(57)【要約】【課題】焼酎排水の有効利用が図るとともに、スクワレン産生藻類の増殖速度を増大させることでスクワレン製造の効率化を図る方法の提供。【解決手段】適切に調整した焼酎排水を培地として使用する、スクワレン産生藻類の培養方法、適切に調整した焼酎排水を培地として使用する、スクワレン産生藻類によるスクワレン製造方法、並びにスクワレン産生藻類を利用した焼酎排水の浄化方法であって、適切に調整した焼酎排水中でスクワレン産生藻類を増殖させることにより、焼酎排水の栄養分を減少させることを特徴とする、焼酎排水の浄化方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
焼酎廃水を培地として使用する、スクワレン産生藻類の培養方法。
【請求項２】
前記スクワレン産生藻類が従属栄養性藻類である、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記スクワレン産生藻類が、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属の株である、請求項１又は２のいずれかに記載の培養方法。
【請求項４】
前記スクワレン産生藻類が、オーランチオキトリウムsp.(Aurantiochytrium sp.)18W-13aである、請求項３に記載の培養方法。
【請求項５】
前記焼酎廃水が、遠心分離及び／又は濾過により清澄される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記焼酎廃水に、糖質、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラルのいずれか1つ以上が添加される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記焼酎廃水に、NaCl、KCl、CaCl2・H2O、MgSO4・7H2O及びMgCl2・6H2Oの１つ以上の塩類が、合計で5〜34‰(g／培地L)の量で添加される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記塩類の添加量が合計で７〜１０‰(g／培地L)である、請求項７に記載の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の培養方法で培養したスクワレン産生藻類を回収し、当該回収されたスクワレン産生藻類からスクワレンを抽出する、スクワレン製造方法。
【請求項１０】
焼酎排水を請求項１〜８のいずれか１項に記載の培養方法で藻類の培地として使用することによる、焼酎排水を浄化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焼酎廃水を培地として使用する、スクワレン産生藻類、特にオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の藻類であるスクワレン産生藻類の培養方法、焼酎廃水を培地としたスクワレン産生藻類によるスクワレン製造方法、さらにはスクワレン産生藻類を利用した焼酎廃水の浄化方法、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物細胞が産生する産物からバイオマス、特にバイオ燃料を取得する技術は、近年、地球温暖化又は埋蔵資源の枯渇等の問題に対する取組みとして注目を集めている。このバイオマスの中でも、微細藻類が産生する炭化水素やトリアシルグリセロール等オイル又は多糖類は、食料と競合せず、大量培養が可能であることから、工業的利用の期待が高く、微細藻類からのバイオ燃料やその他の有用成分の獲得が有望視されている。しかしながら、工業的規模で藻類の大量培養を行うには、運転コストや培地に用いる大量の水資源および栄養塩の確保等の経済的な問題点を解決せねばならない。
【０００３】
例えば、バイオマス生産に利用される従属栄養微生物であるオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の藻類の増殖には、栄養分に富んだ培地を必要とする。かかる藻類の培養に通常利用されるＧＴＹ培地（グルコース２％、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％、人工海水８．５‰）は高価であり、コスト面から見ても工業的大量調製には向かない。
【０００４】
一方で、人口増加や産業の発展に伴い年々産業廃水の排出量は増加しており、水不足が深刻化している今、これらの産業廃水を資源として再利用しようと様々な取り組みが成されている。藻類は廃水中に含まれる栄養塩を吸収して増殖することが可能であるため、藻類培養に廃水を用いることで、低コスト、省エネルギー、そして二酸化炭素排出量の削減を実現した藻類バイオマス生産が可能と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】：特開２００７−２７４９８０号公報
【特許文献２】：特開２００９−１００７４０号公報
【特許文献３】：特開２００７−００２６３７号公報
