(57)【要約】  本発明は、被験化合物または毒素を、細胞に対する影響に関してスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、細胞の頻度、振幅、およびキネティクスプロファイルを測定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物または環境条件を細胞、細胞集合体、または組織に対する影響に関してスクリーニングする方法であって、
（ａ）該細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）バイオセンサー表面、誘電体積層膜（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｌｍ  ｓｔａｃｋ）バイオセンサー表面、または回折格子導波路（ｇｒａｔｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）該細胞、細胞集合体、または組織を該化合物または環境条件と接触させ；
（ｃ）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｄ）該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する、
ことを含み、該化合物または環境条件を該細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して影響を与えることを示す、上記方法。
【請求項２】
２つまたはそれ以上の異なる濃度の該化合物を、該細胞、細胞集合体、または組織の１つまたはそれ以上の集団に、該バイオセンサー表面上の２つまたはそれ以上の区別された個所で添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該細胞が幹細胞、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性幹細胞、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性細胞から分化させた細胞、神経幹細胞、ニューロン、心筋幹細胞、心筋細胞、肝幹細胞、肝細胞、またはそれらを組み合わせたものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ヒトもしくは哺乳動物人工多能性幹細胞系、または、該ヒトもしくは哺乳動物人工多能性細胞から分化させた細胞が心筋細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度または振幅について解析し、頻度がアッセイの時間経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示し、振幅がアッセイの時間経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示す、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度または振幅に関して解析し、頻度が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示し、振幅が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示す、請求項２記載の方法。
【請求項７】
該ピーク波長値または実効屈折率値をキネティクスプロファイルに関して解析し、キネティクスプロファイルが時間の経過と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示す、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該ピーク波長値をキネティクスプロファイルに関して解析し、キネティクスプロファイルが化合物濃度の増加と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示す、請求項２記載の方法。
【請求項９】
該化合物が薬剤、カルシウムチャンネル遮断薬、β-アドレナリン受容体アゴニスト、α-アドレナリン受容体アゴニスト、被験試薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ｈＥＲＧチャンルのモディファイヤー、または毒素である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該細胞集合体が胚葉体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
被験体における薬物毒性のリスクを低減する方法であって、
（ａ）該被験体から作製した人工多能性幹細胞から分化させた１つまたはそれ以上の細胞を、ある用量の薬物と接触と接触させ；
（ｂ）該接触させた１つまたはそれ以上の細胞を毒性に関してアッセイし、ここで該アッセイは、
（i）該細胞を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ii）該細胞を該薬物と接触させ；
（iii）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（iv）該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析し、該薬物を該細胞に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物が該細胞に対して負の毒性効果を有することを示す、
ことを含む；
（ｃ）該薬物が該接触させた細胞に負の毒性効果を有さず、被験体において薬物の該毒性リスクが低減される場合にのみ、該薬物を該被験体に処方または投与する、
ことを含む、上記方法。
【請求項１２】
被験体における薬物毒性のリスクを低減する方法であって、
（ａ）該被験体から作製した人工多能性幹細胞から分化させた１つまたはそれ以上の細胞集団を、２つまたはそれ以上の異なる用量の薬物と接触させ；
（ｂ）該接触させた１つまたはそれ以上の細胞集団を毒性に関してアッセイし、ここで該アッセイは、
（i）該１つまたはそれ以上の細胞集団を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ii）該１つまたはそれ以上の細胞集団を２つまたはそれ以上の異なる濃度の該薬物と接触させ；
（iii）それぞれの該薬物濃度について、１つまたはそれ以上のピーク波長値または実効屈折率値を測定し；
（iv）該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して、それぞれの該薬物濃度について解析し、該薬物を該細胞に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物濃度が該細胞に対して負の毒性効果を有することを示す、
ことを含む；
（ｃ）該薬物濃度が該接触させた細胞に負の毒性効果を有さず、被験体において薬物の該リスクが低減される場合にのみ、該薬物を該被験体に処方または投与する、
ことを含む、上記方法。
【請求項１３】
化合物の毒素または負の環境条件に対する中和活性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）該細胞、細胞集合体、または組織を、該毒素または負の環境条件、および、該化合物と接触させ；
（ｃ）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｄ）ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する、
ことを含み、該化合物を該細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物が該毒素または負の環境条件に対して中和効果を有することを示す、上記方法。
【請求項１４】
化合物の毒素または負の環境条件に対する中和活性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）該１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団を、該毒素または負の環境条件、および、２つまたはそれ以上の異なる濃度の該化合物と接触させ；
（ｃ）それぞれの化合物濃度について、定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｄ）ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して、それぞれの化合物濃度について経時的に解析する、
ことを含み、該化合物を該細胞に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物が該毒素または負の環境条件に対して中和効果を有することを示す、上記方法。
【請求項１５】
該接触段階が、該細胞、細胞集合体、または組織を、少なくとも１つの第２の化合物または少なくとも１つの第２の環境条件と、該第１の化合物または該第１の環境条件の存在下で接触させることを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
