(57)【要約】  本発明は、例えば細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法を提供する。【選択図】図１
2013515458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するために熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
前記アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光シグナルを生成する、
インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
前記増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が、前記細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応がマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のいずれでも、前記アリコート中に存在する場合に増幅することができることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記マイコプラズマ核酸が、少なくとも５０ヌクレオチドのｒｐｏＢ遺伝子部分を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記実施ステップが、以下の縮重プライマー：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）、
を用いて、前記部分を増幅することを含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表わす
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記反応が、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記アリコートが、Ｔａｑポリメラーゼの活性を少なくとも１０％阻害するために十分量の増幅阻害物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記阻害物質が、細胞片、細胞老廃物（例えば多糖またはタンパク質）、およびウシ胎児血清またはその増幅阻害物質成分からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
（ａ）前記実施ステップが第１および第２のプライマーを用いて前記部分を増幅することを含み、前記第１のプライマーが次の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）
を含み、かつ前記第２のプライマーが次の縮重配列：
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表し、
（ｂ）前記増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が細胞培養物中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、リアルタイムでモニターされることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で、一本鎖ＤＮＡのみの存在下で生成する蛍光シグナルの少なくとも２倍の蛍光シグナルを生成するインターカレートする蛍光色素を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法において、前記第１および第２のプライマーが、それぞれ以下の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
からなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法において、前記アリコート中の核酸がさらに精製されないことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法において、前記反応が、ｒｐｏＢ遺伝子にハイブリダイズするように設計された、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、ＳｓｏＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
細胞培養培地からのマイコプラズマＤＮＡを、存在する場合に増幅するためのキットであって、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）を含む第１の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）を含む第２の縮重プライマー
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す
ことを特徴とするキット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のキットにおいて、前記第１のプライマーが、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）からなり、
前記第２のプライマーが、
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
からなることを特徴とするキット。
【請求項２８】
請求項２６に記載のキットにおいて、
ポリメラーゼ；
インターカレートする蛍光色素；
配列番号１または配列番号２によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド
の少なくとも１つまたは複数をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキットにおいて、前記キットが、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子の少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含む核酸を含む陽性対照試料をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
請求項２６に記載のキットにおいて、オスモライトおよび／またはヘパリンをさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットにおいて、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とするキット。
【請求項３２】
請求項２８に記載のキットにおいて、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とするキット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキットにおいて、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的のために参照によって組み込まれる、２００９年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２５６，２１６号の優先権利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマは、最も頻度の高い細胞培養汚染物質の１つである（Ｕｐｈｏｆｆ，Ｃ．Ｃ．およびＤｒｅｘｌｅｒ，Ｈ．Ｇ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９０、１３〜２３）。細胞壁がないこれらの寄生細菌または腐生細菌は、モリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）として分類される。現在、１００を超えるモリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）の種が記載されているが、その８種、すなわちマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（Ｔａｎｇ，Ｊ．ら（２０００）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９、１２１〜１２６）が細胞培養汚染の９５％超を占める。
【０００３】
マイコプラズマは、細胞膜に吸着し、栄養素を枯渇させ、細胞の増殖および遺伝子発現の両方を変化させるため、感染した培養物からの実験結果は信頼性の低いものとなる。他の細菌汚染物質とは異なり、マイコプラズマは通常使用される抗生物質に感受性ではなく、また、培地に濁りを引き起こすこともなく細胞培養上清中で増殖する。このため、特異的な検出方法が使用されないかぎり、マイコプラズマは組織培養物中で看過される可能性がある。したがって、マイコプラズマのための日常試験が必要になる。
【０００４】
微生物培養、生化学アッセイ、核酸染色、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めて、マイコプラズマ検出のための数多くの方法が記載されてきた（Ｄｒｅｘｌｅｒ，Ｈ．Ｇ．およびＵｐｈｏｆｆ，Ｃ．Ｃ．（２００２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３９、７５〜９０）。他で議論されているように（Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｈ．Ｇ．、Ｕ．Ｃ．Ｃ．（２０００）Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、１２４９頁）、それぞれの方法には利点および限界がある。ＰＣＲは、研究室で日常的に使用されている、迅速に、高感度で、大量処理できる検出方法である。最も一般的なモリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）の種を検出するために設計されたいくつかのプライマー対が、高度に保存的なＤＮＡ配列、例えば１６Ｓおよび２３ＳのｒＤＮＡ配列またはその２つの間にあるスペーサーをターゲットとして文献中に記載されてきた（Ｈａｒａｓａｗａ，Ｒ．ら（１９９３）Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４４、４８９〜４９３；Ｓｐａｅｐｅｎ，Ｍ．ら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、７８、８９〜９４；Ｗｉｒｔｈ，Ｍ．ら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、６７〜７７；Ｒａｗａｄｉ，Ｇ．およびＤｕｓｓｕｒｇｅｔ，Ｏ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ、４、１９９〜２０８）。しかしながら、ｒＤＮＡは細菌の間で高度に保存されているので、これらのプライマーの一部は、モリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）に加えて、系統的に関連するグラム陽性菌も検出することが示されてきた（Ｅｌｄｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ら（２００４）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３２、１８３〜１９３）。したがって、ｔｕｆ（Ｓｔｏｒｍｅｒ，Ｍ．ら（２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９９、２９１〜３００）およびｒｐｏＢ遺伝子（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ら（２００７）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７７、２２３〜２３２；Ｐａｌｇｉ，Ｊ．ら（２００７）米国特許出願公開第２００７０２４３５３０号明細書）を含む単一コピー遺伝子をターゲットとするプライマーが設計されてきた。最近では、プライマーおよびＰＣＲ条件がリアルタイムＰＣＲで使用するのに適合するようになっており（Ｓｔｏｒｍｅｒ，Ｍ．ら（２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９９、２９１〜３００；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．ら（２００６）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ、４２、６３〜６９；Ｈａｒａｓａｗａ，Ｒ．ら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４９、８５９〜８６３；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．およびＰａｗｌｉｔａ，Ｍ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、試料の大量、高速、および高感度処理が実現している。Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍａｏ，Ｆ．ら（２００７）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７、７６）などのＤＮＡ結合色素を使用すると、リアルタイムの検出が可能になり、その後に融解曲線分析を行うこともできる。融解曲線分析により、観察された増幅が正確に標的によるものという確証が得られる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法は、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
このアリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
この増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光シグナルを生成する、インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、この増幅産物の存在が、細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、増幅反応は、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のいずれも（すなわち、存在するすべてのもの）、アリコート中に存在する場合に増幅することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、マイコプラズマ核酸は、少なくとも５０ヌクレオチドのｒｐｏＢ遺伝子部分を含む。いくつかの実施形態では、実施ステップは、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）
を含むか、またはこれからなる第１の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
を含むか、またはこれからなる第２の縮重プライマーを用いて、この部分を増幅するステップを含む。ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す。
【０００８】
いくつかの実施形態では、反応は、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、検出ステップは、増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることによりマイコプラズマを同定するステップとをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、増幅反応は検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインはＳｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、アリコートは、Ｔａｑポリメラーゼの活性を少なくとも１０％阻害するために十分量の増幅阻害物質を含む。いくつかの実施形態では、阻害物質は、細胞片、細胞老廃物（例えば多糖またはタンパク質）、およびウシ胎児血清またはその増幅阻害物質成分からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、増幅反応は、増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、オスモライトは、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択される。
【００１４】
本発明はまた、試料中（細胞培養培地中を含むがこれに限定されない）のマイコプラズマを検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、
試料（細胞培養培地を含むがこれに限定されない）のアリコートを得るステップと、
このアリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
（ａ）この実施ステップが第１および第２のプライマーを用いて部分を増幅することを含み、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）
を含むまたはこれからなる第１の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）を含むまたはこれからなる第２の縮重プライマーを含み、ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表し、
（ｂ）増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が試料中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、増幅反応はリアルタイムでモニターされる。いくつかの実施形態では、増幅反応は、二本鎖ＤＮＡの存在下で、一本鎖ＤＮＡのみの存在下で生成する蛍光シグナルの少なくとも２倍の蛍光シグナルを生成するインターカレートする蛍光色素を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１および第２のプライマーは、それぞれ以下の縮重配列からなる。
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
【００１７】
いくつかの実施形態では、アリコート中の核酸はさらに精製されない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、反応は、ｒｐｏＢ遺伝子にハイブリダイズするように設計された１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、検出ステップは、増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることによりマイコプラズマを同定するステップとをさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、増幅反応は検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインはＳｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、増幅反応は、増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、オスモライトは、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択される。
【００２３】
本発明はまた、細胞培養培地からのマイコプラズマＤＮＡを、存在する場合に増幅するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、本キットは、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）を含む第１の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）を含む第２の縮重プライマー
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１のプライマーは
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）からなり、
第２のプライマーはＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）からなる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本キットは、
ポリメラーゼ；
インターカレートする蛍光色素；
配列番号１または配列番号２によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド（すなわち、配列番号１および配列番号２からそれぞれなるプライマーにより増幅条件下でポリヌクレオチドの介在部分が増幅できるほど十分相補的な（場合によっては１００％相補的な）配列を、このポリヌクレオチドが含む）
の少なくとも１つまたは複数をさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本キットは、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子の少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含む核酸を含む陽性対照試料をさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本キットはオスモライトおよび／またはヘパリンをさらに含む。いくつかの実施形態では、オスモライトは、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインはＳｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインである。
【００２９】
定義
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリマーおよびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーまたはそれらのアナログに相当し得る、モノマーのポリマーを互換的に指す。これには、ＲＮＡおよびＤＮＡならびにそれらの改変形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））等の、ヌクレオチドのポリマーが含まれる。特定の用途では、核酸は、複数のモノマータイプ、例えばＲＮＡサブユニットおよびＤＮＡサブユニットの両方を含むポリマーとすることもできる。
【００３０】
核酸は典型的には一本鎖または二本鎖であり、一般にはリン酸ジエステル結合を含有するものであるが、ある場合には、本明細書中で概説するように、例えば、これらに限定されるものではないが、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；ならびにＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９）、ホスホロチオアート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７および米国特許第５，６４４，０４８号明細書）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホホロアミダイト（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６；およびＣａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７）を含む代替骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。これらの文献はそれぞれ参照によって組み込まれるものとする。他のアナログ核酸には、正に荷電した骨格（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号明細書、同第５，６３７，６８４号明細書、同第５，６０２，２４０号明細書、同第５，２１６，１４１号明細書、および同第４，４６９，８６３号明細書；Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、ならびに米国特許第５，２３５，０３３号明細書および同第５，０３４，５０６号明細書と、第６章および第７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編に記載のものを含む非リボース骨格が挙げられる。これらの文献はそれぞれ参照によって組み込まれるものとする。１つまたは複数の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｌ６９〜１７６頁、これは参照によって組み込まれる）。さらに、いくつかの核酸アナログが、例えばＲａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  １９９７年６月２日  ３５頁（これは参照によって組み込まれる）に記載されている。リボース−リン酸エステル骨格のこれらの改変は、標識部分などの追加部分の付加を容易にするために、または生理的環境下におけるこのような分子の安定性および半減期を修正するためになされ得る。
【００３１】
核酸中に典型的に見出される天然の複素環塩基（例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）に加えて、人工的な複素環塩基または他の修飾塩基を有するものも核酸アナログに含まれる。これらの多くが本明細書中に記載されているか、さもなければ参照されている。具体的には、多くの人工的な塩基が、例えば、Ｓｅｅｌａら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７４：１７９０、Ｇｒｅｉｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１〜９７６、およびＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８２：１６４０にさらに記載されている。これらは、それぞれ参照によって組み込まれるものとする。さらなる例として、融解温度（Ｔｍ）修飾因子として作用する、ヌクレオチド中で使われる特定の塩基が、場合によっては含まれる。例えば、これらの中には、７−デアザプリン（例えば７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えばプロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ等）などが含まれる。例えば、参照によって組み込まれる、１９９９年１１月２３日に公表のＳｅｅｌａによる、名称「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ７−ＤＥＡＺＡ−２’−ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」の米国特許第５，９９０，３０３号明細書を参照されたい。代表的な他の複素環塩基としては、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、およびキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、およびキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル等が挙げられる。本発明のプライマーは、例えば、１つまたは２つ以上の上記非天然ヌクレオチドを含むことができる。
