(57)【要約】  インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液の生成および使用に関する方法、システム、および組成物が提供される。方法は、白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること、および電磁場で刺激してインターロイキン−１受容体アンタゴニストの生産を活性化することを含む。インターロイキン−１受容体アンタゴニストは固相抽出剤から分離することができる。患者の炎症部位を治療する方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストと、
可溶性腫瘍壊死因子受容体と
を含んでなり、
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび前記可溶性腫瘍壊死因子受容体が同じ被験体に由来し、かつ、インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび可溶性腫瘍壊死因子受容体それぞれの濃度が全血または血漿に見られる濃度よりも高い、
組成物。
【請求項２】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度が可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度の少なくとも約５，０００倍高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度が全血に見られる濃度よりも少なくとも約１０，０００倍高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度が約３０，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１１０，０００ｐｇ／ｍＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
可溶性腫瘍壊死因子受容体が可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ、可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、またはその双方を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
インターロイキン−１αをさらに含んでなり、溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度がインターロイキン−１αの濃度よりも少なくとも約１０，０００倍高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
生白血球、溶血白血球、またはその双方をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
血小板をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
総タンパク質濃度が全血の総タンパク質濃度よりも高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項１１】
炎症が骨溶解に関連する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症が骨関節炎に関連する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウム、またはそれらの組合せを炎症部位に投与することをさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法であって、
白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること；および
インターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる溶液を前記固相抽出剤から分離すること（前記溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、液体を固相抽出剤と接触させる前の液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度よりも高い）を含んでなる、方法。
【請求項１５】
白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させることが、白血球を含んでなる液体と固相抽出剤を容器内で合わせることを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触が、液体と固相抽出剤を約３０秒〜約２４時間インキュベートすることを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記固相抽出剤が、ビーズ、繊維、粉末、多孔質材、およびそれらの組合せからなる群から選択される形態を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相抽出剤の表面がその表面積を増すためにエッチングされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記固相抽出剤が、無機質、ポリマー、金属、多糖類、およびそれらの組合せからなる群から選択される部材を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記固相抽出剤が、鋼玉、石英、チタン、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される部材を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
白血球を含んでなる液体が、全血、骨髄穿刺液、脂肪組織、それらの画分、およびそれらの混合物を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
白血球を含んでなる液体が血小板に富む血漿を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
白血球を含んでなる液体が濃縮骨髄穿刺液を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
白血球を含んでなる液体が骨髄穿刺液を含んでなり、固相抽出剤がポリアクリルアミドを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
溶液中の可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度が、固相抽出剤に接触させる前の白血球を含んでなる液体中に存在する可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度よりも高い濃度である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
白血球を含んでなる液体が、全血、骨髄穿刺液またはそれらの組合せからなる群から選択される、組織由来の白血球画分を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
白血球画分が、組織を遠心分離して、全血に比べて白血球の濃度を高めることにより調製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
白血球画分が、
組織を、チューブ内に配置された浮標を含んでなるチューブに装入すること（前記浮標は、チューブ内で組織を遠心分離した際に、浮標が一定の平衡の位置に達するように機能し得るような密度を有し、この平衡の位置は白血球を含んでなる第１の画分と第２の画分の間であり、第２の画分は第１の画分の白血球濃度よりも高い白血球濃度を有する）；
前記浮標が第１の画分と第２の画分の間の境界を画定するように前記チューブを遠心分離すること；および
前記白血球画分を取り出すこと
を含んでなるプロセスにより調製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が全血を含んでなり、前記白血球画分が、
一定体積の全血を、２つの浮標を含んでなる分離装置に装入すること（前記浮標は前記血液を、白血球を含んでなる画分を含む３以上の画分に分離するように機能し得る）；
前記分離装置を遠心分離して、白血球画分を生成すること；および
前記分離装置から前記白血球画分を抽出すること
を含んでなるプロセスにより調製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織が骨髄穿刺液を含んでなり、前記白血球画分が、
一定体積の骨髄穿刺液を、２つの浮標を含んでなる分離装置に装入すること（前記浮標は前記骨髄穿刺液を、白血球を含んでなる画分を含む３以上の画分に分離するように機能し得る）；
前記分離装置を遠心分離して、白血球画分を生成すること；および
前記分離装置から前記白血球画分を抽出すること
を含んでなるプロセスにより調製される、請求項２６に記載の方法。前記
【請求項３１】
請求項１４に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項３２】
炎症が骨溶解に関連する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
炎症が骨関節炎に関連する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウム、またはそれらの組合せを炎症部位に投与することをさらに含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
白血球を含んでなる前記液体が、治療される被験体から取得されるか、または治療される被験体に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
被験体において炎症性障害を治療するためのインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法であって、
（１）前記被験体から全血、骨髄穿刺液、またはその双方を含んでなる組織を取得すること；
（２）前記組織および抗凝固剤を、チューブ内に配置された浮標を含んでなるチューブに装入すること（前記浮標は、チューブ内で組織を遠心分離した際に、浮標が一定の平衡の位置に達するような密度を有し、この平衡の位置は白血球を含んでなる第１の画分と第２の画分の間であり、第２の画分は第１の画分の白血球濃度よりも高い白血球濃度を有する）；
（３）前記浮標が第１の画分と第２の画分の間の境界を画定するように前記チューブを遠心分離すること；
（４）第２の画分を回収すること；
（５）前記第２の画分を、固相抽出剤を含んでなる濃縮装置アセンブリに装入し、前記第２の画分を前記固相抽出剤と接触した状態でインキュベートすること；および
（６）前記濃縮装置アセンブリを、前記固相抽出剤から、全血のインターロイキン−１受容体アンタゴニスト濃度よりも高いインターロイキン−１受容体アンタゴニスト濃度を有するインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を分離するための遠心速度で回転させること
を含んでなる、方法。
【請求項３７】
第１の画分が赤血球を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第２の画分が、白血球を含んでなる血小板に富む血漿を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記固相抽出剤が、鋼玉、石英、チタン、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される材料を含んでなるビーズを含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液であって、
インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび可溶性腫瘍壊死因子受容体（双方とも、工程（１）で組織におけるそれらの各濃度よりも高い濃度で存在する）；
生白血球、溶血白血球、またはその双方；ならびに
増殖因子
を含んでなる、溶液。
【請求項４２】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法であって、
濃縮白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること；および
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を前記固相抽出剤から分離すること（前記溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、液体を固相抽出剤と接触させる前の液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度よりも高い）
を含んでなり；
前記濃縮白血球を含んでなる液体が、
白血球を含んでなる組織または組織画分と、単核白血球と結合するように機能し得る抗体に結合された磁性ビーズとを混合すること；および
濃縮白血球を含んでなる液体として使用するために、前記抗体が結合した単核白血球を回収すること
を含んでなる方法により生成される、方法。
【請求項４３】
前記組織または組織画分が、全血、血小板に富む血漿、骨髄穿刺液、脂肪組織、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組織または組織画分が全血を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記組織または組織画分が抗凝固剤をさらに含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体がＣＤ４５に対するものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記固相抽出剤が、鋼玉、石英、チタン、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される部材を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記固相抽出剤がポリアクリルアミドを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４２に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項５０】
炎症が骨溶解に関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
炎症が骨関節炎に関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウム、またはそれらの組合せを炎症部位に投与することをさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記組織または組織画分が、治療される被験体から取得されるか、または治療される被験体に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液が、さらに可溶性腫瘍壊死因子受容体を、前記組織または組織画分中に存在する可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度よりも高い濃度で含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法であって、
濃縮白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること；
前記液体を前記固相抽出剤から分離して、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を取得すること（前記溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、液体を固相抽出剤と接触させる前の液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度よりも高い）
を含んでなり；
前記濃縮白血球を含んでなる前記液体が、白血球を含んでなる組織または組織画分をサイズ排除フィルターに通すことにより調製される、方法。
【請求項５６】
