(57)【要約】  本発明は、２またはそれ以上の抗原を含む混合物中の第一抗原の抗原含量の測定のための特定の方法に関する。本発明はまた、混合ワクチン中の抗原についての効力試験に関する。本発明の方法は、抗原に結合することができる抗体を付加的に含む混合物中の抗原含量の測定を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第一抗原を含む組成物と、（ｉ）第二抗原および（ｉｉ）第一抗原と結合することができる抗体を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量の測定のための方法であって、
Ａ．第一抗原と抗体との間で形成された、混合物中の抗原−抗体複合体を解離する段階、および
Ｂ．免疫測定法によって第一抗原の抗原含量を測定する段階
を含む方法。
【請求項２】
第一抗原がＰＣＶ−２抗原であり、第二抗原がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫測定法がＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
混合物がそのまますぐに使用できるワクチン製剤であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗原−抗体複合体を解離するために混合物を酸溶液と共にインキュベートすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酸溶液がクエン酸溶液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
混合物を酸溶液と共に少なくとも８時間インキュベートすることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
酸溶液と混合物との少なくとも２５、好ましくは２５〜７５、より好ましくは２５〜５０の比率（ｖ／ｖ）で混合物をインキュベートすることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酸溶液が１．０〜３．０のｐＨを有することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくともＰＣＶ−２抗原を含む組成物とマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を含む組成物との混合物中のＰＣＶ−２抗原の抗原含量の測定のための方法であって、
Ａ．２つの組成物を混合する段階、および
Ｂ．免疫測定法によってＰＣＶ−２抗原の抗原含量を測定する段階
を含み、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を、ブタ血清を含まない培養物から得ることを特徴とする方法。
【請求項１１】
少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量の測定のための方法であって、
Ａ．第二抗原と抗体を含む組成物中の、第一抗原と結合することができる抗体から第二抗原を分離する段階、
Ｂ．第一抗原を含む組成物と第二抗原を混合する段階、および
Ｃ．免疫測定法によって混合物中の第一抗原の抗原含量を測定する段階
を含む方法。
【請求項１２】
該方法が混合ワクチンの効力試験であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２またはそれ以上の抗原を含む混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための特定の方法に関する。本発明はまた、混合ワクチン中の抗原についての効力試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の病原生物に由来する防御抗原の組合せを含むワクチンは、ワクチンの受容者と製造者の両方にとって多くの明らかな利益を有する。特に、混合ワクチンまたは多価ワクチンは、より一層の投与の容易さならびに必要な注射の回数およびおそらく通院の回数を減らすことによる患者にとってのより大きな快適さと利便性を提供する。混合ワクチンまたは多価ワクチンはまた、組み合わせたバルク材料、容器、包装、配給および注射装置の処理に関する節約性のゆえに製造および投与するのにより経済的である。
【０００３】
ヒトの健康の分野において混合ワクチンはしばしば小児のワクチン接種に関連して使用される。不活化ポリオを含むまたは含まないＤＴＰ（ジフテリア、破傷風および百日咳）ならびにＭＭＲ（麻疹、耳下腺炎および風疹）などの混合ワクチンは長年にわたって使用されており、近年、この組合せに新しい抗原が追加されている。
【０００４】
動物の健康の分野においても混合ワクチンは一般的に使用される。特に家禽、ブタ、反芻動物およびペット動物のワクチンは、しばしば多数抗原の組合せに基づく。そのようなワクチンの例は、イヌに関してはイヌジステンパーウイルス、肝炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パルボウイルス、レプトスピラウイルスおよび狂犬病ウイルス、ウシに関してはロタウイルス、コロナウイルスおよび大腸菌、家禽についてはニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎、伝染性ファブリキウス嚢病、頭部腫脹症候群および産卵低下症候群に対する混合ワクチンである。
