(57)【要約】  本発明は、概してオリゴヌクレオチド機能性を制御する方法に関し、より具体的には、プライマー又はプローブの機能性を制御する方法に関する。本発明の方法は、プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性を選択的に不活性化又は活性化する手段を提供し、それにより当該のオリゴヌクレオチドを使用する任意の方法の進行を制御する手段を提供するように設計される。プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性を制御する手段の開発は、限定はされないが、ＰＣＲ、等温増幅及び核酸鎖伸長などの増幅反応を含めた幅広い用途において有用である。増幅反応に関して、その有用性は、特定の遺伝子配列により特徴付けられる疾患病態の診断及び／又はモニタリング並びに目的とする特定の遺伝子領域の特性決定又は分析を含め、広範である。
2013523097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法において、
（ｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、前記目的のオリゴヌクレオチド又は前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能性が、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質又は核酸分子のいずれかを標的とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡ分子を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的のオリゴヌクレオチドが、プライマー、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム又はＲＮアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のオリゴヌクレオチドが、遺伝子、遺伝子断片、染色体遺伝子転座切断点又は核酸増幅により産生されたＤＮＡである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがプライマーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進するステップを含む請求項１に記載の方法において、前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長する前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、
（ｉ）前記ターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするもの
（ｉｉ）前記ターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの；又は
（ｉｉｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム−ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの
のいずれかである伸長部を生成する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して３’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの３’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｉｖ）ループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状３’鎖を伸長するステップであって、３’直鎖状鎖は５’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し５’直鎖状鎖は３’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記３’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｖ）直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム−ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により前記相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチド鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ；又は
（ｖｉ）Ｔｍが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがＴｍの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ；又は
（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の３’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップ
を含む方法。
【請求項１１】
核酸増幅、シングルチューブネステッド増幅、ＰＣＲ、等温増幅、一本鎖ＤＮＡの産生において用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アプタマー、ＤＮＡザイム、又はリボザイムの機能性を制御するために用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸増幅方法が、ターゲットＤＮＡを増幅する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー；及び
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、前記部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅方法が、ターゲットＤＮＡを増幅する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーに対するハイブリダイゼーション部位の５’末端に隣接するＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、前記部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸増幅方法が、ターゲットＤＮＡを増幅する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、前記部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅方法が、ターゲットＤＮＡを増幅する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ又は複数が前記第１のプライマーの３’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って３’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、前記部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸増幅方法が、ターゲットＤＮＡ  ｔを増幅する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー
であって、前記ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する３’タグを含むこれらの第２のプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の１つが、前記第２のプライマーの３’領域と相補的な５’領域と、前記プライマー結合部位に隣接する前記ターゲットＤＮＡの配列と比べて相補的な相補配列を有するさらに５’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、前記部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記目的のＤＮＡ領域に沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む方法である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してオリゴヌクレオチド機能性を制御する方法に関し、より具体的にはプライマー又はプローブの機能性を制御する方法に関する。本発明の方法は、プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性を選択的に不活性化又は活性化する手段を提供し、それにより当該のオリゴヌクレオチドを使用する任意の方法の進行を制御する手段を提供するように設計される。プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性を制御する手段の開発は、限定はされないが、ＰＣＲ、等温増幅及び核酸鎖伸長などの増幅反応を含めた幅広い用途において有用である。増幅反応に関して、その有用性は、特定の遺伝子配列により特徴付けられる疾患病態の診断及び／又はモニタリング並びに目的とする特定の遺伝子領域の特性決定又は分析を含め、広範である。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において任意の先行文献（又はそこから得られる情報）、又は任意の公知の事項が参照されることによって、当該の先行文献（又はそこから得られる情報）又は公知の事項が本明細書に関連する注力技術分野における周知の一般的知識の一部をなすと認識又は了解したものとして、又はいかなる形であれそれを示唆するものとして解釈されることはなく、及びそのように解釈されてはならない。
【０００３】
本明細書において執筆者が引用する文献の書誌詳細は、本記載の最後にアルファベット順にまとめている。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ鎖の特定の領域を増幅するために利用される技法である。その領域は単一の遺伝子であることも、単に遺伝子の一部に過ぎないことも、又は非コード配列であることもある。多くのＰＣＲ方法は、典型的には最大１０キロベースペア（ｋｂ）のＤＮＡ断片を増幅するが、一部の技法では最大４０ｋｂのサイズの断片を増幅することも可能である（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９１：５６９５−５６９９）。
【０００５】
現在実施されているとおりのＰＣＲでは、いくつかの基本的な構成要素が必要である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．）。それらの構成要素は、以下である：
・増幅するＤＮＡ断片の領域を含むＤＮＡ鋳型；
・オリゴヌクレオチド、これはプライマーとして働き、増幅するＤＮＡ領域の５’末端及び３’末端にあるＤＮＡ領域と相補的である；
・ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ又は約７０℃の温度最適条件を有する別の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、増幅する領域のＤＮＡコピーを合成するために使用される；及び
・デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、これからＤＮＡポリメラーゼが新しいＤＮＡを構築する。
【０００６】
ＰＣＲは、典型的には１５〜１００μｌの反応容量が入った小さい反応チューブ（０．２〜０．５ｍｌ容量）で行われ、それらの反応チューブはサーマルサイクラーに挿し込まれる。この機械はその内部で反応チューブを反応の各ステップに求められる正確な温度に加熱及び冷却する。多くのサーマルサイクラーは加熱蓋を含み、反応チューブのキャップの内側における凝結を防ぐ。或いは、蒸発を防ぐため、反応混合物上に油層が置かれてもよい。
【０００７】
従ってＰＣＲは、より長いＤＮＡ分子内にあるＤＮＡ配列の指数関数的増幅を可能にする方法である。この反応には複数の増幅サイクルが関わり、各サイクルにおける各分子反応の鋳型は、試料中の最初のＤＮＡの鎖か、又は前のサイクルで合成されたＤＮＡの鎖かのいずれかである。各ＰＣＲサイクルは以下のステップを含む
−ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖を分離する熱による変性
−上流及び下流プライマーの、それらの相補配列とのハイブリダイゼーション
−鋳型配列の相補的コピーを産生するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長
【０００８】
典型的にはＰＣＲ試薬及び条件は、変性、ハイブリダイゼーション及び伸長がほぼ最大効率で起こり、結果として所望の配列の量がサイクル毎にほぼ２倍ずつ増加するように選択される。ＰＣＲの終わりまでに実質的な増幅が起こり、例えば３０サイクルのＰＣＲでは元の鋳型が約２３０（１，０００，０００，０００）倍に増幅される結果となり得る。この程度の増幅で増幅産物の検出及び分析は容易となる。
【０００９】
複数の増幅サイクル後にＰＣＲは終了され、産物が様々な方法で、最も一般的にはゲル電気泳動により分析され得る。ＰＣＲが決まった数のサイクルを用いて行われる場合、通常、増幅された産物の量が入力したターゲットＤＮＡの量と密接に関係することはなく、この種のＰＣＲはむしろ、特定のＤＮＡの存在又は非存在を検出したり、及び／又はさらなる分析に十分なターゲットＤＮＡを提供したりするための定性的なツールである。
【００１０】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の計測には、この方法は逆転写酵素を使用して最初にｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、次にその相補的ＤＮＡがＰＣＲにより増幅され、アガロースゲル電気泳動により分析される。逆転写とそれに続くエンドポイントＰＣＲも同様に本質的に定性的な技法である。
【００１１】
定量化能力を提供するため、リアルタイムＰＣＲが開発された。この手順は一般的なパターンのＰＣＲに従うが、増幅されたＤＮＡが各サイクルの間に定量される。周知されている２つの定量化方法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素及び蛍光がＰＣＲステップの一つの間に変化する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの使用である。しばしばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて少量のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が定量され、研究者は特定の時点における、又は特定の細胞型若しくは組織型における関連する遺伝子発現を定量することが可能である。
【００１２】
（ｉ）二本鎖ＤＮＡに結合する色素を使用したリアルタイムＰＣＲ
Ｓｙｂｒ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡ結合性色素はＰＣＲ反応におけるあらゆる二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合し、色素の蛍光増加をもたらす。従ってＰＣＲ中にＤＮＡ産物が増加すると蛍光強度が増加し、それを各サイクルにおいて計測することでＤＮＡ濃度の定量が可能となる。
【００１３】
（ｉｉ）蛍光レポーター配列法
蛍光レポータープライマー又はプローブを使用する多くの異なる方法が開発されており、そうした方法はＤＮＡ結合性色素の使用と比べて精度及び信頼性がより高い傾向がある。この方法は１つ又は複数のＤＮＡプライマー又はプローブを使用して、プライマー又はプローブがハイブリダイズするＤＮＡのみを定量する。Ｔａｑｍａｎプローブなどのレポータープローブを使用することで特異性が大幅に向上し、いくらかの非特異的なＤＮＡ増幅が存在する場合であっても定量が可能となり得る。配列特異的プライマー又はプローブを使用することによりマルチプレックス−異なる色の標識を有する特異的配列又はプローブを使用することにより同じ反応でいくつかの異なる増幅産物をアッセイすること−が可能となり、但し全てのターゲットが同様の効率で増幅されることを条件とする。
【００１４】
定量化に関しては、反応の指数増幅期の間に存在するＤＮＡの相対濃度が、対数目盛で蛍光対サイクル数をプロットすることにより決定される。蛍光のバックグラウンドを上回る増加又はバックグラウンドを下回る減少について閾値（詳細な方法に依存する）が決定される。試料からの蛍光が閾値を超えるときのサイクルが、サイクル閾値Ｃｔと称される。
【００１５】
次に、試験結果を１つ又は複数の標準物質により生じる結果と比較することによってターゲットＤＮＡの量が決定される。ターゲットＤＮＡがゲノムＤＮＡである場合、一般に一連の標準物質、通常は既知量のターゲットＤＮＡの１０倍希釈物が使用される。ターゲットＤＮＡがｃＤＮＡである場合、一般に別の遺伝子のｃＤＮＡの１つ又は複数の内部標準が使用される。
【００１６】
ＰＣＲ増幅の特異性を高めるように設計された従来のＰＣＲの一種が、ネステッドＰＣＲ反応である。この増幅反応では、２つの逐次的な反応において２つのプライマーセットが使用される。第１の反応において１つのプライマー対を使用してＤＮＡ産物が生成され、このＤＮＡ産物にはターゲット以外の範囲から増幅された産物も含まれ得る。次に第１のＰＣＲからの産物を使用して、１つの（「半ネスト化」）又は２つの異なるプライマーであって、その結合部位が第１のセットの中に位置する（ネスト化される）プライマーを使用する第２の反応が開始される。全てのプライマーの特異性が組み合わされ、通常は単一の産物がもたらされる。
【００１７】
ネステッドＰＣＲは、従来、最初のＰＣＲを１つの反応チューブで行い、増幅産物のアリコートを第２の反応チューブに移し、次に第２のＰＣＲを行うことにより実施される。この手順には２つの欠点がある。この手順は単一のＰＣＲと比べて複雑であり、さらに重要なことには、環境に第１のＰＣＲの増幅産物が混入し、それが後続の実験手順のコンタミネーションをもたらし得るリスクを伴う。そのため、逐次的なＰＣＲを１つの反応チューブで行うためのいくつかの方法が開発されている。
【００１８】
