(57)【要約】本発明は、新規のペプチド、それらを含む医薬組成物並びに化粧品組成物、及び、創傷治癒のためのそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択される配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、５０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが８〜３０アミノ酸で構成される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、アセチル化及び／又はアミド化により化学的に修飾される、請求項１〜２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４】
薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせた、請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも一つのペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
創傷治癒のための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
止血物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎症物質又はそれらの組合せを更に含む、請求項４〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも一つのペプチドを含む、化粧品組成物。
【請求項８】
局所投与、注射、経口投与又は非経口投与に適した形態である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項７に記載の化粧品組成物。
【請求項９】
前記局所投与に適した形態が、ローション、膏薬、ゲル、クリーム、バルサム、チンキ剤、パップ剤、エリキシル剤、ペースト、スプレー、洗眼液滴、ドロップ、懸濁液、分散液、ハイドロゲル、軟膏、エマルジョン又は粉末である、請求項８に記載の医薬組成物又は化粧品組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが創傷部位に投与される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物又は化粧品組成物。
【請求項１１】
前記創傷が開放創傷である、請求項４〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記創傷が閉鎖創傷である、請求項４〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記創傷が急性又は慢性創傷である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを含む医療用デバイス、又は、請求項４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
包帯、ガーゼ、創傷若しくは痛みのための包帯、ガーゼ、創傷又は潰瘍被覆材、皮膚パッチ、あるいは粘着テープの形態である、請求項１４に記載の医療用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、創傷治癒のためのペプチド、前記ペプチドを含む組成物、並びに創傷治癒及び化粧品用途の両方におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
組織内の創傷治癒は、複雑な修復プロセスである。通常の状況下で、急性の創傷治癒のプロセスは、三つのフェーズに分けることができる。初期の炎症期、その後に強固な組織再構築及び増殖（増殖期）が続き、再上皮形成、真皮の血管新生及び創傷閉鎖が起こる成熟段階に引き継がれる。再上皮形成は、上皮組織、主にケラチン生成細胞の移行及び増殖を含む。血管新生は、既存の導管からの新しい血管の成長であり、増殖因子ポリペプチドを含む水溶性のサイトカイン一式、及び、細胞間並びに細胞−マトリックス相互作用によって制御される。慢性創傷は、それらが一般的に長期間に渡って炎症を起こした状態のままであるという点で、通常の急性創傷治癒とは異なるプロファイルを示す。非治癒創傷は、最も一般的に、糖尿病、静脈鬱滞性疾患を有する人々、及び固定された患者において観察することができる。上記の観点では、急性及び慢性創傷治癒の両方の状況における安全かつ効率的に上皮細胞と血管創傷治癒のメカニズムを増強する新規の生体分子を提供することが望ましい。
【０００３】
ジョンソン＆ジョンソン社の遺伝子操作による組替え型ベカプレルミン、又は、ＰＤＧＦ及びデキサメタゾンを含む哺乳動物組織の再生及び修復のための医薬組成物など、創傷治癒を促進するための薬剤が近年開発されてきた（欧州特許第ＥＰ０５７５４８４号明細書）。米国特許第ＵＳ５，９８１，６０６号明細書は、ＴＧＦ−βを含む創傷治癒剤を開示し、米国特許第ＵＳ６，８００，２８６号明細書及び米国特許第ＵＳ５，１５５，２１４号明細書は、ＦＧＦを含む創傷治癒剤を開示する。
【０００４】
上記の治癒剤は全て、成長因子、サイトカイン又はケモカイン、コラーゲン又はヒアルロン酸である。これらの薬剤は、それらが一つの細胞型特定のものではない為、有害事象を誘発するという欠点を呈する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効果的且つ迅速な創傷治癒をもたらし、有害事象を引き起こさない、代替の創傷治癒剤が依然として必要とされている。
【０００６】
本発明は、代替の創傷治癒剤としての新規なペプチドを提供することを目的とし、前記ペプチドは、内皮細胞によって媒介される特定の血管新生である。５０アミノ酸未満であるペプチドは、それらの小さなサイズのため治療用の使用のために興味深いツールであるという利点を呈し：それらは、標的に対して高い親和性−特異性及び低い毒性プロファイル、室温での貯蔵、及び小さなサイズのため組織へのより良い透過性を呈する。
【０００７】
更に、それらは、完全長タンパク質と比較して、容易に合成されるという利点を呈し、従って、その工業的な生産がより標準化され、制御されている。それらは、化学的に合成可能であり、リフォールディング問題、グリコシル化問題及び活性の変動に悩まされることがないため、ウイルスセキュリティの問題を表さない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の一つの目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６の群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含むペプチドである。
【０００９】
本発明の別の目的は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、少なくとも一つのペプチドを含む医薬組成物である。
【００１０】
本発明の別の目的は、創傷治癒のための前記医薬組成物である。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドの少なくとも一つを含む化粧品組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペプチド７、１０及び１１存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生アッセイでの代表的な画像（画像は、培養後６時間で撮影した）。
【図２】ビヒクル処置創傷、１５６Ａタンパク質処置創傷及びペプチド７処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図３】ビヒクル処置創傷、１５６Ａタンパク質処置創傷及びペプチド１０処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図４】ビヒクル処置創傷、１５６Ａタンパク質処置創傷及びペプチド１１処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図５】ビヒクル処置創傷、１５６Ａタンパク質処置創傷及びペプチド７Ｂ処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図６】ビヒクル処置創傷及びペプチド２処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図７】ビヒクル処置創傷及びペプチド６処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図８】ビヒクル処置創傷及びペプチド９処置創傷の創傷治癒の時間経過。
