(57)【要約】本発明は、マラリアの防御および予防のためのワクチンの分野に属し、より詳しくは、プラスモジウム種に感染した網状赤血球由来のエキソソーム、それらの取得方法、マラリアの防御および予防のためのその用途、並びに新規プラスモジウム抗原の発見と同定のためのその使用に関する。また、本発明は、プラスモジウム種抗原を含む人工エキソソームにも関する。最終的に、本発明は、プラスモジウム種に感染した網状赤血球から得られたエキソソームにより見出される特異的抗原に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のプラスモジウム種抗原をその内部またはその表面に含んでなる網状赤血球から単離されることを特徴とするエキソソーム。
【請求項２】
前記エキソソーム中に存在する抗原または抗原類が、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、プラスモジウム・ヨエリ（Plasmodium yoelli）、Ｐ．アチオテンセ（P. achiotense）、Ｐ．アクロマチクム（P. achromaticum）、Ｐ．エジプテンシス（P. aegyptensis）、Ｐ．エウミナタム（P. aeuminatum）、Ｐ．アガメ（P. agamae）、Ｐ．アナサム（P. anasum）、Ｐ．アテルリ（P. atheruri）、Ｐ．アズロフィラム（P. azurophilum）、Ｐ．バリ（P. balli）、Ｐ．バブシコライ（P. bambusicolai）、Ｐ．バシリシ（P. basilisci）、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、Ｐ．ビゲチ（P. bigueti）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．ブリグーイ（P. brygooi）、Ｐ．ブーリアチ（P. booliati）、Ｐ．ブバリス（P. bubalis）、Ｐ．ブッキ（P. bucki）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．カテメリウム（P. cathemerium）、Ｐ．セファロフィ（P. cephalophi）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、Ｐ．チリカフエ（P. chiricahuae）、Ｐ．シルクラリス（P. circularis）、Ｐ．クネミドフォリ（P. cnemidophori）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．コゲシャリ（P. coggeshalli）、Ｐ．コロンビエンセ（P. colombiense）、Ｐ．コラデッチ（P. corradettii）、Ｐ．コターニックス（P. coturnix）、Ｐ．クーランゲシ（P. coulangesi）、Ｐ．ククルス（P. cuculus）、Ｐ．ポポ（P. popo）、Ｐ．シクロプシ（P. cyclopsi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ；P. cynomolgi）、Ｐ．ジミヌチバム（P. diminutivum）、Ｐ．ジプログロッシ（P. diploglossi）、Ｐ．ジサナイケイ（P. dissanaikei）、Ｐ．ドミニカナ（P. dominicana）、シチメンチョウマラリア原虫（Ｐ．デュレ、P. durae）、Ｐ．エゲルニエ（P. egerniae）、Ｐ．エロンガタム（P. elongatum）、Ｐ．エイレシ（P. eylesi）、Ｐ．ファベシア（P. fabesia）、Ｐ．フェアチルジ（P. fairchildi）、Ｐ．ファラックス（P. fallax）、Ｐ．フィールジ（P. fieldi）、Ｐ．フォレイ（P. foleyi）、Ｐ．フォレステリ（P. forresteri）、Ｐ．フロリデンセ（P. floridense）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、Ｐ．ガーンハミ（P. garnhami）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ガリナセウム、P. gallinaceum）、Ｐ．ギガンテウム（P. giganteum）、Ｐ．ジョバンノライ（P. giovannolai）、Ｐ．ギラルジ（P. girardi）、Ｐ．ゴナトジ（P. gonatodi）、Ｐ．ゴンデリ（P. gonderi）、Ｐ．ゲオルゲシ（P. georgesi）、Ｐ．グラシリス（P. gracilis）、Ｐ．グリフィスシ（P. griffithsi）、Ｐ．グアンゴング（P. guanggong）、Ｐ．グンデルシ（P. gundersi）、Ｐ．グヤンネンセ（P. guyannense）、Ｐ．ヘイッシ（P. heischi）、Ｐ．ヘグネリ（P. hegneri）、Ｐ．ヘルマニ（P. hermani）、Ｐ．ヘテロヌクレアレ（P. heteronucleare）、Ｐ．ヘキサメリウム（P. hexamerium）、Ｐ．ホラスピ（P. holaspi）、Ｐ．フッフィ（P. huffi）、Ｐ．ヒロバチ（P. hylobati）、Ｐ．イシペーンシス（P. icipeensis）、Ｐ．イノピナタム（P. inopinatum）、サルマラリア原虫（Ｐ．イヌイ；P. inui）、Ｐ．ジェフェリ（P. jefferi）、Ｐ．ジョセフィーネ（P. josephinae）、Ｐ．ジャクスタヌクレアレ（P. juxtanucleare）、Ｐ．ケンピ（P. kempi）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ；P. knowlesi）、Ｐ．ケントロピクシ（P. kentropyxi）、Ｐ．リーヌクテウス（P. leanucteus）、Ｐ．レムリス（P. lemuris）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ロフレ；P. lophurae）、Ｐ．レピドプチフォルミス（P. lepidoptiformis）、Ｐ．リゴソメ（P. lygosomae）、Ｐ．マブイエ（P. mabuiae）、Ｐ．マッケラセ（P. mackerrasae）、Ｐ．マクリラブレ（P. maculilabre）、Ｐ．メイオール（P. maior）、Ｐ．マルギナタム（P. marginatum）、Ｐ．マチュチナム（P. matutinum）、Ｐ．メキシカヌム（P. mexicanum）、Ｐ．ミナセンセ（P. minasense）、Ｐ．モルラム（P. morulum）、Ｐ．ヌクレオフィリアム（P. nucleophilium）、Ｐ．オクタメリウム（P. octamerium）、Ｐ．オドコイレイ（P. odocoilei）、Ｐ．パペルナイ（P. papernai）、Ｐ．パラヌクレオフィラム（P. paranucleophilum）、Ｐ．パルブラム（P. parvulum）、Ｐ．ペディオエセチイ（P. pedioecetii）、Ｐ．ペレジ（P. pelaezi）、Ｐ．ペルシガルンハミ（P. percygarnhami）、Ｐ．ペテルシ（P. petersi）、Ｐ．ピファノイ（P. pifanoi）、Ｐ．ピノッティ（P. pinotti）、Ｐ．ピノッリ（P. pinorrii）、サルマラリア原虫（Ｐ．ピテシ；P. pitheci）、Ｐ．ピツマニ（P. pitmani）、Ｐ．ポラレ（P. polare）、トリマラリア原虫（Ｐ．プレコックス、P. praecox）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）、トリマラリア原虫（Ｐ．レリクタム、P. relictum）、Ｐ．ラジヌラム（P. rhadinurum）、Ｐ．ロダイニ（P. rhodaini）、Ｐ．ロビンソニ（P. robinsoni）、Ｐ．ルクシ（P. rouxi）、Ｐ．サンドシャミ（P. sandoshami）、Ｐ．ササイ（P. sasai）、オラウータンマラリア原虫（Ｐ．シュバイツイ；P. schweitzi）、Ｐ．シルバチカム（P. silvaticum）、Ｐ．シミウム（P. simium）、Ｐ．セミオバレ（P. semiovale）、Ｐ．ショルティ（P. shortii）、Ｐ．スミルノビ（P. smirnovi）、Ｐ．サブプレコックス（P. subpraecox）、矮小マラリア原虫（Ｐ．テヌエ、P. tenue）、Ｐ．テジェライ（P. tejerai）、Ｐ．トモドニ（P. tomodoni）、Ｐ．トレアルバイ（P. torrealbai）、Ｐ．トラグリ（P. traguli）、Ｐ．トリボロノッチ（P. tribolonoti）、Ｐ．トロピズリ（P. tropiduri）、Ｐ．ユイレンベルギ（P. uilenbergi）、Ｐ．ワテニ（P. watteni）、Ｐ．ウェニオニ（P. wenyoni）、Ｐ．バキュオラタム（P. vacuolatum）、Ｐ．バスタトール（P. vastator）、Ｐ．ボウガニ（P. vaughani）、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）、Ｐ．ボランス（P. volans）、Ｐ．ヤンギ（P. youngi）に属することを特徴とする請求項１記載のエキソソーム。
【請求項３】
前記エキソソーム中に存在する前記抗原または抗原類が、三日熱マラリア原虫（プラスモジウム・ヴィヴァックス）、熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）、四日熱マラリア原虫（プラスモジウム・マラリアエ）、卵形マラリア原虫（プラスモジウム・オバレ）、プラスモジウム・ヨエリ、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ、P. cynomolgi）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ；P. knowlesi）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）に属することを特徴とする請求項２記載のエキソソーム。
【請求項４】
前記エキソソームが、サル、マウスおよび／またはヒトの網状赤血球から単離されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項５】
マラリアに対しての防御および予防に使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項６】
請求項１によるエキソソームを取得する方法であって、
ａ）プラスモジウム種に感染した血液サンプルを取得するステップと、
ｂ）選択肢として、ａ）の血液サンプルから網状赤血球を単離し、培養するステップと、