被験毒素をキネティクスプロファイル特性に関してスクリーニングし、該被験毒素のクラスまたはサブクラスを特定する方法であり、
（ａ）細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）該細胞、細胞集合体、または組織を該被験毒素と接触させ；
（ｃ）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｄ）該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析して、該細胞、細胞集合体、または組織に対する該被験毒素の影響に関するキネティクスプロファイル特性を得；そして、
（ｅ）該被験毒素の該キネティクスプロファイル特性を既知の毒素のキネティクスプロファイル特性と比較し、該被験毒素を、該被験毒素と同様のキネティクスプロファイル特性を有する毒素のクラスまたはサブクラスに分類する、
ことを含む、上記方法。
【請求項１７】
被験化合物または環境条件の心筋細胞の洞調律に対する影響を測定する方法であり、
（ａ）該心筋細胞を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）該心筋細胞を該化合物または環境条件と接触させ；
（ｃ）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｄ）該ピーク波長値または実効屈折率値を洞調律に関して経時的に解析する、
ことを含み、該化合物または環境条件を該心筋細胞と接触させた後に洞調律が変化すれば、該化合物または環境条件が、該心筋細胞の洞調律に影響を与えることを示す、上記方法。
【請求項１８】
該被験化合物または環境条件の該洞調律に対する該影響がQT間隔の延長または短縮である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
心臓細胞もしくは神経細胞、心臓細胞集合体もしくは神経細胞集合体、または、心臓組織もしくは神経組織の拍動パターンまたはバーストパターンを測定する方法であり、
（ａ）該細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し；
（ｂ）定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定し；
（ｃ）該ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する、
ことを含み、該心臓細胞もしくは神経細胞、心臓細胞集合体もしくは神経細胞集合体、または、心臓組織もしくは神経組織の拍動パターンまたはバーストパターンを測定する、上記方法。
【請求項２０】
該細胞、細胞集合体、または組織を該バイオセンサー表面に適用する前、または適用した後に、１つまたはそれ以上の化合物を添加する、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は米国特許仮出願第61/317,995号（2010年3月26日出願）、米国特許仮出願第61/323,076号（2010年4月12日出願）、および米国特許仮出願第61/363,824号（2010年7月13日出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００２】
本発明のある態様は、化合物または環境条件の、細胞、細胞集合体、または組織に対する影響をスクリーニングするための方法を提供する。該方法は、細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用することを含む。該細胞、細胞集合体、または組織を該化合物または環境条件と接触させ、定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。化合物または環境条件を細胞、細胞集合体、または組織と接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して影響を与えることを示す。
【０００３】
必要により、２つまたはそれ以上の異なる濃度の該化合物を、該細胞、細胞集合体、または組織の１つまたはそれ以上の集団に、該バイオセンサー表面上の２つまたはそれ以上の区別された個所で添加してもよい。
【０００４】
該細胞は、幹細胞、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性幹細胞、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性細胞から分化させた細胞、神経幹細胞、ニューロン、心筋幹細胞、心筋細胞、肝幹細胞、肝細胞、またはそれらを組み合わせたものであってもよい。ヒトもしくは哺乳動物人工多能性幹細胞系統、または、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性細胞から分化させた細胞は、心筋細胞であってもよい。
【０００５】
ピーク波長値または実効屈折率値を頻度または振幅に関して解析し、頻度がアッセイ時間の経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示し、また、振幅がアッセイ時間の経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示してもよい。ピーク波長値または実効屈折率値を頻度または振幅に関して解析し、頻度が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示し、また、振幅が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示してもよい。
【０００６】
ピーク波長値をキネティクスプロファイルに関して解析し、キネティクスプロファイルが時間の経過と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示してもよい。ピーク波長値をキネティクスプロファイルに関して解析し、キネティクスプロファイルが化合物濃度の増加と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して負の効果を有することを示してもよい。
【０００７】
該化合物は薬剤、カルシウムチャンネル遮断薬、β-アドレナリン受容体アゴニスト、α-アドレナリン受容体アゴニスト、被験試薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、hERGチャンルのモディファイヤー、または毒素であってもよい。
【０００８】
細胞集合体は胚葉体であってもよい。該細胞、細胞集合体、または組織を、第１の化合物または第１の環境条件の存在下で、少なくとも１つの第２の化合物または第２の環境条件と更に接触させてもよい。
【０００９】
本発明の別の態様では、被験体における薬物毒性のリスクを低減する方法を提供する。該方法は、該被験体から作製した人工多能性幹細胞から分化させた１つまたはそれ以上の細胞を、ある用量の薬物と接触させることを含む。該接触させた１つまたはそれ以上の細胞の毒性をアッセイするために、該細胞を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、該細胞を薬物と接触させる。定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。薬物を細胞と接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物は該細胞に対して負の毒性効果を有することを示している。該薬物が、接触させた細胞に負の毒性効果を有さず、被験体において薬物毒性のリスクが低減される場合にのみ、該薬物を被験体に処方または投与する。
【００１０】
本発明の更に別の態様では、被験体における薬物毒性のリスクを低減する方法を提供する。該方法は、該被験体から作製した人工多能性幹細胞から分化させた１つまたはそれ以上の細胞集団を、２つまたはそれ以上の異なる濃度の薬物と接触させることを含む。該接触させた１つまたはそれ以上の細胞集団を毒性関してアッセイするために、該１つまたはそれ以上の細胞集団を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、該１つまたはそれ以上の細胞集団を２つまたはそれ以上の異なる濃度の薬物と接触させる。それぞれの薬物濃度について、１つまたはそれ以上のピーク波長値または実効屈折率値を測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して、それぞれの薬物濃度について解析する。薬物を該細胞と接触させた後に、頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物濃度が該細胞に対して負の毒性効果を有することを示している。該薬物濃度が、接触させた細胞に負の毒性効果を有さず、薬物毒性の該リスクが低減される場合にのみ、該薬物を該被験体に処方または投与する。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、化合物を、毒素または負の環境条件に対する中和活性に関してスクリーニングする方法を提供する。該方法は、細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、毒素または負の環境条件および化合物と接触させることを含む。定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。化合物を細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物は該毒素または負の環境条件に対して中和効果を有することを示している。
