(57)【要約】  本発明は、転移関連線維芽細胞(「MAF」)特性を構成するバイオマーカーならびに様々な癌の診断および段階評価におけるその使用に関する。それは、少なくとも部分的には、特定の遺伝子の示差的発現の同定が、高い特異度で様々な癌の診断および／または段階を示すという発見に基づく。特に、前記特性の存在は、癌が既に侵襲性になったことを暗示する。従って、様々な実施形態においては、本発明は、被験体におけるバイオマーカー状態の評価を含む診断方法、診断キット、ならびに治療方法を提供する。さらに、特定の遺伝子の示差的発現は、転移能力の獲得のためのマーカーとして機能し得るため、そのような発現プロフィールを用いて、特定の治療的介入の適切性、例えば、ネオアジュバント療法の適切性を予測することができる。そのようなプロフィールを用いて、転移能力の獲得を阻害することができる治療剤をスクリーニングすることもできる。従って、様々な実施形態においては、本発明は、その抗転移特性のための治療剤をスクリーニングする方法ならびにスクリーニングキットを提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体に由来するサンプルにおいて、正常な被験体と比較した、COL11A1遺伝子産物の発現レベルを決定することを含み、COL11A1遺伝子産物の過剰発現が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法。
【請求項２】
被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体に由来するサンプルにおいて、正常な被験体と比較した、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の発現レベルを決定することを含み、前記遺伝子産物の過剰発現が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法。
【請求項３】
発現レベルが、サンプル中の細胞が溶解されるようにサンプルを処理することを含む方法により決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞遺伝子産物を少なくとも部分的に精製し、タンパク質を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞核酸を少なくとも部分的に精製し、前記核酸を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
SNAI1の発現レベルを決定するさらなる工程を含み、SNAI1が過剰発現されず、他の遺伝子産物が過剰発現されるとの決定が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
被験体における癌に関する予後を展開する方法であって、被験体に由来するサンプルにおいて、正常な被験体と比較した、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の発現レベルを決定することを含み、前記遺伝子産物の過剰発現が、被験体に存在する癌が転移性になる可能性を示す、前記方法。
【請求項８】
発現レベルが、サンプル中の細胞が溶解されるようにサンプルを処理することを含む方法により決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞遺伝子産物を少なくとも部分的に精製し、タンパク質を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞核酸を少なくとも部分的に精製し、前記核酸を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
SNAI1の発現レベルを決定するさらなる工程を含み、SNAI1が過剰発現されず、他の遺伝子産物が過剰発現されるとの決定が、被験体に存在する癌が転移性になる可能性を示す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体に由来するサンプルにおいて、正常な被験体と比較した、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも2種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の発現レベルを決定することを含み、前記遺伝子産物の過剰発現が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法。
【請求項１３】
発現レベルが、サンプル中の細胞が溶解されるようにサンプルを処理することを含む方法により決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞遺伝子産物を少なくとも部分的に精製し、タンパク質を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞核酸を少なくとも部分的に精製し、前記核酸を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
SNAI1の発現レベルを決定するさらなる工程を含み、SNAI1が過剰発現されず、他の遺伝子産物が過剰発現されるとの決定が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体に由来するサンプルにおいて、正常な被験体と比較した、COL11A1、THBS2およびINHBAのうちの1種、2種、または3種全部の発現レベルを決定することを含み、前記遺伝子産物の過剰発現が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法。
【請求項１８】
発現レベルが、サンプル中の細胞が溶解されるようにサンプルを処理することを含む方法により決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞タンパク質を少なくとも部分的に精製し、前記遺伝子産物を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞核酸を少なくとも部分的に精製し、前記核酸を検出剤に曝露するさらなる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
SNAI1の発現レベルを決定するさらなる工程を含み、SNAI1が過剰発現されず、他の遺伝子産物が過剰発現されるとの決定が、被験体が侵襲性癌を有することを示す、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１、７、１２または１７に記載の診断方法を実施し、タンパク質が過剰発現される場合、患者が画像化手順を受けることを推奨することを含む、被験体を治療する方法。
【請求項２３】
請求項１、７、１２または１７に記載の診断方法を実施し、タンパク質が過剰発現される場合、患者がネオアジュバント治療を受けないことを推奨することを含む、被験体を治療する方法。
【請求項２４】
請求項１、７、１２または１７に記載の診断方法を実施し、タンパク質が過剰発現される場合、患者がその現在の治療計画を変更することを推奨することを含む、被験体を治療する方法。
【請求項２５】
被験体における癌侵襲を阻害する薬剤を同定する方法であって、転移関連線維芽細胞特性を発現する癌細胞に試験薬剤を曝露することを含み、試験薬剤が該特性における遺伝子の過剰発現を減少させる場合、該試験薬剤を癌の侵襲の阻害における治療剤として用いることができる、前記方法。
【請求項２６】
転移関連線維芽細胞特性が、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の過剰発現を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
転移関連線維芽細胞特性が、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも2種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも2種の遺伝子産物の過剰発現を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
(a)転移関連線維芽細胞特性遺伝子産物と特異的に相互作用することができる標識されたリポーター分子、
(b)対照または較正試薬、および、
(c)キットを使用する様式を記載する説明書、
を含むキット。
【請求項２９】
(a)検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した転移関連線維芽細胞特性抗原と特異的に相互作用する抗体を含むコンジュゲート、
(b)対照または較正試薬、および、
(c)キットを使用する様式を記載する説明書、
を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
転移関連線維芽細胞特性抗原特異的抗体を含み、前記抗体により結合する転移関連線維芽細胞特性抗原が、下記遺伝子：COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、COL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上によりコードされるタンパク質を含むか、またはさもなければそれから由来するものである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
(a)転移関連線維芽細胞特性核酸にハイブリダイズすることができる核酸、
(b)対照または較正試薬、および、
(c)キットを使用する様式を記載する説明書、
を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
(a)下記を含む核酸配列：
(i)転移関連線維芽細胞特性核酸に特異的にハイブリダイズする標的特異的配列、および、
(ii)検出可能な標識；
(b)プライマー核酸配列；
(c)増幅の核酸インジケーター；ならびに、
(d)キットを使用する様式を記載する説明書、
を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３３】
転移関連線維芽細胞特性核酸に特異的にハイブリダイズする核酸が、下記遺伝子：COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、COL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種を含むか、またはさもなければそれから由来するものである、請求項３１または３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年5月28日に出願された米国仮特許出願第61/349,684号および2010年4月13日に出願された米国仮特許出願第61/323,818号（両方ともその全体が参照により本明細書に組入れられるものとする）の利益を主張する。
【０００２】
1. 序論
本発明は、特定の示差的に発現される遺伝子が、癌の侵襲性、例えば、転移の初期段階中の原発腫瘍の特定の細胞の隣接する結合組織への侵襲と関連するという知見に関する。この活性の基礎となる生物学的機構は癌の進行過程の間に生じ、転移性癌腫の移動性および侵襲性の獲得を指示する。従って、この機構と関連するバイオマーカー、例えば、本明細書に開示される特定の示差的に発現される遺伝子の同定を、特定の癌の診断および段階評価のため、癌の進行／退縮のモニタリングのため、治療法の開発のため、ならびに特定の治療戦略の適切性の予測のために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