【０００５】
ワクチンのバッチは、認可または市販承認が発行された後に初めて販売のために出荷され得る。加えて、そのような認可されたワクチンバッチのその後の各バッチは、国または関係する多くの国々の規則に従って正式に出荷されねばならない。この出荷は、規定されたバッチ試験の満足し得る完了後に製造者の権限で許可され得る。それゆえ、ありとあらゆるバッチのワクチンがその意図された作用を有することを保証するために、一貫した品質の製造工程が実施されねばならず、効力試験の適用はそのような工程の必須の要素である。
【０００６】
現在、種々の試験方法、例えば物理化学的性質、抗原性、免疫原性、感染性および感染または疾患に対する防護のアッセイが、ワクチンの効力を測定するために使用される。それらの適用は、ワクチン抗原の性質および試験の目的に依存する。生ワクチンでは、効力はワクチン中に存在する微生物の数（力価）に基づく。不活化ワクチンの場合には、効力はしばしば、標的動物種または別の種、例えばマウスまたはラットにおける免疫応答を測定することによって決定される。あるいは、不活化ワクチンの効力は、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）などの、特異抗体を用いる免疫測定法を使用して、存在する抗原の量（抗原質量）を測定することによるその抗原性に基づき得る。
【０００７】
混合ワクチンの個々の抗原成分についての薬局方要件は、適切かつ有効な効力試験を確立するための出発点を提供するが、より複雑な混合ワクチン中の様々な成分の間での相互作用から生じる問題が広く知られている（Ｖｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．１３７，６２−６６，２００７；Ｓｅｓａｒｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２７，１７７−１８１，１９９９）。各々の混合ワクチンは、活性成分賦形剤と残りの物質との固有の集合体から成る。これらの物質のいずれかが所与の活性成分の効力の正確な測定に干渉し得る。抗原の抗原性または免疫原性への干渉は、存在するその他の抗原の性質、それらの品質、量または比率、ワクチンのアジュバント、防腐剤、安定剤、ｐＨ、等張性等によって引き起こされ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．１３７，６２−６６，２００７
【非特許文献２】Ｓｅｓａｒｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２７，１７７−１８１，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、今や、それぞれ抗原とその他の成分を含む組成物を混合した後、混合ワクチン中の特異抗原と別の成分との間の予想外の相互作用を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物の混合物中の第一抗原の抗原性は、この第一抗原に結合し、それにより抗原−抗体複合体を形成する抗体の存在によって影響を受けること、およびこれらの抗体は第二抗原を含む組成物から生じ得ることが認められた。実施例１および２は、種々の抗原を含む組成物の混合物中では抗原が効率的に検出できないこと、および抗体が、検出すべき抗原を含む組成物とは異なる組成物に由来するそのような混合物中では抗原−抗体複合体が形成され得ることを示す。さらに、抗原−抗体複合体の解離は第一抗原の抗原性の回復をもたらすことが認められた。そのような干渉抗体の存在は、特定の微生物（第二抗原）を動物に由来する血清の存在下にインビトロで培養する必要があること、および血清を採取するこれらの動物が第一抗原に対する抗体を惹起する微生物に感染していることによって説明され得る。混合物中の第一抗原の抗原性へのこれらの抗体の干渉は、販売用のワクチンバッチを出荷するための効力試験などの、免疫測定法における第一抗原の定量に影響を及ぼす。
【００１１】
簡単に述べると、本発明は、少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法に関する。
【００１２】
より詳細には、本発明は、第二抗原を含む組成物が、第一抗原と結合することができる抗体も同時に含む、そのような方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも第一抗原を含む組成物と、（ｉ）第二抗原および（ｉｉ）第一抗原と結合することができる抗体を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法であって、
Ａ．第一抗原と抗体との間で形成された、混合物中の抗原−抗体複合体を解離する段階、および
Ｂ．免疫測定法によって第一抗原の抗原含量を測定する段階
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＣＶ−２を含む一価ワクチンおよびＰＣＶ−２とＭ．ｈｙｏを含む二価ワクチンの力価を示す。
