(57)【要約】  本発明は、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルにおける変化の検出に基づく、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、あるいは前立腺癌ＰＣａの進行をモニタリングするための、被検体における前立腺癌（ＰＣａ）の診断方法および診断キットに関する。本発明は、４〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内の血清ＰＳＡを有する被検体が、前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体において所望の感度で前立腺癌（ＰＣａ）を診断する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記バイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉ）が、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定された、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび追加のバイオマーカーのレベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、さらに
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、追加のバイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、
（ｉ）前記治療の実施前に得た前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記治療の実施中または実施後に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉｉ）前記治療の実施前および実施中または実施後に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を比較することを含んでなり、
前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは
前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法。
【請求項４】
工程（ｉ）および（ｉｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記さらなるバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉｉ）が、前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記追加のバイオマーカーに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかもしくは変化しないこと、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して低下することが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していること、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被検体における前立腺癌（ＰＣａ）の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）第１期に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と
（ｉｉ）第２期に同一被検体から得た生体液体サンプル中の前記遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものであり、前記第２期が、前記第１期よりも後である工程と、
（ｉｉｉ）第１期および第２期に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
第２期でのサンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、前立腺癌が被検体において進行していないことを示し、あるいは
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、前立腺癌の進行を示すものであるとする、方法。
【請求項６】
工程（ｉ）および（ｉｉ）が、患者における前立腺癌についての追加のバイオマーカーのレベルを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉｉ）が、患者における前記バイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、被検体の陽性進行を示し、あるいは
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベル値が、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、被検体の陰性進行を示すものであるとする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、前記被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法。
【請求項８】
工程（ｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉ）が、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカーレベル値に相当するものであり、さらに
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団が、４ｎｇ／ｍＬを超えるＰＳＡレベルを有する患者、および／または陽性ＤＲＥを示す患者で形成されてなる、請求項７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団が、１０ｎｇ／ｍＬよりも低いＰＳＡレベルを有する患者で形成されてなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体液体サンプルが、前立腺マッサージ後に得られる、排泄された尿サンプル由来の沈渣である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
所望の感度が１００％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルが、当該ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲを測定する同一サンプル中の前立腺特異的ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化されてなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前立腺ハウスキーピング遺伝子がＰＳＡであり、ＰＳＡの発現レベルがＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを測定することによって決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子、および／またはハウスキーピング遺伝子の発現レベルが、定量的ＰＣＲによって決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
定量的ＰＣＲが多重ＰＣＲである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者が、孤立性または多発性の高悪性度前立腺上皮内腫瘍に罹患している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１成分と、場合により第２成分とを含んでなるキットであって、
第１成分が、下記からなる一連の試薬であり：
ｉ）    遺伝子ＰＣＡ３の発現レベルを測定可能な試薬；
ｉｉ）  遺伝子ＰＳＭＡの発現レベルを測定可能な試薬；および
ｉｉｉ）遺伝子ＰＳＧＲの発現レベルを測定可能な試薬；
第２成分が、１つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な１つまたはそれ以上の試薬からなる、キット。
【請求項１９】
前立腺癌を有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、あるいは被検体における前立腺癌の進行をモニタリングするための、前立腺癌を診断するための、請求項１８に記載のキットの使用。
【請求項２０】
前立腺生検の候補と評価される被検体が、４〜１０ｎｇ／ｍＬの血清ＰＳＡレベルを有する被検体である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の分野に含まれ、より詳細には、正常な（すなわち、非癌性の）前立腺細胞における発現と比較して、前立腺癌細胞において過剰発現している遺伝子の組み合わせを用いた、前立腺癌の診断の分野に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌（ＰＣａ）は、西洋男性における最も一般的な癌となっており、肺癌を除く任意の他の癌の中で、男性の死亡の最多の原因である。生涯でこの癌を発症するリスクは、男性の６人に１人と推定され、転移性ＰＣａによる死亡のリスクは、３６人に１人である。過去一世紀の１９８０年代後半に、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）試験が導入されたことにより、ＰＣａ検出は劇的に増加したが、死亡率は有意には低下しなかった［Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら（２００７）．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００７．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，２００９年６月９日，５７，４３〜６６］。これには２つの主な理由：５０歳を超える男性集団に広く受け入れられた欠陥のある、非侵襲的な早期診断方法、および、疾患が未だ前立腺に限定されている場合に限り、根治手術によって治癒され得るという事実、がある。
【０００３】
早期における症状はないので、必要な予防検査を受けるのは、女性人口の７０％以上であるのとは対照的に、男性の３０％未満である。現在のところ、これらの検査は診断トライポッドからなる：（ｉ）患者の血液中のＰＳＡの定量、（ｉｉ）直腸指診（ＤＲＥ）検査、そして最後に、（ｉｉｉ）約１０回の経直腸的超音波ガイド下針生検法（ＴＲＵＳ）の診断セットによる確認であり、これは、ＤＲＥで異常があるか、ＰＳＡが上昇しているか（４．０ｎｇ／ｍＬを超える）、実際に２．５ｎｇ／ｍＬを超える傾向があるか、またはＰＳＡ速度（ＰＳＡ変化量）が０．４超０．７５ｎｇ／ｍＬ／年までの男性に行われる。前記検査は、西半球におけるＰＣａスクリーニングについての治療の至適基準を構成している。それにもかかわらず、ＰＳＡおよびＤＲＥは特異度が著しく不足しており、生検は理想的な感度が不足している。
【０００４】
腫瘍マーカーとしてのＰＳＡの限界の１つは、その特異度の不足であり、結果として高い負の生検率をもたらす。ＰＳＡのグレーゾーン（４〜１０ｎｇ／ｍＬ）では、早期ＰＣａを有する男性と、良性過形成（ＢＰＨ）および無症候性慢性前立腺炎などの前立腺の良性症状を有する男性との間で、血清ＰＳＡ値に実質的な重複がある［Ｌｏｅｂ，Ｓ．ら（２００９）．Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）．Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，６４〜６６；Ｐａｎｎｅｋ，Ｊ．およびＰａｒｔｉｎ，Ａ．Ｗ．（１９９７）．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：１９９７年の最新情報、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ  Ｐａｒｋ）１１，１２７３〜１２７８；考察１２７９〜１２８２］。
【０００５】
ＰＳＡスクリーニングの限界を克服するために、種々の試みがなされている。これらとしては、年齢調整ＰＳＡカットオフポイント、遊離型ＰＳＡ、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ速度、ＰＳＡ勾配、およびＰＳＡ倍加時間の使用が挙げられる。これらはすべて、「臨床的に重要な」ＰＣａの症例の検出を改善する手段として提案されている。それにもかかわらず、これらのテストストラテジーのいずれかが健康転帰を改善するという証拠は示唆されていない。
【０００６】
現在のスクリーニングパラメータの結果として、欧州で毎年行われる約３９０，０００回の生検のおよそ３分の２が不必要である［Ｃａｔａｌｏｎａ，ＷＪ．ら、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２４：１１５６〜６１（１９９１）；Ｍａｋｉｎｅｎ，Ｔ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  ｒｏｕｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ＰＣａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２２３１〜６（２００４）］。生検の偽陽性率はおよそゼロであるが、初回の生検における偽陰性率は、１２〜３０％のあたりを変動する。結果的に、陰性の生検所見を有する多くの男性は、ＰＣａを排除するために繰り返し生検を受ける。
【０００７】
進行性ＰＣａのハイリスク患者、および繰り返し前立腺生検を強制される患者を特定するのに役立ち得る、より正確な試験が必要である。したがって、非侵襲的手順を用いて早期にＰＣａを検出する喫緊の必要性がある。
【０００８】
前立腺特異的であるのみならず、前立腺腫瘍において過剰発現もしている、広範囲の有望なＰＣａバイオマーカーが同定されており、これらとしては、ＧＳＴＰ１のＣｐＧ過剰メチル化、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合、およびＲＮＡバイオマーカー  ＰＣＡ３が挙げられる［Ｍａｒｋｓ，Ｌ．Ｓ．およびＢｏｓｔｗｉｃｋ，Ｄ．Ｇ．（２００８）．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＰＣＡ３  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ：Ｅｘａｍｐｌｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．ＰＣＡ３遺伝子テストの前立腺癌得異度：臨床診療からの例、Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ  １０，１７５〜１８１；Ｓａｒａｍａｋｉら（２００８）．ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合は良好な予後を有する前立腺癌のサブグループを特定する、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４，３３９５〜３４００；Ｖｅｎｅｒら（２００８）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｕｒｉｎｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、前立腺癌診断のためのマルチプレックス尿検査の進歩、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５４，８７４〜８８２］。前立腺細胞はＰＣａを有する男性の尿において検出することができ、尿ベースの診断試験は非侵襲性または最小限の侵襲性であるという利点があるため、より広範な男性集団に受け入れられるであろう。ＰＣＡ３発現およびＧＳＴＰ１メチル化についての尿ベースの試験は、大規模なスクリーニングプログラムにすでに記述されているが、癌増殖の多様性を考慮に入れた診断プロファイルに基づく研究は２つしか存在せず、１つはＲＮＡを用い、もう１つはゲノムＤＮＡを用いる［Ｌａｘｍａｎら（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８，６４５〜６４９］。
【０００９】
国際公開ＷＯ０３／００９８１４号には、患者がＰＣａに罹患しているか否かを評価する方法が開示されており、該方法は、患者サンプル中の一連のマーカーから選択されるマーカーの発現レベルを、コントロール非ＰＣａサンプル中の前記マーカーの正常な発現レベルと比較する工程を含み、ここで、患者サンプル中における前記マーカーの発現レベルの有意な上昇および正常レベルは、患者がＰＣａに罹患していることの指標である。ＰＣＡ３（Ｍ３８１）、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）およびＰＳＧＲ（Ｍ３１１）マーカーは、前記一連のマーカーに含まれている；それにもかかわらず、国際公開ＷＯ０３／００９８１４には、ＰＣａの早期検出のための特異的な３遺伝子パネルとして、前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲマーカーの特異的な組み合わせが開示されていない。
【００１０】
ドイツ特許第１０  ２００６  ０３２  ３９４号には、患者サンプル中のマーカー群である、ＺＩＰ／ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＡＭＡＣＲ、ＤＤ３／ＰＣＡ３、Ｄ−ＧＰＣＲ、ＥＺＨ２、ＰＣＧＥＭ１、ＰＤＥＦ、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＧＲ／ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＲＰＭ８から選択される、少なくとも２つのマーカーの発現を比較する工程を含む、ＰＣａの診断方法が開示されている。しかしながら、データの分析はロジスティック回帰分析によって行われている。さらに、ドイツ特許第１０  ２００６  ０３２  ３９４号に記載されているマーカーの好ましい組み合わせのいずれも、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲマーカーの特異的な組み合わせに存在しない。
【００１１】
さらに、国際公開ＷＯ２００８／１２１１３２号には、患者サンプル中の一連のマーカーから選択されるマーカーの発現レベルを基準値と比較する工程を含む、患者がＰＣａに罹患しているか否かを評価する方法が開示されている。ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲマーカーは、前記一連のマーカーに含まれている；それにもかかわらず、国際公開ＷＯ２００８／１２１１３２号には、ＰＣａの早期検出のための特異的な３遺伝子パネルとして、前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲマーカーの特異的な組み合わせが開示されていない。
【００１２】
ＤＲＥおよびＴＲＵＳと組み合わせたＰＳＡ血清測定が、西半球におけるＰＣａスクリーニングについての治療の至適基準を構成しているという事実にもかかわらず、ＰＳＡおよびＤＲＥは特異度が著しく不足しており、生検は理想的な感度が不足している（１２〜３０％の偽陰性）。
【００１３】
ＰＣａの診断に最も一般的に用いられているマーカーの１つは、尿サンプル中のＰＣＡ３の測定である。Ｖａｎ  Ｇｉｌｓら［ｖａｎ  Ｇｉｌｓ  ＭＰら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：９３９〜４３（２００７）］は、癌陽性生検を有する１７４人の男性（３３％）を含む５３４人の患者（血清ＰＳＡ  ３〜１５ｎｇ／ｍＬ）において、ＰＣＡ３の感度６５％および特異度６６％（ＡＵＣ０．６６）を報告した。Ｈｅｓｓｅｌｓら［Ｈｅｓｓｅｌｓ  Ｄら、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ４４：８〜１５；考察１５〜６（２００３）］は、１０８人の患者の集団調査において、感度６７％および特異度８３％（ＡＵＣ０．７２）を観測した。Ｍａｒｋｓら［Ｍａｒｋｓ  ＬＳら；Ｕｒｏｌｏｇｙ  ６９：５３２〜５（２００７）］は、繰り返し生検後に２７％が癌を示した２３３人の患者（ＰＳＡ  ２．５ｎｇ／Ｌ以上）の集団調査において、感度５８％および特異度７２％（ＡＵＣ０．６８）を観測した。Ｇｒｏｓｋｏｐｆら［Ｇｒｏｓｋｏｐｆ  Ｊら；Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：１０８９〜９５（２００６）］は、７０人の患者の集団調査において、感度６９％および特異度７９％（ＡＵＣ０．７５）を観測した。Ｈａｅｓｅら［Ｈａｅｓｅ  Ａら；Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ５４：１０８１〜８（２００８）］は、繰り返し生検陽性のハイリスク患者を特定する研究において、４６３人の患者中３５人のカットオフで、ＰＣＡ３の感度４７％および特異度７２％（ＡＵＣ０．６６）を報告した。