ｃ）ａ）またはｂ）からの血液サンプルの逐次超遠心分離により、網状赤血球由来のエキソソーム画分を取得するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記血液サンプルが、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、プラスモジウム・ヨエリ（Plasmodium yoelli）、Ｐ．アチオテンセ（P. achiotense）、Ｐ．アクロマチクム（P. achromaticum）、Ｐ．エジプテンシス（P. aegyptensis）、Ｐ．エウミナタム（P. aeuminatum）、Ｐ．アガメ（P. agamae）、Ｐ．アナサム（P. anasum）、Ｐ．アテルリ（P. atheruri）、Ｐ．アズロフィラム（P. azurophilum）、Ｐ．バリ（P. balli）、Ｐ．バブシコライ（P. bambusicolai）、Ｐ．バシリシ（P. basilisci）、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、Ｐ．ビゲチ（P. bigueti）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．ブリグーイ（P. brygooi）、Ｐ．ブーリアチ（P. booliati）、Ｐ．ブバリス（P. bubalis）、Ｐ．ブッキ（P. bucki）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．カテメリウム（P. cathemerium）、Ｐ．セファロフィ（P. cephalophi）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、Ｐ．チリカフエ（P. chiricahuae）、Ｐ．シルクラリス（P. circularis）、Ｐ．クネミドフォリ（P. cnemidophori）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．コゲシャリ（P. coggeshalli）、Ｐ．コロンビエンセ（P. colombiense）、Ｐ．コラデッチ（P. corradettii）、Ｐ．コターニックス（P. coturnix）、Ｐ．クーランゲシ（P. coulangesi）、Ｐ．ククルス（P. cuculus）、Ｐ．ポポ（P. popo）、Ｐ．シクロプシ（P. cyclopsi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ、P. cynomolgi）、Ｐ．ジミヌチバム（P. diminutivum）、Ｐ．ジプログロッシ（P. diploglossi）、Ｐ．ジサナイケイ（P. dissanaikei）、Ｐ．ドミニカナ（P. dominicana）、シチメンチョウマラリア原虫（Ｐ．デュレ；P. durae）、Ｐ．エゲルニエ（P. egerniae）、Ｐ．エロンガタム（P. elongatum）、Ｐ．エイレシ（P. eylesi）、Ｐ．ファベシア（P. fabesia）、Ｐ．フェアチルジ（P. fairchildi）、Ｐ．ファラックス（P. fallax）、Ｐ．フィールジ（P. fieldi）、Ｐ．フォレイ（P. foleyi）、Ｐ．フォレステリ（P. forresteri）、Ｐ．フロリデンセ（P. floridense）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、Ｐ．ガーンハミ（P. garnhami）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ガリナセウム、P. gallinaceum）、Ｐ．ギガンテウム（P. giganteum）、Ｐ．ジョバンノライ（P. giovannolai）、Ｐ．ギラルジ（P. girardi）、Ｐ．ゴナトジ（P. gonatodi）、Ｐ．ゴンデリ（P. gonderi）、Ｐ．ゲオルゲシ（P. georgesi）、Ｐ．グラシリス（P. gracilis）、Ｐ．グリフィスシ（P. griffithsi）、Ｐ．グアンゴング（P. guanggong）、Ｐ．グンデルシ（P. gundersi）、Ｐ．グヤンネンセ（P. guyannense）、Ｐ．ヘイッシ（P. heischi）、Ｐ．ヘグネリ（P. hegneri）、Ｐ．ヘルマニ（P. hermani）、Ｐ．ヘテロヌクレアレ（P. heteronucleare）、Ｐ．ヘキサメリウム（P. hexamerium）、Ｐ．ホラスピ（P. holaspi）、Ｐ．フッフィ（P. huffi）、Ｐ．ヒロバチ（P. hylobati）、Ｐ．イシペーンシス（P. icipeensis）、Ｐ．イノピナタム（P. inopinatum）、サルマラリア原虫（Ｐ．イヌイ、P. inui）、Ｐ．ジェフェリ（P. jefferi）、Ｐ．ジョセフィーネ（P. josephinae）、Ｐ．ジャクスタヌクレアレ（P. juxtanucleare）、Ｐ．ケンピ（P. kempi）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．ケントロピクシ（P. kentropyxi）、Ｐ．リーヌクテウス（P. leanucteus）、Ｐ．レムリス（P. lemuris）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ロフレ、P. lophurae���、Ｐ．レピドプチフォルミス（P. lepidoptiformis）、Ｐ．リゴソメ（P. lygosomae）、Ｐ．マブイエ（P. mabuiae）、Ｐ．マッケラセ（P. mackerrasae）、Ｐ．マクリラブレ（P. maculilabre）、Ｐ．メイオール（P. maior）、Ｐ．マルギナタム（P. marginatum）、Ｐ．マチュチナム（P. matutinum）、Ｐ．メキシカヌム（P. mexicanum）、Ｐ．ミナセンセ（P. minasense）、Ｐ．モルラム（P. morulum）、Ｐ．ヌクレオフィリアム（P. nucleophilium）、Ｐ．オクタメリウム（P. octamerium）、Ｐ．オドコイレイ（P. odocoilei）、Ｐ．パペルナイ（P. papernai）、Ｐ．パラヌクレオフィラム（P. paranucleophilum）、Ｐ．パルブラム（P. parvulum）、Ｐ．ペディオエセチイ（P. pedioecetii）、Ｐ．ペレジ（P. pelaezi）、Ｐ．ペルシガルンハミ（P. percygarnhami）、Ｐ．ペテルシ（P. petersi）、Ｐ．ピファノイ（P. pifanoi）、Ｐ．ピノッティ（P. pinotti）、Ｐ．ピノッリ（P. pinorrii）、サルマラリア原虫（Ｐ．ピテシ、P. pitheci）、Ｐ．ピツマニ（P. pitmani）、Ｐ．ポラレ（P. polare）、トリマラリア原虫（Ｐ．プレコックス、P. praecox）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）、トリマラリア原虫（Ｐ．レリクタム、P. relictum）、Ｐ．ラジヌラム（P. rhadinurum）、Ｐ．ロダイニ（P. rhodaini）、Ｐ．ロビンソニ（P. robinsoni）、Ｐ．ルクシ（P. rouxi）、Ｐ．サンドシャミ（P. sandoshami）、Ｐ．ササイ（P. sasai）、オラウータンマラリア原虫（Ｐ．シュバイツイ、P. schweitzi）、Ｐ．シルバチカム（P. silvaticum）、Ｐ．シミウム（P. simium）、Ｐ．セミオバレ（P. semiovale）、Ｐ．ショルティ（P. shortii）、Ｐ．スミルノビ（P. smirnovi）、Ｐ．サブプレコックス（P. subpraecox）、矮小マラリア原虫（Ｐ．テヌエ、P. tenue）、Ｐ．テジェライ（P. tejerai）、Ｐ．トモドニ（P. tomodoni）、Ｐ．トレアルバイ（P. torrealbai）、Ｐ．トラグリ（P. traguli）、Ｐ．トリボロノッチ（P. tribolonoti）、Ｐ．トロピズリ（P. tropiduri）、Ｐ．ユイレンベルギ（P. uilenbergi）、Ｐ．ワテニ（P. watteni）、Ｐ．ウェニオニ（P. wenyoni）、Ｐ．バキュオラタム（P. vacuolatum）、Ｐ．バスタトール（P. vastator）、Ｐ．ボウガニ（P. vaughani）、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）、Ｐ．ボランス（P. volans）、Ｐ．ヤンギ（P. youngi）に感染したものであり得ることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記血液サンプルが、三日熱マラリア原虫（プラスモジウム・ヴィヴァックス）、熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）、四日熱マラリア原虫（プラスモジウム・マラリアエ）、卵形マラリア原虫（プラスモジウム・オバレ）、プラスモジウム・ヨエリ、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ、P. cynomolgi）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）に感染したものであり得ることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
選択肢としての工程ｂ）における前記網状赤血球の単離を、
ｉ）７００〜１０００×ｇで１５〜２５分間遠心分離すること、
ｉｉ）パーコール勾配で、２００〜３００ｇで２５〜３５分間遠心分離すること、
により実施することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
選択肢としての工程ｂ）における前記網状赤血球の単離を、磁気ビーズシステムにより実施することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）の前記逐次超遠心分離が、
ｉ）４００〜７００×ｇで１５〜２５分間、遠心分離するステップと、
ｉｉ）９００〜１０００×ｇで１５〜２５分間、遠心分離するステップと、
ｉｉｉ）１０，０００〜１４，０００×ｇで２０〜４０分間、遠心分離するステップと、
ｉｖ）９０，０００〜１１０，０００×ｇで１〜３時間、遠心分離するステップと、
を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
プラスモジウム種抗原の発見と同定のための請求項１〜５のいずれか１項に記載のエキソソームの使用。
【請求項１３】
配列番号１を有するか、または配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチド。
【請求項１４】
配列番号２を有するか、または配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチド。
【請求項１５】
少なくとも１種のプラスモジウム種の抗原をその内部またはその表面に含むことを特徴とする人工エキソソーム。
【請求項１６】
前記プラスモジウム種の抗原が、配列番号１を有するか、もしくは配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチド、および／または配列番号２を有するか、もしくは配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチドを含むことを特徴とする請求項１５記載の人工エキソソーム。
【請求項１７】
請求項１〜５および／または１５〜１６のいずれか１項に記載のエキソソームおよび／または請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、および少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜５および／または１５〜１６のいずれか１項に記載のエキソソームおよび／または請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のペプチドを含むことを特徴とするマラリアに対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアの防御および予防のためのワクチンの分野に属し、より詳しくは、プラスモジウム種に感染した網状赤血球由来のエキソソーム、それらの取得方法、マラリアの防御および予防のためのその用途、並びに新規プラスモジウム抗原の発見と同定のためのその使用に関する。また、本発明は、プラスモジウム種抗原を含んでなる人工エキソソームにも関する。最終的に、本発明は、プラスモジウム種に感染した網状赤血球から得られたエキソソームにより見出される特異的抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスモジウム種は、マラリアの原因となる病原性微生物であり、“泥沼熱（paludism）”としても知られる。プラスモジウム属には異なる種が存在するが、そのあるものは無害である。それに対し、他の種は高度に感染性であり、世界中のヒトマラリア症例の大半の原因である。後者の中でも最も重要な種は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum、Ｐ．ファルシパルム）と三日熱マラリア原虫（P. vivax、Ｐ．ヴィヴァックス）である。
【０００３】
