(57)【要約】  ｃ−Ｍｅｔ転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の塩基配列に相補的に結合して、細胞内でｃ−Ｍｅｔの発現を抑制すると同時に、免疫反応を誘発しない（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、及び前記ｓｉＲＮＡの癌の予防及び／または治療における用途が提供される。前記ｃ−Ｍｅｔを暗号化するｍＲＮＡと相補結合されるｓｉＲＮＡは、リボ核酸の媒介干渉現象（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）によってほとんど全ての癌細胞に共通的に過発現されるｃ−Ｍｅｔの発現を抑制して、癌細胞の増殖及び転移を阻害することができるので、抗癌剤として有用に使用される。
2013515498.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の表１−１に記載されたｃ−ＭｅｔのｃＤＮＡ領域から選択されたいずれか１つに相当するｍＲＮＡ領域を標的とする１５−３０ｂｐの二重鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）。
【表１】
2013515498.tif 000024
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号３、１８、及び２１からなる群より選択される１つ以上の塩基配列に該当するｍＲＮＡ領域を標的とするものである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは、前記３´末端、５´末端、または両末端に１−５ヌクレオチドからなる突出部が導入されたものである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、下記の表６に記載されたｓｉＲＮＡ１乃至２３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むものである、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。
【表２】
2013515498.tif 000025
【表３】
2013515498.tif 000026
【表４】
2013515498.tif 000027
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡは、
配列番号２４のセンス配列及び配列番号２５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２；
配列番号５４のセンス配列及び配列番号５５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１７；
配列番号６０のセンス配列及び配列番号６１のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２０；
配列番号６２のセンス配列及び配列番号２５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２１；
配列番号６３のセンス配列及び配列番号５５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２２；及び
配列番号６４のセンス配列及び配列番号６１のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２３からなる群より選択されたものである、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡは、１つ以上のリボ核酸の糖構造、または塩基構造、または前記リボ核酸間の結合部位が化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたものである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、
３´末端、５´末端、または両末端のホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合をボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはホスホロチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合に変形するものである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、
３´末端、５´末端、または両末端にＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を導入するものである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
前記化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、
リボース環（ｒｉｂｏｓｅ  ｒｉｎｇ）の２´−位置にある−ＯＨ（ヒドロキシ基）を−ＮＨ２（アミノ基）、−Ｃ−アリル基、−Ｆ（フルオロ基）、及び−Ｏ−Ｍｅ（メチル基）からなる群より選択された１つ以上に置換えるものである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
前記化学的変形されたｓｉＲＮＡは、下記の表１１−１に記載されたｓｉＲＮＡ２４乃至４０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むものである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【表５】
2013515498.tif 000028
【表６】
2013515498.tif 000029
前記表１１−１で、化学的変形の表記法は、下記の表３に記載された通りである。
【表７】
2013515498.tif 000030
【請求項１１】
請求項１乃至１０のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項１２】
前記発現ベクターは、プラジミド、アデノ付属ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及び癌細胞溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群より選択されたものである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１乃至１０のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを有効成分として含む、抗癌組成物。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡを核酸伝達体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）との複合体形態で含む、請求項１３に記載の抗癌組成物。
【請求項１５】
前記核酸伝達体は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポゾーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、及び脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群より選択されたものである、請求項１４に記載の抗癌組成物。
【請求項１６】
抗癌化学療法剤、または
成長因子、成長因子受容体、下位信号伝達蛋白質、ウイルス性腫よう誘発因子、及び抗癌剤耐性遺伝子からなる群より選択されたものの発現を阻害するｓｉＲＮＡを追加的に含む、請求項１３に記載の抗癌組成物。
【請求項１７】
請求項１乃至１０項のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを準備する段階；及び
前記ｓｉＲＮＡをｃ−Ｍｅｔを発現する細胞と接触させる段階；を含む、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１０のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを準備する段階；及び
前記ｓｉＲＮＡをｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞と接触させる段階；を含む、癌細胞の成長を抑制する方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１０のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを準備する段階；及び
前記ｓｉＲＮＡを治療的有効量で患者に投与する段階；を含む、癌を予防及び／または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の塩基配列に相補的に結合して、細胞内でｃ−Ｍｅｔの発現を抑制すると同時に、免疫反応を誘発しない、低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）及び前記ｓｉＲＮＡの癌の予防及び／または治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔは、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の受容体であるため、ＨＧＦＲとも命名され、１９８４年に化学的癌誘発剤（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅ）を処理したヒトの骨肉腫で初めて発見された後、１９８６年にｔｐｒ（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）との遺伝的結合（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ）現象によって潜在的癌誘発遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であることが明らかになった（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１１，２９−３３，１９８４；Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７，９２１−９２４，１９８７；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４５，８９５−９０４，１９８６）。
【０００３】
細胞膜蛋白質として受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫ）の一種であるｃ−Ｍｅｔ受容体が間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で生成された肝細胞成長因子あるいは分散因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）と呼ばれるリガンドと結合すると、正常細胞では細胞の成長及び分化を誘発して、正しい個体の発生及び傷の治癒、新生血管の形成に関与し、癌細胞では癌細胞の増殖、転移などを促進させる（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６，１５１１−９，２０００；Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ，１１，１５３−６５，２００１；Ｂｏｃｃａｃｃｉｏ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，６，６３７−４５，２００６；Ｈｕｈ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１，４４７７−８２，２００４）。
