(57)【要約】トランスジェニック動物が提供される。ある実施形態において、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．軽鎖フレームワークをコードする転写可変領域を含む機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子；ならびに該機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子に操作可能に連結されるｂ）ｉ．機能遺伝子のＣＤＲと同じ２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．該転写可変領域の軽鎖フレームワークと同一のアミノ酸配列である軽鎖フレームワークをそれぞれコードする複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含む。【選択図】図７
2013501525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．軽鎖フレームワーク
をコードする転写軽鎖可変領域を含む機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子；ならびに
ｂ）ｉ．該２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．該転写軽鎖可変領域の前記フレームワーク領域と同一のアミノ酸配列である軽鎖フレームワーク領域
をそれぞれコードする複数の偽遺伝子軽鎖可変領域
を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、
該複数の偽遺伝子軽鎖可変領域が該機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子と操作可能に連結され、該トランスジェニック動物における遺伝子変換によりヌクレオチド配列を該機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の該転写軽鎖可変領域に提供するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．重鎖フレームワーク
をコードする転写重鎖可変領域を含む機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子；ならびに
ｂ）ｉ．該２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．該転写重鎖可変領域の前記フレームワーク領域と同一の前記アミノ酸配列である重鎖フレームワーク領域
をそれぞれコードする複数の偽遺伝子重鎖可変領域
を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含み、複数の該偽遺伝子重鎖可変領域は、該機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子と操作可能に連結され、該トランスジェニック動物における遺伝子変換によりヌクレオチド配列を該機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子の該転写重鎖可変領域に提供する、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
前記２から５のアミノ酸の少なくとも１つが、チロシンまたはトリプトファン残基であり、ならびに前記２から５のアミノ酸の少なくとも１つがアラニン、グリシンまたはセリン残基である、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
前記軽鎖フレームワークが、ヒト・フレームワークである、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
前記軽鎖フレームワークが、ヒト生殖細胞系フレームワークと同一のアミノ酸配列である、請求項４記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
前記トランスジェニック動物が、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジまたはヤギである、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、
操作可能な連結で、イントロン領域、定常ドメインをコードする領域、および３’非翻訳領域（該イントロン領域、該定常ドメインをコードする領域、および該３’非翻訳領域はトランスジェニック動物のゲノムに内在性である）、ならびに
操作可能な連結で、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域および転写可変領域（複数の該偽遺伝子軽鎖可変領域および該転写可変領域はトランスジェニック動物のゲノムに外来性である）を含む、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、少なくとも１０の偽遺伝子軽鎖可変領域を含む、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
前記トランスジェニック動物が、前記トランスジェニック動物の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の前記内在性可変領域を、前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域および前記転写可変領域を含む核酸構築物で置換することにより作製される、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
前記トランスジェニック動物が、前記トランスジェニック動物の内在性偽遺伝子軽鎖可変領域を置換することなく、トランスジェニック動物の内在性機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の少なくとも前記可変領域を、前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域および前記転写可変領域を含む核酸構築物で置換することにより作製される、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域の少なくとも１つが前記転写可変領域に対して逆方向にある、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫する工程；および該抗原に特異的に結合する抗体を該トランスジェニック動物から得る工程を含む方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製する工程；および該ハイブリドーマをスクリーニングし、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスジェニック動物のリンパ球に由来する前記重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸をＰＣＲを用いて増幅する工程、および前記増幅核酸を用いて組み換え抗体を発現する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体をヒト化する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．軽鎖フレームワーク
を含む転写軽鎖可変領域；ならびに
ｂ）ｉ．該２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．該転写軽鎖可変領域の前記軽鎖フレームワークと同一のアミノ酸配列である軽鎖フレームワーク
をそれぞれ含む複数の偽遺伝子軽鎖可変領域
をコードする核酸構築物で、非ヒト動物の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも前記可変領域を置換する工程を含む方法。
【請求項１７】
方法が、
ａ）まず前記トランスジェニック動物の前記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における前記可変領域を欠失させる工程；次いで
ｂ）前記転写軽鎖可変領域および前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を該トランスジェニック動物の前記遺伝子座に付加する工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記トランスジェニック動物の内在性偽遺伝子軽鎖可変領域を置換することなく、前記トランスジェニック動物の内在性機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を、前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域および前記転写可変領域を含む核酸構築物で置換する工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸の前記複数の偽遺伝子軽鎖可変領域の少なくとも１つが前記転写軽鎖可変領域に対して逆方向にある、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
定常ドメイン；および
該定常ドメインと連結される可変ドメインを含む、トランスジェニック動物により産生される抗体であって、
該可変ドメインが、
ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．軽鎖フレームワーク
を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに
ａ）ｉ．該２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；および
ｉｉ．重鎖フレームワーク
を含む重鎖可変ドメイン
を含む抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は２００９年８月１３日に出願された米国仮出願第６１／２７４，３１９号の利益を主張し、該仮出願は全体としてあらゆる目的で参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は特異抗原に結合するタンパク質である。一般に、抗体は標的に特異的であり、免疫エフェクター機構の媒介能を有し、ならびに長い血清半減期を有する。このような性質により、抗体は強力な治療になる。モノクローナル抗体は、癌、炎症、および心血管疾患を含む様々な状態を治療するために治療で使用される。現在、２０を上回る治療抗体製品が市場に存在し、数百が開発中である。
【０００３】
新規な抗体および該抗体の作製方法に一定の需要が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
トランスジェニック非ヒト動物が提供される。ある実施形態において、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．軽鎖フレームワークをコードする転写可変領域を含む機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子；ならびに該機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子と操作可能に連結されるｂ）ｉ．該機能遺伝子のＣＤＲと同じ２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．該転写可変領域の軽鎖フレームワークと同一のアミノ酸配列である軽鎖フレームワークをそれぞれコードする複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含む。複数の該偽遺伝子軽鎖可変領域は、トランスジェニック動物の遺伝子変換により、ヌクレオチド配列を機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の転写可変領域に提供する。
【０００５】
さらに、または上記の代替として、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸（例えば軽鎖と同じ２から５のアミノ酸）から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．重鎖フレームワークをコードする転写可変領域を含む機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子；ならびに該機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子と操作可能に連結されるｂ）ｉ．機能遺伝子と同じ２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．該転写可変領域の重鎖フレームワークと同一のアミノ酸配列である重鎖フレームワークをそれぞれコードする複数の偽遺伝子重鎖可変領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含みうる。複数の該偽遺伝子重鎖可変領域は、トランスジェニック動物の遺伝子変換により、ヌクレオチド配列を機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子の転写可変領域に提供する。
【０００６】
トランスジェニック動物の作製方法および使用方法ならびに該方法により作製される抗体組成物も提供される。
【０００７】
特許または出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を添付した本特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて事務所から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の欠失戦略を模式的に説明する。
【図２】図２は、内在性ニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子の欠失後に、可変領域をコードする偽遺伝子の合成アレイをニワトリ免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に付加する戦略を模式的に説明する。
【図３】図３は可変領域をコードする偽遺伝子のアレイを構築する戦略を模式的に説明する。
【図４】図４は可変領域をコードする偽遺伝子のアレイを挿入するベクターの構築戦略を模式的に説明する。
【図５】図５はニワトリＩｇＬ遺伝子座にａｔｔＰ部位を配置する戦略を模式的に説明する。
【図６】図６はニワトリＩｇＬのノックアウトおよびノックイン・クローンのＰＣＲ分析結果を示す。
【図７】図７はノックインの作製戦略を模式的に説明する。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＣＤＲ１の配列番号：１〜６についての遺伝子変換事象例を説明する。
【図９】図９は多様な重鎖および軽鎖配列の発現レベルを示す表である。
【図１０】図１０は、長いインキュベーション時間後に多様な抗体の安定性を示すグラフである。
【図１１】図１１はＥ６（軽鎖）の配列番号：５３および５４のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２はＣ３（重鎖）の配列番号：５５および５６のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【０００９】
定義
「決定する」、「測定する」、「評価する」、「査定する」および「検定する」という用語は、本明細書でほとんど同じ意味で用いられ、任意の測定形態を指し、要素が存在するか否かの決定も含む。これらの用語は定量的および／または定性的な決定の両方を含む。査定は相対的でも絶対的でもよい。「の存在を決定する」とは、存在する何物かの量の決定および何物かが存在するか否かの決定を含む。
【００１０】
「遺伝子」という用語は、プロモーター領域、コード配列、および３’ＵＴＲを含む核酸配列を指す。
【００１１】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書でほとんど同じ意味で用いられる。
【００１２】
「リーダー配列」とは、タンパク質のＮ末端部に存在し、細胞からタンパク質の成熟形態の分泌を促進するアミノ酸配列である。シグナル配列の定義は機能的配列である。細胞外タンパク質の成熟形態はシグナル配列を欠失し、該配列は分泌過程で切断される。
【００１３】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖およびこれらの化学修飾を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書でほとんど同じ意味で用いられる。
【００１４】
「非ヒト」動物は、ヒトでない種の任意の動物を指す。
【００１５】
「子孫」または「子」という用語は、特定の動物に由来し伝わる全ての未来世代を指す。従って、子孫のＦ１、Ｆ２およびＦ３世代等がこの定義に含まれるように、あらゆる継続世代の子孫がこの中に含まれる。
【００１６】