前記組織または組織画分が、全血、血小板に富む血漿、骨髄穿刺液、脂肪組織、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組織または組織画分が全血を含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記組織または組織画分が抗凝固剤をさらに含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記サイズ排除フィルターが白血球除去または枯渇フィルターである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記組織または組織画分が白血球を含んでなる全血または血小板に富む血漿であり、前記サイズ排除フィルターが赤血球を捕捉するように機能し得る、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記固相抽出剤が、鋼玉、石英、チタン、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物を含んでなる部材からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記固相抽出剤がポリアクリルアミドを含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５５に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項６４】
炎症が骨溶解に関連する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
炎症が骨関節炎に関連する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウム、またはそれらの組合せを炎症部位に投与することをさらに含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織または組織画分が、治療される被験体から取得されるか、または治療される被験体に由来する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液が、さらに可溶性腫瘍壊死因子受容体を、前記組織または組織画分中に存在する可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度よりも高い濃度で含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法であって、
白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること；
前記液体に電磁場をかけること；および
前記液体を前記固相抽出剤から分離して、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を取得すること（前記溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、液体を固相抽出剤と接触させる前の液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度よりも高い）
を含んでなる、方法。
【請求項７０】
白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させることが、白血球を含んでなる液体と固相抽出剤を容器内で合わせることを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記液体が、全血、血小板に富む血漿、骨髄穿刺液、脂肪組織、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記液体が全血または血小板に富む血漿を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記液体が抗凝固剤をさら含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記液体に電磁場をかけることが、液体と固相抽出剤が接触している間に行われる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記溶液中の可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度が、固相抽出剤を接触させる前の白血球を含んでなる液体中に存在する可溶性腫瘍壊死因子受容体の濃度よりも高い濃度である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
白血球を含んでなる液体が、全血、骨髄穿刺液、またはそれらの組合せからなる群から選択される組織に由来する白血球画分を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
前記白血球画分が、前記組織を遠心分離して、全血よりも白血球濃度を高めることにより調製される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記白血球画分が、
組織を、チューブ内に配置された浮標を含んでなるチューブに装入すること（前記浮標は、チューブ内で組織を遠心分離した際に、浮標が一定の平衡の位置に達するように機能し得るような密度を有し、この平衡の位置は白血球を含んでなる第１の画分と第２の画分の間であり、第２の画分は第１の画分の白血球濃度よりも高い白血球濃度を有する）；
前記浮標が第１の画分と第２の画分の間の境界を画定するように前記チューブを遠心分離すること；および
第２の画分を取り出すこと
を含んでなるプロセスにより生成される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記組織が、白血球を含んでなる全血または血小板に富む血漿を含んでなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記チューブが、第２の画分と血小板に乏しい血漿を含んでなる画分の間の境界を画定するように機能し得る仕切り板；および浮標と仕切り板の間に配置された固相抽出剤としてのポリアクリルアミドビーズをさらに含んでなり；
第２の画分が遠心分離後にポリアクリルアミドビーズに接触する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記液体に電磁場をかけることが、第２の画分がポリアクリルアミドビーズと接触している間に行われる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記白血球画分が、
２つの浮標を含んでなる分離装置に装入すること（前記浮標は前記組織を、白血球を含んでなる画分を含む３以上の画分に分離するように機能し得る）；
前記分離装置を遠心分離して、白血球を含んでなる画分を生成すること；および
前記分離装置から前記白血球を含んでなる画分を抽出すること
を含んでなる方法により生成される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記固相抽出剤が、鋼玉、石英、チタン、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される部材である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
前記固相抽出剤がポリアクリルアミドを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８５】
前記電磁場がパルス電磁場または容量結合型電磁場を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８６】
白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させることおよび前記液体に電磁場をかけることが約１時間未満で行われる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８７】
請求項６９に記載の方法に従って生成されたインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含んでなる、被験体における炎症の治療方法。
【請求項８８】
炎症が骨溶解に関連する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
炎症が骨関節炎に関連する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウム、またはそれらの組合せを炎症部位に投与することをさらに含んでなる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
白血球を含んでなる前記液体が、治療される被験体から取得されるか、または治療される被験体に由来する、請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（緒論）
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる組成物、およびそのような組成物を生成、単離、および投与する方法に関する。
【０００２】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、リンパ球およびマクロファージを刺激し、食細胞を活性化し、プロスタグランジン生産を増大させ、骨関節の変性に寄与し、骨髄細胞の増殖を高め、かつ、多くの慢性炎症性症状に関与するサイトカインファミリーを含む。ＩＬ−１は、マクロファージ、単球、および樹状細胞によって生成され、感染に対する炎症性応答の一部となり得る。
【０００３】
ＩＬ−１の作用様式は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ−１ｒａ；「ＩＲＡＰ」とも呼ばれる）によって媒介され得る。ＩＬ−１ｒａは、細胞表面の、ＩＬ−１と同じ受容体に結合し、従って、ＩＬ−１がその細胞にシグナルを送らないようにする。Arend WP, Malyak M, Guthridge CJ, Gabay C (1998) "Interleukin-1 receptor antagonist: role in biology" Annu. Rev. Immunol. 16: 27-55により記載されているように、ＩＬ−１ｒａは、単球、マクロファージ、好中球、多形核細胞（ＰＭＮ）およびその他の細胞を含む白血球から分泌され、様々なＩＬ−１関連の免疫応答および炎症性応答を調整することができる。ＩＬ−１ｒａの生産は、付着性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、他のサイトカイン、および細菌またはウイルス成分を含むいくつかの物質によって刺激される。ＩＬ−１ｒａは、関節炎、大腸炎、および肉芽腫性肺疾患における重要な天然の抗炎症性タンパク質である。
【０００４】
ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１が重要な役割を果たす自己免疫疾患である関節リウマチの治療に使用することができ、この疾患に関連する炎症および軟骨分解を軽減する。例えば、Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標）（アナキンラ）は、組換え非グリコシル化型ＩＬ−１ｒａである(Amgen Manufacturing, Ltd., Thousand Oaks, California)。種々の組換えインターロイキン−１阻害剤および治療方法が２００３年７月２９日発行の米国特許第６，５９９，８７３号明細書(Sommer et al.)；１９９１年１２月２４日発行の米国特許第５，０７５，２２２号明細書(Hannum et al.)；および２００５年９月８日公開の米国特許出願公開第２００５／０１９７２９３号明細書(Mellis et al.)に記載されている。さらに、自己体液の使用を含む、体液からＩＬ−１ｒａを生産する方法が２００３年９月２３日発行の米国特許第６，６２３，４７２号明細書(Reincke et al.)；２００４年３月３０日発行の米国特許第６，７１３，２４６号明細書(Reinecke et al.)；および２００４年７月６日発行の米国特許第６，７５９，１８８号明細書(Reinecke et al.)に記載されている。
【０００５】
ＩＬ−１ｒａを用いた組成物および方法は当技術分野で公知である。例えば、ＩＬ−１ｒａは、２０００年８月１日発行の米国特許第６，０９６，７２８号明細書(Collins et al.)に記載されているように、ヒアルロン酸を含む組成物の一部として送達されている。しかしながら、このような多くの方法および組成物は、ＩＬ−１ｒａの安定性および半減期、ならびに提供されるＩＬ−１ｒａの量および割合に関する問題を伴う。従って、ＩＬ−１ｒａを送達する改良された組成物および方法が望まれ、炎症の管理を含め、インターロイキン−１受容体により媒介される症状および病態の治療に有用となる。
【発明の概要】
【０００６】
（概要）
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに関する、インターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成する、および炎症などのインターロイキン−１受容体により媒介される症状を治療するために患者にインターロイキン−１受容体アンタゴニストを投与する組成物、装置、および方法を提供する。
【０００７】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成する方法は、白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させることを含む。該液体は全血、骨髄穿刺液、脂肪組織、それらの画分（例えば、血小板に富む血漿）およびそれらの混合物であり得る。該固相抽出剤は、ガラス、無機質、ポリマー、金属または多糖類などの材料を含んでなることができ、これらの材料はビーズ、繊維、粉末、および／または多孔質材の形態であり得る。接触させることは、該液体を該固相抽出剤と、約３０秒〜約２４時間の一定時間インキュベートすることを含み得る。次に、該固相抽出剤から溶液を分離することができ、該溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、接触工程前の該液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度よりも高い。
【０００８】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成する方法は、白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と接触させること、および前記液体に電磁場をかけることをさらに含む。次に、該固相抽出剤からインターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる溶液を分離する。固相抽出剤との接触と液体に電磁場をかけるという組合せは、いずれかの工程を単独で適用するよりも白血球により多くのインターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成させるか、またはより速くインターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成させる。例えば、組合せ効果は、白血球を含んでなる液体を固相抽出剤と、電磁場かけずに最大２４時間接触させる際に生産されるのとほぼ同量のインターロイキン−１受容体アンタゴニストを数分〜最大１時間で生産することができる。パルス電磁場または容量結合型電磁場を使用することができる。結果として得られる、溶液中のインターロイキン−１受容体アンタゴニスト濃度は、接触前の液体中のインターロイキン−１受容体アンタゴニスト濃度よりも高い。
【０００９】
白血球を含んでなる液体を生成するための種々の方法が提供される。いくつかの方法は、血液などの組織を遠心分離して、全血に比べて白血球および血小板の濃度を高めることを含む。このような方法は、チューブ内に配置された浮標を含んでなるチューブに組織を装入すること（前記浮標は、チューブ内で組織を遠心分離した際に、浮標が一定の平衡の位置に達するように機能し得るような密度を有し、この位置は白血球画分と第２の画分の間であり、この白血球画分は、第２の画分の白血球濃度よりも高い白血球濃度を有する）というものである。他の方法は、白血球を含んでなる組織または組織画分と、単核白血球と結合するように機能し得る抗体に結合された磁性ビーズとを混合することを含む。次に、濃縮白血球を含んでなる液体を使用するために、抗体が結合した単核白血球を回収する。また、他の方法は、白血球を含んでなる組織または組織画分をサイズ排除フィルターに通すことを含む。
【００１０】