【０００４】
ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔの非正常的な信号伝達は、大部分がＨＧＦあるいはｃ−Ｍｅｔが過発現されたり突然変異が起こって活性が増加した結果であり、多様な癌患者の良くない予後と密接に関連していると言われている。
【０００５】
このように、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質の活性と癌の発生及び転移との間の密接な相互関係が明らかになって、他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤の臨床的成功によって、ｃ−Ｍｅｔをターゲットとした抗癌剤の開発研究が活発に進められているが、現在臨床段階にある候補物質は、ｃ−Ｍｅｔ受容体に拮抗する抗体またはｃ−Ｍｅｔの信号伝達を阻害するチロシンキナーゼ抑制剤などの蛋白質の３次構造を基盤にして設計された化学的合成抑制剤が大部分である。低分子キナーゼ阻害剤は、広範囲キナーゼ阻害剤に比べてｃ−Ｍｅｔに対する選択性は向上したが、薬品がｃ−Ｍｅｔ以外の類似した蛋白質の活性を阻害することによる副作用の恐れが依然としてあり、抗体薬品は、選択性は比較的優れているが、複雑な製造工程による生成の困難性及び保管上の安定性の問題がある。したがって、ｃ−Ｍｅｔの機能を効果的に阻害する薬品の開発の必要性が要求されてきた。
【０００６】
一方、最近では、リボ核酸の媒介干渉現象が、既存の方法では医薬的に不可能（ｎｏｎ−ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）であったターゲットに対しても精密な遺伝子選択性を示す先導物質を迅速に導出すことによって、合成医薬品の開発時に発生する制限されたターゲット及び非選択性に対する解決策を提示して、化学合成医薬品の限界を克服することができる技術として見なされ、既存の方式では治療が難しい各種疾病、特に腫ようの治療剤の開発に利用しようとする研究が活発に進められている。
【０００７】
しかし、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が初期免疫反応を誘発して、予想より非特異的なＲＮＡｉ効果を頻繁に誘発するということを発見した。
【０００８】
ほ乳動物の細胞で長さが長い二重鎖ｓｉＲＮＡは、有害なインターフェロン反応を起こし、長さが短い二重鎖ｓｉＲＮＡも、人体や細胞に有害な初期インターフェロン免疫反応を起こすと報告されており、予想より高い非特異的なＲＮＡｉ効果を誘発すると言われている（Ｋｌｅｉｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５２：５９１−７，２００８）。
【０００９】
一方、癌の進行に重要な役割を果たすｃ−ＭｅｔをターゲットとしたｓｉＲＮＡ抗癌剤の開発が試みられているが、現在までその成果は僅かな水準である。ｓｉＲＮＡの個別シークエンスの遺伝子抑制効果に対して提示されておらず、特に免疫活性に対する考慮は全く行われていない実情である。
【００１０】
このように、既存の方法では医薬品化が不可能なターゲットを含む全ての疾患ターゲット遺伝子の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ薬品は、高い活性及び優れたターゲット選択性などの長所によって、新たな治療剤として無限の可能性を示しているが、治療剤の開発を成功させるためには、血液中の低い安定性、制約的薬品分布、ターゲット以外の効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）、免疫反応の誘発の問題点を解決することが必要である。
【００１１】
最近、このような弱点を改善して、臨床での適用を可能にするために、ｓｉＲＮＡに化学的変形を導入する研究が進められている（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：９５１−９５２，２００６；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｆｕｒｓｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６：２３４２９，２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ここで、本発明者は、本発明の配列特異性が高く、標的遺伝子の転写体に特異的に結合してＲＮＡｉ効果を増加させ、免疫毒性を誘発しない、ｓｉＲＮＡを開発して、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の一例は、ｃ−Ｍｅｔ転写体の塩基配列に相補的に結合して、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを提供する。
【００１４】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを提供する。
【００１５】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを有効成分として含むｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現阻害用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを有効成分として含む抗癌組成物を提供する。
【００１７】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを準備する段階；及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターをｃ−Ｍｅｔを発現する細胞と接触させる段階；を含む、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を抑制する方法、及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターのｃ−Ｍｅｔを発現する細胞でのｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現抑制のための用途を提供する。
【００１８】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを準備する段階；及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターをｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞と接触させる段階；を含む、癌細胞の成長を抑制する方法、及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターのｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞での癌細胞の成長抑制のための用途を提供する。
【００１９】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを準備する段階；及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを治療的有効量で投与して、癌を予防及び／または治療する方法、及び前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターの癌の予防及び／または治療のための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ転写体の塩基配列に相補的に結合して、細胞内でｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を抑制するｓｉＲＮＡ、これを含む医薬組成物、及びその用途を提供する。
【００２１】
一実施例として、本発明は、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを提供する。
【００２２】
また他の例として、本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを有効成分として含むｃ−Ｍｅｔ合成及び／または発現抑制用薬学的組成物を提供する。
【００２３】
また他の例として、本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを有効成分として含む癌細胞成長阻害剤または癌の予防及び／または治療用薬学的組成物（抗癌組成物）を提供する。
【００２４】
本発明は、ヒトを含むほ乳動物のｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ、その選択的スプライシング形態（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍ）、突然変異形態、または同一な系統のｃ−Ｍｅｔ遺伝子の発現を阻害する技術に関連し、これは、本発明で提供されるｓｉＲＮＡを特定容量で患者に投与した時に、ターゲットｍＲＮＡが減少することによって成就する。
【００２５】
以下、これをより詳細に説明する。
【００２６】
前記ｃ−Ｍｅｔは、ほ乳動物由来、好ましくはヒトまたはヒトと同一な系統のｃ−Ｍｅｔ及びその突然変異体であり得る。ヒトと同一な系統とは、遺伝子またはｍＲＮＡがヒトのｃ−Ｍｅｔ遺伝子またはこれから由来するｍＲＮＡと８０％以上の配列類似性を有する他のほ乳動物を言い、具体的に、ヒト、霊長類、齧歯類などを含む。
【００２７】
本発明の一実施例として、ｃ−ＭｅｔをコーディングするｍＲＮＡに相当するセンス鎖のｃＤＮＡ配列は、配列番号１であり得る。
【００２８】
本発明によるｓｉＲＮＡは、前記ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの内部の連続する１５乃至２５ｂｐ、好ましくは１８乃至２２ｂｐからなる領域、好ましくは配列番号２乃至２１からなる群より選択された１種以上の塩基配列に該当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ領域を標的とする。前記好ましいｃＤＮＡ上の標的領域を下記の表１に整理した。したがって、本発明の一実施例で、配列番号１のｃ−ＭｅｔのｃＤＮＡ領域のうち、配列番号２乃至２１からなる群より選択された１種以上の塩基配列に該当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ領域を標的とするｓｉＲＮＡを提供する。具体的に、配列番号３、１８、及び２１からなる群より選択された塩基配列に該当するｍＲＮＡ領域を標的とするｓｉＲＮＡを提供する。
【００２９】
【表１】
2013515498.tif 000003
【００３０】
