(57)【要約】  藻類のバイオマスまたは藻類培養物から藻類タンパク質を選択的に抽出および分画する方法を開示する。生成物を藻類バイオマスから選択的に除去する方法が藻類のタンパク質の効率的な分離を可能にする単一および多工程の抽出プロセスを提供する。このタンパク質は、動物の飼料およびヒトの食料のための再生可能なタンパク質源として用いることができる。さらに、タンパク質の抽出後に藻類バイオマス中に残存する脂質は、再生可能燃料として用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類タンパク質を実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物から選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、アルブミンタンパク質が富化された第１の概ね液相および第１の概ね固相から構成される第１の加熱された抽出混合物を生成すること；
ｂ．アルブミンタンパク質が富化された第１の概ね液相の少なくとも一部を第１の概ね固相から分離すること；
ｃ．第１の概ね固相を塩水と混合し得られた混合物を加熱して、グロブリンタンパク質が富化された第２の概ね液相および第２の概ね固相から構成される第２の加熱された抽出混合物を生成すること；
ｄ．グロブリンタンパク質が富化された第２の概ね液相の少なくとも一部を第２の概ね固相から分離すること；
ｅ．第２の概ね固相を水と混合し加熱して、第３の概ね液相および第３の概ね固相から構成される第３の加熱された抽出混合物を生成することと；
ｆ．第３の加熱された抽出混合物のｐＨを上昇させて、第３の概ね液相をグルテリンタンパク質によって富化すること；
ｇ．グルテリンタンパク質で富化された第３の概ね液相の少なくとも一部を第３の概ね固相から分離すること；
ｈ．第３の概ね固相を溶媒セットと混合し加熱して、プロラミンタンパク質が富化された第４の概ね液相および第４の概ね固相から構成される第４の加熱された抽出混合物を生成すること；および
ｉ．プロラミンタンパク質で富化された少なくとも一部の第４の概ね液相を第４の概ね固相から分離すること
を含む方法。
【請求項２】
分離工程のうち１つ以上が、遠心分離、濾過、浮遊、および沈降からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうち少なくとも１つが、分離する前に、その沸点未満の加熱温度で維持される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、分離する前に、約２０〜約６０分の間、加熱温度で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約４５〜約９０分の間、加熱温度で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約５０℃で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項７】
第４の概ね固相は、脂質が豊富に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からグロブリンタンパク質を選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を塩水と混合し加熱して、グロブリンタンパク質で富化された概ね液相と概ね固相とから構成される加熱された抽出混合物を生成すること；および
ｂ．グロブリンタンパク質が富化された概ね液相の少なくとも一部を概ね固相から分離すること
を含む方法。
【請求項９】
加熱された抽出混合物は、分離する前に、抽出混合物の沸点未満の加熱温度で維持される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からアルブミンタンパク質を選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、加熱された液相および加熱された固相を生成すること；および
ｂ．アルブミンタンパク質を含有する加熱された液相の少なくとも一部を加熱された固相から分離すること
を含む方法。
【請求項１１】
加熱された液相および加熱された固相は、分離する前に、加熱された液相および加熱された固相の組み合わせの沸点未満の加熱温度で維持される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶媒セットはエタノールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
溶媒セットはアルコールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶媒セットは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含む請求項１、５および７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年４月６日出願の米国特許仮出願第６１／３２１，２９０号、題名「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ」および２０１０年４月６日出願の米国特許仮出願第６１／３２１，２８６号、題名「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｃｏ−Ｐｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ」の利益を主張するものであり、全内容は、ここに参考文献として援用される。
【０００２】
本発明は、限定されないが、油およびタンパク質を含む藻類生成物を抽出および分画することに関する。より具体的には、本明細書記載のシステムおよび方法は、湿潤藻類バイオマスを処理するための、わずかに非極性の溶媒による段階抽出および分画を利用する。
【背景技術】
【０００３】
石油は、主に炭化水素から構成される天然資源である。地球から石油を採取することは、高価であり、危険であり、そして、しばしば環境を犠牲にする。さらに、世界中の石油貯留層が急速に減少している。また、石油をガソリンおよびジェット燃料などの有用な燃料に変換するのに必要な輸送ならびに処理のためコストもかさむ。
【０００４】
藻類は、その脂質を生産する能力から近年かなり重要性を高めており、持続可能なバイオ燃料を生成するのに用いられ得る。この能力は、再生可能燃料を生成し、世界的な気候変化を低減し、廃水を処理することに活用され得る。バイオ燃料の供給原料としての藻類の優位性には、１エーカーあたりの生産性が典型的な陸生の油料作物に比べ高く、非食品系供給原料資源、その他生産性のない土地、非耕作地の使用、広範な水源（淡水、汽水、塩水および廃水）の利用、バイオ燃料ならびにカロテノイドおよびクロロフィルなどの有価副産物の両方を含む種々の因子がある。
【０００５】
数千種の藻類が、世界中で過去数十年にわたって脂質生産について審査および研究されてきた。なかでも、脂質生産が豊富な約３００種が確認されている。脂質の組成および含量は、ライフサイクルの種々の段階で変動し、環境および培養条件の影響を受ける。抽出のための戦略およびアプローチは、生化学的組成が大幅変動することおよび藻類の細胞壁の物理的特性のために、使用する個々の藻類種／株に応じてずいぶん異なる。押出のような従来の物理的抽出プロセスが藻類の細胞壁の厚さおよびサイズが小さいこと（約２〜約２０ｎｍ）を考えると、藻類とはうまく合わない。さらに、種子から回収される典型的な油に比べ、藻の油中の多量の極性脂質には、精製の問題点がある。
【０００６】
採取の際、培養物中の典型的な藻類濃度は、約０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲である。これは、藻類単位重量あたりの１０００倍もの水を、油の抽出を始める前に除去しなければならないことを意味する。現在、油性の原料のための既存の油の抽出方法は、抽出される油の収率および品質を改善するために、ほぼ完全に乾燥した原料を厳密には必要とする。藻の塊を加熱して十分に乾燥させるのに必要なエネルギー量に起因して、藻類の原料をバイオ燃料にすることは非経済的である。典型的には、原料は、高温で押出またはフレーク状にし、抽出を高める。この工程は、単細胞でミクロンの大きさという藻類の性質のため既存の設備ではうまくいかない。さらに、藻の油は、二重結合の長鎖脂肪酸であるため非常に不安定である。従来の抽出法で用いられた高温は、油の劣化を引き起こし、かかる方法ではコストが増加する。
【０００７】
溶媒としてヘキサンを用いることにより、乾燥した藻の塊から油を抽出することが当該分野に公知である。このプロセスは、エネルギーを大量に消費する。乾燥のための熱および抽出のためのヘキサンの使用は、この種の処理が脂質およびタンパク質を劣化させるので、低品質の生成物を生成してしまう。
【０００８】
藻の油の抽出は、２つのタイプ：破壊的または非破壊的方法にすることができる。
【０００９】
破壊的方法は、機械的、熱的、酵素的または化学的方法により細胞株に影響を及ぼす。破壊的方法の多くはエマルションを生じ、高価なクリーンアッププロセスを必要とする。藻の油は、高い割合の極性脂質および中性脂質の乳化を高めるタンパク質を含有する。乳化は、溶液中に残る栄養および塩成分によってさらに安定化する。エマルションは中性脂質、極性脂質、タンパク質、および他の藻類生成物を含有する複合混合物であり、大規模な精製プロセスは、バイオ燃料に変換される原料である中性脂質を単離する。
【００１０】
非破壊的方法は収率が低い。ミルキングとは、成長している藻類培養物から脂質を抽出するために溶媒または化学物質を使用することである。ミルキングは藻類生成物を抽出するのに用いられることがある一方で、溶媒の毒性および細胞壁が破壊されるために、ある種の藻類にはうまくいかないことがある。この複雑さにより、一般的なプロセスの開発は困難である。さらに、培地中の濃度をできるかぎり最大にするには、必要とされる溶媒の体積は桁外れに大きくなるだろう。
【００１１】
多相抽出(multiphase extractions)は、複合溶媒混合物を用い、溶媒の回収およびリサイクルのためのメカニズムを要する大規模な蒸留過程を必要とする。このことは、かかる抽出を藻の油を抽出する技術に用いることを非実用的および非経済的なものにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、これらの欠点を克服するために、藻類生成物、特に、藻の油、藻類タンパク質、および藻類カロテノイドを抽出および分画するための改善された方法およびシステムが当該分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書記載の実施形態は、一般的に、例えば、藻類バイオマスを含む油性原料から様々な極性の脂質を抽出するためのシステムおよび方法に関する。特に、本明細書記載の実施形態は、種々な極性の溶媒および／または一連の膜フィルタを用いて藻類バイオマスから種々な極性の脂質を抽出することに関する。いくつかの実施形態では、フィルタとは、マイクロフィルタのことである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、単一の溶媒および水を用いて、油性原料中に存在する成分を抽出および分画する。他の実施形態では、この成分は、限定されないが、タンパク質、極性脂質、および中性脂質を含む。他の実施形態では、１種類を超える溶媒を用いる。他の実施形態では、溶媒の混合物を用いる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法およびシステムは、油性原料から脂質の副産物を抽出するのに有用である。かかる副産物の例に、非限定的に、タンパク質性材料、クロロフィル、およびカロテノイドが挙げられる。本発明の実施形態は、燃料および栄養生成物の両方を生産できる方法で、藻類バイオマスから藻類生成物を同時に抽出したり分画したりできる。
【００１６】
本発明の一実施形態では、タンパク質を淡水藻類から選択的に抽出するための方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物から藻類タンパク質を選択的に除去する方法は、淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、アルブミンタンパク質が富化された第１の概ね液相と第１の概ね固相とから構成される第１の加熱された抽出混合物を生成することと、アルブミンタンパク質が富化された少なくとも一部第１の概ね液相を第１の概ね固相から分離することとを含む。該方法はまた、第１の概ね固相を塩水と混合し得られた混合物を加熱して、グロブリンタンパク質が富化された第２の概ね液相と第２の概ね固相とから構成される第２の加熱された抽出混合物を生成すること、およびグロブリンタンパク質が富化した少なくとも一部の第２の概ね液相を第２の概ね固相から分離することとを含む。該方法は、第２の概ね固相を水と混合し加熱して、第３の概ね液相と第３の概ね固相とから構成される第３の加熱された抽出混合物を生成すること、および第３の加熱された抽出混合物のｐＨを上昇させて、第３の概ね液相をグルテリンタンパク質によって富化することをさらに含む。該方法はまた、グルテリンタンパク質で富化された第３の概ね液相の少なくとも一部を第３の概ね固相から分離すること、および第３の概ね固相を溶媒セットと混合し加熱して、プロラミンタンパク質が富化した第４の概ね液相と第４の概ね固相とから構成される第４の加熱された抽出混合物を生成することを含む。該方法は、プロラミンタンパク質が富化した第４の概ね液相の少なくとも一部を第４の概ね固相から分離することを、さらに含む。本発明のいくつかの態様では、分離工程のうち１つ以上が、遠心分離、濾過、浮遊、および沈降からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される。本発明の他の態様では、第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、分離する前に、その沸点未満の加熱温度で保持される。さらに他の態様では、第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、分離する前に、約２０〜約６０分の間、加熱温度で保持される。さらなる態様では、第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約４５〜約９０分の間、加熱温度で維持される。さらなる態様では、第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約５０℃で維持される。なお別の態様では、第４の概ね固相は、脂質が豊富に含まれる。本発明のさらに他の態様では、溶媒セットはアルコールを含む。いくつかの態様では、溶媒セットはエタノールを含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からグロブリンタンパク質を選択的に除去する方法は、淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を塩水と混合し加熱して、グロブリンタンパク質が豊富に含まれる概ね液相と概ね固相から構成される加熱された抽出混合物を生成すること；グロブリンタンパク質が豊富な概ね液相の少なくとも一部を概ね固相から分離することを含む。本発明のいくつかの態様では、加熱された抽出混合物は、分離する前に、抽出混合物の沸点未満の加熱温度で維持される。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からアルブミンタンパク質を選択的に除去する方法は、淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、加熱された液相および加熱された固相を生成すること；アルブミンタンパク質を含有する少なくとも一部加熱された液相を加熱された固相から分離することとを含む。本発明のいくつかの態様では、加熱された液相および加熱された固相は、分離する前に、加熱された液相および加熱された固相の組み合わせの沸点未満の加熱温度で維持される。本発明のいくつかの実施形態では、溶媒セットは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の例示的な実施形態による方法に含まれる工程のフローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示による脱水プロセスの例示的な実施形態の概略図である。