【００１４】
現在のところ、生検ストラテジーは、不均一な腫瘍病巣を見逃す可能性があるが、尿ベースのアッセイは、前立腺全体に由来する複数の病巣の細胞が尿中に放出されて採取され得るため、非常に有利であろう［Ｌａｘｍａｎ  Ｂら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００６；８：８８５〜８］。しかしながら、マーカーが尿サンプル中で分析される場合、前立腺マッサージ（ＰＭ）後に得られる、排泄された尿サンプル由来の沈渣における定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイは、大部分が悪性でない細胞のバックグラウンドで、少数の悪性細胞を検出し得るであろう。さらに、単一のマーカーがＰＣａの多因子性、多発性および不均一性を必ずしも反映し得るわけではないので、種々のバイオマーカーを組み合わせることにより、単一のバイオマーカーよりも明らかに性能が向上するであろう［Ｅｔｚｉｏｎｉ  Ｒら、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００３；４：５２３〜３８］。複数のマーカーを、臨床データおよび人口統計データと組み合わせて用いることにより、進行性ＰＣａのリスクがある患者の予測およびその予後の評価に役立つであろう。このため、単一のマーカーについて９５％を超える感度の範囲で、特異度は劇的に低下するであろう。例えば、ＰＣＡ３について感度９６％で、特異度はたったの１４％であることがわかった［Ｍａｒｋｓ  ＬＳら、Ｒｅｖ．Ｕｒｏｌ．２００８；１０：１７５〜８１］。
【００１５】
さらに、このトピックで実施した調査にもかかわらず、ＰＣａの診断についても臨床的観点から有用な腫瘍マーカーは、現在ほとんど存在しない。さらに、欧州では毎年、非常に多数の不必要な生検（約２６０，０００回）が行われている。したがって、上記欠点のいずれかを解決するようなＰＣａ診断を可能にする方法が、当該分野で必要である。前記方法により、有利なことに、非侵襲的手順を用いてＰＣａを早期に検出できるはずである。したがって、現在用いられている診断技術を補完するか、またはそれに取って代わる可能性のある、追加のバイオマーカーが必要である。
【発明の概要】
【００１６】
ＰＣａの検出のために、ＰＣＡ３転写産物単独およびＰＳＡ単独よりも優れた、尿転写産物の新規多重パネルが同定されている。本発明者らは、前立腺生検に参加している１５４人の患者から、推定上のＰＣａバイオマーカーであるＰＣＡ３、ＰＳＧＲ、およびＰＳＭＡの過剰発現について、ＰＭ後の尿沈渣を試験した。複合マーカーモデルについての曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８０であった。前立腺生検によるＰＣａ検出率は、３７％（５７人／１５４人）であった。続いて、本発明者らは、血清ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬであって、生検歴のない７７人の男性（３５％がＰＣａを有する）（特に価値のある群）の標的サブセットにおけるその臨床有用性を詳細に試験した。ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）も、ＰＳＡ特異度を高める古典的臨床ツールとして本解析に含めた。多重モデルを用いると、特に価値のある前記群内の男性での曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８９であり、群全体では０．８０であった。感度を９６％にすると、特異度は６２％（群全体で４０％）であった。前記３遺伝子組み合わせをＰＳＡＤと併用すると、実行された不必要な生検の４２％（群全体で２６％）を回避することが可能になるであろう。したがって、本発明者らは、多数の不必要な生検を回避しつつ、ＰＳＡの特異度を高めるのに用いられ得る、尿中のＰＣａを検出する高感度の方法を実証した。この新規方法により、ＰＳＡの診断効率が高まり、ＰＳＡのグレーゾーンに特に有用である。
【００１７】
したがって、本発明は、差次的発現がＰＣａと関連している、遺伝子の組み合わせの同定に基づく。このモデルをさらに用いて、生検を実行すべきか否かを評価する。種々の態様において、本発明は、ＰＣａの有無を評価する（例えば、診断または予後診断する）方法、およびＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法、および被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングする方法を提供し、これらの方法は、被検体由来のサンプルに基づき、ＰＣａに関連する３つの特異的遺伝子（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）の量を定量的に測定するものである。
【００１８】
したがって、第一の態様において、本発明は、被検体において所望の感度でＰＣａを診断する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、方法に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、
（ｉ）前記治療の実施前に得た前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記治療の実施後に得た前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉｉ）前記治療の実施前および後に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を比較することを含み、
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法に関する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）第１期に前記被検体から得た生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）第２期に得た同一被検体の生体液体サンプル中の前記遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記第２期が、前記第１期よりも後であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉｉ）第１期および第２期に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、被検体の陽性進行を示し、あるいは
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、被検体の陰性進行を示すものであるとする、方法に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、第１成分と、場合により第２成分とを含むキットであって、
第１成分が、下記からなる一連の試薬であり：
ｉ）    遺伝子ＰＣＡ３の発現レベルを測定可能な試薬；
ｉｉ）  遺伝子ＰＳＭＡの発現レベルを測定可能な試薬；および
ｉｉｉ）遺伝子ＰＳＧＲの発現レベルを測定可能な試薬；
第２成分が、１つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な１つまたはそれ以上の試薬からなる、キットに関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、あるいは被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングするための、ＰＣａを診断するための、請求項１６に記載のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】尿ベースのＰＣａバイオマーカーの特性決定を示す。Ｆｉｇ．１．１は、ＰＣａを有する男性における、ＰＣＡ３（Ａ）、ＰＳＧＲ（Ｂ）、ＰＳＭＡ（Ｃ）およびＰＳＡＤ（Ｄ）の良性に対する相対的レベル、そして、血清ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬであって、生検歴のないＰＣａを有する男性（特に臨床的に価値のある患者群）におけるＰＣＡ３（Ｅ）、ＰＳＧＲ（Ｆ）、ＰＳＭＡ（Ｇ）およびＰＳＡＤ（Ｈ）の良性に対する相対的レベルを示す。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図２Ａ】生検で前立腺癌が検出された男性および癌が検出されなかった男性における複合バイオマーカーについての受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＰＣＡ３についてのＲＯＣ曲線（×）、ＰＳＧＲについてのＲＯＣ曲線（黒塗りの丸）、およびＰＳＭＡについてのＲＯＣ曲線（▽）、およびＰＳＡＤ（×）、複合３遺伝子のＲＯＣ（黒塗りのひし形）。複合３遺伝子＋ＰＳＡＤのＲＯＣ曲線（□）。完全なＲＯＣ曲線および感度９０〜１００％に相当する領域を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの続き。
【図３】生検で前立腺癌が検出された男性および癌が検出されなかった男性における、ロジスティック回帰モデルとｍＲＯＣモデル３Ｍ（ＰＳＭＡ  ｖ．ＰＳＧＲ  ｖ．ＰＣＡ３）との比較を示す。
【図４Ａ】ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬであって、生検歴のない男性における、個々のマーカーと複合バイオマーカー（ＰＣＡ３、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡ＋ＰＳＡＤ）とを比較した受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＰＣＡ３についてのＲＯＣ曲線（×）、ＰＳＧＲについてのＲＯＣ曲線（黒塗りの丸）、およびＰＳＭＡについてのＲＯＣ曲線（▽）、およびＰＳＡＤ（×）、複合３遺伝子のＲＯＣ（黒塗りのひし形）。複合３遺伝子＋ＰＳＡＤのＲＯＣ曲線（□）。完全なＲＯＣ曲線および感度９０〜１００％に相当する領域を示す。
【図４Ｂ】図４Ａの続き。
【図５】研究対象の全患者と、特に価値のある臨床的リスク群（ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲であって、生検歴なし）とを比較した、回避され得る生検を示す。生検回避率（％）＝（真陰性＋偽陰性）／全患者。感度＝真陽性／（真陽性＋偽陰性）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の診断方法
本発明者らは、ＰＣａと診断された患者の腫瘍サンプルにおいて非ＰＣａ参照サンプルに対して差次的に発現する特異的遺伝子の組み合わせを同定し、これを複合ＲＯＣ分析で分析すると、向上した性能でＰＣａの検出が可能な複合マーカーを得ることが可能になる。例えば、本発明のＦｉｇ．２に示すように、複合ＲＯＣ分析により、ＡＵＣ０．８０でＰＣａの検出が可能になり、個々のマーカー単独についてのＡＵＣ（ＰＣＡ３について０．６１；ＰＳＧＲについて０．６４およびＰＳＭＡについて０．６３）と比較して複合ＲＯＣ分析は向上する。各バイオマーカーにつき１つの検出閾値（カットオフ）を用い；次いで、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、患者を陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値（カットオフ）の範囲にわたって算出した。
【００２６】
したがって、第１の態様において、本発明は、被検体において所望の感度でＰＣａを診断する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、方法に関する。
【００２７】
本発明は、被検体において所望の感度でＰＣａを診断する方法であって、
（ｉ）前記被検体から生体液体を準備する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記生体液体のサンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
（ｉｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、方法に関する。
【００２８】
本明細書中で使用される「診断方法」という語句は、前述の工程から本質的に構成され得るか、または追加の工程を含み得る方法に関する。しかしながら、好ましい実施形態において、この方法はインビトロで実施される（すなわち、ヒトや動物の体内では実施されない）方法であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される診断は、被検体が疾患に罹患している確率を評価することに関する。当業者に理解されるように、このような評価は通常、そうであることが好ましいが、診断される被検体の１００％について正しいわけではない。しかしながら、この用語は、統計的に有意な部分の被検体が、疾患に罹患しているかまたはその傾向があると同定され得ることを必要とする。当業者は、複数の周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、Ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、マンホイットニー検定などを用いることによって、それ以上遅延することなく、ある部分が統計的に有意であるか否かを決定し得る。詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の信頼区間であり、好ましくは少なくとも９９％の信頼区間である。Ｐ値は、好ましくは０．２、０．１、０．０５であり、好ましくは０．０１である。本発明の診断方法により、被検体がＰＣａに罹患しているか否かを評価することが可能になる。
【００２９】
「前立腺癌」という用語は、癌の病期にかかわりなく、前立腺の細胞が突然変異して制御不能に増殖を始める、前立腺の任意の癌をいう。患者におけるＰＣａの進行度は、臨床的および病理組織学的情報を考慮して評価される。癌の病期は、腫瘍サイズ（Ｔ）、リンパ節転移の有無（Ｎ）、転移の存在（Ｍ）、および腫瘍悪性度分類（Ｇ）に基づいて分類される。Ｔ１として分類される腫瘍は、前立腺に限定され、小さすぎて直腸指診で触知することができない。Ｔ１はさらに、Ｔ１ａ（組織サンプル中に５％未満の癌細胞）およびＴ１ｂ（５％を超える）細分を含む。Ｔ１ｃは、患者が増加した前立腺特異抗原（ＰＳＡ；後述の定義を参照）を有することを示す。腫瘍が直腸指診中に触知されるほど大きければ、Ｔ２として分類される。Ｔ２ａは、前立腺の片側（左または右）のみが関与することを意味し、Ｔ２ｂは、両側に腫瘍があることを意味する。Ｔ２は、一般的に「限局性癌」と称される。癌がＴ３であれば、前立腺付近の結合組織（Ｔ３ａ）または精嚢（Ｔ３ｂ）に広がっている。Ｔ４は、癌が前立腺に隣接した組織、例えば、膀胱括約筋、直腸または骨盤壁に広がっていることを示す。前立腺癌はまた、骨盤の所属リンパ節の中へ広がる場合もあり、これは、前立腺癌のＮ１期として評価される。これらＴ３、Ｔ４、およびＮ１期は、まとめて、「局所進行」または局所癌と称される。癌が骨等の遠隔部位に広がっている場合は、「転移した」またはＭ１期であると言われる。遠位リンパ節に広がった前立腺癌がＭ１ａとして分類される一方で、骨に広がったものはＭ１ｂであり、肝臓または脳等の器官に広がったものはＭ１ｃとして評価される。未治療で放置されると、前立腺癌は、ほぼ例外なく骨に転移する。
【００３０】
本明細書中で使用される「被検体」は、哺乳類として分類される任意の動物をいい、家畜、霊長類、およびヒト、例えば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、被検体は、任意の年齢または人種の男性または女性の人間である。
【００３１】
好ましい実施形態において、測定が実施される被検体は、４ｎｇ／ｍＬよりも高いＰＳＡレベルを示す。さらにより好ましい実施形態において、本発明の方法は、１０ｎｇ／ｍＬより低いＰＳＡレベル、より好ましくは、４〜１０ｎｇ／ｍＬの間のＰＳＡレベルを示す被検体において実施される。別の実施形態において、本発明の方法は、前立腺生検を受けたことのない被検体において実施される。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明の方法が適用される被検体は、孤立性の高悪性度前立腺上皮内腫瘍などの前立腺前癌病変を有する患者をいう。
【００３３】
本明細書中で使用される「高悪性度前立腺上皮内腫瘍」または「ＨＧ−ＰＩＮ」という用語は、ハイリスクのＰＣａに関連する病状をいい、異形成、管内異形成、大腺房非定型過形成、非定型原発性過形成、悪性変化を伴う過形成、顕著な非定型性、および管−腺房異形成としても公知である。ＨＧ−ＰＩＮは、高い核／細胞質比、高色素血、粗顆粒状クロマチン、核小体の欠如、孤立性細胞、ならびに細胞および核の多形成によって特徴付けられ得る。ＰＩＮの診断に用いられる方法は、当該技術分野で公知であり、針生検ならびに癌細胞の増殖および転移能の調節に積極的に関与する細胞骨格結合タンパク質であるエズリンの発現の測定が挙げられるが、これらに限定されない（Ｐａｎｇら、Ｕｒｏｌｏｇｙ．２００４年３月；６３（３）：６０９〜１２を参照。また、米国特許第６，０５４，３２０号はＰＩＮの同定キットを提供している。ＨＧ−ＰＩＮは、孤立性および多発性のＨＧ−ＰＩＮを含む。
【００３４】
したがって、ＨＧ−ＰＩＮと診断された患者は、ＨＧ−ＰＩＮの悪性転換の結果として進行性ＰＣａのリスクが高いので、本発明の方法にとりわけ適した候補である。
【００３５】
本明細書中で使用される「感度」という用語は、サンプルが陽性である場合に、本発明の診断方法が陽性結果を示す確率をいう。感度は、真陽性と偽陰性の合計で真陽性結果を割った数として算出される。感度は、本質的には、ある方法が疾患（すなわち、前立腺癌）に罹患している者をいかによく正確に特定するかの尺度である。本発明の方法において、カットオフ値は、個体を診断する感度が少なくとも約７０％であるように選択されることができ、例えば、アッセイされる患者集団の少なくとも６０％において、あるいはアッセイされる患者集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％であるように選択され得る。
【００３６】
第１の工程において、本発明の診断方法は、診断される被検体から単離したサンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルの測定を含む。
【００３７】
本発明の方法によって用いられる「１つまたはそれ以上の遺伝子の発現レベル」という語句は、１つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現の程度をいう。典型的には、所定の遺伝子の発現レベルは、ＲＮＡ発現レベルを測定することによって決定されることができ、ここで「ＲＮＡ発現レベル」という用語は、転写されたＲＮＡ、スプライシングされていない初期ＲＮＡ転写産物または成熟ｍＲＮＡに変換されたＤＮＡ遺伝子配列情報の決定されたレベルをいう。
【００３８】
ＲＮＡ発現は、遺伝子の全ＲＮＡまたは部分配列のいずれかのレベルを測定することによってモニタリングされ得る。実質的には、遺伝子の存在の検出、および遺伝子のレベルの定量のための任意の方法を本発明の範囲内で使用して、バイオマーカー遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを検出し、およびｍＲＮＡのレベルを定量し得る。非限定的な例として、特定の実施形態において、サンプル中の特定のＲＮＡの量を測定するために、当業者に公知の方法を用いて、バイオマーカー遺伝子（ＰＳＧＲ）に関してサンプルから転写されたＲＮＡを抽出および定量し得る。ＲＮＡ分析プロトコルについては、引用して本明細書に組み込む、国際公開ＷＯ２００８／１２１１３２号および国際公開ＷＯ９８／２４９３５号を参照されたい。簡潔に言うと、ＲＮＡは、任意の組織、体液、細胞（例えば、循環腫瘍細胞）などのサンプルから抽出される。例えば、細胞を溶解して、ＲＮＡを適当な溶液中に溶出させ得る。ＲＮＡ抽出に続いて、逆転写酵素を用いて第一鎖合成を行い得る。次いで、遺伝子増幅、より詳細には定量的ＰＣＲアッセイを行い、目的の遺伝子を、例えば１８Ｓ  ｒＲＮＡなどの内部マーカーに対して較正し得るが、例えば２８Ｓ−２５Ｓ  ｒＲＮＡおよび５Ｓ  ｒＲＮＡなどの任意の他の内因性マーカーも用いられ得る。サンプルの測定を多重反復で、例えば３回反復で行う。本発明の実施形態において、ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより市販されているような増幅、レポーター試薬および機器を用いて実行される。標的転写産物の規定の増幅効率を考慮すると、増幅された標的テンプレートからのシグナルが検出可能であるポイント（例えば、サイクル数またはｃｔ）は、測定サンプル中の特定のメッセージ転写産物の量に直接関連し得る。同様に、蛍光、酵素活性、壊変毎分、吸光度などの他の定量化可能なシグナルは、標的テンプレートの既知濃度と相関がある場合（例えば、参照標準曲線）または限定的な変動性を有する標準に対して正規化されている場合、未知サンプル中の標的テンプレート数を定量化するのに用いられ得る。