癌の侵襲性はタンパク質分解が変化した環境と関連し(Kessenbrock K, Cell 2010; 141: 52-67)、活性化された線維芽細胞(繊維芽細胞)の出現を含み得ると仮定されてきた。「癌関連線維芽細胞」(CAF)と呼ばれる、腫瘍の「線維形成性」間質における活性化線維芽細胞の存在は、癌の侵襲性の基礎となる生物学的機構の一部であるようである。本出願で概略されるように、この転移関連線維形成反応と特異的に関連するようであるCAFの特定のサブセットを、本明細書では「転移関連線維芽細胞」(MAF)と呼ぶ。従って、本明細書で、本発明者らは、そのようなMAFの存在と相関する対応する遺伝子発現特性および生物学的機構を、それぞれ「MAF特性」および「MAF機構」と呼ぶ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、癌の侵襲およびその後の転移の基礎となる生物学的機構を特性評価することに大きな目標があり、これが本発明によって取り組まれる問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
3. 発明の概要
本発明は、転移関連線維芽細胞（「MAF」）特性を構成するバイオマーカーならびに様々な癌の診断および段階評価におけるその使用に関する。本発明は、少なくとも部分的には、特定の遺伝子の示差的発現の同定が、高い特異度で様々な癌の診断および／または段階を示すという知見に基づく。従って、様々な実施形態において、本発明は被験体におけるバイオマーカー状態の評価を含む診断方法、診断キット、ならびに治療方法を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、部分的には、特定の遺伝子の示差的発現が侵襲能力の獲得に関するマーカーとして機能し得るため、そのような発現プロフィールを用いて転移能力の獲得を阻害することができる治療剤をスクリーニングすることができるという知見に基づく。従って、様々な実施形態において、本発明は、それらの抗侵襲性および／または抗転移性のための治療剤をスクリーニングする方法ならびにスクリーニングキットを提供する。
【０００７】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体から得たサンプル中の、COL11A1遺伝子産物の、正常な被験体と比較した発現レベルを決定することを含み、COL11A1遺伝子産物の過剰発現が、該被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法に関する。
【０００８】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における侵襲性癌を診断する方法であって、被験体から得たサンプル中の、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の、正常な被験体と比較した発現レベルを決定することを含み、前記遺伝子産物の過剰発現が、該被験体が侵襲性癌を有することを示す、前記方法に関する。そのような特定の実施形態においては、前記発現レベルは、サンプル中の細胞が溶解されるように該サンプルを処理することを含む方法によって決定される。そのような特定の実施形態においては、前記方法は、細胞遺伝子産物を少なくとも部分的に精製し、該タンパク質を検出剤に曝露するさらなる工程を含む。そのような特定の実施形態においては、前記方法は、細胞の核酸を少なくとも部分的に精製し、該核酸を検出剤に曝露するさらなる工程を含む。そのような特定の実施形態においては、前記方法は、SNAI1の発現レベルを決定するさらなる工程を含み、SNAI1が過剰発現されず、他の遺伝子産物が過剰発現されるという決定は、前記被験体が侵襲性癌を有することを示す。
【０００９】
特定の実施形態においては、本発明は、上記で概略され、MAF特性が同定される診断方法を実施すること、患者が画像化手順を受けることを推奨することを含む、被験体を治療する方法に関する。そのような特定の実施形態においては、MAF特性の同定を行った後、患者がネオアジュバント治療を受けないことを推奨する。そのような特定の実施形態においては、MAF特性の同定を行った後、患者がその現在の治療計画を変更することを推奨する。
【００１０】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における癌の侵襲を阻害する薬剤を同定する方法であって、転移関連線維芽細胞特性を発現する癌細胞に試験薬剤を曝露することを含み、試験薬剤が該特性中の遺伝子の過剰発現を低下させる場合、試験薬剤を癌の侵襲を阻害する際の治療剤として使用することができる、前記方法に関する。特定の実施形態においては、方法において用いられる転移関連線維芽細胞特性は、COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、およびCOL1A2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物、ならびにTHBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の過剰発現を含む。
【００１１】
特定の実施形態においては、本発明は、(a)転移関連線維芽細胞特性遺伝子産物と特異的に相互作用することができる標識されたリポーター分子；(b)対照または較正試薬、および(c)キットを使用する様式を記載する説明書を含むキットに関する。
【００１２】
特定の実施形態においては、本発明は、(a)検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した転移関連線維芽細胞特性抗原と特異的に相互作用する抗体を含むコンジュゲート；(b)対照または較正試薬、および(c)キットを使用する様式を記載する説明書を含むキットに関する。そのような特定の実施形態においては、本発明は、転移関連線維芽細胞特性抗原特異的抗体により結合した転移関連線維芽細胞特性抗原が、下記遺伝子：COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、COL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2のうちの1種以上によりコードされるタンパク質を含むか、またはさもなければそれから誘導された、前記抗体を含むキットに関する。
【００１３】
特定の実施形態においては、本発明は、(a)転移関連線維芽細胞特性核酸にハイブリダイズすることができる核酸；(b)対照または較正試薬；および(c)キットを使用する様式を記載する説明書を含むキットに関する。そのような特定の実施形態においては、キットは、(a)(i)転移関連線維芽細胞特性核酸に特異的にハイブリダイズする標的特異的配列、および(ii)検出可能な標識を含む核酸配列；(b)プライマー核酸配列；(c)増幅の核酸インジケーター；ならびに(d)キットを使用する様式を記載する説明書を含む。そのような特定の実施形態においては、本発明は、下記遺伝子：COL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、COL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2のうちの1種を含むか、またはさもなければそれから誘導された、転移関連線維芽細胞特性核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を含むキットに関する。
【００１４】
4. 図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の特定の非限定的な実施形態の全体の工程を示す図である。
【図２】段階IIIcへの移行閾値を段階評価する表現型を用いるTCGA卵巣癌データセットにおけるCOL1A1遺伝子のEVA測定基準の評価を示す図である。
【図３】EVAアルゴリズムの低複雑度実現を示す図である。
【図４】実施例に記載の機械的に偏りのない（表現型のみに依存する）アルゴリズムの疑似コードを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
5. 発明の詳細な説明
5.1. MAF特性の同定
14サンプルの原発腫瘍の遺伝子発現プロフィールと、17サンプルの大網転移腫瘍とを比較する、漿液性乳頭状卵巣癌の研究(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol 2007; 196: 245 e1-11)は、156個の示差的に発現される遺伝子を同定した。独立性に富むデータセットにおけるこれらの遺伝子の有意性を調査するために、本発明者らは、正確な段階評価情報を含む377の卵巣癌サンプルからなるThe Cancer Genome Atlas (TCGA)遺伝子発現データセット上で、これらの156個の遺伝子のみを用いる階層的クラスタリングを実施した。得られたヒートマップは、94サンプルにおける約100個の高度に過剰発現された遺伝子の突出した「レッドスクエア」を示した。注目すべきことに、段階IIIb以下の腫瘍に由来する41サンプルはいずれも94の「レッドスクエア」サンプル内になく(P = 4 x 10-6)、これは腫瘍が少なくとも段階IIIcに進行したことを示すこれらの遺伝子の協調的な過剰発現と一致していた。
【００１７】
この挙動が他の癌における遺伝子によっても示されるかどうかを決定するために、本発明者らは、偏りのない様式で、特定の表現型（特定の段階への移行など）と関連する協調的に過剰発現された遺伝子を同定するコンピュータによる技術を開発した。本発明者らの結果は、過剰発現された遺伝子の同じ「コア」特性を一貫して「再発見」する。本発明者らは、この現象が、それぞれさらなる遺伝子を潜在的に含むそれ自身の特徴を有する複数の癌において起こるが、コア特性は共通であることを見出した。
【００１８】
特定の実施形態においては、本発明は、遺伝子がその極端な（多くの場合、最大の）値を有するが、そうでなければ、本発明者らが「極値関連」(EVA)と呼ぶ、遺伝子と表現型との間の関連の特殊な評価基準の最初の開発を含む場合に、バイナリー（「低段階」対「高段階」）表現型（低／高段階評価の特定の閾値は特定の型の癌に依存する）と関連する遺伝子のクラスターに焦点を当てることにより同定されたMAF特性に関する。簡単に述べると、EVA測定基準は、遺伝子の最も高い発現値を有するサンプルの全サブセットにわたる偏った区分の最小P値である。換言すれば、合計M個のサンプルが存在し、そのうちのN個が「低段階」であり、M-N個が「高段階」であるとすれば、本発明者らは最も高い遺伝子発現値を有するm個のサンプルを選択する。遺伝子発現値が表現型と相関しないとの仮定の下では、選択されたm個のサンプルの中に最大でn個の「低段階」サンプルが存在する確率は、累積超幾何学的確率h(x≦n；M,N,m)により与えられる。次いで、EVA測定基準は、nの全ての可能な値にわたるこれらの確率の最小値の-log10に等しい。例えば、合計300個のサンプルについて、250個の高段階サンプルが存在し、50個の低段階サンプルが存在すると仮定する。さらに、特定の遺伝子の最も高い値を有する100個のサンプルが99個の高段階サンプルおよび1個の低段階サンプルを含むと仮定する。その場合、h(x≦1；300,50,100)は、MATLAB関数hypercdf(1,300,50,100) = 5 x 10-9を用いて評価することができ、少なくとも-log10(5 x 10-9)= 8.3のその遺伝子に関するEVA測定基準が得られる、例えば、101番目のサンプルも高段階である場合、その遺伝子のEVA測定基準はさらにより高い。一度、最も高い値に到達したら、残りのサンプルの分類整理は無関係であり、極値のみが表現型と関連するという仮説を反映することに留意する。図2は、TCGA卵巣癌データセットおよびIIIbとIIIcとの間の段階評価閾値を用いたCOL11A1遺伝子の累積超幾何学的確率の値を示す：最大値(8.31)はm = 133の時に生じる。事実、最も高いCOL11A1発現を有する133個のサンプル全てが段階IIIcまたはIVにある。
