(57)【要約】本発明は、対象における眼疾患の処置の為の方法及び医薬組成物に関する。より特には、本発明は、対象における眼疾患を処置する為の方法であって、i) エコー造影剤マイクロバブル及び関心のある治療用核酸を処方された医薬組成物を該対象の毛様体筋内に送達すること、及び、ii)該医薬組成物が送達された領域を超音波に曝して、該毛様体筋内に該関心のある治療用核酸のトランスフェクションを誘発することからなる工程を含む、前記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における眼疾患を処置する為の方法において使用する為の、エコー造影剤マイクロバブル及び関心のある治療用核酸を処方された医薬組成物であって、該方法が、i)該医薬組成物を該対象の毛様体筋内に送達すること、及び、ii)該医薬組成物が送達された領域を超音波に曝して、該毛様体筋内への該関心のある治療用核酸のトランスフェクションを誘発することからなる工程を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
該関心のある治療用核酸が、デオキシリボ核酸（DNA）分子又はリボ核酸（RNA）分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該関心のある治療用核酸が、ベクター、例えばプラスミド、に挿入されている、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該関心のある核酸が、酵素、血液派生物、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症性因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼのインヒビター、アポトーシスのレギュレーター、凝固因子、それらのレセプター、特には可溶性レセプター、レセプター若しくは接着タンパク質のアゴニスト若しくはアンタゴニストであるペプチド、抗原、抗体、それらの断片又は誘導体、及び細胞の他の必須成分から成る群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該マイクロバブルのシェルが、ポリマー又は、リン脂質及びフッ素化脂質を包含する脂質からなる群から選ばれる界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該マイクロバブル中に入れられるガスが、フッ化炭素化合物、好ましくは、パーフルオロアルカン、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン, パーフルオロペンタン, パーフルオロヘキサン又はパーフルオロヘプタンなど; パーフルオロアルケン、例えばパーフルオロプロペン, パーフルオロブテン, パーフルオロブタジエン, パーフルオロペンテン又はパーフルオロ-4-メチルペント-2-エンなど; パーフルオロアルキン、例えばパーフルオロブト-2-インなど; 及び、パーフルオロシクロアルカン、例えばパーフルオロシクロブタン, パーフルオロメチルシクロブタン, パーフルオロジメチルシクロブタン,  パーフルオロトリメチルシクロブタン,パーフルオロシクロペンタン, パーフルオロメチルシクロペンタン, パーフルオロジメチルシクロペンタン, パーフルオロシクロヘキサン, パーフルオロメチルシクロヘキサン又はパーフルオロシクロヘプタンなど、から選ばれるパーフルオロカーボンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
超音波が、0.5 W/cm2〜5 W/cm2の出力強度Isataを有する800kHz〜3MHzの超音波シグナルを与える超音波装置によって送達される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該眼疾患が、眼増殖性疾患、眼神経変性疾患、緑内障、眼感染疾患、眼炎症性疾患、例えば結膜炎、角膜炎、内皮炎、ぶどう膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ぶどう膜炎、及び炎症性視神経症など、網膜変性、特には網膜色素変性、周辺部網膜変性、黄斑変性、例えば乾燥加齢黄斑変性など、虚血性網膜症、特には未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症など、網膜血管疾患、眼虚血症候群及び他の血管異常、脈絡膜の異常及び腫瘍、硝子体異常、グリア増殖、例えば増殖性硝子体網膜症及び糖尿病性網膜前血管新生を伴うグリア細胞増殖など、からなる群から選ばれるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における眼疾患の処置の為の方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物療法を用いて失明に至る眼疾患、例えば加齢性黄斑変性症及び糖尿病性網膜症、を処置するための興奮させる新たな進歩がある。
【０００３】
治療用タンパク質の繰り返しの硝子体内注入が、治療用タンパク質の眼内送達経路として、急速に頻度を増している。硝子体内注入は一般に実施されており、及び、よく忍容されるが、それらは、まれであるが重度の合併症リスク、例えば網膜病変、白内障形成、及び眼感染症、を伴う。頻繁に繰り返される注入の乏しいコンプライアンスがより問題である。硝子体内注入の頻度を減少する為の革新的方法が広範に探索されている。
【０００４】
遺伝子治療は眼の疾患にとって最適な選択肢であり、及び特には、非ウィルス性遺伝子ベクターが、免疫原性、毒性、及び発がん遺伝子配列の挿入のリスクを伴うウィルスベクターの制限に注意を払わない為に有望である。さらに、非ウィルスベクターは、治療用タンパク質の投与量の管理にとってより適切であり、これは、そのような治療因子の効率及び特異性にとって必須の因子でありうる。例えば、眼組織は、インビボ遺伝子導入のための最近開発されたターゲットである。この文脈において、Behar-Cohenら(2006)は、遺伝子送達のための標的組織として及び透光体（房水及び硝子体液）中への治療用タンパク質の産生の為の貯留容器として毛様体筋をはじめて用いてラットの眼における新規インビボエレクトロトランスファー（ET）技術を開発した(国際公開第2006123248号パンフレット)。その効率は、眼の炎症（ブドウ膜炎）の２つのラットモデルにおけるTNFレセプターの眼内産生の効果を評価することにより示された（Bloquel  C  et  al.  Plasmid  electrotransfer  of  eye  ciliary  muscle:  principles  and  therapeutic  efficacy  using  hTNF-alpha  soluble  receptor   in  uveitis.  FASEB  J.  2006;  20:  389-391.;  Kowalczuk  L  et  al.  Local  ocular  immunomodulation  resulting  from  electrotransfer  of  plasmid  encoding  soluble  TNF  receptors  in  the  ciliary  muscle.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  2009;  50:  1761-1768.;  ouchard  E  et  al.  Effects  of  ciliary  muscle  plasmid  electrotransfer  of  TNF-α  soluble  receptor  variants  in  experimental  uveitis.  Gene  Ther  2009;  16:  862-873.）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
毛様体筋へのエレクトロトランスファーは遺伝子導入の有効な物理的方法であるけれども、それは、電気パルスを送達する為に標的組織への侵襲性針電極配置を要求する。従って、より侵襲性でない方法についてのニーズが当技術分野においてある。商用的なマイクロバブルと組み合わされた低強度超音波曝露が、レポーター遺伝子の筋内送達後に、毛様体平滑筋への遺伝子導入を増加することができるかどうかの研究は以前にない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対象における眼疾患を処置するための方法であって、i)エコー造影剤マイクロバブルと関心のある治療用核酸とを処方された医薬組成物を該対象の毛様体筋へ送達すること、及びii)該医薬組成物が送達された領域を超音波にさらして、該関心のある治療用核酸の該毛様体筋へのトランスフェクションを誘発することからなる工程を含む前記方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らの目的は、透光体（ocular  media）中への治療用タンパク質の分泌についての可能性を有すると以前に示された毛様体筋に特異的に形質移入する為に、市販入手可能なエコー造影剤マイクロバブル（MB）と組み合わされた低強度超音波（US）を用いることの実行可能性を評価することであった。それ故に、Gaussiaルシフェラーゼをコードし且つLacZ遺伝子を有するレポータープラスミドDNA単独又は５０％エコー造影マイクロバブル(Artison)と混合された当該レポータープラスミドDNAが、ラットの眼の毛様体筋に、超音波曝露(1 MHz、2W/cm2  Isata、２分間、50%デューティーサイクル)有り又は無しで、注入された。形質移入の７日後に、透光体中のルシフェラーゼ活性は、US単独で処置された眼又は該プラスミド注入だけを受けた眼と比較したときに、プラスミドを注入され且つMB及びUSにより処理された眼において、有意により高かった。マイクロバブルを加えたUSは、対照のUS処理されていない眼と比べて、発光の2.6倍の増加を示した(p < 0.023)。形質移入の３０日後、ルシフェラーゼ活性の有意な減少が、各実験群において観察された。組織化学的染色は、毛様体領域におけるβガラクトシダーゼ発現を示したが、プラスミド注入部位に限定されなかった。従って、本発明者らははじめて、透光体内における分泌されるタンパク質の眼内産生の為の、眼組織における超音波及びマイクロバブルにより媒介された遺伝子導入のインビボでの実行可能性を示す。これらの結果は、USと組み合わされたマイクロバブルが、毛様体筋細胞を形質移入する為に効率的に用いられうること、及び、それ故に、眼疾患の処置の為に用いられうることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
すなわち、本発明は、対象における眼疾患の処置の為のそのような方法の使用に関する。
【０００９】
