(57)【要約】  ｍＴＯＲＣ２複合体がターンモチーフスレオニンでのＰＫＮ３のリン酸化の調節において役割を有するという発見、およびバイオマーカーとしての、ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化状態の使用が開示される。いくつかの実施形態において、ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化状態は、抗リン酸化Ｔ８６０抗体などの、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンに特異的に結合する抗体を用いて決定される。いくつかの実施形態において、本発明は、癌治療の可能性を有する化合物をスクリーニングするための方法、癌を診断するための方法、癌に罹患している患者の予後を決定するための方法、臨床試験において患者を層別化するための方法、癌に罹患１０している患者を治療するための方法、および特定の治療レジメンの有効性を決定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している患者を治療する方法であって、
ａ．患者から腫瘍試料を得るステップ、
ｂ．腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の試験レベルを決定するステップ、
ｃ．ステップ（ｂ）の腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の試験レベルを、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルと比較するステップ、および
ｄ．細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物を患者に投与するステップ
を包含する方法。
【請求項２】
細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療薬に応答し得る患者を選択するための方法であって、
ａ．患者から腫瘍試料を得るステップ、
ｂ．腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の試験レベルを決定するステップ、
ｃ．ステップ（ｂ）の腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の試験レベルを、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルと比較するステップ、および
ｄ．ステップ（ｂ）のレベルが参照レベルよりも高い場合に患者を選択するステップ
を包含する方法。
【請求項３】
患者における癌治療での化合物の有効性を決定するための方法であって、
ａ．細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物を患者に投与するステップ、
ｂ．投与ステップ（ａ）の後の時点で患者から試験腫瘍試料を得るステップ、
ｃ．ステップ（ｂ）の試験腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の試験レベルを決定するステップ、および
ｄ．ステップ（ｃ）の試験レベルをＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンの参照レベルのリン酸化と比較するステップ
を包含する方法。
【請求項４】
ターンモチーフのリン酸化の参照レベルおよび試験レベルが、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンに特異的な抗リン酸化スレオニン抗体を用いてそれぞれ決定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ターンモチーフスレオニンが、配列番号１のＴ８６０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗体が抗リン酸化Ｔ８６０抗体である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
ターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルが、非癌性組織において見られるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化レベルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルが任意の値である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルが、癌治療用化合物の投与前に患者から得られる腫瘍試料において見られるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化レベルである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｍＴＯＲＣ２経路活性が、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｍＴＯＲＣ２経路活性が、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅの活性化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｍＴＯＲＣ２経路活性が、Ａｋｔのリン酸化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
癌がＰＩ３Ｋにより誘発される癌である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌が前立腺癌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物に応答し得る患者の選択における抗リン酸化Ｔ８６０抗体の使用であって、抗リン酸化Ｔ８６０抗体が、ＰＫＮ３タンパク質のリン酸化されたターンモチーフスレオニンに結合する、使用。
【請求項１６】
抗リン酸化Ｔ８６０抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
抗リン酸化Ｔ８６０抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
患者が、細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物の安全性、有効性、または両方を決定するための臨床試験への参加について選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
癌治療用化合物が、ＰＩ３Ｋにより誘発される癌に対して標的化されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
癌治療用化合物が、前立腺癌に対して標的化されている、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その両方が参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年４月５日に出願された米国特許出願第６１／３２０，９６３号、および２０１０年４月８日に出願された米国特許出願第６１／３２２，０７１号の利益を主張する。
【０００２】
本願は、癌を治療するため、または癌治療のための取り組みにおいて患者を層別化するために、癌患者を選択する方法を対象とする。詳細には、本願は、特定の癌治療法に応答し得る患者を同定または層別化するためのバイオマーカーとしての、ＰＫＮ３タンパク質内のヘリックスターン座にあるリン酸化されたスレオニンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
効果的な癌治療法の開発は、疾患の根底にある分子メカニズムの解明、および新たな薬剤の開発において有用であり得るこれらのメカニズム内の標的分子の同定にますます依存してきている。このような標的分子が利用可能となると、薬剤候補化合物をこれらの標的に対して試験することができる。多くのケースにおいて、このような薬剤候補は、合成化合物または天然化合物からなり得る化合物ライブラリーのメンバーである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特に侵襲性の形態の癌に関与する新たな分子標的を同定して、新たな治療用化合物および治療レジメンを同定および有効性確認できるようにすることが、大いに必要とされている。
