(57)【要約】  本発明は、真核細胞を培養するための培養培地における、増殖および産生促進成分としての、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択されるアミノ酸誘導体の使用に関する。本発明は、さらに、少なくとも０．００１ｍｇ／ｌのレベルで、これらのアミノ酸誘導体を含有する培養培地に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞を培養するための無血清培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および／または産生改善成分として、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなり、前記１種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、１００ｇのタンパク質性の物質当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇの誘導体の濃度を有するプロセス。
【請求項２】
前記Ｎ−アセチルアミノ酸が、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニンおよびＮ−アセチル−オルニチンから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
真核細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および／または産生改善成分として、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−オルニチンおよびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなり、前記１種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、１００ｇのタンパク質性の物質当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇの誘導体の濃度を有するプロセス。
【請求項４】
前記γ−グルタミルアミノ酸が、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンから選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ピログルタミルアミノ酸が、ピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシンから選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチドが、バリニル−グルタメート、グリシルプロリンおよびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸が、それぞれ、５−オキソプロリンおよびＳ−オキソ−メチオニン、ならびにβ−アラニン、２−アミノブチラートおよびホモセリンから選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
【請求項９】
少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは少なくとも５０ｍｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１５０ｇ、より好ましくは２５０ｍｇ〜６０ｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、請求項９に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇ、または乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含有する、真核細胞を培養するための培養培地。
【請求項１２】
０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１１に記載の培養培地。
【請求項１３】
０．０３ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌの、ピログルタミル−グリシン、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１１または１２に記載の培養培地。
【請求項１４】
０．０２ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの、バリニルグルタメートβ−アラニン、２−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸から選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項１５】
ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖、抗生物質およびタンパク質加水分解物から選択される、培養培地の他の従来の構成成分をさらに含有する、請求項８から１４のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項１６】
インビトロで真核細胞を培養する方法であって、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の培養培地において前記細胞を増殖させることを含み、前記真核細胞が、好ましくは、動物細胞、より好ましくは哺乳類および／または昆虫細胞を含む方法。
【請求項１７】
前記培養培地が、コムギ、ダイズ、ワタ、またはエンドウマメタンパク質由来の加水分解物を少なくともさらに含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所望のタンパク質産物を作製するための方法であって、請求項１６または１７に記載の方法を使用して、前記タンパク質産物を産生する真核細胞を培養すること、および前記培養培地から前記タンパク質産物を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核、特に動物細胞を培養するための培地の作製、ならびにそのように作製された細胞培養培地および真核、特に動物細胞のインビトロでの培養のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類、植物または昆虫細胞を培養することによる、貴重な生化学的物質および生物医薬品、例えば抗体および抗生物質の作製は、適切な培養培地を必要とする。細胞培養培地配合物に、不確定な構成要素、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）、いくつかの動物由来のタンパク質および／またはウシ起源のタンパク質加水分解物を含めた、一連の添加剤を補充してきた。
【０００３】
動物細胞培養において使用される血清または血清由来の物質、例えばアルブミン、トランスフェリンまたはインスリンは、培養物およびこれらから得られる生物医薬産物を汚染し得る不必要な作用物質を含有する可能性がある。さらに、ウシ由来のタンパク質産物、例えばウシの肉またはコラーゲン加水分解物は、ＢＳＥ汚染のリスクを有する。さらに、ヒト血清由来の添加剤は、血清によって伝染し得る、肝炎およびＨＩＶを含めた、すべての知られているウイルスに関して試験しなければならない。
【０００４】
結論として、すべての血清由来の産物は、未知の作用物質によって汚染されている可能性がある。細胞培養におけるヒトまたは他の動物源由来の血清またはタンパク質の添加剤の場合、多くの問題（例えば種々の回分の品質および組成の変動およびウイルス、マイコプラズマまたはＢＳＥでの汚染のリスク）が起こり得る。したがって、植物タンパク質加水分解物または植物ペプトンは、動物構成要素を含むべきでない培養培地において通例使用される。