【図９】（Ａ）ペプチド７又はペプチド１０存在下でのＱＰＣＲによるＶＥＧＦの測定。（Ｂ）ペプチド７存在下でのＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦの測定。
【図１０】（Ａ）ペプチド７（４００μｇ／ｍｌ）及びペプチド１０（４００μｇ／ｍｌ）のｐＡｋｔ活性への影響。抗活性ｐＡｋｔモノクローナル抗体を用い、且つ、抗ＧＡＰＤＨ  ｍＡｂを内部対照とする免疫ブロッド法。（Ｂ）ペプチド７及びペプチド１０のＭＡＰＫ活性への影響。Ａ）抗活性化ＭＡＰＫ（ｐＥｒｋ１／２）モノクローナル抗体を用い、且つ、抗ＧＡＰＤＨ  ｍＡｂを内部対照とする免疫ブロッド法。
【図１１】ペプチド７（２ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌ）の糖尿病マウスにおける創傷治癒への影響。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
創傷治癒は、創傷の端部又はその近くにおける細胞の移動並びに増殖、及び、創傷部位への新規又は既存の血管の補充に基づく。
【００１４】
本発明者らは、本発明のペプチドが、血管新生の増加により創傷治癒を促進し、非常に効果的であることを発見した。
【００１５】
本発明のペプチドは、タンパク質１５６Ａのフラグメントである。タンパク質１５６Ａは、欧州特許第ＥＰ１，９５５，７０５号明細書において本発明者らによって記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治癒活性を備える２１７アミノ酸長タンパク質であり、それは参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明のペプチドが、完全長１５６Ａタンパク質よりも創傷治癒の促進により効果的であることを示した。更に、本発明者らは、この促進された効果は、完全長１５６Ａタンパク質の全てのフラグメントによって共有されていないことを示した（実施例参照）。
【００１７】
本発明の一つの目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６の群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含むペプチドである。
【００１８】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５若しくは配列番号：６又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するペプチドである。
ペプチド７：ＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬ（配列番号：１）
ペプチド７Ｂ：ＥＬＤＬＱＡＳＬ（配列番号：２）
ペプチド１０：ＶＳＫＤＶＣＲＬ（配列番号：３）
ペプチド１１：ＱＳＱＫＶＰＲＱＶＱＳ（配列番号：４）
ペプチド７Ａ：ＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤ（配列番号：５）
ペプチド７Ｃ：ＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤ（配列番号：６）
【００１９】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドの機能に著しい影響を与えず、変更もしないアミノ酸修飾を指す、保存的配列修飾を含み得る。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発法及びＰＣＲ媒介突然変異誘発法などの、当該技術分野で公知の標準的な技法により本発明のペプチドの配列中に導入することが可能である。保存的アミノ酸置換は、典型的に、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を備える側鎖を有するアミノ酸残基と置換されている置換である。修飾された本発明のペプチドの配列は、一つ、二つ、三つ、四つ又はそれ以上のアミノ酸挿入、欠失又は置換を含み得る。置換が行われる場合、好ましい置換基は保存的修飾であろう。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において画定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を備えるアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を備えるアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を備えるアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を備えるアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を備えるアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を備えるアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、本発明のペプチドの配列内の一つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換し得、修飾された本発明のペプチドは、本発明のペプチドと比較することにより、保持される機能（即ち、本明細書中に記載される特性）について試験を行うことができる。
【００２０】
「同一性」又は「同一の」という用語は、二つ以上のポリペプチドの配列間の関係性において使用される場合、二つ以上のアミノ酸残基の文字列間の一致する数によって決定されるように、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって対処された、ギャップアライメント（もしあれば）を備える小さい方の二つ以上の配列間の完全一致の割合を測定する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法で用意に計算することが可能である。そのような方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載されている方法を含むがそれらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列の間の最大の一致を提供するように設計される。同一性の決定方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラム中に記載されている。二つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．￥２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）から、一般的に入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用することが可能である。
【００２１】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜５０アミノ酸から成るペプチドである。
【００２２】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜４０アミノ酸から成るペプチドである。
【００２３】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜３０アミノ酸から成るペプチドである。
【００２４】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜２５アミノ酸から成るペプチドである。
