(57)【要約】  腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、例えば、ヒトＴＮＦ−αに結合する、単離された結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合部分ならびに関連する抗体ベースの組成物および分子が開示される。前記抗体を含む医薬組成物、ならびにこの抗体を使用するための治療方法および診断方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に結合することが可能な抗原結合ドメインを含むヒト化結合タンパク質であって、抗原結合ドメインが配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５；配列番号２２の残基９８−１０６；配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の５０−５６または配列番号２３の残基８９−９７のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワークを含む、結合タンパク質。
【請求項２】
少なくとも３つのＣＤＲを含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも３つのＣＤＲが、（ａ）配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５；および配列番号２２の残基９８−１０６ならびに（ｂ）配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の残基５０−５６；または配列番号２３の残基８９−９７である可変ドメインＣＤＲの組を含む、請求項２の結合タンパク質。
【請求項４】
抗原結合ドメインが、配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５；配列番号２２の残基９８−１０６；配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の５０−５６；および配列番号２３の残基８９−９７を含むアミノ酸配列を含む、請求項３の結合タンパク質。
【請求項５】
抗原結合ドメインがＶＨ領域を含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項６】
ＶＨ領域が配列番号２４、２５、２８、２９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸配列を含む、請求項５の結合タンパク質。
【請求項７】
抗原結合ドメインがＶＬ領域を含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項８】
ＶＬ領域アミノ酸配列が配列番号２６、２７、３４、３５および３６である、請求項７の結合タンパク質。
【請求項９】
抗原結合ドメインがＶＨ領域およびＶＬ領域を含む、請求項７の結合タンパク質。
【請求項１０】
ＶＨ領域が配列番号２４、２５、２８、２９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸配列を含み、ならびにＶＬ領域が配列番号２６、２７、３４、３５および３６のアミノ酸配列を含む、請求項９の結合タンパク質。
【請求項１１】
ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号６−２１のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項１２】
ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号９、１０、１１、１２、１５、１６、１７または２１のアミノ酸配列を含む、請求項１１の結合タンパク質。
【請求項１３】
ヒトアクセプターフレームワークが少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列に対して少なくとも６５％同一であり、ならびに前記ヒトアクセプターフレームワークに対して同一である少なくとも７０アミノ酸残基を含む、請求項１１または１２の結合タンパク質。
【請求項１４】
ヒトアクセプターフレームワークが、ＣＤＲに隣接している残基；グリコシル化部位残基；希少残基；ヒトＴＮＦ−αと相互作用することができる残基；ＣＤＲと相互作用することができる残基；カノニカル残基；重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基；バーニアゾーン内の残基；Ｃｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１またはＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワーク間にまたがる領域中の残基であるキー残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む、請求項１３の結合タンパク質。
【請求項１５】
キー残基が、Ｈ１、Ｈ１２、Ｈ２４、Ｈ２７、Ｈ２９、Ｈ３７、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ７６、Ｈ７８、Ｌ１３、Ｌ４３、Ｌ５８、Ｌ７０またはＬ８０である、請求項１４の結合タンパク質。
【請求項１６】
ＶＨ突然変異が、Ｑ１Ｅ、Ｉ１２Ｖ、Ａ２４Ｖ、Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｖ２９Ｆ、Ｆ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｖ６７Ｌ、Ｆ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｒ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｎ７６Ｓ、Ｌ７８ＩまたはＦ７８Ｉである、請求項１５の結合タンパク質。
【請求項１７】
ＶＬ突然変異が、Ｖ１３Ｌ、Ａ４３Ｓ、Ｉ５８Ｖ、Ｅ７０ＤまたはＳ８０Ｐである、請求項１５の結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２４および配列番号２６；配列番号２４および配列番号２７；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２５または配列番号２７のアミノ酸配列を有する２つの可変ドメインを含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項１９】
ＴＮＦ−αの生物学的機能を調節する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２０】
ＴＮＦ−αを中和する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２１】
ＴＮＦ−αのその受容体に結合する能力を減少させる、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２２】
プロヒトＴＮＦ−α、成熟ヒトＴＮＦ−αまたは切断型ヒトＴＮＦ−αのその受容体に結合する能力を減少させる、請求項２１の結合タンパク質。
【請求項２３】
ＴＮＦ依存性サイトカイン産生；ＴＮＦ依存性細胞死滅；ＴＮＦ依存性炎症；ＴＮＦ依存性骨浸食およびＴＮＦ依存性軟骨損傷のうちの１つ以上を減少させる、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２４】
表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２５】
表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；または最大約１０−６ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２６】
最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ；または最大１０−１３Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２７】
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＡ定常ドメインまたはヒトＩｇＥ定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１の結合タンパク質。
【請求項２８】
重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインがヒトＩｇＧ１定常ドメインである、請求項２７の結合タンパク質。
【請求項２９】
ヒトＩｇκ定常ドメインまたはヒトＩｇλ定常ドメインをさらに含む、請求項１または２７の結合タンパク質。
【請求項３０】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインが、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２８の結合タンパク質。
【請求項３１】
軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＩｇκ定常ドメインである、または配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＩｇλ定常ドメインである、請求項２９の結合タンパク質。
【請求項３２】
ヒトＴＮＦ−αに結合することが可能な結合タンパク質であって、
配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇ定常重領域；
配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を有するＩｇ定常軽領域；
配列番号２４、２５、２８、２９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸配列を有するＩｇ可変重領域；および
配列番号２６、２７、３４、３５または３６のアミノ酸配列を有するＩｇ可変軽領域
を含む、結合タンパク質。
【請求項３３】
免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植された抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、多重特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’断片、二特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または単一鎖抗体である、請求項１の結合タンパク質。
【請求項３４】
結晶の形態である、請求項１の結合タンパク質を含む結晶化された結合タンパク質。
【請求項３５】
結晶が担体を含まない医薬徐放結晶である、請求項３４の結晶化された結合タンパク質。
【請求項３６】
結合タンパク質が、インビボにおいて、前記結合タンパク質の可溶性対応物より長い半減期を有する、請求項３４の結晶化された結合タンパク質。
【請求項３７】
（ａ）請求項１または３４の結合タンパク質および成分を含む製剤ならびに（ｂ）少なくとも１つのポリマー担体を含む、ＴＮＦ−α結合タンパク質の放出のための組成物。
【請求項３８】
成分が、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項３７の組成物。
【請求項３９】
ポリマー担体が、ポリアクリル酸、ポリシアノアクリラート、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリデプシペプチド、ポリエステル、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリｂ−ヒドロキシブチラート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン；ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリオルガノホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化された多糖ならびにこれらの混合物および共重合体からなる群の１つ以上から選択されるポリマーである、請求項３７の組成物。
【請求項４０】
請求項１の結合タンパク質およびリンカーまたは免疫グロブリン定常ドメインを含むＴＮＦ−α結合タンパク質構築物。
【請求項４１】
結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項４０のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物。
【請求項４２】
結晶化されたＴＮＦ−α結合タンパク質構築物である、請求項４０のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物。
【請求項４３】
結晶化されたＴＮＦ−α結合タンパク質構築物が、無担体医薬徐放結晶化ＴＮＦ−α結合タンパク質構築物である、請求項４２のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物。
【請求項４４】
前記結合タンパク質構築物の可溶性相当物より大きなインビボ半減期を有する、請求項４０のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物。
【請求項４５】
請求項４０のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物を含み、免疫接着分子、造影剤、治療剤または細胞毒性剤をさらに含む、ＴＮＦ−α結合タンパク質連結体。
【請求項４６】
作用物質が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンである造影剤である、請求項４５の結合タンパク質連結体。
【請求項４７】
放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍである、請求項４６のＴＮＦ−α結合タンパク質連結体。
【請求項４８】
作用物質が、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンまたはアポトーシス剤である治療剤または細胞毒性剤である、請求項４７のＴＮＦ−α結合タンパク質連結体。
【請求項４９】
請求項１のアミノ酸配列を含む結合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項５０】
請求項４０のアミノ酸配列を含むＴＮＦ−α結合タンパク質構築物をコードする単離された核酸。
【請求項５１】
請求項４９または５０の単離された核酸を含むベクター。
【請求項５２】
ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶおよびｐＢＪからなる群から選択される、請求項５１のベクター。
【請求項５３】
請求項５１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
原核細胞である、請求項５３の宿主細胞。
【請求項５５】
真核細胞である、請求項５３の宿主細胞。
【請求項５６】
真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、トリ細胞または昆虫細胞である、請求項５５の宿主細胞。
【請求項５７】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項５５の宿主細胞。
【請求項５８】
ＴＮＦ−αに結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で培養培地において請求項５３の宿主細胞を培養する段階を含む、ＴＮＦ−αに結合するタンパク質を産生する方法。
【請求項５９】
請求項５８の方法に従って生産されたＴＮＦ−α結合タンパク質。
【請求項６０】
請求項１の結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６１】
医薬として許容される担体が、アジュバンドとして機能する、請求項６０の医薬組成物。
【請求項６２】
アジュバンドがヒアルロニダーゼである、請求項６０１の医薬組成物。
【請求項６３】
ＴＮＦ−α活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項６０の医薬組成物。
【請求項６４】
追加の作用物質が、治療剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子遮断剤、接着分子遮断剤、抗サイトカイン抗体またはその機能的断片、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識、検出可能なレポーター、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、経口ステロイド、エピネフリンまたはその類似体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストである、請求項６３の医薬組成物。
【請求項６５】
請求項６０の有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法。
【請求項６６】
ヒトＴＮＦ−α活性を減少させるための方法であって、ヒトＴＮＦ−α活性が減少するように、ヒトＴＮＦ−αを請求項１の結合タンパク質と接触させる段階を含む、方法。
【請求項６７】
ＴＮＦ−α活性が有害である疾患に罹患しているヒト対象におけるヒトＴＮＦ−α活性を減少させるための方法であって、ヒト対象におけるヒトＴＮＦ−α活性が減少するように、および／または治療が達成されるように、請求項１の結合タンパク質をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項６８】
請求項１の結合タンパク質を第二の作用物質の投与前に、それと同時にまたはその後で投与する段階を含む、ＴＮＦ−αが有害である疾患に罹っている患者を治療する方法であって、前記第二の作用物質がヒトＩＬ−１２に結合することが可能な抗体もしくはその断片；ＰＧＥ２；ＬＰＡ；ＮＧＦ；ＣＧＲＰ；ＳｕｂＰ；ＲＡＧＥ；ヒスタミン；ヒスタミン受容体遮断剤；ブラジキニン；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＶＥＧＦ；ＰＬＧＦ；メトトレキサート；コルチコステロイド、グルココルチコイド受容体修飾薬；シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６または非ステロイド系抗炎症薬である、方法。
【請求項６９】
疾患が、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性および非アレルギー性喘息；感染による喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症を伴う状態；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性疾患；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症および／または自己免疫状態；胃腸器の炎症および／または自己免疫状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症および／または自己免疫状態；肝硬変；肝線維症；Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝線維症；強皮症；腫瘍または癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染；ＨＴＬＶ−１感染；保護的１型免疫応答の発現の抑制ならびに予防接種中の保護的１型免疫応答の発現の抑制である、請求項６８の方法。
【請求項７０】
疾患が、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、バセドウ病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑症、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生性疾患、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、発作、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、孤発性の、多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型および多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎、関節炎、ライター病、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸性関節炎、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、エルシニアおよびサルモネラ関連関節炎、脊椎関節症、アテローム性疾患／アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、突発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型原発性低γグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、繊維性肺疾患、突発性間質性肺炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患関連間質性肺疾患、混合性結合組織疾患関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性紅斑性狼瘡関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモシデローシス関連肺疾患、薬物によって誘導された間質性肺疾患、繊維症、放射性繊維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インシュリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連する急性免疫疾患、臓器移植に関連する慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎臓病ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状紅斑性狼瘡、男性不妊症特発性またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（すべてのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱���リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｏｓｔａｔｉｓ）、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギーおよび喘息、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染、精神障害（例えば、うつ病および統合失調症）、Ｔｈ２型およびＴｈ１型によって媒介される疾病、急性および慢性疼痛（疼痛の様々な形態）、ならびに、肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌および腎臓癌および造血性悪性病変（白血病およびリンパ腫）などの癌、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性および慢性寄生性または感染性プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性または慢性細菌感染、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房（ａｅｒｉａｌ）異所性拍動、ＡＩＤＳ認知症複合、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植拒絶、α−１−アンチトリプシン欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗ｃｄ３治療、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏症反応、大動脈（ａｏｒｄｉｃ）および動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈痩、運動失調、心房細動（持続的または発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心機能不全症候群（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｕｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性、小脳疾患、無秩序なまたは多巣性心房頻脈、化学療法関連疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール症、慢性炎症性病変、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、うっ血性心不全、結膜炎、接触性皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性繊維症、サイトカイン療法関連疾患、ボクサー脳、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚科学的症状、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化疾患、瀰漫性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、大脳基底核の疾患、中年のダウン症候群、中枢神経ドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発された薬物誘発性運動疾患、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌疾患、喉頭蓋炎、エプスタイン−バーウイルス感染、紅痛症、垂体外路および小脳疾患、家族性血球貪食性リンパ組織球症、致死的胸腺移植組織拒絶、フリードライヒ失調症、機能的末梢動脈疾患、真菌性敗血症、ガス壊疸、胃潰瘍、糸球体腎炎、いずれかの臓器または組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物に起因する肉芽腫、有毛細胞白血病、ハラーホルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、枯草熱、心臓移植拒絶、血色素症、血��透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解血小板減少紫斑病、出血、肝炎（Ａ型）、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、運動過剰疾患、過敏症反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下疾患、視床下部−下垂体−副腎皮質系評価、特発性アジソン病、特発性肺繊維症、抗体媒介性細胞毒性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線曝露、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再灌流障害、虚血性発作、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、口唇浮腫（ｌｉｐｅｄｅｍａ）、肝臓移植拒絶、リンパ浮腫（ｌｙｍｐｈｅｄｅｒｍａ）、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性／特発性、偏頭痛、ミトコンドリア多系疾患（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉ．ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、混合性結合組織病、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性（メンセル・デジェリーヌ−トーマス・シャイ−ドレーガーおよびマシャド−ジョセフ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・チュバキュロシス、骨髄形成異常、心筋梗塞、真菌虚血疾患、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性Ｉ筋萎縮、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、閉塞性動脈疾患、ＯＫＴ３（登録商標）療法、精巣炎／精巣上体炎、精巣炎／精管復元術処置、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵癌、腫瘍随伴性症候群／悪性腫瘍の高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性疾患、末梢血管疾患、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経炎、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症および皮膚変化症候群、灌流後症候群、ポンプ後症候群、心筋梗塞後開心術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧、放射線療法、レイノー現象および病、レイノー病、レフサム病、規則的なＱＲＳ幅の狭い頻脈症（ｒｅｇｕｌａｒ  ｎａｒｒｏｗ  ＱＲＳ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、腎血管性高血圧、再灌流障害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老年性舞踏病、レビー小体型の老年性認知症、血清反応陰性関節炎、ショック、鎌形赤血球貧血症、皮膚同種異系移植拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶、固形腫瘍、特異性不整脈（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｒｒｙｔｈｍｉａｓ）、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、湿疹、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞またはＦＡＢＡＬＬ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏症反応、ＩＶ型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、じんましん、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルスおよび真菌感染、ウイルス性脳炎（ｖｉｔａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）／無菌性髄膜���、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウィルソン病、いずれかの臓器または組織の異種移植拒絶、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、急性虚血、成人スチル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫異常、自己免疫性腸症、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早期卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心血管疾患、劇症型抗リン脂質症候群、セリアック病、頚部脊椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症のリスクを有する臨床的孤発症候群（ｃｉｓ）、結膜炎、小児発症精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、真性糖尿病、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜症、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症型多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、枯草熱、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ媒介性アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｊｕｎｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、クスマウル病またはクスマウル−マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞性組織球症、網状皮斑、黄斑変性、顕微鏡的多発性血管炎、モルブス・ベヒテレフ（ｍｏｒｂｕｓ  ｂｅｃｈｔｅｒｅｖ）、運動ニューロン疾患、粘膜性類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非Ａ非Ｂ型肝炎、視神経炎、骨溶解、卵巣癌、小関節性ＪＲＡ、末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発性動脈炎（または結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、白毛症、多関節性ＪＲＡ、多内分泌欠損症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ）、ポンプ後症候群、原発性パーキンソニズム、前立腺癌および直腸癌および造血性悪性病変（白血病およびリンパ腫）、前立腺炎、赤芽球癆、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、
