(57)【要約】本発明は、細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子に関し、ここにおいて、該ペプチド分子は、(a)少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸残基の長さを有し；(b)その一次アミノ酸配列中に少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％の正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ(c)アミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQを有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の効率で細胞内に内部移行されるものである。本発明はまた、そのようなペプチドをコードする対応する核酸分子、ならびに1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されている、少なくとも1つの前記ペプチドを含む組成物であって、該結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成される、組成物に向けられる。さらに、本発明は、(a)前記ペプチドまたは組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および(b)前記ペプチドまたは組成物の内部移行を検出する段階を含む、前記ペプチドまたは前記組成物の内部移行挙動を検出する方法に関する。最後に、本発明は、1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための、ならびに癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療における、前記ペプチドまたは前記組成物の使用に関する。2013531988.tif 000020
2013531988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子であって、
(a) 
2013531988.tif 000018
およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたって有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつ
(b)アミノ酸配列
2013531988.tif 000019
を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも200％の効率で細胞内に内部移行される、
ペプチド分子。
【請求項２】
前記ペプチドの少なくとも一部がαへリックス二次構造を形成している、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである、請求項1または2記載のペプチド。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項５】
請求項4記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６】
請求項5記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドの生産方法であって：
(a)請求項6記載の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階；および
(b)産生されたペプチドを単離する段階
を含む、方法。
【請求項８】
1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されており、該結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを含む組成物。
【請求項９】
少なくとも1つのペプチドが1つ以上の他のペプチドに結合されている、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記1つ以上の他のペプチドが少なくとも部分的にαへリックス二次構造を形成している、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
前記1つ以上の他のペプチドがプロアポトーシス性ペプチドである、請求項9または10記載の組成物。
【請求項１２】
請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の生産方法であって：
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを提供する段階；および
(b)該少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の内部移行挙動を検出する方法であって：
(a)該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および
(b)該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物を含み、かつ任意に、1種以上の薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１６】
癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療に使用するための、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物を対象に投与する段階を含む、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療の方法。
【請求項１８】
以下の少なくともいずれか1つを含むキット・オブ・パーツ(kit-of-parts)：
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド；
(b)請求項4記載の核酸分子；
(c)請求項5記載のベクター；
(d)請求項6記載の宿主細胞；および
(e)請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト細胞透過性ペプチド(CPP)の同定および機能解析、ならびにそれらの使用、特にトランスフェクション運搬体としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞の原形質膜は、能動的に輸送されないほとんどの分子の細胞への取り込みを防止する効果的なバリアに相当し、その結果、治療用の物質の標的化送達も妨げられる。特定の分子量、極性および/または正味の電荷をもつごく狭い範囲の分子のみが、細胞膜を通過して(受動的に)拡散することができる。その他のすべての分子は、例えば受容体を介したエンドサイトーシスによって、またはATP結合トランスポーター分子を介して、能動的に輸送されねばならない。さらに、例えばエレクトロポレーション、カチオン性脂質/リポソーム、マイクロインジェクション、ウイルス送達、またはポリマー内へのカプセル化の手段によって、人工的に分子が細胞膜を通過せざるを得ないようにすることもできる。しかし、こうした方法は主に疎水性分子を送達するために利用されている。さらに、これらの方法に伴う重大な副作用と、それらの適用可能性が主にインビトロでの用途に限られるという事実によって、それらは、医学的症状を予防または治療する目的で薬物または他の治療活性剤を細胞に送達するための効果的なツールになるのを妨げられてきた。
【０００３】
とりわけ、標的化送達の要件はまた、RNAi(RNA干渉)ベースの治療薬の開発において大きな課題となることが判明している。こうした薬剤は、疾患の原因となる遺伝子または疾患を促進する遺伝子の発現を妨げる、小さいRNA分子(例えば、siRNA、miRNAまたはshRNA)で構成されている。2001年(Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411, 494-498 (非特許文献1))にRNAiが哺乳動物細胞で実証された後、転写後遺伝子サイレンシングのこの配列特異的メカニズムは、これまで治療介入を利用できなかった疾患を治療するための有望な手段にもなり得る新しいクラスの医薬を開発するために活用できる可能性がある、とすぐに気付くことになった(De Fougerolles, A. et al. (2007) Nat. Rev. Drug Discov. 6, 443-453 (非特許文献2))。
【０００４】
しかしながら、RNAiはサイトゾルで起こるので、どのようなRNAベースの薬物も、その治療効果を発揮するためには、細胞膜を通過する必要がある。この目標を達成するために、これまでにいくつかの方法が記載されており、例えば、脂質(Schroeder, A. et al. (2010) J. Intern. Med. 267, 9-21 (非特許文献3))、ウイルス担体(Liu, Y.P. and Berkhout, B. (2009) Curr. Top. Med. Chem. 9, 1130-1143 (非特許文献4))、およびポリカチオン性ナノ粒子(Howard, K.A. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 710-720 (非特許文献5))などを用いる方法である。
【０００５】
細胞膜を通して分子を移行させる別の方法は、細胞透過性ペプチド(CPP)を用いることである(タンパク質導入ドメイン(PTD)または膜輸送配列(MTS)ともいう；例えば、Fonseca, S.B et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 953-964 (非特許文献6); Heitz, F. et al. (2009) Br. J. Pharmacol. 157, 195-206 (非特許文献7)に概説される)。
【０００６】
CPPは、それらの一次アミノ酸配列とそれらの構造の両面で、不均質なグループのペプチド分子である。CPPの代表的な例としては、HIV-1 TAT輸送ドメイン(Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188 (非特許文献8))およびショウジョウバエ由来のアンテナペディアタンパク質のホメオドメイン(Joliot, A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868 (非特許文献9))が挙げられる。その正確な輸送メカニズムはまだ論争中である。アンテナペディアタンパク質の変異研究によって、ペネトラチンまたはpAntp (Derossi, D. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (非特許文献10))と呼ばれる16アミノ酸の配列が膜輸送に必要かつ十分であることが明らかにされた。その後、他のタンパク質由来のCPP、例えばHIV-1 Tatタンパク質の塩基性配列が開発された(Vives, E. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017 (非特許文献11))。開発された合成ペプチドは両親媒性モデルペプチドMAPである(Oehlke, J. et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414, 127-139 (非特許文献12))。
【０００７】
アンチセンスDNAまたはペプチド核酸(PNA)のCPPへのカップリングは、インビボで所望の効果を発揮することが示された。しかし、CPPがその輸送機能を発揮するためにどのような特性が必要であるのか、まだ問題になっている。一般的に、異なるCPP間で配列および/または構造の類似性はほとんど見出されていない。これまでのところ、唯一一貫して存在する特性は、正の正味電荷をもたらす塩基性(正に荷電した)アミノ酸の含量がかなり高いことである。したがって、CPPは細胞膜の脂質またはタンパク質(プロテオグリカン)の負に荷電したヘッド基に最初に結合すると推測される。しかし、いったん結合すると、そのペプチドは膜結合コンパートメントの内側にまだ残っている。さらなる取り込みのメカニズムは、依然として論議の積み重ねが必要な問題である。CPPはER(そこでそれらは細胞内輸送機構に入る)に「逆行的に」輸送されること(Fischer, R. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 12625-12635 (非特許文献13))、またはそれらは膜を横切って直接移行すること(Rothbard, J.B. et al. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 495-504 (非特許文献14))が提起されている。内部移行のメカニズムに応じて、既知のCPPは主に核内に局在するか、またはそれらが小胞に内部移行される場合には、主にこれらの小胞内に残存し、そしてほんの一部が細胞質に放出されるにすぎない。
【０００８】
多くのCPPは適用された細胞に重大な副作用を及ぼすが、それは、CPPの由来となるタンパク質のほとんどが例えば抗菌物質または毒素として機能することを考えれば、当然とも言える。例えば、CPPは膜の破壊が原因で細胞質の漏れを引き起こすことがあり、また、膜タンパク質の正常な機能を妨げることもある。CPPはさらに、GTPアーゼ活性に影響を及ぼすトランスポータンのように、細胞毒性作用を示す可能性がある(Soomets, U. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1467, 165-176 (非特許文献15))。さらに、多くのCPPは、インビボ状況では満たすことができない、ある極めて特殊な条件下で、それらの機能を発揮するにすぎない、ことを示す証拠が急増している。もう一つの欠点は、標的細胞に応じて、CPPが細胞内で急速に分解され得る、ということである。最後に、多くの既知CPPは非ヒトタンパク質に由来するため、毒性および/または免疫原作用が絶えず観察されており、このことは、例えばヒトでの治療用途のために、これらのペプチドを利用することを妨げる可能性がある。
【０００９】
したがって、上記の制限を克服する改良された細胞透過性ペプチドの必要性が依然として残っている。特に、治療薬などの化合物の標的細胞への送達を、高効率で、しかし重大な細胞毒性および/または免疫原作用を与えることなく、可能にする適切なトランスフェクション小胞またはカーゴ(cargo)に相当する細胞透過性ペプチドが必要とされている。
【００１０】
さらに、そのようなCPPを含む組成物、ならびに診断および治療用途のための分子ツールとしてそうしたCPPを用いる方法も必要とされている。
【００１１】
したがって、そうしたCPPならびに対応する組成物および方法を提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411, 494-498
【非特許文献２】De Fougerolles, A. et al. (2007) Nat. Rev. Drug Discov. 6, 443-453
【非特許文献３】Schroeder, A. et al. (2010) J. Intern. Med. 267, 9-21
【非特許文献４】Liu, Y.P. and Berkhout, B. (2009) Curr. Top. Med. Chem. 9, 1130-1143
【非特許文献５】Howard, K.A. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 710-720
【非特許文献６】Fonseca, S.B et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 953-964
【非特許文献７】Heitz, F. et al. (2009) Br. J. Pharmacol. 157, 195-206
【非特許文献８】Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188
【非特許文献９】Joliot, A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868
【非特許文献１０】Derossi, D. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450
【非特許文献１１】Vives, E. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017
【非特許文献１２】Oehlke, J. et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1414, 127-139
【非特許文献１３】Fischer, R. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 12625-12635
【非特許文献１４】Rothbard, J.B. et al. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 495-504
【非特許文献１５】Soomets, U. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1467, 165-176
【発明の概要】
【００１３】
一局面において、本発明は、細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子に関し、ここにおいて、該ペプチド分子は、(a)少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸残基の長さを有し；(b)その一次アミノ酸配列中に少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％の正に荷電したアミノ酸残基を含み；かつ(c)アミノ酸配列
2013531988.tif 000003
を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の効率で細胞内に内部移行されるものである。
【００１４】
特定の態様において、前記ペプチドの少なくとも一部はαへリックスの二次構造を形成している。
【００１５】
好ましくは、前記ペプチドは哺乳動物、特に好ましくはヒトに由来するものである。
【００１６】
さらなる好ましい態様において、前記ペプチドは、
2013531988.tif 000004
およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
特に好ましい態様において、前記ペプチドは、
2013531988.tif 000005
およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した核酸分子を含むベクターに関する。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチドの生産方法に関し、その方法は、(a)本明細書中で先に定義した宿主細胞を適切な条件下で培養する段階；および(b)産生されたペプチドを単離する段階を含む。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されている本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドを含む組成物であって、前記結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成される、前記組成物に関する。
【００２３】
特定の態様において、前記組成物の少なくとも1つのペプチドは、1つ以上の他のペプチドに結合される。好ましくは、前記1つ以上の他のペプチドが、少なくとも部分的に、αへリックス二次構造を形成する。特定の態様では、前記1つ以上の他のペプチドがプロアポトーシス性(pro-apoptotic)ペプチドである。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した組成物の生産方法に関し、その方法は、(a)本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドを提供する段階；および(b)少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階を含む。
【００２５】
さらに他の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチドまたは本明細書中で先に定義した組成物の内部移行挙動を検出する方法に関し、その方法は、(a)該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および(b)該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階を含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドまたは本明細書中で先に定義した組成物を含有し、必要に応じて、1種以上の薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤をさらに含有する、薬学的組成物に関する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチドまたは本明細書中で先に定義した組成物を、1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのために使用することに関する。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療に使用するための、本明細書中で先に定義したペプチドまたは本明細書中で先に定義した組成物に関する。
【００２９】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドまたは本明細書中で先に定義した組成物を対象に投与することを含む、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療方法に関する。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、(a)本明細書中で先に定義したペプチド；(b)本明細書中で先に定義した核酸分子；(c)本明細書中で先に定義したベクター；(d)本明細書中で先に定義した宿主細胞；および(e)本明細書中で先に定義した組成物の少なくともいずれか1つを含む、キット・オブ・パーツ(kit-of-parts)に関する。
【００３１】
本発明の他の態様は、以後の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヒト細胞透過性ペプチドを同定するためのバイオインフォマティクス的アプローチ。適用されたスクリーニング手順の概略図を示す。SwissProtデータベースのすべてのヒトエントリが、記述および遺伝子オントロジー(GO)アノテーションとともに含まれ(A)、30アミノ酸残基のスライディングウィンドウを用いて分析された(B)。推定上の細胞透過性ペプチド(CPP)を同定するために、バイオインフォマティクスフィルタが適用された(C)：最初に、10以上の正電荷をもつペプチドのみを選択した；第二に、免疫原性の可能性が低い細胞外タンパク質のみを選択した(「ステップ2および3」)。ペプチドの数を絞り込むために、いくつかのアプローチが選択された：最高の等電点(IEP)と最高の疎水性との交点、HIV由来のTATペプチド配列に対する配列類似性、ならびに文献およびBLAST結果の慎重な解析。