本明細書で使用された「標的ｍＲＮＡ」とは、ヒトのｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ、ヒトと同一な系統のｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ、その突然変異体、または選択的スプライシング構造体を称する。具体的に、ＮＭ＿０００２４５、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ：ＮＭ＿００８５９１、Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ：ＮＭ＿００１１６８６２９、ＮＭ＿００１１２７５００：塩基配列２２６２〜２３１７が削除されたスプライシング形態、Ｙ１２３０Ｃ／Ａ３６８９Ｇ、Ｄ１２２８Ｈ／Ｇ３６８２Ｃ、Ｖ１０９２Ｉ／Ｇ３２７４Ａ、Ｍ１２６８Ｔ／Ｔ３７９５Ｃなどのアミノ酸、または塩基配列の突然変異体などが含まれる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、ヒトまたはヒトと同一な系統のｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡやその選択的スプライシング形態、突然変異体を標的とするものであり得る。
【００３１】
本明細書で、「ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域を標的とする」とは、ｓｉＲＮＡが前記ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域の塩基配列のうちの全てまたは一部、例えば塩基配列の８５−１００％と相補的な塩基配列を有して、前記ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域に特異的に結合することができることを意味する。
【００３２】
本明細書で、「相補的」とは、ポリヌクレオチドの両鎖が塩基対を形成することができることを意味する。相補的ポリヌクレオチドの両鎖は、ワトソン−クリック方式で塩基対を形成して、二重鎖を形成する。本発明で、塩基Ｕが言及される場合、特別な言及がない限り、塩基Ｔに置換え可能である。
【００３３】
本発明の薬学的組成物のｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現抑制効果及び癌治療効果は、ｃ−Ｍｅｔの効果的な合成及び／または発現抑制によって成就するため、前記薬学組成物に有効成分として含まれているｓｉＲＮＡは、前記特定のｍＲＮＡ領域のうちの１つ以上を標的とする１５−３０ｂｐの二重鎖ｓｉＲＮＡであり得る。好ましい具体的な例として、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号２２乃至９８のヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のヌクレオチド配列を含むものであり得る。より具体的に、前記ｓｉＲＮＡは、下記の表２に示したｓｉＲＮＡ１乃至ｓｉＲＮＡ４０からなる群より選択された１種以上であり得る。
【００３４】
【表２−１】
2013515498.tif 000004
【表２−２】
2013515498.tif 000005
【表２−３】
2013515498.tif 000006
【表２−４】
2013515498.tif 000007
【００３５】
前記表２で、化学的変形ｓｉＲＮＡ（配列番号６５乃至９８）の化学的変形表記法及び化学的構造変形に関する内容を各々下記の表３及び表４に示した。
【００３６】
【表３】
2013515498.tif 000008
【００３７】
【表４】
2013515498.tif 000009
【００３８】
前記ｓｉＲＮＡは、ｃ−Ｍｅｔ転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の塩基配列の特定標的領域に対する配列特異性が高く、標的遺伝子の転写体に特異的に相補的に結合して、ＲＮＡ干渉効果が増加し、細胞内でｃ−Ｍｅｔの発現及び／または合成抑制効果が優れている。また、免疫誘発活性が最小化されたことを特徴とする。
【００３９】
前記のように、本発明で提供するｓｉＲＮＡは、配列番号１のｃ−ＭｅｔのｃＤＮＡ領域のうち、配列番号２乃至２１からなる群より選択された１種以上の領域に対するｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、好ましくは配列番号２２乃至９８のヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ、より好ましくは配列番号２２乃至９８からなる４０種のｓｉＲＮＡからなる群より選択された１種以上であり得る。前記ｓｉＲＮＡは、リボ核酸の配列そのもの、またはこれを発現する再組合わせベクター（発現ベクター）形態を全て含む概念である。前記発現ベクターは、プルズミドまたはアデノ付属ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、癌細胞溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）などからなる群より選択されるウイルスベクターであり得る。
【００４０】
また、本発明による薬学的組成物は、有効成分としてｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体を含む。前記薬学的に許容される担体は、この分野に通常使用される全ての担体を含み、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストリン、グリセロール、エタノールなどからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに限定されない。
【００４１】
本発明のｓｉＲＮＡまたは薬学的組成物の投与対象患者は、ほ乳動物、好ましくはヒト、猿、齧歯類（マウス、ラット）であり、特に、ｃ−Ｍｅｔの発現と関連する病気や症状を有したり、ｃ−Ｍｅｔの発現抑制を必要とする全てのほ乳動物、例えばヒトであり得る。
【００４２】
ｃ−Ｍｅｔの抑制に有効な効果を得て、免疫反応などの好ましくない副反応を最小化するために、組成物内のｓｉＲＮＡの濃度、または使用または処理濃度は、０．００１乃至１０００ｎＭ、好ましくは０．０１乃至１００ｎＭ、より好ましくは０．１乃至１０ｎＭであり得るが、これに限定されない。
【００４３】
本発明によるｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物によって治療可能な癌は、肺癌、肝癌、大腸癌、すい臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌などの固形癌、及び骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００４４】
以下、ｓｉＲＮＡの構造、設計過程、及びこれを含む薬学的組成物をより詳細に説明する。
【００４５】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機転によってｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ分解を起こして、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質の発現を誘発しなかったり減少させる機能をする。
【００４６】
一実施例で、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）経路を誘発する小さな阻害ＲＮＡ二重鎖（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ）を意味する。具体的に、ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、両鎖が１５−３０ｂｐ、具体的には１９−２５ｂｐまたは２７ｂｐ、さらに具体的には１９−２１ｂｐを含むＲＮＡ二重鎖である。ｓｉＲＮＡは、二重鎖領域を含み、単一鎖がヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）またはｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造を形成する構造であったり、２個の分離された鎖の二重鎖であり得る。センスＲＮＡ鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列と同一な配列を有し、センス鎖及びこれに相補的なアンチセンス鎖が互いにワトソン−クリックの相補的な塩基配列の結合により二重鎖をなしている。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）に捕集されて、ＲＩＳＣがアンチセンス鎖と相補的な目標ｍＲＮＡを確認した後、切断または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）阻害を誘発するようにする。一実施例で、二重鎖ｓｉＲＮＡは、３´末端、５´末端、または両末端に１乃至５ヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する。または、両末端が平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）に切断された形態を有するものである。具体的には、ＵＳ２００２００８６３５６及びＵＳ７０５６７０４に開示されたｓｉＲＮＡである（前記文献は本明細書に参考として含まれている）。
【００４７】
本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖が１５−３０ｂｐの二重鎖であり、突出部がない平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を有する対称構造、または少なくとも１つ、例えば１−５個のヌクレオチド突出部を有する非対称構造であり得る。ヌクレオチド突出部は、いかなる配列でもよいが、ｄＴ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、ジオキシチミジン）２個を付着させることができる。
【００４８】
前記アンチセンス鎖は、生理学的条件で配列番号１のｍＲＮＡの標的領域に混成化される。「生理学的条件で混成化」とは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｉｎ  ｖｉｖｏでｍＲＮＡの特定標的領域と混成化されることを意味する。具体的に、前記アンチセンス鎖は、ｍＲＮＡの標的領域、好ましくは前記表１の配列番号２乃至２１の塩基配列と８５％以上の配列相補性を有することができ、より具体的に、前記アンチセンス鎖は、配列番号１の塩基配列内の連続する１５乃至２５ｂｐ、好ましくは１８乃至２２ｂｐの塩基配列、好ましくは前記表１の配列番号２乃至２１の塩基配列に完全相補的な配列を含むことができる。
【００４９】
また、一実施例で、ｓｉＲＮＡは、一鎖が他の鎖より短い非対称的な二重鎖構造であり得る。具体的に、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ｎｔ）のアンチセンス鎖；及び前記アンチセンス鎖に相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス鎖から構成される二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）のｓｉＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であって、前記ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５´末端が平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）であり、アンチセンス鎖の３´末端に１−５ヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する非対称ｓｉＲＮＡである。具体的に、ＷＯ０９／０７８６８５に開示されたｓｉＲＮＡであり得る。