【００３２】
「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することより決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２つの配列を最適にアライメントするために、付加または欠失を含まない参照配列と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでいてもよい。この割合は、核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中で同一である位置の数を決定してマッチした位置の数を得、比較ウィンドウ中の位置の総数でこのマッチした位置の数を除して、その結果を１００倍して配列同一性の割合を得ることによって計算する。
【００３３】
用語「同一」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列のコンテキストの中では、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列を指す。比較ウィンドウ、すなわち以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてもしくはマニュアルアライメントおよび目視検査によって測定されるような指定配列にわたって、または指定のない場合は全配列にわたって一致が最大になるように比較およびアライメントされる場合に、２つの配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定された割合（すなわち、指定された領域にわたって、または指定のない場合には全配列にわたって、６０％の同一性、場合によっては、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性）を有するとき、配列は「実質的に同一」である。
【００３４】
配列比較については、典型的には、１つの配列を参照配列として置き、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、または代わりのパラメーターを指定してもよい。他に指示がなければ、デフォルトパラメーターと想定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が計算される。
【００３５】
本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１つのセグメントについての言及を含む。このセグメントにおいて、ある配列と、連続した位置が同数の参照配列とを最適にアライメントした後に、この２つの配列を比較することができる。比較のための配列アライメントの方法は当技術分野でよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルアライメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照されたい）により行なうことができる。
【００３６】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした場合、マッチするかまたはある正の閾値スコアＴを満足するかのいずれかである、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含んでいる。Ｔは隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして役立つ。このワードヒットは、累積アライメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（一対のマッチ残基のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリング行列が用いられる。累積アラインメントスコアが、その到達した最大値から量Ｘだけ減少した場合；１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントが蓄積したために累積スコアが０もしくはそれ未満になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合に、それぞれの方向でのワードヒットの延長は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列の場合）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）５０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００３７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供するものである。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は参照配列と類似であると考えられる。
【００３８】
「耐熱性」ポリメラーゼは、当技術分野で一般に使用されるように使用され、例えば複数サイクルのＰＣＲ反応で使用するのに有効となるように、高温（例えば９０℃）で活性を実質的に保持するポリメラーゼを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、モリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）由来のｒｐｏＢ遺伝子を検出するための汎用プライマーの設計を示す図である。プライマー結合領域およびプライマー配列の概観。次の混合塩基の対を使用した。Ｋ：Ｇ、Ｔ：Ｗ：Ａ、Ｔ：Ｒ：Ａ、Ｇ：Ｙ：Ｃ、Ｔ。表示した配列は次のとおりである。順方向プライマー；Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）（Ｐ）（配列番号７）、Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（Ｌ）（配列番号９）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）（Ａ）（配列番号１１）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）（Ｏ）（配列番号１３）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）（Ｓ）（配列番号１５）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）（Ｈ）（配列番号１７）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（Ｆ）（配列番号１９）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）（Ｈｙ）（配列番号２１）、および順方向コンセンサス（配列番号２３）。逆方向プライマー；Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）（Ｐ）（配列番号８）、Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（Ｌ）（配列番号１０）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）（Ａ）（配列番号１２）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）（Ｏ）（配列番号１４）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）（Ｓ）（配列番号１６）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）（Ｈ）（配列番号１８）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（Ｆ）（配列番号２０）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）（Ｈｙ）（配列番号２２）、および逆方向コンセンサス（配列番号２４）。
【図２Ａ】図２は、ｒｐｏＢ  ＰＣＲの特異性を示す図である。図２Ａは、指定のマイコプラズマ種由来のゲノムＤＮＡ２０ｐｇをｒｐｏＢプライマーを用いて増幅した。増幅プロットおよび融解曲線分析を図に示す。
【図２Ｂ】図２は、ｒｐｏＢ  ＰＣＲの特異性を示す図である。図２Ｂは、ＡからのＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで分析した。
【図２Ｃ】図２は、ｒｐｏＢ  ＰＣＲの特異性を示す図である。図２Ｃは、ラット、ヒト、マウス、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のゲノムＤＮＡ１ｎｇを、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のゲノムＤＮＡ１ｐｇと一緒に、Ａ）に記載のようにＰＣＲにより分析した。
【図３Ａ】図３は、ｒｐｏＢ  ＰＣＲの感度を示す図である。Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（Ａ）およびＭ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（Ｂ）由来のゲノムＤＮＡの系列希釈１００ｐｇ〜１ｆｇを、図１Ｂに示すｒｐｏＢプライマーおよびＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いるリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。反応（三つ組）の増幅プロット、融解曲線、および標準曲線を示す。
【図３Ｂ】図３は、ｒｐｏＢ  ＰＣＲの感度を示す図である。Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（Ａ）およびＭ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（Ｂ）由来のゲノムＤＮＡの系列希釈１００ｐｇ〜１ｆｇを、図１Ｂに示すｒｐｏＢプライマーおよびＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いるリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。反応（三つ組）の増幅プロット、融解曲線、および標準曲線を示す。
【図４】図４は、リアルタイムＰＣＲアッセイによる粗試料中のマイコプラズマの検出を示す図である。表２に示すように、反応をセットアップした。様々な汚染および非感染細胞株由来の馴化培地を、新鮮培地および水に加え、１０％の最終濃度にした。ＰＣＲ反応（三つ組）の増幅プロットおよび融解ピーク分析を示す。
【００４０】
表１：本発明人らのリアルタイムＰＣＲアッセイによるｒｐｏＢ  ＰＣＲ増幅に対する通常の培地調製物の効果。示すような様々な組織培養培地（１０％の最終濃度）の存在下または非存在下（水）において、精製されたゲノムマイコプラズマＤＮＡおよびＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘと共に、図１Ｂに示すプライマーを用いてＰＣＲ反応をセットアップした。反応は三つ組で実施し、平均Ｃｔおよび標準偏差を示す。
【００４１】
表２：本発明人らのリアルタイムＰＣＲアッセイによるｒｐｏＢ遺伝子の増幅に対する加齢培養物由来の馴化培地の効果。表１に示すように、反応をセットアップした。示すように、４日を超える期間コンフルエントになるまで成長させた様々な細胞株に由来する馴化培地（ｃｏｎｄ）を１０％の最終濃度まで加えた。三つ組から得られた平均Ｃｔおよび標準偏差を示す。
【００４２】
表３：粗試料中のマイコプラズマの検出。図２に記載の反応（三つ組）の平均Ｃｔならびに標準偏差および主要融解ピークを示す。融解ピークが７７℃と７９℃との間になった場合に試料は陽性であると判定した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
Ｉ．緒言
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、最小限の阻害または阻害なしで、未精製の培養培地試料中にいる数多くの様々なマイコプラズマ種を検出することができるという驚くべき発見に一部分は基づいている。本発明は、細胞培養培地で通常見出されるポリメラーゼ阻害物質に抵抗性があるポリメラーゼ酵素と組み合わせると特に有用である。さらに、本発明者らは、１つのプライマー対による、数多くのマイコプラズマ種の増幅および検出を可能にする特定のプライマーセットを同定した。このプライマーを、阻害物質抵抗性のポリメラーゼと組み合わせると、細胞培養培地中のマイコプラズマの迅速で効率的な検出を可能にする、強力な組合せが誕生する。
【００４４】
ＩＩ．本発明のプライマー
