(57)【要約】自己線維芽細胞の培養物から得られた調整培地を含む、自己局所製剤が開発される。他の局所製剤と異なり、製剤を使用する人によって得られた細胞から単独で誘導されるので、自己由来である。これは、細胞由来のタンパク質とのあらゆる可能性のある反応を回避する。好ましい製剤には、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、および軟膏剤が含まれる。自己真皮線維芽細胞の培養によって得られた調整培地の局所製剤は、傷跡の予防と治療、老化の徴候の低減、および肌質の改善のために、ヒトに局所的に投与される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含み、
前記賦形剤は、前記調整培地、または前記調整培地の材料と混合されて形成される、製剤。
【請求項２】
ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記線維芽細胞は、複数回継代して、前記調整培地を生成する、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
前記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、請求項３記載の製剤。
【請求項５】
前記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、請求項１記載の製剤。
【請求項６】
前記製剤が、少なくとも８０％の集密度で前記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地から得られる材料を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項７】
自己局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含む自己局所製剤を製造する方法であって、
前記培地で前記線維芽細胞を培養することと、前記賦形剤を、前記調整培地または前記調整培地の材料と混合して、局所製剤を製造することと、を含む、
前記方法。
【請求項８】
前記製剤は、ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞は、複数回継代して、前記調整培地を生成する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が、少なくとも８０％の集密度で前記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記調整細胞培養培地を乾燥して、前記賦形剤と混合された材料を製造する、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか一項に記載の真皮線維芽細胞を培養することによって得られた調整培地の製剤を、局所的に投与することを含む、皮膚を治療するための方法。
【請求項１５】
前記製剤を有効量投与して、傷跡または老化の徴候を低減させる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記製剤を有効量投与して、肌質を改善させる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月２７日に出願された米国特許出願シリアル番号第６１／３７７，８０３号、および２０１０年１２月９日に出願された米国特許出願シリアル番号第６１／４２１，５１６号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト対象の皮膚の修復、維持、および／または長期的増強のための局所製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
肌質は、加齢、創傷、日光および他の環境要因への曝露によって、ならびに、疾患または自己免疫疾患によっても劣化する。数世紀にわたって、種々の物質が、泥およびハーブ系混合物、動物性脂肪から、近年の乳濁物、ローション、クリーム、ゲル、および生物製剤まで、適用されている。これらの物質の多くは、医薬として活性のある薬剤を含まないが、その代りに、皮膚に潤いを取り戻し、肌を落ち着かせる、比較的活性のない物質の特性に依存する。一般に、調製物が皮膚上にある限りのみ、利益は継続する。
【０００４】
医薬として活性のある薬剤の多くが、局所用途のために、ローション、ゲル、クリーム、溶液、およびスプレーと混合されている。例としては、炎症を減少させるコルチゾンと抗ヒスタミン剤、感染を治療する抗生物質、抗真菌剤、止痒剤、および乾燥剤が含まれる。一部には、加齢斑（ａｇｉｎｇ  ｓｐｏｔ）を治療する漂白剤、および脱毛する化学物質が含まれる。これらの製剤は、特定の活性成分に対し非常に特異的であり、肌質を回復させるため、または老化の影響を減少させるためには何もしない。
【０００５】
近年、局所生物製剤が開発されている。これらには、サイトカインおよび成長因子等の薬剤、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス材料、ならびにポリヒドロキシ酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）等の水和化合物を含んだ製剤が含まれる。生物製剤の具体的な効果についての結果は、ほとんどの場合、限定的であった。
【０００６】
他の生物製剤は、成長因子、細胞外マトリックス材料、および、細胞培養培地でみられる他の活性物質（例えば、非特許文献１、およびＮａｕｇｈｔｏｎらによる特許文献１（２００９年５月１４日公開））等の活性成分の不確定の混合物を含む。しかしながら、これらの製剤の多くに関する問題は、混合物を投与し、提案された培地の有益な効果を無視する可能性がある異種タンパク質に対する免疫反応を誘発可能なヒトから生じたものではないということである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９０１２３５０３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｅｈｔａら、Ｊ  Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００８  Ｓｅｐ；７（９）：  ８６４−７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、傷跡の予防と治療、老化の徴候の低減、および肌質の改善のために、患者に局所投与する自己真皮線維芽細胞の培養によって得られた調整培地の局所製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
自己線維芽細胞の培養物から得られた調整培地を含む、自己局所製剤が開発される。他の局所製剤と異なり、製剤を使用する人によって得られた細胞から単独で誘導されるので、自己由来である。これは、細胞由来のタンパク質とのあらゆる可能性のある反応を回避する。好ましい製剤には、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、および軟膏剤が含まれる。
【００１１】
