(57)【要約】【課題】  血中半減期が長く、患者の肝臓に特異的に運ばれることで、肝疾患の治療を非常に容易にしかつ他の組織における治療分子の作用による副作用を減少させる、ＡｐｏＡ分子と治療に関連する化合物とが共有結合してなる複合体の提供。【解決手段】  ＡｐｏＡ分子または機能的に同等なその変異体と、治療に関連する化合物とを含んでなり、両成分が共有結合している複合体。前記ＡｐｏＡ分子に対し特異的結合部位を有する組織を前記化合物の特異的標的とする治療における複合体の使用。【選択図】図１
2015038124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＡｐｏＡ分子または機能的に同等なその変異体と、
（ｉｉ）治療に関連する化合物と
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体。
【請求項２】
前記ＡｐｏＡ分子が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＡ−Ｖまたは機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＡｐｏＡ分子が、ヒトＡｐｏＡおよびマウスＡｐｏＡからなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
成分（ｉｉ）が、ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
成分（ｉ）および成分（ｉｉ）が、一本鎖ポリペプチドを形成してなる、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
成分（ｉ）のＣ末端が成分（ｉｉ）のＮ末端に結合しているか、または成分（ｉ）のＮ末端が成分（ｉｉ）のＣ末端に結合してなる、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
成分（ｉｉ）が、インターフェロンである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記インターフェロンが、ヒトまたはマウスインターフェロンα１またはインターフェロンα５である、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
成分（ｉｉ）が、ＴＧＦ−β阻害剤である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、配列番号１（Ｐ１４４）および配列番号２（Ｐ１７）または機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが、ペプチドリンカーにより接続されてなる、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記ペプチドリンカーが、可撓性ペプチドであり、および／またはプロテアーゼ認識部位を含むものである、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記リンカーが、配列番号３（ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ）、配列番号４（ＧＡＰ）またはマトリックスメタロプロテアーゼ−９認識部位からなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物または請求項１５に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体を含んでなる、ナノリポ粒子。
【請求項１８】
前記ナノリポ粒子が、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である、請求項１７に記載のナノリポ粒子。
【請求項１９】
治療に有効な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬製剤。
【請求項２０】
医薬として用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子、または請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
肝疾患の治療または免疫系関連疾患の治療に用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子、または請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
慢性肝炎Ｃ、慢性肝炎Ｂ、肝細胞癌、パーキンソン病、急性間欠性ポルフィリン症、肺線維症、骨転移、全身性硬化症、 限局性強皮症、皮膚癌、光線角化症、ケロイド瘢痕、やけど、心臓線維症、腎線維症、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、リウマチ様関節炎および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子、または請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
ワクチンアジュバント、免疫療法におけるアジュバント、大腸癌の治療におけるアジュバント、抗血管新生薬、または腎臓プロテクターとして用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子、または請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１７または１８に記載のナノリポ粒子または請求項１７に記載の医薬製剤からなる群から選択される第１成分であって、成分（ｉｉ）がＴＧＦ−β１  阻害ペプチドである第１成分と、
（ｂ）免疫刺激サイトカイン、前記サイトカインをコードしているポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、ＴＧＦ−β１阻害ペプチド、細胞毒性薬またはそれらの組み合わせを含んでなる群から選択される第２成分と、
を含んでなる組み合わせ。
【請求項２５】
成分（ａ）または成分（ｂ）における前記ＴＧＦ−β１阻害ペプチドが、ペプチドｐ１４４およびペプチドｐ１７からなる群から選択されるものである、請求項２４に記載の組み合わせ。
【請求項２６】
成分（ｂ）における前記免疫刺激サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項２４または２５に記載の組み合わせ。
【請求項２７】
癌の治療のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の方法による治療を意図した化合物を、安定化しかつ標的組織に対してターゲッティングする方法の分野に包含される。本発明は、特にアポリポタンパク質Ａが、当該タンパク質に対して高い親和性を有する結合部位をその表面に有する全ての組織に対し、治療を意図した化合物をターゲッティングすることができる能力に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
活性成分として巨大分子（macromolecules）を用いた新しい治療形式の開発により、当該分子を安定化しかつそれらが相応する細胞標的に対してターゲッティングする効果的な形態を開発することが必要となった。標的組織に対する特異的ターゲッティングを必要とする治療の例として、特異的成長因子を用いた治療、あるいは標的組織に不在または欠乏している遺伝子を戻すために用いられる遺伝子を用いた治療などがある。ウイルスベクターに基づかない組織特異的な系では、細胞特異性が低いかあるいはそれが無いという問題を有することが多い。
【０００３】
異なる系として、治療化合物を含む脂質小胞であり、肝細胞膜に対して親和性を示す分子が小胞表面にあることによるターゲッティングに基づいて、治療化合物を肝細胞に対してターゲッティングする系が記載されている。
【０００４】
例えば、ＷＯ０７１３０８７３は、微小胞を肝細胞に対してターゲティングするに際し、当該カプセルの表面に、肝細胞に存在するアシアログリコプロテイン、ヒアルロナン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンまたはマンノース受容体によって特異的に認識される化合物を組み込むことによってターゲッティングする方法を記載している。ＷＯ０２０８６０９１は、ナノ小胞を肝細胞に対して、前記ナノ小胞にＢ型肝炎ウイルスコートタンパク質を組み込むことによりターゲッティングする方法を記載している。ＷＯ２００４７３６８４は、表面にＡｐｏＡ１を含むリン脂質円盤状小胞に基づいて、部分的に疎水性の化合物を肝細胞に対してターゲッティングする方法を記載している。Ｌｏｕ等（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００５、１１：９５４−９５９）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を特異的キャリアとして用いて、ＨＤＬがコレステロールなどの疎水性化合物を収容する能力に基づいて、脂溶性抗腫瘍化合物を肝細胞の癌細胞にターゲッティングする方法
を記載している。
【０００５】
最後に、Ｋｉｍ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、  ２００７、  １５：１１４５−１１５２）は、干渉ＲＮＡを肝細胞に対して、干渉ＲＮＡを含みかつ表面にＡｐｏＡ−Ｉを有するリポソームに基づいてターゲッティングする方法を記載している。しかしながら、これらの方法には、前記化合物が、リン脂質の疎水性画分と接触している小胞または人工膜内に収容されているため、疎水性化合物しか担持することができないという欠点を有する。
【０００６】
あるいは、親水性化合物を肝臓に、肝臓により特異的に捕捉される薬剤と前記化合物との複合体を用いることによって、送達するが可能となる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、２６７：１８５９８−１８６０４）は、治療化合物（細胞増殖抑制製剤クロラムブシルおよびプロリル−４ヒドロキシラーゼＩ−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−β−Ａｌａ−Ｐｈｅ−５−オキサプロリン−Ｇｌｙインヒビター）を肝細胞に対して、前記化合物を胆汁酸に結合することによりターゲッティングする方法を記載している。しかしながら、この種の結合では、肝臓への送達のみが可能であり、化合物を治療を意図した他の組織に投与することができない。
【０００７】
ＷＯ０４０８２７２０は、治療活性を有する化合物を肝細胞に対して、Ｂ型肝炎ウイルス外被タンパク質により形成された擬ウイルス粒子に前記化合物を組み込むことによりターゲッティングする方法を記載している。しかしながら、これらのビヒクルは、血漿半減期が短く、持続した治療血漿濃度に至るには継続した投与または高用量での投与が必要であるという問題がある。さらに、擬ウイルス粒子を形成しているウイルスタンパク質は、体液性免疫反応を起こす。
【０００８】
ＷＯ８７０２０６１Ａは、ＬＤＬ受容体を発現する組織に対して、アポリポタンパク質ＢまたはＥ受容体結合領域および活性成分により形成される融合タンパク質を使用することにより、化合物をターゲッティングする方法を記載している。
【０００９】
インターフェロンの半減期が短い問題は、ＷＯ０７０２１４９４により取り扱われた。ＷＯ０７０２１４９４は、アルブミンとインターフェロンにより形成される融合タンパク質を記載している。これらの融合体では、血漿半減期が約１４日である。
【００１０】
したがって、治療化合物を特異的に肝細胞にターゲッティングし、かつ複合体の血漿半減期を長くすることができる好適なビヒクルが必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）ＡｐｏＡ分子またはその機能的に同等な変異体と、
（ｉｉ）治療を意図した化合物と、
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体に関する。
【００１２】
第二の態様によれば、本発明は、前記本発明による複合体をコードするポリヌクレオチド、またはそれを含んでなる遺伝子構築物であって、治療を意図した化合物（ｉｉ）が成分（ｉ）と一本鎖を形成するポリペプチドであるものに関する。
【００１３】
一連の態様によれば、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクター、および本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子構築物もしくはベクター、または本発明の複合体を含んでなるナノリポ粒子を含んでなる宿主細胞に関する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、医薬として用いられる、本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、宿主細胞またはナノリポ粒子に関する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、肝疾患または免疫系と関連した疾患の治療のための、本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、宿主細胞またはナノリポ粒子に関する。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）成分（ｉｉ）がＴＧＦ−β１阻害ペプチドである、本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、宿主細胞、ナノリポ粒子または医薬製剤からなる群から選択される第１成分と、
（ｂ）免疫刺激サイトカイン、前記サイトカインをコードしているポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、ＴＧＦ−β１阻害ペプチド、細胞毒性薬またはそれらの組み合わせを含んでなる群から選択される第２成分と
を含んでなる組成物に関する。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、医薬として使用するための、特に癌の治療のための、本発明の組み合わせに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＦＮαの発現の動態。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＡｐｏＡ１（Ａｐｏ）、ＩＦＮα（ＩＦＮ）、Ａｐｏ−ＩＦＮ（ＡＦ）またはＩＦＮ−Ａｐｏ（ＩＡ）を発現するプラスミドを水圧注入投与した。６時間後および１日目、３日目、６日目および９日目に、血液を採取し、血清ＩＦＮα濃度を、ＥＬＩＳＡにより分析した。１群当たり動物４匹を用いた代表的な実験の平均値および平均値の標準誤差を示す。結果を、反復測定ＡＮＯＶＡにより分析後、ボンフェローニ試験をおこなった。プラスミドＡＦおよびＩＡにより誘発された１日目と３日目のＩＦＮα濃度と、プラスミドＩＦＮにより誘発された濃度との間には有意の差があった（ｐ＜０．００１）。
【図２】ＩＦＮα１の肝臓ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ。水圧注入を、各プラスミドおよび各日の検討のために、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスで実施した。１日目、３日目および６日目に、動物を殺生し、肝臓を摘出した。肝臓ｍＲＮＡを精製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＩＦＮα１遺伝子について実施した。代表的実験の平均値および平均値の標準誤差を示す。結果を、反復測定ＡＮＯＶＡにより分析後、ボンフェローニ試験をおこなった。プラスミドＩＦＮα１、ＡＦおよびＩＡにより誘発されたｍＲＮＡ濃度の間には有意の差はなかった。
【図３】体温および血清ネオプテリン濃度。ＩＦＮαを有する構築物をコードするプラスミドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。３日目に、血液を採取し、血清ネオプテリン（Ａ）濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。同時に、体温（Ｂ）を分析した。２つの独立した実験（Ｎ＝６マウス）の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮαを有する群とＡｐｏＡ１を有する対照群を比較した。＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図４】ＩＦＮα１により誘発できる遺伝子の肝臓ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ。水圧注入を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＩＦＮα１を有する構築物を発現するプラスミドを用いておこなった。３日目に、動物を殺生し、肝臓を摘出した。肝臓ｍＲＮＡを精製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、２’−５’ＯＡＳ（Ａ）、ＵＳＰ１８（Ｂ）、ＩＳＧ１５（Ｃ）およびＩＲＦ１（Ｄ）遺伝子についておこなった。２つの独立した実験（Ｎ＝６マウス）の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮαを有する群とＡｐｏＡ１を有する対照群を比較した。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５Ａ】脾細胞の数および活性化の増加。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、水圧経路によりＩＦＮαを有する種々の構築物を投与し、６日後、マウスを殺生し、脾臓を単離した。脾細胞（Ａ）の数、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）、Ｂ細胞（Ｄ）およびＮＫ細胞（Ｅ）における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を分析した。１群当たり７匹の動物を用いた代表的な実験の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮαを有する群とＡｐｏＡ１を有する対照群を比較した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５ＢＣ】図５Ａ参照。
【図５ＤＥ】図５Ａ参照。
【図６】ＩＦＮαを発現する構築物の存在下での遺伝子ワクチン接種により誘発された特異的溶解の増加。ＢＡＬＢ／ｃマウスをβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドの水圧注入により免疫化し、ＩＦＮαを有する種々の構築物を発現するプラスミドをアジュバントとして共投与した。７日後、細胞傷害性ペプチドおよび高濃度のＣＦＳＥをロードした標的細胞、並びに低濃度のＣＦＳＥを有する対照細胞を、静脈注射した。２４時間後、動物を殺生し、標的細胞と対照細胞の割合を分析して、特異的溶解の百分率を算出した。各群を代表するヒストグラム（Ａ）および１群当たり３匹の動物を用いた代表的実験の平均値および平均値の標準誤差（Ｂ）を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、Ａｐｏ−ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏの群とＩＦＮαを有する群とを比較した。＊＊ｐ＜０．００１。
【図７ＡＢ】種々の免疫系細胞集団におけるＳＲ−ＢＩの発現。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞を単離し、抗ＳＲ−ＢＩ抗体並びにＣＤ４＋Ｔ細胞（抗ＣＤ４）（Ａ）、ＣＤ８＋  リンパ球（抗ＣＤ８）（Ｂ）、ＮＫ細胞（抗ＣＤ４９ｂ）（Ｃ）、単球 ／マクロファージ（抗ＣＤ１１ｂ）（Ｄ）または樹枝状細胞（抗ＣＤ１１ｃ）（Ｅ）を区別するための抗体で標識した。
【図７ＣＤ】図７ＡＢ参照。
【図７Ｅ】図７ＡＢ参照。
【図８】抗腫瘍ワクチン接種モデルにおけるアジュバント効果の影響。各処置群について、１１〜１７匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＡｐｏＡ１（Ａｐｏ）、ＩＦＮα（ＩＦＮ）またはＩＦＮ−Ａｐｏ（ＩＡ）を発現するプラスミドを水圧注入により投与した。２４時間後、これらに、フロイントの不完全アジュバントに細胞傷害性ペプチドＡＨ１を添加したものをワクチン接種した。９日後、５ｘ１０６ＣＴ２６細胞を皮下接種し、腫瘍の発現を経時的に観察した。経時的な腫瘍のないマウスの百分率を示す。実験群を、対数順位検定により対照群と比較した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図９】循環白血球および血小板の動態。ＩＦＮαを有する構築物をコードするプラスミドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。血液を、水圧注入してから１日目に１つの群から採取し、３日目にもう１つの群から採取し、６日目に最後の群から採取した。白血球（Ａ）数および血小板（Ｂ）数を、製造業者の説明書に従ってＺ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて定量化した。２つの独立した実験（Ｎ＝４マウス／日および群）の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮ−Ａｐｏを有する群とＩＦＮを有する群とを比較した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０】ＩＦＮαにより誘発可能な遺伝子の脳ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＩＦＮαを有する構築物を発現するプラスミドを用いて、水圧注入を実施した。１日目に、動物を殺生し、脳を摘出した。脳ｍＲＮＡを、精製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＵＳＰ１８（Ａ）、ＩＳＧ１５（Ｂ）、２’−５’ＯＡＳ（Ｃ）、Ｍｘ１（Ｄ）およびＩＲＦ１（Ｄ）遺伝子についておこなった。２つの独立した実験（Ｎ＝５マウス／群）の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮ−Ａｐｏを有する群とＩＦＮを有する群とを比較した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。これは、２を表す１つの実験である。
【図１１】融合タンパク質の循環高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）への組み込み。ＩＦＮαを有する構築物をコードするプラスミドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。２４時間後、血液を採取し、得られた血清から、ＨＤＬをＮａＢｒ勾配で分画遠心分離により抽出した。種々の群のＨＤＬにおけるＩＦＮαの存在を、インターフェロンバイオアッセイ、細胞傷害性効果保護アッセイ（Ａ）により分析した。ＨＤＬのない（ＨＤＬ−）血清試料およびＨＤＬ含有分画（ＨＤＬ＋）を用いて、ウエスタンブロットをおこなって、アポリポタンパク質ＡＩ（Ｂ）の存在を測定した。
【図１２】ＩＦＮ−Ａｐｏを含有するＨＤＬの投与の血液学的影響。ＩＦＮ−Ａｐｏを含有するＨＤＬのＩＦＮの１００００ＩＵに相当する量、１００００ＩＵの組み換えＩＦＮまたはＰＢＳを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。３日後、白血球（Ａ）数および血小板（Ｂ）数を、製造業者の説明書に従ってＺ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて定量化した。２つの独立した実験（Ｎ＝４〜６マウス／日および群）の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、ＩＦＮ−Ａｐｏを有する群とＩＦＮを有する群とを比較した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【図１３】ＩＬ１２により誘発されたＩＦＮγ誘発の増加。デオキシサイクリンにより誘発可能なプロモーターの制御下でＩＬ１２を発現するプラスミド、および対照構築物またはＴＧＦβインヒビターｐ１７（Ａ）またはＴＧＦβインヒビターｐ１４４（Ｂ）を有する構築物のうちの１つを、水圧注入により投与した。４日後、ＩＦＮγの血清濃度を、ＥＬＩＳＡにより分析した。１群当たり３匹の動物を用いた代表的な実験の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、実験群と対照群とを比較した。＊＊ｐ＜０．００１。
