(57)【要約】【課題】本発明は、膵がん細胞の浸潤や転移を特に有効に抑制できるワクチンを提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンは、ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３のアミノ酸配列（配列番号１）の一部を有するペプチドを含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３のアミノ酸配列（配列番号１）の一部を有するペプチドを含むことを特徴とする膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【請求項２】
上記ペプチドのアミノ酸数が８以上、１２以下である請求項１に記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【請求項３】
上記ペプチドが配列番号２〜４９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【請求項４】
上記ペプチドに加え、さらに、ＫＩＦ２０Ａのアミノ酸配列の一部を有するペプチドを含む請求項１〜３のいずれかに記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【請求項５】
上記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４とＨＬＡ−Ａ２の両方に結合できるものである請求項１〜４のいずれかに記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がん細胞の浸潤や転移を有効に抑制できるワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「腫瘍」とは異常に増殖した細胞を指し、その異常増殖の原因が消失あるいは取り除かれても細胞の増殖が持続する状態をいう。腫瘍の中でも良性腫瘍は腫瘍の増殖が遅く、転移はしない。よって、一般的には切除すれば問題は無く、たとえ切除せずに放置しておいても命に別状はないといえる。一方、悪性腫瘍、即ちがんは、良性腫瘍とは異なり急速に増殖する上に、リンパ節や他の臓器に転移して増殖する。よって、例えば外科的手術により除去しても、僅かにでも残留したがん細胞や、既にリンパ節や他の臓器に転移していたがん細胞が再び増殖を開始することがある。よって、がんはいったん治療が終了した後の予後が悪く、各がんにおいては５年後生存率が調査されており、一般的に、治療により癌が消失したとされてから５年経過後までに再発がない場合がようやく治癒と見なされる。
【０００３】
膵がんは、がんの中で最も予後が悪いといわれている。その原因としては、膵臓が後腹膜臓器であるために早期発見が困難であることに加え、膵がん細胞の運動性がきわめて高いため、例えば２ｃｍ以下の小さながんであっても、周囲の血管、胆管、神経などへすぐに浸潤し、また、近くのリンパ節に転移したり、肝臓などへ遠隔転移したりすることが挙げられる。
【０００４】
上記のとおり、がんが悪性の腫瘍である所以は、特に他組織へ浸潤や転移することにあり、浸潤転移さえしなければ予後も良好なものになると考えられる。そこで、がん細胞の浸潤転移を抑制するための技術が開発されている。
【０００５】
例えば特許文献１，２には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）分子中の末端ヘアピンとそれに続く４個のクリングルドメインを有する分子内断片であるＮＫ４をコードする遺伝子を、がん細胞の浸潤や転移の抑制に利用する発明が記載されている。
【０００６】
ところで、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２  ｍＲＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３，以下、「ＩＧＦ２ＢＰ３」と略記することがある）は、主に核小体に存在し、インスリン様成長因子ＩＩのＲＮＡの５’非翻訳領域３の５’ＵＴＲに結合し、インスリン様成長因子ＩＩの翻訳を阻害する。ＩＧＦ２ＢＰ３をコードする遺伝子は、特許文献３に記載の発明において、その過剰発現ががんの検出に用いられる遺伝子の一つとして挙げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２５０５４９号公報
【特許文献２】特開２００８−７５１４号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１６０７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、がん細胞の浸潤や転移を抑制するための技術は種々検討されているが、特に膵がん細胞がなぜ浸潤転移し易いのかという理由は示されておらず、膵がん細胞の浸潤転移の抑制に必ずしも有効なものではなかった。
【０００９】
そこで本発明は、膵がん細胞の浸潤や転移を特に有効に抑制できるワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、一般的な細胞では主に核小体で見出されるヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３が、膵がん細胞では、浸潤転移する上で必須の細胞内構造物である細胞膜突起中に存在し、膵がん細胞の浸潤転移に大きく関わっていることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
