(57)【要約】本発明は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の調節に有用な組成物および方法を提供する。その組成物および方法のうちのある特定のものは、ＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導するために有用である。本発明はさらに、本発明の方法を用いて産生された細胞およびそれを使用する方法を提供する。その組成物および方法のうちのある特定のものは、上皮細胞がＥＭＴを起こすのを阻害するために有用である。その組成物および方法のうちのある特定のものは、ＥＭＴの阻害を必要とする被験体においてＥＭＴを阻害するために有用である。
2013536689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｄ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも３つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物のうちの各々から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｄ）細胞接着を乱す化合物のうちの各々から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物、ならびに以下の群：（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｄ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも２つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記（ｂ）の化合物が、内因性Ｗｎｔインヒビターを阻害することによって、古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を脱抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記（ｂ）の化合物が、ＤＫＫまたはＳＦＲＰファミリーメンバーを阻害することによって、古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を脱抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、ＤＫＫファミリーメンバーを阻害する第１の化合物およびＳＦＲＰファミリーメンバーを阻害する第２の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ＤＫＫ１を阻害する第１の化合物およびＳＦＲＰ１を阻害する第２の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記（ａ）の化合物が、ＴＧＦベータタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記（ｃ）の化合物が、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記（ｃ）の化合物が、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１６タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記（ｄ）の化合物が、アドヘレンスジャンクションまたはタイトジャンクションの形成または維持を乱す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記（ｄ）の化合物が、Ｅ−カドヘリンを阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＴＧＦ−ベータ１、Ｗｎｔ５ａ、ＤＫＫインヒビター、ＳＦＲＰインヒビターおよびＥ−カドヘリンインヒビターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＴＧＦ−ベータ１、Ｗｎｔ５ａ、ＤＫＫ１インヒビター、ＳＦＲＰ１インヒビターおよびＥ−カドヘリンインヒビターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化合物が、細胞を遺伝的に改変しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、抗体または小分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ＢＭＰ経路のシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化合物が、ＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導するのに有効な濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞培養培地をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
乳腺上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
形質転換していない上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
細胞ベースの治療を必要とする被験体に由来する形質転換していない上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こすように上皮細胞を誘導する方法であって、（ａ）上皮細胞を提供する工程；および（ｂ）該細胞を請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記細胞を、間葉系の表現型の安定的な誘導を引き起こすのに十分な時間にわたって前記組成物と接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上皮細胞から前駆細胞を調製するための方法であって、該方法は：
（ａ）上皮細胞の集団を提供する工程；および
（ｂ）請求項２６に記載の方法によって該上皮細胞の集団においてＥＭＴを誘導し、それにより、前駆細胞が該集団において産生される工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
ＥＭＴを誘導した後に前記集団から前駆細胞を単離する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記前駆細胞のうちの少なくとも一部を目的の細胞型に分化するように誘導する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
細胞の集団を得る方法であって、該方法は：（ａ）乳腺組織を提供する工程；（ｂ）該乳腺組織から基底細胞を単離する工程；および（ｃ）ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路またはＷｎｔシグナル伝達経路を混乱させる条件下で該細胞を維持する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
前記工程（ｃ）の条件が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路およびＷｎｔＣａ２＋シグナル伝達経路を混乱させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ｃ）の条件が、ＴＧＦベータインヒビター、Ｗｎｔインヒビターまたはその両方と前記細胞を接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記（ｃ）の細胞を目的の細胞型に分化させるように誘導する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
上皮細胞におけるＥＭＴを阻害する方法であって、該方法は、以下の群：（ａ）古典的および／または非古典的Ｗｎｔ経路のインヒビター；（ｂ）ＢＭＰ経路を刺激する化合物；ならびに（ｃ）ＴＧＦｂインヒビターのうちの少なくとも２つの各々から選択される少なくとも１つの化合物と該細胞を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記組成物が、ＴＧＦｂインヒビター、ならびに古典的および／または非古典的Ｗｎｔ経路のインヒビターを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、ＴＧＦｂインヒビターおよびＢＭＰアゴニストを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、ＷｎｔインヒビターおよびＢＭＰアゴニストを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｗｎｔインヒビターが、複数のＷｎｔファミリーメンバーに結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｗｎｔインヒビターが、内因性Ｗｎｔインヒビターを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｗｎｔインヒビターが、古典的Ｗｎｔシグナル伝達と非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の両方を阻害する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＢＭＰ経路を刺激する化合物が、ＢＭＰ２、４、５、６、７、９または１０を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
Ｗｎｔインヒビターが、内因性Ｗｎｔアンタゴニストを含み、前記ＢＭＰアゴニストが、ＢＭＰ２、４、５、６、７、９または１０を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
Ｗｎｔインヒビターが、ＳＦＲＰファミリーメンバーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＢＭＰ経路を刺激する化合物が、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、インビトロで行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
ＥＭＴの阻害を必要とする被験体においてＥＭＴを阻害する方法であって、該方法は：以下の群：（ａ）古典的および／または非古典的Ｗｎｔ経路のインヒビター；（ｂ）ＢＭＰ経路を刺激する化合物；ならびに（ｃ）ＴＧＦｂインヒビターのうちの少なくとも２つの各々から選択される少なくとも１つの化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
前記組成物が、ＴＧＦｂインヒビター、ならびに古典的および／または非古典的Ｗｎｔ経路のインヒビターを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が、ＴＧＦｂインヒビターおよびＢＭＰアゴニストを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、ＷｎｔインヒビターおよびＢＭＰアゴニストを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｗｎｔインヒビターが、複数のＷｎｔファミリーメンバーに結合する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｗｎｔインヒビターが、内因性Ｗｎｔインヒビターを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｗｎｔインヒビターが、古典的Ｗｎｔシグナル伝達と非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の両方を阻害する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＢＭＰアゴニストが、ＢＭＰ２、４、５、６、７、９または１０を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
Ｗｎｔインヒビターが、内因性Ｗｎｔアンタゴニストを含み、前記ＢＭＰ経路を刺激する化合物が、ＢＭＰ２、４、５、６、７、９または１０を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
Ｗｎｔインヒビターが、ＳＦＲＰファミリーメンバーを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＢＭＰ経路を刺激する化合物が、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験体が、腫瘍の処置を必要とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験体が、腫瘍の処置を必要とし、前記組成物が、化学療法剤と組み合わせて投与されるか、または放射線治療とともに使用される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体が、腫瘍の処置を必要とし、前記組成物が、該腫瘍の部位に局所的に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体が、腫瘍転移の有意なリスクがあるかを決定する工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍が、癌腫である、請求項５９〜６１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１０年９月１日に出願された米国出願第６１／３７９，３２７号（この教示は、参考として本明細書に援用される）の利益に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＥＭＴ）は、上皮細胞型を、間葉系の特質を有する細胞に相互転換することによって、胚形成の重大な工程を生じさせる分化転換プログラムである。また、ＥＭＴプログラムは、癌腫細胞においても活性化され、それにより、それらの細胞が、転移カスケードの様々な工程を完了させる能力をはじめとした高悪性度の悪性病変に関連する細胞形質を獲得できるようになる。最近の知見は、ＥＭＴを経た成体の上皮細胞が、間葉系の形質に加えて、正常な組織幹細胞（ＳＣ）および腫瘍開始細胞（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）に関連する特性も獲得すると示唆している。当該分野では、ＥＭＴプログラムの誘導または阻害に大きな関心が寄せられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
本発明は、上皮間葉転換の調節に有用な組成物および方法を提供する。１つの態様において、本発明は、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｃ）非古典的（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｄ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも３つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、その組成物は、これらの４つの群のうちの各々からの少なくとも１つの化合物を含む。
【０００４】
別の態様において、本発明は、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；および（ｄ）ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物のうちの少なくとも３つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、その組成物は、これらの４つの群の各々からの少なくとも１つの化合物を含む。
【０００５】
他の態様において、本発明は、例えば本発明の組成物を用いて、ＥＭＴを誘導するまたは阻害する方法を提供する。
【０００６】
当該分野の技術範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学などのある特定の従来の手法が、本発明の態様において有用であり得る。これらの手法のうちのある特定のものの非限定的な説明は、以下の刊行物：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，すべてＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００８年現在の版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８；Ｂｕｒｎｓ，Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ  ｅｄ．，２００５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ  Ｄｅａｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５；Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．Ｄｅ  Ｖｉｔａら編，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，８ｔｈ  ｅｄ．，２００８）に見られる。癌に関するさらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＲＡら、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６にも見られ得る。本明細書中で言及されるすべての特許、特許出願、ウェブサイト、データベース、科学論文および他の刊行物は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】図１は、不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけを示す図面である。（Ａ）明視野位相差顕微鏡法（Ｂｒｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）：上皮ＨＭＬＥ２４＋、Ｔｗｉｓｔを過剰発現するＨＭＬＥ（ＨＴｗｉｓｔ）およびＭＳＰ細胞の像。（Ｂ）免疫ブロット：Ｅ−およびＮ−カドヘリン、ＥＭＴ転写因子（ＴＦ）Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。（Ｃ）免疫蛍光法：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＥＭＴ−ＴＦ  Ｔｗｉｓｔの発現および核局在化、間葉系中間径フィラメントビメンチンおよび上皮サイトケラチンのレベル（ｐａｎＣＫ＝ｐａｎ−サイトケラチン抗体）。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較した、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおけるＥＭＴ−ＴＦ、Ｅ−およびＮ−カドヘリンの発現。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｅ）マンモスフィア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：マンモスフィアの明視野位相差顕微鏡像および定量。マンモスフィア／１５００個の細胞、ｎ＝２４／細胞株。（Ｆ）ＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーのフローサイトメトリー。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を記載の数で、マウスの皮下に埋め込んだ。（Ｈ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ：浸潤された、ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞の明視野位相差顕微鏡像、および定量。ｎ＝３。（Ｉ）肺転移：ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ：ＧＦＰを発現している転移性結節を示す主要な左肺葉の顕微鏡像、拡大された挿入写真、および肺表面転移の定量。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図１−２】図１は、不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけを示す図面である。（Ａ）明視野位相差顕微鏡法（Ｂｒｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）：上皮ＨＭＬＥ２４＋、Ｔｗｉｓｔを過剰発現するＨＭＬＥ（ＨＴｗｉｓｔ）およびＭＳＰ細胞の像。（Ｂ）免疫ブロット：Ｅ−およびＮ−カドヘリン、ＥＭＴ転写因子（ＴＦ）Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。（Ｃ）免疫蛍光法：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＥＭＴ−ＴＦ  Ｔｗｉｓｔの発現および核局在化、間葉系中間径フィラメントビメンチンおよび上皮サイトケラチンのレベル（ｐａｎＣＫ＝ｐａｎ−サイトケラチン抗体）。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較した、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおけるＥＭＴ−ＴＦ、Ｅ−およびＮ−カドヘリンの発現。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｅ）マンモスフィア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：マンモスフィアの明視野位相差顕微鏡像および定量。マンモスフィア／１５００個の細胞、ｎ＝２４／細胞株。（Ｆ）ＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーのフローサイトメトリー。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を記載の数で、マウスの皮下に埋め込んだ。（Ｈ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ：浸潤された、ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞の明視野位相差顕微鏡像、および定量。ｎ＝３。（Ｉ）肺転移：ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ：ＧＦＰを発現している転移性結節を示す主要な左肺葉の顕微鏡像、拡大された挿入写真、および肺表面転移の定量。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図１−３】図１は、不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけを示す図面である。（Ａ）明視野位相差顕微鏡法（Ｂｒｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）：上皮ＨＭＬＥ２４＋、Ｔｗｉｓｔを過剰発現するＨＭＬＥ（ＨＴｗｉｓｔ）およびＭＳＰ細胞の像。（Ｂ）免疫ブロット：Ｅ−およびＮ−カドヘリン、ＥＭＴ転写因子（ＴＦ）Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。（Ｃ）免疫蛍光法：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＥＭＴ−ＴＦ  Ｔｗｉｓｔの発現および核局在化、間葉系中間径フィラメントビメンチンおよび上皮サイトケラチンのレベル（ｐａｎＣＫ＝ｐａｎ−サイトケラチン抗体）。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較した、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおけるＥＭＴ−ＴＦ、Ｅ−およびＮ−カドヘリンの発現。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｅ）マンモスフィア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：マンモスフィアの明視野位相差顕微鏡像および定量。マンモスフィア／１５００個の細胞、ｎ＝２４／細胞株。（Ｆ）ＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーのフローサイトメトリー。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を記載の数で、マウスの皮下に埋め込んだ。（Ｈ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ：浸潤された、ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞の明視野位相差顕微鏡像、および定量。ｎ＝３。（Ｉ）肺転移：ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ：ＧＦＰを発現している転移性結節を示す主要な左肺葉の顕微鏡像、拡大された挿入写真、および肺表面転移の定量。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図１−４】図１は、不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけを示す図面である。（Ａ）明視野位相差顕微鏡法（Ｂｒｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）：上皮ＨＭＬＥ２４＋、Ｔｗｉｓｔを過剰発現するＨＭＬＥ（ＨＴｗｉｓｔ）およびＭＳＰ細胞の像。（Ｂ）免疫ブロット：Ｅ−およびＮ−カドヘリン、ＥＭＴ転写因子（ＴＦ）Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。（Ｃ）免疫蛍光法：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＥＭＴ−ＴＦ  Ｔｗｉｓｔの発現および核局在化、間葉系中間径フィラメントビメンチンおよび上皮サイトケラチンのレベル（ｐａｎＣＫ＝ｐａｎ−サイトケラチン抗体）。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較した、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおけるＥＭＴ−ＴＦ、Ｅ−およびＮ−カドヘリンの発現。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｅ）マンモスフィア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：マンモスフィアの明視野位相差顕微鏡像および定量。マンモスフィア／１５００個の細胞、ｎ＝２４／細胞株。（Ｆ）ＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーのフローサイトメトリー。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を記載の数で、マウスの皮下に埋め込んだ。（Ｈ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ：浸潤された、ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞の明視野位相差顕微鏡像、および定量。ｎ＝３。（Ｉ）肺転移：ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ：ＧＦＰを発現している転移性結節を示す主要な左肺葉の顕微鏡像、拡大された挿入写真、および肺表面転移の定量。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図１−５】図１は、不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけを示す図面である。（Ａ）明視野位相差顕微鏡法（Ｂｒｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）：上皮ＨＭＬＥ２４＋、Ｔｗｉｓｔを過剰発現するＨＭＬＥ（ＨＴｗｉｓｔ）およびＭＳＰ細胞の像。（Ｂ）免疫ブロット：Ｅ−およびＮ−カドヘリン、ＥＭＴ転写因子（ＴＦ）Ｚｅｂ１、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。（Ｃ）免疫蛍光法：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＥＭＴ−ＴＦ  Ｔｗｉｓｔの発現および核局在化、間葉系中間径フィラメントビメンチンおよび上皮サイトケラチンのレベル（ｐａｎＣＫ＝ｐａｎ−サイトケラチン抗体）。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較した、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおけるＥＭＴ−ＴＦ、Ｅ−およびＮ−カドヘリンの発現。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｅ）マンモスフィア（Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：マンモスフィアの明視野位相差顕微鏡像および定量。マンモスフィア／１５００個の細胞、ｎ＝２４／細胞株。（Ｆ）ＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーのフローサイトメトリー。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を記載の数で、マウスの皮下に埋め込んだ。（Ｈ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ：浸潤された、ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞の明視野位相差顕微鏡像、および定量。ｎ＝３。（Ｉ）肺転移：ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ、ＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ：ＧＦＰを発現している転移性結節を示す主要な左肺葉の顕微鏡像、拡大された挿入写真、および肺表面転移の定量。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図２−１】図２は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるオートクリンＴＧＦ−ベータおよびＷｎｔシグナル伝達を示す図面である。（Ａ）ＥＬＩＳＡ：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＴＧＦ−ベータ１の分泌。ｎ＝３。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した。ｎ＝３。（Ｃ）免疫ブロット：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるｓｍａｄ２のリン酸化。（Ｄ）免疫ブロット：溶解する前に、細胞を、通常の培地（＋＋）、通常濃度の１０％に減少させた成長因子（＋）または成長因子非含有培地（−）中で２４時間培養した。（Ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＢＭＰアンタゴニストＧｒｅｍｌｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＫＫ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＥＬＩＳＡ：ＤＫＫ１の分泌（ｎ＝３）。（Ｈ）免疫ブロット：非古典的Ｗｎｔシグナル伝達に関連する経路の活性化状態。（Ｉ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＴＯＰＦｌａｓｈ）：細胞をＳｕｐｅｒ（８ｘ）ＴＯＰ（ＴＣＦ−ＬＥＦレポーター）またはＦＯＰ構築物（コントロール、結合部位が変異したもの）でトランスフェクトした。ｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化されたＦＯＰホタルルシフェラーゼ活性に対するＴＯＰが示されている。ｎ＝３。（Ｊ）ＴＯＰＦｌａｓｈ活性の阻害：ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１組換えタンパク質（１．０μｇ／ｍｌ）を、溶解の１２時間前にＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の成長培地に加えた。ｎ＝３。
【図２−２】図２は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるオートクリンＴＧＦ−ベータおよびＷｎｔシグナル伝達を示す図面である。（Ａ）ＥＬＩＳＡ：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＴＧＦ−ベータ１の分泌。ｎ＝３。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した。ｎ＝３。（Ｃ）免疫ブロット：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるｓｍａｄ２のリン酸化。（Ｄ）免疫ブロット：溶解する前に、細胞を、通常の培地（＋＋）、通常濃度の１０％に減少させた成長因子（＋）または成長因子非含有培地（−）中で２４時間培養した。（Ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＢＭＰアンタゴニストＧｒｅｍｌｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＫＫ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＥＬＩＳＡ：ＤＫＫ１の分泌（ｎ＝３）。（Ｈ）免疫ブロット：非古典的Ｗｎｔシグナル伝達に関連する経路の活性化状態。（Ｉ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＴＯＰＦｌａｓｈ）：細胞をＳｕｐｅｒ（８ｘ）ＴＯＰ（ＴＣＦ−ＬＥＦレポーター）またはＦＯＰ構築物（コントロール、結合部位が変異したもの）でトランスフェクトした。ｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化されたＦＯＰホタルルシフェラーゼ活性に対するＴＯＰが示されている。ｎ＝３。（Ｊ）ＴＯＰＦｌａｓｈ活性の阻害：ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１組換えタンパク質（１．０μｇ／ｍｌ）を、溶解の１２時間前にＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の成長培地に加えた。ｎ＝３。
【図２−３】図２は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるオートクリンＴＧＦ−ベータおよびＷｎｔシグナル伝達を示す図面である。（Ａ）ＥＬＩＳＡ：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＴＧＦ−ベータ１の分泌。ｎ＝３。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した。ｎ＝３。（Ｃ）免疫ブロット：ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるｓｍａｄ２のリン酸化。（Ｄ）免疫ブロット：溶解する前に、細胞を、通常の培地（＋＋）、通常濃度の１０％に減少させた成長因子（＋）または成長因子非含有培地（−）中で２４時間培養した。（Ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＢＭＰアンタゴニストＧｒｅｍｌｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＫＫ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＥＬＩＳＡ：ＤＫＫ１の分泌（ｎ＝３）。（Ｈ）免疫ブロット：非古典的Ｗｎｔシグナル伝達に関連する経路の活性化状態。（Ｉ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＴＯＰＦｌａｓｈ）：細胞をＳｕｐｅｒ（８ｘ）ＴＯＰ（ＴＣＦ−ＬＥＦレポーター）またはＦＯＰ構築物（コントロール、結合部位が変異したもの）でトランスフェクトした。ｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化されたＦＯＰホタルルシフェラーゼ活性に対するＴＯＰが示されている。ｎ＝３。（Ｊ）ＴＯＰＦｌａｓｈ活性の阻害：ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１組換えタンパク質（１．０μｇ／ｍｌ）を、溶解の１２時間前にＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の成長培地に加えた。ｎ＝３。
【図３−１】図３は、オートクリンシグナル伝達は、遊走およびマンモスフィア形成をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：細胞をＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種し、組換えＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を成長培地に加えた；＃ＨＭＬＥコントロール  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰコントロール，ｐ＜１×１０−６、＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐ＜１×１０−６。ｎ＝３。（Ｂ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）のＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質による遊走の用量依存的阻害。ｎ＝３；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐｐ＜１×１０−６、＊＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰ、高濃度  対  低濃度，ｐ＜１×１０−７。ｎ＝３。（Ｃ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）の組換えＢＭＰ４タンパク質による遊走の用量依存的阻害；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール，ｐ＜０．０５，＊＊０．６μｇ／ｍｌ  対  １．２μｇ／ｍｌ，ｐ＜１×１０−４。ｎ＝３。（Ｄ）マンモスフィア形成：組換えＤＫＫ１、ＳＦＲＰ１またはＢＭＰ４タンパク質を、スフィア形成中（５日間）毎日、記載の濃度（μｇ／ｍｌ）で加えた；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊低濃度  対  高濃度または組換えタンパク質，ｐ＜０．０５，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝８。（Ｅ）二次マンモスフィア形成：ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊一次  対  二次スフィア数，ｐ＜０．０１，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝１６。
【図３−２】図３は、オートクリンシグナル伝達は、遊走およびマンモスフィア形成をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：細胞をＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種し、組換えＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を成長培地に加えた；＃ＨＭＬＥコントロール  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰコントロール，ｐ＜１×１０−６、＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐ＜１×１０−６。ｎ＝３。（Ｂ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）のＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質による遊走の用量依存的阻害。ｎ＝３；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐｐ＜１×１０−６、＊＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰ、高濃度  対  低濃度，ｐ＜１×１０−７。ｎ＝３。（Ｃ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）の組換えＢＭＰ４タンパク質による遊走の用量依存的阻害；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール，ｐ＜０．０５，＊＊０．６μｇ／ｍｌ  対  １．２μｇ／ｍｌ，ｐ＜１×１０−４。ｎ＝３。（Ｄ）マンモスフィア形成：組換えＤＫＫ１、ＳＦＲＰ１またはＢＭＰ４タンパク質を、スフィア形成中（５日間）毎日、記載の濃度（μｇ／ｍｌ）で加えた；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊低濃度  対  高濃度または組換えタンパク質，ｐ＜０．０５，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝８。（Ｅ）二次マンモスフィア形成：ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊一次  対  二次スフィア数，ｐ＜０．０１，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝１６。
【図３−３】図３は、オートクリンシグナル伝達は、遊走およびマンモスフィア形成をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：細胞をＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種し、組換えＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を成長培地に加えた；＃ＨＭＬＥコントロール  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰコントロール，ｐ＜１×１０−６、＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐ＜１×１０−６。ｎ＝３。（Ｂ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）のＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質による遊走の用量依存的阻害。ｎ＝３；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１での処理，ｐｐ＜１×１０−６、＊＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰ、高濃度  対  低濃度，ｐ＜１×１０−７。ｎ＝３。（Ｃ）遊走アッセイ：記載の濃度（μｇ／ｍｌ）の組換えＢＭＰ４タンパク質による遊走の用量依存的阻害；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール，ｐ＜０．０５，＊＊０．６μｇ／ｍｌ  対  １．２μｇ／ｍｌ，ｐ＜１×１０−４。ｎ＝３。（Ｄ）マンモスフィア形成：組換えＤＫＫ１、ＳＦＲＰ１またはＢＭＰ４タンパク質を、スフィア形成中（５日間）毎日、記載の濃度（μｇ／ｍｌ）で加えた；＊ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊低濃度  対  高濃度または組換えタンパク質，ｐ＜０．０５，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝８。（Ｅ）二次マンモスフィア形成：ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＊Ｈ−ＴｗｉｓｔまたはＭＳＰコントロール  対  処理，ｐ＜０．０１、＊＊一次  対  二次スフィア数，ｐ＜０．０１，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝１６。
【図４−１】図４は、オートクリンシグナル伝達は、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性および転移をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＭＳＰ（ＭＳＰ−ＲＡＳ）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて播種し、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を加えた；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−８，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ）、ｐ＜１×１０−４，ｎ＝３。（Ｂ）ツモールスフィア（Ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＃コントロール一次  対  二次スフィア形成，ｐ＝０．００１；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０１，ｎ（ツモールスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｃ）フローサイトメトリー：（Ｂ）に記載されたような分離された一次ツモールスフィアのＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー。（Ｄ）ツモールスフィア形成におけるエキソビボ処理後の同所腫瘍形成：（Ｂ）において生成された一次ツモールスフィアをプールし、分離し、１．０×１０５細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ；腫瘍の重量および発生率が示されており、＊は、腫瘍が存在しないことを示している。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｅ）肺転移：ＧＦＰを発現している転移性結節を示している主要な左肺葉の蛍光顕微鏡像、および肺表面転移の数の定量；＊コントロール  対  ＳＦＲＰ１処理，ｐ＜０．０５，＊＊ＳＦＲＰ１  対  ＢＭＰ４または二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｆ）肝臓転移：（Ｄ）に記載されたような細胞を埋め込んだ後の、ＧＦＰを発現している微小転移性結節を示している肝臓表面の蛍光顕微鏡像、および定量：マウス１匹あたり肝臓表面の５つの視野を計数した。＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜０．０５，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５、ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）およびその両方の組み合わせ（Ｓ＋Ｂ）を含むＰＢＳに懸濁されたＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を記載の細胞数でマウスの皮下に埋め込んだ。さらに、２０μ１のＰＢＳまたは記載の用量でタンパク質を含むＰＢＳを、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を埋め込んだ１、２、３および７日後に腫瘍周囲に注射した。
