(57)【要約】疼痛を治療するための以下の式の化合物：2013523755.tif 000030および医薬組成物。
2013523755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物：
【化１】
2013523755.tif 000029
（式中、
Ｒ１は、ＣｌまたはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｃ≡Ｎ、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５、または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ２アルキル、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ３またはＳＯ２ＣＨ３であり、
Ｒ５は、Ｈであるか、またはＲ４と結合してピロリジン−２−オンを形成する）
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ１がＣｌである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｒ２が、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５、または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎである、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
Ｒ２が、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
Ｒ３が、メチル、２−フルオロエチルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
Ｒ３がメチルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
Ｒ５がＨであり、Ｒ４がＣ（Ｏ）ＣＨ３またはＣＯ２ＣＨ３である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項８】
８−（２−クロロフェニル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリンである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な希釈剤もしくは担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
１種以上の治療成分をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
療法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１２】
疼痛の治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１３】
骨関節炎疼痛または片頭痛の治療における請求項１２に記載の使用のための、化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、疼痛を治療するための方法。
【請求項１５】
関節炎疼痛または片頭痛を治療するための請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンナビノイド受容体ＣＢ１およびＣＢ２は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のクラスに属する。ＣＢ１受容体は中枢および末梢の両方で発現される一方で、ＣＢ２受容体は主として末梢で、主に免疫細胞および組織で発現される。
【０００３】
ＣＢ２受容体の薬理学的なおよび治療上の潜在性が、最近概説され（非特許文献１）、これはＣＢ２を疼痛、特に炎症性疼痛および神経因性疼痛の治療のための治療標的として同定している。
【０００４】
ＣＢ２アゴニスト薬、特にＣＢ２選択的アゴニストは、限定的な中枢で媒介される副作用で、疼痛を治療するための標的を提供する。
【０００５】
特許文献１は、プリン化合物およびカンナビノイド受容体リガンドとしての、特にＣＢ１受容体アンタゴニストとしてのその使用に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３７８２３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）１５３、３１９−３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の経口薬剤に関連する副作用の結果として、疼痛を治療するための代替治療を開発する必要があり続ける。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の式の化合物：
【化１】
2013523755.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、ＣｌまたはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｃ≡Ｎ、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５、または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ２アルキル、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ３またはＳＯ２ＣＨ３であり、
Ｒ５は、Ｈであるか、またはＲ４と結合してピロリジン−２−オンを形成する）
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１０】
本発明の化合物は、インビトロにおいてＣＢ２受容体のアゴニストであることが見出されている。本発明の特定の化合物は、既存のＣＢ２アゴニストより高い有効性を示す。本発明の特定の化合物はＣＢ２選択的アゴニストである。本発明の特定の化合物は既存のＣＢ２アゴニストより高いＣＢ２選択性を示す。
【００１１】
本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む、医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な希釈剤または担体と、任意に１種以上の治療成分とを一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、療法に使用するための、化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明はまた、疼痛、特に骨関節炎疼痛または片頭痛の治療に使用するための化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明の別の態様において、疼痛、特に骨関節炎疼痛または片頭痛を治療するための薬剤を製造するための、化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の使用が提供される。