ヒトのプラスモジウム種（熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫（P. malariae、Ｐ．マラリアエ）、卵形マラリア原虫（P. ovale、Ｐ．オヴァレ）、東南アジアマラリア原虫（P. knowlesi、ノウレシ））は、すべて、多かれ少なかれ、赤血球および／またはその前駆体、網状赤血球に感染するが、網状赤血球は成熟と分化の過程を必要として、それらの最終的な赤血球としての機能状態に達する。異なるプラスモジウム種の中でも、そのある種のもの、例えば、三日熱マラリア原虫（P. vivax）などは、他の種よりも高い網状赤血球感染能力を有し、このタイプの細胞に優先的に感染する。
【０００４】
網状赤血球が赤血球へと成熟し、分化する過程においては、後者に必要ではないある種のタンパク質が、多小胞体（ＭＶＢ）に位置する内部小胞に取り込まれ、後に、エキソソームとして知られる小さなナノ小胞体として細胞外媒質に放出される。
【０００５】
最近、抗原提示細胞などの他の細胞が、このタイプのナノ小胞体を分泌し得ること、それが網状赤血球の成熟と分化において、当初報告されていた役割以外の役割を有することを示唆しているとの発見の後、エキソソームに関する研究が活気づいてきた。事実、異なる細胞型についてのいくつもの研究が、エキソソームは、それらが免疫応答に際して細胞間の情報を伝達することで、免疫系の調節に役割を果たしており、従って、細胞間の情報伝達の新しい様式を説明するものであることを明らかにしてきた（非特許文献１）。この方針において、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）（プラスモジウムも属するアピコンプレキサ（Apicomplexa）門の一員である）に実験的に感染させたエキソソームの防御能力が証明されている（非特許文献２）。
【０００６】
さらに、ヒトに対する予防薬または免疫促進剤としてのエキソソームの使用に基づくいくつもの戦略が報告されている（非特許文献３）。
【０００７】
取り分け、国際公開第９７／０５９００号は、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹状細胞などの抗原提示細胞から得られるエキソソームについて開示している。この文献に記載されたエキソソームは、それらが抗原提示細胞から得られるものであるために、その抗原がＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩの環境に提示されるという特性を有する。
【０００８】
同様に、欧州特許第１５２３９９０号は、癌細胞（テキソソームと確認）から、または、抗原負荷もしくは非負荷樹状細胞（本文献ではそれらをデキソソームと称する）から得られるエキソソームについて記載している。
【０００９】
国際公開第２００４／０１４９５４号では異なる戦法を用いているが、その理由は、その表面で所望の抗原を示すエキソソームを得るために、ＣＴ２６系統からの細胞（マウス大腸癌）およびＴＡ３ＨＡ系統からの細胞（マウス乳癌）が、所望の抗原（ｍｕｃ−１）をエンコードする配列をそのゲノムに含んでなる組換えウイルスにより形質移入され、結果として、所望の抗原がこの型の細胞から単離されるエキソソームの表面に発現されるからである。
【００１０】
国際公開第００／２８００１号は、本質的に内在性のＭＨＣ分子を欠損するマスト細胞から得られたエキソソームについて記載している。しかし、本文献に記載されているエキソソームは、その表面に組換えＭＨＣを発現する。
【００１１】
最後に、国際公開第２００８／０９２１５３号は、通常、エキソソームに存在する１種以上の免疫抑制ポリペプチドを欠損する癌細胞から得たエキソソームについて記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９７／０５９００号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第１５２３９９０号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０１４９５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／２８００１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８／０９２１５３号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ショーレイおよびバートナガー（Schorey JS and Bhatnagar S）、Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology（エキソソームの機能、腫瘍免疫学から病原体生物学まで）、Traffic (コペンハーゲン、デンマーク) 2008; 9: 871-881
【非特許文献２】バートナガー、シナガワ、カステリーノ、およびショーレイ（Bhatnagar S, Shinagawa K, Castellino FJ and Schorey JS）、Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo（細胞内病原体に感染したマクロファージから放出されるエキソソームはインビトロおよびインビボにおいて前炎症性応答を促進する）、Blood2007; 110: 3234-3244
【非特許文献３】ヴィオウド、ウルリッヒ、ジトヴォーゲル、およびチャプット（Viaud S, Ullrich E, Zitvogel L and Chaput N）、Exosomes for the treatment of human malignancies（ヒト悪性疾患治療用のエキソソーム）、Horm Metab Res 2008; 40: 82-88
【非特許文献４】リボウト、ベーリイ、シェバレイら（Ribaut C, Berry A, Chevalley S et al）、Concentration and purification by magnetic separation of the erythrocytic stages of all human Plasmodium species（ヒトプラスモジウム種すべての赤血球段階の磁気分離による濃縮と精製）。Malaria journal 2008; 7: 45
【非特許文献５】ストーンおよびウイリアムス（Stone KL and Williams KR）、In The protein protocol handbook（タンパク質プロトコールハンドブック）、編集、Walker JM, Totowa, NJ: Humana Press Inc.; 1996
【非特許文献６】ジュラド、ラエル、リーブら（Jurado JD, Rael ED, Lieb CS et al）、Complement inactivating proteins and intraspecies venom variation in Crotalus oreganus helleri（クロタラス・オルガナス・ヘレリにおけるタンパク質不活化補体および種内毒液変動）、Toxicon2007; 49: 339-350
【非特許文献７】エリアスおよびギューギイ（Elias JE and Gygi SP）、Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry（質量分析法による大規模タンパク質同定における信頼性増大のための目標おとり検索戦略）。Nat Methods 2007; 4: 207-214
【非特許文献８】デルポルチロ、フェルナンデス−ベセラ、ボウマンら（del Portillo HA, Fernandez-Becerra C, Bowman S et al）、A superfamily of variant genes encoded in the subtelomeric region of Plasmodium vivax（三日熱マラリア原虫のサブテロメア領域にエンコードされた変異遺伝子のスーパーファミリー）、 Nature 2001; 410: 839-842
【非特許文献９】カールトン、アダムス、シルバら（Carlton JM, Adams JH, Silva JC et al）、Comparative genomics of the neglected human malaria parasite Plasmodium vivax（放置されたヒトマラリア寄生虫プラスモジウム・ヴィヴァックスの比較ゲノミクス）、Nature2008; 455: 757-763
【非特許文献１０】トンキン、ヴァンドーレン、スパーックら（Tonkin CJ, van Dooren GG, Spurck TP et al）、Localization of organellar proteins in Plasmodium falciparum using a novel set of transfection vectors and a new immunofluorescence fixation method（形質導入ベクターの新規セットおよび新しい免疫蛍光固定化法を用いるプラスモジウム・ファルシパラム中のオルガネラタンパク質の局在部位）、Mol Biochem Parasitol 2004; 137: 13-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の著者らは、この度、プラスモジウムに感染したマウスモデルまたは被験対象の網状赤血球からエキソソームを単離し使用して、マラリアを防御または予防する新規の戦法を開発した。これらのエキソソームは、プラスモジウム種で感染させた末梢血から、または当該末梢血から予め取得した網状赤血球のインビトロ培養物から取得する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の目的は、少なくとも１種のプラスモジウム種抗原をその内部もしくはその表面に含んでなる血漿／網状赤血球の培養物から単離したエキソソームによって表される（以下、本発明のエキソソームとする）。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のエキソソームは、マラリアに対して免疫原性能力を示し、従って、本疾患の防御および予防のためのワクチンの調製において、非常に有力な有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マウス血漿から単離したエキソソームの特性化を描写する図である。（Ａ）動的光散乱による粒度分析、（Ｂ）２％パラホルムアルデヒドで固定した後の陰性染色を示す。縮尺は１００ｎｍを表す。
【図２】（Ａ）対照マウスおよびプラスモジウム・ヨエリ（P. yoelii）１７Ｘ感染マウスの血液から単離した網状赤血球のギームザ染色、（Ｂ）網状赤血球からの陰性染色エキソソームのＥＭ画像を示す。縮尺バーは２００ｎｍを表す。
【図３】寄生虫血の経時的進化と、エキソソームで免疫したマウスの細胞向性の分析を描出する図である。寄生虫血曲線は、２匹の非免疫対照マウス、正常動物の血液から単離したエキソソームで免疫した２匹の対照マウス、Ｐ．ヨエリの非致死性株を感染させた動物から得たエキソソームで免疫した３匹のマウス、およびＰ．ヨエリの致死性株を感染させた動物から得たエキソソームで免疫した３匹のマウスの平均値から計算した。各群の代表動物の、屠殺前日の末梢血塗抹に対するギームザ染色。
【図４】（Ａ）生存曲線、および（Ｂ）予めｅｘＣ（ｎ＝６）およびｅｘＰｙＮＬ（ｎ＝６）で免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウス群のプラスモジウム・ヨエリ（P. yoelii）１７ＸＬ感染の経時的寄生虫血症を示す図である。非免疫マウス（ｎ＝５）は未処理とした。
【図５】エキソソームで免疫した動物血清中の抗Ｐ．ヨエリＩｇＧ抗体の応答についてのウエスタンブロット分析を示す図である。サンプルは２度目の免疫後、２０日目に上顎穿刺により採取した。各パネルは、これらの実験に使用した各動物群の血清混合物に相当する。ウエスタンブロットにおいては、Ｐ．ヨエリの非致死性株（ＡｇＮＬ）および致死性株（ＡｇＬ）から得られた総抗原を使用し、ＩｇＧ抗体の応答は、アルカリホスファターゼに結合し、マウスＩｇＧに対して産生させたヤギ血清を使用することにより検出した。