マイコプラズマ起源の任意の標的核酸を、増幅をベースとした本発明のアプローチの標的として使用することができる。マイコプラズマ核酸は他の生物と共通ではないものが好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、特定の標的核酸は、哺乳類細胞（例えばヒト、ラット、マウス等）には存在しないか、または少なくとも、マイコプラズマの有無のためのアッセイの解釈を変えるのに十分なほど本方法の間に増幅することはない。本発明のプライマーはまた、非マイコプラズマ細菌の核酸を有意には増幅しないことが一般には望ましいが、これは常に可能または必要であるとは限らない。いくつかの実施形態では、常在細菌種に由来する核酸も本発明のプライマーにより増幅可能な場合、いくつかの実施形態では、その核酸は、そのアンプリコンの融解温度または（これらに限定されないが、アンプリコンの長さの測定またはヌクレオチドシークエンシングを行うことを含む）他の検出できる特徴によってマイコプラズマのアンプリコンと識別することができる。
【００４５】
マイコプラズマ種における、検出のための典型的な核酸標的としては、これらに限定されないがｔｕｆ遺伝子（例えば、Ｓｔｏｒｍｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９９：２９１〜３００（２００９）を参照されたい）、Ｐ１遺伝子（例えば、米国特許第６，２７７，５８２号明細書を参照されたい）、これらに限定されないが１６Ｓ遺伝子および／またはスペーサー領域を含む、リボソームＲＮａ（ｒＲＮＡ）の構造遺伝子およびスペーサー領域が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプライマー対を、ｒｐｏＢ遺伝子の少なくとも一部（例えば少なくとも２０、５０、１００塩基対など）を増幅するために使用する。典型的なプライマーセットの一つは、例えば、参照によって組み込まれる、Ｋｏｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２２３〜２３２（２００７）に記載されている。
【００４６】
本発明者らは、すべての細胞培養マイコプラズマ汚染の９５％を説明するマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）の迅速な検出が１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーのみにより可能になることで、特定のプライマーセットがこれまでのマイコプラズマ検出システムよりも著しく改善されていることを発見した。本発明のプライマーはｒｐｏＢ遺伝子を標的とする。本プライマーは、哺乳類の核酸またはほとんどの他の細菌の核酸を増幅せず、シグナルの簡単な検出、すなわち増幅産物の生成の検出によりマイコプラズマが存在することを暫定的に結論づけることを可能にする。シグナルは、例えば増幅産物の融解温度の検出により検出することができる。融解温度は、例えば増幅産物の生成とプライマー二量体または他のアーティファクトの生成とを識別のために有用である。
【００４７】
プライマーの標的領域を、矢印で示すプライマーハイブリダイゼーション領域およびプライマーの方向性と共に、図１に示す。実施例で使用する縮重プライマーは以下のとおりである。
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す。「縮重」プライマーとは、類似であるが同一ではないプライマーの混合物を指す。したがって、上記のプライマーについては、配列番号１を含む順方向プライマーは、関連するプライマーの混合物を含み、Ｗ、Ｙ、Ｒ、およびＭは、関連するプライマーで異なる１つまたは複数の位置を表わす。本発明のいくつかの実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれ配列番号１および配列番号２からなるか、または基本的にそれらからなる。例えば多くの最新のオリゴヌクレオチド合成機を使用して、縮重プライマー混合物を生成することができる。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子、または場合によっては任意のｒｐｏＢ遺伝子にハイブリダイズするように設計された唯一のプライマーは配列番号１および配列番号２を含むか、またはそれらからなるプライマーである。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、増幅反応における唯一の順方向プライマーは配列番号１を含むか、またはそれからなり、増幅反応における唯一の逆方向プライマーは配列番号２を含むか、またはそれからなる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明のプライマーは配列番号１および配列番号２（それぞれ順方向および逆方向プライマー）を含み、１つまたは複数の追加のヌクレオチドおよび／または他の成分（例えば、標識、タグ、ビオチン等）を含むことになる。１つまたは複数のヌクレオチドは、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子（プライマーの残りの部分とアライメントされる）に相補的なヌクレオチド、および／または例えばプライマーの５’末端に標的に相補的ではない追加のヌクレオチド（例えば、制限酵素認識配列を含有する）を含むことができる。
【００５０】
上述したように、いくつかの実施形態では、増幅産物はヌクレオチド配列が決定される。これは、マイコプラズマの正確な種を知ることおよび／または汚染が細菌ＤＮＡの増幅によるものではないと確認することが所望される場合に有用となり得る。ｒｐｏＢ遺伝子を増幅する実施形態では、マイコプラズマｒｐｏＢ  ＤＮＡを増幅する場合に、シークエンシングプライマー：ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＧ（配列番号５）および／またはＣＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＴ（配列番号６）のいずれかまたは両方を使用することにより種の識別が可能になることが見出された。それぞれのプライマーによる少なくとも約５０のヌクレオチドのシークエンシングランにより種を識別することが可能であるが、一般的には、シークエンシングランが完了できれば（例えば３００〜５００ヌクレオチド）容易になる。例えば、シークエンシングプライマーとして配列番号５を用いてヌクレオチドシークエンシングを行うと、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、およびＭ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）が同定できるようになる。シークエンシングプライマーとして配列番号６を用いてヌクレオチドシークエンシングを行うと、Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、およびＭ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）が同定できるようになる。
【００５１】
ＩＩＩ．ポリメラーゼ連鎖反応
本発明はいかなる種類の核酸増幅方法を使用しても実施することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法はポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される。基本レベルでは、ＰＣＲを含む本発明の方法は、細胞培養物に存在する標的マイコプラズマ核酸の少なくとも一部を増幅するステップと、次いで得られるアンプリコンの有無を検出するステップとを含む。場合によっては、ＰＣＲに続いて、得られるアンプリコンを検出および／または分析する（例えば、長さ、ゲル中で移動する能力などの物理的特徴を測定する、融解温度を測定する、ヌクレオチド配列を決定する等）ことができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、アンプリコンの蓄積が「リアルタイム」で（すなわち、連続的に、例えば、増幅の完了後のみではなく、１サイクル当たり１回）モニターされる定量的ＰＣＲである。定量的増幅方法（例えば定量的ＰＣＲまたは定量的線形増幅）は、核酸鋳型の増幅を含み、直接または間接的に（例えば、Ｃｔ値を測定する）増幅ＤＮＡ量を測定するステップと、次いで増幅のサイクル数に基づいて開始鋳型量を計算するステップとを含む。反応を用いるＤＮＡ座の増幅はよく知られている（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８３，２０２号明細書；ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照されたい）。典型的には、ＰＣＲはＤＮＡ鋳型を増幅するために使用される。しかしながら、増幅の別法が記載されており、その別法も、切断されたＤＮＡよりもインタクトＤＮＡを大規模に増幅するかぎり、使用することができる。定量的増幅の方法は、米国特許第６，１８０，３４９号明細書；同第６，０３３，８５４号明細書；および同第５，９７２，６０２号明細書、ならびに、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５〜１００１（１９９６）；ＤｅＧｒａｖｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４（１）：１０６〜１０、１１２〜５（２００３）；Ｄｅｉｍａｎ  Ｂら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２）：１６３〜７９（２００２）に記載されている。
【００５４】
いくつかの実施形態では、定量的増幅は、増幅（例えばＰＣＲ）反応のサイクル中の鋳型のコピーを表わすシグナル（例えばプローブの蛍光）のモニタリングに基づいている。ＰＣＲの初期サイクルでは、形成されたアンプリコン量ではアッセイから測定可能なシグナル出力が得られないので、極めて低いシグナルしか観察されない。初期サイクルの後、形成されたアンプリコン量が増加するにつれて、シグナル強度が測定可能なレベルまで増大し、ＰＣＲが非対数期へ入る後期サイクルでプラトーに達する。シグナル強度対サイクル数のプロットにより、測定可能なシグナルがＰＣＲ反応から得られる特定のサイクルを推定でき、それをＰＣＲのスタート前の標的量を逆算するために用いることができる。この方法により決定される特定のサイクル数は、一般にサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる。典型的な方法は、例えば、加水分解プローブに関しては、Ｈｅｉｄら  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：９８６〜９４（１９９６）に記載されている。
【００５５】
増幅産物の検出のための方法の１つは、５’−３’エキソヌクレアーゼ「加水分解」ＰＣＲアッセイ（ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイとも呼ばれる）である（米国特許第５，２１０，０１５号明細書および同第５，４８７，９７２号明細書；Ｈｏｌｌａｎｄら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：７２７６〜７２８０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１〜３７６６（１９９３））。このアッセイは、増幅反応の間に２重標識蛍光発生プローブ（「ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）がハイブリダイゼーションし、かつ切断されることにより、特定のＰＣＲ産物の蓄積を検出するものである。蛍光発生プローブは、蛍光リポーター色素およびクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲの間に、増幅されているセグメントにこのプローブがハイブリダイズする場合、かつその場合にのみ、このプローブはＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断される。プローブが切断されると、リポーター色素の蛍光強度の増大が生じる。
【００５６】
エネルギー転移の利用に基づく増幅産物を検出する別の方法は、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３〜３０９（１９９６）に記載されている「ビーコンプローブ」の方法である。この方法は、米国特許第５，１１９，８０１号明細書および同第５，３１２，７２８号明細書の対象でもある。この方法では、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用する。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端（５’末端または３’末端のいずれか）にドナーフルオロフォアがあり、他方の末端にアクセプター部分がある。ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒの方法の場合には、このアクセプター部分はクエンチャーである。すなわち、アクセプターは、ドナーにより放出されたエネルギーを吸収するが、その後、それ自体は蛍光を発しない。したがって、ビーコンが開いたコンフォメーションにある場合には、ドナーフルオロフォアの蛍光は検出可能であるが、ビーコンがヘアピン（閉じた）コンフォメーションにある場合には、ドナーフルオロフォアの蛍光はクエンチされる。ＰＣＲで使用された場合、ハイブリダイズしていない分子ビーコンプローブは、蛍光を発しないが、ＰＣＲ産物の鎖の一方にハイブリダイズしていると、このプローブは開いたコンフォメーションにあり、蛍光が検出される（ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３〜３０６（１９９６））。その結果、蛍光量はＰＣＲ産物量が増大するにつれて増大するため、ＰＣＲの進行の尺度として使用することができる。定量的増幅の他の方法もまた利用可能であることは、当業者であれば認識されよう。