【図２】図２は、本開示記載の抽出システムの例示的な実施形態の概略図である。
【図３】図３は、非破壊的に藻の油を抽出する最大効率および極性および非極性の脂質の抽出に及ぼす極性の効果を示す全極性範囲を包含した一連の溶媒を用いた凍結乾燥された藻類バイオマスのＳｏｈｘｌｅｔ抽出を示す比較グラフである。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、メタノールおよび石油エーテルを３つの温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスの中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収を示すグラフ表示である。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、メタノールおよび石油エーテルを３つの温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスの中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収を示すグラフ表示である。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスの中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収を示すグラフ表示である。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスの中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収を示すグラフ表示である。
【図６】図６は、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスの脂質回収を示すグラフである。
【図７】図７は、溶媒対固体バイオマス比が脂質回収に及ぼす効果を示すグラフである。
【図８】図８は、乾燥バイオマスでの水性メタノールの一段階抽出回収の様々な抽出水溶液の有効性を示すグラフである。
【図９】図９は、全工程のメタノール抽出が脂質の累計収率および中性脂質の純度に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、湿潤バイオマスおよびエタノールを用いた脂質の累積回収を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マイクロ波アシスト抽出および従来の抽出システムの抽出時間の比較を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、タンパク質の抽出工程を組み込んだ本開示の例示的な実施形態に記載の方法に含まれる工程のフローチャートである。図１２Ａの単位は全てポンドである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本開示記載の例示的な抽出プロセスに含まれる工程のフローチャートである。
【図１３】図１３は、中性脂質、極性脂質、およびタンパク質を藻類バイオマスから分離するために１０００ｌｂｓ．の藻類バイオマスが抽出および分画を経て処理される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートおよびマスバランス図である。
【図１４】図１４は、藻の塊を処理して種々の生成物を形成することができる本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１５】図１５は、藻類の中性脂質が処理されて種々の生成物を形成する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１６】図１６は、藻類の中性脂質が処理されて燃料生成物を形成する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１７】図１７は、藻類タンパク質を淡水の藻類バイオマスから選択的に抽出する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１８】図１８は、藻類タンパク質を塩水の藻類バイオマスから選択的に抽出する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１９】図１９は、選択いた藻類タンパク質を塩水または淡水藻類バイオマスから抽出する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図２０】図２０は、選択した藻類タンパク質が塩水または淡水藻類バイオマスから抽出される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図２１】図２１は、本明細書に記載の方法を用いて抽出する前および抽出した後のイカダモ種の細胞を示す写真である。細胞は、抽出の前後両方とも実質的に無傷である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
定義
用語「導管」またはその任意の変形体は、本明細書に用いるとき、流体が搬送され得る構造はどれでも含む。導管の非限定的な例に、管、管類、チャネル、またはその他密閉構造が挙げられる。
【００２２】
用語「貯留層」またはその任意の変形体は、本明細書に用いるとき、流体を保持することができる構造はどれでも含む。貯留層の非限定的な例に、池、タンク、湖、タブ、または他の同様の構造が挙げられる。
【００２３】
用語「約」または「およそ」は、本明細書に用いられるとき、当業者が理解することに近いことと定義し、１つの非限定的な実施形態では、該用語は、１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、最も好ましくは０．５％以内にあると定義される。
【００２４】
用語「阻害すること」または「低減すること」あるいはこの用語の任意の変形は、本明細書に用いるとき、所望の結果を得るための測定可能な減少ならどれでも、または完全な阻害を含む。
【００２５】
用語「効果的」は、本明細書に用いるとき、所望の、予想される、または意図した結果を達成するのに適切であることを意味している。
【００２６】
語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、本明細書に用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて用いるとき、「１つ（ｏｎｅ）」を意味する場合があるが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つよりも多い」の意味とも一致する。
【００２７】
用語「または」は、本明細書に用いるとき、本開示は選択肢のみおよび「および／または」とする定義を支持するが、選択肢のみまたはその選択肢は互いに排他的であるということを明示しない限り、「および／または」を意味する。  
【００２８】
用語「湿潤」は、本明細書に用いるとき、約５０％〜約９９．９％の水分を含有することを意味する。水分は、細胞内にあっても細胞外にあってもよい。
【００２９】
用語「溶媒セット」は、本明細書に用いるとき、１種類以上の溶媒を含む組成物を意味する。これらの溶媒は、両親媒性（両親媒性またはわずかに非極性としても知られている）、親水性、または疎水性であってよい。いくつかの実施形態では、この溶媒は、水混和性であり、他の場合には水に非混和性である。本発明の方法を実施するのに用いられ得る溶媒の非限定的な例に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリル、アルカン類（ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル）、ケトン類（メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ））、芳香族類（トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン）、ハロアルカン類（クロロホルム、トリクロロエチレン）、エーテル類（ジエチルエーテル）、および混合物（ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）が挙げられる。
【００３０】
用語「油」は、本明細書に用いるとき、中性脂質および極性脂質を含有する組成物を含む。用語「藻類の油」および「藻の油」は、本明細書に用いるとき、互換的に用いられる。
【００３１】
用語「透析物」または「浸透物」は、本明細書に用いるとき、限定されないがフィルタまたは膜を含む分離装置を通過した材料を意味し得る。
【００３２】
用語「残余分」は、本明細書に用いるとき、透析物が分離装置を通過した後に残る材料を意味し得る。
【００３３】
本明細書では用いられるとき、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的または無制限であり、付加的な、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。
【００３４】
用語「極性脂質」またはその任意の変形体は、本明細書に用いるとき、限定されないが、リン脂質および糖脂質を含む。
【００３５】
用語「中性脂質」またはその任意の変形体は、本明細書に用いるとき、限定されないが、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、カロテノイド、ワックス、ステロールを含む。
【００３６】
用語「固相」は、本明細書に用いるとき、概ねどちらかと言えば固体である材料の集合を称し、相の中の全ての材料が固体であることを意味しない。したがって、いくぶん液体を保持するが相当量の固体を有する相が、該用語の意味の範囲内に包含される。一方で、用語「液相」は、本明細書に用いるとき、概ねどちらかと言えば液体である材料の集合を称し、かかる集合は、固体材料を含んでいてよい。
【００３７】
用語「バイオディーゼル」は、本明細書に用いるとき、藻類に由来する脂肪酸のメチルまたはエチルエステル類のことを言う。
【００３８】
用語「栄養価のあるもの」は、本明細書に用いるとき、健康上および／または医学的利益を提供する食品を称する。非限定的な例に、カロテノイド、カロテン、キサントフィル、例えば、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびルテインが挙げられる。
【００３９】
用語「バイオ燃料」は、本明細書に用いるとき、生物源に由来する燃料を称する。非限定的な例に、バイオディーゼル、ジェット燃料、ディーゼル、ジェット燃料ブレンドストックおよびディーゼルブレンドストックが挙げられる。
【００４０】
極性脂質と併せて用いるときの用語「不純物」は、本明細書に用いるとき、対象の生成物と共に抽出されるまたはこれと同じ特性を有する対象の生成物以外の全成分のことを言う。
【００４１】
用語「潤滑剤」は、極性脂質と併せて用いられているとき、本明細書に用いるとき、水素処理された藻類脂質、例えば、Ｃ１６〜Ｃ２０アルカン類のことを言う。
【００４２】
用語「洗浄剤」は、極性脂質と併せて用いられているとき、本明細書では用いられるとき、糖脂質、リン脂質およびこれらの誘導体を称する。
【００４３】
用語「食品添加物」は、極性脂質と併せて用いるとき、本明細書に用いるとき、藻類に由来する大豆レシチン代用物またはリン脂質のことを言う。
【００４４】
用語「非グリセリン物質」は、本明細書に用いるとき、グリセリン画分と分離するあらゆる不純物のことを言う。さらなるクリーンアップ工程が、医薬品グレードのグリセリンを生成するために存在するものの大部分を除去するだろう。
【００４５】
用語「不飽和脂肪酸」は、本明細書用いるとき、少なくとも１つの二重炭素結合を有する脂肪酸のことを言う。不飽和脂肪酸の非限定的な例に、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オクタデカン酸、リノレン酸、γ−リノレン酸、αリノレン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ホモγリノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサジエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸が挙げられる。骨格鎖の中に２０個以上の炭素原子を有する脂肪酸は一般に「長鎖脂肪酸」と呼ばれる。骨格鎖の中に１９個以下の炭素原子を有する脂肪酸は、一般に「短鎖脂肪酸」と呼ばれる。
【００４６】
不飽和長鎖脂肪酸に、限定されないが、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸、およびω−９脂肪酸が挙げられる。用語「ω−３脂肪酸」は、本明細書に用いるとき、限定されないが、表１に列挙されている脂肪酸のことを言う。
【表１】
2013523156.tif 000003
【００４７】
用語「ジェット燃料ブレンドストック」は、本明細書に用いるとき、ジェット燃料として使用するのに適した炭素鎖長を有するアルカン類のことを言う。
【００４８】
用語「ディーゼルブレンドストック」は、本明細書に用いるとき、ディーゼルとして使用するのに適した炭素鎖長を有するアルカン類のことを言う。
【００４９】
用語「動物飼料」は、本明細書に用いるとき、動物に栄養補給を提供するのに消費され用いられ得る藻類由来物質のことを言う。
【００５０】
用語「ヒト用食物」は、本明細書に用いるとき、人々に栄養補給を提供するのに消費され得る藻類由来物質のことを言う。藻類由来のヒト用食品は、必須の栄養素、例えば、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、またはミネラルを含有し得る。
【００５１】
用語「バイオレメディエーション」は、本明細書に用いるとき、汚染物質、例えば、限定されないが、硝酸塩、リン酸塩、および重金属を、産業廃水または一般廃水から除去するための藻類の成長を使用することを言う。
【００５２】
用語「廃水」は、本明細書に用いるとき、限定されないが、硝酸塩、リン酸塩、および重金属を含む種々の混入物質または汚染物質を含有する産業廃水または一般廃水を称する。