【００５０】
ｓｉＲＮＡを利用した治療において、最も先に考慮されなければならない点は、標的化された遺伝子の塩基配列で最も大きな活性を有する最適の塩基配列を選定することが必要である。具体的に、一実施例で、前臨床試験と臨床試験との間の関連性を高めるために、 種間保存された配列を含むｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡをデザインするのが好ましい。また、一実施例で、ＲＩＳＣに結合するアンチセンス鎖がＲＩＳＣとの結合力が高くなるようにデザインするのが好ましい。したがって、センス鎖及びアンチセンス鎖の熱力学的安定性に違いが発生するようにデザインされて、センス鎖はＲＩＳＣと結合せずに、ガイド配列のアンチセンス鎖がＲＩＳＣとの結合力が高くなるようにする。具体的に、センス鎖のＧＣ配列が６０％を越えず、センス鎖の５´末端から１５番目及び１９番目の間にはアデニン／グアニン塩基が３個以上あり、１〜７番目の間にはＧ／Ｃ塩基が多いものであり得る。また、反復塩基配列によってｓｉＲＮＡそのものの内部塩基配列同士が結合して、ｍＲＮＡに相補的に結合する能力を低下させることがあるので、４個以上の反復塩基配列があるようにデザインするのは避けるのが好ましい。また、１９個の塩基からなるセンス配列の場合、標的遺伝子のｍＲＮＡに結合して転写体分解を起こすためには、センス鎖の５´末端から３番目、１０番目、及び１９番目の塩基配列がアデニンであり得る。
【００５１】
また、本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡは、非特異的な結合及び免疫誘発活性が最小化されたことを特徴とする。ｓｉＲＮＡによるインターフェロンなどの免疫反応の誘発は、主に抗原を提示する免疫細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に存在するＴＬＲ７（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−７）によって起こり、ｓｉＲＮＡのＴＬＲ７との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）は、ＧＵが豊富な配列のように配列特異的に起こるので、ＴＬＲ７によって認知されない配列を含むものであり得る。具体的に、５´−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３´及び５´−ＵＧＵＧＵ−３´のような免疫反応誘発配列を含まず、ｃ−Ｍｅｔ以外の他の遺伝子との相補性が最小７０％以下であり得る。
【００５２】
本発明の一実施例のｃ−ＭｅｔのｃＤＮＡ標的配列の例は、前記表１に記載した配列のヌクレオチドを含む。表１の標的配列に基づいてｓｉＲＮＡの長さを標的配列の長さより長かったり短くデザインしたり、前記ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを加えたり外して、ｓｉＲＮＡ配列をデザインすることができる。
【００５３】
本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖が１５−３０ｂｐの二重鎖であり、突出部がなかったり、少なくとも１つの末端が１−５ヌクレオチド突出部を有し、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件で配列番号２乃至２１、好ましくは配列番号３、１８、２１に対応するｍＲＮＡ領域に混成化される。つまり、前記アンチセンス鎖が配列番号２乃至２１、好ましくは配列番号３、１８、２１の相補的な配列を含む。つまり、本発明のｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡ及びこれを含む薬学的組成物は、有害なインターフェロン反応を誘発せず、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の発現を阻害する特徴を有する。
【００５４】
本発明は、配列番号３（５´−ＧＣＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣＣＧＡＧＡ−３´）、配列番号１８（５´−ＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡ−３´）、及び配列番号２１（５´−ＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＡＴＣＴ−３´）からなる群より選択された１種以上の配列に対応するｍＲＮＡ領域に相補的に結合して、細胞内でｃ−Ｍｅｔの発現を抑制する。
【００５５】
本発明の具体的な例によるｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡは、前記表２に記載した通りである。
【００５６】
一実施例で、前記ｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡは、配列番号２４のセンス配列及び配列番号２５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２、配列番号５４のセンス配列及び配列番号５５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１７、配列番号６０のセンス配列及び配列番号６１のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２０、配列番号６２のセンス配列及び配列番号２５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２１、配列番号６３のセンス配列及び配列番号５５のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２２、配列番号６４のセンス配列及び配列番号６１のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２３からなる群より選択される１種以上であり得る。
【００５７】
ノックダウン（ｃ−Ｍｅｔの発現抑制）は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅、ｂＤＮＡ アッセイ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどの方法でｍＲＮＡまたは蛋白質水準の変化を測定して確認することができる。本発明の一実施例で、リポゾーム複合体を製造して、腫よう細胞株に処理した後、リボ核酸の媒介による発現干渉現象をｍＲＮＡ段階でｂＤＮＡ測定法を使用して確認することができる。
【００５８】
本発明のｓｉＲＮＡ配列は、ｃ−Ｍｅｔの合成または発現を効果的に阻害するだけでなく、免疫反応誘発活性が低いという特徴を有する。
【００５９】
本発明の一実施例で、免疫毒性は、ヒトの末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）にｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ（Ｎ−[１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｙｌｓｕｌｆａｔｅ）複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を処理した後、培養液中に遊離されたサイトカインであるインターフェロンアルファ及びガンマ（ＩＮＦ−ａ及びＩＮＦ−γ）、腫よう壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａ：ＴＮＦ−ａ）、インターリューキン１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２，ＩＬ−１２）などの増加有無を測定して確認することができる。
【００６０】
前記ｓｉＲＮＡは、変形せずに自然に存在するリボ核酸の単位構造を有するものであったり、または１つ以上のリボ核酸の糖構造や塩基構造、または前記リボ核酸間の結合部位が化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたものであり得る。
【００６１】
前記化学的変形によってＲＮＡｉ能力に影響を与えず、例えばニュークレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する抵抗性の増進、細胞内吸収（ｕｐｔａｋｅ）の増加、細胞標的化の向上、安定性の増加、インターフェロン活性の減少、免疫反応及びセンス（ｓｅｎｓｅ）効果などのターゲット以外の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果の減少など、ｓｉＲＮＡの多様な特性を変形しないｓｉＲＮＡより向上させることができる。
【００６２】
ｓｉＲＮＡの化学的変形方法は、特に制限されず、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する当業者であれば、当該技術分野に公知された方法を利用して、所望の方式のとおり前記ｓｉＲＮＡを合成して変形させることができる（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｈｅｎｓｃｈｅｌ，Ｆｒａｎｋ  Ｂｕｃｈｈｏｌｚ１  ａｎｄ  Ｂｉａｎｃａ  Ｈａｂｅｒｍａｎｎ（２００４）ＤＥＱＯＲ：ａ  ｗｅｂｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１１３−Ｗ１２０）。
【００６３】
ｓｉＲＮＡの化学的変形の一例として、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）及びアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖のホスホジエステル結合をホスホロチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合に置換える方法があり、これによってニュークレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）の核酸分解に対する抵抗性を高めることができる。一例として、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）及びアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の両鎖の３´−末端ホスホジエステル結合をホスホロチオネート結合に置換えることができる。
【００６４】
他の一例として、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）またはアンチセンス鎖の５´末端、３´末端、または両末端にＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を導入する方法があり、好ましくはｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖の５´末端に導入する。これによってＲＮＡｉ能力に影響を与えず、ｓｉＲＮＡ安定性を増加させて、免疫反応及び非特異的な抑制効果を減少させることができる。