本方法の産出物は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの組成物および溶液を提供する。インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（例えば、少なくとも約３０，０００ｐｇ／ｍＬ）、可溶性腫瘍壊死因子受容体、生白血球、および／または増殖因子を含み得る。例えば、溶液中の血漿タンパク質の総濃度は少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００１１】
ヒトまたは動物被験体において炎症を治療する方法であって、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を炎症部位に投与することを含む方法が提供される（該溶液は本方法を用いて生成される）。例えば、治療方法は、ヒトまたは動物被験体における人工関節インプラントの部位における摩耗屑に関連する骨溶解などの炎症のために、または炎症が骨関節炎に関する場合に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成する方法の概略図である。
【図２】図２は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成する別法の概略図である。
【図３】図３は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成する別法の概略図である。
【図４】図４は、本技術の一つの実施形態に従って白血球を含んでなる液体を単離するために用いられる代表的デバイスの部分的横断面図である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、本技術の一つの実施形態に従って一定体積の白血球をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための代表的デバイスの横断面図である。
【図６】図６は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法の概略図である。
【図７】図７は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法の概略図である。
【図８】図８は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法の概略図である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、本技術の方法において使用可能な血液成分単離デバイスの、それぞれ等角図および部分的横断面図である。
【図１０】図１０は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａを投与するための方法の概略図である。
【図１１】図１１は、本技術の一つの実施形態に従ってＩＬ−１ｒａを投与する代表的デバイスの部分的横断面図である。
【図１２】
【発明の具体的説明】
【００１３】
本明細書に示される図面は、ある特定の実施形態を記載する目的で、本技術の中でも材料、デバイス、および方法の一般的特徴を例示することを意図するものであることを述べておくべきであろう。これらの図面は、ある任意の実施形態の特徴を厳密に表す必要はなく、本技術の範囲内の特定の実施形態を完全に定義または限定することを必ずしも意図するものではない。
【００１４】
（具体的説明）
技術に関する以下の記載は、１以上の発明の主題、製造および使用の性質を単に例示するに過ぎず、本出願において、または本出願に対する優先権を主張して出願され得る他の出願、またはそれから生じる特許において特許請求される任意の特定の発明の範囲、適用または使用を限定するものではない。本技術の理解を助けることを意図する用語および語句の非限定的記述はこの具体的説明の末尾に示されている。
【００１５】
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を生成、使用、および含む組成物、装置、および方法に関する。図１を参照すると、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成する方法１００が概略的に示されている。白血球を含んでなる液体体積１１０と固相抽出剤１２０を、１３０に示されるように接触させる。１４０に示されるように電磁場を用いて前記細胞を刺激する。接触１３０および刺激１４０の結果、１５０に示されるようにＩＬ−１ｒａに富む溶液が得られる。しかしながら、いくつかの実施形態では、白血球を含んでなる液体には刺激または電磁場の適用を行わず、すなわち、工程１４０が省かれる。白血球を含んでなる液体に電磁場をかけない場合には、矢印１６０で示されるように、工程１３０から直接工程１５０へ進む。１５０のＩＬ−１ｒａに富む溶液を用いて炎症を治療する。ＩＬ−１ｒａに富むとは、その溶液が同体積の全血に見られるよりも多い量のＩＬ−１ｒａを含んでなることを意味する。
【００１６】
白血球を含んでなる液体１１０と固相抽出剤１２０を、電磁場刺激１４０を伴って接触させると、接触１３０または刺激１４０を単独で行うよりも速くＩＬ−１ｒａを生成することができ、かつ／またはより多い量のＩＬ−１ｒａを生成することができる。例えば、白血球を含んでなる液体を電磁場に曝すと、白血球と固相抽出剤の接触の後に起こるタンパク質生産速度が加速化する。場合によっては、本方法は、ＩＬ−１ｒａを生成する他の方法が等量を生成するのに約４〜約２４時間かかり得るところを、１時間未満でＩＬ−１ｒａに富む溶液を提供することができる。再び図１を参照すると、工程１３０および１４０を含む方法は、矢印１６０で示されるように工程１４０を迂回する方法よりも速くＩＬ−１ｒａを生成することができ、かつ／またはより多くのＩＬ−１ｒａを生成することができる。
【００１７】
よって、本発明の方法は、他の方法に比べてＩＬ−１ｒａのより速い、かつ／またはより多い生産を提供することができる。例えば、本技術は、２００３年９月２３日発行の米国特許第６，６２３，４７２号明細書(Reincke et al.)；２００４年３月３０日発行の米国特許第６，７１３，２４６号明細書(Reinecke et al.)；および２００４年７月６日発行の米国特許第６，７５９，１８８号明細書(Reinecke et al.)に記載の方法；ならびに米国特許出願公開第２０１０／００５５０８７号明細書(Higgins et al.)、米国特許出願公開第２００９／０２２０４８２号明細書(Higgins et al.)およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２００９／１０８８９０号(Higgins et al.)に記載の方法に比べて、より速く、かつ／またはより多量にＩＬ−１ｒａを生成することができる。
【００１８】
本技術の機構、有用性または機能を限定するものではないが、固相抽出剤は白血球によるＩＬ−１ｒａ生産の活性化剤として働くと見られる。同様に、白血球の電磁刺激は、固相抽出剤と接触させただけの白血球に比べて、ＩＬ−１ｒａの生産速度および／または生産されるＩＬ−１ｒａの量を増大させると思われる。このように、本方法の接触および刺激の態様は、ＩＬ−１ｒａに富む溶液の生成に相乗的に機能すると見られる。
【００１９】
図１の工程１３０に示すように、白血球を含んでなる液体１１０を固相抽出剤１２０と接触させる。白血球を含んでなる液体１１０は、全血、骨髄穿刺液、脂肪組織、それらの画分およびそれらの混合物であり得る。例えば、血小板に富む血漿は、白血球を含んでなり得る全血の画分である。骨髄穿刺液はまた、骨髄穿刺液から液体を除去することにより調製することができる濃縮骨髄穿刺液も含む。
【００２０】
白血球を含んでなる液体はまた、濃縮白血球を含んでなる液体（全血に見られる濃度よりも高い白血球濃度有する液体を意味する）も含み得る。濃縮白血球は、白血球を含んでなる組織または組織画分と、単核白血球と結合するように機能し得る抗体に結合された磁性ビーズなどの固相支持体とを混合することにより調製することができる。例えば、白血球を含んでなる組織または組織画分は全血、骨髄穿刺液、脂肪組織、それらの画分およびそれらの混合物であり得る。次に、抗体が結合した単核白血球を回収する（例えば、磁石によって保持する）とともに、結合していない細胞または他の組織成分を含む液体を除去、かつ／または洗い流す。結合または保持された白血球は、濃縮白血球となる。
【００２１】
例としては、磁性ビーズなどの固相支持体に結合させることができる抗体が挙げられ、この場合、この抗体は支持体に直接結合されるか、または第２の抗体または他の親和性対などの１以上の分子を介して結合される。いくつかの実施形態では、白血球と選択的に結合する特異的結合メンバー（例えば、抗体）を用いて、磁性捕捉によりサンプルから白血球を回収する。好ましくは、この特異的結合メンバーは、直接的捕捉では、磁性ビーズのコーティングに用いるか、またはストレプトアビジンコーティング磁性ビーズによる白血球の間接的捕捉では、ビオチン化形態で用いられる。
【００２２】
白血球と選択的に結合する特異的結合メンバーは、白血球と結合するが赤血球などの他の細胞とは認め得るほど結合しない抗体であり得る。例としては、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１７、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８４、ＣＤ１０２またはＣＤ１６６に対する抗体が挙げられる。抗体は、当技術分野で公知の方法を用い、白血球と結合するそれらの能力を試験することができる。例えば、抗体はビーズ、膜またはカラムマトリックスなどの固相支持体に結合させることができ、白血球を含んでなる液体をその抗体とともにインキュベートした後に、結合していない成分を洗浄して固相支持体から除去することができる。
【００２３】
濃縮白血球はまた、白血球を含んでなる組織または組織画分をサイズ排除フィルターに通すことにより調製することもできる。このフィルターは、白血球を保持し、液体および白血球よりも小さい組織または組織画分の成分を通過させる孔径を持ち得る。あるいは、このフィルターは、白血球を通過させ、白血球よりも大きい組織または組織画分の成分を保持する孔径を持つこともできる。濾過により白血球を濃縮するためのこのようなフィルターおよびデバイスの例には、当技術分野で公知の種々の白血球除去または枯渇フィルターが含まれる。例としては、Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI)製のＬｅｕｋｏＧｕａｒｄ（商標）およびＬｅｕｋｏｔｒａｐ（商標）フィルターが挙げられ、また、２００３年１１月１１日発行の米国特許第６，６４５，３８８号明細書(Sheikh-Ali et al.)および１９９９年４月２０日発行の米国特許第５，８９５，５７５号明細書（これらは引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものが挙げられる。
【００２４】
固相抽出剤１２０としては、細胞と接触するために特定の表面積を提供する種々の材料を含み得る。固相抽出剤は、連続的材料を含んでなってもよく、または不連続であって、複数の独立した粒子を含んでなってもよい。例えば、固相抽出剤は、複数のビーズ、繊維、粉末、多孔質材、または細胞を含有する液体を含んでなる容器の表面の形態であり得る。固相抽出剤は、種々の横断面（とりわけ、丸、楕円、または多角形など）を有する幾何学的形態を含んでなり得る。固相抽出剤はまた、スポンジに似た連続した多孔ネットワークを含んでいてもよく、または複数の個々の多孔粒子を含んでもよい。固相抽出剤はまた、無孔質材に比べて、多孔性であることによってより大きな表面積を提供し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、固相抽出剤は、例えば粒子が針様の形状である場合など、アスペクト比の大きい粒子を含む。固相抽出剤はまた、長繊維として形成してもよく、ガラスウールであっても、またはガラスウールに似た形態を採ってもよい。
【００２６】
場合によっては、固相抽出剤は、白血球を含んでなる液体を保持する容器の内壁を含んでなり得る。例えば、固相抽出剤は、白血球を含んでなる液体の入ったシリンジの内面を含んでなり得る。他の容器としては、遠沈管などのチューブ、または本明細書の他所に記載されているような血液分画デバイスまたは濃縮装置アセンブリが挙げられる。
【００２７】
固相抽出剤が多孔質スポンジ様材料などの連続的材料である場合、固相抽出剤は吸収に十分な量で使用することができるか、または固相抽出剤の孔隙または間隙内に白血球の全液体体積を実質的に含むことができる。固相抽出剤が複数の粒子などの不連続材料である場合、固相抽出剤は細胞を含有する液体と合わせて、スラリー様組成物を形成することができる。このスラリーは、高固形分画分を含むペースト様から低固形分画分を含む流動の容易なスラリーまで、粘稠度が様々であり得る。
【００２８】
固相抽出剤は、細胞と接触するための大きな表面積を提供し得る。しかしながら、場合によっては、固相抽出剤は、その表面積を増すために、例えば固相抽出剤の表面の物理的または化学的エッチングまたはエローディングによりさらに処理することができる。化学的エッチングについては、材料の性質に応じて、腐食剤を用いて固相抽出剤の表面を改質することができる。改質表面は、アルカリまたは酸、例えば、クロモスルホン酸(chromosulphonic acid)、特に、約２０％〜約８０％濃度、好ましくは約５０％クロモスルホン酸(chromosulphonic acid)を使用することにより作製することができる。表面を化学的に腐食し表面積を増すために、固相抽出剤は腐食剤とともに約５分〜約３０分インキュベートすることができる。次に、固相抽出剤を洗浄して腐食剤を除去することができる。例えば、固相抽出剤は、白血球を含んでなる液体を保持するための容器の内壁を含むことができるが、この場合には、次に、それらの内壁は、液体と接触する表面積を増すようにエッチングされる。
【００２９】
種々のポリマー、金属、セラミック、およびガラスが固相抽出剤として使用可能である。これらには、例えば、ガラスまたは複数のガラス粒子、ガラスウールなどの連続的固相抽出剤、チタン、複数の金属ビーズ、金属粉末などの連続的固相抽出剤、およびそれらの組合せが含まれる。金属の連続的固相抽出剤としては、オープンセル構造を有するブロックまたは他の三次元形状の多孔質金属または金属合金を含み得る。固相抽出剤としては、種々のビーズまたは種々のサイズの粒子（実質的に球形のビーズを含む）を含み得る。ビーズとしては、ポリスチレンビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、金属（例えば、チタン）ビーズ、または他の任意の適当なビーズが含まれる。ビーズは、使用する容器および白血球を含んでなる液体の量に適当な任意のサイズであってよい。場合によっては、ビーズサイズは直径約０．００１ミリメートル〜約３ミリメートルの範囲であり得る。ビーズサイズが十分に小さい場合には、それらのビーズは粉末のように見える場合がある。
【００３０】
固相抽出剤との表面接触は細胞を活性化することができ、場合によって固相抽出剤は、得られるＩＬ−１ｒａに富む溶液の分離および濃縮の助けとなり得る。例えば、多孔質固相抽出剤の場合、細胞を含んでなる液体の一部が孔に入り、そこに留まる。液体中の細胞はこの付加的な表面積とも接触し得る。いくつかの実施形態では、これらの孔は小さくて細胞が入ることはできないが、液体の一部はこれらの孔に入ることができる。例えば遠心分離によって固相抽出剤および孔から液体を除去することができる。いくつかの実施形態では、固相抽出剤は、脱水ポリアクリルアミドビーズなどの、液体の一部を吸収し、それにより吸湿性材料に吸収されていない材料を濃縮する吸湿性材料を含み得る。
【００３１】
好適な固相抽出剤材料の種々の例として、ガラス、無機質、ポリマー、金属、および多糖類が挙げられる。無機質としては、鋼玉および石英が挙げられる。ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、およびポリアクリルアミドが挙げられる。金属としては、チタンが挙げられる。多糖類としては、デキストランおよびアガロースが挙げられる。
【００３２】
白血球を含んでなる液体の汚染を避けるため、固相抽出剤の滅菌は、当技術分野で公知の技術を用いて行うことができる。固相抽出剤の特定の組成に応じて、例えば、オートクレーブなどの加熱および加圧滅菌法が使用可能である。固相抽出剤がオートクレーブ法によって悪影響を受け得る場合には、化学滅菌法または照射などの別法を使用することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、白血球を含んでなる液体と固相抽出剤をかき混ぜて、接触中にこれらの成分をより十分に混合する。このかき混ぜは、液体および固相抽出剤を転倒させるか、振り混ぜるか、揺動させるか、撹拌するか、またはボルテックスにかけることによって行うことができる。かき混ぜは、液体内の細胞と固相抽出剤の接触を増大させ得る。かき混ぜは、一度行ってもよいし、複数回反復してもよいし、周期的に反復してもよいし、または連続的であってもよい。細胞を含んでなる液体と固相抽出剤はまた、その液体が電磁場で刺激されている間にかき混ぜてもよい。