自己真皮線維芽細胞の培養によって得られた調整培地の局所製剤は、傷跡の予防と治療、老化の徴候の低減、および肌質の改善のために、ヒトに局所的に投与される。
【００１２】
または、製品の同種異型は、一般人の使用のために、同様の製造工程を用いて、大量生産されてもよい。この型の製品において、スクリーニングされたドナーは、線維芽細胞の増殖、およびマスターセルバンク（ＭＣＢ）の形成のために、組織を提供する。適切な試験がＭＣＢにおいて行われた後、マスターバンクから増殖させた細胞を使用して、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を形成し、次に、これを、同種異型の局所用製品の製剤に使用される調整培地の製造のために増殖させる。製造工程は、自己工程に類似し、同じ用途であり、局所用製品のすべての最終製剤は、同じ濃度範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、自己線維芽細胞を培養するための標準化製造工程のフローチャートである。
【図１−２】図１は、自己線維芽細胞を培養するための標準化製造工程のフローチャートである。
【図１−３】図１は、自己線維芽細胞を培養するための標準化製造工程のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
線維芽細胞は、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス成分を生産する、皮膚の特殊化された細胞である。これらは、結合組織がこれらから発達する細胞であり、このためこれらの細胞は、皮膚の質感（ｓｋｉｎ  ｔｅｘｔｕｒｅ）、およびコラーゲンを含むマトリクス繊維の分泌に寄与する、細胞外マトリックス成分の合成能を含んだ、ヒト組織の成長に重要な役割を果たす。コラーゲンは、真皮の主成分のうちの１つを構成する、天然型のタンパク質であり、これは、構造および支持を提供する、繊維のマトリックスとして存在する。自己線維芽細胞製品が開発されている。細胞療法製品は、自己線維芽細胞の懸濁剤からなり、標準組織培養手順を用いて、各個人自身の皮膚の生検材料から増殖させる。酵素消化による組織から単離された線維芽細胞は、患者の標的治療域への注入に十分な量に増殖する。自己局所治療製品は、増殖させた線維芽細胞から得られた調整培地からなり、局所投与のために適切な賦形剤と共に製剤化される。
【００１５】
また、この工程を用いて、同種細胞系統を作製し、当該細胞系統を増殖させて、大量生産された局所用製品の製剤のための調整培地を形成してもよい。
【００１６】
Ｉ．製剤
次に示す定義を本明細書に用いる。
ＡＴＭ  分析試験法
アズフィセル（ＡＺＦＩＣＥＬ）‐Ｔ  自己培養された線維芽細胞のためのＵＳＡＮによる命名
原薬採取物（ＢＵＬＫ  ＨＡＲＶＥＳＴ）  低温保存培地における製剤化前の最終採取による材料
ＣＧＭＰ  一般医薬品の製造管理と品質管理に関する基準
ＣＳ  細胞スタック
ＤＭＥＭ  ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
製剤‐注入物（ＤＲＵＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ‐ＩＮＪＥＣＴＩＯＮ）  ＤＭＥＭ内で洗浄され再製剤化され、臨床部位への送達のためにバイアルに充填され準備ができている材料
製剤原料‐クライオバイアル（ＤＲＵＧ  ＳＵＢＳＴＡＮＣＥ−ＣＲＹＯＶＩＡＬ）  低温保存培地において製剤化され、クライオバイアルに小分けにされた原料
ＥＤＴＡ  エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＳ  胚系
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞分類
ＦＢＳ  ウシ胎仔血清
ＧＡ  ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンＢ
ＩＭＤＭ  イスコブ変法ダルベッコ培地
ＩＮＤ  新薬治験開始申請
ＭＣＢ  マスターセルバンク
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＡ  個人細胞分析
ＱＣ  品質管理
ＳＣＮＴ  体細胞核移植
ＳＥＣ  体積排除クロマトグラフィ
ＵＳＰ  米国薬局方
ＷＣＢ  ワーキングセルバンク
【００１７】
Ａ．調整細胞培養培地製剤
標準組織培養手順を用いて、各個人自身の皮膚の生検材料から増殖させた、自己線維芽細胞の懸濁液を使用して、局所自己製剤に使用するために、調整培地を調製する。皮膚組織（真皮層および表皮層）は、患者の耳介後部領域から生検を実施される。
【００１８】
また、この工程を用いて、同種細胞系統を作製し、当該細胞系統を増殖させて、大量生産された局所用製品の製剤のための調整培地を形成してもよい。同種工程におけるマスターセルバンク（ＭＣＢ）を形成するための出発材料および細胞の増殖工程は、自己工程と同様である。
【００１９】
また、線維芽細胞を使用して、培養される他の細胞型を作製し、組織修復または再生のために使用する材料を生産することもできる。体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による患者と遺伝的に同一である、胚幹（ＥＳ）細胞の誘導は、宿主免疫系による拒絶に関する懸念を回避しつつ、多くの変性疾患の症状を治療するか、または緩和する潜在能を維持する。Ｂｙｒｎｅらの文献：Ｎａｔｕｒｅ．  ２００７  Ｎｏｖ  ２２；４５０（７１６９）：４９７−５０２は、成人皮膚線維芽細胞からアカゲザル胚盤胞を生産するための改良ＳＣＮＴアプローチを使用して、これらの胚から良好に２つのＥＳ細胞系統が単離した。ＤＮＡ解析は、核ＤＮＡが、ドナー体細胞と同一であり、ミトコンドリアＤＮＡが、卵母細胞から生じることを確認した。両細胞系は、正常なＥＳ細胞形態を示し、主要幹細胞マーカーを発現させ、転写的に対照ＥＳ細胞に類似し、インビトロおよびインビボにおいて複数の細胞型に分化した。Ｓｐａｒｍａｎらの文献：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００９；２７（６）：  １２５５−６４も参照されたい。図２は、皮膚由来線維芽細胞が、どのように、エピジェネティック再プログラム化を用いて、多能性幹細胞に脱分化し、その後これが、ニューロン、心筋細胞、ベータ膵島細胞、および造血細胞に分化することができるのかについて示す、Ｂｙｒｎｅの文献；２００８  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  １７：Ｒ３７−Ｒ４１からの概要である。Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒらの文献：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  ２００９  Ｆｅｂ；１３６（４）：５０９−２３、およびＫａｎａｗａｔｙらの文献：Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．  ２００９  Ｆｅｂ；３１（２）：  １３４−８を参照されたい。
【００２０】
