(57)【要約】  本開示は、１つ又はそれ以上の褐色中肋（ＢＭＲ）突然変異を有するトウモロコシ植物の接合状態を決定するための組成物及び方法に関する。本開示は、ＢＭＲトウモロコシについての育種プロセスの向上に有用である方法にも関する。一定の実施形態において、ｂｍ３対立遺伝子に関してのトウモロコシ植物の接合状態を決定するための組成物及び方法。
2013531977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び／又は存在／不在を決定するための方法であって、
単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び
前記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの核酸分子、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる２つの核酸分子と接触させる工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、及び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子を、前記増幅反応に含める工程、及び
前記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のレポーター及び前記第二のレポーターが、区別可能な励起／発光スペクトルを有する蛍光色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のレポーターがＦＡＭであり、及び前記第二のレポーターがＶＩＣである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、１０ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子の１つが、配列番号：１０の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、区別可能な励起／発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、ＦＡＭで標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、ＶＩＣで標識される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、ＰＣＲ反応での増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、非ＰＣＲベースの反応での増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ジーメイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）におけるＣＯＭＴ突然変異を同定するための方法であって、配列番号：６を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。
【請求項１４】
植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法であって、
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
前記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程、
前記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子と、接触させる工程、及び
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させることにより、高ストリンジェンシーで少なくとも１つの核酸分子を結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が前記遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え植物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１０年５月１２日に出願された「USE OF BROWN MIDRIB-3 GENE SPECIFIC MARKERS IN MAIZE FOR TRAIT INTROGRESSION」についての米国特許仮出願第６１／３３４，０７３号の出願日の恩恵を主張するものである。
【０００２】
本開示は、一般に、植物育種に関する。褐色中肋３（ｂｍ３）突然変異を有する植物の接合状態を決定するための方法を提供する。さらに、本開示の方法は、ＢＭＲ含有植物系統についての育種プロセスの向上に有用である。
【背景技術】
【０００３】
リグニンは、炭水化物、例えば細胞壁内のヘミセルロースと架橋を形成する、植物中の普遍的成分である。リグニンポリマーは、反芻動物における繊維消化を低下させ、リグニン化の程度は、粗飼料作物可消化率に反比例し得る。Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46: 157-98。褐色中肋（ＢＭＲ）突然変異を有するトウモロコシは、有意に低減されたリグニン含有率、改変されたリグニン組成及び改善された可消化率に関連づけられる、葉の中肋の赤褐色着色を呈示する。少なくとも４つの独立したＢＭＲ突然変異が、トウモロコシにおいて同定されている。Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7: 1435-6。これらの突然変異は、「ｂｍ１、ｂｍ２、ｂｍ３、及びｂｍ４」と呼ばれており、すべて、対照トウモロコシと比較したときに減少されたリグニン含有率を呈示する。ｂｍ３突然変異は、コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７３２３５）遺伝子内の挿入（ｂｍ３−１）、欠失（ｂｍ３−２）、及び挿入／欠失（ｂｍ３−３）を含む。Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16。
【０００４】
ＣＯＭＴ遺伝子は、リグニン生合成に関与する酵素活性を制御する。ＣＯＭＴは、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｙｌｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を利用してコーヒー酸のメチル基を転移させ、その結果、フェルラ酸が生産される。そのフェルラ酸から最終的にコニフェリルアルコール及びシナピルアルコールが生成される。遊離ラジカルの存在下でのコニフェリルアルコールとフェルラ酸アルコールとシナピルアルコールのこの組み合わせが、リグニン生産をもたらす。ｂｍ３突然変異は、特性決定されており、遺伝子不活性化によってコーヒー酸のメチル基転移を阻害すると考えられている。Guillet-Claude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35; Piquemal et al. (2002) Plant Physiology 130:1-11; He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51; Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16。しかし、ｂｍ３遺伝子座での特定の植物の接合状態を特異的に検出及び試験するための迅速な方法は、開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46: 157-98
【非特許文献２】Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7: 1435-6
【非特許文献３】Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7
【非特許文献４】Vignols et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16
【非特許文献５】Guillet-Claude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35
【非特許文献６】Piquemal et al. (2002) Plant Physiology 130:1-11
