅｕｒピペットでトリチュレーションし、パパイン阻害剤で処理することにより組織を解離した。細胞をペレット化し、２％Ｂ２７血清非含有サプリメント、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．５ｍＭグルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、および１０μＭグルタメート（Ｓｉｇｍａ）を含有する神経細胞用基礎培地に再懸濁した。
【００５６】
次いで、解離したニューロンを細胞０．３×１０５個／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレート内の１２ｍｍの円形のカバーガラス上に（パッチクランプ記録用）、および／または０．５×１０５個／ｃｍ２の密度で、ポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ、５０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた６ウェルプレート内で（ウエスタンブロットおよびビオチン化アッセイ用）平板培養した。培養は、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃に維持した。その後、培地の３分の１〜半分を、週に２回、２％Ｂ２７サプリメントおよび０．５ｍＭグルタミンを含有する神経細胞用基本培養培地と交換した。
【００５７】
ＤＩＶ１３−１４ニューロン（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１３〜１４日間培養）の後、培養ニューロンの培地の半分を１２０ｍＭ  ＥｔＯＨ（最終ＥｔＯＨ濃度は６０ｍＭであった）、０．２μＭ  ＤＨＭプラス１２０ｍＭ  ＥｔＯＨ、または０．２μＭ  ＤＨＭのみ（ＤＨＭ対照、即ち、ＥｔＯＨを含まない）を含有する神経細胞用基本培養培地と３０分間交換した後、培地を全て、新鮮な神経細胞用基本培養培地半分プラス元の培地半分とそれぞれ交換した。対照ニューロンは、対応する溶媒でＥｔＯＨ処置ニューロンと同じ手順で処置した。以前の実験に鑑みて、ＥｔＯＨ濃度６０ｍＭを選択した。Ｌｉａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（２００７）を参照されたい。特に、培養ニューロンの処置に使用するＥｔＯＨ濃度は６０ｍＭを選択したが、これは、５ｇ／ｋｇの強制経口投与による中毒後に成体ラットで測定される血中レベルに合致し、それにより約６０ｍＭの血液最高血漿中［ＥｔＯＨ］が約２〜３時間持続し、ＧＡＢＡＡＲに顕著な可塑性および耐性が誘発された。
【００５８】
ＤＩＶ１４ニューロン（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１４日間培養）を溶媒、ＥｔＯＨ、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭまたはＤＨＭ単独で処置した後、２４時間離脱させた。次いで、電気生理学的記録の直前に、カバーガラス上で増殖した細胞を灌流室（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移し、倒立顕微鏡（ＴＥ２００、ニコン（Ｎｉｋｏｎ））で可視化した。電位固定モードで、室温（２２〜２５℃）にて−７０ｍＶの保持電位で培養ニューロンからホールセルパッチクランプ記録を得た。細胞を細胞外溶液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（３１０〜３２０Ｏｓｍ、ＮａＯＨでｐＨ７．４０に調節））で灌流した。ガラスピペットに薄片記録のものと同じ内部溶液を充填し、その入力抵抗は４〜７ＭΩであった。前述と同じ薬理学的方法を使用して、ＧＡＢＡＡＲ媒介ｍＩＰＳＣを記録した。ＧＡＢＡ濃度−反応曲線では、Ｖａｌｖｅｌｉｎｋ  ８．０２高速交換灌流システム（ＡｕｔｏＭａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）でニューロンの神経細胞体の近くに配置された取り外し可能な先端部を通してＧＡＢＡおよび／またはＤＨＭを培養ニューロンに急性投与することにより、誘発されたＧＡＢＡＡＲ媒介電流を記録した。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ２００  Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、電気シグナルを増幅した。ホールセル状態を形成した後、膜パッチが安定化し、記録電極とサイトゾルとの間にイオン交換が起こるように、薬物を投与する前に少なくとも１０分間経過させた。ｐＣｌａｍｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）でデータを取得し、２０ｋＨｚでデジタル化し（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＭｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎｓ  ６．０．７，Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用し、当該技術分野で公知の方法を使用して解析した。Ｈａｍａｎｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｎ  ３３（４）：６２５−６３３；Ｓｔｅｌｌ  ＢＭ  ａｎｄ  Ｍｏｄｙ  Ｉ（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２（１０）：ＲＣ２２３；およびＬｉａｎｇ（２００７）を参照されたい。