線維芽細胞は、細胞融合（Ｃｏｗａｎらの文献：Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００５  Ａｕｇ  ２６；３０９（５７３９）：  １３６９−７３）、直接再プログラム化（Ｔａｋａｈａｓｈｉらの文献：Ｃｅｌｌ．  ２００７  ３０；１３１（５）：８６１−７２）、および体細胞核移植（Ｂｙｒｎｅらの文献２００７）によって、多能性細胞に脱分化することができる。Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、同じ４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ‐Ｍｙｃ）を有する成人ヒト真皮線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の発生を示した。ヒトｉＰＳ細胞は、形態、増殖、表面抗原、遺伝子発現、多能性細胞特異性遺伝子の後成状態、およびテロメラーゼ活性において、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞に類似していた。さらに、これらの細胞は、インビトロおよび奇形腫において、３つの胚葉の細胞型に分化することができた。これらの知見は、ｉＰＳ細胞が、成人ヒト線維芽細胞から発生できることを示す。
【００２１】
Ｂ．細胞の調製
自己製造：
自己線維芽細胞は、レシピエント自身の皮膚生検の酵素消化、および、その後の標準細胞培養法を用いた培養物の増殖によって、誘導される。皮膚組織（真皮層および表皮層）は、対象の耳介後部領域から生検を実施される。一般に、出発材料は、標準無菌法を用いて収集した３つの３ｍｍ穿孔皮膚生検材料からなる。生検材料は、治療する医師によって収集され、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を収容したバイアル内に入れられる。生検材料は、２℃から８℃に冷却した輸送容器で、製造施設に返送される。
【００２２】
製造施設に到着後、生検材料は、受入時に検査され、製造区域に直接移される。工程の開始時に、生検組織は、酵素消化前に洗浄される。洗浄後、細分化せずに、リベラーゼ消化酵素溶液を加え、生検組織は、３７．０±２℃で１時間、インキュベートされる。生検組織消化時間は、培養物中の細胞生存率および増殖率に影響を与える可能性がある、重要な工程パラメーターである。リベラーゼは、ロンザ・ウォーカーズビル（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）社（米国メリーランド州ウォーカーズヴィル）の製剤化製品、およびロシュ・ダイアグノスティック（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社（米国インディアナ州インディアナポリス）から未製剤化製品から入手された、コラゲナーゼ／中性プロテアーゼ酵素のカクテルである。または、サーバ（Ｓｅｒｖａ）社のコラゲナーゼＮＢ６（ドイツ、ハイデルベルク）等の、他の市販コラゲナーゼを使用してもよい。消化後、初期増殖培地（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ）（ＩＭＤＭ、ＧＡ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を加えて、酵素を中和し、細胞を、遠心分離によってペレット化し、５．０ｍＬの初期増殖培地中で再懸濁させる。または、初期増殖培地のみの添加によって生じる酵素の完全な不活性化により、遠心分離は行われない。初期増殖培地は、細胞増殖および増加の開始のためのＴ‐１７５細胞培養フラスコ中への細胞懸濁液の接種前に、加えられる。Ｔ‐７５、Ｔ‐１５０、Ｔ‐１８５、またはＴ‐２２５フラスコを、Ｔ‐７５フラスコの代わりに使用することができる。細胞は、３７±２．０℃、５．０±１．０％のＣＯ２でインキュベートされ、３日から５日ごとに新しい完全増殖培地が供給される。工程における供給はすべて、完全増殖培地の半分を除去し、同じ容積を新しい培地に交換することによって行われる。または、完全な供給を行うことができる。細胞は、継代前３０日よりも長く、Ｔ‐１７５フラスコ中に滞留させるべきではない。培養物の分裂の間、十分な接種密度を確保するために、集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）は、工程全体にわたってモニターされる。
【００２３】
細胞集密度がＴ−１７５フラスコ中で４０％以上の場合、これらはトリプシン処理され、継続的な細胞増殖のために、Ｔ‐５００フラスコ中に接種される。交互に、１個または２個のＴ‐３００フラスコ、１層細胞スタック（１ＣＳ）、１層細胞工場（１ＣＦ）、または２層細胞スタック（２ＣＳ）を、Ｔ‐５００フラスコの代わりに使用することができる。採取前に、各継代時に形態を評価して、工程全体にわたって培養物の純度をモニターする。形態は、観察する試料を、細胞培養の形態試験のための視覚的標準と比較することによって、評価される。培養された単層で増殖させる場合、細胞は、一般的な線維芽細胞形態を示す。細胞は、細長い、紡錘状、もしくは細い伸張を有する紡錘状の外観のいずれかを示すか、または、細胞質の最先端を有する、より大きい、平坦な星状細胞として出現する場合がある。また、これらの形態の混合物も観察される場合がある。集密でない領域において線維芽細胞が、同様に形成される可能性があるが、無作為に、配向される。また、細胞培養物中のケラチン細胞の存在も評価される。ケラチン細胞は、より高い集密度で、円形で、不規則に形成され出現し、これらは、敷石形成で組織して出現する。低い集密度では、ケラチン細胞は、小さいコロニー状で観察することができる。細胞は、３７±２．０℃、５．０±１．０％のＣＯ２でインキュベートされ、３日から５日ごとに、Ｔ‐５００フラスコ内に供給され、かつ５日から７日ごとに１０層細胞スタック（１０ＣＳ）内に供給される。細胞は、継代前１０日よりも長く、Ｔ‐５００フラスコ中に滞留させるべきではない。原薬の安全性のためのＱＣ出荷時試験には、無菌およびエンドトキシン試験が含まれる。細胞集密度が９５％以上の場合、細胞は、１０ＣＳ培養容器、２つの５層細胞スタック（５ＣＳ）、または１０層細胞工場（１０ＣＦ）に継代される。継代は、使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン‐ＥＤＴＡによって処理することによって行い、溶液中にフラスコ内の接着細胞を放出させる。付加的な完全増殖培地を加えて、トリプシンを中和し、Ｔ‐５００フラスコからの細胞は、新しい完全増殖培地を収容した２Ｌ瓶にピペットで移される。２Ｌ瓶の内容物は、１０ＣＳ内に移され、すべての層に接種される。その後、細胞は、３７±２．０℃、５．０±１．０％のＣＯ２でインキュベートされ、５日から７日ごとに新しい完全増殖培地が供給される。細胞は、継代前２０日よりも長く、１０ＣＳ内に滞留するべきではない。
【００２４】
１次採取：１０ＣＳにおける細胞集密度が９５％以上の場合、細胞が採取される。採取は、使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン‐ＥＤＴＡによって処理することによって行い、溶液中に接着細胞を放出させ、付加的な完全増殖培地を加えて、トリプシンを中和する。細胞は、遠心分離、再懸濁によって収集し、工程内品質管理（ＱＣ）試験を行って、全生菌数および細胞生存率を決定する。培地の量が顕著に多く、副産物を生成する多くの細胞が存在するので、調整培地を収集するべき理想点は、この時点にある。