より特には、本発明は、対象における眼疾患を処置するための方法であって、i)エコー造影剤マイクロバブル及び関心のある治療用核酸を処方された医薬組成物を該対象の毛様体筋内に送達すること、及びii)該医薬組成物が送達された領域を超音波にさらして、該関心のある治療用核酸の該毛様体筋への形質移入を誘発することからなる工程を含む、前記方法に関する。
【００１０】
本発明において用いられるべき核酸は、生物学的特性を示す関心のある任意の核酸であってよい。より特には、該核酸は、生物学的活性を示す天然の、切り取られた、人工の、キメラの、又は組み換えの産物（例えば、関心のあるポリペプチド（タンパク質又はペプチドを包含する）、RNA等）をコードする任意の核酸でありうる。
【００１１】
該核酸は、好ましくは、デオキシリボ核酸（DNA）分子（ｃDNA、ｇDNA、合成DNA、人工DNA、組み換えDNA等）又はリボ核酸（RNA）分子（mRNA、tRNA、RNAi、RNAsi、触媒的RNA、アンチセンスRNA、ウィルスRNA等）である。該核酸は、一本鎖又は複数鎖の核酸、好ましくは二本鎖核酸であってよく、又は複合体化されうる。該核酸は、ハイブリッド配列又は合成の若しくは半合成の配列を含みうる。それは、当技術分野の当業者に既知の任意の技術により得られてよく、及び、特には、スクリーニングライブラリーにより、化学的合成により、又は代替的にはスクリーニングライブラリーにより得られた配列の化学的若しくは酵素的修飾を含む混合方法により得られうる。
【００１２】
特定の実施態様において、該治療用核酸は、合成由来又は生合成由来のものであり、又は、ウィルスから抽出されたもの、又は単細胞の若しくは多細胞の真核生物若しくは原核生物から抽出されたものである。
【００１３】
本発明において用いられる該治療用核酸は、該毛様体筋に投与されるときに、裸のものであってよく、任意の化学的、生化学的若しくは生物学的剤に複合体化されていてよく、ベクターに挿入されていてよい。
【００１４】
本明細書内において用いられるときに、語「裸のDNA」は、該DNAの送達又は形質移入を改善し又は該細胞へのその侵入を促進する合成的、生合成的、化学的、生化学的、又は生物学的な剤に組み合わされていない任意の核酸分子をいう。
【００１５】
本明細書内において用いられるときに、語「ベクター」は、結合されている他の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。この語はまた、本願において、任意の送達キャリア、例えばその細胞送達を増すために治療的又は予防的核酸に関連付けられた組成物、をいう。
【００１６】
好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律的な複製及び／又は発現が可能であるものである。ベクターが動作可能に連結された遺伝子の発現を指図することが可能であるベクターは、本明細書内において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形にあり、これは、それらのベクター形態において、染色体に結合されていない環状二本鎖DNAループをいう。本発明において、該プラスミドが、最も一般的に用いられるベクター形態である。該プラスミドは、本発明に従う裸のDNAの好ましい形である。
【００１７】
ベクターは、また、エピソームDNA、酵母人工染色体、ミニ染色体、又はウィルスベクターであってよく、ここで該ウィルスベクターは、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及びウィルス様ベクターからなる群から選ばれる。
【００１８】
該ベクターはまた、脂質小胞、例えばリポソーム、でありうる。リポソームでない、脂質に基づく化合物がさらに、用いられうる。例えば、リポフェクチン及びサイトフェクチン（cytofectin）は、負に荷電した核酸に結合し及び細胞膜を横切ってDNAを運ぶことができる複合体を形成する、脂質に基づく陽イオンである。本発明は、同等の機能に従事し及び当技術分野で知られている本明細書以下の発現ベクターの他の形のものを包含することが意図される。
【００１９】
加えて、本発明に従う核酸は、１又はそれより多くの追加の領域、例えば当業者に利用可能である小さい又は大きいサイズの制御エレメント、例えばプロモーター領域（構成的なもの、制御されたもの、誘発可能なもの、組織特異的なものなど）、例えば毛様体筋における発現を許し及び／又は促進する配列、転写終結シグナル、分泌配列、複製起点、及び／又は核局在シグナル（nls）配列（これはさらに細胞核へのポリヌクレオチド移行を増す）、を含みうる。そのようなnls配列は、先行文献に記載されており、SV40  large  T抗原配列を含む。
【００２０】
追加的に、該核酸はさらに、核酸移転結果（どの組織への移転か、発現の期間等）を選択し、測定し、及びモニターすることにおいて有用な選択可能マーカーを含みうる。使用されうる又は使用の為に適合されうる発現系及びレポーター遺伝子の種類は当技術分野でよく知られている。例えば、ルシフェラーゼ活性、アルカリホスファターゼ活性、又は緑色蛍光タンパク質活性をコードする遺伝子が一般に用いられる。
【００２１】
本発明に従う核酸は、任意のサイズの任意のヌクレオチド配列を含みうる。該核酸はすなわち、簡単なオリゴヌクレオチドからより大きな分子まで、サイズにおいて変化してよく、例えば任意のサイズ（小さい又は大きい）のエキソン及び／又はイントロン及び／又は制御エレメント、任意のサイズ、例えば大きなサイズ、の遺伝子、又は、例えば染色体を含むヌクレオチド配列であってよく、及び、プラスミド、エピソーム、ウィルスゲノム、ファージ、酵母人工染色体、ミニ染色体、アンチセンス分子でありうる。
【００２２】
特に好ましい実施態様において、該ポリヌクレオチドは、生物学的活性を有する産物をコードする二本鎖環状DNA、例えばプラスミド、である。
【００２３】
該核酸は、慣用の組み換えDNA技術、例えば増幅、原核の又は真核の宿主細胞における培養、精製、に従い調製され及び産生されうる。組み換えDNAテクノロジーの技術は、当技術分野の当業者に知られている。
【００２４】
特定の実施態様において、関心のある該核酸は、眼の細胞に対する有益な効果を発揮することができる。内因性物質の欠乏を補い又は内因性物質の過剰を減少しうる。代替的に、それは、該細胞に新たな特性を与えうる。それは例えばアンチセンス配列又は、ポリペプチドをコードする核酸であってよく、これは眼の細胞の機能、形態学、活性及び／又は代謝に影響しうる。
【００２５】
アンチセンス核酸を用いる遺伝子発現下方制御は、翻訳レベル又は転写レベルで達成されうる。本発明のアンチセンス核酸は好ましくは、眼の内因性活性物質をコードする核酸又は対応するメッセンジャーRNAと特異的にハイブリダイズすることができる核酸断片である。これらのアンチセンス核酸は、任意的にそれらの安定性及び選択性を改善する為に任意的に修飾された、合成オリゴヌクレオチドでありうる。また、それらは、DNA配列であってよく、その該細胞内での発現が、内因性の眼の活性物質をコードするｍRNAの全部または一部と相補的なRNAを産生する。アンチセンス核酸は、内因性の眼の活性物質を、逆向きでコードする核酸の全部又は一部の発現により調製されうる。アンチセンス配列が該眼の内因性活性物質の発現を下方制御する又はブロックすることができる限り、アンチセンス配列のいずれの長さも本発明の実施に適している。好ましくは、該アンチセンス配列は、少なくとも20ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸、アンチセンスRNAをコードするDNAの調製及び使用並びにオリゴ及び遺伝子的アンチセンスの使用は、国際公開第92/15680号パンフレットにおいて開示されており、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２６】
上記で記載されたとおりの核酸により任意的に発現される、又は、生物学的に活性な剤として使用可能であり及び本発明の実施に適切な該生物学的に活性なポリペプチド又はタンパク質は、酵素、血液派生物、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症性因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼのインヒビター、アポトーシスのレギュレーター、凝固因子、それらのレセプター、特には可溶性レセプター、レセプター若しくは接着タンパク質のアゴニスト若しくはアンタゴニストであるペプチド、抗原、抗体、それらの断片又は誘導体、及び該細胞の他の必須成分を包含する。
【００２７】
種々の網膜由来神経栄養因子が、変性する光受容細胞を救う能力を有し、及び、本発明に従う方法により送達されうる。好ましい生物学的に活性な剤は、VEGF, アンジオゲニン, アンジオポエチン−1 , DeM, 酸性又は塩基性線維芽細胞成長因子 (aFGF及びbFGF), FGF-2, フォリスタチン, 顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF), 肝細胞増殖因子 (HGF), 分散因子 (SF), レプチン, ミッドカイン, 胎盤増殖因子 (PGF), 血小板由来内皮細胞増殖因子 (PD- ECGF), 血小板由来増殖因子−BB (PDGF−BB), プレイオトロフィン (PTN), RdCVF (桿体由来錐体生存能力因子（Rod-derived Cone Viability Factor）), プログラニュリン, プロリフェリン, 形質転換成長因子−α (TGF-α), 形質転換成長因子−β(TGF-β), 腫瘍壊死因子−α (TNF−α), 血管内皮成長因子(VEGF), 血管透過性因子 (VPF),CNTF, BDNF, GDNF, PEDF, NT3, BFGF, アンジオポエチン, エフリン, EPO, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT5, Gax, 成長ホルモン, [α]−1−アンチトリプシン, カルシトニン, レプチン, アポリポタンパク質, ビタミン、ホルモン又はニューロメディエーター（neuromediator）の生合成の為の酵素, ケモカイン, サイトカイン、例えばIL-1 , IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, それらのレセプター, 該レセプターのいずれかをブロックする抗体, TIMP、例えばTIMP-1 ,TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, アンジオアレスチン（angioarrestin）, エンドスタチン、例えばエンドスタチンXVIII及びエンドスタチンXV, ATF, アンジオスタチン, エンドスタチン及びアンジオスタチンの融合タンパク質, マトリックスメタロプロテイナーゼ−２のC末端ヘモペキシンドメイン, ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン, エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとの融合タンパク質, 胎盤リボヌクレアーゼインヒビター, プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター, 血小板因子−4 (PF4), プロラクチン断片, プロリフェリン関連タンパク質 (PRP), 抗血管新生アンチトロンビンIII, 軟骨由来インヒビター（Cartilage-Derived Inhibitor (CDI)）, CD59補体断片, バスキュロスタチン（vasculostatin）, バソスタチン(カルレティキュリン断片), トロンボスポンジン, フィブロネクチン, 特にはフィブロネクチン断片gro−β, ヘパリナーゼ, ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG), インターフェロンα／β／γ, インターフェロン誘発性タンパク質 (IP-10), インターフェロンにより誘発されたモノカイン (Mig), インターフェロンα誘発性タンパク質10 (IP10), MigとIP10との融合タンパク質, 可溶性Fms様チロシンキナーゼ1 (FLT-1)レセプター, キナーゼ挿入ドメインレセプター (KDR), アポトーシスの制御因子、例えばBcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, Bcl-X ショートアイソフォーム及びGax, それらの断片又は誘導体及び同様物から選択されうる。