【００１９】
次いで、本発明者らは、「高段階」または「低段階」と標識されたいくつかのサンプルの遺伝子発現データセットを考慮した場合、高段階サンプル中でのみ協調的に過剰発現される遺伝子の選択を誘導する機械的に偏りのない（表現型にのみ依存する）アルゴリズムを開発した。本発明者らはまず、EVA測定基準による最も高い順位を有する上位100個の遺伝子を選択した。このセットの遺伝子のみを用いて、本発明者らはギャップ統計値を用いてk平均クラスタリングを実施した(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63: 411-423)。その工程で、実際に遺伝子が協調的に過剰発現される場合、それらはヒートマップ中で良好に整列する。これは、高／低段階表現型と最も関連するクラスターに属するサンプルの選択を誘導する（これを「EVAに基づくサンプル」のセットと呼ぶ）。そのクラスター中のほぼ全てのサンプルが、MAF段階評価閾値を超えたが、非常に少ない例外は誤診断に起因するものであり得る。次に、本発明者らは、(a)「EVAに基づく」および「高段階」の両方であるサンプルと、(b)「EVAに基づかない」および「低段階」の両方であるサンプルとを対比する「クリーン」なMAF表現型を定義する。サンプル数が十分に大きい場合、この「クリーン」な表現型は、本発明者らが、観察された侵襲現象および／または転移関連協調的過剰発現と最も関連する遺伝子を同定することができる最も鋭い方法を提供する。次いで、本発明者らは、遺伝子を順位付けし、「クリーン」表現型を用いる異分散t検定を用いてその多重検定補正P値を計算し、Bonferroni補正後にP<10-3である遺伝子を選択する。最後に、本発明者らは、全ての癌発現データセット上のこれらの選択された遺伝子の交点を見出し、それらを倍数変化に関して順位付けする。
【００２０】
n個のサンプルおよびm個のプローブセットを含むデータセットについて、EVAアルゴリズムは、n x mの累積超幾何学的分布確率を計算する。これは全く計算集約型であってよく、従って本発明者らは、以下に詳述されるように、EVAアルゴリズムが進行するにつれて各プローブセットの累積超幾何学的分布を力学的に「構築」する低複雑度実現アルゴリズムを考案した。
【００２１】
a個の高段階サンプルおよびb個の低段階サンプルを含むデータセットを考慮して、サンプルの全ての可能なサブセットに対応する超幾何学的確率の(a+1)x(b+1)表が構築される。次いで、各プローブセットについて、プローブセットの発現値に従ってサンプルを分類する。この順序付けは、各サンプルについて左下の角から右上の角まで上または右に移動して表を通過する経路をもたらす。経路中の各工程で、高段階サンプルの観察された数以上に遭遇する累積確率を、エントリーを対角線上に下に向かって、および現在のセル自身を含み現在のセルの右に向かって合計することにより計算する。このアルゴリズムは図3に示される視覚的な例を用いて最良に示され、ここでデータセットは合計で3個の低段階サンプルおよび5個の高段階サンプルを有する。各プローブセットは、この表を通過する経路をもたらし、経路の例はここで灰色で示される。レッティング(letting)1は高段階サンプルに対応し、0は低段階サンプルに対応し、この例のプローブセットは経路111001011をもたらす。サブ経路111001に対応する青色のセルについては、この多くの高段階サンプル以上に遭遇する確率を、3つの確率を対角線上に下に向かって、および青色のセル（自身を含む）の右に向かって合計することにより計算する。この場合、確率は非常に高い（82.2％）。この累積確率を、経路に沿って工程毎に計算し、これらのうちの最小のものがEVAアルゴリズムの出力である。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明は、癌侵襲および／またはMAFの存在と関連するバイオマーカー特性に関する。本明細書で用いられる用語「侵襲」および「侵襲性」は、特定の発生率の癌が局所組織に浸潤し、その癌の分散が始まる初期の転移に関する。
【００２３】
本発明の特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性はCOL11A1の過剰発現を含む。
【００２４】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性はCOL11A1およびINHBAの過剰発現を含む。特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性はCOL11A1およびTHBS2の過剰発現を含む。特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性はCOL11A1、INHBAおよびTHBS2の過剰発現を含む。
【００２５】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性は、下記タンパク質：COL11A（好ましい）、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、もしくは少なくとも5種、または少なくとも6種全部の過剰発現を含む。
【００２６】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性は、下記タンパク質：COL11A（好ましい）、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、もしくは少なくとも5種、または少なくとも6種全部；ならびに下記タンパク質：THBS2（好ましい）、INHBA（好ましい）、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の過剰発現を含む。
【００２７】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性は、下記タンパク質：COL11A（好ましい）、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、もしくは少なくとも5種、または少なくとも6種全部；ならびに下記タンパク質：THBS2（好ましい）、INHBA（好ましい）、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の過剰発現を含む；ならびにSNAI1発現が有意に変化しない（例えば、特定の非限定的な実施形態においては、SNAI1遺伝子がメチル化される）。本発明の一つの特定の非限定的な実施形態においては、SNAI1ではなく、COL11A1、THBS2およびINHBAの過剰発現が侵襲的進行を示す。
【００２８】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2のうちの1、2もしくは3種の過剰発現と共に、hsa-miR-22; hsa-miR-514-1/hsa-miR-514-2/hsa-miR-514-3; hsa-miR-152; hsa-miR-509-1/hsa-miR-509-2; hsa-miR-506; hsa-miR-509-3; hsa-miR-214; hsa-miR-510; hsa-miR-199a-1/hsa-miR199a-2; hsa-miR-21; hsa-miR-513c;およびhsa-miR-199bからなる群より選択される1種以上のmiRNAの示差的発現を含む。
【００２９】
特定の実施形態においては、侵襲および／またはMAFの存在のバイオマーカー特性は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2のうちの1、2もしくは3種の過剰発現と共に、PRAME；SNAI1；KRT7；RASSF5；FLJ14816；PPL；CXCR6；SLC12A8；NFATC2；HOM-TES-103；ZNF556；OCIAD2；APS；MGC9712；SLC1A2；HAK；C3orf18；GMPR；およびCORO6からなる群より選択される1種以上の遺伝子の示差的メチル化を含む。
【００３０】
理論によって束縛されないが、上位に順位付けされた遺伝子はMAF特性の一つの特徴がアクチビンシグナリングに基づく線維芽細胞活性化であることを示唆すると考えられる。そのようなシグナリングは、いくつかの形態のタンパク質分解の変化をもたらし、最終的にはコラーゲンCOL11A1、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1および／またはCOL1A2に富む環境を誘導すると考えられる。MAF特性中に存在する他の関連遺伝子は、メタロプロテイナーゼ-3の組織阻害因子(TIMP3)、ストロメリシン-3(MMP11)およびカドヘリン-11(CDH11)である。
【００３１】
miRNAおよびメチル化された遺伝子、例えば、SNAI1などの各々のMAF特性分子は潜在的な治療標的として役立ち得るが、アクチビンシグナリングがMAF機構において役割を果たすと考えられるという事実は、ホリスタチン（アクチビン結合タンパク質）が侵襲および／または転移阻害剤として役立ち得ることを示し、これは最近の研究(Talmadge JE, Clin Cancer Res 2008; 14: 624-6；Ogino H, Clin Cancer Res 2008; 14: 660-7)が個々の癌の種類の意味でまさに示していることである。別の手法は、いくつかの個々の種類の癌において沈黙化されることが知られるTCF21遺伝子などの間葉-上皮移行(MET)メディエーターを用いることである。
【００３２】
MAF特性が多癌侵襲および／または転移関連特性として未だに発見されていないいくつかの理由が存在するが、特定の癌と関連するいくつかの他の部分的に重複する特性は公開されている。第一に、これらの他の特性の各々は、前記特性が特定の段階を超える腫瘍のサブセット中にのみ存在することを認識する正確な表現型定義の欠如に苦しんでいる。実際、卵巣癌における表現型閾値が、段階IIIbと段階IIIcとの間よりもむしろ、段階IIと段階IIIとの間、または段階IIIと段階IVとの間に置かれた場合、前記特性は明らかではない。表現型閾値の間違った選択が逆の結果を与える可能性すらある（下記を参照）。第二に、それぞれの癌の型は、MAF特性に加えてそれ自身のさらなる特徴を有する。例えば、卵巣癌においては、COLEC11、PEG3およびTSPAN8遺伝子の鋭い下方調節を伴うが、他の癌の場合ではそうではない。実際、本発明の一実施形態は、普遍的な侵襲および／または転移関連生物学的機構をより容易に同定することができる共通の多癌「コア」特性の同定である。第三に、および最も重要なことに、MAF特性は間葉-上皮移行(MET)を通じて、またはMAFのアポトーシスにより潜在的に可逆性である。例えば(Ellsworth RE, Clin Exp Metastasis 2009; 26: 205-13)、転移リンパ節サンプルと、その対応する原発性乳癌サンプルとの比較において、COL11A1が原発腫瘍サンプル中で非常により高い発現を有することが見出された。そのような逆の結果はデータ分析を阻害し得る。