【特許文献４】：特開２００７−１８１４５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】： Ｊｏｕｒｎａl ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．  １０２，  Ｎｏ．４，  ３２３−３２７．  ２００６
【非特許文献２】：ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５，  ２２４６−２２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、バイオマス産生藻類の大量培養のための新たな手段の提供にある。
【０００８】
バイオマス産生藻類の大量培養が可能な栄養に富む産業廃水として、例えば食品廃水が考えられる。食品廃液の水分を濾過や蒸留等により除去して残留した固形物を動物飼料の材料とする（例えば特許文献１：特開２００７−２７４９８０、特許文献２：特開２００９−１００７４０等）ことや、土木資材に利用する（例えば特許文献３：特開２００７−００２６３７、特許文献４：特開２００７−１８１４５７等）ことは既に試みられている。しかしながら、廃液の大部分を占める水分は、これらの方法では利用されることなく廃棄される。また、食品廃水といっても、飲料製品（清涼飲料、アルコール飲料）廃水、油脂製品廃水、牛乳、乳製品廃水、農作物加工品廃水、惣菜廃水及び製菓廃水等、様々なものがあり、それぞれの廃水を構成する成分も様々である。
【０００９】
焼酎廃水を含む食品廃水は、従来海洋投棄が行われていたが、陸上発生廃棄物の海洋投棄を規制するロンドン条約の１９９６年の議定書において、食品廃水の海洋投棄が原則として禁止となった。故に、かかる食品廃水の処理手段、あるいはこれを有効利用する手段の開発が切望されている。焼酎廃水をバイオマス産生藻類の培養に活用することができれば、廃水処理の効率化、及び低コストでのバイオマス生産を、同時に達成することができる。焼酎廃水をバイオマス産生藻類の培養に適用する研究は、Ｙａｍａｓａｋｉらにより報告されている（非特許文献１； Ｊｏｕｒｎａl ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．  １０２，  Ｎｏ．４，  ３２３−３２７．  ２００６）。この文献において、麦焼酎廃水中で培養したシゾキトリウム(Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)属の微細藻類から、ＤＨＡ及びＥＰＡが回収されたことが報告されている。
【００１０】
本発明者らは、スクワレンを高効率で産生する藻類を発見し（非特許文献２；ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５，  ２２４６−２２４８）、かかる藻類を培養する培地として利用することでスクワレンを効率よく産生することを可能にする産業廃水を見出すべく、様々な廃水について鋭意研究した結果、驚くべきことに、焼酎廃水を培地として利用してスクワレン産生を培養すると、極めて高い効率でスクワレンの産生が達成されること見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本願は、以下の発明を提供する。
（１）焼酎廃水を培地として使用する、スクワレン産生藻類の培養方法。
（２）前記スクワレン産生藻類が従属栄養性藻類である、（１）に記載の培養方法。
（３）前記スクワレン産生藻類が、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の株である、（１）又は（２）のいずれかに記載の培養方法。
（４）前記スクワレン産生藻類が、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の培養方法。
（５）前記焼酎廃水が、遠心分離した焼酎粕を濾過することにより取得される、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の培養方法。
（６）前記焼酎廃水に、糖質、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラルのいずれか１つ以上が添加される、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の培養方法。
（７）前記焼酎廃水に、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及びＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの１つ以上の塩類が、合計で５〜３４‰（ｇ／培地Ｌ）の量で添加される、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の培養方法。
（８）前記塩類の添加量が合計で７〜１０‰（ｇ／培地Ｌ）である、（７）に記載の培養方法。
（９）（１）〜（８）のいずれか１項に記載の培養方法で培養したスクワレン産生藻類を回収し、当該回収されたスクワレン産生藻類からスクワレンを抽出する、スクワレン製造方法。
