(57)【要約】  本発明は、虎杖根ブタノール分画物とエチルアセテート分画物の肥満治療または予防効能に関するもので、より詳細には虎杖根ブタノール分画物及びエチルアセテート分画物は体内脂肪吸収に係わる重要酵素である膵臓脂肪分解酵素（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ）活性を効果的に抑制し、脂肪エマルジョン（ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を用いた短期間脂肪吸収抑制動物実験で優れた脂肪吸収抑制効果を有する虎杖根ブタノール分画物（ＰＯＣＵ−１ｂ）とエチルアセテート分画物を有効成分として含む、抗肥満治療用薬学組成物及び機能性食品に関するものである。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
虎杖根分画物が、虎杖根抽出物を水に溶解した後、ヘキサン、エチルアセテート、ブタノールを順に用いて分画したブタノール分画物であることを特徴とする、請求項１に記載の肥満予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び改善用機能性食品。
【請求項４】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、高脂血症予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、高脂血症予防及び改善用機能性食品。
【請求項６】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、代謝症侯群予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項７】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、代謝症侯群予防及び改善用機能性食品。
【請求項８】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項９】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び改善用機能性食品。
【請求項１０】
薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物を肥満である個体に投与する工程を含む、肥満治療方法。
【請求項１１】
薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物を個体に投与する工程を含む、肥満予防方法。
【請求項１２】
虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールまたはエチルアセテート抽出した分画物の肥満予防用または治療用組成物の製造に対する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満予防及び治療のための薬学的組成物及び機能性食品にも応用され得る虎杖根抽出物の系統分画物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、エネルギー消耗量に比べてエネルギー摂取量が多くて体内で過剰となったエネルギーが脂肪として蓄積された状態をいい、２００５年の国民健康栄養調査によると、韓国の２０歳以上の成人の３１．８％が肥満であることが示され、１９９５年度の１４．８％に比べて１０年間に二倍以上に増加した（非特許文献１）。このような増加傾向によって肥満による社会経済的損失は、２００１年度の１兆７千億ウォンから毎年増加していて、政府の国民健康増進総合計画では、２０１０年まで成人の肥満率を３０％水準で維持することを主要目標に設定している（保健福祉部、２００５年、国民健康増進総合計画、ｐ．６１−６４）。肥満は、それ自体が有する問題点のみならず、心血管系疾患や糖尿、呼吸器疾患、骨関節炎のような疾病を誘発し得ることから全世界的に肥満に多くの関心が集められていて（非特許文献２）、ＷＨＯ（世界保健機関）では、肥満を世界的な栄養問題として扱い、健康を害する単純危険因子ではなく治療しなければならない疾病として認識している（非特許文献３）。肥満は、エネルギーの過多摂取、運動不足のみならず神経系分泌的要因、薬物原因、遺伝的要因などが複合的に作用するため、肥満を改善するための方法には、食事、運動、行動療法や薬物治療などが用いられている。
【０００３】
最近、肥満治療剤開発のために多くの研究が進行されていて、そのような研究の中の一つが、膵臓脂肪分解酵素阻害剤である。膵臓脂肪分解酵素は、中性脂肪を２−モノアシルグリセロ−ルと脂肪酸に分解する核心酵素で（非特許文献４）、現在知られている代表的な膵臓脂肪分解酵素阻害剤としては、ストレプトマイセス・トキシトリシニに由来したリプスタチンの誘導体であるテトラヒドロリプスタチン（オルリスタット）がある。現在医薬品としても市販中のオルリスタット（ゼニカル）は、摂取された脂肪の約３０％を阻害する程度に効能が最も優れていることが知られている（非特許文献５）。しかし、このような効能にもかかわらず、胃腸障害、過敏症、胆汁分泌障害、脂溶性ビタミン吸収抑制などの副作用があることが知られている（非特許文献６）。また、ＦＤＡの体重減量治療規定によると、長期間投与する抗肥満薬物効果は、薬物投与前の体重の５％が減量されなければならず、このような減量効果は最小限１２ヶ月以上維持されなければならない。しかし、オルリスタットは、２年間長期投与してもダイエットのみ実施した場合より３〜５％程度のみ体重が減少して、脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ吸収を妨害する副作用が示される。１９９８年に発売が開始されて２００１年に９億６，３００ドルの売上げが発生したが、その後このような副作用及び効果の未備によって売上げが減少している。したがって、最近は副作用がない食品及び、天然物から膵臓脂肪分解酵素阻害剤の開発のための研究が進行されている（非特許文献７）。
【０００４】
天然物を活用した抗肥満素材開発に関する結果を詳しくみると、作用機序別に食欲抑制に関与する物質として、ヒドロキシシクエン酸（ＨＣＡ）、オリブラ、チコリ、イヌリンなどの食物繊維などがあり、脂肪の消化及び吸収を阻害する物質として、キトサン、フラボノイドなどがある。熱発生を誘導して脂肪蓄積を抑制する物質として、唐辛子のカプサイシン、緑茶のカテキン、レチノイック酸などがあり、脂質代謝を調節するＬ−カルニチン、共液リノレン酸（ＣＬＡ）、牛乳カルシウムと関連タンパク質などが報告されている。生薬材では、枳実、ミョウガ、決明子、緑茶、松葉、槐花、川（くさかんむりに弓）（せんきゅう）、呉茱萸などが体重調節に効果があるという結果が報告された（非特許文献８〜１３）。したがって、消費者はこのような副作用が少なくて、反対に薬効が優れた自然素材の肥満治療剤により多くの関心を抱いていて、このような要求に応じようと安全かつ効能に優れた天然薬剤の開発が要望されている実情である。
【０００５】
一方、虎杖根（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ  Ｓｉｅｂ．ｅｔ  Ｚｕｃｃ．＝Ｒｅｙｎｏｔｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｈｏｕｔｔ．）は、タデ科に属する多年生草本で根茎は太く、茎は高さ１．５ｍほどである。葉は互い違いでたまご模様、長さ６〜１２ｃｍで、端が尖っていて、葉の柄は長い。花は、雌雄異株で６〜８月に咲く。実は痩果で細毛を帯びたたまご模様で、焦げ茶の輪彩がある。全国の谷間で育ち、日本、中国、台湾に分布する（ペー・キファン、韓国の薬用植物、教学社、２００３年、ｐ．８９）。イタドリの根茎と根は虎杖または虎杖根（Ｐｏｌｙｇｏｎｉ  Ｒｈｉｚｏｍａ＝Ｒｅｙｎｏｕｔｒｉａｅ  Ｒｈｉｚｏｍａ）といって、本草綱目木部中品に収載されている。韓国の民間では緩和、利尿、化膿性皮膚炎、膀胱炎、抗癌などの治療に使われてきて、漢方医学では、（ころもへんに去）風利湿、破（やまいだれに於）、通経、鎮解及び鎮痙に使用する（非特許文献１４、１５）。虎杖根の薬理作用では脂質代謝抑制作用（非特許文献１６）、タンパク質チロシンキナーゼ阻害作用（非特許文献１７）、変異原性抑制作用（非特許文献１８）などが報告されている。虎杖根の成分としては、ポリダチン、レスベラトロール、エモジン、フィスシオン、クリソファン酸など主にスチルベンとアントラキノン、そしてそれらの配糖体が知られている（非特許文献１９、２０）。しかし、いまだに虎杖根分画物に対する研究は成り立ったことがなく、分画物が肥満治療及び予防に良い効果があるという点は報告されたことがない。
【０００６】