【００５３】
用語「富化された」は、本明細書に用いるとき、約５０％以上の含量を意味する。
【００５４】
用語「実質的に」は、本明細書に用いるとき、概ねを意味する。
【００５５】
用語「グロブリンタンパク質」は、本明細書に用いるとき、塩可溶性タンパク質のことを言う。
【００５６】
用語「アルブミンタンパク質」は、本明細書に用いるとき、水溶性タンパク質のことを言う。
【００５７】
用語「グルテリンタンパク質」は、本明細書に用いるとき、アルカリ可溶性タンパク質のことを言う。
【００５８】
用語「プロラミンタンパク質」は、本明細書に用いるとき、アルコール可溶性タンパク質のことを言う。プロラミンタンパク質の非限定的な例は、グリアジン、ゼイン、ホルデイン、アベニンである。
【００５９】
用語「藻類培養物」は、本明細書に用いるとき、培養培地中の藻細胞のことを言う。
【００６０】
用語「藻類バイオマス」は、本明細書に用いるとき、少なくとも部分的に脱水された藻類培養物のことを言う。
【００６１】
用語「脱水された」は、本明細書に用いるとき、少なくともいくらかの水の除去のことを言う。
【００６２】
用語「藻類ペースト」は、本明細書に用いるとき、流動できる流体特性を有する部分的に脱水された藻類培養物のことを言う。一般に、藻類ペーストは、約９０％の水分を有する。
【００６３】
用語「藻類ケーキ」は、本明細書に用いられるとき、藻類ペーストの流体特性に欠き凝集する傾向にある部分的に脱水された藻類培養物のことを言う。一般に、藻類ケーキは、約６０％以下の水分を有する。
【００６４】
塩水藻細胞に、限定されないが、海洋および汽水性藻類種が挙げられる。塩水藻細胞は、限定されないが、海、大洋、および河口などの水辺に実際に見出される。塩水藻類種の非限定的な例として、ナンノクロロプシス属の種、ドナリエラ属の種が挙げられる。
【００６５】
淡水藻細胞が限定されないが、湖および池などの水辺に実際にいる。淡水藻類種の非限定的な例に、イカダモ種、ハエマトコッカス属の種が挙げられる。
【００６６】
本発明の方法に用いられ得る微細藻類の非限定的な例は、以下の門：緑色植物門、藍色植物門（シアノバクテリア）、および不等毛植物門のうちの１つのメンバーである。ある実施形態では、本発明の方法が用いる微細藻類は、以下の鋼：珪藻網、真正眼点藻網、および黄金色藻網のうちの１つのメンバーである。ある実施形態では、本発明の方法が用いる微細藻類は、以下の属：ナンノクロロプシス、クロレラ、ドナリエラ、イカダモ、セレナストラム、オシラトリア、フォルミジウム、スピルリナ、アンフォラ、およびオクロモナスのうちの１つのメンバーである。
【００６７】
本発明の方法に用いられ得る微細藻類種の非限定的な例に以下がある：アクナンセス・オリエンタリス、アグメヌルム種、アンフィプロラ・ヒアリン、アンフォラ・コフェイフォルミス、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・リネア、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・プンクタタ、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・タヨロリ、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・テヌイス、アンフォラ・デリカティッシマ、アンフォラ・デリカティッシマ・バー・キャピタタ、アンフォラ属の種、アナバエナ、アンキストロデスムス、アンキストロデスムス・ファルカタス、ボエケロヴィア・ホオグランディ、ボロディネラ属の種、ボツリョコッキス・ブラウニイ、ボツリョコッカス・スデティクス、バクテリオコッカス・マイナー、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス、カルテリア、キートケロス・グラシリス、キートケロス・ムエレリ、キートケロス・ムエレリ・バー・スブサルスム、キートケロス属の種、クラミドモナス・ペリグラヌラタ、クロレラ・アニトラタ、クロレラ・アンタルクティカ、クロレラ・アウレオビリディス、クロレラ・カンジダ、クロレラ・カプスレイト、クロレラ・デシカート、クロレラ・エリプソイデア、クロレラ・エメルソニイ、クロレラ・フスカ、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ、クロレラ・グルコトロファ、クロレラ・インフシオナム、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ、クロレラ・インフシオナム・バー・アウゼノフィラ、クロレラ・ケッセレリ、クロレラ・ロボフォラ、クロレラ・ルテオビリディス、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス、クロレラ・ルテオビリディス・バー・ルテスセンス、クロレラ・ミニアタ、クロレラ・ミヌティッシマ、クロレラ・ムタビリス、クロレラ・ノクツルナ、クロレラ・オヴァリス、クロレラ・パルバ、クロレラ・ファトフィリア、クロレラ・プリングシェイミィ、クロレラ・プロトセコイデス、クロレラ・プロトセコイデス・バー・アシジコラ、クロレラ・レグラリス、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ、クロレラ・レイシグリィ、クロレラ・サッカロフィア、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア、クロレラ・サリナ、クロレラ・シンプレックス、クロレラ・ソロキニアナ、クロレラ属の種、クロレラ・スファエリカ、クロレラ・スティグマトフォラ、クロレラ・バニエリィ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルティア、クロレラ・ブルガリス・バー・アウトトロフィカ、クロレラ・ブルガリス・バー・ヴィリディス、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルティア、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ヴィリディス、クロレラ・キサンテラ、クロレラ・ゾフィンジエンシス、クロレラ・ツレボウシオイデス、クロレラ・ブルガリス、クロロコッカム・インフシオナム、クロロコッカム属の種、クロロゴニウム属、クロオモナス属の種、クリソスファエラ属の種、クリコスファエラ属の種、クリプテコディニウム・コーニィ、クリプトモナス属の種、サイクロテラ・クリプティカ、サイクロテラ・メネグヒニアナ、サイクロテラ属の種、ドナリエラ属の種、ドナリエラ・バルダウィル、ドナリエラ・バイオクラタ、ドナリエラ・グラヌラテ、ドナリエラ・マリタイム、ドナリエラ・ミヌタ、ドナリエラ・パルバ、ドナリエラ・ペイルセイ、ドナリエラ・プリモレクタ、ドナリエラ・サリナ、ドナリエラ・テリコラ、ドナリエラ・テルチオレクタ、ドナリエラ・ヴィリディス、ドナリエラ・テルチオレクタ、エレモスファエラ・ヴィリディス、エレモスファエラ属の種、エリプソイデン属の種、エウグレナ種、フランセイア属の種、フラギラリア・クロトネンシス、フラギラリア属の種、グレオカプサ属の種、グロエオサムニオン属の種、ヘマトコッカス・プルビアリス、ヒメノモナス属の種、イソクリシス・エーエフエフ・ガルバナ、イソクリシス・ガルバナ、レポシンクリス、ミクルアクチニウム、ミクルアクチニウム、モノラフィディウム・ミヌツム、モノラフィディウム属の種、ナンノクロリス属の種、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス属の種、ナビクラ・アクセプタタ、ナビクラ・ビスカンテラエ、ナビクラ・シュードテネロイデス、ナビクラ・ペリクロサ、ナビクラ・サプロフィラ、ナビクラ属の種、ネフロクロリス属の種、ネフロセルミス属の種、ニツスチア・コムニス、ニツスチア・アレクサンドリア、ニツスチア・クロステリウム、ニツスチア・コムニス、ニツスチア・デイシパタ、ニツスチア・フルスツルム、ニツスチア・ハンツスチアナ、ニツスチア・インコンスピクア、ニツスチア・インテルメディア、ニツスチア・マイクロセファラ、ニツスチア・プシラ、ニツスチア・プシラ・エリプティカ、ニツスチア・プシラ・モノエンシス、ニツスチア・クアヅラングラー、ニツスチア属の種、オクロモナス属の種、オオサイスティス・パルバ、オオサイスティス・プシラ、オオサイスティス属の種、オシラトリア・リムネティカ、オシラトリア属の種、オシラトリア・スブレヴィス、パラクロレラ・ケッセレリ、パスケリア・アシドフィラ、パブロバ属の種、フェオダクチラム・トリコヌタム、ファグス、フォルミジウム属、プラティモナス属の種、プレウロクリシス・カルテレ、プレウロクリシス・デンタテ、プレウロクリシス属の種、プロトテカ・ウィクケルハミイ、プロトテカ・スタグノラ、プロトテカ・ポルトリセンシス、プロトテカ・モリフォルミス、プロトテカ・ゾフィ、シュードクロレラ・アクアティカ、ピラミモナス属の種、ピロボツリス、ロドコッカス・オパクス、サルシノイド・クリソフィテ、セネデスムス・アルマツス、シゾシツリウム、スピロギラ、スピルリナ・プラテンシス、スチココッカス属の種、シネココッカス属の種、シネコシスティス、タゲテス・エレクタ、タゲテス・パツラ、テツラエヅロン、テツラセルミス属の種、テツラセルミス・スエシカ、タラッシオシラ・ウェイッスフロギィ、およびヴィリデイエラ・フリデリシアナ。
【００６８】
他の実施形態では、バイオマスは、限定されないが、ダイズ、トウモロコシ、ヤシ、カメリナ、ヤトロファ、ナタネ、ココナツ、ピーナツ、ベニバナ、綿実、アマニ、ヒマワリ、ヌカ、およびオリーブを含む植物原料であってよい。
【００６９】
種々の極性の脂質および副産物（例えば、タンパク質）を、藻類バイオマスのような湿潤油性材料から抽出するシステムおよび方法が開示されている。特に、本明細書記載の方法およびシステムは、次第に極性が低くなる（すなわち、抽出工程が次に進行するにつれ、溶媒中の水／水の比が次第に減少する）親水性溶媒／水混合物で順次抽出を行うことにより藻類成分の抽出および分画の両方を行う能力に関する。換言すると、藻類中の介在性の溶媒（その重量の７５％）は、最初は水であり、わずかに非極性の溶媒によって徐々に有機溶媒の共沸混合物に置き換えられる。これは、各工程で生じた極性で、可溶性の成分を抽出し、抽出された成分を同時に分画する。酸浸出および／またはアルカリ抽出によるタンパク質性副生成物の抽出も開示する。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態では、単一の溶媒および水を用いて、油性原料中に存在する成分を抽出および分画する。他の実施形態では、油性原料中に存在する成分を抽出および分画するのに溶媒セットおよび水を用いる。いくつかの実施形態では、油性原料は湿潤性である。他の実施形態では、油性原料は藻類である。
【００７１】
極性脂質の回収は、そのイオン電荷、水溶解度、および場所（細胞内、細胞外または膜結合性）に主に依存する。極性脂質の例に、限定されないが、リン脂質および糖脂質が挙げられる。極性脂質を分離および精製するのに用いられ得る方法には、大まかにバッチまたは連続モードがある。バッチモードの例に、沈澱（ｐＨ、有機溶媒）、溶媒抽出および結晶化が挙げられる。連続モードの例に、遠心分離、吸着、泡沫分離および沈澱、ならびに膜技術（タンジェント流濾過、透析濾過および沈澱、限外濾過）が挙げられる。
【００７２】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および実施例は、本発明の具体的な実施形態を示すが、単に例示のつもりであることを理解されたい。したがって、本発明の精神および範囲内の変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになることが企図される。
【００７３】
前述の非破壊的抽出プロセスは、意外にも９０％を超える回収率である。それを原料に用いるとき、値を高める。これは、少なくとも部分的に、バイオマスの長鎖不飽和脂肪酸の高い含量に起因する。加えて、エタノール抽出物、がさらに直接エステル交換され得る。また既存の従来の方法と違って、本明細書記載の方法およびシステムは、あらゆる藻類適用可能であり、水混和性有機溶媒勾配を使用することによって、藻類の中の極性脂質を含むかなりの有価な成分をすることができる。
【００７４】
本発明を使用することによって得られる中性脂質は、金属含量が低いため、脂質画分の安定性を高め、その後の処理工程数を低減する。金属には、酸化触媒作用により、中性脂質を不安定にする傾向がある。さらに、金属は水素化精製の触媒作用を阻害するため、中性脂質混合物が精製され得る前に金属を除去する必要がある。本明細書に開示されているシステムおよび方法は、タンパク質および／または極性脂質画分の中にある金属を抽出することができる。このことは、タンパク質および極性脂質が金属の暴露にあまり影響されず、いくつかの場合では金属によって実際に安定化されるため、有利な点である。
【００７５】
本明細書に開示されているシステムおよび方法は、湿潤バイオマス開始することができ、乾燥および脱水コストを低減する。従来の抽出プロセスと比較して、開示されている抽出および分画プロセスは、溶媒の循環利用と併せて、穏やかな温度および圧力条件により操作コストが比較的低いはずである。さらに、従来の抽出プロセスは、非常にコストが高く、市場の要求を満たすことができない。
【００７６】
本明細書記載のシステムおよび方法のもう一つの態様は、抽出プロセスの間に中性脂質から極性脂質の分離する予備の精製を達成する能力である例示的な実施形態に用いた藻の油と先の実施形態に用いた植物油との相違点に、個々の種類の脂質の割合がある。植物油と比較した例示的な藻類粗油の組成を以下の表２に示す。
【表２】
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【００７７】
植物油の脱ガム（物理的および／または化学的）は、極性脂質（例えば、糖脂質およびリン脂質）を除去するために実施される。化学的に脱ガムされた植物油は、相当量の中性脂質を保持する。この中性脂質画分は、溶媒抽出もしくは超臨界／亜臨界流体抽出または膜技術を用いて、脱ガムされた材料からさらに除去される。対照的に、油性の藻類バイオマスから中性脂質を分離することは、藻の油の中に典型的に認められる極性物質が多量に存在するため、植物油の原料（表２参照）から分離するよりもはるかに困難である。藻の油に存在する割合が非常に高い極性脂質が中性脂質の乳化を増進するためである。乳化は、溶液中に残る栄養および塩成分によってさらに安定化される。結果、極性脂質の存在は、金属と併せて、中性脂質の分離および利用を困難にしている。それでも、極性脂質には既存の市場があるため、回収することは、燃料を生み出す藻の油の使用に重要な価値を与えるだろう。
【００７８】
極性脂質は分子構造により元々、界面活性剤であり、そこには巨大な既存の市場がある。極性脂質を生産する既存の技術の多くは、原材料またはコストが非常に高い。糖脂質およびリン脂質の代替の原料は、主に、藻類の油、オーツ麦油、小麦胚珠油および植物油である。藻類の油は、種、細胞の生理学的状態、培養条件、採取時期、および抽出に利用した溶媒に応じて一般的に約３０〜８５％（ｗ／ｗ）の極性脂質を含有する。さらに、各極性脂質のグリセロール骨格は、中性脂質であるトリアシルグリセロール中の３つの脂肪酸の代わりに付着した２つの脂肪酸基がある。極性脂質のエステル交換では、質量基準あたり、中性脂質のものと比較して、３分の２の最終生成物、すなわち、エステル化脂肪酸しか得られないことがある。したがって、極性脂質の除去および回収は、高品質のバイオ燃料またはトリグリセリドを藻類から生産するのに非常に有利であるだけでなく、付加価値のある副産物である糖脂質およびリン脂質も生成し、藻類のバイオ燃料の生産に関連するコストをひいては相殺し得る。藻類によって生産される種々の油および副産物を容易に回収および分画できることは、藻類の油の生成過程の経済的な成功に有利にはたらく。