【０００５】
しかしながら、動物由来の細胞培養添加剤を有さない培地における動物細胞の増殖は、必ずしも満足のいくものであるとは限らない。インビトロで培養される動物細胞は、塊で増殖することが頻繁に観察される。これは、塊の中心にある細胞が、栄養素を奪われて死ぬことになるので、最適とは言えない条件であるとみなされる。下流プロセスの間に管類またはフィルターを詰まらせるリスクもある。細胞の減少した生存能力は、それらの外観によっても評価することができる。減少した生存能力を有する細胞は、不規則な形、すなわち円形ではない形を示し、さらに、完全に明るい透明な細胞含有物を有する正常な細胞とは対照的である、「粒状化した」細胞含有物を有する。
【０００６】
ＷＯ２００６／１２３９２６は、好ましくはナタネ、コムギまたはキャラウェー由来の少なくとも１つの植物性タンパク質源に基づく、微生物および／または細胞を増殖および／または培養するためのペプチド組成物に関する。コムギ加水分解物の効果は、例において扱う。
【０００７】
ＷＯ２００６／１２８７６４は、複合タンパク質を産生する哺乳類細胞を培養するためのプロセスを開示しており、そこでは１種以上の植物由来のペプトンを、細胞培養物に与える。植物源ダイズ、綿実およびエンドウマメが、例示されている。ＣＨＯ細胞の培養に及ぼすダイズ加水分解物の効果が、添付の例において示されている。
【０００８】
ＷＯ２００９／０２０３８９は、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培養培地の構成成分として、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ（ヒマワリ）種のタンパク質加水分解物の使用を開示している。
【０００９】
ＵＳ５，５３４，５３８は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する細胞培養培地における、Ｎ−アシル化ジペプチド、例えばＮ−アセチル−アラニル−グルタミンの使用に関し、これは、非アシル化ジペプチドよりも加熱滅菌に対して安定である。非アシル化ジペプチドおよび遊離アミノ酸同等物と比較した、細胞増殖に及ぼす効果は観察されなかった。
【００１０】
ＷＯ２００９／０３３０２４Ａ１は、細胞培養培地における、動物由来のペプトンの分画によって得られた、アルギニン含有ジペプチドおよびトリペプチドの使用を開示している。
【００１１】
ＥＰ２１５４２４４Ａ１は、細胞培養培地に関し、ここで、アミノ酸セリンならびにシステインおよび／またはチロシンの濃度が、少なくとも１ｍＭの濃度で維持される。
【００１２】
ＵＳ２００３／０２０３４４８Ａ１は、ダイズ加水分解物および任意選択で添加された遊離アミノ酸を含む、細胞の培養のための無タンパク質および無血清培地を報告している。
【００１３】
ＵＳ２００２／００３９７８７は、微小血管内皮細胞をインビトロで培養するための方法であって、有効量のヒト血清の存在下で、微小血管内皮細胞の富化された集団を培養することを含む方法を開示している。
【００１４】
植物タンパク質加水分解物の機能性は、その化学組成の直接的な結果である。それは、いくつかの要因、例えば原料、プロセッシング要因、プロセス調節および保存条件に影響される。したがって、それは、「ロット間変動」と定義される、持続的であるが、よく研究されていない現象をもたらす。
【００１５】
それは、１０から２５％までの産物収量における変動を意味することができ、それは、直接的な財政結果を有するので、それは、これらの加水分解物の顧客である、生物医薬産業によって表出される主要な懸念である。本発明は、これらの懸念を軽減することを目標とする。
【発明の概要】
【００１６】
ある特定の低分子アミノ酸誘導体が、インビトロでの真核細胞、特に動物細胞の細胞培養物に及ぼす強い増殖および産生促進効果を有することが発見された。選択された誘導体の最小レベルの存在は、一貫した、したがって商業的に魅力的な産生パフォーマンスをもたらす。これらの誘導体を含有する培地は、真核細胞、特に動物細胞を培養するのに非常に適している。したがって、本発明は、かかる特定のアミノ酸誘導体を含有する細胞培養培地、ならびにこれらの培地を作製するプロセスおよび培地構成成分として、これらのアミノ酸誘導体を含有する組成物を使用した、インビトロでの動物細胞の培養のための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、増殖促進または産生改善成分として、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、およびグルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体の使用を伴う、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスに関する。本発明は、乾燥重量基準で、少なくとも少なくとも０．０２ｐｐｍ（０．０２ｍｇ／ｋｇ）、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは少なくとも５０ｐｐｍ（５０ｍｇ／ｋｇ）の上記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培地にも関する。
【００１８】
本記載において、本発明の細胞培養培地の成分の量が、乾燥重量基準で示される場合はいつでも、液体培地における最終濃度は、５％（５０ｇ／ｌ）の乾燥固形物含有量を任意に取ることによって得ることができ、逆もまた同じである。したがって、乾燥物質の１ｋｇ当たり１００ｍｇの量が、好ましいレベルを得る目的で、最終液体培地の１ｌ当たり５ｍｇに相当する。これは、液体培地の乾燥固形物含有量が、５％であるべきであることを決して暗示しない。特定の細胞培養濃度次第で、例えば０．５〜３０ｗｔ．％、好ましくは０．５〜１５ｗｔ．％、より好ましくは１〜１５ｗｔ．％、最も好ましくは１〜５ｗｔ％の乾燥固形物レベルを選ぶことができる。液体培地のタンパク質含有量（アミノ酸およびアミノ酸誘導体を含めて）は、典型的に、０．０５〜２０．０ｗｔ．％、好ましくは０．１〜１０．０ｗｔ．％、より好ましくは０．１〜７．５ｗｔ．％、さらにより好ましくは０．１〜１．０ｗｔ％、最も好ましくは０．１５〜０．７５ｗｔ．％となる。
【００１９】
本発明に従って使用するアミノ酸誘導体は、少なくとも１個から最大３個のアミノ酸残基を含有する。１個または２個のアミノ酸残基に加えて、それらは、官能基、特にアセチル基またはメトキシ基を含有していてもよい。アミノ酸誘導体は、比較的小さい分子であり、好ましくは、１００〜５００Ｄａ、より好ましくは１２０〜４００Ｄａの分子量を有する。
【００２０】
アミノ酸誘導体の好ましい群は、
（ａ）好ましくは単一アミノ酸、特により大きいアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、オルニチン、リジン、シトルリン、アルギニンなどのＮ−アセチルアミノ酸。好ましいＮ−アセチルアミノ酸は、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニンおよびＮ−アセチル−オルニチンである；
（ｂ）特により大きい芳香族アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンのガンマ−グルタミルアミノ酸。ガンマ−グルタミル誘導体は、γ−カルボキシル基によって他のアミノ酸に結合している。好ましいγ−グルタミルアミノ酸は、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンである；
（ｃ）ピログルタミルアミノ酸、例えばピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシン。ピログルタミル基は、グルタミル基であり（ここで、α−アミノ基は、γ−カルボキシル基と縮合して、環状基を形成する）、したがって、ピログルタミル基は、５−オキソピロリジン−２−イルカルボニルアミノ基である；