そこで、本出願人は、天然薬剤を用いた肥満治療及び予防剤を開発中、虎杖根抽出物の分画物が膵臓脂肪分解酵素活性を抑制して、脂肪吸収を抑制する効能を確認することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆ Ｗｅｌｆａｒｅ．２００６年．Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  Ｋｏｒｅａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ
【非特許文献２】Ａｎｔｉｐａｔｉｓ  Ｖ．Ｊ．ら，２００１年，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍ．Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｐｅｒ  Ｂｊｏｒｎｔｏｒｐ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆ Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ．ｐ．３−２２
【非特許文献３】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．１９９８年．Ｏｂｅｓｉｔｙ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ＷＨＯ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，Ｇｅｎｅｖａ
【非特許文献４】Ｂｉｔｏｕ  Ｎ．ら，Ｌｉｐｉｄ，１９９９年，第３４巻，ｐ．４４１−４４５
【非特許文献５】Ｄｒｅｎｔ  Ｍ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ．，１９９５年，第１９巻，ｐ．２２１−２２６
【非特許文献６】Ｐｅｔｅｒ  Ｃ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１年，第５１巻，ｐ．１３５−１４１
【非特許文献７】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ．，２０００年，第２４巻，ｐ．７５８−７６４
【非特許文献８】Ｋｉｍ  Ｍ．Ｈ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｈｅａｔｈ  Ｐｓｙｃｈｏｌ．，２００４年，第９巻，ｐ．４９３−５０９
【非特許文献９】Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．ら，Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，１９９８年，第３３巻，ｐ．９４３−９５９
【非特許文献１０】Ｂｕｒｎｓ  Ａ．Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２００２年，第５６巻，ｐ．３６８−３７７
【非特許文献１１】Ｄｅｌｚｅｎｎｅ  Ｎ．Ｍ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００５年，第１巻，ｐ．１５７−１６１
【非特許文献１２】Ｚａｃｏｕｒ  Ａ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｌｏｌ．，１９９２年，第３８巻，ｐ．６０９−６１３
【非特許文献１３】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｄ．Ｗ．ら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９８６年，第１９９９巻，ｐ．５０９−５１６
【非特許文献１４】ユック・チァンス，亜細亜生薬図鑑，図書出版キョンウォン，１９９７年，ｐ．１４０
【非特許文献１５】ジ・オクピョ、生薬学会誌，１９７５年，第６巻，ｐ．１−４
【非特許文献１６】Ｍａｓａｋｉ  Ｈ．ら，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９５年，第１８巻，ｐ．１６２−１６６，１９９５
【非特許文献１７】Ｊａｙａｔｉｌａｋｅ  Ｇ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１９９３年，第５６巻，ｐ．１８０５−１８１０
【非特許文献１８】Ｓｕら，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，１９９５年，第３２９巻，ｐ．２０５−２１２
【非特許文献１９】Ｐａｎら，Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｃａｉ，２０００年，第２３巻，ｐ．５６−５８
【非特許文献２０】Ｚｈａｎｇ，Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｙｉ  Ｙａｏ，１９９９年，第１１巻，ｐ．１３−１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、肥満の主原因中のひとつであるエネルギーの過剰摂取、その中で脂肪の吸収に関与する重要な酵素である膵臓脂肪分解酵素の活性を抑制して、脂肪エマルジョンを用いた短期間脂肪吸収抑制効能及び高脂肪食餌で誘導した肥満において、体重増加抑制及び体重減少効果を有する、肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、高脂血症または代謝性疾患の予防及び治療のための薬学的組成物と機能性食品を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、肥満予防または治療方法を提供することである。
【００１１】
同時に、本発明の他の目的は、虎杖根抽出物のブタノールまたはエチルアセテート分画物を肥満予防用または治療用組成物の製造に用いる用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、アルコール、水またはその混合物で抽出した虎杖根抽出物からヘキサン、エチルアセテート及びブタノールを順次に用いて分画したエチルアセテート、ブタノールの分画物を有効成分として含む肥満治療及び予防用組成物を提供する。
【００１３】
また、前記分画物を用いた肥満予防及び治療方法を提供する。
【００１４】
同時に、前記分画物を有効成分として含む肥満予防及び改善用健康機能食品を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
虎杖根分画物は、天然抽出物であって既存の肥満治療剤に比べて毒性がなくかつ安全であり、虎杖根抽出物または虎杖根から抽出した化合物であるレスベラトロ−ルに比べて膵臓脂肪分解酵素の活性に非常に効果的で、短期間脂肪吸収抑制効能及び体重増加抑制及び体重減少効果に優れているので、肥満予防及び治療用薬学的組成物及び肥満改善用健康機能食品に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、虎杖根抽出及び系統分離を示した図である。
【図２】図２は、虎杖根ブタノール分画物の体重予防効能を示した図である。ＮＯＲ：対照群；ＨＦＤ：高脂肪食餌；Ｘｅｎ：陽性対照群のゼニカル；ＰＯＣＵ：虎杖根ブタノール分画物
【図３】図３は、虎杖根ブタノール分画物の予防効果を確認するための体重増加分を示す図である。
【図４】図４は、虎杖根ブタノール分画物が皮下脂肪増加予防に及ぼす影響を示す図である。ＮＯＲ：対照群；ＨＦＤ：高脂肪食餌；Ｘｅｎ：陽性対照群のゼニカル；ＰＯＣＵ：虎杖根ブタノール分画物
【図５】図５は、虎杖根ブタノール分画物が生殖器周囲脂肪増加予防に及ぼす影響を示す図である。
【図６】図６は、虎杖根ブタノール分画物が腎臓部位脂肪増加予防に及ぼす影響を示す図である。
【図７】図７は、虎杖根ブタノール分画物処理後の予防効果を観察するために、脂肪細胞の大きさの変化を示した写真である。
【図８】図８は、虎杖根ブタノール分画物処理後の予防効果を観察するために、脂肪細胞の大きさの変化を示した分析結果である。
【図９】図９は、脂肪脂質変化を示す図である（総コレステロール）。
【図１０】図１０は、脂肪脂質変化を示す図である（中性脂肪）。
【図１１】図１１は、脂肪脂質変化を示す図である（遊離脂肪酸）。
【図１２】図１２は、脂肪脂質変化を示す図である（高密度脂質タンパク質；ＨＤＬ）。
【図１３】図１３は、脂肪脂質変化を示す図である（低密度脂質タンパク質；ＬＤＬ）。
【図１４】図１４は、虎杖根のブタノール分画物投与群の脂肪肝予防効能を示す図である。
【図１５】図１５は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肝臓での、中性脂肪含量増加予防効果を示す図である。
【図１６】図１６は、虎杖根のブタノール分画物投与群の脂肪肝予防効果に対するＨ＆Ｅ染色結果を示す図である。
