(57)【要約】【課題】本発明の目的は、対象が抗原に対し耐性であるか、または耐性になることが可能であるかを判定するための方法を提供することである。【解決手段】本発明の目的は、対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかどうかを評価することによって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかどうかを評価する方法であって、
（ａ）前記対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、
（ｂ）前記特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞からの、前記特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の区別を促進するために、前記リンパ球の試料の少なくとも一部分をインキュベートするステップと、
（ｃ）その後に、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が前記試料に存在するかどうかを判定するステップと
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを評価する方法、対象が抗原に対し耐性であるか、または耐性になることが可能であるかを判定するための方法、および対象における抗原に対する耐性を増加または減少させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、感染性微生物または外来抗原などの外来物による感染に対して体を保護する機序を提供する。正常な状態では、免疫系は外来物に対して免疫応答を認識および誘発することができるが、宿主組織については大部分を無視する。宿主組織を無視する免疫系の能力は免疫耐性として周知である。免疫耐性は免疫系が移植された外来組織、感染組織、アレルゲン、および悪性組織などの抗原を無視するように適合されている状態も指す。
【０００３】
自己免疫疾患は、Ｔ細胞が「自己」分子、すなわち、宿主の細胞によって生成される分子を認識し、これに反応する場合に生じる。これは、Ｔ細胞が分子を異質と認識し、その結果として自己分子に対する免疫応答を誘発するように、特異的自己分子がＴ細胞の表面上のタンパク質と相互作用する場合に生じる。組織移植においては、異質組織に存在する非自己主要組織適合性抗原がＴ細胞の表面に接触し、結果として異質抗原に対するＴ細胞の活性化をもたらす。この活性化は最終的に免疫系による同種移植片または異種移植片拒絶をもたらす。
【０００４】
同種移植片拒絶を予防、または自己免疫疾患を治療するための現在の方法は、一般的に、特定の抗原に特異的ではない全身免疫抑制を誘発するものである。その結果、対象は、病原体および日和見菌からの感染にかかりやすくなり、かつ悪性腫瘍のリスク増大になりうる。シクロスポリンＡ、ステロイド、アザチオプリン、抗Ｔ細胞抗体、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、デソキシスペルグアニン、およびＦＫ５０６などのより特異的な免疫抑制剤は、一般的に望ましくない副作用を有し、かつ一般的に、対象が薬剤を一生涯または少なくとも長い時間にわたって投与されることを必要とし、それによって、対象は、治療の長期効果による感染、癌、および／または他の状態の相当なリスクにさらされることとなる。したがって、対象において特異抗原に対する耐性を誘発する方法を提供することが有利であろう。かかる方法を使用し、自己免疫疾患を有する対象における「自己」分子に対する免疫応答を抑制し、または移植組織に存在する抗原に対する耐性を誘発することによって移植組織に対する免疫応答を抑制しうる。
【０００５】
疾患状態は、特異抗原に対する免疫耐性の発達にも起因し、またはそれによって悪化もしうる。例えば、癌および慢性感染などの疾患は、悪性または悪性前細胞上に存在する腫瘍または他の抗原、または感染細胞によって発現される感染性病原体の抗原に対して免疫耐性の発達に起因し、またはそれによって進行しうる。したがって、特異抗原に対する免疫耐性の発達に起因し、またはこれによって悪化される疾患にかかった対象における特異抗原に対する耐性を削減または遮断する方法を提供することも望ましいであろう。
さらに、対象が特異抗原に対して耐性になることができるかを評価するための方法を提供することが望ましいであろう。例えば、シクロスポリンＡなどの免疫抑制剤による患者の治療は、場合により、自己分子または同種抗原などの特異抗原に対する耐性または部分的耐性をもたらしうる。耐性の発症が、かかる免疫抑制剤療法中の患者において、または他の環境において検出されうる場合は、患者が依然として高レベルの免疫抑制剤を必要とするか、または患者が特異抗原に対して十分な耐性を発現し、免疫抑制剤の用量の削減または除去が可能であるかどうかについて評価を行うことができるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９０年、１７１：１４１、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９３年、５５：４５９頁
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９７年、６４：１５５９頁
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９３年、５５、３８０−３８５頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年、１６１；５１４６頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９７８年、１４８；８７８頁
【非特許文献６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．（１９９９年）３１、１５７４−５頁、１９９９年
【非特許文献７】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．、および３１、１５７２ページ、１９９９年
【非特許文献８】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９８年、１１４５−１１４２頁
【非特許文献９】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９３年、５５；３７４−３７９頁
【非特許文献１０】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９３年、５５、４５９−４６８頁
【非特許文献１１】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１９９４年、１２３：１６２−１７２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトまたは動物の体における免疫応答の誘発の中心となるリンパ球のサブセットである。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ヒトまたは動物の体における総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のおよそ１％〜１０％を表すＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団である。
【０００８】
抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫系の細胞にその抗原に対する耐性を与えることができる。
【０００９】
活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がインターロイキン−２（ＩＬ−２）および／またはインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で抗原に接触すると形成される。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は最初に活性後に増殖する。しかし、本発明者らは、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、特異的サイトカインに曝露されない限り、活性化後の最初の増殖後に死滅し、またはさらなる増殖ができないことを見出した。
【００１０】
本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＬ−５、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γの受容体を発現しないことを見出した。しかし、本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、抗原およびＩＬ−２とナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞とを接触させることによって活性化されると、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γ受容体およびＩＬ−１２  β２受容体を発現することを見出した。本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、抗原およびＩＬ−４とナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞とを接触させることによって活性化されると、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＬ−５  α−受容体を発現し、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現が増大することを見出した。本発明者らは、サイトカインのインターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつその増殖を支持することができることを見出した。
【００１１】
これらの所見に基づき、本発明者らは、対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを判定する方法、対象が特異抗原に対して耐性であるか、または耐性になることができるかを判定するための方法、特異抗原に活性化するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を成長させるための方法、および特異抗原に対する耐性を誘発および削減するための方法を開発した。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかどうかを評価する方法であって、
（ａ）対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、
（ｂ）特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞から、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の区別を促進するために、リンパ球の試料の少なくとも一部分をインキュベートするステップと、
（ｃ）その後に特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が試料に存在するかどうかを判定するステップと
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
一般的に、方法のステップ（ｂ）は、他のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に優先して特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖に有利に働く条件下で試料の少なくとも一部分をインキュベートするステップ、または特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に優先して特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖に有利に働く条件下で試料の少なくとも一部分をインキュベートするステップを含んでなる。
【００１４】
一部の実施形態において、試料の少なくとも一部分は、特異抗原、および活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつ／またはその増殖を支持することができる１つもしくは複数のサイトカインの存在下でインキュベートされる。これらの条件下における試料の少なくとも一部分のインキュベーションは、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖に有利に働く。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、またはその増殖を支持することができる１つもしくは複数のサイトカインは、一般的にＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、およびその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインである。これらの実施形態において、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖が検出され、
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料において、特異抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の削減が認められ、または
（ｃ）特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在を示す分子が検出される
場合には、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、試料中に存在することが判定されうる。
【００１５】
一部の他の実施形態において、試料の少なくとも一部分は、特異抗原の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、またはその増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされる。これらの実施形態において、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の削減された増殖が認められ、
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料において、特異抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増大した増殖が認められる
場合には、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、試料中に存在することが判定されうる。
【００１６】
活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、またはその増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、特異抗原との接触後に増殖せず、かつ一般的に生存せず、または特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対して削減された増殖を示す。したがって、試料の少なくとも一部分が特異抗原の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、またはその増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされると、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖における削減が、試料における特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在を示す。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖における削減が、結果としてＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の増大をもたらす。これは、試料におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および／または増殖の削減により、これらの細胞が特異抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖をもはや抑制することができないことを意味するためである。他方、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および他の抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、これらの条件下でインキュベートされると生存し、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。
【００１７】
試料における特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在は、対象が特異抗原に対して耐性であり、または耐性になることができることを示す。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、特異抗原に対して耐性であるか、または耐性になることができるかを判定する方法を提供し、これは
（ａ）対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、
（ｂ）リンパ球の試料の少なくとも一部分を前記特異抗原と接触させるステップと、
（ｃ）リンパ球の試料の少なくとも一部分を、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下、またはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートするステップと、
（ｄ）その後に、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が試料に存在するかを判定するステップと
を含んでなる。
【００１９】
試料における特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在は、
（ｉ）リンパ球の試料の少なくとも一部分が特異抗原と接触され、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつ／または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされる場合における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の非増殖または低増殖、または
（ｉｉ）リンパ球の試料の少なくとも一部分が特異抗原と接触され、かつＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる場合における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖、または
（ｉｉｉ）リンパ球の試料の少なくとも一部分が特異抗原と接触され、かつＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる場合における、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在を示す分子、または
（ｉｖ）リンパ球の試料の少なくとも一部分がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなり、かつリンパ球の試料の少なくとも一部分が特異抗原と接触され、かつＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる場合における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の阻害、または
（ｖ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなり、かつリンパ球の試料の少なくとも一部分が特異抗原と接触され、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされる場合における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の刺激
を検出することによって判定されうる。
【００２０】
活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在を示す分子は、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−１２受容体、またはＩＦＮ−γ受容体の発現などの活性化のシグナルまたは活性化のマーカーである代謝産物でありうる。
【００２１】
一般的に、ＩＬ−１２はＩＬ−１２ｐ７０である。
【００２２】
１つの実施形態において、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を刺激することができるサイトカインの非存在下、および抗−ＩＬ−２および／または抗−ＩＬ−４抗体の存在下でインキュベートされる。本実施形態において、試料における活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の非増殖または低増殖を検出することによって判定されうる。
【００２３】
１つの実施形態において、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下、さらに抗−ＩＬ−２および／または抗−ＩＬ−４抗体の存在下でインキュベートされる。本実施形態において、試料における活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を検出することによって判定されうる。
【００２４】
リンパ球の試料は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有する対象から得られるリンパ球の集団でありうる。１つの実施形態において、リンパ球の試料は単離されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、試料は単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。さらに別の実施形態において、試料は混合リンパ球集団である。一般的に、混合リンパ球集団は非分画リンパ球である。さらに別の実施形態において、試料は対象から得られた単離ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および単離ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を混合することによって得られる混合Ｔ細胞集団でありうる。
【００２５】
１つの実施形態において、リンパ球の試料の少なくとも一部分はＣＤ４＋、ＣＤ２５−リンパ球の増殖を削減する抗体でインキュベートされる。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を削減する抗体は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ、またはＣＤ４＋、ＣＤ２４−Ｔ細胞に特異的に結合する他の抗体を含む。
【００２６】
リンパ球は、リンパ球が特異抗原を認識することを可能にする形でリンパ球に特異抗原を提示するやり方で、特異抗原と接触されうる。リンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下、またはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートする前に、またはそれと同時に特異抗原と接触されうる。一部の実施形態において、試料の少なくとも一部分は、特異抗原とともに試料の少なくとも一部分をインキュベートすることによって特異抗原と接触される。
【００２７】
特異抗原は、抗原提示細胞の表面上に位置した抗原でありうる。かかる場合、特異抗原は抗原提示細胞の表面上のクラスＩＩ主要組織適合性分子と会合している。抗原提示細胞は、抗原提示分子（通常はクラスＩＩ  ＭＨＣ）および、一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を促進するために必要とされるリガンドを発現する任意の細胞でありうる。リガンドの例としては、ＩＣＡＭｌ、ＩＣＡＭ２、ＬＦＡ３、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のリガンド、または任意の活性化リガンドが挙げられる。抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、食細胞、Ｂ−リンパ球、ランゲルハンス細胞、または刺激因子細胞の増殖が障害される（例えば、放射線照射またはマイトマイシンＣ治療によって）非分画リンパ球が挙げられる。
【００２８】
あるいは、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、例えば、米国特許第６，８２８，１５０号明細書または同第６，７８７，１５４号明細書に記載されているものなどの合成抗原提示系における特異抗原と接触されうる。
【００２９】
リンパ球の試料の少なくとも一部分がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる場合、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、リンパ球の試料の少なくとも一部分を特異抗原と接触させるのと同時に、またはその後に少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされうる。
【００３０】
一般的に、リンパ球の試料の少なくとも一部分は培地においてインキュベートされる。培地は、一般的に、特異抗原以外の、リンパ球の活性化をもたらしうる外来性抗原を実質的に含まない。言い換えれば、培地に存在する外来性抗原のレベルは十分に低く、または欠き、ＣＤ４＋Ｔ細胞が培地における（特異抗原以外の）外来性抗原に活性化することはない。
【００３１】
リンパ球の試料の少なくとも一部分がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる場合、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインは、一般的に外来性起源から培地に添加される。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインは、精製タンパク質、組換え、またはそれ以外でありうる。あるいは、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを発現する細胞の存在下でインキュベートされうる。培地は成長因子、栄養、および／または緩衝液を含んでなりうる。
【００３２】
一般的に、リンパ球の試料がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長または増殖を刺激することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされる場合、試料は実質的にサイトカインを含まない培地でインキュベートされる。
【００３３】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖は、当業界で周知の方法によって判定されうる。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を測定し、または増殖しているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合を測定することによって判定されうる。
【００３４】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の数は、細胞数を測定する当業界で周知の任意の方法を使用して判定されうる。かかる方法としては、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査等が挙げられる。
【００３５】
増殖性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の割合は、［Ｈ３］−チミジンなどの放射性標識の取込み率またはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ等の蛍光化合物の取込み率などの方法によって判定されうる。
【００３６】
特異抗原は任意の抗原でありうる。特異抗原は対象の自己抗原でありうるとともに、対象は自己免疫疾患または状態を有する。
【００３７】
特異抗原は同種抗原、例えば、対象への同種移植片、または言い換えれば、同じ種の対象への別の対象に由来する組織の移植の後、または前の同種移植片組織の抗原でありうる。
【００３８】
特異抗原は異種抗原、例えば、対象への異種移植片、または言い換えれば、対象のものとは異なる種からの対象への組織の移植後、または前の異種移植片の抗原でありうる。
【００３９】
特異抗原は、アレルギー応答を誘発するアレルゲンまたはアレルゲンの一部でありうる。
【００４０】
特異抗原は腫瘍抗原でありうる。腫瘍抗原の例は新抗原、腫瘍細胞、または悪性前細胞である。
【００４１】
特異抗原は感染性病原体に由来する抗原でありうる。
【００４２】
特異抗原は単一の特異抗原、または多数の特異抗原でありうる。
【００４３】
特異抗原は治療薬などの薬剤をトランスフェクトされた細胞でありうる。かかる場合、細胞は一般的に対象と同系である。一般的に、薬剤をトランスフェクトされた細胞は幹細胞である。
【００４４】
第３の態様において、本発明は、特異抗原に活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで成長させる方法を提供するが、これはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインビトロで特異抗原に活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養するステップを含んでなる。
【００４５】
１つの実施形態において、この方法は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させる別のステップを含んでなる。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＴ細胞を培養する前に、またはそれと同時にインビトロで特異抗原と接触されうる。一部の実施形態においては、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞を特異抗原と接触させた後に、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養される。
【００４６】
一般的に、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はコンカナバリンＡおよび／または１−ｏ−メチルα−マンノピラノシドの非存在下で培養される。
【００４７】
一般的に、ＩＬ−１２はＩＬ−１２ｐ７０である。
【００４８】
第４の態様において、本発明は、それを必要とする対象における特異抗原に対する耐性を増大させる方法を提供するが、これはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによってインビトロで成長した特異抗原に活性化した有効量のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、対象に投与するステップを含んでなる。
【００４９】
１つの実施形態において、この方法は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させる別のステップを含んでなる。
【００５０】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化Ｔ細胞を培養する前に、またはそれと同時にインビトロで特異抗原と接触されうる。一部の実施形態において、活性化Ｔ細胞を特異抗原と接触させた後に、Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインビトロで培養される。
【００５１】
一般的に、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はコンカナバリンＡおよび／または１−ｏ−メチルα−マンノピラノシドの非存在下で培養される。
【００５２】
一般的に、ＩＬ−１２はＩＬ−１２ｐ７０である。
【００５３】
１つの実施形態において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＩＬ−２およびＩＬ−４の非存在下でインビトロで培養される。
【００５４】
理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、特異抗原に対する耐性が対象におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比を増大させることによって増大されうると考えている。特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与することにより、対象におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比が増大する。
【００５５】
対象におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与する前に対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を削減することによってさらに増大されうる。ＣＤ＋４Ｔ細胞は、当業界で周知の任意の方法によって数が削減されうる。ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むリンパ球は、放射線照射によって削減されうる。ＣＤ４＋リンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、一般的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を対象に投与することによって削減されうる。適切な抗体は、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ、抗−リンパ球グロブリンまたは抗−胸腺細胞グロブリンからなる群から選択される１つもしくは複数の抗体を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはリンパ球に特異的に結合する抗体を投与することによって削減される実施形態において、抗体はその後に除去または不活性化されうる。抗体の除去または不活性化の方法としては、抗イディオタイプ抗体、可溶性ＣＤ４リガンド、治療抗体の投与、もしくは治療抗体を除去または中和する他の方法が挙げられる。
【００５６】
１つの実施形態において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、インビトロで活性化されるナイーブＴ細胞由来である。ナイーブＴ細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させ、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を支持することができる１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＴ細胞を培養することによって活性化されうる。一般的に、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を支持することができるサイトカインは、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子である。
【００５７】
ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、
（ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させ、かつ
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養すること
によってインビトロで活性化されうる。
【００５８】
一般的に、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で、同時に、またはその後に培養される。
【００５９】
あるいは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、
（ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させ、かつ
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養すること
によってインビトロで活性化されうる。
【００６０】
一部の実施形態において、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５またはＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で、同時に、またはその後に培養される。一部の実施形態において、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で活性化されているナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養されうる。
【００６１】
ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、
（ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させ、かつ
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養すること
によってインビトロで活性化されうる。
【００６２】
一般的に、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で、同時に、またはその後に培養される。ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はさらに、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養されうる。
【００６３】
