(57)【要約】本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体の活性に拮抗する、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインの最も膜近位のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）と結合する部分を提供する。本発明は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、たとえば、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）の外部ドメインと結合する部分、たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分、小分子、ペプチド性分子、アプタマー、およびアドネクチンを提供する。
2013515776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）の外部ドメインと結合する部分であって、該ＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する、部分。
【請求項２】
ヒトＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインと結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３】
前記Ｉｇ様ドメインがリガンドと前記ＶＥＧＦ受容体との結合に関与していない、請求項２に記載の部分。
【請求項４】
前記Ｉｇ様ドメインがリガンドと前記ＶＥＧＦ受容体との結合に関与する、請求項２に記載の部分。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦ受容体と該ＶＥＧＦ受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断しない、請求項１に記載の部分。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦ受容体と該ＶＥＧＦ受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断する、請求項１に記載の部分。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ受容体の二量体化を妨げない、請求項１に記載の部分。
【請求項８】
前記ＶＥＧＦ受容体の二量体化を妨げる、請求項１に記載の部分。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦ受容体のそれぞれのプロトマーからの前記外部ドメインの膜近位領域間の相互作用を妨げる、請求項１に記載の部分。
【請求項１０】
前記相互作用がホモタイプである、請求項９に記載の部分。
【請求項１１】
前記相互作用がヘテロタイプである、請求項９に記載の部分。
【請求項１２】
前記外部ドメインの前記膜近位領域がＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）である、請求項９に記載の部分。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する、請求項１２に記載の部分：
Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］。
【請求項１４】
Φがバリンであり、Ｘ１が、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２が、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３が、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４が、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５が、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される（配列番号１５９）、請求項１３に記載の部分。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦ受容体のそれぞれのプロトマーからの前記外部ドメインの前記膜近位領域が１６Åを超える距離によって隔てられることを引き起こす、請求項９に記載の部分。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ１である、請求項１に記載の部分。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ２である、請求項１に記載の部分。
【請求項１８】
前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ３である、請求項１に記載の部分。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦ受容体の前記外部ドメインを不活性状態に固定する、請求項１に記載の部分。
【請求項２０】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２１】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｓｐ７３１と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２２】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２３】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２および７３３からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２４】
ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｓｐ７２５と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２６】
ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２７】
ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６および７２７からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２８】
ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項２９】
ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｓｐ７４２と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３０】
ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３１】
ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３および７４４からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３２】
前記ＶＥＧＦ受容体上のコンフォメーションエピトープと結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３３】
前記コンフォメーションエピトープが、前記ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される、請求項３２に記載の部分。
【請求項３４】
前記コンフォメーションエピトープが、アミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＡｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含む、請求項３２に記載の部分。
【請求項３５】
前記ＶＥＧＦ受容体のリガンド誘導性のチロシン自己リン酸化を遮断する、請求項１に記載の部分。
【請求項３６】
前記ＶＥＧＦ受容体のリガンド誘導性の内在化を遮断する、請求項１に記載の部分。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する、請求項１に記載の部分。
【請求項３８】
前記近接エピトープが、前記ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される、請求項３７に記載の部分。
【請求項３９】
前記近接エピトープが、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、ＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである、請求項３８に記載の部分。
【請求項４０】
単離された抗体またはその抗原結合性一部分である、請求項１に記載の部分。
【請求項４１】
前記抗体またはその抗原結合性一部分が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項４０に記載の部分。
【請求項４２】
前記抗体またはその抗原結合性一部分が、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、ＩｇＧ４定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域およびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項４１に記載の部分。
【請求項４３】
前記抗体重鎖定常領域がＩｇＧ１である、請求項４２に記載の部分。
【請求項４４】
前記抗体またはその抗原結合性一部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片、ＳＭＩＰ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、請求項４０に記載の部分。
【請求項４５】
前記抗体またはその抗原結合性一部分が、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下からなる群より選択されるＫＤで受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合する、請求項４０に記載の部分。
【請求項４６】
請求項４０から請求項４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性一部分を産生するハイブリドーマ。
【請求項４７】
小分子である、請求項１に記載の部分。
【請求項４８】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６、ＶＥＧＦＲ２のＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０、ＶＥＧＦＲ１のＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ３のＡｒｇ７３７、およびＶＥＧＦＲ３のＡｓｐ７４２からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合する、請求項４７に記載の部分。
【請求項４９】
ペプチド性分子である、請求項１に記載の部分。
【請求項５０】
前記ペプチド性分子が、前記ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインに基づいて設計されている、請求項４９に記載の部分。
【請求項５１】
前記ペプチド性分子が、前記ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインに基づいて設計されている、請求項５０に記載の部分。
【請求項５２】
前記ペプチド性分子が、構造：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］を含む、請求項５１に記載の部分。
【請求項５３】
Φがバリンであり、Ｘ１が、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２が、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３が、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４が、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５が、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される（配列番号１５９）、請求項５２に記載の部分。
【請求項５４】
前記ペプチド性分子が、ヒトＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３と少なくとも８０％同一である構造を含む、請求項５０に記載の部分。
【請求項５５】
前記ペプチド性分子が、ヒトＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８〜７２７と少なくとも８０％同一である構造を含む、請求項５０に記載の部分。
【請求項５６】
前記ペプチド性分子が、ヒトＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５〜７４４と少なくとも８０％同一である構造を含む、請求項５０に記載の部分。
【請求項５７】
前記ペプチド性分子が少なくとも１つのＤ−アミノ酸残基を含む、請求項５０に記載の部分。
【請求項５８】
アドネクチンである、請求項１に記載の部分。
【請求項５９】
ヒトＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する部分であって、該部分は、該ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗し、該コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ２の残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１の残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含む、部分。
【請求項６０】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合して、ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する、部分。
【請求項６１】
請求項１から請求項６０のいずれか一項に記載の部分と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項６２】
被験体においてＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに関連する疾患を処置または予防するための薬の調製における、有効量の請求項１から６０のいずれか一項に記載の部分の使用。
【請求項６３】
前記ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに関連する疾患が、がん、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、リンパ性疾患および疼痛に関連する疾患からなる群より選択される、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記がんが、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、ＳＣＬＣ、腎臓がん、結腸がん、リンパ性がんおよび乳がんからなる群より選択される、請求項６３に記載の使用。
【請求項６５】
ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインと結合する部分を同定するための方法であって、
ＶＥＧＦ受容体を候補部分と接触させるステップと、
同時にまたは順次、該ＶＥＧＦ受容体を該ＶＥＧＦ受容体のリガンドと接触させるステップと、
該部分が、該リガンドによって誘導される二量体ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン間の配置、配向および／または距離に影響を与えるか否かを決定して、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインと結合する部分を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項６６】
前記部分が、前記ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記部分が、前記ＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）と結合する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ヒトＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する単離された抗体またはその抗原結合性一部分であって、該単離された抗体またはその抗原結合性一部分は、該ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗し、該コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ２の残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１の残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含む、抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項６９】
ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３と結合して、ＶＥＧＦＲ２の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項７０】
ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５と結合して、ＶＥＧＦＲ１の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項７１】
ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合して、ＶＥＧＦＲ３の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項７２】
ヒトＶＥＧＦ受容体のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合して、該ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項７３】
ヒトＶＥＧＦ受容体のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合して、該ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【請求項７４】
ヒトＶＥＧＦ受容体のＡｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合して、該ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年１２月２９日に出願された米国仮出願番号６１／２９０，７８９に関連し、この出願への優先権を主張する。上記出願の全容は、参考として本明細書に明確に援用される。
【０００２】
連邦政府によって支援された研究または開発についての陳述
本出願は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた、コントラクトＲ０１−ＡＲ  ０５１４４８、Ｒ０１−ＡＲ  ０５１８８６、およびＰ５０  ＡＲ０５４０８６の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリーの３つのメンバーと結合してそれを活性化することによって、血液およびリンパ管の発生および恒常性を調節する（非特許文献１）。ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）は、Ｖ型ＲＴＫのメンバーであり、これは、７個のＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ７）から構成される大きな細胞外領域、１個の膜貫通（ＴＭ）ヘリックス、ならびにチロシンキナーゼ活性および追加の調節配列を有する細胞質領域を含有するファミリーである。ＶＥＧＦＲ外部ドメインの第２および第３のＩｇ様ドメイン、たとえばＤ２およびＤ３は、サイトカインのＶＥＧＦファミリーの５個のメンバー（すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ））の結合部位として機能する（非特許文献２、および非特許文献３）。これらの増殖因子は、共有結合されたホモ二量体である。それぞれのプロトマーは、４本のストランドのβ−シートから構成され、これは、逆平行の様式において構造に構成されており、システインノット増殖因子と命名されている（非特許文献４）。サイトカインのシステインノットファミリーの他のメンバーには、神経増殖因子（ＮＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が含まれる。しかし、ＲＴＫのＰＤＧＦＲファミリー（ＩＩＩ型）の外部ドメインは５個のＩｇ様反復から構成されており、そのうちのＤ１、Ｄ２、およびＤ３は、ＰＤＧＦＲならびにファミリーの他のメンバー（すなわち、ＫＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、およびＦｌｔ３）のリガンド結合領域として機能する。構造的および生化学的実験により、細胞外領域へのＳＣＦ結合がＫＩＴの二量体化を誘導すること、このステップの後には、隣接するＫＩＴ分子の２つの膜近位Ｉｇ様ドメインＤ４とＤ５との間のホモタイプ接触が続くことが示されている（非特許文献５）。野生型および腫瘍発生性ＫＩＴ変異体の生化学的研究により、ホモタイプのＤ４およびＤ５の接触が、ＫＩＴの二量体の細胞質領域を、トランス自己リン酸化、キナーゼ活性化および細胞シグナル伝達を促進する距離および配向で配置することにおいて重要な役割を果たすことが示されている。しかし、ＶＥＧＦ受容体の構造をより良好に特徴づける必要性が存在する。そのような特徴づけにより、薬物、医薬品、または他の生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の標的となり得る領域の、情報に基づいた同定がもたらされるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、（２００６年）７巻（５号）：３５９〜３７１頁
【非特許文献２】Ｂａｒｌｅｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、（１９９７年）２７２巻（１６号）：１０３８２〜１０３８８頁
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｋａｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、（１９９８年）２７３巻（４７号）：３１２８３〜３１２８８頁
【非特許文献４】Ｗｅｉｓｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、（１９９７年）９１巻（５号）：６９５〜７０４頁
【非特許文献５】Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、（２００７年）１３０巻（２号）：３２３〜３３４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、たとえば、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）の外部ドメインと結合する部分、たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分、小分子、ペプチド性分子、アプタマー、およびアドネクチンを提供する。本発明の部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定し、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害し得る。本発明の一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを単量体状態に固定する。本発明の別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインが二量体化することを可能にするが、２つの単量体のＩｇ様ドメイン（たとえばＶＥＧＦ受容体のＤ７−Ｄ７ドメイン）間の配置、配向および／または距離に影響を与え、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害する。言い換えれば、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインの、リガンド誘導性の二量体化を可能にするが、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与えるか、またはＶＥＧＦ受容体におけるコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害する（たとえば、受容体の内在化を阻害する、および／または受容体のチロシン自己リン酸化を阻害する、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力を阻害する）場合がある。本発明は、少なくとも部分的に、ＶＥＧＦ２受容体の外部ドメインの一部の結晶構造の解読に基づく。この結晶構造の解読により、本発明の部分が標的とし得るエピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープの同定が可能となった。
【０００６】
また、本発明は、隣接する受容体間のホモタイプのＤ７の相互作用が、受容体の二量体化において役割を果たすのではなく、２つの受容体の細胞質ドメイン間の相互作用（これは、チロシンキナーゼの活性化をもたらす）を可能にする距離および配向における、それら２つの受容体の膜近位領域の正確な配置に必要であるという発見にも、少なくとも部分的に基づく。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、ヒト血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）の外部ドメインと結合する部分を提供し、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定し、それによってＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する。一実施形態では、部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインと結合する。一実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、リガンドとＶＥＧＦ受容体との結合に関与していない。別の実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、リガンドとＶＥＧＦ受容体との結合に関与する。一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断しない。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断する。一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の二量体化を妨げない。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の二量体化を妨げる。
【０００８】
一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体のそれぞれのプロトマーからの外部ドメインの膜近位領域間の相互作用を妨げる。別の実施形態では、相互作用はホモタイプである。さらに別の実施形態では、相互作用はヘテロタイプである。
【０００９】
一実施形態では、外部ドメインの膜近位領域は、ＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）である。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Φはバリンであり、Ｘ１は、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５は、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【００１０】
別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体のそれぞれのプロトマーからの外部ドメインの膜近位領域が約１６Å、１７Å、１８Å、１９Åまたは２０Åを超える距離によって隔てられることを引き起こす。一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定する。
【００１１】
一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）である。別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）である。別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）である。
【００１２】
別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｓｐ７３１と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１と結合する。さらに別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２および７３３からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する。部分は、前述のアミノ酸残基のうちの任意のものの１Å、２Å、３Å、４Åまたは５Å以内で結合し得る。
【００１３】
一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｓｐ７２５と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６および７２７からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する。部分は、前述のアミノ酸残基のうちの任意のものの１Å、２Å、３Å、４Åまたは５Å以内で結合し得る。
【００１４】
一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｓｐ７４２と結合する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合する。さらに別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３および７４４からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する。部分は、前述のアミノ酸残基のうちの任意のものの１Å、２Å、３Å、４Åまたは５Å以内で結合し得る。
【００１５】
一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する。一実施形態では、コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。さらに別の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、アミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＡｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、部分は、前述のコンフォメーションエピトープの１Å、２Å、３Å、４Åまたは５Å以内で結合する。
【００１６】
別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。一部の実施形態では、部分は、前述のエピトープのうちの任意のものの１Å、２Å、３Å、４Åまたは５Å以内で結合し得る。
【００１７】
一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体のリガンド誘導性のチロシン自己リン酸化を遮断する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体のリガンド誘導性の内在化を遮断する。
【００１８】
一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する部分は、単離された抗体またはその抗原結合性一部分である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域はＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片、ＳＭＩＰ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下からなる群より選択されるＫＤで受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合する。
【００１９】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載のＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する抗体またはその抗原結合性一部分を産生するハイブリドーマを提供する。
【００２０】
一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する部分は小分子である。別の実施形態では、小分子は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６またはＡｓｐ７３１のうちの少なくとも１つと結合する。別の実施形態では、小分子は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０またはＡｓｐ７２５のうちの少なくとも１つと結合する。別の実施形態では、小分子は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７またはＡｓｐ７４２のうちの少なくとも１つと結合する。
【００２１】
別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する部分はペプチド性分子である。一実施形態では、ペプチド性分子は、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインに基づいて設計されている。別の実施形態では、ペプチド性分子は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインに基づいて設計されている。一実施形態では、ペプチド性分子は、構造：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］を含む。具体的な実施形態では、Φはバリンであり、Ｘ１は、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５は、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【００２２】
別の実施形態では、ペプチド性分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３、６７８〜６８３、６８４〜６９０、６９１〜６９７、７０６〜７１２、７１３〜７１６、７１７〜７１９、７２０〜７２４または７２５〜７３４と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である構造を含む。別の実施形態では、ペプチド性分子は、ヒトＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８〜７２７、６７２〜６７７、６７８〜６８４、６８５〜６９１、７００〜７０６、７０７〜７１０、７１１〜７１３、７１４〜７１８または７１９〜７２８と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である構造を含む。別の実施形態では、ペプチド性分子は、ヒトＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５〜７４４、６８９〜６９４、６９５〜７０１、７０２〜７０８、７１７〜７２３、７２４〜７２７、７２８〜７３０、７３１〜７３５または７３６〜７４５と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である構造を含む。別の実施形態では、ペプチド性分子は少なくとも１つのＤ−アミノ酸残基を含む。
【００２３】
一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する部分はアドネクチンである。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合し、ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する部分を提供し、コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ２の残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１の残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、またはＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合し、それによってヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗する部分を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のＶＥＧＦ受容体の外部ドメインと結合する部分と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、被験体に有効量の本発明の部分を投与し、それによって疾患を処置または予防することを含む、被験体においてＶＥＧＦ受容体に関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに関連する疾患は、がん、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、リンパ系の疾患および疼痛に関連する疾患からなる群より選択される。一実施形態では、がんは、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、ＳＣＬＣ、腎臓がん、結腸がん、乳がん、リンパ性がんおよびその成長が間質によって支持される他のがんからなる群より選択される。
【００２８】
一態様では、本発明は、ＶＥＧＦ受容体を候補部分と接触させるステップと、同時にまたは順次、ＶＥＧＦ受容体をＶＥＧＦ受容体のリガンドと接触させるステップと、部分が、リガンド誘導性の二量体ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン間の配置、配向および／または距離に影響を与えるか否かを決定し、それによってＶＥＧＦ受容体の外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインと結合する部分を同定するステップとを含む、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインと結合する部分を同定する方法を提供する。一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定する。別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）と結合する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供し、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗し、コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ２の残基Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１を含む。別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供し、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗し、コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ１の残基Ａｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５を含む。別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン上のコンフォメーションエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供し、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体の活性に拮抗し、コンフォメーションエピトープは、ＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２を含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３と結合し、それによってＶＥＧＦＲ２の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。一態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８〜７２７と結合し、それによってＶＥＧＦＲ１の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５〜７４４と結合し、それによってＶＥＧＦＲ３の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。
【００３１】
一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合し、それによってヒトＶＥＧＦＲ２の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合し、それによってヒトＶＥＧＦＲ１の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ３のＡｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合し、それによってヒトＶＥＧＦＲ３の活性に拮抗する、単離された抗体またはその抗原結合性一部分を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼの外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合する部分を提供し、部分は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定し、それによって受容体チロシンキナーゼの活性に拮抗する。一実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、リガンドと受容体チロシンキナーゼとの結合に関与していても、していなくてもよい。別の実施形態では、部分は、受容体チロシンキナーゼと受容体チロシンキナーゼに対するリガンドとの間の相互作用を遮断しても、しなくてもよい。さらに別の実施形態では、本発明の部分は、受容体チロシンキナーゼの二量体化を妨げても、妨げなくてもよい。さらなる実施形態では、本発明の部分は、リガンド誘導性の受容体の二量体化を妨げないが、受容体チロシンキナーゼの活性化に必要な膜近位領域間のホモタイプまたはヘテロタイプの相互作用を妨げ得る。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明の部分は、受容体チロシンキナーゼのそれぞれのプロトマーからの外部ドメインの膜近位領域間のホモタイプまたはヘテロタイプの相互作用を妨げる。たとえば、本発明の部分は、受容体チロシンキナーゼのそれぞれのプロトマーからの外部ドメインの末端（形質膜に最も近い外部ドメインの末端）が約１５Å、約２０Å、約２５Å、約３０Å、約３５Åまたは約４０Åを超える距離によって隔てられることを引き起こし得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、受容体チロシンキナーゼは、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ、たとえば、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｆｍｓ、Ｆｌｔ３またはＦｌｋ２である。
【００３５】
他の実施形態では、本発明の部分によって結合されるＩｇ様ドメインは、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４ドメインである。具体的な一実施形態では、部分は、以下のＤ４相互作用部位のコンセンサス配列と結合する：ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ［式中、Ｌはロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、アスパラギン、またはリシンからなる群より選択され、Ｘ２は、ロイシン、バリン、アラニン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびアルギニンからなる群より選択され、Ｘ４は、グリシン、バリン、アラニン、グルタミン酸、プロリン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ５は、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン、およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ７は、グリシン、セリン、アラニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびスレオニンからなる群より選択される。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の部分によって結合されるＩｇ様ドメインは、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ５ドメイン、たとえばヒトＫｉｔのアミノ酸残基３０９〜４１３または４１０〜５１９である。具体的な実施形態では、本発明の部分は、Ｄ５相互作用部位からの保存されたアミノ酸のコンセンサス配列と結合し得る。
【００３７】
別の実施形態では、本発明の部分は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４もしくはＤ５ドメインの変異体またはＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７ドメインの変異体と結合する。具体的な実施形態では、部分は、ヒトＫｉｔの変異Ｄ５ドメイン中の点変異と結合し、変異は、Ｔｈｒ４１７、Ｔｙｒ４１８、Ａｓｐ４１９、Ｌｅｕ４２１、Ａｒｇ４２０、Ｔｙｒ５０３、およびＡｌａ５０２からなる群より選択される。
【００３８】