【図２】500のランダムペプチドの疎水性対IEPのプロット。10.5×106個のヒト30merの全体からランダムに選択された500のペプチドを、それらのIEPに対する疎水性についてプロットした。対照ペプチドとしてTAT、poly-Arg、REV、プロタミンおよびINF7(白四角)を加えた。無毒性かつ非トランスフェクションペプチドは黒色の点として、毒性のトランスフェクションペプチドは青色の点として、毒性のペプチドは赤色の点として、無毒性のトランスフェクションペプチドは緑色の点として描かれる。
【図３】解析された全ペプチドの毒性対トランスフェクション能力のプロット。siRNAをトランスフェクトする能力および細胞毒性について解析されたすべてのペプチドは、Aha1 siRNAおよびルシフェラーゼsiRNAの各20μMでの平均GAPDH mRNAレベル(y軸、「毒性」)についてプロットし、同時に各20μMでのルシフェラーゼsiRNAに対するAha1/GAPDHとAha1 siRNAに対するAha1/GAPDHのそれぞれの差異(x軸、「トランスフェクション」)についてプロットした。毒性(70％平均GAPDH mRNA含量)およびトランスフェクション(＞TAT、18％)の閾値は赤い点線で示される。これらの点線は4つの象限をもたらす：左上：無毒性の非トランスフェクションペプチド；右上：無毒性のトランスフェクションペプチド；左下：毒性ペプチド；右下：毒性のトランスフェクションペプチド。挿入ボックスはプロット領域の範囲外の毒性ペプチドを示す。
【図４】ペプチドWNT16の解析。WNT16は、無毒性で、トランスフェクション能力がない(すなわち、非トランスフェクション)ペプチドの例である。実験的アプローチは図3と同じであった。用量依存的効果を示すために、1μMで得られたmRNA値を100％に設定した。生存率は培地対照に対するパーセントとして表される。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図５】ペプチドBPIL3およびFALLの解析。BPIL3は、毒性で、トランスフェクション能力がないペプチドの例である。実験的アプローチは図3と同じであった。(A) Aha1とGAPDHのレベルは同様の挙動を示すものの、GAPDHがより高い感受性を示すことに注目されたい。これによってAha1/GAPDH値の増加が説明される。毒性によってマスクされるトランスフェクション効率を有する毒性ペプチドの潜在的な治療ウィンドウを示すために、同じ解析をFALL(B)で行った。用量依存的効果を解明するために、1μMで得られた両ペプチド(A、B)のmRNA値を100％に設定した。両ペプチド(A、B)の生存率は培地対照に対するパーセントとして表される。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図６】ペプチドCU025の解析。CU025は、毒性で、トランスフェクション能力があるペプチドの例である。実験的アプローチは図3と同じであった。用量依存的効果を示すために、1μMで得られたmRNA値を100％に設定した。生存率は培地対照に対するパーセントとして表される。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図７】無毒性で、トランスフェクション能力があるペプチドの解析。CPXM2、ASM3B、およびNRTNは、無毒性で、トランスフェクション能力があるペプチドの例である。実験的アプローチは図3と同じであった。対照として、TATおよびPoly-ArgについてのAha1/GAPDH比を測定した(A)。CPXM2(B)とASM3B(C)の両方は、GAPDH mRNAに比してAha1 mRNAの濃度依存的減少を示し、その間細胞生存率の有意な妨害を示さない。NRTN(D)の詳細な解析は、細胞生存率に対する有意な用量依存的効果なしに、GAPDH mRNAに比してAha1 mRNAの強い減少をもたらす。(A、B、C、D)すべての場合に、用量依存的効果を示すために、1μMで得られたmRNA値を100％に設定した。生存率は培地対照に対するパーセントとして表される。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図８】選択されたペプチドのゲルシフト分析。ペプチドTAT(A)、NRTN(B)、およびWNT16(D)のそれぞれの複合体形成を示すために、500μgのsiRNA二重鎖を、示したペプチドのモル比で1時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色を用いて分析した。この分析は、siRNAと、それぞれTAT、NRTNおよびWNT16との複合体形成を示す。エチジウムブロマイドへのsiRNAの接近可能性に対するNRTNの影響を示すために、複合体をプロテイナーゼKの存在下および非存在下でインキュベートした(C)。
【図９】NRTN媒介トランスフェクションは細胞の表現型を生じさせるのに十分である。NRTNのsiRNA配列特異性は、ヒトEg5 mRNAを標的とするsiRNA二重鎖をトランスフェクトするペプチドの能力を解析することによって検討した。Eg5ノックダウン依存性のアポトーシス誘導はCytoTox-Glo細胞毒性アッセイ(Promega社)を行うことによって確認した。用量依存的効果を示すために、1μMで得られたmRNA値を100％に設定した。アポトーシスの誘導は培地対照に対するパーセントとして表される。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図１０】GDNFとNRTNの配列アライメント。ラットGDNFとヒトNRTNのアミノ酸配列アライメントはそれらの関係を示している。同一のアミノ酸は白の背景に薄いグレーで、類似したアミノ酸は薄いグレーの背景に黒で、そして異なるアミノ酸は白の背景に黒で示される。ラットGDNFのαへリックスストレッチが示される。使用したNRTNペプチドはボックスで囲ってある。
【図１１】NTRNはαへリックス構造要素を有する。FALL(A)、NRTN(B)、およびTAT(C)ペプチドのUV CD分光分析。スペクトルは、それぞれ10％、25％、および50％トリフルオロエタノール(TFE)の存在下または非存在下(「H2O」)で0.1mg/mlのペプチドを用いて、データピッチ0.1nmおよびバンド幅1nmで195nmから260nmまで測定した。
【図１２】NRTN、TATおよびFALLは細胞透過性ペプチドとして機能する。N末端FITC標識を含むTAT(A)、WNT16(B)、FALL(C)、およびNRTN(D)ペプチドのFACS解析。細胞をペプチドの存在下で3時間インキュベートし、プロテイナーゼKで30分処理し、FITCチャネル内の内部移行ペプチドをFACSによって解析した。黒い線は1μMでのシグナルを示し、薄いグレーは5μMでのシグナルを示し、濃いグレーの線は10μMでのシグナルを示す。
【図１３】NRTNは血清条件下で活性を示す。トランスフェクション媒体中で血清の非存在下(A)および存在下(B)にsiRNA二重鎖をトランスフェクトする能力についてNRTNを分析した。実験的アプローチは図3と同じであった。アッセイは、10％FCSを含む通常のRPMI 1640増殖培地中で実施するか(B)、またはOptiMEM血清使用量低減培地中で3時間、続いてその培地を通常の増殖培地に戻すことによって実施した(A)。用量依存的効果を示すために、1μMで得られたmRNA値を100％に設定した。Aha1 siRNAは黒四角として示される；ルシフェラーゼsiRNAは白丸として示される。
【図１４】ヒト脳内皮細胞へのNRTNの取り込み。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲート化NRTNペプチド(それぞれN末端およびC末端コンジュゲーション)をhCMEC/D3脳内皮細胞と共に5μMで37℃にて1時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄して固定した。蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影した。どちらの場合にも、ペプチドは細胞内エンドソーム構造に局在する。
【図１５】プロアポトーシス性Nur77ペプチドの細胞へのNRTN媒介取り込み。MCF-7ヒト乳癌細胞をさまざまな濃度のNRTN(四角)、Nur(丸)、およびNurNRTN(三角)ペプチドの存在下で24時間インキュベートした。それぞれのアミノ酸配列を下部パネルに示す。細胞生存率(その結果として、アポトーシスの誘導)を評価するための実験的アプローチは図3と同じであった。
【図１６】プロアポトーシス性4E-BP1ペプチドの細胞へのNRTN媒介取り込み。MCF-7ヒト乳癌細胞をさまざまな濃度の4E-BP1(丸)、TAT4E-BP1(四角)、およびNRTN4E-BP1(三角)ペプチドの存在下で24時間インキュベートした(上部パネル)。2つの融合ペプチド(実線)のそれぞれの効果を、それらの不活性変異体(TATinact4E-BP1およびNRTNinact4E-BP1；点線)とさらに比較した(中間パネル)。それぞれのアミノ酸配列を下部パネルに示す。細胞生存率(その結果として、アポトーシスの誘導)を評価するための実験的アプローチは図3と同じであった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、バイオインフォマティクス的スクリーニングと候補ペプチドのその後の実験的評価を組み合わせることによって、以前の「ゴールドスタンダード」基準ペプチドTATに比べて、優れた機能性プロファイル、特に、高い全体的なトランスフェクション効率、血清の存在下での高いトランスフェクション活性、ならびに低度の細胞毒性を示す、いくつかのCPPを同定することができた、という予期せざる知見に基づいている。驚くべきことに、これらのCPPはその一次アミノ酸配列に関していかなる有意な類似性も示さない。かくして、これらのペプチドは治療的介入のための新しい強力な送達剤の開発におけるモジュールとして役立つ可能性がある。
【００３４】
以下で例示的に説明される本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない要素、限定の非存在下で、適切に実施することが可能である。
【００３５】
用語「含む」が本明細書および特許請求の範囲で用いられるとき、それは他の要素またはステップを排除するものではない。本発明において、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい態様であると考えられる。以後、ある群が少なくとも一定数の態様を含むように定義される場合、それはまた、これらの態様のみから好ましくはなる群を開示していると理解されるべきである。
【００３６】
単数形の名詞に言及する際に不定冠詞または定冠詞、例えば「a」、「an」または「the」が用いられる場合、特に断りのない限り、これはその名詞の複数形を含むものである。
【００３７】
本発明との関連で数値が示される場合、当業者は、問題になっている構成の技術的効果が、与えられた数値の±10％、好ましくは±5％の偏差を一般に包含する、精度の区間内で確保されることを理解するであろう。
【００３８】
さらに、本明細書および特許請求の範囲中の第1、第2、第3、(a)、(b)、(c)などの用語は、類似の要素同士を区別するために用いられ、必ずしも逐次的または時間的な順序を記述するために用いられるものではない。そのような用語は適切な状況下で交換可能であり、また、本明細書に記載した本発明の態様は本明細書で説明または例示した順序以外の順序で操作が可能であることを理解すべきである。
【００３９】
用語のさらなる定義は、その用語が用いられる文脈において以下で与えられる。以下の用語または定義は単に本発明の理解を助けるために提供される。これらの定義は、当業者が理解している範囲よりも狭いと解釈されるべきではない。
【００４０】
第1の局面において、本発明は、細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子に関し、ここにおいて、該ペプチド分子は、
(a)少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸残基の長さを有し；
(b)その一次アミノ酸配列中に少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％の正に荷電したアミノ酸残基を含み；そして
(c)アミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1)を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の効率で細胞内に内部移行される。
【００４１】
本明細書中で用いる用語「ペプチド分子」(本明細書では「ペプチド」ともいう)は、複数の天然のまたは修飾されたアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されている、天然に存在するまたは合成の(例えば、化学合成もしくは組換えDNA技術により生成された)直鎖状の巨大分子を指す。そうしたペプチドは、少なくとも2つの同一のまたは異なるペプチド分子からなるオリゴマーを形成することができる。
【００４２】
本発明のペプチドは、少なくとも10アミノ酸残基(例えば、10、11、12、13または14アミノ酸残基)の長さを有し、好ましくは、少なくとも15アミノ酸残基の、少なくとも20アミノ酸残基の、少なくとも25アミノ酸残基の、少なくとも30アミノ酸残基の、少なくとも35アミノ酸残基の、少なくとも40アミノ酸残基の、または少なくとも45アミノ酸残基の長さを有する。特定の態様では、本発明のペプチドは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、43、44または45アミノ酸残基の長さを有する。
【００４３】
本明細書中で用いる用語「天然のアミノ酸残基」とは、自然界でペプチドに組み込まれている22種類の「標準」アミノ酸のいずれかを意味する。これら22種類のうち、20は普遍的遺伝子暗号によって直接コードされる。残りの2つ、セレノシステインとピロリシンは、ユニークな合成機構によってタンパク質に組み込まれる。一般的に、本発明によるペプチドのアミノ酸残基はL-異性体として存在する。いくつかの態様では、本発明によるペプチドの1個以上のアミノ酸残基はD-異性体として存在する。本明細書中で用いる「修飾されたアミノ酸残基」とは、翻訳後修飾されたアミノ酸のような非標準アミノ酸を意味する。翻訳後修飾の例としては、特に、リン酸化、グリコシル化、アシル化(例えば、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化)、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化、ビオチン化、ユビキチン化、化学的性質の変化(例えば、β脱離、脱イミド、脱アミド）、および構造的変化(例えば、ジスルフィド橋の形成)が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で定義されるペプチドのアミノ酸配列は、一般的な規則に従って、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端へと記載される。しかし、対応する「リバース」ペプチドもまた、本発明の範囲内である。本明細書中で用いる用語「リバースペプチド」とは、その「通常の」カウンターパートと同じ配列を有するが、逆方向、すなわちC末端からN末端の方向にあるペプチドを表す。例えば、「通常の」TATペプチドはアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQをもつ。対応する「リバース」TATペプチドはアミノ酸配列QPPRRRQRRKKRGをもつ。
【００４５】
本発明のペプチドは、それぞれの一次アミノ酸配列中に(すなわち、その全長にわたり)少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％の正に荷電したアミノ酸残基を有する。本明細書中で用いる用語「正に荷電したアミノ酸」(本明細書中では「塩基性アミノ酸」ともいう)は、特定のペプチド中に存在するリシン(K)、ヒスチジン(H)およびアルギニン(R)残基の全体を表す。特定の態様では、本発明のペプチドは、その一次アミノ酸配列中に25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％または35％の正に荷電したアミノ酸残基を含む。他の態様では、本発明のペプチドは、それぞれの一次アミノ酸配列中に少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、または少なくとも60％の正に荷電したアミノ酸残基を含む。
【００４６】
本明細書中で用いる用語「細胞内に内部移行する能力がある」とは、細胞膜(特に、外側の「境界」細胞膜(一般的には「原形質膜」ともいう)、エンドソーム膜、および小胞体の膜を含む)を通過するペプチドの能力、および/または所定の薬剤またはカーゴにこれらの細胞膜を通過させるペプチドの能力を指す。そのような細胞膜通過は本明細書では「細胞透過」とも呼ばれる。それに応じて、前記細胞膜を通過する能力があるペプチドは本明細書では「細胞透過性ペプチド」と呼ばれる。本発明においては、あらゆる可能な内部移行機構が想定され、例えば、エネルギー依存性(すなわち、能動)輸送機構(例えば、エンドサイトーシス)とエネルギー非依存性(すなわち、受動)輸送機構(例えば、拡散)の両方が含まれる。本明細書中で用いる用語「内部移行」は、原形質膜を通過したペプチドの少なくとも一部の(小胞、エンドソームなどの異なる細胞コンパートメントへの、または核内への局在とは対照的に)細胞質への局在を含むものとして理解されるべきである。特定の態様において、用いた所定の輸送機構は、内部移行されたペプチドまたは組成物の少なくとも0.01％、少なくとも0.05％、少なくとも0.1％、少なくとも0.5％、少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも5％、または少なくとも10％が細胞質に局在することを保証する。
【００４７】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列
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(SEQ ID NO: 1；Vives, E. et al. (1997), 前掲も参照のこと)を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の効率で細胞内に内部移行される。言い換えれば、ペプチドの機能的活性は基準ペプチド(TATは細胞透過性ペプチドに関して「ゴールドスタンダード」に相当する)と比較して特徴づけられる。特定の態様では、本発明のペプチドは、TATペプチドの内部移行効率の80％、85％、90％または95％の効率で内部移行される。特定の好ましい態様では、本発明のペプチドは、TATペプチドと少なくとも同じ効率(すなわち、100％)で内部移行される。特に好ましくは、本発明のペプチドは、TATペプチドより高い効率(すなわち、100％超または少なくとも101％)で、例えば、TATペプチドの内部移行効率の105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、または200％で内部移行される。
【００４８】
本明細書中で用いる用語「内部移行効率」とは、広い意味で理解されるべきである。この用語は、本発明のペプチドが細胞の原形質膜を通過する程度(すなわち、内部移行挙動それ自体)を指すだけでなく、ペプチドが所定の薬剤またはカーゴに細胞の原形質膜を通過させる効率(すなわち、そのトランスフェクション能力；本明細書では「トランスフェクティビティ」(transfectivity)ともいう)を指す。所定のペプチドの内部移行挙動および/またはトランスフェクション能力を判定する方法が当技術分野では数多く確立されており、例えば、ペプチド(および/またはトランスフェクトされるカーゴ)に検出可能な標識(例えば、蛍光色素)を結合させることによる方法、またはペプチドをレポーター分子に融合させる方法などがあり、したがって、いったんペプチドの細胞内取り込みが起こったら、例えばFACS解析を用いてまたは特異的抗体を介して、検出が可能になる(例えば、Ausubel, F.M. et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USAを参照されたい)。当業者はまた、そのような方法で用いられるペプチドの、該当する場合はカーゴの、それぞれの濃度範囲を選択する方法を十分に把握している。こうした濃度範囲はペプチドの性質、カーゴの大きさ、用いる細胞型などに左右される。
【００４９】
さらなる態様において、本発明のペプチドは、内部移行された後で、それぞれの標的細胞に有意な細胞毒性および/または免疫原作用を及ぼすことがなく、すなわち、それらは(少なくとも細胞のトランスフェクションおよび/または透過を媒介するのに十分な濃度で)細胞の生存を妨げることがない。本明細書中で用いる用語「有意でない」とは、標的細胞の50％未満、好ましくは40％または30％未満、特に20％または10％未満が本発明のペプチドの内部移行後に死滅することである、と理解されるべきである。他の態様では、細胞への内部移行後に本発明のペプチドが及ぼす細胞毒性(および/または免疫原性)の作用は、アミノ酸配列
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を有するTATペプチドが及ぼす対応する作用と同じまたはより低いものである。特定の態様では、細胞への内部移行後に本発明のペプチドが及ぼす細胞毒性(および/または免疫原性)の作用は、TATペプチドが及ぼす作用の95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、または10％未満である。当業者は、所定の化合物の細胞毒性および/またはそうした化合物が適用される所定の標的細胞の生存率を測定する方法について熟知している(例えば、Ausubel, F.M. et al. (2001), 前掲をも参照されたい)。対応するアッセイキットはさまざまな供給業者から市販されている。
【００５０】
特定の態様において、本発明のペプチドの潜在的な固有の細胞毒性および/または免疫原作用は、例えば化学合成または組換えDNA技術を用いて、ペプチドに1つ以上の修飾を導入することによって「マスク」することができる。そのような修飾は、例えば、官能基の付加、除去もしくは置換、またはそうした官能基の位置の変化に関するものであり得る。当業者は、所定のペプチドのそのような「マスキング」をどのように達成すればよいのか、よく承知している。
【００５１】
さらなる態様において、本発明のペプチド分子は、少なくとも1つの構造化されたドメイン、すなわち、直鎖状配列で互いに近接して配置されたアミノ酸残基の特定の空間的配置である、安定した二次構造を形成している(つまり、折りたたまれている)要素を含む。多くの場合、アミノ酸残基間の立体的関係は一般的なものであって、αへリックス(棒状の堅固なコイル構造)およびβ鎖(伸びきった状態のストレッチ、その際、複数のそうしたストレッチが必要に応じて平行または逆平行のβシートを形成する)などの当技術分野でよく知られた周期的構造を生じさせる。本発明の範囲内で、ペプチド分子は、非構造化部分に取り囲まれた1つのそのような構造化ドメインを含んでもよいし、あるいは互いに分離された2つ以上のそうした構造化ドメイン(同じタイプまたは異なるタイプのもの、例えば2つのαへリックスまたは1つのαへリックスと1つのβ鎖)を含んでもよい。いくつかの態様では、ペプチド分子がその全長にわたって二次構造を形成している(すなわち、非構造化領域を含まない)。