「トランスジェニック動物」という語句は、外来核酸（即ち、動物に固有でない組み換え核酸）を含む細胞を含む動物を指す。外来核酸は動物の全細胞または動物の一部だが全てではない細胞に存在しうる。外来核酸分子は、「導入遺伝子」と呼ばれ、１つまたは多数の遺伝子、ｃＤＮＡ等を含みうる。導入遺伝子を受精卵母細胞または初期胚由来の細胞に挿入することにより、得られるトランスジェニック動物は、完全トランスジェニックでもよく、外来核酸をその生殖細胞系列に安定に伝えることができる。あるいは、外来核酸を含む組み換え細胞または組織を動物に移入、例えば移植することにより、外来核酸が導入され、部分トランスジェニック動物を作製してもよい。あるいは、トランスジェニック動物は、遺伝的に改変された体細胞由来の核移植により、または胚性幹細胞もしくは始原生殖細胞などの遺伝的に改変された多機能性細胞の移植により作製してもよい。
【００１７】
「イントロン」という用語は、大半の真核生物において、多数の遺伝子配列の中間に見出されるＤＮＡの配列を指す。これらのイントロン配列は転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前にｍＲＮＡ前駆体転写産物から除去される。このイントロン除去の過程はイントロンの両側にある配列（エキソン）の同時スプライシングにより起こる。
【００１８】
「操作可能に連結する」という用語は、一方の機能が他方に影響を受けるような一本鎖核酸断片上の核酸配列の関連性を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に作用できる（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターは該コード配列と操作可能に連結する。同様に、イントロンがコード配列と操作可能に連結する場合、イントロンはｍＲＮＡからスプライシングされ、コード配列の発現を提供する。遺伝子変換に照らして、２つの核酸配列は、一方の配列が遺伝子変換により他方に配列を「供与」できる場合に、操作可能に連結する。一方が遺伝子変換を介して他方に配列を供与できるという点で２つの配列が非連結である場合、供与する配列は他方の上流または下流であってもよく、２つの配列は、即ち他の介在遺伝子が存在しないという点で、互いに近接してもよい。「非連結」とは関連する遺伝要素が互いに密接に関連しないことを意味し、一方の機能が他方に影響を及ぼさない。
【００１９】
「上流」および「下流」という用語は転写の方向に関して用いられる。
【００２０】
「偽遺伝子」という用語は、開始コドンおよび／または終止コドンを含んでも含まなくてもよいオープン・リーディング・フレームを含む非転写核酸領域を記載するために用いられる。アミノ酸配列は、オープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列がコンピュータで翻訳され、アミノ酸配列を作成できるという意味で、偽遺伝子により「コード」されうる。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座に照らして、偽遺伝子は、プロモーター領域、組み換えシグナル配列またはリーダー配列を含まない。
【００２１】
「ホモ接合性」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座にあることを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」とは、異なる対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座にあることを示す。トランスジェニック動物は導入遺伝子についてホモ接合性でもヘテロ接合性でもよい。
【００２２】
遺伝子に関して、「内在性」という用語は、遺伝子が細胞に固有であることを示し、即ち、遺伝子が非改変細胞ゲノムの特定の遺伝子座に存在することである。内在性遺伝子は（自然界で見出されるような）野生型細胞の該遺伝子座に存在する野生型遺伝子でありうる。内在性遺伝子は、野生型遺伝子と同じゲノムの遺伝子座に存在する場合に改変内在性遺伝子でありうる。このような改変内在性遺伝子の例は、外来核酸が挿入される遺伝子である。内在性遺伝子は核ゲノム、ミトコンドリアゲノム等に存在しうる。
【００２３】
「構築物」という用語は、特異的ヌクレオチド配列の発現目的で作製された、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築に使用される組み換え核酸、一般に組み換えＤＮＡを指す。構築物はベクターまたはゲノムに存在しうる。
【００２４】
「組み換え」という用語は、宿主細胞に本来存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組み換え分子は、天然に存在しない方法でともに連結される２以上の天然の配列を含みうる。組み換え細胞は組み換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。細胞が組み換え核酸を受容する場合、該核酸は細胞にとって「外来性」である。
【００２５】
「選択可能なマーカー」という用語は、宿主で発現できるタンパク質であって、導入核酸またはベクターを含む宿主を容易に選別できるタンパク質を指す。選択可能なマーカーの例として、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）への耐性を与えるタンパク質、宿主細胞に栄養的利益などの代謝優位を与えるタンパク質、および細胞に機能性または表現型の優位（例えば細胞分割）を与えるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生される過程を指す。該過程は転写および翻訳の両方を含む。
【００２７】
細胞への核酸配列の挿入に照らして、「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含む。該核酸配列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ、自律レプリコンに変換され、または一過性に発現する（例えば、トランスフェクションされたｍＲＮＡ）。
【００２８】
１つの遺伝子座を他で置換する内容において、「置換する」という用語は一段階手順または多段階手順を指す。
【００２９】
「コード配列」という用語は、例えばインビボで、適切な調節要素の制御下にある場合、一度転写および翻訳されるとタンパク質を産生する核酸配列を指す。本明細書で用いられるコード配列は、連続ＯＲＦを有し、またはイントロンもしくは非コード配列の存在により中断されるＯＲＦを有しうる。この実施形態において、非コード配列はｍＲＮＡからスプライシングされ、成熟ｍＲＮＡを産生する。偽遺伝子は非転写コード配列を含みうる。
【００３０】
「と逆方向の」という用語は、異なる鎖上にあるコード配列を指す。例えば、転写領域が偽遺伝子に対して逆方向であると記載されるならば、転写領域によりコードされるアミノ酸配列は上鎖または下鎖によりコードされ、偽遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は転写領域に対して他鎖によりコードされる。図８で説明するように、コード配列の方向は矢印により示されうる。
【００３１】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書でほとんど同じ意味で用いられる。これらの用語は当業者によく理解されており、抗原に特異的に結合する１以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。抗体の一形態は抗体の基本的な構造単位を構成する。この形態は四量体であり、２つの同一な抗体鎖対から成り、各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各対において、軽鎖および重鎖の可変領域は共に抗原への結合を担い、定常領域は抗体のエフェクター機能を担う。
【００３２】
認識される免疫グロブリン・ポリペプチドは、カッパおよびラムダの軽鎖ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミューの重鎖または他の種の等価物を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２−末端に約１１０アミノ酸の可変領域およびＣＯＯＨ−末端にカッパまたはラムダの定常領域を含む。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）は同様に可変領域（約１１６アミノ酸）および前記の重鎖定常領域の１つ、例えばガンマ（約３３０アミノ酸）を含む。
【００３３】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、抗体または任意のアイソタイプの免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体断片を含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。抗体は、例えば放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質等で検出可能な程度に標識されうる。抗体は、特異的な結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分にさらに結合しうる。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含むがこれらに限定されない固体支持体と結合してもよい。また、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片、およびモノクローナル抗体も該用語により包含される。
【００３４】
抗体は、例えばＦｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２および二価（即ち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７，  １０５  （１９８７））を含む様々な他の形態、ならびに一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８５，  ５８７９−５８８３  （１９８８）  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  ４２３−４２６  （１９８８）、参照により本明細書に組み入れられる）に存在しうる（一般に、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｎ．Ｙ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８４），  ａｎｄ  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２３，  １５−１６  （１９８６）を参照）。
【００３５】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は３つの超可変領域により分断される「フレームワーク」領域（ＦＲ）から成り、該超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ，  ＩＭＧＴ，  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００９  ｖｏｌ．  ３７  （Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：  Ｄ１００６−１２．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｏｃｔ  ３１を参照；ｉｍｇｔ．ｏｒｇのワールドワイド・ウェブサイトを参照し、以下本明細書で「ＩＭＧＴシステム」と称する）。本明細書で論議される全ての抗体アミノ酸配列の付番はＩＭＧＴシステムに従う。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は相対的に種内で保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖および重鎖を合わせたフレームワーク領域であり、ＣＤＲを位置付け整列するのに役立つ。ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合を担う。
【００３６】
キメラ抗体とは、軽鎖および重鎖の遺伝子が通常、遺伝子操作により、異なる種に属する抗体の可変領域および定常領域の遺伝子から構築された抗体である。例えば、ニワトリまたはウサギのモノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変部は、ガンマ１およびガンマ３などのヒト定常部に連結されうる。治療用キメラ抗体の例は、ニワトリまたはウサギの抗体に由来する可変または抗原結合ドメインおよびヒト抗体に由来する定常またはエフェクタードメインから成るハイブリッドタンパク質である（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＣＲＬ  ９６８８の細胞により作製される抗Ｔａｃキメラ抗体）が、他の哺乳動物種が用いられてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられるように、「ヒト・フレームワーク」という用語は、ヒト抗体のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワークを指し、例えば抗体のヒト生殖細胞系配列のアミノ酸配列である。ある場合では、ヒト・フレームワークは完全にヒト・フレームワークであってもよく、この場合、フレームワークはヒト抗体、例えば生殖細胞系抗体のアミノ酸配列と同一の該配列を有する。
【００３８】
本明細書で用いられるように、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒト抗体に由来し、対応して配置されたアミノ酸で置換された（例えば、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲ内に）１以上のアミノ酸を含む非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化版と比較して、ヒト宿主に免疫応答の低下を生じると予想される。
【００３９】
本方法により設計および産生されるヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響を及ぼさない保存アミノ酸置換をさらに有しうると理解される。保存置換とは、下記の群から等の組み合わせが意図される：ｇｌｙ，  ａｌａ；  ｖａｌ，  ｉｌｅ，  ｌｅｕ；  ａｓｐ，  ｇｌｕ；  ａｓｎ，  ｇｌｎ；  ｓｅｒ，  ｔｈｒ；  ｌｙｓ，  ａｒｇ；  ａｎｄ  ｐｈｅ，  ｔｙｒ。同じ群に存在しないアミノ酸は、「実質的に異なる」アミノ酸である。
【００４０】
「特異的結合」という用語は、異なる被分析物の均一混合物に存在する特定の被分析物に選択的に結合する抗体の能力を指す。ある実施形態において、特異的結合の相互作用は、試料中の所望する被分析物と所望しない被分析物とを識別し、ある実施形態では約１０から１００倍以上（例えば約１０００倍または１０，０００倍を上回る）であろう。
【００４１】
ある実施形態において、抗体および被分析物が抗体／被分析物複合体で特異的に結合する場合のこれらの親和性は、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、もしくは約１０−１２Ｍ未満、またはそれ以下のＫＤ（解離定数）により特徴付けられる。
【００４２】
重鎖または軽抗体鎖の「可変領域」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにフレームワーク領域を含む鎖のＮ末端成熟ドメインである。抗体の重鎖も軽鎖も可変ドメインを含む。全てのドメイン、ＣＤＲおよび残基の数は配列アラインメントおよび構造知識に基づいて割り当てられる。フレームワークおよびＣＤＲ残基の同定および付番はＩＭＧＴシステムにより定義される通りである。
【００４３】
ＶＨは抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは抗体軽鎖の可変ドメインである。
【００４４】
本明細書で用いられるように、「単離される」という用語は、単離される抗体に照らして用いられる場合、抗体が精製前に結びつく他の構成要素から少なくとも６０％遊離、少なくとも７５％遊離、少なくとも９０％遊離、少なくとも９５％遊離、少なくとも９８％遊離、およびさらに少なくとも９９％遊離する対象抗体を指す。
【００４５】
「治療」、「治療する」などの用語は、哺乳動物、例えば具体的にはヒトまたはマウスのあらゆる疾患または状態のあらゆる治療を言及するために本明細書で用いられ、ａ）疾患に罹りやすいが未だ疾患と診断されていない被験体に生じる疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を予防すること；ｂ）疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を阻害すること、例えば患者でその進行を停止しおよび／またはその発病または兆候を遅らせること；ならびに／またはｃ）  疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を緩和すること、例えば状態もしくは疾患および／もしくはその症状を退行させることを含む。