以下、本発明を示す。
【００１２】
［１］  ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３のアミノ酸配列（配列番号１）の一部を有するペプチドを含むことを特徴とする膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【００１３】
［２］  上記ペプチドのアミノ酸数が８以上、１２以下である上記［１］に記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【００１４】
［３］  上記ペプチドが配列番号２〜４９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する上記［１］または［２］に記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【００１５】
［４］  上記ペプチドに加え、さらに、ＫＩＦ２０Ａのアミノ酸配列の一部を有するペプチドを含む上記［１］〜［３］のいずれかに記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【００１６】
［５］  上記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４とＨＬＡ−Ａ２の両方に結合できるものである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチン。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）は、膵がん細胞の細胞膜突起中に存在し、膵がん細胞の運動性の向上に関与し、その浸潤転移に大きな役割を果たしていると考えられる。また、本発明者の実験的知見によれば、ＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現が阻害されると膵がん細胞の運動性は損なわれ、かかる膵がん細胞の浸潤転移は有意に抑制される。よって、ＩＧＦ２ＢＰ３のアミノ酸配列の一部を有するペプチドをワクチンの有効成分として用いれば、ＩＧＦ２ＢＰ３を発現している膵がん細胞がペプチドワクチンにより活性化された細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により障害される結果、高浸潤転移性の細胞が減少して浸潤転移が抑制され得る。一方、ＩＧＦ２ＢＰ３は胎児期における重要臓器で高発現しているが、成人臓器では精巣に若干の発現が認められるものの、重要臓器における発現は皆無である。さらにＩＧＦ２ＢＰ３は、生体細胞由来のタンパク質であるため、その部分アミノ酸配列を有するペプチドは無害で安全なものであると考えられる。従って本発明に係るペプチドワクチンは、膵がん細胞の浸潤転移を安全に抑制できるものとして、非常に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、フィブロネクチン上で培養することにより細胞膜突起の形成を促進したヒト膵管腺がん細胞であるＳ２−０１３株とＰＡＮＣ−１株を、免疫細胞化学的に蛍光標識した写真である。緑色部分は抗ＩＧＦ２ＢＰ３抗体で標識された部分を示し、赤色部分はファロイジンで標識されたアクチンフィラメントを示す。矢印はＩＧＦ２ＢＰ３が細胞膜突起に局在している部分を示し、バーの長さは１０μｍである。
【図２】図２は、フィブロネクチン上で培養したＳ２−０１３株細胞の、共焦点免疫蛍光顕微鏡試験におけるＺ−ｓｔａｃｋ（多層取り込み）写真である。青色部分はＤＡＰＩで染色した核を示し、緑色部分は染色されたＩＧＦ２ＢＰ３を示す。矢印はＩＧＦ２ＢＰ３が細胞膜突起に局在している部分であり、ＩＧＦ２ＢＰ３が細胞膜突起に集積していることが示されている。白枠で囲まれた部分は、拡大された領域を示す。下側と右側のパネルは、それぞれ黄色線部分の断面を示す。バーの長さは１０μｍである。
【図３】図３は、ＩＧＦ２ＢＰ３のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを導入したＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞（ｓｉＩＧＦ−１とｓｉＩＧＦ−２）と、コントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞（Ｓｃｒ−１とＳｃｒ−２）で発現しているタンパク質をウェスタンブロットで解析した結果を示す写真である。
【図４】図４は、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞とコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞の創傷領域への運動性アッセイにおいて創傷領域へ移動した細胞数を示す。
