(57)【要約】凝血塊結合化合物に関連する組成物および方法を開示する。例えば、表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む組成物を開示する。修飾された凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合することができ、ここで、組成物は、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する。修飾された凝血塊結合化合物は、その修飾されていない誘導体と比較して、腫瘍における凝固を増強することができる。開示されたターゲティングは、ガンならびに他の疾患および障害の治療に有用である。【選択図】なし
2013515008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む組成物であって、修飾された凝血塊結合化合物が凝固した血漿タンパク質と選択的に結合し、組成物が、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅し、修飾された凝血塊結合化合物が、その修飾されていない誘導体と比較して腫瘍における凝固を増強する、組成物。
【請求項２】
修飾された凝血塊結合化合物がメチル化された凝血塊結合化合物を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
メチル化された凝血塊結合化合物がメチル化されたアミノ酸断片を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
メチル化されたアミノ酸断片が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
メチル化されたアミノ酸断片が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
メチル化されたアミノ酸断片がアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
メチル化されたアミノ酸断片が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
メチル化されたアミノ酸断片がアミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる、請求項４記載の組成物。
【請求項９】
アミノ酸配列が少なくとも１つ位置でＮまたはＣ−メチル化されている、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ（配列番号８）、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ（配列番号１０）、ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１２）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
複数の凝血塊結合化合物をさらに含み、凝血塊結合化合物が凝固した血漿タンパク質と選択的に結合し、複数の凝血塊結合化合物が、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
複数の凝血塊結合化合物の１以上が修飾された凝血塊結合化合物であり、修飾された凝血塊結合化合物が、それらの修飾されていない誘導体と比較して腫瘍における凝固を増強する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
複数の凝血塊結合化合物の修飾された凝血塊結合化合物の１以上が、メチル化された凝血塊結合化合物を含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化された凝血塊結合化合物の１以上が、メチル化されたアミノ酸断片を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片のそれぞれが、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から独立して選択される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれ独立してアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれ独立してアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれ独立してアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
メチル化されたアミノ酸断片がそれぞれ独立してアミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる、請求項１６記載の組成物。
【請求項２１】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項２２】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項２３】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる、請求項１６記載の組成物。
【請求項２４】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片がそれぞれアミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる、請求項１６記載の組成物。
【請求項２５】
１以上の腫瘍ホーミング化合物をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
１以上の腫瘍ホーミング化合物がアミノ酸断片を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
１以上の腫瘍ホーミング化合物のアミノ酸断片が、アミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体、またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
１以上の腫瘍ホーミング化合物が血栓形成性である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が腫瘍血管内部に結合する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が腫瘍成長を軽減する、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
表面分子が酸化鉄ナノワームを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
表面分子が酸化鉄ナノ粒子を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
表面分子がアルブミンナノ粒子を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
表面分子がリポソームを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
表面分子が微粒子を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
表面分子がフルオロカーボン微小気泡を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
組成物が少なくとも１００の凝血塊結合化合物を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
組成物が少なくとも１０００の凝血塊結合化合物を含む、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
組成物が少なくとも１０，０００の凝血塊結合化合物を含む、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
１以上の成分をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
成分が、血管新生阻害剤、血管形成誘発剤、ガン化学療法薬、細胞毒性薬、抗炎症薬、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、画像造影剤、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射線核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１、および炭素１３からなる群から独立して選択される、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの成分が治療剤である、請求項４０記載の組成物。
【請求項４３】
治療剤がアブラキサンである、請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
治療剤がパクリタキセルである、請求項４２記載の組成物。
【請求項４５】
治療剤がタキソールである、請求項４２記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも１つの成分が血栓形成性である、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも１つの成分が凝血塊結合化合物でない、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
成分のいずれも凝血塊結合化合物でない、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
少なくとも１つの成分がホーミング化合物であり、ホーミング化合物が凝血塊結合化合物ではない、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの成分が検出可能剤である、請求項４０記載の組成物。
【請求項５１】
検出可能剤がＦＡＭである、請求項５０記載の組成物。
【請求項５２】
組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するような十分な数および組成の凝血塊結合化合物を組成物が含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
凝血塊結合化合物の数および組成の十分性が、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定される、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
組成物が十分な密度および組成の凝血塊結合化合物を含むので、組成物が、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
凝血塊結合化合物の密度および組成の十分性が、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定される、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
表面分子が血栓形成性である、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
修飾された凝血塊結合化合物が血栓形成性である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
対象に請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法であって、組成物が凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、組成物が、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する、方法。
【請求項５９】
組成物が腫瘍血管系、創傷部位、または両方に選択的にホーミングする、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
組成物が治療効果を有する、請求項５８または５９記載の方法。
【請求項６１】
治療効果が、腫瘍量の増加の減速または腫瘍量の減少である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
治療効果が腫瘍サイズの増加の減速または腫瘍サイズの減少である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
治療効果が、腫瘍における血液循環の減少または遮断である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
治療効果が、創傷部位での出血の軽減または停止である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
治療効果が、創傷部位で出血が止まるまでの時間の短縮である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
治療効果が、炎症の軽減、創傷治癒速度の増加、瘢痕組織量の減少、痛みの軽減、腫れの軽減、壊死の減少、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
凝固が治療効果を有する、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
対象が治療される１以上の部位を有し、組成物が標的とされ１以上の部位にホーミングする、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
対象が腫瘍を有し、組成物が腫瘍に対して治療効果を有する、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
対象に複数の異なる組成物を投与することを含む方法であって、複数の異なる組成物がそれぞれ請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組成物を含み、組成物が凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、組成物が凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する、方法。
【請求項７１】
対象に複数の異なる組成物を投与することを含む方法であって、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組成物を含み、少なくとも１つの組成物が凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、少なくとも１つの組成物が、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する、方法。
【請求項７２】
複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれが凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれが、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが、表面分子と少なくとも１つの修飾されていない凝血塊結合化合物とを含み、修飾されていない凝血塊結合化合物が、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合する、請求項７１または７２記載の方法。
【請求項７４】
複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが、表面分子と少なくとも１つのホーミング化合物とを含み、ホーミング化合物が、凝血塊結合化合物ではない、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
ホーミング化合物が腫瘍血管系と選択的に結合する、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ホーミング化合物が腫瘍ホーミング化合物である、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
腫瘍ホーミング化合物がアミノ酸断片を含む、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
腫瘍ホーミング化合物のアミノ酸断片がアミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体、またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つが、組成物を構成するホーミング化合物で異なる、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
対象に複数の異なる組成物を投与することを含む方法であって、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組成物を含み、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが、表面分子と少なくとも１つの修飾されていない凝血塊結合化合物とを含み、修飾されていない凝血塊結合化合物が凝固した血漿タンパク質と選択的に結合し、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つが、表面分子と少なくとも１つのホーミング化合物とを含み、ここで、ホーミング化合物が、凝血塊結合化合物ではない、方法。
【請求項８１】
複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つが、組成物を構成する凝血塊結合化合物で異なる、請求項７０〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１８日付で出願された米国特許仮出願番号第６１／２８８，０８３号の利益を主張する。２００９年１２月１８日付で出願された出願番号第６１／２８８，０８３号は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府後援の研究に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金Ｐ０１−ＣＡ１０４８９８、Ｐ０１−ＣＡ−１２４４２７、およびＰ０１−ＣＡ１１９３３５、国立心肺血液研究所により授与された助成金ＨＬ０７０８１８、国立研究資源センターにより授与された助成金１Ｓ１０ＲＲ０１７７５３、ならびにアメリカ国立科学財団により授与されたＤＭＲ０５−２０４１５のもとで政府支援を受けてなされた。政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
２０１０年１２月６日に作成された「２４５２０＿４５＿９００１＿２０１０＿１２＿０６＿ＡＭＤ＿ＡＦＤ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｔｅｘｔ＿Ｆｉｌｅ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして２０１０年１２月２０日に提出され、３，４８１バイトのサイズを有する配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）にしたがって参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
本発明は、一般的に、分子医学、ガン生物学、および心血管疾患の分野に関し、さらに具体的には、腫瘍血管系および動脈硬化性プラークに選択的にホーミングする凝血塊結合化合物に関する。
【背景技術】
【０００５】
ガンの治療における進歩に対する大きな障害は、正常組織に危害を加えることなく、ガンを選択的に標的とすることができる作用物質が比較的少ないことである。例えば、一般的には局部的な治療である放射線療法や外科手術は、治療領域中の正常組織に実質的な損傷を与える可能性があり、その結果、正常組織の瘢痕や喪失をもたらす。それに引きかえ、一般的に全身投与される化学療法は、急速な細胞ターンオーバーや連続的な細胞分裂をする骨髄、粘膜、皮膚および小腸などの器官に実質的な損傷を与える可能性がある。その結果、ガン患者を化学療法薬で静脈内治療する場合に、吐き気、脱毛および血球数の減少などの望ましくない副作用がしばしば起こる。そのような望ましくない副作用は、安全に投与できる薬剤の量を制限し、それにより、生存率を阻害し、患者の生活の質に影響を及ぼす可能性がある。
【０００６】
ナノメディシンは、ナノ粒子を使用して、疾患の診断および治療を容易にする新興分野である。診療所での顕著な早い段階での成功には、ＭＲＩおよびナノ粒子ベースの治療システムにおいて造影剤として超常磁性ナノ粒子を使用することが含まれる（非特許文献１（Desai  2006）;非特許文献２（Weissleder  1995））。腫瘍治療で使用される第一世代のナノ粒子は、腫瘍における優先的な蓄積のための腫瘍血管の「漏れやすさ」に依存するが；この増強された透過性および保持力（ＥＰＲ）は、腫瘍血管の不変の特徴ではなく（非特許文献３（Sinek  2004））、存在する場合であっても、ナノ粒子は依然として腫瘍における高い間質液圧と折り合いをつけなければならない（非特許文献３（Sinek  2004）;非特許文献４（Boucher  1990））。魅力的な代替法は、ナノ粒子に血管中の特異的分子レセプターを標的とさせることである。なぜなら、それらは血流から結合に容易に利用可能であり、腫瘍血管は、正常組織の血管中で顕著に発現されない大量の分子を発現するからである（非特許文献５（Hoffman  2003）;非特許文献６（Oh  2004）;非特許文献７（Ruoslahti  2002））。
【０００７】
ナノ粒子の腫瘍に対する特異的ターゲティングは、種々の実験システムで行われてきたが（非特許文献８（DeNardo  2005）;非特許文献９（Akerman  2002）;非特許文献１０（Cai  2006））、送達効率は一般的に低い。本来は、増幅されたホーミングは、血管損傷部位での十分な血小板蓄積を確実にする重要な機構である。それは、標的結合、活性化、血小板−血小板結合、および血餅の形成を含む。当該技術分野で必要とされているものは、粒子が自身のホーミングを増幅するナノ粒子送達系である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Desai  N,  Trieu  V,  Yao  Z,  Louie  L,  Ci  S,  Yang  A,  Tao  C,  De  T,  Beals  B,  Dykes  D,  Noker  P,  Yao  R,  Labao  E,  Hawkins  M,  Soon-Shiong  P  (2006)  Clin  Cancer  Res  12:  1317-1324.
【非特許文献２】Weissleder  R,  Bogdanov  A,  Jr,  Neuwelt  EA,  Papisov  M  (1995)  Advanced  Drug  Delivery  Reviews  16:  321-334.
【非特許文献３】Sinek  J,  Frieboes  H,  Zheng  X,  Cristini  V  (2004)  Biomed  Microdevices  6:  297-309
【非特許文献４】Boucher  Y,  Baxter  LT,  Jain,  RK  (1990)  Cancer  Res  50:  4478-4484.
【非特許文献５】Hoffman  JA,  Giraudo  E,  Singh  M,  Zhang  L,  Inoue  M,  Porkka  K,  Hanahan  D,  Ruoslahti  E  (2003)  Cancer  Cell  4:  383-391.
【非特許文献６】Oh  P,  Li  Y,  Yu  J,  Durr  E,  Krasinska  KM,  Carver  LA,  Testa  JE,  Schnitzer  JE  (2004)  Nature  429:  629-635.
【非特許文献７】Ruoslahti,  E  (2002)  Nat  Rev  Cancer  2:  83-90.
【非特許文献８】DeNardo  SJ,  DeNardo  GL,  Miers  LA,  Natarajan  A,  Foreman  AR,  Gruettner  C,  Adamson  GN,  Ivkov  R  (2005)  Clin  Cancer  Res  11  :  7087s-7092s.
【非特許文献９】Akerman  ME,  Chan  WC,  Laakkonen  P,  Bhatia  SN,  Ruoslahti  E  (2002)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  99:  12617-12621.
【非特許文献１０】Cai  W,  Shin  DW,  Chen  K,  Gheysens  O,  Cao  Q,  Wang  SX,  Gambhir  SS,  Chen  X  (2006)  Nano  Lett  6:  669-676.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む組成物を開示する。修飾された凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合することができ、この場合、組成物は、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する。修飾された凝血塊結合化合物は、その修飾されていない誘導体と比較して、腫瘍における凝固を増強することができる。
【００１０】
対象に、開示された組成物のいずれかを投与することを含む方法も開示する。組成物は、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、この場合、組成物は凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。
【００１１】
対象に複数の異なる開示された組成物を投与することを含む方法も開示する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、複数の組成物のうちの少なくとも１つは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、組成物のそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、少なくとも１つの組成物は、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。
【００１２】
修飾された凝血塊結合化合物は、メチル化された凝血塊結合化合物を含む可能性がある。メチル化された凝血塊結合化合物はメチル化されたアミノ酸断片を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から選択することができる。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００１３】
アミノ酸配列は、少なくとも１つの位置でＮ−メチル化またはＣ−メチル化される可能性がある。アミノ酸配列は、Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ（配列番号８）、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ（配列番号１０）、ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１２）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である可能性がある。アミノ酸配列は、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である可能性がある。
【００１４】
組成物は、複数の凝血塊結合化合物をさらに含む可能性があり、この場合、凝血塊結合化合物は凝固した血漿タンパク質と選択的に結合し、複数の凝血塊結合化合物は、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれおよび／または集団で、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合することができる。例えば、複数の凝血塊結合化合物の一部または全部は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合することができる。複数の凝血塊結合化合物の１以上は、修飾された凝血塊結合化合物である可能性があり、修飾された凝血塊結合化合物は、それらの修飾されていない誘導体と比較して、腫瘍における凝固を増強する。複数の凝血塊結合化合物の１以上の修飾された凝血塊結合化合物は、メチル化された凝血塊結合化合物を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物の１以上のメチル化された凝血塊結合化合物は、メチル化されたアミノ酸断片を含む可能性がある。
【００１５】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片のそれぞれは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から独立して選択することができる。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００１６】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれアミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００１７】
いくつかの形態で、表面分子は血栓形成性である可能性がある。いくつかの形態で、修飾された凝血塊結合化合物は血栓形成性である可能性がある。
【００１８】
組成物は、１以上の腫瘍ホーミング化合物をさらに含む可能性がある。１以上の腫瘍ホーミング化合物は、アミノ酸断片を含む可能性がある。腫瘍ホーミング化合物の１以上のアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む可能性がある。１以上の腫瘍ホーミング化合物は血栓形成性である可能性がある。
【００１９】
組成物は腫瘍血管内部に結合することができる。組成物は腫瘍成長を低下させることができる。表面分子は酸化鉄ナノワーム（ｎａｎｏｗｏｒｍ）を含む可能性がある。表面分子は酸化鉄ナノ粒子を含む可能性がある。表面分子はアルブミンナノ粒子を含む可能性がある。表面分子はリポソームを含む可能性がある。表面分子は微粒子を含む可能性がある。表面分子はフルオロカーボン微小気泡を含む可能性がある。
【００２０】
組成物は少なくとも１００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物は少なくとも１０００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物は少なくとも１０，０００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。
【００２１】
組成物は、１以上の成分をさらに含む可能性がある。この成分は、血管新生阻害剤、血管形成誘発剤（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、ガン化学療法剤、細胞毒性薬、抗炎症剤、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、画像造影剤（ｉｍａｇｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射線核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１、および炭素１３からなる群から独立して選択することができる。少なくとも１つの成分は治療剤である可能性がある。治療剤は、ガンを治療するための化合物または組成物を含む可能性がある。治療剤は、プログラム細胞死すなわちアポトーシスを誘発する化合物または組成物を含む可能性がある。治療剤はアブラキサンである可能性がある。治療剤はパクリタキセルである可能性がある。治療剤はタキソールである可能性がある。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分は血栓形成性である可能性がある。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分は凝血塊結合化合物であり得ない。いくつかの形態で、どの成分も凝血塊結合化合物でない。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分はホーミング化合物であり、ここで、ホーミング化合物は凝血塊結合化合物ではない。少なくとも１つの成分は検出可能剤である可能性がある。検出可能剤はＦＡＭである可能性がある。
【００２２】
組成物は、腫瘍血管系、創傷部位、または両方に選択的にホーミングすることができる。組成物は治療効果を有する可能性がある。治療効果は、腫瘍量の増加の減速、または腫瘍量の減少である可能性がある。治療効果は、腫瘍サイズの増加の減速、または腫瘍サイズの減少である可能性がある。治療効果は、腫瘍における血液循環の減少または遮断である可能性がある。治療効果は、創傷部位での出血の減少または停止である可能性がある。治療効果は、創傷部位での出血が停止するまでの時間の短縮である可能性がある。治療効果は、炎症の軽減、創傷治癒速度の増加、瘢痕組織量の減少、痛みの軽減、腫れの軽減、壊死の減少、またはそれらの組み合わせを含む可能性がある。
【００２３】
凝固は治療効果を有する可能性がある。対象は１以上の治療されるべき部位を有する可能性があり、この場合、組成物は標的とされる１以上の部位へホーミングする。対象は腫瘍を有する可能性があり、この場合、組成物は腫瘍に対して治療効果を有する。
【００２４】
いくつかの形態で、組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するのに十分な数および組成の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）の数および組成の十分性は、非ヒト動物における凝固および腫瘍での組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。
【００２５】
組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するのに十分な密度および組成の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。凝血塊結合化合物の密度および組成物の十分性は、非ヒト動物における凝固および腫瘍での組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。
【００２６】
複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫ、フィブリン結合ペプチド、凝血塊結合抗体、および凝血塊結合小有機分子を含むアミノ酸断片から選択することができる。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片を含む可能性がある。修飾された凝血塊結合化合物は、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾形態、フィブリン結合ペプチドの修飾形態、凝血塊結合抗体の修飾形態、および凝血塊結合小有機分子の修飾形態を含むアミノ酸断片から独立して選択することができる。修飾された凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾形態を含むアミノ酸断片を含む可能性がある。特に有用な修飾はメチル化である。
【００２７】
凝血塊結合化合物のアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸断片、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から選択することができる。アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含む可能性がある。
【００２８】
アミノ酸断片はさらに、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）も含む可能性がある。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる可能性がある。アミノ酸断片は、アミノ酸配列ＲＥＫからなる可能性がある。
【００２９】
複数の凝血塊結合化合物は、それぞれフィブリン結合ペプチドを含む可能性がある。フィブリン結合ペプチドは、フィブリン結合タンパク質およびそのフィブリン結合誘導体からなる群から独立して選択することができる。別の例では、複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ凝血塊結合抗体を含む可能性がある。さらに、複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ凝血塊結合小有機分子を含む可能性がある。
【００３０】
いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、ここで、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つの修飾されていない凝血塊結合化合物とを含み、ここで、修飾されていない凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つのホーミング化合物とを含み、ここで、ホーミング化合物は、凝血塊結合化合物ではない。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍血管系と選択的に結合することができる。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍ホーミング化合物である可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物はアミノ酸断片を含む可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物のアミノ酸断片はアミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体、またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物を構成するホーミング化合物が異なる可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物を構成する凝血塊結合化合物が異なる可能性がある。
【００３１】
開示された方法および組成物のさらなる利点は、以下の説明で一部記載され、説明から部分的に理解されるか、または開示された方法および組成物の実施により学習することができる。開示された方法および組成物の利点は、添付の請求項で特に指摘される要素および組み合わせにより実現され、達成されるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、どちらも例示的であり、説明のためだけであって、請求される本発明を限定するものではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本明細書中に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示された方法および組成物のいくつかの実施形態を説明し、説明とあわせて、開示された方法および組成物の原則を説明する働きをする。
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＣＲＥＫＡペンタペプチドの腫瘍ホーミングを示す図である。フルオレセイン結合ＣＲＥＫＡペプチド（マウス１匹あたり２００μｇ）を、同系Ｂ１６メラノーマ腫瘍を有するマウスに注射した。野生型マウスにおける腫瘍のフィブリン様構造へのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡのホーミング（Ａ、矢印）およびフィブリノゲンヌルマウスにおいてはホーミングがないこと（Ｂ）を説明するために代表的な顕微鏡視野を示す。（Ｃ）ＣＲＥＫＡファージは管中で凝固した血漿タンパク質と結合し、一方、非組み換え型対照ファージはほとんど結合を示さない。（Ｄ）フルオレセイン−ＣＲＥＫＡと結合した、デキストランコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、凝固した血漿タンパク質と結合し、結合は、遊離ＣＲＥＫＡペプチドにより阻害される。（Ｄ）中の挿入画は、凝血塊結合ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの顕微鏡像を示す。倍率：Ａ〜Ｂ、２００×；Ｄ、６００×。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＣＲＥＫＡ結合酸化鉄粒子の腫瘍ホーミングを示す図である。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を、直径１〜１．５ｃｍのＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン異種移植腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに静脈注射（４ｍｇＦｅ／ｋｇ）した。マウスを５〜６時間後に灌流によって屠殺し、組織をＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光（鏃型）について調べた。核をＤＡＰＩで染色した（画像のいたる所で灰色のスポットが見られる）。（Ａ）２時間前にＰＢＳの注射を受けたＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスからの組織中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの分布（Ａ、上のパネル）または２００μｌのＰＢＳ中０．２マイクロモルのＮｉを含むＮｉ／ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム（Ｎｉ−リポソーム）の分布（Ａ、下のパネル）。（Ｂ）様々な治療後のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの血漿循環半減期。少なくとも４時点を集めた。データを、Ｐｒｉｚｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（カリフォルニア州サンディエゴ））を用いて単一指数関数的減衰に適合させ、半減期値を独立ｔ検定で比較した（＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝１０）。（Ｃ）腫瘍血管におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積。マウスに注射し、パネルＡに示すような組織を集めた。蛍光血管内ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は透過光で見える酸化鉄とオーバーラップする。倍率：６００×。（Ｄ）Ｎｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ注射されたマウスの対照器官。腎臓および肺でところどころ蛍光のスポットが見られる。心臓で見られるスポットは、注射を受けていない対照とは異ならず、このことは、それが自己蛍光であることを示す。少なくとも３回の独立した実験から得られた代表的な結果を示す。倍率ＡおよびＤ、２００×；Ｃ、６００×。
