(57)【要約】  水素化産物を製造するための方法は、清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を提供し、水とアンモニアとを含む上部、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部を形成するために培地を蒸留し、底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により底部に逆溶媒を添加し、液体部分から固体部分を分離し、固体部分を回収し、少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、並びに水素化産物を回収することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素化産物を製造するための方法であって、
（ａ）清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を提供し、
（ｂ）水とアンモニアとを含む第一上部（overhead）、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む第一液体底部（liquid bottoms）を形成するために培地を蒸留し、
（ｃ）第一底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有第一固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、第一底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により底部に逆溶媒を添加し、
（ｄ）第一液体部分から第一固体部分を分離し、
（ｅ）第一固体部分を回収し、
（ｆ）第一固体部分を水に溶解させてＭＡＳ水溶液を作製し、
（ｇ）水とアンモニアとを含む第二上部、並びに、多量のＳＡと、少量のＭＡＳと、水とを含む第二底部を形成するのに十分な温度及び圧力で、ＭＡＳ水溶液を蒸留し、
（ｈ）第二底部を第二液体部分と、実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない第二固体部分とに分離させるために、第二底部を冷却し、
（ｉ）第二液体部分から第二固体部分を分離し、
（ｊ）第二固体部分を回収し、
（ｋ）少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、及び
（ｌ）水素化産物を回収する
ことを含む方法。
【請求項２】
工程ｋの前に、前記第二固体部分を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶液を形成するために、溶媒中に前記第二固体部分を溶解することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＨＦが気相で回収されるように工程ｋが行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＢＤＯが液相で回収されるように工程ｋが行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水素化触媒が、元素周期表のグループＶＩＩＩ由来の少なくとも１の金属を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１の金属が、前記触媒の全重量に基づいて以下：
（ｉ）約０．５〜約１０ｗｔ％のルテニウム、及び
（ｉｉ）約２．０〜約２０ｗｔ％のレニウム
から実質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
約０．１〜約５．０ｗｔ％のスズを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記触媒が、炭素、シリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、シリカ−チタニア、チタニア、チタニア−アルミナ、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、及び炭酸ストロンチウムからなる群から選択される少なくとも１により担持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
水素化産物を製造するための方法であって、
（ａ）清澄化ＳＡ含有発酵培地を提供し、
（ｂ）培地のｐＨに応じて、任意により、培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ、ＮＨ3、及びＮＨ4+のうち少なくとも１を添加し、
（ｃ）水と任意によりアンモニアとを含む上部、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む第一液体底部を形成するために培地を蒸留し、
（ｄ）底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、第一底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により、第一底部に逆溶媒を添加し、
（ｅ）液体部分から固体部分を分離し、
（ｆ）第一固体部分を水に溶解させてＭＡＳ水溶液を作製し、
（ｇ）水とアンモニアとを含む第二上部、並びに、多量のＳＡ、少量のＭＡＳと、水とを含む第二底部を形成するために十分な温度及び圧力で、ＭＡＳ水溶液を蒸留し、
（ｈ）第二底部を第二液体部分と、実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない第二固体部分とに分離させるために、第二底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｉ）第二液体部分から第二固体部分を分離し、
（ｊ）第二固体部分を回収し、
（ｋ）少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、
（ｌ）水素化産物を回収する
ことを含む方法。
【請求項１１】
工程ｋの前に、前記第二固体部分を精製することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶液を形成するために、溶媒中に前記第二固体部分を溶解することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＨＦが気相で回収されるように工程ｋが行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＢＤＯが液相で回収されるように工程ｋが行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記水素化触媒が、元素周期表のグループＶＩＩＩ由来の少なくとも１の金属を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１の金属が、前記触媒の全重量に基づいて以下：
（ｉ）約０．５〜約１０ｗｔ％のルテニウム、及び
（ｉｉ）約２．０〜約２０ｗｔ％のレニウム
から実質的になる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
約０．１〜約５．０ｗｔ％のスズを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記触媒が、炭素、シリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、シリカ−チタニア、チタニア、チタニア−アルミナ、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、及び炭酸ストロンチウムからなる群から選択される少なくとも１により担持される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
水素化産物を製造するための方法であって、
（ａ）清澄化ＭＡＳ含有発酵培地を提供し、
（ｂ）培地のｐＨに応じて、任意により、培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ、ＮＨ3、及びＮＨ4+のうち少なくとも１を添加し、
（ｃ）水と任意によりアンモニアとを含む上部、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部を形成するために培地を蒸留し、
（ｄ）底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により底部に逆溶媒を添加し、
（ｅ）液体部分から固体部分を分離し、
（ｆ）固体部分を回収し、
（ｇ）少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、
（ｌ）水素化産物を回収する
ことを含む方法。
【請求項２０】
水素化産物を製造するための方法であって、
（ａ）清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を提供し、
（ｂ）水とアンモニアとを含む上部、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部を形成するために培地を蒸留し、
（ｃ）底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により底部に逆溶媒を添加し、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離し、
（ｅ）固体部分を回収し、
（ｆ）少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、及び
（ｌ）水素化産物を回収する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年４月１日に出願した米国仮出願番号６１／３２０，０７４の利益を主張する。この出願の主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示発明は、発酵により製造されたコハク酸（ＳＡ）から、水素化産物、特に１，４‐ブタンジオール（ＢＤＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及びガンマ‐ブチロラクトン（ＧＢＬ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖発酵の炭素質産物の中には、炭素含有化学物質の製造原料として使用される石油由来材料の代替品と見做されているものがある。そのような産物の一つがＭＡＳである。
【０００４】
ＳＡは、出発材料として発酵性炭素源、例えば糖を用い、微生物により製造できる。しかし、文献記載の商業化可能なコハク酸産生微生物の多くは、生育、変換及び生産性を最大化するべく最適ｐＨを維持するために、発酵培地を中和する。典型的には、培地への水酸化アンモニウムの添加により、発酵培地のｐＨはｐＨ７又はその付近に維持され、これによりＳＡがＤＡＳに変換される。
【０００５】
櫛来（特開２００５−１３９１５６号公報）は、カウンターイオンとしてアンモニウム塩を加えた発酵培地から得られるＤＡＳ水溶液から、ＭＡＳを取得する方法を記載する。具体的に、ＤＡＳ水溶液からのＭＡＳの結晶化は、当該溶液に酢酸を加えてそのｐＨを４．６〜６．３に調整し、不純物を含むＭＡＳの結晶化を促すことにより行われる。
【０００６】