２ラウンドのＰＣＲを１つの反応チューブで行うには、それらの２ラウンド用のプライマーを初期反応混合物に加える必要がある。このとき、第１ラウンドで外側のプライマー対を使用し、且つ第２ラウンドで内側の対を使用する２つの逐次的なＰＣＲラウンドを生じさせるために用いられている方法には、以下が含まれる：
−２つのＰＣＲラウンドに異なるアニーリング温度を用いること（Ｋｅｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９０，９４：２２３−２２８、Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５３１４８０９号明細書）
−第１ラウンドＰＣＲ用のプライマーの濃度を下げること（Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５３１４８０９号明細書）
−２つのＰＣＲラウンドについてアニーリング時間を変えること  Ｇｒｏｓｚ  ｅｔ  ａｌ  米国特許第５３４０７２８号明細書）
−第２のＰＣＲラウンド用のプライマーの構造を修飾し、このラウンドの間、２つの異なるアニーリング温度を用いること（Ｘｕ  Ｄｉｎｇｂａｎｇ  ＣＮ１８５８２１９号明細書）。
−第２ラウンドＰＣＲに低い変性温度を用いること（Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ  米国特許第５３１４８０９号明細書）
−第１ラウンドＰＣＲ用の化学修飾プライマー及びそれを徐々に破壊し得る酵素を使用すること（Ｄｕ  Ｂｒｅｕｉｌ  Ｌａｓｔｒｕｃｃｉ  米国特許第７２７３７３０号明細書）
−初めは物理的に分離されている第１ラウンド及び第２ラウンドＰＣＲ用試薬を用いること（Ｙｏｕｒｎｏ  米国特許第５５５６７７３号明細書、Ｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．米国特許出願公開第２００６０１７７８４４号明細書）。
【００１９】
これらの方法の全ての基礎をなす原理は、第１ラウンドＰＣＲ用プライマーの活性の急速な、又は漸進的な喪失をある時点で生じさせ、従って進行中の増幅が次第に第２ラウンドＰＣＲ用プライマーの活性に依存するようにすることである。しかしながらこれらの方法はいずれも欠点を有し、その欠点の性質は方法に依存する。そのロバスト性は様々であり、増幅する目的の配列に応じて反応条件の調整が必要となり得る。増幅は、ある場合には第１ラウンドＰＣＲ全体を通じて、別の場合にはＰＣＲが第１ラウンドから第２ラウンドに移行する間、非効率となり得る。結果として実際にはそれほど広く用いられない手法もある一方、検出のみに用いられ、定量には用いられない手法もある。
【００２０】
ルーチンで実施される多くの増幅方法は熱サイクリングを利用して増幅を達成する。転写媒介性増幅、鎖置換増幅、ループ媒介性等温増幅、等温性多置換増幅及びヘリカーゼ依存性増幅などの様々な等温増幅技法も開発されている。しかしながら、これらの等温増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応と比べて複雑性が高く、最適化がいくらか難しい傾向がある。従って等温増幅反応は定量化よりむしろ、エンドポイントの検出により多く用いられる傾向がある。それにもかかわらず等温増幅反応は、サーマルサイクラーが不要で、従ってこれらの方法はセットアップが大幅に簡略化されるため、実に有利である。これは、サーマルサイクラーなどの精巧な機器を利用できない環境では重要な問題であり得る。また、頻繁には行われないが、ネステッド型の等温増幅を実施することも可能である。これらの様々な等温反応は完全にＤＮＡベースであるか、或いはある段階でサイクル式のＲＮＡ産生が関わるが、いずれも、ＤＮＡポリメラーゼの働きに基づきハイブリダイゼーション及び伸長を行うＤＮＡプライマーの使用を伴う。
【００２１】
本発明に至るまでの研究のなかで、プライマー機能性などのオリゴヌクレオチド機能性を、その活性化及び不活性化の双方に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に基づき制御する方法が開発された。この開発により、例えば核酸増幅などのプライマーベースの技法の、効率性の向上が可能となった。例えば、本発明の方法により、プライマー機能性を制御する能力に基づき特異性及び効率性の双方が向上したシングルチューブネステッドＰＣＲの開発が可能となった。これは、特定のプライマーを使用して効率的に増幅し、続いて他のプライマーを使用して効率的に増幅することが可能である。この増幅方法は等温的及び熱的の双方の核酸増幅反応で利用できるため、特に有用である。しかしながら、本発明は単に増幅反応との関連におけるその用途を超えて有用であり、反応の過程においてオリゴヌクレオチドの活性を調節する必要がある任意の反応に関する有用性にまで及ぶ。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上特に必要でない限り、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載される完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）若しくはステップ又は一群の完全体若しくはステップを包含し、しかし任意の他の完全体若しくはステップ又は一群の完全体若しくはステップを排除するものではないことを含意するものと理解され得る。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、用語「〜に由来する」は、特定の完全体又は一群の完全体が、指示される種を起源としているが、必ずしもその指示された供給源から直接得られたとは限らないことを示すと解釈されるものとする。さらに、本明細書で使用されるとき、「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含む。
【００２４】
特に定義しない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００２５】
本発明の一態様は、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）プライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力を調節する方法に関し、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進するステップを含み、ここで前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長するアンチセンスヌクレオチド配列は、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、
（ｉ）ターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするもの；
（ｉｉ）ターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの；又は
（ｉｉｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム−ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの
のいずれかである伸長部を生成する。
【００２８】
別の態様において、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して３’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの３’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｉｖ）ループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状３’鎖を伸長するステップであって、３’直鎖状鎖は５’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し５’直鎖状鎖は３’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記３’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｖ）直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム−ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチドの鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ；又は
（ｖｉ）Ｔｍが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがＴｍの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ；又は
（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の３’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップ
を含む。
【００２９】
一実施形態において、前記核酸はＤＮＡである。
【００３０】
別の実施形態において前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子を標的とする。
【００３１】
別の実施形態において前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性は、プライマー、アプタマー、ＤＮＡザイム、ＲＮアーゼ又はリボザイムとしての機能性である。
【００３２】
別の実施形態においてターゲットＤＮＡを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー；及び
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明はターゲットＤＮＡを増幅する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーのハイブリダイゼーション部位の５’末端に隣接するＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明はターゲットＤＮＡを増幅する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【００３５】
さらになお別の実施形態において、ターゲットＤＮＡを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ又は複数が前記第１のプライマーの３’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って３’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【００３６】
なおもさらに別の実施形態において、ターゲットＤＮＡ  ｔを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー
であって、ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する３’タグを含むこれらの第２のプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の１つが、前記第２のプライマーの３’領域に相補的な３’領域と、プライマー結合部位に隣接するターゲットＤＮＡの配列に対して相補的な相補配列を有するより５’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）目的のＤＮＡ領域に沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】プライマーを不活性化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の概略図である。反応の過程では、アニーリング温度の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間的経過のいずれかに起因して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズし、プライマーが伸長してその鋳型とのミスマッチが生成され、そのミスマッチが伸長を阻止する。
【図２】プライマーを不活性化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の使用の概略図である。反応の過程では、アニーリング温度の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間的経過のいずれかに起因して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズし、プライマーが伸長してプライマーの上流配列に相補的な配列が生成される。伸長した一本鎖プライマーはステム−ループ構造を形成し、ステムはプライマーの５’末端まで延在して、それにより鋳型とのハイブリダイゼーションが阻害される。
【図３】伸長を起こし、且つ活性プライマーを不活性プライマーに変換するオリゴヌクレオチドの使用の概略図である。温度条件の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間の経過のいずれかに起因して、プライマー分子とアンチセンス分子とのハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイズしたアンチセンス分子は伸長し、Ｔｍが上昇して、プライマー分子を結合するその能力も高まる。時間の経過に伴い遊離プライマー分子の濃度は低下し、その機能が下降する点に至る。
【図４】５’タグを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の概略図であり、ここではプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの双方が伸長を起こし、プライマーは不活性プライマーに変換される。温度条件の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間の経過のいずれかに起因して、プライマー分子とアンチセンス分子とのハイブリダイゼーションが起こる。プライマー及びアンチセンス分子の双方が伸長し、各々のＴｍが上昇してそれらの間のハイブリダイゼーションが極めて強力となり、従って遊離プライマーの濃度が著しく低下する。プライマーの伸長によってその鋳型との結合が増加することがないよう確実にするため、アンチセンスオリゴヌクレオチド上の５’タグの配列は、プライマーが伸長するとその鋳型とのミスマッチをもたらすようなものでなければならない。
【図５】不活性プライマーを活性化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の概略図である。プライマーは、その３’末端に鋳型とミスマッチな２つ以上のヌクレオチドが存在するため、最初は不活性である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズすると、プライマーがオリゴヌクレオチドタグに沿って伸長し、このタグの配列は、プライマーの伸長部の配列をここで鋳型と完全に一致させるようなものである。
【図６】プライマーを不活性状態から活性状態に変換するためのさらなる置換プライマーの使用の概略図である。当初、プライマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合しているため不活性である。しかしながら時間の経過に伴い、又はアニーリング温度の変化に伴い、置換プライマーがアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合して伸長し、プライマーに置き換わるため、遊離プライマーの濃度が増加する。次に遊離プライマーは、その鋳型に結合することが可能である。
【図７】プライマーを不活性形態から活性形態に変換するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の概略図である。この場合、Ｔｍが低いプライマー分子は、最初は鋳型にもアンチセンスオリゴヌクレオチドにも結合せず遊離している。温度条件の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間の経過のいずれかに起因して、一部のプライマー分子がその３’末端でアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。プライマー分子は伸長し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、伸長したプライマーを鋳型と完全に一致させるようなものである。二重鎖の変性後、伸長したプライマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドとではなく、鋳型と選択的にハイブリダイズする。
【図８】プライマーを不活性形態から活性形態に変換するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の概略図である。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列及びプライマーオリゴヌクレオチド配列はハイブリダイズして二重鎖（ａ）を形成する別個の分子であってもよく、又はこれらの配列は単一のステム−ループ分子（ｂ）の一部であってもよい。アンチセンス部分は潜在的に分解性である。当初、プライマー配列はアンチセンス配列と強力にハイブリダイズする。時間の経過に伴い徐々にアンチセンス配列の分解が起こり、ここでプライマー配列が遊離し、その鋳型とハイブリダイズすることが可能となる。一つの分解機構は、アンチセンス内部の１つ又は複数のＲＮＡヌクレオチドの存在であり、及び場合により、反応混合物中のリボヌクレアーゼの存在である。
【図９】プライマーを不活性状態から活性状態に変換するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長の使用の概略図である。当初、プライマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合しているため不活性である。ほとんどの場合にアンチセンス分子の原初のステム−ループは開放した位置にある。しかしながら時間の経過に伴い、又はアニーリング温度の変化に伴い、アンチセンス分子の数が増加するなか原初のステムが閉じて伸長が起こり、遊離プライマー分子の濃度が増加して、鋳型との効率的なハイブリダイゼーション及び効率的な増幅が起こる点に至る。