【００３４】
図１の１４０で示されるように、白血球を含んでなる液体は電磁場で刺激することができる。いくつかの実施形態では、この細胞を含んでなる液体の刺激は、液体と固相抽出剤を接触させる前に行うことができることを注記しておくべきであろう。すなわち、本方法の接触工程と刺激工程を始める順序は逆転させることができる。しかしながら、細胞を含んでなる液体が固相抽出剤と接触すると同時に電磁場で刺激されるように、接触工程の少なくとも一部と刺激工程の少なくとも一部とが適切な時間で重複することが好ましい。
【００３５】
白血球を含んでなる液体の電磁場による刺激は、パルス電磁場または容量結合型電磁場などの種々の形態の電磁刺激を含み得る。いくつかの実施形態では、液体は、刺激コイルに結合された電源を用いて刺激される。コイルに電流が流れるとパルス電磁場が生じ、これが液体中にパルス電場を誘導する。このコイルは、チューブまたはシリンジなどの容器内に保持されている場合、液体に部分的に取り囲まれてもよい。コイルは白血球を含んでなる液体を保持する容器に組み込んでもよいし、または着脱可能であってもよい。例えば、コイルが組み込まれたプラスチックチューブを形成することもできるし、またはコイルを一時的に容器に結合させるか、または容器内に置いてもよく、例えば、このチューブはコイルが容器にスナップ嵌合され得るように構成することできる。電源は必要に応じてコイルに接続し、刺激工程を行うことができる。
【００３６】
電磁場による液体の刺激は、少なくとも２つの電極を、液体を挟んで配置することを含んでもよい。次に、これらの電極を容量結合し、それらの間に電磁場を生じるように電気エネルギーをかければよい。従って、電磁場はその液体を通って、ＩＬ−１ｒａ生産の速度および／または量を増大させることができる。他の実施形態では、電極を用いて直流を生じさせることができ、または１以上のコイルを用いてパルス電磁場を生じさせることもできる。
【００３７】
刺激の際の電磁場の強度は、直流、容量結合型電流またはパルス電磁場により生じさせた場合、少なくとも約０．５マイクロボルト／センチメートルである。直流電極の場合には、電流の強さは約１〜約２００マイクロアンペアであり得、いくつかの実施形態では、電流の強さは約２０〜約１００マイクロアンペアであり得る。なおさらなる実施形態では、電流は約２０、約６０または約１００マイクロアンペアであり得る。しかしながら、電流の強さは他の好適な大きさであってもよいと理解するべきである。
【００３８】
刺激工程中にかけられる電磁場は一定であっても、または経時的に変化してもよい。例えば、液体を挟んで配置された電極を用いて正弦波時間変更電磁場をかけることができる。このような正弦波時間変化電磁場の電極間のピーク電圧は約１ボルト〜約１０ボルトであり、いくつかの実施形態では、ピーク電圧は約５ボルトであり得る。相当する生成電場の振幅は、約０．１ミリボルト／センチメートル（ｍＶ／ｃｍ）〜約１００ｍＶ／ｃｍであり得、いくつかの実施形態では、約２０ｍＶ／ｃｍであり得る。正弦波時間変化電場の周波数は約１，０００Ｈｚ〜約２００，０００Ｈｚであり得、いくつかの実施形態では、周波数は約６０，０００Ｈｚであり得る。
【００３９】
液体にかけられる電磁場はパルス電磁場であってもよい。パルス電磁場は、外部コイルとパルス発生装置を用いて誘導することができる。これに関して、パルス電磁場のパルス持続時間は約１０マイクロ秒／パルス〜約２０００マイクロ秒／パルスであり得る。一実施形態では、パルス持続時間は約２２５マイクロ秒であり得る。パルスは電磁バーストを含んでもよく、１回のバーストは１パルス〜約２００パルスを含んでなり得る。あるいは、電磁場は、約１０パルス〜約３０パルスを含んでなるバーストを持ち得る。これに関して、一実施形態では、各バーストは約２０パルスを含んでなり得る。
【００４０】
パルス電磁場のバーストがかけられる周波数は可変である。これに関して、いくつかの実施形態では、バーストは約１Ｈｚ〜約１００Ｈｚの周波数で反復することができ、他の実施形態では約１０Ｈｚ〜約２０Ｈｚの周波数で反復することができる。さらに、バーストは約１．５Ｈｚ、約１５Ｈｚまたは約７６Ｈｚの周波数で反復することができる。バーストの持続時間は約１０マイクロ秒から最大約４０，０００マイクロ秒であり得る。これに関して、バーストの持続時間は約４．５ミリ秒であり得る。
【００４１】
容量結合型電磁場を生成するための好適なデバイスとしては、ＳｐｉｎａｌＰａｋ（商標）脊髄刺激装置(EBI, L.P., Parsippany, New Jersey)、または、ＳｐＦ（商標）ＸＬ  ＩＩｂ脊髄癒合刺激装置(EBI, L.P., Parsippany, New Jersey)などのＤＣ刺激デバイスが含まれる。パルス電磁場は、単一のコイルまたは１対のヘルムヘルツ(Helmholtz)コイルを使用するなど、公知の方法および装置を用いて生成することができる。例えば、好適な装置としては、ＥＢＩ  Ｂｏｎｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）モデル２００１(EBI, L.P., Parsippany, New Jersey)およびＢＴＢＳ刺激コイルが含まれる。直流に関しては、電場は、例えば、Ｏｓｔｅｏｇｅｎ（商標）移植型骨成長刺激装置(EBI, L.P., Parsippany, New Jersey)などの直流電場を生成するための任意の公知のデバイスを用いて生成することができる。電磁場を生成するための他の好適なデバイスも使用可能である。
【００４２】
白血球を含んでなる液体の電磁刺激は、液体と固相抽出剤との接触に関して望まれる場合には、継続および／または反復することができる。しかしながら、液体を電磁場で刺激する工程は、周囲条件に関連する電場または電磁場（ラジオ、電話、デスクトップコンピューターまたは類似のデバイスへの偶然の曝露により生じる電磁場など）以外の、またはそれに加えての電磁場を含むと理解するべきである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、図１に示されるように、接触工程１３０および刺激工程１４０の双方は約１時間未満で行われる。接触工程および刺激工程はまた、約２０℃〜約３７℃の範囲の温度で行うことができる。好ましい実施形態では、白血球を含んでなる液体の温度は、接触工程および刺激工程中、約３７℃に維持される。接触工程および刺激工程の一方または双方は一般にex vivoで行われる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、図１に示されるように、接触工程１３０および刺激工程１４０から生成されたＩＬ−１ｒａに富む溶液１５０を固相抽出剤から分離する。固相抽出剤からの分離は、種々の方法で行われる。例えば、ＩＬ−１ｒａに富む溶液は固相抽出剤から、シリンジを用いるか、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を濾過するか、ＩＬ−１ｒａに富む溶液と固相抽出剤を遠心分離するか、または当技術分野で公知の、固相抽出剤から液体を分離するのに好適な方法を用いることにより取り出すことができる。種々の分離技術を組み合わすこともでき、例えば、ＩＬ−１ｒａに富む溶液をシリンジで取り出す場合には、多孔質固相抽出剤内に入った残留溶液に遠心分離を施し、沈降する溶液をシリンジで取り出すこともできる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１ｒａに富む溶液は、例えば、固相抽出剤に弾力性がありスポンジ様である場合には、加圧を用いて固相抽出剤から取り出すことができ、または真空を用いて抜き取ることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１ｒａに富む溶液が生成される容器は、固相抽出剤からの溶液の分離を助けるように構成することができる。例えば、容器は、一側面、底面または容器のキャップもしくは蓋にフィルター、メッシュスクリーンまたはガラスフリットを含んでもよい。次に、容器を遠心分離し、液体がそのフィルター、メッシュまたはフリットを通過し、固相抽出剤および細胞などの他の材料が保持される。場合によっては、固相抽出剤のみが保持され、実質的に総ての他の材料がフィルター、メッシュまたはフリットを通過する。このようにして、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を遠心分離し、例えば新しい容器に回収することができる。容器の表面が固相抽出剤を形成する場合、この分離は、容器から液体を取り出すことを含む。
【００４６】
ここで図２を参照すると、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法２００が示される。工程２１０で、ヒト被験体などの患者から血液を採取する。以下にさらに述べるように、この血液はそのまま工程２３０で用いてもよいし、または工程２２０で血液画分を作出するために処理してもよい。血液または血液画分は、白血球を含んでなる液体を提供する。本明細書において、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）は、白血球を含み、本方法およびシステムで白血球を含んでなる液体として使用可能であると理解される。例えば、工程２２０に示されるように、血液を遠心分離して、白血球および血小板を含有するＰＲＰを得ることができる。いくつかの実施形態では、白血球を含んでなる液体は、全血の沈降後に形成されるバフィーコート層を含む。
【００４７】
工程２２０で血小板に富む血漿を単離するために使用可能なデバイスの一例を図４に示す。これに関して、デバイス４００は、血液を充填した後に遠心機に入れるチューブなどの容器４０５を含む。容器４０５は、仕切り板４１０と浮標４１５を備えた浮標システムを含む。浮標４１５は、遠心分離時に選択された平衡の位置に達するように調節された選択された密度を有し、この位置は高密度の血液画分と低密度の血液画分の間である。遠心分離の際、浮標４１５は容器４０５内の血液を少なくとも２つの画分に、これらの画分が混ざり合わないように分離する（これらの２画分の間に沈降することによる）。これに関して、仕切り板４１０および浮標４１５は血小板に富む血漿を含んでなる層４２０を画定し、一方、低密度の、血小板に乏しい血漿４２５は一般に仕切り板４１０の上に分画され、高密度の赤血球４３０は一般に浮標４１５の下に分画される。
【００４８】
デバイス４００の遠心分離の後、シリンジまたはチューブは、血小板に富む血漿を抽出するために浮標システムの一部と内部接続されてもよい。種々の実施形態では、このようなデバイスを用いて、全血よりも最大約８倍高い血小板濃度および全血よりも最大約５倍高い白血球濃度を含む血小板に富む血漿を生成することができる。血小板に富む血漿は、全血中に存在する白血球の約８０％〜約９０％を含んでなり得る。このようなデバイスの市販の具体例としては、Biomet Biologics, LLC (Warsaw, Indiana, USA)製のＧＰＳ（商標）ＩＩ血小板濃縮システムおよびBiomet Biologics, LLC (Warsaw, Indiana, USA)製のＧＰＳ（商標）ＩＩＩ血小板分離システムが挙げられる。
【００４９】
図２の工程２２０で血小板に富む血漿を単離するために使用可能なデバイスとしては、例えば、２００２年６月４日発行の米国特許第６，３９８，９７２号明細書(Blasetti et al.)；２００３年１１月１８日発行の米国特許第６，６４９，０７２号明細書(Brandt et al.)；２００４年９月１４日発行の米国特許第６，７９０，３７１号明細書(Dolocek）；２００６年３月１４日発行の米国特許第７，０１１，８５２号明細書(Sukavaneshvar et al.)；２００４年１２月１６日公開の米国特許出願公開第２００４／０２５１２１７号明細書(Leach et al.)（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年５月２６日公開の米国特許出願公開第２００５／０１０９７１６号明細書(Leach et al.)（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年９月８日公開の米国特許出願公開第２００５／０１９６８７４号明細書(Dorian et al.)（引用することにより本明細書の一部とされる）；および２００６年８月１０日公開の米国特許出願公開第２００６／０１７５２４２号明細書(Dorian et al.)（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものが挙げられる。
【００５０】
工程２２０で他の方法を用いて血小板に富む血漿を単離することもできる。例えば、全血を、浮標システムを用いずに遠心分離することができ、全血を多段階で遠心分離してもよく、連続流遠心分離を使用することができ、濾過もまた使用可能である。さらに、血小板に富む血漿および白血球を含む血液成分は、血小板のペレット化を避けるために低速遠心分離工程を用いて赤血球から血漿を分離することによって生成するとこもできる。他の実施形態では、遠心分離された血液から生じたバフィーコート画分を残留血漿から分離し、再懸濁させて白血球を含む血小板に富む血漿を形成することができる。
【００５１】
ＧＰＳ（商標）血小板濃縮および分離システムに加え、工程２２０で血小板に富む血漿を単離するために、Medtronic, Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA)から市販されているＭａｇｅｌｌａｎ（商標）自己血小板分離システム；Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Massachusetts, USA)から市販されているＳｍａｒｔＰＲｅＰ（商標）；ＤｅＰｕｙ(Warsaw, Indiana, USA)；Cytomedix, Inc. (Rockville, Maryland, USA)から市販されているＡｕｔｏｌｏＧｅｌ（商標）プロセス；EmCyte Corporation (Fort Myers, Florida, USA)から市販されているＧｅｎｅｓｉｓＣＳシステム；およびBiomet 3i, Inc. (Palm Beach Gardens, Florida, USA)から市販されているＰＣＣＳシステムをはじめとする様々な他の市販のデバイスが使用可能である。
【００５２】
再び図２を参照して、工程２１０で被験体から採取した血液は、その後の工程２２０または２３０での使用の前に、抗凝固剤と混合してもよい。好適な抗凝固剤としては、ヘパリン、クエン酸リン酸ブドウ糖（ＣＰＤ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、酸性クエン酸ブドウ糖溶液（ＡＣＤ）およびそれらの混合物などの当技術分野で公知のものが挙げられる。抗凝固剤は、被験体から血液を採取するために用いるシリンジ内に入れてもよいし、または血液を採取した後に血液と混合してもよい。
【００５３】
あるいは、またはそれに加えて、工程２２０で遠心分離を施さない工程２１０からの血液を、工程２３０でポリアクリルアミドビーズを含んでなる固相抽出剤と合わせてインキュベートすることができる。この選択肢は、図２で工程２１０から工程２３０へ直接延びている矢印によって示される。この場合、ポリアクリルアミドビーズは血液中でのＩＬ−１ｒａの生産を活性化するが、このＩＬ−１ｒａの濃度は、白血球もしくは血小板を含有する血小板に富む血漿を用いた場合に比べて、または全血に比べて白血球が濃縮された別の液体体積としての白血球に比べて低いものであり得る。
【００５４】
白血球を含んでなる液体はまた、当技術分野で公知の他の方法を用いて調製することもできる。例えば、白血球は全血から、赤血球の溶血によるか、または密度勾配を用いた全血の遠心分離（白血球は遠沈管の底に沈降する）により調製することができる。密度遠心分離の例としては、フィコール−パーク（商標）プラス製品(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, New Jersey, USA)を用いる方法が挙げられる。場合によっては、密度勾配を用いてさらに単核細胞および多形核細胞を分離してもよい。白血球はまた濾過を用いて全血から調製することもでき、例としては、Ａｃｅｌｅｒｅ（商標）ＭＮＣ  Ｈａｒｖｅｓｔシステム(Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA)が挙げられる。白血球はまた骨髄から得ることもできる。
【００５５】