【図２】ａ）実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡによって測定した未処理一価ワクチンに基づく回収率（％）。ｂ）実施例４で述べた酸処理の間の酸とワクチンとの比率（ｖ／ｖ）。
【図３】ａ）実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡによって測定した単位／ｍｌ。
【図４】ａ）５つの独立したＰＣＶバッチを２つ（Ａ、Ｂ）の独立したＭ．ｈｙｏバッチからの１つと各々混合した。１０の製剤すべてを、０．１Ｍクエン酸もしくは酢酸ナトリウムでｐＨ２、３、４もしくは５に調整した０．１Ｍクエン酸、または緩衝液（Ｃ＝対照）のいずれかで実施例４で述べたように酸処理した。濃度は標準的な処理（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ１．５）によって得られた濃度のパーセンテージとして表している。データは、Ｍ．ｈｙｏバッチＡまたはＢのいずれかと組み合わせた５つのＰＣＶバッチの平均±標準偏差として示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
免疫測定法のデザインは様々であり得、試料中のウイルスまたは細菌抗原を定量するために当分野で一般的に使用される免疫測定法のデザインと同様であり得る。例えば、アッセイは、競合的反応または直接的反応に基づき得る。さらに、プロトコールは、マイクロタイタープレートなどの固体支持体を使用し得る。抗原の検出は、標識した（直接的または間接的に）、第一抗原に特異的な抗体（検出抗体）の使用を含み、標識は、酵素、蛍光、化学発光、放射性または染料分子であり得る。検出抗体は、単一特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明による方法において使用される典型的な免疫測定法は、標準的な実験室テキストブック、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．：Ｈａｒｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されている。そのような試験の例は、凝集アッセイ、ＥＬＩＳＡおよびＡｌｐｈａＬＩＳＡである。
【００１６】
抗原は任意の種類の抗原でよいが、好ましくはヒトまたは動物に対して病原性の微生物に由来する。特に、抗原はウイルスまたは細菌に由来する。
【００１７】
一般に、抗原という用語は、ヒトまたは動物に投与された場合免疫応答を誘導する、刺激するまたは増強することができる少なくとも１つのエピトープを含む物質の組成物を指す。
【００１８】
抗原は、好ましくは不活化または弱毒化形態の、全病原体、病原体の抽出物または病原体の免疫原性タンパク質であり得る。
【００１９】
より好ましくは、抗原は、インビトロで培養された細胞において発現され、前記細胞から回収される免疫原性タンパク質である。
【００２０】
特に、第一抗原は、特定の動物種において発生率の高い病原体特異的抗体を誘導する（自然暴露によってまたはワクチン接種によって）病原体の抗原であり得る。
【００２１】
例えば、この病原体は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）、ブタ丹毒菌（エリジペロスリックス・ルジオパシエ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブルータングウイルス、ボーダー病ウイルス、ネオスポラ・カニウム（ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｕｍ）、シチメンチョウコロナウイルスおよび口蹄疫ウイルスから成る群より選択され得る。
【００２２】
特に、第二抗原は、そのインビトロでの培養に関して特定の動物種からの血清に依存する病原体の抗原であり得る。
【００２３】
例えば、この病原体は、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ローソニア属（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）およびネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）から成る群より選択され得る。
【００２４】
本発明による特に好ましい方法では、第一抗原はブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）抗原、特にＰＣＶ−２  ＯＲＦ２抗原である。
【００２５】