一部の実施形態では、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼはヒトＫｉｔであり、本発明の部分は、以下の表４中に示したアミノ酸残基からなる群より選択される、１つまたは複数のアミノ酸残基、たとえば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、または１８個以上のアミノ酸残基と結合する。たとえば、本発明の部分は、以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。具体的な実施形態では、本発明の部分は、Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３からなる群より選択されるＫｉｔ受容体中のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つ、またはＹ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０からなる群より選択されるＫｉｔ受容体中のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合する。本発明の部分は、表４中に同定したポケットもしくは空洞を形成するすべての残基と結合し得るか、または、これらはポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る。当業者には、一部の実施形態では、本発明の部分は、他のＩＩＩ型ＲＴＫにおける上記記載したものに対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の部分は、ヒトＫｉｔのアミノ酸残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕと結合する。さらに別の実施形態では、本発明の部分は、ヒトＫｉｔのアミノ酸残基４１８Ｔｙｒおよび／または５０５Ａｓｎと結合する。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明の部分は、ＰＤＧＦＲαまたはＰＤＧＦＲβ受容体と結合する。類似の実施形態では、本発明の部分は、ヒトＰＤＧＦＲβのアミノ酸残基３８５Ａｒｇおよび／もしくは３９０Ｇｌｕ、またはＰＤＧＦＲα中の対応する残基と結合する。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明の部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばヒトＫｉｔ受容体またはＰＤＧＦ受容体からのＤ３、Ｄ４、もしくはＤ５ドメインまたはヒンジ領域からの２つ以上の残基から構成される。さらなる具体的な実施形態では、本発明の部分は、表４中に記載のアミノ酸残基からなる群より選択される、２個以上の残基、たとえば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、または１８個以上のアミノ酸残基から構成されるヒトＫｉｔ受容体中のコンフォメーションエピトープと結合し得る。特定の実施形態では、本発明の部分は、Ｙ１２５、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸からなるコンフォメーションエピトープと結合する。類似の実施形態では、本発明の部分は、以下のアミノ酸の群のうちの１つから選択される、２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合し得る：Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｆ２０８、およびＴ２９５；Ｌ２２２、Ａ３３９、Ｆ３４０、Ｋ３４２、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３１２、Ｅ３３８、Ｆ３４０、およびＩ３７１；Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｇ３１１、Ｆ３４０、Ｐ３４１、およびＤ３９８；Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｎ３６７、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｇ３８４、Ｔ３８５、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、およびＫ４７１；Ｙ４０８、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｋ４７１、およびＬ４７２；Ｆ３２４、Ｖ３２５、Ｎ３２６、およびＮ４１０；Ｄ３２７、Ｎ４１０、Ｔ４１１、Ｋ４１２、およびＶ４９７；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｖ４０９、およびＫ４７１；Ｌ３８２、Ｇ３８７、Ｖ４０７、およびＶ４０９；Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９；Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｔ４１１、Ｆ４３３、Ｆ４６９、Ｇ４７０、およびＫ４７１；Ｄ３２７、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ａ４３１、Ｇ４３２、およびＫ４７１；Ｙ３５０、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０；Ｙ３５０、Ｒ３５３、およびＦ３５５。上述のように、本発明の部分は、表４中に同定したポケットもしくは空洞を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらはポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る。
【００４２】
さらなる実施形態では、本発明の部分は、表５中に記載のペプチドから選択される２つ以上のアミノ酸残基から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、第１のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基および第２のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基から構成され、第１および第２のペプチドは、表５中に記載のペプチドの群から選択される。したがって、本発明の部分はコンフォメーションエピトープと結合してよく、第１および第２のペプチド群は以下のとおりである：Ａｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２およびＴｈｒ３０４−Ｖａｌ３０８；Ａｓｐ３０９−Ｇｌｙ３１１およびＡｒｇ２２４−Ｇｌｙ２２６；Ｔｈｒ３０３−Ｇｌｕ３０６およびＡｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２；Ａｓｎ３６７−Ａｓｎ３７０およびＳｅｒ２１７−Ｔｙｒ２２１；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＡｓｎ３９６−Ｖａｌ３９９；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＧｌｕ３６８−Ａｒｇ３７２；Ｌｙｓ３５８−Ｔｙｒ３６２およびＶａｌ３７４−Ｈｉｓ３７８；Ａｓｐ３５７−Ｇｌｕ３６０およびＬｅｕ３７７−Ｔｈｒ３８０；Ｍｅｔ３５１−Ｇｌｕ３６０およびＨｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９；Ｈｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９およびＶａｌ３２３−Ａｓｐ３３２；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４９３−Ｔｈｒ５００；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４３１−Ｔｈｒ４３７；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＰｈｅ４６９−Ｖａｌ４７３；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＶａｌ３２５−Ａｓｎ３３０；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｒｇ３８１−Ｇｌｙ３８７；Ｇｌｙ４６６−Ｌｅｕ４７２およびＧｌｙ３８４−Ｇｌｙ３８８；Ｖａｌ３２５−Ｇｌｕ３２９およびＴｙｒ４９４−Ｌｙｓ４９９；Ｔｈｒ４１１−ｌｅｕ４１６およびＶａｌ４９７−Ａｌａ５０２；Ｉｌｅ４１５−Ｌｅｕ４２１およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７；Ａｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＬｙｓ４８４−Ｔｈｒ４８８；およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＧｌｙ４４５−Ｃｙｓ４５０。本発明の部分は、前述の第１および第２のペプチド群を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらは第１および第２のペプチド群を形成する残基のサブセットと結合し得る。
【００４３】
他の実施形態では、本発明の部分は、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである受容体チロシンキナーゼ（Ｖ型受容体チロシンキナーゼ）、たとえば、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）と結合する。本発明の部分によって結合されたＩｇ様ドメインは、一部の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのＤ７ドメインであり得る。具体的な実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：ＩＸ１ＲＶＸ２Ｘ３ＥＤＸ４Ｇ［式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、グルタミン酸、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸およびリシンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびアラニンからなる群より選択される（配列番号１）。
【００４４】
一部の実施形態では、本発明の部分は、単離された抗体またはその抗原結合性一部分である。抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはキメラ抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む。好ましい実施形態では、抗体重鎖定常領域はＩｇＧ１である。さらに、本発明の部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片、ＳＭＩＰ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合性一部分であり得る。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤで受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合する。
【００４５】
一部の実施形態では、本発明の単離された抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＫｉｔのアミノ酸残基３０９〜４１３および／または４１０〜５１９と結合し、それによってヒトＫｉｔの外部ドメインを不活性状態に固定してヒトＫｉｔの活性に拮抗する。
【００４６】
さらなる実施形態では、本発明には、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分を産生するハイブリドーマが含まれる。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、本発明の部分は小分子である。
【００４８】
一部の好ましい実施形態では、本発明の小分子は、表４中に示したアミノ酸残基からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基と結合する。たとえば、本発明の小分子は、以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。具体的な実施形態では、本発明の小分子は、Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３からなる群より選択されるＫｉｔ受容体中のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合する。関連する実施形態では、本発明の小分子は、Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０からなる群より選択されるＫｉｔ受容体中のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つと結合する。当業者には、一部の実施形態では、本発明の小分子は、他のＩＩＩ型ＲＴＫにおける上記記載したものに対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【００４９】
さらなる実施形態では、本発明の部分はペプチド性分子である。一部の実施形態では、ペプチド性分子は、受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインに基づいて設計されている。具体的な実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＫｉｔのＤ４ドメインに基づいて設計されている。本発明のペプチド性分子は、保存されたＤ４相互作用部位、たとえば上述のＤ４コンセンサス配列（ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ）、またはＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４ドメインとアラインメントもしくは比較することによって作製された他のものを含み得る。さらなる実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ヒトＫｉｔのアミノ酸残基３０９〜４１３と少なくとも８０％同一である構造またはヒトＫｉｔのアミノ酸残基４１０〜５１９と少なくとも８０％同一である構造を含む。また、ペプチド性部分は、ＫｉｔのＤ５ドメインに基づいて設計されていてよく、さらなる好ましい実施形態では、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ５ドメインとアラインメントまたは比較することによって作製されたコンセンサス配列を含み得る。代替実施形態では、ペプチド性分子は、変異Ｄ５ドメインの配列またはコンセンサス配列に基づいて設計されていてよい。
【００５０】
本発明のペプチド性部分は、本明細書中で同定したアミノ酸配列のうちの任意のもの（たとえば、配列番号１〜８９、９２、９３、および１０５〜１５７）を含むか、またはそれからなるペプチドであり得る。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明のペプチド性分子は少なくとも１つのＤ−アミノ酸残基を含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明の部分はアドネクチンである。
【００５３】
さらに、一部の実施形態では、本発明の小分子およびペプチド性分子は、標的ＲＴＫ中のコンフォメーションエピトープと結合する。他の実施形態では、本発明の小分子およびペプチド性分子は、コンフォメーションエピトープではない標的ＲＴＫ中のエピトープと結合する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、本発明の部分のうちの任意のものと、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、被験体において受容体チロシンキナーゼに関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。この方法には、被験体に有効量の本発明の部分（たとえば、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７ドメインと結合する部分）を投与し、それによって疾患を処置または予防することが含まれる。好ましい実施形態では、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患は、リンパ性疾患またはがん、たとえば、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、ＳＣＬＣ、黒色腫、腎臓がん、結腸がん、乳がん、リンパ性がんおよび他のがんである。
【００５６】
別の態様では、本発明は、被験体にヒトＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ３−Ｄ４および／またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と結合する部分を有効量で投与し、それによって疾患を処置または予防することによって、被験体において受容体チロシンキナーゼに関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。具体的な実施形態では、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患は、がん、たとえば、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、ＳＣＬＣ、黒色腫、腎臓がん、結腸がん、乳がん、リンパ性がんまたは他のがんである。
【００５７】
別の態様では、本発明は、受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合して受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定する部分を同定する方法を提供する。この方法は、受容体チロシンキナーゼを候補部分と接触させるステップと、同時にまたは順次、受容体チロシンキナーゼを受容体チロシンキナーゼに対するリガンドと接触させるステップと、部分が、リガンド誘導性の二量体の受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメイン間の配置、配向および／または距離に影響を与えるか否かを決定し、それによって受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合して受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定する部分を決定するステップとを含む。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定する部分を同定する方法を提供する。この方法は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼを候補部分と接触させるステップと、同時にまたは順次、受容体チロシンキナーゼを受容体チロシンキナーゼに対するリガンドと接触させるステップと、部分が、リガンド誘導性の二量体の受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ４またはＤ５−Ｄ５ドメイン間の配置、配向および／または距離に影響を与えるか否かを決定し、それによってＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定する部分を同定するステップとを含む。
【００５９】
本発明の他の特長および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴った本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いにより当該官庁から提供される。
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｅは、Ｋｉｔ外部ドメインの結晶構造を示す図である。図１Ａは、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のリボン図（左）および表面表示（右）を示す。右パネルは、左パネル中に示す図の垂直軸に沿った９０°回転後の図を示す。Ｄ１は青色、Ｄ２は緑色、Ｄ３は黄色、Ｄ４はオレンジ色およびＤ５はピンク色に色づけされ、ＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで示されている。図１Ｂ〜Ｅは、Ｄ１−Ｄ２（Ｂ）、Ｄ２−Ｄ３（Ｃ）、Ｄ３−Ｄ４（Ｄ）、およびＤ４−Ｄ５（Ｅ）の境界領域の詳細な図を提供する。色分けは図１Ａと同じである。ドメイン−ドメイン相互作用に参加するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って命名されている。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｅは、Ｋｉｔ外部ドメインの結晶構造を示す図である。図１Ａは、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のリボン図（左）および表面表示（右）を示す。右パネルは、左パネル中に示す図の垂直軸に沿った９０°回転後の図を示す。Ｄ１は青色、Ｄ２は緑色、Ｄ３は黄色、Ｄ４はオレンジ色およびＤ５はピンク色に色づけされ、ＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで示されている。図１Ｂ〜Ｅは、Ｄ１−Ｄ２（Ｂ）、Ｄ２−Ｄ３（Ｃ）、Ｄ３−Ｄ４（Ｄ）、およびＤ４−Ｄ５（Ｅ）の境界領域の詳細な図を提供する。色分けは図１Ａと同じである。ドメイン−ドメイン相互作用に参加するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って命名されている。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｅは、Ｋｉｔ外部ドメインの結晶構造を示す図である。図１Ａは、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のリボン図（左）および表面表示（右）を示す。右パネルは、左パネル中に示す図の垂直軸に沿った９０°回転後の図を示す。Ｄ１は青色、Ｄ２は緑色、Ｄ３は黄色、Ｄ４はオレンジ色およびＤ５はピンク色に色づけされ、ＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで示されている。図１Ｂ〜Ｅは、Ｄ１−Ｄ２（Ｂ）、Ｄ２−Ｄ３（Ｃ）、Ｄ３−Ｄ４（Ｄ）、およびＤ４−Ｄ５（Ｅ）の境界領域の詳細な図を提供する。色分けは図１Ａと同じである。ドメイン−ドメイン相互作用に参加するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って命名されている。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｅは、Ｋｉｔ外部ドメインの結晶構造を示す図である。図１Ａは、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のリボン図（左）および表面表示（右）を示す。右パネルは、左パネル中に示す図の垂直軸に沿った９０°回転後の図を示す。Ｄ１は青色、Ｄ２は緑色、Ｄ３は黄色、Ｄ４はオレンジ色およびＤ５はピンク色に色づけされ、ＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで示されている。図１Ｂ〜Ｅは、Ｄ１−Ｄ２（Ｂ）、Ｄ２−Ｄ３（Ｃ）、Ｄ３−Ｄ４（Ｄ）、およびＤ４−Ｄ５（Ｅ）の境界領域の詳細な図を提供する。色分けは図１Ａと同じである。ドメイン−ドメイン相互作用に参加するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って命名されている。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、Ｋｉｔ外部ドメインの結晶構造を示す図である。図１Ａは、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のリボン図（左）および表面表示（右）を示す。右パネルは、左パネル中に示す図の垂直軸に沿った９０°回転後の図を示す。Ｄ１は青色、Ｄ２は緑色、Ｄ３は黄色、Ｄ４はオレンジ色およびＤ５はピンク色に色づけされ、ＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで示されている。図１Ｂ〜Ｅは、Ｄ１−Ｄ２（Ｂ）、Ｄ２−Ｄ３（Ｃ）、Ｄ３−Ｄ４（Ｄ）、およびＤ４−Ｄ５（Ｅ）の境界領域の詳細な図を提供する。色分けは図１Ａと同じである。ドメイン−ドメイン相互作用に参加するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って命名されている。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ外部ドメインの２：２複合体の結晶構造を示す図である。図２Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体のリボン図を示す。Ｄ１〜Ｄ５の色分けは図１と同じであり、ＳＣＦは赤紫色に色づけされている。ＫｉｔおよびＳＣＦのＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで表されている。矢印は、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体中の大きな空洞を示している。図２Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ外部ドメインの２：２複合体の表面表示を示す。図は、上面図（上）、正面図（中央左）、側面図（中央右）および底面図（下）を示す。色分けはＡと同じである。これらの図は、ＳＣＦ二量体が、２つの対応するＫｉｔ外部ドメインのＤ１、Ｄ２およびＤ３と対称的に相互作用することを示す。さらに、Ｋｉｔ外部ドメインは、２つの隣接する受容体のＤ４間（オレンジ色）およびＤ５間（ピンク色）の側方接触を介して、同種形成性相互作用を形成する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ外部ドメインの２：２複合体の結晶構造を示す図である。図２Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体のリボン図を示す。Ｄ１〜Ｄ５の色分けは図１と同じであり、ＳＣＦは赤紫色に色づけされている。ＫｉｔおよびＳＣＦのＮおよびＣ末端が標識されている。Ｄ１およびＤ５中のジスルフィド結合はボールとスティックのレンダリングで示し、硫黄原子はオレンジ色に色づけされている。アスパラギン連結炭水化物はスティックモデルで表されている。矢印は、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体中の大きな空洞を示している。図２Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ外部ドメインの２：２複合体の表面表示を示す。図は、上面図（上）、正面図（中央左）、側面図（中央右）および底面図（下）を示す。色分けはＡと同じである。これらの図は、ＳＣＦ二量体が、２つの対応するＫｉｔ外部ドメインのＤ１、Ｄ２およびＤ３と対称的に相互作用することを示す。さらに、Ｋｉｔ外部ドメインは、２つの隣接する受容体のＤ４間（オレンジ色）およびＤ５間（ピンク色）の側方接触を介して、同種形成性相互作用を形成する。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｅは、ＫｉｔによるＳＣＦ認識を示す図である。図３ＡはＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の図を示す。ＳＣＦおよびＫｉｔの外部ドメイン中の埋没表面中のアミノ酸は、２つの分子を引き離すことによって可視化されている。図は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３（左）およびＳＣＦ（右）の分子表面を示す。酸性アミノ酸は赤色、塩基性アミノ酸は青色、極性アミノ酸はオレンジ色および疎水性アミノ酸は黄色で示されている。Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位−Ｉ、部位−ＩＩおよび部位−ＩＩＩに丸印が付けられている。図３Ｂは、リガンド−受容体の境界領域中の静電電位の相補性を示す。右パネルは、左パネル中に提示した静電的表面の垂直軸に沿った１８０°の回転後の図を示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の静電表面電位が分子表面上に重ね合わせられており、結合したＳＣＦの画像のインプリントが緑色に色づけされている。右パネルは、青色（正）および赤色（負）に色づけされた、ＳＣＦと結合したＫｉｔの静電表面電位を示す。Ｋｉｔは、シアン色に色づけされたリボン図の形態で示されている。図３Ｃ〜Ｅは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉ（Ｃ）、部位−ＩＩ（Ｄ）および部位−ＩＩＩ（Ｅ）の近接図を示す。ＳＣＦは緑色およびＫｉｔはシアン色に色づけされている。相互作用するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれており、二次構造要素がリボンおよびストランド上に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｅは、ＫｉｔによるＳＣＦ認識を示す図である。図３ＡはＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の図を示す。ＳＣＦおよびＫｉｔの外部ドメイン中の埋没表面中のアミノ酸は、２つの分子を引き離すことによって可視化されている。図は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３（左）およびＳＣＦ（右）の分子表面を示す。酸性アミノ酸は赤色、塩基性アミノ酸は青色、極性アミノ酸はオレンジ色および疎水性アミノ酸は黄色で示されている。Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位−Ｉ、部位−ＩＩおよび部位−ＩＩＩに丸印が付けられている。図３Ｂは、リガンド−受容体の境界領域中の静電電位の相補性を示す。右パネルは、左パネル中に提示した静電的表面の垂直軸に沿った１８０°の回転後の図を示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の静電表面電位が分子表面上に重ね合わせられており、結合したＳＣＦの画像のインプリントが緑色に色づけされている。右パネルは、青色（正）および赤色（負）に色づけされた、ＳＣＦと結合したＫｉｔの静電表面電位を示す。Ｋｉｔは、シアン色に色づけされたリボン図の形態で示されている。図３Ｃ〜Ｅは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉ（Ｃ）、部位−ＩＩ（Ｄ）および部位−ＩＩＩ（Ｅ）の近接図を示す。ＳＣＦは緑色およびＫｉｔはシアン色に色づけされている。相互作用するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれており、二次構造要素がリボンおよびストランド上に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｅは、ＫｉｔによるＳＣＦ認識を示す図である。図３ＡはＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の図を示す。ＳＣＦおよびＫｉｔの外部ドメイン中の埋没表面中のアミノ酸は、２つの分子を引き離すことによって可視化されている。図は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３（左）およびＳＣＦ（右）の分子表面を示す。酸性アミノ酸は赤色、塩基性アミノ酸は青色、極性アミノ酸はオレンジ色および疎水性アミノ酸は黄色で示されている。Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位−Ｉ、部位−ＩＩおよび部位−ＩＩＩに丸印が付けられている。図３Ｂは、リガンド−受容体の境界領域中の静電電位の相補性を示す。右パネルは、左パネル中に提示した静電的表面の垂直軸に沿った１８０°の回転後の図を示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の静電表面電位が分子表面上に重ね合わせられており、結合したＳＣＦの画像のインプリントが緑色に色づけされている。右パネルは、青色（正）および赤色（負）に色づけされた、ＳＣＦと結合したＫｉｔの静電表面電位を示す。Ｋｉｔは、シアン色に色づけされたリボン図の形態で示されている。図３Ｃ〜Ｅは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉ（Ｃ）、部位−ＩＩ（Ｄ）および部位−ＩＩＩ（Ｅ）の近接図を示す。ＳＣＦは緑色およびＫｉｔはシアン色に色づけされている。相互作用するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれており、二次構造要素がリボンおよびストランド上に示されている。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｅは、ＫｉｔによるＳＣＦ認識を示す図である。図３ＡはＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の図を示す。ＳＣＦおよびＫｉｔの外部ドメイン中の埋没表面中のアミノ酸は、２つの分子を引き離すことによって可視化されている。図は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３（左）およびＳＣＦ（右）の分子表面を示す。酸性アミノ酸は赤色、塩基性アミノ酸は青色、極性アミノ酸はオレンジ色および疎水性アミノ酸は黄色で示されている。Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位−Ｉ、部位−ＩＩおよび部位−ＩＩＩに丸印が付けられている。図３Ｂは、リガンド−受容体の境界領域中の静電電位の相補性を示す。右パネルは、左パネル中に提示した静電的表面の垂直軸に沿った１８０°の回転後の図を示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の静電表面電位が分子表面上に重ね合わせられており、結合したＳＣＦの画像のインプリントが緑色に色づけされている。右パネルは、青色（正）および赤色（負）に色づけされた、ＳＣＦと結合したＫｉｔの静電表面電位を示す。Ｋｉｔは、シアン色に色づけされたリボン図の形態で示されている。図３Ｃ〜Ｅは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉ（Ｃ）、部位−ＩＩ（Ｄ）および部位−ＩＩＩ（Ｅ）の近接図を示す。ＳＣＦは緑色およびＫｉｔはシアン色に色づけされている。相互作用するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれており、二次構造要素がリボンおよびストランド上に示されている。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｅは、ＫｉｔによるＳＣＦ認識を示す図である。図３ＡはＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の図を示す。ＳＣＦおよびＫｉｔの外部ドメイン中の埋没表面中のアミノ酸は、２つの分子を引き離すことによって可視化されている。図は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３（左）およびＳＣＦ（右）の分子表面を示す。酸性アミノ酸は赤色、塩基性アミノ酸は青色、極性アミノ酸はオレンジ色および疎水性アミノ酸は黄色で示されている。Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位−Ｉ、部位−ＩＩおよび部位−ＩＩＩに丸印が付けられている。図３Ｂは、リガンド−受容体の境界領域中の静電電位の相補性を示す。右パネルは、左パネル中に提示した静電的表面の垂直軸に沿った１８０°の回転後の図を示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の静電表面電位が分子表面上に重ね合わせられており、結合したＳＣＦの画像のインプリントが緑色に色づけされている。右パネルは、青色（正）および赤色（負）に色づけされた、ＳＣＦと結合したＫｉｔの静電表面電位を示す。Ｋｉｔは、シアン色に色づけされたリボン図の形態で示されている。図３Ｃ〜Ｅは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉ（Ｃ）、部位−ＩＩ（Ｄ）および部位−ＩＩＩ（Ｅ）の近接図を示す。ＳＣＦは緑色およびＫｉｔはシアン色に色づけされている。相互作用するアミノ酸が標識されており、水素結合は黄色い点線として描かれており、二次構造要素がリボンおよびストランド上に示されている。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｃは、Ｋｉｔと結合した際のＳＣＦ中のコンフォメーション変化を示す図である。図４Ａは、２つのＳＣＦプロトマー間の角度がＫｉｔ結合の際に変更されることを示す。この図は、遊離ＳＣＦ（緑色）およびＫｉｔと結合したＳＣＦ（赤紫色）の画像を示す。一方のＳＣＦプロトマーの重ね合わせ（左）は、ヘリックスαＣについて測定された、第２のプロトマーの約５°の角運動を明らかにする（右）。ヘリックスが標識され、円柱として示されている。図４Ｂは、Ｋｉｔ結合の際のＳＣＦのＮ末端中のコンフォメーション変化を示す。Ｋｉｔの部位−ＩＩＩは分子表面（灰色）として示され、遊離ＳＣＦのＮ末端は緑色およびＫｉｔと結合したＳＣＦのＮ末端は赤紫色で示されている。Ｃｙｓ４’とＣｙｓ８９’との間ジスルフィド結合は、黄色い球として示されている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。図４Ｃは、Ｋｉｔの部位−Ｉと結合した際の、ＳＣＦのαＣ−β２ループ中のコンフォメーション変化を示す。色分けはＢと同じである。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｃは、Ｋｉｔと結合した際のＳＣＦ中のコンフォメーション変化を示す図である。図４Ａは、２つのＳＣＦプロトマー間の角度がＫｉｔ結合の際に変更されることを示す。この図は、遊離ＳＣＦ（緑色）およびＫｉｔと結合したＳＣＦ（赤紫色）の画像を示す。一方のＳＣＦプロトマーの重ね合わせ（左）は、ヘリックスαＣについて測定された、第２のプロトマーの約５°の角運動を明らかにする（右）。ヘリックスが標識され、円柱として示されている。図４Ｂは、Ｋｉｔ結合の際のＳＣＦのＮ末端中のコンフォメーション変化を示す。Ｋｉｔの部位−ＩＩＩは分子表面（灰色）として示され、遊離ＳＣＦのＮ末端は緑色およびＫｉｔと結合したＳＣＦのＮ末端は赤紫色で示されている。Ｃｙｓ４’とＣｙｓ８９’との間ジスルフィド結合は、黄色い球として示されている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。図４Ｃは、Ｋｉｔの部位−Ｉと結合した際の、ＳＣＦのαＣ−β２ループ中のコンフォメーション変化を示す。色分けはＢと同じである。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｃは、Ｋｉｔと結合した際のＳＣＦ中のコンフォメーション変化を示す図である。図４Ａは、２つのＳＣＦプロトマー間の角度がＫｉｔ結合の際に変更されることを示す。この図は、遊離ＳＣＦ（緑色）およびＫｉｔと結合したＳＣＦ（赤紫色）の画像を示す。一方のＳＣＦプロトマーの重ね合わせ（左）は、ヘリックスαＣについて測定された、第２のプロトマーの約５°の角運動を明らかにする（右）。ヘリックスが標識され、円柱として示されている。図４Ｂは、Ｋｉｔ結合の際のＳＣＦのＮ末端中のコンフォメーション変化を示す。Ｋｉｔの部位−ＩＩＩは分子表面（灰色）として示され、遊離ＳＣＦのＮ末端は緑色およびＫｉｔと結合したＳＣＦのＮ末端は赤紫色で示されている。Ｃｙｓ４’とＣｙｓ８９’との間ジスルフィド結合は、黄色い球として示されている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。図４Ｃは、Ｋｉｔの部位−Ｉと結合した際の、ＳＣＦのαＣ−β２ループ中のコンフォメーション変化を示す。色分けはＢと同じである。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ結合の際のＫｉｔのＤ４およびＤ５の再配置を示す図である。図５Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体中のＤ４およびＤ５の再配置を示す。Ｋｉｔ単量体からのＤ３およびＳＣＦと結合したＫｉｔのＤ３（どちらも青色に色づけ）の重ね合わせは、結合した形態のＤ４（赤色）が遊離形態のＤ４（緑色）の位置に対して２２°移動することを示している。２つの形態のＤ４（どちらも青色）の重ね合わせ（右パネル）は、ＳＣＦと結合した形態のＤ５（赤色）が遊離形態のＤ５（緑色）の位置に対して２７°移動することを示している。２つの下のパネルは、単量体（緑色）形態およびホモ二量体（赤色）形態のＤ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域のヒンジ領域の近接図を示す。図５Ｂは、図２と同じ配向で見た、ＳＣＦで占有されたＫｉｔのＤ４およびＤ５の表面表示を示す（上パネル）。黒色の輪郭線は、リガンド結合領域へのＳＣＦ結合によって架橋されたＫｉｔ外部ドメイン単量体のＤ４およびＤ５の位置を示す。Ｄ４およびＤ５の再配置は、２つの隣接する外部ドメインのＣ末端の、互いから７５Å〜１５Åの移動をもたらす。下のパネルは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の細胞膜からの図（底面図）を示す。ｘ軸に沿った９０°回転に留意されたい。Ｄ１〜Ｄ５の色分けは図１と同じである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ結合の際のＫｉｔのＤ４およびＤ５の再配置を示す図である。図５Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体中のＤ４およびＤ５の再配置を示す。Ｋｉｔ単量体からのＤ３およびＳＣＦと結合したＫｉｔのＤ３（どちらも青色に色づけ）の重ね合わせは、結合した形態のＤ４（赤色）が遊離形態のＤ４（緑色）の位置に対して２２°移動することを示している。２つの形態のＤ４（どちらも青色）の重ね合わせ（右パネル）は、ＳＣＦと結合した形態のＤ５（赤色）が遊離形態のＤ５（緑色）の位置に対して２７°移動することを示している。２つの下のパネルは、単量体（緑色）形態およびホモ二量体（赤色）形態のＤ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域のヒンジ領域の近接図を示す。図５Ｂは、図２と同じ配向で見た、ＳＣＦで占有されたＫｉｔのＤ４およびＤ５の表面表示を示す（上パネル）。黒色の輪郭線は、リガンド結合領域へのＳＣＦ結合によって架橋されたＫｉｔ外部ドメイン単量体のＤ４およびＤ５の位置を示す。Ｄ４およびＤ５の再配置は、２つの隣接する外部ドメインのＣ末端の、互いから７５Å〜１５Åの移動をもたらす。下のパネルは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の細胞膜からの図（底面図）を示す。ｘ軸に沿った９０°回転に留意されたい。Ｄ１〜Ｄ５の色分けは図１と同じである。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、Ｄ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の境界領域を示す図である。図６Ａ（上パネル）は、Ｄ４−Ｄ４境界領域の図を示す、１．１σレベルの等高線の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを示す。Ｋｉｔプロトマーの主鎖は、それぞれピンク色および黄色のチューブとして表されている。２つの隣接する外部ドメインのＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（下パネル）。２つの隣接するＤ４のＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間に形成された鎖間水素結合は、黄色に色づけされている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って標識されている。図６Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫファミリーのメンバーにわたるＤ４−Ｄ４二量体化モチーフの保存を示す。マウス（ＡＡＨ７５７１６．１）（配列番号９５）、ニワトリ（ＮＰ＿９８９６９２．１）（配列番号９６）、ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＨ６１９４７）（配列番号９７）、サンショウウオ（ＡＡＳ９１１６１．１）（配列番号９８）ならびにゼブラフィッシュ（Ａ型（配列番号９９）およびＢ型（配列番号１００））（ＮＰ＿５７１１２８、ＸＰ＿６９１９０１）相同体の配列とアラインメントした、ヒトＫｉｔ（ＡＡＣ５０９６９．１）（配列番号９４）の残基３７０〜３９８。ヒト（Ｐ０７３３３）（配列番号１０１）、マウス（Ｐ０９５８１）（配列番号１０２）ならびにトラフグＡ型（配列番号１０３）およびＢ型（配列番号１０４）（Ｐ７９７５０、Ｑ８ＵＶＲ８）からのＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列、ならびにヒト（それぞれ配列番号１０５および１０７）（Ｐ１６２３４、Ｐ０９６１９）およびマウス（それぞれ配列番号１０６および１０８）（ＮＰ＿０３５１８８、Ｐ０５６２２）からのＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβからの配列も示されている。また、ヒトＶＥＧＦＲ１〜３型のＶ型ＲＴＫのアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１０９〜１１１）（第７のＩｇ様ドメイン）（Ｐ１７９４８、Ｐ３５９６８およびＰ３５９１６）も提示されている。Ｋｉｔ上の二次構造要素が配列アラインメントの上に示されている。Ａｒｇ３８１およびＬｙｓ３８３、Ｌｅｕ３８２およびＬｅｕ３７９、Ｇｌｕ３８６およびＧｌｙ３８８の保存された残基は、それぞれ青色、黄色、赤色および緑色に色づけされている。図６Ｃは、Ｄ５−Ｄ５境界領域のリボン図を示す。２つの隣接するＫｉｔプロトマーのストランドＡおよびＧは、Ｄ５−Ｄ５境界領域の形成に参加する。Ｄ５−Ｄ５境界領域は、２つの隣接する受容体のＴｙｒ４１８とＡｓｎ５０５との間の側方相互作用によって、恐らくはイオン（複数可）または水分子（複数可）を介して維持されている。図６Ｄは、ＫｉｔのＤ４およびＤ５の静電電位表面を示す。図は、Ｄ４−Ｄ４の相互作用表面の正面図（右）および垂直軸に沿った９０°回転後の図（左）を示す。酸性パッチおよびＤ４−Ｄ４境界領域の位置に丸印が付けられており、相互作用する残基Ａｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６が標識されている。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、Ｄ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の境界領域を示す図である。図６Ａ（上パネル）は、Ｄ４−Ｄ４境界領域の図を示す、１．１σレベルの等高線の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを示す。Ｋｉｔプロトマーの主鎖は、それぞれピンク色および黄色のチューブとして表されている。