(57)【要約】  ハプテン、任意リンカー、及びペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分を含むハプテンコンジュゲートの実施態様が開示されている。幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分はチラミン又はチラミン誘導体である。また、ハプテンコンジュゲートの生成及び使用方法の実施態様が開示されている。特定の実施態様では、ハプテンコンジュゲートは、シグナル増幅アッセイにおいて使用される。ある実施態様では、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、又は７−ジエチルアミノ−３−カルボキシクマリンである。ハプテンは、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分に直接的に、又はリンカーを介して間接的にカップリングされる。ある実施態様では、ハプテンコンジュゲートは、マルチプレックスアッセイにおいて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、２,３,６,７-テトラヒドロ-１１-オキソ-１Ｈ,５Ｈ,１１Ｈ-［１］ベンゾピラノ［６,７,８-ｉｊ］キノリジン-１０-カルボン酸、又は７-ジエチルアミノ-３-カルボキシクマリンから選択されるハプテン；
任意リンカー；及び
一般式
2013531801.tif 000129
を有するペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分
を含んでなり、ＲＣがヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミンから選択されるハプテンコンジュゲート。
【請求項２】
ペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分が、チラミン又はチラミン誘導体である請求項１に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項３】
チラミン及び／又はチラミン誘導体が次の一般式
2013531801.tif 000130
を有し、ここで、Ｒ２５がヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミンから選択され；Ｒ２６がアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、-ＯＲｍ、-ＮＲｍ、及び-ＳＲｍから選択され、ここでｍが１−２０であり；ｎが１−２０であり；Ｚが酸素、硫黄、及びＮＲａから選択され、ここでＲａが水素、脂肪族、アリール、又はアルキルアリールから選択される請求項２に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項４】
チラミン及び／又はチラミン誘導体が、次の化学構造
2013531801.tif 000131
を有する請求項３に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項５】
リンカーが、次の一般式
2013531801.tif 000132
を有し、ここで、各Ｘ１が独立して-ＣＨ２、酸素、硫黄、及び-ＮＲｃから選択され、ここで、Ｒｃが水素、脂肪族、アリール、及びアリールアルキルから選択され；Ｒｂがカルボニル及びスルホキシルから選択され；ｎが１-２０であり；そしてｐが０又は１である請求項１−４の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項６】
ｎが４又は８である請求項５に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項７】
リンカーが、次の化学構造
2013531801.tif 000133
を有する請求項１-６の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項８】
ハプテンがペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分に直接結合されている請求項１−４の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項９】
コンジュゲートが、チラミドシグナル増幅アッセイにおいて使用される場合、４以上のシグナル：ノイズ比を生成できる請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１０】
シグナル：ノイズ比が１０以上である請求項９に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１１】
コンジュゲートが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおけるコンジュゲートと同じハプテンでハプテン化されている核酸によって生成されるシグナルの少なくとも２倍の強さのシグナルを、チラミドシグナル増幅アッセイ生成できる請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１１に記載のハプテンコンジュゲートであって、
2013531801.tif 000134
2013531801.tif 000135
から選択される式を有するハプテンコンジュゲート。
【請求項１３】
ハプテンがアゾールであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000136
を有し、ここで、Ｒ１−Ｒ３が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、シアノ、エステル、エーテル、エキソメチレン、ハロゲン、ヘテロアリール、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、及びその組合せから選択され、Ｘが独立して窒素又は炭素であり、Ｙが酸素、硫黄又は窒素であり、もしＹが酸素又は硫黄である場合はＲ３基はなく、もしＹが窒素である場合は少なくとも１つのＲ３基が存在する請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１４】
ハプテンがニトロアリールであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000137
を有し、ここで、少なくとも１つのＲ２−Ｒ６がニトロであり、残りのＲ２−Ｒ６環置換基が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、複素環、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、ケト、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、エキソメチレンから選択されるか、２以上のＲ２−Ｒ６置換基が環系における原子である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１５】
ハプテンがベンゾフランであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000138
を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、シアノ、エステル、エーテル、エキソメチレン、ハロゲン、ヘテロアリール、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、及びその組合せから選択されるか、又は２以上のＲ１、Ｒ３、及びＲ４置換基が、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子であり、Ｙが、Ｒ５及びＲ６置換基を有する酸素、硫黄又はａ炭素原子であり、ここでＲ５及びＲ６はＲ１、Ｒ３、及びＲ４について記載した通りである請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１６】
ハプテンが尿素か、又はローダミンチオ尿素以外のチオ尿素であり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000139
を有し、ここでＲ１−Ｒ３が独立して水素、脂肪族、アルキル、環式、複素環、アリール及びヘテロアリールであり、Ｙが酸素又は硫黄である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１７】
ハプテンがロテノイドであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000140
を有し、ここで、Ｒ−Ｒ５が独立して水素、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アミノ、アミノ酸、アミド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム、オキシムエーテル、アルキルヒドロキシル、カルボニル、ケト、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、アルキルエステル、アシル、エキソメチレン、エーテル、環式、複素環、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、及びその組合せであり、Ｙが酸素、窒素、又は硫黄である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１８】
ハプテンがオキサゾール又はチアゾールスルホンアミドであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000141
を有し、ここで、Ｒ３−Ｒ６が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、シアノ、エステル、エーテル、エキソメチレン、ハロゲン、ヘテロアリール、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、及びその組合せから選択され、Ｙが酸素又は硫黄である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項１９】
ハプテンがシクロリグナンであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000142
を有し、ここで、Ｒ１−Ｒ８及びＲ１０−Ｒ１２が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、シアノ、エステル、エーテル、エキソメチレン、ハロゲン、ヘテロアリール、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホキシド、及びその組合せから選択されるか、又はそのような化合物の形成に利用可能な２以上のＲ１−Ｒ８及びＲ１０−Ｒ１２置換基が、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子であってもよい請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２０】
ハプテンがヘテロビアリールであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000143
を有し、ここで、Ａ−Ｄが炭素、窒素、酸素、及び硫黄、及びそのすべての組合せから選択され、Ｒ１が水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテルアルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、アルコキシアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート環式、複素環、シアノ（−ＣＮ）、エステル、アルキルエステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム（ＨＯ−Ｎ＝）、ケト、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、又はエキソメチレンである請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２１】
ハプテンがアゾアリールであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000144
を有し、ここで、Ｒ１が水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート環式、複素環、シアノ（−ＣＮ）、エステル、アルキルエステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム（ＨＯ−Ｎ＝）、ケト、スルフヒドリル、スルホニル、又はスルホキシドである請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２２】
ハプテンがベンゾジアゼピンであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000145
有し、 ここで、Ｒ１−Ｒ５が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート環式、複素環、シアノ（−ＣＮ）、エステル、アルキルエステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム（ＨＯ−Ｎ＝）、ケト、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシドから選択されるか、又は図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子から選択され、Ｙが酸素又は硫黄である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２３】
ハプテンがトリテルペンであり、ハプテンコンジュゲートが次の一般式
2013531801.tif 000146
を有し、ここで、Ｒ１−Ｒ２１が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロゲン化アルキル、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート、環式、複素環、シアノ、エステル、アルキルエステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、エキソメチレンから選択され、２以上Ｒ１−Ｒ２１置換基が、図示した一般式を有するハプテンに結合又は縮合されている環系における原子であってもよく、ここで、少なくとも１つのＲ１−Ｒ２１置換基が任意リンカー又はチラミド及び／又はチラミド誘導体に結合され、Ｙが結合であってそれによって５員の環を定めるか、又はＲ２２及びＲ２３置換基を有する炭素原子であり、ここでＲ２２及びＲ２３はＲ１−Ｒ２１について述べた通りである請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２４】
ハプテンが、式
2013531801.tif 000147
を有するシクロリグナンであり、ここで、Ｙが窒素、酸素又は硫黄である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２５】
Ｙが酸素である請求項２４に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２６】
ハプテンコンジュゲートが、次の式
2013531801.tif 000148
ここで、Ｒ２−Ｒ４が独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、オキシム、オキシムエーテル、アルコール、アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート環式、複素環、シアノ（−ＣＮ）、エステル、アルキルエステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム（ＨＯ−Ｎ＝）、ケト、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシドから選択されるか、又は図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子である請求項１−８の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１に記載のハプテンコンジュゲートであって、
2013531801.tif 000149
2013531801.tif 000150
2013531801.tif 000151
2013531801.tif 000152
2013531801.tif 000153
2013531801.tif 000154
2013531801.tif 000155
2013531801.tif 000156
から選択される式を有するハプテンコンジュゲート。
【請求項２８】
リンカーが、次の化学構造
2013531801.tif 000157
を有する請求項２７に記載のハプテンコンジュゲート。
【請求項２９】
請求項１に記載のハプテンコンジュゲートであって、
2013531801.tif 000158
2013531801.tif 000159
2013531801.tif 000160
から選択される式を有するハプテンコンジュゲート。
【請求項３０】
請求項１−２９の何れか一項に記載のハプテンコンジュゲートを含んでなるキット。
【請求項３１】
過酸化物溶液を更に含んでなる請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
ハプテンコンジュゲートが、
2013531801.tif 000161
である請求項３０又は請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
（ａ）サンプル中における第一標的上に第一ペルオキシダーゼを固定化させる工程であって、ここで、第一ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分と反応できる工程；
（ｂ）サンプルを、請求項１−２９の何れか一項に記載の第一ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液と接触させる工程；
（ｃ）サンプルを、過酸化物を含んでなる溶液と接触させ、それによって第一ハプテンコンジュゲートを第一ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させ、固定化第一ペルオキシダーゼ又は固定化第一ペルオキシダーゼの近位に共有結合を形成する工程；及び
（ｄ）第一ハプテンを検出することによって、サンプル中において第一標的を位置付ける工程
を含んでなる方法。
【請求項３４】
ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ペルオキシダーゼが、標的を認識し結合できる部分にコンジュゲートされている請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
部分が、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
部分が抗体である請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ペルオキシダーゼが、標的に位置する一次抗体を認識し結合できる部分にコンジュゲートされている請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
第一標的が核酸配列を含み、第一標的上に第一ペルオキシダーゼを固定化する工程が；
サンプル上に第一ハプテン標識されたプローブを固定化する工程であって、第一ハプテン標識されたプローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸オリゴマー、又はオリゴヌクレオチドを含み、第一ハプテン標識されたプローブが第一標的を認識し結合できる工程；及び
サンプルを、第一ハプテン標識されたプローブに直接的又は間接的に結合できる第一抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程
を含む請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
第一抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートが、第一ハプテン標識されたプローブを認識し結合できる第一抗ハプテン抗体を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
サンプルを、第一抗ハプテン抗体を認識し結合できる第一抗体を含んでなる第一抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程の前に、サンプルを、第一ハプテン標識されたプローブを認識し結合できる第一抗ハプテン抗体と接触させる工程を更に含んでなる請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
第一ハプテンコンジュゲートの第一ハプテンを検出する工程が：
サンプルを、第一ハプテンコンジュゲートの第一ハプテンを認識し結合できる第一抗ハプテン抗体、及び第一検出可能標識と接触させる工程；及び
第一検出可能標識を検出する工程
を更に含む
請求項３３−４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
サンプルを、第一抗ハプテン抗体及び第一検出可能標識と接触させる工程が、サンプルを、第一抗ハプテン抗体コンジュゲートと接触させる工程を含み、第一抗ハプテン抗体コンジュゲートが第一抗ハプテン抗体及び第一検出可能標識を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
サンプルを、第一抗ハプテン抗体及び第一検出可能標識と接触させる工程が：
サンプルを第一抗ハプテン抗体と接触させる工程；及び
サンプルを第一抗体コンジュゲートと接触させる工程であり、第一抗体コンジュゲートが、第一抗ハプテン抗体及び第一検出可能標識を認識し結合できる抗体を含む工程
を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
第一検出可能標識が酵素である請求項４２−４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第一検出可能標識が蛍光標識である請求項４２−４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
蛍光標識が量子ドットである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第一標的が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、明視野顕微鏡、蛍光、又はその任意の組合せによって位置づけされる請求項３３−４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項３３又は請求項３４に記載の方法であって、サンプルが２つ以上の標的を含み、該方法が、
工程（ｃ）の後に、サンプル中における後続標的上に後続ペルオキシダーゼを固定化する工程であり、後続ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分と反応できる工程；
サンプルを、請求項１−２４の何れか一項に記載の後続ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液と接触させる工程であり、後続ハプテンコンジュゲートが第一ハプテン又は何れか他の後続ハプテンと同じでない後続ハプテンを含む工程；
サンプルを、過酸化物を含んでなる溶液と接触させ、それによって、後続ハプテンコンジュゲートを後続ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させ、固定化後続ペルオキシダーゼ又は固定化後続ペルオキシダーゼの近位に共有結合を形成させる工程；及び
第一及び後続ハプテンを検出することによってサンプル中における２つ以上の標的を位置づける工程
を更に含んでなる方法。
【請求項５１】
後続ペルオキシダーゼを固定化する工程の前に、第一ペルオキシダーゼを不活性化させる工程を更に含んでなる請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項３３又は請求項３４に記載の方法であって、ここで、サンプルが２つ以上の標的を含み、各標的が核酸配列を含んでなり、方法が：
工程（ａ）の前に、サンプル上に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを含んでなる第一プローブを固定化する工程であって、ここで、第一プローブは第一ハプテンで標識されており、第一標的を認識し結合でき、ここで、第一ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、又は７−ジエチルアミノ−３−カルボキシクマリンから選択される工程；
工程（ａ）の前に、サンプル上にＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを含んでなる後続プローブを固定化する工程であって、ここで、後続プローブは後続ハプテンで標識されており、後続標的を認識し結合でき、ここで、後続ハプテンは、第一ハプテン又は何れか他の後続ハプテンと同じではなく、またここで、後続ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、又は７−ジエチルアミノ−３−カルボキシクマリンから選択される工程；
ここで、工程（ａ）における第一ペルオキシダーゼを固定化する工程は、サンプルを、第一抗ハプテン抗体及び第一ペルオキシダーゼを含んでなる第一抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程を含み、ここで、第一抗ハプテン抗体は第一ハプテンを認識し結合でき、またここで、第一ペルオキシダーゼはペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分と反応できる；
工程（ｃ）の後に、サンプルを、後続抗ハプテン抗体及び後続ペルオキシダーゼを含んでなる後続抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触される工程であって、ここで、後続抗ハプテン抗体は後続ハプテンを認識し結合でき、またここで、後続ペルオキシダーゼはペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分と反応できる工程；
サンプルを、請求項１−２９の何れか一項に記載の後続ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、後続ハプテンコンジュゲートは、第一ハプテン又は何れか他の後続ハプテンと同じではない後続ハプテンを含む工程；
サンプルを過酸化物を含んでなる溶液と接触される工程であって、それによって、後続ハプテンコンジュゲートは後続ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応し、固定化後続ペルオキシダーゼに、又は固定化後続ペルオキシダーゼの近位に共有結合を形成する工程；及び
第一及び後続ハプテンを検出することによって、サンプル中における２つ以上の標的を位置付けする工程