【図５】図５は、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞とコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞の創傷領域への運動性アッセイにおいて創傷領域に移動した細胞数を示すグラフである。「*」は、ｔ−テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図６】図６は、単層でコンフルエントに増殖したＳ２−０１３株細胞の一部分をピペットチップで除去することにより創傷領域を形成し、当該創傷領域へ向けて遊走しはじめる膵がん細胞の先進部位を免疫染色した写真である。緑色部分は抗ＩＧＦ２ＢＰ３抗体で染色した部分を示す。矢印は、遊走しはじめたＳ２−０１３株細胞の先進部位に形成された細胞膜突起に存在するＩＧＦ２ＢＰ３を示す。バーの長さは１０μｍである。
【図７】図７は、コントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、およびＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復させたＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞のトランスウェル浸潤性アッセイにおいて、浸潤した細胞数を示すグラフである。「*」は、ｔ−テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．００５で有意差があることを示す。
【図８】図８は、コントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、またはＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞を膵臓に移植されたヌードマウスの、ヘマトキシリン−エオシン染色した、膵臓内に形成された腫瘍の写真である。「Ｒ」は腔腹膜組織を示し、「Ｐ」は筋肉組織を示し、「Ｎ」は正常組織を示す。
【図９】図９は、フィブロネクチンで刺激したコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、およびＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復させたＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞の、共焦点免疫蛍光顕微鏡試験におけるＺ−ｓｔａｃｋ（多層取り込み）写真である。青色部分はＤＡＰＩで染色した核を示し、赤色部分はファロイジンで標識されたアクチンフィラメントを示す。矢印は細胞膜突起中に存在するアクチンフィラメントを示す。下側と右側のパネルは、それぞれ白色線部分の断面を示す。バーの長さは１０μｍである。
【図１０】図１０は、フィブロネクチンで刺激したコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞、およびＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復させたＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞の、全細胞数に対する細胞膜突起を有する細胞の割合を示すグラフである。「＊」は、ｔ−テストにおいてコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞またはＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復させたＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図１１】図１１は、フィブロネクチンで刺激したコントロールＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞およびＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞の形態を、位相差顕微鏡を用いて撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンは、ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）のアミノ酸配列（配列番号１）の一部を有するペプチドを有効成分として含む。
【００２０】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、そのアミノ酸配列がインスリンと高度に類似したポリペプチドであり、細胞培養ではインスリンと同様に有糸分裂誘発などの反応を引き起こす。ＩＧＦ−２は初期の発生に要求される第一の成長因子であると考えられ、哺乳類では脳、腎臓、膵臓および筋肉より分泌され、ＩＧＦ−１よりも特異的な作用をし、大人ではインスリンの６００倍の濃度でみられる。ＩＧＦの働きはＩＧＦ結合タンパク質として知られる遺伝子ファミリーにより調節されているが、ＩＧＦ遺伝子の発現は、そのｍＲＮＡに結合するタンパク質によって調節されている。
【００２１】
ＩＧＦ２ＢＰ３はＩＧＦ遺伝子発現の調節因子の一つであり、主に核小体に存在しているのに対して、本発明者は、膵がん細胞内ではその運動性に必須の部位である細胞膜突起に集積しており、膵がん細胞の運動性に大きく関与していることを見出した。例えば、膵がん細胞においてＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子をノックアウトすると、運動性を失って浸潤や転移を起こさなくなる。よって本発明者は、ＩＧＦ２ＢＰ３の部分アミノ酸配列を有するペプチドをワクチンとして用いれば、膵がん細胞の浸潤転移を抑制できるとの本発明を想到した。