別の実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、インビトロで培養する前に、インビボで特異抗原に活性化されうる。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原にすでに活性化した対象から単離されうる。対象に由来する特異抗原に活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、一般的に、特異抗原との接触、および、対象における、言い換えれば、インビボでのＩＬ−２および／またはＩＬ−４への曝露後に、活性化されるであろうことが予想される。
【００６４】
対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の試料は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、および特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有しうることが予想される。これらの細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させ、かつＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによって成長されうる。一部の実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はさらに、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養されうる。
【００６５】
本発明の第３または第４の態様の方法において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを含んでなる任意の培地で培養されうる。培地は一般的にコンカナバリンＡおよび／または１−ｏ−メチルα−マンノピラノシドを含まない。培地は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインに加えて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、およびその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインを含有しうる。培地は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインに加えて、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する１つもしくは複数の抗体を含有しうる。かかる抗体の例としては、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯが挙げられる。培地はさらに、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子を含有しうる。
【００６６】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、一般的にＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養されるが、ここでＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が培養される培地に外部から添加されている。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインは、他のサイトカイン、成長因子、栄養、および／または緩衝液を含んでなる組成物の成分でありうる。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインは、精製タンパク質、組換え、またはそれ以外でありうるが、これらはリンパ球が培養される培地に直接添加される。あるいは、インビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、リンパ球と共培養されるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを過剰発現する細胞の存在下で培養されうる。
【００６７】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、リンパ球が特異抗原を認識することを可能にするやり方でインビトロで特異抗原と接触されうる。一般的に、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面に位置した特異抗原と接触される。特異抗原は、クラスＩＩ主要組織適合性分子と会合して、抗原提示細胞の表面で表示されうる。抗原提示細胞は、抗原提示分子（一般的にクラスＩＩＭＨＣ）、および、一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を促進するために必要とされるリガンドを発現する任意の細胞でありうる。リガンドの例としては、ＩＣＡＭｌ、ＩＣＡＭ２、ＬＦＡ３、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のリガンド、または任意の活性化リガンドが挙げられる。抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、食細胞、Ｂ−リンパ球、ランゲルハンス細胞、または刺激因子細胞の増殖が障害される（例えば、放射線照射またはマイトマイシンＣ治療によって）非分画リンパ球が挙げられる。
【００６８】
あるいは、特異抗原で活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，８２８，１５０号明細書または同第６，７８７，１５４号明細書に記載されているものなどの合成抗原提示系における特異抗原と接触されうる。
【００６９】
１つの実施形態において、それを必要とする対象における特異抗原に対する耐性を増大させる方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与すると同時に、またはその後に投与する別のステップを含んでなる。対象における特異抗原に対する耐性を増大させる方法は、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップをさらに含んでなりうる。
【００７０】
第５の態様において、本発明は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの活性を削減または除去することによって対象における特異抗原に対する耐性を削減し、それによって、対象において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比を減少させる方法を提供する。
【００７１】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との比は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の産生を増大させ、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させる薬剤の有効量を対象に投与することによってさらに減少されうる。一般的に、薬剤はＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子である。薬剤は抗−ＣＤ２５抗体、一般的に抗−ＣＤ２５モノクローナル抗体でありうる。
【００７２】
ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの活性は、対象におけるサイトカインの生物学的活性を削減または除去するための任意の手段によって削減または除去されうる。例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの活性は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの拮抗薬の有効量を投与することによって削減または除去されうる。拮抗薬は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γの活性を削減または除去する任意の分子でありうる。適切な拮抗薬の例としては、抗体受容体分子、アンチセンス分子、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子、またはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの生物学的活性を削減または除去する任意の他の分子が挙げられる。一般的に、拮抗薬は抗体である。一般的に、抗体はモノクローナル抗体である。
【００７３】
第６の態様において、本発明は、サイトカインおよび／または薬剤として許容される担体とともに特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなる組成物を提供するが、前記特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養されている。
【００７４】
第７の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下でインビトロで特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによってインビトロで成長した特異抗原に活性化した治療的に有効量のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を対象に投与するステップを含んでなる。
【００７５】
１つの実施形態において、対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与する前に削減される。一般的に、対象におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の数が削減される。ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、放射線照射、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯなどのＣＤ４、一般的にＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する抗体の投与、または細胞毒性剤の投与、またはアルキル化剤療法を含む対象におけるリンパ球を削減するための当業界で周知の任意の方法によって削減されうる。
【００７６】
１つの実施形態において、この方法は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させる別のステップを含んでなる。特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＴ細胞を培養する前に、またはそれと同時にインビトロで特異抗原と接触されうる。一般的に、Ｔ細胞は、リンパ球を特異抗原と接触させた後に、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養される。
【００７７】
疾患は、１つもしくは複数の特異抗原に対する免疫応答に起因する任意の疾患でありうる。１つの実施形態において、疾患は自己抗原に対する免疫応答、例えば、自己免疫疾患と関係がある。本発明の方法を使用して予防または治療されうる自己免疫疾患の種類の例としては、例えば、１型インスリン依存糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、急性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、特発性肺線維症／肺胞炎、喘息、ブドウ膜炎、虹彩炎、視神経炎、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬、乾癬関節炎、多発性硬化症、進行性全身硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性疾患、自己免疫溶血貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス疾患、習慣的自然流産、レイノー症候群、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、セリアック病、ＡＩＤＳの自己免疫的合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、アジソン病、慢性脱髄性神経障害、膜性腎症、巣状硬化性糸球体腎炎および最小変化腎症を含む糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、関節リウマチ、若年性関節炎が挙げられる。
【００７８】
別の実施形態において、疾患は、対象と接触した非自己抗原に対する免疫応答の結果である。これは、例えば、移植された細胞または組織が対象の免疫系による拒絶を受ける対象への細胞または組織の移植後の場合にありうる。一般的に、移植された細胞または組織は同種移植片または異種移植片の細胞または組織である。移植細胞または組織の例としては、腎、肝、心臓、弁、肺、皮膚、膵、角膜、水晶体、骨髄、筋、結合組織、血管組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞または遺伝子組換え細胞が挙げられる。遺伝子組換え細胞は、例えば、治療または他の薬剤をトランスフェクトされている幹細胞でありうる。
【００７９】
あるいは、疾患は対象と接触したアレルゲンに対する免疫応答の結果でありうる。アレルゲンに起因する疾患の例としては、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、花粉症、アレルギー結膜炎、接触皮膚炎、食物アレルギーが挙げられる。
【００８０】
第８の態様において、本発明は、対象における特異抗原に対する耐性を削減または除去するために使用される場合の組成物を提供し、この組成物は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの拮抗薬を含んでなる。
【００８１】
拮抗薬は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の活性を削減または除去する任意の分子でありうる。適切な拮抗薬の例としては、抗体受容体分子、アンチセンス分子、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子、またはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γの生物学的活性を削減または除去する他の分子が挙げられる。一般的に、拮抗薬は抗体である。
【００８２】
第９の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する耐性に起因する疾患を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの拮抗量の治療的有効量を対象に投与するステップを含んでなる。
【００８３】
１つの実施形態において、この方法は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する抗体の有効量を投与するステップをさらに含んでなりうる。一般的に、抗体は抗ＣＤ２５抗体である。
【００８４】
疾患は特異抗原に対する耐性に起因する任意の疾患でありうる。かかる疾患の例としては、癌、Ｂ型およびＣ型肝炎などの慢性感染症、ハンセン病、結核、クリプトコッカス症、単純ヘルペスが挙げられる。
【００８５】
本発明は、本発明の方法とともに使用されるキットも意図する。対象が特異抗原に対する耐性を与えることができるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを評価するためのキットが、リンパ球の試料をインキュベートするための培地および／またはサイトカインを含んでなりうる。サイトカインは、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の１つもしくは複数でありうる。
【００８６】
特異抗原に対する耐性を増大させるためのキットは、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインを含んでなりうる。このキットは、インビトロで対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を接触させるために適切な形で特異抗原をさらに含んでなりうる。例えば、キットは抗原提示細胞の表面で特異抗原を含んでなりうる。特異抗原の関連部が抗原提示細胞の表面上の適切なＭＨＣ分子に組込まれうることが当業者によって理解されるであろう。キットは、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子をさらに含んでなりうる。
【００８７】
特異抗原に対する耐性を減少させるためのキットは、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの拮抗薬を含んでなりうる。拮抗薬はＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の活性を削減または除去する任意の分子でありうる。適切な拮抗薬の例としては、抗体受容体分子、アンチセンス分子、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子、または、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の生物学的活性を削減または除去する任意の他の分子が挙げられる。一般的に、抗体はモノクローナル抗体である。キットは、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子をさらに含んでなりうる。
【００８８】
上記のキットは、キットの使用説明書をさらに含んでなりうる。
【００８９】
対象は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を産生する任意の対象でありうる。対象は哺乳類でありうる。哺乳類はヒト、または齧歯類などのヒト以外の動物、ヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ、ネコ、イヌ、またはウマでありうる。一般的に、対象はヒトである。
【００９０】
第１０の態様において、本発明は、それを必要とする対象における特異抗原に対する耐性を誘発する方法を提供し、ここで対象の免疫系は特異抗原に曝露されるが、この方法は、対象に対し、
（ｉ）ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量と、
（ｉｉ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量と
を投与するステップを含んでなる。
【００９１】
ＩＬ−２および／またはＩＬ−４、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の投与は、特異抗原と接触したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの活性化を支持し、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を維持および／または刺激することが予想される。
【００９２】
ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与と同時に、またはその後に投与されうる。適切に、ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与の後に投与される。一般的に、ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与後２４時間〜１週間に投与される。
【００９３】
第１０の態様の１つの実施形態において、本方法は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップを含んでなる。
【００９４】
第１０の態様の別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップを含んでなる。
【００９５】
第１０の態様のさらに別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【００９６】
第１０の態様の別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップをさらに含んでなる。
【００９７】
第１１の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防する方法を提供し、この方法は、対象に対し、
（ｉ）ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量と、
（ｉｉ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量と
を投与するステップを含んでなる。
【００９８】
ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与と同時に、またはその後に投与されうる。適切に、ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与の後に投与される。一般的に、ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つのサイトカインは、ステップ（ｉ）の１つもしくは複数のサイトカインの投与後２４時間〜１週間に投与される。
【００９９】
第１１の態様の１つの実施形態において、本方法は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１００】
第１１の態様の別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１０１】
第１１の態様のさらに別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１０２】
第１１の態様の別の実施形態において、本方法は、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップをさらに含んでなる。
【０１０３】
第１１の態様の１つの実施形態において、本方法は、ステップ（ｉｉ）の前に、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を対象から得るステップと、
（ｂ）試料が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対して応答性であるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを判定するステップと
を含んでなりうる。
【０１０４】
かかる実施形態において、ステップ（ｉｉ）は一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が応答性であることが判定されているＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１０５】
１つの実施形態において、１つもしくは複数のサイトカインに対する試料からのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答性は、１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現を検出することによって判定される。１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現は、受容体に対する抗体を使用して検出されうる。１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現は、受容体のＲＮＡの発現を検出することによって検出されうる。例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析等を使用するアッセイを使用し、１つもしくは複数のサイトカインの受容体をコードするｍＲＮＡを検出することができる。
【０１０６】
別の実施形態において、１つもしくは複数のサイトカインに対する応答性は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で試料の増殖を評価することによって判定されうる。例えば、試料は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下、一般的に特異抗原の存在下でもインキュベートされうるが、それによって、１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対して応答性であることを示す。
【０１０７】
疾患は、１つもしくは複数の特異抗原に対する免疫応答に起因する任意の疾患でありうる。１つの実施形態において、疾患は自己抗原に対する免疫応答、例えば、自己免疫疾患と関係がある。本発明の方法を使用して予防または治療されうる自己免疫疾患の種類の例としては、例えば、１型インスリン依存糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、急性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、特発性肺線維症／肺胞炎、喘息、ブドウ膜炎、虹彩炎、視神経炎、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬、乾癬関節炎、多発性硬化症、進行性全身硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性疾患、自己免疫溶血貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス疾患、習慣的自然流産、レイノー症候群、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、セリアック病、ＡＩＤＳの自己免疫的合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、アジソン病、慢性脱髄性神経障害、膜性腎症、巣状硬化性糸球体腎炎および最小変化腎症を含む糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、関節リウマチ、若年性関節炎が挙げられる。
【０１０８】
別の実施形態において、疾患は、対象と接触した非自己抗原に対する免疫応答の結果である。これは、例えば、移植された細胞または組織が対象の免疫系による拒絶を受ける対象への細胞または組織の移植後の場合にありうる。一般的に、移植された細胞または組織は同種移植片または異種移植片の細胞または組織である。移植細胞または組織の例としては、腎、肝、心臓、弁、肺、皮膚、膵、角膜、水晶体、骨髄、筋、結合組織、血管組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞または遺伝子組換え細胞が挙げられる。遺伝子組換え細胞は、例えば、治療または他の薬剤をトランスフェクトされている皮膚細胞を含む自己細胞でありうる。
【０１０９】
あるいは、疾患は対象と接触したアレルゲンに対する免疫応答の結果でありうる。アレルゲンに起因する疾患の例としては、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、花粉症、アレルギー結膜炎、接触皮膚炎、食物アレルギー、薬物または他の化学的アレルギー、毒アレルギーが挙げられる。
【０１１０】
第１２の態様において、本発明は、それを必要とする対象における特異抗原に対する耐性を誘発する方法を提供し、これは対象に対し、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１１１】
一般的に、この方法は、抗ＣＤ−３抗体を投与するステップを含んでなることはない。
【０１１２】
一部の実施形態において、対象の免疫系は特異抗原に曝露される。対象の免疫系が特異抗原に曝露される実施形態において、本方法は、
（ａ）対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、
（ｂ）試料が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対して応答性であるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを判定するステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が応答性である、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量を投与するステップと
を含んでなる。
【０１１３】
第１３の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１１４】
１つの実施形態において、この方法は、
（ａ）対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、
（ｂ）試料が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対して応答性であるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを判定するステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が応答性である、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量を投与するステップと
を含んでなる。
【０１１５】
１つもしくは複数のサイトカインに対する試料からのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答性は、１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現を検出することによって判定される。１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現は、受容体に対する抗体を使用して検出されうる。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの受容体の発現は、受容体のＲＮＡの発現を検出することによって検出されうる。例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析等を使用するアッセイを使用し、ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの受容体をコードするｍＲＮＡを検出することができる。
【０１１６】
ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対する応答性は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で試料の増殖を評価することによって判定されうる。例えば、試料は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下、一般的に特異抗原の存在下でもインキュベートされうるが、それによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインに対して応答性であることを示す。
【０１１７】
１つの実施形態において、この方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインを投与する前、またはそれと同時に、対象に対しＩＬ−２およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１１８】
第１２または第１３の態様の１つの実施形態において、この方法は、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与するステップをさらに含んでなる。
【０１１９】
抗原に対する免疫応答に起因する疾患は、上記の免疫応答に起因する疾患のいずれかでありうる。
【０１２０】
第１４の態様において、本発明は、第９、第１０、または第１２の態様の方法とともに使用される場合のキットを提供し、このキットは、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを含んでなる。キットは、ＩＬ−１３をさらに含んでなりうる。キットは、使用の説明書をさらに含んでなりうる。
【０１２１】
特異抗原に対する耐性を増大させる上記の方法のいずれかを、薬物、一般的に治療薬の送達のために外来物を対象に導入するステップを含む対象の治療の方法において適用されうることも予想される。例えば、本発明の方法を使用し、遺伝子療法のために使用されるウイルス、またはその他の場合に免疫応答を誘発する他の遺伝子送達手段に対する耐性を増大させることができる。
【０１２２】
第１５の態様において、本発明は、それを必要とする対象における耐性を増大させるための薬剤の製造における第３の態様の方法によるインビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２３】
第１６の態様において、本発明は、対象における特異抗原に対する耐性を削減するための薬剤の製造におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、の拮抗薬の使用を提供する。
【０１２４】
第１７の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における第３の態様の方法によるインビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２５】
第１８の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する耐性に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における第３の態様の方法によるインビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２６】
第１９の態様において、本発明は、対象における耐性を誘発する対象の治療のための薬剤の製造におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの使用を提供するが、治療は、薬剤の有効量、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１２７】
第２０の態様において、本発明は、対象における耐性を誘発する対象の治療のための薬剤の製造におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの使用を提供するが、治療は、薬剤の有効量、およびＩＬ−２およびＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を投与するステップを含んでなる。
【０１２８】
第２１の態様において、本発明は、それを必要とする対象に対する耐性を増大させるための薬剤の製造における、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの使用を提供する。
【０１２９】
第２２の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、特異抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの使用を提供する。
【０１３０】
第２３の態様において、本発明は、特異抗原に対しＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を活性化する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させるステップと、
（ｂ）ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養するステップと
を含んでなる。
第２４の態様において、本発明は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養するステップを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１Ａ】ナイーブ非分画リンパ球（破線および黒丸）、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞／リンパ球（実線、黒丸）、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（白丸の細線）、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞（白丸の太線）を示すグラフである。リンパ球を同種抗原と接触させてから２、３、４、５、および６日目に分析された増殖。
【図１Ｂ】４日後における、自己抗原（黒）、ＰＶＧ抗原（ドナー抗原）（薄灰色）、およびルイス抗原（第三者抗原）（濃灰色）に反応したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の比較を示すグラフである。
【図１Ｃ】同種抗原（ＰＶＧ）と接触させた後の、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球（三角）、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（四角）、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞（丸）の集団の連続希釈（ｘ軸上に表示）の増殖（ｙ軸上）を示すグラフである。
【図１Ｄ】同種抗原（ＰＶＧ）と接触させた後６日にわたる、分離したＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と分離したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の混合の増殖に対する効果を示すグラフである。混合物が示されている。
【図１Ｅ】自己抗原（黒色）、ドナー抗原（ＰＶＧ抗原―薄灰色）、または第三者抗原（ルイス―濃灰色）との接触させた後の、ＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図１Ｆ】自己抗原（白丸、細い実線）、ドナー抗原（破線）、または第三者抗原（太線、白四角）と接触させてから４日目の、ＰＶＧ同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来する非分画Ｔ細胞、分画ＣＤ４＋Ｔ細胞、および分画ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の限外希釈アッセイの結果を示すグラフである。
