(57)【要約】  本願発明は３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ）の実質的に固体の形態に、かかる形態の製造方法に、その医薬組成物に、およびそれを用いる治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａとして特徴付けられる３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（コンパウンド１）の固体形態。
【請求項２】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａが、空であるか、または少なくとも一部が溶媒で占められている、複数の反復空洞を含有するコンパウンド１の結晶格子として特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項３】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａが、複数の空洞が空である複数の反復空隙を含有するコンパウンド１の結晶格子として特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項４】
Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、２１.５ないし２１.９°、８.８ないし９.２°および１０.８ないし１１.２°での一または複数のピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項５】
Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、２１.５ないし２１.９°、８.８ないし９.２°、１０.８ないし１１.２°、１８.０ないし１８.４°および２２.９ないし２３.３°での一または複数のピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項６】
２１.７０、８.９８、１１.０４、１８.１６および２３.０６°での一または複数のピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項７】
２１.５ないし２１.９°でのピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項８】
２１.７０でのピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項９】
８.８ないし９.２でのピークで特徴付けられる、請求項１、２または３に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１０】
８.９８°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし９のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１１】
１０.８ないし１１.２°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１０のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１２】
１１.０４°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１１のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１３】
１８.０ないし１８.４°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１２のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１４】
１８.１６°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１３のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１５】
２２.９ないし２３.３°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１４のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１６】
２３.０６°でのピークでさらに特徴付けられる、請求項６ないし１５のいずれか一項に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１７】
図１に回折パターンと実質的に同じパターンにより特徴付けられる、請求項２記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１８】
溶媒和物が複数の反復空洞に適合するのに十分な大きさの有機溶媒和物からなる群より選択される、請求項２記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項１９】
溶媒和物がメタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸メチル、２−ブタノン、ギ酸エチル、酢酸エチルおよび２−メチルテトラヒドロフランからなる群より選択される、請求項１８記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項２０】
コンパウンド１・溶媒和物・形態ＡがＴＧＡで測定された場合に１ないし１０重量％の溶媒和物を含む、請求項１８記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項２１】
コンパウンド１・溶媒和物・形態ＡがＴＧＡで測定された場合に２ないし５重量％の溶媒和物を含む、請求項２０記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項２２】
融点が１８５℃から１９０℃までである、請求項２記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項２３】
Ｐ２１／ｎ空間群および次の単位セルの寸法：
ａ＝１６.５２３５（１０）Å    α＝９０°
ｂ＝１２.７４２５（８）Å      β＝１０３.７３６（４）°
ｃ＝２０.５５１２（１３）Å    γ＝９０°
を有する、請求項２記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ。
【請求項２４】
Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、８.８ないし９.２°、１７.３ないし１７.７°および１８.２ないし１８.６°での１または複数のピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項２５】
Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、８.８ないし９.２°、１７.３ないし１７.７°、１８.２ないし１８.６°、１０.１ないし１０.５°および１５.８ないし１６.２°での１または複数のピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項２６】
８.９６、１７.５１および１８.４５°での１または複数のピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項２７】
８.９６、１７.５１、１８.４５、１０.３３および１６.０１°での１または複数のピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項２８】
８.８ないし９.２°でのピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項２９】
８.９６°でのピークにより特徴付けられる、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３０】
１８.２ないし１８.６°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８または２９に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３１】
１８.４５°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８ないし３０のいずれか一項に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３２】
１０.１ないし１０.５°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８ないし３１のいずれか一項に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３３】
１０.３°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８ないし３２のいずれか一項に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３４】
１５.８ないし１６.２°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８ないし３３のいずれか一項に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３５】
１６.０１°でのピークによりさらに特徴付けられる、請求項２８ないし３４のいずれか一項に記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３６】
図２１の回折パターンと実質的に同じパターンにより特徴付けられる請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３７】
図１９に記載の二量体として特徴付けられる請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３８】
図２０に記載のパッキング図により特徴付けられる請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項３９】
Ｐ−１空間群を有し、次の単位セルの寸法：
ａ＝１０.２７０２（２）Å、ｂ＝１０.８７８２（２）Å、ｃ＝１２.４８２１（３）Å、α＝６７.０２７０（１０）°、β＝６６.１８１０（１０）°およびγ＝７２.４７６０（１０）°を有する、請求項１記載のコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４０】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａが０.１μないし５０μの粒径を有する、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４１】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａが０.１μないし２０μの粒径を有する、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４２】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａが０.１μないし１０μの粒径を有する、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４３】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａが０.１μないし５μの粒径を有する、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４４】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａが２.０μの粒径Ｄ５０を有する、請求項１記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ。
【請求項４５】
請求項１に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａおよび医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
付加的な治療剤をさらに含む、請求項４５記載の医薬組成物。
【請求項４７】
有効量の請求項１に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物におけるＣＦＴＲ介在疾患の治療方法。
【請求項４８】
ＣＦＴＲ介在疾患が、嚢胞性線維症、喘息、喫煙誘発性ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、鼻副鼻腔炎、便秘、膵炎、膵機能不全、先天的な両側の輸精管の不在により惹起される男性不妊症（ＣＢＡＶＤ）、軽度の肺疾患、突発性膵炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、肝疾患、遺伝的気腫、遺伝的ヘモクロマトーシス、凝固−線維素溶解 欠乏症、プロテインＣ欠乏症、１型遺伝的血管性浮腫、脂質処理欠乏症、家族性高コレステロール血症、１型乳糜血症、無βリポタンパク血症、リソソーム蓄積症、I−細胞疾患／シュードハーラー、ムコ多糖症、サンドホフ／テイ・サックス、クリーグラー・ナジャーＩＩ型、多腺性内分泌障害／高インスリン血症、真性糖尿病、ラロン型小人症、マイレオペルオキシダーゼ欠乏症、原発性副甲状腺機能低下症、黒色腫、グリカノシスＣＤＧ１型、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝的低フィブリノゲン血症、ＡＣＴ欠乏症、尿崩症（ＤＩ）、神経骨端軟骨性ＤＩ、神経原性ＤＩ、シャルコー−マリー−ツース症候群、ペリツェウス−メルツバッハー病、神経変性疾患s、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、ピック病、数種のグルタミン神経障害、ハンチントン病、脊髄小脳変性症Ｉ型、脊髄および延髄性筋萎縮、デンタトルバル・パリドルイシャン、筋強直性ジストロフィー、海綿状脳症、遺伝的クロインフェルト−ヤコブ病プリオン蛋白の処理異常が原因、ファブリ病、ストロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患、シェーグレン病、骨粗鬆症、骨減少症、ゴルハム症候群、クロリドチャネロパシー、先天性ミオトニー（トムソンおよびベッカー形態）、バーター症候群 type III、デント病、ビックリ病、てんかん、リソソーム蓄積症、アンジェルマン症候群、原発性線毛運動障害（ＰＣＤ）、線毛の構造および／または機能の遺伝的障害、逆位したＰＣＤ、逆位していないＰＣＤまたは線毛形成不全より選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＣＦＴＲ介在疾患が嚢胞性線維症、気腫、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患または骨粗鬆症である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＣＦＴＲ介在疾患が嚢胞性線維症である、、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
患者がΔＦ５０８変異の嚢胞性線維症膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する、請求項４８ないし５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
患者がＲ１１７Ｈ変異の嚢胞性線維症膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する、請求項４８ないし５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
患者がＧ５５１Ｄ変異の嚢胞性線維症膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する、請求項４８ないし５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
付加的な治療剤を投与することを含む、請求項４８ないし５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａおよびその使用のための説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１０年４月７日付け出願の、発明の名称が「３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸」である、米国仮出願番号６１／３２１７２９に対して３５Ｕ.Ｓ.Ｃ第１１９条の下で優先権を主張するものであり、その内容を出典明示により本願明細書の一部とする。
発明の技術分野
【０００２】
本願発明は、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸で示される化合物の固体状態の形態、例えば結晶形態、その医薬組成物およびそれらを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＦＴＲは、吸収および分泌上皮細胞を含む、種々の細胞型にて発現されるｃＡＭＰ／ＡＴＰ媒介アニオンチャネルであり、アニオンの膜を通るフラックスならびに他のイオンチャネルおよび蛋白の活性を制御する。上皮細胞にて、ＣＦＴＲの正常な機能は、呼吸組織および消化組織を含む、体全体で電解質輸送を維持するのに重大である。ＣＦＴＲは、タンデム反復の膜貫通ドメインでできており、その各々が６個の膜貫通へリックスおよび１個のヌクレオチド結合ドメインを含有する、蛋白をコードする、約１４８０個のアミノ酸から構成される。２つの膜貫通ドメインは、チャネル活性および細胞輸送を制御する、複数のリン酸化部位を有する大きな極性の調節（Ｒ）−領域により連結される。
【０００４】
ＣＦＴＲをコードする遺伝子が同定かつ配列決定されている（Gregory, R. J.ら（1990）Nature 347：382-386；Rich, D.P.ら（1990）Nature 347：358-362）、（Riordan, J. R.ら（1989）Science 245：1066-1073を参照）。この遺伝子の欠如は、ヒトにおいて最も一般的で致命的な遺伝的疾患である、嚢胞性線維症（「ＣＦ」）をもたらす、ＣＦＴＲの変異を惹起する。嚢胞性線維症は合衆国にて２５００人の幼児に約一人が罹患している。合衆国の母集団の中で、１０００万人までのヒトが明らかな病的影響なく、欠陥遺伝子の単一コピーを有する。反対に、ＣＦ関連の遺伝子の２つのコピーを有する個人は、慢性肺疾患を含め、ＣＦの消耗的および致命的作用を患っている。
【０００５】
嚢胞性線維症の患者にて、呼吸上皮組織にて内因的に発現されるＣＦＴＲの変異は頂端アニオン分泌をもたらし、それはイオンと流体輸送の不均衡を引き起こす。もたらされるアニオン輸送の減少は肺での粘液の蓄積の増加に寄与し、ＣＦ患者にて最終的に死亡をもたらす微生物感染を伴うこととなる。呼吸器疾患に加えて、ＣＦ患者は、典型的には、消化管の問題および膵機能不全を患っており、放置して治療されないと、死に至る。加えて、嚢胞性線維症の男性の大部分は不妊症であり、嚢胞性線維症の女性との間で受精率は減少する。ＣＦ関連の遺伝子の２つのコピーの重大な作用とは異なり、ＣＦ関連の遺伝子の単一のコピーを有する個体はコレラに対する抵抗およびジフテリアよりもたらされる脱水症に対する抵抗の増加を示し、おそらくは母集団でのＣＦ遺伝子の相対的な高頻度を説明するものである。
【０００６】
ＣＦ染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列決定分析は、疾患を惹起する種々の変異を明らかにした（Cutting, G. R.ら、（1990）Nature 346：366-369；Dean, M.ら、（1990）Cell 61：863：870；およびKerem、B−S.ら、（1989）Science 245：1073-1080；Kerem、B−Sら、（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：8447-8451）。今日、ＣＦ遺伝子にて疾患を惹起する１０００種より多くの変異が同定されている（http：//www.genet.sickkids.on.ca/cftr/最後の訪問は、２０１１年の４月４日）。最も普及している変異はＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位にあるフェニルアラニンの欠失であり、一般に、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲと称される。この変異は嚢胞性線維症の患者の約７０％で生じ、重度の疾患と関連付けられる。