【００１２】
本発明の更に別の態様は、化合物を、毒素または負の環境条件に対する中和活性に関してスクリーニングする方法を提供する。１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、毒素または負の環境条件、および、２つまたはそれ以上の異なる濃度の化合物と接触させる。定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を、それぞれの化合物濃度について、一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して、それぞれの化合物濃度について、経時的に解析する。化合物を細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物は該毒素に対して中和効果を有することを示している。
【００１３】
本発明の別の態様は、被験毒素をキネティクスプロファイル特性に関してスクリーニングし、該被験毒素のクラスまたはサブクラスを特定する方法を提供する。該方法は、細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、該細胞、細胞集合体、または組織を該被験毒素と接触させることを含む。定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を、一定のアッセイ時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析し、該細胞、細胞集合体、または組織に対する該被験毒素の影響に関するキネティクスプロファイル特性を得る。該被験毒素のキネティクスプロファイル特性を、既知の毒素のキネティクスプロファイル特性と比較し、被験毒素を、該被験毒素と同様のキネティクスプロファイル特性を有する毒素のクラスまたはサブクラスに分類する。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、被験化合物または環境条件が心筋細胞の洞調律に与える影響を試験する方法を提供する。該方法は、心筋細胞を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、該心筋細胞を該化合物または環境条件と接触させることを含む。定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を洞調律に関して経時的に解析する。化合物または環境条件を心筋細胞と接触させた後に洞調律が変化すれば、該化合物または環境条件が、該心筋細胞の洞調律に影響を与えることを示している。該被験化合物または環境条件が洞調律に与える影響は、QT間隔の延長または短縮であってもよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、心臓細胞もしくは神経細胞、心臓細胞集合体もしくは神経細胞集合体、または、心臓組織もしくは神経組織の拍動パターンまたはバーストパターンを測定する方法を提供する。該方法は、細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用し、定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定することを含む。ピーク波長値または実効屈折率値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。心臓細胞もしくは神経細胞、心臓細胞集合体もしくは神経細胞集合体、または、心臓組織もしくは神経組織の拍動パターンまたはバーストパターンを測定する。必要により、該細胞、細胞集合体、または組織をバイオセンサー表面に適用する前、または適用した後に、１つまたはそれ以上の化合物を添加する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Vero細胞に対する、２つの毒素のキネティクスプロファイルを示す。
【図２】ある種の化合物によるVero細胞における細胞毒性の中和の相違を示す。
【図３】毒素によって誘導される細胞死および解毒剤保護の検出を示す。図３Ａは時間的応答プロファイルを示し、図３Ｂは11時間の時点での結果を示す。
【図４】それぞれ作用機序が異なる細胞毒性化合物が、異なるキネティクスプロファイルを有することを示す。
【図５】HeLa細胞における、４つの毒素の濃度依存的細胞毒性を示す。図５Ａはシクロヘキシミドを示す；図５Ｂはジギトニンを示す；図５Ｃはドキソルビシンを示す；図５Ｄはタモキシフェンを示す。
【図６】タモキシフェン、4-ヒドロキシ-タモキシフェン、およびラロキシフェン（ラベルを付していない線）のキネティクスプロファイルを示す。
【図７】一定時間にわたるDNA損傷剤のキネティクスプロファイルを示す。
【図８】種々の濃度の重クロム酸カリウム（図８Ａ）およびシスプラチン（図８Ｂ）のキネティクスプロファイルを示す。
【図９】早期の時点（図９Ｂ）および長期の時点（図９Ａ）でのビンブラスチンのキネティクスプロファイルを示す。
【図１０】マウス胚幹細胞由来心筋細胞に対するドキソルビシンの用量依存的毒性を示す。図１０Ａは、一定時間にわたるドキソルビシンの影響を示す。図１０Ｂは、ドキソルビシン濃度の影響を示す。
【図１１】マウス胚幹細胞由来拍動心筋細胞およびKCl処理したマウス胚幹細胞由来心筋細胞の検出を示す。
【図１２】マウス胚幹細胞由来拍動心筋細胞の検出を示す。
【図１３】マウス胚幹細胞由来拍動心筋細胞の検出およびKClによる拍動の阻害を示す。
【図１４】10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、および0μMのドキソルビシン濃度での、拍動心筋細胞に対するドキソルビシン処理または未処理の影響を示す。
【図１５】心筋細胞の拍動表現型を示す。図１５Ａは高頻度の拍動を、図１５Ｂは中頻度の拍動を、図１５Ｃは低頻度の拍動を、図１５Ｄは不定期の拍動を示す。
【図１６】心筋細胞の高密度同期拍動（図１６Ａ-Ｂ）、および、心筋細胞の低密度非同期拍動（図１６Ｃ-Ｄ）を示す。
【図１７】心筋細胞に対するアミトリプチリンの影響を示す。図１７Ａは、アミトリプチリン添加前の心筋細胞を示す。図１７Ｂ、１７Ｃ、および１７Ｄは、それぞれアミトリプチリン添加の6分後、10分後、および15分後の心筋細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書での使用においては、単数形は、特に明記しない限り、その複数形も包含する。
【００１８】
バイオセンサー
本発明のバイオセンサーは、比色共鳴反射光バイオセンサーまたは回折格子導波路バイオセンサーであってもよい。例えばCunninghamら, "Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique," Sensors and Actuators B, Volume 81, p. 316-328, Jan 5 2002；米国特許公開第2004/0091397号；米国特許第7,094,595号；米国特許第7,264,973号参照。比色共鳴バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（SPR）バイオセンサーではない。SPRバイオセンサーは、金属薄層（例えば銀、金、銅、アルミニウム、ナトリウム、およびインジウム）を有する。該金属は、好適な波長で光と共鳴することができる伝導帯電子を有さなければならない。光に暴露されるSPRバイオセンサー表面は、純粋な金属でなければならない。酸化物、硫化物、および他の薄膜は、SPRに干渉する。比色共鳴バイオセンサーは金属層を有さず、高屈折率物質（例えば硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、および窒化ケイ素）の誘電性コーティングを有する。
【００１９】
本発明のバイオセンサーは、誘電体積層膜バイオセンサー（例えば米国特許第6,320,991号参照）、回折格子バイオセンサー（例えば米国特許第5,955,378号；第6,100,991号参照）、および回折異常バイオセンサー（例えば米国特許第5,925,878号；第RE37,473号参照）であってもよい。誘電体積層膜バイオセンサーは、基板上に形成された多層の誘電体膜を有し、溝または格子が刻まれた表面を有する（米国特許第6,320,991号）。バイオセンサーは光を受け、少なくとも１つの入射角では、光の一部が誘電層内を伝搬する。サンプル媒体のパラメータは、光学異常のシフト、すなわち共振ピークまたはノッチのシフトの検出によって測定される。光学異常のシフトは、共鳴角のシフトまたは共鳴波長のシフトのいずれかとして検出される。
【００２０】