【図２Ａ】自己抗原（黒色）またはドナー抗原（斜交パターン）との接触および示されているサイトカインの存在下でのインキュベーション後の、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＴＧＦ−β（Ｄ）、ＩＦＮ−γ（Ｅ）、ＩＬ−１２（ｐ７０）（Ｆ）、ＩＬ−５（Ｇ）またはＩＬ−１０（Ｈ）の存在下での、自己抗原（黒色）またはドナー抗原（灰色）に対する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の３日目の増殖を示すグラフである。
【図３Ａ】全身照射および様々な用量のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞／リンパ球（Ａ〜Ｄで示した）の投与後のラットにおける心臓同種移植片の拒絶時間を示すグラフである。
【図３Ｂ】Ａ、５×１０６のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球（黒三角）、Ｂ、２０×１０６のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（黒丸）、Ｃ、５×１０６のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞（白三角）、Ｄ、０．５×１０６のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞＋５×１０６のナイーブＴ細胞（白三角）、Ｅ、５×１０６のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞＋５×１０６のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（黒四角）の投与後のラットにおける移植後５０日までの心臓移植片機能を示すグラフである。
【図４Ａ】示された抗原との接触後４日および５日の、ＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（黒色）、あるいは、自己抗原（斜交パターン）と接触、または同種抗原（ＰＶＧ）（網かけ）と接触させたＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対するＩＬ−２（上）およびＩＬ−４（下）の効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】同種抗原とともに、およびサイトカイン（暗い網かけ）なし、ＩＬ−２（中間の網かけ）、またはＩＬ−４（明るい網かけ）で培養したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対する３日〜６日目の効果を示すグラフである。
【図４Ｃ】自己または同種抗原およびＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下で培養したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に由来する単離されたｍＲＮＡに対して、サイトカインまたはサイトカイン受容体（示されているとおり）のライマーを使用する半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４Ｄ】ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下で、自己抗原（ＤＡラット由来）、ドナー抗原（ＰＶＧラット由来）、または第三者抗原（ルイスラット由来）の存在下で培養したＰＶＧ同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞から単離されたｍＲＮＡに対して、サイトカインまたはサイトカイン受容体（示されるとおり）のプライマーを使用する半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４Ｅ】自己刺激因子またはＰＶＧ刺激因子のいずれか、単独またはＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれかとの存在下でインキュベートしたナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞から単離されたｍＲＮＡに対して、ＩＬ−５受容体アルファ鎖またはＧＡＤＰＨのプライマーを使用する半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４Ｆ】自己または同種抗原の存在下で、かつ、サイトカインなし、またはＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれかとの存在下でインキュベートしたナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞から単離されたｍＲＮＡに対する、ＩＦＮ−γ受容体またはＧＡＤＰＨのプライマーを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図５Ａ】単独または１：１の比で混合したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞から単離されたサイトカインｍＲＮＡに対するプライマーを使用する半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。すべての集団はナイーブＤＡラット由来であり、自己または同種抗原の存在下でインキュベートした。
【図５Ｂ】自己抗原（黒色）または同種抗原（灰色）の存在下でインキュベーション後のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞、および１：１の比でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と混合したＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、またはＩＬ−１０を妨害する抗体の効果を対照抗体Ｍｏｇ−Ｉｇ２ａと比較した。
【図６Ａ】ＰＶＧラットまたはルイスラットから、ＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ−４（点線）またはＩＬ−５（実線）のいずれかを添加した培地においてＰＶＧ刺激細胞で３日間培養した）で適合修復させた照射ＤＡラットへ移植した異所性心臓同種移植片の生存を示すグラフである。
【図６Ｂ】ＩＬ−４の存在または非存在下（示されるとおり）でＰＶＧ抗原でインキュベートした後に更に、単独で（白色）、または自己抗原（ＤＡ）（濃い灰色）、ドナー抗原（ＰＶＧ）（黒色）、または第三者抗原（ルイス）（薄い灰色）の存在下で、およびＩＬ−４の存在または非存在下でインキュベートした後の、ＰＶＧ同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図７】示されているサイトカインの存在下で自己抗原または同種抗原との接触後４日目の、ＰＶＧ同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来する非分画ナイーブリンパ球の増殖を示すグラフである。
【図８Ａ】耐性（回復）ルイスラットに由来するリンパ球の投与後のルイスラットにおける実験的アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）の臨床経過を示すグラフである。黒四角は未処置ラットであり、黒丸はＥＡＮに対して耐性のラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞で処置したラットであり、白丸はＥＡＮに対して耐性のラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞で処置したラットである。
【図８Ｂ】耐性（回復）ルイスラットに由来するリンパ球の投与後のルイスラットにおける実験的アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）の経時的な体重変化を示すグラフである。黒四角は未処置ラットであり、黒丸がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞で処置したラットであり、白丸はＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞で処置したラットである。
【図９Ａ】ＰＮＭに反応したナイーブルイスラットに由来する（示されているように）リンパ球の様々な組合せの増殖を示すグラフである。
【図９Ｂ】ＰＮＭ抗原に反応したＰＮＭ抗原に対して耐性のルイスラット（免疫付与後４週間でＥＡＮから回復）に由来する（示されているように）リンパ球の様々な組合せの増殖を示すグラフである。
【図１０】ＰＶＧ抗原の存在下でＩＦＮ−γで培養したＰＶＧ抗原に対して耐性のＤＡラットに由来する２０×１０６ＣＤ４＋細胞（実線、上グラフ）（点線、下グラフ）、５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（太い破線、上および下グラフ）、２０×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（細い破線、上グラフ）、５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と混合したＰＶＧ抗原に対して耐性のＤＡラットに由来する２０×１０６ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（点線、上グラフ）、照射ＤＡラット（細胞なし）（実線、上および下グラフ）を投与した照射ＤＡラットにおける５０日にわたるＰＶＧ心臓同種移植片（上パネル）およびルイス（第三者）心臓同種移植片（下パネル）における生存率（％）を示す図である。
【図１１】図の下部に示されているＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−２およびＩＬ−１２の存在下でＤＡラット（グラフの左欄）に由来する自己抗原または同種抗原（ＰＶＧラット由来）（グラフの右欄）の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（上列）、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞（中央列）、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（下列）のインキュベーションによるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対する効果を示す図である。
【図１２】３日間のＩＬ−２およびＰＶＧ抗原の存在下で活性化後、補充なし（それぞれの刺激）、ＣＨＯ−Ｋ上清（ＣＨＯ−Ｋ）、ＩＬ−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）、またはＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）の存在下のインキュベーション後のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を示す図である。
【図１３】ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下で４日間の自己抗原（ＤＡ抗原）または同種抗原（ＰＶＧ抗原）による培養後のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に由来するＩＬ−２またはＩＬ−１２Ｒβ２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ  ＧＡＰＤＨの結果を示す図である。
【図１４】ＥＡＮの実験疾患モデルにおける重篤度（Ａ）および体重減少（Ｂ）に対するＩＬ−５の投与の効果を示す図である。白四角＝ＩＬ−５投与ラット、黒丸＝ＣＨＯ−Ｋ上清投与ラット、白丸＝未処置。
【図１５】ＰＮＭを用いた免疫付与後１４および２１日のＥＡＮの実験ラットモデルに由来する末梢神経における脱髄神経線維の割合を示す図である。免疫付与時にＩＬ−５で処置したラットは、灰色の棒で表され、未処置だったラットは黒色の棒で表されている。
【図１６】（示されている）ＴＣＲ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、またはＴＮＦ−αに対するプライマーを使用した、ＰＮＭを用いた免疫付与後１４日または２１日のラットの流入領域リンパ節（ＬＮ）または馬尾（ＣＥ）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ後のｍＲＮＡの標準コピー数を示す図である。黒色の棒はＩＬ−５処置を表し、白色の棒は未処置を表す。有意は＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１で示されている。
【図１７】ＤＮＡで免疫化され、かつＩＬ−５（ＩＬ−５）を投与され、またはＩＬ−５（ＣＴＬ）を投与されなかったラットの流入領域リンパ節（ＬＮ）および馬尾（ＣＥ）における１４日目および２１日目のＩＬ−５、ＩＬ５Ｒα、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１８】限外希釈アッセイにおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を示す図である。Ａ、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を１：２の連続希釈でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と混合し、Ｂ、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を、１：２の連続希釈で、ＰＶＧ抗原およびＩＬ−２の存在下で培養されていたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と混合した。
【図１９】限外希釈アッセイにおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を示す図である、Ａ、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を１：２の連続希釈でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と混合し、Ｂ、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を、１：２の連続希釈で、ＰＶＧ抗原およびＩＬ−４の存在下で培養されていたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と混合した。
【図２０】ＩＬ−５、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γおよび自己抗原（Ｓ）、ドナー抗原（Ｄ）、または第三者抗原（Ｔ）の非存在下（ＡおよびＢ）または存在下（ＣおよびＤ）で培養後における、ドナー抗原に対して耐性（ＡおよびＣ）または非耐性（ＢおよびＤ）である対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の予想相対細胞増殖を示す図である。
【図２１】ＩＬ−５、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γおよび自己抗原（Ｓ）、ドナー抗原（Ｄ）、または第三者抗原（Ｔ）の非存在下（ＡおよびＢ）または存在下（ＣおよびＤ）でＣＤ４＋Ｔ細胞の培養後における、ドナー抗原に対して耐性（ＡおよびＣ）または非耐性（ＢおよびＤ）である対象に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の予想相対細胞増殖を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
耐性はきわめて重要な免疫学上の差別的過程であり、それなしには重要な疾患状態が存在しうる。上記の通り、免疫応答の異常な誘発が自己免疫疾患をもたらす環境があり、耐性の再確立が望ましい。例えば、臓器移植後、耐性の誘発が望ましい特殊な環境もある。
【０１３３】
例えば、慢性感染症または癌の場合には、特異抗原に対する耐性の誘発が望ましくない環境もある。かかる環境においては、対象が耐性を発現し、それによって慢性感染症、または腫瘍を削減または除去する感染性病原体または腫瘍の抗原に対する耐性を削減または遮断することが望ましい。
【０１３４】
１つの態様において、本発明は、対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかを評価する方法に関する。特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、特異抗原に耐性を与えることができる。したがって、本発明は、対象が特異抗原に対して耐性であるか、または耐性になることができるかを判定する方法にも関する。本明細書で使用される「耐性」という語は、抗原を外来であると認識する免疫系の部分を抑制する過程を指す。当業者によって、本明細書で使用される「耐性」という語は、「免疫耐性」と同じ意味であることが理解されるであろう。したがって、「特異抗原に対する耐性」という語句は、当業者によって、持続性全身性免疫抑制なしに特異抗原に対する免疫不応答または免疫応答の低下を意味すると理解されるであろう。したがって、特異抗原に耐性の対象が特異抗原以外の対象に外来の抗原に対する免疫応答を誘発することができる。「特異抗原に対して耐性になることができる」対象は、その免疫系が、特異抗原に対して耐性を誘発するために必要なリンパ球を含有するが、さらに特異抗原に対して完全に耐性に進行していない対象である。
【０１３５】
対象は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を産生する対象でありうる。長年、例えば、マウスおよびラットなどのさまざまな種の動物が、ヒト免疫系および他の哺乳類の免疫系を試験するためのモデルとして使用されている。これは、例えば、マウスおよびラットにおける所見がヒトおよび他の哺乳類の免疫系のモデルに適用可能であるためにそうであった。したがって、マウス、ラット、および他の哺乳類の試験において得られる結果は、ヒトおよび他の哺乳類に直接適用可能である（コスタキス（Ｋｏｓｔａｋｉｓ）ら、ＩＲＣＳ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｌｉｂｒ  Ｃｏｍｐｅｎｄ  １９９７年、５、２８０頁）。
【０１３６】
対象が特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるかどうかを評価するための本発明の方法は、対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を得るステップと、特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞からの特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の区別を促進するために、リンパ球の試料の少なくとも一部分をインキュベートするステップと、その後に特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が試料に存在するかどうかを判定するステップとを含んでなる方法。
【０１３７】
試料の少なくとも一部分は、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と他のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞との区別を促進する形でインキュベートされうる。この区別は、例えば、他のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対して特異抗原に活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加または減少した増殖または生存でありうる。この区別は、例えば、他のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対して特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるメッセンジャーＲＮＡ種の増加または減少した発現でありうる。
【０１３８】
一般的に、対象は、その免疫系が特異抗原に曝露される対象である。「リンパ球」という語は、当業者によって、特異的免疫応答を開始および制御するために関与する免疫系の細胞を指すことが理解されるであろう。かかる細胞としては、Ｔ細胞としても周知のＴリンパ球が挙げられる。ＣＤ４＋リンパ球はＴリンパ球である。リンパ球の試料は、例えば、混合末梢リンパ球、単離ＣＤ４＋リンパ球、または単離ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋リンパ球である。一般的に、リンパ球の試料は末梢血リンパ球である。
【０１３９】
リンパ球の試料は一般的に末梢血リンパ球から単離される。インビトロでのＴリンパ球の集団の単離および特徴づけは多くの先行技術の文書、例えば、米国特許第５，６２２，８５３号明細書、および国際特許出願国際公開第００／２０４４５号パンフレットに示されているものに記載されているが、リンパ球を単離するための既知の方法を使用することができる。手短に言えば、１つの任意の方法において、Ｔ細胞を含有する血液試料を哺乳類から採取する。次いで、末梢血リンパ球を上記のＴリンパ球単離のための方法を使用して血液試料から単離する。例えば、末梢血リンパ球は、フィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）グラジエント遠心分離（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州（Ｎ．Ｊ．））によって単離されうる。
【０１４０】
末梢血リンパ球の単離後、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が単離末梢血リンパ球の集団から単離されうる。本明細書で使用される「ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞」は、その表面上でＣＤ４およびＣＤ２５として周知の分化マーカーの集団を発現するリンパ球である。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＣＤ４＋、ＣＤ２５＋リンパ球としても周知である。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ４５ＲＯ−、ＲＢ−などＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の単離において助けとなりうる他のマーカーも発現しうる。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＬ−セレクチンを発現しうる。一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＣＤ４＋、ＣＤ２５＋高Ｔ細胞である。
【０１４１】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体を使用してＣ２５＋Ｔ細胞の積極的な濃縮によって単離される。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、１つもしくは複数の蛍光標識抗ＣＤ２５抗体を使用して多パラメータフローサイトメトリー分析によって単離されうる。この方法は、光分散パラメーターおよび１つもしくは複数の蛍光パラメーターの分析を含む。単離の他の方法としては、例えば、米国特許第５１７，１０１号明細書に既述された磁気ビーズベースの分離が挙げられる。フローサイトメトリー分析は、例えば、ＦＡＣＳｃａｎＴＭフローサイトメーターまたはＦＡＣＳｔａｒＴＭプラス細胞選別装置（いずれもベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、「ＢＤＩＳ」から入手可能）で実行されうる。データ収集は、ＦＡＣＳｃａｎリサーチソフトウェアおよびＦＡＣＳｔａｒプラスソフトウェア（ＢＤＩＳ）で実行されうる。前方散乱光、直交散乱光、および３つの蛍光シグナルが各々の細胞について判定され、リストモードデータファイルに保存される。各々の実験では約３０，０００個の細胞が測定されるが、細胞の数は対象および入手可能なリンパ球によって大幅に変動しうることが理解されるであろう。リストモードデータファイルの分析は、好ましくは、Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇｅｔｅ、ＴＭソフトウェア（ＢＤＩＳ）で実行される。（米国特許第４，８４５，６５３号明細書を参照）。直交散乱光分解能を増大させるために、直交散乱光シグナルは、米国特許第５１７，０９６号明細書に記載された多項機能を使用して変換されうる。光学顕微鏡検査のために、１０，０００個の分類された細胞が５分間、２００ｇで遠心分離し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０  １００ｍｌ中に再懸濁した。サイトスピン調製をシャンドン（Ｓｈａｎｄｏｎ）集細胞遠心機（サーザン・プロダクツ株式会社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ）で行う。分類された細胞を含有するスライドをライト・ギムザ染色（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で染色されうる。
【０１４２】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＢＤＩＳから入手可能なさまざまなモノクローナル抗体を使用する識別および／または単離のために蛍光標識されうる。抗体は次の蛍光色素の１つで蛍光標識されうる。すなわち、フィコエリトリン（「ＰＥ」）、フルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」）、およびペリジニンクロロフィル錯体（「ＰｅｒＣｐ」）。ＰＥおよびＰｅｒＣＰの説明については、それぞれ、米国特許第４，５２０，１１０号明細書、および同第４，８７６，１９０号明細書を参照。使用されうるモノクローナル抗体としては、例えば、抗−ＣＤ４  ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰｅｒＣｐ、抗−ＣＤ２５  ＰＥが挙げられる。（すべての抗体はＢＤＩＳから市販されている）。
【０１４３】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は当業界で周知の方法によって単離されうる。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋細胞を枯渇させることによって単離されうる。
【０１４４】
一部の実施形態において、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができる少なくとも１つのサイトカインの存在下で試料の少なくとも一部分をインキュベートする前に、またはそれと同時に特異抗原と接触されうる。一部の実施形態において、少なくとも一部分は特異抗原の存在下でインキュベートすることによって特異抗原と接触される。試料の少なくとも一部分は、試料におけるリンパ球が特異抗原と接触し、かつ特異抗原を認識することを可能にするやり方で特異抗原の存在下でインキュベートされうる。本明細書で使用される「接触させる」または「接触される」という語は、リンパ球が抗原を認識することを可能にするやり方でリンパ球を抗原と接触させることを指す。言い換えれば、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、試料におけるＴ細胞の活性化を可能にしうるやり方で特異抗原と接触される。
【０１４５】
一般的に、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、例えば、抗原提示細胞などの刺激細胞の表面でリンパ球に対する特異抗原を提示することによって特異抗原と接触される。一般的に、特異抗原は、抗原提示細胞の表面上の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子（一般的にクラスＩＩ）を関係があるリンパ球に提示される。本明細書で定義される「刺激細胞」は、リンパ球が抗原を認識しうるやり方でリンパ球に抗原を提示することができる細胞である。例えば、刺激細胞は腫瘍細胞であり（例えば、米国特許第５，３４２，７７４号明細書、クヌス（Ｋｎｕｔｈ）ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２８０４−２８０８頁、１９８９年）、およびファン・デン・ユンデ（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ）ら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４４：６３４−６４０頁、１９８９年）を参照）、または刺激細胞は抗原提示細胞でありうる。
【０１４６】
「抗原提示細胞」は、Ｔリンパ球に抗原を提示することによって免疫応答の誘発に寄与する細胞であることが当業者によって理解される。抗原提示細胞は樹状細胞、単核食細胞、Ｂリンパ球、非分画リンパ球、またはランゲルハンス細胞でありうる。抗原提示細胞は、例えば、骨髄、血液、胸腺、表皮、肝または胎児肝から単離されうる。抗原提示細胞は、刺激細胞が、例えば、放射線照射またはマイトマイシンＣによる治療によって損なわれている非分画リンパ球でありうる。抗原提示細胞は、関連抗原提示分子（例えば、クラスＩＩＭＨＣ）、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の結合および活性化を促進するために必要である他のリガンドを発現する細胞でありうる。適切なリガンドとしては、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＬＦＡ３、およびＣＤ２８およびＣＴＬ−Ａのリガンド、および他の活性化リガンド、または自己ＭＨＣ分子上に提示され、かつ自己免疫応答で活性化されたＴ細胞によって認識される抗原の一部が挙げられる。
【０１４７】
リンパ球の試料の少なくとも一部分は、米国特許第６，８２８，１５０号明細書または同第６，７８７，１５４号明細書に記載されているものなど合成抗原提示系を使用して特異抗原と接触されうる。
【０１４８】
当業者には明らかであるように、リンパ球の試料をリンパ球の試料の少なくとも一部分を特異抗原と接触させるための上記と同じやり方によって他の抗原と接触させることができる。
【０１４９】
特異抗原は、特異抗原に対して耐性ではない対象における免疫応答を誘発する物質でありうる。特異抗原は対象由来でも由来でなくてもよい。特異抗原は自己抗原でありうるが、これは当業者によって、アレルギー傾向を有するヒトにおける反応を誘発しうる抗原を指すと理解されるであろう。特異抗原は同種抗原でありうるが、これは当業者によって、同じ種の対象由来の抗原を指すと理解されるであろう。特異抗原は異種抗原でありうるが、これは当業者によって、異なる種の対象由来の抗原を指すと理解されるであろう。
【０１５０】
特異抗原はアレルゲンでありうる。
【０１５１】
上記の通り、特異抗原は、抗原に対して耐性ではない対象における免疫応答を誘発する物質でありうる。例えば、典型的な同種抗原は別のヒトに由来するドナー移植細胞または組織でありうる。例えば、典型的な異種抗原は、例えばブタなどのヒトではない動物に由来する移植細胞または組織でありうる。例えば、ブタ、ドナー移植細胞またはヒトまたはヒト以外の動物に由来する組織としては、腎、肝、心臓、肺、皮膚、膵、角膜、水晶体、骨髄、筋、結合組織、血管組織、胃腸組織、神経組織、骨、弁、幹細胞、治療薬などの薬剤でトランスフェクトされた幹細胞などの細胞が挙げえられる。
【０１５２】
抗原提示細胞は、細胞の表面ですでに提示された特異抗原で単離されうる。例えば、自己免疫疾患にかかった対象の脾臓から例えば単離される抗原提示細胞は、細胞の表面で提示された自己抗原を有する。組織移植の場合、移植ドナーの組織から単離される抗原提示細胞は、かかる細胞の表面で提示される同種抗原を有する。例えば、抗原提示細胞は、ドナーの死体に由来する凍結または保存された脾またはリンパ節細胞、または生きているドナーに由来する末梢血球でありうる。あるいは、対象から単離される抗原提示細胞の空のＭＨＣ分子には、米国特許第５，７３１，１６０号明細書に記載された特異抗原を充填させることができ、それによって空のＭＨＣ分子は長さがおよそ８〜１８個のアミノ酸の免疫原性外来ペプチドで充填される。
【０１５３】
抗原提示細胞は、当業界で周知の方法によって血液または組織から単離されうる。例えば、Ｂリンパ球は、標準細胞分離法によって細胞の混合集団（例えば、末梢血または脾臓における他の細胞型）から精製されうる。例えば、付着細胞はプラスチック皿で脾細胞を培養し、非付着Ｔ細胞集団を回収することによって除去されうる。Ｔリンパ球は、抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗ＣＤ３（例えば国際公開第０１／３７８６０号パンフレットを参照）、抗ＣＤ２）および補体で処置された細胞の混合集団から除去されうる。１つの実施形態において、静止Ｂリンパ球は抗原提示細胞として使用される。静止Ｂリンパ球は、Ｂリンパ球の小さなサイズおよび密度に基づく方法によって単離されうる。静止リンパ球様細胞は、トニー（Ｔｏｎｙ）、Ｈ−Ｐ、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、Ｄ．Ｃ．（１９８５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：２２３−２４１頁に記載された対向流遠心溶出法によって単離されうる。対向流遠心溶出法を使用することによって、Ｔ細胞応答を活性化しうる細胞を枯渇した小さな静止リンパ球様細胞集団を、米国特許第６，３１２，６９２号明細書に記載されているように得ることができる。
【０１５４】
別の実施形態において、非分画リンパ球が抗原提示細胞として使用されうる。一般的に、非分画リンパ球は刺激細胞の増殖を損なうように処置される。刺激細胞の増殖を損なうために適切な処置な例としては、放射線照射、またはマイトマイシンＣによる処置が挙げられる。
【０１５５】
本発明の第１の態様の方法の１つの実施形態において、リンパ球の試料の少なくとも一部分を特異抗原と接触させると同時に、またはその後に、リンパ球の試料の少なくとも一部分は、
（ｉ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下、または
（ｉｉ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる。
【０１５６】
一部の実施形態において、試料の一部分は特異抗原と接触され、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされ、かつ試料の別の部分は特異抗原と接触され、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる。
【０１５７】
当業者によって、「ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下」という表現は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＩＬ−２またはＩＬ−４、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子）の活性化を刺激し、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子などの）の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインが、存在しないか、または、それらが生物学的効果を有することがないような低い量で存在することを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用される、「生物学的効果」という表現は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を活性化し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持する能力を指す。「ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で」という表現は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の１つもしくはそれ以上が、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を維持し、かつ／または増殖を促進するのに十分な量で存在することを意味することも理解される。「その生物学的に活性な断片」という表現は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γに関連して特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を維持、または増殖を支持する能力を有するこれらのサイトカインの断片を指し、かつＩＬ−２およびＩＬ−４に関連してナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を支持する能力を有するこれらのサイトカインの断片を指す。例えば、ＩＬ−５の生物学的に活性な断片は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を維持し、かつ／または増殖を支持する能力を有するＩＬ−５分子の部分でありうる。
【０１５８】
本発明者らによって、サイトカインとして、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γは、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができ、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γと相互作用し、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ受容体と同じシグナル変換経路を活性化する分子も活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつ／または増殖を支持することにおいて有効であることが予想される。本明細書で使用される「機能的に同等の分子」という語は、サイトカインまたはその生物学的に活性な断片ではなく、サイトカインと同じ生物学的活性を有する分子を指す。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γに関連して「その機能的に同等の分子」は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片ではないが、それでもＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ受容体のリガンドであり、かつ特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつ／または増殖を支持することができる分子を指す。本明細書で使用される（本パラグラフ以外で）「サイトカイン」という語は、サイトカインの生物学的に活性な断片およびサイトカインの機能的に同等の分子を含む。
