(57)【要約】  本発明は、ショ糖からのイソマルツロースおよびイソマルツロース含有組成物のバイオテクノロジー的製造のために、改善された手段、特に改善された生成物特異性を有するスクロースムターゼおよび改善されたスクロースムターゼを含む微生物細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に示された配列に比してS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qから選択される1またはそれ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有するスクロースムターゼ酵素。
【請求項２】
配列番号1に示された配列に比してアミノ酸置換S303Pを有するアミノ酸配列を有する請求項１に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項３】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換D302Yを有するアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項４】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換S303PおよびD302Yを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項５】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換K180Pを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項６】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換M199Iを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項７】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換Q276Aを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項８】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換A198Dを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項９】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換Y219Fを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項１０】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換V324Tを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項１１】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換T369Lを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項１２】
配列番号1に示された配列に比して少なくともアミノ酸置換A346Qを有するアミノ酸配列を有する請求項１〜１１のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項１３】
酵素が単離されたポリアミノ酸分子として存在する請求項１〜１２のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素を担体に固定化して含む生体触媒。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の1またはそれ以上のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリヌクレオチド分子を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載のポリヌクレオチド分子を細胞の染色体に含む請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１５に記載のポリヌクレオチド分子を染色体外（エピソーム）に含む請求項１７に記載の細胞。
【請求項２０】
エッシェリキア、サルモネラ、セラチア、エルウィニア、エンテロバクター、クレブシエラ、ラウオルテラ、ペクトバクテリウム、シュードモナス、アゾトバクター、パントエア、ロイカネアおよびプロタミノバクターの各属の微生物からなる群より選択される請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２１】
プロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubrum）種の生物から選択される請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞を準備する工程、および
該細胞を請求項１５に記載のポリヌクレオチド分子および／または請求項１６に記載のベクターと接触させる工程
を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項２３】
基質のイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物への転化を可能にする条件のもとで、ショ糖含有基質を請求項１〜１３のいずれか１項に記載のスクロースムターゼ酵素または請求項１４に記載の生体触媒と接触させる工程を含む、ショ糖含有基質からのイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物のバイオテクノロジー的製造方法。
【請求項２４】
基質のイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物への転化を可能にする条件のもとで、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の細胞または請求項２２に記載の方法で製造可能な細胞を、ショ糖含有基質を含む培地で培養する工程を含む、ショ糖含有基質からのイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物のバイオテクノロジー的製造方法。
【請求項２５】
転化の際に細胞がマトリックスに固定化されている請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
イソマルツロースまたはイソマルツロース組成物を培地および／または細胞から単離する工程をさらに含む請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ショ糖からのイソマルツロースおよびイソマルツロース含有組成物のバイオテクノロジー的製造に関し、そのために改善された手段、特に改善された生成物特異性を有するスクロースムターゼおよび改善されたスクロースムターゼを含む微生物細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
周知のようにイソマルツロース（パラチノース）はバイオテクノロジー的プロセスでショ糖（甘蔗糖、甜菜糖）から酵素異性化によって製造することができる。イソマルツロースはショ糖代用物質として食品や類縁製品でますます重要な、生理的に貴重な糖である。イソマルツロースはう蝕原性がなく、ショ糖とほぼ同じエネルギー含有量で低い血糖指数を有する。イソマルツロースは2005年以来食品での使用が許可されている。さらにイソマルツロースは、糖アルコールであるイソマルト、即ち1,6-GPS（6-O-α-D-グルコピラノシル-D-ソルビトール）と1,1-GPM（1-O-α-D-グルコピラノシル-D-マンニトール）のラセミ混合物およびその変形、特にGPSまたはGPMに富む混合物の製造のための原料である。
【０００３】
周知のようにショ糖からのイソマルツロースのバイオテクノロジー的製造は、細菌酵素であるスクロースムターゼE.C.5.4.99.11（同義語：サッカロースムターゼ、スクロースイソメラーゼ、サッカロースイソメラーゼ、イソマルツロースシンターゼ）の活性を有する、好ましくは固定化された細菌細胞またはその断片を使用して行われる。周知のようにスクロースムターゼ活性を有し、バイオテクノロジー的プロセスで使用できる微生物は、特にプロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubrum）、エルウィニア・ラポンチシ（Erwinia rhapontici）、シュードモナス・メソアシドフィラ（Pseudomonas mesoacidophila）、パントエア・ディスペルサ（Pantoea dispersa）およびセラチア・プリムチカ（Serratia plymuthica）である。その内在性スクロースムターゼはSmuA、Pal I、SmtA、MutB、SIM等の略称で知られている。スクロースムターゼは染色体遺伝子によってコードされる。
【０００４】
周知のバイオテクノロジー的システムでは、ショ糖が酵素によって完全にイソマルツロースに異性化されない。むしろその他の異性化産物や副産物が生じる。重要なその他の異性化産物はトレハルロースである。微生物プロタミノバクター・ルブラムにはスクロースムターゼSmuAが存在し、その生成物特異性は、最適化された培養条件のもとでもショ糖が約85％しかイソマルツロースに異性化されないように形成されている。スクロースムターゼSmuAの生成物特異性は改善の余地がある。しかもバイオテクノロジー的手段による工業的イソマルツロース生産は、P.ルブラムのスクロースムターゼSmuAに基づいているのである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、改善された生成物特異性およびイソマルツロースに対する選択性を有し、このため異性化産物中のイソマルツロースの割合が高められ、かくして従来周知のバイオテクノロジー的プロセスでもショ糖からイソマルツロースへの転化をより効率的に行うことができる、SmuAをベースとする改善されたスクロースムターゼおよびこの改善されたスクロースムターゼを含む微生物を提供することを課題とする。さらに本発明は、おおむね変更のない、すでに確立された工業的バイオテクノロジー的プロセスで使用することができ、既成のプロセスで反応条件や工程順序に費用のかかる調整を行わずに済む、SmuAをベースとする改善されたスクロースムターゼを提供することを課題とする。他の生物のスクロースムターゼの使用や新しいバイオテクノロジー的プロセスへの切り替えは回避しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ショ糖のイソマルツロースへの転化に関して改善されたスクロースムターゼ活性、即ちイソマルツロースに対するより高い生成物特異性を有する新規なポリアミノ酸分子を提供することによって、本発明の根底にある技術的課題は完全に解決される。本発明によれば、改善されたスクロースムターゼはプロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubrum）のスクロースムターゼSmuAの野性型配列から好ましくは直接誘導されたアミノ酸配列を有し、配列番号1に示す野性型配列の部位番号にそれぞれ関連する下記のアミノ酸部位の少なくとも1つに、次に挙げるアミノ酸置換、即ちS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qの1またはそれ以上、ならびに2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10個すべての組合せを有する。さらに本発明に基づきこの部位は活性中心の位置に応じて決定される。
【０００７】
そこで本発明は解決手段として、配列番号1に示す配列に比して下記のアミノ酸置換S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qの1またはそれ以上を有するアミノ酸配列の群より選択される、改変されたアミノ酸配列を有し、即ちもっぱら有し、またはこれを含むことを特徴とする改善された新規なスクロースムターゼ酵素を提供する。
【０００８】
また本発明はその機能的改変、即ち本発明に係る改善された新規なスクロースムターゼ酵素の機能を有するように本発明に基づき改変された、配列番号1に示す配列のアミノ酸配列の断片を有し、即ちもっぱら有し、またはこれを含むポリアミノ酸分子に関する。当業者は当該の機能的改変をここに挙げた配列データから容易に作り出し、スクロースムターゼ酵素としてのその機能を周知のように検定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】配列番号1の置換配列（暗灰色のボックス）を含む、本発明に関連して作製されたsmuA欠失プラスミドpUT-GntR-P3C1-DSmuAのベクターマップの一例を示す。この領域はsmuA欠失領域の上流の1267 bpでP.ルブラム染色体に対して相同性を示す。この領域はGntR型転写調節因子遺伝子および瘢痕なしで挿入された3C1プロモーターに対して相同性を有する。smuA欠失領域の下流には655 bpの相同DNA配列がある。置換配列内のsmuA遺伝子の本来の欠失領域は、ヌクレオチド配列として拡大して強調した。天然smuA開始コドンとTAA停止コドンに下線を付した。制限酵素NsiIおよびPmeIに対する導入された切断点認識配列も破線でマークした。pUT誘導体はR6K ori（「転移起点」）に基づいており、選択のためにカナマイシン耐性遺伝子aphIIおよびカテコール-2,3ジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子を担持する。