【図１０】目的のオリゴヌクレオチドの機能を調節するためのライゲーション反応の使用の概略図である。アンチセンス分子が鋳型として働くことで目的のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となる。次にこれらの２つのオリゴヌクレオチドのライゲーションが起こり、それにより目的のオリゴヌクレオチドに伸長が生じると、目的のオリゴヌクレオチドの機能が調節される。
【図１１】プライマーがそれ自体とハイブリダイズすることによるステム−ループの形成とその後の伸長について試験する実験のグラフ表示である。この実験では、図２に示す概念を例証した。一連の「伸長した」プライマーを合成し、これは、３’末端が４〜１２塩基からなり、それらの塩基がプライマーのより５’側の領域と潜在的にハイブリダイズして、その後、最終的にハイブリダイズした領域が最大１２塩基を含み得るように伸長し得るものであるように合成した。ハイブリダイゼーション及び伸長が起こることを可能にするため、プライマーを１２サイクルのＰＣＲに供し、得られた産物に関して融解分析を実施した。融解分析ではＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎが存在し、従ってこの薬剤のインターカレーションにより生じる蛍光によってステムの二本鎖ＤＮＡが認識され得るようにした。ステム−ループのステムが解離する温度はステムの長さに関係する。同一の温度解離ピークから、最初に６〜１２塩基の範囲のハイブリダイゼーション領域を含んだプライマーがＰＣＲ中に全て伸長して１２塩基のステムを有するステム−ループ構造を形成したことが分かる。しかしながら、４塩基又は５塩基のハイブリダイゼーション領域を含んだプライマーはＰＣＲ中に伸長しなかった。これはハイブリダイゼーションが無効であったためと推定される。
【図１１Ａ】図１１の続きである。
【図１２】アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して一本鎖ＤＮＡを産生した実験の結果の画像である。この実験では、２つのプライマー（１２−７５及び１３−７５）を使用して、１２−７５プライマーとハイブリダイズしてそれを不活性化するように設計された２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（１２ＡＳ又は１３ＡＳ）の一方の存在下又は非存在下で、ＳＮｆ２関連ＣＲＥＢＢＰアクチベータタンパク質の遺伝子の領域を増幅した。最初は１５ＰＣＲサイクルを７２℃で実施し、その間に指数関数的増幅が起こった。次にＰＣＲを５８℃でさらに４３サイクル続け、その間にアンチセンスオリゴヌクレオチドが１２−７５プライマーと結合し、徐々に不活性化が生じた。しかしながらラウンド毎の１３−７５プライマーの伸長は続き、一本鎖ＤＮＡの量の増加が生じた。これは、図において上側のバンドとして確認される。アンチセンスオリゴヌクレオチドが不在の場合であっても、多数のサイクル後には少量の一本鎖ＤＮＡが存在した（左側のパネル）。これは、プライマーのうちの一方の消耗に関するいくらかのプライマーの不均衡を反映するものと推定される。
【図１３】アンチセンスＰＣＲの機構。第１段階は高いアニーリング温度を含む；より長い外側プライマーのみがターゲットと結合して産物を生成することができる。第２段階はより低いアニーリング温度を含み、２つのプロセスが起こる。第一に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが外側プライマーとアニールし、外側プライマーがオリゴヌクレオチドに沿って伸長して、結果的に外側プライマーの３’末端がアンプリコン鋳型とミスマッチを有するようになり、プライマーが不活性化される。第二に、ここでより短い内側プライマーがターゲットと結合して伸長することができる。これによりＰＣＲは外側プライマーの使用から内側プライマーの使用へと徐々に切り換わる。
【図１４】４つの異なる遺伝子について研究するアンチセンスｑＰＣＲの分析。増幅は、（ｉ）外側プライマー単独；（ｉｉ）外側プライマー＋アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドが増幅を阻害することを示す）；及び（ｉｉｉ）外側プライマー＋アンチセンスオリゴヌクレオチド＋内側プライマー（内側プライマーが増幅を復活させることを示す）によった。５５のＣｔは、ＰＣＲの終了までに検出可能なシグナルがなかったことを示す。
【図１５】電気泳動法によるアンチセンスＰＣＲの分析。この実験では、１０ｎｇのＤＮＡを高温１５サイクルと、続く低温２０サイクルにわたり増幅した。外側プライマーのみによる増幅では予想された３３３ｂｐバンドが生じ、完全なアンチセンス系による増幅では内側プライマーにより誘導される予想された１１１ｂｐが生じた。トラックＢ及びＥの弱いバンドは、１つの外側プライマー及び１つの内側プライマーにより誘導される１５８ｂｐの産物と一致する。１〜及び２ｘは、通常のプロトコル量である各内側プライマーについての１００ｎｇ、各内側プライマーについての２００ｎｇ、及び対応する外側プライマーと等モルのアンチセンス量の１倍又は２倍である量を指す。
【図１６】アンチセンスＰＣＲにおけるＡＰＣ増幅産物の分析。二段階条件、並びに外側プライマー（ＯＰ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）、及び内側プライマー（ＩＰ）；外側プライマーのみ；又は外側プライマー＋アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを使用して、一次ＰＣＲを実施した。１５、１８、２１、２４、又は３２サイクル後、ＰＣＲを停止させ、二次ＰＣＲでアリコートを分析して、一次ＰＣＲの間に形成された産物を計測した。アンチセンスＰＣＲについては、増幅は外側プライマー又は内側プライマーに起因し得た；従って、長鎖産物又は長鎖産物と短鎖産物との合計のいずれかを、それぞれ外側プライマー又は内側プライマーのいずれかを使用することにより計測した。他の２つのＰＣＲでは内側プライマーが存在しなかったため、長鎖産物のみを計測した。データ凡例において、スラッシュの左側の記載が一次ＰＣＲの構成要素を示し、右側の記載が二次ＰＣＲにおけるプライマー、従って計測した産物を示す。ＰＣＲのサイクルの増加に伴い生成される産物量が増加することを説明するため、Ｃｔ値は逆にして示されることに留意されたい。アンチセンスＰＣＲにおけるアンプリコンの総数及び外側プライマーのみが存在する場合のＰＣＲにおける長鎖アンプリコンの数の双方が指数関数的に増加している（双方のデータセットとも回帰直線を示す）。しかしながらアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在すると、アンチセンスＰＣＲ及び存在するプライマーが長鎖プライマーのみである場合のＰＣＲの双方において長鎖アンプリコンの増幅は次第に緩慢になる。
【図１７】アンチセンスＰＣＲにおける非特異的増幅の減少。２つの遺伝子Ｎ−ＲＡＳ及びＢＣＲについて、アンチセンスＰＣＲ又は外側プライマーを使用する標準的なＰＣＲのいずれかにより増幅を実施し、蛍光をＴａｑｍａｎプローブにより特異的に、又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎにより非特異的に計測した。アンチセンスＰＣＲについては２つのエンドポイントにより計測したＣｔの間に大きい差はなかったが、標準ＰＣＲについてはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎにより計測したＣｔがＴａｑｍａｎにより計測したＣｔと比べて著しく小さかったことから、実質的に非特異性の高い増幅が生じたことが示される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、一部には、反応に関与する１つ又は複数のオリゴヌクレオチドの誘導性の不活性化又は活性化を可能にするアンチセンス技法の設計に基礎を置いている。例えば、ネステッド増幅反応との関連においてオリゴヌクレオチドがプライマーである場合に、一定した最適レベルの効率性を維持するシングルチューブネステッドＰＣＲ法を設計することができる本発明の方法は極めて有用である。この開発により、プライマーベースの技法との関連においてこれまで不可能であった一定の制御性及びロバスト性が可能となった。さらにまた、増幅方法との関連において、この方法は熱的及び等温的の双方の核酸増幅反応に適用可能である。
【００３９】
従って、本発明の一態様は、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００４０】
「目的のオリゴヌクレオチド」に対する言及は、それに関する機能性を制御又は修飾しようとする任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指すものと理解されなければならない。そのため、「機能性」に対する言及は、例えば伸長を起こすプライマーとして働くことによるか、核酸ターゲット又は他のターゲット分子とハイブリダイズすることによるか、又は核酸酵素として働くことにより、ターゲット分子との会合に対して、又はそれにおいて働きを果たすオリゴヌクレオチドの能力を指すものと理解されなければならない。「〜を調節する」に対する言及は、オリゴヌクレオチドの新しい機能の獲得を指すか、或いは既存の機能レベルに変化を生じさせることを指すものと理解されなければならず、それは、遊離している（すなわちハイブリダイズされていない）オリゴヌクレオチドの濃度の変化を生じさせることによるか、又はその配列若しくは構造の変化により達成され得る。目的のオリゴヌクレオチドがプライマーである限りにおいて、いくつかのシナリオでプライマーがそのターゲット核酸とハイブリダイズし得るが伸長できない場合、当該のプライマーは本発明との関連では非機能性と見なされることが理解されなければならない。目的のオリゴヌクレオチドとは、その機能性との関連において、相補的な分子領域、最も一般的にはターゲット核酸領域とハイブリダイズすることが特に求められるものである。これは、限定はされないが、プローブベースの技法（サザンブロット法など）、プライマーベースの技法（核酸増幅など）、核酸伸長、及びターゲットと結合する、及び／又はターゲットを修飾するオリゴヌクレオチドが関与する反応（目的のオリゴヌクレオチドがアプタマー、ＤＮＡザイム又はリボザイムとして働く場合など）を含め、多様な異なるタイプの反応との関連において行われ得る。一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドはプライマーである。
【００４１】
この実施形態によれば、本発明は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）プライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００４２】
「ターゲット分子」に対する言及は、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ又は結合する分子を指すものと理解されなければならない。ターゲット分子は任意の非タンパク質性分子又はタンパク質性分子、例えば核酸又はタンパク質であり得る。しかしながらターゲット核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドではなく、又は前記目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドを伸長若しくはライゲーションの鋳型として使用する別のプライマーではないことは理解されなければならない。
【００４３】
ターゲット分子が核酸、例えば増幅しようとする核酸である限りにおいて、核酸の「目的の領域」又は「ターゲット核酸」に対する言及は、増幅又はプローブしようとするＤＮＡ又はＲＮＡの任意の領域を指すものと理解されなければならない。これは、遺伝子、遺伝子の一部又は遺伝子間領域であり得る。そのため、「遺伝子」に対する言及は、完全長タンパク質であるにしろ、又はタンパク質断片であるにしろ、タンパク質産物をコードするＤＮＡ分子を指すものと理解されなければならない。染色体ＤＮＡに関しては、遺伝子はイントロン及びエクソンの双方の領域を含み得る。しかしながら、目的のＤＮＡがベクターＤＮＡ又は逆転写されたｍＲＮＡである場合に起こり得るように、目的のＤＮＡがｃＤＮＡである限りにおいて、イントロン領域は存在しないこともあり得る。しかしかかるＤＮＡは５’又は３’非翻訳領域を含み得る。従って、「遺伝子」に対する言及は、本明細書では、例えばゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを含め、タンパク質又はタンパク質断片をコードする任意の形態のＤＮＡを包含するものと理解されなければならない。対象とする目的の核酸領域はまた、いずれの特異的遺伝子とも会合しないことが知られるゲノムＤＮＡの非コード部分であってもよい（一般に称されるところの「ジャンク」ＤＮＡ領域など）。それは、ゲノムＤＮＡの２つの領域間か、又はゲノムＤＮＡの１つの領域とウイルス若しくは導入配列などの外来ＤＮＡの領域との間のいずれかに組換え産生されるゲノムＤＮＡの任意の領域であってもよい。それは、一部又は全体が合成的又は組換え的に生成された核酸分子の領域であってもよい。対象とする目的の核酸領域はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む任意の核酸増幅方法により予め増幅されたＤＮＡの領域であってもよい（すなわちそれは増幅法により生成されたものである）。
【００４４】
対象とする「核酸」領域又は「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその誘導体若しくは類似体であってもよい。目的の領域がタンパク性分子をコードするＤＮＡ配列である場合、それは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡ、又は核酸増幅により生成されるＤＮＡの形態をとり得る。しかしながら対象とするＤＮＡがタンパク質をコードしない場合、ゲノムＤＮＡ又は合成的若しくは組換え的に生成されたＤＮＡのいずれも分析の対象となり得る。当業者であれば理解するであろうとおり、合成的に生成されたＤＮＡ及び組換え的に生成されたＤＮＡのいずれもまた、タンパク質の全て又は一部をコードし得る。しかしながら、対象とする方法が目的のＲＮＡ領域に関する場合、通常は初めに、ＲＴ−ＰＣＲを使用するなどしてＲＮＡをＤＮＡに逆転写することが必要となり得ることは理解されるであろう。対象とするＲＮＡは任意の形態のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、一次ＲＮＡ転写物、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどであってもよい。好ましくは、前記目的の核酸領域は、目的のＤＮＡ領域である。そのため、前記ＤＮＡには、最終的に分析の対象となるＲＮＡから逆転写により生成されるＤＮＡ、及びＰＣＲなどの核酸増幅法によって生成されるＤＮＡが含まれる。
【００４５】
従って、本発明の別の態様は、目的のＤＮＡオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００４６】
一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子に関する。
【００４７】
別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、プライマー、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム又はＲＮアーゼである。
【００４８】
本発明はより詳細には、ターゲットＤＮＡに沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ；又は
（ｉｉ）プライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップ
を含む。
【００４９】
「ＤＮＡ」に対する言及は、デオキシリボ核酸又はその誘導体若しくは類似体を指すものと理解されなければならない。この点について、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むあらゆる形態のＤＮＡが包含されることが理解されなければならない。本発明の核酸分子は、天然に存在するもの（生体試料に由来し得るものなど）、組換え産生されるもの、又は合成的に産生されるものを含め、任意の起源であってよい。
【００５０】
「誘導体」に対する言及は、天然の、合成の、又は組換え的な供給源からの前記ＤＮＡの断片、相同体又はオルソログに対する言及を含むものと理解されなければならない。「機能的誘導体」は、ＤＮＡの機能的活性の任意の１つ又は複数を呈する誘導体として理解されなければならない。前記ＤＮＡ配列の誘導体には、他のタンパク質性又は非タンパク質性分子と融合したＤＮＡ分子の特定の領域を有する断片が含まれる。本明細書で企図される「類似体」としては、限定はされないが、その化学的構成又はコンホメーション全体の修飾など、ヌクレオチド又は核酸分子の修飾が挙げられる。これには、例えば、新規の又は修飾されたプリン又はピリミジン塩基の取り込み、又はヌクレオチド又は核酸分子が他のヌクレオチド又は核酸分子と例えば骨格形成又は相補的塩基対ハイブリダイゼーションのレベルで相互作用する方法に対する修飾が含まれる。ヌクレオチド又は核酸分子のビオチン化又は他の形態の標識は、本明細書で定義されるとおりの「機能的誘導体」の例である。
【００５１】
好ましくは、前記ＤＮＡは遺伝子若しくは遺伝子断片、染色体遺伝子転座切断点又は事前の核酸増幅、例えばＰＣＲにより産生されるＤＮＡである。目的のＤＮＡは化学的に合成されてもよく、又は限定はされないが、任意の動物、植物、細菌又はウイルスを含む任意の生物のＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されてもよい。
【００５２】