【図１４】ＣＴ２６腫瘍の発現に対する防御。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、フロイント不完全アジュバントに細胞傷害性ペプチドＡＨ１を添加したものをワクチン接種した。７日後、ＴＧＦβインヒビターを発現する構築物または対照としてのＡｐｏＡ１を水圧注入投与した。別の７日後、５ｘ１０５ＣＴ２６細胞を皮下接種し、腫瘍の発現を経時的に観察した。経時的な腫瘍のないマウスの百分率を示す。実験群を、対数順位検定により対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５】循環高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）へのＡｐｏ−リンカー−Ｐ１４４融合タンパク質の組み込み。ＡｐｏまたはＡｐｏ−リンカー−Ｐ１４４を有する構築物をコードするプラスミドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。２４時間後、血液を採取し、得られた血清から、ＮａＢｒ勾配での分画遠心分離により、ＨＤＬを抽出した。ＨＤＬを含む画分を用いて、ウエスタンブロットをおこなって、アポリポタンパク質ＡＩの存在を測定した。
【図１６】Ａｐｏ−リンカー−Ｐ１４４を含有するＨＤＬを投与した後にＩＬ１２により誘発されるＩＦＮγ誘発の増加。デオキシサイクリンにより誘発可能なプロモーターの制御下でＩＬ１２を発現するプラスミドおよび対照構築物（Ａｐｏ）またはＡｐｏ−リンカー−Ｐ１４４を発現する別のプラスミドを、水圧注入投与した。最後の群に対して、プラスミドＩＬ１２およびＡｐｏ−リンカー−Ｐ１４４を含むＨＤＬ１４μｇ／マウス（腹腔内注射）を投与した。４日後、ＩＦＮγの血清濃度を、ＥＬＩＳＡにより分析した。１群当たり３匹の動物を用いた代表的な実験の平均値および平均値の標準誤差を示す。データをＡＮＯＶＡ、その後にダネット試験により分析し、実験群と対照群とを比較した。＊＊  ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明による複合体
本発明者等は、ＡｐｏＡタンパク質またはその機能的に同等な変異体と、治療を意図した分子とにより形成される複合体は、患者に投与後、血中半減期が、結合なしに、治療を意図した分子を投与した患者で観察されるよりも長いことを見出した。さらに、ＡｐｏＡと、治療を意図した分子との複合体が、患者の肝臓に特異的に運ばれることで、肝疾患の治療を非常に容易にしかつ他の組織における治療分子の作用による副作用が減少する。
【００２０】
したがって、第一の態様によれば、本発明は、
（ｉ）ＡｐｏＡ分子またはその機能的に同等な変異体と、
（ｉｉ）治療を意図した化合物と、
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体に関する。
【００２１】
いずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、肝組織に対する複合体の親和性は、当該組織がＡｐｏＡタンパク質に対し特異的な受容体を有し、その自然機能により表面上にＡｐｏＡ−Ｉを有するＨＤＬを捕捉することによるものであると思われる。さらに、複合体のより長い半減期は、ＡｐｏＡ分子が生体において示す長い半減期（ＡｐｏＡ−Ｉの場合において、ヒトでは３５時間程度、マウスで１０時間程度）に関係があると思われる。さらに、表面にＡｐｏＡ−Ｉに特異的な受容体を発現する他の細胞もあり、これにより他の組織に運ばれる。
【００２２】
１．１ＡｐｏＡ分子
本発明に関連して、「ＡｐｏＡタンパク質」は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の一部分を形成するＡｐｏＡファミリーに属し、特異的に肝細胞の表面で受容体と相互作用することができ、したがって、前記ＡｐｏＡタンパク質に結合した意図する分子をこの器官に運ぶ能力が確保できるもの、と理解される。本発明において使用できるＡｐｏＡ分子は、好ましくはＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＡ−Ｖまたは機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選択される。
【００２３】
好ましい実施態様によれば、本発明において用いられるＡｐｏＡタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である。本発明に関連して、ＡｐｏＡ−Ｉは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の一部分を形成するｐｒｅ−ｐｒｏＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の成熟形態として理解される。ＡｐｏＡ−Ｉは、除去されて前駆体を生じる分泌シグナル配列を含む前駆体（ｐｒｅ−ｐｒｏＡｐｏＡ−Ｉ）として合成される。シグナル配列は１８アミノ酸からなり、プロペプチドは６アミノ酸、およびタンパク質の成熟形態は２４３アミノ酸からなる。シグナルペプチドを欠きかつプロセッシングされたタンパク質の成熟形態が好ましくは使用される。好ましい実施態様によれば、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ヒト由来であり、そのアミノ酸配列は、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセス番号Ｐ０２６４７）を示すものである。別の好ましい実施態様によれば、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ネズミ由来、特にマウス由来であり、そのアミノ酸配列は、配列番号２（ＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセス番号Ｑ００６２３）を示すものである。別の好ましい実施態様によれば、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ネズミ由来、特にラット由来であり、そのアミノ酸配列は、配列番号３（ＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセス番号Ｐ０４６３９）を示すものである。
【００２４】
ＡｐｏＡ−Ｉの機能的に同等な変異体は、上記したヒトまたはネズミＡｐｏＡ−Ｉ配列の１つ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失から生じするものであり、肝細胞に存在するＨＤＬ受容体を形成するいわゆる「スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ」（ＳＲ−ＢＩ）と相互作用する能力は実質的にそのまま失われていない、全てのポリペプチドと理解される。ＨＤＬ受容体と相互作用する能力は、実質的にＭｏｎａｃｏ等（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８７、６：３２５３−３２６０）に記載のようにして、肝細胞膜へのＡｐｏＡ−Ｉ結合を検討することによるか、またはＡｐｏＡ−Ｉまたはその変異体が肝細胞膜受容体へのＨＤＬの結合を阻害する能力を測定することにより求める。肝細胞膜へのＡｐｏＡ−Ｉの変異体の結合の解離定数は、好ましくは少なくとも１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍまたは１０−４Ｍである。
【００２５】
本発明におけるＡｐｏＡ−Ｉの変異体には、ＡｐｏＡ−Ｉポリペプチドとの類似性または同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％または９５％を示すポリペプチドなどがある。２つのポリペプチド間の同一度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を用いて測定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、Ｊ．、１９９０、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて測定される。
【００２６】
本発明に関連して使用されるＡｐｏＡ−Ｉの変異体は、好ましくは野生型ＡｐｏＡ−Ｉに関して長い血中半減期を有しており、ＡｐｏＡ−Ｉで観察されるよりも大きな血清ＡｐｏＡ−Ｉ濃度に到達できる。タンパク質の血中半減期、特にＡｐｏＡ−Ｉの半減期を測定する方法は、当該技術分野において公知であり、とりわけＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．等（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、１９７３、１４：４４６−４５８）、Ｂｌｕｍ等（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９７７、  ６０：７９５−８０７）およびＧｒａｖｅｒｓｅｎ等（Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、５１：１７０−１７７）により記載されている標識タンパク質を用いた代謝標識に基づく方法を用いることなどがある。より長い半減期を示す前記変異体の一例として、例えば、Ｍｉｌａｎｏ（突然変異体Ｒ１７３Ｃを含有する）と称される変異体が挙げられる。
【００２７】
１．２  治療を意図した化合物
本発明に関連して、「治療を意図した化合物」は、疾患の症状を予防または取り除くことのできる化合物と理解される。本発明にあっては、まず、その生物学的活性を実質的に失うことなく、共有結合改変を受け入れ、その結果ＡｐｏＡ−Ｉまたは機能的に同等なその変異体に結合できる、いずれの治療化合物の使用をも意図している。したがって、本発明は、治療に有効な成分として、小有機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、オリゴ糖、核酸等を使用することを意図している。
【００２８】
例えば、ＡｐｏＡ−Ｉまたは機能的に同等なその変異体に結合できる化合物には、抗生物質、コリンエステラーゼ剤、アトロピン、スコポラミン、交感神経作動薬、催眠剤、鎮静剤、抗てんかん薬、オピオイド、鎮痛薬、抗炎症薬、ヒスタミン、脂質誘導体、気管支喘息治療薬、解熱鎮痛薬、キサンチン、浸透圧性利尿薬、水銀化合物、チアジド系化合物およびスルホンアミド、炭酸脱水酵素阻害薬、有機硝酸エステル、高血圧治療薬、強心配糖体、抗不整脈薬、オキシトシン、プロスタグランジン、アルカロイド、子宮収縮抑制、抗蠕虫薬、抗原虫薬、抗マラリア剤、抗アメーバ薬、スルホンアミド、ペニシリン、トリメトロピン、セファロスポリン、スルファメトキサゾール、抗真菌剤、キノロン、抗ウイルス剤、抗生物質、アミノグリコシド、テトラサイクリン類、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、アルキル化剤、副腎皮質ホルモン、代謝拮抗薬、抗生物質、放射性同位元素、アザサイオプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メトトレキサート、抗凝固剤、血栓溶解剤、血小板凝集阻害剤、下垂体前葉ホルモン、甲状腺ホルモンおよび抗甲状腺ホルモン、エストロゲン薬およびプロゲステロン、男性ホルモン剤、アドレノコルチコトロピン、インスリン、副甲状腺ホルモン、ビタミンＤのステロイド誘導体、ビタミン類、（水溶性ビタミン類、例えば、ビタミンＢ複合体およびアスコルビン酸または脂溶性ビタミン、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫまたはビタミンＥ）、抗ヒスタミン薬、抗腫瘍化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物などがある。肝臓に影響しているか、または肝臓に原因がある疾患の治療に有用な化合物が好ましく使用される。
【００２９】
好ましい実施態様によれば、本発明の複合体の成分（ｉｉ）は、ポリペプチド鎖を含んでなる。好ましい実施態様によれば、ポリペプチＡｐｏＡ−Ｉと、成分（ｉｉ）
を構成しているポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドを形成する。本発明は、二つのポリペプチドの二つの相対配向を意図している。したがって、好ましい実施態様によれば、成分（ｉ）のＣ末端は、成分（ｉｉ）のＮ末端に結合している。別の好ましい実施態様によれば、成分（ｉ）のＮ末端は、成分（ｉｉ）のＣ末端に結合している。好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉ複合体が一本鎖ポリペプチドにより形成されるとき、以下のものは形成されない：
（ｉ）ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質のＮ末端に対して、Ｃ末端を介して連結されているＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ａタンパク質。
（ｉｉ）血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ−１）のＮ末端に対して、Ｃ末端を介して連結されているＡｐｏＡ−Ｉタンパク質。
（ｉｉｉ）成分（ｉｉ）は、プラズミノゲン断片の免疫グロブリン重鎖であるか、またはプラズミノゲン断片である。
（ｉＶ）ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質のＮ末端に対して、Ｃ末端を介して連結されているテトラネクチン三量化ドメイン（ＴＴＳＥ）。
【００３０】
本発明による複合体を用いて肝臓に運ばれるポリペプチドには、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、レプチン、アドレノコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、体細胞親和性ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラトニン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン阻害ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、アドレノコルチコトロピンホルモン（ＡＣＴＨ）、体細胞親和性ホルモンまたは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨまたは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨまたはバソプレッシン）、メラトニン、ミュラー阻害因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、Ａｒｇ−バソプレッシン、甲状腺ホルモン、アゾキシメタン、トリヨードチロニン、ＬＩＦ、アンフィレグリン、可溶性トロンボモジュリン、ＳＣＦ、骨形成タンパク質１、ＢＭＰＦ、ＭＧＳＡ、ヘレグリン、メラノトロピン、セクレチン、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房ナトリウム利尿性ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、神経ペプチドＹ、レニン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、第VIII因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン２４（ＩＬ−２４）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンアルファ、ベータ、ガンマ、ＣＤ３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−Ｉ、ＬＦＡ−３、ケモカイン、例えば、ＲＡＮＴＥＳ１α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｗｉｌｍｓの腫瘍抑制遺伝子によりコードされているＷＴ１タンパク質、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、変異成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、骨形成たん白質（ＢＭＰ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦおよびＫＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦおよび関連因子）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子、内皮成長因子、グリア細胞株由来、神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アルファ１−アンチトリプシン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、カーディオトロフィン−１（ＣＴ−１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、セルピン（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｈ１、Ｉ１およびＩ２）、サイクロスポリン、フィブリノゲン、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、イムノグロビン、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ガルフルファーゼ、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１プロテアーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、アデノシンデアミナーゼ、免疫グロブリン、アルブミン、ボツリヌストキシンタイプＡおよびＢ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、細胞形質転換因子ベータ（ＴＧＦ−β）阻害ペプチド、ＩＬ１０インヒビター、ＦｏｘＰ３インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、ＶＥＧＦインヒビター、ＰＤ−１インヒビターおよびＣＤ１５２インヒビターなどがある。
【００３１】
好ましい実施態様によれば、本発明による複合体の成分（ｉｉ）は、インターフェロン（ＩＦＮ）である。インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロンおよびＩＩＩ型インターフェロンとして分類される。Ｉ型インターフェロンは、最初は生体内細胞株のウイルス感染に対する阻害活性の結果として見出され（Ｐｅｓｔｋａ、Ｓ．、Ｋｒａｕｓｅ、Ｃ．Ｄ．およびＷａｌｔｅｒ、Ｍ．Ｒ．２００４．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０２：８−３２）、いわゆるＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）に結合することにより特徴づけられる、サイトカイン活性を有するポリペプチドファミリーである。それらの配列の相同性に応じて、Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）およびインターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）として分類される。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、ほとんどの有核細胞の表面で発現する単一の二量体受容体を共有する。これらのサイトカインの機能は、感染細胞のアポトーシスおよびウイルス複製阻害による死を促進する機構を開始すると同時に、抗原提示を促進することを考えると、複数種類のウイルス感染に対する免疫応答において極めて重要である。また、サイトカインは、直接にＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞、ならびに免疫反応における樹枝状細胞の活性を活性化することによりその機能を果たすという最近の実験報告がある（Ｌｅ  Ｂｏｎ  Ａ．等、２００３．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１００９−１０１５；Ｌｅ  Ｂｏｎ  Ａ．等、２００６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：４６８２−４６８９；Ｌｅ  Ｂｏｎ  Ａ．等、２００６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：２０７４−８）。ＩＩ型インターフェロンは、インターフェロンガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）に結合され、単一のメンバーとしてＩＦＮ−γを含むことを特徴としている。ＩＩＩ型インターフェロンは、それらのシグナルを、ＩＬ−１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）およびＩＦＮラムダ１受容体（ＩＦＮＬＲ１）によって形成される複合体を介して導入し、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２およびＩＦＮ−λ３と称される３種のインターフェロンラムダによって形成される。
【００３２】
好ましい実施態様によれば、成分（ｉｉ）は、Ｉ型インターフェロン、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−τおよびＩＦＮ−ωである。特定の実施態様によれば、本発明の組成物に含まれる少なくとも１つのＩ型インターフェロンは、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）を含む群から選択される。Ｉ型インターフェロンがＩＦＮ−αであるとき、後者は、ヒトＩＦＮ−α遺伝子のファミリーのいずれかの遺伝子メンバーによりコードされているいずれかのインターフェロンに対応することができる。特定の実施態様によれば、少なくとも１つのＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α８およびそれらの組み合わせ（医薬製剤における他の物質との組み合わせを含む）からなる群から選択されるＩＦＮ−αである。さらに特定の実施態様によれば、インターフェロンは、ＩＦＮ−α１であり、好ましくはヒト起源のものである。好ましい実施態様によれば、インターフェロンは、ＩＦＮ−α５である。
【００３３】
Ｉ型インターフェロンのリスト、特に本発明において使用することができるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βのリストが、Ｂｅｋｉｓｚ等（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、  ２００４；２２：２４３−２５１）およびＰｅｔｓｋａ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００４；２０２：８−３２）に記載されている。さらに、本発明によれば、複数種のインターフェロン、例えば、ＩＦＮ−αｎ１（リンパ芽球腫誘導体）またはＩＦＮ−α３（Ｓｅｎｄａｉウイルス（または別のウイルス）またはウイルス粒子で刺激されたヒト白血球により産生されたインターフェロンの組み合わせ）の組み合わせの使用が提供される。
【００３４】
使用されるＩ型インターフェロンの起源は、本発明において重要な点ではない。これは、天然起源であって生物学的液体または組織から抽出され、精製することもでき、また従来の組み換え遺伝子工学および方法、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、  Ｄ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌ編、２００１、第３版、ニューヨークにあるＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）に記載されているようにして産生してもよく、または当該技術分野において記載されている合成プロセスまたはいずれかの他の通常の方法により製造することもできる。