【０００５】
多くの形態の癌は、異常に活性なホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路を伴う。異常なＰＩ３Ｋ経路活性は、通常、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の喪失および／またはＰＩ３Ｋにおける活性化突然変異によって生じると考えられている。最近、Ｇｕｅｒｔｉｎらによって、ｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）が、ＰＩ３Ｋと共にＡｋｔを共活性化し、マウスにおいて腫瘍を形成するためにＰＴＥＮ欠損ヒト前立腺上皮細胞に必要であることが示されている（Ｇｕｅｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １５：１４８〜１５９、２００９）。ｍＴＯＲＣ２は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＦＫ５０６結合タンパク質−１２−ラパマイシン関連タンパク質１（別名、ラパマイシンの哺乳動物標的、ｍＴＯＲ）、ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＳＩＮ１、およびＰＲＯＴＯＲ／ＰＲＲ５を包含する。
【０００６】
したがって、ｍＴＯＲＣ２経路の上流および下流の構成要素の解明によって、ＰＩ３Ｋ経路を伴う特定の形態の癌を治療するための、ｍＴＯＲＣ２活性に影響する作用物質の発見および展開が増強される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、ｍＴＯＲＣ２が、Ｔ８６０の位置を通常割り当てられるＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンをリン酸化することによって、ＰＫＮ３の活性化に関与することを発見した。
【０００８】
一態様において、本発明は、癌に罹患している患者を治療する方法であって、（ａ）患者から腫瘍試料を得るステップ、（ｂ）腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化のレベル（「試験レベル」）を決定するステップ、（ｃ）試験レベルをＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベル（「参照レベル」）と比較するステップ、および（ｄ）細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。比較ステップの結果に基づいて、患者は、癌治療を受けるよう選択される。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療薬に応答し得る患者を選択するための方法であって、（ａ）患者から腫瘍試料を得るステップ、（ｂ）腫瘍試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化のレベル（「試験レベル」）を決定するステップ、（ｃ）試験レベルをＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベル（「参照レベル」）と比較するステップ、および（ｄ）癌治療薬での治療について患者を選択するステップを包含する方法を提供する。図形または文書の形態でエンドユーザーに提示され得る比較の結果に基づいて、医師は、患者が癌治療に応答し得るかどうかを決定し、その決定に基づいて患者を選択する。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、患者における癌治療での化合物の有効性を決定するための方法であって、（ａ）細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物を患者に投与するステップ、（ｂ）投与ステップ後の時点で患者から試験腫瘍試料（「試験試料」）を得るステップ、（ｃ）試験試料におけるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化のレベル（「試験レベル」）を決定するステップ、および（ｄ）試験レベルをＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンの参照レベルのリン酸化（「参照レベル」）と比較するステップを包含する方法を提供する。エンドユーザーに提示され得る比較の結果に基づいて、医師は、化合物が患者における癌の改善に対して何らかの効果を有していたかを決定する。
【００１１】
３つの前述の態様の一実施形態において、ターンモチーフのリン酸化の参照レベルおよび試験レベルは、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンに特異的に結合する抗体を用いてそれぞれ決定される。いくつかの実施形態において、ＰＫＮ３タンパク質は、ターンモチーフスレオニンが残基番号８６０のスレオニン（「Ｔ８６０」）である配列番号１に類似または同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンに特異的に結合する抗体は、抗リン酸化Ｔ８６０抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【００１２】
前述の態様のいくつかの実施形態において、ターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルは、患者の非癌性組織において見られるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化レベル、または、いくつかの患者、ドナー、もしくは組織タイプから得られる非癌性組織において見られる平均レベルである。他の実施形態において、参照レベルは、ｍＴＯＲＣ２活性を伴うことが知られている特に侵襲性の形態の癌において見られるレベル、またはいくつかの供給源から得られる癌におけるレベルの平均である。さらに他の実施形態において、参照レベルは任意のレベルであり、これは、いくつかの実施形態において、所与の薬剤に対する患者の臨床応答に基づくか、またはエクスビボでの細胞応答に基づくか、または特定の患者群の応答に基づく。
【００１３】
第３の態様のいくつかの実施形態において、ターンモチーフスレオニンのリン酸化の参照レベルは、癌治療用化合物の投与前に患者から得られる腫瘍試料において見られるＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化レベルである。
【００１４】
第４の態様において、本発明は、細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物に応答し得る患者の選択における抗リン酸化Ｔ８６０抗体の使用を提供し、抗リン酸化Ｔ８６０抗体は、ＰＫＮ３タンパク質のリン酸化されたターンモチーフスレオニンに結合する。
【００１５】
第４の態様のいくつかの実施形態において、抗リン酸化Ｔ８６０抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態において、抗リン酸化Ｔ８６０抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１６】
第４の態様のいくつかの実施形態において、患者は、細胞におけるｍＴＯＲＣ２経路活性を低下させる癌治療用化合物の安全性および／または有効性を決定するための臨床試験への参加について選択される。
【００１７】
いずれかの前述の態様のいくつかの実施形態において、ｍＴＯＲＣ２経路活性は、ＰＫＮ３タンパク質のターンモチーフスレオニンのリン酸化である。他の実施形態において、ｍＴＯＲＣ２経路活性は、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅの活性化である。さらに他の実施形態において、ｍＴＯＲＣ２経路活性は、Ａｋｔのリン酸化である。
【００１８】