２つの隣接する外部ドメインのＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（下パネル）。２つの隣接するＤ４のＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間に形成された鎖間水素結合は、黄色に色づけされている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って標識されている。図６Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫファミリーのメンバーにわたるＤ４−Ｄ４二量体化モチーフの保存を示す。マウス（ＡＡＨ７５７１６．１）（配列番号９５）、ニワトリ（ＮＰ＿９８９６９２．１）（配列番号９６）、ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＨ６１９４７）（配列番号９７）、サンショウウオ（ＡＡＳ９１１６１．１）（配列番号９８）ならびにゼブラフィッシュ（Ａ型（配列番号９９）およびＢ型（配列番号１００））（ＮＰ＿５７１１２８、ＸＰ＿６９１９０１）相同体の配列とアラインメントした、ヒトＫｉｔ（ＡＡＣ５０９６９．１）（配列番号９４）の残基３７０〜３９８。ヒト（Ｐ０７３３３）（配列番号１０１）、マウス（Ｐ０９５８１）（配列番号１０２）ならびにトラフグＡ型（配列番号１０３）およびＢ型（配列番号１０４）（Ｐ７９７５０、Ｑ８ＵＶＲ８）からのＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列、ならびにヒト（それぞれ配列番号１０５および１０７）（Ｐ１６２３４、Ｐ０９６１９）およびマウス（それぞれ配列番号１０６および１０８）（ＮＰ＿０３５１８８、Ｐ０５６２２）からのＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβからの配列も示されている。また、ヒトＶＥＧＦＲ１〜３型のＶ型ＲＴＫのアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１０９〜１１１）（第７のＩｇ様ドメイン）（Ｐ１７９４８、Ｐ３５９６８およびＰ３５９１６）も提示されている。Ｋｉｔ上の二次構造要素が配列アラインメントの上に示されている。Ａｒｇ３８１およびＬｙｓ３８３、Ｌｅｕ３８２およびＬｅｕ３７９、Ｇｌｕ３８６およびＧｌｙ３８８の保存された残基は、それぞれ青色、黄色、赤色および緑色に色づけされている。図６Ｃは、Ｄ５−Ｄ５境界領域のリボン図を示す。２つの隣接するＫｉｔプロトマーのストランドＡおよびＧは、Ｄ５−Ｄ５境界領域の形成に参加する。Ｄ５−Ｄ５境界領域は、２つの隣接する受容体のＴｙｒ４１８とＡｓｎ５０５との間の側方相互作用によって、恐らくはイオン（複数可）または水分子（複数可）を介して維持されている。図６Ｄは、ＫｉｔのＤ４およびＤ５の静電電位表面を示す。図は、Ｄ４−Ｄ４の相互作用表面の正面図（右）および垂直軸に沿った９０°回転後の図（左）を示す。酸性パッチおよびＤ４−Ｄ４境界領域の位置に丸印が付けられており、相互作用する残基Ａｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６が標識されている。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄは、Ｄ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の境界領域を示す図である。図６Ａ（上パネル）は、Ｄ４−Ｄ４境界領域の図を示す、１．１σレベルの等高線の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを示す。Ｋｉｔプロトマーの主鎖は、それぞれピンク色および黄色のチューブとして表されている。２つの隣接する外部ドメインのＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（下パネル）。２つの隣接するＤ４のＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間に形成された鎖間水素結合は、黄色に色づけされている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って標識されている。図６Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫファミリーのメンバーにわたるＤ４−Ｄ４二量体化モチーフの保存を示す。マウス（ＡＡＨ７５７１６．１）（配列番号９５）、ニワトリ（ＮＰ＿９８９６９２．１）（配列番号９６）、ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＨ６１９４７）（配列番号９７）、サンショウウオ（ＡＡＳ９１１６１．１）（配列番号９８）ならびにゼブラフィッシュ（Ａ型（配列番号９９）およびＢ型（配列番号１００））（ＮＰ＿５７１１２８、ＸＰ＿６９１９０１）相同体の配列とアラインメントした、ヒトＫｉｔ（ＡＡＣ５０９６９．１）（配列番号９４）の残基３７０〜３９８。ヒト（Ｐ０７３３３）（配列番号１０１）、マウス（Ｐ０９５８１）（配列番号１０２）ならびにトラフグＡ型（配列番号１０３）およびＢ型（配列番号１０４）（Ｐ７９７５０、Ｑ８ＵＶＲ８）からのＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列、ならびにヒト（それぞれ配列番号１０５および１０７）（Ｐ１６２３４、Ｐ０９６１９）およびマウス（それぞれ配列番号１０６および１０８）（ＮＰ＿０３５１８８、Ｐ０５６２２）からのＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβからの配列も示されている。また、ヒトＶＥＧＦＲ１〜３型のＶ型ＲＴＫのアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１０９〜１１１）（第７のＩｇ様ドメイン）（Ｐ１７９４８、Ｐ３５９６８およびＰ３５９１６）も提示されている。Ｋｉｔ上の二次構造要素が配列アラインメントの上に示されている。Ａｒｇ３８１およびＬｙｓ３８３、Ｌｅｕ３８２およびＬｅｕ３７９、Ｇｌｕ３８６およびＧｌｙ３８８の保存された残基は、それぞれ青色、黄色、赤色および緑色に色づけされている。図６Ｃは、Ｄ５−Ｄ５境界領域のリボン図を示す。２つの隣接するＫｉｔプロトマーのストランドＡおよびＧは、Ｄ５−Ｄ５境界領域の形成に参加する。Ｄ５−Ｄ５境界領域は、２つの隣接する受容体のＴｙｒ４１８とＡｓｎ５０５との間の側方相互作用によって、恐らくはイオン（複数可）または水分子（複数可）を介して維持されている。図６Ｄは、ＫｉｔのＤ４およびＤ５の静電電位表面を示す。図は、Ｄ４−Ｄ４の相互作用表面の正面図（右）および垂直軸に沿った９０°回転後の図（左）を示す。酸性パッチおよびＤ４−Ｄ４境界領域の位置に丸印が付けられており、相互作用する残基Ａｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６が標識されている。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、Ｄ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の境界領域を示す図である。図６Ａ（上パネル）は、Ｄ４−Ｄ４境界領域の図を示す、１．１σレベルの等高線の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを示す。Ｋｉｔプロトマーの主鎖は、それぞれピンク色および黄色のチューブとして表されている。２つの隣接する外部ドメインのＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（下パネル）。２つの隣接するＤ４のＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間に形成された鎖間水素結合は、黄色に色づけされている。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って標識されている。図６Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫファミリーのメンバーにわたるＤ４−Ｄ４二量体化モチーフの保存を示す。マウス（ＡＡＨ７５７１６．１）（配列番号９５）、ニワトリ（ＮＰ＿９８９６９２．１）（配列番号９６）、ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＨ６１９４７）（配列番号９７）、サンショウウオ（ＡＡＳ９１１６１．１）（配列番号９８）ならびにゼブラフィッシュ（Ａ型（配列番号９９）およびＢ型（配列番号１００））（ＮＰ＿５７１１２８、ＸＰ＿６９１９０１）相同体の配列とアラインメントした、ヒトＫｉｔ（ＡＡＣ５０９６９．１）（配列番号９４）の残基３７０〜３９８。ヒト（Ｐ０７３３３）（配列番号１０１）、マウス（Ｐ０９５８１）（配列番号１０２）ならびにトラフグＡ型（配列番号１０３）およびＢ型（配列番号１０４）（Ｐ７９７５０、Ｑ８ＵＶＲ８）からのＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列、ならびにヒト（それぞれ配列番号１０５および１０７）（Ｐ１６２３４、Ｐ０９６１９）およびマウス（それぞれ配列番号１０６および１０８）（ＮＰ＿０３５１８８、Ｐ０５６２２）からのＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβからの配列も示されている。また、ヒトＶＥＧＦＲ１〜３型のＶ型ＲＴＫのアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１０９〜１１１）（第７のＩｇ様ドメイン）（Ｐ１７９４８、Ｐ３５９６８およびＰ３５９１６）も提示されている。Ｋｉｔ上の二次構造要素が配列アラインメントの上に示されている。Ａｒｇ３８１およびＬｙｓ３８３、Ｌｅｕ３８２およびＬｅｕ３７９、Ｇｌｕ３８６およびＧｌｙ３８８の保存された残基は、それぞれ青色、黄色、赤色および緑色に色づけされている。図６Ｃは、Ｄ５−Ｄ５境界領域のリボン図を示す。２つの隣接するＫｉｔプロトマーのストランドＡおよびＧは、Ｄ５−Ｄ５境界領域の形成に参加する。Ｄ５−Ｄ５境界領域は、２つの隣接する受容体のＴｙｒ４１８とＡｓｎ５０５との間の側方相互作用によって、恐らくはイオン（複数可）または水分子（複数可）を介して維持されている。図６Ｄは、ＫｉｔのＤ４およびＤ５の静電電位表面を示す。図は、Ｄ４−Ｄ４の相互作用表面の正面図（右）および垂直軸に沿った９０°回転後の図（左）を示す。酸性パッチおよびＤ４−Ｄ４境界領域の位置に丸印が付けられており、相互作用する残基Ａｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６が標識されている。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｃは、がんおよび他の疾患に関連づけられているＫｉｔ外部ドメインの変異ならびにＫｉｔおよび他のＲＴＫの活性化の機構を示す図である。図７Ａは、まだら症体質に関与する機能喪失型変異を示し、左パネル中に示す。Ｄ１（青色）、Ｄ２（緑色）およびＤ３（黄色）のリボン図ならびにＳＣＦの表面表示（灰色）。変異したアミノ酸は赤色に色づけされている。ＧＩＳＴ、ＳＣＬＣおよびＡＭＬに関与する機能獲得型変異を右パネルに示す。ホモ二量体形態中のＤ４およびＤ５の表面表示は灰色に色づけされている。ＧＩＳＴ中で重複しているＡｌａ５０２およびＴｙｒ５０３は青色で示されており、Ａｓｐ４１９に近接した欠失および挿入の変異（ＡＭＬおよびＮＣＬＬ）は緑色で示されている。活性化させるＫｉｔ変異はＤ５−Ｄ５境界領域に限局されていることに留意されたい。図７Ｂは、Ｋｉｔの活性化がＤ４−Ｄ４境界領域中の点変異体によって損なわれることを示す。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）、Ｄ４中のＲ３８１ＡまたはＥ３８６Ａ点変異を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、示したように、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを用いて６分間、３７℃で刺激した（上側左パネル）。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞の溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティング（ＩＢ）に供した。抗ｐ−Ｔｙｒ免疫ブロットからのＫｉｔのチロシン自己リン酸化の濃度測定定量（上側右パネル）。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）またはＲ３８１Ａ変異体を安定に発現する３Ｔ３細胞を様々な濃度のＳＣＦで処理した。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞からの溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した（下側左パネル）。ネイティブＳＣＦを使用した、細胞結合１２５Ｉ−ＳＣＦの置換アッセイ。ＷＴ（黒い四角）、Ｒ３８１Ａ（▼）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（◆）、またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ（▲）を発現する３Ｔ３細胞を、１２５Ｉ−ＳＣＦを用いて漸増濃度のネイティブＳＣＦの存在下で処理した。ＷＴ  Ｋｉｔに対するＳＣＦのＥＣ５０（ｃ−Ｋｉｔと結合した１２５Ｉ−ＳＣＦの５０％を置換するリガンド濃度）（１．１ｎＭ）は、Ｒ３８１Ａ（１．０ｎＭ）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（０．８ｎＭ）またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ変異体（１．４ｎＭ）に対するＳＣＦのＥＣ５０に匹敵する。図７Ｃは、隣接する細胞の細胞表面上に発現された可溶性（左パネル）または膜係留（右パネル）ＳＣＦ分子によって駆動される、Ｋｉｔおよび他のＲＴＫの活性化のモデルを示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３リガンド結合モジュールとのＳＣＦ結合は、２つの結合したＫｉｔ外部ドメイン単量体のＣ末端を互いから７５Å以内にする。Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５のヒンジの柔軟性は、２つの隣接する外部ドメインのＣ末端を互いから１５Å以内にする、側方のＤ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用を可能にする。その結果、Ｋｉｔ細胞質ドメインの近接性および局所濃度の増加がキナーゼドメイン中の調節性チロシン残基の自己リン酸化をもたらし、ＰＴＫの���性化がもたらされる。（ＰＴＫの活性化はモデル中に描かれていないことに留意されたい）。細胞質ドメイン中の主要なチロシンのリン酸化に続いて、細胞シグナル伝達分子の相補体のリクルートおよび活性化が進行する。このモデルは、遊離ＳＣＦ構造、リガンドを有さないＫｉｔ、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体およびＫｉｔ  ＰＴＫ構造に基づく（ＰＤＢエントリー１ＱＺＪ、１Ｒ０１および１Ｔ４５）。その構造が決定されていない領域を、二次構造予測を使用してモデリングした（緑色のヘリックスおよび黒色のループ）。ＳＣＦは赤紫色、Ｋｉｔ外部ドメインは青色およびｋｉｔ  ＰＴＫは水色に色づけされている。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｃは、がんおよび他の疾患に関連づけられているＫｉｔ外部ドメインの変異ならびにＫｉｔおよび他のＲＴＫの活性化の機構を示す図である。図７Ａは、まだら症体質に関与する機能喪失型変異を示し、左パネル中に示す。Ｄ１（青色）、Ｄ２（緑色）およびＤ３（黄色）のリボン図ならびにＳＣＦの表面表示（灰色）。変異したアミノ酸は赤色に色づけされている。ＧＩＳＴ、ＳＣＬＣおよびＡＭＬに関与する機能獲得型変異を右パネルに示す。ホモ二量体形態中のＤ４およびＤ５の表面表示は灰色に色づけされている。ＧＩＳＴ中で重複しているＡｌａ５０２およびＴｙｒ５０３は青色で示されており、Ａｓｐ４１９に近接した欠失および挿入の変異（ＡＭＬおよびＮＣＬＬ）は緑色で示されている。活性化させるＫｉｔ変異はＤ５−Ｄ５境界領域に限局されていることに留意されたい。図７Ｂは、Ｋｉｔの活性化がＤ４−Ｄ４境界領域中の点変異体によって損なわれることを示す。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）、Ｄ４中のＲ３８１ＡまたはＥ３８６Ａ点変異を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、示したように、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを用いて６分間、３７℃で刺激した（上側左パネル）。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞の溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティング（ＩＢ）に供した。抗ｐ−Ｔｙｒ免疫ブロットからのＫｉｔのチロシン自己リン酸化の濃度測定定量（上側右パネル）。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）またはＲ３８１Ａ変異体を安定に発現する３Ｔ３細胞を様々な濃度のＳＣＦで処理した。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞からの溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した（下側左パネル）。ネイティブＳＣＦを使用した、細胞結合１２５Ｉ−ＳＣＦの置換アッセイ。ＷＴ（黒い四角）、Ｒ３８１Ａ（▼）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（◆）、またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ（▲）を発現する３Ｔ３細胞を、１２５Ｉ−ＳＣＦを用いて漸増濃度のネイティブＳＣＦの存在下で処理した。ＷＴ  Ｋｉｔに対するＳＣＦのＥＣ５０（ｃ−Ｋｉｔと結合した１２５Ｉ−ＳＣＦの５０％を置換するリガンド濃度）（１．１ｎＭ）は、Ｒ３８１Ａ（１．０ｎＭ）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（０．８ｎＭ）またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ変異体（１．４ｎＭ）に対するＳＣＦのＥＣ５０に匹敵する。図７Ｃは、隣接する細胞の細胞表面上に発現された可溶性（左パネル）または膜係留（右パネル）ＳＣＦ分子によって駆動される、Ｋｉｔおよび他のＲＴＫの活性化のモデルを示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３リガンド結合モジュールとのＳＣＦ結合は、２つの結合したＫｉｔ外部ドメイン単量体のＣ末端を互いから７５Å以内にする。Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５のヒンジの柔軟性は、２つの隣接する外部ドメインのＣ末端を互いから１５Å以内にする、側方のＤ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用を可能にする。その結果、Ｋｉｔ細胞質ドメインの近接性および局所濃度の増加がキナーゼドメイン中の調節性チロシン残基の自己リン酸化をもたらし、ＰＴＫの���性化がもたらされる。（ＰＴＫの活性化はモデル中に描かれていないことに留意されたい）。細胞質ドメイン中の主要なチロシンのリン酸化に続いて、細胞シグナル伝達分子の相補体のリクルートおよび活性化が進行する。このモデルは、遊離ＳＣＦ構造、リガンドを有さないＫｉｔ、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体およびＫｉｔ  ＰＴＫ構造に基づく（ＰＤＢエントリー１ＱＺＪ、１Ｒ０１および１Ｔ４５）。その構造が決定されていない領域を、二次構造予測を使用してモデリングした（緑色のヘリックスおよび黒色のループ）。ＳＣＦは赤紫色、Ｋｉｔ外部ドメインは青色およびｋｉｔ  ＰＴＫは水色に色づけされている。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｃは、がんおよび他の疾患に関連づけられているＫｉｔ外部ドメインの変異ならびにＫｉｔおよび他のＲＴＫの活性化の機構を示す図である。図７Ａは、まだら症体質に関与する機能喪失型変異を示し、左パネル中に示す。Ｄ１（青色）、Ｄ２（緑色）およびＤ３（黄色）のリボン図ならびにＳＣＦの表面表示（灰色）。変異したアミノ酸は赤色に色づけされている。ＧＩＳＴ、ＳＣＬＣおよびＡＭＬに関与する機能獲得型変異を右パネルに示す。ホモ二量体形態中のＤ４およびＤ５の表面表示は灰色に色づけされている。ＧＩＳＴ中で重複しているＡｌａ５０２およびＴｙｒ５０３は青色で示されており、Ａｓｐ４１９に近接した欠失および挿入の変異（ＡＭＬおよびＮＣＬＬ）は緑色で示されている。活性化させるＫｉｔ変異はＤ５−Ｄ５境界領域に限局されていることに留意されたい。図７Ｂは、Ｋｉｔの活性化がＤ４−Ｄ４境界領域中の点変異体によって損なわれることを示す。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）、Ｄ４中のＲ３８１ＡまたはＥ３８６Ａ点変異を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、示したように、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを用いて６分間、３７℃で刺激した（上側左パネル）。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞の溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティング（ＩＢ）に供した。抗ｐ−Ｔｙｒ免疫ブロットからのＫｉｔのチロシン自己リン酸化の濃度測定定量（上側右パネル）。野生型Ｋｉｔ（ＷＴ）またはＲ３８１Ａ変異体を安定に発現する３Ｔ３細胞を様々な濃度のＳＣＦで処理した。刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞からの溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した（下側左パネル）。ネイティブＳＣＦを使用した、細胞結合１２５Ｉ−ＳＣＦの置換アッセイ。ＷＴ（黒い四角）、Ｒ３８１Ａ（▼）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（◆）、またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ（▲）を発現する３Ｔ３細胞を、１２５Ｉ−ＳＣＦを用いて漸増濃度のネイティブＳＣＦの存在下で処理した。ＷＴ  Ｋｉｔに対するＳＣＦのＥＣ５０（ｃ−Ｋｉｔと結合した１２５Ｉ−ＳＣＦの５０％を置換するリガンド濃度）（１．１ｎＭ）は、Ｒ３８１Ａ（１．０ｎＭ）、Ｒ３８１Ａ／Ｅ３８６Ａ（０．８ｎＭ）またはキナーゼ陰性Ｋｉｔ変異体（１．４ｎＭ）に対するＳＣＦのＥＣ５０に匹敵する。図７Ｃは、隣接する細胞の細胞表面上に発現された可溶性（左パネル）または膜係留（右パネル）ＳＣＦ分子によって駆動される、Ｋｉｔおよび他のＲＴＫの活性化のモデルを示す。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３リガンド結合モジュールとのＳＣＦ結合は、２つの結合したＫｉｔ外部ドメイン単量体のＣ末端を互いから７５Å以内にする。Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５のヒンジの柔軟性は、２つの隣接する外部ドメインのＣ末端を互いから１５Å以内にする、側方のＤ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用を可能にする。その結果、Ｋｉｔ細胞質ドメインの近接性および局所濃度の増加がキナーゼドメイン中の調節性チロシン残基の自己リン酸化をもたらし、ＰＴＫの���性化がもたらされる。（ＰＴＫの活性化はモデル中に描かれていないことに留意されたい）。細胞質ドメイン中の主要なチロシンのリン酸化に続いて、細胞シグナル伝達分子の相補体のリクルートおよび活性化が進行する。このモデルは、遊離ＳＣＦ構造、リガンドを有さないＫｉｔ、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体およびＫｉｔ  ＰＴＫ構造に基づく（ＰＤＢエントリー１ＱＺＪ、１Ｒ０１および１Ｔ４５）。その構造が決定されていない領域を、二次構造予測を使用してモデリングした（緑色のヘリックスおよび黒色のループ）。ＳＣＦは赤紫色、Ｋｉｔ外部ドメインは青色およびｋｉｔ  ＰＴＫは水色に色づけされている。
【図８Ａ】図８は、Ｋｉｔ外部ドメインの構造に基づいた、ＩＩＩ型ＲＴＫの構造に基づく配列アラインメント、およびＩＩＩ型ファミリーのＲＴＫのリガンドの構造に基づくアラインメントを示す図である。それぞれの列は、個々のＩｇ様ドメインのアラインメントを示す。アミノ酸配列は、（Ｈａｒｐａｚら（１９９４年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３８巻：５２８〜５３９頁）によって決定され、Ｊｐｒｅｄ（Ｃｕｆｆら（１９９８年）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４巻：８９２〜８９３頁）によって計算されたファミリーメンバーの二次構造予測と一致するように、ＩｇＳＦの折り畳み特徴に基づいて手動でアラインメントした。赤色で示されたアミノ酸は、ＩｇＳＦの折り畳みを決定するアミノ酸を表す。βストランドは矢印によって、およびα−ヘリックスは配列の上のスプリング（ｓｐｒｉｎｇ）によって、ヒトＫｉｔおよびヒトＳＣＦの付番と共に標識されている。リガンド結合の際に低下した溶媒接近可能性を示すリガンド結合部位の残基は、星印によって示されている。部位−Ｉは黒色、部位−ＩＩは赤色および部位−ＩＩＩは緑色に色づけされている。同じ色分けが、ＳＣＦ中の相互作用するアミノ酸残基の標識に使用されている。Ｄ４−Ｄ４相互作用に関与するＤ４のＥＦループが、シアン色の四角で囲まれている。アラインメントに使用されている配列は、Ｋｉｔヒト（ＡＡＣ５０９６９）、Ｋｉｔマウス（ＡＡＨ７５７１６）、ＣＳＦＲ１ヒト（Ｐ０７３３３）、ＰＤＧＦＲαヒト（Ｐ１６２３４）、ＰＤＧＦＲβヒト（Ｐ０９６１９）およびＦｌｔ３ヒト（Ｐ３６８８８）である。リガンド構造のアラインメントには、ＳＣＦ（１ＥＸＺ）、ＣＳＦ（１ＨＭＣ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１ＥＴＥ）のＰＤＢエントリーを、Ｌｓｑｍａｎ（ＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ、１９９５年）を使用して重ね合わせた一方で、ＳＣＦマウスの配列（ＮＰ＿０３８６２６）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してヒトＳＣＦとアラインメントした。図は、それぞれ配列番号１１２〜１４７を出現順に開示する。
【図８Ｂ】図８は、Ｋｉｔ外部ドメインの構造に基づいた、ＩＩＩ型ＲＴＫの構造に基づく配列アラインメント、およびＩＩＩ型ファミリーのＲＴＫのリガンドの構造に基づくアラインメントを示す図である。それぞれの列は、個々のＩｇ様ドメインのアラインメントを示す。アミノ酸配列は、（Ｈａｒｐａｚら（１９９４年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３８巻：５２８〜５３９頁）によって決定され、Ｊｐｒｅｄ（Ｃｕｆｆら（１９９８年）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４巻：８９２〜８９３頁）によって計算されたファミリーメンバーの二次構造予測と一致するように、ＩｇＳＦの折り畳み特徴に基づいて手動でアラインメントした。赤色で示されたアミノ酸は、ＩｇＳＦの折り畳みを決定するアミノ酸を表す。βストランドは矢印によって、およびα−ヘリックスは配列の上のスプリング（ｓｐｒｉｎｇ）によって、ヒトＫｉｔおよびヒトＳＣＦの付番と共に標識されている。リガンド結合の際に低下した溶媒接近可能性を示すリガンド結合部位の残基は、星印によって示されている。部位−Ｉは黒色、部位−ＩＩは赤色および部位−ＩＩＩは緑色に色づけされている。同じ色分けが、ＳＣＦ中の相互作用するアミノ酸残基の標識に使用されている。Ｄ４−Ｄ４相互作用に関与するＤ４のＥＦループが、シアン色の四角で囲まれている。アラインメントに使用されている配列は、Ｋｉｔヒト（ＡＡＣ５０９６９）、Ｋｉｔマウス（ＡＡＨ７５７１６）、ＣＳＦＲ１ヒト（Ｐ０７３３３）、ＰＤＧＦＲαヒト（Ｐ１６２３４）、ＰＤＧＦＲβヒト（Ｐ０９６１９）およびＦｌｔ３ヒト（Ｐ３６８８８）である。リガンド構造のアラインメントには、ＳＣＦ（１ＥＸＺ）、ＣＳＦ（１ＨＭＣ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１ＥＴＥ）のＰＤＢエントリーを、Ｌｓｑｍａｎ（ＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ、１９９５年）を使用して重ね合わせた一方で、ＳＣＦマウスの配列（ＮＰ＿０３８６２６）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してヒトＳＣＦとアラインメントした。図は、それぞれ配列番号１１２〜１４７を出現順に開示する。
【図９】図９は、２：２のＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の全体的な構造の立体図を提供する図である。２：２のＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体のリボンモデルが立体表示で示されている。見え方および色分けは図２Ａと同じである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の表面でのアミノ酸の保存を示す図である。図１０Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの結晶構造複合体の色分けした保存パターンを示す。シアン色からえび茶色を使用して、可変的アミノ酸から保存されたアミノ酸を標識している。図１０Ｂは、２つの分子を互いから引き離すことによる、ＳＣＦおよびＫｉｔの可視化を示す。部位Ｉ、部位ＩＩ、および部位ＩＩＩならびにＤ４−Ｄ４相互作用領域（Ｄ４−Ｄ４境界領域）に丸印が付けられている。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の電子密度を示す図である。図１１Ａは、２：２のＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の部位−ＩＩの部分図を示し、２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップが２σレベルでＫｉｔの周辺に描かれている。Ｋｉｔの主鎖は、標識されている側鎖以外は黄色のチューブで描かれている。図１１Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の電子密度を示しており、１．５σレベルでＫｉｔの周辺に描かれた実験的なマップを用いて遊離Ｋｉｔの部分図を示している。配向および色分けは図１２Ａと同じである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の電子密度を示す図である。図１１Ａは、２：２のＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の部位−ＩＩの部分図を示し、２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップが２σレベルでＫｉｔの周辺に描かれている。Ｋｉｔの主鎖は、標識されている側鎖以外は黄色のチューブで描かれている。図１１Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の電子密度を示しており、１．５σレベルでＫｉｔの周辺に描かれた実験的なマップを用いて遊離Ｋｉｔの部分図を示している。配向および色分けは図１２Ａと同じである。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｄは、遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからのＩｇ様ドメインの重ね合わせた対を示す図である。遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからの個々のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４を重ね合わせている。（Ａ）Ｄ１およびＤ２、（Ｂ）Ｄ２およびＤ３、（Ｃ）Ｄ３およびＤ４ならびに（Ｄ）Ｄ４およびＤ５のＩｇ様ドメインの対の構造が示されており、それぞれの対中の重ね合わされたＩｇ様ドメインは青色に色づけされ、第２の（重ね合わせられていない）Ｉｇ様ドメインは、遊離外部ドメインでは緑色およびＳＣＦと結合した外部ドメインでは赤色に色づけされている。これらの図は、ＳＣＦ結合の際に５個の個々のＫｉｔのＩｇ様ドメインのそれぞれの構造に事実上の変化が起こらず、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３はＳＣＦ結合への準備ができているリガンド結合単位として機能することを示している。対照的に、ＳＣＦと結合したＫｉｔでは、Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域中に大きな再構成が起こる。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｄは、遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからのＩｇ様ドメインの重ね合わせた対を示す図である。遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからの個々のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４を重ね合わせている。（Ａ）Ｄ１およびＤ２、（Ｂ）Ｄ２およびＤ３、（Ｃ）Ｄ３およびＤ４ならびに（Ｄ）Ｄ４およびＤ５のＩｇ様ドメインの対の構造が示されており、それぞれの対中の重ね合わされたＩｇ様ドメインは青色に色づけされ、第２の（重ね合わせられていない）Ｉｇ様ドメインは、遊離外部ドメインでは緑色およびＳＣＦと結合した外部ドメインでは赤色に色づけされている。これらの図は、ＳＣＦ結合の際に５個の個々のＫｉｔのＩｇ様ドメインのそれぞれの構造に事実上の変化が起こらず、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３はＳＣＦ結合への準備ができているリガンド結合単位として機能することを示している。対照的に、ＳＣＦと結合したＫｉｔでは、Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域中に大きな再構成が起こる。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからのＩｇ様ドメインの重ね合わせた対を示す図である。遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからの個々のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４を重ね合わせている。（Ａ）Ｄ１およびＤ２、（Ｂ）Ｄ２およびＤ３、（Ｃ）Ｄ３およびＤ４ならびに（Ｄ）Ｄ４およびＤ５のＩｇ様ドメインの対の構造が示されており、それぞれの対中の重ね合わされたＩｇ様ドメインは青色に色づけされ、第２の（重ね合わせられていない）Ｉｇ様ドメインは、遊離外部ドメインでは緑色およびＳＣＦと結合した外部ドメインでは赤色に色づけされている。これらの図は、ＳＣＦ結合の際に５個の個々のＫｉｔのＩｇ様ドメインのそれぞれの構造に事実上の変化が起こらず、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３はＳＣＦ結合への準備ができているリガンド結合単位として機能することを示している。対照的に、ＳＣＦと結合したＫｉｔでは、Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域中に大きな再構成が起こる。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからのＩｇ様ドメインの重ね合わせた対を示す図である。遊離およびＳＣＦと結合したＫｉｔからの個々のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４を重ね合わせている。（Ａ）Ｄ１およびＤ２、（Ｂ）Ｄ２およびＤ３、（Ｃ）Ｄ３およびＤ４ならびに（Ｄ）Ｄ４およびＤ５のＩｇ様ドメインの対の構造が示されており、それぞれの対中の重ね合わされたＩｇ様ドメインは青色に色づけされ、第２の（重ね合わせられていない）Ｉｇ様ドメインは、遊離外部ドメインでは緑色およびＳＣＦと結合した外部ドメインでは赤色に色づけされている。これらの図は、ＳＣＦ結合の際に５個の個々のＫｉｔのＩｇ様ドメインのそれぞれの構造に事実上の変化が起こらず、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３はＳＣＦ結合への準備ができているリガンド結合単位として機能することを示している。対照的に、ＳＣＦと結合したＫｉｔでは、Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域中に大きな再構成が起こる。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の構造の静電表面電位を示す図である。図１３Ａは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体を具体的に示す。図１３Ｂは、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の構造の静電表面電位、具体的には、ＳＣＦをＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体から引き離した後のＫｉｔの静電表面電位の可視化を示す。正および負荷電の表面がそれぞれ青色および赤色に色づけされている。ＳＣＦ結合領域およびＤ４−Ｄ４境界領域に丸印が付けられている。
【図１４】図１４は、抗Ｋｉｔ−Ｄ５抗体によるＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化の阻害を示す図である。Ｋｉｔを発現する３Ｔ３細胞を、漸増濃度の抗Ｋｉｔ  Ｄ５（Ｋｉｔの第５のＩｇ様ドメインに向けられている）、対照として抗ＳＣＦ（ＳＣＦリガンドに向けられている）、または抗Ｋｉｔ外部ドメイン（Ｋｉｔ外部ドメイン全体に向けられている）と共にインキュベーションした。
【図１５】図１５は、組換えＫｉｔ  Ｄ４を使用したＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化の阻害を示す図である。Ｋｉｔを発現する３Ｔ３細胞を漸増濃度の組換えＫｉｔ−Ｄ４と共に１０分間、室温でインキュベートし、次いで１０分間のＳＣＦ刺激を行った。
【図１６】図１６Ａは、ＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦＲ活性化がＤ４中の点変異によって妨げられることを示す図である。ＷＴ  ＰＤＧＦＲまたはＤ４変異体（Ｒ３８５ＡおよびＥ３９０Ａ）を発現するＰＤＧＦＲ−／−ＭＥＦを終夜血清欠乏させ、示した濃度のＰＤＧＦ  ＢＢで５分間刺激した。細胞溶解物を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降させ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を用いた免疫ブロッティングを行った。膜のストリッピング（ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ｏｆｆ）を行い、抗ｆｌａｇタグ抗体で再ブロッティングして、全ＰＤＧＦＲレベルを決定した。図１６Ｂは、ＰＤＧＦＲを介したシグナル伝達がＤ４中の点変異によって妨げられることを示す図である。ＷＴ  ＰＤＧＦＲならびにＤ４変異体（Ｒ３８５ＡおよびＥ３９０Ａ）を発現するＰＤＧＦＲ−／−ＭＥＦを終夜血清欠乏させ、示した濃度のＰＤＧＦ  ＢＢで、５分間２３℃で刺激した。等量の全細胞溶解物（ＴＣＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、それぞれ抗ホスホ−ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫ、ホスホ−ＡｋｔおよびＡｋｔを用いた免疫ブロッティングによって分析した。この実験は、ＭＡＰＫの応答およびＡｋｔの活性化がどちらもＤ４中の点変異によって妨げられることを示している。図１６Ｃは、ＰＤＧＦＲの活性化を妨げるＤ４中の点変異がＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦＲの二量体化を妨害しないことを示す図である。ＷＴまたはＥ３９０Ａ変異体発現ＰＤＧＦＲ−／−ＭＥＦを終夜血清欠乏させ、次いで、ＤＭＥＭ／５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中の示した量のＰＤＧＦと共に４℃で９０分間インキュベートした。非結合のリガンドを除去した後、細胞を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭのスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）と共に３０分間インキュベートした。刺激していない細胞または刺激した細胞の溶解物を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および抗ｆｌａｇ抗体（左パネル）または抗ｐＴｙｒ抗体（右パネル）を用いた免疫ブロッティングに供した。
【図１７Ａ】図１７は、Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域中の空洞を示す図である。いくつかの空洞が外部ドメイン単量体の構造中のＤ３−Ｄ４境界領域上に点在している。空洞の画定に関与しているアミノ酸は、表４（以下）中に要約されている。２つのＫｉｔ受容体間のホモタイプ相互作用の形成の際、Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域が変更され、Ｄ３からのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、およびＤ４からのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３の残基によって作製される浅い空洞の形成がもたらされる。図１７は、占有されていない単量体（Ａ）およびＳＣＦと結合した二量体（Ｂ）のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域のリボン図、およびＤ３−Ｄ４ポケットのメッシュ表示を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域中の空洞を示す図である。いくつかの空洞が外部ドメイン単量体の構造中のＤ３−Ｄ４境界領域上に点在している。空洞の画定に関与しているアミノ酸は、表４（以下）中に要約されている。２つのＫｉｔ受容体間のホモタイプ相互作用の形成の際、Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域が変更され、Ｄ３からのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、およびＤ４からのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３の残基によって作製される浅い空洞の形成がもたらされる。図１７は、占有されていない単量体（Ａ）およびＳＣＦと結合した二量体（Ｂ）のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域のリボン図、およびＤ３−Ｄ４ポケットのメッシュ表示を示す。