【００２５】
１次１０ＣＳ採取から生じた細胞数を受け入れた後、付加的な細胞が必要な場合、複数の細胞スタック（最大４つの１０ＣＳ）への付加的な継代が行われる（図１のステップ５ａ）。付加的な継代において、新しい完全増殖培地を収容した２Ｌの培地瓶に、１次採取物を加える。再懸濁させた細胞は、複数の細胞スタックに加えられ、３７±２．０℃、５．０±１．０％のＣＯ２でインキュベートされる。細胞採取前の細胞集密度が８０％以上でなければならない場合を除いて、上述するように、細胞スタックが供給され、採取される。採取手順は、上述する１次採取と同様である。細胞および使用済み培地のマイコプラズマ試料は、収集され、１次採取について上述するように、細胞数および生存率を示した。
【００２６】
局所製剤の調製に使用される調整培地は、上述する線維芽細胞製造工程の１次採取後に、１次採取または付加的な継代ステップから、理想的に収集される。工程初期に使用され、最も大きい容積の完全増殖培地を有するフラスコ（Ｔ‐１７５およびＴ‐５００フラスコ）との比較において、集密状態の１０ＣＳは、最大集団の接着細胞に一致する。しかしながら、培地が、工程初期に局所用製品を製造するためのインキュベーション期間後に除去されるか、または、より高い収率のためにプールされる場合、調整培地は、工程のいかなる段階で収集されてもよい。
【００２７】
１０ＣＳ（または、他の選択された培養容器）の採取では、１．５Ｌ（または、上流の培養容器ではこれよりも少ない）の調整培地は、容器から取り出され、２Ｌの瓶等の適切な容器に収集される。培地は、限外濾過、脱水、または凍結乾燥によって濃縮される。濃縮された培地を、種々の培地採取点（例えば、Ｔ‐５００および１０ＣＳ）から合わせてもよいし、または、個々の培地採取物を別々に処理してもよい。
【００２８】
同種製造：
同種線維芽細胞培養物を生産するために、開始組織を提供するドナーを選択する。生検皮膚組織の収集前に、ヒトに、健康状態の一般的な検査を行い、ＨＩＶおよびＢ型肝炎等の血液媒介原因疾患のスクリーニングをする。ドナーが参加資格を得れば、自己工程について上述するように、生検試料を収集し、輸送してもよい。
【００２９】
大集団の需要細胞（ｃｕｓｔｏｍｅｒ）に調整培地を提供するために、ＭＣＢを、その後の細胞増殖および培地収集のために最初に定着させる。ＭＣＢを形成するために、ドナーから収集した生検を、上述する自己工程を用いて増殖させる。採取が完了すれば、一連の安全性試験を行って、次に示すものを含む細胞系統の純度を確認してもよい。
【００３０】
ウイルスのスクリーニング：ウイルス粒子のパネル試験。
無菌性：微生物が存在しないことに対する試験。
マイコプラズマ：具体的には、細胞培養中の潜在的汚染物質と考えられる、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種に分類された微生物が存在しないことに対する試験。
エンドトキシン：発熱性（熱）反応を生ずるタンパク質に対する試験。さらに、細胞の品質を確認するための効果試験を行う。
細胞数：採取された集団における細胞の定量。
細胞生存率：集団における生存可能な細胞の割合。
同一性：線維芽細胞であることが決定された、細胞の割合。
コラーゲン含量：細胞の生物学的に活性のある集団を示す、細胞懸濁液中に含まれるコラーゲンの量。
【００３１】
最終採取後、自己工程について上述するように、細胞を小分けにし、液体窒素の気相中に極低温に保存される。これらの細胞は、ＭＣＢであり、これを下流に使用して、調整培地の収集のために、付加的な培養物に接種する。複数のドナー細胞系統の維持は、製造のための継続的な在庫を提供する。
【００３２】
ＭＣＢバイアルはそれぞれ、新しい線維芽細胞二次培養系統に接種して、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を形成することができる。線維芽細胞を従来の培養容器に継代し、大量培養バイオリアクターに十分接種するのに十分な細胞を生産する。培養物から採取されたバイアルを、凍結し、低温保存場所に置き、最終的なＷＣＢを形成する。
【００３３】
ＷＣＢからの凍結した細胞を、解凍し、従来の細胞培養を用いて、増殖させる。バイオリアクターに接種するのに十分に形成されるまで、細胞は継代される。ワクチン、抗体、および小分子の製造を支援するために、バイオリアクターは、バイオテクノロジー産業で一般に使用される。局所用製品の製剤に使用される、大量の調整培地を形成するために、バイオリアクターを使用し、大量培養物を生産して、収集された培地の量を最大限にしてもよい。
【００３４】
バイオリアクター中の接着細胞培養物は、本出願に直接適用することができる既存の技術である。多くの既製の単位は、種々のサイズで存在し、温度、ＣＯ２、ｐＨ、および溶存酸素等の培養条件を常にモニターし、ロットごとの均一性を確認する。一例には、次に示すものが含まれる。
セリゲン（ＣｅｌｌｉＧｅｎ）（登録商標）シリーズ（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、米国ニュージャージー州エジソン）
ウエーブ（ＷＡＶＥ）（商標）バイオリアクターシステム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。
【００３５】
バイオリアクターは、マイクロキャリアを利用して、線維芽細胞等の接着細胞のための増殖表面として作用する。このキャリアは、直接表面に細胞増殖を支持することが可能な小さい二次元または三次元構造である。多量において、マイクロキャリアは、細胞がバイオリアクター内に接着するために、大きな増殖表面積を提供する。潜在的なキャリアには、次に示すものが含まれる。
【００３６】
ＢｉｏＮＯＣ  ＩＩ（登録商標）（セスコ・バイオエンジニアリング（Ｃｅｓｃｏ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）社製、ベルコ・バイオテクノロジー（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国ニュージャージー州バインランドによって販売）、およびフィブラセル（ＦｉｂｒａＣｅｌ）（登録商標）（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、米国ニュージャージー州エジソン）等のポリブレンド
カルチスフェア（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ）‐Ｇ（パーセル・バイオリティカ（Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）、スウェーデン、アストロップ（Ａｓｔｒｏｐ））等のゼラチン