いずれかの前述の態様のいくつかの実施形態において、癌治療用化合物は、前立腺癌を含む、ＰＩ３Ｋにより誘発される癌に対して標的化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】野生型ＰＫＮ３およびキナーゼデッドＰＫＮ３、リン酸化されたＰＫＮ３（ターンモチーフスレオニンで）、ならびにリン酸化された基質（ＧＳＫα）のドキシサイクリンに誘導された発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図２】ＰＫＮ３、リン酸化されたＰＫＮ３（ターンモチーフスレオニンで）、およびリン酸化された基質（ＧＳＫα）の発現に対する、Ｙ２７６３２、ＳＢ２０２１９０、およびＳＢ２０２４７４の濃度変化の効果を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図３】ＰＫＮ３、リン酸化されたＰＫＮ３（ターンモチーフスレオニンで）、ならびにリン酸化されたＰＫＮ１およびＰＫＮ２の発現に対する、Ｙ２７６３２の濃度変化の効果を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図４】リン酸化されたキナーゼデッドＰＫＮ３−Ｔ８６０、リン酸化されたＰＫＮ３−Ｔ７１８、リン酸化されたＡＫＴ、およびリン酸化されたＳ６Ｋの発現に対する、Ｙ２７６３２の存在下または非存在下でのキナーゼ阻害剤スタウロスポリン、ＷＡＹ−１２５１３２、およびＣＣＩ−７７９の濃度変化の効果を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図５】リン酸化された野生型ＰＫＮ３−Ｔ８６０、リン酸化ＰＫＮ３−Ｔ７１８、リン酸化されたＡＫＴ、およびリン酸化されたＳ６Ｋの発現に対する、Ｙ２７６３２の存在下または非存在下でのキナーゼ阻害剤スタウロスポリン、ＷＡＹ−１２５１３２、およびＣＣＩ−７７９の濃度変化の効果を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図６】ドキシサイクリンの非存在下（パネルＡおよびＤ）、ドキシサイクリンの存在下（パネルＢおよびＥ）、またはドキシサイクリンおよびＷＡＹ−１２５１３２の存在下（パネルＣおよびＦ）で、ドキシサイクリン応答性プロモーターの制御下で野生型ＰＫＮ３構築物（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）またはキナーゼデッドＰＫＮ３構築物（パネルＤ、Ｅ、およびＦ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図７】野生型ＰＫＮ３、キナーゼデッドＰＫＮ３、またはＹ２７６３２の存在下のキナーゼデッドＰＫＮ３を発現する細胞におけるリン酸化ＰＫＮ３−Ｔ８６０およびリン酸化ＡＫＴ−Ｓ４７３の発現に対する、Ｒａｐｔｏｒアンチセンス発現、Ｒｉｃｔｏｒアンチセンス発現、またはｍＴＯＲアンチセンス発現の効果を示すウェスタンブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＰＫＮ３の触媒活性には、２つの保存された部位、すなわち、ＰＤＫ１によってリン酸化される可能性が高い、その活性化ループ内のスレオニン（例えば「Ｔ７１８」）、およびこれまで知られていない上流のキナーゼによってリン酸化される、そのターンモチーフ内のスレオニン（例えば「Ｔ８６０」）での、そのキナーゼドメイン内のリン酸化事象が必要であることが一般に知られている。ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化に関与する未知のキナーゼを解明するための試みにおいて、出願人らは、ヒトＰＫＮ３のスレオニン８６０（Ｔ８６０）にあるターンモチーフリン酸化部位に対する活性化状態の特異的抗体を生じさせ、この抗体を利用して、ＰＫＮ３を活性化するメカニズムを突き止めた。この抗体を用いて、ドキシサイクリン応答性の細胞系におけるＰＫＮ３の状態を調べた。
【００２１】
出願人らは、驚くべきことに、両部位でのＰＫＮ３のリン酸化が、ＰＫＮ３の固有のキナーゼ活性には依存せず、ＰＫＮ３のヌクレオチド結合ポケットの活性な立体構造に依存するということを発見した。ＰＫＮ３のキナーゼ不活性な突然変異体は、そのＡＴＰ結合ポケットがＰＫＮ３のＡＴＰ競合阻害剤によって占められていない限り、これらの部位ではリン酸化されないことが発見された。さらに、Ｔ８６０抗体と組み合わせてキナーゼ不活性な酵素のこの特性を調べることにより、出願人らは、驚くべきことに、ラパマイシン複合体２の哺乳動物標的（「ｍＴＯＲＣ２」）が、ターンモチーフ部位（Ｔ８６０）でのＰＫＮ３のリン酸化に必要であること、およびこのリン酸化事象が腫瘍形成におけるその機能に必要である可能性が高いことを発見した。
【００２２】
したがって、出願人らは、リン酸化状態に特異的なＴ８６０抗体を、患者の層別化および治療的応答のモニタリングのための重要なバイオマーカーツールとして用いることを構想する。出願人らはさらに、キナーゼ欠損ＰＫＮ３（「ＰＫＮ３ｋｄ」）変異体がリン酸化Ｔ８６０抗体と組み合わされた活性な触媒性の中央立体構造を取ることを可能にする、上記のアッセイ系を、癌治療の可能性を有するｍＴＯＲＣ２特異的な阻害剤を同定するための、細胞に基づいたロバストなスクリーニングレジメンとして用いることを構想する。
【００２３】
ＰＫＮ３は、８８９アミノ酸残基長のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである（ヒトオルソログ）。これは、それぞれ残基１５〜７７、９７〜１７０、および１８４〜２３６付近に位置する、３つの逆平行コイルドコイル（ＡＣＣ）ドメインであるＡＣＣ１、ＡＣＣ２、およびＡＣＣ３を含む、Ｎ末端推定調節領域；残基５５９〜８８２に位置するＣ末端触媒領域；ならびに推定調節ドメインと触媒ドメインとの間に位置する、約１００から１３０残基長のＣ２様ドメインを有する。哺乳動物には、少なくとも３つの異なるＰＫＮアイソフォーム（ＰＫＮ１／ＰＫＮα／ＰＡＫ−１／ＰＲＫ−１、ＰＫＮ２／ＰＲＫ２／ＰＡＫ−２／ＰＫＮγ、およびＰＫＮ３／ＰＫＮβ）が存在し、そのそれぞれは、異なる酵素学的特性、組織分布、および様々な機能を示す。ＰＫＮの概説については、Ｍｕｋａｉ，Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７〜２７、２００３を参照されたい。また、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、２００４年６月３日に公開された米国特許出願第２００４０１０６５６９号も参照されたい。
【００２４】
出願人らは、これまでに、侵襲性および薬剤耐性が増大した癌細胞においてＰＫＮ３が上方調節されていることを示している（参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、同時係属している米国仮特許出願第６１／１５９，７３９号および米国仮特許出願第６１／２２６，０７８号のそれぞれ図１および図２を参照されたい）。侵襲性の増大とは、癌細胞が転移性であるか、転移する可能性が高いか、増殖速度が増大しているか、または薬剤耐性であることを意図する。侵襲性の癌は、例えば、トリプルネガティブ乳癌（例えば、Ｄｅｎｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：４４２９〜４４３４、Ａｕｇ．１、２００７を参照されたい）によって例示される。侵襲性の癌はまた、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３／ＲｈｏＣ経路が関与している癌を包含する。
【００２５】
ｍＴＯＲＣ２および／またはＰＫＮ３（または活性のＰＫＮ３経路における他のエフェクター）の活性を阻害する化合物は、細胞の転移および増殖の挙動を制御するために用いることができ、したがって、腫瘍および癌、特に侵襲性の腫瘍および癌を治療する方法を提供することができる。ｍＴＯＲＣ２および／またはＰＫＮ３の活性によってもたらされるシグナル伝達および他の活性の低減は、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３経路の構成要素の１つまたは複数の、転写レベル、翻訳レベル、もしくは翻訳後修飾レベル（例えば、ＰＫＮ３のリン酸化活性化）での低減、または四次構造形成（すなわち、ＰＫＮ３を伴う三重複合体の形成）のレベルでの低減から生じ得る。
【００２６】
ｍＴＯＲＣ２がＰＫＮ３の活性化に、特に侵襲性の癌の病因に関与することから、ターンモチーフスレオニン（例えば、Ｔ８６０）でリン酸化されたＰＫＮ３は、予後マーカー、疾患病期診断マーカー、患者層別化マーカー、または、患者がｍＴＯＲＣ２活性を標的化する癌治療用化合物に応答し得るかどうかについて細胞もしくはこのような種類の細胞を体内に有する患者の状態を診断するためのマーカーとして用いることができる。
【００２７】
ＰＫＮ３は、ＰＩ３Ｋ誘導性の細胞の移動および浸潤の、発生的に調節されたメディエーターである。これは、Ａｋｔ非依存的に、発現レベルおよび触媒活性レベルでＰＩ３Ｋによって調節される。これは、発現パターンが制限されており（内皮細胞、胚細胞、および腫瘍細胞）、ほとんどの正常な細胞機能にとって必須ではない。これは、同所性マウスモデルにおける転移性ＰＣ−３（ＰＴＥＮ−／−）細胞の成長にとって必要である。