【００５９】
ＥｔＯＨ暴露／離脱−ニューロンは、Ｉｔｏｎｉｃの大きさ（溶媒−ニューロンの１３．８±１．４ｐＡからＥｔＯＨ−ニューロンの５．６±１．０ｐＡになった）、および急性ＥｔＯＨに対するその反応性（ＥｔＯＨ増強は溶媒−ニューロンの１０９．６±１５．７％からＥｔＯＨ−ニューロンの１４．３±１８．９％に減少した、図４Ａ、ｐ＜０．０５）の劇的な減少を示したが；ＥｔＯＨ暴露／離脱−ニューロンでは、前述のとおり、急性ＥｔＯＨに対するｍＩＰＳＣ反応性の増加が現れた（ＥｔＯＨによる増強は溶媒−ニューロンの３．０±１０．０％からＥｔＯＨ−ニューロンの３３．７±１４．９％に増加した、図４Ｂ、ｐ＜０．０５）。Ｓｈｅｎ（２０１０）を参照されたい。ＤＨＭとＥｔＯＨの同時投与は、ＧＡＢＡＡＲにおけるこれらの効果に拮抗した（平均したＩｔｏｎｉｃの大きさは１１．２±０．６ｐＡであったが、ＥｔＯＨにより２５．２±１．２ｐＡに増加し、ＥｔＯＨによるｍＩＰＳＣの増強は８．３±９．４％であった）；ＤＨＭ単独暴露／離脱ではＧＡＢＡＡＲ機能は変化しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００６０】
本明細書に記載のとおり培養ニューロンのウエスタンブロットを行い、検査した。培養ニューロンのＧＡＢＡＡＲに関するビオチン化アッセイは前述のとおり行った。Ｃｈｕｎｇ  ＷＯ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８（１２）：６７５８−６７６２を参照されたい。簡潔に言えば、培養皿内のニューロンを氷上に載せ、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＰｒｏｔｅｏＣｈｅｍ）を含有するＰＢＳと共に氷上でニューロンを３０分間インキュベートした。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）とのビオチン反応を急冷した後、ニューロンを変更されたＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、２．５ｍＭピロ硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェート、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、および１μｇ／ｍｌロイペプチン）１５０μｌに溶解した。ホモジネートを１５分間遠心分離した（１４，０００×ｇ、４℃）。上清の一部（１０％）を取り出し、β−アクチンを測定した。残りの上清を５０％ニュートラアビジン・アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）６０μｌと共に４時間４℃でインキュベートし、溶解緩衝液で４回洗浄した。アガロース結合タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液２０μｌ中に溶解させ、沸騰させた。前述のとおり、ウエスタンブロットを行った。
【００６１】
ウエスタンブロットのデータおよびビオチン化データから、ＤＨＭは、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発される培養ニューロンの細胞表面ＧＡＢＡＡＲα４サブユニットの変化をなくすまたは逆転させることが分かった（図１４Ｃ）。これらの知見から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＨＭとＥｔＯＨを同時投与すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制、低減および／または予防できることが実証され、それにより本明細書に開示されるラットでのｉｎ  ｖｉｖｏにおける知見が裏付けられる。
【００６２】
ＤＨＭは対照ニューロンとＥＴＯＨ暴露／離脱ニューロンの両方でＧＡＢＡＡＲ機能を増強する
培養海馬ニューロンに対するＤＨＭの効果も調べた。培養ニューロンにおける、ＤＨＭのＧＡＢＡＡＲ媒介Ｉｔｏｎｉｃ（図５Ａ、白丸、ＥＣ５０＝約０．２μＭ）およびｍＩＰＳＣ（図５Ｂ、白丸、ＥＣ５０＝約０．３μＭ）に対する濃度−反応曲線を作成した。ＥｔＯＨ暴露によりＤＨＭに対するＧＡＢＡＡＲの反応性が変化するかどうかを判定するために、ＥｔＯＨ暴露／離脱したニューロンにおけるＤＨＭ濃度−反応曲線も作成した。ＥｔＯＨ暴露は、ＤＨＭとＩｔｏｎｉｃ（図５Ａ、黒丸、ＥＣ５０＝約０．３μＭ）またはｍＩＰＳＣ（図５Ｂ、黒丸、ＥＣ５０＝約０．５μＭ）との濃度−反応関係に影響を及ぼさなかった。これらの結果から、ＤＨＭはＥｔＯＨ暴露／離脱条件でもシナプスＧＡＢＡＡＲおよびシナプス外ＧＡＢＡＡＲを増強することが分かり、ＤＨＭがＥｔＯＨに対する交叉耐性を生じさせないことが分かる。
【００６３】
ＤＨＭのＧＡＢＡＡＲに対する直接的な効果を明らかにするために、ＧＡＢＡ（１〜３００μＭ）を培養海馬ニューロンにパフ投与し、濃度−反応曲線を作成した。ＤＨＭ（０．３および１μＭ）とＧＡＢＡを同時投与すると、同じＧＡＢＡ濃度におけるＧＡＢＡ活性化電流の振幅が増加し、ＧＡＢＡ濃度−反応曲線が左側にシフトした（図５Ｃおよび５Ｄ）。これらの結果から、ＤＨＭはＧＡＢＡＡＲを直接増強することが分かる。
【００６４】
ＤＨＭはＥＴＯＨ中毒を打ち消し、このＤＨＭの効果はフルマゼニルにより拮抗される
以下のように、さらにＬＯＲＲアッセイを行った。ラットを４群に分け、生理食塩水、ＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、Ｅ）、ＥｔＯＨとＤＨＭとの組み合わせ（１ｍｇ／ｋｇ、Ｅ＋Ｄ１）、またはＤＨＭ（Ｄ１）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＥｔＯＨは、６９±１８のＬＯＲＲを誘発した。Ｅ＋Ｄ１は、ＬＯＲＲを２．７±１．４に低減した（図６Ａ）。ＤＨＭは、生理食塩水と同様に、ＬＯＲＲを誘発しなかった。これらの結果から、ＤＨＭは急性ＥｔＯＨ中毒を打ち消すことが示唆される。