【００２２】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンの有効成分であるペプチドは、ヒトＩＧＦ２ＢＰ３のアミノ酸配列の一部を有する。ヒトＩＧＦ２ＢＰ３のアミノ酸配列は配列番号１に示されており、本発明のペプチドはその一部の配列を有する。
【００２３】
本発明において「アミノ酸配列の一部」とは、全アミノ酸配列ではないといった程度の意味であるが、アミノ酸数としては５以上、１５以下が好適である。当該アミノ酸数が５以上であれば、免疫応答をより確実に起こすことが可能になり得る。一方、当該アミノ酸数が１５以下であれば、細胞障害性Ｔ細胞上のＨＬＡとの結合を十分に確保することができる。当該アミノ酸数としては、６以上がより好ましく、７以上がさらに好ましく、８以上が特に好ましく、また、１４以下がより好ましく、１２以下がさらに好ましく、１０以下が特に好ましい。
【００２４】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンで有効成分として用いるペプチドとしては、具体的には、配列番号２〜４９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
【００２５】
上記ペプチドは、１種のみを用いてもよいが、２種以上を併用し、免疫応答が陽性であるものを選択していくこともできる。この場合のペプチド数としては、例えば、２以上、１０以下とすることができる。当該ペプチド数としては、３以上がより好ましく、また、６以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。
【００２６】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンには、上記ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチドの他に、ＩＧＦ２ＢＰ３以外のタンパク質のアミノ酸配列の一部を有するペプチドを配合してもよい。例えば、単独ではワクチン効果の弱いペプチドであっても、本発明に係る上記ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチドと併用することにより、膵がん細胞に対して優れた浸潤転移抑制作用などの抗がん作用が発揮される可能性がある。このようなＩＧＦ２ＢＰ３以外のタンパク質としては、例えば、ＫＩＦ２０Ａを挙げることができる。ＫＩＦ２０Ａ（ｋｉｎｅｓｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２０Ａ）は膵がん細胞の浸潤転移に関与していることから、その部分アミノ酸配列を有するペプチドを本発明に係るＩＧＦ２ＢＰ３ペプチドと併用することにより、膵がん細胞の浸潤転移を相乗的に抑制できる可能性がある。
【００２７】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンに配合すべき上記ペプチドの選択基準としては、被投与者の細胞障害性Ｔ細胞上のＨＬＡとの結合力を挙げることができる。当該結合力の強いペプチドを選択すれば、被投与者においてより有効な免疫応答が得られる可能性がある。例えば、日本人に多いＨＬＡとしてはＨＬＡ−Ａ２４を挙げることができる。その他、ＨＬＡ−Ａ２など他のＨＬＡとの結合能をも有するペプチドを選択すれば、本発明ワクチンが有効である被投与者の適用範囲を広げられ得る。
【００２８】
本発明で用いるペプチドは、当業者公知の方法により適宜調製することができる。例えば、所望のペプチドをコードするＤＮＡを、鋳型としてヒトＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子を用いるＰＣＲにより増幅し、適切なベクターを用いて大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物に導入して形質転換し、培養した後、精製すればよい。また、固相法などにより化学合成することも可能である。
【００２９】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンの剤形は、所望の投与経路に応じて適宜選択すればよい。例えば、皮下注射の場合には、溶液やエマルションとすればよいし、或いは、凍結乾燥品とし、溶液やエマルションを用事調製してもよい。また、経粘膜投与の場合には、舌下錠などの錠剤、軟膏剤、クリーム剤などとすればよい。
【００３０】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンには、その剤形に応じた添加成分を配合してもよい。添加成分としては、例えば、水やエタノールなどの溶媒；塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの塩；不完全フロイントアジュバント、プルランなどの多糖類、完全フロイントアジュバントなどの免疫増強剤；比較的低分子のポリエチレングリコールなどの水溶性高分子；比較的高分子のポリエチレングリコールなどの基材；クエン酸、乳酸、炭酸カリウムなどのｐＨ調整剤などを挙げることができる。
【００３１】