【００３９】
増幅方法に限定されないが、定量遺伝子発現技術は標的転写産物の増幅を利用し得る。標的転写産物の増幅の代わりに、または増幅と組み合わせて、増幅産物の指数関数的増加により生じる内部マーカーについてのレポーターシグナルの定量も用いられ得る。標的テンプレートの増幅は、等温遺伝子増幅法によって、またはＰＣＲなどの熱サイクルによる遺伝子増幅によって、達成され得る。
【００４０】
特定のＲＮＡを、メッセージ特異的プライマーまたはランダムプライマーを用いて増幅する。特異的プライマーは、ヒトおよび他の動物から得たゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリー由来の情報を含む公共データベース（例えば、Ｕｎｉｇｅｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から得たデータから合成され得る。試験サンプルまたは指標サンプルから得られる特定のＲＮＡから選択的に増幅するために、プライマーを選択する［例えば、ＲＴ  ＰＣＲ，ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓの第１５章．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．第２版，１９９８，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｊｒ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；または第２２章ｐｐ．１４３〜１５１，ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第８６巻，１９９８，Ｒ．ＲａｐｌｅｙおよびＤ．Ｌ．Ｍａｎｎｉｎｇ編，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，または第１４章Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ；または第５章，ｐｐ．５５〜７２，ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆ第１ｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．ＧｅｌｆａｎｄおよびＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照］。増幅は、等温条件でおこなうか、またはサーマルサイクラー［例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手されるＡＢＩ９６００または９７００または７７００］を用いて行う。増幅された核酸は、増幅プライマーについて記載したように公知のデータベースから同定および合成される蛍光タグ化した検出オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される［例えば、Ｔａｑｍａｎ（商標）ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，品番４０２８２３，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，１９９６，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照］。
【００４１】
例えば、限定されないが、増幅されたｃＤＮＡは、適当な検出システム、例えばＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出および定量される。試験サンプル中に含まれる特定のＲＮＡの量は、観察された蛍光の相対量と関連し得る（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５’Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ，Ｙ．Ｓ．ｌｉｅおよびＣＪ．Ｐｅｔｒｏｐｏｌｕｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，９：４３〜４８，またはＲａｐｉｄ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．２１１〜２２９，ＰＣＲ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓの第１４章：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．ＧｅｌｆａｎｄおよびＸＪ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９９；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【００４２】
特定の実施形態において、定量化ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ＰＳＧＲ、ＰＣＡ３、およびＰＳＭＡ遺伝子の発現レベルを検出および定量する。遺伝子発現レベルの従来の定量方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，第１〜３巻に掲載されている。
【００４３】
「ＰＣＡ３」という用語は、第９染色体上に位置する非タンパク質コード遺伝子に相当する前立腺癌抗原３（ＮＣＢＩ受託番号ＡＦ１０３９０７またはＮＲ＿０１５３４２）として公知の遺伝子をいい、９５％を超える原発性ＰＣａ検体およびＰＣａ転移において高度に過剰発現している前立腺特異的非コードＲＮＡをコードしている。
【００４４】
本明細書中で使用される「ＰＳＭＡ」という用語は、前立腺特異的膜抗原として公知であり、ＦＯＬＨ１（葉酸ヒドロラーゼ前立腺特異的膜抗原１）としても公知の遺伝子をいい、少なくとも２つの転写変異体（ＮＭ＿００４４７６およびＮＭ＿００１０１４９８６としてＮＣＢＩで同定）をコードしており、前立腺上皮細胞において高度かつ特異的に発現しており、ＰＣａならびに他の固形腫瘍の新生血管系において強力にアップレギュレートされている完全非脱離性のＩＩ型膜タンパク質をコードしている（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｎｏｎ−ｓｈｅｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードしている［Ｅｌｓａｓｓｅｒ−Ｂｅｉｌｅ，Ｕ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １０：１１８〜２５（２００９）］。
【００４５】
本明細書中で使用される「ＰＳＧＲ」という用語は、ＯＲ５１Ｅ２（嗅覚レセプター、ファミリー５１、サブファミリーＥ、メンバー２、ＮＭ＿０３０７７４）としても公知の前立腺特異的Ｇタンパク質共役レセプターをいい、高度に前立腺組織特異的でありその腫瘍に関連して過剰発現する、Ｇタンパク質共役ＯＲファミリーのメンバーである。
【００４６】
確かに、本発明を実施するのに有用なポリヌクレオチドとしては、変異体、ホモログ、サブタイプ、対立遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。変異体遺伝子が、天然の遺伝子と同様のＰｃａの発現レベルと存在との間の相関を示す限り、本発明の配列はＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の機能的変異体をコードしている必要はないことが理解されるものとする。本明細書中で使用される変異体という用語は、ＰＳＧＲポリヌクレオチドから１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により生じるポリヌクレオチドをいう。ＰＳＧＲの変異体としては、ＰＳＧＲ  ｍＲＮＡに対して少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、典型的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の相同度を示すポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。２つのポリヌクレオチド配列間の相同度は、例えば、当該分野の技術水準で公知の標準的な配列アラインメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３〜１０］などによる、従来の方法によって決定され得る。
【００４７】
本発明において、「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、被検体から単離した生物学的材料を意味する。本明細書中で使用される「生体液体」という用語は、前立腺組織または細胞由来の核酸供給源を提供するサンプルをいい、例えば、前立腺細胞、前立腺組織、前立腺液、尿、射精液、精液などが挙げられる。実際には、前立腺細胞は、ＰＣａを有する男性の尿中に検出され得るので、尿などの流体の使用が推奨される。特定の実施形態において、本発明によるバイオマーカーの決定に用いられるサンプルは、好ましくは前立腺マッサージ（例えば、ＤＲＥ）後かまたは前立腺生検後（生検後）かまたは自然排尿によって得られた尿サンプルである。好ましくは、本発明による方法は、ＰＭ（例えば、ＤＲＥ）後に得られた尿サンプルの使用を含む。このサンプルは、より広く男性集団に受け入れられる最小の侵襲性技術と、正確な診断に十分な細胞を得る可能性との間の最良の妥協案であると考えられる。別の実施形態において、本発明によるバイオマーカーの決定に用いられるサンプルは、前立腺圧出液または前立腺切除によって得られたサンプルである（陰性コントロールとして有用）。排泄された尿サンプルの最初の部分は最も高い濃度の前立腺分泌物および尿道分泌物を含むので［Ｉｗａｋｉｒｉ  Ｊら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  １４９：７８３〜６（１９９３）］、ＰＭ後の排泄された尿サンプル採集を選択した。さらに、このタイプのサンプルは、射精液または前立腺圧出液よりも男性にとって提供することをより受け入れやすい検体である。
【００４８】
第２の工程において、本発明の方法は、前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程を含み、ここで、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において決定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当する。
【００４９】
「カットオフ値」という用語は、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子発現レベルに関して、患者の発現レベルが前記カットオフまたは参照レベルよりも高い場合、被検体が所定の感度でＰＣａに罹患している可能性があることを示す参照発現レベルをいう。典型的には、カットオフ値は受診者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を用いて算出される。
【００５０】
実際には、受診者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は典型的に、「正常」（すなわち、外見上健康）および「疾患」集団における相対頻度に対して変数値をプロットすることによって算出される。任意の特定のマーカーまたはマーカーのパネル（すなわち、前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベル）に関して、疾患に罹患している被検体および罹患していない被検体についてのマーカーレベルの分布は重複する可能性がある。そのような条件下では、試験によって正常と疾患を１００％の確度で完全に区別することはできず、重複する領域は、試験によって正常と疾患を区別できない領域であることを示している。閾値またはカットオフ値を選択し、それより上（または疾患によってマーカーがどのように変化するかによってはそれより下）では試験は異常であるとみなされ、それより下では正常であるとみなされる。ＲＯＣ曲線下面積は、感知された測定値によって状態を正確に特定できる確率の尺度である。試験結果から必ずしも正確な数値が得られない場合でも、ＲＯＣ曲線を使用することができる。結果のランク付けができれば、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば「疾患」サンプルについての試験結果を程度（例えば１＝低、２＝正常、および３＝高）に従ってランク付けしてもよい。このランク付けを「正常」集団における結果と相関させてＲＯＣ曲線を作成してもよい。これらの方法は当該分野で周知である。例えば、Ｈａｎｌｅｙら（１９８２）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４３：２９〜３６を参照されたい。好ましくは、閾値は、ＲＯＣ曲線面積が約０．５を超える、より好ましくは約０．７を超える、さらにより好ましくは約０．８を超える、なおより好ましくは約０．８５を超える、最も好ましくは約０．９を超えるように選択される。この場合の「約」という用語は、所定の測定値の＋／−５％を意味する。
【００５１】
ＲＯＣ曲線の横軸は（１−特異度）を表し、偽陽性の割合とともに上昇する。曲線の縦軸は感度を表し、真陽性の割合とともに上昇する。したがって、選択された特定のカットオフについて、（１−特異度）の値を決定し、対応する感度を求め得る。ＲＯＣ曲線下面積は、測定されたマーカーレベルによって疾患または状態を正確に特定できる確率の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下面積を使用して、試験の有効性を決定し得る。
【００５２】
ある実施形態において、被検体から得たマーカーレベルのプロファイルが特定の診断／予後診断の指標であるか否かの決定は、パネル中の１つまたはそれ以上のマーカーに関する特定の閾値に依存しない。むしろ、本発明はマーカーパネル「プロファイル」全体の統一的な評価を利用し得る。そのようなマーカーパネルにおける変化の特有の「フィンガープリント」パターンは、事実上、特異的な診断または予後診断の指標として機能し得る。本明細書中で説明するように、変化のパターンは、単一のサンプルから、あるいはパネル（またはパネル応答値）の１つまたはそれ以上のメンバーにおける経時変化から得ることができる。本明細書中のパネルとは、一連のマーカーを意味する。
【００５３】
本明細書中で後述されるように、パネル応答値は、好ましくは、特定のマーカーパネルの感度（すなわち、真陽性）の、様々なカットオフでのパネルについての１−（特異度）（すなわち、偽陽性）に対するＲＯＣ曲線をプロットすることにより決定される。これらの方法において、被検体由来マーカー測定値のプロファイルがともに考慮され、診断または予後診断の包括的確率（数値スコアとしてまたはパーセンテージリスクとして表わされる）がもたらされる。そのような実施形態において、あるマーカーサブセットの上昇は、ある患者における特定の診断／予後診断の十分な指標となり得る一方で、異なるマーカーサブセットの上昇は、別の患者における同一のまたは異なる診断／予後診断の十分な指標となり得る。重み係数も、パネルにおける１つまたはそれ以上のマーカーに適用され得る。例えば、特定の診断／予後診断を識別する際に、あるマーカーが非常に高い有用性を有する場合、所定レベルにおいてそのマーカー単独で陽性結果を十分に示すように、そのマーカーが重み付けされ得る。同様に、重み係数により、特定のマーカーは所定レベルでは陽性結果を十分に示し得ないが、別のマーカーも分析に寄与する場合にのみ結果を示し得る。
【００５４】
連続スケールで測定されたマーカーについて、ＲＯＣ曲線は、可能性のあるすべてのカットオフポイント値について評価された、真陽性のフラクションの、偽陽性のフラクションに対するプロットである。双対する結果（すなわち、前立腺癌が存在するか否か）について、ＲＯＣ曲線により、コントロールから症例を区別するためのマーカーの識別能を定量化する。曲線下面積（ＡＵＣ）の標準偏差およびＡＵＣ間の差異は、ＤｅＬｏｎｇら（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９８８，４４：８３７〜８４５）のＵ統計量またはブートストラップリサンプリング法を用いて算定される。
【００５５】
好ましくは、まず各バイオマーカーについてのｋ要素検出閾値を用いてｋマーカーについてＲＯＣ曲線を決定し、次いでその少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超える場合に試験が陽性であると認定される。感度および特異度の値は典型的に、点群を生じ得るｋ要素閾値の範囲にわたって算出される。新たなマーカーについての最適ＲＯＣ曲線点は、以下の方法で得ることができる：固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲内で、特異度についての最大値を選択した。
【００５６】
ある実施形態において、マーカーおよび／またはマーカーパネルは、少なくとも約７０％の感度、より好ましくは少なくとも約８０％の感度、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の感度、より一層好ましくは少なくとも約９０％の感度、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の感度であると同時に、少なくとも約７０％の特異度、より好ましくは少なくとも約８０％の特異度、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の特異度、より一層好ましくは少なくとも約９０％の特異度、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の特異度を示すように選択される。特に好ましい実施形態では、感度および特異度の両方が少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、より一層好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％である。この場合の「約」という用語は、所定の測定値の＋／−５％を意味する。
【００５７】
当業者は、診断または予後診断の指標と、将来的な臨床転帰の診断または予後リスクとの関連付けが統計分析によって為されることを理解するであろう。例えば、統計的に有意なレベルで決定された場合、マーカーレベルがＸよりも高い患者は、マーカーレベルがＸ以下の患者よりも有害転帰を生じる可能性が高いことを示し得る。さらに、ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は、患者の予後を反映し、そしてマーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合、２またはそれ以上の集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を測定することにより決定される。例えば、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３を参照されたい。本発明の好ましい信頼区間は９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％であり、好ましいｐ値は０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。
【００５８】
本明細書中で使用される「前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団」という用語は、前立腺癌を検出し得る１つまたはそれ以上のアッセイに基づき前立腺癌に罹患しているリスクを示すと診断された患者の集団をいう。集団は、例えば、３人、４人、５人、１０人、１５人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の患者を含み得る。
【００５９】
ＰＣａに罹患しているリスクのある患者としては、下記の診断特性の１つまたはそれ以上を示す患者が挙げられるが、これらに限定されない：