【図４−２】図４は、オートクリンシグナル伝達は、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性および転移をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＭＳＰ（ＭＳＰ−ＲＡＳ）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて播種し、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を加えた；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−８，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ）、ｐ＜１×１０−４，ｎ＝３。（Ｂ）ツモールスフィア（Ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＃コントロール一次  対  二次スフィア形成，ｐ＝０．００１；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０１，ｎ（ツモールスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｃ）フローサイトメトリー：（Ｂ）に記載されたような分離された一次ツモールスフィアのＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー。（Ｄ）ツモールスフィア形成におけるエキソビボ処理後の同所腫瘍形成：（Ｂ）において生成された一次ツモールスフィアをプールし、分離し、１．０×１０５細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ；腫瘍の重量および発生率が示されており、＊は、腫瘍が存在しないことを示している。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｅ）肺転移：ＧＦＰを発現している転移性結節を示している主要な左肺葉の蛍光顕微鏡像、および肺表面転移の数の定量；＊コントロール  対  ＳＦＲＰ１処理，ｐ＜０．０５，＊＊ＳＦＲＰ１  対  ＢＭＰ４または二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｆ）肝臓転移：（Ｄ）に記載されたような細胞を埋め込んだ後の、ＧＦＰを発現している微小転移性結節を示している肝臓表面の蛍光顕微鏡像、および定量：マウス１匹あたり肝臓表面の５つの視野を計数した。＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜０．０５，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５、ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）およびその両方の組み合わせ（Ｓ＋Ｂ）を含むＰＢＳに懸濁されたＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を記載の細胞数でマウスの皮下に埋め込んだ。さらに、２０μ１のＰＢＳまたは記載の用量でタンパク質を含むＰＢＳを、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を埋め込んだ１、２、３および７日後に腫瘍周囲に注射した。
【図４−３】図４は、オートクリンシグナル伝達は、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性および転移をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＭＳＰ（ＭＳＰ−ＲＡＳ）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて播種し、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を加えた；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−８，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ）、ｐ＜１×１０−４，ｎ＝３。（Ｂ）ツモールスフィア（Ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＃コントロール一次  対  二次スフィア形成，ｐ＝０．００１；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０１，ｎ（ツモールスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｃ）フローサイトメトリー：（Ｂ）に記載されたような分離された一次ツモールスフィアのＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー。（Ｄ）ツモールスフィア形成におけるエキソビボ処理後の同所腫瘍形成：（Ｂ）において生成された一次ツモールスフィアをプールし、分離し、１．０×１０５細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ；腫瘍の重量および発生率が示されており、＊は、腫瘍が存在しないことを示している。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｅ）肺転移：ＧＦＰを発現している転移性結節を示している主要な左肺葉の蛍光顕微鏡像、および肺表面転移の数の定量；＊コントロール  対  ＳＦＲＰ１処理，ｐ＜０．０５，＊＊ＳＦＲＰ１  対  ＢＭＰ４または二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｆ）肝臓転移：（Ｄ）に記載されたような細胞を埋め込んだ後の、ＧＦＰを発現している微小転移性結節を示している肝臓表面の蛍光顕微鏡像、および定量：マウス１匹あたり肝臓表面の５つの視野を計数した。＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜０．０５，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５、ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）およびその両方の組み合わせ（Ｓ＋Ｂ）を含むＰＢＳに懸濁されたＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を記載の細胞数でマウスの皮下に埋め込んだ。さらに、２０μ１のＰＢＳまたは記載の用量でタンパク質を含むＰＢＳを、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を埋め込んだ１、２、３および７日後に腫瘍周囲に注射した。
【図４−４】図４は、オートクリンシグナル伝達は、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性および転移をコントロールすることを示す図面である。（Ａ）遊走アッセイ：ＲＡＳによって形質転換されたＭＳＰ（ＭＳＰ−ＲＡＳ）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて播種し、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を加えた；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−８，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ）、ｐ＜１×１０−４，ｎ＝３。（Ｂ）ツモールスフィア（Ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）を一次スフィア形成中（５日間）毎日加え、スフィアを分散し、さらなる処理なしで二次スフィア形成のために播種した；＃コントロール一次  対  二次スフィア形成，ｐ＝０．００１；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊単一処理  対  ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４による二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０１，ｎ（ツモールスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｃ）フローサイトメトリー：（Ｂ）に記載されたような分離された一次ツモールスフィアのＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー。（Ｄ）ツモールスフィア形成におけるエキソビボ処理後の同所腫瘍形成：（Ｂ）において生成された一次ツモールスフィアをプールし、分離し、１．０×１０５細胞をマウスの脂肪パッドに埋め込んだ；腫瘍の重量および発生率が示されており、＊は、腫瘍が存在しないことを示している。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｅ）肺転移：ＧＦＰを発現している転移性結節を示している主要な左肺葉の蛍光顕微鏡像、および肺表面転移の数の定量；＊コントロール  対  ＳＦＲＰ１処理，ｐ＜０．０５，＊＊ＳＦＲＰ１  対  ＢＭＰ４または二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５。ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｆ）肝臓転移：（Ｄ）に記載されたような細胞を埋め込んだ後の、ＧＦＰを発現している微小転移性結節を示している肝臓表面の蛍光顕微鏡像、および定量：マウス１匹あたり肝臓表面の５つの視野を計数した。＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜０．０５，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５、ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｇ）腫瘍原性アッセイ：ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）およびその両方の組み合わせ（Ｓ＋Ｂ）を含むＰＢＳに懸濁されたＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を記載の細胞数でマウスの皮下に埋め込んだ。さらに、２０μ１のＰＢＳまたは記載の用量でタンパク質を含むＰＢＳを、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を埋め込んだ１、２、３および７日後に腫瘍周囲に注射した。
【図５−１】図５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｎ−カドヘリン、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＲＮＡを単離する前に、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰまたは−ｓｈＳＦＲＰ１（ＳＦＲＰ１の安定的なノックダウン、図Ｓ５Ａ）細胞を、記載の因子：抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）で３日間毎日処理した。（Ｂ）明視野顕微鏡法：記載されたような処理の１４日後の、コントロール、ＴＧＦ−ベータおよびｉＥＭＴカクテルで処理されたＨＭＬＥ２４＋細胞の像（図Ｓ５Ｄも参照のこと）。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。１４日間の処理後、さらなる刺激なしで４継代にわたって細胞を増殖した。ＰＢＳで処理されたコントロールＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞、ＴＧＦ−ベータ１で処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ培養物（ＴＧＦ−β−ａおよび−ｂ）、ｉＥＭＴカクテルで処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１培養物（ｉＥＭＴ−ａおよび−ｂ）が示されている。（Ｄ）免疫ブロット：ＥＭＴマーカーおよび関連するオートクリン経路。細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。（Ｅ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。＊コントロール  対  ＴＧＦ−ベータ処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊コントロール  対  ｉＥＭＴ処理，ｐ＜１×１０−９、ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝７。（Ｆ）フローサイトメトリー：コントロール、（Ｃ）に記載されたように産生されたＴＧＦ−ベータ−ａおよびｉＥＭＴ−ａ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー発現。（Ｇ）肺転移：（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に８継代にわたって増殖された細胞をＲＡＳで形質転換した；１．０×１０５細胞をマウスの乳房脂肪パッドに注射した；肺の表面上のＧＦＰ標識された転移を定量した；＊コントロール  対  他のすべての群，ｐ＜０．０５，ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｈ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：ＨＭＬＥ−ｉＥＭＴ−ａを、（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に１２継代にわたって増殖し、次いで、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ／ｄ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ／ｄ）またはその両方（Ｓ＋Ｂ）のタンパク質の存在下においてアッセイに播種した；＊コントロール  対  単一処理、ｐ＜０．０１，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５，ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図５−２】図５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｎ−カドヘリン、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＲＮＡを単離する前に、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰまたは−ｓｈＳＦＲＰ１（ＳＦＲＰ１の安定的なノックダウン、図Ｓ５Ａ）細胞を、記載の因子：抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）で３日間毎日処理した。（Ｂ）明視野顕微鏡法：記載されたような処理の１４日後の、コントロール、ＴＧＦ−ベータおよびｉＥＭＴカクテルで処理されたＨＭＬＥ２４＋細胞の像（図Ｓ５Ｄも参照のこと）。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。１４日間の処理後、さらなる刺激なしで４継代にわたって細胞を増殖した。ＰＢＳで処理されたコントロールＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞、ＴＧＦ−ベータ１で処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ培養物（ＴＧＦ−β−ａおよび−ｂ）、ｉＥＭＴカクテルで処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１培養物（ｉＥＭＴ−ａおよび−ｂ）が示されている。（Ｄ）免疫ブロット：ＥＭＴマーカーおよび関連するオートクリン経路。細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。（Ｅ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。＊コントロール  対  ＴＧＦ−ベータ処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊コントロール  対  ｉＥＭＴ処理，ｐ＜１×１０−９、ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝７。（Ｆ）フローサイトメトリー：コントロール、（Ｃ）に記載されたように産生されたＴＧＦ−ベータ−ａおよびｉＥＭＴ−ａ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー発現。（Ｇ）肺転移：（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に８継代にわたって増殖された細胞をＲＡＳで形質転換した；１．０×１０５細胞をマウスの乳房脂肪パッドに注射した；肺の表面上のＧＦＰ標識された転移を定量した；＊コントロール  対  他のすべての群，ｐ＜０．０５，ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｈ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：ＨＭＬＥ−ｉＥＭＴ−ａを、（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に１２継代にわたって増殖し、次いで、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ／ｄ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ／ｄ）またはその両方（Ｓ＋Ｂ）のタンパク質の存在下においてアッセイに播種した；＊コントロール  対  単一処理、ｐ＜０．０１，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５，ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図５−３】図５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｎ−カドヘリン、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＲＮＡを単離する前に、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰまたは−ｓｈＳＦＲＰ１（ＳＦＲＰ１の安定的なノックダウン、図Ｓ５Ａ）細胞を、記載の因子：抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）で３日間毎日処理した。（Ｂ）明視野顕微鏡法：記載されたような処理の１４日後の、コントロール、ＴＧＦ−ベータおよびｉＥＭＴカクテルで処理されたＨＭＬＥ２４＋細胞の像（図Ｓ５Ｄも参照のこと）。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。１４日間の処理後、さらなる刺激なしで４継代にわたって細胞を増殖した。ＰＢＳで処理されたコントロールＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞、ＴＧＦ−ベータ１で処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ培養物（ＴＧＦ−β−ａおよび−ｂ）、ｉＥＭＴカクテルで処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１培養物（ｉＥＭＴ−ａおよび−ｂ）が示されている。（Ｄ）免疫ブロット：ＥＭＴマーカーおよび関連するオートクリン経路。細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。（Ｅ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。＊コントロール  対  ＴＧＦ−ベータ処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊コントロール  対  ｉＥＭＴ処理，ｐ＜１×１０−９、ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝７。（Ｆ）フローサイトメトリー：コントロール、（Ｃ）に記載されたように産生されたＴＧＦ−ベータ−ａおよびｉＥＭＴ−ａ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー発現。（Ｇ）肺転移：（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に８継代にわたって増殖された細胞をＲＡＳで形質転換した；１．０×１０５細胞をマウスの乳房脂肪パッドに注射した；肺の表面上のＧＦＰ標識された転移を定量した；＊コントロール  対  他のすべての群，ｐ＜０．０５，ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｈ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：ＨＭＬＥ−ｉＥＭＴ−ａを、（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に１２継代にわたって増殖し、次いで、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ／ｄ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ／ｄ）またはその両方（Ｓ＋Ｂ）のタンパク質の存在下においてアッセイに播種した；＊コントロール  対  単一処理、ｐ＜０．０１，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５，ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図５−４】図５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｎ−カドヘリン、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。ＲＮＡを単離する前に、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰまたは−ｓｈＳＦＲＰ１（ＳＦＲＰ１の安定的なノックダウン、図Ｓ５Ａ）細胞を、記載の因子：抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）で３日間毎日処理した。（Ｂ）明視野顕微鏡法：記載されたような処理の１４日後の、コントロール、ＴＧＦ−ベータおよびｉＥＭＴカクテルで処理されたＨＭＬＥ２４＋細胞の像（図Ｓ５Ｄも参照のこと）。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。１４日間の処理後、さらなる刺激なしで４継代にわたって細胞を増殖した。ＰＢＳで処理されたコントロールＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞、ＴＧＦ−ベータ１で処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ培養物（ＴＧＦ−β−ａおよび−ｂ）、ｉＥＭＴカクテルで処理された２つのＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１培養物（ｉＥＭＴ−ａおよび−ｂ）が示されている。（Ｄ）免疫ブロット：ＥＭＴマーカーおよび関連するオートクリン経路。細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。（Ｅ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：細胞は、（Ｃ）に記載されたように産生された。＊コントロール  対  ＴＧＦ−ベータ処理，ｐ＜１×１０−４，＊＊コントロール  対  ｉＥＭＴ処理，ｐ＜１×１０−９、ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝７。（Ｆ）フローサイトメトリー：コントロール、（Ｃ）に記載されたように産生されたＴＧＦ−ベータ−ａおよびｉＥＭＴ−ａ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカー発現。（Ｇ）肺転移：（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に８継代にわたって増殖された細胞をＲＡＳで形質転換した；１．０×１０５細胞をマウスの乳房脂肪パッドに注射した；肺の表面上のＧＦＰ標識された転移を定量した；＊コントロール  対  他のすべての群，ｐ＜０．０５，ｎ＝５匹のマウス／群。（Ｈ）遊走（Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ）およびマンモスフィアアッセイ：ＨＭＬＥ−ｉＥＭＴ−ａを、（Ｃ）に記載されたような処理を休止した後に１２継代にわたって増殖し、次いで、組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ／ｄ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ／ｄ）またはその両方（Ｓ＋Ｂ）のタンパク質の存在下においてアッセイに播種した；＊コントロール  対  単一処理、ｐ＜０．０１，＊＊単一処理  対  二重処理（Ｓ＋Ｂ），ｐ＜０．０５，ｎ（遊走）＝３，ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図６−１】図６は、ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現することを示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ：ヒト乳房縮小術からの単一細胞調製物；（１．）死細胞を７ＡＡＤ染色によって除外した後、（２．）ＣＤ４５（白血球）およびＣＤ３１（内皮細胞）が陽性の細胞を除外した。（３．）結果として生じたＬｉｎ−細胞を用いて、基底（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ低−陰性）および管腔（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ陽性）細胞集団を回収した。（Ｂ）明視野位相差顕微鏡法：精製された基底、管腔およびソーティングされていないバルクのＭＥＣをＦＡＣＳ後に５日間培養した。（Ｃ）免疫蛍光法：基底および管腔のＭＥＣ集団をＦＡＣＳ後に５日間培養した；管腔系列マーカー；サイトケラチン（ＣＫ）８、１８およびＭＵＣ１；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｄ）免疫蛍光法：基底系列マーカーＣＫ１４、ｐ６３；筋上皮系列マーカーアルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｅ）免疫蛍光法：間葉系および上皮のマーカー；ビメンチン、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１およびベータカテニン。ＤＡＰＩによる核染色。（Ｆ）免疫蛍光法：ＥＭＴ関連シグナル伝達：Ｓｍａｄ２、ＴＦ  ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂ１。ＤＡＰＩによる核染色。単一蛍光シグナルの像については、画像Ｓ１およびＳ２を参照のこと。
【図６−２】図６は、ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現することを示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ：ヒト乳房縮小術からの単一細胞調製物；（１．）死細胞を７ＡＡＤ染色によって除外した後、（２．）ＣＤ４５（白血球）およびＣＤ３１（内皮細胞）が陽性の細胞を除外した。（３．）結果として生じたＬｉｎ−細胞を用いて、基底（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ低−陰性）および管腔（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ陽性）細胞集団を回収した。（Ｂ）明視野位相差顕微鏡法：精製された基底、管腔およびソーティングされていないバルクのＭＥＣをＦＡＣＳ後に５日間培養した。（Ｃ）免疫蛍光法：基底および管腔のＭＥＣ集団をＦＡＣＳ後に５日間培養した；管腔系列マーカー；サイトケラチン（ＣＫ）８、１８およびＭＵＣ１；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｄ）免疫蛍光法：基底系列マーカーＣＫ１４、ｐ６３；筋上皮系列マーカーアルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｅ）免疫蛍光法：間葉系および上皮のマーカー；ビメンチン、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１およびベータカテニン。ＤＡＰＩによる核染色。（Ｆ）免疫蛍光法：ＥＭＴ関連シグナル伝達：Ｓｍａｄ２、ＴＦ  ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂ１。ＤＡＰＩによる核染色。単一蛍光シグナルの像については、画像Ｓ１およびＳ２を参照のこと。
【図６−３】図６は、ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現することを示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ：ヒト乳房縮小術からの単一細胞調製物；（１．）死細胞を７ＡＡＤ染色によって除外した後、（２．）ＣＤ４５（白血球）およびＣＤ３１（内皮細胞）が陽性の細胞を除外した。（３．）結果として生じたＬｉｎ−細胞を用いて、基底（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ低−陰性）および管腔（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ陽性）細胞集団を回収した。（Ｂ）明視野位相差顕微鏡法：精製された基底、管腔およびソーティングされていないバルクのＭＥＣをＦＡＣＳ後に５日間培養した。（Ｃ）免疫蛍光法：基底および管腔のＭＥＣ集団をＦＡＣＳ後に５日間培養した；管腔系列マーカー；サイトケラチン（ＣＫ）８、１８およびＭＵＣ１；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｄ）免疫蛍光法：基底系列マーカーＣＫ１４、ｐ６３；筋上皮系列マーカーアルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｅ）免疫蛍光法：間葉系および上皮のマーカー；ビメンチン、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１およびベータカテニン。ＤＡＰＩによる核染色。（Ｆ）免疫蛍光法：ＥＭＴ関連シグナル伝達：Ｓｍａｄ２、ＴＦ  ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂ１。ＤＡＰＩによる核染色。単一蛍光シグナルの像については、画像Ｓ１およびＳ２を参照のこと。
【図６−４】図６は、ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現することを示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ：ヒト乳房縮小術からの単一細胞調製物；（１．）死細胞を７ＡＡＤ染色によって除外した後、（２．）ＣＤ４５（白血球）およびＣＤ３１（内皮細胞）が陽性の細胞を除外した。（３．）結果として生じたＬｉｎ−細胞を用いて、基底（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ低−陰性）および管腔（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ陽性）細胞集団を回収した。（Ｂ）明視野位相差顕微鏡法：精製された基底、管腔およびソーティングされていないバルクのＭＥＣをＦＡＣＳ後に５日間培養した。（Ｃ）免疫蛍光法：基底および管腔のＭＥＣ集団をＦＡＣＳ後に５日間培養した；管腔系列マーカー；サイトケラチン（ＣＫ）８、１８およびＭＵＣ１；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｄ）免疫蛍光法：基底系列マーカーＣＫ１４、ｐ６３；筋上皮系列マーカーアルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｅ）免疫蛍光法：間葉系および上皮のマーカー；ビメンチン、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１およびベータカテニン。ＤＡＰＩによる核染色。（Ｆ）免疫蛍光法：ＥＭＴ関連シグナル伝達：Ｓｍａｄ２、ＴＦ  ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂ１。ＤＡＰＩによる核染色。単一蛍光シグナルの像については、画像Ｓ１およびＳ２を参照のこと。
【図６−５】図６は、ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現することを示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ：ヒト乳房縮小術からの単一細胞調製物；（１．）死細胞を７ＡＡＤ染色によって除外した後、（２．）ＣＤ４５（白血球）およびＣＤ３１（内皮細胞）が陽性の細胞を除外した。（３．）結果として生じたＬｉｎ−細胞を用いて、基底（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ低−陰性）および管腔（ＣＤ４９ｆ陽性／ＥｐＣＡＭ陽性）細胞集団を回収した。（Ｂ）明視野位相差顕微鏡法：精製された基底、管腔およびソーティングされていないバルクのＭＥＣをＦＡＣＳ後に５日間培養した。（Ｃ）免疫蛍光法：基底および管腔のＭＥＣ集団をＦＡＣＳ後に５日間培養した；管腔系列マーカー；サイトケラチン（ＣＫ）８、１８およびＭＵＣ１；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｄ）免疫蛍光法：基底系列マーカーＣＫ１４、ｐ６３；筋上皮系列マーカーアルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）；ＤＡＰＩによる核染色。（Ｅ）免疫蛍光法：間葉系および上皮のマーカー；ビメンチン、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１およびベータカテニン。ＤＡＰＩによる核染色。（Ｆ）免疫蛍光法：ＥＭＴ関連シグナル伝達：Ｓｍａｄ２、ＴＦ  ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂ１。ＤＡＰＩによる核染色。単一蛍光シグナルの像については、画像Ｓ１およびＳ２を参照のこと。
【図７−１】図７は、初代ＭＥＣにおける遊走および自己複製の特性：阻害および誘導を示す図面である。（Ａ）マンモスフィアアッセイ：マンモスフィアの顕微鏡像、ならびに精製された基底、管腔およびソーティングされていないＭＥＣ集団によるマンモスフィア形成の定量。一次スフィアは、７日間にわたって形成され、分離され、二次スフィア形成のために播種された。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝４８。（Ｂ）遊走アッセイ：Ｂｏｙｄｅｎチャンバーにおいて遊走した細胞の顕微鏡像および定量。ｎ＝６。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：基底細胞を、ＴＧＦ−ベータインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３５１４２（ＳＢ４３，両方ともが１０μΜのインヒビター）ならびに組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）による５日間の前処理の後、アッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：基底細胞を、（Ｃ）に記載されたような５日間の前処理後に処理された遊走アッセイに播種した。ｎ＝２４。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：管腔細胞を、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）および加えられたすべての因子が一緒になったカクテル（ｉＥＭＴ−ＩＩ）による５日間の前処理後にアッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝２４。（Ｆ）遊走アッセイ：管腔細胞を、（Ｅ）に記載されたような５日間の前処理後にＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。ｎ＝６。（Ｇ）ＨＭＬＥ細胞株において（関連する細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ２４を用いて）、および本発明者らのデータが示すように、初代ＭＥＣにおいて同様の様式で（関連するマーカーＥｐＣＡＭおよびＣＤ４９ｆを用いて）、間葉系および上皮の形質を制御しているオートクリンおよびパラクリン因子のモデル。
【図７−２】図７は、初代ＭＥＣにおける遊走および自己複製の特性：阻害および誘導を示す図面である。（Ａ）マンモスフィアアッセイ：マンモスフィアの顕微鏡像、ならびに精製された基底、管腔およびソーティングされていないＭＥＣ集団によるマンモスフィア形成の定量。一次スフィアは、７日間にわたって形成され、分離され、二次スフィア形成のために播種された。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝４８。（Ｂ）遊走アッセイ：Ｂｏｙｄｅｎチャンバーにおいて遊走した細胞の顕微鏡像および定量。ｎ＝６。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：基底細胞を、ＴＧＦ−ベータインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３５１４２（ＳＢ４３，両方ともが１０μΜのインヒビター）ならびに組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）による５日間の前処理の後、アッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：基底細胞を、（Ｃ）に記載されたような５日間の前処理後に処理された遊走アッセイに播種した。ｎ＝２４。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：管腔細胞を、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）および加えられたすべての因子が一緒になったカクテル（ｉＥＭＴ−ＩＩ）による５日間の前処理後にアッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝２４。（Ｆ）遊走アッセイ：管腔細胞を、（Ｅ）に記載されたような５日間の前処理後にＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。ｎ＝６。（Ｇ）ＨＭＬＥ細胞株において（関連する細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ２４を用いて）、および本発明者らのデータが示すように、初代ＭＥＣにおいて同様の様式で（関連するマーカーＥｐＣＡＭおよびＣＤ４９ｆを用いて）、間葉系および上皮の形質を制御しているオートクリンおよびパラクリン因子のモデル。
【図７−３】図７は、初代ＭＥＣにおける遊走および自己複製の特性：阻害および誘導を示す図面である。（Ａ）マンモスフィアアッセイ：マンモスフィアの顕微鏡像、ならびに精製された基底、管腔およびソーティングされていないＭＥＣ集団によるマンモスフィア形成の定量。一次スフィアは、７日間にわたって形成され、分離され、二次スフィア形成のために播種された。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝４８。（Ｂ）遊走アッセイ：Ｂｏｙｄｅｎチャンバーにおいて遊走した細胞の顕微鏡像および定量。ｎ＝６。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：基底細胞を、ＴＧＦ−ベータインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３５１４２（ＳＢ４３，両方ともが１０μΜのインヒビター）ならびに組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）による５日間の前処理の後、アッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：基底細胞を、（Ｃ）に記載されたような５日間の前処理後に処理された遊走アッセイに播種した。ｎ＝２４。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：管腔細胞を、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）および加えられたすべての因子が一緒になったカクテル（ｉＥＭＴ−ＩＩ）による５日間の前処理後にアッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝２４。（Ｆ）遊走アッセイ：管腔細胞を、（Ｅ）に記載されたような５日間の前処理後にＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。ｎ＝６。（Ｇ）ＨＭＬＥ細胞株において（関連する細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ２４を用いて）、および本発明者らのデータが示すように、初代ＭＥＣにおいて同様の様式で（関連するマーカーＥｐＣＡＭおよびＣＤ４９ｆを用いて）、間葉系および上皮の形質を制御しているオートクリンおよびパラクリン因子のモデル。
【図７−４】図７は、初代ＭＥＣにおける遊走および自己複製の特性：阻害および誘導を示す図面である。（Ａ）マンモスフィアアッセイ：マンモスフィアの顕微鏡像、ならびに精製された基底、管腔およびソーティングされていないＭＥＣ集団によるマンモスフィア形成の定量。一次スフィアは、７日間にわたって形成され、分離され、二次スフィア形成のために播種された。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝４８。（Ｂ）遊走アッセイ：Ｂｏｙｄｅｎチャンバーにおいて遊走した細胞の顕微鏡像および定量。ｎ＝６。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：基底細胞を、ＴＧＦ−ベータインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３５１４２（ＳＢ４３，両方ともが１０μΜのインヒビター）ならびに組換えＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）による５日間の前処理の後、アッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：基底細胞を、（Ｃ）に記載されたような５日間の前処理後に処理された遊走アッセイに播種した。ｎ＝２４。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：管腔細胞を、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＤＫＫ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）および加えられたすべての因子が一緒になったカクテル（ｉＥＭＴ−ＩＩ）による５日間の前処理後にアッセイに播種した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝２４。（Ｆ）遊走アッセイ：管腔細胞を、（Ｅ）に記載されたような５日間の前処理後にＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。ｎ＝６。（Ｇ）ＨＭＬＥ細胞株において（関連する細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ２４を用いて）、および本発明者らのデータが示すように、初代ＭＥＣにおいて同様の様式で（関連するマーカーＥｐＣＡＭおよびＣＤ４９ｆを用いて）、間葉系および上皮の形質を制御しているオートクリンおよびパラクリン因子のモデル。
【図８−１】図Ｓ１は、ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子の発現プロファイルを示す図面である。（Ａ）実験計画：ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の細胞培養上清を用いた分泌型タンパク質のスクリーニング。（Ｂ）細胞培養上清の３つの希釈度（２×−１０×−２０×希釈）に対する列挙された各抗体の一貫した成績に基づいて、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＨＴｗｉｓｔにおいて差次的に分泌されるタンパク質の上位１０％のヒートマップ。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ：ランダムに選択されたタンパク質。アレイ上のシグナル強度の相対的な差異とＥＬＩＳＡによるタンパク質の絶対レベルの倍率差異（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）との比較。（Ｄ）実験計画：遺伝子発現プロファイリング。ＨＭＬＥ  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞ならびにＨＭＬＥ２４＋  対  ＭＳＰ細胞。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞株の遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）から得られたヒートマップが示されている。
【図８−２】図Ｓ１は、ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子の発現プロファイルを示す図面である。（Ａ）実験計画：ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の細胞培養上清を用いた分泌型タンパク質のスクリーニング。（Ｂ）細胞培養上清の３つの希釈度（２×−１０×−２０×希釈）に対する列挙された各抗体の一貫した成績に基づいて、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＨＴｗｉｓｔにおいて差次的に分泌されるタンパク質の上位１０％のヒートマップ。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ：ランダムに選択されたタンパク質。アレイ上のシグナル強度の相対的な差異とＥＬＩＳＡによるタンパク質の絶対レベルの倍率差異（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）との比較。（Ｄ）実験計画：遺伝子発現プロファイリング。ＨＭＬＥ  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞ならびにＨＭＬＥ２４＋  対  ＭＳＰ細胞。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞株の遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）から得られたヒートマップが示されている。
【図８−３】図Ｓ１は、ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子の発現プロファイルを示す図面である。（Ａ）実験計画：ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の細胞培養上清を用いた分泌型タンパク質のスクリーニング。（Ｂ）細胞培養上清の３つの希釈度（２×−１０×−２０×希釈）に対する列挙された各抗体の一貫した成績に基づいて、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＨＴｗｉｓｔにおいて差次的に分泌されるタンパク質の上位１０％のヒートマップ。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ：ランダムに選択されたタンパク質。アレイ上のシグナル強度の相対的な差異とＥＬＩＳＡによるタンパク質の絶対レベルの倍率差異（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）との比較。（Ｄ）実験計画：遺伝子発現プロファイリング。ＨＭＬＥ  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞ならびにＨＭＬＥ２４＋  対  ＭＳＰ細胞。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞株の遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）から得られたヒートマップが示されている。
【図８−４】図Ｓ１は、ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子の発現プロファイルを示す図面である。（Ａ）実験計画：ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の細胞培養上清を用いた分泌型タンパク質のスクリーニング。（Ｂ）細胞培養上清の３つの希釈度（２×−１０×−２０×希釈）に対する列挙された各抗体の一貫した成績に基づいて、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＨＴｗｉｓｔにおいて差次的に分泌されるタンパク質の上位１０％のヒートマップ。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ：ランダムに選択されたタンパク質。アレイ上のシグナル強度の相対的な差異とＥＬＩＳＡによるタンパク質の絶対レベルの倍率差異（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）との比較。（Ｄ）実験計画：遺伝子発現プロファイリング。ＨＭＬＥ  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞ならびにＨＭＬＥ２４＋  対  ＭＳＰ細胞。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞株の遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）から得られたヒートマップが示されている。