【００２５】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜２０アミノ酸から成るペプチドである。
【００２６】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜１８アミノ酸から成るペプチドである。
【００２７】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜１６アミノ酸から成るペプチドである。
【００２８】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜１４アミノ酸から成るペプチドである。
【００２９】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択された配列の内の一つを含むか、又は、それらの少なくとも８アミノ酸のフラグメントを含む、８〜１２アミノ酸から成るペプチドである。
【００３０】
本発明の一実施形態において、配列番号：２を含む８〜３０アミノ酸から成るペプチドは、配列番号：１４〜配列番号：３６又は配列番号２を含むそれらの９〜２９アミノ酸フラグメントのうちの一つである。
配列番号：１４：ＴＶＣＱＳＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬ
配列番号：１５：ＶＣＱＳＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴ
配列番号：１６：ＣＱＳＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲ
配列番号：１７：ＱＳＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱ
配列番号：１８：ＳＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳ
配列番号：１９：ＶＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲ
配列番号：２０：ＬＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬ
配列番号：２１：ＲＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮ
配列番号：２２：ＲＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤ
配列番号：２３：ＴＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥ
配列番号：２４：ＴＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬ
配列番号：２５：ＱＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱ
配列番号：２６：ＥＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡ
配列番号：２７：ＣＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬ
配列番号：２８：ＰＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲ
配列番号：２９：ＶＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤ
配列番号：３０：ＲＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬ
配列番号：３１：ＴＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲ
配列番号：３２：ＳＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲＱ
配列番号：３３：ＬＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲＱＫ
配列番号：３４：ＤＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲＱＫＬ
配列番号：３５：ＲＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲＱＫＬＥ
配列番号：３６：ＥＬＤＬＱＡＳＬＴＲＱＳＲＬＮＤＥＬＱＡＬＲＤＬＲＱＫＬＥＥ
【００３１】
本発明の別の目的は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６から成る群から選択されたアミノ酸配列から本質的に成るペプチドである。
【００３２】
本明細書で使用される「本質的に〜から成る」は、ペプチドの配列が、配列のＮ−末端及び／又はＣ−末端において、１〜５アミノ酸を更に含むことを意味する。前記追加されたアミノ酸は、任意のアミノ酸であり得、ペプチドの生物学的活性を改変しない。
【００３３】
本明細書で使用される「ペプチド」は、その中におけるモノマーがお互いにアミド結合を介して結合したαアミノ酸であるポリマーを指す。ペプチドは、二つ又はしばしばそれ以上のアミノ酸モノマー長さであり、好ましくは５０アミノ酸よりも長くない。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下の通りに省略される：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦ、ロイシンはＬｅｕ又はＬ、イソロイシンはＩｌｅ又はＩ、メチオニンはＭｅｔ又はＭ、バリンはＶａＩ又はＶ、セリンはＳｅｒ又はＳ、プロリンはＰｒｏ又はＰ、スレオニンはＴｈｒ又はＴ、アラニンはＡｌａ又はＡ、チロシンはＴｙｒ又はＹ、ヒシチジンはＨｉｓ又はＨ、グルタミンはＧｌｎ又はＱ、アスパラギンはＡｓｎ又はＮ、リシンはＬｙｓ又はＫ、アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤ、グルタミン酸はＧｌｕ又はＥ、システインはＣｙｓ又はＣ、トリプトファンはＴｒｐ又はＷ、アルギニンはＡｒｇ又はＲ、及び、グリシンはＧｌｙ又はＧ。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α,α−ニ置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非従来的なアミノ酸もまた、本明細書に提供される技術の化合物に適した成分であり得る。非従来的なアミノ酸の例は、β−アラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノル−ロイシン、及び、他の同様のアミノ酸並びにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。
【００３４】
本明細書中に記載したペプチドは、当該技術分野において公知であるように、化学合成又は酵素的合成によって合成的に生産することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質発現ベクター中に導入され、適当な宿主生物（例えば、細菌、昆虫細胞など）で生産され、その後、精製されることが可能である。追加的なポリペプチド（「タグ」）は、ペプチドを精製又は識別する目的のために、追加され得る。タンパク質タグは、例えば、マトリックスへ高い親和性でポリペプチドが吸着されることを可能にし、マトリックスはその後、混合物が有意な程度に溶出されることなく、適切な緩衝液を用いて厳重に洗浄されることを可能にし、吸着された混合物を選択的に溶出することを可能にする。当業者に公知のタンパク質タグの例は、（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、赤血球凝集素タグ、グルタチオントランスフェラーゼ(ＧＳＴ)タグ、アフィニティーキチン結合タグ又はマルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)タグを有するインテインである。これらのタンパク質タグは、Ｎ−末端、Ｃ−末端及び／又は内部に配置することが可能である。