【００６５】
また他の一例として、リボース環（ｒｉｂｏｓｅ  ｒｉｎｇ）の２´−位置にある−ＯＨ（ヒドロキシ基）を−ＮＨ２（アミノ基）、−Ｃ−ａｌｌｙｌ（アリル基）、−Ｆ（フルオロ基）、または−Ｏ−Ｍｅ（またはＣＨ３、メチル基）に置換える化学的変形を与えることができる。例えば、センス鎖の１番目及び２番目の度核酸のリボース環で２´−ＯＨを２´−Ｏ−Ｍｅに置換えたり、アンチセンス鎖の２番目の核酸のリボース環で２´−ＯＨを２´−Ｏ−Ｍｅに置換えたり、またはグアニン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）を含む一部ヌクレオチドでリボース環の２´−ＯＨを２´−Ｏ−Ｍｅ（メチル基）または２´−Ｆ（フルオロ基）に置換えることができる。
【００６６】
前記化学的変形以外にも多様な化学的変形を与えることができ、このような化学的変形は、ある１つ形態の化学的変形だけで行われることもあり、多様な形態の化学的変形が共に行われることもある。
【００６７】
ただし、前記変形において、ｓｉＲＮＡ二重鎖構造を安定化させると同時に、遺伝子の発現阻害活性を減少させないように、好ましくは最小限の変形が行われるようにするのが好ましい。
【００６８】
また、ｓｉＲＮＡにコレステロール、ビオチン、細胞浸透性質を有するペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）などのリガンド（ｌｉｇａｎｄ）をセンス鎖の５´または３´−末端に付着させることも可能である。
【００６９】
本発明のｓｉＲＮＡは、化学的合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、またはダイサー（Ｄｉｃｅｒ）や、その他の類似した活性を有するヌクレアーゼで長い二重鎖ＲＮＡを切断して製造することができる。または、前記のように、ｓｉＲＮＡをプラジミドやウイルス性発現ベクターなどによって発現させて使用することができる。
【００７０】
ｓｉＲＮＡの特定配列がインターフェロンを誘発するか否かを樹枝状細胞を含むヒトの末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）で実験的に確認した後、免疫反応を誘発しない配列を選別して、候補ｓｉＲＮＡ配列として選定することができる。
【００７１】
以下、前記ｓｉＲＮＡの伝達のための薬品伝達システム（ＤＤＳ）を説明する。
【００７２】
ｓｉＲＮＡの細胞内の伝達効果を高めるためには、核酸伝達体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を活用することができる。
【００７３】
細胞内に核酸物質を伝達するための核酸伝達体には、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポゾーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などがある。ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）として、伝達効果が高く、持続時間が長い利点がある。前記ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター、アデノ付属ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、癌細胞溶解性ウイルスベクターなどが含まれる。非ウイルスベクター（ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）は、プラズミドを含むことができる。それ以外にも、リポゾーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などの多様な剤形を使用することができる。核酸伝達のための陽イオン性高分子には、キトサン、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、陽イオン性ポリペプチド（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）などの天然高分子と、ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎ）、線型または分枝型ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｉｍｉｎｅ）、サイクロデキストリン系列多価陽イオン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）などの合成高分子とが含まれる。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ及び核酸伝達体の複合体（薬学的組成物）は、癌の治療のためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ上で細胞内に導入されることができる。下記の実施例で確認することができるように、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ及び核酸伝達体の複合体を細胞内に導入すると、標的蛋白質であるｃ−Ｍｅｔの発現を選択的に減少させたり、標的遺伝子に発生した変異を修正する役割を果たして、癌の生成に関与するｃ−Ｍｅｔの発現が抑制されて、癌細胞が死滅して、癌の治療が可能になる。
【００７５】
本発明のｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、局所、経口、または非経口などで投与するために製剤化されることができる。具体的に、ｓｉＲＮＡの投与は、目の粘膜、膣、または肛門内投与を含む局所投与、または肺、気管支、鼻腔、外皮、内皮、静脈、動脈、皮下、腹腔、筋肉、頭蓋（脳膜または脳室）などの非経口投与、または経口投与などの経路によることができる。局所投与のために、ｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座薬、スプレー、溶液、パウダーなどの形態に製剤化されることができる。非経口投与、脳硬膜あるいは脳室内投与のために、ｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、バッファー、希釈剤、透過促進剤、その他の通常な薬剤学的に使用可能な伝達体あるいは賦形剤などの適切な添加剤を含む滅菌水溶液を含むことができる
【００７６】
また、本発明のｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡを注射用組成物と混合して、腫ようが発生した部位に注射形態で投与したり、ゲル組成物または経皮吸収用粘着組成物と混合して、患部に直接塗ったり張付けて、経皮経路で投与することができるように具現するのが好ましい。前記注射用組成物は、特別な制限はないが、等張性水溶液または懸濁液形態であるのが好ましく、滅菌処理及び／または補助剤（例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩、緩衝剤、及び／またはリポゾーム製剤）を含むことができる。前記ゲル組成物は、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アクリル酸重合体、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）などの通常のゲル製剤と薬学的に許容される担体及び／またはリポゾーム製剤を含み、前記経皮吸収用粘着組成物は、有効成分層が粘着剤層、皮脂吸収のための吸着層、及び治療薬物層を含み、治療薬物層は、薬学的に許容される担体及び／またはリポゾーム製剤を含むものであり得るが、これに制限されない。
【００７７】
また、本発明のｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、ｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡと共に抗癌化学療法剤を追加的に含んだり、または成長因子、成長因子受容体、下位信号伝達蛋白質、ウイルス性腫よう誘発因子、及び抗癌剤耐性遺伝子からなる群より選択されるものの発現を阻害するｓｉＲＮＡを追加的に含むことができる 。
【００７８】
このように、ｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡと共に化学療法剤を併用して化学療法に対する敏感度を高めることによって、治療効果を極大化して、副作用を減少させることができるだけでなく、各種成長因子（例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなど）、成長因子受容体、及び下位信号伝達蛋白質、ウイルス性腫よう誘発因子、抗癌剤耐性遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡと併用して、癌の多様な経路を同時に遮断することによって、抗癌効果を極大化することができる。
【００７９】
本発明のｃ−Ｍｅｔの発現を抑制するｓｉＲＮＡと併用投与が可能な抗癌化学療法剤は、例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オクサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ドキソールビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、バルビシン（ｖａｌｕｂｉｃｉｎ）、コキュミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ゲフィニチブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニフ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ビンプラシチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００８０】
本発明のまた他の例は、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現抑制のための有効量の前記ｃ−ＭｅｔｓｉＲＮＡを準備する段階；及びｃ−Ｍｅｔを発現する細胞に前記ｓｉＲＮＡを接触させる段階；を含む、ｃ−Ｍｅｔの発現及び／または合成を抑制する方法を提供する。
【００８１】
また他の例は、ｃ−Ｍｅｔの合成及び／または発現抑制のための有効量の前記ｃ−ＭｅｔｓｉＲＮＡを準備する段階；及びｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞に前記ｓｉＲＮＡを接触させる段階；を含む、癌細胞の成長を抑制する方法を提供する。
【００８２】
また他の例は、前記ｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡを準備する段階；及び前記ｓｉＲＮＡを治療学的有効量で患者に投与する段階；を含む、癌を予防及び／または治療する方法を提供する。
【００８３】
前記癌を予防及び／または治療する方法は、好ましくは、前記投与段階以前に前記ｓｉＲＮＡの投与対象である癌の予防及び／または治療が要求される患者を特定する段階；をさらに含むことができる。
【００８４】