【図８−５】図Ｓ１は、ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子の発現プロファイルを示す図面である。（Ａ）実験計画：ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の細胞培養上清を用いた分泌型タンパク質のスクリーニング。（Ｂ）細胞培養上清の３つの希釈度（２×−１０×−２０×希釈）に対する列挙された各抗体の一貫した成績に基づいて、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＨＴｗｉｓｔにおいて差次的に分泌されるタンパク質の上位１０％のヒートマップ。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ：ランダムに選択されたタンパク質。アレイ上のシグナル強度の相対的な差異とＥＬＩＳＡによるタンパク質の絶対レベルの倍率差異（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）との比較。（Ｄ）実験計画：遺伝子発現プロファイリング。ＨＭＬＥ  対  ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞ならびにＨＭＬＥ２４＋  対  ＭＳＰ細胞。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞株の遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）から得られたヒートマップが示されている。
【図８−６】図Ｓ２は、ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図面である。（Ａ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＢＭＰリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｂ）ＨＭＬＥ２４＋およびＭＳＰ細胞株におけるＳＦＲＰアイソフォーム。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｃ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｄ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔ、ＴＧＦ−ベータおよびＢＭＰシグナル伝達において作用する分泌型タンパク質の差次的発現の要約。
【図８−７】図Ｓ２は、ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図面である。（Ａ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＢＭＰリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｂ）ＨＭＬＥ２４＋およびＭＳＰ細胞株におけるＳＦＲＰアイソフォーム。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｃ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｄ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔ、ＴＧＦ−ベータおよびＢＭＰシグナル伝達において作用する分泌型タンパク質の差次的発現の要約。
【図８−８】図Ｓ２は、ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図面である。（Ａ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＢＭＰリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｂ）ＨＭＬＥ２４＋およびＭＳＰ細胞株におけるＳＦＲＰアイソフォーム。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｃ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔリガンド。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３。（Ｄ）ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞株におけるＷｎｔ、ＴＧＦ−ベータおよびＢＭＰシグナル伝達において作用する分泌型タンパク質の差次的発現の要約。
【図８−９】図Ｓ３は、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株におけるオートクリンシグナル伝達の阻害を示す図面である。（Ａ）成長曲線：組換えＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）またはＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）で毎日処理されたＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株の増殖アッセイ（ＭＴＳ）。ｎ＝４。（Ｂ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）または記載されるような組み合わせの存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５，＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１。ｎ＝３。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、（Ｂ）に記載されたようなタンパク質で処理した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５、＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１、ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を、ＴＧＦ−βレセプターＩインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３，両方１０μΜ）の存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰを、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（１０μΜ）またはその両方の組み合わせで処理した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図８−１０】図Ｓ３は、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株におけるオートクリンシグナル伝達の阻害を示す図面である。（Ａ）成長曲線：組換えＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）またはＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）で毎日処理されたＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株の増殖アッセイ（ＭＴＳ）。ｎ＝４。（Ｂ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）または記載されるような組み合わせの存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５，＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１。ｎ＝３。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、（Ｂ）に記載されたようなタンパク質で処理した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５、＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１、ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を、ＴＧＦ−βレセプターＩインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３，両方１０μΜ）の存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰを、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（１０μΜ）またはその両方の組み合わせで処理した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図８−１１】図Ｓ３は、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株におけるオートクリンシグナル伝達の阻害を示す図面である。（Ａ）成長曲線：組換えＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）またはＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）で毎日処理されたＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株の増殖アッセイ（ＭＴＳ）。ｎ＝４。（Ｂ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）または記載されるような組み合わせの存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５，＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１。ｎ＝３。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、（Ｂ）に記載されたようなタンパク質で処理した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５、＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１、ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を、ＴＧＦ−βレセプターＩインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３，両方１０μΜ）の存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰを、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（１０μΜ）またはその両方の組み合わせで処理した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図８−１２】図Ｓ３は、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株におけるオートクリンシグナル伝達の阻害を示す図面である。（Ａ）成長曲線：組換えＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）またはＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）で毎日処理されたＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞株の増殖アッセイ（ＭＴＳ）。ｎ＝４。（Ｂ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、ＤＫＫ１（１μｇ／ｍｌ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）または記載されるような組み合わせの存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５，＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１。ｎ＝３。（Ｃ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔ細胞を、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、（Ｂ）に記載されたようなタンパク質で処理した；＊コントロール  対  単一処理，ｐ＜１×１０−５、＊＊単一処理  対  二重処理，ｐ＜０．０１、ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。（Ｄ）遊走アッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を、ＴＧＦ−βレセプターＩインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３，両方１０μΜ）の存在下においてＢｏｙｄｅｎチャンバーに播種した。（Ｅ）マンモスフィアアッセイ：ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰを、マンモスフィア形成中（５日間）毎日、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（１０μΜ）またはその両方の組み合わせで処理した。ｎ（マンモスフィア）／１０００個の細胞，ｎ＝６。
【図８−１３】図Ｓ４は、増殖アッセイを示す図面である。ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５μｇ／ｍｌ）タンパク質またはその両方の組み合わせで５日間、毎日処理した。累積増殖をＭＴＳアッセイによって測定した。ｎ＝６。
【図８−１４】図Ｓ５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３；コントロールヘアピン標的化ＧＦＰ（ｓｈＧＦＰ）を発現している細胞と比較された、ヘアピンをコードする２つのベクター（ｓｈＳＦＲＰ１ａおよび−ｂ）を安定的に発現しているＨＭＬＥ２４＋におけるＳＦＲＰ１  ｍＲＮＡレベル。ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１ｂをｉＥＭＴ実験のために使用した。（Ｂ）フローサイトメトリー：ＨＭＬＥ、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーの発現。（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した；細胞を組換えＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。ｎ＝３。（Ｄ）明視野顕微鏡法：未処理のコントロール細胞（ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ細胞の２つの培養物のうちの１つ、およびｉＥＭＴ−カクテル：ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン−抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞の２つの培養物のうちの１つの像。（Ｅ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：記載の細胞を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後に、ｓｍａｄ（ＳＢＥ４）およびベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）レポータープラスミドでトランスフェクトした。ｎ＝３。（Ｆ）成長曲線：記載の細胞株の増殖を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後の３日間にわたるＭＴＳアッセイによってモニターした。ｎ＝１２。
【図８−１５】図Ｓ５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３；コントロールヘアピン標的化ＧＦＰ（ｓｈＧＦＰ）を発現している細胞と比較された、ヘアピンをコードする２つのベクター（ｓｈＳＦＲＰ１ａおよび−ｂ）を安定的に発現しているＨＭＬＥ２４＋におけるＳＦＲＰ１  ｍＲＮＡレベル。ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１ｂをｉＥＭＴ実験のために使用した。（Ｂ）フローサイトメトリー：ＨＭＬＥ、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーの発現。（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した；細胞を組換えＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。ｎ＝３。（Ｄ）明視野顕微鏡法：未処理のコントロール細胞（ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ細胞の２つの培養物のうちの１つ、およびｉＥＭＴ−カクテル：ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン−抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞の２つの培養物のうちの１つの像。（Ｅ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：記載の細胞を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後に、ｓｍａｄ（ＳＢＥ４）およびベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）レポータープラスミドでトランスフェクトした。ｎ＝３。（Ｆ）成長曲線：記載の細胞株の増殖を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後の３日間にわたるＭＴＳアッセイによってモニターした。ｎ＝１２。
【図８−１６】図Ｓ５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３；コントロールヘアピン標的化ＧＦＰ（ｓｈＧＦＰ）を発現している細胞と比較された、ヘアピンをコードする２つのベクター（ｓｈＳＦＲＰ１ａおよび−ｂ）を安定的に発現しているＨＭＬＥ２４＋におけるＳＦＲＰ１  ｍＲＮＡレベル。ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１ｂをｉＥＭＴ実験のために使用した。（Ｂ）フローサイトメトリー：ＨＭＬＥ、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーの発現。（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した；細胞を組換えＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。ｎ＝３。（Ｄ）明視野顕微鏡法：未処理のコントロール細胞（ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ細胞の２つの培養物のうちの１つ、およびｉＥＭＴ−カクテル：ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン−抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞の２つの培養物のうちの１つの像。（Ｅ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：記載の細胞を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後に、ｓｍａｄ（ＳＢＥ４）およびベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）レポータープラスミドでトランスフェクトした。ｎ＝３。（Ｆ）成長曲線：記載の細胞株の増殖を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後の３日間にわたるＭＴＳアッセイによってモニターした。ｎ＝１２。
【図８−１７】図Ｓ５は、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激は、ＨＭＬＥ２４＋細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に入るのを可能にすることを示す図面である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ：ＳＦＲＰ１。Ｌ３２が、ローディングコントロールだった。ｎ＝３；コントロールヘアピン標的化ＧＦＰ（ｓｈＧＦＰ）を発現している細胞と比較された、ヘアピンをコードする２つのベクター（ｓｈＳＦＲＰ１ａおよび−ｂ）を安定的に発現しているＨＭＬＥ２４＋におけるＳＦＲＰ１  ｍＲＮＡレベル。ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１ｂをｉＥＭＴ実験のために使用した。（Ｂ）フローサイトメトリー：ＨＭＬＥ、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ２４細胞表面マーカーの発現。（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：Ｓｍａｄ転写活性：細胞をＳＢＥ４−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼレベルをｐＧＬ−ＳＶ４０ウミシイタケトランスフェクションコントロールに対して正規化した；細胞を組換えＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。ｎ＝３。（Ｄ）明視野顕微鏡法：未処理のコントロール細胞（ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１）、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ細胞の２つの培養物のうちの１つ、およびｉＥＭＴ−カクテル：ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン−抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理されたＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞の２つの培養物のうちの１つの像。（Ｅ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ：記載の細胞を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後に、ｓｍａｄ（ＳＢＥ４）およびベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）レポータープラスミドでトランスフェクトした。ｎ＝３。（Ｆ）成長曲線：記載の細胞株の増殖を、（Ｄ）に記載されたような１４日間の処理を休止した８継代後の３日間にわたるＭＴＳアッセイによってモニターした。ｎ＝１２。
【図８−１８】図Ｓ６は、初代ＭＥＣの免疫蛍光法を示す図面である。（Ａ）ＦＡＣＳ後にガラススライド上で７日間培養された基底および管腔細胞におけるＥ−カドヘリンの発現。矢印は、Ｅ−カドヘリン発現を失った、上皮島の外側で個々に遊走する細胞を指し示している。ＤＡＰＩを用いて核を染色した。（Ｂ）ＦＡＣＳ後にガラススライド上で７日間培養された管腔細胞におけるＺｅｂ１の発現。矢印は、Ｚｅｂ１の高い核発現を獲得した、上皮島の外側で個々に遊走する細胞を指し示している。
【図８−１９】図Ｓ７は、基底および管腔のＭＥＣにおける遊走能および自己複製能の調節を示す図面である。（Ａ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ−１型レセプターインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（１０μΜ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）で４８時間毎に処理された基底細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｂ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）またはすべての因子の組み合わせ（ｉＥＭＴ−ＩＩ）で４８時間毎に処理された管腔細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｃ）最初の継代の４日前に（Ａ）に記載されたように処理された基底細胞の顕微鏡像。（Ｄ）最初の継代の４日前に（Ｂ）に記載されたように処理された管腔細胞の顕微鏡像。
【図８−２０】図Ｓ７は、基底および管腔のＭＥＣにおける遊走能および自己複製能の調節を示す図面である。（Ａ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ−１型レセプターインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（１０μΜ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）で４８時間毎に処理された基底細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｂ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）またはすべての因子の組み合わせ（ｉＥＭＴ−ＩＩ）で４８時間毎に処理された管腔細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｃ）最初の継代の４日前に（Ａ）に記載されたように処理された基底細胞の顕微鏡像。（Ｄ）最初の継代の４日前に（Ｂ）に記載されたように処理された管腔細胞の顕微鏡像。
【図８−２１】図Ｓ７は、基底および管腔のＭＥＣにおける遊走能および自己複製能の調節を示す図面である。（Ａ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ−１型レセプターインヒビターＡ８３−０１およびＳＢ４３１５４２（１０μΜ）、ＳＦＲＰ１（１μｇ／ｍｌ）で４８時間毎に処理された基底細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｂ）成長曲線：記載の因子、ＴＧＦ−ベータ１（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ５ａ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＤＫＫ１−（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｅ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ）またはすべての因子の組み合わせ（ｉＥＭＴ−ＩＩ）で４８時間毎に処理された管腔細胞；細胞を記載の時点において計数した。ｎ＝２。（Ｃ）最初の継代の４日前に（Ａ）に記載されたように処理された基底細胞の顕微鏡像。（Ｄ）最初の継代の４日前に（Ｂ）に記載されたように処理された管腔細胞の顕微鏡像。
【図８−２２】画像Ｓ１およびＳ２は、単一蛍光シグナルの像である（図６の簡単な説明を参照のこと）。
【図８−２３】画像Ｓ１およびＳ２は、単一蛍光シグナルの像である（図６の簡単な説明を参照のこと）。
【図８−２４】画像Ｓ１およびＳ２は、単一蛍光シグナルの像である（図６の簡単な説明を参照のこと）。
【図８−２５】画像Ｓ１およびＳ２は、単一蛍光シグナルの像である（図６の簡単な説明を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達経路が、ＥＭＴの誘導、ならびにＥＭＴを経たことに関連する間葉系状態および幹細胞（ＳＣ）様状態の維持において重要な役割を果たすという発見に関する。本発明のある特定の実施形態に係るこれらのシグナル伝達経路の調節は、ＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導する手段ならびに／またはＥＭＴを起こした細胞の間葉系およびＳＣ様の状態を維持する手段を提供する。本発明の他のある特定の実施形態に係るこれらのシグナル伝達経路の調節は、上皮細胞がＥＭＴを起こすのを阻害する手段ならびに／または間葉系およびＳＣ様の状態における細胞がその状態を維持するのを阻害する手段をもたらす。
【０００９】
当該分野で公知であるように、上皮細胞は、それらの側面の膜において細胞間接着複合体（例えば、タイトジャンクション、アドヘレンスジャンクション、デスモソーム、ギャップジャンクション）によって密着しており、代表的にはクラスターとしてまたはシート状で成長する傾向があり、Ｅ−カドヘリンなどの特徴的なマーカーを発現し、そして間葉系マーカー（例えば、Ｎ−カドヘリン、フィブロネクチンおよびビメンチン）を低発現するかまたは全く発現しない。目的のいくつかの実施形態において、上皮細胞は、ＣＤ４４低および／またはＣＤ２４高である。上皮細胞とは対照的に、間葉系細胞（例えば、ＥＭＴを起こした細胞）は、細胞間結合を欠き、細長い形状を示すことおよびクラスターとしてではなく単一細胞として存在する高い傾向を示すことが多い。それらは、特徴的なマーカー（例えば、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリンおよびα−平滑筋アクチン）を発現し、代表的には、上皮マーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン）を低発現するか、または全く発現せず、上皮細胞と比べて遊走能が高いことが多い。例えば、間葉系細胞は、例えばインビトロにおいて、遊走アッセイを評価したとき、上皮細胞よりも少なくとも５倍高い遊走能を有し得る。いくつかの実施形態において、遊走は、少なくとも１０、２０、５０、１００倍以上高められる。間葉系細胞の特徴的な特性を示す細胞は、間葉系状態にあるかまたは間葉系表現型を示すと本明細書中で称され得る。
【００１０】
幹細胞は、他の特徴の中でも、様々な細胞型を生じ得る未分化細胞である。本発明では、正常な幹細胞は、（ａ）比較的未分化であり；（ｂ）同様に未分化な娘細胞（「娘」）を産生することができ；（ｃ）幾多の継続的な成長分裂サイクルを通じて自身を複製することができるそのような娘の系列を産生することができ；かつ（ｄ）そのような細胞が、哺乳動物の身体の１つまたは別の機能性組織の特殊化された形質を獲得するのを可能にする分化プログラムを適切な条件下で開始することができる娘を産生することができる、正常な（非新生物の）細胞と定義される。癌幹細胞（ＣＳＣ）は、機能的には、二次性腫瘍を、例えば高効率で、播種するおよび生成する能力を有する、腫瘍内の細胞と定義される。したがって、癌幹細胞は、通常の幹細胞に関連する特徴（例えば、自己複製能、および特定の癌に見られる複数の細胞型を生じる能力）を有する。通常の幹細胞または癌幹細胞の特性を有する細胞は、幹細胞（ＳＣ）様細胞、または幹細胞（ＳＣ）様状態にある、または「前駆細胞」と本明細書中で称され得る。いくつかの実施形態において、ＳＣ様細胞は、１つ以上の特徴的なマーカーの高レベルの発現もしくは局在化を示すか、または分化細胞型に特徴的なある特定のマーカーの発現を欠く。
【００１１】
種々の細胞外シグナル（ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータリガンド、Ｎｏｔｃｈ、Ｓｏｎｉｃ  ＨｅｄｇｅｈｏｇならびにＥＧＦを含む）が、様々な細胞型においてＥＭＴを誘導し得る。これらの状況シグナル（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ）に応答して、ある特定の多面発現性の転写因子（ＴＦ）（例えば、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２）の発現が誘導される。次いで、これらのＴＦは、ＥＭＴプログラムを取り仕切るように作用する。ＥＭＴはまた、例えば遺伝子操作アプローチによって、上皮細胞がＴＦ（例えば、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、ＦｏｘＣ２およびＥ４７）を発現することによっても生じ得る。本発明では、少なくともいくつかの上皮細胞型においてＥＭＴを誘導し得るＴＦは、ＥＭＴ  ＴＦと称される。
【００１２】
正常細胞および腫瘍細胞においてＥＭＴプログラムを誘導し、それに続いてＥＭＴ関連特性を維持する、オートクリンおよびパラクリン機構を特徴付けるために、本発明者らは、そのような細胞によって産生される分子（例えば、成長因子および細胞外で作動する他のシグナル伝達分子）に注目した。ＥＭＴを起こした乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）とＥＭＴを起こしていないコントロール細胞との、分泌型タンパク質の発現プロファイルおよび遺伝子発現プロファイルを比較することを含むアプローチを用いたとき、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達経路と、ＥＭＴの誘導ならびにその結果として生じる間葉系およびＳＣ様の状態の維持に関わる分子とが同定された。
【００１３】
用語「オートクリンシグナル伝達」は、しばしば、ある細胞がその細胞に作用する物質（オートクリン物質）を分泌してその細胞を変化させるシグナル伝達のことを指すために使用される。パラクリンシグナル伝達は、代表的には、ある細胞がその細胞の環境内の他の細胞に作用する物質を分泌してそれらの細胞を変化させるシグナル伝達のことを指す。例えば、培養中の細胞によって分泌された物質は、同じ培養容器内の他の細胞に作用し得、インビボにおいてある細胞によって分泌された物質は、代表的には同じ組織または器官内の、それが拡散し得る他の細胞に作用し得る。オートクリン物質およびパラクリン物質は、タンパク質、小分子、脂質などであり得、それらとしては、種々の異なる成長因子およびホルモンが挙げられる。それらは、分泌されるものであることが多いが、細胞表面に結合した分子も包含される。代表的には、オートクリン物質またはパラクリン物質は、その物質が作用する細胞によって発現されているレセプターに結合して、下流のシグナル伝達事象（その詳細は、関わる特定の物質、レセプターおよび／またはシグナル伝達経路によって異なる）をもたらすことによって、その効果を発揮する。本発明では、パラクリンシグナル伝達経路は、別段示されない限り、通常、「ホモタイプ」の、すなわち、同じタイプの細胞間のシグナル伝達に関わると想定される。用語「オートクリン」および「パラクリン」は、本明細書中で交換可能に使用され、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達経路は、しばしば本明細書中で「オートクリンシグナル伝達経路」とひとまとめにして称され得る。
【００１４】
本明細書中の目的のオートクリンシグナル伝達経路には、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路およびＷｎｔシグナル伝達経路が含まれる。本発明の理解を促す目的で、これらの経路およびそれらのある特定の分子構成要素が、簡潔に説明され得る。当業者は、これらの経路に関するさらなる詳細を承知しているだろう。当業者はまた、これらの経路に関与するタンパク質の配列、ならびにそれらをコードするゲノム配列およびｍＲＮＡ配列を、公的に利用可能なデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において利用可能なデータベース、例えば、Ｇｅｎｅ、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓなど）から容易に得ることもできるだろう。例えば、Ｇｅｎｅデータベースは、配列および機能情報を提供しており、それらは、例えば、目的の遺伝子またはタンパク質の名称または遺伝子ＩＤについて検索することによって得ることができる。表１および２は、本明細書中の目的のある特定のヒト遺伝子の遺伝子名および遺伝子ＩＤを提供している。当業者は、他の目的の生物における対応する遺伝子の遺伝子ＩＤを容易に得ることができるだろう。ＴＧＦ−βスーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のタンパク質は、多種多様のプロセスにおいて重要な役割を果たす。ＴＧＦ−βスーパーファミリーには、ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）およびＢＭＰ（ＢＭＰ２、ＢＭＰ３ａ、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ−２）およびＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ−１１）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ−７）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ−６）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ−５）およびＢＭＰ１５を含む）、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１５、インヒビンＡ、インヒビンＢ、インヒビンＣおよびインヒビンＥが含まれる。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドは、二量体化し、そして細胞表面上のＩ型およびＩＩ型レセプターセリン／トレオニンキナーゼに結合してそれらを１つにすることによって、シグナル伝達を惹起する。ヒトのレセプターセリン／トレオニンキナーゼファミリーには、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関わる７つのＩ型および５つのＩＩ型レセプターが含まれる。Ｉ型レセプター（アクチビンレセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）としても知られる）には、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２（ＡｃｔＲ−Ｉとしても知られる）、ＡＬＫ３（ＢＭＰＲ−ＩＡとしても知られる）、ＡＬＫ４（ＡｃｔＲ−ＩＢとしても知られる）、ＡＬＫ５（ＴＧＦβＲ−Ｉとしても知られる）、ＡＬＫ６（ＢＭＰＲ−ＩＢとしても知られる）およびＡＬＫ７が含まれる。ＩＩ型レセプターには、ＴＧＦβＲ−ＩＩ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、ＡＣＴＲ−ＩＩＡ、ＡＣＴＲ−ＩＩＢおよびＡＭＨＲ−ＩＩが含まれる。異なるＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーが、これらのレセプターの異なるサブセットを含む複合体を形成する。例えば、ＴＧＦβは、Ｉ型レセプターのＡＬＫ１および／またはＡＬＫ５ならびにＩＩ型レセプターのＴＧＦβＲ−ＩＩと複合体を形成する一方で、ＢＭＰは、Ｉ型レセプターのＡＬＫ２、ＡＬＫ３および／またはＡＬＫ６ならびにＩＩ型レセプターのＢＭＰＩＩ−Ｒ、ＡＣＴＲ−ＩＩＡおよび／またはＡＣＴＲ−ＩＩＢと複合体を形成する。
【００１５】
ＴＧＦβとＢＭＰの両方のシグナル伝達経路において、ＩＩ型レセプターは、Ｉ型レセプターをリン酸化し、次いでそれは、レセプター制御型ＳＭＡＤ（Ｒ−Ｓｍａｄ）（ＴＧＦｂシグナル伝達に対するＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３、ならびにＢＭＰシグナル伝達に対するＳｍａｄ１、５および８を含む）をリン酸化して活性化する。活性化されたＲ−Ｓｍａｄは、共通のパートナーＳｍａｄであるＳｍａｄ４と相互作用する。Ｒ−ＳＭＡＤ／Ｓｍａｄ４複合体は、核に移行し、そこでそれらは転写因子として作用し、標的遺伝子の特異性を与えるのを助ける種々の転写補助因子との相互作用を含むプロセスである、標的遺伝子の発現の制御に関わる。
【００１６】
ＢＭＰは、細胞外の空間においてＢＭＰに結合することによりＢＭＰがそのレセプターに結合するのを妨げることによってＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストとして機能する種々の内因性分泌型タンパク質による制御に供される。この文脈における「内因性」とは、その分子を含むおよび／または産生する細胞または生物にとって天然のものであり、かつ、人間の手によって直接または間接的に導入されていない、分子のことを指す。例えば、それを産生するかもしくはそれが見られる細胞または生物のゲノムによって（すなわち、遺伝子操作またはゲノムに影響する他の操作の結果としてではなく）天然にコードされる核酸またはタンパク質は、その細胞または生物にとって内因性であると考えられる。本発明では、用語「内因性」は、ある分子をコードする異種核酸をそのような細胞または生物（またはそれらの祖先）に導入することを必要とせず、本明細書中の目的の細胞または生物（例えば、ＥＭＴを誘導することまたは阻害することが望まれる細胞または生物）のゲノムにおいてコードされる分子、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のことを指すために使用されることが多い。本明細書中で明らかになるように、用語「内因性」は、代表的には、動物によって天然に産生され、かつそれを産生する生物においてＴＧＦｂ、ＢＭＰおよび／またはＷｎｔ経路を制御する際に役割を果たす、ある特定の分子のことを指すために使用される。「内因性」分子は、インビトロおよび／またはインビボの多種多様の状況のいずれにおいても使用され得ること、ならびに任意の好適な方法を用いて（例えば、任意の好適な細胞型において組換えＤＮＡ技術を用いて）産生され得るかまたは得ることができることが認識されるだろう。用語「内因性」は、これらの点に限定されないと意図される。内因性ＢＭＰインヒビタータンパク質としては、とりわけ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、ＰＲＤＣ（ＤａｎおよびＣｅｒｂｅｒｕｓに関するタンパク質、時折ｇｒｅｍｌｉｎ−２とも称される）、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様１、Ｃｈｏｒｄｉｎ様２、Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ２、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、Ｔｗｉｓｔｅｄ  ＧａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎおよびＳｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＵＳＡＧ−１、Ｔｓｕｋｕｓｈｉ、ＢｒｏｒｉｎならびにＢｒｏｒｉｎ様が挙げられる。ＢＭＰアンタゴニストは、システインノットモチーフ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｍｏｔｉｆ）を含み、この領域の差異に基づいていくつかのサブファミリーに分けられ得る。これらには、ＣＡＮ（ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＤａｎ）ファミリー（８員環）、Ｔｗｉｓｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ（９員環）ならびにＣｈｏｒｄｉｎおよびＮｏｇｇｉｎ（１０員環）が含まれる（Ａｖｓｉａｎ−Ｋｒｅｔｃｈｍｅｒ  Ｏ．ａｎｄ  Ｈｓｕｅｈ  Ａ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８，１−１２，２００４）。ＢＭＰ３およびＢＭＰ１５は、ある特定の状況において、他のＢＭＰのアンタゴニストとして機能し得る。
【００１７】
【表１】
2013536689.tif 000003
Ｗｎｔシグナル伝達は、細胞運命決定、細胞遊走および器官形成をはじめとした多種多様の細胞プロセスを制御する。Ｗｎｔは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）レセプターファミリーのメンバーの細胞外ドメインに結合する分泌型糖タンパク質である。１９個のヒトＷｎｔ遺伝子が存在する。いくつかのＷｎｔでは、場合によっては異なるタンパク質アイソフォーム（例えば、Ｗｎｔ１６ｖ１およびＷｎｔ１６ｖ２）をコードする、複数の転写物バリアント（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ）が存在する。多くの事例において、Ｗｎｔシグナル伝達の媒介にはコレセプターが関わっている。例えば、低密度リポタンパク質関連レセプタータンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）は、Ｆｚに対するコレセプターとして作用し得る。Ｗｎｔがそのレセプター複合体に結合した後、Ｗｎｔによって媒介されるシグナルは、細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）に伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｄｓｈの段階においていくつかの異なる経路に分かれる。古典的経路は、アドヘレンスジャンクションタンパク質β−カテニンの蓄積およびその核への移行を引き起こす。Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、細胞質β−カテニンは、他のタンパク質の中でもグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）を含むβ−カテニン破壊複合体によって分解される。ＧＳＫ３によるβ−カテニンのリン酸化は、それをユビキチン化およびその後の破壊の標的にする。Ｗｎｔとそのレセプター複合体との結合によって、β−カテニン破壊複合体が混乱することによりβ−カテニンが蓄積する。β−カテニンは核に移行し、そこでいくつかの種々のパートナーに結合して転写コアクチベーターとして機能することによって、遺伝子転写を制御する。
【００１８】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路（非β−カテニン依存性経路とも称される）は、β−カテニンを介した遺伝子の転写に影響しないが、その代わりに、単量体ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅ（平面内細胞極性（ｐｌａｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ）経路）、ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）をはじめとした他の様々な分子、および細胞内カルシウムレベルの変化（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路）を介して効果を発揮する。Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路では、Ｗｎｔ／Ｆｚシグナル伝達によって小胞体（ＥＲ）から細胞内にＣａ２＋が放出され、それにより、いくつかのＣａ２＋感受性タンパク質（タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩを含む）がＧタンパク質依存的様式で活性化される。
【００１９】
ほとんどのＷｎｔタンパク質が、主として古典的経路を介してシグナル伝達すると考えられているが、いくつかの異なるＷｎｔ（Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１およびＷｎｔ１６を含む）は、主に非古典的Ｗｎｔ経路を介してシグナル伝達する。例えば、Ｗｎｔ５ａは、非古典的経路を活性化し得、細胞内Ｃａ２＋放出を刺激し得るが、β−カテニンの安定化を活性化しない。対照的に、Ｗｎｔ１１は、ある特定の状況において、古典的経路を介しても作用し得る。
【００２０】
Ｗｎｔシグナル伝達は、細胞外の環境においてＷｎｔに結合し、Ｆｚおよび／もしくはコレセプターとの相互作用を阻害する、ならびに／またはそのレセプター／コレセプターに結合することによって、Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストとして作用する、種々の内因性分泌型タンパク質によって制御される。これらのインヒビターには、Ｄｉｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）ファミリータンパク質（そのうち、ヒトでは４種存在する）、可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＲＦＰ、そのうち、ヒトでは４種存在する：ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ３（正式名称はｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（Ｆｒｚｂ）である）、ＳＦＲＰ４およびＳＦＲＰ５）およびＷｎｔインヒビタータンパク質１（ＷＩＦ１）が含まれる。
【００２１】
ＷｎｔおよびＷｎｔシグナル伝達経路に関するかなりの情報が、以下のウェブサイト：ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｒｎｕｓｓｅ／ｗｎｔｗｉｎｄｏｗ．ｈｔｍｌにおいて入手可能である。