【図２】smuA欠失変異体P.ルブラム3C1DsmuAの作製のための本発明のプロセス：相同組換えによる天然smuA遺伝子の置換を概略図により例示する。宿主細胞P.ルブラム3C1で好ましくは非複製型のベクター（例えばpUTベクター）をベースとして、好ましくは大腸菌でsmuA置換プラスミドが構築される。このためにsmuA遺伝子の上流と下流で2つのDNA断片が塩基に厳密に増幅され、融合される（図１を参照）。ライゲーション反応の後にXmaI/PstI断片が生じる（配列番号2を参照）。この断片は欠失smuA遺伝子の上流に、推定gntR調節因子をコードする1267 bpの大きさのDNA断片と3C1プロモーターを担持し、下流には655 bpの大きさのDNA断片が隣接する。生じたプラスミドは宿主細胞、この場合P.ルブラム3C1に転移される。好ましくはカナマイシンでの選択によって、染色体に置換プラスミドを担持するコロニーが選択される。置換プラスミドは好ましくは2つの相同領域の少なくとも1つにより染色体に組み込まれている。カナマイシンを含まない培地での培養は、組み込まれたプラスミドが第2のクロスオーバー（第2の組換え事象）により再び染色体から解離された欠失株の選択を可能にする。このようなコロニーは好ましくはカテコールの添加の後にxylE活性が欠如することにより、周知のように表現型に基づいて検出することができる（黄変なし）。続いて野生型の再構築をもたらす置換プラスミドの完全な解離をさらに排除するために、欠失株の作製の成功を分子生物学的方法（例えばPCR［ポリメラーゼ連鎖反応］）によって周知のように検査することができる。
【図３】smuA欠失変異体P.ルブラム3C1DsmuAでのsmuA配列変異体の発現のための本発明のプロセスを概略図により例示する。即ち宿主細胞P.ルブラム3C1DsmuAで好ましくは非複製型のベクター（例えばpUTベクター）をベースとして、好ましくは大腸菌で組込み型smuA*発現プラスミドが構築される。このためにアミノ酸置換によって改変された本発明に係る上記のSmuAのアミノ酸配列をコードするsmuA*遺伝子が、推定gntR調節因子をコードし、発現のために必要な3C1プロモーターを担持する、1267 bpの大きさのDNA断片と融合される。続いて好ましくは非複製型のベクター（例えばpUTベクター）への融合産物の挿入が行われる。生じたプラスミドは宿主細胞、この場合はP.ルブラム3C1DsmuAに転移される。好ましくはカナマイシンでの選択によって、smuA*発現プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれたコロニーが選択される。続いて分子生物学的方法（例えばPCR）によって組込み株の作製の成功を周知のように検査することができる。組み込まれたsmuA*変異型遺伝子の発現は強力な3C1プロモーターによって行われる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第1の実施態様では、アミノ酸置換がS303位にあり、好ましくはアミノ酸Pに置換される。
【００１１】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がD302位にあり、好ましくはアミノ酸Yに置換されている。置換S303PおよびD302Yの組合せが特に好ましい。
【００１２】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がK180位にあり、好ましくはアミノ酸Pに置換されている。
【００１３】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がM199位にあり、好ましくはアミノ酸Iに置換されている（M199I）。
【００１４】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がQ276位にあり、好ましくはアミノ酸Aに置換されている。
【００１５】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がA198位にあり、好ましくはアミノ酸Dに置換されている。
【００１６】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がY219位にあり、好ましくはアミノ酸Fに置換されている。
【００１７】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がV324位にあり、好ましくはアミノ酸Tに置換されている。
【００１８】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がT369位にあり、好ましくはアミノ酸Lに置換されている。
【００１９】
本発明の代替または追加の実施態様では、アミノ酸置換がA346位にあり、好ましくはアミノ酸Qに置換されている。
【００２０】
複数のアミノ酸置換の下記で詳述する好ましい組合せに加えて、次の追加のアミノ酸が単独で、または組合せとして、即ちM199IとV114I、Q122R、Q276A、N423E、L426I、L426Fとの組合せとして可能である。
【００２１】
S303Pと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはS303P + D302Yである。別の好ましい組合せはS303P + M199Iである。別の好ましい組合せはS303P + Q276Aである。別の好ましい組合せはS303P + A198Dである。別の好ましい組合せはS303P + Y219Fである。別の好ましい組合せはS303P + V324Tである。別の好ましい組合せはS303P + T369Lである。別の好ましい組合せはS303P + A346Qである。
【００２２】
またS303PおよびD302Yと、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２３】
またS303PおよびK180Pと、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２４】
またS303PおよびM199Iと、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２５】
またS303PおよびQ276Aと、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２６】
またS303PおよびA198Dと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２７】
またS303PおよびY219Fと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２８】
またS303PおよびV324Tと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００２９】
またS303PおよびT369Lと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００３０】
またS303PおよびA346Qと、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００３１】
その好ましい組合せはS303P + D302Y + K180Pである。別の変形ではこの組合せがさらにM199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + M199I、S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + Q276A、S303P + D302Y + K180P + A198D、S303P + D302Y + K180P + Y219F、S303P + D302Y + K180P + V324T、S303P + D302Y + K180P + T369Lおよび／またはS303P + D302Y + K180P + A346Qが好ましい。
【００３２】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + M199Iである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + M199I + S303P + D302Y +  M199I + Q276A、S303P + D302Y + M199I + A198D、S303P + D302Y + M199I + Y219F、S303P + D302Y + M199I + V324T、S303P + D302Y + M199I + T369Lおよび／またはS303P + D302Y + M199I + A346Qが好ましい。別の好ましい構成は前に述べた。
【００３３】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + Q276Aである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + Q276A + A198D、S303P + D302Y + Q276A + Y219F、S303P + D302Y + Q276A + V324T、S303P + D302Y + Q276A + T369L、S303P + D302Y + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３４】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + A198D + Y219F、S303P + D302Y + A198D + V324T、S303P + D302Y + A198D + T369Lおよび／またはS303P + D302Y + A198D + A346Q が好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３５】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + Y219F + V324T、S303P + D302Y + Y219F + T369Lおよび／またはS303P + D302Y + Y219F + A346Q が好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３６】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + V324T + T369Lおよび／またはS303P + D302Y + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３７】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + D302Y + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３８】
別の好ましい組合せはS303P + D302Y + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにK180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００３９】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + M199Iである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + M199I + S303P + K180P + M199I + Q276A、S303P + K180P + M199I + A198D、S303P + K180P + M199I + Y219F、S303P + K180P + M199I + V324T、S303P + K180P + M199I + T369Lおよび／またはS303P + K180P + M199I + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４０】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + Q276Aである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + Q276A + A198D、S303P + K180P + Q276A + Y219F、S303P + K180P +Q276A + V324T、S303P + K180P + Q276A + T369Lおよび／またはS303P + K180P + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４１】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + A198D + Y219F、S303P + K180P + A198D + V324T、S303P + K180P + A198D + T369Lおよび／またはS303P + K180P + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４２】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + Y219F + V324T、S303P + K180P + Y219F + T369Lおよび／またはS303P + K180P + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４３】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + V324T + T369Lおよび／またはS303P + K180P + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４４】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + K180P + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４５】