本発明によって治療可能な癌は、大部分の固形癌（肺癌、肝癌、大腸癌、すい臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌）、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００８５】
前記患者は、ほ乳動物、好ましくはヒト、猿、齧歯類（マウス、ラットなど）などであり、特に、ｃ−Ｍｅｔの発現と関連する病気や症状（例えば癌）を有したり、ｃ−Ｍｅｔの発現抑制を必要とする全てのほ乳動物、例えばヒトであり得る。
【００８６】
本発明によるｓｉＲＮＡの有効量は、ｃ−Ｍｅｔの発現または合成抑制またはこれによる癌細胞成長阻害及び癌治療効果を得るために要求される投与量を意味する。したがって、疾患の種類、症状の程度、投与されるｓｉＲＮＡの種類、剤形の種類、患者の年令、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用される化学抗癌剤などの薬品をはじめとする多様な因子により適切に調節されることができる。例えば、１日投与容量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであるのが好ましく、前記容量は、一度に全てが投与されたり、数回にわたって分量して投与されることができる。
【００８７】
本発明のｃ−Ｍｅｔ転写体（ｍＲＮＡ）の塩基配列に相補的なｓｉＲＮＡまたはその化学的変形された構造は、リボ核酸の媒介干渉現象（ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）によって癌細胞に共通的に発現するｃ−Ｍｅｔの発現を抑制して癌細胞を死滅させるので、優れた抗癌効果を発揮することができる。また、免疫反応を最小限に誘発する長所がある。
【００８８】
既存の大部分の薬品がすでに発現した蛋白質の機能を抑制するのに対して、本発明のＲＮＡｉ機転は、特定の病気の誘発蛋白質の発現を高い選択性及び活性で阻害することができるだけでなく、蛋白質が合成される前段階のｍＲＮＡを分解するので、副作用を誘発せずに癌の成長及び転移を抑制して、より根源的な癌治療技術になると期待される。
【００８９】
また、ｃ−ＭｅｔのｓｉＲＮＡと共に化学療法剤を併用して、化学療法に対する敏感度を高めることによって、治療効果を極大化して、副作用を減少させることができるだけでなく、各種成長因子（ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなど）、成長因子受容体、及び下位信号伝達蛋白質、ウイルス性腫よう誘発因子、抗癌剤耐性遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡと併用して、癌の多様な経路を同時に遮断することによって、抗癌効果を極大化することができる付加的な利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１ａ−１ｄ】ｓｉＲＮＡ処理によるサイトカイン濃度変化を示すもので、１ａはインターフェロンアルファ、１ｂはインターフェロンガンマ、１ｃはインターリューキン１２、１ｄは腫よう壊死因子の濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
以下、実施例を通して本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を代表的に例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるのではない。
【００９２】
実施例１．ｃ−Ｍｅｔの発現抑制用ｓｉＲＮＡが結合する標的塩基配列のデザイン
ｓｉＤｅｓｉｇｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｓｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＫＲＩＢＢ）、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ）、及びｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）のｓｉＲＮＡデザインプログラムを使用して、ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０００２４５）の中からｓｉＲＮＡが結合する標的塩基配列を導出した。
【００９３】
【表５】
2013515498.tif 000010
【００９４】
実施例２．ｃ−Ｍｅｔの発現抑制用ｓｉＲＮＡの製造
実施例１でデザインした標的塩基配列に結合することができるｓｉＲＮＡの２３種を三千里製薬（韓国）に合成依頼して使用した。２３種のｓｉＲＮＡの配列は、表６のように両鎖の３´末端にｄＴｄＴを含むようにした。
【００９５】
【表６−１】
2013515498.tif 000011
【表６−２】
2013515498.tif 000012
【表６−３】
2013515498.tif 000013
【００９６】
実施例３．ｓｉＲＮＡを利用した腫よう細胞株でのｃ−Ｍｅｔの発現抑制試験
前記実施例２で製造した各々のｓｉＲＮＡを利用して、腫よう細胞株のヒト肺癌細胞株（Ａ５４９、ＡＴＣＣ）及びヒト肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＡＴＣＣ）を形質転換させて、形質転換された腫よう細胞株でｃ−Ｍｅｔの発現様相を測定した。
【００９７】
実施例３−１．腫よう細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手したヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）を１０％の牛胎児血清、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の条件下で培養した。
【００９８】
実施例３−２．ｃ−Ｍｅｔの発現抑制用ｓｉＲＮＡ及びリポゾームの複合体の製造
実施例２のｓｉＲＮＡ１乃至２３の２３個のｓｉＲＮＡを１０ｎＭで各々含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｕｌ及びウェル（ｗｅｌｌ）当り０．４ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を同一な体積で混合して、常温で２０分間反応させて、ｓｉＲＮＡ及びリポゾームの複合体を各々製造した。
【００９９】
実施例３−３．ｃ−ＭｅｔターゲットｓｉＲＮＡを利用した腫よう細胞株でのｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現抑制
前記実施例３−１で培養した肺癌細胞株及び肝癌細胞株を９６ウェルプレートに各々ウェル当り１０４細胞数ずつ分株（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。２４時間後に培地を除去して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地をウェル（ｗｅｌｌ）当り５０μｌずつ添加した。前記実施例３−２で製造したｓｉＲＮＡ及びリポゾームの複合体組成物５０μｌを添加して、２４時間、３７℃、５％の二酸化炭素が維持される細胞培養器で培養した。
ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現が５０％阻害される薬品濃度であるＩＣ５０数値の計算のために、肺癌細胞株（Ａ−５４９）に各々のｓｉＲＮＡを０．００６４ｎＭ乃至１００ｎＭの間の７種類の濃度範囲で処理した。
【０１００】
実施例３−４．ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの定量分析＿肺癌細胞
ｓｉＲＮＡリポゾーム複合体によって発現抑制されたｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現程度は、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）を利用したｂＤＮＡ測定法で測定した。
【０１０１】
１０ｎＭのｓｉＲＮＡリポゾーム複合体をヒト肺癌細胞株に２４時間処理した後、ｍＲＮＡを定量した。製造会社のプロトコル通り、９６ウェルプレートの１ウェル（ｗｅｌｌ）当り１００μｌの溶菌混合物（Ｌｙｓｉｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｂＤＮＡ  ｋｉｔ）を処理して、５０℃で１時間細胞を溶解した。Ｐａｎｏｍｉｃｓ社でｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡに特異的に結合するプローブ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｃａｔ．#ＳＡ−１０１５７）を購入して、得られた細胞サンプルのうちの８０μｌと共に９６ウェルプレートに混合した。ｍＲＮＡがウェルに固定されてプローブと結合することができるように、５５℃で１６時間乃至２０時間反応させた。続いて、各ウェルにキットの増幅作用試薬１００μｌを入れて、５５℃で反応させて洗浄する過程を二段階行った。第３増幅作用試薬１００μｌを入れて、５０℃で反応させた後、発光を誘発する試薬１００μｌを入れて、５分後に蛍光及び発光測定器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｓｙｎｅｒｇｙ−ＨＴ）に入れて、発光値を測定して、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）だけを処理した対照群の発光値（１００％）に対する百分率値を算出して表７に示した。この百分率値は、対照群及び各ｓｉＲＮＡを処理した試験群でのｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ発現率を示す。
【０１０２】
表７から分かるように、２０種のｓｉＲＮＡのうち、ｃ−Ｍｅｔの発現を４０％以下に抑制するｓｉＲＮＡが１６種、４０％以上７０％以下に抑制するｓｉＲＮＡが１種、７０％以上に抑制するｓｉＲＮＡが３種であることを確認した。
【０１０３】
【表７】
2013515498.tif 000014
【０１０４】
前記表７において、優れた遺伝子の発現抑制効果を有する３種のｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０番に対してＡ５４９細胞株を使用して１００ｎＭから０．００６４ｎＭの範囲でｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現減少効果を調査して、ＩＣ５０を求めて、下記の表８に示した。ＩＣ５０数値は、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０（ＥＬＩＳＡ機器）モデルで支援されるＳｏｆｒ  Ｍａｘ  ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して計算した。ｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０のＩＣ５０数値をｓｉＲＮＡ１４及び１５と比較した時、５乃至１００倍ほど優れていることが分かる。
【０１０５】
【表８】
2013515498.tif 000015
【０１０６】
実施例３−５．ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの定量分析＿肝癌細胞