本発明の方法に使用できる他のバイオセンサーには、回折格子導波路バイオセンサーがあり、これは、例えば米国特許第5,738,825号に記載されている。回折格子導波路バイオセンサーは、導波路膜と、入射光照射野を導波路膜にインカップルして回折光照射野を生成する回折格子とを含む。導波路膜の実効屈折率の変化を検出する。波動が装置内の有意な距離を輸送されなければならないような装置（例えば回折格子バイオセンサー）は、比色共鳴反射光バイオセンサーの空間分解能は有さない。
【００２１】
比色共鳴反射光バイオセンサーにより、蛍光タグ、比色標識、または他のタイプの検出タグもしくは検出標識を使用せずに、バイオセンサー表面上で生化学的相互作用を測定することが可能となる。バイオセンサー表面は、コリメート光および／または白色光を照射した際に狭帯域の波長だけを反射または伝送する（「共鳴格子効果」）ように設計された光学構造を有する。反射の場合、この狭帯域波長は波長「ピーク」と呼ばれる。伝送の場合、この狭帯域波長は波長「ディップ」と呼ばれる。「ピーク波長値（peak wavelength value；PWV）」は、物質（例えば生体物質）がバイオセンサー表面に沈着するか、またはバイオセンサー表面から除去される際に変化する。波長ディップを検出することもできる。読み出し機器を用いて、バイオセンサー表面上の区別された個所をコリメート光および／もしくは白色光で照射し、反射光を集光する。集光された光を波長分光計に導入してPWVを測定する。
【００２２】
本明細書においてPWVの変化について記載する場合、これは、理解されるように、使用するバイオセンサーのタイプによって、共鳴角のシフト、共鳴波長のシフト、および実効屈折率の変化と同義である。更に、本明細書において比色共鳴バイオセンサーについて記載する場合、理解されるように、これは誘電体積層膜バイオセンサー、回折格子型バイオセンサー、回折異常バイオセンサー、および回折格子導波路バイオセンサーと同義である。
【００２３】
検出システムは、バイオセンサー、バイオセンサーに光を照射する光源、およびバイオセンサーから反射する光を検出する検出器を含んでもよい。ある態様では、フィルターの適用によって読み出し装置を簡素化し、既定の閾値を超えるポジティブな結果だけが検出されるようにすることができる。
【００２４】
光源は、比色共鳴反射光バイオセンサーをその上表面（すなわち、細胞を適用する面）から照射するか、またはその底表面から照射してもよい。バイオセンサーのそれぞれの個別位置で共鳴波長のシフトを測定することにより、いずれの個別位置にそれらと結合または会合するマス（mass）が存在するかを決定できる。シフトの度合いを用いて、例えば被験サンプル中のリガンドの量、または、１つもしくはそれ以上の特異的に結合する基質と被験サンプル中のリガンドとの化学的親和性を測定することができる。また、シフトの度合いを用いて、センサー表面上でのわずかな質量変化を検出することもできる。
【００２５】
バイオセンサーの照射を２回行ってもよい。第１の測定では、バイオセンサー上に固定した細胞を有するバイオセンサーアレイの、１つまたはそれ以上の個別位置の反射スペクトルを測定する。第２の測定では、１つもしくはそれ以上の化合物をバイオセンサーに適用した後、または環境条件を変化させた後に、反射スペクトルを測定する。これら２つの測定におけるピーク波長の相違が、該化合物または環境条件の該細胞に対する影響の測定値となる。この照射法では、ピーク共鳴波長がわずかに変化した領域で起こりうる、バイオセンサー表面におけるわずかな不均一性を制御することができる。また、この方法では、バイオセンサー上の細胞の濃度または分子量を種々に制御できる。
【００２６】
バイオセンサーに、２つまたはそれ以上の時点で２回またはそれ以上の照射を行い、定期的なピーク波長の測定値（または他の測定値、例えば共鳴角測定値のシフト、波長測定値のシフト、または屈折率測定値）を得てもよい。あるいはまた、バイオセンサーを連続的に照射し、連続的に測定値を得てもよい。経時的アッセイは、約1/100秒、1/10秒、1/2秒、1秒、2秒、5秒、秒、10秒、20秒、30秒、45秒、60秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、20分、60分、2時間、3時間、4時間、5時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、またはそれ以上であってもよい。
【００２７】
初代細胞または幹細胞のような細胞を、１つまたはそれ以上のリガンドによってバイオセンサーに固定してもよい。本発明のある態様では、細胞外マトリクスリガンドとの反応によって、細胞をバイオセンサーに固定する。インテグリンは、細胞外マトリクス（ECM）と相互作用し、細胞内シグナルを仲介する、細胞表面受容体である。インテグリンは、細胞骨格形成、細胞運動性、細胞周期の調節、細胞のインテグリン親和性の調節、細胞のウイルスへの付着、細胞の、他の細胞またはECMへの付着に関与する。また、インテグリンは、シグナル伝達、すなわち、細胞が、細胞内および細胞間で、ある種のシグナルまたは刺激を別のものに変換する過程にも関与する。インテグリンは、ECMから細胞への情報、および、細胞から他の細胞（例えば他の細胞上のインテグリンを介して）またはECMへの情報を伝達する。インテグリンおよびそのECMリガンドのリストは、Takadaら,Genome Biology 8:215（2007）によって報告されている（表１参照）。
【００２８】
【表１】
2013523095.tif 000002
【００２９】
ECMと相互作用する他の細胞表面受容体に、焦点接着タンパク質がある。焦点接着タンパク質は大型の複合体を形成し、これによって細胞の骨格がECMに結合される。焦点接着タンパク質には、例えばタリン、α-アクチニン、フィラミン、ビンキュリン、焦点接着キナーゼ、パキシリン、パルビン（parvin）、アクトパキシン（actopaxin）、ネキシリン（nexilin）、フィンブリン、G-アクチン、ビメンチン、シンテニン、その他多くのものがある。
【００３０】
ECMと相互作用する、更に別の細胞表面受容体には、それらに限定される訳ではないが、分化抗原群（cluster of differentiation；CD）分子がある。CD分子は種々の方法で作用し、多くの場合、細胞の受容体またはリガンドとして作用する。ECMと相互作用する、他の細胞表面受容体には、カドヘリン、アドへリン、およびセレクチンがある。
【００３１】
ECMは多くの機能（例えば、細胞にサポートおよび足場を提供すること、組織を互いに分離すること、および細胞内コミュニケーションの調節）を有する。ECMは線維性タンパク質およびグリコサミノグリカンから成る。グリコサミノグリカンは、炭水化物ポリマーであって、通常、ECMタンパク質に結合してプロテオグリカン（例えばヘパリン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラチン硫酸プロテオグリカン）を形成する。プロテオグリカンとして存在しないグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸である。ECMタンパク質には、例えばコラーゲン（線維性コラーゲン、FACITコラーゲン、短鎖コラーゲン、基底膜コラーゲン、およびその他のタイプのコラーゲンなど）、フィブロネクチン、エラスチン、およびラミニンがある（更なるECMタンパク質の例は、表１を参照されたい）。本明細書において有用なECMリガンドには、ECMタンパク質および／またはそのペプチドフラグメント（例えば、フィブロネクチンのRGD含有ペプチドフラグメントまたはコラーゲンのペプチドフラグメント）、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、およびヒアルロン酸がある。
【００３２】
「特異的に結合する」または「〜に特異的である」とは、細胞表面受容体（例えばインテグリンまたは焦点接着タンパク質など）が関連する細胞外マトリクスリガンドに、他の非特異的に分子に対するより高い親和性で結合することを意味する。非特異的分子は、該細胞受容体に実質的に結合しない。例えば、インテグリンα4／β1はECMリガンド、フィブロネクチンに特異的に結合するが、非特異的ECMリガンドであるコラーゲンまたはラミニンには特異的に結合しない。本発明のある態様では、細胞外マトリクスリガンドが表面（例えばバイオセンサー表面）に固定化されており、該細胞外マトリクスリガンドへの細胞表面受容体の特異的結合によって、細胞が該細胞外マトリクスリガンドに、つまりは該表面に固定され、これによって、該細胞は、一般的な細胞アッセイの洗浄過程で該表面から除去されることがない。
【００３３】
細胞を、バイオセンサーに固定されたECMリガンドへの細胞表面受容体（例えばインテグリン）の結合によって該バイオセンサー表面に特異的に固定することにより、該細胞のバイオセンサーへの結合および該細胞の刺激に対する応答を、バイオセンサー表面に特異的に固定されていない細胞に比較して、劇的に改変することができる。必須ではないが、ECMリガンド結合を介して細胞をバイオセンサーに固定することにより、刺激に対する細胞の応答の検出を大幅に向上または増加できる。本発明のある態様では、該細胞は血清未含有培地中に存在する。血清未含有培地は、約10、5、4、3、2、1、0.5%、またそれ未満の血清を含有する。血清未含有培地は、約0％の血清、または約0％から約1％の血清を含有してもよい。本発明のある態様では、１つまたはそれ以上のタイプのECMリガンドを固定してあるバイオセンサー表面に、細胞を添加する。本発明の別の態様では、細胞を１つまたはそれ以上のタイプのECMリガンドと合一した後、該バイオセンサー表面に添加する。