【００３５】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の組成物に含まれている少なくとも１つのＩ型インターフェロンは、ペグインターフェロンの形態である。ペグインターフェロンを調整するいくつかの例が、ＵＳ５７６２９２３およびＵＳ５７６６５８２に記載されている。さらに、すでに市販されているインターフェロン形態（ペグインターフェロンまたは非ペグインターフェロン）のものを使用することもできる。これらには、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（ヒト組み換えＩＦＮ−α２ａ）およびＰＥＧＡＳＹＳ（ペグＩＦＮ−α）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社製ＩＮＴＲＯＮ−Ａ（ヒト組み換えＩＦＮ−α２ｂ）およびＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ヘグＩＦＮ−α２ｂ）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＡＬＦＥＲＯＮ−Ｎ（ＩＦＮ−α３ｎ、天然のインターフェロンの組み合わせ）、またはＩｎｔｅｒＭｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製ＩＦＮＥＲＧＥＮ（ＩＦＮ−αｃｏｎ１）（この配列はコンセンサス配列であり、天然の配列とは正確には対応しない）などがあるが、これらには限定されない。ＩＦＮ−β製剤、例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製ＡＶＯＮＥＸ（ＩＦＮ−β１ａ）、ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ社製ＲＥＢＩＦ（ＩＦＮ−β１ａ）およびＢａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（ＩＦＮ−β１ｂ）も含まれる。
【００３６】
好ましい実施態様によれば、本発明による複合体は、Ｃ末端を介して融合したＡｐｏＡ１により、およびインターフェロンα１分子のＮ末端を有する可撓性リンカーにより形成される。別の好ましい実施態様によれば、本発明の複合体は、Ｃ末端を介して融合されたインターフェロンα１分子により、およびＡｐｏＡ１分子のＮ末端を有する可撓性リンカーにより形成される。
【００３７】
別の好ましい実施態様によれば、成分（ｉｉ）は、ＴＧＦ−ベータインヒビターである。本発明による複合体の一部分を形成することができるＴＧＦ−ベータインヒビターには、ＴＧＦ−β１における受容体結合部位に結合し、したがって、受容体への結合をブロックするＴＧＦ−ベータ１受容体配列から選択されるペプチドインヒビターなどがある。これらの種類のペプチドは、ＷＯ２０００３１１３５に記載されており、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。好ましい実施態様によれば、ＴＧＦ−β１阻害ペプチドを、ＴＧＦ−β１ＩＩＩ型受容体から得る。さらに好ましい実施態様によれば、阻害ペプチドは、配列ＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮ（配列番号４）を有するペプチドｐ１４４である。
【００３８】
同様に、本発明によれば、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ１受容体との間の相互作用を阻害する阻害ペプチドの使用が提供される。ここで、シグナル伝達は、前記相互作用に対する反応で生じ、ＷＯ２００５１９２４４に記載されているファージ表示遺伝子ライブラリーとして同定される。引用することによりＷＯ２００５１９２４４の全体が本明細書の一部とされる。好ましい実施態様によれば、阻害ペプチドは、配列ＫＲＩＷＦＩＰＲＳＳＷＹＥＲＡ（配列番号５）、ならびにそのトランケート変異体として特徴付けられ、ＷＯ２００７０４８８５７（引用することによりその全体が本明細書の一部とされる）に記載されているように、ＴＧＦβ１とその受容体との間の相互作用を阻害する能力を実質的に保存する、ペプチドｐ１７である。
【００３９】
１．３  成分ＡｐｏＡと治療的に活性な化合物との間のリンカー要素
ＡｐｏＡタンパク質と、ペプチドの性質を有する第２成分を含んでなる本発明の目的とする複合体は、ＡｐｏＡタンパク質と前記第２成分を直接接続する結合を含んでいてもよく、またはＡｐｏＡタンパク質とペプチドの性質を有する前記第２成分との間に、リンカーとしての役割を果たす追加のアミノ酸配列を含むことができる。本発明によれば、前記非天然中間体アミノ酸配列は、ドメイン間のヒンジ領域としての役割を果たし、個々のドメインの立体形状を維持しながら、互いに独立して可動である。この意味において、本発明による好ましい非天然中間体アミノ酸配列は、この可動を可能にする構造的延性により特徴づけられるヒンジ領域である。特定の実施態様によれば、前記非天然中間体アミノ酸配列は、非天然可撓性リンカーである。好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、長さが２０アミノ酸以下である可撓性リンカーペプチドである。より好ましい実施態様によれば、リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記可撓性リンカーは、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列として、例えば、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号６）、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号７）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号８）などを挙げることができる。これらの配列は、他のタンパク質ドメインに対して設計されたコイル状らせんを結合するのに使用されてきた（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｋ．Ｍ．、Ａｒｎｄｔ、Ｋ．Ｍ．およびＡｌｂｅｒ、Ｔ．、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０００、３２８：２６１−２８１）。前記リンカーは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号９）を含んでなるか、またはアミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号９）からなる。
【００４０】
リンカー領域の効果により、ＡｐｏＡタンパク質および成分（ｉｉ）との間に空間が形成される。したがって、ＡｐｏＡの二次構造は、成分（ｉｉ）の存在により影響されることはなく、そして成分（ｉｉ）はＡｐｏＡの二次構造によって影響されることはない。好ましくは、スペーサーは、ペプチドの性質を有している。好ましくは、リンカーペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含んでなる。
【００４１】
リンカーは、二重結合により本発明の複合体の２つの成分の側に伸びた成分に結合でき、好ましくは、スペーサーは実質的に非免疫原性でありおよび／またはシステイン残基を含んでいない。同じようにして、スペーサーの立体構造は、好ましくは直鎖または実質的に直鎖である。
【００４２】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましいものとして、例えば、結合タンパク質の機能を実質的に劣化させることなく、または結合タンパク質のうちの１つの機能を少なくとも実質的に劣化させることなく、タンパク質を結合するのに使用されているものなどである。より好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、コイル状らせんを有する構造を含んでなるタンパク質を結合するために使用されている。
【００４３】
リンカーは、テトラネクチンの残基５３〜５６（テトラネクチンにおいてβシートを形成している）および残基５７〜５９（テトラネクチンにおいてねじれを形成している）（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｂ．Ｂ．等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２：３８８−３９６、１９９７）。セグメントの配列は、ＧＴＫＶＨＭＫ（配列番号１０）である。このリンカーは、野生型テトラネクチンに存在するとき、三量化領域をＣＲＤドメインと結合させるので、一般的に三量化領域を別のドメインに接続するのに好適であるという利点がある。さらに、得られた構築物は、リンカーなしの構築物よりもより免疫原性であることはない。
【００４４】
あるいは、ヒトフィブロネクチンからの接続ストランド３からのサブ配列を、アミノ酸１９９２〜２１０２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴナンバリング、エントリーＰ０２７５１）に対応するリンカーとして選択することができる。アミノ酸番号２０３７〜２０４９に対応するサブ配列ＰＧＴＳＧＱＱＰＳＶＧＱＱ（配列番号１１）が好ましくは使用され、そのサブ配列断片内で、アミノ酸２０３８〜２０４２に対応するＧＴＳＧＱ（配列番号５２）がより好ましい。この構築物は、容易にタンパク質分解的切断される傾向になく、そしてフィブロネクチンが血漿中に高濃度で存在するので、それほど免疫原性ではない。
【００４５】
別法として、好適なペプチドリンカーは、ネズミＩｇＧ３の上ヒンジ領域の１０アミノ酸残基配列に基づくものであることができる。このペプチド（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号１２）は、コイル状らせん（Ｐａｃｋ  Ｐ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ａ．、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１５７９−１５８４）により二量化した抗体を産生するのに使用されており、本発明によるスペーサーペプチドとして有用であることができる。ヒトＩｇＧ３の上ヒンジ領域の対応配列は、さらに好ましいことがある。ヒトＩｇＧ３配列は、ヒトにおいて免疫原性であるとは思われない。
【００４６】
好ましい実施態様によれば、リンカーペプチドを、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号１３）のペプチドおよび配列ＧＡＰのペプチドからなる群から選択する。
【００４７】
あるいは、本発明の複合体の２つの成分は、ペプチドにより接続できる。このペプチドの配列はプロテアーゼの開裂標的を含んでいるので、成分（ｉｉ）からＡｐｏＡ１を分離することができる。本発明のポリペプチドに組み込むのに好適なプロテアーゼ開裂部位は、エンテロキナーゼ（開裂部位ＤＤＤＤＫ、配列番号１４）、第Ｘａ因子（開裂部位ＩＥＤＧＲ、配列番号１５）、トロンビン（開裂部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号１６）、ＴＥＶプロテアーゼ（開裂部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号１７）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（開裂部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号１８）、インテインなどである。好ましい実施態様によれば、複合体が肝臓に到達したら、ＡｐｏＡおよび成分（ｉｉ）の分離が生じるように、開裂部位は、腫瘍組織、炎症組織または肝臓において発現されるプロテアーゼ開裂部位である。好ましい実施態様によれば、リンカーは、マトリックス金属プロテアーゼ−９認識部位（開裂部位ＬＦＰＴＳ、配列番号１９）を含む。
【００４８】
２．本発明の複合体を得る方法
本発明による複合体は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて得ることができる。すなわち、ＡｐｏＡタンパク質または前記タンパク質の変異体は任意の標準法により得ることが可能である。例えば、ＡｐｏＡ―Iタンパク質は個人のまたは実験動物の血清サンプルから精製することができる(ＷＯ９８０７７５１、ＷＯ９８１１１４０、Ｊａｃｋｓｏｎ等．、１９７６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４２０：３４２−３４９、Ｂｏｒｒｅｓｅｎ、Ａ．Ｌ．およびＫｉｎｄｔ、Ｔ．Ｊ．、１９７８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．５：５−１２およびＦｏｒｇｅｚ、Ｐ．およびＣｈａｐｍａｎ、Ｍ．Ｊ．、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、６：２８３−９６)．一方、ＡｐｏＡ―Iタンパク質はｃＤＮＡから、例えば大腸菌、出芽酵母、メタノール資化酵母、昆虫細胞などの異種生体中の表現型の発現を利用し、ＷＯ０７０２３４７６、ＷＯ９５２５７８６、ＷＯ８７０２０６２、Ｆｅｎｇ等、（Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｘｐｒ.  Ｐｕｒｉｆ．、２００６，４６：３３７−４２），Ｐｙｌｅ等、１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５：１２０４６−５２、Ｂｒｉｓｓｅｔｔｅ等．、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １９９１、２：２９６−３０３）およびＢｏｎｅｎ、Ｄ．Ｋ．（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９７，２７２：５６５９−６７）に記載されているような従来技術に公知の方法を用いて得ることができる。
【００４９】
十分な量の精製ＡｐｏＡタンパク質があれば、それを目標の治療用化合物に複合できる。治療的に有効な成分(ii)のＡｐｏ  Ａ分子への複合は様々な方法によっておこなうことができる。１つの可能性としては、官能基の治療的に有効な成分への前記成分の活性を阻害しない位置における直接複合がある。本発明において理解されるように、官能基とは分子中の特定の原子の基を指し、それは前記分子の特徴的な化学反応の要因となるものである。官能基の例としては、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、カルボキサミド、１級、２級、３級、および４級アミン、アミノキシ、アジド、アゾ（ジイミド）、ベンジル、カーボネート、エステル、エーテル、グリオキシリル、ハロアルキル、ハロホルミル、イミン、イミド、ケトン、マレイミド、イソシアニド、イソシアネート、カルボニル、ニトレート、ニトライト、ニトロ、ニトロソ、ペルオキシド、フェニル、ホスフィン、ホスフェート、ホスホノ、ピリジル、スルフィド、スルホニル、スルフィニル、チオエステル、チオール、および酸化３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられるが、これらに限定されない。前記基の例としては、Ａｐｏ  Ａ分子中のチオール基と特定的に反応するマレイミドまたはグリオキシリル基、およびＡｐｏ  Ａ分子中の1級アミン基と反応する酸化３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられる。
【００５０】
もう１つの可能性としては、治療的に有効な成分(ii)をＡｐｏＡ分子にホモ-またはヘテロ-２官能性基を用いて複合することである。２官能性基は最初治療的に有効な化合物に、そしてＡｐｏＡタンパク質に複合できるか、あるいは２官能性基をＡｐｏ  Ａタンパク質に複合し、そしてそれを治療的に有効な化合物に複合することが可能である。これらの複合体の種類の説明に役立つ実例としては、複合体の第１成分が、複合体の第２成分中のアミノ基に順に結合するヘテロ二官能性基中のケトン基に結合するアミノキシ基を含むケトン−オキシム（ＵＳ２００５０２５５０４２に記載）として知られる複合体が挙げられる。
【００５１】
他の実施態様においては、本発明による複合体の成分(i)および(ii)を複合するのに用いる薬剤は、光分解により、化学的に、熱的に、あるいは酵素により加工することができる。細胞標的中の酵素により加水分解可能な連結剤を用いることは特に興味深いので、治療的に有効な化合物は細胞の内側にのみ放出される。細胞内加工ができる連結剤の種類の例はＷＯ０４０５４６２２、ＷＯ０６１０７６１７、ＷＯ０７０４６８９３、およびＷＯ０７１１２１９３に記載されている。
【００５２】
好ましい実施態様において、本発明の複合体の成分(ii)は、オリゴペプチドおよびペプチドの両方を含むペプチドの性質を有する化合物である。ポリペプチド鎖を化学的に変性する方法は当業者に広く知られており、その例としては、システイン部位に存在するチオール基を介する複合に基づく方法、リシン部位に存在する１級アミノ基を介する複合に基づく方法(ＵＳ６８０９１８６)、およびＮ−およびＣ−末端部位を介する複合に基づく方法が挙げられる。ポリペプチドを変性して他の化合物に連結させるのに適した試薬の例としては、グルタルアルデヒド（化合物をポリペプチドのＮ末端に結合させる）、カルボジイミド（化合物をポリペプチドのＣ末端に結合させる）、Ｎ末端およびシステイン部位を活性化させるサクシンイミドエステル（例えば、ＭＢＳ、ＳＭＣＣ）、チロシン部位を活性化させるベンジジン（ＢＤＢ）、およびグリコシル化されたタンパク質の炭水化物部位を活性化させる過ヨウ素酸塩が挙げられる。
【００５３】
成分ＡｐｏＡおよび対象の治療用化合物が単純ペプチド鎖を形成する特殊な場合においては、複合体を単一の工程で前記複合体をコード化する本発明の遺伝子構築物を用いて発現させることが可能であり、そのために前記構築物は、転写成分および場合により翻訳調節成分と共に異種生体中の複合体の発現に適したベクター中に導入される。本発明の発現カセット中に存在する転写成分および場合により翻訳調節成分はプロモーターを含み、このプロモーターは、それらが動作可能に連結するヌクレオチドの配列および、例えば開始シグナルおよび停止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、転写促進剤、転写阻害剤などの、転写およびその時と場所について適合する制御に対して必要なまたは適合するその他の配列を管理するものである。前記成分は、本発明による発現カセットおよび組換えベクターを構築するのに用いられるベクターと同様に、一般的に、用いられる宿主細胞に従って選択される。
【００５４】
３．本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、および宿主細胞
もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチドは、その中で成分(ii)がペプチドの性質を有し、その中でポリペプチドＡｐｏＡが（相対的な配向性に拘らずおよび両成分が直接接続されまたはスペーサ領域により分離されるという事実に拘らず）単一ペプチド鎖を形成する複合体だけをコードするものである。
【００５５】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子構築物に関する。構築物は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する配列の操作制御下にある本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。当業者に理解されるように、本発明によるポリヌクレオチドは、標的組織の核に接触し、そこで転写および翻訳され生物学的に活性な融合タンパク質を生成しなければならない。この理由から、投与される有効成分がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは好ましくは前躯体プレ−プロＡｐｏＡＩまたはＡｐｏＡＩ変異体の前躯体をコード化せねばならず、すなわち、前躯体の発現の後、前躯体はシグナル配列の結果として分泌され、プロセッシングされて成熟ＡｐｏＡＩを生成する。
【００５６】
インターフェロン分子とＣ−末端を介して融合されるＡｐｏＡにより形成される複合体が発現される場合において、複合体をコード化するポリヌクレオチドにとって、ＡｐｏＡＩシグナル配列をコード化する配列が先行することは好ましいことである。ＡｐｏＡ分子のＮ−末端と共にそれのＣ−末端を介して融合されるインターフェロン分子により形成される複合体が発現される事象において、複合体をコード化するポリヌクレオチドにとって、インターフェロンα1シグナル配列をコード化する配列が先行することは好ましいことである。
【００５７】
原則的にいかなるプロモーターも、当該プロモーターが、ポリヌクレオチドが発現すべき細胞と適合性がある限り、本発明の遺伝子構築物に用いることができる。よって、本発明の実施に適合するプロモーターとしては次のものが挙げられるが、必ずしもこれらのものに限定されるものではない。すなわち、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、およびＢ型肝炎ウイルスなどの真核ウイルスのゲノムの誘導体などの構成的プロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、レトロウイルス長末端反復領域、免疫グロブリン遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子のプロモーター並びにテトラサイクリン系、ＮＦκＢ／ＵＶ光系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系、および熱ショック遺伝子のプロモーターなどのタンパク質の発現が分子または外因性シグナルの添加に依存する誘導性プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載されたＲＮＡポリメラーゼＩＩの調節可能なプロモーター並びに組織特異的なプロモーター。好ましい実施態様において、本発明の遺伝子構築物は、ヒト血清アルブミン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、アルファ−1−ミクログロブリン遺伝子、またはアルドラーゼ遺伝子などの主に肝の発現遺伝子のプロモーター領域に存在する発現向上領域を含み、それらは数種類のコピーの態様中の単一コピーの態様であるか、単離された態様であるか、あるいはサイトメガロウイルスプロモーター、アルファ-1-アンチトリプシンプロモーター、またはアルブミンプロモーターなどの他の肝特異的発現要素との組み合わせの態様であるか、である。
【００５８】
組織特異的なプロモーターのその他の例としては、アルブミン遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ等．、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスの核プロモーター（Ｓａｎｄｉｇ等、１９９６、  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、  ３：１００２−９）：、アルファ-フェトタンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ等．、１９９６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４）、およびチロキシンに結合したグロブリン-結合タンパク質のプロモーター（Ｗａｎｇ  L.、等．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５６３−１１５６６）が挙げられる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドまたはそれらを形成する遺伝子構築物はベクターの一部分を形成できる。かくして、もう1つの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクターに関する。当業者に理解されるように、用いることのできるベクターの種類に制限はなく、それは前記ベクターが、増殖に適したおよびポリヌクレオチドまたは適合する遺伝子構築物を得るのに適したクローン化ベクターまたは複合体を精製するのに適した種々の異種生体中の発現ベクターであり得るからである。従って、本発明による適合するベクターには次のベクターが含まれる。すなわち、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプトおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥＩ、ｐＣＲＩ、およびＲＰ４などの原核生物中の発現ベクター、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのファージおよびシャトルベクター、２ミクロンプラスミド、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、動原体性プラスミドなどの種類のベクターなどの酵母菌中の発現ベクター、ｐＡＣシリーズベクターおよびｐＶＬシリーズベクターなどの昆虫細胞中の発現ベクター、ｐIＢI、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ, ｐＡＶＡ, ｐＣＡＭＢＩＡ、 ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズベクターなどの植物中の発現のベクターなどの植物中の発現ベクター、およびウイルスベクターに基づく上位の真核細胞中の発現ベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連のウイルス、並びにレトロウイルスおよびレンチウイルス）、並びにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４、１−ＣＭＶ(アンビオン)、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ  ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｒＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸＩ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣI、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、およびｐＴＤＴ１などの非ウイルスベクター。