【００４６】
「被験体」、「宿主」、「患者」および「個体」という用語は本明細書でほとんど同じ意味で用いられ、診断または治療が望まれる任意の哺乳動物被験体、とりわけヒトを指す。他の被験体は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含みうる。
【００４７】
「天然の」抗体とは、例えばファージディスプレイにより作製された非天然対の抗体とは対照的に、抗体の重鎖および軽鎖免疫グロブリンが多細胞生物の免疫系により自然界で選択された抗体である。このように、ある抗体は任意のウイルス（例えばバクテリオファージＭ１３）に由来する配列を含まない。脾臓、リンパ節および骨髄は、動物で天然の抗体を産生する組織の例である。
【００４８】
細胞に核酸配列を挿入する内容において、「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、該核酸配列は細胞に一過性に存在し、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ、自律レプリコンに変換されうる。
【００４９】
「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００または少なくとも５０，０００以上を指す。ある場合では、複数は少なくとも１０から５０を含む。他の実施形態においては、複数は少なくとも５０から１，０００でありうる。
さらなる定義が本開示のいずれかにありうる。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
トランスジェニック動物が提供される。ある実施形態において、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．フレームワーク領域；をコードする転写可変領域を含む機能性免疫グロブリン遺伝子；ならびに該機能性免疫グロブリン遺伝子に操作可能に連結されるｂ）ｉ．機能遺伝子と同じ２から５の異なるアミノ酸から成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．該転写可変領域のフレームワーク領域と同一のアミノ酸配列であるフレームワーク領域をそれぞれコードする複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む。複数の該偽遺伝子可変領域は、トランスジェニック動物の遺伝子変換により、ヌクレオチド配列を機能性免疫グロブリン遺伝子の転写可変領域に提供する。免疫グロブリン遺伝子座は免疫グロブリン軽鎖遺伝子座または免疫グロブリン重鎖遺伝子座でありうる。ある場合では、動物は本明細書に記載する重鎖および軽鎖の両遺伝子座を含みうる。
【００５１】
本発明がさらに記載される前に、本発明が特定の記載実施形態に限定されるものでないことが理解されるべきであり、そのようなものとして、無論、変化しうる。本明細書で用いられる専門用語は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、限定する意図はないことも理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００５２】
値の範囲が提示される場合、明確に他を指示する文脈でない限り、下限の単位の１０分の１まで、該範囲の上下限間の各介在値、および該規定範囲における任意の他の規定値または介在値が本発明の範囲内に包含されると理解される。
【００５３】
他に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または等価な任意の方法および物質が本発明の実施または試験で使用できるが、好ましい方法および物質を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、引用される刊行物に関連する方法および／または物質を開示し説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「１つの（ａ）」、「および」、および「その（ｔｈｅ）」は、明確に他を指定する文脈でない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」についての言及は複数の細胞を含み、「１つの候補薬剤」についての言及は１以上の候補薬剤および当業者に知られるその等価物などについての言及を含む。さらに、特許請求の範囲は任意の選択要素を除くように記載してもよいことに留意する。このように、この記述は、請求の範囲の要素の列挙に関連する「専ら」、「唯一の」などの排他的用語の使用、または「否定的」限定の使用について、先行詞として役立つことを意図する。
【００５５】
本明細書で論議される刊行物は、本出願の出願日前の開示についてのみ提示される。本明細書において、本発明が先行発明によって該刊行物に先行する権利がないことを承認するものとして解釈されるべきではない。さらに、提示される刊行物の日付は実際の発行日と異なる可能性があり、自主的に確認する必要がありうる。
【００５６】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、個々の刊行物および特許が参照により組み入れられると具体的および個別的に示されるように、参照により本明細書に組み入れられ、引用される刊行物に関連する方法および／または物質を開示し説明するために参照により本明細書に組み入れられる。任意の刊行物の引用は、出願日前の開示についてであり、本発明が先行発明によって該刊行物に先行する権利がないことを承認するものとして解釈されるべきではない。さらに、提示される刊行物の日付は実際の発行日と異なる可能性があり、自主的に確認する必要がありうる。
【００５７】
この開示を読むと、当業者には明らかなように、本明細書に記載および説明される個々の実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、個別の構成要素、および他の幾つかの実施形態のいずれかの特性と容易に分離または組み合わされうる特性を有する。
列挙するいずれの方法も、列挙される事象順序または論理的に可能な任意の他の順序で実施できる。
【００５８】
トランスジェニック動物
上述のように、トランスジェニック動物が提供される。ある実施形態において、動物は一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる任意の非ヒト動物であってもよく、このように、動物は多様な異なる動物のいずれでもよい。一実施形態において、動物は、トリ、例えばニワトリもしくはシチメンチョウなどのキジ目の一員、もしくはアヒルもしくはガチョウなどのカモ目の一員、または哺乳動物、例えばウサギなどのウサギ目、もしくはウシ、ヒツジ、ブタもしくはヤギなどの家畜でありうる。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、非齧歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）、非霊長類のトランスジェニック動物でありうる。
【００５９】
この開示には、合成可変領域のアレイをコードする１以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック・ニワトリに関するものもある。多数の動物の免疫グロブリン遺伝子座のヌクレオチド配列は該動物のゲノムの改変方法と同様に知られているため、以下に記載する一般概念は、任意の適切な動物、即ち一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる任意の動物に容易に適合しうる。転写される免疫グロブリンの重鎖または軽鎖遺伝子の可変領域と、異なる可変領域を含み操作可能に連結された（上流）偽遺伝子との遺伝子変換による抗体多様性の生成は、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ  （Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  １９９８  １７：  ４３−７０），  Ｂｕｃｃｈｉｎｉ  （Ｎａｔｕｒｅ  １９８７  ３２６：  ４０９−１１），  Ｋｎｉｇｈｔ  （Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４  ５６：  １７９−２１８），  Ｌａｎｇｍａｎ  （Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３  １４４：  ４２２−４６），  Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ  （Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７  １５：  １８５−２０６），  Ｒｅｙｎａｕｄ    （Ｃｅｌｌ  １９８９  ５９：  １７１−８３）およびＲａｔｃｌｉｆｆｅ  （Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６  ３０：  １０１−１１８）などの様々な刊行物に記載されている。
【００６０】
ある実施形態において、トランスジェニック動物は発現（即ち、転写され、ｍＲＮＡを産生し、続いて翻訳される）して抗体の軽鎖を産生する機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子、および、機能性軽鎖遺伝子と操作可能に連結される（これはニワトリの場合であり、多数の他の種はそのすぐ上流にある）複数の異なる偽遺伝子軽鎖可変領域を含む。該偽遺伝子の可変領域は、遺伝子変換により（即ち、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域の配列を偽遺伝子可変領域の配列と置換することにより）、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の配列を改変するという点で、機能性免疫グロブリン軽鎖と操作可能に連結される。トランスジェニック動物において、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との遺伝子変換は、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域の配列をわずか１コドンから可変領域の全長まで改変する。ある場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子の可変領域から少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）の配列を機能遺伝子の可変領域内に提供しうる。トランスジェニック動物により産生される抗体の軽鎖は、従って、偽遺伝子可変領域から機能性軽鎖遺伝子の可変領域内に提供されるいずれの配列によってもコードされる。
【００６１】
同様に、トランスジェニック動物は、転写および翻訳されて抗体の重鎖を産生する機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子、および該機能性重鎖遺伝子と（例えば、そのすぐ上流で）操作可能に連結される複数の異なる偽遺伝子重鎖可変領域も含みうる。該偽遺伝子の可変領域は、遺伝子変換により、機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子の配列を改変するという点で、機能性免疫グロブリン軽鎖と操作可能に連結される。トランスジェニック動物において、機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との遺伝子変換は、機能性免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列をわずか１コドンから可変領域の全長まで改変する。ある場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子の可変領域から少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）の配列を機能遺伝子の可変領域に提供しうる。トランスジェニック動物により産生される抗体の重鎖は、従って、偽遺伝子可変領域から機能性重鎖遺伝子の可変領域内に提供されるいずれの配列によってもコードされる。
【００６２】
トランスジェニック動物により産生される抗体は、従って、偽遺伝子可変領域から機能遺伝子の可変領域に提供されるいずれの配列によってもコードされる。異なる配列は動物の異なる細胞に提供されるため、動物の抗体レパートリーは、どの配列が偽遺伝子可変領域から機能遺伝子の可変領域に提供されるかにより決定される。
【００６３】
特定の実施形態において、可変領域偽遺伝子によりコードされるフレームワークは、偽遺伝子が操作可能に連結される機能遺伝子のフレームワーク領域とアミノ酸配列で同一である。換言すれば、偽遺伝子によりコードされるＦＲ１領域の全てのアミノ酸配列は、転写可変ドメインによりコードされるＦＲ１領域と同一であってもよく、偽遺伝子によりコードされるＦＲ２領域の全てのアミノ酸配列は、転写可変ドメインによりコードされるＦＲ２領域と同一であってもよく、偽遺伝子によりコードされるＦＲ３領域の全てのアミノ酸配列は、転写可変ドメインによりコードされるＦＲ３領域と同一であってもよく、ならびに偽遺伝子によりコードされるＦＲ４領域の全てのアミノ酸配列は、転写可変ドメインによりコードされるＦＲ４領域と同一であってもよく、これにより、規定の重鎖および／または軽鎖のフレームワークをもつ抗体を産生できる。
【００６４】
特定の実施形態において、可変領域偽遺伝子のフレームワークをコードするヌクレオチド配列は、偽遺伝子が操作可能に連結される機能遺伝子のフレームワークをコードするヌクレオチド配列と同一でありうる。換言すれば、偽遺伝子のＦＲ１領域の全てをコードするヌクレオチド配列は、転写可変ドメインのＦＲ１領域をコードするヌクレオチド配列と同一であってもよく、偽遺伝子のＦＲ２領域の全てをコードするヌクレオチド配列は、転写可変ドメインのＦＲ２領域をコードするヌクレオチド配列と同一であってもよく、偽遺伝子のＦＲ３領域の全てをコードするヌクレオチド配列は、転写可変ドメインのＦＲ３領域をコードするヌクレオチド配列と同一であってもよく、ならびに偽遺伝子のＦＲ４領域の全てをコードするヌクレオチド配列は、転写可変ドメインのＦＲ４領域をコードするヌクレオチド配列と同一であってもよく、これにより、規定のヌクレオチド配列をもつ機能遺伝子をもたらす。
【００６５】
選択されるフレームワーク配列は、ヒトであってもよく、例えば、ヒト抗体の生殖細胞系配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一な配列を有しうることにより、ヒト・フレームワークを含む抗体を産生できる。
【００６６】
特定の実施形態において、軽鎖生殖細胞系配列は、Ａ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０、Ａ２３、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ５、Ａ７、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ９、Ｏ１、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１４、Ｏ１８、Ｏ２、Ｏ４、およびＯ８を含むヒトＶＫ配列から選択されるが、これらに限定されない。ある実施形態において、軽鎖ヒト生殖細胞系フレームワークは、Ｖ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１７、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、およびＶ５−６から選択される。異なる生殖細胞系配列の記載については、ＰＣＴ  ＷＯ  ２００５／００５６０４を参照のこと。
【００６７】
他の実施形態において、重鎖ヒト生殖細胞系フレームワークは、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、およびＶＨ７−８１から選択される。異なる生殖細胞系配列の記載については、ＰＣＴ  ＷＯ  ２００５／００５６０４を参照のこと。
【００６８】
幾つかの実施形態において、導入され、転写される可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列はヒトであってもよく、即ち、ヒト抗体のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列または生殖細胞系配列を含みうる。これらの実施形態において、ＣＤＲおよびフレームワークの両方がヒトであってもよい。他の実施形態において、導入され、転写される可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列は、ヒトではなく、代わりにヒト配列に少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％以上同一であってもよい。例えば、ヒト配列と比較して、導入され、転写される可変領域は１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態において、導入され、転写される可変領域のヌクレオチド配列は、図１１および１２に示される可変領域と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％以上同一でありうる。一実施形態において、使用されるフレームワーク配列は、図１１および１２に示されるフレームワーク配列と比較して、１、２、３、４または５以上の置換を含む。