【００１３】
本発明は、有効量の本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、疼痛を治療するための方法を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、関節炎疼痛または片頭痛を治療するための方法を提供する。
【００１４】
本発明の化合物は、疼痛、特に骨関節炎疼痛または片頭痛の治療に使用されることが好ましい。
【００１５】
ＣＢ２受容体アゴニストはまた、多発性硬化症の治療において治療可能性を有すると識別されている（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）１５３，２１６−２２５およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００８）２８３，１３３２０−１３３２９）。
【００１６】
本発明の好ましい種は、以下の式の化合物：
【化２】
2013523755.tif 000004
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は本明細書に定義される通りである）
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００１７】
式ＩまたはＩＩの化合物の特定のクラスが好ましい。以下の列挙した選択がこのような好ましいクラスを記載している：
１）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎであり、
２）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３であり、
３）Ｒ３はメチル、エチル、２−フルオロエチルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
４）Ｒ３はメチルまたはエチルであり、
５）Ｒ４はＣ（Ｏ）ＣＨ３またはＣＯ２ＣＨ３であり、
６）Ｒ５はＨであり、
７）Ｒ５はＨであり、Ｒ４はＣ（Ｏ）ＣＨ３またはＣＯ２ＣＨ３であり、
８）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ４はＣ（Ｏ）ＣＨ３またはＣＯ２ＣＨ３であり、
９）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５または−ＣＨ２Ｃ≡Ｎであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ４はＣ（Ｏ）ＣＨ３またはＣＯ２ＣＨ３であり、Ｒ３はメチル、エチル、２−フルオロエチルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
１０）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３であり、Ｒ３はメチル、エチル、２−フルオロエチルまたはＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、
１１）Ｒ２は−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３であり、Ｒ３はメチルまたはエチルである。
【００１８】
本発明の化合物の各々の薬学的に許容可能な塩は本出願の範囲内に意図される。
【００１９】
本明細書全体を通して用いられる場合、基が「本明細書中で定義される（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ）」または「本明細書中で定義される（ｈｅｒｅｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ）」によって修飾される場合、その基は第１に思い浮かぶ定義および最も広義の定義、ならびにその基の特定の定義の各々およびすべてを包含するということが理解されるべきである。
【００２０】
上記でおよび本発明の説明全体を通して用いられる場合、以下の用語は、特段の記載がない限り、以下の意味を有する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、Ｃ１〜Ｃ２アルキルという用語はメチルまたはエチルを意味する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、Ｃ１〜Ｃ２フルオロアルキルという用語は、１以上の水素がフッ素で置換されている、本明細書中で定義されるＣ１〜Ｃ２アルキル基を意味し、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、２，２−ジフルオロエチルおよび２，２，２トリフルオロエチルが挙げられる。好ましいＣ１〜Ｃ２フルオロアルキル基は２−フルオロエチルである。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、生命体に対して実質的に無毒である本発明の化合物の塩を意味する。このような塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６、２−１９（１９７７）を参照のこと。好ましい薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である。
【００２４】
本発明の実施形態は本明細書に提示される例を包含し、そして提示される例は１つのキラル形態または立体配座形態、またはそれらの塩であり得るが、本発明のさらなる実施形態は、記載されたその例のすべての他の立体異性形態および／または立体配座形態、ならびにその薬学的に許容可能な塩を包含する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「ＣＢ２選択的アゴニスト」または「ＣＢ２選択性」という用語は、ＣＢ１よりもＣＢ２に対してより大きい効力を有する化合物を意味する。好ましくは、本発明の化合物は≧５０倍のＣＢ２選択性を示す。より好ましくは、本発明の化合物は≧１００倍のＣＢ２選択性を示す。最も好ましくは、本発明の化合物は≧５００倍のＣＢ２選択性を示す。
【００２６】
本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。好ましくは、このような組成物は、経口投与用である。このような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ，Ｇｅｎｎａｒｏら編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５）を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下のスキーム、調製例および実施例は、本発明の実施をよりよく説明するために提供される。これらのスキーム、調製例および実施例の工程についての適切な反応条件は当該技術分野で周知であり、溶媒および補助試薬の置換を含む反応条件の適切な修飾は当業者の能力の範囲内である。