【００２８】
特定の実施態様において、該核酸は、TNFαレセプター, TGFβ2レセプター, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CCR2、又はMIP1の可溶性断片をコードする。該核酸はまた、他の好ましい実施態様において、抗体、一本鎖抗体の可変断片（ScFv）、又は、免疫治療の目的の為の認識能力を有する任意の他の抗体断片をコードする。
【００２９】
本発明の特定の実施態様において、該生物学的に活性な核酸は、本発明において使用可能な治療タンパク質、例えば上記で記載されたもの、の前駆体をコードする。
【００３０】
さらに、本発明の他の実施態様において、異なる生物学的に活性な複数の産物類をコードする複数の核酸の混合物が用いられうる。この変異体は、該眼細胞における種々の産物の共発現を許す。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、ガスコアを閉じこんだシェルから構成されるエコー造影剤マイクロバブルを含む。典型的には、該マイクロバブルは、0.1〜10ミクロンの直径を有するが、この特徴は、限定するものとして考えられるべきでなく、そしてそれ故に、l0ミクロン超の直径又は0,1ミクロン未満の直径を有するマイクロバブルも本発明に包含される。
【００３２】
本明細書内において用いられるときに「エコー造影剤マイクロバブル」は、気体を有する内部空間を囲む、略球形の形を有するシェルを有するミクロスフィアをいう。本明細書内において言及されるマイクロバブル「シェル」は、マイクロバブルの該内部空間を囲む膜をいい、及び、語「ガス」は、本明細書内において用いられるときに、室温及び標準大気圧気相にあり又は約70℃若しくはそれより低い遷移温度で気相への相変化を受けうる、低毒性の物質を示す。
【００３３】
超音波造影剤としてのマイクロバブルを形成するための組成物及び方法は、当技術分野でよく確立されている。それ故に、当技術分野の当業者は、本発明において用いられるマイクロバブルを形成するための材料及び方法を知っている。マイクロバブルの調製の為の手順の例が、米国特許第4,446,442号明細書, 米国特許第4,684,479号明細書, 米国特許第4,718,433号明細書, 米国特許第5,088,499号明細書, 米国特許第5, 123,414号明細書, 米国特許第5,271,928号明細書, 米国特許第5,413,774号明細書, 米国特許第5,445,813号明細書, 米国特許第5,556,610号明細書, 米国特許第5,597,549号明細書, 米国特許第5,686,060号明細書, 米国特許第5,773,527号明細書, 米国特許第5,798,091号明細書, 米国特許第5,827,504号明細書, 米国特許第6,217,850号明細書, 米国特許第6,416,740号明細書, 米国特許第6,443,898号明細書, 及び欧州特許第0458745号明細書に記載されており、これらの全体の開示が引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００３４】
マイクロバブルシェルは、マイクロバブルの該内部空隙を囲む膜である。マイクロバブルシェルは典型的には、約10〜約200 nmの厚さであり、及び、該ガスコアの破壊及び拡散を防ぐことに役立つ。該マイクロバブルシェルは典型的には、界面活性剤又はポリマーを含む。マイクロバブル調製における使用の為に適した界面活性剤は、該ガスと、該マイクロバブルを含む該媒体、通常は水性媒体、との間の界面で層を形成することによってマイクロバブルの形成及び維持を助ける任意の化合物又は組成物を包含する。該界面活性剤は、一つの化合物を含んでよく、又は、化合物の組み合わせを含んでもよい。該マイクロバブルの形成を促進することができる広い範囲の化合物が本発明において用いられうることが、当技術分野の当業者によって理解される。最適な界面活性剤は、過度の実験を要求しない実証研究により決定されうる。本発明の技術分野の当業者は、生体適合性などの特性に基づいて、適切な界面活性剤を選択するであろう。好ましい界面活性剤は、リン脂質及びフッ素化脂質を包含する脂質を包含する。使用されうる脂質は、脂肪酸; リゾ脂質(lysolipids); ホスファチジルコリン;ジオレオイルホスファチジルコリン,ジミリストイルホスファチジルコリン, ジペンタデカノイルホスファチジルコリン, ジラウロイルホスファチジルコリン, ジオレオイルホスファチジルコリン, ジパルミトイルホスファチジルコリン, 及びジステアロイルホスファチジルコリンを含む; ホスファチジルエタノールアミン,ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む; ホスファチジルセリン; ホスファチジルグリセロール; ホスファチジルイノシトール; スフィンゴ脂質; スフィンゴミエリン; 糖脂質; ガングリオシドGM1 ; ガングオシドGM2; グルコリピド; スルファチド; グリコスフィンゴリピド; ホスファチジン酸; パルミチン酸; ステアリン酸; アラキドン酸; オレイン酸; ポリマー含有脂質、例えばポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸、又はポリビニルピロリドン; スルホン化モノ−、ジ−、オリゴ−、又はポリサッカリド含有脂質; コレステロール, コレステロールサルフェート; コレステロールヘミサクシネート（cholesterol hemisuccinate）; トコフェロールヘミサクシネート, エーテル及びエステル−結合脂肪酸を有する脂質, 重合化脂質, ジアセチルホスフェート, ステアリルアミン, カルジオリピン, 6〜8炭素長の短鎖脂肪酸を有するホスホリピド, 非対称アシル鎖を有する合成ホスホリピド, 6-(5-コレステン-3p-イルオキシ)-l-チオ-(3-D-ガラクトピラノシド, ジガラクトシルジグリセリド, 6-(5-コレステン-3(3イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ-6-デオキシ-l-チオ-(3-D-ガラクトピラノシド, 6-(5-コレステン-3(3-イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ-6-デオキシル(deoxyl)-lチオ-a-D-マンノピラノシド, 12-(((7'ジエチルアミノクマリン-3-イル)カルボニル)メチルアミノ) オクタデカン酸; N-[12-(((7'-ジエチルアミノクマリン-3-イル) カルボニル)メチルアミノ)オクタデカノイル]-2-アミノパルミチン酸; コレステリル(4'-トリメチルアンモニオ)ブタノエート; N- サクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン; 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール; l,2-ジパルミトイル-sn-3-サクシニルグリセロール; 1,3-ジパルミトイル-2-サクシニルグリセロール; 1-ヘキサデシル-2-パルミ��イルグリセロホスホエタノールアミン; パルミトイルホモシステイン; 及びそれらの組み合わせ; ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド, セチルトリメチルアンモニウムブロミド, ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド, アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド, ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド, ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムブロミド, ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド, セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド, セチルピリジニウムブロミド; ペンタフルオロオクタデシルヨージド, パーフルオロオクチルブロミド, パーフルオロデカリン, パーフルオロドデカリン, パーフルオロオクチルヨージド, パーフルオロトリプロピルアミン, 及びパーフルオロトリブチルアミンを包含する。本発明における使用の為に有用なポリマーは、タンパク質、特にはアルブミン、特にはヒト血清アルブミン、及び他の生体適合性ポリマー（ポリシアノアクリレート及びポリ(t-ブチルオキシカルボニルメチル)グルタメートを包含する）を包含する。該マイクロバブルシェルの性質は、該マイクロバブルの柔軟性、超音波の効果、及び特異的な細胞タイプへの結合特性を決定する。
【００３５】