（ｄ）グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、例えばバリニル（ｖａｌｉｎｙｌ）−グルタメートおよびグリシルプロリン；環状ジペプチド、例えばシクロ−（グリシル−グルタメート）も含まれる；
（ｅ）オキソ−アミノ酸、例えば５−オキソプロリンおよびＳ−オキソ−メチオニン（メチオニンスルホキシド）；
（ｆ）ホモ−アミノ酸（ここで、「ホモ」は、標準のアミノ酸（遺伝コードの翻訳によって直接的に得られる２０種のアミノ酸の１種）の主鎖における１個のメチレン基の添加を意味する）、例えばβ−アラニン、ホモセリン、および２−アミノ−ブチラート（「ホモ−アラニン」）
を含む。
【００２１】
最も好ましいアミノ酸誘導体は、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニン、シクロ−グリシル−グルタメート、バリニルグルタメート、５−オキソプロリンおよびβ−アラニンである。
【００２２】
本発明に従って使用するアミノ酸誘導体は、そのようなものとして使用することができる。構成要素のほとんどは、商業的に入手可能である。代わりに、それらを、一般に知られている合成または半合成手順によって作製することができる。誘導体のほとんどは、適したタンパク質画分または加水分解物、特に植物由来のタンパク質、例えばダイズ、エンドウマメ、レンズマメ、コムギ（グルテン）、綿実、イネ、ヒマワリ、ベニバナなどから単離することもできる。それらは、タンパク質画分から、またはより好都合に、タンパク質加水分解物から抽出または富化することができる。かかる方法は、例えば、Ｓａｔｏ，Ｎｉｓｉｍｕｒａ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（９）：３４０３−３４０５（１９９８）、Ｈｉｇａｋｉ−Ｓａｔｏ，Ｓａｔｏ，他  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：８−１３，（２００３）、およびＭｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（４）：７０６−７０９（１９６２）によって、当技術分野で既知である。
【００２３】
したがって、本発明は、以下にさらに詳しく述べるように、培地のさらなる構成成分に、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、およびグルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される、ある量の１種以上のアミノ酸誘導体を添加することによって、細胞培養培地を作製するプロセスに関し、その結果、培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなる。培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌとなることが好ましい。誘導体は、そのようなものとして、例えば精製および／もしくは合成生成物として、または濃縮物、すなわちタンパク質性の物質を、少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１０％、またはさらに少なくとも２５重量％のレベルまで濃縮するまたは富化することによって得られた生成物として添加することができる。
【００２４】
本発明は、さらに、本プロセスによって得られる細胞培養培地に関する。より明確には、本発明は、最終液体培地の１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含有し、ここで、濃度は、個々のアミノ酸誘導体当たりである、真核細胞を培養するための培養培地に関する。培地における最終濃度が、前記個々のアミノ酸誘導体当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌとなることが好ましい。本発明の細胞培養培地の乾燥重量の観点では、それは、乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇ、かつ乾燥物質の１ｋｇ当たり多くとも１０００ｇ、好ましくは多くとも２０ｇ、より好ましくは多くとも２ｇの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含有する。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、細胞培養培地は、５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは２５０ｍｇ〜１５０ｇの濃度で、上記のアミノ酸誘導体の１種以上を含有する。より好ましいレベルは、１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌまたは乾燥物質１ｋｇ当たり２００ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは５００ｍｇ〜５０ｇであり、さらにより好ましいレベルは、２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌまたは乾燥物質１ｋｇ当たり１〜２５ｇである。
【００２６】
Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンに関して、真核細胞を培養するための培養培地における好ましいレベルは、少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇ、または乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ、好ましくは２５０ｍｇ、より好ましいレベルは、１０ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、さらにより好ましいレベルは、１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ、最も好ましいレベルは、２０〜４００ｍｇ／ｌ（０．２〜５０、および１〜２ｇ／乾燥物質ｋｇ）である。ピログルタミルアミノ酸、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンに関して、好ましいレベルは、０．０３ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ（０．６ｍｇ／ｋｇ〜６００ｇ／乾燥物質ｋｇ）、好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ（０．６〜６００、好ましくは１．５〜１５０ｇ／乾燥物質ｋｇ）であり、より好ましいレベルは、５０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ（２．５〜５０ｇ／ｋｇ）である。バリニル−グルタメート、β−アラニン、２−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸に関して、好ましいレベルは、０．０２ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ（０．４ｍｇ／ｋｇ〜４００ｇ／乾燥物質ｋｇ）、好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌであり、最も好ましいレベルは、５０〜５００ｍｇ／ｌ（４００ｍｇ〜４００ｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１００ｇ／ｋｇおよび２．５〜２５ｇ／乾燥物質ｋｇ）である。
【００２７】