【００２８】
さらに、当業者は、いくつかの例では、部分が導入される順序は重要ではないということを理解する。式Ｉの化合物を生成するために必要とされる工程の特定の順序は、化学の当業者によって十分理解されるように、合成しようとする特定の化合物、出発化合物、およびその置換部分の相対的不安定性に依存する。当業者は、すべての置換基がすべての反応条件と適合するというわけではないということを理解する。これらの化合物は、合成の好都合な時点で当該技術分野における周知の方法によって保護または修飾され得る。
【００２９】
適切な保護基としては、本明細書中で以降「Ｇｒｅｅｎｅ」と呼ばれるＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９１に記載される保護基が挙げられる。Ｇｒｅｅｎｅは、当業者によって使用されるべき適切な保護基の「保護」および「脱保護」についての適切な条件を示す。
【００３０】
本発明の中間体および最終生成物は、所望に応じて、再結晶またはシリカゲルもしくはアルミナなどの固体支持体上でのクロマトグラフィーなどの一般的な技術によってさらに精製され得る。
【００３１】
本発明の化合物名は、ＩＵＰＡＣ命名機能を有するＳｙｍｙｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．ＮＥＴを使用して生成される。
【００３２】
本明細書で使用される略語は以下の通りに定義される。「ブライン」は飽和塩化ナトリウム水溶液を意味し；「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＤＤＱ」は２，３ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４ベンゾキノンを意味し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し；「ＧＤＰ」はグアノシン二リン酸を意味し；「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を意味し；「ＭＣＰＢＡ」はメタ−クロロ過安息香酸；「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し；「ｔＢＯＣ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを意味する。
【００３３】
【化３】
2013523755.tif 000005
式（Ｉ）の化合物はスキーム１に記載される反応に従って調製できる。
【００３４】
工程１において、４，６−ジクロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イルアミンは、置換反応においてアミン（１）と反応して、ジアミノピリミジン（２）を生じる。この反応は、好ましくは密閉管において、約９０〜１６０℃などの高温にて、エタノールまたはイソプロパノールなどの溶媒中で、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの適切な塩基の存在下で進行し得る。あるいは、この反応はマイクロ波照射を用いて達成され得る。
【００３５】
工程２において、イミンは、シリカ上の塩化第二鉄、またはｐ−トルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下で、ジアミノピリミジン（２）およびベンズアルデヒド（３）から形成される。この反応は、約７０℃〜１１０℃などの高温にて、１，４−ジオキサンまたはトルエンなどの適切な溶媒中で発生する。シリカの非存在下で、分子篩が加えられて、反応から水を除去できる。濾過により固体を除去し、濃縮した後、イミンの酸化的環化が、約−３０〜４０℃などの適切な温度にて、ＤＤＱなどのオキシデートの存在下で、ジクロロメタンなどの適切な溶媒中で達成されて、６−クロロプリン（４）を得ることができる。
【００３６】
工程３において、６−クロロプリン（４）はピペラジン（５）との置換反応を受けて、式（Ｉ）の化合物を生じる。この反応は、約５０〜１００℃などの高温にて、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールなどの溶媒中で、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの適切な塩基の存在下で進行し得る。あるいは、この反応はマイクロ波照射を用いて達成できる。
【００３７】
ピペラジニル部分に存在するアミン官能基は、ｔＢＯＣなどの適切な保護基を用いて保護できることは当業者により理解されるだろう。工程３における置換後、続いて保護基が除去され、アミンのアシル化またはアルキル化により式（Ｉ）のさらなる化合物が作製できる。同様に、Ｒ２がアミン官能基を含む場合、アミンは上述の順序でｔＢＯＣ基などの好適な保護基を用いて保護され得る。続いて、それは脱保護され、アシル化されるか、またはスルホニル化されて、本発明のさらなる化合物を作製できる。
【００３８】
さらに、一部の官能基は合成経路における種々の工程においてさらなる反応を受け得る。例えば、アセトアミド中間体（式中、Ｒ２＝Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）は塩化ホスホリルを用いてニトリルに変換され得る。
【００３９】
【化４】
2013523755.tif 000006
スキーム２において、式（９）の化合物を作製する方法が記載される。
【００４０】
工程１において、６−クロロ−２−メチル−Ｎ４−（２−メチルスルファニルエチル）ピリミジン−４，５−ジアミン（６）を、上記のスキーム１、工程２について実質的に記載されているようにベンズアルデヒド（３）と反応して、アルキルチオプリン（７）を得る。
【００４１】
工程２において、アルキルチオプリン（７）はアルキルスルホニルプリン（８）に酸化される。この反応は、約０〜４０℃などの適切な温度にて、ジクロロメタンなどの適切な溶媒中で、ＭＣＰＢＡなどの適切な酸化剤の存在下で進行する。
【００４２】
工程３において、クロロアルキルスルホニルプリン（８）を、適切に置換されたピペラジン（５）と置換反応して、上記のスキーム１、工程３に実質的に記載されているようにピペラジニルプリン（９）を得る。
【００４３】
【化５】
2013523755.tif 000007
スキーム３において、式（９）の化合物を合成する代替経路が示される。
【００４４】
工程１において、６−クロロ−２−メチル−Ｎ４−（２−メチルスルファニルエチル）ピリミジン−４，５−ジアミン（６）を、約３〜６日間、約１２０〜１５０℃などの高温にて、アニソールなどの適切な溶媒中で、ベンズアルデヒド（３）およびピペラジン（５）と共に混合して、アルキルチオピペラジニルプリン（１０）を得る。
【００４５】
工程２において、アルキルチオピペラジニルプリン（１０）は式（９）のスルホンに酸化される。この反応は、約０〜６０℃などの適切な温度にて、ペルオキシ一硫酸カリウム水溶液（オキソン（登録商標））を用いて、適切な溶媒、例えばＴＨＦとＭｅＯＨの混合物中で発生する。あるいは、アルキルチオはＭＣＰＢＡを用いて酸化され得る。