ｓａｐｈｏ（滑膜炎、アクネ、膿疱症、骨過形成および骨髄炎）、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、二次性副腎不全、シリコーン関連結合組織病、スネドン−ウィルキンソン皮膚症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラスマ性網膜炎、中毒性表皮剥離症、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体関連周期的症候群）、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、じんましん、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季結膜炎、ウイルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性、創傷治癒、エルシニアまたはサルモネラ関連間接症からなる群から選択される、請求項６８の方法。
【請求項７１】
ＴＮＦ−αが有害である疾患に罹っている患者を治療する方法であって、請求項１の結合タンパク質を第二の作用物質の投与前に、それと同時にまたはその後で投与する段階を含み、前記第二の作用物質が吸入ステロイド；βアゴニスト；短時間作用性または長時間作用性βアゴニスト；ロイコトリエンまたはロイコトリエン受容体のアンタゴニスト；ＡＤＶＡＩＲ；ＩｇＥ阻害剤；抗ＩｇＥ抗体；ＸＯＬＡＩＲ；ホスホジエステラーゼ阻害剤；ＰＤＥ４阻害剤；キサンチン；抗コリン薬；マスト細胞安定化剤；クロモリン；ＩＬ−４阻害剤；ＩＬ−５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤；Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含むヒスタミンまたはその受容体のアンタゴニスト；プロスタグランジンＤまたはその受容体ＤＰ１およびＣＲＴＨ２のアンタゴニスト；ＴＮＦアンタゴニスト；ＴＮＦ受容体の可溶性断片；ＥＮＢＲＥＬ；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト；ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体アンタゴニスト；ＴＧＦ−βアンタゴニスト；インターフェロンγ；ペルフェニドン；化学療法薬、メトトレキサート；レフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、ＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２またはｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；免疫調節剤；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ−２、ＭＫ−２およびＮＦｋＢ阻害剤；ブデノシド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチラート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１β抗体；抗ＩＬ−６抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦもしくはＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドの抗体；ＦＫ５０６；ラパマイシン；ミコフェノラート・モフェチル；イブプロフェン；プレドニゾロン；ホスホジエステラーゼ阻害剤；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤、補体阻害剤；アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤；ＴＮＦ−α□変換酵素阻害剤；Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；６−メルカプトプリン；アンギオテンシン変換酵素阻害剤；可溶性サイトカイン受容体；可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体；可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ；ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１またはＴＧＦ−βである、方法。
【請求項７２】
対象への投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される少なくとも１つの様式による、請求項６７の方法。
【請求項７３】
イムノアッセイにより試験試料中のＴＮＦ−αまたはその断片の存在を決定する方法であって、前記イムノアッセイが、試験試料を請求項１に記載の少なくとも１つの結合タンパク質またはその断片および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含む、方法。
【請求項７４】
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質またはその断片と接触させ、前記結合タンパク質が、ＴＮＦ−αまたはその断片上のエピトープに結合して、第一の複合体を形成する段階；
（ｉｉ）前記複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させ、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質またはその断片が結合していない、前記第一の複合体上または前記ＴＮＦ−αもしくはその断片上のエピトープに結合して、第二の複合体を形成する段階；および
（ｉｉｉ）前記第二の複合体中の前記検出可能な標識によって発生したシグナルに基づいて、前記試験試料において前記ＴＮＦ−αまたはその断片の存在を検出し、前記ＴＮＦ−αまたはその断片の存在が前記検出可能な標識によって発生した前記シグナルと直接相関している段階
をさらに含む、請求項７３の方法。
【請求項７５】
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質またはその断片と接触させ、前記結合タンパク質またはその断片が、ＴＮＦ−αまたはその断片上のエピトープに結合して、第一の複合体を形成する段階；
（ｉｉ）前記複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させ、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質またはその断片への結合について、ＴＮＦ−αもしくはその断片と競合して、第二の複合体を形成する段階；および
（ｉｉｉ）前記第二の複合体中の前記検出可能な標識によって発生したシグナルに基づいて、前記試験試料において前記ＴＮＦ−αまたはその断片の存在を検出し、前記ＴＮＦ−αまたはその断片の存在が前記検出可能な標識によって発生した前記シグナルと間接的に相関している段階
をさらに含む、請求項７３の方法。
【請求項７６】
患者の治療的／予防的処置の効力を診断、予後診断または評価することを場合によってさらに含む、請求項７３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月７日提出の米国特許仮出願第６１／３２１，６３３号の優先権を主張するものであり、前記特許文献はこれによりいかなる目的であれその全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、ＴＮＦ−α結合タンパク質ならびに関節炎リウマチ、変形性関節炎、乾癬、多発性硬化症および他の自己免疫疾患などの急性および慢性免疫疾患の予防および／または治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
当技術分野には、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子−α、ＴＮＦおよびカケクチンとも呼ばれる）に結合することが可能な改良された抗体の必要性が存在する。一実施形態では、前記抗体はＴＮＦ−αを中和することができる。本発明は、ＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αに高親和性で結合し、ＴＮＦ−αに結合して中和することができる、結合タンパク質、ＣＤＲ移植された抗体、ヒト化抗体およびそれらの断片の新規のファミリーを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＴＮＦ−α結合タンパク質、特に、ＴＮＦ−αに結合する抗ＴＮＦ−α抗体またはその抗原結合部分に関する。一実施形態において、ＴＮＦ−αに結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２２−３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００５】
一態様において、本発明は、配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５；配列番号２２の残基９８−１０６；配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の残基５０−５６および配列番号２３の残基８９−９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む、ヒトＴＮＦ−αに結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、ヒトアクセプターフレームワークを含むヒト化結合タンパク質を提供する。一実施形態では、結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲを含む、例えば、（ａ）配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５および配列番号２２の残基９８−１０６ならびに（ｂ）配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の５０−５６および配列番号２３の残基８９−９７からなる群から選択される可変ドメインＣＤＲの組を含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号２２の残基３１−３５；配列番号２２の残基５０−６５；配列番号２２の残基９８−１０６；配列番号２３の残基２４−３４；配列番号２３の５０−５６および配列番号２３の残基８９−９７を含むアミノ酸配列を含む。
【０００６】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、例えば、配列番号２４、２５、２８、２９，３０、３１、３２および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態において、抗原結合ドメインは、例えば、配列番号２６、２７、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、例えば、ＶＨ領域が配列番号２４、２５、２８、２９，３０、３１、３２および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が配列番号２６、２７、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
【０００７】
一実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号６−２１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号９、１０、１１、１２、１５、１６、１７および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列はヒトアクセプターフレームワークの配列に対して少なくとも６５％同一であり、ヒトアクセプターフレームワークに対して同一である少なくとも７０アミノ酸残基を含む。別の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、ＣＤＲに隣接する残基；グリコシル化部位残基；希少残基；ヒトＴＮＦ−αと相互作用することができる残基；ＣＤＲと相互作用することができる残基；カノニカル残基；重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基；バーニアゾーン内の残基；およびＣｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワーク間にまたがる領域中の残基からなる群から選択されるキー残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む。一実施形態において、キー残基は、Ｈ１、Ｈ１２、Ｈ２４、Ｈ２７、Ｈ２９、Ｈ３７、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ７６、Ｈ７８、Ｌ１３、Ｌ４３、Ｌ５８、Ｌ７０およびＬ８０からなる群から選択される。一実施形態において、ＶＨ突然変異は、Ｑ１Ｅ、Ｉ１２Ｖ、Ａ２４Ｖ、Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｖ２９Ｆ、Ｆ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｖ６７Ｌ、Ｆ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｒ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｎ７６Ｓ、Ｌ７８ＩおよびＦ７８Ｉからなる群から選択される。別の実施形態において、ＶＬ突然変異は、Ｖ１３Ｉ、Ａ４３Ｓ、Ｉ５８Ｖ、Ｅ７０ＤおよびＳ８０Ｐからなる群から選択される。一実施形態において、結合タンパク質は２つの可変ドメインを含み、２つの可変ドメインは、配列番号２４と配列番号２６；配列番号２４と配列番号２７；配列番号２５と配列番号２６；配列番号２５と配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０００８】
一実施形態において、結合タンパク質はＴＮＦ−αに結合する。別の実施形態において、結合タンパク質は、ＴＮＦ−αの生物学的機能を調節する。別の実施形態において、結合タンパク質はＴＮＦ−αを中和する。さらに別の実施形態において、結合タンパク質は、ＴＮＦ−αのその受容体に結合する能力を減少させる、例えば、結合タンパク質は、プロヒトＴＮＦ−α、成熟ヒトＴＮＦ−αまたは切断型ヒトＴＮＦ−αのこれらの受容体に結合する能力を減少させる。さらに別の実施形態において、結合タンパク質は、ＴＮＦ依存性サイトカイン産生；ＴＮＦ依存性細胞死滅；ＴＮＦ依存性炎症；ＴＮＦ依存性骨浸食およびＴＮＦ依存性軟骨損傷からなる群から選択される１つ以上のＴＮＦ−α生物学的活性を減少させる。
【０００９】
一実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１および少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。別の実施形態において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；および最大約１０−６ｓ−１からなる群から選択される解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。さらに別の実施形態において、結合タンパク質は、最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍおよび最大１０−１３Ｍからなる群から選択される解離定数（ＫＤ）を有する。
【００１０】
一実施形態において、結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＡ定常ドメインおよびヒトＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。特定の実施形態において、重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインは、ヒトＩｇＧ１定常ドメインである。別の実施形態において、結合タンパク質は、ヒトＩｇκ定常ドメインおよびヒトＩｇλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む。例えば、一実施形態において、結合ドメインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常ドメインは、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＩｇκ定常ドメインである。さらに別の実施形態において、軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＩｇλ定常ドメインである。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常重領域；配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ定常軽領域；配列番号２４、２５、２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変重領域ならびに配列番号２６、２７、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇ可変軽領域を含む、ヒトＴＮＦ−αに結合することが可能な結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明の結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植された抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、多重特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’断片、二特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびに単一鎖抗体からなる群から選択される。
【００１２】
別の態様において、本発明は、結晶の形態である、本発明の結合タンパク質を含む結晶化された結合タンパク質を提供する。一実施形態において、結晶は無担体医薬徐放結晶である。別の実施形態では、結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性相当物より大きなインビボ半減期を有する。別の実施形態において、結合タンパク質は生物学的活性を保持している。
【００１３】
別の態様において、本発明は、（ａ）本発明の結晶化された結合タンパク質および成分を含む製剤ならびに（ｂ）少なくとも１つのポリマー担体を含む、ＴＮＦ−α結合タンパク質の放出のための組成物を提供する。一実施形態において、ポリマー担体は、：ポリアクリル酸、ポリシアノアクリラート、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリデプシペプチド、ポリエステル、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体またはＰＬＧＡ、ポリｂ−ヒドロキシブチラート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン；ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリオルガノホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化された多糖、ならびにこれらの混合物および共重合体からなる群の１つ以上から選択されるポリマーである。別の実施形態において、成分は、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明のＴＮＦ−α結合タンパク質ならびにリンカーおよび免疫グロブリン定常ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含むＴＮＦ−α結合タンパク質構築物を提供する。一実施形態において、結合タンパク質はヒトグリコシル化パターンを有する。別の実施形態において、結合タンパク質構築物は、結晶化されたＴＮＦ−α結合タンパク質構築物である。さらに別の実施形態において、結晶化されたＴＮＦ−α結合タンパク質構築物は、無担体医薬徐放結晶化ＴＮＦ−α結合タンパク質構築物である。特定の実施形態において、ＴＮＦ−α結合タンパク質構築物は、結合タンパク質構築物の可溶性相当物より大きなインビボ半減期を有する。別の実施形態において、結合タンパク質構築物は生物学的活性を保持している。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本発明のＴＮＦ−α結合タンパク質構築物を含み、免疫接着分子、造影剤、治療剤および細胞毒性剤からなる群から選択される作用物質をさらに含むＴＮＦ−α結合タンパク質連結体を提供する。一実施形態において、作用物質は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される造影剤である。一実施形態において、造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である。別の実施形態において、作用物質は、代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシンおよびアポトーシス剤からなる群から選択される治療剤または細胞毒性剤である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本発明の結合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の単離された核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶおよびｐＢＪからなる群から選択される。一実施形態において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞または真菌細胞である。別の実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。例えば、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫Ｓｆ９細胞である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＴＮＦ−αに結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で培養培地において本発明の宿主細胞を培養する段階を含む、ＴＮＦ−αに結合するタンパク質を産生する方法、ならびにこの方法により産生されるＴＮＦ−α結合タンパク質も提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明の結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬として許容される担体は、結合タンパク質の吸収または分散を増加させるのに有用なアジュバンドとして機能する。別の実施形態において、アジュバンドはヒアルロニダーゼである。別の実施形態において、医薬組成物は、ＴＮＦ−α活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子遮断剤、接着分子遮断剤、抗サイトカイン抗体またはその機能的断片、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識、検出可能なレポーター、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、イムノグロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬剤、抗うつ剤、抗精神病薬、刺激物質、喘息薬、βアゴニスト、吸引用ステロイド、経口ステロイド、エピネフリンまたはその類似体、サイトカインおよびサイトカインアンタゴニストをさらに含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦ−α活性が減少するように、ヒトＴＮＦ−αを本発明の結合タンパク質と接触させる段階を含む、ヒトＴＮＦ−α活性を減少させるための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるヒトＴＮＦ−α活性が減少するように、本発明の結合タンパク質をヒト対象に投与する段階を含む、ＴＮＦ−α活性が有害である疾患に罹っているヒト対象においてヒトＴＮＦ−α活性を減少させるための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療が達成されるように、本発明の結合タンパク質を対象に投与する段階を含む、ＴＮＦ−α活性が有害である疾病または疾患について対象を治療するための方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合することが可能な抗体またはその断片；ＰＧＥ２；ＬＰＡ；ＮＧＦ；ＣＧＲＰ；ＳｕｂＰ；ＲＡＧＥ；ヒスタミン；ヒスタミン受容体遮断剤；ブラジキニン；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＶＥＧＦ；ＰＬＧＦ；メトトレキサート；コルチコステロイド、グルココルチコイド受容体修飾薬；シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、非ステロイド系抗炎症薬およびスクレロスチンからなる群から選択される第二の作用物質の投与前に、それと同時にまたはその後で本発明の結合タンパク質を投与する段階を含む、ＴＮＦ−αが有害である疾患に罹っている患者を治療する方法を提供する。一実施形態において、疾患は、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性および非アレルギー性喘息；感染による喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症を伴う状態；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性疾患；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症および／または自己免疫状態；胃腸器の炎症および／または自己免疫状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症および／または自己免疫状態；肝硬変；肝線維症；Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝線維症；強皮症；腫瘍または癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染；ＨＴＬＶ−１感染；保護的１型免疫応答の発現の抑制ならびに予防接種中の保護的１型免疫応答の発現の抑制からなる群から選択される。一実施形態において、疾患は、関節炎リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、バセドウ病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑症、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生性疾患、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、発作、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、孤発性の、多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型および多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎、関節炎、ライター病、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸性関節炎、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、エルシニアおよびサルモネラ関連関節炎、脊椎関節症、アテローム性疾患／アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、突発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型原発性低γグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、繊維性肺疾患、突発性間質性肺炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患関連間質性肺疾患、混合性結合組織疾患関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性紅斑性狼瘡関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヘモシデローシス関連肺疾患、薬物によって誘導された間質性肺疾患、繊維症、放射性繊維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インシュリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連する急性免疫疾患、臓器移植に関連する慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎臓病ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状紅斑性狼瘡、男性不妊症特発性またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（すべてのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｙｘｏｅｄｅｍａ）、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｏｓｔａｔｉｓ）、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギーおよび喘息、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染、精神障害（例えば、うつ病および統合失調症）、Ｔｈ２型およびＴｈ１型によって媒介される疾病、急性および慢性疼痛（疼痛の様々な形態）、ならびに、肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌および腎臓癌および造血性悪性病変（白血病およびリンパ腫）などの癌、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性および慢性寄生性または感染性プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性または慢性細菌感染、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房（ａｅｒｉａｌ）異所性拍動、ＡＩＤＳ認知症複合、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植拒絶、α−１−アンチトリプシン欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、貧���、狭心症、前角細胞変性、抗ＣＤ３治療、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏症反応（ａｎｔｉ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、大動脈（ａｏｒｄｉｃ）および動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈痩、運動失調、心房細動（持続的または発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心機能不全症候群（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｕｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性、小脳疾患、無秩序なまたは多巣性心房頻脈、化学療法関連疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール症、慢性炎症性病変、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、うっ血性心不全、結膜炎、接触性皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性繊維症、サイトカイン療法関連疾患、ボクサー脳、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚科学的症状、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化疾患、瀰漫性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、大脳基底核の疾患、中年のダウン症候群、中枢神経ドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発された薬物誘発性運動疾患、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌疾患、喉頭蓋炎、エプスタイン−バーウイルス感染、紅痛症、垂体外路および小脳疾患、家族性血球貪食性リンパ組織球症、致死的胸腺移植組織拒絶、フリードライヒ失調症、機能的末梢動脈疾患、真菌性敗血症、ガス壊疸、胃潰瘍、糸球体腎炎、いずれかの臓器または組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物に起因する肉芽腫、有毛細胞白血病、ハラーホルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、枯草熱、心臓移植拒絶、血色素症、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解血小板減少紫斑病、出血、肝炎（Ａ型）、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、運動過剰疾患、過敏症反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下疾患、視床下部−下垂体−副腎皮質系評価、特発性アジソン病、特発性肺繊維症、抗体媒介性細胞毒性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線曝露、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再灌流障害、虚血性発作、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪血症（ｌｉｐｅｄｅｍａ）、肝臓移植拒絶、リンパ浮腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｅｍｉａ）、代謝性／特発性疾患、偏頭痛、ミトコンドリア多系疾患（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉ．ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、混合性結合組織病、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性（メンセル・デジェリーヌ−トーマス・シャイ−ドレーガーおよびマシャド−ジョセフ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・チュバキュロシス、骨髄形成異常、心���梗塞、真菌虚血疾患、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性Ｉ筋萎縮、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、閉塞性動脈疾患、ＯＫＴ３（登録商標）療法、精巣炎／精巣上体炎、精巣炎／精管復元術処置、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵癌、腫瘍随伴性症候群／悪性腫瘍の高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性疾患、末梢血管疾患、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経炎、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症および皮膚変化症候群（ｓｋｉｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、灌流後症候群（ｐｏｓｔ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ  ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋梗塞後開心術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧、放射線療法、レイノー現象および病、レイノー病、レフサム病、規則的なＱＲＳ幅の狭い頻脈症（ｒｅｇｕｌａｒ  ｎａｒｒｏｗ  ＱＲＳ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、腎血管性高血圧、再灌流障害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老年性舞踏病、レビー小体型の老年性認知症、血清反応陰性関節炎、ショック、鎌形赤血球貧血症、皮膚同種異系移植拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶、固形腫瘍、特異性不整脈、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、湿疹、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞またはＦＡＢＡＬＬ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏症反応、ＩＶ型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、じんましん、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルスおよび真菌感染、ウイルス性脳炎（ｖｉｔａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウィルソン病、いずれかの臓器または組織の異種移植拒絶、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、急性虚血、成人スチル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹
、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫異常、自己免疫性腸症、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早期卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心血管疾患、劇症型抗リン脂質症候群、セリアック病、頚部脊椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症のリスクを有する臨床的孤発症候群（ＣＩＳ）、結膜炎、小児発症精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、真性糖尿病、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜症、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症型多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、枯草熱、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ媒介性アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｊｕｎｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、クスマウル病またはクスマウル−マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞性組織球症、網状皮斑、黄斑変性、顕微鏡的多発性血管炎、モルブス・ベヒテレフ（ｍｏｒｂｕｓ  ｂｅｃｈｔｅｒｅｖ）、運動ニューロン疾患、粘膜性類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非Ａ非Ｂ型肝炎、視神経炎、骨溶解、卵巣癌、小関節性ＪＲＡ、末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発性動脈炎（または結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、白毛症、多関節性ＪＲＡ、多内分泌欠損症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ）、ポンプ後症候群、原発性パーキンソニズム、前立腺癌および直腸癌および造血性悪性病変（白血病およびリンパ腫）、前立腺炎、赤芽球癆、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、ｓａｐｈｏ（滑膜炎、アクネ、膿疱症、骨過形成および骨髄炎）、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、坐骨神経痛、シリコーン関連結合組織病、スネドン−ウィルキンソン皮膚症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラスマ性網膜炎、中毒性表皮剥離症、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体関連周期的症候群）、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、じんましん、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季結膜炎、ウイルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性、創傷治癒、エルシニアおよびサルモネラ関連関節症からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、吸入ステロイド；βアゴニスト；短時間作用性または長時間作用性βアゴニスト；ロイコトリエンまたはロイコトリエン受容体のアンタゴニスト；ＡＤＶＡＩＲ；ＩｇＥ阻害剤；抗ＩｇＥ抗体；ＸＯＬＡＩＲ；ホスホジエステラーゼ阻害剤；ＰＤＥ４阻害剤；キサンチン；抗コリン薬；マスト細胞安定化剤；クロモリン；ＩＬ−４阻害剤；ＩＬ−５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤；Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含むヒスタミンまたはその受容体のアンタゴニスト；プロスタグランジンＤまたはその受容体ＤＰ１およびＣＲＴＨ２のアンタゴニスト；ＴＮＦアンタゴニスト；ＴＮＦ受容体の可溶性断片；ＥＮＢＲＥＬ；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト；ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体アンタゴニスト；ＴＧＦ−βアンタゴニスト；インターフェロンγ；ペルフェニドン（ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）；化学療法薬、メトトレキサート；レフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、ＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２またはｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；免疫調節剤；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ−２、ＭＫ−２およびＮＦｋＢ阻害剤、ブデノシド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチラート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１βｍＡｂ抗体；抗ＩＬ−６抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦまたはＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドの抗体；ＦＫ５０６；ラパマイシン、ミコフェノラート・モフェチル；イブプロフェン；プレドニゾロン；ホスホジエステラーゼ阻害剤；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤；ＴＮＦ−α変換酵素阻害剤；Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；６−メルカプトプリン；アンギオテンシン変換酵素阻害剤；可溶性サイトカイン受容体；可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体；可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ；ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１；およびＴＧＦ−βからなる群から選択される第二の作用物質の投与前に、それと同時にまたはその後で本発明の結合タンパク質を投与する段階を含む、ＴＮＦ−αが有害である疾患に罹っている患者を治療する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明の結合タンパク質は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、結腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される少なくとも１つの様式によって、対象に投与される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＴＮＦ−α結合タンパク質、特に、ＴＮＦ−α（すなわち、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子−α、ＴＮＦおよびカケクチン）に結合する抗ＴＮＦ−α抗体またはその抗原結合部分に関する。本発明の様々な態様は、抗体および抗体断片ならびにその医薬組成物、ならびにそのような抗体および断片を作製するための核酸、組み換え発現ベクターおよび宿主細胞に関する。ヒトＴＮＦ−αを検出するための、ヒトＴＮＦ−αをインビトロでまたはインビボで阻害するためのおよび遺伝子発現またはＴＮＦ−α関連機能を調節するための本発明の抗体を使用する方法も本発明により包含されている。本発明の抗体を含む組成物、ならびにそのような抗体を使用する方法も記載されている。
【００２４】
本明細書に別段の定義がなければ、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。しかしながら、何らかの曖昧さが伏在している場合には、用語の意味および範囲は明確であるべきであり、本明細書中に付与されている定義は、すべての辞書または本明細書外の定義に優越する。さらに、文脈上別段の必要がなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本願において、「または」の使用は、別段の記載がなければ、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語ならびに「含む」および「含まれた」などの用語のその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別段の記載がなければ、１つのユニットを含む要素および成分ならびに１より多いサブユニットを含む要素および成分をともに包含する。
【００２５】
一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリッド形成に関連して使用される命名法およびこれらの技術は、周知のものであり、本分野において一般的に使用されている。一般に、本発明の方法および技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用方法に従い、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献中に記載されているように、実施することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、本分野で一般的に遂行されているように、または本明細書に記載されているように、実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医薬品化学および薬化学に関して使用される命名法、ならびに本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医薬品化学および薬化学の実験室操作および技術は、周知のものであり、本分野で一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、調合、および送達、および患者の治療に対しては、標準的な技術を使用し得る。
【００２６】
本発明をさらに容易に理解し得るように、いくつかの用語を以下に定義する。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のあらゆるポリマー鎖を表す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に使用され、同じく、アミノ酸のポリマー鎖を表す。「ポリペプチド」という用語は、固有または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体または多量体であり得る。
【００２８】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その由来起源または由来源のために、その固有の状態において当該タンパク質またはポリペプチドとともに存在する天然に随伴される成分を伴わないタンパク質またはポリペプチドであり、同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含まず、異なる種から得られた細胞によって発現され、または天然には存在しない。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、またはポリペプチドが本来由来する細胞とは異なる細胞系の中で合成されたポリペプチドは、それに本来付随している成分から「単離」されている。タンパク質は、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用し、単離によって、本来付随している成分が実質的に存在しないようにすることもできる。
【００２９】
「回収する」という用語は、例えば、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって、ポリペプチドなどの化学種を、本来付随する成分を実質的に含まないようにする方法を表す。
【００３０】
「ヒトＴＮＦ−α」（本明細書ではｈＴＮＦ−αと略記される）という用語は、三量体サイトカインタンパク質を含む。前記用語は、３つの１７．５ｋＤ  ＴＮＦ−αタンパク質を含むホモ三量体タンパク質を含む。ホモ三量体タンパク質は「ＴＮＦ−αタンパク質」と呼ばれる。ヒト「ＴＮＦ−α」という用語は、標準組み換え発現法により調製することができる組み換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α）を含むものとする。ヒトＴＮＦ−αの配列は、表１に示される。
【００３１】
【表１】
2013523153.tif 000002
【００３２】
「生物学的活性」とは、サイトカインのすべての固有の生物学的特性を表す。ＴＮＦ−αの生物学的特性には、ＴＮＦ受容体に結合することが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
第二の化学種との抗体、タンパク質またはペプチドの相互作用に関して、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、相互作用が、化学種、例えば、抗体上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存し、例えば、抗体がタンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的であれば、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応中での、エピトープＡを含有する分子（すなわち、標識されていない遊離のＡ）の存在は、抗体に結合した、標識されたＡの量を減少させる。
【００３４】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）から構成されるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子もしくはその抗原結合部分、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持したすべての機能的断片、変異体、バリアントまたはこれらの誘導体を広く表す。このような変異体、バリアントまたは誘導体抗体のフォーマットは、本分野において公知である。これらの非限定的な実施形態は、以下に論述されている。
【００３５】
完全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略称される。）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略称される。）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）が散在された超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へ、さらに細分割することが可能である。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００３６】
抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合領域」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＴＮＦ−α）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を表す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行可能であることは示されている。このような抗体の実施形態は、二特異的、二重特異的または多重特異的フォーマットを有することができ、２つまたはそれ以上の異なる抗原に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組み換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上にある２つのドメイン間での対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、両ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作出する二価の二特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３を参照）。このような抗体結合部分は、本分野において公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０  ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
【００３７】
「抗体構築物」という用語は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１つ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを表す。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合された２つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分を連結するのに使用される。そのようなリンカーポリペプチドは当技術分野では周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重または軽鎖定常ドメインを表す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は当技術分野では公知であり、表２に示されている。
【００３８】
【表２】
2013523153.tif 000003
【００３９】
抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成される、さらに大きな免疫接着分子の一部であってもよい。そのような免疫接着分子の例には、ストレプトアビジンコア領域を使用しての四量体ｓｃＦｖ分子の作製（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）ならびにシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用しての二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子の作製（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、全抗体の、それぞれパパインまたはペプシン消化などの従来の技法を使用して全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載されるように、標準組み換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。
【００４０】
「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体またはその抗原結合部分（例えば、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合する単離された抗体は、ｈＴＮＦ−α以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない。）を表す。しかし、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＴＮＦ−α分子などの他の抗原に交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質が実質的になくてもよい。
【００４１】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体またはその抗原結合部分を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＥ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな突然変異導入もしくは部位特異的突然変異導入によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないものとする。
【００４２】
「組み換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ（２０００）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段によって調製され、発現され、作製され、もしくは単離された抗体など、組み換え手段によって調製され、発現され、作製され、もしくは単離されたすべてのヒト抗体またはその抗原結合部分を含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異導入（または、ヒトＩｇ配列に対して遺伝子導入された動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異導入）に供され、したがって、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらの配列に関連しつつも、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しない場合があり得る配列である。
【００４３】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体またはその抗原結合部分を表す。
【００４４】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、ヒトＣＤＲの１つ以上（例えば、ＣＤＲ３）がマウスＣＤＲ配列で置換されているヒト重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置換されている抗体またはその抗原結合部分を表す。
【００４５】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト類似に」、すなわち、ヒト生殖系列可変配列により類似するように改変された抗体またはその抗原結合部分を表す。ヒト化抗体の１つの種類は、ヒト以外のＣＤＲ配列がヒトＶＨおよびＶＬフレームワークに導入されたＣＤＲ移植された抗体である。
【００４６】
「Ｋａｂａｔ番号」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。本分野において認められているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＮＯ．９１−３２４２）。Ｍａｒｔｉｎ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｉｎ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００１）、Ｃｈａｐｔｅｒ３１、ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｐａｇｅｓ４３２−４３３．も参照されたい。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０６にわたる。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
【００４７】
「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域のうちの１つ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を与えるまたはコードする抗体または核酸配列を表す。いくつかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域（複数可）を与えるまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を表す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域のうちの１つ以上および定常領域（複数可）を与えるまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を表す。特定の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域のうちの１つ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を与えるまたはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を表す。この実施形態と一致して、アクセプターは、ヒト抗体の１つ以上の特定の位置には存在しない少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも１０のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域（複数可）は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販されている抗体）に由来するまたはから得られる。
【００４８】
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表す。重鎖および軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、各可変領域に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と表記される。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することが可能な単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を表す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載された系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））は、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表記する。）と表記される。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、これは、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界が、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５によって記載されている。さらに別のＣＤＲ境界定義が、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測または実験的な発見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
【００４９】
「カノニカル」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７により定義される特定のカノニカルＣＤＲ構造を定義するＣＤＲまたはフレームワーク中の残基を表す。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．に従えば、多くの抗体のＣＤＲの決定的な部分は、アミノ酸配列のレベルには大きな多様性があるがほぼ同じペプチド骨格立体構造を有する。各カノニカル構造は、ループを形成するアミノ酸残基の隣接するセグメントに対する１組のペプチド骨格捻れ角を主に特定する。
【００５０】
「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを提供する抗体を表す。特定の実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるまたは由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関して、「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を表す。
【００５１】
「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を表す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なる系によって決定され得るので、フレームワーク配列の意義は、これに対応して、異なる解釈に供せられる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）は、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域も、各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表記されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定の亜領域を特定せずに、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。１つのＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つまたはそれ以上を表す。