増田（特開２００７−２５４３５４号公報、２００７年１０月４日公開）は、式Ｈ4ＮＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＮＨ4の「コハク酸アンモニウム」の希釈水溶液の部分的脱アンモニアを記載する。開示された分子式からは、この「コハク酸アンモニウム」がコハク酸二アンモニウムであることが分かる。増田によれば、コハク酸アンモニウム溶液を加熱することにより水及びアンモニアを除去し、コハク酸アンモニウムに加えて、コハク酸一アンモニウム、コハク酸、コハク酸モノアミド、コハク酸イミド、コハク酸アミド、又はコハク酸エステルのうち少なくとも１を含む固体ＳＡ系組成物を回収する。ここから、櫛来と同様に、増田が記載する方法も、産生されるＭＡＳ産物は不純物を含むものと推測される。櫛来及び増田の何れの方法も、高純度ＭＡＳを得るためには、得られる物質に対して種々の精製法を施す必要がある。
【０００７】
ＭＡＳに由来するＳＡなどの、生物由来ＳＡは、多くの商業的に重要な化学物質及びポリマーの合成のためのプラットフォーム分子である。従って、ＢＯＤ、ＴＨＦ、及びＧＢＬなどの誘導体に対する商業的に実施できる経路を、しっかり統合するための柔軟性を示す精製技術を提供することが非常に望まれる。発酵由来のＳＡをＢＤＯ、ＴＨＦ、及びＧＢＬに変換するための経済的に及び技術的に実施できる解決方法の不足に答えて、直接水素化用の十分な純度の対費用効果の高いＳＡ流部（stream）を供給するための方法を提供することは、有用であろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者等は、清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を提供し、水及びアンモニアを含む第一上部（overhead）、並びに、ＭＡＳ，少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む第一液体底部（first liquid bottoms）を形成するために培地を蒸留し、第一底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有第一固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、第一底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により、底部に逆溶媒を添加し、第一液体部分から第一固体部分を分離し、第一固体部分を回収し、第一固体部分を水に溶解させてＭＡＳ水溶液を作製し、水及びアンモニアを含む第二上部（second overhead）、並びに、多量のＳＡと、少量のＭＡＳと、水とを含む第二底部を形成するのに十分な温度及び圧力で、ＭＡＳ水溶液を蒸留し、第二底部を第二液体部分と、これに接触する実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない第二固体部分とに分離させるために、第二底部を冷却し、第二液体部分から第二固体部分を分離し、第二固体部分を回収し、少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、並びに水素化産物を回収することを含む水素化産物を製造するための方法を提供する。
【０００９】
また本発明者等は、清澄化ＳＡ含有発酵培地を提供し、培地のｐＨを６以下に維持するために任意により、培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ，ＮＨ3及びＮＨ4+のうち少なくとも１を添加し、水及びアンモニアを含む上部、並びに、ＭＡＳと，少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部を形成するために培地を蒸留し、底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、任意により底部に逆溶媒を添加し、液体部分から固体部分を分離し、固体部分を回収し、固体部分を水に溶解してＭＡＳ水溶液を作製し、水及びアンモニアを含む第二上部、並びに、多量のＳＡと、少量のＭＡＳと、水とを含む第二底部を形成するのに十分な温度及び圧力で、ＭＡＳ水溶液を蒸留し、第二底部を第二液体部分と、実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない第二固体部分とに分離させるために、第二底部を冷却及び／又はエバポレートし、第二液体部分から第二固体部分を分離し、第二固体部分を回収し、少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、並びに水素化産物を回収することを含む水素化産物を製造するための方法を提供する。
【００１０】
更に本発明者等は、ＤＡＳ含有発酵培地を製造することを提供し、水及びアンモニアを含む第一上部、並びに、ＭＡＳと、少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む第一液体底部を形成するための培地を蒸留し、底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成物を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに任意により、底部に逆溶媒を添加し、液体部分から固体部分を分離し、固体部分を回収し、固体部分を水に溶解してＭＡＳ水溶液を作製し、水及びアンモニアを含む第二上部、並びに、多量のＳＡと、少量のＭＡＳと、水とを含む第二底部を形成するのに十分な温度及び圧力で、ＭＡＳ水溶液を蒸留し、第二底部を第二液体部分と、これに接触する好ましくは実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない第二固体部分とに分離させるために、第二底部を冷却及び／又はエバポレートし、第二液体部分から第二固体部分を分離し、第二固体部分を回収し、少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、並びに水素化産物を回収することを含む水素化産物のための方法を提供する。
【００１１】
更に発明者等は、清澄化ＭＡＳ含有発酵培地を提供し、培地のｐＨを好ましくは６以下に維持するために、任意により、培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ，ＮＨ3、及びＮＨ4+のうち少なくとも１を添加し、水及び任意によりアンモニアを含む上部、並びに、ＭＡＳと，少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部を形成するために培地を蒸留し、底部をＤＡＳ含有液体部分と、実質的にＤＡＳを含まないＭＡＳ含有固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、任意により、底部に逆溶媒を添加し、液体部分から固体部分を分離し、固体部分を回収し、少なくとも１の水素化触媒の存在下で、第二固体部分を水素化し、ＴＨＦ、ＧＢＬ、又はＢＤＯのうち少なくとも１を含む水素化産物を作製し、並びに水素化産物を回収することを含む水素化産物を製造するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、発酵由来ＳＡからＢＤＯ、ＴＨＦ、及びＧＢＬの水素化のために完全に統合された方法を模式的に示し、並びに２段階の間に、ＭＡＳの結晶化工程を有するＤＡＳの２段階脱アンモニアを示す。
【図２】図２は、発酵由来ＳＡからＢＤＯ、ＴＨＦ、及びＧＢＬの水素化のために完全に統合された工程を模式的に示し、及び２段階の間に、ＭＡＳの結晶化工程を有するＤＡＳの２段階脱アンモニアを示す。水素化前に、任意の精密濾過工程をＳＡの更なる精製のために含む。
【図３】図３は、水及び３０％ＤＡＳ水溶液の各々に対するＭＡＳの溶解性を、温度の関数として表したグラフである。
【図４】図４は、本発明の方法の所定の側面を示すフロー図である。
【図５】図５は、ＭＡＳ（ＨＳｕ−）、ＤＡＳ（Ｓｕ−２）、及びＳＡ（Ｈ２Ｓｕ）のモル分率を、１３５℃におけるｐＨの関数として表したグラフである。
【図６】図６は、２５℃における図５と同様のグラフである。
【図７】図７は、所定の温度でのＭＡＳ、ＤＡＳ及び水の三成分図である。
【図８】図８は、本発明の方法により製造されたＭＡＳ結晶の顕微鏡図である。
【図９】図９は、本発明の方法により製造されたＳＡ結晶の顕微鏡図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
当然のことではあるが、以下の説明のうち少なくとも一部は、図における例示のために選択された方法の代表例を指すことを意図したものであり、添付の特許請求の範囲を除いて、本開示発明を定義又は限定することを意図したものではない。
【００１４】
本発明の方法は、例えば図１を参照することにより理解される。図１は、本発明の方法の代表例１０をブロック図として表したものである。
【００１５】
生育槽は、通常は備え付けの蒸気滅菌可能な発酵槽であって、ＤＡＳ、ＭＡＳ、及び／又はＳＡ含有発酵培地の製造に用いられる微生物培養物（未記載）の培養に使用し得る。そのような生育槽は本技術分野で公知であり、更に言及しない。
【００１６】
この微生物培養物は、炭水化物糖等の発酵性炭素源からＳＡを産生し得る微生物を含んでいてもよい。微生物の代表例としては、これらに限定される訳ではないが、大腸菌（Escherichia coli）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（また、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum））、エンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）、ベイヨネラ パルビュラ（Veillonella parvula）、アクチノバチルス スクシノゲネス（Atinobacillus succinogenes）、マンヘイミア スクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）、アネロビオスピリルム スクシニシプロデューセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、ペシロマイセス バリオッティ（Paecilomyces Varioti）、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バクテロイデス フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）、バクテロイデス アミロフィラス（Bacteroides amylophilus）、アルカリゲネス ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、カンジダ ブルンプチイ（Candida brumptii）、カンジダ カテヌラタ（Candida catenulate）、カンジダ ミコデルマ（Candida mycoderma）、カンジダ ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、カンジダ パルディゲナ（Candida paludigena）、カンジダ ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ ユチリス（Candida utilis）、デバリオマイセス ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、フサリウム オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、ヒュミコラ ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、クロエケラ・アピキュラータ（Kloeckera apiculata）、クルイベロマイセス ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス ウィッケルハミ（Kluyveromyces wickerhamii）、ペニシリウム シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）、ピキア アノマーラ（Pichia anomala）、ピキア ベッセイ（Pichia besseyi）、ピキア メディア（Pichia media）、ピキア ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii）、ピキア イノシトヴォラ（Pichia inositovora）、ピキア・スティピディス（Pichia stipidis）、サッカロミセス バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）、ヤロウィア リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、それらの混合物等が挙げられる。