【００３３】
MAF特性の潜在的可逆性は、該特性が力学的プロセスの一部であり、おそらく全ての侵襲および／または転移サンプルが、いくつかの点で、そこにあるが、一時的なものに過ぎず、本発明者らがそれらのサブセット中でのみそれを観察する理由を説明するという事実を強調する。「あらゆる型の癌細胞は部分的な、または完全なEMTを受けて、運動性および侵襲性になるはずであることはほとんど証明されていないが、もっともらしい(Weinberg RA, New York: Garland Science; 2007, p.600)」ことが既に認識されている。本開示まで、実現されていない目標であった、MAF機構を標的化する任意の侵襲および／または転移を阻害する治療的介入は様々な癌の型にわたって前転移性腫瘍に広く適用可能であるため、これは特に面白い。
【００３４】
従って、本発明者らは、公共的に利用可能な生物学的情報のコンピュータによる分析を用いて、システム生物学が、多癌侵襲関連遺伝子発現特性のコアを示し、この多癌転移関連特性の同定が臨床適用、例えば、侵襲および／または転移を阻害する治療剤をもたらすことを示した。近い将来、多くの癌に関する次世代の配列決定、miRNAおよびメチル化情報などの莫大な量のさらなる情報が利用可能になり、この研究を基にさらなるコンピュータによる研究を刺激し、対応する複雑な生物学的プロセスの詳細を解明することができるであろう。
【００３５】
5.2. MAF特性を用いるアッセイ
本明細書に記載の知見の直接的な臨床適用は、高特異性侵襲および／または転移感知バイオマーカーアッセイ方法の開発に関する。特定の実施形態においては、そのようなアッセイ方法としては、限定されるものではないが、核酸増幅アッセイ；核酸ハイブリダイゼーションアッセイ；およびタンパク質検出アッセイが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明のアッセイは、そのような検出技術の組合せ、例えば、限定されるものではないが、核酸レベルでの遺伝子の発現の変化、例えば、過剰発現または発現低下を検出するための増幅およびハイブリダイゼーションの両方を用いるアッセイ；タンパク質レベルでの遺伝子の発現の変化を検出する免疫アッセイ；ならびに核酸に基づく検出工程とタンパク質に基づく検出工程とを含む組合せアッセイを含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「過剰発現」とは、正常値または対照値と比較した遺伝子産物の発現の増加を指し、非限定的な実施形態においては、少なくとも約30％または少なくとも約40％または少なくとも約50％または少なくとも約100％または少なくとも約200％または少なくとも約300％または少なくとも約400％または少なくとも約500％または少なくとも1000％の増加である。
【００３７】
本明細書で用いられる「発現低下」とは、正常値または対照値と比較した遺伝子産物の発現の低下を指し、非限定的な実施形態においては、少なくとも約30％もしくは少なくとも約40％もしくは少なくとも約50％、少なくとも約90％の低下、または従来の方法を用いた場合に発現が本質的に検出不可能であるレベルまでの低下である。
【００３８】
本明細書で用いられる「遺伝子産物」とは、遺伝子の転写および／または翻訳の任意の産物を指す。従って、遺伝子産物としては、限定されるものではないが、プレmRNA、mRNAおよびタンパク質が挙げられる。
【００３９】
特定の実施形態においては、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅に基づくアッセイを用いてサンプル中のMAF特性の全部または一部を示す遺伝子発現の検出のための組成物および方法を提供する。
【００４０】
非限定的な実施形態においては、上記のMAF特性内の遺伝子／タンパク質は、所与のアッセイで評価される遺伝子／タンパク質の少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％である。
【００４１】
特定の実施形態においては、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを用いてサンプル中のMAF特性の全部または一部を示す遺伝子発現の検出のための組成物および方法であって、該サンプルに由来する核酸、またはその増幅産物を1個以上の核酸プローブ配列のアレイにハイブリダイズさせる前記組成物および方法を提供する。特定の実施形態においては、「アレイ」は、支持体に結合した1個以上の核酸プローブを含む支持体、好ましくは、固体を含む。好ましいアレイは、典型的には異なる既知の一で基質の表面に結合した複数の異なる核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」または「チップ」とも記載されるこれらのアレイは、当業界で一般的に記載されており、例えば、米国特許第5,143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号、第5,677,195号、第5,800,992号、第6,040,193号、第5,424,186号およびFodorら、Science, 251:767-777 (1991)を参照されたい。
【００４２】
一般に、アレイは様々な技術、例えば、機械的合成方法またはフォトリソグラフィー法と固相合成法との組合せを含む光指示合成方法を用いて製造することができる。機械的合成方法を用いるこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第5,384,261号および第6,040,193号（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。平面アレイ表面が好ましいが、アレイを実質的に任意の形状の表面またはさらには複数の表面上で製造することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどの繊維、ガラスまたはその他の任意の好適な基質上の核酸であってよい。米国特許第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号および第5,800,992号を参照されたい。
【００４３】
特定の実施形態においては、本発明のアレイは、診断的、予後的、および／もしくは予測的使用を可能にするような様式で包装するか、または全部を含む装置であってもよい；例えば、米国特許第5,856,174号および第5,922,591号を参照されたい。
【００４４】
特定の実施形態においては、本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、プライマー伸長工程を含む。固相支持体からのプライマーの伸長のための方法は、例えば、米国特許第5,547,839号および第6,770,751号に開示されている。さらに、プライマー伸長を用いるサンプルを遺伝子型決定する方法は、例えば、米国特許第5,888,819号および第5,981,176号に開示されている。
【００４５】
特定の実施形態においては、サンプル中のMAF特性の全部または一部の検出のための方法は、核酸増幅に基づくアッセイを含む。特定の実施形態においては、そのようなアッセイとしては、限定されるものではないが、リアルタイムPCR（例えば、Mackay, Clin. Microbiol. Infect. 10(3): 190-212, 2004を参照）、鎖置換増幅(SDA)（例えば、Jolley and Nasir, Comb. Chem. High Throughput Screen. 6(3):235-44, 2003を参照)、自己持続配列複製反応(3SR) (例えば、Muellerら、Histochem. Cell. Biol. 108(4-5):431-7, 1997を参照)、リガーゼ連鎖反応(LCR) (例えば、Lafflerら、Ann. Biol. Clin. (Paris).51(9):821-6, 1993を参照)、転写媒介性増幅(TMA) (例えば、Princeら、J. Viral Hepat. 11(3):236-42, 2004を参照)、または核酸配列に基づく増幅(NASBA) (例えば、Romanoら、Clin. Lab. Med. 16(1):89-103, 1996を参照)が挙げられる。
【００４６】
本発明の特定の実施形態においては、PCRに基づくアッセイ、例えば、限定されるものではないが、リアルタイムPCRを用いて、試験サンプル中のMAF特性の存在を検出する。特定の実施形態においては、MAF特性に特異的なPCRプライマーセットを用いて、MAF特性関連RNAおよび／またはDNA標的を増幅する。そのような標的のためのシグナルを、例えば、蛍光標識プローブを用いて生成させることができる。そのような標的配列の非存在下では、フルオロフォアの蛍光放出を、特定の実施形態においては、プローブ核酸に機能し得る形で連結されたクエンチング分子により消失させることができる。しかしながら、標的配列の存在下では、プローブはプライマー伸長工程の間に鋳型核酸に結合し、プライマー伸長工程を触媒するポリメラーゼのヌクレアーゼ活性はフルオロフォアの遊離および検出可能なシグナルの生成をもたらし、フルオロフォアは最早クエンチング分子に連結されない（Bustin, J. Mol. Endocrinol 25, 169-193(2000)に概説されている）。フルオロフォア（例えば、FAM、TET、またはCy5）および対応するクエンチング分子（例えば、BHQ1またはBHQ2）の選択は当業者の技術の範囲内にあり、特異的な標識キットは市販されている。
【００４７】
特定の実施形態においては、本発明は、目的の遺伝子によりコードされたタンパク質の濃度の変化を検出することによるサンプル中のMAF特性の全部または一部を示す遺伝子発現の検出のための組成物および方法を提供する。
【００４８】
特定の実施形態においては、本発明は、目的の遺伝子により発現されたタンパク質の濃度の変化を検出することによる遺伝子発現の調節を検出するための免疫アッセイの使用に関する。免疫アッセイを介するタンパク質発現の変化を検出するためのいくつかの技術が公知である（The Immunoassay Handbook、第2版、David Wild(編)、Nature Publishing Group, London 2001を参照）。そのような特定の免疫アッセイにおいては、目的のタンパク質と特異的に相互作用することができる抗体試薬、例えば、MAF特性の個々のメンバーを、固相に共有または非共有結合させる。共有結合のための連結剤は公知であり、固相の一部であってもよく、またはコーティングの前にそれに誘導体化されてもよい。免疫アッセイにおいて用いられる固相の例は、多孔性および非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ストリップ、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチックチューブである。固相材料の選択および抗体試薬を標識する方法は、所望のアッセイ形式性能特性に基づいて決定される。いくつかの免疫アッセイについては、標識を必要としないが、特定の実施形態においては、免疫アッセイにおいて用いられる抗体試薬を、シグナル生成化合物または「標識」に結合させる。このシグナル生成化合物または「標識」は、それ自身検出可能なものであるか、または1種以上のさらなる化合物と反応して、検出可能な生成物を生成することができる（米国特許第6,395,472 B1号も参照）。そのようなシグナル生成化合物の例としては、色原体、放射性アイソトープ（例えば、125I、131I、32P、3H、35Sおよび14C）、蛍光化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、化学発光化合物、粒子（可視性もしくは蛍光性）、核酸、錯化剤、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびリボヌクレアーゼ）などの触媒が挙げられる。酵素使用の場合、発色基質、蛍光基質、または発光基質の添加は検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光法、内面反射蛍光法、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびRaman分光法などの他の検出系も、本発明の方法の意味において有用である。
