(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞結合剤および細胞毒性物質を含む細胞毒性コンジュゲート、該コンジュゲートを含む療法用組成物、該コンジュゲートを細胞増殖の阻害および疾患の処置に使用する方法、ならびに細胞毒性コンジュゲートを含むキットの提供。【解決手段】細胞結合剤は特に、ＣＡ６グリコトープを認識して結合するモノクローナル抗体およびそのエピトープ結合フラグメント。また、ヒト化もしくはリサーフェシングしたバージョンの抗ＣＡ６ネズミモノクローナル抗体ＤＳ６およびそのエピトープ結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６よりなる群から選択されるアミノ酸配列：
【化１】
2015012861.tif 000052
を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２】
少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントおよび少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントを含み、その際、少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントがそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３により表わされるアミノ酸配列：
【化２】
2015012861.tif 000053
を有する順次３つの配列相補性決定領域を含み、少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントがそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６により表わされるアミノ酸配列：
【化３】
2015012861.tif 000054
を有する順次３つの配列相補性決定領域を含む、抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表わされるアミノ酸配列：
【化４】
2015012861.tif 000055
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項４】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項３に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項５】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項６】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列：
【化５】
2015012861.tif 000056
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項７】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項８】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項９】
請求項１、２、３または６のいずれか１項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１、２、３または６のいずれか１項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのＬ鎖またはＨ鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
ベクターが該抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
ベクターが該抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】
下記を含むリサーフェシング法により作製された、ＣＡ６グリコトープに結合するヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント：
（ａ）げっ歯類およびヒトの抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変部のプールのｘ線結晶学的構造により得た相対アクセシビリティー分布から位置アラインメントを作成して、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を求め、その際げっ歯類およびヒトのすべての可変部のアラインメント位置が少なくとも約９８％同一であり；
（ｂ）げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントについて、工程（ａ）で求めたＨ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を用いて、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を決定し；
（ｃ）ヒト抗体アミノ酸配列から、工程（ｂ）で決定したＨ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基に最も近い同一性を有する、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を同定し；
（ｄ）げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部フレームワークアミノ酸配列において、工程（ｂ）で決定したＨ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を、工程（ｃ）で同定したＨ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し；
（ｅ）げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部、および工程（ｄ）で特定した置換により得られたげっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部の三次元モデルを構築し；
（ｆ）工程（ｅ）で構築した三次元モデルを比較し、工程（ｂ）または（ｃ）で決定した組から、げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から５Å以内にあるアミノ酸残基を同定し；
（ｇ）工程（ｆ）で同定したいずれかの残基をヒトのアミノ酸残基から元のげっ歯類のアミノ酸残基に交換し、これにより表面に露出したアミノ酸残基のヒト化用の一組を決定し；
（ｈ）工程（ｂ）で決定したげっ歯類抗体可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を、工程（ｇ）で決定したヒト化用の、可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し；そして
（ｉ）ＣＡ６グリコトープに結合するヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを作製する。
【請求項１６】
ヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメントがエピトープ結合フラグメントである、請求項１５に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１７】
エピトープ結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントよりなる群から選択される、請求項１６に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１８】
表面に露出したアミノ酸残基が、溶媒アクセシビリティー３０％を超える残基である、請求項１５または１６に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６よりなる群から選択されるアミノ酸配列：
【化６】
2015012861.tif 000057
を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１５に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２０】
少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントおよび少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントを含み、その際、少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントがそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３により表わされるアミノ酸配列：
【化７】
2015012861.tif 000058
を有する順次３つの配列相補性決定領域を含み、少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントがそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６により表わされるアミノ酸配列：
【化８】
2015012861.tif 000059
を有する順次３つの配列相補性決定領域を含む、請求項１５に記載のヒト化したげっ歯類
抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列：
【化９】
2015012861.tif 000060
性を有するＬ鎖可変部を含む、請求項１５に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列：
【化１０】
2015012861.tif 000061
を有するＨ鎖可変部を含む、請求項１５に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２３】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞に結合する改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、下記により作製される改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１：
【化１１】
2015012861.tif 000062
よりなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを調製し；
（ｂ）該ＤＮＡポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列の少なくとも１つの残基を変化させるように、（ａ）のＤＮＡポリヌクレオチドに少なくとも１つのヌクレオチドの変異、欠失または挿入を導入し；
（ｃ）（ｂ）のＤＮＡポリヌクレオチドがコードする抗体または抗体フラグメントを発現させ；そして
（ｄ）発現した抗体または抗体フラグメントをＣＡ６グリコトープ発現細胞への結合親和性の改良についてスクリーニングし、これにより、改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを得る。
【請求項２４】
少なくとも１つのヌクレオチドの変異、欠失または挿入を、オリゴヌクレオチド仲介による部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、誤りがちなＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミューテーター株の使用よりなる群から選択される方法により行う、請求項２３に記載の改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２５】
細胞結合剤および細胞毒性物質を含み、細胞結合剤がＣＡ６グリコトープに結合する、細胞毒性コンジュゲート。
【請求項２６】
細胞結合剤と細胞毒性物質が共有結合している、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項２７】
細胞結合剤と細胞毒性物質がＰＥＧ連結基により共有結合している、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項２８】
細胞結合剤と細胞毒性物質が、細胞毒性物質のチオールまたはジスルフィド官能基により共有結合している、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項２９】
細胞結合剤が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体のフラグメント、ヒト化またはリサーフェシングした抗体、抗体の機能均等物、改良された抗体、インターフェロン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、トランスフェリンおよびビタミンよりなる群から選択されるメンバーである、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３０】
抗体のフラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントよりなる群から選択される、請求項２９に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３１】
細胞結合剤が、抗ＣＡ６モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３２】
細胞結合剤が、ネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３３】
細胞結合剤が、ヒト化バージョンのネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３４】
細胞毒性物質が、メイタンシノイド化合物、タキソイド化合物、ＣＣ−１０６５化合物、ドラスタチン化合物、ダウノルビシン化合物、およびドキソルビシン化合物よりなる群から選択されるメンバーである、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３５】
細胞毒性物質が、式（Ｉ）のメイタンシンＤＭ１：
【化１２】
2015012861.tif 000063
である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３６】
細胞毒性物質が、式（ＩＩ）のメイタンシンＤＭ４：
【化１３】
2015012861.tif 000064
である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３７】
細胞毒性物質が、式（ＩＩＩ）のメイタンシン：
【化１４】
2015012861.tif 000065
［式中：
Ｙ’は、
【化１５】
2015012861.tif 000066
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔのうち少なくとも２つはいかなる場合にもゼロではなく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３８】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、ＺがＨである、請求項３７に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項３９】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、ＺがＨである、請求項３７に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４０】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項３７に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４１】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項３７に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４２】
細胞毒性物質が、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）よりなる群から選択されるメイタンシン：
【化１６】
2015012861.tif 000067
［式中：
Ｙは、
【化１７】
2015012861.tif 000068
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｍａｙは、Ｃ−３の側鎖、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシを有する、またはＣ−２０デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４３】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、ＺがＨである、請求項４２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４４】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、ＺがＨである、請求項４２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４５】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項４２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４６】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項４２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４７】
細胞毒性物質が、式（ＩＶ−Ｌ）で表わされる、請求項４２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４８】
細胞毒性物質が、式（Ｖ）のメイタンシン：
【化１８】
2015012861.tif 000069
［式中：
Ｙは、
【化１９】
2015012861.tif 000070
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項４９】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍがそれぞれ１であり；ｎが０であり；ＺがＨである、請求項４８に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５０】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０であり；ＺがＨである、請求項４８に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５１】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項４８に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５２】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である、請求項４８に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５３】
細胞毒性物質が、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）および（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）よりなる群から選択されるメイタンシン：
【化２０】
2015012861.tif 000071
［式中：
Ｙ２は、
【化２１】
2015012861.tif 000072
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲまたはＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｍａｙは、メイタンシノイド類である］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５４】
細胞毒性物質が、式（ＶＩＩ）のメイタンシン：
【化２２】
2015012861.tif 000073
［式中：
Ｙ２’は、
【化２３】
2015012861.tif 000074
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔのうち少なくとも２つはいかなる場合にもゼロではなく；
Ｚ２は、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５５】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルである、請求項５４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５６】
細胞毒性物質が、式（ＶＩＩＩ）のメイタンシン：
【化２４】
2015012861.tif 000075
［式中：
Ｙ１’は、
【化２５】
2015012861.tif 000076
を表わし、ここで
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔのうち少なくとも２つはいかなる場合にも非ゼロではない］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５７】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルである、請求項５６に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５８】
Ｒ１およびＲ２がメチルである、請求項５６に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項５９】
細胞毒性物質が、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）よりなる群から選択されるメイタンシン：
【化２６】
2015012861.tif 000077
［式中：
Ｙ１は、
【化２７】
2015012861.tif 000078
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｍａｙは、Ｃ−３の側鎖、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシを有する、またはＣ−２０デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６０】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであるか、あるいはＲ１およびＲ２がメチルである、請求項５９に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６１】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍがそれぞれ１であり；ｎが０である、請求項５９に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６２】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０である、請求項５９に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６３】
細胞毒性物質が、式（ＩＸ−Ｌ）で表わされる、請求項６０に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６４】
細胞毒性物質が、式（ＩＸ−Ｌ）で表わされる、請求項６１に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６５】
細胞毒性物質が、式（ＩＸ−Ｌ）で表わされる、請求項６２に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６６】
細胞毒性物質が、式（Ｘ）のメイタンシン：
【化２８】
2015012861.tif 000079
［式中：
Ｙ１は、
【化２９】
2015012861.tif 000080
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｍａｙは、Ｃ−３の側鎖、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシを有する、またはＣ−２０デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす］である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６７】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０である、請求項６６に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６８】
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０である、請求項６６に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項６９】
細胞結合剤が、ヒト化バージョンのネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントであり、かつ細胞毒性物質がＤＭ１またはＤＭ４である、請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項７０】
細胞毒性物質が、式（ＩＩ）のタキサン：
【化３０】
2015012861.tif 000081
である、請求項３４に記載の細胞毒性コンジュゲート。
【請求項７１】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する方法であって、ＣＡ６グリコトープ発現細胞を請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲートと接触させることを含む方法。
【請求項７２】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としての抗ＣＡ６モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を含む方法。
【請求項７３】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としての抗ＣＡ６モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む方法。
【請求項７４】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を含む方法。
【請求項７５】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む方法。
【請求項７６】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、増殖の阻害により細胞が死滅する方法。
【請求項７７】
ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項７１に記載の方法であって、インビボ、インビトロまたはエクスビボで実施する方法。
【請求項７８】
請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、療法用組成物。
【請求項７９】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を含む、請求項７８に記載の療法用組成物。