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、腫瘍血管におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片を有するマウスに、図２の説明文に記載されているようにしてＮｉ−リポソームおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子を注射した。ナノ粒子注射の６時間後にマウスを灌流し、組織を集めた。（Ａ）上のパネル：血管におけるナノ粒子蛍光とＣＤ３１染色との共存（＊）；中央のパネル：腫瘍血管におけるナノ粒子蛍光と抗フィブリン（フィブリノゲン）染色との共存（＊）。挿入画−腫瘍血管中で原線維に沿って分散したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを示す画像；下のパネル：ナノ粒子蛍光と血小板の抗ＣＤ４１染色とは共存しない。（Ｂ）ＤｉＩで染色した赤血球を血流のマーカーとして使用する腫瘍の生体共焦点顕微鏡検査。矢印は、その内部で静止した赤血球が血流の閉塞を示す血管を指し示す。前記血管中の血流は閉塞していない。１分の動画（Ｍｏｖｉｅ  ２  ｉｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）からの連続した６コマを示す。（Ｃ）ＣＲＥＫＡでコーティングされたリポソームは腫瘍血管中でフィブリンと共存する。結果は３回の独立した実験の代表例である。倍率：ＡおよびＣ、６００×、Ｂ、２００×。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、腫瘍におけるナノ粒子蓄積に対する血液凝固の効果を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン異種移植片を有するマウスに、ＰＢＳまたは８００Ｕ／ｋｇのヘパリンのボーラスを静脈注射し、続いて１２０分後にＮｉ−リポソーム（またはＰＢＳ）およびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ（または対照ナノ粒子）を静脈注射した。マウスにさらなるヘパリンを腹腔内注射により（合計１０００Ｕ／ｋｇ）またはＰＢＳを実験全体にわたって投与した。（Ａ）腫瘍をナノ粒子注射の６時間後に取り出し、異なる処置後の腫瘍中の磁気シグナルをＳＱＵＩＤで測定した。アミノ化デキストランＳＰＩＯは粒子対照（対照ＳＰＩＯ）としての役割を果たした。組織中のＳＰＩＯナノ粒子濃度を、ブランク組織の反磁性および常磁性バックグラウンドを差し引いた後のＩＴ磁場での組織の飽和磁化値（電磁単位、ｅｍｕ）による表す。磁化値を組織の乾燥重量に対して正規化した。３回の実験から得られた結果を示す。（Ｂ）ヘパリンで処置されたマウスの腫瘍血管中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子の外観の代表例。（Ｃ）血管中の凝固に対するヘパリンの効果の定量化。マウスを、前述のようにＰＢＳ（白色棒グラフ）またはヘパリン（黒色棒グラフ）で前処置し、続いてＮｉリポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子で処置した。各処置を代表する２つの腫瘍から得た３つのセクションを血管について抗ＣＤ３１で染色し、蛍光および蛍光凝血塊について陽性の血管のパーセンテージを測定した。ヘパリンは、粒子を含む血管のパーセンテージを有意に変えなかったが、蛍光で満たされた内腔の発生率を大幅に減少させたことに注意。（Ｄ）Ｎｉ−リポソームと、それに続いてＣｙ７で標識されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯとを投与されたマウス（ヘパリン前処置有またはヘパリン前処置無）の近赤外画像化。Ｏｄｙｓｓｅｙ  ２  ＮＩＲスキャナー（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ネブラスカ州リンカーン））を用いてＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子注射の８時間後に画像を取得した。示した画像は、灰色（７００ｎｍチャンネル、身体および食餌自己蛍光）および白色（８００ｎｍチャンネル、Ｃｙ７）の２色の合成画像である。矢印は腫瘍を、鏃型は肝臓を指し示す。ヘパリンで前処理されたマウスでは腫瘍からのシグナルが強力に減少することに注意。３回のうちの代表的な実験を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＣＲＥＫＡペプチドの腫瘍ホーミングを示す図である。（Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン異種移植腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスまたは乳房腫瘍を有するトランスジェニックＭＭＴＶ  ＰｙＭＴマウスに、０．１ｍｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡを静脈内注射した。注射後２４時間に灌流によって動物を屠殺し、組織セクションを蛍光顕微鏡検査によって調べた。右のパネル、ＭＤＡ−ＭＢ４３５腫瘍マウスの対照器官。倍率２００×。（Ｂ）。６時間前に３０μｇのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＣＲＥＫＡを注射されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスの動物全体の画像化。Ｍａｅｓｔｒｏ画像化システム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォバーン））を使用して、画像を取得し、処理した。矢印は腫瘍を、そして鏃型は膀胱を指し示す。ペプチドは尿中に排泄されて、肝臓に蓄積されないことに注意。
【図６】フルオレセインで標識されたＣＲＥＫＡペプチドでの種々の置換レベルに関連した酸化鉄ナノ粒子（ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ）の蛍光強度を示す図である。結合粒子により発せられる蛍光は、置換のレベルと直線的に関連する。Ａ．Ｕ．＝任意の単位。
【図７】ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、腫瘍組織中に蓄積するが、非ＲＥＳ正常組織中には蓄積しないことを示す図である。低倍率（４０×）を用いてこれらの画像を作製した。なぜなら、凝固がＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光（白色スポット）に集中した血管だけがこの倍率で見えるからである。ナノ粒子は、腫瘍組織における凝血塊中にトラップされるが（矢印）、非ＲＥＳ正常組織中にはトラップされないことを示す。注射を実施し、図２においてと同様の分析のために組織を調製した。１０回のうちの代表的な実験を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、肝臓において、フィブリン（フィブリノゲン）染色とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯとは共存しないことを示す。フィブリン（フィブリノゲン）陽性構造は、肝臓によるフィブリノゲン産生からのバックグラウンドである可能性がある。というのも、これはナノ粒子と共存せず（Ａ）、注射されていないマウス由来の肝臓は、類似したフィブリン（フィブリノゲン）染色を示したからである（Ｂ）。倍率６００×。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ナノ粒子ホーミングにおける血小板の役割を示す。（Ａ）。４ｍｇ／ｋｇのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯをマウスに注射した５分後に血液を採取し、５０μｌアリコートを磁気カラム中に流した。結合したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子をカラムから溶出させ、スライド上で濃縮し、抗ＣＤ４１抗体で染色した。粒子の一部は、血小板と結合するようである。（Ｂ）。血小板除去マウスからの腫瘍におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯホーミングおよび凝血塊形成を示す低倍率画像（４０×）。血小板除去は、記載されるようにしてマウスを０．１ｍｇの抗ＣＤ４１モノクローナル抗体で処置することによっておこなった（Van  der  Heyde  and  Gramaglia(2005)）。マウスに続いて、図２の説明文に記載されているようにＮｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを投与した。抗血小板処置は蛍光凝血塊の発生率を減少させなかった（図７中の腫瘍パネルと比較）。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＲＥＫＡペプチドならびにそのＮ−メチル化およびＣ−メチル化変異体の腫瘍蓄積を示す図である。同所性２２Ｒｖ−１異種移植腫瘍を有するマウスに２００μｇのＦＡＭ結合ＣＲＥＫＡまたはメチル化ＣＲＥＫＡペプチドを静脈内注射した。ペプチドを３時間循環させた。マウスを次いで、ＰＢＳで経心臓灌流し、器官を集め、ＵＶ光下で観察した。図１０Ａ：Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いた蛍光の定量化。いくつかのＮ／Ｃ−メチル化ＣＲＥＫＡ類似体は、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力な蛍光を生じた。エラーバーは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜４）を示す。図１０Ｂ：ＣＲＥＫＡ、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡまたはＣ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡペプチドを注射されたマウスから得られた代表的な画像。点線は器官があった場所を示し、実線は腫瘍の輪郭を示す。中央および右のパネルは、表示されたペプチドを注射したマウスからの共焦点像を示す。グルタミン酸がＮ−メチル化されている、ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドは、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力に腫瘍組織中で蓄積する。核をＤＡＰＩで染色し、血管をＣＤ３１染色で可視化した。倍率×２００。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＲＥＫＡペプチドならびにそのＮ−メチル化およびＣ−メチル化変異体の腫瘍蓄積を示す図である。同所性２２Ｒｖ−１異種移植腫瘍を有するマウスに２００μｇのＦＡＭ結合ＣＲＥＫＡまたはメチル化ＣＲＥＫＡペプチドを静脈内注射した。ペプチドを３時間循環させた。マウスを次いで、ＰＢＳで経心臓灌流し、器官を集め、ＵＶ光下で観察した。図１０Ａ：Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いた蛍光の定量化。いくつかのＮ／Ｃ−メチル化ＣＲＥＫＡ類似体は、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力な蛍光を生じた。エラーバーは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜４）を示す。図１０Ｂ：ＣＲＥＫＡ、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡまたはＣ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡペプチドを注射されたマウスから得られた代表的な画像。点線は器官があった場所を示し、実線は腫瘍の輪郭を示す。中央および右のパネルは、表示されたペプチドを注射したマウスからの共焦点像を示す。グルタミン酸がＮ−メチル化されている、ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドは、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力に腫瘍組織中で蓄積する。核をＤＡＰＩで染色し、血管をＣＤ３１染色で可視化した。倍率×２００。
【図１１】図１１は、Ｎ−メチル化されたＣＲＥＫＡペプチドが、腫瘍内部での血管への酸化鉄ナノワームのホーミングを改善することを示す図である。ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドまたはそのＮ−メチル化された変異体でコーティングされたナノワームを、２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン腫瘍を有するヌードマウスに静脈注射した。腫瘍を５時間後に収集し、そして腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１または抗フィブリン（フィブリノゲン）で染色し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。ＣＲＥＫＡでコーティングされたナノワームは腫瘍血管中で凝固を引き起こし、それら自身のホーミングを増幅する（Ｓｉｍｂｅｒｇら、２００６）。Ｎ−メチル化合物は、修飾されていないペプチドよりも、特に、腫瘍の内部での蓄積および凝固の誘発に有効である。倍率×２００。右下パネルは、隣のパネルの点線の部分の高倍率（×４００）画像を示す。ペプチド結合粒子を見ることができ；血管および凝固を、抗ＣＤ３１または抗フィブリン（フィブリノゲン）染色で別々に視覚化した。
【図１２−１】図１２−１は図１２Ａおよび図１２Ｂである。図１２Ａ〜２Ｃは、ＣＲＥＫＡと別の腫瘍ホーミングペプチドとの組み合わせが、ホーミングおよびＣＲＥＫＡで誘発された凝固の効率を増強することを示す図である。図１２Ａ：ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣまたはＣＧＫＲでコーティングされた酸化鉄ナノワームを、２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍を５時間後に収集し、腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。図１２Ｂ：ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣペプチド（淡灰色）およびローダミンで標識されたＣＲＥＫＡペプチド（灰色）でコーティングされたナノワームの混合物を、２２Ｒｖ−１腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射（各ナノワーム調製物１ｋｇあたり２．５ｍｇのＦｅ）し、そして組織を５時間後に収集した。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１および抗フィブリン（フィブリノゲン）で染色し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。倍率は×１００（または４００×）である。核をＤＡＰＩで染色した。図１２Ｃ：ＰＢＳ、またはＣＲＥＫＡもしくはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワーム、あるいはＣＲＫＤＫＣとＣＲＥＫＡナノワームとの混合物を注射されたマウスから得られた２２Ｒｖ−１同所性腫瘍の低温切開片を抗フィブリン（フィブリノゲン）抗体で免疫組織化学的に染色した（濃色部分）。試料をＳｃａｎｓｃｏｐｅでの画像分析に付して、フィブリン（フィブリノゲン）陽性領域を定量化した。挿入画は、陽性染色の例を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜２Ｃは、ＣＲＥＫＡと別の腫瘍ホーミングペプチドとの組み合わせが、ホーミングおよびＣＲＥＫＡで誘発された凝固の効率を増強することを示す図である。図１２Ａ：ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣまたはＣＧＫＲでコーティングされた酸化鉄ナノワームを、２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍を５時間後に収集し、腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。図１２Ｂ：ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣペプチド（淡灰色）およびローダミンで標識されたＣＲＥＫＡペプチド（灰色）でコーティングされたナノワームの混合物を、２２Ｒｖ−１腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射（各ナノワーム調製物１ｋｇあたり２．５ｍｇのＦｅ）し、そして組織を５時間後に収集した。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１および抗フィブリン（フィブリノゲン）で染色し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。倍率は×１００（または４００×）である。核をＤＡＰＩで染色した。図１２Ｃ：ＰＢＳ、またはＣＲＥＫＡもしくはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワーム、あるいはＣＲＫＤＫＣとＣＲＥＫＡナノワームとの混合物を注射されたマウスから得られた２２Ｒｖ−１同所性腫瘍の低温切開片を抗フィブリン（フィブリノゲン）抗体で免疫組織化学的に染色した（濃色部分）。試料をＳｃａｎｓｃｏｐｅでの画像分析に付して、フィブリン（フィブリノゲン）陽性領域を定量化した。挿入画は、陽性染色の例を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノワームを用いた２２Ｒｖ−１ヒト前立腺ガン同所性異種移植片のＭＲ画像化を示す図である。図１３Ａ：Ｔ２加重ＭＲ画像。均等割合のＣＲＫＤＫＣでコーティングされたナノワームおよびＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワームの混合物（合計用量５ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。粒子を表示された期間循環させた。腫瘍を通る軸平面のグレイスケールおよび擬似カラー画像を示す。ガドリニウム（Ｇｄ）およびＦｅｒｉｄｅｘ（Ｆｅ）を標準試料として使用した。ナノワームは腫瘍中の血管を強調する。図１３Ｂ：様々な時点での腫瘍鉄含有量の定量的変化を示すヒストグラム。標的化ナノワームだけが時間とともに腫瘍において有意な蓄積を示す。パネル１と２とでスケールが異なることに注意すべきである。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノワームを用いた２２Ｒｖ−１ヒト前立腺ガン同所性異種移植片のＭＲ画像化を示す図である。図１３Ａ：Ｔ２加重ＭＲ画像。均等割合のＣＲＫＤＫＣでコーティングされたナノワームおよびＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワームの混合物（合計用量５ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。粒子を表示された期間循環させた。腫瘍を通る軸平面のグレイスケールおよび擬似カラー画像を示す。ガドリニウム（Ｇｄ）およびＦｅｒｉｄｅｘ（Ｆｅ）を標準試料として使用した。ナノワームは腫瘍中の血管を強調する。図１３Ｂ：様々な時点での腫瘍鉄含有量の定量的変化を示すヒストグラム。標的化ナノワームだけが時間とともに腫瘍において有意な蓄積を示す。パネル１と２とでスケールが異なることに注意すべきである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、標的化ナノワームでの腫瘍治療を示す。２２Ｒｖ−１ヒト前立腺ガンの２週齢同所性異種移植片を有するマウスに、ＣＲＫＤＫＣコーティングされたナノワーム、もしくはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワーム、または等量の両粒子の組み合わせを静脈内注射した。すべてのナノワームを、５Ｋポリエチレングリコールでもコーティングした。粒子を１日おきに１４日間投与した（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、合計累積用量３５ｍｇ／ｋｇ）。図１４Ａ：最後の注射の１日後の腫瘍容積。類似した結果が２回の独立した実験で得られた（ｎ＝１０（ＰＢＳ、ＣＲＫＤＫＣ）、１２（ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫおよび、１２ＣＲＫＤＫＣ＋ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ）。黒色の線は、腫瘍容積野平均を示す。統計分析をスチューデントｔ検定で実施した。二重星印、ｐ＜０．０１。図１４Ｂ：Ｈ＆Ｅ染色は、標的化腫瘍の中央に大きな壊死領域と、生存腫瘍周縁部で閉鎖血管とを示す。腫瘍血管にホーミングするが、凝固を引き起こさないＣＲＫＤＫＣ粒子を投与された群における類似したサイズの腫瘍は、壊死または閉鎖血管を示さない。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＣＲＫ、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ、または組み合わせ（ＣＲＫとＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ粒子との混合物）でコーティングされた５Ｋ−ＰＥＧ−ＳＰＩＯを用いた腫瘍治療研究を示す。図１５Ａおよび１５Ｂ：最後の注射の翌日の、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ結合ＳＰＩＯナノ粒子と混合された腫瘍ホーミングＣＲＫの蛍光画像。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１（図１５Ａ）または抗フィブリン（フィブリノゲン）（図１５Ｂ）で染色し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。スケールバー２００μｍ（上）および５０μｍ（下）。核をＤＡＰＩ（小さな環状スペック）、混合物ペプチド結合ＳＰＩＯ（明るい領域）で染色し、血管をＣＤ３１（図１５Ａ）フィブリノゲン（淡灰色）（図１５Ｂ）染色で可視化した。組織学的検査およびフィブリン（フィブリノゲン）染色で、治療された腫瘍マウスの正常な器官では損傷またはフィブリンで満たされた血管は検出されなかった。
【図１６−１】図１６−１は図１６Ａおよび図１６Ｂである。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、ＣＲＥＫＡ−ＮＷと、別の腫瘍ホーミングペプチドでコーティングされたナノワームとを組み合わせることにより、ホーミング効率が増強されることを示す図である。（Ａ）ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノワームを、同所性２２Ｒｖ１ヒト前立腺腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射した（体重１キログラムあたり５ｍｇの鉄）。マウスにＮｉ−リポソームを前もって注射して、細胞内皮系による取り込みを減少させた（Sirnberg  D  et  ai.  Biornimetic  amplification  ofnanoparticle  homing  to  tumors.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  2007;104(3):932-936）。腫瘍を５時間後に収集し、そして腫瘍セクションを抗体で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた（腫瘍中のナノワームの蓄積および血液からのナノワームのクリアランスに関して、５時間の時点がナノワームホーミングに最適であることが判明した）。ＣＲＥＫＡでコーティングされた粒子は明るい染色で示され；血管および凝固を抗ＣＤ３１（鏃型で示した例）または抗フィブリン（フィブリノゲン）染色（矢印で示した例）で別々に視覚化した；核をＤＡＰＩで染色した（暗い染色）。バーは２００μｍを表す。（Ｂ）ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣまたはＣＧＫＲＫでコーティングされたナノワームを静脈内注射し、組織を収集し、Ａにおいてと同様に処理した。ＣＲＫＤＫＣでコーティングされた粒子またはＣＧＫＲＫでコーティングされた粒子を淡灰色で示す；抗ＣＤ３１で可視化された血管はマゼンタであり（白色はＣＤ３１とコーティングされた粒子との共存を示す）、抗フィブリン（フィブリノゲン）染色で視覚化されたものは、暗灰色である（星印は、フィブリン（フィブリノゲン）とコーティングされた粒子との共存を示す）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。大血管を右側のパネルについて選択した。なぜなら、血管内凝固（ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷまたはＣＧＫＲＫ−ＮＷによって促進されない）はさらに大きな血管で最も明らかであるからである。バーは２００μｍ（左および中央のパネル）および１００μｍ（右パネル）を表す。（Ｃ）ローダミンで標識されたＣＲＥＫＡでコーティングされたナノワーム（第１パネルにおいて淡灰色染色）と、ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣでコーティングされたナノワーム（第２パネルにおいて淡灰色染色）との混合物を静脈内注射し（各ナノワーム調製物１キログラムあたり２．５ｍｇの鉄）、Ａにおいてと同様に組織を集め、そして処理し、フィブリン（フィブリノゲン）について染色した（第３パネルにおいて淡灰色）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。（Ｄ）マウスにパネルＡ、Ｂ、またはＣにおいてと同様に表示される物質を注射した。抗フィブリン（フィブリノゲン）抗体で染色されたセクションをＳｃａｎｓｃｏｐｅでの画像分析に付して、フィブリン（フィブリノゲン）陽性領域を定量化した。挿入画は、ナノワーム混合物を注射されたマウスから得られる腫瘍周縁部（左）および内部（右）における抗フィブリン（フィブリノゲン）免疫染色の例を示す。バーは５０μｍを表す。統計分析は分散分析で実施した。エラーバーはＳＥＭ��表す（ｎ＝５〜６）；＊＊Ｐ＜０．０１
【図１６−２】図１６−２は図１６Ｃおよび図１６Ｄである。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、ＣＲＥＫＡ−ＮＷと、別の腫瘍ホーミングペプチドでコーティングされたナノワームとを組み合わせることにより、ホーミング効率が増強されることを示す図である。（Ａ）ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノワームを、同所性２２Ｒｖ１ヒト前立腺腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射した（体重１キログラムあたり５ｍｇの鉄）。マウスにＮｉ−リポソームを前もって注射して、細胞内皮系による取り込みを減少させた（Sirnberg  D  et  ai.  Biornimetic  amplification  ofnanoparticle  homing  to  tumors.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  2007;104(3):932-936）。腫瘍を５時間後に収集し、そして腫瘍セクションを抗体で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた（腫瘍中のナノワームの蓄積および血液からのナノワームのクリアランスに関して、５時間の時点がナノワームホーミングに最適であることが判明した）。ＣＲＥＫＡでコーティングされた粒子は明るい染色で示され；血管および凝固を抗ＣＤ３１（鏃型で示した例）または抗フィブリン（フィブリノゲン）染色（矢印で示した例）で別々に視覚化した；核をＤＡＰＩで染色した（暗い染色）。バーは２００μｍを表す。（Ｂ）ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣまたはＣＧＫＲＫでコーティングされたナノワームを静脈内注射し、組織を収集し、Ａにおいてと同様に処理した。ＣＲＫＤＫＣでコーティングされた粒子またはＣＧＫＲＫでコーティングされた粒子を淡灰色で示す；抗ＣＤ３１で可視化された血管はマゼンタであり（白色はＣＤ３１とコーティングされた粒子との共存を示す）、抗フィブリン（フィブリノゲン）染色で視覚化されたものは、暗灰色である（星印は、フィブリン（フィブリノゲン）とコーティングされた粒子との共存を示す）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。大血管を右側のパネルについて選択した。なぜなら、血管内凝固（ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷまたはＣＧＫＲＫ−ＮＷによって促進されない）はさらに大きな血管で最も明らかであるからである。バーは２００μｍ（左および中央のパネル）および１００μｍ（右パネル）を表す。（Ｃ）ローダミンで標識されたＣＲＥＫＡでコーティングされたナノワーム（第１パネルにおいて淡灰色染色）と、ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣでコーティングされたナノワーム（第２パネルにおいて淡灰色染色）との混合物を静脈内注射し（各ナノワーム調製物１キログラムあたり２．５ｍｇの鉄）、Ａにおいてと同様に組織を集め、そして処理し、フィブリン（フィブリノゲン）について染色した（第３パネルにおいて淡灰色）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。（Ｄ）マウスにパネルＡ、Ｂ、またはＣにおいてと同様に表示される物質を注射した。抗フィブリン（フィブリノゲン）抗体で染色されたセクションをＳｃａｎｓｃｏｐｅでの画像分析に付して、フィブリン（フィブリノゲン）陽性領域を定量化した。挿入画は、ナノワーム混合物を注射されたマウスから得られる腫瘍周縁部（左）および内部（右）における抗フィブリン（フィブリノゲン）免疫染色の例を示す。バーは５０μｍを表す。統計分析は分散分析で実施した。エラーバーはＳＥＭ��表す（ｎ＝５〜６）；＊＊Ｐ＜０．０１
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ペプチドでコーティングされたナノワームで処置されたマウスの腫瘍における血液循環のＣＥＵＳ画像化を示す図である。（Ａ）Ｎｉ−リポソームをあらかじめ注射されたマウスに、続いてＣＲＥＫＡ−ＮＷとＣＲＫＤＫＣ−ＮＷとの混合物を注射し、そして、表示された時間の後に、超音波造影剤を注射した。様々な時点で得られるＣＥＵＳおよび従来型超音波（ＵＳ）画像を示す。画像は、画像化された３つの腫瘍の代表的なものである。（Ｂ）パネルＡで記載された実験から得られる異なる腫瘍領域および周囲組織における血流の増強分析曲線。マウスをそれぞれスキャンのために麻酔し、超音波装置中に再導入したので、時間によって腫瘍の配向は若干異なる。ｎ＝３。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ペプチドでコーティングされたナノワームで処置されたマウスの腫瘍における血液循環のＣＥＵＳ画像化を示す図である。（Ａ）Ｎｉ−リポソームをあらかじめ注射されたマウスに、続いてＣＲＥＫＡ−ＮＷとＣＲＫＤＫＣ−ＮＷとの混合物を注射し、そして、表示された時間の後に、超音波造影剤を注射した。様々な時点で得られるＣＥＵＳおよび従来型超音波（ＵＳ）画像を示す。画像は、画像化された３つの腫瘍の代表的なものである。（Ｂ）パネルＡで記載された実験から得られる異なる腫瘍領域および周囲組織における血流の増強分析曲線。マウスをそれぞれスキャンのために麻酔し、超音波装置中に再導入したので、時間によって腫瘍の配向は若干異なる。ｎ＝３。
【図１８−１】図１８−１は図１８Ａおよび図１８Ｂである。図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＣＲＥＫＡペプチドおよびそのＮ／Ｃα−メチル化変異体の腫瘍蓄積を示す図である。同所性２２Ｒｖ１異種移植腫瘍を有するマウスに、２００μｇのＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡまたはＮ／Ｃα−メチル化ＣＲＥＫＡペプチドを静脈内注射し、これを３時間循環させた。この時点は、修飾されていないＣＲＥＫＡとメチル化された変異体の一部との間の差を強調する（Ｄ）。マウスを、ＰＢＳで経心臓灌流し、示された器官を集め、紫外線光下で観察した。（Ａ）ＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。いくつかのＮ／Ｃα−メチル化ＣＲＥＫＡ類似体は、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力な蛍光を生じた。統計分析は分散分析で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３〜４）；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ〜Ｃ）ＣＲＥＫＡまたはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡペプチドを注射したマウスからの代表的な画像（Ｂ、２２Ｒｖ１異種移植片；Ｃ、ＬＡＰＣ９異種移植片）。一番上のパネルにおいて、白色点線は、器官が肉眼検査された場所を示し、黄色の線は、腫瘍の輪郭を示す。一番下のパネルは、前記のペプチド（淡灰色染色）を注射されたマウスからの腫瘍セクションの共焦点像を示す。血管を抗ＣＤ３１で視覚化し（星印で示す）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。（Ｂ右パネル）代表的な共焦点像フィールドは、腫瘍間質のマーカーとして用いられる抗フィブリン（フィブリノゲン）（暗灰色染色）および抗フィブロネクチン（暗灰色染色）染色に関してＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡペプチド（明色染色）の局在化を示す；核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。バーは５０μｍを表す。（Ｃ右パネル）ＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。統計分析をスチューデントｔ検定で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスへのペプチド注射の１５分後または３時間後のＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡは、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも長時間にわたり強力な蛍光を生じた。統計分析をスチューデントｔ検定で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３〜４）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ＮＭｅ）および（ＣＭｅ）は、それぞれ、Ｎ−メチル化残基またはＣα−メチル化残基を示す。
【図１８−２】図１８−２は図１８Ｃおよび図１８Ｄである。図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＣＲＥＫＡペプチドおよびそのＮ／Ｃα−メチル化変異体の腫瘍蓄積を示す図である。同所性２２Ｒｖ１異種移植腫瘍を有するマウスに、２００μｇのＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡまたはＮ／Ｃα−メチル化ＣＲＥＫＡペプチドを静脈内注射し、これを３時間循環させた。この時点は、修飾されていないＣＲＥＫＡとメチル化された変異体の一部との間の差を強調する（Ｄ）。マウスを、ＰＢＳで経心臓灌流し、示された器官を集め、紫外線光下で観察した。（Ａ）ＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。いくつかのＮ／Ｃα−メチル化ＣＲＥＫＡ類似体は、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも強力な蛍光を生じた。統計分析は分散分析で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３〜４）；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ〜Ｃ）ＣＲＥＫＡまたはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡペプチドを注射したマウスからの代表的な画像（Ｂ、２２Ｒｖ１異種移植片；Ｃ、ＬＡＰＣ９異種移植片）。一番上のパネルにおいて、白色点線は、器官が肉眼検査された場所を示し、黄色の線は、腫瘍の輪郭を示す。一番下のパネルは、前記のペプチド（淡灰色染色）を注射されたマウスからの腫瘍セクションの共焦点像を示す。血管を抗ＣＤ３１で視覚化し（星印で示す）；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。（Ｂ右パネル）代表的な共焦点像フィールドは、腫瘍間質のマーカーとして用いられる抗フィブリン（フィブリノゲン）（暗灰色染色）および抗フィブロネクチン（暗灰色染色）染色に関してＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡペプチド（明色染色）の局在化を示す；核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。バーは５０μｍを表す。（Ｃ右パネル）ＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。統計分析をスチューデントｔ検定で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスへのペプチド注射の１５分後または３時間後のＩｍａｇｅＪソフトウェアでの蛍光の定量化。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡは、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも長時間にわたり強力な蛍光を生じた。統計分析をスチューデントｔ検定で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝３〜４）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ＮＭｅ）および（ＣＭｅ）は、それぞれ、Ｎ−メチル化残基またはＣα−メチル化残基を示す。
【図１９】２２Ｒｖ１腫瘍にホーミングするＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ−ＮＷを示す図である。同所性２２Ｒｖ１異種移植腫瘍を有するマウスに、２００μｇのＦＡＭで標識されたＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡまたはＦＡＭ−ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡでコーティングされたナノワーム１キログラムあたり５ｍｇの鉄を静脈注射した。ペプチドを３時間循環させ、ナノワームを５時間循環させた。マウスを次いで、ＰＢＳで経心臓灌流し、腫瘍を集めた。腫瘍セクションを、ＣＤ３１または抗フィブリン（フィブリノゲン）（淡灰色染色）で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。ナノワームは明色であり；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。ｎ＝３。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、Ｎ−メチル化ＣＲＥＫＡペプチド類似体でコーティングされたナノワームの改善された腫瘍ホーミングを示す図である。ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドまたはそのＮ−メチル化された変異体、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワームを、２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスに静脈注射した（１ｋｇあたり合計用量５ｍｇの鉄）。（Ａ）腫瘍を５時間後に収集し、そして腫瘍セクションを抗体で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷは明色であり；血管および凝固を抗ＣＤ３１または抗フィブリン（フィブリノゲン）染色（暗灰色染色）で別々に視覚化した。核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは１００μｍを表す（挿入画において５０μｍ）。（Ｂ）Ｔ２加重磁気共鳴画像（ファーストスピンエコー、繰り返し時間＝６．４秒、エコー時間＝６９ｍｓ）。ＣＲＥＫＡ−ＮＷまたはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷを、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。粒子を７〜８時間（ディファレンシャルホーミングに最適になるように予備実験で決定された時間）循環させた。腫瘍を通る軸平面のグレースケール画像を示す。ガドリニウム（Ｇｄ）およびＦｅｒｉｄｅｘ（鉄）を標準試料として使用した、ｎ＝３〜４。
【図２１−１】図２１−１は図２１Ａおよび図２１Ｂである。図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄは、ナノワーム分布ならびに血管内凝固、腫瘍アポトーシス、および腫瘍療法に対する効果を示す。２２Ｒｖ１ヒト前立腺ガンの２週齢同所性異種移植片を有するマウスに、５−ｋＤａのＰＥＧスペーサーを通してペプチドでコーティングされたナノワームを静脈注射した。ナノワームを１日おきに１４日間投与した（１日１キログラムあたり５ｍｇの鉄、合計累積用量３５ｍｇ／ｋｇ）。（Ａ）腫瘍セクションを抗ＣＤ３１で染色し（淡灰色染色）；ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷ／ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷ組み合わせは明色の染色として示される；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。腫瘍の中央の壊死領域は自己蛍光性である。（Ｂ）ＣＥＵＳ画像化および分析は、治療の最後で腫瘍血流の減少を示した。画像はｎ＝３の代表的なものである。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色は、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷ／ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷの組み合わせで処置された典型的な腫瘍の中央で大きな壊死領域（矢印）を示し、これらの腫瘍の生存可能な周縁部における血管を閉塞させた（破線矢印）。ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷ単独で処置されたマウス由来の類似したサイズの腫瘍を比較のために示す。（Ｄ）ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシス分析は淡灰色染色として示される；ナノワーム組み合わせは明色スポットとして示される；核をＤＡＰＩで染色した。バーは２００μｍを表す。