図２の工程２３０で示すように、工程２２０からの血小板に富む血漿を、ポリアクリルアミドビーズを含んでなる固相抽出剤と接触させる。いくつかの実施形態では、血小板に富む血漿を脱水ポリアクリルアミドビーズとともに、血小板に富む血漿中の液体の一部を除去するのに有効な時間インキュベートする。このインキュベーションは、約３０秒〜約７２時間の期間行えばよく、約２０℃〜約４１℃の温度で行えばよい。例えば、インキュベーションは約１分〜約４８時間、約５分〜約１２時間、または約１０分〜約６時間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約３７℃で行う。いくつかの実施形態では、血小板に富む血漿はインキュベートしないが、その後の処理を行うのに必要なだけポリアクリルアミドビーズと接触させる。接触は周囲条件、例えば、約２０〜２５℃の温度で行えばよい。
【００５６】
工程２３０で固相抽出剤として用いるポリアクリルアミドビーズは、ポリアクリルアミドゲルから形成される比較的均一なビーズを生産するための当技術分野で公知な制御されかつ標準化されたプロトコールを用いてアクリルアミドモノマーを重合させることにより形成することができる。一般に、ポリアクリルアミドは、好適な二官能性架橋剤、最も一般的にはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビスアクリルアミド）を用いてアクリルアミドを重合させることにより形成される。ゲル重合は通常、過硫酸アンモニウムで開始させ、反応速度をＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）などの触媒に添加により加速化する。種々の実施形態では、ポリアクリルアミドビーズはビーズ１ミリリットル当たり０．５マイクロモルのカルボキシル基を含んでなり、これは弱陰イオン性（負電荷）を付与する。これらのビーズはまた一般に、ｐＨ変化に耐性があり、かつ、多くの水性溶液および有機溶液中で安定である。総アクリルアミド濃度を調整することにより、ポリアクリルアミドゲルは広範な粒径で形成させることができる。さらに、ポリアクリルアミドビーズは、多くの粒径で形成させることができ、比較的均一な粒径分布を持ち得る。ビーズ粒径は直径数ミクロメートル〜直径数ミリメートルの範囲であり得る。例えば、様々なタイプのＢｉｏ−Ｇｅｌ（商標）Ｐポリアクリルアミドゲルビーズ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)が、約４５μｍ未満から最大約１８０μｍの範囲の粒径を持つ。ポリアクリルアミドビーズはまた、SNF Floerger (Riceboro, Georgia, USA)、Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois, USA)、およびPolymers, Inc. (Fayetteville, Arkansas, USA)からも市販されている。
【００５７】
重合されれば、ポリアクリルアミドビーズを乾燥させ、粉末様形態で保存することができる。乾燥ビーズは水に不溶性であるが、再水和の際に著しく膨潤することができる。再水和はポリアクリルアミドビーズを、乾燥状態での大きさの約２倍〜約３倍であり得るゲル粘稠度に戻す。従って、乾燥ポリアクリルアミドビーズ（すなわち、脱水ポリアクリルアミドビーズ）は、ビーズ孔径よりも小さい溶質を含む液体体積の一部を吸収するために使用可能であり、白血球により生成されるＩＬ−１ｒａを濃縮する働きをし得る。例えば、工程２３０で乾燥ポリアクリルアミドビーズを血液および／または血小板に富む血漿と合わせると、白血球によるＩＬ−１ｒａの生産が活性化され、また、乾燥ビーズが水和および膨潤するにつれ、総液体体積が減る。
【００５８】
本技術の機構、有用性または機能を限定するものではないが、ポリアクリルアミドビーズは、白血球によるＩＬ−１ｒａ生産の活性化剤として働き得る。従って、乾燥ポリアクリルアミドビーズの場合、白血球の体積から液体が吸収され、それにより、形成されたＩＬ−１ｒａを濃縮するだけでなく、これらのビーズはさらに白血球によるＩＬ−１ｒａ生産を刺激するための表面として働く。例えば、ＧＰＳ（商標）ＩＩシステムなどの図４によるデバイスを用いて得られた血小板に富む血漿を用いて回収されたＩＬ−１ｒａは、全血に比べてＩＬ−１ｒａ濃度に約５倍の増加をもたらし得る。その後、以下にさらに記載するように、Ｐｌａｓｍａｘ（商標）デバイス(Biomet Biologics, LLC, Warsaw, Indiana, USA)などの図５Ａおよび５Ｂによるデバイスを用いてＩＬ−１ｒａに富む溶液をインキュベートし単離すると、ＩＬ−１ｒａの濃度は最終濃度増加約２００倍まで、約４０倍以上増加し得る。よって、このＩＬ−１ｒａ量の増加は、おそらく、単にサンプルの体積を減らすことによる濃度の増大によるものではなく、１つには、ポリアクリルアミドビーズによる白血球、および血小板由来の他の増殖因子の活性化によるＩＬ−１ｒａの生産および／または放出の増大によるものであると思われる。
【００５９】
図２を参照して、２４０で示すように血小板に富む血漿を電磁場で刺激する。血小板に富む血漿の近くに置いたコイルを用い、パルス電磁場（ＰＥＭＦ）をかける。例えば、Ｐｌａｓｍａｘ（商標）デバイスなど、血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズを保持する容器内、または容器の一部の周囲に１以上のコイルを置くことができる。場合によっては、２つのコイルを用い、血小板に富む血漿の入った容器をこれらのコイルの間に配置する。ＰＥＭＦは、米国特許第７，７４４，８６９号明細書（２０１０年６月２９日発行）、同第７，５２０，８４９号明細書（２００９年４月２１日発行）、および同第６，９５５，６４２号明細書（２００５年１０月１８日発行）（総てSimonに対するものであり、引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているパラメーターを用いてかけることができる。
【００６０】
血小板に富む血漿をポリアクリルアミド(polyacrymide)ビーズと接触させ、電磁場刺激を行った後、ＩＬ−１ｒａに富む溶液が生成され、図２の工程２５０に示すようにこれらのビーズから単離することができる。ＩＬ−１ｒａに富む溶液の単離は、液体体積を排出し、ビーズを残すことによって行えばよい。場合によっては、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を排出する前に、遠心分離によってこれらのビーズを沈降させてもよい。単離はまた濾過によって行ってもよく、例えば、遠心力を用いるか、または真空を使用することにより、ポリアクリルアミドビーズはフィルターに保持され、ＩＬ−１ｒａに富む溶液はフィルターを通過する。工程２３０のポリアクリルアミドビーズとの接触に乾燥ポリアクリルアミドビーズを用いる場合、再水和時にビーズが膨潤するにつれ液体体積が減り、それにより、生じたＩＬ−１ｒａに富む溶液が濃縮される。この増大した濃度を維持するために、単離工程２５０では、ビーズを圧縮しないよう、または膨潤したビーズから液体を排出させないように注意すべきである。例えば、強い遠心力または強い真空はビーズを崩壊させ、かつ／またはビーズの内容積から液体を排出させることがある。
【００６１】
場合によっては、血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの接触（工程２３０の通り）、電磁場刺激（２４０の通り）、および生じたＩＬ−１ｒａに富む溶液の単離（工程２５０の通り）は、単一のデバイスを用いて行ってもよい。血小板に富む血漿をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするためのデバイスを図５Ａおよび５Ｂに示す。これに関して、デバイス５００は、上部チャンバー５０５と下部チャンバー５１０を備える。上部チャンバー５０５は端壁５１５を備え、これを通ってゲルビーズ撹拌装置５２５の撹拌装置軸５２０が延長する。デバイス５００はまた入口５３０を備え、端壁５１５を通って上部チャンバー５０５へと延長する。デバイス５００はまた、血漿濃縮コンジット５４０と連絡する出口５３５を含む。上部チャンバー５０５の底面はフィルター５４５を含み、その上面は脱水された濃縮ポリアクリルアミドビーズ５５０を支持する。
【００６２】
使用の際には、白血球を含有する流体５５５（例えば、血小板に富む血漿）を入口５３０から上部チャンバー５０５に注入し、ポリアクリルアミドビーズ５５０と混合する。流体５５５およびポリアクリルアミドビーズ５５０は撹拌装置軸５２０とゲルビーズ撹拌装置５２５を回転させて、流体５５５とビーズ５５０の混合を助けることにより混合することができる。次に、混合された流体５５５とポリアクリルアミドビーズ５５０を、所望の温度で所望の時間、インキュベートする。この時間の間、混合された流体５５５とポリアクリルアミドビーズ５５０を、混合された流体５５５とポリアクリルアミドビーズ５５０が入った上部チャンバー５０５の一部を挟んで配置された２つのコイルを用いてかけられるパルス電磁場などの電磁場で刺激する。その後、デバイス５００を遠心分離し、その結果、液体は下部チャンバー５１０へと通過し、一方、ポリアクリルアミドビーズ５５０はフィルター５４５により保持され、それにより、生じたＩＬ−１ｒａ溶液５６０からポリアクリルアミドビーズ５５０を分離し、ＩＬ−１ｒａ溶液は下部チャンバー５１０で回収する。溶液５６０は出口５３５でデバイスから取り出すことができる。
【００６３】
図５のデバイス例は、２００６年８月１０日公開の米国特許出願公開第２００６／０１７５２６８号明細書(Dorian et al.publi)；および２００６年１１月２日公開の米国特許出願公開第２００６／０２４３６７６号明細書(Swift et al.)（双方とも引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されている。このようなデバイスは、Biomet Biologics, LLC (Warsaw, Indiana, USA)から製のＰｌａｓｍａｘ（商標）プラス血漿濃縮装置として市販されている。
【００６４】
再び図２を参照し、工程２６０で、ＩＬ−１ｒａに富む溶液をヒトまたは動物被験体などの患者に投与する。ＩＬ−１ｒａに富む溶液を受容する患者は、工程２１０で血液が取得された、または血液が由来する患者と同じ患者であってよい。この場合、本方法はＩＬ−１ｒａの自己調製を提供する。投与は、シリンジを用いてＩＬ−１ｒａに富む溶液を注射するか、外科的に適用するか、または別の外科手術と並行して適用するなど、種々の手段を用いて行ってよい。しかしながら、工程２６０は、ＩＬ−１ｒａに富む溶液が移植、注射、またはそうでなければ、炎症などのインターロイキン−１受容体の刺激に関連する影響に介入するために、ある部位にまたはその近傍に投与される任意の生物医学的に許容される工程または手順を含み得ると理解するべきである。例えば、関節炎により引き起こされる炎症を治療するために、自己ＩＬ−１ｒａに富む溶液を注射により患者に投与し得る。注射は炎症を起こした関節の滑膜空隙部位もしくは滑膜空隙中、またはそうでなければ関節部位またはその近傍に行い得る。
【００６５】
図２に示される方法と同様の方式で、脂肪組織を用いて、図３に概略が示されるように、別法３００で使用するための脂肪細胞を含んでなる液体を提供することもできる。この場合、工程３１０で脂肪組織を患者から取得し、その脂肪組織をさらに処理するか３２０、またはそのまま脂肪細胞を含んでなる液体として使用する。その脂肪組織を、ポリアクリルアミドビーズを含んでなる固相抽出剤と接触させ、インキュベートし３３０、電磁場で刺激し３４０、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を単離し３５０、図２に示される同様の工程に関して記載されている方法で患者に投与する３６０。しかしながら、脂肪組織３１０の取得と脂肪組織３２０の処理は、以下の態様をさらに含むことができる。
【００６６】
液体体積としての脂肪細胞は単離された脂肪組織の一部であってもよく、この場合、例えば、この脂肪組織は他の細胞種を含み得る。脂肪細胞とポリアクリルアミドビーズの接触３３０は、液体体積としての脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズとともに、電磁場刺激３４０を含め、約３０秒〜約２４時間の範囲の時間、好ましくは、約１時間未満インキュベートすることを含み得る。接触３３０はまた、液体体積としての脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズと接触させることに加えて、白血球を含んでなる液体体積をポリアクリルアミドビーズと接触させることを含んでもよい。液体体積としての白血球は全血、血小板に富む血漿、または全血および血小板に富む血漿であり得る。白血球はまた骨髄から取得することもできる。
【００６７】
脂肪組織とは、皮下、大網／内臓、乳房、性腺または他の脂肪組織部位に由来し得る、白色脂肪組織または褐色脂肪組織いずれかの任意の脂肪組織を意味する。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、吸引補助脂肪組織切除術または脂肪吸引によって単離されたヒト皮下脂肪に由来する。白血球を含み得る脂肪細胞およびその他の細胞は、機械的および破壊的遠心分離などの当技術分野で公知の方法をはじめとする好適な任意の方法を用いて、脂肪組織および／または組織部分から単離および／または分離することができる。脂肪細胞およびその他の細胞はまた、酵素消化を用いて単離することもできる。例えば、脂肪細胞およびその他の細胞は、脂肪穿刺物から単離し、音波処理および／または酵素消化により処理し、遠心分離により富化することができる。脂肪組織から単離された脂肪細胞およびその他の細胞は１回以上の洗浄およびペレット化を行うことができる。
【００６８】
脂肪組織および脂肪細胞を単離する方法は、以下の態様を含み得る。約５０ｃｃの脂肪組織を吸引補助チューメセント(tumescent)脂肪吸引により、吸引ホースと脂肪吸引カニューレに取り付けた専用の回収容器内に回収することができる。この回収容器はチューメセント流体を通過させ、固形脂肪組織を保持するガーゼタイプのグリッドフィルターを備えることができる。脂肪組織を回収した後に、回収容器を吸引デバイスから取り出し、遠心分離デバイスに再び取り付ける。このフィルターユニットは、孔径およそ１００マイクロメートルのフィルターをさらに含んでもよい。脂肪組織の入った回収容器を遠心分離デバイスに取り付けたら、組織を音波処理する。音波処理の後、装置全体を遠心機バケットに装入し、約３００×ｇで約５分間遠心分離する。遠心分離の後、回収容器をフィルターユニットとともに取り外す。脂肪細胞およびその他の細胞を含有するペレットは、自己血漿、血漿濃縮液、および／または血小板に富む血漿などの生体適合性溶液に再懸濁させることができる。
【００６９】
脂肪組織はまた、消化酵素および隣接する細胞間の接合を弱くするキレート剤で処理してもよく、これにより相当の細胞破壊を伴わずに、組織を分散させて、脂肪細胞を含む個々の細胞の懸濁液とすることが可能となる。解離の後、脂肪細胞およびその他の細胞は細胞の懸濁液および解離組織から単離することができる。
【００７０】
脂肪組織を単離および／または分画するための種々の方法およびデバイスとしては、Leach et al.の米国特許第７，３７４，６７８号明細書（２００８年５月２０日発行）および同第７，１７９，３９１号明細書（２００７年２月２０日発行）ならびにLeach et al.の米国特許出願公開第２００９／００１４３９１号明細書（２００９年１月１５日公開）、同第２００８／０２８３４７４号明細書（２００８年１１月２０日公開）および同第２００７／０２０８３２１号明細書（２００７年９月６日公開）に記載されているものが挙げられる。脂肪細胞の単離にＧＰＳ（商標）血小板濃縮システム(Biomet, Warsaw, IN)などのデバイスを使用することもできる。これらの方法は、患者に対して脂肪穿刺を行うことにより脂肪細胞およびその他の細胞を取得して脂肪組織を得ること、その脂肪組織を酵素消化すること、ならびにその脂肪細胞をこれらのデバイスを用いて分離および／または洗浄することを含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、脂肪組織の単離は、標準的脂肪穿刺による組織の抽出、切除した脂肪組織からの単離によるか、またはSound Surgical Technologies, LLC, Louisville, Coloradoから入手可能な、ＶＥＮＴＸ（商標）カニューレと組み合わせたＶＡＳＥＲ（商標）超音波破壊装置の使用によって行うことができる。
【００７２】
白血球を含む脂肪細胞およびその他の細胞と固相抽出剤（例えば、ポリアクリルアミドビーズ）の表面との接触は、ＩＬ−１ｒａの生産および分泌を刺激すると思われる。また、脂肪組織が白血球を含み得る場合には、産生されるＩＬ−１ｒａの量と白血球の濃度の間には相関があると思われる。よって、白血球が脂肪組織と脂肪組織から得られる脂肪細胞の双方に存在し得る場合には、本方法は脂肪細胞を取得するために脂肪組織および解離された脂肪組織を使用することができる。