サイトポア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ）（商標）（ＧＥヘルスケア社製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）コーティング／非コーティングポリスチレン、２Ｄマイクロヘックス（２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘ）（商標）（ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、ドイツ、ヴィースバーデン）、サイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）（登録商標）（ＧＥヘルスケア、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、またはＨｙ‐Ｑスフェア（Ｈｙ−Ｑ  Ｓｐｈｅｒｅ）（商標）（サーモ・サイエンティフィック・ハイクローン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ）社製、米国ユタ州ローガン）等）等のセルロース
【００３７】
マイクロキャリアを有するバイオリアクターに接種されると、工程時において、培養物に新しい培地を供給される。複数の供給は、培養の間数日おきに行われる。調整培地は、無菌的に収集され、適切な容器に小分けされ、その後の処理のために凍結される。
【００３８】
または、バイオリアクターの代わりに、組織フラスコ（ｔｉｓｓｕｅ  ｆｌａｋ）および細胞スタック等の古典的な培養容器を使用して、ＷＣＢを増殖させ、局所製剤で使用する培地を収集してもよい。
【００３９】
Ｃ．製剤
担体は、細胞培養培地から組織に活性物質を送達することができる、任意のゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、またはエアゾールとしてもよい。活性剤が水性環境中に不溶である場合、適切な乳化剤が必要である。浸透促進剤を加えて、活性剤が、角皮層の障壁を横断することを可能にしてもよい。一実施態様において、担体は、水アルコールゲル等の、無臭および無味であり、迅速に溶解するゲルである。
【００４０】
１．賦形剤
本明細書に使用する「水可溶性」とは、１００ｍｌの水当たり５ｇ以上の溶解度を有する物質をいう。
【００４１】
本明細書に使用する「脂質可溶性」とは、ヒマシ油等の疎水性液体１００ｍｌ当たり５ｇ以上の溶解度を有する物質をいう。
【００４２】
本明細書に使用する「親水性」とは、容易に水と相互作用する、強力な極性基を有した物質をいう。
【００４３】
「親油性」とは、脂質に対して親和性を有する化合物をいう。
【００４４】
「両親媒性」とは、親水性と親油性（疎水性）とを組み合わせた分子をいう。
【００４５】
本明細書に使用する「疎水性」とは、水に対して親和性のない物質をいい、水を撥水し、吸収しない傾向があり、また、水中に溶解しないか、または水と混合しない傾向もある。
【００４６】
「ゲル」は、ゼリー等の半固体材料を製造するための、連続相と分散相が組み合わされたコロイドである。
【００４７】
「油」は、少なくとも９５重量％の親油性物質を含む組成物である。親油性物質の例には、天然および合成油、脂肪、脂肪酸、レシチン、トリグリセリド、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
「連続相」とは、固形物が懸濁するか、または他の液体の液滴が分散する液体をいい、しばしば外部相とも称される。また、連続相とは、固体粒子または流体粒子が分散するコロイドの流体相もいう。連続相が、水（または他の親水性溶媒）である場合、水溶性または親水性薬剤は、連続相（分散に対立するものとしての）に溶解する。多相製剤（例えば、乳濁物）において、個別の相（ｄｉｓｃｒｅｅｔ  ｐｈａｓｅ）は、連続相内に懸濁されるか、または分散する。局所投与用賦形剤には、抗微生物性化合物（例えば、パラベン）、抗酸化剤（例えば、ナトリウムアスコルビルアセタート（ｓｏｄｉｕｍ  ａｓｃｏｒｂｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、およびα‐トコフェロール）、安定剤（例えば、ソルビトール）、および／または、親水相と疎水相を共に有する安定な乳濁物を生成するための乳化剤が含まれてもよい。
【００４９】
「希釈剤」が、製剤中に溶解し、分散し、または別の方法で担体に導入するために含まれてもよい。希釈剤の例には、水、緩衝水溶液、１価アルコール等の有機親水性希釈剤、低分子量グリコール、およびポリオール（例えば、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
適切な賦形剤は、製剤の種類に基づいて選択される。標準賦形剤には、ゼラチン、カゼイン、レシチン、アラビアゴム、コレステロール、トラガカントゴム、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、グリセリルモノステアラート、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化蝋、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンステアラート、コロイド状（ｃｏｌｌｏｉｄｏｌ）二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非晶質セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、糖、および澱粉が含まれる。
【００５１】
乳濁物は、第２の液体全体中に一つの液体の小水滴が分散された調製物である。分散した液体は、不連続相であり、分散媒は連続相である。油が分散した液体であり、水溶液が連続相である場合、乳濁物は、水中油型乳濁物として知られており、水もしくは水溶液が分散相であり、かつ油または脂肪質の物質が連続相である場合、乳濁物は、油中水型乳濁物として知られている。油相は、ＨＦＡ推進剤等の推進剤の少なくとも一部からなってもよい。油相および水相のいずれか一方か、またはこれらの両方は、１つ以上の界面活性剤、乳化剤、乳化安定剤、緩衝剤、および他の賦形剤を含んでもよい。好ましい賦形剤には、界面活性剤（特に、非イオン界面活性剤）；乳化剤（特に、乳化蝋）；および、液状不揮発性非水性材料（特に、プロピレングリコール等のグリコール）が含まれる。油相は、他の油状の医薬として承認された賦形剤を含んでもよい。例えば、ヒドロキシル化ヒマシ油または胡麻油等の材料を、界面活性剤または乳化剤として油相に使用してもよい。
【００５２】
「皮膚軟化剤」は、外部から塗布される、皮膚を軟化させ、または落ち着かせる薬剤であり、当業者に一般に知られており、また、「医薬賦形剤ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」（第４版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３）等の概論にリストされる。これらには、アーモンドオイル、ヒマシ油、イナゴマメ（ｃｅｒａｔｏｎｉａ）抽出物、セトステアロイルアルコール（ｃｅｔｏｓｔｅａｒｏｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、セチルアルコール、セチルエステルワックス、コレステロール、綿実油、シクロメチコン、パルミトステアリン酸エチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐａｌｍｉｔｏｓｔｅａｒａｔｅ）、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、グリセリルモノオレアート、イソプロピルミリスタート、イソプロピルパルミタート、ラノリン、レシチン、軽油、中鎖トリグリセリド、鉱油およびラノリンアルコール、ワセリン、ワセリンおよびラノリンアルコール、大豆油、澱粉、ステアリルアルコール、ヒマワリ油、キシリトール、ならびにこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。一実施態様において、皮膚軟化剤は、エチルヘキシルステアラート、およびエチルヘキシルパルミタートである。