【実施例】
【００４６】
調製例１
６−クロロ−２−メチル−Ｎ４−（２−メチルスルファニルエチル）ピリミジン−４，５−ジアミン
【化６】
2013523755.tif 000008
９０℃にて３０時間、イソプロパノール（５００ｍＬ）中の４，６−ジクロロ−２−メチル−ピリミジン−５−アミン（４６．０ｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）、２−（メチルチオ）エチルアミン（４０．０５ｇ、０．４３９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５３．３ｇ、０．５１７ｍｏｌ）の溶液を加熱する。反応混合物を室温まで冷却し、濃縮する。残渣をジクロロメタン（２Ｌ）に溶解し、水（２×５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄する。固体の硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、茶色の固体を得る。酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラム上で残渣を精製して、標題化合物（５６ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）２３３（Ｍ＋１）。
【００４７】
適切なアミンおよび４，６−ジクロロ−２−メチル−ピリミジン−５−アミンを用いて、調製例１に記載されている手順に実質的に従って以下の表におけるジアミノピリミジンを調製する。ジクロロメタン／メタノール、酢酸エチル／ヘキサン（調製例６）、またはアセトン／ヘキサン（調製例８）の溶離液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製する。
【００４８】
【表１−１】
2013523755.tif 000009
【表１−２】
2013523755.tif 000010
【００４９】
調製例９
６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−９−（２−メチルスルファニルエチル）プリン
【化７】
2013523755.tif 000011
１００℃で１６時間、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の６−クロロ−２−メチル−Ｎ４−（２−メチルスルファニルエチル）ピリミジン−４，５−ジアミン（１．６３ｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、２−クロロベンズアルデヒド（１．９６ｇ、０．０１４ｍｏｌ）、およびＳｉＯ２上の１５％ＦｅＣｌ３（４．８９ｇ）の混合物を加熱する。反応物を冷却し、珪藻土での濾過によりシリカを除去する。濾液を減圧下で濃縮して残渣を得る。残渣を乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、０℃にて２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（１．５８ｇ、０．００７ｍｏｌ）を加える。室温にて２時間、反応混合物を攪拌する。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液、水およびブラインで洗浄する。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）で溶離するシリカゲルカラム上で残渣を精製して、標題化合物（１．９ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３５３（Ｍ＋１）。
【００５０】
適切なジアミノピリミジンおよび適切なベンズアルデヒドを用いて、調製例９に記載されている手順に実質的に従って以下の表におけるフェニルプリンを調製する。酢酸エチル：ヘキサン、ジクロロメタン：メタノール、またはヘキサン：アセトンの溶離液を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【００５１】
【表２】
2013523755.tif 000012
【００５２】
調製例１５
２−［６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−プリン−９−イル］アセトアミド
【化８】
2013523755.tif 000013
トルエン（５０ｍＬ）中の２−［（５−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−４−イル）アミノ］アセトアミド（２．２ｇ、０．０１ｍｏｌ）、２−クロロベンズアルデヒド（２．８６ｇ、０．０２ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．２ｇ）および分子篩（１．０ｇ）の混合物を１６時間加熱還流する。冷却し、珪藻土での濾過により篩を除去する。減圧下で濾液を濃縮して残渣を得る。残渣を乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（２．３ｇ、０．０１ｍｏｌ）を０℃にて加える。室温まで加温し、２時間攪拌する。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液、水、およびブラインで洗浄する。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。ジクロロメタン：メタノール（９８：２）で溶離するシリカゲルカラム上で残渣を精製して、標題化合物（０．３ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３３６（Ｍ＋１）。
【００５３】
適切なジアミノピリミジンおよび２−クロロベンズアルデヒドを用いて、調製例１５に記載されている手順に実質的に従って以下の表におけるフェニルプリンを調製する。
【００５４】
【表３】
2013523755.tif 000014
【００５５】
調製例１７
２−［６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−プリン−９−イル］アセトニトリル
【化９】
2013523755.tif 000015
１１０℃にて１６時間、２−［６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−プリン−９−イル］アセトアミド（０．３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）および塩化ホスホリル（２．５ｍＬ）の溶液を加熱する。反応物を重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出する。有機物を水およびブラインで洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、標題化合物（０．２ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３１８（Ｍ＋１）。