【００３５】
本発明の一つの目的は、本明細書中に上述したペプチドであり、前記ペプチドは修飾されている。
【００３６】
本明細書に提供されるペプチドは、当該技術分野において公知の方法により修飾することが可能である。
【００３７】
例えば、ペプチドは、リン酸塩、酢酸塩、又は様々な脂質及び炭水化物などの一つ以上の官能基を付加することによって修飾することが可能である。本発明のペプチドはまた、ペプチド誘導体として存在することも可能である。用語「ペプチド誘導体」は、アミノ基（−ＮＨ−）、より具体的には、ペプチド結合を有する化合物を指す。ペプチドは、置換されたアミドと見なし得る。アミド基のように、ペプチド結合は、高い共鳴安定度を表す。ペプチド結合中のＣ−Ｎ単結合は、典型的に、約４０％の二重結合性及びＣ＝Ｏ二重結合、約４０％の単結合性を有する。「保護基」は、保護されていない官能基を伴う望まない反応（タンパク質分解など）を防ぐ基である。アミノ保護基の特定の例は、ホルミル；トリフルオロアセチル；ベンジルオキシカルボニル；（オルト−又はパラ−）クロロベンジルオキシカルボニル及び（オルト−又はパラ−）ブロモベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニル；及び、ｔ−ブトキシカルボニル及びｔ−アミルオキシカルボニルなどの脂肪族オキシカルボニルを含む。アミノ酸のカルボキシル基は、エステル基に変換して保護することが可能である。エステル基は、ベンジルエステル、メトキシベンジルエステルなどの置換ベンジルエステル、シクロヘキシルエステルなどのアルキルエステル、シクロヘプチルエステル、又は、ｔ−ブチルエステルを含む。例え保護基を必要としなくても、グアニジノ部分は、ニトロ、又は、トシル、メトキシベンゼンスルホニル若しくはメシチレンスルホニルなどのアリールスルホニルによって保護され得る。イミダゾールの保護基は、トシル、ベンジル及びジニトロフェニルを含む。トリプトファンのインドール基は、ホルミルにより保護されるか、又は保護されない可能性もある。
【００３８】
ペプチドの修飾は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの寿命を改善することを目的とする。修飾の一つの型は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のペプチドのＮ又はＣ末端への付加である。ＰＥＧは、高い水への溶解度、溶液及び低免疫原性の高い移動度などのペプチドのための理想的なキャリアにする多くの特性を有すると、当業者に公知である。この修飾はまた、エキソペプチダーゼからペプチドを保護し、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全体的なそれらの安定性を増加させる。
【００３９】
エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼによるペプチドの分解を防ぐために使用される他の修飾は、アセチル又はグリコシル化などのＮ−末端修飾、アミド化及びペプチド内の特定部位での非天然アミノ酸（β−アミノ及びα−トリフルオロメチルアミノ酸）の使用などのＣ−末端修飾を含む。
【００４０】
ペプチド分子の大きさを増加させる別の選択肢は、ヒトγ免疫グロブリンのＦｃドメインへのペプチドの遺伝子融合又はアルブミンへのペプチドの融合である。
【００４１】
本発明の別の目的は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、上述したペプチドの少なくとも一つを含む医薬組成物である。
【００４２】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象に、治療的に有効量の少なくとも一つの本発明のペプチドを投与することを含む、創傷治癒方法である。
【００４３】
本発明によれば、対象は任意の哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４４】
本発明の一実施形態において、対象は糖尿病に罹患していてもよい。本発明の一実施形態において、対象は糖尿病と診断されてもよい。
【００４５】
「治療的に有効な投与量又は量」は、所望の生物学的結果を誘発するのに十分な投与量レベルを指す。その結果は、徴候、症状、又は病気の原因、又は生物学的システムの任意の他の所望の修飾の緩和であり得る。好ましくはこの投与量又は量は、上皮及び／又は内皮創傷治癒応答を刺激又は増強し、そのようにして、創傷治癒を誘導又は増強するのに十分であろう。
【００４６】
用語「薬学的に許容可能」は、過度の毒性無しに哺乳類に投与できる化合物及び組成物を指す。適切な賦形剤は、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及びエタノール溶液、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）、植物油などを含む。一つは、また、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどの適当な防腐剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤、及び緩衝剤を含んでもよい。
【００４７】
一実施形態において、組成物は、ペプチドの薬学的に許容される塩を含み得る。
【００４８】
薬学的に許容可能な塩の例は、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などを含む。無機塩基との塩の例は、ナトリウム塩・カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩・マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、及びアンモニウム塩を含む。有機塩基との塩の例は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンを含む。無機酸との塩の例は、塩酸、ホウ酸、硝酸、硫酸、及びリン酸との塩を含む。有機酸との塩の例は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びｐ−トルエンスルホン酸との塩を含む。塩基性アミノ酸との塩の例は、アルギニン、リシン及びオルニチンとの塩を含む。酸性アミノ酸との塩の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸との塩を含む。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｐ  １４１８，１９８５に開示され、その全体の開示は参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４９】
本明細書中で使用するように、用語「創傷治癒」は、創傷の増強、改善、増加、又は閉鎖の誘発、治癒、又は修復を指す。例えば、本発明のペプチドを用いて治療した創傷の治癒時間と、本発明のペプチドを用いて治療しなかった創傷とを比較した場合、約１０％の減少、好ましくは約２０％、２５％、３０％、４０％、より好ましくは約５０％の減少、最も好ましくは約７５％の減少など、創傷治癒は促進されると考えられる。逆に、瘢痕形成の程度は、創傷治癒が促進されるかどうかを確かめるために使用することが可能である。
【００５０】
創傷は、哺乳類の任意の位置において見つけられた内部の創傷又は外部の創傷であり得る。創傷は、例えば、外力、悪い健康状態、老化、日光、熱若しくは化学反応への暴露により生じる、又は、内部の生理的プロセスによる損傷により生じる、皮膚又は組織の完全性が破壊されている物理的な外傷の一種である。組織の外側層が損傷している場合は、創傷が開放創傷とみなされる。
【００５１】
創傷はまた、開胸手術、臓器移植、切断、関節と股関節置換などの補綴の移植などの、外科的処置が原因で生じ得る。
【００５２】
創傷は、開放創傷又は閉鎖創傷であり得る。
【００５３】
開放創傷は、皮膚が破れている創傷を指す。開放創傷は、例えば、切開（即ち、切断具（例えば、ナイフ、レーザーなど）により皮膚が破かれた創傷）、裂傷（即ち、通常、皮膚が鈍い又は鈍器で破かれた創傷）、擦過傷（例えば、一般的に、皮膚の最上層が掻き取られている浅い創傷）、刺し傷（点綴的には、爪又は針などの皮膚を穿刺するものにより生じる）、貫通傷（例えば、ナイフなどのものによって生じる）、及び銃創を含む。
