(57)【要約】【課題】  Ｆｃ結合性タンパク質の安定性、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供すること。【解決手段】  ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、細胞外領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸に置換することで、熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤により、前記課題を解決する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換した、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギンまたはプロリンに置換した、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項４】
配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、請求項３に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項５】
配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項６】
さらに、以下の（４１）から（４４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４１）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４２）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（４３）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（４４）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
【請求項８】
請求項７に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【請求項９】
請求項７に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別する方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の精製方法で得られる抗体。
【請求項１１】
請求項７に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の分離方法で得られる糖鎖。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１６】
宿主が大腸菌である、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させ、その培養物から発現されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、熱や酸に対する安定性が野生型よりも高いＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０７Ｍ−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献２】Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、熱や酸に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｑ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換した、（Ａ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【０００８】
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギンまたはプロリンに置換した、（Ｂ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【０００９】
（Ｄ）配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、（Ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【００１０】
（Ｅ）配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、（Ｄ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【００１１】
（Ｆ）さらに、以下の（４１）から（４４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４１）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４２）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（４３）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（４４）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
（Ｇ）（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、吸着剤。
【００１２】
（Ｈ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
【００１３】
（Ｉ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の
違いを識別する方法。
【００１４】
（Ｊ）（Ｈ）に記載の精製方法で得られる抗体。
【００１５】
（Ｋ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
【００１６】
（Ｌ）（Ｋ）に記載の分離方法で得られる糖鎖。
【００１７】
（Ｍ）（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌ
クレオチド。
【００１８】
（Ｎ）（Ｍ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００１９】
（Ｏ）（Ｎ）に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【００２０】
（Ｐ）宿主が大腸菌である、（Ｏ）に記載の形質転換体。
【００２１】
（Ｑ）（Ｏ）または（Ｐ）に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパ
ク質を発現させ、その培養物から発現されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合
性タンパク質の製造方法。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質であって、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのうち、少なくともいずれかの１つの置換である。中でも、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのうちいずれかの置換が生じていると、熱安定性が向上するため好ましい。また、野生型ヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ６６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ６６Ａｒｇ、Ｇｌｙ１４７Ａｓｐ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓまたはＶａｌ１７６Ｐｈｅの置換が生じた変異体が知られているが、前記特定位置におけるアミノ酸置換以外にこれらのアミノ酸置換を含んでいてもよい。
【００２４】
なおアミノ酸置換を行なうことで本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【００２５】
本発明のＦｃ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はない。一例として、以下の（ａ）から（ｈ）に示すＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱および酸に対する安定性が向上する点で好ましい。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）
（ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
【００２６】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドの作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ヒトＦｃγＲＩ（またはＦｃ結合性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等があげられる。
【００３０】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
【００３１】
本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３２】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
【００３３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００３４】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）が例示できる。