マイクロバブルに所望の特徴を与える為に、追加的な成分が任意的に該マイクロバブルシェルに含まれうる。該マイクロバブルは、該マイクロバブル膜に含まれる又は該マイクロバブル膜に結合されたリガンド又はターゲティング分子を含んでよく、ここで該リガンド又はターゲティング分子は、標的表面又は組織に結合する。例えば米国特許第6,245,318号明細書; 米国特許第6,264,917号明細書; P.  A.  Dayton,  et  al.,  "Targeted  imaging  using  ultrasound,"  J.  of  Magn.  Reson.  Imaging,  2002,  16(4),  362-77;  S.  H.  Bloch,  et  al,  "Targeted  imaging  using  ultrasound  contrast  agents,"  IEEE  Engineering  in  Medicine  and  Biology  Magazine,  2004,  23(5),  18-29;  A.  Klibanov,  et  al,  米国特許出願公開第2005/0260189号明細書を参照されたい。これらの全体の開示が引用することにより本明細書内に組み込まれる。そのようなターゲティング物質をそれらのシェル内に入れているマイクロバブルは、本発明の範囲内に包含される。包含されうるそのようなターゲティング分子の例は、抗体及び抗体断片、細胞接着分子、それらの受容体、サイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、ペプチド模倣物、及びそれらの断片; 細胞接着分子、サイトカイン、成長因子、及びペプチドホルモンについての受容体の非ペプチドアゴニスト／アンタゴニスト又は非生物活性バインダー; オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチド; プロテアーゼ基質又はインヒビター; 生物学的レセプターの小分子リガンド; 不活化プロテアーゼを包含する。該リガンド又はターゲティング分子がバイオポリマーである場合、及び本発明の方法及び組成物がヒトにおいて用いられる場合、該分子は、好ましくは、免疫原性の可能性を減少する為にヒトに由来するものである。
【００３６】
該マイクロバブル中の封入の為のガスの代表的なクラスは、すなわち、一般的なガス、例えば空気; 窒素; 酸素; 二酸化炭素; 水素; 不活性ガス、例えばヘリウム, アルゴン, キセノン又はクリプトン; フッ化硫黄, 例えば六フッ化硫黄, 十フッ化二硫黄又は五フッ化トリフルオロメチル硫黄（trifluoromethylsulphur  pentafluoride）; 六フッ化セレン; 任意的にハロゲン化されたシラン、例えばメチルシラン又はジメチルシラン; 低分子量炭化水素(例えば、最大で7の炭素原子を含む), 例えばアルカン、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン又はペンタン、シクロアルカン、例えばシクロプロパン、シクロブタン又はシクロペンタン、アルケン、例えばエチレン、プロペン、プロパジエン又はブテン、及びアルキン、例えばアセチレン又はプロピン; エーテル、例えばジメチルエーテル; ケトン; エステル; ハロゲン化低分子量炭化水素 (例えば、最大で7の炭素原子を含む); 及びそれらの混合物を包含する。有利には、ハロゲン化気体中のハロゲン原子の少なくともいくつかがフッ素であり; 例えばブロモクロロジフルオロメタン, クロロジフルオロメタン, ジクロロジフルオロメタン, ブロモトリフルオロメタン, クロロトリフルオロメタン, クロロペンタフルオロエタン, ジクロロテトラフルオロエタン, クロロトリフルオロエチレン, フルオロエチレン, フッ化エチル, 1, 1-ジフルオロエタン及びパーフルオロ炭素である。他のハロゲン化ガスは、塩化メチル、フッ素化（例えば過フッ素化）ケトン、例えばパーフルオロアセトン、及びフッ素化（例えば過フッ素化）エーテル、例えばパーフルオロジエチルエーテル、及びチオエーテル、例えばトリフルオロメチルサルファイドを包含する。本発明において用いられうるガスの特定の例は: 空気, アレン, アルゴン, ブロモクロロフルオロメタン, ブロモクロロジフルオロメタン, ブロモジフルオロメタン, ブロモフルオロメタン, 3-ブロモ-l-ペンテン, ブロモトリフルオロメタン, 1,2-ブタジエン, 1,3-ブタジエン, 1-ブテン, 2-ブテン, 1-ブチン, 2-ブチン, 二酸化炭素, 硫化カルボニル, 1-クロロ-1,1-ジフルオロエタン, 2-クロロ-l,l-ジフルオロエタン, l-クロロ-1,1,2,2-テトラフルオロエタン, クロロシクロペンテン, クロロジフルオロメタン, クロロジフルオロニトロメタン, クロロエタン, クロロフルオロメタン, 2-クロロ-l,l,1,4,4,4ヘキサフルオロブチン, 1-クロロ-1,1,2,2,2-ペンタフルオロエタン, 1-クロロ-l,2,2,2-テトラフルオロエタン, クロロトリフルオロメタン, シクロブタン, シクロプロパン, 1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-デカフルオロペンタン, ジブロモジフルオロメタン, l,2-ジブロモ-l,l,2,2-テトラフルオロメタン, 1,1-ジクロロジアセチレン, 1,1-ジクロロ-2,2ジフルオロエチレン, 1,2-ジクロロ-l,2-ジフルオロエチレン, ジクロロジフルオロメタン,1,1-ジクロロエタン, 1,1-ジクロロエチレン, ジクロロフルオロメタン, 1,1-ジクロロ-l-フルオロエタン, 1,1-ジクロロ-l,2,2,2-テトラフルオロエタン, 2,2-ジクロロ-l,1,1-トリフルオロエタン, 1,1-ジフルオロエタン, 1,2-ジフルオロエタン, 1,2-ジフルオロエチレン, ジフルオロメタン, 2,2-ジフルオロプロパン, 1,1-ジメチルシクロプロパン, 1,2-ジメチルシクロプロパン, ジメチルエチルアミン, 2,3-ジメチル-2-ノルボルナン, 2,2-ジメチルプロパン, エタン, エチルシクロプロパン, 3-エチル-3-メチルジアジリジン, エチルビニルエーテル, フルオロエタン, 1-フルオロブタン, ヘリウム, 1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン, ヘキサフルオロ-1,3ブタジエン, 1,1,1,2,3,3-ヘキサフルオロ-2,3-ジクロロプロパン, 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロプロパン, ヘキサフルオロ-2-メチル-l-ブテン, 1,1,1,2,2,3-ヘキサフルオロプロパン, ヘキサフルオロプロピレン, ヨードトリフルオロメタン, クリプトン, 3-メチル-l-ブテン, 2-メチル-lブテン-3-イン, 3-メチル-1-ブチン, メチルシクロブタン, メチルシクロプロパン, イソプロピルアセチレン, メタン, 2-メチル-l,3-ブタジエン, 2-メチル-ブタン, メチルエーテル, メチルイソプロピルエーテル, メチルラクテート, 亜硝酸メチル, 硫化メチル, メチルビニルエーテル, ネオン, 窒素, 亜酸化窒素, l-ノネン-3-イン, オクタフルオロ-2-ブテン, オクタフルオロシクロブタン, オクタフルオロシクロペンテン, 酸素, 1,4-ペンタジエン, n-ペンタン, 1,1,1,3,3-ペンタフルオロブタン, ペンタフルオロエタン, 1,1,1,3,3-ペンタフルオロプロパン, 1-ペンテン, E-2-ペンテン, Z-2ペンテン, パーフルオロブタン, パーフルオロ-1-ブテン, パーフルオロ-2ブテン, パーフルオロ-2-ブチン, パーフルオロシクロブテン, パーフルオロジメチルアミン, パーフルオロエタン, パーフルオロメタン, パーフルオロヘキサン, パーフルオロペンタン, パーフルオロ-1-ペンテン, パーフルオロプロパン, パーフルオロプロピレン, プロパン, プロペン, プロピン, 六フッ化セレン, 六フッ化硫黄, テトラフルオロアレン, 1,1,1,2-テトラフルオロエタン, 1,1,2,2-テトラフルオロエタン, テトラフルオロメタン, トリクロロフルオロメタン, トリフルオロメチル五フッ化硫黄（trifluoromethyl  sulfur  pentafluoride）, l,l,2-トリクロロ-l,2,2トリフルオロエタン, 1,1,1-トリフルオロエタン, トリフルオロメタン, ビニルアセチレン, ビニルエーテル, 及びキセノン、及びそれらの混合物を包含する。
【００３７】
本発明の好ましいガスは、フッ化炭素化合物であり、以下の化合物を包含する：パーフルオロカーボン、パーフルオロアルカンを含む; ハイドロフルオロカーボン、ハイドロフルオロアルカンを含む; クロロフルオロカーボン、クロロフルオロアルカンを含む; ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロアルカンを含む; 及びハロン (臭素、フッ素、及び任意的に塩素を含むハロアルカン)。パーフルオロカーボン、特にはパーフルオロアルカンが特に好ましい。代表的なパーフルオロカーボンは、パーフルオロアルカン、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えばパーフルオロ-n-ブタン, 任意的に他のアイソマー、例えばパーフルオロ-iso-ブタン、との混合物である), パーフルオロペンタン, パーフルオロヘキサン又はパーフルオロヘプタン; パーフルオロアルケン、例えばパーフルオロプロペン, パーフルオロブテン (例えば、パーフルオロブト-2-エン), パーフルオロブタジエン, パーフルオロペンテン(例えばパーフルオロペント-l-エン) 又はパーフルオロ-4-メチルペント-2-エン; パーフルオロアルキン、例えばパーフルオロブト-2-イン; 及び、パーフルオロシクロアルカン、例えばパーフルオロシクロブタン, パーフルオロメチルシクロブタン, パーフルオロジメチルシクロブタン,  パーフルオロトリメチルシクロブタン,パーフルオロシクロペンタン, パーフルオロメチルシクロペンタン, パーフルオロジメチルシクロペンタン, パーフルオロシクロヘキサン, パーフルオロメチルシクロヘキサン又はパーフルオロシクロヘプタンを包含する。また、６フッ化硫黄も好ましい。これらのガスのうち、パーフルオロプロパン及びパーフルオロブタンが特に好ましく、というのもそれらのヒトにおける眼内注入にとって示された安全性の故である。それらは、網膜剥離を安定化するための眼内注入の為のヒト研究において用いられている。他の不活性ガス、例えば６フッ化硫黄、もまた本発明において有用である。
【００３８】
該ガスは好ましくは、該マイクロバブルシェル内の空間の少なくとも50%を満たし、いくつかの実施態様において、該空間の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を満たす。いくつかの実施態様において、該ガスは、該マイクロバブルシェル内の空間を実質的に満たす。
【００３９】
該界面活性剤に加えて、マイクロバブルの形成の為に又はインビボ使用の為のマイクロバブルの調製の為に、該水性相内に他の剤を入れることが望ましくありうる。そのような剤は、有利には、慣用の粘度調整剤、バッファー、例えばホスフェートバッファー又は他の慣用の生体適合的バッファー、又はｐＨ調整剤、例えば酸又は塩基、及び浸透圧剤（等張性、高浸透圧性、又は低浸透圧性を与えるため）を包含しうる。好ましい溶液は、約7のｐＨを有し及び等張性である。そのような剤の例は、塩化ナトリウム及びスクロースを包含する。例えば、炭水化物及びそれらのリン酸化誘導体及びスルホン化誘導体; ポリエーテル、好ましくは400〜8000の分子量を有するもの; ジ- 及びトリヒドロキシアルカン及びそれらのポリマー、好ましくは800〜8000の分子量を有するものを含むがこれらの限定されない種々の粘度調整剤の添加により、マイクロバブル溶液は安定化されうる。グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコールもまた、本発明における安定化剤として有用でありうる。