配列番号３、１８、２１を標的とする対称構造のｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０とセンス鎖がアンチセンス鎖より短い非対称構造のｓｉＲＮＡ２１、２２、２３とを４ｎＭの濃度で肝癌細胞株であるＳＫ−Ｈｅｐ−１に処理してｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの抑制効果を調査して、下記の表９に示した。実験方法は、実施例３−４と同一な方式で行った。
【０１０７】
【表９】
2013515498.tif 000016
【０１０８】
表９に示されているように、配列番号３、１８、及び２１を標的とする場合、非対称構造ｓｉＲＮＡでも対称構造ｓｉＲＮＡと類似した程度にｃ−Ｍｅｔの発現を効果的に抑制することが分かった。
【０１０９】
実施例４．ｓｉＲＮＡによる細胞増殖抑制試験
ｓｉＲＮＡ２、１４、及び１５による細胞増殖抑制効果を測定した。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を９６ウェルプレートにウェル（ｗｅｌｌ）当り２．５×１０３細胞数で分株（ｓｅｅｄｉｎｇ）した２４時間後に、ウェル（ｗｅｌｌ）当り０．４μｌで実施例３−２の方法で製造したｓｉＲＮＡリポゾーム複合体をｓｉＲＮＡ濃度別にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で実施例３−３の方法の通り添加した。添加した後、２４時間ごとに新鮮な細胞培養培地２００μｌに交換して、５日間、３７℃、５％の二酸化炭素が維持される細胞培養器で維持させた。その後、ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）に３０分間固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）させ、ＳＲＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ，Ｓｉｇｍａ）で３０分間室温で染色した。１０％（ｖ／ｖ）の酢酸でウェル（ｗｅｌｌ）を４〜５回洗浄した後、自然乾燥させて、一日おいた後、１０ｍＭの非緩衝トリス（ｕｎｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｔｒｉｓ）溶液（Ｓｉｇｍａ）２００μｌを入れて吸光度測定器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ−ＨＴ）を使用して５４０ｎｍでの吸光度を測定して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅだけ処理した対照群（１００％）の吸光度に対する百分率値を算出した。
【０１１０】
この百分率値は、対照群と比較したｓｉＲＮＡ２、１４、１５のｓｉＲＮＡを処理した試験群での細胞増殖率を意味する。ｓｉＲＮＡ処理濃度別に算出された百分率値を利用してＩＣ５０値を求めて、下記の表１０に示した。表１０に示したように、ｓｉＲＮＡ２のＩＣ５０値がｓｉＲＮＡ１４及び１５より２０〜５０倍の低い数値を示し、ｓｉＲＮＡ２の細胞増殖阻害効果が２０〜５０倍と非常に優れていることを確認することができた。したがって、本発明のｓｉＲＮＡ２は、ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現を減少させるだけでなく、ｃ−Ｍｅｔの発現減少による癌細胞の増殖抑制を直接的に誘発して、非常に優れた抗癌効果を示すことを確認することができた。
【０１１１】
【表１０】
2013515498.tif 000017
【０１１２】
実施例５．ｓｉＲＮＡによる免疫活性サイトカインの遊離抑制効果
本発明のｓｉＲＮＡが免疫毒性があるかを評価するために、下記のような過程で実験を行った。
【０１１３】
実施例５−１．末梢血液単核細胞の準備
ヒトの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験当日に健康な支援者が供給した血液からヒストペイク１０７７試薬（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、密度傾斜遠心分離法（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を利用して分離した（Ｂｏｙｕｍ  Ａ．Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２１（Ｓｕｐｐｌ９７）：７７，１９６８）。血液は、１：１比率で互いに混合されないように１５ｍｌチューブに分株されたヒストペイク１０７７（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７）試薬上に注意深く入れた。４００ｘｇ、常温で３０分間遠心分離した後、滅菌パイペットでＰＢＭＣが含まれている層だけを分離した。分離されたＰＢＭＣが入れられたチューブに１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を入れた後、２５０ｘｇで１０分間遠心分離して、５ｍｌのＰＢＳで二回さらにＰＢＭＣを洗浄した。分離されたＰＢＭＣは、血清が含まれない培地であるｘ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）培地に４×１０６細胞／ｍｌになるように浮遊させた後、９６ウェルプレートにウェル（ｗｅｌｌ）当り１００ｕｌずつ分株した。
【０１１４】
実施例５−２．ｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＰＡ複合体の製造
前記実施例５−１で準備されたＰＢＭＣ細胞に分株のためのｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＰＡ複合体を下記のような方法で製造した。ＤＯＴＡＰトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬（ＲＯＣＨＥ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５ｕｌとｘ−ｖｉｖｏ１５培地４５ｕｌ及びｓｉＲＮＡ１ｕｌ（５０ｕＭ）とｘ−ｖｉｖｏ１５培地４９ｕｌを各々混合して製造した後、１０分間室温で反応させた。１０分後、ＤＯＴＡＰが含まれている溶液及びｓｉＲＮＡが含まれている溶液を混合して、２０分間２０〜２５℃で反応させた。
【０１１５】
実施例５−３．細胞の培養
分株されたＰＢＭＣ培養液１００ｕＬに実施例５−２の方法によって製造されたｓｉＲＮＡ２、１４、及び１５のｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体をウェル当り１００ｕｌずつ添加した後（ｓｉＲＮＡ最終濃度２５０ｎＭ）、３７℃のＣＯ２細胞培養器で１８時間培養した。対照群として、ｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体を処理しない細胞培養群及びｓｉＲＮＡを含まずにＤＯＴＡＰだけが処理された細胞培養群を使用し、陽性対照群としては、ｓｉＲＮＡの代わりに免疫反応を誘発すると言われている物質であるＰｏｌｙＩ：Ｃ（Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｓｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及びＡＰＯＢ−１ｓｉＲＮＡ（センス  ＧＵＣ  ＡＵＣ  ＡＣＡ  ＣＵＧ  ＡＡＵ  ＡＣＣ  ＡＡＵ（配列番号９９），アンチセンス：＊ＡＵＵ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＣＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＡＣ（配列番号１００），：５´ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，三千里製薬）を前記実施例５−２と同様な方法でＤＯＴＡＰと複合体を形成して処理した細胞培養群を使用した。培養後、細胞上層液だけを分離した。
【０１１６】
実施例５−４．免疫活性の測定
上層液内に含まれているインターフェロンアルファ及びガンマ（ＩＮＦ−ａ、及びＩＮＦ−γ）、腫よう壊死因子（ＴＮＦ−ａ）、インターリューキン１２（ＩＬ−１２）の含有量は、Ｐｒｏｃａｒｔａ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ，ＳＡ）を使用して測定した。つまり、各サイトカインに対する抗体が付着されたビード（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｅａｄ）５０ｕｌをフィルタープレート（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に移して、洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で１回洗浄した後、５０ｕｌのＰＢＭＣ培養液の上層液及びサイトカイン標準液を分注して、常温で６０分間５００ｒｐｍで揺さぶって培養した。
その後、洗浄緩衝液で１回洗浄して、キット内に含まれている検出用（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体２５ｕｌを分株して、５００ｒｐｍで揺さぶって３０分間常温で反応させた。再び減圧下で反応液を除去して洗浄した後、キット内に含まれているストレプトアビジン−ＰＥ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）５０ｕｌを分株して５００ｒｐｍで揺さぶって常温で３０分間反応させた後、減圧下で反応液を除去して、３回洗浄した。１２０ｕｌの測定緩衝液（ｒｅａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を分株して５００ｒｐｍで５分間揺さぶった後に、Ｌｕｍｉｎｅｘ機器（Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）を使用して各サイトカインビード（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｂｅａｄ）別ＰＥ蛍光程度を測定し、その結果を図１ａ−１ｄに示した。試料中のサイトカイン濃度は、１．２２〜２０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の標準減量曲線から計算した。
【０１１７】
図１ａ−１ｄで、「Ｍｅｄｉｕｍ」は何も処理しない対照群、「ＤＯＴＡＰ」はＤＯＴＡＰ単独処理群、「ＰＯＬＹＩ：Ｃ」または「ＡＰＯＢ−１」は陽性対照物質処理群、「ｓｉＲＮＡ２」は配列番号２４及び２５のｓｉＲＮＡを処理した試験群、「ｓｉＲＮＡ１４」は配列番号４８及び４９のｓｉＲＮＡ、及び「ｓｉＲＮＡ１５」は配列番号５０及び５１のｓｉＲＮＡを処理した試験群を示す。図１ａ−１ｄを通してＰＢＭＣで分泌されるサイトカインの水準が分かるが、１ａはインターフェロンアルファ、１ｂはインターフェロンガンマ、１ｃはインターリューキン１２、１ｄは腫よう壊死因子を示したものである。
【０１１８】
ｓｉＲＮＡ２は、対照群及びＤＯＴＡＰ単独処理群に比べて全てのサイトカインで非常に弱い水準の増加だけを示し、陽性対照物質として使用されたＰＯＬＹＩ：Ｃ及びＡＰＯＢ−１によって誘発されたサイトカインの増加量に比べれば、非常に僅かな水準の増加である。また、ｓｉＲＮＡ１４及びｓｉＲＮＡ１５に比べると、インターフェロンアルファ及びインターフェロンガンマ、特にインターフェロンアルファの増加が顕著に低いことが分かる。したがって、ｓｉＲＮＡ２は、ヒトのＰＢＭＣで免疫活性をほとんど誘発しないことを確認することができた。