別の好ましい組合せはS303P + K180P + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４６】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + Q276Aである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + M199I + Q276A + S303P + M199I + Q276A + A198D、S303P + M199I + Q276A + Y219F、S303P + M199I + Q276A + V324Tおよび／またはS303P + M199I + Q276A+ T369L、S303P + M199I + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４７】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + M199I + A198D + Y219F、S303P + M199I + A198D + V324T、S303P + M199I + A198D + T369Lおよび／またはS303P + M199I + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４８】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + M199I + Y219F + V324Tおよび／またはS303P + M199I + Y219F + T369L、S303P + M199I + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００４９】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + M199I + V324T + T369Lおよび／またはS303P + M199I + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５０】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + M199I + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５１】
別の好ましい組合せはS303P + M199I + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５２】
別の好ましい組合せはS303P + Q276A + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Q276A + A198D + Y219F、S303P + Q276A + A198D + V324T、S303P + Q276A + A198D + T369Lおよび／またはS303P + Q276A + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５３】
別の好ましい組合せはS303P + Q276A + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Q276A + Y219F + V324T、S303P + Q276A + Y219F + T369Lおよび／またはS303P + Q276A + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５４】
別の好ましい組合せはS303P + Q276A + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Q276A + V324T + T369Lおよび／またはS303P + Q276A + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５５】
別の好ましい組合せはS303P + Q276A + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Q276A + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５６】
別の好ましい組合せはS303P + Q276A + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５７】
別の好ましい組合せはS303P + A198D + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + A198D + Y219F + V324T、S303P + A198D + Y219F + T369Lおよび／またはS303P + A198D + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５８】
別の好ましい組合せはS303P + A198D + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + A198D + V324T + T369L、S303P + A198D + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００５９】
別の好ましい組合せはS303P + A198D + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + A198D + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６０】
別の好ましい組合せはS303P + A198D + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６１】
別の好ましい組合せはS303P + Y219F + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Y219F + V324T + T369Lおよび／またはS303P + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６２】
別の好ましい組合せはS303P + Y219F + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６３】
別の好ましい組合せはS303P + Y219F + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６４】
別の好ましい組合せはS303P + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。S303P + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６５】
別の好ましい組合せはS303P + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６６】
別の好ましい組合せはS303P + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにD302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００６７】
D302Yと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはD302Y + K180Pである。別の好ましい組合せはD302Y + M199Iである。別の好ましい組合せはD302Y + Q276Aである。別の好ましい組合せはD302Y + A198Dである。別の好ましい組合せはD302Y + Y219Fである。別の好ましい組合せはD302Y + V324Tである。別の好ましい組合せはD302Y + T369Lである。別の好ましい組合せはD302Y + A346Qである。
【００６８】
またD302YおよびK180Pと、S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００６９】
またD302YおよびM199Iと、S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７０】
またD302YおよびQ276Aと、S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７１】
またD302YおよびA198Dと、S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７２】
またD302YおよびY219Fと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７３】
またD302YおよびV324Tと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７４】
またD302YおよびT369Lと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７５】
またD302YおよびA346Qと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７６】
またD302Yと、S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【００７７】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + M199Iである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + M199I + D302Y + K180P + M199I + Q276A、D302Y + K180P + M199I + A198D、D302Y + K180P + M199I + Y219F、D302Y + K180P + M199I + V324T、D302Y + K180P + M199I + T369Lおよび／またはD302Y + K180P + M199I + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００７８】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + Q276Aである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + Q276A + A198D、D302Y + K180P + Q276A + Y219F、D302Y + K180P + Q276A + V324T、D302Y + K180P + Q276A + T369Lおよび／またはD302Y + K180P + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００７９】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + A198D + Y219F、D302Y + K180P + A198D + V324T、D302Y + K180P + A198D + T369Lおよび／またはD302Y + K180P + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８０】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + Y219F + V324T、D302Y + K180P + Y219F + T369Lおよび／またはD302Y + K180P + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８１】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + V324T + T369Lおよび／またはD302Y + K180P + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８２】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + K180P + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８３】