【００６９】
特定の実施形態において、定常ドメインをコードする領域、イントロンの部分、および機能遺伝子の３’ＵＴＲを含む軽鎖遺伝子座の部分は動物に内在性であり、機能遺伝子の可変領域を含む軽鎖遺伝子座の残部、イントロンの残部および偽遺伝子は、該動物に外来性であり、即ち機能性軽鎖遺伝子が作製され、偽遺伝子が遺伝子変換により機能性軽鎖遺伝子に配列を提供できるように組み換えられ、定常ドメイン、一部のイントロンおよび３’ＵＴＲに近位で動物に導入される。ある場合では、動物の軽鎖遺伝子座は、操作可能な連結で、イントロン領域、定常ドメインをコードする領域および３’非翻訳領域を含む。該イントロン領域、定常ドメインをコードする領域および３’非翻訳領域はトランスジェニック動物のゲノムおよび複数の偽遺伝子軽鎖可変領域に内在性であり、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域はトランスジェニック動物のゲノムに外来性である。あるいは、定常ドメインをコードする領域もトランスジェニック動物のゲノムに外来性でありうる。
【００７０】
同様に、定常領域、イントロン領域の一部、および機能遺伝子の３’ＵＴＲを含む重鎖遺伝子座の一部は動物に内在性であり、機能遺伝子の可変ドメインを含む重鎖遺伝子座の残部、イントロンの残部および偽遺伝子は該動物にとって外来性であり、即ち機能遺伝子が作製され、偽遺伝子が遺伝子変換により機能遺伝子に配列を提供できるように組み換えられ、定常ドメイン、一部のイントロンおよび３’ＵＴＲに近位で動物に導入される。ある場合では、動物の重鎖遺伝子座は、操作可能な連結で、イントロン領域、定常ドメインをコードする領域および３’非翻訳領域を含み、該イントロン領域、定常ドメインをコードする領域および３’非翻訳領域はトランスジェニック動物のゲノムおよび複数の偽遺伝子重鎖可変領域に内在性であり、複数の偽遺伝子重鎖可変領域はトランスジェニック動物のゲノムに外来性である。
【００７１】
ある実施形態において、被験体のトランスジェニック動物により産生される抗体は、内在性定常ドメインおよび該動物に外来性である可変ドメインを含みうる。内在性定常領域がこれらの実施形態で使用されうるため、抗体はさらにクラススイッチおよび親和性成熟（動物が正常な免疫系の発達を経ることを可能にする）を経て、正常な免疫応答を開始しうる。特定の実施形態において、トランスジェニック・ニワトリは、ＩｇＭ、ＩｇＹおよびＩｇＡをコードする重鎖遺伝子座に３つの内在性定常領域を有する。Ｂ細胞発生の初期段階中、Ｂ細胞はＩｇＭを発現する。親和性成熟が進行するにつれて、クラススイッチは定常領域をＩｇＹまたはＩｇＡに変換する。ＩｇＹは液性免疫を生体および新生ニワトリの両方に提供し、両ニワトリは卵黄内に沈着される蓄積によって約２００  ｍｇのＩｇＹを受容する。ＩｇＡは主としてリンパ組織（例えば、脾臓、パイアー斑およびハーダー腺）および卵管で見出される。
【００７２】
上述したように、軽鎖遺伝子座の偽遺伝子および機能遺伝子の両可変領域のコードされるフレームワーク領域が互いに同一でありうるのに対し、偽遺伝子の各々の可変領域によりコードされるＣＤＲ領域は互いに異なる（即ち、複数の偽遺伝子はそれぞれ他のＣＤＲ１領域の全てのアミノ酸配列と異なるＣＤＲ１領域をコードし、複数の偽遺伝子はそれぞれ他のＣＤＲ２領域の全てのアミノ酸配列と異なるＣＤＲ２領域をコードし、複数の偽遺伝子はそれぞれ他のＣＤＲ３領域の全てのアミノ酸配列と異なるＣＤＲ３領域をコードする）。重鎖遺伝子座についても同様に、偽遺伝子の各々の可変領域によりコードされるＣＤＲ領域は互いに異なる。
【００７３】
ある場合では、軽鎖可変ドメイン、および／または重鎖可変ドメインによりコードされるＣＤＲ領域は、僅か２から５（即ち、２、３、４または５）の異なるアミノ酸残基から成り、この文脈において、「から成る」という用語は、ＣＤＲ内の各アミノ酸の位置が２から５のアミノ酸残基群から独立して選択される１つのアミノ酸残基により占有されることを意味するつもりである。２〜５アミノ酸から成るＣＤＲの例は本開示の実施例欄に記載される。ある実施形態では、２から５アミノ酸の少なくとも１つはチロシンまたはトリプトファン残基のような巨大アミノ酸であり、２から５アミノ酸の少なくとも１つはアラニン、グリシンまたはセリン残基のような小アミノ酸残基である。
【００７４】
ＣＤＲは長さが多様でありうる。ある実施形態において、重鎖ＣＤＲ１は長さ６から１２のアミノ酸残基の範囲にあり、重鎖ＣＤＲ２は長さ４から１２のアミノ酸残基の範囲にあり、重鎖ＣＤＲ３は長さ３から２５のアミノ酸残基の範囲にあり、軽鎖ＣＤＲ１は長さ４から１４のアミノ酸残基の範囲にあり、軽鎖ＣＤＲ２は長さ２から１０のアミノ酸残基の範囲にあり、軽鎖ＣＤＲ３は長さ５から１１のアミノ酸残基の範囲にありうるが、これらの範囲外の長さのＣＤＲを有する抗体も想定される。
【００７５】
親和性成熟中に遺伝子変換と無関係に起きる突然変異の結果として生じる比較的少数のアミノ酸を除いて（これは、例えばアミノ酸の１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満で起きる）、トランスジェニック動物により産生され得られる抗体は、２から５の異なるアミノ酸のみから成る軽鎖および／または重鎖ＣＤＲを有しうる。例示実施形態において、ＣＤＲは、チロシンおよびトリプトファンから選択される２５％から７５％（例えば４０％から６０％）の巨大アミノ酸、およびアラニン、グリシン、およびセリンから選択される２５％から７５％（例えば４０％から６０％）の小アミノ酸と、残り（即ち、アミノ酸の１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満）の他の任意の天然アミノ酸から成る。偽遺伝子の各ＣＤＲにおけるアミノ酸の具体的な順序は無作為に作成されうる。
【００７６】
軽鎖および／または重鎖遺伝子座に存在する導入偽遺伝子の可変領域数は変化し、特定の実施形態では、５〜３０、例えば１０から２５の範囲でありうる。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０以上）は、転写軽鎖可変領域に対して逆方向でありうる。同様に、特定の実施形態において、複数の偽遺伝子重鎖可変領域の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０以上）は、重鎖の転写可変領域に対して逆方向でありうる。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子可変領域は交互の方向ではなく、ある場合では（図８で説明するように）、むしろ、転写可変領域に対して逆方向にある一連の少なくとも５または少なくとも１０の隣接偽遺伝子領域を含む。一実施形態において、転写可変領域から最も遠位にある偽遺伝子領域は転写可変領域と同じ方向であり、最遠位領域と転写可変領域との間にある偽遺伝子領域は転写可変領域に対して逆方向である。
【００７７】
上述したトランスジェニック動物は、動物の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および／または重鎖遺伝子座の内在性可変領域を、組み換え構築された複数の偽遺伝子軽鎖可変領域と置換することにより作製されうる。抗体レパートリーを生成するために遺伝子変換を用いるトランスジェニック動物の作製方法は、多数の種の生殖細胞系免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子座の構造および／または配列のように（例えばＢｕｔｌｅｒ  Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  １９９８  １７：４３−７０  ａｎｄ  Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６  ３０：  １０１−１１８）知られており（例えば、鳥については、Ｓａｙｅｇｈ，  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １９９９  ７２：３１−７  ａｎｄ  Ｋａｍｉｈｉｒａ，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  ９１：  １７１−８９、およびウサギについては、Ｂｏｓｚｅ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ２００３    １２  ：５４１−５３  ａｎｄ  Ｆａｎ，  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｉｎｔ．  １９９９  ４９：  ５８３−９４、およびウシについてはＳａｌａｍｏｎｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６  １２４：  ４６９−７２を参照）、上述した動物は本開示の常法により作製されうる。
【００７８】
トランスジェニック動物の作製方法が提供される。ある実施形態において、該方法は、適切な動物の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の可変領域を、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．軽鎖フレームワーク領域をコードする軽鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ．  ２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．軽鎖可変領域によりコードされ対応するフレームワーク領域と同一の軽鎖フレームワーク領域をそれぞれコードする複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を含む核酸構築物と置換する工程を含む。構築物を組み込むと、軽鎖可変領域はトランスジェニック動物の機能性免疫グロブリン遺伝子座の転写可変領域になり、偽遺伝子可変領域は遺伝子変換により転写Ｖ領域の配列を改変する。特定の実施形態において、操作される遺伝子座は、偽Ｖ、転写Ｖ、ならびにＤおよびＪ遺伝子分節を含む内在性Ｖ領域を完全に置換するよう設計される。しかしながら、非コード配列（イントロン）は、中に含まれうる内在性調節要素を保存するために内在性配置に保たれうる。
【００７９】
同様に、該方法は、動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域を、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．重鎖フレームワーク領域をコードする重鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ．  ２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．重鎖可変領域によりコードされ対応するフレームワーク領域と同一の重鎖フレームワーク領域をそれぞれコードする複数の偽遺伝子重鎖可変領域と置換する工程を含みうる。構築物を組み込むと、可変領域はトランスジェニック動物の機能性免疫グロブリン遺伝子座の転写可変領域になり、偽遺伝子Ｖ領域は遺伝子変換により転写可変領域の配列を改変する。遺伝子変換により、１以上の供与偽遺伝子から転写Ｖ領域に、小（例えば１〜１０ヌクレオチド）、中（１０〜３０ヌクレオチド）、または大（＞３０ヌクレオチド）ＤＮＡ分節が提供されうる。遺伝子変換は多数反復して生じ得るため、多重偽Ｖは活発に発現するＶ遺伝子に配列を提供しうる。遺伝子変換の過程は偽遺伝子の選択に関して極めて可変的であるため、各々が所定のリンパ球で利用される程度で、広く多様な抗体レパートリーがトランスジェニック動物をもたらす。
【００８０】
容易に明らかなように、該方法は、まず動物（転写可変領域および偽遺伝子可変領域、ならびに間の全配列を含む）の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における可変領域を含む領域を欠失させて、例えば定常領域配列と転写可変領域との間に定常領域配列およびイントロンの一部を残す工程；次いで転写軽鎖可変領域、イントロンの残部、および複数の偽遺伝子軽鎖可変領域を哺乳動物の遺伝子座に付加する工程を含みうる。
【００８１】
特定の実施形態において、図５および７で図式で説明するように、トランスジェニック動物の内在機能性免疫グロブリン遺伝子の少なくとも可変領域は、該トランスジェニック動物の内在性偽遺伝子可変領域を置換することなく、複数の偽遺伝子可変領域および転写可変領域を含む核酸構築物により置換されうる。このように、得られる免疫グロブリン遺伝子座（重鎖または軽鎖の遺伝子座でありうる）は、転写可変領域の上流の導入偽遺伝子のアレイに加えて内在性偽遺伝子のアレイを含みうる。
【００８２】
一度、対象のトランスジェニック動物が作製されると、抗原に対する抗体は、動物を抗原で免疫することにより容易に得られる。様々な抗原がトランスジェニック宿主動物を免疫するために使用できる。このような抗原は、微生物、例えばウイルスおよび単細胞生物（細菌および菌類など）、生存する、弱毒化した、または死んだ微生物断片、または微生物から単離された抗原性分子を含む。
【００８３】
ある実施形態において、動物は、治療抗体を産生するために、ＧＤ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２  ＡＦＰ（アルファ−フェトプロテイン）、ＢｌｙＳ（ＴＮＦおよびＡＰＯＬに関連するリガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ２（Ｔ−ｃｅｌｌ表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロ多量体）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリン・アルファ−Ｌ）、ＣＤ１４（単球分化抗原）、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＣＤ４４ｖ６（白血球の接着を媒介する）、ＣＤ５２  （ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の共刺激因子）、補体成分Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ  クラスＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶs３、インテグリンａ４s１およびａ４s７、インテグリンs２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１s、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＫＤＲ  （ＶＥＧＦＲ−２）、ｌｅｗｉｓｙ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦsＲ（ベータ血小板由来増殖因子受容体）、ＰＭＳＡ、腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ−セレクチン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質１）またはＶＥＧＦなどで免疫されうる。
【００８４】
抗原は、アジュバントの有無に関わらず、任意の簡便な方法でトランスジェニック宿主動物に投与でき、所定の計画に従って投与できる。
【００８５】
免疫後、免疫されたトランスジェニック動物からの血清または乳は、抗原に特異的な医薬品等級のポリクローナル抗体の精製用に分画できる。トランスジェニック鳥の場合、抗体は卵黄の分画によっても作製できる。濃縮され、精製された免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲル濾過など）、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーを用いた選択的沈殿により得られうる。
【００８６】
モノクローナル抗体を作製するため、抗体産生細胞、例えば脾臓細胞は、免疫されたトランスジェニック動物から単離され、ハイブリドーマ産生用の形質転換細胞株との細胞融合で使用され、あるいは抗体をコードするｃＤＮＡは標準的な分子生物学技術によりクローニングされ、トランスフェクション細胞で発現する。モノクローナル抗体の作製手法は当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０  Ａ１号、米国特許第４，９７７，０８１号、ＷＯ  ９７／１６５３７号、およびＥＰ  ０  ４９１  ０５７  Ｂ１号を参照のこと。これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。クローニングされたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のインビトロ産生は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９  （２０００）およびＢｕｒｔｏｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７  （１９９５）により記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