本発明による方法において使用されるＰＣＶ−２  ＯＲＦ２抗原は約３０ｋＤａのタンパク質であり、市販のＰＣＶ２ワクチン、例えばＰｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＰＣＶ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびＳｕｖａｘｙｎ（商標）ＰＣＶ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）において活性成分として使用される。本発明による方法において使用されるＰＣＶ−２  ＯＲＦ２は、例えば、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２タンパク質をコードする遺伝子で形質転換され、昆虫細胞において該タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスに感染させた、インビトロ培養した昆虫細胞から得ることができる（Ｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７，４０３１−４０３７，２００９；Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２２８１−８７，２０００およびＦａｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６，１４８８−９９，２００８）。
【００２６】
上述した本発明による別の好ましい方法では、第二抗原はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ｈｙｏ）であり、第二抗原を含む組成物は、血清、特に第一抗原に対する血清抗体であって、かつ第一抗原に結合することができる血清抗体を付加的に含む。
【００２７】
本発明による特に好ましい方法では、第一抗原はＰＣＶ−２抗原、好ましくはＰＣＶ−２  ＯＲＦ２タンパク質であり、第二抗原はＭ．ｈｙｏ抗原、好ましくはＭ．ｈｙｏバクテリンである。
【００２８】
基本的に、本発明の方法は、分析する抗原の抗原含量を従来の免疫測定法で測定する前に、分析する抗原を含む混合物を前処理することを含む。この前処理は、第一抗原と、この第一抗原と結合することができる抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の解離を含む。本発明者らは、そのような解離段階が第一抗原を再び免疫測定法で定量できるようにすることを示した。
【００２９】
ヒトおよび動物の健康の両分野で、３以上の異なる抗原を含む混合ワクチンを製造することは一般的である。特に、動物の健康の分野では３〜６の異なる抗原を含む混合ワクチンも珍しくない。それゆえ、本発明の方法はまた、種々の抗原を含む３以上の組成物、特に３〜６の組成物から成る混合物中の第一抗原の抗原含量を測定することを企図する。
【００３０】
上述した本発明による特に適切な方法は、免疫測定法として周知のＥＬＩＳＡを含む。
【００３１】
上述した本発明による方法において使用される例示的なＥＬＩＳＡでは、以下の段階を用いる：
−ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルを第一抗原に対する捕捉抗体、好ましくはモノクローナル抗体で被覆する段階、
−分析する混合物の試験試料（その連続希釈）を、標準品（その一連の希釈）および適切な対照溶液と共に、ウェルにおいてインキュベートする段階、
−ウェルを、第一抗原に対する検出抗体、好ましくはモノクローナル抗体と共にインキュベートする段階。検出抗体は、酵素で直接的に、好ましくは間接的に、標識し得る。好ましくは、検出抗体はビオチン化抗体である。
【００３２】
−間接標識の場合は、ウェルを、酵素を抗体に結合させる酵素コンジュゲートと共にインキュベートする段階。好ましくは、コンジュゲートはアビジン酵素コンジュゲートである。
【００３３】
−酵素基質溶液をウェルに添加し、次いで色素体検出する段階。
試験試料中の抗原の量を標準品に対して計算する。より詳細なＥＬＩＳＡ手順を実施例で説明する。
【００３４】
典型的には、本明細書で使用される酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼであり、酵素基質はＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）である。
【００３５】
本発明による方法は、混合ワクチンの製造工程における様々な段階で混合物中の特定の抗原の効力を測定するために使用できる。例えば、本発明の方法は、培養容器から直接採取した、抗原を含む２またはそれ以上の組成物から成る混合物の試料に適用することができる。
【００３６】
あるいは、組成物は、例えば遠心分離、ろ過または沈殿によって、さらに精製された形態の抗原を含む。
【００３７】
理想的には、ワクチン中の抗原の効力は、その最終的なワクチン製剤中で、すなわちそのすぐに使用できる形態で測定される。すぐに使用できるワクチン製剤は、ワクチンが現場で使用されるのに必要かつ十分なすべての成分および賦形剤を含む。特に、すぐに使用できるワクチンは、２またはそれ以上の抗原、アジュバント、安定剤および防腐剤を含む。
【００３８】
それゆえ、上述した本発明による好ましい方法では、混合物はすぐに使用できるワクチン製剤である。
【００３９】
上述した本発明による特に好ましい方法では、混合物を酸溶液と共にインキュベートして抗原−抗体複合体を解離する。
【００４０】
この前処理段階では、混合物を、ＰＢＳ緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの緩衝液としてであってもよい、酸（解離）溶液で希釈し、インキュベートして抗原−抗体複合体を解離させる。インキュベーションは、光振とう下に室温で実施し得る。前処理段階後、酸処理した混合物の試料を免疫測定法において、好ましくは酸処理した混合物の試料をＥＬＩＳＡプレートに添加し、上述したようにさらに試験することによって分析する。