本発明の特に好ましい態様において、アミノ酸誘導体を、１種以上の植物性タンパク質加水分解物の部分として使用する。タンパク質加水分解物は、当技術分野で知られている方法によって、例えば、マメ、マメ科植物、種子などを、圧力をかける、粉砕する、外皮をとるおよび／または圧搾することによって、所望の場合、続いて例えば、有機溶媒、例えばヘキサンを使用して脱脂することによってプロセッシングすることによって作製することができる。好ましくは、脱脂された種子材料は、少なくとも２０ｗｔ％のタンパク質を含有する。脱脂された種子材料は、好ましくは、１０ｗｔ．％未満の脂肪含有量を有する。
【００２８】
タンパク質加水分解物は、通常、酵素によるタンパク質分解によって得られ、プロテオライセート（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓａｔｅ）とも称することができる。任意選択で細かく砕かれた、（脱脂された）植物種子材料を、細菌、真菌、植物もしくは動物起源またはそれらの混合物由来の、しかしながら好ましくは、酵素は、動物源由来ではない、エンドおよび／またはエキソプロテアーゼを使用して、加水分解に供する。酵素は、組換えＤＮＡ技法を使用して作製してもよい。好ましい酵素は、エンドプロテアーゼである。より好ましくは、酵素は、アルカリプロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、サブチリシン（Ａｌｃａｌａｓｅ）、セリンエンドプロテアーゼを含む。特に適した酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ由来のＡｌｃａｌａｓｅ、および／またはＭｅｒｃｋ由来のパパインを含む。他の適した酵素は、例えばＮｅｕｔｒａｓｅを含む。
【００２９】
加水分解条件は、完全に特定のタンパク質源および加水分解の所望の程度次第で、３０分〜３０時間；好ましくは１〜６時間、最も好ましくは２〜４時間の反応時間を含み、温度は、２０〜６５℃、好ましくは４０℃〜６０℃である。ｐＨは、６．０〜８．５、好ましくは６．６〜８．０に調整してもよく、７．０〜８．０が最も好ましい。溶液における加水分解するタンパク質の濃度は、１〜１０％のタンパク質、好ましくは２〜８、最も好ましくは３〜６ｗｔ．％である。使用する酵素の量は、基質に基づいて、０．５〜１０ｗｔ％、好ましくは１〜５ｗｔ％、最も好ましくは１．５〜３．５ｗｔ％である。
【００３０】
加水分解は、好ましくは、５〜５０％、好ましくは１０〜４０％、最も好ましくは１０〜３０％の加水分解の程度が達成されるまで行う。加水分解反応は、熱処理を使用して、終結する。好ましくは、熱処理は、８０〜１００℃で１５〜９０分（バッチ熱処理）、または１００〜１２０℃で１〜５分の加熱時間を包含する。加水分解の程度は、例において実証するように、従来のホルモール滴定を使用して決定してもよい。加水分解反応の終結後、反応混合物を、任意選択で、ポリッシュして、例えば、当技術分野において知られている遠心分離またはろ過補助物（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  ａｉｄ）、例えば珪藻土（例えばＣｅｌｉｔｅ（登録商標）、Ｄｉｃａｌｉｔｅ（登録商標）、Ｈｙｆｌｏ（登録商標））を使用して、不溶性部分を除去することができる。好ましくは、加水分解物は、乾燥物質基準で、１０ｗｔ．％未満、より好ましくは５ｗｔ．％未満、最も好ましくは２ｗｔ．％未満の不水溶性材料を含有する。加水分解物を、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させることができる。加水分解物を、そのようなものとして使用してもよく、またはさらに画分してもよい。
【００３１】
加水分解物は、好ましくは、総タンパク質基準で、１００〜５００Ｄａの分子量を有する、２０〜８０ｗｔ．％、特に２０〜６０ｗｔ．％のペプチド、および／または５００〜１０００Ｄａの分子量の１０〜３０ｗｔ．％のペプチドを含有する。ペプチド長さの観点では、加水分解物は、好ましくは、総タンパク質基準で、少なくとも１５ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも２５ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも３５ｗｔ．％、最大例えば８５ｗｔ．％、より好ましくは最大６５ｗｔ．％、最も好ましくは最大５５ｗｔ．％のジからペンタペプチド、８〜３０ｗｔ．％のヘキサからノナペプチド、少なくとも８ｗｔ．％、特に１５〜６０ｗｔ．％のより高いペプチドおよび０．１〜３０ｗｔ．％、好ましくは０．５〜１０ｗｔ．％の遊離アミノ酸を含有する。好ましい態様において、加水分解物を、好ましくは５または１０ｋＤａの分画分子量を使用して、限外ろ過してもよい。加水分解物は、さらなる構成成分、例えば炭水化物、可溶性の繊維、多価金属塩などを含有していてもよい。好ましくは、タンパク質含有量（遊離アミノ酸を含むすべてのタンパク質性の材料）は、３０〜９０ｗｔ．％、より好ましくは４５〜８５ｗｔ．％である。これらの量は、乾燥重量基準である。
【００３２】
加水分解物は、培養培地の他の従来の構成成分、例えば植物または動物サイトカインおよび／または増殖因子（これらが、動物起源のものではないという条件で）、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、グルコースを含めた糖、抗生物質などと組み合わせてもよい。植物ホルモンは、オーキシン、ジベレリン、アブシジン酸およびそれらの組合せを含む。
【００３３】
さらに、商業的に入手可能な基本培地を、本発明のアミノ酸誘導体およびタンパク質加水分解物と組み合わせて使用してもよい。動物細胞系に関して、ＣＨＯ−１として、Ｌｏｎｚａ製のＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ−１  ＣＤ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ、またはＳＡＦＣ製のＥｘｃｅｌｌ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯを使用してもよい。植物細胞に関して、ＳＡＦＣから得られるＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ基本培地を使用してもよい。加水分解物は、アミノ酸誘導体が上記で示した量で存在することを可能にする任意の比率での、種々のタンパク質源由来の加水分解物、例えばコムギおよびダイズ、ダイズおよびエンドウマメ、イネおよび綿実由来の加水分解物とすることもできる。細胞培養培地は、好ましくは、完全に再現可能であるためにおよび／または汚染を避けるために、血清、例えばウシ胎児血清、または血清由来の構成要素を含有しない。好ましくは、細胞培養培地は、動物構成要素、例えば動物由来のタンパク質および／または動物、例えばウシ起源のタンパク質加水分解物を含まない。したがって、好ましい態様において、本発明は、本明細書で定義した、真核細胞を培養するための無血清培養培地、およびかかる無血清培養培地を調製するプロセスに関する。
【００３４】
当技術分野で通例知られているダイズタンパク質加水分解物を補充した、化学的に定義された、商業的に入手可能な培地において存在する特許請求したアミノ酸誘導体の選択を対象とする化合物分析を、例の節において提供する。この分析から、当技術分野において一般に適用される加水分解物に基づくまたは加水分解物が富化された培地におけるこれらの特定のアミノ酸誘導体の濃度は、本発明による細胞培養培地のものよりも少なくとも２桁低いことが明らかである。
【００３５】
本発明による細胞培養培地と培養する方法の両方は、真核細胞、特に動物細胞の培養を支持する能力があり、ここで、能力は、それが、少なくともインビトロでの細胞の生存、増殖および／または分化ならびに好ましくは細胞による産物の発現も可能にすることを意味する。回分、流加、連続または潅流反応器における培養は、すべて認識されている。
【００３６】