【００７９】
本明細書記載の方法およびシステムの態様は、藻類バイオマスのような油性原料からタンパク質を抽出する能力である。本明細書に開示されている、藻類バイオマスからタンパク質性材料を抽出する方法は、柔軟かつカスタマイズ可能な抽出および分画プロセスを含む。例えば、いくつかの実施形態では、抽出および分画は、一つの工程で行われ、高効率なプロセスを提供する。かかるバイオマスから調達されるタンパク質が動物飼料、食品成分および工業製品に有用である。例えば、繊維、接着剤、塗料、セラミック、インク、化粧品、布地、チューイングガム、および生分解性プラスチックのような応用に有用である。
【００８０】
本明細書記載の方法およびシステムもう一つの態様には、抽出される成分を基準にした藻類バイオマス対溶媒の比を変動させることが含まれる。一つの実施形態では、藻類バイオマスを等重量の溶媒と混合する。別の実施形態では、藻類バイオマスをさらに重量の小さい溶媒と混合する。別の実施形態では、藻類バイオマスをさらに重量が大きい溶媒と混合する。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスと混合される溶媒の量は、用いられる溶媒および藻類バイオマス／溶媒混合物の望ましい極性を基準にして計算される。他の実施形態では、藻の塊は、数工程を経て抽出される。例示的な実施形態では、最初にわずかに非極性の水混和性溶媒によって重量の約５０〜６０％の割合で、藻類バイオマスを順次抽出する。次に、残存する藻類固体は溶媒中固体の重量の約７０％を用いて抽出される。最後に、溶媒中固体の重量の約９０％を用いて抽出される。本発明の態様を報告したが、当業者は、藻類生成物を選択的に抽出するために、藻類バイオマスおよび／または固体の比を所望の極性に調整することによって、異なる極性の異なる溶媒を用いることができるだろう。
【００８１】
例えば、好ましい実施形態では、用いる溶媒はエタノールである。溶媒の比を変動させることによって成分が選択的に単離され得る。タンパク質が約５０％のエタノールによって藻類バイオマスから、約８０％エタノールによって極性脂質から、および約９５％以上のエタノールによって中性脂質から、それぞれ抽出され得る。メタノールを用いるならば、藻類バイオマスからタンパク質を抽出するための溶媒濃度は、約７０％になるであろう。極性脂質は約９０％メタノールを必要とし、中性脂質は約１００％メタノールを必要とするだろう。
【００８２】
本明細書記載のシステムおよび方法の実施形態は、意外で予想しない結果を示す。まず、回収／抽出プロセスは、湿潤バイオマス上で実施され得る。これには、例示的な実施形態が、細胞を乾燥させおよび破壊するのに必要な大量のエネルギーを使用を回避しなくてすむという、主に経済的な利点がある。本発明のシステムおよび方法を用いると、乾燥藻類バイオマスから中性脂質の抽出する効率が非常に良くなる。開示されているプロセスから得られる収率は、従来の抽出方法で得られるものより有意に高く、純度が高い。従来の抽出がエマルションを頻繁にもたらして成分の分離が極めて困難になるためである。
【００８３】
例示的な実施形態を、あらゆる藻類または非藻の油性原料に適用してもよい。例示的な実施形態が、限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルを含む水−混和性のわずかに非極性のあらゆる溶媒を用いてもよい。具体的な実施形態に植物の再生可能溶媒、例えば、エタノールを用いてよい。試験したアルコール溶媒は、単離された中性脂質の収率および純度がさらに高い。エタノールは、本明細書に開示されている他の溶媒と比較してコストが比較的経済的である。いくつかの例示的な実施形態では、抽出および分画は、１つの工程で、続いて、必要に応じて、膜に基づく精製により実施され得る。得られたバイオマスはほとんど水を含まず、水性藻類スラリーよりも少ないエネルギーで完全に乾燥させることができる。
【００８４】
いくつかの例示的な実施形態では、抽出に用いられる溶媒は、エタノールである。他の実施形態では、限定されないが、シクロヘキサン、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、イソプロパノール、およびメタノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、同じ溶媒が順次抽出工程に用いられる。他の実施形態では、様々な溶媒が各抽出工程で用いられる。さらに他の実施形態では、２種類以上の溶媒が混合して１つ以上の抽出工程に用いられる。
【００８５】
本明細書記載の方法のいくつかの実施形態では、抽出工程のどこかで用いられる２種類以上の溶媒の混合物が、少なくとも１種類の親水性溶媒および少なくとも１種類の疎水性溶媒を含む。かかる混合物を用いる場合、親水性溶媒は、拡散を介してバイオマスから材料を抽出する。一方で、比較的少量の疎水性溶媒が組み合わせて用いられ、対象の材料が少量の疎水性溶媒で濃縮されるような液−液分離に含まれる。２種類の異なる溶媒は、当該分野に公知の技術を用いて分離することができる２層系を形成する。かかる実施では、疎水性溶媒は、アルカン、エステル、ケトン、芳香族、ハロアルカン、エーテル、または市販の混合物（例えば、ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）のうちのいずれか１種類以上であってよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抽出プロセスは、ｐＨ偏位を１つ以上の工程に組み込む。かかるｐＨ偏位は、タンパク質性材料を単離するのに有用である。いくつかの実施形態では、抽出プロセスのｐＨは、酸（例えば、約５未満）である。いくつかの実施形態では、抽出プロセスのｐＨはアルカリ性（例えば、約１０超）である。
【００８７】
従来の抽出手順のヘキサンの使用は、副産物を食品に用いることができないくらいに藻類バイオマスを汚染する。本発明の実施形態が当該分野の公知の発明よりも優れていることは、必要なエネルギーがはるかに少なく、生成物を燃料だけでなく食料品および栄養補給剤としても使用することに適していることである。
【００８８】
本明細書が考察しているいずれの実施形態も、本発明のあらゆる方法またはシステムに実施され得、またその逆も然りであることが意図される。さらに、本発明のシステムは、本発明の方法を達成するのに用いられ得る。
【００８９】
例示的な実施形態の説明
藻類からの油の溶媒抽出に関して、最良の場合のシナリオは、溶媒がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を選択的に抽出し、高い回収率で藻細胞内の全極性脂質および非ＴＡＧ中性脂質、例えばワックス、ステロールを残すことである。第２オプションは、極性脂質を選択的に抽出し、次いで、極性脂質を含まない純度の高い中性脂質を抽出して、その結果、高い回収率を得ることである。最後のオプションは、抽出物全ての脂質を抽出して、１つまたは２つの工程で非常に高い回収率を達成することである。
【００９０】
図１Ａを参照すると、フローチャート１００は、藻類が含有するバイオマスから脂質の分画および精製に用いられる方法の例示的な実施形態を含む工程の概要である。第１工程１１０では、藻細胞を採取する。後の工程１２０では、藻細胞から水が除去されて、１０〜２５％の固体バイオマスを得る。工程１３０では、溶媒に基づく抽出がバイオマス上で実施されて、画分を収集する。いくつかの実施形態では、工程１３０は、ｐＨに基づく抽出および画分の収集も組み込む。最後に、さらに小さな脂質成分を分離するために、限定されないが、濾過、デカント、および遠心分離のような技術を含む固相／液相分離が、工程１４０にて実施され得る。
【００９１】
藻類バイオマスは、工程１１０にて採取されるとき、典型的には約１〜５ｇ／Ｌの全固体からなる。バイオマスは、限定されないが、気泡浮上分離、膜濾過、軟凝集、沈降、フィルタ押圧、デカンテーションまたは遠心分離を含む技術を用いて工程１２０にて部分的に脱水され得る。脱水とは、固体または半固体物質から水をいくらか、大部分または全部除去することである。本発明の実施形態は、採取した藻類バイオマスから水を除去する脱水技術を利用する。脱水は、本明細書記載の方法のいずれか１つまたは組み合わせて、およびその他当業者に公知の方法によって行われ得る。
【００９２】
工程１２０から得られた脱水された藻類バイオマスは、一般的に約１０〜３０％の固体からなる。このバイオマスは、次いで、水混和性のわずかに非極性の溶媒（例えば、アルコール類）によって、各段階で画分を隔離する多段階向流溶媒抽出プロセスで抽出され得る。この種のプロセスは、資本および運転経費の両方を低減することができる。いくつかの実施形態では、バイオマスはまた、酸および／またはアルカリ抽出を経て、タンパク質材料を分画する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、藻類バイオマスの脱水は、採取された藻類バイオマスを溶媒、例えば、エタノールで処理することによって行われ得る。藻類バイオマスは、次いで、溶液から分離して沈降し、次いで、液体は、限定されないが、サイフォンのような方法によって除去され得る。この新規の脱水方法は、公知の方法よりも資本および運転コストが低く、溶媒の循環利用を可能にし、バイオマスの乾燥にかかるコストを低減し、藻類成分の抽出および／または分離の前に藻類バイオマスの極性を減少させるという利点もある。実際、本明細書に記載の溶媒に基づく沈降分離の過程は、有機溶媒が藻類表面の負電荷を低減または中和させることから、部分的に効果があることが理論化されている。本発明のいくつかの実施形態では、脱水方法は、さらに多くの水を除去するように組み合わされる。いくつかの実施形態では、脱水プロセスの間に溶媒を添加することから、抽出過程を開始する。
【００９４】
図１Ｂは、脱水プロセス３００の例示的な実施を示す。約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ（すなわち、０．１〜１％ｗ／ｗ）の最終乾燥重量を有する藻類培養物３１０は、水分離プロセス３２０に付される。プロセス３２０には、遠心分離、デカント、沈降または濾過があり得る。１つの実施形態では、培養物の水から藻類バイオマスを分離するのに焼結金属槽フィルタを用いる。かかるフィルタを用いると、回収された水３３０は、他の藻類培養物を対象に循環利用される。一方で、回収された藻類バイオマスは、約２００ｇ／Ｌ（すなわち、１０〜２０％ｗ／ｗ）の藻類の密度が高い「藻類ペースト」まで濃縮されている。この濃縮された藻類ペーストは、次いで、溶媒に基づく沈降プロセス３５０の中で溶媒３４０で処理される。
【００９５】
沈降プロセス３５０は、溶媒３４０を藻類ペーストに添加して、約１：１から約１：１０の溶媒対バイオマスの重量／重量比の混合物を得ることを含む。藻類は沈降用のベッセルに沈降して、溶媒／水混合物３６０が例えば、サイフォンおよび／またはデカントによって除去される。溶媒は、周知の技術、例えば、蒸留および／またはパーベーパレイションによって回収および再使用され得る。残存する湿潤バイオマス３７０には、アルコールおよび水溶液中に約３０％〜約６０％ｗ／ｗの固体含量があると予想される。
【００９６】
脱水に理想的な溶媒は、１．１ｇ／ｍＬ超または０．９ｇ／ｍＬ未満の密度の産業上よく使われる水溶性溶媒である。例えば、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、エタノール、メタノール、１−プロパノール、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、および／またはグリセリンが挙げられる。溶媒密度が１．１ｇ／ｍＬを超えるとき、藻類バイオマスは、沈降用のベッセルの底部に沈殿物を作るというよりむしろ浮いているだろう。
【００９７】
図２は、抽出システム２００の例示的な実施形態の概略図である。湿潤または乾燥藻類バイオマスは、限定されないが、移動ベルト、スクリューコンベヤ、または直通抽出チャンバを含む当該分野に公知の方法を用いて輸送される。抽出用の溶媒は、各バイオマスのスロット位置に割り当てられた貯蔵タンクから再循環される。抽出混合物は濾過され、バイオマス固体をスロットに戻し、抽出物を貯蔵タンクに戻す。ベルト上の固体は、抽出に必要な滞留時間に基づいて周期的に移動する。各貯蔵タンクの抽出物は、飽和時に補給されても、未使用の溶媒によって連続的に置き換えられてもよい。これにより、下流の処理時間およびコストも飛躍的に低減する。この実施形態は、一次貯留層２１０、輸送機構２２０、複数の分離装置２４１〜２４８（例えば、膜濾過装置）、複数の抽出貯留層２６１〜２６８、および複数のリサイクルポンプ２８１〜２８７を含む。この実施形態では、一次貯留層２１０は、複数の入口貯留層２１１〜２１８に分割される。
【００９８】
操作の間、藻類バイオマス２０１は、輸送機構２２０の第１の端２２１付近の第１入口貯留層２１１に置かれる。加えて、溶媒２０５は、輸送機構２２０の第２の端２２２付近の入口貯留層２１８内に置かれる。輸送機構２２０は、輸送機構２２０に沿って、第１端２２１から第２端２２２に藻類バイオマスを向かわせる。藻類バイオマスは輸送されるときに、複数の分離装置２４１〜２４８を通過して、種々の極性の画分に分離される。分離装置２４１〜２４８を通過する透析物部分は、貯留層２６１〜２６８に向かう。
【００９９】
例えば、第１分離装置２４１を通過する藻類バイオマスの透析物部分（例えば、分離装置２４１を通過するのに十分に小さい液体および粒子を含有する部分）は、第１貯留層２６１に向かう。第１貯留層２６１から、透析物部分が循環利用されて第１入口貯留層２０１に戻り得る。第１分離装置２４１を通過しない藻類バイオマスの残余部分は、次いで、輸送機構２２０によって、第２入口貯留層２１２、および第１分離装置２４１よりも微細な分離または濾過媒体を含み得る第２分離装置２４２に向かってよい。
【０１００】
第２分離装置２４２を通過する透析物部分のセグメントは、第２貯留層２６２に向かって、次いで循環利用されてリサイクルポンプ２８２を介して第２入口貯留層２１２に戻されてよい。第２分離装置２４２を通過しない藻類バイオマスの残余または抽出部分は、輸送機構２２０によって第３入口貯留層２１３に向かってよい。このプロセスは、各段階での残余部分がその後の入口貯留層に向かうように入口貯留層２１３〜２１８および分離装置２４３〜２４８について繰り返されてよいが、透析物部分はリサイクル貯留層に向かって、循環利用されて現在の入口貯留層に戻る。
【０１０１】
例示的な実施形態では、第１画分は、水分が最も多い状態とわずかに非極性の溶媒との比、すなわち、極性が最も高い混合物で抽出されるが、最後の画分は、純度が最も高く、わずかに非極性の溶媒、すなわち極性が最も低い混合物で抽出される。このプロセスは、画分によって極性を低下させる順序で成分を抽出する。第１画分の機能は、残りの水を除去して溶媒抽出プロセスを促進することである。それに続く画分は、極性脂質が豊富に含まれる、最後の画分は中性脂質が豊富に含まれる。