【００５２】
ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は当技術分野では公知である。本発明の一実施形態において、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、Ｖ−ｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）からまたはＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）から収載される配列から選択される。本発明の別の実施形態において、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、表３および表４に記載される配列から選択される。
【００５３】
【表３】
2013523153.tif 000004
【００５４】
【表４】
2013523153.tif 000005
【００５５】
「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝的再編成および変異をもたらす成熟プロセスを経ていない非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０参照）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟した抗体遺伝子より、種内の個体に特徴的な必須のアミノ酸配列構造を保存する傾向がより大きく、このため、その種において治療的に使用された場合に、外来源に由来するものと認識される可能性がより低いという認識から生じる。
【００５６】
「キー」残基という用語は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に対してより多くの影響を及ぼす可変領域内のある種の残基を表す。キー残基には、ＣＤＲに隣接している残基、潜在的グリコシル化部位（例えば、Ｎ−またはＯ−グリコシル化部位）、希少残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基、バーニアゾーン内の残基およびＣｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワーク間にまたがる領域中の残基のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
「ヒト化抗体」という用語は、対象の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくは断片である。ＣＤＲに関して、「実質的に」という用語は、ＣＤＲが、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有することを表す。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に一致し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域も含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖のみを含有する。
【００５８】
ヒト化抗体は、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリンならびに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を制限なしに含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１つを超えるクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得、特定の定常ドメインは、当技術分野では周知の技法を使用して望ましいエフェクター機能を最適化するように選択され得る。
【００５９】
ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基が、ドナー抗体ともまたはコンセンサスフレームワークとも一致しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失により変異誘発され得る。特定の実施形態において、そのような変異は広範囲ではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および少なくとも９５％は、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に一致することになる。「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を表す。「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を表す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７参照））。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、そのファミリーのその位置に最も頻繁に存在するアミノ酸により占められている。２つのアミノ酸が等しく頻繁に存在する場合、コンセンサス配列にはどちらでも含むことができる。
【００６０】
「バーニア」ゾーンという用語は、Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９により記載されている、ＣＤＲ構造を調整し、そのフィットを抗原に合わせて微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを表す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの根底にある層を形成し、ＣＤＲの構造および抗体の親和性に影響を及ぼし得る。
【００６１】
「多価結合タンパク質」という用語は、本明細書においては、２つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表すために使用される。多価結合タンパク質は、３つまたはそれ以上の抗原結合部位を有するように工学的に作製され、一般に、天然に存在する抗体ではない。「多重特異的結合タンパク質」という用語は、２つまたはそれより多い関連する標的または無関係な標的に結合することが可能な結合タンパク質を表す。本明細書において使用される二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質または二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）は、２つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、四価または多価結合タンパク質である。そのようなＤＶＤ−Ｉｇは、単一特異的であり得、すなわち、１つの抗原に結合することが可能である、または多重特異的であり得、すなわち、２つまたはそれ以上の抗原に結合することが可能である。２つの重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドを含むＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇと表される。ＤＶＤ−Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドおよび２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、計６ＣＤＲが抗原結合部位当たりの抗原結合に関与する。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許第７，６１２，１８１号に開示されている。
【００６２】
本発明の一態様は、ＴＮＦ−αに結合することが可能な結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質に関する。特定の実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、ＴＮＦ−αおよび第二の標的に結合することが可能である。
【００６３】
「中和」という用語は、結合タンパク質がサイトカインに特異的に結合すると、サイトカインの生物学的活性を中和することを表す。特定の実施形態において、中和結合タンパク質は、ｈＴＮＦ−αへのその結合がｈＴＮＦ−αの生物学的活性を抑制する中和抗体であり、例えば、中和結合タンパク質はｈＴＮＦ−αに結合して、ｈＴＮＦ−αの生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれよりも多く低下させる。中和結合タンパク質によるｈＴＮＦ−αの生物学的活性の抑制は、当技術分野で周知のｈＴＮＦ−α生物学的活性の１つ以上の指標を測定することにより評価することが可能である。例えば、Ｌ９２９細胞に対するＴＮＦ−αの細胞毒性の中和である。
【００６４】
別の実施形態において、「アゴニスト作用を及ぼす（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）」という用語は、結合タンパク質がＴＮＦ−α、例えば、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合すると、ＴＮＦ−αの生物学的活性が増加することを表す。特定の実施形態において、アゴナイジング結合タンパク質は、ＴＮＦ−αへのその結合によりＴＮＦ−αの生物学的活性が増加するアゴニスト抗体である。特定の実施形態において、アゴニスト結合タンパク質は、ＴＮＦ−αに結合してＴＮＦ−αの生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％増加させる。アゴニスト結合タンパク質によるＴＮＦ−αの生物学的活性の抑制は、当技術分野で周知のＴＮＦ−α生物学的活性の１つ以上の指標を測定することにより評価することが可能である。
【００６５】
「活性」という用語は、抗原に対する抗体、例えば、ＴＮＦ−α抗原に結合する抗ｈＴＮＦ−α抗体の結合特異性／親和性および／または抗体、例えば、ｈＴＮＦ−αへのその結合がｈＴＮＦ−αの生物学的活性を抑制する抗ｈＴＮＦ−α抗体の中和能力（もしくは、アゴナイジング能力）、例えば、Ｌ９２９細胞に対するＴＮＦ−αの細胞毒性の中和などの活性を含む。
【００６６】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン、例えば、抗体またはＴ細胞受容体が結合する抗原上の部位を表す。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホリルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープとは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態において、抗体が、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を優先的に認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合すると言われている。エピトープは、近接するアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングにより並置された非近接アミノ酸の両方から形成することが可能である。近接するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶剤に曝露されると保持され、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶剤を用いて処理すると失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間的構造に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。所与の抗体によりどのエピトープが結合されているかを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野では周知であり、例えば、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイが含まれ、ＴＮＦ−α由来の重複しているまたは近接しているペプチドは、所与の抗ＴＮＦ−α抗体との反応性について試験される。エピトープの空間的構造を決定する方法には、当技術分野の技法および本明細書に記載される技法、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅｄ．（１９９６）参照）。
【００６７】
本明細書に記載される特定の抗体により認識されるエピトープのすべてまたは一部（例えば、同じもしくは重複している領域または前記領域間のもしくは前記領域にまたがる領域）を含むＴＮＦ−α上のエピトープに結合する抗体も本発明により包含される。
【００６８】
同じエピトープに結合する抗体および／またはＴＮＦ−α、例えば、ヒトＴＮＦ−αへの結合について本明細書に記載される抗体と競合する抗体も本発明により包含される。同じエピトープを認識するまたは結合について競合する抗体は、通常の技法を使用して同定することが可能である。そのような技法には、例えば、標的抗原に別の抗体が結合するのを遮断する１つの抗体の能力を示すイムノアッセイ、すなわち、競合的結合アッセイが含まれる。競合的結合は、試験中の免疫グロブリンが、ｈＴＮＦ−αなどの共通の抗原への基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される。数多くの種類の競合的結合アッセイ、例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９：２４２参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５４６参照）；および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃａｎｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７）が知られている。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合している精製された抗原またはこれら非標識試験免疫グロブリンおよび標識された基準免疫グロブリンのどちらかを坦持する細胞の使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合している標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在している。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、競合する抗体は共通の抗原への基準抗原の特異的結合を、少なくとも５０−５５％、５５−６０％、６０−６５％、６５−７０％、７０−７５％またはさらにそれよりも多く抑制する。
【００６９】
他の技法には、例えば、エピトープの原子分解を与える抗原−抗体複合体の結晶のＸ線解析などのエピトープマッピング法が含まれる。他の方法は、抗原断片または抗原の変異した変種への抗体の結合をモニターし、そこでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾のせいによる結合の喪失が、エピトープ成分の指標と見なされることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法も使用することが可能である。これらの方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリー由来の特定の短いペプチドを親和性単離する対象の抗体の能力に依拠している。次に、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのに使用される抗体と一致するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングでは、立体構造的不連続エピトープを位置付けることが明らかにされている計算アルゴリズムも開発されている。
【００７０】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を表す。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
【００７１】
「Ｋｏｎ」という用語は、例えば、本分野で知られている抗体／抗原複合体を形成する、結合タンパク質（例えば、抗体）と抗原の結合についての結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）定数を表す。「Ｋｏｎ」は、「結合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）定数」または「ｋａ」という用語によっても知られ、これらは本明細書において互換的に使用される。抗体とその標的抗原の結合速度または抗体と抗原間での複合体形成の速度を示しているこの値は、以下の方程式によっても示される：
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
【００７２】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、結合タンパク質（例えば、抗体）の、例えば、本分野で知られている抗体／抗原複合体からの解離についての解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）定数または「解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）定数」を表す。この値は、抗体のその標的抗原からの解離速度またはＡｂ−Ａｇ複合体の遊離抗体および抗原への経時的な分離を示し、以下の方程式によって示される：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
【００７３】
「ＫＤ」という用語は、「平衡解離定数」を表すものとし、平衡状態での滴定測定においてまたは解離速度定数（ｋｏｆｆ）を結合速度定数（ｋｏｎ）で割ることによって得られた値を表す。結合速度定数、解離速度定数および平衡解離定数は、抗体と抗原の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定する方法は本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術の使用は、高い感度を提供し、平衡状態で生理的緩衝液中の試料を調べることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチおよび機器を使用することが可能である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動態排除アッセイ）アッセイも使用することが可能である。
【００７４】
「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の同定を与える標識が取り込まれたタンパク質を表す。特定の実施形態において、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）；酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレートなどの磁気作用物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
「抗体連結体」という用語は、第二の化学部分（治療剤または細胞毒性剤など）に化学的に連結された抗体などの結合タンパク質を表す。「作用物質」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子または生物由来物質から作製された抽出物を表記するために使用される。一実施形態において、治療剤または細胞毒性剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらの類似体または相同体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
「結晶」および「結晶化された」という用語は、結晶の形態で存在する抗体またはその抗原結合部分を表す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態または液体の結晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って整列されている。結晶中で反復されている基礎的単位または構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶的対称性に合致する配置での非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を与える。すべての三次元中での規則的な転換による単位格子の反復は、結晶を与える。Ｇｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、２ｎｄ  ｅｄ．、（Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｇｉｅｇｅ、ｅｄｓ．）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）、ｐｐ．１−１６を参照されたい。
【００７７】
「ポリヌクレオチド」という用語は、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの重合体形態、すなわち、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態を意味する。前記用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含むが、特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡである。
【００７８】
「単離されたポリペプチド」という用語は、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはこれらのいくつかの組合せの）ポリヌクレオチドを意味し、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が本来その中でともに見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない、本来連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されている、またはより大きな配列の一部として本来存在しない、ことを意味する。
【００７９】
「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる該核酸分子を表す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中へ導入されて、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組み換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）発現ベクターのような他の形態を含むものとする。
【００８０】
「作用可能に連結された」という用語は、記載された成分をそれらを所期の様式で機能させることができる関係にある併置状態を表す。コード配列に対して「作用可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結されている。「作用可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現調節配列および目的の遺伝子を調節するように、トランスにてまたは離れて作用する発現調節配列の両方を含む。「発現調節配列」という用語は、連結されているコード配列の発現およびプロセッシングに影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列を表す。発現調節配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望であれば、タンパク質分泌を増強させる配列が含まれる。このような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような調節配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」という用語は、その存在が発現およびプロセッシングに不可欠である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列および融合対配列も含むことが可能である。
【００８１】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に入るすべてのプロセスを表す。形質転換は、本分野で周知の様々な方法を用いて、自然の条件または人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核または真核宿主細胞中へ外来核酸配列を挿入するためのいずれかの公知の方法に依拠し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェションおよび粒子照射を含み得るが、これらに限定されない。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、または宿主染色体の一部として、その中で複製することできる安定に形質転換された細胞が含まれる。これらには、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを、限られた時間にわたって一過性に発現する細胞も含まれる。
【００８２】
「組み換え宿主細胞」（または単に、「宿主細胞」）という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表す。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表すことを理解すべきである。突然変異または環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、「宿主細胞」という用語の範囲になお含まれる。特定の実施形態において、宿主細胞には、生物のいずれかの界から選択される原核および真核細胞が含まれる。真核細胞には、原生生物、真菌、植物および動物細胞が含まれる。特定の実施形態において、宿主細胞には、原核細胞株Ｅ．コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９および真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に対しては標準的な技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または本分野で一般的に遂行されているように、または本明細書に記載されているように、実施され得る。一般に、先述の技術および手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献中に記載されているように、実施し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００８４】
「トランスジェニック生物」とは、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を表し、生物中に導入された導入遺伝子（または生物の子孫）は、生物中に自然に発現されていないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」とは、細胞のゲノム中に安定におよび作用可能に組み込まれているＤＮＡ構築物であり、この細胞からトランスジェニック生物が発達し、トランスジェニック生物の１つ以上の細胞種または組織中で、コードされた遺伝子産物の発現を誘導する。
【００８５】
「制御する」または「調節する」という用語は互換的に使用され、目的の分子の活性（例えば、ｈＴＮＦ−αの生物学的活性）の変化または変更を表す。調節は、目的の分子の一定の活性または機能の規模の増加または減少であり得る。分子の典型的な活性および機能には、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化およびシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
これに対応して、「調節物質」という用語は、目的の分子の活性または機能（例えば、ｈＴＮＦ−αの生物学的活性）を変化または変更させることが可能な化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の増加または減少を引き起こし得る。ある種の実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性または機能の規模を減少させる阻害剤である。典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチバディ、炭水化物または小有機分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ペプチバディは、例えば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【００８７】
「アゴニスト」という用語は、目的分子と接触したときに、アゴニストの不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の増加を引き起こす調節物質を表す。興味深い特定のアゴニストには、ＴＮＦ−αポリペプチドまたはポリペプチド、核酸、炭水化物またはｈＴＮＦ−αに結合する他のすべての分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、目的分子と接触したときに、アンタゴニストの不存在下で観察される活性または機能の規模と比べて、分子のある種の活性または機能の規模の減少を引き起こす調節物質を表す。興味深い具体的なアンタゴニストには、ＴＮＦ−α、例えばｈＴＮＦ−αの生物学的または免疫学的活性を遮断または調節するアンタゴニストが含まれる。ｈＴＮＦ−αのアンタゴニストおよび阻害剤には、タンパク質、核酸、炭水化物またはｈＴＮＦ−αに結合する他のすべての分子が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
「有効量」という用語は、疾患もしくはその１つもしくはそれ以上の症候の重度および／または持続時間を低下もしくは軽減し、疾患の進行を抑制し、疾患の退行を引き起こし、疾患に伴う１つもしくはそれ以上の症候の再発、発達、発症もしくは進行を予防し、疾患を検出し、または別の療法（例えば、予防的または治療的剤）の予防的または治療的効果を増強もしくは改善するのに十分である療法の量を表す。
【００９０】
「試料」という用語は、本明細書において最も広義で使用される。「生物学的試料」は、生物または生物であったものから得られた物質のいずれかの量を含むが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよびその他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
Ｉ．ヒトＴＮＦ−αに結合する抗体
本発明の一態様は、ＴＮＦ−αに高い親和性で、低い解離速度でおよび高い中和能力で結合する単離されたマウスモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明の第二の態様は、ＴＮＦ−αに結合するキメラ抗体を提供する。本発明の第三の態様は、ＴＮＦ−αに結合するＣＤＲ移植された抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明の第四の態様は、ＴＮＦ−αに結合するヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。特定の実施形態において、抗体またはその部分は、単離された抗体である。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗ＴＮＦ−αを中和するまたはＴＮＦ−α機能を調節する。
【００９２】
Ａ．抗ＴＮＦ−α抗体を作製する方法
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技法のうちのいずれによっても作製し得る。
【００９３】
１．ハイブリドーマ技術を使用する抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用を含む、当技術分野において公知の多種多様な技法を使用して調製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３（Ｊ．Ｌ．Ｔｕｒｋ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｄｉｔｏｒ）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１）．ｐｐ．５６３−５８７において教唆される技法を含む、ハイブリドーマ技法を使用して作製することが可能である。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を表し、その抗体を作製する方法ではない。
【００９４】
ハイブリドーマ技術を使用して抗体を作製し特定の抗体についてスクリーニングするための方法は、常用であり当技術分野では周知である。一実施形態において、本発明は、ハイブリドーマが本発明の抗原を用いて免疫されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより作製される、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養し、次に、本発明のポリペプチドに結合することが可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて融合により生じるハイブリドーマをスクリーニングすることを含む、モノクローナル抗体を作製する方法および前記方法により産生される抗体を提供する。手短に言えば、マウスはＴＮＦ−α抗原を用いて免疫することが可能である。特定の実施形態において、ＴＮＦ−α抗原はアジュバンドと一緒に投与されて、免疫応答を刺激する。そのようなアジュバンドには、完全もしくは不完全フロイントアジュバンド、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）が含まれる。そのようなアジュバンドは、ポリペプチドを局所的沈着物に隔離することにより急速な分散から保護し得るまたはそのようなアジュバンドは、宿主を刺激してマクロファージおよび免疫系の他の成分に対して走化性である因子を分泌させる物質を含有し得る。特定の実施形態において、ポリペプチドが投与されている場合、免疫スケジュールは数週間にわたり広がる、ポリペプチドの２回またはそれ以上の投与を含む。