【００３５】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００３６】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００３７】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００３８】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３９】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００４０】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、糖鎖を有した抗体を精製するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、糖鎖を有した抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、糖鎖を有した抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な、糖鎖を有した抗体は、Ｆｃ結合性タンパク質と親和性を有する、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製することができる。また糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、糖鎖を有した抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができ、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。
【００４１】
本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるには、糖鎖を有した抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に糖鎖を有した抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【００４２】
なお糖鎖を有した抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を精製する際、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき分離できることから、糖鎖そのものの分離にも利用できる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は野生型ヒトＦｃγＲＩＩＩａと比較し、熱および酸に対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質はイムノグロブリンを分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を評価した結果を示す図である。図中の野生型はアミノ酸置換の無いＦｃ結合性タンパク質を示している。
【図３】１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性を評価した結果を示す図である。図中の野生型はアミノ酸置換の無いＦｃ結合性タンパク質を示している。
【図４】ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体の溶出を示したクロマトチャートである。図中のＦｒは回収したフラクションの位置を示している。
【図５】抗体に付加した糖鎖構造の一覧を示した図である。図中のＮ１からＮ８は表１０のＮ１からＮ８に対応し、Ｍ１およびＭ２は表１１のＭ１およびＭ２に対応している。
【図６】ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体精製の結果を示した図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。（Ａ）はヒトＩｇＧ１の精製結果を、（Ｂ）はヒトＩｇＧ３の精製結果を、それぞれ示している。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００４７】
【表１】
2015086216.tif 000003
（２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００４８】
【表２】
2015086216.tif 000004
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００４９】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００５０】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＥＲ−ｅＦｃＲのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．２６％であった。
【００５１】
【表３】
2015086216.tif 000005
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【００５２】
実施例３  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍に希釈した。希釈した溶液を４５℃で１０分間熱処理を行なった。
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中から野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００５３】
（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、野生型のＦｃ結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００５４】
【表４】
2015086216.tif 000006
表４に示す、アミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ２と命名し、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ２と命名した。ＦｃＲ２のアミノ酸配列を配列番号２７に、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２８に示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号２７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目の位置にそれぞれ存在する。
【００５５】
実施例４  アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例３で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｇ）に示す７種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ３
（ｂ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置
換を行なったＦｃＲ４
（ｃ）ＦｃＲ４に対し、さらにＡｓｎ９２Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ａ
（ｄ）ＦｃＲ４に対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ｂ
（ｅ）ＦｃＲ５ａに対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ａ
（ｆ）ＦｃＲ５ｂに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ｂ
（ｇ）ＦｃＲ６ａに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ７
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００５６】
（ａ）ＦｃＲ３
実施例３で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ３を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ３を作製した。
（ａ−１）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２４および配列番号２９（５’−ＡＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｆとした。
【００５７】
【表５】
2015086216.tif 000007
（ａ−２）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型とし、配列番号２３および配列番号３０（５’−ＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ３Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ３Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ３ｐを得た。
【００５８】
【表６】
2015086216.tif 000008
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ３ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ２に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００５９】
【表７】
2015086216.tif 000009
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ３を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６０】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１に、前記ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３２に示す。なお配列番号３１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６１】
（ｂ）ＦｃＲ４