【００５２】
好ましい態様において、本明細書で定義したペプチド分子の少なくとも一部は、αへリックス二次構造を形成する。αへリックス要素は少なくとも4または6個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも8または10個のアミノ酸残基を含むことができる。特定の態様では、本発明のペプチド分子は唯一の二次構造として単一のαへリックス要素を含む。
【００５３】
好ましい態様において、本発明のペプチド分子は哺乳動物由来のものであり、すなわち、それらはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマまたはサルなどの生物に由来する。特に好ましくは、ペプチド分子はヒト由来のものであり、すなわち、それらはヒト配列に由来するか、またはヒト配列に相当する。本明細書中で用いる用語「ヒト配列に由来する」とは、天然に存在するヒト配列に比較して、マイナーな修飾(例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換)を保有するヒト由来の配列を意味する。本明細書中で用いる用語「ヒト配列に相当する」とは、天然に存在するヒト配列と同一である(すなわち、配列変化または修飾がない)配列を意味する。
【００５４】
さらなる好ましい態様において、本発明のペプチド分子は、
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(FALL39 Var.1ペプチド(FALLペプチドともいう)；SEQ ID NO: 10)；および
SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
特に好ましい態様において、ペプチドはSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５６】
本明細書中で用いる用語「配列同一性パーセント(％)」とは、テンプレートアミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較したときの、2つ以上のアライメントしたアミノ酸配列の同一アミノ酸のマッチ数を表す。言い換えれば、2つ以上の配列または部分配列(すなわち、それに由来する断片またはトランケーション)に対してアライメントを用いる場合、同一であるアミノ酸残基のパーセントは、比較ウィンドウにわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて測定される指定領域にわたって、(部分)配列を比較して、最大の一致のためにアライメントする場合、あるいは(部分)配列を手動でアライメントして目視により検査する場合に、決定することができる。かくして、上記の定義は、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10の全長配列のみならず、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれかに含まれる少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸配列の任意のトランケーションにも適用される。
【００５７】
2つのタンパク質配列間の同一性レベルを評価するために、当技術分野で知られている適当なコンピュータプログラムを用いて、それらをコンピュータ上でアライメントすることができる。そのようなプログラムとして、特にBLAST (Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410)、FASTA (Lipman, D.J. and Pearson, W.R. (1985) Science 227, 1435-1441)、またはSmith- Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. and Waterman, M.S. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197)の実行が挙げられる。これらのプログラムは、ペアワイズ配列アライメントを提供することに加えて、さらに配列同一性レベル(通常は同一性パーセント)および偶然によるそのアライメントの発生の確率(P値)をも報告する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとしてワード長(W)3および期待値(E)10を使用する。BLOSUM62スコア行列(Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)は、アライメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=4、および両鎖の比較を用いる。CLUSTALW (Higgins, D. et al. (1994) Nucl. Acids Res. 2, 4673-4680)のようなコンピュータプログラムは、3つ以上の配列をアライメントするために用いることができる。さらに、CLUSTALWではその同一性の計算において配列ギャップが考慮される。
【００５８】
アミノ酸配列が、その全長にわたり、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性を有する限り、それは本発明の態様の範囲内である。存在するアミノ酸変化のタイプ(例えば、1個以上のアミノ酸残基の末端付加、挿入、欠失、および置換、またはそれらの組み合わせ)は無関係である。特定の態様では、「アミノ酸配列誘導体」は、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれか1つに対して少なくとも70％、少なくとも72％、少なくとも74％、少なくとも76％、または少なくとも78％の全体的な配列同一性を有する。好ましくは、「アミノ酸配列誘導体」は、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 10のいずれか1つに対して少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の全体的な配列同一性を有する。
【００５９】
第2の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチド分子をコードする核酸分子に関する。
【００６０】
本明細書中で用いる用語「核酸分子」は、本発明のペプチドをコードする任意の核酸を表す。そのような核酸分子の例には、天然に存在する核酸、例えばデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、ならびに化学合成されるかまたは組換え遺伝子技術を用いて作製される人工的に設計された核酸、例えば核酸アナログ、特にペプチド核酸(PNA)またはロックド核酸(LNA)が含まれる(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), Molecular cloning: A laboratory manual (第3版) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい)。天然に存在する核酸の具体的な例としては、DNA配列、例えばゲノムDNAもしくはcDNA分子、ならびにRNA配列、例えばhnRNA、mRNAもしくはrRNA分子、またはそれらの逆相補的核酸配列が挙げられる。そうした核酸は任意の長さのものであってよく、一本鎖または二本鎖分子のどちらでもよい。一般的に、本発明の標的核酸は長さが30〜5,000ヌクレオチド、例えば30〜3,000ヌクレオチド、45〜2,000ヌクレオチド、60〜1,000ヌクレオチド、または75〜500ヌクレオチドである。本明細書中で用いる用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方(すなわち、RNAおよびDNA分子)を指すと理解すべきである。
【００６１】
好ましくは、本発明の核酸分子は、その発現を可能にする遺伝子構築物(一般的に「発現カセット」とも表記される)の不可欠な部分として存在する。遺伝子構築物は、それが転写および/または翻訳調節に関する情報を含む配列要素を含む場合に、そしてそのような配列がペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結」されている場合に、「核酸分子を発現する能力がある」、または「核酸(すなわち、ヌクレオチド)配列の発現を可能にする」ことができる、と称される。機能的な連結とは、調節配列要素と発現される配列(および/または互いに発現される複数の配列)とが遺伝子発現を可能にする方法で接続されている結合のことである。
【００６２】
遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種間で異なることがあるが、一般には、これらの領域はプロモーターを含み、そのプロモーターは、原核生物では、プロモーターそれ自体、すなわち転写の開始を指令するDNA要素、ならびにRNAに転写されたとき翻訳開始のシグナルを出すDNA要素の両方を含む。そのようなプロモーター領域には通常、転写と翻訳に関与する5'非コード配列、例えば、原核生物では-35/-10ボックスおよびShine-Dalgarno要素、または真核生物ではTATAボックス、CAAT配列および5'キャップ形成要素が含まれる。これらの領域はまた、エンハンサーまたはリプレッサー要素、ならびに天然のポリペプチドを宿主細胞の特定のコンパートメントに標的化するための翻訳されるシグナルおよびリーダー配列を含むことができる。適当な原核生物プロモーターとしては、特に大腸菌(E. coli)のlacUV5、trp、tetおよびtacプロモーター、ならびにT7ファージプロモーターが挙げられる。適当な真核生物プロモーターとしては、特にSV40初期および後期プロモーター、RSVおよびCMVプロモーター、ならびに酵母AOX1およびGAL1プロモーターが挙げられる。さらに、3'非コード配列は転写終結、ポリアデニル化などに関与する調節要素を含むことができる。しかし、これらの終結配列が特定の宿主細胞内で十分に機能しない場合には、それらをその細胞内で機能するシグナルと置き換えることができる。当業者はこれらすべての調節要素に精通しており、所定の状況下で核酸分子を発現させるのに適したそのような要素の選択は当業者の常識の範囲内である。
【００６３】
本発明の核酸分子は、必要に応じて発現カセットの一部として、ベクターまたは他のクローニング用運搬体内に含まれていてもよい。したがって、さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００６４】
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージ、人工染色体、または遺伝子工学で一般的に用いられる他の運搬体であり得る。好ましくは、ベクターは本発明の核酸分子の発現を指令することができる発現ベクターである。そうした発現ベクターは、上記の調節配列および発現される核酸配列を別として、少なくとも1つの複製起点、および発現のために用いる宿主と適合しうる種に由来する制御配列、ならびにトランスフェクトされた細胞に選択可能な表現型を付与する1つ以上の選択マーカーを含むことができる。2つ以上の複製起点を含む、特別に設計されたベクター(すなわち、シャトルベクター)は、細菌と真菌細胞間または細菌と動物細胞間など、異なる宿主間でDNA分子の移し変えが可能である。原核細胞に適した複製起点には、例えば、ColE1およびM13が含まれる。哺乳動物ベクター内の代表的な複製起点はSV40である。適切な原核細胞用の選択マーカーとしては、特にカナマイシン、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。真核細胞では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびグルタミンシンターゼ遺伝子が、使用される代表的な選択マーカーに相当する。組換えベクターを設計および/または変更するために使用できる方法は当技術分野で確立されている(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。
【００６５】
適切なベクターが数多く市販されており、当業者には周知である。さらに、当業者であれば、所定の状況下で関心対象の核酸分子を発現させるためにどのベクターが適しているかを判別することができる。そうしたベクターの例としては、とりわけ、原核生物用のベクター、例えばpUCシリーズ、pBluescript、pETシリーズ、pCRTOPO、λgt11、pBBR1-MCSシリーズ、およびpBC2、ならびに哺乳動物細胞での発現に適合しうるベクター、例えばpCEP4、pXT1、pSG5、pRSVneo、pSV2-dhfr、pcDNA3、pSIR、およびpIRES-EGFPが挙げられる。ピキア・パストリス(Pichia pastoris)での遺伝子発現に適するプラスミドベクターの例としては、特にpAO815、pPIC9K、およびpPIC3.5Kが挙げられる。
【００６６】
あるいは、本明細書中で定義した本発明の核酸分子はまた、別の核酸分子との翻訳融合体をもたらすようなベクター内に挿入することもできる。その別の核酸分子は、例えば、本発明のペプチドの溶解性を高めるおよび/または精製を容易にするペプチドもしくはタンパク質をコードし得る。そのようなベクターの例としては、pET32、pET41、およびpET43が挙げられる。
【００６７】
別の局面において、本発明は、本明細書で先に定義したベクターを含む宿主細胞に関する。
【００６８】
核酸ベクターの宿主細胞への導入は、さまざまな形質転換、形質導入またはトランスフェクション法の手段によって達成することができ、それらのすべてが当技術分野で確立されている(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。
【００６９】
本発明の範囲内で、導入されたベクターは、独立した遺伝単位として宿主細胞内で増やして維持することができるか、またはそれは遺伝子組換えを介して宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。そうした組換えは非相同組換えによってゲノムのランダムな位置で、または相同組換えによってゲノムの特定の位置で、または部位特異的インテグラーゼを介して起こり得る。
【００７０】
本発明の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよいが、後者の細胞が好適である。適切な原核宿主細胞には、特に大腸菌(E. coli) (例えば、BL21、DH5α、XL-1-Blue、JM105、JM110、およびRosetta(登録商標))、枯草菌(Bacillus subtilis)、サルモネラ属(Salmonella)菌種、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)が含まれる。適切な真核宿主細胞には、特に酵母(例えば、ピキア・パストリスおよびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫細胞(例えば、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaaster)S2細胞およびヨトウガ(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞)、および植物細胞が含まれる。好ましくは、本発明で用いる真核宿主細胞は哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。
【００７１】
適切な哺乳動物細胞としては、特に不死化細胞株、例えばヒトHela、HEK293、H9、MCF7、およびJurkat細胞、マウスNIH3T3、C127、およびL細胞、サルCOS1およびCOS7細胞、ウズラQC1-3細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。これらすべての宿主細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection; Manassas, VA, 米国)またはドイツ微生物培養細胞コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; Braunschweig, ドイツ)などの寄託機関に加えて、さまざまな商業的供給業者からも入手することができる。また、初代哺乳動物細胞、すなわち(特に胚盤胞、胚、幼生期、成体を含む任意の発達段階の)生物から直接得られた細胞は、本発明の範囲内である。適切な初代細胞の例には、心筋細胞、初代肝細胞、線維芽細胞、神経細胞、ならびに幹細胞が含まれる。初代細胞に由来する安定した不死化細胞株も本発明の範囲内である。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は多細胞生物の一部を構成している。言い換えれば、本発明はまた、本明細書で定義した少なくとも1つの宿主細胞を含むトランスジェニック生物に関する。好ましくは、トランスジェニック生物は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、サルまたはヒトである。
【００７３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書で定義したペプチドの生産方法に関し、その方法は、
(a)本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階；および
(b)産生されたペプチドを単離する段階
を含む。
【００７４】
多くの適切な方法がペプチドを適切な宿主細胞内で産生させるために利用可能である。原核細胞または哺乳動物細胞株などの単細胞宿主を用いる場合、当業者はさまざまな培養条件に戻すことができる。好都合なことに、産生されたペプチドは培養培地、培養細胞の溶解物もしくは抽出物から、または単離された(生体)膜から、確立された手法により収穫される(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。宿主細胞が多細胞生物の一部である場合には、これらの細胞の部分が本発明のペプチドを単離するための供給源となり得る。
【００７５】
上記の宿主細胞に適した培養培地および条件は当技術分野で周知である。例えば、細菌培養に適した条件では、ルリア-ベルターニ(LB)培地で通気下に細菌を増殖させる必要がある。発現産物の収量および溶解性を高めるためには、培地を緩衝化したり、当技術分野で公知の適当な添加剤(例えば、シャペロン、低頻度コドンtRNA、補欠分子族、補因子、金属イオンなど)を培地に補充したりすることができる。一般的に、大腸菌は4〜37℃で培養されるが、正確な温度または一連の温度は発現される分子によって決まる。一般に、当業者はまた、こうした条件を宿主の要求と発現されるペプチドまたはタンパク質の要件に適応させねばならないことも分かっている。宿主細胞内での関心対象の核酸分子の発現を調節するために誘導性発現系(例えば、テトラサイクリン誘導性Tet-On/Tet-Off系またはエクジソン誘導系)が用いられる場合は、適切な誘導剤の添加によって発現を引き出すことができる。
【００７６】
使用する特定の細胞型およびその特定の増殖要件に応じて、哺乳動物細胞の培養は、例えば、10％(v/v)FCS(ウシ胎児血清)、2mM L-グルタミン、および100U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地またはDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)で行うことができる。あるいはまた、血清濃度を低減させた増殖培地、例えばOptiMEMを使用してもよい。細胞は5％CO2の水飽和雰囲気下に37℃でインキュベートすることが可能である。
【００７７】
昆虫細胞の培養に適した培地には、特に10％FCSを添加したTNM、またはSF900培地が含まれる。昆虫細胞は通常、27℃で付着培養または懸濁培養として増殖させる。
【００７８】
原核細胞と真核細胞の両方に適した発現プロトコルは当技術分野で周知である(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。それぞれのアッセイ系、キットおよび試薬はさまざまな供給業者から市販されている。
【００７９】
本発明のペプチド分子を生産するための代替方法には、mRNAのインビトロ翻訳が含まれる。適当な無細胞インビトロ翻訳システムとしては、とりわけ、ウサギ網状赤血球溶血液、コムギ胚芽抽出液、イヌ膵臓ミクロソーム液、大腸菌S30抽出液、ならびに連続した転写/翻訳システムが挙げられる。対応するアッセイ系はさまざまな供給業者から市販されている。
【００８０】
産生されたペプチドの単離方法は当技術分野で周知であり、とりわけ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、(サイズ排除クロマトグラフィー)、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、ディスクゲル電気泳動、および免疫沈降が挙げられる(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。
【００８１】
別の局面において、本発明は、少なくとも1つの他の成分(本明細書では「カーゴ」ともいう)に結合されている、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドを含む組成物(本明細書では「複合体」ともいう)に関し、前記の少なくとも1つの他の成分は好ましくは1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つであり、ここにおいて、前記結合は共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成される。
【００８２】
本明細書中で用いる用語「結合」とは、その最も広い意味で理解されるべきであり、すなわち、それは2つ以上の化合物間の分子間相互作用の任意のタイプを指す。用語「共有結合」は、得られる分子を結び付ける相互引力を生じさせる、2つの成分間の1対以上の電子の共有によって特徴づけられる化学結合の分子内形態を指す。用語「非共有結合」は、分子同士または分子の部分同士を通常は特定の方向または配置で結び付けるための力を提供する分子間または分子の部分間の、天然では共有結合性でない、さまざまな相互作用を指す。そのような非共有結合相互作用には、特にイオン結合、疎水相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、および双極子双極子結合が含まれる。共有結合の場合には、本発明のペプチドは少なくとも1つの他の成分に直接連結させるか、または本発明のペプチドと少なくとも1つの他の成分を物理的に分離する(その結果、どちらの成分も他方への接近のためにその機能が制限されないことを保証する)のに役立つリンカー分子を介して連結させることができる。少なくとも1つの他の成分に応じて、リンカーは、例えばペプチド結合、アミノ酸、適切な長さのペプチド、または所望の機能を提供する異なる分子であり得る。特定の態様では、リンカーはリシンまたはアルギニン残基であり、そのε-アミノ基は本明細書で定義したペプチドを種々の他の成分に連結させるのに適している。当業者は、一般的な知識に基づいて、適切なリンカー分子、特にリンカーペプチドを設計する方法を知っている。例えば、ペプチドリンカーはLIP(Loops in Proteins)データベース(Michalsky, E. et al. (2003) Prot. Eng. 56, 979-985)から選択することができる。そうしたリンカーは、本発明のペプチドのNまたはC末端に、適切と見なされる場合には、非末端アミノ酸残基にも、結合させることができる。