【００５３】
「界面活性剤」は、表面張力を低下させて、これによって、製品の乳化、泡立ち、分散、拡散、および湿潤特性を増加させる、表面活性剤である。適切な非イオン界面活性剤には、乳化蝋、グリセリルモノオレアート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、モノステアリン酸グリセリン、ポロキサマ、ポビドン、およびこれらの組合せが含まれる。一実施態様において、非イオン界面活性剤は、ステアリルアルコールである。
【００５４】
「乳化剤」は、１つの液体の別の液体中の懸濁を促進し、油と水の安定した混合物または乳濁物の形成を促進する、表面活性物質である。一般的な乳化剤は、金属石鹸、特定の動物油と植物油、および種々の極性化合物である。適切な乳化剤には、アカシア、陰イオン乳化蝋、ステアリン酸カルシウム、カルボマー、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ジエタノールアミン、エチレングリコールパルミトステアラート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐａｌｍｉｔｏｓｔｅａｒａｔｅ）、モノステアリン酸グリセリン、グリセリルモノオレアート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ラノリン、含水物（ｈｙｄｒｏｕｓ）、ラノリンアルコール、レシチン、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース、鉱油およびラノリンアルコール、単塩基リン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、モノエタノールアミン、非イオン乳化蝋、オレイン酸、ポロキサマ、ポロキサマ類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステアラート、プロピレングリコールアルギナート、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、クエン酸ナトリウム二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ヒマワリ油、トラガカントゴム、トリエタノールアミン、キサンタンゴム、ならびにこれらの組合せが含まれる。一実施態様において、乳化剤は、グリセロールステアラートである。
【００５５】
「ローション」は、低粘性から中粘性の液状製剤である。ローションは、懸濁化剤および分散剤の使用によって分散媒中で可溶である、微細粉末状物質を含むことができる。あるいは、ローションは、ビヒクルと混和せず、乳化剤または他の適切な安定剤によって通常分散する、分散相液状物質として有することができる。一実施態様において、ローションは、１００から１０００センチストークの粘度を有する乳濁物の形態である。ローションの流動性は、広い表面積において迅速で均一の塗布を可能にする。ローションは、一般に、皮膚表面上にこれらの医薬成分の薄いコーティングを残して、皮膚上で乾燥することを意図するものである。
【００５６】
「クリーム」は、「水中油型」または「油中水型」のいずれかの粘稠液または半固体の乳濁物である。クリームは、乳化剤および／または他の安定化剤を含んでもよい。一実施態様において、製剤は、１０００センチストークを超える（一般に、２０，０００から５０，０００センチストークの範囲の）粘度を有するクリームの形態である。クリームは、多くの場合、一般に、広がりやすく、除去しやすいので、軟膏よりも好ましい。
【００５７】
クリームとローションの間の基本的な相違は、粘性であり、粘性は、製剤を調整するのに使用される、種々の油の量／使用、および水の割合に依存する。クリームは、一般に、ローションよりも濃く、種々の用途があり、皮膚に対する所望の効果によって、多くの種々の油／バターを使用することが多い。クリーム製剤において、水を基準にした割合は、全体の約６０％から７５％であり、油を基準とした割合は、全体の約２０％から３０％であり、合計１００％に対してこれら以外は、乳化剤、保存剤、および添加剤である。
【００５８】
「軟膏」は、軟膏基剤と、任意選択的に、１つ以上の活性剤を含む半固体の調製物である。適切な軟膏基剤の例には、炭化水素基剤（例えば、ワセリン、白色ワセリン、黄色軟膏、および鉱油）；吸収基剤（親水性ワセリン、無水ラノリン、ラノリン、およびコールドクリーム）；水分除去性基剤（例えば、親水性軟膏）、ならびに水溶性基剤（ｗａｔｅｒ−ｒｅｍｏｖａｂｌｅ  ｂａｓｅ）（例えば、ポリエチレングリコール軟膏）が含まれる。ペーストは、一般に、高い割合の固形物を含む点で軟膏と異なる。ペーストは、一般に、同じ成分で調製された軟膏よりも、吸収性があり、脂っぽくない。
【００５９】
「ゲル」は、液体ビヒクル中に溶解されたか、または懸濁させた増粘剤または高分子材料の作用によって半固体にされた、液体ビヒクル中に、小分子または大分子の分散物を含む、半固体系である。この液体には、親油性成分、水性成分、またはこれらの両方を含んでもよい。一部の乳濁物はゲルであってもよく、他の場合には、この乳濁物には、ゲル成分が含まれてもよい。しかしながら、非混和性成分の均質化された混合物を含まないので、一部のゲルは、乳濁物ではない。適切なゲル化剤には、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロース等の改良セルロース；カルボポールホモポリマーおよび共重合体；ならびに、これらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。液体ビヒクル中の適切な溶媒には、ジグリコールモノエチルエーテル；プロピレングリコール等のアルキレングリコール；ジメチルイソソルビド；イソプロピルアルコールおよびエタノール等のアルコールが含まれるが、これらに限定されない。溶媒は、一般に、薬剤溶解能により選択される。また、皮膚感触、および／または、製剤の軟化を改善する、他の添加剤も導入してもよい。かかる添加剤の一例には、イソプロピルミリスタート、酢酸エチル、Ｃ１２‐Ｃ１５安息香酸アルキル、鉱油、スクアラン、シクロメチコン、カプリン酸／カプリルトリグリセリド、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