【００２８】
正常な細胞において、ＰＩ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）経路は、増殖因子の誘導および平行シグナル伝達経路に対するＰＩ３キナーゼ活性によって特徴付けされる。細胞への増殖因子刺激によって、細胞膜でのその同族受容体が活性化し、これが次に、ＰＩ３キナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子と会合して、これを活性化する。ＰＩ３キナーゼ（調節性のｐ８５サブユニットおよび触媒性のｐ１１０サブユニットからなる）の活性化によって、リン酸化によるＡｋｔの活性化が生じ、これによって、増殖、生存、またはさらに下流への移動などの細胞応答が補助される。ＰＴＥＮは、したがって、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼ経路に関与する腫瘍抑制因子であり、前記腫瘍抑制因子は、細胞の成長および形質転換の調節におけるその役割について過去に広く研究されている（概説については、例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．およびＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ６：３４７〜３５７、２０００を参照されたい）。
【００２９】
腫瘍抑制因子ＰＴＥＮは、ＰＩ３キナーゼ触媒型の反応を逆転させることによってＰＩ３キナーゼの負の調節因子として機能し、それによって、確実に、経路の活性化を一時的かつ制御された様式で生じさせる。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の慢性的な過剰活性化は、ＰＴＥＮの機能的不活化によって生じる。ＰＩ３キナーゼ活性は、低分子阻害剤ＬＹ２９４００２を添加することによってブロックすることができる。平行経路で作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活性および下流での応答は、例えば、低分子阻害剤ＰＤ９８０５９によって阻害することができる。
【００３０】
ＰＴＥＮ機能の喪失を介する、ＰＩ３キナーゼ経路の慢性的な活性化は、腫瘍形成および転移の主な原因であり、このことは、この腫瘍抑制因子が、制御された細胞増殖について重要なチェックポイントであることを示す。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３キナーゼ経路が活性化形態のＰＩ３キナーゼを介して慢性的に誘導されている細胞と、類似の特徴を示す。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化は、細胞サイクルの開始にとって十分であり、発癌性の形質転換の特徴である細胞変化を促進する。
【００３１】
ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）は、細胞の成長、細胞増殖、細胞の運動性、細胞の生存、タンパク質合成、および転写を調節する、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲのラパマイシン非感受性の同伴物（Ｒｉｃｔｏｒ）、ＧβＬ、および哺乳動物のストレス活性化タンパク質キナーゼ相互作用タンパク質１（ｍＳＩＮ１）を包含する。ｍＴＯＲＣ２は、セリン残基Ｓ４７３でセリン／スレオニンタンパク質キナーゼＡｋｔ／ＰＫＢをリン酸化することが示されている。セリンのリン酸化は、ＰＤＫ１によるスレオニンＴ３０８残基でのＡｋｔのリン酸化を刺激し、Ａｋｔを完全に活性化させる。ｍＴＯＲＣ２は、ＰＴＥＮに関連する癌の発生にとって重要であることが知られている（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２００８  Ｊｕｌ  ２３；２７（１４）：１９３２〜４３;およびＧｕｅｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｆｅｂ  ３；１５（２）：１４８〜５９を参照されたい）。
【００３２】
ＰＩ３キナーゼ経路の異常調節を伴う疾患および症状はよく知られている。したがって、これらの症状および疾患のいずれも、本発明の方法によって対処されてよく、薬剤および診断薬、その設計、スクリーニング、または製造が本明細書において教示される。限定ではなく説明のために、症状および疾患は以下のものである：子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜の過形成、コーデン症候群、遺伝性の非ポリープ性の結腸直腸癌、リ・フラウメニ（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｅ）症候群、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、バナヤンゾナナ症候群、ＬＤＤ（レルミット・デュクロス（Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｋｌｏ）症候群）、Ｃｏｗ疾患（ＣＤ）およびバナヤンライリールバルカバ症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫大頭疾患、皮膚粘膜の病変（例えば、外毛根鞘腫）、大頭、精神遅滞、胃腸の過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房の線維嚢胞性疾患、小脳の異形成神経節細胞腫、ならびに乳房および甲状腺の悪性腫瘍。
【００３３】
これを考慮して、活性化型のリン酸化されたＰＫＮ３およびその会合したエフェクター（例えば、ｍＴＯＲＣ２およびＲｈｏＣ）は、上流標的に向けられた他の薬剤よりも副作用が少ない薬剤によって対処され得る、ＰＩ３キナーゼ経路の下流の有益な薬剤標的である。したがって、本発明は、当技術分野において知られているものよりも選択的な薬学的に活性な化合物の設計、スクリーニング、開発、および製造に適切な薬剤標的、例えば、通常はＰＩ３キナーゼを標的化する２−（４−モルホリニル）８−フェニルクロモン（「ＬＹ２９４００２」）、ならびに通常はｍＴＯＲ（複合体１および複合体２の両方）を標的化するラパマイシンおよび２−［１−（２，４−ジクロロフェニル）−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン］ヒドラジンカルボキシイミドアミドジヒドロクロリド（「ＷＡＹ−１２５１３２」）を提供する。ＰＫＮ３シグナル伝達機構のこの特定部分（すなわち、ターンモチーフスレオニンでのリン酸化）および経路に関与する任意のさらに下流の分子を制御することにより、シグナル伝達カスケードにおける非常に限られた数のその平行分岐またはさらに上流の標的のみが、望ましくない効果を生じさせる可能性が高い。したがって、細胞サイクル、ＤＮＡ修復、アポトーシス、グルコース輸送、翻訳に関連するＰＩ３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は影響されない。
【００３４】
タンパク質キナーゼＮベータ（ＰＫＮβ）としても知られている、ＰＫＮ３（ＰＫＮ３は配列番号１で示される）をコードする核酸の完全な配列は、通常、公共のデータバンクで入手可能である（例えば、とりわけ、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１３３５５、ＢＡ８５６２５、ＸＭ＿００１１５９７７６を参照されたい）。また、ＰＫＮ３のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０３７４８７．２で、データバンクで入手可能である。当業者には、ターンモチーフスレオニンを含む他のＰＫＮ３オルソログおよびＰＫＮ３ホモログが本発明の実施において有用であることが容易に認識または予想されよう。ｍＴＯＲ（ｍＴＯＲは配列番号２で例示される）（ヒトオルソログ）をコードする核酸の完全な配列は、通常、公共のデータバンクで入手可能である（例えば、とりわけ、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００４９５８、ＢＣ１１７１６６、Ｌ３４０７５を参照されたい）。また、ｍＴＯＲのアミノ酸配列は、とりわけ受託番号Ｐ４２３４５、Ｐ４２３４６、Ｑ９ＪＬＮ９、ＮＰ＿０６３９７１、ＮＰ＿００４９４９、およびＮＰ＿０６４３９３で、データバンクで入手可能である。当業者には、他のｍＴＯＲオルソログおよびｍＴＯＲホモログが本発明の実施において有用であることが容易に認識または予想されよう。ｍＴＯＲは、例えば、Ｍｅｎｏｎ，Ｓ．およびＭａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．、Ｃｏｍｍｏｎ  ｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８  Ｄｅｃ；２７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ４３〜５１において論じられている。ＰＫＮ３およびｍＴＯＲの誘導体またはトランケート型、ならびにその複合体２に会合したタンパク質が、所望の効果が得られ得る限りにおいて、本発明に従って用いられ得ることは、本発明の範囲内である。したがって、誘導体化およびトランケーションの程度は、通常の分析によって当業者が決定することができる。