【非特許文献７】He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51
【発明の概要】
【０００６】
ＢＭＲ含有系統についての育種プロセスを大きく向上させることができるＢＭＲトウモロコシ品種（例えば、ｂｍ３突然変異体）のハイスループットＰＣＲベース分子特性決定方法を本明細書に開示する。ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子の存在又は不在を決定することによる、植物組織サンプル、及び従って該サンプルを調製した植物の接合状態の決定方法を開示する。従って、ｂｍ３遺伝子座における接合状態ステータスを特異的に検出及び試験する、エンドポイント加水分解プローブＰＣＲベース接合状態アッセイ（これを本明細書ではＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとして言及する）を提供する。アッセイであって、ｂｍ３突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスを同じアッセイにおいて利用するものであるアッセイを開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ｂｍ３突然変異を有するＣＯＭＴ遺伝子及びＣＯＭＴ遺伝子（約１．８ｋｂｐ）の部分的増幅のために設計されたオリゴヌクレオチドの略図を含む。
【図２】図２は、１２のｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３系統（野生型系統）からの部分ＣＯＭＴ遺伝子配列の増幅の描写を含む。ＰＣＲ生成物を２％ Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）で視覚化し、その後、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターへの配列クローニングのために０．８％  Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ＣｌｏｎｅＷｅｌｌによって抽出した。
【図３ａ】図３は、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ遺伝子からのコンセンサス配列のアラインメントを含む。３つの以前に記載された欠失／挿入突然変異に下線を引く。
【図３ｂ】図３は、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ遺伝子からのコンセンサス配列のアラインメントを含む。３つの以前に記載された欠失／挿入突然変異に下線を引く。
【図４】図４は、ｂｍ３突然変異に特異的なプライマーを有するＣＯＭＴ遺伝子及びインタクトＣＯＭＴ遺伝子の略図を含む。（Ａ）点線がｂｍ３欠失を表すＣＯＭＴ遺伝子。ＣＯＭＴ遺伝子特異的プライマーが、その欠失部位内にある。（Ｂ）ｂｍ３突然変異遺伝子。ｂｍ３特異的オリゴヌクレオチドは、欠失部位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわたる、ジャンクションにある。
【図５ａ】図５ａは、ｂｍ３については（ａ）ＦＭＡに関する及び（ｂ）野生型ＣＯＭＴについては（リアルタイムＰＣＲ機の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣに関する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを含む。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。
【図５ｂ】図５ｂは、ｂｍ３については（ａ）ＦＭＡに関する及び（ｂ）野生型ＣＯＭＴについては（リアルタイムＰＣＲ機の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣに関する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを含む。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。
【図６】図６は、サイクル３０でＦＡＭの相対蛍光単位に基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて行った、対立遺伝子１（ホモ接合性ｂｍ３）との遺伝子型決定、及びサイクル３０で（機械の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣの相対蛍光単位に基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて行った、対立遺伝子２（ホモ接合性野生型ＣＯＭＴ）との遺伝子型決定を含む。
【図７】図７は、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いて行ったｂｍ３接合状態決定を含む。ＰＣＲ読取値と蛍光読取値を比較して、下で説明するように分布グラフを生成した：ＳＯＢ１＝ＦＡＭのバックグラウンドを超えるシグナル（５３５ｎｍでのバックグラウンドシグナルの平均値を超えるサンプルシグナル）、ＳＯＢ２＝ＶＩＣのバックグラウンドを超えるシグナル（５６０ｎｍでのバックグラウンドシグナルの平均値を超えるサンプルシグナル）。対数目盛で、野生型についてはＳＯＢ１／ＳＯＢ２＜１、ヘミ接合体については１＜ＳＯＢ１／ＳＯＢ２＜５、及びホモ接合体についてはＳＯＢ１／ＳＯＢ２＞５で遺伝子型決定を行った。
【図８】図８は、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いて行ったｂｍ３接合状態決定を含む。ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ：ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）で、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｘ軸にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。
【０００８】
配列表
添付の配列表に載っている核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において定義されているとおりの、ヌクレオチド塩基についての標準的文字略記を用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖しか示されていないが、表示されている鎖へ任意の参照によりその相補鎖が含まれると解される。添付の配列表において：
配列番号：１は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子を増幅するために使用したフォワードプライマー配列（ＢＭ３５＿Ｆ）：ＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧＣを示す。
配列番号：２は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子を増幅するために使用したリバースプライマー配列（ＢＭ３５＿Ｒ）：ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＡＣＡＴＧＧを示す。
配列番号：３は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子をシークエンスするために使用したＣＯＭＴ遺伝子からオリゴヌクレオチド配列（ＢＭ１２３４Ｒ）：ＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧを示す。
配列番号：４は、突然変異体ｂｍ３対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプライマー配列（ＢＭ３＿Ｆ）：ＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡを示す。
配列番号：５は、突然変異体ｂｍ３対立遺伝子を同定するために使用したリバースプライマー配列（ＢＭ３＿Ｒ）：ＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧを示す。