【００１７】
好ましい微生物は、受託番号ＰＴＡ−５１３２としてＡＴＣＣに供託された大腸菌株である。より好ましくは、この株から３つの抗生物質耐性遺伝子（ｃａｔ、ａｍｐｈｌ、ｔｅｔＡ）を除去したものである。抗生物質耐性遺伝子ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性をコードする）及びａｍｐｈｌ（カナマイシン耐性をコードする）の除去は、Datsenko KA and Wanner BL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Jun 6, 97(12), 6640-5に記載のいわゆる「ラムダ−レッド」（“Lamda-red (λ-red)”）法により行うことができる。本文献の主題は引用により本明細書に組み込まれる。テトラサイクリン耐性遺伝子tetAは、Bochner al., J Bacteriol., 1980, August; 143(2), 926-933により初めて報告された方法を用いて除去することができる。本文献の主題は引用により本明細書に組み込まれる。グルコースが本微生物の発酵性炭素源として好ましい。
【００１８】
発酵性炭素源（例えば炭水化物及び糖）を、任意により窒素源及び複合栄養素（例えばコーンスティープリカー）、ビタミン、塩、細胞成長及び／又は産物生成を改善し得る他の材料等の追加培地成分、並びに水と共に、微生物培養物の生育及び維持のために生育槽１２に供給してもよい。一般的には、微生物培養物は、酸素富化ガス（例えば空気）の散布により提供される好気性条件下で培養される。一般的には、微生物培養物の培養の間、ｐＨ調節のために酸（例えば硫酸）及び水酸化アンモニウムを供給する。
【００１９】
ある例（未記載）によれば、酸素富化ガスを酸素欠乏ガス（例えば、ＣＯ2等）に変えることにより、生育槽内の（酸素富化ガス散布により提供される）好気性条件を、嫌気性条件に変更する。嫌気性環境により、生育槽ではインサイチュ（in situ）で、発酵性炭素源からＳＡへの生物変換が生じる。発酵性炭素源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために、水酸化アンモニウムを供給してもよい。水酸化アンモニウムの存在により、産生されたＳＡの少なくとも一部は中和されてＤＡＳとなり、ＤＡＳを含有する培地が産生される。ＣＯ2は、ＳＡ産生のための更なる炭素源を提供する。
【００２０】
他の例によれば、生育槽の内容物を、流部（stream）を経由して、炭水化物源からＳＡへの生物変換用の別の生物変換槽に移送してもよい。ＳＡ産生を生じさせる嫌気性条件を提供するために、生物変換槽には酸素欠乏ガス（例えばＣＯ2）を散布する。炭水化物源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために水酸化アンモニウムを供給する。水酸化アンモニウムの存在により、産生されたＳＡの少なくとも一部は中和されてＤＡＳとなり、ＤＡＳを含有する培地が産生される。ＣＯ2は、ＳＡ産生のための更なる炭素源を提供する。
【００２１】
更に他の例によれば、生物変換を比較的低いｐＨ（例えば３〜６）で行ってもよい。炭水化物源からＳＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために塩基（水酸化アンモニウム又はアンモニア）を供給してもよい。所望のｐＨに応じて、水酸化アンモニウムの存在又は不在により、ＳＡが産生されるか、或いは産生されたＳＡの少なくとも一部が中和されて、ＭＡＳ、ＤＡＳ、又はＳＡ、ＭＡＳ及び／又はＤＡＳを含む混合物となる。即ち、生物変換時に産生されたＳＡは、任意により追加工程としてアンモニア又は水酸化アンモニウムを供給することにより、その後に中和されて、ＤＡＳを含有する培地が産生される。従って、「ＤＡＳ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＤＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＭＡＳ及び／又はＳＡを含むことを意味する。同様に、「ＭＡＳ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＭＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＳ及び／又はＳＡを含むことを意味する。
【００２２】
発酵性炭素源の生物変換の結果として（生物変換を行う場所に応じて槽又は流部のいずれかで）生じる培地は、通常は不溶性固体、例えば細胞性バイオマスや他の懸濁物等を含む。そこで、蒸留前に流部を経由して清澄化装置に移送し、不溶性固体を除去して培地を清澄化する。これによって後の蒸留装置の汚損を低減し又は予防する。不溶性固体の除去は、数種の固液分離技術の何れかを単独又は組合せで用いて行うことができる。固液分離技術としては、限定されるものではないが、遠心分離や濾過（限定されるものではないが、限外濾過、精密濾過又は深層濾過が挙げられる）が挙げられる。濾過技術は公知技術に基づいて選択し得る。可溶性無機化合物は、複数の公知の方法により除去することができる。例としては、限定されるものではないが、イオン交換、物理吸着等が挙げられる。
【００２３】
遠心分離の例として、連続ディスクスタック遠心分離が挙げられる。場合によっては、遠心分離後に、深層濾過等の研磨濾過（polishing filtration）工程を追加すると有益である。斯かる濾過には、珪藻土等の濾過助剤を使用してもよい。研磨濾過として、より好ましくは限外濾過又は精密濾過である。限外濾過及び精密濾過膜は、例えばセラミックやポリマー等からなる。ポリマー膜の一例として、Koch Membrane System（850 Main Street, Wilmington, MA, USA）製SelRO MPS-U20P（ｐＨ安定限外濾過膜）が挙げられる。これは分子量カットオフ２５０００ダルトンの市販ポリエーテルスルホン膜であって、通常は圧力０．３５〜１．３８ＭＰａ（最大圧力１．５５Ｍｐａ）、最高温度５０℃で使用できる。遠心分離と研磨濾過とを組み合わせて使用する代わりに、限外又は精密濾過膜を用いたクロスフロー濾過を単独で実施してもよい。
【００２４】
こうして清澄化された、実質的に微生物培養物や他の固体を含まないＤＡＳ含有培地又はＭＡＳ含有培地を、流部を経由して蒸留装置に移送する。
【００２５】
清澄化培地は、ＤＡＳ及び／又はＭＡＳを、培地中の全ジカルボン酸アンモニウム塩の少なくとも大部分、好ましくは少なくとも約７０ｗｔ％、より好ましくは８０ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％の量で含むべきである。ＤＡＳ及び／又はＭＡＳの濃度は、発酵培地中の全ジカルボン酸塩に対する重量パーセント（ｗｔ％）として、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やその他の公知法により容易に決定できる。
【００２６】
蒸留装置から水及びアンモニアが上部（overhead）として除去されるとともに、任意により、少なくとも一部が流部を経由して生物変換槽（或いは嫌気性モードで操作の場合、生育槽）で再利用（recycle）される。蒸留温度及び圧力は重要ではなく、少なくとも蒸留上部が水及びアンモニアを含み、蒸留底部（bottoms）が好ましくは少なくとも幾らかのＤＡＳと少なくとも約２０ｗｔ％との水を含むように、蒸留を実施すればよい。水の量は少なくとも約３０ｗｔ％がより好ましく、少なくとも約４０ｗｔ％が更に好ましい。蒸留工程からのアンモニア除去率は、温度を上昇させるに従って増加し、また、蒸留時に蒸気を注入することにより（未記載）増加させることができる。蒸留時のアンモニア除去率は、真空下、加圧下で蒸留を行い、或いは蒸留装置に空気、窒素等の不活性ガスを散布することによっても増加させることができる。
【００２７】
蒸留工程時の水の除去は、底部が少なくとも約２０％の水を含む限りにおいて、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘプタン等の有機共沸剤の使用により促進することができる。水と共沸混合物を形成し得る有機剤の存在下で蒸留を行うと、蒸留によって水相及び有機相を含む二相性底部が生じる。この場合、水相を有機相から分離し、蒸留底部として使用することができる。底部における水のレベルを少なくとも約３０ｗｔ％に維持すれば、コハク酸アミドやコハク酸イミド等の副生物を実質的に避けることができる。
【００２８】
蒸留工程の好ましい温度は、圧力にもよるが、約５０〜約３００℃の範囲である。より好ましい温度範囲は、圧力にもよるが、約９０〜約１５０℃である。約１１０〜約１４０℃の蒸留温度が好適である。「蒸留温度」とは底部の温度を指す（バッチ蒸留の場合は、最終的に所望量の上部が得られた時点の温度でもよい。）。
【００２９】
水混和性有機溶媒又はアンモニア分離溶媒を添加することにより、上述した範囲の蒸留温度及び圧力において、脱アンモニアが容易になる場合がある。斯かる溶媒としては、受動的水素結合を形成し得る非プロトン性、双極性、酸素含有溶媒が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルアセトアミド等のアミド、ジメチルスルホン、スルホラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ガンマブチロラクトン等のスルホン、ジオキサン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）等のエーテル等が挙げられる。斯かる溶媒は、清澄化培地中のＤＡＳ又はＭＡＳからアンモニアの除去に役立つ。蒸留法によらず、蒸留は、底部に少なくとも幾らかのＤＡＳと、少なくとも約２０ｗｔ％、より有利には少なくとも約３０ｗｔ％の水とが保持されるように行うことが好ましい。