を更に含んでなる方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、サンプル中における２つ以上の標的を位置付けする工程が、
サンプルを、第一抗ハプテン抗体−量子ドットコンジュゲート及び後続抗ハプテン抗体−量子ドットコンジュゲートを含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、第一抗ハプテン抗体−量子ドットコンジュゲートは、第一ハプテン−チラミドコンジュゲートの第一ハプテン及び第一量子ドットを認識し結合できる第一抗体を含み、後続抗ハプテン抗体−量子ドットコンジュゲートは、後続ハプテン−チラミドコンジュゲートの後続ハプテン及び後続量子ドットを認識し結合できる後続抗体を含み、ここで後続量子ドットは、第一量子ドット又は何れか他の後続量子ドットと同じではない工程；及び
第一及び後続量子ドットから蛍光を検出する工程
を更に含む方法。
【請求項５４】
サンプルを後続抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程の前に、第一抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートを不活化する工程を更に含んでなる請求項５２又は請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
サンプルが乳癌を有すると疑われる被験体から得られ、第一プローブ又は後続プローブの少なくとも一つが、ＨＥＲ２ｍＲＮＡ、ＥＲｍＲＮＡ、Ｋｉ−６７ｍＲＮＡ、又はＰＧＲｍＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンスＲＮＡプローブである請求項５２−５４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１０年７月２日に出願された米国仮出願第６１／３９８，９４６号、及び２０１１年２月２８日に出願された米国仮出願第６１／４６４，２１６号の優先件を主張するものであって、その全体をここに援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、サンプル中における標的の同時の同定及び／又は可視化について、様々な組合せにおいて使用できるハプテン及びハプテンコンジュゲートに関する。
【０００３】
（発明の分野）
免疫組織化学、又はＩＨＣは、組織サンプルの細胞中におけるタンパク質等の抗原を位置付け、抗原を使用し、特定抗原への抗体の特異的結合を促進する方法を示す。この検出技術は、任意のタンパク質が組織サンプル内のどこに位置するかを正確に示すことができる利点を有する。組織自体を調べるのにも有効な方法である。
【０００４】
組織抗原及び核酸を検出するためのハプテン等の小分子の使用は、ＩＨＣにおける卓越した方法となった。ハプテンは、抗ハプテン抗体との組合せにおいて、特定の分子標的を検出するのに有用である。例えば、一次抗体及び核酸プローブ等の特異的結合部分は、一又は複数のハプテン分子で標識でき、一旦これらの特異的結合部分がそれらの分子標的に結合したら、それらは、発色ベース検出システムの一部として酵素、又は蛍光標識等の検出可能な標識を含む抗ハプテン抗体コンジュゲートを使用して検出できる。サンプルへの検出可能な 抗ハプテン抗体コンジュゲートの結合は、サンプル中における標的の存在を示す。
【０００５】
二次代謝産物としてジギタリス植物に専ら存在するジゴキシゲニンは、様々な分子アッセイにおいて利用されているハプテンの例である。米国特許第４，４６９，７９７号は、試験サンプルにおける薬剤への抗ジゴキシン抗体の特異的結合に基づき、血液サンプルにおけるジゴキシン濃度を決定するためにイムノアッセイを使用することを開示する。米国特許第５，１９８，５３７号は、イムノアッセイ等の免疫学的検査において使用されている多くの更なるジゴキシゲニン誘導体を記載する。
【０００６】
組織及び細胞学的サンプルのｉｎ ｓｉｔｕアッセイ、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイ、特にかかるサンプルのマルチプレックスアッセイでは、バックグラウンド干渉無く所望の結果を提供する方法を特定及び開発することが高く所望される。一つのこのような方法は、特許である触媒レポーター堆積（ＣＡＲＤ）に基づく、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）の使用を含む。米国特許第６，５９３，１００号は、ＣＡＲＤ又はチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）方法における酵素の触媒作用を、標識フェノールコンジュゲートを酵素と反応させることによって増強させることを開示し、ここで、反応は、増強試薬の存在中において実施される。
【０００７】
方法は、ハプテンを使用するアッセイから得られるシグナルを増加するために用いられるが、これらの方法からの結果は、シグナル増幅が、対応するバックグラウンドシグナル増幅によって損なわれることを示す。バックグラウンドシグナルにおける対応する増加無く、最適な結果を生成できるシグナル増幅への需要がある。
【発明の概要】
【０００８】
ハプテンコンジュゲートの実施態様が開示される。幾つかの実施態様では、コンジュゲートはハプテン、任意リンカー、及びペルオキシダーゼ−活性化可能  アリール部分を含む。ある実施態様では、ペルオキシダーゼ−活性化可能  アリール部分はチラミン又はチラミン誘導体である。また開示されるのは、ハプテンコンジュゲートの製造及び使用方法の実施態様である。
【０００９】
幾つかの実施態様では、ハプテンは、アゾール（例えば、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール）、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、又はクマリン（例えば、２,３,６,７-テトラヒドロ-１１-オキソ-１Ｈ,５Ｈ,１１Ｈ-［１］ベンゾピラノ［６,７,８-ｉｊ］キノリジン-１０-カルボン酸又は７-ジエチルアミノ-３-カルボキシクマリン）から選択される。ハプテンは、ペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分、例えばチラミン又はチラミン誘導体に直接カップリングされうる。あるいは、ハプテンは、チラミン又はチラミン誘導体にリンカーを介してカップリングされうる。よって、ある実施態様では、コンジュゲートは、下に示す一般式を有する。
ハプテン-任意リンカー-チラミン／チラミン誘導体
【００１０】
開示のハプテンコンジュゲートの実施態様は、ペルオキシダーゼ酵素及び過酸化物と組み合わされた時にフリーラジカルを形成し、その後、フェノール含有化合物、例えばチロシンと二量体を形成できるペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分を含む。ペルオキシダーゼ−活性化可能部分は一般式
2013531801.tif 000002
を有し、ここで、ＲＣは、ペルオキシダーゼ酵素及び過酸化物と組み合わせられた時に、フリーラジカルを形成できる官能基である。適切な官能基は、ヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミン基を含む。幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分はチラミン
2013531801.tif 000003
又は次の一般式を有するチラミン誘導体であり、
2013531801.tif 000004
ここで、Ｒ２５はヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミンから選択され；Ｒ２６はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲｍ、−ＮＲｍ、及び−ＳＲｍから選択され、ここで、ｍは１−２０であり；ｎは１−２０であり；Ｚは酸素、硫黄、又はＮＲａから選択され、ここでＲａは水素、脂肪族、アリール、又はアルキルアリールから選択される。
【００１１】
開示のハプテンコンジュゲートの特定の実施態様は、一般式を有するリンカーを含み
2013531801.tif 000005
ここで、各Ｘ１は独立して、-ＣＨ２、酸素、硫黄、及び-ＮＲから選択され、ここで、Ｒ３は水素、脂肪族、アリール、及びアリールアルキルから選択され；Ｒｂはカルボニル及びスルホキシルから選択され；ｎは１−２０であり；ｐは０又は１である。ある実施態様では、リンカーは、式ＰＥＧｎを有するポリエチレングリコールであって、ここでｎは１−５０であり、例えば４又は８である。特定の実施態様では、リンカーは次の化学構造を有する。
2013531801.tif 000006
【００１２】
幾つかの実施態様では、ハプテンコンジュゲートは：
2013531801.tif 000007
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2013531801.tif 000014
から選択される式を有するハプテン-チラミドコンジュゲートである。
【００１３】
例示的なハプテン-チラミドコンジュゲート：
2013531801.tif 000015
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を含む。
【００１４】
上記のハプテンコンジュゲートを含むキットの実施態様も開示される。幾つかの実施態様では、ハプテンコンジュゲートはハプテン-チラミドコンジュゲートである。ある実施態様では、キットは、過酸化物溶液、例えば過酸化水素溶液を更に含む。特定の実施態様では、キットは、式：
2013531801.tif 000023
を有するハプテン-チラミドコンジュゲートを含む。
【００１５】
ハプテンコンジュゲートを使用する方法の実施態様が開示される。一般的に、方法は、ａ）サンプル中における標的上にペルオキシダーゼを固定化する工程であって、ここで、ペルオキシダーゼはペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分、例えばチラミン又はチラミン誘導体と反応できる工程、ｂ）サンプルを、ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液と接触される工程であって、ここで、ハプテンコンジュゲートは、上記のペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分に結合されたハプテンを含む工程、及びｃ）サンプルを、過酸化物を含んでなる溶液と接触させる工程であって、それによってハプテンコンジュゲートがペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応し、固定化ペルオキシダーゼに、又は固定化ペルオキシダーゼの近位に共有結合を形成する工程；及びｄ）ハプテンを検出することによって、サンプル中における標的を位置付ける工程を含む。
【００１６】
幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼである。ある実施態様では、ペルオキシダーゼは、標的に直接的又は間接的に結合できる、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又はアミノ酸等の部分にコンジュゲートされる。
【００１７】
幾つかの実施態様では、標的は核酸配列を含み、ペルオキシダーゼは、ハプテン標識されたプローブをサンプル上に固定化する工程であって、ここでプローブは標的を認識し結合でき、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸オリゴマー、又はオリゴヌクレオチドを含む工程；及びサンプルを、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程によって、標的上に固定化される。ある実施態様では、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートは、ハプテン標識されたプローブを認識し結合できる抗ハプテン抗体を含む。他の実施態様では、サンプルを、抗ハプテン抗体を認識し結合できる抗体を含む抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触される前に、サンプルを、ハプテン標識されたプローブを認識し結合できる抗ハプテン抗体と接触させる。
【００１８】
標的は、ハプテンが、何れかの適切な手段によって直接的又は間接的に（例えば、検出可能な標識によって）検出される時、サンプル中において位置付けされうる。幾つかの実施態様では、標的は、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡又は分光法、デジタル画像分析、又はその任意の組合せによって位置付けされる。
【００１９】
幾つかの実施態様では、ハプテンは直接的に検出される。例えば、ハプテンが量子ドットにコンジュゲートされている場合、量子ドットは、特性波長でのその蛍光によって検出されうる。他の実施態様では、ハプテンの検出は、サンプルを、抗ハプテン抗体及び検出可能な標識と接触させる工程、及び標識を検出する工程を含む。ある実施態様では、検出可能な標識は抗ハプテン抗体にコンジュゲートされ、抗ハプテン抗体-標識コンジュゲートを形成し、コンジュゲートはハプテンに結合する。他の実施態様では、サンプルを、ハプテンに結合する抗ハプテン抗体と接触させる。次いで、サンプルを、抗ハプテン抗体に結合できる抗体コンジュゲートと接触させ、ここで、抗体コンジュゲートは、検出可能な標識又は検出可能な標識システムの要素を含む。ある実施態様では、検出可能な標識システムの要素は、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであり、発色性基質又は基質／色原体複合体と反応し、それによって検出可能な発色性析出を生成する。他の実施態様では、標識は蛍光標識、例えば量子ドットである。
【００２０】
幾つかの実施態様では、方法は、サンプル中における２つ以上の標的を検出するのに適切である。一般的に、方法は、ａ）２つ以上の標的を含んでなるサンプルを提供する工程；ｂ）サンプル中における第一標的上に第一ペルオキシダーゼを固定化する工程；ｃ）サンプルを、第一ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液、及び過酸化物を含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、第一ハプテンコンジュゲートはペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分に結合されている第一ハプテンを含む工程；ｄ）サンプル中において後続標的上に後続ペルオキシダーゼを固定化する工程；ｅ）サンプルを、後続ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液、及び過酸化物を含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、後続ハプテンコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分に結合された後続ハプテンを含み、ここで、後続ハプテンは第一ハプテン又は何れかの他の後続ハプテンと同じではない工程；及びｆ）第一及び後続ハプテンを検出することによってサンプル中における２つ以上の標的を位置付けする工程を含む。幾つかの実施態様では、第一ペルオキシダーゼは、後続標的上に後続ペルオキシダーゼを固定化する前に不活性化される。ある実施態様では、第一ハプテンコンジュゲート及び後続ハプテンコンジュゲートはハプテン−チラミドコンジュゲートである。
【００２１】
幾つかの実施態様では、方法は、サンプル中における２以上の核酸配列標的を検出するのに適切である。一般的に、方法は、ａ）２以上の核酸配列標的を含んでなるサンプルを提供する工程；ｂ）サンプル上にＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを含んでなる第一プローブを固定化する工程であって、ここで、第一プローブは第一ハプテンで標識されており、第一標的を認識し結合できる工程；ｃ）サンプル上にＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを含んでなる後続プローブを固定化する工程であって、ここで、後続プローブは、後続ハプテンで標識されており、後続標的を認識し結合でき、ここで、後続ハプテンは第一ハプテン又は何れか他の後続ハプテンと同じではない工程；ｄ）サンプルを、第一抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程であって、ここで、第一抗ハプテン抗体は、第一ハプテンを認識し結合できる工程；ｅ）サンプルを、第一ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液、及び過酸化物を含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、第一ハプテンチラミドコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分に結合された第一ハプテンを含む工程；ｆ）サンプルを、後続抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させる工程であって、ここで、後続抗ハプテン抗体は、後続ハプテンに結合し認識できる工程；ｇ）サンプルを、後続ハプテンコンジュゲートを含んでなる溶液、及び過酸化物を含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、後続ハプテンチラミドコンジュゲートは、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分に結合された後続ハプテンを含む工程；及びｈ）第一及び後続ハプテンを検出することによってサンプル中における２つ以上の標的を位置付けする工程を含む。幾つかの実施態様では、第一抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートは、サンプルを後続抗ハプテン−抗体コンジュゲートと接触させる前に、不活性化される。ある実施態様では、第一ハプテンコンジュゲート及び後続ハプテンコンジュゲートはハプテン−チラミドコンジュゲートである。
【００２２】
幾つかの実施態様では、 サンプル中における２つ以上の標的を位置付ける工程は、サンプルを、第一ハプテン及び第一量子ドットを認識し結合できる第一抗体を含んでなる第一抗ハプテン抗体-量子ドットコンジュゲート、及び後続ハプテン及び後続量子ドットを認識し結合できる後続抗体を含んでなる後続抗ハプテン抗体-量子ドットコンジュゲートを含んでなる溶液と接触させる工程であって、ここで、後続量子ドットは第一量子ドット又は何れか他の後続量子ドットではない工程、及び第一及び後続量子ドットからの蛍光を検出する工程を更に含む。
【００２３】
特定の実施態様では、サンプルは、乳癌を有すると疑われる被験体から得られ、少なくとも１つの第一プローブ又は後続プローブは、ＨＥＲ２ｍＲＮＡ，ＥＲｍＲＮＡ，Ｋｉ６７ｍＲＮＡ、又はＰＧＲｍＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンスＲＮＡプローブである。
【００２４】
発明の前述の及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面の参照と共に進行する以下の詳細な説明からより明瞭となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１はハプテン-チラミドコンジュゲートを使用する方法の一実施態様の概要図である。
【図２】図２はハプテン-チラミドコンジュゲートからのシグナルを増幅する方法の一実施態様の概要図である。
【図３】図３Ａはハプテン-チラミドコンジュゲートを使用する方法の一実施態様の概要図である。図３Ｂはハプテン-チラミドコンジュゲートを使用する方法の他の実施態様の概要図である。
【図４】図４はマルチプレックスアッセイにおける、ハプテン-チラミドコンジュゲートを使用する方法の実施態様の概要図である。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは共に、マルチプレックスｍＲＮＡ-ＩＳＨアッセイにおける、ハプテン-チラミドコンジュゲートを使用する方法の一実施態様の概要図である。
【図６】図６は、０．７５ｍＭのスズ酸ナトリウム、４０ｍＭのホウ酸，  １０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム十水和物、及び３０ｍＭの塩化ナトリウム（チラミド増幅希釈剤）中に５．５μＭに希釈されたＢＤ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＢＤ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図８】図８はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＢＦ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＢＦ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＤＡＢＳＹＬ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＤＡＢＳＹＬ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＤＣＣ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＤＣＣ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１４】図１４はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＤＩＧ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＤＩＧ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１６】図１６はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＤＮＰ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＤＮＰ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１８】図１８はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＦＩＴＣ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＦＩＴＣ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２０】図２０はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＨＱ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＨＱ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２２】図２２はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＮＣＡ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２３】図２３は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＮＣＡ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２４】図２４はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＮＰ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２５】図２５は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＮＰ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２６】図２６はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＰＰＴ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２７】図２７は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＰＰＴ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２８】図２８はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＲｈｏｄ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図２９】図２９は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＲｈｏｄ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図３０はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＲＯＴ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図３１】図３１は、チラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＲＯＴ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図３２】図３２はチラミド増幅希釈剤中に５．５μＭに希釈されたＴＳ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図３３】図３３はチラミド増幅希釈剤中に５５μＭに希釈されたＴＳ-チラミドコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるｂｃｌ２（１２４）抗体の評価を示す顕微鏡写真である。
【図３４】図３４はシグナル強度及び天然ハプテン抗体検出効果の範囲を示すグラフである。