（１０）焼酎廃水を（１）〜（８）に記載の培養方法で培地として使用することによる、焼酎廃水を浄化する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、焼酎廃水の有効利用が図れるとともに、スクワレン産生藻類の増殖速度を増大させることでスクワレン製造の効率化をも図ることができる。しかも、焼酎廃水の効率的な浄化も達成される。
【００１３】
焼酎廃水は、驚くべきことに、対照の微生物培養用培地であるＧＴＹ培地と同様の効率で、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａによるスクワレン生産を達成した。同様に試験された大豆廃水及びオイルパーム廃液では同株によるスクワレン生産が殆ど認められなかったことを鑑みて、かかる焼酎廃水培地の高度なスクワレン生産支持は、驚異的な結果といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＧＴＹ培地、又は焼酎廃水の濾液若しくはその希釈物に塩類を添加したものを培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図２】図２は、ＧＴＹ培地、又は大豆廃水の濾液若しくはその希釈物に塩類を添加したものを培地とした場合の、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図３】図３は、ＧＴＹ培地、又はオイルパームの濾液若しくはその希釈物に塩類を添加したものを培地とした場合の、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図４】図４は、焼酎廃水浄化作用の評価実験における、ＧＴＹ培地、又は焼酎廃水培地を培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図５】図５は、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａを培養している培地中のＤＯＣの経時変化を示す。
【図６】図６は、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａを培養している培地中のＤＴＮの経時変化を示す。
【図７】図７は、オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａを培養している培地中のＤＴＰの経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一般に、焼酎は、穀物等の原材料を麹菌及び酵母によりアルコール発酵させた発酵液からエタノールを蒸留することにより製造される。本発明における焼酎廃水とは、この焼酎の製造過程において生じる、発酵液から蒸留によりアルコールを抽出した後の残留発酵液をいう。焼酎廃水は、原材料、麹菌及び酵母に由来する、糖質、有機酸、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びミネラル等を豊富に含有する。
【００１６】
焼酎廃水は、原材料、麹菌及び酵母由来の様々な固形物を含有する。スクワレン産生藻類の培養に際して、焼酎廃水中の固形物は、遠心分離や濾過等、公知の手段により除去され、清澄な水溶液が培地として使用される。
【００１７】
本発明において、上記清澄な焼酎廃水は、濾過滅菌、オートクレーブ滅菌、煮沸滅菌、及び放射線滅菌等、公知の手段で滅菌されてもよい。
【００１８】
本発明において、上記清澄な焼酎廃水に様々な添加物を添加することにより、当該廃水が、スクワレン産生藻類の培養に適した組成となるように調整されてもよい。当該添加物として、糖質、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル等が挙げられる。更に、必要であれば適当な酸又は塩基を加えることにより適宜ｐＨを調整できる。培地の好適なｐＨは培養するスクワレン産生藻類の種類に依存するであろう。
【００１９】
好ましくは、前記焼酎廃水に、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及びＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの１つ以上の塩類が添加される。好ましくは、前記塩類は、合計で５〜３４‰（ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。より好ましくは、前記塩類は、合計で５〜１２‰（ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。特に好ましくは、前記塩類の添加量は、合計で７〜１０‰（ｇ／培地Ｌ）となる。
【００２０】