【０１０２】
油画分は、エステル化されて、長鎖不飽和脂肪酸を遊離することができる。カロテノイドおよび長鎖不飽和脂肪酸は、プロセス、例えば、非分子蒸留と併せた分子蒸留を用いて油から分離され得る。脂肪酸はすべて、分子蒸留を用いてカロテノイドから分離され得る。蒸留物は、単一の蒸留カラムを用いて分画されて、精製のために、より短鎖の脂肪酸を分離することができる。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム中に高沸点残渣となり残存する。
【０１０３】
いくつかの非限定的な実施形態では、本明細書では記載されている抽出システムおよび方法は、タンパク質材料を油性原料（例えば、藻類バイオマス）から単離するための１つ以上の工程を組み込む。かかるタンパクの質抽出工程は、ｐＨ調整を使用して、タンパク質の単離および抽出を達成する。例えば、１つの非限定的な実施形態では、第１分離装置中の溶媒のｐＨは、タンパク質を抽出するために最適化され、第１画分はタンパク質材料が豊富になる。タンパク質の抽出工程のｐＨは、対象のタンパク質のｐＫａに応じて調整される。対象のタンパク質のｐＫａは、限定されないが、Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ式、経験的方法、分子動力学に基づく方法を用いること、または滴定曲線を使用することを含む、当業者に公知の方法を用いて確かめられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、溶媒のｐＨはアルカリ性である。例えば、いくつかの実施形態では、溶媒のｐＨは、約１０超である。他の実施形態では、溶媒ｐＨは、約１０〜約１２の範囲である。他の実施形態では、溶媒ｐＨは、約１０、約１１、または約１２である。他の実施形態では、溶媒ｐＨは酸性である。例えば、いくつかの実施形態では、溶媒ｐＨは約５未満である。他の実施形態では、溶媒ｐＨは、約２〜約５の範囲である。さらなる実施形態では、溶媒ｐＨは、約２、約３、約４、約４．５、または約５である。第１分離装置の抽出部分は、次いで、続く入口貯留層に向かい、極性に基づいて、抽出および分画を達成する。別の非限定的な実施形態では、タンパク質材料が同様の手段（すなわち、溶媒のｐＨ調整）によって最後の分離装置の中で分離される。
【０１０５】
溶媒ｐＨの調整は、当業者に公知の方法で行う。例えば、酸性のｐＨは、適切な酸を溶媒ストリーム中へ混合することによって得られる。タンパク質の抽出に有用な例示的な酸に、限定しないが、リン酸、硫酸、および塩化水素酸が挙げられる。同様に、アルカリ性のｐＨは、適切な塩基を溶媒ストリーム中への添加および混合することによって得られる。タンパク質の抽出に有用な塩に、例えば、限定しないが、水酸化カリウム、および水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、本明細書記載の抽出および分画システムとは別個のシステムの中で抽出される。例えば、いくつかの実施形態では、藻類バイオマスは、ｐＨ調整された溶媒混合物中に浸漬され、続いて、適切な分離技術（例えば、遠心分離、または濾過）を介して単離される。残存する固体は、次いで、本明細書に記載されているように、極性に基づく抽出および分画システムに導入される。同様に、いくつかの実施形態では、極性ベースの抽出および分画プロセスから残存する抽出物は、ｐＨ調整された溶媒混合物に暴露されて、抽出プロセスの最後にタンパク質の材料を単離する。
【０１０７】
図３に示すように、溶媒の選択および極性に基づく分画の理論は、溶媒およびＳｏｈｘｌｅｔ抽出プロセスを用いる抽出への影響を詳しく分析することによって発展し、固体材料から脂質を分離することを可能とする。Ｓｏｈｘｌｅｔ抽出システムは、脂質の種類を選択しおよび回収するための溶媒を迅速にスクリーニングするために用いる。アルカン類、シクロアルカン、ハロゲン化アルキル、エステル類、ケトン類といった広範囲の極性を包含する種々の化学物質から溶媒を試験した。抽出の前に、抽出されるバイオマスの脂質の含量および組成は、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ脂質抽出法といった藻類の油を概算するための標準的な方法を用いて３回試験した。バイオマスに含有する脂質の計は、２２．１６％であり、そのうち４９．５２％が中性脂質であった。
【０１０８】
図３は、種々の極性および非極性溶媒をＳｏｈｘｌｅｔ抽出プロセスを併用して乾燥した藻の塊を抽出することによって集められたデータである。アルカン溶媒の鎖長に応じて、６０〜７０％の純度の中性脂質および回収した脂質の計の１５〜４５％が、破壊および溶媒の抽出することなく得ることができる。試験した最長鎖のアルカン溶媒、ヘプタンでは、中性脂質の６０％および脂質の計の４２％が回収された。図３に示すように、溶媒および例えば、ヘキサンを用いた従来の抽出法を用いたときの乾燥した藻の塊の抽出の結果は上がらず、コストがかかり収率が低い。本明細書に開示されているシステムおよび方法は、成分の損失を最小にしながら種々の極性の成分を分離するためにわずかに非極性の溶媒の水に対する割合を制御することによって、この非効率性に対処する。
【０１０９】
炭素数がさらに少ないアルコール溶媒は、極性脂質に対してさらに選択的であった。中性脂質の純度はメタノールで２２％、エタノールで４５％であった。イソプロピルアルコールは、極性と非極性脂質との間でいずれの選択性も示さず、５２％の純度の中性脂質生成物となった。メタノールは、脂質の計の６７％および極性脂質の９０％超を回収した。したがって、メタノールは、本発明の実施形態の優良な候補であり、ヘプタンまたはヘキサンを用いて中性脂質を抽出する前に油性原料から極性脂質を選択的に抽出するのに用いることができる。試験したその他の種類の溶媒のクラスは、中性脂質の純度が４９％に近く、原型のバイオマスに存在する脂質の組成とほとんど変わらないため、脂質クラスに対していずれの選択性も示さなかった。さらに、溶媒によって回収された脂質の計は、約１５〜３５％の範囲にあり、この溶媒を特定の脂質クラスを選択的に抽出することまたは脂質全体抽出するのに適さなかった。
【０１１０】
Ｓｏｈｘｌｅｔ分析から得られる結果は、以下に記載の実施例１の標準的なベンチスケールのバッチ溶媒抽出装置を用いて、確認した。溶媒は、極性脂質を回収する第１工程にメタノール、中性脂質を回収する第２工程に石油エーテルを選択した。抽出は全て、１：１０の固体：溶媒比で実施した。この実験の各抽出工程は１時間であった。その他の実験（データ示さず）は、約４５分以上が抽出を成功させるのに十分な時間であることを示している。この保持時間はシステムの熱と物質の移動に依存する。
【０１１１】
メタノールによる抽出は、最適な温度を明らかにするために、４０℃、５０℃、および６５℃で実施した。石油エーテルによる抽出は、溶媒の沸点に近い３５℃で実施した。石油エーテルを選択した理由は、中性脂質に対して高い選択性があること、沸点が低く、および抽出後に観察たした生成物の質が優れているためである。
【０１１２】
図４Ａは、６５℃でメタノールによる抽出工程の後に実施した石油エーテルによる抽出における中性脂質の純度は８０％を超えており、この２つの抽出工程の組み合わせは、最終の粗油生成物の中性脂質の含量を高めることを示している。図４Ｂは、中性脂質回収が率の計低く、第１工程では中性脂質が相当量失われていることを示している。
【０１１３】
メタノールによる抽出工程の中性脂質の損失を最小にするために、水を溶媒に添加することによって溶媒の極性を増加させてよい。図５Ａおよび５Ｂは上記バイオマスを７０％ｖ／ｖの水性メタノールで抽出し、続いて石油エーテルで抽出した結果を示す。図５Ａは、中性脂質の純度は、純粋なメタノールを使用した場合よりも、石油エーテルによる抽出のほうがかなり高かったことを示す。さらに、中性脂質の損失は、第１抽出工程の水性メタノールの使用によって大幅に低減した。図５Ｂに見られるように、高温でのメタノールによる抽出により、中性脂質の純度が改善したが、その後の工程では脂質回収率の計がわずかに減少した。
【０１１４】
いくつかの例示的な実施形態では、抽出プロセスの温度は、藻類バイオマスに存在する藻類成分の安定性を最適なものにするように制御される。藻類タンパク質、カロテノイド、およびクロロフィルは、温度感受性を示す藻類の成分の例である。他の実施形態では、温度は温度に感受性のある藻類の成分が藻類バイオマスから抽出された後に上昇させる。
【０１１５】
さらに他の例示的な実施形態では、抽出プロセスの温度は、所望の生成物の収率を最適化するように調整される。抽出は、周囲温度から抽出混合物の沸点まで、しかしこれ未満で実施することができる。他の実施形態では、抽出プロセスの温度は、所望の生成物の溶解度に応じて変化する。他の実施形態では、抽出の温度は抽出されるバイオマスの藻類株に応じて最適化される。抽出温度が上昇することで、所望の化合物の溶解度が増加し、抽出の回収を高める抽出混合物の粘度が減少する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抽出は、抽出混合物の沸点を上昇させるために加圧下に実行する。この実施では、所望の生成物のうちいずれかが崩壊し、変性し、分解し、または破壊され始める温度未満に抽出混合物の温度を維持しながら、圧力は沸騰を防止するのに必要な程度にまで増加させる。
【０１１７】
いくつかの例示的な実施形態では、抽出は、用いる溶媒の沸点付近、抽出が実施される条件（例えば、気圧または上昇した圧）下で実施する。他の実施形態では、抽出は、他の抽出条件を考慮しながら、抽出混合物の沸点付近で実施する。かかる温度で、藻細胞内への溶媒の気相の浸透速度は、物質移動抵抗がさらに低いために、速くなる。抽出温度が溶媒の沸点を著しく超えるならば、溶媒−水システムは共沸混合物を形成し得る。このように、溶媒の沸点またはその付近にシステムを維持すればコストを低減しながら、抽出を高めるのに十分な蒸気を生成するだろう。加えて、油の溶解度は温度が増せば増加し、溶媒沸点に近い温度での抽出の効果をさらに高める可能性がある。図６は、水性メタノール−石油エーテルによる抽出スキームの脂質回収率の計を示す。図５Ｂに観察されるように、メタノールによる抽出を沸騰温度付近で実施することで中性脂質の回収がわずかに減少するが、脂質の回収率の計が高まる。
【０１１８】
他の実施形態では、抽出は、周囲照明条件下で実施する。他の実施形態では、抽出は、光感受性の藻類成分を劣化から保護するために、限定されないが、スチール管またはケースのような不透明な容器の中で実施する。カロテノイドは光感受性の藻類成分である。
【０１１９】
他の例示的な実施形態では、抽出は、標準的な大気条件下で行われる。さらに他の実施形態では、抽出は、酸化しやすい藻類成分を保護するために、窒素雰囲気下で実施する。さらに他の実施形態では、抽出は、酸化しやすい藻類成分を保護するために、不活性ガス雰囲気下で実施する。酸化しやすい藻類成分に、カロテノイド、クロロフィル、および脂質が挙げられる。
【０１２０】
例示的な実施形態では、抽出のための溶媒対固体比は、バイオマス中の固体の乾燥重量を基準として３〜５の間にある。残りの藻類バイオマスは、炭水化物（例えば、デンプン）が豊富であり、供給原料として用い、抽出に用いられる溶媒を生成することができる。
【０１２１】
図７は、溶媒対固体比の脂質の回収率の計への影響を示す。溶媒対固体比が増加するに従い、脂質回収率の計が応えるかのように飛躍的に増加した。これは、他の一般的に用いられている油抽出溶媒、例えば、ヘキサンと比較して、メタノール中の脂質の溶解度が低いためであると考えられる。
【０１２２】
成分の溶解度は、抽出プロセスの中で用いられる溶媒の極性の影響を受ける。溶解度の特性は、湿潤バイオマス対溶媒の比を明らかにするのに用いられ得る。例えば、４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスには、１００ｇの湿潤バイオマスにつき４０ｇのバイオマスおよび６０ｇの水がある。１００ｇのエタノールをこの混合物に添加すると、エタノール対湿潤バイオマスの比は、１部の湿潤バイオマス対１部のエタノールであり、混合物中のエタノールの濃度は、１００／（１００＋６０）＝約６２％ｗ／ｗのエタノール（液相中）である。エタノール水混合物中６２％ｗ／ｗのエタノールは、６．６の極性指数に相当し、重量および成分の極性を平均したものによって計算される。６２％のエタノールおよび３８％の水を含有する混合物中では、エタノールの極性指数は５．２であり、水の極性指数は９であり、結果、（０．６２＊５．２＋．３８＊９）約６．６の極性指数をもたらす。極性脂質および中性脂質の、抽出のための混合物の極性指数は、それぞれ約５．８および５．４であると計算される。本開示に照らして、当業者はこれらの成分を選択的に抽出することができる溶媒セットを調合することができる。
【０１２３】
別の例では、抽出溶媒がイソプロピルアルコールおよびエタノールの１：１混合物であるとき、この溶媒の極性は、（（３．９＋５．４）／２）、約４．６５である。溶媒対湿潤バイオマスの比は、極性を適合させるように計算される。６．６の極性指数を得るには、本発明者らは、以下の代数方程式を解くことによって計算される５５％ｗ／ｗのＩＰＡ−水混合物を作製する必要がある：
【数１】
2013523156.tif 000005
【０１２４】
４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスについて、１００部の湿潤バイオマス対７５部の溶媒混合物の比に相当する。４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスには、１００ｇの湿潤バイオマスにつき４０ｇのバイオマスおよび６０ｇの水がある。７５ｇの溶媒混合物がこの混合物に添加されると、混合物中の溶媒の濃度は（７５／（７５＋６０））であり、溶媒混合物−水溶液中約５５％ｗ／ｗの溶媒混合物となる。この計算は、各抽出段階の各生成物について溶媒バイオマス比を得るのに用いられ得る。溶媒セットのいくつかの非限定的な例を表３に表す。
【表３−１】
2013523156.tif 000006
【表３−２】
2013523156.tif 000007
【０１２５】
全例記載の抽出混合物は、略固相および概ね液相から作製される。この相は、抽出後に分離する。これに続いて、液体溶媒を液相から除去することができ、抽出生成物が生じる。いくつかの実施形態では、溶媒は蒸発する。かかる実施では、液体−液体抽出技術は、蒸発する必要がある溶媒の量を低減するのに用いられ得る。用いられるいずれの溶媒も、条件が許すならば循環利用され得る。
【０１２６】
抽出前の藻類バイオマスの処理は脂質抽出の生産性および効率を高めることを理論化した。この方向では、塩基または別の有機溶媒を藻類バイオマスに添加して表面特性を変更し抽出を高める効果を比較しながら実験を行った。水性メタノール、水性水酸化ナトリウム、および水性ＤＭＳＯを含む種々の処理を試みた。図８に実証するように、５％のＤＭＳＯを添加することにより、脂質の回収が３倍に増加する。この抽出工程は、メタノールによる抽出工程を飛躍的に低減するのに活用されてよい。しかし、上記実験で用いた溶液は、コストが高く、粘度、ならびにＤＭＳＯの回収および循環利用の観点から、大規模に使用するには理想的でないことがある。
【０１２７】