本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、オリゴヌクレオチド機能性がアンチセンス技法により制御され得ることが見出された。具体的には、オリゴヌクレオチドの機能性（例えばプライマーのハイブリダイズする、又は伸長を起こす能力）が調節されるようにオリゴヌクレオチド又はアンチセンス分子のいずれかに配列変化を生じさせることと併せたアンチセンス分子の使用に基づき、プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性の不活性化及び／又はその後の活性化のいずれかを行う方法が開発された。これに関連して「伸長」に対する言及は、ハイブリダイズする鋳型に沿って３’核酸伸長を起こすようにポリメラーゼに誘導される当該のプライマーの能力を指すものと理解されなければならない。かかる伸長反応は、主にＰＣＲなどの核酸増幅反応との関連において利用される。しかしながら当業者は、プライマー伸長反応について一本鎖ＤＮＡの産生などの他の適用もあることを理解するであろう。配列変化は任意の好適な手段により生じさせることができ、それらの手段としては例えばアンチセンス分子の使用が挙げられ、このアンチセンス分子は、ターゲットへのハイブリダイゼーションに続いて伸長する（又は逆に機能的プライマーが現れるよう分解され得る）オリゴヌクレオチドの能力を直接遮断するか、又はそれ自体が伸長を起こし、若しくはオリゴヌクレオチド伸長の鋳型を形成することによりプライマーの機能性を同様に制御する。
【００５３】
古典的なＰＣＲでは、プライマー及び反応条件は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長が最大効率で、又はそれに近い効率で起こり、従ってアンプリコンの数がサイクル毎にほぼ二倍となり、効率的な指数関数的増幅をもたらすように設計される。最適効率を実現するには適切な濃度のプライマーが重要である。連続反応において２つ以上のプライマーセットが使用される場合、ＤＮＡ増幅のより高い特異性を達成することができる。このように、結合部位が第１のセットの結合部位より内側に位置するプライマーを使用してさらなる増幅を行うことにより、ターゲット以外の範囲から増幅される任意の非特異的産物の影響を最小限に抑えることができる。全てのプライマーの特異性が組み合わされ、通常は単一の産物がもたらされる。ネステッドＰＣＲは逐次的な一連の個別反応として実施することができ、又は単一の反応容器で実施することもできる。シングルチューブネステッドＰＣＲ反応の魅力は明らかであるものの、この手法は、異なる増幅ラウンド間の効率性に一貫性がないなどの問題を抱えており、それが量的な結果の達成が求められた場合に大きい制約となっている。異なるプライマーセットから順番に増幅を生じさせるため、先行技術の方法の多くにおいて主に中心となっているのは、外側プライマーの濃度を下げるとともに第１段階に高いアニーリング温度を、且つ第２段階により低い温度を含む方法である。しかしながら増幅の効率性は異なるプライマーセット間にあるとおり著しい差があり、そのためこの方法の有用性は限られている。
【００５４】
従って、本発明のネステッドＰＣＲの実施形態との関連では、外側プライマーが伸長を起こしている間は内側プライマーが不活性化され得る。その後外側プライマーを、それとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して不活性化することができ、その間、反応の条件の変化によるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと内側プライマーとの間のハイブリダイゼーション若しくはそれらの解離によるかのいずれかにより、内側プライマー機能性が回復される。この相互作用は数多くの方法のいずれで行われてもよく、それらの方法については以下でさらに詳細に考察する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが外側及び／又は内側プライマーとハイブリダイゼーションすると遊離プライマーの濃度が低下し、次にそれによって当該プライマーのＤＮＡターゲット鋳型とのハイブリダイゼーションが非効率となり得る一方、解離は逆の効果を及ぼし得る。ハイブリダイゼーションは複数の変数に左右される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのプライマーとのハイブリダイゼーションの強さ及び程度は、その配列及び長さ、ハイブリダイゼーションを低下させる、或いは増加させる任意のミスマッチ又は修飾の存在、オリゴヌクレオチドの濃度及びアニーリング温度又は時間に依存し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も３’側の塩基がプライマーの最も５’側の塩基とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを除き、アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはその３’方向への伸長を生じる。これにより、後続のサイクルの間により強力にハイブリダイズし得るより長いアンチセンスオリゴヌクレオチドが産生され得る。
【００５５】
「オリゴヌクレオチド」に対する言及は、ヌクレオチド、又はその機能的誘導体若しくは類似体の配列を含む任意の分子を指すものと理解されなければならない。「プライマー」に対する言及は、核酸ターゲットとハイブリダイズする機能を有し、且つ伸長又はライゲーション反応を起こす実際の又は潜在的な機能を有するオリゴヌクレオチドを指すものと理解されなければならない。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」に対する言及は、その一部又は全てが目的のオリゴヌクレオチドの一部又は全てと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを指すものと理解されなければならない。オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは非核酸成分を含み得ることは理解されなければならない。例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、非核酸タグ、例えば蛍光タグ又は酵素タグ、又は分子のプローブとしての使用を促進するか、又はその他の形でその検出若しくは固定化を促進する他の何らかの非核酸成分も含み得る。オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、さらなる核酸成分も含み得る。別の例では、オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸側鎖を呈するペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってもよい。好ましくは、前記プライマーはＤＮＡプライマーである。
【００５６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的のオリゴヌクレオチド、例えばプライマー又はプローブとハイブリダイズするように設計される。従って、「〜を標的とする」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが対象とする目的のオリゴヌクレオチドのある領域とハイブリダイズすることを意味する。従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドの一部のみにわたってハイブリダイズしてもよく、又はそれは目的のオリゴヌクレオチドの完全長にわたりハイブリダイズしてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは「アンチセンス」オリゴヌクレオチドと称されるが、この用語の使用には、プライマーなどの対象とする目的のオリゴヌクレオチドとのアンチセンスのハイブリダイゼーションを可能にするようにこのアンチセンスのヌクレオチド配列が設計されることを示す意図があることが理解されなければならない。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載するために本明細書で使用される命名法に関して、目的のオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端はアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端と称され、一方で他方の末端がアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端であることも理解されなければならない。
【００５７】
本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、本発明の反応は、反応中に存在する目的のオリゴヌクレオチドの数及び調節することが意図されるその機能に応じて、１種の、或いは２種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するように設計され得る。また、ネステッド増幅反応との関連において、利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上のフォワードプライマー又は１つ以上のリバースプライマーのいずれを標的としてもよいことも理解されなければならない。別の代替例において反応は、１つ以上のフォワードプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと１つ以上のリバースプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとの双方を使用するように設計されてもよい。
【００５８】
一態様において、本発明の方法は、アンチセンス：目的のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションイベントを、それらの分子の一方又はその複合体と会合する別のオリゴヌクレオチド分子のいずれかに配列変化を生じさせて目的のオリゴヌクレオチドの機能性を最終的に調節するための基礎として用いることに基づく。「〜を調節する」又は「調節」に対する言及は、ターゲット分子とハイブリダイズ又は結合すること及び／又はヌクレオチド伸長を起こすことが可能な目的のオリゴヌクレオチドが非機能性にされること、又はその逆が起こること、すなわちターゲット分子とのハイブリダイゼーション又は結合及び／又は伸長を起こすことができない点で不活性な目的のオリゴヌクレオチドが機能性にされることを意味することが意図される。後者の状況では、目的のオリゴヌクレオチドは本発明の方法の増幅によって不活性にされたものであっても、又は最初からその形態で産生されたものであってもよく、その後適切な時点で機能性にされ得る。そのため、「ヌクレオチド配列変化」に対する言及は、変化イベント以前の配列と比べたときのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する任意の変化を指すものと理解されなければならず、限定はされないが、目的のオリゴヌクレオチド、アンチセンス分子又はその他の、オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチド形成部分のヌクレオチド伸長、１つ以上のヌクレオチドの突然変異又は付加又は欠失、又は核酸分子の分解が含まれる。
【００５９】
このヌクレオチド配列変化を達成する方法としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
【００６０】
本発明の一態様におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、プライマーなどのハイブリダイズした機能的な目的のオリゴヌクレオチドがそれに対して伸長し、それによって非機能性になるか、又はその逆が起こる鋳型を提供することに基づき機能する。これはより具体的には以下のとおり説明される：
【００６１】
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド上の５’タグ
プライマーの伸長を阻害するこの機構は、プライマーの３’末端にハイブリダイズするようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計すること、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端にオリゴヌクレオチドタグ（また本明細書では同義的にオリゴヌクレオチド伸長部とも称される）を配置することに基づく。この機構の概略図を図１に示す。
【００６２】
プライマーがタグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、プライマーは３’方向に伸長する。この二重鎖の解離後、伸長したプライマーは相補的な鋳型鎖とハイブリダイズし得る。鋳型に沿って効率的に伸長させるため、プライマー伸長部の配列は、その伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と相補的でなければならず、そうなるには、オリゴヌクレオチドタグの配列は伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と同じでなければならない。しかしながら、オリゴヌクレオチドタグの配列が、伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と異なる場合、さらなる伸長及び増幅が起こることはなく、すなわちプライマーは不活性化されたことになり得る。結果として、サイクル数の増加に伴い徐々にプライマー分子の不活性化が起こり、この現象は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの外側プライマーとのハイブリダイゼーションにより生じる直接的な阻害効果と相乗的に作用する。
【００６３】
当業者は、タグの本質的な特性が、伸長したプライマーが続く増幅において働くことができないようにプライマーを３’伸長させるための鋳型として働くことであることを理解するであろう。これは、正常なヌクレオチドか、或いは修飾されたヌクレオチド、例えばイソデオキシシトシン又はイソデオキシグアニンのいずれかなどの５’アンチセンスオリゴヌクレオチドタグを含むことにより達成することができる（反応には相補的なヌクレオチドが存在しなければならない）。オリゴヌクレオチドタグの配列と伸長部にハイブリダイズし得る鋳型鎖の配列との違いが大きいほど、プライマーの不活性化の程度が大きくなる。特に効率的な不活性化は、オリゴヌクレオチドタグの配列を伸長部にハイブリダイズし得る鋳型鎖の当該配列と正確に相補的にすることによってもたらされる。従って、増幅反応が進むに従い、熱サイクリング中の繰り返されるアニーリングによるか、或いは等温反応の一定温度にある間のアニーリングにより、一部のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子がプライマーとハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしたプライマー分子はタグに沿って３’方向に伸長し、タグの配列は伸長したプライマーの３’末端がここで対応する鋳型配列とミスマッチを有するように選択されている。従って伸長したプライマー分子は、なおも核酸鋳型とハイブリダイズすることはできるが、伸長はできない。従って反応が進むに従い、プライマー分子は徐々に不活性化され、増幅に至ることができない。
【００６４】
「オリゴヌクレオチドタグ」に対する言及は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結されるヌクレオチド配列を指すものと理解されなければならない。一実施形態において、タグは１〜１０塩基長、好ましくは２〜５塩基長、及びより好ましくは２〜３塩基長である。
【００６５】
対象とするタグは、タグの配列に相補的なヌクレオチド配列がプライマーの３’末端のハイブリダイゼーション部位の５’側ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に対して「ミスマッチを有する」ように設計される。「ミスマッチを有する」とは、タグの配列が、プライマーのアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及びタグに沿ったプライマーの伸長の後に、伸長したプライマーのうち元のプライマーに対応する部分のみが目的のＤＮＡ領域とハイブリダイズすることができ、伸長部分は目的のＤＮＡ領域とのそのハイブリダイゼーションを促進しない配列となるようなものであることを意味する。このように、このプライマーの３’末端は目的のＤＮＡ領域とハイブリダイズすることができないため、増幅中のこのプライマーのいかなるそれ以上の伸長も阻害される。従って、プライマーがアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、プライマーは３’方向に伸長し、このように修飾されるプライマーが続いてそのアンプリコン鋳型とハイブリダイズするときに３’方向への効率的な伸長を阻止する末端配列を生じる。
【００６６】
反応の過程では、アニーリング温度の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間的経過のいずれかに起因して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズし、プライマーが伸長してその鋳型とのミスマッチを生じ、このミスマッチは伸長を阻止する。
【００６７】
（ｉｉ）ステム−ループの形成によるプライマーの不活性化
この機構の概略図を図２に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’タグの配列は、それに沿ってプライマーが伸長すると、伸長したプライマーの３’末端の配列が同じプライマーの別の配列と相補的になるように選択される。この状況では、伸長したプライマーの３’末端はループ状に折り返し、その相補配列とハイブリダイズすることが可能となる。相補配列がプライマーの５’末端まで延在しない場合、プライマーの３’末端はプライマーの５’末端に到達するまでプライマーに沿って伸長することができる。いずれの場合にもステム−ループ構造が作られ、ステムの２本のアーム間のハイブリダイゼーション強度を決定するステムの長さ及び配列に応じて、ステム−ループ構造が解けてプライマーがその鋳型とハイブリダイズする能力が阻害される。伸長したプライマーの３’領域がどのようにプライマーの５’領域とハイブリダイズし、次に伸長してステム−ループのより長いステムを形成するかについての例を図１１に示す。
【００６８】