【００５４】
閉鎖創傷は、典型的には、皮膚が破れていない創傷である。閉鎖創傷は、例えば、皮下組織に損傷を与える鈍力の外傷によって生じる挫傷（又はあざ）、次々に皮下へ血を集める血管への損傷により生じる血腫、長期間に渡って適用された大きな又は極端な量の力により生じる圧挫損傷、急性及び慢性創傷を含む。
【００５５】
創傷の非限定的な例は以下の通りである：
−熱、電気、放射線（例えば、日焼け及びレーザー手術）又は化学物質への暴露である熱傷
−高齢化や環境に起因する皮膚の傷（これは、例えば、ひび割れ、乾燥肌、肌荒れなどを含む）
−組織を損傷する外力による創傷
−潰瘍（皮膚又は粘膜の表面における病変）
−糖尿病の創傷は通常、脚及び足の神経障害（糖尿病性神経障害）及び低血流によって引き起こされるしびれが原因の足の負傷である。最も深刻な負傷は足潰瘍である。糖尿病性足潰瘍は、罹患する危険性が非常に高く、時々、それらは治癒することが不可能である。非治癒性足潰瘍は、糖尿病を持つ人々について切断の頻繁に生じる原因である。
−褥創、褥瘡（床ずれ）即ち、身体の任意の部分、特に骨質又は軟骨領域に渡る部分への変化のない圧力によって引き起こされる病変
【００５６】
本発明の一実施形態において、本明細書中に上述した医薬組成物は、創傷治療のためのものである。
【００５７】
本発明の一実施形態において、本発明の組成物は、急性又は慢性創傷の治療のためのものである。
【００５８】
急性創傷は、無傷の皮膚への外部の損傷によって引き起こされ、創傷の原因となった対象物に応じて、異なる型に分類され得る：例えば、切開又は切開された創傷、裂傷、擦り傷及び引っかき傷、火傷、爪又は針などの皮膚を刺すものにより生じた刺し傷、体に進入するナイフなどのものにより生じた貫通傷、弾丸又は同様の発射物が体の中又は体を貫通して駆動することにより生じる銃創などである。急性創傷はまた、打撲又はあざ、血腫、長期間に渡って適用された大きな又は極端な量の力によって生じた圧挫損傷などの閉じた傷であり得る。他の急性創傷は、乾癬、にきび及び湿疹などの皮膚疾患による。
【００５９】
慢性創傷は、最終的に皮膚や上皮組織の整合性を損なうような素因となる条件に関連付けられている内因性メカニズムによって最も頻繁に生じる。一般的な慢性創傷は、静脈性潰瘍であり、これは通常脚に発生して主に高齢者に影響を与え、糖尿病性潰瘍は別の主な慢性創傷の原因であり、一般的にかかと、肩甲骨及び仙骨、角膜潰瘍などの圧力がかけられる通常の身体の部分の動きを阻害するような麻痺などの症状を持つ人々に発生する褥瘡は、最も一般的には、細菌、ウイルス、真菌又はアメーバ及び消化性潰瘍の感染によって引き起こされる。他の型の慢性創傷は、虚血及び放射能中毒などの原因によるものであり得る。全ての慢性創傷は、予測不可能な方法でゆっくりと治癒する。創傷は、例えば、眼球、粘液、肺、腎臓、心臓、腸、腱、肝臓又は、例えば静脈、静脈、動脈、毛細血管のような血管組織などの任意の組織に関連し得る。
【００６０】
本発明によれば、本発明のペプチドは、血管新生を活性化する利点を示し、それによって創傷治癒を促進する。
【００６１】
本発明の一実施形態において、組成物は、糖尿病患者における創傷の治癒のためのものである。糖尿病の最も衰弱性の合併症の一つは、慢性の非治癒性潰瘍の発症である。特に、非治癒性脚潰瘍は、糖尿病患者の１５％に発生する。糖尿病性足潰瘍は、罹患した人々の約２０％で切断につながり、アメリカ合衆国及びヨーロッパにおいて非外傷性下肢切断の主要な原因である。本発明者らは、本明細書において、本発明のペプチドは、糖尿病のマウスにおける創傷領域の減少に有効であることを示した（実施例参照）。一実施形態において、本発明の組成物は、糖尿病患者における創傷治癒を促進及び／又は加速するためのものである。
【００６２】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを少なくとも一つ含む化粧品組成物である。この組成物は、例えば、皮膚の老化、蜂巣炎、乾燥肌、ひび割れの予防、又は口腔アフタ性病変、口腔しゃく熱症候群の治療などの、化粧品用途のためのものである。
【００６３】
本発明によれば、本発明のペプチドは、経口的に、局地的に、又は、皮下、皮内若しくは筋肉内注射剤、徐放性のデポ剤、静脈内注射、鼻腔内投与などを含む非経口的手段により投与され得る。
【００６４】
本発明によれば、本発明のペプチドを含む組成物は、水溶液、乳液、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。
【００６５】
局所投与のための組成物の例は、本発明のペプチドの少なくとも一つを含む、ローション、膏薬、ゲル、クリーム、バルサム、チンキ剤、パップ剤、エリキシル剤、ペースト、スプレー、洗眼液滴、ドロップ、懸濁液、分散液、ハイドロゲル、軟膏、エマルジョン又は粉末を含むがそれらに限定されない。
【００６６】
他の局所製剤は、エアロゾル、包帯、被覆材材料、アルギン酸塩被覆材及びその他の創傷被覆材を含む。
【００６７】
経口製剤は、飲用可能な懸濁液又は溶液、シロップ、錠剤、カプセル剤、丸剤を含むがそれらに限定されない。
【００６８】
あるいは、一つは、局所的に治療されるべき部位付近の移植のために、適切な医療デバイスに、本発明のペプチドを組み込むか又はカプセル化することができる。
【００６９】
本発明によれば、医療デバイスは、経皮的な医療デバイス、制御された薬物放出医療デバイス、薬剤溶出型ステントの形態であり得る。経皮的な医療デバイスは、本発明のペプチドの経皮的プロセスによる、ゆっくりとした放出のためのデバイス（例えば貼付剤）を指す。薬剤溶出型ステントは、本発明のペプチドで被覆されたステントを指す。
【００７０】
本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドは、吸収又は吸着製品などの医療デバイスに含まれる。適切な吸収又は吸着製品は、例えば、創傷部位に用いられた場合、創傷液を吸収又は吸着することができる。そのような製品の例は、例えば、包帯、ガーゼ、創傷又は傷の包帯、皮膚パッチ及び粘着テープを含む。多くの型の包帯は、市販されており、フィルム（例えば、ポリウレタンフィルム）、親水性ロコロイド（ポリウレタン発泡体に結合した親水性コロイド粒子）、ヒドロゲル（少なくとも約６０％の水を含む架橋ポリマー）、発泡体（親水性又は疎水性）、キトサン系包帯、カルシウムアルギン酸塩（アルギン酸カルシウム由来の繊維の不織布複合材）、セロファン（可塑剤を含むセルロース）を含む。具体的には、本発明のペプチドが内に含浸されるか又は製品の表面に（共有結合又はその他の方法で）添付されている液体吸収性製品の使用が意図されている。
【００７１】
本発明によれば、組成物は、１ミリリットル又は１グラムの組成物当たり約０．０００１〜５００ｍｇのペプチドの量で、好ましくは１ミリリットル又は１グラムの組成物当たり約０．００１〜５０ｍｇ、より好ましくは１ミリリットル又は１グラムの組成物当たり０．０１〜５ｍｇ、更により好ましくは１ミリリットル又は１グラムの組成物当たり０．１〜１ｍｇの量で本発明のペプチドを含む。
【００７２】
本発明によれば、組成物は、約０．０１〜９０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％の量で、本発明のペプチドを含む。
【００７３】
本発明の別の実施形態において、本発明のペプチドの少なくとも一つを含む組成物は、更に、少なくとも一つの他の創傷治癒剤を含み得る。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、本発明のペプチドの少なくとも一つを含む組成物は、少なくとも一つの他の創傷治癒剤と組み合わせて使用され得る。
【００７５】
そのような他の創傷治癒剤は、成長因子、サイトカイン、酵素、細胞外マトリックス成分を含むがそれらに限定されない。例えば、本発明のペプチドと組み合わせた内皮細胞外マトリックスのコラゲナーゼ処置が、ペプチドの非存在下におけるコラゲナーゼ処置の誘導的影響よりも高いレベルまで、相乗的に内皮移行を加速及び増殖し得る。
【００７６】