−  ＤＲＥ陽性、すなわち、Ｒｉｃｈｉｅ  ＪＰら（Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９９３，４２：３６５〜７４）およびＣａｒｖａｌｈａｌ  ＧＦら（Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９９９，１６１：８３５〜９）によって記載されるような、検者が手袋をして潤滑させた指を直腸に挿入して、前立腺の大きさ、形状、および触感を調べる手順により検出される、でこぼこな、硬い、またはごつごつした領域の存在。ＤＲＥは前立腺の背部を評価するにすぎないが、ＰＣａの８５％は前立腺のこの部分に生じる。ＤＲＥで触知され得るＰＣａは一般に、より進行性である。
−  経直腸超音波（前立腺超音波、超音波スキャンまたは超音波検査としても公知）であり、体の一部を高周波音波に暴露して体内の画像を作成する工程を含む。超音波画像はリアルタイムに取り込まれるので、内臓の構造および動き、ならびに血管を流れる血液を示し得る。
−  血中ＰＳＡレベルの上昇：血中ＰＳＡレベルの上昇を示す患者における生検の決定レベルについての基準は存在しないが、種々のＰＳＡ値が決定レベルとして任意に選択されており、詳細には、５０歳男性において、ＰＣａ検出に加えて１９９４年のＦＤＡのベースになった臨床試験において生検についての決定レベルとして４ｎｇ／ｍＬよりも高いレベルが選択され；前立腺癌、肺癌、大腸癌および卵巣癌（ＰＬＣＯ）試験において生検決定レベルとして４ｎｇ／ｍＬが用いられ、欧州ＰＣａスクリーニング無作為化試験（ＥＲＳＰＣ）およびＰｒｏｔｅｃＴ試験において３ｎｇ／ｍＬが用いられ、２００７年の米国包括的癌ネットワーク（ＮＣＣＮ）ガイドラインにおいて２．５ｎｇ／ｍＬが用いられている。ＰＳＡレベルは癌以外にも多くの理由で変化し得る。高ＰＳＡレベルの２つの一般的な原因は、前立腺の肥大（前立腺肥大症（ＢＰＨ））および前立腺の感染（前立腺炎）である。
−  前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の血中レベルの上昇。
−  ５０歳よりも高齢の患者。
【００６０】
好ましい実施形態において、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団の患者は、ＰＳＡレベルが４ｎｇ／ｍＬよりも高い患者、および／または陽性ＤＲＥを示す患者である。さらにより好ましい実施形態において、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団は、望ましくない多数の偽陽性および偽陰性と関連する血清または血液中ＰＳＡレベルに相当する、いわゆるグレーゾーンの範囲内に見られるＰＳＡレベルを有する患者で形成される。典型的には、グレーゾーンは４ｎｇ／ｍＬよりも高く１０ｎｇ／ｍＬよりも低いＰＳＡレベルに相当する。
【００６１】
より好ましい実施形態において、本発明の方法が実施される被検体は、生検が実施されたことのない患者である。
【００６２】
所定の患者におけるＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子のレベルを、多重マーカーＲＯＣ曲線分析を用いて所望の感度で最大の特異度を与えるように決定された各遺伝子についての発現レベルと比較したら、少なくとも１つの上記遺伝子の発現レベルが前記所定の発現レベルより高い場合に、患者が所望の感度で前立腺癌を有すると診断される。検査対象の被検体のサンプル中の遺伝子の「発現レベルの有意な上昇」という用語は、本明細書中で使用される場合、カットオフ値に対して発現レベルが少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも上昇していることをいう。
【００６３】
本明細書中で使用される「特異度」という用語は、サンプルが陽性でない場合に、本発明の診断方法が陰性結果を示す確率を意味する。特異度は、真陰性結果を真陰性と偽陽性の合計で割った数として算出される。特異度は本質的に、ある方法が前立腺癌を有さない者をいかに良く除外するかの尺度である。本発明の方法において、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現についてのカットオフ値は、感度が少なくとも約７０％である場合に、アッセイされる患者集団の少なくとも６０％において、あるいはアッセイされる患者集団の少なくとも６５％、７０％、７５％または８０％において、個体診断の特異度が７０〜１００％の範囲、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であるように選択され得る。本発明の実施例に示すように、本方法により感度９６％および特異度４０％でＰＣａの存在を診断することが可能になり、陽性および陰性的中率はそれぞれ４９％および９５％であった（Ｆｉｇ．２）。
【００６４】
本明細書中で使用される「陰性的中率」という用語は、「ＮＰＶ」と同義であり、前立腺癌を有さないと診断された個体が実際にその疾患を有さない確率を意味する。陰性的中率は、真陰性を真陰性と偽陰性の合計で割った数として算出され得る。
【００６５】
本明細書中で使用される「陽性的中率」という用語は、「ＰＰＶ」と同義であり、線維症を有すると診断された個体が実際にその状態を有する確率を意味する。陽性的中率は、真陽性を真陽性と偽陽性の合計で割った数として算出され得る。
【００６６】
本発明の方法により、本発明の方法で測定した少なくとも１つのマーカーの発現が、基準となるカットオフ値よりも高い場合、本診断方法の特異度を実質的に低下させることなく、所望の感度でＰＣａの検出が可能になる。この驚くべき効果は、種々の遺伝子の発現の変化が、腫瘍の起源、腫瘍サブタイプ、進行度に依存して、患者によって異なり得るという事実に起因すると考えられる。このような状況では、単一の遺伝子または遺伝子のペアワイズ組み合わせの決定では、場合によっては正確に診断されず、感度が低下することもあるだろう。本発明による方法により、３つの遺伝子すべての発現を測定することによって、特異度に影響を与えることなく感度を高めることが可能になる。
【００６７】
当業者に理解されるように、少なくともＰＣＡ３の、少なくともＰＳＭＡの、または少なくともＰＳＧＲの発現レベルがカットオフ値よりも高い場合、診断は陽性になり得る。さらに、上記３つの遺伝子のうちの２つの発現レベルが各遺伝子についての基準値よりも高い場合、例えば、ＰＣＡ３およびＰＳＭＡレベルが高くなる場合、ＰＣＡ３およびＰＳＧＲが高くなる場合、またはＰＣＡ３およびＰＳＧＲが高くなる場合にも、陽性診断が下される。さらに、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルが同時に高くなる場合、陽性診断になる。
【００６８】
本発明によって提供されるＰＣａの診断方法は、分析を受ける被検体由来の前立腺細胞を含む尿サンプルを用いて実施され得るので、非侵襲的方法であり、その高い感度および特異度（９６％の感度で４０％の特異度が得られる）に起因して信頼性が高く、さらに、陽性的中率および陰性的中率はそれぞれ４９％および９５％である。したがって、まとめると、これらの結果を用いて、通常の泌尿器科業務に容易に組み込み得るＰＣａの高度に特異的な試験を開発することが可能であり、とりわけ後述するような特に臨床的に価値のある患者群（血清ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬであって、生検歴のない患者）において、ＰＳＡ試験の低い特異度に起因する多数の不必要な生検を有意に減少させ得る。
【００６９】
好ましい実施形態において、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルは、サンプル中のこれらの遺伝子の発現レベルの上昇が前立腺細胞の悪性増殖の結果ではなく、むしろ例えばＢＰＨにおいて生じるような非悪性前立腺成長の結果である場合があることを考慮して、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを用いて正規化される。さらに、本方法は、これらのマーカーを発現している前立腺以外の組織由来の細胞を含むサンプル中で実施され得る。特に、本方法が尿沈渣中で実施される場合、癌細胞の他に、尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞を検知する可能性がある。したがって、好ましい実施形態において、本マーカーパネルを形成する種々の遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の量に対して正規化される。
【００７０】
本明細書中で使用される「正規化」という用語は、定量的数値を、他の遺伝子分析によって得られる遺伝子発現量と比較し得る数値に変換することを意味する。典型的には、遺伝子発現量の正規化のための指標として、一定に発現しているハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現レベルを用いることによって正規化を行う。
【００７１】
本明細書中で使用される「ハウスキーピング遺伝子」という用語は、すべての組織において普遍的遍在的に発現している遺伝子をいう。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するのに必要な基本的で重要な機能を示すタンパク質をコードしている。ハウスキーピング遺伝子は、特に細胞増殖期および生物成長期にはいくらか変動があるものの、通常すべての細胞および組織において同程度のレベルで発現している。一般に用いられるハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、βアクチン遺伝子、チューブリン遺伝子、リボソームの１８Ｓまたは２８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子の例示的なリストは、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，３６２〜３６５（２００３）に掲載されている。
【００７２】
好ましい実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は「前立腺ハウスキーピング遺伝子」である。本明細書中で使用される「前立腺ハウスキーピング遺伝子」という用語は、前立腺細胞において、その細胞が正常前立腺細胞であるか前立腺腺癌細胞であるかにかかわらず一定レベルで発現している遺伝子をいう。この遺伝子により、サンプル中の前立腺由来細胞の数を検出することが可能になる。
【００７３】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の第１の方法は、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲを定量するサンプルと同一サンプル中の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対する正規化後の、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルの使用を含む。
【００７４】
本発明における使用に適した前立腺ハウスキーピング遺伝子としては、ＰＳＡ（Ｓｏｋｏｌｌら、１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２４：２５３〜２５９）、ＤＤ３（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５９：５９７５〜９）、ＨＰＧ−１、ＰＳＭ、ＮＫＸ３、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、Ｔｒｐ−ｐ８（Ｔｓｖａｌｅｒら）、前立腺酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、チモシンｂ−１５、ＨＰＣ１基礎前立腺遺伝子、ｈＫＬＫ２遺伝子によってコードされる前立腺特異的腺性カリクレインタンパク質ｈＫ２、ｈＫＬＫ３遺伝子によってコードされる前立腺特異的抗原タンパク質ｈＫ３（ＰＳＡ）、ＳＩＭ２遺伝子（国際公開ＷＯ０９１３５０１９Ａ号）、ＥＲＧ遺伝子（国際公開ＷＯ０９１３５０１９Ａ号）、ＴＭＰＲＳＳ２、ＰＳＭすなわち前立腺特異的膜抗原（Ｆａｉｒら、１９９７，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３２：１４０〜１４８）、ＰＳＣＡすなわち前立腺幹細胞抗原（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１７３５〜１７４０）、ＴＭＰＲＳＳ２（Ｌｉｎら、１９９９．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４１８０〜４１８４）、ＰＤＥＦ（Ｏｅｔｔｇｅｎら、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２１６〜１２２５）、ＰＳＧ−１すなわち前立腺特異的遺伝子−１（Ｈｅｒｎｅｓｓ，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３２９〜３３６）、ＰＣＡ３（Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓら、１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５９７５〜５９７９、国際公開ＷＯ９８／０４５４２０号、国際公開ＷＯ０１／０２３５号、国際公開ＷＯ２００４／０７００５６号、国際公開ＷＯ２００５／００３３８７号）、ＰＣＧＥＭ１（Ｓｒｉｋａｎｔａｎら、２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２２１６〜１２２２１）、ならびに遺伝子Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、およびＰ７７５Ｐ（Ｓｔｏｌｋら、２００４．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０：２１４〜２２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
好ましい実施形態において、前立腺ハウスキーピング遺伝子はＰＳＡ遺伝子である。本明細書中で使用されるＰＳＡという用語は、前立腺の腺上皮細胞によるアンドロゲン制御下で発現し、精漿中に分泌されて液化するセリンプロテアーゼ活性を有する糖タンパク質をコードしている、第１９染色体上に位置する遺伝子をいう。ＰＳＡタンパク質は通常、前立腺に限局しているが、癌またはＢＰＨなどの前立腺疾患の場合にはＰＳＡが血液中に漏出して、タンパク質複合体に結合していたり結合していなかったりといった種々の形態で存在する（Ｅｌ−Ｓｈｉｒｂｉｎｙ，１９９４，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１：９９）。血清総ＰＳＡ濃度の測定は、前立腺癌患者のスクリーニングおよび管理において最も頻繁に用いられるＦＤＡ承認の生化学試験の１つである。これまでの研究では、ＰＳＡを用いたスクリーニングをＤＲＥおよび経直腸超音波と併用すると、未だ前立腺のみに局在している場合が多い早期ＰＣａの検出が増加することが示唆されている（Ｂｒａｗｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４７：８４１）。血清ＰＳＡはまた、治療後、特に外科的前立腺切除後の患者のモニタリングにも有用である。しかしまた、総ＰＳＡ測定により特定される異常に高いレベルを示す患者の多数は、後に前立腺癌を有さないことが判明する。最近、遊離型／総ＰＳＡパーセント比測定の概念が、４〜１０ｎｇ／ｍＬの間のＰＳＡを有する男性におけるＰＣａスクリーニングの特異性を高めることが示された（Ｌｅｔｒａｎら，１９９８，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６０：４２６）。好ましい実施形態において、ＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを用いて正規化を行う。
【００７６】
本発明者らはまた、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）または血清ＰＳＡレベルを含む群から選択される、前立腺癌についての追加のバイオマーカーを組み込むことにより、マーカーパネルの診断価値がさらに高まり得ることも未出した。
【００７７】
したがって、本発明の実施例に示すように、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルならびにＰＳＡＤを含むマーカーパネルにより、ＡＵＣ０．８９で前立腺癌の診断が可能であるのに対して、ＰＳＡＤを含まない上記３つの発現レベルの使用では、ＡＵＣが０．８２となる。複合マーカーモデルについての感度は９６％、特異度は４０％であった。陽性的中率および陰性的中率は、それぞれ４９％および９５％であった（Ｆｉｇ．２を参照）。
【００７８】
「バイオマーカー」という用語は、当該技術分野全般にわたって用いられ、プロセス、事象または状態の特有の生物学的指標または生物学的に誘導された指標を意味する。
【００７９】
追加のバイオマーカーを診断方法に組み込むために、（ｉ）研究対象の患者における追加のバイオマーカー値の測定、（ｉｉ）バイオマーカー値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較（ここで、前記カットオフ値は、複合４マーカーパネルを用いて算出されたＲＯＣ曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当する）が必要である。
【００８０】
ここで、追加のバイオマーカーはＰＳＡＤであり、本発明の診断方法はさらに、（ｉ）研究対象の患者におけるＰＳＡＤ値の測定、（ｉｉ）ＰＳＡＤ値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較（ここで、前記カットオフ値は、複合４マーカーパネルを用いて算出されたＲＯＣ曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当する）を含む。
【００８１】
ここで、追加のバイオマーカーはＰＳＡであり、本発明の診断方法はさらに、（ｉ）研究対象の患者におけるＰＳＡ値の測定、（ｉｉ）ＰＳＡ値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較（ここで、前記カットオフ値は、複合４マーカーパネルを用いて算出されたＲＯＣ曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当する）を含む。
【００８２】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の診断方法はさらに、工程（ｉ）患者におけるＰＳＡＤの測定、工程（ｉｉ）患者におけるＰＳＡＤ値とＰＳＡＤについての所定のカットオフ値との比較（ここで、前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において決定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡＤに基づいて算出されたＲＯＣ曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡＤ値に相当する）を含み、最後に、患者が前立腺癌を示すか否かについて決定を行う（ここで、前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇している場合、またはＰＳＡＤ値が前記所定のカットオフ値に対して上昇している場合、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示す）。
【００８３】
本明細書中で使用される「ＰＳＡ密度」またはＰＳＡＤという用語は、体液サンプル由来のＰＳＡ値を前立腺体積で割って得られるＰＳＡ値をいう。
【００８４】
例：ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）＝ＰＳＡ値／前立腺体積
【００８５】
ＰＳＡＤ（ＰＳＡ／前立腺体積）値は、サンプル（例えば、血清、血液など、好ましくは血清）中のＰＳＡ濃度および前立腺体積（エコグラフィー（ｅｃｏｇｒａｐｈｙ））を測定することにより、以下の式に従って決定され得る：
ＰＳＡ密度＝ＰＳＡ体積／前立腺体積
【００８６】
サンプル（例えば、血清、血液など）中のＰＳＡ濃度は、前述のような当業者に周知の従来方法（例えば、免疫学的方法など）を含む、サンプル中のＰＳＡ濃度を決定する任意の方法によって決定され得る。
【００８７】
前立腺体積は、当業者に周知の従来方法（式  Ｈ×Ｗ×Ｌ×０．５２を用いたいわゆるＴＲＵＳ検査を含むがこれに限定されない）を含む、前立腺の体積を測定する任意の方法によって測定され得る。前立腺体積は、典型的には、超音波測定（最大径で行う経直腸超音波測定（ＴＲＵＳ）を含むがこれに限定されない）に基づいて決定される。さらに別の特定の実施形態において、ＴＲＵＳ測定は、Ｈ×Ｗ×Ｌ×０．５２の楕円体体積法によって算出される。この体積は、前立腺全体の測定を行うことによって算出され得るか、あるいは、転移帯（ＴＺ）／尿道周囲良性前立腺腺葉（腺腫）の体積も得ることができ、これらの値を用いてＰＳＡ密度を決定する。