【００９５】
ＴＮＦ−α抗原を用いる動物の免疫化後、抗体および／または抗体産生細胞を動物から得ることができる。抗ＴＮＦ−α抗体含有血清は、動物を出血させるまたは屠殺することにより動物から得られる。血清は動物から得られると同時に使用してよく、免疫グロブリン画分は血清から得られるまたは抗ＴＮＦ−α抗体は血清から精製し得る。このようにして得られる血清または免疫グロブリンは、ポリクローナルであり、したがって異種な一連の特性を有する。
【００９６】
免疫応答が検出される、例えば、抗原ＴＮＦ−αに特異的な抗体がマウス血清において検出されると、マウス脾臓は収穫され脾細胞は単離される。次に、脾細胞は周知の技法により任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０由来の細胞に融合される。ハイブリドーマが選択され、限界希釈によりクローン化される。次に、ハイブリドーマクローンは、ＴＮＦ−αに結合することが可能な抗体を分泌する細胞について当技術分野において公知の方法によりアッセイされる。腹水液は、一般に高レベルの抗体を含有しているが、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することにより作製することが可能である。
【００９７】
別の実施形態において、抗体産生不死化ハイブリドーマは免疫された動物から調製し得る。免疫後、動物は屠殺され、脾臓Ｂ細胞は、当技術分野では周知である不死化された骨髄腫細胞に融合される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、上記を参照されたい。特定の実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞系）。融合および抗生物質選択後、ハイブリドーマは、ＴＮＦ−αもしくはその一部またはＴＮＦ−αを発現している細胞を使用してスクリーニングされる。特定の実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡを使用して実施される。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、国際ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／３７５０４において提供されている。
【００９８】
抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマは、選択され、クローン化され、強いハイブリドーマ増殖、高抗体産生および下でさらに考察されるような望ましい抗体特徴を含む望ましい特徴についてさらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、同系動物において、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいてインビボで、または細胞培養においてインビトロで培養され拡大され得る。ハイブリドーマを選択し、クローン化し、拡大する方法は当業者には周知である。
【００９９】
特定の実施形態において、ハイブリドーマは、上記のようなマウスハイブリドーマである。別の特定の実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒト、非マウス種において産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が抗ＴＮＦ−α抗体を発現しているヒト細胞に融合されているヒトハイブリドーマである。
【０１００】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技法により作製され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質切断により産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０１０１】
２．ＳＬＡＭを使用する抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
本発明の別の態様において、組み換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０２５５１およびＢａｂｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載されているように、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ；ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）として本分野で呼ばれている手法を用いて、単一の単離されたリンパ球から作製される。この方法において、対象の抗体を分泌する単一細胞、例えば、セクション１に記載される免疫された動物のいずれか１つに由来するリンパ球は、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用してスクリーニングされ、抗原ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αのサブユニットまたはこれらの断片は、ビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球に連結され、ＴＮＦ−αに対する特異性を有する抗体を分泌する単一細胞を同定するのに使用される。対象の抗体分泌細胞の同定に続いて、重および軽鎖可変領域ｃＤＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲにより細胞から救済され、その後、これらの可変領域は、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）との関連で、発現させることが可能である。増幅された免疫グロブリン配列で形質移入され、インビボで選択されたリンパ球に由来する宿主細胞は、次いで、例えば、ＴＮＦ−αに対する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞をパニングすることによって、インビトロで、さらに分析および選択を行うことが可能である。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１およびＰＣＴ公開ＷＯ００／５６７７２に記載されているものなど、インビトロでのアフィニティー成熟方法によるなど、インビトロで操作することが可能である。
【０１０２】
３．トランスジェニック動物を使用する抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、抗体は、ＴＮＦ−α抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつかまたはすべてを含む非ヒト動物を免疫することによって産生される。特定の実施形態において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス（ヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大断片を含み、マウス抗体産生を欠失している改変されたマウス系統）である。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第５，９８５，６１５号、第５，９９８，２０９号、第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、第６，１１４，５９８号および第６，１３０，３６４号を参照されたい。１９９１年７月２５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１、１９９４年２月３日に公開されたＷＯ９４／０２６０２、ともに１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５、１９９８年４月２３日に公開されたＷＯ９８／１６６５４、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、１９９８年１１月１２日に公開されたＷＯ９８／５０４３３、１９９９年９月１０日に公開されたＷＯ９９／４５０３１、１９９９年１０月２１日に公開されたＷＯ９９／５３０４９、２０００年２月２４日に公開されたＷＯ  ００  ０９５６０および２０００年６月２９日に公開されたＷＯ００／０３７５０４も参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトＭａｂｓを生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびｘ軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列配置ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含有する。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５を参照されたい。
【０１０３】
４．組み変え抗体ライブラリーを使用する抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法も使用することが可能であり、抗体ライブラリーは、所望の結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組み換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングの方法は、本分野において周知であり、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９７／２９１３１；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３６９−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−  ８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２、および米国特許公開第２００３０１８６３７４号に記載されている方法が含まれる。
【０１０４】
組み換え抗体ライブラリーは、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αの一部を用いて免疫された対象由来であり得る。あるいは、組み換え抗体ライブラリーは、未処置の対象、すなわち、ヒトＴＮＦ−αを用いて免疫されたことがないヒト対象由来のヒト抗体ライブラリーなどの、ＴＮＦ−αを用いて免疫されたことのないヒト由来であってよい。本発明の抗体は、ヒトＴＮＦ−αを含むペプチドを用いて組み換え抗体ライブラリーをスクリーニングし、それによってＴＮＦ−αを認識する抗体を選択することにより選択される。そのようなスクリーニングおよび選択を行うための方法は当技術分野では周知であり、例えば、前の段落の参考文献に記載されている。ヒトＴＮＦ−αから特定のｋｏｆｆ速度定数で解離する抗体などの、ｈＴＮＦ−αに対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴という当技術分野で公知の方法を使用して、所望のｋｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有する抗体などの、ｈＴＮＦ−αに対して特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、ｈＴＮＦ−α活性の抑制を評価するための当技術分野において公知の標準法を使用し得る。
【０１０５】
一態様において、本発明は、ＴＮＦ−α、例えばヒトＴＮＦ−αに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分に関する。特定の実施形態において、抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、抗体は組み換え抗体またはモノクローナル抗体である。
【０１０６】
例えば、本発明の抗体は、本分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することも可能である。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、これらをコードしているポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために使用することが可能である。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて、選択または同定することが可能である。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組み換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドで安定化されたＦｖ抗体ドメインとともにファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することが可能なファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４）；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；およびＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されているものが含まれる。
【０１０７】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ヒト抗体または他の所望されるすべての抗原結合断片を含む完全な抗体を作製するために、ファージから得た抗体コード領域を単離および使用し、例えば、以下に詳述されているように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌など、あらゆる所望の宿主中で発現させることが可能である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３に開示されている方法などの本分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組み換え的に産生するための技術も使用することが可能である。一本鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために使用することが可能な技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−８８；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７９９５−７９９９；ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１に記載されているものが含まれる。
【０１０８】
ファージディスプレイによる組み換え抗体ライブラリーのスクリーニングに代えて、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための本分野で公知の他の方法を、本発明の二重特異性抗体の同定のために適用することが可能である。代替的発現系の１つの種類は、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３１７００およびＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７−１２３０２に記載されているような、組み換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されるものである。この系において、ピューロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質をそれらの３’末端に担持する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって、ｍＲＮＡおよびこれがコードするペプチドまたはタンパク質の間に共有結合的融合物が作製される。したがって、特異的なｍＲＮＡは、コードされているペプチドまたはタンパク質、例えば抗体またはその一部の特性（抗体またはその一部の、二重特異性抗原への結合など）に基づいて、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮することが可能である。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された、抗体またはその一部をコードする核酸配列は、上記されているような組み換え手段によって（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）発現されることが可能であり、さらに、最初に選択された配列中に変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによって、または上記されているように、組み換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によって、さらなる親和性成熟に供することが可能である。
【０１０９】
別のアプローチにおいて、本発明の抗体は、本分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することも可能である。酵母ディスプレイ法では、抗体ドメインを酵母細胞壁に繋留し、これらを酵母の表面上にディスプレイするために、遺伝学的な方法が使用される。特に、このような酵母は、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために使用することが可能である。本発明の抗体を作製するために使用することが可能な酵母ディスプレイ法の例には、Ｗｉｔｔｒｕｐ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第６，６９９，６５８号およびＦｒｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ.米国特許第６，１１４，１４７号に開示されているものが含まれる。
【０１１０】
Ｂ．組み換えＴＮＦ−α抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技法のいずれによっても産生し得る。例えば、重鎖と軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準技法により宿主細胞にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現である。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、異種ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために一般に使用されている多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション等を包含するものとする。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも本発明の抗体を発現することは可能であるが、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が企図されている。なぜならば、そのような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は正しくフォールディングされ免疫学的に活性な抗体を組立て分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。
【０１１１】
本発明の組み換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるＤＨＦＲ選択可能マーカーと一緒に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、宿主細胞における抗体の発現、特に、宿主細胞が増殖されている培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することにより抗体は産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することが可能である。
【０１１２】
宿主細胞を使用して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を産生することも可能である。上記手順の変動は本発明の範囲内であることは理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組み換えＤＮＡ技術を使用して、対象の抗原に結合するのに必要ではない軽鎖と重鎖のどちらかまたは両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを取り除いてもよい。そのような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体に包含されている。さらに、標準化学的架橋法により本発明の抗体を第二の抗体に架橋させることにより、１つの重鎖と１つの軽鎖は本発明の抗体であり、残りの重鎖と軽鎖は対象の抗原以外の抗原に特異的である二機能性抗体を産生し得る。
【０１１３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組み換え発現のための例となるシステムにおいて、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子はそれぞれ、この遺伝子の高レベルの転写を推進するＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに作用可能に連結されている。組み換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を使用して前記ベクターがトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も坦持している。選択された形質転換体宿主細胞は培養されて、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、培養培地から無傷の抗体が回収される。標準分子生物学技法を使用して、組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養して、培養培地から抗体を回収する。さらに、本発明は、本発明の組み換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培養培地において培養することにより本発明の組み換え抗体を合成する方法を提供する。前記方法は、組み換え抗体を培養培地から単離することもさらに含むことが可能である。
【０１１４】
１．抗ｈＴＮＦ−α抗体
表５は、本発明の抗ｈＴＮＦ−α抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列の一覧表である（ＣＤＲ配列は太字で示されている）。
【０１１５】
【表５】
2013523153.tif 000006
【０１１６】
２．抗ｈＴＮＦ−αキメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野では公知であり、実施例２．１において詳細に考察されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第４，８１６，５６７号；および米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライスすることにより、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）を使用することが可能である。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のキメラ抗体は、セクション１に記載されるマウスモノクローナル抗ヒトＴＮＦ−α抗体の重鎖定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域で置き換えることにより産生される。
【０１１８】
３．抗ＴＮＦ−αＣＤＲ移植された抗体
本発明のＣＤＲ移植された抗体は、ヒト抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つ以上が、本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列と置換される。あらゆるヒト抗体から得られるフレームワーク配列が、ＣＤＲ移植のためのテンプレートとしての役割を果たし得る。しかしながら、このようなフレームワーク上への直鎖の置換は、しばしば、抗原への結合親和性を若干喪失させる。元のマウス抗体に対して、ヒト抗体がより相同であるほど、ヒトフレームワークとマウスＣＤＲの組合せは、親和性を低下させ得るＣＤＲ中の歪みを導入する可能性がより低くなる。したがって、一実施形態において、ＣＤＲ以外のマウス可変フレームワークを置換するために選択されたヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、ＣＤＲを除くヒトおよびマウス可変領域は、少なくとも７０％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、ＣＤＲを除くヒトおよびマウス可変領域は、少なくとも７５％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、ＣＤＲを除くヒトおよびマウス可変領域は、少なくとも８０％の配列同一性を有する。キメラ抗体を作製する方法は、本分野において公知であり、実施例２．２において詳細に考察されている（ＥＰ特許第０２３９４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号も参照）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３），およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）。
【０１１９】
特定の実施形態において、本発明は、表６に記載されるＶＨおよび／またはＶＬ鎖を有するＣＤＲ移植された抗体を提供する。
【０１２０】
【表６】
2013523153.tif 000007
【０１２１】
４．抗ｈＴＮＦ−αヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体から得られる抗体分子である。公知のヒトＩｇ配列は、開示されている。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏ−ｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ  ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｎａ．ｈｔｍｌ。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）。このような導入された配列は、免疫原性を低下させるために、または結合、親和性、結合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期もしくは本分野で公知の他のいずれかの適切な特性を減少、増強もしくは修飾するために使用することが可能である。
【０１２２】
ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるために、抗原結合を改善させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、本分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するために、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７を参照されたい。）。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列が採り得る三次元立体構造を図式および表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基は、所望される抗体特性（標的抗原に対して増加された親和性など）が達成されるように、コンセンサスおよび輸入配列から選択され、組み合わせることが可能である。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接、および最も実質的に関与する。抗体は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６−２３０８；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７，ＷＯ９８／０６８３４（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０）、ＷＯ９７／２００３２（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８）、ＷＯ９２／１１２７２（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０）、ＷＯ９２／０３４６１（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９）、ＷＯ９４／１８２１９（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４）、ＷＯ９２／０１０４７（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４）、ＷＯ９３／０６２１３（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５）；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４およびＷＯ９０／１４４３０、欧州公開第ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６およびＥＰ０２３９４００、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号および第４，８１６，５６７号に記載されているものなどの（但し、これらに限定されない。）、本分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することが可能である。
【０１２３】
Ｃ．抗体および抗体産生細胞系の作製
一実施形態において、本発明の抗ＴＮＦ−α抗体は、当技術分野において公知のいくつかのインビトロおよびインビボアッセイのうちのいずれか１つにより評価された場合、ＴＮＦ−α活性を減少させるまたは中和する高い能力を示す。あるいは、本発明の抗ＴＮＦ−α抗体は、ＴＮＦ−α活性を増加させるまたは刺激する高い能力も示す。
【０１２４】
特定の実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＮＦ−αに結合し、表面プラズモン共鳴により決定される場合、抗体またはその抗原結合部分は、約０．１ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し、または約１×１０−６Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制する。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定される場合、約１×１０−２ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し得る、または約１×１０−７Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定される場合、約１×１０−３ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し得る、または約１×１０−８Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定される場合、約１×１０−４ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し得る、または約１×１０−９Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定される場合、約１×１０−５ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し得る、または約１×１０−１０Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴により決定される場合、約１×１０−５ｓ−１もしくはそれより少ないｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦ−αから解離し得る、または約１×１０−１１Ｍもしくはそれよりも少ないＩＣ５０でヒトＴＮＦ−α活性を抑制し得る。
【０１２５】
ある種の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの、重鎖定常領域を含む。一実施形態において、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域、すなわち、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかを含むことができる。別の実施形態において、抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片または単一鎖Ｆｖ断片であることが可能である。
【０１２６】