【００３４】
本発明のある態様では、ECMリガンドを精製する。精製ECMリガンドは、細胞物質、他のタイプのECMリガンド、化学物質前駆体、ECMリガンドの調製に使用される化学物質、またはそれらを組み合わせたものを実質的に含有しないECMリガンド標品である。他のタイプのECMリガンド、細胞物質、培地、化学物質前駆体、ECMリガンドの調製に使用される化学物質などを実質的に含有しないECMリガンド標品は、約30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、1%未満、またはそれ以上の他のECMリガンドを含有する。従って、精製ECMリガンドは約70%、80%、90%、95%、99%、またはそれ以上の純度である。精製ECMリガンドには、未精製もしくは半精製標品、またはECMリガンドの混合物で純度が70%未満のもの（例えばウシ胎仔血清）は含まれない。本発明のある態様では、ECMリガンドは精製せず、ECMタンパク質および非ECMタンパク質の混合物を含有する。非精製ECMリガンド標品の例として、ウシ胎仔血清、牛血清アルブミン、およびオボアルブミンがある。
【００３５】
本発明のバイオセンサーは、内部表面（例えば液体を含有する容器の底表面）を有してもよい。液体を含有する容器は、例えばマイクロプレートウェル、ペトリ皿、またはマイクロ流体チャネルであってもよい。本発明のある態様は、任意のタイプのマイクロタイタープレートに組み込まれたバイオセンサーである。例えば、バイオセンサー表面の上方に反応容器の壁を配することによって、バイオセンサーをマイクロプレートの底表面に組み込み、各反応「個所」が個別の被験サンプルに暴露されるようにしてもよい。従って、個々のマイクロタイタープレートウェルが個別の反応容器の役割を果たす。これによって、反応に使用する溶液が混合されることなく、個別の化学反応が隣接するウェル内で行われ、化学的に異なる試験溶液を個別のウェルに適用することができる。
【００３６】
細胞アッセイ
本発明のアッセイでは、死亡細胞対生存細胞のリードアウト以上の情報が得られる。本発明のアッセイでは、培地中の細胞の頻度、速度、およびキネティクスプロファイルに関する情報が得られる。特に、本発明のアッセイを使用して、培地中の拍動心筋細胞またはバースト神経細胞の頻度、速度、およびキネティクスプロファイルを測定することができる。拍動心筋細胞またはバースト神経細胞の頻度および速度を測定できる本発明のアッセイは、細胞毒性または他の影響を測定するための新規の方法である。心筋細胞における「拍動」という現象は、一般に、hERGチャンネル（拍動現象を介在するカリウムイオンチャンネル）の開閉を測定するパッチクランプ法を用い、ある細胞のある時点について測定される。hERGチャンネルが（例えばチャンネルの阻害剤によって）損なわれると、QT延長症候群が発症し、多くの場合死に至る。本発明のアッセイによれば、パッチクランプ・システムにおける１つまたは２〜３のチャンネルにわたる電位差の変化ではなく、拍動を測定することができる。従って、本発明のアッセイにより、hERGチャンネルを介する拍動頻度および拍動速度の変化を検出することが可能となる。また、同時に、パッチクランプの直交法として、別のイオンチャンネルも測定できる。本発明のアッセイによれば、拍動またはバースト表現型に加えて、細胞接着および細胞形態の変化をモニタリングできるため、より特異性の低い細胞毒性を拍動細胞またはバースト細胞で測定することが可能となる。
【００３７】
神経細胞のバーストまたはスパイク間隔を本発明の方法で検出することができる。ニューロンの入力誘導型（input-driven）バースティングまたは内因性バースティングを測定できる。検出できるパターンの具体例として、例えば、常に活性なニューロン(例えば介在ニューロン)による興奮性スパイク（tonic spiking）または通常のスパイク、バースト発火するニューロンによる位相性バースト（phasic bursting）、および、発火率の高いニューロン（例えば皮質阻害介在ニューロン、淡蒼球細胞、網膜神経節細胞）による高速スパイク（fast spiking）がある。このように、本発明のアッセイによれば、培地中で神経細胞のバーストまたはスパイクの速度、頻度、およびキネティクスプロファイルを測定することができる。更に、本発明によって、これらのバーストまたはスパイクパターンに対する化合物の影響を検出することができる。
【００３８】
速度、頻度、およびキネティクスプロファイルは、高速高分解能装置、例えばBIND（登録商標）リーダー（すなわち、比色共鳴反射光バイオセンサーシステム）、およびデータを定量するための相当するアルゴリズムを用いて、リアルタイムで検出できる。例えば、米国特許第7,422,891号、第7,327,454号、第7,301,628号、第7,292,336号、第7,170,599号、第7,158,230号、第7,142,296号、第7,118,710号を参照されたい。更に、これらの方法によって、細胞、および刺激に対するそれら細胞の特徴的な形態学的応答および接着応答をリアルタイムで検出できる。
【００３９】
本発明は、細胞、細胞集合体、または組織に対する影響に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。例えば、速度、頻度、キネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものを、任意のタイプの化合物（単数または複数）、環境条件（単数または複数）、またはそれらを組み合わせたものに暴露した任意の種類の細胞について測定してもよい。細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射光バイオセンサー表面に適用し、１つまたはそれ以上の被験化合物または環境条件を細胞、細胞集合体、または組織に添加する。該細胞、細胞集合体、または組織をバイオセンサー表面に適用する前に、該化合物または環境条件を該細胞、細胞集合体、または組織に添加してもよい。該細胞、細胞集合体、または組織のPWV（または実効屈折率）を一定時間にわたってモニタリングする。PWVのモニタリングは、化合物または環境条件を添加する前、化合物または環境条件を添加している間、化合物または環境条件を添加した後に行ってもよく、また、それらを組み合わせてもよい。PWVの測定（または他の測定）は、毎秒約1、2、3、4、5、10、20回またはそれ以上（または、毎秒約1から20回の間の任意の回数）行ってもよい。PWVの測定は、約2、5、10、20、30、45、または60秒毎に（または約2から60秒の間の任意の秒毎に）行ってもよい。PWVの測定は、約1、2、3、4、5、10、20、または60分毎に（または約1から60分の間の任意の分毎に）行ってもよい。
【００４０】
頻度
細胞が心筋細胞である場合、該細胞は培地中で拍動し、拍動細胞は、該細胞の拍動速度または頻度を示すPWVパターン（正-負PWVシフト）または実効屈折率パターンを生ずる。図１２参照。各拍動間の時間の長さを測定してもよい。化合物、細胞外マトリクス、または環境条件（例えば塩濃度、バッファーのタイプ、培地のタイプ、血清のタイプ、温度、酸素濃度）の、細胞の拍動頻度に対する影響を測定してもよい。
【００４１】
細胞がニューロンの場合、該細胞は培地中でバースト／スパイクし、該バースト／スパイク細胞は、バースト／スパイク速度またはバースト／スパイク頻度を示すPWVパターンまたは実効屈折率パターンを生ずる。各バーストまたはスパイク間の時間の長さを測定してもよい。化合物、細胞外マトリクス、または環境条件の、細胞のバーストまたはスパイク頻度に与える影響を測定してもよい。
【００４２】
振幅
細胞が心筋細胞の場合、該細胞は心筋細胞の拍動強度を示すPWVパターンまたは実効屈折率パターンを生ずる。これが振幅の測定値である。図１０Ａ-Ｂでは、心筋細胞をバッファーまたはドキソルビシンで処理した。心筋細胞をバッファーで処理すると、拍動の振幅は一定時間にわたって強くなる。すなわち、該細胞が培地中でより強く拍動するため、Y軸のPWV測定値の幅が一定時間にわたって大きくなる。場合により、例えば毒素では、一定時間にわたってPWV測定値の幅が減少し、バッファーまたは有益な化合物では一定時間にわたってPWV測定値の幅が保持されるか、もしくは増加する。
【００４３】
細胞がニューロンの場合、該細胞はバーストまたはスパイクの強度を示すPWVパターンまたは実効屈折率パターンを生ずる。これが振幅の測定値である。
【００４４】
キネティクスプロファイル