【００８８】
「経直腸超音波」または「ＴＲＵＳ」は、音波を用いて前立腺のビデオ画像を作成する、５〜１５分の外来患者手順である。この手順は、小さな潤滑させたプローブの直腸中への配置を含み、このプローブが音波を発し、この音波が前立腺に入ってエコーを生じる。前立腺腫瘍は、正常前立腺組織とは異なるエコーを生じることが多い。跳ね返ったエコーは、エコーのパターンを前立腺の像に変換するコンピュータに送られる。ＴＲＵＳを用いて前立腺の重量を推定し、医師がＰＳＡ密度について理解を深めるのに役立ち、これによりＢＰＨをＰＣａと識別するのに役立つ。
【００８９】
「前立腺体積を測定する楕円体体積法」は、前立腺の体積を評価する方法であり、ＴＲＵＳ手順の重要かつ不可欠な部分である。いくつかの式が用いられているが、最も一般的な式は楕円体式であり、前立腺の３寸法の測定が必要である。寸法はまず、軸面において、最大横断寸法の推定点で横断および前後寸法を測定することによって決定される。膀胱頸部により前立腺の頭側範囲が不明瞭になることが多いため、縦寸法は、正中線から少し離れた矢状面において測定される。次いで、以下のように楕円体積式が適用される：体積＝高さ×幅×長さ×０．５２。
【００９０】
また、前立腺体積は、ＰＳＡ、ｃＰＳＡ（ＰＳＡとα１−アンチキモトリプシン）、遊離型ＰＳＡ、Ｂ−ＰＳＡ（良性ＰＳＡ）；ＰＲＯ−ＰＳＡ（前立腺癌と関連し、天然プロＰＳＡならびに不完全プロＰＳＡ形態である［−２］ｐＰＳＡおよび［−４］ｐＰＳＡからなる、遊離型ＰＳＡの前駆体アイソフォーム）および／またはヒトカリクレイン（ＨＫ２）測定の組み合わせを用いることにより、非侵襲的に測定され得る。
【００９１】
本明細書中で使用される「ＰＳＡ」という用語は、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーであって前立腺の細胞によって産生される、３３ｋＤａキモトリプシン様タンパク質の血清中濃度に関する。
【００９２】
本明細書中で使用される「血清総ＰＳＡレベル」という用語は、ＰＳＡの血清中濃度に関し、「遊離型ＰＳＡ」（非結合型であるか、別の物質に結合していないＰＳＡ）と「結合型ＰＳＡ」（α−１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＴ）、プロテアーゼＣインヒビター（ＰＣｌ）、およびα−２マクログロブリン（ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｐｓｉｌｏｎｌｉｎ）（Ａ２Ｍ）などの別の物質に結合しているＰＳＡ）の合計に相当する。
【００９３】
本明細書中で使用される「血清遊離型ＰＳＡレベル」という用語は、非結合型であるか別の物質に結合していないＰＳＡの量をいう。
【００９４】
本明細書中で使用される「血清遊離型ＰＳＡの、血清総ＰＳＡに対する比」という用語は、「遊離型ＰＳＡ」（非結合型であるか、別の物質に結合していないＰＳＡ）と「結合型ＰＳＡ」（α−１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＴ）、プロテアーゼＣインヒビター（ＰＣｌ）、およびα−２マクログロブリン（ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｐｓｉｌｏｎｌｉｎ）（Ａ２Ｍ）などの別の物質に結合しているＰＳＡ）の血清中濃度の比をいう。
【００９５】
本明細書中で使用される「プロＰＳＡ」という用語は、ＰＳＡの前駆体形態をいう。ＰＳＡの完全長前駆体形態は、７アミノ酸のプロペプチド（すなわち、リーダーペプチド）であるＡＰＬＩＬＳＲを含み、その後に２３７アミノ酸の成熟ＰＳＡタンパク質が続いている。プロＰＳＡの完全長アミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、Ｋｕｍａｒ  Ａ．ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９７，５７：３１１１〜３１１４）によって完全に記載されている。本発明の目的では、プロペプチド配列の最後のアミノ酸「Ｒ」を、［−１］アミノ酸と数える。例えば［−７］プロＰＳＡとは、その末端がプロペプチドの−７アミノ酸（ａ．ａ．）から始まるプロＰＳＡである。これは完全長プロＰＳＡを含む。［−５］プロＰＳＡは、プロＰＳＡの末端がプロペプチドの−５ａ．ａ．から始まることを示し、これはプロペプチド配列の最後の５アミノ酸配列を含む。本発明の目的では、プロＰＳＡは、プロペプチドの任意のアミノ酸から始まる末端を有する、完全長形態のプロＰＳＡと切断形態のプロＰＳＡとの両方を包含するものとする。すなわち、プロＰＳＡは、［−１］プロＰＳＡ、［−２］プロＰＳＡ、［−３］プロＰＳＡ、［−４］プロＰＳＡ、［−５］プロＰＳＡ、［−６］プロＰＳＡ、［−７］プロＰＳＡ、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００９６】
「ＰＳＡ倍加時間」という用語は、治療期間にわたる血清ＰＳＡの倍加数と定義される。
【００９７】
本発明の方法により、少なくとも１つの上記マーカーがカットオフ値に対して有意に上昇している、ＰＣａに罹患している患者の識別が可能になる。当業者に理解されるように、少なくともＰＣＡ３の、少なくともＰＳＭＡの、または少なくともＰＳＧＲの発現レベルあるいは少なくともＰＳＡＤ／血清ＰＳＡがカットオフ値よりも高い場合、診断は陽性になり得る。さらに、これら３つのマーカーのうち少なくとも２つの発現レベルが各遺伝子についての基準値よりも高い場合、例えば、ＰＣＡ３レベルおよびＰＳＧＲレベルが高くなる場合、ＰＣＡ３レベルおよびＰＳＭＡレベルが高くなる場合、ＰＣＡ３レベルおよびＰＳＡＤ／血清ＰＳＡレベルが高くなる場合、ＰＳＧＲおよびＰＳＭＡレベルが高くなる場合、ＰＳＧＲレベルおよびＰＳＡＤ／血清ＰＳＡが高くなる場合、またはＰＳＭＡレベルおよびＰＳＡＤ／血清ＰＳＡが高くなる場合にも、陽性診断が下される。さらに、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、およびＰＳＧＲの発現レベルが同時に高くなる場合、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡの発現レベルおよびＰＳＡＤ／ＰＳＡ血清値が同時に高くなる場合、ＰＣＡ３およびＰＳＧＲの発現レベルおよびＰＳＡＤ／ＰＳＡ血清値が同時に高くなる場合、ならびにＰＳＧＲおよびＰＳＭＡの発現レベルおよびＰＳＡＤ／ＰＳＡ血清が同時に高くなる場合、陽性診断になる。
【００９８】
ＰＣａ治療に対する反応を評価またはモニタリングする方法
本発明の教示は、ＰＣａを有する被検体に行った治療の有効性をモニタリングおよび決定するのに用いられ得る。詳細には、本発明は、種々のマーカーの発現レベルが、所定の治療に対してＰＣａが応答するか否かをモニタリングするのに用いられ得るという事実に基づく。しかしながら、前立腺の外科的切除により、種々のマーカーの産生を担う器官がもはや存在しないので、これらのマーカーはもはや発現しなくなる。したがって、本発明の方法は、患者が前立腺を完全には切除しない方法（例えば、放射線療法、化学療法など）で治療されているような場合に、特に有用である。
【００９９】
したがって、別の態様において、本発明は、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、
（ｉ）前記治療の実施前に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記治療の実施後に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉｉ）前記治療の実施前および後に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を比較することを含み、
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示すものであるとする、方法に関する。
【０１００】
また、別の態様において、本発明は、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、
（ｉ）前記治療の実施前に得た前記被検体から単離したサンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記治療の実施後に得た前記被検体から単離したサンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉｉ）前記治療の実施前および後に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を比較することを含み、
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法に関する。
【０１０１】
本明細書中で使用される「治療に対する応答を評価またはモニタリングする」という語句は、ＰＣａを有する被検体に実施した治療に対する前記被検体の応答を決定する可能性に関する。ＰＣａ治療において、癌を除去するかまたは封じ込めるために様々な治療が用いられ得る。ＰＣａの治療は、監視療法、ホルモン療法、密封小線源治療（前立腺密封小線源治療）および外照射療法を含む放射線療法、高密度焦点式超音波療法（ＨＩＦＵ）、化学療法、またはいくつかの組み合わせを含み得る。どの選択が最良であるかは、病期、グリーソンスコア、およびＰＳＡレベルに依存する。他の重要な因子は、その男性の年齢、全身的健康、ならびに潜在的治療および起こり得る副作用に対する感情である。すべての治療は、勃起不全および尿失禁などの重大な副作用を伴う可能性があるので、治療の議論は、治療の目標とライフスタイル変更のリスクとのバランスに重点を置く場合が多い。
【０１０２】
簡潔に言うと、上述の要因（例えば、被検体の年齢、ならびに癌の大きさ、位置、および段階）によって、（ｉ）化学療法などの細胞毒性／細胞増殖抑制治療（癌に対する医薬生成物を用い、その医薬生成物が血管を通って体内を循環する際に癌性細胞を破壊する）；放射線療法（高エネルギー放射線を用いて癌細胞を死滅させる）、および抗腫瘍薬；および／または（ｉｉ）免疫療法（投与された化合物が、癌に対する免疫システムの生来の機能を刺激、増強または強化することにより、癌性細胞を認識して体内から除去する）が用いられ得る。したがって、本発明の方法により、任意の治療に対する、特に任意の細胞毒性／細胞増殖抑制治療に対する、より詳細には化学療法、放射線療法、抗腫瘍薬またはこれらの組み合わせによる治療に対する、ＰＣａを有する被検体の応答を決定することが可能になる。
【０１０３】
適当な化学療法薬としては、アルキル化剤［例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＢＢＲ３４６４、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド（Ｉｆｏｓｍａｄｅ）、メルファラン、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、ＴｈｉｏＴＰＡ、ウラムスチン、など］；代謝拮抗薬［例えば、プリン（アザチオプリン、メルカプトプリン）、ピリミジン（カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン）、葉酸（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）、など］；ビンカアルカロイド［例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、など］；タキサン［例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ＢＭＳ−２４７５５０、など］；アントラサイクリン［例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、マイトマイシン、など］；トポイソメラーゼインヒビター［例えば、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、など］；モノクローナル抗体［例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、など］）；光増感剤［例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、ベルテポルフィン、など］；チロシンキナーゼインヒビター［例えば、グリベック（商標）］；上皮増殖因子レセプターインヒビター［例えば、イレッサ（商標）、エルロチニブ（タルセバ（商標））、ゲフィチニブ、など］；ＦＰＴアーゼインヒビター［例えば、ＦＴＩ（Ｒｌ１５７７７、ＳＣＨ６６３３６、Ｌ−７７８，１２３）、など］；ＫＤＲインヒビター［例えば、ＳＵ６６６８、ＰＴＫ７８７、など］；プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）インヒビター［例えば、ＰＳ３４１、など］；ＴＳ／ＤＮＡ合成インヒビター［例えば、ＺＤ９３３１、ラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｒｅｘｅｄ）（ＺＤ１６９４、トムデックス）、ＺＤ９３３１、５−ＦＵ、など］；Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼインヒビター［例えば、ＳＡＭ４６８Ａ、など］；ＤＮＡメチル化剤［例えば、ＴＭＺ、など］；ＤＮＡ結合剤［例えば、ＰＺＡ、など］；Ｏ６−アルキルグアニンＡＧＴに結合して不活化する薬剤［例えば、ＢＧ］；ｃ−ｒａ／−ｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド［例えば、ＩＳＩＳ−５１３２（ＣＧＰ−６９８４６Ａ）］；腫瘍免疫療法；ステロイド性および／または非ステロイド性抗炎症薬［例えば、コルチコステロイド、ＣＯＸ−２インヒビター］；またはアリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、ダサチニブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、およびトレチノインなどの他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。適当な化学療法薬は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  ｉｎ  ＣＤ−ＲＯＭ，第１３版などの文献にさらに詳細に記載されている。
【０１０４】
本発明態様によると、第１期に得たＰＣａを有する被検体由来のサンプル（第１被検体サンプル）において測定された遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルと、第２期に得たＰＣａを有する被検体由来のサンプル（第２被検体サンプル）において測定された遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルとを比較して、ＰＣａを有する前記被検体における治療に対する応答の有効性を評価またはモニタリングすることが可能になる。第２被検体サンプルは、第２期に、すなわち、第１期の後の任意の時間に、例えば、第１被検体サンプルの１日後、１週間後、１か月後、２か月後、３か月後、１年後、２年後、またはそれ以降に、第１測定が得られたＰＣａを有する同一被検体から採取され得る。特定の実施形態において、第１被検体サンプルは、被検体が治療（例えば、化学療法、または放射線療法）を受ける前に採取され、そして第２被検体サンプルは、治療後に採取される。別の特定の実施形態において、第１被検体サンプルは、被検体が治療（例えば、化学療法、または放射線療法）を始めた／受けた後に採取され、そして第２被検体サンプルは、その後、有効性が評価またはモニタリングされる一連の治療の間の異なる時期に採取される。これらの方法により、以前にＰＣａと診断された選択被検体に対する特定の治療の評価が可能になる。したがって、前記治療が前記被検体におけるＰＣａを治療するのに有効でない場合、前記治療を変更して新たな治療を設計し、前記被検体におけるＰＣａを治療すべきである。一連の新たな治療は、本方法によって容易に追随され得る。
【０１０５】
本発明の診断方法に関して前述したように、バイオマーカー遺伝子（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）の発現レベルは、例えばｑＰＣＲのような、当該技術分野で公知の任意の適当な手段によって決定され得る。測定は、実質的に反復可能な条件下で行われる。
【０１０６】
異なる時期での被検体サンプル（第１および第２被検体サンプル）中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定したら、第１被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第２被検体サンプル中の前記遺伝子の各々の発現に有意な低下が認められる場合、同定が必要である。検査対象の第２被検体サンプル中の遺伝子の発現の低下は、前記第２被検体サンプル中の発現レベルが第１被検体サンプル中のその発現レベルに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち、存在しない）低下している場合、前記第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して「有意な低下」とみなされる。
【０１０７】
同様に、検査対象の第２被検体サンプル中の遺伝子の発現の上昇は、前記第２被検体サンプル中の発現レベルが第１被検体サンプル中のその発現レベルに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれ以上上昇している場合、前記第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して「有意な上昇」とみなされる。
【０１０８】
同様に、第２被検体サンプル中の発現レベルが（原文欠落）である場合に、検査対象の第２被検体サンプル中の遺伝子の発現が前記第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して変化しない場合、それらの発現レベルは２つの測定間で実質的に一定であることを示す。例として、一定の発現レベルは、第１測定が１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、１０１％以下、９９％以上、９８％以上、９７％以上、９７％以上、９６％以上または９５％以上であることを示す。
【０１０９】
したがって、第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）の発現レベルにおける有意な低下は、ＰＣａを有する被検体に実施された治療が効果があることを示す。反対に、第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な低下が達成されない場合（変化なしまたは有意な上昇）、あるいは、第１被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な上昇が達成される場合、前記被検体に実施された治療は、前記被検体におけるＰＣａの治療に効果がなく；したがって、前記治療を変更して新たな治療を設計し、前記被検体におけるＰＣａを治療すべきである。一連の新たな治療は、本方法によって容易に追随され得る。
【０１１０】
さらに、本発明によるＰＣａ治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法は、少なくとも１つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも追加のバイオマーカー値がカットオフ値よりも低い場合に治療が効果があるとみなされるか、あるいは少なくとも１つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも追加のバイオマーカー値がカットオフ値よりも高い場合に治療が効果がないとみなされるように、種々の遺伝子の発現レベルとＰＣａについての追加のバイオマーカーの値を組み合わせることによって、さらに改善され得る。本発明の診断方法に関して説明する場合、追加のバイオマーカーは、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの、血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）またはＰＳＡからなる群から選択される。