本発明に係る膵がん細胞浸潤転移抑制ワクチンに配合するペプチドは、事前に選択してもよい。例えば、投与予定者から血清試料を取得し、被検ペプチドに対する免疫反応を試験し、高いＣＴＬ誘導能が得られるペプチドを選択することができる。
【００３２】
本発明ワクチンの投与量は、患者の重篤度、性別、年齢などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１回の投与あたりの各ペプチドの投与量がそれぞれ１ｍｇ以上、１５ｍｇ以下程度、より好ましくは３ｍｇ以上、５ｍｇ以下程度となるようにすることができる。
【００３３】
投与方法も適宜選択すればよいが、例えば、腋下または鼠径部近傍に皮下注射することが好ましい。
【００３４】
本発明ワクチンは、効率的な免疫応答のため２回以上投与することが好ましい。例えば、５日以上、１０日以下、好ましくは１週間に１回の投与間隔で、５回以上投与することが好ましい。但し、注射部位の発赤や発熱などの症状がある場合には、例えば投与を１回以上省略した後に投与を再開することもできる。投与回数の上限は特に制限されず、患者に炎症や痛みなどの症状が出ない限り十分な免疫応答が得られるまでとすればよいが、例えば、５０回以下とすることができる。
【００３５】
本発明ワクチンを２回以上投与する場合には、有効成分として配合するペプチドを適宜変更してもよい。例えば、血液試料を患者より適宜取得し、細胞障害性Ｔ細胞を活性化するペプチドと活性化しないペプチドを特定し、良好な免疫応答が得られるペプチドを選択していくことが可能である。
【００３６】
本発明ワクチンの投与対象は膵がん患者であるが、膵がん細胞がリンパ節や他の臓器に転移した患者にも投与することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００３８】
実施例１：  ＩＧＦ２ＢＰ３の転移性膵がん細胞における所在確認
免疫細胞化学的手法を用い、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）細胞内におけるＩＧＦ２ＢＰの所在を確認した。ＰＤＡＣ細胞としては、中分化ＰＤＡＣ細胞（Ｓ２−０１３株）と未分化ＰＤＡＣ細胞（ＰＡＮＣ−１株）の２種を用いた。
【００３９】
（１）  膵がん細胞の培養
ヒトＰＤＡＣ細胞ＳＵＩＴ−２株の亜系であるＳ２−０１３株を、宮崎大学の岩村威志先生より頂いた。また、ＰＤＡＣ細胞ＰＡＮＣ−１株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。これら細胞は、加熱により不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）中、５％ＣＯ2を含む湿潤雰囲気下で培養した。
【００４０】
（２）  共焦点免疫蛍光顕微鏡試験
ガラス製のカバースリップを、室温で１時間、１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）でコートした。各ＰＤＡＣ細胞を当該フィブロネクチンコートカバースリップ上に播き、５時間インキュベートした。次いで、当該細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で被覆した後、抗ＩＧＦ２ＢＰ３一次抗体等と１時間インキュベートした。さらに、ローダミンが結合したファロイジン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ製）の存在下または不存在下、蛍光色素であるＡｌｅｘａ４８８−，Ａｌｅｘａ５４６−，Ａｌｅｘａ５９４−またはＡｌｅｘａ６４７−結合二次抗体（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ製）を用いた。いくつかの一次抗体には、市販の抗体標識技術（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製「Ｚｅｎｏｎ（登録商標）」を用い、緑色または赤色の蛍光色素分子を結合させた。各試料は、共焦点レーザスキャン蛍光相関分光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ製「Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」）で可視化した。得られた顕微鏡像の写真を図１，２に示す。
【００４１】
（３）  結果と考察
膵管腺がん細胞であるＳ２−０１３株またはＰＡＮＣ−１株をフィブロネクチン上で培養して細胞膜突起の形成を促進したところ、図１の写真に示された矢印部分のとおり、ＩＧＦ２ＢＰ３は細胞膜突起に集積していた。共焦点免疫蛍光顕微鏡試験におけるＺ−ｓｔａｃｋ（多層取り込み）写真である図２によれば、フィブロネクチンで刺激されたＳ２−０１３株では、細胞膜突起中に局在している細胞質顆粒中に、ＩＧＦ２ＢＰ３の発現を確認することができた。
【００４２】
かかる知見と以上の結果より、細胞の運動性に必須の部位である細胞膜突起にＩＧＦ２ＢＰ３が集積するので、ＩＧＦ２ＢＰ３は、膵がん細胞の運動性や浸潤にとり重要であることが明らかとなった。
【００４３】
実施例２：  転移性膵がん細胞におけるＩＧＦ２ＢＰ３のノックダウン試験
（１）  ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡ干渉