【００６０】
本発明のベクターは、ベクターによって形質転換され、形質移入され、感染され得る細胞を形質転換させ、形質移入し、感染させるために用いることができる。該細胞は原核性であっても真核性であってもよい。一例として、該ＤＮＡ配列が導入されるベクターは、プラスミドであり得るかまたはそれが宿主細胞に導入される場合に該細胞のゲノム中に統合され、それが統合されたクロモゾーム（或いは複数のクロモゾーム）と共に複製するベクターでもよい。ベクターは、当業者には公知の従来の方法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｋ等、（２００１年）上述の通り）。
【００６１】
したがって、もう１つの態様において、本発明はポリヌクレオチド、遺伝子構築物、または本発明のベクターを含んでなる細胞に関し、そのために該細胞は本発明により提供される構築物またはベクターにより形質転換され、形質移入され、または感染されることが可能であってきた。形質転換され、形質移入され、または感染された細胞は当業者に公知の従来法によって得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｋ等、（２００１年）上述の通り）。特定の実施態様において、該宿主細胞は適したベクターで形質移入されたまたは感染された動物細胞である。
【００６２】
本発明による複合体の発現に適した宿主細胞の例としては、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞の例としては、バチルス属、ストレプトミセス属、およびブドウ球菌属の種などのグラム陽性細菌細胞、およびエシェリキア属およびプソイドモナス属の細胞などのグラム陰性細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞の好ましい例としては、サッカロミセス属、ピキアパストリス属、およびハンゼヌラポリモルファ属などの酵母菌の細胞が挙げられる。昆虫細胞の例としては、ショウジョウバエ属細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。その他の細胞の中で、植物細胞の例としては、穀物用植物、医療用植物、観賞用植物、または球根植物などの作物植物の細胞が挙げられる。本発明における適した哺乳類細胞の例としては、上皮細胞系（ブタなど）、骨肉腫細胞系（ヒトなど）、神経芽細胞腫細胞系（ヒトなど）、上皮癌細胞系（ヒトなど）、グリア細胞（ネズミなど）、肝細胞系（サルなど）、ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ細胞系のＤ３細胞、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１などのヒトＥＳ細胞、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７およびｈＭＳＣ細胞が挙げられる。
【００６３】
もう１つの態様において、本発明は、本発明による複合体を含んでなるナノリポ粒子に関する。
【００６４】
本発明に用いられているように、用語「ナノリポ粒子」は用語「リポタンパク質」または「リポタンパク粒子」と同等であり、これらは相互変換可能に用いることができる。本明細書において「ナノリポ粒子」は、アポリポタンパク質、リン脂質、および遊離コレステロールにより形成される外部極性被覆により被覆された無極性脂質（エステル化コレステロールおよびトリグリセリドなど）の核により形成される水溶性の粒子を表すものと解釈される。
【００６５】
ナノリポ粒子またはリポタンパク質はその比重に従い、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）に分類される。種々のリポタンパク質の特徴を第１表に示す。
【００６６】
【表１】
2015038124.tif 000003
【００６７】
特定の態様において、本発明によるナノリポ粒子はその組成が表１に示されるＨＤＬであり、タンパク質分画はＡｐｏＡ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＤ、およびＡｐｏＥにより形成される。
【００６８】
本発明のナノ粒子は当業者に公知の方法を用いて得られる。その１例として、ナノリポ粒子は試験管内ではＬｅｒｃｈ等（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、１９９６、７１：１５５−１６４）に記載のあるようにコレステロールおよびホスファチジルコリンを本発明の複合体に添加することにより得られ、生体内では本発明の複合体を肝臓内に発現する遺伝子導入非ヒト動物に用いることにより得られ、この場合複合体は、ナノ粒子がそこから単離され得るナノ粒子の血清中に分泌される。
【００６９】
４．本発明による複合体の医療的使用
本発明による複合体は、治療対象の化合物を肝臓まで運び、またそれを安定化させるのに有用である。それゆえ、もう１つの態様において、本発明は、複合体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、または宿主細胞、または本発明によるナノリポ粒子の治療的に有効な量、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含んでなる医薬製剤に関する。
【００７０】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明のナノリポ粒子、または医薬品に使用するための医薬品組成物に関する。
【００７１】
医薬品として使用するために、本発明による複合体はプロドラッグ、塩、溶媒和物、または包接化合物の形態であってよく、これらの単独の形態であってもよく、また追加の活性剤との組み合わせの形態でもよい。本発明による化合物の組み合わせは、薬学的観点から許容し得る賦形剤と共に配合することができる。本発明における使用に対して好ましい賦形剤の例としては、糖類、澱粉、セルロース、ガム類、およびタンパク質が挙げられる。特定の実施態様において、本発明の医薬品組成物は固形医薬品剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、被覆錠剤、顆粒剤、坐剤、液状剤に再構成可能な結晶性または非晶性無菌固形剤、など）、液状医薬品財形（例えば、溶液、懸濁液、乳剤、エリキシル剤、ローション、軟膏、など）、または半固形医薬品剤形（ジェル、軟膏、クリーム、など）に配合される。本発明の医薬品組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸内経路を含むがこれらに限定されない如何なる経路によっても投与することができる。有効成分の投与の種々の形態の、用いられる賦形剤の、およびそれらを製造する方法の、審査は、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ、  Ｃ．  Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、  Ｌｕｚａｎ  ５、  Ｓ．Ａ．  ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、  １９９３およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、  Ｅｄ．）、２０th  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ、ＵＳＡ（２０００）に見出すことができる。薬学的に許容できるビヒクルの例としては従来技術に公知のものであり、リン酸塩緩衝の食塩水溶液、水、油／水乳剤などの乳剤、種々の種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。該ビヒクルを含んでなる組成物は、従来技術に公知の従来法により配合することができる。
【００７２】
核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または遺伝子構築物）を投与する事象において、本発明は、該核酸の投与のために特に調製した医薬品組成物を提供する。医薬品組成物は該核酸を裸の形態で、即ち核酸を生体のヌクレアーゼによる劣化から保護する化合物の不在下で含むことができ、これには形質移入のために用いる試薬に伴う毒性が排除されるという有利が伴う。裸の形態の化合物を投与するのに適した経路としては、静脈内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜下、局所、および経口経路が挙げられる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、２００２、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２１：８５７−８６７）。一方、核酸はリポゾームの一部を形成しながら投与され得、コレステロールに複合され得、或いはＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質から誘導されるペプチドＴａｔ、キイロショウジョウバエ・アンテナペディア・タンパク質のホメオドメインの第３螺旋、単純疱疹ウイルスのＶＰ２２タンパク質、およびＷＯ０７０６９０９０（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ、Ａ．等、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ、２１：９９−１０３、Ｓｃｈｗａｒｚｅ、Ｓ．Ｒ．等、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．、２１：４５−４８、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｍ等、２００３、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０、およびＳｎｙｄｅｒ、Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ、  Ｓ．Ｆ．、２００４、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２１：３８９−３９３）に記載されたようなアルギニンオリゴマーおよびペプチドなどの、細胞膜を通して転座を促進できる化合物に複合され得る。一方、ポリヌクレオチドは、プラスミド・ベクターのまたはウイルス・ベクターの、好ましくはムリン・リュウケミア・ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルスなどのアデノ−関連ウイルス中のまたはレトロウイルス中のアデノウイルスに基づくベクターの一部を形成しながら投与され得る。
【００７３】
もう１つの実施態様において、本発明の組成物およびポリヌクレオチドはＬｉｕ，Ｆ．らが記述した（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９９、６：１２５８−６６）ように、いわゆる「流体力学的投与（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」の手段により投与される。該方法によれば、化合物は静脈内経路により生体内に高速度・高容量で導入され、より拡散された分散を伴う高形質移入を生じる。細胞内導入の効能は投与した薬液の容量および注射の速度に直接依存することが実証された（Ｌｉｕ等、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１４３７−１４４１）。マウスにおいて、投与は３〜５秒間に１ｍＬ／体重１０ｇの値に最適化した（Ｈｏｄｇｅｓ等、２００３、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ、３：９１−９１８）。ポリヌクレオチドの流体力学的投与後のポリヌクレオチドによる生体内細胞形質移入を可能にする精密な機構は未だ完全には知られていない。マウスの場合において、尾静脈経由の投与が心拍数を超える速度で行われ、その結果、投与された薬液は上大静脈中に蓄積するものと考えられている。この薬液は引き続き器官の管に到達し、更に引き続き該管中の窓を通して管外空間に到達する。かくしてポリヌクレオチドは、血液と混合される前に標的器官の細胞と接触し、そのためヌクレアーゼによる劣化の可能性が低減される。
【００７４】
本発明の組成物は、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ未満の投与量、好ましくは体重１ｋｇあたり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、または０．００００１ｍｇ未満およびＲＮＡ剤の２００ｎｍｏｌ未満（即ち、体重１ｋｇあたり約４．４×１０１６または体重１ｋｇあたり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、または０．０７５ｎｍｏｌ未満）で投与することができる。単位投与量は注射、吸引、または局所投与により投与できる。本発明の２官能性ポリヌクレオチドおよび組成物は、標的ｍＲＮＡが発現している器官に直接投与できるが、この場合、１器官あたり０．００００１ｍｇから３ｍｇの投与量、好ましくは１器官あたり０．０００１ｍｇから０．００１ｍｇの投与量、１器官あたり約０．０３ｍｇから３．０ｍｇの投与量、１器官あたり約０．１ｍｇから３．０ｍｇの投与量、または１器官あたり０．３ｍｇから３．０ｍｇの投与量が投与される。
【００７５】
投与量は処置される症状の重症度および反応に依存し、数日間および数ヶ月間の間にまたは症状が和らぐのが観察されるまで投与量を変動させることができる。最適投与量は、患者の生体内の薬剤の濃度を定期的に測定することにより決定できる。最適投与量は、動物実験における事前の試験管内または生体内アッセイにより得られるＥＣ５０値より決定できる。単位投与量は１日１回または１日１回未満の割りで、好ましくは２、４、８、３０日ごとに１回未満の割で投与できる。一方、初回投与量を投与した後は、一般に初回投与量より少ない量を１回または数回一定量を投与できる。保守投与計画には、０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重１ｋｇ・日の範囲の、例えば１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．００００１ｍｇ／体重１ｋｇ・日の投与量で患者を処置することを含めることができる。保守投与は、好ましくは最大５、１０、または３０日ごとに１回の割りで投与される。処置は、患者の罹っている病気の種類、その重篤度、および患者の容態により変動する期間の間は続けられるべきである。処置後は患者の展開を監視して、病気が処置に対応しない場合には投与量を増やさねばならないとか、病気の回復が観察されたまたは望ましくない副作用が観察された場合には投与量を減らさねばならないとかを決定しなければならない。
【００７６】
毎日の投与量は、個々の状況に応じて単一の投与量または２回以上の投与量で投与できる。繰り返しの投与または頻繁な投与が望ましい場合は、ポンプなどの投与装置の埋め込み、半恒久的な（静脈内、腹腔内、槽内、または包内）カテーテル、または液溜めなどが推奨できる。
【００７７】
本発明による複合体、それらをコードするポリヌクレオチド、本発明の該ポリヌクレオチドおよびナノリポ粒子を含んでなる遺伝子構築物およびベクターは、治療対象の化合物を標的組織まで輸送する該複合体の能力を与えられた治療的処置の方法に用いることができる。当業者に理解されるように、本発明の化合物で処置し得る病気は、（ｉ）ＡｐｏＡに連結した有効成分に依存し、（ｉｉ）該複合体が輸送される組織に依存する。第２表には、該複合体および複合体中に組み込まれるべき有効成分によって処置され得る病気が、限定されない方法により記載されている。
【００７８】
【表２】
2015038124.tif 000004
【表３】
2015038124.tif 000005
【００７９】
本発明による複合体は、ＡｐｏＡに対する十分な親和性を有し、該ポリペプチドと結合した後、内在化される能力を有する表面分子が発現する器官または組織にとって標的となる能力を有する。該表面分子は、ＳＲ−Ｂ１（スカベンジャー受容体Ｂ、１型）、ＳＲ−Ａ１（スカベンジャー受容体Ａ、１型）、ＳＲ−Ａ２（スカベンジャー受容体Ａ、１型）、およびＳＲ−Ｃ（スカベンジャー受容体Ｃ）を含む。治療的に有効な化合物はかくして、該標的器官または組織に輸送され得る。これらの器官には、肝臓だけでなくその表面に十分な量のＳＲ−Ｂ１受容体を発現する全ての細胞が含まれる。本発明の実施例７では、特にＣＤ４＋Ｔ細胞中、ＣＤ８＋Ｔ細胞中、ＮＫ細胞中、樹状細胞中、および単球／マクロファージ中の、免疫系の種々の濃度でのＳＲ−Ｂ１受容体の存在を例証している。本発明はかくして、免疫系関連の病気の治療のための本発明の複合体の使用も提供する。加えて、破骨細胞中（Ｂｒｏｄｅｕｒ等、２００８、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．  ２３：３２６−３７）、内皮細胞中（Ｙｅｈ等、２００２、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１６１：９５−１０３）、腸管上皮中（Ｃａｉ、Ｓ．Ｆ．等、２００１、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、４２：９０２−９０９）、胆管上皮中（Ｍｉｑｕｅｌ等、Ｇｕｔ．、２００３、５２：１０１７−１０２４）、脂肪組織中（Ａｃｔｉｏｎ  等、  １９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６９：２１００３−２１００９”）、および肺中（Ａｃｔｉｏｎ等、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６９：２１００３−２１００９）のＳＲ−ＢＩ受容体の発現は知られている。
【００８０】
したがって、本発明による複合体は、治療を意図した化合物を予め指示した部分に運ぶのに好適である。したがって、標的器官を考慮すると、本発明の複合体は、肝疾患、例えば、肝内胆汁鬱滞、肝疾患（アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、肝室変性、肝腫脹、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症、肝膿瘍、肝硬変（アルコール性肝硬変、胆汁性肝硬変、実験的肝硬変）、アルコール性肝障害（脂肪肝、肝炎、肝硬変）、寄生虫症（エキノコックス症、肝蛭症、アメーバ性腫瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性および胆汁鬱滞性）、肝(臓)炎（アルコール性肝炎、慢性肝炎、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬剤誘発肝炎、中毒性肝炎、ウィルス性肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎およびＥ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性の肝臓症、二次胆汁性肝硬変、一次胆汁性肝硬変、肝性エンセファロパシ、門脈圧亢進症、肝細胞腺腫、血管腫、胆石、肝新生物（血管筋脂肪腫、石灰化肝転移、石灰化肝転移、線維層板型肝細胞癌、限局性結節性過形成、肝細胞腺腫、肝胆道嚢胞腺腫、肝芽腫、肝細胞癌、肝細胞腫、肝癌、肝血管内皮腫、結節性再生性過形成、良性肝腫瘍、良性肝腫瘍（肝嚢胞、多嚢胞性嚢腫、肝胆道嚢胞腺腫、肝間葉系腫瘍［間葉性過誤腫、小児血管内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍］、胆管上皮腫瘍、胆管過誤腫、胆管腺腫、悪性肝腫瘍［肝芽腫、肝芽腫、肝細胞癌、胆管細胞癌、胆管癌、嚢胞腺癌、毛細管腫瘍、血管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、胎児性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、扁平上皮癌、原発性リンパ腫］）、エリスロ肝性ポルフィリン症、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、遅発性皮膚ポリフィリン症）、ツェルヴェーガー症候群の治療に使用することができる。
【００８１】
本発明による複合体は、免疫系疾患、例えば、以下の疾患の治療に使用することができる：
自己免疫疾患：アジソン病、自己免疫性溶血性貧、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質症候群、リウマチ様関節炎、自己免疫性神経系疾患、疱疹状皮膚炎、1型糖尿病、家族性地中海熱、ＩＧＡ糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性肝炎、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、全身性エリテマトーデス、交感性眼炎、天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌不全症、特発性血小板減少性紫斑病、ライター症候群および自己免疫性甲状腺炎）；
血液型不適合による疾患：胎児赤芽球症、Ｒｈ同種免疫；
膜性増殖性糸球体腎炎；
移植片対宿主病；
過敏性：薬剤過敏症、公害病、過敏症障害（細胞移動抑制、急性散在性脳脊髄炎）、即時型アレルギー（アナフィラキシー、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎）、免疫複合体病（過敏症による血管炎、アルサス反応、血清病）、ラテックスアレルギー、ヴィスラー症候群；
免疫不全症候群、例えば、異常ガンマグロブリン血症、ＨＩＶ−１感染症、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２感染症、地方病性牛白血病、リンパ球減少、ファージ機能障害、例えば、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫症、ヨブ症候群、無ガンマグロブリン血、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、白血球粘着不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群；
血小板減少性紫斑病；
免疫増殖性疾患：高グロブリン血症（シュニッツラー症候群）、リンパ（組織）増殖性疾患（肉芽腫、重鎖病、ヘアリー細胞白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病、リンパ増殖性疾患、リンパ腫、サルコイドーシス、無ガンマグロブリン血、巨大リンパ節過形成、免疫芽細胞リンパ腫、感染性腺熱、リンパ腫様肉芽腫症、マレック病、セザリー症候群、腫瘍崩壊症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、免疫増殖性小腸疾患、形質細胞性白血病、異常蛋白血症および血小板減少性紫斑病）、異常蛋白血症。
【００８２】
本発明による複合体は、毛細血管内皮病、例えば、以下の疾患の治療に使用することができる：動脈硬化、閉塞性動脈症、結合性によるレイノー病、原始高血圧および二次性肺高血圧、糖尿病性細小血管症、バージャー病、全身性硬化症、脈管炎および続いて局所貧血を伴う内皮障害により特徴付けられる全ての疾患。
【００８３】