【０１５９】
リンパ球の試料の少なくとも一部分は培地においてインキュベートされうる。適切には、培地は細胞培養培地である。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされたリンパ球は、一般的に、サイトカインを含有することがなく、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激することがなく、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することがないような低い量でサイトカインを含有する培地でインキュベートされる。サイトカインを含まない培地は当業界で周知であり、かつ外来血清なしで、馴化培地または特異サイトカインが添加されている。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされたリンパ球の試料の少なくとも一部分は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインが添加されている上記と同じ培地においてインキュベートされうる。
【０１６０】
活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が活性化されている抗原に対し対象における耐性を与えることができる。したがって、特異抗原に対して耐性であった対象の末梢血は、その特異抗原に対する耐性を与えることができる特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなることが予想される。しかし、上記の通り、本発明者らは、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異サイトカインの非存在下で短命であり、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は一般に、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされない限り、特異抗原との接触後２４時間〜１週間の期間後には生存不可能であり、または生存能力が低下していることを見出した。
【０１６１】
本発明者らは、特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と特異抗原に活性化されていないものとの区別を促進するためにリンパ球の試料がインキュベートされうる方法を開発した。例えば、本発明者らは、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインを含有しない培地で特異抗原と接触すると、増殖することができず、一般的に死滅することを確認した。したがって、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子など、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下では増殖せず、かつ特異抗原に対する耐性は、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で特異抗原とリンパ球が接触する場合にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の低増殖または非増殖によって判定されうる。
【０１６２】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在は、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対して測定することによって検出されうる。したがって、１つの実施形態において、対象における特異抗原に対する耐性は、
（ａ）対象からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなる試料を得るステップと、
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させるステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の第１の部分、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の第２の部分をインキュベートするステップと、
（ｄ）その後に、各々の部分に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が増殖し、それによって特異抗原に対する耐性が、第１の部分のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対して第２の部分のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を増大させることによって示されるかを検出するステップと
によって判定されうる。
【０１６３】
特異抗原に対する対象の耐性の欠如は、第１の部分に対する第２の部分のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖の減少、または増殖の無変化によって示される。
【０１６４】
１つの形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、抗ＣＤ４５ＲＢ  ＲＯなどのＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を除去または不活性化する抗体と組合せて使用されうる。したがって、別の実施形態において、対象における特異抗原に対する耐性は、
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなる試料を対象から得るステップと、
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させるステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を不活性化する抗体の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートするステップと、
（ｄ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞の第１の部分、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞の第２の部分をインキュベートするステップと、
（ｅ）その後に、各々の部分に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が増殖し、それによって特異抗原に対する耐性が、第１の部分のＴ細胞に対して第２の部分のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖させることによって示されるかを検出するステップと
によって判定されうる。
【０１６５】
特異抗原に対する対象の耐性の欠如は、第１の部分に対する第２の部分のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖の減少、または増殖の無変化によって示される。
【０１６６】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を不活性化する抗体は、国際公開公報第国際公開第０２／０７２８３２号パンフレットに記載されているものなどの抗ＣＤ４５  ＲＢ／ＲＯ抗体である。
【０１６７】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を支持する特異抗原およびサイトカインの存在下でインキュベートされない限り、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を有する対象から得られる試料において増殖しないと、第１の部分は増殖しないが、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる第２の部分は増殖する。
【０１６８】
場合により、リンパ球は抗ＩＬ−２および／または抗ＩＬ−４抗体の存在下にインキュベートされ、ＩＬ−２またはＩＬ−４を不活性化する。
【０１６９】
あるいは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を測定することによってＣＤ４＋Ｔ細胞集団において判定されうる。特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が特異抗原の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で成長または生存することができないと、それらは、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を刺激することができるサイトカインの非存在下で特異抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ集団の活性化および増殖を阻害することができない。しかし、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の一部分は第三者抗原に応答して増殖し、したがって、第三者抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を抑制する。
【０１７０】
したがって、耐性は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖と比較することによって、対象に由来するＣＤ４＋リンパ球の試料において判定されうる。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を刺激することができるサイトカインの非存在下で、第三者抗原に応答したＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖は、特異抗原に対して耐性の対象に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞における混合集団の増殖に対して増大する。対照的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、特異抗原に応答した単離ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖は、特異抗原に対して耐性の対象からＣＤ４＋Ｔ細胞における混合集団の増殖に対して増大しない。したがって、別の実施形態において、方法は、
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料を対象から得るステップと、
（ｂ）試料からＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団を調製するステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の第１の部分を特異抗原と、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の第１の部分を特異抗原と接触させ、かつＣＤ４＋Ｔ細胞集団の第２の部分を別の抗原と、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の第２の部分を別の抗原と接触させるステップと、
（ｄ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を刺激することができるサイトカインの非存在下で第１および第２の部分をインキュベートするステップと
（ｅ）その後に第１および第２の部分におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の部分の増殖を比較し、それによって、第１の部分におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団の増殖に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖の低増加または非増加、および第２の部分におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖の増加が、対象における特異抗原に対する耐性を示すステップとを含んでなる。
【０１７１】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなるリンパ球の試料の部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させることによって調製される。
【０１７２】
本実施形態において、特異抗原に対して耐性の対象に由来する第１の部分における特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原に応答して増殖せず、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖を抑制することができない。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、Ｔ細胞を特異抗原と接触させた後のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の第１の部分の増殖と同様となる。しかし、第２の部分のＣＤ４＋集団におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は別の抗原との接触後に増殖し、したがって、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害することができる。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞集団から除去されると、結果として生じるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は濃縮され、第２の部分のこれら濃縮細胞は、別の抗原との接触後に大幅な増殖を示す。
【０１７３】
対象が特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなることがない場合は、第１の部分における特異抗原に応答した増殖のレベルは、第２の部分における別の抗原との接触後の増殖と同様となり、すなわち、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の応答は第１の部分における非分画ＣＤ４＋細胞の増殖よりも大きくなる。
【０１７４】
ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激することができるサイトカインの非存在下で特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を検出することによって耐性を判定することが可能であるが、これはナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の１つもしくは複数の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激することができるサイトカインの非存在下で増殖することができないためである。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激することができるサイトカインの非存在下で、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが増殖する。
【０１７５】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、特異抗原に応答してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害する。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激することができるサイトカインの非存在下で非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を測定することによって検出されうる。したがって、別の実施形態において、方法は、
（ａ）非分画リンパ球を含んでなる試料を対象から得るステップであって、試料はＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなるステップと、
（ｂ）非分画リンパ球を特異抗原と接触させるステップと、
（ｃ）非分画リンパ球の第１の部分をＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、かつ非分画リンパ球の第２の部分をＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートするステップと、
（ｄ）その後に第２の部分に対する第１の部分における非分画リンパ球の増殖を検出し、それによって、第１の部分に対する第２の部分におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の低下が、対象が特異抗原に対して耐性であることを示すステップと
を含んでなる。
【０１７６】
非分画リンパ球集団において、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖は、結果として、特異抗原に応答したＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の阻害をもたらす。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖は通常、少数ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖よりも規模が大きく、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−集団の阻害は小さなＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の増殖を増大させることによって上回らない。耐性対象に由来する試料における正味の効果は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされた非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされた非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害である。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖の欠如は、結果として、特異抗原に応答して（ＣＤ４＋集団における）ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖をもたらすが、この応答は、特定のサイトカインなしに死滅する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって阻害されない。
【０１７７】
本発明者らはさらに、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下、特異抗原との接触後に増殖することはできないが、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で別の抗原との接触に応答して増殖することを見出した。したがって、別の実施形態において、方法は、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなる試料を対象から得るステップと、
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の第１の部分を特異抗原と、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の第２の部分を別の抗原と接触させるステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で第１および第２の部分をインキュベートするステップと、
（ｄ）その後に第１および第２の部分におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を検出し、それによって、第１の部分におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する第２の部分におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の大きな増殖が、対象が特異抗原に対して耐性であることを示すステップと
を含んでなる。
【０１７８】
別の抗原は特異抗原のものとは異なることが当業者によって理解されるであろう。例えば、特異抗原がドナー抗原でありうる場合、別の抗原は第三者抗原でありうる。
【０１７９】
本発明者らはさらに、特異抗原に対して耐性の動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートすると、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の比を約１：３より大きく、一般的に約１：１で混合した場合に耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって完全には抑制されないことを見出した。これは、少なくとも１：３、一般的に１：１の比で存在する場合、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答を完全に阻害するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の能力と対照的である。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γは特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、かつ増殖を支持すると、特異抗原、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の１つもしくは複数の存在下の特異抗原に対して耐性の対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のインキュベーションは、結果として、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖の阻害をもたらすことになる。
【０１８０】
したがって、別の実施形態において、方法は、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料を対象から得るステップと、
（ｂ）約１：３（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞）よりも大きい比、一般的に約１：１でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる混合Ｔ細胞集団を試料から調製するステップと、
（ｃ）混合Ｔ細胞集団の第１の部分を特異抗原と、かつ混合Ｔ細胞集団の第２の部分を別の抗原と接触させるステップと、
（ｄ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で第１および第２の部分をインキュベートするステップと、
（ｅ）その後に第２の部分に対する第１の部分の増殖を判定し、それによって第２の部分に対する第１の部分の大きな増殖が、対象が特異抗原に対して耐性であることを示すステップと
を含んでなる。
【０１８１】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団は、試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団は試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、混合Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団とＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団を混合させ、１：３よりも大きいＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の比を得ることによって調製される。
【０１８２】
第１および第２の部分が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でインキュベートされると、特異抗原に活性したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原に応答して生存または増殖せず、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害することができない。対照的に、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は第２の部分においてＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害することができる。
【０１８３】
別の実施形態において、この方法は、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料を対象から得るステップと
（ｂ）試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を１：３よりも大きい比で含んでなる混合Ｔ細胞集団を調製するステップと、
（ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団および混合Ｔ細胞集団を特異抗原と接触させるステップと、
（ｄ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団および混合Ｔ細胞集団をインキュベートするステップと、
（ｅ）その後にＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団および混合Ｔ細胞集団の増殖を判定し、それによって混合Ｔ細胞集団の増殖がその後にＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖と同じであると、対象が特異抗原に対して耐性であることを示すステップと
を含んでなる。
【０１８４】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団は、試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団は試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、混合Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団とＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団を混合させ、１：３よりも大きいＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の比を得ることによって調製される。
【０１８５】
本実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、混合Ｔ細胞集団における活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は生存せず、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制することができない。この効果は、混合Ｔ細胞集団におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖とほぼ同じになることである。
【０１８６】
別の実施形態において、この方法は、
（ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでなる試料を対象から得るステップと
（ｂ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を１：３よりも大きい比、一般的に１：１で混合することによって試料から混合Ｔ細胞集団を調製するステップと、
（ｃ）混合Ｔ細胞集団を特異抗原と接触させるステップと、
（ｄ）混合Ｔ細胞集団の第１の部分を、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、かつＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で混合Ｔ細胞集団の第２の部分をインキュベートするステップと、
（ｅ）その後に第１および第２の部分におけるＴ細胞の増殖を判定し、それによって、第２の部分に対して第１の部分のＴ細胞の大きな増殖が、特異抗原に対する耐性を示すステップと
を含んでなる。
【０１８７】
一般的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団は、試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、かつＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団は試料の一部分からＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を枯渇させることによって調製され、混合Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団とＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団を混合させ、１：３よりも大きいＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の比を得ることによって調製される。
【０１８８】
本実施形態において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で生存および増殖し、結果として、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害する。対照的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下で、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は増殖または生存せず、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を阻害することがない。結果として、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下で、Ｔ細胞の増殖は第１の部分で大きくなる。
【０１８９】
リンパ球の試料の少なくとも一部分がＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でインキュベートされる実施形態において、リンパ球の少なくとも１つの試料は、一部の実施形態において、
（ａ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、または
（ｂ）ＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｃ）ＩＬ−１２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｄ）ＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｅ）ＩＬ−２３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、
の存在下でインキュベートされうる。
【０１９０】
リンパ球の試料の少なくとも一部分がインキュベートされ、特異抗原に活性化されていないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と特異抗原に活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の区別を促進する期間としては、２４時間〜１０日、２４時間〜９日、２４時間〜８日、２４時間〜７日、２４時間〜６日、２４時間〜５日、２４時間〜４日、２４時間〜３日を挙げることができる。
【０１９１】
本明細書で使用される「増殖」という語は、細胞または細胞増殖の分裂を指す。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖は、リンパ球集団の増殖を測定するための当業界で周知の方法によって判定されうる。適切な方法の例は、例えば、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９９年）６７：６０５−６１３頁に記載されている。
【０１９２】
特異抗原は任意の抗原でありうる。例えば、移植に対する耐性の進展について試験する場合、特異抗原は一般的にドナー抗原になる。ドナー抗原は同種抗原または異種抗原でありうる。自己免疫疾患中の耐性の進展について試験する場合、特異抗原は一般的に自己抗原となる。感染性病原体に対する耐性について試験する場合、特異抗原は一般的に感染性病原体またはその感染性病原体由来の抗原となる。腫瘍に対する耐性について試験する場合、特異的な物質は一般的に腫瘍抗原または組織となる。
【０１９３】
当業者によって、この方法は、特異抗原に対する耐性が対象において経時的に変化しているか判定するために継時的に適用されうることが理解されるであろう。
【０１９４】
本発明者らはさらに、特異抗原に活性化し、したがって、対象における特異抗原に対する耐性を誘発することができるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がインビトロで培養されうる方法を開発した。これは、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で増殖しうるという本発明者らによる所見によって可能となる。したがって、本発明はさらに、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによってインビトロで特異抗原に対して活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を成長させる方法を提供する。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は一般的に、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養する前に、またはそれと同時にインビトロで特異抗原と接触される。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原の存在下で培養されうる。
【０１９５】
一部の実施形態において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの非存在下で培養されると活性化後にインビトロで生存可能のままである時間よりも長い期間、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養されうる。
【０１９６】
インビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、それを必要とする対象に投与され、特異抗原に対する対象の耐性を増大させることができる。インビトロで成長した特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用し、特異抗原を認識するが、他の抗原を認識しない免疫系のその部分抑制することができる。特異抗原に（一般の抗原にではなく）に対する耐性が増大すると、特異抗原を認識することがない免疫系のその部分は大きく影響は受けない。例えば、耐性は特定の移植組織に誘発されうるが、同時に対象は無関係のドナー等に由来する感染性病原体または移植組織など他の抗原に応答して有効な免疫を誘発することができる。言い換えれば、対象は移植組織の特異抗原に対して耐性であるが、対象はその他の場合に免疫抑制性ではない。対照的に、対象における移植拒絶を改善または削減する既知の方法は、例えば、病原体および日和見菌からの感染、および癌に対象をかかりやすくするすべての抗原に対する対象の免疫系の免疫抑制を含む。
【０１９７】
したがって、本発明はさらに、対象における特異抗原に対する耐性を増大させるための方法を提供するが、これは対象に対し、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の有効量を投与するステップを含んでなり、ここで活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによってインビトロで成長されている。本明細書で使用される「特異抗原に対する耐性を増殖させる」という表現は、本発明の方法の適用前に特異抗原に対する耐性に対して特異抗原に対する耐性の増大を意味する。
【０１９８】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は一般的にインビトロで
（ａ）特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をインビトロで特異抗原と接触させ、
（ｂ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養すること
によって成長される。
【０１９９】
活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、一部の実施形態において、
（ａ）ＩＬ−５、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、または
（ｂ）ＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｃ）ＩＬ−１２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｄ）ＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、または、
（ｅ）ＩＬ−２３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、
の存在下培養されうる。
【０２００】