【００５７】
核酸の定量的増幅を行う様々な他の方法も知られている。例えば、いくつかの方法では、オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズしたときに蛍光変化が生じるように組み立てられた１つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドが使用される。例えば、このような方法の１つは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する二重フルオロフォアアプローチ、例えば２つのオリゴプローブがアンプリコンにアニールするＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ハイブリダイゼーションプローブである。このオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが効率的なエネルギー転移に適した距離に分離した状態で、ヘッドトゥーテールの配向にてハイブリダイズするように設計されている。核酸に結合しているときまたは伸長産物に組み込まれているとき、シグナルを発するように組み立てられた標識オリゴヌクレオチドの他の例としては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プローブ（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４〜８０７、１９９９、および米国特許第６，３２６，１４５号明細書）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）（またはＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標））プローブ（例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６〜２５２１、１９９７、および米国特許第６，１１７，６３５号明細書）、ならびにクエンチャーがなくともシグナルの減少を引き起こす二次構造を形成し、標的にハイブリダイズしたときに増強されたシグナルを発するプローブ（例えば、Ｌｕｘプローブ（商標））が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は標識されたプローブオリゴヌクレオチドを含んでいない。例えば、リアルタイムまたはエンドポイントでのアンプリコンの蓄積をモニターするためのＴａｑｍａｎまたは他の標識されたオリゴヌクレオチドプローブが反応混合物にはない。これらの実施形態の一部では、インターカレートする蛍光色素が含まれている。いくつかの実施形態では、インターカレートする色素は、シグナル鎖核酸よりも二本鎖核酸に結合しているときにシグナルを変化させる（増大または減少させる）。典型的な試剤としては、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤ（商標）、およびＥＶＡＧＲＥＥＮ（商標）が挙げられる。これらの試剤は鋳型に特異的ではないので、シグナルは鋳型特異的な増幅に基づいて生成されると仮定される。このことは、鋳型配列の融解点が一般には、例えばプライマー二量体よりも著しく高いので、温度の関数としてシグナルをモニターすることにより確認することができる。
【００５９】
ＰＣＲ反応のいくつかの成分はよく知られており、当業者により容易に決定することができる。特定の態様では、ｑＰＣＲなどの増幅反応における効率を改善するために、添加物として追加の化合物を含むことが望ましい場合がある。例えば、特定の結合色素（一非限定例では、ＥｖａＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ結合色素）を含む調製物の中、または特定の増幅阻害物質の存在下で使用される場合に、エキソヌクレアーゼ活性を欠く本発明のポリメラーゼが特定の標的に対して低い効率を示す状況が起こり得る。そのような低い効率は、いくつかの実施形態では、低いＤＮＡ投入濃度と関係したＣｔ値の遅延の結果である場合がある。特定の反応の効率を測定する方法は当技術分野で知られている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、効率を改善するために本発明の増幅反応にオスモライトが含まれることがある。例えば、参照により組込まれる国際公開第２０１０／０８０９１０号パンフレットを参照されたい。オスモライトファミリーのメンバーがタンパク質の熱安定性を改善すること（Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２）、およびＤＮＡ二重らせんの安定性を減少させること（Ｃｈａｄａｌａｖａｄａ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７）が示されてきた。本発明で使用するオスモライトには、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。サルコシンは、従来のＰＣＲ（Ｈｅｎｋｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７）を改善することが示されている化学物質であるベタインに化学的に類似している。
【００６１】
オスモライトの従来の使用では、このような化合物の安定効果は比較的高い濃度（＞１Ｍ）で一般に観察される。しかしながら、本発明の方法では、ミリモル濃度のオスモライトが、ｑＰＣＲなどの増幅反応の反応効率を改善するために効果的であることが見出された。例えば、参照によって組み込まれる国際公開第２０１０／０８０９１０号パンフレットを参照されたい。作用機序に関係付けられるものではなく、効率のこの改善は低いＤＮＡ鋳型濃度を含有する反応に対するＣｔ値の改善の結果である可能性がある。いくつかの実施形態では、約１００〜約１０００ｍＭ濃度のオスモライトが本発明の方法およびキットの中で使用される。またさらなる実施形態では、約５０〜約７００、約１００〜約６００、約１５０〜約５００、約２００〜約４００ｍＭ濃度、または約３００〜約３５０ｍＭ濃度のオスモライトが本発明の方法およびキットの中で使用される。いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキットの中で使用されるオスモライトはサルコシンである。実際に、サルコシンの添加により、水を含む対照と比較して、増幅反応の効率が改善されたことが判明している。
【００６２】
いくつかの実施形態では、特に低コピーの標的核酸の増幅においてまたは増幅阻害物質の存在下において、プライムされていない二本鎖核酸標的にポリメラーゼが結合することにより効率が低下する。二本鎖の標的にポリメラーゼが結合すると、それらの標的の変性、プライマーとのハイブリダイゼーション、および増幅反応が妨げられることになる。プライムされた鋳型に対するポリメラーゼの特異性を向上させるために、いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキットはヘパリンを利用する。例えば、参照によって組み込まれる国際公開第２０１０／０８０９１０号明細書を参照されたい。負に荷電するヘパリン分子は、反応混合物中に含まれると、二本鎖核酸の静電的性質を模倣することができる。ヘパリンの添加は、作用機序に制限されることなく、一本鎖のプライムされた鋳型が利用できるようになるまで、過剰ポリメラーゼが二本鎖の鋳型に結合することを妨げることができる。いくつかの典型的な実施形態では、ヘパリンは、本発明の方法およびキットの中で約５０〜約７５０ｐｇ／μｌの濃度で使用される。さらに典型的な実施形態では、ヘパリンは、本発明の方法およびキットの中で約７５〜約７００、約１００〜約６００、約１２５〜約５００、約１５０〜約４００、約１７５〜約３００、または約２００〜約２５０ｐｇ／μｌの濃度で使用される。
【００６３】
ＩＶ．ポリメラ−ゼ
本発明に有用なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することができる任意のポリメラーゼとすることができる。典型的なＤＮＡポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼであり、それらはＰＣＲに特に有用である。耐熱性ポリメラーゼは、サーマス・アクティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）、およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の他の種、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）、パイロコッカス・ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）、およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の他の種、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）、ピロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（Ｐｏｃ）、ピロディクティウム・アビシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ａｂｙｓｓｉ）（Ｐａｂ）、およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）、ならびにそれらの突然変異体、変異体、または誘導体など多種多様な好熱性細菌から単離されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドポリメラーゼである。このようなハイブリッドポリメラーゼは向上した処理能力を示すことが知られている。例えば、米国特許出願公開第２００６／００５１７４号明細書；同第２００４／０２１９５５８号明細書；同第２００４／０２１４１９４号明細書；同第２００４／０１９１８２５号明細書；同第２００４／００８１９６３号明細書；同第２００４／０００２０７６号明細書；同第２００３／０１６２１７３号明細書；同第２００３／０１４８３３０号明細書；同第２００３／０１３８８３０号明細書、ならびに米国特許第６，６２７，４２４号明細書および同第７，４４５，８９８号明細書を参照されたい。これらの文献はそれぞれ、すべての目的のために、特にポリメラーゼ、ハイブリッド／キメラポリメラーゼに関係するすべての教示のために、またこのようなポリメラーゼを作製および使用するすべての方法のために、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００６５】
一態様では、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くハイブリッドポリメラーゼを提供する。一実施形態では、このようなハイブリッドポリメラーゼは、このエキソヌクレアーゼ欠失を与える二重点変異をポリメラーゼドメイン中に含む。特定の実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼは、二重点変異Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａをポリメラーゼドメイン中に含む。
【００６６】
さらなる実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼは配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる。またさらなる実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼは、配列番号３に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼは配列番号４のアミノ酸配列を有する。またさらなる実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼは、配列番号４に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明のハイブリッドポリメラーゼの結合ドメインは、耐熱性生物由来であり、高温、例えば４５℃を超える温度で活性の上昇を示す。例えば、Ｓｓｏ７ｄおよびＳａｃ７ｄは、それぞれ超好熱性の古細菌（ａｒｃｈａｅａｂａｃｔｅｒｉａ）スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）およびＳ．アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）に由来する小さい（約７ｋｄ  ＭＷ）、塩基性の染色体タンパク質である（例えば、Ｃｈｏｌｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ９５０：１９３〜２０３、１９８８；Ｂａｕｍａｎｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１：８０８〜８１９、１９９４；およびＧａｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．５：７８２〜７８６、１９９８を参照されたい）。これらのタンパク質は配列非依存的にＤＮＡに結合し、結合した場合、いくつかの条件下で最大４０℃、ＤＮＡのＴｍを上昇させる（ＭｃＡｆｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１００６３〜１００７７、１９９５）。これらのタンパク質およびそれらのホモログは、改良されたポリメラーゼ融合タンパク質の中で配列非特異的なＤＮＡ結合ドメインとして使用されることが多い。Ｓｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、および関連配列（本明細書では「Ｓｓｏ７配列」または「Ｓｓｏ７ドメイン」と呼称する）は、当技術分野で知られている（例えば、受託番号（Ｐ３９４７６（Ｓｓｏ７ｄ）（配列番号２５）；Ｐ１３１２３（Ｓａｃ７ｄ）（配列番号２６）；およびＰ１３１２５（Ｓａｃ７ｅ）（配列番号２７）。これらの配列は、典型的には、少なくとも７５％以上、８０％、８５％、９０％、または９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、Ｓｓｏ７タンパク質は、典型的には、Ｓｓｏ７ｄ配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明で使用するハイブリッドポリメラーゼは、例えば、米国特許出願公開第２００６／００５１７４号明細書；同第２００４／０２１９５５８号明細書；同第２００４／０２１４１９４号明細書；同第２００４／０１９１８２５号明細書；同第２００４／００８１９６３号明細書；同第２００４／０００２０７６号明細書；同第２００３／０１６２１７３号明細書；同第２００３／０１４８３３０号明細書；同第２００３／０１３８８３０号明細書、ならびに米国特許第６，６２７，４２４号明細書および同第７，４４５，８９８号明細書に記載されている。これらの文献はそれぞれ、すべての目的のために、特にポリメラーゼ、ハイブリッド／キメラポリメラーゼに関係するすべての教示のために、またこのようなポリメラーゼを作製および使用するすべての方法のために、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。ハイブリッドポリメラーゼタンパク質の例およびハイブリッドタンパク質を生成する方法もまた、国際公開第２００４０１１６０５号パンフレットの中に開示されている。この文献は、すべての目的のために、特にハイブリッドタンパク質の生成と関係するすべての教示のために、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００７０】
Ｖ．試料調製
上述の説明および実施例にあるように、本発明の一態様では、標的マイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅させる前に、細胞培養物から核酸を精製する必要も、細胞培養物中に存在する阻害物質を除去する必要もない。したがって、本発明は、場合によっては哺乳類または他の非原核細胞を含有する細胞培養培地のアリコートを増幅反応に加え、マイコプラズマ核酸の存在に向けて増幅する態様を提供する。簡潔にいえば、特に、本明細書に記載のｒｐｏＢプライマーを使用する場合、かつ／あるいは安定化添加物（例えばオスモライトおよび／もしくはヘパリン）および／または異種のＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドポリメラーゼを使用する場合、細胞培養培地のアリコートを増幅に直接使用することができるという点で試料調製の必要性はない。
【００７１】
動物細胞のための典型的な非限定培養培地としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、またはＩＭＤＭが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、細胞培地はウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）またはｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））を含むことになる。細胞培養物中に見出されるいくつかの成分がいくつかのポリメラーゼに対して阻害的になる可能性がある。阻害因子として、例えば、ヘモグロビン、ラクトフェリン、および免疫グロブリン、ならびに例えば細胞片、細胞老廃物（例えば多糖またはタンパク質）を挙げることができる。
【００７２】
ＶＩ．キット
本発明はまた、例えば、細胞培養中の可能なマイコプラズマ汚染を検出するためのキットを提供する。キットは、場合によっては、書面の説明書または電子説明書（例えばＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ上）を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、キットの中に試薬を保持するためのケースまたは容器を含むことになる。これらは別々にまたは一緒に含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）を含む（またはこれからなる）第１のプライマー（すなわちプライマーの縮重混合物）、ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表わす；
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）を含む（またはこれからなる）第２のプライマー（すなわちプライマーの縮重混合物）、ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表わす；
ポリメラーゼ（本明細書に記載のハイブリッドポリメラーゼを含むが、これらに限定されない）；
インターカレートする蛍光色素；
配列番号１または配列番号２によりプライムされ、ポリメラーゼにより増幅することができるポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド；ならびに／または
オスモライトおよび／もしくはヘパリン
の１つまたは複数を含むことになる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本キットは、酵素活性用に好適な緩衝液（例えば、好適なようにＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋、および／またはＭｎ＋＋を含むかまたは除外する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットはヌクレオチド（デオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチドまたはそれらのアナログを含むが、これらに限定されない）をさらに含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本キットは陰性対照をさらに含む。いくつかの実施形態では、陰性対照はマイコプラズマＤＮＡを含まない、水または組織培養培地である。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、クレームされた発明を限定するものではない。
【００７７】
ＰＣＲの主要な欠点の１つは、臨床試料および組織培養試料の中に存在するＰＣＲ阻害物質に影響を受けやすく、そのため偽陰性結果が得られることである（Ｒｏｓｓｅｎ，Ｌ．ら（１９９２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１７、３７〜４５；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ｇ．（１９９７）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３、３７４１〜３７５１；Ｒａｚｉｎ，Ｓ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ、８、４９７〜５１１）。血液に由来するいくつかの阻害成分が、ヘモグロビン（Ａｌ−Ｓｏｕｄ，Ｗ．Ａ．およびＲａｄｓｔｒｏｍ，Ｐ．（２００１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３９、４８５〜４９３）、ラクトフェリン（Ａｌ−Ｓｏｕｄ，Ｗ．Ａ．およびＲａｄｓｔｒｏｍ，Ｐ．（２００１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３９、４８５〜４９３）、ならびに免疫グロブリン（Ａｌ−Ｓｏｕｄ，Ｗ．Ａ．ら（２０００）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３８、３４５〜３５０）を含めて同定されてきたが、これらはすべて、ほとんどのＦＢＳ調製物の中に存在する。さらに、細胞片、様々なタンパク質、および多糖も、ＰＣＲ反応を阻害することが記載された（Ｈａｒａｓａｗａ，Ｒ．ら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４９、８５９〜８６３；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ｇ．（１９９７）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３、３７４１〜３７５１）。したがって、ＰＣＲプロトコルは、ＰＣＲの前にマイコプラズマ由来のゲノムＤＮＡを精製する試料調製ステップを一般に含んでいる。試料調製ステップは時間がかかるだけでなく、試料の損失および間違いの原因にもなる。
【００７８】
ＰＣＲ阻害物質に対して高い耐性を有する酵素を生成するために、配列選択性を示さないＳｓｏ７ｄのｄｓＤＮＡ−結合タンパク質６３アミノ酸を含有する新しいポリメラーゼが設計されている（Ｗａｎｇ，Ｙ．、米国特許出願公開第２００４／００８１９６３号明細書；Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、米国特許出願公開第２００４／０００２０７６号明細書；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｏｒｎ，Ｐ．Ｂ．ら、米国特許出願公開第２００４／０２１９５５８号明細書）。Ｓｓｏ７ｄは、ポリメラーゼに対して、複製されたＤＮＡの副溝上にスライディンググリップを与えて、触媒活性または酵素安定性を損なわずに、処理能力を劇的に高める。この酵素は、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素を含有する特定の緩衝液調製物と組み合わせると、ＰＣＲ阻害物質に対する高い耐性だけでなく、短い反応時間および長いＰＣＲ産物を合成する能力を実現する強力な研究ツールになる。
【００７９】
ここで、本発明人らは、ＤＮＡ標的として単一コピー遺伝子を用いて、組織培養試料中のマイコプラズマ汚染を検出する新しいリアルタイムＰＣＲアッセイを記載する。本発明人らは、ｒｐｏＢ遺伝子中の保存配列を標的にするプライマーを設計してきており、これらのプライマーにより８種の一般的なマイコプラズマ種を特異的に検出することが可能である。本発明人らのデータにより、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘに基づいたｒｐｏＢ  ＰＣＲは、ＰＣＲ阻害物質による妨害を最小限にまたは無くして、組織培養上清中のマイコプラズマを検出することを可能にすることが実証される。このアッセイは、様々な一般的な培地調製物および最終濃度１０％のＦＢＳに抵抗性である。細胞由来の馴化培地による阻害は見出されなかった。本発明人らのアッセイの感度は１遺伝子コピーと６遺伝子コピーとの間である。このアッセイはマイコプラズマに特異的であり、他の一般的な組織培養汚染を試験する場合に、交差反応性は観察されなかった。最後に、本発明人らは、粗組織培養試料中のマイコプラズマを信頼性高く検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを、Ｌｏｎｚａ社製のマイコアラート（ｍｙｃｏａｌｅｒｔ）キットを標準として用いて、検証した。
【００８０】
材料および方法
以下の種に由来するゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから購入した。Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）（２３２０６Ｄ）；Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）（２３７１４Ｄ）；Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）（２３８３８Ｄ）；Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（１９９８９Ｄ）；Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、株ＰＧ２１（２３１１４Ｄ））；Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）（２５９６０Ｄ）；Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）（１７９８１Ｄ）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（１０２３１Ｄ−５）；ラクトバチルス・カゼイ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（３３４Ｄ）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（２３８５７Ｄ）。Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）（ＮＣＴＣ０１０１１３）のゲノムＤＮＡはＭｉｎｅｒｖａ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。Ｉｓｃｏｖｅｓ培地はＡＴＣＣ、ＦＢＳはＨｙｃｌｏｎｅ、ＥＧＭ２はＬｏｎｚａ、およびＥｓｇｒｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅはＣｈｅｍｉｃｏｎ、Ｌ１５はＳｉｇｍａから購入した。ＲＰＭＩ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｆ１２Ｋ、ＫＳＦＭ、ＯＰＴＩＭＥＭ、ＭＥＭ、およびＭＥＭ  ＡＬＰＨＡは、Ｇｉｂｃｏから入手した。すべての培地（ＫＳＦ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ＥＳＧＲＯ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ＯＰＴＩＭＥＭ以外）に１０％のＦＢＳを添加した。汚染および非感染の培養細胞株を、様々な共同研究者から入手した。プライマーはＩＤＴから入手した。プライマーの配列は次のとおりである。順方向プライマー５’−ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’；逆方向プライマー５’−ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ−３’。リアルタイムＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム上で容量２０μｌ中にて、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、指定の鋳型、および最終濃度０．５マイクロモルのプライマーを用いて、以下の条件下で実施した。最初の変性：９４℃、３分、および９４℃、１０秒、５８℃、３０秒、７２℃、３０秒の４０サイクル。データはＣＦＸデータマネージャーソフトウェアを用いて分析した。