【図２１−２】図２１−２は図２１Ｃおよび図２１Ｄである。図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄは、ナノワーム分布ならびに血管内凝固、腫瘍アポトーシス、および腫瘍療法に対する効果を示す。２２Ｒｖ１ヒト前立腺ガンの２週齢同所性異種移植片を有するマウスに、５−ｋＤａのＰＥＧスペーサーを通してペプチドでコーティングされたナノワームを静脈注射した。ナノワームを１日おきに１４日間投与した（１日１キログラムあたり５ｍｇの鉄、合計累積用量３５ｍｇ／ｋｇ）。（Ａ）腫瘍セクションを抗ＣＤ３１で染色し（淡灰色染色）；ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷ／ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷ組み合わせは明色の染色として示される；核をＤＡＰＩで染色した（暗色の円）。バーは２００μｍを表す。腫瘍の中央の壊死領域は自己蛍光性である。（Ｂ）ＣＥＵＳ画像化および分析は、治療の最後で腫瘍血流の減少を示した。画像はｎ＝３の代表的なものである。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色は、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷ／ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷの組み合わせで処置された典型的な腫瘍の中央で大きな壊死領域（矢印）を示し、これらの腫瘍の生存可能な周縁部における血管を閉塞させた（破線矢印）。ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷ単独で処置されたマウス由来の類似したサイズの腫瘍を比較のために示す。（Ｄ）ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシス分析は淡灰色染色として示される；ナノワーム組み合わせは明色スポットとして示される；核をＤＡＰＩで染色した。バーは２００μｍを表す。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、標的化ナノワームでの腫瘍治療を示す。２２Ｒｖ１またはＬＡＰＣ９ヒト前立腺ガンの同所性異種移植片（それぞれ、接種の２週間後または１０日後）を有するマウスに、ペプチドでコーティングされたナノワームを、５ｋＤａのＰＥＧスペーサーを通して静脈内注射した。粒子を１日おきに１４日間投与した（１日に付き１キログラムあたり５ｍｇの鉄、合計累積用量３５ｍｇ／ｋｇ）。（Ａ）２２Ｒｖ１モデルにおける最後の注射の１日後の腫瘍容積を示す。統計分析は分散分析で実施した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝１０〜１２）；＊＊Ｐ＜０．０１；＜０．００１。２回の独立した実験で類似した結果が得られた。（Ｂ）ＬＡＰＣ９腫瘍を有するマウスをパネルＡで記載したようにして治療し、長時間にわたって生存率をモニタリングした（１群につきｎ＝８）。矢印は、ナノワーム治療を停止した日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示された方法および組成物は、特定の実施形態およびその中に含まれる実施例の以下の詳細な説明ならびに図およびそれらの前述および後述の説明を参照することにより、さらに容易に理解できる。
【００３４】
本発明の化合物、組成物、物品、装置、および／または方法が開示され、記載される前に、それらは、特に明記しない限り特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー法に限定されないか、または特に明記しない限り特定の試薬に限定されず、したがってもちろん様々であり得ると理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのために用いられ、限定するものであることを意図しないことも理解されるべきである。
【００３５】
定義
明細書および添付の請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の記載がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２以上のそのような担体の混合物などを含む。
【００３６】
範囲は、本明細書中で、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」の使用により、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの終点が、他の終点に関連し、かつ他の終点から独立しての両方で重要であることがさらに理解されるであろう。本明細書中では多くの値が開示され、そのそれぞれの値はさらに、本明細書中では、その値自体以外に、「約」その特定の値としても開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されるならば、「約１０」も開示される。当業者には適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、その値［以上」および値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されるならば、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。本出願全体を通して、データは異なる形式の数で提供され、このデータは、終点および出発点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示されるならば、１０および１５を越える、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５に等しい、とは、開示されたものならびに１０から１５の間も考慮されると理解される。２つの特定の単位間のそれぞれの単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【００３７】
本明細書および以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多くの用語が参照される：
【００３８】
「随意の」または「場合によっては」とは、その後に記載される事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、そして記載が、前記事象または状況が起こる例およびそれが起こらない例を含むことを意味する。
【００３９】
本出願全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、それらの全体が、本出願が関連する最新技術をさらに完全に記載するために、本明細書によって参照により本出願に組み込まれる。開示された参考文献はまた、その参考文献が基づく文で検討されているそれらに含まれる物質について、本明細書中に参照により個別かつ具体的に組み込まれる。
【００４０】
開示された方法および組成物は、特に明記しない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に限定されず、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するだけの目的のためであって、限定することを意図するものではないことも理解される。
【００４１】
材料
開示された組成物を調製するために用いられる成分、ならびに本明細書中で開示される方法で用いられる組成物自体が開示される。これらや他の物質が本明細書中で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の様々な個々の組み合わせおよび集団的組み合わせならびに並べ替えのそれぞれの特定指示が明白に開示されていなくても、それぞれは本明細書中で具体的に想定され、記載されていると理解される。例えば、特定のペプチドが開示され、検討され、ペプチドを含む多くの分子に対して多くの修飾をなすことができるならば、特に想定されるのは、ペプチドのあらゆる組み合わせおよび並べ替えならびに特に別段の記載がない限り可能な修飾である。したがって、分子Ａ、Ｂ、Ｃならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、組み合わせ分子の一例Ａ−Ｄが開示されている場合、個別に列挙されていない場合でも、それぞれは個別かつ集合的に想定され、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが検討され、開示されることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの亜群が検討され、開示される。この考えは、これらに限定されるものではないが、開示された組成物の作製法および使用法におけるステップをはじめとする本出願の全ての態様に当てはまる。したがって、実施することができる種々のさらなるステップがある場合、これらの更なるステップのそれぞれは、任意の特定の実施形態または開示された方法の実施形態の組み合わせで実施することができると理解される。
【００４２】
表面分子と少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物とを含む組成物を開示する。修飾された凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合することができ、この場合、組成物は、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する。修飾された凝血塊結合化合物は、その修飾されていない誘導体と比較して、腫瘍における凝固を増強することができる。
【００４３】
対象に開示された組成物のいずれかを投与することを含む方法も開示する。組成物は凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、この場合、組成物は、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。
【００４４】
対象に複数の異なる開示された組成物を投与することを含む方法も開示する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、表面分子および少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物を含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子および少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物を含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、複数の組成物のうちの少なくとも１つは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、組成物のそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、少なくとも１つの組成物は、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。
【００４５】
修飾された凝血塊結合化合物は、メチル化された凝血塊結合化合物を含む可能性がある。メチル化された凝血塊結合化合物は、メチル化されたアミノ酸断片を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から選択することができる。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００４６】
アミノ酸配列は、少なくとも１つの位置でＮ−メチル化またはＣ−メチル化される可能性がある。アミノ酸配列は、Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ（配列番号８）、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ（配列番号１０）、ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１２）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である可能性がある。アミノ酸配列は、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ（配列番号９）、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ（配列番号１１）、またはＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ（配列番号１３）である可能性がある。
【００４７】
組成物は、複数の凝血塊結合化合物を含む可能性があり、この場合、凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し、複数の凝血塊結合化合物は、凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅する。複数の凝血塊結合化合物の１以上は、修飾された凝血塊結合化合物である可能性があり、この場合、修飾された凝血塊結合化合物は、それらの修飾されていない誘導体と比較して、腫瘍での凝固を増強する。複数の凝血塊結合化合物の１以上の修飾された凝血塊結合化合物は、メチル化された凝血塊結合化合物を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物の１以上のメチル化された凝血塊結合化合物は、メチル化されたアミノ酸断片を含む可能性がある。
【００４８】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片のそれぞれは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなるアミノ酸断片、およびメチル化誘導体アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から独立して選択することができる。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。メチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００４９】
複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体またはその保存的変異体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体を含む可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）のメチル化誘導体からなる可能性がある。複数の凝血塊結合化合物のメチル化されたアミノ酸断片は、それぞれ、アミノ酸配列ＲＥＫのメチル化誘導体からなる可能性がある。
【００５０】
いくつかの形態で、表面分子は、血栓形成性である可能性がある。いくつかの形態で、修飾された凝血塊結合化合物は、血栓形成性である可能性がある。
【００５１】
組成物は、１以上の腫瘍ホーミング化合物をさらに含む可能性がある。１以上の腫瘍ホーミング化合物は、アミノ酸断片を含む可能性がある。腫瘍ホーミング化合物の１以上のアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む可能性がある。１以上の腫瘍ホーミング化合物は、血栓形成性である可能性がある。
【００５２】
組成物は、腫瘍血管内部に結合することができる。組成物は、腫瘍成長を軽減することができる。表面分子は、酸化鉄ナノワームを含む可能性がある。表面分子は、酸化鉄ナノ粒子を含む可能性がある。表面分子は、アルブミンナノ粒子を含む可能性がある。表面分子は、リポソームを含む可能性がある。表面分子は、微粒子を含む可能性がある。表面分子は、フルオロカーボン微小気泡を含む可能性がある。
【００５３】
組成物は、少なくとも１００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物は、少なくとも１０００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物は、少なくとも１０，０００の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。
【００５４】
組成物は、１以上の成分をさらに含む可能性がある。当該成分は、血管新生阻害剤、血管形成誘発剤、ガン化学療法剤、細胞毒性薬、抗炎症剤、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、画像造影剤、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射線核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１、および炭素１３からなる群から独立して選択することができる。少なくとも１つの成分は治療剤である可能性がある。治療剤は、ガンを治療するための化合物または組成物を含む可能性がある。治療剤は、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘発する化合物または組成物を含む可能性がある。治療剤はアブラキサンである可能性がある。治療剤はパクリタキセルである可能性がある。治療剤はタキソールである可能性がある。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分は、血栓形成性である可能性がある。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分は凝血塊結合化合物でない。いくつかの形態で、どの成分も凝血塊結合化合物ではない。いくつかの形態で、少なくとも１つの成分はホーミング化合物であり、ここで、ホーミング化合物は、凝血塊結合化合物ではない。少なくとも１つの成分は検出可能剤である可能性がある。検出可能剤はＦＡＭである可能性がある。
【００５５】
組成物は、腫瘍血管系、創傷部位、または両者に選択的にホーミングすることができる。組成物は治療効果を有する可能性がある。治療効果は、腫瘍量の増加の減速または腫瘍量の減少である可能性がある。治療効果は、腫瘍サイズの増加の減速または腫瘍サイズの減少である可能性がある。治療効果は、腫瘍における血液循環の減少または遮断である可能性がある。治療効果は、創傷部位での出血の軽減または停止である可能性がある。治療効果は、創傷部位での出血が停止するまでの時間の短縮である可能性がある。治療効果は、炎症の軽減、創傷治癒速度の増加、瘢痕組織量の減少、痛みの軽減、腫れの軽減、壊死の減少、または組み合わせを含む可能性がある。
【００５６】
凝固は治療効果を有する可能性がある。対象は標的とされる１以上の部位を有する可能性があり、この場合、組成物は標的とされる１以上の部位にホーミングする。対象は腫瘍を有する可能性があり、この場合、組成物は腫瘍に対して治療効果を有する。
【００５７】
いくつかの形態で、組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するように十分な数および組成の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）の数および組成の十分性は、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。
【００５８】
組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するように十分な密度および組成の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）の密度および組成物の十分性は、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。
【００５９】
複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片、フィブリン結合ペプチド、凝血塊結合抗体、および凝血塊結合小有機分子から選択することができる。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片を含む可能性がある。修飾された凝血塊結合化合物は、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾形態、フィブリン結合ペプチドの修飾形態、凝血塊結合抗体の修飾形態、および凝血塊結合小有機分子の修飾形態を含むアミノ酸断片から独立して選択することができる。修飾された凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾形態を含むアミノ酸断片を含む可能性がある。特に有用な修飾はメチル化である。
【００６０】
凝血塊結合化合物のアミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸断片、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から選択することができる。アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含む可能性がある。
【００６１】
アミノ酸断片はさらに、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含む可能性がある。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる可能性もある。アミノ酸断片はアミノ酸配列ＲＥＫから構成される可能性がある。
【００６２】
複数の凝血塊結合化合物は、それぞれフィブリン結合ペプチドを含む可能性がある。フィブリン結合ペプチドは独立して、フィブリン結合タンパク質およびそれらのフィブリン結合誘導体からなる群から選択することができる。別の例では、複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ、凝血塊結合抗体を含む可能性がある。さらに、複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ凝血塊結合小有機分子を含む可能性がある。
【００６３】
いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、この場合、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固した血漿タンパク質へ選択的にホーミングする可能性があり、この場合、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つの修飾されていない凝血塊結合化合物とを含み、ここで、修飾されていない凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つのホーミング化合物とを含み、ここで、ホーミング化合物は、凝血塊結合化合物ではない。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍血管系と選択的に結合することができる。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍ホーミング化合物である可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物は、アミノ酸断片を含む可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物のアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体、またはアミノ酸配列ＣＧＫＲＫ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物を構成するホーミング化合物が異なる可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物を構成する凝血塊結合化合物が異なる可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、ここで、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。
【００６４】
腫瘍にホーミングするだけではなく、それら自身のホーミングを増幅する組成物がさらに開示される。系は、凝固した血漿タンパク質を認識し、腫瘍に選択的にホーミングする凝血塊結合化合物に基づき、この場合、凝血塊結合化合物は血管壁および腫瘍間質に結合する。凝血塊結合化合物とカップリングする表面分子は、腫瘍血管中または創傷部位で蓄積する可能性があり、ここでそれらはさらなる局所的凝固を誘発し、それによりさらに多くの粒子についての新規結合部位が生じる。系は血小板を模倣し、血小板も自由に循環するが、患部で蓄積し、その部位での自身の蓄積を増幅する。凝固に基づく増幅は、腫瘍画像化を大幅に増強し、薬剤担体機能も想定される。
【００６５】
固体腫瘍を治療するための新規方策を開発する際に、腫瘍細胞自身よりもむしろ腫瘍の脈管構造を標的とすることを含む方法が明らかな利点を提供する。腫瘍を通る、例えばフィブリン形成に特異的な腫瘍血管系を通る血流の遮断の誘発は、腫瘍部位における流入および流出プロセスを妨害し、かくして抗腫瘍効果が得られる。腫瘍への血液供給の停止は、凝固剤への特異的暴露により凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ、ｃｌｏｔｔｉｎｇ）プロセスに有利に腫瘍関連血管における凝結原−フィブリン溶解バランスをシフトさせることによって達成することができる。
【００６６】
修飾された凝血塊結合化合物を含む組成物を腫瘍細胞自体に向かわせる。そこで、化合物は蓄積し、さらなる凝固を誘発する。修飾することができ、細胞上または腫瘍血管系および／または間質の環境中で特異的にもしくは優先的に発現、局在化、吸着または誘導できる多くの適切な凝血塊結合化合物が同定されている。これらを以下でさらに詳細に検討する。
【００６７】
開示された組成物は、例えば、凝固を引き起こすことができる（血栓形成）、組成物がホーミングするかもしくは標的とする部位での凝固を増大もしくは増強することができる、および／または、組成物がホーミングするかもしくは標的とする部位で蓄積することができるかまたは組成物の蓄積を増大もしくは増強することができる。そのような組成物を血栓形成性組成物と見なすことができる。開示された組成物のこれらの効果は、例えば、１以上の血栓形成性凝血塊結合化合物、１以上の血栓形成性表面分子、１以上の血栓形成性化合物、１以上の血栓形成性ペプチド、１以上の血栓形成性凝血塊結合ペプチド、および／または１以上の血栓形成性成分を組成物中に含めることによって、引き起こすことができる、および／または増強することができる。例えば、開示された組成物は、１以上の血栓形成性凝血塊結合化合物、１以上の血栓形成性表面分子、１以上の血栓形成性化合物、１以上の血栓形成性ペプチド、１以上の血栓形成性凝血塊結合ペプチド、および／または１以上の血栓形成性成分から構成される可能性がある。開示された組成物はさらに、１以上の非血栓形成性凝血塊結合化合物、１以上の非血栓形成性表面分子、１以上の非血栓形成性化合物、１以上の非血栓形成性ペプチド、１以上の非血栓形成性凝血塊結合ペプチド、および／または１以上の非血栓形成性成分から構成される可能性もある。
【００６８】
Ａ．凝血塊結合化合物
凝血塊結合化合物は、凝血塊および／または凝固した血漿タンパク質などの凝血塊の成分と相互作用する能力を有する任意の化合物である可能性がある。凝血塊結合化合物の修飾形態を使用することにより、凝血塊増幅および腫瘍に対する効果の有効性を増大させることができることが見出されている。組成物はまた、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍中および損傷部位での組成物の蓄積を増幅するような十分な数および組成の凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）も含む可能性がある。一例において、凝血塊結合化合物の数および組成の十分性は、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。別の例では、凝血塊結合化合物の数および組成の十分性は、凝固ならびに凝固部位および損傷部位での組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。凝血塊結合化合物は修飾または非修飾である可能性がある。
【００６９】
複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＡＲを含むアミノ酸断片（例えば、ＣＡＲＳＫＫＤＣ（配列番号６））、アミノ酸配列ＣＲＫを含むアミノ酸断片（例えば、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５））、フィブリン結合ペプチド、凝血塊と結合しフィブリンと結合しないペプチド（例えば、ＣＧＬＩＩＱＫＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、凝血塊結合抗体、ならびに凝血塊結合小有機分子から選択することができる。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片を含む可能性がある。そのようなペプチドはさらに、米国特許出願第２００８／０３０５１０１号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）でも記載されている。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドはさらに、米国特許出願第２００９／００３６３４９号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）にも記載されている。
【００７０】
組成物は、任意の数の凝血塊結合組成物を含む可能性がある。一例として、組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、もしくは１００，０００、またはそれ以上の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物は、前記の数の間の任意の数も含む可能性がある。
【００７１】
「ホーミング分子」という用語は、本明細書中で用いられる場合、正常組織よりもむしろ特定の標的部位または組織にインビボで選択的にホーミングする任意の分子を意味する。同様に、「ホーミングペプチド」または「ホーミングペプチド模倣物」という用語は、正常組織よりもむしろ特定の標的部位または組織に選択的にホーミングするペプチドを意味する。例えば、腫瘍にインビボで選択的にホーミングするホーミング分子は、全ての腫瘍にホーミングする可能性があるか、または１つの腫瘍タイプもしくはサブセットへの優先的なホーミングを示す可能性があると理解される。
【００７２】
「選択的にホーミングする」により、インビボで、ホーミング分子が非標的と比較して標的に優先的に結合することを意味する。例えば、ホーミング分子は、非腫瘍組織または非創傷組織と比較して、１以上の腫瘍、創傷組織、または血餅の凝固した血漿と優先的に結合し得る。そのようなホーミング分子は、例えば腫瘍に選択的にホーミングする可能性がある。例えば、腫瘍への選択的ホーミングは、一般的に、非腫瘍組織のいくつかの組織タイプと比較して、腫瘍（または他の標的）内での少なくとも２倍高い局在化により特徴付けられる。ホーミング分子は、非腫瘍組織のいくつかもしくは多くの組織タイプと比較して、またはほとんどもしくは全ての非腫瘍組織と比較して、腫瘍（または他の標的）に対する５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上の優先的な局在化により特徴付けることができる。したがって、場合によっては、ホーミング分子は部分的には標的組織へのホーミングに加えて１以上の正常な器官へホーミングすると理解される。選択的ホーミングは、ターゲティングと呼ぶこともできる。
【００７３】
有用な凝血塊結合化合物としては、例えば、凝血塊結合ペプチド、凝血塊結合抗体、凝血塊結合小有機分子、血栓形成性凝血塊結合化合物、血栓形成性凝血塊結合ペプチド、血栓形成性凝血塊結合抗体、血栓形成性凝血塊結合小有機分子、非血栓形成性凝血塊結合化合物、非血栓形成性凝血塊結合ペプチド、非血栓形成性凝血塊結合抗体、および／または非血栓形成性凝血塊結合小有機分子を挙げることができる。
【００７４】
組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍における組成物の蓄積を増幅するように十分な数、密度、および／または組成の凝血塊結合化合物を含む可能性がある。凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）の数、密度、および／または組成の十分性は、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。
【００７５】
表面分子上の凝血塊結合化合物の密度は、任意の好適な方法で記載することができる。例えば、密度は、例えば、表面分子の所定の面積、表面積、容積、単位、サブユニット、アーム等あたりの凝血塊結合化合物の数として表現することができる。密度は、例えば、全表面分子の面積、表面積、容積、単位、サブユニット、アーム等に対するものであるか、または表面分子の部分の面積、表面積、容積、単位、サブユニット、アーム等に対するものでもある可能性がある。例えば、凝血塊結合化合物の十分な密度は、表面分子の一部で存在し得る。この濃密な部分の存在は、凝固を引き起こし、組成物の蓄積を増幅する可能性がある。したがって、十分な密度の凝血塊結合化合物を有する組成物は、全表面分子について、または表面分子の１つだけもしくはそれ以上の部分について閾値密度（またはそれ以上）を有する可能性がある。
【００７６】
密度は、任意の好適な方法で測定または算出することができる。例えば、１つの表面分子または表面分子の群上に存在する凝血塊結合化合物の数または量は、例えば、標識された凝血塊結合化合物により産生されるシグナルのレベルまたは強度を検出し、表面分子の構造的特性に基づいて密度を計算することによって、測定することができる。
【００７７】
凝血塊結合化合物の密度または閾値密度は、例えば、表面分子の全体もしくは一部の１平方ｎＭあたり、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００の凝血塊結合化合物である可能性がある。組成物は、前記密度の間の任意の密度も含む可能性がある。
【００７８】
凝血塊結合化合物の密度または閾値密度は、例えば、表面分子の全体もしくは一部の１平方μＭあたり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００、９５００、１０，０００の凝血塊結合化合物である可能性がある。組成物は、前記密度の間の任意の密度も含む可能性がある。
【００７９】
凝血塊結合化合物の密度または閾値密度は、例えば、表面分子の全体もしくは一部の１立方ｎＭあたり、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００の凝血塊結合化合物である可能性がある。組成物は、前記密度の間の任意の密度も含む可能性がある。
【００８０】
凝血塊結合化合物の密度または閾値密度は、例えば、表面分子の全体もしくは一部の１立方μＭあたり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００、９５００、１０，０００の凝血塊結合化合物である可能性がある。組成物は、前記密度の間の任意の密度も含む可能性がある。
【００８１】
１．修飾された凝血塊結合化合物
開示された凝血塊結合化合物は、凝血塊結合化合物の修飾形態を含む可能性がある。凝血塊結合化合物は、任意の有用な修飾を有する可能性がある。例えば、いくつかの修飾は、凝血塊結合化合物を安定化させることができる。例えば、開示された凝血塊結合化合物はメチル化された凝血塊結合化合物を含む。メチル化された凝血塊結合化合物は、凝血塊結合化合物がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸断片を含む場合に特に有用である。例えば、凝血塊結合化合物は修飾された凝血塊結合化合物である可能性があり、この場合、例えば、修飾された凝血塊結合化合物には、修飾されたアミノ酸断片またはアミノ酸配列が含まれる。例えば、修飾された凝血塊結合化合物はメチル化された凝血塊結合化合物である可能性があり、この場合、例えば、メチル化された凝血塊結合化合物には、メチル化されたアミノ酸断片またはアミノ酸配列が含まれる。他の修飾を単独または組み合わせのいずれかで用いることができる。凝血塊結合化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸断片および／もしくはアミノ酸配列であるか、またはタンパク質、ペプチド、アミノ酸断片および／もしくはアミノ酸配列を含む場合、修飾は、そのタンパク質、ペプチド、アミノ酸断片、アミノ酸配列ならびに／またはそのタンパク質、ペプチド、アミノ酸断片および／もしくはアミノ酸配列中の任意のアミノ酸に対してである可能性がある。アミノ酸およびペプチド修飾は、当業者に公知であり、そのいくつかは、以下や本明細書の別の箇所で記載される。メチル化が開示された凝血塊結合化合物に特に有用な修飾である。
【００８２】
凝血塊結合化合物の修飾形態を使用することにより、凝血塊増幅および腫瘍に対する影響の有用性を増大させることができることが見いだされた。組成物は、この組成物が凝固を引き起こし、腫瘍においておよび損傷部位での組成物の蓄積を増幅するのに十分な数および組成の凝血塊結合化合物（修飾または非修飾）も含む可能性がある。一例において、修飾および／または非修飾凝血塊結合化合物の数および組成の十分性は、非ヒト動物における腫瘍での凝固および組成物の蓄積の増幅を評価することによって決定することができる。そのような方法を、以下でさらに詳細に検討する。
【００８３】
複数の修飾および／または非修飾凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾または非修飾形態を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＡＲの修飾または非修飾形態を含むアミノ酸断片（たとえば、ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号６））、アミノ酸配列ＣＲＫの修飾または非修飾形態を含むアミノ酸断片（たとえば、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５））、フィブリン結合ペプチドの修飾または非修飾形態、凝血塊に結合しフィブリンに結合しないペプチドの修飾または非修飾形態（たとえば、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、凝血塊結合抗体の修飾または非修飾形態、ならびに凝血塊結合小有機分子の修飾または非修飾形態から選択することができる。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫの修飾または非修飾形態を含むアミノ酸断片を含む可能性がある。そのようなペプチドは、米国特許出願第２００８／０３０５１０１号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）にも記載されている。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドは、米国特許出願第２００９／００３６３４９号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）にも記載されている。
【００８４】
組成物は、任意の数の修飾および／または非修飾凝血塊結合化合物を含む可能性がある。一例として、組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、もしくは１００，０００、またはそれ以上の修飾および／または非修飾凝血塊結合化合物を含む可能性がある。組成物はさらに、前記の数の間の任意の数も含む可能性がある。
【００８５】
本明細書中で用いられる場合、タンパク質、ペプチド、アミノ酸断片、アミノ酸配列などの「メチル化誘導体」は、メチル化された、タンパク質、ペプチド、アミノ酸断片、アミノ酸配列などの形態を指す。文脈上、特に指示のない限り、タンパク質、ペプチド、アミノ酸断片、アミノ酸配列などのメチル化誘導体への言及は、メチル化以外の主なタンパク質、ペプチド、アミノ酸断片、アミノ酸配列などの修飾を含まない。メチル化誘導体は他の修飾も有する可能性があるが、そのような修飾は一般に有名である。例えば、アミノ酸配列の保存的変異体は、ベースのアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む。したがって、例えば、特定のアミノ酸配列の「メチル化誘導体」「およびその保存的変異体」への言及は、特定のアミノ酸配列のメチル化された形態および特定のアミノ酸配列の保存的変異体のメチル化形態を含むが、誘導の他の修飾は含まない。別の例として、アミノ酸置換を含むアミノ酸断片のメチル化誘導体への言及は、アミノ酸断片のアミノ酸配列のメチル化形態を含み、アミノ酸断片のアミノ酸配列のメチル化形態は、アミノ酸置換を含む。
【００８６】
ペプチドは、種々の修飾を有する可能性がある。修飾を用いて、ペプチドの特性を変更または改善することができる。例えば、開示されたペプチドを１以上のアミノ酸でＮ−メチル化、Ｏメチル化、Ｓメチル化、Ｃ−メチル化、または組み合わせをすることができる。
【００８７】
開示されたペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾することができる。アミノ末端修飾としては、メチル化（たとえば、−ＮＨＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２）、（たとえば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体、α−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、もしくはアルファ−ヨード酢酸での）アセチル化、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基の付加、またはＲＣＯＯ−により定義されるカルボキシレート官能基もしくはＲ−ＳＯ２−（式中、Ｒは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなどからなる群から選択される）により定義されるスルホニル官能基、および類似の基を含む任意のブロッキング基でのアミノ末端のブロッキングが挙げられる。Ｎ末端で非アミノ酸を組み入れて（Ｎ末端アミノ基がないように）、プロテアーゼに対する感受性を減少させるか、またはペプチド化合物のコンフォメーションを制限することもできる。好ましい実施形態では、Ｎ末端を酢酸または無水酢酸でアセチル化する。
【００８８】
カルボキシ末端修飾は、カルボキサミド基で置換すること、またはカルボキシ末端で環状ラクタムを形成して、構造的拘束を導入することを含む。開示されたペプチドを環化するか、または非アミノもしくは非カルボキシ残基をペプチドの末端で組み入れて、末端アミノもしくはカルボキシル基がないようにするか、プロテアーゼに対する感受性を減少させるか、またはペプチドのコンフォメーションを制限することもできる。開示されたペプチドのＣ末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにその低級エステル誘導体、ならびにその薬剤的に許容される塩が挙げられる。
【００８９】
遺伝的にコード化されたアミノ酸（または立体異性Ｄアミノ酸）の天然に存在する側鎖を他の側鎖、たとえばアルキル、低級（Ｃ１−６）アルキル、環状４、５、６〜７員アルキル、アミド、アミド低級アルキルアミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル誘導体、ならびに４、５、６〜７員複素環などの基で置換することができる。特に、プロリン残基の環サイズが５員から４、６、または７員に変更されているプロリン類似体を用いることができる。環状基は飽和または不飽和である可能性があり、そして不飽和であるならば、芳香族または非芳香族である可能性がある。複素環基は、好ましくは、１以上の窒素、酸素、および／または硫黄ヘテロ原子を含む。そのような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（たとえば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（たとえば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（たとえば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（たとえば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（たとえば、チオモルホリノ）、およびトリアゾリルが挙げられる。これらの複素環基は、置換または非置換である可能性がある。基が置換されている場合、その置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換もしくは非置換フェニルである可能性がある。