別の好ましい組合せはD302Y + K180P + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８４】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + Q276Aである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + M199I + Q276A + A198D、D302Y + M199I + Q276A + Y219F、D302Y + M199I + Q276A + V324Tおよび／またはD302Y + M199I + Q276A + T369L、D302Y + M199I + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８５】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + M199I + A198D + Y219F、D302Y + M199I + A198D + V324T、D302Y + M199I + A198D + T369Lおよび／またはD302Y + M199I + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８６】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + M199I + Y219F + V324T、D302Y + M199I + Y219F + T369Lおよび／またはD302Y + M199I + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８７】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + M199I + V324T + T369L、D302Y + M199I + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８８】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + M199I + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００８９】
別の好ましい組合せはD302Y + M199I + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９０】
別の好ましい組合せはD302Y + Q276A + A198D である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Q276A + A198D + Y219F、D302Y + Q276A + A198D + V324T、D302Y + Q276A + A198D + T369Lおよび／またはD302Y + Q276A + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９１】
別の好ましい組合せはD302Y + Q276A + Y219F である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Q276A + Y219F + V324Tおよび／またはD302Y + Q276A + Y219F + T369L、D302Y + Q276A + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９２】
別の好ましい組合せはD302Y + Q276A + V324T である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Q276A + V324T + T369L、D302Y + Q276A + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９３】
別の好ましい組合せはD302Y + Q276A + T369L である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Q276A + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９４】
別の好ましい組合せはD302Y + Q276A + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９５】
別の好ましい組合せはD302Y + A198D + V324T である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + A198D + V324T + T369Lおよび／またはD302Y + A198D + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９６】
別の好ましい組合せはD302Y + A198D + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + A198D + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９７】
別の好ましい組合せはD302Y + A198D + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９８】
別の好ましい組合せはD302Y + Y219F + V324T である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Y219F + V324T + T369L、 D302Y + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【００９９】
別の好ましい組合せはD302Y + Y219F + T369L である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１００】
別の好ましい組合せはD302Y + Y219F + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１０１】
別の好ましい組合せはD302Y + V324T + T369L である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。D302Y + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１０２】
別の好ましい組合せはD302Y + V324T + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１０３】
別の好ましい組合せはD302Y + T369L + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１０４】
K180Pと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。別の好ましい組合せはK180P + Q276Aである。別の好ましい組合せはK180P + A198Dである。別の好ましい組合せはK180P + Y219Fである。別の好ましい組合せはK180P + V324Tである。別の好ましい組合せはK180P + T369Lである。別の好ましい組合せはK180P + A346Qである。
【０１０５】
K180PおよびM199Iと、S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１０６】
K180PおよびQ276Aと、S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１０７】
K180PおよびA198Dと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１０８】
K180PおよびY219Fと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１０９】
K180PおよびV324Tと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１１０】
K180PおよびT369Lと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１１１】
K180PおよびA346Qと、S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１１２】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + Q276A である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + M199I + Q276A + A198D、K180P + M199I + Q276A + Y219F、K180P + M199I + Q276A + V324T、K180P + M199I + Q276A + T369Lおよび／またはK180P + M199I + Q276A + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１３】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + A198D である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + M199I + A198D + Y219F、K180P + M199I + A198D + V324T、K180P + M199I + A198D + T369Lおよび／またはK180P + M199I + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１４】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + Y219F である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + M199I + Y219F + V324T、K180P + M199I + Y219F + T369Lおよび／またはK180P + M199I + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１５】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + V324T である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + M199I + V324T + T369L、K180P + M199I + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１６】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + T369L である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + M199I + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１７】
別の好ましい組合せはK180P + M199I + A346Q である。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１８】
別の好ましい組合せはK180P + Q276A + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Q276A + A198D + Y219F、K180P + Q276A + A198D + V324T、K180P + Q276A + A198D + T369Lおよび／またはK180P + Q276A + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１１９】
別の好ましい組合せはK180P + Q276A + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Q276A + Y219F + V324T、K180P + Q276A + Y219F + T369Lおよび／またはK180P + Q276A + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２０】