抗体エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、本分野において周知である（米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号参照）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体の半減期／排除速度および抗原−抗体複合体を媒介する。いくつかの事例において、これらのエフェクター機能は、治療用抗体のために望ましいが、別の事例では、治療目的に応じて、必要でない場合があり得、または有害である場合さえあり得る。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれ、ＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑへの結合を介して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のエフェクター機能が変化されるように、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域において置換されている。
【０１２７】
一実施形態は、標識された結合タンパク質を提供し、ここで、本発明の抗体または抗体部分は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）へ誘導体化され、または連結される。例えば、本発明の標識された結合タンパク質は、別の抗体（例えば、二特異的抗体またはダイアボティ）、検出可能作用物質、細胞毒性剤、薬剤および／または別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との、抗体または抗体部分の会合を媒介可能なタンパク質もしくはペプチドなどの１つ以上の他の分子実体へ、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有会合またはその他によって）本発明の抗体または抗体部分を機能的に連結することによって誘導することが可能である。
【０１２８】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化し得る有用な検出可能作用物質には、蛍光化合物が含まれる。典型的な蛍光検出可能作用物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素でも誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合には、検出可能な反応産物を生成させるために、本酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって抗体が検出される。例えば、検出可能作用物質西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能な発色した反応産物をもたらす。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定を通じても検出され得る。
【０１２９】
本発明の別の実施形態は、結晶化された結合タンパク質を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書において開示されるホール抗ＴＮＦ−α抗体およびその断片の結晶、ならびにそのような結晶を含む製剤および組成物に関する。一実施形態において、結晶化された結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性対応物より大きなインビボ半減期を有する。別の実施形態において、結合タンパク質は、結晶化後の生物活性を保持する。
【０１３０】
本発明の結晶化された結合タンパク質は、本分野で公知の方法に従って、およびＰＣＴ公開ＷＯ０２／７２６３６に開示されているように産生され得る。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、抗体またはその抗原結合部分が１つ以上の炭水化物残基を含む、グリコシル化された結合タンパク質を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを経ることがあり得る。特に、糖（グリコシル）残基は、酵素的に付加され得る（グリコシル化として知られる方法）。共有結合されたオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質または糖タンパク質として知られる。タンパク質グリコシル化は、対象のタンパク質のアミノ酸配列およびその中でタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転移酵素およびグリコシダーゼ）を産生し得、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要因のために、タンパク質グリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、タンパク質がその中で発現されている宿主系に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、グリコシル化された結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるように、グリコシル残基を含む。
【０１３２】
異なるタンパク質グリコシル化は異なるタンパク質特性をもたらし得ることが、当業者に公知である。例えば、酵母などの微生物宿主中で産生され、酵母内在経路を用いてグリコシル化された治療用タンパク質の効力は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現された同じタンパク質の効力と比べて低下され得る。また、このような糖タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性であり得、投与後に、減少したインビボ半減期を示し得る。ヒトおよび他の動物中の特異的な受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し得、血流からのタンパク質の迅速な除去を促進し得る。他の有害な効果は、タンパク質の折り畳み、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、運搬、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質または因子による認識、抗原性またはアレルゲン性の変化が含まれ得る。したがって、当業者は、グリコシル化の特異的な組成およびパターン、例えば、ヒト細胞中または意図される対象動物の種特異的細胞中で産生されるものと同一または少なくとも類似のグリコシル化組成およびパターンを有する治療タンパク質を好み得る。
【０１３３】
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化されたタンパク質を発現することは、異種グリコシル化酵素を発現するために宿主細胞を遺伝的に修飾することによって達成され得る。本分野で公知の技術を使用して、当業者は、ヒトタンパク質グリコシル化を呈する抗体またはその抗原結合部分を作製し得る。例えば、酵母株中で産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を呈するように（米国特許第７，４４９，３０８号および第７，０２９，８７２号）、酵母株は、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に修飾されている。
【０１３４】
さらに、ライブラリーのメンバー宿主細胞がバリアントグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝学的に改変された宿主細胞のライブラリーを用いて、目的のタンパク質を発現させ得ることが、当業者によって理解されている。次いで、当業者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択および単離し得る。一実施形態において、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、改善または改変された生物学的特性を示す。
【０１３５】
Ｄ．抗ＴＮＦ−α抗体の使用
ヒトＴＮＦ−αに結合するその能力を考慮すると、例えば、本発明の抗ヒトＴＮＦ−α抗体またはその部分を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学などの従来のイムノアッセイを使用して、ＴＮＦ−α（例えば、血清または血漿などの生体試料において）を検出することが可能である。本発明は、生体試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させて、ＴＮＦ−αに結合している抗体（もしくは抗体部分）または非結合抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって生体試料中のＴＮＦ−αを検出することを含む、生体試料中のＴＮＦ−αを検出するための方法を提供する。抗体は、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進するために、検出可能な物質で直接または間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる；および適切な放射性材料の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍが含まれる。
【０１３６】
抗体を標識する代わりに、ヒトＴＮＦ−αは、検出可能物質で標識されたｒｈＴＮＦ−α標準物質および非標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体を利用する競合イムノアッセイにより生体液中においてアッセイすることが可能である。このアッセイでは、生体試料、標識されたｒｈＴＮＦ−α標準物質および抗ヒトＴＮＦ−α抗体を組み合わせて、非標識抗体に結合している標識されたｒｈＴＮＦ−α標準物質の量が決定される。生体試料中のヒトＴＮＦ−αの量は、抗ヒトＴＮＦ−α抗体に結合している標識されたｒｈＴＮＦ−α標準物質の量に反比例している。同様に、ヒトＴＮＦ−αは、検出可能物質で標識されたｒｈＴＮＦ−α標準物質および非標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体を利用する競合イムノアッセイにより生体液中においてもアッセイすることが可能である。
【０１３７】
一実施形態において、本発明の抗体および抗体部分は、ＴＮＦ−α活性、例えば、ヒトＴＮＦ−α活性をインビトロでもインビボでも中和することができる。別の実施形態において、本発明の抗体および抗体部分は、ヒトＴＮＦ−α活性、例えば、ヒトＴＮＦ−α活性を増加させるまたは刺激することができる。したがって、本発明のそのような抗体および抗体部分を使用して、例えば、ｈＴＮＦ−αを含有する細胞培養物中で、ヒト対象においてまたは本発明の抗体が交差反応するＴＮＦ−αを有する他の哺乳動物対象において、ｈＴＮＦ−α活性を抑制するまたは増加させることができる。一実施形態において、本発明は、ｈＴＮＦ−α活性が抑制されるまたは増加されるように、ｈＴＮＦ−αを本発明の抗体または抗体部分と接触させることを含む、ｈＴＮＦ−α活性を抑制するまたは増加させるための方法を提供する。例えば、ｈＴＮＦ−αを含有するまたは含有すると疑われる細胞培養物において、本発明の抗体または抗体部分を培養培地に添加して、培養物中でｈＴＮＦ−α活性を抑制するまたは増加させることができる。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明は、対象において、有利には、ＴＮＦ−α活性が有害であるまたは、代わりに有益である疾病または疾患に罹っている対象から、ｈＴＮＦ−α活性を減少させるまたは増加させるための方法を提供する。本発明は、対象中のＴＮＦ−α活性が減少するまたは増加するように、本発明の抗体または抗体部分を対象に投与することを含む、そのような疾病または疾患に罹っている対象においてＴＮＦ−α活性を減少させるまたは増加させるための方法を提供する。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αはヒトＴＮＦ−αであり、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体が結合することができるＴＮＦ−αを発現している哺乳動物であることが可能である。さらに、対象は、ＴＮＦ−αが導入されている（例えば、ＴＮＦ−αの投与によってまたはＴＮＦ−αトランス遺伝子の発現によって）哺乳動物であることが可能である。本発明の抗体は、治療目的でヒト対象に投与することが可能である。さらに、本発明の抗体は、獣医学目的でまたはヒト疾病の動物モデルとして、その抗体が結合することができるＴＮＦ−αを発現している非ヒト哺乳動物に投与することが可能である。後者に関しては、そのような動物モデルは本発明の抗体の治療効果を評価する（例えば、投与の投与量および時間経過を試験する）ために有用であり得る。
【０１３９】
「ＴＮＦ−α活性が有害である疾患」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＴＮＦ−α活性の存在が、疾患の病態生理の原因であることがまたは疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、または疑われている疾病およびその他の疾患を含む。したがって、ＴＮＦ−α活性が有害である疾患は、ＴＮＦ−α活性の低下が疾患の症候および／または進行を緩和することが予測される疾患である。そのような疾患は、例えば、疾患に罹っている対象の生体液中のＴＮＦ−αの濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液、等中のＴＮＦ−αの濃度の増加）により証明し得、この濃度の増加は、例えば、上記の抗ＴＮＦ−α抗体を使用して検出することができる。本発明の抗体を用いて治療することが可能な疾患の非限定的例には、本発明の抗体の医薬組成物に関する下のセクションにおいて考察される疾患が含まれる。
【０１４０】
あるいは、「ＴＮＦ−α活性が有益である疾患」という用語には、疾患に罹っている対象中のＴＮＦ−α活性の存在が、疾患の病態生理を治療するのに有益であるまたは疾患の治療に寄与する要因であるのいずれかであることが明らかにされているまたはそうであると疑われている疾病または他の疾患が含まれる。したがって、ＴＮＦ−α活性が有益である疾患は、ＴＮＦ−α活性の増加が疾患の症状および／または進行を軽減すると予想される疾患である。本発明の抗体を用いて治療することが可能な疾患の非限定的例には、本発明の抗体の医薬組成物に関する下のセクションにおいて考察される疾患が含まれる。
【０１４１】
Ｅ．医薬組成物
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分および医薬として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、疾患を診断し、検出し、もしくはモニタリングし、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、もしくは軽減する上で、および／または研究において使用されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の本発明の抗体を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の本発明の抗体、およびＴＮＦ−α活性が有害である疾患を治療するための、本発明の抗体以外の１つ以上の予防または治療剤を含む。特定の実施形態において、予防剤または治療剤は、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減に有用であることが知られており、または疾患または１つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減においてこれまで使用されており、もしくは現在使用されている。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
【０１４２】
本発明の抗体および抗体部分は、対象に投与するのに適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体および抗体部分ならびに医薬として許容される担体を含む。「医薬として許容される担体」という用語は、生理的に適合性がある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体の例には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上およびこれらの組合せが含まれる。多くの場合において、等張剤、例えば、組成物中の糖、マニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムが含まれる。医薬として許容される担体は、抗体または抗体部分の保存期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの補助物質の微量をさらに含み得る。
【０１４３】
様々な送達系が公知であり、例えば、リポソーム、微粒子、ミクロカプセル、抗体または抗体断片を発現することができる組み換え細胞、受容体によって媒介されるエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物などに封入して、本発明の１つもしくはそれ以上の抗体または本発明の１つもしくはそれ以上の抗体および疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、管理し、治療し、もしくは軽減するのに有用な予防剤または治療剤の組合せを投与するために使用することが可能である。本発明の予防剤または治療剤を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻内および経口経路）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、例えば、吸入装置または噴霧器およびエアロゾル化剤を加えた製剤の使用によって、経肺投与を使用することが可能である。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；第５，９８５，３２０号；第５，９８５，３０９号；第５，９３４，２７２号；第５，８７４，０６４号；第５，８５５，９１３号；および第５，２９０，５４０号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。一実施形態において、本発明の抗体、組合せ療法または本発明の組成物は、ＡｌｋｅｒｍｅｓＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。特定の実施形態において、本発明の予防剤または治療剤は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、経肺または皮下投与される。予防剤または治療剤は、あらゆる都合のよい経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮下の裏打ち（例えば、口粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与され得、生物学的に活性な他の作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。
【０１４４】
特定の実施形態において、治療を必要としている部位へ局所的に、本発明の予防剤または治療剤を投与することが望ましい場合があり得る。これは、例えば、局所的注入によって、注射によって、またはインプラントの手段によって達成され得るが、これらに限定されるものではなく、前記インプラントは、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、ポリマー、繊維性マトリックス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリックスなどの、膜およびマトリックスを含む多孔性または非多孔性材料である。一実施形態において、本発明の１つ以上の抗体アンタゴニストの有効量は、疾患またはその症候を予防し、治療し、管理し、および／または軽減するために、対象の罹患した部位へ局所的に投与される。別の実施形態において、本発明の１つ以上の抗体の有効量は、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、および／または軽減するために、本発明の抗体以外の１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の予防剤または治療剤）の有効量と組み合わせて、対象の罹患した部位へ局所的に投与される。
【０１４５】
別の実施形態において、予防剤または治療剤は、調節された放出系または徐放系に入れて送達することが可能である。一実施形態において、調節された放出または徐放を達成するためにポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９参照）。別の実施形態において、本発明の治療薬の調節された放出または徐放を達成するために、ポリマー材料を使用することが可能である。（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ.ＩＩ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，（１９８４），ｐｐ．１１５−１３８；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，（Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，ｅｄｓ．），（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２３（１）：６１−１２６を参照されたい。Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７  １：１０５−１１２）；米国特許第５，６７９，３７７号；第５，９１６，５９７号；第５，９１２，０１５号；第５，９８９，４６３号；および米国特許第５，１２８，３２６号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＷＯ９９／２０２５３も参照されたい。徐放製剤中で使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、溶脱可能な不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、生物分解性である。さらに別の実施形態において、調節された放出系または徐放系は、予防剤または治療剤の近くに配置されて、全身投薬量の一部のみを必要とするようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．ＩＩ，ｓｕｐｒａ，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０１４６】
徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説中に論述されている。本発明の１つ以上の治療剤を含む徐放製剤を作製するために、当業者に公知のあらゆる技術を使用することが可能である。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｏｎｃｏｌ．  ３９：１７９−１８９，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５０：３７２−３７７，Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４およびＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｔｅｒ．２４：７５９−７６０を参照されたい。
【０１４７】
本発明の組成物が予防剤または治療剤をコードする核酸である特定の実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部として、核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用によって、または直接の注射によって、または微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎ）の使用によって、核酸が細胞内となるように核酸を投与し、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤でコーティングし、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して核酸を投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）、核酸がコードしている予防剤または治療剤の発現を促進するために、核酸をインビボで投与することが可能である。あるいは、相同的組み換えによる発現のために、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に取り込むことが可能である。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、その予定された投与経路と適合的であるように製剤化される。投与の経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与が含まれるが、これらに限定されない。特異的な実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内または局所投与に適合された医薬組成物として、定型的な手法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤および注射の部位における痛みを和らげるための局所麻酔剤（リグノカムンｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）なども含み得る。
【０１４９】
本発明の組成物が局所的に投与されるべき場合には、組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態でまたは当業者に周知の他の形態で製剤化することが可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）を参照されたい。噴霧不能な局所剤形の場合には、局所適用に適合性のある担体または１つもしくはそれ以上の賦形剤を含み、水より大きな動粘性係数を有する粘性ないし半固体または固体の形態が典型的には使用される。適切な製剤は、所望であれば、滅菌され、または、例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合された、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、粉末、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）など（これらに限定されない）を含む。他の適切な局所剤形には、場合によって固体または液体不活性担体と組み合わされた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、ＦＲＥＯＮ（登録商標）などの気体状噴射剤）との混合物中または搾り出し瓶中に梱包されている噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれる。所望であれば、医薬組成物および剤形に、加湿剤または湿潤剤も添加することが可能である。このような追加の成分の例は、本分野において周知である。
【０１５０】
本発明の方法が組成物の鼻内投与を含む場合には、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト中に、または点鼻薬の形態で製剤化することが可能である。特に、本発明に従って使用するための予防剤または治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体）を用いて、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達することが可能である。加圧されたエアロゾルの場合には、投薬単位は、定量された量を送達するためのバルブを付与することによって決定され得る。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入装置またはガス注入装置で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される。）を製剤化し得る。
【０１５１】
本発明の方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル、カシェ剤、ゲルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で、組成物を経口的に製剤化することが可能である。錠剤またはカプセルは、従来の手段によって、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、イモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、医薬として許容される賦形剤とともに調製することが可能である。錠剤は、本分野において周知な方法によって被覆され得る。経口投与用の液体調製物は、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態（これらに限定されない。）を採り得、または、使用前に、水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として与えられ得る。このような液体調製物は、慣用の手段によって、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの医薬として許容される添加物とともに調製され得る。調製物は、適宜、緩衝液塩、着香剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。経口投与用調製物は、予防剤または治療剤の遅い放出、調節された放出または徐放のために、適切に製剤化され得る。
【０１５２】
本発明の方法は、例えば、吸入装置または噴霧器の使用、エアロゾル化剤とともに製剤化された組成物の使用によって、経肺投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；第５，９８５，３２０号；第５，９８５，３０９号；第５，９３４，２７２号；第５，８７４，０６４号；第５，８５５，９１３号；および第５，２９０，５４０号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。特定の実施形態において、本発明の抗体、組合せ療法および／または本発明の組成物は、ＡｌｋｅｒｍｅｓＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．ＵＳ）を用いて投与される。
【０１５３】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続的注入による）非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含み得る。注射用製剤は、添加された防腐剤とともに、単位剤形で（例えば、アンプル以上投薬容器に入れて）与え得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態を採り得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末形態であり得る。
【０１５４】
本発明の方法は、さらに、デポ調製物として製剤化された組成物の投与を含み得る。このような長期作用製剤は、（例えば、皮下または筋肉内への）植え込みによって、または筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、組成物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）調合され得る。
【０１５５】
本発明の方法は、中性または塩形態として製剤化された組成物の投与を包含する。医薬として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンとともに形成された塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンとともに形成された塩が含まれる。
【０１５６】
一般的には、組成物の成分は、別個に、または単位剤形中に（例えば、活性剤の量を示した注射器またはにおい袋など、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥粉末または無水濃縮物として）一緒に混合されて供給される。投与の様式が注入である場合には、組成物は、医薬等級の無菌水または生理的食塩水を含有する注入瓶を用いて分配することが可能である。投与の様式が注射による場合には、注射用の無菌水または生理的食塩水の注射器は、投与前に成分が混合され得るように提供することが可能である。
【０１５７】
特に、本発明は、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または本発明の医薬組成物が、薬剤の量を示した注射器またはにおい袋など、密閉された容器中に梱包されることも提供する。一実施形態において、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または医薬組成物は、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末または無水濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度になるように（例えば、水または生理的食塩水で）再構成することができる。一実施形態において、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投薬量で、密封された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された予防もしくは治療剤または医薬組成物は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で保存されるべきであり、本発明の予防剤もしくは治療剤または医薬組成物は、再構成後、１週以内、５日以内、７２時間以内、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内に、または１時間以内に投与されるべきである。別の実施形態において、本発明の予防剤もしくは治療剤の１つもしくはそれ以上または本発明の医薬組成物は、薬剤の量および濃度を示す密閉された容器中に、液体形態で供給される。一実施形態において、投与された組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで、密封された容器中に供給される。液体形態は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で保存されるべきである。