【０００７】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、新生蛋白の正確な折り畳みを妨げる。この結果、変異蛋白は小胞体（ＥＲ）を送り出し、原形質膜に輸送することができない。その結果、該膜に存在するチャネルの数は野生型ＣＦＴＲを発現する細胞にて観察されるよりもずっと少ない。輸送能の損傷に加えて、該変異はチャネルの開閉の損傷をもたらす。該膜におけるチャネル数の減少および開閉の損傷が一緒になって、上皮組織を横切るアニオン輸送の減少に至り、イオンおよび流体輸送の損傷に至る（Quinton,P. M.（１1990）、FASEB J. 4：2709-2727）。しかしながら，研究は、該膜におけるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ数の減少は、野生型ＣＦＴＲよりも少ないが、関数であることを明らかにした（Dalemansら（1991）、Nature Lond. 354：526-528；Denningら、前掲；PasykおよびFoskett（1995）、J. Cell. Biochem. 270：12347-50）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに加えて、輸送、合成および／またはチャネル開閉に損傷をもたらすＣＦＴＲにおける他の疾患を惹起する変異をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし、アニオン分泌を改変し、疾患の進行および／または重度を修飾できた。
【０００８】
ＣＦＴＲはまた、種々の分子を移動させるが、アニオンの輸送がイオンおよび水を上皮組織を通って移動させる重要な機構における一の要素を示すことは明らかである。他の要素として、上皮Ｎａ＋チャネル、ＥＮａＣ、Ｎａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋コトランスポーター、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ、および塩素の細胞への摂取に関与する側底膜Ｋ＋チャネルが挙げられる。
【０００９】
これらの要素は、一緒になって、その選択的発現および細胞内での局所化を介して上皮組織を横切る指向性輸送を達成するように作用する。塩素吸収は、頂端膜に存在するＥＮａＣとＣＦＴＲの協調的な活動、および細胞の側底膜表面に発現するＮａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよびＣｌ−チャネルにより起こる。腔側からの塩素の第二の活性な輸送は細胞内塩素の蓄積をもたらし、そのことは細胞をＣｌ−チャネルを介して受動的に発することを可能とし、方向性のある輸送がもたらされる。Ｎａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋コトランスポーター、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ、および側底膜表面上の側底膜Ｋ＋チャネルおよび腔側上のＣＦＴＲのアレンジメントは、腔側上のＣＦＴＲを介する塩素の分泌を調整する。水は、おそらく、それ自身活動的に輸送されないため、上皮組織を横切るその流れは、ナトリウムおよび塩素のおおきな流れにより形成されるごくわずかな経上皮浸透勾配に依存する。
【００１０】
上記されるように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、新生蛋白を正確に折り畳むことを妨げ、結果として、この変異蛋白は、ＥＲを送り出し、原形質膜に輸送することはできない。その結果、十分な量の成熟蛋白は原形質膜には存在せず、上皮組織内での塩素輸送は顕著に縮小される。実際、ＥＲ機構によりＡＢＣトランスポーターをプロセシングする欠損小胞体（ＥＲ）のこの細胞現象は、ＣＦ疾患についてだけでなく、広範囲に及ぶ他の単離された遺伝性疾患についても基礎となることが明らかにされた。ＥＲ機構が誤作動しうる２つの方法は、分解に至る蛋白のＥＲエクスポートへのカップリングの喪失によるか、またはこれらの欠損／異常な折り畳み構造の蛋白のＥＲ蓄積によるかのいずれかである［Aridor Mら、Nature Med.、5（7）、p. 745-751（1999）；Shastry, B.S.ら、Neurochem. International、43、p. 1-7（2003）；Rutishauser, J.ら、Swiss Med Wkly、132、p. 211-222（2002）；Morello, JPら、TIPS、21、p. 466-469（2000）；Bross P.ら、Human Mut.、14、p. 186-198（1999）］。
【００１１】
塩の形態の化合物３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパン カルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、国際ＰＣＴ公開２００７０５６３４１（該出願は出典明示によりその内容を本願明細書の一部とされる）にて、ＣＦＴＲ活性のモジュレータとして、かくして嚢胞性線維症などのＣＦＴＲ介在疾患の有用な治療剤として開示されている。３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の形態Ｉ（「コンパウンド１・形態Ｉ」）は、実質的に結晶の無塩の形態であり、米国特許出願１２/３２７,９０２（２００８年１２月４日出願）（その内容を出典明示により本願明細書の一部とする）に開示されている。しかしながら、治療剤として使用するのに適する医薬組成物にて容易に用いることができる、該化合物の他の安定した固体形態に対する要求が残っている。
【発明の概要】
【００１２】
本願発明は、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（以下、「コンパウンド１」という）で示される化合物の固体多形形態に関するものであり、以下の構造：
【化１】
2013523836.tif 000002
１
を有する。
【００１３】
多形は化合物の固体形態に関して既知の現象である。多形体の物理特性が、例えば、溶解度、溶解速度、流動性、吸収速度および安定性に影響を与えることが知られている。かくして、組成物を開発および調製するにおいて、特定の化合物を選択することが重要である。
【００１４】
一の実施態様において、コンパウンド１は、本願明細書にて「コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ」と称される溶媒和された形態である。一の実施態様において、該溶媒和形態はコンパウンド１・メタノール溶媒和物・形態Ａである。もう一つ別の実施態様において、溶媒和物はコンパウンド１・エタノール溶媒和物・形態Ａである。他の実施態様は：
コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・２−プロパノール溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・アセトニトリル溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・テトラヒドロフラン溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・酢酸メチル溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・２−ブタノン溶媒和物・形態Ａ；
コンパウンド１・ギ酸エチル溶媒和物・形態Ａ；および
コンパウンド１・２−メチルテトラヒドロフラン溶媒和物・形態Ａ
を包含する。
【００１５】
さらにもう一つ別の態様において、コンパウンド１は塩の形態である。塩の形態は「コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ」と称される。
【００１６】
本願明細書に開示されるコンパウンド１の固体形態およびその医薬組成物は、例えば、嚢胞性線維症などのＣＦＴＲ介在疾患の重度を軽くするのに有用である。コンパウンド１の固体形態は他のコンパウンド１の固体形態、ならびに本願明細書に開示の方法を用いて、コンパウンド１の固体形態を含む医薬組成物を調製するのに使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】コンパウンド１・溶媒和物・形態ＡのＸ−線粉末回折パターンを示す。
【図２】以下の群より選択されるコンパウンド１・溶媒和物・形態のＸ−線回折パターンを示す：１）コンパウンド１・メタノール溶媒和物・形態Ａ；２）コンパウンド１・エタノール溶媒和物・形態Ａ；３）コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａ；４）コンパウンド１・２−プロパノール溶媒和物・形態Ａ；５）コンパウンド１・アセトニトリル溶媒和物・形態Ａ；６）コンパウンド１・テトラヒドロフラン溶媒和物・形態Ａ；７）コンパウンド１・酢酸メチル溶媒和物・形態Ａ；８）コンパウンド１・２−ブタノン溶媒和物・形態Ａ；９）コンパウンド１・ギ酸エチル溶媒和物・形態Ａ；および１０）コンパウンド１・２−メチルテトラヒドロフラン溶媒和物・形態Ａ。
【図３】コンパウンド１・メタノール溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図４】コンパウンド１・エタノール溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図５】コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図６】コンパウンド１・２−プロパノール溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図７】コンパウンド１・アセトニトリル溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図８】コンパウンド１・テトラヒドロフラン溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図９】コンパウンド１・酢酸メチル溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図１０】コンパウンド１・２−ブタノン溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図１１】コンパウンド１・ギ酸エチル溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図１２】コンパウンド１・２−メチルテトラヒドロフラン溶媒和物・形態ＡのＸ−線回折パターンを提供する。
【図１３】コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図１４】コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの熱重量分析（ＴＧＡ）プロットを示す。
【図１５】単結晶Ｘ−線解析に基づく、コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を示す。
【図１６】単結晶Ｘ−線解析に基づく、二量体としてのコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を示す。
【図１７】単結晶Ｘ−線解析に基づく、カルボン酸基の間の水素結合を示すコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を示す。
【図１８】単結晶Ｘ−線解析に基づく、溶媒和物としてアセトンを示すコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を示す。
【図１９】コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの二量体の立体配座の描写を示す。
【図２０】コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａのパッキング図を示す。
【図２１】結晶構造より算出されるコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態ＡのＸ−線回折パターンを示す。
【図２２】コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの固体１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１５.０ＫＨｚスピン）を示す。
【図２３】コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの固体１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル（１２.５ＫＨｚスピン）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本願明細書にて用いられるように、特記しない限り、以下の定義が当てはまる。
【００１９】
本願明細書にて使用されるような「ＣＦＴＲ」なる語は、限定されるものではないが、ΔＦ５０８  ＣＦＴＲおよびＧ５５１Ｄ  ＣＦＴＲを含む、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子または制御因子活性能を有するその変異体を意味する（例えば、http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/を参照のこと、ＣＦＴＲ変異について、２００９年５月２８日にアクセスしたのが最後である）。
【００２０】
本願明細書にて用いられるように、「結晶性」は、構造単位が固定された幾何学模様または格子模様にて配置されており、その結果、結晶固体が厳格な長距離秩序を有する、化合物または組成物をいう。結晶構造を構成する構造単位は、原子、分子またはイオンであり得る。結晶固体は一定の融点を示す。
【００２１】
本願明細書にて用いられるように、「実質的に結晶性」なる語は、その分子の位置にて主に長距離秩序を有する固体材料をいう。例えば、実質的に結晶性の材料は、８５％より大きな結晶化度（例、約９０％より大きな結晶化度または約９５％より大きな結晶化度）を有する。「実質的に結晶性」なる語は、１００％の結晶化度を有する材料を示す「結晶性」なる記述子も包含するということである。
【００２２】
本願明細書にて用いられるように、「制御する」なる語は、例えば、活性を測定可能な量で増加または減少させることを意味する。
【００２３】
本願明細書にて用いられるように、「イソ構造の溶媒和物」は、いくつかのまたはすべての空洞が同一または異なる溶媒分子で占められていてもよい複数の反復空洞を有する結晶格子の化合物をいう。
【００２４】
「ＤＳＣ」なる語は示差走査熱量測定を意味する。
【００２５】
「ＴＧＡ」なる語は、熱重量分析を意味する。
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ
【００２６】
一の態様において、本願発明は、「コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａ」と称される、イソ構造の溶媒和物の形態である、コンパウンド１の固体形態を特徴付ける。
【００２７】
本願明細書にて開示されるような、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、その結晶格子の空隙が空であるか、適当な溶媒の一または複数の分子で占められているか、または部分的に占められている、コンパウンド１の結晶格子を含む。適当な溶媒は、限定されないが、メタノール、エタノール、アセトン、２−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸メチル、２−ブタノン、ギ酸エチルおよび２−メチルテトラヒドロフランを包含する。Ｘ−線粉末回折、融点およびＤＳＣなどのコンパウンド１のイソ構造の溶媒和物の形態の特定の物理特性は、問題となる特定の溶媒分子により実質的に影響を受けない。
【００２８】
一の実施態様において、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、２１.５０ないし２１.９０°、８.８０ないし９.２０°および１０.８０ないし１１.２０°での１または複数のピークにより特徴付けられる。
【００２９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、２１.５０ないし２１.９０°、８.８０ないし９.２０°、１０.８０ないし１１.２０°、１８.００ないし１８.４０°および２２.９０ないし２３.３０°での１または複数のピークにより特徴付けられる。
【００３０】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、２１.７０、８.９８および１１.０４°での１または複数のピークにより特徴付けられる。
【００３１】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、２１.７０、８.９８、１１.０４、１８.１６および２３.０６°での１または複数のピークにより特徴付けられる。
【００３２】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、２１.５０ないし２１.９０°でのピークにより特徴付けられる。
【００３３】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２１.７０°でのピークにより特徴付けられる。
【００３４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、８.８０ないし９.２０°でのピークにより特徴付けられる。
【００３５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、８.９８°でのピークにより特徴付けられる。
【００３６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１０.８０ないし１１.２０°でのピークにより特徴付けられる。
【００３７】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１１.０４°でのピークにより特徴付けられる。
【００３８】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１８.００ないし１８.４０°でのピークにより特徴付けられる。
【００３９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１８.１６°でのピークにより特徴付けられる。
【００４０】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２２.９０ないし２３.３０°でのピークにより特徴付けられる。
【００４１】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２３.０６°でのピークにより特徴付けられる。
【００４２】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２０.４０ないし２０.８０°でのピークにより特徴付けられる。
【００４３】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２０.６３°でのピークにより特徴付けられる。
【００４４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２２.００ないし２２.４０°でのピークにより特徴付けられる。
【００４５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、２２.２２°でのピークにより特徴付けられる。
【００４６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１８.４０ないし１８.８０°でのピークにより特徴付けられる。
【００４７】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１８.５７°でのピークにより特徴付けられる。
【００４８】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１６.５０ないし１６.９０°でのピークにより特徴付けられる。