【００４０】
任意的に、本発明のマイクロバブルはさらに、１又はそれより多くの物質を封入しうる。非限定的な例は、治療分子又は造影剤を包含する。
【００４１】
造影剤は、常磁性ガス、例えば大気ガス、これは微量の酸素17又は常磁性イオン、例えばMn2+, Gd2+, 及びFe3+、並びに超常磁性粒子 (フェライト、酸化鉄Fe304)を含み及びすなわち磁気共鳴画像法(MRI)の為の感受性造影剤（susceptibility contrast agents）として用いられうる、放射線不透過性金属イオン、例えばヨウ素、バリウム、臭素、又はタングステン、Ｘ線造影剤としての使用の為、及び四極子核からのガス、これは磁気共鳴造影剤としての使用の為の可能性を有しうる、を包含するがこれらに限定されない。
【００４２】
例となる治療用分子は、抗新生物剤、例えばプラチナ化合物（例えばスピロプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン）、メトトレキセート、フルオロウラシル、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、シトシン  アラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えば、PAM、L-PAM又はフェニルアラニンマスタード）、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジンヒドロクロリドダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシンヒドロクロリド、ドキソルビシンヒドロクロリド、タキソール、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンホスフェートナトリウム、フルタミド、リュープロリドアセテート、メゲストロールアセテート、タモキシフェンシトレート、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(m-AMSA)、アスパラギナーゼ (L−アスパラギナーゼ) Erwinaアスパラギナーゼ、エトポシド (VP−16)、インターフェロンa−2a、インターフェロンa−2b、テニポシド (VM−26)、ビンブラスチンサルフェート (VLB)、ビンクリスチンサルフェート、ブレオマイシン、ブレオマイシンサルフェート、メトトレキセート、アドリアマイシン、アラビノシル、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、及びダカルバジン; 有糸分裂阻害剤、例えばエトポシド及びビンカアルカロイド;放射性医薬、例えば放射性ヨウ素及びリン製品; ホルモン、例えばプロゲスチン、エストロゲン、アンチエストロゲン、成長ホルモン、メラニン細胞刺激性ホルモン、エストラジオール、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、ベタメタゾンアセテート及びベタメタゾンナトリウムホスフェート、ベタメタゾン二ナトリウムホスフェート、ベタメタゾンナトリウムホスフェート、コルチゾンアセテート、デキサメタゾン、デキサメタゾンアセテート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、フルニソリド、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンシピオネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェート、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネート、パラメタゾンアセテート、プレドニゾロン、プレドニゾロンアセテート、プレドニゾロンナトリウムホスフェート、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンジアセテート、トリアムシノロンヘキサセトニド、フルドロコルチゾンアセテート、オキシトシン、バソプレシン、及びそれらの誘導体; 抗寄生虫剤、ビタミン、例えばシアノコバラミンレチノイン酸、レチノイド及び誘導体、例えばレチノールパルミテート、及びa−トコフェロール; 酵素を包含するペプチド、例えばマンガンスーパーオキシドジスムターゼ及びアルカリホスファターゼ; 抗アレルギー剤、例えばアンレキサノクス（amelexanox）; 抗凝固剤、例えばフェンプロクモン及びヘパリン; 循環器系作用薬、例えばプロプラノロール; 代謝増強剤（metabolic potentiators）、例えばグルタチオン; 抗結核剤、例えばパラ−アミノサリチル酸、イソニアジド、カプレオ���イシンサルフェートサイクロセリン、エタンブトールヒドロクロリドエチオナミド、ピラジンアミド、リファムピン、及びストレプトマイシンサルフェート; 抗ウィルス剤、例えばアシクロビル、アマンタジンアジドチミジン、 (AZT, DDI, Foscarnet, 又はZidovudine)、リバビリン、及びビダラビンモノハイドレート(アデニンアラビノシド、ara−A); 抗狭心症剤、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、エリトリトールテトラナイトレート、イソソルビドジナイトレート、ニトログリセリン、(グリセリルトリナイトレート)及びペンタエリトリトールテトラナイトレート; 抗生物質、例えばダプソン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セファクロル、セファドロキシル、セファリキシン、セフラジン  エリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ジクロキサシリン、シクラシリン、ピクロキサシリン（picloxacillin）、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ及びペニシリンＶを包含するペニシリン、チカルシリン  リファムピン、及びテトラサイクリン; 抗炎症剤、例えばジフルニサル、イブブロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アスピリン、及びサリチレート; 抗原虫剤、例えばクロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロニダゾール、キニーネ及びアンチモン酸メグルミン; 抗リウマチ剤、例えばペニシラミン; 麻酔剤、例えばプレゴリック; オピエート、例えばコデイン、ヘロイン、メタドン、モルヒネ及びアヘン; 強心性配糖体、例えばデスラノシド、ジギトキシン、ジゴキシン、ジギタリン、及びジギタリス; 神経筋遮断剤、例えばアトラクリウムメシレート、ガラミントリエチオダイド、臭化ヘキサフルオレニウム、ヨウ化メトクリン、臭化パンクロニウム、塩化サクシニルコリン(塩化スキサメトニウム)、塩化ツボクラリン、及び臭化ベクロニウム; 鎮静剤(催眠剤)、例えばアモバルビタール、アモバルビタールナトリウム、アプロバルビタール、ブタバルビタールナトリウム、抱水クロラール、エトクロルビノール、エチナメート、フルラゼパムヒドロクロリド、グルテチミド、メトトリメプラジンヒドロクロリド、メチプリロン、ミダゾラムヒドロクロリド、パラアルデヒド、ペントバルビタール、ペントバルビタールナトリウム、フェノバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウム、タルブタール、テマゼパム、及びトリアゾラム; 局所麻酔剤、例えばブピバカインヒドロクロリド、クロロプロカインヒドロクロリド、エチドカインヒドロクロリド、リドカインヒドロクロリド、メピバカインヒドロクロリド、プロカインヒドロクロリド、及びテトラカインヒドロクロリド; 全身麻酔剤、例えばドロペリドール、エトミデート、ドロペリノールと一緒のクエン酸フェンタニル、ケタミンヒドロクロリド、メトヘキシタールナトリウム、及びチオペンタールナトリウム; 放射性粒子又はイオン、例えばストロンチウム、ヨウ化レニウム及びイットリウム; 及びプロドラッグ、例えば米国特許第6,443,898号明細書に開示されたもの（この開示は、引用することによりそっ���りそのまま本明細書内に組み込まれる）を包含するが、これらに限定されない。
【００４３】
典型的には、約10%〜約60%のマイクロバブルの量が、関心のある該核酸を含む該溶液に添加される。
【００４４】
本発明の医薬組成物はまた、適合的であり又は生理学的に許容できるキャリア、添加物、又は希釈剤を含みうる。
【００４５】
語「医薬的に」又は「医薬的に許容できる」は、必要に応じて哺乳動物、特にはヒト、に投与されたときに、薬害反応、アレルギー反応、又は他の有害反応を生成しない分子実体及び組成物をいう。医薬的に許容できるキャリア又は添加物は、任意の種類の、非毒性の固形の、半固形の、又は液状のフィラー、希釈剤、封入物質、又は製剤補助物をいう。
【００４６】
医薬的に適合性の又は生理学的に許容できるキャリア、添加物、又は希釈剤は、本発明の方法にとって医薬的に許容でき、殺菌したものであり、及び、及び、中性〜弱酸性の、等張性の、緩衝食塩水（ホスフェート、塩化物等を含む）、水性の又は油性の溶液又は懸濁物から、より好ましくはスクロース、トレハロース、界面活性剤、タンパク質及びアミノ酸から選ばれうる希釈剤及びフィラーを包含する。該医薬的に適合性の又は生理学的に許容できるキャリア、添加物、又は希釈剤は、好ましくは、適した分散性、湿潤性、懸濁性の、鎮静性の（soothing）、等張性の、又は粘性の構築剤、安定化剤、保存料、及び、等張性溶液を形成する為に適切なバッファーを用いて製剤化される。該特定の医薬的に許容できるキャリア及び活性化合物対キャリアの比は、該組成物の溶解性及び化学的特性、特定の投与様式、及び標準的な医薬的プラクティスによって決定される。当技術分野の当業者は、既知の技術によってそのようなビヒクルをどのように処方するかを理解するであろう。
【００４７】
安定化剤の例は、エデト酸二ナトリウム又は同様物である。等張剤の例は、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、及びマンニトール、又は同様物である。バッファーの例は、クエン酸、リン酸水素ナトリウム、氷酢酸、及びトロメタモール、又は同様物である。ｐＨ調整剤の例は、塩化水素酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、及び炭酸水素ナトリウム、又は同様物である。鎮静性剤（soothing  agent）の例は、ベンジルアルコール又は同様物である。保存料の例は、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、p−ヒドロキシベンゾエートエステル、安息香酸ナトリウム、及びクロロブタノール、又は同様物である。