【００６５】
追加の前処置および後処置実験も行った。ＥｔＯＨ注射（Ｄ１＋Ｅ）の３０分前に投与すると、ＤＨＭはＬＯＲＲを８．２±４．１に低減した（図６Ｂ）。ＬＯＲＲを誘発したＥｔＯＨ注射の３０分後、生理食塩水を注射したラットではＬＯＲＲがさらに４２±９．１継続したが；ＤＨＭを注射すると、残りのＬＯＲＲが１９±１．０に低減した（Ｅ＋生理食塩水の４２％、図６Ｂ）。これらの結果から、ＤＨＭはＥｔＯＨ中毒を打ち消すことが示唆される。従って、ＥｔＯＨ暴露の３０分前または３０分後に投与した場合でも、ＤＨＭは中〜高用量のＥｔＯＨ中毒を効果的に緩和する。
【００６６】
ＤＨＭの抗ＥｔＯＨ効果の標的を調べるため、ＧＡＢＡＡＲを調節する選択的ベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルを試験した。Ｈｕｎｋｅｌｅｒ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：５１４−５１６を参照されたい。ＥｔＯＨは６９±１１．３ＬＯＲＲを誘発した；ＤＨＭ（３ｍｇ／ｋｇ）とＥｔＯＨを同時注射するとＬＯＲＲが２．７±１．７に低減した（図６Ｃ）。フルマゼニル（１０ｍｇ／ｋｇ）はＤＨＭによるＬＯＲＲの低減を逆転させた（５６．１±４．６）。ＤＨＭ用量を１０ｍｇ／ｋｇに増加すると、フルマゼニルの効果が低下した（２９．３±４．８）が、フルマゼニルの用量を３０ｍｇ／ｋｇに増加すると、ＤＨＭ効果に対するその拮抗作用が増大した（５８．２±３．９）。フルマゼニルとＥｔＯＨの同時注射では、ＥｔＯＨ群と比較してＬＯＲＲは変化しなかった（７１．１±４．８、図６Ｃ）。これらの結果から、ＧＡＢＡＡＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥｔＯＨ誘発性ＬＯＲＲという行動効果に重要な役割を果たすことが示唆される。フルマゼニルは、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲに対するＤＨＭの効果に競合的に拮抗する。さらに、その結果から、ＤＨＭとＥｔＯＨの相互作用は、ＧＡＢＡＡＲベンゾジアゼピン部位におけるＤＨＭの作用を含み、これがＥｔＯＨ中毒に対するＤＨＭの治療効果の根底にあり得ることが示唆される。
【００６７】
高用量のＤＨＭ（ＥｔＯＨ中毒に対するそのアンタゴニスト効果のための用量より数百倍高い用量）について調べた。ＤＨＭ（１００および３００ｍｇ／ｋｇ）は、それぞれ、０．９±０．８および４．０±２．８のＬＯＲＲしか誘発しなかった（図７）。このことから、ＤＨＭは典型的なベンゾジアゼピンであるだけではないことが示唆される。高用量のフルマゼニル（２００ｍｇ／ｋｇ）ではＬＯＲＲは誘発されなかった（図７）。
【００６８】
ＥｔＯＨ群およびＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群の血漿中ＥｔＯＨ濃度（血漿中［ＥｔＯＨ］）を測定するために、ＬＯＲＲアッセイ中、５〜１８０分の様々な時点で静脈血サンプルを採取した。血漿中［ＥｔＯＨ］アッセイを行うために、ＥｔＯＨまたはＥ＋Ｄｉ．ｐ．注射後の様々な時点（０、５、３０、６０、９０、１８０分）におけるラットの尾静脈から、または随意アルコール２瓶選択手順後のラット（ＥｔＯＨ群およびＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群）から血液サンプルを採集した。Ｌｉａｎｇ（２００７）を参照されたい。ラットを拘束管に入れ、その尾は約４０℃で温暖であった。レールの先端部の尾静脈を鋭利な刃で穿刺した。約０．２ｍｌの静脈血を、ヘパリンリチウム（Ｒａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｙｏｎｋｅｒｓ，ＮＹ）を含有する毛細管採血チューブに滴下した。血液サンプルを２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、アッセイを行うまで−８０度で貯蔵した。各血液サンプルのＥｔＯＨ含有量をＥｔＯＨ標準液を用い、アルコールオキシダーゼ反応手順（ＧＭ７  Ｍｉｃｒｏ−Ｓｔａｔ；Ａｎａｌｏｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｕｎｅｎｂｅｒｇ，ＭＡ）を使用してデュープリケートで測定した。
【００６９】
ＥｔＯＨにより、５分以内にＬＯＲＲの発生が誘発された。血漿中［ＥｔＯＨ］は５分間急速に増加した後、約６０分まで比較的ゆっくりと増加し、その後［ＥｔＯＨ］は徐々に低下した。Ｅ＋Ｄ１群とＥ＋Ｄ１０群（ＤＨＭ１、１０ｍｇ／ｋｇ）では、血漿中［ＥｔＯＨ］の上昇時間が早い時点で遅くなった（図８）。しかし、３０分〜６０分まで、ＥｔＯＨ群とＥ＋Ｄ１群の間には血漿中［ＥｔＯＨ］に統計学的有意差は見られなかった（３０分：ＥｔＯＨ対Ｅ＋Ｄ１＝３３４．９±３７．８対２８７．７±２１．５ｍｇ／ｄｌ、および６０分：ＥｔＯＨ対Ｅ＋Ｄ１＝３５３．７±３５．４対３２６．２７±１７．８ｍｇ／ｄｌ）が、その時間中、Ｅ＋Ｄ１０は［ＥｔＯＨ］を有意に減少させた（３０分：２５０．６±１２．２および６０分：３０６．０±７．６ｍｇ／ｄｌ、図８）。３０分〜６０分の間、ＥｔＯＨ群は眠っていたが、Ｅ＋Ｄ１群とＥ＋Ｄ１０群は覚醒していた。これらの結果から、ＤＨＭはＥｔＯＨの薬物動態に影響を及ぼすことが示唆されるが、この効果は、ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲをＤＨＭが防止することを説明するのに十分ではない。