別の好ましい組合せはK180P + Q276A + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Q276A + V324T + T369Lおよび／またはK180P + Q276A + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２１】
別の好ましい組合せはK180P + Q276A + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Q276A + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２２】
別の好ましい組合せはK180P + Q276A + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２３】
別の好ましい組合せはK180P + A198D + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + A198D + Y219F + V324T、K180P + A198D + Y219F + T369Lおよび／またはK180P + A198D + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２４】
別の好ましい組合せはK180P + A198D + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + A198D + V324T + T369Lおよび／またはK180P + A198D + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２５】
別の好ましい組合せはK180P + A198D + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + A198D + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２６】
別の好ましい組合せはK180P + A198D + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２７】
別の好ましい組合せはK180P + Y219F + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Y219F + V324T + T369L、K180P + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２８】
別の好ましい組合せはK180P + Y219F + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１２９】
別の好ましい組合せはK180P + Y219F + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１３０】
別の好ましい組合せはK180P + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。K180P + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１３１】
別の好ましい組合せはK180P + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１３２】
別の好ましい組合せはK180P + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１３３】
M199Iと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。別の好ましい組合せはM199I + Q276Aである。別の好ましい組合せはM199I + A198Dである。別の好ましい組合せはM199I + Y219Fである。別の好ましい組合せはM199I + V324Tである。別の好ましい組合せはM199I + T369Lである。別の好ましい組合せはM199I + A346Qである。
【０１３４】
M199IおよびQ276Aと、S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１３５】
M199IおよびA198Dと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１３６】
M199IおよびY219Fと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１３７】
M199IおよびV324Tと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１３８】
M199IおよびT369Lと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１３９】
M199IおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１４０】
別の好ましい組合せはM199I + Q276A + A198Dである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Q276A + A198D + Y219F、M199I + Q276A + A198D + V324T、M199I + Q276A + A198D + T369Lおよび／またはM199I + Q276A + A198D + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４１】
別の好ましい組合せはM199I + Q276A + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、A198D、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Q276A + Y219F + V324Tおよび／またはM199I + Q276A + Y219F + T369L、M199I + Q276A + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４２】
別の好ましい組合せはM199I + Q276A + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Q276A + V324T + T369L および／またはM199I + Q276A + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４３】
別の好ましい組合せはM199I + Q276A + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Q276A + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４４】
別の好ましい組合せはM199I + Q276A + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４５】
別の好ましい組合せはM199I + A198D + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + A198D + Y219F + V324Tおよび／またはM199I + A198D + Y219F + T369L、M199I + A198D + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４６】
別の好ましい組合せはM199I + A198D + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + A198D + V324T + T369L、M199I + A198D + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４７】
別の好ましい組合せはM199I + A198D + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + A198D + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４８】
別の好ましい組合せはM199I + A198D + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１４９】
別の好ましい組合せはM199I + Y219F + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Y219F + V324T + T369Lおよび／またはM199I + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５０】
別の好ましい組合せはM199I + Y219F + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５１】
別の好ましい組合せはM199I + Y219F + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５２】
別の好ましい組合せはM199I + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。M199I + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５３】
別の好ましい組合せはM199I + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５４】
別の好ましい組合せはM199I + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１５５】
Q276Aと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。別の好ましい組合せはQ276A + A198Dである。別の好ましい組合せはQ276A + Y219Fである。別の好ましい組合せはQ276A + V324Tである。別の好ましい組合せはQ276A + T369Lである。別の好ましい組合せはQ276A + A346Qである。
【０１５６】
Q276AおよびA198Dと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１５７】
Q276AおよびY219Fと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１５８】
Q276AおよびV324Tと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１５９】
Q276AおよびT369Lと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１６０】
Q276AおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１６１】
Q276Aと、S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１６２】
別の好ましい組合せはQ276A + A198D + Y219Fである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、V324T、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + A198D + Y219F + V324Tおよび／またはQ276A + A198D + Y219F + T369L、Q276A + A198D + Y219F + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６３】
別の好ましい組合せはQ276A + A198D + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + A198D + V324T + T369Lおよび／またはQ276A + A198D + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６４】
別の好ましい組合せはQ276A + A198D + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + A198D + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６５】
別の好ましい組合せはQ276A + A198D + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６６】
別の好ましい組合せはQ276A + Y219F + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + Y219F + V324T + T369Lおよび／またはQ276A + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６７】
別の好ましい組合せはQ276A + Y219F + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６８】