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ４を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ４を作製した。
（ｂ−１）（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｆを得た。また実施例３で取得した、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を含んだＦｃ結合性タンパク質（表４）を発現するプラスミドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なうことでＰＣＲ産物ｍ４Ｒを得た。
（ｂ−２）（ｂ−１）により得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ４Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ４Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐとした。
（ｂ−３）（ｂ−２）で得られたＰＣＲ産物ｍ４ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ４を得た。
（ｂ−６）ｐＥＴ−ＦｃＲ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６２】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ４のアミノ酸配列を配列番号３３に、前記ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３４に示す。なお、配列番号３３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６３】
（ｃ）ＦｃＲ５ａ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ａを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＡｓｎ９２Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ａを作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３５（５’−ＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＦとした。
（ｃ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号３６（５’−ＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＲとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ａＦ、ｍ５ａＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ５ａＦとｍ５ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ａｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６４】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ａのアミノ酸配列を配列番号３７に、前記ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３８に示す。なお、配列番号３７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６５】
（ｄ）ＦｃＲ５ｂ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ｂを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ｂを作製した。
（ｄ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９（５’−ＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＦとした。
（ｄ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０（５’−ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＲとした。
（ｄ−３）（ｄ−１）および（ｄ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ｂＦ、ｍ５ｂＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ５ｂＦとｍ５ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐとした。
（ｄ−４）（ｄ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ−５）（ｄ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを得た。
（ｄ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６６】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列を配列番号４１に、前記ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４２に示す。なお、配列番号４１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６７】
（ｅ）ＦｃＲ６ａ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ａを作製した。具体的には、（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ａを作製した。
（ｅ−１）（ｃ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＦとした。
（ｅ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＲとした。
（ｅ−３）（ｅ−１）および（ｅ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ａＦ、ｍ６ａＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ａＦとｍ６ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ａｐとした。
（ｅ−４）（ｅ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｅ−５）（ｅ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｅ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを得た。
（ｅ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ６ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６８】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ａのアミノ酸配列を配列番号４３に、前記ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に示す。なお、配列番号４３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００６９】
（ｆ）ＦｃＲ６ｂ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ｂを作製した。具体的には、（ｄ）で作製したＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ｂを作製した。
（ｆ−１）（ｄ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５（５’−ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＦとした。
（ｆ−２）（ｄ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＲとした。
（ｆ−３）（ｆ−１）および（ｆ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ｂＦ、ｍ６ｂＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ｂＦとｍ６ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐとした。
（ｆ−４）（ｆ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｆ−５）（ｆ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｆ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ６ｂを得た。
（ｆ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ６ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００７０】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列を配列番号４７に、前記ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に示す。なお、配列番号４７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
【００７１】
（ｇ）ＦｃＲ７
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ７を作製した。具体的には、（ｅ）で作製したＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ７を作製した。