本明細書で使用される「藻類」には、藍藻類、原核緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、珪藻類、褐藻類、ラビンリンチュラ類、黄緑藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類、真正眼点藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、プラシノ藻類、緑藻類、車軸藻類などがあり、好ましくは、微細藻類とよばれる、藍藻類、珪藻類、ラビンチュラ類、真正眼点藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類、ユーグレナ藻類、プラシノ藻類や緑藻類がある。好ましくは、本発明に適する藻類は従属栄養藻類である。また、本発明に適する藻類としては、好ましくは、ユーグレナ、ボトリオコッカス、スピルリナ、ミクロキスティス・エルギノーサ、スピルリナ、オーランチオキトリウム、シゾキトリウムがある。特に好ましいのはオーランチオキトリウム属の藻類であり、より好ましいのはオーランチオキトリウムｓｐ．、最も好ましいのはオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａである。
【００２１】
本発明におけるスクワレン産生藻類の培養又は焼酎廃水の浄化は、当該株を上記のように調整された焼酎廃水に播種し、定法にしたがって培養することにより行われる。培養条件は培養するスクワレン産生藻類の種類に依存し、温度は５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１０〜３０℃にて、通常１〜１０日間、好ましくは３〜７日間培養を行い、通気又は嫌気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で行うことができる。
【００２２】
本発明に使用するスクワレン産生藻類は、適当な細胞培養手段を有する培養装置で培養してよい。「細胞培養手段」とは、細胞を培養するためのあらゆる機能を有する手段を意味し、例えば、培養槽であり、当該培養槽は、攪拌装置、振動装置、温度制御装置、ｐＨ調節装置、濁度測定装置、光制御装置、ＣＯ２等の特定気体濃度測定装置及び圧力測定装置から選択される１又は複数の装置を有してもよい。当該培養槽は濃縮・分離槽と同一の槽であっても、濃縮・分離槽とは別の槽であってもよい。濃縮・分離槽と別の槽である場合、適切な手段、例えば流路等により連結されていてもよい。
【００２３】
一般的に細胞の培養工程には、細胞数が時間に対して対数的に増殖する対数増殖期と、対数増殖期後の定常期がある。例えば藻類の場合、光合成及び増殖用培地の栄養素により対数的に増殖する増殖期と、スクワレンを産生するスクワレン産生期に分けることができる。好ましくは増殖期とスクワレン産生期で培地を交換することが望ましい。
【００２４】
本発明はさらに、焼酎廃水を培地とした上記培養方法で培養したスクワレン産生藻類を回収し、当該回収されたスクワレン産生藻類からスクワレンを抽出する、スクワレン製造方法を提供する。本発明のスクワレン製造方法は、調整された焼酎廃水を培地としてスクワレン産生藻類を培養することにより、当該スクワレン産生藻類にスクワレンを産生させることを特徴とする。
【００２５】
本明細書でいう「バイオマス」とは、細胞が産生するあらゆるバイオマスのことを言い、具体的には、例えば、燃料、食料、医療品、及びその他の工業用品又は生活用品として必要なバイオマスやその原料のことを言う。当該バイオマスには、樹脂、燃料又は界面活性剤糖のもととなる炭化水素、糖類、タンパク質、アミノ酸等がある。例えばバイオマス産生藻類の産生するバイオマスとしては、有機炭素源を利用して産生した炭化水素などのオイルや多糖類がある。具体的には、オイルとして、アルカン、エポキシアルカン、アルカデイエン、アルカトリエン、トリテルペノイド、テトレテルペノイドなどの炭化水素、グリセリン１分子の脂肪酸３分子が結合したトリアシルグリセロールなどがあり、より具体的には、バイオマス産生藻類がユーグレナ・グラシリスＮＩＥＳ−４８の場合、トリアシルグリセロールなどの脂質や嫌気的条件下で産生されるワックスエステル等がある。また、バイオマス産生藻類がオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの場合、スクワレンが産生され得る。多糖類としては、フコースを含む多糖類等があり、また天然色素としてカロチノイドがある。
【００２６】
本発明のスクワレン産生藻類が産生するスクワレンは、当業者に既知の方法で抽出及び分析することができる。例えば、上記の通りスクワレン産生藻類を培養して増殖させ、得られた培養液から遠心分離又は濾過等により回収したスクワレン産生藻類のペレットを、凍結乾燥又は加温による乾燥等により乾燥させる。または、培養後の培地をそのままスクワレンの抽出ステップに用いてもよい。
【００２７】
得られた細胞乾燥物、又は培養後の細胞を含有する培地から、有機溶媒を用いて脂質たるスクワレンを抽出できる。抽出は、異なる有機溶媒を用いて２度以上行ってもよい。有機溶媒としては、例えばクロロホルム・メタノール混合溶媒（例えば、１：１、１：２）、又はエタノール・ジエチルエーテル混合溶媒等の極性溶媒と弱極性溶媒の混合液を用いることができる。上記抽出後に、例えば窒素気流下で濃縮乾固したサンプルから、ｎ−ヘキサンを用いて抽出する。得られた抽出液を、当業者に既知の方法で精製する。例えば、シリカゲルや酸性白土を用い、極性脂質を吸着させて精製することができる。また、精製したスクワレンを、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ，ＩＲ、ガスクロマトグラフィー、ＧＣ／ＭＳ等により分析する。