膵がん細胞の浸潤転移に関するＩＧＦ２ＢＰ３の影響を明らかにするために、ＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを発現するベクターを用いて、Ｓ２−０１３株細胞におけるＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現を阻害した。
【００４４】
ＧＰ２−２９３パッケージング細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）に、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製「
ＴＲ３００１３」）またはＩＧＦ２ＢＰ３  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製「ＴＧ３１２２２１」）を組み込んだ複製欠損レンチウィルスを発生させるｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に一時的に感染させた。引き続き、それぞれのｓｉＲＮＡを内包しているＧＰ−２９３パッケージング細胞をＳ２−０１３株細胞に感染させた。感染から４８時間後、Ｓ２−０１３株細胞をフラスコに移し、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で７日間培養することにより、ＩＧＦ２ＢＰ３  ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡを安定的に発現するＳ２−０１３株細胞由来のクローン細胞を多数得た。各クローン細胞におけるＩＧＦ２ＢＰ３発現抑制の程度をウェスタンブロット解析した。結果を図３に示す。なお、図３中、「Ｓｃｒ」はｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌのｓｉＲＮＡを恒常的に発現するコントロールクローンであり、「ｓｉＩＧＦ」はＩＧＦ２ＢＰ３特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現してＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されているクローンであり、「ＧＡＰＤＨ」はウェスタンブロット解析で各サンプルが等量用いられていることを示すインターナルコントロールとしてのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００４５】
図３に示す結果のとおり、免疫ブロットによりＩＧＦ２ＢＰ３のノックダウンが確認された。以下の実験において、細胞は、ウェスタンブロット解析によりＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現が抑制されていることを確認できたクローン細胞であるＳｃｒ−１とＳｃｒ−２を用いた。
【００４６】
別途、ＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現抑制が膵管腺がん細胞（Ｓ２−０１３株またはＰＡＮＣ−１細胞）の増殖に影響を及ぼさないことを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴアッセイにより確認した。
【００４７】
（２）  創傷領域運動性アッセイ
各創傷治癒アッセイでは、プラスチック製のピペットチップを用い、コンフルエントの単層細胞に創傷領域として十字型の切れ込みを入れた。観測する創傷領域にいくつかマーキングした後に、位相差顕微鏡を使って写真撮影した。マークした創傷領域に遊走する細胞を１時間から８時間観察し、写真撮影を継続的に行った。遊走した細胞による創傷領域の塞がりの度合いを、遊走した細胞を計数することにより定量化した。細胞の写真を図４に、定量値を図５に示す。
【００４８】
図４に示す結果のとおり、ＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現抑制により、コンフルエント培養物されたＳ２−０１３株の創傷領域への細胞の移動が阻害された。また、図５のとおり、創傷領域に移動する細胞の数は、ＩＧＦ２ＢＰ３遺伝子の発現をＲＮＡ干渉で阻害することにより、有意に減少した。
【００４９】
（３）  細胞運動先進部の免疫細胞染色
プラスチック製ピペットチップを用い、コンフルエントのＳ２−０１３株細胞に十字型の切れ込みを入れた後、創傷領域への細胞の遊走を促進させた。４時間後、細胞を一次抗体で免疫染色し、上記実施例１と同様にして蛍光体結合二次抗体とインキュベートした。創傷領域へ遊走しはじめた細胞の運動先進部を、共焦点レーザスキャン蛍光相関分光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ製「Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」）で観察した。結果を図６に示す。図６のとおり、遊走を開始したＳ２−０１３株細胞のアクチンが重合している細胞先進部にＩＧＦ２ＢＰ３が集積していた。
【００５０】
（４）  マトリゲル浸潤アッセイ