このように、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック動物を抗原で免疫する工程および抗原に特異的に結合する抗体をトランスジェニック動物から得る工程を含む方法も提供される。該方法は、トランスジェニック動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製する工程、およびハイブリドーマをスクリーニングして抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定する工程を含みうる。
【００８８】
抗体が既にヒト・フレームワーク領域を含まない場合、該方法は、抗体をヒト化する工程をさらに含みうる。この方法は、抗体の定常ドメインをヒト定常ドメインで交換し、キメラ抗体を作成する工程、およびある場合では、例えばＣＤＲのグラフトまたは再浮上（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）等により抗体の可変ドメインをヒト化する工程を含みうる。ヒト型化は、Ｗｉｎｔｅｒ  （Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  （１９８８）），  Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：  ２２９６  （１９９３）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１  （１９８７），  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：４２８５  （１９９２）；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３  （１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：米国９８／１６２８０号、米国９６／１８９７８号、米国９１／０９６３０号、米国９１／０５９３９号、米国９４／０１２３４号、英国８９／０１３３４号、英国９１／０１１３４号、英国９２／０１７５５号、ＷＯ９０／１４４４３号、ＷＯ９０／１４４２４号、ＷＯ９０／１４４３０号、欧州特許第２２９２４６号の方法に従って実行でき、それぞれは全体として参照により本明細書に組み入れられ、本明細書で引用される参照文献を含む。
【００８９】
抗体組成物
抗体組成物が提供される。抗体は、産生される抗体のＣＤＲ（即ち、対象動物により産生される抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域）を最小限に有し、一実施形態において、対象動物により産生される抗体の全可変ドメイン（即ち、ＣＤＲとフレームワーク）を含む。このような抗体組成物は、抗原に特異的に結合するポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含み、この作製方法は知られており、上述される。
【００９０】
親和性成熟中に機能遺伝子の可変ドメインに対する非遺伝子変換に基づくアミノ酸変化に起因した比較的少数のアミノ酸（即ち、アミノ酸の１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満で生じる）を除いて、対象抗体の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲは上述した遺伝子座によりコードされる２〜５アミノ酸から成る。同様に、フレームワーク領域は、単量体型、製造の容易さ、高溶解度、および熱力学安定性などの望ましい特質を有することが知られる規定配列を含む。
【００９１】
上記のように、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは動物の免疫系により天然で対合する。このような抗体は、ある場合では、宿主細胞により翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）され、トランスジェニック動物の種に特有なグリコシル化パターンおよび組成を有しうる。
【００９２】
ある実施形態において、トランスジェニック動物により産生される抗体が提供され、該抗体は可変ドメインと連結した定常ドメインを含む。該可変ドメインは、ａ）ｉ．２から５の異なるアミノ酸から成る軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．軽鎖フレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメイン；ならびにｂ）ｉ．  ２から５の異なるアミノ酸から成る重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域；およびｉｉ．重鎖フレームワーク領域を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００９３】
特定の実施形態において、得られる抗体は、図１１および１２に示される抗体のフレームワークと少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるフレームワークを有しうる。
【００９４】
スクリーニングの方法
対象トランスジェニック動物により産生される抗体は、目的の抗体を同定するためにスクリーニングされうる。一般に、この方法は、上述の方法を用いてモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリッド細胞を産生する工程、および様々な検定の１つまたは組み合わせを用いて複数のモノクローナル抗体をスクリーニングする工程を含む。一般に、これらの検定は機能検定であり、下記の通りに分類されうる：抗体の結合親和性または特異性を検出する検定、および抗体が過程を阻害する能力を検出する検定。
【００９５】
抗原との特異的な結合活性、または阻害活性を有するとして同定されるモノクローナル抗体は、目的のモノクローナル抗体と呼ばれる。
【００９６】
結合検定
これらの検定において、抗体は基質に特異的に結合する能力について試験される。抗体結合に照らして、「特異的に」という用語は、特異的抗原、即ちポリペプチド、またはエピトープに対する抗体の高結合性および／または高親和性結合を指す。多数の実施形態において、特異的抗原は、抗体産生細胞が単離された動物宿主を免疫するために使用される抗原（または抗原の断片もしくは細画分）である。抗原またはその断片に特異的に結合する抗体は、他の抗原に対する同じ抗体の結合よりも強力である。ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いながらも検出可能なレベル（例えば、目的のポリペプチドに示される結合の１０％以下）で他のポリペプチドに結合しうる。このような弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば適切な対照の使用により、対象ポリペプチドへの特異的な抗体結合と容易に識別できる。一般に、特異的抗体は、１０−７  Ｍ以上、例えば１０−８Ｍ以上（例えば、１０−９Ｍ、１０−１０、１０−１１など）の結合親和性で抗原に結合する。一般に、１０−６Ｍ以下の結合親和性をもつ抗体は、現在使用される従来方法を用いて検出可能なレベルで抗原に結合しないという点で有用ではない。
【００９７】
典型的には、スクリーニング検定の実施において、抗体を産生する宿主細胞のライブラリーにより産生される抗体試料は、各抗体が、例えばプレート数およびプレート上の位置、または抗体を産生した宿主細胞培養物を同定できる他の識別子を用いて同定できる方法で、固体支持体上に置かれる。
【００９８】
本発明の抗体は当技術分野で知られる任意の方法により免疫特異的結合についてスクリーニングされうる。使用できる免疫測定は、ほんの数例を挙げれば、ウェスタンブロットなどの技術を用いる競合および非競合検定系、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）、「サンドウィッチ」免疫測定、免疫沈降測定、沈降素反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定、凝集測定、補体結合測定、免疫放射測定、蛍光免疫測定、およびプロテインＡ免疫測定を含むが、これらに限定されない。このような検定は日常的なものであり、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これは全体として参照により本明細書に組み入れられる）。例示的な免疫測定は以下に簡潔に記載する（が、限定を意図しない）。
【００９９】
免疫沈降手順は一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはタンパク質阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラジロール）などの溶解緩衝液で細胞集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、セ氏４度で一定期間（例えば、１〜４時間）インキュベーションする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、４ｏＣで約１時間以上インキュベーションする工程、ビーズを溶菌緩衝液で洗浄する工程、ならびにビーズをＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁する工程を含む。特定の抗原を免疫沈降させる目的抗体の能力は、例えばウェスタンブロット分析により評価できる。当業者は、抗体の抗原への結合を増加させバックグラウンドを減少させるよう改変できるパラメータ（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を予め除去する）に関して精通しているであろう。
【０１００】
ウェスタンブロット分析は一般に、タンパク質試料の調製、続いてポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのタンパク質試料の電気泳動、およびポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜への分離タンパク質試料の転写を含む。転写後、膜はブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳ）でブロックし、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、一次抗体（目的の抗体）でインキュベーションし、ブロッキング緩衝液で希釈する。このインキュベーション後、膜は洗浄緩衝液で洗浄し、酵素基質（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）と結合させた二次抗体（一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）でインキュベーションし、さらなる洗浄後、抗原の存在が検出されうる。当業者は、検出シグナルを増大させバックグランド・ノイズを減少させるよう改変できるパラメータに関して精通するであろう。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェル・マイクロタイター・プレートのウェルを抗原で被覆する工程、酵素基質（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合させた目的の抗体を添加する工程、および一定期間インキュベーションする工程、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は検出可能な化合物と結合させる必要はないが、代わりに、検出可能な化合物と結合させた二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加されうる。さらに、ウェルを抗原で被覆するかわりに、抗体がウェルへ被覆しうる。この場合、検出可能な化合物と結合させた二次抗体は、目的とする抗原を被覆ウェルに添加した後に添加されうる。当業者は、検出シグナルを増大させるよう改変できるパラメータおよび当技術分野で知られるＥＬＩＳＡの他の変形に関して精通するであろう。
【０１０２】
抗体の抗原への結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は競合結合検定により測定できる。競合結合検定の一例は、多量の非標識抗原の存在下で標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）を目的抗体とインキュベーションする工程、および標識抗原と結合した抗体を検出する工程を含む放射免疫測定である。特定抗原に対する目的抗体の親和性および結合オフレートはスキャッチャード・プロット分析によりデータから決定できる。二次抗体との競合も放射免疫測定を用いて決定できる。この場合、抗原は、多量の非標識二次抗体の存在下で、標識化合物（３Ｈまたは１２５Ｉ）と結合させた目的抗体とインキュベーションされる。
【０１０３】
本発明の抗体は、当技術分野で一般に知られる技術を用いて抗原を発現できるベクターまたはベクター単独でトランスフェクションされた細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞）を免疫細胞化学方法を用いてスクリーニングしてもよい。抗原でトランスフェクションされた細胞に結合するが、ベクターのみでトランスフェクションされた細胞には結合しない抗体は、抗原特異的である。
【０１０４】
ある実施形態において、しかしながら、検定は抗原捕捉検定であり、抗体のアレイまたはマイクロアレイはこの目的で使用してもよい。ポリペプチドのマイクロアレイの作製方法および使用方法は当技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，３７２，４８３号、第６，３５２，８４２号、第６，３４６，４１６号および第６，２４２，２６６号を参照）。
【０１０５】
阻害剤検定
ある実施形態において、検定は、第一化合物と第二化合物（例えば、２つの生体高分子化合物）との相互作用に対する抗体の特異的阻害を測定し、または特異的に反応（例えば、酵素反応）を阻害する。相互作用阻害検定において、１つの相互作用基質である、通常、タンパク質などの生体高分子化合物（例えば受容体）は、反応槽の固体支持体に結合しうる。抗体が反応槽に添加され、続いて、基質の検出可能な結合相手、通常、タンパク質などの生体高分子化合物（例えば受容体の放射標識リガンド）が添加される。槽の洗浄後、相互作用の阻害は、槽に存在する検出可能な結合相手の量を決定することにより測定されうる。相互作用の阻害は、抗体を含まない対照検定と比較して、結合相手の結合が約２０％を超えて、約５０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、または約９０％を超えてもしくは９５％以上減少する場合に生じる。
【０１０６】
反応阻害検定において、酵素は反応槽で固体支持体と結合しうる。抗体は通常、反応槽、続いて酵素の基質に添加される。多数の実施形態において、酵素と基質の反応産物が検出可能であり、一定時間後に、反応は通常停止する。反応が停止した後、反応阻害は槽に存在する検出可能な反応産物のレベルを決定することにより測定されうる。反応阻害は、抗体を含まない対照検定と比較して、反応速度が約２０％を超えて、約５０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、または約９０％を超えてもしくは９５％以上低下する場合に生じる。
【０１０７】
インビボ検定
ある実施形態において、モノクローナル抗体はインビボで試験される。一般に、該方法は、疾患または状態の動物モデルに対象モノクローナル抗体を投与する工程、およびモデル動物の疾患または状態に及ぼすモノクローナル抗体の影響を決定する工程を含む。本発明のインビボ検定は対照を含み、適切な対照はモノクローナル抗体が存在しない試料を含む。一般に、複数の検定混合物は、種々の濃度に対する異なる応答を得るために、異なる抗体濃度で並行して行われる。典型的には、これらの濃度の１つは、負の対照として、即ち、ゼロ濃度または検出レベル未満として、役立つ。
【０１０８】
目的のモノクローナル抗体は、動物モデルの疾患または状態の症状を調節する、即ち、抗体不在下の対照と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上までに該症状を増減するものである。一般に、目的のモノクローナル抗体は、対象動物を疾患または状態を患わない類似または同等の動物にさせる。本発明の方法および組成物を用いて同定された治療価値を有するモノクローナル抗体は、「治療」抗体と呼ばれる。
【０１０９】
目的の抗体を発現するハイブリッド細胞は免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むため、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸は、目的のモノクローナル抗体を発現する宿主細胞が同定される場合に同定されうる。このように、対象核酸は当業者に知られる様々な方法により同定されうる。同様な方法は、ハイブリドーマ技術を用いたモノクローナル抗体の産生において、宿主細胞培養物を同定するために用いられる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８８）  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。