【請求項８０】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６ま
たはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項７８に記載の療法用組成物。
【請求項８１】
癌を伴う対象の処置方法であって、癌を伴う対象に療法有効量の請求項７８に記載の療法用組成物を投与し、癌を伴う対象をこれにより処置する方法。
【請求項８２】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を含む、請求項８１に記載の癌を伴う対象の処置方法。
【請求項８３】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項８１に記載の癌を伴う対象の処置方法。
【請求項８４】
癌が、ＣＡ６グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項８１に記載の癌を伴う対象の処置方法。
【請求項８５】
癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項８１に記載の癌を伴う対象の処置方法。
【請求項８６】
請求項２５に記載の細胞毒性コンジュゲートを含み、さらに
ａ）細胞毒性コンジュゲートを収容するコンパートメント；および
ｂ）キットを使用するための指示
を含むキット。
【請求項８７】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８９】
指示が、癌を伴う対象を処置するための指示を含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項９０】
癌が、ＣＡ６グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
請求項７８に記載の療法用組成物を含み、さらに
ａ）療法用組成物を収容するコンパートメント；および
ｂ）キットを使用するための指示
を含むキット。
【請求項９３】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのＤＭ１またはＤＭ４を
含む、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体ＤＳ６またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項９２に記載のキット。
【請求項９５】
指示が、癌を伴う対象を処置するための指示を含む、請求項９２に記載のキット。
【請求項９６】
癌が、ＣＡ６グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項９６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[01]  本出願は、米国仮特許出願60/488,447（2003年7月21日出願）による優先権を主
張する。
【０００２】
発明の分野
[02]  本発明は、ネズミ抗ＣＡ６グリコトープ（glycotope）モノクローナル抗体、お
よびそのヒト化またはリサーフェシング（表面再建）した（resurfaced）バージョンに関する。本発明はまた、前記の抗ＣＡ６グリコトープモノクローナル抗体のエピトープ結合フラグメント、および前記の抗ＣＡ６グリコトープモノクローナル抗体のヒト化またはリサーフェシングしたバージョンのエピトープ結合フラグメントに関する。
【０００３】
[03]  本発明はさらに、細胞結合剤および細胞毒性物質を含む細胞毒性コンジュゲート、該コンジュゲートを含む療法用組成物、該コンジュゲートを細胞増殖の阻害および疾患の処置に使用する方法、ならびに細胞毒性コンジュゲートを含むキットに関する。細胞結合剤は特に、ＣＡ６グリコトープを認識して結合するモノクローナル抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、またはそのヒト化もしくはリサーフェシングしたバージョンである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
[04]  周囲の癌以外の細胞および組織に害を与えることなく標的癌細胞を特異的に破壊する抗癌療法薬を開発する試みは多数あった。そのような療法薬は、ヒト患者の癌療法を大幅に改良する可能性をもつ。
【０００５】
[05]  有望な方法のひとつは、細胞結合剤、たとえばモノクローナル抗体と、細胞毒を連結することであった（Sela et al., Immunoconjugates 189-216（C. Vogel編, 1987）
；Ghose et al., Targeted Drugs 1-22（E. Goldberg編, 1983）；Diener et al., Antibody mediated delivery systems 1-23（J. Rodwell編, 1988）；Pietersz et al., Antibody mediated delivery systems 25-53（J. Rodwell編, 1988）；Bumol et al., Antibody mediated delivery systems 55-79（J. Rodwell編, 1988））。細胞結合剤の選択によ
り、癌細胞表面に発現する分子の発現プロフィールに基づいて特定のタイプの癌細胞のみを認識して結合するようにこれらの細胞毒性コンジュゲートを設計できる。
【０００６】
[06]  そのような細胞毒性コンジュゲートには、多様なネズミモノクローナル抗体に連結した細胞毒、たとえばメトトレキセート（methotrexate）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンブラスチン（vinblastine）、メルファラン（melphalan）、マイトマイシンＣ、およびクロラムブシル（chlorambucil）が用いられている。場合によっては、たとえば下記の介在キャリヤー分子により薬物分子が抗体分子に連結された：血清アルブミン（Garnet et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986)；Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunolther. 81-86 (1986)；Endo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)）、デキストラン（Hurwitz
et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980)；Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985)；Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986)；Shoval et al., 85
Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280 (1988)）、またはポリグルタミン酸（Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984)；Kato et al., 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984)；Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)）。
【０００７】
[07]  ある程度の有望性を示した具体的なコンジュゲートの一例は、結腸直腸腫瘍および膵臓腫瘍に発現する抗原ＣａｎＡｇに対して形成されたＣ２４２抗体と、メイタンシン（maytansine）誘導体ＤＭ１のコンジュゲートである（Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8618-8623 (1996)）。このコンジュゲートのインビトロ評価は、細胞表面に発現したＣａｎＡｇに対するそれの結合親和性が見掛けＫｄ値３×１０−１１Ｍと高く、ＣａｎＡｇ陽性細胞に対するそれの細胞毒力価がＩＣ５０  ６×１０−１１Ｍと高いことを指摘した。この細胞毒性は過剰の非結合抗体により遮断され、またこのコンジュゲートに対する抗原陰性細胞の感受性は１００倍以上低かったので、細胞毒性は抗原依存性であった。各標的細胞に対する高い親和性と高い抗原選択的細胞毒性の両方を備えた抗体−ＤＭ１コンジュゲートの他の例には、下記とのコンジュゲートが含まれる：ｈｕＮ９０１、ヒトＣＤ５６に対するヒト化バージョン抗体；ｈｕＭｙ９−６、ヒトＣＤ３３に対するヒト化バージョン抗体；ｈｕＮ２４２、ＣａｎＡｇ  Ｍｕｃ１エピトープに対するヒト化バージョン抗体；ｈｕＪ５９１、ＰＳＭＡに対する脱免疫化抗体；トラスツヅマブ（trastuzumab）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対するヒト化抗体；ビバツヅマブ（vivatuzumab）、ＣＤ４４ｖ６に対するヒト化抗体。
【０００８】
[08]  特定のタイプの癌細胞を特異的に認識する他の細胞毒性コンジュゲートの開発は、癌患者を処置するために用いる方法の改良を続ける際に重要であろう。
[09]  そのために本発明は、癌細胞表面に発現した分子／受容体を認識して結合する抗体の開発、ならびに抗体などの細胞結合剤および細胞毒性物質を含む、癌細胞表面に発現した分子／受容体を特異的にターゲティングする新規な細胞毒性コンジュゲートの開発を目的とする。
【０００９】
[10]  より具体的には、本発明は、癌細胞が発現するＭｕｃ１ムチン受容体上の新規なＣＡ６シアログリコトープ（sialoglycotope）の特性解明、およびＭｕｃ１ムチンの新規なＣＡ６シアログリコトープを認識し、ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するために細胞毒性物質と関連して使用できる抗体、好ましくはヒト化抗体の提供を目的とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
[11]  本発明は、Ｍｕｃ１ムチン受容体の新規なＣＡ６シアログリコトープを特異的に認識して結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む。他の態様において本発明は、Ｍｕｃ１ムチン受容体の新規なＣＡ６シアログリコトープ（”ＣＡ６グリコトープ”）を認識するヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む。
【００１１】
[12]  他の好ましい態様において本発明は、ネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６（”ＤＳ６抗体”）、およびリサーフェシングまたはヒト化したバージョンのＤＳ６抗体であって、該抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのＬ鎖およびＨ鎖の両方において、表面に露出した残基を既知のヒト抗体表面にいっそう近似するものに置換した抗体を含む。本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、それらを投与するヒト対象においてそれらの免疫原性が完全ネズミバージョンよりはるかに少ない（または完全に非免疫原性である）という点で改良された特性をもつ。したがって、本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、Ｍｕｃ１ムチン受容体上の新規なシアログリコトープ、すなわちＣＡ６グリコトープを特異的に認識するが、ヒトに対して免疫原性ではない。これらのヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを、薬物、たとえばメイタンシノイド（maytansinoid）類にコンジュゲートさせて、Ｍｕｃ１  ＣＡ６シアログリコトープへその薬物をターゲティングすることにより、抗原発現細胞に対して
特異的な細胞毒性をもつプロドラッグを形成できる。したがって、そのような抗体および低分子高毒性薬物（たとえばメイタンシノイド類、タキサン（taxane）類、およびＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞毒性コンジュゲートを、腫瘍、たとえば胸部腫瘍および卵巣腫瘍の処置のための療法薬として使用できる。
【００１２】
[13]  本発明のヒト化バージョンＤＳ６抗体を、それらのＬ鎖およびＨ鎖両方の可変部の各アミノ酸配列、Ｌ鎖およびＨ鎖可変部の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、それらの表面アミノ酸の同定、ならびに組換え形態でそれらを発現させる手段の開示に関して、本明細書中で完全に解明する。
【００１３】
[14]  １態様においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３により表わされるアミノ酸配列：
【００１４】
【化１】
2015012861.tif 000002
【００１５】
を有するＣＤＲを含むＨ鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６により表わされるアミノ酸配列：
【００１６】
【化２】
2015012861.tif 000003
【００１７】
を有するＣＤＲを含むＬ鎖をもつ、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[15]  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表わされるアミノ酸配列：
【００１８】
【化３】
2015012861.tif 000004
【００１９】
との少なくとも９０％の配列同一性を備えたアミノ酸配列を有するＬ鎖可変部をもつ、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合フラグメントをも提供する。
[16]  同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１により表わされるアミノ酸配列：
【００２０】
【化４】
2015012861.tif 000005
【００２１】
との少なくとも９０％の配列同一性を備えたアミノ酸配列を有するＨ鎖可変部をもつ、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[17]  他の態様においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
【００２２】
【化５】
2015012861.tif 000006
【００２３】
に対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化またはリサーフェシングしたＬ鎖可変部をもつ、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[18]  同様に、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
【００２４】
【化６】
2015012861.tif 000007
【００２５】
に対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化またはリサーフェシングしたＨ鎖可変部をもつ、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[19]  本発明のヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、Ｌ鎖および／またはＨ鎖アミノ酸残基の１以上の位置（表１の星印の残基により定められる）における置換をも含むことができる。これらの位置は、ヒト残基に交換する必要のあるネズミ表面フレームワーク残基であって、ＣＤＲから５Å以内にある残基を表わす。たとえば、ネズミ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の第１アミノ酸残基Ｑは、抗体をヒト化するためにＥに置換された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。しかし、この残基はＣＤＲに近接するので、抗体の親和性を維持するためにネズミ残基Ｑへの復帰変異が必要となる可能性がある。
【００２６】
【表１】
2015012861.tif 000008
【００２７】
[20]  これをさらに表２に示す。この表には、ｍｕＤＳ６可変部表面残基を、最も相同性の高い３つのヒト可変部表面残基とアラインしたものを示す。表１のアミノ酸残基は、表２の下線を施したアミノ酸残基に対応する。
【００２８】
【表２】
2015012861.tif 000009
【００２９】
[21]  本発明はさらに、（１）ＣＡ６グリコトープを認識して結合する細胞結合剤、および（２）細胞毒性物質を含む、細胞毒性コンジュゲートを提供する。細胞毒性コンジュゲートにおいて、細胞結合剤はＣＡ６グリコトープに対して高い親和性をもち、細胞毒性物質はＣＡ６グリコトープ発現細胞に対して高度の細胞毒性をもち、したがって本発明の
細胞毒性コンジュゲートは有効な殺細胞薬を形成する。
【００３０】
[22]  好ましい態様において、細胞結合剤は抗ＣＡ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、より好ましくはヒト化した抗ＣＡ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであり、細胞毒性物質は直接に、または開裂性もしくは非開裂性のリンカーを介して、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに共有結合している。より好ましい態様において、細胞結合剤はヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであり、細胞毒性物質はタキソール（taxol）類、メイタンシノイド類、ＣＣ−１０６５またはＣ
Ｃ−１０６５類似体である。
【００３１】
[23]  本発明の好ましい態様において、細胞結合剤はヒト化した抗ＣＡ６抗体であり、細胞毒性物質はメイタンシノイド類またはタキサンなどの細胞毒である。
[24]  より好ましくは、細胞結合剤はヒト化した抗ＣＡ６抗体ＤＳ６であり、細胞毒性物質はメイタンシン化合物、たとえばＤＭ１またはＤＭ４である。
【００３２】
[25]  本発明は、ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する方法をも含む。好ましい態様においては、ＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する方法をインビボで実施して細胞を死滅させるが、インビトロおよびエクスビボでの用途も含まれる。
【００３３】
[26]  本発明は、細胞毒性コンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、療法用組成物をも提供する。
[27]  本発明はさらに、本発明の療法用組成物を用いて癌を伴う対象を処置する方法を含む。好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートは抗ＣＡ６抗体および細胞毒性物質を含む。より好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートはヒト化ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲート、ヒト化ＤＳ６抗体−ＤＭ４コンジュゲート、またはヒト化ＤＳ６抗体−タキサンコンジュゲートを含み、このコンジュゲートを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と共に投与する。
【００３４】
[28]  本発明には、抗ＣＡ６抗体−細胞毒性物質コンジュゲート、および使用のための指示を含む、キットも含まれる。好ましい態様において、抗ＣＡ６抗体はヒト化ＤＳ６抗体であり、細胞毒性物質はメイタンシン化合物、たとえばＤＭ１もしくはＤＭ４、またはタキサン類であり、指示は癌を伴う対象を処置する際に本発明のコンジュゲートを使用するための指示である。キットは、医薬的に許容できる配合物を調製するのに必要な成分、たとえばコンジュゲートが凍結乾燥状態または濃縮形態である場合には希釈剤、および配合物を投与するのに必要な成分をも含む。
【００３５】
[29]  本発明は、ＣＡ６グリコトープを特異的に認識して結合する抗体の誘導体をも含む。好ましい態様において、抗体誘導体は、ＣＡ６グリコトープを結合する抗体をリサーフェシングまたはヒト化することにより調製され、それらの誘導体は宿主に対する免疫原性が低下している。
【００３６】
[30]  本発明はさらに、研究または診断の用途に使用するためにさらに標識されたヒト化抗体またはそのフラグメントを提供する。好ましい態様において、標識は放射性標識、発蛍光団、発色団、造影剤または金属イオンである。
【００３７】
[31]  癌を伴う疑いのある対象に、標識したヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを投与し、対象の体内での標識分布を測定またはモニターすることを含む、診断方法も提供される。
【００３８】
[32]  本発明は、本発明のヒト化抗体コンジュゲートを単独で、または他の細胞毒性物
質もしくは療法薬と組み合わせて投与することにより、癌を伴う対象を処置する方法をも提供する。癌は、たとえば胸部癌（乳癌）、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌、膵臓癌、ＣＡ６を発現する肉腫もしくは癌、またはＣＡ６グリコトープを主に発現する他の癌であってまだ判定されていないもののうち１種類以上であってよい。
【００３９】
[33]  別途記載しない限り、本明細書に引用したすべての参考文献および特許を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ＤＳ６抗体が特定の癌細胞系の表面に結合する能力を判定するために実施した試験の結果を示す。ＤＳ６第１抗体およびＦＩＴＣコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）第２抗体と共にインキュベートした細胞系の蛍光を、フローサイトメトリーにより測定した。ＤＳ６抗体は、Ｃａｏｖ−３（図１Ａ）およびＴ−４７Ｄ（図１Ｂ）細胞を、それぞれ１．８４８ｎＭおよび２．５８６ｎＭの見掛けＫｄで結合した。抗原陰性細胞系ＳＫ−ＯＶ−３（図１Ｃ）およびＣｏｌｏ２０５（図１Ｄ）は、抗原特異的結合を示さなかった。
【図２】図２は、エピトープ発現のドットブロット分析の結果を示す。Ｃａｏｖ−３（図２Ａおよび図２Ｂ）、ＳＫＭＥＬ２８（図２Ｃ）およびＣｏｌｏ２０５（図２Ｄ）細胞溶解物を個別にニトロセルロース膜上にスポットし、次いで個別にプロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸と共にインキュベートした。次いで膜を、ＤＳ６抗体（図２Ａ）、ＣＭ１抗体（図２Ｂ）、Ｒ２４抗体（図２Ｃ）、またはＣ２４２抗体（図２Ｄ）でイムノブロッティングした。
【図３】図３は、ＤＳ６の抗原発現のドットブロット分析結果を示す。Ｃａｏｖ−３細胞溶解物を個別にＰＶＤＦ膜上にスポットし、次いでトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）の存在下でインキュベートした。次いで膜を、ＣＭ１抗体（１および２）またはＤＳ６抗体（３および４）でイムノブロッティングした。
【図４】図４は、ＤＳ６の抗原のグリコトープ分析の結果を示す。Ｎ−グリカナーゼ（”Ｎ−ｇｌｙ”）、Ｏ−グリカナーゼ（”Ｏ−ｇｌｙ”）、および／またはシアリダーゼ（”Ｓ”）で前処理したＣａｏｖ−３細胞溶解物をニトロセルロース上にスポットし、次いでＤＳ６抗体またはＣＭ１抗体（Ｍｕｃ１  ＶＮＴＲ）でイムノブロッティングした。
【図５−１】図５は、ＤＳ６の抗原のウェスタンブロット分析の結果を示す。細胞溶解物を免疫沈降（”ＩＰ”）させ、ＤＳ６抗体でイムノブロッティングした。抗原は、抗原陽性Ｃａｏｖ−３（図５Ａおよび図５Ｂ）およびＴ４７Ｄ（図５Ｃ）細胞にみられた＞２５０ｋＤａのタンパク質バンドに対応する。抗原陰性ＳＫ−ＯＶ−３（図５Ｄ）およびＣｏｌｏ２０５（図５Ｅ）細胞系は、このバンドを示さない。免疫沈降の後、Ｃａｏｖ−３細胞溶解物のプロテインＧのバンドを、（図５Ａ）ノイラミニダーゼ（”Ｎ”）または（図５Ｂ）過ヨウ素酸（”ＰＡ”）と共にインキュベートした。抗体（”α”）、ＩＰ前（”Ｌｙｓ”）およびＩＰ後フロースルー（”ＦＴ”）溶解物対照を、同一ゲル上に流した。Ｃａｏｖ−３免疫沈降物を同様にＮ−グリカナーゼ（”Ｎ−ｇｌｙ”）、Ｏ−グリカナーゼ（”Ｏ−ｇｌｙ”）、および／またはシアリダーゼ（”Ｓ”）と共にインキュベートし（図５Ｆ参照）、ブロットを代わりにビオチニル化−ＤＳ６およびストレプトアビジン−ＨＲＰで検査した。
【図５−２】図５は、ＤＳ６の抗原のウェスタンブロット分析の結果を示す。細胞溶解物を免疫沈降（”ＩＰ”）させ、ＤＳ６抗体でイムノブロッティングした。抗原は、抗原陽性Ｃａｏｖ−３（図５Ａおよび図５Ｂ）およびＴ４７Ｄ（図５Ｃ）細胞にみられた＞２５０ｋＤａのタンパク質バンドに対応する。抗原陰性ＳＫ−ＯＶ−３（図５Ｄ）およびＣｏｌｏ２０５（図５Ｅ）細胞系は、このバンドを示さない。免疫沈降の後、Ｃａｏｖ−３細胞溶解物のプロテインＧのバンドを、（図５Ａ）ノイラミニダーゼ（”Ｎ”）または（図５Ｂ）過ヨウ素酸（”ＰＡ”）と共にインキュベートした。抗体（”α”）、ＩＰ前（”Ｌｙｓ”）およびＩＰ後フロースルー（”ＦＴ”）溶解物対照を、同一ゲル上に流した。Ｃａｏｖ−３免疫沈降物を同様にＮ−グリカナーゼ（”Ｎ−ｇｌｙ”）、Ｏ−グリカナーゼ（”Ｏ−ｇｌｙ”）、および／またはシアリダーゼ（”Ｓ”）と共にインキュベートし（図５Ｆ参照）、ブロットを代わりにビオチニル化−ＤＳ６およびストレプトアビジン−ＨＲＰで検査した。
【図６】図６は、Ｃａｏｖ−３（図６Ａ）およびＨｅＬａ（図６Ｂ）細胞溶解物についてのＤＳ６抗体およびＣＭ１抗体の免疫沈降および／またはイムノブロッティングの結果を示す。オーバーラップしたＣＭ１とＤＳ６ウェスタンブロット信号は、ＤＳ６の抗原がＭｕｃ１タンパク質上にあることを表わす。ＨｅＬａ細胞溶解物では、タンデム反復配列の個数が異なる別個の対立遺伝子により支配されたＭｕｃ１発現により、Ｍｕｃ１ダブレットが生じる。
【図７】図７は、ＤＳ６抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの設計（図７Ａ）および標準曲線（図７Ｂ）を示す。標準曲線は、既知濃度の市販ＣＡ１５−３標準品を用いて作成された（１ ＣＡ１５−３単位＝１ ＤＳ６単位）。
【図８】図８は、定量ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。検出抗体（ストレプトアビジン−ＨＲＰ／ビオチン−ＤＳ６）信号の標準曲線（図８Ｃ）は、プレート結合したヤギ抗マウスＩｇＧにより捕獲された（図８Ａ）またはＥＬＩＳＡプレートに直接結合した（図８Ｂ）、既知濃度のビオチン−ＤＳ６を用いて作成された。
【図９】図９は、ネズミＤＳ６抗体のＬ鎖（図９Ａ）およびＨ鎖（図９Ｂ）可変部のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。各配列中の３つのＣＤＲに下線を施した（Ｋａｂａｔ定義）。
【図１０】図１０は、Ｋａｂａｔ定義により判定したネズミＤＳ６抗体のＬ鎖（図１０Ａ）およびＨ鎖（図１０Ｂ）ＣＤＲを示す。ＡｂＭモデリングソフトウェアによれば、Ｈ鎖ＣＤＲに関する定義にわずかな差が生じる（図１０Ｃ）。
【図１１】図１１は、ネズミＤＳ６抗体のＬ鎖（”ｍｕＤＳ６ＬＣ”）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基１〜９５）およびＨ鎖（”ｍｕＤＳ６ＨＣ”）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１〜９８）のアミノ酸配列を、ＩｇＶ？ａｐ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＩｇＶｈ  Ｊ５５８．４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）遺伝子の生殖系列配列とアラインさせたものを示す。灰色は配列の相異を示す。