【図６】Ｐ．ヨエリの非致死性株を感染させたマウスの血液からのエキソソームで免疫した動物中のＴ細胞、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の細胞内染色分析を描出する図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣｐＧ−ＯＤＮ中のＰｙＮＬエキソソーム５マイクログラムで免疫した。最初の免疫から２週間後に、ＣｐＧ−ＯＤＮを含まないエキソソーム５マイクログラムによる追加免疫を実施した。（Ａ）ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋の割合は、インビトロの再刺激、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析後に計算した。ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋であるＣＳＦＥｌｏリンパ球の割合は（Ｂ）に示し、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋の割合は（Ｃ）に示す。データは、１回の実験に相当するものであり、３匹の非免疫マウスと、非致死性ｅｘＰｙＮＬ株を感染させたマウスに由来するエキソソームで免疫した３匹のマウスの平均±標準誤差として表す。
【図７】１７ＸＬ−ｐＲＢＣを認識する免疫血清の明視野像および蛍光像を示す図である。ＮＩ＝非免疫マウスからの血清、ｅｘＣ＝非感染マウスＲＥＸからのエキソソームで免疫したマウスからの血清、ｅｘＰｙＩ＝Ｐ．ヨエリＮＬ−感染動物からのＲＥＸで免疫した２匹のマウスからの血清を示す。
【図８Ａ】Ｐ．ヨエリに感染したマウスからの、またはＰ．ヴィヴァックスに感染した患者からの末梢血由来エキソソームに存在する抗原のプロテオミクス分析により得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。該スペクトルの生命情報科学分析は、分析したエキソソームサンプル中に、Ｐ．ヨエリおよびＰ．ヴィヴァックス双方の抗原が存在することを確実に示す。
【図８Ｂ】Ｐ．ヨエリに感染したマウスからの、またはＰ．ヴィヴァックスに感染した患者からの末梢血由来エキソソームに存在する抗原のプロテオミクス分析により得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。該スペクトルの生命情報科学分析は、分析したエキソソームサンプル中に、Ｐ．ヨエリおよびＰ．ヴィヴァックス双方の抗原が存在することを確実に示す。
【図８Ｃ】Ｐ．ヨエリに感染したマウスからの、またはＰ．ヴィヴァックスに感染した患者からの末梢血由来エキソソームに存在する抗原のプロテオミクス分析により得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。該スペクトルの生命情報科学分析は、分析したエキソソームサンプル中に、Ｐ．ヨエリおよびＰ．ヴィヴァックス双方の抗原が存在することを確実に示す。
【図８Ｄ】Ｐ．ヨエリに感染したマウスからの、またはＰ．ヴィヴァックスに感染した患者からの末梢血由来エキソソームに存在する抗原のプロテオミクス分析により得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。該スペクトルの生命情報科学分析は、分析したエキソソームサンプル中に、Ｐ．ヨエリおよびＰ．ヴィヴァックス双方の抗原が存在することを確実に示す。
【図９】Ａ）Ｖｉｒ多重遺伝子族保存モチーフの模式図、Ｂ）ＶｉｒペプチドＬＰ１（左）とＶｉｒペプチドＬＰ２（右）の模式図である。
【図１０】ブラジルの地域流行性領域からの一部の血清が、合成長鎖ペプチドを認識し得ることを示すバイオプレックス（Bioplex）アッセイを示す図である。
【図１１】抗−Ｌｐ１（Ａ）および抗−Ｌｐ２（Ｂ）が、三日熱マラリア原虫自然感染のＶｉｒタンパク質を同定し得ることを示す免疫蛍光アッセイを示す図である。
【図１２】Ｌｐ１およびＬｐ２ペプチドを含んでなる免疫金標識人工エキソソームの画像並びにそれらの組成中の画像である。該エキソソームは、７９：２０：１のモル比の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、および４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリルホスファチジルエタノールアミン（ＭＢＰ−ＰＥ）を含む。免疫標識は、ＬＰ１およびＬＰ２Ｖｉｒペプチドに対する抗体で実施し、次いで、プロテインＡ−金とインキュベートすることにより行った。縮尺バーは２００ｎｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のエキソソームに存在する抗原または抗原類は、いずれのプラスモジウム種からも由来し得る。本発明の特定の実施態様において、該エキソソームに存在する抗原または抗原類は、以下のプラスモジウム種に由来する：三日熱マラリア原虫（Ｐ．ヴィヴァックス、P. vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ファルシパルム、P. falciparum）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．マラリアエ、P. malariae）、卵形マラリア原虫（Ｐ．オバレ、P. ovale）、Ｐ．ヨエリ（P. yoelli）、Ｐ．アチオテンセ（P. achiotense）、Ｐ．アクロマチクム（P. achromaticum）、Ｐ．エジプテンシス（P. aegyptensis）、Ｐ．エウミナタム（P. aeuminatum）、Ｐ．アガメ（P. agamae）、Ｐ．アナサム（P. anasum）、Ｐ．アテルリ（P. atheruri）、Ｐ．アズロフィラム（P. azurophilum）、Ｐ．バリ（P. balli）、Ｐ．バブシコライ（P. bambusicolai）、Ｐ．バシリシ（P. basilisci）、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、Ｐ．ビゲチ（P. bigueti）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム；P. brasilianum）、Ｐ．ブリグーイ（P. brygooi）、Ｐ．ブーリアチ（P. booliati）、Ｐ．ブバリス（P. bubalis）、Ｐ．ブッキ（P. bucki）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．カテメリウム（P. cathemerium）、Ｐ．セファロフィ（P. cephalophi）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、Ｐ．チリカフエ（P. chiricahuae）、Ｐ．シルクラリス（P. circularis）、Ｐ．クネミドフォリ（P. cnemidophori）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．コゲシャリ（P. coggeshalli）、Ｐ．コロンビエンセ（P. colombiense）、Ｐ．コラデッチ（P. corradettii）、Ｐ．コターニックス（P. coturnix）、Ｐ．クーランゲシ（P. coulangesi）、Ｐ．ククルス（P. cuculus）、Ｐ．ポポ（P. popo）、Ｐ．シクロプシ（P. cyclopsi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ；P. cynomolgi）、Ｐ．ジミヌチバム（P. diminutivum）、Ｐ．ジプログロッシ（P. diploglossi）、Ｐ．ジサナイケイ（P. dissanaikei）、Ｐ．ドミニカナ（P. dominicana）、シチメンチョウマラリア原虫（Ｐ．デュレ、P. durae）、Ｐ．エゲルニエ（P. egerniae）、Ｐ．エロンガタム（P. elongatum）、Ｐ．エイレシ（P. eylesi）、Ｐ．ファベシア（P. fabesia）、Ｐ．フェアチルジ（P. fairchildi）、Ｐ．ファラックス（P. fallax）、Ｐ．フィールジ（P. fieldi）、Ｐ．フォレイ（P. foleyi）、Ｐ．フォレステリ（P. forresteri）、Ｐ．フロリデンセ（P. floridense）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、Ｐ．ガーンハミ（P. garnhami）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ガリナセウム、P. gallinaceum）、Ｐ．ギガンテウム（P. giganteum）、Ｐ．ジョバンノライ（P. giovannolai）、Ｐ．ギラルジ（P. girardi）、Ｐ．ゴナトジ（P. gonatodi）、Ｐ．ゴンデリ（P. gonderi）、Ｐ．ゲオルゲシ（P. georgesi）、Ｐ．グラシリス（P. gracilis）、Ｐ．グリフィスシ（P. griffithsi）、Ｐ．グアンゴング（P. guanggong）、Ｐ．グンデルシ（P. gundersi）、Ｐ．グヤンネンセ（P. guyannense）、Ｐ．ヘイッシ（P. heischi）、Ｐ．ヘグネリ（P. hegneri）、Ｐ．ヘルマニ（P. hermani）、Ｐ．ヘテロヌクレアレ（P. heteronucleare）、Ｐ．ヘキサメリウム（P. hexamerium）、Ｐ．ホラスピ（P. holaspi）、Ｐ．フッフィ（P. huffi）、Ｐ．ヒロバチ（P. hylobati）、Ｐ．イシペーンシス（P. icipeensis）、Ｐ．イノピナタム（P. inopinatum）、サルマラリア原虫（Ｐ．イヌイ、P. inui）、Ｐ．ジェフェリ（P. jefferi）、Ｐ．ジョセフィーネ（P. josephinae）、Ｐ．ジャクスタヌクレアレ（P. juxtanucleare）、Ｐ．ケンピ（P. kempi）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．ケントロピクシ（P. kentropyxi）、Ｐ．リーヌクテウス（P. leanucteus）、Ｐ．レムリス（P. lemuris）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ロフレ、P. lophurae）、Ｐ．レピドプチフォルミス（P. lepidoptiformis）、Ｐ．リゴソメ（P. lygosomae）、Ｐ．マブイエ（P. mabuiae）、Ｐ．マッケラセ（P. mackerrasae）、Ｐ．マクリラブレ（P. maculilabre）、Ｐ．メイオール（P. maior）、Ｐ．マルギナタム（P. marginatum）、Ｐ．マチュチナム（P. matutinum）、Ｐ．メキシカヌム（P. mexicanum）、Ｐ．ミナセンセ（P. minasense）、Ｐ．モルラム（P. morulum）、Ｐ．ヌクレオフィリアム（P. nucleophilium）、Ｐ．オクタメリウム（P. octamerium）、Ｐ．オドコイレイ（P. odocoilei）、Ｐ．パペルナイ（P. papernai）、Ｐ．パラヌクレオフィラム（P. paranucleophilum）、Ｐ．パルブラム（P. parvulum）、Ｐ．ペディオエセチイ（P. pedioecetii）、Ｐ．ペレジ（P. pelaezi）、Ｐ．ペルシガルンハミ（P. percygarnhami）、Ｐ．ペテルシ（P. petersi）、Ｐ．ピファノイ（P. pifanoi）、Ｐ．ピノッティ（P. pinotti）、Ｐ．ピノッリ（P. pinorrii）、サルマラリア原虫（Ｐ．ピテシ、P. pitheci）、Ｐ．ピツマニ（P. pitmani）、Ｐ．ポラレ（P. polare）、トリマラリア原虫（Ｐ．プレコックス、P. praecox）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）、トリマラリア原虫（Ｐ．レリクタム、P. relictum）、Ｐ．ラジヌラム（P. rhadinurum）、Ｐ．ロダイニ（P. rhodaini）、Ｐ．ロビンソニ（P. robinsoni）、Ｐ．ルクシ（P. rouxi）、Ｐ．サンドシャミ（P. sandoshami）、Ｐ．ササイ（P. sasai）、オラウータンマラリア原虫（Ｐ．シュバイツイ、P. schweitzi）、Ｐ．シルバチカム（P. silvaticum）、Ｐ．シミウム（P. simium）、Ｐ．セミオバレ（P. semiovale）、Ｐ．ショルティ（P. shortii）、Ｐ．スミルノビ（P. smirnovi）、Ｐ．サブプレコックス（P. subpraecox）、矮小マラリア原虫（Ｐ．テヌエ、P. tenue）、Ｐ．テジェライ（P. tejerai）、Ｐ．トモドニ（P. tomodoni）、Ｐ．トレアルバイ（P. torrealbai）、Ｐ．トラグリ（P. traguli）、Ｐ．トリボロノッチ（P. tribolonoti）、Ｐ．トロピズリ（P. tropiduri）、Ｐ．ユイレンベルギ（P. uilenbergi）、Ｐ．ワテニ（P. watteni）、Ｐ．ウェニオニ（P. wenyoni）、Ｐ．バキュオラタム（P. vacuolatum）、Ｐ．バスタトール（P. vastator）、Ｐ．ボウガニ（P. vaughani）、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）、Ｐ．ボランス（P. volans）、またはＰ．ヤンギ（P. youngi）。