【図１８Ａ】図１８は、Ｄ４−Ｄ５ヒンジ領域中の空洞を示す図である。小さな空洞は、Ｋｉｔ単量体のＤ４のＡＢループおよびＥＦループ、Ｄ４−Ｄ５接続リンカーならびにＤ５のＤＥループおよびＦＧループの一部によって形成される。空洞を画定する残基は表４（以下）中に要約されている。空洞の形状および大きさは、Ｋｉｔ外部ドメイン二量体構造中で変化している。Ｄ４のＥＦループおよびストランドＧ、Ｄ４−Ｄ５リンカーならびにＤ５のストランドＢおよびＤＥループによって形成される主要な空洞は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の形成に重要な領域であるＤ４のＥＦループの下に位置する。空洞の近くに位置するＤ５のＤＥループは、非結合および占有されたＫｉｔ構造の両方の電子密度の低い品質によって明らかとなるように、高い柔軟性を有し得ることに留意されたい。図１８は、占有されていない単量体（Ａ）およびＳＣＦ−二量体（Ｂ）のリボン図、ならびにＤ４−Ｄ５ヒンジ領域の周辺の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、Ｄ４−Ｄ５ヒンジ領域中の空洞を示す図である。小さな空洞は、Ｋｉｔ単量体のＤ４のＡＢループおよびＥＦループ、Ｄ４−Ｄ５接続リンカーならびにＤ５のＤＥループおよびＦＧループの一部によって形成される。空洞を画定する残基は表４（以下）中に要約されている。空洞の形状および大きさは、Ｋｉｔ外部ドメイン二量体構造中で変化している。Ｄ４のＥＦループおよびストランドＧ、Ｄ４−Ｄ５リンカーならびにＤ５のストランドＢおよびＤＥループによって形成される主要な空洞は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の形成に重要な領域であるＤ４のＥＦループの下に位置する。空洞の近くに位置するＤ５のＤＥループは、非結合および占有されたＫｉｔ構造の両方の電子密度の低い品質によって明らかとなるように、高い柔軟性を有し得ることに留意されたい。図１８は、占有されていない単量体（Ａ）およびＳＣＦ−二量体（Ｂ）のリボン図、ならびにＤ４−Ｄ５ヒンジ領域の周辺の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【図１９Ａ】図１９は、Ｄ４ホモタイプ相互作用を媒介する領域での空洞を示す図である。ＫｉｔのＤ４のＣＤループおよびＥＦループによって形成される凹表面は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の真上に位置する。Ｄ４からの残基Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０は、外部ドメイン二量体構造中の凹表面に約１３０Ａ２の表面積を提供する。Ｄ４ホモタイプ境界領域中で重要な役割を果たすＧｌｕ３８６の側鎖は、表面の中心に向かって突出する。凹表面の特徴的な特長は、荷電残基（Ｇｌｕ３８６およびＬｙｓ３５８）によって囲まれた小さな疎水性パッチである。表面の大きさおよび接近可能性は、ホモタイプのＤ４：Ｄ４相互作用の際に変更され、ドメインの上部に向かって折り畳まれるＣＤループのコンフォメーション中で変化が起こる。凹表面の形成に関与する残基は表４（以下）中に要約されている。以下の図中のパネルＡは、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ４（示さず）上に重ねたＫｉｔの占有されていないＤ４ドメイン（金色）のリボン図、ならびにリガンドで占有された（緑色）外部ドメインの構造と占有されていない外部ドメインの構造（赤色）との間のＣＤおよびＥＦループの異なるコンフォメーションを示す。Ｄ４：Ｄ４相互作用に重要な残基はスティックモデルの様式で示されている。パネルＢおよびＣは、占有されていないＫｉｔ（図１９Ｂ）およびＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造（図１９Ｃ）のリボン図、ならびにＤ４ホモタイプ境界領域の上の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【図１９Ｂ】図１９は、Ｄ４ホモタイプ相互作用を媒介する領域での空洞を示す図である。ＫｉｔのＤ４のＣＤループおよびＥＦループによって形成される凹表面は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の真上に位置する。Ｄ４からの残基Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０は、外部ドメイン二量体構造中の凹表面に約１３０Ａ２の表面積を提供する。Ｄ４ホモタイプ境界領域中で重要な役割を果たすＧｌｕ３８６の側鎖は、表面の中心に向かって突出する。凹表面の特徴的な特長は、荷電残基（Ｇｌｕ３８６およびＬｙｓ３５８）によって囲まれた小さな疎水性パッチである。表面の大きさおよび接近可能性は、ホモタイプのＤ４：Ｄ４相互作用の際に変更され、ドメインの上部に向かって折り畳まれるＣＤループのコンフォメーション中で変化が起こる。凹表面の形成に関与する残基は表４（以下）中に要約されている。以下の図中のパネルＡは、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ４（示さず）上に重ねたＫｉｔの占有されていないＤ４ドメイン（金色）のリボン図、ならびにリガンドで占有された（緑色）外部ドメインの構造と占有されていない外部ドメインの構造（赤色）との間のＣＤおよびＥＦループの異なるコンフォメーションを示す。Ｄ４：Ｄ４相互作用に重要な残基はスティックモデルの様式で示されている。パネルＢおよびＣは、占有されていないＫｉｔ（図１９Ｂ）およびＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造（図１９Ｃ）のリボン図、ならびにＤ４ホモタイプ境界領域の上の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【図１９Ｃ】図１９は、Ｄ４ホモタイプ相互作用を媒介する領域での空洞を示す図である。ＫｉｔのＤ４のＣＤループおよびＥＦループによって形成される凹表面は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の真上に位置する。Ｄ４からの残基Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０は、外部ドメイン二量体構造中の凹表面に約１３０Ａ２の表面積を提供する。Ｄ４ホモタイプ境界領域中で重要な役割を果たすＧｌｕ３８６の側鎖は、表面の中心に向かって突出する。凹表面の特徴的な特長は、荷電残基（Ｇｌｕ３８６およびＬｙｓ３５８）によって囲まれた小さな疎水性パッチである。表面の大きさおよび接近可能性は、ホモタイプのＤ４：Ｄ４相互作用の際に変更され、ドメインの上部に向かって折り畳まれるＣＤループのコンフォメーション中で変化が起こる。凹表面の形成に関与する残基は表４（以下）中に要約されている。以下の図中のパネルＡは、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ４（示さず）上に重ねたＫｉｔの占有されていないＤ４ドメイン（金色）のリボン図、ならびにリガンドで占有された（緑色）外部ドメインの構造と占有されていない外部ドメインの構造（赤色）との間のＣＤおよびＥＦループの異なるコンフォメーションを示す。Ｄ４：Ｄ４相互作用に重要な残基はスティックモデルの様式で示されている。パネルＢおよびＣは、占有されていないＫｉｔ（図１９Ｂ）およびＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造（図１９Ｃ）のリボン図、ならびにＤ４ホモタイプ境界領域の上の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【図２０Ａ】図２０は、リガンド結合するＤ２およびＤ３領域での凹表面を示す図である。浅い凹表面が、Ｄ２およびＤ３のリガンド結合表面の一部の上に位置する。小さなポケットに関与する残基は、Ｄ２からのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３からのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９である。ポケットは、親水性残基によって囲まれた小さな疎水性パッチによって形成される。占有されていないＫｉｔ構造とＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造との間で大きな変更はなく、全体的な埋没表面積は約５００Ａ２である。図ＡおよびＢは、占有されていないＫｉｔ（Ａ）およびＳＣＦと結合したＫｉｔ（Ｂ）のリボン図、ならびにＤ２−Ｄ３ポケットのメッシュ表示を示す。
【図２０Ｂ】図２０は、リガンド結合するＤ２およびＤ３領域での凹表面を示す図である。浅い凹表面が、Ｄ２およびＤ３のリガンド結合表面の一部の上に位置する。小さなポケットに関与する残基は、Ｄ２からのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３からのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９である。ポケットは、親水性残基によって囲まれた小さな疎水性パッチによって形成される。占有されていないＫｉｔ構造とＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造との間で大きな変更はなく、全体的な埋没表面積は約５００Ａ２である。図ＡおよびＢは、占有されていないＫｉｔ（Ａ）およびＳＣＦと結合したＫｉｔ（Ｂ）のリボン図、ならびにＤ２−Ｄ３ポケットのメッシュ表示を示す。
【図２１Ａ】図２１は、ＰＤＧＦ受容体の膜近位領域の、構造に基づく配列解析および相同性モデリングを示す図である。図２１Ａは、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＫｉｔのＤ４のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１４８から１５７）のアラインメントを示す。ＩｇＳＦの折り畳みにおいて主要な残基およびヒトＫｉｔ構造のＤ４のＩｇの折り畳みのコア残基のアミノ酸は、それぞれ赤色および緑色に色づけされている。Ｄ４ホモタイプ相互作用に関与する２つの主要な塩基性および酸性の残基は、それぞれ青色および赤色の四角で囲まれている。Ｉｇ様ドメイン上の保存されたジスルフィド結合形成システイン残基に対応する位置（Ｂ５およびＦ５）は、星印によって示されている。βストランドは、Ｋｉｔ配列の下の矢印によって標識されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って示されている。図２１Ｂは、ＰＤＧＦＲの細胞外ドメインの膜近位領域のモデルを示す。ＰＤＧＦＲβ外部ドメインの膜近位領域は白色に色づけされており、透明な分子表面を有するリボンとして示されている（Ｄ４はオレンジ色に色づけされており、Ｄ５はピンク色に色づけされている、左パネル）。２つの隣接するＰＤＧＦＲβ分子のＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（右パネル）は、Ｄ４間の相互作用が、２つの隣接するＥＦループから突出した残基Ａｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０によって媒介されることを示している。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。
【図２１Ｂ】図２１は、ＰＤＧＦ受容体の膜近位領域の、構造に基づく配列解析および相同性モデリングを示す図である。図２１Ａは、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＫｉｔのＤ４のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１４８から１５７）のアラインメントを示す。ＩｇＳＦの折り畳みにおいて主要な残基およびヒトＫｉｔ構造のＤ４のＩｇの折り畳みのコア残基のアミノ酸は、それぞれ赤色および緑色に色づけされている。Ｄ４ホモタイプ相互作用に関与する２つの主要な塩基性および酸性の残基は、それぞれ青色および赤色の四角で囲まれている。Ｉｇ様ドメイン上の保存されたジスルフィド結合形成システイン残基に対応する位置（Ｂ５およびＦ５）は、星印によって示されている。βストランドは、Ｋｉｔ配列の下の矢印によって標識されている。二次構造要素はＩｇＳＦ命名法に従って示されている。図２１Ｂは、ＰＤＧＦＲの細胞外ドメインの膜近位領域のモデルを示す。ＰＤＧＦＲβ外部ドメインの膜近位領域は白色に色づけされており、透明な分子表面を有するリボンとして示されている（Ｄ４はオレンジ色に色づけされており、Ｄ５はピンク色に色づけされている、左パネル）。２つの隣接するＰＤＧＦＲβ分子のＤ４−Ｄ４境界領域の近接図（右パネル）は、Ｄ４間の相互作用が、２つの隣接するＥＦループから突出した残基Ａｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０によって媒介されることを示している。主要なアミノ酸が標識され、スティックモデルとして示されている。
【図２２】図２２は、ＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦＲ活性化がＤ４中の変異によって損なわれることを示す実験の結果を示す図である。図２２Ａは、ＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ誘導性のチロシン自己リン酸化が、ＰＤＧＦＲβのＥ３９０Ａ、Ｒ３８５Ａ、ＲＥ／ＡＡ、およびＲＫＥ／ＡＡＡ変異体を発現する細胞において強く損なわれていることを示す実験の結果を示す。図２２Ｂは、野生型および変異体ＰＤＧＦＲβの置換曲線を示すグラフである。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ４を用いた曲線への適合によって決定した。図２２Ｃは、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ変異がＰＤＧＦＲの固有のチロシンキナーゼ活性に影響を与えないことを示す免疫ブロットからの結果を示す。
【図２３】図２３は、ＰＤＧＦで刺激した、Ｄ４ドメインが変異したＰＤＧＦＲβが、不活性の二量体の形態で細胞表面上に発現されていることを示す、免疫沈降実験からの結果を示す図である。細胞溶解物を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降させ、免疫ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、それぞれ抗ｆｌａｇ抗体（左パネル）および抗ホスホチロシン抗体（右パネル）を用いて免疫ブロットした。
【図２４】図２４は、ＰＤＧＦ誘導性の細胞応答がＰＤＧＦＲβのＤ４変異体中の変異によって損なわれることを示す免疫沈降実験からの結果を示す図である。
【図２５】図２５は、アクチン環形成のＰＤＧＦ刺激がＰＤＧＦＲのＤ４変異体を発現するＭＥＦ中で損なわれていることを示す実験からの結果を示す図である。５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで２分間刺激した後に、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦの約８３％が環状アクチン環形成を示した一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異細胞の５％のみが同様の環状アクチン環形成を示した。さらに、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦにおいてＰＤＧＦ刺激の２〜５分後にピークとなる一過性の環状アクチン環形成は、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞中で弱く検出された。
【図２６Ａ】図２６は、ＰＤＧＦＲの内在化およびユビキチン媒介性のＰＤＧＦＲの分解がＰＤＧＦＲのＤ４中の変異によって損なわれることを示す実験の結果を示す図である。図２６Ａは、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦと結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態が、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲを発現する細胞と結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態よりもはるかに速いことを示すグラフである。図２６Ｂは、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体の分解の動態が強く減じられたことを示し、ＷＴ  ＰＤＧＦＲの半分がＰＤＧＦ刺激の１．５時間以内に分解された一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体の半減期は約４〜６時間まで伸びていた。図２６Ｃは、Ｅ３９０Ａ  ＰＤＧＦＲのユビキチン化のＰＤＧＦ誘導性の刺激も、同様の条件下でＷＴ  ＰＤＧＦＲと比較して強く低下したことを示す実験を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、ＰＤＧＦＲの内在化およびユビキチン媒介性のＰＤＧＦＲの分解がＰＤＧＦＲのＤ４中の変異によって損なわれることを示す実験の結果を示す図である。図２６Ａは、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦと結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態が、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲを発現する細胞と結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態よりもはるかに速いことを示すグラフである。図２６Ｂは、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体の分解の動態が強く減じられたことを示し、ＷＴ  ＰＤＧＦＲの半分がＰＤＧＦ刺激の１．５時間以内に分解された一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体の半減期は約４〜６時間まで伸びていた。図２６Ｃは、Ｅ３９０Ａ  ＰＤＧＦＲのユビキチン化のＰＤＧＦ誘導性の刺激も、同様の条件下でＷＴ  ＰＤＧＦＲと比較して強く低下したことを示す実験を示す。
【図２６Ｃ】図２６は、ＰＤＧＦＲの内在化およびユビキチン媒介性のＰＤＧＦＲの分解がＰＤＧＦＲのＤ４中の変異によって損なわれることを示す実験の結果を示す図である。図２６Ａは、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦと結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態が、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲを発現する細胞と結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態よりもはるかに速いことを示すグラフである。図２６Ｂは、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体の分解の動態が強く減じられたことを示し、ＷＴ  ＰＤＧＦＲの半分がＰＤＧＦ刺激の１．５時間以内に分解された一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体の半減期は約４〜６時間まで伸びていた。図２６Ｃは、Ｅ３９０Ａ  ＰＤＧＦＲのユビキチン化のＰＤＧＦ誘導性の刺激も、同様の条件下でＷＴ  ＰＤＧＦＲと比較して強く低下したことを示す実験を示す。
【図２７】図２７は、Ｄ４境界領域の破壊がＫＩＴ中の腫瘍発生性変異を遮断することを示す実験の結果を示す図である。野生型ＫＩＴへのＳＣＦ刺激は、ＫＩＴの増強されたチロシン自己リン酸化によって明らかとなるＫＩＴの活性化の増強をもたらす。この実験は、ＫＩＴの腫瘍発生性のＤ５−反復変異体が構成的にチロシン自己リン酸化されていることをさらに示す。対照的に、Ｄ５−反復／Ｅ３８６Ａ変異体は、腫瘍発生性のＤ５−反復変異によって媒介されるＫＩＴの構成的なチロシン自己リン酸化を遮断する。
【図２８】図２８は、ＫＩＴ−Ｄ４のホモタイプ相互作用モチーフに対応するペプチドに向けられた抗体が完全長のＫＩＴ受容体を認識することを示す免疫ブロット実験の結果を示す図である。
【図２９】図２９Ａは、様々な種からのＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のＤ７の予測されたＥＦ−ループ領域の、構造に基づく複数配列アラインメントを示す図である。ＩセットＩｇフレーム中の主要なアミノ酸が緑色で強調されており、ＥＦループ中の保存されたＡｒｇ／Ａｓｐ対が赤色で強調されている。図２９Ｂは、ＶＥＧＦＲのＤ４とＫＩＴ、ＣＳＦ１ＲおよびＰＤＧＦＲ（ＩＩＩ型ＲＴＫ）のＤ４との予測されたＥＦ−ループ領域の比較を示す。ＩセットＩｇフレーム中の主要なアミノ酸が緑色で強調されており、ＥＦループ中の保存されたＡｒｇ／ＡｓｐまたはＧｌｕ対が赤色で強調されている。ＥＦ−ループ中の逆の荷電を有する保存されていないアミノ酸が青色で強調されている。保存されたＹ−コーナー（ｃｏｎｎｅｒ）モチーフが＊で示されている。
【図３０】図３０は、ＶＥＧＦＲ２のリガンド誘導性の活性化がＤ７のＥＦループ領域中の変異によって損なわれるが、Ｄ４のＥＦループ領域中の変異によっては影響を受けないことを示す図である。図３０Ａは、野生型ＶＥＧＦＲ２、Ｒ７２６ＡまたはＥ７３１Ａ  ＶＥＧＦＲ２変異体を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、示した量のＶＥＧＦで、５分間、３７℃で刺激したことを示す。刺激していないかまたはＶＥＧＦで刺激した細胞からの溶解物を、抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いた免疫沈降、次いで、抗ｐＴｙｒまたは抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いた免疫ブロッティング（ＩＢ）に供した。同じ実験からの全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、次いで、抗ホスホＭＡＰＫ（ｐＭＡＰＫ）または抗ＭＡＰＫ抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。図３０Ｂは、ＷＴ  ＶＥＧＦＲ２−ＰＤＧＦＲキメラ受容体またはＤ７領域中に変異（Ｒ７２６Ａ、Ｄ７３１ＡもしくはＲ７２６／Ｄ７３１二重変異体ＲＤ／２Ａ）を保有するキメラ受容体を安定に発現する血清欠乏させた３Ｔ３細胞を、ＶＥＧＦで５分間、３７℃で刺激したことを示す。刺激していないかまたはＶＥＧＦで刺激した細胞からの溶解物を、キメラ受容体の細胞質領域に対する抗体を用いた免疫沈降、次いで、それぞれ抗ｐＴｙｒまたは抗タグ（ＦＬＡＧ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した。図３０Ｃは、ＷＴ  ＶＥＧＦＲ１−ＰＤＧＦＲキメラ受容体またはＤ７領域中に変異（Ｒ７２１Ａ、Ｄ７２５ＡもしくはＲ７２１Ｄ７２５／２Ａ二重変異）を保有するキメラ受容体を安定に発現する血清欠乏させた３Ｔ３細胞を、ＶＥＧＦで５分間、３７℃で刺激したことを示す。刺激していないかまたはＶＥＧＦで刺激した細胞からの溶解物を、キメラ受容体の細胞質領域に向けられた抗体を用いた免疫沈降、次いで、それぞれ抗ｐＴｙｒまたは抗タグ（ＦＬＡＧ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した。図３０Ｄは、ＷＴ  ＶＥＧＦＲ２−ＰＤＧＦＲキメラ受容体またはＤ４領域中に変異（Ｄ３９２ＡもしくはＤ３８７／Ｒ３９１Ａ二重変異）を保有するキメラ受容体を発現する３Ｔ３細胞を、図３０Ａに記載のように分析したことを示す。
【図３１】図３１は、ＶＥＧＦＲ２外部ドメインのＤ７の二量体の構造を示す図である。図３１Ａは、リボン図およびＤ７ホモ二量体の構造の透明な分子表面を示す（側面図）。Ａｓｐ７３１およびＡｒｇ７２６がスティックモデルとして示されている。図３１Ｂは、２つの隣接する分子（ピンク色および緑色）のホモタイプのＤ７境界領域の近接図を示す。Ａｓｐ７３１およびＡｒｇ７２６によって形成された塩橋が破線として示されている。図３１Ｃは、Ｄ７ホモ二量体（側面図）の荷電分布を表面電位モデルとして示す（左パネル）。ホモタイプ接触を媒介するＤ７の表面の図（右パネル）。図３１Ｄは、Ｄ７−Ｄ７境界領域の図を示す、１．１σレベルの等高線の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを示す。ＶＥＧＦＲのＤ７プロトマーの主鎖は、それぞれピンク色および黄色のチューブとして表されている。
【図３２】図３２は、ＶＥＧＦＲ２のＤ７の構造と二量体ＫＩＴ−ＳＣＦ複合体のＤ４の構造との重ね合わせを示す図である。ＶＥＧＦＲのＤ７の構造（ＰＤＢ  ＩＤコード：３ＫＶＱ）およびＳＣＦとの複合体中のＫＩＴの二量体（ＰＤＢ  ＩＤコード：２Ｅ９Ｗ）の重ね合わせ（左パネル）。重ね合わせたＤ７およびＤ４領域のより近接した図が、ドメイン構成およびホモタイプ接触の高い類似度を明らかにする（右パネル）。ＶＥＧＦＲのＤ７は緑色で、およびＥＦループは黄色で例示されている。ＫＩＴのＤ４は灰色で、およびそのＥＦループはオレンジ色で例示されている。
【図３３】図３３は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の系統学的分析を示す図である。図３３Ａは、様々な種からのＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫ中の保存されたＥＦ−ループの位置を示す。保存されたＥＦ−ループモチーフを含有するＩｇ様ドメインが青色で示されている。図３３Ｂは、ＶＥＧＦＲ２のＤ７領域の色分けした保存パターンを示す。ヒトＶＥＧＦＲのアミノ酸配列を、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して非重複データベース（ｎｒ）を相同配列について検索するためのクエリとして使用した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｏｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁（１９９０年））。Ｄ７の配列アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２を使用して行い（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻（２２号）：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））、２０の主要な残基についてのＩｇＳＦの折り畳みの制約に基づいて手動で調節した。アミノ酸配列のアラインメントをＣｏｎｓｕｒｆ３．０サーバーに供して（Ｌａｎｄａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３巻（ウェブサーバー号）：Ｗ２９９〜３０２頁（２００５年））、それぞれの位置の最大尤度の正規化された進化率を生成した。シアン色からえび茶色を使用して、可変的アミノ酸から保存されたアミノ酸を標識している。図３３Ｃは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の系統樹が、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２の使用に基づいた隣接−連結（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ−ｊｏｉｎｉｎｇ）方法によって作成されたことを示す。分析に使用したアミノ酸配列には、ＶＥＧＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ（ｇｉ：１１３２１５９７）、ＶＥＧＦＲ２＿ＤＯＧ（ｇｉ：１１４１５８６３２）、ＶＥＧＦＲ２＿ＨＯＲＳＥ（ｇｉ：１９４２０９１５４）、ＶＥＧＦＲ２＿ＣＡＴＴＬＥ（ｇｉ：１５８５０８５５１）、ＶＥＧＦＲ２＿ＲＡＴ（ｇｉ：５６２６９８００）、ＶＥＧＦＲ２＿ＭＯＵＳＥ（ｇｉ：２７７７７６４８）、ＶＥＧＦＲ２＿ＣＨＩＣＫ（ｇｉ：５２１３８６３９）、ＶＥＧＦＲ２＿ＱＵＡＩＬ（ｇｉ：１７１８１８８）、ＶＥＧＦＲ２＿ＺＥＢＲＡＦＩＳＨ（ｇｉ：４６４０１４４４）、ＶＥＧＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ｇｉ：１４３８１１４７４）、ＶＥＧＦＲ１＿ＭＯＵＳＥ（ｇｉ：１４８６７３８９２）、ＶＥＦＧＲ１＿ＲＡＴ（ｇｉ：１４９０３４８３５）、ＶＥＦＧＲ１＿ＨＯＲＳＥ（ｇｉ：１４９７３０１１９）、ＶＥＧＦＲ１＿ＣＨＩＣＫ（ｇｉ：８２１０５１３２）、ＶＥＧＦＲ１＿ＺＥＢＲＡＦＩＳＨ（ｇｉ：７２５３５１４８）、ＶＥＧＦＲ＿ＳＥＡＵＲＣＨＩＮ（ｇｉ：１４４２２６９８８）、ＶＥＲ１＿Ｃ＿ＥＬＥＧＡＮＳ（ｇｉ：６００３６９４）、ＶＥＲ３＿Ｃ＿ＥＬＥＧＡＮＳ（ｇｉ：３８７７９６７）、ＶＥＲ４＿Ｃ＿ＥＬＥＧＡＮＳ（ｇｉ：３８７７９６８）、ＰＶＲ＿ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ（ｇｉ：４５５５２２５２）、ＶＥＧＦＲ＿ＳＥＡＳＱＵＩＲＴ（ｇｉ：１９８４３４０５２）が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼ、たとえばＶＥＧＦ受容体、たとえばヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）の外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはＩｇ様ドメイン間のヒンジと結合する部分、たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分、小分子、ペプチド性分子、アプタマー、およびアドネクチンを提供する。本発明の部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを不活性状態に固定し、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害することができる。本発明の一実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインを単量体状態に固定する。本発明の別の実施形態では、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインが二量体化することを可能にするが、２つの単量体のＩｇ様ドメイン（たとえばＶＥＧＦ受容体のＤ７−Ｄ７ドメイン）間の配置、配向および／または距離に影響を与え、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害する。言い換えれば、部分は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインの、リガンド誘導性の二量体化を可能にするが、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与えるか、またはＶＥＧＦ受容体中のコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ、それによってＶＥＧＦ受容体の活性を阻害する（たとえば、受容体の内在化を阻害する、および／または受容体のチロシン自己リン酸化を阻害する、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力を阻害する）場合がある。本発明は、少なくとも部分的に、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２の外部ドメイン全体の結晶構造の解読に基づく。この結晶構造の解読により、本発明の部分が標的とし得るエピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープの同定が可能となった。
【００６２】
本明細書中で使用する用語「部分」には、外部ドメイン、たとえば受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合する任意の部分が含まれることを意図し、部分は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態、たとえば単量体状態に固定し、それによって受容体チロシンキナーゼの活性に拮抗する。部分は、単離された抗体もしくはその抗原結合性一部分、小分子、ペプチド性分子（たとえば、受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインの構造に基づいて設計されているペプチド性分子）、アプタマーまたはアドネクチンであることができる。一部の態様では、部分は、受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインを接続するヒンジ領域（たとえば、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ３−Ｄ４またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域）と結合する。
【００６３】
一部の実施形態では、部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体の特定の配列、たとえば、ＶＥＧＦＲ１の残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ２の残基７２４〜７３３、ＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ３の残基７３５〜７４４、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合する。あるいは、部分は、ヒトＫｉｔ受容体の特定の配列、たとえば、ヒトＫｉｔの残基３０９〜４１３、残基４１０〜５１９、３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕ、または４１８Ｔｙｒおよび５０５Ａｓｎと結合する。残基３０９〜４１３がヒトＫｉｔのＤ４ドメインを含み、残基４１０〜５１９がＤ５ドメインを含み、本明細書においてＫｉｔ受容体の二量体化に重要であると示されている。残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕは、本明細書中においてＤ４ドメインの非共有結合性会合、したがって受容体の二量体化に重要であると示されている、ＫｉｔのＤ４ドメイン中の残基である。同様に、残基４１８Ｔｙｒおよび５０５Ａｓｎは、本明細書中において受容体の二量体化に重要であると示されている、ＫｉｔのＤ５ドメイン中の残基である。当業者には、前述の残基と特異的に結合する部分が、たとえば２つの単量体ＫｉｔまたはＶＥＧＦ受容体分子の二量体化を妨げることによって、受容体の活性に拮抗できることが理解されよう。
【００６４】
さらなる実施形態では、部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体中の変異したアミノ酸残基と結合し、上記アミノ酸残基は、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０もしくはＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６もしくはＡｓｐ７３１、またはＶＥＧＦＲ３のＡｒｇ７３７もしくはＡｓｐ７４２のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態では、部分は、ヒトＫｉｔ中の変異したアミノ酸残基と結合し、上記アミノ酸残基は、４１７Ｔｈｒ、４１８Ｔｙｒ、４１９Ａｓｐ、４２１Ｌｅｕ、４２０Ａｒｇ、５０３Ｔｙｒ、または５０２Ａｌａのうちの少なくとも１つである。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の部分は、表４（以下）中に記載の小さな空洞またはポケットを構成するＫｉｔ受容体中の１つまたは複数の残基と結合する。たとえば、本発明の部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域中の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｄ３ドメインからのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２およびＤ４ドメインからのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３。また、本発明の部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ４ドメイン中で凹表面を構成する以下の残基のうちの１つまたは複数とも結合し得る：Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０。別の実施形態では、本発明の部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ２−Ｄ３ヒンジ領域中でポケットを形成する以下の残基のうちの１つまたは複数と結合する：Ｄ２ドメインからのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３ドメインからのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９。
【００６６】
したがって、一部の実施形態では、本発明の部分は、近接したアミノ酸残基または近接していないアミノ酸残基と結合し、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能し得る。また、本発明の部分は、ホモタイプもしくはヘテロタイプのＤ４もしくはＤ５受容体の相互作用を妨げるかまたはリガンド−受容体の相互作用部位を不安定化するようにも作用し得る。一部の好ましい実施形態では、本発明の部分は、Ｋｉｔ受容体上の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合する：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。当業者には、一部の実施形態では、本発明の部分は、他のＩＩＩ型ＲＴＫ中の対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【００６７】
具体的な実施形態では、本発明の部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープと結合する。コンフォメーションまたは不連続エピトープは、ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばヒトＫｉｔ受容体またはＰＤＧＦ受容体からのＤ３、Ｄ４、および／もしくはＤ５ドメインまたはＤ４−Ｄ５もしくはＤ３−Ｄ４ヒンジ領域からの２つ以上の残基から構成され得る。たとえば、コンフォメーションまたは不連続エピトープは、表４中に記載した残基のうちの２つ以上から構成され得る。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明の部分は、Ｙ１２５、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸からなるコンフォメーションエピトープと結合する。類似の実施形態では、本発明の部分は、以下のアミノ酸の群のうちの１つから選択される、２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合し得る：Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｆ２０８、およびＴ２９５；Ｌ２２２、Ａ３３９、Ｆ３４０、Ｋ３４２、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３１２、Ｅ３３８、Ｆ３４０、およびＩ３７１；Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｇ３１１、Ｆ３４０、Ｐ３４１、およびＤ３９８；Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｎ３６７、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｇ３８４、Ｔ３８５、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、およびＫ４７１；Ｙ４０８、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｋ４７１、およびＬ４７２；Ｆ３２４、Ｖ３２５、Ｎ３２６、およびＮ４１０；Ｄ３２７、Ｎ４１０、Ｔ４１１、Ｋ４１２、およびＶ４９７；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｖ４０９、およびＫ４７１；Ｌ３８２、Ｇ３８７、Ｖ４０７、およびＶ４０９；Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９；Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｔ４１１、Ｆ４３３、Ｆ４６９、Ｇ４７０、およびＫ４７１；Ｄ３２７、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ａ４３１、Ｇ４３２、およびＫ４７１；Ｙ３５０、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０；Ｙ３５０、Ｒ３５３、およびＦ３５５。上述のように、本発明の部分は、表４中に同定したポケットもしくは空洞を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらはポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の部分に言及した場合、その意図は、部分がエピトープ（たとえば表４中に同定したポケットまたは空洞）を構成する具体的な残基のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明の部分は、表５中に記載のペプチドから選択される２つ以上のアミノ酸残基から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、第１のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基および第２のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基から構成され、第１および第２のペプチドは、表５中に記載のペプチドの群から選択される。したがって、本発明の部分はコンフォメーションエピトープと結合してよく、表５からの前記第１および第２のペプチド群は以下のとおりである：Ａｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２およびＴｈｒ３０４−Ｖａｌ３０８；Ａｓｐ３０９−Ｇｌｙ３１１およびＡｒｇ２２４−Ｇｌｙ２２６；Ｔｈｒ３０３−Ｇｌｕ３０６およびＡｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２；Ａｓｎ３６７−Ａｓｎ３７０およびＳｅｒ２１７−Ｔｙｒ２２１；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＡｓｎ３９６−Ｖａｌ３９９；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＧｌｕ３６８−Ａｒｇ３７２；Ｌｙｓ３５８−Ｔｙｒ３６２およびＶａｌ３７４−Ｈｉｓ３７８；Ａｓｐ３５７−Ｇｌｕ３６０およびＬｅｕ３７７−Ｔｈｒ３８０；Ｍｅｔ３５１−Ｇｌｕ３６０およびＨｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９；Ｈｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９およびＶａｌ３２３−Ａｓｐ３３２；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４９３−Ｔｈｒ５００；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４３１−Ｔｈｒ４３７；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＰｈｅ４６９−Ｖａｌ４７３；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＶａｌ３２５−Ａｓｎ３３０；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｒｇ３８１−Ｇｌｙ３８７；Ｇｌｙ４６６−Ｌｅｕ４７２およびＧｌｙ３８４−Ｇｌｙ３８８；Ｖａｌ３２５−Ｇｌｕ３２９およびＴｙｒ４９４−Ｌｙｓ４９９；Ｔｈｒ４１１−ｌｅｕ４１６およびＶａｌ４９７−Ａｌａ５０２；Ｉｌｅ４１５−Ｌｅｕ４２１およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７；Ａｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＬｙｓ４８４−Ｔｈｒ４８８；およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＧｌｙ４４５−Ｃｙｓ４５０。本発明の部分は、前述の第１および第２のペプチド群を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらは第１および第２のペプチド群を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の部分に言及した場合、その意図は、部分がエピトープを構成する具体的な残基（たとえば表５中に同定した具体的なペプチド）のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の部分は、Ｅ３３、Ｐ３４、Ｄ７２、Ｅ７６、Ｎ７７、Ｋ７８、Ｑ７９、Ｋ１５８、Ｄ１５９、Ｎ２５０、Ｓ２５１、Ｑ２５２、Ｔ２５３、Ｋ２５４、Ｌ２５５、Ｎ２６０、Ｗ２６２、Ｈ２６４、Ｇ２６５、Ｅ３４４、Ｎ３５２、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｔ３５６、Ｄ３５７、Ｙ３６２、Ｓ３６５、Ｅ３６６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、およびＧ４６６からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションまたは不連続エピトープと結合する。
【００７１】
別の実施形態では、本発明の部分は、ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の部分は、ヒトＰＤＧＦＲβのアミノ酸残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕ、またはＰＤＧＦＲα中の対応する残基と結合する。ヒトＰＤＧＦＲβの残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕは、Ｋｉｔ受容体の残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕに類似しており、ＰＤＧＦＲβのホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用を媒介する。本発明の部分は、チロシンキナーゼの活性化に必須の距離および配向での細胞質ドメインの配置に必須の、ＩＩＩ型ＲＴＫの膜近位領域間の重要なホモタイプ相互作用（ヒトＰＤＧＦＲβの３８５Ａｒｇと３９０Ｇｌｕとの間に形成された塩橋など）を妨げることによって、受容体の活性化に対するその阻害効果を発揮し得る。本明細書中に記述した実験は、ホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用はＰＤＧＦＲβの二量体化に必要ではなく、ＰＤＧＦＲβの二量体化は受容体の活性化に必要であるが十分ではないことを示している。したがって、本発明の部分は、ＰＤＧＦＲβの二量体化を可能にする一方で、活性化を妨げ得る。構造に基づく配列アラインメントにより、ＥＦループの大きさ、ならびにＤ４−Ｄ４境界領域を含む重要なアミノ酸は、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１Ｒ中で保存されていることが示されている。したがって、一部の実施形態では、本発明の部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４またはＤ５ドメインの保存された領域に対して標的化し得る。本発明の部分が、ＲＴＫのグリコシル化形態上に現れてもよい糖残基に結合してもよいこともまた、当業者によって十分に理解されるであろう。本発明の部分が、アミノ酸残基および糖残基の両方から構成されるエピトープに結合するであろうということがさらに考えられる。
【００７３】
用語「受容体チロシンキナーゼ」および「ＲＴＫ」は、チロシン残基をリン酸化する膜受容体の周知のファミリーを指すために互換性があるように本明細書において使用される。多数が、発生または細胞分裂において重要な役割を果たす。受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内触媒ドメインを有する。細胞外ドメインは、サイトカイン、増殖因子、または他のリガンドに結合し、システインリッチ領域、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、カドヘリン様ドメイン、クリングル様ドメイン、第ＶＩＩＩ因子様ドメイン、グリシンリッチ領域、ロイシンリッチ領域、酸性領域、およびジスコイジン様ドメインを含む、１つまたは複数の同定可能な構造モチーフから一般に構成される。細胞内キナーゼドメインの活性化は、細胞外ドメインへのリガンド結合によって達成され、これは、受容体の二量体化を誘発する。このように活性化された受容体は、触媒ドメインの外側のチロシン残基を自己リン酸化し、活性な受容体のコンフォメーションの安定化を促進することができる。リン酸化された残基はまた、タンパク質（これは、次いで細胞内でのシグナルへと変換する）に対する結合部位としても働く。ＲＴＫの例は、Ｋｉｔ受容体（幹細胞因子受容体またはＳＣＦ受容体としても公知）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体、神経増殖因子（ＮＧＦ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＰＤＧＦ受容体−α、ＰＤＧＦ受容体−β、ＣＳＦ−１受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体またはＦｍｓとしても公知）、およびＦｌｔ３受容体（Ｆｌｋ２としても公知）を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、ＲＴＫは、ＩＩＩ型ＲＴＫである。本発明の別の実施形態では、ＲＴＫは、Ｖ型ＲＴＫ、つまりＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。
【００７５】