【００４９】
本明細書に記載のアッセイ方法の一つに従って試験される被験体から得た「サンプル」は、組織の少なくとも一部、腫瘍の少なくとも一部、細胞、細胞集団、または流体（例えば、血液、脳脊髄液、尿、発現された前立腺液、腹水、胸水、腹水など）であってよい。特定の実施形態においては、本発明のアッセイと共に用いられるサンプルを、生検により取得する。生検は切開技術または経皮的技術により行うことができる。切開生検は、外科用メスを用いて都合良く実施され、全腫瘍塊（切除生検）または腫瘍塊の一部（切開生検）の除去を含んでもよい。対照的に、経皮的生検は一般に、盲目的に、または画像化装置を援用して針のような器具を用いて実施され、微細針吸引(FNA)またはコア生検であってもよい。FNA生検においては、個々の細胞または細胞のクラスターを細胞学的検査のために取得する。コア生検においては、組織のコアまたは断片を、凍結切片またはパラフィン切片により行うことができる組織学的検査のために取得する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態においては、本明細書に記載のアッセイ方法を用いて、癌におけるMAF特性の存在を検出することができる。特定の実施形態においては、そのような癌としては、固形腫瘍の存在を含むものが挙げられる。特定の実施形態においては、そのような癌としては、上皮癌が挙げられる。特定の実施形態においては、そのような癌としては、例えば、限定されるものではないが、卵巣、胃、膵臓、十二指腸、肝臓、結腸、乳腺、膣、頸部、前立腺、肺、睾丸、口腔、食道の癌、ならびに神経芽細胞腫およびユーイング肉腫が挙げられる。
【００５１】
特定の実施形態においては、本発明は、MAF特性の診断的、予後的および／または予測的使用を可能にするアッセイ方法に関する。例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載のアッセイ方法は、診断的な意味で用いることができ、例えば、サンプル中のMAF特性の全部または一部を検出することにより、侵襲性の癌を診断することができる。特定の非限定的な実施形態においては、本明細書に記載のアッセイ方法は、予後的な意味で用いることができ、例えば、MAF特性の全部または一部の検出により、転移がまだ同定されていない状況におけるなど、将来のそのような転移の可能性の評価が可能になる。特定の非限定的な実施形態においては、本明細書に記載のアッセイ方法は、予測的な意味で用いることができ、例えば、MAF特性の全部または一部の検出により、限定されるものではないが、ネオアジュバント療法、外科的切除(rescion)、および／または化学療法などの特定の種類の治療法の起こり得る利益の評価が可能になる。
【００５２】
特定の非限定的な実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、被験体における癌が侵襲性および／もしくは転移性形態に進行したかどうか、または寛解したかどうか（例えば、治療に応答して）を決定することができる。
【００５３】
特定の非限定的な実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、癌を段階評価することができる（臨床段階評価により侵襲が起こったかどうかを考慮する場合）。MAF特性が、特定の癌において異なる段階で起こる侵襲のマーカーとして様々な癌に存在するという事実に起因して、そのような多癌段階評価が可能である。例えば、特定の実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および神経芽細胞腫から選択される癌を段階評価することができる。特定の実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、乳癌がin situで段階Iに達する時を同定することができる。特定の実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、卵巣癌が段階III、およびより具体的には段階IIIcに達する時を同定することができる。特定の実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、結腸直腸癌が段階IIに達する時を同定することができる。特定の実施形態においては、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、神経芽細胞腫が段階Iを超えて進行した時を同定することができる。
【００５４】
特定の非限定的な実施形態においては、MAF特性の少なくとも一部が乳癌におけるネオアジュバント化学療法に対する耐性と関連すると以前に同定されたため(Farmer P, Nat Med 2009; 15: 68-74)、本発明のマーカーおよびアッセイ方法を用いて、限定されるものではないが、上皮癌などの癌と診断された被験体における薬剤応答を予測することができる。しかしながら、本開示の出願まで認識されていなかったMAF特性の多癌関連性に起因して、本発明の特定の実施形態は、卵巣、胃、膵臓、十二指腸、肝臓、結腸、膣、頸部、前立腺、肺および睾丸の癌からなる群より選択される上皮癌と診断された被験体における薬剤応答を予測するためのMAF特性の存在を用いることに関する。
【００５５】
特定の非限定的な実施形態においては、MAF特性、またはそれと関連するマーカーのサブセットを用いて、被験体における治療法の文脈上の（相対的）利益を評価することができる。例えば、治療剤の決定が、癌が被験体中に存在するとの仮定に基づく場合、MAF特性、またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在は、癌が侵襲性であることを示唆する。特定の非限定的な実施形態としては、外科的処置または放射線抗腫瘍処置の前のネオアジュバント化学療法および／または免疫療法の、悪性腫瘍を有する被験体に対する相対的利益を、MAF特性またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在を決定することにより評価することができ、MAF特性またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在は被験体に対するネオアジュバント療法により付与された相対的利益の減少を示す。
【００５６】
特定の実施形態においては、本発明のアッセイは、MAF特性と関連する遺伝子の発現、例えば、限定されるものではないが、過剰発現の協調的調節を検出することができる。特定の実施形態においては、そのような検出は、限定されるものではないが、COL11A1、THBS2およびINHBAの発現の検出を含む。特定の実施形態においては、そのような検出は、限定されるものではないが、COL11A1（好ましい）、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2；ならびに下記のもの：THBS2（好ましい）、INHBA（好ましい）、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の発現の検出を含む。例えば、限定されるものではないが、癌と診断されたか、または癌の存在もしくは段階について評価される被験体（ここで、癌は好ましくは、限定されるものではないが、上皮癌）から得たサンプルを、MAF遺伝子の存在および／または下記タンパク質：COL11A1（好ましい）、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、およびCOL1A2のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、もしくは少なくとも5種、または6種全部；ならびに下記のもの：THBS2（好ましい）、INHBA（好ましい）、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の過剰発現について試験することができる。好ましくは、限定されるものではないが、SNAI1発現は変化しない（さらに、特定の非限定的な実施形態においては、SNAI1遺伝子はメチル化される）。本発明の一つの特定の非限定的な実施形態においては、SNAI1ではなく、COL11A1、THBS2およびINHBAの過剰発現は、侵襲性および／または転移性進行を有する癌の診断を示す。
【００５７】
特定の実施形態においては、本発明の高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1の過剰発現を検出する。
【００５８】
特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1およびINHBAの協調的過剰発現を検出する。特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1およびTHBS2の協調的過剰発現を検出する。特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1、INHBA、およびTHBS2の協調的過剰発現を検出する。
【００５９】
特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1、INHBAおよびTHBS2の1種、2種、もしくは3種全部の協調的過剰発現およびCOL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2の1種以上；ならびに下記のもの：VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2の1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の発現を検出する。
【００６０】
特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1、INHBAおよびTHBS2のうちの1種、2種もしくは3種全部の協調的過剰発現と共に、hsa-miR-22; hsa-miR-514-1/hsa-miR-514-2|hsa-miR-514-3; hsa-miR-152; hsa-miR-508; hsa-miR-509-1/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509-3; hsa-miR-507; hsa-miR-509-1/hsa-miR-509-2; hsa-miR-506; hsa-miR-509-3; hsa-miR-214; hsa-miR-510; hsa-miR-199a-1/hsa-miR199a-2; hsa-miR-21; hsa-miR-513c; およびhsa-miR-199bからなる群より選択される1種以上のmiRNAの示差的発現を検出する。