【００５６】
調製例１８
６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン
【化１０】
2013523755.tif 000016
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−９−（２−メチルスルファニルエチル）プリン（１．９８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、メタ−クロロ過安息香酸（２．４ｇ、０．０１４ｍｏｌ）を加え、６時間加熱還流する。反応混合物を冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。ジクロロメタン：メタノール（９８：２）で溶離するシリカゲルカラム上で残渣を精製して、標題化合物（１．９５ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３８５（Ｍ＋１）。
【００５７】
調製例１９
１−（２−フルオロエチル）ピペラジン二塩酸塩
【化１１】
2013523755.tif 000017
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピペラジン（１．６００ｇ、８．５９０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．５６ｇ、２５．７７ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（触媒）（１０ｍｇ、６６．７μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）、および１−ブロモ−２−フルオロエタン（７０４．０μＬ、９．４５ｍｍｏｌ）を反応器に入れる。還流温度で一晩攪拌しながら混合物を加熱する。反応が完了すると、室温まで冷却し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を酢酸エチルと水との間に分配する。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、純粋な４−（２−フルオロ−エチル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得る。ＧＣ−ＭＳｍ／ｚ２３２（Ｍ）。
【００５８】
１，４−ジオキサン（２１．５２ｍＬ、８６．１ｍｍｏｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌを、窒素下で室温にて、乾燥ジクロロメタン（６０ｍＬ）中の４−（２−フルオロ−エチル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．００ｇ、８．６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加える。窒素下で一晩攪拌する。減圧下で反応物を濃縮して、標題化合物（１．７８ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１３３（Ｍ＋１）。
【００５９】
実施例１
８−（２−クロロフェニル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン塩酸塩
【化１２】
2013523755.tif 000018
９０℃にて１６時間、エタノール（１５ｍＬ）中の６−クロロ−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン（０．３ｇ、０．０００７ｍｏｌ）、Ｎ−メチルピペラジン（０．０８ｇ、０．０００８ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０８ｇ、０．０００８ｍｏｌ）の溶液を加熱する。冷却し、減圧下で反応混合物を濃縮する。残渣を乾燥ジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、水、およびブラインで洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。溶離液としてジクロロメタン：メタノール（９６：４）を用いてシリカゲルカラム上で残渣を精製して、８−（２−クロロフェニル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン（０．２４ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４９（Ｍ＋１）．
【００６０】
０℃にて、エーテル（４ｍＬ）中の８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−（メチルスルホニル）エチル）−９Ｈ−プリン（０．２４ｇ、０．０００５ｍｏｌ）の溶液に、ＨＣｌ（エーテル中の２．０ｍ溶液）（０．０１８ｇ、０．０００５ｍｏｌ、１．０当量）を加え、室温にて２時間攪拌する。沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、白色の固体として標題化合物（０．１５ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４９（Ｍ＋１）。
【００６１】
適切に置換されたピペラジンおよび置換された６−クロロプリンを用いて、実施例１に記載されている手順に実質的に従って以下の表におけるフェニルピペラジニルプリンを調製する。
【００６２】
【表４−１】
2013523755.tif 000019
【表４−２】
2013523755.tif 000020
【表４−３】
2013523755.tif 000021
【表４−４】
2013523755.tif 000022
【００６３】
調製例２４
８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−メチルスルファニルエチル）プリン
【化１３】
2013523755.tif 000023
２Ｌの丸底フラスコ中で、６−クロロ−２−メチル−Ｎ４−（２−（メチルチオ）エチル）ピリミジン−４，５−ジアミン（２８．１ｇ、１２０．７ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルピペラジン（１４．７６ｍｌ、１３２．８１ｍｍｏｌ）をメトキシベンゼンに溶解する。２−クロロベンズアルデヒド（２０．３８ｍＬ、１８１．１ｍｍｏｌ）を一度に加え、温度を１４０℃まで上昇させ、この温度で４日間維持する。反応混合物を冷却し、減圧下で濃縮する。得られた油を２Ｎの塩化水素水溶液（２００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（５００ｍＬ）で洗浄する。有機層を捨てる。ｐＨ＝１４になるまで、水層を水酸化ナトリウム水溶液で処理する。ジクロロメタン中で抽出する。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して、茶色の油として標題化合物（４３ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４１７（Ｍ＋１）。