泡は、ガス状推進剤と組み合わせた乳濁物からなる。ガス状推進剤は、主として、ハイドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）からなる。適切な推進剤には、１，１，１，２‐テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３‐ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７）等のＨＦＡが含まれるが、現在承認されているか、医療利用のために承認されるようになるかもしれない、これらと他のＨＦＡの混合物および混合材料が適切である。推進剤には、噴霧時に、可燃性または爆発性の蒸気を生成する可能性がある、炭化水素推進剤ガスは好ましくない。さらに、組成物は、使用時に、可燃性または爆発性の蒸気を生成する可能性がある、揮発性アルコールを含まないことが好ましい。
【００６１】
緩衝剤は、組成物のｐＨを調節するのに使用される。好ましくは、緩衝剤は、約４から約７．５のｐＨ、より好ましくは約４から約７のｐＨ、最も好ましくは約５から約７のｐＨの組成物を緩衝する。好ましい実施態様において、緩衝剤は、トリエタノールアミンである。
【００６２】
保存剤は、菌類および微生物の増殖を防ぐのに使用することができる。適切な抗真菌剤および抗微生物剤には、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、およびチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
２．浸透促進剤
浸透促進剤は、皮膚（特に、角皮層）を通した、薬剤の経皮的送達を促進するために、頻繁に使用される。一部の浸透促進剤は、皮膚炎症、皮膚毒性、および皮膚アレルギーを生ずる。しかしながら、より一般的に使用されるものには、尿素（カルボニルジアミド）、イミド尿素、Ｎ，Ｎ‐ジエチルホルムアミド、Ｎ‐メチル‐２‐ピロリジン、１‐ドデカル‐アザシクロフェプタン‐２‐オン（１−ｄｏｄｅｃａｌ−ａｚａｃｙｃｌｏｐｈｅｐｔａｎｅ−２−ｏｎｅ）、チオグリコール酸カルシウム、２‐ピロリジン（２−ｐｙｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ‐ジエチル‐ｍ‐トルアミド、オレイン酸とそのエステル誘導体（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ビニル、およびグリセリルモノオレアート（ｇｌｙｃｅｒｙｌｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）等）、ソルビタンモノラウラートおよびソルビタンモノオレアート等のソルビタンエステル、イソプロピルラウラート、イソプロピルミリスタート、イソプロピルパルミタート、ジイソプロピルアジパート、プロピレングリコールモノラウラート、プロピレングリコールモノオレアート（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅａ）等の他の脂肪酸エステル、ならびに、ＢＲＩＪ（登録商標）７６（ステアリルポリ（１０オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）７８（ステアリルポリ（２０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）９６（オレイルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）、およびＢＲＩＪ（登録商標）７２１（ステアリルポリ（２１）オキシエチレンエーテル）（ＩＣＩアメリカズ（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）社製）等の非イオン洗浄剤が含まれる。
【００６４】
３．製剤
培地が十分に濃縮されると、粉末または液体は、選択された局所用ビヒクルと混合される。混合は、手動または機械装置を使用して行うことができる。製剤化後、製品は、適切なディスペンサーに充填され、エンドユーザに配送される。最終容器の一例には、ポンプボトル、スクイーズボトル、ジャー、チューブ、またはバイアルが含まれてもよい。
【００６５】
濃縮材料は、液体（１００ｍＬ未満）か、または用いる濃縮方法に依存する粉末形態のいずれかであってもよい。試験実施において、１０ＣＳの線維芽細胞培養物から収集された全１．５Ｌの凍結乾燥物は、２３ｇから２７ｇの粉末材料（Ｎ＝３）を生成した。加えられた濃縮調整培地は、意図した使用に依存して、賦形剤に対して１％から９５％の範囲であるが、一般に１％から５％の範囲である。これらの濃度では、局所用製品の複数の容器は、継続的な供給のために１人の患者用に、または、同種調整培地から発酵する場合、大量販売用に製造することができる。
【００６６】
４．調整培地の特性評価
全コラーゲン：
全コラーゲン含量の試験は、注入可能な自己細胞療法の公表基準の一部であり、線維芽細胞が、培養物において生物学的に活性があることを示す。また、調整培地も、特性評価試験の一部として、コラーゲン含量について歴史的に試験されている。試験を、シクロアッセイキット（Ｓｉｃｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（バイオカラー・ライフ・サイエンス・アッセイズ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙｓ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）社製、英国）を使用して行った。キットは、コラーゲンＩからＶを測定し、全コラーゲン含量の値を報告する。
【００６７】
表１は、培養物から直接採取した調整培地（Ｎ＝１０、４つの別々の細胞培養ロットから採取）のコラーゲン含量の結果を示す。さらに、媒体収集の細胞の継代数および細胞集密度を、表１に示し、当該表は、コラーゲンが、４０％から１００％の集密度、および種々の細胞継代の工程で、種々の継代で存在することを示す。
【００６８】
【表１】
2013536252.tif 000002
【００６９】
アミノ酸：
完全増殖媒体のＩＭＤＭ成分は、細胞増殖を支援するアミノ酸を含む。自己製造工程時に収集された調整培地試料を、体積排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ、Ｎ＝６）を使用して、アミノ酸含量について試験した。表３は、選択されたアミノ酸の報告された濃度範囲を示す。
【００７０】
【表２】
2013536252.tif 000003
【００７１】
ＩＩ．投与および治療の方法
調製物は、任意の位置、特に、老化により、皮膚が薄くなった、変色した、またはしわが生じた場所へ局所的に送達するのに使用されてもよい。内因子および外因子により、皮膚の老化が生じる。内因性老化か自然老化の原因である因子は、構造的で機能的である。構造的に、表皮はより薄くなり、角質細胞は、あまり付着せず、また、真皮‐上皮接合部は平坦になる。機能的に、線維芽細胞の数および生合成能が低減し、真皮は、萎縮し、比較的無細胞および無血管になる。紫外線光照射への曝露は、外因性老化または光老化の主な原因である。外因性老化の特徴は、弾性の喪失、粗さおよび乾燥の増加、不規則な色素沈着、深いしわの発生、ガサガサした外観、水疱形成、および創傷治癒の低下である。老化の目に見える外観（特に、顔面のしわ、およびひだ）は、患者がこれを低減しようと試みる、一般的な影響である。顔面の筋、しわ、およびひだの治療における選択肢には、外科手術、神経毒、充填物、レーザー、非切除的治療、マイクロダーマブレーション（ｍｉｃｒｏｄｅｒｍａｂｒａｓｉｏｎ）、およびケミカルピールが含まれる。これらの治療の多くは、老化の徴候の治療において、安全性、効果、および効果期間が異なる。本明細書に説明する製剤は、皮膚中の細胞を刺激して、増殖させ、分裂させることによって、細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）の生産を増加させることによって、および／または、皮膚の改善に多元的な効果がある場合があり、既存の細胞外マトリックスの再組織化を刺激することによって、作用する場合がある。