創傷の修復に影響する薬剤はまた、創傷治癒プロセスを強化するために、そのような組成物中に含まれ得る。そのような薬剤は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの、多数の成長因子のファミリーを含む。より好ましくは、薬剤は、増殖因子β（ＴＧＦ−β）又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーを変換する。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、本発明の組成物は、更に、止血物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎症物質又はそれらの組合せを含む。
【００７８】
本明細書で提供される技術は、記載された特定の方法論、プロトコル、構造、数式及び試薬に限定されるものではなく、当業者に公知である方法を更に含む。また、本明細書中で使用した用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、何ら、本明細書中に提供される用語の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００７９】
材料及び方法
材料
培養培地及び試薬
【００８０】
培養培地ＥＧＭ−２ＭＶは、Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）から入手した。カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−Ｂ−Ｄ−チオ−１−ガラクトピラノシド）、カナマイシン及びクロラムフェニコールは、Ｅｕｒｏｂｉｏ（Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、フランス）から購入した。
【００８１】
マトリゲルは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ、フランス）から購入した。
【００８２】
細菌培養培地ＬＢ、サーモスクリプト(Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ)及び高適合度プラチナＨＩＦＩ酵素は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）から入手した。
【００８３】
ＲＮｅａｓｙミニキット、ＱＩＡＱＵＩＣＫ及びＱｉａｐｒｅｐミニプレップは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手し、キットＲＡＣＥ５’３’ＲＡＣＥキットは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅから入手した。
【００８４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）、及びインターフェロンγ（ＩＮＦγ）は、Ｒ＆Ｄ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、イギリス）から購入した。クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター及び発現ベクターＰＣＩ  ｎｅｏベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ−ｌｅｓ−ｂａｉｎｓ、フランス）から購入し、一方、ベクターｐＥＴ３０はＮａｖａｇｅｎ−Ｍｅｒｃｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  Ｓ．Ａ．Ｓ、Ｆｏｎｔｅｎａｓｙ  ｓｏｕｓ  Ｂｏｉｓ、フランスにより分配されたＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ、イギリス）。
【００８５】
ヒトＶＥＧＦＡサンドイッチＥＬＩＳＡキットは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【００８６】
ペプチド
ペプチド７、１０、１１、７Ｂ、７Ａ、７Ｃ、２（配列番号：１１）、６（配列番号：１２）及び９（配列番号：１３）は、化学修飾としてＮ−末端アセチル化及びＣ−末端アミド化を用いてＧｅｎｅＣｕｓｔにより化学的に合成した。全てのペプチドは、ＨＰＬＣ精製ステップに供し、少なくとも９５％の純度の凍結乾燥粉末となった。
【００８７】
タンパク質１６５Ａは、欧州特許第ＥＰ１９５５７０５号明細書に記載されているように得た。
【００８８】
動物
五週齢の特定病原体にかかっていないメスのスイスヌードマウス（体重１９〜２２ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（６９５９２  Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）から購入した。動物は、犠牲になるまで我々の動物医療施設に収容した。動物飼育施設（ＣＥＲＦＥ、Ｅｖｒｙ、フランス）農業及び研究のフランス文部省により認定されている。動物実験は、動物実験の倫理指針（指令番号８６／６０９  ＣＥＥ）及び実験新生組織形成における動物の福祉のための英国のガイドライン（実験新生組織形成における動物の福祉のための、がん研究のガイドラインに関する英国共同調整委員会（１９９８）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ。７７：１〜１０）に従って実施した。
【００８９】
方法
ペプチド合成
全てのペプチドを化学的に合成した後、ＨＰＬＣ精製ステップにより、精製したペプチドの純度が確かに少なくとも９０％となるようにした。
【表１】
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【００９０】
血管新生アッセイ
ヒト微小血管内皮細胞の血管新生（ＨＭＥＣ）は、Ｇｒａｎｔら（１９８９、Ｃｅｌｌ，１９８９，５８：９３３）により記載されたマトリゲルアッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏへ導入した。この方法は、マトリゲルマトリックスに毛細管構造を形成する内皮細胞の分化に基づく。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス腫瘍から調製し、これは、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、プロテオヘパラン硫酸及び他の成長因子を含む基底膜タンパク質の複雑な混合物を表す。
【００９１】
簡単に説明すると、２５０μｌのマトリゲルを、２４ウェル培養プレートの各ウェルへ移し、マトリックス溶液を固化させるために、３０分間３７℃で培養した。完全な増殖培地ＥＧＭ−２ＮＶで増殖させたＨＭＥＣをトリプシンによって採取し、同じ増殖培地中に懸濁させ、タンパク質存在下又は非存在下で、７０，０００細胞を含む５００μｌを、各ウェル中の固化したマトリゲルの上に加えた。細胞は、１８〜２４時間、３７℃で、５％のＣＯ２を含む加湿された雰囲気中に維持した。内皮管形成は、倒立光学顕微鏡下で観察し、写真撮影を行った。
【００９２】
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ
示された濃度の組み換えタンパク質ＧＳ−１５６Ａ又はビヒクル由来のペプチド７又はペプチド１０に２４時間暴露した後、ＨＭＥＣ（５×１０５細胞／ｍｌ）、全ｍＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキットを使用して分離した。ＲＮＡ収率及び純度は、分光光度分析により評価した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、前述のように実施した（Ｖｏｇｈｅｌら、２００８）。簡単に説明すると、０．５μｇの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマー及びＭ−ＭＬＶ（２００Ｕ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、合成したｃＤＮＡは、ＰＣＲ生成物及び以下のプライマーの検出のために、ＤＮＡ結合色素ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩを使用するリアルタイムＰＣＲ増幅のために、直ちに使用した：ＶＥＧＦ−Ａについて（センス、５’ＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡ−３’（配列番号：７）、アンチセンス、５’−ＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧ−３’（配列番号：８））、ＧＡＰＤＨについて（センス、５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ−３’（配列番号：９）、アンチセンス、５’−ＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧ−３’（配列番号：１０））。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＤＮＡエンジンＯＰＴＩＣＯＮ２連続蛍光検出器（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、アメリカ合衆国）を用いて実行した。結果は以下の式を使用して定量した：ＣｏｐｙＴＦ：ＣｏｐｙＧＡＰＤＨ＝２Ｃ（ｔ）ＧＡＰＤＨ−Ｃ（ｔ）ＴＦ。全てのＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲル上での電気泳動により分析し、臭化エチジウムで可視化し、Ｇｅｎｅｓｎａｐ６．００．２６ソフトウェアを使用して分析した（Ｓｙｎｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、イギリス）。濃度分析は、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ分析ソフトウェアＶｅｒｓｉｏｎ３．０２．００（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して実施した。
【００９３】
タンパク質定量
血清を取り除いたＨＭＥＣを、異なる濃度のペプチド７又はペプチド１０又はビヒクルを用いて、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２下で６時間培養した。氷冷ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をタンパク質抽出用緩衝液(ＰＥＢ)(２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｒｏｎ、２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロ−リン酸、１ｍＭのＮａ３Ｖｏ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μＭのＰＭＳＦ)で懸濁した。タンパク質含有量は、ブラッドフォード法により測定した。培養培地中又は抽出物中のＶＥＧＦＡ濃度は、メーカーの指示に従って、ヒトＶＥＧＦＡサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して決定した。
【００９４】
プロテインキナーゼＢ（ｐＡｋｔ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化状態
ｐＡｋｔの活性化状態は、抗ホスホセリン４７３  ｐＡｋｔ抗体を用いて、抗ＧＡＰＤＨ  ｍＡｂを内部標準として、ウェスタンブロット法により決定した。
【００９５】
ＭＡＰＫの活性化状態は、抗活性化ＭＡＰＫ（ｐＥｒｋ１／２）抗体を用いて、抗ＧＡＰＤＨｍＡｂを内部標準として、ウェスタンブロット法により決定した。
【００９６】
ペプチドの投与経路及び投与
ビヒクル（バッチＡ）は、全ての適用について、１０ｍｌ／ｋｇの標準化されたボリュームでの局所適用により投与した。本発明のペプチド、タンパク質１５６Ａ又はペプチド２、６及び９は、ビヒクル中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で局所適用により投与した。治療のプロトコルは、以下の通りである：
グループ１：（バッチＡ、ビヒクル）：負傷後１０分１局所適用
グループ２：（ペプチド７、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ３：（ペプチド１０、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ４：（ペプチド１１、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ５：（ペプチド７Ｂ、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ６：（ペプチド２、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ７：（ペプチド６、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ８：（ペプチド９、０．５ｍｇ／ｍｌ）：負傷後１０分１局所適用
グループ９：（タンパク質１５６Ａ、０．５ｍｇ／ｍｌ）負傷後１０分１局所適用
【００９７】
負傷
健康なメスのＢＡＬＢＣスイスマウスを、ケタミン−キシラジンの腹腔内注射により麻酔した（８０ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、Ｒｅｆ．Ｋ−１１３、Ｓｉｇｍａ、フランス）。二つの経皮傷、それぞれ幅５ｍｍ及び深さ約１〜２ｍｍを、５ｍｍパンチを使用して、それぞれのマウスの右及び左脇腹に受傷させた。マウスを受傷後２時間観察した。
【００９８】
治療スケジュール
Ｄ１及び動物の負傷後１０分で、マウスは３匹ごとの９グループに無作為に割り付けた。
【００９９】
全ての治療は、４日間、１局所適用／日の頻度で局所的に受傷させた。グループ１の動物は、ビヒクル溶液（バッチＡ）を用いて治療した。グループ２〜グループ９の動物は、投与量５ｍｇ／ｋｇで示されたペプチド又は１５６Ａタンパク質を用いて治療した。
【０１００】
マウスを治療し、治療後２時間観察した。
【０１０１】
ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、Ｒｅｆ．Ｋ−１１３、Ｓｉｇｍａ、フランス）を、頸椎脱臼により犠牲にする前に動物を麻酔するために使用した。
【０１０２】
糖尿病マウスにおける負傷
糖尿病のメスのｏｂ／ｏｂ  Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを、ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、Ｒｅｆ．Ｋ−１１３、Ｓｉｇｍａ、フランス）のＩＰ注射により麻酔した。二つの経皮傷、それぞれ幅８ｍｍ及び深さ１〜２ｍｍは、８ｍｍのパンチを使用して、それぞれのマウスの右脇腹に受傷させた。マウスを受傷後２時間観察した。
【０１０３】
治療
Ｄ１及び動物の負傷後１０分で、マウスは５匹ごとの３グループに無作為に割り付けた。
【０１０４】
全ての治療は、４日間、１皮下注射／日の頻度で、負傷した領域の下の皮下(ＳＢ)注射により受傷させた。グループ１の動物は、ビヒクル溶液（バッチＡ、２００μｌ／注射、負傷した領域の下）を注射した。グループ２の動物は、ビヒクル中のＰ７溶液（２ｍｇのＰ７／ビヒクル１ｍｌ）を注射した（２００μｌ／注射、１６ｍｇ／ｋｇ、負傷した領域の下）。グループ３の動物は、ビヒクル中Ｐ７溶液（５ｍｇのＰ７／ビヒクル１ｍｌ）を注射した（２００μｌ／注射、４０ｍｇ／ｋｇ、負傷した領域の下）。
【０１０５】
マウスは、治療後２時間観察した。
【０１０６】
ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、Ｒｅｆ．Ｋ−１１３、Ｓｉｇｍａ、フランス）を、頸椎脱臼により犠牲にする前に動物を麻酔するために使用した。
【０１０７】
結果
本発明のペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を誘発する