（ｇ−１）（ｅ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｆとした。
（ｇ−２）（ｅ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｒとした。
（ｇ−３）（ｇ−１）および（ｇ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ７Ｆ、ｍ７Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ７Ｆとｍ７Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐとした。
（ｇ−４）（ｇ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ７ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−４）と同様のＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｇ−５）（ｇ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｇ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して７箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ７を得た。
（ｇ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ７のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００７２】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ７のアミノ酸配列を配列番号４９に、前記ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５０に示す。なお、配列番号４９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ７のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４９において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目
の位置にそれぞれ存在する。
【００７３】
実施例５  改良Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、実施例３で選択した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２）、および実施例４で作製した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の野生型Ｆｃ結合性タンパク質および変異型のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、市販のＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社：４３２５−ＦＣ−０５０）を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（６）各タンパク質の濃度が５μｇ／ｍＬになるよう１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。これを等量に分け、一方はサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて４５℃で１０分間加熱処理を行ない、もう一方は熱処理をしなかった。前記熱処理後、または非熱処理のタンパク質の抗体結合活性を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定し、熱処理を行なった場合の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【００７４】
結果を表８に示す。今回評価した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２、ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し、残存活性が高くなっており、当該変異型のＦｃ結合性タンパク質の熱安定性が向上していることが確認された。
【００７５】
【表８】
2015086216.tif 000010
実施例６  改良Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価
（１）実施例５（１）から（５）と同様の方法で改良Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
（２）各タンパク質の濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。希釈した各Ｆｃ結合性タンパク質６０μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）１２０μＬを混合し、３０℃で２時間静置した。
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【００７６】
結果を表９に示す。今回評価した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２、ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し、残存活性が高くなっており、当該変異型のＦｃ結合性タンパク質の酸安定性が向上していることが確認された。
【００７７】
【表９】
2015086216.tif 000011
実施例７  １箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換のうち、配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）、３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）および１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）について、他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を、それぞれ下記の方法で作製した。
【００７８】
（Ａ）配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ａ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５１（５’−ＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＮＮＫＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＦとした。
（Ａ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５２（５’−ＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＭＮＮＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＲとした。
（Ａ−３）（Ａ−１）および（Ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（２７ｐＦ、２７ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、２７ｐＦと２７ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を２７ｐとした。
（Ａ−４）（Ａ−３）で得られたＰＣＲ産物２７ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の２７番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ａ−５）（Ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００７９】
結果、Ｖａｌ２７Ｇｌｙ（Ｖ２７Ｇ）、Ｖａｌ２７Ｌｙｓ（Ｖ２７Ｋ）、Ｖａｌ２７Ｔｈｒ（Ｖ２７Ｔ）、Ｖａｌ２７Ａｌａ（Ｖ２７Ａ）、Ｖａｌ２７Ｔｒｐ（Ｖ２７Ｗ）、またはＶａｌ２７Ａｒｇ（Ｖ２７Ｒ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００８０】
（Ｂ）配列番号１の３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合
性タンパク質の作製
（Ｂ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５３（５’−ＡＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＮＮＫＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＦとした。
（Ｂ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５４（５’−ＡＧＣＡＣＧＣＧＭＮＮＣＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＲとした。
（Ｂ−３）（Ｂ−１）および（Ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（３５ｐＦ、３５ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、３５ｐＦと３５ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を３５ｐとした。
（Ｂ−４）（Ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物３５ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の３５番目のチロシンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ｂ−５）（Ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００８１】