【０１１１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程（ｉ）および（ｉｉ）を行うことによって実施されるが、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡＤの決定をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）は、患者におけるＰＳＡＤレベルをＰＳＡＤについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡＤに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡＤ値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの低下または前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡＤ値の低下が検出される場合に治療が効果があるか否かについて、あるいは、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの上昇もしくは変化なしまたは前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡＤ値の上昇もしくは変化なしが検出される場合に治療が効果がないか否かについて、結論が得られる。
【０１１２】
したがって、好ましい実施形態において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程（ｉ）および（ｉｉ）を行うことによって実施されるが、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡの決定をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）は、患者におけるＰＳＡレベルをＰＳＡについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡ値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの低下または前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡ値の低下が検出される場合に治療が効果があるか否かについて、あるいは、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの上昇もしくは変化なしまたは前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡ値の上昇もしくは変化なしが検出される場合に治療が効果がないか否かについて、結論が得られる。
【０１１３】
被検体におけるＰＣａの進行のモニタリング
本発明の教示は、被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングするのにも用いられ得る。したがって、別の態様において、本発明は被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングする方法であって、
ａ）第１期に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
ｂ）第２期に単離した同一被検体の生体液体サンプル中の前記遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択され、前記第２期が、前記第１期よりも後である、工程と、
ｃ）前記第１期および第２期に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、ＰＣａが被検体において進行していないことを示すものであるとする、方法に関する。
【０１１４】
また、被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングする方法であって、
ａ）第１期に得た被検体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
ｂ）第２期に得た同一被検体のサンプル中の前記遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択され、前記第２期が、前記第１期よりも後である、工程と、
ｃ）前記第１期および第２期に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、ＰＣａが進行していることを示すものであるとする、方法。
【０１１５】
本発明中で使用される「ＰＣａの進行をモニタリングする」という語句は、「予後を決定する」と同義であり、ＰＣａと診断された患者における疾患の進行を示す１つまたはいくつかのパラメータの決定に関する。ＰＣａと診断された被検体の変化を決定するのに適したパラメータは、腫瘍反応、再発のリスク、被検体の無病生存率および／または全生存率の群から選択される。本明細書中で使用される「再発のリスク」という語句は、無病生存期間後に再びＰＣａおよび／または後発転移を発症している被検体の確率と理解され；「無病生存率」は、癌が検出されない治療後の期間と理解され；そして「被検体の全生存率」は、診断または治療時から、規定の期間後に生存している被検体のパーセンテージと理解される。本明細書中で使用される疾患進行は、（原文欠落）を意味する。
【０１１６】
好ましい実施形態において、ＰＣａの進行をモニタリングする方法は、臓器限局疾患（ＯＣＤ）から非臓器限局疾患（ＮＯＣＤ）への分化を検出するのに用いられ得る。別の好ましい実施形態において、ＰＣａの進行をモニタリングする方法は、悪性前立腺癌または臨床的に重要な／低悪性度のＰＣａの予測に用いられ得る。
【０１１７】
本発明の態様によると、第１期に得たＰＣａを有する被検体由来のサンプル（第１被検体サンプル）において決定された遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルならびに第２期に得たＰＣａを有する被検体由来のサンプル（第２被検体サンプル）において決定された遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルを、各々の遺伝子についてのカットオフ値（前記カットオフ値は、上記で定義されたように決定される）と各々比較する。第２被検体サンプルは、第２期に、すなわち、第１期の後の任意の時間に、例えば、第１被検体サンプルの１日後、１週間後、１か月後、２か月後、３か月後、１年後、２年後、またはそれ以降に、第１測定が得られたＰＣａを有する同一被検体から採取され得る。特定の実施形態において、第１被検体サンプルは、被検体が治療（例えば、化学療法、または放射線療法）を受ける前に採取され、そして第２被検体サンプルは、治療後に採取される。別の特定の実施形態において、第１被検体サンプルは、被検体が治療（例えば、化学療法、または放射線療法）を始めた／受けた後に採取され、そして第２被検体サンプルは、その後、一連の治療の間の異なる時期に採取される。これらの方法により、以前にＰＣａに罹患していると診断された選択被検体におけるＰＣａの進行の評価が可能になる。したがって、ＰＣａが予後不良である場合、さらなる治療を設計して、前記被検体におけるＰＣａを治療すべきである。前記新たな治療後のＰＣａの進行は、本発明の教示によって容易に追跡され得る。
【０１１８】
本発明の診断方法に関して前述したように、バイオマーカー遺伝子（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）の発現レベルは、例えばｑＰＣＲのような、当該技術分野で公知の任意の適当な手段によって決定され得る。測定は、実質的に反復可能な条件下で行われる。
【０１１９】
異なる時期での被検体サンプル（第１および第２被検体サンプル）中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定したら、第１被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現に有意な上昇が認められる場合、同定が必要である。あるいは、所望であれば、第１被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現の有意な低下または変化なしが認められる場合、分析してもよい。バイオマーカー遺伝子の発現レベルに適用される「有意な上昇」、「有意な低下」および「変化なし」という用語は、既に定義されている。
【０１２０】
したがって、第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対する、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）の発現レベルの有意な上昇は、検査対象の被検体におけるＰＣａが進行中である（すなわち、予後不良である）ことを示し；したがって、検査対象の被検体に実施される治療を変更し、新たな治療を設計して前記被検体におけるＰＣａを治療すべきである。被検体におけるＰＣａの進行は、本方法によって容易に追跡され得る。
【０１２１】
反対に、第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な上昇が達成されない場合、あるいは、第１被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第２被検体サンプル中の少なくとも１つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに有意な低下が達成される場合、検査対象の被検体におけるＰＣａは進行中ではない（すなわち、予後不良ではない）。
【０１２２】
さらに、本発明によるＰＣａの進行をモニタリングする方法は、少なくとも１つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも前記追加のバイオマーカーの値がカットオフ値よりも低い場合に疾患が進行していないとみなされるように、種々の遺伝子の発現レベルとＰＣａについての追加のバイオマーカーの値とを組み合わせることによって、さらに改善され得る。上記に説明したように、追加のバイオマーカーは、ＰＳＡＤおよびＰＳＡからなる群から選択される。
【０１２３】
したがって、別の態様において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程（ｉ）および（ｉｉ）を行うことによって実施されるが、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡＤの決定をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）は、患者におけるＰＳＡＤレベルをＰＳＡＤについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡＤに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡＤ値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの上昇または変化なし、あるいは前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡＤ値の上昇または変化なしが検出される場合に、ＰＣａが進行中であるか否かについて結論が得られる。
【０１２４】
別の態様において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程（ｉ）および（ｉｉ）を行うことによって実施されるが、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡの決定をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）は、患者におけるＰＳＡレベルをＰＳＡについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡ値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルの上昇または変化なし、あるいは前記所定のカットオフ値に対するＰＳＡ値の上昇または変化なしが検出される場合に、ＰＣａが進行中であるか否かについて結論が得られる。
【０１２５】
生検のための患者の選択
上記のように、本発明の教示は、生検のための患者を選択するのに用いられ得る。実際に、ＰＳＡ試験の特異度が低いために多くの不必要な生検が実施されている。これは特に、「グレーゾーン」と言われている、４．０〜１０．０ｎｇ／ｍＬの間の範囲に血清ＰＳＡレベルを有する患者における場合であり、ＰＳＡＤは総ＰＳＡよりも有意に正確であった［Ｏｈｏｒｉ  Ｍら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４６：６６６〜７１（１９９５）］。
【０１２６】
本発明者らが示すように、本発明のマーカーパネルの適用により、高い感度および特異度で患者がＰＣａに罹患しているか否かについての決定が可能になり、その結果、不必要な生検の数を有意に減少させ得る。例えば本発明の実施例に示すように、特に臨床的に価値のある群（血清ＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲であって、生検歴なし）において、本発明によって提供される３成分バイオマーカーをＰＳＡＤと組み合わせて用いて回避され得る生検の数は、「回避される生検＝真陰性＋偽陰性」として算出され：
−  感度１００％で、３２．５％の生検が回避され、そして
−  感度９６％で、４１．６％の生検が回避され得る。
これは、欧州全体で年間に回避される生検約１２６，７５０〜１６２，２４０回に相当する。
【０１２７】
したがって、別の態様において、本発明は、被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程と
を含み、
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。
【０１２８】
被検体が前立腺を受けるべきか否かを評価する方法は、追加の前立腺バイオマーカーの決定によって改善され得る。詳細には、追加のマーカーは、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの、血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）（本発明の診断方法に関して上記に説明されるように定義および算出される）であることができる。
【０１２９】
本発明の方法によって分析される患者は、好ましくは以前に前立腺生検を受けたことのない患者である。別の好ましい実施形態において、本発明によって分析される患者は、以前に少なくとも１回の生検、以前に少なくとも２回の生検、以前に少なくとも３回またはそれ以上の生検を受けたことのある患者である。
【０１３０】
したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明による生検のための患者を選択する方法であって、
工程（ｉ）は、患者におけるＰＳＡＤを決定する工程をさらに含み、
工程（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡＤレベルをＰＳＡＤについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡＤに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡＤ値に相当するものであり、そして
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、ＰＳＡＤ値が前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。
【０１３１】
別の好ましい態様において、本発明は、本発明による生検のための患者を選択する方法であって、
工程（ｉ）は、患者におけるＰＳＡを決定する工程をさらに含み、
工程（ｉｉ）は、患者におけるＰＳＡレベルをＰＳＡについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、前記所定のカットオフ値は、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよびＰＳＡに基づいて算出されたＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するＰＳＡ値に相当するものであり、そして
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、ＰＳＡ値が前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。
【０１３２】
好ましい実施形態において、被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価するための方法は、ＰＳＡレベルが４ｎｇ／ｍＬよりも高い患者、陽性ＤＲＥを示す患者、または５０歳よりも高齢の患者で形成される。より好ましい実施形態において、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団は、ＰＳＡレベルが１０ｎｇ／ｍＬよりも低い患者で形成される。
【０１３３】
本発明のキット
別の態様において、本発明は、第１成分と、場合により第２成分とを含むキットであって、
第１成分が、下記からなる一連の試薬であり：
（ｉ）    遺伝子ＰＣＡ３の発現レベルを測定可能な試薬；
（ｉｉ）  遺伝子ＰＳＭＡの発現レベルを測定可能な試薬；および
（ｉｉｉ）遺伝子ＰＳＧＲの発現レベルを測定可能な試薬；
第２成分が、１つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な１つまたはそれ以上の試薬からなる、キットに関する。
【０１３４】
本発明のキットは、ＰＣａの診断のために、すなわち、患者がＰＣａに罹患しているか否かを評価するために、あるいはＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするために、すなわち、ＰＣａと診断された被検体における治療の効果を評価するために、あるいは被検体におけるＰＣａの進行または分化をモニタリングするために、すなわち、ＰＣａと診断された被検体の予後を決定するために、用いられ得る。
【０１３５】
本発明に関し、「キット」は、輸送および保管が可能なように包装された、本発明の方法を実施するのに必要な種々の試薬を含む製品と理解される。キットの構成要素を包装するのに適した材料としては、クリスタル、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ビン、バイアル、紙、封筒などが挙げられる。さらに、本発明のキットは、キット中の種々の構成要素の同時使用、逐次使用または個別使用のための説明書を含み得る。前記説明書は、印刷物の形態であるか、または例えば電子記憶媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）などの、被検体に読まれ得るような説明書を保存可能な電子支持体の形態であってもよい。さらにまた、メディアは前記説明書を提供するインターネットアドレス（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｄＤＲＭｓｓｅｓ）を含み得る。
【０１３６】
「遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬」は、遺伝子の発現レベルを測定すること、例えばＲＮＡ材料の抽出など、例えば対応するｍＲＮＡのレベルの測定などが可能な化合物または一連の化合物、例えばＲＴによって対応するｃＤＮＡを合成するためのプライマー、ＤＮＡの増幅のためのプライマー、前記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なプローブ（または対応するｃＤＮＡ）、Ｔａｑｍａｎプローブなどを意味する。
【０１３７】
特定の実施形態において、本発明のキットは、ｑＰＣＲアッセイで用いられるように設計される。さらに、好ましい実施形態では、本発明のキットの第１構成要素は、遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの各々に対する特異的Ｔａｑｍａｎプローブからなる。ｑＰＣＲ分析で用いられる遺伝子発現アッセイは、当業者によって設計され得るか、または例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから、コードＨｓ０１３７１９３８−ｍ１（ＰＣＡ３）、Ｈｓ００３７９５１５−ｍ１（ＰＳＭＡ）およびＨｓ００９５１９５２−ｍ１（ＰＳＧＲ）（実施例１）のもとに市販されている。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、ＰＣａの診断のための、ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、被検体におけるＰＣａの進行をモニタリングするための、あるいは患者が前立腺生検を受けるべきか否かを決定するための、本発明のキットの使用に関する。
【０１３９】
好ましい実施形態において、本発明のキットの使用は、４〜１０ｎｇ／ｍＬの血清ＰＳＡレベルを有する被検体において実施される。
【０１４０】
本発明を以下の実施例によって以下に詳述するが、これらは単に例示的なものであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１４１】
実施例１
尿におけるＰＣａの早期検出のための３遺伝子パネルの同定