【図１２】図１２は、ネズミＤＳ６（ｍｕＤＳ６）Ｌ鎖（”ｍｕＤＳ６ＬＣ”）およびＨ鎖（”ｍｕＤＳ６ＨＣ”）配列に最も相同性が高く、Ｂｒｏｏｋｈａｅｖｅｎデータベースに解決済み構造ファイルをもつ、１０種類のＬ鎖およびＨ鎖抗体配列を示す。相同性が最も高いものから最も低いものの順に配列を並べた。
【図１３−１】図１３は、ネズミＤＳ６抗体Ｌ鎖可変部のいずれのフレームワーク残基が表面アクセス可能であるかを推定するための表面アクセシビリティーデータおよび計算値を示す。平均表面アクセシビリティー２５〜３５％の位置をマーク（＊？？＊）し、第２ラウンドの分析を行った。ＤＳ６抗体のＬ鎖可変部（図１３Ａ）およびＨ鎖可変部（図１３Ｂ）。
【図１３−２】図１３は、ネズミＤＳ６抗体Ｌ鎖可変部のいずれのフレームワーク残基が表面アクセス可能であるかを推定するための表面アクセシビリティーデータおよび計算値を示す。平均表面アクセシビリティー２５〜３５％の位置をマーク（＊？？＊）し、第２ラウンドの分析を行った。ＤＳ６抗体のＬ鎖可変部（図１３Ａ）およびＨ鎖可変部（図１３Ｂ）。
【図１４】図１４は、ｐｒＤＳ６ｖ１．０哺乳動物発現プラスミド地図を示す。このプラスミドを用いて、組換えキメラおよびヒト化ＤＳ６抗体を構築し、発現させた。
【図１５】図１５は、ネズミＤＳ６抗体（”ｍｕＤＳ６”）およびヒト化ＤＳ６抗体（”ｈｕＤＳ６”）（ｖ１．０およびｖ１．２）のＬ鎖（図１５Ａ）およびＨ鎖（図１５Ｂ）可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６は、ヒト化ＤＳ６抗体（”ｈｕＤＳ６”）（ｖ１．０およびｖ１．２）のＬ鎖可変部のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、ヒト化ＤＳ６抗体（”ｈｕＤＳ６”）ｖ１．０（図１７Ａ）およびｖ１．２（図１７Ｂ）のＨ鎖可変部のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ＷＩＳＨ細胞について実施したアッセイからのｍｕＤＳ６およびｈｕＤＳ６クローンのフローサイトメトリー結合曲線を示す。（図１８Ａ）キメラ、ｖ１．０、およびｖ１．２ヒトＤＳ６クローンの結合親和性（それぞれＫｄ＝３．１５、３．７１および４．２０ｎＭ）は、（図１８Ｂ）裸およびビオチニル化ネズミＤＳ６の結合親和性（それぞれＫｄ＝１．９３および２．８０ｎＭ）と同等であった。
【図１９】図１９は、ｈｕＤＳ６抗体とｍｕＤＳ６の競合結合アッセイの結果を示す。（図１９Ａ）ＷＩＳＨ細胞をビオチン−ｍｕＤＳ６およびストレプトアビジン−ＤＴＡＦと共にインキュベートして、見掛けＫｄが６．７６ｎＭの結合曲線を得た。（図１９Ｂ）種々の濃度の裸ｍｕＤＳ６、ｈｕＤＳ６  ｖ１．０およびｖ１．２を２ｎＭのビオチン−ｍｕＤＳ６と結合させ、次いでストレプトアビジン−ＤＴＡＦと結合させた。
【図２０】図２０は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートと対比した非コンジュゲートＤＳ６抗体の結合親和性の測定結果を示す。これらの結果は、ＤＭ１コンジュゲーションが抗体の結合親和性に有害な作用を及ぼさないことを立証する。ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの見掛けＫｄ（３．９０２ｎＭ）（”ＤＳ６−ＤＭ１”）は、裸の抗体のもの（２．０２０ｎＭ）（”ＤＳ６”）よりわずかに大きかった。
【図２１】図２１は、抗ネズミＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤＭ１コンジュゲート（２°Ａｂ−ＤＭ１）の存在下または不存在下での、ＤＳ６抗体を用いた間接的な細胞生存率アッセイの結果を示す。抗原陽性Ｃａｏｖ−３細胞は、二次コンジュゲート（”ＤＳ６＋２°Ａｂ−ＤＭ１”）の存在下でのみ、ＤＳ６抗体依存性で死滅した（ＩＣ５０＝４２４．９ｐＭ）。
【図２２】図２２は、ＤＳ６抗体およびヒト化ＤＳ６抗体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の結果を示す。これらの結果は、ＨＰＡＣ細胞（図２２Ａ）およびＺＲ−７５−１細胞（図２２Ｂ）に対してＤＳ６抗体またはヒト化ＤＳ６抗体（ｖ１．０およびｖ１．２）のＣＤＣ仲介作用がないことを立証した。
【図２３−１】図２３は、遊離メイタンシンと対比したＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６の抗原が陽性である卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞系を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートへの連続曝露の細胞毒性について試験した（左パネル）。これらの細胞系を、遊離メイタンシンへの７２時間曝露により同様にメイタンシン感受性について試験した（右パネル）。試験した卵巣癌細胞系は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞系は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞系は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞系は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−２】図２３は、遊離メイタンシンと対比したＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６の抗原が陽性である卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞系を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートへの連続曝露の細胞毒性について試験した（左パネル）。これらの細胞系を、遊離メイタンシンへの７２時間曝露により同様にメイタンシン感受性について試験した（右パネル）。試験した卵巣癌細胞系は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞系は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞系は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞系は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−３】図２３は、遊離メイタンシンと対比したＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６の抗原が陽性である卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞系を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートへの連続曝露の細胞毒性について試験した（左パネル）。これらの細胞系を、遊離メイタンシンへの７２時間曝露により同様にメイタンシン感受性について試験した（右パネル）。試験した卵巣癌細胞系は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞系は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞系は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞系は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−４】図２３は、遊離メイタンシンと対比したＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６の抗原が陽性である卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞系を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートへの連続曝露の細胞毒性について試験した（左パネル）。これらの細胞系を、遊離メイタンシンへの７２時間曝露により同様にメイタンシン感受性について試験した（右パネル）。試験した卵巣癌細胞系は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞系は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞系は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞系は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２４−１】図２４は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。ＭＴＴ細胞生存率アッセイにおいて、ヒトの卵巣癌（図２４Ａ、図２４Ｂおよび図２４Ｃ）、乳癌（図２４Ｄおよび図２４Ｅ）、子宮頸癌（図２４Ｆおよび図２４Ｇ）および膵臓癌（図２３Ｈおよび図２４Ｉ）細胞系は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲート依存性で死滅した。裸のＤＳ６はこれらの細胞の増殖に有害な作用を及ぼさなかった。これは、細胞毒性にとってＤＭ１コンジュゲーションが必要であることを示す。
【図２４−２】図２４は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。ＭＴＴ細胞生存率アッセイにおいて、ヒトの卵巣癌（図２４Ａ、図２４Ｂおよび図２４Ｃ）、乳癌（図２４Ｄおよび図２４Ｅ）、子宮頸癌（図２４Ｆおよび図２４Ｇ）および膵臓癌（図２３Ｈおよび図２４Ｉ）細胞系は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲート依存性で死滅した。裸のＤＳ６はこれらの細胞の増殖に有害な作用を及ぼさなかった。これは、細胞毒性にとってＤＭ１コンジュゲーションが必要であることを示す。
【図２５】図２５Ａは、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが、樹立した皮下ＫＢ腫瘍異種移植体に及ぼすインビボ抗腫瘍効果試験の結果を示す。腫瘍細胞を０日目に接種し、６日目に第１回の処理を行った。免疫コンジュゲート処理を１日１回、合計５回続けた。腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートをＤＭ１  １５０または２２５μｇ／ｋｇの用量で投与した：それぞれ５．７および８．５ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に相当する。試験期間中、マウスの体重（図２５Ｂ）をモニターした。
【図２６−１】図２６は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが、樹立した皮下腫瘍異種移植体に及ぼす抗腫瘍効果試験の結果を示す。ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を０日目に接種し、６および１３日目に免疫コンジュゲート処理を行った。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートをＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇの用量で投与した：これは２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に相当する。試験期間中、腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）およびマウスの体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）をモニターした。
【図２６−２】図２６は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが、樹立した皮下腫瘍異種移植体に及ぼす抗腫瘍効果試験の結果を示す。ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を０日目に接種し、６および１３日目に免疫コンジュゲート処理を行った。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートをＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇの用量で投与した：これは２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に相当する。試験期間中、腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）およびマウスの体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）をモニターした。
【図２６−３】図２６は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが、樹立した皮下腫瘍異種移植体に及ぼす抗腫瘍効果試験の結果を示す。ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を０日目に接種し、６および１３日目に免疫コンジュゲート処理を行った。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートをＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇの用量で投与した：これは２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に相当する。試験期間中、腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）およびマウスの体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）をモニターした。
【図２６−４】図２６は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが、樹立した皮下腫瘍異種移植体に及ぼす抗腫瘍効果試験の結果を示す。ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を０日目に接種し、６および１３日目に免疫コンジュゲート処理を行った。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートをＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇの用量で投与した：これは２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に相当する。試験期間中、腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）およびマウスの体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）をモニターした。
【図２７】図２７は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートが腹腔内ＯＶＣＡＲ５腫瘍に及ぼすインビボ有効性試験の結果を示す。腫瘍細胞を０日目に腹腔内注射し、６および１３日目に免疫コンジュゲート処理を行った。体重減少が２０％を超えた時点で、動物を安楽死させた。
【図２８】図２８は、ＨｅＬａ細胞への裸およびタキサン−コンジュゲートＤＳ６抗体の結合親和性試験で得たフローサイトメトリー結合曲線を示す。タキサン（ＭＭ１−２０２）コンジュゲーションは、抗体の結合親和性に有害な影響を及ぼさない。ＤＳ６−ＭＭ１−２０２コンジュゲートの見掛けＫｄ（１．２４ｎＭ）は、裸のＤＳ６抗体のもの（６２９ｐＭ）よりわずかに大きかった。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
[62]  本発明は、特に抗ＣＡ６モノクローナル抗体、抗ＣＡ６ヒト化抗体、および抗ＣＡ６抗体フラグメントを提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントはそれぞれ、細胞表面のＣＡ６グリコトープを特異的に認識して結合するように設計される。多くのヒト腫瘍がＣＡ６を発現することが知られている：漿液性卵巣癌の９５％、子宮内膜様卵巣癌の５０％、子宮頸部の新生物の５０％、子宮内膜の新生物の６９％、外陰の新生物の８０％、胸部癌の６０％、膵臓腫瘍の６７％、および尿路上皮の腫瘍の４８％；しかし、正常なヒト組織が発現することは稀である。
【００４２】
[63]  Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6): 866-872 (2000)による報文は、ＣＡ６
エピトープが存在するタンパク質はＣＡ６エピトープを含むＮ−結合炭水化物をもつ８０ｋＤａのタンパク質であると誤って同定した；その際、彼らはハイブリドーマ上清を同定に用いた。その後、本発明者らは精製したＤＳ６を用いて、ＣＡ６エピトープは２５０ｋＤａを超える非ジスルフィド結合−糖タンパク質のＯ−結合炭水化物上にあることを立証した。さらに、この糖タンパク質をムチンＭｕｃ１と同定した。異なるＭｕｃ１対立遺伝
子は可変数タンデム反復配列（ＶＮＴＲ）ドメインに異なる数のタンデム反復配列をもつので、細胞はしばしばサイズの異なる２つの別個のＭｕｃ１タンパク質を発現する（Taylor-Papadimitriou, Biochim. Biophys. Acta 1455 (2-3): 301-13 (1999)）。ＶＮＴＲドメインの反復数の相異およびグリコシル化の相異のため、Ｍｕｃ１の分子量は細胞系毎に異なる。
【００４３】
[64]  ＣＡ６免疫反応性が過ヨウ素酸に対して感受性であることは、ＣＡ６が炭水化物エピトープ、すなわち”グリコトープ”であることを示す。さらにＣＡ６免疫反応性がビブリオコレラ（Vibrio cholerae）由来のノイラミニダーゼ処理に対対して感受性である
ことは、ＣＡ６がシアル酸依存性グリコトープ、すなわち”シアログリコトープ”であることを示す。
【００４４】
[65]  ＣＡ６の特性解明についての詳細は実施例２にある（後記を参照）。ＣＡ６についての詳細はさらに下記にある：
【００４５】
【化７】
2015012861.tif 000010
【００４６】
[66]  本発明には、２つの主成分を含む細胞毒性コンジュゲートも含まれる。第１成分は、ＣＡ６グリコトープを認識して結合する細胞結合剤である。細胞結合剤は、細胞毒性コンジュゲートが目標とする細胞のみを認識して結合するほど高度の特異性で、Ｍｕｃ１上のＣＡ６シアログリコトープを認識すべきである。高度の特異性により、コンジュゲートは非特異的結合から生じる副作用がほとんどなしに、標的を定めて作用することができる。
【００４７】
[67]  他の態様において、本発明の細胞結合剤はまた、コンジュゲートの細胞毒性薬物部分が細胞に作用しうるのに十分な期間、および／またはコンジュゲートが細胞にインターナリゼーションされるのに十分な期間、コンジュゲートが標的細胞と接触しているほど高度の親和性で、ＣＡ６グリコトープを認識する。
【００４８】
[68]  好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートは細胞結合剤として抗ＣＡ６抗体、より好ましくはネズミＤＳ６抗ＣＡ６モノクローナル抗体を含む。より好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートはヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む。ＤＳ６抗体はＣＡ６を高度の特異性で認識することができ、細胞毒性物質を異常な細胞または組織、たとえば癌細胞へ、標的を定めて指向させる。
【００４９】
[69]  本発明の細胞毒性コンジュゲートの第２成分は、細胞毒性物質である。好ましい態様において、細胞毒性物質はタキソール類、メイタンシノイド類、たとえばＤＭ１もしくはＤＭ４、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。好ましい態様において本発明の細胞結合剤は、直接に、または開裂性もしくは非開裂性のリンカーを介して、細胞毒性物質に共有結合している。
【００５０】
[70]  細胞結合剤、細胞毒性物質、およびリンカーについて、以下に詳述する。
細胞結合剤
[71]  療法薬としての本発明化合物の有効性は、適切な細胞結合剤を慎重に選択することに依存する。細胞結合剤は、現在知られている、または将来知られる、いかなる種類であってもよく、これにはペプチドおよび非ペプチドが含まれる。細胞結合剤は、細胞を特異的または非特異的に結合しうるいかなる化合物であってもよい。一般に、これらは抗体（特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養輸送分子（たとえばトランスフェリン）、または他のいずれかの細胞結合性の分子もしくは物質であってよい。
【００５１】
[72]  使用できる結合剤のより具体的な例には、下記のものが含まれる：
（ａ）ポリクローナル抗体；
（ｂ）モノクローナル抗体；
（ｃ）抗体のフラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ（Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)；Spring et al., J. Immunol. 113: 470-478 (1974)；Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)）；
（ｄ）インターフェロン（たとえばα、β、γ）；
（ｅ）リンホカイン、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
（ｆ）ホルモン、たとえばインスリン、ＴＲＨ（チロトロピン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、たとえばアンドロゲンおよびエストロゲン；
（ｇ）増殖因子、たとえばコロニー刺激因子、たとえばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Burgess, Ｉmmunology Today 5: 155-158 (1984)）；
（ｈ）トランスフェリン（O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 260: 932-937 (1985)）；ならびに
（ｉ）ビタミン、たとえば葉酸類。
【００５２】
抗体
[73]  適切な細胞結合剤の選択は、標的とする個々の細胞集団に依存する事項であるが、適切な抗体を入手または調製できれば一般に抗体が好ましく、モノクローナル抗体がより好ましい。
【００５３】
[74]  モノクローナル抗体法により、特異的モノクローナル抗体の形のきわめて特異的な細胞結合剤を調製できる。当技術分野で特に周知の方法は、マウス、ラット、ハムスターその他のいずれかの哺乳動物を目的の抗原、たとえば無傷の標的細胞、標的細胞から単離した抗原、全ウイルス体、弱毒した全ウイルス体、およびウイルスタンパク質、たとえばウイルスコートタンパク質で免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体を作製する方法である。感作されたヒト細胞も使用できる。モノクローナル抗体を作製するための他の方法は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変部）、特にヒトｓｃＦｖのファージライブラリーの使用である（たとえば、Griffiths et al., USP 5,885,793および5,969,108；McCafferty et al., WO 92/01047；Liming et al., WO 99/06587を参照）。
【００５４】
[75]  典型的な抗体は、ジスルフィド結合により連結した２つの同一Ｈ鎖と２つの同一Ｌ鎖からなる。可変部は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の一部であって、抗体間で配列が異なり、抗原に対する個々の抗体の結合および特異性において協調する部分である。変動は必ずしも抗体可変部全体に均一に分布するわけではない。変動は一般に、Ｌ鎖およびＨ鎖両方の可変部において、可変部の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変部と呼ばれる３つのセグメント内に集中している。より高度に保存された部分の可変部はフレームワーク領域と呼ばれる。Ｈ鎖およびＬ鎖の可変部は４つのフレームワーク領域を含み、これらは多く
の場合βシート構造をとり、各フレームワーク領域は３つのＣＤＲにより連結し、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によって近接した状態に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（E.A.Kabat et al., Sequences of 
Ｉmmunological Interest, 第5版, 1991, NIH）。
【００５５】
[76]  定常部は、Ｈ鎖の一部である。それは抗原への抗体の結合に直接には関係しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与など、実際には多様なエフェクター機能を示す。
【００５６】
[77]  本発明に使用するのに適したモノクローナル抗体には、ネズミＤＳ６モノクローナル抗体が含まれる（USP 6,596,503；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４４９）。
ヒト化またはリサーフェシングしたＤＳ６抗体
[78]  好ましくは、ヒト化した抗ＣＡ６抗体を本発明の細胞結合剤として使用する。そのようなヒト化抗体の好ましい態様は、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである。
【００５７】
[79]  ヒト化の目標は、抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を維持した状態で、異種抗体、たとえばネズミ抗体をヒトに導入するために免疫原性を低下させることである。
【００５８】
[80]  ヒト化抗体は、リサーフェシングおよびＣＤＲグラフト形成など幾つかの方法により調製できる。本発明において用いるリサーフェシング法は、分子モデリング、統計学的分析および変異誘発を併用して、抗体可変部の非ＣＤＲ表面を標的宿主の既知抗体の表面に類似するように変化させる。
【００５９】
[81]  抗体をリサーフェシングする方策および方法、ならびに異なる宿主内での抗体の免疫原性を低下させる他の方法は、USP 5,639,641（Pedersenら）に開示されており、そ
の全体を本明細書に援用する。要約すると、好ましい方法においては、（１）抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変部プールの位置アラインメントを作成して、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を求め、その際すべての可変部についてのアラインメント位置が少なくとも約９８％同一であり；（２）げっ歯類の抗体（またはそのフラグメント）について、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を決定し；（３）げっ歯類の表面露出した一組のアミノ酸残基に最も近い同一性を有する、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を同定し；（４）工程（２）で決定した、Ｈ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基において、げっ歯類抗体の相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から５Å以内にあるアミノ酸残基以外を、工程（３）で決定したＨ鎖およびＬ鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し；こうして（５）結合特異性をもつヒト化したげっ歯類抗体を製造する。