特異抗原に活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで活性化されうる。一部の実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はナイーブＴ細胞として単離され、その後にインビトロで活性化される。「ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞」という語は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４の存在下で抗原によって接触されてなく、したがって活性化していないＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を指す。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は胸腺、骨髄、リンパ球様組織、または血液から単離されうる。一般的に、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は対象から単離される。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞を抗原と接触させ、かつＩＬ−２およびＩＬ−４、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＴ細胞を培養することによってインビトロで活性化されうる。
【０２０１】
したがって、１つの実施形態において、インビトロで特異抗原に活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を成長させる方法は、次のステップ、すなわち、
（ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させ、かつＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下でリンパ球を培養し、それによってＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を活性化するステップと、
（ｂ）活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと
を含んでなりうる。
【０２０２】
上記のステップ（ａ）および（ｂ）は同時に行うことができ、またはステップ（ａ）をステップ（ｂ）の前に行うことができる。
【０２０３】
細胞表面で提示される特異抗原を有する抗原提示細胞は一般的に、特異抗原に活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を可能にするのに十分な長さの時間、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で３７℃でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と共培養される。
【０２０４】
別の実施形態において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はインビボで活性化され、その後に本発明の方法において使用するために単離される。この場合、インビボで活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は末梢血リンパ球から単離される。一般的に、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は対象から単離される。
【０２０５】
理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、インビボで活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の場合、インビボでの抗原との接触後、常在ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化はその後に、インビボで、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在によって支持されると考えている。しかし、この活性化の後、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で抗原とのさらなる接触に対して応答性ではない。
【０２０６】
別の実施形態において、特異抗原に活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、
（ａ）活性化およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の混合物をインビトロで特異抗原と接触させ、
（ｂ）ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養すること
によって成長されうる。
【０２０７】
本実施形態において、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を可能にするが、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在は、特異抗原に活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を可能にする。
【０２０８】
一部の実施形態において、活性化およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の混合物はインビトロで特異抗原と接触され、かつＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、ＩＬ−１３、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、およびＩＬ−５、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の存在下で培養される。
【０２０９】
対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がナイーブであるか、インビボで特異抗原に活性化されているかは直ちに明らかにはならないと予想される。一般的に、Ｔ細胞はナイーブであると判定され、またはＴ細胞を特異抗原と接触させ、かつＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＴ細胞の増殖を判定することによってインビボで活性化されうる。かかる条件下で、ナイーブＴ細胞は増殖を受けないが、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は増殖を示す。
【０２１０】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が活性化されると、インビトロまたはインビボに関係なく、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は次いで上記と同様のやり方で抗原と接触される。すなわち、特異抗原に活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面でＴ細胞に抗原を提示することによって特異抗原と接触される。一般的に、抗原は抗原提示細胞の表面で主要組織適合性（ＭＨＣ）分子（一般的にクラスＩＩ）と関係があるＴ細胞に提示される。
【０２１１】
特異抗原の接触後、または接触と同時に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で培養される。上記の通り、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は短命であり、通常、３日間超生存し続けことはない。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養することによって、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原との接触後または接触中に増殖を受けることができる。培養するステップは、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカイン、および一般的に、特異抗原を有する抗原提示細胞を含有する培地中でＴ細胞を単純にインキュベートすることによって達成されうる。例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインの存在下で培養することによって、Ｔ細胞はＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインと接触される。
【０２１２】
本明細書で使用される「培養する」という語は、インビトロでの細胞の生きた状態での成長および維持を指す。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養するステップは、十分な炭素、窒素、酸素、および他の栄養、成長因子、緩衝液、補因子、およびＴ細胞の生存能力を少なくとも維持するために必要な他の物質を提供する培養培地でＴ細胞を単純にインキュベートすることによって達成されうる。例えば、Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および抗菌剤、成長因子、他のサイトカインなど他のサプリメントを添加したＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ中に培養されうる（例えば、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９３年）５５：３７４−３７９頁を参照）。適切な培地の例としては、例えば、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、血清の有無または削減された血清を含むＥＭＥＭ、さらに場合により抗生物質、脂質、トランスフェリン、インスリン、必要に応じてアミノ酸および補因子などの追加の栄養サプリメントを含むなど当業者に周知である培地製剤が挙げられる。
【０２１３】
一般に、培養されたＴ細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートされる。
【０２１４】
特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で培養される。一般的に、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインは、培養培地の一部として、または精製ポリペプチドとして、Ｔ細胞が培養される培地に外部から添加される単離ポリペプチドである。あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインは、Ｔ細胞と共培養される細胞における異種遺伝子発現の産物でありうる。
【０２１５】
上記の通り、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異抗原と接触させ、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下でＴ細胞を培養することは、結果として、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０２１６】
別の実施形態において、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、細胞系統の混合集団の部分として、または混合集団の部分として特異抗原と接触され、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は上記の単離方法を使用して単離されうる。
【０２１７】
ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの存在下で培養すると同時に、かつ増殖後に、Ｔ細胞は次いで対象に投与されうる。
【０２１８】
Ｔ細胞は対象に投与され、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を増大させる。Ｔ細胞は一般的に非経口投与によって投与される。非経口投与の製剤としては、滅菌水性担体中の懸濁液が挙げられる。懸濁液用の水性担体としては、食塩水および緩衝培地を挙げることができる。非経口担体としては、リンパ球の活性および生存能力を維持することができる溶液が挙げられ、例えば、細胞培養培地、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、流体および栄養補給液を含む乳酸加リンガー静脈内賦形剤、電解質補給液（リンガーデキストロースに基づく）などを挙げることができる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、成長因子、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在しうる。
【０２１９】
Ｔ細胞は、注射によって、または独立してまたは一緒に長期にわたって漸進的注入によって非経口投与される。投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、腔内、間接内、または経皮的に投与されうる。一般的に、投与は静脈内である。
【０２２０】
投与は免疫活性の部位への局部投与または局所投与でありうる。
【０２２１】
一般的に、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が投与され、約１：２０、対象におけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の比を得る。一般的には１：１０。
【０２２２】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において、抗原に対する免疫応答に起因する疾患を治療または予防するための方法を提供する。例えば、疾患は、自己免疫疾患、または同種移植片または異種移植片拒絶に起因する宿主対移植片疾患、またはアレルギー反応でありうる。
【０２２３】
１つの実施形態において、疾患は自己免疫疾患である。本明細書で使用される「自己免疫疾患」は、自己抗原に対する免疫応答に起因する疾患を指す。自己免疫疾患としては、これら具体的な種類の自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、１型インスリン依存糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、急性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、特発性肺線維症／肺胞炎、喘息、ブドウ膜炎、虹彩炎、視神経炎、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬、乾癬関節炎、多発性硬化症、進行性全身硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性疾患、自己免疫溶血貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス疾患、習慣的自然流産、レイノー症候群、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、セリアック病、ＡＩＤＳの自己免疫的合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、アジソン病、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎および結膜炎、喘息、慢性脱髄性神経障害、膜性腎症、巣状硬化性糸球体腎炎および最小変化腎症を含む糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、関節リウマチ、若年性関節炎である。
【０２２４】
理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、自己免疫疾患は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との比の不均衡の結果でありうると考えている。本発明は、インビトロで免疫耐性を誘発することができるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養し、その後にこれらの細胞を対象に導入し、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との比を増大させることによって、これらの細胞間の比が操作されることを可能にする。
【０２２５】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との比は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの有効量を対象に投与することによってさらに増大されうる。
【０２２６】
別の実施形態において、疾患は同種移植片拒絶に起因する宿主対移植片疾患である。「同種移植片拒絶」という語は、当業者によって、対象における移植片または移植組織の抗原に対する免疫応答を指すが、ここで移植片または組織は対象と同じ種の異なるメンバーから得られることが当業者によって理解されるであろう。
【０２２７】
同種移植片拒絶はすべての種類の同種移植片の拒絶を含み、例えば、角膜、心臓、弁、肺、腎、肝、膵、膵島、脳、骨、腸、皮膚、骨髄、幹細胞、造血細胞、または他の細胞の同種移植片を挙げることができる。
【０２２８】
さらに別の実施形態において、疾患は、骨髄移植または他の移植、または小腸移植片などリンパ造血細胞に起因する移植片対宿主疾患である。
【０２２９】
さらに別の実施形態において、疾患は異種移植片に対する宿主対移植片応答である。「異種移植片拒絶」という語は、当業者によって、対象における移植片または組織移植片の抗原に対する免疫応答を指すが、ここで組織は対象に由来する異なる種のメンバーから得られることが理解されるであろう。
【０２３０】
異種移植片拒絶はすべての種類の異種移植片の拒絶を含み、例えば、角膜、心臓、肺、腎、肝、膵、膵島、脳、骨、腸、皮膚、弁、骨髄、幹細胞、造血細胞、または、例えば、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ、カンガルー、またはウマに由来する他の細胞の異種移植片を挙げることができる。
【０２３１】
別の実施形態において、疾患はアレルギーである。「アレルギー」という語は、当業者によって、Ｔ細胞応答、一般的に、アレルゲンとの接触後のＴｈ２応答と関係があるＩ型過敏性を指すと理解されるであろう。アレルギーはアレルゲンに対するアレルギーでありうるが、例えば、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、花粉症、アレルギー性結膜炎、接触皮膚炎、食物アレルギー、薬物または他の化学アレルギー、真菌アレルギー、もしくは他のアレルゲンまたはその一部に対する上記のアレルギーが挙げられる。
【０２３２】
一般に、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの語は、本明細書では、所望の薬理的および／または生理的を得るための対象、組織、または細胞に作用することを意味するために使用される。効果は、完全にまたは部分的において予防的であり、かつ／または疾患の部分的または完全な治癒において疾患または疾患の徴候または症状の予防において治療的でありうる。
【０２３３】
疾患は、上記の方法に従ってインビトロで成長されている活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および薬剤として許容される担体を含んでなる組成物の治療的に有効量を対象に投与することによって治療されうる。組成物は、上記の方法に従ってインビトロで成長されている活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなり、従来の非毒性の薬剤として許容される担体、アジュバント、および賦形剤を含有する製剤で非経口投与されうる。
【０２３４】
本明細書で使用される「治療有効量」という語は、所望の治療応答を得るために有効な量を意味する。例えば、上記のものなど自己免疫疾患を予防または治療するために十分な量。
【０２３５】
特定の治療有効量は、明らかに、治療される特定の状態、対象の健康状態、治療される哺乳類の種類、治療期間、併用療法（もしあれば）の性質、および使用される特定の製剤、対象の免疫系の相対構成細胞集団としてのかかる因子によって変動する。
【０２３６】
本明細書で使用される「薬剤として許容される担体」は、薬剤として許容される懸濁化剤、培地、または対象に治療組成物を送達するための賦形剤である。薬剤として許容される担体としては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）：マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１４０５−１４１２頁、１４６１−１４８７頁（１９７５年）、およびＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ．、第１４版、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：米国薬剤協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（１９７５年）に記載されているように、塩、保存剤、緩衝剤などを含む水溶液、非毒性賦形剤が挙げられる。医薬組成物のさまざまな成分のｐＨおよび正確な濃度は、当業界のルーチンに従って細胞の生存能力および活性を維持するために調節される。グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）とギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）のＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第７版）を参照。
【０２３７】
サイトカインまたは抗体を含んでなる組成物を、インビボ適用のために、注射によって、または独立してまたは一緒に長期にわたって漸進的注入によって非経口投与することができる。投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、腔内、間接内、経皮的、または皮下的に行われうる。一般的に、サイトカインおよび抗体は皮下投与される。
【０２３８】
組成物は、好ましくは、用量単位で調製および投与される。対象の治療のために、化合物の活性、投与様式、疾患の性質および重篤度、対象の年齢および体重によって、異なる日用量を使用することができる。しかし、環境条件次第で、高い日用量または低い日用量が適切でありうる。日用量の投与は、個々の用量単位または小さな用量単位の形で１回投与によって、および特定の間隔で分割用量の複数回投与によって行われうる。
【０２３９】
本発明による組成物は、治療有効量で、免疫活性の部位に全身投与、局部または局所投与されうる。この使用に有効な量は、もちろん、副作用の重篤度、および対象の体重や健康状態によって決まる。一般的に、インビドロで使用される用量は、組成物の投与に有用な量における有用な指針を提供し、動物モデルは細胞毒性副作用の治療のための有効量を判定するために使用されうる。さまざまな考察が、例えば、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７頁（１９９０年）に記載されている。
【０２４０】
組成物は滅菌注射用懸濁液の形でありうる。この懸濁液は、上述されている細胞懸濁液を懸濁および投与するために適切な薬剤を使用する既知の方法に従って形成されうる。細胞を懸濁するために使用されうる許容される賦形剤および溶剤には細胞培養培地、リンガーデキストロース、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。
【０２４１】
本発明の組成物の用量レベルは、体重１キログラム当りほぼ約５×１０６〜約５×１０９細胞程度であり、一般的な用量範囲は１日体重１キログラム当り約５×１０６〜約５×１０８細胞（１日患者当り約３×１０８細胞〜約３×１０１１）である。担体材料と組合せて１回量を形成しうる細胞の量は治療される宿主および特定の投与様式によって変動する。例えば、ヒトへの投与を対象にする製剤には約５×１０８〜５×１０１０細胞および適切かつ都合のよい量の担体材料が含まれ、これは総組成物の約５から９５パーセントで変動しうる。投与単位形は一般に約５×１０８〜１０９細胞を含有する。
【０２４２】
本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の投与がＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の活性を抑制し、結果として同種抗原に対する全身の免疫抑制をもたらすと考えている。本発明者らは、特異抗原に対する耐性が、特異抗原に対して同様の削減された免疫応答を提供するために投与されることが必要となるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の量よりも有意に少ない特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用することにより増大しうると考えている。
【０２４３】
しかし、特定の患者の特異的用量レベルは、細胞の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、薬物の組合せ、および療法を受ける特定の疾患の重篤度を含むさまざまな因子によって決まることが理解されるであろう。
【０２４４】
特異抗原に対する耐性が望ましくない環境もある。例えば、腫瘍細胞、または慢性感染症における感染性病原体に対する耐性は望ましくない。本発明では、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択されるサイトカインの存在に対する特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の要件が耐性を削減または遮断するために有効に使用されうることが予想される。
【０２４５】
したがって、別の態様において、本発明は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γからなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインの活性を削減または除去することによって対象における特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させるステップを含んでなる特異抗原に対する耐性を削減する方法を提供する。ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γの活性は、対象におけるこれらのサイトカインの活性を削減するために当業界で周知の方法によって削減されうる。一般的に、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γの活性は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γの拮抗薬の有効量を投与することによって削減されうる。拮抗薬の例としては、抗体、可溶性受容体またはその一部分、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子等が挙げられる。例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γの活性は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γに対する抗体を投与することによって削減されうる。
【０２４６】
耐性は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の有効量を投与することによってさらに削減されうる。理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の投与が、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を活性化し、それによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの要件にこれらのＴ細胞をコミットさせると考えている。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γ、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子の非存在下で、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は死滅し、さらに特異抗原に対する耐性を削減することが予想される。
【０２４７】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／または、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および／またはＩＦＮ−γの抗体などの拮抗薬の１つもしくは複数を含んでなる組成物は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでなる組成物に関連して、上記の通り調製および投与されうる。
【０２４８】
本発明の方法とともに使用するためにキットも意図されている。本明細書で使用される「キット」という語は、本発明の方法においていっしょに使用されうる一群の要素を指す。例えば、このキットを使用し、対象における耐性を誘発することができる対象、または言い換えれば、診断キットにおけるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在を検出し、または本発明に従って抗原に対する耐性を誘発するための細胞を調製し、または抗体および／またはサイトカインを対象に投与することができる。キットは、例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカイン、単離タンパク質、または、例えば、リンパ球の培養のために適切な培地などの培地を含みうる。キットはさらに、ＩＬ−２およびＩＬ−４からなる群から選択される１つもしくは複数のサイトカインを含んでなりうる。キットはさらに、抗原または抗原提示細胞を含んでなりうる。キットはさらに、キットの要素を使用する本発明の方法を適用するための説明書を含んでなりうる。
【０２４９】
キットはさらに、例えば、さまざまなアレルゲンに対する耐性の試験のための多数の抗原など、１つもしくは複数の特異抗原を含んでなりうる。キットの抗原は、本明細書に記載されている通り抗原提示細胞の表面に存在しうる。
【０２５０】
別の形態では、キットは次の１つもしくは複数に対する抗体を含みうる。すなわち、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３またはＩＦＮ−γ、またはその生物学的に活性な断片。
【０２５１】
キットはさらに、ＩＬ−２、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子、および／またはＩＬ−４、その生物学的に活性な断片、またはその機能的に同等の分子を含んでなりうる。
【０２５２】
本発明はここでさらに次の非限定的実施例についてのみ参照することによって説明される。しかし、次の実施例は例示されているだけであると理解すべきであり、上記の本発明の一般性に対する制限として決して理解すべきではない。具体的には、本発明は自己免疫疾患、組織拒絶、およびアレルギー反応に関連して詳しく記載されているが、本明細書の所見が自己免疫疾患、組織拒絶、およびアレルギー反応の治療に限定されていないことは明らかに理解されるであろう。
【実施例】
【０２５３】
実施例１
これらの試験では、混合リンパ球培養（ＭＬＣ）における、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞サブセット、またはこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの組合せに対する、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を比較した。細胞は、ナイーブＤＡラットまたは完全に同種のＰＶＧ異所性心臓移植片に対して耐性であるまたはＤＡラットのいずれかのリンパ節および脾臓から調製した。耐性としては、免疫抑制の維持の非存在下での、７５日後の移植片の非拒絶として定義した。自己（ＤＡ）、および完全にＭＨＣ不適合な特異的ドナー（ＰＶＧ）および完全にＭＨＣ不適合な第三者（ルイス）に対する応答を比較した。ＤＡ、ＰＶＧ、ルイスはＭＨＣ抗原を共有せず、完全に互いに対して同種である。この耐性の性質は、以前に記載されており、シクロスポリン、および抗ＣＤ４または抗ＣＤ３モノクローナル抗体療法を含む移植後最初の２週間における様々な療法によって、ＰＶＧ異所性心臓同種移植片でＤＡラットにおいて耐性の性質が誘発されうる（Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９０年、１７１：１４１、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９３年、５５：４５９頁、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９７年、６４：１５５９頁）。特異的ドナー刺激に対する非分画末梢リンパ球のＭＬＣ増殖性応答は、一般に第三者のものと同等である（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９３年、５５、３８０−３８５頁）。
【０２５４】
材料と方法
動物および方法。ＤＡ  ラット（ＲＴ１ａ）、ＰＶＧラット（ＲＴ１ｃ）、ルイスラット（ＲＴ１ｌ）、およびスプラーグードーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、以前に記載されている通り繁殖させて維持した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年、１６１；５１４６頁）。
【０２５５】
異所性心臓移植片、放射線照射、およびリンパ節や脾臓細胞の調製を含む手術法は以前に記載されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９７８年、１４８；８７８頁）。異所性心臓移植片の生存を、拒絶と関係がある収縮および腫脹の喪失についての触診によって毎日モニタリングした。心電図活性の全喪失が認められる場合と同等の収縮の全喪失として拒絶を定義した。耐性になることになっている一部の移植片は、一時的に腫脹を有し、収縮性が低下したが、回復した。このことは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を媒介する特異的耐性を誘発するために必要とされうる急性炎症性応答と一致する。
【０２５６】
末梢リンパ球様細胞の調製
脾臓およびリンパ節細胞（ＬＮＣ）に由来する単一細胞懸濁液を、記載されている通り（３４）調製し、ＲＢＣを、０．８３％ＮＨ４Ｃｌ、０．１％ＫＨＣＯ３、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ７．２）によって溶解した。細胞をＰＢＳ／２％ＢＳＡ（ＭｕｌｔｉＧｅｌ、バイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、オーストラリア）中に再懸濁した。
【０２５７】
サブセットをｍＡｂおよび間接免疫蛍光染色、およびＦＡＣＳｃａｎでの分析によって、記載されている通り（３５）識別した。使用されるモノクローナル抗体は、Ｒ７．２（ＴＣＲ−α、β）、Ｇ４．１８（ＣＤ３）、Ｗ３／２５（ＣＤ４）、ＭＲＣＯｘ８（ＣＤ８）、ＭＲＣＯｘ３９（ＣＤ２５、ＩＬ−２Ｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ）、Ｌ３１６（ＣＤ１２２  ＩＬ−２Ｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ）、（ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）／ベクトン・ディッケンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（カリフォルニア州））であった。
【０２５８】
Ｔ細胞のサブセットを、（９）に記載されているＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞を枯渇させる間接パニング法と、メーカー（ミルテニイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇａｄｅｎｂａｃｈ、ドイツ）によって記載されている磁気ビーズ分離法およびＭＡＣＳカラムの組合せによって増加させた。
【０２５９】
手短に言えば、最適な濃度のＭＲＣＯｘ８（抗ＣＤ８モノクローナル抗体）およびＭＲＣ  Ｏｘ３３（Ｂ細胞、および他の白血球に結合するが、Ｔ細胞には結合しない抗ＣＤ４５ＲＡモノクローナル）により、細胞を４℃でインキュベートし、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで３回洗浄し、次いで２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。これらの細胞を３０分間、４℃で、ウサギ抗ラットＩｇおよび抗マウスＩｇ（ＤＡＫＯ  Ａ／ｓ．Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）でコーティングしたペトリ皿（グライナー・ラボアテヒニック（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）においてインキュベートした。この上清をＰＢＳ  ８５μｌ中で濃縮し、４℃で１５分間、１０６細胞当りヤギ抗マウスＩｇマイクロビーズ（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）１３μｌでインキュベートした。洗浄後、細胞をＣＳ  ＭＡＣＳカラム（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で溶出し、ＣＤ４＋Ｔ細胞について９７−９９％の濃縮を得た。次いで、濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞を４℃で２０分間、ＰＥコンジュゲートＭＲＣＯｘ３９（抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）でインキュベートし、次いで２回洗浄してから、マウス抗ＰＥ  ｍＡｂマイクロビーズ（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）８μｌ／１０６細胞で１５分間、４℃でのインキュベーションした。次いで、ＬＳ  ＭＡＣＳカラム（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を通じて細胞を溶出し、ＭＬＣにおける使用のための２０％ルイスラット血清を有する培地、またはラットへの注射用のＰＢＳ／２％ＢＳＡのいずれかに再懸濁した。細胞は９６−９９％ＣＤ４＋であり、枯渇させた集団は１％未満のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋高Ｔ細胞を有した。濃縮した集団は８５−９５％ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋高Ｔ細胞であった。当業者にとっては、分離方法によりＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の集団が優先的に濃縮されるので、濃縮ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋高Ｔ細胞を指すことは周知である。