【図３５】図３５は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＢＤ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３６】図３６は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＢＦ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３７】図３７は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＤＡＢＳＹＬ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３８】図３８は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＤＣＣ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３９】図３９は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＤＩＧ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４０】図４０は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＤＮＰ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４１】図４１は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＨＱ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４２】図４２は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＮＣＡ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４３】図４３は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＮＰ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４４】図４４は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＰＰＴ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４５】図４５は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＲＯＴ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４６】図４６は、ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びＱｄ６５５にコンジュゲートされたストレプトアビジンで検出されるＴＳ標識された抗センス及びセンスＲＮＡの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４７】図４７は、天然抗ハプテン抗体及び開示のハプテン-チラミドコンジュゲートの実施態様を用いて得られる相対シグナル強度を示すグラフである。
【図４８】図４８は、同族モノクローナル抗体と、その後のＱｄ６５５コンジュゲートされたヤギ抗マウスポリクローナル抗体を使用して検出されるハプテン-チラミドコンジュゲートの蛍光を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。
【図４９】図４９は、同族モノクローナル抗体-Ｑｄ６５５コンジュゲートで検出されるＤＮＰ-チラミドコンジュゲートの蛍光を示す２つの蛍光顕微鏡写真である。
【図５０】図５０Ａ-Ｄは、Ｃａｌｕ-３異種移植片組織にハイブリダイズされたＤＮＰ-、ＢＦ-、ＮＰ-、及びＴＳ標識された抗センス１８Ｓ  ＲＮＡプローブの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真であり、それぞれＱｄ６５５、Ｑｄ６０５、Ｑｄ５８５、及びＱｄ５６５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出される。
【図５１】図５１ＡはＦＩＧＳの成画像である。５０Ａ-Ｄ。図５１Ｂは、それぞれＱｄ６５５、Ｑｄ６０５、Ｑｄ５８５、及びＱｄ５６５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出される、ハイブリダイズされたＤＮＰ-、ＢＦ-、ＮＰ-、及びＴＳ標識されたセンス鎖１８Ｓ  ＲＮＡプローブの蛍光顕微鏡写真の合成画像である。
【図５２】図５２Ａ-Ｄは、Ｃａｌｕ-３異種移植片組織にハイブリダイズされたＮＰ標識Ｋｉ６７、ＴＳ標識ＨＥＲ２、ＢＦ標識ＥＲ、及びＤＮＰ標識ＡＣＴＢ  抗センスＲＮＡプローブの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真であり、それぞれＱｄ５２５、Ｑｄ５６５、Ｑｄ６０５、及びＱｄ６５５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出される。
【図５３】図５３Ａ-Ｄは、ＭＣＦ-７異種移植片組織にハイブリダイズされたＮＰ標識Ｋｉ６７、ＴＳ標識ＨＥＲ２、ＢＦ標識ＥＲ、及びＤＮＰ標識ＡＣＴＢ  抗センスＲＮＡプローブの蛍光を示す蛍光顕微鏡写真であり、それぞれＱｄ５２５、Ｑｄ５６５、Ｑｄ６０５、及びＱｄ６５５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出される。
【図５４】図５４ＡはＦＩＧＳの成画像である。５２Ａ-Ｄ。図５４ＢはＦＩＧＳの成画像である。５３Ａ-Ｄ。
【図５５】図５５Ａ-Ｃは、それぞれＣａｌｕ-３、ＺＲ７５-１、及びＭＣＦ-７異種移植片組織にハイブリダイズされたＤＮＰ標識されたＨＥＲ２アンチセンスＲＮＡプローブの蛍光顕微鏡写真であり、Ｑｄ６５５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出される。
【図５６】図５６は、Ｃａｌｕ-３、ＺＲ７５-１、及びＭＣＦ-７異種移植片組織におけるＨＥＲ２：ＡＣＴＢｍＲＮＡ比を示すグラフであり、ｑＰＣＲ及びｍＲＮＡ-ＩＳＨアッセイで検出される。
【図５７】図５７は、Ｃａｌｕ-３異種移植片細胞におけるＨＥＲ２の確率的発現を示す蛍光顕微鏡写真である。発現は、Ｃａｌｕ-３異種移植片組織にハイブリダイズされたＤＮＰ標識されたＨＥＲ２アンチセンスＲＮＡプローブを使用して可視化し、Ｑｄ６５５にコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体で検出した。
【図５８】図５８は、小葉乳癌における、増幅無しのｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ロックド核酸）プローブ、ｍｉＲ２０５の評価を示す顕微鏡写真である。
【図５９】図５９は、ＨＱ-チラミドコンジュゲートを使用した、増幅による小葉乳癌組織におけるｍｉＲ２０５の評価を示す顕微鏡写真である。
【図６０】図６０は、増幅無しの、扁桃組織におけるｍｉＲＮＡ  ＬＮＡプローブ、ｍｉＲ１２６の評価を示す顕微鏡写真である。
【図６１】図６１は、ＨＱ-チラミドコンジュゲートを使用した、増幅による扁桃組織におけるｍｉＲ１２６の評価を示す顕微鏡写真である。
【００２６】
（詳細な説明）
I.用語及び略称
特に明記しない限り、技術用語は、従前の使用法に従って用いられる。分子生物学の共通の用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829)；及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341）；及び他の類似の文献中に見られる。
【００２７】
本願明細書で用いられるように、単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象物を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が明確に示さない限り、「及び」を含むことを意図している。また、本願明細書で用いられるように、用語「含む」は「包含する」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む」ことは、Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。核酸又はポリペプチド又は他の化合物に与えられた、全てのヌクレオチドの大きさ又はアミノ酸の大きさ及び全ての分子量又は分子質量値は近似値であり、記載のために提供されたものであることはよく理解されるところである。ここに記載のものに類似又は均等な方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用可能であるが、適切な方法及び材料を下に記載する。本願明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献は、その全てが出典明示により援用される。矛盾する場合には、用語の説明を含み、本願明細書が統制する。さらに、材料、方法及び実施例は、単に例示であり、限定する意図はない。
【００２８】
この開示の様々な実施例の検討を容易にするために、特定用語の説明を以下に提供する：
【００２９】
ＡＣＴＢ：ベータ-アクチン。
【００３０】
増幅：増幅とは、シグナルを強くさせる作用又は結果を指す。
【００３１】
抗体：「抗体」は、まとめて、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子（一例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、それらの組み合わせ、および任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウス等の哺乳類における免疫応答中に産生される同様の分子を含むが、それらに限定されない）、及び、他の分子（例えば、対象の分子の結合定数、すなわち、生物試料における他の分子の結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１より大、少なくとも１０４Ｍ−１より大、または少なくとも１０５Ｍ−１より大である結合定数を有する抗体および抗体断片）への結合を実質的に除いて、対象の分子（または対象の極めて類似する分子の群）に特異的に結合する、抗体断片を指す。
【００３２】
より具体的には、「抗体」は、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも１つの軽鎖もしくは重鎖免疫グロブリン可変領域を含んでなるポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖からなり、これらの各々は可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。一緒になって、ＶＨ領域およびＶＬ領域は抗体により認識される抗原を結合することに関与する。
【００３３】
これには、インタクトな免疫グロブリンならびに当該技術分野において周知であるそれらの変異体及び一部が包含される。抗体断片には、タンパク質分解抗体断片［例えば、当該技術分野において既知であるようなＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片およびＦａｂ断片］、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性のｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）及び、ラクダ科動物抗体が挙げられる（例えば、米国特許第６，０１５，６９５号；同第６，００５，０７９号、同第５，８７４，５４１号；同第５，８４０，５２６号；同第５，８００，９８８号；及び同第５，７５９，８０８号を参照のこと）。
【００３４】
抗原：特定の液性又は細胞性免疫の産物、例えば抗体分子又はＴ細胞受容体によって特異的に結合されうる化合物、組成物、又は物質。抗原は、何れかのタイプの分子であり得、例えば、ハプテン、単純中間代謝産物、糖 (例えば、オリゴ糖)、脂質、及びホルモン、並びに高分子、例えば複合炭水化物(例えば、多糖)、リン脂質、核酸及びタンパク質を含む。
【００３５】
ＢＤ：ベンゾジアゼピン、例えば、（Ｅ）-２-（２-（２-オキソ-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンゾ［ｂ］［１,４］ジアゼピン-４-イル）フェノキシ）アセトアミド、ハプテン。
【００３６】
ＢＦ：ベンゾフラザン、例えば、２,１,３-ベンゾオキサジアゾール-５-カルバミド、ハプテン。
【００３７】
コンジュゲーティング、連結、結合又はリンク；一分子を他の分子に連結しより大きな分子を生成すること。例えば、２つのポリペプチドを一つの近接ポリペプチド分子にするか、又はポリペプチドにハプテン又は他の分子を共有結合する。例えばｓｃＦｖ抗体。
【００３８】
コンジュゲート：２以上の化合物の結合によって形成される化合物、例えば、水の脱離と共にアルコール及び有機酸から形成されるエステル。コンジュゲートの例は、限定するものではないが、ハプテン−抗体コンジュゲート、酵素−抗体コンジュゲート、ハプテン−チラミドコンジュゲート、ハプテン−リンカー−チラミンコンジュゲート、標識されたプローブ（例えば、ジニトロフェニル標識されたｍＲＮＡプローブ）。
【００３９】
カップリング:「カップリング」なる用語は、直接的又は間接的に結合させることを意味する。第一原子又は分子は、第二原子又は分子に直接的にカップリング又は間接的にカップリングされうる。
【００４０】
ＤＡＢＳＹＬ：４-（ジメチルアミノ）アゾベンゼン-４'-スルホンアミド、ハプテン。
【００４１】
ＤＣＣ：７-（ジエチルアミノ）クマリン-３-カルボン酸（７-（ジエチルアミノ）-２-オキソ-２Ｈ-クロメン-３-カルボン酸）、ハプテン。
【００４２】
誘導体：誘導体は、一原子又は原子の群を他の原子又は原子の群で置換することによって、類似な化合物から得られる化合物。
【００４３】
検出可能な標識：他の分子、例えば抗体又はタンパク質に直接的又は間接的に結合され、該分子の検出を容易にする検出可能な化合物又は組成物。標識の具体的な非限定例は、蛍光タグ、酵素、及び放射性同位体を含む。
【００４４】
ＤＩＧ：ジゴキシゲニン、ハプテン。
【００４５】
ＤＮＰ：２,４-ジニトロフェニル、ハプテン。
【００４６】
エピトープ:抗原決定基。これらは、抗原性の、すなわち、特定の免疫反応を引き起こす分子上の特定の化学基又は又は近接又は非近接ペプチド配列。抗体は特定の抗原性エピトープに結合する。
【００４７】
ＥＲ：エストロゲン受容体；  ＥＲ陽性乳癌は、抗エストロゲン治療から利益を得うる。
【００４８】
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート、  ハプテン。
【００４９】
官能基：分子の特徴的な化学反応に関与する、分子内の原子の特定の基。例示的な官能基は、限定するものではないが、アルカン、アルケン、アルキン、アレーン、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、エポキシド、ヒドロキシル、カルボニル（ケトン）、アルデヒド、炭酸エステル、カルボキシレート、エーテル、エステル、ペルオキシ、ヒドロペルオキシ、カルボキサミド、アミン（一級、二級、三級）、アンモニウム、イミド、アジド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、硝酸、亜硝酸、ニトリル、ニトロアルカン、ニトロソ、ピリジル、リン酸、スルホニル、スルフィド、チオール（スルフヒドリル）、ジスルフィドを含む。
【００５０】
ハプテン：抗体と特異的に結合できるが、典型的にはそれ自体では免疫原となることが実質的には不可能な分子、典型的には小分子。
【００５１】
ＨＥＲ２：ヒト上皮増殖因子受容体２、乳癌における高い攻撃性と連結するタンパク質
【００５２】
Ｋｉ６７：ＭＫＩ６７遺伝子にコードされるタンパク質；細胞増殖及びリボソームＲＮＡ転写に関連する核タンパク質
【００５３】
リンカー：ここで使用される場合、リンカーは２つの部分間に位置する分子又は原子の群。例えば、ハプテン−チラミドコンジュゲートは、ハプテン及びチラミン又はチラミン誘導体間にリンカーを含む。典型的にはリンカーは二官能性、すなわち、リンカーは各端に官能基を含み、官能基はリンカーを２つの部分にカップリングするために使用される。２つの官能基は同じであるか、すなわちホモ二官能性リンカー、又は異なる、すなわちヘテロ二官能性リンカーでありうる。
【００５４】
ロックド核酸（ＬＮＡ）：しばしば隔絶ＲＮＡ（inaccessible RNA）と称されるＬＮＡは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。リボース部分が２’酸素及び４’炭素を連結する余分な架橋によって修飾されている。ＬＮＡオリゴマーは商業的に入手可能であり、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション特性(例えば、融解温度)を増加させるために使用される。
【００５５】
部分：部分は分子の断片、又はコンジュゲートの一部である。
【００５６】
興味の分子又は標的：その存在、位置及び／又は濃度が決定される分子。興味の分子の例はタンパク質及び核酸配列、を含む。
【００５７】
モノクローナル抗体：Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞によって生産される抗体。モノクローナル抗体は当業者に知られている方法によって生産される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００５８】
マルチプレックス（Multiplex、多重、多重化）：本発明の実施態様は、複数の異なるコンジュゲートを用いて、所望されるように、サンプル中の複数の標的を実質的に同時か又は逐次に、検出されることを可能にする実施態様を指す。多重化とは、核酸、一般的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質を、両方個別に、かつ任意の及び全ての組み合わせで、同定及び／又は定量することを含み得る。多重化とはまた、その解剖学的文脈において、細胞内の遺伝子、メッセンジャー及びタンパク質の２つ以上を検出することを含めることができる。
【００５９】
ＮＣＡ：ニトロケイ皮酸、例えば４,５-ジメトキシ-２-ニトロシンナミド（cinnamide）、ハプテン。
【００６０】
ＮＰ：ニトロピラゾール、例えば５-ニトロ-３-ピラゾールカルバミド。ハプテン。
【００６１】
ペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分：ペルオキシダーゼ酵素及び過酸化物と結合した場合に、フリーラジカルを形成できるアリール部分。典型的には、ペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分は、一般式
2013531801.tif 000024
を有し、ここで、ＲＣは、ペルオキシダーゼ酵素及び過酸化物と結合した場合に、フリーラジカルを形成できる官能基である。適切な官能基はヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミン基を含む。
【００６２】
ＰＧＲ又はＰＲ：プロゲステロン受容体；ＰＧＲ-陽性癌細胞の増殖は、プロゲステロンに影響される。
【００６３】
ポリペプチド：単量体が、アミド結合によって一つに連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファ-アミノ酸の場合、Ｌ-光学異性体又はＤ-光学異性体のどちらかが使用できる。「ポリペプチド」又は「タンパク質」なる用語は、ここで使用される場合、任意のアミノ酸配列を包含することを意図し、糖タンパク質等の修飾された配列を含む。「ポリペプチド」なる用語は具体的に、天然に生じるタンパク質、並びに組換え又は合成で生産されたものを含むことを意図する。「残基」又は「アミノ酸残基」なる用語は、タンパク質, ポリペプチド, 又はペプチドに組み込まれているアミノ酸への言及を含む。
【００６４】
ＰＰＴ：ポドフィロトキシン、例えばｐ-メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド（pyrazopodophyllamide）、ハプテン。
【００６５】
タンパク質：アミノ酸から成る分子、特にポリペプチド。
【００６６】
近位：「近位」なる用語は、付着又は起源の点に、又は近くにあることを意味する。ここで使用される場合、近位とは、サンプル内の標的上に固定されているペルオキシダーゼコンジュゲートの約１００ｎｍ内、約５０ｎｍ内、約１０ｎｍ、又は約５ｎｍ内を意味する。また、近位とは、約１０オングストローム〜約１００ｎｍ、約１０オングストローム〜約５０ｎｍ、約１０オングストローム〜約１０ｎｍ、又は約１０オングストローム〜約５ｎｍの範囲内を意味しうる。
【００６７】
精製された：「精製された」なる用語は、絶対的な純度を要求せず；むしろ相対的な用語として意図される。よって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、コンジュゲート、又は他の活性化合物は、タンパク質又は他の混入物から全体又は部分的に単離されたものである。一般的に、開示の使用のための実質的に精製されたペプチド、タンパク質、コンジュゲート、又は他の活性化合物は、治療的投与のための完全な薬学的製剤中における薬学的担体、賦形剤、バッファー、吸収促進剤、安定剤、保存剤、アジュバント又は他の共成分（co-ingredient）との、ペプチド、タンパク質、コンジュゲート又は他の活性化合物の混合又は製剤化より前に、調製物中に存在する全高分子種の８０％超を含む。より典型的には、ペプチド、タンパク質、コンジュゲート又は他の活性化合物は、他の製剤成分との混合より前に、精製された調製物中に存在する全高分子種の９０％より大、しばしば９５％より大を示すまで精製される。他の場合では、精製調製物は、本質的に均一であり得、他の高分子種は一般的な技術によって検出できない。
【００６８】
量子ドット：量子閉込めによる大きさに依存した電子及び光学特性を示すナノスケール粒子。量子ドットは、例えば、半導体材料（例えばセレン化カドミウム及び硫化鉛）で構成され、結晶子（分子線エピタキシアル成長を経て成長する）等から構成される。様々な界面化学及び蛍光特性を有する種々の量子ドットは、Invitrogen Corporation, Eugene, OR から商業的に入手可能である（例えば、米国特許番号６，８１５，０６４、６，６８２５９６及び６，６４９，１３８を参照のこと（それぞれ本願明細書に出典明示により引用したものとする））。量子ドットは、Evident Technologies (Troy, NY)からも商業的に入手可能である。他の量子ドットは、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓ、ＩｎＧａＮ量子ドットなどの合金量子ドットを含む（合金量子ドット及び製造方法は、例えば米国出願公開第２００５／００１２１８２号及びＰＣＴ公報ＷＯ２００５／００１８８９に開示される）。
【００６９】
反応基：この出願中における式は「反応基」に言及し、これはここに記載のように、第一ユニットを第二ユニットにカップリングするのに適した任意の様々な基でありうる。例えば、反応基は、アミン−反応基、例えばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、酸クロリド、例えばスルホニルクロリド、アルデヒド及びグリオキサル、エポキシド及びオキシラン、炭酸、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、及びその組合せでありうる。適切なチオール−反応性官能基は、ハロアセチル及びハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール−ジスルフィド交換試薬、例えばピリジルジスルフィド、ＴＮＢ−チオール、及びジスルフィド還元剤、及びその組合せを含む。適切なカルボキシレート−反応性官能基は、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール化合物、及びカルボジイミドを含む。適切なヒドロキシル−反応性官能基は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロギ酸、過ヨウ素酸酸化化合物、酵素的酸化、アルキルハロゲン、及びイソシアネートを含む。アルデヒド及びケトン−反応性官能基は、ヒドラジン、シッフ塩基、還元的アミノ化産物、マンニッヒ縮合産物、及びその組合せを含む。活性水素−反応性化合物は、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合産物、ヨード化反応産物、及びその組合せを含む。光反応性化学官能基は、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾフォノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体、及びその組合せを含む。
【００７０】
Ｒｈｏｄ：ローダミン、ハプテン。ローダミンハプテンの一例は、次の化学構造
2013531801.tif 000025
を有する。
【００７１】
ＲＯＴ：ロテノン、例えばロテノンイソキサゾリン、ハプテン。
【００７２】
サンプル：被験体から得られる、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、又はその組合せを有する生物学的試料。例は、限定するものではないが、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科的試料、羊水穿刺サンプル及びオートプシー物質を含む。
【００７３】
特異的結合部分：特異的結合対のメンバー。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して、互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的サンプル中における他の分子との、結合対の２メンバーのどちらかの結合定数より、少なくとも１０３Ｍ−１より大、１０４Ｍ−１より大、又は１０５Ｍ−１より大の結合定数を有しうる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、アビジン、例えばストレプトアビジン、及びプロテインＡ）、核酸配列、及びタンパク質−核酸を含む。また、特異的結合部分は、このような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（又はその部分）を含む。
【００７４】
ＴＳ：チアゾールスルホンアミド、例えば、２-アセトアミド-４-メチル-５-チアゾールスルホンアミド、ハプテン。
【００７５】
ＩＩ．ハプテン
ハプテンの開示の実施態様は、ピラゾール、具体的にはニトロピラゾール；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素及びチオ尿素、具体的にはフェニル尿素、及びより具体的にはフェニルチオ尿素；ロテノン及びロテノン誘導体、ここではロテノイドとしても言及される；オキサゾール及びチアゾール、具体的にはオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド；クマリン及びクマリン誘導体；ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体に例示されるシクロリグナン；及びその組合せを含む。ハプテン及びそれらの調製及び使用の方法の実施態様は、米国特許第７，６９５，９２９号に開示されており、参照によってその全体をここに援用する。
【００７６】