【００１９】
本発明の好適な実施態様において、該エキソソームは、ヒト、サル、および／または齧歯類に感染するプラスモジウム種に由来する抗原を含んでなる、すなわち、本発明の好適な実施態様において、エキソソームの内部または表面に存在する当該抗原または抗原類は、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、プラスモジウム・ヨエリ（Plasmodium yoelli）、Ｐ．ベルゲイ（P. berghei）、Ｐ．ブラシリアヌム（P. brasilianum）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、Ｐ．シノモルギ（P. cynomolgi）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、Ｐ．ノウレシ（P. knowlesi）、またはＰ．レイチェノウイ（P. reichenowi）に属する。
【００２０】
本発明のエキソソームは、プラスモジウム種に感染したいずれかの哺乳動物の網状赤血球から分離し得るが、好ましくは、ヒト、サルおよび／またはマウスの網状赤血球から分離する。好適な実施態様では、ヒトの網状赤血球を使用するようにして、それらをヒトの患者に投与したときに、できる限り不所望の反応を予防するようにする。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、本発明のエキソソームを取得する方法によって象徴され、その方法は、
ａ）プラスモジウム種に感染した血液サンプルを取得すること、
ｂ）選択肢として、ａ）の血液サンプルから網状赤血球を単離し、培養すること、
ｃ）ａ）またはｂ）からの血液サンプルの逐次超遠心分離により、網状赤血球由来のエキソソーム画分を取得すること、
を特徴とする。
【００２２】
特定の実施態様において、該血液サンプルは以下のプラスモジウム種に感染した血液であってもよい。三日熱マラリア原虫（Ｐ．ヴィヴァックス、P. vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ファルシパルム、P. falciparum）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．マラリアエ、P. malariae）、卵形マラリア原虫（Ｐ．オバレ、P. ovale）、Ｐ．ヨエリ（P. yoelli）、Ｐ．アチオテンセ（P. achiotense）、Ｐ．アクロマチクム（P. achromaticum）、Ｐ．エジプテンシス（P. aegyptensis）、Ｐ．エウミナタム（P. aeuminatum）、Ｐ．アガメ（P. agamae）、Ｐ．アナサム（P. anasum）、Ｐ．アテルリ（P. atheruri）、Ｐ．アズロフィラム（P. azurophilum）、Ｐ．バリ（P. balli）、Ｐ．バブシコライ（P. bambusicolai）、Ｐ．バシリシ（P. basilisci）、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、Ｐ．ビゲチ（P. bigueti）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．ブリグーイ（P. brygooi）、Ｐ．ブーリアチ（P. booliati）、Ｐ．ブバリス（P. bubalis）、Ｐ．ブッキ（P. bucki）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．カテメリウム（P. cathemerium）、Ｐ．セファロフィ（P. cephalophi）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、Ｐ．チリカフエ（P. chiricahuae）、Ｐ．シルクラリス（P. circularis）、Ｐ．クネミドフォリ（P. cnemidophori）、Ｐ．コートネイ（P. coatneyi）、Ｐ．コゲシャリ（P. coggeshalli）、Ｐ．コロンビエンセ（P. colombiense）、Ｐ．コラデッチ（P. corradettii）、Ｐ．コターニックス（P. coturnix）、Ｐ．クーランゲシ（P. coulangesi）、Ｐ．ククルス（P. cuculus）、Ｐ．ポポ（P. popo）、Ｐ．シクロプシ（P. cyclopsi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ、P. cynomolgi）、Ｐ．ジミヌチバム（P. diminutivum）、Ｐ．ジプログロッシ（P. diploglossi）、Ｐ．ジサナイケイ（P. dissanaikei）、Ｐ．ドミニカナ（P. dominicana）、シチメンチョウマラリア原虫（Ｐ．デュレ、P. durae）、Ｐ．エゲルニエ（P. egerniae）、Ｐ．エロンガタム（P. elongatum）、Ｐ．エイレシ（P. eylesi）、Ｐ．ファベシア（P. fabesia）、Ｐ．フェアチルジ（P. fairchildi）、Ｐ．ファラックス（P. fallax）、Ｐ．フィールジ（P. fieldi）、Ｐ．フォレイ（P. foleyi）、Ｐ．フォレステリ（P. forresteri）、Ｐ．フロリデンセ（P. floridense）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、Ｐ．ガーンハミ（P. garnhami）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ガリナセウム、P. gallinaceum）、Ｐ．ギガンテウム（P. giganteum）、Ｐ．ジョバンノライ（P. giovannolai）、Ｐ．ギラルジ（P. girardi）、Ｐ．ゴナトジ（P. gonatodi）、Ｐ．ゴンデリ（P. gonderi）、Ｐ．ゲオルゲシ（P. georgesi）、Ｐ．グラシリス（P. gracilis）、Ｐ．グリフィスシ（P. griffithsi）、Ｐ．グアンゴング（P. guanggong）、Ｐ．グンデルシ（P. gundersi）、Ｐ．グヤンネンセ（P. guyannense）、Ｐ．ヘイッシ（P. heischi）、Ｐ．ヘグネリ（P. hegneri）、Ｐ．ヘルマニ（P. hermani）、Ｐ．ヘテロヌクレアレ（P. heteronucleare）、Ｐ．ヘキサメリウム（P. hexamerium）、Ｐ．ホラスピ（P. holaspi）、Ｐ．フッフィ（P. huffi）、Ｐ．ヒロバチ（P. hylobati）、Ｐ．イシペーンシス（P. icipeensis）、Ｐ．イノピナタム（P. inopinatum）、サルマラリア原虫（Ｐ．イヌイ、P. inui）、Ｐ．ジェフェリ（P. jefferi）、Ｐ．ジョセフィーネ（P. josephinae）、Ｐ．ジャクスタヌクレアレ（P. juxtanucleare）、Ｐ．ケンピ（P. kempi）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．ケントロピクシ（P. kentropyxi）、Ｐ．リーヌクテウス（P. leanucteus）、Ｐ．レムリス（P. lemuris）、ニワトリマラリア原虫（Ｐ．ロフレ、P. lophurae）、Ｐ．レピドプチフォルミス（P. lepidoptiformis）、Ｐ．リゴソメ（P. lygosomae）、Ｐ．マブイエ（P. mabuiae）、Ｐ．マッケラセ（P. mackerrasae）、Ｐ．マクリラブレ（P. maculilabre）、Ｐ．メイオール（P. maior）、Ｐ．マルギナタム（P. marginatum）、Ｐ．マチュチナム（P. matutinum）、Ｐ．メキシカヌム（P. mexicanum）、Ｐ．ミナセンセ（P. minasense）、Ｐ．モルラム（P. morulum）、Ｐ．ヌクレオフィリアム（P. nucleophilium）、Ｐ．オクタメリウム（P. octamerium）、Ｐ．オドコイレイ（P. odocoilei）、Ｐ．パペルナイ（P. papernai）、Ｐ．パラヌクレオフィラム（P. paranucleophilum）、Ｐ．パルブラム（P. parvulum）、Ｐ．ペディオエセチイ（P. pedioecetii）、Ｐ．ペレジ（P. pelaezi）、Ｐ．ペルシガルンハミ（P. percygarnhami）、Ｐ．ペテルシ（P. petersi）、Ｐ．ピファノイ（P. pifanoi）、Ｐ．ピノッティ（P. pinotti）、Ｐ．ピノッリ（P. pinorrii）、サルマラリア原虫（Ｐ．ピテシ、P. pitheci）、Ｐ．ピツマニ（P. pitmani）、Ｐ．ポラレ（P. polare）、トリマラリア原虫（Ｐ．プレコックス、P. praecox）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）、トリマラリア原虫（Ｐ．レリクタム、P. relictum）、Ｐ．ラジヌラム（P. rhadinurum）、Ｐ．ロダイニ（P. rhodaini）、Ｐ．ロビンソニ（P. robinsoni）、Ｐ．ルクシ（P. rouxi）、Ｐ．サンドシャミ（P. sandoshami）、Ｐ．ササイ（P. sasai）、オラウータンマラリア原虫（Ｐ．シュバイツイ、P. schweitzi）、Ｐ．シルバチカム（P. silvaticum）、Ｐ．シミウム（P. simium）、Ｐ．セミオバレ（P. semiovale）、Ｐ．ショルティ（P. shortii）、Ｐ．スミルノビ（P. smirnovi）、Ｐ．サブプレコックス（P. subpraecox）、矮小マラリア原虫（Ｐ．テヌエ、P. tenue）、Ｐ．テジェライ（P. tejerai）、Ｐ．トモドニ（P. tomodoni）、Ｐ．トレアルバイ（P. torrealbai）、Ｐ．トラグリ（P. traguli）、Ｐ．トリボロノッチ（P. tribolonoti）、Ｐ．トロピズリ（P. tropiduri）、Ｐ．ユイレンベルギ（P. uilenbergi）、Ｐ．ワテニ（P. watteni）、Ｐ．ウェニオニ（P. wenyoni）、Ｐ．バキュオラタム（P. vacuolatum）、Ｐ．バスタトール（P. vastator）、Ｐ．ボウガニ（P. vaughani）、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）、Ｐ．ボランス（P. volans）、またはＰ．ヤンギ（P. youngi）。
【００２３】
しかし、本発明の好適な実施態様において、該血液サンプルは、三日熱マラリア原虫（プラスモジウム・ヴィヴァックス）、熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）、四日熱マラリア原虫（プラスモジウム・マラリアエ）、卵形マラリア原虫（プラスモジウム・オバレ）、プラスモジウム・ヨエリ、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ、P. cynomolgi）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）に感染したものである。