【００２２】
【表２】
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本発明は、ＴＧＦβ経路ならびに古典的および非古典的Ｗｎｔ経路のオートクリン刺激、ならびにＢＭＰ経路のシグナル伝達の制限が、ＥＭＴの誘導ならびにその結果として生じる間葉系およびＳＣ様の状態の維持において共同して働き得るという認識を包含する。本発明のある特定の実施形態によると、これらの経路は、ＥＭＴを亢進させるためまたは阻害するために、種々の異なるアプローチを用いて調節され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、上皮細胞がＥＭＴを起こす性質は、ＴＧＦβおよびＷｎｔシグナル伝達経路が刺激される方法、ならびに／またはＥＭＴを誘導するおよび／もしくは維持する内因性物質によってＢＭＰシグナル伝達が阻害される方法を模倣することによって亢進される。いくつかの実施形態において、間葉系および／またはＳＣ様の状態の維持は、そのような細胞を間葉系およびＳＣ様の状態で維持する傾向がある１つ以上のオートクリンシグナル伝達経路を模倣することもしくは増強することによって、ならびに／またはそのようなシグナル伝達経路が作動性であることに許容的な細胞外の環境を提供することによって、促進される。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、そのような細胞がＥＭＴを起こすように別途誘導し得る１つ以上のオートクリンシグナル伝達経路を干渉することによって、ＥＭＴを起こすのを阻害される。いくつかの実施形態において、間葉系および／またはＳＣ様の状態の維持は、ＳＣ様の状態を別途維持し得る１つ以上のオートクリンシグナル伝達経路を妨害することによって阻害される。そのようなアプローチは、例えば細胞治療において使用するための、幹細胞の形成または分化を誘導する方法において有用であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＭＴの誘導または維持は、ＴＧＦβおよびＷｎｔ経路の刺激とともに、細胞接着を乱すことによって、例えば、アドヘレンスジャンクションの形成または維持を乱すことによって、促進される。
【００２３】
実施例でさらに詳細に記載されるように、間葉系（ｍｅｓｅｃｈｙｍａｌ）およびＳＣ様の状態の乳腺細胞は、乳腺上皮細胞と比較して、ある特定のＴＧＦβ、ＢＭＰおよびＷｎｔ経路リガンドならびに内因性アンタゴニストの分泌において種々の差異を示すと見出された。これらの差異は、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化、ＢＭＰシグナル伝達の制限、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の脱抑制、および非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の活性化をもたらす。これらのオートクリン経路は、正常細胞と形質転換した細胞の両方において、ＥＭＴの誘導および間葉系状態の維持において共同して働く。例えば、ＥＭＴを起こした細胞が、ＥＭＴを起こしていないコントロール細胞と比較して、ＴＧＦβ１の多い分泌、ならびにＳｍａｄレポータープラスミドの高い活性および高いＳｍａｄ２リン酸化（活性なＴＧＦβシグナル伝達の指標）を示すことが発見された。したがって、オートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達は、ＥＭＴを起こしていないコントロール細胞と比べて、ＥＭＴを起こした細胞において活性だった。さらに、ＥＭＴを起こした細胞は、（１）ＢＭＰリガンド産生の減少および（２）分泌されるＢＭＰアンタゴニストのアップレギュレーションを介してＢＭＰシグナル伝達を制限する細胞外のシグナル伝達の環境を示すと見出された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＢＭＰシグナル伝達の制限によって、オートクリンＴＧＦβシグナル伝達に許容的な細胞外の環境が作られ、それによってＥＭＴの誘導が促進され、その維持に寄与する可能性がある。
【００２４】
また、内因性Ｗｎｔアンタゴニストの分泌が、ＥＭＴを起こしていないコントロール細胞と比べてＥＭＴを起こした細胞においてダウンレギュレートされることも発見された。このダウンレギュレーションは、内因性インヒビターのダウンレギュレーションに依存する古典的Ｗｎｔシグナル伝達の増大（例えば、β−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦレポーターの活性の増大によって証明されるような）を伴った。さらに、ＥＭＴを起こしたＭＥＣは、関連する下流の非古典的シグナル伝達経路の活性の増大（例えば、活性化されたタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）タンパク質、ならびにＪＮＫおよびその下流の標的であるｃ−Ｊｕｎのリン酸化の増加によって証明されるような）を伴う、ほとんどの非古典的Ｗｎｔリガンドのアップレギュレーションを示した。特に、内因性ＷｎｔインヒビターであるＳＦＲＰ１およびＤＫＫ１の分泌は減少したが、非古典的Ｗｎｔタンパク質であるＷｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１６ｖ１およびＷｎｔ１６ｖ２の分泌は、コントロール細胞と比べて、ＥＭＴを起こした細胞では増加した。
【００２５】
本発明は、これらの発見に少なくとも部分的に基づく種々の組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、インビトロで（すなわち、生物の身体の外で、例えば、細胞培養容器内で）行われる。他の実施形態において、本発明の方法は、インビボで、例えば、１つ以上の化合物または組成物を被験体に投与することによって、行われる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも部分的にインビトロで行われ、例えば、細胞を、インビトロで組成物と接触させ、その後、その細胞を、例えば、実験または治療の目的のために、被験体に導入する。したがって、別段示されないかまたは別段文脈から明らかでない限り、本発明のいずれの方法も、インビトロおよびインビボでの実施形態を包含し、本発明のいずれの組成物も、インビトロまたはインビボにおいて使用され得ることが理解されるべきである。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法は、乳腺細胞に適用されるおよび／または乳腺細胞を使用する。乳腺組織（ｍａｍｍａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ）に由来する細胞が本明細書中で例証されるが、本発明は、様々な実施形態において、他の組織に由来する細胞を包含することが理解されるだろう。特定の内因性ＴＧＦ、Ｗｎｔおよび／もしくはＢＭＰリガンド、ならびに／またはオートクリンＴＧＦ、Ｗｎｔおよび／もしくはＢＭＰシグナル伝達経路において作動性のアンタゴニストに関するある特定の詳細が、他のいくつかの細胞型では異なり得ることが認識されるだろう。当業者は、実施例に記載されるプロファイリングアプローチを適用することにより、特定のＴＧＦ、Ｗｎｔおよび／もしくはＢＭＰリガンド、ならびに／またはＥＭＴを誘導するもしくは阻害するように作用するアンタゴニストならびに／または間葉系およびＳＣ様の状態で細胞を維持するもしくはその維持に対抗するように作用するアンタゴニストを同定し得るか、あるいは目的の細胞型においてこれらの経路に関わるタンパク質を調べることにより、差次的に分泌されるおよび／または発現されるタンパク質を同定し得る。用語「リガンド」とは、細胞レセプターなどの別の化学物質（例えば、分子または複合体）に結合する化学物質（例えば、分子または複合体）のことを指すことが理解されるだろう。例えば、ＢＭＰリガンドは、ＢＭＰレセプターに結合する。用語「アゴニスト」とは、細胞レセプターまたはレセプター複合体に結合し、かつその細胞による応答を引き起こす（例えば、シグナル伝達経路を刺激する）化学物質（例えば、分子または複合体）のことを指す。「アンタゴニスト」は、アゴニストの活性を阻止するかまたはそれに別途拮抗する化合物である。例えば、アンタゴニストは、アゴニストと同じレセプター（またはコレセプター）に結合し得るが、代表的には、そのアゴニストによって引き起こされる応答を誘発しない（かつ、そのような結合はアゴニストの結合を干渉する）か、またはアンタゴニストは、アゴニストに結合して、そのアゴニストがレセプターに結合するのを妨げ得る。別段特定されないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書中で称されるリガンドは、通常、アゴニストである。
【００２６】
本発明の組成物および方法が、他のシグナル伝達経路（例えば、Ｎｏｔｃｈ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、チロシンキナーゼレセプター（例えば、Ｍｅｔ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦレセプターファミリーメンバー）を介したシグナル伝達、ＮＦｋＢ経路、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）経路および／またはマイクロＲＮＡ制御性経路）の操作とともに使用され得ることも予想される。
【００２７】
本発明の組成物および方法において使用するための、ならびに／または本発明の方法が適用され得る、上皮細胞（または他の細胞）は、多種多様の起源のいずれかから得ることができるか、またはある特定のインビボでの用途の場合、種々の組織もしくは器官に存在し得る。それらの細胞は、様々な実施形態において、初代細胞、細胞株の細胞、形質転換していない細胞、形質転換した細胞、遺伝的に改変された細胞、または遺伝的に改変されていない細胞であり得る。例えば、細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物の被験体（細胞ベースの治療の意図されるレシピエントもしくはその親類または無関係のドナーであり得る）から得ることができ、廃棄される外科手術上のサンプルもしくは被験体由来の細胞サンプルまたは増殖された細胞株から得られる場合もある。乳腺組織は、細胞の有用な起源である。例えば、初代ヒト乳腺上皮細胞（ＭＥＣＳ）は、機械的分離によって新鮮な乳房縮小組織（乳房縮小術）から得ることができ、所望であれば、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）などの方法によってさらに精製され得る。そのような初代ＭＥＣＳ（または他の上皮細胞型）の培養物は、様々な遺伝的エレメント（例えば、不死化細胞株を作製するためのヒトテロメラーゼホロ酵素（ｈＴＥＲＴ）の触媒サブユニットをコードするベクター（例えば、レトロウイルスベクター））を導入することによって、遺伝的に改変され得る。そのような細胞株は、例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ラージＴ抗原およびｈａＲＡＳ癌遺伝子をコードするベクター（例えば、レトロウイルスベクター）による感染を介して、さらに遺伝的に改変され、形質転換され得る。いくつかの実施形態では、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡスポンジなどを発現するように細胞を遺伝的に改変することによって、遺伝子発現が低下される。種々の異なる癌遺伝子および／または癌抑制遺伝子が、細胞を遺伝的に改変するために使用され得ることが認識されるだろう。当業者は、哺乳動物細胞の一過性のまたは安定的なトランスフェクションに適したベクター（例えば、ウイルス、プラスミド）および遺伝的エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーのような調節エレメントなど）を承知しているだろう。いくつかの実施形態において、制御可能な（例えば、誘導可能なおよび／または抑制可能な）発現調節領域（例えば、プロモーター）が、細胞における目的のＲＮＡまたはタンパク質の制御可能な発現を達成するために使用される。別の実施形態において、目的のタンパク質、およびホルモンレセプター、例えば、エストロゲンレセプターなどのステロイドホルモンレセプター、または被験体の体内に通常存在しない化合物に選択的に応答し得るそのバリアント（例えば、選択的なエストロゲンレセプター調節因子）のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質を使用することによって、活性が制御される。さらに、ヒトおよびマウスの乳癌由来の樹立細胞株（例えば、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および４Ｔ１細胞）が使用され得る。当業者は、本発明の実施形態において使用され得る他の細胞株（例えば、他の癌のタイプに由来するもの）を承知しているだろう。
【００２８】
代表的には、ＥＭＴを誘導する本発明の方法が、間葉系とＳＣ様の両方の状態にある細胞を産生すること、およびＥＭＴを阻害する本発明の方法が、そのような細胞の産生を阻害することが認識されるだろう。句「間葉系および／またはＳＣ様の状態」における用語「および／または」は、本発明がそのように限定するとみなされるべきでないことを指摘するために使用される。例えば、間葉系細胞または幹細胞に特徴的であると考えられる表現型（例えば、上に記載された表現型）は、本発明の使用に関するある特定の実施形態において特に興味深い場合がある。
【００２９】
ＩＩ．ＥＭＴの誘導または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持
いくつかの態様において、本発明は、ＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導するために有用または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態で細胞を維持するために有用な組成物ならびに方法を提供する。本発明は、ＥＭＴを誘導する方法を提供し、その方法は、以下のプロセス：（ａ）ＴＧＦ−β経路のシグナル伝達の刺激；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達の刺激；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達の刺激；および（ｄ）細胞接着を乱すことのうちの少なくとも３つが起きる培養条件に上皮細胞を供する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、これらのプロセスの４つすべてが起きる条件下で培養される。本発明はさらに、間葉系および／またはＳＣ様の状態で細胞を維持する方法を提供し、その方法は、以下のプロセス：（ａ）ＴＧＦ−β経路のシグナル伝達の刺激；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達の刺激；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達の刺激；および（ｄ）細胞接着を乱すことのうちの少なくとも３つが起きる培養条件にＳＣ様状態の細胞を供する工程を包含する。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、これらのプロセスの４つすべてが起きる条件下で培養される。いくつかの実施形態において、間葉系および／またはＳＣ様の状態の細胞は、ＥＭＴを起こした上皮細胞に由来する。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、本発明の方法に従って、ＥＭＴを起こすように誘導された。本発明の様々な態様のいくつかの実施形態において、非古典的Ｗｎｔ経路の刺激は、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路またはＪＮＫ／ｃ−Ｊｕｎ経路の刺激を含む。
【００３０】
本発明は、ＥＭＴを起こすようにならびに／または間葉系およびＳＣ様の状態で細胞を維持するようにＴＧＦβアゴニストが上皮細胞を誘導する能力をＢＭＰシグナル伝達が阻害するように作動し得るという認識を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β経路のシグナル伝達の刺激は、ＴＧＦ−βシグナル伝達に許容的な細胞外の環境を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βシグナル伝達に許容的な環境は、ＢＭＰ経路のシグナル伝達が阻害される環境である。したがって、本発明は、ＴＧＦβアゴニストがＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導する能力を亢進する方法を提供し、ここで、その細胞は、それがＴＧＦβアゴニストに曝露される環境に存在し、その方法は、ＢＭＰ経路のシグナル伝達が阻害されるようにその細胞の環境を改変する工程を包含する。本発明はさらに、ＴＧＦβアゴニストが間葉系および／またはＳＣ様の状態で細胞を維持する能力を亢進する方法を提供し、その方法は、ＴＧＦβアゴニストを含む環境に細胞を曝露する工程を包含し、ＢＭＰ経路のシグナル伝達が、阻害される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ経路のシグナル伝達の阻害は、別途ＢＭＰシグナル伝達を刺激し得る１つ以上の内因性ＢＭＰリガンドの合成のダウンレギュレートまたはＢＭＰアンタゴニストの提供を包含する。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明は、細胞による内因性Ｗｎｔアンタゴニストの分泌が、上皮細胞がＥＭＴを起こすのを阻害し得るという認識に関する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｗｎｔ経路のシグナル伝達の刺激は、１つ以上の内因性Ｗｎｔインヒビターを阻害することによるＷｎｔ経路のシグナル伝達の脱抑制を包含する。Ｗｎｔアンタゴニストの阻害は、Ｗｎｔシグナル伝達を脱抑制し得、それによって、ＥＭＴが促進され、そして／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持が促進される。１つの態様において、本発明は、ＥＭＴを起こすように細胞を誘導する方法を提供し、ここで、その細胞は、細胞の集団のメンバーであり、その集団内の少なくともいくつかの細胞は、内因性Ｗｎｔアンタゴニストを分泌し、その方法は、その集団内の細胞によって分泌されるＷｎｔアンタゴニストを阻害する工程を包含する。別の態様において、本発明は、ＥＭＴを起こすように細胞を誘導する方法を提供し、ここで、その細胞は、細胞の集団のメンバーであり、その集団内の少なくともいくつかの細胞は、Ｗｎｔアンタゴニストを分泌し、その方法は、それらの細胞を、Ｗｎｔアンタゴニストを阻害する物質と接触させる工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、その方法は、ＳＦＲＰファミリーメンバーおよびＤＫＫファミリーメンバーを阻害する工程を包含し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記の方法は、上述の経路またはプロセスの１つ以上を刺激するまたは阻害する化合物と上皮細胞を接触させる工程を包含する。例えば、本発明は、ＥＭＴを誘導する方法を提供し、その方法は、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｃ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｄ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも３つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む組成物と上皮細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物は、上述の４つの群の各々からの１つ以上の化合物を含む。ＥＭＴを誘導するため、ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態で細胞を維持するために有用な組成物は、本明細書中で「ＥＭＴ誘導組成物」または「ＥＭＴ誘導カクテル」と称され得る。本発明のＥＭＴ誘導組成物は、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する化合物をさらに含み得る。例示的な化合物を下記でさらに論じる。
【００３３】
いくつかの態様において、本発明は、間葉系および／またはＳＣ様の状態を誘導するための方法を提供し、その方法は、上皮細胞を本発明のＥＭＴ誘導組成物と接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、細胞は、その細胞がＥＭＴを起こし、続いて、その培養培地にＥＭＴ誘導組成物のいずれの構成要素も加える必要なく長期間にわたって間葉系およびＳＣ様の状態を維持するのに十分な時間にわたって、接触される。いくつかの実施形態において、長期間とは、少なくとも１０継代のことを指す。本発明では、所与のセットの条件下で少なくとも１０継代にわたって持続する状態が、「安定」と考えられる。いくつかの実施形態において、長期間とは、少なくとも１２継代（約３６の集団倍増）、１５、２０、２５またはそれ以上の継代のことを指す。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、少なくとも約１４日間にわたってＥＭＴ誘導組成物と接触される。当然のことながら、細胞は、それよりも長い期間にわたって、例えば、約２０、２５もしくは３０日間またはそれ以上にわたって、ＥＭＴ誘導組成物と接触され得る。当業者は、ＥＭＴの安定的な誘導に必要な最短時間が、例えば、ＥＭＴ誘導カクテルの特定の構成要素、それらが使用される濃度、および上皮細胞のタイプに左右され得ることを認識するだろう。さらに、当業者は、所望であれば、特定の上皮細胞のタイプに対して上記方法を最適化するために、特定の構成要素および濃度を容易に変更し得る。
【００３４】
いくつかの態様において、本発明は、ＴＧＦβアゴニストがＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導する能力を高める方法を提供し、その方法は：（ａ）上皮細胞およびＴＧＦβアゴニストを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を阻害する化合物とその細胞を接触させる工程を包含する。本発明はさらに、ＴＧＦβアゴニストが間葉系および／またはＳＣ様の状態で細胞を維持する能力を高める方法を提供し、その方法は：（ａ）間葉系細胞およびＴＧＦβアゴニストを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を阻害する化合物とその細胞を接触させる工程を包含する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ誘導カクテルと接触した細胞は、例えば、インビトロにおいて、遊走または浸潤アッセイを評価したとき、ＥＭＴ誘導カクテルと接触していないコントロール細胞よりも少なくとも５倍高い遊走能または浸潤能を有する。いくつかの実施形態において、遊走および／または浸潤は、少なくとも１０、２０、５０、１００倍またはそれ以上高められる。遊走または浸潤に対する化合物または組成物の効果は、当該分野で公知の任意の方法を用いて評価され得る。例えば、Ｖａｌｓｔｅｒ  Ａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ，３７（２）：２０８−１５，２００５および実施例を参照のこと。そのような多くのアッセイが、フィルターで隔離された、培地で満たされた２つの区画からなるチャンバー（例えば、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー）を含み、それは、様々な構成要素、例えば、ＥＣＭ構成要素（例えば、マトリゲル）を通過して浸潤する能力を評価するために、そのような構成要素でコーティングされ得る。細胞懸濁液が、その区画のうちの１つに入れられ、インキュベートされる。細胞は、その区画からフィルターの細孔を通ってフィルターの反対側に遊走し、次いで、定量される。所望であれば、被験物質は、例えば、そのような物質の遊走／浸潤に対する効果を評価するために、いずれかの区画における培地中に含められ得、かつ／または細胞は、その細胞をチャンバーに導入する前に被験物質に曝露され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ誘導カクテルに接触した細胞は、ＥＭＴ誘導カクテルと接触していないコントロール細胞と比べて、高い自己複製能を有する。例えば、ＥＭＴ誘導カクテルと接触した細胞は、ＥＭＴ誘導カクテルと接触していないコントロール細胞よりも、少なくとも２倍または少なくとも５倍高い自己複製能を有し得る。いくつかの実施形態において、自己複製能は、少なくとも１０、２０、５０、１００倍またはそれ以上高められる。自己複製能に対する化合物または組成物の効果は、当該分野で公知の任意の方法を用いて評価され得る。例えば、一次もしくは二次マンモスフィア形成またはツモールスフィアの形成の阻害が評価され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ誘導カクテルと接触した形質転換した細胞は、ＥＭＴ誘導カクテルと接触していないコントロール細胞よりも少なくとも２倍または少なくとも５倍高い腫瘍開始能を有する。いくつかの実施形態において、腫瘍開始能は、少なくとも１０、２０、５０、１００倍またはそれ以上高められる。腫瘍開始能は、当該分野で公知の方法を用いて、例えば、非ヒト動物宿主、例えば、免疫無防備状態の非ヒト宿主に細胞を導入することによって、評価され得る。代表的には、その宿主は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラットである。免疫無防備状態のげっ歯類の系統は、当該分野で公知である。例えば、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ、ヌードマウスまたはラットが使用され得る。別の実施形態において、胸腺が外科的に除去されているか、または例えば放射線照射もしくは化学剤などの手段によって非機能性にされているか、あるいは薬物または遺伝的操作（例えば、免疫系の発達および／または機能において重要な分子をコードする１つ以上の遺伝子のノックダウンまたはノックアウト）によって免疫系が抑制されている動物が使用される。例えば、Ｒａｇ１および／またはＲａｇ２ノックアウト動物が使用され得る。
【００３８】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＥＭＴを誘導するためおよび／または維持するための本発明の方法は、いくつかの利点を提供し得る。いくつかの実施形態において、ＥＭＴを誘導するおよび／または維持する本発明の方法は、正常な状態および／または病理学的状態においてインビボで生じるものに似ており、正常なおよび／もしくは病理学的なＥＭＴの研究のため、またはＥＭＴを変更（例えば、阻害または促進）し得るさらなる物質の同定もしくは特徴づけのために、生理的に関連性のある状況を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、上皮細胞の遺伝的改変を必要とすることなく、ＥＭＴの誘導および／または維持を可能にする。例えば、下記でさらに記載されるように、後に細胞ベースの治療のために使用される予定の前駆細胞を産生するためにＥＭＴが使用されるとき、遺伝的改変の回避が望ましい場合がある。
【００３９】
ＩＩＩ．ＥＭＴの誘導ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持の阻害
いくつかの態様において、本発明は、ＥＭＴの誘導の阻害ならびに／または細胞による間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持の阻害に有用な組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導するように、ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態で細胞を維持するように、別途作動し得る１つ以上のシグナル伝達経路を混乱させる（干渉する）工程を包含する。
【００４０】
１つの態様において、本発明は、上皮細胞がＥＭＴを起こすのを阻害する方法を提供し、その方法は、その細胞の古典的および／もしくは非古典的Ｗｎｔ経路シグナル伝達経路を阻害する工程、ならびに／またはその細胞のＢＭＰ経路シグナル伝達経路を刺激する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、１つ以上の古典的および／または非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路（ｐａｔｈａｙｓ）を阻害する工程ならびにその細胞のＢＭＰシグナル伝達経路を刺激する工程を包含する。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ経路を阻害する工程およびＢＭＰシグナル伝達を刺激する工程は、相加効果または相乗効果を有する。本発明はさらに、ＥＭＴを阻害する方法を提供し、その方法は、古典的および／もしくは非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する１つ以上の化合物ならびに／またはＢＭＰ経路のシグナル伝達を刺激する１つ以上の化合物と上皮細胞を接触させる工程を包含する。本発明の様々な態様のいくつかの実施形態において、非古典的Ｗｎｔ経路を阻害する工程は、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路またはＪＮＫ／ｃ−Ｊｕｎ経路を阻害する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本発明のその方法は、ＴＧＦβ経路が刺激された状況において（例えば、ＴＧＦｂアゴニストの存在下において）有用であり、ここで、そのＴＧＦβ経路の刺激は、別途ＥＭＴを促進し得る。いくつかの実施形態において、その方法はさらに、その細胞のＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害する工程を包含する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＢＭＰシグナル伝達を制限することによってＴＧＦβシグナル伝達に許容的な環境が提供されるという発見は、ＢＭＰシグナル伝達の刺激が、ＴＧＦβリガンドがＥＭＴを誘導する能力ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態で細胞を維持する能力を限定し得ることを示唆する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＷｎｔインヒビターおよびＢＭＰアゴニストと上皮細胞を接触させ、それによりＥＭＴが阻害される工程を包含する。
【００４１】
本発明はさらに、細胞が間葉系および／またはＳＣ様の状態を維持するのを阻害する方法を提供し、その方法は、その細胞の古典的および／もしくは非古典的Ｗｎｔ経路シグナル伝達経路を阻害する工程、ならびに／またはその細胞のＢＭＰ経路シグナル伝達経路を刺激する工程を包含する。本発明はさらに、細胞が間葉系および／またはＳＣ様の状態を維持するのを阻害する方法を提供し、その方法は、古典的および／もしくは非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する１つ以上の化合物ならびに／またはＢＭＰ経路のシグナル伝達を刺激する１つ以上の化合物と細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、本発明のその方法は、ＴＧＦβ経路が刺激された状況において有用であり、ここで、そのＴＧＦβ経路の刺激は、間葉系および／またはＳＣ様の状態で細胞を維持することに別途寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のその方法は、ＴＧＦｂシグナル伝達が刺激された（例えば、ＴＧＦｂアゴニストの存在下の）環境における細胞に適用され、ここで、ＴＧＦｂシグナル伝達経路の刺激は、間葉系および／またはＳＣ様の状態で細胞を維持するように別途作動し得る。
【００４２】
別の態様において、本発明は、上皮細胞がＥＭＴを起こすのを阻害する方法を提供し、その方法は、以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｂ）古典的および／または非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｃ）ＢＭＰ経路のシグナル伝達を刺激する化合物のうちの少なくとも２つの各々から選択される１つ以上の化合物を含む組成物と上皮細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物は、上述の３つの群の各々からの１つ以上の化合物を含む。ＥＭＴを阻害するためならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持を阻害するために有用な組成物は、本明細書中で「ＥＭＴ阻害組成物」または「ＥＭＴ阻害カクテル」と称され得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、古典的および非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する少なくとも１つの化合物を含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、古典的および非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する少なくとも１つの化合物、ならびにＢＭＰ経路のシグナル伝達を刺激する少なくとも１つの化合物を含む。いくつかの実施形態において、本発明の任意の組成物または方法においてＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物は、ＢＭＰアゴニストを含む。いくつかの実施形態において、本発明の任意の組成物または方法においてＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物は、例えば、内因性ＢＭＰアンタゴニストを阻害することによって、ＢＭＰシグナル伝達を脱抑制する化合物を含む。例示的な化合物を下記でさらに論じる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約１２時間〜約１０日間の範囲の時間にわたって、ＥＭＴ阻害組成物と接触される。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、少なくとも約１０日間にわたってＥＭＴ阻害組成物と接触される。当然のことながら、細胞は、それよりも長い期間にわたって、例えば、約１５、２０、２５もしくは３０日間またはそれ以上にわたって、例えば、ＥＭＴを起こした細胞において、例えば、ＥＭＴの阻害ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態の維持の阻害が望まれるだけの長さにわたって、その組成物と接触され得る。当業者は、ＥＭＴ阻害組成物の特定の構成要素およびそれらが使用される濃度が変動し得ること認識するだろう。所望であれば、当業者は、特定の細胞型に対して上記方法を最適化するために、特定の構成要素および濃度を容易に変更し得る。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明は、ＴＧＦβアゴニストがＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導する能力を低下させる方法を提供し、その方法は：（ａ）上皮細胞およびＴＧＦβアゴニストを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物および／または古典的もしくは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する化合物と細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの態様において、本発明は、ＴＧＦβアゴニストが、細胞による間葉系および／またはＳＣ様の状態の維持を促進する能力を低下させる方法を提供し、その方法は；（ａ）間葉系および／またはＳＣ様の状態の細胞ならびにＴＧＦβアゴニストを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物および／または古典的もしくは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する化合物とその細胞を接触させる工程を包含する。
【００４５】
本発明はさらに、上皮細胞がＥＭＴを起こすのをＴＧＦβインヒビターが阻害する能力を亢進する方法を提供し、その方法は：（ａ）上皮細胞およびＴＧＦβインヒビターを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物および／または古典的もしくは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する化合物とその細胞を接触させる工程を包含する。本発明はさらに、細胞による間葉系および／またはＳＣ様の状態の維持をＴＧＦβインヒビターが阻害する能力を亢進する方法を提供し、その方法は：（ａ）上皮細胞およびＴＧＦβインヒビターを含む組成物を提供する工程；ならびに（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物および／または古典的もしくは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する化合物とその細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その細胞は、ＢＭＰシグナル伝達を刺激する少なくとも１つの化合物および古典的または非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する少なくとも１つの化合物と接触される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を刺激する化合物および／または古典的もしくは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する化合物と細胞を接触させる工程は、同程度の、ＥＭＴの阻害ならびに／または間葉系および／もしくはＳＣ様の特性の阻害を達成しつつ、より少量またはより低濃度のＴＧＦβインヒビターの使用を可能にする。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ阻害組成物の１つ以上の構成要素と接触した細胞は、例えばインビトロにおいて、遊走または浸潤アッセイを用いて評価されたとき、ＥＭＴ阻害カクテルと接触していないコントロール細胞よりも低い、遊走能または浸潤能を有する。いくつかの実施形態において、遊走および／または浸潤は、本発明のＥＭＴ阻害組成物の１つ以上の構成要素と接触した細胞において、少なくとも１０、２０、５０、１００倍またはそれ以上低下される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ阻害組成物の１つ以上の構成要素と接触した細胞は、そのように接触していないコントロール細胞よりも低い自己複製能を有する。いくつかの実施形態において、自己複製は、本発明のＥＭＴ阻害組成物の１つ以上の構成要素と接触した細胞において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ阻害カクテルと接触した形質転換した細胞は、ＥＭＴ阻害カクテルと接触していないコントロール細胞よりも低い腫瘍開始能を有する。例えば、ＥＭＴ阻害組成物と接触した形質転換した細胞の腫瘍開始能は、ＥＭＴ阻害カクテルと接触していないコントロール細胞と比べて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍またはそれ以上低下され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ阻害カクテルと接触した腫瘍原性細胞は、ＥＭＴ阻害組成物と接触していないコントロール細胞と比べて、低い転移能を有する。例えば、転移能は、ＥＭＴ阻害組成物と接触していないコントロール細胞と比べて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍低下され得る。転移または腫瘍形成は、当該分野で公知であるようなインビボ転移アッセイを用いて測定され得る。例えば、転移を測定するために、腫瘍原性細胞を動物宿主に（例えば、同所位または皮下に）埋め込み得、そして好適な時間が経過した後、第２の位置（例えば、肝臓、肺）における転移巣の数を評価し得る。病巣の数を、原発腫瘍の重量に基づいて正規化し得る。腫瘍形成能を測定するために、腫瘍原性細胞を、動物宿主に（例えば、同所位または皮下に）埋め込み得、そして好適な時間が経過した後、形成している腫瘍の数を評価し得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＥＭＴを阻害する方法は、例えば、細胞ベースの治療において使用するための目的の細胞型への幹細胞の定方向分化において、間葉系および／またはＳＣ様の状態からの脱却を促進するために有用である。
【００５１】
ＩＶ．ＴＧＦベータ、ＢＭＰもしくはＷｎｔシグナル伝達経路を調節する際または細胞接着を乱す際に使用するための化合物
一般に、種々の好適な任意の化合物（「物質」とも称される）が、本発明に従って、ＴＧＦβ、Ｗｎｔおよび／またはＢＭＰシグナル伝達経路を調節するために使用され得る。化合物は、例えば、タンパク質（この用語は、本明細書中で「ポリペプチド」と交換可能に使用される）、小分子、核酸などを含み得る。「小分子」は、本明細書中で使用されるとき、約２キロダルトン（ＫＤａ）未満の質量の有機分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、約１．５ＫＤａ未満または約１ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態において、小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａまたは１００Ｄａ未満である。しばしば、小分子は、少なくとも５０Ｄａの質量を有する。いくつかの実施形態において、小分子は、非重合体である。いくつかの実施形態において、小分子は、アミノ酸ではない。いくつかの実施形態において、小分子は、ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態において、小分子は、サッカライドではない。いくつかの実施形態において、小分子は、複数の炭素−炭素結合を含み、タンパク質との構造上の相互作用（例えば、水素結合）にとって重要な１つ以上のヘテロ原子および／または１つ以上の官能基、例えば、アミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み得、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの官能基を含み得る。小分子は、上記官能基の１つ以上で必要に応じて置換される、１つ以上の環状炭素もしくは複素環式の構造、および／または芳香族もしくは多環芳香族の構造を含むことが多い。本明細書中の目的のポリペプチドは、標準的なアミノ酸（天然においてタンパク質中に最もよく見られる２０種のＬ−アミノ酸）を含むことが多い。しかしながら、当該分野で公知の（例えば、天然に見られるかまたは天然に存在しない）他のアミノ酸および／またはアミノ酸アナログも、本発明のある特定の実施形態において使用され得る。ポリペプチド中のアミノ酸（例えば、ＮもしくはＣ末端または側鎖におけるもの）の１つ以上が、例えば、アルキル基、炭水化物基、リン酸基、脂質、リンカーなどのような部分の付加、例えば、共有結合によって、改変され得る。ポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドの安定性を高めるため、半減期を延長するため、または他の特性を望ましく改変するために、例えば、ポリエチレングリコールなどの部分の付加（ＰＥＧ化）によって改変され得る。いくつかの実施形態において、核酸（この用語は、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される）は、標準的なヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕと省略される）を含む。他の実施形態において、核酸は、１つ以上の非標準的なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。核酸は、化学的または生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）、改変された糖（２’−フルオロリボース、アラビノースまたはヘキソース）、改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートまたは５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸またはモルホリノを含み得る。いくつかの実���形態において、核酸は、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、少なくともいくつかのヌクレオシドは、非ホスホジエステル結合によって連結される。核酸は、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖であり得る。少なくとも部分的に二本鎖の核酸は、１つ以上のオーバーハング、例えば、５’および／または３’オーバーハングを有し得る。研究目的または治療目的のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アプタマーまたはアンチセンスベースの分子の状況において有用である、当該分野で公知の核酸の改変（例えば、ヌクレオシドおよび／または骨格の改変）、非標準的なヌクレオチド、送達ビヒクルおよびアプローチなどは、本発明の様々な実施形態において使用するために企図されている。例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，ＳＴ（編）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８；Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．（編）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＲＳＣ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８を参照のこと。「抗体」は、免疫グロブリン、および抗原に結合することができる免疫グロブリンドメインを含むその誘導体を包含する。抗体は、哺乳動物または鳥類の種、例えば、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ウサギ）、ヤギ、ニワトリなどを起源とし得るか、またはファージディスプレイなどの手法を用いてエキソビボで作製され得る。抗体は、本発明のある特定の実施形態において有用である。抗体は、様々な免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはそれらのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）のメンバーを含み、様々な実施形態では、抗体フラグメントまたは分子（例えば、抗原結合部位を保持している、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変部分））を包含し、１つ以上の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）を含む組換え分子を包含する。抗体は、様々な実施形態において、一価、二価または多価であり得る。その抗体は、キメラまたは「ヒト化」抗体であり得る。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい場合がある。ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＲＮＡｉ）は、当該分野で公知であるような種々の方法で、真核細胞、例えば、脊椎動物細胞において発現を阻害するために使用され得る。本明細書中で使用されるとき、用語「ＲＮＡｉ物質」は、真核細胞においてＲＮＡｉを達成するために使用され得る核酸を包含する。例示的なＲＮＡｉ物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。当該分野で公知であるように、ｓｉＲＮＡは、代表的には、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する２本の別個の核酸鎖を含む。それらは、例えば、標準的な核酸合成法を用いて、または例えばＲＮａｓｅＩＩＩもしくはダイサーなどのＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素によるより長いｄｓＲＮＡの切断によって、インビトロで合成され得る。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、約１５〜２９ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば、１７〜２５ｎｔ長、例えば、１９〜２３ｎｔ長の二重鎖部分を含み、ここで、いずれかまたは両方の鎖が、デオキシリボヌクレオチドから構成され得る１〜５ヌクレオチド長（例えば、２ヌクレオチド）の３’オーバーハングを必要に応じて有する。いくつかの実施形態において、それらの鎖は、その二重鎖部分では完全に相補的であるが、他の実施形態では、二重鎖部分は、１つ以上のミスマッチのヌクレオチド対またはバルジを含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの各鎖は、１５〜２９ヌクレオチド長、例えば、１９〜２５ｎｔ長、例えば、２１〜２３ｎｔ長である。ｓｈＲＮＡは、主に自己相補的でない領域によって分断された２つの相補的部分を含む単一の核酸鎖を含む。その相補的部分は、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成し、自己相補的でない領域は、その二重鎖の一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端とが接続されたループを形成する。ｓｈＲＮＡは、細胞内プロセシングを受けてｓｉＲＮＡを生成し得る。ＲＮＡｉ物質には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡ前駆体も含まれる。本明細書中で使用されるとき、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、天然に存在する核酸、および天然に存在するｍｉＲＮＡと類似の様式で機能する人工的に設計された核酸を包含する。ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ物質は、ｓｉＲＮＡ（例えば、互いにハイブリダイズし得る２本の別個の鎖）、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体の転写のための鋳型を含むベクターである。そのようなベクターは、その鋳型を脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞に導入するために使用され、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の一過性のまたは安定的な発現をもたらし得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態において、化合物は、天然に存在するポリペプチドを含む。本発明では、ポリペプチドは、それが、天然に見られるポリペプチドのアミノ酸配列を有する場合、「天然に存在する」と言われる。例えば、天然に見られるポリペプチドと配列が同一である組換え的に産生されたポリペプチドは、「天然に存在する」ポリペプチドであると言われる。ＴＧＦｂ、Ｗｎｔおよび／またはＢＭＰレセプターの天然に存在するアゴニストは、本発明のある特定の実施形態において、それぞれＴＧＦｂ、Ｗｎｔおよび／またはＢＭＰ経路を介したシグナル伝達を刺激するために使用され得る。Ｗｎｔおよび／またはＢＭＰタンパク質の天然に存在するアンタゴニストは、本発明のある特定の実施形態において、それぞれＷｎｔおよび／またはＢＭＰ経路を介したシグナル伝達を阻害するために使用され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路を刺激する化合物は、不活性なオートクリン物質をプロセシングすることによってそれを活性型に変換するかまたは細胞表面もしくは細胞外マトリックスに結合されるオートクリン物質を放出するプロテアーゼ、あるいはその経路の内因性インヒビターを切断して不活性化するプロテアーゼを含む。例えば、成熟ＴＧＦ−βが、潜在型の二量体の形態で細胞によって分泌され得ること（ここで、潜在型は、アミノ末端のプロドメインＬＡＰ（潜在型関連（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質）によって引き起こされる）、および細胞外マトリックスに結合する潜在型ＴＧＦ−β１結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に結合され得ることが認識されるだろう。いくつかの実施形態において、ＥＣＭからのＬＡＰの除去および／または成熟ＴＧＦ−Ｂの放出に関わるプロテアーゼは、ＴＧＦｂシグナル伝達を刺激する。