図９は、８工程のメタノールによる抽出が、抽出された中性脂質の収率の累計および純度に及ぼす効果を示すチャートである。この実施形態では、１１２ｇの湿潤バイオマス（２５．６％乾燥重量）を、３５０ｍＬの純粋なメタノールで抽出し、各工程に１６０Ｗの照射電力で１０分間加熱した。その結果、抽出温度が抽出混合物の沸点付近である約７５℃であった。本プロセスを用いて、極性脂質の多くが抽出されると、純度の高い中性脂質が藻の油から得られることが判明した。図９は、極性脂質が全て抽出されると、高純度の中性脂質を単離することか可能であることを示す。この場合には、メタノールによる抽出工程５〜８では、９０％の中性脂質純度で、全バイオマスの５％の収率が得られた。さらに、上述の抽出混合物の沸点で、バイオマス中の大部分の水が、炭水化物、タンパク質および金属と併せて、第１抽出工程では完全に抽出される。
【０１２８】
図１０は、脂質およびタンパク質を湿潤バイオマスから抽出するためにエタノールを使用することにより脂質の回収の効率を上げることができることを示す。エタノールを用いることによって、メタノールを用いることによって一般に必要な９工程より約４工程で８０％の脂質回収率の計を達成できる。回収率の増加は、メタノールと比較してエタノール中の脂質の溶解度が高いことに起因し得る。さらに、水性エタノールの沸点は、水性メタノールよりも高く、脂質を一層回収する。温度が高いことが油の粘性を低くし、分散性を改善するためである。本プロセスの別の明確な利点は、油の画分中の残りのエタノールをエステル交換に用いること、およびバイオマスを乾燥させる操作への熱負荷を低くすることである。
【０１２９】
さらに、図１０は、初期の画分は脂質が豊富にはない状態で、タンパク質および他の高度極性分子を含有するし、続いて極性脂質が豊富にある画分、最終的に中性脂質画分になることを実証する。適切に抽出装置を設計することにより、単一の抽出および分画プロセス内で全３種類の生成物を回収することができる。
【０１３０】
本発明の別の実施形態は、抽出を補助するためにマイクロ波を利用する。本出願に開示する事前に集められたデータに基づいて、メタノールが、全種類の脂質を藻類から抽出するための最良の単一溶媒であることが示される。本出願の実施例１記載されているように、一つの溶媒を用いたマイクロ波抽出システムの有効性に関するデータを集めるために、単一溶媒を用いた複数工程による抽出を実施した。
【０１３１】
図１１は、抽出時間および脂質回収率の計を従来の抽出とマイクロ波補助抽出とで比較した対数プロットである。曲線のスロープに基づいて、マイクロ波システムは抽出時間を約５倍以上に低減することが計算された。従来の方法は、正味の脂質の回収率が高いが、これは、極性脂質の回収率が高いことに起因する。この成績に基づいて、マイクロ波の補助のある場合とない場合で溶媒による乾燥藻類バイオマスを抽出するための条件を最適化した。本発明のいくつかの実施形態は、従前のマイクロ波装置を用い、水分子を励起する波長を放出する。本発明の実施形態は、種々の溶媒を励起することを可能とするカスタマイズしたマイクロ波装置を利用する。本発明の他の実施形態は、藻類バイオマスに存在する脂質を励起することを可能とするカスタムのマイクロ波装置を利用する。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスに存在する脂質は、マイクロ波を用いて励起され、さらに脂質成分の藻類バイオマスから脂質成分を分離しおよび抽出する。
【０１３２】
水分含量は、油の抽出の効率に影響する、バイオマスのパラメータパラメータである。本発明のいくつかの実施形態では、乾燥した藻の塊は抽出および分画される。他の実施形態では、藻の塊は湿っている。藻類質量含有率が１０％、２５％、および３３％であるバイオマスのサンプルを、水分が抽出の性能に及ぼす影響を調査するのに用いた。
【０１３３】
図１２Ａは、藻類バイオマスから生成物を段階的に抽出する例示的プロセス４００を示す。図１２Ａの単位は全てポンドである。図１２Ａは、プロセス４００のマスバランスを示すが、実施するための設備および／またはシステムの詳細は、本明細書の他の箇所に記載する。５ポンドの藻類を含有するバイオマスには、約０．６３ポンドの極性脂質、１．８７ポンドの中性脂質、１ポンドのタンパク質、および１．５ポンドの炭水化物がある。バイオマスおよび１０００ポンドの水を脱水工程４０５で処理し、９５０ポンドの水を混合物から分離して、４５ポンドの水中の５ポンドの藻類を第１抽出工程４１０に通す。本明細書に開示されている脱水技術は、脱水工程４０５に用いられ得る。第１抽出工程４１０では、２３８ポンドのエタノールおよび１２ポンドの水を前工程からの藻類および水と合わせる。第１抽出工程４１０には、約８０．９％ｗ／ｗのエタノールの液相がある。２３１ポンドのエタノール、５３ポンドの水、および０．５ポンドの藻類タンパク質を第１液相が回収し、これから、水およびエタノールを例えば、蒸発によって除去し、タンパク質が豊富な生成物４１５が残る。蒸発から回収された溶媒は、第１抽出工程４１０に循環利用することができる。
【０１３４】
第１抽出工程４１０からの第１固相が第２抽出工程４２０を通過する（この第１固相は、４．５ポンドの藻類、２．６ポンドの水、および１０．９ポンドのエタノールを含む）。８６ポンドのエタノールおよび４ポンドの水を前工程からの第１固相に添加する。第２抽出工程４２０には、約９３．６％ｗ／ｗのエタノールの液相がある。８５．９ポンドのエタノール、５．９ポンドの水、および０．６ポンドの極性脂質の第２液相を回収し、水およびエタノールを例えば、蒸発によって除去し、極性脂質が豊富な生成物４２５が残る。蒸発から回収された溶媒は、第２抽出工程４２０に循環利用することができる。
【０１３５】
第２抽出工程４２０からの第２固相が第３抽出工程４３０を通過する（この第１固相は、３．９ポンドの藻類、０．７ポンドの水、および１１ポンドのエタノールを含む）。７４．５ポンドのエタノールおよび３．５ポンドの水を前工程からの第２固相に添加する。第３抽出工程４３０には、約９５．４％ｗ／ｗのエタノールの液相がある。７８．９ポンドのエタノール、３．９ポンドの水、および１．６ポンドの中性脂質の第３液相を回収し、水およびエタノールを例えば、蒸発によって除去し、中性脂質が豊富な生成物４３５が残る。蒸発から回収された溶媒は、第２抽出工程４３０に循環利用することができる。２．３ポンドの藻類、０．３ポンドの水、および６．６ポンドのエタノールの固相が残存する。
【０１３６】
図１２Ａに実証されているように、逐次的な各エタノール抽出工程によって得られる脂質特性は、出発藻類中の水分含量影響を大きく受けた。プロセス４００のモデルを、初期含水量に差がある３つの異なるバイオマス収集物に実行した。初期含水量が減少するに従い、最も多く脂質を回収する工程は第３抽出工程から第４（示さず）に変化した。しかし、この３つのバイオマスサンプルから回収した脂質の総計に差はなく、どれも藻類バイオマスの脂質含量の計が９５％を超えた。
【０１３７】
水分含量が高い藻の塊が用いたときは、水性エタノール混合物中のエタノール濃度はかなり低くなり、粗抽出物中の中性脂質の割合も低かった。９０％の水を含む藻類ペーストを脱水するプロセスは、エネルギーを極めて大量に消費することが報告されている。本明細書に記載の方法は、多くは水分である藻の塊をうまく抽出および分画するのに図らずも用いることができる。全体的な脂質の回収は、９０％の水（１０％の藻類固体）を含有する藻類ペーストから出発しても有意に影響しないため、本明細書に開示されている方法は、従来の抽出法とは違ってエネルギーを大量に消費する乾燥工程を必要としない。
【０１３８】
図１２Ｂは、プロセス４００の抽出工程の１つの例示的実施５００を示す。藻類バイオマスおよび溶媒混合物５０５は、抽出ベッセル５１０にある。藻類を抽出後（本明細書の他の箇所記載）、混合物は、粗濾過システム５１５、例えば、焼結金属管フィルタにあり、混合物を液相および固相に分離する。固相は下流の抽出工程を通過する。液相は、溶媒除去システム５２０、例えば、エバポレータを通過し、液相中の溶媒（例えば、エタノール）含量を低減する。溶媒除去後に残存する液相は、場合により遠心分離機５２５を通過する。溶媒除去システムに残存するあらゆる固体は、循環利用または廃棄される。遠心分離機５２５は、所望の藻類生成物（例えば、タンパク質または脂質）を液相中のあらゆる残存する水および／または固体から分離することを補助する。
【０１３９】
図１４は、藻の塊が処理されて１種類以上の藻類生成物を形成または回収することができるプロセス６００の例を示す。この例では、藻類バイオマスを本明細書に開示されている方法を用いて前部のプロセス６０５の中で段階的に抽出する。抽出および分離工程はエステル化プロセス６１０、加水分解プロセス６１５、水素処理プロセス６２０、および／または蒸留プロセス６２５へと続き、成分および生成物をさらに単離する。成分および生成物は、藻類脂質、藻類タンパク質、グリセリン、カロテノイド、栄養価のあるもの（例えば、長鎖不飽和油および／またはエステル類）、燃料エステル類（一般に、炭素数がＣ２０以下の鎖長を有するエステル類）、燃料、燃料添加剤、ナフサ、および／または液体石油代用物を含む。好ましい実施形態では、燃料エステル類は、炭素数がＣ１６の鎖長である。他には、燃料エステル類は、Ｃ１８の鎖長である。さらに他の実施形態では、燃料エステル類は、鎖長が炭素数がＣ２０以下の混合物である。
【０１４０】
エステル化プロセス６１０、加水分解プロセス６１５、水素処理プロセス６２０、および蒸留プロセス６２５は、任意であり種々の順序で用いられてよい。破線の矢印および点線の矢印は、加水分解、水素処理、および／または蒸留プロセスが脂質の画分処理に実施されてもよいときの全てではないがいくつかの選択肢を示す。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、抽出および／または分離が行われた後、中性脂質の画分は燃料生成物および／または添加物を作製するために水素処理を直接することができる。あるいは、他の実施形態では、中性脂質の画分をエステル化プロセス６１０に通してもよい。
【０１４１】
エステル化プロセス６１０は、当該分野に公知の技術、例えば、酸／塩基触媒作用を含み得、エステル交換を含み得る。塩基触媒作用は、いくつかの生成物を生成するのに除外しないが、塩基触媒作用の間に形成される石鹸は下流の処理を複雑にする可能性があり、これを回避するときには酸触媒作用が好ましい酵素的エステル化技術を用いてもよい。エステル化は、実質的に純粋な脂質材料（本明細書で用いるとき７５％を超の脂質）を処理し得る。エステル化後、副生成物のグリセリンを除去することができる。次いで、エステル化脂質は、鎖長が様々なエステル化脂質および脂質画分中に存在するカロテノイドを分離するために、分子および／または非分子蒸留（プロセス６２５）を経てもよい。次いで、エステル化脂質は、水素処理プロセス６２０を通過し、ジェット燃料、バイオディーゼル、および他の燃料生成物を生成することができる。当該分野公知の水素処理プロセスのいずれも用いることができ、かかるプロセスは、水素を脂質分子に添加し、酸素分子を除去する。水素処理についての例示的な条件がトリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル類を、６００ｐｓｉの範囲の高圧下および６００°Ｆの範囲の温度下に水素と反応させることを含む。ＮｉＭｏまたはＣｏＭｏがよく使用されている溶媒である。
【０１４２】
未精製の脂質よりも燃料エステル類を水素処理することにはいくつかの利点がある。まず、エステル化プロセス６１０は、藻の油に存在する一定のリンおよび金属化合物の濃度を低下する。この物質は、水素処理プロセスに一般に用いられる触媒には毒である。このように、水素処理触媒の寿命は水素処理の前のエステル化により長くなる。また、エステル化は、水素処理される化合物の分子重量を低減し、水素処理プロセス６２０の性能を改善する。さらに、エステル化が水素処理に必要とされるエネルギーを低減することから、蒸留プロセス６２５からの燃料エステル類を蒸気の形態で水素処理されるように保持することは有利な点である。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、藻類の中性脂質は、燃料生成物および添加剤に変換するために、直接水素処理される。他の実施では、中性脂質はエステル化され、蒸留プロセス６２５を介してカロテノイド、長鎖不飽和エステル類、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）エステル類、および／または燃料エステル類に分離される。蒸留プロセス６２５は、分子蒸留および当該分野に公知の蒸留技術を含み得る。例えば、蒸留物は、簡単な蒸留カラムを用いて分画されて、精製のために、より短鎖の脂肪酸を分離することができる。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム中に高沸点残渣として残存する。いくつかの実施形態では、残存する蒸気は、次いで、水素処理プロセスに送られてよい。本発明の利点の２つは、純粋な原料および蒸気生成物を生じさせることであり、上記のように、エネルギー集約的な水素処理反応が好ましい。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、極性脂質（および場合により中性脂質）は、エステル化プロセスを通過する前に加水分解プロセス６１５の中で加水分解される。そうすることで、藻類の脂肪酸を解き、非常に多くの藻類脂質が有用な生成物となる。
【０１４５】
図１５は、栄養価のある生成物を中性脂質から生成するプロセス７００を示すフローチャートである。プロセス７００の一実施では、中性脂質は、ＥＰＡが豊富な油からカロテノイドを分離する吸着プロセス７０５に供給される。中性脂質の由来は、本明細書に開示されているあらゆる選択的な抽出技術によって生成された藻類源であり得る。しかし、中性脂質は、他の資源、例えば、植物源からであってもかまわない。
【０１４６】
吸着プロセス７０５は、中性脂質を、カロテノイド、例えば、ベータカロテンおよびキサントフィルを吸着する吸着剤と接触させることを含む。一つの実施では、吸着剤は、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ２０ＳＳ（ＩＴＯＣＨＵ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．から市販されている）である。中性脂質は、バッチタイプのプロセスの中で吸着剤に接触し得、ここで、中性脂質および吸着剤は、選択された時間ベッセルに保持される。接触時間の経過後、吸収剤および液体を当該分野に公知の技術を用いて分離する。他の実施では吸着剤は、吸着剤床に保持し、中性脂質は吸着剤床を通過する。吸着剤床を通過する際、中性脂質のカロテノイド含量は低減し、ＥＰＡが豊富な油を生成する。
【０１４７】
カロテノイドは、限定されないが、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールといったアルコール類、例えば、酢酸エチルまたは酢酸ブチルといったエステル類、例えば、ヘキサンおよびペンタンといったアルカン類、を含む適切な溶媒で吸着剤を処理することによって吸着剤材料から回収され得る。
【０１４８】
図１６は、燃料生成物８３０を中性脂質８０５から生成するためのプロセス８００を示すフローチャートである。中性脂質は、本明細書に開示されている選択的抽出技術のいずれかによって生成された藻類源からのものであり得る。しかし、中性脂質は、他の資源、例えば、植物源からであってもよい。中性脂質は、脱ガムプロセス８１０の中で処理し、酸で洗浄し、中性脂質中の金属およびリン脂質の濃度を下げる。いくつかの実施では、リン酸を比較的希釈した溶液を中性脂質に添加し、混合物を加熱しおよびかき混ぜる。沈殿したリン脂質および金属を例えば、遠心分離機によって残存する油から分離する。