下に提供する一般式について、置換基が示されていない場合は、当業者は置換基が水素であることを理解するだろう。原子に連結されていないが、例えば環系の内部に伸展するように示されている結合は、このような置換基の位置が可変であることを示す。結合を通って描かれている曲線は、幾つかの追加構造がその位置に結合されていることを示し、典型的にはリンカー、又はチラミン又はチラミン誘導体にハプテンをカップリングするために使用される官能基又は部分である。更に、一又は複数のキラル中心を有する化合物について立体化学が示されていない場合、全てのエナンチオマー及びジアステロマー（diasteromer）が含まれる。同様に、脂肪族又はアルキル基の記述について、その全ての構造異性体がまた含まれる。他に示さない限り、下に提供する一般式におけるＲ基は独立して、水素、アシル、アルデヒド、アルコキシ、脂肪族、特に低級脂肪族（例えば、イソプレン）、置換化脂肪族、ヘテロ脂肪族、例えばヘテロ原子を有する有機鎖、例えば酸素、窒素、硫黄、アルキル、特に２０以下の炭素原子を有するアルキル、及び更により典型的には１０以下の原子を有する低級アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、及びブチル、置換化アルキル、例えばハロゲン化アルキル (例えば-ＣＸ３、ここで Xはハロゲン化物及びその組合せ（鎖においてか又はそれに結合されている））、オキシム、オキシムエーテル（例えば、メトキシイミン、ＣＨ３−Ｏ−Ｎ＝）アルコール（すなわち、脂肪族又はアルキルヒドロキシル、特に低級アルキルヒドロキシル）アミド、アミノ、アミノ酸、アリール、アルキルアリール、例えばベンジル、炭水化物、単糖、例えばグルコース及びフルクトース、二糖、例えばスクロース及びラクトース、オリゴ糖及び多糖、カルボニル、カルボキシル、カルボキシレート（その塩を含み、例えば第１族金属又はアンモニウムイオンカルボキシレート）、環式、シアノ（−ＣＮ）、エステル、例えばアルキルエステル、エーテル、エキソメチレン、ハロゲン、ヘテロアリール、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、オキシム（ＨＯ−Ｎ＝）、ケト、例えば脂肪族ケトン、ニトロ、スルフヒドリル、スルホニル、スルホキシド、エキソメチレン及びその組合せから選択される。
【００７７】
１．アゾール
本発明のハプテンの第一の一般的クラスは、典型的にはオキサゾール及びピラゾールであり、より典型的にはニトロオキサゾール及びニトロピラゾールであり、次の一般的な化学式を有する。
2013531801.tif 000026
Ｒ１−Ｒ４は、ハプテンとしての機能を干渉せず、潜在的に亢進させる任意の基でありうる。より具体的には、Ｒ１−Ｒ４は上記した通りである。また、２以上のこれらのＲ１−Ｒ４置換基は図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。少なくとも１つのＲ１−Ｒ４置換基はリンカーに結合されているか、又はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適した官能基である。Ｒ１−Ｒ４は、最も典型的には脂肪族、水素又はニトロ基、より典型的にはアルキル、水素又はニトロ、更により典型的には低級（１０以下の炭素原子）アルキル、水素、ニトロ、又はその組合せである。ニトロ基の数は様々であるが、最も典型的には１又は２のニトロ基がある。Ｘは独立して窒素又は炭素である。Ｙは酸素、硫黄又は窒素である。Ｙが酸素又は硫黄である場合は、Ｒ１基はない。Ｙが窒素である場合、少なくとも１つのＲ１基がある。
【００７８】
当業者は、２以上の  ヘテロ原子を有する化合物について、その相対位置が可変であることを理解するだろう。更に、２以上のヘテロ原子も可能であり、トリアジン等である。
【００７９】
これらのアゾール化合物の少なくとも１つのＲ１−Ｒ４は、何らかの他の基に結合されるか、又は可変官能基である。例えば、図示した化合物は、アゾール環の任意の適切な位置で、チラミン又はチラミン誘導体に直接、又はリンカーにカップリングされうる。
【００８０】
作用実施態様は典型的には、モノ-又はジニトロピラゾール誘導体であり、少なくとも１つのＲ１−Ｒ４はニトロ基であり、残りのＲ１−Ｒ４は、リンカー又はチラミン又はチラミン誘導体にハプテンをカップリングするために使用される。
2013531801.tif 000027
【００８１】
一特定化合物は、次の構造を有する。
2013531801.tif 000028
【００８２】
２．ニトロアリール
本発明のハプテンの第二の一般的クラスは、ニトロアリール化合物である。例示的なニトロアリール化合物は、限定するものではないが、ニトロフェニル、ニトロビフェニル、ニトロトリフェニル等、及びすべてのヘテロアリール相応物を含み、次の一般的な化学式を有する。
2013531801.tif 000029
この一般式に関して、少なくとも１つのＲ１−Ｒ６はニトロである。一以上のＲ１−Ｒ６がニトロである場合、複数のニトロ置換基の相対的な環位置、又は他の環置換基に対するニトロ置換基の全ての組合せが、このクラスの開示のハプテンに含まれる。ジニトロアリール化合物が最も典型的である。残りの環置換基は上記した通りである。少なくとも１つのＲ１−Ｒ６置換基はリンカーに結合されているか、又はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適した官能基である。
【００８３】
また、２以上のＲ１−Ｒ６置換基は、環系、例えばナフタレン（下に示す）又はアントラセン型誘導体における原子、典型的には炭素原子でありうる。６員の環系以外の環系が形成され得、例えば縮合６−５環系である。
2013531801.tif 000030
また、Ｒ１−Ｒ８が持つ環位置の少なくとも１つは、リンカーに結合されているか、又は共有結合などによるチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適した可変官能基である。例えば、本発明のニトロアリール化合物は、様々な任意の環位置に、チラミン又はチラミン誘導体、又はリンカーへのカップリングのための官能基を含みうる。
【００８４】
作用実施態様は、ニトロフェニル化合物に例示される。単なる例として、モノニトロアリール化合物は、ニトロシンナミド化合物に例示される。ニトロシンナミドベースの化合物の一実施態様は、下に示す４,５−ジメトキシ−２−ニトロシンナミドに例示される。
2013531801.tif 000031
【００８５】
また、化合物のニトロフェニルクラスは、ジニトロフェニル化合物に代表される。ニトロ基を持たない環位置の残りの炭素原子の少なくとも１つは、官能基に、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に直接結合されている。これらの基の相対位置のすべての組合せは、開示のハプテンのクラスに含まれる。
2013531801.tif 000032
作用実施態様は、下記のように、リンカーにカップリングされた２,４−ジニトロフェニル化合物に、より具体的に例示される。
2013531801.tif 000033
Ｒ１−Ｒ３は上記した通りである。
【００８６】
３．ベンゾフラザン
ベンゾフラザン及びその誘導体は、発明の範囲内である他のクラスのハプテンである。ベンゾフラザン型化合物の一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000034
Ｒ１−Ｒ４は上記した通りである。また、２以上のこれらのＲ１−Ｒ４置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。少なくとも１つのＲ１−Ｒ４置換基はリンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に直接結合されている。ＹはＲ５及びＲ６置換基を有する炭素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、Ｒ１−Ｒ４について述べたように、酸素又は硫黄、典型的には酸素である。
【００８７】
Ｙが酸素である化合物は、次の構造を有する化合物によってより具体的に例示され、ここで、Ｒ１−Ｒ４上記の通りであり、最も典型的には独立して水素及び低級アルキルである。
2013531801.tif 000035
このクラスのハプテンによる化合物の一作用実施態様は、次の化学構造を有する。
2013531801.tif 000036
【００８８】
４．トリテルペン
トリテルペンは、発明の範囲内である他のクラスのハプテンである。環状トリテルペンに共通する基本的な環構造は、下に示すように４つの６員の縮合環、Ａ−Ｄを有する。
2013531801.tif 000037
多くの刊行物が、本発明の実施に有用なトリテルペンの属である、天然に生じる半合成及び合成トリテルペン種に言及しており:  J.C. Connolly and R. A. Hill, Triterpenoids, Nat. Prod. Rep., 19, 494-513 (2002); Baglin et al., A Review of Natural and Modified Beculinic, Ursolic and Echinocystic Acid Derivatives as Potential Antitumor and Anti-HIV Agents, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 3, 525-539; W.N. and M.C. Setzer, Plant-Derived Triterpenoids as Potential Antineoplastic Agents, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 3, 540-556 (2003); and Baltina, Chemical Modification of Glycyrrhizic Acid as a Route to New Bioactive Compounds for Medicine, Current Medicinal Chemistry, 10, 155-171 92003);を含み、その各々を出典明記によってここに援用する。
【００８９】
本開示及びその作用実施態様、並びにこれらの先行刊行物によって提供される開示に基づき、またこの第一一般式の参照から、Ｒ１−Ｒ２１は上記した通りである。また、２以上のこれらのＲ１−Ｒ２１置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。少なくとも１つのＲ１−Ｒ２１置換基は、リンカーに結合されているか、又はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適した官能基である。Ｙは結合であって、それによって５員の環を定めるか、又はＲ２２及びＲ２３置換基を持つ炭素原子であり、ここで、これらのＲ基は上記した通りである。
【００９０】
また、このクラスのハプテンを例示するトリテルペンの開示の実施態様はＥ環を含み得、このＥ環は様々な環サイズであり得、特に、環において５−７の原子、典型的には炭素原子を有する環でありうる。例えば、Ｅ環は、次の一般式に示すように６員の環であり得、ここで、Ｒ１−Ｒ３１はＲ１−Ｒ２１について上に記載した通りである。
2013531801.tif 000038
【００９１】
次の一般式は、Ｒ１３置換基が、水素、ヒドロキシル、エステル、すなわち−ＯＲ３４から選択されるＲ３３置換基を持つアシル基でありうることを示し、ここで、Ｒ３４は脂肪族、典型的にはアルキル又は置換化アルキル、より典型的には低級アルキル、アミド、例えば一級アミド（−ＮＨ２）、二級アミド（−ＮＨＲ３５）及び三級アミド（−ＮＲ３５Ｒ３６）であり、ここで、Ｒ３５及びＲ３６は脂肪族、典型的には低級脂肪族、より典型的にはアルキル、置換化アルキル、更に典型的には低級アルキル又は置換化低級アルキルである。また、この一般式は、Ｒ１置換基がしばしばＯＲ３２置換基であることを示し、ここで、Ｒ３２は水素又は脂肪族、より典型的にはアルキル又は置換化アルキル、更により典型的には低級アルキルである。残りのＲ基は、第一一般式について上記した通りである。
2013531801.tif 000039
【００９２】
また、下の式によって示す様に５員の環であり得、ここで、Ｒ１−Ｒ２９基は、Ｒ１−Ｒ２１について上記した通りである。
2013531801.tif 000040
2013531801.tif 000041
【００９３】
これらの一般式に関して、Ｒ１−Ｒ２９基は、Ｒ１−Ｒ２１について上記した通りである。
【００９４】
Ｅ環が６員の環である例示的な化合物と同様に、Ｅ環が５員の環である化合物もまた、上記のようにＲ１及びＲ１３に置換基を含みうる。具体的には、この一般式は、Ｒ１３置換基が、水素、ヒドロキシル、エステル、すなわち−ＯＲ３４から選択されるＲ３３置換基を持つアシル基でありうることを示し、ここで、Ｒ３４は脂肪族、典型的にはアルキル又は置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル、アミド、例えば一級アミド（−ＮＨ２）、二級アミド（−ＮＨＲ３５）及び三級アミド（−ＮＲ３５Ｒ３６）であり、ここで、Ｒ３５及びＲ３６は脂肪族、典型的には低級脂肪族、より典型的にはアルキル、置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル又は置換化低級アルキルである。また、この一般式は、Ｒ１置換基がしばしばＯＲ３２置換基であることを示し、ここで、Ｒ３２は水素又は脂肪族、より典型的にはアルキル又は置換化アルキル、更により典型的には低級アルキルである。
【００９５】
また、例示的な化合物は、Ａ及びＥ環の双方として５員の環を含む。このような例示的な化合物の一般式を下に示し、ここで、Ｒ１−Ｒ２９置換基は上記した通りである。
2013531801.tif 000042
【００９６】
また、Ｒ１及びＲ１３置換基は、酸素ベースの官能基でありうる。Ｒ１３置換基は、水素、ヒドロキシル、エステル、すなわち−ＯＲ３４から選択されるＲ３３置換基を持つアシル基であり得、ここで、Ｒ３４は脂肪族、典型的にはアルキル又は置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル、アミド、例えば一級アミド（−ＮＨ２）、二級アミド（−ＮＨＲ３５）及び三級アミド（−ＮＲ３５Ｒ３６）であり、ここで、Ｒ３５及びＲ３６は脂肪族、典型的には低級脂肪族、より典型的にはアルキル、置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル又は置換化低級アルキルである。また、この一般式は、Ｒ１置換基がしばしばＯＲ３２置換基であることを示し、ここで、Ｒ３２は水素又は脂肪族、より典型的にはアルキル又は置換化アルキル、更により典型的には低級アルキルである。
2013531801.tif 000043
【００９７】
また、本発明の例示的なトリテルペンは、一又は複数のＡ−Ｅ環に、一又は複数の不飽和部位を含みうる。例示的な化合物はしばしば、下に示すように、Ｃ環において少なくとも１つの不飽和部位、例えばＣ環において二重結合を有する。
2013531801.tif 000044
不飽和部位は、Ｃ環について下に示す様に、アルファ、ベータ不飽和ケトンでありうる。
2013531801.tif 000045
【００９８】
また、トリテルペンは多くのステレオジェニック炭素原子を有する。当業者は、特定のエナンチオマーが最も天然に生じ易いことを理解するだろう。天然に生じるエナンチオマーが、開示の実施態様の実施に最も入手可能であり、及び／又は効果的でありうるが、全ての他の可能な立体異性体が発明の範囲内である。更に、他の天然に生じるトリテルペン、又はその合成誘導体、又は完全な合成化合物は、（１）異なる立体化学、（２）異なる置換基を有し得、更に、天然に生じる化合物では置換されていない位置で置換されうる。上に提供されている一般式は、キラル中心で立体化学を示さない。これは、各キラル中心での両エナンチオマー、及びその全ジアステレオマー異性体の組合せが、発明の範囲内であることを示す。
【００９９】
本発明の特定の作用実施態様は、次の一般式に例示され、ここで、置換基は上記お通りである。
2013531801.tif 000046
【０１００】
本発明の実施のためのハプテンとして有用な天然に生じるトリテルペンの立体化学及び置換基を下に示す。
2013531801.tif 000047
Ａ環におけるヒドロキシル基は典型的には、作用実施態様では、カルボニル官能基に酸化される。結果として、カルボニル基を持つ炭素原子はもはやキラル中心ではない。
【０１０１】
５．尿素及びチオ尿素
尿素及びチオ尿素、特にアリール及びヘテロアリール尿素及びチオ尿素は、発明の範囲内である他のクラスのハプテンである。本発明の尿素ベースのハプテンの一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000048
この一般式に関して、Ｒ１−Ｒ３は独立して、水素、脂肪族、置換化脂肪族、典型的にはアルキル、置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル及び置換化低級アルキル、環式、複素環、アリール及びヘテロアリールである。より具体的には、Ｒ１は典型的にはアリール又は脂肪族であり、発色活性を促進する少なくとも１つ不飽和部位をしばしば有する。Ｒ２及びＲ３は最も典型的には独立して水素及び低級アルキルである。Ｙは酸素（尿素誘導体）又は硫黄（チオ尿素）である。
【０１０２】
アリール誘導体は典型的には次の式を有する。
2013531801.tif 000049
Ｒ１−Ｒ７は上記した通りである。また、少なくとも１つのＲ３−Ｒ７置換基は、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に結合されている。また、このような結合に利用可能な２以上のこれらのＲ３−Ｒ７置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。
【０１０３】
また、下に提供する例示的な構造によって示されるように、更なる環が存在しうる。Ｒ基はＲ１−Ｒ７について上記した通りであり、Ｙは酸素又は硫黄である。
2013531801.tif 000050
【０１０４】
チオ尿素の特定のサブクラスを下に示す。
2013531801.tif 000051
この一般式に関して、ｎは１〜５、典型的には１−２であり、Ｒ１及びＲ２は独立して水素又は低級アルキルであり、Ｘは独立してハロゲン化物又は異なるハロゲン化物の組合せである。
【０１０５】
フェニルチオ尿素の作用実施態様の一例を下に提供する。
2013531801.tif 000052
トリフルオロメチル基が、チオ尿素部分に対して２及び４位置に示されている。当業者は、２,３など、２基置換化合物について全ての相対位置を有する化合物、及び２つ以上のトリハロアルキル置換基を、かかる複数のトリハロアルキル置換基の全ての可能な相対位置に有する化合物も、発明の範囲であることを理解するだろう。
【０１０６】
ローダミンチオ尿素ハプテンの特定の例は、次の式を有する。
2013531801.tif 000053
【０１０７】
６．ロテノイド
ロテノイドと総称されるロテノン及びロテノンベースのハプテンは、発明の範囲内である他のクラスのハプテンを提供する。ロテノン、及びロテノンベースのハプテンの第一一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000054
多くの刊行物が、本発明の実施に有用なロテノイド属を記述するのに有用な、天然に生じる半合成及び合成ロテノイドに言及しており：Leslie Crombie and Donald Whiting, Biosynthesis in the Rotenoids Group of Natural Products:  Application of Isotope Methodology, Phytochemistry, 49, 1479-1507 (1998); and Nianbai Fang, and John Casida, Cube Resin Insecticide:  Identification and Biological Activity of 29 Rotenoid Constituents;を含み、その各々を出典明記によってここに援用する。本開示及び作用実施態様、並びにこれらの先行公開によって提供される開示に基づき、またこの第一一般式に関し、Ｒ１−Ｒ１４は上記した通りである。また、２以上のこれらのＲ１−Ｒ１４置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。また、少なくとも１つのＲ１−Ｒ１４置換基は、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に結合されている。
【０１０８】
Ｒ６及びＲ７は上記の通りでありうるが、このような置換基はより典型的には独立して水素、ＯＲ１５であり、ここで、Ｒ１５は水素、脂肪族、置換化脂肪族、典型的にはアルキル、置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル及び置換化低級アルキル、例えば低級アルキルハロゲン化物、環式、複素環、アリール及びヘテロアリール、−ＮＲ２１であり、ここで、Ｒ２１は水素、脂肪族、置換化脂肪族、典型的にはアルキル、置換化アルキル、更により典型的には低級アルキル及び置換化低級アルキル、例えば低級アルキルハロゲン化物、環式、複素環、アリール及びヘテロアリール、又はＮ−Ｌ−ＲＧであり、ここでＬはリンカー又は反応基、例えばアミンであり、更なる詳細はここで検討する通りである。
【０１０９】
また、Ｒ６及びＲ７は二重結合、例えば、カルボニルを形成するための酸素への二重結合を形成しうる。Ｒ６及び／又はＲ７が−Ｌ−ＲＧでない場合、少なくとも１つのＲ置換基は、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に結合される。
【０１１０】
また、Ｂ環は少なくとも１つの更なる不飽和部位を含みうる。例えば、Ｒ５及びＲ１２は二重結合を形成しうる。
【０１１１】
Ｒ１０及びＲ１１は５−又は６員の環に連結されうる。例えば、Ｒ１０及びＲ１１はピラン又はフラン環を定義し得、より具体的には置換化及び／又は不飽和ピラン又はフラン環である。
【０１１２】
また、本発明の特定の例示的なロテノンベースのハプテンは、典型的には次の第二一般式を満たす。
2013531801.tif 000055
この第二一般式に関して、Ｒ置換基は上記した通りである。Ｒ６又はＲ７が−Ｌ−ＲＧでない場合、少なくとも１つの残りのＲ基は、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に結合される。
【０１１３】
Ｒ１０及びＲ１１は５−又は６員の環、例えばピラン又はフラン、及びより具体的には置換化及び／又は不飽和ピラン又はフラン環に連結されうる。よって、本発明の特定のロテノンベースのハプテンの記載に有用な第三一般式を下に提供し、ここで、Ｒ置換基は上記した通りである。
2013531801.tif 000056
下に示すように、Ｙは結合であってそれによって５員の環を定義するか、又はＲ１９及びＲ２０置換基を持つ６員の環における炭素原子であり、ここでＲ置換基は上記した通りである。
2013531801.tif 000057
2013531801.tif 000058
環接合部のＲ５及びＲ１２を、特定の立体化学を示すことなく示している。天然に生じる化合物はｃｉｓ−環接合部を有するが、ラセミ混合物も本発明の実施に有用である。トランス立体異性体も、素早く平衡化されラセミ混合物を形成しうる。
【０１１４】
このクラスの化合物の作用実施態様は、より典型的には次の第三一般式を満たす。
2013531801.tif 000059
【０１１５】
この一般式に関して、Ｒ６及びＲ７は水素、アルキルであるか、酸素等に対し二重結合を定義しカルボニルを形成する。Ｒ１５及びＲ１６は独立して水素及び脂肪族、典型的には低級脂肪族、例えばアルケニルであり、その一例はイソプレンであり、下に示す。
2013531801.tif 000060
また、特定のエナンチオマーが上式に示されているが、当業者は、発明の範囲が、示した特定のエナンチオマーに限定されないことを理解するだろう。代わりに、ハプテンとして作用する全立体異性体もまた、開示の範囲内である。このクラスの化合物について上で検討した全置換が、この特定の化合物に適用される。他の置換も当業者には容易に明瞭である。例えば、Ａ環におけるメトキシ基は、任意のアルコキシ化合物、特定の低級アルコキシ基でありうる。イソプレンユニットはまた、リンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのハプテンのカップリングについて、おそらく他の位置、又は少なくとも第二位置を提供するために、合成的に修飾できるオレフィンを提供する。例えば、オレフィンはヒドロホウ素化によってアルコールに転換されうる。またそれは、ハプテンとして又は更なる転換に有用な中間体としての使用のために、ハロゲン化物又はエポキシドに転換されうる。
【０１１６】
本発明のロテノンベースのハプテンを記述する第四一般式は、下に提供するように、特にロテノンイソキサゾリンを対象にする。
2013531801.tif 000061
Ｒ−Ｒ５は上記の通りであり、更に全ての分岐鎖脂肪族異性体を含む。少なくとも１つのＲ−Ｒ５置換基はまた、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に結合されている。Ｙは酸素、窒素、又は硫黄である。
【０１１７】
この第四一般式を満たすロテノンベースのハプテンの特定の作用実施態様を下に提供する。
2013531801.tif 000062
【０１１８】
７．オキサゾール及びチアゾール
オキサゾール及びチアゾールスルホンアミドは、発明の範囲である他のクラスのハプテンを提供する。オキサゾール及びチアゾールスルホンアミドの一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000063
この第一一般式に関して、Ｒ１−Ｒ３は上記した通りである。２以上のこれらのＲ１−Ｒ３置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子である。少なくとも１つのＲ１−Ｒ３置換基は、リンカーに結合されているか、又はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適切な官能基である。Ｙは酸素又は硫黄、典型的には硫黄である。
【０１１９】
特定の例示的な作用実施態様では、Ｒ１はアミドであり、例えば下に示すアミド誘導体であった。Ｒ２はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングの位置を提供するが、Ｒ１及びＲ２によって示される位置はまた、リンカー及び／又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングのための別の、又は更なる位置を提供する。特定の作用実施態様のＲ２は、−ＳＯ２であり、スルホンアミドを形成することによってリンカーをカップリングするために使用された。よって、このクラスのハプテンを例示するハプテンの作用実施態様のための第二一般式を下に示し、ここで、Ｒ３−Ｒ６置換基及びＹは上記した通りである。
2013531801.tif 000064
特定の作用実施態様Ｒ６はアルキル、特に低級アルキル、例えばメチルであり、Ｙは硫黄であった。
【０１２０】
このクラスのハプテンによる化合物の一作用実施態様は、次の化学構造を有した。
2013531801.tif 000065
【０１２１】
チアゾール又はオキサゾールはまた、より大きな環系の一部でありうる。例えば、５員のオキサゾール又はチアゾールは、少なくとも１つの更なる環、例えばフェニル環にカップリングされ得、下に示す。
2013531801.tif 000066
Ｒ１−Ｒ５基は一般的に上記の通りでありうるが、このような化合物はまた、リンカー及び／又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングのための位置、例えばＲ５を提供する。一つの可能なスルホンアミド誘導体を下に提供する。
2013531801.tif 000067
【０１２２】
８．クマリン
クマリン及びクマリン誘導体は、発明の範囲内であるハプテンの他のクラスを提供する。クマリン及びクマリン誘導体の一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000068