【図１７】図１７は、虎杖根のブタノール分画物投与群の血中でのインスリン耐性予防を示す図である。
【図１８】図１８は、虎杖根のブタノール分画物投与群の膵臓ベータ細胞破壊予防効果を示す図である。
【図１９】図１９は、虎杖根のブタノール分画物投与群の脂肪生成マーカーであるａＰ２  ｍＲＮＡの増加予防効果を示す図である。
【図２０】図２０は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肥満治療効果を確認するための高度肥満ネズミの体重減少に及ぼす影響を示す図である。
【図２１】図２１は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肥満治療効果を確認するための高度肥満ネズミの各部位脂肪重量の減少に及ぼす影響を示した図である（褐色脂肪）。
【図２２】図２２は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肥満治療効果を確認するための高度肥満ネズミの各部位脂肪重量の減少に及ぼす影響を示した図である（生殖器周囲脂肪）。
【図２３】図２３は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肥満治療効果を確認するための高度肥満ネズミの各部位脂肪重量の減少に及ぼす影響を示した図である（腎臓周囲脂肪）。
【図２４】図２４は、虎杖根のブタノール分画物投与群の肥満治療効果を確認するための高度肥満ネズミの各部位脂肪重量の減少に及ぼす影響を示した図である（皮下脂肪）。
【図２５】図２５は、虎杖根ブタノール分画物が脂肪細胞の大きさに及ぼす影響を示す写真である。
【図２６】図２６は、虎杖根ブタノール分画物が脂肪細胞の大きさに及ぼす影響を示す分析結果である。
【図２７】図２７は、虎杖根ブタノール分画物投与群の脂肪脂質変化を示す図である（総コレステロール）。
【図２８】図２８は、虎杖根ブタノール分画物投与群の脂肪脂質変化を示す図である（中性脂肪）。
【図２９】図２９は、虎杖根ブタノール分画物投与群の脂肪脂質変化を示す図である（ＨＤＬ）。
【図３０】図３０は、虎杖根ブタノール分画物投与群の脂肪脂質変化を示す図である（ＬＤＬ）。
【図３１】図３１は、虎杖根ブタノール分画物投与群の脂肪肝治療効能を示す図である。
【図３２】図３２は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝臓の重さ変化を示す図である。
【図３３】図３３は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織Ｈ＆Ｅ染色を示す図である。
【図３４】図３４は、虎杖根ブタノール分画物の肝臓での中性脂肪含量変化を示す図である。
【図３５】図３５は、虎杖根ブタノール分画物の血中ＴＮＦ−α濃度を示す図である。
【図３６】図３６は、虎杖根ブタノール分画物の血中ＩＬ−６濃度を示す図である。
【図３７】図３７は、虎杖根ブタノール分画物の脂肪組織内ＩＬ−６濃度を示す図である。
【図３８】図３８は、虎杖根ブタノール分画物の脂肪組織内ＴＮＦ−α濃度を示す図である。
【図３９】図３９は、虎杖根ブタノール分画物の血糖を示す図である。
【図４０】図４０は、虎杖根ブタノール分画物の血中インスリンを示す図である。
【図４１】図４１は、虎杖根ブタノール分画物のＨｂＡ１ｃを示す図である。
【図４２】図４２は、虎杖根ブタノール分画物のインスリン敏感度を示す図である。
【図４４】図４４は、虎杖根ブタノール分画物投与群で膵臓ベータ細胞の変化を示す図である。
【図４５】図４５は、虎杖根ブタノール分画物処理によるＳＯＣＳタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図４６】図４６は、虎杖根ブタノール分画物処理によるＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性分析を示す図である。
【図４７】図４７は、虎杖根ブタノール分画物投与群の血中アディポネクチン濃度変化を示した図である。
【図４８】図４８は、虎杖根ブタノール分画物投与群の血中レプチン濃度変化を示す図である。
【図４９】図４９は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＡＭＰＫタンパク質発現の変化を示す図である。
【図５０】図５０は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＡＭＰＫタンパク質発現の変化を示す図である。
【図５１】図５１は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＡＭＰＫタンパク質発現の変化を示す図である。
【図５２】図５２は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＡＣＣタンパク質発現変化を示す図である。
【図５３】図５３は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＦＡＳ  ｍＲＮＡ発現変化を示す図である。
【図５４】図５４は、虎杖根ブタノール分画物投与群の肝組織内ＣＰＴ−１活性の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記目的を達成するために、本発明は、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満に対する予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
また、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満、高脂血症及び代謝症侯群に対する予防及び改善用機能性食品を提供する。
【００１９】
また、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
また、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満予防及び改善用機能性食品を提供する。
【００２１】
また、薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物を肥満個体に投与する工程を含む、肥満治療方法を提供する。
【００２２】
同時に、薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物を個体に投与する工程を含む、肥満予防方法を提供する。
【００２３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２４】
本発明は、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物またはエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満、高脂血症及び代謝症侯群に対する予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２５】
本発明者は、虎杖根の抽出物、分画物及びそれから抽出した単一化合物であるレスベラトロ−ルに対して研究中、虎杖根のブタノール分画物及びエチルアセテート分画物が、虎杖根の水抽出物、エチルアルコール抽出物及びレスベラトロ−ルに比べて肥満治療に顕著な効果があることを明らかにすることによって、虎杖根の分画物が肥満治療及び予防に用いられ得ることを明らかにした。
【００２６】
前記虎杖根抽出物は、超音波抽出法、ろ過法及び還流抽出法など当業界の通常的な抽出方法で製造されたものであり得る。
【００２７】
前記虎杖根抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたはそれらの混合溶媒で抽出した抽出物であり得、メタノールまたはエチルアルコールで抽出した抽出物であることが好ましい。
【００２８】
前記溶媒は、虎杖根抽出物の１〜１０倍を使用することができ、１〜５倍を使用することが好ましい。
【００２９】
本発明の分画物は、前記抽出された抽出物から溶媒を飛ばして得た残渣に水とヘキサンを入れてヘキサン層を分離して得た。また、ヘキサン層を除いた水層にエチルアセテートを混合した後、エチルアセテート層を分離して得た。また、エチルアセテート層を除去した後、ブタノールを混合した後、ブタノール層を分離して得た。最後にブタノール層を除去した後、水層を得た（実施例１〜６参照）。
【００３０】
前記抽出物の中で、水抽出物、エチルアルコール抽出物と前記分画物中のヘキサン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物及び純粋分離した化合物であるレスベラトロ−ルを用いて、肥満治療剤ターゲットである膵臓脂肪分解酵素の阻害効果を観察した（実験例１及び表１参照）。その結果、ブタノール分画物がエチルアルコール抽出物や、水抽出物及びレスベラトロ−ルより４．６倍、２２倍、７．８倍効能が優れていることを確認した。同時に、エチルアセテート分画の場合にも、エチルアルコール抽出物、水抽出物及びレスベラトロ−ルに比べて２．７倍、１３．４倍及び４．７倍抑制効能が優れていることを確認した。