細胞増殖曲線は、細胞が、繁殖かつ増殖する実質的な増殖期、および細胞が、多かれ少なかれ定常状態にあるが、対象の代謝産物、例えば抗体の産生を開始する産生期において区別することができる。本発明のアミノ酸誘導体は、動物または他の真核細胞の増殖期と産生期の両方を支持する能力がある。
【００３７】
細胞培養培地は、液体としてまたは粉末化された、乾燥された形で提供してもよい。液体培地における（本質的に水溶性の）加水分解物の量は、当業者によって決定され得るが、好ましくは０．０１〜１０．０ｗｔ／ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜４．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ／ｖｏｌ％、または０．０５〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．１〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、最も好ましくは０．２〜０．６ｗｔ／ｖｏｌ％を含む。
【００３８】
水で元に戻すことができる乾燥培養培地における加水分解物の量は、培地構成要素次第であるが、典型的に、２〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは５〜５０％ｗ／ｗの範囲内である。細胞培養培地は、好ましくは１０〜０．１、より好ましくは２．５〜０．４のグルコース対加水分解物の乾燥重量比で、糖、特にグルコース、および上記のさらなる構成要素も好ましくは含有する。
【００３９】
さらに、本発明は、真核細胞を培養するための細胞培地の使用に関する。真核生物は、真菌（酵母を含めて）、原生生物、クロミスタ、植物界および後生動物（動物）を含む。本発明は、特に、好ましくはインビトロでの培養で、植物細胞、例えばイネ、タバコおよびトウモロコシ、ならびに特に動物細胞を培養するための使用に関する。培養する細胞は、天然源由来であっても、または遺伝的に改変されていてもよい。動物細胞は、特に、哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばＰＥＲ  Ｃ６細胞（登録商標）、げっ歯類細胞、特にＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞、トリ、魚、爬虫類、両生類または昆虫細胞を含めた、脊椎動物および無脊椎動物細胞を含む。
【００４０】
本発明の方法によって培養される細胞は、生物医薬産業においてさらに精製してもよいタンパク質産物の発現に特に使用する。本発明の培養培地において有利に作製することができるタンパク質産物の非限定的な例は、エリスロポエチン（血液障害を治療するための）、エタネルセプト（リウマチ性疾患および痛風を治療するためのＴＮＦ−α阻害剤）、アルファドルナーゼ（嚢胞性線維症の治療のためのデオキシリボヌクレアーゼ）、ベータインターフェロン（多発性硬化症を治療するための）および広範囲の治療上のモノクローナル抗体を含む。所望のタンパク質産物を、当技術分野で知られている方法、例えば分画、アフィニティークロマトグラフィー（吸着−脱着）など、またはそれらの組合せによって、例えば培養培地から細胞を分離し、無細胞の液体（上清）からタンパク質産物を単離することによって回収してもよい。
【００４１】
さらに、本発明は、アミノ酸誘導体を含有する画分、ならびに植物もしくは動物サイトカインおよび／または増殖因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、植物ホルモン、ヌクレオチド、糖および抗生物質から選択される培養培地の１つ以上の構成成分を含むキットに関する。構成成分は、１つ以上の組合せとしてキットにおいて存在してもよい。例えば、アミノ酸誘導体は、乾燥または溶解した形で別々に存在してもよく、培養培地のさらなる構成成分、例えば植物もしくは動物サイトカインおよび／または増殖因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖ならびに抗生物質の部分またはすべては、別々の組合せとして存在してもよい。代わりに、アミノ酸誘導体は、例えばさらなるアミノ酸および／またはペプチドおよび／または糖と予混してもよく、任意の残りの構成成分は、別々にまたは１つ以上の組合せで存在してもよい。組成物の少なくとも１つが、液体であることが好ましく、この液体は、有利に滅菌してもよい。キットの組成物は、培養培地の使用に先立って混合する。
【００４２】
したがって、本発明によるアミノ酸誘導体およびそれらの使用は、いくつかの重要な利点を有することが発見された。それらは、通常のタンパク質構成成分によって提供される増殖を超える増殖促進効果を有する。それらは、強化された産生、産生および／または増殖のより低い変動をもたらし、費用効果が高い。
【００４３】
インビトロで培養した動物細胞は、塊または集団で増殖せず、単一の細胞として存在する。第二に、細胞の生存能力は、それらの完全な円形および明るい透明な細胞含有物によって判断して良好である。第三に、所望の細胞産物の発現レベルを妥協することなく、最先端の細胞培養培地、例えば非血清タンパク質、特にダイズタンパク質に基づくものと比較して、非常に高い細胞密度を得ることができる。第四に、加水分解物を、動物細胞のインビトロでの培養のための任意の基本培養培地と組み合わせることができ、上記の利点を有する多種多様の細胞培養培地の製造を可能にする。さらに、培養は、長期に及ぶことができ、より高い産物収量をもたらす。
【実施例】
【００４４】
例１：ダイズからのガンマ−グルタミルペプチドの単離：
Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（１９６２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（４）：７０６−７０９の方法に従った：黄ダイズ（２５ｋｇ）を、粉末化し、７０％エタノールで室温で徹底的に抽出した。抽出物を５℃まで冷却し、本温度で数日間放置した後、清澄な上清を、Ｄｏｗｅｘ  ５０カラム（水素型、５℃）に通した。抽出前にマメを脱脂しなかったので、樹脂カラム上にかなりの材料の沈殿があった。本材料は、アルコールまたは水洗浄によって除去せず、溶出中に２Ｎアンモニアで再溶解した。
【００４５】
溶出液を、真空中で４０℃で蒸発させ、残渣を水に溶解し、汚染物質をｐＨ４．０での沈殿によって除去した。部分的に精製したアミノ酸を、Ｄｏｗｅｘ  １  Ａｃ（２００−４００メッシュ）の５．８×１２７ｃｍカラム上で吸収させ、脱イオン水で徹底的に洗浄して、中性および塩基性アミノ酸を除去した。最初の溶出剤は、０．１Ｎ酢酸であり、１分当たり３．５ｍｌの流量で、２１−ｍｌの画分を回収した。酢酸の規定度を、画分９００で０．３、および画分１４００で１．０に変え、２．０Ｎ酢酸を、画分２４００でカラムに導入した。代替の画分からの溶液の１個の液滴を、いくつも列をなして、ろ紙の大きいシート上に置き、乾燥させ、０．５％ニンヒドリンのエタノール溶液を噴霧した。色の密度は、ピークアミノ酸濃度を含有する管を示した。次いで、ピークを、小さい（１８×１８ｃｍ  ２方向性クロマトグラムを使用することによって調査し、これは、画分２０００〜２３００が、グルタミン酸−フェニルアラニンペプチドを含有し、画分２６３０〜２８７０が、グルタミン酸−チロシンペプチドを含有したことを示した。画分２０００〜２３００を、２６３０  ２８７０のように、組み合わせ、溶媒を真空中で除去し、化合物を、無色の固体として水から結晶化した。数回の再結晶の後、数百ミリグラムの各ペプチドを、無色の結晶として得た。
【００４６】
例２：コムギグルテンのピログルタミルペプチドの単離：
Ｓａｔｏ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（９）：３４０３−３４０５．（１９９８）およびＨｉｇａｋｉ−Ｓａｔｏ他  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：８−１３（２００３）の方法に従った：