【００８１】
マイコアラートマイコプラズマ検出キットはＬｏｎｚａから入手し、製造業者の推奨に従って使用した。ルミネセンスの記録はＢｉｏ−Ｒａｄ社製のＬｕｍｉｍａｒｋ上で行った。
【００８２】
結果
リアルタイムＰＣＲのための汎用ｒｐｏＢプライマーの設計
ｒｐｏＢ遺伝子は、従来のＰＣＲにより細胞培養物中のマイコプラズマ汚染を検出するためにこれまで述べられてきた（Ｋｏｎｇ、Ｈ．ら（２００７）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７７、２２３〜２３２）。リアルタイムＰＣＲに適したプライマーを設計するために、マイコプラズマ８種（Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）；Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）；Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）；Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）；Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）；Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）；Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ））の配列を、Ａｃｃｅｌｒｙｓにより開発されたソフトウェアを用いてアライメントした。細胞培養汚染に見出される最も一般的な８種を検出するために、４００〜６００ｂｐにわたる２つの保存領域をプライマー結合部位として選択し、保存性が低い様々な位置に混合塩基を用いた（図１）。
【００８３】
プライマーが８種すべてを検出できることを確認するために、一般的なマイコプラズマ８種を用いてＰＣＲ反応を行った。ゲノムＤＮＡ  ２０ｐｇ、ｒｐｏＢプライマー、およびＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いてリアルタイム−ＰＣＲをセットアップした。ＰＣＲ反応の後、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分析した。図２Ａに示すように、ｒｐｏＢプライマーにより、試験したマイコプラズマ種すべての検出がサイクル２２と２７との間で可能になった。融解ピーク温度は７７．５と８０．５℃との間であった。配列アラインメントから予測されるように、ＰＣＲ産物の大きさは、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）については６００ｂｐ、他のすべての種については４００ｂｐであった（図２Ｂ）。要約すると、これらのデータから、ｒｐｏＢプライマーは最も一般的なマイコプラズマの特異的検出に適していることが示された。
【００８４】
本発明人らは、他の様々な種に対するプライマーの交差反応性を試験した。組織培養細胞は培地へＤＮＡを放出する可能性があるので、組織培養細胞の一般的な供給源であるヒト、マウス、およびラットのゲノムＤＮＡを試験した。本発明人らはまた、系統発生的に関連する細菌（ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））および一般的な非マイコプラズマの組織培養汚染物質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））を試験した。様々な種に由来するゲノムＤＮＡ  １ｎｇを、ＥｖａＧｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘと共にｒｐｏＢプライマーを用いるＰＣＲに供した。図２Ｃに示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のゲノムＤＮＡのみがＰＣＲ増幅を引き起こした。ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）のゲノムＤＮＡに対する検出限界は約１０ｐｇであった（データを示さず）。これは約３×１０６細菌／ｍｌに相当し、他の手段、例えば顕微鏡観察によっても、古典的細菌汚染として明らかになるものである。したがって、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）汚染がマイコプラズマ汚染として間違えられる可能性は極めて少ない。他のＤＮＡ鋳型では特異的シグナルは生じなかった。これらのデータより、ｒｐｏＢプライマーは、汚染された細胞培養物中で見出される最も一般的なマイコプラズマ８種の特異的な検出に適していることが示された。
【００８５】
ＰＣＲの感度
マイコプラズマ種の間でｒｐｏＢ遺伝子の配列に相違があるため、ＰＣＲアッセイの感度によっては種の間に様々な検出限界が生み出される可能性がある。アッセイの感度を調べるために、本発明人らは、代表的なマイコプラズマ２種に対する検出限界を測定した。Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のｒｐｏＢ遺伝子の配列は、保存性が低くかつ本発明人らのプライマーとミスマッチを示し（図１Ｂ、ラベルＬ）、他の種よりも遅いＣｔ値を生じさせた（図２Ａ、円を伴う線）ので、Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）を選択した。Ｍ．ファーメンタンス由来のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列（図１Ｂ、ラベルＦ）は、プライマー配列とほぼ同一であり、本発明人らの方法では早いＣｔで検出された。（図２Ａ、クロスを伴う線）。アッセイがこれら２種に対して成功する範囲を決定するために、ゲノムＤＮＡの１０倍の系列希釈（１００ｐｇ〜１ｆｇ）を、ｒｐｏＢ  ＰＣＲアッセイに供した。保存性が低い種であるＡ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）に対しては、１０ｆｇが検出限界であり（図３Ａ）、これは、ゲノムサイズを１４９７ｋｂ（ＮＣ＿０１０１６３．１）とすれば、約６コピーのゲノムに相当する。Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた場合は（図３Ｂ）、１２４５ｂｐのゲノムサイズに基づいて、約１コピーに相当する、１ｆｇのゲノムＤＮＡが検出された（Ｓｃｈａｅｖｅｒｂｅｋｅ，Ｔ．ら（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３６、１２２６〜１２３１）。極めて低いコピー数の評価は、コピー数を決定するために、Ｃｔよりもむしろ、数多くの複製の中で成功した増幅の数を用いるアプローチ（Ｓｙｋｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、４４４〜４４９）のようなデジタルＰＣＲによって行うのが最善である。この方法では、鋳型分子のポアソン分布が仮定され、単コピー反応の６６％のみが標的を含有し、したがって増幅し、１未満のコピーを有するものはそれより少ないことに相当する（Ｓｙｋｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、４４４〜４４９）。単コピーの検出を確認するために、本発明人らは、鋳型としてＭ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ゲノムＤＮＡ  １ｆｇを用いて７５の複製試料を増幅した。ｒｐｏＢアンプリコンは、反応の５３％で増幅に成功し、これは０．８のゲノム当量に基づいた予測と一致する（データを示さず）。したがって、本発明人らの方法は、高感度であり、ＰＣＲ反応当たり約１〜６のゲノムコピーを検出することができる。
【００８６】
ＰＣＲ阻害物質に対する抵抗性
ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘの有用な特性の１つは、血液または血清などの粗試料中に存在するＰＣＲ阻害物質に対するその抵抗性である。本発明人らは、ＦＢＳを含む様々な細胞培養培地の存在下でＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘの性能を試験した。培地は１０％の最終濃度でリアルタイムＰＣＲ反応に含めた。このｍｉｘの性能特性を試験するために、本発明人らは、マイコプラズマ感染試料に由来する精製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として用いた。表１に示すように、精製されたＤＮＡ単独の増幅から、平均２７のＣｔが得られた。様々な培地調製物をＰＣＲ反応に加えた場合は、本発明人らはＣｔのわずかな遅延（０．５Ｃｔ未満）を観察した。ＦＢＳのみが、ほぼ１Ｃｔの遅延を示した。これらのデータより、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘは、様々な組織培養培地の存在下で、また１０％のＦＢＳ（最終濃度）の存在下で極めて効率的なＰＣＲ増幅を生み出すことが示される。
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【００８７】
培地成分だけでなく細胞片および過剰量のＤＮＡ（アポトーシス細胞由来）もまた、ＰＣＲ阻害を引き起こす可能性があることが示唆されてきた（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ら（２００７）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７７、２２３〜２３２；Ｈａｒａｓａｗａ，Ｒ．ら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４９、８５９〜８６３）。この仮定を試験するために、加齢しコンフルエントを超えた細胞培養物に由来する馴化培地がＰＣＲを阻害するかどうかを検討した。表２に示すように、様々なタイプの馴化培地を加えると、わずかなＣｔ遅延のみ（１Ｃｔ未満）が起こり、したがって、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて実施するＰＣＲ反応では、ＰＣＲ阻害物質の存在による影響は最小限であることが示された。
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【００８８】
最後に、本発明人らは、事前に試料調製をしていない粗試料中のマイコプラズマ検出に関してリアルタイムＰＣＲアッセイの性能を試験した。Ｌｏｎｚａ社製の市販のマイコプラズマ検出キットを用いて、本発明人らは様々な細胞培養上清試料をスクリーニングし、１０の汚染試料および１０の非汚染試料を同定した（データを示さず）。本発明人らは、本発明人らのリアルタイムＰＣＲアッセイで培地対照および非鋳型対照と共にそれらの試料を試験した。細胞培養上清は、全く試料調製をせずにＰＣＲに直接供した。本発明人らは、１０の感染試料すべてでマイコプラズマを検出することができたが（実線、図４Ａ）、非感染試料は特異的増幅を引き起こさなかった（円を伴う線）。陽性試料については、２１と３４との間のＣｔ値および７８．５と７９℃との間の融解ピークが得られたが（表３）、非感染試料および対照試料では、Ｃｔは３９を超えていた（特異的融解ピークはなし）。
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【００８９】
考察
マイコプラズマは組織培養において誤った結果に導く恐れのある深刻な問題である。容易に判断することができる典型的な細菌または真菌の汚染物質と異なり、マイコプラズマ汚染は特異的な試験なしでは容易に検出できないため、検出されないままになることが簡単に起こり得る。したがって、定期的な試験が、強く推奨されるが、現在の試験方法が有する問題のために、試験を常に行うわけにはいかない。本発明人らは、ここで、細胞培養上清中のマイコプラズマを検出するための新規のリアルタイムＰＣＲアッセイを提示する。本発明人らのプロトコルの主な利点は、改善された特異性および感度、広範囲な試料調製の回避、ＨＴ試料スループット、簡単な反応セットアップ、および速度である。これらの利点によりマイコプラズマ汚染の試験がはるかに実用的なものになる。