【００５４】
用語「インヒビター」は、目的の分子もしくは複合体（「標的」）の発現を阻害するおよび／またはそれらの１つ以上の活性を阻害する化合物を包含する。例えば、標的の１つ以上の活性が、ある化合物の存在下においてもしくはそれを使用した結果として、その化合物の非存在下と比べて低下する場合、および／またはその標的のレベルもしくは量が、その化合物の存在下においてもしくはそれを使用した結果として、その化合物の非存在下と比べて減少する場合、その化合物は、標的の「インヒビター」である。ある特定の実施形態では、インヒビターが標的と物理的に相互作用するという点において、そのインヒビターは、その標的に対して直接作用する。他の実施形態において、インヒビターは、例えば、その標的の合成または活性にとって必要な第２の分子を阻害することによって、間接的に作用する。いくつかの実施形態において、インヒビターは、アンタゴニストである。阻害する方法は、標的の量を減少させる方法および標的の１つ以上の機能を干渉する方法を包含する。いくつかの実施形態において、標的は、その発現または翻訳後プロセシングを阻害するかまたは干渉することによって阻害され、その結果、減少した量の機能性の標的が生成される。本明細書中で使用されるとき、「発現」は、ポリペプチドの産生に関わる細胞プロセスを包含し、それには、転写、ｍＲＮＡプロセシングおよび輸送（真核細胞の場合）ならびにｍＲＮＡ翻訳が含まれる。発現を阻害するためまたは干渉するために有用な種々の方法が、本発明の実施形態において適用され得る。通常、そのような方法は、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの合成の減少、ならびに結果として、存在する活性の総レベルの低下がもたらされる。他の阻害手段としては、適切な局在化、分泌、または翻訳と同時もしくは翻訳後のプロセシングを干渉すること、あるいは分解の増大を促進することが挙げられる。活性を阻害する方法は、標的またはその標的に対するレセプターもしくはコレセプターに結合し、それにより、その標的が、そのレセプターまたはその標的の活性に必要な他の分子と相互作用するのを阻止することを包含し得る。他の阻害手段としては、酵素の活性部位または触媒残基または基質結合部位に結合すること、二量体化または他のタンパク質間相互作用を阻止することなどが挙げられる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路のインヒビターは、その経路のアゴニストを分解するプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路のインヒビターは、その経路のアゴニストの発現を阻害するかまたはその経路において機能するレセプターの生成を阻害するＲＮＡ干渉を介して作用する物質（「ＲＮＡｉ物質」）、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路のインヒビターは、その経路のアゴニストの発現を阻害するかまたはその経路において機能するレセプターの生成を阻害するアンチセンス機構を介して作用する物質を含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達経路のインヒビターは、その経路のアゴニストに結合してそれを阻害するか、またはその経路において機能するレセプターに結合してそれを阻害する、抗体またはアプタマーを含む。本発明において有用なある特定の化合物に関するさらなる詳細は、下記に提供される。当業者は、本発明を実施する際に使用され得る他の化合物を承知しているだろう。
【００５６】
ＴＧＦｂシグナル伝達は、天然に存在するＴＧＦｂポリペプチド（ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２またはＴＧＦｂ３）を用いて刺激され得る。他の実施形態において、ＴＧＦシグナル伝達を刺激するために、小分子またはペプチドが使用される。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１６４８（ＷＯ／２００９／０５１６６０）では、ＴＧＦベータシグナル伝達を活性化すると報告されている小分子が開示されている。
【００５７】
ＴＧＦｂシグナル伝達は、種々の任意の化合物およびアプローチを用いて阻害され得る。いくつかの実施形態において、ＴＧＦベータインヒビターは、ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの可溶性部分を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、異種部分、例えば、Ｆｃドメイン、例えば、可溶性ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター：Ｆｃ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、ＴＧＦベータインヒビターは、ＴＧＦベータ、例えば、ＴＧＦベータに結合する抗体を含み、ＴＧＦベータがそのレセプターと相互作用するのを妨げる。例えば、ＣＡＴ−１９２およびＧＣ１００８は、活性なＴＧＦベータ１に結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態において、ＴＧＦベータインヒビターは、ＴＧＦβレセプターに結合する抗体を含み、ＴＧＦベータがそれに結合するのを妨げる。別の実施形態では、ＴＧＦｂシグナル伝達を阻害するため、例えば、細胞によるＴＧＦまたはＴＧＦβレセプターの産生を阻害するために、核酸（例えば、ＲＮＡｉ物質またはアンチセンス物質）が使用される。例えば、ＡＰ１２００９は、アンチセンス物質であるＴＧＦ−ｂ２インヒビターである。他の実施形態において、ＴＧＦベータインヒビターは、小分子である。例えば、その小分子は、ＴＧＦベータレセプター、例えば、Ｉ型ＴＧＦベータレセプター（例えば、ＡＬＫ１またはＡＬＫ５）および／またはＩＩ型ＴＧＦベータレセプターに結合してそれを阻害し得る。例えば、そのような化合物は、ＴＧＦベータＩ型レセプターキナーゼのＡＴＰ結合部位または基質結合部位を干渉し得る。いくつかのそのような分子が、当該分野で公知である。例としては、例えば、Ａ８３−０１、ＳＢ４３１５４２、ＳＭ−１６およびＬＹ２１０９７６１（ＩおよびＩＩ型レセプターの二重のインヒビター）および構造上関連する化合物が挙げられる。当業者は、他のＴＧＦｂインヒビターを承知しているだろう。
【００５８】
ＢＭＰシグナル伝達は、内因性ＢＭＰアンタゴニストまたはその機能性バリアントもしくはフラグメントを用いて阻害され得る。ＢＭＰシグナル伝達を阻害する他の化合物が、本発明のある特定の実施形態において使用され得る。例えば、ドルソモルフィンおよびドルソモルフィン誘導体（例えば、ＬＤＮ−１９３１８９）は、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する小分子である（例えば、Ｃｕｎｙ，ＧＤら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１８：４３８８−４３９２，２００８およびその中の参考文献、ならびにＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１６０６（ＷＯ２００９／１１４１８０）を参照のこと）。他の実施形態において、１つ以上のＢＭＰリガンドおよび／またはＩ型もしくはＩＩ型ＢＭＰレセプターの発現は、ＲＮＡｉまたはアンチセンスアプローチを用いて阻害される。例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、ＢＭＰＩＩ−Ｒ、ＡＣＴＲ−ＩＩＡおよび／またはＡＣＴＲ−ＩＩＢを阻害するために使用され得る。
【００５９】
ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはそれらの機能性バリアント）を用いて刺激され得る。ＢＭＰシグナル伝達はまた、例えば、潜在的にはＴｒｉｂｂｌｅ３のアップレギュレーションに関わる機序によってＢＭＰシグナル伝達を刺激すると報告されているアミロライド誘導体フェナミルなどの小分子を用いても活性化され得る（Ｐａｒｋ  ＫＷ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９：３９０５−３９１４，２００９）。同様の効果を有するフェナミルの誘導体が合成され得ると予想されることは、当然のことであろう。他の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達は、内因性ＢＭＰアンタゴニストのインヒビターを用いて刺激される。例えば、そのようなＢＭＰアンタゴニストに対する抗体が使用され得る。１つの実施形態において、Ｃｈｏｒｄｉｎ様２またはＧｒｅｍｌｉｎに対する抗体が使用される。他の実施形態において、１つ以上の天然に存在するＢＭＰアンタゴニストの合成は、ＲＮＡｉまたはアンチセンス分子を用いて阻害される。
【００６０】
Ｗｎｔシグナル伝達は、種々のアプローチを用いて阻害され得る。本発明のある特定の実施形態によると、複数のＷｎｔファミリーメンバーを阻害することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ阻害組成物は、例えば、２つのＷｎｔから、目的の細胞または生物によって発現されるＷｎｔタンパク質の全構成要素までにわたる、複数のＷｎｔタンパク質を阻害することができる化合物を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、１つ以上の内因性Ｗｎｔアンタゴニスト（例えば、ＳＦＲＰまたはＤＫＫタンパク質）を用いて阻害される。例えば、ＳＦＲＰ１が使用され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＦＲＰファミリーメンバーおよび少なくとも１つのＤＫＫファミリーメンバー、例えば、ＳＦＲＰ１およびＤＫＫ１が使用される。
【００６１】
Ｗｎｔを阻害する他のアプローチとしては、複数のＷｎｔの翻訳と同時もしくは翻訳後のプロセシング（例えば、グリコシル化、脂質化）、分泌および／または破壊に関わるタンパク質、あるいは複数のＷｎｔと別途相互作用してその活性を促進するタンパク質を阻害することが挙げられる。例えば、ポーキュパイン（ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）は、Ｗｎｔの活性を促進し、そして／またはその活性に必要な、Ｗｎｔの脂質修飾に関わる小胞体常在性アシルトランスフェラーゼである。したがって、ポーキュパインのインヒビターは、複数のＷｎｔタンパク質および経路を阻害し得る。ポーキュパインを阻害するある特定の小分子の説明については、例えば、Ｃｈｅｎ  Ｂら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．５（２）：１００−７，２００９を参照のこと。Ａｘｉｎは、Ｗｎｔの負の制御因子として機能する。Ａｘｉｎ複合体を安定化するかまたはその活性を促進する小分子が、古典的Ｗｎｔ経路を阻害するために使用され得る。Ａｘｉｎを阻害するある特定の小分子の説明については、例えば、Ｌｕ  Ｊら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，１９（１４）：３８２５−７，２００９およびＣｈｅｎ，前出を参照のこと。Ｅｖｅｎｎｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ（Ｅｖｉ；Ｗｎｔｌｅｓｓ（Ｗｌｓ）およびＳｐｒｉｎｔｅｒとしても知られる）は、特に複数のＷｎｔの分泌に必要とされる膜タンパク質である（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  Ｃら、Ｃｅｌｌ，１２５（３）：５０９−２２，２００６）。したがって、Ｗｎｔｌｅｓｓのインヒビターは、複数のＷｎｔタンパク質および経路を阻害し得る。当業者は、阻害され得るかまたは複数のＷｎｔを阻害するように刺激され得る他のタンパク質を承知しているだろう。
【００６２】
Ｗｎｔシグナル伝達は、種々の異なる方法によって刺激され得る。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、１つ以上の内因性Ｗｎｔアンタゴニスト（例えば、上に記載されたもの）を阻害することによって活性化される。これらの内因性アンタゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するように機能するので、このアプローチは、「脱抑制」とも称される。内因性Ｗｎｔインヒビターは、そのインヒビターに結合してそれがＷｎｔレセプターと効率的に相互作用するのを妨げる、抗体、アプタマーまたは小分子などの物質を用いて阻害され得る。他の実施形態において、内因性Ｗｎｔアンタゴニストの合成および／または分泌は、ＲＮＡｉ物質またはアンチセンスアプローチを用いて阻害される。いくつかの実施形態において、ＳＦＲＰ１は、ＷＡＹ−３１６６０６などのジアリールスルホンスルホンアミドを用いて阻害される。例えば、Ｍｏｏｒｅ，ＷＪら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５２（１）：１０５−１６，２００９を参照のこと。他の実施形態において、ＳＦＲＰ１は、イミノオキソチアゾリジンを用いて阻害される。例えば、Ｓｈｉ  Ｍら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１９（２２）：６３３７−９，２００９を参照のこと。
【００６３】
他の実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、必要に応じて細胞を内因性Ｗｎｔアンタゴニストのインヒビターと接触させることとともに、細胞を１つ以上のＷｎｔタンパク質と接触させることによって活性化され得る。可溶性の生物学的に活性なＷｎｔタンパク質は、当該分野で公知の方法を用いて精製された形態で調製され得る。例えば、米国特許公開番号２００４０２４８８０３およびＷｉｌｌｅｒｔ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４２３；４４８−５２，２００３を参照のこと。ある特定の実施形態において、その可溶性の生物学的に活性なＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１６（Ｗｎｔ１６ｖ１またはＷｎｔ１６ｖ２）である。
【００６４】
他の実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路の１つ以上の工程に関わるタンパク質に作用する小分子が使用され得る。例えば、ＧＳＫ３インヒビターが、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するために使用され得る。現在、ＧＳＫ３の多くの強力かつ選択的な小分子インヒビターが同定されている（Ｗａｇｍａｎ  ＡＳ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＷ，Ｂｕｓｓｉｅｒｅ  ＤＥ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．，１０（１０）：１１０５−３７，２００４）。有用な例示的なＧＳＫ３インヒビターとしては、以下が挙げられる；（１）ＢＩＯ：強力で可逆性、かつＡＴＰ競合性のＧＳＫ−３インヒビターである、（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム．６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７，９３５−９４６，２００４）。（２）ＡＲ−ＡＯ  １４４１８；Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素。ＡＲ−Ａ０１４４１８は、ＡＴＰ競合的様式で（Ｋｉ＝３８ｎＭ）ＧＳＫ３を阻害する（ＩＣ５０＝１０４ｎＭ）。ＡＲ−Ａ０１４４１８は、ｃｄｋ２もしくはｃｄｋ５（ＩＣ５０＞１００μΜ）または他の２６個のキナーゼを有意に阻害しないことから、ＧＳＫ３に対する高い特異性が示される（Ｂｈａｔ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４５９３７−４５９４５，２００３）。（３）ＳＢ２１６７６３：３−（２．４−ジクロロフェニルＶ４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−ｖｌＶ１Ｈ−ピロール−２．５−ジオン。例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１，６３５−６３９，（２００１）およびＣｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７，９４−１０２，（２００１）を参照のこと。（４）ＳＢ４１５２８６：３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン。ＳＢ４１５２８６は、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１，６３５−６３９，２００１およびＣｏｕｇｈｌａｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，７９３−８０３，２０００に記載されている。（５）ＴＤＺＤ−８：４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン。この化合物は、チアジアゾリジノン誘導体であり、ＧＳＫ−３βの非ＡＴＰ競合性インヒビターである、ＧＳＫ−３の選択的インヒビターである（ＩＣ５０＝２μΜ）。これは、＞１００μＭでは、Ｃｄｋ−１／サイクリンＢ、ＣＫ−ＩＩ、ＰＫＡまたはＰＫＣを阻害しない。ＧＳＫ−３βのキナーゼ部位に結合すると提唱されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，１２９２−１２９９，２００２）；ＣＨＩＲ−９１１およびＣＨＩＲ−８３７（それぞれＣＴ−９９０２１およびＣＴ−９８０２３とも称される）Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）ならびに関連化合物が、有用である。塩化リチウム、バルプロ酸ナトリウムおよびＧＳＫ３インヒビターＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、他の有用なＧＳＫ３インヒビターである。さら��るＧＳＫ３インヒビターは、米国特許第６，０５７，１１７号および同第６，６０８，０６３号；米国特許出願公開２００４００９２５３５、２００４０２０９８７８、２００５００５４６６３に記載されている。他の有用なＧＳＫ３インヒビターは、ＷＯ／２００３／０４９７３９；ＷＯ／２００２／０８５９０９；ＷＯ／２００３／０１１２８７；ＷＯ／２００５／０３９４８５、および／またはＷＯ／２００６／０９１７３７に記載されている。Ｗｎｔシグナル伝達を刺激する有用な化合物および方法の考察については、ＷＯ／２００９／０３２１９４もまた参照のこと。当業者は、複数のＷｎｔを刺激するように阻害され得るかまたは刺激され得る、Ｗｎｔの翻訳と同時もしくは翻訳後のプロセシング、分泌または破壊に関わるタンパク質も承知しているだろう。
【００６５】
本発明の方法において化合物が使用される濃度、例えば、細胞培養培地にそのような化合物を加えた後にその中にそれが存在する濃度は、様々であり得る。例えば、好適な範囲は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０，０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜２，５００ｎｇ／ｍｌなどであり得る。特定の濃度は、その物質の効力および独自性、それと併用して使用される他の物質、ならびに所望の結果に依存し得る。ある特定の化合物に対するいくつかの非限定的な濃度は、実施例に提供される。例示的で非限定的な範囲は、様々な実施形態において、そのような濃度の０．１倍〜１０倍、例えば、０．２倍〜５倍または０．５倍〜２倍に及び得る。
【００６６】
当業者は、ＴＧＦβ、ＷｎｔおよびＢＭＰ経路を制御する際、例えば、刺激する際または阻害する際に関わる特定の内因性分子が、種々の細胞型において異なり得ることを認識するだろう。例えば、種々の上皮細胞のタイプが、天然に種々の内因性Ｗｎｔインヒビターを発現し得る。当業者は、そのような細胞においてＥＭＴを誘導するために、それらのインヒビターから適切なインヒビターを選択し得る。例えば、細胞が、ＳＦＲＰ１ではなく主にＳＦＲＰ２を発現する場合、ＳＦＲＰ２に対する抗体が、ＥＭＴの誘導ならびに／または間葉系およびＳＣ様の状態の維持を促進するように、Ｗｎｔシグナル伝達を脱抑制するために使用され得る。
【００６７】
非古典的経路、例えば、ＷｎｔＣａ２＋経路において、または本発明のある特定の実施形態において、Ｗｎｔの下流で機能する１つ以上の分子も阻害することもできるだろうし、代わりにそれを阻害することもできるだろう。例えば、ＪＮＫ／ｃ−Ｊｕｎ経路は、非古典的Ｗｎｔ経路（例えば、Ｗｎｔ５ａの下流）およびＴＧＦβの下流で機能する。ＰＫＣは、非古典的Ｗｎｔ経路における下流（例えば、Ｗｎｔ５ａの下流）で機能する。これらのタンパク質の数多くの小分子インヒビターが、当該分野で公知であり、ＥＭＴ阻害組成物中で使用され得る。例えば、ＳＰ６００２５およびＢＩ−７８Ｄ３は、小分子ＪＮＫインヒビターである。ＰＫＣ４１２およびＣＧＰ４１２５１は、小分子ＰＫＣインヒビターである。
【００６８】
本発明のある特定の方法は、細胞接着を乱す工程を含む。上で述べたように、上皮細胞は、タイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションなどの細胞間接着複合体によって互いに接着している。本発明のある特定の実施形態において、そのような複合体の形成および／または維持を乱すことは、ＥＭＴを促進し、かつ／または間葉系および／もしくはＳＣ様の状態で細胞を維持することを助ける。接着複合体の形成および／または維持は、そのような接着複合体の構成要素であるタンパク質（例えば、その細胞外ドメイン）に結合する抗体と細胞を接触させることによって、乱され得る。例えば、Ｅ−カドヘリン（アドヘレンスジャンクションタンパク質）またはＯｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ１もしくはＣｌａｕｄｉｎ２（細胞外ドメインを有するタイトジャンクションタンパク質）に結合する抗体が、いくつかの実施形態において使用され得る。接着複合体タンパク質に結合する他の物質（例えば、アプタマー）も、ある特定の実施形態において使用され得る。これらのタンパク質の１つ以上の産生を阻害するために、ＲＮＡｉまたはアンチセンス分子が使用され得る。他の実施形態において、接着複合体タンパク質を切断するプロテアーゼが使用される。例えば、マトリクスメタロプロテアーゼまたはカルパインが、いくつかの実施形態において使用され得る。
【００６９】
上で論じられたように、本発明のいくつかの実施形態において、天然に存在するポリペプチドが、本発明の組成物および／または方法において使用される。本発明のいくつかの実施形態において、天然に存在するポリペプチドのバリアントが、使用される。ポリペプチドのバリアントには、そのポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｄｅ）と比べて１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって異なるポリペプチドが含まれる。例えば、天然に存在するポリペプチドのポリペプチドバリアントには、天然に存在するポリペプチドと比べて１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって異なるポリペプチドが含まれる。付加は、ポリペプチド内への挿入またはＮもしくはＣ末端における付加であり得る。いくつかの実施形態において、置換、欠失または付加されたアミノ酸の数は、例えば、約１〜３０個、例えば、約１〜２０個、例えば、約１〜１０個、例えば、約１〜５個、例えば、１、２、３、４または５個であり得る。特定のタンパク質に対する参照配列の天然に存在する対立遺伝子バリアントが、その集団内に存在し得ること、およびそのようなバリアントが、本発明のある特定の実施形態において使用され得ることが認識されるだろう。本明細書中に包含されるスプライスバリアントが存在し得ることも認識されるだろう。いくつかの実施形態において、ポリペプチドバリアントは、その配列が、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸にわたって、またはそのポリペプチドの全長にわたって、そのポリペプチドの配列と相同である（が、そのポリペプチドの配列と同一ではない）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドバリアントは、そのポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％にわたって、そのポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるポリペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドバリアントは、その配列が、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸にわたって、または天然に存在するポリペプチドの全長にわたってその天然に存在するポリペプチドの配列と相同である（が、その天然に存在するポリペプチドの配列と同一ではない）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドバリアントは、その天然に存在するポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％にわたって、その天然に存在するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドのフラグメントを含むか、またはそれからなる。フラグメントは、天然に存在するポリペプチドよりも短く、かつそのフラグメントの長さにわたって天然に存在するポリペプチドと同一である。いくつかの実施形態において、フラグメントは、天然に存在するポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の長さである。いくつかの実施形態において、天然に存在するポリペプチドのＣ末端における１つ以上のアミノ酸が、欠失されている。いくつかの実施形態において、Ｎ末端における１つ以上のアミノ酸が欠失されている。目的の配列Ａと第２の配列Ｂとの間の同一性パーセントは、それらの配列をアラインメントし、同一性が最大になるようにギャップを導入し、向かい側で同一残基である残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定し、ＴＧＡおよびＴＧＢ（ここで、ＴＧＡおよびＴＧＢは、アラインメントしたときの配列ＡおよびＢにおける残基および内部のギャップの位置の数の合計である）の最小数で除して、１００を乗じることによって、計算され得る。特定の同一性パーセントを達成するために必要な同一の残基の数を計算するとき、端数は、最も近い整数に丸める。当業者は、配列のアラインメントおよび／または同一性パーセントの決定のために使用され得る種々のコンピュータプログラムを承知しているだろう。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴなどのようなコンピュータプログラムが、アラインメントを生成する。Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３におけるように改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２２６４−２２６８，１９９０）は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。いくつかの実施形態において、比較する目的でギャップが挿入されたアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータが使用され得る。ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを有するウェブサイトを参照のこと。他の好適なプログラムとしては、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ，Ｎｕｃ  Ａｃ  Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）およびＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１；これはＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＳＢ，Ｗｕｎｓｃｈ  ＣＤ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８：４４３−４５３，１９７０）を実装している）が挙げられる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドバリアントは、機能性バリアントであり、すなわち、このバリアントは、目的の天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在しないポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を少なくとも部分的に保持している。いくつかの実施形態において、機能性バリアントは、そのポリペプチド、例えば、天然に存在するポリペプチドの活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の活性、例えば、ほぼ等しい活性を保持する。いくつかの実施形態において、機能性バリアントは、天然に存在するポリペプチドよりも高い活性を有し得る。
【００７１】
当業者は、本明細書中の目的のポリペプチドの機能性バリアントまたはフラグメントを容易に作製し得る。例えば、活性にとって重要な様々な残基およびドメインの同定、ならびに活性を有意に低下させずに変更され得る様々な残基に関する情報、ならびに他のポリペプチドとのアラインメントおよび場合によっては構造の情報が入手可能である。そのような情報がまだ利用可能でない場合、同様の解析が、他のタンパク質に対して容易に行われ得る。その情報は、機能性バリアントおよびフラグメントを設計するために使用され得る。多くのタンパク質が複数のドメインを含み、それらのドメインの１つ以上が、目的の生物学的活性に関与し得ることが認識されるだろう。当業者は、例えば、欠失解析を用いて、またはキメラタンパク質を作製して（特定の活性が２つ以上の異なるタンパク質間で異なる場合）、そのようなドメインを容易に同定し得る。したがって、例えば、完全長ポリペプチドではなく、機能性ドメインを含むポリペプチドが、使用され得る。例えば、特定の標的への結合に関与するドメインが、ある特定の実施形態において、その標的に結合する目的のために使用され得る。いくつかの実施形態において、バリアントは、天然に存在するポリペプチドと比べて、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含む。保存的置換は、関わる残基の側鎖サイズ、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。当該分野で公知であるように、そのような置換は、一般に、非保存的置換と比べて活性を保持するバリアントをもたらす可能性が高い。１つの実施形態において、アミノ酸は、以下の通り分類される：
特別：Ｃ
中性および小型：Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ
極性および比較的小型：Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ
極性および比較的大型：Ｒ、Ｈ、Ｋ
非極性および比較的小型：Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ
非極性のおよび比較的大型：Ｆ、Ｗ、Ｙ
特別：Ｃ  。
【００７２】
例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５０：５６−６８，２０００を参照のこと。いくつかの実施形態において、プロリン（Ｐ）は、第２の特別なアミノ酸としてそれ自体の群に入れられると考えられる。特定の群の中で、ある特定の置換、例えば、イソロイシンによるロイシン（またはその逆）、トレオニンによるセリン（またはその逆）またはグリシンによるアラニン（またはその逆）の置換が、特に興味深い場合がある。当然のことながら、非保存的置換も同様に、機能の保持と両立可能であることが多い。いくつかの実施形態において、置換または欠失は、活性にとって重要であると当該分野で公知のアミノ酸を変更しないかまたは欠失させない。いくつかの実施形態において、変更は、種々の哺乳動物種間で高度に保存されていないアミノ酸において行われる。いくつかの実施形態において、置換は、あるアミノ酸を、種々の種において対応する位置に存在するアミノ酸に変更させる。いくつかの実施形態において、機能性バリアントは、例えば、天然に存在するポリペプチドの全長の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％にわたって、その天然に存在するポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のポリペプチドを含む。所望であれば、ポリペプチドバリアントは、任意の好適な方法を用いて活性を評価するために、無細胞アッセイおよび／もしくは細胞ベースのアッセイにおいて、またはインビボで、試験され得る。例えば、結合活性を評価する数多くの方法が、当該分野で公知である。天然に存在する特定のタンパク質が、本明細書中に記載されるおよび／または特許請求される本発明の組成物および／または方法において言及される場合、そのような組成物および／または方法は、別段示されない限り（例えば、特定の配列番号またはアクセッション番号を列挙することによって）または別段文脈から明らかでない限り、そのようなタンパク質（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｅ  ＩＤ  ＮＯまたはアクセッション番号によって定義されるもの）が使用される実施形態、およびそのようなタンパク質の機能性バリアントが使用される実施形態を包含することも理解されるべきである。本出願人は、請求項を、任意の範囲のバリアントおよび／または任意の特定の配列に限定する権利を留保している。
【００７３】
いくつかの実施形態において、天然に存在するポリペプチドのバリアントは、異種ポリペプチド部分を含む。その異種部分は、天然に存在するポリペプチドに存在しないかまたはそれと相同でない配列を有することが多い。異種部分は、例えば、５〜約５，０００アミノ酸長またはそれ以上であり得る。それは、５〜約１，０００アミノ酸長であることが多い。いくつかの実施形態において、異種部分は、異なるポリペプチドに見られる配列、例えば、機能ドメインを含む。いくつかの実施形態において、異種部分は、ポリペプチドを精製するため、発現させるため、可溶化するためおよび／または検出するために有用な配列を含む。いくつかの実施形態において、異種部分は、ポリペプチド「タグ」、例えば、親和性タグまたはエピトープタグを含む。例えば、そのタグは、親和性タグ（例えば、ＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ＸＨｉｓ、Ｆｌａｇ、ＧＳＴ）、蛍光または発光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ）、溶解性向上タグ（例えば、ＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ  Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体変異体）であり得る。例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｄ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  Ｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１７（４）：３５３−８（２００６）を参照のこと。いくつかの実施形態において、タグは、複数の機能を果たし得る。タグは、比較的小さい（例えば、数アミノ酸から約１００アミノ酸長までの範囲である）ことが多い。いくつかの実施形態において、タグは、１００アミノ酸長より長い、例えば、約５００アミノ酸長まで、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、タグは、ＮまたはＣ末端に、例えば、ＮまたはＣ末端融合物として、配置される。上記ポリペプチドは、複数のタグを含み得る。いくつかの実施形態において、６ＸＨｉｓタグおよびＮＵＳタグが、例えば、Ｎ末端に、存在する。いくつかの実施形態において、タグは、切断可能であり、例えば、プロテアーゼによってポリペプチドから除去され得る。いくつかの実施形態において、これは、タグをコードする配列とそのポリペプチドの残りの部分をコードする配列との間にプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含めることによって達成される。例示的なプロテアーゼとしては、例えば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、「自己切断型」タグが使用される。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３を参照のこと。タグをコードする配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して５’または３’（またはその両方）に配置され得る。いくつかの実施形態において、タグまたは他の異種配列は、ポリペプチドリンカーによってポリペプチドの残りの部分と分断される。例えば、リンカーは、短いポリペプチド（例えば、１５〜２５アミノ酸）であり得る。リンカーは、小型のアミノ酸残基（例えば、セリン、グリシンおよび／またはアラニン）から構成されることが多い。異種ドメインは、膜貫通ドメイン、分泌シグナルドメインなどを含み得る。いくつかの実施形態において、���種ドメインは、ポリペプチドの安定性を高めるか、またはそのインビボ半減期を延長する。例示的な相同ドメインとしては、例えば、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、免疫グロブリンのＦｃドメインなどが挙げられる。
【００７４】
他の実施形態において、バリアントは、内因性アンタゴニストによる阻害に対して低い感受性を有し得る。例えば、内因性ＷｎｔまたはＢＭＰアンタゴニストと天然に存在するＷｎｔまたはＢＭＰとの結合において役割を果たすアミノ酸に変更を有するＷｎｔまたはＢＭＰバリアントが作製され得る。
【００７５】
一般に、ＴＧＦβ、ＢＭＰおよび／もしくはＷｎｔシグナル伝達経路を調節するため、または細胞接着を乱すために有用な化合物は、任意の好適な方法を用いて作製され得るか、または得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明において有用なタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。天然に存在するポリペプチドをコードする核酸は、例えば、そのポリペプチドを発現する細胞から（例えば、ＰＣＲもしくは他の増幅方法によって、またはクローニングによって）、または公知のポリペプチド配列に基づく合成によって、容易に得ることができる。代表的には、その核酸を、好適なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）に挿入し、次いでそれを適切な宿主細胞（様々な実施形態において、原核生物または真核生物であり得る）に導入する。その宿主細胞を、そのポリペプチドの産生に適した条件下で維持する。グリコシル化などの修飾を受けるタンパク質の場合、当業者は、適切な修飾を行う宿主細胞を選択し得る。例えば、哺乳動物細胞または他の真核細胞が使用され得る。当業者は、遺伝暗号の縮重に起因して数多くの異なる核酸配列が所望のポリペプチドをコードし得ることを知っているだろう。必要に応じて、最適な宿主細胞における発現のために、配列がコドン最適化される。特定のバリアントをコードする核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いてまたは他の標準的な方法によって、例えば、天然に存在する配列を改変することによって、容易に作製され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、所望のタンパク質は、所望のタンパク質を分泌する（天然にまたは遺伝的改変の結果として）細胞を培養するために使用された細胞培養培地などの起源から少なくとも部分的に精製される。化学合成、タンパク質ライゲーションなどのような他のタンパク質作製方法が、ある特定の実施形態において使用され得る。通常、本明細書中の目的の化合物または細胞は、精製され得る。「精製」とは、天然において関連する構成要素の大部分から分離されたときまたは初めから生成されたときの物質または実体（例えば、化合物）のことを指す。一般に、そのような精製は、人間の手による実行を含む。精製された物質または実体は、部分的に精製されていてもよいし、実質的に精製されていてもよいし、純粋であってもよい。そのような物質または実体は、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超純粋であり得る。いくつかの実施形態において、核酸またはポリペプチドは、それらが、調製物中に存在するそれぞれ全核酸材料または全ポリペプチド材料の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を構成するように、精製される。純度は、例えば、乾燥重量、クロマトグラフィーによる追跡におけるピークのサイズ、分子の存在量、ゲル上のバンドの強度、もしくは分子の存在量と相関する任意のシグナルの強度、または当該分野で認められている任意の定量方法に基づき得る。いくつかの実施形態において、水、緩衝液、イオンおよび／または小分子（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸などの前駆体）が、必要に応じて、精製された調製物中に存在し得る。精製された分子は、それを他の物質（例えば、他の細胞材料）から分離することによって、または所望の純度を達成するような様式でそれを生成することによって、調製され得る。いくつかの実施形態において、精製された分子または組成物とは、当該分野で認められている任意の精製方法を用いて調製された分子または組成物のことを指す。いくつかの実施形態において、「部分的に精製された」は、細胞によって産生された分子が、もはやその細胞内に存在しないこと、例えば、その細胞が、溶解され、必要に応じて、その細胞材料（例えば、細胞壁、細胞膜、細胞小器官）の少なくともいくらかが除去されたことを意味する。細胞を含む組成物の状況では、様々な実施形態において、それらの細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超が、特定のタイプであり得、かつ／または特定のマーカー発現プロファイル、表現型の特徴などを有し得る。
【００７７】
本明細書中の化合物および組成物が、所望の生物学的効果および／または治療効果を達成するのに有効な量で本発明の方法において使用され得ることが理解されるだろう。
【００７８】
Ｖ．培養培地およびキット
本発明はさらに、本発明のＥＭＴ誘導組成物または本発明のＥＭＴ阻害組成物を含む組成物を提供し、ここで、その組成物はさらに、細胞培養培地または少なくともいくつかの細胞培養培地構成要素を含む。種々の細胞培養培地のうちのいずれかが使用され得る。例示的な細胞培養培地としては、例えば、ＭＥＧＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２およびそれらの混合物が挙げられる。当業者は、そのような培養培地の構成要素（例えば、栄養分（例えば、糖およびアミノ酸）、ビタミン、微量元素、イオン、脂質、ホルモン、成長因子および他の標準的な細胞培養培地成分など）およびそれを調製するための方法を承知しているだろう。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと。当業者は、細胞培養培地の様々な構成要素の多くの正確な量が、その培養培地が細胞の成長を助ける能力に悪影響を及ぼさずに、変更され得ることを認識するだろう。例えば、培養培地は、様々な実施形態において、０．１〜１００倍の濃度の任意の１つ以上の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態において、培養培地は、目的の上皮細胞型の培養に適している。したがって、本発明は、ＥＭＴの誘導のために上皮細胞を培養すること、および／または間葉系細胞を間葉系の状態で維持するためにそのような細胞を培養することに適した細胞培養培地を提供する。
【００７９】
本発明は、種々のキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載されるようにＥＭＴを誘導するためおよび／または維持するために有用な物質の一群を備える。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載されるようにＥＭＴを阻害するために有用な物質の一群を備える。任意の物質の組み合わせが、提供され得る。簡潔にする目的で、その様々な組み合わせは、個別に列挙されない。それらの物質は、個別の容器、例えば、チューブに包装され得る。所望であれば、適合する物質を、同じ容器内に一緒に包装してもよい。いくつかの実施形態において、そのキットの一部として、またはそのキットとともに（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）、細胞が提供される。他のキット構成要素としては、例えば、上皮細胞に特徴的または間葉系細胞もしくはＳＣ様細胞に特徴的な１つ以上のマーカーの発現を検出するために有用な試薬（例えば、抗体、レポータープラスミド、プローブ、プライマー）が挙げられ得る。上記のいずれのキットも、使用するための指示書を備え得る。
【００８０】
ＶＩ．用途
本明細書中に記載される組成物および／または方法は、種々の異なる用途において使用法が見出されており、その用途は、本発明の態様である。例示的かつ非限定的な用途が、この項に記載される。
【００８１】
１．スクリーニング法