【００３１】
これとともに脂肪エマルジョン吸収抑制能力を確認するために、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験を実施した（実験例２及び表２参照）。その結果、虎杖根エチルアルコール抽出物のブタノール分画物の場合には、陽性対照群であるゼニカルに次ぐ、優れた効果を示すことを確認し、エチルアセテート分画物の場合にも、水抽出物、エチルアルコール抽出物及びレスベラトロ−ルに比べて顕著に脂肪エマルジョン吸収抑制能力があることを確認した。
【００３２】
このようにして、虎杖根抽出物のブタノール分画物及びエチルアセテート分画物が、生体内で脂肪吸収を抑制して肥満治療及び予防用薬学的組成物に用いられ得ることを確認した。
【００３３】
膵臓脂肪分解酵素活性を抑制して脂肪エマルジョン吸収能力を阻害することを確認した後、実際に動物実験を通じて肥満予防に効果があるかどうか確認した。
【００３４】
本発明者は、肥満予防効果を確認するために、動物での脂肪生成抑制効能を観察した（実験例３参照）。虎杖根抽出物のブタノール分画物１％投与時に体重変化量は、正常群と非常に類似に変化することを確認し、このような効果は製品に常用化されたゼニカルに比べて優れていることが分かる（図２及び図３参照）。
【００３５】
また、身体各部位別に脂肪増加効能を観察した結果、皮下脂肪、生殖器周囲及び腎臓周囲のすべてで、脂肪増加率が低いことが分かった（図４〜６参照）。
【００３６】
このような体重の変化を細胞水準で確認するために、脂肪組織を摘出して観察した結果、脂肪細胞の大きさが虎杖根のブタノール分画物で顕著に減少することを確認することができた（図７及び図８参照）。
【００３７】
併せて、高脂肪食餌といっしょに虎杖根抽出物のブタノール分画物を投与したネズミから脂肪肝を採取して、脂肪蓄積の有無を確認し（実験例３〜４及び図１４参照）、肝臓での中性脂肪含量変化を確認し（図１５参照）、肝組織Ｈ＆Ｅ染色で肝組織の変化を確認し（図１６参照）、血中でのインスリン含量変化を確認し（図１７参照）、膵臓ベータ細胞（図１８参照）及び脂肪生成マーカー（ａＰ２）発現変化を確認した（図１９参照）。その結果、肝臓に脂肪蓄積が抑制され、中性脂肪の含量が低くなり、肝組織の変化が少なく、血中インスリン含量変化が少なく、膵臓ベータ細胞の破壊が抑制される点及び脂肪生成マーカーの発現が抑制される点から、虎杖根抽出物のブタノール分画物が肥満予防に効果があることが分かる。
【００３８】
また、実際の動物実験を通じて肥満治療に効果があるかどうか確認した。
【００３９】
肥満治療を確認するために高脂肪食餌で誘発された肥満ネズミの体重の減少を確認した。その結果、実験例４にみられるようにブタノール分画物の場合には、体重減量効果があることを確認した（図２０参照）。また、各部位の脂肪減少割合を測定した結果、生殖器、腎臓周囲、皮下脂肪及び褐色脂肪のすべてで１％虎杖根ブタノール分画物投与時に顕著な効果があることを確認した（図２１〜図２４参照）。また、脂肪細胞の大きさも正常な水準で維持されることを確認した（図２５参照）。このような結果から本発明の虎杖根抽出物のブタノール分画物の場合、肥満治療に顕著な効果があることを確認した。
【００４０】
併せて、高脂肪食餌で肥満を誘導したネズミと肥満ネズミに虎杖根抽出物のブタノール分画物を投与したネズミから脂肪肝を採取して、脂肪蓄積の有無を確認し（実験例４〜５及び図３１参照）、肝臓の重さ変化を確認し（図３２参照）、肝組織Ｈ＆Ｅ染色で肝組織の変化を確認し（図３３参照）、肝臓の中性脂肪含量変化を確認し（図３４参照）、血中及び脂肪組織内ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの濃度を確認し（図３５及び図３６参照）、血糖、血中インスリン、ＨｂＡ１ｃ、インスリン敏感度の変化を確認し（図３９〜図４３）、膵臓ベータ細胞（図４４参照）変化を確認した。その結果、肝臓の脂肪が除去され、肝臓の重さが減少し、中性脂肪の含量が低くなり、血中及び脂肪組織内でＩＬ−６及びＴＮＦ−αの濃度が低くなり、血糖、血中インスリン、ＨｂＡ１ｃ、インスリン敏感度のすべてが正常群と類似であることを確認することによって、虎杖根抽出物のブタノール分画物が肥満治療に効果があることが分かる。
【００４１】
本発明は、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールで抽出した分画物またはエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、高脂血症に対する予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００４２】
高脂血症に対する予防効果を立証するために、高脂肪食餌といっしょに虎杖根抽出物のブタノール分画物を投与したネズミから血液を採取して、脂肪代謝関連指標である総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの増加量を確認した。その結果、高脂肪食餌群でも虎杖根抽出物のブタノール分画物投与群では、脂肪代謝関連指標が顕著に低くなって高脂血症に効能があることを確認した（実験例３〜４及び図９〜図１３参照）。
【００４３】
また、高脂血症に対する治療効果を立証するために、肥満が誘導されたネズミ及び肥満が誘導されたネズミに虎杖根抽出物のブタノール分画物を投与したネズミから血液を採取して、脂肪代謝関連指標である総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの増加量を確認した。その結果、高脂肪食餌群でも虎杖根抽出物のブタノール分画物投与群では、脂肪代謝関連指標が顕著に低くなって高脂血症に効能があることを確認した（実験例４〜４及び図２７〜図３０参照）。
【００４４】
本発明は、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールまたはエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、代謝症侯群に対する予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００４５】
発明者は、虎杖根抽出物のブタノール分画物が脂肪代謝に及ぼす影響を観察した結果（実験例４〜７参照）、脂肪代謝に影響を及ぼす因子である血中アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）及び血中レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の濃度が減少して正常な水準になることを確認した。
【００４６】
脂質代謝に対するブタノール分画物の効能を検証するために、肝組織内のＡＭＰＫタンパク質発現変化、肝組織内ＡＣＣタンパク質発現変化、肝組織内ＦＡＳ  ｍＲＮＡ発現変化、肝組織内ＣＰＴ−１活性変化を観察した結果、ブタノール分画物を処理した群で正常群と類似であることを確認した（図４７〜５４参照）。このようにして虎杖根抽出物のブタノール分画物が脂肪代謝を維持するのに効果的であることを確認し、脂質代謝症侯群に対する予防及び治療用薬学的組成物として用いられ得ることが分かった。
【００４７】
本発明は、薬学的組成物総重量に対して本発明の虎杖根抽出物の分画物を０．１〜９９．９重量％を有効成分として含み、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口のさまざまな剤形であり得る。製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤では、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤では、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤及び懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基材には、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００４９】
本発明の薬学的組成物を適用し得る個体は脊椎動物で、好ましくは哺乳動物であり、さらに好ましくはネズミ、マウス、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、チンパンジー、ゴリラ、ヒトのような類人猿類動物が最も好ましい。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、皮膚外用または腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射方式を選択することが好ましく、最も好ましいのは、皮膚外用として使用する。