１．材料および方法
１．１  患者、および尿の採取
本検査は、バル・デ・ブロン病院の治験審査委員会によって承認された。すべての尿サンプルは、バル・デ・ブロン病院（バルセロナ−スペイン）の泌尿器科から得られ、前立腺生検を受けた１９８人の男性から前立腺マッサージ（ＰＭ）直後に採取された。生検の指標は、異常な直腸指診（ＤＲＥ）および／または４ｎｇ／ｍＬよりも高い血清ＰＳＡであった。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。他の既知の腫瘍がある患者および／またはＰＣａ治療歴のある患者は検査から除外した。これらの１５４人の患者の臨床的および病理学的情報データを表１に示す。
【０１４２】
ＰＭ方法：ＰＭは、前立腺の底から頂部および各葉の側方から中線に激しい指圧を規則正しくかけることによって行った。
【０１４３】
生検方法およびＰＣａ検出率：生検は、エンドファイア型超音波トランスデューサ（Ｆａｌｃｏｎ  ２１０１、Ｂ−Ｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）および自動１８ゲージニードル（Ｂａｒｄ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。すべての手順において採取した最小数のコアは１０個であり、１〜８個の間の追加のコアをＶｉｅｎｎａ  ｎｏｍｏｇｒａｍ［Ｒｅｍｚｉら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００５；１７４：１２５６〜６０；考察１２６０〜１；著者回答１２６１］に従って採取した。
【０１４４】
検査を行った全被検体群について、１９８検体のうち１５４検体で分析に十分なＲＮＡが得られ、情報価値のある検体率７８％（９１％の患者がＰＣａを有し、２８％が良性）に相当した。前立腺生検によるＰＣａ検出率は３７％（５７／１５４）であった。生検を行うか否かを決定するのに特に臨床的に価値のある、ＰＳＡ  ４〜１０ｎｇ／ｍＬ範囲内で、生検歴なしの７７人の患者の亜群において、ＰＣａ検出率は３６％（２８／７７）であった（表１）。
【０１４５】
【表１】
2013531997.tif 000002
【０１４６】
１．２  サンプル調製
尿サンプル（約５０ｍＬの初尿）を採尿カップに採取し、氷上で保持し、実験室に輸送し、そして３０分以内に加工した。尿サンプルを４℃で１０分間、２，５００×ｇで遠心分離し、次いでペレットを冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（１×）で２回洗浄した。最後に、ペレットをＲＮＡ抽出まで−８０℃で１：５ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で保存した。
【０１４７】
１．２．１  ＲＮＡ単離およびプレ増幅
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、尿ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１本鎖ｃＤＮＡ合成を実施し、プレ増幅まで−８０℃でＴａｑＭａｎ  Ｐｒｅａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて保存した。
【０１４８】
１．２．２  定量ＰＣＲ分析
３つの推定ＰＣａ尿バイオマーカー（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）を、本発明者らによって選択した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて前記３つの推定ＰＣａ尿バイオマーカーおよびコントロール転写物ＰＳＡを分析するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ｑＰＣＲ装置において３連で反応を行い、標準偏差（ＳＴＤＥＶ）が０．３８の値よりも低い結果のみを採用した。閾値をｑＰＣＲの対数期に設定した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＳＤＳソフトウェアＶ２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各プレートについて同一のベースラインおよび閾値を設定してデータ分析を行い、各サンプル中のすべての遺伝子についての閾値サイクル（Ｃｔ）値を得た。尿沈渣中に正常に見出される非癌性細胞、例えば、尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞においても前記マーカーが発現しているかもしれない可能性を排除するために、臨床検体中の含有量を前立腺由来ＲＮＡの量に正規化した。尿中には比較的少数の前立腺細胞しか見出されないので、ｑＰＣＲの前にｃＤＮＡプレ増幅工程を行った。本発明者らは、次いで、検体に情報価値があるか否か、すなわちＲＮＡの存在量が正確な結果を得るのに十分であるか否かを決定するために、プレ増幅の前に、ｃｔ（ＰＳＡ）のｑＰＣＲカットオフを３５よりも低く規定した。各マーカーについて、ｌｏｇ（ｃｔ（マーカー）／ｃｔ（ＰＳＡ）×１０００としてスコアを算出した。各マーカーについてのカットオフ値を決定し、マーカーがカットオフ値を超えた場合に検体を陽性とカウントした。
【０１４９】
１．３  統計分析
ＰＣａ生検個体と陰性生検個体との間の平均値を比較することによって、候補バイオマーカーの特徴付けを達成した。データの分布が正常である場合はウェルチ補正したｔ検定を用い、その他の場合にはマンホイットニー検定を用いた。正規性はシャピロウィルクの正規性検定で検証した。すべての検定は、分散を安定化させるために適用される対数変換データで実施した。多変量解析を用いて、候補マーカーと疾患状態との間の関連を調査した。
【０１５０】
受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、ＰＣａ群の患者をその他から識別するための尺度としての各マーカースコアの性能を評価した。ＰＳＡの場合と同様に、各マーカーについてＲＯＣ曲線を個々に算出し、マーカーの組み合わせについて多変量ＲＯＣ（ｍｕｌｔｉＲＯＣ）を算出した。
【０１５１】
簡潔に言うと、各バイオマーカーにつき１つの検出閾値を用い；次いで、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超えた場合、新たなマーカーを陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値の範囲にわたって算出した。新たなマーカーについてのＭｕｌｔｉＲＯＣ曲線点群は、以下の方法で得た：固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲から、特異度についての最大値を選択した。
【０１５２】
２つ以上のマーカー（ｋ）を組み合わせるために、以下の手順に従った：まず、各バイオマーカーにつき１つのｋ成分検出閾値を用い；次いで、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超えた場合、新たなマーカーを陽性と認定した。感度および特異度の値は、ｋ成分閾値の範囲にわたって算出した。これにより点群を得た。新たなマーカーについての最適ＲＯＣ曲線点群は、以下の方法で得た：固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲内で、特異度についての最大値を選択した（Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００３，９５，５１１〜５１５）。ｋが増加すると計算の複雑性が指数関数的に増すので、同時に３つのマーカーのみを加えた。最適ＲＯＣ曲線点をもたらすｋ成分カットオフ値を用いて、ｋ多重マーカーに新たな変数の追加を行った。これらのｋ成分閾値を新たな変数の値と組み合わせて、新たな最適ＲＯＣ曲線を得るために用いられる（ｋ＋１）成分検出閾値を得た。統計分析は、ＰＡＳＷ  Ｖ１７．０、およびフリー統計的言語Ｒ、およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のＲＯＣパッケージを用いて行った。
【０１５３】
複合マーカーと個々のマーカーとの間の結果予測性能を比較するために、ＭｕｌｔｉＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣｍ）を測定した。複合モデルが、固定感度で個々のバイオマーカーよりも有意によく結果を予測し得るか否かを決定するために、本発明者らは、比率についてのＺ検定を用いて、対応する偽陽性率を比較した。Ｚ検定のための偽陽性率の分散の計算を、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、およびＰＣＡ３各々単独について、Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｓｔａｔ．２００９；２０：４８５〜４８７）に説明されるように実施した。本発明者らは、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＰＣＡ３、およびＰＳＡの組み合わせ（（ＰＳＭＡ＿ＰＳＧＲ＿ＰＣＡ３）＿ＰＳＡ）の場合に、再サンプリング手法を用いた。これらの比較におけるＰ値は、偽発見率手順［Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．Ｓｅｒ．Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌ）１９９５；５７：２８９〜３００）に従い、多重検定問題について補正した。
【０１５４】
バイオマーカーの組み合わせの性能を示すＲＯＣ曲線の作成における主要な懸念は、過剰適合である。このバイアスを制御するために、本発明者らは折半（５０％）法に基づく手法を用いて結果を検証した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００１；５４：７７４〜７８１）。簡潔に言うと、サンプルの５０％をトレーニングセットとして用いて、ＲＯＣ曲線を計算した。このＲＯＣ曲線を用いて、規定された一連の感度（９０〜１００％）を得るのに必要なカットオフ値を決定した。したがって、決定したカットオフを用い、試験サンプルを用いて各感度に対応する特異度を推定した。この手順を５００回繰り返し、全反復後に得られる平均値を計算することによって、最終推定を得た。統計分析は、ＰＡＳＷ  Ｖ１７．０、およびフリー統計的言語Ｒ、およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のＲＯＣパッケージを用いて行った。
【０１５５】
２．結果
前立腺生検によるＰＣａ検出率は、３７％（５７／１５４）であった。検査を行った全被検体群について、１９８検体のうち１５４検体で分析に十分なＲＮＡが得られ、情報価値のある検体率７８．８％（ＰＣａを有する患者について９５．０％および良性患者について７０．３％）に相当した。
【０１５６】
ＰＣａを有する患者を針生検陰性の患者から識別し得るか否かを決定するために、１５４人の患者からＰＭ後に得られた尿沈渣において、ＰＣＡ３、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡおよび追加の臨床的パラメータを試験した。ＰＣＡ３（ｐ＝０．０１８）、ＰＳＧＲ（ｐ＜０．００１）、ＰＳＭＡ（ｐ＝０．０１６）およびＰＳＡＤ（ｐ＝０．０２７）は、統計学的に有意であったが（Ｆｉｇ．１（Ａ〜Ｄ）箱髭図）、一方、ＰＳＡ（ｐ＝０．５５）、遊離型ＰＳＡ［ｆＰＳＡ］（ｐ＝０．６０）および前立腺体積［ＰＳＴ  ＶＯＬ］（ｐ＝０．０５３）は、統計学的有意性を示さなかった。
【０１５７】
多変量解析後、本発明者らは、ＲＯＣ曲線分析についてＰＣＡ３、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡＤを選択して、診断有効性を視覚化し、尿サンプルの遺伝子に基づくｑＰＣＲアッセイのデータをまとめた。以下のＡＵＣ値を得た：ＰＣＡ３（０．６０）、ＰＳＧＲ（０．６４）、ＰＳＭＡ（０．６２）、およびＰＳＡＤ（０．６１）（Ｆｉｇ．２）。有意水準Ｐ（面積＝０．５）は、それぞれｐ＝０．０４３、０．００２、０．０１２および０．０５１であった。
【０１５８】
種々のバイオマーカーの組み合わせにより単一バイオマーカーよりも性能を改善し得るか否かを決定するために、ＭｕｌｔｉＲＯＣ手法（ＰＳＭＡ＿ＰＳＧＲ＿ＰＣＡ３）を用いて、かつ従来の二項ロジスティック回帰分析を用いて、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、およびＰＣＡ３（３Ｍ）を組み合わせた。
【０１５９】
癌の多因子性により、ある患者においてマーカーＡが陽性であり、別の患者においてマーカーＢが陽性であり得るという可能性がある。ロジスティックモデルは、ロジスティック曲線を患者についての疾患の確率に適合させる。この技術を用いて、個々の重みを各々に割り当てると、両マーカーの組み合わせは本質的に直線である。これは、両マーカーの発現が各マーカー単独よりも有意であるという仮定の下で有効である。しかしながら、ＡまたはＢのいずれかの発現が単独で、患者を分類するのに十分である場合、情報の損失がある。そのため、本発明で開発されたモデルにおいて、複合マーカーは、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、陽性と認定した。ＭｕｌｔｉＲＯＣモデルの性能は、ロジスティック回帰分析よりも優れていた（Ｆｉｇ．３）。
【０１６０】
３Ｍ（ＰＳＭＡ＿ＰＳＧＲ＿ＰＣＡ３）についてのＭｕｌｔｉＲＯＣ下面積は、０．７４［０．６８〜０．８０］であった（Ｆｉｇ．２）。それらの間で比較を行い、以下の結果を得た：３Ｍ  対  ＰＣＡ３（Ｐ＝０．００７１）、３Ｍ  対  ＰＳＧＲ（Ｐ＝０．０４９３）、３Ｍ  対  ＰＳＭＡ（Ｐ＝０．０２５３）、ＰＳＭＡ  対  ＰＳＧＲ（Ｐ＝０．７５）、ＰＳＭＡ  対  ＰＣＡ３（Ｐ＝０．６９）、およびＰＳＧＲ  対  ＰＣＡ３（Ｐ＝０．４６）（表２）。
【０１６１】
【表２】
2013531997.tif 000003
【０１６２】
ＰＳＭＡについての感度および特異度の合計を最大にすると、アッセイ感度は８１％［６８〜９０］、そして特異度は４１％［３１〜５２］であった。ＰＳＧＲについては、アッセイ感度６３％［４９〜７７］および特異度６４％［５４〜７３］、そしてＰＣＡ３については、感度８６％［７４〜９４］および特異度３５％［２７〜４５］を達成した。３Ｍについては、感度８９％［７９〜９５］および特異度４５％［３５〜５７］であった。ＲＯＣ曲線の統計比較を表２に示す。感度を臨床的に価値のある値の範囲である９０〜１００％に固定することによって、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＰＣＡ３および３Ｍを比較した場合、感度１００％で個々のマーカーについての特異度は０％まで低下するが、複合モデルは特異度２９％［２１〜３９］を維持した（Ｆｉｇ．２）。標準Ｚ検定を行い、これらの差異が有意か否かを調べた。例えば、９６％の感度について、以下のＰ値を得た：３ＭとＰＳＭＡとの比較；Ｐ１／４  ０．０００１、３ＭとＰＳＧＲとの比較；Ｐ１／４  ０．０００２、３ＭとＰＣＡ３との比較；Ｐ１／４  ０．０００６。このデータを検証するために、本発明者らは５００回反復での折半法によって検証を行った。本発明者らは、感度９０％〜１００％の範囲で検証ＲＯＣ曲線を構築した（表３）。
【０１６３】
【表３】
2013531997.tif 000004
【０１６４】
次いで、３マーカーモデル（３Ｍ）をＰＳＡＤ（ＰＳＡ／ＰＳＴ  ＶＯＬ）と組み合わせて新たなマーカーとした。このために、本発明者らは、各バイオマーカーにつき１つの４成分マーカー検出閾値を用いた。複合マーカーは、少なくとも１つのマーカーがその検出閾値を超えた場合に、陽性と認定した。ＲＯＣ曲線を描くために、本発明者らは、感度および特異度の値を４成分閾値の範囲にわたって算出した。したがって、本発明者らは、感度についての値を固定することができた。特異度についての最大値は、感度値に合致させて本発明者らが得た特異度の範囲内から選択した。複合マーカーモデルについてのＡＵＣは、０．８０［０．７１〜０．８３］であった。感度９６％で、特異度は４０％であった。陽性および陰性的中率は、それぞれ４８％および９５％であった（Ｆｉｇ．２）。表４は、前記組み合わせ［（ＰＣＡ３、ＰＳＲＧおよびＰＳＭＡ）およびＰＳＡＤ］の数値を含む。
【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
ＰＳＡ  ４〜１０ｎｇ／ｍＬの患者における３マーカーモデル
生検を行うべきか否かを決定するために、特に臨床的に価値のある亜群を試験した。この群は、結果が４〜１０ｎｇ／ｍＬの間のＰＳＡ診断「グレーゾーン」であった、前立腺生検（ＰＢ）歴のない８２人の患者から構成された。ＰＢによるＰＣａ検出率は３４％（２８／８２）であった（表１）。検査を行った全被検体群について、９３検体のうち８２検体で分析に十分なＲＮＡが得られ、情報価値のある検体率８８．２％に相当した。
【０１６７】
単変量解析によって全マーカーを試験し、ＰＣａを有する患者を陰性ＰＢの患者と区別し得るか否かを調べた。以下の結果を得た：ＰＳＭＡ（ｐ＝０．００３）、ＰＳＧＲ（ｐ＝０．００９）、ＰＣＡ３（ｐ＝０．０２５）、ＰＳＡＤ（ｐ＝０．０３６）（Ｆｉｇ．１）および前立腺体積（ｐ＝０．０２）は統計的に有意であったが、一方、ＰＳＡ（ｐ＝０．２６）およびｆＰＳＡ（ｐ＝０．６７）は、全く統計学的有意性を示さなかった。本発明者らは、以下のＡＵＣ［９５％ＣＩ］値を得た：ＰＳＭＡ  ０．７４［０．６３〜０．８６］、ＰＳＧＲ  ０．６６［０．５４〜０．７９］、およびＰＣＡ３  ０．６１［０．４８〜０．７４］。３ＭについてのＡＵＣは０．８２［０．７７〜０．８６］、３ＭとＰＳＡＤの組み合わせについてのＡＵＣは０．８０であった（Ｆｉｇ．４）。ＲＯＣ曲線の統計比較を表２に示す。
【０１６８】
ＰＳＭＡについての感度および特異度の合計を最大にすると、感度は６４％［４４〜８１］、そして特異度は７０％［５６〜８２］であった。ＰＳＧＲについて、感度は６１％［４１〜７９］および特異度は７０％［５６〜８２］であり、そしてＰＣＡ３について、アッセイ感度は７１％［５１〜８７］および特異度は５４％［４０〜６７］であった。３Ｍについて、本発明者らは、感度８９％［７２〜９６］および特異度５７％［４４〜７０］を達成した。次いで、本発明者らは、感度を臨床的に価値のある値の範囲である９０〜１００％に固定することによって、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＰＣＡ３および３Ｍを比較した。感度１００％で個々のマーカーについての特異度は０％まで低下するが、複合モデルは特異度４６％［３７〜６３］を維持した。本発明者らは、ＰＳＭＡについて４％［１〜１３］、ＰＳＧＲについて１２％［６〜２４］、およびＰＣＡ３について０％［０〜７］の感度を得た（Ｆｉｇ．３）。２つの比率についての標準試験を感度（９０％〜１００％）の範囲において行い、これらの差異が有意か否かを調べた。感度９０％〜１００％の範囲における検証ＲＯＣ曲線を表５に示す。例えば、感度９６％について、本発明者らは以下のＰ値を得た：３ＭとＰＳＭＡとの比較、ｐ＝０．０００５、３ＭとＰＳＧＲとの比較、ｐ＜０．０００１、３ＭとＰＣＡ３との比較、ｐ＝０．０００１。
【０１６９】
【表５】
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【０１７０】
回避し得る生検数の決定
最後に、回避し得る生検数を、群全体およびＰＳＡ  ４〜１０ｎｇ／ｍＬの群において、複合マーカーモデル（３Ｍ）を用いて、回避される生検％＝真陰性＋偽陰性として算出した。感度９６％について、ＰＳＡの全範囲および繰り返し生検を含む群全体において２３％（３Ｍ  ｖ  ＰＳＡで２３％）の生検を回避することができた。この場合の陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）は、それぞれ４６％および９４％であった。生検歴がなく、かつ結果がＰＳＡ「グレーゾーン」の４〜１０ｎｇ／ｍＬの間である、特に価値のある臨床リスク群の分析において、感度９６％で３４％の生検を回避することができた。ＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ５１％および９６％であった（Ｆｉｇ．５）。
【０１７１】
３つのマーカーの組み合わせ（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）は、ＰＳＭＡ、ＰＣＡ３およびＡＭＡＣＲの組み合わせよりも高い感度を示す
スコアの決定は、前述のように実施した。
【０１７２】
各バイオマーカーにつき１つの検出閾値（カットオフ）を用い；次いで、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、患者を陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値（カットオフ）の範囲にわたって算出した。固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲から、特異度についての最大値を選択した。