３．０×１０4個の細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ（２４ウェルプレート，孔径：８μｍ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）の上部チャンバーに播種した。無血清培地を当該上部チャンバーに加え、５％ＦＣＳを含む溶媒を下部チャンバーに添加した。細胞を上部チャンバー内で２２時間インキュベートした。次いで、３つの独立した領域を顕微鏡で観察し、下部チャンバーへＭａｔｒｉｇｅｌを溶解して浸潤した細胞を計数した。同様の実験を３回繰り返し、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌのｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＳ２−０１３コントロールクローン（Ｓｃｒ−１およびＳｃｒ−２）とＩＧＦ２ＢＰ３特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現してＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたＳ２−０１３クローン（ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２）との間で比較した。結果を図７に示す。
【００５１】
図７に示す結果のとおり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒを使った浸潤性アッセイの結果、ＩＧＦ２ＢＰ３の発現をＲＮＡ干渉により阻害したＳ２−０１３株（ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２）の浸潤性は、コントロール（Ｓｃｒ−１およびＳｃｒ−２）に対して有意に抑制された。
【００５２】
また、ＩＧＦ２ＢＰ３全アミノ酸をコードするｃＤＮＡを増幅するために、Ｓ２−０１３株細胞のＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｃ−末端にｍｙｃ−ＤＤＫタグを生じるｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ製）に導入した。以下、得られたベクターを「ＩＧＦ２ＢＰ３−ｐＣＭＶ６」という。ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２クローン細胞にＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復させるために、ＩＧＦ２ＢＰ３−ｐＣＭＶ６をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ製）を用いてｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２クローン細胞にトランスフェクションを行った。結果を図７に示す。図７中の「＊」は、モックベクターをトランスフェクションした細胞に対して、ＩＧＦ２ＢＰ３−ｐＣＭＶ６をトランスフェクションした細胞が、ｔ−テストにおいてｐ＜０．００５で浸潤した細胞が有意に回復したことを示す。
【００５３】
図７に示す結果のとおり、ＩＧＦ２ＢＰ３−ｐＣＭＶ６のＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞へのトランスフェクションは、ＩＧＦ２ＢＰ３発現を回復することによりＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉにより生じた細胞の浸潤抑制を無効にすることが見出された。
【００５４】
（５）  マウスと腫瘍細胞の同所移植
６週齢の無菌雌性無胸腺ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）を日本エスエルシー株式会社から購入し、高知大学研究機関内動物管理使用ガイドラインに従って扱った。ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌのｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＳ２−０１３コントロールクローン（Ｓｃｒ−１およびＳｃｒ−２）とＩＧＦ２ＢＰ３特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現してＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたＳ２−０１３クローン（ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２）を、各マウスの膵臓へ外科的かつ同所的に移植することにより、マウス膵臓内に腫瘍を形成させた。移植から４２日後にマウスを屠殺し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行い、マウスの膵臓内に形成された腫瘍から後腹膜への浸潤の有無と、肺および肝臓への転移の有無を調べた。また、マウス膵臓内に形成された腫瘍を計量した。計量結果、および後腹膜への浸潤と遠隔転移の有無を表１に、染色写真を図８に示す。なお、図８中、「Ｒ」は腔腹膜組織を示し、「Ｐ」は筋肉組織を示し、「Ｎ」は正常組織を示す。
【００５５】
【表１】
2015227292.tif 000002
【００５６】