このようなプライマーの修飾は、反応中にアニーリング温度が変化することにより生じ得るか、又は一定のアニーリング温度にある時間経過において起こり得る。ステム−ループ構造が生じることによるプライマーの不活性化は、プライマーを不活性化してそれがその鋳型又はゲノムの他の領域とハイブリダイズすることを阻止することが所望される場合に特に価値を有し得る。これは、内側プライマーの結合部位が外側プライマーの結合部位と部分的に重複するときに、この状況では外側プライマーの任意のハイブリダイゼーションが、それが伸長できないことにより不活性であっても内側プライマーのハイブリダイゼーションを阻害し得るため、有用であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’タグが伸長したプライマーのステム−ループ構成を作り出すように設計されるとき、ほぼ全ての場合において伸長したプライマーの配列は、ステム−ループが解けて伸長したプライマーがその鋳型と結合してもなおミスマッチが存在し、伸長したプライマーを不活性とするような配列である。
【００６９】
（ｉｉｉ）タグ付きプライマーの再機能化
この機構の概略図を図５に示す。
【００７０】
理解され得るとおり、上記の項目（ｉ）に記載するプライマーは、プライマーの伸長によってプライマーハイブリダイゼーション部位の一部と比べてミスマッチを有するヌクレオチド配列が導入されるため、非機能性となり得る。かかるプライマーは、項目（ｉ）に記載する方法により生成されるにしろ、又は他の方法で合成的若しくは組換え的に産生されるにしろ、プライマーの３’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、但しその配列が目的の核酸領域の配列に対応するさらなるオリゴヌクレオチドタグを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、再活性化することができる。このタグに沿ったプライマーの伸長を促進することにより伸長したプライマー分子が生成され、この分子は、その５’末端及び３’末端に、目的の核酸領域と相補的な配列の領域を含む。ミスマッチを有する介在配列は相補領域と比べて十分に短く、従ってそのミスマッチを有する介在配列にもかかわらず、目的のＤＮＡ領域とのプライマーのハイブリダイゼーション及び続く伸長が可能である。
【００７１】
従ってプライマーは、最初はその３’末端に鋳型とミスマッチを有する２つ以上のヌクレオチドが存在するため不活性である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズすると、プライマーはオリゴヌクレオチドタグに沿って伸長し、その配列は、ここでプライマーの伸長部の配列が鋳型と一致するような配列である。
【００７２】
（ｉｖ）Ｔｍ調節によるプライマーの活性化
アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った伸長によりプライマーを活性化する別の変形例を、Ｔｍの調節により達成することができる。この機構の概略図を図７に示す。未変性プライマーのＴｍは、その鋳型及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれとのハイブリダイゼーションも非効率的となるように設計される。しかしながら次第に時間の経過に伴いプライマー分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして伸長し、そのＴｍが上昇するため効率的なプライマーとなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは鋳型とのハイブリダイゼーションと競合するが、鋳型と一致するプライマーの５’オーバーハングにより、鋳型とのハイブリダイゼーションが優先されることが確実となる。
【００７３】
本発明の第２の態様に関して、目的のオリゴヌクレオチドの機能性の制御はアンチセンス分子それ自体の伸長又は分解に基づく。本質的に、この方法を用いることで、プローブ又はプライマーとして機能し得る遊離型の目的のオリゴヌクレオチドの濃度を上昇させるか、或いは低下させることができる。具体的には：
【００７４】
（ｉ）目的のオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
増幅反応が進むに従い、熱サイクル中の繰り返されるアニーリングによるか、或いは等温反応の一定温度にある間のアニーリングにより、一部のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、目的のオリゴヌクレオチドに沿って３’方向に伸長し得る。この機構の概略図を図３に示す。これらの伸長したアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドとさらに強力にハイブリダイズし、時間とともにその数が徐々に増加し得る。結果として目的のオリゴヌクレオチドの阻害が高まり、遊離型の目的のオリゴヌクレオチドの数が減少するために目的のオリゴヌクレオチド活性が徐々に「オフに切り換わる」。
【００７５】
この方法に対する変形例では（その概略図を図４に示す）、目的のオリゴヌクレオチド及びさらなる５’タグを組み込むアンチセンスオリゴヌクレオチド構造の使用を伴い、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び目的のオリゴヌクレオチドの双方の伸長がもたらされ、より強固にハイブリダイズされる二重鎖が生じる。５’タグの配列は、伸長した目的のオリゴヌクレオチドがその鋳型とミスマッチを有し、それにより目的のオリゴヌクレオチドが伸長してもプライマーの鋳型との結合性が向上しないことが確実となるような配列であり得る。
【００７６】
（ｉｉ）オリゴヌクレオチド複合体
さらに別の実施形態では、アンチセンス分子がオリゴヌクレオチド複合体の一部を形成してもよい。「オリゴヌクレオチド複合体」とは、２つ以上の会合したオリゴヌクレオチドを含む複合体を意味する。本発明との関連において、さらなるオリゴヌクレオチドが複合体と会合してもよく、或いは、複合体の一部を形成する１つ以上のオリゴヌクレオチドが解離又は分解してもよいことは理解されなければならない。また、対象とする「複合体」は、ハイブリダイゼーションにより会合される別個のオリゴヌクレオチド、又は例えばリン酸ジエステル結合若しくは他の化学結合によってつなぎ合わされ単一の配列を形成し、次にはそれがステム−ループ構造を形成し得るオリゴヌクレオチドに対する言及を含むことも理解されなければならない。従ってこの複合体は、機能的に区別される領域を有する単一のＤＮＡ鎖を含む。例えば、複合体はステム−ループ構造の形態をとってもよく、ここでこの構造の一端には目的のオリゴヌクレオチドがある一方、他端にはアンチセンス配列がある。この構造のアンチセンス末端が折り返されて目的のオリゴヌクレオチド末端とハイブリダイズする場合、アンチセンス「ハイブリダイゼーション」が起こっている。従って、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は目的のオリゴヌクレオチドと別個の分子であってもよく、又は上述のとおり、目的のオリゴヌクレオチドに結合しているか、若しくは他の形でそれと連続していてもよいことが理解されなければならない。
【００７７】
その概略図を図６に示す一例において、目的のオリゴヌクレオチドの活性化は置換プライマーを使用して達成され得る。オリゴヌクレオチド複合体は当初、アンチセンス分子とハイブリダイズするプライマー分子などの目的のオリゴヌクレオチドを含む。従って目的のオリゴヌクレオチドは、最初はアンチセンス分子にハイブリダイズされているため不活性である。複合体に置換プライマーが導入されると、それがアンチセンス分子とハイブリダイズして伸長を起こし、それにより目的のオリゴヌクレオチドに置き換わる。それにより遊離型の目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる。目的のオリゴヌクレオチドの分解を回避するため、置換プライマーのポリメラーゼ媒介性伸長は置換活性を有しなければならないが、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有してはならない。
【００７８】
その概略図を図８（ａ）に示す別の例において、目的のオリゴヌクレオチドの活性化はアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解により達成され得る。オリゴヌクレオチド複合体は当初、潜在的に分解可能なアンチセンス分子とハイブリダイズするプライマー分子などの目的のオリゴヌクレオチドを含む。従って目的のオリゴヌクレオチドは、最初はアンチセンス分子にハイブリダイズされているため不活性である。アンチセンス配列は１つ又は複数のリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドを含み得る。それを含む場合、ジヌクレオチド結合の加水分解速度が増加し得る。リボヌクレオチド加水分解速度は、反応にＲＮアーゼＡ又はＲＮアーゼＨなどのリボヌクレアーゼを二価陽イオンと共に導入するか、又は反応にテルビウムなどのランタニドの陽イオンを導入することによりさらに増加し得る。アンチセンス配列が徐々に加水分解すると目的のオリゴヌクレオチドが遊離し、次第にその活性が増加し得る。
【００７９】
ステム−ループオリゴヌクレオチド複合体の特徴としては、限定はされないが、以下を挙げることができる：
（ａ）目的のオリゴヌクレオチド、並びにステムの３’鎖が５’鎖とハイブリダイズしているステム−ループ構造を有するように設計されるオリゴヌクレオチドであって、但し５’鎖が３’鎖より長く、且つ目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、従って任意の遊離型の目的のオリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしてそれを不活性化することが可能な一本鎖領域を含むオリゴヌクレオチド。従ってステムの５’鎖がアンチセンス配列であり、目的のオリゴヌクレオチド分子を非機能性にする。この機構の概略図を図９に示す。
【００８０】
しかしながらこれは動的な状況であり、ステムは開いたり閉じたりし、目的のオリゴヌクレオチドは結合したり解離したりする。従ってステム−ループ分子の３’伸長を促進するように増幅サイクルを設計することができる。サイクル毎にアンチセンス分子が伸長して大きいステムが生じ、これは後続のサイクルで開くことはない。従って目的のオリゴヌクレオチド分子はハイブリダイズすることができず、その目的のＤＮＡ領域に結合可能となる。ここでもまた、ステムのポリメラーゼ媒介性３’伸長は５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するべきでないことが求められる。
【００８１】
二次的なアンチセンス配列を有するステム−ループ構造を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される場合、ミニステムの長さ及びＴｍは、反応が進むに従い二次アンチセンス配列の３’伸長が起こり、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチド全体が伸長したステムを有する明確なステム−ループ構造を形成するように選択される。従ってアンチセンス活性は徐々に失われ、目的のオリゴヌクレオチド活性が徐々に増加する。
【００８２】
（ｂ）ステムの３’鎖が目的のオリゴヌクレオチド配列を有し、ステムの５’鎖がアンチセンス配列を有するステム−ループ構造を有するように設計されるオリゴヌクレオチドは、有効に機能するために必要な折り畳まれていない構造と比べてステム−ループ構造の方がエネルギー的にはるかに有利であるため、機能性のオリゴヌクレオチドとして働くことができない。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び目的のオリゴヌクレオチドは単一のステム−ループ分子の一部であるものの、ステムのアンチセンス部分は潜在的に分解性である。当初、目的のオリゴヌクレオチド配列はステム−ループ構造によってアンチセンス配列と強力にハイブリダイズしている。この機構の概略図を図８（ｂ）に示す。時間の経過に伴い、徐々にアンチセンス配列の分解が起こり、ステム−ループ構造が消失する結果としてここで目的のオリゴヌクレオチド配列が遊離し、その鋳型とハイブリダイズすることが可能となる。一つの分解機構は、アンチセンス内における１つ又は複数のＲＮＡヌクレオチドの存在、及び必要であれば反応混合物中のリボヌクレアーゼの存在である。
【００８３】
アンチセンス配列は１つ又は複数のリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドを含み得る。それを含む場合、ジヌクレオチド結合の加水分解速度が増加し得る。リボヌクレオチド加水分解速度は、反応にＲＮアーゼＡ又はＲＮアーゼＨなどのリボヌクレアーゼを二価陽イオンと共に導入するとさらに増加し得る。アンチセンス配列が徐々に加水分解すると直鎖状アンチセンスオリゴヌクレオチドが目的のオリゴヌクレオチドから解離し、又はステム−ループが解けてアンチセンス阻害が失われ、それにより目的のオリゴヌクレオチド活性が次第に増加し得る。
【００８４】
（ｃ）その概略図を図１０に示すオリゴヌクレオチド複合体のさらに別の例において、この複合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドにより形成され、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドの３’末端に結合し、且つ目的のオリゴヌクレオチドの直ちに３’側にハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドのための結合部位を提供する５’伸長部を有する。リガーゼ酵素の働きによって目的のオリゴヌクレオチドが前記第２のオリゴヌクレオチドとライゲートして配列を形成し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドの機能の喪失又は獲得がもたらされ、前記機能はターゲット分子との相互作用に関与する。反応の過程において、第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーションは反応中に徐々に起こり得るか、又は反応の条件を制御することにより制御され得る。
【００８５】
従って、本発明の一態様は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力を調節する方法に関し、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進するステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長するアンチセンスヌクレオチド配列が、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、
（ｉ）ターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするもの；
（ｉｉ）ターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの；又は
（ｉｉｉ）前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム−ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの
のいずれかである伸長部を生成する、ステップを含む。
【００８６】
一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドはプライマーである。
【００８７】
別の態様において、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して３’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの３’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｉｖ）ループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状３’鎖を伸長するステップであって、３’直鎖状鎖は５’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し５’直鎖状鎖は３’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記３’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ；又は
（ｖ）直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム−ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチドの鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ；又は
（ｖｉ）Ｔｍが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがＴｍの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ；又は
（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の３’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップ
を含む。
【００８８】
一実施形態において、前記核酸はＤＮＡである。
【００８９】
別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子を標的とする。
【００９０】
別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性は、プライマー、アプタマー、ＤＮＡザイム、ＲＮアーゼ又はリボザイムとしての機能性である。
【００９１】
従って、ターゲットＤＮＡに沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法が提供され、前記方法は、前記プライマーをアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記プライマーの３’伸長を促進するステップにおいて、それに沿って前記プライマーが伸長するアンチセンスヌクレオチド配列が、プライマー伸長部であって、
（ｉ）ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記プライマーを機能性にするもの；又は
（ｉｉ）ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記プライマーを非機能性にするもの；又は