【００６０】
[82]  下記を含めた他の多様な方法で抗体をヒト化することができる：ＣＤＲグラフト形成（EP 0 239 400；WO 91/09967；USP 5,530,101；および5,585,089）、ベニーリング
（veneering）またはリサーフェシング（EP 0 592 106；EP 519 596；Padlan E.A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498；Studnika G.M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814；Roguska M.A. et al., 1994, PNAS 91: 969-973）、および連鎖シャフリング（USP 5,565,332）。ヒト抗体は、ファージディスプレー法を含めた多様
な既知方法により調製できる。USP 4,444,887、4,716,111、5,545,806、および5,814,318；ならびに国際特許出願公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO
96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照（これらの参考文献の全体を本明細
書に援用する）。
【００６１】
[83]  好ましい態様において、本発明はＭｕｃ１ムチン上の新規なシアログリコトープ（ＣＡ６グリコトープ）を認識するヒト化抗体またはそのフラグメントを提供する。他の態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、さらにＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する能力をもつ。
【００６２】
[84]  より好ましい態様においては、ヒト化またはリサーフェシングしたバージョンのＤＳ６抗体であって、該抗体またはそのフラグメントのＬ鎖およびＨ鎖の両方において表面に露出した残基を既知のヒト抗体表面にいっそう近似するものに置換した抗体が提供される。本発明のヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、改良された特性をもつ。たとえば、発明のヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、Ｍｕｃ１ムチン上の新規なシアログリコトープ（ＣＡ６グリコトープ）を特異的に認識する。より好ましくは、本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、さらにＣＡ６グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する能力をもつ。本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを、薬物、たとえばメイタンシノイド類にコンジュゲートさせると、新規なＭｕｃ１シアログリコトープＣＡ６へその薬物をターゲティングすることにより抗原発現細胞に対して特異的な細胞毒性をもつプロドラッグを形成できる。そのような抗体および低分子高毒性薬物（たとえばメイタンシノイド類、タキサン類、およびＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞毒性コンジュゲートを、腫瘍、たとえば胸部腫瘍および卵巣腫瘍の処置のための療法薬として使用できる。
【００６３】
[85]  本発明のヒト化バージョンＤＳ６抗体を、それらのＨ鎖およびＬ鎖両方の可変部の各アミノ酸配列、Ｌ鎖およびＨ鎖両方の可変部の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、それらの表面アミノ酸の同定、ならびに組換え形態でそれらを発現させる手段の開示に関して、本明細書中で完全に解明する。
【００６４】
[86]  １態様においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３により表わされるアミノ酸配列：
【００６５】
【化８】
2015012861.tif 000011
【００６６】
を有するＣＤＲを含むＨ鎖をもつ、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[87]  Ｈ鎖ＣＤＲをＡｂＭモデリングソフトウェアにより決定すると、それらはＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２０〜２２：
【００６７】
【化９】
2015012861.tif 000012
【００６８】
により表わされる。
[88]  同態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４〜６により表わされるアミノ酸配列：
【００６９】
【化１０】
2015012861.tif 000013
【００７０】
を有するＣＤＲを含むＬ鎖をもつ。
[89]  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表わされるアミノ酸配列：
【００７１】
【化１１】
2015012861.tif 000014
【００７２】
との少なくとも９０％の配列同一性を備えたアミノ酸配列を有するＬ鎖可変部をもつ、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントをも提供する。
[90]  同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１により表わされるアミノ酸配列：
【００７３】
【化１２】
2015012861.tif 000015
【００７４】
との少なくとも９０％の配列同一性を備えたアミノ酸配列を有するＨ鎖可変部をもつ、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[91]  他の態様においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
【００７５】
【化１３】
2015012861.tif 000016
【００７６】
に対応するアミノ酸配列を有するヒト化またはリサーフェシングしたＬ鎖可変部をもつ、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[92]  同様に、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
【００７７】
【化１４】
2015012861.tif 000017
【００７８】
に対応するアミノ酸配列を有するヒト化またはリサーフェシングしたＨ鎖可変部をもつ、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。
[93]  本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、ｍｕＤＳ６の結合親和性および特異性を保持するために、Ｌ鎖および／またはＨ鎖可変部のＣＤＲに近接するヒト表面アミノ酸残基の１以上の位置において、対応する表１の星印の残基（Ｋａｂａｔ番号表示）により定められるｍｕＤＳ６表面残基で交換されたバージョンをも含む。
【００７９】
【表３】
2015012861.tif 000018
【００８０】
[94]  ＤＳ６抗体のＬ鎖およびＨ鎖ならびにそのヒト化バージョンの一次アミノ酸およびＤＮＡ配列を本明細書に開示する。ただし、本発明の範囲はこれらの配列を含む抗体およびフラグメントに限定されるのではなく、Ｍｕｃ１受容体上の腫瘍特異的ユニークグリコトープとしてのＣＡ６に特異的に結合するすべての抗体およびフラグメントが本発明に含まれる。好ましくは、ＣＡ６に特異的に結合する抗体およびフラグメントは、その受容体の生物活性に拮抗する。より好ましくは、そのような抗体はさらに実質的にアゴニスト活性をもたない。したがって本発明の抗体および抗体フラグメントは、ＤＳ６抗体またはそのヒト化誘導体とはそれらの骨格、ＣＤＲ、ならびに／あるいはＬ鎖およびＨ鎖のアミノ酸配列が異なっていても、なお本発明の範囲に含まれる可能性がある。
【００８１】
[95]  ＤＳ６抗体のＣＤＲをモデリングにより同定し、それらの分子構造を推定した。この場合も、ＣＤＲはエピトープ認識にとって重要であるが、それらは本発明の抗体および抗体フラグメントに必須ではない。したがって、たとえば本発明の抗体の親和性変異により生じる改良された特性をもつ抗体およびフラグメントが提供される。
【００８２】
[96]  ＤＳ６が由来すると思われるマウスＬ鎖ＩｇＶ？ａｐ４生殖系列遺伝子およびＨ鎖ＩｇＶｈ  Ｊ５５８．４１生殖系列遺伝子を、ＤＳ６抗体の配列とアラインさせたものを図１１に示す。この比較により、ＣＤＲ中の幾つかを含めて、ＤＳ６抗体中に可能な体細胞変異を同定する。
【００８３】
[97]  ＤＳ６抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変部の配列、ならびにＤＳ６抗体のＣＤＲの配列は、これまで知られておらず、それらを図９Ａおよび９Ｂに示す。そのような情報を用いて、ヒト化バージョンのＤＳ６抗体を製造できる。
【００８４】
抗体フラグメント
[98]  本発明の抗体には、前記に述べた全長抗体およびエピトープ結合フラグメントの両方が含まれる。本明細書中で用いる”抗体フラグメント”には、全長抗体が認識するエピトープに結合する能力を保持する抗体部分がいずれも含まれ、一般に”エピトープ結合フラグメント”と呼ばれる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨ領域を含むフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含めたエピトープ結合フラグメントは、可変部（１以上）を単独で、または下記のものの全体もしくは一部と組み合わせて含むことができる：ヒンジ部、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。
【００８５】
[99]  そのようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの一方または両方を含むことができる。好ましくは、抗体フラグメントは全抗体の６つのＣＤＲすべてを含むが、そのような領域すべてより少ない領域、たとえば３、４または５つのＣＤＲを含むフラグメントも機能性である。さらに、これらのフラグメントは下記の免疫グロブリンクラスのいずれかのメンバーであってもよく、あるいはそれらのメンバーを結合していてもよい：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそのサブクラス。
【００８６】
[100]  ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント
）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）などの酵素を用いるタンパク質分解開裂により調製することができる。
【００８７】
[101]  一本鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、抗体Ｌ鎖可変部（ＶＬ）の少なくと
も１つのフラグメントに連結した抗体Ｈ鎖可変部（ＶＨ）の少なくとも１つのフラグメントを含む、エピトープ結合フラグメントである。リンカーは、一本鎖抗体フラグメントが由来する全抗体の標的分子結合特異性を維持するように、（ＶＬ）および（ＶＨ）領域が連結した際にそれらの適正な三次元フォールディングが確実に起きるように選択された短かいフレキシブルペプチドであってよい。（ＶＬ）または（ＶＨ）配列のカルボキシル末端は、相補的な（ＶＬ）または（ＶＨ）配列のアミノ酸末端に、リンカーにより共有結合していてもよい。
【００８８】
[102]  本発明の一本鎖抗体フラグメントは、本明細書に記載する全抗体の少なくとも
１つの可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）をもつが、これらの抗体の定常ドメインの一部または全部を欠如する、アミノ酸配列を含む。これらの定常ドメインは抗原結合には必要ないが、全抗体の構造の主要部分を構成する。したがって一本鎖抗体フラグメントは、定常ドメインの一部または全部を含む抗体の使用に伴う問題の一部を克服することができる。たとえば一本鎖抗体フラグメントは、生体分子とＨ鎖定常部の不都合な相互作用または他の目的外の生物活性がないという傾向をもつ。さらに、一本鎖抗体フラグメントは全抗体よりかなり小さく、したがって毛管透過性が全抗体より大きいので、一本鎖抗体フラグメントはより効率的に標的抗原結合部位に局在化して結合することができる。また、抗体フラグメントは原核細胞において比較的大規模に産生することができ、したがってそれらの製造が容易になる。さらに、相対的に小さいサイズの一本鎖抗体フラグメントは、全抗体よりレシピエントにおいて免疫反応を誘発する可能性がより少ない。
【００８９】
[103]  一本鎖抗体フラグメントは、当業者に周知の分子クローニング、抗体ファージ
ディスプレーライブラリー、またはこれらに類する方法で調製できる。これらのタンパク質は、たとえば真核細胞、または細菌を含めた原核細胞において産生できる。本発明のエピトープ結合フラグメントは、当技術分野で既知の種々のファージディスプレー法によっても調製できる。ファージディスプレー法では、機能性抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に、機能性抗体ドメインを表示させる。特に、そのようなファージを用いて、レパトアまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（たとえばヒトまたはネズミ）から発現するエピトープ結合ドメインを表示させることができる。目的抗原を結合するエピトープ結合ドメインを発現するファージを、抗原により、たとえば固体表面またはビーズに結合または捕獲させた標識抗原により、選択または同定することができる。これらの方法に用いるファージは一般に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合させたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインをもつファージから発現させたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファージである。
【００９０】
[104]  本発明のエピトープ結合フラグメントの製造に使用できるファージディスプレ
ー法の例には、下記に開示されるものが含まれる；
【００９１】
【化１５】
2015012861.tif 000019
【００９２】
これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
[105]  ファージを選択した後、前記フラグメントをコードするファージ領域を単離し
、選択した宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）において、たとえば下記に詳述する組換えＤＮＡ法で発現させることにより、エピトープ結合フラグメントを製造できる。たとえば、下記に開示される当技術分野で既知の方法によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え製造する技術も使用できる；国際特許出願公開WO 92/22324；Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864-869；Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34；およびBetter et al., 1988, Science 240: 1041-1043；これらの参考文献の全体を本明細書に援用する。一本鎖Ｆｖおよび抗体を製造
するために使用できる技術の例には、USP 4,946,778および5,258,498；Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88；Shu et al., 1993, PNAS 90: 7995-7999；Skerra et al., 1988, Science 240: 1038-1040に記載のものが含まれる。
【００９３】
機能均等物
[106]  本発明には、抗ＣＡ６抗体およびヒト化した抗ＣＡ６抗体の機能均等物も含ま
れる。用語”機能均等物”には、たとえば相同配列をもつ抗体、キメラ抗体、人工抗体および修飾抗体が含まれ、その際、機能均等物はそれぞれ、ＣＡ６に結合する能力により規定される。”抗体フラグメント”と呼ばれる分子グループと”機能均等物”と呼ばれるグループに重複があることは、当業者に理解されるであろう。機能均等物を製造する方法は、たとえば国際特許出願公開WO 93/21319；欧州特許出願239,400；国際特許出願公開WO 89/09622；欧州特許出願338,745；および欧州特許出願EP 332,424に開示されており、これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００９４】
[107]  相同配列をもつ抗体は、本発明の抗ＣＡ６抗体およびヒト化した抗ＣＡ６抗体
のアミノ酸配列との配列相同性をもつアミノ酸配列を有する抗体である。好ましくは、相同性は本発明の抗ＣＡ６抗体およびヒト化した抗ＣＡ６抗体の可変部のアミノ酸配列との相同性である。本明細書中のアミノ酸配列に適用する”配列相同性”は、たとえばPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)によるＦＡＳＴＡ検索法により判定して、他のアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３
％、または９４％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性をもつ配列と定義される。
【００９５】
[108]  本明細書中で用いるキメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来す
るものである。たとえばネズミモノクローナル抗体に由来する可変部をもつ抗体をヒト免疫グロブリン定常部と対合させる。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で既知である。たとえばMorrison, 1985, Science 229: 1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202；USP 5,807,715；4,816,567；および4,816,397を参照；それらの全体を本明細書に援用する。
【００９６】
[109]  ヒト化形のキメラ抗体は、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒトフレー
ムワークドメイン中へ置換することにより作製できる；たとえば国際特許出願公開WO 92/22653を参照。ヒト化キメラ抗体は、実質的または全体的に、対応するヒト抗体領域に由
来する定常部および相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変部と、実質的または全体的にヒト以外の哺乳動物に由来するＣＤＲをもつ。
【００９７】
[110]  人工抗体には、ｓｃＦｖフラグメント、ジアボディー、トリアボディー、テト
ラボディーおよびｍｒｕが含まれる（Winter, G. and Milstein, C., 1991, Nature 349:
293-299；Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology 11: 548-557による概
説を参照）；これらはそれぞれ抗原結合能をもつ。一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）の場合、抗体のＶＨおよびＶＬドメインがフレキシブルペプチドにより連結される。一般にこのリンカーペプチドはアミノ酸残基約１５個の長さである。リンカーがこれよりはるかに小さく、たとえばアミノ酸５個の場合、ジアボディーが形成され、これは二価ｓｃＦｖ二量体である。リンカーをアミノ酸残基３個未満に短かくすると、トリアボディーおよびテトラボディーと呼ばれる三量体および四量体構造が形成される。抗体の最小結合単位は、ＣＤＲ、一般にＨ鎖のＣＤＲ２であり、これは別個に使用できるのに十分な特異的認識能および結合能をもつ。そのようなフラグメントは、分子認識単位、すなわちｍｒｕと呼ばれる。そのようなｍｒｕ数個を短かいリンカーペプチドで結合させ、したがって１個のｍｒｕより高いアビディティーをもつ人工的な結合タンパク質を形成することができる。
【００９８】
[111]  本発明の機能均等物には、修飾抗体、たとえば抗体にいずれかのタイプの分子
を共有結合させることにより修飾された抗体も含まれる。たとえば修飾抗体には、たとえばグリコシル化、ペジル化（pegylation）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾された抗体が含まれる。共有結合は抗体が抗イディオタイプ応答を発するのを妨げない。これらの修飾は既知の方法により実施でき、これには特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、修飾抗体は１以上の非古典アミノ酸を含むことができる。
【００９９】
[112]  機能均等物は、異なるフレームワーク内の異なる鎖上にある異なるＣＤＲを交
換することにより製造できる。たとえば異なるＨ鎖の置換により、特定の一組のＣＤＲについて異なるクラスの抗体が得られ、これによりたとえばＩｇＧ１−４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１−２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプおよびイソタイプを製造することができる。同様に、特定の一組のＣＤＲを完全合成フレームワーク内に埋め込むことにより、本発明の範囲に含まれる人工抗体を製造できる。
【０１００】
[113]  機能均等物は、当技術分野で既知の多様な方法を用いた、特定の一組のＣＤＲ
を囲む可変部および／または定常部の配列内における変異、欠失および／または挿入によって容易に製造できる。
【０１０１】
[114]  本発明の抗体フラグメントおよび機能均等物には、ＤＳ６抗体と比較して検出
可能な、ＣＡ６への結合度をもつ分子が含まれる。検出可能な結合度には、ＣＡ６へのネズミＤＳ６抗体の結合能の少なくとも１０〜１００％の範囲、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のすべての数値が含まれる。
【０１０２】
改良された抗体
[115]  ＣＤＲは、エピトープ認識および抗体結合にとって第１に重要である。しかし
、抗体がそれのコグネイトエピトープを認識して結合する能力を妨げることなく、ＣＤＲを構成する残基を交換することができる。たとえばエピトープ認識には影響を与えずにエピトープに対する抗体の結合親和性を高める交換を行うことができる。
【０１０３】
[116]  したがって本発明の範囲には、同様に特異的にＣＡ６を認識し、好ましくはよ
り高い親和性で結合する、改良バージョンのネズミおよびヒト両方の抗体が含まれる。
[117]  幾つかの研究は、一次抗体配列の知見に基づいて抗体の配列内の多様な位置に
１以上のアミノ酸交換を導入することが、抗体の特性、たとえば結合および発現レベルに及ぼす影響を探索した（Yang, W.P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403；Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915；Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539）。
【０１０４】
[118]  これらの研究において、オリゴヌクレオチド仲介による部位特異的変異誘発、
カセット変異誘発、誤りがちなＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミューテーター株などの方法で、Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３またはフレームワーク領域の配列を変化させることにより、一次抗体の均等物が形成された（Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539；Adey, N.B. et al.,”Phage Display of Peptides and Proteins”,1996, 16章, pp.277-291, 編者Kay, B.K. et al., Academic Press）。一次抗体の配列を変化させるこれらの方法により、二次抗体の親和性が改良された
【０１０５】
【化１６】
2015012861.tif 000020
【０１０６】
[119]  抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる同様な特異的方式により、本明細書
に記載する抗体配列を用いて、ＣＡ６に対する改良された親和性など、改良された機能をもつ抗ＣＡ６抗体を開発することができる。
【０１０７】
[120]  改良された抗体には、動物の免疫化、ハイブリドーマ形成、および特異的特性
をもつ抗体の選択のための標準法により製造された、改良された特性をもつ抗体も含まれる。
【０１０８】
細胞毒性物質
[121]  本発明の細胞毒性コンジュゲートに用いられる細胞毒性物質は、細胞死に至ら
せ、または細胞死を誘発し、または何らかの様式で細胞の生存性を低下させる、いかなる化合物であってもよい。好ましい細胞毒性物質には、たとえば後記に定めるメイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド類、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、ドラスタチン（dolastatin）およびドラスタチン類似体が含まれる。これらの細胞毒性物質を、本明細書に開示する抗体、抗体フラグメント、機能均等物、改良された抗体およびそれらの類似体にコンジュゲートさせる。
【０１０９】
[122]  細胞毒性コンジュゲートは、インビトロ法により製造できる。薬物またはプロ
ドラッグを抗体に結合させるために、連結基を用いる。適切な連結基は当技術分野で周知であり、これにはジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。たとえばジスルフィド交換反応を用いて、または抗体と薬物またはプロドラッグの間にチオエーテル結合を形成することにより、コンジュゲートを構築できる。
【０１１０】
メイタンシノイド類
[123]  細胞毒性コンジュゲートを形成するために本発明に使用できる細胞毒性物質に
は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体が含まれる。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノール（maytansinol）およびメイタンシノール類似体が含まれ
る。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して毒性の高い薬物である。
【０１１１】
[124]  適切なメイタンシノール類の例には、修飾された芳香環をもつもの、および他
の位置に修飾をもつものが含まれる。そのような適切なメイタンシノイド類は、下記USP
に記載されている：
【０１１２】
【化１７】
2015012861.tif 000021
【０１１３】
[125]  修飾された芳香環をもつ適切なメイタンシノール類似体の具体例には、下記の
ものが含まれる：
[126]  （１）Ｃ−１９−デクロロ（USP 4,256,746）（アンサマイトシン（ansamytocin）Ｐ２のＬＡＨ還元により製造）；
[127]  （２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−
デクロロ（USP 4,361,650および4,307,016）（ストレプトミセス属（Streptomyces）もしくはアクチノミセス属（Actinomyces）を用いる脱メチル、またはＬＡＨを用いる脱クロ