別の好ましい組合せはQ276A + Y219F + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１６９】
別の好ましい組合せはQ276A + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Q276A + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１７０】
別の好ましい組合せはQ276A + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１７１】
別の好ましい組合せはQ276A + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１７２】
A198Dと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはA198D + Y219Fである。別の好ましい組合せはA198D + V324Tである。別の好ましい組合せはA198D + T369Lである。別の好ましい組合せはA198D + A346Qである。
【０１７３】
A198DおよびY219Fと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１７４】
A198DおよびV324Tと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１７５】
A198DおよびT369Lと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１７６】
A198DおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１７７】
A198Dと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１７８】
好ましい組合せはA198D + Y219F + V324Tである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、T369LおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。A198D + Y219F + V324T + T369Lおよび／またはA198D + Y219F + V324T + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１７９】
別の好ましい組合せはA198D + Y219F + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324TおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。A198D + Y219F + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１８０】
別の好ましい組合せはA198D + Y219F + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324TおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１８１】
別の好ましい組合せはA198D + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219FおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。A198D + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１８２】
別の好ましい組合せはA198D + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219FおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１８３】
別の好ましい組合せはA198D + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219FおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１８４】
Y219Fと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはY219F + V324Tである。別の好ましい組合せはY219F + T369Lである。別の好ましい組合せはY219F + A346Qである。
【０１８５】
Y219FおよびV324Tと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１８６】
Y219FおよびT369Lと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１８７】
Y219FおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324TおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１８８】
Y219Fと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１８９】
別の好ましい組合せはY219F + V324T + T369Lである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198DおよびA346Qのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。Y219F + V324T + T369L + A346Qが好ましい。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１９０】
別の好ましい組合せはY219F + V324T + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198DおよびT369Lのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１９１】
別の好ましい組合せはY219F + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198DおよびV324Tのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１９２】
V324Tと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369LおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはV324T + T369Lである。別の好ましい組合せはV324T + A346Qである。
【０１９３】
V324TおよびT369Lと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１９４】
V324TおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびT369Lからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１９５】
好ましい組合せはV324T + T369L + A346Qである。別の変形ではこの組合せがさらにS303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198DおよびY219Fのいずれか1つまたは幾つかと組み合わされている。その他の好ましい構成は前に述べた。
【０１９６】
T369Lと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324TおよびA346Qからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せが好ましい。好ましい組合せはT369L + A346Qである。
【０１９７】
T369LおよびA346Qと、S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219FおよびV324Tからなる群より選択される少なくとも1つの別のアミノ酸または正確に1つの別のアミノ酸との組合せも好ましい。
【０１９８】
また本発明はアミノ酸置換によって改変された前記のSmuAのアミノ酸配列をそれぞれコードする核酸分子、即ちポリヌクレオチド分子に関する。もちろんこれには多数のポリヌクレオチド分子が含まれ、それらは縮重遺伝コードに基づき複数の形態で現れることが可能であるが、同じ本発明のポリアミノ酸分子をコードする。当業者は、与えられた本発明のアミノ酸配列から、このアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子の所定の群を見出すのに適したバイオインフォマティクスの方法を知っている。
【０１９９】
第１の実施態様では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は単離されたポリ核酸分子として存在する。
【０２００】
代替実施態様では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は、生物系、特に生物細胞、好ましくは細菌細胞で本発明に係る改変型スクロースムターゼの発現を仲介する構築物の形で、またはその構成部分として存在する。第１の実施態様では、このような構築物は本発明に係るポリヌクレオチド分子を単数または複数のコピーで含む発現カセットである。発現カセットはさらにポリヌクレオチド分子の発現の制御のための少なくとも1個のプロモーターエレメントおよび場合によってはさらにターミネーター配列を含むことが好ましい。
【０２０１】
少なくとも1個または好ましくは数個の発現カセットを含むベクター構築物も本発明の目的である。
【０２０２】
本発明に係るポリヌクレオチド分子の生物系での発現のために、発現カセットおよびベクター構築物のプロモーターとして、周知のプロモーターが可能である。スクロースムターゼ野生型遺伝子の天然プロモーターが好ましい。代案として、本発明に係る改変型スクロースムターゼの発現を一層よく仲介し、特に発現されたスクロースムターゼの何倍も高められた活性、即ち特に容積活性を可能にするプロモーターエレメントが好ましい。
【０２０３】
また本発明は、本発明に係る改変型スクロースムターゼの好ましくは染色体外発現のための上記の発現ベクターのほかに、生物細胞のゲノムに含まれるスクロースムターゼをコードする野生型遺伝子を、本発明に係る改変型スクロースムターゼをコードする本発明のポリヌクレオチド分子と置換するのに適した構築物に関する。このような置換プラスミドは、本発明に係るポリヌクレオチド分子を細胞の染色体ゲノムに組み込むのに役立つ。遺伝子置換を仲介する置換プラスミドは、特に導入先の宿主細胞において自己複製しないように設計されている。好ましいベクター構築物はR6K複製起点に基づくpUT誘導体である。このベクターは特にP.ルブラム株の宿主細胞で複製せず、少なくとも条件によっては複製しない。
【０２０４】
本発明に係るポリヌクレオチド分子は、いずれにせよショ糖をイソマルツロースに転化するために用いることができる宿主細胞から選択される宿主細胞に、染色体外発現構築物の形で、または染色体遺伝子置換によって、導入することができる。
【０２０５】
また本発明は、本発明に係る細胞の作製のための、上記で特徴づけた本発明に係るポリヌクレオチド分子、置換プロモーターおよびその断片または完全なスクロースムターゼ発現カセットの使用に関する。
【０２０６】
また本発明はこのような細胞の作製のための、上記で特徴づけたベクター、即ち本発明の第1の態様によれば置換プラスミド、本発明の第2の態様によれば発現ベクターの使用に関する。
【０２０７】
また本発明は新規な生成物スペクトルを有する生物細胞、即ちショ糖含有基質から少なくとも85重量％以上（イソマルツロース組成物の乾物重量に関して）、好ましくは86重量％以上、87重量％以上、88重量％以上、89重量％以上、90重量％以上、91重量％以上、92重量％以上、93重量％以上、94重量％以上、特に好ましくは95重量％以上を有するイソマルツロース組成物を合成することができる細胞を包含する。
【０２０８】