【００４１】
酸溶液の性質は重要ではないことが認められた。実施例は、様々な酸溶液が、同時に抗原の抗原性には影響を及ぼさずに、抗原−抗体複合体を解離できることを示す。
【００４２】
上述した本発明によるさらなる好ましい方法では、酸溶液は、酢酸溶液、硫酸溶液、塩酸溶液またはクエン酸溶液であり、好ましくは、酸溶液はクエン酸溶液である。
【００４３】
上述した本発明による選択的な方法では、酸溶液は緩衝液である。
【００４４】
酸溶液と混合物のインキュベーション時間は、抗原−抗体複合体中の抗原の性質によって異なり得る。好ましくは、インキュベーション時間は、すぐに使用できるワクチンに関して少なくとも８時間、好ましくは８〜１８時間、より好ましくは１６〜１８時間である。
【００４５】
したがって、上述した本発明による別の好ましい方法では、混合物を酸溶液と共に少なくとも８時間インキュベートする。
【００４６】
また、酸溶液と混合物との比率（ｖ／ｖ）が抗原−抗体複合体の解離のレベルに影響を及ぼし得ることも本発明者らによって見出された。酸溶液と混合物との少なくとも２５の比率（ｖ／ｖ）で、特に２５〜７５の比率（ｖ／ｖ）で、さらに特に２５〜５０の比率（ｖ／ｖ）で良好な結果が得られた。
【００４７】
したがって、上述した本発明による別の好ましい方法では、酸溶液と混合物との少なくとも２５、好ましくは２５〜７５、より好ましくは２５〜５０の比率（ｖ／ｖ）で混合物をインキュベートする。
【００４８】
上述した本発明によるさらなる好ましい方法では、酸溶液は１．０〜３．０、好ましくは１．５（±０．２）のｐＨを有する。
【００４９】
上述した本発明による方法では、酸溶液と混合物のインキュベーション後であるが、免疫測定法でのその分析の前に、酸処理した混合物のｐＨをより中性のｐＨに、好ましくは５〜７に上昇させてもよい。これは、酸処理した混合物に塩基溶液または緩衝液を添加することによって実施できる。このための適切な溶液は、水酸化ナトリウム、リン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液である。
【００５０】
本発明はまた、少なくともＰＣＶ−２抗原を含む組成物とＭ．ｈｙｏ抗原を含む組成物との混合物中のＰＣＶ−２抗原の抗原含量を測定するための方法であって、
Ａ．２つの組成物を混合する段階、および
Ｂ．免疫測定法によってＰＣＶ−２抗原の抗原含量を測定する段階
を含み、Ｍ．ｈｙｏ抗原を、非ブタ血清を含む培養物から得ることを特徴とする方法を対象とする。
【００５１】
特に、Ｍ．ｈｙｏ抗原は、ウシ、ウマまたはヒツジ血清を含む培養物から得る（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３２，５１９−５２６，１９８８；Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１７８，１４９−１５２，２００８）。
【００５２】
さらなる選択的な方法では、第二抗原および第一抗原に対する抗体を含む組成物を、これら２つの成分の分離に供し、その後第二抗原だけを含む組成物を、第一抗原を含む組成物と混合する。続いて、第一抗原の抗原含量を免疫測定法によって測定する。
【００５３】
それゆえ、本発明はまた、少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法であって、
Ａ．第二抗原と抗体を含む組成物中の、第一抗原と結合することができる抗体から第二抗原を分離する段階、
Ｂ．第一抗原を含む組成物と第二抗原を混合する段階、および
Ｃ．免疫測定法によって混合物中の第一抗原の抗原含量を測定する段階
を含む方法に関する。
【００５４】
例えば抗原を培養した培地からの第二抗原の分離は、このために使用できる通常の方法によって実施することができる。例えば、第二抗原が細菌である場合は、これらを１５，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって分離することができる。
【００５５】
また、分離は、抗体に対して親和性を示すリガンドで抗体を捕捉し、次いでこれらのリガンド−抗体複合体を第二抗原から分離する免疫除去によって慣例的に実施することも可能である。このために一般的に使用されるリガンドは、プロテインＧ、プロテインＡまたは分離すべき抗体に対する抗体である。通常、これらのリガンドは、抗体からの抗原の分離を容易にする固相（例えばセファロース４Ｂ）に結合される。
【００５６】
それゆえ、この方法の好ましい実施形態では、遠心分離または免疫除去段階によって分離を実施する。
【００５７】
この方法のさらなる好ましい実施形態では、本明細書で使用する抗原および適用する免疫測定法は上記で定義したものと同じである。
【００５８】
本発明はまた、混合ワクチンの効力試験であることをさらに特徴とする、上述した方法のいずれかを対象とする。
【００５９】
ワクチンの効力試験は、適切な実験室試験によってまたは防御免疫を生じさせることを意図した方法でのワクチンの投与を介して得られる適切に制御された臨床データによって指示される、ワクチンの特異的能力または効力を測定するための試験と定義される。そこで、本発明において使用される効力試験は、ワクチンのバッチが重要なアッセイパラメータに適合するか否かを示すデータを提供するための、市販を目的として生産されたワクチンのバッチに関して適用される試験である。