結果、Ｔｙｒ３５Ｃｙｓ（Ｙ３５Ｃ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ（Ｙ３５Ｄ）、Ｔｙｒ３５Ｐｈｅ（Ｙ３５Ｆ）、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ（Ｙ３５Ｇ）、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ（Ｙ３５Ｋ）、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ（Ｙ３５Ｌ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ（Ｙ３５Ｎ）、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ（Ｙ３５Ｐ）、Ｔｙｒ３５Ａｒｇ（Ｙ３５Ｒ）、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ（Ｙ３５Ｓ）、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ（Ｙ３５Ｔ）、Ｔｙｒ３５Ｖａｌ（Ｙ３５Ｖ）、またはＴｙｒ３５Ｔｒｐ（Ｙ３５Ｗ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００８２】
（Ｃ）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を他のアミノ酸に置換したＦ
ｃ結合性タンパク質の作製
（Ｃ−１）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５５（５’−ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＮＮＫＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＦとした。
（Ｃ−２）実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５６（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＭＮＮＣＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４の（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＲとした。
（Ｃ−３）（Ｃ−１）および（Ｃ−２）により得られた２種類のＰＣＲ産物（１２１ｐＦ、１２１ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、１２１ｐＦと１２１ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を１２１ｐとした。
（Ｃ−４）（Ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物１２１ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施例４（ａ−４）と同様のＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の１２１番目のグルタミン酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを
作製した。
（Ｃ−５）（Ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
【００８３】
結果、Ｇｌｕ１２１Ｌｙｓ（Ｅ１２１Ｋ）、Ｇｌｕ１２１Ｐｒｏ（Ｅ１２１Ｐ）、Ｇｌｕ１２１Ａｒｇ（Ｅ１２１Ｒ）、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ（Ｅ１２１Ｇ）、Ｇｌｕ１２１Ｈｉｓ（Ｅ１２１Ｈ）、またはＧｌｕ１２１Ｖａｌ（Ｅ１２１Ｖ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
【００８４】
実施例８  １アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、および実施例７で作製した１箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実施例３（１）および（２）と同様の方法でそれぞれ培養を行ない、野生型Ｆｃ結合性タンパク質および１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）発現した１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて抗体との結合活性を調べた。
【００８５】
結果を図２に示す。配列番号１の２７番目のバリンをグリシン（Ｖ２７Ｇ）、リジン（Ｖ２７Ｋ）、スレオニン（Ｖ２７Ｔ）、アラニン（Ｖ２７Ａ）、アルギニン（Ｖ２７Ｒ）、に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した一方、配列番号１の２７番目のＶａｌがトリプトファン（Ｖ２７Ｗ）へ置換すると、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
【００８６】
配列番号１の３５番目のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ３５Ｄ）、フェニルアラニン（Ｙ３５Ｆ）、グリシン（Ｙ３５Ｇ）、リジン（Ｙ３５Ｋ）、ロイシン（Ｙ３５Ｌ）、アスパラギン（Ｙ３５Ｎ）、プロリン（Ｙ３５Ｐ）、セリン（Ｙ３５Ｓ）、スレオニン（Ｙ３５Ｔ）、バリン（Ｙ３５Ｖ）、トリプトファン（Ｙ３５Ｗ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＹ３５Ｄ、Ｙ３５Ｇ、Ｙ３５Ｋ、Ｙ３５Ｌ、Ｙ３５Ｎ、Ｙ３５Ｐ、Ｙ３５Ｓ、Ｙ３５Ｔ、Ｙ３５Ｗは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の３５番目のチロシンを、システイン（Ｙ３５Ｃ）、アルギニン（Ｙ３５Ｒ）に置換した場合は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であった。
【００８７】
配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、リジン（Ｅ１２１Ｋ）、アルギニン（Ｅ１２１Ｒ）、グリシン（Ｅ１２１Ｇ）、ヒスチジン（Ｅ１２１Ｈ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＥ１２１Ｇは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、バリン（Ｅ１２１Ｖ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であり、プロリン（Ｅ１２１Ｐ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
【００８８】
実施例９  １アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
実施例８で評価した１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性を比較するため、実施例３（３）と同様の方法で熱処理を行ない（４５℃、１０分間）、残存活性を算出した。
【００８９】
結果を図３に示す。配列番号１の３５番目のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ３５Ｄ）、グリシン（Ｙ３５Ｇ）、リジン（Ｙ３５Ｋ）、ロイシン（Ｙ３５Ｌ）、アスパラギン（Ｙ３５Ｎ）、プロリン（Ｙ３５Ｐ）、セリン（Ｙ３５Ｓ）、スレオニン（Ｙ３５Ｔ）にそれぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質、ならびに配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、グリシン（Ｅ１２１Ｇ）に置換したＦｃ結合性タンパク質は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に熱安定性が向上した。中でもＹ３５Ｎ、Ｙ３５Ｐは野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に熱安定性が向上した。
【００９０】
実施例１０  ＦｃＲ５ａの大量調製
（１）実施例４（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット社製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０
分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）（４）で回収した菌体の一部を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた破砕液に終濃度で２０ｍＭとなるようイミダゾールを添加後、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）５０ｍＬを充填したＸＫ  ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．５Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＦｃＲ５ａを溶出した。
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア社製）３０ｍＬを充填したＨＲ  １６／１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃＲ５ａを溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００９１】
実施例１１  ＦｃＲ５ａ固定化ゲルの作製