【００６４】
実施例１１
８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン塩酸塩
【化１４】
2013523755.tif 000024
８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−メチルスルファニルエチル）プリン（３８．５ｇ、９２．３ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（２７７ｍＬ）およびメタノール（２７７ｍＬ）の溶液に溶解する。水（５５４ｍＬ）中のペルオキシ一硫酸カリウム（オキソン（登録商標））（７９．５ｇ、１２９．３ｍｍｏｌ）の溶液を調製する。ペルオキシ一硫酸カリウム溶液（３００ｍＬ）を５分にわたって加え、３０分間攪拌する。次いでさらなるペルオキシ一硫酸カリウム溶液（１５０ｍＬ、続いて３０分後に５０ｍＬ）を加える。最後の添加の後、反応混合物を３０分間攪拌する。固体のメタ重亜硫酸ナトリウム（４９．１ｇ、２５８．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて一晩攪拌する。重炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×１Ｌ）中で抽出する。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、橙色の残渣を得る。溶離液として１：１のジクロロメタン−ヘキサン中の５〜５０％エタノールを用いてシリカゲルカラム上で残渣を精製する。適切な画分を合わせ、蒸発させて、固体を得る。エーテルで固体を粉砕し、真空下で乾燥させて、８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン（１１．４ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４９（Ｍ＋１）。
【００６５】
８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−９−（２−メチルスルホニルエチル）プリン（１１．３ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）をエタノール（１５０ｍＬ）に懸濁し、１Ｎの塩化水素水溶液（６．２９ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ、１当量）を加える。混合物を一晩攪拌し、減圧下で濃縮する。沈殿した固体を濾過により回収し、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥させて、標題化合物（１０．６ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４９（Ｍ＋１）。
【００６６】
実施例１２
２−［８−（２−クロロフェニル）−６−（４−エチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−プリン−９−イル］エタンアミン塩酸塩
【化１５】
2013523755.tif 000025
０℃にて、ジクロロメタン（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−６−（４−エチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−プリン−９−イル］エチル］カルバメート（０．６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌する。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。溶離液としてジクロロメタン−メタノール（９６：４）を用いるシリカゲルカラム上で残渣を精製して、２−［８−（２−クロロフェニル）−６−（４−エチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−プリン−９−イル］エタンアミン（０．３ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４００（Ｍ＋１）。
【００６７】
０℃にて、エーテル（５ｍＬ）中の２−［８−（２−クロロフェニル）−６−（４−エチルピペラジン−１−イル）−２−メチル−プリン−９−イル］エタンアミン（０．３ｇ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物にＨＣｌ（エーテル中２．０Ｍ溶液）（０．０２７ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌する。濾過により沈殿物を回収し、エーテルで洗浄する。真空下で乾燥させて、白色の固体として標題化合物（０．２５ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４００（Ｍ＋１）。
【００６８】
実施例１３
メチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エチル］カルバメート塩酸塩
【化１６】
2013523755.tif 000026
０℃にて、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エチル］カルバメート（０．５１ｇ、０．００１ｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加える。反応物を室温まで加温し、２時間攪拌する。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いでジクロロメタンで抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エタンアミン（０．３９ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３８６（Ｍ＋１）。
【００６９】
０℃にて、乾燥ジクロロメタン（４ｍＬ）中の２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エタンアミン（０．３９ｇ、０．００１０ｍｏｌ）およびピリジン（４．０ｍＬ）の溶液に、クロロギ酸メチル（０．２５ｇ、０．００２７ｍｏｌ）を加える。室温まで加温し、２時間攪拌する。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いでジクロロメタンで抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。溶離液としてジクロロメタン：メタノール（９７：３）を用いるシリカゲルカラム上で残渣を精製して、メチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エチル］カルバメート（０．３ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４４（Ｍ＋１）。