【０１１９】
実施例６．化学的変形されたｃ−Ｍｅｔの発現抑制用ｓｉＲＮＡの製造
前記実施例２で製造したｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０を、前記表４に示されているように６種類の形態（ｍｏｄ１〜６）に化学的構造が変形するようにデザインし、デザインされた化学的変形ｓｉＲＮＡは、三千里製薬（韓国）に合成依頼して使用した。化学的に変形された１７種のｓｉＲＮＡを下記の表１１に示し、化学的変形の表記法は、前記表３と同一である。
【０１２０】
【表１１−１】
2013515498.tif 000018
【表１１−２】
2013515498.tif 000019
【０１２１】
実施例７．化学的変形ｓｉＲＮＡを利用した腫よう細胞株でのｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡの発現抑制試験
ｓｉＲＮＡを化学的構造変形させた時にも腫よう細胞株でｍＲＮＡの抑制効果が維持されるかを確認するために、化学的構造変形しない前記実施例２のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０）、化学的構造変形した前記実施例６のｓｉＲＮＡ２４乃至４０の１７個のｓｉＲＮＡを使用したこと以外は、前記実施例３−２と同様な方法でリポゾーム複合体を製造して、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９，ＡＴＣＣ）を形質転換させて（１０ｎＭのｓｉＲＮＡ）、形質転換された腫よう細胞株でｃ−Ｍｅｔの発現様相を実施例３−４と同一に定量分析し、その結果を下記の表１２に示した。表１２で、ｍｏｄ０は化学的構造変形しない状態のｓｉＲＮＡを示し、ＮＤは測定されないことを示す。
【０１２２】
【表１２】
2013515498.tif 000020
【０１２３】
前記表１２から分かるように、ｓｉＲＮＡ２、１７、及び２０を化学的構造変形させた時にも腫よう細胞株でｍＲＮＡの抑制効果が維持されることが分かった。特に、ｍｏｄ２、ｍｏｄ３、ｍｏｄ５、そしてｍｏｄ６の場合、化学的構造変形しないｓｉＲＮＡと比較する時、同等または類似した効果を示した。
【０１２４】
実施例８．化学的変形ｓｉＲＮＡの免疫活性サイトカインの遊離抑制試験
化学的構造変形によるｓｉＲＮＡの免疫毒性減少程度を確認するために、ｓｉＲＮＡ番号２、１７、及び２０番を各々ｍｏｄ１−ｍｏｄ６まで構造変形させた後、ヒトの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に処理して、遊離されるサイトカインを定量した。試験は、前記実施例５の方法と同一に実施し、ＰＢＭＣで遊離されたサイトカイン（インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、インターリューキン１２、腫よう壊死因子）の培養液中の濃度を定量して、下記の表１３に示した。表１３で、「Ｍｅｄｉｕｍ」は何も処理しない対照群、「ＤＯＴＡＰ」はＤＯＴＡＰ単独処理群、「ＰＯＬＹＩ：Ｃ」または「ＡＰＯＢ−１」は陽性対照物質処理群、「ｓｉＲＮＡ２」はｓｉＲＮＡ２にｍｏｄ０〜５を処理した試験群、「ｓｉＲＮＡ１７」はｓｉＲＮＡ１７にｍｏｄ０〜６を処理した試験群、「ｓｉＲＮＡ２０」はｓｉＲＮＡ２０にｍｏｄ０〜６を処理した試験群を示す。ｍｏｄ０は、化学的構造変形しない状態のｓｉＲＮＡを示し、ｍｏｄ１〜６は、表４で説明した通りである。
【０１２５】
【表１３−１】
2013515498.tif 000021
【表１３−２】
2013515498.tif 000022
【０１２６】
前記表１３から分かるように、ｓｉＲＮＡ２の場合、構造変形に関係なく対照群及びＤＯＴＡＰ単独処理群に比べて全てのサイトカインで変化がなかったり、非常に低い水準の増加だけを示した。
【０１２７】
反面、ｓｉＲＮＡ１７及び２０の場合、化学的構造変形によってインターフェロンアルファの水準が急激に減少することを確認することができた。その他の残りのサイトカインは、大きな変化がなかったり、非常に低い水準の増加だけを示した。したがって、ｓｉＲＮＡ１７及び２０の場合で化学的構造変形することにより、免疫活性を顕著に減少させる可能性があることを確認することができた。
【０１２８】
実施例９．化学的変形ｓｉＲＮＡのセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖によるターゲット以外の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果の抑制試験
本発明のｓｉＲＮＡの化学的構造変形によってセンス鎖によるターゲット以外の効果を除去することができるかを下記のような方法で実験した。
【０１２９】
実施例９−１．ホタルルシフェラーゼベクター（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ）の準備
ホタルルシフェラーゼを発現するｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ）ベクターに、各々のｓｉＲＮＡに対してアンチセンス鎖に相補的な配列及びセンス鎖に相補的な配列を各々クローニングして入れて、二つの異なるプラジミドを各々準備した。前記相補的な配列は、コスモジンテクに依頼して、両末端にＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素シート突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有するようにデザインして合成した後に、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴベクターのＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素シートを利用してクローニングして入れた。
【０１３０】
実施例９−２．ｓｉＲＮＡの化学的構造変形によるターゲット以外の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果の抑制測定
前記実施例９−１で準備されたｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス各鎖の相補的な配列が含まれているプラジミドを利用して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖の効果程度を測定した。センス鎖によるターゲット以外の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果が起こる程度は、センス鎖がＲＩＳＣと結合して、センス鎖と相補的な塩基配列を有する配列に作用する時に、センス鎖の相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼプラジミドにより発現するルシフェラーゼ量がｓｉＲＮＡを処理しない細胞に比べて減少することを確認することによって知ることができる。また、アンチセンスの相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼプラジミドを処理した細胞については、ｓｉＲＮＡによって発現するルシフェラーゼの減少程度にアンチセンスによるｓｉＲＮＡの効果が化学的構造変形した後にある程度維持されるかを確認することができる。
【０１３１】
具体的に、ホタルルシフェラーゼベクター（ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｖｅｃｔｏｒ）をｓｉＲＮＡと共にＨｅＬａとＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ）内にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後に、発現するホタルルシフェラーゼの量をルシフェラーゼアッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）で測定した。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）一日前にＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株を２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに６＊１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで準備した。相補的な塩基配列がクローニングされたルシフェラーゼベクター（１００ｎｇ）をｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）と補正ベクターであるレニルラルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現するｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（２ｎｇ，Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にリポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）でトランスフェクションさせた。細胞は、トランスフェクション２４時間後に、自然型溶解バッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用して溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。
【０１３２】
ホタルルシフェラーゼ測定値は、レニラルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）測定値にトランスフェクション効果を補正した後、ｓｉＲＮＡなく各鎖の相補的な配列をクローニングして入れたホタルルシフェラーゼベクター及びレニラルシフェラーゼベクターだけトランスフェクションさせた対照群の補正されたルシフェラーゼ数値（１００％）に対する百分率値を算出して、下記の表１４に示した。表１４で、ｍｏｄ０は化学的構造変形しない状態のｓｉＲＮＡを示し、ｍｏｄ１〜６は表４で説明した通りである。
【０１３３】
【表１４】
2013515498.tif 000023
【０１３４】
前記表１４から分かるように、ヒトの肺癌細胞株Ａ５４９及び子宮頸部癌細胞株Ｈｅｌａの全てが、ｓｉＲＮＡ２の場合、化学的構造変形しないｓｉＲＮＡ（ｍｏｄ０）そのものにもセンス鎖によるターゲット以外の効果がなかった。しかし、ｓｉＲＮＡ２０は、センス鎖に相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼの活性が減少することによって、センス鎖によるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果を示したが、化学的構造変形させた場合、特に、ｍｏｄ２及び５でセンス鎖の効果が明確に減少した。つまり、アンチセンスの効果はそのまま維持され、センス鎖の効果は減少することを確認することができた。
【図１ａ】
2013515498.tif 000031
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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