【００７３】
図６を参照すると、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法６００が示されている。この場合、まず、工程６１０で患者から血液を採取する。工程６２０に進んで、血液を遠心分離して血小板に富む血漿を単離する。図２の方法と同様に、血小板に富む血漿は、図４に示されるものなどの種々のデバイスを用いて単離することができる。例えば、二重浮標機構を含むデバイスは、浮標４１５と仕切り板４１０の間にポリアクリルアミドビーズを含むことができる。このポリアクリルアミドビーズは、図２の工程２３０に関して記載されているように、乾燥状態であっても水和状態であってもよい。
【００７４】
工程６２０において遠心分離中、血小板に富む血漿は浮標４１５と仕切り板４１０の間に集まり、ポリアクリルアミドビーズと接触するようになる。低密度の血小板に乏しい血漿成分は血小板に富む血漿の上に形成し、より高密度の赤血球成分は血小板に富む血漿の下に形成する。遠心分離が完了したら、分離された血液成分の入ったチューブを、工程６３０に示される所望の時間、所望の温度でインキュベートすればよく、ここで、血小板に富む血漿をさらに電磁場で刺激する。このようにして、浮標と仕切り板の間に位置する血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの混合物内で白血球によりＩＬ−１ｒａが生成される。
【００７５】
乾燥ポリアクリルアミドビーズを使用する場合には、工程６２０で遠心分離が完了したら、インキュベーション前に上部の血小板に乏しい血漿成分と下部の赤血球成分をそのチューブから除去して、２つの浮標部分の間にある血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの混合物を残してもよい。あるいは、血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの混合物をチューブから取り出してもよい。いずれの場合でも、血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの混合物を血小板に乏しい血漿と赤血球成分との流体接触から分離することで、その後の乾燥ポリアクリルアミドビーズの膨潤および再水和により血小板に富む血漿の液体体積が効果的に減じられ、得られるＩＬ−１ｒａ溶液のさらなる濃縮が可能となる。
【００７６】
工程６３０で接触および刺激を行った後に、工程６４０に示されるように、ＩＬ−１ｒａに富む溶液をポリアクリルアミドビーズから単離する。ＩＬ−１ｒａに富む溶液のビーズからの分離は、図２の工程２５０に関して記載されたものなどの種々の手段を用いて行うことができる。工程６５０に示されるように、その後、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を患者に投与する。投与は、図２の工程２６０に関して記載されたものなどの種々の手段を用いて行うことができる。
【００７７】
ここで図７を参照すると、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法７００が示されている。工程７１０で患者から血液を採取する。白血球と血小板を含有する血小板に富む血漿を生成するために、工程７２０で示されるように、大体積濃縮デバイスを用いて血液を濾過し、血液成分の一部を効果的に除去する。
【００７８】
工程７２０で使用するのに好適なデバイスとしては、分離装置アセンブリおよび濃縮装置アセンブリが含まれる。分離装置アセンブリは、フェルトフィルターなどのフィルターに赤血球を捕捉する。このフィルターは、遠心分離中に赤血球を受容および捕捉するようなサイズの孔と通路を備えている。このデバイスは、血液を、フィルターを内面とするバランス円筒型分離チャンバー内で、ある速度で回転させることにより赤血球を捕捉するものであり、分離チャンバーとフィルターは放射状に延びるプレートにより分離区画内に分画される。この分離チャンバーの回転速度は、白血球を含む、血小板に富む血漿を分離区画内に分離することを可能とする。
【００７９】
濃縮装置アセンブリは、図２の工程２３０に関して記載されるように、乾燥ポリアクリルアミドビーズを用いて血小板に富む血漿中の液体を吸収することにより、血小板に富む血漿を濃縮することができる。血小板に富む血漿は回転濃縮チャンバー内でポリアクリルアミドビーズと接触させ、これらのビーズを撹拌しながら血小板に富む血漿濃縮液を生成する。次に、血小板に富む血漿とポリアクリルアミドビーズの混合物を、濃縮装置アセンブリ内にて電磁場で刺激することで、ビーズの膨潤と液体の吸収による溶液のさらなる濃縮を含め、ＩＬ−１ｒａの生成が可能となる。得られたＩＬ−１ｒａに富む溶液は、この濃縮チャンバーを、血小板に富む血漿濃縮液をビーズから分離するような速度で回転させることによって回収する。
【００８０】
このようなデバイスの例としては、Ｖｏｒｔｅｃｈ（商標）濃縮システム(Biomet Biologics, LLC, Warsaw, Indiana, USA)が挙げられ、また、２００６年８月１０日公開の米国特許出願公開第２００６／０１７５２４４号明細書(Dorian et al.)および２００６年８月１０日公開の米国特許出願公開第２００６／０１７５２４２号明細書(Dorian et al.)（これらは引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているものが挙げられる。これらのデバイスは、図２の工程２２０に関して記載された浮標を備えたチューブを使用する代わりに、またはその使用に加えて使用し、白血球と血小板を含む血小板に富む血漿を生成することができる。
【００８１】
工程７３０に示されるように、次に、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を患者に投与する。投与は、図２に工程２６０に関して記載されたものなどの種々の手段を用いて行うことができる。
【００８２】
図８を参照すれば、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための別法８００が示されている。工程８１０で示されるように、患者から血液を採取し、工程８２０で示されるように、ポリアクリルアミドビーズと合わせる。図２の工程２３０に関して記載されるように、ポリアクリルアミドビーズは乾燥状態であっても水和状態であってもよい。次に、工程８３０で、濾過を用いて一定体積の白血球とポリアクリルアミドビーズを赤血球から分離する。濾過は、白血球とビーズは捕捉するが、赤血球などの血液成分は１以上の濾液とともに通すための単一のフィルターまたはサイズ排除フィルター系を用いて行うことができる。濾過が完了したら、ＩＬ−１ｒａの生産を活性化し、かつさらに乾燥ポリアクリルアミドビーズを使用する場合には液体体積を減じるために、工程８４０で示されるように、一定体積の白血球とポリアクリルアミドビーズをインキュベートする。この時点で、工程８５０で示されるように、液体体積としての白血球に、その液体をポリアクリルアミドビーズと接触させながら、電磁場に曝してＩＬ−１ｒａを生成させる。また、工程８４０および８５０のインキュベーションの際に液体に血小板を加えてもよい。
【００８３】
工程８６０で、ＩＬ−１ｒａに富む溶液をポリアクリルアミドビーズから単離する。液体体積を排出してビーズを残すなどの種々の単離手段が使用可能である。場合によっては、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を排出する前に、遠心分離によってこれらのビーズを沈降させる。単離はまた濾過によって行ってもよく、例えば、遠心分離によって生じる力を使用するか、または真空を使用することにより、ポリアクリルアミドビーズはフィルターに保持され、ＩＬ−１ｒａに富む溶液はフィルターを通過する。場合によっては、ＩＬ−１ｒａに富む溶液は、工程８３０で用いたものと同じフィルターまたはフィルター系を通して溶液を引くことによってポリアクリルアミドビーズから単離する。ＩＬ−１ｒａに富む溶液は新しい回収チャンバーに引き込んでもよいし、または１以上の初期濾液を除去した場合には、それまでに使用した濾液回収チャンバーに引き込んでもよい。次に、工程８７０で示されるように、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を患者に投与する。
【００８４】
本方法およびシステムによって生成されたＩＬ−１ｒａに富む溶液の種々の調製物は、最終単離ＩＬ−１ｒａ産物を処理するための除菌フィルターを含めることによって除菌してもよい。同様に、抗生物質をインキュベーションの際にポリアクリルアミドビーズに含めてもよいし、または本明細書に記載の方法の種々の工程の１以上に添加してもよい。
【００８５】
本技術は、非自己材料または組換え材料を使用する場合に起こり得る免疫上の問題を軽減し、かつ／または実質的になくす自己ＩＬ−１ｒａに富む溶液を含め、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を調製するための改良法を提供する。さらに、このＩＬ−１ｒａは患者の細胞により生産されるので、グリコシル化などの天然の翻訳後修飾もすでに存在している。ほとんどの組換えタンパク質では、それらは原核生物宿主で生産されるので、そうではない。
【００８６】
本方法およびシステムで生成されるＩＬ−１ｒａに富む溶液は、生存全血細胞を含んでなること、ならびに全血に比べて高濃度のＩＬ−１ｒａ、可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦ−ｒＩおよびｓＴＮＦｒ−ＩＩを含む）、血漿タンパク質、および増殖因子を有することを特徴とし得る。しかしながら、ある任意の溶液中に存在する濃度は、本方法で使用する全血または血漿中に存在する成分の初期レベルによって変動し得ること、および濃度の上昇は初期レベルに対するものであることが理解される。
【００８７】
一般に、ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１ｒａに富む溶液中に少なくとも約１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも約２５，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも約３０，０００ｐｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。血漿タンパク質レベルは一般に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。特に、アルブミンは、約４０ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、フィブリノーゲンは、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。ｓＴＮＦ−ｒ１は一般に、少なくとも約１５００ｐｇ／ｍＬなど、全血よりも高い濃度で存在する。高濃度の増殖因子としては、血小板由来増殖因子ＰＧＤＦ−ＡＢ（５０，０００ｐｇ／ｍＬよりの高い、または７０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い濃度）；トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β１（１５０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い、または１９０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い濃度）；インスリン様増殖因子ＩＧＦ−１（約１４０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い、または１６０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い濃度）；塩基性線維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦ（１５０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い、または１７０，０００ｐｇ／ｍＬよりも高い濃度）；および血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ（１，２００ｐｇ／ｍＬよりも高い、または１，４００ｐｇ／ｍＬよりも高い濃度）が挙げられる。炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン１α、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子−αおよびインターロイキン１０）の濃度は一般に全血よりも有意に高くはなく、低い場合もある。各成分の具体的レベルの例を下表１に示す。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
ＩＬ−１ｒａに富む溶液は、ＩＬ−１の影響に介入し、インターロイキン−１受容体を介するシグナル伝達を減衰するために投与することができる。ＩＬ−１ｒａに富む溶液は、多くの組織および器官で発現されるインターロイキン−１型受容体に対するＩＬ−１の結合を競合的に阻害することによって、関節炎に関連する炎症および軟骨の分解を含む天然ＩＬ−１の生物活性を遮断するために使用することができる。例えば、骨吸収および組織損傷（ＩＬ−１によるプロテオグリカンの消失の結果としての軟骨分解など）をＩＬ−１ｒａに富む溶液の投与によって治療することができる。関節炎患者では、滑膜および滑液中に、内因性のＩＬ−１ｒａは、これらの患者のＩＬ−１濃度を打ち消すのに有効な濃度で見られないことがあり、従って、これらの症状およびこれらの部位を治療するために本ＩＬ−１ｒａに富む溶液を投与することができる。用量、投与、および処置頻度は、有効な治療を達成するために確立された医療行為に基づいて改変することができる。
【００９０】
本技術はさらに、ＩＬ−１ｒａを送達する方法を提供する。このような送達方法はＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの溶液を含むことができ、この場合、フィブリノーゲンが活性化されて、処置部位においてＩＬ−１ｒａを保護および保持するフィブリンマトリックスを形成する。ＩＬ−１ｒａが送達されると、フィブリンマトリックスがin situに形成され得る。
【００９１】
フィブリノーゲンは、凝固剤およびカルシウムで活性化することにより架橋されて三次元マトリックスとなり得る。好適な凝固剤としては、トロンビン（例えば、ウシトロンビン、組換えヒトトロンビン、プールヒトトロンビンまたは自己トロンビン）、自己凝固タンパク質、およびポリエチレングリコールが挙げられる。カルシウムは、塩化カルシウムなどのカルシウム塩の形態であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、凝固剤は、治療される患者から得られた血液に由来する凝固画分としての自己凝固タンパク質を含んでなる。好適な凝固画分は、全血または血漿をカルシウム溶液（例えば、エタノール中の塩化カルシウム）とともに血液単離デバイスに装入する工程；その全血または血漿を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱する工程；および凝固画分を単離する工程によって取得することができる。この単離は、加熱された全血または血漿を遠心分離することによって行うことができる。好適な単離デバイスを図９Ａおよび９Ｂに示す。このようなデバイスは、Biomet Biologics LLC, Warsaw, Indiana, USAにより販売されるＣｌｏｔａｌｙｓｔ（商標）自己トロンビン回収システムとして市販されている。
【００９３】
図９Ａおよび９Ｂを参照すると、この血液分離デバイス９００は一般に、メインチャンバー９０２を画定する第１の端部９０４と第２の端部９０６に沿った円筒壁を備えた本体を含む。第１の端部９０４には、第１のポート９０８、第２のポート９１０、第３のポート９１２、ベント９１３、およびフィルター９１４がある。第１のポート９０８、第２のポート９１０、第３のポート９１２、およびベント９１３はそれぞれ第１の端部９０４を通って延び、デバイス９００の外部とメインチャンバー９０２の間の流体連絡を可能とする。第１のポート９０８は第１のキャップ９１６で覆うことができ、第２のポート９１０は第２のキャップ９１８で覆うことができ、第３のポート９１２は第３のキャップ９２０で覆うことができる。第１のポート９０８のための第１の交換用キャップ９２２は、第１のテザー９２４で第１のポート９０８に取り付けることができる。第１のカバー９２６は、第１の交換用キャップ９２２が使用されていない場合には、第１の交換用キャップ９２２に固定することができる。第２のポート９１０のための第２の交換用キャップ９２８は、第２のテザー９３０で第２のポート９１０に取り付けることができる。第２のカバー９３２は、第２の交換用キャップ９２８が使用されていない場合には、第２の交換用キャップ９２８に固定することができる。