【０１４９】
処理された油は、漂白プロセス８１５を通過し、クロロフィルおよび他の着色化合物を除去する。いくつかの実施では、漂白プロセス８１５は、油をクレイおよび／または他の吸着剤材料、例えば、漂白クレイ（すなわちベントナイトまたはフーラー土）に接触させることを含み、油中のクロロフィルおよび他の着色化合物の濃度を下げる。処理された油は、水素処理プロセス８２０を通過し、油の成分に水素添加しおよび脱酸素化して燃料生成物、例えば、ジェット燃料混合物、ディーゼル燃料添加剤、およびプロパンを形成する。加えて、水素処理プロセス８２０もまた、例えば、ＬＰＧおよびナフサといったより短鎖の化合物を、クラッキングしおよび作製する。本明細書に記載の水素処理プロセスのいずれも水素処理プロセス８２０に用いてもよい。
【０１５０】
水素処理プロセス８２０の中で作成した化合物の混合物は、蒸留プロセス８２５を通過し、種々の燃料生成物８３０に分離する。蒸留プロセス８２５は、燃料化合物を分離するための本明細書に記載のまたは当該分野に公知である分子および非分子蒸留技術のいずれかを含んでよい。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態では、タンパク質は、藻類バイオマスから選択的に抽出され得る。開示されている方法を用いたタンパク質の抽出には、多くの利点がある。特に、藻細胞は、所望のタンパク質を抽出する前に溶解する必要がない。これは、抽出を簡素化し、費用を低減する。本発明の方法は、種々のクラスのタンパク質の溶解度の特性を、藻類培養物、バイオマス、ペースト、またはケーキから選択的に抽出および分画するために利用する。
【０１５２】
例えば、藻類バイオマスは、水および塩に可溶性のタンパク質（アルブミンおよびグロブリンと呼ばれる）を抽出するために加熱しおよび混合してもよい。この混合物は、グルテリンと呼ばれるアルカリ可溶性タンパク質を回収するためにｐＨを変えてもよい。続いてプロラミンと呼ばれるアルコール可溶性タンパク質を溶媒を用いて分離する工程がある。残存するバイオマスは、炭水化物および脂質が豊富に含まれるだろう。
【０１５３】
タンパク質を図１７および１８に示されるように、塩水および炭水藻細胞の両方から抽出することができる。塩水藻類培養物またはバイオマス中にある塩は、様々な種類のタンパク質の抽出に影響するが、本明細書に開示されている方法は、淡水または塩水藻類のどちらかからでもタンパク質を抽出することを可能にする。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、淡水藻細胞からのタンパク質抽出が図１７に示される新規なプロセスによって達成される。淡水藻細胞または淡水藻類バイオマスを加熱し混合する。混合には、例えば、限定されないが、撹拌、振とう、および揺動といった当該分野に公知の種々の方法がある。このプロセスは、概ね第１の概ね液相および第１の概ね固相から構成される、第１の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相を次いで分離する。分離には、限定されないが、遠心分離、デカンテーション、浮遊、沈降、および濾過を含む、当該分野公知の種々の方法がある。この第１の概ね液相は、アルブミンタンパク質が富化されている。
【０１５５】
第１の概ね固相は、次いで、塩水と混合し、加熱し、第２の概ね液相および第２の概ね固相から構成され、第２の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。塩水は天然の海水であっても水性塩溶液であってもよい。かかる溶液の一例が主にＮａＣｌを含む典型的には約３５ｇ／Ｌの溶液である。その後固体および液相は分離する。この第２の概ね液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。
【０１５６】
第２の概ね固相は、次いで、水と混合し、加熱し、第３の概ね液相および第３の概ね固相から構成される、加熱された第３の抽出混合物またはスラリーを生成する。第３抽出混合物またはスラリーのｐＨは、次いで、約９超まで上げられ、第３の概ね液相にはグルテリンタンパク質が富化されるようになる。固体および液相は分離され、第３の概ね液相は、グルテリンタンパク質が富化されている。
【０１５７】
第３の概ね固相は、次いで、溶媒セットと混合し、加熱し、第４の概ね液相および第４の概ね固相から構成され、加熱された第４の抽出混合物またはスラリーを生成する。好ましい一実施形態では、溶媒セットはエタノールを含む。他の非限定的な実施形態では、溶媒セットは、メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルの溶媒のうちの１種類以上を含む。固体および液相は次いで分離される。この第４の概ね液相は、プロラミンタンパク質が富化されている。残存する第４の概ね固相は、出発原料の藻類バイオマスの組成に応じて脂質が富化されていてよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、図１８に示される新規なプロセスによって塩水藻細胞からタンパク質を抽出する。塩水藻細胞または塩水藻類バイオマスは加熱および混合される。混合には、例えば、限定されないが、撹拌、振とう、および揺動といった当該分野に公知の種々の方法がある。このプロセスは、第１の概ね液相および第１の概ね固相から構成され、第１の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相は次いで分離される。分離は、限定されないが、遠心分離、デカンテーション、浮遊、沈降、および濾過を含む当該分野に公知の種々の方法がある。この第１の概ね液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。
【０１５９】
第１の概ね固相は、次いで、水と混合され、加熱されて、第２の概ね液相および第２の概ね固相から構成され、第２の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相は次いで分離される。この第２の概ね液相は、アルブミンタンパク質が富化されている。
【０１６０】
第２の概ね固相は、次いで、水と混合し、加熱し、第３の概ね液相および第３の概ね固相から構成され、第３の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。この第３抽出混合物またはスラリーのｐＨは、次いで、約９超まで上げられ、第３の概ね液相にはグルテリンタンパク質が富化されている。固体および液相は次いで分離され、第３の概ね液相は、グルテリンタンパク質が富化されている。
【０１６１】
第３の概ね固相は、次いで、溶媒セットと混合し、加熱されて、第４の概ね液相および第４の概ね固相から構成され、第４の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。好ましい一実施形態では、溶媒セットはエタノールを含む。他の非限定的な実施形態では、溶媒セットは、メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルといった溶媒のうち１種類以上を含む。固体および液相は次いで分離される。この第４の概ね液相は、プロラミンタンパク質が富化されている。残存する第４の概ね固相は、出発藻類バイオマスの組成に応じて脂質が富化されていてよい。
【０１６２】
開示されている方法は、図１７〜２０に示されるように様々な種類のタンパク質の選択的抽出も提供する。上記抽出プロセスの工程のいずれもが、単一のタンパク質生成物を選択的に抽出するために、工程の残りと別個に実施されてもよい。この２つの例は図１７および１８にあり、抽出工程１ａの周囲の破線のボックスに説明する。
【０１６３】
非限定的な例では、前記バイオマスを塩水と混合して加熱し、概ね液相および概ね固相から構成される加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって、グロブリンタンパク質を淡水藻類バイオマスから選択的に抽出することができる。固相および液相は次いで分離され得る。液相はグロブリンタンパク質が豊富に含まれる。図１７の抽出工程１ａを参照されたい。
【０１６４】
別の非限定的な例では、前記バイオマスを水と混合し加熱し、概ね液相および概ね固相から構成される加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって、アルブミンタンパク質を塩水藻類バイオマスから選択的に抽出することができる。固相および液相は次いで分離され得る。液相はグロブリンタンパク質が富化されている。図１８の抽出工程１ａを参照されたい。
【０１６５】
さらなる非限定的な例では、プロラミンタンパク質は、図１９に示されるように、淡水または塩水藻類バイオマスのどちらかから選択的に抽出することができる。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒セットと混合し、加熱し、概ね液相および概ね固相から構成される加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって達成される。固体および液相は次いで分離され得る。液相はプロラミンタンパク質が富化されている。
【０１６６】
別の非限定的な例では、タンパク質画分を、図２０に示されるように、淡水または塩水藻類バイオマスのどちらかから選択的に抽出することができる。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒セットと混合し、抽出混合物またはスラリーを生成し、および混合物の中のｐＨを変化させることによって達成される。固体および液相は次いで分離され得る。液相はタンパク質が富化されている。
【０１６７】
本発明の態様について述べてきたが、当業者は、一つの工程の抽出プロセスまたは多工程の抽出プロセスのいずれかによって、淡水または塩水藻類バイオマスの、どちらかからでも、所望のタンパク質を選択的に抽出することができる。本開示に照らして、藻の塊のタンパク質含量および対象のタンパク質の可溶性の特性を考慮すれば、当業者が上記の開示の多工程の抽出スキームの順序を置き換えることができる。開示されている方法のその他の実施形態は、各抽出工程の間に洗浄工程を組み込むこともあり得る。
【０１６８】
開示されているタンパク質の抽出法のいずれについても、抽出混合物／スラリーは、一定時間、加熱温度で維持してよい。いくつかの実施形態では、抽出混合物は、約２０分〜約９０分の間、加熱温度で維持される。いくつかの態様では、抽出混合物は、約２０分と約６０分の間、加熱温度で維持される。他の態様では、抽出混合物は、約４５分〜約９０分の間、加熱温度で維持される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、抽出混合物／スラリーは、約５０℃未満の温度で加熱してよい。いくつかの態様では、アルブミン、グロブリン、およびグルテリンタンパク質を約５０℃未満の温度で抽出する。他の実施形態では、抽出混合物／スラリーは、抽出混合物／スラリーの沸点近くの温度で加熱する。いくつかの態様では、プロラミンタンパク質は、抽出混合物／スラリーの沸点近くの温度で加熱する。他の実施形態では、圧力は、抽出を高めるための加熱および混合工程の間、大気圧を超えて最大で５０ｐｓｉ（これを含む）まで上げる。
【実施例】
【０１７０】
実施例１
緑色植物の微細藻類スセネデスムス・ジモルファス（ＳＤ）を、屋外パネル光バイオリアクタの中で培養した。種々の脂質含量のＳＤサンプルを採取した。遠心分離によってバルク水を除去した後、藻類サンプルを３〜５ｃｍの藻類ケーキにして、使用まで−８０℃で貯蔵した。事前に計算した量の湿潤藻類バイオマス（１５ｇの乾燥藻類の等量）および９０ｍＬのエタノール溶媒を、冷却器、機械的撹拌および熱電対を備えた３つ口フラスコに添加した。一つの実験では、混合物をマイクロ波照射下に１０分間還流した。第２の実験では、混合物を高周波加熱によって１時間還流した。その後、混合物を室温にまで冷却し、濾過によって透析物と残余分とに分離した。
【０１７１】
藻類サンプルの脂質の計を、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒの脂質抽出法に従ってクロロホルム−メタノール−水システムを用いて分析した。この脂質の計を脂質の回収を計算するための参考として用いた。脂質全体を、６０〜２００メッシュのシリカゲル（メルク社、ドイツ）を用いて、標準的なカラムクロマトグラフィ方法によって、中性脂質および極性脂質にさらに分離した。各脂質画分を事前に秤量したバイアルに移し、回転エバポレータ（Ｂｕｃｈｉ、スイス）を用いて初めに３０℃で蒸発させ、次いで高真空下に乾燥した。乾燥した残余分を窒素下に置き、秤量した。各サンプルの脂肪酸の特性を、内部の標準としてヘプタデカン酸（Ｃ１７：０）を用いて脂肪酸メチルエステル類に誘導体化した後に、ＧＣ−ＭＳによって定量した。
【０１７２】
結果（データ示さず）は、抽出を補助するマイクロ波が中性脂質の分離にはやや効果的が低かったが、第１抽出工程の極性脂質の除去に最も効果があることを示さした。高周波加熱の抽出効果はさらに一貫している。最終的な収率は、抽出を補助するマイクロ波と抽出を補助する高周波加熱との間に差はなかったが、抽出を補助するマイクロ波のほうがが有意に速い。
【０１７３】
実施例２
藻類バイオマスからのタンパク質の抽出
（１）酸浸出：藻類バイオマスをｐＨ４．５で１時間、水に浸漬した。次いで、サンプルを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを除去した。残存する固体を希酸（ｐＨ４．５）で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１７４】
（２）アルカリ抽出：藻類バイオマスをｐＨ１１で１時間、水に浸漬し、続いてｐＨ調整された水を添加した。次いで、サンプルを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを除去した。上澄みを希酸（ｐＨ４．５）で中和し、続いて遠心分離した。残存する固体を希酸（ｐＨ４．５）で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１７５】
酸浸出およびアルカリ抽出の結果を表４では以下に示す。
【表４】
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【０１７６】
タンパク質の収率を重量基準で計算し、凍結乾燥された固体の重量を、ｐＨ調整した水に浸漬する前の藻類バイオマスの重量と比較した。タンパク質の純度を米国油脂化学学会（Ｂａ−２ａ−３８）の公式な方法によって明らかにし、各プロセスの凍結乾燥された固体中の窒素の量を測定した。タンパク質が藻類生成物の抽出の価値を上げる重要な生成物であるため、この情報により、本明細書に開示されているシステムおよび方法に、タンパク質の濃度が様々な原料を使用することができる。
【０１７７】
実施例３
塩水藻類バイオマスからのタンパク質抽出