設計された小さなペプチド７（配列番号：１）、１０（配列番号：３）、及び１１（配列番号：４）を合成し、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生誘発活性についての試験をした（上述の方法における記載の通り）。
【０１０８】
ＨＭＥＣ及び各ペプチドの４００μｇ／ｍｌ最終濃度を使用した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイの結果を表１に示す。画像は、インキュベーション後６時間で撮影した。
【０１０９】
これらの結果は、ペプチド７、１０、及び１１が、強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生誘発活性を有することを示し、これらのペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生誘発活性は、以下の通りに分類することができる；ペプチド７＞ペプチド１０＞ペプチド１１。
【０１１０】
ペプチド７を用いた創傷治癒
ペプチド７を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクル又は１５６Ａタンパク質を用いて治療した創傷よりも早く治癒したことを示した（図２）。治療後１、２、３及び４日で、ビヒクルで治療の創傷はそれぞれ１６．９、２１．１、４５．９及び５７．５％の治癒を示し、１５６Ａで治療した創傷は、それぞれ４０．２、４２．１、５７．６及び６４．９％の治癒を示し、一方、ペプチド番号７で治療した創傷は、それぞれ、治療後１、２、３及び４日で、５２．８、６０．１、６５．６及び８２．９％の治癒を示した。
【０１１１】
ペプチド１０を用いた創傷治癒
ペプチド１０を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクル又は１５６Ａタンパク質を用いて治療した創傷よりも早く治癒したことを示した（図３）。治療後１、２、３及び４日で、ビヒクルで治療の創傷はそれぞれ１６．９、２１．１、４５．９及び５７．５％の治癒を示し、１５６Ａで治療した創傷は、それぞれ４０．２、４２．１、５７．６及び６４．９％の治癒を示し、一方、ペプチド１０で治療した創傷は、それぞれ、治療後１、２、３及び４日で、４２．８、６１．３、６５．６及び７８．９％の治癒を示した。
【０１１２】
ペプチド１１を用いた創傷治癒
ペプチド１１を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクル又は１５６Ａタンパク質を用いて治療した創傷よりも早く治癒したことを示した（図４）。治療後１、２、３及び４日で、ビヒクルで治療の創傷はそれぞれ１６．９、２１．１、４５．９及び５７．５％の治癒を示し、１５６Ａで治療した創傷は、それぞれ４０．２、４２．１、５７．６及び６４．９％の治癒を示し、一方、ペプチド１１で治療した創傷は、それぞれ、治療後１、２、３及び４日で、４１．９、５２．１、５８．４及び６４．４％の治癒を示した。
【０１１３】
ペプチド７Ｂを用いた創傷治癒
ペプチド７Ｂを用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクル又は１５６Ａタンパク質を用いて治療した創傷よりも早く治癒したことを示した（図５）。治療後１、２、３及び４日で、ビヒクルで治療の創傷はそれぞれ１６．９、２１．１、４５．９及び５７．５％の治癒を示し、１５６Ａで治療した創傷は、それぞれ４０．２、４２．１、５７．６及び６４．９％の治癒を示し、一方、ペプチド７Ｂで治療した創傷は、それぞれ、治療後１、２、３及び４日で、３３．２、５６．９、６３．７及び７６．６％の治癒を示した。
【０１１４】
ペプチド２を用いた創傷治癒
ペプチド２を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクルを用いて治療した創傷よりも遅く治癒したことを示した（図６）。
【０１１５】
ペプチド６を用いた創傷治癒
ペプチド６を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクルを用いて治療した創傷よりも遅く治癒したことを示した（図７）。
【０１１６】
ペプチド９を用いた創傷治癒
ペプチド９を用いた治療後の創傷治癒の試験は、このペプチドを用いて治療した創傷は、ビヒクルを用いて治療した創傷よりも遅く治癒したことを示した（図８）。
【０１１７】
ペプチド７は、ＨＭＥＣにおける転写及び翻訳レベルの両方で、ＶＥＧＦ発現を誘発する
ＶＥＧＦＡ発現へのペプチド７及びペプチド１０の影響を調査した。そのために、ＨＭＥＣをペプチド７（４００μｇ／ｍｌ最終濃度）又はペプチド１０（４００μｇ／ｍｌ最終濃度）のいずれかで６時間インキュベートし、その後、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によりＶＥＧＦＡの発現を測定した。結果は、ペプチド７でインキュベートしたＨＭＥＣは、ペプチドを加えずにインキュベートしたＨＭＥＣ（対照）よりも、約１７０％高いＶＥＧＦＡｍＲＮＡを発現した（図９Ａ）。同じ図９に示した結果はまた、ペプチド１０でインキュベートしたＨＭＥＣは、ペプチドを加えずにインキュベートしたＨＭＥＣ（対照）よりも、約６０％高いＶＥＧＦＡｍＲＮＡを発現した。
【０１１８】
ＶＥＧＦＡのこの誘発転写発現を翻訳レベルでも見つけることができることを示すために、我々は、ＶＥＧＦＡタンパク質の濃度を決定するために、ヒトＶＥＧＦＡ特定サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ペプチド７の濃度を増加させながらインキュベートしたＨＭＥＣ培養培地の分析は、ＶＥＧＦＡ生合成及び排出の約２倍の増加が存在することを証明する、４００μｇ／ｍｌのペプチド７で約９７％の増加のピークに達する培養培地中のＶＥＧＦタンパク質における投与依存性増加が存在することを示した（ｐ＜０．００１）（図９Ｂ）。
これらの結果は、ペプチド７により誘発された、ＶＥＧＦＡの誘発転写発現はまた誘発レベルでも見つけられたことを示している。
【０１１９】
ペプチド７及びペプチド１０は、ＨＭＥＣにおけるＭＡＰＫではなく、タンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）活性を誘発する
ペプチド７又はペプチド１０を用いたインキュベーションにおける、ＨＭＥＣ中のＡｌｔの状態を調査した。結果は、ＨＭＥＣ（対照）が控えめなレベルの活性化されたＡｋｔを有していることを示していた（図１０Ａ、レーン１及び４）。ペプチド７でインキュベートしたＨＭＥＣ細胞系は、しかしながら、ペプチドを用いずにインキュベートしたＨＭＥＣ（対照）と比較して、培養後１０分及び３０分で、非常に高いレベルの活性化したＡｋｔを表し（図１０Ａ、それぞれレーン２及び５）、このことは、ペプチド７がＡｋｔ活性を誘発することを示している。
【０１２０】
ペプチド１０でインキュベートしたＨＭＥＣ細胞系におけるＡｋｔ状態の調査はまた、ペプチドを用いずにインキュベートしたＨＭＥＣ（対照）と比較して、培養後１０分及び３０分で、非常に高いレベルの活性化したＡｋｔが存在することを示し（図１０Ａ、それぞれレーン３及び６）、このことは、ペプチド１０もまたＡｋｔ活性を誘発することを示している。
【０１２１】
我々はまた、細胞内シグナル伝達の別のカスケードがＶＥＧＦ発現の調節に関与することができることを表すことが良く確立されているため、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の状態を調査した。結果は、ペプチドを加えずにインキュベートしたＨＭＥＣ（対照）、ペプチド７でインキュベートしたＨＭＥＣ、ペプチド１０でインキュベートしたＨＭＥＣの間で、Ｅｒｋ１及び２の活性レベルにおいて有意な変動が無いことを示し（図１０Ｂ）、ペプチド７もペプチド１０も、ＭＡＰＫを活性化せず、ＭＡＰＫカスケードは、ペプチド７及びペプチド１０が誘発したＶＥＧＦの発現に関与していないように考えられる。
【０１２２】
ペプチド７は糖尿病マウスにおける創傷治癒を誘発する
図１１は、対照と比較して、糖尿病マウスにおける創傷の強い治癒を誘発することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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