【０１１０】
例えば、目的のモノクローナル抗体を同定すると、目的の抗体を発現する宿主細胞は、抗体試料毎に対応する宿主細胞培養物を列挙する「参照」表を用いて同定されうる。他のある実施形態において、抗体ライブラリー試料識別子を含む参照表、対応する発現カセットライブラリー試料識別子および／または宿主細胞識別子が対象核酸を同定するために使用されうる。
【０１１１】
一度同定されると、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸は回収され、特徴決定され、および当業者になじみのある技術を用いて操作されうる（Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  （１９９５）  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。
【０１１２】
抗体の発現
目的のモノクローナル抗体を産生する幾つかの方法も提供される。一般に、これらの方法は、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体産生に十分な条件下でインキュベーションする工程を含む。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、目的のモノクローナル抗体を産生する方法は、目的のモノクローナル抗体用の同定発現カセットを適切なベクターに移す工程、および組み換えベクターを宿主細胞に移しモノクローナル抗体の発現を提供する工程を含む。幾つかの実施形態において、対象方法は、同定された重鎖および軽鎖から、少なくとも可変ドメインをコードする配列を免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現に適切なベクターに移す工程を含む。適切な定常ドメインをコードする配列および／または他の抗体ドメインをコードする配列がこの時点で可変ドメインをコードする配列に付加されてもよい。これらの核酸修飾は対象抗体のヒト化も可能にしうる。
【０１１４】
対象モノクローナル抗体は、抗体の合成について当技術分野で知られる任意の方法により、特に組み換え発現技術により、産生できる。
【０１１５】
対象モノクローナル抗体、またはその断片、誘導体もしくは類似体の組み換え発現は、通常、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を要する。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。このように、本発明は、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【０１１６】
発現ベクターは従来技術により宿主細胞に移され、トランスフェクションされた細胞は次いで培養し対象抗体を産生する。大半の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、宿主細胞で共発現し、免疫グロブリン分子全体の発現をもたらす。
【０１１７】
様々な宿主発現ベクター系は対象のモノクローナル抗体を発現するために利用されうる。これらは、抗体をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；抗体をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス、ピチア属）；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（メタロチオネイン・プロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５  Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞など）を含むがこれらに限定されない。多数の実施形態において、大腸菌などの細菌細胞、および真核細胞は、組み換え抗体分子全体の発現用に使用される。例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒト・サイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せて、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１  （１９８６）；  Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２  （１９９０））。
【０１１８】
細菌系では、幾つかの発現ベクターは、発現する抗体分子向けの用途に応じて選択されうる。例えば、大量のタンパク質を産生すべき場合、抗体分子の医薬組成物を生成するため、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましい。このようなベクターは、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１７９１  （１９８３））（抗体をコードする配列は、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃ  Ｚをコードする領域をインフレームでもつベクターに個別に連結されうる）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３１０１−３１０９  （１９８５）；  Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４：５５０３−５５０９  （１９８９））などを含むがこれらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させるために使用されうる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、基質グルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出により溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から切り離せるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよう設計される。
【０１１９】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォミカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｍｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は抗体を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。抗体をコードする配列はウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリン・プロモーター）の制御下に置かれる。
【０１２０】
哺乳動物宿主細胞において、幾つかのウイルスに基づく発現系は対象の抗体を発現するために利用されうる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体をコードする配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部リーダー配列に連結されうる。このキメラ遺伝子は次いでインビトロまたはインビボの組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入されうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主で抗体分子を発現できる生存組み換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９  （１９８４）を参照）。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネータ等の包含により増強されうる（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１−５４４  （１９８７）を参照）。
【０１２１】
組み換え抗体の長期高収率産生のため、安定な発現が用いられうる。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株が操作されうる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は免疫グロブリン発現カセットおよび選択可能なマーカーで形質転換できる。外来ＤＮＡの導入後、操作細胞は強化培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に移される。組み換えプラスミドの選択可能なマーカーは選択に対する耐性を与え、細胞はプラスミドを染色体に安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成でき、巣は順にクローニングされ、細胞株に展開できる。このような操作細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用でありうる。
【０１２２】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  （１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２  （１９９２））、およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  （１９８０））遺伝子を含むがこれらに限定されない幾つかの選択系が用いられうる。また、代謝拮抗剤耐性は、下記の遺伝子について選択の基礎として使用できる：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５７  （１９８０）；  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７  （１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２  （１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｎａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７  （１９９３）；  ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５  （１９９３））；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７  （１９８４））。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られる方法は、所望する組み換えクローンを選択するために日常的に適用され、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９３）；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９０）；  ａｎｄ  ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，  Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）；  Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１  （１９８１）に記載されている。
【０１２３】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクターを用いて共トランスフェクションされてもよく、第一のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードし、第二のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードする。２つのベクターは異なる選択可能なマーカーおよび複製起点を含み、これらは重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする。あるいは、重鎖および軽鎖の両ポリペプチドをコードし発現できる単一ベクターが使用されてもよい。
【０１２４】
一度、本発明の抗体分子が産生されると、免疫グロブリン分子を精製するために当技術分野で知られる任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ後に特異的抗原に対する親和性による）、およびサイジング・カラム・クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差異により、またはタンパク質を精製する他の任意の標準技術により、精製されうる。多数の実施形態において、抗体は細胞から培地中に分泌され、培地から収集される。
【０１２５】
有用性
当技術分野で知られるように、または本明細書に記載するように、本発明の少なくとも１つの抗体を用いて、例えば細胞、組織、器官、動物、または患者に治療上有効な量の抗体を投与または接触させることにより、細胞、組織、器官、動物または患者において、少なくとも１つの抗原関連疾患を調節または治療する方法も提供される。本発明は、細胞、組織、器官、動物、または患者において、肥満、免疫関連疾患、心臓血管疾患、感染病、悪性疾患または神経疾患の少なくとも１つを含むがこれらに限定されない少なくとも１つの抗原関連疾患を調節または治療する方法も提供する。
【０１２６】
典型的には、病態の治療は、有効量または用量の少なくとも１つの抗体組成物を投与することにより達成される。該組成物は、合計して平均で、組成物中に含まれる活性剤の特異的活性に応じて、１投薬につき患者１キログラム当たり少なくとも約０．０１から５００ミリグラムの少なくとも１つの抗体、好ましくは単回または複数回投与につき少なくとも約０．１から１００ミリグラムの抗体／キログラム患者となる。あるいは、有効な血清濃度は、単回または複数回の投与につき０．１−５０００ｎｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適切な投薬は医師に知られており、無論、特定の病状、投与される組成物の特異的活性、および治療を受ける特定の患者に左右されるであろう。幾つかの事例において、所望の治療量に達するため、反復投与、即ち、特定の監視用量または定量の反復個別投与の提供を必要とし、所望する日用量または効果が達成されるまで個別投与が反復される。
【０１２７】
対象の抗体は、ある実施形態において、抗体が検出可能なマーカーと結合するまたは検出可能なマーカーと結合した二次抗体とともに一次抗体として使用される診断においても使用できる。検出可能なマーカーは、放射標識および非放射標識を含み、当業者に周知である。一般的な非放射標識は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび蛍光分子などの検出可能な酵素を含む。蛍光分子はある波長の光を吸収し、他の波長で発光するため、例えば蛍光顕微鏡で可視化できる。分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーおよびフローソーターは周知であり、蛍光色素に共有結合させることにより蛍光にされた特異的分子を検出するためによく使用される。緑色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質の赤方シフト変異体、アミノクマリン酢酸（ＡＭＣＡ）、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルコーダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｏｄａｍｉｎｅ）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサス・レッド、Ｃｙ３．０およびＣｙ５．０などの蛍光色素は有用な標識の例である。
【０１２８】
蛍光マーカーが使用される場合、該分子は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの細胞単離戦略に使用できる。蛍光活性化細胞選別において、蛍光分子で標識される細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  （Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．）  ＦＡＣＳ  ＩＶサイトメーターなどのフロー・サイトメーターまたは同等な機器で電子的に選別される。蛍光分子は、特異的な細胞表面抗原を認識する抗体である。抗体は、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）などの蛍光マーカーに結合する。
【実施例】
【０１２９】
下記の実施例は、本発明のある実施形態および態様を証明しさらに説明するために提示されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１３０】