本明細書において使用されるように、用語「受容体チロシンキナーゼのＩＩＩ型ファミリー」または「ＩＩＩ型ＲＴＫ」は、それらの外部ドメインにおいて５つの免疫グロブリン様ドメインまたはＩｇ様ドメインを典型的に含有する受容体チロシンキナーゼを含むように意図される。ＩＩＩ型ＲＴＫの例は、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｆｌｔ３受容体（Ｆｌｋ２としても公知）、およびＫｉｔ受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、ＩＩＩ型ＲＴＫは、Ｋｉｔ（ＳＣＦ受容体としても当技術分野において公知である）である。Ｋｉｔは、他のＩＩＩ型ＲＴＫと同様に、１回膜貫通（ＴＭ）ドメインの手段によって細胞質領域に接続されるグリコシル化細胞外リガンド結合ドメイン（外部ドメイン）から構成される（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（２０００年）Ｃｅｌｌ  １０３巻：２１１〜２２５頁において概説される）。ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばＫｉｔまたはＰＤＧＦＲの他の特徴は、大きなキナーゼ挿入領域を有する細胞質タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインである。Ｋｉｔ受容体の少なくとも２つのスプライスアイソフォームが存在することが公知であり、短い方は、インフレームスプライス部位を利用する。Ｋｉｔのすべてのアイソフォームおよび他の上記に記載されるＲＴＫは、本発明によって包含される。
【００７６】
本明細書において使用されるように、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の「Ｉｇ様ドメイン」は、ＲＴＫの外部ドメイン中に存在することが当技術分野において周知であるドメインを含むように意図される。ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ（ＩＩＩ型ＲＴＫ）、たとえばＫｉｔのファミリーの外部ドメインでは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５として公知である、５つのそのようなドメインがある。ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ１、Ｄ２、およびＤ３ドメインは、ＲＴＫのリガンドへの結合に関与する（ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁において概説される）。したがって、本発明の一実施形態では、用語「Ｉｇ様ドメイン」は、リガンド結合に関与するＲＴＫのドメインを含むようには意図されない。本発明の好ましい実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４および／またはＤ５ドメインである。ＶＥＧＦ受容体ファミリーの外部ドメインでは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、およびＤ７として公知の、７つのＩｇ様ドメインがある。本発明の好ましい一実施形態では、Ｉｇ様ドメインは、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのＤ７ドメインである。
【００７７】
本明細書において使用されるように、Ｖ型ＲＴＫとしても公知である、用語「血管内皮増殖因子受容体」、「ＶＥＧＦ受容体」、または「ＶＥＧＦ受容体ファミリー」は、血管内皮増殖因子に対するＲＴＫ受容体を含む。上記に記載されるように、これらのＲＴＫは、それらの外部ドメインにおいて７つのＩｇ様ドメインを有する。ＶＥＧＦファミリー受容体の例は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１としても公知である）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦｌｋ−１としても公知である）、およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ−４としても公知である）である。
【００７８】
用語、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の「外部ドメイン」は、当技術分野で周知であり、ＲＴＫの細胞外部分（ｐａｒｔ）、すなわち、形質膜の外側にあるＲＴＫの部分（ｐａｒｔ）をいう。
【００７９】
用語、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインの「膜近位領域」とは、形質膜に対して近接しており、好ましくは、リガンドとＲＴＫとの結合に直接関与していない、ＲＴＫの細胞外部分（ｐａｒｔ）をいう。膜近位領域の例には、それだけには限定されないが、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４ドメイン、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ５ドメイン、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ３−Ｄ４ヒンジ領域、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ５ヒンジ領域、およびＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７ドメインが含まれる。
【００８０】
本明細書中で使用する用語「ホモタイプ相互作用」とは、２つの単量体受容体からの２つの同一の膜近位領域間の相互作用をいう。
【００８１】
本明細書中で使用する用語「ヘテロタイプ相互作用」とは、２つの単量体受容体からの２つの異なる膜近位領域間の相互作用をいう。ヘテロタイプ相互作用は、２つの異なる種類の単量体受容体の二量体化の結果、または同じ単量体受容体の野生型および変異体形態の二量体化の結果であり得る。たとえば、がん患者は、特定の受容体の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子を保有し得ることが当技術分野で周知である。
【００８２】
本明細書中で使用する用語「単量体状態」とは、ＲＴＫ分子が、同じかまたは異なる種類の第２のＲＴＫポリペプチドと会合していない単一のポリペプチド鎖から構成されている、ＲＴＫの状態をいう。ＲＴＫの二量体化は自己リン酸化および受容体の活性化をもたらす。したがって、単量体状態のＲＴＫは不活性状態にある。また、単量体状態は、単一のＲＴＫのＤ４、Ｄ５、またはＤ７ドメインが、それぞれ第２のＲＴＫのＤ４、Ｄ５、またはＤ７ドメインと会合していない状態でもある。
【００８３】
本明細書中で使用する「プロトマー」とは、ＲＴＫなどのオリゴマータンパク質の構造単位である。プロトマーは、定義された化学量論でアセンブルしてオリゴマーを形成し得るタンパク質サブユニットである。ＶＥＧＦＲ受容体チロシンキナーゼファミリーは、共有結合されたホモ二量体であり、それぞれのＶＥＧＦＲプロトマーは、４本のストランドのβ−シートから構成され、これは、逆平行の様式において構造に構成されており、「システインノット増殖因子」と命名されている。
【００８４】
語句「受容体チロシンキナーゼの外部ドメインを不活性状態に固定する」とは、受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する本発明の部分の能力をいう。言い換えれば、この語句には、不活性または阻害された受容体立体配置の形成に向かって平衡をシフトさせる、本発明の部分の能力が含まれる。たとえば、本発明の部分は、部分の非存在下での受容体の活性と比較して、受容体チロシンキナーゼの活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％阻害し得る。
【００８５】
本明細書中で使用する用語「不活性状態」とは、ＲＴＫ分子が下流のシグナル伝達を活性化させることができない、ＲＴＫの状態をいう。不活性状態とは、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインが二量体化することは可能であるが、２つの単量体のＩｇ様ドメイン（たとえば、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ４もしくはＤ５−Ｄ５ドメインまたはＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７−Ｄ７ドメイン）間の配置、配向、コンフォメーション、および／または距離が、受容体チロシンキナーゼの活性が阻害される（たとえば、受容体の内在化が阻害される、および／または受容体のチロシン自己リン酸化が阻害される、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力が阻害される）ように変更されている状態であり得る。また、不活性状態には、上述の単量体状態も含まれる。また、不活性状態とは、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインが受容体リガンドと結合しており、二量体化されているが、受容体の活性化を可能にするコンフォメーション変化を未だ受けていない状態でもあり得る。実施例２２〜２５は、ＲＴＫの活性化に重要であるが（たとえば、Ｄ４またはＤ５のホモタイプ相互作用を媒介することによって）、受容体の二量体化に必要ではない特定の保存されたアミノ酸残基が存在することを示す実験をさらに記述する。用語「不活性状態」には、本発明の部分が、部分の非存在下での受容体の活性と比較して、受容体チロシンキナーゼの活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低下または阻害し得る状態が含まれる。本明細書中に記述した機能的アッセイのうちの任意のものを使用して、受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する本発明の部分の能力を決定し得る。一部の実施形態では、本発明の部分は、たとえば、ほとんどまたはすべての標的ＲＴＫが不活性化されている場合に、幅広い効果を示し得る。他の実施形態では、本発明の部分は、たとえば、標的ＲＴＫの一部分が不活性化されている場合に、より狭い効果を示し得る。そのような実施形態では、前記部分の非存在下での受容体と比較して、受容体のうちの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が不活性状態に固定されている。
【００８６】
本明細書中で使用する用語「コンフォメーションエピトープ」または「非直鎖状エピトープ」または「不連続エピトープ」は、互換性があるように使用され、単一のタンパク質鎖中の連続していないアミノ酸である少なくとも２つのアミノ酸から構成されるエピトープをいう。たとえば、コンフォメーションエピトープは、介在アミノ酸のストレッチによって隔てられているが、本発明の部分によって単一のエピトープとして認識されるために十分に近い、２つ以上のアミノ酸から構成されていてもよい。さらなる例として、単一のタンパク質鎖上の介在アミノ酸によって隔てられているアミノ酸、または別々のタンパク質鎖上に存在するアミノ酸は、タンパク質の構造または複合体のコンフォメーション形状が原因で近接させられて、本発明の部分によって結合され得るコンフォメーションエピトープとなり得る。特定の不連続およびコンフォメーションエピトープが本明細書中に記載されている（たとえば表４および５を参照）。
【００８７】
当業者には、一般に、本発明の部分によって結合される直鎖状エピトープは、ＲＴＫの二次、三次、または四次構造に依存していても、していなくてもよいことが理解されよう。たとえば、一部の実施形態では、本発明の部分は、天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているか否かにかかわらず、アミノ酸の群と結合し得る。他の実施形態では、本発明の部分は、エピトープを構成する個々のアミノ酸残基を認識しない場合があり、エピトープを認識および結合するために特定のコンフォメーション（ベンド、ツイスト、ターンまたは折り畳み）を必要とする場合がある。
【００８８】
本明細書中で使用する用語「近接エピトープ」または「連続エピトープ」は、互換性があるように使用され、単一のタンパク質鎖中の連続したアミノ酸である少なくとも２つのアミノ酸から構成されるエピトープをいう。特定の近接エピトープは本明細書中に記載されている（たとえば表８を参照）。一実施形態では、本発明の部分は、ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。
【００８９】
本明細書中で使用する語句「疎水性アミノ酸」とは、疎水性特性を含むアミノ酸、たとえば、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、セリン、プロリンおよび本明細書中に記載の他のものをいう。
【００９０】
本発明の様々な態様は、以下のサブセクション中にさらに詳述されている。
【００９１】
Ｉ．ヒト受容体チロシンキナーゼの外部ドメインと結合する抗体
本発明の一態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合する部分は、抗体またはその抗原結合断片である。
【００９２】
本明細書中で言及する用語「抗体」には、完全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合性一部分」）または単鎖が含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性一部分をいう。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で構成された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた、免疫グロブリンと宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００９３】
本明細書中で使用する用語、抗体の「抗原結合性一部分」（または単に「抗体の一部分」）とは、抗原（たとえば、ＫｉｔのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン）と特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つまたは複数の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。用語、抗体の「抗原結合性一部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  （Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照）、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁）、（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を使用して、これらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって一緒にすることができ、ここではＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、たとえば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照）。そのような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合性一部分」内に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングする。
【００９４】
本明細書中で使用する「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図する（たとえば、ＲＴＫのＩｇ様ドメインと特異的に結合する単離された抗体は、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。しかし、「単離された抗体」には、そのすべてがたとえばＲＴＫのＩｇ様ドメインと特異的に結合するポリクローナル抗体が含まれ得る。
【００９５】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００９６】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入された変異）が含まれ得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体が含まれることを意図しない。
【００９７】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００９８】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（たとえばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（以下にさらに記載）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞、たとえばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合はｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞性変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖系列のレパートリー中に天然では存在しないであろう配列である。
【００９９】
本明細書中で使用する「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【０１００】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書中で用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用される。
【０１０１】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の改変された形態、たとえば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートをいう。
【０１０２】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体をいうことを意図する。さらなるフレームワーク領域の改変をヒトフレームワーク配列内に行い得る。当業者には、配列が特定の種に「由来する」場合、前記配列は、可変領域アミノ酸がマウス抗体からとられる場合などのように、タンパク質配列であり得るか、または、前記配列は、可変領域をコードしている核酸がマウスＤＮＡからとられる場合などのように、ＤＮＡ配列であり得ることが理解されよう。また、ヒト化抗体は、ヒトおよび非ヒト（たとえばマウスまたはウサギ）の抗体の公知の配列に基づいて設計してもよい。設計した抗体（ヒトおよび非ヒト残基をどちらも組み込む可能性がある）を、化学合成できる。また、配列をＤＮＡレベルで合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現させて、ヒト化抗体を作製してもよい。
【０１０３】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域の配列がマウス抗体に由来し、定常領域の配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域の配列が１つの種に由来し、定常領域の配列が別の種に由来する抗体をいうことを意図する。
【０１０４】
用語「抗体模倣体」または「抗体擬態物」とは、抗原と結合する抗体の能力を模倣することができる分子をいうことを意図し、これらは、ネイティブの抗体構造に限定されない。そのような抗体模倣体の例には、それだけには限定されないが、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチンに基づいた結合分子）、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー、およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）が含まれ、これらのすべては、伝統的な抗体結合を模倣する一方で、明白に異なる機構を介して産生されて機能する結合構造を用いる。本発明の実施形態は、抗体またはその抗原結合性一部分に向けられているため、上述の抗体模倣体にも適用される。
【０１０５】
本明細書中で使用する、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン「と特異的に結合する」抗体とは、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤでＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合する抗体をいうことを意図する。
【０１０６】
本明細書中で使用する用語、タンパク質または細胞「と実質的に結合しない」とは、タンパク質または細胞と結合しないか、または高い親和性で結合しない、すなわち、タンパク質または細胞と１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを意味する。
【０１０７】
本明細書中で使用する用語「Ｋ会合」または「Ｋａ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の会合速度をいうことを意図する一方で、本明細書中で使用する用語「Ｋ解離」または「Ｋｄ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の解離速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、解離定数をいうことを意図する。抗体のＫＤ値は、当分野の十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
【０１０８】
本明細書中で使用する、ＩｇＧ型抗体に言及する場合の用語「高親和性」とは、ＲＴＫのＩｇ様ドメインに対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプでは変動する場合がある。たとえば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【０１０９】
抗体
本発明の抗体は、ＲＴＫ、たとえばヒトＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーのＩｇ様ドメインと特異的に結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分とＲＴＫ単量体のＩｇ様ドメインとの結合は、外部ドメインを不活性状態、たとえば単量体状態に固定し、したがって、二量体化して下流のシグナル伝達経路を活性化させるＲＴＫの能力に拮抗する。たとえば、抗体は、受容体チロシンキナーゼのリガンド誘導性のチロシン自己リン酸化および／または受容体の内在化を遮断し得る。
【０１１０】
本発明の抗体は、ＲＴＫの特定のＩｇ様ドメイン、たとえば、ヒトＫｉｔのＤ４ドメインもしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと結合するように選択または設計されている。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫ、たとえばＫｉｔ受容体またはＶＥＧＦ受容体のドメインと相同性を共有するタンパク質と結合するように選択または設計されている。たとえば、抗体は、ドメイン、たとえば、Ｋｉｔ受容体のＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるドメインと結合するように選択または設計され得る。そのような抗体またはその抗原結合性一部分は、場合によってはＫｉｔ、ＶＥＧＦ受容体、および他のＲＴＫ中の、ＫｉｔのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと機能的に類似のタンパク質ドメインと結合することができるであろう。
【０１１１】
また、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫ、たとえばヒトＩＩＩ型ＲＴＫのＩｇ様ドメインに由来する特定のモチーフまたはコンセンサス配列と結合するようにも選択または設計され得、このことは、抗体またはその抗原結合性一部分が、ヒトＩＩＩ型ＲＴＫファミリーのメンバー間およびＩＩＩ型ＲＴＫと他のＲＴＫ、たとえばＶ型ＲＴＫとの間で共有されているエピトープまたはドメインと特異的に結合することを可能にし得る。そのような直鎖状コンセンサス配列は、たとえば、配列アラインメントアルゴリズムを使用して、様々なＲＴＫのドメイン、たとえばＤ４ドメインのドメインを、ＲＴＫの種類にわたってまたは種にわたってアラインメントすることによって見つけ得る（図６Ｂを参照）。当業者は、たとえば様々な種（たとえば、ヒト、マウス、ラット）からのＫｉｔのＤ４ドメインのタンパク質配列をアラインメントして、どのタンパク質残基が、アラインメントした配列のうちの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％で保存されているかを決定し得る。その後、そのようなコンセンサス配列を使用して、コンセンサス配列と特異的に結合し、したがってＫｉｔ  ＲＴＫの最も保存された残基と結合する抗体または他の部分を作製し得る。同様に、Ｖ型ＲＴＫのＤ７ドメインのタンパク質配列をアラインメントして（図６を参照）、本発明の部分を作製するためのコンセンサス配列を得ることもできる。当業者には、最も高度に保存された残基は、進化を通して保存されており、タンパク質の機能に重要である可能性が最も高いものであることが理解されよう。あるいは、ＲＴＫの様々なクラスにわたってアラインメントを行う場合、そのようなコンセンサス配列に対して作製された抗体は、抗体が複数のＲＴＫの種類における類似のＩｇ様ドメインと結合することを可能にするであろう。
【０１１２】
具体的な一実施形態では、本発明の部分（たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分）は、以下のＤ４相互作用部位のコンセンサス配列と結合する：ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ［式中、Ｌはロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、アスパラギン、またはリシンからなる群より選択され、Ｘ２は、ロイシン、バリン、アラニン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびアルギニンからなる群より選択され、Ｘ４は、グリシン、バリン、アラニン、グルタミン酸、プロリン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ５は、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン、およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ７は、グリシン、セリン、アラニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびスレオニンからなる群より選択される。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明の部分（たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分）は、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：ＩＸ１ＲＶＸ２Ｘ３ＥＤＸ４Ｇ［式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、グルタミン酸、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸およびリシンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびアラニンからなる群より選択される（配列番号１）。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明の部分（たとえば、抗体またはその抗原結合性一部分）は、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Φはバリンであり、Ｘ１は、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５は、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【０１１５】
本発明の抗体は、ＲＴＫのリガンド結合部位、たとえばＫｉｔ受容体のＳＣＦ結合部位と結合しない。したがって、本明細書中に記載の抗体は、その標的リガンドと結合する受容体の能力に拮抗しない。
【０１１６】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＫｉｔ受容体の特定の配列、たとえば、ヒトＫｉｔ受容体の残基３０９〜４１３、残基４１０〜５１９、３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕ、または４１８Ｔｙｒおよび５０５Ａｓｎと結合する。
【０１１７】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、タンパク質における三次元構造を示すタンパク質モチーフまたはコンセンサス配列と結合する。そのようなモチーフまたはコンセンサス配列は、近接した一連のアミノ酸ではなく、ＲＴＫの三次元の折り畳みから生じる近接していないアミノ酸の構成を示す（すなわち「構造モチーフ」または「非直鎖状エピトープ」）。そのようなモチーフの例は、Ｋｉｔ受容体のＤ４−Ｄ４もしくはＤ５−Ｄ５結合境界領域またはＶＥＧＦ受容体のＤ７−Ｄ７結合境界領域である。一実施形態では、本発明の抗体は、たとえばＤ４−Ｄ４、Ｄ５−Ｄ５またはＤ７−Ｄ７境界領域中の非直鎖状エピトープと結合して、ＲＴＫの活性化を妨げる。
【０１１８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、表４（以下）中に記載の小さな空洞またはポケットを構成するＫｉｔ受容体中の１つまたは複数の残基と結合し得る。たとえば、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域中の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｄ３ドメインからのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２およびＤ４ドメインからのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３。また、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ４ドメイン中で凹表面を構成する以下の残基のうちの１つまたは複数とも結合し得る：Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０。別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｋｉｔ受容体のＤ２−Ｄ３ヒンジ領域中でポケットを形成する以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｄ２ドメインからのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３ドメインからのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９。
【０１１９】
したがって、一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、近接したアミノ酸残基または近接していないアミノ酸残基と結合し、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能し得る。また、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ホモタイプのＤ４もしくはＤ５受容体の相互作用を妨げるかまたはリガンド−受容体の相互作用部位を不安定化するようにも作用し得る。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｋｉｔ受容体上の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。
【０１２０】
当業者には、一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、他のＩＩＩ型ＲＴＫ中の対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【０１２１】
具体的な実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープと結合する。コンフォメーションまたは不連続エピトープは、ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばヒトＫｉｔ受容体またはＰＤＧＦ受容体からのＤ３、Ｄ４、もしくはＤ５ドメインまたはＤ４−Ｄ５もしくはＤ３−Ｄ４ヒンジ領域からの２つ以上の残基から構成され得る。たとえば、コンフォメーションまたは不連続エピトープは、以下の表４中に記載の残基のうちの２つ以上から構成され得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｙ１２５、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸からなるコンフォメーションエピトープと結合する。類似の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、以下のアミノ酸の群のうちの１つから選択される、２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合し得る：Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｆ２０８、およびＴ２９５；Ｌ２２２、Ａ３３９、Ｆ３４０、Ｋ３４２、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３１２、Ｅ３３８、Ｆ３４０、およびＩ３７１；Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｇ３１１、Ｆ３４０、Ｐ３４１、およびＤ３９８；Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｎ３６７、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｇ３８４、Ｔ３８５、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、およびＫ４７１；Ｙ４０８、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｋ４７１、およびＬ４７２；Ｆ３２４、Ｖ３２５、Ｎ３２６、およびＮ４１０；Ｄ３２７、Ｎ４１０、Ｔ４１１、Ｋ４１２、およびＶ４９７；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｖ４０９、およびＫ４７１；Ｌ３８２、Ｇ３８７、Ｖ４０７、およびＶ４０９；Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９；Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｔ４１１、Ｆ４３３、Ｆ４６９、Ｇ４７０、およびＫ４７１；Ｄ３２７、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ａ４３１、Ｇ４３２、およびＫ４７１；Ｙ３５０、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０；Ｙ３５０、Ｒ３５３、およびＦ３５５。上述のように、本発明の抗体は、表４中に同定したポケットもしくは空洞を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらはポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の抗体に言及した場合、その意図は、抗体がエピトープ（たとえば表４中に同定したポケットまたは空洞）を構成する具体的な残基のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、表５中に記載のペプチドから選択される２つ以上のアミノ酸残基から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、第１のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基および第２のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基から構成され、第１および第２のペプチドは、表５中に記載のペプチドの群から選択される。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分はコンフォメーションエピトープと結合し、第１および第２のペプチド群は以下のとおりである：Ａｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２およびＴｈｒ３０４−Ｖａｌ３０８；Ａｓｐ３０９−Ｇｌｙ３１１およびＡｒｇ２２４−Ｇｌｙ２２６；Ｔｈｒ３０３−Ｇｌｕ３０６およびＡｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２；Ａｓｎ３６７−Ａｓｎ３７０およびＳｅｒ２１７−Ｔｙｒ２２１；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＡｓｎ３９６−Ｖａｌ３９９；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＧｌｕ３６８−Ａｒｇ３７２；Ｌｙｓ３５８−Ｔｙｒ３６２およびＶａｌ３７４−Ｈｉｓ３７８；Ａｓｐ３５７−Ｇｌｕ３６０およびＬｅｕ３７７−Ｔｈｒ３８０；Ｍｅｔ３５１−Ｇｌｕ３６０およびＨｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９；Ｈｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９およびＶａｌ３２３−Ａｓｐ３３２；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４９３−Ｔｈｒ５００；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４３１−Ｔｈｒ４３７；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＰｈｅ４６９−Ｖａｌ４７３；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＶａｌ３２５−Ａｓｎ３３０；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｒｇ３８１−Ｇｌｙ３８７；Ｇｌｙ４６６−Ｌｅｕ４７２およびＧｌｙ３８４−Ｇｌｙ３８８；Ｖａｌ３２５−Ｇｌｕ３２９およびＴｙｒ４９４−Ｌｙｓ４９９；Ｔｈｒ４１１−ｌｅｕ４１６およびＶａｌ４９７−Ａｌａ５０２；Ｉｌｅ４１５−Ｌｅｕ４２１およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７；Ａｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＬｙｓ４８４−Ｔｈｒ４８８；およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＧｌｙ４４５−Ｃｙｓ４５０。
【０１２４】
本発明の抗体は、前述の第１および第２のペプチド群を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらは第１および第２のペプチド群を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の抗体に言及した場合、その意図は、抗体がエピトープを構成する具体的な残基（たとえば表５中に同定した具体的なペプチド）のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、Ｅ３３、Ｐ３４、Ｄ７２、Ｅ７６、Ｎ７７、Ｋ７８、Ｑ７９、Ｋ１５８、Ｄ１５９、Ｎ２５０、Ｓ２５１、Ｑ２５２、Ｔ２５３、Ｋ２５４、Ｌ２５５、Ｎ２６０、Ｗ２６２、Ｈ２６４、Ｇ２６５、Ｅ３４４、Ｎ３５２、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｔ３５６、Ｄ３５７、Ｙ３６２、Ｓ３６５、Ｅ３６６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、およびＧ４６６からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションまたは不連続エピトープと結合する。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＰＤＧＦＲβのアミノ酸残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕ、またはＰＤＧＦＲα中の対応する残基と結合する。ヒトＰＤＧＦＲβの残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕは、Ｋｉｔ受容体の残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕに類似しており、ＰＤＧＦＲβのホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用を媒介する。本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、チロシンキナーゼの活性化に必須の距離および配向での細胞質ドメインの配置に必須の、ＩＩＩ型ＲＴＫの膜近位領域間の重要なホモタイプ相互作用（ヒトＰＤＧＦＲβの３８５Ａｒｇと３９０Ｇｌｕとの間に形成された塩橋など）を妨げることによって、受容体の活性化に対するその阻害効果を発揮し得る。本明細書中に記述した実験は、ホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用がＰＤＧＦＲβの二量体化に必要ではなく、ＰＤＧＦＲβの二量体化は受容体の活性化に必要であるが十分ではないことを示している。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＰＤＧＦＲβの二量体化を可能にする一方で、活性化を妨げ得る。構造に基づく配列アラインメントにより、ＥＦループの大きさ、ならびにＤ４−Ｄ４境界領域を含む重要なアミノ酸は、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１Ｒ中で保存されていることが示されている。したがって、一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４またはＤ５ドメインの保存された領域に対して標的化し得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ヒトＶＥＧＦ受容体の特定の配列、たとえば、ＶＥＧＦＲ１の残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ２の残基７２４〜７３３、ＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ３の残基７３５〜７４４、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合する。
【０１２８】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性一部分は、変異ＲＴＫと特異的に結合するように選択または設計されている。好ましい実施形態では、変異ＲＴＫは腫瘍形成性または腫瘍発生性の変異体である。具体的な一実施形態では、抗体またはその抗原結合性一部分は、腫瘍発生性Ｋｉｔ受容体変異体と結合するように選択または設計されている。本発明の抗体によって標的化され得るいくつかのＫｉｔ受容体変異体は、以下のアミノ酸のうちの１つまたは複数中に変異を有するＫｉｔ受容体である：Ｔｈｒ４１７、Ｔｙｒ４１８、Ａｓｐ４１９、Ｌｅｕ４２１、Ａｒｇ４２０、Ｔｙｒ５０３、またはＡｌａ５０２。当業者には、本発明の方法がＫｉｔ中の他の変異または他のＲＴＫ中の変異に適用可能であることが理解されよう。変異ＲＴＫを標的化することの１つの利点は、治療用抗体が、変異を含有する細胞上のＲＴＫのみと結合して、健康な細胞にはほとんどまたは完全に影響を与えない可能性があることである。したがって、変異が腫瘍形成性である事例では、腫瘍細胞のみが治療のために標的化され、副作用および必要用量が潜在的に低下する。
【０１３０】
好ましくは、抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、１×１０−８Ｍ以下のＫＤ、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合する。ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばＫｉｔまたはＶＥＧＦ受容体に対する抗体の結合能力を評価するための標準のアッセイは、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含めて、当技術分野で公知である。また、抗体の結合動態（たとえば結合親和性）も、ＥＬＩＳＡ、ＳｃａｔｃｈａｒｄおよびＢｉａｃｏｒｅ分析によるものなどの当技術分野で公知の標準のアッセイによって評価することができる。
【０１３１】
操作および改変した抗体
抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を本発明の方法に従って調製し、改変した抗体を操作設計するための出発物質として使用してよく、改変した抗体は、開始抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、元の可変領域の一方または両方（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、たとえば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を改変することによって、操作することができる。それに加えてまたは代わって、抗体は、たとえば抗体のエフェクター機能（複数可）を変更するために、定常領域（複数可）内の残基を改変することによって操作することができる。
【０１３２】
行うことができる１つの種類の可変領域の操作は、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に６個の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。そのため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外の配列よりも、個々の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原の相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植した、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列が含まれる発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら（１９９８年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁、Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．ら（１９８６年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁、Ｑｕｅｅｎ，  Ｃ．ら（１９８９年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｅ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６巻：１００２９〜１００３３頁、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１３３】