この一般式に関し、Ｒ１−Ｒ６は上記した通りである。少なくとも１つのＲ１−Ｒ６置換基がまた典型的には、リンカー又はチラミン又はチラミン誘導体に結合されている。特定の作用実施態様は、リンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングについて、Ｒ５置換基を有するとして示されている位置を使用した。４位置は、蛍光がこれらの化合物を検出するために使用される場合、重要でありうる。４位置での水素以外の置換基は、蛍光をクエンチすると信じられているが、このような誘導体は依然として発色団でありうる。Ｙは酸素、窒素又は硫黄である。このような化合物の形成に利用可能な２以上のＲ１−Ｒ６置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。これらのタイプの化合物の例示的な実施態様を下に提供する。
2013531801.tif 000069
当業者は、環が複素環及び／又はヘテロアリールであることを理解するだろう。
【０１２３】
作用実施態様は典型的には、少なくとも１つのリンカー、チラミン又はチラミン誘導体カップリング位置を有する縮合Ａ−Ｄ環系であり、一つの可能なカップリング位置を下に示す。
2013531801.tif 000070
この一般式に関して、Ｒ及びＹ可変基は上記した通りである。最も典型的には、Ｒ１−Ｒ１４は独立して水素又は低級アルキルである。クマリンベースのハプテンの特定の実施態様は、２,３,６,７-テトラヒドロ-１１-オキソ-１Ｈ,５Ｈ,１１Ｈ-［１］ベンゾピラノ［６,７,８-ｉｊ］キノリジン-１０-カルボン酸
2013531801.tif 000071
及び７-（ジエチルアミノ）クマリン-３-カルボン酸
2013531801.tif 000072
を含む。
【０１２４】
９．シクロリグナン
リグニンベースの化合物、特にシクロリグナン、例えばポドフィロトキシン及びその誘導体は、発明の範囲内である他のクラスのハプテンを提供する。これらのシクロリグナンベースの誘導体の第一一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000073
多くの刊行物が、本発明の実施に有用なシクロリグナンの属を記述するのに有用な、天然に生じる半合成及び合成シクロリグナンに言及しており：Stephanie Desbene and Sylviane Giorgi-Renault, Drugs that Inhibit Tubulin Polymerization:The Particular Case of ポドフィロトキシン and Analogues, Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 2, 71-90 (2002); M. Gordaliza et al., Podophyllotoxin:Distribution, Sources, Applications and New Cytotoxic Derivatives, Toxicon, 44, 441-459 (2004); Phillipe Meresse et al., Etoposide:Discovery and Medicinal Chemistry, Current Medicinal Chemistry, 11, 2443-2466 (2004); M. Pujol et al., Synthesis and Biological Activity of New Class of Dioxygenated Anticancer Agents, Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 5, 215-237 (2005); and Youngjae You, Podophyllotoxin Derivatives:Current Synthetic Approaches for New Anticancer Agents, Current Pharmaceutical Design, 11, 1695-1717 (2005);を含み、その各々を出典明記によってここに援用する。
【０１２５】
本開示及び作用実施態様、並びにこれらの先行刊行物によって提供されている開示に基づき、また、この第一一般式に関し、Ｒ１−Ｒ１２は上記した通りである。少なくとも１つのＲ１−Ｒ１２は、リンカー、又はチラミン又はチラミン誘導体への化合物のカップリングの位置を提供する。更に、特定のＲ基は環系における原子でありうる。例えば、Ｒ２及びＲ３、並びに２つのＲ７−Ｒ１０は、環系において連結されうる。少なくとも１つのＲ１２及びＲ１１もしばしばアリール基、例えばベンゼン環又は置換化ベンゼン環である。
【０１２６】
また、特定の作用実施態様は次の第二一般式を満たし、ここでＲ置換基は上記した通りである。
2013531801.tif 000074
【０１２７】
少なくとも１つのＲ１１及びＲ１２がアリール基である例示的な化合物は次の一般式を有し、ここでＲ置換基は上記した通りである。
2013531801.tif 000075
Ｒ１６−Ｒ２０は一般的に上記した通りであるが、より典型的には独立して水素又はアルコキシ、典型的には低級アルコキシ、例えばメトキシであり、下に示す。
2013531801.tif 000076
少なくとも１つのＲ置換基は典型的には、リンカーに結合されているか、リンカーと反応可能な反応性官能基であるか、又は−Ｌ−ＲＧである。例えば、Ｒ５はしばしば−Ｌ−ＲＧである。
【０１２８】
Ｒ５及びＲ６はまた二重結合を形成し得、例えば、カルボニル官能基を形成する酸素への二重結合、又はイミンを形成する窒素原子への二重結合である。Ｒ５及びＲ６が二重結合を形成する特定の例示的な化合物は次の一般式を有し、ここで、残りのＲ置換基は上記した通りである。Ｙは窒素、酸素又は硫黄から選択される。Ｙが窒素である場合、窒素原子は、それに結合される水素、又は水素以外の幾つかの原子、官能基又は化学的部分を更に有しうる。例えば、窒素は、脂肪族置換基、例えばアルキル基、アリール又はヘテロアリール置換基、又は置換化アリール又はヘテロアリール置換基、例えばアルキル及び／又はアルコキシ置換化アリール又はヘテロアリール置換基を有しうる。
2013531801.tif 000077
Ｒ１６−Ｒ２０は独立して、水素及びアルコキシ、より典型的には低級アルコキシ、例えばメトキシから選択され、下に示す。
2013531801.tif 000078
本発明の全てのハプテンコンジュゲートと同様に、少なくとも１つのＲ置換基は、典型的にはリンカーに結合されるか、リンカーと反応可能な反応性官能基であるか、−Ｌ−ＲＧであるか、又はチラミン又はチラミン誘導体に直接結合されている。例えば、Ｒ９はしばしば−Ｌ−ＲＧである。
【０１２９】
このシクロリグナンクラスのハプテンを例示する化合物であるポドフィロトキシンの化学構造を下に提供する。
2013531801.tif 000079
ポドフィロックスとも称されるポドフィロトキシンは、４１４．４０の分子量、Ｃ２２Ｈ２２Ｏ８の組成式を有する非アルカロイド毒素である。ポドフィロトキシンは、アメリカハッカクレンポドフィルム（American Mayapple Podophyllum peltatum）の根茎に、重さで０．３〜１．０％の濃度で存在する。ポドフィロトキシンの融点は１８３．３−１８４．０℃である。
【０１３０】
従って、本発明によるシクロリグナンは実質的に、次の一般式を有するポドフィロトキシン構造に基づき、Ｙは窒素、酸素又は硫黄から選択される。
2013531801.tif 000080
本発明によるシクロリグナンハプテンの具体的な例を下に示す。
2013531801.tif 000081
この化合物を、ポドフィロトキシンから開始して作成した。ポドフィロトキシンのヒドロキシル基を酸化し、ケトンにした。次いで、ケトンを置換化ヒドラジンと反応させ、上記の化合物を生成した。ヒドラジン試薬は、所望により置換可能であり、脂肪族及びアリール置換基を含む。
【０１３１】
１０．ヘテロビアリール
本発明の他の一般的なクラスのハプテンは、ヘテロビアリール化合物、典型的にはフェニルキノリン及びキノキサリンである。開示のヘテロビアリール化合物は、下記の第一の一般的な化学式を有する。
2013531801.tif 000082
この一般式に関し、Ａ−Ｄは、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、及びそのすべての組合せから選択される。最も典型的にはＡ−Ｄは炭素又は窒素であり、置換又は非置換でありうる。Ｒ１−Ｒ２は上記した通りであり、アルコキシアリール、例えばメトキシアリール及びエトキシアリールを更に含む。２以上のＲ１−Ｒ２置換基、最も典型的には複数のＲ１置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。少なくとも１つのＲ１−Ｒ２置換基は典型的には、リンカーに、又はチラミン又はチラミン誘導体に直接結合されている。
【０１３２】
ヘテロビアリール化合物の特定の実施態様は、次の式を有する。
2013531801.tif 000083
Ｒ１及びＲ２は、第一一般式について上記した通りである。Ｙは酸素、窒素又は硫黄であり、典型的には窒素である。Ｙが窒素である場合、式はまた、一又は複数の窒素原子への二重結合を含みうる。
【０１３３】
単一ヘテロ原子を有する化合物は、次のような、フェニルキノリンに例示される。
2013531801.tif 000084
より具体的な実施態様は、次の一般式に例示されるアリール置換化ハプテンを含む。
2013531801.tif 000085
この一般式に関し、Ｒ１−Ｒ３は上記した通りである。より典型的には、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はアシルであり、またＲ３はアルコキシである。特定の例、２−（３,４−ジメトキシフェニル）キノリン−４−カルボン酸を下に提供する。
2013531801.tif 000086
【０１３４】
２つのヘテロ原子を有する化合物は、下の一般式に示すキノキサリンに代表される。
2013531801.tif 000087
また、Ｒ１及びＲ２置換基は、このクラスのハプテンに関して、上記した通りである。本発明のビアリール-ジヘテロ原子ハプテンの特定の例は、下の３-ヒドロキシ-２-キノキサリンカルバミドに例示される。
2013531801.tif 000088
【０１３５】
１１．アゾアリール
本発明の他の一般的なクラスのハプテンは、アゾアリール化合物、例えば下の第一一般化学式を有するアゾベンゼンである。
2013531801.tif 000089
Ｒ１−Ｒ２は上記した通りであり、アルコキシアリール、例えばメトキシアリール及びエトキシアリールを更に含む。また、２以上のＲ２置換基は、図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。例えば、２Ｒ２置換基は、縮合フェニル環、又は縮合複素環又はヘテロアリール構造を形成しうる。
【０１３６】
特定の開示のアゾアリール化合物は、第一アミン置換基及び第二アリール置換基を有する。これらの化合物は典型的には、次の式を有する。
2013531801.tif 000090
この一般式に関し、Ｒ２−Ｒ４はこのクラスのハプテンに関して上記した通りであり、特定の実施態様は、Ｒ２−Ｒ３脂肪族、具体的にはアルキル、より具体的には低級アルキル、及びＲ４水素を有する。
【０１３７】
アゾアリール化合物を記載する第三一般式を下に提供する。
2013531801.tif 000091
Ｒ２−Ｒ５は、この特定のクラスのハプテンについて上記した通りである。少なくとも１つのＲ２−Ｒ５は、コンジュゲートを形成するための、アゾアリールハプテンへのリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体のカップリングのための位置を定義する。例えば、Ｒ５はハロゲン化スルホニル官能基でありうる。例えば下に示すようなハロゲン化スルホニルは、アゾアリールハプテンへのリンカーのカップリングに有用な官能基である。
2013531801.tif 000092
この式に関して、Ｒ２−Ｒ５は上記した通りである。Ｘはハロゲン化物である。これらのアゾアリールハプテンの特定の実施態様、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホニルクロライドは下に提供する式を有する。
2013531801.tif 000093
【０１３８】
１２．ベンゾジアゼピン
本発明による他のクラスのハプテンは、下に示す第一一般式を有するベンゾジアゼピンハプテンである。
2013531801.tif 000094
Ｒ１−Ｒ５は上記した通りである。また、２以上のＲ５置換基は図示した一般式を有する化合物に結合又は縮合されている環系における原子、典型的には炭素原子でありうる。少なくとも１つのＲ１−Ｒ５位置は、リンカーに結合されているか、又はリンカー又はチラミン又はチラミン誘導体へのカップリングに適切な官能基によって占有される。Ｒ１−Ｒ５は最も典型的には脂肪族、アリール、水素、又はヒドロキシル、更により典型的にはアルキル、水素又はフェニルである。Ｙは酸素又は硫黄、最も典型的には酸素である。
【０１３９】
ベンゾジアゼピンハプテンの特定の実施態様は、下に示すようにＲ１アリールを有する。
2013531801.tif 000095
これらの実施態様について、Ｒ２−Ｒ５はこのクラスのハプテンについて上記した通りであり、より典型的には、このような置換基は独立して、脂肪族、特にアルキル、水素及びヒドロキシルから選択される。特定の開示の実施態様は、下に示すようにフェニル化合物である。
2013531801.tif 000096
また、Ｒ２−Ｒ６は上記した通りであるが、より典型的には、このような置換基は独立して、脂肪族、特にアルキル、水素及びヒドロキシルから選択される。特定の開示の実施態様はフェニル化合物であり、下に示す。特定の実施態様、４−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１,４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オンを下に提供する。
2013531801.tif 000097
【０１４０】
ＩＩＩ．リンカー
１．一般
一般式に示されるように
ハプテン−任意リンカー−チラミン／チラミン誘導体
本出願のコンジュゲートは、リンカーを含みうる。この目的のために現在知られているか、又は将来開発される任意のリンカーが、ここに開示のハプテンにカップリングすることによって本発明のコンジュゲートを形成するために使用できる。有用なリンカーは、ホモ−又はヘテロ二官能性でありうるが、より典型的にはヘテロ二官能性である。
【０１４１】
２．脂肪族
単に例であって限定するものではないが、開示のハプテンコンジュゲートの形成に適切な第一クラスのリンカーは、脂肪族化合物、例えば一又は複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖、又はアルキル鎖である。脂肪族鎖はまた典型的には末端官能基を含み、例であって限定するものではないが、ハプテン及び他の所望の化合物、例えばチラミンへのカップリングを容易にするカルボニル−反応基、アミン−反応基、チオール−反応基又は光−反応基を含む。鎖の長さは様々であり得るが典型的には、約３０原子の上限実用限界を有する。約３０炭素原子より長い鎖連鎖は、より小さい鎖連鎖を有する化合物より効果的でないことが証明されている。よって、脂肪族鎖リンカーは、典型的には、約１炭素原子〜約３０炭素原子の鎖長を有する。しかしながら当業者は、特定のリンカーが３０を超える原子を有し、依然としてチラミン又はチラミン誘導体へのハプテンの結合に効果的に作用し、依然としてコンジュゲートが所望するように機能する場合、このような鎖は発明の範囲内であることを理解するだろう。
【０１４２】
３．アルキレンオキシド
本開示の実施態様の実施に有用な第二クラスのリンカーは、アルキレンオキシドである。アルキレンオキシドは、グリコール、例えばエチレングリコールを参照することによってここに代表される。本発明のハプテンコンジュゲートは、リンカーの親水性がそれらの炭化水素鎖と比較して増加する場合、特に有用であると証明された。結果として、アルキレンオキシド、例えばグリコールは、この発明の実施に有用であると証明された。当業者は、酸素原子の数が増加すると、化合物の親水性も増加しうることを理解するだろう。よって、本発明のリンカーは典型的には（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎの式を有し、ここでｎは約２〜約１５であるが、より具体的には約２〜約８である。
【０１４３】
本発明の特定の開示の実施態様の実施に有用なヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、譲受人の同時係属出願に開示されており、"Nanoparticle Conjugates," U.S. Patent Application No.11/413,778, filed April 28, 2006; "Antibody Conjugates," U.S. Application No. 11/413,418, filed April 27, 2006; and “Molecular Conjugate,” U.S. Application No. 11/603,425, filed November 21, 2006を含み、全てのその出願を出典明記によってここに援用する。当業者は、これらの出願に開示のリンカーが、特定の結合部分、シグナル生成部分、及びハプテンを、全ての所望の組合せにおいて連結するために使用できることを理解するだろう。ヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーを下に開示し、それらの使用は、ハプテン及び検出可能な標識へのチラミンのカップリングを参照することによって例示される。
【０１４４】
開示のコンジュゲートとの使用のためのリンカーの一特定の実施態様は、下に示す一般構造を有するヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーであり：
2013531801.tif 000098
ここで、Ａ及びＢは異なる反応基を含み、ｘは２〜１０（例えば２、３又は４）の整数であり、そしてｙは１〜５０、例えば２〜３０、例えば３〜２０又は４〜１２の整数である。一又は複数の水素原子は、更なる官能基、例えばヒドロキシル基、アルコキシ基（例えばメトキシ及びエトキシ）、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、スルファト基及びアミノ基（モノ−及びジ−置換化アミノ基、例えばジアルキルアミノ基を含む）と置換されうる。
【０１４５】
リンカーのＡ及びＢは独立して、カルボニル−反応基、アミン−反応基、チオール−反応基又は光−反応基を含むが、同じではない。カルボニル−反応基の例は、アルデヒド−及びケトン−反応基、例えばヒドラジン誘導体及びアミンを含む。アミン−反応基の例は、活性エステル、例えばＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳ、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、炭酸、ハロゲン化アリール、イミドエステル、無水物及び同様なものを含む。チオール−反応基の例は、非重合性マイケルアクセプター、ハロアセチル基（例えばヨードアセチル）、ハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、求核性置換を受けうる芳香族基、例えばフルオロベンゼン基（例えばテトラ及びペンタフルオロベンゼン基）、及びジスルフィド基、例えばピリジルジスルフィド基及びエルマン試薬で活性化されるチオールを含む。光−反応基の例は、アリールアジド及びハロゲン化アリールアジドを含む。あるいは、Ａ及び／又はＢは、特定タイプの反応基と反応する官能基でありうる。例えば、Ａ及び／又はＢは、アミン基、チオール基、又はカルボニル−含有基であり得、それは、ハプテン及び／又はチラミン又はチラミン誘導体に導入されているか、そうでなければ存在する対応する反応基（例えばそれぞれアミン−反応基、チオール−反応基又はカルボニル−反応基）と反応するだろう。これらのタイプの基の各々の更なる例は、当業者に明瞭であろう。一タイプの反応基を他と交換するための反応条件及び方法に関する更なる例及び情報は、Hermanson, “Bioconjugate Techniques,” Academic Press, San Diego, 1996に提供されており、出典明記によってここに援用する。特定の実施態様では、チオール-反応基はビニルスルホン以外である。
【０１４６】
幾つかの実施態様では、ヘテロ二官能性リンカーは次の式を有し：
2013531801.tif 000099
ここで、Ａ及びＢは異なる反応基であり、上記した通りであり；ｘ及びｙは上記した通りであり、Ｘ及びＹは更なるスペーサ基であり、例えば、１及び１０の間の炭素、例えば１及び６の間の炭素又は１及び４の間の炭素を有し、場合によっては一又は複数のアミド結合、エーテル結合、エステル結合及び同様なものを含むスペーサ基である。スペーサＸ及びＹは同じであるか又は異なり得、直鎖、分岐又は環式（例えば、脂肪族又は芳香族環式構造）であり得、非置換又は置換でありうる。スペーサにおける置換基でありうる官能基は、カルボニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）原子、アルコキシ基（例えばメトキシ及びエトキシ）、ニトロ基、及び硫酸基を含む。
【０１４７】
特定の実施態様では、ヘテロ二官能性リンカーは次の式を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーを含み、
2013531801.tif 000100
ここで、ｎ＝１〜５０、例えば、ｎ＝２〜３０、例えばｎ＝３〜２０又はｎ＝４〜１２である。特定の実施態様では、ｎ＝４又は８である。
【０１４８】
ＩＶ．ハプテンコンジュゲート
ハプテンコンジュゲートは、ハプテン、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分、及び場合によってはリンカーを含む。ある実施態様では、ハプテン及びリンカーは、ペルオキシダーゼ活性可能部分にコンジュゲートされており、一般式
ハプテン−任意リンカー−ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分
を有する。
【０１４９】
幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼ活性化可能アリール部分はチラミン又はチラミン誘導体である。ある実施態様では、ハプテン及び任意リンカーはチラミンにコンジュゲートされており、一般式
ハプテン−任意リンカー−チラミン
を有する。
【０１５０】
他の実施態様では、ハプテン及び任意リンカーはチラミン誘導体にコンジュゲートされており、次の一般式を有する。
ハプテン−任意リンカー−チラミン誘導体
【０１５１】
チラミン誘導体の実施態様は、一般式
2013531801.tif 000101
を有し、ここで、Ｒ２５はヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換化アミンから選択され；Ｒ２６はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲｍ、−ＮＲｍ、及び−ＳＲｍから選択され、ここでｍは１−２０であり；ｎは１−２０であり；Ｚは酸素、硫黄、又はＮＲａから選択され、ここでＲａは水素、脂肪族、アリール、又はアルキルアリールから選択される。よって、コンジュゲート次の一般式を有する。
2013531801.tif 000102
【０１５２】
幾つかの実施態様では、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、ポドフィロトキシンベースの化合物、及びその組合せから選択される。リンカーは、存在するなら、脂肪族、ヘテロ脂肪族、又はヘテロ二官能性でありうる。
【０１５３】
ある実施態様では、コンジュゲートは、下の表１に示すような一般式を有する。表１における各々の一般式では、各Ｒ基の置換基、Ｘ、Ｙ、及びＺは、ハプテン、リンカー、及びチラミド誘導体の上記の検討において挙げた通りである。
2013531801.tif 000103
2013531801.tif 000104
【０１５４】
特定の実施態様では、コンジュゲートは、表２に示す式を有するハプテン−チラミドコンジュゲートである。
2013531801.tif 000105
2013531801.tif 000106
【０１５５】
Ｖ．ハプテンコンジュゲートの生成方法
幾つかの実施態様では、求電子性官能基を有するか、又は求電子性官能基に転換できる官能基を有するハプテンは、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分を含んでなる化合物に、又はリンカー，例えば、脂肪族又はポリ（アルキレンオキシド）リンカーにコンジュゲートされている。ある実施態様では、ハプテンは、カルボン酸官能基を含み、これは、限定するものではないが、ハロゲン化アシル、エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、又は無水物等の、活性化された求電子性カルボニル含有官能基に転換される。ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分は、ハプテンの活性化求電子性官能基と反応できる求核性官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、チオール、又はそれらから形成される陰イオン）を含む。ハプテンの求電子性基は、有機化学合成の当業者に知られている有機カップリング技術を使用して、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分の求核性基にカップリングできる。コンジュゲートがリンカーを含む実施態様では、リンカーは典型的には、一端に求核性官能基を有し、他端に求電子性官能基を有する。リンカーの求核性基はハプテンの求電子性基にカップリングされ得、リンカーの求電子性基は活性化され、有機化学合成の当業者に知られている有機カップリング技術を使用して、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分の求核性基にカップリングされうる。
【０１５６】
一実施態様では、下のスキーム１に示すように、カルボン酸官能基を有するハプテンは、リンカーを介してチラミンにコンジュゲートされている。ハプテンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にカップリングされ、ハプテン−ＮＨＳエステルを生成する。反応は、ハプテン及びＮＨＳが可溶性である溶媒において実施され；一適切な溶媒はジクロロメタンである。幾つかの実施態様では、Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミドがカップリング剤として使用される。尿素副産物は濾過によって除去され、活性エステルは更に精製することなく使用されうる。
【０１５７】
幾つかの実施態様では、ハプテン−ＮＨＳエステルはリンカーにカップリングされている。例えば、ハプテン−ＮＨＳエステルは、ＰＥＧアミノ酸を使用してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーにカップリングされ得、塩基条件下で（例えば、トリエチルアミン及びジクロロメタンの溶液中において）、ＰＥＧアミノ酸を用いる反応によって、対応するアミドに転換される。作用実施態様では、ｄＰＥＧ（登録商標）８アミノ酸 (Quanta BioDesign Ltd., Powell, OH)を使用した。産物は、フラッシュクロマトグラフィーによって精製されうる。
【０１５８】