【００７０】
０℃にて、エーテル（６ｍＬ）中のメチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）プリン−９−イル］エチル］カルバメート（０．３ｇ、０．０００６ｍｏｌ）の溶液に、ＨＣｌ（エーテル中の２．０Ｍ溶液）（０．０２４ｇ、０．０００６ｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌する。沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、白色の固体として標題化合物（０．２８ｇ）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４４（Ｍ＋１）。
【００７１】
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−［８−（２−クロロフェニル）−６−［４−（２−フルオロエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチル−プリン−９−イル］エチル］カルバメートまたはｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−［６−（４−アセチルピペラジン−１−イル）−８−（２−クロロフェニル）−２−メチル−プリン−９−イル］エチル］カルバメートで開始して、実施例１３に記載されている手順に実質的に従って以下の表における実施例を調製する。脱保護し、クロロギ酸メチル、塩化メタンスルホニル、または無水酢酸と反応させる。
【００７２】
【表５−１】
2013523755.tif 000027
【表５−２】
2013523755.tif 000028
【００７３】
ＣＢ１およびＣＢ２のインビトロ機能アッセイ
例示した化合物は、ＳＰＡベースのＧＴＰ−γ−３５Ｓ結合アッセイを使用して、アゴニスト様式で試験される。すべてのアッセイ成分は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、（室温でｐＨ  ７．４）から構成されるアッセイ緩衝液中で調製される。半対数の化合物希釈を、ＢＳＡ（最終０．１２５％）を含有するアッセイ緩衝液中で行う。ＧＴＰ−γ３５−Ｓ結合は、ＣＢ１アッセイについて全膜捕捉技術およびＣＢ２アッセイについてこれまでに記載された抗体捕捉技術（ＤｅＬａｐｐら  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８９：９４６−９５５、１９９９）の修飾を使用して、９６ウェルフォーマットで測定される。すべてのインキュベーションを室温で行う。
【００７４】
ＣＢ１：
ｈＣＢ１−ＣＨＯ膜、ＧＤＰ（最終１ｕＭ）、およびサポニン（最終１０ｕｇ／ｍＬ）をアッセイ緩衝液に加え、ホモジナイズする。希釈した化合物、ＧＴＰ−γ−３５Ｓ（最終５００ｎＭ）および膜をアッセイプレートに加え、３０分間インキュベートする。次いで１ｍｇ／ウェルのＷｈｅａｔｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ＳＰＡビーズを加え、プレートを密閉し、ボルテックスにかけ、さらに１時間インキュベートする。次いでプレートを７００×ｇで１０分間遠心分離し、シンチレーションカウンタを使用して１ウェルあたり１分間計数する。
【００７５】
ＣＢ２−Ｓｆ９：
ｈＣＢ２−Ｓｆ９膜およびＧＤＰ（最終１ｕＭ）をアッセイ緩衝液に加え、ホモジナイズする。希釈した化合物および膜をアッセイプレートに加え、１５分間プレインキュベーショトする。この後、ＧＴＰ−γ−３５Ｓ（最終５００ｎＭ）を加え、さらに３５分間インキュベートする。次に、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０洗浄剤（最終０．２％）、抗Ｇｉ抗体（１：３６２の最終希釈）、および１．２５ｍｇの抗ウサギ抗体シンチレーション近接アッセイビーズを含有する混合物を加える。次いでこのプレートを密閉し、ボルテックスにかけ、さらに２時間インキュベートし、この後、遠心分離し、ＣＢ１について計数する。
【００７６】
データを分析するために、最初にすべてのウェルからバックグラウンドを差し引く。アゴニスト／逆アゴニスト用量反応データを完全アゴニスト（メタンアンダミド（ｍｅｔｈａｎａｎｄａｍｉｄｅ））反応に対して正規化することにより、アゴニスト有効性パーセントを決定する。Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＢａｓｅおよびＸＬＦｉｔ３を用いた４パラメーターのロジスティック換算フィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｉｔ）を使用して、データを分析する。
【００７７】
例示した化合物のすべてを基本的に上記のとおりに試験し、各々が≦１００ｎＭのＣＢ２についての相対的ＥＣ５０値を有することを見出した。実施例２は、ＣＢ２について１７．２ｎＭの相対的ＥＣ５０値およびＣＢ１について５５６０ｎＭの相対的ＥＣ５０値を有する。実施例１６は、ＣＢ２について１３．５ｎＭ、およびＣＢ１について＞１０００００ｎＭの相対的ＥＣ５０値を有する。
【００７８】
このように、本発明の化合物はＣＢ２インビトロ活性を示す。さらに、本発明の化合物はＣＢ１よりもＣＢ２に対して選択性を示し、そのため中枢で媒介される副作用について限定的な潜在性をもたらす。
【００７９】
ヒトおよびラットのＣＢ２受容体からの３Ｈ−ＣＰ５５９４０の置換
Ｆｅｌｄｅｒらの方法（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｏｃｏｌ．４８：４４３−４５０、１９９５）を、わずかの修飾を加えて利用した。具体的にいうと、ヒトまたはラットのＣＢ２受容体を安定にまたは一過性に発現する細胞由来の膜ホモジネートを遠心分離によって洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＢＳＡ緩衝液中で希釈した。３Ｈ−ＣＰ５５９４０の特異的結合を１μＭ  ＣＰ５５９４０を用いて定義した。特異的な３Ｈ−ＣＰ５５９４０結合を置き換えるための化合物の能力を、３００μｌの量で室温で９０分間インキュベートすることによって、１％ジメチルスルホキシドの存在下で、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、ＥＤＴＡ、ＢＳＡ緩衝液中で、ある濃度範囲にわたって試験した。水中の０．５％ポリビニルピロリドン、０．１％ポリソルベート２０で前処理したＵｎｉｆｉｌｔｅｒ９６ウェルマイクロプレートを冷Ｔｒｉｓ緩衝液で３回洗浄した。次いで反応混合物をフィルタープレートに移し、その直後に急速濾過および冷Ｔｒｉｓ緩衝液を用いる３回の２００μｌの洗浄によってインキュベートを停止した。フィルタープレートを乾燥した後、ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０を各ウェルに加え、プレートを密閉し、毎分崩壊の測定のために計数した。置換曲線をグラフ化し、得られたＫｉ値をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを利用して決定した。