【００６１】
特定の実施形態においては、高特異性侵襲感知バイオマーカーアッセイは、COL11A1、INHBAおよびTHBS2の1種、2種、もしくは3種全部の協調的過剰発現と共に、PRAME; SNAI1; KRT7; RASSF5; FLJ14816; PPL; CXCR6; SLC12A8; NFATC2; HOM-TES-103; ZNF556; OCIAD2; APS; MGC9712; SLC1A2; HAK; C3orf18; GMPR; およびCORO6からなる群より選択される1種以上の遺伝子の示差的メチル化を検出する。
【００６２】
診断キットも本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、本発明は、試験サンプル中のMAF特性の全部または一部の存在を決定するためのキットを含む。
【００６３】
サンプル中のMAF特性の全部または一部の存在を決定することに向けられたキットは、a)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのMAF特性抗原およびb)検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した前記MAF特性抗原と特異的に相互作用する抗体を含むコンジュゲートを含んでもよい。キットはまた、抗原に結合する試薬を含む対照または較正試薬ならびにキットを使用する様式を記載する説明書を含んでもよい。
【００６４】
特定の実施形態においては、キットは、MAF特性抗原が、下記遺伝子：COL11A1 (好ましい)、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、およびCOL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2のうちの1種以上によりコードされたタンパク質を含むか、またはさもなければそれから誘導された、1種以上のMAF特性抗原特異的抗体を含む。
【００６５】
特定の実施形態においては、本発明は、MAF特性核酸の検出に有用なキットおよび組成物に関する。特定の実施形態においては、そのようなキットは1種以上のMAF特性核酸にハイブリダイズすることができる核酸を含む。例えば、限定されるものではないが、そのようなキットを、MAF特性核酸を検出するためのハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅アッセイと共に用いることができる。図1は、そのようなキットの非限定例において用いることができる一般的な戦略を示す。
【００６６】
特定の実施形態においては、本発明のキットを用いて使用することができるハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅アッセイとしては、限定されるものではないが、リアルタイムPCR（例えば、Mackay, Clin. Microbiol. Infect. 10(3):190-212, 2004を参照)、鎖置換増幅(SDA) (例えば、JolleyおよびNasir, Comb. Chem. High Throughput Screen. 6(3):235-44, 2003を参照)、自己持続配列複製反応 (3SR) (例えば、Muellerら、Histochem. Cell. Biol. 108(4-5):431-7, 1997を参照)、リガーゼ連鎖反応(LCR) (例えば、Lafflerら、Ann. Biol. Clin. Paris).51(9):821-6, 1993を参照)、転写媒介性増幅(TMA) (例えば、Princeら、J. Viral Hepat. 11(3):236-42, 2004を参照)、または核酸配列に基づく増幅(NASBA) (例えば、Romanoら、Clin. Lab. Med. 16(1):89-103, 1996を参照)が挙げられる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態においては、MAF特性核酸の検出のためのキットは、(1)MAF特性核酸に特異的にハイブリダイズする標的特異的配列を含む核酸配列、および(ii)検出可能な標識を含む。そのようなキットはさらに、標的配列の増幅を媒介する、ネステッドおよび／またはヘミネステッドプライマーなどの、プライマーとして機能し得る1つ以上のさらなる核酸配列を含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明のキットはさらに、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応アッセイの意味で用いられる標識されたプローブなどの、増幅の指示因子として機能するさらなる核酸配列を含んでもよい。
【００６８】
本発明のキットはまた、複数のMAF特性核酸を同時に、または連続的に検出するのに有用である。そのような状況では、キットは、それぞれ異なる核酸標的について、異なるセットのプライマーおよび1つ以上の異なる標識を含んでもよい。
【００６９】
特定の実施形態においては、キットは下記遺伝子：COL11A1 (好ましい)、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、およびCOL1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1、およびSNAI2のうちの1種以上を含むか、またはさもなければそれから誘導された核酸（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、プライマー、またはRT-PCRプローブ）を含む。
【００７０】
本明細書に記載の任意の例示的アッセイ形式および本発明による任意のキットを、例えば、米国特許第5,089,424号および第5,006,309号に記載のように、ならびに当業界で公知の任意の市販の検出プラットフォームと共に、自動化および半自動化系（微粒子を含む固相が存在する場合のものなど）における使用のために適合させるか、または最適化することができる。
【００７１】
特定の実施形態においては、本発明の方法、アッセイ、および／またはキットは、MAF特性の全部または一部の検出に関し、そのような検出はバイナリー、検出／非検出結果の形態を取ってもよい。特定の実施形態においては、本発明の方法、アッセイ、および／またはキットは、MAF特性の全部または一部の検出に関し、そのような検出は多因子結果の形態を取ってもよい。例えば、限定されるものではないが、そのような多因子結果は、１、2、3以上の因子に基づくスコアの形態を取ってもよい。そのような因子としては、限定されるものではないが、(1)MAF特性遺伝子産物の発現、メチル化の状態、および／またはmiRNAの存在の変化の検出；(2)変化したレベルを示すサンプル中のMAF特性遺伝子産物の数、メチル化の状態、および／またはmiRNAの存在；ならびに(3)MAF特性遺伝子産物、メチル化の状態、および／またはmiRNAの存在のそのような変化の程度が挙げられる。
【００７２】
5.3. MAF特性に基づく治療方法
さらに非限定的な実施形態においては、本発明は、被験体を治療する方法、例えば、限定されるものではないが、上記の診断方法を実施した後、MAF特性が被験体のサンプル中で検出された場合、患者がさらなる診断手順(例えば、X線、超音波、コンピュータ断層撮影(CAT走査)または磁気共鳴画像化(MRI)などの画像化手順)を受けることを推奨し、被験体が侵襲および／または転移を阻害する薬剤を含む療法を投与されることを推奨することを含む方法を提供する。
【００７３】
本発明の特定の非限定的な実施形態においては、上記の診断方法を実施し、そのアッセイの結果を考慮して治療の決定を行う。例えば、限定されるものではないが、外科的処置または放射線抗腫瘍処置の前にネオアジュバント化学療法および／または免疫療法を処方するかどうかなどの治療的決定を、上記の診断方法の結果を考慮して行うことができる。診断方法の結果は、MAF特性、またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在は局在化されていない癌を示すため、被験体から得られたサンプル中の、MAF特性またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在が、ネオアジュバント療法により被験体に付与された相対的利益の減少を示すとして治療的決定と関連する。
【００７４】
特定の実施形態においては、上記の診断方法を実施し、特定の治療計画を継続するかどうかに関する決定をそのアッセイの結果を考慮して行う。例えば、限定されるものではないが、特定の治療計画を継続するかどうか、例えば、特定の化学療法、放射線療法、および／または分子標的化療法(例えば、癌細胞特異的抗体療法)を継続するかどうかの決定を、上記の診断方法の結果を考慮して行うことができる。診断方法の結果は、被験体から得られたサンプル中の、MAF特性またはそれと関連するマーカーのサブセットの存在が、その治療法に対する被験体の応答性を示し得るとして特定の治療計画を継続するかどうかの決定と関連する。
【００７５】
5.4. MAF特性に基づく薬剤探索方法
本発明を用いて、MAF特性により提供された生物学的知識から推定された標的を用いて多癌侵襲阻害治療剤を開発することもできる。様々な非限定的な実施形態においては、本発明は、被験体における癌の侵襲および／または転移性播種を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。そのような特定の実施形態においては、前記方法は、MAF特性を発現する癌細胞に試験薬剤を曝露することを含み、試験薬剤が該特性における遺伝子の過剰発現を減少させる場合、この試験薬剤を癌の侵襲および／または転移の阻害における治療剤として用いることができる。
【００７６】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のMAF特性中の遺伝子の発現に対する試験薬剤の効果を決定し(例えば、限定されるものではないが、下記タンパク質：COL11A1(好ましい)、COL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種もしくは少なくとも5種；ならびに下記：THBS2(好ましい)、INHBA(好ましい)、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上もしくは2種以上もしくは3種以上の過剰発現)、試験薬剤が前記特性中の遺伝子の発現を減少させる場合、前記試験薬剤を癌の侵襲および／または転移の治療／予防における治療剤として用いることができる。
【００７７】
特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1の発現に関連してアッセイされる。特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1およびINHBAの発現に関連してアッセイされる。特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1およびTHBS2の発現に関連してアッセイされる。特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2の発現に関連してアッセイされる。