【００４９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１６.６６°でのピークにより特徴付けられる。
【００５０】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１９.７０ないし２０.１０°でのピークにより特徴付けられる。
【００５１】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａはさらに、１９.８６°でのピークにより特徴付けられる。
【００５２】
ある実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、図１の回折パターンと実質的に同様のパターンにより特徴付けられる。
【００５３】
ある実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、図２の回折パターンと実質的に同様のパターンにより特徴付けられる。
【００５４】
他の実施態様にて、化合物Ｉとの溶媒和物の形態Ａを形成する、溶媒和物または溶媒和物の混合物は、コンパウンド１の結晶格子の間隙に適合する十分な大きさの有機溶媒からなる群より選択される。ある実施態様にて、溶媒和物は測定して約１００Å３の空隙に適合するのに十分な大きさのものである。
【００５５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを形成する溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、２−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸メチル、２−ブタノン、ギ酸エチルおよび２−メチルテトラヒドロフランからなる群より選択される。回折パターンは、以下のコンパウンド１・溶媒和物・Ａ形態：メタノール（図３）、エタノール（図４）、アセトン（図５）、２−プロパノール（図６）、アセトニトリル（図７）、テトラヒドロフラン（図８）、酢酸メチル（図９）、２−ブタノン（図１０）、ギ酸エチル（図１１）および２−メチルテトラヒドロフラン（図１２）について提供される。
【００５６】
もう一つ別の実施態様にて、本願発明は、Ｐ２１／ｎ空間群および次の単位セルの寸法：ａ＝１６.５２３５（１０）Å、ｂ＝１２.７４２５（８）Å、ｃ＝２０.５５１２（１３）Å、α＝９０°、β＝１０３.７３６（４）°、およびγ＝９０°を有する結晶性コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａを特徴付ける。
【００５７】
もう一つ別の実施態様にて、本願発明は、ＤＳＣまたは当業者に既知の同様の分析方法により測定されるような１または複数の相転移を示すコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを提供する。ある実施態様において、コンパウンド１・溶媒和物・形態ＡのＤＳＣは図１３に示されるＤＳＣトレースと実質的に同じである。
【００５８】
この態様のもう一つ別の実施態様にて、ＤＳＣは２相転移を示す。
【００５９】
もう一つ別の実施態様にて、ＤＳＣは３相転移を示す。
【００６０】
もう一つ別の実施態様にて、相転移の一は２００と２０７℃の間を占める。
【００６１】
もう一つ別の実施態様にて、相転移の一は２０４と２０℃の間を占める。
【００６２】
もう一つ別の実施態様にて、相転移の一は１８３と１９０℃の間を占める。
【００６３】
もう一つ別の実施態様にて、相転移の一は１８５と１８７℃の間を占める。
【００６４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの融点は１８３℃ないし１９０℃である。
【００６５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの融点は１８５℃ないし１８７℃である。
【００６６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、ＴＧＡでの測定により、１ないし１０重量％（ｗｔ％）の溶媒和物を含む。ある実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態ＡのＴＧＡは図１４に示されるＴＧＡトレースと実質的に同じである。
【００６７】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、ＴＧＡまたは当業者に既知の同様の分析方法によって測定されるように、２ないし５重量％の溶媒和物を含む。
【００６８】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座は、Ｘ−線解析を基礎とする、図１５の記載の構造と実質的に同じである。
【００６９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａは、Ｐ２１／ｎ空間群および以下の単位セルの寸法を有する：
ａ＝１６.５２３５（１０）Å    α＝９０°
ｂ＝１２.７４２５（８）Å      β＝１０３.７３６（４）°
ｃ＝２０.５５１２（１３）Å    γ＝９０°
コンパウンド１・塩酸塩・形態Ａ
【００７０】
もう一つ別の態様にて、本願発明は、結晶性塩酸塩である、もう一つ別のコンパウンド１の固体形態を提供する。この固体形態はコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａと称される。
【００７１】
一の態様において、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、８.８０ないし９.２０°、１７.３０ないし１７.７０°および１８.２０ないし１８.６０°での一または複数のピークにより特徴付けられる。
【００７２】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、Ｃｕ  Ｋ  アルファ線を用いて得られるＸ−線粉末回折にて、８.８０ないし９.２０°、１７.３０ないし１７.７０°、１８.２０ないし１８.６０°、１０.１０ないし１０.５０および１５.８０ないし１６.２０°での一または複数のピークにより特徴付けられる。
【００７３】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、８.９６、１７.５１および１８.４５°での一または複数のピークにより特徴付けられる。
【００７４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、８.９６、１７.５１、１８.４５、１０.３３および１６.０１°での一または複数のピークにより特徴付けられる。
【００７５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、８.８０ないし９.２０°でのピークにより特徴付けられる。
【００７６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、８.９６°でのピークにより特徴付けられる。
【００７７】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１７.３０ないし１７.７０°でのピークにより特徴付けられる。
【００７８】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは１７.５１°でのピークにより特徴付けられる。
【００７９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１８.２０ないし１８.６０°でのピークにより特徴付けられる。
【００８０】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１８.４５°でのピークにより特徴付けられる。
【００８１】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１０.１０ないし１０.５０°でのピークにより特徴付けられる。
【００８２】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１０.３３°でのピークにより特徴付けられる。
【００８３】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１５.８０ないし１６.２０°でのピークにより特徴付けられる。
【００８４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１６.０１°でのピークにより特徴付けられる。
【００８５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１１.７０ないし１２.１０°でのピークにより特徴付けられる。
【００８６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１１.９４°でのピークにより特徴付けられる。
【００８７】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、７.９０ないし８.３０°でのピークにより特徴付けられる。
【００８８】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、８.１４°でのピークにより特徴付けられる。
【００８９】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、９.９０ないし１０.３０°でのピークにより特徴付けられる。
【００９０】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１０.１０°でのピークにより特徴付けられる。
【００９１】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１６.４０ないし１６.８０°でのピークにより特徴付けられる。
【００９２】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１６.５５°でのピークにより特徴付けられる。
【００９３】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、９.３０ないし９.７０°でのピークにより特徴付けられる。
【００９４】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、９.５４°でのピークにより特徴付けられる。
【００９５】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１６.４０ないし１６.８０°でのピークにより特徴付けられる。
【００９６】
もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａはさらに、１６.５５°でのピークにより特徴付けられる。
【００９７】
ある実施態様において、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、図１９に示されるように、二量体として特徴付けられる。
【００９８】
ある実施態様において、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは図２０に示されるパッキング図により特徴付けられる。
【００９９】
ある実施態様、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは図２１の回折パターンと実質的に同様のパターンにより特徴付けられる。
【０１００】
もう一つ別の実施態様にて、本願発明は、Ｐ−１空間群および次の単位セルの寸法：ａ＝１０.２７０２（２）Å、ｂ＝１０.８７８２（２）Å、ｃ＝１２.４８２１（３）Å、α＝６７.０２７０ （１０）°、β＝６６.１８１０ （１０）°、およびγ＝７２.４７６０（１０）°を有する結晶性コンパウンド１・塩酸塩・形態Ａを特徴付ける。
【０１０１】
もう一つ別の実施態様にて、本願発明はコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａおよびそのための使用説明書を含むキットを特徴付ける。
化合物・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの合成
【０１０２】
化合物・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａとして上記に指定および記載される本願発明の固体形態は、コンパウンド１を含む前駆体から、およびコンパウンド１の他の固体形態から調製され得る。このセクションはコンパウンド１およびコンパウンド１の他の固体形態の合成、ならびにこれら他の固体形態のコンパウンド１、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａと称される本願発明の固体形態への変換を記載する。
スキーム１  コンパウンド１の調製に使用される酸塩化物の合成
【化２】
2013523836.tif 000003
【０１０３】
スキーム１は、コンパウンド１を製造するのに使用される（スキーム４を参照のこと）、１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボニルクロリドの調製を記載する。出発物質の２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−カルボン酸は、Saltigo（Lanxess Corporationの関連会社）より市販されている。２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−カルボン酸にあるカルボン酸の部分の還元は第一アルコールをもたらし、それは塩化チオニルを用いて対応する第一アルキルクロリドである５−（クロロメチル）−２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソールに変換される。該アルキルクロリドは、その後で、シアン化ナトリウムを用いて置換することで、ニトリルである２−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）アセトニトリルに変換される。該ニトリルを１−ブロモ−２−クロロエタンで塩基の存在下で処理し、１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボニトリルを得る。該ニトリルを１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボン酸に塩基性条件下で変換し、つづいて塩化チオニルで処理し、必要とする酸クロリドを得る。
スキーム２  必要とする酸クロリドの別の合成法
【化３】
2013523836.tif 000004
【０１０４】
スキーム２は必要な酸クロリドの別の合成法を提供する。化合物の５−ブロモメチル−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソールをシアノ酢酸エチルとパラジウム触媒の存在下でカップリングさせ、対応するアルファシアノエチルエステルを形成させる。該エステル部分をカルボン酸に鹸化し、シアノエチル化合物を得る。シアノエチル化合物を１−ブロモ−２−クロロエタンを用いて塩基の存在下でアルキル化に付し、シアノシクロプロピル化合物を得る。該シアノシクロプロピル化合物を塩基で処理し、カルボン酸塩を得、それを酸で処理することによりカルボン酸に変換する。次に、カルボン酸の酸クロリドへの変換は塩化チオニルなどの塩素化剤を用いて達成される。
スキーム３  コンパウンド１を調製するのに使用されるアミンの合成
【化４】
2013523836.tif 000005
【０１０５】
スキーム３は３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルの調製を記載し、それをスキーム４にあるように１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボニルクロリド（スキーム１および２を参照のこと）とカップリングさせ、コンパウンド１を酸付加塩として得る。パラジウム触媒の２−ブロモ−３−メチルピリジンと３−（tert−ブトキシカルボニル）フェニルボロン酸とのカップリングにより、３−（３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルを得、それをその後で一連の工程を介して所望の化合物に変換する。
スキーム４  コンパウンド１の酸付加塩の形成
【化５】
2013523836.tif 000006
【０１０６】
コンパウンド１はスキーム４に示されるように酸付加塩として調製される。スキーム１または２の酸クロリドと、スキーム３のアミンとの、トリエチルアミンおよび触媒としての４−ジメチルアミノピリジンカップリング等を用いるカップリングは、最初に、コンパウンド１のtert−ブチルエステル前駆体としての、tert−ブチルエステルである、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−t−ブチルベンゾエートを提供する。tert−ブチルエステルと、ＨＣｌなどの酸との処理でコンパウンド１の塩酸塩が得られる。コンパウンド１の塩酸塩は、典型的には、結晶固体であり、本願発明の固体形態、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを含む、コンパウンド１の他の固体形態を調製するのに使用され得る。
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの、コンパウンド１の塩酸塩からの調製
【０１０７】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、コンパウンド１の塩酸塩などの塩形態を、適当な溶媒に、効果的な時間、分散または溶解させ、つづいて結晶のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを濾過により単離することで調製され得る。
コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａのコンパウンド１の塩酸塩からの調製
【０１０８】
コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、コンパウンド１の塩酸塩を最小量の溶媒に溶かし、溶媒をゆっくりとした蒸発で除去することにより、コンパウンド１の塩酸塩より調製され得る。実施態様において、該溶媒はアルコールである。もう一つ別の実施態様にて、溶媒はエタノールである。ゆっくりとした蒸発は溶媒の蒸発を妨げることで実施される。例えば、一の実施態様にて、ゆっくりとした蒸発は、コンパウンド１の塩酸塩をバイアルに溶かし、該バイアルを一の孔が開けられたパラフィルムで覆うことを含む。
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａのコンパウンド１・形態Ｉからの調製
【０１０９】
コンパウンド１・形態１（上記されている、および２００８年１２月４日付け出願の米国特許出願１２/３２７,９０２に開示されている）が、本願発明の固体形態、特にコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの調製に使用され得る、コンパウンド１のもう一つ別の固体形態である。
【０１１０】
コンパウンド１・形態１は、コンパウンド１の塩酸塩を適当な溶媒に効果的な時間分散または溶解させることで、該塩酸塩より調製され得る。適当な溶媒は、コンパウンド１の塩酸塩の形態が水にほんのわずかに溶解するだけであっても、水または５０％メタノール／水の混合液などのアルコール／水の混合液であってもよい。あるいはまた、適当な溶媒は水である。
【０１１１】
コンパウンド１の他の酸付加塩はまた、他の無機または有機酸より誘導される塩などの、コンパウンド１・形態１を調製するのに用いられてもよい。他の塩はまた、コンパウンド１のtert-ブチルエステルの前駆体を酸介在の加水分解に付すことで得られる（スキーム４を参照のこと）。他の酸より誘導される塩は、例えば、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、安息香酸およびマロン酸を包含してもよい。これらのコンパウンド１の塩の形態は、使用される溶媒に応じて、可溶性であってもなくてもよいが、溶解性の欠如はコンパウンド１・形態Ｉの形成を妨げない。コンパウンド１・形態Ｉをコンパウンド１の塩から形成するのに効果的な時間は、２時間と２４時間の間、またはそれ以上とすることができる。必要な時間は温度と反比例すると認識される。すなわち、温度が高いほど、酸の溶解に影響し、コンパウンド１・形態Ｉを形成するのに必要な時間は短くなる。溶媒が水の場合、その分散液を室温で約２４時間攪拌すると、形態Ｉが約９８％の收率で得られる。方法の目的のために、コンパウンド１の塩の溶液が望ましい場合、高温を用いてもよい。溶液を高温で効果的な時間攪拌した後、冷却して再結晶させ、実質的に純粋なコンパウンド１・形態Ｉを得る。「実質的に純粋な」とは、約９０％以上または約９５％以上または約９８％以上または約９９％以上の純度をいう。選択される温度は、部分的には、使用される溶媒に依存し、十分に当業者が決定しうる範囲内にあり、典型的には室温と約８０℃の間にある。