【００２４】
本方法の工程ｂ）は任意工程であるが、それを実施することが本発明の好適な選択肢である。工程ｂ）を実施することにより、エキソソーム画分が、網状赤血球由来のエキソソームとしてより純度の高いものとなる。工程ｂ）を実施しない場合、該エキソソーム画分は、例えば、樹状細胞などの網状赤血球以外の他の細胞型からの微量のエキソソームを含み得る。
【００２５】
全血サンプルからの網状赤血球の単離は、
ｉ）７００〜１０００×ｇで１５〜２５分間遠心分離すること、
ｉｉ）パーコール勾配にて、２００〜３００ｇで２５〜３５分間遠心分離すること、
により実施し得る。
【００２６】
工程ｂ）における網状赤血球の単離はまた、磁気ビーズシステムを使用することによっても実施し得る。例えば、磁気ビーズは抗ＣＤ７１抗体に接合させるのがよいが、その理由は、ＣＤ７１が網状赤血球の主要表面マーカであるからである。
【００２７】
網状赤血球の単離の後、これらは一般的な条件下にインビトロで培養する。
【００２８】
本方法の工程ｃ）は、工程ａ）からの血液サンプルから、または工程ｂ）からのインビトロ培養網状赤血球から、逐次超遠心分離する工程を含む。
【００２９】
特定および好適な実施態様において、逐次超遠心分離は、以下を含む。
ｉ）４００〜７００×ｇで１５〜２５分間、遠心分離すること、
ｉｉ）９００〜１０００×ｇで１５〜２５分間、遠心分離すること、
ｉｉｉ）１０，０００〜１４，０００×ｇで２０〜４０分間、遠心分離すること、
ｉｖ）９０，０００〜１１０，０００×ｇで１〜３時間、遠心分離すること。
【００３０】
選択肢として、この最初の逐次超遠心分離の後、得られるペレットを緩衝液、好ましくは、ＰＢＳに懸濁し、次いで、エキソソーム画分を粒子径によって弁別するフィルタ（フィルタは約０．２０μｍの孔径を有するものとする）で濾過する。この操作の後、好ましくは、９０，０００〜１１，０００×ｇで１〜３時間、再度遠心分離する。
【００３１】
逐次遠心分離は、好ましくは、０〜７℃の低温で実施し、精製したエキソソームのタンパク質およびタンパク質構造の完全性を保存するようにしなければならない。
【００３２】
エキソソームを直接全血から取得する場合、すなわち、本方法の工程ｂ）を実施しない場合、通常、大半、網状赤血球由来のエキソソームにより形成されるエキソソーム画分が取得される。しかしながら、この画分は他の血液細胞型に由来するエキソソームの画分を僅かながら含有し得る。
【００３３】
得られる画分は、網状赤血球由来のエキソソームが十分に高濃度であるが、選択肢として、さらに高濃度の画分を所望する場合には、得られたエキソソーム画分を免疫単離による精製方法に付してもよい。免疫単離はエキソソーム中に存在する網状赤血球の特定の分子に対する特異的抗体を使用すること意味する。特定の実施態様において、免疫単離は、トランスフェリン受容体に対する特異的抗体を用いることによって実施してもよい。
【００３４】
網状赤血球由来のエキソソームの免疫単離は、トランスフェリン受容体に対する抗体を被覆した磁気ビーズにより実施し得る。網状赤血球由来のエキソソームは、一旦、抗−トランスフェリン受容体抗体を介して磁気ビーズに付着させ、そこから酸処理によって分離することができる。
【００３５】
本発明のエキソソームの分析は、実施例にて説明するように、プラスモジウム種の内部または表面に存在する抗原の発見と同定を可能とする。この意味で、本発明の目的は、プラスモジウム種抗原の発見と同定のために、プラスモジウム種を感染させた網状赤血球から単離したエキソソームを使用することでもある。
【００３６】
本発明にて同定された抗原の一つは、プラスモジウム・ヨエリからのタンパク質Ｙｉｒである（このものは三日熱マラリア原虫からのタンパク質Ｖｉｒのオーソログである）。このタンパク質から、本発明者らは２種類のＶｉｒ誘導ペプチドを開発した。これらのペプチドはモルモットの免疫で抗原性を示し、患者のＰ．ヴィヴァックス感染網状赤血球を認識する特異的ＩｇＧ免疫応答を惹起し得ることが証明された。
【００３７】
従って、本発明の目的は、また、配列番号１を有するか、または配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチド、並びに配列番号１を有するか、または配列番号２と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチドである。これらのペプチドは、それぞれＬｐ１およびＬｐ２と呼称されている。
【００３８】
本発明のもう一つの側面は、その内部またはその表面に少なくとも１種のプラスモジウム種抗原を含んでなる人工エキソソームである。
【００３９】
該人工エキソソームは既知の方法（デラ・ペナ、de la Pena et al. 2009）により開発されたものであり、Ｌｐ１およびＬｐ２と同定されたプラスモジウム抗原を含んでなるが、他のいずれのプラスモジウム抗原をその人工エキソソーム製剤中に取り込んでいてもよい。人工エキソソームの使用は、免疫した患者に起こる自己免疫応答の危険を低減する。
【００４０】
本発明の好適な実施態様において、該人工エキソソームは、主として、サル、マウスまたはヒトに感染するプラスモジウム種からの抗原に結合させる。かかる抗原は、例えば、三日熱マラリア原虫（プラスモジウム・ヴィヴァックス）、熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）、四日熱マラリア原虫（プラスモジウム・マラリアエ）、卵形マラリア原虫（プラスモジウム・オバレ）、プラスモジウム・ヨエリ、齧歯類マラリア原虫（Ｐ．ベルゲイ、P. berghei）、ブラジルマラリア原虫（Ｐ．ブラシリアヌム、P. brasilianum）、Ｐ．チャボウディ（P. chabaudi）、サルマラリア原虫（Ｐ．シノモルギ；P. cynomolgi）、Ｐ．フラジル（P. fragile）、サルマラリア原虫（Ｐ．ノウレシ、P. knowlesi）、Ｐ．レイチェノウイ（P. reichenowi）である。好適な実施態様において、該人工エキソソームは、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）または卵形マラリア原虫（P. ovale）などの抗原である。
【００４１】
本発明の好適な実施態様は、配列番号１または配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチド、および／または配列番号２または配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有するＶｉｒ由来のペプチドを含むプラスモジウム種の抗原を含んでなる人工エキソソームによって象徴される。
【００４２】
本発明のもう一つの目的は、本発明のエキソソームもしくは本発明の人工エキソソーム、および／または配列番号１および／または配列番号２のペプチドまたは配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも８５％の相同性を有するペプチド、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含んでなる医薬組成物である。
【００４３】
該添加剤は、担体、支持物質、滑沢剤、充填剤、溶剤、希釈剤、着色剤、矯味剤（例えば、糖）、抗酸化剤および／または結合剤から選択し得る。これらの補助物質および／または添加剤の選択、および使用すべき量の選択は、該医薬組成物の適用形態に左右されよう。
【００４４】
本発明による医薬組成物は、経口投与または非経口投与のいずれの投与形態にも適合可能であり、例えば、経肺経路、鼻腔経路、直腸経路および／または静脈内経路による投与形態に適合し得る。従って、本発明による製剤は局所または全身投与、具体的には、皮膚、皮下、筋肉内、関節内、腹腔内、胸腔内、口腔内、舌下、鼻腔内、経皮、膣内、経口または非経口投与に適合させ得る。
【００４５】
本発明の最終的目的は、マラリアに対するワクチンであって、本発明のエキソソームもしくは本発明の人工エキソソーム、および／または配列番号１および／または配列番号２のペプチドまたは配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも８５％の相同性を有するペプチドを含んでなるワクチンである。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、その範囲を限定しようとするものではない。
【００４７】
＜実施例１：エキソソームの精製＞
［１．１．マウス血液からの直接の精製］
エキソソームはＥＤＴＡ中に採血したマウス血液から取得した血漿から精製した。Ｐ．ヨエリ１７Ｘおよび１７ＸＬ株による感染および非感染のＢａｌｂ／ｃマウス（１０〜４０％寄生虫血症）の血漿を使用した。エキソソームを分離するために、血清を４℃で、５００×ｇで３０分間、１２０００×ｇで３５分間および１００，０００×ｇで２時間、逐次遠心分離した。最終の沈殿物をＰＢＳに再懸濁し（通常、血清の当初容量の５×）、０．２２μｍのフィルタで濾過し、４℃で２時間、１００，０００×ｇで遠心分離した。沈殿物を１×ＰＢＳに再懸濁し、回収されるタンパク質の量をブラドフォードアッセイにより定量した。血清１．５ｍｌから、約５マイクログラムのエキソソームを得る。得られた物質を直ちに使用するか、または急速冷却により凍結して、−８０℃で保存する。
【００４８】
エキソソームを動的光散乱（ＤＬＳ）および電子顕微鏡（ＥＭ）により分析して、その純度を確認し、形態を観察した（図１）。ＤＬＳ測定には、ゼータサイザーナノＳ（Zetasizer Nano S）(マルバーンインスツルーメント、Malvern Instruments)を使用して、２５℃のＰＢＳ中、０．１μｇ／μｌの懸濁液５０μｌにつき分析した。ＥＭによる分析は２％パラホルムアルデヒド中、４℃で一夜固定した新鮮なエキソソーム標品で操作した。エキソソームを１分間フォームバーグリッドに載置した後、蒸留水で洗浄した。酢酸ウラニル／蒸留水の２％溶液で１分間、グリッドを陰性染色した。完全に乾燥した後、グリッドをＪＥＯＬ１０１０透過電子顕微鏡下で観察した。両技法により、エキソソームについて先に記載したサイズに匹敵する直径をもつナノ小胞の均一な個体群が明らかになった。
【００４９】
［１．２．マウスのインビトロ培養網状赤血球からの精製］
エキソソームを網状赤血球培養液の上清から精製した。網状赤血球は、ＥＤＴＡ中に採血したマウス血液から取得した。Ｐ．ヨエリ１７Ｘ株による感染および非感染のＢａｌｂ／ｃマウス（２０〜４０％寄生虫血症）の血液を使用した。網状赤血球を分離するために、血液を７００〜１０００×ｇで２０分間遠心分離した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した後、血液からの網状赤血球は、パーコール／ＮａＣｌ密度勾配の頂部に積層することにより精製した。そうするために、パーコール溶液（密度、１．０９６ｇ／ｍＬ）５ミリリットルを１５ｍＬ容量のチューブに入れた。パーコール（密度、１．０５８ｇ／ｍＬ）２ミリリットルをその上に積層した。最終ヘマトクリット５０％までＰＢＳ希釈した血液２ｍｌを各チューブの頂部に積層した。チューブを４℃、２５０×ｇで３０分間遠心分離した。２つのパーコール層の界面から網状赤血球を採取し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００５０】
５ｍＭグルタミン、３％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、および５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中、精製した網状赤血球（図２Ａ）を１〜５×１０７細胞／ｍＬの密度として、３７℃で２４時間培養した。培地中に外来のエキソソームの混入汚染する可能性を回避するために、ウシ胎仔血清は予め遠心分離した（１００，０００×ｇ ｏ．ｎ．）。エキソソームは、４℃、５００×ｇで２０分間、９００〜１０００×ｇで２０分間、１２，０００×ｇで３０分間、および１００，０００×ｇで２時間遠心分離することにより、上清から単離した。最終のペレットを大容量のＰＢＳ（通常、当初容量の５×）に再懸濁し、０．２２μｍのフィルタで濾過し、４℃、１００，０００×ｇで２時間遠心分離した。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、回収されるタンパク質の量をブラドフォードアッセイにより定量した。