【００３５】
本発明の背景では、ＰＫＮ３、ｍＴＯＲ、およびｍＴＯＲＣ２会合タンパク質（すなわち、ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＳＩＮ１、およびＰＲＯＴＯＲ／ＰＲＲ５）をコードする核酸配列という用語にはまた、前述の受託番号によって特定される核酸配列にハイブリダイズする核酸または前述のアミノ酸配列に由来し得るあらゆる核酸配列が含まれる。このようなハイブリダイゼーションは、当業者に知られている。このようなハイブリダイゼーションの特殊性は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得ることができる。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋにおいて特定されるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションである。
【００３６】
さらに、ＰＫＮ３、ｍＴＯＲ、およびｍＴＯＲＣ２会合タンパク質をコードする核酸はまた、前述の核酸配列のいずれかに相同な配列を含む核酸配列であり、これにより、配列相同性の程度は、７５、８０、８５、９０、または９５％である。
【００３７】
ヒトＰＫＮ３に対するオルソログを、とりわけ、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、カエノラブディティスエレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ならびにサッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）ほどに進化的に多様な生物において、見ることができる。ＰＫＮ３のケースでは、同一性パーセントは、以前に述べた様々な種について、それぞれ６７％、５１％、３８％、３６％、６３％、および４４％である。ヒトｍＴＯＲに対するオルソログは、それぞれ９８％、９６％、９０％、および６２％の同一性パーセントで、齧歯動物、鳥、硬骨魚、および昆虫において見られる。当業者には、いかなるこれらのまたは他のオルソログおよびホモログも、このようなホモログを用いて生成される薬剤または診断薬が依然としてヒトＰＫＮ３またはｍＴＯＲＣ２または任意の他の意図されたＰＫＮ３もしくはｍＴＯＲＣ２と相互作用し得るならば、本発明の実施に原則として適切であることが認識されよう。
【００３８】
ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化状態（「リン酸化ＰＫＮ３マーカー」）またはｍＴＯＲＣ２活性の他の読み出し（「ｍＴＯＲＣ２読み出し」）を、患者の層別化のための、または患者における、ｍＴＯＲ活性、さらに好ましくはｍＴＯＲＣ２活性を標的化する抗癌化合物に対する腫瘍の応答についての、バイオマーカーとして用いることができる。抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡなどの、異なるクラスの化合物に属する適切な抗癌化合物、ならびに有機低分子を用いることができる。抗癌化合物は、リン酸化ＰＫＮ３に基づくスクリーニング、または他のｍＴＯＲＣ２読み出しスクリーニングを用いて、設計、選択、スクリーニング、生成、または製造することができる。このようなスクリーニング方法において、第１のステップは、１つまたは複数のいわゆる候補化合物または試験化合物を提供することである。本明細書において用いられる候補化合物は、その適合性が、本明細書において記載されている癌の治療もしくは軽減のための試験系において試験される化合物、または癌のための診断手段もしくは診断薬として用いられる化合物である。
【００３９】
候補化合物が試験系においてそれぞれの効果を示すならば、前記候補化合物は、前記疾患および疾患状態を治療するための適切な手段または作用物質であり、原則的にその上、前記疾患および疾患状態についての適切な診断薬でもある。第２のステップにおいて、候補化合物を、ＰＫＮ３タンパク質（またはターンモチーフスレオニンを含むその断片）およびｍＴＯＲＣ２（「ＰＫＮ３／ｍＴＯＲＣ２系」）を包含する系と接触させる。ＰＫＮ３／ｍＴＯＲＣ２系はまた、本明細書において、活性化型のリン酸化されたＰＫＮ３のキナーゼ活性を検出する系とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、さらに、ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化状態を直接的に評価することに加え、活性化型のリン酸化されたＰＫＮ３のキナーゼ活性を、基質、例えば、配列ＧＰＧＲＲＧＲＲＲＴＳＳＦＡＥＧＧ（配列番号３）を有する診断的なＧＳＫ３由来断片のリン酸化を決定することによって評価することができる。
【００４０】
本明細書において記載される、リン酸化ＰＫＮ３に基づくスクリーニング法または他のｍＴＯＲＣ２読み出しスクリーニング法はまた、さらなる検討から機能的ではないまたは不活性な化合物を排除するために有用である。したがって、ＰＫＮ３キナーゼの活性またはリン酸化状態（通常、「ＰＫＮ３状態」）を、対象または試験系から得られる第１の試料において測定して、治療前レベルを得ることができ、その後、試験化合物を対象または試験系に投与し、試験化合物を投与した後の時点で対象または試験系から得られる第２の試料におけるＰＫＮ３の状態を測定し、それによって、試験レベルについてのデータを得る。治療前レベル（第１のレベル）を試験レベル（第２のレベル）と比較することができ、治療前レベルと比較して試験レベルで低下していないことを示すデータは、試験化合物が対象において効果的ではなく、試験作用物質がさらなる評価または研究から排除され得ることを示す。
【００４１】
本明細書において記載されるｍＴＯＲＣ２読み出しスクリーニング法（例えば、リン酸化ＰＫＮ３に基づくスクリーニング）は、患者が、作用メカニズムとしてＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化の妨害を有する特定の抗癌化合物に応答し得るかどうかを評価するために有用である。前記評価は、治療目的での患者集団の層別化、および臨床試験への参加者の選択において有用である。腫瘍試料は患者から得られ、ターンモチーフスレオニンのリン酸化されたＰＫＮ３（例えば、Ｐ＊Ｔ８６０）の相対量（例えば、特異的活性）が決定される。ターンモチーフスレオニンのリン酸化されたＰＫＮ３の相対量は、抗リン酸化スレオニン抗体などを用いてリン酸化スレオニンＰＫＮ３のレベルを直接的に測定することによって、または、ＰＫＮ３キナーゼ基質の活性を測定することなどによってリン酸化スレオニンＰＫＮ３のキナーゼ活性を測定することによって、決定することができる。リン酸化されたターンモチーフスレオニンＰＫＮ３のレベルが上昇している患者は、ｍＴＯＲＣ２に対して標的化された治療法に応答する可能性が高い患者として選択される。
【００４２】
本明細書において記載されるｍＴＯＲＣ２読み出しスクリーニング法（例えば、リン酸化ＰＫＮ３に基づくスクリーニング）はまた、患者が、作用メカニズムとしてＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化の妨害を有する特定の抗癌化合物に応答しているかまたは応答したかを評価するために有用である。腫瘍試料は治療の前に患者から得られ、ターンモチーフスレオニンのリン酸化されたＰＫＮ３（例えば、Ｐ＊Ｔ８６０）の相対量（例えば、特異的活性）が決定される。ターンモチーフスレオニンのリン酸化されたＰＫＮ３の相対量は、抗リン酸化スレオニン抗体などを用いてリン酸化スレオニンＰＫＮ３のレベルを直接的に測定することによって、または、ＰＫＮ３キナーゼ基質の活性を測定することなどによってリン酸化スレオニンＰＫＮ３のキナーゼ活性を測定することによって、決定することができる。このレベルによって、特定の患者の基底レベルが確立される。治療を開始した後の１つまたは複数の期間に、腫瘍試料が患者から得られ、リン酸化されたターンモチーフスレオニンＰＫＮ３のレベル（「治療レベル」）が決定され、初期基底レベルと比較される。基底レベルに対する治療レベルでの低下は、抗癌治療法が有効であることを示す。