【００９０】
マイコプラズマのリアルタイムＰＣＲ検出用のいくつかのプロトコルが文献に記載されているが、それらの大部分はリボソームＤＮＡ配列の検出に基づいている（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．ら（２００６）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ、４２、６３〜６９；Ｈａｒａｓａｗａ，Ｒ．ら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４９、８５９〜８６３；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．およびＰａｗｌｉｔａ，Ｍ．（２００９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）。それらの遺伝子の主な欠点は、その高い保存性により、そのプライマーがマイコプラズマに特異的ではなく、しかも系統発生的に関連する他の細菌を検出する恐れもあるということである（Ｔａｎｇ，Ｊ．ら（２０００）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９、１２１〜１２６；Ｅｌｄｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ら（２００４）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３２、１８３〜１９３）。非標的種を検出しない特異的プローブを組み込むことによりＰＣＲ反応の特異性を改善することは可能である（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．およびＰａｗｌｉｔａ，Ｍ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．；Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ）。しかし、このアプローチでは、材料費が高くなる。
【００９１】
種交差反応性を回避するために、保存性が低い他のマイコプラズマ遺伝子がＰＣＲ検出のために用いられてきた。Ｓｔｏｒｍｅｒらは、広範囲プライマーおよびマイコプラズマ特異的プローブを用いて、ｔｕｆ遺伝子の増幅のためのアッセイを開発した（Ｓｔｏｒｍｅｒ，Ｍ．ら（２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９９、２９１〜３００）。そのアッセイは、３３の細菌および真菌の種と交差反応性を示さないが、２つの一般的な細胞培養汚染物質（Ｔａｎｇ，Ｊ．ら（２０００）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９、１２１〜１２６；Ｔｉｍｅｎｅｔｓｋｙ、Ｊ．ら（２００６）Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ、３９、９０７〜９１４）である、マイコプラズマ種のＭ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）およびＭ．ピルム（Ｍ．  ｐｉｒｕｍ）の検出に関するデータはない（Ｓｔｏｒｍｅｒ，Ｍ．ら（２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９９、２９１〜３００）。本発明人らの実験によると、ｔｕｆプライマーではこれら２つの種は検出されなかった（データを示さず）。本発明人らは、Ｓｔｏｒｍｅｒが提示したアッセイはマイコプラズマに高度に特異的であり、臨床関連のモリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）の種を検出するために十分最適化されたものであるが、細胞培養中の一般的なマイコプラズマ種すべてを試験するには十分でないと考えている。
【００９２】
別のアプローチとして、ｒｐｏＢ遺伝子の領域を標的とする、リアルタイムＰＣＲに適したプライマーを本発明人らは設計した。このプライマーにより、少なくとも８種の一般的なマイコプラズマ種が特異的に検出できるようになった（図２Ａ、Ｂ）。試験したマイコプラズマ８種すべてと関連非標的細菌で唯一のラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）のゲノムＤＮＡが増幅することを本発明人らは観察した。これにより、これらのプライマーがマイコプラズマ種の間を幅広くカバーする優れた特異性を併せ持つことが示唆される（図２）。
【００９３】
ｒｐｏＢアッセイの感度は、検出する種に応じて、反応当たり約１〜６のゲノムコピーであると判定された（図３）。典型的なマイコプラズマ感染培養物は、１０５〜１０８コロニー形成単位／ｍｌを含有している（Ｗｉｒｔｈ，Ｍ．ら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、６７〜７７）。したがって、この方法には弱感染の培養物でも十分検出できる感度がある。
【００９４】
最も一般的な８種の等量ゲノムＤＮＡを試験したとき、最初と最後に検出された種の間で５Ｃｔの相違を本発明人らは観察した。このことは、最も一般的な８種のプライマー結合部位用に選択したｒｐｏＢ配列の相同性が完全ではなく、その結果、様々な標的の間でプライマー結合およびＰＣＲ増幅効率に相違が生じた事実により説明することができる。別の可能な説明は、異なる２社のベンダーから入手したゲノムＤＮＡの出発原料の質および量における相違である。
【００９５】
本発明人らの方法では検出の前に試料調製の必要がないことをここで示す。ＦＢＳならびに細胞片および細胞老廃物を含有する馴化培地を含む最も一般的な培地調製物を本発明人らは試験した。試験した培地のいずれも１Ｃｔを超える遅延をもたらさないことを本発明人らは見出し、本発明人らのＰＣＲアッセイはＰＣＲ阻害物質に対して高度に抵抗性であることが示された（表１−２）。試料調製ステップの省略により、いくつかの利点が得られる。ＤＮＡ精製は労働力を必要とする作業である。本発明人らの方法ではこれは最早必要ないので、多数の試料を同時に処理することができる。試料調製ステップの省略により、試料の損失および間違いが起こる機会がほとんどなくなるので、アッセイの質も改善される。本発明人らの方法は、迅速で、反応のセットアップが容易であるので、魅力的でもある。極めてわずかなハンドリング時間と共に２時間未満で結果を得ることができるため、試験による研究室資源の消費はもはや大きくない。
【００９６】
実際の試料でｒｐｏＢアッセイの有効性を試験するために、市販の生化学的マイコプラズマ試験キット（Ｍａｒｉｏｔｔｉ，Ｅ．ら（２００８）Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ、３２、３２３〜３２６）により同定された１０の感染および１０の非感染培養物セットを本発明人らは調べた。ｒｐｏＢアッセイにより、２０の細胞培養試料すべてに関して市販のキットと同じ結果が得られ（図４、表３）、本発明人らの方法がマイコプラズマ感染試料の定期的な試験に適していることが示唆された。生化学をベースとするキットは未接種培地の試料を陽性と同定したが、本発明人らのｒｐｏＢアッセイはそうではなかったため（データを示さず）、本発明人らの結果は、１つの対照試料に関してのみ、そのキットと異なっていた。生化学的方法の既知の欠点の１つは、偽陽性が生じることである（Ｓｙｋｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、４４４〜４４９）。これは、この試験が研究室環境中にかなり豊富にあるＡＴＰの検出に基づいているという事実による可能性がある。
【００９７】
まとめると、本発明人らはここに、研究室の定期的な試験に適した、マイコプラズマ感染の伝播を防止するための簡単なマイコプラズマ検出方法を示す。
【００９８】
本明細書に記載の実施例および実施形態は説明のみを目的とするものであり、それらに照らして、様々な修正または変更が、当業者に示唆されるであろうが、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれるべきものであることは理解されよう。本明細書に引用されたすべての出版物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
非公式配列表
配列番号１
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ
配列番号２
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ
配列番号３
2013515458.tif 000006
配列番号４
2013515458.tif 000007
配列番号５
ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＧ
配列番号６
ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＴ
配列番号７
Ｍ  ピルム（Ｍ  ｐｉｒｕｍ）
順方向
ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣ
配列番号８
Ｍ  ピルム（Ｍ  ｐｉｒｕｍ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴ
配列番号９
Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）
順方向
ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡ
配列番号１０
Ａ．ライドラウィー（Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＧＴ
配列番号１１
Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）
順方向
ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡ
配列番号１２
Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴ
配列番号１３
Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）
順方向
ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ
配列番号１４
Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＴ
配列番号１５
Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）
順方向
ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡ
配列番号１６
Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴ
配列番号１７
Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）
順方向
ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡ
配列番号１８
Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴ
配列番号１９
Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）
順方向
ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ
配列番号２０
Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＴ
配列番号２１
Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）
順方向
ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡ
配列番号２２
Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）
逆方向
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＴ
配列番号２３
図１順方向コンセンサス
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ
配列番号２４
図１逆方向コンセンサス
ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＫＧＧＴＧＧＷＡＡＲＡＧＴＣＡＡＡＡＹＧＧ
【図１】
2013515458.tif 000008
【図２Ａ−１】
2013515458.tif 000009
【図２Ａ−２】
2013515458.tif 000010
【図２Ａ−３】
2013515458.tif 000011
【図２Ｂ】
2013515458.tif 000012
【図２Ｃ】
2013515458.tif 000013
【図３Ａ−１】
2013515458.tif 000014
【図３Ａ−２】
2013515458.tif 000015
【図３Ｂ−１】
2013515458.tif 000016
【図３Ｂ−２】
2013515458.tif 000017
【図４−１】
2013515458.tif 000018
【図４−２】
2013515458.tif 000019
【配列表】
2013515458000001.xml
【国際調査報告】
2013515458.tif 000024
2013515458.tif 000025
2013515458.tif 000026