【００９４】
第１のポート９０８と第２のポート９１０はそれぞれ、ガラスビーズ９４０などの材料がメインチャンバー９０２の第１および第２のポート９０８および９１０から出ていかないようにストップバルブを含む。これらのバルブは、ダックビルバルブなどの好適な任意のバルブであり得る。
【００９５】
特に図９Ｂを参照すると、第３のポート９１２は、メインチャンバー９０２内を延びる延長チューブ部分９３４を含む。この延長部９３４は、第１の端部９０４からメインチャンバー９０２内の深部まで延び、トロンビンおよびその他の血液凝固因子などの選択材料をメインチャンバー９０２内から抜き取ることを可能とする。例えば、また、以下にさらに記載されるように、メインチャンバー９０２が全血、試薬（例えば、エタノールまたは他の好適な溶媒に溶かしたカルシウム化合物を含んでなるカルシウム溶液）、抗凝固剤、およびガラスビーズを含む場合には、この混合物をインキュベーションおよび遠心分離すると、ほとんどが赤血球、血漿、およびガラスビーズを含む凝固塊がメインチャンバー９０２の第２の端部９０６に形成される。これらの凝固塊の上の、第１の端部９０４に最も近い凝固塊側に、トロンビンおよび他の凝固因子を含んでなる流出液が形成される。第２の端部９０６の凝固塊はこの流出液から視覚的に識別することができる。延長チューブ部分９３４を用いてトロンビンおよびその他の凝固因子を抽出するために、延長チューブ部分９３４を、メインチャンバー９０２内の、凝固塊に最も近い流出液の部分とほぼ同一のレベルの深さまで延ばす。
【００９６】
チップ９３６は延長部９３４の遠位端に設けられている。このチップ９３６は延長部９３４からほぼ直角に延びる。チップはくぼみまたは刻み目９３７を含む。２つのサポートポスト９３９が延長部９３４からチップ９３６の周りに半径方向に延び、メインチャンバー９０２の内面に接触している。サポートポスト９３９は、チップ９３６をメインチャンバー９０２内の一定の位置に保持するために、メインチャンバー９０２の内面に対してチップ９３６を偏向させる。チップ９３６がメインチャンバー９０２の内面に接触している場合、刻み目９３７は、メインチャンバー９０２の内壁とチップ９３６の間に開口部または空間を設け、刻み目９３７からチップ９３６へ材料を通過させる。チップ９３６は、特にチップ９３６周辺のさらなる材料を刻み目９３７に持ってくるようにメインチャンバー９０２を傾ける際に、延長部９３４から抜き取られる材料の量を最大にする助けをする。これら２つのサポートポスト９３９とチップ９３６は、延長部９３４をメインチャンバー９０２の中心に置く助けをする。
【００９７】
ポート９０８、９１０、および９１２は、シリンジなどの好適な流体送達または輸送デバイスと協同するサイズとする。例えば、第１のポート９０８は、第１のポート９０８からメインチャンバー９０２へ試薬を通過させるように試薬シリンジと協同するサイズとすることができ；第２のポート９１０は、第２のポート９１０からメインチャンバー９０２へ血液を通過させるように血液シリンジと協同するサイズとすることができ；また、第３のポート９１２は、メインチャンバー９０２からトロンビンおよびその他の凝固因子などの血液成分を抜き取らせるようにシリンジと協同するサイズとすることができる。
【００９８】
フィルター９１４は、メインチャンバー９０２内から第３のポート９１２を経てフィルターを取り出す場合に、濾材として好適な任意のフィルターであり得る。フィルター９１４はポリエステルスクリーンを含み、このスクリーンは第１のポート９０８と第２のポート９１０の上に取り付けられる。このポリエステルスクリーンは、約１５ミクロン〜約２５ミクロンの範囲の大きさの開口部を含む。例えば、この開口部は約１７ミクロンの大きさであり得る。フィルター９１４の代わりに、またはそれに加えて、フィルター９１４と類似のフィルターを延長部９３４またはチップ９３６内に設けることもできる。
【００９９】
メインチャンバー９０２は、ガラスビーズ９４０などの活性化剤をさらに含む。このガラスビーズの負電荷表面は凝固および血液凝固因子の放出を活性化し、メインチャンバー９０２の第２の端部９０６に凝固塊を形成する。ガラスビーズ９４０は、ボロシリケートビーズなど、任意の好適なタイプのガラスビーズであり得る。
【０１００】
図９Ａおよび９Ｂのデバイスを用いた凝固剤の例示的生産方法は、塩化カルシウムとエタノールを含んでなる試薬を第１のポート９０８からメインチャンバー９０２に注入することで始まる。試薬を注入した後、第１のポート９０８を第１の交換用キャップ９２２を用いて塞ぐ。抗凝固剤を含む血液を第２のポート９１０からメインチャンバー９０２に注入する。血液を注入した後、第２のポート９１０を第２の交換用キャップ９２８を用いて塞ぐ。場合により、シリンジと血液分離デバイス９００を約２５℃の温度に予熱してもよい。
【０１０１】
血液成分分離デバイス９００の内容物を、このデバイス９００を繰り返し（例えば、約１２回）転倒させることにより混合して血液とガラスビーズを接触させる。混合の後、デバイスをインキュベートする。インキュベーション過程は、デバイス９００の内容物が約２５℃で約１５分間加熱される温度および時間であり得る。このインキュベーション時間が終了すると、赤血球、血漿およびガラスビーズの凝固塊がメインチャンバー９０２の第２の端部９０６に生じる。インキュベーションが完了した後、デバイス９００を、存在し得るゲルを取り除き、崩壊させるように十分に振盪する。次に、デバイス９００を好適な遠心機に入れ、約３２００ＲＰＭで約１５分間回転させ、トロンビンを残りの血液成分から分離する。遠心分離後、トロンビンおよびその他の凝固因子の流出液を凝固塊から分離する。遠心分離が完了した後に、第３のキャップ９２０を取り外し、シリンジなどの好適な抽出デバイスを用いて、トロンビンおよびその他の凝固因子の流出液を第３のポート９１２、延長部９３４、およびチップ９３６の経路により、メインチャンバー９０２から取り出す。
【０１０２】
従って、本技術のＩＬ−１ｒａに富む溶液の送達は、ＩＬ−１ｒａ、フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウムを投与して、処置部位にフィブリンマトリックスを形成させることを含み得る。外因性フィブリノーゲン（例えば、ウシトロンビン、好ましくは、１０００Ｕ／ｍＬ）はＩＬ−１ｒａ溶液に加えてよい。または、ＩＬ−１ｒａ溶液がすでに十分な量の内因性フィブリノーゲンを含んでいる場合もある。ＩＬ−１ｒａおよび／もしくはフィブリノーゲンの溶液またはその調製物がＡＣＤ−Ａ（抗凝固剤クエン酸ブドウ糖溶液）などの抗凝固剤を含む場合には、フィブリノーゲンを活性化するためのカルシウム（トロンビンを伴う）の添加は、抗凝固剤中のキレーターの有効量を越えるべきである。
【０１０３】
本方法を用いて調製されるＩＬ−１ｒａに富む溶液は、全血に比べて高い濃度の内因性フィブリノーゲンを提供することができる。例えば、ポリアクリルアミドビーズと図５Ａおよび５Ｂに示されるデバイスを用いる上記方法の結果として、全血に比べてＩＬ−１ｒａとフィブリノーゲンの双方に富む溶液が得られる。このようなデバイスは、Biomet Biologics, LLC (Warsaw, Indiana, USA)からＰｌａｓｍａｘ（商標）プラス血漿濃縮装置として市販されており、２００６年８月１０日公開の米国特許出願公開第２００６／０１７５２６８号明細書(Dorian et al.)；および２００６年１１月２日公開の米国特許出願公開第２００６／０２４３６７６号明細書(Swift et al.)（双方とも引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているデバイスおよび使用方法が含まれる。このＩＬ−１ｒａに富み、かつ、フィブリノーゲンに富む溶液を、最初の全血が由来する被験体を治療するために使用することができる（すなわち、自己治療）。
【０１０４】
ポリアクリルアミドビーズをＰｌａｓｍａｘ（商標）プラス血漿濃縮装置を用いる上記方法を用いて調製されたＩＬ−１ｒａに富み、かつ、フィブリノーゲンに富む溶液は、全血に比べてフィブリノーゲン濃度に約３倍（３×）の増加を有する溶液を提供する。３倍高い濃度のフィブリノーゲンから形成されるフィブリンマトリックス／血餅は、基準のフィブリノーゲンレベルから形成されたフィブリン血餅よりも堅固であり、崩壊および吸収に対しても耐性が高い。
【０１０５】
図１０を参照すると、ＩＬ−１ｒａ  １０００を送達するための概略図が示されている。工程１０１０で、ＩＬ−１ｒａの溶液（ＩＬ−１ｒａ）を準備する。このＩＬ−１ｒａ溶液は、本開示に記載されている方法を用いて調製することができる。工程１０２０で、外因性フィブリノーゲンをこのＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ）溶液に加える。外因性フィブリノーゲンは、前記のＩＬ−１ｒａ溶液とは異なる供給源（異なる患者など）から調製してもよいし、またはウシ起源であってもよい。あるいは、外因性フィブリノーゲンは、前記のＩＬ−１ｒａ溶液と同じ供給源または患者であるが、異なる出発材料から調製してもよい。例えば、ＩＬ−１ｒａ溶液および外因性フィブリノーゲンは、同じ患者から採取した異なる血液サンプルから調製してもよい。あるいは、工程１０３０に示されるように、ＩＬ−１ｒａとフィブリノーゲンの双方が富化された溶液を、例えば、本明細書に記載されるように、白血球を含んでなる液体、ポリアクリルアミドビーズ、電磁場刺激、およびＰｌａｓｍａｘ（商標）デバイスを使用することによって調製する。工程１０４０でトロンビンとカルシウムの溶液を準備し、処置部位にＩＬ−１ｒａ溶液とともに同時投与する。その後、工程１０５０に示されるように、合わせた溶液中のフィブリンをin situで架橋し、処置部位にマトリックスを形成させ、このマトリックスがＩＬ−１ｒａを保護し、保持し、放出を遅延させる働きをする。
【０１０６】
ＩＬ−１ｒａの送達は、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの第１の溶液と、トロンビンおよびカルシウムの第２の溶液とを被験体に同時投与することを含み得る。このような実施形態では、第１の溶液と第２の溶液は、溶液が混合され、処置部位に注入される後までフィブリノーゲンがフィブリンマトリックスを形成しないように、投与するまで、別々に維持される。これらの溶液は処置部位に送達する直前に混合してもよいし、または処置部位で混合してもよい。
【０１０７】
図１１を参照すると、二連シリンジデバイス１１００が医学上適当な手順で使用可能である。この二連シリンジデバイス１１００は、第１の円筒部１１０５と第２の円筒部１１１０を含み、双方とも混合チャンバー１１１５に接続されている。第１のプランジャー１１２０が第１の円筒部１１０５内に挿入され、第２のプランジャー１１２５が第２の円筒部１１１０内に挿入されている。第１のプランジャー１１２０と第２のプランジャー１１２５とは部材１１３０により接続されている。混合チャンバー１１１５は、カニューレ１１３５に接続している。二連シリンジデバイス１１００は、第１の円筒部１１０５内にＩＬ−１ｒａとフィブリノーゲの第１の溶液１１４０を含み、第２の円筒部１１１０内にトロンビンとカルシウムの第２の溶液１１４５を含む。同時投与の際、部材１１３０は混合チャンバー１１１５に向かって押され、その結果、第１の円筒部１１０５と第２の円筒部１１１０の双方の内容物が混合チャンバー１１１５に押し出される。混合された第１の溶液１１４０と第２の溶液１１４５はカニューレ１１３５を通り、患者の関節１１６０内の処置部位１１５５においてフィブリンマトリックス１１５０を形成する。
【０１０８】
図１１に示される実施形態では、患者の関節１１６０は、大腿１１６５、脛骨１１７０、腓骨１１７５、膝蓋骨１１８０、および軟骨１１８５を含む膝関節である。しかしながら、処置部位１１５５は、肩、肘、手関節、足関節、股関節、および脊柱を含め、ヒトまたは動物患者のいずれの関節であってもよいと理解するべきでる。さらに、本方法は、筋肉および腱などの他の組織内の部位における炎症を治療するためにも使用することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、二連シリンジデバイス１１００は、患者の関節１１６０の軟組織を貫通して、混合された第１の溶液１１４０と第２の溶液１１４５を投与するために用いられる。例えば、カニューレ１１３５は、皮下針などの中空針であり得る。あるいは、カニューレ１１３５の挿入を可能とするために患者の関節１１６０を切開してもよく、これにより、二連シリンジデバイス１１００を処置部位１１５５に挿入することができる。
【０１１０】
示されていないいくつかの実施形態では、二連シリンジデバイス１１００は混合チャンバー１１１５を備えず、その代わりに、２本のカニューレ１１３５を含み、１本が各円筒部から処置部位１１５５に達する。この場合、第１の溶液１１４０と第２の溶液１１４５はこれらの別個のカニューレ１１３５を通り、処置部位１１５５で混ざり合い、フィブリンマトリックス１１５０を形成する。いくつかの実施形態では、二連シリンジデバイスの代わりに２つの別個の一円筒型シリンジデバイスが使用される。
【０１１１】
本送達方法で形成されるフィブリンマトリックスは、炎症を増大させることなく処置部位に留まることができる。フィブリンマトリックス内のＩＬ−１ｒａは酵素分解から保護され、フィブリンマトリックスに結合することができ、これにより、ＩＬ−１ｒａはそのマトリックスから経時的にゆっくり放出される。これらの方法は、結果として、フィブリンマトリックス担体を含まないＩＬ−１ｒａの注射に比べて、ＩＬ−１ｒａの持続的送達を提供し得る。
【０１１２】
以下の特定の実施例は、本技術の組成物および方法をいかにして製造および使用するかを例示する目的で提供され、そうではないことが明示されない限り、与えられた本技術の実施形態が製造もしくは試験されたこと、またはされなかったことの表明を意図するものではない。
【実施例】
【０１１３】
実施例１−ＩＬ−１ｒａに富む溶液の特性決定
インターロイキン−Ｉ受容体アンタゴニストに富む溶液は、同意を得た７名の提供者から調製した。５ｍＬの抗凝固剤クエン酸ブドウ糖溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ、Citra Anticoagulant, Inc., Braintree, MA）の入った６０ｃｃシリンジに血液（５５ｍＬ）を採取した。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）は、ＧＰＳ  ＩＩＩ血小板濃度システム（８００−１  ００３Ａ、Biomet Biologics, Warsaw, IN）を使用説明書に従って用いて作製した。この溶液は、１グラムのポリアクリルアミドビーズ(Biomet Biologics, Warsaw, IN)を含有する改変型Ｐｌａｓｍａｘデバイスに６ｍＬのＰＲＰを加えることによって生成した。ＩＬ−Ｉｒａ溶液をＰｌａｓｍａｘデバイスから取り出し、アッセイのために−５０℃で冷凍した。サイトカイン含量は、１６プレックスＥＬＩＳＡ(Searchlight Protein Array, Aushon Biosystems, Billerica, MA)にてアッセイした。分析物としては、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−Ｉ３、ＩＬ−Ｉｒａ、ＩＦＮ−γ、ｓＴＮＦ−ＲＩ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ｂＦＧＦ、ＴＢＦ−β１、およびＴＢＦ−β２が挙げられた。
【０１１４】
この溶液は、同化性サイトカイン（ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２（表２参照））および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ、ｓＴＮＦ−ＲＩ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、（表３参照））の双方を含んでおり、大用量の異化性サイトカイン（ＩＬ−ｌα、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（表４参照））は発現しなかった。抗炎症性サイトカインＩＬ−ＩｒａおよびｓＴＮＦ−Ｒは総てｎｇ／ｍＬ量で検出されたのに対し、異化性分析物は総てｐｇ／ｍＬ量であった。しかしながら、ドナー間の変動は検出されなかった。異化性サイトカインＩＬ−ｌおよびＴＮＦ−ａと、抗炎症性分析物ＩＬ−ｌｒａおよびｓＴＮＦ−Ｒとの間の相関を比較したが、大きな相関は検出されなかった（表５）。平均で、ＩＬ−ｌｒａはＩＬ−１αより１３，２６０倍多く、ＩＬ−１βより約７，５６１倍多かった。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