【００５１】
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様であり、一日の投与量は、虎杖根抽出物の分画物の量を基準に０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは３０〜５００ｍｇ／ｋｇで、さらに好ましくは５０〜３００ｍｇ／ｋｇで、一日に１〜６回投与することができる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００５３】
また、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノール分画物またはエチルアセテートで抽出した分画物を有効成分として含む、肥満、高脂血症及び代謝症侯群で構成された群から選択された一つ以上の疾患に対する予防及び改善用機能性食品を提供する。
【００５４】
虎杖根は、すでに薬剤として用いられている天然抽出物で、生体毒性がなくかつ安全であると判断されるので、健康食品に非常に有用に使用することができる。さらに、虎杖根の抽出物のブタノール分画物またはエチルアセテート分画物の場合には、肥満予防及び治療効果が優れているので、肥満予防及び改善用機能性食品に非常に有用に用いられ得る。
【００５５】
本発明の機能性食品は、様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康食品１００重量部当たり０．０１〜０．０４重量部、好ましくは約０．０２〜０．０３重量部の範囲で選択することが好ましい。
【００５６】
前記の他に、本発明の機能性食品は、様々な営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に、本発明の機能性食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが本発明の健康食品１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００５７】
また、薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物またはエチルアセテート分画物を肥満の個体に投与する工程を含む、肥満、高脂血症または代謝症侯群の治療方法を提供する。
【００５８】
実験例４で高脂肪食餌で肥満が誘導されたネズミに虎杖根抽出物のブタノール分画物を投与して、実質的に肥満、高脂血症及び代謝症侯群治療に効果があることを確認した。
【００５９】
前記治療方法を適用することができる個体は、実施例で裏付されているマウスの外にもマウスのような脊椎動物が可能である。好ましくは哺乳動物であり、それより好ましくはネズミ、マウス、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、チンパンジー、ゴリラ及びヒトのような類人猿動物が最も好ましい。
【００６０】
前記の治療方法としては、実施例では皮膚外用及び腹腔内注射方法を示しているが、細胞毒性がないので、前記方法以外にも経口または非経口投与することができ、非経口投与時には、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射方式を選択することが好ましい。最も好ましいのは、実施例のような皮膚外用で使用することである。
【００６１】
前記治療方法時の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様である。
【００６２】
また、薬学的に有効な量の虎杖根ブタノール分画物を個体に投与する工程を含む、肥満、高脂血症または代謝症侯群の予防方法を提供する。
【００６３】
実験例３にみられるように高脂肪食餌を給餌することと虎杖根抽出物のブタノール分画物を一緒に処理して本発明の分画物が、肥満、高脂血症または代謝症侯群に予防効果があることを確認した。ゆえに、一般個体に本発明の虎杖根抽出物のブタノール分画物を処理時、個体の肥満を予防することができるであろう。
【００６４】
併せて、虎杖根の水、アルコール、またはそれらの混合溶媒の抽出物を追加的にブタノールまたはエチルアセテート抽出した分画物を、肥満、高脂血症または代謝症侯予防用または治療用組成物の製造に用いる用途を提供する。
【００６５】
本発明の虎杖根抽出物のブタノール分画物またはエチルアセテート分画物は、肥満、高脂血症または代謝症侯群に対する予防及び治療効果が立証されるので、前記疾患を治療するための薬学組成物製造時に本発明の分画物を用いることができる。
【００６６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
（発明を実施するための形態）
＜実施例１＞虎杖根水抽出物製造
実験に使用した虎杖［Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ  Ｓｉｅｂ．ｅｔ  Ｚｕｃｃ．＝Ｒｅｙｎｏｔｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｈｏｕｔｔ．；Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ］の根茎（虎杖根）は、大田に位置した百済堂漢方薬局で購入して（にちへんに景）園大生命科学科キム・ズファン教授が同定した。証拠標本（ｎｏ．ＫＩＯＭ−ＰＯＣＵ１）は、韓国漢方医学研究院糖尿合併症研究センターの標本室に保管中である。
【００６７】
陰干して細切した虎杖根（３０ｇ）に３００ｍｌの蒸留水を入れて、抽出容器で常温状態で２時間３回反復抽出してろ過した後、水抽出物を得た。前記抽出液を回転減圧濃縮機を用いて４０℃で濃縮した。濃縮物は再び減圧乾燥を経て最終的に虎杖根水抽出物（２．５ｇ）を獲得した。
＜実施例２＞虎杖根エチルアルコール抽出物製造
陰干して細切した虎杖根６．８ｋｇをエチルアルコール３６ｌに入れて、抽出容器で常温状態で２４時間３回抽出した後、４０℃の減圧下で濃縮させてエチルアルコール抽出物を得た。前記抽出液をろ過した後、減圧状態で濃縮した。ここで、構成成分の分解及び加水分解を防止できるように濃縮時の温度を４０〜４５℃以下に維持した。その結果、エチルアルコール抽出物５８０ｇを得た。
＜実施例３＞虎杖根ヘキサン分画物製造
実施例２で得た虎杖根エチルアルコール抽出物を蒸留水２ｌに懸濁させた後、図１に示されたようにノルマルヘキサン２ｌを用いて３回反復抽出してノルマルヘキサン層４６ｇを得た。
＜実施例４＞虎杖根エチルアセテート分画物製造
実施例２で得た虎杖根エチルアルコール抽出物を蒸留水２ｌに懸濁させた後、図１に示されたようにノルマルヘキサン２ｌを用いてノルマルヘキサン層と水層を分離した。このようにして得た水層にエチルアセテート２ｌを用いて３回反復抽出してエチルアセテート層２５０ｇを得た。
＜実施例５＞虎杖根ブタノール分画物製造
実施例２で得た虎杖根エチルアルコール抽出物を蒸留水に懸濁させた後、図１に示されたようにノルマルヘキサン、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）、ノルマルブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）で順次に系統分離をして減圧下で濃縮して凍結乾燥してノルマルブタノール分画物１５０ｇを得た。
＜実施例６＞虎杖根エチルアルコール抽出物のエチルアセテート分画物からレスベラトロ−ルの製造
虎杖根エチルアセテート分画物（２５０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０−２３０ｍｅｓｈ、φ１２×６０ｃｍ、メチレンクロライド／メタノール＝１００：０→０：１００）を実施して総１０個の１次小分画に分けた（Ｆ１〜Ｆ１０）。その中の分画物Ｆ５（４．９ｇ）をクロロホルムとメタノール混合溶媒で中圧液体クロマトグラフィー（クロロホルム１００％、４０分；９８％、３０分；９５％、４０分；９０％、６０分；Ｈｉ−Ｆｌａｓｈ  ２Ｌシリカゲルカラム、φ１２×６０ｃｍ、Ｙａｍａｚｅｎ  ＹＦＬＣ  ＡＩ−５８０、日本）を実施して、トランスレスベラトロ−ルを純粋分離して構造を同定した。
【００６８】
前記で記述したように単一化合物１８０ｍｇを分離した後、分光器機（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ）データを分析した結果、レスベラトロ−ル（化学式１参照）であることを確認した。レスベラトロ−ル−白色粉末、