【０１１２】
あるいはまた、コンパウンド１・形態Ｉは、コンパウンド１のtert-ブチルエステル前駆体を、例えばギ酸などの適当な酸と適当な反応条件下で反応させ、コンパウンド１・形態Ｉを得ることにより直接形成され得る（スキーム４を参照のこと）。例えば、tert−ブチルエステルをギ酸などの適当な酸と、６０ないし８０℃で７ないし９時間反応させ、外界温度に冷却し、該反応混合物を水に添加し、再び６０ないし８０℃にて効果的な時間加熱する。ついで、コンパウンド１・形態１を濾過で単離する。
【０１１３】
コンパウンド１・形態Ｉは有機溶媒で再結晶されることでさらに精製されてもよい。有機溶媒の例は、限定されるものではないが、トルエン、クメン、アニソール、１−ブタノール、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、メチルt−ブチルエーテル、メチルイソブチルケトンおよび１−プロパノール−水の混合液を包含する。温度は上記したとおりであってもよい。例えば、コンパウンド１・形態Ｉは、完全に溶解するまで、７５℃で１−ブタノールに溶解される。該溶液を０.２℃の速度で１０℃に冷却し、コンパウンド１・形態Ｉの結晶を得、それは濾過により単離されてもよい。
【０１１４】
上記されるように、コンパウンド１・形態１を用いてコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａが調製され得る。そこで、適当な溶媒中、十分な濃度で十分な時間にて一定量のコンパウンド１・形態Ｉをスラリーにする。ついで、該スラリーを遠心分離で、または真空下で濾過し、外界条件で十分な時間乾燥させ、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを得る。
【０１１５】
ある実施態様にて、約２０ないし４０ｍｇのコンパウンド１・形態Ｉを約４００ないし６００μＬの適当な溶媒にてスラリーにする。もう一つ別の実施態様にて、約２５ないし３５ｍｇのコンパウンド１・形態Ｉを約４５０ないし５５０μＬの適当な溶媒にてスラリーにする。もう一つ別の実施態様にて、約３０ｍｇのコンパウンド１・形態Ｉを約５００μＬの適当な溶媒にてスラリーにする。
【０１１６】
ある実施態様にて、コンパウンド１・形態Ｉが溶媒でスラリーとなる時間は１時間と４日間の間である。より具体的には、コンパウンド１・形態Ｉが溶媒でスラリーとなる時間は１日と３日の間である。より具体的には、該時間は２日間である。
【０１１７】
ある実施態様にて、適当な溶媒は、コンパウンド１の結晶格子の空隙に適合するのに十分な大きさの有機溶媒より選択される。他の実施態様において、該溶媒和物は約１００Å３の空隙に適合するのに十分な大きさである。
【０１１８】
他の実施態様にて、該溶媒はメタノール、エタノール、アセトン、２−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸メチル、２−ブタノン、ギ酸エチルおよび  ２−メチルテトラヒドロフランからなる群より選択される。
【０１１９】
他の実施態様にて、これらの溶媒の２またはそれ以上の混合液を用いてコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを得てもよい。あるいはまた、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、これらの化合物の１または複数と水とを含む混合液より得てもよい。
【０１２０】
ある実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを乾燥するための効果的な時間は１ないし２４時間である。より具体的には、該時間は６ないし１８時間である。より詳細には、該時間は約１２時間である。
使用、組成物およい投与
医薬上許容される組成物
【０１２１】
本願発明のもう一つ別の態様において、医薬上許容される組成物が提供され、ここでこれらの組成物は、本願明細書に記載される、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを含み、所望により医薬上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでもよい。ある実施態様において、これらの組成物は所望によりさらに一または複数の付加的な治療剤を含んでもよい。
【０１２２】
上記されるように、本願発明の医薬上許容される組成物は、付加的に、医薬上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含み、それは、本願明細書にて使用されるように、いずれか、すべての溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤等を、所望の個々の剤形に適するように含む。Remington's Pharmaceutical Sciences、Sixteenth Edition、E. W. Martin （Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、1980）は、医薬上許容される組成物を処方するのに使用される種々の担体を、およびその既知の調製方法を開示する。通常の担体が、望ましくない生物学的作用を生成するか、さもなければ医薬上許容される組成物の他の成分と有害な方法にて相互作用するなどの、本願発明の化合物と適合しない範囲を除いて、その使用は本願発明の範囲内にあると考えられる。医薬上許容される担体として供することのできる材料の例として、限定されるものではないが、以下の物：イオン交換体；アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；ヒト血清アルブミンなどの血清蛋白；ホスフェート、グリシン、ソルビン酸またはソルビン酸カリウムなどの緩衝物質；植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物；水；塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素ジナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカまたは三ケイ酸マグネシウム；ポリビニルピロリドン；ポリアクリレート；ワックス；ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー；羊毛脂；ラクトース、グルコースまたはシュークロースなどの糖類；コーン澱粉およびイモ澱粉などの澱粉；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤用ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油または大豆油などの油類；プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含水；セイライン等張液；リンゲル溶液； エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびに他の非毒性の適合性滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および香料、保存剤および酸化防止剤が挙げられるが、それらはまた当業者の判断に従って組成物中に配合され得る。
方法および処理
【０１２３】
さらにもう一つ別の態様にて、本願発明は、ＣＦＴＲにより関連付けられる病状、疾患または障害の治療方法を提供する。ある実施態様において、本願発明は、ＣＦＴＲ活性の欠乏により関連付けられる病状、疾患または障害を治療する方法であって、本願明細書に記載される、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａおよびコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａより選択されるコンパウンド１の固体形態を含む組成物を、それを必要とする対象に、好ましくは哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【０１２４】
本願明細書にて用いられるように、「ＣＦＴＲ介在疾患」は、嚢胞性線維症、喘息、喫煙誘発性ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、鼻副鼻腔炎、便秘、膵炎、膵機能不全、先天的な両側の輸精管の不在により惹起される男性不妊症（ＣＢＡＶＤ）、軽度の肺疾患、突発性膵炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、肝疾患、遺伝的気腫、遺伝的ヘモクロマトーシス、凝固−線維素溶解欠乏症、プロテインＣ欠乏症、１型遺伝性血管性浮腫、脂質処理欠乏症、家族性高コレステロール血症、１型乳糜血症、無βリポタンパク血症、リソソーム蓄積症、I−細胞疾患／シュードハーラー、ムコ多糖症、サンドホフ／テイ・サックス、クリーグラー・ナジャーＩＩ型、多腺性内分泌障害/高インスリン血症、真性糖尿病、ラロン型小人症、マイレオペルオキシダーゼ欠乏症、原発性副甲状腺機能低下症、黒色腫、グリカノシスＣＤＧＩ型、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝的低フィブリノゲン血症、ＡＣＴ欠乏症、尿崩症 （ＤＩ）、神経骨端軟骨性（neurophyseal）ＤＩ、神経原性ＤＩ、シャルコー−マリー−ツース症候群、ペリツェウス−メルツバッハー病、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、ピック病、数種のポリグルタミン神経障害、ハンチントン病、脊髄小脳変性症Ｉ型、脊髄および延髄性筋萎縮、デンタトルバル・パリドルイシャン（dentatorubal pallidoluysian）、筋強直性ジストロフィー、海綿状脳症、遺伝的クロインフェルト−ヤコブ病（プリオン蛋白の処理異常が原因）、ファブリ病、ストロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患、シェーグレン病、骨粗鬆症、骨減少症、ゴルハム（Gorham）症候群、クロリドチャネロパシー（chloride channelopathy）、先天性ミオトニー（トムソンおよびベッカー形態）、バーター症候群ＩＩＩ型、デント病、ビックリ病、てんかん、ビックリ病、リソソーム蓄積症、アンジェルマン症候群、原発性線毛運動障害（ＰＣＤ）、線毛の構造および／または機能の遺伝的障害、逆位したＰＣＤ（カールタジュナー症候群としても知られる）、逆位していないＰＣＤまたは線毛形成不全より選択される疾患である。
【０１２５】
ある実施態様にて、本願発明は、ヒトにおけるＣＦＴＲ介在疾患の治療方法であって、該ヒトに有効量の本願明細書に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１２６】
別の好ましい実施態様によれば、本願発明は、ヒトにおける嚢胞性線維症の治療方法であって、該ヒトに有効量の本願明細書に記載のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１２７】
もう一つ別の実施態様にて、該ヒトは、ΔＦ５０８変異の嚢胞性線維性膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する。もう一つ別の実施態様にて、該ヒトは、Ｒ１１７Ｈ変異の嚢胞性線維性膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する。もう一つ別の実施態様にて、該ヒトは、Ｇ５５１Ｄ変異の嚢胞性線維性膜貫通受容体（ＣＦＴＲ）を有する。
【０１２８】
本願発明によれば、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはその医薬上許容される組成物の「有効量」は、上記される疾患を治療するのに、あるいはその重度を和らげるのに効果的な量である。
【０１２９】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物は、上記される一または複数の疾患を治療するのに、あるいはその重度を和らげるのに効果的な量および投与経路を用いて投与されてもよい。
【０１３０】
ある実施態様にて、本願明細書にて記載される、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物は、呼吸器の頂端膜にて、および呼吸器以外の上皮にて残りのＣＦＴＲ活性を示す患者で嚢胞性線維症を治療するか、あるいはその重度を和らげるのに有用である。上皮表面での残りのＣＦＴＲ活性の存在は、当該分野にて公知の方法、例、標準的電気生理学的、生化学的または組織化学的方法を用いて容易に検出され得る。かかる方法は、インビボまたはエクスビボにて電気生理学的方法を用いてＣＦＴＲ活性を同定し、汗または唾液中のＣｌ−濃度を測定し、あるいはエクスビボにて生化学的または組織化学的方法を用いて細胞表面密度をモニター観察する。かかる方法の使用で、残りのＣＦＴＲ活性が、最も一般的な変異、ΔＦ５０８についてホモ接合の、またはヘテロ接合の患者を含め、種々の異なる変異についてホモ接合の、またはヘテロ接合の患者にて容易に検出され得る。
【０１３１】
一の態様において、本願明細書にて記載される、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物は、残りのＣＦＴＲ活性を示す特定の遺伝子型、例えば、クラスＩＩＩ変異（制御または開閉の損傷）、クラスＩＶ変異（伝導度の改変）またはクラスＶ変異（合成の減少）の範囲内にある患者において、嚢胞性線維症を治療するか、またはその重度を和らげるのに有用である（Lee R. Choo−Kang、Pamela L.、Zeitlin、Type I、II、III、IV, and V cystic fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy； Current Opinion in Pulmonary Medicine 6; 521-529, 2000）。残りのＣＦＴＲ活性を示す他の患者の遺伝子型は、これらのクラスの一つとホモ接合の患者の遺伝子型または他のクラスの変異（クラスＩ変異、クラスＩＩ変異または分類されていない変異）とヘテロ接合した遺伝子型を包含する。
【０１３２】
一の態様において、本願明細書にて記載されるような、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物は、特定の臨床表現型、例えば、上皮の頂端膜での残りのＣＦＴＲ活性の量と典型的には相互に関連する中程度ないし軽度の臨床表現型の範囲内にある患者にて嚢胞性線維症を治療するか、あるいはその重度を和らげるのに有用である。かかる表現型は膵機能不全を示す患者または突発性膵炎で先天性両側輸精管欠損症と、または軽度の肺疾患と診断された患者を包含する。
【０１３３】
必要とする正確な量は、対象の種、年齢および一般的状態、感染の重篤度、個々の薬剤、その投与方法等に応じて、対象で変化するであろう。本願発明の化合物は、好ましくは、投与を容易にし、投与量を均一にするために単位剤形に処方される。本願明細書にて使用されるような「単位剤形」なる語は、処置される患者に適する薬剤の物理的に別個の単位をいう。しかしながら、本願発明の化合物および組成物の一日の総使用量は正当な医学的判断の範囲内にあり、顧問医によって決定されるであろう。個々の患者または生物に対して特異的な有効用量レベルは、治療される障害および該障害の重篤度；利用される特定の化合物の活性；利用される特定の組成物；患者の年齢、体重、総体的な健康、性別および食事；投与期間、投与経路および利用される特定の化合物の排泄速度；処置の持続期間；利用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物を含む、種々の因子、ならびに医学の分野にて周知の同様の因子に依存するであろう。本願明細書にて使用されるような「患者」または「対象」なる語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０１３４】
本願発明の医薬上許容される組成物は、ヒトおよび他の哺乳動物に、治療されるべき感染の重度に応じて、経口、経直腸、非経口、嚢内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏またはドロップによるなど）、バッカル、口腔または経鼻スプレー等により投与され得る。ある実施態様にて、本願発明の化合物は、経口または非経口的に、一日当たり患者の体重１ｋｇに付き約０.０１ｍｇないし約５０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇから約２５ｍｇで、一日に１または複数回投与され、所望の治療効果を得る。
【０１３５】
ある実施態様において、投与単位におけるコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの投与量は１００ｍｇないし１,０００ｍｇである。もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの投与量は２００ｍｇないし９００ｍｇである。もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの投与量は３００ｍｇないし８００ｍｇである。もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの投与量は４００ｍｇないし７００ｍｇである。もう一つ別の実施態様にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの投与量は５００ｍｇないし６００ｍｇである。
【０１３６】
もう一つ別の実施態様にて、本願発明は、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを、０.１ミクロンと５０ミクロンの間の有意な粒径フラクションを有する粒子を生成するのに適する空気圧を用いて、適当な一般的ミル化装置でのジェットミル化に供することを含む。もう一つ別の実施態様にて、粒径は０.１ミクロンと２０ミクロンの間にある。もう一つ別の実施態様にて、該粒径は０.１ミクロンと１０ミクロンの間にある。もう一つ別の実施態様にて、該粒径は１.０ミクロンと５ミクロンの間にある。さらにもう一つ別の実施態様において、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは２.０ミクロンの粒径Ｄ５０を有する。
【０１３７】
注射可能な製剤、例えば、滅菌性注射水性または油性懸濁液は、適当な分散または湿潤剤および沈殿防止剤を用い、既知の方法に従って、処方されてもよい。滅菌性注射製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌性注射溶液、懸濁液またはエマルジョン、例えば、１,３−ブタンジオール中溶液であってもよい。なかでも、利用できる許容されるビヒクルおよび溶媒は水、リンガー溶液、Ｕ.Ｓ.Ｐ.および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌した固定油は溶媒または懸濁過媒体として利用するのに都合がよい。この目的には、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含め、無菌性の固定油が利用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射製剤の調製に用いられる。
【０１３８】
該注射製剤は、例えば細菌保持フィルターを通して濾過することで、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散しうる、滅菌固体組成物の形態の滅菌化剤を配合することにより滅菌処理され得る。
【０１３９】
直腸または膣投与用の組成物は、好ましくは、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・塩酸塩・形態Ａを、室温で固体であるが、体温で液体である、カカオ脂、ポリエチレングリコール、または坐剤用ワックスなどの適当な非刺激性賦形剤または担体と混合することで調製され得、それによって直腸または膣腔にて融解し、活性化合物を放出する、坐剤である。