実施例２−ウマ血液から作製されたインターロイキン−ｌ受容体アンタゴニストに富む溶液
インターロイキン−Ｉ受容体アンタゴニストに富む溶液をウマ血液から調製した。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）は、ＧＰＳ  １１Ｉ血小板濃度システム（８００１００３Ａ、Biomet Biologics, Warsaw, IN)を使用説明書に従って用いて作製した。この溶液は、１グラムのポリアクリルアミドビーズ(Biomet Biologics, Warsaw, IN)を含有する改変型Ｐｌａｓｍａｘデバイスに６ｍＬのＰＲＰを加えることによって生成した。ＩＬ−Ｉｒａ溶液をＰｌａｓｍａｘデバイスから取り出し、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｑｕｉｎｅ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット、R&D Systems, Minneapolis, MN）のために−５０℃で冷凍した。基準の全血、ＰＲＰ、およびＩＬ−Ｉｒａ溶液でウマＩＬ−ｌｒａを測定した。用いたデバイスはインターロイキン−Ｉ受容体アンタゴニストに富む溶液を生成することができた（図１２）。
【０１２０】
実施例３−血小板に富む血漿からのＩＬ−１ｒａの生成
ＩＬ−１ｒａに富む溶液を次のようにして作製する。ＡＣＤ−Ａ(Braintree, Massachusetts, USA)で抗凝固処理（１０％）をした全血（７０ｍＬ）を、５名の健康なボランティアから採取する。一部（１０ｍＬ）を全血測定用に取っておく。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）（６ｍＬ）をＧＰＳ（商標）ＩＩシステム(Biomet Biologics, LLC, Warsaw, Indiana, USA)を用いて作製する。Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, Higgins J. “Producing Accurate Platelet Counts for Platelet Rich Plasma: Validation of a Hematology Analyzer and Preparation Techniques for Counting” J. Craniofac. Surg. (2005) Sep. 16(5):749-56に記載されているような検証済み手順に従い、総血球数を全血およびＰＲＰサンプルに関して補正する。
【０１２１】
ＰＲＰ生産の後、５ｍＬのＰＲＰを改変型血漿濃縮デバイス（Ｐｌａｓｍａｘ（商標）、Biomet Biologics LLC, Warsaw, Indiana, USA）に加え、デバイス内でポリアクリルアミド脱水ビーズとともに室温で２４時間インキュベートする。電磁場刺激は、刺激コイルを用い、このＰＲＰとポリアクリルアミドビーズ間にパルス電磁場の形態でかける。パルス電磁場のパルス持続時間は約２２５マイクロ秒／パルスである。これらのパルスは電磁バーストから構成され、各バーストは約２０パルスを含む。各バーストは約１５ヘルツの周波数で反復され、その持続時間は約４．５ミリ秒である。ポリアクリルアミドビーズとの接触および電磁場による刺激の後、血漿濃縮デバイスを遠心分離して血清画分を分離する。
【０１２２】
０時間での基準ＩＬ−１ｒａレベルを分析するため、全血およびＰＲＰサンプルを５０μＬのトロンビンおよび１０％ＣａＣｌ２（１，０００単位／ｍＬ）で活性化させる。血餅を形成させ、室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、血餅を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。これらの血餅から血清を回収し、ＥＬＩＳＡ分析用に保持する。血漿濃縮装置から得た血清画分はトロンビンによる活性化の必要はなく、そのまま供試する。ＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１ｒａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）キット、R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA）を用い、総てのサンプルのＩＬ−１ｒａを分析する。
【０１２３】
ＰＲＰサンプルは、血小板に約８倍の増加、白血球（ＷＢＣ）に約５倍の増加、ＷＢＣの単球画分に約９倍の増加、およびＷＢＣｓのＰＭＮ画分に約３倍の増加をもたらす。全血およびＰＲＰサンプルにおけるＩＬ−１ｒａ生産は、ＷＢＣ濃度に最も密接に相関している。ＰＲＰにおける５倍の増加は、おそらくＷＢＣｓの増加によるものであり、全血およびＰＲＰ双方のＩＬ−１ｒａ値は基準のＩＬ−１ｒａ含量と考えることができる。これは、血漿濃縮装置でのインキュベーション後のＩＬ−１ｒａにおける１９５倍の増加とは対照的である。この血漿濃縮デバイスは一般に、脱水工程によって生じる体積減のために血漿タンパク質濃度に３倍の増加をもたらす。このように体積が３分の１になることでは、ＩＬ−１ｒａ量に見られる増加レベルを説明できない。従って、この増加レベルは、固相抽出剤（例えば、ポリアクリルアミドビーズ）との接触および電磁場刺激中の、ＷＢＣｓにＩＬ−１ｒａを産生させる刺激を示すものである。
【０１２４】
相関分析は、ＩＬ−１ｒａ生産が、血小板含量よりもＷＢＣの増加に密接な相関があることを示す。これらのＩＬ−１ｒａレベルは、ＰＲＰ中の単球集団で見られるほどの密接な相関がない。単球が活性化されず、血清は血漿のトロンビン活性化により回収されることから、このことは驚くことではない。しかしながら、単球は、ひと度血漿濃縮デバイスで活性化されると、考えられる著しいＩＬ−１ｒａ生産に関与する可能性がある。
【０１２５】
実施例４−濃縮血漿マトリックスからのＩＬ−１ｒａの溶出
抗凝固処理血液（１２０ｃｃ）を５名の提供者から採取する。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）は、ＧＰＳ（商標）ＩＩＩディスポーザブル(Biomet Biologics LLC, Warsaw, Indiana, USA)を用いて調製する。ＰＲＰを改変型血漿濃縮デバイス（Ｐｌａｓｍａｘ（商標）、Biomet Biologics LLC, Warsaw, Indiana, USA）に装入し、処理を行う。産出物を次の４群に分ける：トロンビン活性化（１Ｍ  ＣａＣｌ２中１０００Ｕ／ｍＬ）有りおよび無しの濃縮血漿中のＩＬ−１ｒａ、またはトロンビン活性化有りおよび無しの細胞不含ＩＬ−１ｒａ。ＩＬ−１ｒａを、ＥＬＩＳＡ(R&D Systems)を用いて経時的に測定する。
【０１２６】
ＰＲＰをＰｌａｓｍａｘ（商標）デバイス内でポリアクリルアミドビーズと接触させ、同時に容量結合型電磁場を用いて電磁場刺激を与える。
【０１２７】
凝固しなかったＰＲＰは２４時間で平均約５０ｎｇ産出する。細胞不含サンプルは、２４時間で変化はなく、約３４ｎｇ産出する。凝固すると、ＩＬ−１ｒａの溶出は緩慢となり、１０時間後に溶出されるのは約３０％に過ぎない。細胞不含サンプルにおける放出も遅延するが、１０時間後には利用可能なＩＬ−１ｒａが１００％溶出する。
【０１２８】
実施例５−脂肪組織からのＩＬ−１ｒａの生成
脂肪細胞は次のようにして調製する。脂肪組織を細かく刻み（約１ｃｍ３）、３７℃の水浴にて１８０分間、間欠的機械撹拌下、２ｍｇ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼ(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)中で消化する。消化は、培地または血液由来溶液を添加することによって中和することができる。この細胞懸濁液を遠心分離（２５℃、３００×ｇで７分）した後、細胞ペレットから上清を除去する。次に、このペレットを適合する溶液に再懸濁させ、脂肪細胞を含んでなる液体体積を得る。
【０１２９】
あるいは、このペレットを被験体から得た全血に懸濁させ、Biomet Biologics, Inc. (Warsaw, Ind.)製のＧＰＳ（商標）血小板濃縮システムに添加する。遠心分離の後、血小板に富む血漿層（脂肪細胞も含有する）をこのシステムから抽出する。
【０１３０】
次に、脂肪細胞（場合により血小板に富む血漿を含む）をポリアクリルアミドビーズと合わせ、１対のヘルムヘルツコイルを使用することによりパルス電磁場に曝し、ＩＬ−１ｒａの生産を刺激する。この液体溶液から脂肪細胞およびポリアクリルアミドビーズを分離してＩＬ−１ｒａに富む溶液を得る。
【０１３１】
実施例６−脂肪穿刺物からのＩＬ−１ｒａの生成
ＩＬ−１ｒａの治療用組成物を脂肪細胞から生成する。ヒト脂肪細胞の単離は、脂肪穿刺／脂肪吸引手順からヒト皮下脂肪組織を取得すること、およびその組織をＩ型コラゲナーゼ溶液(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)中、３７℃で１時間、穏やかな撹拌下で消化することにより行う。解離した細胞を５００μｍおよび２５０μｍのＮｉｔｅｘフィルターで濾過する。この画分を３００×ｇで５分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを血液由来溶液などの適合する溶液に再懸濁させる。
【０１３２】
脂肪細胞を、図３Ａおよび３Ｂに示されているものなどのデバイス内でポリアクリルアミドビーズと合わせる。脂肪細胞を含有する流体３５５を入口３３０から上部チャンバーに注入し、ポリアクリルアミドビーズ３５０と混合する。流体３５５およびポリアクリルアミドビーズ３５０は、撹拌装置軸３２０とゲルビーズ撹拌装置３２５を回転させて流体３５５とビーズ３５０の混合を助けることにより混合することができる。次に、混合された流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０とを電磁場で刺激する。電気刺激は、刺激コイルを用い、流体３５５（ポリアクリルアミドビーズ３５０と接触している脂肪細胞を含んでなる液体）にパルス電磁場の形態でかける。パルス電磁場のパルス持続時間は約２２５マイクロ秒／パルスである。これらのパルスは電磁バーストから構成され、各バーストは約２０パルスを含む。各バーストは約１５ヘルツの周波数で反復され、その持続時間は約４．５ミリ秒である。流体３５５はポリアクリルアミドビーズ３５０との接触を維持し、所望の時間、所望の温度にてパルス電磁場で刺激し、ＩＬ−１ｒａを生成する。
【０１３３】
次に、デバイス３００を遠心分離すると、液体は下部チャンバー３１０へと通過するのに対し、ポリアクリルアミドビーズ３５０はフィルター３４５に保持され、それによりポリアクリルアミドビーズ３５０を、生じたＩＬ−１ｒａ溶液３６０から分離し、これを下部チャンバー３１０に集める。ＩＬ−１ｒａに富む溶液３６０は、デバイスの出口３３５から取り出すことができる。
【０１３４】
本明細書に記載の実施例および他の実施形態は例示であって、本技術の組成物および方法の全範囲を示す上で限定を意図するものではない。本技術の範囲内で実施形態、材料、組成物および方法の特定の等価な変更、改変および変形を行ってもよく、実質的に同等の結果が得られる。
【０１３５】
用語の非限定的記述
本明細書で用いる見出し（「緒論」および「概要」など）および小見出しは、単に本開示の範囲内の論点の全般的構成を意図するものであって、本技術またはその任意の態様の開示を限定することを意図するものではない。特に、「緒論」に開示される主題は新規な技術を含み、従来技術の記述を構成するものではないと考えられる。「概要」に開示される主題は、本技術またはその任意の実施形態の全範囲の網羅的または完全な開示ではない。本明細書の一節内の材料の、特定の有用性を持つとしての分類または記述は便宜上のものであって、その材料を任意の所与の組成物として使用する場合に、本明細書におけるその分類に従って必ずまたは単独で機能しなければならないと断定すべきではない。
【０１３６】
本記載および特定の実施例は、本技術の実施形態を示すが、単に例示を意図するものであって、本技術の範囲の限定を意図するものではない。さらに、述べられた特徴を有する複数の実施形態の記述は、付加的特徴を有する他の実施形態、または述べられた特徴の違う組合せを組み込んだ他の実施形態を排除することを意図するものではない。特定の実施例は、本技術の組成物および方法をいかにして製造および使用するかを例示する目的で提供され、そうではないことが明示されない限り、与えられた本技術の実施形態が製造もしくは試験されたこと、またはされなかったことの表明を意図するものではない。
【０１３７】
本明細書において、「好む」または「好ましい」とは、特定の状況下で特定の利益を提供する本技術の実施形態を意味する。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態が好ましい場合もある。さらに、１以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、本技術の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【０１３８】
本明細書において、「含む」およびその変形は非限定的であることを意図し、従って、ある一覧における項目の列挙は、本技術の材料、組成物、デバイス、および方法に有用であり得る他の同様の項目を排除するものではない。同様に、「できる」および「してよい」およびそれらの変形も非限定的であることを意図し、従って、ある実施形態は特定の要素または特徴を含んでなることができる、または含んでなって良いとは、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を排除するものではない。
【０１３９】
本明細書では、本技術の実施形態を記載および特許請求するために、含む、含有するまたは有するなどの非制限的用語の同義語としてオープンエンドの用語「含んでなる」が使用されるが、実施形態は、代わりに、「からなる」または「から本質的になる」などのより制限的な用語を用いて記載し得る。よって、材料、成分または工程段階を列挙する所与の実施形態のいずれに関しても、本技術はまた特に、そのような材料、成分もしくは工程からなり、またはから本質的になり、そのような付加的な材料、成分もしくは工程を、たとえそのような付加的な材料、成分または工程が本出願に明示されていなくとも、排除する（からなるの場合）、また、その実施形態の重要な特性に影響を及ぼす付加的な材料、成分または工程を排除する（から本質的になるの場合）実施形態も含む。例えば、要素Ａ、ＢおよびＣを列挙する組成物または工程の列挙は特に、Ａ、ＢおよびＣからなる、および本質的になり、当技術分野で列挙される可能性のある要素Ｄを、たとえその要素Ｄが本明細書において排除されることが明示されていなくとも、排除する実施形態を想定する。
【０１４０】
本明細書に言及される場合、総ての組成パーセンテージは特に断りのない限り、全組成物の重量に対するものである。範囲の開示は、特に断りのない限り、端点を含み、その全範囲内の総ての異なる値およびさらに分割された範囲を含む。よって、例えば、「Ａ〜Ｂ」または「約Ａ〜約Ｂ」の範囲は、ＡおよびＢを含む。特定のパラメーター（温度、分子量、重量パーセンテージなど）の値および値の範囲の開示は、本明細書において有用な他の値および値の範囲を排除するものではない。所与のパラメーターに関して例示された特定の２つ以上の値は、そのパラメーターに関して特許請求され得る値の範囲の端点を定義し得ると想定される。例えば、パラメーターＸが本明細書で値Ａを有するとして例示され、また、値Ｚを有するとして例示される場合、パラメーターＸは約Ａ〜約Ｚの範囲の値を有し得ると想定される。同様に、あるパラメーターに関する値の２つ以上の範囲（そのような範囲が入れ子状態であっても、重複していても、または異なっても）の開示は、開示された範囲の端点を用いて特許請求され得る値に対して可能性のある総ての範囲の組合せを包含すると想定される。例えば、パラメーターＸが１〜１０、または２〜９、または３〜８の範囲の値を有するとして例示される場合、パラメーターＸは、１〜９、１〜８、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜８、２〜３、３〜１０、および３〜９を含む、他の値の範囲を有し得ることもまた想定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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