1H-NMR (300 MHz, acetone-d6) δ: 7.36 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2'/H-6'), 7.02 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-8), 6.78 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3'/H-5'), 6.74 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-7), 6.51 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-2/H-6), 6.25 (1H, t, J = 2.0 Hz, H-4). 13C-NMR (75 MHz, acetone-d6) δ: 159.6 (C-3'/C-5'), 158.2 (C-4), 141.0 (C-1'), 130.1 (C-1), 129.2 (C-8), 128.8 (C-2/C-6), 126.9 (C-7), 116.5 (C-3/C-5), 105.8 (C-2'/C-6'), 102.8 (C-4')
【００６９】
【化１】
2013515763.tif 000003
【００７０】
＜実験例１＞膵臓脂肪分解酵素（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ）活性抑制実験
虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のヘキサン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルを用いて、試験管内でブタ膵臓脂肪分解酵素活性抑制実験を実施した。
【００７１】
膵臓脂肪分解酵素抑制実験は、ブタ膵臓脂肪分解酵素を用いて測定した。まず、酵素緩衝溶液［１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）ａｎｄ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ６．８］に混合したブタ膵臓脂肪分解酵素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）３０μＬ（１０ユニット）とトリスバッファー（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣ１  ａｎｄ  ５ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．０）８５０μｌを混合して準備した。そこに多様な濃度で準備した試験物質と陽性対照群であるオルリスタット（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１００μｌを混合して３７℃で１５分間インキュベーションする。以後、基質溶液［１０ｍＭ  ｐ−ＮＰＢ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）ｉｎ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ］２０μｌを添加した後、１５分間さらにインキュベーションする。リパーゼ活性は、ｐ−ＮＰＢがリパーゼによって加水分解されて出るパラ−ニトロフェノールをＥＬＩＳＡ検出機（ＢＩＯ−ＴＥＫ，Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ，米国）を用いて４００ｎｍの波長で吸光度を測定した。リパーゼ活性抑制程度は、試験物質によって抑制された吸光度の比率をパーセント値に換算して計算し、リパーゼの活性を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【００７２】
前記方法によって虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のヘキサン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルを準備して前記実験例にしたがって実験し、試験管内で膵臓脂肪分解酵素活性抑制効能を測定して、その結果を表１に示した。
【００７３】
【表１】
2013515763.tif 000004
【００７４】
表１の結果のように虎杖根エチルアルコール抽出物のブタノール分画（１５．８±２．６μｇ／ｍｌ）→エチルアセテート分画（２６．４±１．９μｇ／ｍｌ）→エチルアルコール抽出物（７２．５±６．７μｇ／ｍｌ）→レスベラトロ−ル（１２４±６．７μｇ／ｍｌ）→ヘキサン層（３２６．９±３６．６μｇ／ｍｌ）→水抽出物（３５２．９±１６．５μｇ／ｍｌ）の順に効能が良かった。エチルアルコール抽出物や、水抽出物及びレスベラトロ−ルよりも、ブタノール分画が４．６倍、２２倍、７．８倍さらに効能が優れていた。またエチルアセテート分画も、エチルアルコール抽出物や、水抽出物及びレスベラトロ−ルよりも２．７倍、１３．４倍、４．７倍抑制効能がさらに優れていた。虎杖根の水やエチルアルコール抽出物よりも、エチルアセテート分画とブタノール分画の効能が非常に優れていることが判明した。
＜実験例２＞動物での脂肪エマルジョン短期間吸収能力分析
虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のヘキサン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルが、ネズミの腸管で脂肪が分解されて吸収される程度を抑制する能力を測定した。
【００７５】
４週齢の雄のウィスターラット（ｍａｌｅ  ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）（Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ，韓国）を１週間馴化させて準備した。実験前１８時間絶食させた後、３ｍｌ脂肪エマルジョン（３ｍｌコーンオイル、５０ｍｇコール酸、３ｍｌ食塩水と１ｇコレステリルオレイン酸）と虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のヘキサン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルをそれぞれ１００、２５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与して、陰性対照群には同量の食塩水（ｓａｌｉｎｅ）のみ投与した。対照薬物には、オルリスタット（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を２００ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。薬物投与直前及び薬物投与後に１時間間隔で総４時間、尾静脈から血液を採取した。採取した血液は、５５００ｇで５分間遠心分離した後、血漿を分離した。血漿トリアシルグリセライド濃度は、ワコー中性脂肪Ｅ−テストキット（Ｗａｋｏ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅ−Ｔｅｓｔ  ｋｉｔ）を用いて測定した。
【００７６】
脂肪エマルジョンと虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のエチルアセテート分画物、ブタノール分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルを投与して、短期間脂肪吸収の抑制能力を測定する動物実験を実施した結果、＜表２＞に見られるように脂肪エマルジョンのみを投与した群では、投与２時間後に血液内中性脂肪量が２倍以上増加した。しかし、虎杖根ブタノール分画物とエチルアセテート分画を投与した群では、明らかな中性脂肪の増加が示されなかった。
【００７７】
２５０ｍｇ投与群の場合は、ブタノール分画（１４０．１±３２．４ｍｇ／ｄＬ）→エチルアセテート分画（１７０．１±３２．４ｍｇ／ｄＬ）→水抽出物（１９１．３±２３．１ｍｇ／ｄＬ）→エチルアルコール抽出物（１９４．４±１８．８ｍｇ／ｄＬ）→レスベラトロ−ル（２２８．５±８．４ｍｇ／ｄＬ）の順で、脂肪吸収抑制効能が優れていた。
【００７８】
すなわち、エチルアルコール抽出物や水抽出物及びレスベラトロ−ルよりも、ブタノール分画とエチルアセテート分画が動物実験で効能がさらに優れていることが証明された（表２参照）。
【００７９】
【表２】
2013515763.tif 000005
【００８０】
＊前記＜表２＞は、動物での虎杖根エチルアルコール抽出物とその抽出物のヘキサン層、エチルアセテート層、ブタノール層及び水層のそれぞれ分画物と水抽出物及びレスベラトロ−ルの脂肪エマルジョン短期間吸収抑制効力を示す。
＜実験例３＞抗肥満効能指標である脂肪生成（Ａｎｔｉ−ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効能