配列番号：６は、５’末端にＦＭＡ及び３’末端にＭＧＢＮＦＱを有する突然変異体ｂｍ３対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列（ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ）：ＦＡＭ−ＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＧ−ＭＧＢＮＦＱを示す。
配列番号：７は、野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプライマー配列（ＣＯＭＴ＿Ｆ）：ＣＧＣＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣを示す。
配列番号：８は、野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を同定するために使用したリバースプライマー配列（ＣＯＭＴ＿Ｒ）：ＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＡを示す。
配列番号：９は、５’末端にＶＩＣ及び３’末端にＭＧＢＮＦＱを有する野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列（ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ）：ＶＩＣ−ＣＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣ−ＭＧＢＮＦＱを示す。
配列番号：１０は、ｂｍ３ヌクレオチド配列を示す。
配列番号：１１は、部分ＣＯＭＴヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Ｉ．幾つかの実施形態の概観
ＢＭＲ含有植物系統についての育種プロセスを大いに向上させることができるｂｍ３トウモロコシ品種のハイスループットＰＣＲベース分子特性決定方法を本明細書に開示する。特定の実施形態において、該方法は、単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物から得る工程、該単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び該トウモロコシ植物からの単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程を含む。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、１０ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、配列番号：１０の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一である。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、配列番号：１１の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一である。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができない。一定の実施形態において、配列番号：１０又は配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、配列番号：１〜９からなる群より選択される。
【００１０】
トウモロコシ植物におけるＢＭＲ突然変異を同定するための方法も開示する。一部の実施形態において、該方法は、トウモロコシ植物からのゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができる核酸分子に暴露する工程を含むことができる。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができる核酸分子は、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６からなる群より選択することができる。
【００１１】
植物生殖質に（例えば、ｂｍ３対立遺伝子の遺伝子移入によって）低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法をさらに開示する。一部の実施形態において、該方法は、ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と戻し交配する工程、該交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程、単離されたゲノムＤＮＡの該サンプルを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得た植物を繁殖させることにより、ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配種から、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子に高ストリンジェンシーで結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が該遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程を含むことができる。
【００１２】
本開示のハイスループットＰＣＲベース分子法に従って決定された遺伝子型及び／又は接合状態を有するトウモロコシ植物、並びに低リグニン含有率の形質をトウモロコシ植物生殖質に確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための本開示の方法に従って生産される、低リグニン含有率の形質を呈示する遺伝子組換えトウモロコシ植物も開示する。
【００１３】
ＩＩ．略語
ＢＭＲ  褐色中肋
ＭＧＢＮＦＱ  Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｎ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ    Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｉ
ＦＡＭ  ６−カルボキシ−フルオレセイン
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＦＵ  相対蛍光単位
ＶＩＣ  ６−カルボキシ−ローダミン
【００１４】
ＩＩＩ．用語
後に続く説明及び表において多数の用語を用いる。そのような用語が与えられている範囲を含む、本明細書及び特許請求の範囲の明確な及び一致した理解をもたらすために、以下の定義を提供する：
戻し交配：戻し交配は、育種家が、親の１つに雑種後代、例えばＦ１雑種の親遺伝子型の１つを有する第一世代雑種Ｆ１を戻すように繰り返し交配するプロセスである。
ＢＭＲトウモロコシ：本明細書において用いる場合、用語「ＢＭＲトウモロコシ」は、褐色中肋突然変異、例えばｂｍ１、ｂｍ２、ｂｍ３及びｂｍ４として特性決定される突然変異を有するトウモロコシ品種を指す。ＢＭＲトウモロコシ品種は、概して、葉の中肋の赤褐色着色を呈示する。ＢＭＲトウモロコシは、概して、より低いリグニン含有率、より高い繊維可消化率及びより高い乾物摂取量も特徴とする。ＢＭＲトウモロコシ品種の非限定的な例としては、Ｆ２Ｆ２９７、Ｆ２Ｆ３８３、Ｆ２Ｆ４８８、Ｆ２Ｆ４４９、Ｆ２Ｆ５６６、Ｆ２Ｆ６１０、Ｆ２Ｆ６２２、Ｆ２Ｆ６６５、Ｆ２Ｆ６３３、Ｆ２Ｆ６８２、Ｆ２Ｆ７２１、Ｆ２Ｆ７００、及びＦ２Ｆ７９７が挙げられる。
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体は、相補塩基間で、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）又は逆フーグスティーン水素結合を含む、水素結合によってハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びチミン（Ｔ））又はプリン（アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は、「塩基対合」と呼ばれる。より具体的には、Ａは、Ｔ又はＵに水素結合することとなり、Ｇは、Ｃに結合することとなる。「相補的」は、２つの異なる核酸配列間で又は同じ核酸配列の２つの異なる領域間で発生する塩基対合を指す。