（ｉｉｉ）前記プライマーの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部がプライマーの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム−ループ構造を形成して前記プライマーを非機能性にするもの
のいずれかである伸長部を生成する。
【００９２】
別の態様において、ＤＮＡプライマーの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記プライマーの３’末端にハイブリダイズし、前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長を促進することにより、前記プライマーを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端を前記プライマーの３’末端とハイブリダイズし、前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記プライマーの３’伸長を促進することにより、前記プライマーを非機能性にするステップ；又は
（ｉｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的の第１のプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体を、第１のプライマーがハイブリダイズする領域に対して３’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第２のプライマーと接触させて、前記第２のプライマーの３’伸長を生じさせるステップにおいて、前記第２のプライマーは伸長すると前記第１のプライマーに置き換わり、前記第１のプライマーが機能性になる、ステップ；又は
（ｉｖ）ループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状３’鎖を伸長するステップであって、３’直鎖状鎖は５’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し５’直鎖状鎖は３’直鎖状鎖より長く、且つ前記プライマーと相補的な一本鎖領域であって、前記プライマーにハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記３’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記プライマーに置き換わり、前記プライマーが機能性になる、ステップ；又は
（ｖ）直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム−ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状のプライマー鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ；又は
（ｖｉ）Ｔｍが低いプライマーをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記プライマーの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長したプライマーがＴｍの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ；又は
（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズしたプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体と、プライマーがハイブリダイズする領域の３’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記プライマーと前記オリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記プライマーの機能性が調節される、ステップ
を含む。
【００９３】
本発明の方法は、全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドが同じタイプの構造であるように設計されてもよく、又は一つの方法において任意の２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド構造タイプが使用されるように設計されてもよいことが理解されなければならない。
【００９４】
以上に詳述したとおり、本発明の方法は広範に適用され、それらの適用としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
（ｉ）核酸増幅中に用いられる不活性化方法。これは増幅との関連において適用することができる。用途としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
【００９５】
・ネステッド増幅
不活性化は外側プライマーが関わるように設計することができ、及び反応は、外側プライマーが不活性となった後に内側プライマーが活性になることを確実とし得る条件下で実施され得る。当業者は、かかる条件が、（ｉ）反応全体を通じた内側プライマーの活性を可能にするのに十分なアニーリング温度、又は（ｉｉ）内側プライマーが最初は不活性であったが反応の過程で活性になったアニーリング温度の段階的又は漸進的な低下、又は（ｉｉｉ）先述のとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用による反応の過程での１つ又は複数の不活性な内側プライマーの活性への変換、を含むであろうことを理解し得る。閉じられた単一のチューブでのネステッドＰＣＲの実施を可能にするためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用については、Ｂｒｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）に記載されている。
【００９６】
・一本鎖ＤＮＡの産生
核酸増幅反応の終盤における一本鎖ＤＮＡの産生は、配列決定、定量化、及び多様なプローブを増幅産物の検出に使用する能力を含め、様々な目的に有用であり得る。１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが関わる増幅反応による一本鎖ＤＮＡの産生は、一方のプライマーが他方のプライマーより時間的に早く不活性化されるように反応条件を調整することによって達成され得る。当業者は、これを達成する一つの方法が、１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを使用すること、及び規定のサイクル数後にターゲットプライマーが不活性化され、それにより他方のプライマーがアニーリング及び伸長を続行できることで一本鎖ＤＮＡ量の増加が生じるように、アニーリング温度などの反応条件を調整することであると認識するであろう。この使用の例を図１２に示す。
【００９７】
（ｉｉ）核酸増幅中の活性化方法。これはＰＣＲ又は等温増幅のいずれとの関連においても適用することができ、これらの増幅はネステッド増幅との関連において用いられ得る。ネステッド増幅について、後順の核酸増幅サイクルにおいてのみ内側プライマーが活性であることを確実にすると、完全に非特異的な産物、或いはターゲット産物に近い配列関係を有するものの、その増幅は求められない産物の非特異的増幅が内側プライマーによって生じる機会が最小限となる。
【００９８】
ここでもまた条件は、一定のアニーリング温度で、活性化が反応の過程において漸進的に起こるようにすることができ、又は温度条件は、反応中に活性化が起こる点を制御するように調整することもできる。
【００９９】
（ｉｉｉ）その活性状態にある目的のオリゴヌクレオチドが、タンパク質分子とハイブリダイズして前記タンパク質分子の構造又は機能の変化を引き起こすアプタマーとして機能するとき、又はそれぞれＤＮＡ若しくはＲＮＡからなり、核酸分子とハイブリダイズして酵素として働くＤＮＡザイム若しくはリボザイムとして機能するとき、活性化方法及び不活性化方法の双方を用いることもできる。
【０１００】
従って一実施形態において、本発明は、ネステッド増幅反応において使用しようとするプライマーの誘導性の不活性化又は活性化を可能にし、それにより一定した最適レベルの効率性を維持するシングルチューブネステッドＰＣＲ法の設計が可能となる。より具体的には、この開発により、シングルチューブネステッドＰＣＲとの関連においてこれまで不可能であった一定の制御性及びロバスト性が可能となった。本発明の方法は、特異的遺伝子などの目的の特異的ＤＮＡ領域の分析が必要となる任意の適用に関連して有用である。さらにまた、この方法は熱的及び等温的の双方の核酸増幅反応の改善に適用可能である。
【０１０１】
この実施形態によれば、ターゲットＤＮＡを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー；及び
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションに影響を与える様々な要因を理解することは、当業者が１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーが関与するシングルチューブネステッドＰＣＲの設計において、（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのプライマーとのハイブリダイゼーションが、当該のプライマーがアニーリング及び伸長することが必要な段階では最小限しかなく、又は存在しないが、他のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階ではそれが起こり、及び／又は（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの別のプライマーとのハイブリダイゼーションが、当該のプライマーのアニーリング及び伸長が不可能であることが必要で、且つ他のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階では最小限しかなく、又は存在しないが、当該のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階ではそれが起こるように設計するのに役立ち得る。
【０１０３】
「フォワードプライマー」に対する言及は、目的のＤＮＡ試料中の、及びＰＣＲにおけるターゲットＤＮＡを、そのターゲットＤＮＡのアンチセンス鎖とハイブリダイズすることにより増幅するプライマーを指すものと理解されなければならない。
【０１０４】
「リバースプライマー」に対する言及は、目的のＤＮＡ試料中の、及びＰＣＲにおけるターゲットＤＮＡを、そのターゲットＤＮＡのセンス鎖とハイブリダイズすることにより増幅するプライマーを指すものと理解されなければならない。
【０１０５】
位置に関する「下流」又は「上流」に対する言及は、センスＤＮＡ鎖に対する位置を指し、「下流」が３’を指して「上流」が５’を指すすものと理解されなければならない。
【０１０６】
以上に詳述したとおり、ＰＣＲ又は等温反応などのネステッド核酸増幅反応は、ターゲットＤＮＡ内で徐々により内側の配列とハイブリダイズするよう標的を定める２つ以上のフォワード及びリバースプライマーセットの使用に基礎を置いている。本発明との関連において、「第１の」フォワード及びリバースプライマーに対する言及は、ターゲットＤＮＡの最も外側の位置にハイブリダイズするプライマーを指すものと理解されなければならない。「第２の」フォワード及びリバースプライマーは、内側のプライマーを指すものと理解されなければならない。すなわち、これらの第２のプライマーは、それぞれ第１のフォワードプライマーの下流及び第１のリバースプライマーの上流にある配列とハイブリダイズするように設計される。ターゲットＤＮＡに沿ってどのような間隔でこれらのプライマーをハイブリダイズさせるかについての設計は、当業者の技能の範囲内にある。また、それぞれ第２のフォワードプライマーの下流及び第２のリバースプライマーの上流にある配列とハイブリダイズするように設計される第３のフォワード及びリバースプライマーセットを組み込む方法をとってもよいことが理解されなければならない。
【０１０７】
本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、本発明の反応を、ネステッド反応ではなくセミネステッド反応を用いるように設計することができる。この場合、第２のフォワードプライマー又は第２のリバースプライマーのいずれかが使用されず、残る単一のフォワードプライマー又は単一のリバースプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しない。
【０１０８】
一実施形態において、本発明はターゲットＤＮＡを増幅する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーのハイブリダイゼーション部位の５’末端に隣接するＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明はターゲットＤＮＡを増幅する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが５’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第１のプライマーの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【０１１０】
別の実施形態において、ターゲットＤＮＡを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ又は複数が前記第１のプライマーの３’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って３’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記第２のプライマーを機能性にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第１のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【０１１１】
一実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは前記プライマーの３’末端にハイブリダイズし、前記プライマーに沿って伸長する。
【０１１２】
別の実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端は前記プライマーの３’末端とハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端は前記プライマーに沿って伸長し、及び前記プライマーの３’末端は前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿って伸長する。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、ターゲットＤＮＡを増幅する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、
（ａ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のフォワードプライマー及び前記ターゲットＤＮＡを標的とする第１のリバースプライマー；及び
（ｂ）前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のフォワードプライマーであって、前記第１のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第２のフォワードプライマー
前記ターゲットＤＮＡを標的とする第２のリバースプライマーであって、前記第１のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第２のリバースプライマー
であって、ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する３’タグを含むこれらの第２のプライマー；及び
（ｃ）前記プライマーの１つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の１つが、前記第２のプライマーの３’領域に相補的な３’領域と、プライマー結合部位に隣接するターゲットＤＮＡの配列に対して相補的な相補配列を有するより５’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド
と接触させるステップにおいて、部分（ｂ）及び（ｃ）の分子を、ステップ（ｉｉ）の増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップ（ｉｉｉ）の増幅の前に反応に加えることができる、ステップ；及び
（ｉｉ）前記第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第２のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ；及び
（ｉｖ）目的のＤＮＡ領域に沿った前記第２のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第１のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第１のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップ（ｉｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅するステップ
を含む。
【０１１４】
従って本発明の方法は、最も外側のプライマーの初期増幅が最初は主要な増幅反応として効率的に進行することを可能にする。しかしながら、この増幅を完了して内側の第２のプライマーセットの増幅に移ることが求められるため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの第１のフォワードプライマーとのハイブリダイゼーションが生じ、その結果、ターゲットＤＮＡとの関連においてそれ以上のいかなる伸長が起こることも有効に阻止されるプライマーが生成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドから結合している内側プライマーが放出されることと併せて、進行中の外側プライマーの不要な増幅が最小限に抑えられ、内側プライマーの増幅が、効率的な増幅を促進する条件下で進行することができる。例えば外側プライマーそれ自体がそのハイブリダイゼーション部位との内側プライマーのハイブリダイゼーションを有効に妨げる場合には、内側プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する必要はないことが理解されなければならない。