【００６０】
本発明による好ましい効力試験では、免疫測定法はＥＬＩＳＡ（上記で概説した）であり、重要なアッセイパラメータは、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表される混合物中の第一抗原の抗原質量である。ＥＵは抗原の内標準に関連し、抗原の内標準は標的動物における防御免疫に相関する。
【００６１】
実施例
【実施例１】
【００６２】
ＥＬＩＳＡにおけるＰＣＶ−２抗原の定量へのＭ．ｈｙｏ組成物の影響
品質管理の手段として、ＰＣＶ２含有ワクチンの濃度を、ＰＣＶ２に特異的な２つのモノクローナル抗体に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定する。しかし、一価ワクチンと比較して、ＰＣＶ２およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）製剤を含む二価ワクチンでは予想より明らかに低い濃度が測定された。
【００６３】
Ｍ．ハイオニューモニエおよびＰＣＶ−２抗原を含む混合ワクチンを以下のように生産した：Ｍ．ハイオニューモニエ株１１をＦｒｉｉｓ（Ｎｏｒｄ．Ｖｅｔ．−Ｍｅｄ．，２７，３３７−３３９，１９７５）によって最初に記述された培地に基づくブロス培地で培養することにより、Ｍ．ハイオニューモニエ全細胞抗原を生産する。これは、酵母抽出物、血清ならびにブタおよびウシ起源の様々な抽出物を含む複合培地である。培養の最後に、細菌細胞を不活化し、全培養物を限外ろ過によって少なくとも１０倍濃縮して、ワクチンの製剤のために使用した。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を、昆虫細胞の増殖に適した培地で培養したヨトウガ（スポドプテラ・フルギペルダ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）細胞におけるバキュロウイルス発現を用いて組換えによって生産した。ウイルス液を採取し、ウイルス粒子を不活化した後、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を遠心分離によって濃縮し、ワクチン生産に使用した。混合ワクチンを調製するため、これら２つの抗原を混合し、緩衝液で希釈して、油中水型アジュバントＸｓｏｌｖｅ（ビタミンＥ酢酸塩／軽質流動パラフィン／Ｔｗｅｅｎ  ８０）と７０／３０（ｖ／ｖ）の比率で混ぜ合わせた。
【００６４】
プラセボまたはいくつかのバッチのＭ．ｈｙｏ製剤とＰＣＶ２製剤との混合からの結果の要約を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2013536427.tif 000002
ａ）参照製剤と試験サンプルの滴定をＥＬＩＳＡにより比較してＰＶＣ濃度を決定した。この目的を達成するため、９６ウェルＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートをｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液で希釈した最適濃度のモノクローナル抗体３／１Ｂ４−ＩＮＴを用いて４℃で一晩培養し、ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ（ＥＩＡ緩衝液）を含有するＰＢＳで希釈した参照試料及び試験試料の一連の希釈液を３７℃で１時間培養した。洗浄工程に続いて、ＥＩＡ緩衝液で希釈した最適濃度のビオチン標識したモノクローナル抗体５／６Ｈ１２−ＩＮＴを３７℃で１時間培養した。洗浄工程に続いて、ＥＩＡ緩衝液で希釈した最適濃度のＨＲＰ−標識したアビジンを３７℃で０．５時間培養した。洗浄工程に続いて、最適濃度のＴＭＢ基質を１５分間培養し、硫酸で培養を止め、ＥＬＩＳＡ読み取り機で光学密度を測定した。４ＰＬ法により濃度を計算した。ＥＬＩＳＡ単位で数値を表した（３回の測定の平均）。
【００６６】
ｂ）Ｍ．ハイオニューモニエがない場合に同量のＰＣＶを含有するワクチンと比較した回復率（％）
これらの結果は、ＰＣＶおよびＭ．ｈｙｏを含むワクチンにおいて、Ｍ．ｈｙｏが混合ワクチン中のＰＣＶ−２抗原の検出可能性に悪影響を及ぼすことならびに回収率の程度（３１％〜８０％）が混合したＰＣＶ−２製剤とＭ．ｈｙｏ製剤の組合せに依存することを示す。
【実施例２】
【００６７】
抗原−抗体複合体の同定
二価ＰＣＶ−２／Ｍ．ｈｙｏワクチン中の抗原−抗体複合体をサンドイッチＥＬＩＳＡによって明らかにした。ＰＣＶ−２抗原とポリクローナルブタ抗ＰＣＶ−２抗体との間の複合体を、マイクロタイタープレートのウェルに被覆したモノクローナル抗ＰＣＶ−２抗体によって捕捉し、酵素標識抗ブタＩｇＧコンジュゲートを用いて検出する。図１は、ＰＣＶ−２を含む一価ワクチンおよびＰＣＶ−２とＭ．ｈｙｏを含む二価ワクチンの力価を示す。標識モノクローナル抗ＰＣＶ抗体の代わりに、複合体を酵素標識抗ブタＩｇＧコンジュゲートで検出したことを除き、実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡを実施した。データの点は３回の平均を示す。結果は、ａ）Ｍ．ｈｙｏ製剤がブタ抗ＰＣＶ−２抗体を含むことおよびｂ）これらの抗体がＰＣＶ−２と複合体を形成することを明らかにする（図１）。