キネティクスプロファイルは、ある細胞集団の、一定時間（約1、5、10、30、60秒、約1、2、3、4、5、10、20、40、60分、またはそれ以上）にわたる、約2、5、10、20、50、100、250、500、1,000、またはそれ以上のPWV（または実効屈折率値）の集積である。キネティクスプロファイルは、一定時間にわたるPWVの変化を示し、また、被験化合物または環境条件のユニークな特徴を表す。例えば、被験化合物が毒素である場合、該細胞は衰弱し、やがては死に至るため、PWVは一定時間にわたって低下する。該化合物が該細胞に対して中立的効果または正の効果を有する場合、PWVは一定時間にわたって増加し、該細胞の強化または増殖を示す。キネティクスプロファイルは、２つまたはそれ以上の異なる濃度の被験化合物を施与した細胞集団のPWVであってもよい。キネティクスプロファイルは、濃度を変化させた場合のPWVの変化を示し、また、被験化合物または環境条件のユニークな特徴を表す。
【００４５】
細胞
本発明のアッセイを任意の細胞、例えば、ヒトもしくは哺乳動物胚細胞、ヒトもしくは哺乳動物成体幹細胞、および人工多能性幹細胞と共に使用してもよい。人工多能性幹細胞は、ある種の遺伝子の強制発現を誘導することによって、非多能性細胞（例えば成体体細胞）から人工的に作製した多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、例えばニューロン、神経幹細胞、心筋細胞、テラトーマ、または胚様体であってもよい。他の使用できる細胞には、例えば心筋細胞、肝細胞、ニューロン、またはそれらを組み合わせたもの（例えば肝細胞と心筋細胞を組み合わせたもの、または肝細胞と心筋細胞を混合したもの）がある。ニューロンは任意のタイプのニューロン、例えばI型ニューロン、II型ニューロン、介在ニューロン、籠細胞、ベッツ細胞、中型有棘ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、レンショー細胞、顆粒細胞、前角細胞、または運動ニューロンであってもよい。
【００４６】
細胞のスクリーニング法
本発明のある態様は、化合物または環境条件を、細胞、細胞集合体、または組織に対する影響に関してスクリーニングする方法を提供する。細胞、細胞集合体、または組織を、比色共鳴反射バイオセンサー（または他のバイオセンサー）表面に適用する。細胞、細胞集合体、または組織を、被験化合物または環境条件と接触させる。定期的または連続的なピーク波長値を一定時間にわたって測定および記録する。ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。化合物または環境条件を細胞、細胞集合体、または組織と接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞、細胞集合体、または組織に対して影響を与えることを示す。２つまたはそれ以上の異なる濃度の該化合物を、該細胞、細胞集合体、または組織の１つまたはそれ以上の集団に、該バイオセンサー表面上の１つまたはそれ以上の区別された個所で添加してもよい。１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団が２つまたはそれ以上（例えば2、3、4、5、10、15、20、100、250、またはそれ以上）の集団を含む場合、該集団は同じであるか、または異なっていてもよい。
【００４７】
頻度がアッセイ時間の経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して負の効果を有することを示し、また、振幅がアッセイ時間の経過と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して負の効果を有することを示してもよい。負の効果は、該細胞の衰弱または細胞死であってもよい。頻度が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物が該細胞に対して負の効果を有することを示し、振幅が化合物濃度の増加と共に低下すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して負の効果を有することを示してもよい。
【００４８】
頻度がアッセイ時間の経過と共に増加すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して中立的効果または正の効果を有することを示し、また、振幅がアッセイ時間の経過と共に増加すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して中立的効果または正の効果を有することを示してもよい。正の効果または中立的効果は、細胞の強化、成長、または分裂であってもよい。頻度が化合物濃度の増加と共に増加すれば、該化合物が該細胞に対して中立的効果または正の効果を有することを示し、また、振幅が化合物濃度の増加と共に増加すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して中立的効果または正の効果を有することを示してもよい。
【００４９】
ピーク波長値のキネティクスプロファイルを解析し、キネティクスプロファイルがアッセイ時間の経過と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して負の効果を有することを示してもよい。キネティクスプロファイルが化合物濃度の増加と共に正のピーク波長値から負のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して負の効果を有することを示してもよい。
【００５０】
ピーク波長値のキネティクスプロファイルを解析し、キネティクスプロファイルがアッセイ時間の経過と共に負のピーク波長値または中立的なピーク波長値から中立的なピーク波長値または正のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して正の効果または中立的効果を有することを示してもよい。キネティクスプロファイルが化合物濃度の増加と共に負のピーク波長値または中立的なピーク波長値から中立的なピーク波長値または正のピーク波長値に変化すれば、該化合物または環境条件が該細胞に対して正の効果または中立的効果を有することを示してもよい。
【００５１】
該細胞は、ヒトもしくは哺乳動物幹細胞、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性幹細胞（例えば心筋細胞）、ヒトもしくは哺乳動物人工多能性細胞（例えば心筋細胞）から分化させた細胞、神経幹細胞、ニューロン、心筋幹細胞、心筋細胞（cardiomyocytes）、心筋細胞（myocardiocyteal muscle cells）、肝幹細胞、肝細胞、またはそれらを組み合わせたもの（例えば心筋細胞と肝細胞を組み合わせたもの、または心筋細胞と肝細胞を混合したもの）であってもよい。細胞集合体は、任意のタイプの細胞集合体、例えば胚様体であってもよい。組織は任意のタイプの組織、例えば肝組織、心臓組織、脳組織、神経組織、または脊髄組織であってもよい。
【００５２】
該化合物は、例えば薬剤、カルシウムチャンネル遮断薬、β-アドレナリン受容体アゴニスト、α-アドレナリン受容体アゴニスト、被験試薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、hERGチャンルのモディファイヤー、または毒素であってもよい。
【００５３】
薬剤の毒性リスクを低減する方法
本発明のある態様は、被験体（例えばヒトまたは哺乳動物被験体）において薬物毒性のリスクを低減する方法を提供する。当該被験体から作成した人工多能性幹細胞系統から分化させた１つまたはそれ以上の細胞をある用量の薬物と接触させてもよい。該接触させた１つまたはそれ以上の細胞を、毒性についてアッセイする。該細胞を比色共鳴反射バイオセンサー（または他のバイオセンサー）表面に適用する。該細胞を薬物と接触させ、定期的なピーク波長値を一定のアッセイ時間にわたって測定する。ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。薬物を細胞に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物は該細胞に対して負の毒性効果を有することを示している。該薬物が、接触させた細胞に負の毒性効果を有さない場合にのみ、該薬物を該被験体に処方または投与する。
【００５４】
本発明の別の態様は、被験体（例えばヒトまたは哺乳動物被験体）において薬物毒性のリスクを低減する方法を提供する。該方法は、被験体から作製した人工多能性幹細胞系統から分化させた１つまたはそれ以上の細胞を、２つまたはそれ以上の異なる用量の薬物と接触させること、および、該接触させた１つまたはそれ以上の細胞集団を毒性についてアッセイすることを含む。該アッセイは、１つまたはそれ以上の細胞集団を比色共鳴反射バイオセンサー表面に適用すること、および、該１つまたはそれ以上の細胞集団を２つまたはそれ以上の異なる濃度の薬物と接触させることを含む。各薬物濃度について、１つまたはそれ以上のピーク波長値を検出する。各薬物濃度について、ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して解析する。薬物を細胞に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが負に変化すれば、該薬物濃度は該細胞に対して負の毒性効果を有することを示している。該薬物濃度が、接触させた細胞に負の毒性効果を有さない場合にのみ、該薬物を該被験体に処方または投与する。
【００５５】
化合物の中和活性をスクリーニングする方法