【０１４０】
経口投与用固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、散剤および顆粒を包含する。かかる固体剤形にて、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・塩酸塩・形態Ａを、少なくとも１種の不活性な医薬上許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸ジカルシウムと、および／またはａ）澱粉、ラクトース、シュークロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、シュークロースおよびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、イモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、あるケイ酸塩および炭酸ナトリウム、ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤、ｆ）第４アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑剤およびその混合物と混合する。カプセル、錠剤およびピルの場合には、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。
【０１４１】
同種の固体組成物はまた、かかる賦形剤をラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として用い、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセルにて充填剤として利用されてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティングおよび製薬の分野にて周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製され得る。該剤形は、所望により、乳白剤を含有してもよく、活性成分だけを、または優先的に、消化管のある部分にて、所望により遅延放出の様式にて放出する組成物とすることもできる。使用することのできる包埋組成物の例はポリマー物質およびワックスを包含する。同種の固体組成物はまた、かかる賦形剤をラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として用い、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセルにて充填剤として利用されてもよい。
【０１４２】
活性化合物はまた、上記した１または複数の賦形剤とのマイクロカプセル化形態でもあり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび製薬の分野にて周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製され得る。かかる固体剤形にて、活性化合物は、シュークロース、ラクトースまたは澱粉などの少なくとも１種の不活性な希釈剤と混合されてもよい。かかる剤形はまた、通常の慣行にあるように、不活性な希釈剤以外の付加的な物質、例えば、錠剤化滑剤およびステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースなどの他の錠剤化助剤を含んでもよい。カプセル、錠剤およびピルの場合には、該剤形はまた、緩衝化剤を含んでもよい。該剤形は、所望により、乳白剤を含有してもよく、活性成分だけを、または優先的に、消化管のある部分にて、所望により遅延放出の様式にて放出する組成物とすることもできる。使用することのできる包埋組成物の例はポリマー物質およびワックスを包含する。
【０１４３】
本願明細書に記載されるようなコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物は併用療法にて利用され得、すなわち、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａは、１または複数の他の望ましい治療剤または医療と同時に、該治療剤等に先立って、または該治療剤等の後で投与され得る。併用療法にて利用するための療法（治療剤または医療）の特定の組み合わせは、所望の治療剤および／または医療の適合性および達成されるべき望ましい治療剤作用を考慮するであろう。利用される治療剤は同じ障害について望ましい作用を達成し（例えば、本願発明の化合物を同じ障害を治療するのに使用されるもう一つ別の薬剤と同時に投与されてもよい）、あるいは異なる作用（例えば、副作用の制御）を達成するとも考えられる。本願明細書にて用いられるように、特定の疾患または病状を治療または防止するのに通常投与される付加的な治療剤は、「治療される疾患または病態に適するもの」として公知である。
【０１４４】
一の実施態様において、付加的な薬剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生剤、抗感染剤、抗炎症剤、本願発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節剤または滋養剤より選択される。
【０１４５】
一の実施態様において、付加的な薬剤は（Ｒ）−１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２,３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドである。もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤はＮ−（５−ヒドロキシ−２,４−ジ−tert−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドである。もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は表１より選択される：
表１
【表１】
2013523836.tif 000007
【表２】
2013523836.tif 000008
【０１４６】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は上記した薬剤のいずれかの組み合わせである。例えば、該組成物は、コンパウンド１、（Ｒ）−１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２,３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドおよびＮ−（５−ヒドロキシ−２,４−ジ−tert−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドを含む。もう一つ別の例として、該組成物はコンパウンド１、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２,４−ジ−tert−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドおよび表１からの一の化合物、すなわち表１の化合物１ないし１４またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１４７】
一の実施態様において、付加的な治療剤は抗生剤である。本願発明にて有用な代表的な抗生剤は、トブラマイシン吸入粉末（ＴＩＰ）を含むトブラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナンの噴霧化形態を含むアズトレオナン、アミカシン（そのリポソーム製剤を含む）、シプロフロキサシン（吸入による投与に適するその製剤を含む）、レボフラキサシン（その噴霧化製剤を含む）および２種の抗生剤の組み合わせ、例、ホスホマイシンとトブラマイシンの組み合わせを包含する。
【０１４８】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は粘液溶解物質である。本願発明にて有用な代表的な粘液溶解物質はプルモザイム（登録商標）を包含する。
【０１４９】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は気管支拡張剤である。代表的な気管支拡張剤は、アルベテロール、硫酸メタプロテネロール、酢酸ピルブテロール、サルメテロールまたは硫酸テトラブリンを包含する。
【０１５０】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は肺気道表面を液状に戻すのに効果的である。かかる薬剤は、細胞の内外にある塩の動きを改善し、粘液を肺気道にてさらに水和されるようにし、したがってより容易に清掃される。代表的なかかる薬剤は、高張セイライン、デヌホソール（denufosol）テトラナトリウム（［［（３Ｓ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシオキソラン−２−イル］メトキシ−ヒドロキシホスホリル］［［［（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ,５Ｒ）−５−（２,４−ジオキソピリミジン−１−イル）−３、４−ジヒドロキシオキソラン−２−イル］メトキシ−ヒドロキシホスホリル］オキシ−ヒドロキシホスホリル］水素ホスフェート）またはブロンキトール（マンニトールの吸入製剤）を包含する。
【０１５１】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は抗炎症剤、すなわち、肺における炎症を軽減しうる薬剤である。本願発明にて有用な代表的なかかる薬剤は、イブプロフェン、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）、シルデナフィル、吸入用グルタチオン、ピオグリタゾン、ヒドロキシクロロキンまたはシマバスタチンを包含する。
【０１５２】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤はコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａ以外のＣＦＴＲ調節剤、すなわちＣＦＴＲ活性を調節するのに作用を有する薬剤である。代表的なかかる薬剤は、アタルレン（「ＰＴＣ１２４（登録商標）」；３−［５−（２−フルオロフェニル）−１,２,４−オキサジアゾール−３−イル］安息香酸）、シナプルチド、ランコブチド、デペレスタット（ヒト組換え好中球エラスターゼ阻害剤）およびコビプロストン（７−{（２Ｒ、４ａＲ、５Ｒ、７ａＲ）−２−［（３Ｓ）−１,１−ジフルオロ−３−メチルペンチル］−２−ヒドロキシ−６−オキソオクタヒドロシクロペンタ［ｂ］ピラン−５−イル}ヘプタン酸）を包含する。
【０１５３】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は滋養剤である。代表的な滋養剤として、パンクレアーゼ（登録商標）、パンクレアカルブ（登録商標）、ウルトラーゼ（登録商標）またはクレオン（登録商標）を含むパンクレリパーゼ（膵酵素補充療法）、リプロトトマーゼ（登録商標）（以前はトリザイテック（登録商標））、アクアデックス（登録商標）またはグルタチオン吸入が挙げられる。一の実施態様において、付加的な滋養剤はパンクレリパーゼである。
【０１５４】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は、ゲンタマイシン、クルクミン、シクロホスファミド、４−フェニルブチレート、ミグルスタット、フェロジピン、ニモジピン、フィロキンＢ、ゲニエステイン、アピゲニン、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ調節剤、例えばロリプラム、シルデナフィル、ミルリノン、タダラフィル、アムリノン、イソプロテレノール、アルブテロールおよびアルメテロール、デオキシスペルグアリン、ＨＳＰ９０阻害剤、ＨＳＰ７０阻害剤、プロテオソーム阻害剤、例えばエポキソマイシン、ラクタシスチン等より選択される。
【０１５５】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は、ＷＯ２００４０２８４８０、ＷＯ２００４１１０３５２、ＷＯ２００５０９４３７４、ＷＯ２００５１２０４９７またはＷＯ２００６１０１７４０に開示されている化合物である。
【０１５６】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は、ＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾ（ｃ）キノリジニウム誘導体またはＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾピラン誘導体である。
【０１５７】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は、ＵＳ７２０２２６２、ＵＳ６９９２０９６、ＵＳ２００６０１４８８６４、ＵＳ２００６０１４８８６３、ＵＳ２００６００３５９４３、ＵＳ２００５０１６４９７３、ＷＯ２００６１１０４８３、ＷＯ２００６０４４４５６、ＷＯ２００６０４４６８２、ＷＯ２００６０４４５０５、ＷＯ２００６０４４５０３、ＷＯ２００６０４４５０２またはＷＯ２００４０９１５０２に開示されている化合物である。
【０１５８】
もう一つ別の実施態様にて、付加的な薬剤は、ＷＯ２００４０８０９７２、ＷＯ２００４１１１０１４、ＷＯ２００５０３５５１４、ＷＯ２００５０４９０１８、ＷＯ２００６０９９２５６、ＷＯ２００６１２７５８８またはＷＯ２００７０４４５６０に開示されている化合物である。
【０１５９】
本願発明の組成物に配合される付加的な治療剤の量は、該治療剤を唯一の活性剤として含む組成物にて通常投与される量よりも少ないであろう。好ましくは、本願明細書にて開示される組成物中の付加的な治療剤の量は、該薬剤を唯一の治療的に活性な薬剤として含む組成物中に通常存在する量の約５０％から１００％の範囲にあるであろう。
【０１６０】
本願明細書に記載されるようなコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物はまた、補綴、人工弁、代用血管、ステントおよびカテーテルなどの移植可能な医学装置をコーティングするための組成物に組み入れてもよい。したがって、本願発明は、もう一つ別の態様にて、本願明細書に記載されるようなコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａまたはその医薬上許容される組成物、および該移植装置を被覆するのに適する担体を含む、移植装置を被覆するための組成物を包含する。さらにもう一つ別の態様にて、本願発明は、本願明細書にて記載されるようなコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａあるいはその医薬上許容される組成物と、該移植用装置を被覆するのに適する担体とを含む組成物で被覆された移植用装置を包含する。適当なコーティングおよび被覆された移植用装置の調製は米国特許第６,０９９,５６２号；第５,８８６,０２６号；および第５,３０４,１２１号に記載されている。コーティングは、典型的には、ヒドロゲルポリマー、ポリメチルジシロキサン、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、エチレンビニルアセテートおよびその混合物などの生体適合性ポリマー材料である。所望により、該コーティングはさらに、フルオロシリコーン、多糖類、ポリエチレングリコール、リン脂質またはその組み合わせなどの適当なトップコートでカバーされ、該組成物にて放出特性を発揮してもよい。
【０１６１】
次に実施例が、本願発明をさらに詳細に理解するために、記載される。これらの実施例は単に説明のために記載されるに過ぎず、如何なる場合も、本願発明を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例
方法および材料
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）
【０１６２】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａについての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）データをＤＳＣ  Ｑ１００  Ｖ９．６  Ｂｕｉｌｄ２９０（TA Instruments、New Castle、DE）を用いて収集した。温度をインジウムで検査し、熱用量をサファイアで検査した。３−６ｍｇのサンプルを１のピンホールでの蓋を用いてクリンプされているアルミニウム製パンにて評量した。サンプルを１.０℃／分の加熱速度で、５０ｍｌ／分で窒素気体をパージしながら、２５℃から３５０℃までスキャンした。データをThermal Advantage Q Series（登録商標）バージョン２.２.０.２４８ソフトウェアで収集し、Universal Analysisソフトウェアバージョン４.１Ｄ（TA Instruments、New Castle、DE）で解析した。報告されている数字は単分析（single analyses）を示す。
ジェット・ミリング（Jet Milling）記載
【０１６３】
未微粉化のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを篩にかけ、ジェット・ミル・ホッパーに入れる前に、塊を分ける。篩はすべて使い捨てであり、使用前にきれいに拭き取る。未微粉化のコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを加圧窒素気体を用いて供給速度を調節してジェット・ミル・ホッパーに加える。気体圧は４０−４５／４５−７０（ベンチュリ／ミル）ＰＳＩの範囲にあり、供給速度は０.５−１.６ｋｇ／時間の範囲にある。コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを粒子間衝突および粒子壁衝突を介してミルで微粒化し、処理したコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを微粉化された生成物の容器に注ぐ。当業者はまた、一部は上記した条件に基づき、ピンミリングを介して、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａまたはコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａを好ましい粒径とすることを考える。
ＸＲＰＤ（Ｘ−線粉末回折） 
【０１６４】
Ｘ−線回折（ＸＲＤ）データをBruker D8 DISCOVERまたはBruker APEX II粉末回折計のいずれかで収集した。Bruker D8 DISCOVER回折計はHI−STAR平面映像検出装置および平坦なグラファイト単色光分光計を備えた。Ｋ−アルファ線のＣｕ密封管を４０ｋｖ、３５ｍＡで用いた。サンプルをゼロ−バックグラウンドのシリコーンウェハーに２５℃で置いた。各サンプルには、２つのデータフレームを２種の異なるθ２角：８°および２６°で各１２０秒間集めた。該データをＧＡＤＤＳソフトウェアで積分し、ＤＩＦＦＲＡＣＴｐｌｕｓＥＶＡソフトウェアで統合した。報告されたピーク位置の不確実性は±０.２°である。
【０１６５】
Bruker II粉末回折計は密封管Ｃｕ  Ｋα源およびＡｐｅｘＩＩ  ＣＣＤ検出器を備えた。構造をＳＨＥＬＸプログラム（Sheldrick、G.M.、Acta Cryst.（2008） A64、112-122）を用いて明らかにして精密化した。
【０１６６】
ビトリド（Vitride（登録商標））（水素化ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウム［またはＮａＡｌＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）２］、トルエン中６５重量％溶液）をAldrich Chemicalsより購入した。
【０１６７】
２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸をSaltigo（Lanxess Corporationの関連会社）より購入した。
【０１６８】
本願明細書にて、化合物名はその化合物の構造を正確に記載していないかもしれないが、その構造は名称に優先するものとする。
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールの調製.