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「特異的に相補的な」は、安定した特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとの間で発生するような十分な相補性度を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるためにそのターゲット配列に１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドのターゲットＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が、該ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能に干渉するとき、及び特異的結合が望まれる条件下、例えばインビボアッセイ又は系の場合に生理条件下で非ターゲット配列への該オリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な相補性度が存在するとき、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
特定のストリンジェンシー度を生じさせる結果となるハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質、並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに依存して、様々である。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（とりわけ、Ｎａ＋及び／又はＭｇ２＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの一因となるが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定のストリンジェンシー度を達成するために必要とされるハイブリダイゼーション条件についての計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11において論じられている。
本開示のために、「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子とターゲット配列の間に２５％未満のミスマッチがある場合にハイブリダイゼーションが発生する条件を包含する。「ストリンジェント条件」は、特定のストリンジェンシーレベルにさらに定義することができる。従って、本明細書において用いる場合、「中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）ストリンジェンシー」条件は、２５％より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件である。「中（ｍｅｄｉｕｍ）ストリンジェンシー」の条件は、１５％より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、及び「高ストリンジェンシー」の条件は、１０％より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」の条件は、６％より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態において、ストリンジェント条件は、製造業者の説示に従って希釈されたＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定用マスターミックス（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３７１３５５）中、６０℃でのハイブリダイゼーションを含み得る。
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸又はタンパク質）は、該成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生体成分、すなわち他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ並びにタンパク質から実質的に分離された、該他の生体成分とは別に生産された、又は該他の生体成分から精製された。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子、タンパク質及びペプチドも包含する。
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断によって、又は個々のヌクレオチド前駆体を合成することによって形成され得る。自動合成装置は、数百塩基対までの長さのオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。オリゴヌクレオチドは相補ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのプローブとしてそれらを使用することができる。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）をＰＣＲ、小さいＤＮＡ配列の増幅のための技術において使用することができる。ＰＣＲにおいて、該オリゴヌクレオチドは、概して、「プライマー」と呼ばれ、これは、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長すること及び相補鎖を複製することを可能にするものである。
接合状態：本明細書において用いる場合、用語「接合状態」は、生物における遺伝形質のための遺伝子の対立遺伝子の類似性又はそれらの欠失を指す。両方の対立遺伝子が同じである場合、その生物は、その形質について「ホモ接合性」である。両方の対立遺伝子が異なる場合、その生物は、その形質について「ヘテロ接合性」である。一方の対立遺伝子が欠けている場合、それは、「ヘミ接合性」である。両方の対立遺伝子が欠けている場合、それは、「ヌル接合性」である。
特に別の説明がない限り、本明細書において用いるすべての専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の通常の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及びMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる。
【００１５】
ＩＶ．ｂｍｒトウモロコシの遺伝子型及び接合状態決定のためのハイスループット方法
Ａ．概観
ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイをここで説明する。特定の実施例は、同じアッセイにおいてｂｍ３欠失に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスとを利用する。これらの実施例では、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子の存在／不在によって、接合状態を決定することができる。該アッセイをさらなる実行のためにハイスループットゲノム分析グループに付託した。該アッセイは、ＢＭＲ遺伝子移入プロジェクトの育種プロセスを大きく向上させることができる。
【００１６】
Ｂ．褐色中肋トウモロコシ
褐色中肋（ＢＭＲ）トウモロコシ植物は、Ｖ４からＶ６期における葉の中肋の褐色着色及び房を付けた後の髄の淡褐色呈色を特徴とする。褐色中肋ハイブリッドトウモロコシは、トウモロコシ植物組織中のリグニン含有率を低下させる遺伝子突然変異、例えば、ｂｍ２突然変異又はｂｍ３突然変異を有する。褐色中肋３遺伝子は、染色体４の短いアーム上に位置し、ｂｍ３対立遺伝子は、劣性である。褐色中肋２遺伝子は、染色体１の長いアーム上に位置し、ｂｍ２対立遺伝子も劣性である。リグニンポリマーは、トウモロコシ植物中の繊維の可消化性を制限する。褐色中肋トウモロコシ中の低減されたリグニンは、結果として、通常のトウモロコシより可消化性が高い繊維を有するサイレージを生じさせる。動物飼養試験により、通常のサイレージと比較して、ＢＭＲトウモロコシサイレージでの約１０パーセント多い摂取量及び増加された産乳量が証明された。
【００１７】