【００７０】
ＤＨＭはＥＴＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲの増強に拮抗し、その効果はフルマゼニルにより阻害される
前に行ったとおり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける海馬薄片の歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）でホールセルパッチクランプ記録を行った。ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）の灌流液中投与により、Ｉｔｏｎｉｃは２２．０±０．７から４６．９±１．４ｐＡに増加し、ｍＩＰＳＣは０．５３±０．０２から０．６４±０．０２ｎＣに増大した（図９、パネルＡ〜Ｃ）。ＥｔＯＨの効果は、ＤＨＭにより濃度依存的に拮抗された（０．３および１．０μＭ）。
【００７１】
次いで、ＤＨＭの抗ＥｔＯＨ作用に対するフルマゼニルの効果を本明細書に記載のとおり試験した。ＤＨＭ（３μＭ）は、ＥｔＯＨによって増強されるＩｔｏｎｉｃを４４．８±２．３から２１．０±０．９ｐＡに、ｍＩＰＳＣを０．７８±０．０１から０．７０±０．０２ｎＣに減少させたが、フルマゼニル（１０μＭ）によりＤＨＭの作用は逆転した（Ｉｔｏｎｉｃを３７．３±１．６ｐＡに、ｍＩＰＳＣを０．７８±０．０１ｎＣに逆転させた、図９、パネルＤ〜Ｆ）。これらのデータから、ＤＨＭは、ＥｔＯＨによって誘発されるシナプス外ＧＡＢＡＡＲとシナプスＧＡＢＡＡＲの両方の増強に拮抗し、その効果はフルマゼニルによって阻害されることが示唆される。これらのデータは行動実験観察（図６Ｃ）と一致し、ＧＡＢＡＡＲベンゾジアゼピン部位に対するＤＨＭとＥｔＯＨの相互作用が、ＥｔＯＨ中毒に対するＤＨＭの治療効果の根底にある細胞機構であることが分かる。
【００７２】
ＤＨＭはベンゾジアゼピン部位におけるＧＡＢＡＡＲの正の調節物質である
海馬薄片中のＤＧＣのＧＡＢＡＡＲ媒介ＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣに対するＤＨＭ（０．１〜３０μＭ）の効果。ＤＨＭ（１μＭ）によりＩｔｏｎｉｃが増大し（２２．５±２．５から４４．０±４．１ｐＡ）、ｍＩＰＳＣ面積が増加した（０．５９±０．０１から０．７２±０．０３ｎＣ、図１０、パネルＡ〜Ｃ）が、この効果は濃度依存的であった（０．１〜３０μＭ）。これらの結果から、ＤＨＭはＣＮＳニューロンのＧＡＢＡＡＲ機能を増強することが分かる。
【００７３】
ＧＡＢＡＡＲに対するＤＨＭの作用部位をさらに調べるため、ＤＩＶ１３〜１４（ＤＩＶ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数）における培養海馬ニューロンのＧＡＢＡＡＲ機能を亢進させるＤＨＭに対するフルマゼニルの効果を分析した。ＤＨＭ（１μＭ）は、Ｉｔｏｎｉｃ（対照の１９４．９±１３．６％）およびｍＩＰＳＣ面積（対照の１８１．８±９．２％、図１０、パネルＤ〜Ｆ）を増強した。フルマゼニルは、ＤＨＭによって増大するＧＡＢＡＡＲ電流を濃度依存的に抑制した（１０μＭフルマゼニルによりＩｔｏｎｉｃ：１４３．０±３．２％に、ｍＩＰＳＣ：１２５．７±３．９％に減少、図１０、パネルＤ〜Ｆ）。これらの観察から、ＤＨＭはＧＡＢＡＡの同じ部位に作用し、ベンゾジアゼピンと同様にＧＡＢＡＡＲ機能を増強することが示唆される。
【００７４】
未処置成体ラットから得られる皮質膜ホモジネート中の［３Ｈ］フルニトラゼパム結合を使用するベンゾジアゼピン部位に対するＤＨＭ（０．０３〜１００μＭ）の作用を調べた。放射性リガンド結合アッセイのためのラット皮質膜の標準的な準備手順は、前述のとおり行ったが、遠心分離および洗浄の速度と回数、ならびに緩衝液の組成は変更した。Ｌｉ  ＧＤ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：８６１５−８６２０を参照されたい。未処置ラット皮質を脳から切除し、０．３２Ｍショ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、６５０×ｇ、４℃で遠心分離した。その後の上清を１５０，０００×ｇで遠心分離し、所望の膜含有ペレットを回収した。ペレットを洗浄し、１回目に氷冷水を使用し、２回目に５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭベンザミジンＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭベンゼトニウムＨＣｌ、０．０１％バシトラシン、０．２ＰＭＳＦを含有する膜緩衝液（ｐＨ７．４）を使用してさらに２回遠心分離し、得られるペレットを凍結した。結合アッセイの当日、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＫＣｌを含有するアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４）中でペレットをホモジナイズし、遠心分離し、新鮮なアッセイ緩衝液中に再懸濁させ、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌにした。［３Ｈ］フルニトラゼパム（８５．２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、脳ホモジネート、およびＤＨＭを混合して最終アッセイ容量０．５ｍｌにし、氷上でインキュベートし、Ｂｒａｎｄｅｌ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  Ｍ−２４Ｒ（Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）で濾過した。サンプルの計数はＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ−３８０１液体シンチレーションカウンターで行った。特異的結合は、全結合量（ゼロ非標識リガンド）から最終濃度１０μＭのフルラゼパム（Ｓｉｇｍａ）の存在下での結合を減じたものとして定義された。データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＩＣ５０（一部位競合式）およびＨｉｌｌの式の傾き（Ｓ字状用量反応式）を求めた。実験はトリプリケートで行った。