抗体のフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列が含まれる公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参考資料から得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、そのそれぞれの内容が明確に本明細書中に参考として組み込まれている、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上でｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅから利用可能）、ならびにＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１年）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ｍ．ら（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７巻：７７６〜７９８頁、およびＣｏｘ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｌ．ら（１９９４年）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：８２７〜８３６頁中に見つけることができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に見つけることができる。
【０１３４】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５巻：３３８９〜３４０２頁）と呼ばれる配列類似度の検索方法のうちの１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較する。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列との間の統計的に有意なアラインメントが、アラインメントした単語の高スコアのセグメント対（ＨＳＰ）を含有する可能性が高いという点で、発見的なアルゴリズムである。そのスコアを伸長またはトリミングによって改善させることができないセグメント対は、ヒットと呼ばれる。手短に述べると、ＶＢＡＳＥ起源のヌクレオチド配列（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）を翻訳し、ＦＲ１からＦＲ３のフレームワーク領域（両端を含む）を保持する。データベース配列は、平均して９８個の残基の長さを有する。タンパク質の全長にわたって正確に一致する重複配列を除去する。オフにした低複雑度フィルター以外はデフォルトの標準のパラメータを用いたプログラムｂｌａｓｔｐ、およびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを使用したタンパク質のＢＬＡＳＴ検索により、上位５件のヒットがフィルタリングされて、配列一致が得られる。ヌクレオチド配列を６個すべてのフレームにおいて翻訳し、データベース配列の一致セグメント中にストップコドンを有さないフレームが潜在的なヒットとみなされる。これを、次に、６個すべてのフレームにおいて抗体配列を翻訳し、これらの翻訳物を、６個すべてのフレームにおいて動的に翻訳されたＶＢＡＳＥヌクレオチド配列と比較する、ＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを使用して確認する。ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から利用可能なものなどの他のヒト生殖系列配列データベースは、上述のようにＶＢＡＳＥと同様に検索することができる。
【０１３５】
同一性は、配列の全長にわたる抗体配列とタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸一致である。陽性（同一性＋置換の一致）は、同一ではないが、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスによって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合は、最大の陽性を有するヒットが、一致する配列ヒットであると決定される。
【０１３６】
同定されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に見つかるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植することができるか、または、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１つもしくは複数の変異を含有するフレームワーク領域上に移植することができる。たとえば、特定の事例では、抗体の抗原結合能力を維持または増強させるために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが判明している（たとえば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１３７】
別の種類の可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（たとえば親和性）を改善させることである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性の変異誘発を行って変異（複数可）を導入することができ、抗体結合または目的の他の機能的特性に対する効果を、当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。たとえば、本発明の抗体を変異させてライブラリを作製してよく、その後、これを、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえば、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインとの結合についてスクリーニングし得る。好ましくは、保存された改変（上述）が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個を超えない残基が変更される。
【０１３８】
別の種類のフレームワークの改変は、フレームワーク領域内、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法は「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらの米国特許公開第２００３０１５３０４３号中にさらに詳述されている。
【０１３９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、またはそれに代わって、本発明の抗体を、典型的には、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性などの、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、Ｆｃ領域内に改変が含まれるように操作し得る。さらに、本発明の抗体を、やはり抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、化学修飾（たとえば、１つもしくは複数の化学部分を抗体に付着させることができる）またはそのグリコシル化を変更させるために改変し得る。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳述されている。Ｆｃ領域中の残基の付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１４０】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されるように、たとえば増加または減少するように改変する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらの米国特許第５，６７７，４２５号中にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、たとえば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するために、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変更されている。
【０１４１】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異させる。より詳細には、抗体が、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌプロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比較して損なわれたＳｐＡ結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸の変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの境界領域内に導入する。この手法は、Ｗａｒｄらの米国特許第６，１６５，７４５号中にさらに詳述されている。
【０１４２】
別の実施形態では、抗体を、その生物学的半減期を増加させるために改変する。様々な手法が可能である。たとえば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの変異のうちの１つまたは複数を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更することができる。これらの戦略は、抗体とＲＴＫのＩｇ様ドメインとの結合が損なわれない限りは有効である。
【０１４３】
さらに他の実施形態では、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによってＦｃ領域を変更する。たとえば、抗体が、エフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変更させられるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であることができる。この手法は、どちらもＷｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号中にさらに詳述されている。
【０１４４】
別の例では、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した（ａｂｏｌｉｓｈ）補体依存性細胞毒（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらの米国特許第６，１９４，５５１号中にさらに詳述されている。
【０１４５】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９における１つまたは複数のアミノ酸残基を変更し、それによって補体を固定する抗体の能力を変更させる。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらのＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号中にさらに記載されている。
【０１４６】
さらに別の例では、抗体依存性細胞毒（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるかおよび／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために、以下の位置のうちの１つまたは複数のアミノ酸を改変することによってＦｃ領域を改変する：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。この手法は、ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２号中にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有するバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：６５９１〜６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の変異は、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善させることが示された。さらに、以下の組合せの変異体が、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善させることが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１４７】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体のＣ末端を、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国仮出願第６０／９５７，２７１号に記載のように、システイン残基の導入によって改変する。そのような改変には、それだけには限定されないが、完全長重鎖配列のＣ末端でまたはその付近での既存のアミノ酸残基の置き換え、および完全長重鎖配列のＣ末端へのシステイン含有伸長の導入が含まれる。好ましい実施形態では、システイン含有伸長は、配列アラニン−アラニン−システインを含む（Ｎ末端からＣ末端）。
【０１４８】
好ましい実施形態では、そのようなＣ末端のシステイン改変の存在は、治療剤またはマーカー分子などのパートナー分子をコンジュゲートする位置を提供する。具体的には、Ｃ末端のシステイン改変による反応性チオール基の存在を使用して、以下に詳述するジスルフィドリンカーを用いてパートナー分子をコンジュゲートさせることができる。この様式での抗体とパートナー分子とのコンジュゲーションは、特定の付着部位についての制御の増加を可能にする。さらに、付着部位をＣ末端にまたはその付近に導入することによって、コンジュゲーションが最適化されて、抗体の機能的特性への妨害が低下または排除され、コンジュゲート調製物の単純分析および品質管理が可能となる。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。たとえば、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作製することができる（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、たとえば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。そのような炭水化物の改変は、たとえば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化の排除をもたらす、１つまたは複数のアミノ酸の置換を行うことができる。上記のような、グリコシル化されていないことは、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのような手法は、Ｃｏらの米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号中にさらに詳述されている。グリコシル化を変更するためのさらなる手法は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Ｈａｎａｉらの米国特許第７，２１４，７７５号、Ｐｒｅｓｔａの米国特許第６，７３７，０５６号、Ｐｒｅｓｔａの米国公開第２００７００２０２６０号、ＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０８４９２６号、ＺｈｕらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００６／０８９２９４号、およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０５５９１６号中にさらに詳述されている。
【０１５０】
それに加えてまたは代わって、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、グリコシル化の種類の変更を有する抗体を作製することができる。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示されている。そのような炭水化物の改変は、たとえば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることによって変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。たとえば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって作製した（Ｙａｍａｎｅらの米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７巻：６１４〜２２頁を参照）。別の例として、ＨａｎａｉらのＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードしているＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載しており、これにより、アルファ１，６結合関連の酵素の低下または排除によって、そのような細胞系中で発現された抗体は低フコシル化を示す。Ｈａｎａｉらはまた、抗体のＦｃ領域と結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性が低いか、または酵素活性を有さない細胞系、たとえばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）を記載している。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる能力が低下しており、やはりその宿主細胞中で発現された抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁も参照）。ＵｍａｎａらのＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２号は、操作した細胞系中で発現された抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（たとえばベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作した細胞系を記載している（Ｕｍａｎａら（１９９９年）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７巻：１７６〜１８０頁も参照）。あるいは、フコシダーゼ酵素を使用して抗体のフコース残基を切断して除去し得る。たとえば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼがフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，  Ａ．Ｌ．ら（１９７５年）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４巻：５５１���〜２３頁）。
【０１５１】
それに加えてまたは代わって、グリコシル化の種類の変更を有する抗体を作製することができ、その変更は、抗体のシアリル化（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）のレベルに関する。そのような変更は、どちらもその全体が参考として組み込まれているＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０８４９２６号およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開ＷＯ／２００７／０５５９１６号に記載されている。たとえば、たとえばＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｅｎｓのシアリダーゼなどのシアリダーゼを用いた酵素反応を用い得る。そのような反応の条件は、一般に、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，８３１，０７７号に記載されている。適切な酵素の他の非限定的な例は、それぞれＳｃｈｌｏｅｍｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５巻（４号）、８８２〜８９３頁（１９７５年）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３３８巻、５２９〜５３８頁（１９９９年）に記載されているノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦである。脱シアリル化された抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを使用することによってさらに精製し得る。あるいは、シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素を用いることなどによる、シアリル化のレベルを増加させる方法を用い得る。そのような反応の条件は、一般に、Ｂａｓｓｅｔら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５１巻（３号）、３０７〜３１１頁（２０００年）に記載されている。
【０１５２】
本発明によって企図される本明細書中の抗体の別の改変はペグ化である。抗体は、たとえば抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を増加させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体またはその断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片と付着される条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性の水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施する。本明細書中で使用する用語「ポリエチレングリコール」には、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のうちの任意のものが包含されることを意図する。特定の実施形態では、ペグ化する抗体はグリコシル化されていない抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。たとえば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらのＥＰ０  １５４  ３１６号およびＩｓｈｉｋａｗａらのＥＰ０  ４０１  ３８４号を参照されたい。したがって、ここに記載されているペグ化方法は、以下に記載の本発明のペプチド性分子にも適用される。
【０１５３】
抗体断片および抗体模倣体
本発明は伝統的な抗体に限定されず、抗体断片および抗体模倣体を使用することによって実施し得る。以下に詳述するように、多種多様な抗体断片および抗体模倣体の技術が現在では開発されており、当技術分野で広く公知である。これらの技術のうちのいくつかでは（ドメイン抗体、ナノボディ、およびＵｎｉＢｏｄｙなど）、伝統的な抗体構造の断片または他の改変を使用するが、伝統的な抗体結合を模倣する一方で明白に異なる機構を介して産生されて機能する結合構造を用いる、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディなどの代替技術も存在する。これらの代替構造の一部はＧｉｌｌおよびＤａｍｌｅ  （２００６年）  １７巻：６５３〜６５８頁中に総説されている。
【０１５４】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）とは、抗体の最も小さな機能的結合単位であり、ヒト抗体重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のどちらかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全にヒトのＶＨおよびＶＬ  ｄＡｂの一連の大きく高度に機能的なライブラリ（それぞれのライブラリ中に１００億個を超える異なる配列）、ならびに治療標的に特異的なｄＡｂを選択するためのこれらのライブラリの使用を開発している。多くの慣用の抗体と対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母、および哺乳動物の細胞系中で良好に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，１７２，１９７号、第６，６９６，２４５号、米国出願第２００４／０１１０９４１号、欧州特許出願第１４３３８４６号、欧州特許第０３６８６８４号および第０６１６６４０号、ＷＯ０５／０３５５７２号、ＷＯ０４／１０１７９０号、ＷＯ０４／０８１０２６号、ＷＯ０４／０５８８２１号、ＷＯ０４／００３０１９号およびＷＯ０３／００２６０９号を参照することによって得ることができる。
【０１５５】
ナノボディとは、天然に存在する重鎖抗体のユニークな構造的および機能的特性を含有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、１個の可変ドメイン（ＶＨＨ）ならびに２個の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含有する。重要なことに、クローニングおよび単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を保有する完全に安定なポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のＶＨドメインと高い相同性を有しており、活性を全く失わずにさらにヒト化することができる。重要なことに、ナノボディは低い免疫原性の可能性を有しており、これはナノボディリード化合物を用いた霊長類の研究で確認されている。
【０１５６】
ナノボディは、慣用の抗体の利点を小分子薬の重要な特長と組み合わせる。慣用の抗体と同様、ナノボディは、高い標的特異性、その標的に対する高い親和性および低い固有の毒性を示す。しかし、小分子薬と同様、これらは酵素を阻害し、受容体のくぼみ（ｃｌｅｆｔ）に容易に接近することができる。さらに、ナノボディは非常に安定であり、注射以外の手段によって投与することができ（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ０４／０４１８６７号を参照）、製造が容易である。ナノボディの他の利点には、その大きさが小さいことの結果として、一般的ではないかまたは隠れたエピトープを認識すること、そのユニークな三次元の薬物様式の柔軟性によって高い親和性および選択性でタンパク質標的の空洞または活性部位内に結合すること、半減期の調整（ｔａｉｌｏｒ）、ならびに創薬の容易性および速度が含まれる。
【０１５７】
ナノボディは単一の遺伝子によってコードされており、ほとんどすべての原核生物および真核生物の宿主、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＵＳ６，７６５，０８７号を参照）、カビ（たとえば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）および酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ）（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＵＳ６，８３８，２５４号を参照）中で効率的に産生される。産生プロセスは拡張性があり、複数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは慣用の抗体と比較して優れた安定性を示すため、これらは、長い貯蔵寿命のすぐに使用できる溶液として処方することができる。
【０１５８】
Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ方法（たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ０６／０７９３７２号を参照）とは、Ｂ細胞の自動の高スルーアウト（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ）の選択に基づいており、本発明との関係において使用することができる、所望の標的に対するナノボディを生じるための正当な方法である。
【０１５９】
ＵｎｉＢｏｄｙは別の抗体断片技術であるが、これはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づいている。ヒンジ領域の欠失は、伝統的なＩｇＧ４抗体の本質的に半分の大きさであり、ＩｇＧ４抗体の二価の結合領域の代わりに一価の結合領域を有する分子をもたらす。また、ＩｇＧ４抗体は不活性であり、したがって免疫系と相互作用しないことが周知であり、これは、免疫応答が所望されない疾患の処置に有利な場合があり、この利点はＵｎｉＢｏｄｙに伝えられる。たとえば、ＵｎｉＢｏｄｙは、結合している細胞を阻害またはサイレンシングするように機能し得るが、死滅はさせない。さらに、がん細胞と結合するＵｎｉＢｏｄｙは、それが増殖するように刺激しない。さらに、ＵｎｉＢｏｄｙは伝統的なＩｇＧ４抗体の約半分の大きさであるため、潜在的に有利な有効性を伴って、より大きな固形腫瘍にわたってより良好な分布を示し得る。ＵｎｉＢｏｄｙは、完全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体からクリアランスされ、その抗原に対して完全抗体と同様の親和性で結合することができる。ＵｎｉＢｏｄｙのさらなる詳細は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている特許出願ＷＯ２００７／０５９７８２を参照することによって得ることができる。
【０１６０】
アドネクチン分子とは、フィブロネクチンタンパク質の１つまたは複数のドメインに由来する操作した結合タンパク質である。フィブロネクチンは、人体中に天然に存在する。これは細胞外基質中に不溶性の糖タンパク質二量体として存在し、リンカータンパク質としても役割を果たす。また、これは血漿中でジスルフィド連結二量体として可溶性形態でも存在する。フィブロネクチンの血漿形態は肝臓細胞（肝細胞）によって合成され、ＥＣＭ形態は軟骨細胞、マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、および上皮の一部の細胞によって産生される（Ｗａｒｄ  Ｍ．およびＭａｒｃｅｙ，  Ｄ．、ｃａｌｌｕｔｈｅｒａｎ．ｅｄｕ／Ａｃａｄｅｍｉｃ＿Ｐｒｏｇｒａｍｓ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ＢｉｏＤｅｖ／ｏｍｍ／ｆｉｂｒｏ／ｆｉｂｒｏ．ｈｔｍを参照）。既に言及したように、フィブロネクチンは、細胞接着分子として天然で機能し得るか、または細胞外基質中で接触させることによって細胞の相互作用を媒介し得る。典型的には、フィブロネクチンは３つの異なるタンパク質モジュール、すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型モジュールからできている。フィブロネクチンの機能の構造の総説には、ＰａｎｋｏｖおよびＹａｍａｄａ  （２００２年）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１５巻（パート２０）：３８６１〜３頁、ＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒおよびＥｎｇｅｌ  （２００２年）  ２１巻：１１５〜１２８頁、ならびにＬｕｃｅｎａら（２００７年）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｃｌｉｎ．４８巻：２４９〜２６２頁を参照されたい。
【０１６１】
好ましい実施形態では、アドネクチン分子は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから、２つのベータシートの間に分布した複数のベータストランドから構成されるネイティブタンパク質を変更することによって誘導する。起源の組織に応じて、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｇ）は、たとえば１Ｆｎ３、２Ｆｎ３、３Ｆｎ３などを表示し得る複数のＩＩＩ型ドメインを含有し得る。１０Ｆｎ３ドメインは、インテグリン結合モチーフを含有し、ベータストランドを接続する３つのループをさらに含有する。これらのループは、ＩｇＧ重鎖の抗原結合ループに対応するものと考えてよく、目的の標的、たとえばＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと特異的に結合させるために、以下に記述した方法によって変更し得る。好ましくは、本発明の目的に有用なフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ、ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から受託コード：１ｔｔｇで入手することができるフィブロネクチンＩＩＩ型分子の構造をコードしている配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を示す配列である。また、アドネクチン分子は、単純な単量体の１０Ｆｎ３構造ではなく１０Ｆｎ３関連分子のポリマーから誘導してもよい。
【０１６２】
ネイティブ１０Ｆｎ３ドメインは典型的にはインテグリンと結合するが、アドネクチン分子となるように適応させられた１０Ｆｎ３タンパク質は、目的の抗原、たとえばＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばヒトＫｉｔのＤ４またはＤ５ドメインと結合するように変更されている。一実施形態では、１０Ｆｎ３分子への変更は、ベータストランドへの少なくとも１つの変異を含む。好ましい実施形態では、１０Ｆｎ３分子のベータストランドを接続するループ領域は、ヒト受容体チロシンキナーゼ、たとえばＶＥＧＦ受容体またはＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ、たとえばヒトＫｉｔのＩｇ様ドメインと結合するように変更されている。
【０１６３】
１０Ｆｎ３中の変更は、それだけには限定されないが、誤りがちなＰＣＲ、部位特異的変異誘発、ＤＮＡシャフリング、または本明細書中で参照した他の種類の組換え変異誘発を含めた、当技術分野で公知の任意の方法によって行い得る。一例では、１０Ｆｎ３配列をコードしているＤＮＡのバリアントｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接合成し、後にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写および翻訳し得る。あるいは、標準の方法を使用して天然の１０Ｆｎ３配列をゲノムから単離またはクローニングし（たとえば米国特許出願第２００７００８２３６５号に記載のように行う）、その後、当技術分野で公知の変異誘発方法を使用して変異させてもよい。
【０１６４】
一実施形態では、標的タンパク質、たとえばＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインを、カラムのレジンまたはマイクロタイタープレート中のウェルなどの固体支持体上に固定し得る。その後、標的を潜在的な結合タンパク質のライブラリと接触させる。ライブラリは、１０Ｆｎ３配列の変異誘発／ランダム化または１０Ｆｎ３ループ領域（ベータストランドではない）の変異誘発／ランダム化によって野生型１０Ｆｎ３から誘導した、１０Ｆｎ３クローンまたはアドネクチン分子を含み得る。好ましい実施形態では、ライブラリは、Ｓｚｏｓｔａｋら、米国出願第０９／００７，００５号および第０９／２４７，１９０号、Ｓｚｏｓｔａｋら、ＷＯ９８９／３１７００、ならびにＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ  （１９９７年）  ９４巻：１２２９７〜１２３０２頁に記載の技法によって作製したＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリであり得る。また、ライブラリは、ＤＮＡ−タンパク質ライブラリであってもよい（たとえば、Ｌｏｈｓｅ、米国出願第６０／１１０，５４９号、米国出願第０９／４５９，１９０号、およびＷＯ００／３２８２３号に記載）。その後、融合ライブラリを固定した標的（たとえばヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン）と共にインキュベートし、固体支持体を洗浄して非特異的結合部分を除去する。その後、緊密に結合したものをストリンジェントな条件下で溶出させ、ＰＣＲを使用して、遺伝情報を増幅するか、または結合分子の新しいライブラリを作製してプロセスを繰り返す（さらなる変異誘発を用いてまたは用いずに）。選択／変異誘発のプロセスは、十分な親和性で標的と結合したものが得られるまで繰り返し得る。本発明で使用するためのアドネクチン分子を、Ｂｒｉｓｔｏｎ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ企業であるＡｄｎｅｘｕｓによって用いられるＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用して操作し得る。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ技術を、上記で参照した技法に基づいて開発した（たとえばＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ  （１９９７年）  ９４巻：１２２９７〜１２３０２頁）。変更された１０Ｆｎ３ドメインのライブラリを作製し、本発明で使用し得る適切に結合するもの（ｂｉｎｄｅｒ）を選択する方法は、以下の米国特許および特許出願の文書中に完全に記載されており、本明細書中に参考として組み込まれている：米国特許第７，１１５，３９６号、第６，８１８，４１８号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、第７，１９５，８８０号、第６，４１６，９５０号、第６，２１４，５５３号、第６６２３９２６号、第６，３１２，９２７号、第６，６０２，６８５号、第６，５１８，０１８号、第６，２０７，４４６号、第６，２５８，５５８号、第６，４３６，６６５号、第６，２８１，３４４号、第７，２７０，９５０号、第６，９５１，７２５号、第６，８４６，６５５号、第７，０７８，１９７号、第６，４２９，３００号、第７，１２５，６６９号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、ならびに米国特許出願第２００７００８２３６５号、第２００５０２５５５４８号、第２００５００３８���２９号、第２００３０１４３６１６号、第２００２０１８２５９７号、第２００２０１７７１５８号、第２００４００８６９８０号、第２００４０２５３６１２号、第２００３００２２２３６号、第２００３００１３１６０号、第２００３００２７１９４号、第２００３００１３１１０号、第２００４０２５９１５５号、第２００２０１８２６８７号、第２００６０２７０６０４号、第２００６０２４６０５９号、第２００３０１００００４号、第２００３０１４３６１６号、および第２００２０１８２５９７号。１０Ｆｎ３などのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン中に多様性を生じさせ、次いで選択ステップを行うことは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母表面ディスプレイ、たとえば、Ｌｉｐｏｖｓｅｋら（２００７年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６８巻：１０２４〜１０４１頁、Ｓｅｒｇｅｅｖａら（２００６年）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ５８巻：１６２２〜１６５４頁、Ｐｅｔｔｙら（２００７年）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５巻：７〜１５頁、Ｒｏｔｈｅら（２００６年）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ６巻：１７７〜１８７頁、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  （２００５年）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：１１０５〜１１１６頁などの当技術分野で公知の他の方法を使用して達成し得る。
【０１６５】
当業者には、上記言及した参考文献中の方法を使用して、好ましい１０Ｆｎ３ドメイン以外のタンパク質から抗体擬態物を誘導し得ることが理解されよう。上記参照した方法によって抗体擬態物を作製するために使用することができるさらなる分子には、それだけには限定されないが、ヒトフィブロネクチンモジュール１Ｆｎ３〜９Ｆｎ３および１１Ｆｎ３〜１７Ｆｎ３ならびに非ヒト動物および原核生物からの関連するＦｎ３モジュールが含まれる。さらに、テネイシンおよびウンデュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）などの、１０Ｆｎ３と配列相同性を有する他のタンパク質からのＦｎ３モジュールも使用し得る。免疫グロブリン様の折り畳みを有する（が、ＶＨドメインと非関連の配列を有する）他の例示的なタンパク質には、Ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−２、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼインヒビター、Ｅ−カドヘリン、および抗生物質色素タンパク質が含まれる。関連構造を有するさらなるドメインは、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＶＣＡＭ−１のＣ２およびＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、テロキンのＩセット免疫グロブリンの折り畳み、テリキン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ−ＳＦ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、ベータ−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ならびにトランスグルタミナーゼに由来し得る。あるいは、１つまたは複数の免疫グロブリン様の折り畳みが含まれる任意の他のタンパク質を利用して、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎｇ）様結合部分を作製し得る。そのようなタンパク質は、たとえばプログラムＳＣＯＰを使用して同定し得る（Ｍｕｒｚｉｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４７巻：５３６頁（１９９５年）、Ｌｏ  Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：２５７頁（２０００年））。
【０１６６】
アプタマーは、本発明によって包含される別の種類の抗体模倣体である。アプタマーとは、典型的には、特定の分子標的と結合する小さなヌクレオチドポリマーである。アプタマーは一本鎖または二本鎖の核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得るが、ＤＮＡに基づくアプタマーは、最も一般的には二本鎖である。アプタマー核酸には定義された長さは存在しない。しかし、アプタマー分子は、最も一般的には１５〜４０個のヌクレオチドの長さである。
【０１６７】
アプタマーはしばしば複雑な三次元構造を形成し、これが標的分子に対するその親和性を決定する。アプタマーは、ほぼ完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作および増幅できることが主な理由で、単純な抗体を超える多くの利点を提供することができる。さらに、アプタマーは、多くの場合に免疫応答をわずかにしか誘導しないか、または誘導しない。
【０１６８】
アプタマーは様々な技法を使用して作製し得るが、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ．  （１９９０年）  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４６巻（６２８７号）：８１８〜２２頁）およびＳＥＬＥＸ方法（指数関数的な富化によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９２年．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２８巻（３号）：８６２〜９頁）を使用して、もともとは開発された。すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ．  Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ＩＳＢＮ：９７８−３−５２７−３１０５９−３、Ｕｌｒｉｃｈら、２００６年．  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ９巻（８号）：６１９〜３２頁、Ｃｅｒｃｈｉａおよびｄｅ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｓ．  ２００７年．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３６１巻：１８７〜２００頁、ＩｒｅｓｏｎおよびＫｅｌｌａｎｄ．  ２００６年．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年  ５巻（１２号）：２９５７〜６２頁、米国特許第５５８２９８１号、第５８４０８６７号、第５７５６２９１号、第６２６１７８３号、第６４５８５５９号、第５７９２６１３号、第６１１１０９５号、ならびに米国特許出願第１１／４８２，６７１号、第１１／１０２，４２８号、第１１／２９１，６１０号、および第１０／６２７，５４３号を含めた、アプタマーを作製する他の方法およびその使用が公開されている。
【０１６９】
ＳＥＬＥＸ方法が明らかに最も一般的であり、３つの基本的なステップで実施する。第１に、候補核酸分子のライブラリを特定の分子標的との結合に関して選択する。第２に、標的に対して十分な親和性を有する核酸を、結合しないものから分離する。第３に、結合した核酸を増幅し、第２のライブラリを形成し、このプロセスを繰り返す。それぞれの反復に際して、標的分子に対してより高い親和性を有するアプタマーが選択される。ＳＥＬＥＸ方法は、本明細書中に参考として組み込まれている以下の出版物中により完全に記載されている：Ｂｕｇａｕｔら、２００６年．  ４巻（２２号）：４０８２〜８頁、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇら、２００７年  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００７年  ２４巻（４号）：３８１〜４０３頁、およびＧｏｐｉｎａｔｈ．  ２００７年．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７年．  ３８７巻（１号）：１７１〜８２頁。
【０１７０】