【００９０】
リン酸化、および他の方法によりペプチドを容易に修飾することもできる［たとえば、Hruby,  et  al.  (1990)  Biochem  J.  268:249-262に記載されているとおり］。
【００９１】
開示されたペプチドは、類似した生物学的活性を有する非ペプチド化合物の構造モデルとしての機能も果たし得る。当業者らは、主要ペプチド化合物と同じかまたは類似した所望の生物学的活性を有するが、溶解度、安定性、ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関して主要化合物よりも有利な活性を有する化合物を構築するために種々の技術が利用可能であることを認識している［Morgan  and  Gainor  (1989)  Ann.  Rep.  Med.  Chem.  24:243-252を参照のこと］。これらの技術としては、これらに限定されるものではないが、ペプチド骨格を、ホスホネート、アミデート、カーバメート、スルホンアミド、第２アミン、およびＮ−メチルアミノ酸から構成される骨格で置換することが挙げられる。
【００９２】
２．ペプチドおよびアミノ酸断片
いくつかの形態で、凝血塊結合化合物は、ペプチド、ペプチド模倣物、および／もしくはアミノ酸断片である可能性があるか、またはペプチド、ペプチド模倣物、および／もしくはアミノ酸断片を含む可能性がある。文脈上、特に指示のない限り、本明細書中での「ペプチド」への言及は、ペプチドの一部を形成し得るか、またはペプチド全体を構成し得るアミノ酸断片も指すことが意図される。開示されたペプチドは、単離された形態である可能性がある。開示されたペプチドに関連して本明細書中で用いられる場合、「単離された」という用語は、夾雑ポリペプチド、脂質、核酸および通常、細胞中のペプチドに関連するか、またはライブラリ中もしくは粗調製物中のペプチドと関連する他の細胞性物質などの物質を比較的含まない形態のペプチドを意味する。
【００９３】
開示されたペプチドおよびアミノ酸断片は、任意の好適な長さを有する可能性がある。開示されたペプチドは、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５または４０残基未満の比較的短い長さを有する可能性がある。開示されたペプチドはまた、有意により長い配列との関連で有用である可能性がある。したがって、ペプチドは、例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００または２０００残基までの長さを有する可能性がある。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基の長さを有する可能性がある。さらなる実施形態において、ペプチドは、５〜２００残基、５〜１００残基、５〜９０残基、５〜８０残基、５〜７０残基、５〜６０残基、５〜５０残基、５〜４０残基、５〜３０残基、５〜２０残基、５〜１５残基、５〜１０残基、１０〜２００残基、１０〜１００残基、１０〜９０残基、１０〜８０残基、１０〜７０残基、１０〜６０残基、１０〜５０残基、１０〜４０残基、１０〜３０残基、１０〜２０残基、２０〜２００残基、２０〜１００残基、２０〜９０残基、２０〜８０残基、２０〜７０残基、２０〜６０残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基または２０〜３０残基の長さを有する可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「残基」という用語は、アミノ酸またはアミノ酸類似体を指す。
【００９４】
開示されたアミノ酸断片は、例えば、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５または４０残基未満の比較的短い長さを有する可能性がある。開示されたアミノ酸断片はまた、有意により長い配列との関連で有用である可能性がある。したがって、アミノ酸断片は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００または２０００残基までの長さを有する可能性がある。特定の実施形態では、アミノ酸断片は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基の長さを有する可能性がある。さらなる実施形態において、アミノ酸断片は、５〜２００残基、５〜１００残基、５〜９０残基、５〜８０残基、５〜７０残基、５〜６０残基、５〜５０残基、５〜４０残基、５〜３０残基、５〜２０残基、５〜１５残基、５〜１０残基、１０〜２００残基、１０〜１００残基、１０〜９０残基、１０〜８０残基、１０〜７０残基、１０〜６０残基、１０〜５０残基、１０〜４０残基、１０〜３０残基、１０〜２０残基、２０〜２００残基、２０〜１００残基、２０〜９０残基、２０〜８０残基、２０〜７０残基、２０〜６０残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基または２０〜３０残基の長さを有する可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「残基」という用語は、アミノ酸またはアミノ酸類似体を指す。
【００９５】
本明細書は種々のタンパク質、タンパク質配列、ペプチド、ペプチド配列、およびアミノ酸配列を検討しているので、それらの配列をコード化することができる核酸も開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコード化する配列を有する全ての核酸ならびに、縮重核酸を含み、タンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコード化する全ての核酸を包含する。したがって、各特定の核酸配列は本明細書中ではすべて書き出されていない可能性があるが、あらゆる配列が開示されたタンパク質配列により本明細書中で実際に開示され、記載されると理解される。
【００９６】
ペプチドと似ているが、天然のペプチド結合により結合しない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体に関する結合は、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨＨ２ＳＯ−（これらや他のものは、Spatola,  A.  F.  in  Chemistry  and  Biochemistry  of  Amino  Acids,  Peptides,  and  Proteins,  B.  Weinstein,  eds.,  Marcel  Dekker,  New  York,  p.  267  (1983);Spatola,  A.  F.,  Vega  Data  (March  1983)、Vol.  1,  Issue  3,  Peptide  Backbone  Modifications  （総説）；Morley,  Trends  Pharm  Sci  (1980)  pp.  463-468;Hudson,  D.  et  al,  Int  J  Pept  Prot  Res  14:177-185  (1979)  （−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２）；Spatola  et  al.  Life  Sci  38:  1243-1249  (1986)（−ＣＨＨ２−Ｓ）；Hann  J.  Chem.  Soc  Perkin  Trans.  I  307-314  (1982)  （−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Almquist  et  al.  J.  Med.  Chem.  23:  1392-1398  (1980)  （−ＣＯＣＨ２−）；Jennings-White  et  al.  Tetrahedron  Lett  23:2533  (1982)（−ＣＯＣＨ２−）；Szelke  et  al.  European  Appln,  EP  45665  CA  (1982):  97:39405  (1982)（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Holladay  et  al.  Tetrahedron.  Lett  24:4401-4404  (1983)  （−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびHruby  Life  Sci  31  :  189-199  (1982)  （−ＣＨ２−Ｓ−）；（そのそれぞれは、参照により本明細書中に組み込まれる）で見出すことができる。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体、たとえばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸などは、結合原子間に１より多い原子を有する可能性があると理解される。
【００９７】
別の機能を有する第２ペプチドに融合した凝血塊結合ペプチドを含む二官能性ペプチドも開示される。そのような二官能性ペプチドは、完全長分子の異なる部分により付与される少なくとも２つの機能を有し、例えば、凝固を促進する能力に加えて、抗血管新生活性またはアポトーシス促進活性を示すことができる。
【００９８】
それぞれ独立して、ペプチドまたはアミノ酸断片（例えば、アミノ酸配列配列番号１、またはその保存的変異体もしくはペプチド模倣物）を含む少なくとも２つのサブ配列を包含する単離された多価ペプチドも開示される。多価ペプチドは、例えば、それぞれ独立してペプチドを含む、少なくとも３、少なくとも５または少なくとも１０のそのようなサブ配列を有する可能性がある。特定の実施形態では、多価ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０の同一または非同一サブ配列を有する可能性がある。これは、開示された組成物を含む可能性がある複数の凝血塊結合化合物以外である。さらなる実施形態では、多価ペプチドは、配列番号１の繰り返しなどの同一サブ配列を含む可能性がある。さらなる実施形態では、多価ペプチドは、連続した同一または非同一サブ配列を含み、それらは介在するアミノ酸によって分離されない。
【００９９】
本明細書中で用いられる場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド、タンパク質、タンパク質の断片などを意味するために広く用いられる。「ペプチド模倣物」という用語は、本明細書中で用いられる場合、それが構造的に基づくペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。そのようなペプチド模倣物としては、化学的に修飾されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド様分子、およびペプトイドが挙げられ、ペプチド模倣物が誘導されるペプチドの標的との選択的相互作用などの活性を有する（例えば、Goodman  and  Ro,  Peptidomimetics  for  Drug  Design,  in  “Burger’s  Medicinal  Chemistry  and  Drug  Discovery”  Vol.  1  (ed.  M.  E.  Wolff;John  Wiley  &  Sons  1995)、pages  803-861を参照のこと）。
【０１００】
例えば、制約されたアミノ酸を含むペプチド様分子、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分、またはアミド結合同配体をはじめとする種々のペプチド模倣物は、当該技術分野で公知である。制約された天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド模倣物は、例えば、α−メチル化アミノ酸；α，α−ジアルキルグリシンまたはα−アミノシクロアルカンカルボン酸；Ｎα−Ｃα環化アミノ酸；Ｎα−メチル化アミノ酸；β−もしくはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸；α，β−不飽和アミノ酸；β，β−ジメチルもしくはβ−メチルアミノ酸；β−置換−２，３−メタノアミノ酸；Ｎ−ＣεもしくはＣα−ＣΔ環化アミノ酸；置換プロリンもしくは別のアミノ酸模倣物を含み得る。ペプチド二次構造を模倣するペプチド模倣物は、例えば、非ペプチドβターン模倣物；γターン模倣物；βシート構造の模倣物；またはらせん構造の模倣物を含み得、そのそれぞれは、当該技術分野で周知である。ペプチド模倣はまた、例えば、アミド結合同配体、たとえば逆・反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）修飾；還元アミド結合；メチレンチオエーテルもしくはメチレン−スルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランス−オレフィンもしくはフルオロオレフィン結合；１，５−二置換テトラゾール環；ケトメチレンもしくはフルオロケトメチレン結合または別のアミド同配体を含むペプチド様分子でもある可能性がある。当業者は、これらや他のペプチド模倣物が本明細書中で用いられる「ペプチド模倣物」という用語の意味に含まれることを理解する。
【０１０１】
ペプチド模倣物を同定するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、潜在的ペプチド模倣物のライブラリを含むデータベースのスクリーニングを含む。一例として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知結晶構造を有する、３００，０００を越える化合物のコレクションを含む（Allen  et  al,  Acta  Crystalloqr.Section  B,  35:2331  (1979））。この構造寄託物（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）は、新規結晶構造が決定され、開示されたペプチド同じ形状などの好適な形状、ならびに標的分子に対して潜在的な幾何学的および化学的相補性を有する化合物についてスクリーニングすることができる際に、継続的に更新される。ペプチドの結晶構造またはペプチドと結合する標的分子が利用可能でない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤを用いて構造を生成させることができる（Rusinko  et  al,  J.  Chem.  Inf.  Comput.  Sci.  29:251  (1989)）。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サンレアンドロ））は、市販され、例えば、ガン細胞と選択的に相互作用する際に活性を有するペプチドの潜在的なペプチド模倣物を同定するために検索することもできる、約１００，０００の化合物を含む。
【０１０２】
３．ホーミングペプチド
当該技術分野では、凝固した血漿タンパク質にホーミングするペプチドのいくつかの例がある。例としては、ＲＥＫ、ＲＥＫを含むペプチド、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）、およびＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むペプチドが挙げられる。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸断片、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸断片から独立して選択することもできる。アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的変異体を含む可能性がある。
【０１０３】
アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含む可能性がある。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる可能性がある。アミノ酸断片はアミノ酸配列ＲＥＫからなる可能性がある。
【０１０４】
４．他の凝血塊結合ペプチド
凝血塊結合化合物はさらに、フィブリン結合ペプチド（ＦＢＰ）を含む可能性がある。フィブリン結合ペプチドの例は、当該技術分野で公知である（Van  Rooijen  N,  Sanders  A  (1994)  J  Immunol  Methods  174:  83-93;Moghimi  SM,  Hunter  AC,  Murray  JC  (2001)  Pharmacol  Rev  53  :  283-318；米国特許第５，７９２，７４２号（すべて、フィブリン結合ペプチドに関するそれらの教唆について全体として参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０１０５】
凝血塊結合ペプチドはさらに、フィブリン以外のタンパク質とも結合することができる。例としては、凝血塊中に組み入れられるようになったフィブロネクチンと結合するペプチド（Pilch  et  al.,  (2006)  PNAS,  103:  2800-2804（凝血塊結合ペプチドに関するその教唆に関してその全体が本明細書中に組み込まれる））が挙げられる。凝血塊結合ペプチドの一例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３）が挙げられる。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）またはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）を含むアミノ酸断片、あるいはアミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）からなるアミノ酸断片から独立して選択することもできる。アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）またはその保存的変異体を含む可能性がある。
【０１０６】
アミノ酸断片はさらに、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）も含む可能性がある。アミノ酸断片はさらに、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）からなる可能性もある。
【０１０７】
アミノ酸断片はさらに、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号６））、およびアミノ酸配列ＣＲＫ（たとえば、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）も含む可能性がある。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドはさらに、米国特許出願第２００９／００３６３４９号（そのようなペプチドの記載に関して参照により本明細書中に組み込まれる）でも記載されている。
【０１０８】
５．凝血塊結合抗体
凝血塊結合化合物は凝血塊結合抗体を含む可能性がある。凝血塊結合抗体の例は、当該技術分野で公知である（Holvoet  et  al.  Circulation,  Vol  87,  1007-1016,  1993;Bode  et  al.  J.  Biol.  Chem.,  Vol.  264,  Issue  2,  944-948,  Jan,  1989;Huang  et  al.  Science  1997:  Vol.  275.  no.  5299,  pp.  547  -550（すべては、凝血塊結合抗体に関するそれらの教唆についてその全体が参照により本明細書中に組み込まれる））。
【０１０９】
「抗体」という用語は、本明細書中では広義で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を包含する。インタクト免疫グロブリン分子に加えて、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒトもしくはヒト化バージョンまたはその断片も、それらが凝血塊と結合するか、または相互作用するそれらの能力について選択されるかぎり、「抗体」という用語に含まれる。抗体は、本明細書中で記載されるインビトロアッセイを用いて、または類似の方法により、それらの所望の活性について試験することができ、その後、それらのインビボ治療および／または予防活性を、公知の臨床検査法にしたがって試験する。
【０１１０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体、すなわち、集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセット中に存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である抗体を指す。本明細書中のモノクローナル抗体は特に、重および／または軽鎖の一部が、特定の種由来であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同性であり、一方、鎖の残りは、別の種由来であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片中の対応する配列と同一であるかまたは相同性である、「キメラ」抗体を、それらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびMorrison  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  81  :6851-6855  (1984)を参照のこと）。
【０１１１】
開示されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。例えば、開示されたモノクローナル抗体は、Kohler  and  Milstein,  Nature,  256:495  (1975)により記載されているハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適切な宿主動物を、典型的には、免疫剤で免疫化して、この免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。別法として、たとえば、本明細書中に記載されるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を用いて、インビトロでリンパ球を免疫化することができる。
【０１１２】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly  et  al）で記載されているものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。開示されたモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、通常の手順を用いて容易に単離することができ配列決定することができる（たとえば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。抗体または抗体フラグメントのライブラリは、たとえば、米国特許第５，８０４，４４０号（Burton  et  al）および米国特許第６，０９６，４４１号（Barbas  et  al）で記載されているようなファージディスプレー技術を用いて、生成させ、スクリーニングすることもできる。
【０１１３】
インビトロ法は、一価抗体を調製するためにも好適である。抗体を消化して、その断片、特にＦａｂフラグメントを産生することは、当該技術分野で公知の常用手技を用いて達成することができる。たとえば、消化は、パパインを用いて実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号で記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生し、それぞれは１つの抗原結合部位と、残りのＦｃ断片とを有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる断片が生じる。
【０１１４】
断片は、他の配列と結合しているかどうかにかかわらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾も含む可能性がある。ただし、抗体または抗体フラグメントの活性は、非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して著しく改変または損なわれないものとする。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／付加すること、その生体寿命（ｂｉｏ−ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を増大させること、その分泌特性を改変することなどのいくつかのさらなる特性を提供することができる。いずれにせよ、抗体または抗体フラグメントは、生物活性特性、例えばその同族抗原に対する特異的結合を有していなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性領域は、タンパク質の特異的領域の突然変異誘発と、それに続く発現、および発現されたポリペプチドの試験によって同定することができる。そのような方法は、当業者には容易に明らかであり、抗体または抗体フラグメントをコード化する核酸の部位特異的突然変異誘発を含む可能性がある。（Zoller,  M.J.  Curr.  Opin.  Biotechnol.  3:348-354,  1992）。
【０１１５】
本明細書中で用いられる場合、「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指す可能性もある。多くの非ヒト抗体（たとえば、マウス、ラット、またはウサギ由来のもの）は、ヒトにおいて自然に抗原性であり、したがって、ヒトに投与された場合に望ましくない免疫応答を引き起こす可能性がある。したがって、当該方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を減らす働きをする。
【０１１６】
ヒト抗体は、任意の技術を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体産生のための技術の例としては、Ｃｏｌｅら（Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy,  Alan  R.  Liss,  p.  77,  1985）およびＢｏｅｒｎｅｒら（J.  Immunol.,  147(1):86-95、1991）により記載されるものが挙げられる。ヒト抗体（およびそれらの断片）は、ファージディスプレーライブラリを用いて産生することもできる（Hoogenboom  et  al,  J.  Mol.  Biol,  227:381,  1991;Marks  et  al.,  J.  Mol.  Biol,  222:581,  1991）。
【０１１７】
ヒト抗体は、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫化に反応して、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック突然変異マウスが記載されている（たとえば、Jakobovits  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:2551-255  (1993);Jakobovits  et  al,  Nature,  362:255-258  (1993);Bruggermann  et  al,  Year  in  Immunol,  7:33  (1993)を参照のこと）。特に、これらのキメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖Ｊ領域（Ｈ））遺伝子のホモ接合欠失の結果、内因性抗体産生が完全に阻害され、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイをそのような生殖細胞系変異体マウス中にうまく移すと、その結果、抗原攻撃によりヒト抗体が産生される。所望の活性を有する抗体を、本明細書中に記載されるようなＥｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を用いて選択する。
【０１１８】
抗体ヒト化技術は、一般的に、抗体分子の１以上のポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ配列を操作する、組換えＤＮＡ技術を使用することを含む。したがって、非ヒト抗体のヒト化形態（またはその断片）は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワーク中に組み入れられた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含むキメラ抗体または抗体鎖（またはその断片、例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または他の抗原結合部分）である。
【０１１９】
ヒト化抗体を生成させるために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基を、所望の抗原結合特性（たとえば、標的抗原に対するあるレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１以上のＣＤＲからの残基と置換する。数例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はさらに、レシピエント抗体においても、インポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基も含む可能性がある。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中へ導入された１以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似の部位由来の残基により置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般的に、抗体定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト抗体の抗体定常領域の少なくとも一部分を含む（Jones  et  al.,  Nature,  321  :522-525  (1986)、Reichmann  et  al,  Nature,  332:323-327  (1988)、およびPresta,  Curr.  Opin.  Struct.  Biol,  2:593-596  (1992)）。
【０１２０】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Jones  et  al,  Nature,  321  :522-525  (1986)、Riechmann  et  al,  Nature,  332:323-327  (1988)、Verhoeyen  et  al,  Science,  239:  1534-1536  (1988)）にしたがって、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより生成させることができる。ヒト化抗体を産生するために用いられる方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly  et  al）、米国特許第５，５６５，３３２号（Hoogenboom  et  al）、米国特許第５，７２１，３６７号（Kay  et  al）、米国特許第５，８３７，２４３号（Deo  et  al）、米国特許第５，９３９，５９８号（Kucherlapati  et  al）、米国特許第６，１３０，３６４号（Jakobovits  et  al）、および米国特許第６，１８０，３７７号（Morgan  et  al）号にも記載されている。
【０１２１】
６．小有機分子
凝血塊結合化合物は小有機分子でもある可能性がある。凝血塊と相互作用または結合できる小有機分子は、当該技術分野で公知である。これらの分子は、当該技術分野で公知の方法、たとえばコンビナトリアルケミストリーにより同定することもできる。小有機分子のいくつかの形態は、１０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子である可能性がある。
【０１２２】
コンビナトリアルケミストリーには、これらに限定されるものではないが、たとえば、凝血塊と相互作用できる小分子、凝血塊と結合した分子、たとえばフィブリンもしくはフィブロネクチン、または凝固した血漿タンパク質を単離するためのすべての方法が含まれる。分子の大きなプールを合成し、その複雑な混合物をある選択および富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）プロセス、たとえば凝血塊との相互作用の検出に付す。
【０１２３】
種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせて当業者に周知の方法を用いて、所望の標的と結合または相互作用する小分子を単離し、特徴づけることができる。これらの化合物の相対的結合親和性を比較し、当業者に周知である競合的結合研究を用いて最適化合物を同定することができる。例えば、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を用いる競合的結合研究を用いることができる。
【０１２４】
コンビナトリアルライブラリを作製し、コンビナトリアルライブラリをスクリーニングして、所望の標的と結合する分子を単離するための技術は当業者に周知である。代表的な技術および方法は、これらに限定されるものではないが、米国特許第５，０８４，８２４号、第５，２８８，５１４号、第５，４４９，７５４号、第５，５０６，３３７号、第５，５３９，０８３号、第５，５４５，５６８号、第５，５５６，７６２号、第５，５６５，３２４号、第５，５６５，３３２号、第５，５７３，９０５号、第５，６１８，８２５号、第５，６１９，６８０号、５，６２７，２１０号、５，６４６，２８５号、５，６６３，０４６号、第５，６７０，３２６号、第５，６７７，１９５号、５，６８３，８９９号、第５，６８８，６９６号、第５，６８８，９９７号、第５，６９８，６８５号、５，７１２，１４６号、第５，７２１，０９９号、第５，７２３，５９８号、第５，７４１，７１３号、第５，７９２，４３１号、第５，８０７，６８３号、第５，８０７，７５４号、第５，８２１，１３０号、５，８３１，０１４号、第５，８３４，１９５号、５，８３４，３１８号、第５，８３４，５８８号、第５，８４０，５００号、５，８４７，１５０号、５，８５６，１０７号、第５，８５６，４９６号、第５，８５９，１９０号、５，８６４，０１０号、５，８７４，４４３号、第５，８７７，２１４号、第５，８８０，９７２号、第５，８８６，１２６号、第５，８８６，１２７号、第５，８９１，７３７号、第５，９１６，８９９号、第５，９１９，９５５号、５，９２５，５２７号、第５，９３９，２６８号、第５，９４２，３８７号、第５，９４５，０７０号、５，９４８，６９６号、第５，９５８，７０２号、第５，９５８，７９２号、第５，９６２，３３７号、第５，９６５，７１９号、第５，９７２，７１９号、第５，９７６，８９４号、第５，９８０，７０４号、第５，９８５，３５６号、第５，９９９，０８６号、第６，００１，５７９号、第６，００４，６１７号、第６，００８，３２１号、第６，０１７，７６８号、第６，０２５，３７１号、第６，０３０，９１７号、第６，０４０，１９３号、第６，０４５，６７１号、第６，０４５，７５５、６，０６０，５９６号、および第６，０６１，６３６号で見いだすことができる。
【０１２５】
コンビナトリアルライブラリは、多くの異なる合成技術を用いて広範囲の分子から作製することができる。例えば、融合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環状物（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔａｇｓ）（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノサブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含むライブラリ。
【０１２６】
本明細書中で用いられる場合、コンビナトリアル法およびライブラリは、伝統的なスクリーニング法およびライブラリならびに反復相プロセスで用いられる方法およびライブラリを含んでいた。小有機分子のライブラリは、一般的に、少なくとも２の有機化合物、多くの場合は少なくとも約２５、１００  ５００の異なる有機化合物、さらに一般的には少なくとも約１０００の異なる有機化合物、好ましくは少なくとも約２５００の異なる有機化合物、さらに好ましくは少なくとも約５０００の異なる有機化合物、そして最も好ましくは少なくとも約１０，０００またはそれ以上の異なる有機化合物を含む。ライブラリは、ライブラリの各分子がライブラリの他の分子から空間的に分離され得るように選択または構築することができ（たとえば、ライブラリの各メンバーは別のマイクロタイタープレート中に存在する）、またはライブラリの２以上のメンバーは、デコンボリューションの方法が容易に利用可能であるならば、組み合わせることができる。有機化合物のライブラリを調製する方法は、本発明には重要でない。
【０１２７】
Ｂ．腫瘍ホーミング化合物
開示された組成物は１以上の腫瘍ホーミング化合物も含む可能性がある。腫瘍ホーミング化合物は、腫瘍および腫瘍関連組織に選択的にホーミングする化合物である。腫瘍を標的とし、腫瘍と結合し、および／または腫瘍にホーミングする多くの化合物が知られており、そのほとんどを、開示された組成物において腫瘍ホーミング化合物として使用することができる。腫瘍は凝血塊関連タンパク質を含む可能性があるので、いくつかの凝血塊結合および凝血塊−ホーミング化合物も腫瘍ホーミング化合物である可能性がある。そのような腫瘍ホーミング凝血塊結合化合物は、本明細書中で記載されるような腫瘍ホーミング化合物として使用することができる。
【０１２８】
腫瘍ホーミング化合物は、それぞれ独立して、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＡＲを含むアミノ酸断片（たとえば、ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号６））、アミノ酸配列ＣＲＫを含むアミノ酸断片（たとえば、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５））、フィブリン結合ペプチド、凝血塊と結合しフィブリンと結合しないペプチド（たとえば、ＣＧＬＩＩＱＫＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、凝血塊結合抗体、および凝血塊結合小有機分子から選択することができる。複数の凝血塊結合化合物は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸断片を含む可能性がある。そのようなペプチドはさらに、米国特許出願公開第２００８／０３０５１０１号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）にも記載されている。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドも、米国特許出願第２００９／００３６３４９（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０１２９】
組成物は、任意の数の腫瘍ホーミング化合物を含む可能性がある。一例として、組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、もしくは１００，０００、またはそれ以上の腫瘍ホーミング化合物を含む可能性がある。複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）はまた、前記数の間の任意の数も含む可能性がある。
【０１３０】
腫瘍ホーミング化合物はまた、フィブリン結合ペプチド（ＦＢＰ）も含む可能性がある。フィブリン結合ペプチドの例は、当該技術分野で公知である（Van  Rooijen  N,  Sanders  A  (1994)  J  Immunol  Methods  174:  83-93;Moghimi  SM,  Hunter  AC,  Murray  JC  (2001)  Pharmacol  Rev  53:  283-318；米国特許第５，７９２，７４２号（すべて、それらのフィブリン結合ペプチドに関するそれらの教唆についてそれらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０１３１】
腫瘍ホーミング化合物はまた、フィブリン以外のタンパク質と結合することもできる。例としては、凝血塊中に組み込まれるようになったフィブロネクチンと結合するペプチドが挙げられる（Pilch  et  al,  (2006)  PNAS,  103:  2800-2804（凝血塊結合ペプチドに関するその教唆に関してその全体が本明細書中に組み込まれる）。凝血塊結合ペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３）が挙げられる。アミノ酸断片はまた、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）あるいはその保存的変異体を含むアミノ酸断片、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）を含むアミノ酸断片、あるいはアミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）からなるアミノ酸断片から独立して選択することもできる。アミノ酸断片は、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）またはその保存的変異体を含む可能性がある。
【０１３２】
アミノ酸断片はまた、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）も含む可能性がある。アミノ酸断片はまた、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）からなる可能性もある。
【０１３３】
アミノ酸断片はまた、それぞれ独立して、アミノ酸配列ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号６））、およびアミノ酸配列ＣＲＫ（例えば、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）を含む可能性もある。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドも、米国特許出願第２００９／００３６３４９号（そのようなペプチドの記載について参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０１３４】
腫瘍ホーミング化合物はまた修飾することもできる。凝血塊結合化合物について本明細書中で記載される修飾のいずれかは、開示された腫瘍ホーミング化合物で使用することもできる。腫瘍ホーミング化合物は、血栓形成性または非血栓形成性である可能性がある。
【０１３５】
Ｃ．表面分子