虎杖根ブタノール分画物（以下ＰＯＣＵ−１ｂとする。）の体重増加抑制効能及び脂肪生成、脂肪肝、高脂血症、インスリン分泌などに及ぼす効能を検証した。
【００８１】
試験動物には、生後３週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを準備した後、肥満を誘導するために高脂肪飼料を給餌した。高脂肪食餌は、ＡＩＮ７６Ａ食餌（ＡＩＮ７６Ａ  ｂａｓｅｄ  ４５Ｋｃａｌ％  Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．米国，Ｄ１２４５１，カロリー構成：脂肪４５％、炭水化物３５％、タンパク質２０％）を使用し、正常食餌には、ピュリナげっ歯類食餌（Ｐｕｒｉｎａ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）を使用し、飼料と飲用水は自由給餌した。試験薬物であるＰＯＣＵは、高脂肪飼料に重量対比０．１％、１％の濃度で混合し、対照薬物であるゼニカルは０．１％の濃度で飼料と混合して供給した。１０週間、薬物を混合した高脂肪飼料を供給して肥満を誘導し、毎週体重の変化を分析した。１０週後に剖検を実施して、脂肪、肝、膵臓、筋肉などを分離して薬物の効能を分析した。
＜３−１＞体重変化観察
高脂肪飼料のみを投与した群は持続的に体重が増加したが、虎杖根ブタノール分画物  １．０％混合群は有意に体重増加が抑制された（＊ｐ＜０．０１）（図２参照）。体重増加程度は、高脂肪飼料投与群が１０．９ｇで、ゼニカル投与群は６．１ｇであるが、虎杖根ブタノール分画物混合群は３．６ｇでゼニカルよりも優れた体重増加予防効果が示された（＄，＊ｐ＜０．０１）（図３参照）。
＜３−２＞各部位脂肪増加予防効能観察
脂肪組織の増加有無を分析するために、生殖器周囲脂肪（左／右）、腎臓周囲脂肪（左／右）、皮下脂肪（左／右）及び褐色脂肪を注意深く摘出して生理食塩水で洗浄した後、ろ過紙で水分を除去した後、脂肪組織の重量を測定した。
【００８２】
その結果、虎杖根ブタノール分画物投与群（１％混合群）が非常に良く各部位での脂肪増加を予防した（皮下脂肪：０．１５ｇ、生殖器周囲脂肪：０．２１ｇ、腎臓周囲脂肪：０．０７ｇ）。単一化合物であるゼニカル程度に効能（皮下脂肪：０．１４ｇ、生殖器周囲脂肪：０．１７ｇ、腎臓周囲脂肪：０．０４ｇ）が優れていることが証明された（＊Ｐ＜０．０１）（図４、５及び６参照）。
＜３−３＞脂肪細胞の大きさ抑制効能観察
摘出した脂肪組織を１０％ホルマリンに固定した後、パラフィン包埋してスライド組織を準備した後、Ｈ＆Ｅ染色をして光学顕微鏡下で脂肪細胞の大きさを分析した。図７に見られるように、高脂肪食餌群は脂肪細胞の大きさが顕著に増加したが（１２５μｍ）、虎杖根ブタノール分画物投与群は正常な水準で（６１μｍ）維持され、ゼニカル（７５μｍ）より効能がさらに優れていた（＃ｐ＜０．０１）（図７参照）。
＜３−４＞抗高脂血症効能観察
試験終了後、実験動物を１６時間絶食させて、剖検時に腹大動脈から血液を採取して  ３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清及び血漿を分離した。分離した血清を用いて脂肪代謝関連指標である中性脂肪、高密度脂質タンパク質（ＨＤＬ）、低密度脂質タンパク質（ＬＤＬ）、総コレステロールを血清自動分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０６０，日本）を用いて測定した。
【００８３】
結果的に高脂肪食餌群で、総コレステロール、中性脂肪、ＬＤＬ、遊離脂肪酸の含量がそれぞれ１８３％、１６１％、２６７％、１１４％以上有意に増加した。しかし、虎杖根ブタノール分画物投与群（１％）は、総コレステロール（２９％）、中性脂肪（２２％）、ＬＤＬ（３２％）、遊離脂肪酸（３２％）の含量を有意に減少させる、優れた効能を証明した（図９、図１０、図１１、図１２及び図１３参照）。
＜３−５＞脂肪肝に予防効能
脂肪が増加するにつれて脂肪にも脂肪が蓄積して脂肪肝に進展する。脂肪肝に進展すると蓄積された脂肪によって肝臓本来の色相である鮮紅色が消える。
【００８４】
図１４に示されたように虎杖根ブタノール分画物（１％）投与群の肝の色相は正常群のような鮮紅色に維持された（図１４参照）。これは、虎杖根ブタノール分画物（１％）の投与群は、肝臓に脂肪が蓄積することを予防したことを意味する。
【００８５】
また、肝臓での中性脂肪の量を分析した結果、虎杖根ブタノール分画物投与（０．１％、１．０％）によって中性脂肪増加がそれぞれ３３％、４０％有意に（＃ｐ＜０．０１）予防されたことを確認した（図１５参照）。
【００８６】
剖検時に採取した肝組織を１０％中性化ホルマリンに固定した後、組織処理後ヘマトキシリンエオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を実施して光学顕微鏡下で観察した。肝組織を染色した結果、正常群の場合は中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ  ｖｅｉｎ）中心に肝組織がよく観察されたが、高脂肪食餌群は過度な脂肪蓄積によって肝組織が顕著に変化したことを確認した。しかし、虎杖根ブタノール分画物投与群（１％）は、ほとんど正常群の肝組織のような様相を示した（図１６参照）。これは、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与で脂肪肝合併症が予防されたことを証明する。
＜３−６＞インスリン耐性予防効能観察
肥満は、インスリン耐性を誘発して自動的に糖尿病に進展する。虎杖根ブタノール分画物（１％）投与で、インスリン耐性が有意に（＃ｐ＜０．０１）予防されたことが確認された（図１７参照）。
【００８７】
同時に、膵臓でインスリン分泌細胞であるベータ細胞変化を分析した結果、高脂肪食餌群はベータ細胞がほとんど破壊されたが、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与群の場合はほとんど正常群のようなベータ細胞がたくさん観察された（図１８参照）。このことから、虎杖根ブタノール分画物（１％）がベータ細胞の破壊を予防して血中のインスリン耐性を予防することが証明された。
＜３−７＞脂肪生成マーカー（ａＰ２）発現変化
肝組織からｍＲＮＡを抽出した後、脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）マーカーであるａＰ２プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。図１９のように脂肪生成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）マーカーであるａＰ２  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを通じて分析した結果、高脂肪食餌群でａＰ２マーカーが１．４倍以上増加し、虎杖根ブタノール分画物１％給餌群では有意に正常水準に減少した（＊ｐ＜０．０１）。これは、高脂質飼料による脂肪生成が虎杖根ブタノール分画物によって抑制されたことを示す。
＜実験例４＞虎杖根ブタノール分画物の脂肪分解効能（肥満治療効能）
＜４−１＞体重減少変化観察
虎杖根ブタノール分画物（ＰＯＣＵ−１ｂ）の高脂肪食餌で誘発された肥満ネズミの体重減少及び脂肪分解に及ぼす影響を調べるために、高脂肪飼料を薬物供給前に１０週間供給して高度の肥満を誘導した後、虎杖根ブタノール分画物（０．１％、１．０％）を投与して体重の変化を観察した。虎杖根ブタノール分画物（１％）給餌によって、ゼニカルよりも効能が優れ有意な体重減少治療効能を示した（＊，＊＊ｐ＜０．０１）（図２０参照）。
＜４−２＞各部位の脂肪増加予防効能観察
図２１〜図２４に示したように、各部位別の脂肪重さを測定した結果、生殖器周囲脂肪は高脂肪食餌群で約１１ｇで正常食餌群６．２ｇに比べて約２倍増加した一方、虎杖根ブタノール分画物（１％）給餌群では６．３ｇで、１％給餌群では有意に脂肪重さが減少した（ｐ＜０．０１）。腎臓周囲脂肪及び皮下脂肪の場合にもこのような同一な結果が示され、褐色脂肪の場合虎杖根ブタノール分画物０．１％、１．０％給餌群ですべて有意な脂肪重さの減少が観察された（ｐ＜０．０１）。
＜４−３＞  脂肪細胞の大きさ抑制効能観察
剖検時に摘出した脂肪組織を１０％中性ホルマリンに固定した後、パラフィン包埋してスライド組織を準備した後、Ｈ＆Ｅ染色をして光学顕微鏡下で脂肪細胞の大きさを分析した。
【００８８】
図２５及び図２６にみられるように、高脂肪食餌群は脂肪細胞の大きさが顕著に増加したが（７９μｍ）、虎杖根ブタノール分画物投与群は正常な水準で（５６μｍ）維持された（＃ｐ＜０．０１）。
＜４−４＞抗高脂血症効能