【００７５】
ＤＨＭによる［３Ｈ］フルニトラゼパム結合の有意な抑制が０．３μＭから濃度依存的に認められたが、ＩＣ５０は４．３６μＭであり、Ｈｉｌｌの式の傾きは−０．７３であった（図１０、パネルＧ）。これらのデータから、ＤＨＭがＧＡＢＡＡＲへの［３Ｈ］フルニトラゼパム結合を、見かけ上競合的に、直接的に抑制することが示唆され、ＤＨＭがＧＡＢＡＡＲベンゾジアゼピン部位に作用するものと考えられることが分かる。
【００７６】
培養海馬ニューロンのＧＡＢＡＡＲ媒介電流に対するＤＨＭの効果も調べた。ＤＨＭは、Ｉｔｏｎｉｃを濃度依存的に増強し（０．３μＭ  ＤＨＭにより、９．５±１．５から２１．０±２．３ｐＡになり、ＥＣ５０は約０．２０μＭであった）、ｍＩＰＳＣを増加させた（１μＭ  ＤＨＭにより対照の１２８．２±８．３％になり、ＥＣ５０は約０．２０μＭであった；１μＭより高いＤＨＭに対する反応は僅かに減少した、図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【００７７】
ＤＩＶ１４の培養ニューロンで１０および３００μＭ  ＧＡＢＡの局所パフ投与によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ電流に対するＤＨＭの効果を調べた。ＤＨＭ（０．３および１μＭ）とＧＡＢＡを同時投与すると、ＧＡＢＡ電流の振幅が増大し、ＧＡＢＡ濃度−反応曲線は左側にシフトした（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。これらの結果から、ＤＨＭはＧＡＢＡＡＲに直接作用し、シナプスＧＡＢＡＡＲおよびシナプス外ＧＡＢＡＡＲを強力に増強することが示唆される。
【００７８】
ＤＨＭはＥＴＯＨ離脱症候を予防し、ＥＴＯＨ暴露／離脱によって誘発されるラット海馬のＧＡＢＡＡＲ可塑性を予防する
ラットのＥｔＯＨ離脱症候に対するＤＨＭの効果を調べた。ラットを４群に分け、溶媒、ＥｔＯＨ（５ｇ／ｋｇ、Ｅ）、ＥｔＯＨとＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、Ｅ＋Ｄ）の組み合わせ、またはＤＨＭをそれぞれ強制経口投与した。注射の４８時間後、ラットをさらに３群に分け、ＥｔＯＨ離脱の徴候を測定した。
【００７９】
ＥｔＯＨ離脱に関連する不安および歩行運動／運動失調をＥｔＯＨ離脱したラットで、高架十字迷路で測定した（ＥＰＭ、図１２Ａ）。滞在時間を分単位で測定した。十字迷路を作成し、前述のとおり測定値を記録した。Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１０：１２３４−１２４５を参照されたい。簡潔に言えば、迷路は床から１ｍ上昇させ、直角に配置された長さ５１ｃｍ、幅１１．５ｃｍの４本のアームを備えた。クローズドアームは、アームの長さにわたる高さ３０ｃｍの不透明な壁を有した。試験時、各動物を迷路の中心にオープンアームに面するように置き、５分間探索させた。このセッション中、動物の行動（例えば、アームに進入する回数、および１回の進入当たりの各アームでの滞在時間）をカムコーダーで記録した。
【００８０】
溶媒群に属する対象のオープンアームでの滞在時間は２．７１±０．７１であり、クローズドアームでの滞在時間は１．８０±０．６７であった。ＥｔＯＨ群に属する対象は、溶媒群と比較して、オープンアームでの滞在時間が有意に短くなり（０．８８±０．３２）、クローズドアームでの滞在時間が長くなった（３．６４±０．２７）が；ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ（Ｅ＋Ｄ）群に属する対象の滞在時間は類似していた（オープン：２．６８±０．７７、およびクローズド：１．８８±０．７９）。ＤＨＭは、ラットのどちらのアームでの滞在時間にも影響を及ぼさなかった（オープン：２．９２±０．７０およびクローズド：１．５２±０．５６）。これらのデータから、（１）ＥｔＯＨ暴露／離脱により不安が生じる、（２）ＤＨＭとＥｔＯＨを併用すると、ＥｔＯＨによって誘発される不安が抑制、低減および／または予防される、および（３）ＤＨＭは不安レベルに影響を及ぼさないことが示唆される。
【００８１】
ＥｔＯＨに対する耐性を、急性ＥｔＯＨによって誘発されるＬＯＲＲ（単位：分、図１２Ｂ）で測定した。ＥｔＯＨにより、溶媒群の対象では６３．６±７．０のＬＯＲＲが誘発され、それに対しＥｔＯＨ群の対象では１０．８±３．８のＬＯＲＲが誘発された。ＥｔＯＨによりＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群の対象では６１．０±３．８のＬＯＲＲが誘発され、ＤＨＭ群の対象では６５．６±８．４のＬＯＲＲが誘発された。これらの結果から、ＥｔＯＨへの単回暴露によりＥｔＯＨに対する耐性が生じ、ＤＨＭは、このＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されたＥｔＯＨに対する耐性を抑制、低減および／または予防することが示唆される。
【００８２】