Ｎ末端ブロックペプチドの単離：ＡＧ５０ＷＸ８強力な陽イオン交換体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、ミニスピンカラム（１０×５ｍｍ、ｉ．ｄ．、ＡＢ−１１５０、Ａｔｔｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に充填した。５０％メタノールおよび蒸留水で連続的に予洗したカラムを、１０ｍＭのギ酸で平衡化した。ペプチド試料（５０μｇ／１００μＬ）を、ミニスピンカラムに適用した。Ｎ末端ブロックペプチドを、１０ｍＭのギ酸（１００ｍＬ×３回）で溶出した。
【００４７】
ピログルタメートアミノペプチダーゼ消化：Ｎ末端ブロックペプチド画分を、１ｍＵのブタの肝臓ピログルタメートアミノペプチダーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で、１００μＬの付属の反応緩衝液において３７℃で３時間消化した。反応を、１０μＬのギ酸を添加することによって終結した。
【００４８】
例３：誘導体化したアミノ酸（ダイズ加水分解物）の調製：
Ｌｅｏｎｅ−Ｂａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：４２６３−４２６９（１９９５）の手順に従って、本明細書で記載したアシル化アミノ酸を調製した。Ｎ−シクロヘキサノイルフェニルグリシンの調製を、代表例として示す。フェニルグリシン（５０．０ｇ、３３１ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら、オープンフラスコにおける水酸化ナトリウム水溶液（４１４ｍＬ、２Ｎ）に溶解した。生じた溶液を、氷水浴において約１０〜１５℃まで冷却し、反応温度を約１０〜１５℃で維持しながら、シクロヘキサンカルボニルクロリド（４４．２ｍＬ、３３１ｍｍｏｌ）を、滴下添加した。添加が完了した後、反応溶液を、室温で２．５時間撹拌した。反応混合物のｐＨを、塩酸水溶液（３７％）で９．５に調整し、未反応のフェニルグリシンを、白色固体として分離し、ろ過によって除去した。次いで、ろ液のｐＨを、さらに４．５に低下させ、粗Ｎ−シクロヘキサノイルフェニルグリシンを、溶液から沈殿させた。この固体を、ろ過によって除去し、メタノールから再結晶させて、Ｎ−シクロヘキサノイル−フェニルグリシンを得た。
【００４９】
例４：特許請求したアミノ酸誘導体を含有するタンパク質加水分解物の分析および増殖刺激の証拠
商業的な植物タンパク質加水分解物、例えばＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ  Ｄｏｍｏ、ＵＳＡから得られるＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ、ＷＧＥ８０Ｍ−ＵＦ、ＣＮＥ８０Ｍ−ＵＦ、ＰＣＥ８０Ｂを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）供給源および線形イオントラップ（ＬＩＴ）質量分析器からなるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計を使用して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ２）によって分析した。試料抽出物を、２つのアリコートに分け、乾燥させ、次いで酸性または塩基性ＬＣ適合性溶媒中で元に戻した。別々の専用のカラムを使用した２つの独立的な注入において、１つのアリコートを、酸性陽イオン最適化条件を使用して、他方を、塩基性陰イオン最適化条件を使用して、分析した。酸性条件において元に戻した抽出物を、どちらも０．１％ギ酸を含有する水およびメタノールを使用して、他方、塩基性抽出物も、６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する水／メタノールを使用して、勾配溶出した。ＭＳ分析は、ダイナミックイクスクルージョン（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を使用して、ＭＳとデータ依存ＭＳ２スキャンを交互に行った。生化学的物質を、精製された標準または反復性の未知の実体（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｅｎｔｉｔｙ）のメタボロミクスライブラリー登録との比較によって同定した。クロマトグラフィーの特性および質量スペクトルの組合せは、特定の化合物または同重体実体（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ）への適合の指標を示す。したがって、植物タンパク質加水分解物において存在する生化学的構成要素の概要およびそれらの相対濃度が、作成された。
【００５０】
さらに、すべての加水分解物を、細胞増殖および抗体産生に関して、細胞培養アッセイにおいて試験した。
【００５１】
線形回帰分析を、細胞増殖および抗体産生に有意に影響する生化学的構成要素を同定するために、細胞増殖および化合物分析データに行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３のＳＬＯＰＥ関数を使用して、抗体産生および構成要素の相対濃度間の相関を計算し、その結果を、以下の表１において示す。右上がりの傾きが高いほど、細胞培養物における生化学的構成要素の重要性が高い。同様にＭＳ  Ｅｘｃｅｌの相関回帰関数を使用して計算したｐ値は、値の有意性を表し、ｐ値（すべて０〜１）が低いほど、測定された値は有意性が高い。
【表１】
2013536683.tif 000002
【００５２】
例５：細胞培養培地の調製
細胞培養アッセイを、商業的に入手可能なＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９１１１９）において行った。本培地に、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、プルロニック酸、ヒポキサンチン（１００μＭ）およびチミジン（１５μＭ）を添加した。ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加して、増殖アッセイ中のあらゆる細菌増殖を防いだ。培地に、すべてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した、β−アラニン、γ−グルタミルシステイン、グリシル−グリシン、Ｌ−ホモセリンまたはＮ−アセチルメチオニンを、異なる濃度（１×１０−５から１×１０−１％（ｗ／ｖ）、表２参照）で補充した。補充した培地を、ボルテックスミキサーで混合し、０．２２μｍフィルターを使用してろ過し、その後、増殖アッセイにおいて使用した。
【００５３】
例６：ＩｇＧ産生および細胞増殖：ＣＨＯ細胞のインビトロでの培養
細胞系
ＩｇＧを発現するＣＨＯ細胞系を使用した（ＣＨＯ−２：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１３９７、ＩｇＧ４を産生）。細胞系を、接着条件において数継代の間、増殖させ、いったんコンフルエントになると、それらを、例５において記載した補充した培地における無動物条件に移した。
【００５４】
増殖および産生曲線