【０１５８】
本発明の抗体および抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。一実施形態において、抗体または抗体部分は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、フリント容器または琥珀色の容器、注射器または予め充填されたシリンジ中の液体または凍結乾燥された剤形から構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）、最適には５−１０ｍＭであり得る。他の適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。０−３００ｍＭの濃度に（最適には、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の溶液の毒性を修飾するために、塩化ナトリウムを使用することが可能である。凍結乾燥された剤形に対して、凍結保護剤、主に、０−１０％のスクロース（最適には、０．５−１．０％）を含めることが可能である。他の適切な凍結保護剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、主に、１−１０％のマニトール（最適には、２−４％）を含めることが可能である。液体および凍結乾燥された両剤形において、安定化剤、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には、５−１０ｍＭ）を使用することが可能である。他の適切な充填剤には、グリシン、アルギニンが含まれ、０−０．０５％のポリソルベート−８０（最適には、０．００５−０．０１％）として含めることが可能である。さらなる界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）など、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび坐薬などの、液体、半固体および固体剤形が含まれる。特定の形態は、予定される投与の様式および治療用途に依存する。典型的な組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫に対して使用される組成物と同様の組成物など、注射可能溶液または注入可能溶液の形態である。投与の様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）を含む。特定の実施形態において、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。別の特定の実施形態において、抗体は、筋肉内注入または皮下注射によって投与される。
【０１６０】
治療組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化することが可能である。無菌注射可能溶液は、上で列記されている成分の１つまたは組合せを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物（すなわち、抗体、抗体部分）を取り込ませた後、必要に応じて、濾過滅菌を行うことによって調製することが可能である。一般的に、分散液は、塩基性分散溶媒および上で列記されたものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、調製の方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、あらゆる追加の所望される成分を加えた活性成分の粉末を与える真空乾燥および粉末乾燥を含む。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
【０１６１】
本発明の抗体および抗体部分は、本分野で公知の様々な方法によって投与することが可能であるが、多くの治療用途において、例えば、投与経路／様式は皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよび微小封入された送達系を含む徐放製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生物分解可能な生物適合性ポリマーを使用することが可能である。このような製剤の多くの調製方法は、特許が付与されているまたは一般的に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１６２】
ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与され得る。また、化合物（および、所望であれば、その他の成分）は、硬いもしくは軟い殻のゼラチンカプセル中に封入され、錠剤へと圧縮され、または患者の食事中に直接取り込ませ得る。経口治療投与の場合、化合物は、賦形剤とともに取り込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活化を妨げるための物質で化合物を被覆し、またはその不活化を妨げるための物質とともに化合物を同時投与することが必要であり得る。
【０１６３】
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗体部分は、ＴＮＦ−α活性が有害である疾患を治療するのに有用である、１つ以上のさらなる治療剤とともに共製剤化され、および／または同時投与される。例えば、本発明の抗ｈＴＮＦ−α抗体または抗体部分は、他の錠剤に結合する１つ以上のさらなる抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体または細胞表面分子に結合する抗体）とともに共製剤化され、および／または同時投与され得る。さらに、本発明の１つ以上の抗体は、先述の治療剤の２つまたはそれ以上と組み合わせて使用され得る。このような組合せ療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、様々な単独療法に伴って生じ得る毒性または合併症が回避される。
【０１６４】
ある種の実施形態において、ＴＮＦ−αの抗体またはその断片は、本分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国出願第６，６６０，８４３号に記載されている。
【０１６５】
特定の実施形態において、本発明の抗体または本発明の別の予防剤もしくは治療剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子治療によって、疾患または１つもしくはそれ以上のその症候を治療し、予防し、管理し、または軽減するために投与される。遺伝子治療は、発現された核酸または発現可能な核酸の、対象への投与によって実行される治療を表す。本発明の本実施形態において、核酸は、予防的効果または治療的効果を媒介する、本発明のコードされたそれらの抗体または予防剤もしくは治療剤を産生する。
【０１６６】
本発明に従って、本分野で利用可能な遺伝子治療のためのあらゆる方法を使用することが可能である。遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１１（５）：１５５を参照されたい。使用可能な組み換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られた方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、米国特許公開第２００９／０２９７５１４号に開示されている。
【０１６７】
ＴＮＦ−αは、免疫および炎症要素を含む種々の疾病に付随する病態において決定的に重要な役割を果たしている。これらの疾病には、後天性免疫不全症症候群；後天性免疫不全関連疾患；後天性悪性貧血；急性冠症候群；急性および慢性疼痛（異なる形態の疼痛）；急性特発性多発神経炎；臓器移植に付随する急性免疫疾患；臓器移植に付随する急性または慢性免疫疾患；急性炎症性脱髄性多発性神経根筋障害；急性虚血；急性肝疾患；急性リウマチ熱；急性横断性脊髄炎；アジソン病；成人（急性）呼吸促迫症候群；成人スティル病；アルコール性肝硬変；アルコール誘発肝損傷；アレルギー性疾患；アレルギー；脱毛症；円形脱毛症；アルツハイマー病；アナフィラキシー；強直性脊髄炎；強直性脊髄炎関連肺疾患；抗リン脂質抗体症候群；再生不良性貧血；動脈硬化症；関節症；喘息；アテローム性疾患／動脈硬化症；アテローム性動脈硬化；アトピー性アレルギー；アトピー性湿疹；アトピー性皮膚炎；萎縮性自己免疫甲状腺機能低下症；自己免疫水疱症；自己免疫皮膚炎；自己免疫性糖尿病；連鎖球菌感染に付随する自己免疫障害；自己免疫性腸症；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性肝炎；自己免疫聴力損失；自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）；自己免疫媒介低血糖症；自己免疫性心筋炎；自己免疫性好中球減少症；自己免疫早発卵巣不全；自己免疫性血小板減少症（ＡＩＴＰ）；自己免疫性甲状腺疾患；自己免疫ブドウ膜炎；閉塞性細気管支炎；ベーチェット病；癌瞼炎；気管支拡張症；水疱性類天疱瘡；悪液質；心血管疾患；劇症型抗リン脂質症候群；セリアック病；頸椎症；クラミジア；胆汁うっ滞；慢性活動性肝炎；慢性好酸球性肺炎；慢性疲労症候群；臓器移植に付随する慢性免疫疾患；慢性虚血；慢性肝疾患；慢性粘膜皮膚カンジダ症；瘢痕性類天疱瘡；多発性硬化症のリスクを有する臨床的孤発症候群（ＣＩＳ）；分類不能型免疫不全症（分類不能型低γグロブリン血症）；結合組織疾患関連間質性肺疾患；結膜炎；クームス陽性溶血性貧血；小児期発症精神障害；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；クローン病；原因不明自己免疫肝炎；原因不明線維性肺胞炎；涙嚢炎；鬱病；皮膚炎強皮症；皮膚筋炎；皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患；糖尿病性網膜症；真性糖尿病；拡張型心筋症；円板状エリテマトーデス；椎間板ヘルニア；椎間板脱出症；播種性血管内凝固；薬物性肝炎；薬物性間質性肺疾患；薬物性免疫性溶血性貧血；心内膜炎；子宮内膜症；眼内炎；腸疾患滑膜炎；上強膜炎；多形性紅斑；重症型多形性紅斑；女性不妊症；線維症；線維症肺疾患；妊娠性類天疱瘡；巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）；糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｄｅｓ）；甲状腺腫性自己免疫甲状腺機能低下症（橋本病）；グッドパスチャー症候群；痛風関節炎；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）；グレーブス病；Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染；ギランバレー症候群（ＧＢＳ）；ヘモジデリン沈着症関連肺疾患；枯草熱；心不全；溶血性貧血；ヘノッホ・シェーライン紫斑症；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ヒューズ症候群；ハンチントン舞踏病；甲状腺機能亢進症；副甲状腺機能低下症；特発性白血球減少症；特発性血小板減少症；特発性パーキンソン病；特発性間質性肺炎；特異体質肝疾患；ＩｇＥ媒介ア��ルギー；免疫性溶血性貧血；封入体筋炎；感染症；伝染性眼性炎症性疾患；炎症性腸疾患；炎症性脱髄性疾患；炎症性心疾患；炎症性腎疾患；インシュリン依存性糖尿病；間質性肺炎；ＩＰＦ／ＵＩＰ；虹彩炎；若年性慢性関節炎；若年性悪性貧血；若年性関節リウマチ；川崎病；角膜炎；乾性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）；クスマウル病またはクスマウル−マイヤー病；ランドリー麻痺；ランゲルハンス細胞組織球症；線状ＩｇＡ病；網状皮斑；ライム関節炎；リンパ性浸潤性肺疾患；黄斑変性症；特発性男性不妊症またはＮＯＳ；悪性腫瘍；腎臓の微細脈管炎；顕微鏡的多発血管症；混合結合組織疾患関連肺疾患；ベヒテレフ病；運動ニューロン障害；粘膜類天疱瘡；多発性硬化症（すべてのサブタイプ：原発性進行性、二次性進行型、再発寛解型、等）；多臓器不全；筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病；重症筋無力症；骨髄異形成症候群；心筋梗塞；心筋炎；ネフローゼ症候群；神経根障害；神経障害；非アルコール性脂肪性肝炎；非Ａ非Ｂ型肝炎；視神経炎；臓器移植拒絶；変形性関節炎；骨溶解症；卵巣癌；卵巣機能不全；膵炎；寄生虫症；パーキンソン病；小関節ＪＲＡ；類天疱瘡；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；末梢血管閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）；末梢血管疾患（ＰＶＤ）；末梢動脈疾患（ＰＡＤ）；水晶体起因性ブドウ膜炎；静脈炎；結節性多発動脈症（または結節性動脈周囲炎）；多発性軟骨炎；リウマチ性多発筋痛症；白髪症；多関節型ＪＲＡ；多内分泌腺症候群（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；多発性筋炎；多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型および多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型；リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）；感染後間質性肺疾患；炎症後間質性肺疾患；ポストポンプ症候群；早期卵巣機能不全；原発性胆汁性肝硬変；原発性粘液水腫；原発性パーキンソン症；原発性硬化性胆管炎；原発性硬化性肝炎；原発性脈管炎；前立腺直腸癌および造血器悪性腫瘍（白血病およびリンパ腫）；前立腺炎；乾癬；乾癬１型；乾癬２型；乾癬性関節炎；乾癬性関節症；結合組織疾患に続発する肺高血圧症；結節性多発動脈炎の肺症状；赤芽球癆；原発性副腎不全；放射線線維症；反応性関節炎；ライター病；再発性視神経脊髄炎；腎疾患ＮＯＳ；再狭窄；関節リウマチ；関節リウマチ関連間質性肺疾患；リウマチ性心疾患；ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、挫瘡、膿疱症、骨増殖症および骨炎）；サルコイドーシス；統合失調症；シュミット症候群；強皮症；続発性アミロイドーシス；ショック肺；強膜炎；坐骨神経痛；続発性副腎機能不全；敗血症症候群；化膿性関節炎；敗血症性ショック；血清陰性関節症；シリコーン関連結合組織疾患；シェーグレン病関連肺疾患；シェーグレン症候群；スネドン−ウィルキンソン皮膚症；精子自己免疫；脊椎関節炎；脊椎炎アンキロサン（ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ａｎｋｙｌｏｓａｎｓ）；スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）；スチル病；脳卒中；交感性眼炎；全身性炎症反応症候群；全身性エリテマトーデス；全身性エリテマトーデス関連肺疾患；全身性硬化症；全身性硬化症関連間質性肺疾患；高安病／動脈炎；側頭動脈炎；Ｔｈ２型およびＴｈ１型によって媒介される疾病；甲状腺炎；毒素性ショック症候群；トキソプラスマ性網膜炎；中毒性表皮壊死症；横断性脊髄炎；ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体１型（ＴＮＦＲ）−関連周期的症候群）；黒色表皮腫を伴うＢ型インシュリン抵抗性；１型アレルギー反応；１型自己免疫肝炎（古典的自己免疫またはルポイド肝炎）；２型自己免疫肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）ｅ；ＩＩ型糖尿病；潰瘍性大腸炎性関節症；潰瘍性大腸炎；蕁麻疹；通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）；ブドウ膜炎；血管炎性瀰漫性肺疾患；脈管炎；春季カタル；ウイルス性網膜炎；白斑；フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）；ウェゲナー肉芽腫症；滲出型横斑変性；創傷治癒；エルシニアおよびサルモネラ関連関節症が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６８】
本発明の抗体および抗体部分を使用して、自己免疫疾患、特に、炎症、関節リウマチ、変形性関節炎；乾癬；多発性硬化症に付随する自己免疫疾患および他の自己免疫疾患に罹っているヒトを治療することが可能である。
【０１６９】
本発明の抗体または抗体部分は、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療において有用な１つ以上の追加の治療剤とともに投与することも可能である。
【０１７０】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、このような疾病を治療するために、単独で、または組み合わせて使用することが可能である。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、単独で、または追加の作用物質、例えば治療剤と組み合わせて使用することが可能であり、前記追加の作用物質は、その意図される目的に対して、当業者によって選択されることを理解すべきである。例えば、追加の作用物質は、本発明の抗体によって治療されている疾病または症状を治療するのに有用であると本分野で認識されている治療剤とすることが可能である。追加の作用物質は、治療組成物に有益な属性を付与する作用物質、例えば、組成物の粘性に影響を与える作用物質とすることも可能である。
【０１７１】
本発明に含まれるべき組合せは、それらの意図される目的に対して有用な組合せであることをさらに理解すべきである。以下に記されている作用物質は、例示を目的とするものであって、限定を意図するものではない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の作用物質であり得る。当該組合せにおいて、形成された組成物がその意図される機能を実行することが可能であれば、組合せは、２以上の追加の作用物質、例えば、２または３個の追加の作用物質を含むこともできる。
【０１７２】
特定の組合せは、ＮＳＡＩＤとも称される非ステロイド性抗炎症薬（イブプロフェンのような薬物が含まれる。）である。他の組合せは、プレドニゾロンなどのコルチコステロイドである。ステロイド使用の周知の副作用は、本発明の抗ＴＮＦ−α抗体と組み合わせて患者を治療するときに必要とされるステロイド用量を徐々に減らすことによって、低減することが可能であり、または除去することさえ可能である。本発明の抗体または抗体部分とともに組み合わせることが可能な関節リウマチに対する治療剤の非限定的な例には、以下のもの：サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；その他のヒトサイトカインまたは成長因子（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ）に対する抗体またはこれらのアンタゴニストが含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡまたはＣＤ１５４を含むこれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることが可能である。
【０１７３】
治療剤の特定の組合せは、異なる点で、自己免疫およびこれに続く炎症カスケードを干渉し得る。特定の例には、キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１）、ＣＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、および可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、これらの誘導体、（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）およびＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤などのようなＴＮＦアンタゴニストが含まれる。同様にＩＬ−１阻害剤（インターロイキン−１変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ＲＡなど）は、同じ理由のために有効であり得る。他の組合せは、インターロイキン１１との組合せである。さらに別の組合せは、ＴＮＦ−α機能と平行して、ＩＬ−１２機能に依存して、またはＩＬ−１２と協調して作用し得る自己免疫応答の他の中心的プレーヤとの組合せである。さらに別の組合せは、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤との組合せである。さらに別の組合せには、抗体、可溶性受容体または拮抗性リガンドを含む、共同刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストとの組合せである。
【０１７４】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジン、クロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオリンゴ酸塩（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン作動性受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリカート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノラート・モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する作用物質（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびそれらの誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、ｓＩＬ−ＩＲ１、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、炎症抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリムシノロン・アセトニド、プロポキシフェンナプシラート／ａｐａｐ、フォラート、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、塩酸オキシコドン、ヒドロコドン二酒石酸塩／ａｐａｐ、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組み換え、塩酸トラマドール、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロナートナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、塩酸リドカイン、インドメタシン、硫酸グルコサミン／コンドロイチン、塩酸アミトリプチリン、スルファジアジン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸オロパタジン、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８ＢＰ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１およびメソプラムなどの作用物質とも組み合わされ得る。特定の組合せには、��トトレキサートまたはレフルノミドが含まれ、中度または重度の関節リウマチの症例では、シクロスポリンが含まれる。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するための投薬量で、および所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。抗体または抗体部分の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別および個体の体重ならびに抗体または抗体部分が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、抗体または抗体部分のあらゆる毒性効果または有害効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、および所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。典型的には、疾病のより初期段階の前にまたは疾病のより初期段階において、予防的投薬が患者に使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。
【０１７６】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を与えるように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与することができ、複数の分割された用量を経時的に投与することができ、または、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少もしくは増加させ得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投薬単位形態は、治療されるべき哺乳動物患者に対する統一された投薬として適した、物理的に分離された単位を表し、各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の投薬単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき具体的な治療効果または予防効果ならびに（ｂ）個体における過敏症の治療用のこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
【０１７７】
緩和されるべき症状の種類および重度に応じて、投薬量の値が変化し得ることに注意すべきである。いずれかの具体的な患者に対して、個体の要求に従って、組成物の投与を行いまたは監督している者の専門的判断に従って、特異的投薬計画を経時的に調整すべきこと、および、本明細書に記載されている投薬量の範囲は典型的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている組成物の範囲または実施に限定することを意図したものではないことをさらに理解すべきである。
【０１７８】
本発明の方法の他の適切な改変および適合は、本発明の範囲または本明細書に開示されている実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を用いてこれらを行い得ることが当業者に自明である。ここに、本発明を詳しく記載してきたが、例示のみを目的とし、本発明を限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することによって、本発明がより明確に理解される。
【実施例】
【０１７９】
[実施例１]
組み換え抗ヒトＴＮＦ−α抗体
実施例１．１：組み換えキメラ抗ヒトＴＮＦ−α抗体の構築および発現
マウス抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体ＭＡＫ１９５重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、細菌における相同組み換えによる２つのヒンジ領域のアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｃＤＮＡ断片によって置換された。これらの変異は、２３４位（ＥＵ番号付け）のロイシンからアラニンの変更であり、２３５位のロイシンからアラニンの変更である（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２）。これらの抗体の各々の軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域によって置換された。全長のキメラ抗体は、ＰＨｙｂＥ発現プラスミドに連結されたキメラ重鎖および軽鎖のｃＤＮＡの同時の形質移入によってＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現された。組み換えキメラ抗体を含む細胞上清は、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーによって精製され、結合した抗体は酸性緩衝液の添加によって溶出された。抗体は中和され、ＰＢＳ中で透析された。
【０１８０】
次に、精製されたキメラ抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体は、抗原結合を確認するためのＥＬＩＳＡによりｈＴＮＦ−αタンパク質に結合するその能力について試験された。
【０１８１】
実施例１．２：ＣＤＲ移植された抗ヒトＴＮＦ−α抗体の構築
当技術分野では周知の標準法を適用することにより、モノクローナル抗体ＭＡＫ１９５（上の表５参照）のＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ配列が、異なるヒト重および軽鎖アクセプター配列に移植された。
【０１８２】
本発明のモノクローナル抗体ＭＡＫ１９５のＶＨおよびＶＬ配列との配列ＶＨおよびＶＬアラインメントに基づいて、以下の：
ａ）重鎖アクセプター配列を構築するためのＶＨ４−５９（ＩＧＨＶ４−５９）およびＶＨ３−５３（ＩＧＨＶ３−５３）、ならびに連結配列ｈＪＨ４
ｂ）軽鎖アクセプター配列を構築するための１−３９／Ｏ１２および３−１５／Ｌ２、ならびにｈＪＫ２
である既知のヒト配列が選択された。
【０１８３】
ＭＡＫ１９５の対応するＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを前記アクセプター配列に移植することにより、ＣＤＲ移植されたヒト化、改変ＶＨおよびＶＬ配列が調製された（上の表６も参照）。
【０１８４】
実施例１．３：ＣＤＲ移植された抗体におけるフレームワーク逆突然変異の構築
ヒト化抗体フレームワーク逆突然変異を作製するために、可変ドメインの新規合成によりならびに／または変異原性プライマーとＰＣＲおよび当技術分野で周知の方法（例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１；ＷＯ９９／５４４４０；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０（１２）：３６５５−９ａｎｄ  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７（１）：１０５−１１参照）を使用して、実施例１．２に従って調製された通りに、突然変異はＣＤＲ移植された抗体配列に導入される。逆突然変異と他の突然変異の異なる組合せは、以下のＣＤＲ移植片ごとに構築される。各ヒト化抗体の提唱される設計の概要は下に示されている。これらの突然変異の残基番号はＫａｂａｔ付番方式に基づいている。
【０１８５】
重鎖ｈＭＡＫ１９５ＶＨ．１ｚでは、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬインターフェイシング残基のうちの１つ以上は以下の通り：Ｇ２７→Ｆ、Ｉ２９→Ｌ、Ｉ３７→Ｖ、Ｉ４８→Ｌ、Ｖ６７→Ｌ、Ｖ７１→Ｋ、Ｔ７３→Ｎ、Ｎ７６→ＳおよびＦ７８→Ｉに逆突然変異された。
【０１８６】
追加の突然変異には、以下の：Ｑ１→Ｅが含まれる。
【０１８７】
重鎖ｈＭＡＫ１９５ＶＨ．２ｚでは、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬインターフェイシング残基のうちの１つ以上は以下の通り：Ａ２４→Ｖ、Ｆ２９→Ｌ、Ｖ４８→Ｌ、Ｆ６７→Ｌ、Ｒ７１→Ｋ、Ｓ４９→Ｇ、Ｎ７６→ＳおよびＬ７８→Ｉに逆突然変異される。
【０１８８】
追加の突然変異には、以下の：Ｑ１→Ｅ、Ｉ１２→ＶおよびＶ２９→Ｆが含まれる。
【０１８９】
軽鎖ｈＭＡＫ１９５Ｖｋ．１では、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬインターフェイシング残基のうちの１つ以上は以下の通り：Ａ４３→Ｓに逆突然変異される。
【０１９０】
軽鎖ｈＭＡＫ１９５Ｖｋ．２ｚでは、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬインターフェイシング残基のうちの１つ以上は以下の通り：Ａ４３→Ｓ、Ｉ５８→Ｖに逆突然変異される。
【０１９１】
追加の突然変異には、以下の：Ｖ１３→Ｌ、Ｅ７０→ＤおよびＳ８０→Ｐが含まれる。
【０１９２】
実施例１．４：フレームワーク逆突然変異を含有するヒト化抗ｈＴＮＦ−α重および軽鎖
【０１９３】
【表７】
2013523153.tif 000008
【０１９４】
実施例１．５：ヒト化抗ｈＴＮＦ−α  ｈＭＡＫ１９５抗体ＶＨ／ＶＬ対合
【０１９５】
【表８】
2013523153.tif 000009
【０１９６】
実施例１．６：ＢＩＡＣＯＲＥ技術を使用する親和性決定
【０１９７】
【表９】
2013523153.tif 000010
【０１９８】
ＢＩＡＣＯＲＥ法：