実施例１
概要
簡潔には、ニワトリは生物物理学特性を備えたヒト・フレームワークを含む抗体を産生するように操作され、これは容易に作製され、最適な薬理特性を有する。操作されたニワトリの免疫グロブリン遺伝子は、同一のフレームワーク領域、ならびにセリン、チロシン、アラニンおよびアスパラギン酸塩のランダム配列から成るＣＤＲとともに２０の合成偽遺伝子のアレイを有し、抗原に特異的な高親和性抗体を産生する。このニワトリ株は免疫され、モノクローナル抗体が回収される。
【０１３１】
ＶＬ偽遺伝子のアレイの遺伝子変換（全ての偽遺伝子は同一のフレームワーク領域を有し、ＣＤＲはセリン、チロシン、アラニンおよびアスパラギン酸塩のランダムアレイから成る）は、インビトロ遺伝子変換により軽鎖を多様化し続けるウイルス形質転換されたニワトリ前Ｂ細胞株由来のＤＴ４０細胞を用いて証明される。さらに、ＤＴ４０細胞は高い率で相同組み換えを受け、該組み換えはニワトリ機能性可変領域を組み換え可変領域で置換するための直接経路を提供する。
【０１３２】
ＤＴ４０細胞のチキン軽鎖Ｖ領域のアレイを、単一のヒト・フレームワーク領域ならびにセリン、チロシン、アラニンおよびアスパラギン酸塩から成るＣＤＲに由来する合成アレイで置換するためのノックイン標的ベクターが創出される。単一ヒト・フレームワークにおける合成ＣＤＲの遺伝子変換はＤＴ４０細胞で証明される。
【０１３３】
合成ヒトＶ領域のアレイは、始原生殖細胞（ＰＧＣ）のニワトリＩｇＬおよびＩｇＨ遺伝子座に挿入される。遺伝改変されたＰＧＣは鳥株を創出するために使用され、該株からヒト抗体が免疫後に得られる。これらの鳥は最初のトランスジェニック動物であり、予測可能な製造特性および薬理特性をもつ被操作ヒト抗体を得る。
【０１３４】
Ｖκ３フレームワーク配列は、最高の溶解度を有し、単量体として存在し、ならびに熱力学的に安定であるために使用される。ＶＨ３フレームワーク配列は、同じ理由で、ならびにＶＨ３フレームワークが十分に発現することが示されたため、使用される。
【０１３５】
実施例２
機能性Ｖおよび偽遺伝子のアレイ
機能性Ｖ（即ち、Ｖ領域）は、ＶＢａｓｅデータベースで列挙されるヒトＶκ３配列のフレームワーク、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の共通配列を抽出することにより得られた。ＶＫ３のＣＤＲ３については共通配列が導き出せないため、ＶＢａｓｅからｈｕｍＩＧＫＶ０９６配列が使用された。このＶＫ３配列はゲノムＤＮＡおよび生産的再編成で確認した。偽遺伝子は、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、およびトリプトファン（Ｗ）のランダム・アレイのようなＶκ３の共通配列を用いるよう設計された。これらの配列は表１で以下に示す。
【０１３６】
表１．機能性Ｖκ３由来遺伝子および偽Ｖ（ＰＳＩ）遺伝子におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、およびトリプトファン（Ｗ）の配列
【表１】
2013501525.tif 000003
【０１３７】
偽遺伝子アレイのＣＤＲ領域は僅か３アミノ酸から構築された：それぞれ４０／５０／１０％の比率でチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）およびトリプトファン（Ｗ）。この戦略において、チロシンおよびトリプトファンは一次抗原接触残基であると予測される一方、セリンは結合ポケット内に適切な間隔を提供する。該アレイは、ＹまたはＷが任意のＣＤＲのあらゆる位置に出現でき、あるいは十分な数の秩序配列をまとめて提供できるよう設計され、遺伝子変換を通して効率良く任意の可能な配列を生成する。この設計により、野生型ニワトリの偽遺伝子アレイからレパートリーを作製するために使用される同じ遺伝子変換過程を用いて、多様性が合成アレイから生じると推測される。
【０１３８】
このアレイの性能は、Ｙ、ＳおよびＷ残基を含む模擬「抗原で選択される」ＣＤＲ配列のパネルを創出することにより、コンピュータで試験した。アレイの適切な組成（表１に列挙）は、インビトロで最適と考えられる分布である、４０％チロシン、５０％セリン、および１０％トリプトファンであった。シミュレーションされるＣＤＲ１（またはＣＤＲ３、両方とも６つの位置を有するため）のアミノ酸配列（ＳＡＡＳ）は、乱数発生器を用いて、０から０．４の値をチロシンに、＞０．４から．９をセリンに、ならびに＞０．９から１をトリプトファンに割り当てることで創出された。ＣＤＲ１（またはＣＤＲ３）のこのシミュレーションの出力は表２に示す。
【０１３９】
表２．表１の偽遺伝子（ＰＳＩ）アレイから予測される配列を作製するために必要なＣＤＲ１（またはＣＤＲ３）のシミュレーション・アミノ酸配列（ＳＡＡＳ）および遺伝子変換（ＧＣ）事象
【表２】
2013501525.tif 000004
【０１４０】
表２のシミュレーション・アミノ酸配列、およびＳＡＡＳを創出するために使用されうるＰＳＩを達成するために必要な遺伝子変換の最小数は、手動で求め、「ＧＣ事象」の欄で示す。一般に、本発明者達は、僅か２または３の遺伝子変換様事象で、平均２．６で任意のＳＡＡＳを創出できた。遺伝子変換頻度の公表推定値は１Ｖ遺伝子につき３〜６の独立事象に及ぶため、偽遺伝子アレイは、任意の抗原配列に極めて特異的なクローンを作製するのに十分な配列および機能的多様性を生成できるべきである。
【０１４１】
実施例３
遺伝子標的構築物
ゲノムの修飾は２段階で行われる。まず、遺伝子標的ベクターがニワトリＤＴ−４０細胞に導入され、内在性ニワトリ軽鎖偽Ｖ遺伝子（約２０Ｋｂ配列）およびニワトリ機能性Ｖ領域（リーダー、ＶＪおよび対応するイントロン配列を含む）の全アレイを除去する。標的ベクターの図式設計は図１で説明する。
【０１４２】
偽Ｖ２５の上流配列は５’相同領域として使用され、Ｊ−ＣイントロンにおけるＪの下流配列は３’相同領域として使用でき、相同組換えによる標的化を促進する。ｌｏｘＰに隣接し、β−アクチンプロモーターにより駆動するｎｅｏＲカセットは、選別に使用された後、ｃｒｅ媒介性組み換えにより標的細胞で除去できる。さらに、ａｔｔＰ部位およびプロモーターを欠くｐｕｒｏＲ（３’末端にＦＲＴ配列をもつ）が標的ベクターに含まれる（以下の記載を参照）。これは、必要に応じて、合成Ｖｓの他のアレイの組み込みを容易にする。得られる標的遺伝子座は全てのニワトリ偽Ｖおよび機能性Ｖのアレイを除去する。第二段階において、ａｔｔＢ部位およびプロモーター（５’末端にＦＲＴ配列をもつ）を備えた置換ベクターにおける合成Ｖアレイ（図２でＬ−ｓＶＪとして示される合成偽Ｖｓおよび機能性Ｖκ３の両方を備える）は、ファージｐｈｉＣ３１インテグラーゼ媒介性部位特異的組み換えにより、ａｔｔＰ部位で前標的遺伝子座に挿入される（図２）。正確な組み込み事象により、プロモーターおよびプロモーターを欠くｐｕｒｏＲはともにピューロ（ｐｕｒｏ）で選別できる。これにより、予め導入されたａｔｔＰ部位での正確な組み込みを、ニワトリ・ゲノムに存在する偽ａｔｔＰ部位での取り込みに対してほぼ１００％の効率までさらに強化される。プロモーター−ｐｕｒｏＲ配列は、必要に応じて、再度ＦＲＴを介して除去できる。
【０１４３】
合成Ｖアレイの組立は図３および図４で説明する。具体的には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社により開発されたインフュージョン（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ）技術は、最終ベクターへの下流クローニング用に合成Ｖｓ小断片を作製するために用いられる。インフュージョン技術は末端で相同配列と１５ｂｂ重複したＤＮＡ断片を効率良く「融合」できる。１５ｂｐの相同末端は遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの末端に付加され得る。この技術は４以上のＤＮＡ片を継ぎ目無く効率的に組み立てるために用いられてきた。合成偽Ｖアレイを再構築するために、約２５Ｋｂにまたがる３９の分節（セグメント）（内在性ニワトリＩｇＬ配列に由来する２０の合成偽Ｖｓおよび１９の偽Ｖ間配列）がともに連結される。合成偽Ｖ遺伝子は遺伝子合成により得られる。偽Ｖ間配列はＢＡＣ  ＤＮＡからＰＣＲにより得られる。全ｃＩｇＬ遺伝子座を含むＢＡＣクローン（ＣＨ２６１−２９Ｃ１２）は、オークランド小児病院研究所（ＣＨＯＲＩ）から得られる。この過程で、１５ｂｐの相同末端は各分節の末端に付加される。最初に、３分節がインフュージョンによりともに組み立てられる。各分節は、隣接する分節またはベクターに相同な（色分けされた）１５ｂｐ配列を含む。修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系中間ベクターはインフュージョン用の線状化ベクターＤＮＡとして使用される。１回目のインフュージョン後、１３の中間分節が存在する。これらの１３の分節は、２回目のインフュージョンを経て、９以下の開始分節をそれぞれ含む５つの最終分節を得る。
【０１４４】
固有の制限部位が最終分節の指示位置に付加され、従来の制限部位媒介性クローニングによる全合成偽Ｖ遺伝子座の組立を容易にする。ｐＢｅｌｏＢＡＣ系ベクターは、ａｔｔＢおよびプロモーター、および７つの固有制限部位（ＲＥ−１からＲＥ−７）を含むように修飾され、合成Ｖアレイの最終組立てを可能にする。偽Ｖ１リーダーとリーダー−合成ヒトＶＪフレームワークの配列（図４のＬ−ｓＶＪ）との間に内在性ニワトリ配列を含むＤＮＡ断片は、全ＶＬ遺伝子座を再構築するためにベクターにクローニングされる。
【０１４５】
遺伝子変換の頻度は近接する遺伝子座の転写に影響を受け得るため、本発明者達は、除去を容易にする選択可能なマーカーに隣接するＬｏｘまたはＦＲＴ部位を有する構築物を設計した。ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を切除するため、クローンはＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でトランスフェクションし、ピューロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を切除するため、クローンはフリパーゼ（Ｆｌｉｐａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を発現するプラスミドでトランスフェクションされる。次いで、細胞は単一播種し、選択可能なマーカーを含まないクローンを得た。一度これらのクローンが見えると（通常５〜７日）、本発明者達はサザン解析を用いて、抗生物質耐性遺伝子が切除されたことを確認する。本発明者達は、次いで、１．５ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンＡを培養物に添加し、遺伝子変換を強化する。次の４週間、本発明者達は、ｓＩｇＭ＋表現型への復帰変異を監視し、ヒトＶ配列へのニワトリ偽Ｖ領域の寄与を査定する。
【０１４６】
実施例４
ＤＴ４０細胞の培養およびトランスフェクション
ＤＴ４０細胞は１０％リン酸トリプトース培養液、５５μＭベータ−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳおよび２％ニワトリ血清を補足したＤＭＥＭで増殖する。細胞は２．５ｘ１０５細胞／ｍｌで播種し、２から３日間隔で分割する。培地が過密になりすぎないよう注意する。
【０１４７】
トランスフェクション用に対数期の５ｘ１０６個の細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、ペレットにし、１００μｌのＡｍａｘａ  Ｖ緩衝液に再懸濁する。５μｇの線状化ＤＮＡを添加し、懸濁液はキュベットに移し、５５０Ｖおよび２５μＦの指数関数的減衰パルスを用いて電気穿孔する。電気穿孔直後に、細胞は、１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブの５００μｌの予熱した培地に入れ、３７℃で静置する。２０分後、細胞は４０ｍｌの培地に再懸濁し、１００μｌのアリコートは４つの９６ウェル・プレートに入れる。トランスフェクションの翌日、選別用に使用される抗生物質（例えば、１ｍｇ／ｍｌの２Ｘ濃度のピューロマイシン）を含む同体積（１００μｌ）の培地を添加して、０．５ｍｇ／ｍｌの最終ピューロマイシン濃度にする。５から７日以内に、コロニーは直径約２ｍｍに増殖し、２４ウェル・プレートに移す。コロニーは、次いで、上記と同じ培養条件を用いて拡大する。
【０１４８】
安定にトランスフェクションされたコロニーは、ＰＣＲにより分析して標的化を決定し、標的化はサザン解析により候補クローンで確認する。本発明者達はそれぞれの遺伝子改変についてサザン分析により少なくとも２つのクローンを同定する。
【０１４９】
実施例５
ｓＩｇＭ＋復帰変異検定を用いた遺伝子変換の評価
遺伝子変換率はｓＩｇＭ＋復帰変異検定により監視する（Ｙａｎｇ  ｅ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０３：  ２９１９−２９２８，  ２００６）。この系において、ＶＬ遺伝子の１２８位に単一塩基挿入を有するフレームシフト変異のＤＴ４０−ＣＬ１８により、軽鎖は内在性重鎖と対合できないため、細胞は表面ＩｇＭ−である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。フレームシフト変異が遺伝子変換事象により復帰変異する場合、細胞は蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）により容易に同定されるｓＩｇＭ＋の表現型になる。ＤＴ４０−ＣＬ１８フレームシフト変異体からの培養開始４週後、約１．５％の細胞がｓＩｇＭ＋である。次いで、これらのクローンは回収され、Ｖ領域は機能性Ｖの多様性を十分に実証するために配列決定される。
【０１５０】
この適用において、機能性Ｖκ３遺伝子は共通配列であるため、ＣＤＲは、セリン、アラニンおよびチロシンに加えてトリプトファン、グリシン、バリン、グルタミンおよびアスパラギンから成る。合成偽Ｖｓにおける４アミノ酸の蓄積は遺伝子変換の測定基準である。
【０１５１】
この適用においてｓＩｇＭ復帰変異検定を用いるために、ヒト機能性Ｖ領域はＣＤＲ１にアンバー終止コドンを含むよう設計される。従って、導入遺伝子の野生型も変異版も代わりにＤＴ４０細胞のゲノムの導入ａｔｔＰ部位に挿入される。野生型版は、機能性軽鎖が内在性重鎖と対合できＩｇＭ発現を再構築することの証拠を提供する。重鎖および軽鎖の定常領域はニワトリ起源であるため、正常な対合が生じそうであるが、ヒトおよびニワトリのＶ領域間で干渉の可能性がある。その通りだとすると、本発明者達はｓＩｇＭ＋復帰変異検定を利用できず、遺伝子変換事象の評価を専ら配列分析に依存するであろう。しかしながら、マウス可変領域がニワトリ定常領域に接合する場合に完全抗体が組み立てられるため、キメラ・ヒト−ニワトリ軽鎖がニワトリ重鎖と対合するという本発明者達の推測に対する信憑性を高める。さらに、Ｖκ３はニワトリ機能性Ｖｓと約７０％相同であり、この相同性レベルは生産的な対合を容易にすると予期される。
【０１５２】
４週間の培養期間の終わりに、導入遺伝子の変異版を発現する細胞はウサギ抗ニワトリＩｇ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、単一ｓＩｇＭ＋細胞はＦＡＣＳにより９６ウェル・プレートへ選別される。これらのデータは、遺伝子変換が起きたという最初の示唆を提供し、本発明者達は細胞の約１．５％がｓＩｇＭ＋であると予測する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。細胞は５〜７日間増殖し、ＩｇＭ  ｍＲＮＡは各ウェルから調製される。得られるｃＤＮＡは５’リーダー・ペプチド・プライマーおよび３’  ＣＬプライマーを用いて増幅する。両プライマーはニワトリ起源であるため、遺伝子変換の程度に関わらず、ＶＬを増幅する。アンプリコンはＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされる。大腸菌形質転換体コロニー由来のプラスミドＤＮＡは各ウェルから調製され、クローニングされた挿入物は配列決定される。配列は原型ＣＤＲと比較して分析し、チロシン、セリンおよびトリプトファンの蓄積は遺伝子変換の指標として用いられる。
【０１５３】
実施例６
ノックアウト・ベクターおよびＤＴ４０細胞における該ベクターのトランスフェクション
下記の実施例で提示されるデータはヒトＩｇ軽鎖導入遺伝子が単一のフレームワーク領域を含むことを示し、上流のヒト合成偽遺伝子のアレイはニワトリＢ細胞株ＤＴ４０のニワトリ軽鎖遺伝子座に挿入できる。遺伝子変換はニワトリＢ細胞の合成ＣＤＲを多様化する。
【０１５４】
ヒトＶ領域によるニワトリ軽鎖遺伝子座の置換は上記の通りに２段階で行った：ｃｈＩｇＬ遺伝子座のノックアウトおよび該遺伝子座のａｔｔＰ部位の置換、続いてインテグラーゼを用いたヒトＶ領域のノックイン。ノックアウト・ベクターはＶ、ＪおよびＣ領域を欠失し（図５）、ニワトリ偽遺伝子を残すように設計され、これは、ヒトＶとの配列相同性が低いため（フレームワーク領域２のごく僅かな長さに弱い相同性）、遺伝子変換を妨げないと予測される。
【０１５５】