【００５１】
エキソソームは、その純度を確認し、形態を可視化するために、電子顕微鏡（ＥＭ）により分析した（図２Ｂ）。ＥＭによる分析は、２％パラホルムアルデヒド中、４℃で一夜固定した新鮮なエキソソームで実施した。次いで、エキソソームを２０分間フォームバーグリッド上に沈着させた後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、グリッドを１％グルタールアルデヒド中で５分間固定し、蒸留水で洗浄し、シュウ酸ウラニル溶液（ｐＨ＝７）により５分間、および酢酸ウラニル（４％）−メチルセルロース（２％）により４℃で１０分間、陰性染色した。完全に乾燥した後、グリッドをＪＥＯＬ１０１０透過電子顕微鏡下で観察した。この技法により、エキソソームについて先に報告したサイズに匹敵する直径をもつ、サンプル中の小胞の均一な個体群が明らかになった。
【００５２】
［１．３．ヒトのインビトロ培養網状赤血球からのエキソソームの精製］
末梢血からのヒト網状赤血球は、バルセローナの血液組織バンク（www.bancsang.net）の未処理血液バッグから取得した。サンプルを取得するために、すでに実施例１．２に記載した方法に従い、パーコール密度勾配で遠心分離を行った。このサンプルは、プラスモディパー（Plasmodipur）フィルタ（ユーロジアグノスティカ）により、予め白血球を除去したものであった。
【００５３】
この方法と並行して、ヒト網状赤血球を、また、精製システムＭｉｄｉ−ＭＡＣＳ（ミディ−マックス）（ミルテニイバイオテック；Miltenyi Biotec）を用い、製造業者の指示書に従い、抗−ＣＤ７１（網状赤血球の主表面マーカ）と接合した磁気ビーズにより濃縮した。両方の方法で濃縮したヒト網状赤血球は、異なる培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ）に２４時間保持し、実施例１．２に記載した方法に従って、超遠心分離により、ヒト網状赤血球由来のエキソソーム（ｈＲＥＸ）を上清から濃縮した。
【００５４】
［１．４．三日熱マラリア原虫に感染したヒト網状赤血球からの精製］
成熟形の三日熱マラリア原虫に感染した網状赤血球は、文献（リボウトら、Ribaut et al.（非特許文献４））に記載された方法に従い、磁気カラムシステムＭｉｄｉ−ＭＡＣＳ（ミディ−マックス）（ミルテニイバイオテック；Miltenyi Biotec）を用い、捕集した。感染した網状赤血球は、不完全培地で洗浄し、異なる培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ）に２４時間保持した。
ヒト三日熱マラリア原虫感染網状赤血球由来のエキソソーム（ｈｉＲＥＸ）は、実施例１．３に記載した方法に従って、超遠心分離により、上清から濃縮した。
【００５５】
＜実施例２：エキソソームの免疫原性＞
［２．１．マウス血液から直接精製して得られたエキソソームの免疫原性］
非感染マウス（ｅｘＣ）の血液、および実施例１．１にて得られた非致死株（ｅｘＰｙＮＬ）と致死株（ｅｘＰｙＬ）のエキソソームを感染させたマウスの血液に由来するエキソソームでＢａｌｃ／ｃマウスを免疫した。免疫するために、マウスは、ケタミン（１００ｍｇ／Ｋｇ）とミダゾラム（５ｍｇ／Ｋｇ）の組合せを腹腔内注射して麻酔した後、ＰＢＳ１００μｌ中のエキソソーム５μｇを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。２０日間の間を置き２回のエキソソーム投与（ｉ．ｖ．）で免疫した４〜６匹のＢａｌｃ／ｃマウス（９〜１１週令）の群につき、エキソソームによる実験を２回実施した。非免疫（ＮＩ）マウスは未処理とした。２回目の２０日後に、すべてのマウスを致死株の寄生虫（Ｐ．ヨエリ１７ＸＬ）５×１０５〜１０６により感染させ、寄生虫血症を毎日調節した。顕著なことは、各株のエキソソームで免疫したマウスの半数が、ＮＩマウスおよびｅｘＣマウスと比較した場合、寄生虫血症曲線において差異を示し、その生存期間がより長いことであった（図３）。さらに、感染動物のエキソソームで免疫したマウスは、網状赤血球血症の増加を示すのみならず、網状赤血球への正赤血球致死株の細胞向性の変化をも示した（表１）。
【００５６】
【表１】
2013515495.tif 000002
【００５７】
［２．２．インビトロ培養網状赤血球の精製により得られたエキソソームの免疫原性］
非感染網状赤血球（ｅｘＣ）および実施例１．２で得られた非致死性Ｐ．ヨエリ１７Ｘ株（ｅｘＰｙＮＬ）に感染した網状赤血球の培養物から得られたエキソソームでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。免疫のために、マウスに１０μｇのエキソソームと１０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ−１８２６を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。２０日後に、マウスを５μｇのエキソソームで免疫した。２回目の免疫の２０日後、すべてのマウスを５×１０５のＰ．ヨエリ１７ＸＬで免疫し、寄生虫血症を毎日追跡した。２回の実験は免疫した６匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（９〜１１週令）の群により遂行した。非免疫マウス（ＮＩ）は未処理とした。注目すべきことに、Ｐ．ヨエリ１７Ｘで感染した網状赤血球からのエキソソームで免疫した５／６匹のマウスは、致死性寄生虫、Ｐ．ヨエリ１７ＸＬでの感染に耐えた（図４）。
【００５８】
＜実施例３：体液性および細胞性応答＞
［３．１．マウスの血液から直接精製したエキソソームにより引き出される体液性ＩｇＧ免疫応答および細胞性免疫応答］
実施例１．１にて精製したエキソソームの免疫原能力を証明した後、防御応答が体液性および／または細胞性免疫応答と関連したものであるかどうかを評価するために、実験を開始した。
【００５９】
特異的抗体の産生を検討するために、２度目の免疫の２０日前に、血清を採取し、−２０℃に保存した。ＮＩ、ｅｘＣ、ｅｘＰｙＮＬおよびｅｘＰｙＬ群の動物の血清混合物を用いて、エキソソームでの免疫により誘導された循環抗−Ｐ．ヨエリ抗体について分析した。感染した赤血球を１．５Ｍ−ＮＨ４Ｃｌ、０．１Ｍ−ＫＨＣＯ３および０．００１Ｍ−ＥＤＴＡで溶解させ、次いで数回の凍結融解サイクルを繰り返すことにより得た総Ｐ．ヨエリ抗体溶解液を用いてウエスタンブロットを実施した。非致死性感染により生じたエキソソームで免疫したマウスは、両株のＰ．ヨエリ抗原に対して特異的ＩｇＧ抗体を産生した（図５）。非免疫動物の血清中には、予測通りに、Ｐ．ヨエリに対する抗体が検出されなかった。
【００６０】
細胞性免疫応答を評価するための個々の細胞のサイトカイン産生は、細胞内染色により実施した。２度目の免疫の２０日後に、免疫した動物の脾臓細胞（脾細胞）を９６穴プレート上に、３組となるように播種した（５×１０５細胞／ウエル）。脾細胞は、温度不活化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、２β−メルカプトエタノール（５０μＭ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（０．１ｍＭ）を補足したＤＭＥＭ培地中、１０μｇ／ｍｌのＰ．ヨエリ抗原もしくは５μｇの凍結エキソソーム調製品の存在下または不存在下に培養した。増殖を分析するために、培養に先立ち、ヴィブラント（vybrant）ＣＦＤＡＳＥ細胞トレーサーキット（インビトロゲン、Invitrogen）を用い、５−６−カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により細胞を染色した。３７℃で７２時間プレートをインキュベートし、最後の４時間には、ホルボールミリステートアセテート（５０ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞を採取し、洗浄し、異なる表面マーカを検出するために、異なる発蛍光基に接合した抗体を用いて、２０分間染色した。ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した後、細胞をサイトフィックス／サイトパーム（ＢＤバイオサイエンス）により室温で２０分間固定化し、次いで、洗浄し、それらを透過するパーム／ワッシュ溶液に再懸濁した。透過処理後、細胞を異なるサイトカインに対する特異的結合抗体により３０分間染色した。サンプルはＦＡＣＳカリブール中で分析した。７２時間の培養の後、ウエル中の細胞の色と量の可視化実験は、エキソソームの存在およびＰ．ヨエリ抗原の存在下においてのみ、ｅｘＰｙＮＬ網状赤血球においてより高い防御応答を示すことを明らかにした。ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ脾細胞の数は、ｅｘＰｙＮＬで免疫した動物において増大し、またエキソソームと総Ｐ．ヨエリ抗原で再刺激した後に増大した（図６Ａ）。ＩＦＮ−γ単独、またはＩＬ−２との組み合わせでＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋増殖Ｔ細胞（ＣＳＦＥ低）は、Ｐ．ヨエリ抗原とエキソソームでの再刺激後の同じ動物群において、より高次数で検出される（図６Ｂ、６Ｃ）。
【００６１】
［３．２．インビトロで培養した網状赤血球から精製したエキソソームにより引き出される体液性ＩｇＧ免疫応答］
本実施例は、実施例１．２にて精製したエキソソームが、成熟段階のＰ．ヨエリ−感染赤血球細胞（ｐＲＢＣ）を認識する寄生虫特異的体液性ＩｇＧ免疫応答を引き出し得ることを示す。
【００６２】
エキソソームにより引き出された体液性ＩｇＧ免疫応答は、免疫化の２０日後に採取し、寄生虫につき試験した免疫マウスからの血清を用いて、免疫蛍光法により検討した。免疫蛍光アッセイは、１７ＸＬ感染血液塗抹を冷メタノールで固定化し、空気乾燥して、その後に室温で３０分間、５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックしたものにつき実施した。スライドは、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１／１０に希釈したマウス血清と４℃で一夜、室温で１時間インキュベートした。反応性のＩｇＧは、アレキサフローア（Alexa Fluor）４８８（インビトロゲン）に結合させ、１／２００に希釈した抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、室温で１時間検出した。洗浄後、核を室温で７分間、ＤＡＰＩ（インビトロゲン；５ｍｇ／ｍＬ）で染色した。ｐＲＢＣを認識する血清は、倒立６３×オイル対物レンズを装着したライカＴＣＳ−ＳＬ顕微鏡を使用し、明視野およびグリーン蛍光に対して画像化した。非免疫マウスからの血清および非感染動物からのエキソソームで免疫したマウスからの血清を陰性対照として使用した。図７に示すように、ｅｘＰｙでの免疫化は感染した赤血球細胞を認識し得るＩｇＧ抗体を惹起した。
【００６３】
＜実施例４：抗原のプロテオミクス分析＞
Ｂａｌｂ／ｃ−Ｐ．ヨエリのマウスモデルを用いて、マラリアの実験的感染におけるエキソソームの免疫原性に関するデータを生成することに加えて、Ｐ．ヨエリを感染させたマウスから得られたエキソソームまたはＰ．ヴィヴァックスを有する患者から得られたエキソソームが寄生虫の抗原を含むということを示すデータも生成された。最後に、未感染のマウス、Ｐ．ヨエリの致死性および非致死性株を感染させたマウス、健常人ボランティア、および三日熱マラリアの患者の精製したエキソソーム５マイクログラム分割量につき、質量分析法により分析した。
【００６４】