本明細書に記載のとおり、過剰興奮性を、ＰＴＺ誘発性発作の持続時間で分析した（図１２Ｃ）。ＰＴＺにより、溶媒群の対象では０．９±０．２分間の発作が誘発され、ＥｔＯＨ群の対象では６．５±１．１分間の発作が誘発された。発作の持続時間はＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群で最小であった（１．７±０．８分間）。ＤＨＭ群におけるＰＴＺ誘発性発作は、溶媒群と類似していた（０．６±０．４分間）。これらの結果から、ＥｔＯＨ暴露／離脱により発作感受性（過剰興奮性）が増加し、ＤＨＭはこれらのＥｔＯＨの効果を緩和することが示唆される。
【００８３】
上記の４つの処置を行った４８時間後の、海馬のＧＡＢＡＡＲα４サブユニットの全タンパク質含有量を分析した。ウエスタンブロットから、ＥｔＯＨ暴露により、全α４−タンパク質レベルが、溶媒群のものと比較して、１８４．０±２６．０％に増加することが分かった。ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群では全α４−タンパク質レベルは増加しなかった（対照の９３．０±２１．０％）。ＤＨＭ暴露は、α４サブユニットレベルに影響を及ぼさなかった（対照の８８．３±１０．３％、図１２Ｄおよび１２Ｅ）。これらのデータから、ＤＨＭは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＥｔＯＨ暴露／離脱によって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性を抑制、低減および／または予防することが分かる。
【００８４】
ＤＨＭがＥｔＯＨによって誘発されるＣＮＳニューロンのＧＡＢＡＡＲ可塑性を予防するかどうかを分析した。４群のラットに溶媒（溶媒群）、ＥｔＯＨ（ＥｔＯＨ群）、ＥｔＯＨとＤＨＭの組み合わせ（１ｍｇ／ｋｇ、Ｅ＋Ｄ、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群）、またはＤＨＭ（ＤＨＭ群）を強制経口投与した。４８時間離脱した後、海馬薄片中のＤＧＣで、ホールセルＧＡＢＡＡＲ媒介電流を記録した。溶媒群では、ＥｔＯＨ（６０ｍＭ）の灌流液中投与により、Ｉｔｏｎｉｃが２８．８±３．１から６２．１±３．３ｐＡに増大した（図１３、パネルＡ、Ｇ）。ＥｔＯＨによりｍＩＰＳＣ面積は０．６７±０．０８から０．７８±０．１０ｎＣに増大した（図１３、パネルＡ、Ｈ）。ＥｔＯＨ群では、ＥｔＯＨによりＩｔｏｎｉｃは増加しなかった（１３．０±０．９５から１３．８±１．２８ｐＡになった）が、ｍＩＰＳＣ面積は０．９５±０．０１から１．４±０．０２ｎＣに大きく増大した（図１３、パネルＢ、Ｇ、Ｈ）。ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ群では、ＥｔＯＨによりＩｔｏｎｉｃが３０．０±２．８から６０．０±２．２ｐＡに増加したが、ｍＩＰＳＣ調節は変化しなかった（０．７０±０．０３から０．７８±０．０２ｎＣになった、図１３、パネルＣ、Ｇ、Ｈ）。ＤＨＭ群では、ＥｔＯＨに対するＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣの反応は、溶媒群（図１３、パネルＤ、Ｇ、Ｈ）のものと類似していた。これらの結果から、ＥｔＯＨとＤＨＭの組み合わせを胃内投与すると、その後のＥｔＯＨ耐性と、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性が両方とも抑制される、低減されるおよび／または予防されることが示唆される。
【００８５】
ベンゾジアゼピンのアゴニストであるゾルピデムの、上記の４つの処置の後の、ラットのＤＧＣに対する効果。ゾルピデムは、溶媒群と同様にＤＨＭ群でもＧＡＢＡＡＲ電流の増強を誘発したが、ＥｔＯＨ群のＧＡＢＡＡＲ電流には影響を及ぼさなかったため、ＥｔＯＨはゾルピデムに対する交叉耐性を生じさせる（図１３、パネルＦ、Ｉ、Ｊ）ことが示唆される。これらの結果から、ＥｔＯＨとＤＨＭを併用投与すると、ＥｔＯＨによって誘発されるＧＡＢＡＡＲ可塑性が抑制、低減および／または予防され、ＤＨＭはＥｔＯＨに対しても、ゾルピデムに対しても交叉耐性も生じさせないことが分かる。
【００８６】
ＥｔＯＨに予め暴露された培養ニューロンに対するＤＨＭの効果を調べた。ＤＨＭの灌流液中投与により、ＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣが濃度依存的に増大した（０．０３〜３０μＭ、図１４Ａおよび１４Ｂ）。Ｉｔｏｎｉｃ（約０．２０μＭ）およびｍＥＰＳＣ（約０．１５μＭ）を増大させるＥＣ５０は溶媒群のものと類似していた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。データから、ＤＨＭは、ＥｔＯＨに対する耐性を生じさせるＥｔＯＨ暴露／離脱の後でも、依然としてシナプスＧＡＢＡＡＲおよびシナプス外ＧＡＢＡＡＲの増強に有効であることが示唆される。
【００８７】
細胞表面ビオチン化と、その後のウエスタンブロット分析を使用して、培養ニューロンのα４サブユニットの表面発現を測定した。ＥｔＯＨ処置ニューロンでは、α４サブユニット表面発現の増加が認められた（対照の２４９．７±２８．１％）が；ＥｔＯＨ＋ＤＨＭで処置されたニューロンではこの増加が阻害された（対照の１２３．０±８．４％、図１４Ｃおよび１４Ｄ）。ＤＨＭによりα４表面発現は変化しなかった（対照の１２５．０±２７．３％、図１４Ｃおよび１４Ｄ）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから、ＥｔＯＨとＤＨＭを併用投与すると、通常、ＥｔＯＨへの暴露（ＥｔＯＨへの単回暴露および慢性的間欠的暴露を含む）により生じるＧＡＢＡＡＲ可塑性が抑制、低減および／または予防されることが分かる。
【００８８】