ｂｍ３突然変異を同定する方法を提供する。本開示の方法は、例えば、特定のトウモロコシ植物、又は特定のトウモロコシ品種をＢＭＲトウモロコシとして同定するのに有用であり得る。開示する方法は、ＢＭＲトウモロコシと他のトウモロコシ品種を交配させることによる、又は第一のＢＭＲ突然変異を有するＢＭＲトウモロコシと第二のＢＭＲ突然変異を有するＢＭＲトウモロコシとを交配させること（例えば、ｂｍ１トウモロコシ品種とｂｍ３トウモロコシ品種を交配させること）による、トウモロコシ生殖質へのＢＭＲ形質の信頼できる及び予測できる遺伝子移入にも有用であり得る。多くのＢＭＲ突然変異が当業者に公知であり、一部のＢＭＲ突然変異は特性決定（例えば、マッピング及びシークエンシング）されている。本開示の方法は、ＢＭＲ突然変異を同定するために、ＢＭＲトウモロコシ植物又は品種の遺伝子型及び／又は接合状態を決定するために、並びにトウモロコシ生殖質への任意のＢＭＲ突然変異の遺伝子移入に、用いることができる。
【００１８】
Ｃ．エンドポイントＰＣＲ検出アッセイ
ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイをここで説明する。特定の実施形態では、遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを用いて、トウモロコシの接合状態をｂｍ３突然変異について分析することができる。
遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマー及びプローブを、対象の遺伝子における公知突然変異に基づいて、設計することができる。例えば、ｂｍ３特異的アッセイ用のプライマー及びプローブを、コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）遺伝子の３’末端での９７８ｂｐ欠失に基づいて、設計することができる。突然変異（例えば、ｂｍ３）に特異的なオリゴヌクレオチド及び破壊されていない野生型遺伝子（例えば、ＣＯＭＴ）に特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて使用するバイプレックス反応において、該特異的オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡサンプル中に存在する該突然変異遺伝子及び／又は該野生型遺伝子のいずれか又は両方からの配列を選択的に増幅する。
【００１９】
一部の実施形態において、ｂｍ３特異的アッセイは、長さが７１ｂｐであるフラグメントであって、９７８ｂｐのヌクレオチド配列が野生型ＣＯＭＴ遺伝子から欠失されたジャンクション部位に固有であるものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ（配列番号：６））は、２つのＰＣＲプライマー（例えば、ＢＭ３＿Ｆ（配列番号：４）及びＢＭ３＿Ｒ（配列番号：５））の間のゲノムＤＮＡサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００２０】
一部の実施形態において、野生型ＣＯＭＴ遺伝子特異的アッセイは、長さが６５ｂｐであるＣＯＭＴ遺伝子のフラグメントであって、ＣＯＭＴ遺伝子座の非ｂｍ３配列を増幅することができないように（ｂｍ３突然変異体では欠失されている）エキソン２内に位置するものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ（配列番号：９））は、２つのＰＣＲプライマー（例えば、ＣＯＭＴ＿Ｆ（配列番号：７）及びＣＯＭＴ＿Ｒ（配列番号：８））の間のゲノムＤＮＡサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００２１】
ターゲット特異的オリゴヌクレオチドを、例えば蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、及びＭＧＢＮＦＱ）で、標識することができ、それによってターゲット特異的蛍光シグナルの迅速な定量を可能にすることができる。所定数のサイクルの後、例えば、反応が初期指数関数的増幅期にあるときに、ＰＣＲ生成物を測定することができる。陰性対照サンプルは、例えばｂｍ３突然変異を有さない、任意のトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを含むことができる。陽性対照サンプルは、ＢＭＲ突然変異、例えばＣＯＭＴ遺伝子におけるｂｍ３欠失突然変異を有するトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを含むことができる。対照ヘミ接合性サンプルは、ｂｍ３突然変異についてヘミ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを含むことができ、又はヘミ接合性サンプルは、ｂｍ３についてホモ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのＤＮＡと同じ割合の陰性対照ＤＮＡを含むことができる。
【００２２】
当業者に公知の方法によって、ＤＮＡをトウモロコシ植物組織から単離する（例えば、抽出する、及び精製する）ことができる。ＤＮＡ単離用の市販のキット、例えばＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．からのものを利用することができる。一部の実施形態では、特定の植物からの葉ディスクを打ち抜き、コレクションチューブに移す。各サンプリング後にパンチャーを７０％アルコールで浄化し、水ですすぎ、乾燥させることができる。ＤＮＡ抽出用緩衝液を、製造業者の推奨に従って調製することができる。その後、キットを製造業者の説示に従って使用して、ＤＮＡを単離することができる。最後に、その単離されたＤＮＡの濃度を、例えば、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）定量キット（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び分光光度計を使用して、又は任意の他の適する技術によって、決定することができる。
【００２３】
プライマー、プローブ及びゲノムＤＮＡサンプルを調製すると、又は別様に利用可能にすると、ＰＣＲ反応を行って該ゲノムＤＮＡサンプル中の対象の核酸配列（例えば、ＢＭＲ突然変異に特有の配列）を同定することができる。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡサンプルを除いてすべての反応成分を含有する個々のＰＣＲ反応混合物を調製する。ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴトウモロコシのためのプライマー及び遺伝子特異的プローブを含むバイプレックス反応のための反応混合物は、酵素、反応用緩衝液、ｂｍ３突然変異のためのフォワード及びリバースプライマー、野生型ＣＯＭＴ遺伝子のためのフォワード及びリバースプライマー、ｂｍ３突然変異のための遺伝子特異的プローブ、ＣＯＭＴ遺伝子のための遺伝子特異的プローブ、並びに水を含み得る。一部のＰＣＲアッセイ系（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）において、酵素及び緩衝液は、単一のキット構成要素（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定用マスターミックス；カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３７１３５５）中に存在することがある。
【００２４】
反応混合物を別様に調製すると、ゲノムＤＮＡサンプルを添加し、反応を開始させることができる。サンプル中のゲノムＤＮＡの量を正規化する必要はない。しかし、当業者は、比較的等濃度のゲノムＤＮＡサンプルを使用することにより、最良の結果を獲得することができる。
【００２５】
一部の実施形態では、適切な対照を用いてＰＣＲアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）を構成することができる。例えば、（１）試薬を有するがＤＮＡサンプルを有さない陰性対照、（２）ｂｍ３トウモロコシゲノムＤＮＡを含むホモ接合性陽性対照、（３）及び上で説明したようなヘミ接合性陽性対照を含む対照ウエルを伴うマルチ・ウエル・プレートにおいて反応を行うことができる。その後、適するサイクル条件下でＰＣＲによってＤＮＡを増幅する。例えば、ＧｅｎＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用する一部の実施形態では、９５℃で１５分間の単一の初期変性サイクルがあり、それに３０サイクルの変性（９２℃で１５秒間）そしてアニーリング／伸長（６０℃で６０秒間）というサイクルが続き得る。ＰＣＲサイクル条件を現場の人間の自由裁量によって変えて、匹敵する結果を得ることができることは、当業者には理解される。