ハプテン含有リンカーは、室温でＮＨＳ及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミドとの反応によって活性化され、カルボキシ−ＰＥＧ−ハプテンの対応するＮＨＳ  エステルを生成する。尿素副産物は濾過によって除去され、ＮＨＳ  エステルは更に精製することなく使用されうる。
【０１５９】
所望のハプテン−チラミドコンジュゲートは、ＮＨＳ  エステルのスクシンイミド部分の、チラミンとの置換によって得られる。反応は、ＮＨＳ  エステルが可溶性である溶媒中において実施され；一適切な溶媒はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。産物はフラッシュクロマトグラフィーによって精製されうる。
2013531801.tif 000107
【０１６０】
一実施態様では、ハプテンは３−ヒドロキシキノキサリン−２−カルボン酸であり、カップリング剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  （ＥＤＡＣ）である。ハプテン及びＮＨＳ  エステルは、適切な溶媒、例えばＤＭＦに溶解される。ハプテン−ＮＨＳ  エステルはＤＭＦに不溶性であり、濾過によって収集できる。残りの反応はスキーム１に概要するように実施され、リンカーカップリングはＤＭＦ／トリエチルアミンにおいて実施される。
【０１６１】
Ｖ．ハプテンコンジュゲートの使用方法
開示のハプテンコンジュゲートの実施態様は、シグナル増幅アッセイにおいて利用できる。シグナル増幅は、固相にペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分を共有結合するために、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性を利用する。固相は、顕微鏡スライド等の基質に固定化されている細胞又は細胞構造のタンパク質成分でありうる。幾つかのペルオキシダーゼ酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）は、過酸化物の存在下において、特定化合物、例えばフェノール化合物の二量体化を、おそらくフリーラジカルの生成によって触媒する。よって、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分が、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び過酸化物（例えば、過酸化水素）の存在下において、タンパク質含有サンプルに加えられる場合、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分はフリーラジカルを形成し、その後、チロシンアミノ酸のフェノール基と二量体を形成する。しかしながら、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分を、所望の標的か又はその近位においてサンプルと特異的に結合することが所望される。この目的は、下に記載のように、酵素を標的領域上に固定化することによって達成される。固定化酵素に近位であるペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分のみが、固定化酵素の近傍、又は近位においてチロシン残基と反応し二量体を形成し、酵素自身におけるチロシン残基、酵素がコンジュゲートされている抗体におけるチロシン残基、及び／又は固定化酵素に近位、例えば固定化酵素の約１００ｎｍ内、約５０ｎｍ内、約１０ｎｍ内、又は約５ｎｍ内であるサンプルにおけるチロシン残基を含む。例えば、チロシン残基は、固定化酵素から約１０オングストローム〜約１００ｎｍ，約１０オングストローム〜約５０ｎｍ、約１０オングストローム〜約１０ｎｍ、又は約１０オングストローム〜約５ｎｍの距離内でありうる。このような近位結合は、ＩＨＣ及び／又はＩＳＨと使用される一般的な染色方法と少なくとも同程度の特異性で、標的が検出されることを可能にする。例えば、開示の方法の実施態様は、核膜対核領域、細胞膜対細胞質領域など、サブ細胞構造が区別されることを可能にする。
【０１６２】
幾つかの実施態様では、ハプテンコンジュゲートは、チラミドシグナル増幅アッセイにおいて活用できるハプテン−チラミドコンジュゲートである。チラミドシグナル増幅は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、免疫細胞化学、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）検出スキームと適合性のあるペルオキシダーゼベースのシグナル増幅システムである。チラミドシグナル増幅アッセイは、「直接的」又は「間接的」でありうる。直接的チラミドシグナル増幅アッセイは、標識、例えば蛍光標識がチラミンに結合し、標識−チラミドコンジュゲートを形成する時に実施され、標識は、標識−チラミドコンジュゲートがサンプルに結合された後に検出される。間接的チラミドシグナル増幅アッセイは、ハプテンがチラミンに結合される時に実施される。蛍光又は酵素標識された抗ハプテン抗体は、ハプテンを検出するために使用される。
【０１６３】
開示の実施態様では、シグナル増幅アッセイは典型的には次の工程を含む：ａ）サンプル中における標的上に酵素を固定化する工程；ｂ）酵素がハプテンコンジュゲートと反応できるようにサンプルをハプテンコンジュゲートと接触させ、それによって固定化酵素に近位でサンプルへのハプテンコンジュゲートの結合を生じさせる工程；ｃ）サンプルを、ハプテンに結合可能な標識された抗ハプテン抗体と接触させる工程；及びｄ）任意の適切な手段によって標識された抗ハプテン抗体を検出することによって、サンプル中における標的を位置づけ又は可視化する工程。ある実施態様では、ハプテンコンジュゲートはハプテン−チラミドコンジュゲートである。標的は、その存在、位置及び／又は濃度が決定される任意の興味の分子でありうる。興味の分子の例は、タンパク質及び核酸配列を含む。
【０１６４】
典型的にはサンプルは、タンパク質、例えば組織サンプルを有する。典型的には、固定化酵素は、ペルオキシダーゼ−活性化可能アリール部分、例えばチラミドと反応できるペルオキシダーゼ酵素である。幾つかの実施態様では、酵素は、サンプルを標的に結合する酵素コンジュゲートでインキュベートすることによって標的上に固定化される。酵素は、標的に結合できる任意の部分にコンジュゲートされうる。適切な部分は、限定するものではないが、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又はアミノ酸を含む。
【０１６５】
他の実施態様では、酵素の固定化は複数工程プロセスである。例えば、サンプルは、標的に結合する第一部分（例えば、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド、又はアミノ酸）でインキュベートされうる。次いで、サンプルは、第一部分に結合できる部分を含んでなる酵素コンジュゲートでインキュベートされうる。第一部分が標的に対する抗体である幾つかの実施態様では、該２工程プロセスはより多用途であり得、なぜなら使用者が「ユニバーサル」酵素−抗体コンジュゲートを使用することが可能であるからである。例えば、第一抗体がウサギモノクローナル抗体である場合、酵素−抗体コンジュゲートは、任意のウサギモノクローナル抗体に結合できる抗体を含みうる。複数工程プロセスは、各標的に適した酵素−抗体コンジュゲートを生成する必要を排除できる。
【０１６６】
幾つかの実施態様では、第一部分は、標識されたプローブ、例えば標識されたオリゴヌクレオチドでありうる。プローブがサンプルにハイブリダイズされた後、標識を認識する第一抗体が導入され、標識されたプローブに結合する。第一抗体は酵素−抗体コンジュゲートでありうる。しかしながら、第一抗体が酵素にコンジュゲートされない場合、酵素−抗体コンジュゲートが導入され、ここで、コンジュゲートの抗体部分は、第一抗体を認識し結合する。
【０１６７】
一旦、酵素がサンプルに固定化されたら、ハプテンコンジュゲートが、酵素がペルオキシダーゼ-活性化可能アリール部分と反応できる適切な条件下で導入される。典型的には、酵素はペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼである。よって、適切な条件は、過酸化物 (例えば、過酸化水素)を含み、また酵素にその所望の機能を実施させる塩濃度及びpHを有する反応バッファー、又は溶液を含む。反応は、酵素に適切な温度で実施される。例えば、酵素が 西洋ワサビペルオキシダーゼである場合、反応は35-40℃で実施されうる。このような条件下で、ペルオキシダーゼ-活性化可能 アリール部分は過酸化物及び酵素と反応し、典型的には、固定化酵素自身内のチロシン残基を含む、固定化酵素に近位にチロシン残基に結合することによって、ペルオキシダーゼ-活性化可能 アリール部分は、サンプルに共有結合する活性形態に転換される。
【０１６８】
図１は、固定化組織サンプル１１０に、ハプテンコンジュゲート、例えばハプテン−チラミドコンジュゲート１００を結合する方法の一実施態様を示す概要図である。一次抗体１２０は、固定化組織サンプル１１０内においてエピトープ１３０に結合する。二次抗体１４０が導入され、一次抗体１２０に結合する。例えば、一次抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、二次抗体は、何れかのマウスＩｇＧ抗体に結合する抗マウス抗体でありうる。図１では、西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗体コンジュゲート１４０は二次抗体を含む。ハプテン−チラミドコンジュゲート１００を加える。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び過酸化物（例えば、過酸化水素）の存在中において、ハプテン−チラミドコンジュゲート１００は、酵素部位の近位に共有結合する。コンジュゲートは、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体コンジュゲート１４０内のチロシン残基、一次抗体１２０内のチロシン残基、又は例えばサンプル１１０内のタンパク質１５０中におけるチロシン残基に結合できる。図１は、チラミンのフェノール基がタンパク質中におけるチロシン残基のフェノール基に結合する時に形成される二量体１６０を図示する。
【０１６９】
ハプテンコンジュゲートがサンプルに結合した後、その存在は適切な手段によって検出される。幾つかの実施態様では、ハプテンは直接検出されうる。例えば、量子ドットにコンジュゲートされたハプテンは、特性波長で量子ドットの蛍光によって検出されうる。他の実施態様では、ハプテンは間接的に検出される。例えば、抗ハプテン抗体が導入され、ハプテンに結合されうる。ある実施態様では、抗ハプテン抗体は、抗体及び検出可能な標識を含んでなるコンジュゲートである。他の実施態様では、抗ハプテン抗体を認識する標識−抗体コンジュゲートがその後導入され、抗ハプテン抗体に結合される。標識は適切な手段によって検出される。
【０１７０】
図２は、ハプテン−チラミド／チロシン二量体１６０を検出する方法の一実施態様を示す。抗ハプテン抗体１７０が導入される。抗ハプテン抗体１７０は典型的には、抗体及び標識（例えば、フルオロフォア又は他の直接検出可能な標識）又はａｎ酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等）を含んでなるコンジュゲートである。図示する実施態様では、抗ハプテン抗体１７０はＨＲＰ−抗体コンジュゲートである。抗ハプテン抗体１７０は、ハプテン−チラミド／チロシン二量体１６０のハプテン部分に結合する。次いで、抗ハプテン抗体１７０は任意の適切な手段によって検出される。例えば、抗ハプテン抗体がＨＲＰ−抗体コンジュゲートである場合、３、３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）アッセイが、ＨＲＰの発色検出に使用されうる。他の実施態様では、抗ハプテン抗体は、フルオロフォア−抗体コンジュゲートであり得、フルオロフォア（例えば、量子ドット）はその蛍光によって検出されうる。
【０１７１】
図３Ａは、ハプテンコンジュゲートを使用して、サンプル中における標的オリゴヌクレオチド配列を検出する方法の一実施態様を示す。標的オリゴヌクレオチド配列を含むサンプル３００が提供される。標識３２０（例えば、標識されたＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドプローブ）を含む相補プローブ３１０が導入され、サンプル３００中における標的配列に結合する。抗標識抗体−酵素コンジュゲート３３０（例えば、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗標識抗体）が加えられ、標識３２０に結合する。ハプテンコンジュゲート、例えばハプテン−チラミドコンジュゲート３４０が導入される。ＨＲＰ及び過酸化物の存在中において、ハプテンチラミドコンジュゲート３４０は、チロシン残基（例えば、抗体−酵素コンジュゲート３３０中、又はサンプル３００内のチロシン残基）と反応し、抗体−酵素コンジュゲート３３０の近位に共有結合する。抗ハプテン抗体−標識コンジュゲート３５０が加えられ、ハプテン−チラミドコンジュゲート３４０に結合する。標識３５５が適切な手段によって検出される。作用実施態様では、標識３５５はＱｄ６５５量子ドットであり、６５５ｎｍでのその蛍光を蛍光顕微鏡を使用して検出した。
【０１７２】
図３Ｂは、ハプテンコンジュゲートを使用して、サンプル中における標的オリゴヌクレオチド配列を検出する方法の他の実施態様を示す。標的オリゴヌクレオチド配列を含むサンプル３００が提供される。標識３２０（例えば、標識されたＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドプローブ）を含む相補プローブ３１０が導入され、サンプル３００中における標的配列に結合する。作用実施態様では、標識３２０はＤＮＰであった。抗標識抗体３３２（例えば、抗ＤＮＰ抗体）が加えられ、標識３２０に結合する。酵素−抗体コンジュゲート３３４（例えば、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗体）がその後、抗体３３２に結合する。ハプテン−チラミドコンジュゲート３４０が導入される。ＨＲＰ及び過酸化物の存在中において、ハプテン−チラミドコンジュゲート３４０は、チロシン残基（例えば、酵素−抗体コンジュゲート３３４中、抗体３３２中、又はサンプル３００内におけるチロシン残基）と反応し、酵素−抗体コンジュゲート３３４に近位に共有結合する。抗ハプテン抗体３５２が加えられ、ハプテン−チラミドコンジュゲート３４０に結合する。次に、抗ハプテン抗体３５２を認識し、結合する標識された抗体３６０が加えられる。標識３６２は適切な手段によって検出される。作用実施態様では、標識３６２はＱｄ６５５量子ドットであり、６５５ｎｍでのその蛍光を蛍光顕微鏡を使用して検出した。
【０１７３】
幾つかの実施態様では、ハプテンコンジュゲートは、サンプル中における異なるタンパク質及び／又はオリゴペプチド標的のマルチプレックス検出に使用される。マルチプレキシングは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光ＩＨＣ／ＩＳＨ、又はその任意の組合せを用いて実施されうる。図４は、３つのタンパク質及び／又はオリゴペプチド標的のマルチプレックス検出の方法の一実施態様を示す。サンプル４００は、複数の標的４０２、４０４、４０６を含む。第一一次抗体４１０は第一標的４０２に結合する。第一抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２０が導入され、一次抗体４１０に結合する。第一ハプテンコンジュゲート４３０が加えられる。過酸化物及びペルオキシダーゼの存在中において、ハプテンコンジュゲート４３０は、第一標的４０２の近位に共有結合する。幾つかの実施態様では、第一抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２０が、過剰の過酸化物の添加などによって非活性化され、サンプルは、過剰の過酸化物を除去するために洗浄される。非活性化は、第一ペルオキシダーゼ及び後続ハプテン−チラミドコンジュゲート間の何れかの反応を排除するために実施されうる。次いで、第二一次抗体４１２が加えられ、第二標的４０４に結合する。第二抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２２が導入され、第二一次抗体４１２に結合する。第二ハプテンコンジュゲート４３２が加えられる。過酸化物及びペルオキシダーゼの存在中において、第二ハプテンコンジュゲート４３２は、第二標的４０４の近位に共有結合する。幾つかの実施態様では、第二抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２２が、過剰の過酸化物の添加によって非活性化され、サンプルは、過剰の過酸化物を除去するために洗浄される。次いで第三一次抗体４１４が加えられ、第三標的４０６に結合する。第三抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２４が導入され、第三一次抗体４１４に結合する。第三ハプテンコンジュゲート４３４が加えられる。過酸化物及びペルオキシダーゼの存在中において、第三ハプテンコンジュゲート４３４は、第三標的４０６の近位に共有結合する。
【０１７４】
特定の実施態様では、抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート４２０、４２２、４２４は同じであり、全３つの一次抗体を認識できる抗体を含む。例えば、一次抗体４１０、４１２、４１４が、それらのそれぞれの標的に特異的なマウスモノクローナル抗体である場合、抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートはヤギ抗マウス抗体を含みうる。
【０１７５】
典型的にはハプテンコンジュゲート４３０、４３２、４３４は、互いに異なるハプテンを含む。ハプテンは、上記の方法の実施態様を使用して検出される。典型的には、各々のハプテンを検出するために異なる標識が使用され、３つの標的４０２、４０４、４０６が互いに区別可能である。
【０１７６】
ハプテン-チラミドコンジュゲートを伴うハプテン-チラミドコンジュゲートにおける少なくとも幾つかのハプテンの有用性は、直接的結合アッセイにおけるハプテンの有用性と比較して予測不可能できない。実際、チラミドシグナル増幅アッセイにおける特定のハプテンの有用性は、直接的結合アッセイにおけるハプテンの有用性と逆相関した。例えば、幾つかのハプテン(例えば、DIG及びDNP)は、直接的アッセイにおいて使用される時、例えば、ハプテン-抗体複合体が標的に結合する時、頑強なシグナルを生成する。しかしながら、幾つかの頑強なハプテンは、チラミドシグナル増幅アッセイにおける使用に容認できず、そこではそれらは高バックグラウンドノイズを生成し、低シグナル:バックグラウンドノイズ比を生じる。例えば、扁桃組織において抗体を可視化するためにスクリーニングアッセイを使用する場合（実施例２を参照）、5.5 μMの濃度で適用される場合、DIG-チラミドコンジュゲートは、1.33のシグナル/ノイズ比を生成する。55μμMの濃度では、シグナル:ノイズ比は1.07であった。DNP-チラミドコンジュゲートは、5.5μMで 2.67のシグナル:ノイズ比を生じる。逆に、直接アッセイにおいて弱い検出のみを提供する他のハプテンは、驚くべきことに優れた結果を生じた。例えば HQ-, ローダミン-,及びDABSYL-チラミドコンジュゲートは、各々 、55 μMの濃度で適用された場合、16のシグナル:ノイズ比を生じた。ロテノン コンジュゲートは、 15のシグナル:ノイズ比を生じた。
【０１７７】
予期しなかった結果はまた、ハプテンがプローブに直接結合された場合に得られるシグナル、及びチラミドシグナル増幅 がハプテン-チラミドコンジュゲートを使用して実施された時に得られるシグナルを含んでなるmRNA-ISHアッセイにおいても見られた(実施例3を参照のこと)。結果は、特定のハプテン-チラミドコンジュゲートの性能が、対応するハプテン化RNAプローブの性能から予測できないことを示した。驚いたことに、BD-, DIG-, HQ-, 及びNCA-チラミドコンジュゲートは全て強いシグナルを生成したが、それらのそれぞれのハプテン化プローブはほとんどあるいは全くシグナルを生成しなかった。
【０１７８】
幾つかの実施態様では、ハプテンコンジュゲートは、RNA-ISHアッセイを使用する、組織サンプルにおける複数の遺伝子のマルチプレックス検出に使用される(実施例5を参照)。マルチプレックスアッセイは、複数標的遺伝子からの遺伝子発現の同時の可視化及び評価を可能にする。遺伝子発現データは、癌患者のための治療法選択に影響しうる。例えば、乳癌に関与する特定遺伝子に対応するmRNAレベルは、患者のリスクに相関する。乳癌のリスク及び評価に関連した例示的なmRNA標的は、増殖標的(例えば、Ki-67, STK15, Survivin, Cyclin B1, MYBL2)、浸潤標的(例えば、ストロメライシン3, カテプシンL2)、HER2 標的(例えば、HER2, GRB7)、エストロゲン標的(例えば、ER, PGR, Bcl2, SCUBE2)、及び他の標的(例えば、GSTM1, CD68, BAG1)を含む。RNAレベルの決定は、各患者に特定の治療計画を作成するのに有用なデータを、臨床医に提供する。
【０１７９】
組織サンプルが得られ、固定される。興味の特定のRNA標的にハイブリダイズできるハプテン標識されたプローブが調製され、固定化組織サンプルとハイブリダイズされる。各プローブは異なるハプテンで標識され、異なるRNA標的にハイブリダイズされる。幾つかの実施態様では、ハイブリダイゼーションシグナルは、シグナル増幅を使用して増加され、各プローブの近傍に堆積されるハプテンの数を増加する。ハプテンは、互いに異なる波長で蛍光を発することができる量子ドットにコンジュゲートされた抗ハプテン抗体を使用する。マルチプレックスRNA-ISHアッセイは、サンプル中における各標的に点状シグナルを生成し、組織サンプル内の各標的の存在及び相対量の同時評価を可能にする。所望であれば、各プローブは、適切な波長で特定量子ドットからの蛍光を検出するために、波長フィルターを使用して個々に検出できる。幾つかの実施態様では、シグナルは、各画像におけるバックグラウンドより上のピクセルの数を計数することによって定量化される。
【０１８０】
他の実施態様では、組織に結合した全ての量子ドットからの蛍光を示す合成スペクトル画像が、干渉スペクトル画像を使用して得られる。量子ドットは、紫外線、例えば370 nmを使用して励起され、量子ドットの蛍光の画像は、広域スペクトル、例えば450-800 nmにわたって、例えば3-5 nmごとに様々な波長で得られ、合成スペクトル画像が生成される。量子ドットは、狭ガウス分布において蛍光を放出し、量子ドットの特性波長でスペクトルピークを生じ、例えばQd655は655 nmでスペクトルピークを生じるだろう。この狭分布は、合成スペクトル画像が、適切なソフトウェアパッケージ、及び定量化される各量子ドットからのシグナルを使用して非混合されることを可能にする。合成スペクトル画像を非混合するために、各分離画像における各ピクセルの光強度が、各々の画像化波長で決定される。平均バックグラウンド強度が画像について決定され、バックグラウンドに匹敵する光強度を有する任意のピクセルに、ゼロの値を割り当てる。ピクセルの光強度の激増が、その位置での量子ドットがその放出スペクトルと共に画像化される時、見られ、ピクセルは、その波長について１の値が割り当てられる。量子ドットシグナルは、各量子ドットの特性波長で１の値が割り当てられた、画像におけるピクセルの数を計数することによって定量化される。この手順はまた、共局在量子ドット、すなわち、画像の同じピクセル位置に位置する２つの異なる量子ドット(例えば、Qd525及びQd605)を検出することができる。ソフトウェアが逐次画像をステップスルーすると、特定のピクセル位置での光強度が第一波長(例えば、525 nm)で増加し、第一波長で蛍光を放出する第一量子ドットの存在を示す。ソフトウェアが画像をステップスルーすると、そのピクセル位置での光強度は、バックグラウンドに戻り、次いで、また、第二波長(例えば、605 nm)を増加し、第二波長で蛍光を放出する第二量子ドットの存在を示す。
【０１８１】
図５Ａ及び５Ｂは共に、マルチプレックスＲＮＡ−ＩＳＨアッセイの一実施態様を示す。異なるハプテン８０６、８０８で標識された複数のアンチセンス又はセンス鎖ＲＮＡプローブ８０２、８０４が組織サンプルでハイブリダイズされ、それらのそれぞれの遺伝子標的８１０、８１２に結合する。内因性ペルオキシダーゼが、ペルオキシダーゼインヒビターによって非活性化される。幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼは過剰の過酸化物の添加によって非活性化され、サンプルは過剰の過酸化物を除去するために洗浄される。ハプテン８０６を認識し、結合できる第一酵素コンジュゲートの抗ハプテンモノクローナル抗体８１４を、組織サンプルに加え、反応させる。幾つかの実施態様では、酵素はペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシド（ＨＲＰ）８１６である。次いで、組織サンプルを、過酸化物の存在中において、ハプテン８０６を含むハプテン−チラミドコンジュゲート８１８でインキュベートすることによって、ハプテン８０６を増幅させた。ハプテン−チラミドコンジュゲート８１６が酵素と反応すると、複数のハプテン−チラミドコンジュゲート８１８がプローブ８０２の近傍に析出される。ＨＲＰ８１６は、ペルオキシダーゼインヒビターを使用して不活性化される（「Ｘ」で示される）。
【０１８２】
ハプテン８０８を認識し、結合できる第二酵素コンジュゲートの抗ハプテンモノクローナル抗体８２０を組織サンプルに加え、反応させる。組織サンプルを、過酸化物の存在中において、ハプテン８０８を含むチラミド−ハプテンコンジュゲート８２２でインキュベートすることによって、ハプテン８０８を増幅させる。ハプテン−チラミドコンジュゲート８２２が酵素と反応すると、複数のハプテン−チラミドコンジュゲート８２２が、プローブ８０４の近傍に堆積される。更なるハプテン化プローブが使用される場合、各ハプテンを増幅するために工程が反復される。
【０１８３】
各ハプテンが増幅された後、抗ハプテンモノクローナル抗体−量子ドットコンジュゲート８２４、８２６の混合が、組織サンプルに加えられる。各コンジュゲート８２４、８２６は、個々のハプテン、例えばハプテン８０６又は８０８をそれぞれ認識し結合できる抗体８２８、８３０を含む。各コンジュゲート８２４、８２６はまた、異なる量子ドット８３２、８３４を含む。例えば、量子ドット８３２は６５５ｎｍで蛍光を放出するＱ６５５であり得、量子ドット８３４は５２５ｎｍで蛍光を放出するＱｄ５２５でありうる。
【０１８４】
幾つかの実施態様では、ハプテン−チラミドコンジュゲートは、ＲＮＡ−ＩＳＨアッセイを使用し、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）を検出するために使用される（実施例６参照）。マイクロＲＮＡは、翻訳抑制などによって遺伝子発現を負に調節する、小、非コーディングＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ-２０５は、胚発生の間に組織リモデリングを促進させるプロセスである、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を制御する。しかしながら、ＥＭＴは、腫瘍転移における初期工程でもある。ｍｉＲ−２０５等のマイクロＲＮＡの下方制御は、腫瘍進行における重要な工程でありうる。例えば、ｍｉＲ−２０５の発現は、幾つかの乳癌において下方制御又は欠失されている。ＭｉＲ−２０５はまた、扁平細胞及び非小細胞肺癌を層別化するために使用できる(J. Clin Oncol., 2009, 27(12):2030-7)。他のｍｉｃｒｏＲＮＡは、血管新生シグナル伝達カスケードを調節することが分かっている。例えば、ｍｉＲ−１２６の下方制御は、血管新生を通して癌進行を悪化させ、炎症を増加させうる。よって、マイクロＲＮＡ発現レベルは、疾患状態の指標でありうる。