増殖および産生曲線を測定するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、バッフルドフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）における懸濁培養において増殖させた。２０×１０６個の細胞を、２５ｍｌの培地においてバッフルドフラスコに移した。添加されたアミノ酸誘導体を有するおよび有さない化学的に定義された培地を、試験した。新鮮な培地を、増殖アッセイ中に添加しなかった。細胞を、ＣＥＤＥＸ  ＨｉＲｅｓ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、計数した。細胞計数を使用して、増殖曲線下面積を計算し、Ｌｉｎｇ，Ｃ．Ｘ，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｈ．（２００３），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，ｐｐ．３２９−３４１において詳細に報告されているように、無次元の曲線下面積（ＡＵＣ）値として表した。上清試料を、ＩｇＧ産生測定のために１日おきに採取した。ＩｇＧ産生を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、測定した。特定のＩｇＧ産生を、累積のＩｇＧ産生（ｍｇ／ｍｌで）対増殖アッセイの１１日目に測定されたＡＵＣの比をとることによって計算した。細胞を、位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５、倍率４００倍）を使用して、視覚的に検査した。細胞の外観は、アミノ酸誘導体の十分なレベルが培地において存在した場合、著しく改善された。単一の細胞のみが観察され、細胞の凝集は見られなかった。細胞の形も、正に影響された。細胞は、アミノ酸誘導体の十分なレベルを含有する培地において培養した場合、非常により円形かつ明るい外観を有した。これは、多くの細胞凝集体が、アミノ酸誘導体を有さない化学的に定義された培地において増殖したＣＨＯ細胞培養物において存在したという知見と、対照的であった。
【表２】
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【００５５】
例７：ダイズタンパク質加水分解物の分析
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に基づく方法を使用して、加水分解物におけるアミノ酸誘導体Ｌ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対濃度を決定した。純粋なＬ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。誘導体を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水で個々に希釈して、濃度域を得た。希釈した誘導体に関して得られたＬＣ−ＭＳ保持域を、それぞれの構成要素の濃度に対してプロットして、検量線を得た。その後、ダイズタンパク質加水分解物（ＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ、ＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ  Ｄｏｍｏ）試料のＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて同定されたピークを、個々のアミノ酸誘導体構成要素に特定のＬＣ−ＭＳピークと関連づけた。個々の構成要素に関する検量線を使用して、ダイズ加水分解物におけるアミノ酸誘導体Ｌ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対量を、計算した。
【表３】
2013536683.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月30日(2013.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞を培養するための無血清培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および／または産生改善成分として、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなり、前記１種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、１００ｇのタンパク質性の物質当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇの誘導体の濃度を有するプロセス。
【請求項２】
前記Ｎ−アセチルアミノ酸が、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニンおよびＮ−アセチル−オルニチンから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記γ−グルタミルアミノ酸が、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンから選択される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記ピログルタミルアミノ酸が、ピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシンから選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチドが、バリニル−グルタメート、グリシルプロリンおよびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸が、それぞれ、５−オキソプロリンおよびＳ−オキソ−メチオニン、ならびにβ−アラニン、２−アミノブチラートおよびホモセリンから選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
【請求項８】
少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは少なくとも５０ｍｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、請求項７に記載の細胞培養培地。
【請求項９】
５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１５０ｇ、より好ましくは２５０ｍｇ〜６０ｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇ、または乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含有する、真核細胞を培養するための培養培地。
【請求項１１】
０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１２】
０．０３ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌの、ピログルタミル−グリシン、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１０または１１に記載の培養培地。
【請求項１３】
０．０２ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの、バリニルグルタメートβ−アラニン、２−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸から選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項１４】
インビトロで真核細胞を培養する方法であって、請求項７から１３のいずれか１項に記載の培養培地において前記細胞を増殖させることを含み、前記真核細胞が、好ましくは、動物細胞、より好ましくは哺乳類および／または昆虫細胞を含む方法。
【請求項１５】
所望のタンパク質産物を作製するための方法であって、請求項１４に記載の方法を使用して、前記タンパク質産物を産生する真核細胞を培養すること、および前記培養培地から前記タンパク質産物を回収することを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
例７：ダイズタンパク質加水分解物の分析