また、本発明の「アプタマー」には、ヌクレオチドの代わりにペプチドから作製されたアプタマー分子も含まれる。ペプチドアプタマーはヌクレオチドアプタマーと多くの特性を共有し（たとえば、大きさが小さいこと、および高い親和性で標的分子と結合する能力）、ヌクレオチドアプタマーを作製するために使用したものと同様の原理を有する選択方法によって作製し得る。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＢａｉｎｅｓおよびＣｏｌａｓ．  ２００６年．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．  １１巻（７〜８号）：３３４〜４１頁ならびにＢｉｃｋｌｅら、２００６年．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  １巻（３号）：１０６６〜９１頁。
【０１７１】
アフィボディ分子とは、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８個のアミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく新しいクラスの親和性タンパク質を表す。この３つのヘリックスバンドルのドメインは、コンビナトリアルファージミドライブラリを構築するための骨格として使用されており、これから、ファージディスプレイ技術を使用して、所望の分子を標的とするアフィボディバリアントを選択することができる（Ｎｏｒｄ  Ｋ、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ、Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｊ、Ｓｔａｈｌ  Ｓ、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７年、１５巻：７７２〜７頁。Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ、Ｇｒｏｎｌｕｎｄ  Ｈ、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  （ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２年、２６９巻：２６４７〜５５頁）。アフィボディ分子の単純かつ堅調な構造とその低分子量（６ｋＤａ）とが組み合わされることで、これらは多種多様な応用、たとえば、検出試薬として（Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ、Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｍ、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２年、２６１巻：１９９〜２１１頁）および受容体の相互作用の阻害（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ  Ｋ、Ｘｕ  Ｚ、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｇ、Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２８−ＣＤ８０  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｙ  ａ  ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３年、１６巻：６９１〜７頁）に適切となる。アフィボディおよびその産生方法のさらなる詳細は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，８３１，０１２号を参照することによって得ることができる。
【０１７２】
ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ））は、非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するために開発された抗体模倣体ＤＲＰ（設計反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））技術の一例である。アンキリンなどの反復タンパク質またはロイシンリッチな反復タンパク質は遍在性の結合分子であり、これらは、抗体とは異なり、細胞内および細胞外に存在する。そのユニークなモジュール構造は反復する構造単位（反復）を特長とし、これらは一緒に積み重なって、可変性かつモジュール式の標的結合表面を示す細長い反復ドメインを形成する。このモジュラリティに基づいて、高度に多様化した結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製することができる。この戦略には、可変性の表面残基を示す自己適合性反復のコンセンサス設計および反復ドメインへのそのランダムアセンブリが含まれる。
【０１７３】
ＤＡＲＰｉｎは細菌発現系中で非常に高い収率で産生させることができ、これらは公知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含めた幅広い範囲の標的タンパク質に対する、特異性の高い高親和性のＤＡＲＰｉｎが選択されている。１桁のナノモルからピコモルの範囲の親和性を有するＤＡＲＰｉｎを得ることができる。
【０１７４】
ＤＡＲＰｉｎは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップの応用、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含めた、広い範囲の応用で使用されている。また、ＤＡＲＰｉｎは、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合した細胞内マーカータンパク質として、細胞内区画中で活性が高いことも証明された。さらに、ＤＡＲＰｉｎはｐＭ範囲のＩＣ５０でウイルス進入を阻害するために使用された。ＤＡＲＰｉｎは、タンパク質−タンパク質の相互作用を遮断するためだけでなく、酵素を阻害するためにも理想的である。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの、ほとんどの場合はアロステリックな様式での阻害が成功している。非常に速く特異的な腫瘍上の富化および非常に好ましい腫瘍対血液の比により、ＤＡＲＰｉｎはｉｎ  ｖｉｖｏ診断または治療手法に非常に適したものとなっている。
【０１７５】
ＤＡＲＰｉｎおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報は、どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第２００４／０１３２０２８号および国際特許出願公開ＷＯ０２／２０５６５号中に見つけることができる。
【０１７６】
アンチカリンはさらなる抗体模倣体の技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒトの組織および体液中で天然かつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、化学的感受性化合物または不溶性化合物の生理的輸送および貯蔵に関連する様々な機能をｉｎ  ｖｉｖｏで行うように進化している。リポカリンは、タンパク質の一方の末端で、４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む堅調な固有の構造を有する。これらのループは、結合ポケットへの入り口を形成し、分子のこの部分中のコンフォメーションの相違が、個々のリポカリン間の結合特異性の変動の原因となっている。
【０１７７】
保存されたβ−シートフレームワークによって支持される超可変ループの全体的な構造は免疫グロブリンを連想させるが、リポカリンは、大きさに関して抗体とは相当に異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０〜１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖から構成されている。
【０１７８】
リポカリンをクローニングし、そのループを操作に供して、アンチカリンを作製する。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが作製されており、アンチカリンディスプレイにより、結合機能の選択およびスクリーニング、次いで原核生物または真核生物系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生が可能となる。研究により、事実上任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンを開発することができ、単離することができ、ナノモル以上の範囲の結合親和性を得ることができることを示すことに成功している。
【０１７９】
また、アンチカリンは、二重標的化タンパク質、いわゆるＤｕｏｃａｌｉｎとしての形式とすることもできる。Ｄｕｏｃａｌｉｎは、標準の製造プロセスを使用して容易に生成される１つの単量体タンパク質において２つの別々の治療標的と結合し、その一方で、その２つの結合ドメインの構造配向にかかわらず、標的特異性および親和性を保持する。
【０１８０】
単一の分子による複数の標的の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、複数の原因因子の関与が公知である疾患において特に有利である。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎなどの二価または多価の結合様式は、疾患における細胞表面分子の標的化、シグナル伝達経路におけるアゴニスト効果の媒介、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介した増強された内在化効果の誘導において顕著な潜在性を有する。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎの高い固有の安定性は単量体のアンチカリンに匹敵し、Ｄｕｏｃａｌｉｎに柔軟な処方および送達潜在性を提供する。
【０１８１】
アンチカリンに関するさらなる情報は、どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，２５０，２９７号および国際特許出願公開ＷＯ９９／１６８７３号中に見つけることができる。
【０１８２】
本発明との関係において有用な別の抗体模倣体の技術はアビマーである。アビマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのエクソンシャフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化しており、結合および阻害の特性を有する複数ドメインのタンパク質を生じる。複数の独立した結合ドメインの連結によりアビディティが生じることが示されており、慣用の単一エピトープの結合タンパク質と比較して改善された親和性および特異性がもたらされる。他の潜在的な利点には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける複数標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、改善された熱安定性およびプロテアーゼに対する耐性が含まれる。ナノモル以下の親和性を有するアビマーが様々な標的に対して得られている。
【０１８３】
アビマーに関するさらなる情報は、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許出願第２００６／０２８６６０３号、第２００６／０２３４２９９号、第２００６／０２２３１１４号、第２００６／０１７７８３１号、第２００６／０００８８４４号、第２００５／０２２１３８４号、第２００５／０１６４３０１号、第２００５／００８９９３２号、第２００５／００５３９７３号、第２００５／００４８５１２号、第２００４／０１７５７５６号中に見つけることができる。
【０１８４】
バーサボディは、本発明との関係において使用できる別の抗体模倣体の技術である。バーサボディとは、＞１５％のシステインを有する３〜５ｋＤａの小さなタンパク質であり、高いジスルフィド密度の骨格を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置き換えている。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸を少数のジスルフィドで置き換えることで、より小さく、より親水性であり（凝集および非特異的結合がより少ない）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性であり、より低い密度のＴ細胞エピトープを有するタンパク質がもたらされる。なぜならば、ＭＨＣ提示に最も寄与する残基は疎水性残基であるからである。これらの４つの特性はすべて、免疫原性に影響を与えることが周知であり、これらが一緒になって免疫原性の大きな減少を引き起こすと予想される。
【０１８５】
バーサボディのインスピレーションは、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびイソギンチャク（ａｎｅｍｏｎｅ）によって産生される天然の注射用生物製薬（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）から得られており、これは、予想外に低い免疫原性を示すことが公知である。選択された天然タンパク質ファミリーから開始して、設計およびスクリーニングによって、大きさ、疎水性、タンパク質分解性抗原プロセッシング、およびエピトープ密度を天然の注射用タンパク質の平均よりもはるかに低いレベルまで最小化する。
【０１８６】
バーサボディの構造を考慮すると、これらの抗体模倣体は、多結合価、多特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含めた多用途の様式を提供する。さらに、バーサボディはＥ．ｃｏｌｉ中で高い収率で製造され、また、その親水性および小さな大きさのため、バーサボディは可溶性が高く、高濃度で処方することができる。バーサボディは並外れて熱安定性であり（煮沸することができる）、長い貯蔵寿命を提供する。
【０１８７】
バーサボディに関するさらなる情報は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第２００７／０１９１２７２号中に見つけることができる。
【０１８８】
ＳＭＩＰ（商標）（小モジュール免疫製薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）−Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、標的結合、エフェクター機能、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、および発現レベルが維持および最適化されるように操作されている。ＳＭＩＰは、３つの明白に異なるモジュールドメインからなる。第１に、これらは、特異性を与える任意のタンパク質（たとえば、細胞表面受容体、単鎖抗体、可溶性タンパク質など）からなり得る結合ドメインを含有する。第２に、これらは、結合ドメインとエフェクタードメインとの間の柔軟なリンカーとして機能するヒンジドメインを含有し、ＳＭＩＰ薬物の多量体化の制御も助ける。最後に、ＳＭＩＰは、Ｆｃドメインまたは他の特別に設計したタンパク質を含めた様々な分子から由来し得るエフェクタードメインを含有する。様々な異なる結合、ヒンジ、およびエフェクタードメインを有するＳＭＩＰの単純な構築を可能にする設計のモジュラリティは、迅速かつカスタマイズ可能な薬物設計を提供する。
【０１８９】
どのようにして設計するかの例を含めた、ＳＭＩＰに関するさらなる情報は、Ｚｈａｏら（２００７年）  Ｂｌｏｏｄ  １１０巻：２５６９〜７７頁ならびに米国特許出願第２００５０２３８６４６号、第２００５０２０２５３４号、第２００５０２０２０２８号、第２００５０２０２０２３号、第２００５０２０２０１２号、第２００５０１８６２１６号、第２００５０１８０９７０号、および第２００５０１７５６１４号中に見つけ得る。
【０１９０】
上記に提供した抗体断片および抗体模倣体の技術の詳細な説明は、本明細書との関係において使用できるすべての技術の包括的なリストであることを意図しない。たとえば、やはり限定するものではないが、ポリペプチドに基づく代替技術を含めた様々な追加の技術、たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＱｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５巻（８号）  ９２１〜９２９頁（２００７年）中に概要が示されている相補性決定領域の融合、ならびにすべて本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，７８９，１５７号、第５，８６４，０２６号、第５，７１２，３７５号、第５，７６３，５６６号、第６，０１３，４４３号、第６，３７６，４７４号、第６，６１３，５２６号、第６，１１４，１２０号、第６，２６１，７７４号、および第６，３８７，６２０号に記載されているＲＮＡアプタマー技術などの核酸に基づく技術を、本発明との関係において使用することができる。
【０１９１】
抗体の物理特性
ＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合する本発明の抗体は、様々な物理特性によってさらに特徴づけされ得る。様々なアッセイを使用して、これらの物理特性に基づいて様々な抗体のクラスを検出および／または区別し得る。
【０１９２】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のどちらかの中に１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。可変領域中の１つまたは複数のグリコシル化部位の存在は、変更された抗原結合による、抗体の免疫原性の増加または抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９７２年）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１巻：６７３〜７０２頁、Ｇａｌａ  ＦＡおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ  （２００４年）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２巻：５４８９〜９４頁、Ｗａｌｌｉｃｋら（１９８８年）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８巻：１０９９〜１０９頁、Ｓｐｉｒｏ  ＲＧ  （２００２年）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２巻：４３Ｒ〜５６Ｒ頁、Ｐａｒｅｋｈら（１９８５年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１６巻：４５２〜７頁、Ｍｉｍｕｒａら（２０００年）  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７巻：６９７〜７０６頁）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こることが公知である。可変領域のグリコシル化を、Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔアッセイを使用して試験でき、これは、抗体を切断してＦａｂを生成し、その後、過ヨウ素酸塩の酸化およびシッフ塩基の形成を測定するアッセイを使用してグリコシル化について試験し得る。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Ｄｉｏｎｅｘライトクロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ）を使用して試験され得、これは、Ｆａｂからの糖類を単糖へと切断し、個々の糖類含有量を分析する。一部の例では、可変領域のグリコシル化を含有しない抗体を有することが好ましい場合がある。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによって、または当技術分野で周知の標準の技法を使用してグリコシル化モチーフ内の残基を変異させることによって達成することができる。
【０１９３】
それぞれの抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有するが、一般に、抗体は６〜９．５のｐＨ範囲となる。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲となり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲となる。抗体は、この範囲の外のｐＩを有し得る。効果は一般に知られていないが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でいくらかの折り畳みの崩れ（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）および不安定性を有し得ると推測されている。等電点は、ｐＨ勾配を生じるキャピラリー等電点電気泳動アッセイを使用して試験してよく、正確さを増すためにレーザー集束を利用し得る（Ｊａｎｉｎｉら（２００２年）  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３巻：１６０５〜１１頁、Ｍａら（２００１年）  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３巻：Ｓ７５〜８９頁、Ｈｕｎｔら（１９９８年）  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００巻：３５５〜６７頁）。一部の例では、正常な範囲内となるｐＩ値を含有する抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、または当技術分野で周知の標準の技法を使用して荷電表面残基を変異させることによって達成することができる。
【０１９４】
それぞれの抗体は、熱安定性の指標である融解温度を有する（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ＲおよびＭａｎｎｉｎｇ  ＭＣ  （２００２年）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３巻：３６１〜７１頁）。より高い熱安定性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより高い全体的な抗体の安定性を示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定などの技法を使用して測定し得る（Ｃｈｅｎら（２００３年）  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０巻：１９５２〜６０頁、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９年）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８巻：４７〜５２頁）。ＴＭ１は、抗体の最初の折り畳みの崩れの温度を示す。ＴＭ２は、抗体の完全な折り畳みの崩れの温度を示す。一般に、本発明の抗体のＴＭ１は６０℃より高いことが好ましく、好ましくは６５℃より高く、さらにより好ましくは７０℃より高い。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を使用して測定し得る（Ｍｕｒｒａｙら（２００２年）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０巻：３４３〜９頁）。
【０１９５】
好ましい実施形態では、迅速に分解されない抗体が所望され得る。抗体の断片化は、当技術分野で十分に理解されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定し得る（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪおよびＨｕｇｈｅｓ  ＤＥ  （１９９５年）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７巻：３６２６〜３２頁）。
【０１９６】
別の好ましい実施形態では、最小限の凝集効果を有する抗体を選択する。凝集は、望まない免疫応答の惹起および／または変更されたかもしくは望ましくない薬物動態学的特性をもたらし得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集を、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および光散乱を含めた当技術分野で周知のいくつかの技法によって測定し、単量体、二量体、三量体または多量体を同定し得る。
【０１９７】
本発明のポリクローナル抗体の産生
本発明のポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な技法によって産生させることができる。ポリクローナル抗体は様々なＢ細胞系に由来し、したがって、同じ抗原上の複数のエピトープを認識し得る。ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な哺乳動物を、目的の抗原、たとえばＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばヒトＫｉｔのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはヒトＶＥＧＦのＤ７ドメインで免疫化することによって産生させる。ポリクローナル抗体の産生にしばしば使用される動物は、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、ヒツジ、および最も一般的にはウサギである。以下の実施例１４では、ウサギをＫｉｔの第４（Ｄ４）もしくは第５の（Ｄ５）Ｉｇ様ドメインまたはＫｉｔの外部ドメイン全体で免疫化することによって、ポリクローナル抗Ｋｉｔ抗体を作製した。ポリクローナル抗体を産生させる標準の方法は当技術分野で広く公知であり、本発明の方法と組み合わせることができる（たとえば、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｍ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｂｋｉｔｔｏ／Ｋｉｔｔｏｌａｂｐａｇｅ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＰＡｂ．ｈｔｍｌ、米国特許第４，７１９，２９０号、第６，３３５，１６３号、第５，７８９，２０８号、第２，５２０，０７６号、第２，５４３，２１５号、および第３，５９７，４０９号）。
【０１９８】
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、慣用のモノクローナル抗体方法、たとえば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５年）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技法を含めた、様々な技法によって産生させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理上は、モノクローナル抗体を産生させる他の技法、たとえば、Ｂリンパ球のウイルスまたは腫瘍発生性形質転換を用いることができる。抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその抗原結合性一部分は、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、より好ましくはヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン上の任意のエピトープ、本明細書中に記述したコンセンサス（ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ）配列、あるいは本明細書中に記載の任意のコンフォメーション、不連続、または直鎖状エピトープに対して産生させ得ることに留意されたい。
【０１９９】
当技術分野で公知のいくつかの方法が、目的の不連続エピトープと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の特異的な選択に有用である。たとえば、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国公開第２００５／０１６９９２５号に開示されている技法は、タンパク質配列内の２つの異なるペプチドと結合する抗体の選択を可能にする。そのような方法は、本明細書中に開示したコンフォメーションおよび不連続エピトープを特異的に標的とするために、本発明に従って使用し得る。コンフォメーションエピトープがタンパク質の二次的構造である場合、そのような構造は、しばしば、より小さなペプチド（たとえば＜５０個のアミノ酸）中でより容易に形成される。したがって、動物をより小さなペプチドで免疫化することで、一部のコンフォメーションエピトープを捕らえることができる。あるいは、コンフォメーションエピトープを含む２つの小さなペプチド（たとえば表５中に同定したペプチド）を柔軟なリンカー（たとえば、ポリグリコール、または極性の非荷電のアミノ酸のストレッチ）で接続させ得る。リンカーは、ペプチドが様々な相互作用の配向を探索することを可能にする。この構築体を用いた免疫化、次いで適切なスクリーニングにより、コンフォメーションエピトープに向けられた抗体の同定が可能となる場合がある。好ましい実施形態では、ＲＴＫの特定のドメイン（たとえば、Ｋｉｔ外部ドメインのドメイン４もしくはドメイン５またはＶＥＧＦ受容体のＤ７）で動物を免疫化し、続いて目的のエピトープと結合する抗体についてスクリーニングすることによって、特定のコンフォメーションまたは直鎖状エピトープに対するペプチドを作製し得る。一実施形態では、低温電子顕微鏡観察（Ｊｉａｎｇら（２００８年）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻、１１３０〜１１３４頁、Ｊｏａｃｈｉｍ  （２００６年）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ＿ＩＳＢＮ：０１９５１８２１８９）を使用して、本発明の抗体または抗原結合断片によって結合されたエピトープを同定し得る。別の実施形態では、ＲＴＫまたはそのドメインを、結合した抗体またはその抗原結合断片と共に結晶化し、Ｘ線結晶構造解析によって分析して、結合した正確なエピトープを決定し得る。さらに、エピトープを、ＲＴＫ配列の一部分をマウスまたは別の種からの対応する配列で置き換えることによってマッピングし得る。目的のエピトープに向けられた抗体はヒト配列領域と選択的に結合し、したがって、標的エピトープを順次マッピングすることが可能である。このキメラに基づいたエピトープマッピングの技法は、様々な設定でのエピトープの同定における使用で成功している（その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれているＨｅｎｒｉｋｓｓｏｎおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  （１９９７年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  １０巻（６号）：５５９〜５６８頁、Ｎｅｔｚｅｒら（１９９９年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９年４月１６日、２７４巻（１６号）：１１２６７〜７４頁、Ｈｓｉａら（１９９６年）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９巻、５３〜６３頁を参照）。
【０２００】
標的ＲＴＫ（たとえばＫｉｔ  ＲＴＫまたはＶＥＧＦ受容体）中の目的のエピトープはグリコシル化されていないと考えられている。しかし、目的のＲＴＫがグリコシル化されている場合、抗体またはその抗原結合性一部分（および本発明の他の部分）を、関連するアミノ酸および／または糖残基と結合するように産生させ得る。たとえば、Ｋｉｔタンパク質は少なくとも１０箇所の潜在的なＮ連結グリコシル化の部位を有することが当技術分野で公知である（Ｍｏｒｓｔｙｎ、Ｆｏｏｔｅ、Ｌｉｅｓｃｈｋｅ  （２００４年）  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ：１５８８２９３０２５）。さらに、ＫｉｔはＯ連結グリコシル化およびシアル酸残基との付着を示し得ると考えられている（Ｗｙｐｙｃｈ  Ｊら（１９９５年）  Ｂｌｏｏｄ、８５巻（１号）：６６〜７３頁）。したがって、抗体またはその抗原結合性一部分（および本発明の他の部分）を、本明細書中で同定した任意のエピトープに付着していてもよい糖残基と結合するようにも産生させ得ることが企図される。この目的のために、目的の抗原性ペプチドを、正しくグリコシル化されるように動物細胞中で産生させてよく、その後、グリコシル化された抗原性ペプチドを使用して動物を免疫化し得る。グリコシル化されたペプチドを産生させるための適切な細胞および技法は当技術分野で公知であり、以下にさらに記載されている（たとえば、ＧｌｙｃｏＦｉ，Ｉｎｃ．、ニューハンプシャー州ＬｅｂａｎｏｎおよびＢｉｏＷａ、ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎから利用可能な技術を参照）。ペプチドの正しいグリコシル化を、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、酸加水分解（単糖の組成を決定するため）、化学的または酵素的切断、および質量分析（ＭＳ）などの任意の標準の方法を使用して試験して、グリカンを同定し得る。また、グリカン分析を加速させるためにレクチンに基づくアレイを使用するＰｒｏｃｏｇｎｉａ（ｐｒｏｃｏｇｎｉａ．ｃｏｍ）によって提供される技術も使用し得る。還元性アルカリ性切断もしくは「ベータ排除」、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー、および質量分析またはこれらの技法のうちの任意の組合せなどの技法を使用して、Ｏ−グリコシル化を具体的に検出し得る。
【０２０１】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は非常に良好に確立された手順である。免疫化プロトコルおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離する技法は当技術分野で公知である。また、融合パートナー（たとえばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０２０２】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上述のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードしているＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準の分子生物学的技法を使用して非マウス（たとえばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。たとえば、キメラ抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を使用してマウス可変領域をヒト定常領域に連結させることができる（たとえばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。ヒト化抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を使用してマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク内に挿入することができる（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。あるいは、ヒトおよび非ヒト配列の知識が与えられた場合は、ヒト化抗体をＤＮＡまたはタンパク質レベルで設計し得る。そのような抗体を、直接化学合成し得るか、または、ＤＮＡを合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで発現させて、ヒト化抗体を産生させ得る。
【０２０３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばＫｉｔのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインに向けられたそのようなヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫系の一部をマウス系の代わりに保有するトランスジェニックまたはトランス染色体マウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックおよびトランス染色体マウスには、本明細書中でそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭ  ｍｉｃｅ（商標）と呼ぶマウスが含まれ、これらは本明細書中で「ヒトＩｇマウス」と総称する。
【０２０４】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内在性のμおよびκ鎖の遺伝子座を不活性化させる標的化変異と一緒に、再構成されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードしているヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（たとえばＬｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻（６４７４号）：８５６〜８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子はクラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを生じる（Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．ら（１９９４年）、上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （１９９４年）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３巻：４９〜１０１頁、Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，  Ｄ．  （１９９５年）  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：６５〜９３頁、ならびにＨａｒｄｉｎｇ，  Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （１９９５年）  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４巻：５３６〜５４６頁中に総説）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスによって保有されるゲノム改変は、そのすべての内容がその全体で本明細書中に具体的に参考として組み込まれている、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．ら（１９９２年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：６２８７〜６２９５頁、Ｃｈｅｎ，  Ｊ．ら（１９９３年）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５巻：６４７〜６５６頁、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：３７２０〜３７２４頁、Ｃｈｏｉら（１９９３年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４巻：１１７〜１２３頁、Ｃｈｅｎ，  Ｊ．ら（１９９３年）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２巻：８２１〜８３０頁、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４年）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：２９１２〜２９２０頁、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．ら（１９９４年）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６巻：５７９〜５９１頁、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，  Ｄ．ら（１９９６年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：８４５〜８５１頁中にさらに記載されている。すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号およびＷＯ９９／４５９６２号、ならびにＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号をさらに参照されたい。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体を、ヒト重鎖の導入遺伝子およびヒト軽鎖のトランス染色体を保有するマウスなどの、導入遺伝子およびトランス染色体のヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用して産生させることができる。本明細書中で「ＫＭ  ｍｉｃｅ（商標）」と呼ぶそのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号中に詳述されている。
【０２０６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が当技術分野で利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。たとえば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用することができ、そのようなマウスは、たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号および第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０２０７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランス染色体動物系が当後術分野で利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。たとえば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖のトランス染色体およびヒト軽鎖のトランス染色体をどちらも保有するマウスを使用することができ、そのようなマウスはＴｏｍｉｚｕｋａら（２０００年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７巻：７２２〜７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を保有するウシが当技術分野で記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０巻：８８９〜８９４頁）、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。
【０２０８】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ方法は、当技術分野で確立されている。たとえば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、および第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号および第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号および第６，１７２，１９７号、ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号および第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【０２０９】
また、本発明のヒトモノクローナル抗体を、免疫化の際にヒト抗体の応答を生じることができるようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。そのようなマウスは、たとえば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号および第５，６９８，７６７号に記載されている。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の抗体を、Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．ら（（１９９１年）．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻、５８１頁）、Ｎｉｓｓｉｍ，  Ａ．ら（（１９９４年）．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３巻、６９２頁）ならびに米国特許第６，７９４，１３２号、第６５６２３４１号、第６０５７０９８号、第５８２１０４７号、および第６５１２０９７号に記載のように、周知のファージディスプレイ技法を使用して産生させ得る。
【０２１１】
さらなる実施形態では、本発明の抗体を、たとえば、米国特許第６，４２３，５３８号、第６，３００，０６５号、第６，６９６，２５１号、第６，６９９，６５８号に記載のように、酵母細胞表面ディスプレイ技術を使用して見つけ得る。
【０２１２】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化したマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系と融合させることができる。生じるハイブリドーマを、抗原に特異的な抗体の産生についてスクリーニングすることができる。たとえば、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％のＰＥＧを用いて１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）と融合させることができる。あるいは、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ大チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ）を使用した電界に基づく電気融合方法を使用して融合させることができる。細胞を平底マイクロタイタープレート中に約２×１０−５個でプレートに入れ、次いで、２０％の胎児クローン血清、１８％の「６５３」馴化培地、５％のオリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＨＡＴは融合の２４時間後に加える）を含有する選択培地中で２週間インキュベートする。約２週間後、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で細胞を培養することができる。その後、個々のウェルをＥＬＩＳＡによってヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ成長が起こった後、通常は１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再度プレートに入れ、再度スクリーニングすることができ、まだヒトＩｇＧについて陽性である場合は、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも２倍でサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、特徴づけのために少量の抗体を組織培養培地中で産生させることができる。