本明細書中で開示される表面分子（あるいは表面粒子と呼ばれる）は、凝血塊結合化合物と、組成物が凝血塊に送達されるような方法で結合することができ、ここで、それは蓄積することができ、さらに凝固を引き起こし得る。表面分子は、凝血塊結合化合物とともに用いることができる任意の物質である可能性があり、サイズまたは物質により限定されない。例としては、これらに限定されるものではないが、ナノ粒子（例えば、酸化鉄ナノ粒子またはアルブミンナノ粒子）、リポソーム、小有機分子、微粒子、または微小気泡、たとえばフルオロカーボン微小気泡が挙げられる。表面分子という用語は、開示された組成物の成分を同定するために用いられるが、限定することを意図しない。特に、開示された表面分子は、単一分子から構成される物質、化合物、組成物、粒子または他の物質に限定されない。むしろ、開示される表面分子は、凝血塊結合化合物の少なくともいくつかが表面分子の表面上に提示され、および／またはアクセス可能であるように複数の凝血塊結合化合物と結合することができる任意の物質、化合物、組成物、粒子および／または他の材料である可能性がある。好適な表面分子の種々の例は本明細書中で記載され、開示される。
【０１３６】
表面分子は、検出可能である可能性があるか、またはＡｂｒａｘａｎｅ（商標）などの治療剤である可能性がある。検出可能である可能性があるか、または治療的である可能性がある成分を考察する以下のセクションもまた、表面分子に当てはまる。表面分子は、血栓形成性または非血栓形成性である可能性がある。
【０１３７】
１．ナノ粒子、微粒子、および微小気泡
「ナノ粒子」という用語は、ナノメートルで測定されるサイズを有するナノスケールの粒子、例えば、約１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有するナノスケールの粒子を指す。ナノ粒子の例としては、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、ナノワーム、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（例えば、共有結合した金属キレートを有する）、ナノ繊維、ナノホーム、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープおよび量子ドットが挙げられる。ナノ粒子は検出可能なシグナルを、例えば、光子（高周波数および可視光子を含む）の吸収および／または放出ならびにプラズモン共鳴により生じることができる。
【０１３８】
微小球（または微小気泡）も、本明細書中で開示される方法で使用することができる。発色団を含む微小球は、フォトニック結晶、生物学的標識、およびマイクロ流体チャンネルにおける流れの視覚化をはじめとする様々な用途で利用されてきた。例えば、Y.  Lin,  et  al,  Appl.  Phys  Lett.  2002,  81,  3134;D.  Wang,  et  al,  Chem.  Mater.  2003,  15,  2724;X.  Gao,  et  al,  J.  Biomed.  Opt.  2002,  7,  532;M.  Han,  et  al,  Nature  Biotechnology.  2001,  19,  631;V.  M.  Pai,  et  al,  Mag.  &  Magnetic  Mater.  1999,  194,  262（そのそれぞれは全体として参照により組み込まれる）を参照のこと。発色団の光安定性および微小球の単分散性は、どちらも重要である可能性がある。
【０１３９】
ナノ粒子、例えば、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノクリスタルを微小球中に組み入れることができる。ナノ粒子の光学特性、磁気特性および電子特性は、微小球と結合している間にそれらを観察可能にし、そして微小球を同定し、空間的にモニタリングすることを可能にすることができる。例えば、コロイド的に合成された半導体ナノクリスタルの高い光安定性、良好な蛍光効率および広い放射同調性（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）により、それらは発色団の優れた選択肢となる可能性がある。有機色素とは異なり、異なる色（すなわち、異なる波長）を発するナノクリスタルは、単一光源で同時に励起することができる。コロイド的に合成された半導体ナノクリスタル（例えば、コア−シェルＣｄＳｅ／ＺｎＳおよびＣｄＳ／ＺｎＳナノクリスタル）を微小球中に組み入れることができる。微小球は単分散シリカ微小球である可能性がある。
【０１４０】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノクリスタルである可能性がある。金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子の金属としては、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、金、亜鉛、カドミウム、スカンジウム、イッテルビウム、ランタン、ランタニド系列もしくはアクチニド系列元素（たとえば、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、トリウム、プロトアクチニウム、およびウラン）、ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、鉛、アンチモン、ビスマス、ポロニウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、およびバリウムを挙げることができる。ある実施形態において、金属は、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銀、金、セリウムまたはサマリウムである可能性がある。金属酸化物は、これらの材料のいずれかまたは材料の組み合わせの酸化物である可能性がある。例えば、金属は金である可能性があるか、または金属酸化物は、酸化鉄、酸化コバルト、酸化亜鉛、酸化セリウム、もしくは酸化チタンである可能性がある。金属および金属酸化物ナノ粒子の調製は、例えば、米国特許第５，８９７，９４５号および第６，７５９，１９９号（そのそれぞれは全体として参照により組み込まれる）に記載されている。
【０１４１】
２．リポソーム
「リポソーム」は、この用語が本明細書中で用いられる場合、内部水性空間を取り巻く外側の脂質二重または多重層膜を含む構造を指す。リポソームを用いて、細胞に送達するために任意の生物学的活性剤をパッケージすることができる。
【０１４２】
リポソームを形成するための材料および手順は当業者に周知である。適切な媒体中に分散すると、種々のリン脂質は膨潤し、水和し、脂質二分子層を分離する水性媒体の層を有する多層同心二重層ベシクルを形成する。これらの系は、マルチラメラリポソームまたはマルチラメラ脂質ベシクル（「ＭＬＶ」）と呼ばれ、１０ｎｍ〜１００μｍの範囲内の直径を有する。これらのＭＬＶは、Bangham,  et  al,  J  Mol.  Biol.  13:238-252(1965)によって最初に記載された。一般に、脂質または親油性物質を有機溶媒中に溶解させる。溶媒を、たとえば真空下、ロータリーエバポレーションによって除去すると、脂質残基は容器の壁上にフィルムを形成する。典型的には電解質または親水性生物学的活性物質を含む水性溶液を次いでフィルムに添加する。撹拌すると大ＭＬＶが生じる。より小さなＭＬＶが望ましい場合、大きなベシクルを、超音波処理、孔サイズが減少するフィルターを通した連続ろ過に付すか、または他の形態の機械的剪断により低減させる。例えば、加圧押出（Barenholz,  et  al,  FEBS  Lett.  99:210-214  (1979)）によるなど、ＭＬＶをラメラのサイズおよび数の両方で減少させることができる技術もある。
【０１４３】
リポソームは、ユニラメラベシクルの形態をとることもでき、これはＭＬＶのさらに大規模な超音波処理によって調製することができ、水溶液を取り囲む１つの球状の脂質二分子層からなる。ユニラメラベシクル（「ＵＬＶ」）は、２０〜２００ｎｍの範囲内の直径を有する小さなものである可能性があり、一方、より大きなＵＬＶは２００ｎｍ〜２μｍの範囲内の直径を有する可能性がある。ユニラメラベシクルを作製するための周知技術がいくつかある。Papahadjopoulos,  et  al.,  Biochim  et  Biophys  Acta  135:624-238  (1968)では、リン脂質の水性分散液の超音波処理により、水溶液を取り囲む脂質二分子層を有する小ＵＬＶが生成する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，０８９，８０１号は、超音波処理によりリポソーム前駆体を形成し、続いて両親媒性化合物を含む水性媒体を添加し、遠心分離して、生体分子脂質層系を形成することを記載している。
【０１４４】
小ＵＬＶは、Batzri,  et  al.,  Biochim  et  Biophys  Acta  298:1015-1019  (1973)により記載されているエタノール注入技術およびDeamer,  et  al.,  Biochim  et  Biophys  Acta  443:629-634  (1976)のエーテル注入技術によって調製することもできる。これらの方法は、脂質の有機溶液を緩衝溶液中に迅速に注入することを含み、その結果、ユニラメラリポソームが迅速に形成される。ＵＬＶを作製するための別の技術は、Ｗｅｄｅｒらにより、“Liposome  Technology”,  ed.  G.  Gregoriadis,  CRC  Press  Inc.,  Boca  Raton,  Fla.,  Vol.  I,  Chapter  7,  pg.  79-107  (1984)で教唆されている。この洗浄剤除去法は、脂質および添加剤を洗浄剤で撹拌または超音波処理により可溶化して、所望のベシクルを産生することを含む。
【０１４５】
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号は、有機溶媒中脂質の油中水エマルジョンの形成を含む逆相蒸発技術による大ＵＬＶの調製および水性緩衝溶液中にカプセル化される薬剤を記載している。有機溶媒を圧力下で除去して、混合物を得、これを撹拌下または水性媒体中に分散させて、ＵＬＶに変換する。Ｓｕｚｕｋｉら、米国特許第４，０１６，１００号は、薬剤および脂質の水性リン脂質分散液を凍結／解凍することにより、ユニラメラベシクル中に薬剤を封入する別の方法を記載している。
【０１４６】
ＭＬＶおよびＵＬＶに加えて、リポソームも多胞体である可能性がある。Kim,  et  al,  Biochim  et  Biophys  Acta  728:339-348  (1983)で記載されているように、これらの多胞体リポソームは球形であり、内部顆粒状構造を含む。外膜は脂質二分子層であり、内部領域は、二分子層隔壁によって分離された小さな区画を含む。さらに別の種類のリポソームはオリゴラメラベシクル（「ＯＬＶ」）であり、これは複数の周辺脂質層により取り囲まれた大きな中央区画を有する。２〜１５μｍの直径を有するこれらのベシクルは、Callo,  et  al,  Cryobiology  22(3):251-267  (1985)で記載されている。
【０１４７】
Ｍｅｚｅｉら、米国特許第４，４８５，０５４号および第４，７６１，２８８号も、脂質ベシクルの調製方法を記載している。最近では、Ｈｓｕ、米国特許第５，６５３，９９６号は、エアロゾル化を利用するリポソームの調製方法を記載し、Ｙｉｏｕｒｎａｓら、米国特許第５，０１３，４９７号は、高速−剪断混合チャンバーを利用するリポソームの調製方法を記載している。特定の出発材料を用いてＵＬＶ（Wallach  et  al、米国特許第４，８５３，２２８）またはＯＬＶ（Wallach、米国特許第５，４７４，８４８号および第５，６２８，９３６号）を製造する方法も記載されている。
【０１４８】
すべての前記脂質ベシクルおよびそれらの調製法の包括的な総説は、“Liposome  Technology”,  ed.  G.  Gregoriadis,  CRC  Press  Inc.,  Boca  Raton,  Fla.,  Vol.  I,  II  &  III  (1984)で記載されている。本発明における使用に好適な種々の脂質ベシクルを記載するこの参考文献や前記参考文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４９】
Ｄ．成分
本明細書中で開示される組成物は、１以上の成分をさらに含む可能性がある。例えば、成分は、独立して、血管新生阻害剤、血管形成誘発剤、ガン化学療法剤、細胞毒性薬、抗炎症薬、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、画像造影剤、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射線核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１、および炭素１３からなる群から選択することができる。少なくとも１つの成分は治療剤である可能性がある。治療剤の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。少なくとも１つの成分は、検出可能剤である可能性がある。
【０１５０】
本明細書中で用いられる場合、「成分」という用語は、一般的に、連結または結合した分子に生物学的に有用な機能を付与する物理的、化学的、または生物学的物質を意味するために広く用いられる。本明細書中で開示されるように、成分の特性はまた、表面分子において見いだすことができるか、または表面分子および成分はどちらも本明細書中で開示される特徴のうちの１つを共有する可能性がある。例えば、表面分子は検出可能剤を含み得、一方、成分は治療剤を含む可能性がある。これは、本明細書中で開示されるような成分の１以上の特性も含む可能性がある凝血塊結合化合物にも当てはまる。以下の治療剤および検出可能剤の記載は、成分、表面分子、または凝血塊結合化合物のいずれかに適用されることが意図される。したがって、例えば、成分は、開示された表面分子、凝血塊結合化合物、組成物、または表面分子および凝血塊結合化合物の複合体と結合し得るか、カップリングし得るか、またはその一部であり得る。
【０１５１】
成分は、これらの限定されるものではないが、生物学的物質、たとえば、細胞、ファージもしくは他のウイルス；有機化学物質、たとえば小分子；放射線核種；核酸分子もしくはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；またはペプチドをはじめとする任意の天然または非天然物質である可能性がある。有用な成分としては、これらに限定されるものではないが、治療剤、たとえばガン化学療法剤、細胞毒性薬、アポトーシス促進剤、および血管新生阻害剤；検出可能な標識および画像化剤；ならびにタグまたは他の不溶性支持体を含む。有用な成分としてはさらに、これらに限定されるものではないが、ファージ及び他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックスまたは粒子、たとえば金粒子、マイクロデバイスおよびナノデバイス、ならびにナノスケール半導体材料が挙げられる。当該技術分野で公知のこれらや他の成分は、組成物の成分である可能性がある。成分は血栓形成性または非血栓形成性である可能性がある。
【０１５２】
１．治療剤
成分は治療剤である可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「治療剤」という用語は、正常または病的組織において１以上の生物活性を有する分子を意味する。種々の治療剤を成分として使用することができる。治療剤は、ガンを治療するための化合物または組成物を含む可能性がある。治療剤は、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘発する化合物または組成物を含む可能性がある。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、治療剤はガン化学療法剤である可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「ガン化学療法剤」は、ガン細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学作用物質である。そのようなガン化学療法剤は、これらに限定されるものではないが、タキサン、たとえばドセタキセル；アントラサイクリン、たとえばドキソルビシン；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；代謝拮抗薬；白金剤、たとえばシスプラチンもしくはカルボプラチン；ステロイド、たとえばメトトレキサート；抗生物質、たとえばアドリアマイシン；イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）；または選択的エストロゲンレセプターモジュレータ；抗体、たとえばトラスツズマブである可能性がある。
【０１５４】
タキサンは、本明細書中で開示される組成物で有用な化学療法剤である。有用なタキサンとしては、これらに限定されるものではないが、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州パーシッパニー））およびパクリタキセル（タキソール；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ニュージャージー州プリンストン））が挙げられる。例えば、Chan  et  al,  J.  Clin.  Oncol.  17:2341-2354  (1999)、およびParidaens  et  al,  J.  Clin.  Oncol.  18:724  (2000)を参照のこと。
【０１５５】
本明細書中で開示される組成物で有用なガン化学療法剤はまた、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、イダルビシンまたはダウノルビシンでもある可能性がある。ドキソルビシンが一般的に使用されるガン化学療法剤であり、例えば、乳ガンの治療に有用である可能性がある（Stewart  and  Ratain,  In:  “Cancer:  Principles  and  practice  of  oncology”  5th  ed.,  chap.  19  (eds.  DeVita,  Jr.,  et  al;  J.  P.  Lippincott  1997);Harris  et  al,  In  “Cancer:  Principles  and  practice  of  oncology,”  前出、1997）。加えて、ドキソルビシンは抗血管新生活性を有し（Folkman,  Nature  Biotechnology  15:510  (1997);Steiner,  In  “Angiogenesis:  Key  principles-Science,  technology  and  medicine,”  pp.  449-454  (eds.  Steiner  et  al.;Birkhauser  Verlag,  1992)）、これはガンの治療におけるその有効性に寄与する可能性がある。
【０１５６】
アルキル化剤、例えばメルファランまたはクロランブシルも有用なガン化学療法剤である可能性がある。同様に、ビンカアルカロイド、例えばビンデシン、ビンブラスチンもしくはビノレルビン；または代謝拮抗薬、例えば５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジンまたはその誘導体は有用なガン化学療法剤である可能性がある。
【０１５７】
白金剤も有用なガン化学療法剤である可能性がある。そのような白金剤は、例えば、Crown,  Seminars  in  Oncol.  28:28-37  (2001)で記載されるようなシスプラチンまたはカルボプラチンである可能性がある。他の有用なガン化学療法剤としては、これらに限定されるものではないが、メトトレキサート、マイトマイシン−Ｃ、アドリアマイシン、イホスファミドおよびアンサマイシンが挙げられる。
【０１５８】
乳ガンおよび他のホルモンに依存したガンの治療に有用なガン化学療法剤も、エストロゲンの効果を拮抗する薬剤、例えば選択的エストロゲンレセプターモジュレータまたは抗エストロゲンである可能性がある。選択的エストロゲンレセプターモジュレータであるタモキシフェンは、乳ガンの治療用組成物で用いることができるガン化学療法剤である（Fisher  et  al.,  J.  Natl.  Cancer  Instit.  90:  1371-1388  (1998)）。
【０１５９】
治療剤は抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体である可能性がある。一例として、抗上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）抗体、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）．）は、乳ガンを過剰発現するＨＥＲ２／ｎｅｕを治療するために有用な治療剤である可能性がある（White  et  al.,  Annu.  Rev.  Med.  52:  125-141  (2001)）。
【０１６０】
有用な治療剤は細胞毒性薬でもある可能性があり、これは、本明細書中で用いられる場合、細胞死を直接的または間接的に促進する任意の分子である可能性がある。有用な細胞毒性薬としては、これらに限定されるものではないが、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸分子、細胞およびウイルスが挙げられる。非限定的例として、有用な細胞毒性薬としては、細胞毒性小分子、例えばドキソルビシン、ドセタキセルまたはトラスツズマブ；抗菌ペプチド、例えば以下でさらに記載するもの；アポトーシス促進ポリペプチド、例えばカスパーゼおよび毒素、例えば、カスパーゼ−８；ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素、例えばＤＡＢ３８９ＥＧＦ、トウゴマ（ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）毒素（リシン）；ならびに細胞毒性細胞、例えば細胞毒性Ｔ細胞が挙げられる。例えば、Martin  et  al.,  Cancer  Res.  60:3218-3224  (2000);Kreitman  and  Pastan,  Blood  90:252-259  (1997);Allam  et  al,  Cancer  Res.  57:2615-2618  (1997);およびOsborne  and  Coronado-Heinsohn,  Cancer  J.  Sci.  Am.  2:175  (1996)が挙げられる。当業者は、本明細書中に記載されるか、または当該技術分野で公知のこれらの細胞毒性薬やさらなる細胞毒性薬が開示された組成物および方法で有用である可能性があることを理解する。
【０１６１】
一実施形態において、治療剤は治療ポリペプチドである可能性がある。本明細書中で用いられる場合、治療ポリペプチドは、生物学的に有用な機能を有する任意のポリペプチドである可能性がある。有用な治療ポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、サイトカイン、抗体、細胞毒性ポリペプチド；アポトーシス促進ポリペプチド；および抗血管新生ポリペプチドを含む。非限定的例として、有用な治療ポリペプチドは、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、リンホタクチン（ＬＴＮ）または樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）；抗ＨＥＲ２抗体またはその断片；例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素、例えばＤＡＢ３８９ＥＧＦもしくはリシンなどの毒素またはカスパーゼを含む細胞毒性ポリペプチド；あるいは抗血管新生ポリペプチド、例えばアンギオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、血小板因子４；アナステリン；または本明細書中でさらに記載されるかまたは当該技術分野で公知のもののうちの１つである可能性がある（下記を参照のこと）。生物学的活性を有するこれらや他のポリペプチドは、「治療ポリペプチド」である可能性があると理解される。
【０１６２】
治療剤は、血管新生阻害剤でもある可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「血管新生阻害剤」という用語は、血管の成長および発生である血管形成を軽減または防止する分子を意味する。種々の血管新生阻害剤を通常の方法により調製することができる。そのような血管新生阻害剤としては、限定されることなく、小分子；タンパク質、たとえば、脈管形成因子、転写因子および抗体のドミナントネガティブ形；ペプチド；ならびにリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、例えば、脈管形成因子およびレセプターのドミナントネガティブ形、転写因子、ならびに抗体およびその抗原結合断片をコード化する核酸分子をはじめとする核酸分子が挙げられる。例えば、Hagedorn  and  Bikfalvi,  Crit.  Rev.  Oncol.  Hematol.  34:89-110  (2000)、およびKirsch  et  al,  J.  Neurooncol.  50:  149-163  (2000)を参照のこと。
【０１６３】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、インビボでの乳ガン血管形成をはじめとする多くの種類のガンの血管形成について重要であることが示されている（Borgstrom  et  al,  AntiCancer  Res.  19:4213-4214  (1999)）。ＶＥＧＦの生物学的効果としては、内皮細胞増殖、生存、遊走および管形成の刺激、ならびに血管透過性の調節が挙げられる。血管新生阻害剤は、例えば、ＶＥＧＦまたは別の脈管形成因子の発現またはシグナリングを軽減する阻害剤または中和抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体である可能性がある（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、前出、１９９９）。血管新生阻害剤はまた、別の脈管形成因子、例えば線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、例えばＦＧＦ−１（酸性）、ＦＧＦ−２（塩基性）、ＦＧＦ−４もしくはＦＧＦ−５（Slavin  et  al,  Cell  Biol.  Int.  19:431-444  (1995);Folkman  and  Shing,  J.  Biol.  Chem.  267:  10931-10934  (1992)）または脈管形成因子、例えばアンジオポエチン−１、内皮細胞特異的Ｔｉｅ２レセプターチロシンキナーゼを介してシグナルを送る因子（Davis  et  al,  Cell  87:1161-1169  (1996)；およびSuri  et  al,  Cell  87:1171-1180(1996)）、またはこれらの脈管形成因子のうちの１つのレセプターを阻害することもできる。種々の機構は、これらに限定されるものではないが、レセプター結合の直接阻害、脈管形成因子の細胞外空間中への分泌を減少させることによる間接阻害、または脈管形成因子の発現、機能もしくはシグナリングの阻害をはじめとする脈管形成因子の活性を阻害する働きをすることができると理解される。
【０１６４】
これらに限定されるものではないが、アンギオスタチン；アンギオスタチンのクリングルペプチド；エンドスタチン；アナステリン、フィブロネクチンのヘパリン結合断片；アンチトロンビンの修飾形態；コラゲナーゼ阻害剤；基底膜ターンオーバー阻害剤；血管新生抑制ステロイド；血小板因子４ならびにその断片およびペプチド；トロンボスポンジンならびにその断片およびペプチド；ならびにドキソルビシン（O’Reilly  et  al,  Cell  79:315-328  (1994));O’Reilly  et  al,  Cell  88:277-285(1997)  ;  Homandberg  et  al,  Am.  J.  Path.  120:327-332  (1985);Homandberg  et-al,  Biochim.  Biophys.  Acta  874:61-71  (1986);およびO’Reilly  et  al,  Science  285:  1926-1928  (1999)）をはじめとする種々の他の分子も、血管新生阻害剤として機能することができる。市販の血管新生阻害剤としては、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチンおよび２ＭＥ２（ＥｎｔｒｅＭｅｄ（メリーランド州ロックビル））；抗ＶＥＧＦ抗体、例えばアバスチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆ）；およびＶＥＧＦＲ−２阻害剤、例えばＳＵ５４１６、ＶＥＧＦＲ−２の小分子阻害剤（ＳＵＧＥＮ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ））およびＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ）、ＶＥＧＦＲ−２の小分子阻害剤、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子Ｉレセプターが挙げられる。これらや他の抗血管新生剤は、通常の方法により調製することができ、本明細書中で用いられる「血管新生阻害剤」という用語に含まれると理解される。
【０１６５】
本明細書中で開示される組成物を炎症または損傷部位で用いることもできる。この目的に有用な成分としては、炎症を防止する抗炎症薬、組織成長を防止する再狭窄防止薬、血栓の形成を阻害もしくは制御する抗血栓形成性剤または血栓溶解剤、および組織成長を調節し、組織の治癒を増強する生物活性剤を含むいくつかの基本群に属する治療剤を挙げることができる有用な治療剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ステロイド、フィブロネクチン、抗凝固剤、抗血小板機能剤、血管の内部表面壁上の平滑筋細胞成長を防止する薬剤、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、アスピリン、クマジン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、抗増殖剤（メトトレキサート、シスプラチン、フルオロウラシル、アドリアマイシン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、ベータカロテン、ビタミンＥ）、代謝拮抗薬、トロンボキサン阻害剤、非ステロイド性およびステロイド性抗炎症剤、ベータおよびカルシウムチャンネルブロッカー、ＤＮＡおよびＲＮＡフラグメントを含む遺伝子材料、完全発現遺伝子、抗体、リンホカイン、成長因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン、およびインテグリンが挙げられる。
【０１６６】
有用な治療剤は抗菌ペプチドでもある可能性がある。これは、創傷部位または他の感染部位を標的とするために特に有用である可能性がある。したがって、例えば、抗菌ペプチドを含む成分も開示され、ここで、組成物は選択的にインターナライズされ、標的とされる領域に対して高い毒性を示す。有用な抗菌ペプチドは、組成物中に組み込まれない場合に低いほ乳類細胞毒性を有する可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「抗菌ペプチド」という用語は、抗菌活性を有する天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドを意味し、抗菌活性とは、１以上の微生物を殺すかまたはその成長を遅らせる能力である。抗菌ペプチドは、グラム陽性またはグラム陰性菌をはじめとする細菌株、または真菌もしくは原生動物の１以上を殺すかまたはその成長を遅らせることができる。したがって、抗菌ペプチドは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の１以上の株に対して静菌または殺菌活性を有する可能性がある。以下により拘束されることを望まないが、抗菌ペプチドは、自己凝集の結果として膜二重層を通るイオンチャンネルを形成する能力のために生物学的活性を有する可能性がある。
【０１６７】
抗菌ペプチドは、典型的には非常に塩基性であり、線状もしくは環状構造を有する可能性がある。以下でさらに検討するように、抗菌ペプチドは両親媒性アルファ−らせん構造を有する可能性がある（米国特許第５，７８９，５４２号；Javadpour  et  al,  J.  Med.  Chem.  39:3107-3113  (1996)；およびBlondelle  and  Houghten、Biochem.  31  :  12688-12694  (1992)を参照のこと）。抗菌ペプチドはまた、Mancheno  et  al,  J.ヘ゜フ゜チト゛  Res.  51  :  142-148  (1998)で記載されているように、β鎖／シート形成性ペプチドである可能性がある。
【０１６８】
抗菌ペプチドは、天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドである可能性がある。天然に存在する抗菌ペプチドは、細菌、昆虫、両生類、およびほ乳類などの生物学的起源から単離され、宿主生物を細菌感染症から保護できる誘導性防御タンパク質であると考えられる。天然に存在する抗菌ペプチドとしては、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシンおよびセクロピンが挙げられる（例えば、Maloy  and  Kari,  Biopolymers  37:  105-122  (1995);Alvarez-Bravo  et  al,  Biochem.  J.  302:535-538  (1994);Bessalle  et  al,  FEBS  274:-151-155  (1990.);およびBlondelle  and  Houghten  in  Bristol  (Ed.),Annual  Reports  in  Medicinal  Chemistry  pages  159-168  Academic  Press,  San  Diegoを参照のこと）。抗菌ペプチドは、天然ペプチドの類似体、特に両親媒性を保持するか、または増強するものでもある可能性がある（下記を参照のこと）。
【０１６９】
本明細書中で開示される組成物中に組み込まれた抗菌ペプチドは、組成物と結合する場合、低いほ乳類細胞毒性を有する可能性がある。ほ乳類細胞毒性は、通常のアッセイを用いて容易に評価することができる。一例として、ほ乳類細胞毒性は、Javadpour  et  al.、前出、１９９６で記載されているようにしてインビトロでのヒト赤血球の溶解により分析することができる。低いほ乳類細胞毒性を有する抗菌ペプチドは、ヒト赤血球に対して溶解性でないか、または溶解活性のために、１００μΜを越える濃度、好ましくは２００、３００、５００または１０００μΜを越える濃度を必要とする。
【０１７０】
一実施形態において、開示されているのは、抗菌ペプチド部分が真核生物細胞によってインターナライズされた場合にミトコンドリア膜の破壊を促進する組成物である。特に、そのような抗菌ペプチドは、真核生物膜と比較すると優先的にミトコンドリア膜を破壊する。ミトコンドリア膜は、細菌膜と同様に、しかし真核生物血漿膜とは対照的に、高含有量の負に荷電したリン脂質を有する。抗菌ペプチドは、例えば、ミトコンドリアの膨潤についてのアッセイまたは当該技術分野で周知の別のアッセイを用いて、ミトコンドリア膜の破壊における活性について分析することができる。
【０１７１】
例えば、５０μＭ、４０μΜ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、またはそれ以下で著しいミトコンドリア膨潤を誘発する抗菌ペプチドは、ミトコンドリア膜の破壊を促進するペプチドと見なされる。
【０１７２】
抗菌ペプチドは、一般的に希水溶液中でランダムコイルコンフォメーションを有するが、らせんを促進する溶媒および両親媒性媒体、たとえばミセル、合成二分子層または細胞膜により、高レベルのらせん度を誘導することができる。α−らせん構造は当該技術分野で周知であり、１回転あたり３．６残基を有し、１残基あたり１．５Åの並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により特徴づけられる（１回転あたり５．４Å；Creighton,  Proteins:  Structures  and  Molecular  Properties  W.  H  Freeman,  New  York  (1984)を参照のこと）。両親媒性α−らせん構造において、極性および非極性アミノ酸残基は両親媒性らせん中で一列に整列され、この両親媒性らせんは、ペプチドをらせん軸に沿って見た場合、疎水性アミノ酸残基が主に片面上にあり、親水性残基が主に反対側の面にあるα−らせんである。
【０１７３】
共通の特徴として両親媒性α−らせん構造を共有する種々の配列の抗菌ペプチドが単離されている（Saberwal  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta  1197:  109-131  (1994)）。両親媒性およびらせん度を増強すると予測されるアミノ酸置換を有する天然のペプチドの類似体は、典型的には増大した抗菌活性を有する。一般に、増大した抗菌活性を有する類似体はまた、増大したほ乳類細胞に対する細胞毒性を有する（Maloy  et  al.,  Biopolymers  37:  105-122  (1995)）。
【０１７４】
抗菌ペプチドに関連して本明細書中で使用されるように、「両親媒性α−らせん構造」という用語は、生理的ｐＨで複数の極性残基を含む親水性面と、非極性残基を含む疎水性面とを有するα−らせんを意味する。極性残基は、例えば、リジンまたはアルギニン残基である可能性があり、一方、非極性残基は、例えば、ロイシンまたはアラニン残基である可能性がある。両親媒性α−らせん構造を有する抗菌ペプチドは、一般的に、同数の極性残基と非極性残基とを両親媒性ドメイン内に有し、ペプチドに中性ｐＨで全体的に正の電荷を与えるために十分な数の塩基性残基を有する（Saberwal  et  al,  Biochim.  Biophys.  Acta  1197:  109-131  (1994)）。当業者は、らせんを促進するアミノ酸、たとえばロイシンおよびアラニンを抗菌ペプチド中に有利に含めることができることを理解する（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、１９８４を参照のこと）。両親媒性α−らせん構造を有する合成抗菌ペプチドは、例えば、米国特許第５，７８９，５４２号（McLaughlin  and  Becker）で記載されているように、当該技術分野で公知である。
【０１７５】
これらや他の薬剤が有用な治療剤であり、これを開示された組成物および方法と別にまたは一緒に用いることができることは、医薬腫瘍学の分野の当業者には理解される。したがって、本明細書中で開示される組成物は１以上のそのような治療剤を含み得、さらなる成分が所望により組成物の一部として含まれる可能性があることが理解される。非限定的例として、場合によっては、凝血塊結合化合物と治療剤との間にオリゴペプチドスペーサーを利用することが望ましい可能性がある（Fitzpatrick  and  Garnett,  Anticancer  Drug  Des.  10:  1-9  (1995)）。
【０１７６】
他の有用な薬剤としては、血栓溶解剤、アスピリン、抗凝固剤、鎮痛剤および精神安定剤、ベータ−ブロッカー、ａｃｅ−阻害剤、硝酸塩、リズム安定剤、および利尿薬が挙げられる。心臓に対する損傷を制限する薬剤は、心臓発作の数時間以内に投与される場合に最もよく働く。血餅を分解し、酸素を多く含む血液が閉塞した動脈中を流れることを可能にする血栓溶解剤は、心臓発作後にできるだけ早く投与されるならば、患者の生存可能性を増大させる。心臓発作後数時間以内に投与された血栓溶解剤は、最も有効である。静脈内注射されると、これらは、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）またはアニストレプラーゼ、組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｒ−ｔＰＡ）、およびストレプトキナーゼを含む。開示された化合物は、これらの薬剤や類似した薬剤のいずれかを使用することができる。
【０１７７】
２．検出可能剤
開示された組成物中の成分は、検出可能剤でもある可能性がある。種々の検出可能剤が開示された方法において有用である。本明細書中で用いられる場合、「検出可能剤」という用語は、検出され得る任意の分子を指す。有用な検出可能剤は、インビボ投与することができ、その後検出される化合物および分子を含む。開示された組成物および方法において有用な検出可能剤としては、これらに限定されるものではないが、放射標識および蛍光分子が挙げられる。検出可能剤は、例えば、好ましくは非侵襲性および／またはインビボ視覚化技術により、直接または間接いずれかでの検出を促進する任意の分子である可能性がある。例えば、検出可能剤は、例えば、放射線技術、磁気共鳴技術、または超音波技術をはじめとする任意の公知画像化技術により検出可能である可能性がある。検出可能剤としては、例えば、造影剤を挙げることができ、たとえばこの場合、造影剤はイオン性または非イオン性である。いくつかの実施形態において、たとえば、検出可能剤は、タンタル化合物および／またはバリウム化合物、たとえば硫酸バリウムを含む。いくつかの実施形態において、検出可能剤はヨウ素、たとえば放射性ヨウ素を含む。いくつかの実施形態において、たとえば、検出可能剤は、有機ヨード酸、たとえばヨードカルボン酸、トリヨードフェノール、ヨードホルム、および／またはテトラヨードエチレンを含む。いくつかの実施形態において、検出可能剤は、非放射性検出可能剤、たとえば非放射性同位体を含む。例えば、Ｇｄは、ある実施形態において非放射性検出可能剤として用いることができる。
【０１７８】
検出可能剤の他の例としては、検出可能な放射線を放射するか、または放射させることができる分子（たとえば、蛍光励起、放射性崩壊、スピン共鳴励起など）、局所的電磁場に影響を及ぼす分子（たとえば、磁性、強磁性、強磁性、常磁性、および／または超常磁性種）、放射線エネルギーを吸収または散乱する分子（たとえば、発色団および／またはフルオロフォア）、量子ドット、重元素および／またはその化合物が挙げられる。たとえば、米国公開第２００４／０００９１２２号で記載される検出可能剤を参照のこと。検出可能剤の他の例としては、プロトン放出分子、放射線不透過性分子、および／または放射性分子、たとえばＴｃ−９９ｍおよび／またはＸｅ−１３のような放射線核種が挙げられる。そのような分子は、放射性医薬品として用いることができる。さらに他の実施形態において、開示される組成物は、本明細書中で開示される検出可能剤の任意の組み合わせを含む１以上の異なる種類の検出可能剤を含む可能性がある。
【０１７９】