【化６】
2013523836.tif 000009
【０１６９】
市販の２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（１.０当量）をトルエン（１０倍容量）にてスラリーにした。ビトリド（登録商標）（２当量）を１５ないし２５℃の温度を維持する速度で滴下漏斗で添加した。添加の終わりに、温度を４０℃に上げ、２時間経過後、１０％（ｗ／ｗ）水性（aq）ＮａＯＨ（４.０当量）を温度を４０ないし５０℃に滴下漏斗を介して注意して加えた。さらに３０分間撹拌した後、層を４０℃で分離した。有機相を２０℃に冷却し、ついで水（２ｘ１.５容量）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して粗（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールを得、それを次の工程にて直接使用した。
５−クロロメチル−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソールの調製
【化７】
2013523836.tif 000010
【０１７０】
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノール（１.０当量）をＭＴＢＥ（５倍容量）に溶かした。触媒量の４−（Ｎ,Ｎ−ジメチル）アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１モル％）を加え、ＳＯＣｌ２（１.２当量）を滴下漏斗を介して添加した。ＳＯＣｌ２を反応器にて温度が１５ないし２５℃の温度を維持するような速度で添加した。温度を３０℃に上げ、１時間経過した後、２０℃に冷却した。水（４倍容量）を、温度を３０℃より低く維持しながら、滴下漏斗を介して添加した。さらに３０分間撹拌した後、層を分離した。有機層を撹拌し、１０％（ｗ／ｖ）水性ＮａＯＨ（４.４倍容量）を添加した。１５ないし２０分間撹拌した後、層を分離した。ついで、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して粗５−クロロメチル−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソールを得、それを次の工程にて直接使用した。
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルの調製
【化８】
2013523836.tif 000011
【０１７１】
５−クロロメチル−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール（１当量）のＤＭＳＯ（１.２５倍容量）中溶液を、温度を３０ないし４０℃に維持しながら、ＮａＣＮ（１.４当量）のＤＭＳＯ（３倍容量）中スラリーに加えた。該混合物を１時間撹拌し、ついで水（６倍容量）を加え、つづいてメチルtert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（４倍容量）を加えた。３０分間撹拌した後、層を分離した。水層をＭＴＢＥ（１.８倍容量）で抽出した。合わせた有機層を水（１.８倍容量）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮させて粗（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（９５％）を得、それを次の工程にて直接使用した。
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−酢酸エチル−アセトニトリルの合成
【化９】
2013523836.tif 000012
【０１７２】
反応器に窒素をパージし、トルエン（９００ｍＬ）でチャージした。窒素拡散を介して溶媒を１６時間以上脱気した。ついで、該反応器にＮａ３ＰＯ４（１５５.７ｇ、９４９.５ミリモル）を、つづいてビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（７.２８ｇ、１２.６６ミリモル）を充填した。tert-ブチルホスフィンのヘキサン中１０％ｗ／ｗ溶液（５１.２３ｇ、２５.３２ミリモル）を窒素パージした滴下漏斗より２３℃で１０分間にわたって充填した。該混合物を５０分間にわたって撹拌し、その時点で５−ブロモ−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール（７５ｇ、３１６.５ミリモル）を１分間にわたって添加した。さらに５０分間撹拌した後、該混合物をシアノ酢酸エチル（７１.６ｇ、６３３.０ミリモル）を５分間にわたって、つづいて水（４.５ｍＬ）を一度に充填した。該混合物を７０℃で４０分間にわたって加熱し、１ないし２時間毎にＨＰＬＣで反応物の生成物への変換割合について分析した。変換の完了が観察された後（典型的には、５ないし８時間後に１００％変換）、該混合物を２０ないし２５℃に冷却し、セライトパッドを介して濾過した。該セライトパッドをトルエン（２ｘ４５０ｍＬ）で濯ぎ、合わせた有機液を真空下６０−６５℃で３００ｍＬに濃縮した。濃縮液にＤＭＳＯ（２２５ｍＬ）を充填し、真空下、７０ないし８０℃で、溶媒の活発な蒸留が止むまで濃縮した。該溶液を２０ないし２５℃に冷却し、工程２の調製にてＤＭＳＯで９００ｍＬに希釈した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７.１６−７.１０（ｍ，２Ｈ）、７.０３（ｄ，Ｊ＝８.２Ｈｚ，１Ｈ）、４.６３（ｓ，１Ｈ）、４.１９（ｍ，２Ｈ）、１.２３（t、Ｊ＝７.１Ｈｚ，３Ｈ）。
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルの合成
【化１０】
2013523836.tif 000013
【０１７３】
上記した（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−酢酸エチル−アセトニトリルのＤＭＳＯ溶液に３Ｎ ＨＣｌ（６１７.３ｍＬ、１.８５モル）を内部温度を４０℃以下に維持しながら２０分間にわたって充填した。ついで、該混合物を１時間にわたって７５℃に冷却し、１ないし２時間毎にＨＰＬＣで変換割合について分析した。９９％より大きな変換が観察されたならば（典型的には５ないし６時間後）、反応物を２０ないし２５℃に冷却し、抽出の間に完全な相分離を可能とするのに十分な時間、ＭＴＢＥ（２ｘ５２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出液を５％ ＮａＣｌ（２ｘ３７５ｍＬ）で洗浄した。ついで、該溶液を、冷却したリザバーフラスコを備えた１.５ないし２.５トールの真空蒸留に適する装置に移した。該溶液を６０℃以下の温度で真空下にて濃縮し、溶媒を除去した。ついで、（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルを、１２５ないし１３０℃（オーブン温度）および１.５ないし２.０トールで得られた油より蒸留した。（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルを５−ブロモ−２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソールより６６％収率（２工程）および９１.５％のＡＵＣのＨＰＬＣ純度（９５％のｗ／ｗアッセイに相当する）にて透明な油として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ ７.４４（ｂｒｓ，１Ｈ）、７.４３（ｄ，Ｊ＝８.４Ｈｚ，１Ｈ）、７.２２（ｄｄ，Ｊ＝８.２、１.８Ｈｚ，１Ｈ）、４.０７（ｓ，２Ｈ）。
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルの調製
【化１１】
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【０１７４】
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（１.０当量）、５０重量％の水性ＫＯＨ（５.０当量）、１−ブロモ−２−クロロエタン（１.５当量）およびＯｃｔ４ＮＢｒ（０.０２当量）を７０℃で１時間加熱した。該反応混合物を冷却し、ついでＭＴＢＥおよび水で後処理した。有機相を水およびブラインで洗浄した。溶媒を除去して（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを得た。
１−（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸の調製
【化１２】
2013523836.tif 000015
【０１７５】
（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルをエタノール（５倍容量）中６Ｍ  ＮａＯＨ（８当量）を用いて８０℃で一夜加水分解した。該混合物を室温に冷却し、エタノールを真空下で蒸発させた。残渣を水およびＭＴＢＥに溶かし、１Ｍ  ＨＣｌを加え、層を分離した。ついで、ＭＴＢＥ層をジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）（０.９７当量）で処理した。スラリーを０℃に冷却し、濾過し、ヘプタンで洗浄し、対応するＤＣＨＡ塩を得た。該塩をＭＴＢＥおよび１０％ クエン酸に溶かし、すべての固体が溶解するまで撹拌した。層を分離し、ＭＴＢＥ層を水およびブラインで洗浄した。溶媒をヘプタンと交換し、つづいて濾過し、真空オーブンで５０℃にて一夜乾燥させて１−（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸を得た。
１−（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの調製
【化１３】
2013523836.tif 000016
【０１７６】
１−（２,２−ジフルオロ−１,３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸（１.２当量）をトルエン（２.５倍容量）でスラリーにし、混合物を６０℃に加熱した。ＳＯＣｌ２（１.４当量）を滴下漏斗より添加した。トルエンおよびＳＯＣｌ２を３０分後に該反応混合物より蒸留した。付加的なトルエン（２.５倍容量）を加え、得られた混合物を再び蒸留し、生成物の酸塩化物を油状物として得、それをさらに精製することなく用いた。
３−（３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルの調製
【化１４】
2013523836.tif 000017
【０１７７】
２−ブロモ−３−メチルピリジン（１.０当量）をトルエン（１２倍容量）に溶かした。Ｋ２ＣＯ３（４.８当量）を、つづいて水（３.５倍容量）を添加した。得られた混合物をＮ２流下で１時間６５℃に加熱した。ついで、３−（t−ブトキシカルボニル）フェニルボロン酸（１.０５当量）およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２ＣＨ２Ｃｌ２（０.０１５当量）を添加し、該混合物を８０℃に加熱した。２時間後、加熱を止め、水（３.５倍容量）を加え、層を分離した。ついで、有機相を水（３.５倍容量）で洗浄し、１０％水性メタンスルホン酸（２当量のＭｓＯＨ、７.７倍容量）で抽出した。水相を５０％水性ＮａＯＨ（２当量）で塩基性にし、ＥｔＯＡｃ（８倍容量）で抽出した。有機層を濃縮して粗３−（３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（８２％）を得、それを次の工程にて直接使用した。
２−（３−（tert−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシドの調製
【化１５】
2013523836.tif 000018
【０１７８】
３−（３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチル（１.０当量）をＥｔＯＡｃ（６倍容量）に溶かした。水（０.３倍容量）を加え、つづいて尿素−過酸化水素（３当量）を加えた。次に、無水フタル酸（３当量）を固体としての混合物に、反応器の温度を４５℃より下の温度を維持する速度で少しずつ添加した。無水フタル酸の添加終了後、該混合物を４５℃に加熱した。付加的に４時間撹拌した後、加熱を止めた。１０％ｗ／ｗ水性Ｎａ２ＳＯ３（１.５当量）を滴下漏斗を介して添加した。Ｎａ２ＳＯ３添加の完了後、該混合物をさらに３０分間撹拌し、層を分離した。有機層を撹拌し、１０％ｗｔ／ｗｔ水性Ｎａ２ＣＯ３（２当量）を加えた。３０分間撹拌した後、層を分離した。有機相を１３％ｗ／ｖ水性ＮａＣｌで洗浄した。ついで、有機相を濾過し、濃縮して粗２−（３−（tert−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシド（９５％）を得、それを次の工程にて直接使用した。
３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルの調製
【化１６】
2013523836.tif 000019
【０１７９】
２−（３−（tert−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシド（１当量）およびピリジン（４当量）のアセトニトリル（８倍容量）中溶液を７０℃に加熱した。無水メタンスルホン酸（１.５当量）のＭｅＣＮ（２倍容量）中溶液を、温度を７５℃より下の温度に維持しながら、５０分間にわたって滴下漏斗を介して添加した。添加終了後、該混合物をさらに０.５時間撹拌した。ついで、該混合物を外界温度に冷却させた。エタノールアミン（１０当量）を滴下漏斗を介して添加した。２時間撹拌した後、水（６倍容量）を添加し、該混合物を１０℃に冷却した。３時間撹拌した後、該固体を濾過により集め、水（３倍容量）、２：１のアセトニトリル／水（３倍容量）およびアセトニトリル（２ｘ１.５倍容量）で洗浄した。該固体を乾燥オーブンにて５０℃でわずかにＮ２を供給しながら一定重量（１％未満の差）になるまで乾燥させ、３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルを赤黄色固体（５３％収率）として得た。
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）− シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチルの調製
【化１７】
2013523836.tif 000020
【０１８０】
上記した粗酸塩化物をトルエン（酸塩化物に基づいて２.５倍容量）に溶かし、滴下漏斗を介して３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチル（１当量）、ＤＭＡＰ（０.０２当量）およびトリエチルアミン（３.０当量）のトルエン（３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルに基づき４倍容量）中混合物に添加した。２時間後、水（３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸tert−ブチルに基づいて４倍容量）を反応混合物に添加した。３０分間撹拌した後、層を分離した。ついで、有機相を濾過し、濃縮して３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチル（定量的な粗収率）の粘性の油を得た。アセトニトリル（粗生成物に基づき３倍容量）を加え、結晶化が生じるまで蒸留させた。水（粗生成物に基づき２倍容量）を加え、該混合物を２時間撹拌した。固体を濾過により集め、１：１（容量）のアセトニトリル／水（粗生成物に基づき２ｘ１容量）で洗浄し、フィルター上、真空下で部分的に乾燥させた。固体を真空オーブン中６０℃でわずかにＮ２を供給しながら重量が一定になるまで（１％未満の差）乾燥させ、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチルを褐色固体として得た。
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ塩の調製