本発明の複合体は、骨疾患、例えば、骨の異常な増大により特徴付けられる異形成の治療に使用されることができる。このような状態の代表例として、軟骨無形成症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成、ゴーシェ病、低リン血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫症、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、骨折、歯周病、仮関節、化膿性骨髄炎、骨減少を生じる状態、例えば、貧血症状、ステロイドおよびヘパリンにより生じる骨減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏、特発性骨粗しょう症、先天性骨減少、アルコール依存症、クッシング病、先端巨大症、性腺機能低下症、一過性局所骨粗鬆症および骨軟化症が挙げられる。
【００８４】
本発明による複合体は、腸上皮疾患、例えば、吸収不全症候群、クローン病、腸憩室性疾患、麻痺性イレウスおよび腸閉塞の治療に使用できる。
【００８５】
本発明による複合体は、呼吸器疾患、例えば、以下の疾患の治療に使用することができる：鼻前庭炎、非アレルギー鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、副鼻腔炎、若年性の血管線維腫、鼻の癌および若年性の血管線維腫、声帯ポリープ、小節、接触潰瘍、声帯まひ、喉頭嚢胞、咽頭炎、へんとう炎、扁桃腺蜂巣炎、副咽頭間隙膿瘍、喉頭炎、喉頭嚢胞、咽喉癌（例えば、鼻咽腔癌、へんとう腺癌、喉頭癌）、肺癌（扁平上皮癌、小球性癌、大球性癌、腺癌）、アレルギー性疾患（好酸性肺炎、アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫、グッドパスチャー症候群、肺炎（例えば、細菌性肺炎（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、グラム陰性細菌、例えば、クレブシエラおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐにより生じる肺炎、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉにより生じる肺炎ならびにウイルス性肺炎（例えば、インフルエンザまたは水痘）、細気管支炎、ポリオ、喉頭気管気管支炎（クループ症候群とも称される）、合胞体ウイルスによる呼吸器感染、流行性耳下腺炎、伝染性紅斑、小児ばら疹、風疹、真菌性肺炎（例えば、免疫抑制患者におけるヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、ブラストミセス症および真菌症、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓにより生じるクリプトコッカス症；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．により生じるアスペルギルス症；Ｃａｎｄｉｄａにより生じるカンジダ症；およびムコール菌症）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉによる感染、異型肺炎（例えば、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．により生じるもの）、日和見肺炎、院内肺炎、化学肺臓炎および誤嚥性肺炎、胸膜疾患（例えば、胸膜炎、胸水および気胸（例えば、単純自然気胸、複雑自然気胸、緊張性気胸）、閉塞性気道疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性または急性慢性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺、炭塵肺、アスベスト肺、ベリリウム症、職業喘息、綿肺および良性塵肺症）、浸潤性肺疾患、例えば、肺線維症、線維化性肺胞炎、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、類リンパ球性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖（例えば、レッテレル-シヴェ病、ハンド-シュラー-クリスチャン病、エオジン好性細胞肉芽腫）、特発性肺血鉄症、サルコイドーシスおよび肺胞蛋白症、急性呼吸窮迫症候群、浮腫、肺塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス性、細菌性気管支炎）、気管支拡張症、肺拡張不全、肺膿瘍および肺嚢胞性線維症。
【００８６】
好ましい実施態様によれば、本発明は、治療活性成分はインターフェロンであることを意図している。この場合、複合体またはそれらをコードするポリヌクレオチドは、インターフェロンに反応する肝疾患、例えば、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、肝細胞癌、肝硬変、線維症の治療に有用である。
【００８７】
さらに、免疫系細胞にＳＲ−ＢＩ受容体が存在することを考えると、本発明による複合体は、治療活性成分を前記細胞にターゲッティングするのに使用できる。したがって、好ましい実施態様によれば、インターフェロンを治療活性成分として含有する本発明による複合体は、ワクチンの免疫反応を高めるためにアジュバントとして使用できる。ワクチンは、感染症をトリガーできる生物に対するワクチン、腫瘍に対するワクチン、アレルゲンに対するワクチンであることができる。ワクチンは、病原菌、腫瘍またはアレルゲンの成分（ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、マルチエピトープペプチド、断片等）を含んでいてもよく、または前記生物、腫瘍またはアレルゲンのポリペプチドをコードする核酸により形成される遺伝子ワクチンでもよい。
【００８８】
別の実施態様によれば、本発明の複合体は、ＴＧＦ−β１ペプチドインヒビターを含んでなる。これらの複合体は、ＴＧＦ−β１の過剰または自由発現に関連した疾患または病理学的障害、例えば、以下の疾患または障害の治療に使用できる：（ｉ）器官または組織の機能の喪失と関連した線維症、例えば、肺線維症、肝線維症（肝硬変）、心臓線維症、腎線維症、角膜線維症等、（ｉｉ）外科および美容外科合併症、例えば、皮膚および腹膜手術に関連した線維症、やけどに関連した線維症、骨関節線維症、ケロイドなど。
【００８９】
本発明者等は、ＴＧＦ−β１ペプチドインヒビターをＩＬ−１２とともに含んでなる本発明による複合体を投与すると、ＩＬ−１２によりもたらされるＩＦＮ−ガンマの誘発の刺激を生じることを示した。ＩＦＮ−γが公知の抗腫瘍剤であることを考えると、本発明者等の知見は、免疫刺激サイトカインと、ＴＧＦ−β１阻害ペプチドを含んでなる本発明による複合体の組み合わせに基づく新規な抗腫瘍治療の道を開く。
【００９０】
したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ａ）本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、宿主細胞、ナノリポ粒子および医薬製剤からなる群から選択される第１成分であって、成分（ｉｉ）がＴＧＦ−β１阻害ペプチドである第１成分と、
（ｂ）免疫刺激サイトカイン、前記サイトカインをコードしているポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、ＴＧＦ−β１阻害ペプチド、細胞毒性薬およびそれらの組み合わせを含んでなる群から選択される第２成分と、
を含んでなる組成物に関する。
【００９１】
ＴＧＦ−β１阻害ペプチドを含んでなるＡｐｏＡ複合体とともに投与することができる免疫刺激サイトカインには、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどがあるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、刺激サイトカインは、ＩＬ−１２である。
【００９２】
本発明による組成物の成分（ｂ）を構成することができるＴＧＦ−β１阻害ペプチドは、上記した本発明による複合体の一部分を構成するものと実質的に同じである。したがって、ＴＧＦ−β１阻害ペプチドは、ペプチドｐ１４４（配列番号４）またはペプチドｐ１７（配列番号５）であることができるが、これらには限定されない。本発明の複合体の一部分を構成するおよび第二成分を構成するペプチドは、同一でもよく、異なっていてもよい。
【００９３】
本明細書において使用される用語「細胞毒性薬」は、細胞の成長を選択的または非選択的に殺生または阻害することができる化合物である。細胞毒性薬としては、例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、塩酸エピルビシン、およびシクロホスファミドおよびそれらの類似体または同族体、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン）、ブレオマイシンが挙げられる。
【００９４】
別の態様によれば、本発明による組成物は、種々の種類の腫瘍、例えば、以下の腫瘍（これらには限定されない）の治療に使用することができる：血液癌（例えば、白血病またはリンパ腫）、神経性腫瘍（例えば、星状細胞腫または膠芽細胞腫）、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃腸腫瘍（例えば、胃、膵または大腸癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、腎細胞癌、尿生殖器腫瘍（卵嚢癌、膣癌、子宮頚癌、膀胱癌、睾丸癌、前立腺癌）、骨腫瘍および血管腫瘍。
【００９５】
したがって、別の態様によれば、本発明は、癌の治療のための、本発明による組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明による組成物を、それを必要としている対象に投与することを含んでなる癌の治療方法に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物の、癌の治療薬剤の調製のための使用に関する。
【００９６】
使用されるべき本明細書に記載の本発明の組成物の成分の治療に有効な量は、例えば、治療対象、投与経路および患者の状態に依存する。したがって、治療者が最適な治療効果を得るために必要とする用量を決定し、投与経路を修正することが好ましい。典型的な１日の用量は、約０．０１ｍｇ/ｋｇから２５０ｍｇ/ｋｇまたはそれ以上で、毎日、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、または週１回でよい。
【００９７】
組成物の投与は、種々の手段でおこなうことができる。例えば、組成物の成分（ａ）および成分（ｂ）は、順次、別個および／または同時に投与することができる。一実施態様によれば、組成物の成分（ａ）および成分（ｂ）は、同時に投与される（必要に応じて反復して）。一実施態様によれば、別個の製剤を順次投与（必要に応じて反復投与）する。一実施態様によれば、別個の製剤を別々に（必要に応じて反復して）投与する。当業者には、成分（ａ）および成分（ｂ）の別個の製剤は、順次または連続投与されるよく、その場合、成分（ａ）を投与してから成分（ｂ）を投与してもよく、または成分（ｂ）を投与してから成分（ａ）を投与してもよいことは理解されるであろう。一実施態様によれば、成分（ａ）および成分（ｂ）の別個の製剤は、選択的投与パターンで投与できる。本発明の組成物の成分（ａ）および成分（ｂ）の別個の製剤投与がシーケンス投与または別個投与の場合、第二製剤の投与の遅延は併用療法の有益な効果が失われるものであってはならない。
【００９８】
本発明を、以下実施例により説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１
材料および方法
１．発現ベクターの構築：
１．１ＲＮＡ抽出：
マウスの肝臓または処置マウスの脳から得た総ＲＮＡを、個々の試料から、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ社、スペイン、マドリッド）を用いて単離した。試料の濃度および純度を、分光光度計（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、エッペンドルフ社）で、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度（３２０ｎｍでバックグラウンド補正）により測定した。
【０１００】
１．２総ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ合成
総ＲＮＡ（３μｇ）をＤＮａｓｅＩで処理し、ＲＮａｓｅＯＵＴの存在下でＭ−ＭＬＶ  ＲＴを用いて、ｃＤＮＡにレトロ転写した（全ての試薬は、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手）。肝総ｃＤＮＡ２５μlを得た。反応を３７℃で１時間インキュベーションし、９５℃で１分間変性し、そして４℃とした。試料を直ちにＰＣＲに使用するか、または−２０℃で保存した。
【０１０１】
１．３マウスアポリポタンパク質Ａ１（ｍＡｐｏＡ１）ｃＤＮＡの獲得およびクローニング：
センスプライマー５’−ＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣ−３’（ＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１）（配列番号２０）およびアンチセンスプライマー５’−ＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴ−３’（ＲｖＴＧＡｍｍＡｐｏＡ１）（配列番号２１）を、設計した。ｍＡｐｏＡ１ｃＤＮＡ（７９５総ヌクレオチド：シグナルペプチドをコードしている７２ヌクレオチドおよび天然タンパク質をコードしている７２３ヌクレオチド）を、２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を用いて、肝総ｃＤＮＡについて、ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、英国、ロンドン）を用いて、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５５℃で４０秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間の処理により、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、Ａｇａｒｏｓｅ  Ｄ−１低ＥＥＯ  １％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションさせ、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＡｐｏＡ１のｃＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１と称する）。最後に、得られた配列を、配列決定法により確認した。
【０１０２】
１．４  マウスインターフェロンアルファ１（ｍＩＦＮα１）ｃＤＮＡの獲得およびクローニング
センスプライマー５’−ＡＴＧＧＣＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴ−３’（ＦｗＡＴＧｍＩＦＮα１）（配列番号２２）およびアンチセンスプライマー５’−ＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣ−３’（ＲｖＴＧＡｍＩＦＮα１）（配列番号２３）を設計した。ｍＩＦＮα１  ｃＤＮＡ（５７０総ヌクレオチド：シグナルペプチドをコードしている６９ヌクレオチドおよび天然タンパク質をコードしている５０１ヌクレオチド）を、肝総ｃＤＮＡについて、ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（英国ロンドンにあるＢｉｏｌｉｎｅ社）を用いたＰＣＲにより増幅した。増幅条件は、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５５℃で４０秒間および７２℃で４０秒間後、７２℃で７分間であった。ＰＣＲ産物を、Ａｇａｒｏｓｅ  Ｄ−１低ＥＥＯ  １％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてミグレーションさせ、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＩＦＮα１のｃＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１と称する）。最後に、配列を、配列決定法により確認した。
【０１０３】
１．５遺伝子融合設計：
１．５．１  ｍＡｐｏＡ１遺伝子へのｍＩＦＮα１遺伝子のＣ末端融合：アポＩＦＮ
ＡｐｏＡ１遺伝子の３’におけるＡｓｃＩ酵素の制限部位を構成する９−ヌクレオチド配列（ＧＧＣＧＣＧＣＣＣ）を導入し、停止コドンを除去した、アンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＣ−３’（ＲｖＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１）（配列番号２４）を設計した。この付加した制限配列は、構成タンパク質に対して一定の移動度を提供する短結合ペプチドＧＡＰに翻訳される。成熟ｍＩＦＮα１タンパク質をコードしている配列の５’にＡｓｃＩ制限配列を導入（すなわち、シグナルペプチド配列を除去）した、センスプライマー５’ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡ−３’（ＦｗＡｓｃＩｍＩＦＮα１）（配列番号：２５）を設計した。
【０１０４】
ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、英国、ロンドン）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１ならびにプライマーであるＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１およびＲｖＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１を用いて、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５７℃で４０秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間の条件でのＰＣＲにより増幅を実施した。ＰＣＲ産物（８０４ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）でマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩのＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）ｍＡｐｏＡ１にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩと称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１０５】
平行して、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１ならびにプライマーであるＦｗＡｓｃＩｍＩＦＮα１およびＲｖＴＧＡｍＩＦＮα１を用いたＰＣＲにより増幅を実施した。ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、英国、ロンドン）および以下の増幅条件を使用した：２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５７℃で４０秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間。ＰＣＲ産物（５１０ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したＡｓｃＩ−ｍＩＦＮα１のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＩＦＮα１と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１０６】
遺伝子融合を実施するために、プラスミドｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩおよびｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＩＦＮα１を、ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ骨格に存在する制限部位ＰｍｅＩを用いて、ＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素、１ｘＢＳＡおよびＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）により、それぞれ独立して３７℃で１．５時間消化した。両方の消化物を１％アガロースゲルにおいてマイグレーションし、対応するバンドから開環ベクターｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩおよびｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＩＦＮα１インサートを精製した。産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（高濃度）および２ＸＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ社、米国ウイスコンシン州）（緩衝液）を用いて、１：３（ベクター：インサート）比でライゲーションし、混合物を室温で１０分間インキュベーションした。続いて、Ｔｏｐ１０バクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）を形質転換した。ベクターがこの抗生物質に耐性のある遺伝子を含有するので、形質転換したバクテリアを、アンピシリン含有ＬＢ培地を入れたペトリ皿での成長により選択した。陽性細菌のプラスミドＤＮＡを、ＭｉｎｉＰｒｅｐ法（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）により抽出し、続いてこのプラスミド２μgをＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄにあるＢｉｏｌａｂｓ社）で消化し、１％アガロースゲルにおいて電気泳動により消化物を分離してインサートの存在を確認する。得られた６８２５ヌクレオチドプラスミドを、以下ｐＣＭＶ−Ａｐｏ−ＩＦＮ（ｐＣＭＶ−ＡＦ）と称する。
【０１０７】
１．５．２  ｍＡｐｏＡ１遺伝子へのｍＩＦＮα１遺伝子のＮ末端融合:ＩＦＮ−Ａｐｏ
ｍＩＦＮα１遺伝子の３’にＡｓｃＩ酵素の制限部位を形成し、停止コドンを除去する９−ヌクレオチド配列（ＧＧＣＧＣＧＣＣＣ）を導入したアンチセンスプライマー５’−ＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣ−３’（ＲｖＡｓｃＩｍＩＦＮα１）（配列番号：２６）を設計した。ＡｓｃＩ制限配列を成熟ｍＡｐｏＡ１タンパク質をコードする配列の５’に導入した（すなわち、シグナルペプチド配列を削除した）センスプライマー５’−ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧ−３’（ＦｗＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１）（配列番号：２７）を設計した。このプライマーは、５’に３ヌクレオチドを含み、ＡｓｃＩでの開裂を可能とする。
【０１０８】
ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、英国、ロンドン）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１ならびにプライマーであるＦｗＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１およびＲｖＴＧＡｍＡｐｏＡ１を用いて、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５７℃で４０秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間の条件でのＰＣＲにより増幅を実施した。ＰＣＲ産物（７３２ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）でマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したＡｓｃＩ−ｍＡｐｏＡ１のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＡｐｏＡ１と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１０９】