【００４３】
上記のリン酸化されたターンモチーフスレオニンＰＫＮ３のレベルを決定する方法には、適切な抗体を用いる検出が含まれる。適切な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換えモノクローナル抗体であり得る、抗リン酸化Ｔ８６０抗体が含まれる。抗体は、当業者に知られているようにして生成することができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．、およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、（１９８８）によって記載されている。適切な抗体はまた、他の周知の方法によって、例えば、抗体ライブラリーからのファージディスプレイ選択によって、生成することができる。
【００４４】
ｍＴＯＲＣ２／リン酸化されたターンモチーフスレオニンＰＫＮ３複合体のケースでは、複合体の活性の増大または低下を、機能的キナーゼアッセイにおいて決定することができる。腫瘍試料または腫瘍試料に由来する細胞系を、抗癌化合物と接触させることができ、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３系の活性の変化が決定される。いくつかのケースにおいて、抗癌化合物は、とりわけ、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、または機能的核酸からなるライブラリーを含む、化合物ライブラリー内にあり得る。後者の化合物は、当業者に知られているようにして生成することができる。
【００４５】
ＰＫＮ３のリン酸化されたターンモチーフスレオニンに特異的な抗体の製造は、当業者に知られている。本発明の抗体には、ナノボディ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体）、および抗イディオタイプ抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体は、特異的抗原に結合する抗体の実質的に均質な集団である。通常、抗体は、例えば従来のハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８;Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７）を用いて作製することができる。さらなる抗体生産技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい。本発明は、いかなる特定の供給源、生産方法、または抗体の他の特別な特徴にも限定されない。
【００４６】
用語「抗体」はまた、無傷分子と、抗原を結合し得るＦａｂ、一本鎖Ｆｖ抗体（ＳｃＦｖ）、および低分子モジュラー免疫薬剤（ＳＭＩＰ）などの断片との両方を含むことを意図する。Ｆａｂ断片は、無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からさらに迅速に排出され、無傷抗体ほどには非特異的な組織結合を有さない可能性がある（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５）。キメラ抗体は、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域（ＶＨ、ＶＬ）およびヒト免疫グロブリン定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＬ）を有するものなど、その異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。キメラ抗体およびその生産方法は、当技術分野において知られている（Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３〜３２７７;Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５;Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３〜６４６;Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公開）;Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）;Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）;Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）;Ｋｕｄｏら、欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）;Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）;Ｓａｈａｇａｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６〜１０７４;Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）;Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９〜３４４３;Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４〜２１８;Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３）。ＳＭＩＰは、１つの結合ドメイン、１つのヒンジドメイン、および１つのエフェクタードメインを包含する、一本鎖ポリペプチドである。ＳＭＩＰならびにその使用および適用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号、米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号、米国特許出願公開第２００４／００５８４４５号、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号、米国特許出願公開第２００５／０１７５６１４号、米国特許出願公開第２００５／０１８０９７０号、米国特許出願公開第２００５／０１８６２１６号、米国特許出願公開第２００５／０２０２０１２号、米国特許出願公開第２００５／０２０２０２３号、米国特許出願公開第２００５／０２０２０２８号、米国特許出願公開第２００５／０２０２５３４号、および米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号、ならびにその関連する特許ファミリーメンバーにおいて開示されており、これらの全てはここで、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本発明に従って用いられ得る抗体は、１つまたは複数のマーカーまたは標識を有し得る。このようなマーカーまたは標識は、その診断用途またはその治療用途において、抗体を検出するために有用であり得る。好ましくは、マーカーおよび標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金、およびフルオレセインを包含する群から選択され、例えばＥＬＩＳＡ法において用いられる。これらのおよびさらなるマーカーおよび方法は、例えば、上記のＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅにおいて記載されている。
【００４８】
一実施形態において、抗体は、ＰＫＮ３のターンモチーフ（配列番号４：８４７−ＹＦＥＧＥＦＴＧＬＰＰＡＬＴＰＰＡＰＨＳＬＬＴＡＲＱＱＡ−８７４）内の位置８６０にあるリン酸化スレオニン（四角で囲まれた）を認識する、ＰＫＮ３の活性化状態に特異的な抗体を包含する。前記抗体は、とりわけ、ＰＫＮ３の発現および活性化の増大についてのプローブとして、ならびに患者の層別化および治療的応答についてのバイオマーカーとして有用である。
【００４９】
ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体もしくはその構成要素および断片または前記ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体もしくはその構成要素および断片をコードする核酸を用いて生成され得る、さらなるクラスの医薬品、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体を妨害する化合物および診断薬は、前記複合体もしくはその構成要素および断片または核酸に結合するペプチドである。このようなペプチドは、ファージディスプレイなどの当技術分野の水準の方法を用いて生成することができる。基本的に、ペプチドライブラリーは、ファージの表面上に生成および提示され、提示されたライブラリーは、標的と、本ケースでは例えばＰＰＲＣ複合体またはその構成要素と接触する。標的に結合するペプチドは、その後、好ましくは標的分子との複合体として、それぞれの反応から除去される。結合特徴が少なくともある程度は塩濃度などの特定の実験設定に依存することが、当業者に知られている。標的分子に高い親和性または大きな力で結合するペプチドをライブラリーの未結合メンバーから分離した後、および場合によってまた標的分子を標的分子とペプチドとの複合体から除去した後、それぞれのペプチド（単数または複数）を実質的に特徴付けすることができる。
【００５０】
特徴付けステップの前に、増幅ステップを、場合によって、例えばペプチドをコードするファージを増殖させることによって行ってもよい。いくつかの実施形態において、特徴付けは、標的に結合するペプチドの配列決定を包含する。基本的に、ペプチドは長さが限定されていないが、約８から２０アミノ酸の長さを有するペプチドが通常、それぞれの方法において得られる。ライブラリーのサイズは、約１０２から１０１８、または１０８から１０１５の異なるペプチドであり得るが、ライブラリーのサイズは、これに限られない。
【００５１】
本発明によると、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体またはその構成要素、および前記ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体またはその構成要素をコードする核酸を、侵襲性の癌を治療するための医薬品を製造または開発するため、およびスクリーニングプロセスにおいて前記侵襲性の癌を診断するための手段を製造または開発するための標的として用いることができ、これによって、スクリーニングプロセスにおいて低分子または低分子ライブラリーが用いられる。このスクリーニングは、標的であるｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体またはその構成要素（標的）を、好ましくは上記に特定したライブラリーから得られた、単一の低分子または様々な低分子（ライブラリーなど）と、同時にまたは続けて接触させるステップ、および、標的に結合し、他の低分子に関連してスクリーニングされた場合に未結合のまたは相互作用していない低分子から分離され得るｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体の機能または完全性を妨害する、低分子またはライブラリーメンバーを同定するステップを包含する。
【００５２】
結合および未結合は、特定の実験設定によって大きく影響され得る。反応パラメータのストリンジェンシーを変化させる際、結合および未結合の程度を変化させることが可能であり、これによって、このスクリーニングプロセスの良好な調整が可能になる。いくつかの実施形態において、標的と特異的に相互作用する１つまたはいくつかの低分子を同定した後に、この低分子をさらに特徴付けすることができる。このさらなる特徴付けは、例えば、低分子を同定すること、ならびにその分子構造およびさらなる物理的、化学的、生物学的、または医学的特徴を決定することにあり得る。いくつかの実施形態において、天然化合物は、約１００から１０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、低分子は、当業者に知られているＬｅｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  Ｆｉｖｅに従う低分子である（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２３：３〜２５、１９９７を参照されたい）。あるいは、低分子はまた、天然生成物とは対照的に、組み合わせ化学から生じる合成低分子であるように定義され得る。しかし、これらの定義は当技術分野におけるそれぞれの用語の一般的な理解に従属するものにすぎないことに留意されたい。全てのキナーゼのように、ｍＴＯＲＣ２／ＰＫＮ３複合体のＰＫＮ３構成要素は、ＡＴＰ結合部位を含み、このような部位に結合することが知られている薬剤は、したがって、ＰＰＲＣ機能を阻害するための適切な候補化合物である。適切な化合物の例には、限定はしないが、ＬＹ−２７６３２、Ｒｏ−３  １−８２２０、およびＨＡ１０７７が含まれ、これらの全ては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００５３】
本発明はさらに、本発明の範囲の限定ではない以下の実施例によって例示される。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）ＰＫＮ３タンパク質構築物
ヒトＰＫＮ３（ＷＴまたはｗｔ）の完全長ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性プロモーターの制御下でＧＳＴ融合発現ベクター内にクローニングした。Ｋ５８８Ｒ置換を包含するキナーゼデッド（ＫＤまたはｋｄ）型のＰＫＮ３もまた、同一の戦略を用いて同一のベクター内にクローニングした。タンパク質を、ＰＫＮ３  ＷＴ構築物およびＫＤ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。図１は、ＷＴ  ＰＫＮ３およびＫＤ  ＰＫＮ３の生産がドキシサイクリン誘導に応答性であることを示す。ＷＴ  ＰＫＮ３は、ターンモチーフスレオニンでリン酸化されており（Ｐ＊−ＰＫＮ３Ｔ８６０）、ＧＳＫα基質をリン酸化するが、ＫＤ型はどちらでもない（図１）。
【００５５】
タンパク質の抽出のために、細胞を冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４℃で、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１５％（容積／容積）グリセロール、１％（容積／容積）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｌ当たり１０ｍｇのアプロチニン、２０ｍＭのロイペプチン、２ｍＭのベンズアミジン、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、２５ｍＭのβ−グリセロールリン酸、５０ｍＭのＮａＦ、および１０ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液中に溶解した。溶解物を、１４０００×ｇで５分間遠心分離することによって澄明化し、溶解物のアリコートを、タンパク質の発現および酵素活性について分析した（以下を参照されたい）。試料をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。フィルターを、５％（重量／容積）粉乳を含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％［容積／容積］Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％［重量／容積］のアジ化ナトリウム）内でブロックした。それぞれの抗体を、適切な希釈でＴＢＳＴに添加した。結合した抗体を、ＴＢＳＴ内の抗マウス、抗ヤギ、または抗ウサギコンジュゲートアルカリホスファターゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出し、洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（Ｐｒｏｍｅｇａ）で顕在化させた。あるいは、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を用い、増強した化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって顕在化させた。
【００５６】