【００７８】
特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2のうちの1種、2種もしくは3種全部の発現ならびにCOL10A1、COL5A1、COL5A2、COL1A1およびCOL1A2、VCAN、FAP、MMP11、POSTN、ADAM12、LOX、FN1およびSNAI2のうちの1種以上の発現に関連してアッセイされる。
【００７９】
特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2のうちの1種、2種もしくは3種全部の発現ならびにhsa-miR-22; hsa-miR-514-1/hsa-miR-514-2/hsa-miR-514-3; hsa-miR-152; hsa-miR-508; hsa-miR-509-1/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509-3; hsa-miR-507; hsa-miR-509-1/hsa-miR-509-2; hsa-miR-506; hsa-miR-509-3; hsa-miR-214; hsa-miR-510; hsa-miR-199a-1/hsa-miR199a-2; hsa-miR-21; hsa-miR-513c; およびhsa-miR-199bからなる群より選択される1種以上のmiRNAの発現に関連してアッセイされる。
【００８０】
特定の実施形態においては、試験薬剤の効果は、COL11A1、INHBAおよびTHBS2の1種、2種または3種全部の発現ならびにPRAME; SNAI1; KRT7; RASSF5; FLJ14816; PPL; CXCR6; SLC12A8; NFATC2; HOM-TES-103; ZNF556; OCIAD2; APS; MGC9712; SLC1A2; HAK; C3orf18; GMPR; およびCORO6からなる群より選択される1個以上の遺伝子のメチル化に関連してアッセイされる。
【００８１】
5.5. 相乗的遺伝子対の検出
特定の実施形態においては、第2のステップとして、本発明者らは、個別にではなく、一緒にMAF特性の特定のメンバーと最も関連する遺伝子対を同定し、従って、それらは以前の調査には出現しなかった。この仕事のために、本発明者らは、生物学的発見をさらに容易にすることができる(Watkinson J, Ann N Y Acad Sci 2009;1158:302-13)に記載のコンピュータ方法を用いて、MAF特性メンバーとのその相乗作用(Anastassiou D, Mol Syst Biol 2007;3:83)に従って遺伝子対を順位付けた。本発明者らは、両方の種類の癌に共通するのではなく、2つの卵巣癌の間ならびに2つの結腸直腸癌の間の強い検証の非限定例を発見した。特に興味深いのは、両方の結腸癌における上位の遺伝子のうちにある遺伝子対(CCL11、MMP2)および(SLAM7、SLAM8)、ならびに両方の卵巣癌における上位の遺伝子のうちにある遺伝子対(C7、PDGFRA)、(C7、ECM2)、(TCF21、ECM2)(TCF21は公知の間葉上皮メディエーターである)である。
【００８２】
特定の実施形態においては、相互情報および相乗作用を評価することができる。例えば、2個の遺伝子G1およびG2の発現レベルなどの2つの変数が、対応する限界(marginal)p1およびp2を含む同時確率密度p12ならびに単純化された表記を用いることにより統制されると仮定すれば、相互情報I(G1;G2)は相関の一般的尺度であり、期待値E{log(p12/p1p2)}と定義される。第3の変数G3に関する2つの変数G1、G2の相乗作用は[14]I(G1,G2;G3)-[I(G1;G3)+I(G2;G3)]、すなわち、純粋にG1とG2との相乗的協働に起因する対G1、G2とG3との結合の部分(「全部」-「部分」の合計)に等しい。
【００８３】
5.6. 統計分析
遺伝子発現データに加えて、miRNA発現とMAF特性に対する遺伝子メチル化との関係も調査し、本発明の文脈で用いることができる。例えば、限定されるものではないが、miRNA発現および遺伝子メチル化活性の有意性、ならびに相乗作用対に関するP値評価を、以下のように実施することができる。本発明者らは、多重検定補正を構成する順列に基づく手法を適用した：本発明者らは、それぞれの順列実験において包括的検索を行った後、対応する100の最高値をセーブする、クラス標識の100の順列実験を行った。これらの100の最高値スコアのセットを用いて、本発明者らは、Gumbel(I型極値)分布の位置パラメータおよび尺度パラメータの最尤法を取得したところ、蓄積密度関数Fが得られた。次いで、実際のスコアx0のP値は、表現型と関連しない無帰仮説の下では1-F(x0)である。同様に、相乗作用対について、本発明者らは、COL11A1プローブ値をそれぞれ無作為に順序を変えた以外は元と同一である100のデータセットにおけるトップスコアの相乗作用を発見し、トップの順序の相乗作用スコアを、Gumbel分布を用いて上記のようにモデル化した。
【実施例】
【００８４】
6. 実施例
6.1. 実施例1
本発明者らは、遺伝子がその極値(多くの場合、最大値)を有する場合、転移バイナリー(「低段階」対「高段階」)表現型と関連する遺伝子クラスターに焦点を当てるためであるが、そうでなければ、本発明者らは最初に、本発明者らが「極値関連」(EVA)と呼ぶ、遺伝子と表現型との関連の特殊な尺度を開発した。簡単に述べると、EVA測定基準は、遺伝子の最も高い発現値を有するサンプルの全サブセットにわたる偏った区分の最小P値である。換言すれば、合計M個のサンプルが存在し、そのうちのN個が「低段階」であり、M-N個が「高段階」であるとすれば、本発明者らは最も高い遺伝子発現値を有するm個のサンプルを選択する。遺伝子発現値が表現型と相関しないとの仮定の下では、選択されたm個のサンプルの中に最大でn個の「低段階」サンプルが存在する確率は、累積超幾何学的確率h(x≦n；M,N,m)により与えられる。次いで、EVA測定基準は、nの全ての可能な値にわたるこれらの確率の最小値の-log10に等しい。例えば、合計300個のサンプルについて、250個の高段階サンプルが存在し、50個の低段階サンプルが存在すると仮定する。さらに、特定の遺伝子の最も高い値を有する100個のサンプルが99個の高段階サンプルおよび1個の低段階サンプルを含むと仮定する。その場合、h(x≦1；300,50,100)は、MATLAB関数hypercdf(1,300,50,100) = 5 x 10-9を用いて評価することができ、少なくとも-log10(5 x 10-9)= 8.3のその遺伝子に関するEVA測定基準が得られる、例えば、101番目のサンプルも高段階である場合、その遺伝子のEVA測定基準はさらにより高い。一度、最も高い値に到達したら、残りのサンプルの分類整理は無関係であり、極値のみが表現型と関連するという仮説を反映することに留意する。図2は、TCGA卵巣癌データセットおよびIIIbとIIIcとの間の段階評価閾値を用いたCOL11A1遺伝子の累積超幾何学的確率の値を示す：最大値(8.31)はm = 133の時に生じる。事実、最も高いCOL11A1発現を有する133個のサンプル全てが段階IIIcまたはIVにある。
【００８５】
次いで、本発明者らは、「高段階」または「低段階」と標識されたいくつかのサンプルの遺伝子発現データセットを考慮した場合、高段階サンプル中でのみ協調的に過剰発現される遺伝子の選択を誘導する機械的に偏りのない(表現型にのみ依存する)アルゴリズムを開発した。本発明者らはまず、EVA測定基準による最も高い順位を有する上位100個の遺伝子を選択する。このセットの遺伝子のみを用いて、本発明者らはギャップ統計値を用いてk平均クラスタリングを実施した(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63: 411-423)。その工程で、実際に遺伝子が協調的に過剰発現される場合、それらはヒートマップ中で良好に整列する。これは、高／低段階表現型と最も関連するクラスターに属するサンプルの選択を誘導する(これを「EVAに基づくサンプル」のセットと呼ぶ)。そのクラスター中のほぼ全てのサンプルが、MAF段階評価閾値を超えたが、非常に少ない例外は誤診断に起因するものであり得る。次に、本発明者らは、(a)「EVAに基づく」および「高段階」の両方であるサンプルと、(b)「EVAに基づかない」および「低段階」の両方であるサンプルとを対比する「クリーン」なMAF表現型を定義する。サンプル数が十分に大きい場合、この「クリーン」な表現型は、本発明者らが、観察された侵襲現象および／または転移関連協調的過剰発現と最も関連する遺伝子を同定することができる最も鋭い方法を提供する。次いで、本発明者らは、遺伝子を順位付けし、「クリーン」表現型を用いる異分散t検定を用いてその多重検定補正P値を計算し、Bonferroni補正後にP<10-3である遺伝子を選択する。最後に、本発明者らは、全ての癌発現データセット上のこれらの選択された遺伝子の交点を見出し、それらを倍数変化に関して順位付けする。
【００８６】
n個のサンプルおよびm個のプローブセットを含むデータセットについて、EVAアルゴリズムは、n x mの累積超幾何学的分布確率を計算する。これは全く計算集約型であってよく、従って本発明者らは、以下に詳述されるように、EVAアルゴリズムが進行するにつれて各プローブセットの累積超幾何学的分布を力学的に「構築」する低複雑度実現アルゴリズムを考案した。
【００８７】
a個の高段階サンプルおよびb個の低段階サンプルを含むデータセットを考慮して、サンプルの全ての可能なサブセットに対応する超幾何学的確率の(a+1)x(b+1)表が構築される。次いで、各プローブセットについて、プローブセットの発現値に従ってサンプルを分類する。この順序付けは、各サンプルについて左下の角から右上の角まで上または右に移動して表を通過する経路をもたらす。経路中の各工程で、高段階サンプルの観察された数以上に遭遇する累積確率を、エントリーを対角線上に下に向かって、および現在のセル自身を含む現在のセルの右に向かって合計することにより計算する。このアルゴリズムは図3に示される視覚的な例を用いて最良に示され、ここでデータセットは合計で3個の低段階サンプルおよび5個の高段階サンプルを有する。各プローブセットは、この表を通過する経路をもたらし、経路の例はここで灰色で示される。レッティング1は高段階サンプルに対応し、0は低段階サンプルに対応し、この例のプローブセットは経路111001011をもたらす。サブ経路111001に対応する青色のセルについては、この多くの高段階サンプル以上に遭遇する確率を、3つの確率を対角線上に下に向かって、および青色のセル（自身を含む）の右に向かって合計することにより計算する。この場合、確率は非常に高い（82.2％）。この累積確率を、経路に沿って工程毎に計算し、これらのうちの最小のものがEVAアルゴリズムの出力である。このアルゴリズムの疑似コードを図4に与える。
【００８８】