ロにより製造）；および
[128]  （３）Ｃ−２０−デメトキシ，Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）＋／−
デクロロ（USP 4,294,757）（塩化アシルを用いるアシル化により製造）。
【０１１４】
[129]  他の位置に修飾をもつ適切なメイタンシノール類似体の具体例には、下記のも
のが含まれる：
[130]  （１）Ｃ−９−ＳＨ（USP 4,424,219）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５の反応により製造）；
[131]  （２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（USP 4,331,5
98）；
[132]  （３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨま
たはＣＨ２ＯＡｃ）（USP 4,450,254）（ノカルディア属（Nocardia）から製造）；
[133]  （４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（USP 4,364,866）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換により製造）；
[134]  （５）Ｃ−１５−メトキシ（USP 4,313,946および4,315,929）（トレビア・ヌ
ーディフロラ（Trewia nudiflora）から単離）；
[135]  （６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（USP 4,362,663および4,322,348）（ストレプ
トミセス属によるメイタンシノールの脱メチルにより製造）；および
[136]  （７）４，５−デオキシ（USP 4,371,533）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により製造）。
【０１１５】
[137]  好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートは、チオール含有メ
イタンシノイド（ＤＭ１）、正式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれるものを細胞毒性物質として使用する。ＤＭ１は、下記の構造式（Ｉ）により表わされる：
【０１１６】
【化１８】
2015012861.tif 000022
【０１１７】
[138]  他の好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートは、チオール含
有メイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンを細胞毒性物質として使用する。ＤＭ４は、下記の構造式（ＩＩ）により表わされる：
【０１１８】
【化１９】
2015012861.tif 000023
【０１１９】
[139]  本発明の他の態様においては他のメイタンシン類を使用でき、これには硫黄原
子を保有する炭素原子におけるモノまたはジ−アルキル置換をもつチオール−およびジスルフィド含有メイタンシノイドが含まれる。これらには、下記をもつメイタンシノイドが
含まれる：Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチル、アシル基がヒンダードスルフヒドリル基を保有するアシル化アミノ酸側鎖、その際チオール官能基を保有するアシル基の炭素原子は１または２つの置換基をもち、それらの置換基はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子をもつ直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子をもつ環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに置換基の１つはＨであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
【０１２０】
[140]  そのような他のメイタンシン類には、式（ＩＩＩ）により表わされる化合物が
含まれる：
【０１２１】
【化２０】
2015012861.tif 000024
【０１２２】
式中：
Ｙ’は、
【０１２３】
【化２１】
2015012861.tif 000025
【０１２４】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕのうち少なくとも２つはいかなる場合にもゼロではなく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖
アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
【０１２５】
[141]  式（ＩＩＩ）の好ましい態様には、下記の式（ＩＩＩ）の化合物が含まれる：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、ＺがＨである；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、ＺがＨである；
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｚが−ＳＣＨ３である；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ３である。
【０１２６】
[142]  そのような他のメイタンシン類には、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）または（
ＩＶ−Ｄ，Ｌ）により表わされる化合物も含まれる：
【０１２７】
【化２２】
2015012861.tif 000026
【０１２８】
式中：
Ｙは、
【０１２９】
【化２３】
2015012861.tif 000027
【０１３０】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｍａｙは、Ｃ−３の側鎖、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシを有する、またはＣ−２０デスメチルであるメイタンシノイドを表わす。
【０１３１】
[143]  式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には、
下記の式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、ＺがＨである；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、ＺがＨである；
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である。
【０１３２】
[144]  好ましくは、細胞毒性物質は式（ＩＶ−Ｌ）で表わされる。
[145]  そのような他のメイタンシン類には、式（Ｖ）により表わされる化合物も含ま
れる：
【０１３３】
【化２４】
2015012861.tif 000028
【０１３４】
式中：
Ｙは、
【０１３５】
【化２５】
2015012861.tif 000029
【０１３６】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
【０１３７】
[146]  式（Ｖ）の好ましい態様には、下記の式（Ｖ）の化合物が含まれる：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍがそれぞれ１であり；ｎが０であり；ＺがＨである；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０であり；ＺがＨである；
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ３である。
【０１３８】
[147]  そのような他のメイタンシン類には、さらに式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）ま
たは（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）により表わされる化合物が含まれる：
【０１３９】
【化２６】
2015012861.tif 000030
【０１４０】
式中：
Ｙ２は、
【０１４１】
【化２７】
2015012861.tif 000031
【０１４２】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲまたはＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｍａｙは、メイタンシノイドである。
【０１４３】
[148]  そのような他のメイタンシン類には、式（ＶＩＩ）により表わされる化合物も
含まれる：
【０１４４】
【化２８】
2015012861.tif 000032
【０１４５】
式中：
Ｙ２’は、
【０１４６】
【化２９】
2015012861.tif 000033
【０１４７】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕのうち少なくとも２つはいかなる場合にもゼロではなく；
Ｚ２は、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
【０１４８】
[149]  式（ＶＩＩ）の好ましい態様には、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨである式（
ＶＩＩ）の化合物が含まれる。
[150]  前記のメイタンシノイド類を、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６またはその相同体もしくは
フラグメントにコンジュゲートさせることができる。その際、メイタンシノイドのＣ−３
にあるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基にあるチオール−もしくはジスルフィド官能基、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルを用いて、抗体をメイタンシノイドに結合させ、その際、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基のチオール−もしくはジスルフィド官能基は１または２つの置換基をもつ炭素原子にあり、それらの置換基はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子をもつ直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子をもつ分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに置換基の１つはＨであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
【０１４９】
[151]  本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＶＩＩＩ）のメイタンシノイドにコ
ンジュゲートした抗ＣＡ６抗体ＤＳ６またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
【０１５０】
【化３０】
2015012861.tif 000034
【０１５１】
式中：
Ｙ１’は、
【０１５２】
【化３１】
2015012861.tif 000035
【０１５３】
を表わし、ここで
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕのうち少なくとも２つはいかなる場合にも非ゼロではない。
【０１５４】
[152]  好ましくは、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、あるいはＲ１およびＲ２
がメチルである。
[153]  本発明のより好ましいコンジュゲートは、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）また
は（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）のメイタンシノイドにコンジュゲートした抗ＣＡ６抗体ＤＳ６またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
【０１５５】
【化３２】
2015012861.tif 000036
【０１５６】
式中：
Ｙ１は、
【０１５７】
【化３３】
2015012861.tif 000037
【０１５８】
を表わし、ここで
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｍａｙは、Ｃ−３の側鎖、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシを有する、またはＣ−２０デスメチルであるメイタンシノイドを表わす。
【０１５９】
[154]  式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には、
下記の式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであるか、あるいはＲ１およびＲ２がメチルである；
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍがそれぞれ１であり；ｎが０である；
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０である。
【０１６０】
[155]  好ましくは、細胞毒性物質は式（ＩＸ−Ｌ）で表わされる。
[156]  本発明のより好ましいコンジュゲートは、式（Ｘ）のメイタンシノイドにコン
ジュゲートした抗ＣＡ６抗体ＤＳ６またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
【０１６１】
【化３４】
2015012861.tif 000038
【０１６２】
式中の置換基は前記の式（ＩＸ）について定めたものである。
[157]  特に好ましいものは、前記化合物においてＲ１がＨであり、Ｒ２がメチルであ
り、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０である化合物である。
【０１６３】
[158]  さらに特に好ましいものは、前記化合物においてＲ１およびＲ２がメチルであ
り、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０である化合物である。
【０１６４】
[159]  さらに、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好ましい。
[160]  出願中の米国特許出願10/849,136（2004年5月20日出願）に教示される各メイタンシノイドも、本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できる。米国特許出願10/849,136の開示内容全体を本明細書に援用する。
【０１６５】
ジスルフィドを含む連結基
[161]  メイタンシノイド類を細胞結合剤、たとえばＤＳ６抗体に連結するために、メ
イタンシノイド類は連結部分を含む。連結部分には、完全に有効なメイタンシノイド類を特定の部位で放出しうる化学結合が含まれる。適切な化学結合は当技術分野で周知であり、これにはジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましいものはジスルフィド結合である。
【０１６６】
[162]  連結部分には、反応性化学基も含まれる。好ましい態様において、反応性化学
基はジスルフィド結合連結部分を介してメイタンシノイドに共有結合することができる。
[163]  特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スル
ホスクシンイミジルエステルである。
【０１６７】
[164]  反応性化学基を有する連結基を含む特に好ましいメイタンシノイド類は、メイ
タンシノールおよびその類似体のＣ−３エステルであって、連結部分はジスルフィド結合を含み、反応性化学基はＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む。
【０１６８】
[165]  メイタンシノイド類の多数の位置を連結部分の化学連結のための位置として使
用できる。たとえば、ヒドロキシ基をもつＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシ基をもつＣ−２０位がすべて有用であると予想される。しかし、Ｃ−３位が好ましく、メイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
【０１６９】
[166]  連結部分をもつメイタンシノールのエステルの合成を、ジスルフィド結合を含
む連結部分に関連して記載するが、他のメイタンシノイド類を使用できるのと同様に、他の化学結合（前記）をもつ連結部分も本発明に関して使用できることは当業者に理解されるであろう。他の化学結合の具体例には、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。USP 5,208,020（本明細書に援用する）
の開示内容は、そのような結合をもつメイタンシノイド類の製造を教示している。
【０１７０】
[167]  反応性基を有するジスルフィド部分をもつメイタンシノイドおよびメイタンシ
ノイド誘導体の合成は、USP 6,441,163および6,333,410、ならびに米国特許出願10/161,651に記載されており、それぞれを本明細書に援用する。
【０１７１】
[168]  反応性基を含むメイタンシノイド類、たとえばＤＭ１を、抗体、たとえばＤＳ
６抗体と反応させて、細胞毒性コンジュゲートを製造する。これらのコンジュゲートは、ＨＰＬＣまたはゲル濾過により精製できる。
【０１７２】
[169]  そのような抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを製造するための幾つかの
優れた方法が、USP 6,333,410、ならびに米国特許出願09/867,598、10/161,651および10/024,290に提示されており、それぞれの全体を本明細書に援用する。
【０１７３】
[170]  一般に、水性緩衝液中の抗体溶液を、反応性基を有するジスルフィド部分をも
つメイタンシノイドの過剰モルと共にインキュベートしてもよい。過剰のアミン（たとえばエタノールアミン、タウリンなど）の添加により、反応混合物を反応停止することができる。次いでメイタンシノイド−抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製することができる。
【０１７４】
[171]  抗体分子当たり結合したメイタンシノイド類の個数は、２５２ｎｍおよび２８
０ｎｍにおける吸光度の比を分光光度法で測定することにより判定できる。平均１〜１０個のメイタンシノイド分子／抗体分子が好ましい。
【０１７５】
[172]  抗体とメイタンシノイド薬物のコンジュゲートを、それらが多様な不都合な細
胞系の増殖を抑制する活性についてインビトロで評価することができる。たとえばヒト類表皮癌細胞系Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌細胞系ＳＷ２、ヒト胸部腫瘍細胞系ＳＫＢＲ３、およびバーキットリンパ腫細胞系Ｎａｍａｌｗａなどの細胞系を用いて、これらの化合物の細胞毒性を容易に評価することができる。評価すべき細胞を本発明化合物に２４時間曝露し、細胞の生存率を既知の方法による直接アッセイ法で測定することができる。次いでアッセイ結果からＩＣ５０値を計算できる。
【０１７６】
ＰＥＧを含む連結基
[173]  ＰＥＧ連結基を用いてメイタンシノイド類を細胞結合剤に結合させることもで
きる；米国特許出願10/024,290に記載。これらのＰＥＧ連結基は、水および非水性溶媒の両方に可溶性であり、１以上の細胞毒性物質を細胞結合剤に結合させるために使用できる。ＰＥＧ連結基の例にはヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが含まれ、これはこのリンカーの反対側の末端において、一端では官能性スルフヒドリル基またはジスルフィド基により、他端では活性エステルにより、細胞毒性物質と細胞結合剤に結合する。
【０１７７】
[174]  ＰＥＧ連結基を用いる細胞毒性コンジュゲートの合成の一般例として、具体的
な詳細について再び米国特許出願10/024,290を援用する。反応性ＰＥＧ部分をもつ１以上の細胞毒性物質を細胞結合剤と反応させることにより合成を開始し、それぞれの反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルを細胞結合剤のアミノ酸残基で置換して、ＰＥＧ連結基により細胞結合剤に共有結合した１以上の細胞毒性物質を含む細胞毒性コンジュゲートを得る。
【０１７８】
タキサン類
[175]  本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いる細胞毒性物質は、タキサン類
またはその誘導体であってもよい。
【０１７９】
[176]  タキサン類は、癌の処置に広く用いられている天然の細胞毒性産物パクリタキ
セル（paclitaxel）（タキソール、Taxol）、および半合成誘導体ドセタキセル（docetaxel）（タキソテレ、Taxotere）の２種類の化合物を含む化合物群である。タキサン類は有糸分裂紡錘体毒であり、チューブリンの開重合を阻害して細胞死に至らせる。ドセタキセルおよびパクリタキセルは癌の処置に有用な薬剤であるが、正常細胞に対するそれらの非特異的毒性のため、それらの抗腫瘍活性には限界がある。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの化合物自体は、細胞結合剤のコンジュゲート中に使用するのに十分なほど有効ではない。
【０１８０】
[177]  細胞毒性コンジュゲートの製造に使用するのに好ましいタキサンは、式（ＸＩ
）のタキサンである：
【０１８１】
【化３５】
2015012861.tif 000039
【０１８２】
[178]  本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できるタキサン類の合成方法、およ
びタキサン類を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートさせる方法は、USP 5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738および6,436,931、ならびに米国特許出願10/024,290、10/144,042、10/207,814、10/210,112および10/369,563に詳述されている。
【０１８３】
ＣＣ−１０６５類似体
[179]  本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いられる細胞毒性物質は、ＣＣ−
１０６５またはその誘導体であってもよい。
【０１８４】
[180]  ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Streptomyces zelensis）の培養ブロスから単離された有効な抗腫瘍性抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、慣用される抗癌薬、たとえばドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンより、インビトロで約１０００倍有効である（B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537
(1982)）。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、USP 6,372,738、6,340,701、5,846,545
および5,585,499に開示されている。
【０１８５】
[181]  ＣＣ−１０６５の細胞毒効力は、そのアルキル化活性およびそのＤＮＡ結合活
性またはＤＮＡインターカレーション活性と相関する。これら２つの活性は、この分子の別個の部分にある。たとえばアルキル化活性はシクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニット中に含まれ、ＤＮＡ結合活性は２つのピロロインドールサブユニット中にある。
【０１８６】
[182]  ＣＣ−１０６５は細胞毒性物質として、ある種の魅力的な特色をもつが、療法
使用には限界がある。ＣＣ−１０６５をマウスに投与すると、遅延性肝毒性を生じ、１２．５μｇ／ｋｇの静脈内１回投与後、５０日目に死亡した｛V.L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)｝。これは、遅延毒性を生じない類似体を開発する試みに拍車をかけ、ＣＣ−１０６５をモデルとしたより単純な類似体が報告された｛M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)｝。
【０１８７】
[183]  他の系列の類似体では、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンゾインドール（ＣＢＩ
）部分で置換された｛D.L.Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833 (1990)；D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)｝。これらの化合物は、
マウスにおいて遅延毒性を生じることなく親化合物の高いインビトロ力価を保持している。ＣＣ−１０６５と同様にこれらの化合物はアルキル化剤であり、ＤＮＡの副溝に共有結合様式で結合して、細胞死に至らせる。しかし、最も有望な類似体アドゼレシン（Adozelesin）およびカルゼレシン（Carzelesin）の臨床評価は、失望すべき結果をもたらした｛B.F.Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996)；I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2, 1717-1723 (1996)｝。これらの薬物はそれらの高い全身毒性
のため、低い療法効果を示す。
【０１８８】
[184]  ＣＣ−１０６５類似体の療法有効性は、腫瘍部位へ標的を定めて送達すること
によりインビボ分布を変化させ、標的外の組織に対する毒性を低下させ、これにより全身毒性を低下させることによって、大幅に改良できる。この目標を達成するために、ＣＣ−１０６５の類似体および誘導体と、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする細胞結合剤のコンジュゲートが報告された｛USP；5,475,092；5,585,499；5,846,545｝。これらのコンジュゲートは一般に、インビトロでの高い標的特異的毒性、およびマウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおける著しい抗腫瘍活性を示す｛R.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)｝。
【０１８９】
[185]  本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できるＣＣ−１０６５類似体を合成
する方法、およびこれらの類似体を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートさせる方法は、USP 5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660および6,586,618、ならびに米
国特許出願10/116,053および10/265,452に詳述されている。
【０１９０】
他の薬物
[186]  メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビン
ブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、およびクロラムブシル、カリケアマイシン（calicheamicin）、ツブリシン（tubulysin）およびツブリシン類似体、デュオカルマイシン（duocarmycin）およびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタ
チン類似体も、本発明のコンジュゲートの製造に適切である。これらの薬物分子も、中間キャリヤー分子、たとえば血清アルブミンにより、抗体分子に連結させることができる。たとえば米国特許出願09/740991に記載されるドキサルビシンおよびダウノルビシン化合
物も、有用な細胞毒性物質であろう。
【０１９１】
療法用組成物
[187]  本発明は、下記のものを含む療法用組成物をも提供する：
（ａ）有効量の１種類以上の細胞毒性コンジュゲート、および
（ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー。
【０１９２】
[188]  本発明は、特定の細胞集団の増殖を阻害する方法であって、標的細胞または標
的細胞を含む組織と、有効量の細胞毒性コンジュゲートとを、または細胞毒性コンジュゲートを単独でまたは他の細胞毒性物質もしくは療法薬と組み合わせて含む療法剤とを、接触させることを含む方法をも提供する。
【０１９３】
[189]  本発明は、本発明の療法用組成物を用いて癌を伴う対象を処置する方法をも含
む。
[190]  細胞毒性コンジュゲートを、インビトロ力価および特異性について、これまで
に記載された方法で評価することができる（たとえばR.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)を参照）。抗腫瘍活性は、マウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、同様にこれまでに記載された方法で評価することができる（たとえばLiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8618-8623 (1996)を参照）。
【０１９４】
[191]  医薬的に許容できる適切なキャリヤーは周知であり、当業者が臨床状況に基づ
いて決定できる。本明細書中で用いるキャリヤーには、希釈剤および賦形剤が含まれる。
[192]  適切なキャリヤー、希釈剤および／または賦形剤の例には、下記のものが含ま
れる：（１）ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、１〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するもの、または含有しないもの、（２）０．９％の食塩水（０．９％  ｗ／ｖの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）のデキストロース；酸化防止剤、たとえばトリプタミン（tryptamine）および安定剤Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有してもよい。
【０１９５】
[193]  特定の細胞集団の増殖を阻害する方法は、インビトロ、インビボ、またはエク
スビボで実施できる。本明細書中で用いる増殖阻害は、短期間または長期間のいずれであっても、細胞の増殖を遅延させ、細胞の生存性を低下させ、細胞死に至らせ、細胞を溶解し、および細胞死を誘発することを意味する。
【０１９６】
[194]  インビトロ使用の例には下記のものが含まれる：自己骨髄を同一患者に移植す
る前に罹患または悪性細胞を殺すための処理；骨髄を移植する前にコンピテントＴ細胞を殺して移植片対宿主疾患（GVHD）を防止するための処理；目的変異体以外の標的抗原を発現しないすべての細胞を殺すため、または不都合な抗原を発現する変異体を殺すための、細胞培養物の処理。
【０１９７】
[195]  臨床以外のインビトロ使用の条件は、当業者が容易に決定できる。
[196]  臨床エクスビボ使用の例は、癌の処置または自己免疫疾患の処置に際して自己
移植前に骨髄から腫瘍細胞またはリンパ球様細胞を除去すること、あるいは移植片対宿主疾患（GVHD）を防止するために移植前に自己または同種異系骨髄または組織からコンピテントＴ細胞および他のリンパ球様細胞を除去することである。処理は、下記に従って実施できる。骨髄を患者または他の個体から採取し、次いで本発明の細胞毒性物質を添加した血清含有培地中でインキュベートする。濃度約１０μＭ〜１ｐＭ、約３０分〜約４８時間、３７℃である。濃度およびインキュベーション時間の厳密な条件、すなわち用量は、当業者が容易に決定できる。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、既知の方法に従って静脈内注入により患者に戻す。患者が骨髄の採取時と処理済み細胞の再注入時との間に他の処置、たとえば切除化学療法または全身照射のコースを受ける場合、処置済み骨髄細胞を標準的な医療装置により液体窒素中に凍結保存しておく。
【０１９８】
[197]  臨床インビボ使用については、本発明の細胞毒性コンジュゲートを溶液として
調製し、これを無菌性および内毒素濃度について検査する。細胞毒性コンジュゲート投与のための適切なプロトコルの例は、下記のとおりである。コンジュゲートを週１回、４週間、静脈内ボーラスとして毎週投与する。ボーラス用量を５０〜１００ｍｌの生理食塩水中において投与し、これに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加してもよい。投与量は、静脈内に１回当たり１０μｇ〜１００ｍｇ（１日１００ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ）である。より好ましくは、投与量は５０μｇ〜３０ｍｇである。最も好ましくは、投与量は１〜２０ｍｇである。４週間の処置後、患者は週１回基準の処置を継続して受けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量、時間などに関する具体的な臨床プロトコルは、当業者が臨床状況に基づいて決定できる。
【０１９９】
[198]  特定の細胞集団を殺すためのインビボ法またはエクスビボ法により処置できる
病的状態の例には、たとえば下記を含めたいずれかのタイプの悪性疾患が含まれる：肺癌、胸部癌、結腸癌、前立腺癌、腎癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、ＣＡ６を発現する肉腫または癌、ならびにＣＡ６グリコトープを主に発現する他の癌であってまだ判定されていないもの；自己免疫疾患、たとえば全身性狼瘡、リウマチ様関節炎、および多発硬化症；移植片拒絶、たとえば腎移植片拒絶、肝移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶、および骨髄移植片拒絶；移植片対宿主疾患；ウイルス感染症、たとえばｍＶ感染症、ＨＩＶ感染症、エイズなど；ならびに寄生虫感染症、たとえばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症、ならびに当業者が判定する他の疾患。
【０２００】
キット
[199]  本発明には、たとえば前記の細胞毒性コンジュゲートおよび特定の細胞タイプ
を殺すのにその細胞毒性コンジュゲートを使用するための指示を含むキットも含まれる。指示には、細胞毒性コンジュゲートをインビトロ、インビボまたはエクスビボで使用するための指示が含まれる。
【０２０１】
[200]  一般にキットは細胞毒性コンジュゲートを収容するためのコンパートメントを
備えている。細胞毒性コンジュゲートは、キットに収容できる凍結乾燥した形、液状または他の形状であってよい。キットには、キット中の指示に述べられた方法を実施するのに必要な他の構成部材、たとえば凍結乾燥粉末を再構成するための無菌溶液、患者に投与する前に細胞毒性コンジュゲートと組み合わせる他の薬剤、およびコンジュゲートを患者に投与するのを補助する用具を収容してもよい。
【０２０２】
他の態様
[201]  本発明はさらに、研究または診断用途に使用するためにさらに標識したモノク
ローナル抗体、ヒト化抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。好ましい態様において、標識は放射性標識、発蛍光団、発色団、造影剤または金属イオンである。
【０２０３】
[202]  癌を伴う疑いのある対象に標識抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを
投与し、対象の体内における標識の分布を測定またはモニターする診断法も提供される。
【実施例】
【０２０４】
実施例
[203]  本発明の広い範囲は以下の実施例を参照すると最も良く理解される。これらは
本発明を特定の態様に限定するためのものではない。
【０２０５】
実施例１：フローサイトメトリー結合アッセイによる抗原陽性および陰性細胞系の同定
[204]  フローサイトメトリー分析を用いて、ＤＳ６エピトープであるＣＡ６を細胞表
面に局在化させた。ヒト細胞系は下記のもの以外をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した：ＯＶＣＡＲ５細胞（Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6): 866-872 (2000)）、ＯＶＣＡＲ８およびＩＧＲＯＶ１細胞（M. Seiden, Massachusetts General Hospital）。すべての細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Cambrex Bio Science、メーン
州ロックランド）および１０％  ｖ／ｖのウシ胎仔血清（Atlas Biologicals、コロラド
州フォート・コリンズ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（以下、培地と呼ぶ）で増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター内に維持した。
【０２０６】
[205]  細胞（１〜２×１０−５個／ウェル）を氷上で３〜４時間、９６ウェルプレー
ト内でＦＡＣＳ緩衝液（２％のヤギ血清、ＲＰＭＩ）中に調製した系列希釈濃度のＤＳ６抗体と共にインキュベートした。細胞を卓上型遠心機により１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。培地を除去した後、次いでウェルに１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を再充填した。次いでこの洗浄工程を繰り返した。ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）をＦＡＣＳ緩衝液に１：１００希釈し、細胞と共に氷上で１時間インキュベートした。信号の光減退を防ぐために、プレートに箔で蓋をした。２回の洗浄後、細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターにより分析した。
【０２０７】
[206]  腫瘍免疫組織化学から予想されたように、卵巣、胸部、子宮頸部および膵臓に
由来する細胞系には主にＣＡ６エピトープがみられた（表３）。しかし、他の腫瘍タイプの若干の細胞系が示すＣＡ６発現は限定されていた。ＤＳ６抗体は１３５．６ｐＭの見掛けＫＤで結合する（ＰＣ−３細胞において、表３）。抗原陽性細胞における結合曲線（図１）の最大平均蛍光（表３）は、抗原の相対密度を示唆する。
【０２０８】
【表４】
2015012861.tif 000040
【０２０９】
＊  平均最大相対平均蛍光
実施例２：ＤＳ６エピトープの特性解明
[207]  タンパク質分解（プロナーゼおよびプロテイナーゼＫ）および／または糖分解
（ノイラミニダーゼおよび過ヨウ素酸）処理により消化したＣＡ６陽性細胞溶解物（Ｃａｏｖ−３）のドットブロットをイムノブロッティングすることにより、ＤＳ６の抗原ＣＡ６の特性を分析した。陽性対照として、多様なタイプのエピトープを認識する他の抗体を、抗原陽性細胞系の溶解物について試験した（Ｃａｏｖ−３とＣＭ１；Ｃｏｌｏ２０５とＣ２４２；ＳＫＭＥＬ２８とＲ２４）。ＣＭ１は、Ｍｕｃ１の可変数タンデム反復ドメイン（ＶＮＴＲ）のタンパク質エピトープを認識する抗体であり、したがってタンパク質エピトープについての対照となる。Ｃ２４２は、Ｍｕｃ１上の新規な結腸直腸癌特異的なシアル酸依存性グリコトープ（ＣａｎＡｇ）に結合し、タンパク質上のグリコトープについての対照となる。Ｒ２４は、黒色腫に特異的なＧＤ３ガングリオシドに結合し、したがって非タンパク質骨格上のグリコトープについての対照となる。
【０２１０】
[208]  Ｃａｏｖ−３、Ｃｏｌｏ２０５およびＳＫＭＥＬ２８細胞を１５ｃｍの組織培
養プレートに接種した。培地（３０ｍＬ／プレート）を細胞溶解前日に交換した。改変ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム）、プロテアーゼ阻害薬（ＰＭＳＦ、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、およびアプロチニン）、およびＰＢＳを、氷上で予冷した。培地をプレートから吸引した後、細胞を１０ｍｌの冷却ＰＢＳで２回洗浄した。以後のすべての工程を氷上および／または４℃の低温室内で実施した。最後のＰＢＳ洗浄後、細胞を１〜２ｍＬの溶解用緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液に新たにプロテアーゼ阻害薬を添加して、最終濃度１ｍＭのＰＭＳＦ、１μＭのペプスタチンＡ、１０μ
ｇ／ｍｌのロイペプチン、および２μｇ／ｍｌのアプロチニンにしたもの）中で溶解した。溶解物を細胞リフターによりプレートから掻き取り、懸濁液を１８Ｇ注射針で吸引排出（５〜１０回）することにより摩砕処理した。溶解物を１０分間回転させ、次いで微量遠心機により最大速度（１３Ｋ  ｒｐｍ）で１０分間遠心した。ペレットを廃棄し、次いで上清をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Biorad）によりアッセイした。
【０２１１】
[209]  溶解物（２μｌ）を、ピペットで乾燥０．２μｍニトロセルロース膜上へ直接
滴下した。スポットを約３０秒間風乾した。それぞれが１個のスポットを含むように、膜を細断した。スポットを、プロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌの酵素、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５ｍＭのＣａＣｌ２）、プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌの酵素、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５ｍＭのＣａＣｌ２）、ノイラミニダーゼ（２０ｍＵ／ｍｌの酵素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ７．５、５ｍＭのＣａＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）、または過ヨウ素酸（２０ｍＭ、０．５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）の存在下に３７℃で１時間インキュベートした。試薬はRoche（酵素）およびVWR（過ヨウ素酸）から購入された。膜をＴ−ＴＢＳ洗浄用緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１×ＴＢＳ）中で洗浄し（５分）、遮断用緩衝液（３％のＢＳＡ、Ｔ−ＴＢＳ）中、室温で２時間遮断し、遮断用緩衝液中２μｇ／ｍｌの第１抗体（すなわちＤＳ６、ＣＭ１、Ｃ２４２、Ｒ２４）と共に４℃で一夜インキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳ中で５分間、３回洗浄し、次いでＨＲＰコンジュゲートしたヤギ抗マウス（またはヒト）ＩｇＧ第２抗体（Jackson Immunoresearch；遮断用緩衝液中に１：２０００希釈）中、室温で１時間インキュベートした。これらのイムノブロットを３回洗浄し、ＥＣＬシステム（Amersham）により現像した。
【０２１２】
[210]  消化した対照溶解物のイムノブロット（図２）は、ＣＭ１信号がタンパク質エ
ピトープを認識する抗体について予想されたとおりタンパク質分解処理により破壊されたが、糖分解消化物は影響を受けないことを示した。Ｃ２４２信号は、タンパク質上のグリコトープを認識する抗体について予想されたとおり、タンパク質分解または糖分解のいずれの処理によっても破壊された。タンパク質分解処理により影響されなかったＲ２４信号は、ガングリオシドを認識する抗体について予想されたとおり、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸処理により破壊された。消化したＣａｏｖ−３溶解物のドットブロットのＤＳ６イムノブロットは、タンパク質分解および糖分解のいずれの化合物による処理においても信号消失を示した。したがって、Ｃ２４２と同様に、ＤＳ６はタンパク質コア上の炭水化物エピトープに結合する。さらに、ＤＳ６イムノブロットの信号はノイラミニダーゼ処理に感受性であった。したがって、ＣａｎＡｇと同様に、ＣＡ６はシアル酸依存性グリコトープである。
【０２１３】
[211]  ＣＡ６の炭水化物性を確認するために、Ｃａｏｖ−３溶解物をＰＶＤＦ膜にス
ポットし、化学的脱グリコシル剤トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）により、窒素下に周囲温度で５分間処理した。ブロットをＴ−ＴＢＳで洗浄し、ＣＭ１またはＤＳ６でイムノブロッティングした（図３）。ＤＳ６信号は酸処理に際して破壊され、ＣＡ６がグリコトープである証拠がさらに得られた。ＴＦＭＳＡ処理に際してＣＭ１信号が増強したのは、この酸処理がフィルター上のタンパク質に影響を及ぼさないことを指摘し、かつ糖分解処理はＣＭ１が認識するタンパク質エピトープを露出させたことを示唆する。
【０２１４】
[212]  ＣＡ６が存在する炭水化物の構造をさらに解明するために、ドットブロットを
Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはシアリダーゼで消化した（図４）。Ｃａｏｖ−３細胞溶解物（１００μｇ、３０μｌ）を１００℃で５分間、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含有する変性用緩衝液（Glyko）２．５μｌと共にインキュベ
ートした。変性した溶解物を次いで１μｌのＮ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはシアリダーゼＡ（Glyko）により３７℃で１時間消化した。消化した溶解物を次
いでニトロセルロース上にスポットし（２μｌ）、前記と同様にイムノブロッティングし
た。
【０２１５】
[213]  Ｎ−グリカナーゼはＤＳ６イムノブロット信号に明らかな影響を及ぼさなかっ
た。しかし、シアリダーゼで消化した試料は信号を発生しなかった。Ｏ−グリカナーゼはシアリダーゼによる前処理なしではシアル化Ｏ−結合炭水化物を消化できないので、Ｏ−グリカナーゼ単独で処理した試料のＤＳ６信号には影響がなかった。これに対し、Ｎ−グリカナーゼは、活性にとってグリコシド酵素による前処理を必要としない。Ｎ−グリカナーゼ処理がＤＳ６信号に影響を及ぼさないという事実は、ＣＡ６エピトープがシアル化Ｏ−結合炭水化物鎖上に存在する可能性が最も高いことを示唆する。
【０２１６】
実施例３：ＣＡ６エピトープが存在する抗原の解明
[214]  ＣＡ６シアログリコトープが存在する抗原を同定するために、ＤＳ６免疫沈降
物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した。細胞溶解物の上清（１ｍＬ／試料；３〜５ｍｇのタンパク質）を、４℃で１〜２時間回転させながら、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液で平衡化したプロテインＧビーズ（３０μｌ）により予備清澄化した。以後のすべての工程を氷上および／または４℃の低温室内で実施した。予備清澄処理済みビーズを微量遠心機で短時間（２〜３秒）遠心した。予備清澄化した上清を新たな試験管に移し、２μｇのＤＳ６と共に回転させながら一夜インキュベートした。新たな平衡化したプロテインＧビーズ（３０μｌ）を溶解物に添加し、回転させながら１時間インキュベートした。このビーズ−溶解物懸濁液を微量遠心機で短時間遠心し、所望によりこの免疫沈降後溶解物の試料を採取した。ビーズを１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液で５〜１０回洗浄した。
【０２１７】
[215]  免疫沈降したＤＳ６試料を、次いで３０μｌのノイラミニダーゼ（２０ｍＵの
ノイラミニダーゼ（Roche）、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５、５ｍＭのＣａＣｌ２
、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）または３０μｌの過ヨウ素酸（２０ｍＭの過ヨウ素酸（VWR）、０．５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）により３７℃で１時間消化した。次いでそれ
らを３０μｌの２×試料装填用緩衝液（β−メルカプトエタノールを含有）に再懸濁した。ビーズを５分間煮沸し、装填用緩衝液の上清を４−１２％または４−２０％トリス−グリシンゲル（Invitrogen）に装填した。ゲルをＬａｅｍｌｉ電気泳動用緩衝液中、１２５ｖで１．５時間展開した。Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓブロット転写装置（Biorad）により、２０ｍＡで一夜、ゲル試料を０．２μｍのニトロセルロース膜（Invitrogen）上へ転写した。前記の実施例２に記載したように、膜をＤＳ６でイムノブロッティングした。
【０２１８】
[216]  あるいは、免疫沈降したビーズをまず変性させ、次いでＮ−グリカナーゼ、Ｏ
−グリカナーゼおよび／またはシアリダーゼＡ（Glyko）により酵素消化した。ビーズを
２７μｌのインキュベーション用緩衝液および２μｌの変性溶液（Glyko）に再懸濁し、
１００℃で５分間インキュベートした。室温に冷却した後、界面活性剤溶液（２μｌ）を添加し、試料を１μｌのＮ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはシアリダーゼＡと共に３７℃で４時間インキュベートした。５×試料装填用緩衝液（７μｌ）を添加した後、試料を５分間煮沸した。試料を前記と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、イムノブロッティングした。
【０２１９】
[217]  ＤＳ６は、抗原陽性細胞溶解物中にみられる＞２５０ｋＤａのタンパク質バン
ドを免疫沈降させる（図５Ａ、ＢおよびＣ）。ある細胞系（すなわちＴ−４７Ｄ）ではダブレットがみられる。この＞２５０ｋＤａのバンドは、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸で処理したＣａｏｖ−３免疫沈降物中では破壊されており（図５ＡおよびＢ）、これはＣＡ６エピトープがこの＞２５０ｋＤａのバンド上にあることを示唆する。＞２５０ｋＤａのバンドは免疫沈降物のＮ−グリカナーゼ処理に不感受性であることも示され、これはＣＡ６がＯ−結合炭水化物上にあることと一致する（図５Ｆ）。２５０ｋＤａのバンドが
ＣＡ６抗原であることをさらに支持するものは、ＤＳ６の抗原が陰性である細胞からはＤＳ６はそのようなバンドを免疫沈降しないという事実である（図５ＤおよびＥ）。
【０２２０】
[218]  幾つかの系列の証拠から、ＣＡ６抗原はＭｕｃ１であることが示唆された。分
子量が高く、Ｏ−結合炭水化物特異的な糖分解酵素に対して感受性であるので、ＣＡ６抗原はムチンであると思われた。ムチンの過剰発現は特に胸部および卵巣の腫瘍において解明されており、ＤＳ６の主な腫瘍反応性と一致する。さらに、ＣＡ６はＣａｎＡｇ（Ｍｕｃ１上のシアログリコトープ）と同様に過ヨウ素酸沈降に不感受性であり、これはＣＡ６抗原が著しくＯ−グリコシル化されていることを示唆する。あるＤＳ６発現細胞系においてＤＳ６が＞２５０ｋＤａのダブレットを免疫沈降させたという所見は、ＣＡ６がＭｕｃ１であることを示唆した。ヒトＭｕｃ１の特色は、タンデム反復配列の個数が異なる２つのＭｕｃ１対立遺伝子の存在により分子量の異なる２つのＭｕｃ１タンパク質が生成することである。
【０２２１】
[219]  ＣＡ６がＭｕｃ１上にあるかどうかを調べるために、Ｃａｏｖ−３からのＤＳ
６免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、ＤＳ６またはＭｕｃ１  ＶＮＴＲ抗体ＣＭ１でイムノブロッティングした。図６Ａから分かるように、ＣＭ１はＤＳ６が免疫沈降させた＞２５０ｋＤａのバンドと強く反応する。図６Ｂでは、ＨｅＬａ細胞溶解物からのＤＳ６およびＣＭ１の免疫沈降物が、ＤＳ６またはＣＭ１のいずれで免疫沈降させた場合にも同じ＞２５０ｋＤａのダブレットを示す。これらの結果は、ＣＡ６エピトープが実際にＭｕｃ−１タンパク質上にあることを指摘する。ＨｅＬａ（およびＴ−４７Ｄ）細胞にみられるＤＳ６ダブレットは、タンデム反復配列の個数が異なる別個の対立遺伝子によりＭｕｃ−１発現が支配されているという事実により説明できる。
【０２２２】
[220]  ＣＭ１およびＤＳ６は、同じＭｕｃ−１タンパク質ではあるが異なるエピトー
プに結合する。Ｃａｏｖ−３溶解物のドットブロットをトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）で化学的に脱グリコシルすると、ＤＳ６信号が破壊された（図３）。しかし、この同じ処理によりＣＭ１信号は増強した。脱グリコシルは、ＣＭ１抗体に対する隠れたエピトープを露出させた可能性がある。さらに、ＤＳ６およびＣＭ１のフローサイトメトリー結合の結果を比較すると（表４）、ＣＡ６エピトープはＭｕｃ１を発現するすべての細胞上に存在するわけではないことが立証される。高濃度のＭｕｃ１  ＣａｎＡｇシアログリコトープを発現することが知られている細胞系Ｃｏｌｏ２０５（表３）にＣＡ６エピトープが存在しない点に注目すると、興味深い。
【０２２３】
【表５】
2015012861.tif 000041
【０２２４】
＊ＭＭＦ＝最大平均相対蛍光
実施例４：放出されたＣＡ６エピトープの定量分析
[221]  ＣＡ６エピトープは、多くの癌患者において血流中へ放出されることが知られ
ている分子Ｍｕｃ１上に存在するので、そのような濃度がＤＳ６抗体療法の妨げとなるかを判定するために定量操作を行った。循環抗体が抗原に結合すると、血中から免疫複合体が急速にクリアランスされると考えられる。抗体投与量の有意部分が急速に循環から排除されると、腫瘍に到達する量が減少し、抗体療法薬の抗腫瘍活性が低下する可能性がある。有効性の高い細胞毒性化合物に抗体をコンジュゲートさせると、コンジュゲートの急速なクリアランスは非特異的毒性を高める可能性がある。したがって、抗体−低分子薬物コンジュゲート、たとえばＤＳ６−ＤＭ１の場合、高濃度の放出抗原が抗腫瘍効果を低下させ、かつ用量を制限する毒性を高める可能性があると予想された。
【０２２５】
[222]  抗体療法薬についての最近の臨床試験により、放出抗原濃度が薬物動態に及ぼ
す影響に関する情報が得られた。たとえばｈｅｒ２／ｎｅｕを発現する転移性乳癌の治療に用いられる抗体トラスツヅマブ（ハーセプチン、Herceptin）を用いた臨床試験で、Ｈ
ｅｒ２／ｎｅｕ濃度が５００ｎｇ／ｍＬ未満の場合はトラスツヅマブクリアランスの薬物動態は変化しないことが示された（Pegram et al., J. Clin. Oncol. 16(8): 2659-71 (1998)）。放出されたＨｅｒ２／ｎｅｕの分子量が１１０，０００ダルトンであると仮定すると、４．５ｎＭ未満のモル濃度の放出Ｈｅｒ２／ｎｅｕは薬物動態にほとんど影響しないと思われる。
【０２２６】