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に基づく方法を使用して、加水分解物におけるアミノ酸誘導体Ｌ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対濃度を決定した。純粋なＬ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。誘導体を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水で個々に希釈して、濃度域を得た。希釈した誘導体に関して得られたＬＣ−ＭＳ保持域を、それぞれの構成要素の濃度に対してプロットして、検量線を得た。その後、ダイズタンパク質加水分解物（ＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ、ＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ  Ｄｏｍｏ）試料のＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて同定されたピークを、個々のアミノ酸誘導体構成要素に特定のＬＣ−ＭＳピークと関連づけた。個々の構成要素に関する検量線を使用して、ダイズ加水分解物におけるアミノ酸誘導体Ｌ−ホモセリン、β−アラニン、Ｎ−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対量を、計算した。
【表３】
2013536683.tif 000005
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
真核細胞を培養するための無血清培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および／または産生改善成分として、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなり、前記１種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、１００ｇのタンパク質性の物質当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇの誘導体の濃度を有するプロセス。
［２］
前記Ｎ−アセチルアミノ酸が、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニンおよびＮ−アセチル−オルニチンから選択される、［１］に記載のプロセス。
［３］
真核細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および／または産生改善成分として、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−オルニチンおよびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌとなり、前記１種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、１００ｇのタンパク質性の物質当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇの誘導体の濃度を有するプロセス。
［４］
前記γ−グルタミルアミノ酸が、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンから選択される、［１］から［３］のいずれか１に記載のプロセス。
［５］
前記ピログルタミルアミノ酸が、ピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシンから選択される、［１］から［４］のいずれか１に記載のプロセス。
［６］
前記グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチドが、バリニル−グルタメート、グリシルプロリンおよびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される、［１］から［５］のいずれか１に記載のプロセス。
［７］
前記オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸が、それぞれ、５−オキソプロリンおよびＳ−オキソ−メチオニン、ならびにβ−アラニン、２−アミノブチラートおよびホモセリンから選択される、［１］から［６］のいずれか１に記載のプロセス。
［８］
［１］〜［７］のいずれか１に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
［９］
少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは少なくとも５０ｍｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、［８］に記載の細胞培養培地。
［１０］
５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、または乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１５０ｇ、より好ましくは２５０ｍｇ〜６０ｇの濃度で、前記アミノ酸誘導体の１種以上を含有する、［９］に記載の細胞培養培地。
［１１］
１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇ、または乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含有する、真核細胞を培養するための培養培地。
［１２］
０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの、Ｎ−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、［１１］に記載の培養培地。
［１３］
０．０３ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌの、ピログルタミル−グリシン、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、［１１］または［１２］に記載の培養培地。
［１４］
０．０２ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの、バリニルグルタメートβ−アラニン、２−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸から選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含む、［１１］から［１３］のいずれか１に記載の培養培地。
［１５］
ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖、抗生物質およびタンパク質加水分解物から選択される、培養培地の他の従来の構成成分をさらに含有する、［８］から［１４］のいずれか１に記載の培養培地。
［１６］
インビトロで真核細胞を培養する方法であって、［７］〜［１４］のいずれか１に記載の培養培地において前記細胞を増殖させることを含み、前記真核細胞が、好ましくは、動物細胞、より好ましくは哺乳類および／または昆虫細胞を含む方法。
［１７］
前記培養培地が、コムギ、ダイズ、ワタ、またはエンドウマメタンパク質由来の加水分解物を少なくともさらに含有する、［１６］に記載の方法。
［１８］
所望のタンパク質産物を作製するための方法であって、［１６］または［１７］に記載の方法を使用して、前記タンパク質産物を産生する真核細胞を培養すること、および前記培養培地から前記タンパク質産物を回収することを含む方法。
【国際調査報告】
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