【０１８５】
ＶＩ．キット
本開示の開示の実施態様は、発明の方法の様々な実施態様を実施するためのキットを含む。キットは、ここに開示のハプテンコンジュゲート、例えばハプテン−チラミドコンジュゲート又はハプテン−チラミド誘導体コンジュゲートを含む。幾つかの実施態様では、キットは、過酸化物溶液、例えば過酸化水素溶液を更に含む。特定の実施態様では、キットは、ＨＱ−チラミドコンジュゲート及び過酸化水素溶液を含む。
【０１８６】
幾つかの実施態様では、キットは、ここに開示の複数のハプテンコンジュゲート、例えばハプテン−チラミドコンジュゲート及び／又はハプテン−チラミド誘導体コンジュゲートを含む。このようなキットは、サンプル中における複数の標的のマルチプレックス検出に特に有用でありうる。ある実施態様では、キットは、サンプル中における一又は複数の標的に結合できる一又は複数のハプテン標識されたプローブを更に含みうる。
【０１８７】
特定の実施態様では、キットは、抗ハプテン抗体，抗ハプテン抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート、抗体−標識コンジュゲートを更に含み得、ここで、抗体は、抗ハプテン抗体、抗ハプテン抗体−標識コンジュゲート、又はその任意の組合せを認識し、結合できる。標識は、抗体にコンジュゲートできる任意の検出可能な標識でありうる。検出可能な標識は、例えば、発色アッセイにおいて検出できる酵素、及び蛍光アッセイにおいて検出できる量子ドットを含む。
【０１８８】
幾つかの実施態様では、キットは、標識の検出に適切な試薬を更に含みうる。例えば、標識がＨＲＰの場合、キットは、３,３’-ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）アッセイを実施するための試薬を含みうる。
【０１８９】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、作用実施態様及び一般プロトコルのある特定の特徴を説明するために提供される。発明の範囲は、以下の実施例によって例示されるこれらの特性に限定されない。
【０１９０】
実施例１
ハプテン-ｄＰＥＧ（登録商標）８-チラミド合成
この実施例は、ハプテン-リンカー-チラミドコンジュゲートの形成に適した一方法を説明する。
【０１９１】
ハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを合成する一般的手順
スキーム1 (セクションIV)に示す合成は、下記の異なる合成によって調製されたHQ (3-ヒドロキシキノキサリン)以外の、ハプテンのためのハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを調製するために使用した。ハプテンは、BD (ベンゾジアゼピン), BF (ベンゾフラザン), DABSYL (4-(ジメチルアミノ)アゾベンゼン-4'-スルホンアミド), DCC (7-(ジエチルアミノ)クマリン-3-カルボン酸), DIG (ジゴキシゲニン), DNP (ジニトロフェニル), FITC (フルオレセインイソチオシアネート), NCA (ニトロケイ皮酸), NP (ニトロピラゾール), PPT (ポドフィロトキシン), Rhod (ローダミン), ROT (ロテノン),及びTS (チアゾールスルホンアミド)を含んだ。合成は、カップリング剤としてN,N'-ジシクロヘキシル-カルボジイミドを使用して、ハプテン NHS エステルを生成することから始めた。尿素副産物を濾過オフし、活性エステルを更に精製することなく使用した。次いで、活性エステルを、塩基条件下でdPEG（登録商標）8 アミノ酸 (Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH)にカップリングさせ、産物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カルボキシ-dPEG（登録商標）8-ハプテンのＮＨＳエステルを、上記で詳細に示したように、N,N'-ジシクロヘキシル-カルボジイミドを使用して生成した。なるべく少量のチラミンでの処理と、その後のフラッシュクロマトグラフィーから、ハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドを得た。
【０１９２】
個々のチラミドコンジュゲート
記:全ての実施例において、ハプテン dPEG（登録商標）8 NHS エステルは、上記で詳細に示したように合成した。
【０１９３】
N-(30-(4-ヒドロキシフェニル)-27-オキソ-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサ-28-アザトリアコンチル)ベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-5-カルボキサミド (BF):
2013531801.tif 000108
活性 エステル中間体(1.26 mmol)及びチラミド (1.64 mmol)を3mLの乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。残留物を濃縮し、最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、765 mgのチラミド産物(86 %) を厚油として得た。
【０１９４】
2,4-ジニトロフェニル-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (DNP):
2013531801.tif 000109
活性 エステル中間体(1.31 mmol)及びチラミド (1.31 mmol)を４ｍＬの乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、837 mgのチラミド産物(88 %)を厚黄色油として得た。
【０１９５】
7-(ジエチルアミノ)-N-(30-(4-ヒドロキシフェニル)-27-オキソ-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサ-28-アザトリアコンチル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキサミド (DCC):
2013531801.tif 000110
活性 エステル中間体(1.26mmol)及びチラミド (1.26 mmol)を3mL の乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５０８  ｍｇのチラミド産物（７１  ％）を厚黄色油として得た。
【０１９６】
4,5-ジメトキシ-2-ニトロ桂皮酸-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (NCA):
2013531801.tif 000111
活性 エステル中間体(1.45 mmol)及びチラミド (1.60 mmol)を3mL の乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、 958 mgの チラミド産物(83 %) を厚油として得た。
【０１９７】
2-アセトアミド-4-メチル-5-チアゾールスルホンアミド-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (TS):  
2013531801.tif 000112
活性 エステル中間体(2.27 mmol)及びチラミド (2.72 mmol) を5mL の乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、 1.255 g のチラミド産物(71 %) を厚油として得た。
【０１９８】
2-(2-(2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[b][1,4]ジアゼピン-4-イル)フェノキシ)-(27-オキソ-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサオクタコシル)カルボキシ-チラミド (BD):  
2013531801.tif 000113
活性 エステル中間体(0.706 mmol)及びチラミド (0.706 mmol)を3mL の乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、 536 mgのチラミド産物(91 %)を 厚油として得た。
【０１９９】
5-ニトロ-3-ピラゾール-dPEG（登録商標）8カルボキシチラミド (NP):
2013531801.tif 000114
活性 エステル中間体(1.27 mmol)及びチラミド (1.33 mmol)を3mLの 乾燥ＤＭＦに採り、 乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。 残留物を濃縮し、 最小限のDCMに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、730 mg の チラミド産物(79 %)を 厚油として得た。
【０２００】
ピラゾポドフィラミド-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (PPT):  
2013531801.tif 000115
活性 エステル中間体(7.65 μmol)及びチラミド (7.29 μmol)を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。反応混合物をsemi-preparative HPLCによって精製し、4.4μmolの チラミド産物(61 %)を 厚油として得た。
【０２０１】
ロテノンイソオキサゾリンアミド-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (ROT):  
2013531801.tif 000116
活性 エステル中間体(7.65 μmol)及びチラミド (7.29 μmol) を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で乾燥ＤＭＦに採り、乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。  反応混合物をsemi-preparative HPLCによって精製し、 5.3μmolのチラミド産物(73 %) を厚油として得た。
【０２０２】
4-(ジメチルアミノ)アゾベンゼン-4'-スルホンアミド-dPEG（登録商標）8-カルボキシチラミド (DABSYL):  
2013531801.tif 000117
活性 エステル中間体(7.65 μmol)及びチラミド (7.29 μmol)を  １０ｍｇ／ｍＬの濃度で乾燥ＤＭＦに採り、 乾燥窒素下で１６時間攪拌させた。反応混合物を分取用（semi-preparative ）HPLCによって精製し、6.3μmol の チラミド産物(87 %) を厚油として得た。
【０２０３】
HQ-dPEG（登録商標）8-チラミド
3-ヒドロキシ-N-(30-(4-ヒドロキシフェニル)-27-オキソ-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサ-28-アザトリアコンチル)キノキサリン-2-カルボキサミド (HQ):10 mLの乾燥ＤＭＦ中における3-ヒドロキシキノキサリン-2-カルボン酸 (11.55 mmol, 1.0当量)の溶液に、EDAC (17.33 mmol, 1.5当量)及びN-ヒドロキシスクシンイミド (17.33 mmol, 1.5当量)を加え、反応物を乾燥窒素下で16時間攪拌した。反応物を焼結ガラス漏斗を通して濾過し、黄色沈殿物を2 mLの DMFで２回洗浄し、真空下で乾燥させ、3.25 g (11.3 mmol, 98%) の 活性 エステル 1を黄色固体として得た。
2013531801.tif 000118
【０２０４】
5 mLの乾燥ＤＭＦ中における2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 3-ヒドロキシキノキサリン-2-カルボキシレート 1 (2.1 mmol, 1.0当量)の溶液に、アミノ-dPEG（登録商標）8-カルボン酸 (2.3mmol, 1.1当量)及びトリエチルアミン (3.45 mmol, 1.5当量)を加え、反応物を乾燥窒素下で３時間攪拌させた。反応物を真空下で濃縮し、最小限の DCMに採った。0.5% AcOHを有する10-20% MeOH / DCMで溶出する自動フラッシュクロマトグラフィーにより、1.21 g (1.97 mmol, 94%)のアミノ酸 2 を黄色油として得た。
2013531801.tif 000119
【０２０５】
10 mLの乾燥DCM中における1-(3-ヒドロキシキノキサリン-2-yl)-1-オキソ-5,8,11,14,17,20,23,26-オクタオキサ-2-アザノナコサン-29-オイック酸 2 (2.18 mmol, 1.0当量)の溶液に、 DCM (3.27 mmol, 1.5当量)及びN-ヒドロキシスクシンイミド (3.27mmol, 1.5当量)中における1.0 Mの DCCを加え、反応物を乾燥窒素下で16時間攪拌した。反応物を焼結ガラス漏斗を通して濾過して尿素副産物を除去し、残留物を真空下で乾燥させ、1.35 gの活性 エステル 3を得て、これを更に精製することなく使用した。
2013531801.tif 000120
【０２０６】
5 mLの乾燥ＤＭＦ中の2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(3-ヒドロキシキノキサリン-2-イル)-1-オキソ-5,8,11,14,17,20,23,26-オクタオキサ-2-アザノナコサン-29-oate 3 ( 0.49 mmol, 1.0当量)の溶液に、チラミン (0.54 mmol, 1.1当量)を加え、反応物を乾燥窒素下で18時間攪拌させた。反応を、DCMで、次いで飽和炭酸水素ナトリウムで２回、次いでブラインで２回希釈し、有機層を真空下で濃縮し、最低限のDCMに採る。5-20% MeOH / DCMで溶出される自動フラッシュクロマトグラフィーにより、0.312 g (0.426 mmol, 86%)のハプテン-チラミドコンジュゲート 4を厚黄色油として得た。
2013531801.tif 000121
3-ヒドロキシ-N-(30-(4-ヒドロキシフェニル)-27-オキソ-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサ-28-アザトリアコンチル)キノキサリン-2-カルボキサミド
【０２０７】
合成ハプテン-チラミドコンジュゲートをHPLC, UV/VIS,及び質量分析によって特徴付けた。HPLCを、8μLの注入量、15.0分のランタイム、254 nmでの吸光度測定で実施した。水/アセトニトリル勾配を実施するWaters C18 X-Bridge 4.6 x 100 mm (5 μ)カラムを使用した。UV/VISスペクトルを200-600 nmの範囲にわたって得た。質量分析を、100-3000の取得m/z範囲を用いてESI を使用しJEOL AccuTOFにおいて実施した。合成され、後の実施例において使用される特定のハプテン-チラミドコンジュゲートの構造を下の表３に示す。
2013531801.tif 000122
2013531801.tif 000123
【０２０８】
実施例2
チラミド-ハプテンコンジュゲートの比較のための扁桃組織におけるbcl2 (124)抗体の評価
この実施例は、チラミド-ハプテンコンジュゲートを使用した、扁桃組織におけるbcl2 (124)抗体の可視化を実証する。ハプテンをポリエチレングリコールリンカーによってチラミンにコンジュゲートさせ、実施例1に記載するようにハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを形成した。評価したハプテンはBD, BF, DABSYL, DCC, DIG, DNP, FITC, HQ, NCA, NP, PPT, Rhod, ROT,及びTSを含む。
【０２０９】
扁桃組織切片を有するスライドを、自動染色装置(BenchMark（登録商標）XT, Ventana Medical Systems, Inc, (VMSI) Tucson, AZ)の標準プロトコルを使用して作った。典型的な自動プロトコルは次の通りである。
【０２１０】
スライド上のパラフィンコートされた組織を75℃に8分間加熱し、EZPrep (VMSI #950-102)で一度処理し、液体カバースリップ (LCS, VMSI #650-010)の適用の前に体積を75℃で調整した。７５℃での更なる８分のインキュベーション後、スライドをすすぎ、EZPrep体積を調整し、その後LCSによって組織を脱パラフィンした。スライドを37℃まで冷却し、4分間インキュベートした。スライドをEZPrepで十分にすすぎ、その後LCSを適用した。スライドを95℃に8分間加熱し、その後LCSを適用した。次いで、スライドを100℃に加熱し、4分間インキュベートした。毎4分間、24分間、セルコンディショニング液(CC1, VMSI #950-124)及びLCSをスライドの乾燥を防ぐために適用した。反応バッファー(VMSI #950-300)で２回すすいだ後、100μL のUVインヒビター (VMSI ultraView DAB Detection Kit #760-500の要素)をスライドに適用し、4分間インキュベートした。スライドを反応バッファーで一度すすいでから、100 μL のbcl2 (124)抗体 (VSMI #760-4240)を16分間 37℃で適用した。スライドを反応バッファーで３回すすいでから、100 μL のブロッキング溶液(10% デキストラン硫酸ナトリウム塩(avg. MW 10K), 2.5M 塩化ナトリウム, 1% BSA, 0.1% 冷却された魚の皮膚ゼラチン, 0.1% Triton（登録商標）X-100, 0.05% Tween（登録商標）20, 0.1% Proclin（登録商標）300) 及び 100 μL のultraView HRP universal multimer (VMSI ultraView DAB Detection Kit #760-500の一要素)を添加した。２試薬を37℃で20分間、共にインキュベートした。
【０２１１】
スライドを 反応バッファーで４回すすいでから、100 μL の チラミド ハプテンコンジュゲートを手動でスライドに適用した。チラミド-ハプテンコンジュゲートを、チラミド増幅希釈剤 (0.75 mM スズ酸ナトリウム, 40 mM ホウ酸, 10 mM 四ホウ酸ナトリウム十水和物,及び30 mM 塩化ナトリウム)中において、55 μM及び5.5 μMに希釈した。手動適用が完了した後、100 μL のultraView H2O2をスライドに適用し、12分間37℃でインキュベートした。スライドを反応バッファーにおいて３回洗浄した後、100μL のブロッキング溶液と、HRPにコンジュゲートされたそれぞれのマウス抗ハプテンモノクローナル抗体の100μL の 5 μg/mL溶液を8分間 37℃で共インキュベートした。HRPコンジュゲートを、13.5 mg/mLの加水分解カゼインと共に、0.1 M PBSバッファー, pH 7.2中において希釈した。反応バッファーで4回すすいだ後、100 μLの両ultraView DAB及びultraView H2O2をスライドに適用し、LCSを用い37℃で8分間共インキュベートした。100 μLのUltraView Copperをスライドに適用する前に、スライドを反応バッファー中において1回すすぎ、4分間 37℃でインキュベートした。次いで、スライドを反応バッファーで2回すすいだ後、ヘマトキシリンII (VMSI #750-2021)で対比染色し、これをスライド上で、LCSを用い4分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、ブルーイング試薬(VMSI #760-2037)を適用し、対比染色を完了させるために4分間インキュベートした。器具からスライドを外し、固体カバースリップの手動適用の前に洗剤で処理した。
【０２１２】
スライドを明視野顕微鏡を通して見た。スライドの写真を図6-33に示す。表4に示す結果は、1-4のスケールにおけるシグナル強度（例えば、染色の強度）の主観的スコアを含み、4が最も強く染色されている。バックグラウンド(BG) スコア and シグナル:ノイズ比も提供する。
2013531801.tif 000124
例示的な結果を提供するコンジュゲートは、DABSYL-、HQ-、ローダミン-、及びロテノン-チラミドコンジュゲートを含む(図8-9、20-21、及び28-31)。暗い染色が好ましい場合、NCA-及びNP-チラミドコンジュゲートも優れた結果を生成する(図22-25)。染色暗度は、例えばチラミド-ハプテンコンジュゲートのインキュベーション時間の調節、一次抗体濃度の調節（すなわち、この実施例におけるbcl2 (124)抗体）、及び／又は一次抗体インキュベーション時間の調節によって調節できる。
【０２１３】
実施例3
mRNA-ISHアッセイにおける天然抗ハプテンシグナル及びハプテン-チラミドコンジュゲートシグナルの比較
この実施例は、ハプテンがプローブに直接結合される時にmRNA-ISHアッセイにおいて得られるシグナルと、チラミドシグナル増幅がハプテン-チラミドコンジュゲートを使用して実施される時に得られるシグナルとを比較する。ハプテンは、実施例1に記載のように、ポリエチレングリコールリンカーを介してチラミンにコンジュゲートされ、ハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを形成する。BD、BF、DABSYL、DCC、DIG、DNP、HQ、NCA、NP、PPT、ROT、及びTS ハプテンを評価した。
【０２１４】
天然抗ハプテンシグナル決定
ドットブロット構成。Genoramaスポッティング溶液に懸濁された異なる濃度の３の１マイクロリットル滴のセンス鎖又はアンチセンス鎖ACTB (ベータ-actin) RNAを、Asper SA-1マイクロアレイ(Asper Biotech Ltd., Tartu, Estonia)の異なる領域にスポットし、スライドを室温で乾燥させた。RNAを、300 mJのUV照射を使用してスライドにクロスリンクした。
【０２１５】
ドットブロットハイブリダイゼーション。Mirusリンカーアームを使用して異なるハプテンで化学的に標識されたACTBアンチセンスリボプローブを、製造者の指示に従い調製した(Mirus Bio LLC, Madison, WI)。１００ナノグラムの各プローブを、1 mLのRibohybeＴＭ(VMSI #760-104)溶液に再懸濁させ、異なるディスペンサーにおいて。RNAを、Asper SA-1マイクロアレイスライドに付け、UVクロスリンクさせた。調製したドットブロットスライドをDiscovery（登録商標）XT instrument (VMSI)に搭載し、一滴(100 μL)のハプテン化（haptenylated）アンチセンスACTBリボプローブをスライドに分注し、80℃で8分間変性させ、65℃で6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを75℃で8分間、0.1x SSC (塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムバッファー, VMSI #950-110)を使用して３回洗浄した。各々独自にハプテン化したプローブを、5 μg の同族天然抗ハプテン抗体、その後ビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体 (VMSI #213-2194)及び量子ドット (Qd) 655にコンジュゲートされたストレプトアビジン(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して検出した。スライドを勾配アルコールを使用して脱水し、カバースリップを使用した。
【０２１６】
ドットブロットシグナル定量化。ドットブロットスライドを、Spectral Imaging camera (Applied Spectral Imaging (ASI), Vista, CA)を装着したZeiss 蛍光顕微鏡を使用して分析した。ドットブロットスライドあたり、各々３のセンス(実験)及び アンチセンス (ネガティブコントロール)スポットの画像を、40X対物及びASIソフトウェアパッケージを使用して撮った。Qd655コンジュゲート抗体から生成される各ドットの蛍光シグナルの値を、各ピクセルの生の655-nmスペクトルデータを、エクセルスプレッドシートにエクスポートすることによって得た；各ピクセルのシグナルを各々異なるドットについて平均し、95%信頼区間をスポットについて決定した。バックグラウンドを、ネガティブコントロールアンチセンススポットのシグナルを使用して決定した。全スライドにおいて、バックグラウンドは無視でき、実験シグナルへの有意な貢献はなかった。データを、各々のハプテン/天然抗ハプテン対(図34)についてプロットした。シグナルにおける変動性は、天然-抗ハプテン抗体検出効果の範囲を提案し、ここでDCC > DNP > BF > DABSYL > NP > TS > PPT > DIG > BD > ROT > NCA > HQである。
【０２１７】
組織ハイブリダイゼーション。Superfrostスライドに搭載したホルマリン固定パラフィン包埋Calu-3異種移植片組織を、脱パラフィン化し、抗原を、RiboClear (VMSI #760-4125)変性剤、RiboCC VMSI #760-107)試薬、及びプロテアーゼ3 (VMSI #760-2020)を使用して回収した。回収後、一滴(100μL)のハプテン化 アンチセンス又はセンス鎖 ACTBプローブをスライドに分注し、80℃で8分間変性させ、65℃で6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションスライドを、75℃で8分間、0.1x SSCを使用して３回洗浄した後、各々独自にハプテン化したプローブを、5 μg の同族天然抗ハプテン抗体、次にビオチン化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体及びQd655にコンジュゲートされたストレプトアビジンを使用して検出した。スライドを、DAPI (VMSI #760-4196)を使用して対比染色した。スライドを、勾配アルコールを使用して脱水し、カバースリップを適用した。DAPI及び655-nm QDotＴＭ放出シグナルを、Spectral Imaging camera (Applied Spectral Imaging (ASI) Vista, CA)に装着したOlympus 蛍光顕微鏡を使用して画像化した(図35-46)。センス鎖を、ネガティブコントロールとして使用した。センス鎖により観察される何れかの染色は、どのくらいバックグラウンド又は非特異的染色が、検出システム単独に起因するか示す。
【０２１８】
組織シグナル定量化。QDotＴＭ 655 nm蛍光放出シグナルを使用し、画像を順位付けした。順位付けは、相対シグナル:ノイズ (アンチセンス:センスプローブ)強度スケール(0-10) (図47)を使用して、2人の盲検リーダーによって行った。
【０２１９】
ハプテン-チラミドコンジュゲートシグナル決定