ＤＨＭにより慢性的随意アルコール摂取ラットモデルでのＥＴＯＨ消費が低減する
アルコール消費に対するＤＨＭの効果を調べた。流体は全て１００ｍｌのガラスメスシリンダーに入れて提供し、逆転明暗サイクル室を消灯して１５分後にステンレス鋼製の飲み口を挿入した。流体を提供して３０分後と２４時間後に瓶の重量を測定した。健康状態を監視するために各ラットの体重を毎日測定し、体重１キログラム当たりのエタノール摂取グラム数を算出した。ラットを４群に分け、それぞれ水／水、２０％ＥｔＯＨ／水、Ｅ＋Ｄ／水、またはＤＨＭ／水の２瓶の選択肢に間欠的にアクセスさせた。
【００８９】
ラットは、２週間、水／水、２０％（ｗ／ｖ）ＥｔＯＨ／水、ＥｔＯＨ＋ＤＨＭ（０．０５ｍｇ／ｍｌ、Ｅ＋Ｄ）／水またはＤＨＭ／水の２瓶の選択肢に自由にアクセスするように訓練された。第１週は、どの瓶にも甘味料（２ｐｋ／Ｌ）を添加した。第２週は、どの瓶にも甘味料（１ｐｋ／Ｌ）を添加した。訓練後、毎週３回各２４時間（月曜日、水曜日、および金曜日）、ラットに水／水、ＥｔＯＨ／水、Ｅ＋Ｄ／水、またはＤＨＭ／水（全て甘味料なし）の２瓶の選択肢にアクセスさせた。ＥｔＯＨアクセス時間とＥｔＯＨアクセス時間との間、ラットを２瓶の水に無制限にアクセスさせた。左右の好みを調整するため、ＥｔＯＨ瓶の配置は、各ＥｔＯＨ飲酒セッション毎に交替した。ラットは、２０％ＥｔＯＨ間欠的アクセス２瓶選択パラダイムを７週間継続した（２１回のＥｔＯＨ−アクセスセッション）。ＥｔＯＨ群の半分には、第５週（１３回目のセッション）以降、ＥｔＯＨ瓶にＤＨＭを添加した。残りのＥｔＯＨ群はＥｔＯＨ−アクセスセッションを継続した。ＥｔＯＨ消費を体重１キログラム当たり消費されるＥｔＯＨのグラム数として表した。ラットの２瓶の水へのアクセスは対照群と見なした。実験の終了時、対照ラットとＥｔＯＨ飲酒ラットの間には体重に有意差はなかった。
【００９０】
第２週から、ＥｔＯＨ／水群ではＥｔＯＨ消費が３．１±１．３から７．５±０．５ｇ／ｋｇ／日に増加した。ＥｔＯＨとＤＨＭを併用投与すると（Ｅ＋Ｄ／水群）、このＥｔＯＨ摂取の増加が打ち消される（２．６±０．４ｇ／ｋｇ／日、図１５Ａ）。４週間後、ＥｔＯＨ／水群をさらに２群に分け、一方はＥｔＯＨ／水を継続し、他方にはＥ＋Ｄ／水を提供した。Ｅ／水の部分群は高レベルのＥｔＯＨ摂取を維持したが、Ｅ＋Ｄ／水の部分群ではＥｔＯＨ消費が、Ｅ＋Ｄ／水で開始した群のものと同様に、第５週の終わりに１．８±１．０ｇ／ｋｇ／日、および第６週の終わりに１．２±０．２ｇ／ｋｇ／日に大きく低減した（図１５Ａ）。４群間には全流体消費に有意差はない。これらの結果から、ＤＨＭは、アルコールと共に摂取すると、過度のアルコール消費（乱用）を抑制、低減および／または予防することが示唆される。ＥｔＯＨ暴露により高い随意ＥｔＯＨ消費が既に定着している場合、ＤＨＭによりアルコール消費が低減する（アルコール乱用が治療される）。
【００９１】
第４週の終わりに、Ｅ＋Ｄ／水に暴露されたラット群の血漿中［ＥｔＯＨ］は、Ｅ／水に暴露された群のものより有意に低かった。血漿中［ＥｔＯＨ］は、測定された消費ＥｔＯＨ量とよく相関した。各動物の血漿中［ＥｔＯＨ］（ｍｇ／ｄｌ）は、第４週の終わりのアルコール日に開始した３０、４５、６０および１００分の随意２０％ＥｔＯＨの後に測定した。２群の血漿中［ＥｔＯＨ］には有意差があった（ｐ＜０．０５、図１５Ｂ）。これらのデータから、ＤＨＭは、高い随意ＥｔＯＨ消費（ＥｔＯＨ乱用）を抑制、低減および／または予防することが示唆される。
【００９２】
追加の実験を行ったが、これから、雌性ラットではＤＨＭ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｎ＝ラット６匹／群）で併用処置するとＥｔＯＨ（３ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって誘発されるＬＯＲＲ持続時間が減少することが分かるが、これは雄性ラットのものと類似している。同様に、雌性ラットでは、ＤＨＭ＋ＥｔＯＨを併用投与すると同様に、ＥｔＯＨ中毒／離脱によって誘発されるＰＴＺ誘発性発作の持続時間および発作の発生率の増加が抑制、低減および／または予防される。
【００９３】
本明細書の実験から、培養されたまたは薄片の海馬ニューロンで、ＤＨＭはＧＡＢＡＡＲ媒介ｍＩＰＳＣおよび強直性電流を濃度依存的に増強したことが分かる。培養ニューロンでは、ＤＨＭによりＧＡＢＡ濃度−反応関係が左側にシフトした。これらの結果から、ＤＨＭは、シナプスＧＡＢＡＡＲとシナプス外ＧＡＢＡＡＲの両方を増強することが示唆される。しかし、ＤＨＭ暴露／離脱により、細胞レベルでの持続的なＧＡＢＡＡＲ可塑性は誘発されなかった。ＤＨＭは、ＥｔＯＨ中毒を緩和するのに十分な用量範囲で、ＬＯＲＲなどの中毒性症候も誘発せず、発作感受性の増加などのＡＷＳも引き起こさず、ＥｔＯＨに対する交叉耐性も誘発しなかった。従って、ＤＨＭを使用して、急性および慢性的アルコール消費を治療することができる。
【００９４】
ラットのＥｔＯＨ暴露からの離脱において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの行動実験から、ヒトＡＷＳで観察される症候と同様に、発作閾値の低下、不安、および鎮静／麻酔薬に対する耐性が認められる。本明細書に開示するとおり、ＤＨＭとＥｔＯＨの併用投与から４８時間の離脱で急性ＥｔＯＨに対する顕著なＩｔｏｎｉｃ感受性が認められることが、海馬薄片での試験から分かる。また、ＤＨＭとＥｔＯＨを併用投与すると、ＥｔＯＨ処置によるベースラインＩｔｏｎｉｃの大きさの低減が阻害される。類似のＤＨＭ効果が培養海馬ニューロンでも認められた。これらのラット海馬の結果から、ＥｔＯＨによって誘発されるα４含有ＧＡＢＡＡＲの変化はＤＨＭによって阻害されることが分かる。これらの結果から、ＤＨＭは、ＧＡＢＡＡＲ機能に対するＥｔＯＨの効果に拮抗するだけでなく、シナプス外からシナプスへのα４含有ＧＡＢＡＡＲの再局在化を阻害することも示唆される。従って、ＤＨＭを使用して、ＥｔＯＨへの暴露により生じるＧＡＢＡＡＲ可塑性に関連するアルコール使用障害を治療することができる。