【００８３】
好ましい態様において、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つの他の成分に非共有結合相互作用を介して、例えば(可逆的)複合体形成を介して、結合される。
【００８４】
他の特定の態様において、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つの他の成分に共有結合相互作用を介して、例えば融合分子の形で、結合される。本明細書中で用いる用語「融合分子」は、少なくとも1つの他の成分に連結された本発明のペプチドを含み、それゆえ単一の化学種を形成している、少なくとも2つの成分からなる分子を意味する。ペプチドと少なくとも1つの他の成分は、先に記載したようにリンカーによって分離されていても、直接連結されていてもよい。少なくとも1つの他の成分は、本発明のペプチドにN末端、C末端または末端アミノ酸以外の任意のアミノ酸で融合させることができるが、N末端への融合が好適である。追加の成分を、融合分子にすでに含まれている成分に融合させることも可能である。当業者は、本発明の融合分子中の成分の最適な順序および/またはそれらの組み合わせを判別するためのアッセイを熟知している。一般的に、融合分子が本発明のペプチドと少なくとも1つの他のペプチドを含むとき、その用語は、融合が結果的に天然のペプチドをもたらす場合の融合分子を含まない。本発明のペプチドの生産について先に記載した方法に従って、融合分子を生産し、単離することができる。
【００８５】
本発明の組成物は本明細書中で定義した1つ以上のペプチドを含むことができる。少なくとも2つの複数のペプチドの場合、これらは同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る。その逆に、本発明の少なくとも1つのペプチドが2つ以上の他の成分に結合される場合、これらの成分は同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る(例えば、2つの核酸分子、または1つの核酸分子と1つのペプチド分子)。特定の態様では、本発明の単一のペプチドが2つ以上の複数の他の成分に結合される。他の態様では、2つ以上の複数の本発明のペプチドが単一の他の成分に結合される。
【００８６】
好ましい態様において、少なくとも1つの他の成分は、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドまたはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群より選択される。
【００８７】
本発明による組成物はまた、さらなる成分を含むことができ、例えば、本明細書中で定義した1つ以上のペプチドと少なくとも1つの他の成分との結合を安定化させるための作用剤(例：キレート剤)；組成物を保護するための作用剤(例：細胞ヌクレアーゼに対するもの)；または細胞への取り込みを促進するために組成物の正味電荷を補償するための作用剤を含んでいてよい。
【００８８】
本明細書中で用いる用語「小分子」とは、その最も広い意味で理解されるべきであり、それは低分子量の有機化合物を含むだけでなく、標識およびレポーター分子(下記参照)、ハプテン(すなわち、より大きいキャリアに結合されたときのみ、免疫応答を引き出すことができる小分子)、例えばヒドララジン、ウルシオール、フルオレセイン、ビオチン、およびジゴキシゲニン、ならびにアプタマーをも含むものである。
【００８９】
本明細書中で用いる用語「ナノ粒子」とは、少なくとも1つの寸法が100nm未満の微細粒子を表す。一般的に、ナノ粒子は50nm〜500nm(すなわち、0.05μm〜0.5μm)の範囲の直径を有し、生理学的環境で構造的に安定しており、かつ薬物または他の生物活性剤などのより小さい分子を収容することが可能であり、その後所望の部位に送達され得るものである。多くのナノ粒子(またはナノキャリア)は温度感受性および/またはpH感受性であり、すなわち、それらは加熱および/またはpHの変化によりそれらのカーゴを放出する。そのようなナノキャリアは、閉じ込められた化合物が解放されるまで、分解および消化液からそれらの化合物を保護している。
【００９０】
特定の態様において、組成物中に含まれる本発明の少なくとも1つのペプチドは、1つ以上の核酸分子に結合される。好ましくは、1つ以上の核酸分子が結合される本発明の少なくとも1つのペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００９１】
本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチドが結合される1つ以上の核酸分子は、任意の長さの天然のまたは人工的なDNA分子もしくはRNA分子(アプタマーを含む)とすることができ、それらは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。2つ以上の核酸分子が少なくとも1つのペプチドに結合される態様では、これらの核酸分子は同じタイプ(すなわち、同一のヌクレオチド配列をもつ)または異なるタイプのものであり得る。一般的には、本発明の1つのペプチドが単一の核酸分子に結合される。
【００９２】
特定の態様において、1つ以上の核酸分子はRNA分子であり、一般的には、小さい非コードRNA分子(すなわち、ペプチドまたはタンパク質に翻訳されないRNA、例えばsnRNA、snoRNA、stRNA、siRNA、miRNA、およびshRNA)であり、好ましくは、RNA分子はsiRNA分子、miRNA分子、およびshRNA分子からなる群より選択される。
【００９３】
本明細書中で用いる用語「miRNA分子」(または「miRNA」)は、当技術分野での通常の意味を有する(例えば、Bartel, D.P. (2004) Cell 23, 281-292; He, L. and Hannon, G.J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531に概説される)。したがって、用語「マイクロRNA」は、局所RNA前駆体miRNA構造を形成することができる、転写産物からプロセッシングされたゲノム遺伝子座由来の内因性RNA分子を表す。成熟miRNAは通常20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さであるが、他の数のヌクレオチド、例えば18、19、26または27ヌクレオチドも存在し得る。
【００９４】
miRNAをコードする配列は、フランキングゲノム配列と対合して、成熟miRNAを不完全なRNA二重鎖(本明細書ではステム-ループもしくはヘアピン構造またはpre-miRNAともいう)内に配置する能力があり、このRNA二重鎖はより長い前駆体転写産物からのmiRNAのプロセッシングのための中間体として機能する。このプロセッシングは一般に、それぞれDroshaとDicerと呼ばれる2種類の特異的なエンドヌクレアーゼの連続作用を介して起こる。Droshaは、一次転写産物(「pri-miRNA」という)から、一般的にはヘアピンまたはステム-ループ構造に折りたたまれるmiRNA前駆体を生成する。このmiRNA前駆体から、miRNA二重鎖がDicerによって切り出され、それはヘアピンまたはステム-ループ構造の一方のアームに成熟miRNAを、他方のアームに同様のサイズのセグメント(通常はmiRNA*という)を含む。その後miRNAはその機能を発揮するためにその標的mRNAへと導かれるが、miRNA*はほとんどの場合分解される。miRNAとその標的との相補性の程度に応じて、miRNAは異なる調節プロセスを導くことができる。miRNAに高度に相補的な標的mRNAはRNA干渉(RNAi)と同じメカニズムにより特異的に切断され、そしてmiRNAは短鎖干渉性RNA(siRNA)として機能する。miRNAにあまり相補的でない標的mRNAは、細胞分解経路に送られ、かつ/または翻訳が抑制される。しかしながら、miRNAがその標的mRNAの翻訳を抑制するメカニズムは、まだ論争中である。
【００９５】
いくつかの態様において、本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチド分子に結合される1つ以上の核酸分子は、成熟miRNA分子である。他の態様では、miRNA前駆体分子が用いられる。本明細書中で用いる用語「miRNA前駆体」(または「前駆体miRNA」もしくは「pre-miRNA」)は、成熟miRNAがプロセッシングされるmiRNA一次転写産物の部分を指す。一般的に、pre-miRNAは安定したヘアピン(すなわち、二重鎖)またはステム-ループ構造に折りたたまれる。ヘアピン構造は長さが50〜120ヌクレオチド、一般には55〜100ヌクレオチド、好ましくは60〜90ヌクレオチドの範囲である(miRNAに対合しているヌクレオチド残基(つまり「ステム」)と介在セグメント(つまり「ループ」)をカウントするが、より遠位の配列を除く)。
【００９６】
本明細書中で用いる用語「siRNA分子」(または「siRNA」)もまた、当技術分野での通常の意味を有する(例えば、Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Nat. Rev. Drug Disc. 3, 318-329; Rana, T.M. (2007) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 23-36に概説される)。したがって、「siRNA」は、一般にはその3'末端に2ヌクレオチドオーバーハングがあって、その5'末端にリン酸基がある、二本鎖RNA分子を表す。成熟siRNAは通常20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さであるが、他の数のヌクレオチド、例えば18、19、26または27ヌクレオチドも存在し得る。本発明の範囲内で、最大49ヌクレオチドまでの長さをもつsiRNA前駆体分子も同様に用いることができる。成熟siRNAはDicerによってそのような前駆体からプロセッシングされる。
【００９７】
伝統的には、細胞に外因的に導入される干渉性RNAを指すために用語「siRNA」が用いられた。その間に、内在性siRNAがさまざまな生物で発見されており、少なくとも4つのクラスに分類される：トランス作動性siRNA(tasiRNA)、リピート関連siRNA(rasiRNA)、低分子スキャン(small-scan)(scn)RNAおよびPiwi相互作用性(pi)RNA (例えば、Rana, T.M. (2007) 前掲に概説される)。
【００９８】
siRNAの一方の鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれる。RISCは、このsiRNA鎖を用いて、取り込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA標的分子を同定し、その後これらの標的mRNAを切断する。RISCに取り込まれるsiRNA鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られる。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られる他方のsiRNA鎖は、siRNAから取り除かれ、そして標的mRNAに少なくとも部分的に相同である。当業者であれば、原理的に、siRNAのいずれか一方の鎖がRISCに取り込まれて、ガイド鎖として機能し得ることを認識するだろう。しかし、siRNAの設計(例えば、所望のガイド鎖の5'末端での低下したsiRNA二重鎖安定性)は、RISCへの所望のガイド鎖の取り込みに有利に働くことができる。siRNAのアンチセンス鎖はsiRNAの能動的なガイド剤である。というのは、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれ、その結果として、切断または翻訳抑制のためにアンチセンスsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的な標的mRNAをRISCが同定するのを可能にするからである。ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するmRNAのRISC媒介切断は、そのmRNAおよび対応するタンパク質の定常状態レベルの減少につながる。
【００９９】
本明細書中で用いる用語「shRNA分子」(すなわち、短鎖ヘアピンRNA分子)とは、ステム-ループまたはヘアピン構造の「siRNA二重鎖」のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む人工的な一本鎖干渉性RNA分子を表す。このヘアピン構造のステムは一般に長さが19〜29ヌクレオチドの範囲であり、そしてループは一般に4〜15ヌクレオチドの長さである(例えば、Siolas, D. et al. (2004) Nat. Biotechnol. 23, 227-231を参照されたい)。通常、shRNA分子はDNA発現ベクター内でRNAポリメラーゼIIIプロモーター(例えば、U6プロモーター)の制御下にコードされる。
【０１００】
いくつかの態様において、上記のRNA分子はもっぱらリボヌクレオチド単位で構成される骨格構造を含む。他の態様では、そうしたRNA分子は少なくとも1つのリボヌクレオチド骨格単位と少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド骨格単位を含む。さらに、RNA分子はリボースの2'-OH基の2'-O-メチル基または2'-O-メトキシエチル基(「2'-O-メチル化」ともいう)への1つ以上の修飾を含むことができ、これによって、培養培地中でのヌクレアーゼ分解が防止され、かつ、重要なことには、小さいRNA分子の不可逆的阻害につながる、RNA誘導サイレンシング複合体ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖切断も防止された。2'-O-メチル化と機能的に同等であるもう1つの可能な修飾には、ロックド核酸(LNA)が含まれ、これは、RNAを模倣する糖コンフォメーションでロックされた二環式フラノース単位を有する1つ以上のLNAヌクレオチド単量体を含む核酸アナログに相当する(例えば、Orom, U.A. et al. (2006) Gene 372, 137-141を参照されたい)。
【０１０１】
他のいくつかの態様において、本発明の少なくとも1つのペプチド分子に結合される核酸分子は、内在性miRNA発現のサイレンサーに相当する。そのようなサイレンサーの一例は、「アンタゴミア」(antagomir)と呼ばれる、化学的に作製されたオリゴヌクレオチドであり、これはコレステロールにコンジュゲート化された一本鎖23ヌクレオチドRNA分子に相当する(Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature 438, 685-689)。このような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドに代わるものとして、トランスジーンから産生されるRNAとして細胞内で発現させることができるマイクロRNA阻害剤が作製された。「マイクロRNAスポンジ」と呼ばれる、これらの競合阻害剤は強力なプロモーターから発現される転写産物であり、関心対象のマイクロRNAへの複数のタンデム結合部位を含む(Ebert, M.S. et al. (2007) Nat. Methods 4, 721-726)。
【０１０２】
特に好ましい態様において、前記組成物中に含まれる少なくとも1つのペプチドは、1つ以上の他のペプチドに結合される。本明細書中で用いる用語「他のペプチド」とは、これらのペプチドが、本明細書中で定義した、細胞内に内部移行する能力があるペプチド(すなわち、特許請求の範囲で特定されたペプチド)とは異なっている、ことを意味する。
【０１０３】
特に好ましくは、1つ以上の他のペプチド分子が結合される本発明の少なくとも1つのペプチドは、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチドが結合される1つ以上の他のペプチドは、任意の長さの天然のまたは人工的な分子であり得る。例えば、そのような他のペプチドの長さは2〜500アミノ酸または5〜200アミノ酸の範囲とすることができる。一般的には、そうしたペプチドは8〜100アミノ酸または10〜50アミノ酸の長さを有する。好ましくは、そうしたペプチドの長さは10〜40アミノ酸、12〜35アミノ酸または15〜30アミノ酸の範囲であり得る。人工的なペプチド分子は化学合成、組換えDNA技術またはそれらの組み合わせによって得ることができる。これらすべての合成方法は当技術分野で確立されている(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲を参照されたい)。
【０１０５】
2つ以上の他のペプチド分子が本発明の少なくとも1つのペプチドに結合される態様において、これらの他のペプチド分子は、同じタイプのもの(すなわち、同一のアミノ酸配列をもつ)または異なるタイプのものであり得る。一般的には、本発明の1つのペプチドが単一の他のペプチド分子に結合される。
【０１０６】
さらなる態様において、1つ以上の他のペプチド分子は、少なくとも1つの構造化されたドメイン、すなわち、直鎖状配列で互いに近接して配置されたアミノ酸残基の特定の空間的配置である、安定した二次構造を形成している(つまり、折りたたまれている)要素を含む。多くの場合、アミノ酸残基間の立体的関係は、通常のものであって、αへリックス(棒状の堅固なコイル構造)およびβ鎖(伸びきった状態のストレッチ、その際、複数のそうしたストレッチが必要に応じて平行または逆平行のβシートを形成する)などの当技術分野でよく知られた周期的構造を生じさせる。ペプチド分子は、非構造化部分に取り囲まれた1つのそのような構造化ドメインを含んでもよいし、あるいは互いに分離された2つ以上のそうした構造化ドメイン(同じタイプまたは異なるタイプのもの、例えば2つのαへリックスまたは1つのαへリックスと1つのβ鎖)を含んでもよい。ペプチド分子はその全長にわたってそのような二次構造を形成することができる(すなわち、非構造化領域を含まない)。2つ以上の他のペプチド分子が本明細書中で定義した組成物に含まれる場合には、他のペプチド分子の一部が少なくとも1つの構造化ドメインを含むのに対し、残りの部分が構造化されていないこともあり得る。
【０１０７】
好ましい態様において、本明細書中で定義した1つ以上の他のペプチド分子の少なくとも一部はαへリックス二次構造を形成する。αへリックス要素は少なくとも4または6個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも8または10個のアミノ酸残基を含むことができる。特定の態様では、本発明のペプチド分子は唯一の二次構造として単一のαへリックス要素を含む。
【０１０８】
他の特定の態様において、1つ以上の他のペプチドは、プロアポトーシス性ペプチド、すなわち、アポトーシス(つまり、プログラムされた細胞死)を誘導および/またはモジュレートする能力があるペプチドである。当業者は、アポトーシスの開始および/または仲介に関与するタンパク質因子、ならびにプロアポトーシス機能を保持するペプチド配列を選択するための適切な手段に精通している。例えば、そのようなプロアポトーシス因子は、科学文献からだけでなく、「APOPTOSIS Database」などの各種データベースからも取得することができる(Doctor, K.S. et al. (2003) Cell Death Diff. 10, 621 -623)。
【０１０９】
他の態様において、1つ以上の他のペプチドは、細胞腫瘍サプレッサーの活性化/抑制解除、細胞癌遺伝子の阻害、および構成的に活性なタンパク質変異体の阻害からなる群より選択される機能を有する。さらに他の態様では、1つ以上のペプチドは、サイトカイン受容体、アンギオテンシン受容体、エンドセリン受容体、バソプレシン受容体、およびブラジキニン受容体などの細胞受容体の天然または合成のリガンド(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト)に相当する。この場合も同様に、多数のこの種のペプチドが当技術分野で周知であり、さまざまな供給源から容易に取得することができる。
【０１１０】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した組成物の生産方法に関し、その方法は、
(a)本発明の少なくとも1つのペプチドを提供する段階；および
(b)少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階
を含む。
【０１１１】
当業者は、前記方法を実施するための適切な反応条件について熟知している(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲; Ausubel, F.M. et al. (2001) 前掲を参照されたい)。
【０１１２】
さらなる局面において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の組成物(すなわち、カーゴに結合された少なくとも1つのペプチド)の内部移行挙動を検出する方法に関し、その方法は、
(a)該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および
(b)該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階
を含む。
【０１１３】
前記方法は、医療(例えば、診断)または研究目的のためのペプチドまたは組成物の適用可能性を予測するのに特に適している。ペプチドまたは組成物の効果的な内部移行が検出され、任意で、その局在が細胞質内である場合、それは、それぞれの化合物を特定の用途に使用できることを示している。
【０１１４】
そのために、本発明のペプチドまたは組成物は1つ以上の検出可能な標識に融合させることができる。本発明に従って使用できる標識には、化学的、物理的または酵素的反応で検出可能な化合物またはシグナルを直接または間接的に生成する任意の化合物が含まれる。標識化とその後の検出は当技術分野で周知の方法によって達成することができる(例えば、Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), 前掲; およびLottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germanyを参照されたい)。標識は、とりわけ、蛍光標識、酵素標識、発色標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属、および金コロイドから選択することができる。これらすべてのタイプの標識は当技術分野で確立されており、さまざまな供給業者から商業的に入手することができる。そうした標識によって媒介される物理的反応の例は、照射による蛍光または燐光の放出である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼは、発色反応生成物の形成を触媒し、本発明で使用することができる酵素標識の例である。
【０１１５】