【０１１５】
以上に詳述したとおり、本発明は、増幅状況によっては、初期増幅サイクルの間に活性な１つ又は一対のプライマーを有すること、及び次に急激に又は漸進的に不活性になること、及び初期サイクルの間に不活性な１つ又は別の対のプライマーを有すること、及び次に後続のサイクルの間に急激に又は漸進的に活性になることが望ましいものであり得るという事実に基礎を置いている。
【０１１６】
プライマーのアンチセンスオリゴヌクレオチドとの、及びプライマーのターゲットＤＮＡとの相互作用の促進が、任意の好適な方法により行われてもよい。それらの方法は当業者に公知であろう。そのために、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は内側プライマーは任意の好適な時点で反応チューブに導入され得ることは理解されなければならない。導入は概して初期増幅サイクルの開始前、すなわちフォワード及びリバース外側プライマーと同時であるが、外側プライマーによる初期増幅サイクルの後に１つ又は複数の導入が行われてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は内側プライマーの導入方法は、当業者がどのように増幅反応を実施しようとしているかに依存し得るが、一般には使用を簡略化するため、及びコンタミネーションを回避するため、通常、反応全体を単一のチューブで実施可能であることが望ましい。しかしながら、本発明のステップを達成する任意の他の方法を用いることができる。
【０１１７】
プライマー特異的増幅を達成する方法もまた、当業者に極めて周知されている。好ましい方法では、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応である。
【０１１８】
「試料」に対する言及は、生体試料又は非生体試料のいずれかを指すものと理解されなければならない。非生体試料の例としては、例えば、合成的に産生された核酸集団の核酸産物が挙げられる。「生体試料」に対する言及は、限定はされないが、動物、植物又は微生物（微生物培養物を含む）などの任意の生きている生物、並びに限定はされないが、細胞物質、血液、粘液、糞便、尿、組織生検標本、動物の体内に導入され、続いて取り出された流体（例えば、肺洗浄後に肺から抜き出した生理食塩水又は腸洗浄から回収した溶液など）、植物材料又は種子若しくは花などの植物繁殖材料又は微生物コロニーなどに由来する生物学的材料の任意の試料を指すものと理解されなければならない。本発明の方法により試験される生体試料は直接試験されてもよく、又は試験前に何らかの形の処理が必要であってもよい。例えば、生検試料は試験前に均質化が必要であり得る。さらに、生体試料が液状形態でない限りにおいて、緩衝液などの試薬を添加して試料を流動化させることが必要となり得る。
【０１１９】
ターゲットＤＮＡ又は他の分子が生体試料中に存在する限りにおいて、生体試料は直接試験されてもよく、或いは生体試料中に存在する核酸材料の全て又は一部が試験前に単離されてもよい。ターゲット核酸分子を試験前に前処理すること、例えば生ウイルスの不活性化又はゲル上での泳動は、本発明の範囲内にある。また、生体試料は新しく採取されてもよく、又は試験前に（例えば凍結することにより）保存されていたか、若しくは他の方法で試験前に処理されたもの（培養を受けることによるなど）であってもよいことも理解されなければならない。
【０１２０】
試料をプライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと「接触させる」に対する言及は、プライマーの試料との混合を、相互作用（例えばハイブリダイゼーション）が起こり得るように促進することを指すものと理解されなければならない。この目的を達成する手段は当業者には周知されているであろう。本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、接触の程度は反応条件並びにプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのＴｍ値により決定される。接触はアニーリング温度を制御することにより操作することができ、従って接触は高温では起こらないが、低温では起こる。或いは接触は、一定の温度にある間に一定の速度で生じさせることもできる。或いはタッチダウンＰＣＲなどにおいてはアニーリング温度が徐々に変化するため、接触の程度が徐々に変化し得る。
【０１２１】
本明細書に開示される方法における試験にどのような種類の試料が最も好適であるかの選択は、モニタされる病態の性質など、状況の性質に依存し得る。例えば、好ましい実施形態では腫瘍性の病態が分析対象である。腫瘍性の病態が白血病である場合、血液試料、リンパ液試料又は骨髄穿刺液が好適な試験試料を提供し得るであろう。腫瘍性の病態がリンパ腫である場合、リンパ節生検又は血液若しくは骨髄試料が試験に好適な組織源を提供し得るであろう。また、元の腫瘍性細胞源をモニタしているかどうか、又は発生点からの新生物の転移又は他の形態の広がりの存在がモニタされるべきかどうかに関しても考慮が必要であり得る。この点について、任意の一つの哺乳動物から複数の異なる試料を採取して試験することが望ましいこともある。別の例において、別の好ましい実施形態では感染症の病態が分析対象である。性質及び感染部位を確定するには、血液、体液、排泄物又は組織の試料が試験に好適な試料を提供し得るとともに、特定の核酸配列の増幅に必要なプライマーは、感染に関与している可能性のある生物の範囲が検出の対象となり得るように選択され得る。所与の検出シナリオに適切な試料及び増幅システムの選択は、当業者の技能の範囲に含まれ得る。
【０１２２】
用語「哺乳動物」には、それが本明細書で使用される限りにおいて、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）及び捕獲野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒト又は実験室試験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。用語「生物」は、それが本明細書で使用される限りにおいて、限定はされないが、動物、植物、細菌、ウイルス及び真菌を含めた任意の生きている実体を指す。
【０１２３】
本発明は以下の非限定的な例を参照してさらに説明される。
【実施例】
【０１２４】
実施例１
表１は、アンチセンスによる活性な外側プライマーの不活性状態への変換及び不活性な内側プライマーの活性状態への変換を示す２つの実験の結果を示す。
【０１２５】
表２、表３、及び表４は、使用されるプロトコルの様々な態様を示す。
【０１２６】
実施例２
熱サイクリングにおける核酸増幅
以下の方法は、ＰＣＲの過程におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した外側プライマーのオフへの切換え及び内側プライマーのオンへの切換えを含む。外側プライマーの機能性が失われる時点より前に内側プライマーがオンに切り換わって完全に機能性になるように条件を調整する。
【０１２７】
方法
ＰＣＲ：２０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．４、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む反応物中、１００ｎｇの各外側プライマー、１００ｎｇの各内側プライマー、対応する外側及び内側プライマーと等しいモル濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチド、２．５ｍＭのマグネシウム、２００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、１ｕのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔａｑｍａｎ加水分解プローブ並びに様々な質量のＤＮＡを含む２５μＬの反応物を使用。サイクリング条件：９６℃２分間、次に４０サイクルの９４℃１５秒間、５８℃６０秒間、７２℃６０秒間。
【０１２８】
外側及び内側プライマー：Ｔｍ値の計算には塩基スタッキングモデルを使用し（Ｂｏｒｅｒ  Ｐ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９７４）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６：８４３及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６０に基づく、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍにて利用可能）、及び２．５ｍＭのマグネシウム、２００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ並びに１００ｎｇのプライマーを仮定した。プライマーが効率的な増幅を生じる温度の３ｇｅを決定するためアニーリング温度の勾配を使用。Ｔｍが６０〜６５℃の外側及び内側プライマーが十分である。
【０１２９】
内側プライマーは、プライマーが鋳型鎖とハイブリダイズすると、３’末端の２つの塩基がミスマッチをもたらすように設計される。これにより、ＰＣＲの初期サイクルの間にプライマーが不活性となる。
【０１３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：
（ａ）外側プライマーに対するものは、外側プライマーの３’末端に対するアンチセンス配列に基づき、且つ各々が３ヌクレオチドの５’タグ及び３’タグを有する。
【０１３１】
外側プライマーはハイブリダイゼーション後に５’タグに沿って伸長し得るため、タグの３’−５’配列は、未変性プライマーがハイブリダイズし得る点の直ちに下流にある鋳型鎖の３’−５’配列と相補的である。この設計により、伸長したプライマーの３’末端とその鋳型との間に３塩基のミスマッチが生じ、それが外側プライマーのさらなる伸長を阻止し、従ってターゲットの増幅が防止される。オリゴヌクレオチドの３’末端における３塩基の配列は、オリゴヌクレオチドの潜在的にハイブリダイズする各塩基がプライマーの潜在的にハイブリダイズする塩基と同じであるような配列である。ここでもまた、この設計により３塩基のミスマッチが生じ、それがオリゴヌクレオチドの伸長を阻止する。この戦略により、より高いＴｍを有し、且つ望ましくない阻害を及ぼし得る過度に長いアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＣＲの初期高温段階にある間に産生されることが防止される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’方向への伸長もまた３’末端のアミン修飾により防止することができる。
【０１３２】
（ｂ）内側プライマーに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ塩基を含め、内側プライマーの３’末端に対するアンチセンス配列に基づく。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは５’タグと、３’末端のタグ又はアミン修飾のいずれかとを有する。５’タグは４〜６塩基を含み、その配列は、プライマーとのハイブリダイゼーションが起こるとプライマーが伸長し、鋳型配列と完全に一致する３’配列を生じるように選択される。
【０１３３】
外側プライマーと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチドのコアハイブリダイゼーション配列について４８〜５５℃のＴｍ範囲が、外側プライマーの十分な漸進的阻害をもたらす。内側プライマーと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、５２〜５６℃のＴｍ範囲が、内側プライマーの十分な漸進的活性化を生じる。概して外側プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＴｍ値は４９〜５１℃とすべきで、一方、内側プライマーを標的とするそれのＴｍ値は５２〜５４℃とすべきである。
【０１３４】
実施例３
等温核酸増幅
以下のプロトコルは、等温核酸増幅中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して逐次的にあるプライマーセットの活性をオフに切り換え、別のプライマーセットの活性をオンに切り換える。第２のセットのプライマーは、第１のプライマーセットがターゲットとする部位より内側の部位をターゲットとし、すなわち反応はネステッド増幅である。ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）が、等温増幅に用いられる方法である。
【０１３５】
方法
ＨＤＡは、Ｂｉｏｈｅｌｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給されるＩｓｏＡｍｐ  ＩＩ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｔＨＤＡキットの使用を含む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｈｅｌｉｘ．ｃｏｍ／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐ）。詳細な増幅プロトコル及びＨＤＡについての指示事項は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｈｅｌｉｘ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／−Ｈ０１１０Ｓ＿ｆｕｌｌ＿ｖｅｒｓｉｏｎ＿ＢＨ．ｐｄｆに提供され、プロトコルＣが、通常用いられるプロトコルである。
【０１３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用には、反応物に対する以下の修飾及び／又は添加を伴う：
各１００ｎｇの全４つのプライマー
アンチセンスオリゴヌクレオチド−各々がそのターゲットプライマーと等モル濃度で存在する。外側プライマーを標的とするオリゴヌクレオチドは約５０℃のＴｍを有し、内側プライマーを標的とするオリゴヌクレオチドは約５３℃のＴｍを有する。
インキュベーション−６０℃１２０分間
【０１３７】
実施例４
ＰＣＲにおけるステム−ループプライマーのステムの伸長
この実験の結果は図１１に示す。この実験は、図２に示す戦略の一部を例証する。１０サイクルにわたるＰＣＲ反応において、ステムがループ状に折り返してプライマーのより５’側の領域とハイブリダイズすることが潜在的に可能な配列の、４〜１２塩基の３’ステムを有するプライマーが存在した。次に融解曲線法を実施することにより、ステムの伸長可能性を分析した。図中のデータは、４塩基又は５塩基のステムがＴａｑポリメラーゼにより伸長されなかった一方、６塩基以上のステムは１２塩基の長さに完全に伸長されたことを示す。
【０１３８】
実施例５
プライマーの不活性化による一本鎖ＤＮＡの産生
一本鎖ＤＮＡには数多くの用途がある。図１２に示すこの実験では、一方のプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＣＲに組み込んだ。７２℃のアニーリング温度で最初の１５サイクルを実施し、これらのサイクル中に指数関数的増幅が起こった。次にアニーリング温度を５８℃に下げると、このとき一方のプライマーのそのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる漸進的な不活性化が生じ、次に他方のプライマーの伸長によりもたらされた一本鎖ＤＮＡの産生が確認された。２つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、一方は１２塩基のコアで、他方は１３塩基のコアであった。
【０１３９】
実施例６
アンチセンスＰＣＲ：ネステッドシングルチューブＰＣＲの単純且つロバストな実施方法
材料及び方法
ＰＣＲ
特に指定しない限り、２５μｌ反応物は、１００ｎｇの各外側プライマー、２００ｎｇの各内側プライマー、対応する外側プライマーに等しいモル濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチド、２．５ｍＭのマグネシウム、各２００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、１ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔａｑｍａｎ加水分解プローブ、並びに３０ｐｇ〜１００ｎｇのＤＮＡを含んだ。反応物は手動でセットアップし、ＰＣＲは２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び２．５ｍＭのＭｇＣｌ２において実施した。特に指定しない限り、サイクリング条件は以下のとおりとした：ホットスタート、９６℃２分間；１５サイクルの高温「第１段階」、すなわち９４℃１５秒間及び７２℃６０秒間；インキュベーション５分間５８℃；次に４０サイクルの低温「第２段階」、すなわち９４℃１５秒間、５８℃９０秒間、及び７２℃６０秒間。このプロファイルは「二段階プロトコル」と称される。サイクル数について示される全ての結果は、ＰＣＲの開始からの総サイクル数を示す（すなわち最初の高温１５サイクルが含まれる）。ＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５  ｉＣｙｃｌｅｒ（ソフトウェアバージョン２．０．１４８．６０６２３）で実施した。ＤＮＡは健康被験者の血液約５０ｍｌに由来し、これはＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔによって製造者のプロトコル（カラム精製、ＲＮアーゼ不使用）に従い採取し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計によりＱｕａｎｔ−ｉＴ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて定量化した。
【０１４０】
外側プライマー及び内側プライマー