本発明のある態様は、既知の毒素または負の環境条件（すなわち、細胞を衰弱もしくは死滅させる環境条件、または、細胞の成長もしくは分裂に負の効果を有する環境条件）に対して中和活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射バイオセンサー（または他のバイオセンサー）表面に適用すること、および、細胞、細胞集合体、または組織を既知の毒素および化合物と接触させることを含む。定期的または連続的なピーク波長値を一定のアッセイ時間にわたって測定する。ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。化合物を細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物は該毒素に対して中和効果を有することを示している。
【００５６】
本発明の別の態様は、既知の毒素に対して中和活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団を比色共鳴反射バイオセンサー（または他のバイオセンサー）表面に適用すること、および、該１つまたはそれ以上の細胞、細胞集合体、または組織集団を該既知の毒素および２つまたはそれ以上の異なる濃度の化合物と接触させることを含む。それぞれの化合物濃度について、定期的または連続的なピーク波長値を一定のアッセイ時間にわたって測定する。それぞれの化合物濃度について、ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析する。化合物を細胞、細胞集合体、または組織に接触させた後に頻度、振幅、またはキネティクスプロファイルが正に変化すれば、該化合物は該毒素に対して中和効果を有することを示している。接触段階は、該細胞、細胞集合体、または組織を、少なくとも１つの第２の化合物（例えば1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、またはそれ以上）または少なくとも１つの第２の環境条件（例えば1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、またはそれ以上）と、該第１の化合物または環境条件の存在下で接触させることを更に含んでもよい。
【００５７】
化合物のキネティクスプロファイル特性をスクリーニングする方法
本発明のある態様は、被験毒素または化合物をキネティクスプロファイル特性に関してスクリーニングし、該毒素または化合物のクラスまたはサブクラスを特定する方法を提供する。細胞、細胞集合体、または組織を比色共鳴反射バイオセンサー（または他のバイオセンサー）表面に適用し、該細胞、細胞集合体、または組織を被験毒素または化合物と接触させる。定期的または連続的なピーク波長値を一定のアッセイ時間にわたって測定する。ピーク波長値を、頻度、振幅、もしくはキネティクスプロファイル、またはそれらを組み合わせたものに関して経時的に解析し、被験毒素または被験化合物の細胞、細胞集合体、または組織に対する影響に関するキネティクスプロファイル特性を得る。被験毒素または化合物のキネティクスプロファイル特性を、既知の毒素または化合物のキネティクスプロファイル特性と比較し、被験毒素または化合物を、それらと同様のキネティクスプロファイルを有する毒素または化合物のクラスまたはサブクラスに分類する。
【００５８】
キネティクスプロファイル特性は、２つまたはそれ以上（例えば2、3、4、5、10、15、20、またはそれ以上）の毒素クラスまたはサブクラス（例えばDNA損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAジャイレース阻害剤、RNA阻害剤、イオンチャンネル阻害剤など）または化合物のキネティクスプロファイルを測定することによって得られる。同じクラスまたはサブクラスに属する毒素または化合物の２つまたはそれ以上のキネティクスプロファイルが類似していれば（例えば図７参照）、このキネティクスプロファイルを併せたものがキネティクスプロファイル特性である。
【００５９】
心筋細胞の洞調律に対する影響をスクリーニングする方法
本発明は、心筋細胞の洞調律に対する被験化合物または環境条件の影響を測定する方法を提供する。該方法は、任意のタイプの心筋細胞を比色共鳴反射バイオセンサー表面、誘電体積層膜バイオセンサー表面、または回折格子導波路バイオセンサー表面に適用することを含む。該心筋細胞を該化合物または環境条件と接触させ、定期的または連続的なピーク波長値または実効屈折率値を一定時間にわたって測定する。ピーク波長値または実効屈折率値を、洞調律に関して経時的に解析する。化合物または環境条件を心筋細胞と接触させた後に洞調律が変化すれば、該化合物または環境条件が該心筋細胞の洞調律に対して影響を与えること示す。
【００６０】
化合物、化合物の組み合わせ、または環境条件の、洞調律の波動、セグメント、および間隔に対する非常に特異的な影響を測定してもよい。例えば、QT間隔の延長（または短縮）を、本発明の方法を用いて測定してもよい。心拍数で補正したQT間隔（QTc）をバゼットの式を用いて測定してもよい。PR間隔、PRセグメント、STセグメントの長さの変化（延長または短縮）を測定してもよい。更に、QRS群、P波、Q波、R波、S波、またはT波の幅の拡大；QRS群、P波、Q波、R波、S波、またはT波の異常な偏向；QRS群、P波、Q波、R波、S波、またはT波の継続時間；QRS群、P波、Q波、R波、S波、またはT波の振幅；およびQRS群、P波、Q波、R波、S波、またはT波の形態（例えばT波のノッチ）を、本発明の方法によって検出してもよい。
【００６１】
本明細書で参照する全ての特許、特許出願、および他の科学文献または技術文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明について例証的に記載したが、これは任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）（本明細書には具体的に開示していない）を欠いた状態で実施してもよい。従って、例えば、本明細書において、「含む」、「本質的に〜から成る」、および「〜から成る」という用語は同義であり、それと同時に、その通常の意味を有する。使用する用語および表現は制限ではなく説明のための用語として使用するものであり、それらの用語および表現の使用においては、表記および説明する特長の同等物またはその一部のいずれをも除外することを意図せず、認識されるように、本発明の特許請求の範囲内で種々の改変を行うことができる。従って、態様および更なる特長によって本発明を具体的に開示したが、当業者は本明細書に開示した本発明の改変および変更の手段をとってもよく、それらの改変および変更は、添付の特許請求の範囲に定義する本発明の範囲内に含まれるとみなされることは理解されるべきである。
【００６２】
更に、本発明の特長または観点をマーカッシュ群または他の選択肢群で記載する場合、当業者に認識されるように、本発明はマーカッシュ群または他の選択肢群の任意の個別メンバーまたはメンバーのサブグループでも記述される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：キネティクスプロファイル特性
ベロ細胞を、完全培地中、25,000細胞／ウェルで比色共鳴反射バイオセンサー・マイクロタイタープレートに播種した。細胞を、２つの毒素のうちの１つに、数種の異なる濃度で、１６時間暴露した。毒素の毒性効果は、毒素添加の1.5から2.0時間後に明らかであった。毒素XのIC50は37ng/mlであった。毒素YのIC50は0.187ng/mlであった。毒素Xおよび毒素Yのキネティクスプロファイルを図１に示す。PWVは、毒素による細胞の死滅に伴って、濃度依存的に負にシフトした。
【００６４】
別の実験において、ここでも、ベロ細胞を比色共鳴反射バイオセンサー・マイクロタイタープレートのウェルに播種した。２つの毒素（毒素Xまたは毒素Y）を細胞に添加した。化合物４または化合物１もウェルに添加した。化合物４は毒素Xを阻害するが、毒素Yは阻害しない。化合物１は毒素Xおよび毒素Yの両方を阻害する。化合物４を添加したウェルでは、毒素Xが阻害された。図２Ａは、一定時間にわたる、毒素Ｘによる細胞死の阻害を示す（薄線）。PWVの負へのシフトで明らかなように、毒素Ｙによる細胞死は阻害されなかった。図２Ａ（太線）参照。化合物１を細胞に添加した場合、該毒素による細胞死は化合物１によって阻害され、負のPWVの中和が観察された。図２Ｂ参照。従って、本発明のアッセイを用いて、毒素を中和する化合物をスクリーニングすることができる。
【００６５】
図３Ａ-Ｂは、毒素の濃度を漸増させて、中和用量の解毒剤と混合した実験を示す。CHO細胞を完全培地中、25,000細胞／ウェルでCA2 384-ウェル BIND（トレードマーク）バイオセンサープレートに3-4時間播種した。その後、毒素または毒素：解毒剤混合物をウェルに添加した。BIND（トレードマーク）バイオセンサープレートリーダーを用いて、室温で15-16時間、細胞をモニタリングした。結果を図３Ａ-Ｂに示す。図３Ａは時間的応答プロファイルを示し、図３Ｂは11時間の時点での結果を示す。毒素によって誘導される用量依存的な負のPWVへのシフトが中和されていることによって明らかなように、解毒剤は細胞を細胞死から保護する。