ＰＫＮ抗体は、Ｌｅｅｎｄｅｒｓ、２００４において記載されている。ＰＤＫ１抗体、リン酸化ＧＳＫα抗体、ＧＳＴ抗体、ＰＮＫ３−Ｔ７１８抗体、Ｓ６Ｋ−ＳＴ３８９抗体、およびＡＫＴ−Ｓ４７３抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から市販されている。抗リン酸化ＰＫＮ３  Ｔ８６０ウサギモノクローナル抗体を、標準的な手順に従って生産した（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：９３４８〜９３５２を参照されたい）。
【００５７】
（実施例２）キナーゼ不活性なＰＫＮ３をプライムするためのＡＴＰ競合阻害剤の使用
様々なＡＴＰ型キナーゼ阻害剤を、組換え野生型（ＷＴ）とキナーゼデッド（ＫＤ）型との両方のＰＫＮ３のキナーゼ活性を阻害する能力について評価した。ＷＴ型またはＫＤ型のＰＫＮ３でトランスフェクトした細胞を、既知のＡＴＰ型キナーゼ阻害剤であるＹ２７６３２、ＳＢ２０２１９０、およびＳＢ２０２４７４（ＳＢ２０２１９０の不活性な形態）で処理した（Ｉｓｈｉｚａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５７：９７６〜９８３、２０００;Ｍａｎｔｈｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６４（３）：４０９〜４１７、１９９８）。Ｙ２７６３２およびＳＢ２０２１９０の両方は、リン酸化ＧＳＫαの読み出しを用いて、濃度依存的にキナーゼ活性なリン酸化されたＰＫＮ３のキナーゼ活性を阻害することが示されたが、ＳＢ２０２４７４はそうではなかった（図２）。キナーゼデッドＰＫＮ３は、ターンモチーフスレオニンでリン酸化されておらず、ＧＳＫ３由来の基質をリン酸化しなかった（図２）。
【００５８】
ＰＫＮ３のプライミングは固有のキナーゼ活性を必要としないが、ＡＴＰ結合ポケットを介する立体構造の調節に依存するかどうかを決定するために、ＫＤ  ＰＫＮ３およびＷＴ  ＰＫＮ３をＡＴＰ結合ポケット競合阻害剤Ｙ２７６３２、ＳＢ２０２１９０、およびＳＢ２０２４７４で処理した（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６（６）：６２４〜６３０、２００９を参照されたい）。驚くべきことに、Ｙ２７６３２およびＳＢ２０２１９０の両方が、濃度依存的に、キナーゼデッドＰＫＮ３がターンモチーフスレオニンでリン酸化されるようプライムしたが、ＳＢ２０２４７４はそうではないことが観察された（図３）。
【００５９】
Ｙ２７６３２でプライムされたＰＫＮ３（ＷＴ型およびＫＤ型）を、ＰＫＮ３のリン酸化メカニズムを調べるためのさらなる研究に用いた。
【００６０】
（実施例３）ターンモチーフのリン酸化の調節
ＫＤ  ＰＫＮ３およびＷＴ  ＰＫＮ３の両方の生産を、トランスフェクトされた細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで５時間処理することによって誘導した。ＰＫＮ３ターンモチーフのリン酸化の上流の調節因子を決定するための試みにおいて、ＰＫＮ３を１０μＭのＹ２７６３２でプライムし、次に、様々なキナーゼ阻害剤で７時間処理した（図４：ＫＤ−ＰＫＮ３、図５：ＷＴ−ＰＫＮ３）。ＰＤＫ１の阻害剤であるスタウロスポリンは、濃度依存的に、Ｔ７１８部位およびＴ８６０部位の両方でＰＫＮ３（ＷＴおよびＫＤ）のリン酸化を阻害することが示された（図４および図５、パネルＡ）。ＰＤＫ１がＴ７１８をリン酸化することは、当技術分野において通常見られることであり、これは、Ｔ８６０のリン酸化の前に生じる。スタウロスポリンは、Ｔ７１８のリン酸化を防ぐことによってＴ８６０のリン酸化を阻害すると考えられる。
【００６１】
ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方の潜在的な阻害剤であるＷＡＹ−１２５１３２（別名、ＷＹＥ−１３２、ＷＯ２００９０５２１４５を参照されたい）（Ｙｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０（２）：６２１〜６３１、Ｊａｎｕａｒｙ  １５、２０１０を参照されたい）は、用量依存的にＴ８６０のリン酸化を阻害するが、Ｔ７１８のリン酸化は阻害しないことが示された（図４および図５、パネルＢ）。対照として、ＷＡＹ−１２５１３２は、ｍＴＯＲＣ１の標的であるＳ６Ｋ−ＳＴ３８９およびｍＴＯＲＣ２の標的であるＡＫＴ−Ｓ４７３のリン酸化を阻害することが示された。
【００６２】
ｍＴＯＲＣ１の阻害剤であるＣＣＩ−７７９（別名、テムシロリムス）（Ｔｏｒｎｅａｕら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、（２００８）９９：１１９７〜１２０３）。テムシロリムスの化学名は、（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン（ｏｘａａｚａｃｙｃｌｏｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔｉｎｅ）−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン４’−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオネート］、またはラパマイシン、４２−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエート］である。ＣＣＩ−７７９は、Ｓ６Ｋ−ＳＴ３８９を阻害するが、プライムされたＰＫＮ３−Ｔ８６０もしくはＰＫＮ３−Ｔ７１８、ＰＫＮ１、ＰＫＮ２、またはＡＫＴ−Ｓ４７３には影響しないことが示された（図４および図５、パネルＣ）。総合すると、これらの結果は、ｍＴＯＲＣ２がＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化において必須の機能を有することを示唆する。
【００６３】
細胞におけるＰＫＮ３誘導性の形態学的変化に対するＷＡＹ−１２５１３２の効果を試験した。ドキシサイクリン処理した、ＷＴ  ＰＫＮ３でトランスフェクトされた細胞は、ドキシサイクリンで処理していない細胞と比較して形質転換した表現型を示した（図６、パネルＢをパネルＡと比較されたい）。ＷＡＹ−１２５１３２での処理によって、この効果は逆転し（図６、パネルＣ）、このことは、ｍＴＯＲを介するＰＫＮ３の活性化のブロックが、その細胞形質転換活性を阻害することを示す。ＫＤ  ＰＫＮ３は、ＷＡＹ−１２５１３２で処理していてもいなくても、細胞の形態には影響を有さなかった（図６、パネルＤ〜Ｆ）。
【００６４】
（実施例４）ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化のためのｍＴＯＲＣ２の必要性
ＰＫＮ３のターンモチーフスレオニンのリン酸化におけるｍＴＯＲＣ２とｍＴＯＲＣ１との役割をさらに区別するために、ＫＤ  ＰＫＮ３またはＷＴ  ＰＫＮ３を発現する細胞を、様々なｍＴＯＲ複合体構成要素に対する３つのアンチセンス構築物であるｒａｐｔｏｒ（ｍＴＯＲＣ１の構成要素）、ｒｉｃｔｏｒ（ｍＴＯＲＣ２の構成要素）、およびｍＴＯＲ（両方の構成要素）の１つでトランスフェクトした。図７、パネルＡは、ｒａｐｔｏｒアンチセンス（カラム３および４）、ｒｉｃｔｏｒアンチセンス（カラム５および６）、またはｍＴＯＲアンチセンス（カラム７および８）でトランスフェクトしたＷＴ  ＰＫＮ３を示す。図７、パネルＢは、ｒａｐｔｏｒアンチセンス（カラム１２）、ｒｉｃｔｏｒアンチセンス（カラム１３）、またはｍＴＯＲアンチセンス（カラム１４）でトランスフェクトしたＫＤ  ＰＫＮ３を示す。図７、パネルＣは、ｒａｐｔｏｒアンチセンス（カラム１７）、ｒｉｃｔｏｒアンチセンス（カラム１８）、またはｍＴＯＲアンチセンス（カラム１９）でトランスフェクトした、Ｙ２７６３２でプライムしたＫＤ  ＰＫＮ３を示す。全てのケースにおいて、ｒａｐｔｏｒのノックダウンは、ＰＫＮ３ターンモチーフのリン酸化のレベルには影響せず、一方、ｍＴＯＲまたはｒｉｃｔｏｒのノックダウンは、それぞれ、ターンモチーフスレオニン（例えば、ＰＫＮ３−Ｔ８６０）でリン酸化されたＰＫＮ３の相対量を低減させた（図７の点線の四角で囲まれた領域を参照されたい）。
【００６５】
この結果は、共にｍＴＯＲＣ２を包含するｍＴＯＲおよびｒｉｃｔｏｒが、ＰＫＮ３のターンモチーフのリン酸化にそれぞれ必要であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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