別の局面において、本発明は、1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための本明細書中で定義したペプチドまたは本明細書中で定義した組成物の使用、すなわち、特定の標的細胞にカーゴを輸送するための運搬手段としての前記化合物の適用に関する。
【０１１６】
特定の態様において、本発明は、特定の細胞のトランスフェクションおよび/または特定の細胞への薬剤の標的送達のための、1つ以上の核酸分子および1つ以上のペプチドまたはタンパク質からなる群の少なくともいずれか1つに結合された本発明の少なくとも1つのペプチドを含む本明細書中で先に定義した組成物の使用に関する。
【０１１７】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチド分子または本明細書中で定義した組成物(すなわち、カーゴに結合された少なくとも1つのペプチド)を含み、必要に応じて、1種以上の薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤をさらに含む薬学的組成物に関する。
【０１１８】
本明細書中で用いる用語「薬学的組成物」は、対象に、特にヒト患者に、投与するための組成物に関係する。本発明による薬学的組成物としては、当技術分野で確立された任意の医薬剤形、例えば、特にカプセル剤、マイクロカプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、粉剤、ペレット剤、多粒子製剤(例えば、ビーズ、顆粒または結晶）、エアゾール剤、スプレー剤、フォーム剤、溶液剤、分散液剤、チンキ剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液剤、油中水型エマルジョン、例えば軟膏剤、水中油型エマルジョン、例えばクリーム剤、ローション剤、およびバルム剤が挙げられる。製剤は個別の投与単位にまたは複数回投与用の容器に包装することができる。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物には、経口、直腸、鼻腔内、局所(口腔および舌下を含む)、腹腔内および非経口(筋肉内、皮下および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは吹送による投与に適した製剤が含まれる。投与は局所的でも全身的でもよい。
【０１２０】
薬学的組成物は確立された方法に従って調製することができる(例えば、Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; Crowder, T.M. et al. (2003) A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL; Niazi, S.K. (2004) Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, CRC Press, Boca Raton, FLを参照されたい)。
【０１２１】
前記組成物を調製する場合、1種以上の薬学的に許容される、(すなわち)不活性な、無機または有機賦形剤(すなわち、担体)を用いることができる。例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤または顆粒剤を調製するために、例えば、乳糖、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ワックス、固体または液体ポリオール、天然油および硬化油を使用することができる。溶液剤、懸濁液剤、乳剤、エアゾール混合物、または使用前に溶液剤もしくはエアゾール混合物に再調製するための粉剤を調製するのに適した賦形剤としては、特に水、アルコール、グリセロール、ポリオール、およびこれらの適当な混合物、ならびに植物油が挙げられる。薬学的組成物はまた、添加剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、乳化剤、さらに溶剤もしくは可溶化剤、またはデポー効果を達成するための作用剤などを含んでもよい。後者は、本発明の活性ペプチドまたは組成物を徐放性もしくは持続放出性送達システムまたは標的化された送達システム、例えばリポソーム、ナノ粒子、およびマイクロカプセルに組み込むことができる、と理解されるべきである。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は適切な用量で対象に投与することができる。適用される特定の投薬レジメンは、主治医ならびに臨床的要因により決定されるだろう。医療分野では周知であるように、所定の患者のための適切な投与量は、患者の体格、性別および年齢、投与される特定の化合物、投与時間および経路、全身的な健康状態、既往歴、ならびに同時に投与される他の薬物を含めて、多くの要因に左右される。所定の状況のための治療有効量はルーチンワークの実験により容易に決定され、通常の臨床医または医師の技量と判断の範囲内である。一般的に、定期的な投与としての投与量は1日あたり1μg〜1gの範囲とすべきである。しかし、好ましい投与量は1日あたり0.01mg〜100mgの範囲、さらに好ましい投与量は0.01mg〜50mgの範囲、最も好ましい投与量は1日あたり0.01mg〜10mgの範囲であり得る。
【０１２３】
さらに別の局面において、本発明は、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療に使用するための、本明細書中で定義したペプチドまたは本明細書中で定義した組成物に関する。この目的のために、本発明のペプチドまたは組成物は、本明細書中で先に定義した薬学的組成物に製剤化して、対象、好ましくはヒト患者に投与することができる。
【０１２４】
本明細書中で用いる用語「癌」とは、遺伝的再プログラミングに基づいた標的細胞の制御不能な分裂と、浸潤を介した隣接組織への直接増殖により、または転移による遠隔部位(そこに癌細胞は血流またはリンパ系を介して輸送される)への着床により、波及する標的細胞の能力とによって特徴づけられる悪性新生物の任意のタイプまたは形態を意味する。例としては、特に乳癌、大腸癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、黒色腫、肝臓癌、および肺癌が挙げられる。
【０１２５】
本明細書中で用いる用語「免疫疾患」とは、免疫系のあらゆる障害を指す。そうした免疫疾患の例には、特に免疫不全症(すなわち、感染症と戦う免疫系の能力が損なわれているか完全に失われている、AIDSまたはSCIDなどの、先天的または後天的な症状)、過敏症(アレルギーまたは喘息など)、および自己免疫疾患が含まれる。本明細書中で用いる用語「自己免疫疾患」とは、内因性物質および組織に対する生体の過剰な免疫応答(ここでは生体が自己の細胞を攻撃する)に起因するあらゆる障害を意味する、と理解されるべきである。自己免疫疾患の例としては、特に多発性硬化症、クローン病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、および多発性関節炎が挙げられる。
【０１２６】
本明細書中で用いる用語「心血管疾患」とは、心臓と冠状血管のあらゆる障害を指す。心血管疾患の例としては、特に冠状動脈性心臓病、狭心症、動脈硬化症、心筋症、心筋梗塞、虚血、および心筋炎が挙げられる。
【０１２７】
本明細書中で用いる用語「神経疾患」(または「神経学的障害」)とは、中枢神経系(CNS)(すなわち、脳と脊髄)の疾患および末梢神経系の疾患を含む神経系のあらゆる障害を指す。CNS疾患の例としては、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、閉じ込め症候群(Locked-in syndrome)、およびトゥレット症候群が挙げられる。末梢神経系の疾患の例としては、例えば、多発単神経炎および多発ニューロパシーが挙げられる。
【０１２８】
本明細書中で用いる用語「感染症」とは、細菌、ウイルスまたは真菌などの外来病原体による宿主生物のコロニー形成に基づくあらゆる障害を指す。細菌感染症の例には、特に、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳、サルモネラ症、破傷風、およびチフスが含まれる。ウイルス感染症の例には、特に、風邪、インフルエンザ、デング熱、エボラ出血熱、肝炎、おたふく風邪、ポリオ、狂犬病、および天然痘が含まれる。真菌感染症の例には、特に、足白癬、ブラストミセス症、およびカンジダ症が含まれる。
【０１２９】
本明細書中で用いる用語「炎症性疾患」とは、例えば、にきび、喘息、花粉症、関節炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、および移植拒絶を含めて、炎症を伴うあらゆる障害を指す。
【０１３０】
さらなる局面において、本発明は、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療方法に関し、その方法は、本発明の少なくとも1つのペプチドまたは本発明の組成物を対象に投与することを含む。好ましくは、対象はヒト患者である。
【０１３１】
最後の局面において、本発明は、以下の成分(a)〜(e)の少なくともいずれか1つを含むキット・オブ・パーツに関する：
(a)本明細書中で先に定義したペプチド分子；
(b)本明細書中で先に定義した核酸分子；
(c)本明細書中で先に定義したベクター；
(d)本明細書中で先に定義した宿主細胞；および
(e)本明細書中で先に定義した組成物。
【０１３２】
キットの種々の成分(a)〜(e)は、1つ以上のバイアルなどの、1つ以上の容器に包装することができる。例えば、キットに含まれる各成分を別々の容器に包装してもよい。
【０１３３】
キットの上記成分は、凍結乾燥もしくは乾燥した形で、またはリン酸緩衝生理食塩水もしくはTris/EDTA (TE)緩衝液などの適切な緩衝液中に溶解した状態で、提供することができる。本発明の宿主細胞は、寒天プレート上に画線培養された「ステップ培養」として、または長期保存に適したいずれか他の形で提供することができる。このような保存方法は当技術分野で確立されている。
【０１３４】
キットはまた、特に防腐剤、上記成分の保存および/または再調製のための増殖培地および/または緩衝液、洗浄液などを含めて、追加の試薬を含むことができる。こうした試薬は成分(a)〜(e)の1つ以上と組み合わせて、すなわち、同じ容器に入れて(例えば、ペプチドまたは核酸分子を適切な緩衝液中に溶解して)提供してもよい。あるいは、こうした追加の試薬の少なくとも一部を別々の容器で提供してもよい。
【０１３５】
本発明は、図面および以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは単に本発明の特定の態様を例示する目的のためのものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：材料および方法
1.1 哺乳動物細胞培養
MCF7細胞を96ウェルプレートに15,000個/ウェルの細胞密度で播種した。その細胞を10％FCS(ウシ胎児血清)とL-グルタミンを添加したRPMI 1640培地で37℃、5％CO2および85％湿度にて24時間インキュベートした。機能アッセイのため、細胞をOptiMEM培地で洗浄し、かつRPMI 1640をOptiMEMで置き換えた(すべての試薬はInvitrogen社(Carlsbad, CA, 米国)から購入した)。siRNAとペプチドの複合体は、100nM siRNAを、示した濃度のペプチドとOptiMEM中で室温にて30分インキュベートすることによって形成させた。その複合体を細胞に添加して3時間インキュベートした。その後、OptiMEMを通常のRPMI 1640増殖培地と交換した。細胞は、bDNA溶解液を生成するためにさらに21時間インキュベートし、CellTiter-GloまたはCytoTox-Gloアッセイ(下記参照)を行うためにさらに45時間インキュベートした。
【０１３７】
1.2 mRNAレベルの定量化
細胞のmRNAレベルの定量化のため、個々のmRNAレベルの検出を可能にするbDNA(分岐DNA)アッセイを行った。そのために、分析すべき細胞の特定数を96ウェルプレートに播種して、一晩付着させた。翌日、細胞をsiRNAでトランスフェクトした。
【０１３８】
さらに24時間後、QuantiGene Plex 2.0アッセイキットを用いてメーカー(Affymetrix社, Santa Clara, CA, 米国)の指示に従ってmRNA種を定量した。簡単に説明すると、細胞溶解物を遺伝子特異的プローブセットの存在下で捕捉プレートに移し、53℃で一晩インキュベートした。洗浄後、そのウェルを増幅剤およびアルカリホスファターゼ(AP)結合標識プローブと53℃で順次インキュベートしたが、その合間に洗浄工程を入れた。続いて、発光AP基質ジオキセタンを添加して、53℃で30分インキュベートした。発光はInfiniteF200発光プレートリーダー(Tecan Austria GmbH, Groeding, オーストリア)を用いてアッセイした。
【０１３９】
1.3 細胞生存率アッセイ
生細胞の数を測定するために、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega社, Madison, Wl, 米国)をメーカーのプロトコルに従って使用した。細胞をペプチドおよびsiRNAの存在下で48時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、存在するATPの量に比例する発光シグナルを生成させ、このシグナルはひいては、存在する生細胞の数に比例する。発光はInfiniteF200発光リーダーで解析した。
【０１４０】
1.4 細胞毒性アッセイ
ペプチドの細胞毒性を測定するため、CytoTox-Glo細胞毒性アッセイ(Promega社, Madison, Wl, 米国)をメーカーのプロトコルに従って使用した。細胞をペプチドおよびsiRNAの存在下で48時間インキュベートした。その後、細胞膜の完全性が失われた細胞から放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定するために、細胞を発光性ペプチド基質で処理した。この基質は生細胞の無傷の膜を通過することができず、生細胞の集団からは認めうるシグナルを生成しない。したがって、このアッセイの発光は死細胞を表す。その後、96ウェルプレートをInfiniteF200発光リーダーで解析した。
【０１４１】
1.5 ペプチド合成
ペプチド合成は、Fmoc化学を用いて自動Applied Biosystems ABI 433Aペプチド合成機で確立されたプロトコル(FastMoc 0.25mmol)に従って行った。反復サイクルで、それぞれのペプチド配列を、対応するFmocアミノ酸の連続的カップリングによって組み立てた。
【０１４２】
各カップリング工程において、N末端のFmoc基は、N-メチルピロリドン中の20％ピペリジンで樹脂を処理することによって除去した。カップリングは、DMF中でHBTU/HOBt(各1mmol)とDIPEA(2mmol)により活性化されたFmoc保護アミノ酸(1mmol)を用いて実施した。カップリング工程後、未反応のアミノ基を、NMP中でAc2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)およびHOBt(0.015M)の混合物で処理することによってキャップした。2工程の合間に、樹脂をN-メチルピロリドンとDMFで十分に洗浄した。立体障害の大きいアミノ酸の取り込みは自動二重カップリングで達成された。この目的のために、中間キャッピング工程なしに1mmolの活性化ビルディングブロックで樹脂を2回処理した。目的配列の完成時に、Fmoc-12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸(TEG-スペーサー)を、標準的な反応条件を用いて、ペプチドにカップリングさせた。続いて、Fmoc-Cys(Trt)-OHをすべてのペプチド配列のアミノ末端に結合させた。最後のFmoc脱保護の後に、ペプチド樹脂をフィルタフリットに入れて、トリフルオロ酢酸と水とトリイソプロピルシランの混合物(19ml対0.5ml対0.5mlの比)で2.5時間処理した。切断溶液を濾過し、冷(0℃)ジイソプロピルエーテル(300ml)を添加してペプチドを沈殿させると、無色の固体が得られ、これをジイソプロピルエーテルで繰り返し洗浄した。粗生成物を酢酸と水の混合物中に再溶解し、凍結乾燥させ、分取逆相HPLC(Chromolith prep RP-18eカラム、100×25mm; Merck KGaA, Darmstadt, ドイツ)で0.1％TFAを含むアセトニトリル/水勾配を用いて精製した。
【０１４３】
1.6 FACS解析
FACS解析のため、MCF7細胞(ATCC番号HTB-22)を、アキュターゼ(accutase)(タンパク質分解およびコラーゲン分解活性を有する酵素溶液；さまざまな供給業者から市販されている)中で15分インキュベートすることにより剥離させた。FACS緩衝液(5％FCSを含むPBS)で洗浄した後、細胞を96ウェルの丸底マルチウェルプレート(カタログ番号3799, Corning社, Corning, NY, 米国)に3×105個/mlの最終細胞密度で播種し、直ちに使用した。細胞はOptiMEM培地中で1μM、5μMおよび10μMのFITC標識ペプチドのそれぞれの存在下に37℃で3時間インキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、プロテイナーゼK(0.02mg/ml)含有緩衝液中37℃で30分インキュベートした。細胞を2回洗浄し、FITCチャネルを用いてFACSCanto II(BD Biosciences社; San Jose, CA, 米国)で解析した。
【０１４４】
1.7 ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイは、水中で500μgのsiRNA二重鎖をそれぞれのペプチドと所定のモル比で混合することによって行った。複合体を37℃で1時間形成させ、エチジウムブロマイドを用いた2.5％アガロースゲル上で分析した(ラン：125Vで40分)。プロテイナーゼK処理の場合は、1μlのプロテイナーゼKを上で示した標準反応に添加した。
【０１４５】
実施例２：潜在的なヒトCPPの同定
2.1 バイオインフォマティクス的アプローチ
HIV由来のTAT(Frankel, A.D. and Pabo, C.O. (1988) Cell 55, 1189-1193; Vives, E. et al. (1997), 前掲)およびモデルペプチドのポリアルギニン(Wender, P.A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13003-13008; Futaki, S. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 5836-5840)により代表される、細胞透過性ペプチド(CPP)の1つのグループは、正に荷電したアミノ酸の含有量が高いことによって特徴づけられる。その他のCPP、いわゆる傾斜ペプチド(tilted peptides)は、荷電した親水性アミノ酸のストレッチと荷電していない親油性アミノ酸のストレッチの両方で構成されている(Lins, L. et al. (2008) Biochim. Biophys. Acta 1778, 1537-1544)。それゆえ、CPPはこれらの特性を両方とも備えるべきであると推測したくなる。ヒトプロテオーム中でそのような配列を同定するために、バイオインフォマティクス的アプローチが採用された。図1は、ペプチドの候補リストを作成するために使用されたワークフローの概略図を示す。
【０１４６】
ペプチドのライブラリーを作製するために、スライディングウィンドウアプローチを用いた。30アミノ酸のウィンドウサイズを選択して、SwissProtタンパク質データベース(Swiss Institute of Bioinformatics; http://www.expasy.org/sprot/)の全エントリに適用した。これにより10,459,557個のペプチドのライブラリーが得られ、1,024,818個がユニークであった。163,887個のペプチドは複数回(平均2.7回)見いだされ、これは数種のタンパク質の反復性を反映している。作製されたライブラリー内で、各ペプチド配列は、その対応するソース情報(そのペプチドの配列、起源タンパク質およびそのタンパク質内の位置)、ならびに起源タンパク質の遺伝子オントロジー(GO)アノテーション(Ashburner, M. et al. (2000) Nat. Genet. 25, 25-39)にリンクされる。各ペプチドに関連づけられる追加の情報には、そのアミノ酸組成、例えば荷電数、等電点(IEP)、および予測される疎水性が含まれる。30アミノ酸のスライディングウィンドウを用いることの理論的根拠は、より大きいペプチドは二次構造(例えば、αへリックスまたはβシート)の点で構造化されている確率が高いので、通常CPPとして用いられるよりも大きいペプチドを得ることであった。こうした二次構造をもつペプチドは、非構造化ペプチドに比較して、細胞透過にとって有利であることが示された(Deshayes, S. et al. (2004) Biochemistry 43, 7698-7706)。さらに、長さが12アミノ酸より短いαへリックスペプチドは、核酸分子と相互作用する能力、それゆえに核酸分子をトランスフェクトする能力が低いことが報告された(Niidome, T. et al. (1999) Bioconjug. Chem. 10, 773-780)。
【０１４７】
さらなる工程では、正に荷電したモデルペプチドTATおよびPoly-Argに対してより高い類似性をもつペプチドを得るために、一次アミノ酸配列中に30％を超える正に荷電したアミノ酸残基(すなわち、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、およびリシン(K))を含むペプチドがフィルタにかけられた。このフィルタは227,307個のペプチドをもたらした。得られた選択を、免疫系によって許容される可能性がより高い(すなわち、免疫原性である確率がより低い)ペプチドについて富化するために、これらの結果を対応するタンパク質エントリのGOにアライメントし、かつ細胞外タンパク質に限定した。最後に、このフィルタ(すなわち、ヒト免疫系に「見える」ヒト細胞外タンパク質に由来する候補の選択)は、ペプチドの数を8630個から583個のタンパク質へと大幅に減少させた。
【０１４８】
2.2 実験的特性評価のためのペプチド候補の選択
ペプチド候補の数を減少させるに至った主な要因は、インシリコ手法(分析可能なサンプルの数を事実上制限しない)から実験的ウエットラボ(wet-lab)解析(包括的に対処できる候補の数のみに制限する)へのシフトであった。さらに、候補リストを短縮するための別の実際的な考慮事項は、取り扱いの容易さ、生物学的アッセイでの適用可能性、そして最後に薬理活性化合物を開発するための実現可能性であった。一方で、明らかに難溶性であるか、または合成するのが難しいペプチド配列は、さらなる評価から除外された。
【０１４９】
この最終段階の候補選択が単一の、またはおそらく2つの、ストリンジェントなパラメータによって決定されるのを避けるために、実験的評価のための最終候補リストは3つの異なるアプローチを用いてまとめられた：
【０１５０】
候補ペプチドの1つのサブセットは、少なくとも30％の正に荷電した残基(「KHR30」)を含むだけでなく、多くの疎水性残基をも含むことにより特徴づけられる。それゆえに、ペプチドはそれらのIEPならびに疎水性に関してランク付けされた。両方のリストで最高得点を獲得した1000個のペプチドの交点から、29のタンパク質に由来する91のペプチドが得られた。最終的に、交点最高値をもつ20のタンパク質に由来する20のペプチドが選択された。