【０１７３】
上記の例において、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲおよびＰＳＭＡの相対発現は、２５人の患者のコホート（４８％がＰＣａを有する）から測定した。ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲについてのカットオフ組み合わせ（それぞれは、１０．３、１６．５７、および１．４３）により、９２％の感度および６７％の特異度を得た。一方、ＰＣＡ３およびＰＳＭＡについて同一のカットオフで、またＡＭＡＣＲについてカットオフ１０２での、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＡＭＡＣＲの組み合わせにより、ともにより低い（かつ感度の差異がかなり大きい）７７％の感度および６４％の特異度を得た。
【０１７４】
次いで、感度および特異度の合計を算出した（それぞれ、１．６および１．４）。ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの組み合わせにより、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＡＭＡＣＲの組み合わせよりも高い値を得た。
【０１７５】
ＡＭＡＣＲについてより低いカットオフを用いると、感度は上昇するが特異度が低下し、したがって、これは実行可能な代替案ではない。例えば、カットオフ９６により、感度８４．６２％および特異度５４．５５％となるが、一方、感度および特異度の合計は１．４のままであり、これは全体としてより良い結果ではないことを示している。
【０１７６】
この例は、少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超える場合に患者がＰＣａについて陽性であると判定する方法により、特異度が低下することなく感度が上昇することを示す。単一マーカーで用いるカットオフを変更すると、常に感度および特異度が同時に変化するので、これは驚きである。一般に、感度を上げるためにより低いカットオフを用いると、特異度値が低下する。驚いたことに、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの組み合わせを用いると、各マーカーを単独で用いた場合と比較して、より高くかつより特異的なカットオフ値を用いて同じ感度値に到達することが可能であった。
【０１７７】
この例は、３つのマーカー（ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ）のいずれかについての少なくとも１つのスコアがその検出閾値を超える場合に、患者がＰＣａについて陽性であると認定する方法により、個々のマーカー各々で用いたのと同じ感度値で、より多くの患者を同定することができることを示す。ＰＳＧＲにより、ＰＣＡ３およびＰＳＭＡのレベルが低い前立腺癌患者１６番および２５番を同定することができた。ＰＳＭＡにより、ＰＣＡ３およびＰＳＧＲのレベルが低い前立腺癌患者１９番を同定することができた（左パネル）。この組み合わせにより、前立腺癌に一般的な転移の不均一性のより多くが攻略されるので、より大きなＰＣａ患者プールの同定が可能になる。対照的に、ＰＳＧＲの代わりにＡＭＡＣＲと組み合わせると、この感度および特異度の組み合わせで、さらなる患者は同定されなかった（右パネル）。
【０１７８】
【表６】
2013531997.tif 000007
【０１７９】
３．考察
本発明者らは、ＰＭ後の尿沈渣におけるＰＣａについての多重ｑＰＣＲベースの試験を開発した。追加の臨床的パラメータの組み込みにより、診断精度をさらに改善し得る。このパラメータの１つはＰＳＡＤであり得る。「グレーゾーン」といわれる、血清ＰＳＡの範囲４．０〜１０．０ｎｇ／ｍＬにおいて、ＰＳＡＤは総ＰＳＡよりも有意に正確であった（Ｏｈｏｒｉ  Ｍら、１９９５、Ｕｒｏｌｏｇｙ４６：６６６〜７１）。したがって、本発明者らは、前立腺生検を行うか否かを決定するための判断基準としてＰＳＡＤを含めた。
【０１８０】
ＰＣａ細胞において高度に過剰発現している前立腺特異的ｍＲＮＡは、理想的な標的である。これらの遺伝子は、尿沈渣中に正常に見出される非癌性細胞、例えば尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞においても発現し得るので、臨床検体中の含有量を前立腺由来ＲＮＡの量に正規化しなければならない。これは、診断指標として遺伝子／ＰＳＡ  ｍＲＮＡ濃度の比を用いることによって達成される。血中タンパク質濃度とは対照的に、ＰＳＡ  ｍＲＮＡ発現は正常前立腺細胞において比較的一定であることが示されており、ＰＣａ細胞におけるＰＳＡ発現の弱いダウンレギュレーションのみが報告されている［Ｍｅｎｇ  ＦＪら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １１：３０５〜９（２００２）］。本検査で用いた遺伝子は、非腫瘍性前立腺組織と比較して、前立腺腫瘍において高いアップレギュレーションを示した。したがって、前立腺腫瘍におけるＰＳＡのダウンレギュレーションは、腫瘍遺伝子／ＰＳＡ比を高めると考えられる。ＰＳＡは、尿中に存在する他の細胞、例えば移行上皮、血液または腎臓においては発現しないので、前立腺ハウスキーピング遺伝子として用いられ得る。検体に情報価値があったか否か、すなわちＲＮＡの存在量が正確な結果を得るのに十分であったか否かを決定するために、本発明者らはＰＳＡ  ｍＲＮＡ収量を用いた。なぜなら、ＰＳＡ  ｍＲＮＡは前立腺細胞にのみ存在し、尿中に存在する他の細胞型の多様な含有量によって影響を受けないためである。
【０１８１】
ＰＣＡ３発現についての尿ベースの試験は、大規模なスクリーニングプログラムにすでに記述されているが、癌発生の不均一性を考慮に入れた診断プロファイルに基づく研究は２つしかない。種々のバイオマーカーの組み合わせにより、単一マーカーよりも明らかに性能が改善されるはずである。これを達成するために、本発明者らは、複合ＲＯＣ分析において、３つの最良のマーカー（ＰＣＡ３、ＰＳＧＲおよびＰＳＭＡ）と新たなマーカーＰＳＡＤとの組み合わせによって作製した尿転写物の新規多重パネルを用いた。分析した検査群において、複合マーカーモデルについてのＡＵＣ（０．８０）は、個々のマーカー単独についてのＡＵＣ：ＰＣＡ３（０．６０）、ＰＳＧＲ（０．６４）およびＰＳＭＡ（０．６２）と比較して、著しく改善された。例えば、ＰＣＡ３のスコア７．２３を、ＰＳＧＲについてのスコア６５．５１、ＰＳＭＡについての４６．６１、およびＰＳＡＤの０．２１と組み合わせると、高い診断精度でＲＯＣ曲線上の点に対応した：感度および特異度（それぞれ９６％および４０％）（Ｆｉｇ．２）。血清ＰＳＡ  ４〜１０ｎｇ／ｍＬで、生検歴なしの患者のみを分析すると、複合マーカーモデルについて、感度９６％およびＡＵＣ（０．８９）で、特異度は６２％に改善された（Ｆｉｇ．４）。
【０１８２】
本発明者らと以前の研究とは、患者尿中のＰＣＡ３転写物を検出するために異なる方法論を用い、そしてそれらの多くは検査群において同じＰＣａ有病率（約３５％）を用いていないので、ＡＵＣを直接比較するのは不適当であった；しかしながら、本発明者らは、上述の検査による結果または血清ＰＳＡと比較した場合、ＰＣＡ３がＡＵＣの改善を示すことを示した。重要なことに、本発明者らは、複合モデルがＰＣＡ３単独と比較して的中可能性を有意に改善することを実証した。複合バイオマーカーアプローチの基礎をなす原理は、乳癌患者における高い再発リスクの同定に提供された試験と一致している［Ｐａｉｋ  Ｓら；Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５１：２８１７〜２６（２００４）ｙ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  ＭＪら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７：１９９９〜２００９（２００２）］。要約すると、本発明者らは、前立腺生検に参加している患者由来の尿沈渣における多重ｑＰＣＲアッセイが、血清ＰＳＡまたはＰＣＡ３単独よりも優れていることを示した。
【０１８３】
これらの知見を臨床に翻訳するために、偽陰性および偽陽性の相対的重要性を考慮することが必要である。したがって、本発明者らは、感度を高い範囲（９０〜１００％）に固定して、対応する特異度を算出することを提案した。本発明者らが高いパーセンテージを選択した理由は、生検を行うべきか否かを決定する試験において、偽陰性は偽陽性よりも悪いためである。これは、癌症例を見落とすことにより、患者にとって致命的な結果になり得るためである［Ｐｅｐｅら、２００８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，１００：１４３２〜１４３８］。感度が１００％に近いと、個々のマーカーについての特異度はしばしば劇的に低下する。本検査では、感度１００％でＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、およびＰＣＡ３についての特異度は０％であったが、複合モデル（３Ｍ）は２９％の特異度を維持した。３ＭをＰＳＡと組み合わせて用いても、それ以上の利点はなかった（２９％）。
【０１８４】
本発明によって得られる複合３−マーカーモデル＋ＰＳＡの結果は、特異度を低下させることなく感度の全体的な上昇をもたらした。臨床に翻訳したところ、本発明者らはＰＳＡ試験単独と同じく高い感度を達成したが、特異度が著しく上昇した。本方法を感度１００％で用いると、３３％の生検が回避され、そして感度９６％で４２％の生検が回避され得た。これは、欧州全体で回避される生検のおおよその年間数１２６，７５０〜１６２，２４０回に相当した。
【０１８５】
本検査および他の検査の可能性のある限界として、用いたＰＣａ陰性患者の定義は、最近の陰性生検に基づいている。しかしながら、陰性の前立腺生検を示す患者の３２％に対して１２％が、後日、実際はＰＣａと診断されるので、この定義は問題であり得る［Ｃｅｒｖｅｒａ  Ｄｅｖａｌ  Ｊら、Ａｃｔａｓ  Ｕｒｏｌ．Ｅｓｐ．２８：６６６〜７１（２００４）およびＲａｂｅｒ  Ｍら、Ａｒｃｈ．Ｉｔａｌ．Ｕｒｏｌ．Ａｎｄｒｏｌ．７２：１９７〜９（２０００）］。その結果、陰性の生検所見を有する多くの男性が、ＰＣａを排除するために繰り返し生検を受け、したがって、生検は陰性であったが陽性試験で陽性である、かなりの数の個体が存在する。それにもかかわらず、本発明によって得られたデータは、ＰＣａについての正確な診断試験を目指して本発明によって提供される４マーカー非侵襲性アッセイ法の適用可能性を支持するものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月17日(2012.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体において所望の感度で前立腺癌（ＰＣａ）を診断する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記バイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉ）が、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定された、ＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび追加のバイオマーカーのレベルに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、さらに
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、追加のバイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前記所望の感度でＰＣａに罹患していることを示すものであるとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣａを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、
（ｉ）前記治療の実施前に得た前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記治療の実施中または実施後に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉｉ）前記治療の実施前および実施中または実施後に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を比較することを含んでなり、
前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは
前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法。
【請求項４】
工程（ｉ）および（ｉｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記さらなるバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉｉ）が、前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記追加のバイオマーカーに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかもしくは変化しないこと、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して低下することが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは
前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していること、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被検体における前立腺癌（ＰＣａ）の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）第１期に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と
（ｉｉ）第２期に同一被検体から得た生体液体サンプル中の前記遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものであり、前記第２期が、前記第１期よりも後である工程と、
（ｉｉｉ）第１期および第２期に得た前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
第２期でのサンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、前立腺癌が被検体において進行していないことを示し、あるいは
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、前立腺癌の進行を示すものであるとする、方法。
【請求項６】
工程（ｉ）および（ｉｉ）が、患者における前立腺癌についての追加のバイオマーカーのレベルを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉｉ）が、患者における前記バイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベルが、第１期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、被検体の陽性進行を示し、あるいは
第２期での被検体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベル値が、第１期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、被検体の陰性進行を示すものであるとする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、
（ｉ）前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、
（ｉｉ）前記ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程と
を含んでなり、
前記生体液体サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、前記被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法。
【請求項８】
工程（ｉ）が、患者におけるＰＣａについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、ＰＳＡ密度（ＰＳＡＤ）、血清遊離型ＰＳＡレベル、血清総ＰＳＡレベル、血清遊離型ＰＳＡレベルの血清総ＰＳＡレベルに対する比、プロＰＳＡレベル、およびＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）からなる群から選択されるものであり、さらに
工程（ｉｉ）が、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたＰＣＡ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出された多変量ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカーレベル値に相当するものであり、さらに
前記サンプル中の少なくとも１つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団が、４ｎｇ／ｍＬを超えるＰＳＡレベルを有する患者、および／または陽性ＤＲＥを示す患者で形成されてなる、請求項７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣａに罹患しているリスクのある患者集団が、１０ｎｇ／ｍＬよりも低いＰＳＡレベルを有する患者で形成されてなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体液体サンプルが、前立腺マッサージ後に得られる、排泄された尿サンプル由来の沈渣である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
所望の感度が１００％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子の発現レベルが、当該ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲを測定する同一サンプル中の前立腺特異的ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化されてなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前立腺ハウスキーピング遺伝子がＰＳＡであり、ＰＳＡの発現レベルがＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを測定することによって決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＡ３、ＰＳＭＡおよびＰＳＧＲ遺伝子、および／またはハウスキーピング遺伝子の発現レベルが、定量的ＰＣＲによって決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
定量的ＰＣＲが多重ＰＣＲである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者が、孤立性または多発性の高悪性度前立腺上皮内腫瘍に罹患している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１成分と、場合により第２成分とを含んでなるキットであって、
第１成分が、下記からなる一連の試薬であり：
ｉ）    遺伝子ＰＣＡ３の発現レベルを測定可能な試薬；
ｉｉ）  遺伝子ＰＳＭＡの発現レベルを測定可能な試薬；および
ｉｉｉ）遺伝子ＰＳＧＲの発現レベルを測定可能な試薬；
第２成分が、１つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な１つまたはそれ以上の試薬からなる、キット。
【請求項１９】
前立腺癌を有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、あるいは被検体における前立腺癌の進行をモニタリングするための、前立腺癌を診断するための、請求項１８に記載のキットの使用。
【請求項２０】
前立腺生検の候補と評価される被検体が、４〜１０ｎｇ／ｍＬの血清ＰＳＡレベルを有する被検体である、請求項１９に記載の使用。
【国際調査報告】
2013531997.tif 000016
2013531997.tif 000017
2013531997.tif 000018