有用な蛍光成分としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート、たとえばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅ（商標）、蛍光エネルギー移動色素、たとえばチアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。他の特異的蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、Ａｃｉｄ  Ｆｕｃｈｓｉｎ、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ、Ａｎｔｈｒｏｙｌ  Ｓｔｅａｒａｔｅ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｒ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｒｅｄ  ６Ｂ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  ７  ＧＬＬ、Ａｔａｂｒｉｎｅ、Ａｕｒａｍｉｎｅ、Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｇ、ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ、Ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｕｌｐｈｏ  ｆｌａｖｉｎ  ＦＦ、Ｃａｌｃｉｅｎ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＣａｌｃｏＦｌｕｏｒ  ＲＷ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒ  Ｗｈｉｔｅ  ＡＢＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒ  Ｗｈｉｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ、Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ、Ｃｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｏ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン（Ｎａｐｈａｌｉｎｅ）５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ  （ジアミノナフチルスルホン酸）、Ｄａｎｓｙｌ  ＮＨ−ＣＨ３、Ｄｉａｍｉｎｏ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ  （ＤＡＯ）、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−Ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎｅ  ７ＧＦＦ、Ｄｏｐａｍｉｎｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ  ＩＴＣ、Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、Ｆｌａｚｏ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｆｌｕｏ  ３、ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、Ｆｕｒａ−２、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １０ＧＦ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｐｉｎｋ  ３Ｇ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｙｅｌｌｏｗ  ５ＧＦ、Ｇｌｏｘａｌｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｇｒａｎｕｌａｒ  Ｂｌｕｅ、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ  Ｃｆ  Ｌｉｑｕｉｄ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＣＨ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ、Ｍａｇｄａｌａ  Ｒｅｄ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  １０  ＧＦＦ、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ８  ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ、ＮＢＤ  Ａｍｉｎｅ、Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ、Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｎｙｌｏｓａｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  Ｅ８Ｇ、Ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ（Ｆｅｕｌｇｅｎ）、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ、Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ３Ｒ、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａ９、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ、Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ  Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｂｌｕｅ  Ｂｌａｃｋ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｐｙｒｏ９、Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｂ、Ｐｙｒｏｚａｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ７ＧＦ、Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  Ｍｕｓｔａｒｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ５  ＧＬＤ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ２００、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ｅｘｔｒａ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＢＢ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＢＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＷＴ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌ、ＳＩＴＳ  （Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、Ｓｔｉｌｂｅｎｅ、Ｓｎａｒｆ  １、Ｓｕｌｐｈｏ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ｃａｎ  Ｃ、Ｓｕｌｐｈｏ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇ  Ｅｘｔｒａ、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、Ｔｈｉａｚｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｒ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ＴＣＮ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ５、Ｔｈｉｏｌｙｔｅ、Ｔｈｉｏｚｏｌ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｉｎｏｐｏｌ  ＣＢＳ、Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ、Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ、Ｕｒａｎｉｎｅ  Ｂ、Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ、Ｘｙｌｅｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ、およびＸＲＩＴＣが挙げられる。
【０１８０】
特に有用な蛍光標識としては、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。これらの蛍光のそれぞれの吸収および放出最大値は：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがってそれらの同時検出が可能になる。フルオレセイン色素の他の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（オハイオ州クリーブランド）をはじめとする種々の商業的供給源から得ることができる。蛍光プローブおよびそれらの使用はさらに、Handbook  of  Fluorescent  Probes  and  Research  Products  by  Richard  P.  Hauglandに記載されている。
【０１８１】
放射性検出可能剤のさらなる例としては、ガンマ放出体、たとえばガンマ放出体Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２５およびＩ−１３１、レニウム−１８６および１８８、ならびにＢｒ−７７（たとえば、Thakur,  M.  L.  et  al,  Throm  Res.  Vol.  9  pg.  345(1976);Powers  et  al,  Neurology  Vol.  32  pg.  938  (1982)；および米国特許第５，０１１，６８６を参照のこと）；陽電子放出体、たとえばＣｕ−６４、Ｃ−１１、およびＯ−１５、ならびにＣｏ−５７、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｈｇ−１９７、Ａｕ−１９８、およびＰｂ−２０３が挙げられる。他の放射性検出可能剤としては、たとえば、トリチウム、Ｃ−１４および／またはタリウム、ならびにＲｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１および／またはＴｌ−２０１を挙げることができる。
【０１８２】
テクネチウム９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）の使用が好ましく、他の出願で記載されている。例えば、米国特許第４，４１８，０５２号および米国特許第５，０２４，８２９号を参照のこと。Ｔｃ−９９ｍは、１４０ｋｅＶの単一光子エネルギーおよび約６時間の半減期を有するガンマ放出体であり、Ｍｏ−９９／Ｔｃ−９９発生器から容易に得ることができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、放射性検出可能剤を含む組成物は、ターゲティング成分を検出に好適な放射性同位体とカップリングさせることによって調製することができる。カップリングは、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ−，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）および／またはメタロチオネインなどのキレート化剤により起こり得、これらのいずれかはターゲティング成分と共有結合することができる。いくつかの実施形態において、テクネチウム９９ｍ、還元剤、および水溶性リガンドの水性混合物を調製し、次いで開示されたターゲティング成分と反応させることができる。そのような方法は、当該技術分野で公知であり、たとえば、国際公開第ＷＯ９９／６４４４６号を参照のこと。いくつかの実施形態において、放射性ヨウ素を含む組成物は、交換反応を使用して調製することができる。例えば、熱ヨウ素を冷ヨウ素で交換することは、当該技術分野で周知である。別法として、放射性ヨウ素標識化合物を、対応するブロモ化合物からトリブチルスタンニル中間体を経て調製することができる。
【０１８４】
磁気検出可能剤としては、常磁性造影剤、たとえば磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）で用いられるガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸などが挙げられる（たとえば、De  Roos,  A.  et  al,  Int.  J.  Card.  Imaging  Vol.  7  pg.  133  (1991)を参照のこと）。いくつかの好ましい実施形態は、原子番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４２、４４、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０を有する元素の二価または三価イオンである常磁性原子を検出可能剤として使用する。好適なイオンとしては、これらに限定されるものではないが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）、ならびにガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態は、強力な磁気モーメントを有する原子、たとえばガドリニウム（ＩＩＩ）を使用する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、磁気検出可能剤を含む組成物は、ターゲティング成分を常磁性原子とカップリングさせることによって調製することができる。例えば、好適な常磁性原子の金属酸化物または金属塩、たとえば硝酸塩、塩化物または硫酸塩を水／アルコール媒体、たとえば、メチル、エチル、および／またはイソプロピルアルコール中に溶解または懸濁させることができる。混合物を等量のターゲティング成分の類似した水／アルコール媒体中溶液に添加し、撹拌することができる。混合物を反応が完了またはほぼ完了するまで穏やかに加熱することができる。形成された不溶性組成物は、ろ過により得ることができ、一方、可溶性組成物は、溶媒の蒸発により得ることができる。キレート化成分上の酸基が開示された組成物中に残存するならば、無機塩基（たとえば、ナトリウム、カリウムおよび／またはリチウムの水酸化物、炭素塩および／または重炭酸塩）、有機塩基、および／または塩基性アミノ酸を用いて、酸性基を中和して、たとえば、組成物の単離または精製を容易にすることができる。
【０１８６】
好ましい実施形態において、凝血塊結合化合物が凝固部位と相互作用する能力を妨害しないような方法で検出可能剤を組成物とカップリングさせることができる。いくつかの実施形態において、検出可能剤を凝血塊結合化合物と化学的に結合させることができる。いくつかの実施形態において、検出可能剤を、それ自体が凝血塊結合化合物と化学的に結合した成分と化学的に結合させ、画像化およびターゲティング成分を間接的に連結することができる。
【０１８７】
３．ホーミング分子
凝血塊結合化合物以外のホーミング分子を開示された組成物において用いることができる。例えば、例えば、１以上の腫瘍、創傷組織、または血餅の凝固した血漿に選択的にホーミングするホーミング分子が開示される。種々のホーミング分子を開示された組成物、複合体および方法で用いることができる。そのようなホーミング分子としては、限定されることなく、本明細書中で開示されるペプチドが挙げられる。開示された化合物、組成物、複合体および方法は、種々の形態の開示されたホーミング分子（開示されたペプチドおよびペプチド模倣物を含む）を含む可能性があるかまたは使用することができる。表現の便宜上、本明細書中の多くの箇所で、ペプチドの使用または包含が記載される。そのような場合、種々の形態のホーミング分子はまた、ペプチドに関して記載されるのと同じかまたは類似した方法で使用または含まれる可能性があり、そのような使用および包含が具体的に想定され、開示されると考えられると理解される。
【０１８８】
本明細書中で用いられる場合、「分子」という用語は、広義で用いられて、ポリマーまたは非ポリマー有機化学物質、たとえば小分子薬剤；核酸分子、たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ、たとえばｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチド；ペプチド；またはタンパク質、たとえば成長因子もしくは抗体またはそのフラグメント、たとえばＦｖ、Ｆｄ、もしくはＦａｂフラグメントまたは抗原結合ドメインを含む別の抗体フラグメントを意味する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ホーミング分子は、例えば、１以上の腫瘍、創傷組織、または血餅の凝固した血漿に選択的にホーミングし、そして抗体またはその抗原結合断片でない分子である可能性がある。「抗体」という用語は、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドまたはポリペプチドを指す、当該技術分野で認められた用語である。例えば、Borrabaeck,  Antibody  Engineering  2nd  Edition,  Oxford  University  Press,  New  York  (1995)を参照のこと。
【０１９０】
優先的なおよび／または選択的ホーミングをはじめとするホーミングとは、任意の正常および／または非標的化領域（例えば、非腫瘍、非凝血塊、および／または非創傷）と結合しないこと意味しない。いくつかの実施形態において、ホーミングは、選択的に、相対的Ｋｉに関して、他の非標的成分よりも、対応する標的について例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２００倍選択的である可能性がある。いくつかの実施形態において、ホーミング分子は、対応する標的に対して、少なくとも約５０倍の選択性、少なくとも約１００倍の選択性、少なくとも約２００倍の選択性、少なくとも約３００倍の選択性、少なくとも約４００倍の選択性、少なくとも約５００倍の選択性、少なくとも約６００倍の選択性、少なくとも約７００倍の選択性、少なくとも約８００倍の選択性、少なくとも約１０００倍の選択性、または少なくとも約１５００倍の選択性を有する可能性がある。例えば、いくつかの好ましい実施形態において、ホーミング分子は、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約２０μＭ未満、約１５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約３μＭ未満、または約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ、または約７５ｎＭ未満の標的に対するＫｉ値を有する可能性がある。いくつかの好ましい実施形態において、ホーミング分子は、約５０μＭ超、約２５μＭ超、約２０μＭ超、約１５μＭ超、約１０μＭ超、約５μＭ超、約３μＭ超、または約１μＭ超、約５００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約１５０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約２５ｎＭ超、約２０ｎＭ超、約１５ｎＭ超、約１０ｎＭ超、約５ｎＭ超、約３ｎＭ、または約１ｎＭ超の標的に対するＫ；値を有する可能性がある。いくつかの好ましい実施形態において、ターゲティング成分は、約１０−４Ｍ未満、約１０−５Ｍ未満、約１０−５Ｍ未満、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満のＫＤでその標的と結合する。
【０１９１】
その標的を認識および／または結合するホーミング分子に関連での結合は、一般的に非共有結合および相互作用を含み、たとえば、ホーミング分子が非共有結合によりその標的と結合または付着することができる場合である。結合は、高親和性または低親和性のいずれかである可能性があり、好ましくは高親和性である。有用である可能性がある結合力の例としては、これらに限定されるものではないが、非共有結合、たとえば双極子相互作用、静電力、水素結合、疎水性相互作用、イオン結合、および／またはファンデアワールス力が挙げられる。結合はまた、共有結合、たとえばホーミング分子がその標的に共有結合により結合、付着あるいはカップリングすることができる場合を含む可能性がある。
【０１９２】
Ｅ．医薬組成物および担体
開示された組成物は、単独で、または薬剤的に許容される担体中でのいずれかでインビボ投与することができる。「薬剤的に許容される」により、生物学的またはその他で望ましくない物質を意味する。すなわち、この物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、またはそれが含まれる医薬組成物中の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用したりすることなく、本明細書中で開示される組成物とともに対象に投与することができる。担体は、当業者には周知のように、自然に選択されて、活性成分の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑える。物質は、溶液、懸濁液中である可能性がある（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞中に組み入れられる）。担体は血栓形成性または非血栓形成性である可能性がある。
【０１９３】
１．薬剤的に許容される担体
本明細書中で開示される組成物は、薬剤的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
【０１９４】
好適な担体およびそれらの処方は、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy  (19th  ed.)  ed.  A.R.  Gennaro,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  PA  1995に記載されている。典型的には、適切な量の薬剤的に許容される塩を処方中で使用して、処方を等張にする。薬剤的に許容される担体の例としては、これらに限定されるものではないが、生理食塩水リンゲル液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、さらに好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、持続放出製剤、たとえば抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、たとえばフィルム、リポソームまたは微粒子などの成形品の形態である。ある担体は、たとえば、投与経路および投与される組成物の濃度によってさらに好ましい可能性があることは、当業者には明らかであろう。
【０１９５】
医薬担体は当業者に公知である。これらは、最も典型的には、生理的ｐＨでの滅菌水、生理食塩水、および緩衝液などの溶液をはじめとする、ヒトに対する薬剤の投与のための標準的単体である。組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者により用いられる標準的手順にしたがって投与される。
【０１９６】
医薬組成物は、最適の分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、表面活性剤などを含む可能性がある。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１以上の活性成分も含む可能性がある。
【０１９７】
医薬組成物を、局所的または全身性治療が望ましいかどうか、そして治療される領域によって、多くの方法で投与することができる。投与は、局所（眼科的、経膣的、直腸的、鼻腔内を包含する）、経口的、吸入により、または非経口的、たとえば点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射によるものである可能性がある。開示された抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与することができる。
【０１９８】
非経口投与用製剤としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。
【０１９９】
局所投与用処方としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要である可能性があるか、または望ましい可能性がある。
【０２００】
経口投与用組成物としては、粉末または顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が挙げられる。増粘剤、フレーバー、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。
【０２０１】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびに、たとえばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によるか、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびに有機塩基モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応により形成される、薬剤的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる。
【０２０２】
Ｆ．コンピュータ支援薬剤設計
開示された組成物を任意の分子モデリング技術用標的として用いて、開示された組成物の構造を同定するか、または開示された組成物と所望の方法で相互称する潜在的もしくは実際の分子、たとえば、小分子を同定することができる。
【０２０３】
開示された組成物をモデリング技術で用いる場合、阻害または刺激または標的分子の機能などの特定の所望の特性を有する高分子などの分子が同定されることが理解される。開示された組成物、ペプチドなどを用いる場合に同定され、単離される分子も開示される。したがって、開示された組成物を含む分子モデリング胞を用いて産生される生成物も本明細書中で開示されると見なされる。
【０２０４】
したがって、最適の分子と結合する分子を単離するための１つの方法は、合理的な設計による。これは、構造情報およびコンピュータモデリングにより達成することができる。コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計の可視化が可能になる。三次元構造物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲ画像化から得られたデータに依存する。分子力学は、力の場のデータを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、どのように新規化合物が標的分子と連結するかの予想を可能にし、結合特異性を完璧にするための化合物および標的分子の構造の実験操作を可能にする。一方または両方で小さな変化がなされる場合の分子−化合物相互作用がどのようなものであるかの予想は、分子力学ソフトウェアならびに、通常、分子設計プログラムおよびユーザー間の使い勝手の良いメニュー形式のインターフェースを備えた計算集約型コンピュータを必要とする。
【０２０５】
分子モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ウォルサム）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、ｏｆ  分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子同士の挙動の双方向の構築、修飾、視覚化、および分析を可能にする。
【０２０６】
Rotivinen,  et  al,  1988  Acta  Pharmaceutica  Fennica  97,  159-166;Ripka,  New  Scientist  54-57  (June  16,  1988);McKinaly  and  Rossmann,  1989  Annu.  Rev.  Pharmacol.  Toxiciol.  29,  111-122;Perry  and  Davies,  QSAR:  Quantitative  Structure-Activity  Relationships  in  Drug  Design  pp.  189-193  (Alan  R.  Liss,  Inc.  1989);Lewis  and  Dean,  1989  Proc.  R.  Soc.  Lond.  236,  125-140  and  141-162；および、核酸成分のモデル酵素に関しては、Askew,  et  al,  1989  J.  Am.  Chem.  Soc.  111,  1082-1090などの、多くの論文が特定のタンパク質と相互に作用する薬剤のコンピュータモデリングを検討している。化学物質をスクリーニングし、視覚的に表す他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パサデナ）、Ａｌｌｅｌｉｘ，  Ｉｎｃ，（カナダ国オンタリオ州ミシソーガ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，  Ｉｎｃ．（オンタリオ州ケンブリッジ）などの会社から入手可能である。これらは主に特定のタンパク質に対して特異的な薬剤へ適用するために設計されるが、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的領域が同定されたら、その領域と特異的に相互作用する分子を設計するために適応させることができる。
【０２０７】
結合を改変できる化合物の設計および生成に関して前述されているが、天然の生成物または合成の化学物質をはじめとする既知化合物、ならびにタンパク質をはじめとする生物活性物質のライブラリを、基質結合または酵素活性を改変する化合物についてスクリーニングすることもできる。
【０２０８】
Ｇ．類似した機能を有する組成物
本明細書中で開示される組成物は、凝血塊との結合または凝血塊形成の増強などのある機能を有すると理解される。開示された機能を実施するためのある構造要件が本明細書中で開示され、開示された構造に関連する同じ機能を実施出来る種々の構造があり、これらの構造は最終的に同じ結果、たとえば刺激または阻害を達成するであろうと理解される。
【０２０９】
Ｈ．キット
本明細書中で開示される方法の実施で用いることができる試薬に好ましいキットが本明細書中で開示される。キットは、任意の試薬または本明細書中で検討される試薬の組み合わせまたは開示された方法の実施で必要とされるかまたは有益であると理解されるものを含む可能性がある。例えば、キットは本明細書中で開示される組成物を含む可能性がある。
【０２１０】
Ｉ．混合物
方法が、混合または組成物もしくは成分もしくは試薬を接触させることを含む場合はいつでも、当該方法を実施することにより、多くの異なる混合物が形成される。例えば、方法が３つの混合ステップを含むならば、これらのステップのうちのそれぞれ１つの後に、ステップが別々に実施されるならば、独自の混合物が形成される。加えて、混合物は、ステップがどのように実施されたかに関係なく、ステップのすべての完了時に形成される。本開示は、開示された方法の実行により得られるこれらの混合物、ならびにたとえば本明細書中に開示される、任意の開示された試薬、組成物、または成分を含む混合物を想定する。
【０２１１】
Ｊ．システム
開示されているのは、開示された方法を実行するため、または実行を助けるために有用なシステムである。システムは、一般的に、構造物、機械、装置などの製造の物品、および組成物、化合物、物質などの組み合わせを含む。開示されているかまたは開示から明らかなそのような組み合わせが想定される。
【０２１２】
Ｋ．コンピュータ可読媒体
開示された核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表すことができると理解される。これらの配列を表示するための種々の方法がある。たとえば、ヌクレオチドグアノシンは、Ｇまたはｇにより表すことができる。同様に、アミノ酸バリンは、ＶａｌまたはＶにより表すことができる。当業者らは、任意の核酸またはタンパク質配列を、存在する種々の方法のいずれかで表示し、表す方法を理解し、そのそれぞれは、本明細書中に開示されていると考えられる。本明細書中で特に想定されるのは、コンピュータ可読媒体、たとえば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスク、または他のコンピュータ可読媒体上のこれらの配列の表示である。開示された配列のバイナリーコード表示も開示される。当業者らは、コンピュータ可読媒体がどのようなものかを理解している。したがって、核酸またはタンパク質配列を記録、格納、または保存するコンピュータ可読媒体。
【０２１３】
Ｌ．ペプチド合成
本明細書中で開示される組成物および開示された方法を実施するために必要な組成物は、特に断りのない限り、特定の試薬または化合物に関して当業者に公知の任意の方法を用いて作製することができる。
【０２１４】
開示されたタンパク質、たとえば配列番号１を産生する１つの方法は、２以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒にタンパク質ケミストリー技術により連結することである。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドは、現在利用可能な実験装置を用い、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）ケミストリーのいずれかを用いて化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティー））。当業者は、たとえば、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準的化学反応により合成することがｄけいることは容易に理解できる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することができ、合成樹脂から切断することはできず、一方、ペプチドまたはタンパク質の他の断片を合成し、続いて樹脂から切断することができ、それにより、他の断片上で機能的にブロックされた末端基が露出する。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片はそれぞれ、それらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合により共有結合して、抗体、またはそれらの断片を形成することができる。（Grant  GA  (1992)  Synthetic  Peptides:  A  User  Guide.  W.H.  Freeman  and  Co.,  N.Y.  (1992);Bodansky  M  and  Trost  B.,  Ed.  (1993)  Principles  of  Peptide  Synthesis.  Springer-Verlag  Inc.,  NY  （少なくともペプチド合成に関連する材料について参照により本明細書中に組み入れられる）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを本明細書中で記載するようにして独立してインビボで合成する。単離されたら、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを連結させて、類似のペプチド縮合反応によりペプチドまたはその断片を形成することができる。
【０２１５】
例えば、クローンまたは合成ペプチド断片の酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を結合させて、より大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインを産生することが可能になる（Abrahmsen  L  et  al.,  Biochemistry,  30:4151(1991)）。別法として、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを用いて、大きなペプチドまたはポリペプチドをより短いペプチド断片から合成的に構築することができる。この方法は、２ステップの化学的反応からなる（Dawson  et  al.  Synthesis  of  Proteins  by  Native  Chemical  Ligation.  Science,  266:776-779  (1994)）。第１ステップは、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチド断片とを化学選択的反応させて、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を得ることである。反応条件を変化させないで、この中間体は、自発的で迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位での自然のペプチド結合を形成することである（Baggiolini  M  et  al.  (1992)  FEBS  Lett.  307:97-101;Clark-Lewis  I  et  al,  J.Biol.Chem.,  269:  16075  (1994);Clark-Lewis  I  et  al.,  Biochemistry,  30:3128  (1991);Rajarathnam  K  et  al.,  Biochemistry  33:6623-30  (1994)）。
【０２１６】
あるいは、保護されていないペプチド断片は、化学的ライゲーションの結果としてペプチド断片間に形成される結合が天然でない（非ペプチド）結合である場合に、化学的に連結される（Schnolzer,  M  et  al.  Science,  256:221  (1992)）。この技術を用いて、タンパク質ドメインの類似体ならびに完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質が合成されてきた（deLisle  Milton  RC  et  al.,  Techniques  in  Protein  Chemistry  IV.  Academic  Press,  New  York,  pp.  257-267  (1992)）。
【０２１７】
方法
本明細書中で開示されるのは、対象に１以上の本明細書中で開示される組成物を投与することを含む方法である。組成物は、凝固した血漿タンパク質へ選択的にホーミングする。組成物は、凝固を引き起こすことができ、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅することができる。方法のいくつかの形態は、対象に本明細書中で開示される組成物を投与することを含み、ここで、当該組成物は凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、当該組成物は、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。組成物は、腫瘍血管系、創傷部位、または両方に選択的にホーミングする可能性がある。
【０２１８】
対象に複数の異なる開示された組成物を投与することを含む方法も開示される。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、表面分子および少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物を含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子および少なくとも１つの修飾された凝血塊結合化合物を含む。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、複数の組成物のうちの少なくとも１つは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする。いくつかの形態で、組成物のそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、少なくとも１つの組成物は、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位で組成物の蓄積を増幅する。
【０２１９】
一例において、組成物は治療効果を有する可能性がある。これは、組成物のために起こる増強された凝血塊の形成によって達しすることができる。この効果は、治療剤の腫瘍部位または創傷部位への送達によって増強され得る。
【０２２０】
治療効果は、腫瘍量の増加の減速または腫瘍量の減少である可能性がある。この腫瘍量の増加における減速、または腫瘍量の減少は、治療されていない腫瘍、または異なる方法により治療された腫瘍と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％またはそれ以上の腫瘍量の増加における改善または腫瘍量の減少である可能性がある。
【０２２１】
治療効果は、腫瘍における血液循環の減少または遮断でもある可能性がある。この腫瘍における血液循環の減少または遮断は、治療されていない腫瘍、または異なる方法により治療された腫瘍と比較して、腫瘍における血液循環の有効な遮断において、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％またはそれ以上の改善である可能性がある。
【０２２２】
治療効果は、創傷部位での出血の軽減または停止でもある可能性がある。この創傷部位での出血の軽減または停止は、治療されていない創傷、または異なる方法で治療された創傷と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％またはそれ以上の創傷部位での出血の軽減または停止である可能性がある。
【０２２３】
治療効果は、創傷部位において出血が停止するまでの時間の短縮でもある可能性がある。創傷部位での出血の軽減または停止は、治療されていない創傷、または異なる方法で治療された創傷と比較して、創傷部位で出血が停止するまでの時間において１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％またはそれ以上の減少である可能性がある。
【０２２４】
治療効果は、炎症の軽減、創傷治癒速度の増加、瘢痕組織量の減少、痛みの軽減、腫れの軽減、壊死の減少、またはそれらの組み合わせも含む可能性がある。この効果は、治療していない対象、または異なる方法で治療された対象と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％またはそれ以上の改善である可能性がある。
【０２２５】
さらに、本明細書中の別の箇所で開示されるように、凝固はそれ自体、治療効果を有する可能性がある。対象は、標的とされる１以上の部位を有し得、ここで、組成物は標的とされる１以上の部位へホーミングする。例えば、対象は複数の腫瘍または損傷部位を有する可能性がある。
【０２２６】
開示された組成物を用いて、ガンなどの制御されない細胞増殖が起こる任意の疾患を治療することができる。異なる種類のガンの非限定的リストは以下のようである可能性がある：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固体組織の癌腫、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、グリオーマ、高悪性度グリオーマ、芽細胞種、神経芽細胞種、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、線腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移ガン、またはガン一般。
【０２２７】
開示された組成物を使用して治療できるガンの代表的な非限定的例は以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱ガン、脳ガン、神経系ガン、頭頸部ガン、頭頸部扁平上皮細胞癌、腎臓ガン、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガンなどの肺ガン、神経芽細胞種／神経膠芽細胞種、卵巣ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、皮膚ガン、肝臓ガン、黒色腫、口、咽喉、咽頭、および肺の扁平上皮細胞癌、結腸ガン、子宮頸癌、子宮頸癌腫、乳ガン、および上皮ガン、腎臓ガン、尿生殖器ガン、肺ガン、食道癌腫、頭頸部癌腫、大腸ガン、造血ガン；精巣ガン；結腸および直腸ガン、前立腺ガン、または膵臓ガン。