本発明に従ってＥＭＴを起こすように誘導された細胞は、化合物を同定するためおよび／または特徴付けるための種々の異なる方法において使用され得る。例えば、細胞を、ＥＭＴ誘導組成物またはＥＭＴ阻害組成物の構成要素のすべてではないがいくつかおよび被験化合物と接触し得る。その被験化合物が、組成物から取り除かれた化合物の活性を提供する能力が、評価される。このように、ＥＭＴを誘導するためまたは阻害するために有用な追加の化合物が同定され得る。いくつかの態様において、本発明は、ＥＭＴを促進する化合物を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、（ｉ）以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）ＢＭＰ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｃ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｄ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｅ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも２つ、またはいくつかの実施形態では少なくとも３つ、またはいくつかの実施形態では少なくとも４つの各々から選択される１つ以上の化合物ならびに被験化合物と単離された上皮細胞とを接触させる工程；ならびに（ｉｉ）それらの細胞をＥＭＴの証拠について評価する工程を包含し、ここで、それらの細胞が、好適なコントロールと比べて、ＥＭＴを起こしたという強い証拠を示す場合、その化合物は、ＥＭＴを促進する化合物と同定される。このように、例えば、ＥＭＴを誘導するのに寄与する化合物（例えば、小分子）が同定され得る。いくつかの態様において、本発明の方法は、ＴＧＦβシグナル伝達を刺激する、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を刺激する（例えば、脱抑制する）、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する、細胞接着を阻害する（例えば、アドヘレンスジャンクションの形成を阻止する）、および／または他の機構によって作用する、物質を同定する。そのような化合物は、いったん同定されると、ＴＧＦβシグナル伝達を刺激すること、ＢＭＰシグナル伝達を阻害すること、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を刺激する（例えば、脱抑制する）こと、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化すること、および／またはアドヘレンスジャンクションの形成を阻止することが望まれる他の方法において使用され得る。
【００８２】
他の態様において、本発明は、ＥＭＴを阻害する化合物を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、（ｉ）以下の群：（ａ）ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｂ）ＢＭＰ経路のシグナル伝達を阻害する化合物；（ｃ）古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；（ｄ）非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を刺激する化合物；および（ｅ）細胞接着を乱す化合物のうちの少なくとも２つ、またはいくつかの実施形態では少なくとも３つ、またはいくつかの実施形態では少なくとも４つの各々、またはいくつかの実施形態ではその各々から選択される１つ以上の化合物ならびに被験化合物と単離された上皮細胞とを接触させる工程；ならびに（ｉｉ）それらの細胞をＥＭＴの証拠について評価する工程を包含し、ここで、それらの細胞が、好適なコントロールと比べて、ＥＭＴを起こしたという弱い証拠を示す場合、その化合物は、ＥＭＴを阻害する化合物と同定される。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、工程（ｉ）の他の化合物と接触する前に、被験化合物で前処理される。被験化合物は、上記細胞が他の化合物と接触する際に存在してもよいし、しなくてもよい。いくつかの実施形態において、この方法は、ＴＧＦ−ベータ経路のシグナル伝達を阻害する化合物、ＢＭＰ経路のシグナル伝達を刺激する、古典的および／もしくは非古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達を阻害する、細胞接着を促進する、ならびに／または他の機構によって作用する化合物を同定し得る。そのような化合物は、いったん同定されると、特定の活性が望まれる他の方法において使用され得る。
【００８３】
上記方法（または本発明の他の方法）においてＥＭＴの証拠について細胞を評価するために、例えば、ＥＭＴ  ＴＦ（例えば、Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、Ｔｗｉｓｔなど）および／または間葉系マーカー（例えば、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンなど）の誘導が調べられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、被験化合物を含む化合物の組み合わせと接触した細胞の集団において、好適なコントロールと比べて、少なくとも１つのＥＭＴ関連ＴＦの、例えば、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍のアップレギュレーションは、その化合物がＥＭＴを促進することを示唆する。いくつかの実施形態では、被験化合物を含む化合物の組み合わせと接触した細胞の集団において、好適なコントロールと比べて、少なくとも１つのＥＭＴ関連ＴＦの、例えば、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍のダウンレギュレーションは、その化合物がＥＭＴを阻害することを示唆する。その代わりにまたはさらに、ＥＭＴを起こした細胞において高められた運動性または自己複製能などの特性が調べられ得る。その代わりにまたはさらに、細胞が上皮の特徴の変化（減少または増加）を示す程度が測定され得る。例えば、ＥＭＴを起こした細胞は、マーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン、上皮サイトケラチンなど）の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、マーカーの発現は、少なくとも５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上減少する。本発明のいくつかの実施形態において、上皮細胞は、ＣＤ４４低かつＣＤ２４高である一方、ＥＭＴを起こした細胞は、ＣＤ４４高かつＣＤ２４低である。細胞のマーカーパターンは、細胞蛍光励起細胞分取および免疫組織化学などのような手法によって、容易に測定され得ることが認識されるだろう。理解される（ｕｎｄｅｒｔｏｏｄ）ように、細胞マーカーおよびその発現レベルに関して、「ｎｅｇ」（−）とは、そのマーカーの発現がないこともしくは無視できるほどであることまたは低レベルであることを指し、「ｐｏｓ」（＋）とは、強い発現のことを指す。細胞マーカーの発現が「ｎｅｇ」から「ｐｏｓ」に変化することは、発現していない状態または低レベルの発現から、高レベルまたはより高いレベルの発現に変化することを表す。したがって、「低」とは、低レベルを指し、「高」とは、容易に検出可能なレベルおよび高レベルの発現を指し、低発現と高発現との差異、および／または低発現レベルから高発現レベルへ、もしくは高発現レベルから低発現レベルへの変化は、容易に当業者に明らかであろう。
【００８４】
上記方法に対する好適なコントロールは、例えば、ＥＭＴを起こした証拠が、被験化合物の非存在下において（または有意に少ない量の被験化合物の存在下において）工程（ｉ）の同じ組み合わせの化合物と接触した同じタイプの細胞によって示される程度であり得る。いったん、（被験化合物の非存在下において）生じ得るＥＭＴのレベルが確立されると、被験化合物のスクリーニングと平行してその方法をコントロール細胞において行う必要がない可能性があると理解されるだろう。ＥＭＴを阻害する化合物は、例えば、ＥＭＴに関連する状態（例えば、本明細書中で論じられる状態および／または当該分野で公知の状態）の処置において、種々の使用法を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＥＭＴの誘導および／または維持に関わる１つ以上のオートクリンシグナル伝達経路を混乱させる化合物は、そのような目的のために特に効果的であり得る。これらの経路の少なくとも１つを混乱させる化合物の各々は、組み合わせて使用されるとき、ＥＭＴの阻害において相乗効果を有し得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明のＥＭＴ誘導方法を用いてＥＭＴを起こすように誘導された細胞は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とする化合物を同定するスクリーニングにおいて使用される。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２２５４（ＷＯ／２００９／１２６３１０）を参照のこと。例えば、本発明は、化合物が癌幹細胞の成長および／または生存を阻害する能力を試験するための方法を提供し、その方法は、（ａ）１つ以上の被験細胞をその化合物と接触させる工程（ここで、その１つ以上の被験細胞は、本発明に従って誘導されたＥＭＴを起こしている）ならびに（ｂ）その化合物による１つ以上の被験細胞の成長および／または生存の阻害のレベルを検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、被験細胞は、上皮細胞、例えば、形質転換した上皮細胞である。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、１つ以上のコントロール細胞を上記化合物と接触させる工程、ならびにその化合物による１つ以上のコントロール細胞の成長および／または生存の阻害のレベルを検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その１つ以上のコントロール細胞は、ＥＭＴを起こしていない上皮細胞、例えば、本発明のＥＭＴ誘導組成物と接触していないかまたは別途ＥＭＴを起こすように誘導されていない細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）１つ以上の被験細胞および１つ以上のコントロール細胞を化合物と接触させる工程（ここで、その１つ以上の被験細胞は、本発明に従って誘導された上皮から間葉系への転換を起こしており、１つ以上のコントロール細胞は、ＥＭＴを起こしていない）、（ｂ）その化合物による１つ以上の被験細胞およびコントロール細胞の成長および／または生存の阻害のレベルを検出する工程；ならびに（ｃ）その化合物が、被験細胞の成長および／または生存に対してコントロール細胞よりも大きな抑制効果を有する場合、その化合物をＣＳＣ選択的化学療法剤候補と同定する工程を包含する。
【００８６】
多種多様の被験化合物が、本発明の方法において使用され得る。例えば、被験化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物またはハイブリッド分子であり得る。化合物は、自然源から得ることができるか、または合成的に作製することができる。化合物は、少なくとも部分的に純粋であり得るか、または抽出物中もしくは他のタイプの混合物中に存在し得る。抽出物またはその画分は、例えば、植物、動物、微生物、海洋生物、発酵ブロス（例えば、土壌、細菌または真菌の発酵ブロス）などから生成され得る。いくつかの実施形態において、化合物コレクション（「ライブラリー」）が試験される。そのライブラリーは、例えば、１００〜５００，０００種の化合物またはそれ以上を含み得る。化合物は、マルチウェル（ｍｕｌｔｗｅｌｌ）プレートに整列されていることが多い。それらは、溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解され得るか、または乾燥した形態で（例えば、粉末または固体として）提供され得る。合成、半合成および／または天然に存在する化合物の一群が試験され得る。化合物ライブラリーは、構造的に関係するか、構造的に異なるかまたは構造的に無関係の化合物を含み得る。化合物は、人工的な（人間によって発明され、天然では見られない構造を有する）ものであってもよいし、天然に存在するものであってもよい。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、他の創薬プログラムにおいて「ヒット」もしくは「リード」と同定された少なくともいくつかの化合物および／またはそれらの誘導体を含む。化合物ライブラリーは、天然物、および／または非特異的（ｎｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくは特異的な（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）有機合成化学を用いて生成された化合物を含み得る。化合物ライブラリーは、小分子ライブラリーであることが多い。興味深い他のライブラリーとしては、ペプチドまたはペプトイドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーおよびオリゴヌクレオチドライブラリーが挙げられる。ライブラリーは、絞り込まれている場合がある（例えば、主に、同じコア構造を有するか、同じ前駆体に由来するか、または少なくとも１つの共通の生化学的活性を有する化合物から構成されている場合がある）。
【００８７】
化合物ライブラリーは、いくつかの商業的供給業者（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｏｓｙｎ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ）および行政機関から入手可能である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍの構成機関であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＭＬＳＭＲ）は、例えばハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイにおいて使用するための、既知および未知の生物学的活性を有する＞３００，０００種の化学的に異なる化合物のコレクションを同定するため、取得するため、維持するため、および配布するために計画された（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｌｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｌｉ／を参照のこと）。ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＣ）は、ヒト臨床試験において有用な履歴を有するおよそ４５０種の小分子のプレーティングされたアレイである。これらの化合物は、公知の安全性プロファイルで、非常に薬物に似ている。そのＮＣＣコレクションは、６枚の９６ウェルプレートに整列されている。５０μｌの各化合物が、１００％ＤＭＳＯ中のおよそ１０ｍＭ溶液として、供給されている。いくつかの実施形態において、「承認されたヒト用薬物」を含む化合物の一群が試験される。「承認されたヒト用薬物」は、政府の規制当局（例えば、ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ、またはそれらの販売が可能になる前に少なくともその治療薬の安全性の評価に関与する同様の機関）によってヒトを処置する際の使用が承認された化合物である。被験化合物は、例えば、抗新生物薬、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗原虫薬、抗寄生虫薬、抗うつ薬、抗精神病薬、麻酔薬、抗狭心症薬、抗高血圧薬、抗不整脈薬、抗炎症薬、鎮痛薬、抗血栓薬、制吐薬、免疫調節剤、抗糖尿病薬、脂質もしくはコレステロール低下薬（例えば、スタチン）、抗痙攣薬、抗凝固薬、抗不安薬、催眠薬（睡眠導入薬）、ホルモン薬または抗ホルモン薬などであり得る。いくつかの実施形態において、化合物は、少なくともいくらかの前臨床もしくは臨床開発を経ているか、または「薬物様」の特性を有すると判断されているかもしくは予測されている、化合物である。例えば、被験化合物は、第Ｉ相治験または非ヒト動物における少なくとも前臨床試験を完了しており、安全性および耐容性の証拠が示されている場合がある。いくつかの実施形態において、被験化合物は、その化合物が投与され得る生物の細胞またはその化合物が試験され得る細胞にとって、使用される濃度において、またはいくつかの実施形態では、使用される濃度よりも最大１０倍、１００倍もしくは１，０００倍高い濃度において、実質的に無毒性である。例えば、細胞の生存率および／もしくは増殖に対して統計学的に有意な影響がない可能性があるか、または生存率もしくは増殖の減少は、様々な実施形態において、わずか１％、５％もしくは１０％であり得る。細胞傷害性および／または細胞増殖に対する影響は、種々の任意のアッセ��を用いて評価され得る。例えば、細胞代謝アッセイ（例えば、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ、ＭＴＴ、ＭＴＳ、ＸＴＴおよびＣｅｌｌＴｉｔｒｅ  Ｇｌｏアッセイ）、細胞膜完全性アッセイ、ＡＴＰベースの細胞生存能力アッセイ、ミトコンドリアレダクターゼ活性アッセイ、ＢｒｄＵ、ＥｄＵまたはＨ３−チミジン取り込みアッセイが、使用され得る。他の実施形態において、少なくともいくらかの細胞傷害性が、許容可能であり得るか、またはいくつかの実施形態では、望ましいだろう。例えば、非癌性細胞と比べて癌幹細胞に対して差次的な細胞傷害性を示す化合物が、著しく興味深いだろう。いくつかの実施形態において、被験化合物は、当該分野において公知であるかもしくは使用されている細胞培養培地中、例えば、脊椎動物、例えば、哺乳動物の細胞の培養に適した培養培地中に見られる化合物ではないか、またはその被験化合物が、当該分野において公知であるかもしくは使用されている細胞培養培地中に見られる化合物である場合、その被験化合物は、本発明の方法において使用される際、異なる濃度、例えば、より高い濃度で使用される。
【００８８】
本発明の化合物のスクリーニングおよび／または特徴づけの任意の方法のいくつかの態様において、被験化合物は、所定の用量で被験細胞（および必要に応じてコントロール細胞）と接触される。１つの実施形態において、その用量は、最大約１ｎＭであり得る。別の実施形態において、その用量は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭであり得る。別の実施形態において、その用量は、約１００ｎＭ〜約１０μＭであり得る。別の実施形態において、その用量は、１０μＭ以上、例えば、１０μＭ〜１００μＭであり得る。適切な時間、必要に応じて所定の時間にわたってインキュベートした後、その被験細胞における目的のパラメーター（ｐａｒａｍｔｅｒ）に対する化合物または組成物の作用が、当業者に公知の、例えば、本明細書中に記載されるような、適切な方法によって測定される。細胞は、様々な時間にわたって化合物と接触され得る。ある特定の実施形態において、細胞は、１２時間〜２０日間、例えば、１〜１０日間、２〜５日間またはその間の任意の範囲もしくは特定の値にわたって接触される。細胞は、一過性にまたは持続的に接触され得る。所望であれば、その化合物は、細胞に対する作用を評価する前に除去され得る。
【００８９】
２．前駆細胞の調製および使用
いくつかの態様において、本発明は、前駆細胞を調製する方法を提供し、その方法は、上に記載されたようなＥＭＴを起こすように上皮細胞を誘導する工程を包含する。１つの態様において、前駆細胞は、上皮細胞の少なくともいくつかがＥＭＴを起こすように十分な時間にわたってそれらの細胞を本発明のＥＭＴ誘導組成物と接触させることにより前駆細胞を産生することによって、産生される。その方法はさらに、ＥＭＴを起こし、かつ前駆細胞の特性を示す細胞を、ＥＭＴを起こしていない細胞から、例えばマーカーの発現に基づいて、分離する工程を包含し得る。
【００９０】
本明細書中に記載されるように調製される前駆細胞は、本発明の一態様であり、種々の使用法を有する。そのような使用法としては、正常な上皮細胞に由来する前駆細胞またはそのような前駆細胞に由来する分化細胞が被験体に移植されるかまたは埋め込まれる（例えば、さらに下記に記載されるように）細胞ベースの治療、治療的な分子または生物学的に活性な分子の生物学的活性を前駆細胞において評価するためもしくはスクリーニングするための方法、前駆細胞の成長、維持および／もしくは分化において使用するための新しいおよび／または改善された手順および化合物を同定するための方法、ならびに／または前駆細胞に由来する産物（例えば、内因性タンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、融合ポリペプチドなど）の製造を含む生成のための方法が挙げられる。治療的な分子または生物学的に活性な分子の生物学的活性を評価するためまたはスクリーニングするための方法（例えば、新しいリード化合物を同定するスクリーニング、ならびに前駆細胞から特定の細胞系列への分化に有利である物質および条件を同定すること）は、前駆細胞の他の使用法の例である。前駆細胞およびその使用法に関する非限定的な考察については、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２５５８９（ＷＯ／２００７／００５６１１）を参照のこと。
【００９１】
他の実施形態において、ＥＭＴ阻害組成物またはＥＭＴ誘導組成物は、当該分野で公知の任意の方法を用いて得られる幹細胞とともに使用され得る。例えば、ＥＭＴ阻害組成物は、そのような細胞から所望の細胞型または細胞系列への分化を促進するために有用であり得る。別の非限定的な例では、ＥＭＴ誘導組成物は、増殖中にそのような細胞の幹細胞状態を維持するために有用であり得る。
【００９２】
３．処置方法およびそのための組成物
本発明は、被験体を処置する種々の方法を提供する。本発明はさらに、その方法の実施に適した組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。被験体は、代表的にはヒトであるが、他の哺乳動物種も本発明の方法を用いて処置され得る。例えば、被験体は、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ）、有蹄動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギの種）、イヌおよびネコであり得る。いくつかの実施形態において、動物は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギまたはヒツジである。上記のある特定の方法は、ＥＭＴの阻害を必要とする被験体においてＥＭＴを阻害する工程を含む。他の本発明の方法は、前駆細胞またはそれらから分化した細胞を用いた細胞治療を包含し、ここで、その前駆細胞は、本明細書中に記載されるようにＥＭＴを誘導することによって産生される。「処置する（Ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および類似の用語は、被験体の医学的および／または外科的な管理を提供することを指す。処置としては、被験体への化合物または組成物（例えば、薬学的組成物）の投与が挙げられ得るが、これに限定されない。処置は、代表的には、被験体にとって有益な様式で、疾患、障害または望ましくない状態の経過を変化させる試みとして着手される。処置の効果には、通常、そのような用語が適用される疾患、障害もしくは状態またはそのような疾患、障害もしくは状態の１つ以上の症状もしくは徴候を後退させること、緩和すること、それらの重症度を低下させること、それらの発症を遅延させること、治癒すること、それらの進行を阻害すること、および／またはそれらの発生もしくは再発の可能性を低下させることが含まれ得る。本発明の組成物は、疾患もしくは状態を発症している被験体または一般集団のメンバーと比べて発症するリスクの高い被験体に投与され得る。本発明の組成物は、予防的に、すなわち、ある状態の任意の症状または症候を発症する前に、投与され得る。代表的には、この場合、被験体は、その状態を発症するリスクがあり得る。例えば、本発明の組成物は、被験体が感染物質に曝露される前または病原となる事象が生じる前に投与され得る。「予防する」とは、その疾患もしくは状態が生じる可能性を低下させるために、またはその疾患もしくは状態が生じた場合にはその重症度を低下させるために、その疾患または状態をまだ発症していない被験体に、化合物または組成物（例えば、薬学的組成物）を投与することを指し得る。その被験体は、その疾患または状態を発症するリスクがある（例えば、その集団の他の多くのほとんどのメンバーと比べて高いリスクがある）、またはその疾患を発症する可能性を高める危険因子を有すると同定され得る。
【００９３】
本発明の方法に従って産生された前駆細胞が使用され得る細胞ベースの治療は、多種多様の疾患および状態の処置を包含する。例としては、神経性の疾患または神経系に影響する他の状態（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷、外傷性脳損傷および脳卒中）が挙げられる。外傷性損傷（例えば、組織損傷、骨折）、熱傷、心臓疾患（例えば、種々の任意の異なる原因に起因する心筋症）、糖尿病（例えば、インスリンを産生するベータ細胞の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｓ）を伴うＩ型糖尿病）、禿頭症、視力喪失および失明、歯の脱落、変形性関節症、腱および靭帯の損傷、骨軟骨症ならびに筋ジストロフィは、細胞ベースの治療によって利益を享受し得る他の状態である。骨、筋肉（例えば、心筋、骨格筋、平滑筋）、皮膚、軟骨、神経および脳が、前駆細胞ベースの治療が標的とし得る細胞および組織である。当業者は、前駆細胞を所望の細胞系列または目的の細胞型に分化させるのに有用な組成物および方法を承知しているだろう。所望の細胞型は、細胞選別、樹脂またはマトリックスへの結合などのような方法を用いて、他の細胞から分離され得る。そのような分離は、例えば、目的の細胞型に特徴的なマーカーの発現、またはそのような細胞型に特徴的でないマーカーの発現がないことに基づき得る。前駆細胞または分化した子孫は、不全の器官（例えば、心臓）にその機能を増強するために埋め込まれ得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞または分化した子孫は、整形外科術、泌尿器外科術、婦人科外科術、形成外科術、結腸直腸外科術および／または耳鼻咽喉科外科術、ヘルニア修復術などの状況において、組織の再建または封鎖を助けるために使用され得る。さらに、前駆細胞および／またはその分化した子孫は、組織または器官（例えば、皮膚、軟部組織、血管、腎臓、肝臓、膀胱など）のエキソビボおよび／またはインビボにおける構築において使用され得ると構想される。ある特定の実施形態において、細胞は、所望であれば、天然に存在する材料および／または合成材料（例えば、生体適合性、必要に応じて生分解性のポリマー、ポリペプチドなど）を含む、適切な足場またはマトリックスと併用され得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞が被験体に導入される場合、インビボにおいてそのような細胞の分化を促進する物質が投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞治療において使用するための前駆細胞を得るために使用される上皮細胞は、意図されるレシピエントである被験体から得られる。いくつかの実施形態において、その上皮細胞は、異なる個体、代表的には、同じ種のメンバーから得られる。他の実施形態において、所望であれば、細胞は、その組織適合性（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙ）を改善するように改変され得、そして／または適合性のドナーが、選択され得る。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＥＭＴ誘導組成物の構成要素は、インビボでＥＭＴを誘導するために被験体に投与される。いくつかの実施形態において、それらの構成要素は、組み合わせて投与される。句「組み合わせて」は、併用処置に関して本明細書中で使用されるとき、第１および第２の化合物の投与について、（ｉ）直前に投与された第１の薬剤の用量の９０％超が不活性型に代謝されるかもしくは身体から排出される前に、ある用量の第２の化合物が投与されるように；または（ｉｉ）第１および第２の化合物の用量が、互いの４８時間以内に投与されるように、または（ｉｉｉ）それらの薬剤が、重複した時間の間に投与されるように（例えば、連続的または断続的な注入によって）；または（ｉｖ）前述のものの任意の組み合わせであるように行われる投与を意味する。すべての化合物が上述の基準を満たす場合、またはいくつかの実施形態では、各化合物が、その組み合わせの他の少なくとも１つの化合物に対して「第２の化合物」と考えられ得る場合、複数の化合物が組み合わせて投与されると考えられる。それらの化合物は、単一の組成物の構成要素として一緒に投与されてもよいが、そのように投与される必要はない。いくつかの実施形態において、それらは、実質的に同時に（これは、互いの１０分未満を意味する）個別に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、それらは、互いに対して短時間以内に（これは、３時間未満、時折、１時間未満だけ離れていることを意味する）個別に投与されてもよい。それらの化合物は、同じ投与経路で投与されてもよいが、そのように投与される必要はない。任意の順序での複数の化合物の投与が包含される。第２の化合物と組み合わせて投与されるとき、特定の生物学的応答を誘発するために必要とされる第１の化合物の有効量は、第２の化合物の非存在下において投与されるときの第１の化合物（またはその逆）の有効量よりも少なくてもよいし多くてもよく、それによって、一方の化合物が他方の非存在下において投与される場合に必要とされる量と比べていずれかまたは両方の薬剤の用量の調整が可能になる。例えば、本発明の化合物が組み合わせて投与されるとき、それらの化合物のいずれかの治療量以下の投与量、またはその両方の治療量以下の投与量が、処置を必要とする被験体の処置において使用され得る。いくつかの実施形態において、２つの化合物が組み合わせて使用されるとき、いくつかの実施形態では、望ましい治療結果をもたらすために、第２の化合物が、治療量以下の量で投与され得る。「治療量以下の量」は、本明細書中で使用されるとき、他方の化合物の非存在下において投与された場合に被験体において治療結果をもたらすと予想され得る量より少ない量、例えば、推奨量より少ない量のことを指す。複数の化合物の効果は、相加的または相乗的であり得るが、そうである必要はない。それらの化合物の１つ以上が、複数回投与され得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、後に投与されるＴＧＦベータアゴニストに許容的な環境をもたらすために、ＢＭＰインヒビターが投与される。いくつかの実施形態において、それらの化合物は、互いの２、４、８、１２、２４または４８時間以内に少なくとも１回投与される。
【００９６】
インビボでＥＭＴを誘導することは、細胞ベースの治療が有用である様々な疾患および状態において有益であり得る。例えば、インビボでＥＭＴを誘導することによって、損傷したまたは欠陥のある器官または組織を修復するための多数の幹細胞が提供され得る。そのために、ＥＭＴを誘導する化合物が、組織または器官の損傷しているまたは欠陥のある部位にまたはその部位付近に、局所的に投与され得る。
【００９７】
別の態様において、本発明は、ＥＭＴの阻害を必要とする被験体においてＥＭＴを阻害する方法を提供し、その方法は、その被験体に、本発明のＥＭＴ阻害組成物の構成要素を組み合わせて投与する工程を包含する。その被験体は、ＥＭＴがインビボで生じるおよびその状態の１つ以上の病理的特徴に関与する状態のリスクがあるか、またはその状態に苦しんでいる可能性がある。本発明のいくつかの実施形態において、ＥＭＴ阻害組成物は、ＷｎｔアンタゴニストおよびＢＭＰアゴニストを含む。例えば、そのような組成物の１つは、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦｂインヒビターと組み合わせた、被験体へのＢＭＰ経路アクチベーターの投与は、所与の用量のＴＧＦｂインヒビターの治療効果を高める。本発明のいくつかの実施形態において、ＴＧＦｂインヒビターと組み合わせた、被験体へのＢＭＰ経路アクチベーターの投与は、より少量のＴＧＦｂインヒビターが少なくとも等価な治療効果で使用されることを可能にする。
【００９８】
いくつかの実施形態において、被験体は、癌の処置を必要とする。当該分野で公知であるように、癌は、コントロールされないまたは異常にコントロールされた細胞増殖および他の悪性細胞の特性を特徴とする疾患である。ＥＭＴプロセスによって、細胞が遊走特性を獲得することが可能となり、それにより、癌細胞の播種および転移が促される。さらに、ＥＭＴを起こした癌細胞は、癌幹細胞に特徴的な特性である、高い自己複製能および腫瘍開始能を示す。本発明のいくつかの実施形態において、ＥＭＴを誘導するおよび／または維持するオートクリンシグナル伝達ループを本発明に従って干渉することによって、腫瘍の転移および／または腫瘍の再燃もしくは再発が減少する。ＥＭＴを誘導するおよび／または維持するオートクリンシグナル伝達ループを本発明に従って干渉することによって、治療（例えば、化学療法剤）に対する抵抗性を低下させること、および癌細胞を免疫介在性の内因性の防御機構に対してより感受性にすることが助けられ得る。いくつかの実施形態において、それらの癌はまた、化学療法、放射線照射および／または外科術を用いて処置される。ＥＭＴ阻害組成物が、局所的に、例えば、腫瘍部位に、例えば、外科術または放射線照射の前、最中および／または後に投与され得ることが企図される。例えば、非限定的な実施形態において、ＥＭＴ阻害組成物は、外科術の前の４週間以内に少なくとも１回、および／または外科術後の４週間以内に少なくとも１回投与され得る。別の非限定的な実施形態では、ＥＭＴ阻害組成物は、放射線照射処置を開始する前の４週間以内に少なくとも１回、および／または放射線照射処置の過程が完了した後の４週間以内に少なくとも１回、ならびに必要に応じて、放射線照射処置間に１回以上、投与され得る。
【００９９】
１つの態様において、本発明は、癌の処置を必要とする被験体を処置する方法を提供し、その方法は、本発明のＥＭＴ阻害組成物の構成要素をその被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＥＭＴ阻害組成物の構成要素は、局所的に、腫瘍の近傍に、または腫瘍が外科的に除去された部位もしくは腫瘍が放射線照射される部位に、投与される。本明細書中で使用されるとき、癌という用語は、以下のタイプの癌に限定されないがこれらを包含する：乳癌；胆管癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液学的新生物；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮癌腫を含む口腔癌；上皮細胞、ストローマ細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じる癌を含む卵巣癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、メルケル細胞癌腫、カポジ肉腫、基底細胞癌腫および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｓ）（例えば、セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍および胚細胞性腫瘍）を含む精巣癌；甲状腺腺癌および髄様癌腫を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌。いくつかの実施形態において、癌は、結腸癌腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、子宮頸癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞癌腫、胆管癌腫、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍または精巣腫瘍である。１つの実施形態において、癌は、肺癌腫である。１つの実施形態において、癌は、乳癌腫である。いくつかの実施形態において、癌は、上皮起源であると考えられる。いくつかの実施形態において、癌は、不明な細胞起源であるが、上皮細胞に関連する分子または組織学的な特徴（例えば、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチンまたは細胞間橋の産生）を有する。
【０１００】
例えば、癌を処置するための本明細書中に開示される方法において有用であり得る形質転換学療法薬の非限定的な例としては、アルキル化剤およびアルキル化様剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、フォテムスチン（Ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金剤（すなわち、アルキル化様剤）（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ＢＢＲ３４６４およびサトラプラチン（Ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ））、ブスルファン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロマイド、チオテパ、トレオスルファン（Ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）およびウラムスチン）；代謝拮抗物質（例えば、葉酸（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）およびラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）））；プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン（Ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチンおよびチオグアニン）；ピリミジン（例えば、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジンおよびゲムシタビン）；紡錘体毒／有糸分裂インヒビター（例えば、タキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）およびビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン））；細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質（例えば、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロンおよびバルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の様々な種によって天然に産生される化合物（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）およびヒドロキシ尿素）；トポイソメラーゼインヒビター（例えば、カンプトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）（例えば、カンプトテシン、トポテカンおよびイリノテカン）およびポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｓ）（例えば、エトポシド、テニポシド））；癌免疫療法用のモノクローナル抗体（例えば、抗レセプターチロシンキナーゼ（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ）、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブおよびトシツモマブ）およびその他のもの、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブおよびゲムツズマブ）；光増感剤（例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン）；チロシンキナーゼインヒビター（例えば、セジラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）およびバンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ））；セリン／トレオニンキナーゼインヒビター（例えば、Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、インスリンレセプターファミリーメンバー、ＥＧＦレセプターファミリーメンバー、ｍＴＯＲ、Ｒａｆキナーゼファミリー、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ（例えば、ＰＩ３キナーゼ）、ＰＩキナーゼ様キナーゼファミリーメンバー、サイクリン依存性キナーゼファミリーメンバー、オーロラキナーゼファミリーのインヒビター）、成長因子レセプターアンタゴニストおよびその他のもの（例えば、レチノイド（例えば、アリトレチノインおよびトレチノイン）、アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ（例えば、ペガスパルガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ））、ベキサロテン、ボルテゾミブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、イクサベピロン（Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、マソプロコール（Ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）、ミトタンおよびテストラクトン、Ｈｓｐ９０インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、血管新生インヒビター、例えば、抗血管内皮成長因子剤（例えば、ベバシズマブ）、マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター、アポトーシス促進物質（例えば、アポトーシス誘導物質）、抗炎症剤）などが挙げられる。
【０１０１】
他の実施形態において、インビボでＥＭＴを阻害する方法は、線維症（この用語は、例えば、修復プロセスまたは復古プロセスとしての、器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成または発生のことを指す）を特徴とする疾患および状態の処置において使用される。例えば、筋線維芽細胞が、ＥＭＴを通じて生じて、罹患組織に蓄積し得、その組織でそれらは、コラーゲンなどのＥＣＭ構成要素を分泌する。線維症は、例えば、特定の物質（例えば、種々の医薬を含む化学剤、感染物質）への曝露によって、炎症の結果として引き起こされ得るか、または特発性であり得る。例えば、肺線維症は、処置の結果として、またはとりわけ、様々な化学療法薬（例えば、メトトレキサート、シクロホスファミド）；心臓の不整脈および他の心臓血管の問題を処置するために使用される医薬（例えば、アミオダロン、プロプラノロール）；ならびにいくつかの抗生物質（例えば、ニトロフラントイン、スルファサラジン）への曝露の結果として生じ得る。線維症は、外傷後または外科術後に生じ得る。線維症は、種々の器官および組織（例えば、腎臓、肺、肝臓、心臓（ｈｅａｒ）、皮膚、腸、骨髄、眼（例えば、水晶体、網膜）、後腹膜、縦隔、腸間膜、脈管系、リンパ系、筋骨格系（例えば、筋肉、関節）など）に影響し得る。線維症は、全身性でもあり得、複数の組織および器官に影響し得る。線維症は、潜在的には、正常な組織を少なくとも部分的に置き換え、その機能を損ない、そして／または損傷した組織の適切な修復（例えば、外科術、外傷、熱傷の後の）を干渉して、そのような器官および組織の機能に悪影響を及ぼし得る。例えば、心筋線維症、腎線維症および肺線維症は、消耗性であり得、致死的であり得る。本発明の実施形態によると、ＥＭＴ阻害組成物は、ＥＭＴを誘導するプロセスおよび／または線維症に関与する状態で細胞を維持するプロセスを阻害するために使用され得る。そのような組成物は、線維性組織の蓄積を阻害するためおよび／または後退させるために使用され得る。
【０１０２】
本発明の処置方法は、目的の疾患または状態、例えば、ＥＭＴを阻害するかまたは誘導することが望ましい状態に苦しんでいるかまたはそのリスクがある被験体を同定するかまたは提供する工程を包含し得る。「〜のリスクがある」は、そのような被験体が、その被験体の１つ以上の状況、状態もしくは特質の非存在下において有し得るリスクと比べて、および／またはその集団の平均的な健常のメンバーが有し得るリスクと比べて、および／またはその被験体が以前に有していたリスクと比べて、高いリスクがあることを含意する。いくつかの実施形態において、被験体は、疾患または状態を発症する少なくとも２０％高いリスク（１．２倍高いリスク）がある。被験体を「リスクがある」とし得る状態の例は、特定の疾患または状態に応じて様々であり得、それらとしては、その疾患または状態の家族歴；その疾患または状態を発症するリスクを高めると当該分野において公知であるかまたは考えられている特定の物理的または化学的な物質への曝露または曝露の可能性（例えば、職業、習慣などに起因して）；変異または遺伝的多型を有しない一般的集団の他のメンバーと比べてその疾患を発症するかまたは有する高いリスクに関連する、そのような変異、遺伝的多型、遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイルおよび／または血液中の特定の物質の存在；免疫抑制；他の疾患もしくは状態の存在、年齢、外科術または他の外傷；症状の存在；あるいは被験体の医療提供者の判断および技術の範囲内の、その被験体を高いリスクにする他の任意の状態が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、被験体は、例えば、１つ以上の危険因子、および代表的には、ある疾患または状態の１つ以上の症状または徴候を有する結果として、その疾患または状態を有すると疑われる。本発明に係る処置を必要とする被験体を同定するために、任意の好適な方法が使用され得る。例えば、そのような方法としては、症状、病歴（入手可能な場合）、理学的検査、臨床検査、画像研究、免疫診断アッセイ、核酸ベースの診断法などに少なくとも部分的に基づく臨床診断が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、診断は、血清学（例えば、その疾患に関連するマーカーと特異的に反応する抗体の検出）に少なくとも部分的に基づき得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、被験体は、癌または癌の再発のリスクがある。癌のリスクがある被験体は、例えば、癌と診断されていないが、例えば同じ性別の、同年齢のコントロールと比べて癌を発症する高いリスクを有する被験体であり得る。例えば、その被験体は、対応するコントロールのリスクの少なくとも１．２倍のリスクを有し得る。例えば、（ｉ）被験体が、変異または遺伝的多型を有しない一般的集団の他のメンバーと比べて癌を発症するかまたは有する高いリスクに関連するそのような変異、遺伝的多型、遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイル、および／または血液中の特定の物質の存在を有する場合；（ｉｉ）被験体が、癌の家族歴を有すること、突然変異原、発癌性物質または腫瘍を促進する物質もしくは状態（例えば、アスベスト、タバコの煙、アフラトキシン、放射線照射、慢性感染症／炎症など）に曝露されていること、高齢などの１つ以上の危険因子を有する場合、その被験体は、癌を発症する「リスクがある」と考えられ得る。いくつかの実施形態において、被験体は、癌の１つ以上の症状を有するが、その疾患と診断されておらず、例えば、被験体は、癌を有すると疑われ得る。
【０１０４】
本明細書中に開示されるおよび／または本明細書中に記載される方法を用いて同定される化合物および組成物は、任意の好適な手段によって（例えば、経口的に、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、非経口的に、腹腔内に、鞘内に、気管内に、眼に、舌下に、膣に、直腸に、経皮的に、または吸入によって、例えば、エアロゾルとして）投与され得る。処置される疾患状態のタイプに応じて、本発明の化合物は、例えば、吸入され得るか、経口摂取され得るか、局所的に投与され得るか、または全身経路によって投与され得る。したがって、種々の投与様式または投与経路が利用可能である。当然のことながら、選択される特定の様式は、選択される特定の化合物、処置される特定の状態および治療効果に必要な投与量に左右され得る。複数の化合物が投与される場合、それらは、様々な実施形態において、同じまたは異なる経路を用いて投与され得る。本発明の方法は、概して、医学的または獣医学的に許容され得る任意の投与様式（これは、臨床的に許容できない（例えば、医学的または獣医学的に許容できない）有害作用を引き起こすことなく、許容され得る効力レベルをもたらす任意の様式を意味する）を用いて実施され得る。いくつかの実施形態において、投与経路は、非経口であり、それには、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｕｓ）および胸骨内への注射または注入の手法が含まれる。いくつかの実施形態において、投与経路は、経口である。いくつかの実施形態において、化合物または組成物は、罹患しているまたは損傷している腫瘍の部位にまたは部位付近に送達され得る。いくつかの実施形態において、吸入される医薬が有用である。そのような投与は、例えば、肺癌または肺線維症の処置を必要とする被験体における、肺への直接的な送達を可能にするが、そのような投与は、ある特定の化合物の全身性送達を達成するためにも使用され得る。通常、いくつかのタイプの定量吸入器が、吸入による投与のために使用される。これらのデバイスのタイプとしては、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動式ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、スペーサー／保持チャンバーを備えたＭＤＩ、および噴霧器が挙げられる。他の実施形態において、例えば、中枢神経系の腫瘍を有する被験体では、鞘内または頭蓋内投与が有用であり得る。治療薬を投与するための他の適切な経路およびデバイスは、当業者に明らかであろう。