【００９５】
本明細書の実験から、未処置ＧＡＢＡＡＲおよびＥｔＯＨに暴露されたＧＡＢＡＡＲでは、ＤＨＭがシナプスＧＡＢＡＡＲおよびシナプス外ＧＡＢＡＡＲを効果的に増強し続けることが分かる。さらにＤＨＭは、急性ＥｔＯＨによる、脳薄片中の未変性海馬ニューロンのシナプスＧＡＢＡＡＲの増強を阻害する。これらの結果から、ＤＨＭはＧＡＢＡＡＲの調節物質であることが分かり、それによりＤＨＭはベンゾジアゼピンなどの他の薬剤に対して耐性を有する対象のアルコール中毒およびＡＷＳの有効な治療となり得ることが分かる。
【００９６】
ダイジン、ケルセチン、ゲニステイン、ミリセチン、およびプエラリンを用いた比較実験から、ＥｔＯＨ暴露によるＧＡＢＡＡＲに関連するアルコール中毒、アルコール使用障害およびアルコール乱用に対するＤＨＭの効果は特有であり得ることが分かる。特に、ラット海馬薄片のニューロンのパッチクランプ記録から、Ａ）ＤＨＭはシナプス外ＧＡＢＡＡＲ媒介強直性電流（Ｉｔｏｎｉｃ）およびシナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）を増強するが、ダイジンはＩｔｏｎｉｃには影響を及ぼさず、ｍＩＰＳＣを有意に増強したことが分かる。ケルセチンは、ＩｔｏｎｉｃにもｍＩＰＳＣにも影響を及ぼさなかった。従って、ＤＨＭを使用してシナプス外ＧＡＢＡＡＲを選択的に調節することができる。ラット海馬薄片中のニューロンのパッチクランプ記録から、６０ｍＭ  ＥｔＯＨの存在下で、ＤＨＭは、ＥｔＯＨによるＧＡＢＡＡＲ媒介ＩｔｏｎｉｃおよびｍＩＰＳＣの増強を用量依存的に阻害するが、ダイジンおよびケルセチンは阻害しないことが分かる。［３Ｈ］フルニトラゼパム結合アッセイから、ＤＨＭ、ダイドゼインおよびダインジン（ｄａｉｎｚｉｎ）はＧＡＢＡＡＲに結合するが、［３Ｈ］フルニトラゼパムにより著しく置換され；他方、ゲニステイン、ミリセチン、プエラリンおよびケルセチンはＧＡＢＡＡＲに結合しないことが分かる。これらの結果から、ＤＨＭは、アルコールによるＣＮＳニューロンのＧＡＢＡＡＲの増強に特有に拮抗することが分かる。
【００９７】
本発明の開示を理解するまたは完成させるのに必要な程度、本明細書に記載の全ての出版物、特許、および特許出願は、それぞれが個々に参照により本明細書に明示的に援用されるのと同程度、参照により本明細書に明示的に援用される。
【００９８】
本明細書に開示される実施例および実験は、本発明を説明することを目的とするものであって、本発明を限定するものではない。本発明の例示的実施形態を上記のとおり記載したが、当業者は、本明細書内の開示内容は例示に過ぎず、本発明の範囲内で他の様々な代替、改変、および変更がなされ得ることに留意すべきである。従って、本発明は本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールへの暴露によって起こるＧＡＢＡＡＲ可塑性に関連するアルコール中毒およびアルコール使用障害を治療する、抑制する、低減するおよび／または逆転させるのに使用される、エタノールに暴露される、暴露されているおよび／または暴露されたＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物。
【請求項２】
前記ＧＡＢＡＡ受容体の活性を増強するためにＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡＡ受容体に対するエタノールの作用に拮抗すべく、エタノールへの暴露前、暴露中および／または暴露後にＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物。
【請求項４】
対象のエタノール中毒、アルコール離脱症候群の症候、アルコール使用障害および／またはアルコール乱用を治療する、抑制するおよび／または低減するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物。
【請求項５】
請求項４に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記アルコール離脱症候群の症候が、エタノールに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項４に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記治療が前記エタノールへの暴露によって起こる前記対象の注意力の低下を低減するまたは抑制することを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記ジヒドロミリセチン組成物が有効量投与されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記ジヒドロミリセチン組成物がエタノールへの暴露前、暴露中および／または暴露後に投与されることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記ジヒドロミリセチン組成物が飲料などの食品の形態で投与され、前記食品がエタノールを含有しても含有しなくてもよいことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＧＡＢＡＡ受容体に投与されるジヒドロミリセチン組成物において、前記ジヒドロミリセチン組成物がエタノールと併用投与されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
本明細書に開示される本発明。