初めに塩水中約１〜１０％ｗ／ｗの固体から成る塩水藻類培養物を５０℃に加熱し、この温度で１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液体抽出物はグロブリンタンパク質が豊富に含まれることが判明した（元の藻類バイオマスにタンパク質の計の約１０％が存在）。
【０１７８】
固体を次いで淡水に懸濁させ、約５０℃まで加熱し、約１時間維持した。得られたスラリーを再び遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、アルブミンタンパク質が豊富に含まれることが判明した（元の藻類バイオマスにタンパク質の計の約１０％が存在）．
【０１７９】
固体をエタノールに懸濁させ、７０％ｗ／ｗの混合物を得た。この混合物を約７５℃に加熱し、この温度で約１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、アルブミンタンパク質が豊富に含まれることが判明した（元の藻類バイオマスにタンパク質の計の約3０％が存在）。
【０１８０】
固体を次いでアルカリ溶液（水性ＮａＯＨ、ｐＨ９）に懸濁させ、約５０℃に加熱し、この温度で約１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、グルテリンタンパク質が豊富に含まれることが判明した（元の藻類バイオマスにタンパク質の計の約５０％が存在）。
【０１８１】
実施例４
エタノールによる藻類バイオマスの工程分画および抽出
１０００ポンドのナンノクロロプシス属のバイオマス（アリゾナ州立大学、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｇａｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た株２０２．０から培養、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０４８）を採取し、藻類が約３５％ｗ／ｗ含まれ、次いで最終的に凍結するまで脱水した。
【０１８２】
抽出工程を、ヒンジ付蓋を有する４００ガロンの二重釜の中で実施した。蓋をストラップで固定し、シリコーンでシールした。システムには、翼軸が２つ付いた２馬力の防爆モーターが付属のミキサーもある。凍結した藻類原料をタンクに移し替え、等重量のエタノールを空気圧ドラムポンプを用いてポンプで吸い上げた。原料を１５分間撹拌し、水蒸気でジャケット加熱して、各抽出工程が所望の温度となった。所望の温度は、沸点近く、混合物の沸点の３℃以内を意味するが、沸騰はしない。この所望の温度は、エタノールの割合が変化するに応じて混合物の沸点が変化するため、各抽出工程ごとに異なる。所望の温度に達したら、システムは、釜の内容物が均一に加熱されるために６０分間所望の温度で保持しながら連続的に撹拌した。
【０１８３】
釜の内容物を、１分あたり約１ガロンで空気圧のＶｉｋｉｎｇのベーンポンプを用いて、抽出ベッセルの外にポンプで吸い上げ、Ｓｈａｒｐｌｅｓデカンタ遠心分離機にかけた。デカンタ遠心分離機のロータ速度は約６０００ｒｐｍであった。固体を密閉したプラスチックドラムに集め、液体に対して約５０％ｗ／ｗの固体からなった。これらの固体を釜に戻し、上記の抽出工程を繰り返した。デカンタからの液体ストリームを原料タンク内に集め、次いで膜濾過システムに供給した。用いた膜は、Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の０．３７５ｆｔ２ＳＳの膜であった。操作条件は６０℃±５℃であり、４０ｐｓｉの平均圧力勾配であった。膜システムを圧縮空気で約１５分ごとに逆洗浄し、流束を維持した。膜システムから収集した浸透物は、粒子状物を含まなかった。残余分を収集し、デカンタに循環利用した。
【０１８４】
この抽出および分画は、各抽出の過程を通じて溶媒の極性が変化するためである。図１３に示される抽出では、過程は約６５％の純粋な水（３５％ｗ／ｗの藻類固体）を含有する約１０００ｌｂｓ．の湿潤藻類バイオマスから始まる。変性エタノール８６０ｌｂｓ．（９５％のエタノールおよび５％のメタノール）と混合し、その結果、約５５％の水性エタノールを含有する混合物となった。固体および液体は上記のデカンタを用いて分離した。湿潤固体部分は、５２５ｌｂｓの重量であり、４０％の乾燥質量であった。９５％変性エタノールの計５２５ｌｂｓ．を固体に添加し、その結果、約８５％を水性エタノールが占める混合物となった。固体および液体は上記のデカンタを用いて分離した。固体部分は、３５４．５ｌｂｓの重量であり、４０％の乾燥質量であった。この塊に、変性エタノール７００ｌｂｓ．を別に添加し、その結果、約９５％の水性エタノールの混合物となった。固体および液体は上記のデカンタを用いて分離した。得られた固体は、約４０％の乾燥質量であった。このバイオマスは、水およびエタノールの潜熱に基づいて計算すると、乾燥させるのに６０％未満のエネルギーが必要となる。
【０１８５】
いくつかの実験では（データ示さず）、その他の種類の変性エタノールを試した。９５％のエタノールおよび５％のイソプロピルアルコールを含有する変性エタノールを抽出に用いたが、９５％のエタノールおよび５％メタノールのものほど効果は認められなかった。１００％のエタノールを使用することが本発明の好ましい実施形態であるが、コストの制約によって通常は利用できない。
【０１８６】
膜システムからの透過流を、社内で製作した回分蒸留器を用いて蒸発させた。操作条件は、真空蒸留の間、約８０℃であった。透過中のエタノールを全て蒸発させた。この抽出工程を３回繰り返し、その結果、図１３に示すように、４つの生成物のプールとなった。これは、各抽出工程について、混合物に水を添加することで極性が変化し、工程ごとに異なる成分が抽出されるためである。生成物１は、藻類タンパク質を含有し、その結果、操作の条件下に気化できなった過剰の水がシステム内に残った。生成物２は極性脂質を含有した。生成物３は中性脂質を含有した。最終的に、生成物４は残りのバイオマスであり、潜在的な副産物、例えば、カロテノイドを含有した。
【０１８７】
実施例５
エタノールによる藻類バイオマスの脱水および抽出
採取の際、藻類バイオマスは、典型的には約０．１〜０．５％（ｗ／ｗ）の固体を含有する。限定されないが膜濾過、遠心分離、加熱、沈降または浮遊を含む藻類の産業に公知の方法のどれを用いても脱水することができる。凝集は、浮遊または沈降のどちらかを補助することができる。かかる方法の典型的な結果は、約１０％ｗ／ｗの固体を含有する藻類スラリーである。さらに脱水するために、残存する遊離水のいくらかを除去して４０％ｗ／ｗに近い固体濃度を得る別の脱水方法が用いられてよい。しかし、脱水にかかるコストは、最初に脱水が行われた後に指数関数的に増加する。本明細書に開示されているシステムおよび方法の利点は、たった１回の脱水をした藻の塊を抽出しおよび分画することができることである。
【０１８８】
かかるプロセスの例は、第一巡の抽出に、実施例３に記載のプロトコルに従い、純度が９０％の水を含有する湿潤バイオマス１０００ｌｂｓ．を変性エタノール１０００ｌｂｓ．（９５％のＥｔＯＨおよび５％のＭｅＯＨ）と混合して、その結果、約５０％の水性エタノールの溶媒混合物となる。結果物のバイオマス（３５０ｌｂｓ．）は、乾燥の程度が４０％である。この湿潤した固体の組成は、５０％が水性エタノールである。別の変性エタノールが３５０ｌｂｓ．であれば、混合物の組成は約８１％が水性エタノールであろう。結果物のバイオマス（２３５ｌｂｓ．）は、乾燥の程度は４０％である。この湿潤した固体の溶媒組成は、８１％が水性エタノールである。別の変性エタノールが４７０ｌｂｓ．であれば、混合物の組成は、約９５％が水性エタノールであろう。結果物の固体は、約９５％がエタノールで、乾燥の程度は４０％であろう。この湿潤バイオマスは、水およびエタノールの潜熱に基づいて、乾燥させるのに６０％未満のエネルギーを必要とする。この場合、藻類１００ｌｂｓ．は、エタノール１８２０ｌｂｓ．を用いて抽出した。出発物質の４０％が藻類固体である実施例３と比較すると、乾燥藻類３５０ｌｂｓ．等量はエタノール２０８５ｌｂｓ．によって抽出した。
【０１８９】
参照文献
以下の参考文献は、その内容全体を参照により本明細書に援用する：
米国特許第７，１４８，３６６号
Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，  ９２（１）：３９−９０，  ２００９．  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌＣｈｉｓｔｉ，  Ｙ．  （２００７）．  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２５，  ２９４−３０６．  −  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
Ａｍｉｎ，  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｎｖｅｒｓ．  Ｍａｎａｇｅ．，  ５０：１８３４−１８４０，  ２００９．  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ａｎｄ  ｇａｓ
Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄｓ，  ４７：５９１−５９７，  ２００９．  ＳＣＦ  ＣＯ２  ｂａｓｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｌｉｐｉｄｓ
Ｂｌｉｇｈ  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｄｙｅｒ  Ｗ  Ｊ．  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９．
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月19日(2012.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類タンパク質を実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物から選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、第１の概ね液相および第１の概ね固相から構成される第１の加熱された抽出混合物を生成すること；
ｂ．第１の概ね液相の少なくとも一部を第１の概ね固相から分離すること；
ｃ．第１の概ね固相を塩水と混合し得られた混合物を加熱して、第２の概ね液相および第２の概ね固相から構成される第２の加熱された抽出混合物を生成すること；
ｄ．第２の概ね液相の少なくとも一部を第２の概ね固相から分離すること；
ｅ．第２の概ね固相を水と混合し加熱して、第３の概ね液相および第３の概ね固相から構成される第３の加熱された抽出混合物を生成すること；
ｆ．第３の加熱された抽出混合物のｐＨを上昇させること；
ｇ．第３の概ね液相の少なくとも一部を第３の概ね固相から分離すること；
ｈ．第３の概ね固相を溶媒セットと混合し加熱して、第４の概ね液相および第４の概ね固相から構成される第４の加熱された抽出混合物を生成すること；および
ｉ．少なくとも一部の第４の概ね液相を第４の概ね固相から分離すること；
を含み、
第１の概ね液相は、第２、第３、および第４の概ね液相よりアルブミンタンパク質濃度が高く、第２の概ね液相は、第１、第３、および第４の概ね液相よりグロブリンタンパク質濃度が高く、第３の概ね液相は、第１、第２、および第４の概ね液相よりグルテリンタンパク質濃度が高く、第４の概ね液相は、第１、第２、および第３の概ね液相よりプロラミンタンパク質濃度が高い、前記方法。
【請求項２】
分離工程のうち１つ以上が、遠心分離、濾過、浮遊、および沈降からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、分離する前に、その沸点未満の加熱温度で維持される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、分離する前に、約２０〜約６０分の間、加熱温度で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約４５〜約９０分の間、加熱温度で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１、第２、第３、および第４の加熱された抽出混合物のうちの少なくとも１つが、約５０℃で維持される請求項３に記載の方法。
【請求項７】
第４の概ね固相は脂質を豊富に含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からグロブリンタンパク質を選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を塩水と混合し加熱して、グロブリンタンパク質で富化された概ね液相と概ね固相とから構成される加熱された抽出混合物を生成すること；及び
ｂ．グロブリンタンパク質で富化された概ね液相の少なくとも一部を概ね固相から分離すること
を含む方法。
【請求項９】
加熱された抽出混合物は、分離する前に、抽出混合物の沸点未満の加熱温度で維持される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
実質的に無傷の藻細胞から構成される淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物からアルブミンタンパク質を選択的に除去する方法であって：
ａ．淡水藻類バイオマスまたは淡水藻類培養物を加熱および混合して、加熱された液相および加熱された固相を生成すること；および
ｂ．アルブミンタンパク質を含有する加熱された液相の少なくとも一部を加熱された固相から分離すること
を含む方法。
【請求項１１】
加熱された液相および加熱された固相は、分離する前に、加熱された液相および加熱された固相の組み合わせの沸点未満の加熱温度で維持される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶媒セットはエタノールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
溶媒セットはアルコールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶媒セットは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含む請求項１，５および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アルブミンタンパク質を第１の概ね液相から回収することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
グロブリンタンパク質を第２の概ね液相から回収することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
グルテリンタンパク質を第３の概ね液相から回収することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
プロラミンタンパク質を第４の概ね液相から回収することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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