【０２６０】
一部の実験では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、非分画リンパ球様細胞を４℃で２０分間、ＰＥコンジュゲートＭＲＣＯｘ３９によるインキュベーションし、次いで２回洗浄した後に、１５分間、４℃でマウス抗−ＰＥｍＡｂマイクロビーズ（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によるインキュベーションによって直接濃縮した。次いで、ＬＳ  ＭＡＣＳカラム（ミルテニィ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を通じて細胞を溶出し、ＭＬＣにおける使用のための２０％ルイスラット血清を有する培地、またはラットへの注射用のＰＢＳ／２％ＢＳＡのいずれかに再懸濁した。
【０２６１】
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）
刺激細胞は、２４時間前に８．５グレイ全身照射が与えられたラットの胸腺由来であった。この刺激細胞の集団は成熟リンパ球が枯渇し、抗原提示細胞が増大している。増大した抗原提示細胞は、好ましい。なぜならば、機能的リンパ球様細胞が刺激され、かつ応答細胞を活性化するサイトカインを産生し、またはバックグラウンド刺激をもたらしうるからである。全身照射ドナーに由来する刺激細胞は、２４時間以内にインビボで破壊された末梢および胸腺リンパ球様細胞を有する。樹状細胞を増大するために使用されうる代わりの方法が、モノクローナル抗体選択および磁気ビーズ分離を用いたものである。刺激細胞を照射し、一夜放置して末梢リンパ球を照射の効果で死滅させ、抗原提示細胞が増大した集団を残すこともできる。１０４のこれらの刺激細胞が、インビトロで照射した２×１０５の脾臓細胞と同様に有効であった。刺激細胞に対する応答細胞の通常の比は、末梢リンパ球様細胞を刺激因子として使用する場合に１：１〜２：１であるが、ＴおよびＢリンパ球の枯渇によって抗原提示細胞の増大が認められる場合、刺激細胞に対する応答は１０−１００：１でありうる。
【０２６２】
Ｕ底マイクロタイタープレート（リンブロ（Ｌｉｎｂｒｏ）、Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｓ、バージニア州（ＶＡ）におけるマイクロ培養は、２００μｌの全容積のウェル当り、２×１０４の刺激細胞、および、２×１０５または１×１０５の応答細胞で行った。通常、各々の実験試料のために、４−６個の複製ウェルを用いた。使用される細胞培養培地は、１００ｎｇ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（グラクソ（Ｇｌａｘｏ）、Ｂｏｒｏｎｉａ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、および２０％ルイスラット血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０（ジブコ（ＧＩＢＣＯ）、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州（ＮＹ）であった。２０％ルイスラット血清は低いバックグラウンド刺激をもたらした。自己または同じ種の血清は、結果としてきわめて低いバックグラウンド刺激をもたらした。この低いバックグラウンドは、培地において使用されていないウシ胎仔血清など産物中の異種タンパク質に対する応答の除去によるものである。
【０２６３】
他の実験では、Ｔ細胞サブセットの連続希釈物を、２×１０５の刺激細胞とともに培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの異なる比の混合物も、限外希釈アッセイにおいて２×１０４の刺激細胞とともに培養した。
【０２６４】
５％ＣＯ２を含有する加湿空気中３７℃で細胞を培養し、さまざな時点、通常、３、４、５、および６日目の時点で、培養物をＴｉｔｒｅｔｅｋ細胞回収機（フロー・ラブ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ）、Ａｙｒｓｈｉｒｅ、スコットランド）で回収する１６時間前に、０．５μＣｉ  ３Ｈ−ＴｄＲ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、イリノイ州（ＩＬ））でパルスした。ベータカウンタ（１４５０マイクロベータプラス、ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））で計算する前に液体シンチレーション液を添加することによって増殖を分析した。他のウェルを２４時間および４８時間で回収し、サイトカインｍＲＮＡ誘導のＲＴ−ＰＣＲ分析のためにｍＲＮＡを抽出した。
【０２６５】
結果
図１Ａ
ナイーブ非分画リンパ球の増殖の測定、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の濃縮集団の測定の結果は、図１Ａに示されている。図１Ａからわかるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞の４および５日目の応答は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇後に得られた細胞（濃縮ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞で示される）よりも小さい。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれかによるよりもはるかに小さい。この動態試験は、４および５日目の増殖が、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖性応答を明らかに示すために最も有用であることを明らかに示す。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、早期に３および４日目にピークに達し、５または６日目には減少するのに対して、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、４日目までは現れることはなく、減少前の５および６日目にピークを示す。
【０２６６】
図１Ｂ
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の自己刺激株、および２つの同種刺激株に対する増殖の比較の結果が図１Ｂに示されている。図１Ｂからわかるように、同系ＤＡ刺激因子に対する４日目の増殖性応答はすべての場合に低い。ＰＶＧおよびルイスに対する応答は、各々の細胞のサブタイプにおいて同様である。上記の通り、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答は他の集団よりも小さく、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも大きな応答を有する。
【０２６７】
図１Ｃ
図１Ｃは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の連続希釈の結果を示す。図１Ｃからわかるように、すべての希釈でＣＤ４＋、ＣＤ２５−による応答におけるＴ細胞は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の同等の数のものよりも大きい。非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞は、およそ５％のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と９５％のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の混合集団である。したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の大きな増殖は単純に濃縮の効果による（すなわち、５％のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の喪失による）ものではない。このことは、マイナーな集団であるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、主要な集団であるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を阻害する効果を有するということと一致するものである。
【０２６８】
図１Ｄ
分離したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、分離したナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と混合する効果を試験し、その結果は図１Ｄに示されている。図１Ｄからわかるように、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、活性な抑制効果をＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対して有した。これらの実験において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との１：１０の混合は、結果として、ＣＤ４＋Ｔ細胞における混合集団（比は１：１０−１：２０）と同様の増殖性応答をもたらした。比を１：１に増大させことにより、結果として、増殖性応答のほぼ完全な抑制をもたらした。このことは、インビトロでの免疫応答に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の明らかな非特異的阻害効果と一致する。
【０２６９】
図１Ｅ
これは耐性動物に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞の４および５日目の応答は、第三者ルイスに対してのように耐性株（ＰＶＧ）と同様である。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇後においては（濃縮ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と示される）、耐性株に対する増殖性応答は第三者に対してよりも小さい。
【０２７０】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答は、非分画ＣＤ４＋またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれかよりもはるかに小さい。
【０２７１】
これらのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、それらの応答が自己（ＤＡ）に対する応答と同様であるという点で特異的ドナーに対して応答することがない。耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は第三者に対するその応答を保持し、これは特異的ドナーまたは自己のいずれかに対してよりも大きい。
【０２７２】
自己（ＤＡ）に対する応答はすべての培養において完全に同種の刺激因子、ＰＶＧ、またはルイスに対する応答よりも小さい。ＭＨＣ無関係株であるＰＶＧおよびルイスに対する応答は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞について同様であるが、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞についてルイスに対してよりもＰＶＧに対して小さい。
【０２７３】
これらの結果は、耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が標準の培養条件で死滅することを示唆している。したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の混合集団においてＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を阻害することがなく、よって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の除去は、濃縮されたＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答の増強をもたらすことはない。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞だけではドナー同種抗原に応答することはなく、これもまた、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が生存せず、成長のためのサイトカインへの依存の可能性と一致する。
【０２７４】
図１Ｆ
これは、ＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の連続希釈を示す。すべての希釈でＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞による特異的ドナー（ＰＶＧ）に対する応答は、第三者（ルイス）に対する応答よりも小さく、かつ自己（ＤＡ）に対する応答と同じくらいの大きさである。対照的に、非分画末梢リンパ球またはＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合、特異的ドナー（ＰＶＧ）に対する応答は、第三者（ルイス）と同様であり、かつ自己（ＤＡ）と同じくらいの大きさである。すべての希釈で第三者（ルイス）または自己（ＤＡ）に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、同等数の非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもはるかに大きい。
【０２７５】
この試験は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＰＶＧに対する応答が、ルイスと比べて減少し、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞で確認されるもの（非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞で確認されたものを上回るＰＶＧおよびルイスに対する同様の増加が認められた）とは異なることを明らかに示す。さらに、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のＰＶＧに対する応答はつねに自己に対するよりも大きい。
【０２７６】
この試験により、耐性動物に由来する非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答の原因は、ＰＶＧに対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答の減少が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって阻害されないことであることを示唆する。対照的に、ＰＶＧに対して耐性の動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、第三者ルイスに対する応答を阻害する能力を保持し、その除去により、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ルイスに対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答の増強をもたらした。
【０２７７】
これらの試験は、ナイーブと比べて、耐性動物においてはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞における違いがあることを明らかに示した。このことは、耐性宿主に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、重大な成長因子が存在しない培養において死滅し、それによって、このアッセイにおいて抑制できないことと一致する。あるいは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の活性化は結果として、耐性を維持する特異的ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の機能を促進するのではなく破壊するサイトカイン環境の変化をもたらす。すなわち、早期Ｔ細胞活性化サイトカインの新しい活性化および放出は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を媒介する特異的耐性を破壊する。
【０２７８】
結論
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖性応答については、以下の特徴を有する：
ａ）ＭＨＣ不適合同種抗原に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖性応答は、バックグラウンドを除去する明確な培養条件で再現的に分析されうる。
ｂ）ナイーブ動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖性応答は、ＭＨＣ不適合刺激因子のみで、自己に対しては応答しない。
ｃ）ナイーブ動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制する。
ｄ）耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖性応答は、第三者に対してのみで特異的ドナーまたは自己に対しては応答しない。
ｅ）耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、特異的ドナーに対する耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答を阻害することはできないが、第三者に対する応答を阻害することができる。
ｆ）ナイーブ動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、非同種抗原特異的抑制効果を有する。この効果は、ＣＤ４＋、ＣＤ２４＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を延長させ、または増殖を支持することができるサイトカインの非存在下では、応答抑制の能力を第三者同種抗原には保持するが特異的ドナー同種抗原には保持しない耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と異なるものである。
【０２７９】
実施例２
次の実験では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＭＬＣにおける増殖性応答に対するさまざまなサイトカインの効果を試験し、および個々のサイトカインに対するナイーブおよび耐性濃縮ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を比較した。
【０２８０】
材料と方法
サイトカインを記載されている通り生成したが、これはＩＬ−２（３２、３３）を含み、１単位をＩＬ−２依存ＣＴＬＬ系の最大増殖の５０％を誘発するために必要とされる単位として定義した。クローン製造およびこれらのサイトカインの分析は記載されており、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクションのための標準方法が使用され（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．（１９９９年）３１、１５７４−５頁、１９９９年、および３１、１５７２ページ、１９９９年）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３が含まれた。ヒトＴＧＦ−βをシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。サイトカインを各々の該当するウェルに５０μｌアリコートのＣＨＯ−Ｋトランスフェクト細胞系上清として添加した。これらの上清はｍｌ当り５０００−５０，０００単位を有する。したがって、関連サイトカインは最終濃度がｍｌ当り１０００−１２，０００単位であった。対照は培地に添加された非トランスフェクトＣＨＯ−ｋ１細胞系からの上清とした。
【０２８１】
逆転写―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および半定量ＰＣＲは記載されている（３１、３５）。すべての試料を、吸光度およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＰＣＲによるｃＤＮＡの定量によって標準化した。サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのプライマーおよび最適なサイクル条件は記載されている（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９８年、１１４５−１１４２頁）。ＩＦＮ−γ受容体およびＩＬ−５受容体アルファ鎖のプライマーをデザインし、確認した。反応および増幅条件をＰＣＲ機器（コルベット・リサーチ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｓｙｄｎｅｙ、ＮＳＷ、オーストラリア）を使用して各々のプライマーセットについて最適化した。次いで、ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで染色した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の特異性をサザントランスファーおよびジデオキシゲニン（ＤＩＧ）３’末端標識オリゴヌクレオチドプローブプローブによるハイブリダイゼーションによって検証した。ハイブリダイズプローブをＤＩＧ発光検出キット（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して検出した。使用した半定量法のＲＴ−ＰＣＲの方法は以前に記載された（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９７年、６４、１５５９−１５６７頁）。開始ｃＤＮＡ試料を未希釈、１０、１００、および１０００倍希釈で分析し、各々の産物の最適な範囲でのサイクルで反応を終了させた。大部分の試料について、二重サンプルを用いて各々の希釈で分析した。ｍＲＮＡのレベルをＰＣＲ産物が検出された最低の希釈を使用して比較した。ｃＤＮＡを有さない陰性対照、およびＣｏｎＡ刺激ラットリンパ球に由来するｃＤＮＡ陽性対照をすべての実験に含めた。
【０２８２】
結果
濃縮ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を自己（ＤＡ）、特異的ドナー（ＰＶＧ）、および第三者（ルイス）刺激因子に対してＭＬＣにおいて培養した。培養物を上記の通り３−４日で増殖について分析した。
【０２８３】
図２Ａ
図２Ａは、示されているサイトカインの存在下でＤＡ抗原またはＰＶＧ抗原のいずれかに対するナイーブＤＡ細胞の応答を示す。図２Ａからわかるように、ＩＬ−２およびＩＬ−４のみが結果としてナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖の増強をもたらした。これらのサイトカインは、自己、および両方の同種刺激因子に対する増殖を同様の程度に増強した。これは、ＩＬ−２、またはＩＬ−４のいずれかによるポリクローナル活性化と一致する。ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γの添加はナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を増強することはなかった。自己に対するバックグラウンド応答が約１００ｃｐｍであり、蒸留水で得られたカウントと同等であることに注意されたい。すなわち、使用された方法により、（図１に記載されているように）、培地、または刺激細胞のような背景因子に対する非特異的増殖は認められなかった。バックグラウンドカウントは分析した蒸留水と同等である。
【０２８４】
図２Ｂ
図２Ｂは、ＴＧＦ−β（Ｄ）、ＩＦＮ−γ（Ｅ）、ＩＬ−１２ｐ７０（Ｆ）、ＩＬ−５（Ｇ）、またはＩＬ−１０（Ｈ）の存在下で自己抗原（黒色）またはドナー抗原（灰色）に対する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の３日目での増殖を示すグラフである。図２Ｂは、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答がいくつかの態様においてナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答と異なることを示す。最初に、図１Ｅに記載されている通り、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異的サイトカインの非存在下で特異的ドナーに対して増殖することはなく、それによってナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と異なる。活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と同様に第三者ルイスに対して増殖する。活性化およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は自己（ＤＡ）に対して増殖することはない。
【０２８５】
ＩＬ−２またはＩＬ−４の培養への添加は結果として、自己（ＤＡ）、特異的ドナー（ＰＶＧ）、および第三者（ルイス）に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖性応答の顕著な増強が認められたという点で、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞で確認されたもの（データは示さず）と同様のポリクローナル活性化をもたらした。
【０２８６】
他のサイトカインに対する応答では一部のサイトカインの特異的ドナーＰＶＧに対する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の異なるパターンが確認されたが、その他では確認されなかった。自己（ＤＡ）および第三者ルイス刺激因子に対する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答は、すべてのサイトカインのナイーブ細胞の応答と同様であった。
【０２８７】
したがって、これらの実験により、ＰＶＧ（ドナーまたは特異抗原）に対する異なる応答が明らかに示され、これはＩＦＮ−γおよびＩＬ−５で最も顕著であった。ＩＬ−１２（ｐ７０）およびＴＧＦ−βも効果を示した。対照培養および増殖を誘発することがなかったサイトカインによる培養は、バックグラウンドで約１００ｃｐｍの応答を有した。
【０２８８】
これらの実験は、特異抗原に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、成長または生存するためにＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γのいずれかを必要とすることを明らかに示した。
【０２８９】
結論
サイトカインは、ナイーブおよび耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する異なる効果を有する。すなわち、
ａ）ＩＬ−２およびＩＬ−４は、自己、特異的ドナー、および第三者に対する、ナイーブまたは耐性細胞ドナーに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を顕著に増強する。
ｂ）ＩＬ−５およびＩＦＮ−γは、特異的ドナーに対してのみ耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を増強し、自己または第三者に対しては増強しない。それらは自己または同種抗原に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対する効果を有さない。
【０２９０】
実施例３
これらの試験では、耐性を宿主に移動させるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の能力を試験した。
【０２９１】
材料と方法
adoptive transferアッセイ
これらを記載されている通り行った（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９７８年、１４８；８７８−８８９頁およびＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９３年、５５；３７４−３７９頁）。手短に言えば、６０Ｃｏ源から７．５−８．５グレイでＤＡラットを照射し、次いで、やはり照射されていたＰＶＧドナーに由来する異所性成体心臓を移植した（図３Ａ）。この照射源は、記載されている通り（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９７８年、１４８；８７８−８８９頁）、１５−３０分にわたる処置を必要とした。その後の実験では、照射源は線型加速器であり、全身照射は２−３分で送達された。これらの照射宿主には異所性心臓移植片が与えられ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、非分画または濃縮されたＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞により照射の２４時間以内に回復させた。心臓移植片拒絶を最初に毎日の触診によって、疑いがある場合は、ＥＣＧモニタリングでモニタリングした。拒絶は、心電図活性の全喪失と同等であるすべての明白な収縮の喪失がある場合に記録される。
【０２９２】
結果
図３Ａおよび３Ｂは、照射宿主へのadoptive transferの拒絶反応をもたらすナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の能力を示す。
【０２９３】
図３Ｂで報告された試験では、半定量スケールを使用し、この半定量スケールにおいては、４＋のスコアは、正常な補助心臓移植片率で強い収縮を示した場合であり、３＋は、わずかな減速および／または収縮性の削減を示した場合であり、２＋は、明らかな減速および移植片の腫脹を示したが、拍動の明らかな触診を示した場合であり、１＋は、顕著な減速および不十分な触診可能な拍動を示した場合であり、これは通常、ＥＣＧの大幅に削減された振幅と関係があるものであり、０は、触診可能な収縮を示さず、検出可能なＥＣＧ活性がないのと同等である場合である。
【０２９４】
図３Ａ
図３Ａは、異なる用量のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞で回復させたadoptive照射ＤＡラットにおける拒絶時間の比較を示す。データはＢ．ホール（Ｈａｌｌ）教授のすべての実験室およびサイトからまとめられた。Ａ群、ｎ＝７、Ｂ群、ｎ＝１７、Ｃ群、ｎ＝８６、Ｄ群、ｎ＝６。宿主における細胞の均衡を変化させるために、ＤＡ宿主自体のリンパ球がほぼ致死性の全身照射（７００−８５０ｒａｄｓ）によって破壊されたadoptive transfer実験を行った。本モデルでは、異所性ＰＶＧ心臓移植片は全身照射宿主によっては拒絶されないが、非照射宿主では、最初に設定された拒絶時間である６−９日で生じる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮集団による照射宿主の回復により、拒絶反応が回復されるが、正常な最初の設定時間には回復しない。これらの細胞と用量依存性ではなく、５００万個のＣＤ４＋Ｔ細胞が２０００万または１億個のＣＤ４＋Ｔ細胞と同等に有効である。平均の拒絶時間は、これらの細胞で１２日未満である。
【０２９５】
【表１】
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【０２９６】
ＰＶＧ同種移植片を有するadoptiveＤＡ宿主における濃縮ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の効果を比較したが、その結果は表１に示されている。図３Ａにおけるように、非分画ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は最初の設定拒絶時間で拒絶が生じなかったが、平均１１日で拒絶が生じた。本モデルでは、照射源は図１におけるものと異なった。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は拒絶をもたらす能力がなく、拒絶した移植片はなかった。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞はほぼ最初の設定テンポに拒絶が生じた。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と１：１の比で混合することにより、拒絶の発生が阻止され、移植片は１００日にわたって有意な拒絶エピソードなしに機能するように思われた。数を増やすためにドナー抗原（ＰＶＧ）およびＩＬ−２で３日間の培養によって増大させたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制した。これは混合リンパ球培養の方法において記載された通りに行われたが、まとめて５０ｍｌ組織培養フラスコ中であった。これらの結果は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はドナー抗原で培養され、インビトロで増大し、抑制機能を維持し、拒絶をもたらす能力を獲得しないことを明らかに示す。
【０２９７】
図３Ｂ
照射したadoptive宿主における拒絶時間に対する回復接種におけるナイーブＣＤ２５−、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ２５＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を変化させることの効果を試験し、その結果のグラフが図３Ｂに示されている。
【０２９８】
図３Ｂは、Ａ、５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（黒三角）（ｎ＝９）、Ｂ、２０×Ｉ０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（黒丸）（ｎ＝４）、Ｃ、５×１０６ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−、Ｔ細胞（白三角）（ｎ＝４）、Ｄ、０．５×１０６ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（白四角）（ｎ＝９）：Ｅ、５×１０６ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞および５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（黒四角）（ｎ＝９）の投与後のラットにおける移植後５０日までの心臓移植片機能を示す。このスケールでは、２０００万個のＣＤ４＋Ｔ細胞を投与したラットは最も迅速に拒絶をもたらし、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を投与したラットが同様に迅速な拒絶を示した。５００万個のＣＤ４＋Ｔ細胞のみ投与したラットは、ＣＤ２５−、ＣＤ４＋Ｔ細胞で回復したラットほど迅速でなく拒絶した。５０万個のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を５００万個のＣＤ４＋Ｔ細胞と混合することにより、さらに拒絶過程が減速し、移植片が完全には拒絶されなかったが、不十分な機能を長期間示した。これらの動物では、ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ２５−、ＣＤ４＋Ｔ細胞の比が１：５−１０であったのに対し、非分画細胞を投与した動物では１：２０−４０であった。
【０２９９】
５００万個のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を５００万個のＣＤ４＋Ｔ細胞と混合することにより、拒絶が完全に抑制され、移植片が、いつまでもきわめて十分な機能で生存した。
【０３００】
これらの試験は、ほぼ１：１の比で存在する場合には、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を抑制することを明らかに示す。
【０３０１】
さらに、これは、ＩＬ−２での培養によるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増大が、宿主のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が枯渇され、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の機能が損なわれている場合には、かかる比を達成するために十分な自己抑制Ｔ細胞の産生を可能にすることを示す。ドナー抗原でのナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養は、これらの細胞を、拒絶をもたらしうる細胞に変換することはない。したがって、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養は、抑制ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を拡大しうる。ＩＬ−４でのインビトロでの非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の処置は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の耐性効果を増強することはなく、濃縮ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が使用される必要があることを示す（データは示さず）。
【０３０２】
結論
インビボでＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との均衡を変化させることにより、耐性をもたらすことができ、照射宿主における拒絶を回復するために使用されるナイーブ細胞による実験によって、以下が明らかにされる。
ａ）ナイーブ非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞は用量応答効果を示すことはなく、９０％を超えるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する１−１０％のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の恒常性の均衡があることが示唆される。
ｂ）１−１０％のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の除去により、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が迅速な拒絶をもたらすことが可能となり、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるその自然な混合集団におけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が拒絶を抑えることが確認される。
ｃ）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞単独では拒絶をもたらすことがなく、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞との比が増大すると拒絶を阻害しうるが、その比が１：１の場合にほぼ完全な拒絶の抑制を示す。
ｄ）特異的ドナー抗原およびＩＬ−２を用いてＭＬＣにおいて増大させたナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、１：１の比で抑制する能力を保持し、拒絶をもたらす細胞に戻ることはない。
【０３０３】
実施例４
本試験では、ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下での抗原との接触後のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を試験した。
【０３０４】
図４Ａ
図４Ａは、刺激細胞なし、すなわち抗原なしの場合（第１の列）、自己刺激細胞、すなわちＤＡラットに由来する抗原を提示する抗原提示細胞を用いた場合（中央の列）、または同種ＰＶＧ刺激細胞、すなわちＰＶＧラットに由来する抗原を提示する抗原提示細胞を用い場合の、ＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養の結果を示す。
【０３０５】
図４Ａの上部パネルは、ＩＬ−２の存在下でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を抗原と接触させる効果を示す。図２からわかるように、ＩＬ−２の存在下のＰＶＧ抗原との接触は、結果として、すべてのアッセイにおいて増殖の増大をもたらしたが、４日目よりも５日目で大きな効果を示した。自己および同種刺激細胞に対する増殖は同様であり、非刺激因子に対する増殖ははるかに小さかった。
【０３０６】
図４Ａの下部パネルは、ＩＬ−４の存在下でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を抗原と接触させる効果を示す。同種に対する応答は、自己または刺激因子を有さないものよりも大きかった。このことは、ＩＬ−４の存在下でＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養する効果は、細胞が自己抗原ではなく特異抗原と接触されると大きくなることを示す。
【０３０７】
図４Ｂ
図４Ｂは、同種ＰＶＧ刺激細胞を用いて培養した、ＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖の時間経過を示す。サイトカインの添加なしに培養された細胞は、図１Ａに記載されている通り３日目に増殖のピークを示した。バックグラウンドでのカウント（１５０ｃｃｐｍ未満の蒸留水カウントと同等）により５日目および６日目で検出可能な増殖はなかった。ＩＬ−２は、すべての日にちで顕著な増殖を誘発し、５日目にピークを示した。ＩＬ−４は、すべての日にちで増殖を増強し、この増殖は４日目でピークを示した。培養の３−４日後のこれら細胞の表現型のプロフィールは、ＣＤ８およびＣＤ４を発現する二重陽性集団の出現があり（細胞の１０−３５％）、ＣＤ２５を発現し続けることを示す。最初の細胞は１％未満のＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞、および２％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞であった。
【０３０８】
図４Ｃ
図４Ｃは、ＩＬ−２およびＩＬ−４で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるサイトカインおよびサイトカイン受容体のｍＲＮＡ発現の半定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【０３０９】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＣＨＯ−ｋ１細胞上清を用いた対照による、ＭＬＣおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が培養された２つの実験が示されている。培養はｍＲＮＡを抽出する前の３日間であった。半定量ＲＴ−ＰＣＲを記載されている通り行った（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９７年、６４、１５５９−１５６７頁）。試料は、右から左へのｃＤＮＡの連続希釈である。結果は、どの処置でもＩＬ−２の誘発は認められなかったが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、および誘導型一酸化窒素合成酵素では十分なｍＲＮＡが認められた。ＩＬ−２で培養した細胞は、ＩＬ−４で培養された細胞では発現しなかったＩＬ−１２Ｒβ２を発現した。ＩＬ−２ではＩＬ−５Ｒαの発現はなかったが、他の実験ではこの受容体はＩＬ−４での培養によって誘発される。
【０３１０】
図４Ｄ
図４Ｄは、培養された耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるサイトカインおよびサイトカイン受容体誘発を示す。これにより、特異的ドナー、第三者刺激因子または自己刺激因子によって刺激された耐性細胞を比較した。培養物はサイトカインが補充されず（ＣＴＬの上の３つの系）またはＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＣＨＯ−ｋ上清が添加された。−＆＋ＣＴＬＳは、アッセイそのものの対照として使用したＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞に由来するｃＤＮＡであった（−＆＋対照）。ｍＲＮＡは、右から左へのｃＤＮＡの連続希釈による半定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された。
【０３１１】
どのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞調製物にもＩＬ−２ｍＲＮＡの誘発は認められなかった。最も一貫して十分なｍＲＮＡは、すべてのアッセイで検出され、ＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれかによるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養後に増強される傾向があったＩＦＮ−γについてであった。ＩＬ−１２Ｒβ２がＩＬ−２で、わずかな程度にはＩＬ−４で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞において誘発され、サイトカインなしで培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞においては確認されなかった。ＩＦＮ−γｍＲＮＡはＩＬ−４で培養された細胞において誘発された。
【０３１２】
ＩＬ−４およびＩＬ−５のｍＲＮＡのみ、ＩＬ−２またはＩＬ−４に曝露されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞において主に誘発され、サイトカインなしまたはＣＨＯ−ｋ上清で培養された対照ではいずれも誘発されなかった。ＩＬ−１３ｍＲＮＡがすべての試料で検出され、ＩＬ−２およびＩＬ−４による一部の誘発を示したが、これは部分的にＧＡＰＤＨレベルにより開始ｃＤＮＡにおける差異を示しうる。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡはすべての培養物に存在し、差別的ではなかった。ＩＬ−５ＲαのｍＲＮＡは、きわめてかすかなバンドによって示されている通りＩＬ−４に曝露されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞において誘発された。４日目に分析した試料は、ＩＬ−４ｍＲＮＡで培養された細胞においてＩＬ−５Ｒα  ｍＲＮＡのより明らかな発現を示す。図４参照。
【０３１３】
これは、Ｔ抑制細胞の異なる集団がＩＬ−２およびＩＬ−４で誘発されうることを示し、ＩＬ−２はＴｈ１サイトカインに応答しうる細胞を誘発し、ＩＬ−４はＩＬ−５などＴｈ２サイトカインに応答しうる細胞を誘発する。
【０３１４】
図４Ｅ
図４Ｅは、ＩＬ−５−Ｒα鎖がＩＬ−４で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞において誘発されることを示す。本試験では、ＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を４日間、自己ＤＡ刺激因子またはＰＶＧ刺激因子で培養した。ＩＬ−５Ｒα  ｍＲＮＡを細胞から収集したｃＤＮＡにおいて分析した。細胞をｎｉｌサイトカイン、ＩＬ−２、またはＩＬ−４で培養した。ＩＬ−５Ｒα  ｍＲＮＡのみがＩＬ−４で培養された細胞において検出され、自己抗原で培養されたものよりも同種抗原で培養されたものでレベルが大きかった。対象は非培養ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣｏｎＡ活性化リンパ球に由来するｃＤＮＡ、およびＩＬ−５Ｒαを有する既知のｃＤＮＡであった。
【０３１５】
図４Ｆ
図４Ｆは、ＩＬ−２の存在下で抗原との接触させたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞でのＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮＧＲ）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。
【０３１６】
本試験は、ＩＦＮ−γ受容体の誘発が、ＩＬ−２および同種抗原ＰＶＧ刺激因子で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞では認められ、そして、ＩＬ−２および自己ＤＡ刺激因子で培養された場合はわずかな程度で認められるが、サイトカインなしで培養された細胞では認められないことを明らかに示した。
【０３１７】
総合すれば、図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃにおけるこれらの試験は、Ｔｈ１応答（すなわちＩＬ−２）および同種抗原で曝露および活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２などＴｈ１サイトカインにそれらを応答させることを可能にする受容体を発現したことを示す。他方、同種抗原の存在下でＴｈ２細胞（すなわちＩＬ−４）によって曝露および活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５などのＴｈ２サイトカインの受容体を発現する。それらはＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡも発現する。これらの結果は、ＰＶＧに対する耐性を有するラットに由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−５のいずれかが培養に添加されている場合は、ＰＶＧに対しては増殖するが、自己または第三者に対しては増殖しない（しかし、サイトカインが存在しない場合には、そうはならない）という、本発明者らの所見と一致する。
【０３１８】
発明者は、免疫応答の正常な環境下では、初期の活性化により、結果としてＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の両方の種類の活性化をもたらすＩＬ−２およびＩＬ−４がありうることを提案する。
【０３１９】
発明者は、これら２つの種類の活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＴｓ１細胞およびＴｓ２細胞と呼ぶことを提案する。Ｔｓ１細胞は、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１２ｐ７０ｗに対する応答を得るＩＬ−２によって活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞であり、Ｔｓ２細胞はＩＬ−５に対する応答を得るＩＬ−４によって活性されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。Ｔｓは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制Ｔ細胞(suppressor T cell)表現型を指す。
【０３２０】
結論
ＩＬ−２およびＩｌ−４は、培養においてＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する異なる効果を有し、その効果は、以下を含む。
ａ）両方は自己および同種抗原に対する増殖を刺激するが、ＩＬ−４に対する応答は、ＩＬ−２によるよりも早くピークを示し、かつ漸減する。
ｂ）ＩＬ−２による培養は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋二重陽性ＣＤ２５＋Ｔ細胞の発達をもたらす。二重陽性細胞のこの発達は、おそらく、ＣＤ８を再発現するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の脱分化である。
ｃ）ＩＬ−２またはＩＬ−４による培養ではいずれもＩＬ−２  ｍＲＮＡの検出可能発現が誘発されないが、ＩＬ−２およびＩＬ−４はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ、ｉＮＯＳのｍＲＮＡを誘発する。ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦ−βの検出可能な特異的誘発は存在しないように思われる。
ｄ）新しいサイトカイン受容体の遅延発現があり、ＩＬ−２および抗原で培養されるとＩＦＮ−γＲが出現する。ＩＬ−５ＲはＩＬ−４により出現する。ＩＬ−１２Ｒβ２は、両方の刺激因子により出現するが、おそらく、ＩＬ−４よりもＩＬ−２により多く出現する。
ｅ）ＩＬ−２またはＩＬ−４で培養された耐性細胞によるサイトカインｍＲＮＡ出現のパターンは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるものと同様であり、これと一致して、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のポリクローナル活性化であり、同種抗原特異的ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化ではない。
ｆ）ＩＬ−２はＩＦＮ−γ／ＩＬ−１２ｐ７０依存抑制細胞を誘発し、本発明者らは、名称をＴｓ１とすることを提案する。
ｇ）ＩＬ−４はＩＬ−５依存抑制細胞を誘発し、本発明者らは名称をＴｓ２とすることを望む。
【０３２１】
実施例５
本試験ではＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を試験した。
【０３２２】
図５Ａ
図５Ａは、ＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞、および混合ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のＤＡまたはＰＶＧ抗原との接触後のＧＡＰＤＨ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびｉＮＯＳｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。これらの培養から抽出されたｍＲＮＡはわずかであるので、本アッセイでは、ｃＤＮＡの最大濃度で2つの試料を試験した。自己（ＤＡ）刺激因子で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが最小のサイトカイン誘発を示す。ＰＶＧ刺激因子により、ＩＬ−２  ｍＲＮＡは認められないが、一部のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β発現が認められる。対照的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＰＶＧによって刺激されると、試験したすべてのサイトカインｍＲＮＡの顕著な誘発が認められ、このプロフィールはＤＡ抗原で刺激し場合に確認されたものと同様である。しかし、自己刺激因子により、ＩＬ−５  ｍＲＮＡ誘発は認められない。注目すべきは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は、自己ＭＬＣとして周知である自己に対する顕著な増殖性応答を有し、したがって、自己に応答するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるサイトカイン  ｍＲＮＡの顕著な誘発は、顕著な自己増殖性応答と一致する。
【０３２３】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞とナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の１：１の比での混合試験では、前述されている通り増殖の完全な抑制が認められる。これらの培養では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞によるものと比べ、同種応答においてＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５  ｍＲＮＡの発現における顕著な削減が認められる。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β  ｍＲＮＡにおけるわずかな削減が認められ、ＰＶＧに対してＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のみで確認されたものと比べ、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡレベルに対する効果は認められなかった。ＣＴＬはＣｏｎＡ刺激Ｔ細胞に由来するｃＤＮＡによるアッセイである。
【０３２４】
これらの結果は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によるＭＬＣの抑制がＩＦＮ−γおよびｉＮＯＳ誘発と関係があり、ＮＯ産生がこの抑制効果を媒介しうることが示唆された。この可能性は、ｉＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＩＬをＭＬＣに添加することによって試験した。
【０３２５】
図５Ｂ
図５Ｂは、ＭＬＣにおけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖についてのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の阻害効果に対する、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０およびｉＮＯＳを妨害する効果を示すグラフである。
【０３２６】
本実験では、ｉＮＯＳまたはＩＬ−５、ＴＧＦ−β、およびＩＬ−１０に対するモノクローナル抗体が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制を妨害しうるかを、それらが１：１の比で培養される場合について試験した。下部パネルからわかるように、対照（ＣＴＮ）は完全に抑制され、ｉＮＯＳ、抗−ＩＬ−５、抗−ＴＧＦ−βおよび抗−ＩＬ−１０モノクローナル抗体が添加された場合に、増殖の増強が、完全に同種のドナーに生じたが、対照の抗Ｍｏｇ  Ｉｇ２ａモノクローナル抗体を用いた場合は生じなかった。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のみ（上部右パネルを参照）のものに対する回復された増殖はなく、効果は非特異的ではなかったが、ｉＮＯＳも抗体も、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞増殖を増強した抗−ＴＧＦ−βを除き、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のみの増殖またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみに対する効果を示さなかった。これらの結果は、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βが、ＭＬＣにおけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果における機能的効果を有することを示す。これは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の非特異的抑制が、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γの効果により部分的に媒介されることも示す。
【０３２７】
結論
ＭＬＣにおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果は、以下のものと関係がある。
ａ）ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と１：１で混合されると、ＭＬＣ増殖を完全に抑制する。
ｂ）ＭＬＣにおけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のみの誘発と比較した、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５  ｍＲＮＡ発現の誘発における顕著な削減、およびＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−γ  ｍＲＮＡの誘発の小さな削減、ただし、ｉＮＯＳの削減は見られない。
ｃ）抗−ＩＬ−５または抗−ＴＧＦ−βまたは抗−ＩＬ−１０モノクローナル抗体による妨害が、抑制を部分的に妨害し、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βが、ＭＬＣにおけるＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞による抑制の媒介に効果を有する。
【０３２８】
実施例６
ＰＶＧ同種移植片に対する耐性を有するＤＡラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の培養における生存に対するＩＬ−４またはＩＬ−５の効果を試験した。耐性媒介細胞の生存を、ＰＶＧ心臓同種移植片に特異的耐性をadoptive transferし、第三者ルイス同種移植片の拒絶をもたらす能力を保持する能力によって分析した。
【０３２９】
これらの試験では、７５日にわたって生存したＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットの脾臓およびリンパ節に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。移植片受容および耐性は、記載されている通り、移植の時点における免疫抑制の短期間後、シクロスポリン治療または抗ＣＤ４または抗ＣＤ３モノクローナル抗体療法の１０日後に発現した（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９７年、６４、１５５９−１５６７頁、および１９９３年、５５、４５９−４６８頁）。耐性をトランスファーするこれらの細胞の能力を、図３Ａおよび３Ｂにおいて上述されている照射adoptive宿主において検査した。
【０３３０】
初期の試験では、本発明者らは、新鮮な耐性細胞が特異的ドナー（ＰＶＧ）に耐性をトランスファーするが、第三者移植片を拒絶することを明らかにしていた。耐性細胞のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との４：１の比での混合、すなわち、２０００万個の耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞と５００万個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の混合を使用し、耐性細胞が拒絶をもたらすことからナイーブ細胞を抑制しうることを示す。以前の試験およびこれらの試験の対照は、３日間の混合リンパ球培養における特異的ドナー刺激因子による耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養物が結果として、その耐性をトランスファーする能力の喪失をもたらすことを示した。同様の条件下のナイーブ細胞の培養は結果として拒絶をもたらす細胞をもたらした。
【０３３１】
耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的ドナー刺激因子およびＣｏＡ上清のサイトカインを多く含む培地で培養すると、それらは特異的ドナーに耐性をトランスファーする能力を保持したが、記載されている通り、第三者移植片拒絶をもたらす能力を保持した（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９３年、５５、３７４−３７９頁）。この基本データは実験の対照として報告され、以前に記載された結果の通りであった。
【０３３２】
図６Ａ
図６Ａは、ＰＶＧ抗原とともに、かつＣｏＡ上清なしにＭＬＣにおいてＩＬ−４またはＩＬ−５のみで培養された後のＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。この実験は、ＩＬ−５のみが特異的抑制ＣＤ４＋Ｔ細胞をトランスファーする耐性を維持することを明らかに示した。同じ細胞は、第三者移植片拒絶をもたらす能力を保持しており、このことから、ＩＬ−５のみでは、耐性媒介細胞を誘発しないことを明らかにした。ＩＬ−２（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９３年、５５、３７４−３７９頁）でもＩＬ−４（上記のデータを参照）のみでも、特異抗原を有する培養において、これら抑制ＣＤ４＋Ｔ細胞を維持しないが、すべてのこれらサイトカインを有するＣｏｎＡ上清がＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的抑制機能を維持する。
【０３３３】
総合すると、同種移植片耐性を有するラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の培養によるこれらの実験は、ＩＬ−５のみがＣｏｎＡ上清の代わりとなりうることを明らかに示した。ＩＬ−２またはＩＬ−４のみのいずれかは耐性維持細胞を維持するには不十分である。
【０３３４】
図６Ｂ
図６Ｂは、耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の、異なる刺激細胞に曝露された場合にインビトロで増殖する能力に対する、ＩＬ−４および特異的ドナー抗原を用いたＭＬＣにおける培養の効果の試験結果を示す。
【０３３５】
ＰＶＧ心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、３日間、ＩＬ−４を含むまたは含まない、一次ＭＬＣにおいて、ＰＶＧ（特異的同種）刺激細胞に対して培養した。これらの細胞をその後に洗浄し、２４時間放置し、次いで二次ＭＬＣのみ、またはＤＡ（同系）、ＰＶＧ（特異的同種）、またはルイス（第三者同種）刺激細胞に対して培養した。増殖を二次培養の２−３日目に分析した。
【０３３６】
耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−４が一次ＭＬＣに添加されるかどうかに関係なく、特異的ドナーＰＶＧに対して増殖の大幅な削減を示す。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞はドナーおよび第三者刺激因子に対する同様の応答を有した。これらのデータは、ＩＬ−４が非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制効果を維持せず、ＩＬ−４が入手可能な唯一のサイトカインである場合には、特異的耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が培養で死滅することが示唆されたadoptive transferアッセイにおける所見と一致する。したがって、ＩＬ−４で培養されたＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞は生存し、特異的ドナーおよび第三者に対する同種活性を維持する。これらの結果は、ＩＬ−４で培養された耐性細胞が特異的耐性をトランスファーする能力を維持することがないという図６Ａに記載されたadoptive transfer試験と一致する。この試験は、耐性動物に由来する特異的ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の培養がＩＬ−４によって維持することができず、かつＩＬ−４が耐性を再誘発しないことも明らかに示す。すなわち、耐性動物に由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＩＬ−４および同種抗原によって維持または拡大されない。
【０３３７】
結論
ＩＬ−４ではなく、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−５は、培養における特異的ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞耐性媒介抑制細胞の生存を促進し、それらが耐性をトランスファーする能力を保持することを可能にする。
ａ）ＭＬＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の同種抗原特異的耐性媒介細胞の生存は、ＩＬ−５またはＣｏｎ  Ａ  ｓｕｐによって支持されうる。ＩＬ−４の添加のみでは耐性媒介ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存は促進されない。
ｂ）耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＭＬＣにおける特異的ドナーに対して増殖ができないことは、特異的ドナー同種抗原およびＩＬ−４による前培養によって回復されない。
【０３３８】
実施例７
この試験ではＭＬＣにおける活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖に対するさまざまなサイトカインの効果を試験した。
【０３３９】
図７
図７では、ＰＶＧ心臓同種移植片に対する耐性を有するＤＡラットに由来する非分画リンパ球のＭＬＣにおける増殖に対する個々のサイトカインの効果を試験する。
【０３４０】
本実験では、ＰＶＧ心臓同種移植片に対する耐性を有するＤＡラットに由来する非分画リンパ球の増殖に対するさまざまなサイトカインの効果がＭＬＣを試験する。提案は、重要なサイトカインは、耐性を維持する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を促進し、かつこれらはＭＬＣにおける非分画細胞の増殖性応答を阻害しうるというものであった。
【０３４１】
この図は、ＩＬ−２およびＩＬ−４が、自己ＤＡおよび特異的ドナーＰＶＧに対する増殖を顕著に増強することを示す。ＩＬ−５およびＩＦＮ−γはＰＶＧに対する応答を阻害するが、自己に対しては阻害しない。他のサイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０ホモ二量体、およびＩＬ−１２ｐ７０を含めて同様の効果を有した。
【０３４２】
このデータは、耐性状態の試験が、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γを添加することによって検出されうることを示す。これらのサイトカインは、ドナー抗原特異的活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存および機能を促進することによって非分画耐性リンパ球の増殖を阻害しうるため、それらはＭＬＣにおける増殖性応答を抑制する。この効果は、増殖の減少、または活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性機能を検出する他の手段によって検出されうる。
【０３４３】
結論
耐性動物に由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を促進するサイトカイン（具体的にはＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１２）の添加により、ＭＬＣにおける特異的ドナー抗原に対する非分画末梢リンパ球の増殖が削減される。
【０３４４】
実施例８
本実験では、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与することによってラットにおけるＥＡＮを治療する能力を試験した。
【０３４５】
方法
方法；ＥＡＮを１０−１５週齢のメスラットにおいて、記載されている通り（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１９９４年、１２３：１６２−１７２頁）、フロイントの完全アジュバント中のウシ末梢神経ミエリンを免疫付与することによって誘発した。体重を計り、臨床所見、および半定量スコアを使用する麻痺の評価によって、疾患活性について動物を毎日モニタリングした。使用したスコアは、５＋死亡または安楽死を必要とする全麻痺、４＋全肢の麻痺、３＋全後肢の麻痺、および虚弱前腕、２＋虚弱後肢、１＋虚弱尾、０正常であった。
【０３４６】
結果
図８
図８Ａおよび８Ｂにおいて、ルイスラットにおける実験的アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）の臨床経過に対する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞のadoptive transferの効果を試験した。
【０３４７】
構想の証拠として、ナイーブラットにおけるＥＡＮの発症しＥＡＮから回復したルイスラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を、これらの細胞をナイーブルイスラットに、フロイントの完全アジュバント中のＰＮＭを用いたこれらの免疫付与時において、adoptive transferすることによって試験した。これらの耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を、これらの耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の効果と比較した。
【０３４８】
本モデルでは、回復するモデルは、正常と思われ、免疫抗原での再免疫付与によるＥＡＮの再誘導に対して耐性である。すなわち、それらはその最初の疾患後に耐性とみなされ、したがって、ＥＡＮから回復したばかりのラットは、活性化耐性ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の十分な供給源とみなされた。したがって、免疫付与後３０日目にＥＡＮから回復したルイスラットを、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を調製するために使用した。ルイスラットの全群（ｎ＝５−１２）を、末梢神経ミエリン（ＰＮＭ）およびフロイントのアジュバントを用いて免疫化した。１群には５００万個のＣＤ２５＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞を静注し、別の１群には５００万個のＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を静注した。対照群には免疫付与の時点で細胞を投与しなかった。耐性ラットに由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与した群は、その疾患が免疫付与後約１５−１６日で２．５＋のピークを示した対照と比べ、臨床経過がはるかに軽度であり、最大疾患スコアは１を少し回った。耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が投与されたラットは、より重篤な疾患を発症し、３＋でピークを示し、より早い発症とゆっくりの回復を示した。
【０３４９】
別の実験では、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が免疫付与の０日目に投与された。これらはＥＡＮの臨床経過に対する効果を示さず、このことから、本実施例の効果が、耐性動物に由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果であることが確認された。
【０３５０】
体重減少は、耐性動物に由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が投与された群においてはるかに小さく、耐性動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が投与された群において、細胞が投与されなかった対照よりもわずかに大きかった。（図８Ｂ）
【０３５１】