塩基スタッキングモデル（Ｂｏｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６（１９７４）８４３−８５３）及びＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｊ．ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）１４６０−１４６５）に基づく、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍで利用可能）を使用し、２．５ｍＭのマグネシウム及び６００ｎＭのプライマーを仮定してＴｍ値を計算した。次にプライマーが効率的な増幅を生じる温度範囲を、アニーリング温度の勾配を用いて実験的に決定した。様々な予想Ｔｍ値のプライマーを調べ、最終的に７７〜７８℃のＴｍ値の外側プライマー（少なくとも７４℃のアニーリングまで効率的な増幅を生じることが分かった）と、５８〜６２℃のＴｍ値の内側プライマー（６１〜６４℃のアニーリングまで効率的な増幅を生じることが分かった）とを使用した。
【０１４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
その分子は外側プライマーの３’末端に対するアンチセンス配列に基づいた。分子は、ＰＣＲの初期高温段階における外側プライマーとのハイブリダイゼーションは最小限であるが、後の低温段階では実質的なハイブリダイゼーションが生じ得るＴｍを有するように設計した。分子は、各々が３ヌクレオチドからなる５’タグ及び３’タグを有した。外側プライマーはハイブリダイゼーション後に５’タグに沿って伸長し得るため、タグの３’−５’配列は、未変性プライマーがハイブリダイズし得る点の直ちに下流にある鋳型鎖の３’−５’配列との相補配列であった。この設計により、伸長したプライマーの３’末端とその鋳型との間に３塩基のミスマッチが生じ、各ミスマッチはａ：ａ、ｇ：ｇ、ｃ：ｃ、又はｔ：ｔのいずれかであり得た。これにより外側プライマーのさらなる伸長が阻止され、従ってターゲットの増幅が防止され得た。オリゴヌクレオチドの３’末端における３塩基の配列は、オリゴヌクレオチドの潜在的にハイブリダイズする各塩基が外側プライマーの潜在的にハイブリダイズする塩基と同じであるような配列であった。ここでもまた、この設計により３塩基のミスマッチが生じ、それが外側プライマーに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を阻止し得た。この戦略により、より高いＴｍを有し、且つ望ましくない阻害を及ぼし得る過度に長いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲの初期高温段階中に産生されることが防止された。
【０１４２】
５’タグ及び３’タグを除くコア配列について各アンチセンスオリゴヌクレオチドのＴｍ値を決定し、各対のメンバーはほぼ同じＴｍを有した。外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが内側プライマーを含まないＰＣＲを実施することにより、双方のプライマーセット及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む完全なＰＣＲ、並びに外側プライマーのみを含むＰＣＲの双方を対照として使用して、各対の阻害活性を試験した。対の各メンバーが４８〜５５℃のＴｍを有するオリゴヌクレオチド対が、高温の第１段階の間には阻害を生じることなしにＰＣＲの低温の第２段階の間に外側プライマーの十分な阻害をもたらしたことが分かった。最終的なプロトコルで用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、４９〜５４℃であった。
【０１４３】
データ報告及び統計的検定
データはＭＩＱＥ（定量的リアルタイムＰＣＲ実験の公表における最小限の情報）の指針に準拠して報告する（Ｂｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５５（２００９）  ６１１−６２２）。差はスチューデントｔ検定で検定した。
【０１４４】
結果
４つの遺伝子についてアンチセンスｑＰＣＲ戦略を調べた：ＮＲＡＳ（神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス癌遺伝子ホモログ、ｇｅｎｅＩＤ  ４８９３、ＭＩＭ  １６４７９０）の４７５ｂｐセグメント、ＢＣＲ（切断点クラスター領域、ｇｅｎｅＩＤ  ６１３、ＭＩＭ  １５１４１０）の２８７ｂｐのセグメント、ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリポーシス、ｇｅｎｅＩＤ  ３２４、ＭＩＭ  ６１１７３１）の４７４ｂｐセグメント、及び再配列免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子（ＩＧＨ＠、ｇｅｎｅＩＤ  ３４９２）の１８４ｂｐセグメント。各システムの開発では複数のプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを調べた。最終的に使用したプライマー及びオリゴヌクレオチドを表５に示す。
【０１４５】
Ｔｍ計算値を様々なアニーリング温度における機能と相関付ける予備調査から、個々のプライマーがそのＴｍ計算値＋５〜７℃に等しいアニーリング温度まで効率的に増幅し、プライマー対がその平均Ｔｍ値＋２〜４℃に等しいアニーリング温度まで効率的に増幅し、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド対が平均オリゴヌクレオチドＴｍ値＋約１０℃に等しいアニーリング温度まで外側プライマー対の計測可能な阻害を生じたことが示された。アンチセンスオリゴヌクレオチド対による外側プライマーの十分な阻害についての有用な基準は、ＰＣＲにおける唯一のプライマーが外側プライマーであるとき、二段階ＰＣＲプロトコルを用いたこと、添加したＤＮＡの質量が、６又は７サイクルの低温サイクル後にサイクル閾値（Ｃｔ）に達し、次にアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えると５〜１０サイクルだけＣｔが増加したような質量であったことであった。そのＴｍに加え、アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果の大きさはまた、そのモル濃度、アニーリングの継続時間、及びアニーリング温度によっても影響を受けることが分かった。アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果は、反応に一つのオリゴヌクレオチドのみを使用した場合には低下したが、Ｔｍを２〜３℃上げたオリゴヌクレオチドを使用することにより、阻害効果を十分に高めることができた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’タグを省略すると、ＰＣＲの初期高温段階における増幅の阻害に変化が生じた（データは示さず）。
【０１４６】
材料及び方法に記載するとおりの最終的なアンチセンスｑＰＣＲプロトコルを用いた結果を図１４に示す。様々な範囲のＤＮＡ質量の増幅を行い、広範囲のサイクルに関してシステムの性能を試験した。外側プライマー、内側プライマー、及び一対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み込む完全なシステムが、外側プライマー単独での増幅と同じＣｔ結果をもたらしたことが分かる。外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下における増幅の結果を外側プライマーのみによる増幅の結果と比較すると、７又は８サイクルの低温サイクル後には外側プライマーの著しい阻害が既に起こったことが明らかである。他方で、外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのみの存在下における増幅の結果を、内側プライマーもまた含む完全なシステムによる増幅の結果と比較すると、７又は８サイクルの低温サイクル後の主要なＰＣＲ産物が、内側プライマーによる増幅で生じたものであったことが明らかである。電気泳動法により、最終的な増幅産物が内側プライマーにより誘導された増幅の結果であったことが確認された。一実験の結果を図１５に示す。
【０１４７】
アンチセンスｑＰＣＲの増幅効率と標準的なｑＰＣＲの増幅効率との直接比較を２１の実験−８つはＮ−ＲＡＳ、５つはＢＣＲ、６つはＡＰＣ、及び２つはＩＧＨ−で実施し、各実験で０．１〜１００ｎｇのＤＮＡを増幅した。統計的に有意な差は認められなかった。ＣｔとＤＮＡの質量の対数との関係の平均の傾きは、アンチセンスｑＰＣＲについて−３．６２及び標準ＰＣＲについて−３．５８であり、対応のある差の標準誤差は０．０６５であった。所与のＤＮＡ質量についてのアンチセンスｑＰＣＲのＣｔ値と標準ｑＰＣＲのＣｔ値との差の平均は−０．４６７であり、標準誤差は０．２５２であった（ｔ＝１．８５、Ｐ＜０．１、両側）。この結果の最も明らかな解釈は、２つの技法間に実質的な増幅効率の差がないことである。現実に小さい実質的な差があったなら、この結果は事実上、アンチセンスｑＰＣＲによる増幅がより効率的であることを示唆するものとなったであろう。
【０１４８】
ＡＰＣ遺伝子を調べてアンチセンスＰＣＲの間における外側及び内側プライマーによる増幅の結果を分析する一実験において、ＰＣＲを様々なサイクル数の後に停止させ、アリコートを第２のｑＰＣＲによりアッセイして、産生された様々なアンプリコンを定量化した。この二次アッセイでは、外側プライマーは一次ＰＣＲにおいて外側プライマーにより産生された長鎖アンプリコンのみを定量化した一方、内側プライマーは全アンプリコン（すなわち、内側プライマーにより産生された短鎖アンプリコン及び外側プライマーにより産生された長鎖アンプリコンの双方）を定量化した。この結果を図１６に示す。Ｃｔ値はアンプリコン数の対数と線形関係を有するため、Ｃｔスケールを逆にして示していることに留意されたい。アンチセンスｑＰＣＲ及び外側プライマーのみを使用した標準ｑＰＣＲの双方で、産生されたアンプリコン総数は同等に指数関数的に増加した。しかしながらアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在すると、アンチセンスＰＣＲにおいても、或いは外側プライマーのみを併う場合においても、外側プライマーによる長鎖の産物の増幅は漸進的な阻害を示した。これはサイクル２１（すなわち、６低温サイクル後）により明らかであり、この時点でネステッドＰＣＲでは長鎖アンプリコンは全アンプリコンの約１０％のみであった。
【０１４９】
４つの遺伝子ターゲットの各々について、アンチセンスｑＰＣＲの非特異的増幅に対する効果を試験した。３０ｐｇ〜１００ｎｇの範囲のＤＮＡ質量を、外側プライマーのみを使用する標準的なＰＣＲによるか、又はアンチセンスｑＰＣＲいずれかにより増幅し、Ｃｔ値は、目的の産物に特異的なＴａｑｍａｎプローブか、又は全てのＰＣＲ産物−目的の産物及び非特異的な産物の双方を計測するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎかのいずれかにより決定した。各遺伝子による第１の実験では、アンチセンスｑＰＣＲ及び標準ＰＣＲ（外側プライマーのみを使用）の双方に二段階温度プロファイルを使用した。サイクル１５以降のより低いアニーリング温度が外側プライマー単独には僅かに最適以下であった可能性があるため、Ｎ−ＲＡＳ、ＡＰＣ、及びＢＣＲによる第２の比較を実施し、ここではアンチセンスｑＰＣＲを通常の温度プロファイルで実施した一方、標準ＰＣＲを全サイクルについて７２℃のアニーリング温度で実施した。全サイクルに７２℃のアニーリング温度を使用したＩＧＨ遺伝子の増幅試験は、Ｔａｑｍａｎプローブのアニーリングが６１℃の温度を上回ると低下したため不可能であった。この結果は、７つの実験全てについて本質的に同じであった。そのうち２つを図１７に示す。アンチセンスＰＣＲは外側プライマー単独によるＰＣＲと比較して平均２．９８のＣｔの増加をもたらした（標準誤差［ＳＥ］＝０．６６、Ｐ＜０．０１）。アンチセンスＰＣＲを用いたときに閾値に達するまでにかかるサイクル数のこの増加は、特異的増幅の減少又は非特異的増幅の減少に起因した可能性があった。しかしながら、Ｔａｑｍａｎによる結果が示すとおり、アンチセンスＰＣＲは特異的増幅の減少を生じなかった。アンチセンスＰＣＲは実際には平均０．８２Ｃｔ単位（ＳＥ＝０．３６）の減少を生じた；すなわち、アンチセンスＰＣＲでは古典的ＰＣＲと比べて僅かに早く閾値に達した。従って、消去法により、アンチセンスＰＣＲのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎエンドポイントに対する効果は、非特異的増幅を減少させることであったはずである。
【０１５０】
希薄なターゲットの定量化には多数のＰＣＲサイクルが必要であり、この状況では、低温サイクルの数を減らし、ひいてはこの段階における非特異的増幅の可能性を最小限に抑えるため、１５サイクルより多い高温サイクルの実施が望ましい可能性がある。従って本発明者らは、高温段階の間のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる外側プライマーの漸進的な不活性化が最終的に増幅効率を低下させ得るかどうかを調査した。３つの実験を実施した：１つの実験につきＮ−ＲＡＳ、ＢＣＲ、及びＡＰＣの１つを試験した。７２℃のアニーリング温度を使用して、最大３５サイクルのＣｔ値が観察されるように様々なＤＮＡ質量を外側プライマーによって増幅した。アンチセンスオリゴヌクレオチドも存在した場合には阻害はなかったが、但し、１つの対が５０℃のＴｍ値で、１つの対が５５℃のＴｍ値である２対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験したＮ−ＲＡＳを調べる実験は例外であった。後者のプライマー対を使用したとき、３２サイクル後に僅かな阻害が観測された。従ってデータから、ＰＣＲの高温の第１段階について、最大３０サイクルまではアンチセンスオリゴヌクレオチドによる計測可能な阻害なしに安全に用いられ得たことが示唆された。
【０１５１】
【表１】
2013523097.tif 000003
表１：実験１０２４及び実験１０２５の結果。ＰＣＲの過程における活性プライマーの不活性化及び不活性プライマーの活性化を示す。行Ａは活性の外側プライマーのみを使用する対照であり、行Ｂは、反応にアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えることにより延長が達成されることを示す。行Ｃは、外側プライマーが不活性であるにも関わらず、活性の内側プライマーを加えると増幅を維持することができることを示す。しかしながら行Ｄは、活性の内側プライマーではなく不活性の内側プライマーを加えたもので、再び反応が損なわれたことを示す。行Ｅ及び行Ｆは、不活性の内側プライマーが、それを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えることにより活性になり得ることを示す。行Ｅと行Ｆとは、行Ｆで使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドが僅かに長いタグを有した点のみが異なる。
【０１５２】
【表２】
2013523097.tif 000004
表２：実験１０２４及び実験１０２５で使用したプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド。Ａ〜Ｆの説明については表１を参照のこと。各行に示される配列対が当該の反応に重要な可変要素である。
【０１５３】
【表３】
2013523097.tif 000005
表３：実験１０２４及び実験１０２５についての試薬ワークシート。双方とも同じプロトコルを使用した。
【０１５４】
【表４】
2013523097.tif 000006
表４：実験１０２４及び実験１０２５についてのＰＣＲサイクリング条件
【０１５５】
【表５】
2013523097.tif 000007
注．アンチセンスプライマーの５’タグ及び３’タグは大文字で示す。遺伝子はＮＲＡＳ
（神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス癌遺伝子ホモログ、ｇｅｎｅＩＤ  ４８９３、ＭＩＭ  １
６４７９０）、ＢＣＲ（切断点クラスター領域、ｇｅｎｅＩＤ  ６１３、ＭＩＭ  １５１４１０）、ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリポーシス、ｇｅｎｅＩＤ  ３２４、ＭＩＭ  ６１１７３１）、及び再配列免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子（ＩＧＨ＠、ｇｅｎｅＩＤ  ３４９２）である。
【０１５６】
当業者は、本明細書に記載される発明が具体的に記載されるもの以外の変形例及び改良例を受け入れ得ることを理解するであろう。本発明はかかる変形例及び改良例を全て包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で参照又は指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物も全て、個別に、又はまとめて、並びに前記ステップ又は特徴のうちの任意の２つ以上のあらゆる組み合わせも包含する。
【０１５７】
参考文献
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【図１】
2013523097.tif 000008
【図２】
2013523097.tif 000009
【図３】
2013523097.tif 000010
【図４】
2013523097.tif 000011
【図５】
2013523097.tif 000012
【図６】
2013523097.tif 000013
【図７】
2013523097.tif 000014
【図８】
2013523097.tif 000015
【図９】
2013523097.tif 000016
【図１０】
2013523097.tif 000017
【図１１】
2013523097.tif 000018
【図１１Ａ】
2013523097.tif 000019
【図１２】
2013523097.tif 000020
【図１３】
2013523097.tif 000021
【図１４】
2013523097.tif 000022
【図１５】
2013523097.tif 000023
【図１６】
2013523097.tif 000024
【図１７】
2013523097.tif 000025
【配列表】
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【国際調査報告】
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