【００４８】
簡単な水性溶液のものよりも大きい粘度が、該活性化合物の眼吸収を増加する為に、該処方物を分注する際の変動を減少する為に、処方物の懸濁物又はエマルジョンの成分の物理的な分離を減少する為に、及び／又は、それら以外に、眼処方物を改善する為に望ましい。そのような粘度構築性剤は例えば、ポリニビルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又は当技術分野の当業者に既知の他の剤を包含する。そのような剤は典型的には、約0.01〜約2重量％のレベルで採用される。
【００４９】
対象の毛様筋又は細胞への投与の為の医薬組成物の調製物形態は好ましくは液状調製物である。該液状調製物は、例えば、該生物学的に活性な剤を、BSS（Balanced  Salt  Solution：平衡塩類溶液）、グリセリン溶液、ヒアルロン酸溶液、及び同様物に溶解することによって調製されうる。特定の組成物は例えば、BBS (60%)及びヒアルロン酸(40%)を含む。安定化剤、等張剤、バッファー、ｐＨ調整剤、鎮静剤（soothing  agent）、保存料、電解質、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び／又は塩素、又は同様物が、任意的に、該液状調製物に適切な量で添加されうる。
【００５０】
該医薬組成物は、任意の追加的な活性成分又はアジュバントを含んでよく、又は、該生物学的に活性な剤が、任意の追加的な活性成分又はアジュバントと（本発明に従う使用において）組み合わされてよい。該アジュバントは、該予防剤又は治療剤の生物学的活性を促進し又は増加する任意の物質、混合物、溶質、又は組成物、例えば、該剤の送達又は移動を改善する任意の生物学的、合成的、又は生合成的な剤、から選択されてよく、及び、本発明に従う（送達キャリアとしての）ベクターに組み込まれうる。該アジュバントは、該予防剤若しくは治療剤含有組成物と別に又は逐次的に、及び／又は、異なる注入部位で、調整され及び投与されてよい。本発明に従う複数の剤及び／又はアジュバントによる処置は、剤及び／又はアジュンバントの混合物を用いて行われる必要は無いが、別個の医薬調製物を用いて行われてよい。該調製物は、同時に送達される必要は無いが、調和されて、同じ処置期間内に、すなわち１週間以内又は１か月以内又は次々に、患者に送達されうる。
【００５１】
任意の適切な治療剤は、本発明の組成物と調和されうる。本発明に従う方法を通じて上記生物学的に活性な（予防的又は治療的）剤に加えて投与されうる治療剤の非限定的な例はまた、透過性剤、例えばウィルス、脂質小胞、ヒアルロン酸、脂質に基づく陽イオン、ポリカチオン性のエマルジョン、カチオン性ペプチド、ポリプレックス等; 抗生物質及び抗微生物剤、例えばテトラサイクリンヒドロクロリド、ロイコマイシン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、エリスロマイシン、スルファチアゾール及びニトロフラゾン; 局所麻酔剤、例えばベンゾカイン; 血管収縮剤、例えばフェニレフリンヒドロクロリド、テトラヒドロゾリンヒドロクロリド、ナファゾリンナイトレート、オキシメタゾリンヒドロクロリド、及びトラマゾリンヒドロクロリド; 強心剤、例えばジギタリス及びジゴキシン; 血管拡張剤、例えばニトログリセリン及びパパベリンヒドロクロリド; 防腐剤、例えばクロルヘキシジンヒドロクロリド、ヘキシルレゾルシノール、デカリニウム塩化物、及びエタクリジン; 酵素、例えば塩化リゾチーム及びデキストラナーゼ; 降圧剤; 鎮静剤; 抗腫瘍剤; ステロイド系抗炎症剤、例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン、フルチカゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アセトニド、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、及びベクロメタゾンジプロピオネート; 非ステロイド系抗炎症剤、例えばアセトアミノフェン、アスピリン、アミノピリン、フェニルブタゾン、メフェナム酸、イブプロフェン、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、コルヒチン、及びプロベネシド（probenocid）; 酵素的抗炎症剤、例えばキモトリプシン及びブロメラインセラチオペプチダーゼ; 抗ヒスタミン剤、例えばジフェンヒドラミンヒドロクロリド、クロロフェニラミンマレエート及びクレマスチン; 抗アレルギー剤; 及び、鎮痛性化合物を包含する。
【００５２】
本発明の組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、所望の生物学的活性を得るために有効である活性成分量を得るように適合されうる。しかしながら、任意の特定の患者に特異的な投与量レベルは、体重、一般健康状態、性、食生活、時間、吸収及び排出の速度、他の薬剤との併用、及び処置されている特定の疾患の重症度を含む種々の因子に依存するであろうことが理解されるべきである。本発明の医薬組成物は、複数の注入部位で毛様体筋中に送達されうる。また、該送達は、時間にわたって繰り返されうる。
【００５３】
超音波は、約10 kHz又はそれより大きい周波数を有する高周波数音である。本発明における使用にとって好ましい周波数は、人間の聴覚範囲を超えるものであり、約800kHz〜約3MHzの周波数範囲にあるものである。用いられる超音波の周波数及び強度は、送達部位でのマイクロバブル選択的破壊を達成するための要件により決定される。マイクロバブル破壊を最適化するための要件パラメータは研究されており、当技術分野の当業者に知られている。一般に、約700 kPa〜200kPaのピーク負圧の範囲内の超音波強度が、送達部位で選択的にマイクロバブルを破壊する為に有効であろうことが予測される。該超音波は、当技術分野で周知の任意の超音波装置により適用されうる。例えば、該装置は、ゲルの間置後に眼表面に適用される集束プローブ（focused  probe）又は非集束プローブ（unfocused  probe）から構成されうる。該プローブは、1 mm直径〜15 mm直径である。典型的には、該装置は、0,5 W/cm2〜5 W/cm2の出力強度Isata（spatial  average  temporal  average  intensity）を有する800kHz〜3MHzの超音波シグナルを提供する。該シグナルは、20秒〜5分の期間送達される。該超音波装置は、パルス−エコーモードで又は連続的モードで送達されうる。
【００５４】
リアルタイム超音波生体顕微鏡検査法（ＵＢＭ）イメージングシステムと該超音波装置との組み合わせは、毛様体領域の可視化を許す為に、及び、局所的遺伝子送達の為により正確に針注入をガイドする為に、特に適切でありうる。
【００５５】
該マイクロバブルは、超音波処理領域において破壊され、それらの含有物を放出する。キャビテーション（cavitation）はまた、関心のある治療用核酸の送達を可能にする細胞透過性を増大する小さな衝撃波を形成する。マイクロバブルの使用はまた、炎症応答の量を限定しえ、及び、繰り返し注入を許しうる。気体により満たされたミクロスフィアは、非熱的キャビテーションについてのエネルギー閾値を有効に低くする。
【００５６】
本発明の方法により処置されうる眼疾患の非限定的な例は、眼増殖性疾患、眼神経変性疾患、緑内障、眼感染疾患、眼炎症性疾患（例えば、結膜炎、角膜炎、内皮炎、ぶどう膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ぶどう膜炎、及び炎症性視神経症)、網膜変性 (特に、網膜色素変性、周辺部網膜変性、黄斑変性、例えば乾燥加齢黄斑変性)、虚血性網膜症(特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症)、網膜血管疾患、眼虚血症候群及び他の血管異常、脈絡膜の異常及び腫瘍、硝子体異常、グリア増殖、例えば増殖性硝子体網膜症及び糖尿病性網膜前血管新生を伴うグリア細胞増殖等、を包含する。本発明により予防され又は処置されうる主な疾患が以下に記載される。
【００５７】
眼内炎症は、眼内組織、主にはぶどう膜及び網膜、の炎症の全ての種類を再編成する。眼内炎症は、免疫学的原因、感染性の原因、医原性の原因からのもの、又は未知の病因のものでありうる。それらは、急性、再発性、又は慢性のものでありうる。眼内炎症は、治療可能な盲目の最大の原因である。後部眼内炎症は、血管炎、視神経炎、硝子体炎、及びコレア網膜炎（chorea  retinitis）を伴いうる。
【００５８】
遺伝性網膜ジストロフィー又は網膜色素変性は、視覚サイクルに関与する遺伝子における変異又は欠失に起因する遺伝性の失明に至る疾患である。それらは若い年齢において始まり、そして、全盲までゆっくりと進行する。光受容体の喪失は、網膜色素細胞の喪失に、及び、後期の脈管及び視神経の萎縮に関連している。これらの遺伝性変性のいくつかは、ミトコンドリアＤＮＡにおける変異に起因する。
【００５９】
緑内障の２つの主要な種類がある：慢性緑内障又は原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）及び急性閉塞隅角緑内障。他のバリエーションは、先天性緑内障、色素性緑内障、血管新生緑内障、及び続発性緑内障を包含する。緑内障は、高眼圧と類似するが、付随する視神経損傷及び視力喪失を伴う。緑内障は通常は、点眼剤、レーザー、又は慣用の眼の手術により処置される。もし処置されないならば、緑内障は失明を引き起こすであろう。
【００６０】
血管新生は、新血管形成をもたらす新毛細血管の形成である。血管新生は、脈管基底膜及び間質マトリックスの内皮細胞媒介分解、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖、及び内皮細胞による毛細血管ループ（capillary  loops）の形成を含む一連の逐次的工程を含む複雑なプロセスである。血管新生は、脈管構造の発達及び維持の為の正常なプロセスであるけれども、病理学的状態（すなわち血管新生依存性疾患）が起こり、そこでは血管成長は実際には有害である。血管新生は、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、及び角膜瘢痕を含む眼組織重要疾患に顕著に関連付けられる。眼における血管の或る異常増殖は、入射光を、網膜に到達する前に、散乱し及びブロックしうる。新脈管形成は、眼のほとんどすべての組織で起こり、及び、眼組織機能を顕著に変えうる。最も脅威的な眼新生血管疾患のいくつかは、網膜に影響を及ぼすものである。例えば、多くの糖尿病性患者は、網膜の前面及び硝子体内で漏出性新血管を形成し、増殖性硝子体網膜症を引き起こすことにより特徴づけられる網膜症を発症する。加齢性黄斑変性を有する患者のサブセットは、網膜下新血管形成を発症し、これは最終的に失明をもたらす。