【００３０】
蒸留は、常圧下、減圧下又は加圧下で行うことができる。蒸留としては、一段フラッシュ（one stage flash）、多段式蒸留（即ち、多段式カラム蒸留）等が挙げられる。一段フラッシュは、任意の種類のフラッシャー（例えば塗膜エバポレーター、薄膜エバポレーター、サーモサイフォンフラッシャー、強制循環フラッシャー等）で行うことができる。多段蒸留カラムは、トレー、充填物（packing）等を用いて達成することができる。充填物は、不規則充填物（例えばラシヒ（Raschig）リング、ポール（Pall）リング、バール（Berl）サドル等）でも、規則充填物（例えばコークスルザー（Koch Sulzer）充填物、インタロックス（Intalox）充填物、メラパック（Mellapak）等）でもよい。トレーは、任意のデザイン（例えばシーブトレー、バルブトレー、バブルカップトレー等）でもよい。蒸留は任意の理論段数で行うことができる。
【００３１】
蒸留装置がカラムの場合、その構成は特に重要ではなく、周知の基準に基づいて設計することができる。カラムは、ストリッピングモード、精留（rectifying）モード、又は分留（fractionation）モードの何れかで操作することができる。蒸留は、バッチモードで行ってもよく、連続モードで行ってもよい。連続モードでは、培地を蒸留装置に連続的に注入してもよく、また、上部及び底部の形成に伴いこれらを連続的に装置から除去してもよい。蒸留により得られる蒸留物はアンモニア水溶液であり、蒸留底部はＭＡＳ及びＤＡＳの液体状の水溶液である。これらは更に、他の発酵副生物の塩（即ち、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、乳酸アンモニウム等）や、色素体を含んでもよい。
【００３２】
蒸留底部を、流部を経由して冷却装置に移送し、常法により冷却してもよい。冷却法は重要ではないが、好ましい技術を以下に記載する。熱交換機（熱回収型）を使用することができる。フラッシュ気化冷却器を用いて底部を約１５℃まで冷却してもよい。０℃までの冷却には、通常は冷蔵冷却剤を用いる。例としてはグリコール溶液や、それほど好ましくはないが、塩水等が挙げられる。収量の更なる増大を図る目的で、冷却の前に濃縮工程を組み入れてもよい。更に、公知の方法、例えば、真空エバポレーションと共に、一体型冷却ジャケット及び／又は外部熱交換器を用いた徐熱等を用いて、濃縮及び冷却の両方を組み合わせてもよい。
【００３３】
本発明者等は、液体底部に幾らかのＤＡＳが存在することで、液体状の水溶液たるＤＡＳ含有底部に対するＭＡＳの溶解性が低下し、これによって底部が容易に、少なくともＭＡＳ「から実質的になる」（consisting essentially of）（固体部分が少なくとも実質的に純粋な結晶ＭＡＳであることを意味する）固体部分と、これに接する液体部分とに冷却誘導分離されることを見出した。図３は、０〜６０℃の範囲内の様々な温度における、３０ｗｔ％ＤＡＳ水溶液に対するＭＡＳの溶解性の低下を示す。上方の曲線は、ＭＡＳが０℃においても顕著な水溶性（即ち、水溶液に対して約２０ｗｔ％）を維持していることを示す。下方の曲線は、ＭＡＳが０℃において３０ｗｔ％ＤＡＳ水溶液に実質的に不溶性であることを示す。ここから本発明者等は、ＭＡＳ水溶液に幾らかのＤＡＳが含まれている方が、水溶液からＭＡＳをより完全に結晶化できることを見出した。斯かる溶液中のＤＡＳの好ましい濃度は、ｐｐｍレベルから約３ｗｔ％までの範囲である。これによって、ＤＡＳが存在しない場合に必要な温度よりも高い温度で、ＭＡＳを結晶化する（即ち、蒸留底部の固体部分を形成する）ことが可能となる。
【００３４】
水性培地に含まれるＤＡＳから約５０％のアンモニアを除去した場合、コハク酸種は、操作温度及び圧力に応じて、４．８〜５．４のｐＨ範囲内で、ＤＡＳ：ＭＡＳ：ＳＡが約０．１：０．８：０．１という平衡モル分布を確立する。この組成物を濃縮及び冷却すると、ＭＡＳは水に対する溶解限界を超え、結晶化する。ＭＡＳが固相に相変化する場合、液相平衡が崩壊し、より多くのＭＡＳが生じる（ＤＡＳがＳＡにアンモニウムイオンを提供する）。これによって更に多くのＭＡＳが溶液から結晶化し、相当量のＳＡを消費するまで結晶化が継続するため、ｐＨが上昇する傾向がある。ｐＨが上昇すると、液相分布はＤＡＳに対して親和性となる。しかし、ＤＡＳは水溶性が高いため、ＭＡＳの溶解性はＤＡＳよりも低くなり、結晶化が続くことになる。要するに、液相平衡とコハク酸種の固液平衡とが、ＭＡＳ結晶化の「ポンプ」として機能することにより、高収率のＭＡＳ結晶化が可能となるのである。
【００３５】
上述の冷却、エバポレーション又は気化冷却に加えて、逆溶媒の添加を行うことにより、ＭＡＳの結晶化が可能及び／又は容易になる。ここで逆溶媒としては、通常は水と混和性であるが、ＭＡＳ等の水溶性の塩の溶解性がより低く、斯かる塩の結晶化を生じるような溶媒が挙げられる。ＭＡＳに対して逆溶媒効果を有する溶媒としては、エタノールやプロパノール等のアルコール、メチルエチルケトン等のケトン、テトラヒドロフラン等のエーテル等が挙げられる。逆溶媒の使用は公知であり、冷却やエバポレーションと組み合わせて使用しても、個別に使用してもよい。
【００３６】
蒸留底部を、液体部分から固体部分を分離するために、流部を経由して分離器に導入してもよい。分離は、加圧濾過（例えば、Nutsche又はRosenmond型加圧濾過器）、遠心分離等により達成できる。生じた固体産物を産物として回収し、所望により標準法で乾燥してもよい。
【００３７】
分離後、固体部分の（１又は２以上の）表面に液体部分が残存することのないように、固体部分を処理することが望ましい。固体部分の表面に残る液体部分の量を最小化するための一つの方法は、分離した固体部分を水洗し、洗浄後の固体部分を乾燥することである。固体部分を洗浄するための簡便な方法としては、いわゆる「バスケット遠心分離」の使用が挙げられる。適切なバスケット遠心分離機は、The Western States Machine Company（Hamilton, OH, USA）から入手できる。
【００３８】
分離器の液体部分（即ち母液）は、残存する溶解ＭＡＳ、任意の非変換ＤＡＳ、酢酸アンモニウム、乳酸類（lactate）、ギ酸類（formate）等の任意の発酵副生物、その他の微量不純物を含む場合がある。この液体部分を、流部を経由して下流装置に導入する。一例によれば、装置は、混合物を適量の水酸化カリウムで処理することにより、例えばアンモニウム塩をカリウム塩に変換し、解氷剤（de-icer）を作製する手段であってもよい。この反応で生じたアンモニアを回収し、生物変換槽（又は嫌気性モードで操作する生育槽）で再利用してもよい。得られたカリウム塩混合物は、解氷剤及び防氷剤（anti-icer）として有用である。
【００３９】
ＭＡＳの回収を促進し、更にはＤＡＳからＭＡＳへの変換を推進するために、固体分離工程由来の母液を、流部を経由して、蒸留装置で再利用（又はその一部を再利用）してもよい。
【００４０】
冷却誘導結晶化の固体部分は、実質的に純粋なＭＡＳであり、ひいてはＭＡＳの公知用途に有用である。
【００４１】
ＨＰＬＣを用いて、コハク酸アミドやコハク酸イミド等の窒素含有不純物の存在を検出してもよい。ＭＡＳの純度は元素炭素及び窒素分析により決定できる。アンモニア電極を用いてＭＡＳ純度の粗近似値を決定することも可能である。
【００４２】
状況や種々の操作入力によっては、発酵培地が清澄化ＭＡＳ含有発酵培地又は清澄化ＳＡ含有発酵培地である場合がある。斯かる状況では、実質的に純粋なＭＡＳの産生を容易にするために、任意によりこれらの発酵培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ、アンモニア及び／又は水酸化アンモニウムを添加するのが有利な場合もある。例えば、培地がＭＡＳ含有培地又はＳＡ含有培地となるような方向に、発酵培地のｐＨを操作してもよい。上述した実質的に純粋なＭＡＳの製造を容易にするために、任意によりこれらの発酵培地にＭＡＳ、ＤＡＳ、ＳＡ、アンモニア及び／又は水酸化アンモニウムを添加し、培地のｐＨを好ましくは＜６に調整してもよい。また、所望により、他の物質由来のＭＡＳ、ＤＡＳ及び／又はＳＡを添加してもよい。ある特定の形態によれば、蒸留工程で得られる液体底部、及び／又は、分離器由来の固体部分から、ＭＡＳ、ＤＡＳ及び水を発酵培地に再導入（recycle）するのが特に有利である。ＭＡＳ含有培地については、そのような培地は通常、発酵培地がＭＡＳと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＳ及び／又はＳＡ等を含むことを意味する。
【００４３】
固体部分からアンモニアを除去することによりＳＡに変換できる。これは以下のように実施できる。上述の任意の変換法により取得した（実質的にＭＡＳからなる）固体部分を水に溶解させると、ＭＡＳ水溶液が得られる。次にこの溶液を、水とアンモニアとを含む上部、並びに、多量のＳＡと、少量のＭＡＳと、水とを含む底部を形成するのに十分な温度及び圧力で、蒸留する。この底部を冷却し、実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない固体部分と、これに接触する液体部分とに分離させる。固体部分を第二液体部分から分離すれば、ＨＰＬＣで測定した場合に実質的に純粋なＳＡとして回収できる。
【００４４】
次に図４を参照しながら、本発明の特に好ましい方法の一つを説明する。図４では、ＤＡＳの流部１００は、例えば（特に）ＤＡＳを含む清澄化発酵培地の流部であるが、蒸留カラム１０２で反応性エバポレーション／蒸留を受ける。蒸留は広い温度範囲に亘って生じるが、例えば約１１０から約１４５℃、好ましくは約１３５℃の範囲とする。蒸留カラム１０２中の圧力は、約１．５〜約４ｂａｒ、好ましくは約３．５ｂａｒという広い範囲とすることができる。水及びアンモニアは、蒸留カラム１０２で分離され、上部１０４を形成する。液体底部１０６は、ＭＡＳ、少なくとも幾らかのＤＡＳ、及び少なくとも約２０％ｗｔ％の水を含む。一般に、底部１０６は、約５〜約２０ｗｔ％のＭＡＳ、約８０ｗｔ％〜約９５ｗｔ％の水、及び約１〜約３ｗｔ％のＤＡＳを含む。底部のｐＨは、例えば約４．６〜約５．６の範囲である。
【００４５】
底部１０６を濃縮器１０８に導入し、ここで上部流（overhead stream）１１０を介して水を除去する。濃縮器１０８は、例えば約９０℃〜約１１０℃、好ましくは約１００℃の温度で、また、例えば約０．９ｂａｒ〜約１．２ｂａｒ、好ましくは約１．１０３ｂａｒ等の圧力で操作できる。
【００４６】
濃縮器１０８は、通常約４０ｗｔ％〜約７０ｗｔ％、好ましくは約５５ｗｔ％のＭＡＳを含む底部流（bottom stream）１１２を製造する。よって、濃縮器はＭＡＳ量を、通常約２〜約１１倍、好ましくは約４倍〜６倍に濃縮する。
【００４７】
底部流１１２は、一般的に約５０〜約７０℃、好ましくは約６０℃の温度で操作する第一晶析装置１１４に導入される。晶析装置により水相上部流（water overhead stream）１１６が産生される。底部１１８は遠心分離機１２０に導入され、ここで通常約９５％のＭＡＳ収率を有する固体流（solid stream）１２２が産生される。残りの液体フロー（liquid flow）１２４は第二晶析装置１２６に送られ、ここで上部流１２８により更に水が除去される。第二晶析装置１２６は通常約３０℃〜約５０℃、好ましくは約４０℃の温度で操作される。底部流１３０は遠心分離機１３２に導入される。遠心分離機により産生される固体流１３４は水流（water stream）１３６に再溶解される。ここで水は通常約７０〜約９０℃、好ましくは約９０℃の温度範囲で導入される。この流部は第一ミキサー１３８に導入され、第一晶析装置１１４に戻る第一再導入フロー１４０を産生する。