標的ベクター用の５’および３’相同アームは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により調製され、ピューロマイシン、ＥＧＦＰおよびプロモーターを欠くｎｅｏ選択可能なカセットとともに組み立てられた。ＥＧＦＰマーカーは、トランスフェクションされた細胞およびコロニーを同定し追跡するのに有用であり、とりわけ原生殖細胞の場合、細胞が増殖する支持細胞層が小コロニーの可視化を時折困難にするため有用である。さらに、ＥＧＦＰは、ＵＶ光をヒナに照らすことにより原生殖細胞におけるノックアウトまたはノックインの生殖細胞系列伝達のスクリーニングおよび緑色蛍光の査定を容易にする。ピューロマイシン遺伝子はノックアウト・クローンの選別に用いられ、プロモーターを欠くｎｅｏ遺伝子は後に偽遺伝子アレイのインテグラーゼ媒介性挿入の選別に使用される。ａｔｔＰ部位はΦＣ３１インテグラーゼによる組み換えのためｎｅｏ遺伝子の前に配置された。ｌｏｘＰ部位は後にＣｒｅリコンビナーゼにより選択可能なマーカーを除去するために含められた。
【０１５６】
ノックアウトベクターは野生型ＤＴ４０細胞にトランスフェクションされ、ピューロマイシン耐性クローンが選別され、相同組み換えにより該ベクターを組み込んだクローンがスクリーニングされることにより、軽鎖をノックアウトした。ＤＴ４０における軽鎖遺伝子の２つの対立遺伝子の内、一方は生殖細胞系立体配置にあり発現しないのに対して、他方はＶＪ再編成を経て軽鎖遺伝子を発現する。再編成された対立遺伝子は、内在性軽鎖の発現を除外するため、ノックアウトされてもよく、表面ＩｇＭ−陰性細胞をもたらし、下流分析を平易にする。生殖細胞系対立遺伝子は、ＲＡＧ−１が発現しないため、再編成できない。スクリーニングされた１１７クローンの内、８クローンは再編成された対立遺伝子のノックアウトを有し、１０は生殖細胞系対立遺伝子のノックアウトを有し、全体頻度は約１５％の標的化であり、ＤＴ４０の期待度数であった。図６はスクリーニングの結果例を示す。
【０１５７】
図６の左パネルはノックアウトから得られた結果を示す。一方のプライマーは標的ベクターのゲノム隣接領域５’にあり（ａｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｇｔｇｇｃｔａｔｇ；配列番号：５３）、他方のプライマーは選択可能なマーカーカセットにある（ａｔａｃｇａｔｇｔｔｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｔｔ；配列番号：５４）。図６の第二パネルは対立遺伝子特異的ＰＣＲを示す。両プライマーはニワトリ軽鎖遺伝子座にあり（順方向プライマーＧＣＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣ  （配列番号：５５）；逆方向プライマーｇａｇａｃｇａｇｇｔｃａｇｃｇａｃｔｃａｃ  （配列番号：５６））、ＶＪイントロンが該対立遺伝子から欠失されたため、再編成対立遺伝子（Ｒ対立遺伝子）からより小さな産物を産生し、生殖細胞系対立遺伝子（Ｇ対立遺伝子）はイントロンを含み、より大きな断片を産生する。生殖系対立遺伝子のノックアウト（ＫＯ−Ｇ）において、Ｒ対立遺伝子のみが検出される。再編成対立遺伝子のノックアウト（ＫＯ−Ｒ）においては、Ｇ対立遺伝子のみが検出される。図６のパネルの第三セットはノックインについて得られた結果を示す。５’検定は、組み込みの５’側にβ−アクチン−ｎｅｏ融合を検出する（順方向プライマーｃｔｃｔｇｃｔａａｃｃａｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔｔｃ  （配列番号：５７）；逆方向プライマーＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴ  （配列番号：５８））。３’検定はａｔｔＲ部位にわたる軽鎖に２プライマーを使用する（順方向プライマーｃｇｃａｃａｃｇｔａｔａａｃａｔｃｃａｔｇａａ  （配列番号：５９）；逆方向プライマーｇｔｇｔｇａｇａｔｇｃａｇａｃａｇｃａｃｇｃ  （配列番号：６０））。ノックイン試料において、野生型対立遺伝子もノックイン対立遺伝子も検出されるのに対し、野生型試料においては、野生型断片のみが観察される。図６の第四パネルは、ＤＴ４０クローン（ＫＩ）の２つのノックインでｈｕＶＫ−ｃｈＣＬキメラ軽鎖の発現を示すＲＴ−ＰＣＲ結果を示す（ｈｕＶＫ反応：順方向プライマーＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣ  （配列番号：６１）；逆方向プライマーｃａｇｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｔａｔａｃ  （配列番号：６２）；Ｂ−アクチン反応順方向プライマーａａｃａｃｃｃｃａｇｃｃａｔｇｔａｔｇｔａ  （配列番号：６３）；Ｂ−アクチン反応逆方向プライマーｔｔｔｃａｔｔｇｔｇｃｔａｇｇｔｇｃｃａ  （配列番号：６４））。対照試料は親ノックアウト（ＫＯ）であった。
【０１５８】
実施例７
ノックインベクターおよびＤＴ４０細胞における該ベクターのトランスフェクション
機能性Ｖおよび偽遺伝子アレイは幾つかのニワトリおよびヒトＩｇ配列から組み立てられた（図７）。ベクターは、機能性再編成ヒトＶカッパ遺伝子（ｈｕＶＫ）、ニワトリ軽鎖定常領域、合成ＶＫ偽遺伝子（ＳｙｎＶＫ）およびニワトリ・イントロンのアレイ、ならびに軽鎖の適切な発現用の調節配列を含む。機能性ＶＫは幾つかの基準を満たし、下流の製造能力の基準もニワトリのＢ細胞発生を支持するための基準も満たす。使用される機能性ＶＫおよびＶＨは、高レベルで発現し、適切な構造に折り畳まれ、互いに効率良く対合して機能性抗体分子を形成し、ニワトリで自己反応性Ｂ細胞をもたらす任意のニワトリ・エピトープを認識しない。
【０１５９】
挿入用のヒトＶＫおよびＶＨ遺伝子の機能性対を選別するために、再編成された幾つかの機能性ヒトＶｓがヒトＢ細胞ＤＮＡからクローニングされた。次いで、１６のＶＫおよび１６のＶＨ遺伝子は、高レベルで発現する機能性的抗体を形成する対を見出すために、組み合わせて発現した。選択されたＶＫ配列のクローンＥ６はフレームワーク領域１の３アミノ酸変化を除いて生殖細胞系遺伝子ＶＫ３−１５と同一であった。ＳｙｎＶＫ偽遺伝子アレイは、ｈｕＶＫ  Ｅ６と同一のフレームワーク領域、ならびにチロシンおよびトリプトファンを含むＣＤＲを有するよう設計された。ＳｙｎＶＫ遺伝子が合成され、１２偽遺伝子のアレイに組み立てられた。機能性ヒトＶＫはニワトリ・イントロン配列を用いて合成された後、ニワトリ軽鎖プロモーター、定常領域およびＪ−Ｃイントロンとともにクローニングされた。得られるノックイン遺伝子座は、ニワトリ非コード調節配列を用いて、ニワトリ軽鎖定常領域にスプライシングされる完全ヒトＶ領域から成るキメラ軽鎖を発現する。最後に、ノックアウト対立遺伝子にベクターを挿入するため、本発明者達はａｔｔＢ部位およびβ−アクチンプロモーターを付加し、ｌｏｘＰ部位は選択可能なマーカーおよびプラスミド骨格を最終的に切除するために含められた。ノックイン戦略は図７で説明する。
【０１６０】
ＳｙｎＶＫ挿入ベクターは遺伝子変換用に簡易な表面ＩｇＭ  （ｓＩｇＭ）復帰変異検定ができるよう設計された（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ，  Ｒｅｙｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ａｎ  ＡＬＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ    Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９９０  ｖｏｌ．  ９  （３）  ｐｐ．  ９２１−７）。終止コドンは、全長軽鎖が発現しないように、「機能性」発現ヒトＶ領域のＣＤＲ１に導入された。軽鎖が存在しないと、ＤＴ４０重鎖は細胞表面に輸送されず、ノックイン細胞はｓＩｇＭ陰性である。終止コドンを含まないＳｙｎＶＫ偽遺伝子によるＣＤＲ１の遺伝子変換は、軽鎖配列を修復し、その全長オープン・リーディング・フレームを復元する。次いで、軽鎖は重鎖に結合し、完全ＩｇＭ複合体を形成し、細胞はｓＩｇＭ陽性になる。ＤＴ４０ノックイン・クローンはマウス抗ニワトリＩｇＭ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いてｓＩｇＭ発現について染色し、フローサイトメトリーによりｓＩｇＭ陽性細胞を選別し、配列レベルで遺伝子変換を詳細に分析するために、遺伝子変換された純粋な細胞集団を得ることができる。完全野生型Ｅ６  ＶＫ領域をもつベクター版も、キメラ軽鎖（ヒトＶ領域＋ニワトリＣ領域）が十分に発現し、ＤＴ４０重鎖と対合できることを検証するために作製され、ヤギ抗ヒトカッパ抗体はトランスフェクションされたＤＴ４０の表面上でヒト可変領域の発現を検証した。
【０１６１】
ＳｙｎＶＫ挿入ベクターは、ＣＭＶ−インテグラーゼ発現構築物を用いて、ＩｇＬノックアウトＤＴ４０細胞内に共トランスフェクションされた。両構築物は、環状超らせんＤＮＡとして導入された。ノックアウト細胞は、ノックアウト対立遺伝子のｎｅｏ遺伝子がプロモーターを欠くために、Ｇ４１８選別に対して感受性があると予期され、ＳｙｎＶＫベクターを挿入し、β−アクチンプロモーターをｎｅｏ遺伝子と連結した後のみ、Ｇ４１８耐性が誘導される。ＳｙｎＶＫベクターのトランスフェクション後、細胞は４または６  ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８  （ノックアウト細胞でいくらか観察されるバックグラウンドｎｅｏ耐性のため、比較的高レベルの薬剤選択が必要とされた）で挿入選別された。コロニーが得られ、挿入の５’および３’側ならびにヒトＶＫ機能遺伝子についてのＰＣＲ検定を用いて、８個の中から２コロニーがノックインを含むことが見出された。図２は該クローンの１つについてのＰＣＲ結果を示す。
【０１６２】
実施例８
ＤＴ４０細胞における合成Ｖ領域の遺伝子変換の証明
軽鎖ノックインＤＴ４０クローンは、終止コドンの修復ならびにＣＤＲ１へのチロシンおよびトリプトファンの同時挿入をもたらす遺伝子変換事象が蓄積する時間を見越して、トランスフェクション後数週間増殖させた。細胞は幾つかの時点で試料採取し、マウス抗ニワトリＩｇＭ抗体を用いてｓＩｇＭ発現について染色した。トランスフェクション後約２週間のノックインクローンにおいて、あるとしても、ごく僅かの細胞がｓＩｇＭを発現した。トランスフェクション後２９〜４１日目に、僅かな割合（０．２％）のｓＩｇＭ陽性細胞が観察されたことにより、本発明者達はＰＣＲ用にＦＡＣＳにより細胞を選別し、配列分析できた。僅か２つの偽遺伝子（２−ＳｙｎＶＫ）を含むノックイン構築物の初期版および１２の偽遺伝子版（１２−ＳｙｎＶＫ）をもつ細胞株が分析された。
【０１６３】
ゲノムＤＮＡは分別されたｓＩｇＭ＋細胞から調製し、機能性ｈｕＶＫ遺伝子はヒトＶＫリーダー配列およびｈｕＶＫの下流にあるイントロンにおいてプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物はクローニングされ、単一コロニーは少量調製および配列決定用に採取した。高品質の配列が約３５０のＰＣＲクローンから得られた。明白に偽遺伝子供与体と指定される確実な遺伝子変換が２−ＳｙｎＶＫで８６クローン、１２−ＳｙｎＶＫで１５７クローン観察された（図８）。それぞれの遺伝子変換事象は、チロシンまたはトリプトファンのいずれかを含む機能性Ｖに合成ＣＤＲを創出した。ＣＤＲ１の終始コドンの修復が選択されたため、多数の遺伝子変換がＣＤＲ１のみで観察されたということになる。４配列において、遺伝子変換はＣＤＲ２でも観察され、ＣＤＲ１を変換した同一の偽遺伝子が各事例でＣＤＲ２も変換したため、おそらく単一の長い遺伝子変換事象の結果であろう。幾つかの配列は明白な遺伝子変換を含んだが、特定の偽遺伝子供与体を指定することは不可能であった。これらの配列は、２つの重複する遺伝子変換事象、または単一の偽遺伝子による短い中断された遺伝子変換の結果であるからである。ニワトリＶＬ偽遺伝子による遺伝子変換の証拠は観察されなかった。遺伝子変換経路の全てはＳｙｎＶＫ偽遺伝子プールに由来するからである。ＤＴ４０によりまたはＴａｑポリメラーゼの誤りにより導入されたかもしれない幾つかの点突然変異も観察された。しかしながら、１つの配列は点突然変異により終止コドンを修復し、これはｓＩｇＭ発現で選別されたため、ＤＴ４０由来の突然変異の可能性がある。
【０１６４】
２−ＳｙｎＶＫおよび１２−ＳｙｎＶＫの両方を含む細胞において、ＳｙｎＶＫ９偽遺伝子を除く全てのＳｙｎＶ偽遺伝子が遺伝子変換に関与した（図８）。２−ＳｙｎＶＫでは、近位の偽遺伝子は遠位の偽遺伝子より約９倍利用された。２つの偽遺伝子は機能性ＶＫと比較して異なる方向にもあり、近位の偽遺伝子は逆方向であり、これは、近接または方向のいずれが遺伝子変換に関与する偽遺伝子の効率を決定する際により重要であるかという疑問を提起した。１２のＳｙｎＶＫ細胞において、遠位偽遺伝子および近位偽遺伝子は同様な頻度で用いられたため、機能性ＶＫとの近接は遺伝子変換の頻度に影響を及ぼさないようだった。従って、方向は近接より重要であり、逆方向はより効率的であるかもしれない。
【０１６５】
２つのＳｙｎＶＫおよび１２のＳｙｎＶＫを含む構築物は図８Ａに図示し、付番されたＳｙｎＶＫ偽遺伝子、機能性ｈｕＶＫ遺伝子、およびニワトリ定常領域を示す。偽遺伝子は任意でアレイのクローニング前に付番され、番号順に組み立てられなかった。ＳｙｎＶＫおよびｈｕＶＫの方向は上下の矢印で示す。各偽遺伝子が遺伝子変換で使用された回数を示す。観察される遺伝子変換事象の幾つかは特定の偽遺伝子を指定できなかったため、遺伝子変換事象の総数は僅かに多い。図８Ｂは遺伝子変換事象の例を示す。「機能性」ｈｕＶＫのＣＤＲ１配列が示される（入力）。終止コドンには下線を引く。表面ＩｇＭ＋  ＤＴ４０から得られる配列は、右に示される遺伝子変換で使用されたＳｙｎＶＫ偽遺伝子とともに、以下に示す。チロシンおよびトリプトファンはＣＤＲ１の全位置に蓄積した。ダッシュは入力配列との配列同一性を示す。
【０１６６】
偽遺伝子ＳｙｎＶＫ９は遺伝子変換が無く、ＳｙｎＶＫ３は僅か１事象であった。これらの２つの偽遺伝子はＣＤＲ１の第３コドンに巨大残基（チロシンまたはトリプトファン）を挿入するのに対し、他の偽遺伝子は全て該位置で野生型バリン残基を挿入する。特異的重鎖をもつこの人工ＤＴ４０系において、該位置に巨大残基をもつ軽鎖が抗体を不活性化することは可能であり、これらの偽遺伝子による遺伝子変換でｓＩｇＭ陽性復帰変異体を回復することは不可能である。
【０１６７】
上記で論議したこれらの結果は、ニワトリＢ細胞でのヒトＶＫ領域の遺伝子変換を証明し、チロシンおよびトリプトファンを含む合成ＣＤＲを創出する。
【０１６８】
実施例９
最適なヒトＶＨおよびＶＬフレームワークの同定
ｃＤＮＡは正常なヒト末梢血リンパ球から調製し、ＶＨ３およびＶＫ３に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。ＶＨ３プライマーは、５‘ＧＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＫＡＧＣＴＧＧ  ３’  順方向（配列番号：４９）であり、５’ＡＴＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧ  ３’逆方向（配列番号：５０）であった。このプライマー対は、ＶＨ３／ＩｇＧ１アイソタイプの完全重鎖に対応する１．５  ｋｂ  ＤＮＡ断片を増幅した。
【０１６９】
ＶＫ３プライマーは、５’ＧＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣ  ３’順方向（配列番号：５１）および５’  ＧＧＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ  ３’逆方向（配列番号：５２）であった。このプライマー対は、ＶＫ３／ＣＫアイソタイプの完全軽鎖に対応する７００ｂｐ  ＤＮＡ断片を増幅した。
【０１７０】
アンプリコンは発現ベクターｐＦ４ａ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）に直接クローニングし、機能コード配列を有することを確認した。３０の固有配列重鎖および３０の固有配列軽鎖は発現レベルの評価に用いた。全ての実験において、プラスミドＤＮＡは慎重に定量化し、一過性トランスフェクションで使用し、完全ヒトＩｇＧタンパク質を産生した。該タンパク質は次いでＥＬＩＳＡにより定量化した。まず、単一の機能性重鎖は３０軽鎖のそれぞれと対合した。並行して、単一の軽鎖は３０機能性重鎖のそれぞれと対合した。これにより、上位１６の発現重鎖および上位１６の軽鎖を選別でき、４つの８ｘ８マトリクスを作成した。マトリクス例は図９に示す。
【０１７１】
上位２つの重鎖および軽鎖はこれらのマトリクスから選択され、プラスミドＤＮＡ濃度を変えることにより一過性トランスフェクションでさらに分析した。また、異なる対の相対的安定性は、タンパク質定量前に３７°Ｃで長いインキュベーションにより評価した。図１０に示されるこれらの実験結果は、発現レベルおよび安定性に最適な対がクローン「Ｅ６」軽鎖およびクローン「Ｃ３」重鎖であることを明白に証明する。これらのＶ遺伝子のフレームワーク領域は、従って、ＳｙｎＶ軽鎖および重鎖遺伝子座の構築の基準としてそれぞれ使用された。Ｅ６およびＣ３クローンのヌクレオチド配列ならびにコードされるアミノ酸配列は図１１および１２に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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