【００６８】
二価ワクチンにおけるＰＣＶ−２の低い検出可能性についての最も考えられる説明は、ブタ抗ＰＣＶ−２抗体がＰＣＶ−２サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて関連するＰＣＶ−２エピトープをブロックすることである。ＰＣＶ−２抗体は、ワクチンを商業規模で製造するためにＭ．ｈｙｏを培養するのに使用される培地において必要な市販のブタ血清バッチ中に存在することが認められた。
【実施例３】
【００６９】
Ｍ．ｈｙｏの阻害作用を無効にする試み
Ｍ．ｈｙｏ製剤の阻害作用を無効にする手順を、同じ量のＰＣＶ−２を含むがＭ．ｈｙｏを含まない製剤（一価ワクチン）またはＭ．ｈｙｏも含む製剤（二価ワクチン）の２つのワクチン製剤を処理することによって試験した。サンドイッチＥＬＩＳＡを、実施例１で述べたように、希釈液中の様々な濃度の試薬（ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、デオキシコール酸ナトリウム、尿素）の存在下で実施した。さらに、硫酸アンモニウム（ＡＳ）沈殿（ＴｒｉｔｏｎなしまたはＴｒｉｔｏｎの存在下で）の上清とペレットおよびサイズ分離分画（Ｔｒｉｔｏｎの存在下で）を検定した。
【００７０】
【表２】
2013536427.tif 000003
表２の結果は、いずれの処理も一価ワクチンに影響を及ぼさず、Ｍ．ｈｙｏの阻害作用を無効にしなかったことを示す。
【実施例４】
【００７１】
ウイルス抗原−抗体複合体への酸処理の影響
酸処理の潜在的作用を評価した。ワクチン１容（容積）を０．１Ｍクエン酸（蒸留水で希釈した）４９容と混合し、光振とうしながら室温で一晩インキュベートする。
【００７２】
開発した標準的な手順を用いて得られた代表的な結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
2013536427.tif 000004
表３の結果は、Ｍ．ｈｙｏ製剤の阻害作用を酸処理によって無効にできることを明らかにする。
【実施例５】
【００７４】
細菌抗原−抗体複合体への酸処理の影響
細菌抗原−抗体複合体への酸処理の影響を明らかにするため、レプトスピラ症に対するイヌワクチンの成分（レプトスピラ・タラソビ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ  ｔａｒａｓｓｏｖｉ））を、酸処理を伴ってまたは酸処理なしで、Ｌ．ｔａｒａｓｓｏｖｉ特異的抗体を含む人為的に添加したポリクローナルイヌ血清抗体の存在下および不在下でＰＣＶ−２  ＥＬＩＳＡに相当するサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて定量した。
【００７５】
【表４】
2013536427.tif 000005
ａ）タラソビ特異的モノクローナル抗体（Ａ）を用いて、実施例１に記載されているように原則的にＥＬＩＳＡによりＬ．タラソビ抗体を定量した。ＥＬＩＳＡ（Ｂ．Ｄ）による抗原定量の前に、ポリクローナル抗タラソビ抗体を含むＣａｎｉｎｅ血漿と抗原を培養した。実施例４に記載されているように酸処理を行った。ＥＬＩＳＡの結果をコントロール実験（Ａ）の％として表した。数値は、繰り返しの平均±Ｓｔｄである。
【００７６】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡによる細菌ワクチン成分の定量へのイヌ血清抗体の阻害作用を酸処理によって無効にできることを明らかにする。
【実施例６】
【００７７】
酸処理に影響を及ぼすパラメータ
６．１．種々の酸および塩基の能力
ワクチン製剤中の抗原含量の測定へのいくつかの酸および塩基の作用を表５に要約する。
【００７８】
【表５】
2013536427.tif 000006
これらの結果は、Ｍ．ｈｙｏの阻害作用が使用される酸の種類とは無関係であることを明らかにした。
【００７９】
ｐＨ１３．５の水酸化ナトリウムでの処理は、ＥＬＩＳＡによるＰＣＶ−２抗原の検出を完全に無効にした。これはおそらくＥＬＩＳＡにおいて使用されるモノクローナル抗体によって認識されるＰＣＶ−２エピトープの破壊に起因すると考えられる。
【００８０】
６．２．酸濃度の影響
０．１Ｍクエン酸と一価または二価ワクチンとの比率（ｖ／ｖ）を変えることによって酸濃度の影響を試験した（図２）。
【００８１】
図２の結果は、二価ワクチンの低い回収率が≧２５の比率での酸処理によって克服できることを明らかにする。
【００８２】
６．３．処理時間の影響
処理時間の影響を図３に示す。
【００８３】
結果は、十分な度合の阻害無効化のためには≧８時間の処理が必要であることを指示する。
【００８４】
６．４．ｐＨの影響
種々のｐＨでの酸処理によってｐＨの影響を評価した（図４）。
【００８５】
これらのデータは、ｐＨ≦３での酸処理がＭ．ｈｙｏ製剤の阻害作用の有意の無効化をもたらすことを示す。
【実施例７】
【００８６】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるＰＣＶ  ＯＲＦ２抗原含量の測定
７．１  標的：