平行して、ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、英国、ロンドン）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１ならびにプライマーであるＦｗＡＴＧｍＩＦＮα１およびＲｖＡｓｃＩｍＩＦＮα１を用い、以下の増幅条件下でのＰＣＲにより増幅を実施した：２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５７℃で４０秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間。ＰＣＲ産物（５７６ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＩＦＮα１−ＡｓｃＩのＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１−ＡｓｃＩと称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１０】
遺伝子融合を実施するために、プラスミドｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＡｐｏＡ１およびｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１−ＡｓｃＩを、ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ骨格に存在する制限部位ＰｍｅＩを用いて、ＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素、１ｘＢＳＡおよびＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄにあるＢｉｏｌａｂｓ社）により、独立的に３７℃で１．５時間消化した。両方の消化物を１％アガロースゲルにおいてマイグレーションし、対応するバンドから開環ベクターｐＣＭＶ−ｍＩＦＮα１−ＡｓｃＩおよびｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ｍＡｐｏＡ１インサートを精製した。産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（高濃度）および２ＸＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ社、米国ウイスコンシン州）（緩衝液）を用いて、１：３（ベクター：インサート）比でライゲーションし、混合物を室温で１０分間インキュベーションした。続いて、Ｔｏｐ１０バクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）を形質転換した。ベクターがこの抗生物質に耐性のある遺伝子を含有するので、形質転換したバクテリアを、アンピシリン含有ＬＢ培地を入れたペトリ皿での成長により選択した。陽性細菌のプラスミドＤＮＡを、ＭｉｎｉＰｒｅｐ法（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）により抽出し、続いてこのプラスミド２μgをＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、１％アガロースゲルにおいて電気泳動により消化物を分離してインサートの存在を確認する。得られた６８２２ヌクレオチドプラスミドを、以下ｐＣＭＶ−ＩＦＮ−Ａｐｏ（ｐＣＭＶ−ＩＡ）と称する。
【０１１１】
１．５．３  ｍＡｐｏＡ１遺伝子へのペプチドｐ１７のＣ末端融合
プライマー５’−ＴＣＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣ−３’（ＲｖｍＡｐｏＡ１ｐ１７）（配列番号：２８）を設計した。これを、Ｅａｓｙ−Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲクローニング酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩおよびプライマーであるＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１およびＲｖｍＡｐｏＡ１ｐ１７を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、以下の条件でおこなった：９５℃で１分間、９５℃で４０秒間の３０サイクル、６０℃で４０秒間および７２℃で１分間、その後７２℃で７分間。ＰＣＲ産物を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１７のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１７と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１２】
１．５．４  ｍＡｐｏＡ１遺伝子へのペプチドｐ１４４のＣ末端融合
プライマー５’−ＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣ−３’  （ＲｖｍＡｐｏＡ１ｐ１４４）（配列番号：２９）を設計した。これを、Ｅａｓｙ−Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲクローニング酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩおよびプライマーであるＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１およびＲｖｍＡｐｏＡ１ｐ１４４を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、以下の条件でおこなった：９５℃で１分間、９５℃で４０秒間の３０サイクル、６５℃で４０秒間および７２℃で１分間、その後７２℃で７分間。ＰＣＲ産物を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（スペインのマドリッドにあるＰｒｏｎａｄｉｓａ社）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１３】
１．５．５  ｍＡｐｏＡ１シグナルペプチドの遺伝子配列のクローニング：
融合ｍＡｐｏＡ１およびペプチド融合実験において対照としての役割を果たすプラスミドを構築するために、ｍＡｐｏＡ１シグナルペプチド配列（ＳＰｍＡｐｏＡ１）をペプチドｐ１７およびｐ１４４と遺伝子融合する（ＡｓｃＩの配列を付加しない）ことにより、確実にペプチドの分泌がｍＡｐｏＡ１−ペプチドと同じであるようにする。プライマーＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１とともに使用し、鋳型としてｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１を用いてＳＰｍＡｐｏＡ１を増幅する、プライマー５’−ＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧ−３’  （ＲｖＳＰｍＡｐｏＡ１）（配列番号：３０）を設計した。ＰＣＲ産物（７２ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したＳＰｍＡｐｏＡ１のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（カリフォルニア州ＣａｒｌｓｂｅｄにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＳＰｍＡｐｏＡ１と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１４】
１．５．６  ｍＡｐｏＡ１シグナルペプチド遺伝子配列へのペプチドｐ１７のＣ末端融合：
プライマー５’−ＴＣＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧ−３’（ＲｖＳＰｍＡｐｏＡ１ｐ１７）（配列番号：３１）を設計し、これをプライマーＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１とともに使用して、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１鋳型から始めて、ＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１７を増幅した。ＰＣＲ産物（１２０ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）により精製した。精製したＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１７のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１７と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１５】
１．５．７  ｍＡｐｏＡ１シグナルペプチド遺伝子配列へのペプチドｐ１４４のＣ末端融合
プライマー５’−ＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧ−３’（ＲｖＳＰｍＡｐｏＡ１ｐ１４４）（配列番号：３２）を設計し、これをプライマーＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１とともに使用して、ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１鋳型から始めて、ＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１４４を増幅した。ＰＣＲ産物（１１７ヌクレオチド）を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州ＶａｌｅｎｃｉａにあるＱｉａｇｅｎ社）により精製した。精製したＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１４４のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１４４と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１６】
１．５．８  ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４へのＭＭＰ９配列の導入
ペプチドｐ１４４の開裂により放出される可能性のあるこの遺伝子から生成される融合タンパク質を提供するために、融合タンパク質のアミノ酸配列を開裂して完全ｐ１４４を放出できるタンパク質分解酵素を、ＭＥＲＯＰＳデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）により検討した。調査の結果、候補として金属プロテアーゼ９（ＭＭＰ９）が見いだされ、これは、開裂を生じさせて、ｐ１４４配列にアミノ酸Ｓを残すものであった。癌における存在が報告されていることから、このタンパク質分解酵素の使用により、構築物に、阻害（局在であり、全身性でない阻害）が必要な部位にこのＴＧＦ−β阻害が放出される能力がさらに付与された。ＤＮＡ配列ＣＴＴＴＴＣＣＣＧＡＣＧＴＣＴ（配列番号：５１）（アミノ酸：ＬＦＰＴＳ、配列番号：１９）は、前記開裂部位に翻訳される：ＬＦＰＴ−Ｓ  ＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮ（配列番号：４）。
【０１１７】
プライマー５’−ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＣ−３’（ＦｗＭＭｐ９ＡｓｃＩｐ１４４）（配列番号：３３）および５’−ＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡ−３’（ＲｖＭＭｐ９ＡｓｃＩｐ１４４）（配列番号：３４）を設計した。これを、Ｅａｓｙ−Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲクローニング酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）とともに、鋳型としてのｐＣＭＶ−ＳＰｍＡｐｏＡ１−ｐ１４４を用いて増幅した。ＰＣＲは、２７２０Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）において、以下の条件でおこなった：９４℃で２分間、９４℃で４０秒間の３０サイクル、５４℃で４５秒間および７２℃で４０秒間、その後７２℃で７分間。ＰＣＲ産物を、ＡｇａｒｏｓｅＤ−１低ＥＥＯ１％アガロースゲル（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ社、スペイン、マドリッド）においてマイグレーションし、ゲル断片を、ＰｅｒｆｅｃｔＰｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ドイツ）で精製した（７０ヌクレオチド）。精製したＡｓｃＩ−ＭＭＰ９−ｐ１４４のＤＮＡを、製造業者から提供された説明書にしたがって、発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）にクローニングした（以下、ｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ＭＭＰ９−ｐ１４４と称する）。最後に、配列を配列決定法により確認した。
【０１１８】
遺伝子融合を実施するために、プラスミドｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４およびｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ＭＭｐ９−ｐ１４４を、独立してＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ制限酵素（後者はｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ骨格に存在する）で消化した。ＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素、１ｘＢＳＡおよびＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国Ｂｅｖｅｒｌｙ）を用いて、消化を、３７℃で１．５時間おこなった。両方の消化物を１％アガロースゲルにおいてマイグレーションし、対応するバンドから開環ベクターｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４およびｐＣＭＶ−ＡｓｃＩ−ＭＭｐ９−ｐ１４４１インサートを精製した。産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（高濃度）および２ＸＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（米国ウイスコンシン州にあるＰｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ社）（緩衝液）を用いて、１：３（ベクター：インサート）比でライゲーションし、混合物を室温で１０分間インキュベーションした。続いて、Ｔｏｐ１０バクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）を形質転換した。ベクターがこの抗生物質に耐性のある遺伝子を含有するので、形質転換したバクテリアを、アンピシリン含有ＬＢ培地を入れたペトリ皿での成長により選択した。陽性細菌のプラスミドＤＮＡを、ＭｉｎｉＰｒｅｐ法（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）により抽出し、続いてこのプラスミド２μgをＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、１％アガロースゲルにおいて電気泳動により消化物を分離してインサートの存在を確認する。得られた６３２４ヌクレオチドプラスミドを、以下ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ＭＭＰ９−ｐ１４４と称する。
【０１１９】
１．５．９  ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ｐ１４４へのリンカー配列の導入
タンパク質とペプチドｐ１４４との間を移動する可能性のある、この遺伝子から生成した融合タンパク質を提供するために、アミノ酸に翻訳されたときの配列がＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号：１３）である可撓性延長リンカーをコードするＤＮＡ配列（ＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＴＧＡＣ、配列番号：５３）を導入した。これは、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（コイル）構造をとり、天然ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（１ｂ０ｐＡ＿２）において結合ペプチドとして存在する。
【０１２０】
プライマー５’−ＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＧＡＧＣ−３’（ＦｗＬＩＮＫＥＲｐ１４４）（配列番号：３５）および５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧ−３’（ＲｖＬＩＮＫＥＲｐ１４４）（配列番号：３６）を、各々濃度１００ｍＭで設計した。各プライマー１０μlを混合し、サーマルサイクラーにおいてハイブリダイゼーション（９５℃で２分間、５２℃で１０分間）し、４℃とした。これらのプライマーのハイブリダイゼーションでは、リンカーに対応する配列およびｐ１４４に対応する配列で完了するが、５’におけるＡｓｃＩによる開裂と適合する付着末端および３’におけるＮｏｔＩと適合する付着末端が残る。
【０１２１】
プラスミドｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ｐ１４４を、ＡｓｃＩ（Ｂｕｆｆｅｒ４、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、ＰｅｒｆｅｃｔＰｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ドイツ）でＤＮＡを精製し、続いて、消化緩衝液が不適合であるために、ＮｏｔＩ（Ｂｕｆｆｅｒ３およびＢＳＡ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化した。１%アガロースゲルでマイグレーションし、開環ベクターをＰｅｒｆｅｃｔＰｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ドイツ）で精製した。産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（高濃度）および２ＸＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ社、米国ウイスコンシン州）（緩衝液）を用いて、１：３（ベクター：インサート）比でライゲーションし、混合物を室温で１０分間インキュベーションした。続いて、Ｔｏｐ１０バクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂｅｄ）を形質転換した。ベクターがこの抗生物質に耐性のある遺伝子を含有するので、形質転換したバクテリアを、アンピシリン含有ＬＢ培地を入れたペトリ皿での成長により選択した。得られた６３７３ヌクレオチドプラスミドを、以下ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ−ＬＩＮＫＥＲ−ｐ１４４と称する。最後に、この配列を、配列決定法により確認した。
【０１２２】
１．実験：
２．１動物：
実験を、雌の免疫適格ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスで５〜７週間おこなった（Ｈａｒｌａｎ社、スペイン、バルセロナ）。動物を、特定の外部無病原条件下で、Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａ  Ａｐｌｉｃａｄａ（ＣＩＭＡ社、スペイン、パンプローナ）の指示および倫理規定に従って処置した。
【０１２３】
２．２  動物の取り扱いおよび腫瘍モデル：
各ＤＮＡプラスミド（２０μｇ）を、０．９％食塩水（Ｂｒａｕｎ）１．８ｍｌに再懸濁し、２７．５Ｇ針および２．５ｍｌシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、スペイン）を用いて、水圧注入（Ｌｉｕ等，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：１２５８−１２６６）により、尾静脈を介して導入した。血液試料は、イソフルレン（Ｆｏｒａｎｅ、Ａｂｂｏｔｔ社）の吸入による麻酔後、後眼窩経路により得た。血清を２回の連続遠心分離（９．１ｘｇ、５分間）して回収し、−２０℃で保存した。非経口麻酔を、ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ）とキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ）との９：１混合物を２００μl／マウス腹腔内注射することによりおこなった。温度を、ＴｈｅｒｍｏＫｌｉｎｉｋ温度計（Ａｒｔｓａｎａ社、イタリア、Ｇｒａｎｄａｔｅにある）と腹部を接触させることにより測定した。
【０１２４】
２．２．１  血液分析
血液をマウスから管に採取し、最終濃度０．５％ヘパリン（Ｍａｙｎｅ社）とした。ｉ）総白血球を測定するために、全血を、容器内で、ＩｓｏｔｏｎＩＩ希釈液２０ｍｌで１：１０００希釈し、測定２分前に、Ｚａｐ−ＯｇｌｏｂｉｎＩＩ溶解試薬３滴を添加した。ｉｉ）総赤血球細胞を測定するために、全血を、容器内で、ＩｓｏｔｏｎＩＩ希釈液１０ｍｌで１：５００００希釈をした。ｉｉｉ）血小板を測定するために、全血を、管内で、ＩｓｏｔｏｎＩＩ希釈液５００μlで１：２５希釈し、４℃、６００ｇの条件で１．５分間遠心分離し、上清を管に移して、ＩｓｏｔｏｎＩＩ希釈液２０ｍｌで１：４００希釈し、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒにより、試料を製造業者により各々推薦されている設定で分析した（全ての材料および試薬は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社から入手した）。
【０１２５】
２．２．２  ＣＴ２６に対するワクチン接種モデル
遺伝子導入による抗腫瘍効果を分析するために、２種のワクチン接種プロトコルを実施した：
Ａ）０．９％生理食塩水（１００μｌ／マウス）に溶解した、アミノ酸配列ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：５４）を有するペプチドＡＨ−１（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ社、英国オックスフォード）（５０μｇ／マウス）と、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ、ＳＩＧＭＡ社、スペイン、マドリッド）（１００μｌ／マウス）を用いて、ワクチン接種プロトコルを実施した。混合物を、Ｂｒａｎｓｏｎ社ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０で超音波処理した。各動物に、２５Ｇ針および１ｍｌシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、スペイン）を用いて、混合物２００μｌを接種した。このとき、１００μｌをマウスの左側腹に導入し、５０μｌを足の裏に導入した。７日後、種々の構築物を、水圧注入により投与した（Ｌｉｕ等、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６：１２５８−１２６６）。水圧注入してから７日後、インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、スペイン）を用いて、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹に、５ｘ１０５ＣＴ２６結腸癌細胞を２００μｌのＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社、英国、ペイズリー）に再懸濁したものを皮下注射することにより腫瘍を確立した。