【００２６】
Ｄ．遺伝子型及び／又は接合状態の決定
ＰＣＲアッセイ（例えば、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）を、ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの遺伝子型及び／又は接合状態分析に使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブをレポーター（例えば、蛍光部分）で標識することができる。蛍光検出を用いるアッセイについては、プローブの検出に適している励起及び発光波長設定を用いて分光蛍光光度計（例えば、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ（商標）；スイス、メンネドルフ）でＰＣＲ反応生成物を分析することができる。例えば、蛍光色素、ＦＡＭを、４８５ｎｍの励起波長及び５３５ｎｍの発光波長で測定することができる。あるいは、蛍光色素、ＶＩＣを、５２５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長で測定することができる。
【００２７】
ＰＣＲ反応及びプローブ検出の完了後、例えば任意の適するコンピュータ・グラフィック・ソフトウェアを使用して、表及び分布グラフを生成することができる。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性ＤＮＡで得られた結果は、陰性及び陽性対照として使うことができる。ある分離集団において、データ点の３つのクラスタを得、それによって、それらの分離されたクラスタの１つに属する可能性が高いというサンプル結果の視覚的決定を可能にすることができる。あるいは、データ解析コンピュータソフトウェアを使用して、サンプル結果がそれぞれの分離されたクラスタに属する尤度を計算することができ、最も尤度の高いクラスタがそのサンプルの名称になる。視覚的決定を行うとき、例えばデータ点の３つのクラスタが明瞭に見えるとき、各クラスタの境界は任意であり得る。
【００２８】
適する分析パッケージ、例えばＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）を使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析することもできる。突然変異体対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナルの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を一方の軸にプロットし、野生型対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナルのＲＦＵを他方の軸にプロットして、グラフを生成することができる。その後、データのグラフィック表示でのクラスタ分離に基づいて、接合状態決定を行うことができる。
【００２９】
突然変異体ゲノムＤＮＡ（例えば、ＢＭＲ突然変異）を含有しないサンプルは、結果として、野生型ＰＣＲ生成物の蛍光読取値しかもたらすことができない。ヘミ接合性又はホモ接合性突然変異体ゲノムＤＮＡを含有するサンプルは、結果として、陰性バックグラウンド対照のものより高い突然変異体特異的プローブについてのＲＦＵ読取値をもたらすことができる。サンプルが妥当な結果を生じさせない場合、そのサンプル中のゲノムＤＮＡは、妥当な質及び／又は量のものでないことがあり、新たなＤＮＡ調製及び／又は新たなＰＣＲ反応を行うべきである。好ましくは、ＤＮＡサンプルを含有しない陰性対照サンプルは、遺伝子特異的プローブの非常に低い検出を示す。公知ホモ接合性対照が、該対照中の突然変異体ＤＮＡ又は野生型ＤＮＡの高い検出のみを示すこと、及び公知ヘミ接合性対照が、突然変異体ＤＮＡと野生型ＤＮＡの両方の高い検出を示すことも好ましい。
【００３０】
サンプルのスクリーニングの前に、すべての適切な対照を用いてＰＣＲ法並びに遺伝子型及び／又は接合状態決定の「試験ラン」を行うことができる。該方法のさらなる最適化は、用い方（例えば、ゲノムＤＮＡ調製方法、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、実験装置など）によって差があることがある成分には望ましいものであり得る。許容可能なプローブ検出レベル（例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブについての許容可能なＲＦＵ）で、公知ゲノムＤＮＡテンプレートにおいて突然変異体配列及び／又は野生型配列の両方を増幅する、ＰＣＲ及び熱サイクリング条件を確立することができる。
【００３１】
Ｅ．植物生殖質への低リグニン含有率の形質の遺伝子移入
有性生殖を含む従来の植物育種によって、リグニン含有率が低いトウモロコシ植物（例えば、ＢＭＲトウモロコシ）を生産するための方法をここで説明する。方法は、ＢＭＲ突然変異の少なくとも１つのコピー（例えば、ｂｍ３、ｂｍ３−１、ｂｍ３−２）をそのゲノム内に含む第一の親トウモロコシ植物を第二の親トウモロコシ植物に交配させて、Ｆ１後代を生産することを含み得る。該第一の植物は、例えば、ＢＭＲトウモロコシ品種Ｆ２Ｆ２９７、Ｆ２Ｆ３８３、Ｆ２Ｆ４８８、Ｆ２Ｆ４４９、Ｆ２Ｆ５６６、Ｆ２Ｆ６１０、Ｆ２Ｆ６２２、Ｆ２Ｆ６６５、Ｆ２Ｆ６３３、Ｆ２Ｆ６８２、Ｆ２Ｆ７２１、Ｆ２Ｆ７００及びＦ２Ｆ７９７を含む、任意のＢＭＲトウモロコシ植物であり得る。該第二の親トウモロコシ植物は、該第一のトウモロコシ植物と交配させたときに生育可能な後代トウモロコシ植物（すなわち、種子）を生産することができる任意のトウモロコシ植物であり得る。該第一及び第二の親トウモロコシ植物は、同じトウモロコシ種（例えば、ジーメイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ））のものであってもよい。該方法は、Ｆ１後代を自家受粉させてＦ２後代を生産することをさらに含むことができる。方法は、Ｆ１又はＦ２後代植物を第一又は第二いずれかの親トウモロコシ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物へと戻し交配することから１又はそれ以上の世代をさらに含むことができる。あるいは、第一の交配のＦ１後代、又は任意の後続の交配種を、第一又は第二いずれかの植物とは異なる系統又は遺伝子型のものである第三のトウモロコシ植物に交配させることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、後代植物を本開示の遺伝子型及び／又は接合状態決定に付す。後代植物の遺伝子型を判定すると、及び／又はそれらの接合状態を決定すると、当業者は、所望の遺伝子構成を有する後代植物を選択することができる。そのような選択された後代植物を、さらなる交配、自家受粉、又は栽培に使用することができる。本開示の方法によって導かれるＢＭＲ突然変異の遺伝子移入方法は、所望の遺伝子構成を有さない植物の栽培及び／又は繁殖を低減又は排除し、それによって、（予想されるメンデル遺伝様式により）望ましい信頼性及び予測性をもたらす。
【００３３】
ある特定の特徴及び／又は実施形態を例証するために以下の実施例を提供する。以下の実施例を、説明する特定の特徴又は実施形態に本開示を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：材料及び方法
植物及び遺伝物質。ホモ接合性ｂｍ３対立遺伝子及びホモ接合性野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を含有するトウモロコシ葉サンプルを用意した。
【００３５】
全ゲノムＤＮＡの単離及び定量。１サンプルあたり８つの葉ディスクを打ち抜き、Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（登録商標）２０００を使用して微粉に粉砕した。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ（商標）９６ウエルキット（カリフォルニア州バレンシア）で抽出した。ＰＣＲの前に、製造業者の説示を用いてＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）定量キット（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。
【００３６】