【００４８】
遠心分離機１３２由来の液体の残りは、流部１４１を経由して第三晶析装置１４２に導入され、水の上部流１４４を産生する。第三晶析装置１３２は、通常は約１０〜約３０℃、一般的には約２０℃の温度で操作される。底部フロー１４６の残りは第三遠心分離機１４８に導入され、第三遠心分離機１４８により産生される固体物質は、流部１５２を経由して第二ミキサー１５０に導入される。この第三の固体流は第二水流１５４に溶解される。第二水流１５４は、通常約５０〜約７０℃の温度範囲、好ましくは約７０℃で水を導入する。第二ミキサー１５０により再導入流部１５６が産生され、これが第二晶析装置１２６で再利用される。残る物質は第三遠心分離機１４８からパージ流部１５８により系外に排出される。パージ流部１５８は通常、流部１１２中に含まれる全ＭＡＳの約５ｗｔ％を占める。晶析装置１１４、１２６、及び１４２における所望の結晶化温度は、（図示のように）エバポレーションにより、若しくは外部冷却媒体との間接的な接触により、又はこれらの組合せにより達成できる。
【００４９】
図５は、１３５℃におけるＭＡＳ、ＤＡＳ及びＳＡのモル分率をｐＨの関数として示したグラフである。１３５℃は、図４の蒸留カラム１０２の一般的な温度である。図６は、温度が２５℃であることを除いて、図５と同様である。これらの図は、特定の温度における３成分の相対比率のｐＨ依存性を示す。本発明の方法によれば、反応性エバポレーション／蒸留ユニット１０２及び濃縮ユニット１０８の典型的な操作ｐＨは、例えば約５．３であり、これによりＭＡＳの産生量は最大となる。水溶性培地中に含まれるＤＡＳから約５０％のアンモニアを除去した場合、コハク酸種は、操作温度及び圧力に応じて、ｐＨ約４．８〜約５．４の範囲内で、ＤＡＳ：ＭＡＳ：ＳＡが約０．１：０．８：０．１となるような平衡モル分布を確立する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本発明者等は、この組成物を濃縮及び冷却した場合、ＭＡＳは水に対する溶解度の限度を超え、結晶化するものと考える。また、ＭＡＳが固相への相変化を生じた場合、液相平衡が徐々に崩壊し、（ＤＡＳがＳＡにアンモニウムイオンを提供して）より多くのＭＡＳが産生されると考えられる。これによって更に多くのＭＡＳが溶液から結晶化し、相当量のＳＡを消費するまで結晶化が継続するため、ｐＨが上昇する傾向があると考えられる。ｐＨの上昇に伴い、液相分布はＤＡＳに親和性を示す。しかし、ＤＡＳは水溶性が高いため、ＭＡＳの溶解性はＤＡＳよりも低くなり、結晶化が続くことになる。要するに、液相平衡とコハク酸種の固液平衡とが、ＭＡＳ結晶化の「ポンプ」として機能することにより、高収率のＭＡＳ結晶化が可能となるのである。
【００５０】
図７は、３つの異なる温度、即ち２０℃、３５℃及び６０℃におけるＭＡＳ、ＤＡＳ及び水の三成分図である。この図は、異なる温度において純粋なＭＡＳ又はＤＡＳの結晶化を生じる固液平衡を例示するものである。本発明者等の解釈によれば、図７の実験的な溶解性データから、ＭＡＳ、ＤＡＳ、及び水を含む液体組成物が冷却されて固体部分の分離を生じた場合、仮に液体組成物が「Ａ」として特定される共晶点の左側に位置すると仮定すれば、固液平衡原理により、固体部分が純粋なＭＡＳであることが示唆される。逆に、ＭＡＳ、ＤＡＳ、及び水を含む液体組成物が冷却されて固体部分の分離を生じた場合、仮に液体組成物が「Ａ」として特定される共晶点の右側に位置すると仮定すれば、固液平衡原理により、固体部分が純粋なＤＡＳであることが示唆される。図４に代表例を示した本発明の方法は、「Ａ」として特定される共晶点の左側で操作するように設計されているので、純粋なＭＡＳが産生されるものと期待される。
【００５１】
以下、図４及び図７を参照しながら、代表的な方法を記載する。一般に、流部１００は点「Ｐ」の代表例であり、約５ｗｔ％のＤＡＳを含む培地である。反応性エバポレーション／蒸留工程１０２では、水及びアンモニアがエバポレート／蒸留されて１０ｗｔ％ＭＡＳ含有溶液を形成する。これは通常は点「Ｑ」により示される。続いて、濃縮ユニット１０８では、ＭＡＳ含有溶液が濃縮されて６０ｗｔ％ＭＡＳ含有溶液を生じる。これは通常は点「Ｒ」により示される。最後に、６０ｗｔ％ＭＡＳ含有溶液は（エバポレーション、間接接触冷却、又はそれらの組合せにより）冷却されて、約３７ｗｔ％ＭＡＳ含有液体部分を産生する。これは固体部分と接触する点「Ｓ」により示される。本発明の方法は一般に共晶点の左側で操作されるので、固液平衡原理によれば、この図７は、固体部分が実質的にＤＡＳを含まない、実質的に純粋なＭＡＳであることを示唆する。
【００５２】
図８は、本発明の方法に従って製造された代表的なＭＡＳ結晶を示す顕微鏡図である。同様に、図９は、本発明の方法に従って製造された代表的なＳＡ結晶の顕微鏡図である。顕微鏡図は、ＭＡＳが、ＳＡとは異なる結晶形を有することを示している。以下に本発明者等は、本発明の方法を用いることにより、実質的にＤＡＳ及びＳＡの両方を含まない、実質的に純粋なＭＡＳを製造できることを示す。
【００５３】
水素化反応槽に直接的に注入できるＳＡの水性溶液を形成するために、ＳＡを水に溶解してもよい。注入溶液中のＳＡの好ましい濃度は、約４％〜約５０％、より好ましくは約４％〜約１０％である。
【００５４】
ＳＡ溶液は、図２中に模式的に示されたような精密濾過を用いて、更に精製できる。驚くべきことに、本発明者等は、精密ろ過が、構造化された水素化触媒の性能を改悪するかもしれないポリペプチド及びポリサッカライドなどの発酵由来不純物を濾過して取り除くのに有用であることを認めた。
【００５５】
図１及び図２中で示されているようなＳＡを含む流部は、高温及び高圧で水素と水素化触媒とを接触させて、ＴＨＦ、ＢＤＯ、及びＧＢＬを含む水素化産物を製造してもよい。
【００５６】
ＳＡの水素化のために有用な触媒の主要成分は、パラジウム、ルテニウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、白金、ニッケル、コバルト、銅、鉄、及びそれらの化合物由来の少なくとも１の金属であってもよい。
【００５７】
化学的プロモーターは、触媒の活性を増大するかもしれない。プロモーターは、触媒成分の化学的加工中の任意の工程の間に、触媒内に組み込んでもよい。化学的プロモーターは、一般的に触媒の物理的又は化学的機能を高めるだけでなく、望まない副反応を妨害するために添加できる。適切なプロモーターは、これらに限定される訳ではないが、スズ、亜鉛、銅、金、銀、及びそれらの混合物が挙げられる。好ましい金属プロモーターは、スズである。使用し得る他のプロモーターは、例えば、周期表のグループＩ及びグループＩＩから選択される元素である。
【００５８】
触媒は、担持されてもよく、担持されなくてもよい。担持触媒は、活性触媒が、噴霧、浸漬、又は物理的混合、続いて乾燥、か焼、及び必要に応じて、還元又は酸化などの方法を通して活性化などのいくつかの方法により支持材料上に蓄積されたものである。支持体として頻繁に使用される材料は、触媒の単位重量当り活性部位の高い濃縮を提供できる高い総表面積（外部及び内部）を有する多孔質固体でもよい。触媒支持体は、触媒の機能を高めるであろう。担持金属触媒は、触媒が金属である担持触媒である。
【００５９】
触媒担持材料上に担持されていない触媒は、非担持触媒である。非担持触媒は、例えば、白金黒（platinum black）又はＲａｎｅｙ（登録商標）（W. R. Grace & Co., Columbia, MD）触媒であってもよい。Ｒａｎｅｙ（登録商標）触媒は、活性金属（１又は２以上の）（active metal）及び浸出可能金属（leachable metal）（通常、アルミニウム）を含む合金を選択的に浸出するために、高い表面積を有する。Ｒａｎｅｙ（登録商標）触媒は、より高い特定の領域のため高い活性を有し、水素化反応においてより低い温度での使用を可能にする。Ｒａｎｅｙ（登録商標）触媒の活性金属は、ニッケル、銅、コバルト、鉄、ロジウム、ルテニウム、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、パラジウム、及びそれらの化合物のうち少なくとも１を含む。
【００６０】
プロモーター金属は、Ｒａｎｅｙ（登録商標）触媒の選択性及び／又は活性に影響を及ぼすために、基剤（base）Ｒａｎｅｙ（登録商標）金属にまた添加してもよい。Ｒａｎｅｙ（登録商標）触媒用のプロモーター金属は、元素の周期表のグループＩＩＩＡからＶＩＩＩＡ、ＩＢ、及びＩＩＢまでの遷移金属から選択してもよい。プロモーター金属の例は、これらに限定される訳ではないが、他の重量パーセントも可能であるが、一般的に総金属の約２ｗｔ％で、クロム、モリブデン、白金、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、及びパラジウムを含む。
【００６１】
触媒支持体は、任意の固体、不活性物質、これらに限定される訳ではないが、シリカ、アルミナ、及びチタニアなどの酸化物、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、並びに炭素が挙げられる。触媒支持体は、粉末、顆粒、ペレットなどの形態でもよい。
【００６２】
好ましい支持体材料は、炭素、アルミナ、シリカ、シリカ−アルミナ、シリカ−チタニア、チタニア、チタニア−アルミナ、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸ストロンチウム、及びそれらの化合物のうちの少なくとも１であってもよい。担持金属触媒は、１又は２以上の化合物から作られた支持体材料を、また有することができる。より好ましい支持体は、炭素、チタニア、及びアルミナである。更に好ましい支持体は、約１００ｍ2／ｇ超の表面積を有する炭素である。更に好ましい支持体は、約２００ｍ2／ｇ超の表面積を有する炭素である。好ましくは、炭素は、触媒支持体の約５ｗｔ％未満の灰分含量を有する。灰分含量は、炭素の焼却後に残る無機残留物である（炭素の元の重量のパーセンテージとして表す）。
【００６３】
担持触媒中の金属触媒の好ましい含量は、金属触媒重量＋支持体重量に基づく担持触媒の約０．１％〜約２０％であってもよい。より好ましい金属触媒含量範囲は、担持触媒の約１％〜約１０％である。
【００６４】
金属触媒と支持体系との組合せは、本明細書中で言及した任意の支持体を有する、本明細書中で言及した任意の金属を含んでもよい。好ましい金属触媒と支持体との組合せは、炭素担持パラジウム、アルミナ担持パラジウム、チタニア担持パラジウム、炭素担持プラチナ、アルミナ担持プラチナ、シリカ担持プラチナ、シリカ担持イリジウム、炭素担持イリジウム、アルミナ担持イリジウム、炭素担持ロジウム、シリカ担持ロジウム、アルミナ担持ロジウム、炭素担持ニッケル、アルミナ担持ニッケル、シリカ担持ニッケル、炭素担持レニウム、シリカ担持レニウム、アルミナ担持レニウム、炭素担持ルテニウム、アルミナ担持ルテニウム、及びシリカ担持ルテニウムが挙げられる。
【００６５】
更に好ましい金属触媒と支持体との組合せは、炭素担持ルテニウム、アルミナ担持ルテニウム、炭素担持パラジウム、アルミナ担持パラジウム、チタニア担持パラジウム、炭素担持プラチナ、アルミナ担持プラチナ、炭素担持ロジウム、及びアルミナ担持ロジウムが挙げられる。
【００６６】