【化１８】
2013523836.tif 000021
【０１８１】
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチル（１.０当量）のＭｅＣＮ（３.０倍容量）中スラリーに、水（０.８３倍容量）を、つづいて水性濃塩酸（０.８３倍容量）を添加した。該混合物を４５±５℃に加熱した。２４ないし４８時間撹拌した後に、反応が完了し、該混合物を外界温度にまで冷却させた。水（１.３３倍容量）を加え、該混合物を撹拌した。固体を濾過で集め、水（２ｘ０.３倍容量）で洗浄し、フィルター上、真空下で部分的に乾燥させた。固体を真空オーブン中６０℃でわずかにＮ２を供給しながら重量が一定になるまで（１％未満の差）乾燥させ、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌを灰白色固体として得た。
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・形態Ｉ・方法Ａの調製
【化１９】
2013523836.tif 000022
【０１８２】
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ（１当量）の水（１０倍容量）中スラリーを外界温度で撹拌した。２４時間撹拌した後、サンプルを採取した。サンプルを濾過し、固体を水で洗浄した（２回）。固体サンプルをＤＳＣ分析に供した。ＤＳＣ分析が形態Ｉへの完全な変換を示した場合、該固体を濾過により集め、水（２ｘ１.０倍容量）で洗浄し、フィルター上、真空下で部分的に乾燥させた。ついで、該固体を真空オーブン中６０℃でわずかにＮ２を供給しながら重量が一定になるまで（１％未満の差）乾燥させ、形態Ｉの化合物を灰白色固体として得た（９８％収率）。  １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）９.１４（ｓ，１Ｈ）、７.９９−７.９３（ｍ，３Ｈ）、７.８０−７.７８（ｍ，１Ｈ）、７.７４−７.７２（ｍ，１Ｈ）、７.６０−７.５５（ｍ，２Ｈ）、７.４１−７.３３（ｍ，２Ｈ）、２.２４（ｓ，３Ｈ）、１.５３−１.５１（ｍ，２Ｈ）、１.１９−１.１７（ｍ，２Ｈ）。
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル） シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・形態Ｉ・方法Ｂの調製
【化２０】
2013523836.tif 000023
【０１８３】
３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチル（１.０当量）のギ酸（３.０倍容量）中溶液を撹拌しながら７０±１０℃で８時間加熱した。クロマトグラフィー操作により、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチルが１.０％未満のＡＵＣが残っている場合、該反応は完了したものとみなされる。該混合物を外界温度にまで冷却した。該溶液を水（６倍容量）に加え、５０℃で加熱して撹拌した。ついで、該混合物を、３−（６−（１−（２,２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１,３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸ｔ−ブチルの濃度がわずか０.８％（ＡＵＣ）となるまで、７０±１０℃に加熱した。固体を濾過で集め、水（２ｘ３倍容量）で洗浄し、フィルター上、真空下で部分的に乾燥させた。該固体を真空オーブン中６０℃でわずかにＮ２を供給しながら重量が一定になるまで（１％未満の差）乾燥させ、形態Ｉの化合物を灰白色固体として得た。
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａのコンパウンド１・形態Ｉからの調製
【０１８４】
コンパウンド１・形態Ｉ（約３０ｍｇ）を５００μＬの適当な溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトン、２−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸メチル、２−ブタノン、ギ酸エチルおよびテトラヒドロフラン）にて２日間でスラリーにした。ついで、該スラリーを遠心分離によりまたは真空下で濾過し、外界温度で一夜放置して乾燥させ、コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａを得た。
【０１８５】
コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態ＡのＤＳＣトレースを図１３に示し、それは２相転移を示す。コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの融点は、約１８８℃および２０５℃で起こる。
【０１８６】
コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａの実際のＸ−線粉末回折パターンを図１に示す。表２は実際の図１のピークを相対強度の降順にて列挙する。
表２
【表３】
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【０１８７】
単結晶Ｘ−線解析を基礎とするコンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を図１５−１８に示す。図１５は単結晶Ｘ−線解析を基礎とするコンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を示す。図１６は単結晶Ｘ−線解析を基礎とするカルボン酸基の間の水素結合を示す二量体としてのコンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座の描写を提供する。図１７はコンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの四量体の立体配座の描写を提供する。図１８は単結晶Ｘ−線解析を基礎とするコンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの立体配座を提供する。コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａおよびアセトンの化学量論は約４.４：１（１Ｈ  ＮＭＲから計算して４.４８：１；Ｘ−線から４.３８：１）である。結晶構造は、単位セル当たり２つの空隙またはポケットを、または宿主分子当たり１つの空隙を有する分子のパッキングを示す。アセトン溶媒和物においては、空隙の約９２％がアセトン分子で占められる。コンパウンド１・溶媒和物・形態Ａは、次の単位セルの寸法：ａ＝１６.５２３５（１０）Å、ｂ＝１２.７４２５（８）Å、ｃ＝２０.５５１２（１３）Å、α＝９０°、β＝１０３.７３６（４）°、γ＝９０°Ｖ＝４２０３.３（５）Å３、＝４を有する単斜晶系Ｐ２１／ｎ空間群である。構造データより計算したコンパウンド１・溶媒和物・形態Ａにおけるコンパウンド１の密度は１００Ｋで１.４３０／ｃｍ３である。
【０１８８】
コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの固体１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図２２に示す。表３は関連するピークの化学シフトを提供する。
表３
【表４】
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【０１８９】
コンパウンド１・アセトン溶媒和物・形態Ａの固体１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを図２３に示す。星印のピークはスピンニングサイドバンドを示す。表４は関連するピークの化学シフトを提供する。
表４
【表５】
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コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの調製
【０１９０】
コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの無色結晶が、コンパウンド１・塩酸塩のエタノール中濃縮溶液をゆっくりと蒸発させることで得られた。０.３０ｘ１／５ｘ０.１５ｍｍの寸法を有する結晶を選択し、鉱油を用いてきれいにし、マイクロマウント（MicroMount）に取り付け、Bruker APEXII回折計に集中させた。配向マトリックスおよび初期セルパラメータを提供するのに、逆格子空間にて分けられた４０個のフレームの３つのバッチを得た。最終セルパラメータを得、十分なデータに基づいて精緻化した。
【０１９１】
図１９は、単結晶分析に基づく、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａの二量体としての立体配座の描写を提供する。図２０は、単結晶分析に基づく、コンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態Ａのパッキング図を提供する。結晶構造より計算されたコンパウンド１・ＨＣｌ塩・形態ＡのＸ−線回折パターンを図２１に示す。表５は図２１について計算されたピークを相対強度の降順にて含有する。
表５
【表６】
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アッセイ
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ修正特性を検出および測定するアッセイ
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ修飾特性をアッセイするための膜電位光学方法
【０１９２】
光学膜電位アッセイは、GonzalezおよびTsien（Gonzalez, J. E.およびR. Y. Tsien（1995）「Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells」Biophys J 69（4）：1272-80、およびGonzalez, J. E.およびR. Y. Tsien（1997）「Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer」Chem Biol 4（4）：269-77を参照）に記載の電位感受性ＦＲＥＴセンサを、Voltage/Ion Probe Reader（ＶＩＰＲ）などの蛍光変化を測定するための器具類（Gonzalez, J. E.、K. Oadesら、（1999）「Cell-based assays and instrumentation for screening ion−channel targets」Drug Discov Today 4（9）：431-439を参照）と組み合わせて利用した。
【０１９３】
これらの電位感受性アッセイは、膜溶解性で電位感受性の色素、ＤｉＳＢＡＣ２（３）と、形質膜の外葉に結合し、ＦＲＥＴドナーとして作用する、蛍光性リン脂質、ＣＣ２−ＤＭＰＥの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）における変化に基づく。膜電位（Ｖｍ）の変化は負に帯電しているＤｉＳＢＡＣ２（３）を形質膜を通って再分配させ、したがって、ＣＣ２−ＤＭＰＥからのエネルギー移動の量を変化させる。蛍光発光の変化は、９６−または３８４−ウェルマイクロタイタープレートにてセルベースのスクリーンを行うように設計されている、一の統合された液体ハンドラおよび蛍光検出器である、ＶＩＰＲ（登録商標）ＩＩを用いてモニター観察される。
１．修正化合物の同定
【０１９４】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに関連する輸送障害を修正する小分子を同定するのに、単回添加のＨＴＳアッセイを開発した。細胞を試験化合物の存在または不在（負対照）にて血清不含培地に３７℃で１６時間インキュベートした。正対照として、３８４ウェルのプレートに置いた細胞を２７℃で１６時間インキュベートし、「温度修正」ΔＦ５０８−ＣＦＴＲとした。その後で細胞をクレブス・リンゲル溶液で３回濯ぎ、電位感受性色素を負荷した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化するのに、１０μＭホルスコリンおよびＣＦＴＲ増強剤、ゲニステイン（２０μＭ）をＣｌ−−不含培地と一緒に各ウェルに加えた。Ｃｌ−−不含培地の添加はΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性化に応答してＣｌ−の流出を促進し、得られた膜脱分極はＦＲＥＴを基礎とする電位センサー色素を用いて所望によりモニター観察されてもよい。
２．増強剤化合物の同定
【０１９５】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの増強剤を同定するのに、二回添加のＨＴＳアッセイを開発した。第一の添加の間に、Ｃｌ−−不含培地を試験化合物と共にまたはなしで各ウェルに添加した。２２秒後に、２ないし１０μＭのホルスコリンを含有する第二添加のＣｌ−−不含培地を加え、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化した。２回添加した後の細胞外Ｃｌ−濃度は２８ｍＭであり、それはΔＦ５０８−ＣＦＴＲの活性化に応答してＣｌ−の流出を促進し、得られた膜脱分極は所望によりＦＲＥＴを基礎とする電位センサー色素を用いてモニター観察された。
３．溶液
浴溶液＃１（ｍＭ）：ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ４.５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＯＨを用いてｐＨ７.４に調整）
クロリド不含の浴溶液：浴溶液＃１中のクロリド塩をグルコン酸塩と置き換えた。
ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液として調製し、−２０℃で貯蔵した。
ＤＭＳＯ中１０ｍＭストックとして調製し、−２０℃で貯蔵した。
４．細胞培養
【０１９６】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を膜電位の光学測定用に用いる。該細胞を、３７℃で５％ＣＯ２および９０％湿度で、２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１ｘＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１ｘペン／スウトレプトおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを１７５ｃｍ２培養フラスコ中に補足したダルベコ修飾イーグル培地に維持する。すべての光学アッセイについて、細胞を３０,０００／ウェルで３８４ウェルのマトリゲル被覆プレートに播種し、３７℃で２時間培養し、その後で増強剤アッセイ用に２７℃で２４時間培養する。修正アッセイ用に、細胞を２７℃または３７℃で、化合物と共にまたはなしで１６ないし２４時間培養する。
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性をアッセイするための電気生理学的アッセイ
１．チャンバーアッセイの使用
【０１９７】