【０１０５】
１つ以上の化合物（例えば、本発明のＥＭＴ阻害組成物またはＥＭＴ誘導組成物の構成要素）の好適な調製物、例えば、実質的に純粋な調製物は、被験体への投与に適した適切な薬学的組成物を生成するために１つ以上の薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤などと組み合され得る。そのような薬学的に許容され得る組成物は、本発明の一態様である。用語「薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤」とは、組成物の活性成分の生物学的活性または有効性を有意に干渉せず、それが使用されるまたは投与される濃度において宿主にとって過度に毒性でない、キャリア（この用語は、キャリア、媒質、希釈剤、溶媒、ビヒクルなどを包含する）または賦形剤のことを指す。他の薬学的に許容され得る成分も同様に、その組成物中に存在し得る。薬学的に活性な化合物の製剤化に適した物質およびその使用は、当該分野で周知である（薬学的に許容され得る物質および様々なタイプの薬学的組成物を調製する方法のさらなる考察のために、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、およびそのより最近の版またはバージョン（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の化合物および組成物は、目的の特定の疾患または状態を処置するために当該分野において使用される任意の化合物または組成物と組み合わせて使用され得る。
【０１０６】
薬学的組成物は、代表的には、意図される投与経路と適合するように製剤化される。例えば、非経口投与用の調製物としては、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝媒質、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーを含む）が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；保存剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための物質である。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。そのような非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または反復投与用バイアルに封入され得る。
【０１０７】
そのような組成物において使用するための薬学的組成物および化合物は、規制当局によって定められた規格、基準またはガイドラインを満たす条件下で製造され得る。例えば、そのような組成物および化合物は、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＭＰ）に従って製造され得、かつ／またはヒトに投与される医薬品にとって適切な品質管理手順に供され得る。被験体に投与される細胞およびそれらを含む組成物は、適用可能な規格、基準またはガイドラインに従って、そのような目的にとって適切であるように、維持され得、取り扱われ得る。
【０１０８】
経口投与の場合、化合物は、活性な化合物を当該分野で周知の薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。そのようなキャリアは、本発明の化合物が、処置される被験体による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして製剤化されるのを可能にする。経口剤形に適した賦形剤は、例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））などの充填剤である。所望であれば、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））を加えてもよい。必要に応じて、経口製剤はまた、体内の酸性条件を中和するために食塩水または緩衝液において製剤化され得るか、またはいかなるキャリアも用いずに投与され得る。糖衣錠のコアは、好適なコーティングを伴って提供される。このために、濃縮された糖溶液（必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタンを含み得る）、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または有機溶媒混合物が使用され得る。識別のため、または活性な化合物の用量の種々の組み合わせを特徴付けるために、それらの錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を加えてもよい。
【０１０９】
経口的に使用され得る医薬品には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作られた軟らかい密封カプセルが含まれる。その押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに必要に応じて安定剤とともに、活性成分を含み得る。軟カプセルでは、活性な化合物は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）に溶解され得るかまたは懸濁され得る。さらに、安定剤が加えられてもよい。経口投与用に製剤化されるミクロスフェアも使用され得る。そのようなミクロスフェアは、当該分野において十分に定義されている。
【０１１０】
経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を改善する物質および／または吸収を高める物質を組み込み得る。
【０１１１】
吸入による投与の場合、本発明の組成物は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素、フルオロカーボンなどのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアロゾルスプレーまたは噴霧器の形態で送達され得る。液体または乾燥エアロゾル（例えば、乾燥粉末、大きな多孔性粒子など）が使用され得る。本発明は、点鼻薬または他の経鼻投与の形態を用いた組成物の送達も企図する。
【０１１２】
局所適用の場合、薬学的組成物は、そのような組成物（ｃｏｍｐｏｒｉｓｉｔｉｏｎ）の使用に適した１つ以上の薬学的に許容され得るキャリアに懸濁されたまたは溶解された活性な構成要素を含む好適な軟膏、ローション、ゲルまたはクリームとして製剤化され得る。
【０１１３】
眼への局所的送達の場合、薬学的に許容され得る組成物は、例えば、点眼液または軟膏として使用するために、等張性のｐＨ調整された滅菌食塩水における、溶液または微粒子化された懸濁液として製剤化され得る。
【０１１４】
薬学的組成物は、経粘膜的または経皮的送達のために製剤化され得る。経粘膜的または経皮的投与の場合、浸透すべきバリアにとって適切な浸透剤がその製剤において使用され得る。そのような浸透剤は、通常、当該分野で公知である。本発明の薬学的組成物は、直腸送達のために、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤を含む）または停留浣腸として製剤化され得る。
【０１１５】
組織、例えば、疾患の部位（例えば、腫瘍部位または腫瘍部位付近）への直接的な投与は、例えば、注射によって、またはその組織内に徐放インプラントを埋め込むことによって、達成され得る。いくつかの実施形態において、上記化合物の少なくとも１つが、埋め込まれた徐放デバイスからの放出、浸透圧ポンプまたは他の薬物送達デバイスによる放出によって、投与される。徐放インプラントは、任意の好適な部位に埋め込まれ得る。いくつかの実施形態において、徐放インプラントは、再発癌を発症するリスクまたは慢性状態（例えば、代表的には、少なくとも６ヶ月およびしばしば数年または無期限に続く状態）を有するリスクのある被験体の予防的処置のために使用される。いくつかの実施形態において、徐放インプラントまたは薬物送達デバイスは、治療レベルの活性な薬剤を少なくとも３０日間、例えば、少なくとも６０日間、例えば、最大３ヶ月間、６ヶ月間またはそれ以上、送達する。化合物は、粒子、例えば、微小粒子、マイクロカプセルまたはナノ粒子に被包され得るか、または組み込まれ得る。生分解性で生体適合性のポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエーテルおよびポリ乳酸）が使用され得る。そのような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであろう。限定ではないが、例えば、いくつかの粒子ベースの送達系が、ｓｉＲＮＡの送達のために当該分野で公知である。本発明は、そのような組成物の使用を企図する。リポソームまたは他の脂質ベースの粒子もまた、薬学的に許容され得るキャリアとして使用され得る。
【０１１６】
薬学的に許容され得る塩、エステル、そのようなエステルの塩、プロドラッグ、活性な代謝産物、または投与を必要とする被験体に投与されると化合物を直接または間接的に提供することができる任意の誘導体が、ある特定の実施形態において使用され得ることが認識されるだろう。用語「薬学的に許容され得る塩」とは、まっとうな医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などなしに、ヒトおよび／またはそれより下等動物の組織と接触して使用するのに適しており、かつ合理的なベネフィット／リスク比に見合った、塩のことを指す。多種多様の薬学的に許容され得る適切な塩が、当該分野で周知である。薬学的に許容され得る塩としては、好適な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基から得られる塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
血漿半減期を延長するため、クリアランスを減少させるため、または所望であれば、化合物、例えば、ポリペプチドの特性を別途改変するために、種々のアプローチを使用することができる。これらのアプローチのいくつかを論じている概説については、例えば、Ｗｅｒｌｅ  Ｍら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｌａｓｍａ  ｈａｌｆ  ｌｉｆｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇｓ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３０（４）３５１−６７，２００６およびＪｅｖｓｅｖａｒ  Ｓら、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５（１）：１１３−１２８，２０１０を参照のこと。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物は、被験体に投与されるとき、好ましくは、それが投与される疾患または状態を処置するのに十分な時間にわたって、かつそのような十分な量で、投与される。活性な薬剤の治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって評価され得る。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトまたは他の被験体における使用に適したある範囲の投与量を製剤化する際に使用され得る。ヒトに投与するための種々の用量が、当該分野で公知であるように、ヒトにおける臨床試験でさらに試験され得る。使用される用量は、最大耐用量またはそれよりも少ない用量であり得る。薬学的組成物中の活性な薬剤の治療的に有効な用量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。他の例示的な用量としては、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態において、単回用量が投与されるが、他の実施形態では、複数回用量が投与される。当業者は、任意の特定の状況における適切な用量が、使用される薬剤の効力に依存し、必要に応じて特定のレシピエントに対して調整され得ることを認識するだろう。ある被験体専用の用量レベルは、種々の因子（使用される特定の薬剤の活性、特定の疾患または状態およびその重症度、その被験体の年齢、体重、全般的な健康状態などを含む）に依存し得る。同様に、細胞ベースの治療において投与される細胞の数も、そのような考慮すべき事柄、投与される細胞のタイプなどに基づいて当業者によって決定され得、それはしばしば、数十から数十万、数百万であり得る。
【０１１９】
薬学的組成物、特に、経口または非経口組成物用のものを、投与を容易にするためおよび投与量を均一にするために単位剤形で製剤化することが望ましい場合がある。単位剤形は、この用語が本明細書中で使用されるとき、処置される被験体に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位のことを指し；各単位は、適切な薬学的に許容され得るキャリアと併せて、所望の治療効果をもたらすと算出された所定量の活性な薬剤を含む。治療レジメンが、数日間、数週間、数ヶ月または数年に及び得る期間にわたる複数の単位剤形の投与を含み得ることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、例えば、予防を達成するためまたは慢性疾患の場合に、処置は、無期限に継続され得る。被験体は、１日に１回以上の投薬を受けてもよいし、処置期間中、１日おきにまたはそれよりも低い頻度で投薬を受けてもよい。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：不死化ヒト乳腺上皮細胞細胞から単離された間葉系亜集団の特徴づけ
本発明者らは、本発明者らが不死化ヒトＭＥＣ（本明細書中以後、ＨＭＬＥ細胞と称される，実験手順）から単離した細胞の少数亜集団の特性を調べた。Ｔｗｉｓｔ  ＴＦの異所性発現によるＥＭＴを通じて駆動されたＨＭＬＥ細胞（ＨＴｗｉｓｔ細胞；Ｙａｎｇら、２００４）と同様に、これらの細胞は、間葉系の形態を示し、「間葉系亜集団」にちなんでＭＳＰと名付けられた（図１Ａ）。これらのＭＳＰ細胞は、最初に、ＨＭＬＥ細胞の単層培養物の培養培地上清に浮遊している細胞の集団として単離された。本発明者らは、解析のために、親のＨＭＬＥ培養物からごく少数の間葉系細胞（それはＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性の細胞表面プロファイルを示すと示されている（Ｍａｎｉら、２００８））を取り出すことを望んだ。ＭＡＣＳ（磁石活性化細胞分離法（Ｍａｇｎｅｔ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ））を用いて、上皮状態のＭＥＣと密接に関連するマーカーであるＣＤ２４を発現しているＨＭＬＥ細胞をポジティブ選択することにより、精製された上皮ＨＭＬＥ２４＋集団を得た。
【０１２１】
様々な解析を通じて、本発明者らは、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比較して、ＭＳＰ細胞では上皮マーカーがダウンレギュレートされ；その代わりに、それらは、間葉系マーカーおよびＨＴｗｉｓｔ細胞と類似のＥＭＴプログラムの構成要素を発現することに注目した（図１Ｂ〜Ｄ）。こうして、本発明者らは、Ｔｗｉｓｔの内因性ｍＲＮＡレベルが、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比べてＭＳＰでは１０倍アップレギュレートされることを見出した。さらに、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞は、Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ２、ＦｏｘＣ２およびＳｎａｉｌというＥＭＴを誘導するＴＦを高レベルで発現した（図１Ｂ〜Ｄ）。注目すべきことに、ＥＭＴ−ＴＦであるＳｌｕｇのタンパク質発現の増加は、ＭＳＰ細胞だけで見出された（図１Ｂ）。
【０１２２】
懸濁培養においてクローン密度（ｃｌｏｎａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）でプレーティングされたときＭＥＣが増殖してマンモスフィアを形成する能力は、マウスおよびヒトの乳腺上皮前駆細胞およびＳＣ集団の存在と関連した（Ｄｏｎｔｕら、２００３；Ｐｅｃｅら、２０１０；Ｙｕら、２００７）。ゆえに、本発明者らは、ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞のマンモスフィア形成能を比較した。ＨＭＬＥ２４＋細胞と比べて、マンモスフィア形成能は、ＨＴｗｉｓｔ細胞では３０倍高く、独立して得られた２つのＭＳＰ細胞株では１０〜２０倍高かった（図１Ｅ）。
【０１２３】
腫瘍開始細胞について濃縮された患者由来のヒト乳癌細胞集団と同様に（Ａｌ−Ｈａｊｊら、２００３）、Ｈ−ＲＡＳ癌遺伝子によって形質転換されたＨＴｗｉｓｔ細胞は、ＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性プロファイルを示すと以前に示された（ＨＴｗｉｓｔ−ＲＡＳと命名された、Ｍａｎｉら、２００８）。同様に、ＲＡＳによって形質転換されたＭＳＰ細胞（ＭＳＰ−ＲＡＳ）の９８％が、ＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性プロファイルを示した（図１Ｆ）。対照的に、これらの細胞の一部が、ＣＤ２４高／ＣＤ４４低−陰性状態にあるバルクである、ＲＡＳによって形質転換されたＨＭＬＥ２４＋細胞集団の２％未満を構成した。
【０１２４】
ＨＴｗｉｓｔ−ＲＡＳ細胞は、ＨＭＬＥ−ＲＡＳ細胞と比べて高効率で腫瘍を産生した（Ｍａｎｉら、２００８）。ゆえに、本発明者らは、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍開始能をＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ集団と比べて試験した。以前に公開された結果（Ｍａｎｉら、２００８）と一致して、皮下での腫瘍形成のためには１×１０５個のＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ細胞の埋め込みが必要だったのに対し、ＨＴｗｉｓｔ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＲＡＳ集団は、腫瘍開始細胞について少なくとも２桁濃縮された（図１Ｇ）。あわせると、これらのデータから、ＭＳＰ細胞は、ＨＴｗｉｓｔ細胞と同様に、正常なＳＣおよび腫瘍開始細胞の形質転換した誘導体のある特定の特性を示すと示唆された。
【０１２５】
Ｔｗｉｓｔの発現は、乳癌発病のマウスモデルにおいて転移に必要であると示されている（Ｙａｎｇら、２００４）。これらの知見によって、本発明者らは、ＲＡＳによって形質転換された独立して単離された２つのＭＳＰ細胞株（ＭＳＰ、ＭＳＰ−ＩＩ）の浸潤能および転移能を調べた。ＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ細胞と比べて、両方のＭＳＰ−ＲＡＳ細胞株が、インビトロにおいて２０倍の浸潤性増加を示した（図１Ｈ）。マウスの乳房脂肪パッドに埋め込まれたＧＦＰで標識されたＭＳＰ−ＲＡＳおよびＭＳＰ−ＩＩ−ＲＡＳ細胞は、転移性の低いＨＭＬＥ２４＋−ＲＡＳ細胞と比べて、肺において転移巣を播種するそれぞれ１０および５倍高い能力を有する腫瘍を生じた（図１Ｉ）。
【０１２６】
まとめると、これらの観察結果は、ＭＳＰ細胞が、間葉系および運動性の形質ならびに正常なＳＣを含む細胞集団に関連する特性を示すことを特徴とする細胞状態にあることを示唆した；それらの形質転換した誘導体であるＭＳＰ−ＲＡＳ細胞は、ＥＭＴを経ることに関連する形質を発現し続け、ある特定のＳＣの形質および腫瘍を開始する形質の獲得を伴った。それゆえ、ＭＳＰは、ＨＴｗｉｓｔ細胞と表現型的に似ている。しかしながら、それらの細胞状態の最初の誘導は、自然に生じるが故に、導入された実験的に予め決定された遺伝因子によって誘発されなかった。
【０１２７】
実施例２：ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるオートクリンシグナル伝達の状態の比較プロファイリング
本発明者らは、ＥＭＴを経たことに関連する間葉系およびＳＣ様の状態の維持が、オートクリンシグナル伝達ループの活性化に依存し得ると推測した。本発明者らが推論したそのようなオートクリンループの性質は、ＭＥＣがＥＭＴを経る前および経た後にそのＭＥＣによって培養培地中に放出される因子を比較することによって明らかにされ得る。この考えを試験するために、本発明者らは、抗体アレイを用いて、ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の分泌型タンパク質プロファイルを特徴付けた（図Ｓ１Ａ）。ＨＴｗｉｓｔ細胞において差次的に制御される分泌型タンパク質を同定するために、本発明者らは、希釈系列にわたって一貫した変化を示す上位１０％のタンパク質をヒートマップにおける可視化のために選択した（図Ｓ１Ｂ）。本発明者らはまた、ＥＬＩＳＡによっていくつかのタンパク質の差次的な分泌を検証した（図Ｓ１Ｃ）。そのアレイ上の抗体の機能的分類に基づくと、この「ＥＭＴ分泌型タンパク質プロファイル」が、主に、血管新生促進因子、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−ベータおよびＦＧＦシグナル伝達経路において作用するタンパク質、ケモカインおよびサイトカイン、ならびに本発明者らが機能群に割り当てることができなかった他のタンパク質を含むと見出された（表３）。
【０１２８】
【表３】
2013536689.tif 000005
本発明者らは、ＥＭＴ分泌型タンパク質プロファイルにおける因子のいくつかがヘテロタイプのパラクリンシグナル伝達チャネルを介して作動する可能性があると結論付けた。例えば、いくつかのアンギオポエチン様成長因子は、ＨＴｗｉｓｔにおいてアップレギュレートされるタンパク質の中に含まれた；そのような因子は、正常組織および腫瘍組織の脈管構造を構成する内皮細胞に影響し得る。しかしながら、本発明者らの最初の研究では、本発明者らは、オートクリン様式で機能する可能性がある因子に注目することを望んだ。このため、下に記載される研究では、分泌型タンパク質プロファイルに含まれる構成要素を含む他のシグナル伝達経路を重要視した。ＥＭＴ分泌型タンパク質プロファイルに含まれる３つのうち２つのＦＧＦリガンドが、ダウンレギュレートされたので、本発明者らは、その残りの２つの機能群であるＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータシグナル伝達をより詳細に調べた。
【０１２９】
分泌型タンパク質の変化と下流の経路の活性化とを結びつけるため、およびアレイ上の抗体の提示によってもたらされる偏りを克服するために、本発明者らは、ＨＭＬＥ、ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ  ＴＦを発現しているＨＭＬＥ細胞（ＨＳｎａｉｌ）、および独立して得られた３つのＭＳＰ細胞株のマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングによる上記の解析を企図して、「ＥＭＴ遺伝子発現プロファイル」を生成した（図Ｓ１Ｄ）。これらの細胞集団のすべてのＥＭＴプログラムに共通して関わる経路を見つけるために、本発明者らは、ＥＭＴ発現プロファイルを遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）に供した。２つの遺伝子セットの両方が、ＨＴｗｉｓｔ、ＨＳｎａｉｌおよびＭＳＰ細胞において有意な濃縮を示した：これらは、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達経路（一般にカルシウムシグナル伝達および遊走表現型を示唆する（Ｊａｕｌｉａｃら、２００２；Ｙｏｅｌｉ−Ｌｅｒｎｅｒら、２００５））ならびにＴＧＦ−ベータシグナル伝達によってアップレギュレートされる遺伝子を包含した（図Ｓ１Ｄ）。まとめると、このＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子発現プロファイルは、Ｗｎｔ、カルシウムシグナル伝達およびＴＧＦ−ベータ経路が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において特異的に調節され得るといういくらかの示唆を提供した。発生と腫瘍の両方の状況でのＥＭＴの誘導におけるＴＧＦ−ベータの十分に認識されている役割（Ｚａｖａｄｉｌら、２００１）は、本発明者らの実験アプローチを確証する１つの手段として役立った。
【０１３０】
実施例３；ＥＭＴに関連するオートクリンシグナル伝達：ＴＧＦ−ベータの活性化およびＢＭＰシグナル伝達の制限
上記の知見を受けて、本発明者らは、はじめに、ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞におけるＴＧＦ−ベータシグナル伝達の活性化状態に着目した。本発明者らは、ＨＭＬＥ２４＋細胞に比べて、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞によってＴＧＦ−ベータ−１タンパク質が多く分泌されることに注目した（ＥＬＩＳＡによって、それぞれ２倍および３〜４倍、図２Ａ）。本発明者らはまた、Ｓｍａｄ−レポータープラスミド（ＳＢＥ４−ｌｕｃ、図２Ｂ）の高い活性（１．５〜２倍）も観察した。最後に、活性なＴＧＦ−ベータシグナル伝達の指標であるＳｍａｄ２のリン酸化は、上皮ＨＭＬＥ２４＋細胞ではほとんど存在しなかったが、ＭＳＰ細胞では容易に検出された（図２Ｃ）。すべての成長因子が枯渇した培養培地中でＭＳＰ細胞を増殖したとき、Ｓｍａｄ２のリン酸化は、強いままだったことから、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達のオートクリン起源に対する裏づけがもたらされた（図２Ｄ）。まとめると、これらの結果から、オートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞では活性であるが、この経路は、親のＨＭＬＥ２４＋細胞では比較的不活性であることが示唆された。
【０１３１】
ＥＭＴ分泌型タンパク質および発現プロファイルが、２つの分泌型ＢＭＰアンタゴニストであるＣｈｏｒｄｉｎ様２およびＧｒｅｍｌｉｎのアップレギュレーションを明らかにしたので、本発明者らの関心は、ＢＭＰシグナル伝達にも向かった。これは、親のＨＭＬＥ２４＋細胞集団と比較した、ＭＳＰおよびＨＴｗｉｓｔ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ解析によって確かめられた（図２Ｅ）。本発明者らは、ＢＭＰリガンドの発現状態を調べた。本発明者らは、劇的かつ予期しない結果を認めた：いくつかのＢＭＰリガンドが、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞においてダウンレギュレートされた（ＢＭＰ２、４、５、６、７、９、１０について＞１０倍、図Ｓ２Ａ）。まとめると、これらの観察結果は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞が、（１）ＢＭＰリガンドを産生しないこと、ならびに（２）分泌型ＢＭＰアンタゴニストＣｈｏｒｄｉｎ様２およびＧｒｅｍｌｉｎのアップレギュレーションを介してＢＭＰシグナル伝達を制限する細胞外のシグナル伝達環境を示すという示唆を提供した。本発明者らは、協力して作用するこれらの変化が、オートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達に許容的な細胞外の環境を作り出すと結論付けた。
【０１３２】
実施例４：ＥＭＴに関連するオートクリンシグナル伝達；古典的および非古典的Ｗｎｔシグナル伝達はＷｎｔアンタゴニストのダウンレギュレーションによって促進された
ＥＭＴ分泌型タンパク質および遺伝子発現プロファイルにＷｎｔおよびカルシウムシグナル伝達経路が存在することを考慮して、本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞においてさらなるオートクリンシグナル伝達経路が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達と共同して働き得るか否かを判定することを望んだ。ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞における分泌型Ｗｎｔアンタゴニストの２クラスのダウンレギュレーションは、本発明者らの関心をＷｎｔシグナル伝達経路に向けた。はじめに、ＥＭＴ発現プロファイルにおいて、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−１（ＳＦＲＰ１）のｍＲＮＡレベルがダウンレギュレートされた。その後のＲＴ−ＰＣＲ解析から、ＨＭＬＥ２４＋と比べてＨＴｗｉｓｔ細胞ではＳＦＲＰ１  ｍＲＮＡが５倍ダウンレギュレーションされること、およびＭＳＰ細胞株ではその発現がほとんどないことが確かめられた（図２Ｆ）。重要なことには、ＳＦＲＰ１は、ＭＳＰ細胞と比べてＨＭＬＥ２４＋細胞において有意なレベルで発現される唯一のＳＦＲＰアイソフォームだった（図Ｓ２Ｂ）。機能的には、ＳＦＲＰ１は、細胞外の空間において古典的Ｗｎｔリガンドと非古典的Ｗｎｔリガンドの両方に結合する分泌型デコイレセプターとして作用する（Ｇａｌｌｉら、２００６）。さらに、ＥＭＴ分泌型タンパク質プロファイルにおいて、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）がダウンレギュレートされており、このことを本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔ細胞とＭＳＰ細胞の両方においてＥＬＩＳＡによって確かめた（それぞれ８および５倍、図２Ｇ）。ＤＫＫ１は、レセプター複合体形成を乱すことによって、主に古典的Ｗｎｔ経路を阻害すると考えられている（Ｂａｆｉｃｏら、２００４）。
【０１３３】
本発明者らはまた、Ｗｎｔリガンドの産生が、ＥＭＴを経ると変化するか否かも調べた。実際に、非古典的Ｗｎｔ５ａリガンドの発現は、ＥＭＴ発現プロファイルにおいてアップレギュレートされており、このことは、免疫ブロット法によって確かめられた（図２Ｈ）。残りの２１個のＷｎｔリガンドのＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において非古典的Ｗｎｔリガンドである１６ｖ１および１６ｖ２のアップレギュレーション（両方１０倍）を明らかにしたのに対し、他のＷｎｔリガンドは、同様のレベルで発現され（Ｗｎｔ２、２ｂおよび６）、その他のすべてがダウンレギュレートされた（５〜１００倍、図Ｓ２Ｄ）。
【０１３４】
ＨＴｗｉｓｔ細胞とＭＳＰ細胞の両方においてＷｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１６ｖ１および１６ｖ２非古典的リガンドのアップレギュレーションが認められたことを考慮して、本発明者らは、関連する下流のシグナル伝達経路の活性を解析した。非古典的ＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターへのＷｎｔ５ａの結合は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソフォームに収束するカルシウムシグナル伝達を活性化すると示されており、メラノーマ細胞の浸潤性に必要である（Ｄｉｓｓａｎａｙａｋｅら、２００７）。実際に、ｐａｎ−ホスホＰＫＣ抗体を用いて、本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において有意なレベルの活性化されたＰＫＣを認めたが、ＨＭＬＥ２４＋細胞では認められなかった（図２Ｆ）。
【０１３５】
さらに、ＪＮＫシグナル伝達は、乳癌浸潤の必須の構成要素としてのＷｎｔ５ａによって活性化されると示されている（Ｐｕｋｒｏｐら、２００６）。本発明者らは、親のＨＭＬＥ２４＋細胞と比べてＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ集団において、ＪＮＫおよびその下流の標的であるｃ−Ｊｕｎのリン酸化の増加を見出した（図２Ｈ）。外因的に加えられたＷｎｔリガンドが培養培地中に存在しなかったので、これらの結果は、オートクリン非古典的Ｗｎｔシグナル伝達が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において活性であり、ＰＫＣおよびＪＮＫタンパク質が関わる少なくとも２つの下流の経路を介して作用することが示唆された。
【０１３６】
ベータ−カテニン依存性の古典的Ｗｎｔシグナル伝達の活性の変化を測定するために、本発明者らは、ＴＯＰＦｌａｓｈレポーターアッセイ（Ｖｅｅｍａｎら、２００３）を利用した。これらの解析は、ＨＴｗｉｓｔ細胞におけるＦＯＰ活性（変異したＴＣＦ−ＬＥＦ結合部位を有するコントロールプラスミド）と比べて５倍高いＴＯＰ（ベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦレポーター）活性、およびその２つのＭＳＰ株における１０〜２０倍高いＴＯＰ／ＦＯＰ活性を明らかにした（図２Ｉ）。対照的に、ベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ転写活性は、ＨＭＬＥ２４＋細胞において検出不可能だった。これらの観察結果は、ベータ−カテニン依存性の古典的Ｗｎｔシグナル伝達が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞では活性であるが、ＨＭＬＥ２４＋細胞では活性でないことを証明した。観察されたＷｎｔアンタゴニストのダウンレギュレーションは、ベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦ転写活性にとって必要であるとみられる：組換えＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１を加えることにより、ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰ細胞においてＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性がそれぞれ１．５〜２倍減少した（図２Ｊ）。実際に、ＤＫＫ１およびＳＦＲＰ１の発現は、ある特定の乳癌細胞株においてオートクリンＷｎｔシグナル伝達の律速の決定因子であると示されている（Ｂａｆｉｃｏら、２００４；Ｓｕｚｕｋｉら、２００４）。本発明者らのここまでの観察結果とまとめると、これらの実験から、古典的および非古典的Ｗｎｔ経路ならびにＴＧＦ−ベータ経路を介したオートクリンシグナル伝達が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において、これらの３つの経路の分泌型アンタゴニストの有意なダウンレギュレーションを少なくとも部分的に介して可能になると示唆された（図Ｓ２Ｄ）。
【０１３７】
実施例５：オートクリンシグナル伝達はＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の遊走およびマンモスフィア形成をコントロールする
ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路を介したオートクリンシグナル伝達は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において活性だったが、これらの経路を介した進行中のオートクリンシグナル伝達が、これらの細胞の機能特性を維持するために必要とされているか否かは不明なままだった。したがって、本発明者らは、ＥＭＴに関連する２つの細胞生物学的形質の継続した発現が、そのようなオートクリンシグナル伝達に依存するか否かを判定した：遊走能およびマンモスフィア形成能。後者の形質は、足場非依存性の生存および成長ならびに自己複製のインビトロにおける基準として役立つ（Ｄｏｎｔｕら、２００３；Ｐｅｃｅら、２０１０；Ｙｕら、２００７）。このために、本発明者らは、培養されたＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞培養物に、ＨＭＬＥ２４＋細胞と比べてこれらの細胞においてダウンレギュレートされると本発明者らが見出した分泌型の抑制因子のいくつかを再度加えた。
【０１３８】
ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞と比べて、ＨＭＬＥ２４＋細胞は、インビトロにおいて１０倍低い遊走能を示した。組換えＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１タンパク質を加えたとき、この周縁の運動性は、さらに減少しなかった（図３Ａ）。対照的に、ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１をＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の培養培地に加えることによって、その遊走が用量依存的様式で阻害された（図３ＡおよびＢ）。最高濃度において、組換えＤＫＫ１は、遊走を１０倍減少させた一方で、ＳＦＲＰ１は、これらの細胞の運動性を２０倍減少させた（図３ＡおよびＢ）。組換えＢＭＰ４は、遊走に対してそれほど強力な効果を有しなかった（ＨＴｗｉｓｔまたはＭＳＰ細胞において最高２倍の減少を誘導した）（図３Ｃ）。重要なことには、ＨＭＬＥ２４＋、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の接着性培養物の増殖は、これらの組換えタンパク質のいずれの存在によっても影響されず、これらの物質の一般的な細胞分裂抑制作用および細胞傷害作用は排除された（図Ｓ３Ａ）。
【０１３９】
本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞においてＤＫＫ１、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４がマンモスフィア形成を阻害するそれぞれの能力も試験した。組換えＤＫＫ１は、これらの培養物を最初に播種したときから開始して５日間にわたって毎日加えたとき、形成されるマンモスフィアの数を、ＨＴｗｉｓｔでは４０％およびＭＳＰ細胞では２０％減少させた（図３Ｄ）。最初に形成されたマンモスフィアからの細胞を分離して、さらなるＤＫＫ１処理なしの二次マンモスフィア培養に再導入したとき、本発明者らは、両方の細胞株が、二次スフィア形成能の２５％の減少を示すことを見出した（図３Ｅ）。二次マンモスフィアが、さらなる処理の非存在下において播種されたので、これらの結果は、自己複製能を有する細胞の亜集団における有意であるが中程度の減少を示唆した。ＳＦＲＰ１は、一次および二次マンモスフィア形成に対してＤＫＫ１よりも強力な効果を有した：加えられたＳＦＲＰ１タンパク質は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の一次マンモスフィア形成をそれぞれ５０％および４０％、二次スフィア形成を９０％および８０％減少させた（図３ＤおよびＥ）。組換えＢＭＰ４は、一次マンモスフィア形成を６０％減少させ、二次スフィア形成を９０％阻害した（図３ＤおよびＥ）。まとめると、これらのデータは、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４ならびにそれほどではないにせよＤＫＫ１が、マンモスフィア培養物において、遊走と自己複製の両方を阻害することを示唆した。
【０１４０】
ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１をＢＭＰ４と組み合わせてＨＴｗｉｓｔ細胞に加えることにより、遊走に対して相加効果を有した（個別に加えたときの３、５および２倍と比べて、それぞれ８および７倍、図Ｓ３Ｂ）。一次マンモスフィア形成において、本発明者らは、ＤＫＫ１またはＳＦＲＰ１がＢＭＰ４とともに加えられたとき、スフィア形成効率の７４％の低下を認めた（図Ｓ３Ｃ）。これは、ＤＫＫ１およびＳＦＲＰ１が個々に加えられたときの４０％の減少、ならびにＢＭＰ４が個々に加えられたときの６４％の減少に匹敵した（図Ｓ３Ｃ）。これらの応答は、それらの３つの物質が少なくとも部分的に、異なる下流の経路を介して働くこと、ならびに遊走能および自己複製能の維持が、オートクリンＷｎｔシグナル伝達経路の活性化と連続的なシグナル伝達との組み合わせ、ならびにＢＭＰシグナル伝達の不活性化に依存するという考えを強化することを示唆した。
【０１４１】
本発明者らは、ＴＧＦ−ベータレセプターＩ型に特異的なインヒビター（Ａ８３−０１およびＳＢ４３１５４２）によるオートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の遊走およびマンモスフィア形成を、ＢＭＰ４タンパク質を加えたときと同様の程度に減弱させたことに注目する（図Ｓ３ＤおよびＳ３Ｅ）。しかしながら、これらの２つの物質の組み合わせは、相加効果を有しなかった（図Ｓ３ＤおよびＥ）ことから、ＢＭＰ４が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を干渉することによってその抑制効果の大部分を発揮すると示唆される。まとめると、これらのデータは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰにおける進行中のオートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達による遊走能および自己複製能の維持が、ＢＭＰシグナル伝達の同時の減少に依存することを示唆した。
【０１４２】
実施例６：オートクリンシグナル伝達はＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性および転移をコントロールする
不死化された非腫瘍原性ＭＳＰ細胞の遊走能および自己複製能をコントロールする際のオートクリンシグナル伝達に対する役割を確立した後、本発明者らは、それらの形質転換した誘導体であるＭＳＰ−ＲＡＳ細胞が、同様の制御ループを用いて腫瘍原性および転移性の挙動を維持するか否かを判定することを望んだ。ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞は、その不死化された対応物と同様に、ＳＦＲＰ１またはＢＭＰ４による遊走およびツモールスフィア形成の阻害に対して感受性のままだった（後者の形質は、クローン密度における形質転換した細胞の足場非依存性増殖を評価する）。ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を組換えＳＦＲＰ１に曝露することによって、運動性がインビトロにおいて９倍減少した一方で、ＢＭＰ４処理によって、遊走が４倍阻害された（図４Ａ）。これらの細胞をＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４で組み合わせて処理することによって、遊走が相乗的に３０倍阻害された（図４Ａ）。重要なことには、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の増殖は、これらの組換えタンパク質の存在によって影響されず、再度、非特異的な細胞分裂抑制作用および細胞傷害作用が排除された（図Ｓ４）。
【０１４３】
ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を、一次ツモールスフィアの形成中に組換えＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４で処理すると、一次スフィア形成と二次スフィア形成の両方が、単独で加えられた各因子によって４０％減少し、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４が組み合わせて加えられると６０％減少した（図４Ｂ）。二次ツモールスフィアの形成の阻害は、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４で処理した際の長期間にわたる自己複製能の喪失を示唆した。まとめると、これらのデータは、オートクリンシグナル伝達が、ツモールスフィアの形成によって判断されるように、ＲＡＳ癌遺伝子による形質転換後のＭＳＰ細胞において遊走能および自己複製能をコントロールし続けることを示唆した。ＭＳＰ−ＲＡＳのこれらの特性は、その不死化された形質転換されていない前駆体と同様に、それらを天然に存在する分泌型シグナル伝達アンタゴニストに曝露することによって乱され得る。
【０１４４】
観察されたツモールスフィア形成の減弱が、腫瘍開始細胞に特徴的な細胞表面マーカー（Ａｌ−Ｈａｊｊら、２００３）の発現の喪失と相関したか否かを試験するために、本発明者らは、フローサイトメトリーを行うことにより、ＭＳＰ−ＲＡＳ一次ツモールスフィアのＣＤ４４／ＣＤ２４細胞表面マーカープロファイルを解析した。本発明者らは、ＭＳＰ−ＲＡＳコントロールツモールスフィアが、少数のＣＤ２４陽性細胞しか含まず（６．４％，図４Ｃ）、大部分が、腫瘍開始能について濃縮された細胞集団に関連するＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性プロファイルを示すことを見出した。対照的に、ＳＦＲＰ１またはＢＭＰ４の存在下において形成されたより少数の一次ツモールスフィアでは、本発明者らは、ＳＦＲＰ１とＢＭＰ４の両方で処理された細胞において、６．４％から４０％および４３％までのＣＤ２４陽性細胞の増加を認めた（図４Ｃ）。しかしながら、これらの細胞のほとんどが、ＣＤ４４を発現し続け、少数しかＣＤ４４低−陰性／ＣＤ２４陽性プロファイルに変化しなかった。それゆえ、処理された際のこれらの細胞表面マーカーの発現の変化は、分化様プロセスの可能性を示唆したが、ツモールスフィアの阻害の程度と緊密に相関しなかった。
【０１４５】
本発明者らはまた、インビトロでのＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４への曝露によって、その後のインビボでのＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の挙動が影響を受けるか否かを判定することも望んだ。このために、本発明者らは、ＳＦＲＰ１、ＢＭＰ４もしくはその両方の組み合わせによる５日間のインビトロ処理中に形成された一次コントロールＭＳＰ−ＲＡＳツモールスフィアまたは残りのツモールスフィアから単一細胞懸濁液を調製した。これらの集団をマウスの乳房脂肪パッドに注射した後、本発明者らは、エキソビボでＳＦＲＰ１、ＢＭＰ４またはその両方の組み合わせに曝露されたＭＳＰ−ＲＡＳ細胞のマンモスフィアを起源とする腫瘍の重量が、平均して３倍減少したことに注目した（図４Ｄ）。しかしながら、本発明者らは、ＢＭＰ４および組み合わせで処理された群については腫瘍発生率の中程度の減少しか認めなかった（３０％、図４Ｄ）。これらのデータから、十分な数の腫瘍開始細胞が、処理されたツモールスフィア内に残存していることにより腫瘍が生じることが示唆されたが、しかしながら、腫瘍の重量が減少したことによって示唆されるように、その腫瘍開始細胞は、インビボにおいて活発に増殖するおよび／または生存する能力が損なわれていた。
【０１４６】
さらに、本発明者らは、コントロール細胞と比較したときの、エキソビボで処理された細胞の同所注射後の肺および肝臓転移の有意な減少に注目した（図４ＥおよびＦ）。負荷された原発腫瘍の差を説明するために、本発明者らは、肺および肝臓の表面上において計数された転移巣の数を、対応する原発腫瘍の重量で正規化した。この尺度を用いたとき、本発明者らは、ＳＦＲＰ１処理群における肺転移の２倍の減少、ＢＭＰ４における７．５倍の減少および組み合わせ処理群における４．５倍の減少を認めた（図４ＥおよびＦ）。インビトロにおける遊走に対する影響と同調して、ＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４との組み合わせ処理は、肝臓における転移巣の数の平均＞１０倍の減少に対して相乗効果を有した（それに対して、ＳＦＲＰ１およびまたはＢＭＰ４のいずれか単独でエキソビボにおいて処置されたマウスでは２．５および５倍の減少）。
【０１４７】
本発明者らは、実際の腫瘍開始において組換えＳＦＲＰ１およびＢＭＰ４が存在することが、本発明者らが以前に行ったエキソビボ前処理と比べて、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞に対してより強い効果を発揮し得ると推測した。このために、本発明者らは、ＳＦＲＰ１、ＢＭＰ４およびその両方の組み合わせとともに、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を限界希釈物としてマウスの皮下に埋め込んだ（図４Ｇ）。さらに、２０μｌのＰＢＳまたは記載の用量で組換えタンパク質を含むＰＢＳを、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞を埋め込んだ１、２、３および７日後に、腫瘍周囲に注射した。それを行ったことにより、ＳＦＲＰ１、ＢＭＰ４または組み合わせ処置に対して腫瘍発生率が少なくとも１桁低下した（図４Ｇ）ことから、腫瘍開始においていずれかのタンパク質が存在することが、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞の腫瘍原性を乱すのに十分であることが示唆される。
【０１４８】