Ｂ）遺伝子構築物を水圧注入により投与した。水圧注入してから１日後、ペプチドＡＨ−１でのワクチン接種を、上記の方法で実施した。９日後、５ｘ１０６個の結腸直腸腺癌細胞（ＣＴ２６）、皮下注射により接種した。デジタル精密ゲージを用いて、腫瘍の追跡をおこなった。
【０１２６】
２．３  使用細胞株の詳細な説明
ＣＴ２６細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃマウス結腸直腸腺癌から得、発癌物質Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル−ウレタンにより導入し、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社、英国、ペイズリー）で培養し、５６℃で不活性化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、１％５ｘ１０−３β−メルカプトエタノールを添加した。細胞株ＭＣ３８（マウス腺癌細胞）、完全ＤＭＥＭ（５６℃で不活性化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンを添加）において培養した、Ｌ９２９（マウス線維芽細胞由来の細胞）および２９３（ヒトアデノウイルス型５に属するＥ１領域を安定導入したヒト胎児腎臓細胞、ＥＣＡＣＣ第８５１２０６０２号）。
【０１２７】
記載の細胞を、加湿インキュベートチャンバー中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気の条件で培養した。培養瓶およびプレートは、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ社（ドイツ、Ｅｓｓｅｎ）から入手した。
【０１２８】
２．４  ｍＩＦＮα１、ＩＦＮγおよびＮｅｏｐｔｅｒｉｎの測定
ｍＩＦＮα１濃度を、ＮＵＮＣマキシソープフラット９６ウエルプレートにおいて、ＥＬＩＳＡ法により測定した。抗ｍＩＦＮα１中和Ａｂ抗体（ＲＭＭＡ−１、ＰＢＬ）を、ＰＢＳ１ｘで１／１０００希釈し、１００μｌ／ウエルをプレーティングし、湿潤環境下４℃でＯ／Ｎインキュベーションした。ＰＢＳ  １ｘ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．２〜７．４）で５回洗浄後、プレートを、室温で１時間、ＰＢＳ  １ｘ  １％ＢＳＡ溶液３００μｌ／ウエルでブロッキングした。血清試料をＰＢＳ  １ｘ  １％  ＢＳＡ溶液で１／１００希釈し、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ  １ｘ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄後、１００μl／ウエルのウサギ抗ＩＦＮαポリクローナル抗体（ＰＢＬ）で１時間インキュベーションし、ＰＢＳ１ｘ  １％ＢＳＡ溶液で１／１０００希釈した。ＰＢＳ  １ｘ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄後、１００μl／ウエルのＨＲＰ−複合ロバα−ウサギＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を添加し、ＰＢＳ１ｘ１％ＢＳＡ溶液で１／４０００希釈し、室温で１時間保持した。ＰＢＳ１ｘ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄後、１００μl／ウエルのＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ基質溶液（ＢＤ）を添加し、室温かつ暗所で１５分後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４５０μlを添加した。最後に、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、５４０ｎｍで補正した。
【０１２９】
血清中ＩＦＮγ濃度を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）で測定した。血清中ネオプテリン濃度を、製造業者から提供された説明書に従って、Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＩＢＬ社、ハンブルグ）により測定した。
【０１３０】
２．５  定量的ＰＣＲ
ｃＤＮＡ  ２μlを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、表１の特定のプライマーとともにインキュベーションした。発現がｍＩＦＮα１またはｍＡｐｏＡ１により影響されないので、マウスアクチンを使用して遺伝子発現を標準化した。ｍＲＮＡ値を式２ΔＣｔ（式中、ΔＣｔは、ｍアクチンと標的遺伝子との間の閾値サイクル差を示す）により表した。
【０１３１】
表１  使用プライマーリスト
【表４】
2015038124.tif 000006
【表５】
2015038124.tif 000007
【０１３２】
２．６  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｋｉｌｌｉｎｇ
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝３／群）に、０日目に、ｐＣＭＶ−ＬａｃＺ  ２０μｇおよび検討する各構築物（ｉ）ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１、ｉｉ）ｐＣＭＶ−ＩＦＮα１、ｉｉｉ）ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏ−ＩＦＮ、ｉｖ）０．９％生理食塩水（Ｂｒａｕｎ社）に溶解したｐＣＭＶ−ｍＩＦＮ−ＡｐｏＡ１）２０μｇを、上記した水圧注入により免疫化した。７日目に、非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓から得た脾細胞を単離し、赤血球細胞をＡＣＫ溶液（Ｃａｍｂｒｅｘ社、メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解した。得られた脾細胞を２群に分け、そのうちの１群を、ＲＰＭＩ１６４０培地および９μＭペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（β−ガラクトシダーゼ由来の細胞傷害性エピトープ、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ社、英国オックスフォード）を用いて、３７℃で３０分間インキュベーションした。第２群を、ペプチドなしで同じ処理をした。ペプチドを添加した脾細胞を、２．５μＭＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）（オレゴン州ＥｕｇｅｎｅにあるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で標識した。対照脾細胞を、０．２５μＭ  ＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｌｏｗ）で標識した。最後に、両方の集団を、１：１比で混合し、１０７細胞を野生型マウスまたは免疫化マウスに静脈内注射した。２４時間後、動物を殺生した。取り出した脾臓を細分し、ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞とＣＦＳＥｌｏｗ細胞との比を、ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。特異的溶解百分率を、下式中により算出した：
【数１】
2015038124.tif 000008
【０１３３】
２．７  ＳＲＢ１の発現の測定：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓由来の脾細胞を、単離した。取り出し、細分した脾臓を８群に分け、それらのうちの４群を、ウサギ抗ＳＲ−Ｂ１ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ社、コロラド州Ｎｏｖｕｓ）およびＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ抗体とともに、１０分間インキュベーションした：ｉ）ＣＤ４＋細胞集団を定義するためのＲ−ＰＥ−複合ラット抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）モノクローナル抗体、およびＣＤ８＋細胞集団を定義するためのＡＰＣ複合ラット抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モノクローナル抗体、ｉｉ）ＮＫ細胞集団を定義するためのＡＰＣ−複合マウス抗マウスＮＫ−１．１（ＮＫＲ−Ｐ１ＢおよびＮＫＲ−Ｐ１Ｃ）モノクローナル抗体、ｉｉｉ）単球 細胞集団を定義するためのＡＰＣ−ラット抗マウスＣＤ１１ｂ、ｉｖ）樹状細胞集団を定義するためのＡＰＣ−  ＣＤ１１ｃ。その他の４群を、対照として使用し、抗ＳＲＢ１なしで、それぞれの抗体とともに、１０分間インキュベーションした。標識脾細胞を、ＰＢＳおよび５％ウシ胎仔血清で洗浄し、ＦＩＴＣ複合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）とともに、１０分間インキュベーションした。このように染色した試料を、ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）を用いて、フローサイトメトリーにより検討した。
【０１３４】
２．８  臭化ナトリウム勾配での分画遠心法によるＨＤＬの単離：
プラスミドｍＡｐｏＡ１、ＩＦＮα１、Ａｐｏ−ＩＦＮ、ＩＦＮ−ＡｐｏまたはＡｐｏＡＩ−リンカー−Ｐ１４４を水圧注入してから２４時間後、血液をマウスから管に採取し、最終濃度０．５％ヘパリン（Ｍａｙｎｅ）とし、直ちに血漿を遠心分離（５０００ｇ、２０分間）により抽出した。
【０１３５】
種々の密度の臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）溶液を、蒸留水で２５ｍＬの最終溶液とした。ＥＤＴＡを最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）で添加した。ＮａＢｒ（Ｆｌｕｋａ社）を添加して溶液を得た：０．２２５ｇ（ρ＝１．００６ｇ／ｍｌ）、１．４３１ｇ（ρ＝１．０４ｇ／ｍｌ）、７．０８５ｇ（ρ＝１．２１ｇ／ｍｌ）および１３．５７３ｇ（ρ＝１．４  ｇ／ｍｌ）。ＮａＢｒは高吸湿性の塩であるので、密度を確認し、必要なときに蒸留水を添加して補正した。
【０１３６】
超遠心分離後の浮遊によりリポタンパク質を順次分離する方法を、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｓｕｒｅｄａ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０３、７３−７７（２００２））により記載されたプロトコルを少し改良して、ＴＬＡ１００．４ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を備えたＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｏｐｔｉｍａ  ＭＡＸにおいて、２〜４ｍＬのマウス血漿（試料に応じて一つとする）から、以下の密度でおこなった：ＶＬＤＬ＜１．００６ｇ／ｍＬ、ＬＤＬ１．００６〜１．０４ｇ／ｍＬおよびＨＤＬ１．０４〜１．２１ｇ／ｍＬ。ｉ）ＶＬＤＬの単離：マウス血漿４００μｌを３ｍｌポリカーボネート管に移し、ρ＝１．００６ｇ／ｍｌ  ＮａＢｒ溶液１１００μlを添加した。試料を、２時間、４℃、３３６０００ｇの条件で遠心分離した。上清約６５０μｌを、ピペットで採取し、−２０℃で保存した。ｉｉ）ＬＤＬの単離：残り容積の沈殿物に、下式で算出された容積のρ＝１．４ｇ／ｍｌ  ＮａＢｒ溶液を添加することにより密度を１．０４とした。
【数２】
2015038124.tif 000009
【０１３７】
ρ＝１．０４ｇ／ｍｌ  ＮａＢｒ溶液で容積を１．５ｍｌとし、試料を２．５時間、４℃、３３６０００ｇの条件で遠心分離した。上清３００〜４００μlをピペットで採取し、−２０℃で保存した。ｉｉｉ）ＨＤＬの単離：沈殿物約８００μｌを新しい管に移し、上記したようにして密度を１．２１ｇ／ｍＬとし、ρ＝１．２１ｇ／ｍｌ  ＮａＢｒ溶液で容積を１．５ｍＬとした。試料を、３．５時間、４℃、３３６０００ｇの条件で遠心分離し、ＨＤＬに相当する上清画分約４００μｌおよびリポタンパク質不含有血漿（ＬＤＰ）に相当する沈殿画分を採取し、−２０℃で保存した。
【０１３８】
２．９  ｍＡｐｏＡ１に対する電気泳動および免疫ブロッティング
各試料について、ＨＤＬまたはＬＤＰ画分２５μlを、４−２０％Ｔｒｉｓ−ヘペス  ＰＡＧＥ  ＬｏｎｇＬｉｆｅ  ｉＧｅｌｓ（Ｎｕｓｅｐ社）勾配ゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ社）に移した。タンパク質を、ｍＡｐｏＡ１に対するヤギポリクローナル抗体、１：２００希釈（ヤギポリクローナル抗アポリポタンパク質Ａ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびヤギＩｇＧに対する抗体、１：２００００希釈（抗ヤギＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ複合体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて検出した。膜を、ＥＣＬプラス  ウエスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて展開した。
【０１３９】
２．１０  ＩＦＮ活性バイオアッセイ：細胞変性効果（ＣＰＥ）：
Ａｐｏ−ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏを含有するマウス血漿から単離したＨＤＬ画分のＩＦＮ活性を、活性バイオアッセイにより算出し、ＩＦＮが脳心筋炎溶菌ウイルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性活性に対して細胞を保護する能力を、試料を順次希釈により、広範囲なプレーティングしたＩＦＮ濃度にわたって、測定した。この希釈で、３ｘ１０５Ｌ９２９細胞／ウエルを、９６−ウエルＣｅｌｌｓｔａｒ細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ社）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で、Ｏ／Ｎインキュベーションして、付着細胞の単層を形成した。次に、同量のＥＭＣＶ（ｐｆｕ／ウエル）を添加し、対照として使用した未処理細胞が溶解するまで２４時間インキュベーションした。この時点で、ＩＦＮ効果により保護されている生存細胞を、製造業者の説明書に従って、ＶｉａＬｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ展開溶液（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、光度法により測定した。読み取り値を、プロットして用量−反応曲線（Ｐｒｉｓｍ５、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を作成した。この曲線から、抗ウイルス活性でのＩＦＮ製剤の効力を、各アッセイに使用されるｒＩＦＮα組み換えタンパク質標準（ＰＢＬ）の希釈を参照して算出することができる。
【０１４０】
２．１１  ｒＩＦＮおよび単離したＨＤＬ  ＩＦＮ−Ａｐｏ画分を用いた実験
活性バイオアッセイにより測定された１００００ＩＵのマウスｒＩＦＮアルファ（ＣＨＯ由来マウス、Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ社）または１００００ＩＵのＨＤＬ  ＩＦＮ−Ａｐｏを、マウスに後眼窩注射した。
【０１４１】
２．１２  データの統計的分析
データの統計的分析を、Ｐｒｉｓｍ５コンピュータプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いておこなった。腫瘍発生データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフで表し、対数順位検定により分析した。種々の時間で検討したデータを、反復測定ＡＮＯＶＡにより分析後、ボンフェローニ検定をおこなった。残りのパラメータを、ＡＮＯＶＡにより分析後、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後分析により多重比較した。ｐ＜０．０５値は、有意であると考えられた。
【０１４２】
実施例２
キメラ構築物ＡｐｏＡ１−ＩＦＮαの水圧投与より、血清ＩＦＮ濃度が増加する
血清マウスＩＦＮα濃度のレベルを比較するために、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡｐｏＡＩ）、マウスインターフェロンアルファ１（ＩＦＮα１）、Ａｐｏ−ＩＦＮ（ＡｐｏＡ１とＩＦＮα１の融合物）またはＩＦＮ−Ａｐｏ（ＩＦＮα１とＡｐｏＡ１の融合物）を発現するプラスミドを、水圧注入によりマウス４匹からなる群に投与する。６時間後および１日目、３日目、６日目および９日目に得られた血清を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。ＡｐｏＡ１を発現する対照プラスミドを投与したマウスの血清は、検出可能なＩＦＮα濃度を示さず、水圧投与自体またはＡｐｏＡ１の発現は、内在性ＩＦＮαの発現を誘発しなかった（図１）。ＩＦＮα１を発現するプラスミドを注射したマウスは、６時間後高ＩＦＮα１濃度となり、急速に減少した（図１）。Ａｐｏ−ＩＦＮまたはＩＦＮ−Ａｐｏをコードするプラスミドを投与したマウスは、１日目でより高い血清インターフェロン濃度を有していた。さらに、プラスミドＩＦＮα１を注射したマウスとは異なり、３日目で高ＩＦＮα濃度が得られた（図１）。したがって、ＩＦＮαとＡｐｏＡ１の融合タンパク質を発現する構築物は、より高くかつより持続した血清ＩＦＮα濃度を有している。
【０１４３】
実施例３
メッセンジャーＲＮＡ動態は、キメラ構築物ＡｐｏＡ１−ＩＦＮαにおいて変化しない
血清ＩＦＮα濃度差は、ＩＦＮαに関する融合タンパク質の血漿半減期の増加によるか、これらのタンパク質の発現の増加により説明できる。これらの２つの選択肢の間を区別するために、これらの構築物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）動態を分析した。このために、０日目、１日目、３日目および６日目に、ＡｐｏＡ１、ＩＦＮα１、Ａｐｏ−ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏを発現するプラスミドを水圧注入投与したマウスの肝臓を、採取した。これらの試料のＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲをおこなった。図２から明らかなように、ＩＦＮα１  ｍＲＮＡ濃度を、ＡｐｏＡ１試料ではなく、ＩＦＮα１、Ａｐｏ−ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏ試料について、１日目に検出した。ｍＲＮＡ濃度は、ＩＦＮαを有する構築物の群間では有意な差はなかった。３日目と６日目に、ＩＦＮα１  ｍＲＮＡ濃度は、いずれの試料でも検出されなかった。したがって、ｍＲＮＡ動態はＩＦＮα１含有構築物を投与した全ての群において類似しており、キメラ構築物ＡｐｏＡ１−ＩＦＮα１では発現が増加するという仮説を捨てることができる。
【０１４４】
実施例４
キメラ構築物ＡｐｏＡ１−ＩＦＮαを注射したマウスは、より高い血清ネオプテリンおよび体温レベルを有する
ｉ）キメラタンパク質がＩＦＮαの生物学的活性を維持したこと、およびｉｉ）より持続するレベルがより高い生物学的活性と相関することを確認するために、ＩＦＮαの投与後に増加する２つのパラメータを分析した。プラスミドを投与してから３日後に、これらのパラメータを検討した。このときに、ＩＦＮα１を有する構築物により産生されたＩＦＮαは、もはや検出されなかったが、キメラ構築物により産生されたものが検出された。まず、血清ネオプテリン濃度を分析した。ネオプテリンは、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンにより刺激されたマクロファージにより合成されたＧＴＰのカタボライト産物である。ＩＦＮα配列を含む３つのプラスミドは、血清ネオプテリン濃度を増加したが、キメラ構築物のみが顕著に増加した（図３Ａ）。第２に、注射したマウスの腹部の体温を測定した。３つの構築物で、高レベルが観察され、キメラ構築物を投与した後に得られるレベルが際立っている（図３Ｂ）。したがって、キメラタンパク質は、インターフェロンにより誘発される２つの生物学的パラメータを増加することができ、生物学的活性を保持し、この活性が３日目における血清ＩＦＮα濃度と相関することが明らかである。
【０１４５】
実施例５
キメラ構築物ＡｐｏＡ１−ＩＦＮαはインターフェロン刺激遺伝子の肝臓発現レベルを増加させる
Ｉ型インターフェロンの活性には、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）によりコードされているタンパク質が介在している。ＩＦＮαがそれらの膜受容体に結合した後、シグナル伝達カスケードが活性化され、ＩＳＧ転写の活性化を生じる。また、キメラ構築物がこれらの遺伝子を誘発するかどうかを確認するために、これらの遺伝子のうちの４個のｍＲＮＡレベルを、水圧投与してから３日目に分析した。分析した遺伝子は、ＩＲＦ１、２’〜５’ＯＡＳ、ＵＳＰ１８、ＩＳＧ１５、Ｍｘ１である。図４から明らかなように、キメラ構築物は検討したＩＳＧのｍＲＮＡレベルを増加する。また、ＩＦＮαを発現するプラスミドにより生じた増加は、３日目に血清ＩＦＮα濃度がもはや検出されなかったにもかかわらず、検出することができる。
【０１４６】
実施例６
ＩＦＮαを有する構築物は脾細胞の数および活性を増加させる
構築物の免疫刺激活性を調べるために、脾臓細胞の数および活性の増加を、まず分析した。そのために、プラスミドを水圧注入で注射し、６日後に脾臓を細分し、総細胞をカウントし、脾細胞を、主リンパ球集団を同定するための抗体および活性化マーカー（ＣＤ６９）で標識後、フローサイトメトリーにより分析した。ＩＦＮαを有する構築物を注射すると、顕著に脾細胞を増加させた。ＩＦＮ−Ａｐｏをコードする構築物は、アッセイにおいてかなり際立っている（図５Ａ）。種々の脾細胞集団を標識するために、抗ＣＤ４抗体をＣＤ４＋Ｔ細胞マーカーとして；抗ＣＤ８をＣＤ８＋Ｔ細胞マーカーとして；抗ＣＤ１９をＢ細胞マーカーとして；抗ＣＤ４９ｂをＮＫ細胞マーカーとして使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞との関係で、キメラ構築物は、ＩＦＮαとは異なり、活性化ＣＤ４＋細胞百分率を増加させた（図５Ｂ）。しかしながら、ＩＦＮαは、顕著ではないがＣＤ８＋細胞百分率を増加させた。増加は、Ａｐｏ−ＩＦＮで顕著であり、ＩＦＮ−Ａｐｏでとりわけ高かった（図５Ｃ）。活性化Ｂ細胞百分率は、ＣＤ８＋と同じプロファイルに従う。この場合、ＩＦＮ−Ａｐｏのみは、顕著な増加を生じる（図５Ｄ）。最後に、ＮＫ細胞は、ＩＦＮαプラスミドで高活性を示し、このパラメータはキメラ構築物によっては超えられない（図５Ｅ）。このデータは、ＩＦＮ−Ａｐｏが高いアジュバント効果を有することができることを示唆している。
【０１４７】
実施例７
ＩＦＮ−Ａｐｏは細胞傷害性リンパ球により誘発される特異的溶解を増加させる
ＩＦＮ−Ａｐｏのアジュバント効果を確認するために、ＤＮＡワクチンにより誘発される細胞傷害活性の増加を、種々の構築物の存在下で分析した。免疫原性β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするＬａｃＺ遺伝子を、抗原モデルとして選択した。このタンパク質をコードするプラスミドを、ＡｐｏＡ１、ＩＦＮα１、Ａｐｏ−ＩＦＮまたはＩＦＮ−Ａｐｏをコードするプラスミドとともに、注射した。遺伝子のワクチン接種をしてから７日後、２．５μＭ  ＣＦＳＥで標識し、β−ガラクトシダーゼタンパク質由来の細胞傷害性エピトープＨ２Ｋｄ  ＴＰＨＰＡＲＩＧＬをロードした脾細胞を、静脈注射した。内部対照として、脾細胞にペプチドなしで、０．２５μＭ  ＣＦＳＥを注射した。２４時間後、細胞傷害性エピトープをロードした脾細胞の特異的溶解をフローサイトメトリーにより定量化した。図６において、ＩＦＮαを有するＡｐｏＡ１に関してより高い溶解が観察され、Ａｐｏ−ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏが続き、これを有する構築物で特異的溶解の最高値が得られる。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化百分率の結果と相関し、ＩＦＮ−Ａｐｏは、遺伝子ワクチン接種モデルにおける最高のアジュバント効果を有する構築物であると結論することができた。