[223]  他の例では、カンツヅマブメルタンシン（cantuzumab mertansine）（ｈｕＣ２４２−ＤＭ１）を用いた臨床試験により、処理前放出ＣａｎＡｇ（Ｃ２４２のエピトープ）濃度と抗体クリアランスの薬物動態に相関性がないことが指摘された（Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2): 211-22 (2003)）。ＤＳ６が認識するＣＡ６エピトープと同様に、ＣａｎＡｇエピトープはＭｕｃ１上にあるユニークな腫瘍特異的Ｏ−結合シアログリコトープである。しかし、ＣａｎＡｇエピトープの不均一性のため、モル量で定量するのは困難である。一般的な集団において、Ｍｕｃ１対立遺伝子の長さは可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメインのタンデム反復配列の個数に応じて異なる。各タンデム反復配列中に、Ｏ−結合グリコシル化のための部位が幾つかある。ＣａｎＡｇ発現の複雑さに加えて、固有のグリコシルトランスフェラーゼ活性が細胞毎に異なる。したがって、一人の患者においてすら、Ｍｕｃ１分子当たり広範なＣａｎＡｇエピトープの可能性がある。さらに、Ｍｕｃ１分子当たりのＣａｎＡｇエピトープの比率は、患者集団全体で異なるであろう。このため、血清試料中へ放出されたＣａｎＡｇをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定する。この場合、ＣａｎＡｇエピトープをもつ放出Ｍｕｃ１をＣ２４２で捕獲し、ビオチニル化Ｃ２４２／ストレプトアビジンＨＲＰ系により検出する。放出ＣａｎＡｇを、Ｍｕｃ１のモル濃度ではなく、血清のｍｌ当たりのエピトープ数に比例する標準単位（Ｕ）で定量する。同様に、放出ＣＡ６エピトープの定量についても類似の状況が生じる。これに対し、トラスツズマブについては放出ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子当たり１つのエピトープしかなく、放出抗原の定量は大幅に簡略化される。
【０２２７】
[224]  放出ＣＡ６エピトープ濃度と、トラスツズマブおよびカンツヅマブメルタンシ
ンを用いた臨床試験でみられるものとの相関性を調べるために、Ｍｕｃ１上のシアログリコトープのように複雑な放出エピトープのモル濃度を求めるための方法を開発した。まず、ＤＳ６のための簡単なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ法を確立した。このアッセイ法の概念を図７Ａに示す。ＤＳ６を用いて、ＣＡ６エピトープをもつＭｕｃ１を捕獲した。各Ｍｕｃ１分子が複数のＣＡ６エピトープをもつので、ビオチニル化ＤＳ６もトレーサー抗体として用いた。捕獲されたＣＡ６に結合したビオチニル化ＤＳ６を、基質としてのＡＢＴＳを用いてストレプトアビジン−ＨＲＰにより検出した。卵巣癌患者の血清から、または乳癌患者において放出Ｍｕｃ１をモニターするために用いる市販のＭｕｃ１試験キット（ＣＡ１５−３）より得た標準品から、ＣＡ６エピトープを捕獲した。ＤＳ６の単位／
ｍｌをＣＡ１５−３標準品の単位／ｍｌと等しく任意に設定した。
【０２２８】
[225]  図７Ｂに、ＣＡ１５−３標準品を用いたＤＳ６サンドイッチＥＬＩＳＡの結果
を示す。得られた曲線は、ＣＡ１５−３アッセイにおいてＣＡ１５−３標準品を用いて得たものときわめて類似する。ＤＳ６の単位／ｍｌをＣＡ６のモル濃度に換算するためには、信号をＤＳ６のピコグラム数に換算するビオチニル化ＤＳ６標準曲線が必要である。ＣＡ６エピトープとビオチニル化ＤＳ６抗体の化学量論的量を１：１、ビオチニル化ＤＳ６の分子量を１６０，０００ダルトンと仮定して、試料の添加体積当たり捕獲されたＣＡ６のモル数を計算することができる。
【０２２９】
[226]  図８ＡおよびＢには、ビオチニル化ＤＳ６の標準曲線を作成するための２つの
別法を表わす。図８Ａでは、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を用いてビオチニル化ＤＳ６を捕獲し、これを図７に示したサンドイッチＥＬＩＳＡに用いたものと同じ方法で検出する。図８Ｂに示した方法では、ビオチニル化ＤＳ６を直接にＥＬＩＳＡプレート上に配置し、図８Ａと同様に検出する。図８Ｃにみられるように、各方法で作成したビオチニル化ＤＳ６標準曲線は良く一致する。
【０２３０】
[227]  表５に、多様な放出抗原についての卵巣癌患者の血清試料の分析を示す。一般
にＣＡ１２５  ＥＬＩＳＡを用いて放出ＣＡ１２５の単位／ｍｌを測定することにより、卵巣癌患者の治療をモニターする。血清試料についてＣＡ１２５状態を求めた。一般にＣＡ１５−３  ＥＬＩＳＡを用い、ＤＳ６が認識するものとは異なるエピトープを認識する抗体の捕獲および検出を利用して放出Ｍｕｃ１の単位／ｍｌを測定することにより、乳癌患者をモニターする。表５では、卵巣癌患者の血清試料においてＣＡ１５−３を測定する。
【０２３１】
【表６】
2015012861.tif 000042
【０２３２】
１  市販のＥＬＩＳＡキットにより測定
２  市販のＣＡ１５−３標準品により測定（１ ＣＡ１５−３ Ｕ＝１ ＤＳ６ Ｕ）
３  ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチン−ＤＳ６標準曲線
４  ビオチン−ＤＳ６標準曲線
[228]  表５に報告したＣＡ１５−３値については、CanAg Diagnosticsから市販される
ＣＡ１５−３エンザイムイムノアッセイキットを用いた。ＤＳ６の単位／ｍｌについては、ＣＡ１５−３標準品（CanAg Diagnosticsから市販されるＣＡ１５−３エンザイムイム
ノアッセイキットより）をＤＳ６サンドイッチＥＬＩＳＡに用いて標準曲線を作成した。ＤＳ６の単位／ｍｌをＣＡ１５−３の単位／ｍｌと等しく任意に設定した。最後の２欄において、放出ＣＡ６のピコモル濃度（ｐＭ）は、図８Ｃに示したビオチニル化ＤＳ６の標準曲線を用いて計算された。
【０２３３】
[229]  ＣａｎＡｇ濃度の定量分析について、ＣａｎＡｇ血清濃度はカンツヅマブメル
タンシン臨床試験に参加した患者について処置前に報告されたものである（Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2): 211-22 (2003)）。ＤＳ６について記載したものと同様なＥＬＩＳＡアッセイにより、ＣａｎＡｇ標準品を用いてＣａｎＡｇ標準曲線を作成した。Ｃ２４２を用いてＣａｎＡｇ標準品を捕獲した。捕獲したＣａｎＡｇの検出は、ビオチニル化Ｃ２４２トレーサーを用い、続いて基質としてのＡＢＴＳを用いてストレプトアビジン−ＨＲＰで現像することにより達成された。ビオチニル化ＤＳ６について行ったようにビオチニル化−Ｃ２４２標準曲線を作成し、循環ＣａｎＡｇエピトープの単位／ｍｌをモル濃度に換算することができた。表６に、カンツヅマブメルタンシン臨床試験患者からのＣａｎＡｇ濃度および対応する循環ＣａｎＡｇモル濃度計算値を報告する。
【０２３４】
【表７】
2015012861.tif 000043
【０２３５】
１  サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した循環ＣａｎＡｇの処理前濃度
２  ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチン−Ｃ２４２標準曲線
４  ビオチン−Ｃ２４２標準曲線
[230]  卵巣癌患者における放出ＣＡ６のｐＭ濃度とＣａｎＡｇ陽性癌患者における放
出ＣａｎＡｇについて計算したものとを比較すると、一般に放出ＣＡ６濃度は放出ＣａｎＡｇ濃度と類似することが示される。さらに、卵巣癌患者の血清試料１６中２つだけが４．５ｎＭより高い濃度をもつ（信号が標準曲線の範囲外にある血清試料５および９）；これは、これより高いとＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者についての臨床試験でハーセプチンの薬物動態に変化がみられた濃度である。４．５ｎＭより高いＣａｎＡｇ濃度は、臨床試験患者３７人中３人のみにみられた。この臨床試験では、放出ＣａｎＡｇ濃度とより急速なカンツヅマブメルタンシンクリアランスの相関性はなかった。ただし、最高ＣａｎＡｇ濃度（３１２４０Ｕ／ｍｌ）の患者は、輸注後８時間しかサンプリングしなかった。これらの結果は、Ｍｕｃ１の特定のエピトープ、たとえばＣＡ６およびＣａｎＡｇは癌患者に
おいて放出されるが、抗体療法処置を妨げる濃度で放出されるわけではないことを示す。
【０２３６】
実施例６：ネズミＤＳ６抗体可変部のクローニング
[231]  ネズミモノクローナル抗体、たとえばＤＳ６は、ヒトの免疫系により異物と認
識されるので、臨床設定での有用性に限界がある。患者はヒト抗ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）を急速に発現し、その結果ネズミ抗体は急速にクリアランスされる。このため、ネズミＤＳ６（ｍｕＤＳ６）の可変部をリサーフェシングしてヒト化ＤＳ６（ｈｕＤＳ６）抗体を作製した。
【０２３７】
[232]  ネズミＤＳ６抗体可変部をＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。ＤＳ６ハイ
ブリドーマ細胞の周密Ｔ１７５フラスコから、Quiagen RNeasy miniprepキットにより全
ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度をＵＶ分光光度法により測定し、４〜５μｇの全ＲＮＡについて、Gibco Superscript IIキットおよびランダム四量体プライマーを用いてＲＴ反応を行った。
【０２３８】
[233]  縮重プライマーを用い、Wang Z et al., J. Immunol Methods, 1月13日; 233 (1-2): 167-77 (2000)に記載の方法に従って、ＰＣＲ反応を実施した。縮重ＰＣＲ反応に
はＲＴ反応ミックスをそのまま使用した。３’側Ｌ鎖プライマー、ＨｉｎｄＫＬ
【０２３９】
【化３６】
2015012861.tif 000044
【０２４０】
および３’側Ｈ鎖プライマー、ＢａｍＩｇＧ１
【０２４１】
【化３７】
2015012861.tif 000045
【０２４２】
を用い、５’末端に対するＰＣＲプライマーは、Ｌ鎖についてはＳａｃ１ＭＫ
【０２４３】
【化３８】
2015012861.tif 000046
【０２４４】
Ｈ鎖についてはＥｃｏＲ１ＭＨ１
【０２４５】
【化３９】
2015012861.tif 000047
【０２４６】
とＥｃｏＲ１ＭＨ２
【０２４７】
【化４０】
2015012861.tif 000048
【０２４８】
の等量ミックスであった（混合塩基：Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ
＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）。
[234]  １０％ＤＭＳＯを補充した以外は、ＰＣＲ反応は標準的であった（５０μｌの
反応ミックスが、最終濃度１×の反応用緩衝液（ROCHE）、各２ｍＭのｄＮＴＰ、各１ｍ
Ｍのプライマー、２μｌのＲＴ反応体、５μｌのＤＭＳＯ、および０．５μｌのＴａｑ（ROCHE）を含有）。MJ researchサーモサイクラーにより、Wang Z et al.,（J. Immunol Methods, 1月13日; 233 (1-2): 167-77 (2000)）から応用したプログラムを用いてＰＣＲ
反応を実施した：１）９４℃、３分；２）９４℃、１５秒；３）４５℃、１分；４）７２℃、２分；５）工程２に戻って２９回；６）最終延長工程７２℃、１０分で終了。ＰＣＲプライマーにより作製したＰＣＲ生成物を、制限酵素によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Stratagene）中へクローニングした。Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ配列決定サービスによりＨ鎖およびＬ鎖クローンの配列を決定した。
【０２４９】
[235]  ５’末端ｃＤＮＡ配列を確認するために、さらにＰＣＲおよびクローニングを
行った。縮重ＰＣＲクローンから決定したＤＳ６のＬ鎖およびＨ鎖ｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ検索フェブサイトに入力し、提示したシグナル配列をもつネズミ抗体配列を保存した。これらのシグナルペプチドから、関連ＤＮＡ配列間で保存されている延長配列を用いてＰＣＲプライマーを設計した。ＥｃｏＲ１制限部位をリーダー配列プライマー（表７）に付加し、これらを前記のＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。
【０２５０】
【表８】
2015012861.tif 000049
【０２５１】
[236]  ポリメラーゼ生成配列エラーの可能性を同定して回避するために、幾つかの個
々のＬ鎖およびＨ鎖クローンの配列を決定した。Ｌ鎖およびＨ鎖両方のＲＴ−ＰＣＲクローンについて１つの配列のみが得られた。これらの配列は、ネズミＤＳ６  Ｌ鎖およびＨ鎖配列を増幅してシグナル配列に延長することができるプライマーを設計するのに十分であった。これらのフォローアップＰＣＲ反応から得た後続クローンにより、最初の縮重プライマーにより変化した可変部の５’末端配列が確認された。種々のｃＤＮＡクローンからの累積結果により、図９に示す最終的なネズミＤＳ６  Ｌ鎖およびＨ鎖配列が得られた。ＫａｂａｔおよびＡｂＭ定義を用いて、３つのＬ鎖およびＨ鎖ＣＤＲを同定した（図９および１０）。ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔデータベースの検索により、ｍｕＤＳ６抗体のＬ鎖可変部はネズミＩｇＶ？ａｐ４生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高く、Ｈ鎖可変部はネズミＩｇＶｈ  Ｊ５５８．４１生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高いことが示された（図１１）。
【０２５２】
実施例７：ＤＳ６抗体の可変部表面残基の決定
[237]  Pedersenら(1994)およびRoguskaら(1996)が記載した抗体リサーフェシング法は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を推定することから始まる。表面残基は、その全表面積の少なくとも３０％に水分子が到達できるアミノ酸と定義される。ｍｕＤＳ６の表面残基を見いだすための構造が未決定であったので、本発明者らは１０種類の抗体を１２７の抗体構造ファイル中で最も相同性の高い配列とアラインさせた（図１２）。アラインしたこれらの配列について、各Ｋａｂａｔ位置に対する溶媒アクセシビリティーを平均した（図
１３ＡおよびＢ）。
【０２５３】
[238]  平均アクセシビリティー２５〜３５％の表面位置について、両側をフランキン
グする２つの同一残基を含む抗体サブセットの比較により、第２ラウンドの分析を行った（図１３ＡおよびＢ）。第２ラウンドの分析後、ｍｕＤＳ６のＨ鎖についての推定表面残基２１個は２３個に増加し、３０％より高い推定表面アクセシビリティーをもつ残基のリストにＴｙｒ３およびＬｙｓ２３が加えられた。本発明者らがリサーフェシングした大部分の抗体においてＨ鎖ＣＤＲ１のＫａｂａｔ定義を用いるが、ＤＳ６については計算に際して故意にではなくＡｂＭ定義を用いたので、Ｈ鎖残基Ｔ２８は他の場合と同様なフレームワーク表面残基と定義されなかった。第２ラウンドの分析Ａｌａ８０の表面アクセシビリティーが３０．５％から２７．８％に低下したので、Ｌ鎖表面位置の数は１６から１５に減少した。合わせて、ｍｕＤＳ６のＨ鎖およびＬ鎖可変部配列は３８個の推定表面アクセシブルフレームワーク残基をもつ。
【０２５４】
実施例８：ヒト抗体の選択
[239]  ネズミＤＳ６可変部の表面位置を、Ｋａｂａｔデータベースにおいてヒト抗体
配列の対応する位置と比較した（Johnson G., Wu TT. Nucleic Acids Res. 1月1日; 29 (1): 205-6 (2001)）。抗体データベース処理ソフトウェア（Searle, 1998）を用いて、天然Ｈ鎖およびＬ鎖ヒト抗体対から表面残基を抽出してアラインした。特にＣＤＲから５Å以内にある位置を考慮して最も同一性の高い表面残基をもつヒト抗体可変部表面を、ネズミＤＳ６抗体可変部表面残基と交換するために選択した。
【０２５５】
実施例９：キメラおよびヒト化抗体の発現ベクター
[240]  Ｈ鎖およびＬ鎖対合配列を単一の哺乳動物発現ベクター中へクローニングした
。ヒト可変配列に対するＰＣＲプライマーにより、ヒトシグナル配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩクローニングベクター中に付加できる制限部位を形成した。次いで、それぞれＬ鎖またはＨ鎖についてＥｃｏＲ１およびＢｓｉＷＩまたはＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩを用いて、哺乳動物発現プラスミド中へこれらの可変配列をクローニングした（図１４）。Ｌ鎖可変配列をヒトＩｇＫａｐｐａ定常部上へ読み枠を一致させてクローニングし、Ｈ鎖可変配列をヒトＩｇＧａｍｍａ１定常部配列中へクローニングした。最終発現プラスミドにおいて、ヒトＣＭＶプロモーターはＬ鎖およびＨ鎖両方のｃＤＮＡ配列の発現を誘発する。
【０２５６】
実施例１０：ＤＳ６活性に負の影響を及ぼす可能性のある残基の同定
[241]  現在では大部分のヒト化に際し、問題となる可能性のある残基としてＣＤＲに
近接する残基を同定するために対象抗体の分子モデルを構築する。リサーフェシングした抗体の数が増えており、問題の想定に際して歴史的経験から作業することは少なくともモデル構築と同程度に有効であるので、ＤＳ６については分子モデルを構築しなかった。その代わりにネズミＤＳ６表面残基を従来リサーフェシングされた抗体のものと比較し、抗体の結合活性に対する影響について低リスク残基から高リスク残基までを同定した。
【０２５７】
[242]  従来のヒト化から入手できる解明済み抗体構造および分子モデルの両方におい
て、類似の残基セットについてＣＤＲから５Å以内にあるものを繰り返し同定する。このデータを用いて、ＣＤＲに近接していると思われるネズミＤＳ６残基、およびおそらく５Å以内にあるものを、表１に挙げる。これらの位置の多くも従来のヒト化に際して交換されたが、Ｈ鎖の位置７４のみはこれまで結合活性を失わせた。ネズミ抗体の結合活性を保存するために、ｈｕＣ２４２およびｈｕＢ４の両方においてこの位置のネズミ残基は保持された。他方、ヒト化６．２Ｇ５Ｃ６においては、この同一位置を対応するヒト残基に交換しても活性は失われなかった（６．２Ｇ５Ｃ６は抗ＩＧＦ１−Ｒ抗体であり、しばしば単に抗Ｃ６と呼ばれる）。表１の残基はいずれもヒト化抗体において問題を提起する可能
性があるが、Ｈ鎖残基Ｐ７３はこの位置における従来の経験のため特に問題である。
【０２５８】
実施例１１：最も相同性の高いヒト表面の選択
[243]  ｍｕＤＳ６をリサーフェシングするための候補となるヒト抗体表面を、Ｋａｂ
ａｔ抗体配列データベースからＳＲソフトウェアを用いて求めた。このソフトウェアは、抗体データベースに対して特定の残基位置のみを検索するためのインターフェースを提供する。天然対を保存するために、Ｌ鎖およびＨ鎖両方の表面残基を相互比較した。配列同一性をランク付けするために、Ｋａｂａｔデータベースから最も相同性の高いヒト表面をアラインした。ＳＲ  Ｋａｂａｔデータベースソフトウェアによりアラインしたトップ３つの表面を表２に示す。次いでこれらの表面を比較して、表１で同定した残基にするために必要な交換が最少であるのはどのヒト表面であるかを同定した。抗Ｒｈ（Ｄ）抗体２８Ｅ４は表面残基交換の必要な数が最も少なく（合計１１）、問題となる可能性のある残基のリストに含まれるのはこれらのうち３個のみである。２８Ｅ４抗体は最も相同性の高いヒト表面を提供するので、ｍｕＤＳ６をリサーフェシングするための最良の候補である。
【０２５９】
実施例１２：ヒト化ＤＳ６抗体のＤＮＡ配列の構築
[244]  ＰＣＲ変異誘発により、前記１１個の表面残基をＤＳ６のものと交換した。リ
サーフェシングしたヒトＤＳ６遺伝子を構築するために、ネズミＤＳ６可変部ｃＤＮＡクローンにＰＣＲ変異誘を行った。リサーフェシングしたＤＳ６に必要なアミノ酸変化を生じさせるために、下記の表８に示すヒト化用プライマーセットを設計した。
【０２６０】
【表９】
2015012861.tif 000050
【０２６１】
[245]  １０％ＤＭＳＯを補充した以外は、ＰＣＲ反応は標準的であった（５０μｌの
反応ミックスが、最終濃度１×の反応用緩衝液（ROCHE）、各２ｍＭのｄＮＴＰ、各１ｍ
Ｍのプライマー、１００ｎｇの鋳型、５μｌのＤＭＳＯ、および０．５μｌのＴａｑ（ROCHE）を含有）。MJ researchサーモサイクラーで下記のプログラムを用いて操作した：１）９４℃、３分；２）９４℃、１５秒；３）５５℃、１分；４）７２℃、１分；５）工程２に戻って２９回；６）最終延長工程７２℃、４分で終了。ＰＣＲ生成物をそれらに対応する制限酵素で消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクター中へクローニングした。アミノ酸の変化を確認するために、クローンの配列を決定した。
【０２６２】
[246]  Ｈ鎖残基Ｐ７３の交換は過去に問題を生じたので、２つのバージョンのＨ鎖を
構築した：１つはヒト２８Ｅ４  Ｔ７３を含むもの、１つはネズミＰ７３を保持したもの。両バージョンのヒト化ＤＳ６において、他の１０個の表面残基をネズミのものからヒト２８Ｅ４残基に交換した（表２）。通常の命名法に従えば、最もヒトに近いものはバージョン１．０である。これは１１個すべてのヒト表面残基をもつからである。さらにバージョンが必要な場合、ネズミＰ７３を保持したＨ鎖バージョンをバージョン１．２と命名し、バージョン１．１は最大数のネズミ残基を含むバージョンのために残しておく。２つのヒト化バージョンのアミノ酸配列をネズミＤＳ６アミノ酸配列とアラインさせて図１５ＡおよびＢに示す。両方のヒト化ＤＳ６抗体遺伝子を、一過性および安定トランスフェクションのために抗体発現プラスミド（図１４）中へクローニングした。ヒト化バージョンｖ１．０とｖ１．２のＬ鎖可変部のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は同一であり、図１６に示される。ヒト化バージョンｖ１．０およびｖ１．２のＨ鎖ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図１７ＡおよびＢに示す。
【０２６３】
実施例１３：ＣＨＯ細胞におけるｈｕＤＳ６の発現および精製ならびに親和性測定
[247]  ヒト化バージョンがｍｕＤＳ６の結合親和性を保持しているかどうかを判定す
るためには、抗体を発現させ、精製する必要があった。ＣＨＯ細胞に各抗体発現プラスミドをトランスフェクションした。ｈｕＤＳ６の一過性発現レベルはきわめて低かったので、安定な細胞系を選択した。
【０２６４】
[248]  ＣＨＯＤＧ４４細胞（４．３２×１０６個／プレート）を１５ｃｍのプレート
内で非選択培地（Ａｌｐｈａ  ＭＥＭ＋ヌクレオチド（Gibco）；４ｍＭのＬ−グルタミ
ン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％  ｖ／ｖのＦＢＳを補充したもの）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れた。翌日、ＰｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクションのためのQuiagen推奨プロトコ
ル改変版を用いて、細胞にｈｕＤＳ６  ｖ１．０およびｖ１．２発現プラスミドをトランスフェクションした。非選択培地を細胞から吸引した。プレートを７ｍｌの予熱（３７℃）ＰＢＳで洗浄し、２０ｍｌの非選択培地を補給した。プラスミドＤＮＡ（１１μｇ）を８００μｌのハイブリドーマＳＦＭ（Gibco）中へ希釈した。次いで７０μｌのＰｏｌｙ
ｆｅｃｔ（Quiagen）をこのＤＮＡ／ＳＦＭ混合物に添加した。次いでＰｏｌｙｆｅｃｔ
混合物を数秒間穏やかに渦撹拌し、周囲温度で１０分間インキュベートした。非選択培地（２．７ｍｌ）を混合物に添加した。最終混合物を、接種した細胞と共に２４時間インキュベートした。
【０２６５】
[249]  トランスフェクション混合物／培地をプレートから除去し、次いで細胞をトリ
プシン処理し、計数した。次いで細胞を９６ウェルプレート内の選択培地（Ａｌｐｈａ  ＭＥＭ−ヌクレオチド；４ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％  ｖ／ｖのＦＢＳ、１．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したもの）（２５０μｌ／ウェル）に、種々の密度（１８００、６００、２００、および６７個／ウェル）で接種した。必要ならば培地を補充しながら、細胞を２〜３週間インキュベートした。定量ＥＬＩＳＡにより、ウェルを抗体産生レベルについてスクリーニングした。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ２ＨＢ  ９６ウェルプレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２抗体（Jackson Immunoresearch；１μｇ／ウェル、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｌ中）でコーティングし、周囲温度で揺動しながら１．５時間インキュベートした。以後のすべての工程を周囲温度で実施した。ウェルをＴ−ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＴＢＳ）で２回洗浄し、２００μｌの遮断用緩衝液（１％ＢＳＡ、Ｔ−ＴＢＳ）で１時間遮断した。ウェルをＴ−ＴＢＳで２回洗浄した。別のプレート内で、抗体標準品ＥＭ１６４（１００ｎｇ／ｍｌ）および培養上清を遮断用緩衝液により系列希釈した（１：２または１：３）。これらの希釈液（１００μｌ）をＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間インキュベートした。ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、遮断用緩衝液中に１：３０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＡＰ（Jackson Immunoresear
ch）１００μｌと共に４５分間インキュベートした。ウェルをＴ−ＴＢＳで５回洗浄した後、１００μｌのＰＮＰＰ現像試薬（１０ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート・二ナトリウム塩；Pierce）、０．１Ｍのジエタノールアミン、ｐＨ１０．３の緩衝液）により２５分間現像した。４０５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。標準曲線の直線部分の吸光度の読み（培養上清の）を用いて、抗体濃度を判定した。
【０２６６】
[250]  ＥＬＩＳＡにより同定した産生度が最も高いクローンを、次いで展延し、凍結
細胞ストックを調製した。精製するのに十分な量を産生させるために、細胞を３０ｍｌの選択培地で１５ｃｍのプレートに展延し（約１×１０６個／プレート）、１週間インキュベートした。培養上清を２５０ｍｌのコニカルチューブ中へ採集し、卓上型遠心機で遠心し（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）、次いで０．２μｍの濾過装置により無菌的に濾過した。
【０２６７】
[251]  ＤＳ６を精製するために、濾過した培養上清にＮａＯＨペレットを添加して最
終ｐＨ８．０にした。Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Amersham）を２０〜５０カラム体積の結合用緩衝液で平衡化した。上清を蠕動ポンプでカラムに装入した。次いでカラムを５０カラム体積の結合用緩衝液で洗浄した。結合した抗体を溶離用緩衝液（１００Ｍｍの酢酸、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３）により、フラクションコレクターに取り付けた試験管中へ溶離した。溶出した抗体を、次いで中和用緩衝液（２ＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ１０．０）により中和し、次いでＰＢＳ中で一夜透析した。透析した抗体を０．２μｍのシリンジフィルターにより濾過した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定して最終タンパク質濃度を判定した。