【００６１】
糖尿病性網膜症は、眼の内側の網膜血管が周囲組織中に血液及び流体を漏らす場合に起こる。糖尿病を有する患者の約８０％が糖尿病性網膜症を発症する。この疾患は一般に、レーザーを用いて処置される。しかしながら、レーザー治療は、網膜静脈閉塞、視力喪失、硝子体出血を含む合併症を伴い、及び、ときどき失敗する。もし処置されないままならば、糖尿病性網膜症は失明を引き起こしうる。
【００６２】
未熟児網膜症（ROP）は、未熟児で生まれた赤ちゃんに発症する。それは、網膜及び硝子体内の血管の異常増殖からなる。ROPの後期への進行は、網膜上の瘢痕組織の形成、硝子体出血及び網膜剥離をもたらしうる。その処置は通常、レーザー又は凍結治療（冷凍）により行われる。
【００６３】
虚血性網膜症は、神経網膜の苦痛、細胞死、及び新血管新生をもたらす血管閉塞（毛細血管又は大血管）に関連付けられる網膜症である。黄斑変性は、中心視を冒す疾患であり、及び、視力の喪失をもたらす。若い人々を襲う黄斑変性の形があるけれども、症状は、最も一般的には６０歳超の人々に起こる。すなわち、この疾患は、加齢性黄斑変性（AMD）と呼ばれる。ヒトの視覚の中心だけが通常は冒されるので、該疾患からの失明はまれに起こる。しかしながら、網膜の中心における黄斑への損傷は、まっすぐ前を明らかに見る能力を破壊しうる。萎縮型（dry  form）は、神経網膜、RPE細胞、及び脈絡膜の変性を付随する。滲出型（wet  form）は、上記の現象及び、脈絡毛細管及び／又は網膜血管からの新血管の成長、網膜下の剥離及び出血、上皮下の出血及び裂孔等を付随する。黄斑変性は通常は、６０歳の後に発生する。中心視が減少される一方で、多くの患者は、ある程度の視力を維持し、そして、完全に失明することはない。
【００６４】
角膜炎は角膜の炎症である。角膜炎は、バクテリア、ウィルス、又は真菌の感染により、眼瞼の異常又は涙を形成する能力の減少から結果するドライアイにより、非常に明るい光への曝露により、傷付ける又は眼にとどまる異物により、眼のメークアップ、ホコリ、花粉、汚染、若しくは他の刺激物への敏感性又はアレルギー反応により、及びビタミンA欠乏により引き起こされうる。
【００６５】
黄斑ひだ（網膜上膜、網膜しわ、黄斑前線維症、及びセロファン黄斑症とも呼ばれる）は、網膜から離れる硝子体の加齢に伴う収縮に最もしばしば起因し、網膜が瘢痕形成し及びしわ形成することを引き起こす。黄斑ひだの他の原因は、（手術又は眼の傷からの）外傷、網膜剥離、炎症、及び網膜血管の問題を包含する。唯一の処置は、瘢痕組織をはがすことを組み合わされた硝子体切除術（硝子体の除去）からなる手術である。硝子体切除術の最も一般的な合併症は、白内障発達の速度の増大である。
【００６６】
処置される眼の疾患は、強膜炎、結膜炎、角膜炎、内皮炎、ぶどう膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網脈絡膜炎、前部ぶどう膜炎、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、遺伝性網膜ジストロフィー、加齢性黄斑変性、開放隅角緑内障、新生血管緑内障、虚血性網膜症などから選ばれうる。
【００６７】
本発明の特定の局面は、慢性ぶどう膜炎を処置する方法であって、それを患う対象の毛様体筋に、TNFαについての可溶性レセプターをコードする核酸を送達することを含む前記方法である。
【００６８】
本発明の他の特定の局面は、眼内新生血管又は黄斑浮腫を処置する方法であって、それを患う対象の毛様体筋に、抗 VEGF、抗VEGFレセプター、又は抗PLGFをコードする核酸を送達することを含む前記方法である。
【００６９】
本発明のさらなる特定の局面は、網膜色素変性を処置し又は遅らせる方法であって、それを患う対象の毛様体筋に、上記で記載されたとおりの神経栄養因子をコードする核酸を送達することを含む前記方法である。
【００７０】
本発明の他の特定の局面は、糖尿病性網膜症を処置する方法であって、それを患う対象の毛様体筋に、抗IRS-1 又はIGF-1をコードする核酸をコードする核酸を送達することを含む前記方法である。
【００７１】
本発明はまた、エコー造影剤マイクロバブルと、対象における眼疾患を処置するための方法において使用する為の関心のある治療用核酸とを処方された医薬組成物に関し、ここで該方法は、i)該医薬組成物を該対象の毛様体筋に送達すること、及び、ii)該医薬組成物が送達された領域を超音波に曝して、関心のある該治療用核酸の該毛様体筋内へのトランスフェクションを誘発することを含む。
【００７２】
本発明の方法に従い、眼疾患を予防し又は処置する為のキットが想定される。装置及び本発明に従う医薬組成物が、キット中に一緒に提供されうる。該キット内に、構成要素は別個に包装されてよく又は含まれていてよい。他の構成要素、例えば添加物、キャリア、他の薬剤又はアジュバント、該活性物質又は組成物の投与の為の説明物、及び投与又は注入装置が、同様に該キットに供給されうる。説明物は、書面の形、ビデオの形、又はオーディオの形にあってよく、紙、電子媒体、に収容されてよく、又は他の源、例えばウェブサイト又は参照マニュアル、への参照として収容されてよい。
【００７３】
本発明は、以下の図面及び実施例によりさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いかなる様式においても、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００７４】
材料及び方法
【００７５】
動物：150〜200 gの重さのメスのLewisラットが、７週齢でJanvier (Le Genest-Saint-Isle, フランス)から購入され、そして、我々の施設で１週間、本研究に含める前に、飼われた。実験は、the  Use  of  Animals  in  Ophthalmic  and  Vision  Researchについてのthe  Association  for  Research  in  Vision  and  Ophthalmology(ARVO) 声明書に従い実施された。実験の為に、ラットは、Ketamine  1000(80 mg/kg; Virbac, Carros, フランス)及びLargactil (0.5 mg/kg; Sanofi-Aventis, パリ, フランス)の混合物の筋肉内注入により麻酔された。実験の終わりで、ラットは二酸化炭素吸入により犠牲にされた。
【００７６】
プラスミド：２つの市販入手可能なプラスミドが、投与の為に及び毛様体筋におけるレポーター遺伝子発現を確認する為に用いられた：pCMV-Gluc-1 (Nanolight Technology, Pinetop, AZ, 米国)（サイトメガロウィルス(CMV)プロモーターの制御下で分泌されるGaussiaルシフェラーゼをコードする、Clontech(Palo Alto, CA, 米国)から購入された）及びpVAXl-LacZ (Invitrogen, Carlsbad, CA, 米国)（CMVプロモーターの制御下のLacZ遺伝子を含む (Clontech, Palo Alto, CA, 米国)）。
【００７７】
Escherichia  coli  DH5-alpha中での増幅後、プラスミドはNucleobond  AX1000キット(Macherey-Nagel  GmbH  &  Co,  KG)によって、製造者の指示に従い精製され、そして次に、10μL生理食塩水中の15μgプラスミド、すなわちMB無しの1,5μg/μL又は50% MBと一緒の3μg/μL、を注入する為に、適切な濃度で調製された。
【００７８】
マイクロバブル（MB）：我々は、すべての我々の実験について、市販入手可能な、使用準備のできた、Artison  Corp.(Inola, OK, 米国)により提供された第二世代マイクロバブルを用いた。該Artison  MBは、パーフルオロカーボンガスで満たされており且つ約2.4μｍの直径を有する脂質シェルUS造影剤である。該MB溶液は、１ミリメートル当たり約13xl08のマイクロスフィアから構成される。
【００７９】
MBは、製造者の指示に従い調製された。Artison  MBは最初に、１０秒間そのバイアルを穏やかに振とうすることにより、均一な乳状の白い懸濁物を得るまで再分散され、その後該懸濁物の所望の量が、該バイアルから引き抜かれた。次に、該バブルが、該プラスミド溶液に添加され、そして、１０秒間穏やかに混合されて、それらの注入直前にそれらの組み合わせを許した。
【００８０】
超音波装置：超音波（US）処理は、研究の為に設計されたソノポレーション（sonoporation）システム（Sonitron  2000、Artison(Inola, OK, 米国)から、1 MHz又は3MHz (切り替え可能)のいずれかで動作するプレーンの非集束型トランスデューサ（plane unfocused transducer）を有する）を用いて実施された。3-mm直径プローブが、ラット実験の為に小領域に音響エネルギーを送達する為に選択された。該トランスデューサは、0〜5W/cm2の出力強度Isata(spatial-average temporal-average intensity)を有し、0.1 W/cm2の増加で調節可能であり、5〜100%で変わるデューティーサイクル（１つのパルス期間にわたるon時間の百分率）及び可変のパルス繰り返し周波数を有した。US適用のパルスモードの利点は、不都合な熱的効果が減少されうることである。処理時間は、0〜20分で調節可能であった。
【００８１】
ラット毛様体筋へのインビトロソノポレーション：治療実験の為に、眼が、外科用シートを用いて位置を保たれた。１５μｇのプラスミドDNA単独又はMBと混合された１５μｇのプラスミドDNAが、次に、外科用顕微鏡下で、両方のラットの眼の毛様体筋に、100-μｌマイクロシリンジ(BD-microfine syringe, NM Medical, Asnieres, フランス)の３０ゲージディスポーザブル針を用いて注入された。縁（透明角膜が白い不透明の角膜に接合する接合点）の後の強膜直下の毛様体筋に到達する為に、該注入は、該縁の側頭上側において実施された。該注入の直後に、超音波チップが、透明カップリングゲル（Gelaser, Alcon, Rueil-Malmaison, フランス）の介在後に眼表面上に直接に適用され、そして、注入された領域がUSに曝された。USプローブは、処置の間、動かされなかった。両方の眼が、同じ手順を用いて、同じ作業者により処理された。全ての実験において、以下のUS設定が適用された：1 MHz, 2分間の2W/cm2Isata, 5 ms (on時間)のパルス幅及び5 ms (off時間)のパルス間隔を有する50%のデューティーサイクル、並びに100 Hzのパルス繰返し周波数。
【００８２】
実験計画：２セットの実験が、合計で36のLewisラットに対して実施された。同じ動物からの両方の眼が、同一の様式で処理された。
【００８３】