表１に示す結果のとおり、マウス膵臓内に形成された腫瘍から後腹膜への浸潤は、コントロールクローン細胞（Ｓｃｒ−１およびＳｃｒ−２）に比べ、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞（ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２）の方が有意に低かった。また、コントロールクローン細胞由来の膵がん組織は肝臓や肺へ転移したのに対して、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞由来の膵がん組織は転移しなかった。
【００５７】
また、図８に示す結果のとおり、コントロールクローン細胞由来の膵がん組織は、マウスの膵臓組織全体へ浸潤していた。特に、腫瘍組織と正常組織との間の境界は、コントロール試料では明確でなかった。それに対して、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞由来の膵がん組織は、その大部分がマウスの間質細胞により包まれ、マウス正常膵臓組織から明確に分離されていた。コントロールクローン細胞を移植されたマウスでは、腹膜の表面は、コントロールクローン細胞由来の膵がん組織から播種された比較的厚いがん細胞層で覆われており、がん細胞は筋層まで浸潤していた。一方、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞を移植されたマウスでは、腹膜の大部分においてがん細胞は認められなかった。さらに、コントロールクローン細胞を移植されたマウスでは、肺と肝臓に転移巣が認められたが、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞を移植されたマウスでは、肺および肝臓への転移巣は皆無であった。以上の結果より、膵がん細胞でＩＧＦ２ＢＰ３の発現を抑制することにより肺や肝などへの転移を完全に防ぐことができ、また、ＩＧＦ２ＢＰ３は膵がんの新規治療標的分子になり得るといえる。
【００５８】
（６）  考察
以上の結果は、ＩＧＦ２ＢＰ３が膵がん細胞の浸潤転移を特に促進し、また、生体内における膵臓の腫瘍形成において、ＩＧＦ２ＢＰ３の発現量の低減が、１）膵臓内における腫瘍の増加と、２）膵臓の隣接組織への浸潤と、３）他の組織への転移に影響を及ぼすことを示している。
【００５９】
実施例３：  細胞の細胞膜突起の形成におけるＩＧＦ２ＢＰ３の役割
共焦点顕微鏡を用い、フィブロネクチンで刺激したＳ２−０１３株細胞におけるアクチンフィラメントの重合と細胞膜突起の３次元構造を調べた。共焦点顕微鏡の詳しい条件は、上記実施例１と同様とした。結果を図９〜１１に示す。
【００６０】
図９は、細胞膜直下に形成されたアクチンフィラメントの写真である。図９のとおり、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌのｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＳ２−０１３コントロールクローン（Ｓｃｒ−１）に比べ、ＩＧＦ２ＢＰ３特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現してＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたＳ２−０１３クローン（ｓｉＩＧＦ−１）における重合アクチンフィラメントの量は少ない。かかる結果は、ＩＧＦ２ＢＰ３−ＲＮＡｉ  Ｓ２−０１３株細胞へのＩＧＦ２ＢＰ３−ｐＣＭＶ６のトランスフェクションによって、ＩＧＦ２ＢＰ３の発現が回復し、細胞膜直下のアクチンフィラメントの重合が復活することを示している。
【００６１】
図１０は、全細胞中、細胞膜突起を有する細胞の割合である。図１０のとおり、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン（ｓｉＩＧＦ−１およびｓｉＩＧＦ−２）における細胞膜突起を有する細胞の割合は、コントロールクローン（Ｓｃｒ−１およびＳｃｒ−２）に比べて有意に少ない。
【００６２】
図１１は、コントロールクローン細胞（Ｓｃｒ−１）とＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞（ｓｉＩＧＦ−１）の位相差顕微鏡を用いた写真である。図１１のとおり、コントロールクローン細胞は紡錘形であり線維芽細胞様の形態を示す一方で、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞は丸状であり上皮細胞様の形態を示した。線維芽細胞様形態は上皮細胞様形態に比べて浸潤転移傾向の強いことが多いので、かかる結果は、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されたクローン細胞が、ＩＧＦ２ＢＰ３発現が抑制されていないコントロールクローン細胞よりも浸潤転移能が低いことを示す。
【図１】
2015227292.tif 000003
【図２】
2015227292.tif 000004
【図３】
2015227292.tif 000005
【図４】
2015227292.tif 000006
【図５】
2015227292.tif 000007
【図６】
2015227292.tif 000008
【図７】
2015227292.tif 000009
【図８】
2015227292.tif 000010
【図９】
2015227292.tif 000011
【図１０】
2015227292.tif 000012
【図１１】
2015227292.tif 000013
【配列表】
2015227292000001.app