要約すると、ＢＭＰ４およびＳＦＲＰ１によるＭＳＰ−ＲＡＳ細胞のエキソビボ処理は、これらの細胞がインビボにおいて活発に増殖する能力、および続いて同所埋め込み部位から転移を生じる能力を乱した。さらに、ＢＭＰ４およびＳＦＲＰ１のインビボ送達は、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞が腫瘍を開始する能力を減弱させた。ここまでの観察結果とまとめると、これらのデータから、進行中のオートクリンシグナル伝達が、間葉系およびＳＣ様の状態にある不死化された非腫瘍原性細胞の生物学的特性ならびにそれらの形質転換した誘導体の対応する形質の維持において重要な役割を果たすと示唆された。
【０１４９】
実施例７：許容的な細胞外の環境を作ることによって、ＴＧＦ−ベータはＥＭＴを開始することが可能になる
本発明者らは、ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路が関わるシグナル伝達チャネルが遊走能および自己複製能を維持するためだけに働くのか、またはそれらが、上皮細胞が間葉系およびＳＣ様の状態に初めて入るのを誘導するためにも機能し得るのかを判定することを望んだ。はじめに、本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞においてオートクリン様式で機能する同じタンパク質リガンドが、ＥＭＴを誘導するためにＨＭＬＥ２４＋細胞に適用され得るかを検討した。
【０１５０】
ＥＭＴプログラムの活性化に対する初期のおよび特異的な読み出しとして、本発明者らは、Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２  ＥＭＴ−ＴＦの発現をモニターした。なぜなら、それらのｍＲＮＡ発現は、親のＨＭＬＥ２４＋細胞ではほとんど存在しなかったが、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞では高度にアップレギュレートされたからである（図１Ａ）。対照的に、他のＥＭＴ−ＴＦは、ＨＭＬＥ２４＋細胞では有意なレベルですでに発現されていたか（Ｔｗｉｓｔ）、または翻訳後に制御されていた（Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、図１Ｂ〜Ｄ）。さらに、本発明者らは、間葉系マーカーであるＮ−カドヘリン（その発現は、本発明者らによってＨＭＬＥ２４＋細胞ではほとんど存在しないと見出されていた）の発現を測定した（図１ＢおよびＤ）。
【０１５１】
はじめに、本発明者らは、本発明者らの以前の実験によってＥＭＴ関連特性の維持と結びつけられた３つのシグナル伝達因子のうちの１つであるＴＧＦ−ベータに曝露することによってＨＭＬＥ２４＋細胞においてＥＭＴを誘導することを試みた。ＴＧＦ−ベータは、ＥＭＴを誘導すると報告された歴史的に最初の細胞外因子だったが（Ｏｆｔら、１９９８）、３日間にわたって組換えＴＧＦ−ベータ１でＨＭＬＥ２４＋細胞を処理しても、Ｎ−カドヘリン、Ｚｅｂ１またはＺｅｂ２の有意な誘導はもたらされなかった（図５Ａ）。注目すべきことに、後者は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の標的として記載されている（Ｓｈｉｒａｋｉｈａｒａら、２００７）。ＨＭＬＥ２４＋細胞をＴＧＦ−ベータで処理したとき、Ｓｍａｄ−レポーターアッセイは、活性の中程度のアップレギュレーションを証明したので（１．５倍、図Ｓ５Ａ）、上記の応答性の欠如は、ＴＧＦ−ベータシグナルを処理できないことに起因しなかった。さらに、これらのデータは、ＢＭＰリガンドからの任意の抑制シグナルを圧倒するのに十分なＴＧＦ−ベータの添加量が、ＨＭＬＥ２４＋細胞によって正常に産生されることを示唆した。
【０１５２】
ＥＭＴ誘導に対する、共同して働くさらなるシグナル伝達経路の寄与を調査するために、本発明者らは、単独でまたはＨＭＬＥ２４＋細胞と組み合わせて加えられる以下の調節因子の効果を検討した：
１）ＨＭＬＥ２４＋細胞におけるオートクリンＷｎｔシグナル伝達の脱阻止（Ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）。ＳＦＲＰ１中和抗体は入手可能でなかったので、本発明者らは、小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを用いて、ＨＭＬＥ２４＋細胞においてＳＦＲＰ１をコードするｍＲＮＡの発現をノックダウンした（図Ｓ５ＢおよびＣ）。このＷｎｔ阻害の減少を補完するために、本発明者らは、それらのｓｈＲＮＡと組み合わせて抗ＤＫＫ１中和抗体を使用した。
【０１５３】
２）Ｗｎｔ５ａの添加。Ｗｎｔ５ａは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞においてアップレギュレートされる３つの非古典的Ｗｎｔリガンドの中に入っていたので、本発明者らは、組換えＷｎｔ５ａをＨＭＬＥ２４＋細胞の培養物に加えた。
【０１５４】
３）細胞散乱の促進。おそらく、上皮島の外縁の細胞は、すべての面において細胞間ジャンクションを形成できないので、以前に本発明者らおよびその他の者は、それらの細胞が、上皮の特徴のいくつかを失っていることに注目していた（Ｇｏｄａｒら、２００８；Ｓａｖａｇｎｅｒら、２００５；Ｚａｖａｄｉｌら、２００１）。ゆえに、さらなる潜在的なＥＭＴ誘導シグナルとして、本発明者らは、その培養細胞に抗Ｅ−カドヘリンモノクローナル抗体を加えることによって、アドヘレンスジャンクションの形成を阻止した。
【０１５５】
単一の因子または様々な組み合わせと比較して、これらの物質の効果を要約するために（図５Ａ）、これらのＥＭＴを誘導する構成要素のすべてをＴＧＦ−ベータとともに加えることだけで、Ｚｅｂ１（６倍）とＺｅｂ２（２５倍）の両方ならびにＮ−カドヘリンのＲＮＡ発現（９倍、図５Ａ）が有意に誘導された。ゆえに、古典的Ｗｎｔ経路の脱抑制、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の活性化、およびアドヘレンスジャンクション形成の乱れは、ＴＧＦ−ベータ経路と共同して働くことにより、ＥＭＴ−ＴＦの発現を誘導する。本明細書中以後、本発明者らは、ＳＦＲＰ１発現の同時ノックダウンにおいて使用されるこの誘導カクテルのことを「ｉＥＭＴ」と称する。
【０１５６】
実施例８：ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路の同時刺激によって、ＨＭＬＥ２４＋細胞は間葉系およびＳＣ様の状態に入ることが可能になる
ｉＥＭＴカクテルによって引き起こされるＥＭＴプログラムが、安定的に間葉系およびＳＣ様の状態に入る細胞をもたらすか否かは不明なままである。この可能性を検討するために、本発明者らは、ＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰ細胞の２つの培養物を独立してＴＧＦ−ベータだけで、およびＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＳＦＲＰ１細胞の２つの培養物をｉＥＭＴカクテルで、１４日間にわたって処理した。本発明者らは、それらの応答を、未処理のＨＭＬＥ２４＋−ｓｈＧＦＰおよび−ｓｈＳＦＲＰ１コントロール細胞と比較した。最初の処理の３日後に、上皮島の明白な細胞の散乱および分散が、ｉＥＭＴ培養物だけで観察された（図Ｓ５Ｄ）。１４日間にわたって、これらの細胞は、前後の極性を示す単一の細胞を特徴とする間葉系の形態を獲得した（図Ｓ５Ｄ）。これらの１４日間の後のさらなる処理の休止後、ｉＥＭＴ細胞は、組織培養におけるその後の少なくとも１２継代（約３６の集団倍増）にわたって、上皮の表現型に戻らなかった（図５Ｂ、図Ｓ５Ｄ）。これらの表現型的に（ｐｈｅｎｏｙｐｉｃａｌｌｙ）安定したｉＥＭＴ細胞において、本発明者らは、Ｅ−カドヘリン発現からＮ−カドヘリン発現への切り替えを認めた（図５ＣおよびＤ、Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｉｎ，１９９９）。対照的に、ＴＧＦ−ベータだけで処理された細胞（ＴＧＦ−ベータ細胞）は、Ｎ−カドヘリンのほんのわずかのアップレギュレーションを示したが、Ｅ−カドヘリンレベルは、強いままだった（図５ＣおよびＤ）。Ｅ−カドヘリンの抑制は、ある特定のＥＭＴの誘導に対する律速段階であると示されている（Ｏｎｄｅｒら、２００８）。ＥＭＴ−ＴＦであるＺｅｂ１、Ｚｅｂ２およびＴｗｉｓｔのＲＴ−ＰＣＲ解析は、ｉＥＭＴで処理された細胞が、安定的に間葉系状態に移ったというさらなる証拠を提供した：これらのすべてが、未処理のコントロールおよびＴＧＦｂ細胞と比べて＞１００倍アップレギュレートされた（図５Ｃ）。
【０１５７】
さらに、進行中のオートクリンＴＧＦ−ベータシグナル伝達を示すように、本発明者らは、Ｓｍａｄ−レポーター活性の３〜４倍の増加（図Ｓ５Ｅ）およびｉＥＭＴ細胞における容易に検出可能なＳｍａｄ２のリン酸化を認めた（すべてがコントロールおよびＴＧＦ−ベータ処理細胞と比べて）（図５Ｄ）。本発明者らはまた、これらの細胞におけるオートクリンの非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を示唆する、ＰＫＣおよびＪＮＫのリン酸化の増加と平行して生じる高レベルのＷｎｔ５ａも検出した（図５Ｄ）。本発明者らは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を示唆する、ベータ−カテニン／ＴＣＦ−ＬＥＦレポーター活性の４倍の上昇を測定した（図Ｓ５Ｅ）。本発明者らは、ＥＭＴの安定的な維持が、ＥＭＴに入るのを以前に引き起こした同じ因子が関わるオートクリンシグナル伝達ループの確立と同時に起こると結論付けた。
【０１５８】
本発明者らはまた、間葉系表現型の安定的な誘導が自己複製能の獲得と同時に起きるか否かも調べた。未処理コントロール細胞と比べて、ｉＥＭＴ細胞は、７０倍多いマンモスフィアを形成し、遊走能は、５０倍高かった（図５Ｅ）。対照的に、ＴＧＦ−ベータ細胞は、マンモスフィア形成効率の有意であるがより小さい増加（１０倍）を示したが、運動性の増加を示さなかった。これらの結果と同調して、本発明者らは、ｉＥＭＴ処理細胞では９８％がＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性細胞を示したことに比べて、ＴＧＦ−ベータ処理細胞ではＣＤ４４高／ＣＤ２４低−陰性細胞の割合が比較可能な程度に小さく（０．２％から１．５％に）増加したことを認めた（図５Ｆ）。重要なことには、これらの作用は、ｉＥＭＴ細胞、ＴＧＦ−ベータ細胞とコントロール細胞との間の増殖率の差異に起因すると考えることができなかった；実際には、接着性単層培養物における増殖率は、ＴＧＦ−ベータ細胞またはｉＥＭＴ細胞において安定的により低かった（図Ｓ５Ｇ）。注目すべきことに、ｉＥＭＴ細胞は、オートクリン環境の乱れに対して感受性のままだった：組換えＳＦＲＰ１、ＢＭＰ４またはその両方の組み合わせによるこれらの細胞の処理は、遊走およびマンモスフィア形成を、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞のそれに匹敵する程度に阻害した（図５Ｇ）。
【０１５９】
本発明者らはまた、ｉＥＭＴカクテルで処理された細胞の間葉系およびＳＣ様の状態が、そのような細胞が細胞形質転換のプロセスを経た後に維持されるという証拠も得た。したがって、これらの様々な細胞集団がＲＡＳ癌遺伝子によって形質転換されたとき、マウスの乳房脂肪パッドに埋め込まれたｉＥＭＴ細胞だけが、ＭＳＰ−ＲＡＳ細胞と類似の高頻度で肺転移巣を生じた。対照的に、ＲＡＳによって形質転換されたコントロールＨＭＬＥ細胞および対応するＴＧＦ−ベータ処理集団は、単なる弱い転移性だった（図５Ｈ）。
【０１６０】
まとめると、これらの知見は、間葉系およびＳＣ様の状態の維持に関わる同じ因子が、その誘導物質としても働き得、以前にこれらの機能的特質を非常に低レベルで示した集団から遊走およびＳＣ様の特性を有する細胞を取り出すことができることを示唆した。それらの結果はまた、これらの応答を誘発する際の高効率が、２つ以上の因子を使用することによって得られることも証明する。
【０１６１】
実施例９：ヒト乳腺から単離された基底細胞集団は間葉系マーカーおよびＥＭＴ−ＴＦを発現する
ＨＴｗｉｓｔ、ＭＳＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｉＥＭＴ細胞の遊走および自己複製の形質が、正常な乳腺の範囲内のある特定の細胞集団の特性を反映するか否かを明らかにするために、本発明者らは、ＨＭＬＥ細胞ならびにそれらの様々な間葉系およびＳＣ様の誘導体と表現型的に類似のＭＥＣ集団をヒト乳腺から同定しようと試みた。それを行うために、本発明者らは、最近報告された細胞表面マーカーを用いて、乳房縮小術組織から調製された２つの異なる細胞集団を単離し、培養して増殖させた。ＦＡＣＳ解析によって、本発明者らは、これらの集団を、ＣＤ４９ｆの発現が高いことおよびＥｐＣＡＭの発現が低いかまたはないことに基づいて基底細胞と分類し、そしてＣＤ４９ｆの発現および高レベルのＥｐＣＡＭに基づいて管腔系列に限定される細胞と分類した（図６Ａ、Ｅｉｒｅｗら、２００８；Ｌｉｍら、２００９；Ｓｔｉｎｇｌら、２００１）。幹細胞および二分化能（ｂｉ−ｐｏｔｅｎｔ）の前駆細胞の存在は、基底細胞に限定されると見出されている（Ｅｉｒｅｗら、２００８；Ｓｔｉｎｇｌら、２００１）。
【０１６２】
本発明者らはさらに、以前に記載された種々の系列マーカー（Ｓｔｉｎｇｌ，２００９；Ｖｉｓｖａｄｅｒ，２００９に概説されている）によって、本発明者らのソーティングされた集団を特徴付けた。予想通り、ソーティングされた管腔細胞は、系列マーカーであるサイトケラチン８、１８およびＭＵＣＩを発現したのに対し、ソーティングされた基底細胞は、それらを発現しなかった（図６Ｃ）。逆に、ほとんどの基底細胞が、サイトケラチン１４を発現した一方で、いくつかのクラスターを除く管腔細胞の大部分が、それを発現しなかった（図６Ｄ）。重大なことに、基底細胞だけが、重層化した上皮における基底細胞集団および幹細胞集団の機能的マーカーである（Ｓｅｎｏｏら、２００７）高レベルの核ｐ６３を示した（図６Ｄ）。注目すべきことに、本発明者らは、基底培養物内で、成熟筋上皮細胞のマーカーであるアルファ−平滑筋アクチンをもっぱら発現しているいくつかの細胞も認めた（図６Ｄ）。要約すると、本発明者らは、本発明者らの細胞ソーティングおよびその後の単層培養における増殖によって、適切なマーカーを発現し続ける基底細胞および管腔細胞の高度に精製された集団が得られると結論付けた。
【０１６３】
本発明者らは、基底細胞集団が主に、前後の極性を示す単一の細胞からなるのに対し、管腔細胞が、堅固に密集した上皮島を形成することに注目した（図６Ｂ）。本発明者らはまた、上皮および間葉系のマーカーの発現も測定した：実際に、基底細胞は、間葉系マーカーであるビメンチンを高レベルで発現したが、それらは、ＺＯ−１を含むタイトジャンクション（図６Ｅ）も、低レベルのＥ−カドヘリンによって判断されるようなアドヘレンスジャンクションも形成しなかった（それらのほとんどが原形質膜に局在化しなかった）（図Ｓ６Ａ）。著しく対照的に、管腔細胞は、細胞膜に局在化する高レベルのＺＯ−１およびＥ−カドヘリン（その両方が、分化した上皮細胞に関連する）を発現した（図６Ｅ、Ｓ６Ａ）。
【０１６４】
本発明者らがＥＭＴ関連形質の誘導および維持に関連づけたシグナル伝達経路（具体的にはＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータ経路）の活性化と基底細胞の間葉系特性が相関するか否かを判定することに進んだ。実際に、基底細胞は、活性なＷｎｔシグナル伝達を示唆する、細胞質および核のベータ−カテニン発現を示した。対照的に、管腔細胞では、ベータ−カテニン発現は、原形質膜にほぼ完全に限局された（図６Ｅ）。さらに、本発明者らは、基底細胞が、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を示唆する高レベルの核Ｓｍａｄ２、ならびにＥＭＴ−ＴＦであるＺＥＢ１およびＴｗｉｓｔを発現すると見出した（図６Ｆ）。これらの３つのタンパク質の発現レベルは、管腔細胞においてより低く、細胞質におけるものだった（図６Ｆ）。これらのデータから、基底細胞が、より間葉系の状態にあり、以前に研究されたＨＴｗｉｓｔ、ＭＳＰおよびＨＭＬＥ２４＋−ｉＥＭＴ細胞と同様のＥＭＴ−ＴＦを発現すると示唆された。基底集団は、幹細胞および筋上皮系列と管腔系列の両方を生じる二分化能の前駆細胞を含むと報告されているので（Ｅｉｒｅｗら、２００８；Ｓｔｉｎｇｌら、２００１）、本発明者らのデータは、乳腺上皮幹細胞および前駆細胞集団が、管腔に限定される細胞に分化する際に間葉系上皮転換（ＭＥＴ）様のプロセスを起こし得ることを示唆した。
【０１６５】
実施例１０：初代ＭＥＣにおける遊走および自己複製の特性は、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞と類似のシグナル伝達機構によってコントロールされる
次に、本発明者らは、本発明者らが単離した基底細胞が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞の機能特性と同様の、間葉系およびＳＣ様の状態の機能特性を示すか否かを試験することを望んだ。はじめに、本発明者らは、マンモスフィアアッセイを用いて、前駆細胞またはＳＣの存在について試験した。本発明者らのもとでは、ソーティングされていないバルクＭＥＣ集団は、０．１５％というマンモスフィア形成頻度を示したのに対し、１０倍の濃縮に対応する上記基底細胞の１〜２％が、マンモスフィアを形成した（図７Ａ）。対照的に、管腔細胞のわずか０．０９％が、概してより小さいサイズのマンモスフィアを生じた（図７Ａ）。著しいことに、一次スフィアが分離されて二次スフィア形成のためにマンモスフィアアッセイに再導入されたとき、本発明者らは、基底細胞においてマンモスフィア形成効率の５倍上昇を認め、このことから、スフィア形成細胞の増殖が示唆された（図７Ａ）。ソーティングされていない細胞では、本発明者らは、マンモスフィア形成効率の２倍上昇を認めた。しかしながら、管腔細胞によって形成される小さいマンモスフィアは増殖しなかった。これらのデータから、基底細胞がマンモスフィアアッセイにおいて自己複製することが示唆され、それらが前駆細胞およびＳＣについて濃縮されるという見解が増強される。
【０１６６】
ＨＭＬＥモデル系において、本発明者らは、ＥＭＴを経ることによって、遊走特性と自己複製特性の両方がもたらされることを認めており、それにより、本発明者らは、ソーティングされた初代ＭＥＣの運動性の測定を促された。実際に、基底細胞は、高度に運動性であり、ソーティングされていないバルクＭＥＣと比べて、インビトロにおいて２０倍高い遊走能を示した。対照的に、管腔細胞のほとんどが遊走しなかった（バルクＭＥＣよりも２倍低い運動性に対応した）（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータから、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞と同様に、初代基底細胞が、自己複製能と遊走能の両方について濃縮されることが証明される。
【０１６７】
本発明者らは、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞において作動しているオートクリンループが、基底ＭＥＣの自己複製能および遊走能の維持を可能にするか否かを試験することも試みた。組換えＢＭＰ４は、初代ＭＥＣに対して強い抗増殖作用を発揮したので（データ示さず）、本発明者らは、その代わりに、ＴＧＦ−ベータＩ型レセプターに特異的な薬理学的インヒビター（Ａ８３−０１およびＳＢ４３１５４２）を使用することによって直接、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害した。さらに、本発明者らは、組換えＳＦＲＰ１を適用することによって、オートクリンＷｎｔシグナル伝達を阻止した。単層培養物において両方のＴＧＦ−ベータインヒビターまたはＳＦＲＰ１で５日間にわたって毎日処理した後、基底細胞において、さらなる処理なしの遊走アッセイおよびマンモスフィアアッセイを行った。重要なことには、これらの処理は、単層培養物において基底細胞の増殖を減少させなかったことから、任意の通常の細胞傷害（ｃｙｔｏｘｉｃ）作用が排除された（図Ｓ７Ａ）。注目すべきことに、ＴＧＦ−ベータインヒビターで処理された基底細胞は、より上皮の形態を示した（図Ｓ７Ｂ）。
【０１６８】
著しいことに、ＴＧＦ−ベータインヒビターまたはＳＦＲＰ−１での前処理によって、マンモスフィア形成が８０〜９０％減少した（図７Ｃ）。さらに、本発明者らは、ＴＧＦ−ベータインヒビターでの前処理によって運動性の完全な阻害およびＳＦＲＰ１での前処理によって３倍の減少を認めた（図７Ｄ）。ＷｎｔおよびＴＧＦ−ベータリガンドが外因的に加えられなかったので、これらのデータは、基底細胞が、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞と同様に、オートクリンＴＧＦ−ベータおよびＷｎｔシグナル伝達経路を使用して、自己複製能と遊走能の両方を維持したことを示唆する。
【０１６９】
ＨＭＬＥ２４＋細胞を用いた本発明者らの実験と類似して、本発明者らは、類似のＥＭＴ誘導カクテル（Ｗｎｔ５ａ、抗Ｅ−カドヘリンおよび抗ＤＫＫ１抗体とともにＴＧＦ−ベータからなる）を介して管腔細胞において遊走能および自己複製能が誘導され得るか否かを判定することを望んだ（ｉＥＭＴ−ＩＩ、図７Ｅ）。本発明者らは、ｉＥＭＴ処理中に上皮島の明白な細胞の散乱および分散を認めたが、他の培養物では認められなかった（図Ｓ７Ｄ）。しかしながら、ＨＭＬＥ２４＋細胞とは対照的に、これらの管腔細胞の初代培養物において、本発明者らは、単一の薬剤としてＴＧＦ−ベータで５日間処置した後に運動性細胞とマンモスフィア形成細胞の両方の有意な増加を認めた（それぞれ８倍および３倍、図７ＥおよびＦ）ことから、初代管腔細胞が、ＨＭＬＥ２４＋細胞よりもＴＧＦ−ベータに対して応答性であると示唆される。しかしながら、そのｉＥＭＴカクテルを加えることによって、２０倍超の運動性促進と５倍のマンモスフィア形成効率との相加効果がもたらされた（図７ＥおよびＦ）。注目すべきことに、コントロール管腔細胞のアッセイにおけるこれらの特性のベースラインレベルは、最小だった（平均して、０．０００３％の細胞が遊走し、０．０３％がマンモスフィアを生じた）。本発明者らはまた、マンモスフィアアッセイとは対照的に、単層での増殖では、ＴＧＦ−ベータおよびｉＥＭＴで処理された管腔培養物が有意に減少したことも認め、このことから、これらの細胞が、ＴＧＦ−ベータの成長抑制作用（ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら、１９９７）に応答すると示唆される。
【０１７０】
まとめると、これらの結果から、ヒト乳腺組織から単離された基底ＭＥＣが、不死化ＨＴｗｉｓｔ、ＭＳＰおよびｉＥＭＴ集団と類似の遊走および自己複製の特性について濃縮されることが示唆された。新たに単離された基底細胞におけるこれらの特性の維持は、間葉系／ＳＣ様の状態にある不死化されたＨＭＬＥ細胞と形質転換したＨＭＬＥ細胞の両方において作動しているオートクリンループと同一ではないとしても同様のオートクリンループに依存するとみられる。重要なことには、これらのオートクリン因子は、先の実験において証明されたようなＨＭＬＥ細胞におけるＥＭＴの誘導と同様に、遊走および自己複製の特性を誘導するために管腔細胞に適用され得る。まとめると、これらのデータから、ＨＭＬＥ細胞株においてＥＭＴを経ることが、基底ＭＥＣに天然に存在する特性の採用を反映すると示唆される。
【０１７１】
実施例１〜１０に対する材料および実験手順
細胞株。ヒト乳腺上皮細胞株（ＨＭＬＥ）を、記載されているように作製し、標準的なプロトコル（Ｅｌｅｎｂａａｓら、２００１）に従ってＭＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させた。細胞株の詳細な説明を下に提供する。
【０１７２】
初代乳腺上皮細胞の培養。以前に記載されたように（Ｓｔｉｎｇｌら、２００１）、閉経前の女性の乳房縮小術から初代ヒト乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）の単一細胞の懸濁液を作製した。３人のドナーからのデータが本研究に含められている。初代ＭＥＣを、４％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において、１％ウシ胎児血清が補充されたＭＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中、コラーゲンＩコーティングプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で培養した。
【０１７３】
遊走および浸潤アッセイ。遊走アッセイの場合、２×１０４個の細胞を、８μｍの細孔を有する２４ウェル細胞培養インサート（Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。浸潤アッセイの場合、マトリゲルでコーティングされたインサート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。１２〜４８時間後、そのフィルターの上の面の細胞を綿棒で除去した。可視化のために、フィルターの下の面の細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色キット（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色した。
【０１７４】
マンモスフィアおよびツモールスフィアアッセイ。以前に記載された（Ｄｏｎｔｕら、２００３）ものから改変を加えてアッセイを行った：２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（両方ともＳｉｇｍａ）およびＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）が補充された１．３％メチルセルロース（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＭＥＧＭ培地の入った９６ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１０００個の細胞／ウェルを播種した。一次スフィアを、トリプシン処理によって分離し、二次スフィア形成に向けて５〜７日後に再度プレーティングした。
【０１７５】
動物試験。研究に関わるすべての動物が、ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって承認されたプロトコルに従った。腫瘍原性研究の場合、ＰＢＳに１：４希釈された１００μＬのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の記載の細胞数を、同齢の雌のヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの側腹部の両側に皮下注射した。１０週間後、マウスを屠殺し、剖検した。同所性注射の場合、ＰＢＳに懸濁された１×１０５個の細胞を、同齢の雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの２つの鼠径部の乳腺の各々に注射した。１０週間後または腫瘍が直径＞１ｃｍに達したら、マウスを屠殺した。検体単離から３時間以内に肺表面への転移を、蛍光顕微鏡を用いて数えた。
【０１７６】
免疫ブロット。タンパク質を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いて抽出し、濃度をＬｏｗｒｙアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によって測定した。タンパク質溶解産物を、４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＨＲＰに連結された二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプロービングし、ＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で可視化した。
【０１７７】
免疫蛍光法。細胞をＬａｂｔｅｋ  ＩＩ−ＣＣ２チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上で生育し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００／ＰＢＳで透過処理した後、１０％ヤギ血清（Ｃａｌｔａｇ）でブロッキングした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ−４８８または−５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合されたヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギだった。細胞の核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で可視化した。スライドをＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄアンチフェード試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントした。
【０１７８】
蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリー。標準的なプロトコルに従って細胞を調製し、ＦＡＣＳの前に氷上で０．１％ＦＢＳ／ＰＢＳに懸濁した。７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、死細胞を除外した。サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＳＯＲＰにおいてソーティングし、ＢＤ  ＬＳＲＩＩにおいてＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１７９】
抗体アレイ。ＨＭＬＥ２４＋およびＨＴｗｉｓｔ細胞の培養培地を４８時間インキュベートした後に回収し、２０μｍのメッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）で濾過した。各サンプルをビオチン化し、３つの希釈率でＬシリーズ５００−抗体アレイ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）とハイブリダイズした。各アレイにおいて、タンパク質強度値に対してバックグラウンドサブトラクションを行い、内部標準で補正し（ｓｃａｌｅｄ）、１単位未満を切り捨てた（ｆｌｏｏｒｅｄ  ａｔ  １  ｕｎｉｔ）。各希釈率において、３つ組のアレイに対するｔ検定のｐ値を用いてタンパク質をランク付けし、異なる方向の変化を示す抗体を除外した。上位１０％とアッセイされたタンパク質を、３つの希釈率にわたる平均ランクによって選択した。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡ。培養培地を４８時間インキュベートした後に回収し、２０μｍのメッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）で濾過した。すべてのＥＬＩＳＡを、商業的に入手可能なキットを製造者の指示書に従って使用して行った。ＤＫＫ１、ペントラキシン３、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ−ｃおよびｕＰＡに対しては、キットおよび補助的製品をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。すべてのＥＬＩＳＡの読み出した結果を細胞数で正規化した。
【０１８１】
マイクロアレイハイブリダイゼーション、データ収集および解析。ＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞に対する３つの独立した培養プレートから、ならびにＨＭＬＥ２４＋および独立して作製された３つのＭＳＰ細胞株の２つの独立したプレートから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＲＮＡの合成、およびマイクロアレイのハイブリダイゼーション／スキャニングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ製品を用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐのマニュアルに記載されているように行った。生データ（ＣＥＬ）のファイルを正規化し、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを使用してＲＭＡを用いてプローブセットの値にサマライズした（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２００３）。（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、２００５）に記載されているように、マイクロアレイのデータをＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）に供した。このために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／）からの９９０種のキュレートされた（ｃｕｒａｔｅｄ）遺伝子セットを照会した。
【０１８２】
細胞株。ヒト乳腺上皮細胞株（ＨＭＬＥ）は、記載されたように作製され、ヒトテロメラーゼ酵素の触媒サブユニット、ｈＴＥＲＴおよびＳＶ−４０ラージＴ抗原を発現するレトロウイルスベクターを用いて不死化された（Ｅｌｅｎｂａａｓら、２００１）。ＨＭＬＥ細胞は、標準的なプロトコルに従って、ＭＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖された。ＣＤ２４陽性ＨＭＬＥ（ＨＭＬＥ２４＋）細胞は、製造者の指示書に従うＣＤ２４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるポジティブ選択のために、マウスＩｇＧ用のＣｅｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＭＡＣＳによって精製された。間葉系亜集団（ＭＳＰ）細胞は、ＨＭＬＥ細胞のコンフルエントな単層培養物において自由に浮遊している細胞の少数集団として検出された。これらのＭＳＰ集団は、ＨＭＬＥ培養物から取り出されると、新しい培養皿に再度接着し、その後、単層培養物として増殖された。
【０１８３】
プラスミド、ウイルス産生および標的細胞の感染。ＨＭＬＥ細胞は、ｐＢＡＢＥ−Ｔｗｉｓｔまたは−Ｓｎａｉｌベクターに感染することにより、以前に記載されたように（Ｍａｎｉら、２００８；Ｙａｎｇら、２００４）ＨＴｗｉｓｔおよびＨＳｎａｉｌ細胞を産生する細胞だった。腫瘍原性タンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＨＭＬＥ、ＨＴｗｉｓｔおよびＭＳＰ細胞を作製するために、細胞にｐＢａｂｅ−Ｖ１２Ｈ−ＲＡＳ（Ｅｌｅｎｂａａｓら、２００１）およびｐＲＲＬ−ＧＦＰベクターを感染させた。ＳＦＲＰ１を安定的にノックダウンするために、ｐＬＫＯ１小ヘアピン発現ベクターをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した（ｓｈＳＲＰ１＿ａ、クローンＩＤ  ＴＲＣＮ０００００６２１６８、ｓｈＳＦＲＰ１＿ｂ、クローンＩＤ  ＴＲＣＮ０００００６２１６７２）。標的細胞の作製および感染は、以前に記載された（Ｓｔｅｗａｒｔら、２００３）。感染した細胞は、２μｇ／ｍＬピューロマイシン、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンおよび２００μｇ／ｍＬネオマイシンで選択した。
【０１８４】
ルシフェラーゼアッセイ。レポータープラスミドは、以前に記載された：Ｓｕｐｅｒ  ８ｘＴＯＰＦｌａｓｈ、対応するＦＯＰＦｌａｓｈコントロールプラスミド（Ｖｅｅｍａｎら、２００３）およびＳＢＥ４−ｌｕｃ（Ｚａｗｅｌら、１９９８）。Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、５．０×１０４個の細胞を、５００ｎｇの記載のホタルルシフェラーゼレポータープラスミドおよび５０ｎｇのｐＧＬ−ＳＶ４０−ウミシイタケルシフェラーゼノーマライゼーションコントロールプラスミドでコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜４８時間後に溶解産物を回収し、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【０１８５】
組換えタンパク質およびインヒビター。組換えヒトＤＫＫ１、ＳＦＲＰ１およびマウスＷｎｔ５ａは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。組換えＢＭＰ４は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔから入手した。小分子インヒビターは、Ｔｏｃｒｉｓ製（Ａ８３−０１，Ｔｏｊｏら、２００５）およびＳｉｇｍａ製（ＳＢ４３１５４２，Ｌａｐｉｎｇら、２００２）だった。抗ＤＫＫ１抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＨＥＣＤ−１）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【０１８６】
抗体
免疫ブロット法：ベータ−アクチン、Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ（Ａｂｅａｍ）；Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）；ＺＥＢ１（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ）；ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔ１８３／Ｙ１８５，クローンＧ９）、ＪＮＫ、ホスホ−ｃ−ＪＵＮ（Ｓ６３）、ＪＵＮ、ホスホ−ＰＫＣ（ｐａｎ，ベータＩＩ／Ｓｅｒ６６０）、Ｓｌｕｇ（Ｃｌ９Ｇ７）、ホスホ−ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ２／３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；Ｗｎｔ５ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１８７】
免疫蛍光法：Ｅ−カドヘリン、ｓｍａｄ２／３、Ｔｗｉｓｔ、ＺＥＢ１，免疫ブロット法を参照のこと；アルファ−平滑筋アクチン−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ）、ベータ−カテニン、すべて（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、サイトケラチン８（ＴＲＯＭＡ−１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、サイトケラチン１４（ＡＦ６４，Ｃｏｖａｎｃｅ）、サイトケラチン１８（ＤＣ１０，ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、ＭＵＣ−１（ＨＭＰＶ，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｐａｎ−サイトケラチン（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）、ｐ６３（４Ａ４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ビメンチン（Ｖ９，Ｓｉｇｍａ）、ＺＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１８８】
ＦＡＣＳ：ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＤ２４−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３１−ＡＰＣ（ＷＭ５９，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ＣＤ４５−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＣＤ４９ｆ−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【０１８９】
ＲＮＡの調製およびＲＴ−ＰＣＲ解析。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を増幅のために使用し、サンプルをＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ−ＩＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において泳動した。解析は、以前に記載された（Ｙａｎｇら、２００４）。プライマーのリストを下に提供する。
【０１９０】
【表４−１】
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【０１９１】
【表４−２】
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【０１９２】
【表４−３】
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増殖アッセイ。細胞の成長速度を測定するために、１０００個の細胞を９６ウェルプレート上に３つ組で播種した。細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示書に従って使用して測定した。
【０１９３】
統計解析。データは、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。別段示されない限り、スチューデントｔ検定（両側）を用いて、２群を比較した（ｐ＜０．０５を有意であると考えた）。
【０１９４】
【化１】
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【０１９５】
【化２】
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【０１９６】
【化３】
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【０１９７】
【化４】
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当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するかまたは単なる通常の実験を用いて確かめることができる。本発明の範囲は、説明またはその中で示される詳細に限定されないと意図されている。「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それと反対のことが示されないかまたは文脈から別段明らかでない限り、１つまたは１つより多いことを意味し得る。本発明の方法の多くが、細胞の集団を用いて、例えば、インビトロまたはインビボにおいて実施されることが多いことが理解されるだろう。したがって、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は、その細胞が、細胞の集団（例えば、実質的に遺伝的に同一の細胞を含むかまたはそれらからなる集団）のメンバーである実施形態を包含すると理解されるべきである。しかしながら、本発明は、本発明の方法が個別の細胞に適用される実施形態を包含する。したがって、「細胞（ｃｅｌｌｓ）」という言及は、細胞の集団内の個別の細胞に適用可能な実施形態および単離された個別の細胞に適用可能な実施形態を包含すると理解されるべきである。
【０１９８】
ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それと反対のことが示されないかまたは文脈から別段明らかでない限り、その群の１つ、１つより多いまたはすべてのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらにおいて使用されるか、またはそれらと別途関連性があることを満たしていると考えられる。本発明は、その群の厳密に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらにおいて使用されているか、またはそれらと別途関連性がある実施形態を包含する。本発明はまた、その群の２つ以上またはすべてのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらにおいて使用されているか、またはそれらと別途関連性がある実施形態を包含する。本明細書中に記載されるすべての実施形態が、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。適切なときは常に、それらの実施形態のいずれもが他のそのような１つ以上の実施形態と自由に組み合され得ることも企図される。さらに、本発明は、１つ以上の請求項（当初の請求項であるかその後加えられた請求項であるかを問わず）からの１つ以上の限定、エレメント、節、記述用語などが、別の請求項（当初の請求項であるかその後加えられた請求項であるかを問わず）に導入された、すべてのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属している任意の請求項が、同じ基本請求項に従属している他の任意の請求項に見られる１つ以上のエレメントまたは限定を包含するように改変され得、異なる請求項に存在するエレメントのことを言及している任意の請求項が、そのような請求項と同じ基本請求項に従属している他の任意の請求項に見られる１つ以上のエレメントまたは限定を包含するように改変され得る。さらに、請求項が組成物を述べている場合、本発明は、例えば、本明細書中に開示される方法に従って、その組成物を生成する方法、および例えば、本明細書中に開示される目的のために、その組成物を使用する方法を提供する。請求項が方法を述べている場合、本発明は、その方法を行うために適した組成物およびその組成物を生成する方法を提供する。また、請求項が組成物を生成する方法を述べている場合、別段示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じ得ると当業者が認識しない限り、本発明は、本発明の方法に従って生成される組成物およびその組成物を使用する方法を提供する。
【０１９９】
エレメントがリストとして、例えば、マーカッシュ群形式で示される場合、それらのエレメントの各部分群もまた開示され、任意のエレメントが、その群から除去され得る。簡潔さのために、これらの実施形態のうちのいくつかだけが、本明細書中で具体的に述べられてきたが、本発明は、そのような実施形態のすべてを包含する。通常、本発明または本発明の態様が、特定のエレメント、特徴などを含むと言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、そのようなエレメント、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になることも理解されるべきである。
【０２００】
本明細書中で数値範囲が述べられる場合、本発明は、その終点を含む実施形態、両方の終点が除外される実施形態、および一方の終点が含められ、他方が除外される実施形態を包含する。別段示されない限り、両方の終点が含められると想定されるべきである。さらに、別段示されないかまたは文脈および当業者の理解から別段明らかでない場合、範囲として表現される値は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の種々の実施形態において述べられる範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲を想定し得る。「Ｘ未満」、「Ｘ超」または「少なくともＸ」などの句が使用される場合（ここで、Ｘは、数またはパーセンテージである）、その範囲の下限または上限として任意の妥当な値が選択され得ると理解されるべきである。数値のリストが本明細書中で述べられる場合（「少なくとも」が前に置かれるか否かを問わず）、本発明が、それらの間の任意の値またはそのリスト内の任意の２つの値によって定義される範囲に関する実施形態を包含すること、および最も小さい値が、最小値と見なされ得、かつ最も大きい値が、最大値と見なされ得ることも理解される。さらに、数、例えば、パーセンテージのリストの前に「少なくとも」が置かれる場合、その用語は、そのリスト内の各数に適用される。数値の前に「約」または「およそ」が置かれている本発明の任意の実施形態に対して、本発明は、その厳密な値が列挙されている実施形態を包含する。数値の前に「約」または「およそ」が置かれていない本発明の任意の実施形態に対して、本発明は、その値の前に「約」または「およそ」が置かれている実施形態を包含する。「およそ」または「約」は、別段述べられないかまたは別段文脈から明らかでない限り（例えば、そのような数が、可能性のある値の１００％を許されないほど超え得る場合）、通常、ある数の１％またはいくつかの実施形態では５％またはいくつかの実施形態では１０％のいずれかの方向の（その数より多いまたは小さい）範囲内に入る数を包含する。
【０２０１】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態、態様、エレメント、特徴など、例えば、任意の化合物、細胞型、条件、疾患などは、明確に除外され得る。
【図８−１６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図８−２１】
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【図８−２２】
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【図８−２３】
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【図８−２４】
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【図８−２５】
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【国際調査報告】
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