【００２８】
前記スクワレン産生藻類は、その乾燥重量当たり、少なくとも１０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％のスクワレンを含有することができる。
【００２９】
本発明はさらにスクワレン産生藻類を利用した焼酎廃水の浄化方法を提供する。この方法は、上記のように調整した焼酎廃水中でスクワレン産生藻類を培養及び増殖させることにより、焼酎廃水中の有機炭素、窒素及びリン酸等の栄養分を当該スクワレン産生藻類に同化させて、それらの濃度を低下させることを特徴とする。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３１】
実験に用いたスクワレン産生藻類と焼酎廃水
本実験ではスクワレン産生藻類としてオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａを用いた。当該株は、焼酎廃水中の栄養分を同化してスクワレンを産生する。焼酎廃水は、霧島酒造から提供されたものを用いた。
【００３２】
実験１  焼酎廃水の希釈系列を用いたオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力の評価
霧島酒造から提供された焼酎廃水を、５０００ｒｐｍ、１５分で遠心分離後、Ｎｏ．２の濾紙で濾過して、清澄な焼酎廃水を得た。当該廃水を、蒸留水で２５％、５０％、７５％に希釈した。当該希釈廃水及び希釈をしていない廃水に、主要塩類を２５％海水相当の塩分（８．５‰）となるように添加した（ＮａＣｌ  ５．８５  ｇ／Ｌ，  ＫＣｌ  ０．１９  ｇ／Ｌ，  ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ  ０．３７  ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．２３  ｇ／Ｌ，  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １．０２  ｇ／Ｌ）。これらを、焼酎廃水の希釈系列とした。
【００３３】
対照培地として、ＧＴＹ培地（グルコース２％、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％）に、上記焼酎廃水に添加したのと同量の主要塩類を添加し、更に、１Ｎ  ＨＣｌ及び１０Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．３に調整したものを用意した。
【００３４】
上記各培地を、３００ｍｌ容積の三角フラスコに１８０ｍｌ注ぎ、これらにオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａを播種した。フラスコの口をシリコ栓で封じ、２５℃で往復振盪培養した（１００ストローク／分）。
【００３５】
培養中の培養液１ｍｌを所定のタイムポイントで回収し、紫外可視吸光度計により６６０ｎｍの光学濁度を計測することで、増殖曲線を得た。培養は、全ての培養で増殖がプラトーに達するまで、最長で１１０時間実施された。
【００３６】
培養終了後の培養液を５０〜１００  ｍＬ回収し、高速冷却遠心分離機で３９００  ｒｐｍ、１５  分遠心分離した。その後、上清を捨て、ペレットを蒸留水で洗浄し、再度遠心分離を行った。その後、試料を−８０℃で凍結し、これらを凍結乾燥機で乾燥させることで、乾燥藻体を得た。乾燥藻体重量を微量天秤により計量し、培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出した。
【００３７】
上記培養液１０  ｍＬに、クロロホルム／メタノール（体積比２：１）混合溶液２０ｍＬを添加後、内部標準物質としてオクタデシルベンゼン１００μｇを添加し、よく混合した。２６００ｒｐｍ、２０分で遠心分離した後、クロロホルム層をＮｏ２．のろ紙でろ過した。当該濾液をエバポレーターにより濃縮乾固した。当該試料に０．５  Ｍ  ＫＯＨ溶液１ｍＬを添加し、９０℃、１時間でけん化反応を行った。その後、当該試料に蒸留水１ｍＬとヘキサン６ｍＬを加えてよく混合した後、ヘキサン層を回収した。当該ヘキサン層を濃縮乾固後、アセトニトリル／テトラヒドロフラン（体積比９：１）混合溶液  １ｍＬを添加し、これを１００倍希釈した。このように調製した試料を、ＨＰＬＣ分析に供して、スクワレン含有量を測定した。
【００３８】
以上の結果を下記表１及び図１に示す。図１は、ＧＴＹ培地、又は調整した焼酎廃水の希釈系列を培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。表１は、各培地における、スクワレン産生藻類の比増殖速度、ダブリングタイム、培養後の乾燥重量及びスクワレン濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。希釈していない焼酎廃水（ＳＤＷ１００％）は、対照培地（ＧＴＹ）と同等の効率で、藻類の増殖を支持し、かつスクワレンを製造することが出来た。