成体ラットは５億−１０億個の末梢リンパ球を有するので、本発明者らは、５００万個のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、これらのナイーブ宿主におけるＣＤ２５＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞比の有意な影響を示さなかったと提案する。これはさらに、５００万個のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の投与がＥＡＮの経過に対する効果を示さなかった所見によって支持される。したがって、その効果は、特異的に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞抑制細胞効果による可能性が特に最も大きく、十分に記載されたナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の非特異的効果ではない。
【０３５２】
これは、有限数の活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が有意に疾患経過を変化させ、急性疾患過程中に耐性を再確立しうることを示す。
【０３５３】
結論
急性自己免疫疾患から回復した動物に由来する特異的活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、自己免疫疾患の重篤度を改善しうる。
【０３５４】
本発明者らは、自己ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、寛解期の疾患動物から得られ、かつさらに活性化されて元にトランスファーされ、耐性を維持し、または再確立しうることを提案する。
【０３５５】
実施例９
細胞サブセットおよび培養は、混合リンパ球培養によるものとした。ＰＮＭを有する抗原提示細胞を、ＰＮＭおよび自己刺激細胞調製物を用いて３７度で１時間、前培養することによって調製した。次いで、これらの細胞を洗浄した。培養条件および増殖の測定はＭＬＣについて記載されている通りであった。
【０３５６】
結果
これらの試験は、自己抗原（この場合にはＥＡＮモデルにおけるＰＮＭ）への曝露前および曝露中に、自己抗原に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の応答の明確なパターンを明らかに示す。
【０３５７】
最初にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞よりもはるかに大きな応答を有し、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答はナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって阻害されうることを示した。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが、ほとんど、またはまったくＰＮＭに対する応答を有さなかった。これはナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＭＬＣにおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞を阻害する能力と同様であった。（図９Ａ）
【０３５８】
第二に、回復したばかりの動物においては、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は特異抗原に対して大きく応答することはなく、特異抗原に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答を完全に阻害することはできないという、活性な抑制表現型が存在する。本発明者らは、これらの細胞が、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、およびおそらくＩＬ−１２に対して応答しうることを予測する。（図９Ｂ）
【０３５９】
図９Ａ
図９Ａについては、ＰＮＭを有するまたは有さない自己抗原提示細胞による培養において刺激した場合のナイーブルイスラットに由来するリンパ球の増殖を試験した。増殖は４日目と５日目で比較した。
【０３６０】
ナイーブ非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を試験した。この応答は、ＭＬＣにおける同種抗原に対するナイーブ細胞応答で確認されたものと同様である。４日目、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は、自己および自己＋ＰＮＭと同様であった。ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも大きく、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞による非特異的抑制の除去と一致した。さらに自己のみおよび自己＋ＰＮＭに対する応答における違いは認められなかった。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は最小の増殖のみを有し、通常な比でＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と混合すると、非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞のものに対する応答を抑制した。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞が１：１の比である場合、ほぼ完全な抑制が認められた。
【０３６１】
５日目の結果は実質的に同様のパターンを有したが、４日目よりも大きな増殖が認められた。さらに、１：１の比で２つの集団を混合することにより、自己のみおよびＰＮＭと自己に対する応答が顕著に抑制された。
【０３６２】
図９Ｂ
図９Ｂについては、本試験では、Ｔ細胞サブセットを、免疫付与後３０日にＥＡＭから回復したルイスラットから調製した。さらに自己抗原提示細胞のみで刺激した培養物、またはＰＮＭで感作した自己抗原提示細胞で刺激した培養物をセットアップし、増殖を４日目および５日目に分析した。非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答は、自己抗原提示細胞に対してよりもＰＮＭに対して大きく、特異的感作と一致した。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみは、ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞で通常見られる以上の非特異的増殖を有した。これはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のポリクローナル活性化によるものとみられる。
【０３６３】
大きな違いは、ＰＮＭに対して１：１でのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞での抑制が不完全であったが、自己に対してはより完全であったことである。このアッセイの結果の本発明者らの解釈は、自己抗原およびＰＮＭに対する２つの応答があるということである。データは、部分的な抗自己応答の抑制と一致するが、抗ＰＮＭ応答を抑制することはできない。これらのデータは、同種抗原特異性を有する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が特異抗原に対する応答を抑制することはないが、第三者応答を非特異的に阻害する能力を保持するという点で移植耐性において確認されたものと同様である。
【０３６４】
結論
ナイーブ動物に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、それらが同種免疫応答で作用するように、自己免疫応答において作用する。
ａ）ナイーブ動物では、自己刺激因子に対するものと同じであるという点で、自己抗原に対する特異的応答は認められない。
ｂ）ナイーブ動物では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の除去が自己刺激因子に対する応答を増強する。ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖が非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖よりも大きい。
ｃ）別のナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞と、特に１：１の比で混合することによって抑制されうる。
ｄ）自己免疫の急性エピソードから回復した動物では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞について、自己抗原と比べ特異抗原に対する応答の増強が認められるが、自己抗原に対するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞による特異的応答は認められない。これらのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を完全に抑制することはなく、特異的同種抗原に対してよりも自己応答に対してより有効である。すなわち、活性化特異的ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はインビトロで抑制することはない。
【０３６５】
実施例１０
本実施例は、ドナー抗原およびＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下でインビトロで培養されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のドナー心臓移植片拒絶を抑制する能力を示す。
【０３６６】
Ｔｓ１細胞（ＩＬ−２の存在下で同種抗原刺激によって産生される、ＩＦＮＧＲおよびＩＬ−１２Ｒβ２を発現する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞）およびＴｓ２細胞（ＩＬ−４の存在下で同種抗原刺激によって産生される、ＩＬ−５ＲαおよびＩＦＮ−γを発現する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞）を、それぞれ、１００単位／ｍｌ超のＩＬ−２またはＩＬ−４、およびＰＶＧラットに由来する抗原提示細胞も存在下における、ＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の３日間の培養により得た。次いで、これらの細胞を、５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞で回復した照射ＤＡラットにおけるＰＶＧまたは第三者心臓同種移植片拒絶を阻止する能力について試験した。実験の結果は表２に示されている。
【０３６７】
表２からわかるように、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との１：１０の比でのナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＰＶＧドナー株に由来する心臓の拒絶を抑制することはなかった。同様に、ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下およびＣＤ４＋Ｔ細胞との１：１０の比で、ＰＶＧ抗原と接触させたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ルイスドナー株に由来する心臓の拒絶を抑制することはなかった。対照的に、ＰＶＧ抗原と接触し、ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下およびナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との１：１０の比で混合されてインキュベートされたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＰＶＧドナー株からの心臓の拒絶を抑制した。したがって、１：１０の比でのＴｓ１およびＴｓ２（ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴＳ１またはＴｓ２Ｔ細胞）はＰＶＧの拒絶を阻止したが、ルイス同種移植片の拒絶は阻止せず、１：１０の比でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞として抑制の誘導および抑制の増強の特異性は抑制しないことを明らかに示した。１：１の比でのナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＰＶＧおよびルイス拒絶を抑制した。したがって、特異的同種抗原およびＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれかによる短い培養では、特異的抑制ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が選択されて拡大し、抑制能力の１０倍の増加をもたらした。
【０３６８】
【表２】
2015133982.tif 000003
【０３６９】
実施例１１
これらの実験では、ＰＶＧラットに由来する抗原に活性化され、かつＰＶＧ細胞およびＩＦＮ−γの存在下で培養されたＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＤＡラットにおけるＰＶＧ心臓移植片の拒絶を抑制することができるかを試験した。
【０３７０】
ＰＶＧラットに由来する心臓同種移植片に対して耐性のＤＡラットに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＶＧ同種抗原（実施例１に記載されている通り）、および１００単位／ｍｌ超のＩＦＮ−γによる混合リンパ球培養物中で培養した。３日後、Ｔ細胞を、特異的ドナーＰＶＧ心臓移植片（ＰＶＧラットから移植）、または第三者ルイス同種移植片（ルイスラットからの移植）のいずれかで移植した照射ＤＡラットにadoptive transferした。次いで、各々の照射ラットを５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞で回復した。次いで、移植片の生存を５０日にわたってモニタリングした。実験の結果は図１０に示されている。図１０の上のグラフは、Ｔ細胞が、ＰＶＧ心臓同種移植片を移植した照射ＤＡラットにadoptive transferされた場合の生存を示す。図１０の下のグラフは、Ｔ細胞が、第三者ルイス心臓同種移植片を移植した照射ＤＡラットにadoptive transferされた場合の生存を示す。
【０３７１】
図１０からわかるように、５０日間にわたって有意な生存を明らかに示した移植片は、細胞を投与しなかったラットにおける移植片（図１０の上および下のグラフを参照、実線）、またはＰＶＧ抗原およびＩＦＮ−γの存在下で培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞を投与したラットにおけるＰＶＧ移植片（ただしルイス移植片ではない）（図１０を参照、上グラフ、点線黒円）であった。ＩＦＮ−γで培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、５×１０６ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と混合すると、同種移植片拒絶を抑制し、それらが抑制能力を保持することを示した。
【０３７２】
これらの結果は、培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞が継続してＰＶＧ同種移植片拒絶を抑制したが、ルイス移植片拒絶を抑制しなかったことを示した。ナイーブ細胞のみが拒絶をもたらしたが、照射は拒絶を遅延させた。
【０３７３】
したがって、これらの結果は、ＩＦＮ−γが耐性動物に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞集団における活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生存を保存しうることを明らかに示す。
【０３７４】
実施例１２
図１１は、ナイーブＤＡラットに由来する非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞サブセット、およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞サブセットについて、ＩＬ−２またはＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−２およびＩＬ−１２ｐ７０の両方を添加した培地において、自己抗原（ＤＡ抗原）または同種抗原（ＰＶＧ抗原）の存在下で４日間Ｔ細胞を培養した後の増殖を比較するために行われた実験を示す。細胞増殖に対する抗原とサイトカインの組合せの効果は図１１に示されている。非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖がグラフの上の列に示され、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞サブセットの増殖がグラフの中央の列に示され、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞サブセットの増殖がグラフの下の列に示されている。グラフの左手の列は自己抗原に対する応答の増殖を示し、グラフの右手の列は同種抗原（ＰＶＧ）に対する応答の増殖を示す。
【０３７５】
図１１からわかるように、増殖は、対照ｎｉｌサイトカインと比較するとＩＬ−１２ｐ７０のみによって増強されなかった。ＩＬ−２はすべてのサブセットの顕著な増殖を誘発し、ＩＬ−１２ｐ７０の添加はＣＤ４＋およびＣＤ４＋、ＣＤ２５＋集団におけるこの増殖を増強したが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞においては増強しなかった。
【０３７６】
これらの結果は、ＩＬ−１２ｐ７０が、抗原およびＩＬ−２（Ｔｓ１細胞）で活性化されているＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を増強することを示す。
【０３７７】
並行実験において、ＩＬ−４およびＩＬ−１２ｐ７０による細胞の培養は、ＩＬ−４クローンによるもの以上に増殖を増強することはなかった。
【０３７８】
実施例１３
本実験では、Ｔｓ１細胞（抗原およびＩＬ−２の存在下の培養によって活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の成長に対するＩＬ−２およびＩＬ−１２ｐ７０の効果を試験した。
【０３７９】
Ｔｓ１細胞を、ＩＬ−２および同種抗原（ＰＶＧ抗原）の存在下でナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を３日間培養することによって調製した。次いで、細胞を洗浄し、同種抗原を添加し、そして、添加なし、ＣＨＯ−Ｋ上清、１００単位／ｍｌ超のＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、またはＩＬ−１２ｐ４０のいずれかを含む新鮮培地に入れた。次いで細胞増速を上記の通り測定した。細胞増殖の結果は図１２に示されている。
【０３８０】
図１２からわかるように、対照のＣＨＯ−Ｋ上清またはＩＬ−１２ｐ４０による培養は、添加なしのものと同様の増殖を示した。ＩＬ−１２ｐ７０の存在下の培養は、ＩＬ−２の存在下の培養がそうであったように、対照と比べ有意に追加の増殖を誘発した。これらの実験は、Ｔｓ１細胞がＩＬ−１２ｐ７０に応答していることを示す。
【０３８１】
実施例１４
ナイーブＤＡラットに由来する非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞サブセット、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞サブセットの増殖を、培地にサイトカインの添加なし、ＩＬ−４またはＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−１２およびＩＬ−１２ｐ７０の両方が添加された場合において、自己抗原（ＤＡ抗原）または同種抗原（ＰＶＧ抗原）に対する４日間の培養後に比較した。増殖は、対照のｎｉｌサイトカインと比較した場合、ＩＬ−１２ｐ７０のみによっては増強されなかった。ＩＬ−４はすべてのサブセットの顕著な増殖を誘発し、ＩＬ−１２ｐ７０の添加は亜集団のいずれの増殖も増強することはなかった。これは、ＩＬ−１２ｐ７０がＴｓ２細胞の増殖を増強することがないことを示した。
【０３８２】
実施例１５
ＲＴ−ＰＣＲを使用し、同種抗原（ＰＶＧラットに由来する細胞）または自己抗原（ＤＡラットに由来する細胞）および１００単位／ｍｌ超のＩＬ−２またはＩＬ−４による培養後のナイーブＤＡラットに由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２β２受容体ｍＲＮＡの発現を分析した。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は図１３に示されている。
【０３８３】
図１３は、サイトカインなし（上パネル）、ＩＬ−２（中央パネル）、またはＩＬ−４（下パネル）とともに、同種抗原（ＰＶＧ）または自己抗原（ＤＡ）を用いて４日間培養させた後の、ＧＡＰＤＨ（対照）、ＩＬ−２またはＩＬ−１２β２受容体ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。図１３からわかるように、細胞がＩＬ−２および同種抗原と培養されるとＩＬ−１２β２受容体について強いバンドが確認された。同種抗原刺激のみの後にＩＬ−１２β２受容体について薄いバンドが確認された。この結果は、ＩＬ−２の存在下で同種抗原と接触させることによって活性化されるＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞でのＩＬ−１２受容体の優先的な上方制御を示す。
【０３８４】
実施例１６
フロイントの完全アジュバント中におけるウシ末梢神経ミエリン（ＰＮＭ）による免疫付与によって１０−１５週齢のメスルイスラットにおいてＥＡＮを、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１９９４年、１２３：１６２−１７２頁に記載されている通り、誘発した。動物を３群に分けた。すなわち（ａ）ＰＮＭおよびフロイントのアジュバントのみ（対照）で免疫付与した群、（ｂ）ＰＮＭおよびフロイントのアジュバントで免疫付与し、ＣＨＯ細胞上清を投与した群（対照）、および（ｃ）ＰＮＭおよびフロイントのアジュバントで免疫付与し、ＩＬ−５（５０００単位／日を、１０日間、臨床の発症日から毎日腹腔内注射）を投与した群。
【０３８５】
ルイスラットのすべての群（ｎ＝５−１２）を末梢神経ミエリン（ＰＮＭ）およびフロイントのアジュバンドで上記の通り免疫付与した。
【０３８６】
体重を計り、臨床所見、および半定量スコアを使用する麻痺の評価によって、疾患活性について動物を毎日モニタリングした。使用したスコアは、４＋全肢の麻痺、３＋全後肢の麻痺、および虚弱前腕、２＋虚弱後肢、１＋虚弱尾、０正常であった。
【０３８７】
図１４Ａについては、ルイスラットにおける実験的アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）の臨床経過に対するＩＬ−５の投与の効果を試験した。
【０３８８】
図１４Ａからわかるように、ＩＬ−５が投与されたラットは、疾患が免疫付与後およそ１５−１６日で２．５＋でピークを示した対照と比較し、臨床経過が軽度であり、最大疾患スコアは１を少し上回るのみであった。
【０３８９】
図１４Ｂは、疾患の経過中の体重減少を示す。体重減少は、ＣＨＯ細胞上清による処置後の未処置対照と比較すると、ＩＬ−５が投与されたラットで小さかった。
【０３９０】
脱髄率もＩＬ−５とともに、またはＩＬ−５無しでＰＮＭで免疫付与したラットにおいて調べた。１４および２１日目の脱髄に対するＩＬ−５による処置の効果は図１５に示されている。図１５からわかるように、ＩＬ−５による処置は、ＥＡＮモデルにおいて通常確認される脱髄を削減しうる。
【０３９１】
上記のデータは、ＩＬ−５の投与がＰＮＭに対する耐性を誘発することによってＥＡＮの重篤度の削減において有効でありうることを示す。
【０３９２】
実施例１７
実施例１６に記載されている通り、ＰＮＭで免疫付与し、ＩＬ−５で処置した動物におけるサイトカインの発現を判定するために、流入領域リンパ節（ＬＮ）および馬尾（ＣＥ）に由来するｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を、ＰＮＭによる免疫付与後１４および２１日目に行った。リアルタイムＰＣＲの結果が図１６に示されている。オープンバーは、ＩＬ−５で処置されなかった対照ラットのｍＲＮＡレベルを表し、クローズドバーはＩＬ−５で処置したラットのｍＲＮＡレベルを表す。測定したサイトカインは、図の上部に示されている。
【０３９３】
図１６からわかるように、免疫付与の部位のリンパ節流入領域には、対照（オープンバー）と比較して、２１日目に、ＩＬ−５処置ラット（クローズドバー）において、ＩＬ−２ではなく、ＩＦＮ−γ発現の顕著な増大が認められたが、ＩＬ−１０が１４日目に削減された。馬尾では、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの顕著な削減が認められ、Ｔｈ１細胞浸潤の削減を示した。ＴＣＲ−αは、２１日目にリンパ節および馬尾の両方で少なかったた、１４日目ではそうではなかった。ＴＣＲ−α、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの結果はコピー数／１０００００ＧＡＰＤＨコピーとして表される。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの結果は、コピー数／１００ＴＣＲ−αコピーで表されている。データは、５つの試料からの二重アッセイを組み合わせたものであり、平均±ＳＤで表した。統計的有意差は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【０３９４】
実施例１８
実施例１５に記載されている通り、ＰＮＭで免疫付与され、未処置（ＣＴＬ）またはＩＬ−５で処置されていたラットにおける流入領域リンパ節および馬尾でのＩＬ−５、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３の発現を、半定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して試験した。半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果は図１７に示されている。
【０３９５】
図１７については、サイトカインｍＲＮＡの半定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＩＬ−５処置動物が免疫付与の部位であるリンパ節流入領域におけるＩＬ−５およびＩＬ−５Ｒαを増大させることを示した。対照（ＣＴＬ）と比較してＩＬ−５処置では、ＩＬ−４の同様の発現が認められたが、ＩＬ−１３は減少した。馬尾では、ＩＬ−５およびＩＬ−５Ｒαが依然として検出されたが、ＴＣＲ−αコピーは減少した（図３を参照）。各々のボックスには連続ｃＤＮＡ希釈が示されており、右側が未希釈、左側が１：１０の希釈である。対照ＧＡＰＤＨ発現がすべての試料で同様であった。１つの代表的な試料とともに１群当り５つの試料からの結果が示されている。
【０３９６】
実施例１９
ＭＬＣにおけるナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖に対するナイーブおよび活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果を、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の１：２連続希釈を一定数のナイーブ（１０５）ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞と混合した限外希釈アッセイで試験した。限外希釈試験の結果は図１８に示されている。
【０３９７】
図１８（Ａ）は、１：１の比でＰＶＧ抗原およびルイス抗原に対する応答を部分的に抑制する新鮮なナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の能力を示す。ＰＶＧ抗原に対する応答を抑制するナイーブＴ細胞の能力は１：８（ナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞）の比で有意に減少した。
【０３９８】
図１８（Ｂ）は、Ｔｓ１細胞（抗原（この場合はＩＬ−２の存在下のＰＶＧ抗原）に活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞）１：１６の比までＰＶＧ抗原に対する応答を選択的に完全に抑制するが、ルイス抗原（第三者）に対しては１：４の比で抑制し、次いで抑制を失うことを示す。
【０３９９】
図１９Ａは、新鮮なナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が１：１の比でＰＶＧ抗原およびルイス抗原に対する応答を部分的に抑制するが、１：８の比では有意な阻害を失うことを示す。図１９（Ｂ）は、Ｔｓ２細胞（ＩＬ−４の存在下で（この場合にはＰＶＧ抗原）に対して活性化したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞）がＰＶＧおよびルイス抗原に対する応答を部分的に抑制し、新鮮なナイーブ細胞で確認されたものと同様の比で抑制することを示す。他の試験では、われわれは、ＭＬＣが主にＩＬ−２およびＩＦＮ−γの誘発によるＴｈ１応答を誘発することを示した。誘発される唯一のＴｈ２サイトカインは、細胞が追加のＩＬ−４に曝露されていない限り、ＩＬ−４であって、ＩＬ−５またはＩＬ−１０であり、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ誘発が有意に抑制されている場合、ＩＬ−４およびＩＬ−５発現が増強される。
【０４００】
実施例２０
本実験は、ＩＬ−２またはＩＬ−４の存在下でナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化後、ＩＬ−２３およびＩＬ−１３の存在下でのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のインキュベーションの影響を判定するために行われた。
【０４０１】
ナイーブＤＡラットに由来するナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＩＬ−２（Ａ群）またはＩＬ−４（Ｂ群）の存在下で上記の通り３〜４日間、ＰＶＧラットに由来する刺激細胞とインキュベートした。３〜４日後、細胞を洗浄し、培養培地を、Ａ群については１００単位／ｍｌ  ＩＬ−１２ｐ７０（陽性対照）、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γ、およびＢ群については１００単位／ｍｌ  ＩＬ−１３またはＩＬ−１３およびＩＬ−５のいずれかを含有する培養培地と交換した。陰性対照はＣＨＯ細胞上清であった。
【０４０２】
ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、およびＩＬ−１３単独の存在下でインキュベートしたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞はさらなる増殖を示した。ＩＬ−１３およびＩＬ−５、またはＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの存在下でインキュベートされたＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞も増殖を増強した。
【０４０３】
次の実施例は、本発明のさまざまな態様のさまざまな実施形態の例示を意図した予言的実施例である。
【０４０４】
予言的実施例１
本実施例は、対象が特異抗原に対して耐性であるかを判定するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の使用を示す。
【０４０５】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、特異抗原に対する耐性を試験する患者から得られるリンパ球から単離されうる。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、上記の方法を使用して単離されうる。
【０４０６】
１つの形態では、対象に由来するおよそ１０５のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のアリコートを、サイトカインを含まないか、またはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γを含有することがない培養培地において、少なくとも３日、一般的には５日間、ドナー抗原、自己抗原、または第三者抗原と接触させる。３日後の細胞増殖は上記の通り測定される。図２０（Ａ）および（Ｂ）は、ドナー抗原に対して耐性（Ａ）または非耐性（Ｂ）である対象に由来する予想結果を示す。図２０に示されている通り、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γの非存在下において、ドナー抗原（Ａ）に対して耐性である対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖がほとんどないか、またはまったく認められなくなる。この点で、ドナー抗原と接触したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の細胞増殖は、自己抗原と接触したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖と同等であろう。対照的に、非耐性対象（Ｂ）に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、第三者抗原との接触に応答して確認されたものと同様の増殖を示す。
【０４０７】
別の形態では、対象に由来するおよそ１０５のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のアリコートを、１０ｍｇ／ｍｌ（どのくらいの量で？）ＩＬ−５、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１２ｐ７０が添加されている１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩなどの培養培地において、少なくとも３日間、ドナー抗原、自己抗原、または第三者抗原と接触させる。３日後の細胞増殖は上記の通り測定される。図２０ＣおよびＤは、ドナー抗原に対して耐性（Ｃ）または非耐性（Ｄ）である対象に由来する予想結果を示す。図２０に示されている通り、ドナー抗原に対して耐性である対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γの存在下で増殖するであろう。この点で、ドナー抗原と接触したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の細胞増殖は、第三者と接触したＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖よりも大きくなる。対照的に、ドナー抗原と接触した非耐性対象に由来するＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、第三者抗原と接触した細胞について確認されたものと同様の増殖を示す。
【０４０８】
予言的実施例２
本実施例は、対象が特異抗原に対して耐性であるかを判定する非分画ＣＤ４＋Ｔ細胞の使用を示す。
【０４０９】
１つの形態では、対象に由来するおよそ１０５のＣＤ４＋Ｔ細胞のアリコートを、サイトカインを含まないか、または少なくともＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、またはＩＬ−１２ｐ７０が添加されていない（１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩなどの）培養培地において、少なくとも４日間、ドナー抗原、自己抗原、または第三者抗原と接触させる。４日後の細胞増殖は上記の通り測定される。図２１（Ａ）および（Ｂ）は、ドナー抗原に対して耐性（Ａ）または非耐性（Ｂ）である対象に由来する予想結果を示す。ドナー抗原に応答した増殖は、サイトカインの非存在下のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の死滅、したがって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の抑制不可能、および、図１Ｆに示されている通り、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞数の減少により第三者に対して応答するものと同様となる。
【０４１０】
図２１（Ｂ）については、非耐性対象において、ドナー抗原に対する応答は第三者に対するものと同じとなり、両者は正常な数のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞、およびナイーブＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞による抑制を有する。
【０４１１】
ＩＬ−５、ＩＬ−１２、またはＩＦＮ−γの存在下で、耐性対象に由来する活性化ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｃに示されている通りドナー抗原に応答したＣＤ４＋、ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を生存および抑制する。したがって、ドナー抗原に応答した耐性対象に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は削減され、自己に対する応答と同様となり、かつ第三者抗原に対する応答よりも小さくなる。非耐性個体に由来するＣＤ４＋細胞（図２１Ｄを参照）は、第三者に応答したものと同様のドナー抗原に対する増殖を示す。
【０４１２】
以下の請求の範囲および本発明の前述の説明において、文脈により言語または必要な意味を表現するために別のやり方が必要とされる場合を除き、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包含的意味で使用され、すなわち、言及された特徴の存在を規定するが、本発明のさまざまな実施形態における別の特徴の存在または追加を排除することはない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【外国語明細書】
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