【図１−１】
2013536252.tif 000004
【図１−２】
2013536252.tif 000005
【図１−３】
2013536252.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月15日(2013.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含み、
前記賦形剤は、前記調整培地、または前記調整培地の材料と混合されて形成される、製剤。
【請求項２】
ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記線維芽細胞は、複数回継代して、前記調整培地を生成する、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
前記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、請求項３記載の製剤。
【請求項５】
前記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、請求項１記載の製剤。
【請求項６】
前記製剤が、少なくとも８０％の集密度で前記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地から得られる材料を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項７】
自己局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含む自己局所製剤を製造する方法であって、
前記培地で前記線維芽細胞を培養することと、前記賦形剤を、前記調整培地または前記調整培地の材料と混合して、局所製剤を製造することと、を含む、
前記方法。
【請求項８】
前記製剤は、ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞は、複数回継代して、前記調整培地を生成する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が、少なくとも８０％の集密度で前記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記調整細胞培養培地を乾燥して、前記賦形剤と混合された材料を製造する、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
皮膚を治療するための製剤であって、該製剤は、請求項１から６のいずれか一項に記載の真皮線維芽細胞を培養することによって得られた調整培地を含み、該製剤は、局所的に投与されることを特徴とする、製剤。
【請求項１５】
請求項１４記載の製剤であって、有効量で投与されると、傷跡または老化の徴候を低減することを特徴とする、製剤。
【請求項１６】
請求項１４記載の製剤であって、有効量で投与されると、肌質を改善することを特徴とする、製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
または、製品の同種異型は、一般人の使用のために、同様の製造工程を用いて、大量生産されてもよい。この型の製品において、スクリーニングされたドナーは、線維芽細胞の増殖、およびマスターセルバンク（ＭＣＢ）の形成のために、組織を提供する。適切な試験がＭＣＢにおいて行われた後、マスターバンクから増殖させた細胞を使用して、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を形成し、次に、これを、同種異型の局所用製品の製剤に使用される調整培地の製造のために増殖させる。製造工程は、自己工程に類似し、同じ用途であり、局所用製品のすべての最終製剤は、同じ濃度範囲内にある。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含み、
上記賦形剤は、上記調整培地、または上記調整培地の材料と混合されて形成される、製剤。
（項目２）
ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、項目１記載の製剤。
（項目３）
上記線維芽細胞は、複数回継代して、上記調整培地を生成する、項目１記載の製剤。
（項目４）
上記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、項目３記載の製剤。
（項目５）
上記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、項目１記載の製剤。
（項目６）
上記製剤が、少なくとも８０％の集密度で上記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地から得られる材料を含む、項目１記載の製剤。
（項目７）
自己局所製剤であって、
局所用賦形剤と、
生検を実施した、意図されたレシピエントから得られた自己線維芽細胞、または培養前に、疾患および適合性のスクリーニングされた１人以上のヒトから得られた線維芽細胞を培養することによって得られる、調整培地と、を含む自己局所製剤を製造する方法であって、
上記培地で上記線維芽細胞を培養することと、上記賦形剤を、上記調整培地または上記調整培地の材料と混合して、局所製剤を製造することと、を含む、
上記方法。
（項目８）
上記製剤は、ゲル、軟膏、ローション、乳濁物、クリーム、泡、ムース、液体、スプレー、懸濁剤、分散剤、およびエアゾールからなる群より選択される、項目７記載の方法。
（項目９）
上記線維芽細胞は、複数回継代して、上記調整培地を生成する、項目７記載の方法。
（項目１０）
上記線維芽細胞が、４０％の集密度に達した後に、継代される、項目７記載の方法。
（項目１１）
上記自己線維芽細胞が、３個の３ｍｍ穿孔皮膚生検材料から得られる、項目７記載の方法。
（項目１２）
上記製剤が、少なくとも８０％の集密度で上記細胞が増殖される、１．５リットルの調整細胞培養培地を含む、項目７記載の方法。
（項目１３）
上記調整細胞培養培地を乾燥して、上記賦形剤と混合された材料を製造する、項目７記載の方法。
（項目１４）
項目１から６のいずれか一項に記載の真皮線維芽細胞を培養することによって得られた調整培地の製剤を、局所的に投与することを含む、皮膚を治療するための方法。
（項目１５）
上記製剤を有効量投与して、傷跡または老化の徴候を低減させる、項目１４記載の方法。
（項目１６）
上記製剤を有効量投与して、肌質を改善させる、項目１４記載の方法。
【国際調査報告】
2013536252.tif 000007
2013536252.tif 000008
2013536252.tif 000009