【００８０】
実施例３は、２７．８ｎＭのヒト受容体Ｋｉ値および１２．６ｎＭのラット受容体Ｋｉ値を有する。実施例２は、２８．４ｎＭのヒト受容体Ｋｉ値および４８．７ｎＭのラット受容体Ｋｉ値を有する。
【００８１】
このように、本発明の化合物は、ヒトおよびラットのＣＢ２受容体の両方に対してインビトロで結合することが示される。
【００８２】
モノヨードアセテート（ＭＩＡ）モデル
すべての研究について、ＭＩＡモデルにおいて疼痛を測定するために、ＭＩＡ注入時およそ８週齢の雄性のＬｅｗｉｓラットを使用する。このラットを１ケージあたり２または３匹の群で収容し、一定温度および１２時間明／１２時間暗のサイクルで維持する。動物は、データ収集の間を除いていつでも餌および水にアクセスできる。
【００８３】
標準的なＭＩＡモデルでは、各ラットの右膝に５０ｕｌの生理食塩水中の０．３ｍｇ  ＭＩＡを、および左膝に５０ｕｌの生理食塩水を注射する。疼痛を、ＭＩＡ注射後様々な時間で（通常、ＭＩＡ注射後１０日より前ではない）、インキャパシタンス試験（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を使用して測定する。これは、ＭＩＡを注射した膝と生理食塩水を注射した膝との間の後肢の体重支持の差を測定し、そして各測定は、各々１秒にわたって測定した３つの別個の測定の平均である。
【００８４】
ＣＢ２アゴニストを用いた研究のために、ラットを用量群（ｎ＝５または６）に無作為化し、次いで検討中の化合物で１回投薬する。投薬は各ラットに対して１５分間だけずらし、用量後の所定の時間（通常２時間）に、疼痛をインキャパシタンス試験を使用して測定する。研究は、通常は、４つの群、ビヒクル（０．２５％ポリソルベート８０を加えた水中の１％カルボキシメチルセルロース）、および単一用量での単一化合物であるか３つの用量の同じ化合物のいずれかであり得る３つの化合物群で行う。結果を、生理食塩水を注射した膝とＭＩＡを注射した膝との間の体重支持の差として報告し、ビヒクルで処置した動物と化合物で処置した動物との間で統計比較を行い、このモデルにおける膝の疼痛に対する化合物の効果を評価する。
【００８５】
実施例１を基本的に上記のとおりに試験し、０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量で、ビヒクルより疼痛を軽減することが見出された。実施例１７を基本的に上記のとおりに試験し、０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量でビヒクルより疼痛を軽減することが見出された。
【００８６】
このように、本発明の化合物は疼痛、特に関節痛の治療において有用であることが示される。
【００８７】
硬膜血漿タンパク質溢出（ＰＰＥ）の動物モデル
雄性Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３５０ｇ）を、ペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、−２．５ｍｍにて切歯バーセットを用いて定位フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。正中線矢状頭皮切開後、頭蓋骨を貫通する２対の両側穴をドリルで開ける（３．２ｍｍ後方、１．８および３．８ｍｍ側方、全ての座標はブレグマを参照とする）。先端を除いて絶縁された、対のステンレス鋼刺激電極（Ｒｈｏｄｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、両方の半球中に９．２ｍｍの深さまで穴を通して下げる。
【００８８】
大腿静脈を露出させ、１用量の試験化合物を、１ｍＬ／ｋｇの用量体積で静脈内注射（ｉ．ｖ．）する。ｉ．ｖ．注射の約８分後、２０ｍｇ／ｋｇ用量のフルオレセインイソチオシアネート−ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）も静脈内注射する。ＦＩＴＣ−ＢＳＡはタンパク質溢出のためのマーカーとして機能する。試験化合物の注射後１０分に、ＰＳＩＵ６光電子分離ユニット（Ｇｒａｓｓ−Ｔｅｌｅｆａｃｔｏｒ）を備えるＭｏｄｅｌ  Ｓ４８  Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒを用いて左三叉神経節を１．０ｍＡの電流強度（５Ｈｚ、５ｍｓｅｃ時間）で５分間刺激する。
【００８９】
あるいは、一晩絶食させたラットに、２ｍＬ／ｋｇの体積で強制飼養により試験化合物を経口投与する。約５０分後、動物を麻酔し、上記のように定位フレームに置く。経口投与の６０分後、動物にＦＩＴＣ−ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を投与する。経口投与の１時間後、上記のように動物を刺激する。
【００９０】
刺激の５分後、４０ｍＬの生理食塩水での瀉血により動物を安楽死させる。頭蓋骨の頂部を、硬膜の採取を容易にするために除去する。膜サンプルを両方の半球から取り除き、水でリンスし、顕微鏡スライドガラス上で平らに広げる。一旦乾燥させて、７０％グリセロール／水溶液を用いて組織にカバースリップをのせる。
【００９１】
格子単色光分光器および分光光度計を備えた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、各サンプルにおけるＦＩＴＣ−ＢＳＡの量を定量する。約４９０ｎｍの励起波長を利用し、５３５ｎｍにおける発光強度を測定する。顕微鏡はモーター駆動ステージを備え、またパーソナルコンピューターとインターフェースで接続している。これにより、コンピューターで制御されたステージの移動が容易になり、各硬膜サンプル上の２５点（５００ｍｍステップ）で蛍光測定する。測定の平均および標準偏差をコンピューターにより測定する。
【００９２】
三叉神経節の電気刺激により誘導される溢出は同側効果である（すなわち、三叉神経節を刺激した硬膜の側でのみ生じる）。これは、対照として硬膜の残りの（刺激されていない）半分の使用を可能にする。刺激していない側における溢出の量に対して刺激した側からの硬膜の溢出の量の比を計算する。対照動物は生理食塩水のみを投与し、約２．０の比を生じる。対照的に、刺激した側から硬膜の溢出を効果的に防止する化合物は約１．０の比を生じる。
【００９３】
実施例１を上記のように実質的に試験し、１０ｍｇ／ｋｇにて経口投与の２時間後、１．１２の溢出比を有することを見出した。実施例７を上記にように実質的に試験し、１０ｍｇ／ｋｇにて経口投与の２時間後、１．１８の溢出比を有することを見出した。
【００９４】
このように、本発明の化合物は、疼痛、特に片頭痛の治療に有用であることが示される。
【国際調査報告】
2013523755.tif 000031
2013523755.tif 000032
2013523755.tif 000033