【表１】
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【００３９】
実験２  大豆廃水の希釈系列を用いたオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力の評価
焼酎廃水以外に、大豆廃水を培地とした場合のオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力の評価を行った。大豆廃水は日本全国またはアジア圏で広く入手しやすく、炭素源や窒素源が豊富に含まれるため、培地源として適当であると思われた。また、焼酎廃水同様、これを有効利用する方法及び効率的に処理する方法の開発が求められている。
【００４０】
株式会社信濃雪から提供された大豆廃水を、上記焼酎廃水と同一の手順を経て希釈系列とした。そして、上記焼酎廃水について行ったのと同様に、オーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力を評価した。
【００４１】
その結果を、以下の表２及び図２に示す。図２は、ＧＴＹ培地、又は調整した大豆廃水の希釈系列を培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。表２は、各培地における、スクワレン産生藻類の比増殖速度、ダブリングタイム、培養後の乾燥重量及びスクワレン濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。大豆廃水の希釈系列（ＳＣＷ１００％、７５％、５０％、２５％）のいずれも、対照培地（ＧＴＹ）と比較して、スクワレンの製造効率は顕著に低かった。しかしながら、希釈していない大豆廃水（ＳＣＷ１００％）において、藻類の乾燥重量は、実験１における希釈していない焼酎廃水を培地とした場合と同等であった。
【表２】
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【００４２】
希釈していない焼酎廃水と、希釈していない大豆廃水との間で、回収された藻類の乾燥重量は同等であったが、焼酎廃水のスクワレン含有量は、大豆廃水の４０倍以上であった。この結果は、スクワレン産生藻類がスクワレンを産生するには、増殖を支持する要素以外に、大豆廃水が有していない何らかの要素が要求されること、及び希釈していない焼酎廃水とＧＴＹ培地は、スクワレン産生藻類の増殖を支持する要素、及びスクワレン産生藻類がスクワレンを産生するのに要求される要素を両方とも備えていることを示唆している。
【００４３】
実験３  オイルパーム廃液の希釈系列を用いたオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力の評価
焼酎廃水以外に、オイルパーム廃液を培地とした場合のオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖及びスクワレン産生能力の評価を行った。オイルパーム廃液は日本では入手困難だが、東南アジア圏においてその処理が大問題となっている食品廃水であるため、これを有効利用する方法及び効率的に処理する方法の開発が求められている。
【００４４】
凍結されたオイルパームを１００℃で解凍し、種子をとり、皮と実にしたもの５３５ｇをジューサーで粉砕し、トータルで５Ｌとなるように超純水を加え、オートクレーブ滅菌した。オイルを分離した液をＮｏ．５、Ｎｏ．２、ＧＦ／Ｃフィルターで吸引濾過した。得られた濾液を、焼酎廃水と同様の手順を経て希釈系列とした。そして、上記焼酎廃水について行ったのと同様に、オーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの増殖（ＯＤ６６０測定のみ）及びスクワレン産生能力を評価した。
【００４５】
その結果を、下記表３及び図３に示す。図３は、ＧＴＹ培地、又は調整したオイルパーム廃液の希釈系列を培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。表３は、ＧＴＹ培地及び希釈していないオイルパーム廃液培地における、スクワレン濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。オイルパーム廃液の希釈系列（Ｏｉｌ  ｐａｌｍ  １００％、７５％、５０％、２５％）のいずれも、対照培地（ＧＴＹ）と比較して、藻類の増殖効率が有意に低かった。そして、希釈していないオイルパーム廃液の３回の試行のいずれも（Ｏｉｌ  ｐａｌｍ  １００％−１、２、３）、対照培地の３回の試行（ＧＴＹ−１、２、３）と比較して、増殖効率の低下だけでは説明できない程に劇的なスクワレンの製造効率の低下を示した。この結果は、実験２で大豆廃水を使用した場合と同様である。
【表３】
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【００４６】