【００６６】
別の実験では、HeLa細胞を100μMのタモキシフェン（カルシウム流入刺激剤）、ドキソルビシン（DNA損傷剤）、シクロヘキシミド（タンパク質合成阻害剤）、ジギトニン（マイルドな界面活性剤）、およびバッファーで処理し、37℃のインキュベーター中、40時間の間、15分毎にBIND（トレードマーク）リーダーでモニタリングした。細胞毒性化合物は、それぞれ異なる作用機序を有し、これによって本発明のアッセイにおいて異なるキネティクスプロファイルを示す。図４参照。毒素を、種々のタイプの細胞に対する影響について試験し、そのキネティクスプロファイルに基づいて、一定の毒素クラスまたはサブクラス（例えばカルシウム流入刺激剤）に分類することができる。これらのアッセイは、毒性化合物のスクリーニングおよびプロファイリングに関して、電気インピーダンス試験より高いハイスループット性を有する。図５に、各細胞傷害剤のPWVシフトを、細胞傷害剤の濃度との相関で示す（図５Ａ：シクロヘキシミド；図５Ｂ：ジギトニン；図５Ｃ：ドキソルビシン；図５Ｄ：タモキシフェン）。
【００６７】
タモキシフェンの細胞毒性は、カルシウム動員の誘導によって起こると考えられている。タモキシフェンのキネティクスプロファイルには、早期の時点での、PWVシフトの急激な低下がある。図６参照。4-ヒドロキシタモキシフェンは、タモキシフェンの代謝産物であり、エストロゲン受容体との親和性および毒性がより高い。4-ヒドロキシタモキシフェンは、タモキシフェンより早期に毒性を開始するというキネティクスプロファイルを有する。図６参照。ラロキシフェン（ラベルを付していない線）は、タモキシフェンと同じクラス（SERM、またはエストロゲン受容体モジュレーター）に属するが、副作用および細胞毒性がはるかに低い。図６参照。
【００６８】
図７は、いくつかの既知のDNA損傷剤の一定時間にわたるPWVを示したものである。いずれも基本的なプロファイルは同様であり、突然の開始、急激な低下を示した後、負のPWVがプラトーになる。シスプラチン（挿入剤）、重クロム酸カリウム（挿入剤）、ドキソルビシン（架橋剤）、およびマイトマイシン（架橋剤）は全て、同様のプロファイルを有し、全てが直接的なDNA損傷剤である。カンプトセシンはトポイソメラーゼ阻害剤であり、やや異なるキネティクスプロファイルを有する。図８Ａ-Ｂは、種々の濃度の重クロム酸カリウム（図８Ａ）およびシスプラチン（図８Ｂ）でのPWVを示す。
【００６９】
多くの化合物は、微小管に対して望ましくない影響を与える。ビンブラスチンは、チューブリンに結合し、微小管の形成を阻害する。ビンブラスチンのキネティクスプロファイルは、他の毒素と異なる。図９Ａ-Ｂ参照。早期の時点（図９Ｂ）では急激な急性応答を示し、その後、長時間にわたって、徐々に負のPWVシフトとなる。早期の応答は、微小管の崩壊によって起こる急性の形態学的効果の結果であると考えられる。長時間にわたる負のPWV応答は、細胞死によるものと考えられる（図９Ａ）。このアッセイは、１つのアッセイにおいて複数のリードアウト（オン・ターゲット＋毒性）が得られる可能性を示している。
【００７０】
実施例２：頻度および速度の測定
mES由来心筋細胞（Cor.At）をAxiogenesis/Lonzaから得た。実験前に、5,000細胞／ウェルをフィブロネクチン・コーティング384ウェルバイオセンサープレートに24時間播種した。これらの細胞は培地中で拍動する。細胞を、BIND（トレードマーク）リーダーで常時モニタリングしながら、37℃においてドキソルビシンで17時間処理した。図１０Ａに示すように、バッファー測定値から、細胞が培地中で拍動することが明らかである。細胞の拍動を示すPWVの振動が見られる。拍動の振幅は、時間と共に強くなっている。すなわち、時間と共に、細胞が培地中でより強く拍動するために、PWV測定値のY軸の広がりが大きくなる。ドキソルビシンを細胞に添加した場合、PWV測定値は負になる。更に、細胞の振幅は、時間と共に弱くなる。ドキソルビシンの効果は用量依存的である。図１０Ｂ参照。
【００７１】
マウス胚幹細胞由来心筋細胞をバイオセンサーのウェルに添加し、BIND（トレードマーク）リーダーにより４測定／秒でPWVを測定した。一方のウェルはKClで処理し、他方のウェルは未処理とした。結果を図１１に示す。BIND（トレードマーク）光学バイオセンサー上での培養で、細胞は同期して拍動し、拍動の頻度を測定することが可能である。図１２参照。KCl処理により、拍動の振幅は喪失し、拍動の頻度は低下する。BIND（トレードマーク）リーダーにより、拍動の頻度および速度を、正-負PWVシフトの振動として測定する。キネティックPWVプロファイルを用いて、拍動の速度および頻度を正確に測定することができる。従って、該アッセイによって、心臓毒性および収縮性に対するオフ・ターゲット薬剤の影響を測定するための、超ハイスループットアッセイが提供される。
【００７２】
別の実験では、心筋細胞を、20,000細胞／ウェルでフィブロネクチン・コーティングバイオセンサープレートに播種した。実験の前に、細胞を37℃で72時間インキュベートした。細胞を3分間モニタリングした後、最終濃度50mMのKClを添加した。結果を図１３に示す。KClをウェルに添加すると、細胞の拍動の速度および頻度は劇的に低下した。これは、化合物の添加前および添加後の細胞のモニタリングを、単一のウェル内で行うことができることを示している。
【００７３】
別の実験では、心筋細胞を数種類の濃度のドキソルビシン（10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、および0μM）で17時間処理した。ドキソルビシン処理の前、および、１７時間のドキソルビシン処理後に、拍動の振幅および頻度を４測定／秒で測定した。結果を図１４に示す。拍動の振幅および頻度は、ドキソルビシンによって濃度依存的に阻害される。
【００７４】
実施例３
BIND（トレードマーク）カートリッジリーダーのOcean Optics HT2000+分光計を、分光計内に光を取り入れるスリットの幅が広くなるように変更し、より多くの光が分光計内に入るようにした。これによって、BIND（トレードマーク）カートリッジリーダーを“パーキング（parked）”にする（すなわち、BIND（トレードマーク）カートリッジリーダーをある位置（例えば、細胞を有するウェルの上）に固定しておく）と、最大1000 Hz、すなわち、最大1000測定／秒の測定が可能となる。測定は、リアルタイムで連続的に行われる。測定は、約2、4、10、50、80、100、250、280、300、400、500、600、700、800、900、1,000Hz、またはそれ以上（または約2から約1,000Hzの間の任意の範囲）で行ってもよい。
【００７５】
精密なBIND（トレードマーク）カートリッジリーダーを使用して、心筋細胞の拍動の測定を行った。図１５に80Hzでの測定結果を示す。これに対し、実施例１および２のデータは4Hzで測定した。サンプリング速度を増加させることにより、個々の拍動の形状をより正確に観察することができる。ウェル間で異なる拍動「表現型」を確認することができ、更に、ウェル中の同期拍動と非同期拍動との相違を測定することができる。図１５Ａは高頻度の拍動を、図１５Ｂは中頻度の拍動を、図１５Ｃは低頻度の拍動を、図１５Ｄは不定期の拍動を示す。図１６Ａ-１６Ｂは高密度の同期拍動を示す。図１６Ｃ-Ｄは低密度の非同期拍動を示す。
【００７６】
心臓毒性（例えばhERGチャンネルの阻害）を有し、そして／または、QTの延長に影響する化合物の影響を測定することができる。QT間隔は、心臓の電気周期における、Q波の開始点とT波の終了点の間の時間の長さである。QT間隔の延長は、心室性頻脈性不整脈および突然死のリスク因子である。本発明の方法を使用し、中／高スループットスクリーニングにおいてQT延長を誘引する化合物のスクリーニングを行うことができる。本発明の方法は、培地中で、心筋細胞の拍動に対する微小な影響から顕著な影響までを測定することができ、これによってインビボにおいて拍動する心臓への効果を予測することができる。
【００７７】
アミトリプチリンは、Elavil（トレードマーク）の商品名で販売されている三環系抗鬱薬である。アミトリプチリンは、主に、セロトニン-ノルエピネフィリン再吸収阻害剤として機能し、これは両伝達物質の輸送体の調節によって行われる。これは、hERGチャンネルの変調およびQTの延長による心臓不整脈に関係する。培地中の拍動心筋細胞にアミトリプチリンを添加し、PWVを常時モニタリングした。図１７Ａは、アミトリプチリン添加前の、一定時間にわたる細胞のPWVを示す。図１７Ｂは、１７Ｃ、および１７Ｄは、それぞれアミトリプチリン添加の6分後、10分後、および15分後の心筋細胞のPWVを示す。アミトリプチリン添加後の、定期的な同期拍動から不定期の非同期拍動への変化が、明らかに観察される。
【００７８】
このように、本発明の方法を用いて、心筋細胞および他の細胞のキネティクスプロファイル、拍動頻度、および拍動速度に対する化合物、化合物の組み合わせ、または環境条件の影響をスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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