ガンマプロテオバクテリアおよび未分類ガンマプロテオバクテリアのグループの微生物から選ばれた宿主細胞が好ましい。細胞はエッシェリキア、サルモネラ、セラチア、エルウィニア、エンテロバクター、クレブシエラ、ラウオルテラ、ペクトバクテリウム、シュードモナス、アゾトバクター、パントエア、ロイカネアおよびプロタミノバクターの各属の微生物からなる群より選択されることが好ましい。特に細胞は、クレブシエラ・エスピー（Klebsiella sp.）、特にLX3株およびNK33-98-8株、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、特に342株、エンテロバクター・エスピー（Enterobacter sp.）、特にSZ62株、エンテロバクター・エスピー（Enterobacter sp.）、特にFMB1株、ラウオルテラ・プランティコラ（Rauoltella planticola）、パントエア・ディスペルサ（Pantoea dispersa）、エルウィニア・ラポンチシ（Erwinia rhapontici）、エルウィニア・タスマニエンシス（Erwinia tasmaniensis）、特にEt1/99株、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）、特にSCRI 1043株、ペクトバクテリウム・カロボタム（Pectobacterium carovotum）、特にサブスピーシーズ・ブラジリエンシス（brasiliensis）、特にPBR 1692株、プロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubrum）、シュードモナス・メソアシドフィラ（Pseudomonas mesoacidophila）、セラチア・プリムチカ（Serratia plymuthica）、アゾトバクター・ビネランディイ（Azotobacter vinelandii）およびロイカネア・ロイコセファリア（Leucanea leucocephalia）からなる群より選択されることが好ましい。特に好ましい変形では、細胞はプロタミノバクター・ルブラム（P.ルブラム）、またはそれから誘導され、バイオテクノロジーで使用可能な菌株である。また本発明はバイオテクノロジー的方法における使用に特に適合しうるこれらの宿主細胞の固定化された、および／または別様に改変された形態に及ぶ。
【０２０９】
特に宿主細胞は細胞内に場合によって存在するスクロースムターゼ野生型遺伝子の欠失変異株である。
【０２１０】
好ましい変形は、細胞に存在する染色体スクロースムターゼ野生型遺伝子が、本発明に係る改変型スクロースムターゼ酵素をコードする染色体のヌクレオチド配列と置換された細胞である。第1の変形ではこの本発明に係る改変型遺伝子は、スクロースムターゼ野生型遺伝子のプロモーターの制御下にある。別の好ましい変形では、この本発明に係る改変型遺伝子は好ましくは内因性相同置換プロモーターの制御下にある。このようなプロモーターは特に、本発明に係る改変型スクロースムターゼの発現を制御することができる、3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-リン酸シンターゼの遺伝子ribBのプロモーター、古い膜タンパク質をコードする遺伝子ompAのプロモーター、推定転写活性化因子をコードする遺伝子ECA2934のプロモーター、リボヌクレアーゼの遺伝子Emeのプロモーター、50SリボソームL21タンパク質のオペロンのプロモーター、低温刺激タンパク質CspEのオペロンのプロモーター、50SリボソームL28タンパク質のオペロンのプロモーターおよびNAD依存性エピメラーゼ脱水酵素の遺伝子のプロモーター、ならびにその機能的プロモーター断片からなる群より選択される。DE102009053566の開示内容、特に表１A、１Bおよび配列記録の配列番号2ないし21の配列の内容の全体を参照する。
【０２１１】
また本発明は、本発明に係る改変型スクロースムターゼが特に上記で特徴づけられたプロモーターの少なくとも1つの調節のもとで染色体外（エピソーム）に発現される細胞に関する。
【０２１２】
また本発明はこのような細胞の作製のための手段に関する。このような手段は、本発明に係る改変型スクロースムターゼをコードする発現可能な断片を少なくとも単一のまたは多重のコピーで含み、さらにこのスクロースムターゼの発現を調節する別のエレメント、特にプロモーターエレメントを少なくとも単一のまたは多重のコピーで含むポリヌクレオチド分子である。本発明のこの態様の代替変形では、本発明に係るポリヌクレオチド分子が発現カセットとして、単離された形で存在する。例えばそれを宿主細胞に周知のように転移することができる。また本発明の目的は、ショ糖をイソマルツロースまたはイソマルツロース含有組成物に転化することができる本発明に係る細胞の作製のための方法である。その場合この方法は少なくとも次の工程を含む。即ち第1の工程では、野生型細胞株またはすでに古典的にもしくは組換えにより改変された細胞株を用意し、第2の工程では、この細胞株と、本発明に係る改変型スクロースムターゼをコードする、上記で特徴づけられた本発明のポリヌクレオチド分子の少なくとも1つ、および／または上記で特徴づけられたベクターの少なくとも1つとを接触または結合させ、こうして本発明に係るポリヌクレオチド分子が発現可能な形で細胞に送り込まれる。
【０２１３】
本発明に関連して「イソマルツロース組成物」とは、スクロースムターゼの活性によるショ糖基質からの異性化産物を意味する。これは圧倒的な割合でイソマルツロースを含む。その他の成分は特にトレハルロース、イソメレジトースならびにフルクトースおよびグルコースである。特に下記の組成物を意味する。即ち80ないし99％イソマルツロース、1ないし10％トレハルロース、0ないし0.5％イソメレジトース、0ないし0.2三糖類、0ないし5％単糖類および0ないし0.2％残糖分。
【０２１４】
特にイソマルツロース組成物中のイソマルツロースの量は少なくとも85重量％以上（イソマルツロース組成物の乾物重量に関して）、好ましくは86重量％以上、87重量％以上、88重量％以上、89重量％以上、90重量％以上、91重量％以上、92重量％以上、93重量％以上、94重量％以上、特に好ましくは95重量％以上であることが好ましい。また本発明は基質であるショ糖またはショ糖含有基質からのイソマルツロースおよび／またはイソマルツロース含有組成物のバイオテクノロジー的製造方法に関する。
【０２１５】
第1の態様では、これは第1工程において、基質のイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物への転化を可能にする条件のもとで、ショ糖含有基質を本発明に係るスクロースムターゼまたは生体触媒と接触させて行う、ショ糖含有基質からのイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物のバイオテクノロジー的製造方法である。
【０２１６】
別の態様では、これは、第1工程において、上記で特徴づけられた細胞を、基質を含む培地で、基質のイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物への転化を可能にする条件のもとで培養する工程を含む、ショ糖含有基質からのイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物のバイオテクノロジー的製造方法である。好ましい後続の工程では、イソマルツロースまたはイソマルツロース組成物を培地から単離することが好ましい。細胞ベースの製造の特殊な実施態様では、細胞がマトリックス、特にアルギン酸マトリックスの表面または中に周知のように固定化される。これは特にショ糖のイソマルツロースまたはイソマルツロース組成物への工業的転化を目指すものである。
【０２１７】
そこで好ましくはショ糖またはショ糖含有基質からのイソマルツロースまたイソマルツロース組成物の好ましくはここで述べた方法によるバイオテクノロジー的製造のための本発明に係る、上記で特徴づけられた細胞の使用も本発明の目的である。
【０２１８】
さらに本発明に係るポリヌクレオチド分子を特に単離された形でまたは細胞断片の構成部分として、無細胞系および生体触媒の開発のために使用することとする。好ましい実施態様では、生体触媒は本発明に係る改変型スクロースムターゼが固定化されている担体を特徴とする。別の好ましい実施態様では、本発明に係るポリヌクレオチド分子が特に単離された形で、固定化されないで、スクロースムターゼ生体触媒として特に可溶形で使用される。
【０２１９】
そこでまた本発明は、おおむね無細胞であって、好ましくは本発明に係る改変型スクロースムターゼが固定化されていることを特徴とする生体触媒に関する。好ましい第1の変形は、担体、好ましくは濾過膜に固定化された細胞断片である。代案として、単離された、好ましくは周知のように合成的に製造された、本発明に係る改変型スクロースムターゼ活性を有する本発明に係るポリアミノ酸分子が存在することが好ましい。好ましい代替実施態様では、生体触媒はスクロースムターゼ活性を有する、本発明に係る非固定化の単離されたポリヌクレオチド分子から形成される。
【０２２０】
下記の図および実施例により本発明をさらに詳しく説明する。但しこれを限定的と解すべきではない。
【０２２１】
配列記録は下記を含む：
配列番号1：Ravaudら、2009年（FEBS Letters 583, 1964-1968）によるP.ルブラムからの野生型スクロースムターゼSmuAのアミノ酸配列：
TQQPLLNEKSIEQSKTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAKQQPDLNWDNPKVRQDLYAMLRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEYTKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLDRDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREPSAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEFLQNVRLTSRDNSRTPFQWDGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQLIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLVVVNFKEQMMRYKLPDNLSIEKVIIDSNSKNVVKKNDSLLELKPWQSGVYKLNQ
【０２２２】
配列番号2：非複製型ベクター、例えばsmuA欠失プラスミドpUT-GntR-P3C1-DSsmuAへのクローニングの後に生じ、相同組換えによるsmuA遺伝子の欠失のために使用することができる1942 bpの大きさのXmaI/PstI断片のDNA配列。このDNA配列は、欠失されるsmuA遺伝子の上流および下流でP.ルブラム3C1に存在する2つのDNA断片の融合から生じる：
CCCGGGATCGCATTCATGTTTTCTCCTTCGGTGAAGTGGTCTACTTTTATGGCGATTTGTATACATTAAAGTGATCAAGGAAAAAATAGCCAGAGGAATAGCCAAATAAATTTCAGGTTTTACAGTGCGGTAACCTCTTTTTGTTGCGCGGTTATCAGGATTCATTTAGGGATAAAGAGGTCTTCAAGTGATCTACAAAACGCTTGCTGAACGTCTGAGAATACGTATCAATTCTGCTGATTTTGCTATCGGCGATGCTTTACCCAGTGAGAAACGTCTGGCTGCCGAATTTTCTGTATCGAGGATGACACTCCGCAAAGCGGTAAATTTACTGATTGAATGGGGGCTGGTACGTCGCTGTCACGGCAGCGGAACCTTCGTCGCGCAGAAAGATCTCCAACATGAAACTCGTGGGCTGATGGGGTTTTCAGAACTGATGAAAGAACTGGGCCGCCCCACGGTGAGCGAGGTGCTGGAGTTTCGAATGATGGGAGCCCCCCCAGCCATCGCCAGCCAGCTGCGAATCAAGGCCGATGAACGCATTTACTATTCGCGTCGCGTAAGGTTTGTGGAAGGGAAGCCTGTGGTGCTGGAAGATAGTTACATGCCTGGCAGGTTATTTGGCAACCTTTCAGTCGCACATCTGGAGGGTTCAAAGTTTTCGTATATAGAAGACGAATGCCATATCAATATCGCAGGGAATTACGAAAGCTTCAGCCCGATCTTGGCAGACAGCACGATCGGCGCGCTACTGCACGTTGCCGAAGGCACGCCGCTGCTGCGCCTGACATCGCTTTCTTACAGTGATACCGGCGACTATATCAACTATTCGGTGATATTCAGAAATGCCAATGAATACCACGTGGACTACCATTTGAAGAGGAATAAATAGCGGGCGAAGGGGAGCTACATTCCTACTATATAGCAATTCTGTTGCCTAGTGTAATGCGAGTTGCCCGCCGGATAAACCAATAACCGCATTCTCCGCAGGGGGCCGAATTGTGCTTTTGCCAATTGCCCTGATTAATCATTAGCGTTATAGTCAGAATGCTTATTCTCAGGGCGGGGTGCAAGTCCCCACCGGCGGTAAATCACCTTCTACGGTGAAAGCCCGCGAGCGCTCAGCCAGTCTCTTGTAGTTTGGTTAGAGGTCAGCAGATCCGGTGTAATTCCGGGGCCGACGGTTATAGTCCGGATGGGAGAGAGTAACGGTATCTGCCGGGCTTGCGCCCGCTTGCGTTATTTTTTTAGAAACAGGAGAGTATTGTAATGCATTTTGTTTAAACTAAATCAATAAATCTCATAGTCACGCCAAATAATGTAAATATATTGAAACTATTAAAACCGGCATTTTATGCCGGTTTTTTTAGCGCAAAATAGGGCTGGCAAAGATAAAGCAGGAGGCTACCACCGTGAGCTATATGCTTTTTTAAAAGGCAAGATTCTCCATCGAGGCTCTGCCGTCACCCGAACGCGATAAACCGCGTTTATCCTCAGATGCCTGGCCGTTGCGCGCAAACGAAGACCGGGGTTTGAGGGCTTGTGGGGCAACGCCGGCGAGCCAGTCAGCTTCTCGTGGGTGCGAGCACATTGCTAATGAACAATCTCGCTTCAAATGTTATCGTGAGAATGAAGTGTTGCAGTGGCGCCGCCGGGGTTTGCGCTCGATTCAGGTCTGATTCACATAACAAGGTCACATGGAAATGAAAGTGTTATTCATCGCTTCGCTAGGCGCTTTATCGTTAATGCAAGCATCATTCTCCTTCGCGGATAATGCCAATGGGAAAAACATCTATTCACAGAGATGTACTATGTGCCACGGAACCGATCTCAAAGGCACGGGGCCATTGGCTGATAAAACCAACCCGCCGACACCTGATCTGACAACCCCCGCTTTCAAAGCACGCCTCAATGATTATCCGGGCGTTATTGTATCCTGCAG