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、結合定数および解離定数の反応速度測定を用いて抗体の親和性を決定する。標的抗原（例えば、精製された組み換え標的抗原）に対する抗体の結合は、泳動ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ  ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％サーファクタントＰ２０）を用いて２５℃にて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）１０００または３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により表面プラズモン共鳴に基づく測定により決定された。すべての化学物質は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手し、または他には本明細書に記載される別の供給元から入手される。例えば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に希釈された、約５０００ＲＵのヤギ抗マウスＩｇＧ、（Ｆｃγ）、断片特異的なポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳ）は、製造業者の使用説明書に従って標準的なアミンカップリングキットおよび２５μｇ／ｍｌでの操作を用いてＣＭ５研究等級のバイオセンサーチップ全体に直接固定化される。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンを用いてブロックする。フローセル２および４における修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用する。フローセル１および３におけるヤギ抗マウスＩｇＧなしの未修飾のカルボキシメチルデキストランを基準表面として使用する。反応速度分析のために、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウェアを用いて、８個すべての注入物の結合および解離相に対して、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルから誘導された速度方程式を同時にフィッティングさせる（グローバルフィット分析を使用）。ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的反応表面の全体で捕捉するために、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中に、精製された抗体を希釈する。リガンドとして捕捉されるべき抗体（２５μｇ／ｍｌ）を５μｌ／分の流速で反応マトリックス全体に注入する。結合速度定数および解離結合定数のｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）およびｋｏｆｆ（ｓ−１）は、２５μｌ／分の連続的流速下で決定される。１０−２００ｎＭの範囲の異なる抗原濃度にて速度論結合測定を行うことによって速度定数を導く。次に、以下の式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎによって、速度論的速度定数から抗体および標的抗原間の反応の平衡解離定数（Ｍ）を計算する。結合を時間の関数として記録し、速度論的反応定数を計算する。このアッセイでは、１０６Ｍ−１ｓ−１程度に速い速度定数、および１０−６ｓ−１程度に遅い解離定数を測定することができる。
【０１９９】
【表１０】
2013523153.tif 000011
【０２００】
Ｂｉａｃｏｒｅ技術により特徴付けられるすべてのヒト化構築物の結合は維持され、マウス親抗体の結合に匹敵していた。
【０２０１】
実施例１．７：ヒトＴＮＦ−αの中和
Ｌ９２９細胞は半コンフルエント密度まで増殖され、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ＃２５３００）を使用して収穫された。細胞はＰＢＳを用いて洗浄され、計測され、４μｇ／ｍＬアクチノマイシンＤを含有するアッセイ培地において１Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁された。細胞は、容積１００μＬおよび５Ｅ４細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９９）に播種された。抗体および対照ＩｇＧはアッセイ培地中４×濃度まで希釈され、連続１対４希釈が実施された。ｈｕＴＮＦ−αはアッセイ培地中４００ｐｇ／ｍＬまで希釈された。抗体試料（２００μＬ）は１対２希釈配合でｈｕＴＮＦ−α（２００μｌ）に添加され、室温で０．５時間インキュベートさせた。
【０２０２】
抗体／ヒトＴＮＦ−α溶液を、最終濃度１００ｐｇ／ｍＬ  ｈｕＴＮＦ−αおよび１５０ｎＭ−０．０００１ｎＭ抗体になるよう蒔かれた細胞に１００μＬで添加された。プレートは、５％ＣＯ２、３７℃で２０時間インキュベートされた。生存率を定量化するため、１００μＬがウェルから取り出され、１０μＬのＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  カタログ番号１１６４４８０７００１）が添加された。プレートはアッセイ条件下で３．５時間インキュベートされた。プレートは、Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ  １９０  ＥＬＩＳＡプレートリーダー上ＯＤ４２０−６００ｎｍで読み取られた。いくつかのアッセイからの平均ＥＣ５０は、表９に含まれている。
【０２０３】
【表１１】
2013523153.tif 000012
【０２０４】
抗ｈＴＮＦ−α抗体はすべて、ＴＮＦ−α中和アッセイにおいて中和を示した。
【０２０５】
実施例１．８：ヒト化モノクローナル抗体の物理化学的およびインビトロでの安定性分析
サイズ排除クロマトグラフィー
水を用いて抗体を２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２０ｍＬをＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃ｋ５５３９−０５ｋ）を用いてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステム上で分析した。２１１ｍＭ硫酸ナトリウム、９２ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を用いて、流速０．３ｍＬ／分にて試料をカラムから溶出した。ＨＰＬＣシステムの操作条件は以下の通りであった：
移動相：２１１ｍＭのＮａ２ＳＯ４、９２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊７Ｈ２０、ｐＨ７．０
勾配：アイソクラチック
流速：０．３ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
オートサンプラー冷却装置温度：４℃
カラムオーブン温度：周囲
実行時間：５０分
【０２０６】
表１０は、上のプロトコールにより決定されるパーセントモノマー（予想される分子量の非凝集性タンパク質）として発現される抗体構築物の純度データを含有している。
【０２０７】
【表１２】
2013523153.tif 000013
【０２０８】
抗ｈＴＮＦ−α抗体は優れたＳＥＣプロファイルを示しており、大半が＞９５％モノマーを示した。
【０２０９】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
還元条件下および非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって抗体を分析する。Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（ロットＡＦＰ０４Ｃ）を対照として用いる。還元条件について、１００ｍＭのＤＴＴを含む２×トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＬＣ２６７６、ロット＃１３２３２０８）と１：１で試料を混合し、６０℃で３０分間加熱する。非還元条件について、試料緩衝液と１：１で試料を混合し、１００℃で５分間加熱する。還元試料（１０ｍｇ／レーン）を１２％プレキャストのトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６００５ｂｏｘ、ロット＃６１１１０２１）上に装填し、非還元試料（１０ｍｇ／レーン）を８％−１６％プレキャストのトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６０４５ｂｏｘ、ロット＃６１１１０２１）上に装填する。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＬＣ５９２５、ロット＃１３５１５４２）を分子量マーカーとして用いる。ゲルをＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセルゲルボックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＩ０００１）に入れ、最初に、ゲル内の試料を積層するために電圧７５を加え、次にダイフロント（ｄｙｅ  ｆｒｏｎｔ）がゲルの底に到達するまで定電圧１２５にしてタンパク質を分離する。使用される泳動緩衝液は１×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液であり、１０×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液（ＡＢＣ、ＭＰＳ−７９−０８０１０６）から調製される。コロイド状青色染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃４６−７０１５、４６−７０１６）を用いてゲルを一晩染色し、バックグラウンドを除くためにＭｉｌｌｉ−Ｑ水で脱染する。次に、Ｅｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎスキャナー（モデル１６８０、Ｓ／Ｎ  ＤＡＳＸ００３６４１）を用いて、染色されたゲルをスキャンする。
【０２１０】
沈降速度分析
３つの標準的な２セクターのカーボン・エポンセンターピースの各々の試料チャンバー内に抗体を装填する。これらのセンターピースは１．２ｃｍの光路長を有し、サファイアウィンドウで構築される。基準緩衝液に関してはＰＢＳを使用し、各チャンバーは１４０μＬを含む。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＸＬ−Ｉ分析用超遠心分離機（シリアル＃ＰＬ１０６Ｃ０１）の４ホール（ＡＮ−６０Ｔｉ）ローターを用いて、すべての試料を同時に試験する。
【０２１１】
実行条件をプログラムし、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（ｖ５．６）を用いて遠心分離制御を行う。試料およびローターは、分析前の１時間（２０．０±０．１℃）熱平衡化させる。適切なセル装填の確認を３０００ｒｐｍで行い、１回のスキャンを各ウェルについて記録する。沈降速度条件は以下の通りである：
試料細胞体積：４２０ｍＬ
基準細胞体積：４２０ｍＬ
温度：２０℃
ローター速度：３５，０００ｒｐｍ
時間：８：００時間
ＵＶ波長：２８０ｎｍ
半径刻み幅：０．００３ｃｍ
データ回収：信号加算平均なしの１段階あたり１データポイント
スキャン総数：１００
【０２１２】
完全な抗体のＬＣ−ＭＳ分子量測定
完全な抗体の分子量をＬＣ−ＭＳによって分析する。水を用いて各抗体を約１ｍｇ／ｍＬに希釈する。タンパク質マイクロトラップ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ、カタログ＃００４／２５１０９／０３）を備えた１１００ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）システムを用いて、脱塩し、試料の５ｍｇをＡＰＩ  ＱＳＴＡＲパルサーｉ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に導入する。短い勾配を用いて試料を溶出する。勾配は、移動相Ａ（ＨＰＬＣ水中の０．０８％ＴＦＡ、０．０２％ＴＦＡ）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．０８％ＦＡおよび０．０２％ＴＦＡ）を用いて、５０ｍＬ／分の流速にて勾配を実行する。質量分析計は、４．５キロボルトの噴霧電圧で操作され、スキャン範囲は２０００から３５００の質量対電荷比である。
【０２１３】
抗体軽鎖および重鎖のＬＣ−ＭＳ分子量測定
抗体軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）および脱グリコシル化されたＨＣの分子量測定をＬＣ−ＭＳによって分析する。水を用いて抗体を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、試料は、最終濃度が１０ｍＭのＤＴＴを用いて、３０分間、３７℃でＬＣおよびＨＣに還元される。抗体を脱グリコシル化するために、１００ｍｇの抗体は、１００ｍＬの全体積中の２ｍＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆ、５ｍＬの１０％Ｎ−オクチルグルコシドとともに、一晩３７℃にてインキュベートされる。脱グリコシル化後、最終濃度が１０ｍＭのＤＴＴを用いて、試料を３０分間、３７℃にて還元する。Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ、カタログ＃２１４ＴＰ５１１５、Ｓ／Ｎ０６０２０６５３７２０４０６９）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムを用いて脱塩し、試料（５ｍｇ）をＡＰＩ  ＱＳＴＡＲパルサーｉ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に導入する。短い勾配を用いて試料を溶出する。勾配は、移動相Ａ（ＨＰＬＣ水中の０．０８％ＦＡ、０．０２％ＴＦＡ）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．０８％ＦＡおよび０．０２％ＴＦＡ）を用いて、５０ｍＬ／分の流速にて勾配を実行する。質量分析計は、４．５キロボルトの噴霧電圧で操作され、スキャン範囲は８００から３５００の質量対電荷比である。
【０２１４】
ペプチドマッピング
７５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の最終濃度が６Ｍの塩酸グアニジンを用いて抗体を１５分間、室温にて変性させる。変性試料は、最終濃度が１０ｍＭのＤＴＴを用いて、３７℃、６０分間還元させ、次に、暗所にて３７℃、３０分間、５０ｍＭヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いてアルキル化される。アルキル化後、４リットルの１０ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して、一晩４℃で試料を透析する。透析された試料は、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８を用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈され、１００ｍｇの抗体は、１：２０（ｗ／ｗ）トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃ：抗体の比でトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｖ５１１１）またはＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃１１  ０４７  ８２５  ００１）を用いて３７℃で４時間消化される。消化物は、１ＮのＨＣｌを１ｍＬ用いてクエンチされる。質量分析計検出を用いたペプチドマッピングについて、４０ｍＬの消化物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムを備えた、Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ、カタログ＃２１８ＴＰ５１、Ｓ／Ｎ  ＮＥ９６０６  １０．３．５）上で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）によって分離される。ペプチドの分離は、移動相Ａ（ＨＰＬＣ等級の水中の０．０２％ＴＦＡおよび０．０８％ＦＡ）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．０２％ＴＦＡおよび０．０８％ＦＡ）を使用する勾配を用いて、５０ｍＬ／分の流速にて実行する。ＡＰＩ  ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ質量分析計は、４．５キロボルトの噴霧電圧のポジティブモードで操作され、スキャン範囲は８００から２５００の質量対電荷比である。
【０２１５】
ジスルフィド結合マッピング
抗体を変性するために、１００ｍＬの抗体は、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中の８ＭグアニジンＨＣｌの３００ｍＬと混合される。ｐＨをチェックして、ｐＨが７から８の間であることを確認し、最終濃度が６ＭのグアニジンＨＣｌ中で１５分間、室温にて試料を変性させる。一部の変性試料（１００ｍＬ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で６００ｍＬに希釈し、最終のグアニジン−ＨＣｌ濃度を１Ｍとする。試料（２２０ｍｇ）は、１：５０のトリプシン：抗体または１：５０のＬｙｓ−Ｃ：抗体（ｗ／ｗ）の比（４．４ｍｇ酵素：２２０ｍｇ試料）でトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｖ５１１１、ロット＃２２２６５９０１）またはＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃１１０４７８２５００１、ロット＃１２８０８０００）を用いて３７℃で約１６時間消化される。さらに５ｍｇのトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃを試料に添加し、消化をさらに２時間、３７℃で進行させる。各試料に１ｍＬのＴＦＡを添加することによって消化を停止させる。消化された試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステム上のＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ、カタログ＃２１８ＴＰ５１、Ｓ／Ｎ  ＮＥ０２０６３０−４−１Ａ）を用いてＲＰＨＰＬＣによって分離される。分離は、移動相Ａ（ＨＰＬＣ等級の水中の０．０２％ＴＦＡおよび０．０８％ＦＡ）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．０２％ＴＦＡおよび０．０８％ＦＡ）を用いて、ペプチドマッピングについて使用されたものと同じ勾配で５０ｍＬ／分の流速にて実行する。ＨＰＬＣの操作条件は、ペプチドマッピングについて使用された条件と同じである。ＡＰＩ  ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ質量分析計は、４．５キロボルトの噴霧電圧のポジティブモードで操作され、スキャン範囲は８００から２５００の質量対電荷比である。ジスルフィド結合は、ペプチドの実測されたＭＷと、ジスルフィド結合によって連結されたトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃペプチドの予測されたＭＷとを合致させることによって割り当てられる。
【０２１６】
遊離スルフヒドリル決定
抗体中の遊離システインを定量するために使用される方法は、特徴的な発色生成物である５−チオ−（２−ニトロ安息香酸）（ＴＮＢ）を生じさせる、エルマン試薬である５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）とスルフヒドリル基（ＳＨ）の反応に基づいている。反応は、式：
ＤＴＮＢ  ＋  ＲＳＨ  →  ＲＳ−ＴＮＢ  ＋  ＴＮＢ−  ＋  Ｈ＋
において説明される。
【０２１７】
ＴＮＢ−の吸光度は、Ｃａｒｙ  ５０分光光度計を用いて、４１２ｎｍで測定される。吸光度曲線は、遊離ＳＨ標準として２−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）の希釈を用いてプロットし、タンパク質中の遊離スルフヒドリル基の濃度は、試料の４１２ｎｍでの吸光度から決定される。
【０２１８】
β−ＭＥ標準ストックは、最終濃度が０．１４２ｍＭになるように、ＨＰＬＣ等級の水を用いて１４．２Ｍのβ−ＭＥを連続希釈することによって調製される。次に、各濃度について３点測定の標準を調製する。アミコンウルトラ１０，０００ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＵＦＣ８０１０９６、ロット＃Ｌ３ＫＮ５２５１）を用いて抗体を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、緩衝液をアダリムマブについて使用した処方緩衝液（５．５７ｍＭリン酸一水素ナトリウム、８．６９ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０６．６９ｍＭのＮａＣｌ、１．０７ｍＭクエン酸ナトリウム、６．４５ｍＭクエン酸、６６．６８ｍＭマンニトール、ｐＨ５．２、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標））に交換する。試料をシェーカー上で室温にて２０分間混合する。次に、１８０ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．１を各試料に添加し、標準は、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．１中の２ｍＭのＤＴＮＢを３００ｍＬ添加する。完全に混合した後、Ｃａｒｙ  ５０分光光度計上で４１２ｎｍの吸光度について試料および標準を測定する。遊離ＳＨの量とβ−ＭＥ標準のＯＤ４１２ｎｍをプロットすることによって、標準曲線を得る。試料の遊離ＳＨ含有量は、ブランクを差し引いた後、この曲線に基づいて計算される。
【０２１９】
弱い陽イオン交換クロマトグラフィー
１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いて抗体を１ｍｇ／ｍＬに希釈する。電荷異質性は、ＷＣＸ−１０  ＰｒｏＰａｃ分析用カラム（Ｄｉｏｎｅｘ、カタログ＃０５４９９３、Ｓ／Ｎ０２７２２）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムを用いて分析される。試料を８０％移動相Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）および２０％移動相Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）においてカラムに充填し、１．０ｍＬ／分の流速で溶出する。
【０２２０】
オリゴ糖プロファイリング
抗体のＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理後に放出されるオリゴ糖は、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）標識試薬を用いて誘導される。蛍光標識されたオリゴ糖は、順相の高速液体クロマトグラフィー（ＮＰＨＰＬＣ）によって分離され、異なる形態のオリゴ糖は、保持時間に基づいて、既知の標準と比較して特徴付けられる。
【０２２１】
抗体を最初にＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて消化し、重鎖のＦｃ部分からＮ結合のオリゴ糖を切断する。２ｍＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆおよび３ｍＬの１０％Ｎ−オクチルグルコシドとともに５００ｍＬエッペンドルフチューブに抗体（２００ｍｇ）を入れる。リン酸緩衝生理食塩水を添加し、最終体積を６０ｍＬにする。７００ＲＰＭに設定したエッペンドルフのサーモミキサー中で一晩３７℃にて試料をインキュベートする。また、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（ロットＡＦＰ０４Ｃ）を対照としてＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて消化する。
【０２２２】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理後、７５０ＲＰＭに設定されたエッペンドルフのサーモミキサー中で９５℃、５分間、試料をインキュベートしてタンパク質を沈殿させ、次に、２分間、１０，０００ＲＰＭでエッペンドルフの遠心分離機に試料を置き、沈殿したタンパク質を沈降させる。オリゴ糖を含む上清を５００ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、スピード−ｖａｃ中、６５℃で乾燥させる。
【０２２３】
Ｐｒｏｚｙｍｅから購入される２ＡＢ標識キット（カタログ＃ＧＫＫ−４０４、ロット＃１３２０２６）を用いて、オリゴ糖を２ＡＢで標識する。製造業者の使用説明書に従って標識試薬を調製する。酢酸（１５０ｍＬ、キットにおいて提供される）をＤＭＳＯバイアル（キットにおいて提供される）に添加し、溶液を数回、上下にピペッティングすることによって混合する。酢酸／ＤＭＳＯ混合物（１００ｍＬ）を２−ＡＢ色素のバイアル（使用直前）に移し、色素が完全に溶解するまで混合する。次に、色素溶液を還元剤（キットにおいて提供される）のバイアルに添加し、十分に混合に混合する（標識試薬）。標識試薬（５ｍＬ）を各々乾燥させたオリゴ糖試料バイアルに添加し、完全に混合する。６５℃で７００−８００ＲＰＭに設定されたエッペンドルフのサーモミキサーに反応バイアルを置き、２時間反応させる。
【０２２４】
標識反応後、Ｐｒｏｚｙｍｅから入手されるＧｌｙｃｏＣｌｅａｎｓカートリッジ（カタログ＃ＧＫＩ−４７２６）を用いて過剰の蛍光色素を取り除く。試料を添加前、カートリッジを１ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄し、その後、１ｍＬの３０％酢酸溶液で５回洗浄する。試料を添加直前に、１ｍＬのアセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ＃ＡＨ０１５−４）をカートリッジに添加する。
【０２２５】
すべてのアセトニトリルがカートリッジを通過した後、新たに洗浄したディスクの中心に試料をスポット状に置き、ディスク上に１０分間吸着させる。１ｍＬのアセトニトリルを用いてディスクを洗浄し、続いて、１ｍＬの９６％アセトニトリルで５回洗浄する。カートリッジを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ上に置き、２−ＡＢ標識されたオリゴ糖をＭｉｌｌｉ−Ｑ水の３回の洗浄（各洗浄あたり４００ｍＬ）により溶出させる。
【０２２６】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムに連結させたＧｌｙｃｏｓｅｐ  Ｎ  ＨＰＬＣ（カタログ＃ＧＫＩ−４７２８）カラムを用いてオリゴ糖を分離する。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムは、システムコントローラー、脱気装置、二重ポンプ、試料冷却器を備えたオートサンプラーおよび蛍光検出器からなっていた。
【０２２７】
高温での安定性
適切な緩衝液、界面活性剤、安定化剤および／または糖を用いて、抗体の最終濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整する。次に、抗体溶液を濾過滅菌し、０．２５ｍＬのアリコートを無菌条件下で調製する。アリコートを−８０℃、５℃、２５℃または４０℃で１、２または３週間放置する。インキュベーション期間の終わりに、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試料を分析する。
【０２２８】
安定性試料は、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。使用される手法は、本明細書に記載されたものと同じである。コロイド状青色染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃４６−７０１５、４６−７０１６）を用いてゲルを一晩染色させ、バックグラウンドが透明になるまでＭｉｌｌｉ−Ｑ水で脱染される。次に、Ｅｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎスキャナー（モデル１６８０、Ｓ／Ｎ  ＤＡＳＸ００３６４１）を用いて、染色されたゲルをスキャンする。高い感度を得るために、銀染色キット（Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳ）を用いて同じゲルを銀染色し、製造業者によって提供される推奨の手順を用いる。
【０２２９】
実施例１．９：ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における形質移入および発現
タンパク質を生成するために、抗ｈＴＮＦ−α抗体ベクター構築物を２９３細胞に形質移入する。使用された２９３の一時的な形質移入の手法は、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２ｅ９）：１−９およびＰｈａｍら（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０（３）：３３２−４４において公開された方法の変法である。形質移入において使用された試薬には以下のものが含まれる：
・１３０ｒｐｍ、３７℃および５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーター内で使い捨ての三角フラスコにおいて培養されるＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａから入手されるＥＢＮＡ１を安定に発現するヒト胎児腎臓細胞株）。
・培養液：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２３３８−０１８）＋２５μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）および０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２４０４０−０３２）。
・形質移入培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５６３０−０８０）。
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）保存液：２５ｋＤａの直鎖状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて調製され、−１５℃未満で保存される１ｍｇ／ｍＬ無菌保存溶液、ｐＨ７．０。
・トリプトン供給培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地中のトリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、１９５５４）の５％ｗ／ｖ無菌保存液。
【０２３０】
形質移入のための細胞調製：形質移入の約２−４時間前に、遠心分離によってＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を回収し、約１００万個の生細胞／ｍＬの細胞密度で培養液中に再懸濁させた。各形質移入について、４０ｍＬの細胞懸濁液を使い捨ての２５０ｍＬ三角フラスコに移し、２−４時間インキュベートした。
【０２３１】
形質移入：形質移入培地およびＰＥＩ保存液を予め室温（ＲＴ）に温めた。各形質移入について、２５μｇのプラスミドＤＮＡおよび５０μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を５ｍＬの形質移入培地と合わせて、１５−２０分間ＲＴにてインキュベートし、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を形成させるようにした。ＢＲ３−Ｉｇ形質移入について、２５μｇのＢＲ３−Ｉｇプラスミドを形質移入ごとに用いた。各５ｍＬのＤＮＡ：ＰＥＩ複合混合物は、予め調製した４０ｍＬの培養物に添加し、１３０ｒｐｍ、３７℃および５％ＣＯ２に設定した加湿インキュベーターに戻された。２０−２８時間後、５ｍＬのトリプトン供給培地を各形質移入に添加され、培養を６日間継続した。
【０２３２】
表１１は、ＨＥＫ  ２９３−６Ｅ細胞中リットルあたりミリグラムとして発現される親抗体の産生量データを含有する。
【０２３３】
【表１３】
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【０２３４】
すべての抗体がＨＥＫ  ２９３−６Ｅ細胞ではよく発現した。大半の場合、ＨＥＫ  ２９３−６Ｅ細胞の上清から、＞５０ｍｇ／Ｌの精製された抗体を容易に得ることができた。
【０２３５】
参照による組み込み
本発明は、分子生物学および薬物送達の分野において周知の技法を、参照によりその全体に組み込む。これらの技法には、以下の出版物に記載される技法を含むが、これらに限定されない。
【０２３６】
【表１４】
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【０２３７】
本出願を通して引用される、すべての引用される参考資料（参考文献、特許、特許出願およびウェブサイトを含む）の内容は、これによって、これらの参考資料がそこに記載されているかのように、参考資料の全体を参照することにより明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の記載がない限り、当該技術分野において周知である免疫学、分子生物学および細胞生物学の従来技術を使用する。
【０２３８】
均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の具体的な形態において体現されもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている本発明を限定するというよりはむしろ、すべての点において例示していると考えるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にあるすべての変更は本明細書に包含されることが意図される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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