【０２６８】
[252]  精製ｈｕＩｇＧの親和性をフローサイトメトリーによりｍｕＤＳ６と比較した
。第１組の実験では、ＣＡ６発現細胞系ＷＩＳＨへの直接結合を測定した。図１８Ａに示すように、キメラＤＳ６、ｈｕＤＳ６  ｖ１．０、およびｈｕＤＳ６  ｖ１．２は、それぞれ３．１５ｎＭ、３．７１ｎＭ、および４．２ｎＭの見掛けＫＤをもつきわめて類似した親和性を示す；これは、リサーフェシングがＣＤＲを撹乱しなかったことを示唆する。これらの親和性は、図１８Ｂに示すｍｕＤＳ６のもの（Ｋｄ＝１．９３ｎＭ）よりわずかに低いだけである。
【０２６９】
ｈｕＤＳ６の各バージョンがｍｕＤＳ６の親和性を保持することを確認するために、比較結合実験を行った。この方式の利点は、ネズミ抗体とヒト抗体の両方に同一の検出系、すなわちビオチン−ｍｕＤＳ６／ストレプトアビジン−ＤＴＡＦを用いることである。結合の間接的な検出に用いる第２試薬が単なる原因で、場合により見掛けＫｄの実験測定値が変動する可能性がある。ビオチン−ｍｕＤＳ６の見掛けＫｄをヤギ抗マウスＦＩＴＣを用いた場合（Ｋｄ＝２．８０ｎＭ；図１８Ｂ）またはストレプトアビジン−ＤＴＡＦを用いた場合（Ｋｄ＝６．７６ｎＭ；図１９Ａ）で比較することにより、これを説明する。ｍｕＤＳ６、ｈｕＤＳ６  ｖ１．０、およびｈｕＤＳ６  ｖ１．２がビオチン−ｍｕＤＳ６と競合する能力を比較した競合結合アッセイの結果を、図１９Ｂに示す。見掛けＥＣ５０は、ｍｕＤＳ６、ｈｕＤＳ６  ｖ１．０、およびｈｕＤＳ６  ｖ１．２についてそれぞれ１２．１８ｎＭ、３７．０７ｎＭ、および２２．６４ｎＭである。これらの結果は、ヒト化ＤＳ６を作製するためのｍｕＤＳ６のリサーフェシングが結合親和性をほとんど低下させないことを示す。
【０２７０】
実施例１４：ＤＳ６−ＤＭ１細胞毒性コンジュゲートの調製
[253]  ＤＳ６抗体（８ｍｇ／ｍｌ）を８倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−４−（
２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）により修飾して、ジチオピリジル基を導入した。９５％  ｖ／ｖの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＫＰｉ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの
ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）および５％  ｖ／ｖのＤＭＡ中、室温で２時間、反応を実施した。わずかに膨張した反応混合物をＮＡＰまたはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（緩衝液Ａ中で平衡化）によりゲル濾過した。２８０ｎｍにおける抗体の吸光度、ならびに２８０および３４３ｎｍにおけるＤＴＴ放出２−メルカプトピリジン（Ｓｐｙ）の吸光度を測定することにより、修飾度を判定した。次いで抗体２．５ｍｇ／ｍＬの修飾ＤＳ６を、Ｓｐｙより１．７倍モル過剰のＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（Ｌ−ＤＭ１）を用いてコンジュゲートさせた。この反応は、ＤＭＡ（３％  ｖ／ｖ）を含む緩衝液Ａ（９７％  ｖ／ｖ）中で実施された。反応物を室温で一夜、約２０時間インキュベートした。不透明な反応混合物を遠心し（１１６２×ｇ、１０分）、次いで緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５）中で平衡化したＮＡＰ−２５またはＳ３００（Ｔａｎｄｅｍ  ３、３×２６／１０脱塩用カラム、Ｇ２５媒体）カラムにより上清をゲル濾過した。ペレットを廃棄した。コンジュゲートを０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターにより無菌的に濾過し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを含む緩衝液Ｂ中で透析した。濾過した材料の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍ両方における吸光度を測定することにより、ＤＳ６の分子当たり連結したＤＭ１分子の個数を判定した。ＤＭ１／抗体比は４．３６であることが認められ、コンジュゲートＤＳ６の工程収率は５５％であった。コンジュゲート抗体の濃度は１．３２ｍｇ／ｍＬであった。この精製コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により生化学的に解明し、９２％が単量体であることが認められた。精製コンジュゲート中のＤＭ１の分析は、９９％が抗体に共有結合していることを示した。図２０に、Ｃａｏ−３細胞へのＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートおよび非修飾ＤＳ６のフローサイトメトリー結合は、ＤＳ６のコンジュゲーションにより親和性がわずかに低下したにすぎないことを示す。
【０２７１】
実施例１５：ＤＳ６−ＤＭ１のインビトロ細胞毒性
[254]  裸の抗体としてのＤＳ６は、細胞培養において増殖または成長の阻害活性を示
さなかった（図２１）。しかし、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ鎖およびＬ鎖へのＤＭ１コンジュゲートの存在下でＤＳ６を細胞と共にインキュベートすると、ＤＳ６はこのコンジュゲートを細胞へ効果的にターゲティングおよび送達して間接的な細胞毒性を生じるのにきわめて有効である（図２１）。裸のＤＳ６に固有の活性をさらに試験するために、ネズミおよびヒト化ＤＳ６を用いる補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイを実施した。ＨＰＡＣおよびＺＲ−７５−１細胞（２５０００個／ウェル）を、９６ウェルプレート内で、５％ヒトまたはウサギ血清ならびに種々の希釈度のネズミまたはヒトＤＳ６の存在下に、２００μｌのＲＨＢＰ培地（ＲＰＭＩ−１６４０；０．１％のＢＳＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２〜７．４）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン）に接種した。細胞を３７℃で２時間インキュベートした。次いでＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（最終濃度１０％）試薬（Biosource）を上清に添加した。細胞を５〜２
４時間インキュベートした後、蛍光を測定した。ネズミおよびヒト化ＤＳ６は両方とも、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイに影響を及ぼさなかった（図２２）。これは、ＤＳ６を療法に使用するためには毒性エフェクター分子へのコンジュゲーションが必要なことを示唆する。
【０２７２】
[255]  種々のＤＳ６陽性細胞系において２つの異なるアッセイ様式を用いて、メイタ
ンシノイドにコンジュゲートしたＤＳ６抗体の細胞毒性を検査した。６ウェルプレート上で、培地中に希釈したコンジュゲート２ｍｌ中に細胞（１０００〜２５００個／ウェル）を接種して、コロニー形成アッセイを実施した。一般に３×１０−１１〜３×１０−９Ｍの数種類の濃度のコンジュゲートに細胞を連続曝露し、３７℃、６％ＣＯ２の加湿チャンバー内で５〜９日間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、コロニーを１％  ｗ／ｖクリスタルバイオレット／１０％  ｖ／ｖホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で染色した。次いで、結合しなかった色素を蒸留水でウェルから十分に洗い去り、プレートを自然乾燥させた。Ｌｅｉｃａ  ＳｔｅｒｅｏＺｏｏｍ  ４解剖顕微鏡によりコロニーを計数した
。
【０２７３】
[256]  コロニー数／接種細胞数としてコロニー形成率（ＰＥ）を計算した。処理細胞
のＰＥ／非処理細胞のＰＥとして生存率を計算した。細胞生存率をコンジュゲートのモル濃度に対してグラフにすることにより、ＩＣ５０濃度を判定した。コロニー形成アッセイ（図２３）において、ＤＳ６−ＤＭ１は８００ｐＭの推定ＩＣ５０でＣａｏ−３細胞を殺すのに有効であった。抗原陰性細胞Ａ３７５は、試験したＤＳ６−ＤＭ１の最高濃度３×１０−９Ｍのコンジュゲートにより、わずかしか影響を受けなかった；これは、コンジュゲートの殺細胞活性が特異的に抗原発現細胞に向けられていることを立証する。しかし、他の多くのＤＳ６陽性細胞系は、メイタンシンに対して明らかに感受性であるにもかかわらず免疫コンジュゲートに対して格別感受性ではなかった。子宮頸部細胞系（ＨｅＬａ、ＫＢ、およびＷＩＳＨ）はコンジュゲートに対して感受性であったが、特定数の卵巣および胸部細胞系のみが細胞毒効果を示した。膵臓細胞系は影響を受けないように思われた。
【０２７４】
[257]  ＭＴＴアッセイにおいて、細胞を９６ウェルプレートに１０００〜５０００個
／ウェルの密度で接種した。裸のＤＳ６またはＤＳ６−ＤＭ１免疫コンジュゲートの系列希釈液と共に、細胞を培地２００μｌに接種した。試料を三重に試験した。次いで細胞と抗体／コンジュゲートの混合物を２〜７日間インキュベートした時点で、ＭＴＴ（［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）］アッセイにより細胞の生存率を評価した。ＭＴＴ（５０μｇ／ウェル）を培養上清に添加し、３７℃で３〜４時間インキュベートした。培地を除去し、ＭＴＴホルマザンをＤＭＳＯ（１７５μｌ／ウェル）に溶解した。５４０〜５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＭＴＴ細胞生存率アッセイ（図２４Ｃ）において、免疫コンジュゲートは１．６１ｎＭの推定ＩＣ５０でＣａｏ−３細胞を効果的に殺すことができた。効果のない裸の抗体と比較して、最高濃度のコンジュゲートを含むウェルには生存細胞が含まれなかった（図２１および２４）。
【０２７５】
[258]  他の細胞系に関するＭＴＴアッセイの結果はわずかに異なっていた（図２４Ａ
、ＢおよびＤ〜Ｉ）。多くの場合、若干の細胞毒性がみられたが、コンジュゲートは全細胞集団を完全に殺すことはできなかった（ＷＩＳＨ細胞を除く）。ＢＴ−２０、ＯＶＣＡＲ５、およびＨＰＡＣ細胞は特に抵抗性であった：最高濃度のコンジュゲート（３２ｎＭ）のウェルにおいて、５０％を超える細胞がなお生存していた。
【０２７６】
実施例１６：コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性
[259]  ＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートのインビボ活性を立証するために、ＳＣＩＤマ
ウスにヒト腫瘍異種移植体を樹立した。ヒト子宮頸癌細胞系ＫＢの皮下モデルを開発した。ＫＢ細胞をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地１００μＬ中５×１０６個を各マウスの右肩下に注射し、６日間増殖させて平均腫瘍体積１４４±１２５ｍｍ３になった時点で薬物処理を開始した。マウスに、ＰＢＳ、ＤＭ１  １５０μｇ／ｋｇのコンジュゲート、またはＤＭ１  ２２５μｇ／ｋｇのコンジュゲート（各群２匹のマウス）を６日間、毎日、静脈内投与した。処理期間中、１日１回、中毒反応をモニターした。処理期間中、腫瘍体積（図２５Ａ）および対応する体重（図２５Ｂ）をモニターした。
【０２７７】
[260]  ＰＢＳ対照で処理したＫＢ腫瘍は、約４日間の倍増時間で急速に増殖した。こ
れに対し、コンジュゲートで処理したマウスは両群とも完全な腫瘍退縮を示した；２２５μｇ／ｋｇおよび１５０μｇ／ｋｇ投与群で、それぞれ処理開始後１４日目および１８日目。１５０μｇ／ｋｇ投与量では、腫瘍遅延が約７０日間であった。２２５μｇ／ｋｇの処理では１２０日目に試験を終了した時点で腫瘍再発の証拠はなかったので、治癒した。図２５Ｂにみられるように、１５０μｇ／ｋｇ群のマウスは体重減少を示さなかった；これは、この用量が十分に耐容されることを示した。高い方の用量では、マウスは３％の一
時的な体重減少を生じたにすぎない。５日間の処理期間中、マウスは目に見える中毒徴候を示さなかった。これらを合わせると、この試験はＤＳ６−ＤＭ１処理によりマウスのＫＢ異種移植腫瘍を無毒性用量で治癒しうることを立証する。
【０２７８】
[261]  ＤＳ６−ＤＭ１活性をさらに皮下異種移植モデルのパネルについて試験した（
図２６参照）。異種移植体の形成に用いた腫瘍細胞系は、ある程度のインビトロメイタンシン感受性およびＣＡ６エピトープ密度を示した（下記の表９を参照）。ＯＶＣＡＲ５細胞およびＴＯＶ−２１Ｇは卵巣腫瘍細胞系である；ＨＰＡＣは膵臓腫瘍細胞系である；ＨｅＬａは子宮頸部腫瘍細胞系である。ＯＶＣＡＲ５およびＴＯＶ−２１Ｇ細胞は低い表面ＣＡ６発現を示す；ＨｅＬａ細胞は中間レベルの表面ＣＡ６発現を示す；ＨＰＡＣは高いＣＡ６表面発現密度を示す。ＴＯＶ−２１ＧおよびＨＰＡＣ細胞はメイタンシン感受性である；ＯＶＣＡＲ５およびＨｅＬａ細胞はメイタンシン感受性が２〜７倍低い。
【０２７９】
【表１０】
2015012861.tif 000051
【０２８０】
＊  平均最大相対平均蛍光
[262]  前記の４細胞系をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地１００μＬ中１×
１０７個を各マウスの右肩下に注射し（各モデル当たり６匹のマウス）、６日間増殖させて、平均腫瘍体積がＯＶＣＡＲ５の被験群および対照群についてはそれぞれ５７．６±６．７および９０．２±１３．４ｍｍ３、ＨＰＡＣの被験群および対照群についてはそれぞれ１４７±２９．６および１７６．２±１８．９ｍｍ３、ＨｅＬａの被験群および対照群についてはそれぞれ１９４．３±３７．２および２０１．７±７１．７ｍｍ３、ＴＯＶ−２１Ｇの被験群および対照群についてはそれぞれ９６．６±２２．８および１５５．６±１３．４ｍｍ３になった時点で、薬物処理を開始した。各モデルについて３匹の対照マウスを週１回のＰＢＳで２回、３匹の被験マウスを週１回のコンジュゲート（ＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇ）で２回、静脈内処理した。処理期間中、１日１回、中毒反応をモニターし、処理期間中、腫瘍体積および体重をモニターした。種々のモデルについてのコンジュゲート効果を図２６Ａ、Ｃ、ＥおよびＧにグラフで示し、対応する体重を図２６Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨにプロットする。ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１ＧおよびＨＰＡＣ細胞系は、各モデルのＰＢＳ対照にみられるように、進行性腫瘍を形成した。ＨｅＬａモデルは、対数増殖開始前に約３週間の遅滞期があった。すべてのモデルにおいて、ＤＳ６−ＤＭ１コンジ
ュゲート処理によりすべてのマウスで腫瘍が完全に退縮した。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＨＰＡＣおよびＨｅＬａモデルについて、マウスは６１日目に腫瘍のない状態を維持している。ＯＶＣＡＲ５モデルでは、腫瘍接種後、約４５日目に腫瘍が再発した。したがって、このモデルではＤＳ６−ＤＭ１処理が腫瘍増殖を約３４日間遅延させている。ＯＶＣＡＲ５細胞はメイタンシン感受性がより低く、かつＣＡ６エピトープ発現が低いので、この増殖遅延は重要である。ＣＡ６エピトープ密度がより高いモデル、またはより高いメイタンシン感受性をもつモデルでは、腫瘍退縮がより著しい。２回投与しただけである点に注目することが重要である。体重減少はみられなかったので、この試験に採用した投与計画は明らかにマウスに対する毒性がなかった。追加またはより多量のコンジュゲートの投与により治癒を達成できると思われる。
【０２８１】
[263]  ヒトの卵巣癌は多くが腹膜の疾患である。ＯＶＣＡＲ５細胞は、ＳＣＩＤマウ
スの腹腔内（ＩＰ）モデルとしてヒト疾患と同様に進行増殖して腫瘍結節を形成し、腹水を産生する。ＩＰモデルにおける活性を立証するために、ＯＶＣＡＲ５  ＩＰ腫瘍を伴うマウスをＤＳ６−ＤＭ１により処理した（図２７）。ＯＶＣＡＲ５細胞をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地１００μＬ中１×１０７個を腹腔内注射した。腫瘍を６日間増殖させた時点で処理を開始した。マウスを週１回で２週間、ＰＢＳまたはＤＭ１  ６００μｇ／ｋｇ量のＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートで処理し、腹膜疾患により生じる体重減少をモニターした。２８日目までにＰＢＳ群のマウスは２０％を超える体重が減少し、安楽死させた。処理群は体重減少が２０％を超えた後、４５日目に安楽死させた。この試験は、ＯＶＣＡＲ５はメイタンシンに対する感受性がより低く、かつ細胞当たりのＣＡ６エピトープが少ないという事実にもかかわらず、ＤＳ６−ＤＭ１が進行性ＯＶＣＡＲ５モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延しうることを立証する。採用した投与計画は目に見える中毒徴候を誘発しなかったので、追加およびより多量を用いてさらに腫瘍増殖の遅延または治癒を達成できると思われる。
【０２８２】
実施例１７：ＤＳ６−ＳＰＰ−タキソイドＭＭ１−２０２細胞毒性コンジュゲートの合成および特性解明
[264]  ＤＳ６をＮ−スルホスクシンイミジル４−ニトロ−２−ピリジル−ペンタノエ
ート（ＳＳＮＰＰ）リンカーにより修飾した。９０％緩衝液Ａ中５０ｍｇのＤＳ６抗体に、ＤＭＡ中１０当量のＳＳＮＰＰを添加した。抗体の最終濃度は８ｍｇ／ｍｌであった。反応物を室温で４時間撹拌し、次いでＧ２５クロマトグラフィーにより精製した。分光光度法で２８０ｎｍ（抗体）および３２５（リンカー）における吸光により、抗体の修飾度を測定し、リンカー３．８２／抗体をもつことが認められた。抗体の回収量は４３．３ｍｇであり、８７％の収率が得られた。ＤＳ６−ニトロＳＰＰのコンジュゲートをタキソイドＭＭ１−２０２（１８１２Ｐ．１６）とコンジュゲートさせた。４２ｍｇ規模で、９０％の緩衝液Ａ、１０％のＤＭ１中においてコンジュゲーションを実施した。前記のタキソイドを０．４３当量／リンカー（各回）で４回、約２０時間かけて添加した。この時点までに反応物は顕著に混濁した。Ｇ２５精製の後、約６４％の収率で回収された生成コンジュゲートはタキソイド約４．３／抗体を含み、未反応リンカー約１当量が残っていた。未反応リンカーを不活性化するために、一夜撹拌しながら１当量のシステイン／未反応リンカーをコンジュゲートに添加した。システインを添加すると明瞭な黄色の呈色が認められ、チオピリジンの遊離が指示された。次いで反応溶液を緩衝液Ｂ／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で透析し、続いて緩衝液Ｂ単独中で数日間かけてさらに透析した。最終コンジュゲートは薬物２．８６／抗体を含んでいた。抗体回収量は１４．７ｍｇであり、全体として３５％の収率が得られた。コンジュゲートをさらにＳＥＣにより生化学的に解明し、単量体８９％、二量体１０．５％、およびより高分子量の凝集体０．５％を含むことが認められた。
【０２８３】
[265]  ＨｅＬａ細胞に対するＤＳ６−ＳＰＰ−タキソイドＭＭ１−２０２とＤＳ６抗
体の結合を比較したフローサイトメトリー分析の結果を図２８に示す。この結果は、ＤＳ６がタキサンにコンジュゲートした場合に結合活性を保持することを示す。
【図１】
2015012861.tif 000082
【図２】
2015012861.tif 000083
【図３】
2015012861.tif 000084
【図４】
2015012861.tif 000085
【図５−１】
2015012861.tif 000086
【図５−２】
2015012861.tif 000087
【図６】
2015012861.tif 000088
【図７】
2015012861.tif 000089
【図８】
2015012861.tif 000090
【図９】
2015012861.tif 000091
【図１０】
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【図１１】
2015012861.tif 000093
【図１２】
2015012861.tif 000094
【図１３−１】
2015012861.tif 000095
【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2015012861.tif 000099
【図１７】
2015012861.tif 000100
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６−１】
2015012861.tif 000113
【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月8日(2014.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
[139]  本発明の他の態様においては他のメイタンシン類を使用でき、これには硫黄原子を保有する炭素原子におけるモノまたはジ−アルキル置換をもつチオール−およびジスルフィド含有メイタンシノイドが含まれる。これらには、下記をもつメイタンシノイドが含まれる：Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチル、アシル基がヒンダードスルフヒドリル基を保有するアシル化アミノ酸側鎖、その際チオール官能基を保有するアシル基の炭素原子は１または２つの置換基をもち、それらの置換基はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子をもつ直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子をもつ環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらに置換基の１つはＨであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
【化２３】
2015012861.tif 000119
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
【化２５】
2015012861.tif 000120
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
【化２７】
2015012861.tif 000121
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
[149]  式（ＶＩＩ）の好ましい態様には、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨである式（ＶＩＩ）の化合物が含まれる。
[150]  前記のメイタンシノイド類を、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６またはその相同体もしくはフラグメントにコンジュゲートさせることができる。その際、メイタンシノイドのＣ−３にあるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基にあるチオール−もしくはジスルフィド官能基、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルを用いて、抗体をメイタンシノイドに結合させ、その際、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基のチオール−もしくはジスルフィド官能基は１または２つの置換基をもつ炭素原子にあり、それらの置換基はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子をもつ直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子をもつ分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらに置換基の１つはＨであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
を表わし、ここで
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立して０または１〜５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕのうち少なくとも２つはいかなる場合にもゼロではない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
【化３３】
2015012861.tif 000122
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015012861000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月22日(2014.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントおよび少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントを含む抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、当該少なくとも１つのＨ鎖可変部またはそのフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１のアミノ酸３１〜３５、５０〜６６、および９９〜１０６をそれぞれ含む順次３つの相補性決定領域を含み、そして当該少なくとも１つのＬ鎖可変部またはそのフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２４〜３３、４９〜５５、および８８〜９６をそれぞれ含む順次３つの相補性決定領域を含む、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項２】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項３】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項４】
Ｌ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項５】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項６】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項７】
Ｈ鎖可変部またはそのフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはそのエピトープフラグメントのＬ鎖またはＨ鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
ベクターが、当該抗体またはエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
ベクターが、当該抗体またはエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
ＣＡ６グリコトープを検出する方法であって、以下：
（ａ）試料を得る；
（ｂ）当該試料を、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはエピトープ結合フラグメントと接触させる；および
（ｃ）（ｂ）の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの、当該試料中のＣＡ６グリコトープへの結合を検出する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）の結合は、当該試料における癌の存在を示す、請求項１４に記載の方法。