【０１４８】
実施例８
ＳＲ−ＢＩの発現
アジュバント活性における増加は、ＩＦＮαの安定性の増加によるか、またはＩＦＮ−ＡｐｏのＡｐｏＡ１画分によりＩＦＮαと免疫系細胞との相互作用がより顕著になるからである。後者の仮説を調査するために、ＡｐｏＡ１の主要な受容体、ＳＲ−ＢＩの存在を、種々の免疫系集団で分析した。野生型マウスからの脾細胞を、単離し、抗ＳＲＢ−Ｉ抗体および集団を定義するための抗体で標識した。以下の抗体を使用した：ＣＤ４＋Ｔ細胞マーカーとしての抗ＣＤ４；ＣＤ８＋Ｔ細胞マーカーとしての抗ＣＤ８；ＮＫ細胞マーカーとしての抗ＣＤ４９ｂ；単球／マクロファージマーカーとしての抗ＣＤ１１ｂ；および樹枝状細胞マーカーとしての抗ＣＤ１１ｃ。ＳＲＢ−Ｉ受容体は、全ての分析した集団において検出された。免疫系エフェクター細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞）において、この受容体を発現する細胞の百分率は、１５％〜２８％の範囲である。この百分率は、単球および樹枝状細胞などの抗原提示能を有する細胞において５０％超に上昇する（図７）。この結果は、アジュバント能を増加するための可能な機構の一つは、抗原提示細胞の成熟がより高レベルあることができることを示唆している。
【０１４９】
実施例９
ＩＦＮ−Ａｐｏは抗腫瘍ワクチン接種プロトコルの効果を向上させる
ＩＦＮ−ＡｐｏがＩＦＮよりも高いアジュバント活性を有することを明らかにした後、この効果がワクチン接種プロトコルにおけるより高い抗腫瘍効果につながるかどうかを評価した。このために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ａｐｏ、ＩＦＮまたはＩＦＮ−Ａｐｏプラスミドを投与し、次の日に、フロイントの不完全アジュバントに細胞傷害性ペプチドＡＨ−１を添加したものをワクチン接種した。このペプチドは、ワクチン接種から９日後に種々の実験群に接種したＣＴ２６腫瘍株により提示される。ワクチン接種とＡｐｏプラスミドを水圧注入した対照群のマウスのほとんどは、ＣＴ２６腫瘍細胞の接種部位において皮下腫瘍を生じた。ワクチン接種に加えてＩＦＮを投与したマウスは、対照群とは大きくは異ならない挙動を示す。しかしながら、ワクチン接種とＩＦＮ−Ａｐｏプラスミドを投与したマウスの約６０％は、腫瘍細胞を拒絶できかつ実験の３０日全体を通じて腫瘍を提示しなかった（図８）。したがって、ＩＦＮ−Ａｐｏのアジュバント効果が大きいほど、ワクチン接種プロトコル効果が増加する。
【０１５０】
実施例１０
ＩＦＮ−ＡｐｏはＩＦＮよりも血液毒性が低い
ＩＦＮの限界の一つは、そのかなりの血液毒性にあり、それにより、強い白血球減少および／または血小板減少を生じた特定の患者の治療を停止しなければならないことがある。種々の構築物を水圧投与した後、血中の白血球および血小板がどのようになるかを分析した。図９Ａから、インターフェロンを有する全ての構築物は、プラスミドを水圧投与してから１日後の白血球の血中レベルが低いことが明らかである。この初期の影響は、ＩＦＮについて記載の二次リンパ器官からの白血球の出口をブロックすることによりもたらされる（Ｓｈｉｏｗ  ＬＲ等、Ｎａｔｕｒｅ．４４０（７０８３）：５４０−４（２００６））。しかしながら、３日目に、ＩＦＮの抗増殖性による毒作用があるとき、ＩＦＮで処置したマウスのみが低レベルを示した。ＩＦＮ−Ａｐｏで処置したマウスにおいて、血中白血球がそれらの正常レベルに回復した。血小板に関して（図９Ｂ）、ＩＦＮで処置した動物において、３日目に減少が観察された。この減少は、ＩＦＮ−Ａｐｏで処置したマウスにおいて顕著に低かった。したがって、ＩＦＮ−Ａｐｏは、白血球と血小板の両方のＩＦＮにより生じる減少程度を減少させる。
【０１５１】
実施例１１
ＩＦＮ−Ａｐｏは脳におけるインターフェロン誘発遺伝子の増加がＩＦＮより少ない
特定の患者における使用を制限するＩＦＮの別の主要な悪影響は、神経精神病学的障害である。中枢神経系における新規な融合分子の影響を検討するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、種々の構築物をコードするプラスミドを注射し、２４時間後に、マウスを殺生し、それらの脳を摘出した。種々の群におけるインターフェロン誘発遺伝子（ＩＳＧ）の増加（図１０）を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。融合タンパク質の血漿濃度はＩＦＮよりも高い（図１）けれども、ＩＳＧの増加は、ＩＦＮにおいて、ＩＦＮ−Ａｐｏ分子よりも顕著に大きかった。このデータは、ＩＦＮへのＡｐｏ分子の融合が血液−脳バリア（ＢＢＢ）通路を変更することを示している。０．０２％〜０．１８％の血漿インターフェロンアルファは、受動拡散によりＢＢＢを妨害する（Ｇｒｅｉｇ、Ｎ．Ｈ．等、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２４５（２）：５７４−８０（１９８８）；Ｇｒｅｉｓｃｈｅｌ、Ａ．等、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、３８（１０）：１５３９〜４３（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ａ．等、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．３７（１）：８５−８（１９８５））。したがって、脳中濃度は、血漿濃度に比例する。これに対して、ＨＤＬのＢＢＢ通路は、ＳＲ−ＢＩによる活性輸送により生じ、非常に制御されかつ低い濃度が維持される（Ｋａｒａｓｉｎｓｋａ、Ｊ．Ｍ．等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９（１１）：３５７９−８９（２００９））。本発明者等の結果は、アポリポタンパク質Ａ１への生物学的活性化合物の結合により、これらのキメラ分子がＨＤＬのＢＢＢを介した輸送機構に従うことになることを示唆している。
【０１５２】
実施例１２
ＩＦＮ−Ａｐｏ融合タンパク質は、循環し、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に組み込まれる
血液中に存在するアポリポタンパク質Ａ１の約９７％は、高密度リポタンパク質と称される高分子のリポタンパク質複合体の形態で循環する。融合タンパク質がＨＤＬに組み込まれることができるかどうかを検討するために、ＩＦＮおよびＩＦＮ−Ａｐｏ分子をコードするプラスミドを水圧経路により注射してから２４時間後に、ＨＤＬを、ＮａＢｒ勾配の分画遠心法により血清から単離した。ＩＦＮバイオアッセイ、すなわち、ウイルスの細胞変性効果からの保護のアッセイを、これらの画分を用いておこなった。段階希釈においてＩＦＮを有する試料とともに上記でインキュベーションした細胞を、細胞変性ウイルスと比較する。試料にインターフェロンがある場合、ウイルスは前処理した細胞を溶解できないであろう。ＩＦＮをコードするプラスミドを投与したマウスから得たＨＤＬは、脳脊髄炎ウイルスの細胞変性効果から細胞を保護することができなかった。このことは、ＩＦＮが循環しＨＤＬに結合しないことを示している。これに対して、２つのＩＦＮ−Ａｐｏ分子は、ＨＤＬにおけるこの手法により実際に検出することができる（図１１Ａ）。その後、ウエスタンブロットをおこなって、ＨＤＬ不含（ＨＤＬ−）血清画分および各群実験のＨＤＬ（ＨＤＬ＋）の画分中のアポリポタンパク質Ａ１を検出した。アポリポタンパク質Ａ１は、いずれのＨＤＬ枯渇画分にも検出されなかった。このことは、ＨＤＬが正しく単離されたことを示している。Ａｐｏプラスミドを投与した群と、ＩＦＮを投与した群の両方において、ＨＤＬの画分において、内在性アポリポタンパク質Ａ１の高さに相当する１つのバンドだけが検出された。これに対して、融合分子に相当するＡｐｏ−ＩＦＮ分子を有する群において、より大きな高さを有するバンドが検出された。ＩＦＮ−Ａｐｏ分子の場合において、内在性ＡｐｏＡ１の他に２つのバンドが検出された。これは、キメラタンパク質の一部分において、二量体が形成されたことを示している（図１１Ｂ）。この現象は、Ｃ末端がこの構築物において自由であり、他のＡｐｏＡ１分子との相互作用ができることによるものである。このデータは、融合分子が高密度リポタンパク質に組み込まれることができることを示している。したがって、これらの分子の生体内分布は、ＨＤＬの生体内分布を支配する法則により支配されている。これは、少なくとも部分的にＩＦＮ活性の一部分で観察される大きな変化を説明している。
【０１５３】
実施例１３
ＩＦＮ−Ａｐｏを含むＨＤＬを再投与すると、水圧投与後に観察される性質が維持される
ＩＦＮ−Ａｐｏをコードするプラスミドを投与したマウスの血清からＩＦＮ−Ａｐｏを含むＨＤＬを精製できる可能性があり、生理学的ＩＦＮ−Ａｐｏナノリポ粒子を提供して生体外と生体内の両方の特性を検討することができる。ＩＦＮ−Ａｐｏを有するＨＤＬを精製し、ＩＦＮ１００００ＩＵ／マウスに相当する量を投与した。３日目に、血中のリンパ球数と血小板数を分析した。組み換えＩＦＮの投与量では、これらのパラメータを減少させることはできなかった。しかしながら、ＩＦＮ−ＡｐｏのＨＤＬを投与したマウスは、顕著に高いレベルを示した（図１２Ａ）。この現象は、ＩＦＮ−ＡｐｏがＩＦＮよりも効率的に潜在的な造血細胞増殖を刺激するという事実によるものである（Ｅｓｓｅｒｓ  ＭＡ等、Ｎａｔｕｒｅ．２月１１日（２００９））。１日目において、ＩＦＮにより誘発される鬱状態を、これらのマウスで測定した。ここでも、組み換えＩＦＮを投与したマウスと、ＩＦＮ−ＡｐｏのＨＤＬを同等の投与量で投与したマウスとの間には大きな差がある。水圧投与後に得られるデータは再現される。
【０１５４】
実施例１４
ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４構築物は、ＩＬ１２−介在ＩＦＮγ誘発を増加する
インターロイキン１２（ＩＬ１２）は、強力な抗腫瘍活性を有する免疫刺激サイトカインである。その活性は、ＩＦＮγにより実質的もたらされる。このメディエーターの産生は、ＴＧＦβにより調整され、したがって、阻害ペプチドｐ１７またはｐ１４４によるブロッキングは、ＩＦＮγ誘発を増加し、したがって、ＩＬ１２の抗腫瘍活性を増加する。種々のペプチド配列により結合されたＡｐｏＡ１およびＴＧＦβ阻害ペプチドにより形成されたキメラ構築物がＩｌ１２介在ＩＦＮγ誘発を増加するかどうかを検討するために、マウスＩＬ１２をコードするプラスミドおよび種々の構築物をコードするプラスミドを、水圧注入により投与した。ＡｐｏＡ１を、対照として使用した。２つの構築物を、ｐ１７を用いて生成した：ｉ）ＡｐｏＡ１シグナルペプチドが先にあるペプチドｐ１７をコードする配列を含むｓｐＰ１７であり、細胞外培地へのペプチドｐ１７の放出が得られる、ｉｉ）ＡｐｏＡ１をコードする遺伝子、続いて３つの結合アミノ酸（ＧＡＰ）、およびｐ１７をコードする配列を含むＡｐｏＡ１−Ｐ１７。構築物ｓｐＰ１４４およびＡｐｏＡ１−Ｐ１４４を、ｐ１４４を用いて生成し、ｐ１７をコードする配列を、ｐ１４４をコードする配列と置き換える。別の２つの構築物をさらに生成した：ｉ）結合ペプチドとしてのメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）の標的を含むＡｐｏＡ１−ＭＭＰ９−Ｐ１４４、ｉｉ）結合ペプチドとしての延長配置を有する配列を含むＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４。
【０１５５】
水圧注入してから４日後、血清ＩＦＮγ濃度を、ＥＬＩＳＡにより分析した。ＩＬ１２およびＡｐｏＡ１をコードするプラスミドを注射することにより、検出可能なレベルのＩＦＮγを生成した。ｐ１７を有する構築物を注射しても、これらのレベルは増加しなかった（図１３Ａ）。しかしながら、ｐ１４４を生成する構築物を投与すると、ＩＦＮγレベルが大きく増加した（図１３Ｂ）。構築物ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４は、ｐ１４４単独により誘発されたよりも顕著に大きな最高レベルを生成した（図１３Ｂ）。不思議なことに、構築物ＡｐｏＡ１−Ｐ１４４およびＡｐｏＡ１−ＭＭＰ９−Ｐ１４４は、ＩＦＮγ誘発を増加しなかった。このことは、結合ペプチド配列がキメラ構築物の活性に大きな影響を有することを示している。構築物ＡｐｏＡ１−ＭＭＰ９−Ｐ１４４は、ＭＭＰ９の存在下でだけ活性である潜在性インヒビターの一例であり、ＡｐｏＡ１への配列結合を開裂すると、ＭＭＰ９が発現する部位において活性ペプチドｐ１４４を放出するであろう。このプロテアーゼは、数多くの種類の腫瘍、例えば、肝細胞癌、および腫瘍間質に侵入する骨髄サプレッサー細胞により発現する。したがって、この構築物は、主に作用しなければならない部位にｐ１４４を放出でき、全身性ＴＧＦβ阻害の悪影響を制限することができる。
【０１５６】
実施例１５
ｐ１７およびＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４を発現する構築物は、腫瘍のないワクチン接種マウスの百分率を増加する
独立した実験モデルでのＴＧＦβ阻害ペプチドを有する構築物の生物学的活性を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、フロイントの不完全アジュバントを用いて細胞傷害性エピトープＨ２Ｋｄ  ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ、配列番号：５４）をワクチン接種した。７日後、種々の構築物を、水圧注入により投与した。さらに７日後、５ｘ１０５ＣＴ２６細胞を、皮下接種した。腫瘍のない動物の百分率を、経時的に分析した。ワクチン、およびＡｐｏＡ１を発現する対照構築物を投与した群において、全てのマウスは、ＣＴ２６細胞接種部位において皮下腫瘍を生じた。しかしながら、ｐ１７を発現する２種の構築物の１つを投与したマウスの５０％超は、実験の終わりに腫瘍のない状態のままであった（図１４Ａ）。ｐ１４４を有する構築物の場合において、ペプチドｐ１４４を発現する構築物、構築物ＡｐｏＡ１−Ｐ１４４および構築物ＡｐｏＡ１−ＭＭｐ９−Ｐ１４４は、極めて限定した効果を有し、実験の終わりでは、腫瘍のないマウスは２０％未満であった。 驚くべきことに、構築物ＡｐｏＡＩ−リンカー−Ｐ１４４は、８５％を超えるマウスにおいて、主要の発症を防止することができた。
【０１５７】
実施例１６
ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４タンパク質は、循環して高密度リポタンパク質に組み込まれる
ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４タンパク質が、ＨＤＬと複合体を形成するかどうかを検討するために、ＨＤＬを含む画分を、ＡｐｏＡ１−リンカーＰ１４４をコードするプラスミドを水圧経路により投与したマウスの血清から単離した。このため、血清を、ＮａＢｒ勾配で分画遠心分離した。ＨＤＬを精製した後、ウエスタンブロットをおこなってアポリポタンパク質Ａ１を検出した。内在性アポリポタンパク質Ａ１に対応する主要バンドの他に、ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４分子に対するより大きな高さを有するバンドが検出された（図１５）。したがって、融合治療ペプチドを有するアポリポタンパク質Ａ１は、生理学的ナノリポ粒子の形態で組み込まれかつ循環することができる。
【０１５８】
実施例１７
ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４を含むＨＤＬは、ＩＬ−１２により誘発されるＩＦＮγを増加する
ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４を含むＨＤＬを精製することにより、ＴＧＦβ活性を阻害する能力を有する生理学的ナノリポ粒子を得ることができる。これらの生体内活性を示すために、ＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４を発現する動物から精製したＨＤＬを、マウスに接種した。このマウスには、ドキシサイクリンの投与に反応してインターロイキン１２を発現するプラスミドの水圧注入投与を同時におこなった。陽性対照として、プラスミドＡｐｏＡ１−リンカー−Ｐ１４４を共投与した。ＨＤＬの投与後に得られるＩＦＮγ濃度は、水圧注入後に得られるものと類似している（図１６）。両方の場合において、ＴＧＦβインヒビターの存在なしでのＩＬ−１２プラスミドの誘発後に得られるよりも顕著に高い。したがって、ＨＤＬに存在するペプチドＰ１４４は生体内でＴＧＦβをブロックすることができ、ＩＦＮγのより大きな誘発を可能とする。したがって、アポリポタンパク質ＡＩとの融合を介してＨＤＬにペプチドを組み込むことは、新規な治療ペプチドを考案する魅力的な戦略である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５ＢＣ】
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【図５ＤＥ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１６】
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【図６】
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【図７ＡＢ】
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【図７ＣＤ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月10日(2014.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＡｐｏＡ分子との類似性または同一性を少なくとも９５％示すポリペプチドと、
（ｉｉ）治療に関連する化合物と
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体。
【請求項２】
（ｉ）ＡｐｏＡ分子の機能的に同等な変異体と、
（ｉｉ）治療に関連する化合物と
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなり、肝細胞膜への前記ＡｐｏＡ分子の機能的に同等な変異体の結合の解離定数が少なくとも１０−８Ｍである、複合体。
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＡｐｏＡ分子との類似性または同一性を少なくとも９５％示すポリペプチドと、
（ｉｉ）治療に関連する化合物と
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体。
【請求項２】
（ｉ）ＡｐｏＡ分子の機能的に同等な変異体と、
（ｉｉ）治療に関連する化合物と
を含んでなり、
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが共有結合してなり、肝細胞膜への前記ＡｐｏＡ分子の機能的に同等な変異体の結合の解離定数が少なくとも１０−８Ｍである、複合体。
【請求項３】
前記ＡｐｏＡ分子が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＡ−Ｖまたは機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＡｐｏＡ分子が、ヒトＡｐｏＡおよびマウスＡｐｏＡからなる群から選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
成分（ｉｉ）が、ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
成分（ｉ）および成分（ｉｉ）が、一本鎖ポリペプチドを形成してなる、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
成分（ｉ）のＣ末端が成分（ｉｉ）のＮ末端に結合しているか、または成分（ｉ）のＮ末端が成分（ｉｉ）のＣ末端に結合してなる、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
成分（ｉｉ）が、インターフェロンである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記インターフェロンが、ヒトまたはマウスインターフェロンα１またはインターフェロンα５である、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
成分（ｉｉ）が、ＴＧＦ−β阻害剤である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、配列番号４（Ｐ１４４）および配列番号５（Ｐ１７）または機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
成分（ｉ）と成分（ｉｉ）とが、ペプチドリンカーにより接続されてなる、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーが、可撓性ペプチドであり、および／またはプロテアーゼ認識部位を含むものである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記リンカーが、配列番号１３（ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ）、ＧＡＰまたはマトリックスメタロプロテアーゼ−９認識部位からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物または請求項１６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体を含んでなる、ナノリポ粒子。
【請求項１９】
前記ナノリポ粒子が、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である、請求項１８に記載のナノリポ粒子。
【請求項２０】
治療に有効な量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬製剤。
【請求項２１】
医薬として用いられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子、または請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
肝疾患の治療または免疫系関連疾患の治療に用いられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子、または請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
慢性肝炎Ｃ、慢性肝炎Ｂ、肝細胞癌、パーキンソン病、急性間欠性ポルフィリン症、肺線維症、骨転移、全身性硬化症、 限局性強皮症、皮膚癌、光線角化症、ケロイド瘢痕、やけど、心臓線維症、腎線維症、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、リウマチ様関節炎および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子、または請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
ワクチンアジュバント、免疫療法におけるアジュバント、大腸癌の治療におけるアジュバント、抗血管新生薬、または腎臓プロテクターとして用いられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子、または請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８または１９に記載のナノリポ粒子または請求項２０に記載の医薬製剤からなる群から選択される第１成分であって、成分（ｉｉ）がＴＧＦ−β１  阻害ペプチドである第１成分と、
（ｂ）免疫刺激サイトカイン、前記サイトカインをコードしているポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、ＴＧＦ−β１阻害ペプチド、細胞毒性薬またはそれらの組み合わせを含んでなる群から選択される第２成分と、
を含んでなる組み合わせ。
【請求項２６】
成分（ａ）または成分（ｂ）における前記ＴＧＦ−β１阻害ペプチドが、ペプチドｐ１４４およびペプチドｐ１７からなる群から選択されるものである、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項２７】
成分（ｂ）における前記免疫刺激サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項２５または２６に記載の組み合わせ。
【請求項２８】
癌の治療のための、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組み合わせ。