より好ましい支持体は、炭素である。更に好ましい支持体は、特に、約２０００ｍ2／ｇ未満のＢＥＴ表面積を有する炭素である。更に好ましい支持体は、特に、約３００〜１０００ｍ2／ｇの表面積を有する炭素である。
【００６７】
一般的に、水素化反応は、約１０００〜約３００ｐｓｉｇまで（７×１０〜約２１×１０Ｐａゲージまで）の圧力で維持された反応槽で、約１００℃〜約３００℃までの温度で行われてもよい。
【００６８】
ＳＡを含むフィードを水素化するために触媒を使用する方法は、操作の様々な公知の様式により行うことができる。従って、全体的な水素化処理は、固定床型反応槽（fixed bed reactor）、ガス又は機械的攪拌式のいずれかの様々な種類の攪拌式スラリー反応槽などで、行うことができる。水素化処理は、バッチ又は連続モードのいずれかで操作でき、ここで水素化する前駆体を含む水相が、高圧で水素を含む気相及び粒状の固体触媒と接触する。
【００６９】
触媒が、所望された又は調節されたモル比でＢＤＯとＴＨＦとを製造するために使用される場合、水素化は、約１５０℃超〜約２６０℃未満の温度で行われるのが好ましい。ＴＨＦに対して高いＢＤＯの比率を得るために、これらの所望する産物への水素化は、この温度範囲の下端又は下端付近で有利に行われるべきである。方法及び条件は、水素化の間のモル比にまた有利に影響を与えることができる。例えば、水素化反応槽から産物の液相除去は、ＴＨＦよりもむしろＢＤＯ製造を促進し及び最大化する傾向がある。対照的に、水素化反応槽から産物の連続蒸気除去は、ＢＤＯを犠牲にしてＴＨＦ製造を最大化する傾向がある。従って、実用的な考察として、ＢＤＯ製造を優先することを意図する低温液体産物除去は、固定床型反応槽の使用が有利である。他方では、ＴＨＦ製造を優先することを意図する気相産物除去は、スラリー又は攪拌反応槽の使用が有利である。
【００７０】
温度、溶媒、触媒、反応槽形状、圧力、及び混合速度は、水素化に影響を与えることができるパラメーターである。これらのパラメーター間の関係は、本処理の反応において、所望する変換、反応速度、及び選択性をもたらすために調節されてもよい。
【００７１】
好ましい温度は、約２５℃〜３５０℃まで、より好ましくは約１００℃〜約３５０℃まで、最も好ましくは、約１５０℃〜３００℃までである。水素圧は、好ましくは約０．１〜約３０ＭＰａ、より好ましくは、約１〜２５ＭＰａ、最も好ましくは、約１〜２０ＭＰａである。
【００７２】
反応は、水中又は有機溶媒の存在下で、適切に行われてもよい。水が、好ましい溶媒である。有用な有機溶媒は、これらに限定される訳ではないが、炭化水素類、エーテル類、アルコール類などが挙げられる。アルコール類は、もっとも好ましく、特にメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びペンタノールなどの低級アルカノールが好ましい。反応は、少なくとも約７０％の範囲で選択性を持って行われるべきである。少なくとも約８５％の選択性が、一般的である。選択性は、ＴＨＦ、ＢＤＯ、及びＧＢＬである変換された物質の重量パーセントであり、ここで、変換された物質は、水素化反応について関与する出発物質の部分である。
【００７３】
本処理は、バッチ、逐次バッチ（即ち、一連のバッチ反応槽）又は連続方法のために習慣的に使用される装置において連続モードで行われてもよい。反応の産物として形成される腹水は、斯かる分離のために習慣的に使用される分離方法により除去される。
【００７４】
好ましい水素化反応槽は、水素圧下及び触媒量についてＲｕ、Ｒｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｍｎ、又はそれらの混合物から選択される構造体触媒（structured catalyst）の存在下、操作されてもよい。反応槽の水素圧及び温度は、所望する水素化産物を得るために調節されてもよい。一般的に、水素化のための反応槽フィードは、約１００℃〜約２１０℃までに維持されるが、より好ましくは約１３５℃〜約１５０℃までに維持される。
【００７５】
ＢＤＯ、ＴＨＦ、及びＧＢＬは、公知の蒸留方法により分離できる。更にＧＢＬは、ＢＤＯ、ＴＨＦ、又は両方の収率を最大化するために、水素化工程に部分的に又は完全に再利用（recycle）することができる。
【実施例】
【００７６】
本発明の方法を、以下の非限定的な代表例により説明する。以下の例の多くにおいては、実際の清澄化ＤＡＳ含有発酵培地の代わりに、合成ＤＡＳ水溶液を使用した。他の例では実際の清澄化ＤＡＳ含有発酵培地を使用する。
【００７７】
実際の培地に見られる典型的な発酵副生物の溶解性ゆえに、合成ＤＡＳ溶液の使用は、本発明の方法における実際の培地の挙動を表す良いモデルであると考えられる。発酵時に産生される主な副生物は、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム及びギ酸アンモニウムである。仮に蒸留工程時にこれらの不純物が存在した場合、全てのＤＡＳがＭＡＳに変換するまで、これらがアンモニアを失って相当量の遊離酸を形成するとは期待し得ないであろう。これは酢酸、乳酸及びギ酸が、ＳＡの二次酸基（ｐＫａ＝５．４８）よりもより強い酸だからである。言い換えれば、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、更にはコハク酸一水素（monohydrogen succinate）さえもが、コハク酸二アニオン（dianion Succinate）よりも弱い塩基なのである。更に、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム、及びギ酸アンモニウムは、ＭＡＳよりも有意に高い水溶性を示し、各々の培地中の濃度はＤＡＳ濃度の１０％未満である。加えて、たとえ蒸留工程時に酸（酢酸、ギ酸及び乳酸）が形成されたとしても、これらは水と混和性であり、水から結晶化しないであろう。これは、母液（即ち液体部分）に溶解した酸不純物を残したまま、ＭＡＳのみが飽和に達し、溶液から結晶化する（即ち固体部分を形成する）ことを意味する。
【００７８】
実施例１
本実施例は、ＤＡＳの一部を蒸留によりＭＡＳに変換し、蒸留底部液体から冷却誘導結晶化によりＭＡＳ固体を回収する手順を示す。
【００７９】
３つ口５００ｍｌ丸底フラスコに、温度計と、上部に還流冷却器（reflux condenser）を有するディーンスタークトラップとを取り付けた。還流冷却器由来のベントを、１．４Ｍ酢酸溶液１００ｇを含むガス洗浄瓶（scrubbing bottle）に誘導した。フラスコに１０％ＤＡＳ水溶液（ｐＨ８．５）４００ｇを充填した。フラスコの内容物をマグネチックスターラーで攪拌しながら、加熱マントルで加熱し、３２０．６ｇの蒸留物（水性アンモニア溶液）を留去し、ディーンスタークトラップを介して取り出した。蒸留物を分析したところ、出発ＤＡＳから、蒸留により約２０％含有アンモニアが除去されたことが分かった（即ち、底部液体中の塩は、約４０％ＭＡＳ及び約６０％ＤＡＳであった。）。ガス洗浄瓶内のアンモニアはごく微量であった。蒸留された最終液滴のポットの最終温度は１１０℃であった。ポット内の残留物（底部液体）（約５３％の水７３．４ｇ）をフラスコに移し、室温で終夜放冷した。室温への冷却により白色針状ＭＡＳが形成された。白色固体を真空濾過によって分離し、湿潤結晶１４ｇ（固体部分）及び母液（液体部分）５６ｇを回収した。湿潤結晶部分（７ｇ）を、真空オーブンで終夜乾燥することにより、乾燥固体６ｇを回収した。Karl-Fisher分析による水含量は０．４％であった。ＨＰＬＣにより固体部分を分析したところ、固体部分には非ＭＡＳ窒素含有不純物（例えばコハク酸イミドやコハク酸アミド）が含まれないことが分かった。
【００８０】
実施例２
本実施例は母液の再利用（recycle）を示す。
【００８１】
１Ｌの丸底フラスコに合成４．５％ＤＡＳ溶液８００ｇを入れ、次いで蒸留ヘッドをフラスコに取り付けた。フラスコ内容物を常圧で蒸留したところ、フラスコには残留物（底部液体）が６７ｇ存在していた。底部液体は約４５％の水を含んでいた。蒸留物のアンモニア分析によれば、第一蒸留サイクルではアンモニアの約２９％が除去され、ＤＡＳとＭＡＳとがそれぞれ４２モル／５８モルの混合物が得られたことが示された。その後、残留物（底部液体）をフラスコから除去し、ウォーターバスに備えたビーカーに移送した。ビーカー内容物を攪拌しながら２０℃に冷却した。残留物が２０℃に達したところで、微量のＭＡＳ結晶を播種し、３０分間攪拌した。その後、バスの温度を１５℃に低下させ、３０分間保持した。続いて温度を１０℃に低下させ、３０分間保持した。その後、温度を５℃に冷却し、３０分間保持し、最後に０℃にし、３０分間保持した。その後、（固体及び液体部分からなる）スラリーを、予備冷却した焼結ガラス濾過ロート及び真空フラスコを用いて迅速に濾過した。固体を真空オーブンで乾燥し、乾燥ＭＡＳ固体１３．９ｇを得た。続いて、母液（液体部分４７．２ｇ）を合成４．５％ＤＡＳ溶液８００ｇと合わせて蒸留し、残留物（底部液体）８６．６ｇを得た。第二蒸留（即ち母液再利用系）では、存在するＤＡＳの全量から約２８％のアンモニアを除去した。その後、残留物（底部液体）を同様の方法で冷却した（結晶化した）。しかし、溶液は４６℃で白濁したので、４６℃で播種し、攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。翌日、温度を５℃ずつ低下しながら０℃まで徐々に降温した。上述のようにスラリー（固体及び液体部分）を除去し、固体を濾過し、ＭＡＳ固体２３．５ｇを回収した。これは、蒸留された新たなＤＡＳ溶液８００ｇのＳＡ相当物の約７５％回収に等しい。第一サイクルから回収した固体は、９５％ＭＡＳ（水分約５％）であった。第二サイクルでは、固体は９７％ＭＡＳ（水分約３％）であった。第二サイクル由来の母液は、２８．８％のＳＡ相当物（即ちＳＡ塩）を含んでいた。
【００８２】
実施例３
本実施例は、冷却された蒸留底部の固体部分に、アミド及びイミド種が存在しないことを示す。
【００８３】
１Ｌの丸底フラスコに、合成４．５％ＤＡＳ溶液８００ｇを入れ、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”オールダーショウ（Oldershaw）セクションを取り付けた。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。フラスコの内容物を加熱マントルで加熱し、マグネチックスターラーで攪拌した。フラスコの内容物の蒸留により、フラスコ内には上部蒸留物７２１．１ｇ及び液体残留物（即ち、蒸留底部）７２．２ｇが生じた。水性アンモニア蒸留物を滴定したところ、アンモニア含量は０．３４％（即ち、ＤＡＳからＭＡＳへの変換率は約５５％）であった。その後、熱い蒸留底部（約ＤＡＳ及びＭＡＳの４７％塩溶液）を三角フラスコに移し、攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。翌朝、白濁溶液を攪拌しつつ１５℃まで冷却して６０分間保持した後、１０℃まで冷却して更に６０分間保持し、最後は５℃に冷却して６０分間保持した。生じた白いスラリーを濾過することにより、湿潤結晶１２．９ｇ及び母液５５．３ｇを回収した。結晶を蒸留水２５．８ｇに溶解させた。結晶溶液をＨＰＬＣ分析したところ、検出可能な量のアミド又はイミド種は存在しなかった。しかし、母液をＨＰＬＣ分析したところ、微量のスクシンアミド酸が見出されたが、検出可能なスクシンアミド又はスクシンイミドは存在しなかった。
【００８４】
実施例４
本実施例では、実質的にＭＡＳからなり実質的にＤＡＳを含まない、冷却された蒸留底部の固体部分を製造する。
【００８５】