【０２２８】
開示された組成物もまた、デコイ粒子前処理後に投与して、細胞内皮系（ＲＥＳ）組織による組成物の取り込みを軽減することができる。そのようなデコイ粒子前処理は、粒子の血液半減期を延長することができ、腫瘍ターゲティングを増大させる。
【０２２９】
方法は、投与後に、開示された組成物を検出することをさらに含む可能性がある。開示された組成物は、蛍光、ＣＴスキャン、ＰＥＴまたはＭＲＩにより検出することができる。開示された組成物は、蛍光により検出することができる。開示された組成物は、対象における腫瘍血管系または腫瘍と結合することができる。
【０２３０】
いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、この場合、複数の組成物のうちの少なくとも１つのそれぞれは、凝固を引き起こし、凝固した血漿タンパク質の部位での組成物の蓄積を増幅する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つの修飾されていない凝血塊結合化合物とを含み、この場合、修飾されていない凝血塊結合化合物は、凝固した血漿タンパク質と選択的に結合する。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも１つは、表面分子と少なくとも１つのホーミング化合物とを含み、ここで、ホーミング化合物は、凝血塊結合化合物ではない。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍血管系と選択的に結合することができる。いくつかの形態で、ホーミング化合物は腫瘍ホーミング化合物である可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物はアミノ酸断片を含む可能性がある。いくつかの形態で、腫瘍ホーミング化合物のアミノ酸断片は、アミノ酸配列ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）もしくはその保存的誘導体、またはアミノ酸配列ＣＧＫＲ（配列番号７）もしくはその保存的誘導体を含む可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物が構成されるホーミング化合物が異なる可能性がある。いくつかの形態で、複数の異なる組成物のうちの少なくとも２つは、組成物が構成される凝血塊結合化合物が異なる可能性がある。
【実施例】
【０２３１】
実施例
以下の実施例は、明細書中で請求される化合物、組成物、物品、装置および／または方法をどのように作製し、評価するかの完全な開示および説明を提供するように提示され、純粋に例示的であることを意図し、開示を制限することを意図しない。数（たとえば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされてきたが、若干の誤差や偏差を考慮すべきである。特に別段の記載がない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０２３２】
Ａ．実施例１：腫瘍へホーミングするナノ粒子の生体模倣増幅
ナノ粒子に基づく診断法および治療法は、粒子中に複数の機能を組み入れることができるので、有用である。１つのそのような機能は、体内の特定の部位にホーミングする能力である。腫瘍にホーミングするだけでなく、それら自身のホーミングを増幅する生体模倣粒子が本明細書中に記載されている。系は、凝固した血漿タンパク質を認識し、腫瘍に選択的にホーミングするペプチドに基づき、腫瘍で、それは血管壁および腫瘍間質に結合する。この腫瘍ホーミングペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子およびリポソームは腫瘍血管中で蓄積し、ここで、それらはさらなる局所的凝固を誘発し、それによりさらに多くの粒子の新しい結合部位を産生する。系は血小板を模倣し、血小板も自由に循環するが、患部に蓄積し、その部位でのそれら自身の蓄積を増幅する。凝固に基づく増幅は腫瘍画像化を大幅に増強し、薬剤担体機能の粒子への付加も用いることができる。
【０２３３】
１．結果
ＣＲＥＫＡペプチド。腫瘍ホーミングペプチドを使用して、標的化ナノ粒子を構築した。このペプチドを、腫瘍を有するＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニック乳ガンマウス（Hutchinson  2000）における腫瘍ホーミングについて、ファージ表示ペプチドライブラリ（Hoffman  2003;Pasqualini  1996）のインビボスクリーニングにより同定した。選択されたファージ調製物において最も頻繁に表されるペプチド配列はＣＲＥＫＡ（ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ｌｙｓ−ａｌａ；配列番号１）であった。蛍光色素がＮ末端に付着したＣＲＥＫＡペプチドを合成し、このペプチドのインビボ分布を、腫瘍を有するマウスで研究した。静脈内注射されたＣＲＥＫＡペプチドは、ＰｙＭＴ腫瘍、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン異種移植片で、注射の数分後から数時間後に容易に検出可能であった。ペプチドは、腫瘍間質において異なる網目構造を形成し（図５）、これはまた、腫瘍中の血管を強調した。ＣＲＥＫＡペプチドは本質的に正常組織で検出不可能であった。顕微鏡検査結果と一致して、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＣＲＥＫＡペプチドを用いた全身画像化は、乳ガン異種移植片、および膀胱におけるペプチド蓄積が明らかになり、これは尿中への過剰なペプチドの排出を反映していた（図５Ｂ）。
【０２３４】
腫瘍は、腫瘍間質および血管壁中に凝固した血漿タンパク質の網目構造を含むが、正常組織で検出可能なそのような網目構造はない（Dvorak  1985;Abe  1999;Pilch  2006）。腫瘍中のＣＲＥＫＡペプチドにより産生される編み目様パターンは、凝固した血漿タンパク質がこのペプチドの標的である可能性がある可動かの研究を促進した。ペプチドをフィブリノゲンノックアウトマウスで試験し、フィブリノゲンノックアウトマウスはそれらの腫瘍においてフィブリン網目構造がない。以前に同定された凝血塊結合ペプチドのように（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）、静脈内注射されたＣＲＥＫＡペプチドは、フィブリノゲンヌルマウス中で成長させたＢ１６Ｆ１黒色腫において蓄積しなかったが、ヌルマウスの正常な腹子において成長させたＢ１６Ｆ１腫瘍で明るい蛍光網目構造を形成した（図１ＡおよびＢ）。この結果と一致して、ＣＲＥＫＡファージは、凝固した血漿タンパク質とインビトロで結合したが、対照無挿入（ｉｎｓｅｒｔｌｅｓｓ）ファージは結合しなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、ＣＲＥＫＡを凝血塊結合ペプチドとして確認する。その構造は、それをナノ粒子ターゲティングでの使用に魅力的なペプチドにする。なぜなら、環状１０アミノ酸ペプチドである他の凝血塊結合ペプチド（Pilch  2006）とは異なり、ＣＲＥＫＡは線状であり、５のアミノ酸しか含まないからである。さらに、１つのシステイン残基のスルフヒドリル基は、結合活性を提供するために必要ではなく、ペプチドを他の成分とカップリングさせるために用いることができる。
【０２３５】
ペプチドでコーティングされたナノ粒子。フルオレセインで標識されたＣＲＥＫＡまたはフルオレセインを５０ｎｍの超常磁性、アミノデキストランコーティングされた酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子の表面上にカップリングさせた。そのような粒子は、それらの化学的性質、薬物動態、および毒物学に関して広範囲に特徴付けられ、ＭＲＩ造影剤として用いられる（Jung  1995;Jung  1995;Weissleder  1989）。フルオレセインで標識されたペプチドをＳＰＩＯにカップリングさせると、強力な蛍光粒子が生じた。ペプチドを粒子から加水分解により放出させると、蛍光がさらに約３倍増大した。これらの結果は、粒子表面でのフルオレセイン分子の近接性が、蛍光の若干の消光を引き起こすことを示す。これにもかかわらず、カップリングしたフルオレセインペプチドからの蛍光は、粒子上のペプチド分子の数とほぼ直線的に関連し（図６）、粒子蛍光を測定することにより、粒子上のペプチド成分の数のトラッキング、および試料中の粒子濃度の基準としての蛍光強度の使用を可能にする。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯをインビボ実験において粒子あたり少なくとも８，０００のペプチド分子とともに使用した。マウスおよびヒト血漿凝血塊にインビトロで結合したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子、および結合は、遊離ペプチドにより阻害され（図ＩＤ）。ナノ粒子は凝血塊中の線維網目構造にそって分布した（図ＩＤ中の挿入画）。これらの結果は、粒子結合ペプチドが、凝固した血漿タンパク質に対するその結合活性を保持することを示す。
【０２３６】
ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの肝臓クリアランスに対する腫瘍ホーミング。最初の実験は、静脈内注射されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子がＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳ガン異種移植片中で有効に蓄積しなかったことを示した。対照的に、高濃度の粒子が細胞内皮系（ＲＥＳ）組織において見られた（図２Ａ、上のパネル）。遊離ＣＲＥＫＡペプチドは有効にこれらの腫瘍にホーミングするので（図５）、ＲＥＳ取り込みがナノ粒子のホーミングに対する大きな障害であると仮定された。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのクリアランスにおけるＲＥＳの役割は、リポソーム型クロドロナートで肝臓におけるＲＥＳマクロファージを枯渇させることにより確認された（Van  Rooijen  1994）。この治療は、粒子半減期を約５倍延長した（図２Ｂ）。粒子状物質を循環から除去した。なぜなら、ある血漿タンパク質は粒子と結合し、ＲＥＳによるそれらの取り込みに関与するからである（オプソニン化；Moghimi  2001  ;Moore  1997）。血漿オプソニンを除去するデコイ粒子を注入することは、別の一般的に使用されるＲＥＳ取り込みをブロックする方法である（Souhami  1981;Fernandez  -Urrusuno  1996）。キレート化Ｎｉ２＋でコーティングされたリポソームを潜在的なデコイ粒子として試験した。なぜなら、酸化鉄およびＮｉ２＋は類似した血漿オプソニンを誘引し、Ｎｉ−リポソームはしたがって全身性循環からそれらを枯渇させることができると推測されたからである。実際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｎｉ−リポソームで前処理されたマウスの血液中で著しく少ない血漿タンパク質がＳＰＩＯと結合することを示した。
【０２３７】
静脈内注射されたＮｉ−リポソームは、血液中のＳＰＩＯおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの半減期を約５倍延長した（図２Ｂ）。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注射の５分前または４８時間前のいずれかに実施されたＮｉ−リポソーム前処理は、腫瘍血管中に主に局在化したナノ粒子の腫瘍ホーミングを大幅に増加させた（図２Ａ下側の腫瘍パネルおよび図２Ｄ）。粒子の局所的濃度は非常に高いので、光学顕微鏡で酸化鉄の褐色がかった色が見え（図２Ｃ、右パネル）、腫瘍血管で観察される蛍光シグナルがインタクトＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ由来であることを示した。Ｎｉ−リポソーム前処理後の肝臓においてはより少ない粒子が見られるが、脾臓中の蓄積は変化しないかまたはさらに増強された（図２Ａ）。他の器官は、Ｎｉ−リポソームの使用の有無によらず、少量のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を含むか、または粒子を全く含まなかった（図ＩＤ）。プレーンなリポソームをデコイ粒子として試験した。これらのリポソームはその後に注射されたＣＫＥＫＡ−ＳＰＩＯの血液半減期および腫瘍ホーミングを延長し（図２Ｂ）、このことはリポソームおよびＳＰＩＯの一般的なクリアランス機構の存在を示す。
【０２３８】
腫瘍血管におけるナノ粒子誘発性血液凝固。リポソーム前処理後に投与されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は主に腫瘍血管と共存し、一部の粒子は周囲の組織中に浸出した用である（図３Ａ、最も上のパネル）。特に、２０％までの腫瘍血管内腔を蛍光物質で満たした。これらの構造をフィブリンについて染色し（図３Ａ中央のパネル）、これらがナノ粒子を含浸した血餅であることを示す。一部の血管において、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、おそらくはフィブリンおよび関連するタンパク質で形成された網目構造にそって分布し（挿入画）、図ＩＤの挿入画で示すパターンと類似していた。
【０２３９】
非ＲＥＳ組織のうちで、腎臓および肺は少量の特異的ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を含んでいた（図２Ｄ）。しかし、その中に凝血塊を有する血管だけを明らかにする低倍率画像は、腎臓中の非常に少ない凝血塊を除いては、これらの組織中に凝固がないことを示した（図７）。肝臓におけるナノ粒子の大量の蓄積にかかわらず、肝臓血管中（図８）でフィブリン（フィブリノゲン）染色とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光との共存は見られなかった。さらに、注射されていないマウス由来の肝臓組織もフィブリン（フィブリノゲン）について染色され（図８Ｂ）、おそらくは肝細胞によるフィブリノゲン産生を反映する。したがって、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子により誘発された凝固は、本質的に腫瘍血管に限定される。
【０２４０】
ナノ粒子は、血小板活性化を引き起こし得、そして血栓形成を増強し得る（Radomski  2005;Khandoga  2004）。血液から回収された一部のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子（＜１％）は血小板と結合するが（図９Ａ）、血小板マーカーについて染色すると、腫瘍血管中で血小板とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子との間に共存は示されなかった（図３Ａ、下側のパネル）。血小板減少症は、マウスに抗ＣＤ４１モノクローナル抗体を注射することにより誘発され（Van  der  Heyde  2005）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍へのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯホーミングに対して顕著な効果は見られなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、血小板がＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのホーミングパターンに関与しないことを示す。
【０２４１】
ナノ粒子による凝血塊の深部浸潤は、これらの凝血塊が、注射前よりむしろ、粒子が血液中を循環する時点で形成されていなければならないことを示した。これは、Ｄｉｌで標識された赤血球をフローマーカーとして使用する生体共焦点顕微鏡検査で試験した。腫瘍血管において時間に依存した凝血塊形成および血流の閉塞があり、形成される凝血塊においてＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯが平行してトラップされた（図３Ｂ）。
【０２４２】
凝固を誘発する効果が、ＳＰＩＯ粒子について特異的であるかどうか、または異なるＣＲＥＫＡでコーティングされた粒子で誘発することができるかどうかを次に試験した。その中にフルオレセイン−ＣＲＥＫＡペプチドが組み込まれたリポソームであって、末端が脂質である（ｌｉｐｉｄ−ｔａｉｌｅｄ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングしたものを使用した。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯと同様に、ＣＲＥＫＡ−リポソームは腫瘍に選択的にホーミングし、腫瘍血管内でフィブリンと共存し（図３Ｃ）、ＣＲＥＫＡリポソームが腫瘍血管中で凝固を引き起こすこともできることを示す。対照ＳＰＩＯまたは対照リポソームを腫瘍マウス中に注射した場合に凝固は見られなかった。
【０２４３】
凝固−増幅された腫瘍ターゲティング。腫瘍血管におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの蓄積に対する凝固の寄与も研究した。Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）での腫瘍磁化の定量分析（図４Ａ）および蛍光シグナルの測定により、ＰＢＳで前処理されたマウスと比較して、Ｎｉ−リポソームで前処理されたマウスにおいて約６倍高いＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの蓄積が明らかになった。アミノ化ＳＰＩＯ対照粒子は、腫瘍中で顕著に蓄積しなかった（図４Ａ）。
【０２４４】
ＳＱＵＩＤ測定結果は、強力な凝固阻害剤であるヘパリンをＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注射の前に注射すると、ナノ粒子の腫瘍蓄積が５０％を越えて減少することを明らかにした（図４Ａ）。顕微鏡検査は、ヘパリンが腫瘍血管内のフィブリン陽性／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ陽性構造を減少させるが、粒子は血管壁に沿って、おそらくは前から存在するフィブリン沈着と依然として結合することを示した（代表的な画像を図４Ｂに示す）。ホーミングパターンの別の定量化は、ヘパリンは、ナノ粒子が血管壁に結合している血管の数を有意に減少させなかったが、血管内凝固を本質的に除去したことを示す（図４Ｃ）。したがって、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの腫瘍血管に対する結合は、これらの粒子と関連する凝固活性を必要としないが、凝固は腫瘍ホーミングの効率を改善する。
【０２４５】
ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯにより誘発された凝固は、全身スキャンで腫瘍シグナルの特に強力な増強を引き起こした。近赤外蛍光化合物であるＣｙ７で標識されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、腫瘍中で有効に蓄積され（図４Ｄ、左手の画像、矢印）、肝臓からも顕著なシグナルがあった（鏃型）。ヘパリンで得られた腫瘍シグナルの減少（図４Ｄ、右手の画像）は、ＳＱＵＩＤにより測定された５０％値よりも蛍光測定結果で大きいようであった。これはおそらくは、凝血塊からの濃縮されたシグナルが、蛍光の光学検出を増強したからである。これらの結果は、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯにより誘発された凝固が腫瘍画像化で特別な利点を提供することを示す。
【０２４６】
２．考察
この実施例は、腫瘍における粒子の有効な蓄積を提供するナノ粒子系の一例を記載する。系は４つの要素に基づく：第１に、ナノ粒子の凝固した血漿タンパク質と結合する腫瘍ホーミングペプチドでのコーティングは、腫瘍血管（および腫瘍間質）に関する特異的親和性を粒子に付与する。第２に、デコイ粒子前処理は粒子の血液半減期を延長し、腫瘍ターゲティングを増大させる。第３に、腫瘍標的化ナノ粒子は、腫瘍血管中で血管内凝固を引き起こす。第４に、血管内凝血塊はさらに多くのナノ粒子を腫瘍中に引き寄せ、ターゲティングを増幅する。
【０２４７】
凝固した血漿タンパク質について特異的親和性を有するペプチドをナノ粒子のターゲティングエレメントとして選択した。腫瘍の間質腔は、フィブリンおよび血液凝固においてフィブリンと架橋結合するようになるタンパク質、例えばフィブロネクチンを含む（Ｄｖｏｒａｋ  １９８５；Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。腫瘍中にこれらの生成物が存在するが、正常組織中には存在しないことは、腫瘍血管の漏出の結果である可能性があり、これにより、血漿タンパク質が血液から腫瘍組織中へ流入することが可能になり、腫瘍組織中で漏れたフィブリノゲンは組織凝結原因子によりフィブリンに変換される（Ｄｖｏｒａｋ  １９８５；Ａｂｅ  １９９９）。凝固は、合成ペプチドで同定することができ、評価することができる新規結合部位を形成する（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。この結果は、ＣＲＥＫＡで修飾されたナノ粒子が、血液および血漿凝血塊と結合するだけでなく、局所的腫瘍凝固も誘発し得ることを示す。粒子の性質は、この活性について限定されない。というのも、ＣＲＥＫＡでコーティングされた酸化鉄およびミクロン−サイズのＣＲＥＫＡでコーティングされたリポソームはどちらも腫瘍血管において凝固を引き起こすことが見出されたからである。ＣＲＥＫＡで修飾された粒子による１以上の凝固生成物の結合は、凝血塊形成の方向において凝固と凝血塊溶解とのバランスをシフトさせることができ、粒子の表面でのこの活性の存在は、接触に依存する凝固を促進することができる。
【０２４８】
一部のナノ物質は、全身性血栓症を誘発することができるが（Gorbet  2004）、ここでは、ＣＲＥＫＡ粒子により誘発された血栓症は腫瘍血管に限定される。腫瘍血管中の高濃度の標的化粒子は、腫瘍血管に対する血栓症の説明をすることができる。しかし、ここでもナノ粒子が高濃度で蓄積する肝臓では検出可能な凝固が見られなかったので、他の因子が重要であるにちがいない。腫瘍で共通の凝結原環境は、凝固の腫瘍特異性に寄与する主な因子である可能性がある（Boccaccio  2005）。
【０２４９】
ナノ粒子の主な利点は、複数の機能を１つの物体上に組み込むことができることである。本明細書中に記載するのは、ナノ粒子のインビボ機能；腫瘍血管においてナノ粒子で誘発された凝固により可能になった自己増殖腫瘍ホーミングおよびさらなるナノ粒子の凝血塊に対する結合である。このナノ粒子系は、いくつかの他の機能を１つの粒子中に結びつける：特異的腫瘍ホーミング、ＲＥＳの回避、および有効な腫瘍画像化。光学的画像化をこの研究で使用したが、１０プラットフォームもＭＲＩ画像化を可能にする。腫瘍血管においてＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子により引き起こされる凝固は、顕微鏡および全身画像化技術による腫瘍検出を改善するようにみえる方法で粒子を局所的に濃縮する働きをする。
【０２５０】
標的化粒子の別の機能は、それらが局所的塞栓症による腫瘍血管の物理的遮断を引き起こすことである。塞栓症または凝固による血管閉塞は、腫瘍成長を低減し得る（Huang  1997;El-Sheikh  2005）。今日まで、腫瘍血管において２０％の閉塞率が達成された。ナノ粒子設計のモジュラー性のために、本明細書中で記載される機能を、さらなる活性を有する粒子中に組み入れることができる。腫瘍血管中で蓄積し、薬剤ペイロードをゆっくりと放出し、同時に血管を閉塞させる薬剤を運ぶナノ粒子を、本明細書中で開示される方法および組成物とともに使用することができる。
【０２５１】
３．物質および方法
ファージスクリーニング、腫瘍およびペプチド。ＣＸ７Ｃ（配列番号４）（式中、Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である）の一般構造を有するペプチドライブラリのインビボスクリーニングを、６５〜７５日齢トランスジェニックＭＭＴＶ  ＰｙＭＴマウス（Hutchinson  2000）を用いて記載されているようにして（Oh  2004）実施した。これらのマウスは、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）の転写制御下でポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ＭＴ）を発現し、１００％のキャリヤで多病巣性乳房腫瘍の誘発に至る。ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍およびペプチド合成は記載されている（Laakkonen  2002;Laakkonen  2004）。Ｂ１６Ｆ１ネズミメラノーマ腫瘍をフィブリノゲンヌルマウス（Suh  1995）およびそれらの正常な腹子で成長させ、それらが０．５〜１ｃｍのサイズに達したら使用した（Pilch  2006）。
【０２５２】
ナノ粒子およびリポソーム。アミノ基官能化デキストランコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５０ｎｍのｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ＳＰＩＯ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ国ロストク））を、クロスリンカーを用いてカップリングさせた。最終カップリング比は、酸化鉄１ｍｇあたり３０ｎｍｏｌのフルオレセインで標識されたペプチド分子、または８，０００ペプチド／粒子であった。Ｃｙ７での近赤外標識に関して、約２０％のアミンをＣｙ７−ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））で誘導体化し、残りのアミンをペプチドの結合に使用した。ＳＰＩＯおよびリポソームに関する詳細を以下に記載する。クロドロナートをＳｉｇｍａから購入し、記載されているようにリポソーム中に組み入れた（Van  Rooijen  and  Sanders  (1994)）。
【０２５３】
ナノ粒子注射。静脈内注射に関して、動物を腹腔内Ａｖｅｒｔｉｎで麻酔し、リポソーム（２  μｍｏｌのＤＳＰＣ）および／またはナノ粒子（１〜４ｍｇＦｅ／ｋｇ体重）を尾静脈中に注射した。動物を注射の５〜２４時間後に麻酔下でＰＢＳでの心灌流により屠殺し、器官を切開し、粒子ホーミングについて分析した。肝臓マクロファージを抑制するために、マウスにリポソーム型クロドロナート懸濁液（１００μｌ／マウス）を静脈内注射し、マウスを２４時間後に実験のために使用した。
【０２５４】
凝血塊に対して結合するファージおよびナノ粒子。凝固した血漿タンパク質に対して結合するファージ結合を記載されているようにして測定した（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ及び対照ＳＰＩＯを新しく形成された血漿凝血塊に遊離ＣＲＥＫＡペプチドの存在下または非存在下で添加した。１０分間のインキュベーションの後、凝血塊を４回ＰＢＳ中で洗浄し、新しい試験管に移し、１００μｌの濃硝酸中で消化した。消化された物質を２ｍｌの蒸留水中で希釈し、遊動結合血漿−光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（コネチカット州ノーウォーク））を用いて鉄濃度を測定した。
【０２５５】
ナノ粒子調製。高いペプチドカップリング密度を達成するために必要な場合、さらなるアミノ基を商業的に入手したＳＰＩＯに以下のようにして添加した：まず、アミノ化ステップの前に粒子を架橋するために、３ｍｌのコロイド（再蒸留水中約１０ｍｇＦｅ／ｍｌ）を５ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨおよび２ｍｌのエピクロロヒドリン（Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス））に添加した。混合物を２４時間室温似て撹拌して、有機相（エピクロロヒドリン）および水性相（デキストランでコーティングされた粒子コロイド）間の相互作用を促進した。過剰のエピクロロヒドリンを除去するために、反応した混合物を、再蒸留水に対して２４時間、透析カセット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州ロックフォード））を用いて透析した。アミノ基を粒子の表面に以下のように添加した：０．０２ｍｌの濃水酸化アンモニウム（３０％）を１ｍｌのコロイド（約１０ｍｇＦｅ／ｍｌ）に添加した。混合物を室温で２４時間攪拌した。反応した混合物を再蒸留水に対して２４時間時間透析した。粒子をさらにすすぐために、コロイドはＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｉｄｉ磁気分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（カリフォルニア州オーバーン））上にトラップされ、ＰＢＳで３回すすぎ、１ｍｌのＰＢＳでカラムから溶出させた。
【０２５６】
ＣＲＥＫＡペプチドをＳＰＩＯに結合させるために、粒子を１ｍｇＦｅ／ｍｌの濃度で再懸濁させ、ヘテロ二官能性リンカーＮ−［ａ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ；Ｐｉｅｒｃｅ）をボルテックス下で添加した（２ｍｇのＦｅあたり２．５ｍｇのリンカー）。室温で４０分間インキュベーション後、粒子を１０ｍｌのＰＢＳで３回、ＭＡＣＳカラム上で洗浄した。遊離末端システインを有するペプチドを、次いで添加した（２ｍｇのＦｅあたり１００μｇのペプチド）。一晩４℃でインキュベーション後、粒子を再度洗浄し、ＰＢＳ中に０．３５ｍｇ／ｍｌＦｅの濃度で再懸濁させた）。粒子に結合するペプチド分子の数を定量化するために、既知量のストックまたはＡＭＡＳ活性化粒子を様々な量のペプチドとともにインキュベートした。インキュベーション完了後、粒子を、１００．０００ＧでＢｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ  １００．３超遠心分離ローターを用いてペレット化し（３０分）、非結合ペプチドの量を蛍光により定量化した。結合ペプチドを粒子から切断するために、粒子を３７℃で一晩ｐＨ１０にてインキュベートした。遊離ペプチドの上清中濃度を、蛍光を読み取り、同じペプチドについて得られた較正曲線を用いることにより決定した。既知量の粒子の蛍光強度を、ペプチド結合密度の関数としてプロットし、傾斜式を用いて、異なるバッチにおける結合密度を決定した。
【０２５７】
リポソーム調製物。リポソームを調製するために、ｌ，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびｌ，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−｛［Ｎ（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］スクシニル｝（ニッケル塩）（すべてＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から入手）をクロロホルム中、５７：３７：１０のモル比で混合し、ロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。脂質をＰＢＳ中で最終ＤＳＰＣ濃度１０ｍＭまで水和した。脂質混合物を１０分間５５℃にて大規模に浴で音波処理して、リポソーム形成を促進した。プレーンリポソームに関しては、ＤＳＰＣおよびコレステロールのみを５７：３７のモル比で使用した。
【０２５８】
ＣＰｖＥＫＡで修飾されたリポソームは、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミド（Ａｖａｎｔｉ）を２倍モル過剰のＣＲＥＫＡと反応させることにより調製した。反応は室温にて窒素下、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で実施した。反応が２時間で完了した後、生成物（黄色沈殿）を遠心分離により洗浄し、エタノール中に溶解させた。エタノール溶液を−２０℃で保存した。リポソーム懸濁液をＣＲＥＫＡ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの乾燥フィルムに添加し、１時間ボルテックスしながら５５℃まで加熱することにより、ＣＲＥＫＡ−ＰＥＧを組み入れた。対照リポソームは、前記のとおり、ただしＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを代わりに使用して調製した。リポソーム調製物を使用するまで４℃で保持した。
【０２５９】
ナノ粒子によるタンパク質結合の分析。可溶性血漿タンパク質のＳＰＩＯナノ粒子に対する結合を試験するために、粒子を１〜２ｍｇ鉄／ｍｌ血漿の濃度のマウスクエン酸血漿とともにインキュベートした。別法として、粒子を動物に注射し、そして血漿を注射後５〜１０分で集めた。粒子を磁気カラム上で洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、そして粒子を２０分間１０％ＳＤＳ中で沸騰させた。酸化鉄を超遠心分離法（１００．０００ｇ、１０分）によりペレット化し、上清中に溶出されたタンパク質をアセトンで一晩−２０℃にて沈殿させた。タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ゲルを銀染色した（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド））。質量分光分析に関して、粒子から抽出されたタンパク質を水中で再構成し；タンパク質アリコートをトリプシンで消化し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ＱＳＴＡＲ液体クロマトグラフＱ−ＴＯＦ質量分析計（カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて分析した。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを用いてデータを分析した（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（マサチューセッツ州ボストン））。
【０２６０】
ナノ粒子クリアランス。ヘパリン化キャピラリーを用いて、ナノ粒子注射後、様々な時点で眼窩周囲神経叢から５０μｌの血液を採取し、血液を３００ｇで２分間遠心分離し、血小板リッチな血漿の１０μｌアリコートを６００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液、ｐＨ８．４中で希釈した。蛍光をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（コネチカット州ノーウォーク）ＬＳ５０Ｂ蛍光分光計で測定し、粒子が循環した時間の関数としてプロットした。
【０２６１】
生体顕微鏡検査。ＭＤＡ−ＭＢ４３５異種移植片を有するマウスにおける腫瘍血流を生体顕微鏡検査により観察した。マウスに、Ｎｉ−リポソームおよび５×ｌ０８のＤｉｌで標識された赤血球を注射した。皮膚弁を脇へ移動させて、腫瘍を露出させ、マウスに４ｍｇ／ｋｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ（時間「０」）を静脈内注射した。ＩＶ−ＯＢ３５Ｆ２２Ｗ２９  ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ対物レンズ（オリンパス株式会社（日本、東京））を用いるＩＶ−１００生体レーザースキャニング顕微鏡（オリンパス株式会社（日本、東京））で腫瘍をスキャンした。注射後１２０分まで１０分間隔で動画を記録した。
【０２６２】
Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）磁力計を用いた組織試料の磁気測定結果。組織試料は集めたら直ちに凍結し、凍結乾燥し、秤量し、ゼラチンカプセル中に入れた。１５０Ｋで操作されるＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＭＰＭＳ２  ＳＱＵＩＤ磁力計（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてなされる磁気測定のためにカプセルを透明なプラスチックストローの中央に挿入した。試料を、段階的に１テスラまで増加する直流磁場に暴露した。組織、カプセルおよびストローの反磁性寄与について補正した。
【０２６３】
Ｂ．実施例２−腫瘍におけるナノ粒子により誘発される血管遮断
腫瘍ホーミングペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号１）でコーティングされた酸化鉄粒子（ナノワームｓ；ＳＰＩＯ）は、このペプチドにより認識される凝固した血漿タンパク質を含む腫瘍血管に特異的にホーミングする。ＣＲＥＫＡ粒子はさらなる凝固を引き起こし、これは腫瘍ホーミングを増幅する。増幅は腫瘍画像化を大幅に増幅するが、腫瘍成長を阻害するために望ましいほど十分な腫瘍血管中の凝固を引き起こさなかった。ＣＲＥＫＡ（配列番号１）に対する化学的修飾、たとえばメチル化は、系が腫瘍成長を阻害しない前立腺ガンモデルにおける血管閉塞のレベルを達成する効率をさらに増大させることが示された。また、１以上の他の腫瘍ホーミング化合物または凝血塊結合化合物を化学的に修飾されたＣＲＥＫＡペプチドとともに組み入れることにより、血管閉塞のレベルをさらに増幅することができた。
【０２６４】
１．結果
実施例１で検討したように、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）でコーティングされた酸化鉄粒子は腫瘍ホーミング系である。ＣＲＥＫＡを化学的に修飾して、腫瘍ホーミング活性を増強することができる。
【０２６５】
実験により、静脈内注射されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子はマウスにおいて２２Ｒｖ−１腫瘍へ有効にホーミングすることが示された。脾臓および肝臓はナノ粒子の非特異的取り込みのために著しいＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を含む唯一の非腫瘍組織であった。
【０２６６】
腫瘍ホーミングは、いくつかの異なる方法を用いてＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ系で改善することができる。たとえば、ホーミング活性は、ＣＲＥＫＡペプチドの化学的修飾により増強することができる。系のホーミング活性を改善するための別の例は、ＣＲＥＫＡまたは化学的に修飾されたＣＲＥＫＡペプチドをＳＰＩＯ上の別の腫瘍ホーミングまたは凝血塊結合ペプチドと組み合わせることである。
【０２６７】
メチル化されたＣＲＥＫＡはホーミング活性を増強することが示された。ＣＲＥＫＡのメチル化は、独立してＮ−メチル化またはＣ−メチル化（ａメチル化としても知られる）のいずれかとして各アミノ酸に関して実施することができる。本明細書中で研究されるメチル化されたまたは非メチル化されたＣＲＥＫＡペプチドとしては、ＣＲＥＫＡ、Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ、ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ、ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ、およびＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）が挙げられる。列挙されたＣＲＥＫＡペプチドのそれぞれを、ＳＰＩＯ上の１以上の他の腫瘍ホーミング化合物と組み合わせることができる。ＣＲＥＫＡペプチドで試験した腫瘍ホーミング化合物はＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）およびＣＧＫＲＫ（配列番号７）であった。
【０２６８】
増強されたＣＲＥＫＡペプチドは、ＳＰＩＯの腫瘍血管へのホーミング、特に腫瘍内部の血管へのホーミングを増大させた。別の腫瘍血管−ホーミングペプチドをＳＰＩＯ上のＣＲＥＫＡと組み合わせた。本発明者らがＣＲＥＫＡと結合したＳＰＩＯと、異なる腫瘍ホーミングペプチドと結合したＳＰＩＯとの混合物を注射した場合、７０％もの腫瘍血管がナノ粒子蛍光について陽性であった。どちらの処理も、凝固により遮断された腫瘍血管の数を増大させ、正常組織における血管内での凝固は増加しなかった。処理により腫瘍成長が非常に著しく減少した。
【０２６９】
ＣＲＥＫＡペプチドならびにそのＮ−メチル化およびＣ−メチル化変異体の腫瘍蓄積。ＣＲＥＫＡのＮ−メチル化およびＣ−メチル化誘導体の蓄積を、同所性２２Ｒｖ−１異種移植腫瘍を有するマウスで測定した。マウスに２００μｇのＦＡＭ−結合ＣＲＥＫＡまたはメチル化されたＣＲＥＫＡペプチド誘導体を静脈内注射した。ペプチドを３時間循環させた。マウスを次いで、ＰＢＳで経心臓灌流し、器官を集め、ＵＶ光下で蛍光を測定した。蛍光をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで分析した。ほとんどのＮ／Ｃ−メチル化されたＣＲＥＫＡ類似体は非修飾ＣＲＥＫＡと比較して、頼強力な蛍光を生じた。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ、ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ、ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ、ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ、およびＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）はすべて、ＣＲＥＫＡと比較して有意により高い蛍光を示した。Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡは、非修飾ＣＲＥＫＡと比較して増強された蛍光を示さない唯一のメチル化ＣＲＥＫＡであった（図１０Ａを参照のこと）。図１０Ｂにおいて、ＣＲＥＫＡおよびＣ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡペプチドの両方と比較してＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡの増強された蛍光を示す。グルタミン酸がＮ−メチル化された、ＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドは、非修飾ＣＲＥＫＡよりも強力に腫瘍組織で蓄積することが示される。
【０２７０】
Ｎ−メチル化されたＣＲＥＫＡペプチドは、腫瘍内部で血管への酸化鉄ナノワームのホーミングを改善する。ＣＲＥＫＡのＦＡＭで標識されたＮ−メチル化誘導体および修飾されていないＣＲＥＫＡでコーティングされたナノワームの蓄積を、２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン腫瘍を有するヌードマウスで測定した。マウスにＦＡＭで標識されたＣＲＥＫＡペプチドまたはそのＮ−メチル化された変異体を静脈内注射した。ペプチドを５時間循環させ、腫瘍をその後収集した。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１または抗フィブリン（フィブリノゲン）で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。ＣＲＥＫＡでコーティングされたナノワームは腫瘍血管で凝固を引き起こし、それら自身のホーミングを増幅する（Simberg  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  104:  932-936  (2007)）。Ｎ−メチル化合物は、修飾されていないペプチドよりも、特に、腫瘍の内部での蓄積および凝固の誘発に有効であることが示された（図１１を参照のこと）。