部分ＣＯＭＴ遺伝子のクローニング及びシークエンシング。オリゴＢＭ３５＿Ｆ（５’−ＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧＣ−３’；配列番号：１）及びＢＭ３４＿Ｒ（５’−ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＡＣＡＴＧＧ−３’；配列番号：２）を用い、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）（日本、滋賀県のＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）と４００ｎＭ ｄＮＴＰと２００ｎＭ フォワード（ＢＭ３５＿Ｆ）及びリバースプライマー（ＢＭ３４＿Ｒ）と３０ｎｇのゲノムＤＮＡとを含有する反応物で、１２のｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３サンプル（表１を参照のこと）から部分ＣＯＭＴ遺伝子のトウモロコシゲノムＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲプログラムを９４℃で２分の変性で開始し、それに３０サイクルの９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間そして７２℃で２分間というサイクルが続いた。ＰＣＲ生成物を２％ Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化し、その後、０．８％ Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ＣｌｏｎｅＷｅｌｌｓ（商標）で抽出した。その後、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、その製造業者の説示に従って、クローニングした。選択されたコロニーを、一晩、１Ｘフリーザー培地（ｆｒｅｅｚｅｒ  ｍｅｄｉａ）で成長させ、この培地は、２．５％ ＬＢ（１Ｌ ＬＢ培地に１０ｇ トリプトン、１０ｇ ＮａＣｌ及び５ｇ 酵母エキス）、３６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｍＭ クエン酸ナトリウム、６．８ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４．４％ グリセロール、０．４ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２．５μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール（使用直前に添加）及び５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含有した。その後、選択されたコロニーを、Ｔ７及びＴ３プロモーター、並びにＣＯＭＴ遺伝子内に位置するＢＭ１２３４Ｒ（５’−ＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧ−３’；配列番号：３）でのシークエンシングのために、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（登録商標）（テキサス州ヒューストン）に送った。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）４．８ソフトウェアを使用して、配列を分析した。ｂｍ３系統からのコンセンサス配列を野生型ＣＯＭＴサンプルと比較することにより、ｂｍ３突然変異を同定した。
【表１】
2013531977.tif 000003
【００３７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ設計及び検証。ｂｍ３系統からのＤＮＡコンセンサス配列に基づいて、プライマー（ＢＭ３＿Ｆ；配列番号：４及びＢＭ３＿Ｒ：配列番号：５）、及び突然変異体対立遺伝子を同定するためのＣＯＭＴ遺伝子の部分配列の３’末端を欠失させたジャンクションに特異的なプローブ（ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ；配列番号：６）；プライマー（ＣＯＭＴ＿Ｆ及びＣＯＭＴ＿Ｒ）及び野生型対立遺伝子を同定するための該欠失領域内のプローブ（ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ）を設計した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ設計に使用した。すべてのプライマー、及びＦＡＭ又はＶＩＣとＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｎ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｉ（ＭＧＢＮＦＱ）色素とを有する二重標識プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスター・シティー）によって合成された。すべてのプライマー及びプローブを１Ｘ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡに溶解して１００μＭにした。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定用マスターミックス（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３７１３５５）をすべてのＰＣＲ反応に使用した。
【００３８】
９６ウエルプレートを使用し、ｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）光学システム（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏＲａｄ）を用いて、９５℃で１５分の変性で開始し、それに５０サイクルの９２℃で１５秒間そして６０℃で１分間というサイクルが続く、２０μＬ容量でのリアルタイムＰＣＲ反応を表２に従って構成した。各サイクル終了時に蛍光シグナルを記録した。
【表２】
2013531977.tif 000004
【００３９】
３８４ウエルプレートを使用する１０μＬ 容量でのエンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを表３に従って構成した。９５℃で１５分の変性で開始し、それに３０サイクルの９２℃で１５秒間そして６０℃で１分間というサイクルが続く増幅のために、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。最適な数のサイクルの後、反応が初期指数関数的増幅期にあるとき、分光蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ（商標）、スイス、メンネドルフ）によって推奨計器設定（ＦＡＭ（ｂｍ３突然変異体）：励起−４８５ｎｍ、発光−５３５ｎｍ；ＶＩＣ（野生型ＣＯＭＴ）：励起−５２５ｎｍ、発光−５６０ｎｍ）でＰＣＲ生成物を測定した。
【表３】
2013531977.tif 000005
【００４０】
データ解析。リアルタイムＰＣＲのために、その値がバックグラウンドよりわずかに上である蛍光閾値をｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアによって自動計算した。規定閾値より上の蛍光を発生させるために必要とされるサイクル数により、閾値サイクル（Ｃｔ値）を決定した。その後、対立遺伝子識別アッセイを用いて遺伝子型を決定した。
【００４１】
エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ及び蛍光読み取りの完了後、レポート色素１のバックグラウンドを超えるシグナル（ＳＯＢ１）及びレポート色素２のバックグラウンドを超えるシグナル（ＳＯＢ２）を計算した。サンプル数と対数尺度でのＳＯＢ１／ＳＯＢ２の絶対比の間の分布グラフを生成した。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性植物のサンプルを対照として使用した。クラスタ分離に基づいて遺伝子型判定を行った。
【００４２】
また、ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）を使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｘ軸にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。