３つ口１Ｌ丸底フラスコに、滴下ロート及び蒸留ヘッドを装着した１”５トレーオールダーショウ（Oldershaw）カラムを取り付けた。蒸留物の採取には氷冷レシーバを用いた。フラスコに合成４．５％ＤＡＳ溶液８００ｇを入れた。フラスコの内容物を加熱マントルで加熱し、マグネチックスターラーで攪拌した。蒸留を開始した。蒸留の実施の間、蒸留物を採取するのと同じ速度で、更なる４．５％ＤＡＳ溶液１６００ｇをフラスコにゆっくりと添加した。合計２１３５ｇの蒸留物を上部（overhead）として得た。蒸留物を滴定したところ、上部が０．３３％アンモニア溶液であることが分かった。熱い水性蒸留底部（２５３．８ｇ）をフラスコから除去し、三角フラスコに移した。蒸留底部を攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。フラスコの内容物に播種し、３０分間攪拌した。その後、スラリーを１５℃まで冷却して６０分間保持し、次に１０℃まで冷却して６０分間保持し、最後に５℃まで冷却して６０分間保持した。その間攪拌を継続した。スラリーを冷却濾過し、固体（即ち固体部分）を冷（約５℃）２０％塩化ナトリウム溶液２０ｇで３回洗浄することにより、母液（即ち液体部分）を置換した。空気を数分間ケーキに流通させて吸引し、できる限り多くの液体を除去した。その後、固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥した。固体を炭素及び窒素分析したところ、炭素と窒素との原子比率は４．０６であった（即ち、ＳＡに対するアンモニア比率１．０１、又は約９９％ＭＡＳ）。１．００の比率を得られなかったのは、固体の洗浄が不完全であったためであると考えられる。
【００８６】
実施例５
本実施例は、ＤＡＳ水溶液からのアンモニア生成に対する溶媒の影響を示す。実験５（Run#5）は、溶媒を使用しない対照実験である。
【００８７】
３つ口１Ｌ丸底フラスコの外側の口に、温度計及びストッパーを取り付けた。中央の口に、５トレー１”オールダーショウ（Oldershaw）セクションを取り付けた。オールダーショウセクションに、蒸留ヘッドを装着した。氷冷５００ｍＬ丸底フラスコを、蒸留ヘッド用のレシーバとして使用した。１Ｌ丸底フラスコに、蒸留水、試験対象溶媒、ＳＡ及び濃縮水酸化アンモニウム溶液を入れた。内容物をマグネチックスターラーで攪拌し、すべての固体を溶解させた。固体が溶解した後、内容物を加熱マントルで加熱し、蒸留物３５０ｇを蒸留した。蒸留物を氷冷５００ｍｌ丸底フラスコに採取した。蒸留物の最後の液滴を採取した時に、ポットの温度を記録した。ポットの内容物を室温まで冷却し、残留物の量及び蒸留物の量を記録した。その後、蒸留物のアンモニア含量を滴定により決定した。結果を表１に記録した。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
実施例６
本実施例では、実質的にＳＡからなり実質的にＭＡＳを含まない、冷却された蒸留底部から固体部分を製造する。
【００９０】
パール（Parr）オートクレーブ３００ｍＬに、合成ＭＡＳ８０ｇ及び水１２０ｇを入れた。オートクレーブを密閉し、内容物を攪拌し、自発圧力（autogenic pressure）１９０ｐｓｉｇで２００℃まで加熱した。内容物が当該温度に達したら、水を速度〜２ｇ／分でオートクレーブに注入し、背圧調整弁で蒸気を速度〜２ｇ／分でオートクレーブから除去した。オートクレーブから除去した蒸気を濃縮し、レシーバに採取した。最終的に合計１０２０ｇの水を注入し、合計１０１９ｇの蒸留物を採取するまで、オートクレーブの運転を上記条件で継続した。蒸留物のアンモニア含量を滴定により測定した（アンモニア０．２９重量％）。ＭＡＳからＳＡへの変換率に換算すると２９％となる。オートクレーブの内容物（１９４．６ｇ）の一部を冷却し、反応槽から排出した。スラリーを三角フラスコ（Erlenmeyer flask）内で攪拌下、室温で終夜に亘り静置した。その後、スラリーを濾過し、固体を水２５ｇで洗浄した。湿潤固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、ＳＡ産物９．５ｇを得た。アンモニウムイオン電極を用いた分析により、０．０１３ミリモルのアンモニウムイオン／ｇであることが分かった。ＨＰＬＣ分析により、この固体は０．８％スクシンアミド酸を含むＳＡであることが分かった。
【００９１】
実施例７
本実施例では、大腸菌（E. Coli）株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５１３２を含む発酵培地由来のＤＡＳ含有清澄化発酵培地を使用した。本実施例は、実質的にＭＡＳからなり、実質的にＤＡＳを含まない冷却された蒸留底部の固体部分を製造する。
【００９２】
１Ｌの３つ口丸底フラスコに、滴下ロート及び蒸留ヘッドを装着した１”５トレーオールダーショウカラムを取り付けた。氷冷レシーバを、蒸留物を採取するために使用した。フラスコに、４．４％ＤＡＳ、１％酢酸アンモニウム、０．０５％ギ酸アンモニウム及び０．０３％乳酸アンモニウムを含む清澄化ＤＡＳ含有発酵培地８００ｇを充填した。フラスコの内容物を加熱マントルで加熱し、マグネチックスターラーで攪拌した。蒸留を開始した。蒸留を運転する間、蒸留物を除去するのと同じ速度で、追加の培地溶液２２００ｇをフラスコにゆっくりと添加した。合計２７０３ｇの蒸留物を上部として取得した。蒸留物を滴定したところ、上部が０．２８％アンモニア溶液であることが分かった。熱い蒸留底部水溶液（２６９．７ｇ）をフラスコから除去し、三角フラスコに移した。蒸留底部を攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。翌日、フラスコの内容物を播種し、及びすべて攪拌しつつ、３０分間攪拌した。その後、スラリーを１５℃に冷却して３０分間保持し、続いて１０℃に冷却して３０分間保持し、最後に５℃に冷却して３０分間保持した。スラリーを冷却濾過し、空気を数分間ケーキに流通させて吸引し、できる限り多くの液体を除去した。淡褐色の固体（７２．５ｇ）及び暗褐色母液（１８８．４ｇ、ｐＨ６．４）を取得した。固体を５０℃で、水７２ｇで溶解させ、再結晶させて母液を除去した。その後、溶液を攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。翌日、フラスコの内容物に播種し、３０分間攪拌した。その後、スラリーを１５℃に冷却して３０分間保持し、続いて１０℃に冷却して３０分間保持し、最後に５℃に冷却して３０分間保持した。その間攪拌を継続した。スラリーを冷却濾過し、空気を数分間ケーキに流通させて吸引し、できる限り多くの液体を除去し、褐色母液１１０ｇ（ｐＨ５．０）を回収した。その後、固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、オフホワイト結晶２４ｇを回収した。固体の炭素及び窒素分析によれば、炭素と窒素のモル比が４．０４（即ち、ＳＡに対するアンモニアの比率１．０１又は約９９％ＭＡＳ）であることが分かった。ＨＰＬＣ分析によれば、ＭＡＳは０．０７％スクシンアミド酸を含むが、検出可能なスクシンアミド、スクシンイミド又は酢酸種は含まないことが分かった。言い換えると、ＭＡＳはＤＡＳを含まず、その他の点では実質的に純粋である。
【００９３】
実施例８
本実施例では、大腸菌（E. Coli）株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５１３２を含む発酵培地由来の発酵ＭＡＳを使用した。本実施例は、実質的にＳＡからなり、及び実質的にＭＡＳを含まない冷却された蒸留底部から固体部分を製造する。
【００９４】
パールオートクレーブ３００ｍＬに、培地由来ＭＡＳ８０ｇ及び水１２０ｇを入れ、密閉して内容物を攪拌し、自発圧力〜２０５ｐｓｉｇで２０２℃に加熱した。内容物が当該温度に達したら、水を速度〜２ｇ／分でオートクレーブに注入し、蒸気を背圧調整弁で速度〜２ｇ／分でオートクレーブから除去した。オートクレーブから出ていく蒸気を濃縮し、レシーバに採取した。合計９０５ｇの水を注入し、合計９０８ｇの蒸留物を採取するまで、オートクレーブの運転を上記条件で継続した。蒸留物のアンモニア含量を滴定により測定した（アンモニア０．３８重量％）。ＭＡＳからＳＡへの変換率に換算すると３４％になる。オートクレーブの内容物（１７８．２ｇ）の一部を冷却し、反応槽から排出した。スラリーを三角フラスコ（Erlenmeyer flask）内で攪拌下、室温で終夜に亘り静置した。その後、スラリーを濾過し、固体を水２５ｇで洗浄した。湿潤固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、ＳＡ産物８．５ｇを得た。アンモニウムイオン電極を介した分析により、０．０２７ミリモルのアンモニウムイオン／ｇであることが分かった。ＨＰＬＣ分析によれば、この固体は、１．４％スクシンアミド酸及び０．１％スクシンアミド不純物を含むＳＡであることが分かった。
【００９５】
実施例９
本実施例では、脱アンモニアを助けるためのアンモニア放出溶媒を使用する。本実施例は、実質的にＳＡからなり、実質的にＭＡＳを含まない冷却された蒸留底部から固体部分を製造する。
【００９６】
５００ｍＬ丸底フラスコに、ＭＡＳ固体２９ｇ、水５１ｇ及びトリグリム８０ｇを充填した。フラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”ガラスオールダーショウカラムセクションを取り付けた。また、水２５００ｇを含む滴下ロートをフラスコに連結した。フラスコをマグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。蒸留物が変化し始めたところで、蒸留物を取得するのと同じ速度で、滴下ロートの水をフラスコに添加した。合計２４９１ｇの蒸留物を取得した。滴定により決定したところ、蒸留物はアンモニア２．３ｇを含んでいた。ＭＡＳからＳＡへの変換率に換算すると６３％となる。その後、フラスコの残留物を三角フラスコに移し、攪拌しつつ−５℃まで冷却した。３０分間攪拌後、スラリーを冷たいうちに濾過し、固体１５．３ｇを回収した。固体を熱水１５．３ｇに溶解した後、攪拌しながらアイスバスで冷却した。冷却スラリーを濾過し、固体を１００℃で２時間、真空オーブンで乾燥し、コハク酸６．５ｇを回収した。ＨＰＬＣ分析によれば、この固体は、０．１８％スクシンアミド酸を含むＳＡであることが分かった。
【００９７】
実施例１０
本実施例では、脱アンモニアを補助するために、アンモニア放出溶媒を使用した。本実施例は、実質的にＭＡＳからなり実質的にＤＡＳを含まない、冷却された蒸留底部の固体部分を製造する。
【００９８】
５００ｍＬ丸底フラスコに、３６％ＤＡＳ水溶液８０ｇ及びトリグリム８０ｇを充填した。フラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”ガラスオールダーショウカラムセクションを取り付けた。また、水７００ｇを含む滴下ロートをフラスコに連結した。フラスコをマグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。蒸留物が変化し始めたところで、蒸留物を取得するのと同じ速度で、滴下ロートの水をフラスコに添加した。合計７４７ｇの蒸留物を取得した。滴定により決定したところ、蒸留物はアンモニア３．７ｇを含んでいた。これは〜５７％のアンモニアを除去したことを意味する。言い換えると、ＤＡＳの全てがＭＡＳに変換され、〜１４％のＭＡＳが更にＳＡに変換された。その後、フラスコの残留物を三角フラスコに移し、攪拌しつつ５℃に冷却した。３０分間攪拌後、スラリーを冷たいうちに濾過し、固体を１００℃の真空オーブンで２時間乾燥し、ＭＡＳ１０．３ｇを回収した。分析の結果、この固体は、０．７７％スクシンアミド酸及び０．１４％スクシンイミドを含むＭＡＳであることが分かった。