【０２７１】
ＣＲＥＫＡの別の腫瘍ホーミングペプチドとの組み合わせは、ホーミングおよびＣＲＥＫＡ誘発性凝固の効率を増強する。ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）またはＣＧＫＲＫ（配列番号７）でコーティングされた酸化鉄ナノワームを、２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍を５時間後に収集し、腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。ＦＡＭで標識されたＣＲＫＤＫＣペプチド（緑）およびローダミンで標識されたＣＲＥＫＡペプチドでコーティングされたナノワームの混合物を、２２Ｒｖ−１腫瘍を有するヌードマウスに静脈内注射し（２．５ｍｇＦｅ／ｋｇの各ナノワーム調製物１ｋｇ）、そして組織を５時間後に収集した。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１および抗フィブリン（フィブリノゲン）で染色し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。倍率は×１００である（右下のパネルでは４００×）。核をＤＡＰＩで染色した。ＰＢＳ、またはＣＲＥＫＡもしくはＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされたナノワーム、またはＣＲＫＤＫＣおよびＣＲＥＫＡナノワームの混合物を注射したマウスから得られた２２Ｒｖ−１同所性腫瘍の低温切開片を、抗フィブリン（フィブリノゲン）抗体で免疫組織化学的に染色した。試料を、Ｓｃａｎｓｃｏｐｅを用いた画像分析に付し、フィブリン（フィブリノゲン）陽性領域を定量化した。結果は、メチル化されたＣＲＥＫＡと別の腫瘍ホーミングペプチドＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）との組み合わせが、ホーミングおよびＣＲＥＫＡで誘発された凝固の効率を増強することを示す（図１２Ｃを参照のこと）。
【０２７２】
ペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノワームを用いた２２Ｒｖ−１ヒト前立腺ガン同所性異種移植片のＭＲ画像化は、ガンキセノグラフの増大したターゲティングを示す。Ｔ２加重ＭＲ画像。均等割合のＣＲＫＤＫＣでコーティングされた（配列番号５）とＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされた（配列番号１）ナノワームとの混合物（合計用量５ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。粒子を表示された時間循環させた。腫瘍を通る軸平面の画像を示す。ガドリニウム（Ｇｄ）およびＦｅｒｉｄｅｘ（Ｆｅ）を標準試料として使用した。ナノワームは腫瘍中の血管を強調する（図１３Ａを参照のこと）。様々な時点での腫瘍鉄含有量の定量的変化を示すヒストグラム。標的とされるナノワームのみが時間とともに腫瘍中で著しい蓄積を示す（図１３Ｂを参照のこと）。
【０２７３】
標的化ナノワームでの腫瘍治療は、結果として腫瘍容積を減少させる。２２Ｒｖ−１ヒト前立腺ガンの２週齢同所性異種移植片を有するマウスに、ＣＲＫＤＫＣでコーティングされた（配列番号５）ナノワーム、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡでコーティングされた（配列番号１）ナノワーム、または両粒子の等量の組み合わせを静脈内注射した。すべてのナノワームはまた、５Ｋポリエチレングリコールでコーティングした。粒子を１日おきに１４日間（５ｍｇ／ｋｇ／日、合計累積用量３５ｍｇ／ｋｇ）投与した。最後の注射の１日後の腫瘍容積は、ＣＲＫＤＫＣ（配列番号５）単独で腫瘍容積において統計的に有意な減少を示し、メチル化されたＣＲＥＫＡ単独ではさらに減少し、組み合わせでは最も減少する（図１４Ａを参照のこと）。類似した結果が２つの独立した実験で観察された。生存腫瘍周縁部において標的とされる腫瘍および閉鎖血管の中央で大きな壊死領域を示すＨ＆Ｅ染色。腫瘍血管にホーミングするが凝固を引き起こさないＣＲＫＤＫＣ粒子を投与された群における類似したサイズの腫瘍は、壊死または閉鎖血管を示さなかった。
【０２７４】
図１５Ａ〜１５Ｃ  ＣＲＫ、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ、または組み合わせ（ＣＲＫおよびＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ粒子の混合物）でコーティングされた５Ｋ−ＰＥＧ−ＳＰＩＯでの腫瘍治療研究により、組織学的検査およびフィブリン（フィブリノゲン）染色で、治療された腫瘍マウスの正常な器官では損傷またはフィブリン充填血管は示されなかった。図１５Ａおよび１５Ｂ：ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−結合ＳＰＩＯナノ粒子と混合された腫瘍ホーミングＣＲＫの蛍光画像を最後の注射の翌日に作製した。腫瘍セクションを抗ＣＤ−３１（図１５Ａ）または抗フィブリン（フィブリノゲン）（図１５Ｂ）で染色し、共焦点顕微鏡法により調べた。核をＤＡＰＩで染色し、混合物ペプチド結合ＳＰＩＯ、および血管をＣＤ３１（図１５Ａ）フィブリノゲン（図１５Ｂ）染色で視覚化した。組織学的検査およびフィブリン（フィブリノゲン）染色において、治療された腫瘍マウスの正常器官では損傷またはフィブリン充填血管はは検出されなかった。
【０２７５】
Ｃ．実施例３：ヒト前立腺ガンにおけるナノ粒子誘発性血管閉塞
１．序文
前立腺ガンの罹患率およびこの疾患による多数の死亡は、このガンについてより良好な治療を開発するための戦略でパラダイムシフトの必要性を強調する（Ｊｅｍａｌ，  ２００８）。１９７０年代から、基礎ガン生物学における進歩により、悪性転換および転移伝播の根底にあるプロセスにおける我々の理解の大幅な進歩に至っている。それでも、ガンの根絶は、主に個々のガンの種々雑多な性質や正常組織を損傷することなく新生細胞に対して療法を標的とさせることが我々にはできないために、未だにとらえどころのない臨床目的である。
【０２７６】
前立腺腫瘍は、解剖学的、組織学的そして遺伝的に異種であり（Macintosh,  1998;Ruijter,  1996;Miller,  1994）、種々の療法に対して種々の応答を引き起こす。これらの障害は、ガン性領域を画像化し、治療の進行を限定された追跡する能力によりさらに拡大される（Jain,  2002;Weissleder,  2002）。腫瘍の異質性を克服するための１つの方法は、腫瘍血管系に焦点を合わせることである。腫瘍血管系は、ホーミングに基づく（ｓｙｎａｐｈｉｃ）ターゲティングの部位として特によく適していることが証明されている。それは、正常組織の血管では発現されない多数の分子を発現し、血管壁は、血液由来の物質について容易にアクセス可能である（Ruoslahti,  2010）。ほとんどの血管法は、抗血管形成療法を使用して、成長する固体腫瘍において、新しい血管の形成を防止する；これらのアプローチは、特に進行期ガンの治療に有用であることが判明している（Folkman,  1995;Ferrara,  1999;Folkman,  2007;Carmeliet,  2000;Beecken,  2001）。別の方法は、腫瘍の脈管構造を閉塞させ、をれにより腫瘍壊死を誘発することに基づく。トランケートされた組織因子の腫瘍へのターゲティングがこの目的のために使用され、一部成功している（Bieker,  2009;Huang,  1997;Kessler,  2005;Nilsson,  2001;Ran,  1998）。ナノメディシンは、ナノ粒子を使用して疾患の診断および治療を促進する新興分野である。ナノ粒子を操作して、複数の機能を果たすようにすることができ、これは単純な薬剤よりも優れた潜在的利点を提供する。この研究では、本発明者らは、より有効かつ安全に腫瘍循環をブロックするナノメディシンに基づくアプローチを設計した。
【０２７７】
ファージディスプレーされたペプチドライブラリのインビボおよびエクスビボでの以前のスクリーニングにより、腫瘍血管における特異的標的が見いだされた（Hoffman,  2004）。この方法で同定される腫瘍ホーミングペプチドのいくつかは、正常な血管および組織では存在しない腫瘍血管壁上ならびに腫瘍間質中の血液凝固の産物を認識する。この相違の理由は、凝結原腫瘍環境および漏れやすい腫瘍血管から組織中へのフィブリノゲンをはじめとする血漿タンパク質の浸出であると考えられる（Abe,  1999;Dvorak,  1985）。ヒトガンをはじめとする種々の腫瘍種の血管におけるこれらの凝固産物を認識する３つの腫瘍ホーミングペプチドが同定されている（Pilch,  2006;Simberg,  2007）。フィブリノゲンのない変異体マウス、または血液凝固中にフィブリンと共有結合するようになる血漿フィブロネクチンが欠損したマウスにおいて成長した腫瘍は、これらのペプチドにより認識されず、このことは、ペプチドがフィブリン−フィブロネクチン複合体を標的とすることを示す。
【０２７８】
最近、フィブリン−フィブロネクチン複合体を認識するペプチドの１つである、配列ＣＲＥＫＡを有するペンタペプチドを使用して、自己増幅性ナノ粒子送達系が設計された（Ｓｉｍｂｅｒｇ，  ２００７）。このペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は腫瘍血管中で蓄積し、ここでそれらはさらなる局所的凝固を誘発し、それによりさらに多くの粒子について新しい結合部位が生じる。この増幅系は、体の他の箇所で凝固または他の明らかな副作用を引き起こすことなく、マウス腫瘍モデルにおいてナノ粒子のホーミングを増強した。自己増幅された腫瘍蓄積は、腫瘍画像化の増強をもたらしたが、腫瘍成長の有意な阻害は得られなかった。本明細書中で開示されるのは、前立腺ガンを標的腫瘍として使用した以前の知見に基づく有効なセラノスティック系である。
【０２７９】
２．方法
ｉ．細胞系および腫瘍
２２Ｒｖ１前立腺ガン細胞系をアメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナッサス）から入手した。細胞を、２ｍＭのグルタミン、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％のＦＣＳを追加したＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃および５％ＣＯ２にて成長させた。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＰＢＳ中２×１０６細胞を同所的に前立腺に注射することにより、異種移植片を作製した。ＬＡＰＣ９ヒト前立腺癌異種移植片をＬｉｌｙ  Ｗｕ博士（カリフォルニア大学（ロサンゼルス））から入手し、記載されているようにして腫瘍を産生するために使用した（Agemy,  2008）。動物実験は、カリフォルニア大学（カリフォルニア州サンタバーバラ）、およびＳａｎｆｏｒｄ−Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（サンディエゴ）のＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された手順にしたがって実施した。
【０２８０】
ｉｉ．ペプチド合成
標準的固相Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕケミストリーを用いる自動マイクロ波支援ペプチド合成機（Ｌｉｂｅｒｔｙ；ＣＥＭ（ノースカロライナ州マシューズ））でペプチドを合成した。合成中、色素を配列から隔てる６−アミノヘキサン酸スペーサーを有する５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でペプチドを標識した。Ｎ／Ｃα−メチル化されたＣＲＥＫＡ類似体の合成に用いられる非タンパク質新生アミノ酸の調製は、他の箇所で報告する。この研究で用いられる化学選択的ライゲーションのために使用される余分のＮ末端アミノシステインを有するＣＲＫＤＫＣの合成は、他の箇所で記載する。
【０２８１】
ｉｉｉ．コンピュータモデリング
各残基を（１つずつ）そのＮ−メチルまたはＣ−メチルカウンターパートで置換することにより構築されたＣＲＥＫＡ類似体のコンフォメーションプロフィールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓシミュレーションにより特徴づけた。方法および集積性分析は（Zanuy,  2009）で記載されているとおりであった。
【０２８２】
ｉｖ．ＮＷおよびＮｉ−リポソームの調製
ＮＷ（Park,  2009）、ペプチドおよびＮｉ−リポソームでコーティングされたＮＷを記載されているようにして調製した（Simberg,  2007）。アミノ化ナノワームをマレイミド−５ＫＰＥＧ−ＮＨＳでＰＥＧ化した（JenKem  Technology）。Ｎｉ−リポソームをし移用したこの実験では、ナノワームを、その後のＮ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステルとのペプチドカップリングのために官能化した（ＡＭＡＳ；Ｐｉｅｒｃｅ）。ペプチド配列中のシステイン由来のチオールと、官能化粒子上のマレイミドとの間のマイケル付加反応で、ペプチドをナノ粒子と結合させた。
【０２８３】
ｖ．インビボペプチドホーミング
０．５〜１ｃｍのサイズに達した場合、同所性前立腺ガンを使用した。フルオレセインで標識された合成ペプチド（約２００μｇ）を、腫瘍を有するマウス中に静脈内注射し、３時間循環させた。マウスを、麻酔下、ＰＢＳで経心臓灌流し、組織を集め、ＵＶ光下で観察し（Ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＴ−９９００、Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カリフォルニア州エンシニータス））、次いで免疫蛍光または免疫組織学のために処理した。
【０２８４】
ｖｉ．インビボＮＷ注射
ＮＷバイオアナリシスを分析するために、同所性２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスに、尾静脈中に注射した（体重１ｋｇあたり５ｍｇの鉄）。ホーミング実験において、マウスを麻酔下のＰＢＳでの心灌流により注射の５〜６時間後に安楽死させ、器官を切開し、粒子ホーミングについて分析した。腫瘍治療実験において、２週齢２２Ｒｖ−１またはＬＡＰＣ９同所性異種移植片を有するヌードマウス（典型的には腫瘍容積中約２００〜２５０ｍｍ３）に、１５０μｌのＰＢＳ中ＮＷまたは対照としてのＰＢＳを静脈内注射した。ＮＷを１日おきに１４日間注射した。合計累積用量は３５ｍｇ鉄／ｋｇであった。治療の最後に、マウスを麻酔下、ＰＢＳで灌流し、腫瘍を収集した。次式：容積（ｍｍ３）＝（ｄ２×Ｄ）／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最小腫瘍直径および最大腫瘍直径である）を用いて腫瘍容積を計算した。
【０２８５】
ｖｉｉ．ペプチド安定性
ペプチドを、ＮＷとペプチド上のシステイン残基とを架橋するリンカーと結合させて、ＯＰＳＳ基とジスルフィドを形成した。ペプチドでコーティングされたＮＷを動物に注射し、血液を注射の１５分後および３時間後に集めた。血漿を分離し、ＮＷを超遠心分離法（１００，０００×ｇ、４℃にて１０分間）によって集めた。ＮＷに結合したタンパク質を、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ２．８とともに磁気ＬＳ  カラム（ＭＡＣＳ分離カラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（ドイツ国ベルギッシュグラッドバッハ））上でインキュベーションすることにより除去した。ペプチドを、１０ｍＭのジチオトレイトールとともに３０分間室温でインキュベートすることにより、ＮＷから切断した。酸化鉄を超遠心分離法（１００，０００×ｇ、４℃で１０分間）によりペプチドから分離し、ペプチドを含む上清フラクションを、マトリックス支援レーザー吸脱着イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により分析した。
【０２８６】
ｖｉｉｉ．免疫蛍光および免疫組織化学
ナノ粒子を注射したマウス由来の組織を、４％のパラホルムアルデヒド中、一晩４℃にて固定し、３０％のスクロース中で一晩低温保護し、ＯＣＴ包埋媒体中で凍結した。組織学的分析のために、７−μｍセクションを切り出し、セクションをＨ＆Ｅ染色した。
【０２８７】
免疫染色のために、組織セクションを、まず１時間、室温にて、二次抗体が生成した種からの１０％の血清とともにインキュベートし、続いて一次抗体とともに一晩４℃にてインキュベートした。以下の抗体を使用した：ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１（１０  μｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンノゼ））、マウスフィブリン（フィブリノゲン）抗血清（１：１００；Ｎｏｒｄｉｃ（オランダ国ティルブルグ））。一次抗体をＡｌｅｘａ  ６４７ヤギ抗ラット、および６４７ロバ抗ヤギ二次抗体（１  ：  １０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン））で検出した。各染色実験は、負の対照として二次抗体のみで染色されたセクションを含んでいた。核をＤＡＰＩ（５μｇ／ｍＬ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。セクションをゲル／マウントのマウンティング培地（Ｂｉｏｍｅｄａ（カリフォルニア州フォスターシティー））でマウントし、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ５００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ（ペンシルベニア州センターバレー）；２００ミクロン顕微鏡写真、２０×倍率および５０ミクロン、４０×）で観察した。
【０２８８】
凍結組織セクションの免疫組織化学的染色のために、内因性ペルオキシダーゼを３％のＨ２Ｏ２（ＤＡＫＯ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でクエンチした。セクションを、１時間、Ｄａｋｏ  ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｂ希釈溶液５％ロバ血清中でブロックした。セクションをＤＡＫＯビオチン／アビジンブロッキング系で処理し；一晩４℃にてマウスフィブリン（フィブリノゲン）抗血清とともにインキュベートした。一次抗体をビオチニル化抗マウスＩｇＧ、およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州バーリンゲーム））で検出した。核をヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州バーリンゲーム））で対比染色した。腫瘍内のフィブリン（フィブリノゲン）のホーミング領域を定量化するために、染色されたセクションをＳｃａｎｓｃｏｐｅ  ＣＭ−１スキャナーでスキャンし、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア４１（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州ビスタ））で分析した。
【０２８９】
アポトーシスは、製造業者の使用説明書にしたがって、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナ州インディアナポリス））を使用して、二本鎖ＤＮＡ切断の同定のためのＴＵＮＥＬアッセイを用いて測定した。
【０２９０】
ｉｘ．磁気共鳴画像化
２２Ｒｖ−１同所性ヒト前立腺ガン異種移植片を有するヌードマウスに、ペプチドでコーティングされているか、またはコーティングしていない超常磁性酸化鉄ＮＷを、体重１ｋｇあたり５ｍｇの鉄の用量で静脈内注射した。各動物にＮＷの１時間前にＮｉ−リポソーム（０．２ミリモルのＮｉ）を投与して、ＮＷの血液半減期を増加させた。ＮＷ注射の約７〜８時間後に、マウスをイソフルランで麻酔し、３−Ｔｅｓｌａ  ＭＲ映像装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州ミルウォーキー））を用いたＴ２加重ＭＲＩスキャンに付した。画像化後、興味のある組織を収集し、免疫蛍光検査のために処理した。
【０２９１】
ｘ．コントラスト増強超音波（ＣＥＵＳ）
Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）造影剤（Ｌａｎｔｈｅｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ；４５μｌの生理食塩水中５μｌ）を、２８ゲージインスリンシリンジを用いてマウスの尾静脈中に注射した。ＬＩ２−５変換器を有するＰｈｉｌｉｐｓ  ｉＵ２２を、低メカニカルインデックス（ＭＩ）、コントラスト特異的画像化モード（電力変調モード）で画像化するために使用した。画像化パラメータを以下のように設定し、研究中同一に保った：深さ２ｃｍ、フォーカスゾーン２ｃｍ、ＭＩ０．０６、５フレーム／秒。２分のシネループを、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＱＬａｂを用いた時間強度曲線分析のためにセーブした。マウスにＣＲＥＫＡ−ＮＷを単独またはＣＲＫＤＫＣ−ＮＷと組み合わせて注射する前、注射の１、３、および６時間後にＣＥＵＳを実施した。腫瘍周縁部、中央、および周りの組織を別々に調べて、腫瘍循環の効率を定量化した。ＮＷで２週間処理した腫瘍のＣＥＵＳ分析を、閾値法でＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて実施し、ここで、増強を有する画素および増強のない画素を計数した（固定数がないので、閾値を任意に設定した）。増強を有する領域のパーセント＝増強された領域の画素数／全腫瘍の画素数×１００。
【０２９２】
ｘｉ．統計分析
データを、両側スチューデント独立ｔ検定または一方向分散分析とそれに続く好適なポストホック試験により分析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。
【０２９３】
３．結果
ｉ．ＣＲＥＫＡの活性を増強するためのナノワームの組み合わせ。
ナノ粒子
休憩粒子よりもペプチド媒介性細胞結合においてより有効である細長い酸化鉄ナノ粒子である「ナノワーム」（ＮＷ）を使用した（Park,  2009）。ＣＲＥＫＡペプチドでコーティングされたナノワーム（ＮＷ）は同所性２２Ｒｖ１ヒト前立腺ガン異種移植腫瘍の血管において蓄積し、そして、血管内腔中のフィブリン（フィブリノゲン）含有堆積物の存在により証明されるように、それらにおいて凝固を引き起こした（図１６ａ）。治療されていないマウスまたはＣＲＥＫＡ以外のペプチドでコーティングされたナノ粒子で治療されたマウスの腫瘍において、主に血管壁はフィブリン（フィブリノゲン）について陽性であった（図１６ｂ）。ＣＲＥＫＡ−ＮＷ治療された２２Ｒｖ１腫瘍における増大したフィブリン（フィブリノゲン）染色のほとんどは腫瘍周辺であり、一方、腫瘍の中央でＮＷ蓄積または凝固はほとんど見られなかった。
【０２９４】
ＣＲＥＫＡと、ＣＲＥＫＡ以外の異なる標的分子を認識する腫瘍ホーミングペプチドとを組み合わせることにより、ＮＷの腫瘍送達を改善することが可能であり、したがって、腫瘍における異なる血管と結合することができる。２つの腫瘍ホーミングペプチド：創傷−ホーミングペプチドとして最初は同定されたＣＲＫＤＫＣ（Jarvinen,  2007）、およびＣＧＫＲＫ（Hoffman,  2003）を、ＣＲＥＫＡ−ＮＷホーミングを増大させるそれらの能力について試験した。両ペプチドは様々な種類の腫瘍の血管と結合する（Jarvinen,  2007;Hoffman,  2003）。ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷおよびＣＧＫＲＫ−ＮＷはどちらもＣＤ３１染色との共存により証明されるように、７０％を越える２２Ｒｖ１腫瘍血管で蓄積した（図１６ｂ；データは不掲載）。
【０２９５】
次にＣＲＥＫＡで二重コーティングされたＮＷおよび他のペプチドのうちの１つを試験した。しかし、二重コーティングされたＮＷは、最小の腫瘍ホーミングしか示さなかった（データは不掲載）。ナノ粒子を同じナノ粒子上で２つの異なるペプチドでコーティングすることにより、各ペプチドの表面密度をホーミングに悪影響を及ぼす程度まで現象させることができる。意外にも、ＣＲＥＫＡ−ＮＷのＣＲＫＤＫＣ−ＮＷまたはＣＧＫＲＫ−ＮＷとの混合物（対照として使用した）は、腫瘍内部の血管へのＣＲＥＫＡ−ＮＷの送達において、およびそれらにおいて凝固を引き起こすのにかなり有効であった。混合された単一ペプチド粒子は腫瘍血管中で凝集する可能性があり、各ペプチドが両種類の粒子を標的へ運ぶのを可能にする。粒子混合物のうち、ＣＲＥＫＡ−ＣＲＫＤＫＣ混合物が腫瘍全体へのホーミングに特に有用であり（図１６ｃ）、次にこの組み合わせに注目した。フィブリン（フィブリノゲン）蓄積の定量化により、ＣＲＥＫＡ−ＮＷをＣＲＫＤＫＣ−ＮＷと組み合わせることにより、ＣＲＥＫＡ−ＮＷ単独と比較すると４〜５倍増強することが示された（図１６ｄ）。造影超音波（Ｃｏｎｔｒａｓｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＣＥＵＳ））画像化は、ＮＷ混合物の注射後６時間で血流の９０％減少を示した（図１７）。
【０２９６】
ｉｉ．非コード化アミノ酸の組み入れによるＣＲＥＫＡの活性の増強
ＣＲＥＫＡをタンパク質分解に対して保護すると、腫瘍ホーミングの効率をさらに増大させることができる。タンパク質分解保護は、非タンパク質新生アミノ酸の組み入れにより達成することができる。ただし、ペプチドの生理活性コンフォメーションは保持されるものとする（Chatterjee,  2008;Zanuy,  2009）。分子モデリング研究に基づいて（Ｚａｎｕｙ、２００９）、いくつかのＮ−およびＣα−メチル化アミノ酸を選択して、ＣＲＥＫＡの重要な残基を置換した。この化学的修飾は、ペプチド骨格のある位置でメチル化として見ることができる（ＮまたはＣａのいずれかで）。Ｎ／Ｃα−メチル化されたアミノ酸を組み入れるＣＲＥＫＡ類似体を、フルオレセイン（ＦＡＭ）で標識されたペプチドとして合成した。ＣＲＥＫＡ類似体のいくつかは、修飾されていないＣＲＥＫＡよりも腫瘍において有意に高い蓄積を示した（図１８ａ）。例外はＣ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ（ここで、アルギニン残基はＮ−メチル化されている）であった。このペプチドは弱い腫瘍蛍光しか生じなかった。共焦点顕微鏡法は器官−レベル分析を裏付けた（図１８ｂでは２２Ｒｖ１腫瘍におけるＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡについて、そして図１８ｃではＬＡＰＣ９腫瘍について示す）。活性なＣＲＥＫＡ類似体は、ＣＲＥＫＡで見られるものよりもより強力かつより広範囲の腫瘍間質内愛目構造パターンを示した。予想どおり、フィブリン（フィブリノゲン）およびフィブロネクチンに対する抗体で腫瘍セクションを染色すると、これらのタンパク質の堆積が豊富な領域中にＣＲＥＫＡ類似体が蓄積することが示された（図１８ｂ右手のパネル）。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡおよびＣＲＥ（ＣａＭｅ）ＫＡはこの点に関して等しく活性であるように見えた（図１９）。
【０２９７】
ＣＲＥＫＡおよびＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡのインビボの腫瘍における安定性を調査するために、これらのペプチドを、２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。ペプチドは、注射の３０分後に腫瘍において等しく強力な蛍光をもたらした（図１８ｄ）。しかし、３時間後に、ＣＲＥＫＡ蛍光は７０％減少し、一方、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡは有意な減少を示さず、このことは、より安定性が高いことを示唆する。これらの観察結果に基づいて、本発明者らは、骨格メチル化されたペプチドＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡおよびＣＲＥ（ＣａＭｅ）ＫＡをナノ粒子での研究のために選択した。
【０２９８】
ｉｉｉ．ＣＲＥＫＡ類似体でコーティングされた酸化鉄ナノワームの腫瘍内分布
静脈内注射されたＣＲＥ（ＣａＭｅ）ＫＡ−ＮＷおよびＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷは、腫瘍周縁部および内部の血管中での大幅に増大された蓄積を示した（図１９および図２０ａ）。これらの領域も抗フィブリン（フィブリノゲン）染色について陽性であった。腫瘍内でのＮ／Ｃα−メチル化されたペプチドでコーティングされたＮＷのこの分布は、ＣＲＥＫＡ−ＮＷと著しく異なり、この場合、ナノ粒子は、腫瘍の内部ではそれほど多くないように見えた（図１９および２０ａを図１６ａと比較）。種々のＮＷ処方からの蛍光は、すべてのナノ粒子を非選択的に取り込む肝臓及び脾臓を除いて、腫瘍を有するマウスの正常組織では観察されなかった。これらのＮＷの肝臓蓄積は類似していた。ＣＲＥＫＡ−ＮＷよりも有意に多いＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷの腫瘍蓄積も、異なる前立腺ガン異種移植片モデルであるＬＡＰＣ９で観察された。
【０２９９】
ＮＷの静脈内注射後の２２Ｒｖ１腫瘍マウスの磁気共鳴画像化は、ＣＲ（ＡＭｅ）ＥＫＡ−ＮＷの腫瘍全体にわたって低強度の血管シグナルを示し、ＣＲＥＫＡ−ＮＷでは類似しているが、より弱いシグナルを示した（図２０ｂ）。非標的化ナノワームは、大部分のナノ粒子が血液から一掃された後のこれらの腫瘍において検出可能なシグナルをもたらさなかった（Sugahara,  2009）。
【０３００】
ｉｖ．ペプチドでコーティングされたＮＷによる腫瘍血管遮断の治療有効性
ＣＲＥＫＡ−ＮＷとＣＲＫＤＫＣ−ＮＷとを組み合わせ、Ｎ／Ｃα−メチル化されたアミノ酸の組み入れにより、ＣＲＥＫＡ自己増幅されたターゲティング系を最適化して、増強された系の腫瘍治療可能性を試験した。ＮＷの肝臓取り込みをブロックするために短期実験で用いられるＮｉ−リポソーム前処理は、長期治療実験には適さなかった；必要な注射回数が２倍になり、Ｎｉ−リポソームの注射を複数回受けたマウスの中には死亡が観察された。リポソーム前処理を省略し、代わりにＮＷをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングし、ホーミングペプチドをナノ粒子とＰＥＧ鎖を通してカップリングさせた。
【０３０１】
ＰＥＧを通してＮＷと結合したペプチドを用いて、ＣＲＥＫＡおよびＣＲ（ＡＭｅ）ＥＫＡのインビボ安定性を直接比較した。ペプチドを、可逆的ジスルフィド結合を通してＰＥＧコーティングとカップリングさせ、コーティングされたＮＷを、２２Ｒｖ１腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。ＮＷを血液から回収し、ペプチドを単離し、質量分析により分析した。１５分の循環後に得られた血液試料中でＣＲＥＫＡおよびＣＲ（ＡＭｅ）ＥＫＡは等しく多く含まれていた。しかし、３時間後、ＣＲＥＫＡは検出不可能であり、このことは、ペプチドが全て分解し、一方、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡの量は約６０％減少しただけであったことを示していた。これらの結果は、化学的修飾により意図されるように、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡはＣＲＥＫＡよりもインビボで安定であることを示す。ＣＲ（ＡＭｅ）ＥＫＡは血漿凝血塊とＣＲＥＫＡよりも若干高い親和性（それぞれＫｄ＝２．５μΜおよび６．０μΜ；データは不掲載）で結合し、このことは、親和性もまたメチル化されたペプチドの優れたホーミング特性に寄与し得ることを示す。
【０３０２】
ＰＥＧのないナノ粒子と比較して、腫瘍血管でのホーミング活性および凝固が若干失われた。複数回注射はこの減少した活性を補うことができる。実際、２週間ＮＷ組み合わせで処置されたマウスの腫瘍における血管の多くは、フィブリン（フィブリノゲン）免疫染色に対して陽性のペプチド粒子および堆積物で満たされていた（図２１Ａ、データは不掲載）。さらに、ＮＷで処理された腫瘍のＣＥＵＳ（造影超音波）分析により、腫瘍血流の減少が明らかになった；ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷ単独では３０％減少し、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷをＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷと組み合わせると、２倍を超える効果が得られた（図２１Ｂ）。
【０３０３】
ＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷと組み合わせたＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷで治療されたマウスから得られた腫瘍の組織学的分析は、腫瘍の中央の核の典型的な損失により明示されるように、広範囲の壊死を示した（図２１ｃ）。対照群における類似したサイズの腫瘍ではアポトーシスまたは壊死の徴候は観察されなかった（ＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷおよびＰＢＳ）。ＴＵＮＥＬ染色により、ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷおよびＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷの組み合わせで処理された腫瘍の生存領域で広範囲のアポトーシスが明らかになった（図２１ｄ）。ＰＢＳまたはＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷ単独を投与されたマウスと比較して、組み合わせで処置されたマウスでは腫瘍成長が非常に著しく阻害された（図２２ａ）。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷ単独は、腫瘍成長のわずかであるが有意な阻害を示した。いずれの治療も、処置されたマウスから得られた体重測定結果および器官の組織学的分析により明示されるように、明らかな全身性毒性を示さなかった。身体の他の箇所における血液凝固の徴候（たとえば、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症による突然死もしくは麻痺）またはＤＩＣ（播種性血管内凝固）の徴候は観察されなかった。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷおよびＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷ組み合わせ治療もＬＡＰＣ９腫瘍マウスにおいて腫瘍成長を阻害し、ビヒクル単独で処置されたマウスと比較して、有意な生存の増加をもたらした（図２２ｂ）。これらの治療は、処置されたマウスから得られた体重測定結果および器官の組織学的分析により明示されるように、明らかな全身性毒性を示さなかった。身体の他の箇所での血液凝固の徴候（たとえば、脳卒中、肺塞栓症または深部静脈血栓症による突然死もしくは麻痺）または播種性血管内凝固の徴候は観察されなかった。
【０３０４】
ｖ．考察
これらの結果は、前立腺腫瘍血管中のホーミングペプチドでコーティングされた酸化鉄ＮＷの相乗的および自己増幅性蓄積に基づく腫瘍治療および画像化法を確立する。本明細書中で示されるように、腫瘍血管の広範囲の被覆は、２つの腫瘍ホーミングペプチド、ＣＲＥＫＡまたはＣＲＫＤＫＣのいずれかでコーティングされたナノ粒子を組み合わせることにより達成できる。Ｎ／Ｃα−メチル化された残基の組み入れによりタンパク質分解に対してＣＲＥＫＡペプチドを保護することにより、ＣＲＥＫＡ−ＮＷが腫瘍血管へホーミングし、そして血管中で凝固を引き起こす能力を増大させることも示される。２つのアプローチを組み合わせることにより、腫瘍の有効なＭＲＩ画像化が可能になり、腫瘍成長の広範囲の阻害がもたらされた。
【０３０５】
ＣＲＥＫＡ自己増幅性腫瘍血管ホーミング系に導入された変化（Simberg,  2007）は、異なるペプチドでコーティングされた２つのナノ粒子種の驚くべき協力作用を明らかにした。前立腺ガン血管のより大きな被覆を達成するために、２つのペプチドは同じ粒子上になければならないと仮定されたが、本明細書中の開示は、それらが別の粒子上にあるとさらに有効であることを示した。ＣＲＥＫＡ−ＮＷとの共蓄積（ｃｏ−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）はＣＲＫＤＫＣペプチドに限定されなかった；別の腫瘍ホーミングペプチドであるＣＧＫＲＫでコーティングされたＮＷも腫瘍血管におけるＣＲＥＫＡ−ＮＷの蓄積を増強したが、ＣＲＫＤＫＣ−ＮＷほど強力ではなかった。この現象の可能な説明は、明らかに、腫瘍血管内で達成される高濃度のＮＷでのみ起こる、２種のナノ粒子の共凝集である。ＣＲＥＫＡ−ＮＷにより誘発される凝固は、さもなければ血流により洗い流される緩く結合したＣＲＫＤＫＣ−ＮＷをトラップすることにより共蓄積に貢献することができる。別の協力作用性２粒子ナノシステムが最近記載された（Park,  2009）。
【０３０６】
ＣＲＥＫＡ−ナノワームの血栓形成促進活性は、腫瘍に関して選択的である。これは、ＣＲＥＫＡ−ＮＷ、およびＮＷ混合物の腫瘍血管中での選択的蓄積に一部起因する。ＣＲＥＫＡでコーティングされた他の種類のナノ粒子および遊離ＣＲＥＫＡペプチドはこの活性を有さないので、ペプチドおよびナノ粒子の酸化鉄成分はどちらも血栓性活性に関与し（Karmali,  2009;Peters,  2009）、ＣＲＥＫＡ以外の腫瘍ホーミングペプチド（ＣＲＫＤＫＣおよびＣＧＫＲＫ）でコーティングされた酸化鉄ＮＷも凝固を引き起こさない。酸化鉄ナノ粒子は、凝結原であることが知られ、凝固産物の親和性は、活性を明らかに増強する。ＮＷは、他のナノ粒子のように、肝臓および脾臓で非特異的に蓄積する（Thorek,  2006）。しかし、この研究、または類似しているが効果が低い系を用いた以前の研究（Simberg,  2007）では、腫瘍マウスの正常組織において凝固は観察されていない。したがって、凝結原（Abe,  1999;Dvorak,  1985）である腫瘍環境は、腫瘍血管において凝固をもたらす役割を果たす可能性がある。動脈硬化性プラークは、わずかな自発的凝固を示す傾向がある（Peters  2009;Smith  1993）。したがって、アテローム性動脈硬化症の存在は、ＣＲＥＫＡ技術の臨床応用における限界である可能性があった。
【０３０７】
ペプチドの薬剤候補としての可能性は、ろ過により循環から尿へ急速に排出されること、およびタンパク質分解を受けやすいことをはじめとする不十分な薬物動態によって制限される。尿中への排出は、ナノ粒子上にコーティングされたペプチドに関連する問題ではないが、結果は、タンパク質分解の重要性を証明する。各ナノ粒子は複数のペプチドでコーティングされているので、活性が著しく失われることなく、ナノ粒子コーティングが一部のタンパク質分解に耐えると予想されるかもしれない。結果は、この場合に当てはまらないことを示した；非コード化アミノ酸を組み入れることによってタンパク質分解的切断からペプチドを保護することは、実質的に、腫瘍ホーミング効率を改善し、腫瘍血管の遮断を増大させた。インビボのペプチドの安定性の直接測定は、増大したペプチド安定性が、メチル化されたＣＲＥＫＡ類似体の改善された特性に関与するという結論を裏付けた。他のペプチドでコーティングされたナノ粒子に拡大されるならば、この結果は、有効なナノ粒子療法の設計に重要な意味を有する可能性がある。
【０３０８】
本明細書中で開示されているのは、２つの同所性前立腺ガン異種移植腫瘍、２２Ｒｖ−１およびＬＡＰＣ９に対する系の抗腫瘍活性である。他の腫瘍種類も同様に標的とされる可能性が高い。というのも、他の種類の腫瘍はＣＲＥＫＡ系によって標的とされることが示されているからである（Simberg,  2007）。複合ＣＲＥＫＡ−ＮＷの効率は、種々の治療で達成される腫瘍血管遮断の程度と強力に相関した。ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷは、ＣＥＵＳによって記録されるように、腫瘍血流の３０％減少を引き起こし、腫瘍サイズの中程度の減少をもたらした。ＣＲＫＤＫＣ−ＰＥＧ−ＮＷとＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ−ＰＥＧ−ＮＷとの組み合わせは、腫瘍血流の７０％をブロックし、腫瘍サイズの強力な減少をもたらし、また動物の生存期間を延長した。特に、これらの結果は、ＮＷの固有の特性のみを利用することによって得られ、この特性によってさらに、腫瘍の画像化も可能になった。薬剤を粒子に添加することによって、このセラノスティックナノシステムの有用性をさらに増強することができる。
【０３０９】
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【０３１０】
配列
配列番号１  ＣＲＥＫＡ
配列番号２  ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ  
配列番号３  ＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ  
配列番号４  ＣＸＸＸＸＸＸＸＣ（ここで、Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である）
配列番号５  ＣＲＫＤＫＣ  
配列番号６  ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ  
配列番号７  ＣＧＫＲＫ  
配列番号８  Ｃ（ＮＭｅ）ＲＥＫＡ  
配列番号９  ＣＲ（ＮＭｅ）ＥＫＡ  
配列番号１０  ＣＲ（ＣＭｅ）ＥＫＡ  
配列番号１１  ＣＲＥ（ＮＭｅ）ＫＡ  
配列番号１２  ＣＲＥ（ＣＭｅ）ＫＡ  
配列番号１３  ＣＲ（ＮＭｅ）Ｅ（ＮＭｅ）ＫＡ  
【図１】
2013515008.tif 000003
【図２】
2013515008.tif 000004
【図３】
2013515008.tif 000005
【図４】
2013515008.tif 000006
【図５】
2013515008.tif 000007
【図６】
2013515008.tif 000008
【図７】
2013515008.tif 000009
【図８】
2013515008.tif 000010
【図９】
2013515008.tif 000011
【図１０Ａ】
2013515008.tif 000012
【図１０Ｂ】
2013515008.tif 000013
【図１１】
2013515008.tif 000014
【図１２−１】
2013515008.tif 000015
【図１２Ｃ】
2013515008.tif 000016
【図１３Ａ】
2013515008.tif 000017
【図１３Ｂ】
2013515008.tif 000018
【図１４】
2013515008.tif 000019
【図１５】
2013515008.tif 000020
【図１６−１】
2013515008.tif 000021
【図１６−２】
2013515008.tif 000022
【図１７Ａ】
2013515008.tif 000023
【図１７Ｂ】
2013515008.tif 000024
【図１８−１】
2013515008.tif 000025
【図１８−２】
2013515008.tif 000026
【図１９】
2013515008.tif 000027
【図２０】
2013515008.tif 000028
【図２１−１】
2013515008.tif 000029
【図２１−２】
2013515008.tif 000030
【図２２】
2013515008.tif 000031
【配列表】
2013515008000001.app
【国際調査報告】
2013515008.tif 000032
2013515008.tif 000033
2013515008.tif 000034