使用した分析方法の影響を評価するため、第二抗原の試料中の抗体によってブロックされる第一抗原の酸による前処理が、第一抗原含量の測定を高感度ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によって行う場合にも必要であるかどうかを試験した。
【００８７】
７．２  試験材料：
注射用蒸留水中の０．１Ｍおよび０．２Ｍクエン酸；免疫測定法緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０；実施例１で述べたのと同じ、ＰＣＶ  ＯＲＦ２に対して特異的なビオチン化マウスモノクローナル抗体：５／６Ｈ１２−ＩＮＴ；非結合アクセプタービーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）；ストレプトアビジン被覆ドナービーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、ＰＥ）；装置：ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）２１０４マルチラベルリーダー（ＰＥ）
７．３  試験方法：
ＰＣＶ  Ｏｒｆ２およびＭ．Ｈｙｏ抗原を含む混合ワクチンの４つの別々のバッチをこれらの試験に使用した。ＰＣＶ抗原を未処理のまま測定するかまたは、実施例４〜６で述べたように、０．１Ｍまたは０．２Ｍのいずれかのクエン酸でおよび種々の前希釈液中でプレインキュベートした。その後この抗原を、各５μｌ試料につき約１０，０００ＥＬＩＳＡ単位のＰＣＶ−２抗原を含むように免疫測定法緩衝液中に取り、それを３８４穴プレートのウェルに移して、その後８回の連続段階でアッセイ緩衝液に１：２希釈した。ビオチン化ＰＣＶ−Ｍｏａｂ  ５／６Ｈ１２−ＩＮＴを別途に前希釈し、５μｌ試料を試験ウェルに添加した。同様に、アクセプタービーズを製造者の指示に従ってＰＣＶ  Ｏｒｆ２に特異的な第二マウスモノクローナル抗体：Ｍｏａｂ  ３／１Ｂ４−ＩＮＴ（実施例１参照）と結合した。これらを適切に希釈し、２０μｌ試料を試験ウェルに添加した。ウェル（この時点で３０μｌを保持する）を２〜８℃で一晩インキュベートした。次に２０μｌの前希釈したドナービーズを抑えた照明下で添加し、ウェルを密封して、室温で１時間インキュベートした。プレートを読み取り、結果を、標準的な表計算ソフトを用いて標準的なロジット‐ログ変換および線形回帰計算によって解析した。８までのデータ点が使用できるように、標準試料と最も高い相関を有する曲線の部分を使用した。
【００８８】
試験群は以下の通りであった：Ａ：酸で前処理していない、アッセイ緩衝液中の１：５前希釈した混合ワクチン抗原のみ；Ｂ：０．１Ｍクエン酸で前処理した、１：５希釈抗原；Ｃ：０．１Ｍクエン酸で前処理した、１：２０希釈抗原；Ｄ：０．２Ｍクエン酸で前処理した、１：５希釈抗原。ＰＣＶ−２抗原の標準試料は７６９６ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌの平均値を有しており、試験試料をこれと比較した。
【００８９】
７．４  結果：
全アッセイを二重に実施した；両方の試験の結果の相違は２０％未満であった。実施した試験の一方からの試料の１つについての典型的な結果を表６に示す：
【００９０】
【表６】
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結果は、Ａ群におけるように、酸による前処理なしではＰＣＶ−２抗原はほとんど測定することができず、投入量の１０％だけが回収されることを明らかにした。しかし、（クエン）酸での前処理により、はるかに多くの投入抗原が測定され（Ｂ、ＣおよびＤ群）、それによりＤ群の条件がここで使用した特定の混合ワクチン抗原に関して最適であった。
【００９１】
７．５  結論：
ＡｌｐｈａＬＩＳＡと同程度の感度の抗原含量測定法を適用した場合でも、良好な定量的測定を得るためには酸による前処理も必要である。
【００９２】
図面の説明
図２：
ａ）実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡによって測定した未処理一価ワクチンに基づく回収率（％）。
ｂ）実施例４で述べた酸処理の間の酸とワクチンとの比率（ｖ／ｖ）。
図３：
ａ）実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡによって測定した単位／ｍｌ。
図４：
ａ）５つの独立したＰＣＶバッチを２つ（Ａ、Ｂ）の独立したＭ．ｈｙｏバッチからの１つと各々混合した。１０の製剤すべてを、０．１Ｍクエン酸もしくは酢酸ナトリウムでｐＨ２、３、４もしくは５に調整した０．１Ｍクエン酸、または緩衝液（Ｃ＝対照）のいずれかで実施例４で述べたように酸処理した。濃度は標準的な処理（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ１．５）によって得られた濃度のパーセンテージとして表している。データは、Ｍ．ｈｙｏバッチＡまたはＢのいずれかと組み合わせた５つのＰＣＶバッチの平均±標準偏差として示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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