【００４３】
実施例２：ＣＯＭＴ遺伝子の部分ｂｍ３突然変異の配列分析
ｂｍ３突然変異体についての遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを設計するために、正確な配列情報を必要とした。そのために、２つのオリゴヌクレオチドを設計して、１２のｂｍ３及び３つの非ｂｍ３系統からのゲノムＤＮＡからの部分ＣＯＭＴ遺伝子（図１）を増幅した。図２。これらのフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングし、Ｔ７及びＴ３プロモーター、並びにＢＭ１２３４Ｒ（配列番号：３）でのシークエンシングのためにＣｏｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．に送った。ＢＭ１２３４Ｒは、ＣＯＭＴ遺伝子の中央に位置し、それを使用して完全長配列情報を獲得した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）４．８を使用して、９つのｂｍ３系統からの高品質配列を分析及びアラインした。ｂｍ３系統からのコンセンサス配列を野生型サンプルと比較した。ＣＯＭＴ遺伝子の３’末端において複数の欠失／挿入突然変異が同定された。例えば、３つの突然変異が確認され、それらに下線を引いた。図３。
【００４４】
遺伝子特異的アッセイ設計及び検証。本発明者らが試験したすべてのｂｍ３系統は、ＣＯＭＴ遺伝子の３’エキソンに大きな欠失突然変異を有する。そこでこの突然変異を遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ設計のために使用した。図４は、オリゴヌクレオチドの位置を示す略図を含む。野生型ＣＯＭＴ遺伝子特異的プライマー及びプローブは、９７８ｂｐ欠失部位内に位置する。ｂｍ３特異的プライマー及びプローブは、欠失部位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわたる、ジャンクションに位置する。
【００４５】
１２の公知ｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３系統を使用して、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを試験した。ｂｍ３系統からのＤＮＡと非ｂｍ３系統からのＤＮＡの同量を併せることにより、６つのヘミ接合性サンプルを作製した。リアルタイムＰＣＲを用いて、アッセイの効率を試験した。ｂｍ３突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて併用した。ＦＡＭを使用してｂｍ３のアンプリコンをモニターし、及びＶＩＣを使用して野生型ＣＯＭＴについてのアンプリコンをモニターした。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。図５ａ及び５ｂ。サイクル３０において、ＦＡＭに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子１と、及びＶＩＣに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子２と、正しい遺伝子型決定を生じさせた。図６。
【００４６】
エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）接合状態分析の検証。ホモ接合性、ヘミ接合性及びヌル（野生型）として分離するｂｍ３集団を含有するＤＮＡサンプルの１つの９６ウエルプレートを使用して、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを試験及び検証した。エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲの１つの利点は、使用の容易さである。エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、より高価なリアルタイムＰＣＲ機を必要としない。いずれの常用ＰＣＲ機も９６又は３８４ウエルプレートに適合し、アッセイを行うには、相対蛍光シグナルを読み取ることができるプレートリーダーで十分である。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲからの結果に基づいて、３０サイクルのＰＣＲ反応は、野生型ＣＯＭＴ遺伝子からｂｍ３遺伝子を効率的に分離することができる。サイクル３０でＰＣＲ反応を停止させた。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ及び蛍光読み取りの完了後、バックグラウンド（Ｈ２Ｏ）を超えるＦＡＭ（ｂｍ３）の蛍光シグナルを、バックグラウンド１を超えるシグナル（ＳＯＢ１）として、及びバックグラウンド２を超えるＶＩＣ（野生型ＣＯＭＴ）（ＳＯＢ２）を計算した。対数尺度でのＳＯＢ１／ＳＯＢ２を用いて、分布グラフを生成した。図７。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性対照は、陰性及び陽性対照となった。ある分離集団において、データ点の３つのクラスタを得、それによってカットオフ点を視覚的に決定することができた。図７における実施例では、データ点の３つのクラスタが明瞭に見えた。野生型についてのデータ点は、１未満であり、ヘミ接合性サンプルについてのものは、１から５の範囲であり、及びホモ接合性のものについてのものは、５より上である。
【００４８】
また、ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）で、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｘ軸にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。図８。ＦＡＭを使用してｂｍ３の増幅をモニターし、ＶＩＣを使用して野生型ＣＯＭＴの増幅をモニターしたので、ＦＡＭの強いシグナルを有し、ＶＩＣのシグナルを殆ど又は全く有さないサンプルは、ホモ接合性ｂｍ３であり、ＶＩＣの強いシグナルを有し、殆ど又は全くＦＡＭを有さないサンプルは、野生型ＣＯＭＴ（ヌル）であり、及びＦＡＭとＶＩＣの両方の強いシグナルを有するサンプルは、ヘミ接合性であった。
【００４９】
このｂｍ３遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイからの遺伝子型及び接合状態決定は、当分野において収集された表現型データと１００％一致した。このアッセイは、ハイスループット様式でｂｍ３接合状態ステータスを特性決定する簡単かつ正確な方法を提供する。
【００５０】
実施例３：ｂｍ３突然変異の遺伝子移入
ｂｍ３突然変異に関してのトウモロコシ植物の接合状態を上で説明したように決定する。トウモロコシ植物がｂｍ３突然変異についてホモ接合性であることを決定する。植物を、従来の植物育種により、野生型ＣＯＭＴ遺伝子についてホモ接合性であることが公知であるトウモロコシ植物、及びｂｍ３突然変異についてホモ接合性のトウモロコシ植物と交配させる。その交配種のＦ１後代を生産する。その後、該交配種のＦ１後代を自家受粉させてＦ２後代を生産する。Ｆ２後代のゲノムＤＮＡのサンプルを調製し、Ｆ２後代植物の接合状態を上で説明したように決定する。
【００５１】
ｂｍ３突然変異についてホモ接合性であるＦ２後代植物を選択する。その後、選択された後代を低リグニン含有率についてアッセイし、望ましく低いリグニンレベルを呈示する後代を交配及び自家受粉によってさらに繁殖させ、得られた後代を栽培する。
【００５２】
本発明を本明細書において一定の好ましい実施形態に関して説明したが、本発明がそのとおり限定されないことは当業者にはわかるし、理解される。むしろ、下の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を逸脱することなく、それらの好ましい実施形態に多くの付加、欠失及び修飾を施すことができる。加えて、１つの実施形態からの特徴を別の実施形態の特徴と組み合わせることができるが、本発明者らが考える本発明の範囲内になお包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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