【０１５１】
候補の第2のサブセットはTATペプチド配列への類似性に基づいて得られた。すべてのペプチドはFASTAアルゴリズム(Lipman, D.J. and Pearson, W.R. (1985), 前掲)を用いて相同性の比較を行った。ペプチドはそれぞれのE値に従ってランク付けされた(E値が低いほど、ランク付けが高くなる)。このアプローチによって、10のタンパク質に由来する135のペプチドが得られた。最終的に、5つのタンパク質に由来する5つのペプチドがさらなる解析のために選択された。
【０１５２】
第3のサブセットとして、25の個々のタンパク質に由来する36の候補ペプチドが、それらの起源タンパク質の機能に関係する文献情報解析に基づいて、実験的評価のために選択された。タンパク質数に対するペプチド数の不一致は、1つのタンパク質からの複数の配列(例えば、CO9 mot1a、CO9 mot1b)または1つの配列の種々の変異体(例えば、ジスルフィド橋を含むまたは欠く、グラニュライシンWT、グラニュライシンG8、グラニュライシンG9など)の使用によって説明される。総じて、30アミノ酸残基の長さが維持されたが、既知モチーフがこうした30merを含むと同定された場合には、そのペプチドの長さを、FALL(Yang, Y.X. et al. (2004) Acta Pharmacol. Sin. 25, 239-245)の場合のように39アミノ酸残基に、または多数のリパーゼのコンセンサス配列であるLIP Cons C WT(Demant, T. et al. (1988) J. Lipid Res. 29, 1603-1611)の場合のように48アミノ酸残基に延長した。制限はこれらの配列に関して得られた文献情報およびBLAST結果の慎重な解析に基づいていた。好ましいものは以下のペプチドであった：補体系の因子のような、膜を妨害することが知られているタンパク質に由来するペプチド；脂質を分解するタンパク質(例えば、リパーゼ)に由来するペプチド；FALL(Nijink, A. and Hancock, R.E. (2009) Curr. Opin. Hematol. 16, 41-47)またはBPIL3(Mulero, J.J. et al. (2002) Immunogenetics 54, 293-300)などの、殺菌性因子を生じさせるタンパク質に由来するペプチド；およびCPPとして作用することが報告されたペプチドに類似するペプチド(Takeshima, K. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 1310-1315; Arrighi, R.B. et al. (2008) Antimicrob. Agents Chemother. 52, 3414-3417)。
【０１５３】
さらなる実験的評価を行ったすべてのペプチド(対照を含む)は表1に記載される。
【０１５４】
初期フィルタの視覚的な実証のため、ペプチドのIEPをその疎水性に対してプロットした。(約10×106の中から)ランダムに選択された500のペプチドに比較して、初期フィルタは明らかに、選択されたペプチドの蓄積につながった(図2参照)。さらなる比較のために、5つの陽性対照ペプチド(すなわち、TAT、REV、プロタミン、Poly-Arg、およびINF7)も加えた。この解析からは、正に荷電した対照ペプチドTAT、REV、プロタミン、および10xArgがフィルタ基準に適合するのに対して、負に荷電した疎水性ペプチドであるINF7はこのスケールの他端に見いだされることが示される。
【０１５５】
選択されたヒト由来のCPP候補に加えて、CPP活性が報告された8つのペプチドを対照としてスクリーニングに加えた(表1参照)。これらのペプチドはヌクレオチドとの非共有結合複合体を形成することができ、トランスフェクション能力を備えている：HIVのトランス活性化タンパク質由来のCPPであるTAT(Ignatovich, I.A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 42625-42636)；HIVのTAT関連ペプチドであるREV(Futaki, S. et al., 前掲)；正に荷電したペプチドの真正な例としてのpoly-Arg (Kim, W.J. et al. (2006) Mol. Ther 14, 343-350)；クロタミン(Nascimento, F.D. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282, 21349-21360)。さらに、トランケートされたプロタミン(Song, E. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 709-717)およびパーフォリンのN末端をヒトペプチドの例として加えた。TAT様CPPのクラスに入らない、さらなる2つの対照は、インフルエンザウイルスHA由来のペプチドInf7(負に荷電した疎水性ペプチド；Plank, C. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918-12924)およびMTS(主に疎水性のペプチド；Lin, Y.Z. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-14258)であった。
【０１５６】
実施例３：siRNAトランスフェクションを媒介するペプチドのスクリーニング
siRNAを哺乳動物細胞にトランスフェクトする能力について潜在的なCPPを分析するために、次第に増加するペプチド濃度(1μMから20μMまで)を一定のsiRNA濃度(100nM)とともに使用した。このペプチド濃度範囲は、TATなどの正に荷電したペプチドが10μMまでの範囲で細胞内に内部移行され、かつサイトゾルへの有意な放出なしに細胞内膜区画にとどまることが示されたことから、採用された(Duchardt, F. et al. (2007) Traffic 8, 848-866)。約5〜10μMの閾値以上でのみ、これらのペプチドはサイトゾルに出ることがわかった。10nM siRNAの濃度は、DharmaFECTトランスフェクション試薬を用いた対照実験で決定された飽和範囲にある(Dharmacon社, Lafayette, CO, 米国；データは示さず)。
【０１５７】
用いたsiRNAオリゴヌクレオチドは、ヒトAha1 mRNA (Panaretou, B. et al. (2002) Mol. Cell 10, 1307-1318)に対して、または対照としてのルシフェラーゼmRNAに対して向けられたものであった
【０１５８】
siRNAと各ペプチドとの複合体をOptiMEM培地中で形成させ、室温で15分インキュベートした。その複合体の存在下にOptiMEM中で細胞を3時間インキュベートした。洗浄後、細胞を通常の増殖培地でさらに21または45時間インキュベートした。その後、Aha1 mRNAと基準mRNA(すなわち、GAPDH mRNA)のレベルをbDNAアッセイにより測定した。これらのアッセイは、それぞれsiAHA1および対照siRNA(siGL3、ルシフェラーゼ)でトランスフェクトされた細胞を用いて行った。
【０１５９】
特異的なRNAiの指標として、GAPDH mRNAレベルに対するAha1 mRNAレベルの低下をsiAHA1トランスフェクト細胞とsiGL3トランスフェクト細胞において比較した。特異的siRNA媒介トランスフェクションは、siGL3トランスフェクト細胞に比較して、siAhA1トランスフェクト細胞においてAha1/GAPDH mRNA値の低下を引き起こす。図3は、これらのアッセイのスクリーニング読み出し(readout)を表す：トランスフェクトされなかった対照細胞のAha1/GAPDH mRNA値を(各アッセイにつき)100％に設定し、それに比較してsiAha1-またはsiGL3-トランスフェクト細胞のAha1/GAPDH mRNA値を表した。この正規化されたデータセットでは、siAha1-およびsiGL3-トランスフェクト細胞のそれぞれのAha1/GAPDH mRNAレベル間の差を求めた。特定のペプチドは、siGL3トランスフェクションを減少させることなくsiAha1トランスフェクションの有意な減少を引き起こし、結果的に正の差分値になる。これらの値が顕著であればあるほど、より特異的なRNAiが観察される(図3参照)。
【０１６０】
選択されたサンプルでは、Aha1 mRNAおよび/またはGAPDH mRNAの減少がすべてのトランスフェクション法で観察された。このことは、siRNAの特異性とは無関係に、適用されたペプチドの増殖阻害または毒性効果の方向に向かわせる。膜の完全性を妨げるペプチド(すなわち、CPP)は、多くの場合、これらのペプチドの一部が殺菌剤としても作用するという事実によって強調されるように、細胞を損傷する固有の能力を備えている(Arrighi, R.B. et al. (2008), 前掲)。したがって、推定上のヒトCPPの細胞毒性活性がCytoTox-GloおよびCellTiter-Gloアッセイ(Promega社, Madison, Wl, 米国)を用いて分析された。CellTiterGlowアッセイにより検出されたペプチド媒介増殖阻害または細胞毒性は、GAPDH mRNAレベルの対応する減少とよく相関した。この観察に基づいて、GAPDH mRNAレベルを毒性のための一般的な読み出し情報として使用した：培地対照に対して100％のGAPDH mRNAの平均測定を無毒性とみなし、99％〜70％の値を中程度の毒性とみなし、そして70％未満の値を毒性とみなした(図3参照)。
【０１６１】
トランスフェクションを媒介するペプチドの効力および/または増殖阻害/毒性に基づいて、異なる表現型カテゴリーが定義された：TATより低いAha1特異的siRNAトランスフェクション効率を示したペプチドは、カテゴリー「非トランスフェクション」ペプチドに割り当てた；TATと同等以上のトランスフェクション効率を示したペプチドは、「トランスフェクション」ペプチドと名づけた。同様に、GAPDH mRNA値＞70％をもたらすペプチドは「無毒性」と分類したのに対し、GAPDH mRNAをより低い値に低減させたペプチドは「毒性」と称した。
【０１６２】
これらのカテゴリーに基づいて、すべてのペプチドは以下の4つのクラスのいずれかに割り当てられた：
(a)非機能性ペプチド(無毒性の非トランスフェクションペプチド)
(b)毒性の非トランスフェクションペプチド
(c)毒性のトランスフェクションペプチド
(d)無毒性のトランスフェクションペプチド。
【０１６３】
3.1 非機能性ペプチド
スクリーニングした61のヒト由来ペプチドのうち41がこのカテゴリーに分類された(表1および図3)。これらのペプチドは細胞に対して有意な毒性を示さなかったし、またそれらは適用された濃度でsiRNAトランスフェクションを媒介しなかった。したがって、インシリコ手法で推定上のCPPとして選択されたペプチドの67％は、トランスフェクションおよび生存率実験においていかなる表現型も示さなかった。以前にCPP活性をもつことが報告された8つの対照ペプチドのグループから、3つのペプチド(クロタミン、MTS、およびパーフォリン)がこのカテゴリーに分類された。
【０１６４】
一例として、図4は、WNTシグナル伝達に関与するタンパク質WNT16に由来するペプチドの表現型を示す(Mazieres, J. et al. (2005) Oncogene 24, 5396-5400)。WNT16ペプチド配列は、それが「KHR10+細胞外」検索プロファイルに適合するとして、実験的評価の候補として加えられた。
【０１６５】
3.2 毒性の非トランスフェクションペプチド
スクリーニングした61のヒト由来ペプチドのうち11が毒性の証拠(生存率の低下および/または70％を超えるGAPDH mRNAの減少)を示したが、適用された濃度でsiRNAトランスフェクションを媒介しなかった(表1および図3参照)。したがって、それらのトランスフェクション能力はTATペプチドと比べて劣っていた。分析した(陽性)対照ペプチドのいずれもこのカテゴリーに分類されなかったので、これらの対照は実際にトランスフェクション能力があると確認された。図5は、このクラスに属するペプチドの2つの例の表現型を示す。
【０１６６】
1つのペプチドはヒトタンパク質BPLI3に由来するものである(図5A; Bingle, C.D. and Craven, C.J. (2004) Trends Immunol. 25, 53-55)。CellTiter-Gloアッセイでは、このペプチドに曝した細胞に生存率の用量依存的低下が観察された。これはGAPDH mRNAレベルの用量依存的低下と平行しており、このことは、増殖抑制および/または毒性の読み出し情報として平均GAPDH mRNA値を用いるアプローチを裏付けている。興味深いことに、CytoTox-Gloアッセイは、BPIL3ペプチドに曝した細胞で有意なアポトーシスを示さなかった(データは示さず)。したがって、このペプチドはアポトーシス以外の作用機序によって増殖阻害および/または細胞死を引き起こす。トランスフェクション活性(GAPDH mRNAに対する特異的Aha1 mRNAの減少)はこのペプチドに認められなかった。
【０１６７】
細胞毒性を示したもう1つのペプチド(図5B)は、ヒトタンパク質カテリシジンに由来するものである(Nijink, A. and Hancock, R.E. (2009), 前掲)。FALLと呼ばれるこのペプチドはまた、抗菌機能を保持することが記載された。FALLペプチドは細胞への曝露時に顕著な毒性を示し、これは細胞の生存率の低下およびGAPDH mRNAレベルの減少によって反映される。潜在的トランスフェクション活性の分析は、毒性が顕著である10μM以上の濃度で(GAPDH mRNAに対する)特異的Aha1 mRNA減少の非確定的な証拠を明らかにしたにすぎない。これらの(毒性)条件下でわずかなmRNA減少が観察されただけである。しかし、より低濃度(5μM)では、Aha1 mRNAの明確かつ特異的な減少を観察することができる。このことは、FALLが、TATよりも劣るトランスフェクション効率であっても、すなわち、トランスフェクションペプチドのクラスに設定された閾値以下であっても、siRNAをトランスフェクトする能力をもつ可能性があることを示している。
【０１６８】
3.3 毒性のトランスフェクションペプチド
このペプチドのクラスには、対照はどれも含まれないが、ヒト候補ペプチドのうち5つが含まれる。後者はトランスフェクション活性の明確な証拠(すなわち、特異的なAha1ノックダウン)を示したが、細胞増殖阻害および/または毒性をも生じさせた。
【０１６９】
一例として、図6は、CU025タンパク質由来のペプチドに曝露された細胞の表現型を示す。CU025は、機能が不明なカルシウム結合ドメイン含有タンパク質(SwissProtアクセッション番号Q9Y426)である。siRNAトランスフェクション実験は、GAPDH mRNAレベルと比較して、Aha1 mRNAレベルの有意かつ特異的な減少を実証した。しかし、このペプチドはまた、生存率アッセイで測定したとき増殖阻害および/または毒性を生じさせ、かつGAPDH mRNAの有意な減少を引き起こした。この生存率の低下は、トランスフェクションおよびRNAiを達成するのに必要なペプチド濃度ですでに明らかになった。したがって、このペプチドおよびこのペプチドクラスの他のメンバーのsiRNAトランスフェクションへの適用可能性は、それらの毒性表現型によって厳しく制限される。
【０１７０】
3.4 無毒性のトランスフェクションペプチド
このクラスのペプチドは、これらのペプチドが細胞の生存率を妨げない濃度でトランスフェクション機能を有するので、siRNAのトランスフェクションを含む用途にとって最も興味深いものである。大部分の対照ペプチドはこのクラスに分類される。実験的評価のために選択された61のヒトペプチド候補のうち、3つのペプチドは、細胞の生存率をまったく妨げないか、ほんの少ししか妨げない濃度で、トランスフェクション活性の明確な証拠を示した。これらのペプチドは、まだ特性解析が行われていないカルボキシペプチダーゼCPXM2(SwissProtアクセッション番号Q8N436)、酸性スフィンゴミエリナーゼ様ホスホジエステラーゼASM3B(SwissProtアクセッション番号Q92485)、およびヒトGDNF関連神経栄養因子ニュールツリン(NRTN; Kotzbauer, P.T. et al. (1996) Nature 384, 467-470)に由来するものであった。
【０１７１】
図7は、CPXM2(図7B)、ASM3B(図7C)、およびNRTN(図7D)ペプチドのトランスフェクション媒介特異的Aha1ノックダウンおよび細胞生存率に対する影響を、TATおよびPoly-Arg(図7A)のそれと比較したものである。CPXM2とASM3Bはどちらも、Aha1特異的siRNAと共に適用したとき、有意な毒性なしに内因性Aha1 mRNAレベルの顕著な減少をもたらした。この表現型は対照ペプチドTATおよびPoly-Argに観察されたものと同様であった(データは示さず)。
【０１７２】
NRTNペプチドは、細胞の生存率にわずかな影響を与えるだけで、GAPDH mRNAレベルに比してAha1 mRNAレベルのより効果的な減少を媒介した。細胞増殖/生存率は高濃度(10μM以上)で影響を受けたにすぎない。興味深いことに、NRTNペプチドは、無毒性の低濃度で、顕著なトランスフェクション機能をまだ示した。これらの濃度で、NTRN由来ペプチドのトランスフェクション効率は、分析したすべての(陽性)対照ペプチドのそれよりも高かった。この表現型に関して、NRTNペプチドをさらに詳細な特性評価に供した。
【０１７３】
実施例４：ペプチド/siRNA複合体の形成はトランスフェクションを媒介するのに必要であるが十分ではない
TATまたはプロタミンなどの荷電ペプチドのトランスフェクション機能を説明し得る作用機序として、正に荷電したペプチドと負に荷電した核酸との複合体の形成が挙げられる。このような複合体は、ペプチドが介在する膜相互作用および/またはエンドソーム脱出機能によって、複合体化された核酸が細胞のサイトゾルに移送されることを可能にする(Law, M. et al. (2008) Biotechnol. Prog. 24, 957-963)。上記の作用機序がNTRN由来ペプチドにも同様に当てはまるかどうかに対処するため、ゲルシフトアッセイを実施した(図8参照)。そのために、siRNAを漸増濃度のペプチドと共にインキュベートし、続いてゲル電気泳動によってそれらの移動パターンを解析した。TATペプチドは、siRNA移動の予想された(陽性対照!)濃度依存的遅滞を示した(図8A)。それゆえ、TATはsiRNA分子との複合体を形成する。TATの場合は、ゲルシフトが10：1のペプチドとsiRNAの比から開始して観察されたが、最も顕著な効果は25：1以上の比で観察された。
【０１７４】
NTRN由来ペプチドに曝露されたsiRNAを用いる平行分析を図8Bに示す。siRNAの遅滞は1：1以上のペプチドとsiRNAの比ですでに観察された。さらに、TAT(常にゲルに移行した)とは対照的に、25：1のNTRNペプチド/siRNA比では、形成された複合体がローディングポケット内に保持された。より高い比では、エチジウムブロマイド染色による検出が妨げられた。この知見は、核酸とポリカチオン性ペプチドとの複合体がインターカレート剤に接近しにくい、という観察と一致している(Wolfert, M.A. and Seymour, L.W. (1996) Gene Ther. 3, 269-273)。ただし、プロテアーゼKで処理することにより、対応するsiRNAシグナルをゲルで観察することができた(図8C参照)。したがって、NRTN由来ペプチドは、高度に凝縮されているような、siRNAとの安定な複合体を形成することが可能である。
【０１７５】
これらの結果は、ペプチド/siRNA複合体の形成がTAT-およびNTRN-由来ペプチドの両方のトランスフェクション機能と関連していることを示した。それゆえ、siRNAトランスフェクションのためにペプチドの膜相互作用および/または「エンドソーム脱出」機能を利用するのに前記複合体化(すなわち、複合体形成)が必要である、と仮定することは理にかなっている。しかし、解決すべき問題は、観察された複合体化がトランスフェクション機能にとっても十分であるか?である。かくして、siRNA複合体化能力が、細胞毒性もトランスフェクション機能も示さないWNT16由来ペプチド(上記参照)について、さらに分析された。WNT16由来ペプチドに曝されたsiRNAのゲルシフトアッセイは、TATペプチドに観察されたよりもさらに強い、電気泳動siRNA移動度の明確な用量依存的遅滞を示した(図8D参照)。1：1以上のペプチド：siRNA比は効果的なゲルシフトを媒介した。非トランスフェクションペプチドが効果的に複合体を形成するという観察は、ペプチドとsiRNAとの複合体化それ自体がトランスフェクション機能を付与するのに十分ではない、ことを示している。したがって、siRNA複合体化は機能するために必要な前提条件であるようだが、ペプチドの追加の配列および/または構造的特徴もまた、トランスフェクションを媒介する上で重要であるのかもしれない。
【０１７６】
上記のデータは、NTRN由来ペプチドがsiRNA分子と複合体を形成し、かつそのトランスフェクションを効果的に媒介することを示した。適用されたsiRNAはsiAha1であったが、siAha1は、熱ショックタンパク質90 ATPaseホモログ1の活性化剤である、細胞ハウスキーピング遺伝子のmRNAを標的とする(Panaretou, B. et al. (2002), 前掲)。ルシフェラーゼmRNAに対するsiRNAを対照として用いた。
【０１７７】
NTRNペプチドがsiRNAトランスフェクションに一般的に適用可能である(そして特定のsiRNA配列に限定されない)ことを証明するために、siAha1以外のsiRNAをトランスフェクトするその能力が検討された。図9は、有糸分裂キネシンEg5のmRNAを標的とするsiRNAのNTRNペプチド媒介トランスフェクションの結果を示す(Blangy, A. et al. (1995) Cell 83, 1159-1169)。細胞Eg5 mRNAレベルの効果的な減少が10μMを超えない濃度で見られた。これらの用量で、NTRNペプチドは細胞の生存率を妨げない。Eg5 mRNAの効果的な枯渇は有糸分裂の停止を引き起こし、結果的にアポトーシスを発生させることが知られている(Blangy, A. et al. (1995), 前掲)。これに応じて、アポトーシス表現型がNTRNペプチド媒介siEg5トランスフェクションの際に観察された(図9)。同一条件下に対照siRNAでトランスフェクションを行っても細胞毒性はなく、したがって、アポトーシス表現型がEg5 mRNAの枯渇によって生じたことが確認される。
【０１７８】
上記のデータは、ヒトNRTN由来ペプチドがsiRNAのトランスフェクションを媒介するのに一般的に適用可能であるだけでなく、そのトランスフェクション効率がRNAi介在細胞表現型を引き出すのに十分であることをも示している。
【０１７９】
実施例５：トランスフェクション能力のあるペプチドは細胞内に内部移行される
スクリーニングの手法で同定されたCPPの内部移行挙動を調べるために、前記ペプチドのFITC標識誘導体(それぞれ1μM、5μM、および10μM)をFACSによって分析した。次のペプチドを使用した：トランスフェクションペプチドとしてNRTN、非トランスフェクションペプチドとしてWNT16、毒性ペプチドとしてFALL、および基準(陽性対照)としてTAT(図12参照)。MCF7細胞をOptiMEM中で蛍光ペプチド誘導体の存在下に37℃で3時間インキュベートした。続いて、細胞表面に結合したタンパク質を除去するために、それゆえに、内部移行ペプチドのモニタリングのみを確実にするために、細胞をプロテイナーゼKにより37℃で30分処理した。その後、細胞をPBSで洗浄し、FACSによって分析した。