上記の試験で検討したように、様々な食品廃水の内、対照培地と同等の藻類の増殖効率及びスクワレン産生効率を示したのは、焼酎廃水のみであった。このことから、微生物の培養には、食品の主原料に由来する成分に加えて、酵母や麹菌等の細菌由来の成分が重要な役割を果たすことが示唆される。
【００４７】
実験４  オーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの焼酎廃水浄化作用の評価
スクワレン産生株は、焼酎廃水中で増殖し、スクワレンを産生する過程で、焼酎廃水中の有機物を同化する。本実験において、スクワレン産生株オーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａの培養の過程における、ＤＯＣ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ、溶存態有機炭素）、ＤＴＮ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ、溶存態全窒素）及びＤＴＰ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ、溶存態全リン）を測定して、当該培養による焼酎廃水中の有機物除去作用の評価を行った。
【００４８】
霧島酒造から提供された焼酎廃水を、５０００ｒｐｍ、１５分で遠心分離後、Ｎｏ．２の濾紙で濾過して、清澄な焼酎廃水を得た。当該廃水に、人工海水（Ｒｅｄ  ｓｅａ  ｓａｌｔ，  Ｒｅｄ  ｓｅａ）を２５％海水相当の塩分（８．５‰）となるように添加した。これを焼酎廃水培地とした。
【００４９】
対照培地として、ＧＴＹ培地（グルコース２％、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％）に、上記焼酎廃水に添加したのと同量の人工海水を添加し、更に、１Ｎ  ＨＣｌ及び１０Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．３に調整したものを用意した。
【００５０】
上記各培地を、３００ｍｌ容積の三角フラスコに１８０ｍｌ注ぎ、これらにオーランチオキトリウムｓｐ．  １８Ｗ−１３ａを播種した。フラスコの口をシリコ栓で封じ、２５℃で往復振盪培養した（１００ストローク／分）。
【００５１】
培養中の培養液１ｍｌを、所定のタイムポイントで回収し、紫外可視吸光度計により６６０ｎｍの光学濁度を計測することで、増殖曲線を得た。図４は、ＧＴＹ培地、又は調整した焼酎廃水を培地とした場合の、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．１８Ｗ−１３ａの密度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【００５２】
培養前、７２時間、９６時間、１２３時間で培養液を回収し、これらを遠心分離し（３９００ｒｐｍ、１５分、４℃）、上清を回収した後、ＧＦ／Ｃガラスフィルターでろ過した。これらの試料を、分析に供するまで、−２０℃で冷凍保存した。
【００５３】
上記試料中の溶存態有機炭素(ＤＯＣ）は、前有機体炭素計（ＴＯＣ−ＶＣＳＨ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて、燃焼触媒酸化方式により測定された。溶存態全窒素（ＤＴＮ）及び溶存態全リン(ＤＴＰ)は、フローインジェクション分析システム（Ａｑｕａｌａｂ）を用いて、それぞれペルオキソ二硫酸カリウム・アルカリ分解‐カドミウム・銅還元カラム法及びペルオキソ二硫酸カリウム分解‐モリブデン青吸光光度法により測定した。
【００５４】
図５は、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．１８Ｗ−１３ａを培養したＧＴＹ及び焼酎廃水培地（ＳＤＷ）中のＤＯＣの経時変化を示す。培養期間中のＤＯＣ除去量(ｍｇ／Ｌ)及び除去率（％）は、最終的に１２３時間で最大となり、ＧＴＹでは９６０２．５ｍｇ／Ｌ（５７．９％）、ＳＤＷでは５３８５．８ｍｇ／Ｌ（３３．７％）であった。
【００５５】
図６は、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．１８Ｗ−１３ａを培養したＧＴＹ及び焼酎廃水培地（ＳＤＷ）中のＤＴＮの経時変化を示す。培養期間中のＤＴＮ除去量(ｍｇ／Ｌ)及び除去率（％）は、７２時間までに急激に除去され、最終的には、ＧＴＹでは４７８．４ｍｇ／Ｌ（４２．８％）、ＳＤＷでは３３４．２ｍｇ／Ｌ（６０．３％）であった。
【００５６】
図７は、スクワレン産生藻類オーランチオキトリウムｓｐ．１８Ｗ−１３ａを培養したＧＴＹ及び焼酎廃水培地（ＳＤＷ）中のＤＴＰの経時変化を示す。培養期間中のＤＴＰ除去量(ｍｇ／Ｌ)及び除去率（％）は、９６時間までに急激に除去され、最終的には、ＧＴＹでは１３３．２ｍｇ／Ｌ（７７．５％）、ＳＤＷでは１１６．３ｍｇ／Ｌ（４０．６％）であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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