光学アッセイにて同定されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲモジュレーターをさらに特徴付けるのに、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現する分極された上皮細胞にてチャンバー実験を行った。Costar Snapwell細胞培養インサート上に増殖させたＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ 上皮細胞をUssingチャンバー（Physiologic Instruments,Inc.、San Diego、CA）に取り付け、単層を電位クランプシステム（Department of Bioengineering、University of Iowa、IA、およびPhysiologic Instruments,Inc.、San Diego、CA）を用いて連続して短絡させた。経上皮電気抵抗を２ｍＶのパルスを加えることで測定した。これらの条件下で、ＦＲＴ上皮は４ＫΩ／ｃｍ２以上の抵抗を示した。該溶液を２７℃で維持し、通気した。電極のオフセット電位および流体の電気抵抗は無細胞インサートを用いて訂正された。これらの条件下、電流は頂端膜にて発現されるΔＦ５０８−ＣＦＴＲを通るＣｌ−の流れを反映する。ＩｓｃはＭＰ１００Ａ−ＣＥインターフェースおよびAcqKnowledgeソフトウェア（ｖ３.２.６；BIOPAC Systems、Santa Barbara、CA）を用いてデジタル処理して示された。
２．修飾化合物の同定
【０１９８】
典型的なプロトコルは側底膜から頂端膜へのＣｌ−濃度の勾配を利用した。この勾配をセットアップするのに、側底膜では通常リンゲルを用い、それに対して頂端膜ではＮａＣｌを等モル量のナトリウムグルコン酸塩（ＮａＯＨでｐＨ７.４と滴定される）と置き換え、上皮を横切るＣｌ−濃度の大きな勾配を得た。実験はすべて無傷の単層で行った。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを十分に活性化するのに、ホルスコリン（１０μＭ）およびＰＤＥ阻害剤、ＩＢＭＸ（１００μＭ）を適用し、つづいてＣＦＴＲ増強剤、ゲニステイン（５０μＭ）を添加した。
【０１９９】
他の細胞型にて観察されるように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現する、ＦＲＴ細胞の低温度でのインキュベーションは、原形質膜におけるＣＦＴＲの機能密度を増加させる。修飾化合物の活性を測定するために、細胞を１０μＭの試験化合物と共に３７℃で２４時間インキュベートし、その後で３回洗浄して記録した。化合物処理の細胞におけるｃＡＭＰ−およびゲニステイン−介在のＩｓｃを２７℃および３７℃の対照に対して正規化し、それは活性の割合として表される。細胞と修正化合物とのプレインキュベーションは、３７℃の対照と比べて、ｃＡＭＰ−およびゲニステイン−介在のＩｓｃを顕著に増加させた。
３．増強剤としての化合物の同定
【０２００】
典型的なプロトコルは側底膜から頂端膜へのＣｌ−濃度の勾配を利用した。この勾配をセットアップするのに、側底膜では通常リンゲルを用い、ナイスタチン（３６０μｇ／ｍｌ）で透過処理され、それに対して頂端膜ではＮａＣｌを等モル量のナトリウムグルコン酸塩（ＮａＯＨでｐＨ７.４と滴定される）と置き換え、上皮を横切るＣｌ−濃度の大きな勾配を得た。実験はすべてナイスタチンでの透過処理の３０分後に行われた。ホルスコリン（１０μＭ）およびすべての試験化合物を細胞培養インサートの両側に加えた。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの推定増強剤の効能を、既知の増強剤、ゲニステインの効能と比較した。
４．溶液
【０２０１】
側底膜溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３５）、ＣａＣｌ２（１.２）、ＭｇＣｌ２（１.２）、Ｋ２ＨＰＯ４（２.４）、ＫＨＰＯ４（０.６）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）およびデキストロース（１０）。
該溶液をＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定した。
【０２０２】
頂端膜溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌをグルコン酸ナトリウム（１３５）で置き換えた以外は、側底膜溶液と同じ。
５．細胞培養
【０２０３】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ（ＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ）を発現するフィッシャー（Fisher）ラット上皮（ＦＲＩ）細胞を、本願発明者らの光学的アッセイより同定されるΔＦ５０８−ＣＦＴＲの推定モジュレータについてUssingチャンバー実験にて使用した。細胞をCostar Snapwell細胞培養インサートで培養し、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したコーン（Coon）修飾ハム（Ham）Ｆ−１２培地にて３７℃および５％ＣＯ２で５日間培養した。化合物の増強剤活性を特徴付けるのに使用する前に、細胞を２７℃で１６ないし４８時間インキュベートし、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲについて修正した。修正化合物の活性を測定するために、細胞を２７℃または３７℃で化合物と共にまたはなしで２４時間インキュベートした。
６．全細胞の記録
【０２０４】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定的に発現する温度−および試験化合物−修正のＮＩＨ３Ｔ３細胞にて巨視的なΔＦ５０８−ＣＦＴＲ電流（ＩΔＦ５０８）を穴あきパッチを用いて全細胞の記録をモニターした。簡単には、ＩΔＦ５０８の電位−クランプ記録をAxopatch 200Bパッチクランプ増幅器（Axon Instruments Inc.、Foster City、CA）を用いて室温で行った。すべての記録を１０ｋＨｚのサンプリング周波数で獲得し、１ｋＨｚで低域フィルターに供された。細胞内溶液で満たされた場合、ピペットは５ないし６ＭΩの抵抗性を有した。これらの記録条件下、Ｃｌ−について逆転電位の室温での計算値（ＥＣｌ）は−２８ｍＶであった。記録はすべて２０ＧΩよりも大きな密封抵抗および１５ＭΩ未満の直列抵抗を有した。パルス発生、データ収集および分析を、Clampex 8（Axon Instruments Inc.）を繋いだDigidata 1320 A/Dインターフェースを備えたＰＣを用いて行った。該浴は２５０μｌ未満のセイラインを含有し、重力駆動かん流システムを用いて２ｍｌ／分の速度で連続して精製した。
７．修正化合物の同定
【０２０５】
修正化合物の、原形質膜における機能的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度の増加に対する活性を測定するために、上記した穴あきパッチの記録技法を用いて、修正化合物で処理した２４時間後の電流密度を測定した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを十分に活性化するために、１０μＭホルスコリンおよび２０μＭゲニステインを該細胞に加えた。本願発明者らの記録条件下で、２７℃で２４時間インキュベートした後の電流密度は、３７℃で２４時間インキュベートした後に観察される密度よりも高かった。これらの結果は、原形質膜にて、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度に対する低温のインキュベーションの既知の効果と一致する。修正化合物のＣＦＴＲ電流密度に対する効果を測定するために、細胞を１０μＭの試験化合物と一緒に３７℃で２４時間インキュベートし、電流密度を２７℃および３７℃の対照と比較した（％活性）。記録する前に、細胞を細胞外記録媒体で３回洗浄し、残りの試験化合物を除去した。１０μＭの修正化合物とのプレインキュベーションは、３７℃の対照と比較して、ｃＡＭＰ−およびゲニステイン−依存性電流を有意に上昇させた。
８．増強剤化合物の同定
【０２０６】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ増強剤の巨視的なΔＦ５０８−ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流（ＩΔＦ５０８）を増大させる能力を、またΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にて、穴あきパッチ記録技法を用いて調べた。光学的アッセイより同定される増強剤は、光学アッセイにて観察されるのと同様の効能および有効性でＩΔＦ５０８にて用量依存性増加を惹起した。試験したすべての細胞にて、増強剤適用前の、および間の逆電位は、計算したＥＣｌ（−２８ｍＶ）である、約−３０ｍＶであった。
９．溶液 
【０２０７】
細胞内溶液（ｍＭ）：アスパラギン酸セシウム（９０）、ＣｓＣｌ（５０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）および２４０μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢ（ＣｓＯＨでｐＨを７.３５に調節）
【０２０８】
細胞外溶液（ｍＭ）：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＣａＣｌ２（２）およびＨＥＰＥＳ（１０）（ＨＣｌでｐＨを７.３５に調節）
１０．細胞培養
【０２０９】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を全細胞の記録のために使用する。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２および９０％湿度にて、１７５ｃｍ２培養フラスコ中、２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１ｘＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１ｘペン／ストレプ、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補足したダルベッコ修飾イーグル培地にて維持する。全細胞を記録するために、２,５００−５,０００細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆のガラスのカバースリップ上に播種し、使用前に２７℃で２４ないし４８時間培養し、増強剤の活性を試験し、修正剤の活性を測定するために３７℃で修正化合物と共にまたはなしでインキュベートした。
１１．シングルチャネルの記録
【０２１０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にて安定して発現される温度修正のΔＦ５０８−ＣＦＴＲのシングルチャネルの活性および増強剤化合物の活性は、切除した裏返しの膜のパッチを用いて観察された。簡単には、シングルチャネル活性の電位クランプの記録を室温でAxopatch 200Bパッチクランプ増幅器（Axon Instruments Inc.）を用いて行った。すべての記録を１０ｋＨｚのサンプリング周波数で獲得し、４００Ｈｚで低域フィルターに供した。パッチピペットをCorning Kovar Sealing ＃７０５２ガラス（World Precision Instruments、Inc.、Sarasota、ＦL）より製造し、それは細胞外溶液で満たされた場合に５ないし８ＭΩの抵抗を有した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲは、切除後に、１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰおよび７５ｎＭのｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼ、触媒性サブユニット（ＰＫＡ；Promega Corp. Madison、WI）を添加することで活性化された。チャネル活性が安定した後、重力駆動マイクロかん流システムを用いてかん流させた。流入物をパッチに隣接して置き、１ないし２秒以内に溶液を完全に交換した。迅速なかん流の間のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤Ｆ−（１０ｍＭ  ＮａＦ）を浴溶液に添加した。これらの記録条件下、チャネル活性はパッチを記録する期間（６０分間まで）を通して一定のままであった。細胞内溶液から細胞外溶液に移動する正電荷（アニオンは反対方向に移動する）により生成される電流は正電流として知られる。ピペット電位（Ｖｐ）は８０ｍＶで維持された。
【０２１１】
チャネル活性を＜２の活性チャネルを含有する膜パッチより分析した。同時に開口される最大数は実験の間の活性チャネルの数を決定した。単一チャネルの電流振幅を測定するために、１２０秒より記録したΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性のデータを１００Ｈｚで「オフライン」のフィルターにかけ、ついでBio-Patch Analysisソフトウェア（Bio-Logic Comp. France）を用いてマルチカウス関数と適合する、すべての点の振幅ヒストグラムを作成するのに用いた。総合的巨視的電流および開確率（ＰＯ）をチャネル活性の１２０秒から測定した。ＰＯをBio-Patchソフトウェアを用いて、または関係式ＰＯ＝１／ｉ（Ｎ）より決定した；ここでＩ＝平均電流、ｉ＝単一チャネル振幅、およびＮ＝パッチにおける活性チャネルの数である。
１２．溶液
【０２１２】
細胞外溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ（１５０）、アスパラギン酸（１５０）、ＣａＣｌ２（５）、ＭｇＣｌ２（２）およびＨＥＰＥＳ（１０）（トリス塩基でｐＨを７.３５に調節）
【０２１３】
細胞内溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（５）、ＴＥＳ（１０）およびトリス塩基（１４）（ＨＣｌでｐＨを７.３５に調節）
１３．細胞培養
【０２１４】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を切除される膜パッチ−クランプの記録のために使用する。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２および９０％湿度にて、１７５ｃｍ２培養フラスコ中、２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１ｘＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１ｘペン／ストレプ、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補足したダルベッコ修飾イーグル培地にて維持する。単一チャネルを記録するために、２,５００−５,０００細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆のガラスのカバースリップ上に播種し、使用前に、２７℃で２４ないし４８時間培養した。
【０２１５】
上記した操作を用いて、活性、すなわち、コンパウンド１のＥＣ５０を上記した技法により測定し、それを表６に示す。
表６
【表７】
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【０２１６】
本願明細書の開示されているすべての刊行物および特許出願は、たとえ個々の刊行物または特許出願が出典明示により具体的かつ個別的に本願明細書の一部とされるとしても、その同じ内容が出典明示により本願明細書の一部とされる。出典明示により本願明細書の一部とされた特許または刊行物に記載の用語の意味が本願明細書に使用される用語の意味と対立するならば、この開示における用語の意味は統制されるであろう。さらには、上記した記載は、本願発明の単なる例示的実施態様を開示するにすぎない。当業者は、かかる記載よりおよび添付した図面および特許請求の範囲より容易に認識し、添付の特許請求の範囲に記載されるように発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変化、修飾および変形をなすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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