（１）実施例１０で調製したＦｃＲ５ａを、限外ろ過膜（ミリポア社製：アミコンウルトラ−１５）を用いて濃縮・緩衝液交換を行ない、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に８．３７ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
（２）担体である親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の水酸基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを反応させてエポキシトヨパールゲルを調製した。
（３）（２）で調製したエポキシトヨパールゲル１００μＬを入れたスピンカラム（バイオラッド社製）を５本用意し、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（４）（１）で調製したＦｃＲ５ａ溶液０．３ｍＬと０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．４５ｍＬとを混合した溶液を、（３）に記載のゲルを充填したスピンカラムにそれぞれ添加し、３５℃で３時間振とうした。
（５）ゲルに加えたＦｃＲ５ａ溶液と０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液の混合溶液を回収した後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．２ｍＬで３回洗浄した。その後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄することでｐＨを中性付近に戻し、ＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．５ｍＬを調製した。
【００９２】
（５）で回収した溶液、および洗浄液中に含まれるタンパク質濃度を測定し、ゲルに固定化されたＦｃＲ５ａの量を算出することで固定化率を計算したところ、添加したＦｃＲ５ａの３３．７％がゲルに固定化していた。
【００９３】
実施例１２  ＦｃＲ５ａ固定化ゲルでの抗体分離
（１）実施例１１で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．５ｍＬをＨＲ１６／５カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）につなげた。その後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。
（２）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬの流速で流し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに調製したヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社製：Ｉ５１５４−１ＭＧ）溶液０．５ｍＬをアプライし、ヒトＩｇＧ１をＦｃＲ５ａ固定化ゲルに吸着させた。その後、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を流すことで平衡化し、２０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエントで、吸着したヒトＩｇＧ１を溶出した。溶出したヒトＩｇＧ１は０．５ｍＬごとにフラクションを回収した。
【００９４】
ヒトＩｇＧ１の溶出パターンと回収したフラクションを図４に示す。回収した溶出フラクションのうち、フラクション１３（Ｆｒ１３）およびフラクション１４（Ｆｒ１４）を混合したものをフラクションＡ（ＦｒＡ）とし、フラクション１６（Ｆｒ１６）およびフラクション１７（Ｆｒ１７）を混合したものをフラクションＢ（ＦｒＢ）とした。
【００９５】
実施例１３  分離抗体の糖鎖構造解析
（１）実施例１２で使用した精製前のヒトＩｇＧ１および溶出フラクション（ＦｒＡ、ＦｒＢ）を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。
（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２−アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。
（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー社製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。
（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。
【００９６】
中性糖鎖の組成比を表１０に、モノシアリル化糖鎖の組成比を表１１に示す。また、帰属した糖鎖構造（Ｎ１からＮ８ならびにＭ１およびＭ２）を図５に示す。表１０に示した結果より、糖鎖構造Ｎ２およびＮ７を有した抗体は精製前およびＦｒＢで検出されたが、ＦｒＡから検出されなかった。すなわち、前記２種の糖鎖構造（図５のＮ２およびＮ７）を持つ抗体は、早く溶出したフラクションであるＦｒＡには検出せず、遅く溶出したフラクションであるＦｒＢで検出されたことから、他の糖鎖構造を有した抗体と比較しＦｃＲ５ａ固定化ゲルへ強く結合することが示された。以上の結果から、本発明の吸着剤の一態様である、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルは、抗体が有する糖鎖構造の違いにより抗体を分離できることがわかった。
【００９７】
【表１０】
2015086216.tif 000012
【００９８】
【表１１】
2015086216.tif 000013
実施例１４  ＦｃＲ５ａ固定化ゲルでの抗体精製
実施例１１で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いて、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３の精製を行なった。
（１）実施例１１と同様の方法でＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．２ｍＬを作製した。作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．１ｍＬをスピンカラムに充填した。
（２）（１）で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲルを充填したカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（３）動物細胞用の培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ライフテクノロジー社製）に１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地に対し、ヒトＩｇＧ１（シグマ社製：Ｉ５１５４−１ＭＧ）またはヒトＩｇＧ３（シグマ社製：Ｉ４６３９−１ＭＧ）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように添加することで模擬培養液を調製した。
（４）（２）で洗浄したカラムに（３）で調製した模擬培養液を０．４ｍＬ加え、２５℃で２時間振とうした。
（５）模擬培養液を取り除き、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで４回洗浄後、５００μＬの０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出し、１００μＬごとにフラクションを回収した。
（６）模擬培養液、溶出フラクションをそれぞれ２×サンプルバッファー（２（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム、６（ｗ／ｖ）％β−メルカプトエタノール、１０（ｗ／ｖ）％グリセリンおよび０．００５（ｗ／ｖ）％ブロモフェノールブルーを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））を添加し加熱処理した。その後、処理したサンプルを５から２０％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（アトー社製）を用いた電気泳動にて分離した。なお比較として、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３（濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ）についても同様の処理を行ない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００９９】
ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３を含む溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を図６に示す。ヒトＩｇＧ１を添加した模擬培養液を精製して得られた、ヒトＩｇＧ１を含む溶出フラクションは、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ１と同様の位置を示しており、かつ模擬培養液に見られるアルブミンのバンドも見られないことからヒトＩｇＧ１を高純度に精製していることが確認できる（図６（Ａ））。また、ヒトＩｇＧ３を添加した模擬培養液を精製して得られた、ヒトＩｇＧ３を含む溶出フラクションも、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ３と同様の位置を示しており、かつ模擬培養液に見られるアルブミンのバンドが見られないことからヒトＩｇＧ３を高純度に精製していることが確認できる（図６（Ｂ））。これらの結果から、本発明の吸着剤の一態様である、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルは、動物細胞用の培養液からヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３が精製できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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