【００９９】
実施例１１
本実施例は、共沸溶液の使用、特に培地中の他の副生物からＭＡＳの分離を示す。
【０１００】
５００ｍＬ３つ口丸底フラスコに、温度計と、２５０ｍＬの滴下ロートと、還流冷却器を装着したディーンスタークトラップとを取り付けた。フラスコに、トルエン１００ｇ及び〜９％のＤＡＳ培地溶液１００ｇ（これは更に約１％酢酸アンモニウム及びギ酸アンモニウムの混合物を含む）を充填した。滴下ロートに、９％コハク酸二アンモニウム培地溶液２５０ｇを充填した。フラスコの内容物をマグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱して沸騰させた。滴下ロートの内容物をフラスコにゆっくり添加することにより、トルエン−水共沸混合物をディーンスタークトラップ内に蒸留させるとともに、トルエンをフラスコに復帰させた。滴下ロートの内容物全てを（蒸留と実質的に同じ速度で）添加した後、内容物を更に還流し、最終的に合計２７７．５ｇの水相をディーンスタークトラップから採取した。フラスコの内容物を熱いうちに除去し、温めた分液ロート内で二相を分離した。水相を攪拌しつつアイスバスで冷却した。生じた固体を、焼結ガラスロートを用いて濾過し、回収した。母液は暗褐色であり、濾過された固体はオフホワイトであった。固体を真空オーブンで乾燥し、ＨＰＬＣで分析した。乾燥固体（５．７ｇ）は、〜９６％のコハク酸一アンモニウムと、〜１％の酢酸アンモニウムからなり、残りは水であった。
【０１０１】
実施例１２
316SS Propak充填物を充填した長さ８フィートの１．５”３１６ＳＳスケジュール４０管を用いて圧力蒸留カラムを組み立てた。カラムの底部にはリボイラーとして投入電熱器を設けた。ニードル弁を介して窒素をリボイラー内に注入し、加圧した。カラムの上部は全除去ラインを設け、これをレシーバ付の３１６ＳＳ多管冷却器（shell and tube condenser）に連結した。レシーバには圧力計及び背圧調整弁を装着した。上部レシーバからの物質の除去は、ニードル弁を通じて、ブローケースを介して行った。予熱したフィードを、ポンプを介して充填物の上部からカラムに注入した。また、予熱した水を、ポンプを介してリボイラーに注入した。このカラムを３０ｐｓｉｇで操作した。カラム温度は１３７℃となった。カラム上部に５ｍＬ／分の速度で１０％合成ＤＡＳ溶液を注入し、水を速度５ｍＬ／分でリボイラーに注入した。上部蒸留物速度は８ｍＬ／分であり、残留物速度は２ｍＬ／分であった。蒸留物のアンモニア量を滴定したところ、蒸留物から〜４７％のアンモニアが除去されたことが分かった（即ち、ＭＡＳへの変換は〜９４％であった。）。残留物液は〜２０％のＭＡＳであり、残留物をＨＰＬＣ分析したところ、スクシンアミド酸に対する非効率性は〜３％であった。
【０１０２】
実施例１３
実施例１２の残留物の一部（８００ｇ）を、バッチ蒸留により、〜５９％のＭＡＳ溶液に濃縮した（即ち水５３０ｇを留去した。）。その後、残留物を攪拌しつつ、５℃に冷却した。生じたスラリーを濾過し、固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、ＭＡＳ固体５２．５ｇを回収した（即ち〜３２％を回収した。）。ＨＰＬＣ分析によれば、この固体は０．４９％スクシンアミド酸を含み、スクシンイミドを含まないことが分かった。
【０１０３】
実施例１４
実施例１２の圧力カラム残留物の別の一部（３２００ｇ）を蒸発晶析装置に移し、真空下６０℃で水２３１２ｇを留去することにより、ＭＡＳを〜７２％に濃縮した。生じた熱いスラリーを遠心分離し、回収した固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、ＭＡＳ固体１３０．７ｇを回収した。遠心分離工程からの母液を室温に冷却し、第二の結晶産物を形成させた。本スラリーを濾過し、回収した固体を真空下７５℃で乾燥し、ＭＡＳ固体１１４．８ｇを回収した。晶析装置へのフィードのコハク酸濃度を基準とすれば、第一及び第二産物によりそれぞれ２０％及び１８％が回収された（即ち、全体では３８％が回収された。）。これら２つの固体産物をＨＰＬＣ分析したところ、第一産物は、検出可能なスクシンアミド酸及びスクシンイミドを有しない一方で、第二産物は、０．９６％スクシンアミド酸及び０．２８％スクシンイミドを有することが分かった。
【０１０４】
比較例１
本例は、トリグリムが存在しない場合、ＭＡＳ水溶液の常圧蒸留では、非常に少ないアンモニアしか除去できないことを示す。
【０１０５】
５００ｍＬ３つ口丸底フラスコに、ＭＡＳ固体３０ｇ及び水１２０ｇを充填した。フラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”ガラスオールダーショウカラムセクションを取り付けた。また、水６００ｇを含む滴下ロートをフラスコに連結した。フラスコをマグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。蒸留物が変化し始めたところで、蒸留物を取得するのと同じ速度で、滴下ロートの水をフラスコに添加した。合計６０６ｇの蒸留物を取得した。滴定により決定したところ、蒸留物はアンモニア０．１５ｇを含んでいた。これは、〜４％のＭＡＳがＳＡに変換されたことを意味する。
【０１０６】
比較例２
本例は、トリグリムが存在しない場合に、ＤＡＳのアンモニア除去が減少することを示す。
【０１０７】
５００ｍＬ丸底フラスコに、３６％水性ＡＳ溶液８０ｇ及び水８０ｇを充填した。フラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１”ガラスオールダーショウカラムセクションを取り付けた。また、水１２００ｇを含む滴下ロートをフラスコに連結した。フラスコを、マグネチックスターラーで攪拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。蒸留物が変化し始めたところで、蒸留物を取得するのと同じ速度で、滴下ロートの水をフラスコに添加した。合計１２９０ｇの蒸留物を取得した。滴定により決定したところ、蒸留物はアンモニア２．２ｇを含んでいた。これは、〜４４％のＤＡＳがＭＡＳに変換されたことを意味する。
【０１０８】
実施例１５‐２２
一連のバッチ水素化反応を、発酵由来ＳＡの水素化について触媒の有効性を評価するために行う。反応を、２５００ｐｓｉｇまでの変化量で、攪拌可能な１２５ｍｌオートクレーブで行う。
【０１０９】
水素化実験を、発酵由来ＳＡの水素化用に適切な触媒組成物の決定のために、インサイチュ（in situ）で触媒を還元することにより行う。実験を、１２５ｍｌオートクレーブ中で、以下の（１）−（５）のように行う。（１）ＲｕＣｌ3・ｘＨ2Ｏ由来の１％ルテニウム溶液０．５１００ｇ、ＨＲｅＯ4溶液（Ｒｅ2Ｏ7由来の７．７％Ｒｅ）０．２７８０ｇ、粒状酸性炭素（particulate acidic carbon）（ＢＥＴ１５００ｍ2／ｇ）０．５０３５ｇ、ＳｎＣｌ4・５Ｈ2Ｏから調製された適量の１２．５％Ｓｎ溶液、及び７％ＳＡ水溶液３５ｇを、オートクレーブ中で混合する。（２）水素を、１２００ｐｓｉｇで反応槽に導入する。（３）反応槽内容物を、７００ｒｐｍで２５０℃に加熱し、２５０℃で３時間保持する。（４）反応槽を、冷却し及び排気する。（５）反応槽中のスラリーのサンプルを濾過し、ガスクロマトグラフィーを使用してＢＤＯ、ＴＨＦ、ＧＢＬ、１‐プロパノール、及びｎ‐ブタノールを分析する。
【０１１０】
水素化実験を、発酵由来ＳＡの水素化用の適切な触媒組成物及び支持体を決定するために、支持体上に蓄積した触媒を予備還元することにより、また行う。触媒を、以下の（１）−（４）のようにして調製する。（１）ＲｕＣｌ3・ｘＨ2Ｏ由来の１％ルテニウム溶液２．０３０５ｇ、ＨＲｅＯ4由来の７．７％レニウム溶液１．１０４ｇ、ＳｎＣｌ4・５Ｈ2Ｏから調製された適量の１２．５％Ｓｎ溶液、及び約１５００ｍ2／ｇのＢＥＴ表面積を有する本質的に酸性（ｐＨ＝４‐４．５）として特徴付けられる粒状炭素支持体（平均粒子径約２０ミクロン）２．０３ｇを、スラリー化する。（２）スラリーを、真空及び窒素パージ下、約１００〜１２０℃で乾燥する。（３）触媒を、約３００℃で約８時間水素−ヘリウムフロー下、還元する。（４）触媒を、ヘリウム下、約５０℃に冷却し、及びＮ2中１％Ｏ2下、３０分間、不動態化する。水素化実験は、１２５ｍｌオートクレーブ中で、以下の（１）‐（５）のように行う。（１）触媒約０．１〜０．５ｇ及び７％ＳＡ水溶液３５ｇをオートクレーブ中で混合する。（２）水素を反応槽に１２００ｐｓｉｎで導入する。（３）反応槽内容物を、７００ｒｐｍで２５０℃に加熱し、２５０℃で３時間保持する。（４）反応槽を冷却し及び排気する。（５）反応槽中のスラリーのサンプルを濾過し、ガスクロマトグラフィーを使用してＢＤＯ、ＴＨＦ、ＧＢＬ、１‐プロパノール、及びｎ‐ブタノールを分析する。
【０１１１】
試薬グレード化学薬品及び脱イオン水で構成された模擬培地から結晶化されたＳＡの水素化を、ＳＡ水素化用の触媒の有効性を決定するために使用する。水素化のためのＳＡを、以下の（１）−（６）のようにして調製する。（１）２５ｗｔ％ＳＡ、２．５ｗｔ％酢酸、０．２５ｗｔ％ギ酸、及び０．２５ｗｔ％乳酸からなる水溶液を、８０℃で、還流冷却器を備えた二重釜（jacketed kettle）中で調製する。（２）熱い溶液を線形冷却プロファイルの後、３時間に亘り溶液を冷却することで２０℃に冷却する。（３）溶液を、７５℃でＳＡ結晶０．１ｇを伴って播種する。（４）スラリーを、２０℃で１時間平衡化する。（５）スラリーを真空濾過で濾過し、水２０ｇで洗浄する。（６）ケーキ５０ｇ（１０ｗｔ％水分）を、脱イオン水５９３ｇに溶解する（７ｗｔ％溶液）。
【０１１２】
発酵由来培地から結晶化されたＳＡの水素化を、発酵由来の持ち越し不純物の影響を立証するために行う。水素化のための発酵由来ＳＡを、以下の（１）−（６）のように調製する。（１）４．５ｗｔ％ＤＡＳ、０．４５ｗｔ％酢酸アンモニウム、０．０５ｗｔ％ギ酸アンモニウム、及び０．０５ｗｔ％乳酸アンモニウムからなる発酵由来培地を、脱アンモニアし、２５％超ＳＡ溶液になるように濃縮する。（２）熱い溶液を線形冷却プロファイルの後、３時間にわたり溶液を冷却することで２０℃に冷却する。（３）溶液を、７５℃でＳＡ結晶０．１ｇを伴って播種する。（４）スラリーを、２０℃で１時間平衡化する。（５）スラリーを真空濾過で濾過し、水２０ｇで洗浄する。（６）ケーキ５０ｇ（１０ｗｔ％水分）を、脱イオン水５９３ｇに溶解する（７ｗｔ％溶液）。
【０１１３】
代表的な結果を、表２中の実施例１５‐２２で示す。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
本発明の方法をその具体的な工程及び態様に即して記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本開示発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の具体的な要素及び工程に代えて、広範な範囲から選択される均等物を用いてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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