［４．１．液体クロマトグラフィに結合した質量分析法による分析］
エキソソーム調製物は、８Ｍ尿素中の０．４Ｍ−ＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁した。サンプルを５ｍＭ−ＤＴＴにより、５０℃で１５分間還元し、１０ｍＭ−ヨードアセトアミドにより室温で３０分間アルキル化し、次いで、尿素濃度が１ＭとなるまでＨＰＬＣ等級の水で希釈した。配列決定純度１／５０（酵素／タンパク質比）を有するトリプシンで１６時間消化した後、１％ギ酸（ＦＡ）を加えて反応を終結させた（非特許文献５）。サンプルはＰＯＲＯＳ  Ｒ２ジップチップで脱塩し（非特許文献６）、真空ポンプで乾燥した。次いで、サンプルを０．１％ＦＡ（２Ｄ ＬＣ−ＭＳシステム（ＬＣ−エクシジェント１Ｄ−プラス、ＥＴＤを有するＭＳ−サーモフィッシャーＬＴＱ ＸＬ、ＥＳＩ源−トリヴァーサ（Tiversa）、アディヴィオン（Adivion））に確保）に再懸濁した。サンプルは、それぞれに強カチオン交換（ＳＣＸ）カラム（５μＬ、オプチマイズドテクノロジー（Optimized Technologies））に容れ、ＮａＣｌ濃度を増加させながら（５％アセトニトリル／０．５％ＦＡ中０〜５００ｍＭ−ＮａＣｌ）、インジェクトすることにより自動的に溶出した。溶出したペプチドを自家製のＣ１８カラム（１ｃｍ、７５μｍ、フェノメネックスルナ（Phenomenex Luna）Ｃ１８、５μｍ）にトラップし、洗浄した。分離はＣ１８キャピラリーカラム（２０ｃｍ、７５μｍ、フェノメネックスルナＣ１８、５μｍ）により、ＡＣＮと０．１％ＦＡの直線勾配にて達成した。スペクトルはデータ依存収集モードにて収集した（図８）。
【００６５】
［４．２．生命情報科学分析］
ＭＳ／ＭＳスペクトル（図５）はＤＴＡフォーマットに変換し、シーケスト（Sequest）（バイオワークス３．３．１にて利用可能；サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、データベース検索に送った。Ｐ．ヴィヴァックスおよびＰ．ヨエリについて使用したデータベースは、プラスモ（Plasmo）ＤＢ（http://plasmodb.org）にて極最近公開されたものであり、またヒトケラチン、ブタトリプシン、培地タンパク質などの配列を汚染物として含むものが検索された（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html またはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db= Protein&itool=toolbar）。配列はすべて逆バージョンの鎖状体に転換し、偽陽性の推定を可能とする（非特許文献７）。得られたデータは、フィルタに通して偽陽性の誤りを約１〜２％とした。
【００６６】
顕著なことは、感染マウスから、または三日熱マラリア患者から得られたエキソソームが、プラスモジウムタンパク質の存在を明らかにしたことである（表２）。個々のスペクトルのデータは、これらのペプチドがプラスモジウムタンパク質に対応することを１００％正しいと証明した。
【００６７】
これらの結果はすべて、該エキソソームが三日熱マラリア原虫を原因とするヒトのマラリアを含め、マラリアの原因となる寄生虫のタンパク質を含むこと、またそれらがマウスモデルにおいて抗原を提示し、免疫応答と防御応答を生成し得ることを明白に証明している。
【００６８】
【表２】
2013515495.tif 000003
【００６９】
【表３】
2013515495.tif 000004
【００７０】
＜実施例５：プラスモジウム・ヨエリに感染した網状赤血球由来のエキソソーム中に同定されるＶｉｒタンパク質、Ｙｉｒタンパク質のオルソログの分析＞
実施例４にて同定したプラスモジウム・ヨエリ中のタンパク質の一つは、タンパク質Ｙｉｒである。Ｙｉｒは三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）のＶｉｒタンパク質に対するオルソログである（非特許文献８）。本実施例は、Ｖｉｒタンパク質が自然感染において免疫原性であり、マウスの免疫に対し抗原性であって、患者の三日熱マラリア感染網状赤血球を認識する特異的ＩｇＧ免疫応答を引き出し得ることを支持するデータを提供する。このデータもまたプラスモジウム種に感染した網状赤血球由来のエキソソームが、プラスモジウム種の発見にとって相当に有用であることを支持する。
【００７１】
［５．１．Ｖｉｒペプチド配列とバイオプレックスアッセイ］
三日熱マラリア原虫の完全なゲノム配列を記載する刊行物において、本発明者らが以前に使用し、報告したＭＥＭＥモデルによると、Ｖｉｒタンパク質は原型保存モチーフ機構を有する。モチーフ１および４ないし１０は、球状ドメインであると予測され、モチーフ２はＴＭドメインに特有な疎水性アミノ酸をコードし、そしてモチーフ３はペクセル（Pexel）様配列を含む（図９Ａ）。これらの保存モチーフに基づき、２種の長鎖ペプチド、すなわち、Ｌｐ１（配列番号１）およびＬｐ２（配列番号２）を設計した。Ｌｐ１は中心コア保存モチーフを含み、Ｌｐ２はＣ−末端保存モチーフを含む。これらのモチーフは非免疫原性リンカー配列を側面に配置しており、モチーフの保存順は、合成長鎖ペプチドに維持されている（図９Ｂ）。
【００７２】
Ｌｐ１およびＬｐ２の配列は以下に示すとおりである。
Ｌｐ１−（配列番号１）
ＶＫＥＬＣＫＫＬＶＲＮＬＫＫＩＳＣＩＹＬＮＹＷＬＹＤＱＩＫＥＲＫＤＬＨＤＹＦＫＮＹＤＴＩＫＣＣＥＫＹＣＴＹＶＴＹＩＫＳＬＹＥＹＤＰＫＤＬＬＳＫＬＤＣ
Ｌｐ２−（配列番号２）
ＩＡＤＳＰＧＴＬＧＴＶＨＥＥＬＤＳＮＦＦＲＮＩＩＭＶＶＧＶＭＭＴＦＦＦＬＹＫＦＴＰＶＧＡＦＦＲＧＧＲＧＲＶＨＲＩＰＲＳＦＨＧＱＦＰＧＫＲＫＧＫＩＦＥＨＮＹＹＥＥＹＥＫＥＬＡＭＹＧＳＥＦＬＤＳＱＭＤＲＹＹＬＮＹＱＰＤＱＤＳＹＹ
【００７３】
これらのペプチドについては、バイオプレックスアッセイに使用して、異なる風土病領域の三日病熱マラリア患者からの血清により、それらの免疫原性をチェックしてきた。バイオプレックスカルボキシル化ビーズ（バイオ−ラッド）を製造業者の指示書（バイオプレックスアミンカップリングキット）に従い、２本の長鎖ペプチドで共有結合により被覆した。カップル結合したビーズは、フェルナンデス−ベッセラ（Fernandez-Becerra）らの文献（２０１０）（非特許文献９）の記載どおりに分析した。簡単に説明すると、５，０００個の被覆ビーズに相当する分割量、５０μｌをそれぞれのアッセイに使用した。血漿サンプルをアッセイバッファに１：５０に希釈し、その分割量５０μｌをビーズに加えた（最終血漿希釈、１：１００）。１：７５００に希釈したビオチニル化ヒトＩｇＧ抗体（シグマ）の分割量５０μｌおよび２μｇ／ｍｌに希釈したフィコエリスリン接合ストレプトアビジンの分割量５０μｌを引き続くインキュベーションに使用した。ビーズを１２５μｌのアッセイバッファ（バイオラッド）に再懸濁して、バイオプレックス１００システムで分析し、結果を中央蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【００７４】
本実施例からの結果は、一部の血清がこれらの長鎖ペプチドを特異的に認識したことから、Ｖｉｒタンパク質が、自然感染において免疫原性であることを証明している（図１０）。
【００７５】
［５．２．Ｖｉｒタンパク質は抗原性であり、自然感染からの三日熱マラリア感染網状赤血球に対して反応する抗体を惹起し得る］
Ｖｉｒ抗原性のより広範な分析を実施するために、これら２種のペプチドに対する２種の抗血清を生成させ、免疫蛍光法により天然の分離株中のＶｉｒタンパク質を認識するようにした。モルモットをこれらの長鎖ペプチドで免疫し、抗−Ｌｐ１および抗−Ｌｐ２抗血清を取得した。三日熱マラリア原虫の野生株におけるＶｉｒタンパク質の異なる細胞レベル下の場所を確認するために、抗−Ｌｐ１および抗−Ｌｐ２によるＩＦＡアッセイを実施した。
【００７６】
抗−Ｌｐ１および抗−Ｌｐ２抗血清は、モルモットを配列番号１および配列番号２のペプチドで免疫することにより生成させた。分割量の三日熱マラリア感染赤血球細胞を不完全ＲＰＭＩで１回洗浄し、先に記載されているように固定化した（非特許文献１０）。固定化した細胞をＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００で透過性を上げ、３％ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１時間ブロックした。スライドはモルモットの抗−Ｌｐ１または抗−Ｌｐ２抗体と一夜インキュベートした。反応はアレキサフローア（Alexa Fluor）４８８（モレキュラープローブ）に結合させた抗−モルモットＩｇＧを用いて進行させた。核はＤＡＰＩ（ＰＢＳ中に希釈した５μｌ／ｍｌ）で１０分間染色した。共焦点顕微鏡法は、レーザ走査共焦点顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５、ライカマイクロシステム）により実施し、画像はイメージＪイメージブラウザーソフトウエアを用いて加工処理した。
【００７７】
三日熱マラリア感染患者（感染はＰＣＲにより確認）のＩＦＡアッセイは、三日熱マラリア原虫の環状期に感染した網状赤血球の表面で蛍光の外輪を示した（図１１Ａおよび１１Ｂ、上段列）。成熟期において、異なる染色パターンは、ＰＶＭにおける網状赤血球表面（図１１Ａ、中段列）、および感染した網状赤血球の表面（図１１Ａ、下段列）に、また寄生虫体内部と感染網状赤血球細胞質ゾル（図１１Ｂ、下段列）において類似していることが判明した。
【００７８】
まとめると、このデータが示すことは、Ｖｉｒペプチドが抗原性であって、ワクチン開発のための抗原としてのそれらの価値を強化する天然の三日熱マラリア原虫株に対して反応する抗体を惹起し得るということである。
【００７９】
＜実施例６：人工エキソソームの調製＞
ペプチドＬｐ１およびＬｐ２を含む人工エキソソームは、以下のリポソーム組成、すなわち、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、および４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリルホスファチジルエタノールアミン（ＭＢＰ−ＰＥ）（モル比７９：２０：１）を用い、１μｇのＶｉｒペプチドＬｐ１およびＬｐを加えて調製した。
【００８０】
脂質を有機溶媒（クロロホルム：メタノール、２：１）に溶解し、混合して、均一な脂質混合物とした。脂質を一旦有機溶媒に混合した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し、丸底フラスコの側壁に脂質薄膜を形成した。残余の微量有機溶媒をＮ２流下３０分間乾燥することにより除去した。クロロホルムの完全除去を確実なものとするために、薄膜をデシケータ中に一夜放置した。乾燥した脂質は、ＰＢＳ中、３７℃で水和した。
【００８１】
多重膜リポソームは、ボルテックスミキサ上、３回の定常４分間の振盪と、引き続く浴中４分間の音波処理により形成した。多重膜リポソームは、押出装置（リポスファスト、アベスチン（(LiposoFast、Avestin）、オタワ、カナダ）の１００ｎｍポリカーボネート膜を通して押出すことによりサイズ縮小し、単層もしくはオリゴ層の小胞を形成させた。リポソームサイズは、ゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）ＺＳ９０（マルバーン（Malvern）株、マルバーン、英国）を用いて動的光散乱により決定した。
【００８２】
人工エキソソーム中のＬｐ１およびＬｐ２の存在は、金微粒子で免疫標識することによりチェックした。免疫標識は、ＬＰ１およびＬｐ２Ｖｉｒペプチドに対する抗体と、引き続くプロテインＡ−金とのインキュベーションにより実施した。図１２は人工エキソソーム中のペプチドの存在を明瞭に示している。
【００８３】
このデータは、マラリア抗原を含むエキソソームが合成によっても入手し得ることを証明している。
【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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