試験終了後に実験動物を１６時間絶食させて、剖検時に腹大動脈から血液を採取して３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清及び血漿を分離した。分離した血清を用いて脂肪代謝関連指標である中性脂肪、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロールを血清自動分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ７０６０，日本）を用いて測定した。
【００８９】
結果的に、高脂肪食餌群で総コレステロール、中性脂肪、ＬＤＬの含量がそれぞれ１４４％、１７１％、１３５％以上有意に増加し、ＨＤＬは９％減少する傾向を示した。しかし、虎杖根ブタノール分画物投与群（１％）は総コレステロール（２７％）、中性脂肪（６５％）、ＬＤＬ（３６％）の含量を有意に減少させる、優れた治療効能を証明した。虎杖根ブタノール分画物投与で（０．１％、１．０％）ＨＤＬの含量がそれぞれ１２７％、１２１％有意に増加した（＃ｐ＜０．０５）（図２７〜図３０参照）。
＜４−５＞脂肪肝治療効能
脂肪が増加するにつれて脂肪にも脂肪が蓄積して脂肪肝に進展する。脂肪肝に進展すると蓄積された脂肪によって肝本来の色相である鮮紅色が消える。
【００９０】
図３１で観察されるように、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与群の肝の色相は正常群のような鮮紅色で維持された（図３１参照）。これは、虎杖根ブタノール分画物（１％）の投与群は肝臓の脂肪蓄積が治ったことを意味する。
【００９１】
また、肝の重さを分析した結果、虎杖根ブタノール分画物投与（０．１％、１．０％）で中性脂肪増加が有意に（＃ｐ＜０．０１）治ったことを確認した（図３２参照）。
【００９２】
同時に剖検時に採取した肝組織を１０％中性化ホルマリンに固定した後、組織処理後Ｈ＆Ｅ染色を実施して光学顕微鏡下で観察した。染色の結果、正常群の場合中心静脈中心に肝組織がよく観察されたが、高脂肪食餌群は過度な脂肪蓄積で肝組織が顕著に変化したことを確認した。しかし、虎杖根ブタノール分画物投与群（１％）はほとんど正常群の肝組織のような様相を示した（図３３参照）。これは、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与によって脂肪肝合併症が治ったことを意味する。
【００９３】
また、肝臓での中性脂肪の量を分析した結果、虎杖根ブタノール分画物投与（０．１％、１．０％）によって中性脂肪増加が有意に（＃ｐ＜０．０５）治ったことを確認した（図３４参照）。
＜４−６＞肥満性インスリン抵抗性（Ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）治療効能
肝及び血清（Ｓｅｒｕｍ）で虎杖根ブタノール分画物によるインスリン代謝調節の核心酵素であるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＳＯＳＣ−３（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ−３）の発現変化を分析した。肥満は、インスリン抵抗性を誘発して深刻な糖尿（合併症）を誘発することはすでに広く知られている。肥満によって、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、アディポネクチンなどが非正常的に作用して肝臓や筋肉でＳＯＣＳ経路とＴＳＣ／ｍＴＯＲ経路を通じてインスリン耐性を引き起こす。
【００９４】
血中アディポサイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−ａの濃度をＥＬＩＳＡを通じて確認し、脂肪細胞でそれらタンパク質の濃度をウエスタンブロットで確認した。
【００９５】
高脂質給餌群の場合、それらアディポサイトカインの濃度が１．４倍程度増加した、一方、虎杖根ブタノール分画物投与（１％）で血中ＩＬ−６とＴＮＦ−ａの濃度が正常水準に回復した（図３５及び図３６参照）。
【００９６】
また、血液だけでなく脂肪組織内でもアディポサイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−ａタンパク質変化も正常に回復する治療効能が証明された（図３７及び図３８参照）。
【００９７】
同時に、血糖、血中インスリン抵抗性、ＨｂＡ１ｃとインスリン敏感度及びＨＯＭＡ数値が虎杖根ブタノール抽出物によって正常に回復した（図３９、図４０、図４１、図４２及び図４３参照）。
【００９８】
インスリンを生成する膵臓組織のベータ細胞の変化を観察するために、抗インスリン抗体（Ａｂｃａｍ，米国）を用いて免疫組織化学染色を実施した。
【００９９】
その結果、高脂質飼料給餌群ではベータ細胞の拡張及びインスリン消失所見が観察される一方、虎杖根ブタノール分画物給餌群ではベータ細胞の形態及びインスリンの量が正常であることが確認された。（図４４参照）。
【０１００】
また、このような虎杖根ブタノール分画物によるインスリン抵抗性の改善が、ＳＯＣＳとＮＦ−ｋＢ信号経路であるかどうか確認してみるために、ＳＯＳＣに対するウエスタンブロット分析とＮＦ−ｋＢ  ＥＬＩＳＡ−基礎ＤＮＡ結合分析を実施した結果、虎杖根ブタノール分画物がＳＯＳＣ水準及びＮＦ−ｋＢの活性を正常水準に回復させる機序によることを確認した。（図４５及び図４６参照）。
＜４−７＞筋肉及び肝組織で脂肪代謝に及ぼす影響
脂肪代謝は、脂肪生成と脂肪分解の均衡が適切に維持されることが理想的であるが、飲食物を通じた過度な営養分の摂取はこのような脂肪代謝の均衡を破って体内筋肉及び肝組織に過度な脂肪の蓄積を引き起こすようになる。このような脂肪代謝の不均衡に虎杖根ブタノール抽出物が及ぼす影響を詳しく調べた。
【０１０１】
脂肪代謝に影響を及ぼす因子には色々あるが、その中で脂肪細胞から分泌する血中アディポサイトカインであるアディポネクチンとレプチンの濃度をＥＬＩＳＡを通じて確認した。図４７及び図４８のように高脂質飼料給餌群では血中アディポネクチンの濃度が０．７倍減少し、反対にレプチンの濃度は２．５倍ほど増加した。しかし、虎杖根ブタノール分画物給餌群（１％）の場合アディポネクチン及びレプチンの血中濃度を正常な水準に回復させた（図４７及び図４８参照）。
【０１０２】
また、脂肪が主に蓄積される臓器である肝組織からタンパク質及びｍＲＮＡを抽出して脂肪代謝に関与する重要因子であるアデノシンモノフォスフェート活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）及び脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現量を分析した。
【０１０３】
その結果、図４９、図５０及び図５１のようにｐ−ＡＭＰＫ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰ−ｋｉｎａｓｅ）及びＡＭＰＫ発現量が高脂質飼料給餌群の場合１０％ほど減少したが、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与によって正常水準に回復した。
【０１０４】
また、図５２のようにＡＣＣ発現量も高脂質飼料給餌群で２３％ほど減少したが、虎杖根ブタノール分画物（１％）群で正常な水準に回復した。
【０１０５】
一方、ＦＡＳ  ｍＲＮＡ発現量の場合、高脂質飼料給餌群で１５０％ほど増加し、虎杖根ブタノール分画物給餌によって濃度依存的に減少した（図５３参照）。
【０１０６】
組織内脂肪酸化に関与する重要酵素であるカルニチンパルミトイル転移酵素１（ＣＰＴ−１）の活性を測定するために肝組織からタンパク質を抽出して、ニトロフェニルブチラートを基質にして活性を測定した。
【０１０７】
図５４のように高脂肪飼料給餌によって脂肪酸化と関連したＣＰＴ−１の活性が５８％ほど有意に減少していたが、虎杖根ブタノール分画物（１％）投与によって正常水準に回復した。
【０１０８】
以上の研究結果を通じて、虎杖根エチルアセテート分画物とブタノール分画物の膵臓脂肪分解酵素活性抑制、腸管脂肪吸収抑制、体重増加抑制及び体重減少などにおいて、抗肥満効能が優れていることが証明され、新しい肥満及び高脂血症、代謝性症侯群のような関連疾病治療剤として用いることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、膵臓脂肪分解酵素活性抑制に効果的で腸管脂肪吸収抑制効果があって肥満治療及び予防に効果的な天然抽出物として、肥満治療及び予防用組成物として薬学的に利用可能であるのみならず、健康機能食品としても有用に用いられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2013515763.tif 000040
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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