実験の第一のセットは、ソノポレーション後7日目 (n = 20ラット)及び30日目 (n = 12ラット)で、毛様体筋中のルシフェラーゼレポーター遺伝子発現のキネティクスを評価することを目的とした。この目的のために、15 μgのpCMV-Gluc-1が、すべての動物の両方の眼の毛様体筋に注入された。プラスミド注入後、４つの実験群が、該７日目評価の為に形成された。第一の群において、対照として従事する為に、追加の処置は実施されなかった（対照群、n=10の眼）。第二の群において、該プラスミド注入の直後に、US暴露が行われた（US群、n=10の眼）。あとの２つの群において、マイクロバブルと混合されたプラスミドDNAが、該毛様体筋に一緒に注入され、次にUS処理が行われ (US+MB 群, n=12の眼)、又は、US暴露されなかった(MB群, n=8の眼)。同様の群：対照群 (n=8の眼)、US群(n=8の眼)及びUS+MB群 (n=8の眼)が、該30日目評価の為に設定された。マイクロバブル単独の効果が、この時点で評価されなかった。１つの追加の未処理ラットが、各時点でのルシフェラーゼ発現についての陰性対照として用いられた。全ての動物は、処置後７日目又は３０日目で犠牲にされた。眼が、眼球除去され、次に、眼液（房水及び硝子体液）が、ルミノメトリーによるルシフェラーゼ活性の評価の為に除去された。
【００８４】
実験の第二セットにおいて、ラットの眼(n＝4)が、LacZ遺伝子を有するプラスミドの毛様体筋へのソノポレーション後に、β−ガラクトシダーゼ活性の局在化を分析する為に用いられた。１５μｇのpVAXl-LacZが、６つの眼の毛様体筋中に注入された。次に、眼が、超音波とマイクロバブル（n＝2の眼）、US (n＝2の眼)又はマイクロバブル単独 (n=2の眼)に曝された。残りのラットは、注入又はUSへの曝露を受けず、対照として従事した。トランスフェクション後７日目で、眼が眼球除去され、そして、組織化学的分析の為に調製された。
【００８５】
眼が、それぞれの実験の直後に、そして次に遺伝子導入の７日後及び３０日後に、裸眼観察により調べられた。
【００８６】
ルシフェラーゼ活性の測定：処置後７日目又は３０日目で、US及び／又はMBと一緒の又はこれら無しの、15 μgのpCMV-Gluc-1の筋肉内注入により処置された眼が、眼球除去された。眼の流体（房水及び硝子体液）が除去され、そして、４℃での５分間の5000gでの遠心後、上清が、使用まで−２０℃で維持された。
【００８７】
ルシフェラーゼ活性が、Renilla  Luciferase  Assay  System (Promega, Charbonnieres, フランス)により、製造者のプロトコルに従い、白い-96-ウェルプレート (Costar（商標）, 組織培養処理された, 白いプレート)中に置かれた各サンプルからの１０μｌに対して評価された。検出器は、ルミノメーターWallac  Victor2, 1420 Multi-label Counter (EG&G Wallac, Evry, フランス)であった。これは、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Promega）を該試料に添加し、２秒の遅れとともに、１０秒にわたって該試料により産生された光を積分する。データ分析は、Wallac  1420ワークステーションソフトウェアを用いて実施された。結果が、各試料について、秒当たりのカウント（cps）で与えられる。背景発光は120 cps未満であった。
【００８８】
毛様体筋領域におけるβガラクトシダーゼ発現の局在化：インシチュ組織化学分析：処理の７日後、眼が眼球除去され、ホスフェート緩衝生理食塩水（PBS）中の２％パラホルムアルデヒド及び０．２％グルタルアルデヒド中に１時間４℃で固定され、次にPBS中で３回リンスされた。眼全体が、次に、一晩、暗所中で室温（３７℃）で、色素産生性X-gal試薬（1mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-d-ガラクトピラノシド, Sigma, Saint-Quentin-Fallavier, フランス）の存在下において、5 mMのK3Fe(CN)6,5mMのK4Fe(CN)6, 2mMのMgCl2及び0.02% NP-40を有するPBS中で、β−ガラクトシダーゼ活性の測色検出のためにインキュベートされた。次に、眼が、パラフィン中に埋められ、そして次に、Microm  HM-340Eミクロトーム (Leica Microsystems, Nussloch GmbH, ドイツ)を用いてスライスされた。縦に10-μｍ厚さの切片が、光軸に平行に切られた。各試料からのパラフィン切片の半分が、グリセロール/PBS (1：1)中に標本にされ、及び、他方の半分が、ヘマトキシリンミョウバン溶液−エオシンにより対比染色されて、核及び細胞質をそれぞれ染めた。Leitz  Aristoplan顕微鏡写真機下での検査の間、画像が、10x又は25xの対物レンズ及び2.55ミリ秒及び14.9ミリ秒でそれぞれ維持された露光時間によりLeica  DFC  480デジタルカメラを用いて撮られた。
【００８９】
統計的分析：データの分析の為に用いられたプログラムは、GraphPad  Prism (GraphPad  Software, San Diego, CA, 米国)であった。結果が、平均±該平均の標準誤差 (SEM)として表される。データ分析は、ノンパラメトリック一元配置分散分析（ANOVA, Kruskal-Wallisテスト）を用いて実施され、続いてDunn's 多重比較検定が行われた。ANOVAの前に、極端な異常値が、Grubb's検定により同定され、そして、データセットから除外された（群当たり１つの点）。統計的有意性は、p <0.05で設定された。
【００９０】
結果：
処理直後及び処理後７日及び３０日での処理された眼の臨床検査は、炎症又は著しい眼の損傷の不在を示した。
【００９１】
眼流体中のルシフェラーゼ活性のキネティクス：Gaussia-ルシフェラーゼ発光が、４つの異なる処置群における、毛様体筋中へのpCMV-Gluc-1プラスミド (15μg)の注入の７日後に、ラット眼液中において示された。眼液中のルシフェラーゼ活性の平均レベルは、対照群（DNA注入単独）と比較して、MB有り又はMB無しのUS暴露により処理された群の両方において増加された。プラスミド及びMBの一緒の投与後にUS適用を受けた眼において（n＝11）、毛様体筋におけるルシフェラーゼ活性は、対照群と比較して（n = 9, p < 0.05）又はMB群と比較して（n = 7, p < 0.005）、約2.6倍だけ有意により高かった。対照的に、US単独(n = 9)は、発光レベルのより少ない増加（対照群と比較して1.5倍、統計的に有意でない差）を誘発した。MB群による差だけが、統計的に有意であった（p< 0.005）。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド単独の注入又はMBと混合されたプラスミドの注入の後にUS暴露無しで、ほとんど検出されなかった。我々の結果は、特にはUS処理された群について、ルシフェラーゼ活性の高い分散を示す。
【００９２】
３０日目で、ルシフェラーゼ遺伝子発現は、処置後７日目及び３０日目の間で約５０％だけ、各実験群において低下した。ANOVA統計分析は、因子「時間」が非常に有意な影響を有し及び全分散の14.16%を占める(p=0.0029)こと、及び、因子「群」が有意な影響を有し及び全分散の10.84%を占める(p=0.0304)ことを示した。両方の因子の交互作用は、有意でないと考えられる。Bonferroni  post テストは、発光が、「US＋MB群」においてだけ、７日目及び３０日目の間で有意に減少することを決定した(p<0.01)。
【００９３】
毛様体筋領域におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の局在化：LacZレポーター遺伝子を有するプラスミドの、毛様体筋を標的としたソノポレーションの７日後、組織化学的染色が、β−ガラクトシダーゼ発現（青い細胞）が、毛様体筋領域細胞中のUS適用の領域内において検出されることを明らかにした。この方法は、US＋MB適用及びUS適用の場合において毛様体筋領域において有効な発現をもたらす一方で、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性は、US適用無し（対照の眼）の毛様体筋領域において観察されなかった。
【００９４】
考察：
本研究の主な目的は、ソノポレーションによる毛様体筋への遺伝子導入の実行可能性を調査することであった。我々の知る限り、我々の研究は、US及びMBにより媒介された、毛様体筋を標的としたインビボプラスミドDNA導入についての最初の研究である。眼において、毛様体平滑筋は、２つの主な利点を提供する。第一に、それは、硝子体腔内の侵入無しで、容易に接近可能な組織である。第二に、この筋肉は、眼球の全部及び後部の間に位置されており、房水並びに硝子体及び網膜に向かってタンパク質分泌を許す。マイクロバブル及びプラスミドDNAの一緒の投与を含む我々の本実験は、遺伝子治療技術の効率を評価するためのマーカーとして広く用いられているレポーター遺伝子を用いて実施された。
【００９５】
我々は、レポーター遺伝子及びMBを有するプラスミド混合物の筋肉内単回投与に続く、毛様体領域に対する外部超音波暴露が、ラット毛様体筋へのインビボ遺伝子導入を促進する簡単且つ有効な方法であることを示した。毛様体筋へ送達された１５μｇプラスミドレポーターのソノポレーション後７日目での眼液（房水及び硝子体液）におけるタンパク質分泌の観察は、この方法の実行可能性を確認する。該筋肉組織中へのルシフェラーゼ取り込みは、ルシフェラーゼ注入単独により処理された対照と比較して、US＋MB群において約2.6倍より高かった。DNA注入後にUSが届けられない場合、遺伝子発現は低かった。
【００９６】
超音波及びマイクロバブルの組み合わせ使用の利益に加えて、我々のアプローチは、ソノポレーションによる眼の遺伝子導入に特異的ないくつかの利点を提供する。第一に、それは、DNA注入の為の筋肉内注射針及び外部US暴露だけを要求し、これは、臨床実践において広く受け入れられている。その安全性は、よく確立されている。USは、毛様体筋のような小さいサイズさえの標的部位内に正確に集束されることができて、局所的な遺伝子送達を引き起こし、及び、臨床的な検査及び治療のために広く用いられる。
【００９７】
要約すると、この研究は、眼の毛様体筋が、DNAソノポレーションにより標的とされることができ、眼球内へのタンパク質分泌を許すことを示す。毛様体筋を標的としたソノポレーションは、種々の眼疾患の処置の為の非ウィルス的で、最小に侵襲的で、安全な、且つ効率的な遺伝子送達手順としての可能性を有する。
【００９８】
参考文献：
この出願を通じて、種々の文献が、この発明に関する技術分野の状況を説明する。これらの文献の開示はここに、引用することにより本開示内に組み込まれる。
【国際調査報告】
2013536187.tif 000002
2013536187.tif 000003
2013536187.tif 000004