本発明者らは、本発明者らが段階評価情報を有している2つは卵巣癌、2つは結腸直腸癌に由来する4つの豊富な遺伝子発現データセット(Jorissen RN, Clin Cancer Res 2009; 15: 7642-51; Smith JJ, Gastroenterology; 138: 958-68)に対してEVAアルゴリズムを実施した。様々な段階評価移行を用いて、協調的に過剰発現される遺伝子を含むサンプルを含むものが、卵巣癌においては段階IIIb、結腸直腸癌においては段階Iを超えると定義されることが明らかになった。興味深いことに、本発明者らは、卵巣癌の大網転移に存在するとして(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol 2007; 196: 245-245 e1-11)に同定された「転移関連遺伝子」も、広範囲の線維形成と相関する卵巣癌の「予後不良」なサブタイプに属するとして(Tothill RW, Clin Cancer Res 2008; 14: 5198-208)に大きく同定されていることに気付いた。
【００８９】
注目すべきことに、本発明者らは、4つのデータセットの全てに共通するP<10-12を有する複数の遺伝子が存在することを見出した。表1は、2より大きい平均対数倍数変化を有するこれらの遺伝子の一覧を示す。倍数変化に関して上位に順位付けされた遺伝子は、COL11A1(プローブ37892_at)、次いで、COL10A1、POSTN、ASPN、THBS2およびFAPであった。これらの遺伝子が協調的に過剰発現されたほぼ全てのサンプルは段階評価閾値に到達し、それは結腸癌については段階II、卵巣癌については段階IIIcである。
【表１】
2013523186.tif 000003
【００９０】
次いで、本発明者らは、新しく同定された特性を、他の癌の様々な段階で示差的に発現されると同定された遺伝子のより大きいセット内に見出すことができる他の研究を過去に遡って同定することを目的とする広範囲の文献検索を行った。本発明者らは、その補足データを探し、その倍数変化に関して特定の欄の遺伝子を再度順位付けることにより、いずれの遺伝子も主要なテキストに記載されていない研究でさえ精査した。多くの引用された参考文献が遺伝子のより大きいセットの文脈においても新しく同定された特性を含有させることには失敗したが、本発明者らは、本発明者らの一覧全体と著しく類似するこれらの参考文献で同定されたより大きいデータセットから癌遺伝子の一覧を単離することができた。しかしながら、これらの参考文献が、新しく同定された特性に含まれる1個以上の遺伝子がより大きいデータセットの文脈で以前に含有された場合でも、その特性の重要性を理解していなかったことが明らかである。第一に、in situの腺管癌(DCIS)と、侵襲性腺管癌(IDC)とを比較する乳癌の研究(9)において、上位に順位付けられた遺伝子は再度、6.50の倍数変化を有するCOL11A1(プローブ37892_at)であったが、次の最も高い倍数変化(4.08)はCOL11A1の別のプローブ、次いで、COL10A1のプローブに対応していた。第二に、早期胃癌(EGC)と進行胃癌(AGC)とを比較する研究(Vecchi M, Oncogene 2007; 26: 4284-94)において、COL11A1(プローブ37892_at)は再度、上位(倍数変化：19.2)、次いで、COL10A1およびFAPであった。従って、卵巣癌および結腸直腸癌に加えて、MAF特性は腺管癌ならびに胃癌に存在するようである。最後に、本発明者らは、COL11A1が、肺(Chong IW, Oncol Rep 2006;16:981-8)および口腔(Schmalbach CE, Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 130:295-302)などの他の種類の癌でも同様に潜在的な転移関連遺伝子と同定されたことに気付いたが、これはMAF特性が全てではないとしても、多くの上皮癌の高段階サンプルのサブセット中に存在し得ることを示唆している。COL11A1と表現型とのこの顕著な一貫した強い関連は、それをMAF特性の「プロキシ」として一般的に用いることができることを示唆する。次いで、これにより、本発明者らは、段階評価情報を含まなくても、MAF特性がそれらのかなり大きなサブセット中の存在する限り、因子の「交点」を発見することを目的とする、多くの種類の癌の全ての公共利用可能な遺伝子発現データベースを利用することが可能になり、本発明者らはMAF生物学的機構の「コア」を同定することができるようになった。乳癌、胃癌および膵臓癌に関する対応する参考文献で提供された情報に関するデータを、表2にまとめる。
【表２】
2013523186.tif 000004
【００９１】
この仕事の第1のステップとして、本発明者らは、COL11A1およびMAF特性と一貫して最も高く関連する特定の遺伝子、メチル化部位、およびmiRNAを同定した。表3Aは、COL11A1と関連する遺伝子の集計一覧を示すが、表3Bおよび表3Cはそれぞれ、MAF特性と関連するメチル化部位およびmiRNA配列に関する。表3A中の一覧は、表現型に基づく遺伝子順位付けと非常に類似している(表1)。全てのデータベース中で上位に順位付けられた表3A中の遺伝子の一覧は、全ての事例において、表現型に基づく遺伝子順位付けと類似していたが、これはCLO11A1をMAF特性のプロキシとして用いることができるという仮説を支持している。COL10A1および他のいくつかのコラーゲンに加えて、上位に順位付けられた遺伝子は、トロンボスポンジン-2(THBS2)、インヒビンβA(INHBA)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、15個を含むロイシンリッチリピート(LRRC15)、ペリオスチン(POSTN)ならびにジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質12(ADAM12)である。FAPの存在は、一般的な線維形成反応を示し、それ自体、MAF特性を推論するのに十分ではない。実際、FAPは場合によっては健康な組織中でもいくつかの他のEMT関連遺伝子と共に同時発現される。しかしながら、COL11A1は、健康な組織においても低段階の癌組織においてもこれらの遺伝子のいずれとも関連しなかったが、これは、それをMAF特性のためのプロキシとして用いることができるという仮説をさらに支持している。これらの結果は、コラーゲン以外の表3Aで上位に順位付けられたTHBS2およびINHBAが、MAF機構において最も重要な役割を果たす因子であることを示す。
【表３】
2013523186.tif 000005
【００９２】
2013523186.tif 000006
【００９３】
2013523186.tif 000007
【００９４】
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【００９５】
2013523186.tif 000009
【００９６】
2013523186.tif 000010
【００９７】
2013523186.tif 000011
【００９８】
2013523186.tif 000012
【００９９】
6.2. 実施例2
第2のステップとして、本発明者らは、個別にではなく、一緒にCOL11A1と最も関連し、遺伝子対を同定し、従って、それらは前記一覧中には出現しない。この仕事のために、本発明者らは、生物学的発見をさらに容易にすることができる(Watkinson J, Ann N Y Acad Sci 2009;1158:302-13)に記載のコンピュータ方法を用いて、COL11A1とのその相乗作用(Anastassiou D, Mol Syst Biol 2007;3:83)に従って遺伝子対を順位付けた。本発明者らは、両方の種類の癌に共通するのではなく、2つの卵巣癌の間ならびに2つの結腸直腸癌の間の強い検証を発見した。特に興味深いのは、両方の結腸癌における上位の遺伝子のうちにある遺伝子対(CCL11、MMP2)および(SLAM7、SLAM8)、ならびに両方の卵巣癌における上位の遺伝子のうちにある遺伝子対(C7、PDGFRA)、(C7、ECM2)、(TCF21、ECM2)(TCF21は公知の間葉上皮メディエーターである)である。
【０１００】
相互情報および相乗作用を、以下のように評価した。2個の遺伝子G1およびG2の発現レベルなどの2つの変数が、対応する限界(marginal)p1およびp2を含む同時確率密度p12ならびに単純化された表記を用いることにより統制されると仮定すれば、相互情報I(G1;G2)は相関の一般的尺度であり、期待値E{log(p12/p1p2)}と定義される。第3の変数G3に関する2つの変数G1、G2の相乗作用は[14]I(G1,G2;G3)-[I(G1;G3)+I(G2;G3)]、すなわち、純粋にG1とG2との相乗的協働に起因する対G1、G2とG3との結合の部分(「全部」-「部分」の合計)に等しい。
【０１０１】
6.2. 実施例3
遺伝子発現データに加えて、miRNA発現と、MAF特性に対するメチル化との関係も調査した。miRNA発現および遺伝子メチル化活性の有意性、ならびに相乗作用対に関するP値評価を、以下のように実施した。本発明者らは、多重検定補正を構成する順列に基づく手法を適用した：本発明者らは、それぞれの順列実験において包括的検索を行った後、対応する100の最高値をセーブする、クラス標識の100の順列実験を行った。これらの100の最高値スコアのセットを用いて、本発明者らは、Gumbel(I型極値)分布の位置パラメータおよび尺度パラメータの最尤法を取得したところ、蓄積密度関数Fが得られた。次いで、実際のスコアx0のP値は、表現型と関連しない無帰仮説の下では1-F(x0)である。同様に、相乗作用対について、本発明者らは、COL11A1プローブ値をそれぞれ無作為に順序を変えた以外は元と同一である100のデータセットにおけるトップスコアの相乗作用を発見し、トップの順序の相乗作用スコアを、Gumbel分布を用いて上記のようにモデル化した。
【０１０２】
本発明者らは、TCGA卵巣データセットのために利用可能なmiRNAおよびメチル化データのみを有していた。尺度としてCOL11A1との相互情報を用いて、本発明者らは多くの統計的に有意なmiRNAを発見したが、これらのうち、hsa-miR-22およびhsa-miR-152、ならびに示差的にメチル化された遺伝子、例えば、SNAI1およびPRAMEは、特に複雑な生物学的機構を示唆する(MAF表現型との相関は、より低い有意性で本質的に同じ一覧をもたらした)。表4は、miRNAの一覧を含むが、表5はメチル化された遺伝子の一覧を含む(両方の場合、多重検定補正P<10-16、上記参照)。SNAI1(snail)メチル化は、この遺伝子が最も重要なEMT関連転写因子の一つであると知られるため、特に重要である。その代わりに、最も強いMAF結合転写因子はAEBP1であり、それは特に興味深い潜在的な標的になる。他のEMT関連転写因子の多く、例えば、SNAI2、TWIST1およびZEB1はMAF特性中で過剰発現されることが多いが、SNAI1はそうではない(そして、本発明者らがメチル化データを有する少なくとも卵巣癌においては、これはその示差的にメチル化された状態に起因する)。かくして、SNAI1発現の欠如は、特定の実施形態においてはMAF特性の重要な特徴的な特徴であり、本発明者らはSNAI1過剰発現もCDH1(E-カドヘリン)下方調節も観察しなかった。
【表４】
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【表５】
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【０１０３】
本明細書で引用された様々な参考文献は、その全体が参照により本明細書に組入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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