【０１８０】
結果は、対照ペプチドTATがMCF細胞内に内部移行されることを示す(図12A参照)。TATの細胞内への取り込みはペプチドの濃度への線形依存性を示し、このことは、TATがsiRNAトランスフェクション試薬として機能する、という知見とも合致する(上記参照)。無毒性の非トランスフェクションペプチドWNT16は、MCF7細胞内への有意な取り込みを示さず(図12B)、このことは、このペプチドがsiRNAをトランスフェクトする能力がないという観察に一致する。これはまた、ペプチドの取り込みが正に荷電したアミノ酸の存在に単純に相関しないことを実証している。毒性のFALLペプチドは線形濃度依存的にMCF細胞内に内部移行された(図12C)。
【０１８１】
トランスフェクション陽性ペプチドNRTNもまたMCF7細胞内に内部移行された(図12D)。しかし、他のペプチドとは対照的に、NRTNは線形濃度依存的な取り込みを示さなかった。実際、濃度を5μMから10μMに増加させると、内部移行の大幅な増加が観察された。この知見は閾値が存在することを示唆しており、その閾値以下では取り込みが有意であるが、少ない。閾値を超えると、細胞への取り込みの顕著な増加が認められる。
【０１８２】
まとめると、これらの結果は、細胞と相互作用しかつ細胞内に内部移行されるようになるトランスフェクション陽性ペプチドの能力を示している。さらに、これらのデータは、分析されたペプチドがトランスフェクション試薬として機能するだけでなく、細胞透過性ペプチドとしても作用することを示している。
【０１８３】
実施例６：ペプチド候補のソーティング、フィルタリング、および分類
インシリコ手法と実験的スクリーニング手法を組み合わせることによって、潜在的CPPまたはトランスフェクション機能を有するペプチド配列がヒトプロテオーム中に見いだされた。これらの候補のうち、3つのペプチドは、トランスフェクション能力があるものの、無毒性であることが判明した；すなわち、それらは細胞の生存率を妨げない用量でトランスフェクション機能を保持している。こうしたペプチドは、とりわけ、将来のsiRNAベースの薬物の一部としてsiRNA送達剤を開発する際にモジュールとして役立つ可能性がある。
【０１８４】
6.1 バイオインフォマティクス的アプローチ
採用したインシリコ手法は、ヒトタンパク質に存在するすべての重複ペプチドを含む30merペプチドライブラリーに基づいていた。10×106個を超えるこれらのペプチドから、583のヒト細胞外タンパク質に由来する8630のペプチドが同定されたが、これらのペプチドは初期の検索文字列(30merペプチド中の正に荷電したアミノ酸残基(すなわち、H+K+R)＞30％)を満たすものであった。
【０１８５】
ウェットラボ実験に供したペプチドのショートリストを作成するために、候補ペプチドの数を負および正の選択段階によってさらに制限した：長い塩基性ストレッチのため、複数のペプチドヒットが単一のタンパク質に生じた場合には、冗長性(redundancy)を回避した。これらのケースのほとんどで、所定のタンパク質に由来する1つの代表的なペプチドが選択された。ペプチドの合成または取り扱いが、例えば複数のジスルフィド橋の存在または予測された低溶解性のために、困難であると認められたペプチドは、さらなる検討から除外した。実験的評価のための候補を(残りのリストから)選択するための、以下を含むいくつかの正の選択パラメータが適用された：(i)高いIEPおよび高度の疎水性；(ii)TATとの配列類似性；ならびに(iii)補体系のタンパク質、殺菌因子、およびリパーゼなどの、ペプチドの起源となるタンパク質の提案された膜相互作用機能。
【０１８６】
6.2 実験的アプローチ
実験的評価の際に、(インシリコ手法により特定された)候補ペプチドを4つのクラスに分類した：(a)非機能性ペプチド(すなわち、無毒性で非トランスフェクション)、(b)毒性の非トランスフェクションペプチド、(c)毒性のトランスフェクションペプチド、および(d)無毒性のトランスフェクションペプチド。
【０１８７】
第1のアプローチでは、ペプチド候補がそれらの最高のIEP値および疎水性プロファイルに基づいて選択され、例えば、トランスフェクション能力のある毒性ペプチドCU025およびCPXM、トランスフェクション能力のない毒性ペプチドCD026およびMMP25などが選択された。したがって、このフィルタは、正電荷アミノ酸に富むペプチド源から推定上の細胞透過性ペプチド(CPP)を同定することができる。
【０１８８】
適用された別のフィルタは、TAT基準ペプチドと候補ペプチドとの配列類似性に基づいていた。TATに対して最も顕著な類似性を有する5つのペプチドが実験的に評価された。しかし、これらのペプチドのうち4つ(TATに対して最高の類似性を示すPROK2を含む)は、細胞の生存率を妨げない用量で検出可能なトランスフェクション活性を示さなかった。NRTN由来のペプチドが唯一の機能性(すなわち、トランスフェクション能力のある)メンバーであった。このペプチドは、トランスフェクション効率がTATよりさらに高く、実施したアッセイにおいて最高のトランスフェクション機能を示した。このことは、これらのペプチドのトランスフェクション活性が一次アミノ酸配列によってだけでなく、特定の配列モチーフ、特に二次構造によっても決定される、ことを示している。
【０１８９】
第3のアプローチでは、候補ペプチドのリストを制限するために、文献データとBLAST結果の両方が採用された。実験的評価のために選択されたものは、その活性のために膜との相互作用を必要とするタンパク質に由来するペプチドであった。選択されたペプチドの大部分は機能的表現型(すなわち、トランスフェクション能力)を示さなかった。膜の完全性を破壊することがよく知られたタンパク質(補体因子またはパーフォリンなど)に由来するペプチドでさえ、トランスフェクション機能を示さなかった。この知見は、これらのタンパク質の膜破壊活性を付与するには、適切に構造化されたドメインが必要でありうることを示唆している(例えば、MACPFドメイン(Rosado, C.J. et al. (2008) Cell. Microbiol. 10, 1765-1774))。明らかに、この機能は、たとえペプチドが採用した検索戦略にマッチしたとしても、それらのペプチドが模倣することのできない機能である。
【０１９０】
一方、CPXM2およびASM3Bにそれぞれ由来する無毒性のトランスフェクションペプチドと、BPIL3およびFALL39に由来する毒性ペプチドはこの第3のグループに含まれる。興味深いことに、毒性と分類されたペプチドの一部は殺菌ペプチドに由来するものであった。この種のペプチドは病原菌の膜の完全性を妨げる。高濃度では、これらのペプチドはヒト癌細胞に対し有毒である。少なくともFALLペプチドは、特定の濃度範囲で、siRNAトランスフェクションを媒介することが示された。この知見は、原形質膜に穴が形成され、その穴を通してsiRNAの非特異的取り込みが起こる、ということで説明できる。別の説明は、ペプチドによって媒介されるsiRNA取り込みがそのペプチドの毒性によってマスクされる、というものである。さらに、最近提案された、CPP取り込みに関与する膜修復機構(Palm-Apergi, C. et al. (2009) FASEB J. 23, 214-223)もまた、これらのペプチドの一部の機能を説明するのに役立つ可能性がある。
【０１９１】
しかし、これらのペプチドがすでにトランスフェクションに必要な濃度で細胞の生存率を低下させるという事実は、siRNA送達のためのこのクラスのペプチドの適用可能性を妨げる。
【０１９２】
実施例７：NRTN由来ペプチドの特性評価
7.1 NRTN由来ペプチドの構造的特徴
ニュールツリン(NRTN)由来ペプチドは、今回のスクリーニングで同定された候補であり、細胞の生存率を妨げない濃度でsiRNAをトランスフェクトする最高の能力を一貫して示していた。このペプチドは、核酸の強い凝縮を伴うsiRNAとの非共有結合複合体を形成することが可能である。この特徴は、NRTN複合体化siRNAがエチジウムブロマイドのインターカレーションに接近できないという知見に沿っている。ゲルシフトアッセイを用いて測定したとき、NRTNとsiRNAとの複合体形成は1：50の比で最大であった。これは本明細書中で用いた機能(すなわち、トランスフェクション能力)についてのインビトロ試験系での100nM siRNA対5μMペプチドの比に相当する。しかし、インビトロ系でNRTNの濃度を複合体飽和以上の比に増加させると、さらなるトランスフェクション活性が観察される。この知見は、細胞表面でのアニオン性プロテオグリカンによる破壊からsiRNA-NRTN複合体を保護する遊離の正電荷NRTNペプチドの能力によって説明できるかもしれない。
【０１９３】
NRTNペプチドがsiRNAトランスフェクションを媒介するメカニズムは何なのだろうか?核酸との複合体の形成は、トランスフェクション能力があるすべてのペプチドがこの特徴を示したので、確かにペプチド機能の1つの必要な要件である。しかし、TATと同様によく、またはそれ以上によくsiRNA複合体を形成するが、トランスフェクション機能を持ち合わせていないペプチドも同定されていたので、複合体形成だけではトランスフェクションを媒介するのに十分ではない。さらに、一次配列の組成、すなわち存在する荷電残基および/または疎水性残基の数が、それだけで機能を媒介することもありそうにない。TATに対して配列類似性をもつ多くのペプチド(非常に高度の配列類似性をもつペプチドを含む)は非機能的であることが判明した。
【０１９４】
NRTN由来ペプチドのトランスフェクション機能のための1つの考えられる説明は、その二次構造に見ることができる。スクリーニングを行うために30merペプチドを(より短いペプチドを使用する他の大多数のアプローチ(Futaki, S. et al. (2001), 前掲; Crombez, L. et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35, 44-46; Jafari, M and Chen, P. (2009) Curr. Top. Med. Chem. 9, 1088-1097)とは対照的に)選択することは、これらのペプチドが特定の二次構造に折りたたまれて、その構造を維持する可能性がより高いという利点を有する。NRTNはTGF増殖因子タンパク質ファミリーのメンバーであり、また、それぞれの構造がすでに解明されているGDNFおよびアルテミンに類似している(Eigenbrot, C. and Gerber, N. (1997) Nat. Struct. Biol. 4, 435-438; Wang, X. et al. (2006) Structure 14, 1083-1092)。
【０１９５】
ラットGDNF配列とヒトNRTN配列の配列アライメントおよび提案された二次構造の比較から、トランスフェクション活性NRTNペプチドストレッチは二次構造を形成し得ることが明らかになった(図10参照)。機能性NRTNペプチドに対応する配列は、一部がそのタンパク質の接近可能な表面上に位置しており、かつアミノ酸の正に荷電したαへリックスストレッチを含んでいる。NRTN内のαへリックス構造の同定は、αへリックス構造が膜透過に関して有利であるという既存の仮説に、完全に沿うものである(Deshayes, S. et al. (2004), 前掲)。分析したNRTN由来ペプチドが完全なαへリックス構造だけでなく周囲の領域をも含むという観察は、より大きいペプチドをスクリーニングする本アプローチの妥当性を支持している。αへリックス構造それ自体(30merペプチドの12アミノ酸をカバーする)が効率のよいトランスフェクションを媒介するのに十分であるかどうかは、まだ解明されていない。しかし、追加の残基の少なくとも一部もまた、ペプチドの機能に必要とされるようである。
【０１９６】
これらの二次構造予測の実験的証拠を得るために、NRTNペプチドは、UV円偏光二色性(UV-CD)分光法を用いて二次構造要素の存在についてさらに分析された(例えば、Whitmore, L. and Wallace, B.A. (2008) Biopolymers 89, 392-400に概説される)。この技法は、非構造化ランダムコイルストレッチに比較して、二次構造に折りたたまれる配列要素をそれらの特定のUVスペクトルに基づいて同定することを可能にする。分析は、Jasco J 715分光偏光計(Jasco社, Easton, MD, 米国)を用いてデータピッチ0.1nmとバンド幅1nmで195nmから260nmまで行った。この装置のセルは0.1cmの長さを有していた。ペプチドは0.1mg/mlの濃度で用いた(図11参照)。
【０１９７】
αへリックス構造に折りたたまれることが以前に示されたFALLペプチドを陽性対照として使用した(Agerberth, B. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 195-199)。水溶液中で、FALLペプチドはランダムコイル構造をとった。共溶媒特性としての10％トリフルオロエタノール(TFE)の存在下で、スペクトルは208nmと222nmのそれぞれで特徴的な最小ピークを示し、TFE濃度の増加(すなわち、25％TFEおよび50％TFE；図11A参照)に伴い、より顕著になった。TFEはペプチドおよびタンパク質における二次構造を安定化し、かつそうした構造の形成を誘導することが知られている(Buck, M. (1998) Q. Rev. Blophys. 31, 297-355)。
【０１９８】
NRTNペプチドをFALLペプチドと同じアッセイ条件下で分析したとき、同様のスペクトル、すなわち、208nmと222nmのそれぞれで最小ピークを示すスペクトルが観察された。それゆえ、NRTNペプチドは、配列相同性データに基づいて予測されるように、αへリックス部分を実際に含んでいる(図11B参照)。
【０１９９】
対照的に、TATペプチドを用いて得られたスペクトルは、このペプチドが二次構造に折りたたまれる形跡を示さなかった。50％TFEの存在下でさえ、このペプチドはランダムコイル構造をとった(図11C参照)。
【０２００】
さらに、FACS解析によってモニタリングされた内部移行挙動は、NRTNペプチドが、例えばsiRNAのための、トランスフェクション試薬として機能するだけでなく、核酸分子の非存在下でさえ、細胞透過性ペプチドとして機能することを実証した。この知見から、NRTNはまた、他のペプチドまたはタンパク質などの、コンジュゲート化カーゴのための適切なキャリアとなり得ることが示唆される。とりわけ、NRTNの内部移行は使用した濃度に線形的に依存しないようである。それどころか、特定の閾値があって、それを超えると細胞への取り込みが生じるようである。こうした閾値現象はTATおよびPoly-Argなどの他のペプチドの内部移行挙動にも観察された(Duchardt, F. et al. (2007), 前掲)。
【０２０１】
さらに、FACS解析は細胞内へのFALLペプチドの強い蓄積を明らかにした。この知見は、FALLが細胞毒性ペプチドとして作用するという観察と一致する。毒性はペプチドと標的細胞との直接の物理的相互作用を必要とする。しかし、NRTNペプチドとは対照的に、FALLの内部移行挙動はその濃度に線形的に依存していた。したがって、FALLの毒性には閾値がなく、これは得られた細胞生存率データと一致して、濃度依存的な細胞毒性を示す。
【０２０２】
一方、非トランスフェクションペプチドWNT16は、細胞内に有意な程度に内部移行されなかった。したがって、ペプチドの一次配列中に正電荷アミノ酸が存在するだけでは、ペプチドのCPPとしての使用可能性を示していない。これらの結果は、(NRTNのように)二次構造に折りたたまれる配列モチーフがCPPの細胞への取り込みのための主な決定要因になり得る、というさらなるヒントを提供する。
【０２０３】
7.2 NRTN由来ペプチドは血清の存在下でトランスフェクション活性を有する
治療用siRNAの送達は、同定されたヒトCPP様ペプチドの興味をそそる1つの適用例である。非ヒト病原体由来配列を同様の機能またはより優れた機能を示すヒト配列で置換することは、トランスフェクションモジュールが免疫原性であり得るというリスクを低減させるので、治療上のアプローチとして有利である。所定のペプチドの治療への応用には、そのペプチドが十分な(トランスフェクション)活性をもつことも必要とされる。さらに、観察されたペプチドのインビトロ活性が、インビボ状況においてもその通りでなければならない。
【０２０４】
本明細書に記載したアッセイのほとんどは、ペプチド媒介トランスフェクションを検出するための、当技術分野で確立されている「標準的なインビトロ条件」下で行った(例えば、Simeoni, F. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 2717-2724; Richard, J.P. et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 15300-15306; Abes, R. et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35, 775-779; Kumar, P. et al. (2007) Nature 448, 39-43; Mueller, J. et al. (2008) Bioconjug. Chem. 19, 2363-2374; Sugita, T. et al. (2008) Br. J. Pharmacol. 153, 1143-1152)。したがって、初期の「トランスフェクション段階」でのインキュベーションは基本的には無血清の条件下で行われる。この段階での血清の添加はCPPのトランスフェクション能力を妨げる(図13参照; Ignatovich, I.A. et al. (2003), 前掲も参照されたい)。しかしながら、(CPP様)ペプチドの治療への適用可能性は、明らかに血清との接触を必要とするだろう。NRTNペプチドが、(低い血清濃度とはいえ)媒体の存在下で、依然としてトランスフェクションを媒介できる、ということは注目に値する(図13参照)。
【０２０５】
7.3 NRTN由来ペプチドは血液脳関門細胞培養モデルにおいて上皮細胞に結合して内部移行する
細胞透過性ペプチドは、細胞へのsiRNA送達のためのトランスフェクション運搬体として適用可能であるだけでなく、例えば脳内にRNAiを媒介するために、血液脳関門などの障壁を透過する上でも機能的であるらしい、ことが以前に報告されている(Mathupala, S.P. (2009) Expert Opin. Ther. Pat. 19, 137-140)。NRTNは中枢神経系に接近する可能性があるグリア細胞由来の神経栄養因子(Sariola, H. and Saarma, M. (2003) J. Cell Sci. 116, 3855-3862)であるため、NRTNはこの点でも同様に機能的でありうると推測したくなる。
【０２０６】
NRTN由来ペプチドと血液脳関門を形成する内皮細胞との潜在的相互作用を評価するために、血液脳関門(BBB)モデルで、hCMEC/D3細胞または初代ヒト脳内皮細胞をNRTN由来ペプチドに曝露した(Weksler, B.B. et al. (2005) FASEB J. 19, 1872-1874; Poller, B. et al. (2008) J. Neurochem. 107, 1358-1363)。これらの分析の結果(図14参照)から、NRTN由来ペプチドはこれらのアッセイ条件下でエンドソーム構造に蓄積する(すなわち、内部移行する)ことが明らかになった。BBB内皮細胞では、親水性分子の細胞通過が密着結合によって効果的に防止され、そしてエンドソームが血液脳関門を横切る巨大分子の制御された輸送を可能にするトランスサイトーシス機構の主な構成要素となる。こうして、NRTN由来ペプチドはBBB機能(すなわち、BBBを横切る輸送を媒介しかつ制御するためのBBB機能)にとって重要なコンパートメントに局在する。
【０２０７】
CPPの治療への適用可能性のさらに考えられる進展は、抗体および抗体フラグメントなどのターゲティング成分とのそれらの組み合わせであろう。
【０２０８】
実施例８：プロアポトーシス性ペプチドの細胞内送達のためのNRTN由来ペプチドの適用
NRTN由来ペプチドの内部移行挙動(上記参照)は、これらのペプチドが、例えばsiRNA分子の、トランスフェクション試薬として機能するだけでなく、「古典的な」細胞透過性ペプチドとしても機能することを示した。この知見は、NRTNが他のペプチドまたはタンパク質などのコンジュゲート化カーゴのための適切なキャリアにもなり得ることを示唆する。
【０２０９】
NRTN由来配列はペプチドの細胞への取り込みを媒介することが可能であるかどうかを調べるために、さまざまな生物学的活性ペプチドをNRTNに融合させた。使用したペプチド融合パートナーは、アポトーシスの媒介に関与する細胞質標的タンパク質と相互作用することが示された。言い換えれば、発現されるかまたは癌細胞の細胞質に能動的に送達される場合、これらのペプチドはアポトーシスを誘導する(すなわち、それらは「プロアポトーシス性」である)。しかし、これらのプロアポトーシス性ペプチドは生体膜それ自体を透過することができない。TAT、ペネトラチン、およびpoly-Argなどの既知CPPへのそれらのコンジュゲーションまたは融合のみが、細胞への取り込みと、ひいてはアポトーシスの誘導を可能にする。
【０２１０】
NRTN由来配列の細胞透過機能を評価するために、次の融合パートナーを使用した：(i)BCL2と相互作用して、それをプロアポトーシス性分子に変換する、核内受容体Nur77由来ペプチド；および(ii)mRNAの5'キャップ構造に結合して、癌細胞のアポトーシスをモジュレートすることが知られている翻訳因子elF4Eと相互作用する、4E-BP1由来ペプチド。
【０２１１】
8.1 プロアポトーシス性NUR77由来ペプチドのNRTN媒介細胞内取り込み
Nur77は、BCLBおよびBCL2などの、アポトーシスの重要なメディエーターと相互作用することができる核内オーファン受容体である。Nur77とBCL2との相互作用は、BCL2のコンフォメーション変化を引き起こし、結果的にそのBH3ドメインの露出をもたらす。これによって、BCL-2はプロアポトーシス機能のあるタンパク質に変換される(Lin, B. et al. (2004) Cell 116, 527-540; Luciano, F. et al. (2007) Blood 109, 3849-3855)。同じ変換は、Nor1などの関連ペプチドに由来するペプチドを用いても達成することができる(Kolluri, S.K. et al. (2008) Cancer Cell 14, 285-298)。
【０２１２】
Nor1およびNur77のそれぞれのBCL2相互作用配列は次のようにアライメントすることができる：
2013531988.tif 000009
BCL-2と相互作用することが可能な、さらに小さいペプチドは、Nor1のC末端12アミノ酸からなる：
2013531988.tif 000010
【０２１３】
BCL-2をプロアポトーシス性分子に変換する能力が判明したにもかかわらず、後者のペプチド(すなわち、「Nor/Nur」；SEQ ID NO: 72)の癌細胞への添加は、高濃度でさえも、アポトーシスを誘導するのに十分ではない。それは、細胞標的タンパク質が細胞質内に位置するが、ペプチドそれ自体が標的に到達するために細胞膜を効果的に透過することができないためである。簡単に説明すると、MCF-7乳癌細胞をこのペプチドの存在下で24時間インキュベートした。細胞の生存率の低下またはアポトーシスの誘導は観察されなかった(細胞毒性および生存率のアッセイについては実施例1を参照されたい)。同様に、ヒト由来CPP NRTNへのこれらの細胞の曝露は、細胞の生存率に影響を及ぼさず、アポトーシスの誘導にもつながらなかった(図15参照)。