【０２２３】
配列番号3：SmuAアミノ酸置換変異体D302Yをコードする完全長遺伝子のヌクレオチド配列。置換されたヌクレオチドを明記した：
ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATTCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAA
【０２２４】
配列番号4：SmuA二重突然変異体D302Y/S303Pをコードする完全長遺伝子のヌクレオチド配列。置換されたヌクレオチドを明記した：
ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATCCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAA
【実施例１】
【０２２５】
P.ルブラム3C1/Z12AにおけるsmuA野生型遺伝子のsmuA配列変異型遺伝子による置換
本発明に係る改変型スクロースムターゼ酵素変異体（SmuA*）の特徴づけは、P.ルブラム3C1株で行われる。この菌株で天然smuAプロモーターと3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-リン酸シンターゼ遺伝子ribBの相同プロモーターとの瘢痕のない置換により、SmuA発現が著しく高められる（菌株3C1のribBプロモーター配列、配列番号2、ヌクレオチド1013-1270位を参照）。本発明に係るSmuA*配列変異体のスクロースムターゼ生成物特異性を決定するために、まずP.ルブラム3C1株に存在するsmuA野生型遺伝子を相同組換えにより欠失させた。続いてSmuA*変異体をコードする遺伝子を相同組換えによりsmuA欠失変異株に組み込む。この手法は相同系での配列改変遺伝子の発現および本発明に係る配列変異体の生成物特異性の詳細な決定を、SmuA野生型活性に影響されずに行うことができる。
【０２２６】
1.1  P.ルブラム3C1/Z12AにおけるsmuA野生型遺伝子の欠失
すべてのクローニングおよびDNA改変は、Sambrookら、1989年（Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring  Harbor, NY）に記載されるように行う。PCRセット、核酸単離用キット、検出および選択方法ならびに培養は、別に指示しない限りそれぞれの製造元の指示に従って確立された方法で行った。
【０２２７】
P.ルブラム3C1/Z12AのsmuA野生型遺伝子の欠失は相同組換えによって行われる。このためにsmuA遺伝子の上流と下流の2つのDNA断片を塩基に厳密に増幅し、例えばリガーゼなしのクローニング（F. Geu-Floresら、2007年, Nucleic Acids Research 35(7): e55）により融合する（図１を参照）。代案として、所望のDNA断片をDNA合成により作ることが可能である。ライゲーション反応または合成の後に、欠失smuA遺伝子の上流にP.ルブラム3C1染色体に対して1267 bpの相同配列の領域を有するXmaI/PstI断片（配列番号2を参照）が生じる。この領域は一方ではGntR型転写調節因子に対して高い相同性を有する「オープンリーディングフレーム（ORF）」をコードし、他方では3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン-4-リン酸シンターゼ遺伝子ribBのPルブラム相同プロモーター3C1を担持する。欠失smuA遺伝子の下流では、P.ルブラム染色体と相同の領域は655 bpである。
【０２２８】
本来のsmuA欠失を行うために、1942 bpの大きさのXmaI/PstI断片を、P.ルブラムで複製しない適当な遺伝子置換ベクターにクローニングする。P.ルブラムにおける遺伝子置換に適した基本ベクターは、R6K複製起点に基づくいわゆるpUT誘導体である（Herreroら、1990年, J. Bacteriol., 172:6557-67）。これらのベクターは、複製のために必須のπタンパク質をコードするpir遺伝子が存在するときだけ複製する。このような菌株は大腸菌S17-1λpirであり（Hrreroら、1990年, J. Bacteriol., 172:6557-67）、それぞれのプロモーター置換プラスミドの構築のために使用される。相同組換えの後、smuAの塩基に厳密な欠失を仲介する代表的な最終欠失構築物（pUT-GntR-P3C1-DSmuA）を図１に示す。
【０２２９】
作製されたsmuA欠失プラスミドのP.ルブラム3C1への転移は、好ましくは大腸菌S17-1λpirとP.ルブラムの間の属間接合によって実現される。使用されるpUTプラスミドはRP4プラスミドの“Origin of Transfer”「転移起点」（oriT）を担持し、大腸菌S17-λpirに染色体組込みされたRP4プラスミドによりP.ルブラムへ移動させることができる（Herreroら、1990年, J, Bacteriol., 172:6557-67）。
【０２３０】
属間接合の条件を次のように最適化した。即ち可能性のあるP.ルブラム3C1接合完了体の選択は、P.ルブラムで選択可能なプラスミドマーカー（例えばaphII、カナマイシン耐性）と、大腸菌ドナーを選択的に阻害する可能性とを必要とする。リファマイシン含有培地（100μg/ml）で平板培養することによって、自発的にリファマイシン耐性P.ルブラム3C1コロニーが生成される（P.ルブラム3C1 Rif）。このコロニーはいずれにせよ野生型と相違がない。接合は次のように行われる。
【０２３１】
smuA置換プラスミドを担持する大腸菌S17-λpirドナー株を5mlのdYT培地（1リットルにつきバクトトリプトン16g、バクト酵母エキス10gおよびNaCl 5g）で、カナマイシン（50μg/ml）を加えて37℃で一晩培養する。受容株P.ルブラム3C1もリファマイシン（100μg/ml）を加えた5mlのdYTで30℃で一晩培養した。それぞれ1mlの一晩培養物をエルレンマイヤー・フラスコで100mlのdYT培地（添加物は上記を参照）に接種して、30℃（P.ルブラム3C1）または37℃（大腸菌）および250 rpmでOD（600nm）0.4ないし0.8に至るまで培養する。供与株と受容株を1：4の比率で混合し、遠心し、1mlのdYTで洗浄し、最後に100μlのdYT培地に受ける（absorbed）。懸濁液をdYT平板上にあるニトロセルロースフィルタ（孔径0.45μm）にピペットで移し、30℃で一晩培養する。続いて1mlのdYTで細胞をフィルタから洗い出し、希釈し、選択用平板に塗抹し（dYT + カナマイシン50μg/mlおよびリファマイシン100μg/ml）、30℃で一晩培養する。
【０２３２】
カナマイシン選択によって、プラスミドが好ましくは2つの相同領域のいずれか1つにより染色体に組み込まれたP.ルブラム3C1接合完了体が得られる（図１）。カナマイシンを含まない培地での培養は、組込みプラスミドが第2のクロスオーバーにより染色体から解離されたsmuA欠失株の選択を可能にする。
【０２３３】
解離の事象を検証するために、置換プラスミドにある着色マーカー遺伝子xylEを使用することができる。xylE遺伝子は、カテコールを2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドに転化するカテコール-2,3-ジオキシゲナーゼをコードする。このことは表現型に基づき顕著な黄色により認識することができる。既に組み込まれた置換プラスミドの解離は稀少な事象であり（1000個のコロニーで1個）、このマーカーを用いてカテコールの添加（噴霧試薬：0.5mol/lの水溶液0.2ml）の後に所望のクローンに残る黄色により検出することができる。置換プラスミドの解離が野生型の再構築をもたらすこともあるから、発生したすべてのsmuA欠失株をPCR試験、サザンプロッティング分析およびゲノム配列決定により検査し、検証することができる。smuA欠失株をP.ルブラム3C1DSmuAで表す（図２）。
【０２３４】
1.2  配列変異体の作製およびP.ルブラム3C1DSmuAへのその組込み
アミノ酸置換によって改変された本発明に係る上記のSmuAアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子は、当業者に周知の種々の方法、例えば遺伝子合成、リガーゼなしのクローニングまたはオバーラップ伸長PCRによって生成することができる。一例として2つの配列変異体、D302Yおよび二重突然変異体D302Y/S303Pの作製および検定を説明する（参照配列は配列番号1）。配列番号3はSmuAアミノ酸置換変異体D302Yをコードする完全長遺伝子のヌクレオチド配列を記述し、配列番号4はSmuA二重突然変異体D302Y/S303Pをコードする完全長遺伝子のヌクレオチド配列を記述する。
【０２３５】
本発明に基づくSmuAのアミノ酸置換（SmuA*）をコードする改変型smuA遺伝子配列変異体（smuA*）を発現のために、実施例1.1で述べたSmuA欠失株に転移することができる。そのために当業者に周知の方法、例えばリガーゼなしのクローニング（上記を参照）を使用して、適当なsmuA*変異型遺伝子を塩基に厳密に非複製型pUT誘導体にクローニングする。図３に示すように、このようなプラスミド、例えばpUT-GntR-P3C1-SmuA*はsmuA変異型遺伝子smuA*のほかに、smuA欠失株P.ルブラム3C1DSmuAの染色体に対して相同性を有する1267 bpの大きさの領域をsmuA*の上流に担持する。この領域により、プラスミドを相同組換えによってP.ルブラム3C1DSmuAの染色体に組み込むことができる（図３）。属間接合（実施例1.1を参照）によって転移を行うことができる。プラスミドがsmuA*の上流で相同領域により染色体に組み込まれた接合完了体が、カナマイシン選択によって得られる。
【０２３６】
正しい組込みの検証はPCR試験によって行われる。検証された接合完了体は、強力な3C1プロモーターによって構成的に発現されるsmuA*変異型遺伝子を担持する。この菌株で生成される、アミノ酸置換によって改変された本発明に係るSmuA配列変異体を、続いて全細胞生物変換での生成物スペクトルに関して分析する。
【実施例２】
【０２３７】
P.ルブラム3C1/Z12Aにおける本発明に係るSmuA変異体株の生成物スペクトル
2.1  HPLC（高速液体クロマトグラフィー）による炭水化物組成の分析
分離された炭水化物の決定は下記の部品、即ちHPLCポンプ、試料送出装置、RI（屈折率）検出器、予備カラム：10mm x 4.6mm、アミノ相（例えばZorbax-NH2）、分離カラム：250mm x 4.6mm、アミノ相（例えばZorbax-NH2）、インターフェース、コンピューターおよび測定データの同定と分析のためのソフトウエアを有するHPLCによって行われる。
【０２３８】
測定は下記のクロマトグラフィー条件のもとで行われた。注入容量：10μl、流量：1.0ないし1.8 ml/min。最適な分離のために設定される流量は分離カラムの種類と状態および溶離液の組成に関係する。その他の分析パラメーターは表１を参照。
【表１】
2013515462.tif 000002
【０２３９】
2.2  振とうフラスコでの全細胞生物変換
本発明に基づく菌株と野生型対照菌株の培養を30mlのLB培地（スタートOD600 0.05）で行った。培地を水平振とう装置でそれぞれ30℃、200rpmで培養した。まず24時間の発酵の後に5ｘOD細胞を取り出し、遠心し、1mlの酢酸カルシウム緩衝溶液（0.01mol/l、pH5.5）で洗浄する。細胞ペレット（5ｘOD細胞に相当）をそれぞれ0.584mol/l（200g/l）のショ糖溶液を含む1.25 mlの酢酸カルシウム緩衝溶液（0.01mol/l、pH5.5）に再懸濁させた。バッチを生物変換のためにディープウエル・プレートで軽く振とうしながら室温で90分培養した。熱処理（5分, 98℃）によって反応を停止した。
【０２４０】
表２はショ糖培養下で発酵の後の上清のHPLC分析の結果を示す。
【表２】
2013515462.tif 000003
【図１】
2013515462.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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