SuperfrostＴＭスライドに搭載された組織染色。ホルマリン固定パラフィン包埋Calu-3ヒト肺癌異種移植片組織を、脱パラフィン化し、抗原を、RiboClear変性剤、RiboCC試薬、及びプロテアーゼ3 (VMSI)を使用して回収した。回収後、一滴(100 μL)のDNP標識されたアンチセンス又はセンス鎖 HER2プローブをスライドに分注し、80℃で8 分間変性させ、65℃で6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、75℃で8分間、0.1x SSCを使用して３回洗浄した。DNPハプテンを、スライドに分注させた天然ウサギ抗DNP モノクローナル 抗体 (VMSI #760-4139)、次いでTSA block (VMSI #760-4142)及びHRPコンジュゲートされたヤギ抗ウサギポリクローナル抗体(VMSI # 760-4315)を使用して検出した。チラミドシグナル増幅を、次のように実施した。一滴のチラミド-ハプテンコンジュゲート (10μg/mL)を各スライドに分注し、次いで一滴のTSA-H2O2 (VMSI #760-4141)を使用した。反応を24分インキュベートした；各チラミドコンジュゲート化ハプテンを、その同族モノクローナル 抗体 (5μg/mL)、次いでQd655コンジュゲート化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体(VMSI #213-2194)を使用して検出した。結果として、各チラミド-ハプテンコンジュゲート/抗ハプテン mAbシステムの性能を、個々に、またプローブ又は量子ドットコンジュゲート変動性に非依存性に評価した。手順を、図3Bに概略的に示す。スライドを、DAPI (VMSI #760-4196)を使用して対比染色した。スライドを、勾配アルコールを使用して脱水し、カバースリップを適用した。DAPI (VMSI #760-4196)及び655-nmシグナルを、Spectral Imaging camera (Applied Spectral Imaging (ASI) Vista, CA)に装着されたOlympus 蛍光顕微鏡を使用して画像化した(図48)。
【０２２０】
組織シグナル定量化。QDotＴＭ655による蛍光放出シグナルを、2人の盲検リーダーによって順位付けした。相対シグナル強度スケール(0 to 10)を使用した結果を含む(図47)。
【０２２１】
図47は、ハプテンから得られる蛍光シグナルにおいて有意な可変性があることを示す。更に、図47に見られるように、特定のハプテン-チラミドコンジュゲートの性能は、対応するハプテン化 RNAプローブの性能から予測できなかった。例えば、BF-チラミドコンジュゲートは、BF標識されたRNAプローブの２倍近く強いシグナルを生成した。逆に、DNP-チラミドコンジュゲートは、DNP標識されたRNAプローブより著しく弱いシグナルを生成した。驚くべきことに、BD-、DIG-、HQ-、及びNCA-チラミドコンジュゲートは全て強いシグナルを生成したが、それらのそれぞれのハプテン化 RNAプローブは、皆無かそれに近いシグナルを生成した。下の表5は、各試験におけるハプテンの順位を提供する。
2013531801.tif 000125
【０２２２】
実施例4
mRNA-ISHアッセイにおけるハプテン-チラミドコンジュゲートシグナル
この実施例は、チラミドシグナル増幅がハプテン-チラミドコンジュゲートを使用して実施された時に、mRNA-ISHアッセイにおいて得られるシグナルを評価する。ハプテンは、ポリエチレングリコールリンカーを介してチラミンにコンジュゲートされ、ハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを形成し、実施例１に記載される。
【０２２３】
組織染色。Superfrostスライドに搭載されたパラフィン包埋Calu-3異種移植片組織を、脱パラフィン化し、抗原を、RiboClear変性剤、RiboCC試薬、及びプロテアーゼ3 (VMSI)を使用して回収した。回収後、一滴(100μl)のハプテン標識されたアンチセンス又はセンス鎖 HER2プローブをスライドに分注し、80℃で8分間変性させ、65℃で6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、75℃で8分間、0.1x SSCを使用して３回洗浄した。ハプテン標識されたプローブを、50 μg/mLの濃度で、HRPにコンジュゲートされた同族抗ハプテンモノクローナル抗体を使用して検出した。HRPコンジュゲートを、TSA Blockと共にスライドに分注した。チラミドシグナル増幅を、次のように実施した：一滴のハプテン-チラミドコンジュゲート (10 μg/mLを、各スライドに分注し、その後一滴のTSA-H2O2 (Ventana)を分注した。反応を24分インキュベートし；各チラミドコンジュゲート化 ハプテンを、Qd655にコンジュゲートされたそれの同族モノクローナル抗体を使用して検出した。手順を、図3Aに模式的に示す。スライドをDAPIを使用して対比染色した。スライドを、勾配アルコールを使用して脱水し、カバースリップを適用した。DAPI及び655nmのシグナルを、Spectral Imaging cameraに装着されたOlympus 蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【０２２４】
図49は、アンチセンス及びセンス鎖 (コントロール) HER2プローブをDNPで標識した場合に得られる結果を示し、検出は、MSxDNP-HRP (HRPにコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体)、DNP-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲート、及びMSxDNP-Qd655 (Qd655にコンジュゲートされた抗DNP モノクローナル 抗体)を使用して実施した。
【０２２５】
実施例5
マルチプレックスin situハイブリダイゼーションs
この実施例は、18S rRNA及び乳癌パネルのマルチプレックスmRNA-ISHアッセイにおいて得られるシグナルを評価する。
【０２２６】
プローブ合成及び製剤：Mirusリンカーアーム(Label IT（登録商標）リンカー)を使用し、異なるハプテンで化学的に標識されたACTB, ER, HER2, Ki67, PR及び18S実験アンチセンス及びコントロールセンスリボプローブを、製造者(Mirus Bio LLC, Madison, WI)の指示に従い調製した。具体的には、ERプローブをベンゾフラザン (BF)で標識し、HER2プローブをチアゾールスルホンアミド (TS)で標識し、Ki67プローブをニトロピラゾール (NP)で標識し、ACTBプローブを2,4-ジニトロフェニル (DNP)で標識した。
2013531801.tif 000126
【０２２７】
標識反応を、製造者のプロトコル(Lit. #ML012, rev. March 31, 2005, accessed at the Mirus Bio website on February 4, 2011)に従い、Amine Label IT（登録商標）試薬(Kit # MIR 3900)及び核酸を、0.2:1〜0.8:1の質量比で組み合わせることによって調製した。例えば、Amine Label IT（登録商標）試薬を、100 μLの再構成溶液を用いて、1 mg/mLのリンカーの最終濃度に再構成した。標識RNAプローブに、37.5 μLの脱イオン化H2O、5 μLの10X Mirus Labeling Buffer A、5 μLのRNAプローブ溶液(1mg/mL)、及び2.5 μLのAmine Label IT（登録商標）試薬を組み合わせた。標識反応を、37℃で1時間インキュベートした。
【０２２８】
標識されたRNAを、1.5容積のAmbion（登録商標）塩化リチウム沈殿溶液(7.5 M 塩化リチウム, 50 mMのEDTA, pH. 8.0, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, cat. # AM9480)を加え、溶液を-20℃で30分間冷却することによって、沈殿させた。溶液を、微量遠心機において15分間、遠心分離し、上澄みを捨てた。ペレットを、氷冷70%エタノールで洗浄し、残留塩を除去した。標識されたRNAを、nuclease-free water (Ambion)に再懸濁させた。
【０２２９】
１時間、室温で、暗所において、約5μg of 標識されたRNAプローブを、10 mM溶液のハプテン-PEG(8)-NHS エステル (無水DMSOにおいて調製)及び100mMのNaHCO3(pH 8.5,新鮮に調製)と反応させることによって、所望のハプテンを、Label IT（登録商標）リンカーの遊離端にカップリングさせた。ハプテン標識されたRNAプローブを、前述のように、塩化リチウム沈殿によって単離した。
【０２３０】
マルチプレックス乳房パネルin situハイブリダイゼーションアッセイでは、１００ナノグラムの各プローブを、1 mLのRibohybeＴＭ(VMSI #760-104)溶液に懸濁させ、ディスペンサーに置いた；モデル18S マルチプレックスアッセイでは、様々なハプテンで標識された１ナノグラムの18Sプローブを、1 mLのRibohybeＴＭ(VMSI #760-104)溶液に懸濁させ、ディスペンサーに置いた。
【０２３１】
マルチプレックスin situハイブリダイゼーション(18S及び乳房パネル):Superfrostスライドに搭載されたホルマリン固定パラフィン包埋Calu-3、ZR75-1及びMCF-7異種移植片組織を、脱パラフィン化し、抗原を、RiboClear (VMSI #760-4125)変性剤、RiboCC VMSI #760-107)試薬、及び3 (VMSI #760-2020)を使用して回収した。回収後、異なるハプテンで標識された一滴(100μl)のカクテルアンチセンス又はセンス鎖プローブをスライドに分注し、80℃で8分間変性させ、65℃で6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、75℃で8分間、0.1x SSCを使用して３回洗浄した；カクテルにおける各ハプテンを、次のように逐次的に検出した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、POインヒビター (VMSI #760-4143)を使用して不活性化し、10 ug/mlのHRPコンジュゲート抗ハプテンモノクローナル抗体をスライドに分注し、24分間インキュベートし、その後TSA block (VMSI #760-4142)を適用した。チラミドシグナル増幅を、スライドに一滴のチラミド-ハプテンコンジュゲート (100 uM)を分注し、その後一滴のTSA-H2O2 (VMSI #760-4141)を分注し、反応を24分間インキュベートすることによって達成した。手順を繰り返し、プローブカクテルにおける各ハプテンを増幅させた。次いで、増幅したハプテンを、各々異なるQdotにコンジュゲートされた抗ハプテンモノクローナル抗体のカクテルを使用して検出した。逐次的マルチプレックス手順を、図5A-5Bに模式的に示す。スライドを、DAPI (VMSI #760-4196)を使用して対比染色し、勾配アルコールを使用して脱水し、カバースリップを適用した。コントロールセンス鎖プローブから成るプローブカクテルを、非特異的相互作用から生じるバックグラウンドを決定するために、全実験において、ネガティブコントロールとして使用した。
【０２３２】
画像化:DAPI及びQdotシグナルを、Spectral Imaging camera (Applied Spectral Imaging (ASI) Vista, CA)に装着されたOlympus 蛍光顕微鏡を使用して画像化した。画像を、40X 対物及びASIソフトウェアパッケージを使用して撮った。
【０２３３】
18S マルチプレックスアッセイ:18S RNAは全細胞において恒常的に発現されるため、それは、マルチプレックスアッセイを展開し試験するのに、適切なモデルシステム及び内因性コントロールになる。18S RNAは細胞において豊富であるため、非常に少量(例えば、ピコモル)の幾つかの18S RNAプローブ−各プローブは同じ標的を指向するが、異なるハプテンで標識される−が、単一組織サンプルに適用でき、標的18S RNA配列に非競合に結合するだろう。等モル量の各プローブは、各プローブから実質的に等しいシグナルを生じることが期待される。
【０２３４】
上記のマルチプレックスアッセイを、DNP、BF、NP、及びTSで標識された18Sプローブを、Calu-30異種移植片組織にハイブリダイズすることによって実施した。DNP-, BF-, NP-, and TS標識プローブを、それぞれ655、605、585、及び565 nmで蛍光を放出できる量子ドットで検出した。モデル18Sマルチプレックス反応において使用される特定の試薬を表6に詳細に記載する。各シグナルを、図50A-Dに示すように、適切な波長で個々に検出した。次いで、画像を、単一合成蛍光画像に組み合わせた(図51A)。ネガティブコントロールとして、類似に標識されたセンス鎖プローブを利用した。類似な４つのセンス鎖プローブがCalu-3異種移植片組織にハイブリダイズされた後の合成蛍光画像は、シグナルを示さなかった(図51B)。
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【０２３５】
乳房パネルマルチプレックスアッセイ:上記のマルチプレックスアッセイを、Calu-3異種移植片組織及びMCF-7種移植片組織サンプルを、NP標識されたKi67、TS標識されたHER2、BF標識されたER、及びDNP標識されたACTB アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズすることによって実施した。Ki67、HER2、ER、及びACTBプローブを、それぞれ525、565、605、及び655 nmで蛍光を放出できる量子ドットで検出した。核のDAPI対比染色を実施した。乳房パネルマルチプレックスハイブリダイゼーションにおいて使用される特定の試薬を、表7に詳細に記載する。各QDotＴＭシグナルを、図52A-D (Calu-3異種移植片組織)及び図53A-D (MCF-7異種移植片組織)に示すように、適切な波長で個々に検出した。Calu-3異種移植片細胞は、HER2+、ER-、Ki67+/-、及びACTB+であることが知られている。予想した通り、強いシグナルがHER2及びACTBプローブから、中程度のシグナルがKi67プローブから、非常に弱いシグナルがERプローブから見られた。MCF-7異種移植片細胞は、HER2-、ER+、Ki67+/-、及び ACTB+であると知られている。予想した通り、強いシグナルがER及びACTBプローブから、中程度のシグナルがKi67プローブから、非常に弱いシグナルがHER2プローブから見られた。４つのプローブの合成蛍光画像を、図54A (Calu-3組織)組織54B (MCF-7組織)に示す。Calu-3 and MCF-7組織にハイブリダイズされた４つのネガティブコントロール、類似センス鎖 RNAプローブの合成蛍光画像は、シグナルを示さなかった。
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【０２３６】
シグナル定量化：Calu-3、ZR75-1、及びMCF-7異種移植片細胞は、高、低、及び中程度量のHER2をそれぞれ発現する。しかしながら、ACTB発現は前細胞において一定であり、内部コントロールとして使用できる。RNA発現との蛍光シグナルの相関を決定するために、上述のように、組織サンプルを、DNP標識されたHER2及びTS標識されたACTB アンチセンスRNAプローブでハイブリダイズし、Qd655及びQd565にコンジュゲートされたモノクローナル抗体でそれぞれ検出した。スペクトル画像を、RawCubeViewerソフトウェアパッケージを使用して非混合化した。各QDotＴＭシグナルに閾値設定しバックグラウンドを除去し、バックグラウンドより上の画像におけるピクセルの数を、RawCubeViewerソフトウェアを使用して計数した。各異種移植片におけるACTBに対するHER2の比を、各画像におけるHER2ピクセルの数を、ACTBピクセルの数で割ることによって決定した。図55A-Cは、それぞれCalu-3, ZR75-1, and MCF-7異種移植片とハイブリダイズさせたHER2プローブから得られる蛍光を示す蛍光顕微鏡写真である。予想した通り、シグナルは、ZR75-1 and MCF-7よりCalu-3においてずっと強く、MCF-7は非常に少ないハイブリダイゼーションを示す。
【０２３７】
比較として、ACTBに対するHER2の比も、以下に示すように定量RT-PCR (qPCR)を使用して決定した。全mRNAを、High Pure FFPE抽出キット(Roche)を使用して、各異種移植片の１０ミクロン切片から抽出した。各RNA サンプルを、High Capacity RTキット(Applied Biosystems)を使用して逆転写した。各サンプルにおけるHER2及びACTB cDNAの相対レベルを、UNG (Applied Biosystems)と共に、Taqmanプローブ及びPlatinum DNAポリメラーゼを使用して決定した。図56は、qPCR及び mRNA-ISHアッセイによって検出される、HER2:ACTB mRNA比を示すグラフである。予想した通り、Calu-3異種移植片は、ZR75-1及びMCF-7異種移植片より、高いHER2:ACTB比を有した。MCF-7のHER2:ACTB mRNA比はほぼゼロであり、MCF-7の既知の低HER2発現から予想される通りである。Calu-3組織におけるHER2:ACTB mRNA比は、qPCRによって決定される比と比較して、mRNA-ISHで決定されるものはおよそ2.5x大きい。差異は、遺伝子発現パターン及び検出方法によって説明できる。全ての細胞が、類似なレベルでACTBを発現する。しかしながら、HER2発現は確率的であり、組織サンプルにおいて幾つかの細胞のみが、図57に示すように何れかの任意時間でHER2を発現している。mRNA-ISHアッセイは、興味の遺伝子を発現しているそれらの細胞のみを検出する。蛍光画像は、HER2発現が見られる興味の領域に注目し得、蛍光シグナルが定量化される場合、高HER2:ACTB比を生成する。対照的に、qPCRを実施する場合、サンプル中における全細胞が破壊され、RNAが抽出され、PCRによって増幅される。よって、qPCR 組織サンプルは、アッセイ時にHER2を活発に発現していない多くの細胞を含みうる。アッセイにおける不活性細胞の包含は、qPCRアッセイによって生成されるHER2 RNAの最終量を低減し、それによって、みかけのHER2:ACTB比を低減させる。
【０２３８】
実施例6
マイクロRNA-ISHアッセイにおけるハプテン-チラミドコンジュゲートシグナル
この実施例は、チラミドシグナル増幅がハプテン-チラミドコンジュゲートを使用して実施される時に、マイクロRNA (miRNA)-ISHアッセイにおいて得られるシグナルを評価する。ハプテンを、ポリエチレングリコールリンカーによってチラミンにコンジュゲートし、実施例1に記載のようにハプテン-dPEG（登録商標）8-チラミドコンジュゲートを形成した。
【０２３９】
A.チラミド-HQ コンジュゲート (Discovery Amp-HQ)を使用した、小葉乳癌組織上におけるmiR205 LNAプローブの評価：以下は、Ventana Discovery Ultra Instrumentからの適合化手順である：
【０２４０】
1.スライド上のパラフィンコート組織を65°Cに4分間加熱し、液体カバースリップ(LCS)で処理した。スライドをEZPrepですすぎ、LCSを再度適用した。このプロセスを、組織の脱パラフィン化を確実にするために、65°Cで合計３回実施した。
2.スライドを反応バッファーにおいてすすぎ、1mM EDTAを有するpH 7.3の5mMのTris Bufferに希釈したプロテイナーゼK (Roche Applied Science #03115836001)の15ug/mL溶液を、37°Cで8分間適用した。
3.RiboWash (VMSI #760-105)で３回すすいだ後、100 μLの二重 DIG 標識されたmiR205 LNAプローブ (750 fmol, Exiqon #18099-15)をスライドに適用し、80°Cに8分間加熱した。8分のインキュベーションの後、スライドを、60°Cで1時間ハイブリダイズした。
4.プローブのハイブリダイゼーション後、スライドに、60°Cで4分間、2x SSCの２回のストリンジェンシー洗浄を行った。
5.スライドを反応バッファーで２回洗浄し、100μLの2μg/mL溶液のマウス抗DIG (Roche Applied Science #11333062910)をスライドに適用し、液体カバースリップを用い、37°Cで20分間インキュベートした。
6.100uLのAmp ペルオキシダーゼインヒビター (VMSI #760-052の要素)を、スライドに8分間適用した。
7.次いで、スライドを反応バッファーで２回洗浄し、一滴のomniMap抗マウスHRP (VMSI #60-4310)を、スライドにおいて16分間37°Cでインキュベートした。
8.スライドを反応バッファーにおいて３回洗浄した後、100μLのDiscovery Amp-HQ コンジュゲート及び一滴のDiscovery Amplification H2O2 (双方ともVMSI #760-052の要素)をスライドに適用し、24分間37°Cでインキュベートした。
9.次いで、スライドを反応バッファーで２回洗浄し、100μLのDiscovery抗HQ AP (VMSI #760-4521)を適用し、スライドにおいて16分間37°Cでインキュベートした。
10.スライドをEZ prepで２回すすぎ、100 μLのアクチベーターCM, NBT CM 及びBCIP CM (全てVMSI #760-161の要素)をスライドに加え、44分間インキュベートした。
11.スライドを反応バッファーにおいて3回すすいだ後、一滴のRed counterstain II (VMSI #780-2218)をスライドに適用し、8分間インキュベートした。
12.２以上の反応バッファー洗浄をスライドに適用し、実行を終了した。
13.スライドを器具から外し、洗剤洗浄で処理した後、カバースリップを手動適用した。スライドを明視野顕微鏡によって見た。
【０２４１】
B.増幅無しでの小葉乳癌組織におけるmiR205 LNAプローブの評価：比較として、上記のPart Aにおける手順を、チラミド-HQ無しで反復した。工程1-5を、Part Aに記載のように実施した。工程5に従い、スライドを反応バッファーで２回洗浄し、100 μLのUltraMap抗マウスAP (VMSI #760-4312)を適用し、スライドにおいて16分間37°Cでインキュベートした。次いで、Part Aに記載の工程10-13の手順を実施した。図58-59は、miR205 検出に対するハプテン-チラミドコンジュゲーションの効果を示す顕微鏡写真である。図58をPart B(増幅無し)における手順を使用して得て、図59をPart A(増幅)における手順を使用して得た。図59におけるmiR205シグナルは、図58におけるシグナルと比較して明らかに増加している。
【０２４２】
C.チラミド-HQ コンジュゲート (Discovery Amp-HQ)を使用した増幅を伴う扁桃組織におけるmiR126 LNAプローブの評価：手順は、上のPart Aに記載したのと同じであるが、次の例外を有する：1)工程3において、二重 DIG標識されたmiR205 LNAプローブの代わりに二重DIG標識されたmiR126 LNAプローブ (Exiqon #88067-15)を使用し、ハイブリダイゼーションを55°Cで実施した；2)工程4において、洗浄を55°Cで実施した。
【０２４３】
D.増幅無しでの扁桃組織におけるmiR126 LNAプローブの評価：比較として、上のpart Cにおける手順を、チラミド-HQ増幅無しで反復した。工程1-5をPart Aに記載のように実施したが、次の例外を有する：1)工程3において、二重DIG標識されたmiR205 LNAプローブの代わりに二重DIG標識されたmiR126 LNAプローブ (750 fmol, Exiqon #88067-15)を使用し、ハイブリダイゼーションを55°Cで実施した；2)工程4において、洗浄を55°Cで実施した。工程5に従い、スライドを反応バッファーで2回洗浄し、100μLのUltraMap抗マウスAP (VMSI #760-4312)を適用し、スライドにおいて16分間37°Cでインキュベートした。次いで、Part Aに記載の工程10-13の手順を実施した。
【０２４４】
図60-61は、miR126検出に対するハプテン-チラミドコンジュゲーションの効果を示す顕微鏡写真である。図60をPart Cにおける手順を使用して得て（増幅無し）、図61をPart Dにおける手順を使用して得た（増幅）。図60におけるmiR126シグナルは、 図61におけるシグナルと比較して明らかに増加している。
【０２４５】
以下の米国特許、特許公開、及び出願は、Ventana Medical Systems, Inc.、本出願の譲受人に譲渡されており、各々を出典明記によりここに援用される: 米国特許第7,695,929号; U.S. Patent Publication No. 2007/0117153; U.S. Patent Publication No. 2006/0246524; U.S. Patent Publication No. 2006/0246423; U.S. Patent Application No. 12/154,472; U.S. Provisional Application No. 61/328,494; U.S. Patent Applications entitled Tyramine and Tyramine Derived Mass Tag Conjugate Compositions and Methods, filed on July 2, 2010; and Enzymatic Amplified Mass Tags for Mass Spectrometric Tissue Imaging and Immunoassays, filed on July 2, 2010。
【０２４６】
開示の発明の原理が適用されうる多くの可能な実施態様を考慮すると、示した実施態様は、単に発明の好ましい実施例であり、発明の範囲を制限するとしてみなされるべきではない。むしろ発明の範囲は、以下の請求の範囲によって定義される。従って、我々は、これらの請求の範囲及び精神である全てを、我々の発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−９】
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【図１０−１３】
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【図１４−１７】
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【図１８−２１】
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【図２２−２５】
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【図２６−２９】
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【図３０−３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８−６１】
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【国際調査報告】
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