【０２１４】
NRTNが実際にCPP機能をもつかどうかを分析するために、C末端でNRTNペプチドの一部に融合されたN末端のNur77由来ペプチドストレッチを含むハイブリッド配列を作製した。適切な融合位置を定めるために、Nur77ペプチドのC末端部分はNRTNペプチド内の配列ストレッチに類似していることが分かり、その領域を融合点として選んだ。得られたNurNRTN融合ペプチドならびに2つの親ペプチドのアミノ酸配列を図15の下部パネルに概略的に示してある。その融合ペプチドは(ほとんど変更されていない形の)Nur77の全長配列ストレッチとNRTNペプチドの短縮されたN末端ストレッチを保持している。得られたペプチドは親NRTNペプチドと同じ長さ(30アミノ酸)を有する。
【０２１５】
NurNRTNのアミノ酸配列は次のとおりである：
2013531988.tif 000011
【０２１６】
Nur77由来ペプチドのBCL2結合特性がNurNRTN融合ペプチドで維持されているかどうかを調べるために、それぞれのNurNRTNおよびNRTNペプチドをヨードアセチルビーズ(Pierce Biotechnology社, Rockford, IL, 米国)にカップリングさせた。そのビーズを組換えBCL2(Calbiochem/Merck社, Darmstadt, ドイツ)とインキュベートし、PBSおよび0.5M NaCl, 0.025 NaN3, 0.05％Tween20で洗浄して未結合タンパク質を除去した。固定化NurNTRN融合ペプチドへのBCL2の特異的結合は、溶出緩衝液(pH2.8)を用いてビーズから結合ペプチドを溶出し、溶出された画分をニトロセルロース(Invitrogen社, Carlsbad, CA, 米国)に移行させ、そしてMemCode Reversible Protein Stain Kit (Pierce Biotechnology社, Rockford, IL, 米国)を用いてタンパク質を検出することによって測定した。これらの分析の結果は、BCL2がNurNRTN融合ペプチドでコーティングされたビーズからの溶出液中に検出され得ることを明らかにした。これとは対照的に、NRTNペプチドでコーティングされたビーズからはごく少量のBCL2しか溶出されなかった。それゆえ、NurNRTN融合ペプチドはBCL2に結合する能力を保持している。
【０２１７】
続いて、NurNRTN融合ペプチドは細胞膜を透過する能力があり、それによって細胞内でプロアポトーシス活性を誘導するかどうかを評価した。MCF-7ヒト乳癌細胞をモデルとして使用した。実験的アプローチは先に記載したとおりであった(実施例1参照)。Nur77およびNRTNペプチドをそれぞれ試験したとき細胞毒性をもたらさなかったペプチド濃度で、融合ペプチドはアポトーシスの誘導によっても反映される顕著な細胞毒性を示した(図15参照)。この効果は用量依存的であった：細胞毒性はペプチドの濃度の増加に伴って増加した。
【０２１８】
対照として、NURペプチドの不活性変異体をNRTNペプチドに融合させた。このペプチドは細胞の生存率を妨げなかった。さらに、NURペプチドと不活性WNT16ペプチドとの融合体も細胞生存率を妨げなかった。
【０２１９】
これらの結果は、NRTN由来配列とそれ自体細胞透過性でないペプチドとの融合体が細胞に進入して、細胞内活性を誘発できる、ことを実証している。言い換えれば、その融合ペプチドのNRTN部分は、細胞内でNur77(すなわち、カーゴ)のプロアポトーシス活性を発揮させるために、運搬体として機能する。さらに、これらの結果は、そのアミノ末端で改変されているNRTN由来配列がCPP機能を保持しているという証拠を提供する。
【０２２０】
8.2 プロアポトーシス性4E-BP1由来ペプチドのNRTN媒介細胞内取り込み
elF4Eは、mRNAの5'キャップ構造に結合する翻訳因子であり、細胞の生存にとって重要である。elF4Eの機能を妨害すると、癌細胞のアポトーシスに導くことができる。タンパク質4E-BP1はelF4Eに結合し、それによってelF4Eの機能をモジュレート/妨害する。その結果、4E-BP1レベルの上昇は、そのelF4E機能のモジュレーションゆえに、翻訳の阻害をもたらし、ひいては癌細胞のアポトーシスを誘導する(Flynn, A. and Proud, C.G. (1996) Cancer Surv. 27, 293-310; Robert, F. and Pelletier, J. (2009) Expert Opin. Ther. Targets 13, 1279-1293)。
【０２２１】
全長4E-BP1のプロアポトーシス機能は20アミノ酸長の小さいペプチドでも達成することができる(Tomoo, K. et al. (2006) Biochem. J. 140, 237-246)。このペプチドはel4FE結合モチーフ(YXRXXLB、ここでXは任意のアミノ酸、Bは疎水性残基である; Moerke, N.J. et al. (2007) Cell 128, 257-267)を含む。さらなる解析によって、この結合モチーフの残りの3つのアミノ酸残基(すなわち、Y、R、L)はプロアポトーシス機能にとって重要であることが示された(Marcotrigiano, J. et al. (1999) Mol. Cell 3, 707-716)。これらの残基を変異させる(例えば、グリシン残基で置換する)と、活性4EBP1由来ペプチドが不活性誘導体へと変換されることになる。
【０２２２】
本明細書で用いる活性および不活性4E-BP1ペプチドのアミノ酸配列は次のとおりである(すべての配列については、図16の下部パネルも参照されたい)：
2013531988.tif 000012
【０２２３】
elF4Eをブロックする能力が判明しているにもかかわらず、4E-BP1由来ペプチドの癌細胞への単純な添加は、高濃度でさえも、アポトーシスを誘導するのに十分ではない。それは、細胞標的タンパク質が細胞質内に位置するが、ペプチドそれ自体が標的に到達するために細胞膜を効果的に透過することができないためである。簡単に説明すると、MCF-7乳癌細胞をこのペプチドの存在下で24時間インキュベートした。細胞の生存率の低下またはアポトーシスの誘導は観察されなかった(細胞毒性および生存率のアッセイについては実施例1を参照されたい)。同様に、ヒト由来CPP NRTNへのこれらの細胞の曝露は、細胞の生存率に影響を及ぼさず、アポトーシスの誘導にもつながらなかった(図16、上部パネル参照)。
【０２２４】
以前に、TATなどの既知CPPを4EBP1由来ペプチドに融合させると、その融合ペプチドの細胞への取り込みが起こることが示されていた(Ko, S.Y. et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15, 4336-4347)。次のTAT/elFE4融合ペプチドを本明細書で用いた：
2013531988.tif 000013
【０２２５】
これらのTAT/4E-BP1融合ペプチドの存在下で24時間インキュベートしたMCF-7乳癌細胞は、20μMの濃度で、細胞生存率の低下およびアポトーシスの誘導による細胞毒性についての明確な証拠を示した(細胞毒性および生存率のアッセイについては実施例1を参照されたい)。この効果は、対応する変異体が完全に不活性であったので、機能的に活性な(すなわち、プロアポトーシス性の)4E-BP1ペプチド配列によって特異的に媒介されたものである(実施例16、中間パネル参照)。
【０２２６】
NRTNが実際にCPP機能をもつかどうかを分析するために、C末端で活性または不活性4EBP1由来ペプチドストレッチに融合されたN末端のNRTNペプチドの一部を含むハイブリッド配列を作製した。得られた2つの融合ペプチドのアミノ酸配列を図16の下部パネルに概略的に示してある。これらの融合ペプチドは4E-BP1の全長配列ストレッチおよび全長NRTNペプチドを保持しており、合計の長さが50アミノ酸となる。したがって、これらの分子は既知CPPよりかなり大きくなっている。
【０２２７】
活性または不活性NRTN/4E-BP1融合ペプチドのアミノ酸配列は次のとおりである：
2013531988.tif 000014
【０２２８】
続いて、NRTN4E-BP1融合ペプチドは細胞膜を透過する能力があり、それによって細胞内でプロアポトーシス活性を誘導するかどうかを評価した。MCF-7ヒト乳癌細胞をモデルとして使用した。実験的アプローチは先に記載したとおりであった(実施例1参照)。4E-BP1およびNRTNペプチドをそれぞれ試験したとき細胞毒性をもたらさなかったペプチド濃度で、融合ペプチドはアポトーシスの誘導によっても反映される顕著な細胞毒性を示した(図16、中間パネル参照)。この効果は用量依存的であった：細胞毒性はペプチドの濃度の増加に伴って増加した。
【０２２９】
さらに、NRTN融合ペプチドは、そのTAT融合対応物と比較して、有意に高い効率を示した。その上、観察された細胞毒性は、融合ペプチドの対応する変異体が不活性であったので、機能的に活性な(すなわち、プロアポトーシス性の)4E-BP1ペプチド配列部分によって特異的に媒介されたものである(実施例16、中間パネル参照)。4E-BP1ペプチドとWNT16ペプチドとの融合体は細胞生存率を妨げなかった。
【０２３０】
これらの結果は、NRTN由来配列とそれ自体細胞透過性でないペプチドとの融合体が細胞に進入して、細胞内活性を誘発できる、ことを実証している。TAT融合ペプチドとの直接比較は、NRTN融合体がより高い効率をもつことを明らかにした。これらの結果はまた、そのカルボキシ末端で改変されているNRTN由来配列がCPP機能を保持するという証拠を提供する。最後に、NRTN由来配列を利用することによって、少なくとも50アミノ酸の長さを有する機能性CPPを作製することが可能である。
【０２３１】
本明細書で例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素、限定の非存在下で、適切に実施することが可能である。したがって、例えば、用語「含む」(comprising, including, containing)は、拡張的かつ限定なしと読み取るものとする。さらに、本明細書で用いた用語および表現は、限定のためではなく、説明のための用語として使用されており、また、示されたおよび記載された特徴またはその部分の任意の均等物を除外するための、そうした用語および表現の使用を意図しておらず、さまざまな変更がクレームされた本発明の範囲内で可能であることが認識される。かくして、本発明は態様および任意的な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に記載の本発明の変更および改変が当業者によってなされ得ること、そしてそのような変更および改変は本発明の範囲内にあるとみなされること、を理解すべきである。
【０２３２】
本発明は本明細書中では広範にかつ上位概念で記載されている。上位概念の開示の範囲内に入る、より狭い種および下位概念のグループ分けもまた、それぞれが本発明の一部を構成する。これには、その属から任意の主題を除く但し書きまたはマイナスの限定を含む本発明の上位概念の記載が含まれ、除かれた材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関係はない。
【０２３３】
他の態様は以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループで記載されている場合、当業者は、本発明がそのマーカッシュグループの個々のメンバーまたは複数のメンバーのサブグループによっても記載されることを認識するだろう。
【０２３４】
（表１）実験的評価に供されたヒト候補CPPおよび対照ペプチド
対照ペプチドはグレーで示される。「クラス」の欄は、ペプチドのトランスフェクション能力および細胞毒性に関するペプチドの機能的分類を表す：「-」、無毒性の非トランスフェクションペプチド；「tox」、毒性の非トランスフェクションペプチド；「+/tox」、毒性のトランスフェクションペプチド；「+」、無毒性のトランスフェクションペプチド。
2013531988.tif 000015
2013531988.tif 000016
2013531988.tif 000017
【図１】
2013531988.tif 000021
【図２】
2013531988.tif 000022
【図３】
2013531988.tif 000023
【図４】
2013531988.tif 000024
【図５】
2013531988.tif 000025
【図６】
2013531988.tif 000026
【図７】
2013531988.tif 000027
【図８】
2013531988.tif 000028
【図９】
2013531988.tif 000029
【図１０】
2013531988.tif 000030
【図１１】
2013531988.tif 000031
【図１２】
2013531988.tif 000032
【図１３】
2013531988.tif 000033
【図１４】
2013531988.tif 000034
【図１５】
2013531988.tif 000035
【図１６】
2013531988.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に内部移行する能力があるペプチドであって、
(a)
2013531988.tif 000037
およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたって有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつ
(b)アミノ酸配列
2013531988.tif 000038
を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも200％の効率で細胞内に内部移行される、
ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドの少なくとも一部がαへリックス二次構造を形成している、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである、請求項1または2記載のペプチド。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項５】
請求項4記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６】
請求項5記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドの生産方法であって：
(a)請求項6記載の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階；および
(b)産生されたペプチドを単離する段階
を含む、方法。
【請求項８】
1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されており、該結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを含む組成物。
【請求項９】
少なくとも1つのペプチドが1つ以上の他のペプチドに結合されている、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記1つ以上の他のペプチドが少なくとも部分的にαへリックス二次構造を形成している、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
前記1つ以上の他のペプチドがプロアポトーシス性ペプチドである、請求項9または10記載の組成物。
【請求項１２】
請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の生産方法であって：
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを提供する段階；および
(b)該少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の内部移行挙動を検出する方法であって：
(a)該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および
(b)該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項1〜3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物を含み、かつ任意に、1種以上の薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
1つ以上の細胞のインビトロの形質転換またはトランスフェクションのための、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１６】
癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療に使用するための、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
以下の少なくともいずれか1つを含むキット・オブ・パーツ(kit-of-parts)：
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド；
(b)請求項4記載の核酸分子；
(c)請求項5記載のベクター；
(d)請求項6記載の宿主細胞；および
(e)請求項8〜11のいずれか一項記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
[本発明1001]
細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子であって、
(a) 
2013531988.tif 000039
およびSEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 4のいずれか1つに対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％の全体的な配列同一性をその全長にわたって有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつ
(b)アミノ酸配列
2013531988.tif 000040
を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも200％の効率で細胞内に内部移行される、
ペプチド分子。
[本発明1002]
前記ペプチドの少なくとも一部がαへリックス二次構造を形成している、本発明1001のペプチド。
[本発明1003]
哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである、本発明1001または1002のペプチド。
[本発明1004]
本発明1001〜1003のいずれかのペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1005]
本発明1004の核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1006]
本発明1005のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1007]
本発明1001〜1003のいずれかのペプチドの生産方法であって：
(a)本発明1006の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階；および
(b)産生されたペプチドを単離する段階
を含む、方法。
[本発明1008]
1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されており、該結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成されている、本発明1001〜1003のいずれかの少なくとも1つのペプチドを含む組成物。
[本発明1009]
少なくとも1つのペプチドが1つ以上の他のペプチドに結合されている、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
前記1つ以上の他のペプチドが少なくとも部分的にαへリックス二次構造を形成している、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
前記1つ以上の他のペプチドがプロアポトーシス性ペプチドである、本発明1009または1010の組成物。
[本発明1012]
本発明1008〜1011のいずれかの組成物の生産方法であって：
(a)本発明1001〜1003のいずれかの少なくとも1つのペプチドを提供する段階；および
(b)該少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階
を含む、方法。
[本発明1013]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドまたは本発明1008〜1011のいずれかの組成物の内部移行挙動を検出する方法であって：
(a)該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階；および
(b)該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階
を含む、方法。
[本発明1014]
本発明1001〜1003のいずれかの少なくとも1つのペプチドまたは本発明1008〜1011のいずれかの組成物を含み、かつ任意に、1種以上の薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤をさらに含む、薬学的組成物。
[本発明1015]
1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための、本発明1001〜1003のいずれかのペプチドまたは本発明1008〜1011のいずれかの組成物の使用。
[本発明1016]
癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療に使用するための、本発明1001〜1003のいずれかのペプチドまたは本発明1008〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1017]
本発明1001〜1003のいずれかの少なくとも1つのペプチドまたは本発明1008〜1011のいずれかの組成物を対象に投与する段階を含む、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防および/または治療の方法。
[本発明1018]
以下の少なくともいずれか1つを含むキット・オブ・パーツ(kit-of-parts)：
(a)本発明1001〜1003のいずれかのペプチド；
(b)本発明1004の核酸分子；
(c)本発明1005のベクター；
(d)本発明1006の宿主細胞；および
(e)本発明1008〜1011のいずれかの組成物。
本発明の他の態様は、以後の詳細な説明から明らかになるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013531988000001.app
【国際調査報告】
2013531988.tif 000041
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