【０２１３】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって確認して、純度を保証することができる。緩衝溶液をＰＢＳに交換することができ、１．４３の消光係数を使用したＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコート分割し、−８０℃で保管することができる。
【０２１４】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体を、たとえば、当技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞のトランスフェクトーマ（ハイブリドーマの一種）中で産生させることもできる（たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  （１９８５年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：１２０２頁）。
【０２１５】
たとえば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡを標準の分子生物学的技法（たとえば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列と作動可能に連結されるように発現ベクター内に挿入することができる。この文脈では、用語「作動可能に連結されている」とは、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図する機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター内にライゲーションされていることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクター内に挿入することができ、またはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（たとえば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター内に挿入される。記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体の遺伝子を作製することができ、これは、ベクター内でＶＨセグメントがＣＨセグメント（複数可）と作動可能に連結されており、ベクター内でＶＫセグメントがＣＬセグメントと作動可能に連結されているように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター内に挿入することによる。それに加えてまたは代わって、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端と連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であることができる。
【０２１６】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」には、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）が含まれることを意図する。そのような調節配列は、たとえばＧｏｅｄｄｅｌ  （Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０年））に記載されている。当業者には、調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素が含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用し得る。さらに、調節要素は、ＳＲプロモーター系などの異なる供給源からの配列から構成され、これは、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復からの配列を含有する（Ｔａｋｅｂｅ，  Ｙ．ら（１９８８年）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８巻：４６６〜４７２頁）。
【０２１７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（たとえば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの付加配列を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、すべてＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。たとえば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞中でメトトレキサート選択／増幅と共に使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０２１８】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードしている発現ベクター（複数可）を標準の技法によって宿主細胞内にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な形態には、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞内に導入するために一般的に使用されている多種多様な技法、たとえば、電気穿孔、カルシウム−リン酸沈降、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどが包含されることを意図する。理論的には、本発明の抗体を原核生物または真核生物のどちらの宿主細胞中でも発現させることが可能であるが、真核生物細胞、具体的には哺乳動物細胞は、正しく折り畳まれた免疫学的に活性のある抗体をアセンブルおよび分泌する可能性が原核生物細胞よりも高いため、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体を高収率で産生させることに対して効果がないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，  Ｍ．  Ａ．およびＷｏｏｄ，  Ｃ．  Ｒ．  （１９８５年）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６巻：１２〜１３頁）。
【０２１９】
本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：４２１６〜４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を、たとえばＲ．  Ｊ．  ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ  （１９８２年）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９巻：６０１〜６２１頁に記載のようにＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用することが含まれる）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。具体的には、ＮＳＯ骨髄腫細胞を用いた使用に関して、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６号およびＥＰ３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードしている組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現、より好ましくは宿主細胞を増殖させている培養培地内への抗体の分泌を可能にするために十分な一定期間の間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を使用して培養培地から収集することができる。
【０２２０】
ＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合する抗体の特徴づけ
本発明の抗体を、外部ドメイン、たとえばＲＴＫのＩｇ様ドメイン（または本明細書中に記述したコンセンサス配列などの任意の選択された領域）との結合について、たとえば標準のＥＬＩＳＡによって試験することができる。手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌの精製したＩｇ様ドメイン（または好ましい受容体ドメイン）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中の５％のウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈液（たとえば、免疫化したマウス、たとえば、ヒトＫｉｔのＤ４またはＤ５ドメインで免疫化したマウスからの血漿の希釈液）をそれぞれのウェルに加え、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた二次試薬（たとえば、ヒト抗体には、ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃに特異的なポリクローナル試薬）と共に１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色（ｄｅｖｅｌｏｐ）させ、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最も高い力価を示す（ｄｅｖｅｌｏｐ）マウスを融合に使用する。
【０２２１】
また、上述のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングすることができる。高いアビディティでたとえばＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴づける。−１４０℃で保管する５〜１０本のバイアル細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために、親細胞の反応性を保持している（ＥＬＩＳＡによる）それぞれのハイブリドーマからの１つのクローンを選択することができる。
【０２２２】
抗ＲＴＫ抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって確認して、純度を保証することができる。緩衝溶液をＰＢＳに交換することができ、１．４３の消光係数を使用したＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコート分割し、−８０℃で保管することができる。
【０２２３】
選択されたモノクローナル抗体が特有なエピトープと結合するか否かを決定するために、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用してそれぞれの抗体をビオチン化することができる。上述のように、非標識のモノクローナル抗体およびビオチン化したモノクローナル抗体を使用した競合研究を、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン（たとえば、Ｋｉｔ−Ｄ４ドメイン、Ｋｉｔ−Ｄ５ドメイン、またはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン）でコーティングした、ＲＴＫでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して行うことができる。ビオチン化したｍＡｂの結合は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−アルカリホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
【０２２４】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して、アイソタイプＥＬＩＳＡを行うことができる。たとえば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンを用いて終夜、４℃でコーティングすることができる。１％のＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製したアイソタイプ対照と、周囲温度で１〜２時間反応させる。その後、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのどちらかに特異的なアルカリホスファターゼとコンジュゲートさせたプローブと反応させることができる。プレートを上述のように発色させて分析する。
【０２２５】
ウエスタンブロッティングによって、抗ＲＴＫヒトＩｇＧをＲＴＫのＩｇ様ドメインまたは本明細書中に提示したコンセンサス配列との反応性についてさらに試験することができる。手短に述べると、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインを調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、試験するモノクローナル抗体でプロービングする。ヒトＩｇＧの結合を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて発色させることができる。
【０２２６】
エピトープマッピングを用いて、本発明の抗体またはその抗原結合断片の結合部位を決定し得る。コンフォメーションエピトープのマッピングをさらに可能にするいくつかの方法が利用可能である。たとえば、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．  ２００４年、８巻（２号）：６１〜７７頁）に開示されている方法を使用し得る。Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらは、２つの新規技法であるＤｏｍａｉｎ  ＳｃａｎおよびＭａｔｒｉｘ  Ｓｃａｎを使用して不連続／コンフォメーションエピトープのマッピングに成功することができた。Ａｎｓｏｎｇら（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００６年．  ４巻（４号）：８４２〜７頁）に開示されている技法も使用し得る。Ａｎｓｏｎｇらは、親和性指向質量分析（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して、抗体Ｒ８Ｂ１２によって認識される不連続エピトープをマッピングした。さらに、タンパク質断層撮影（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）などのイメージング技法を使用して、標的ＲＴＫと結合する抗体またはペプチドを可視化し得る。タンパク質断層撮影は、以前に、分子相互作用についての識見を得るため、および、阻害性抗体が、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩと結合し、それによってＥＧＦＲを柔軟性のない不活性のコンフォメーションに固定することによって作用したことを示すために、使用されている（Ｌａｍｍｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８年．１０５巻（１６号）：６１０９〜１４頁）。また、部位特異的変異誘発などのより伝統的な方法も、不連続エピトープをマッピングするために適用し得る。不連続エピトープに参加すると考えられているアミノ酸領域を選択的に変異させ、本発明の抗体またはその抗原結合断片との結合についてアッセイし得る。どちらかの領域が変異している場合に抗体が結合できないことは、結合が両方のアミノ酸セグメントに依存していることを示している場合がある。上述のように、一部の直鎖状エピトープは、本発明の部分と結合するために存在していなければならない特定の三次元構造によって特徴づけられている。そのようなエピトープを、ＲＴＫがそのネイティブまたは折り畳まれた状態にある場合での抗体（または別の部分）の結合をアッセイし、ＲＴＫが変性されている場合での結合を再度アッセイすることによって、発見し得る。結合が折り畳まれた状態でのみ起こるという観察は、エピトープが、特定の折り畳まれた構造によって特徴づけられる直鎖状エピトープ、または折り畳まれたタンパク質中でのみ存在する不連続エピトープのどちらかであることを示す。
【０２２７】
本明細書中に記載の活性アッセイに加えて、タンパク質断層撮影を使用して、本発明の抗体またはその抗原結合断片が受容体チロシンキナーゼと結合して不活性化させることができるか否かを決定し得る。結合の相互作用の可視化は、抗体の結合が、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与え得ること、または受容体チロシンキナーゼ中のコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ得ることを示し得る。
【０２２８】
ＩＩ．ヒト受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合する小分子
本発明の別の態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合する部分は、小分子である。
【０２２９】
本発明の小分子は、特定の機能的特長または特性によって特徴づけられている。たとえば、小分子は、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえば、Ｋｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン、あるいはＲＴＫのヒンジ領域、たとえば、Ｋｉｔ  ＲＴＫのＤ３−Ｄ４またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と結合する。好ましい実施形態では、小分子インヒビターとＤ３−Ｄ４またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域との結合は、膜近位のＤ４およびＤ５ドメインがトランス自己リン酸化およびチロシンキナーゼドメインの活性化、次いで下流のシグナル伝達経路のリクルートおよび活性化を可能にする距離および配向（位置）になることを可能にする移動を妨げる。一部の実施形態では、小分子の結合は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインが二量体化することを可能にするが、２つの単量体のＩｇ様ドメイン（たとえば、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ４もしくはＤ５−Ｄ５ドメインまたはＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７−Ｄ７ドメイン）間の配置、配向および／または距離に影響を与え、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する場合がある。言い換えれば、部分または小分子は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインの、リガンド誘導性の二量体化を可能にするが、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与え、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する（たとえば、受容体の内在化を阻害する、および／または受容体のチロシン自己リン酸化を阻害する、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力を阻害する）場合がある。
【０２３０】
用語「小分子化合物」、「小分子薬」、「小分子」、または「小分子インヒビター」は、本明細書中で互換性があるように使用され、ＲＴＫに対する効果、およびＲＴＫ、たとえばＫｉｔ  ＲＴＫまたはＶＥＧＦ受容体の二量体化または活性を阻害するその能力についてスクリーニングした本発明の化合物をいう。これらの化合物は、ＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＭＬＳＣＮ）データベースにおける化合物、関連するデータベースにおける化合物、またはその誘導体および／もしくは機能的類似体を含んでいてもよい。
【０２３１】
本明細書において使用されるように、「類似体」または「機能的類似体」は、親化合物に構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる（たとえば、１つまたは複数の原子または官能基が追加されている、除去されている、または修飾されている）化学化合物または小分子インヒビターを指す。類似体は、もとの化合物と異なる化学的または物理的特性を有していても、または有していなくてもよく、改善された生物学的および／または化学的活性を有していても、または有していなくてもよい。たとえば、類似体は、より疎水性であってもよく、またはそれは、親化合物と比較して、改変された活性（増加した、減少した、もしくは親化合物と同一の）を有していてもよい。類似体は、もとの化合物の、天然に存在するかまたは天然に存在しない（たとえば組換え）バリアントであってもよい。他のタイプの類似体は、異性体（鏡像異性体、ジアステレオマー、およびその他同種のもの）および化合物の他のタイプのキラルバリアント、ならびに構造異性体を含む。類似体は、直線状化合物の分岐バリアントまたは環状バリアントであってもよい。たとえば、直線状化合物は、ある種の望ましい特性を与える（たとえば、親水性または生物学的利用能を改善する）ように分岐されたかまたは他の場合には置換された類似体を有していてもよい。
【０２３２】
本明細書において使用されるように、「誘導体」は、親化合物に構造的に類似しており（実際にまたは理論上）、その親化合物から誘導可能である、化学化合物または小分子インヒビターの化学的または生物学的修飾バージョンを指す。親化合物は、「誘導体」を生成するための出発物質であり得、それに対して、親化合物が、「類似体」または「機能的類似体」を生成するための出発物質として必ずしも使用されなくてもよいという点で、「誘導体」は、「類似体」または「機能的類似体」と異なる。誘導体は、親化合物と異なる化学的または物理的特性を有していても、または有していなくてもよい。たとえば、誘導体は、より親水性であってもよく、またはそれは、親化合物と比較して、改変された反応性を有していてもよい。誘導体化（つまり化学的または他の手段による修飾）は、分子内での１つまたは複数の部分の置換（たとえば官能基における変化）を含んでいてもよい。たとえば、水素は、フッ素もしくは塩素などのようなハロゲンと置換されてもよく、またはヒドロキシル基（−−ＯＨ）は、カルボン酸部分（−−ＣＯＯＨ）と交換されてもよい。用語「誘導体」はまた、コンジュゲートおよび親化合物のプロドラッグ（つまり、生理学的条件下でもとの化合物に変換することができる化学的に修飾された誘導体）をも含む。たとえば、プロドラッグは、活性剤の不活性な形態であってもよい。生理学的条件下で、プロドラッグは、化合物の活性形態に変換されてもよい。プロドラッグは、たとえば、窒素原子上の１つまたは２つの水素原子を、アシル基（アシルプロドラッグ）またはカルバメート基（カルバメートプロドラッグ）と交換することによって形成されてもよい。プロドラッグに関するより詳細な情報は、たとえば、Ｆｌｅｉｓｈｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９巻（１９９６年）１１５頁；Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５年；およびＨ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  １６巻（１９９１年）４４３頁において見つけられる。用語「誘導体」はまた、すべての溶媒化合物、たとえば水和物または付加物（たとえばアルコールを用いた付加物）、活性代謝物、および親化合物の塩を記載するために使用される。調製されてもよい塩のタイプは、化合物内の部分の性質に依存する。たとえば、カルボン酸基などのような酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（たとえばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、および生理学的に許容できる４級アンモニウムイオンとの塩、およびアンモニアおよび生理学的に許容できる有機アミン（トリエチルアミン、エタノールアミン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンなど）との酸付加塩）を形成することができる。塩基性基は、たとえば、塩酸（「ＨＣｌ」）、硫酸、もしくはリン酸などのような無機酸と、または酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、もしくはｐ−トルエンスルホン酸などのような有機カルボン酸およびスルホン酸と酸付加塩を形成することができる。塩基性窒素原子に加えてのカルボキシル基などのような、塩基性基および酸性基を同時に含有する化合物は、両性イオンとして存在することができる。塩は、たとえば、陽イオン交換または陰イオン交換によって、溶媒もしくは希釈剤中のまたは他の塩由来の無機または有機酸または塩基と化合物を組み合わせることによって、当業者らに公知の通常の方法によって得ることができる。
【０２３３】
小分子は、１２００以下または１０００以下または９００以下または８００以下または７００以下または６００以下または５００以下または４００以下または３００以下または２００以下または１００以下または５０以下または２５以下または１０以下の分子量を有することが公知である。
【０２３４】
本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫの外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合するように選択または設計される。一部の実施形態では、小分子インヒビターは、ヒトＫｉｔ、ヒトＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域、たとえば、ヒトＫｉｔ受容体のＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＤ３−Ｄ４および／もしくはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と結合し、それによって二量体化して活性となる、たとえば、自己リン酸化して細胞内シグナル伝達経路を活性化する、受容体の能力に拮抗するように選択または設計される。他の実施形態では、小分子インヒビターは、Ｋｉｔ受容体またはＶＥＧＦ受容体のドメインと相同性を共有するドメインと結合するように選択される。たとえば、本発明の小分子は、ＲＴＫのＩｇ様ドメイン、たとえばＫｉｔのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン、あるいはＫｉｔまたはＰＤＧＦＲ受容体のＲＴＫのヒンジ領域、たとえばＤ３−Ｄ４またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％もしくは９９％同一であるドメインに向けられていてよい。そのような小分子は、たとえばＫｉｔまたはＰＤＧＦ受容体のＤ４、Ｄ５もしくはＤ７ドメインまたはＤ３−Ｄ４および／もしくはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と機能的に類似のタンパク質ドメイン（場合によってはＫｉｔ、ＶＥＧＦ受容体および他のＲＴＫ中の）と結合することができるであろう。
【０２３５】
また、本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫ、たとえばヒトＶＥＧＦ受容体またはヒトＩＩＩ型ＲＴＫのＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域に由来する特定のモチーフまたはコンセンサス配列とも結合して、小分子インヒビターがＲＴＫファミリーのメンバー、たとえばヒトＩＩＩ型ＲＴＫファミリーのメンバー間で共有されているドメインと特異的に結合することを可能にし得る。
【０２３６】
具体的な一実施形態では、本発明の小分子は、以下のＤ４相互作用部位のコンセンサス配列と結合する：ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ［式中、Ｌはロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、アスパラギン、またはリシンからなる群より選択され、Ｘ２は、ロイシン、バリン、アラニン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびアルギニンからなる群より選択され、Ｘ４は、グリシン、バリン、アラニン、グルタミン酸、プロリン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ５は、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン、およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ７は、グリシン、セリン、アラニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびスレオニンからなる群より選択される。
【０２３７】
別の実施形態では、本発明の小分子は、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：ＩＸ１ＲＶＸ２Ｘ３ＥＤＸ４Ｇ［式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、グルタミン酸、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸およびリシンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびアラニンからなる群より選択される（配列番号１）。
【０２３８】
別の実施形態では、本発明の部分（たとえば、小分子）は、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Φはバリンであり、Ｘ１は、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５は、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【０２３９】
他の実施形態では、小分子インヒビターは、タンパク質の三次元構造を表すタンパク質モチーフまたはコンセンサス配列と結合する。そのようなモチーフまたはコンセンサス配列は、近接した一連のアミノ酸ではなく、ＲＴＫの三次元の折り畳み（すなわち構造モチーフ）から生じる非直鎖状アミノ酸の構成を表す。そのようなモチーフの例は、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４および／またはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域に基づいて設計されているモチーフである。そのようなモチーフおよびコンセンサス配列は、抗体に関してセクションＩに記述した方法に従って設計し得る。
【０２４０】
重要なことに、本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫのリガンド結合部位、たとえばＫｉｔ受容体のＳＣＦ結合部位と結合しない。言い換えれば、小分子インヒビターは、リガンド結合に関与するＲＴＫのＩｇ様ドメインと結合しない。
【０２４１】
別の実施形態では、本発明の小分子インヒビターはＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。
【０２４２】
さらなる実施形態では、本発明の小分子インヒビターは、ＲＴＫの変異体の外部ドメイン、たとえば変異体のＩｇ様ドメインまたは変異体のヒンジ領域と特異的に結合するように選択または設計されている。好ましい実施形態では、変異ＲＴＫは腫瘍形成性または腫瘍発生性の変異体である。具体的な一実施形態では、小分子インヒビターは、腫瘍発生性Ｋｉｔ受容体変異体と結合するように選択または設計される。本発明の小分子によって標的化され得るＫｉｔ受容体変異体は、以下のアミノ酸のうちの１つまたは複数中に変異を有するＫｉｔ受容体である：Ｔｈｒ４１７、Ｔｙｒ４１８、Ａｓｐ４１９、Ｌｅｕ４２１、Ａｒｇ４２０、Ｔｙｒ５０３、またはＡｌａ５０２。当業者には、本発明の方法がＫｉｔ中の他の変異または他のＲＴＫ中の変異に適用可能であることが理解されよう。変異ＲＴＫを標的化することの１つの利点は、治療的小分子が、変異を含有する細胞上のＲＴＫのみと結合して、健康な細胞にはほとんどまたは完全に影響を与えない可能性があることである。したがって、変異が腫瘍形成性である事例では、腫瘍細胞のみが治療のために標的化され、副作用および必要用量が潜在的に低下する。
【０２４３】
一部の実施形態では、小分子は、ヒトＫｉｔ受容体の特定の配列、たとえば、ヒトＫｉｔ受容体の残基３０９〜４１３、残基４１０〜５１９、３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕ、または４１８Ｔｙｒおよび５０５Ａｓｎと結合する。一部の実施形態では、小分子は、ヒトＶＥＧＦ受容体の特定の配列、たとえば、ＶＥＧＦＲ１の残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ２の残基７２４〜７３３、ＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ３の残基７３５〜７４４、またはＶＥＧＦＲ３の残基Ａｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合する。
【０２４４】
好ましい実施形態では、本発明の小分子は、表４（以下）中に記載の小さな空洞またはポケットを構成するＫｉｔ受容体中の１つまたは複数の残基と結合し得る。たとえば、本発明の小分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域中の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｄ３ドメインからのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２およびＤ４ドメインからのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３。また、本発明の小分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ４ドメイン中で凹表面を構成する以下の残基のうちの１つまたは複数とも結合し得る：Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０。別の実施形態では、本発明の小分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ２−Ｄ３ヒンジ領域中でポケットを形成する以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｄ２ドメインからのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３ドメインからのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９。
【０２４５】
したがって、一部の実施形態では、本発明の小分子は、近接したアミノ酸残基または近接していないアミノ酸残基と結合して、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能し得る。また、本発明の小分子は、ホモタイプのＤ４もしくはＤ５受容体の相互作用を妨げるか、またはリガンド−受容体の相互作用部位を不安定化するようにも作用し得る。一部の好ましい実施形態では、本発明の小分子は、Ｋｉｔ受容体上の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。当業者には、一部の実施形態では、本発明の小分子は、他のＩＩＩ型ＲＴＫ中の対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【０２４６】
具体的な実施形態では、本発明の小分子は、ＩＩＩ型ＲＴＫまたはＶ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープと結合する。コンフォメーションまたは不連続エピトープは、ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばヒトＫｉｔ受容体またはＰＤＧＦ受容体からのＤ３、Ｄ４、もしくはＤ５ドメインまたはＤ４−Ｄ５もしくはＤ３−Ｄ４ヒンジ領域からの２つ以上の残基、あるいはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインからの２つ以上の残基から構成され得る。たとえば、コンフォメーションまたは不連続エピトープは、以下の表４中に記載の残基のうちの２つ以上から構成され得る。特定の実施形態では、本発明の小分子は、Ｙ１２５、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。類似の実施形態では、本発明の小分子は、以下のアミノ酸の群のうちの１つから選択される、２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合し得る：Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｆ２０８、およびＴ２９５；Ｌ２２２、Ａ３３９、Ｆ３４０、Ｋ３４２、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３１２、Ｅ３３８、Ｆ３４０、およびＩ３７１；Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｇ３１１、Ｆ３４０、Ｐ３４１、およびＤ３９８；Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｎ３６７、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｇ３８４、Ｔ３８５、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、およびＫ４７１；Ｙ４０８、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｋ４７１、およびＬ４７２；Ｆ３２４、Ｖ３２５、Ｎ３２６、およびＮ４１０；Ｄ３２７、Ｎ４１０、Ｔ４１１、Ｋ４１２、およびＶ４９７；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｖ４０９、およびＫ４７１；Ｌ３８２、Ｇ３８７、Ｖ４０７、およびＶ４０９；Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９；Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｔ４１１、Ｆ４３３、Ｆ４６９、Ｇ４７０、およびＫ４７１；Ｄ３２７、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ａ４３１、Ｇ４３２、およびＫ４７１；Ｙ３５０、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０；Ｙ３５０、Ｒ３５３、およびＦ３５５。上述のように、本発明の小分子は、表４中に同定したポケットもしくは空洞を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらはポケットもしくは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の小分子に言及した場合、その意図は、小分子がエピトープを構成する具体的な残基（たとえば表４中に同定したポケットまたは空洞）のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【０２４７】
さらなる実施形態では、本発明の小分子は、表５中に記載のペプチドから選択される２つ以上のアミノ酸残基から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、第１のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基および第２のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基から構成され、第１および第２のペプチドは、表５中に記載のペプチドの群から選択される。したがって、本発明の小分子はコンフォメーションエピトープと結合し、第１および第２のペプチド群は以下のとおりである：Ａｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２およびＴｈｒ３０４−Ｖａｌ３０８；Ａｓｐ３０９−Ｇｌｙ３１１およびＡｒｇ２２４−Ｇｌｙ２２６；Ｔｈｒ３０３−Ｇｌｕ３０６およびＡｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２；Ａｓｎ３６７−Ａｓｎ３７０およびＳｅｒ２１７−Ｔｙｒ２２１；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＡｓｎ３９６−Ｖａｌ３９９；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＧｌｕ３６８−Ａｒｇ３７２；Ｌｙｓ３５８−Ｔｙｒ３６２およびＶａｌ３７４−Ｈｉｓ３７８；Ａｓｐ３５７−Ｇｌｕ３６０およびＬｅｕ３７７−Ｔｈｒ３８０；Ｍｅｔ３５１−Ｇｌｕ３６０およびＨｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９；Ｈｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９およびＶａｌ３２３−Ａｓｐ３３２；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４９３−Ｔｈｒ５００；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４３１−Ｔｈｒ４３７；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＰｈｅ４６９−Ｖａｌ４７３；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＶａｌ３２５−Ａｓｎ３３０；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｒｇ３８１−Ｇｌｙ３８７；Ｇｌｙ４６６−Ｌｅｕ４７２およびＧｌｙ３８４−Ｇｌｙ３８８；Ｖａｌ３２５−Ｇｌｕ３２９およびＴｙｒ４９４−Ｌｙｓ４９９；Ｔｈｒ４１１−ｌｅｕ４１６およびＶａｌ４９７−Ａｌａ５０２；Ｉｌｅ４１５−Ｌｅｕ４２１およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７；Ａｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＬｙｓ４８４−Ｔｈｒ４８８；およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＧｌｙ４４５−Ｃｙｓ４５０。本発明の小分子は、前述の第１および第２のペプチド群を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらは第１および第２のペプチド群を形成する残基のサブセットと結合し得る。特定の実施形態では、エピトープ、たとえばコンフォメーションエピトープと結合する本発明の小分子に言及した場合、その意図は、小分子がエピトープを構成する具体的な残基（たとえば表５中に同定した具体的なペプチド）のみと結合し、受容体の直鎖状アミノ酸配列中の他の残基とは結合しないことであることを理解されたい。
【０２４８】
別の実施形態では、本発明の小分子は、Ｅ３３、Ｐ３４、Ｄ７２、Ｅ７６、Ｎ７７、Ｋ７８、Ｑ７９、Ｋ１５８、Ｄ１５９、Ｎ２５０、Ｓ２５１、Ｑ２５２、Ｔ２５３、Ｋ２５４、Ｌ２５５、Ｎ２６０、Ｗ２６２、Ｈ２６４、Ｇ２６５、Ｅ３４４、Ｎ３５２、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｔ３５６、Ｄ３５７、Ｙ３６２、Ｓ３６５、Ｅ３６６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、およびＧ４６６からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションまたは不連続エピトープと結合する。
【０２４９】
別の実施形態では、本発明の小分子は、ヒトＰＤＧＦＲβのアミノ酸残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕ、またはＰＤＧＦＲα中の対応する残基と結合する。ヒトＰＤＧＦＲβの残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕは、Ｋｉｔ受容体の残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕに類似しており、ＰＤＧＦＲβのホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用を媒介する。本発明の小分子は、チロシンキナーゼの活性化に必須の距離および配向での細胞質ドメインの配置に必須の、ＩＩＩ型ＲＴＫの膜近位領域間の重要なホモタイプ相互作用（ヒトＰＤＧＦＲβの３８５Ａｒｇと３９０Ｇｌｕとの間に形成された塩橋など）を妨げることによって、受容体の活性化に対するその阻害効果を発揮し得る。本明細書中に記述した実験は、ホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用はＰＤＧＦＲβの二量体化に必要ではなく、ＰＤＧＦＲβの二量体化は受容体の活性化に必要であるが十分ではないことを示している。したがって、本発明の小分子は、ＰＤＧＦＲβの二量体化を可能にする一方で、活性化を妨げ得る。構造に基づく配列アラインメントにより、ＥＦループの大きさ、ならびにＤ４−Ｄ４境界領域を含む重要なアミノ酸は、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１Ｒ中で保存されていることが示されている。したがって、一部の実施形態では、本発明の小分子は、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４またはＤ５ドメインの保存された領域に対して標的化し得る。
【０２５０】
好ましい実施形態では、本発明の小分子は、ＫｉｔのＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域（たとえば、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４および／もしくはＤ４−Ｄ５ヒンジ領域またはＤ４−Ｄ４および／もしくはＤ５−Ｄ５境界領域結合部位）と、高い親和性、たとえば、１×１０−７Ｍ以下のＫＤ、５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、１×１０−８Ｍ以下のＫＤ、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤの親和性で結合する。
【０２５１】
本発明の小分子インヒビターは、当技術分野で公知のいくつかの方法によって作製または選択し得る。スクリーニング手順を使用して、ＲＴＫの所望のＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域、たとえばヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインと結合するライブラリからの小分子を同定することができる。１つの方法であるＣｈｅｍｅｔｉｃｓ（登録商標）（Ｎｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ）では、ライブラリ中のそれぞれの分子に対するＤＮＡタグを使用して選択を容易にする。Ｃｈｅｍｅｔｉｃｓ（登録商標）システムは、数百万個の化合物を標的結合についてスクリーニングすることを可能にする。小分子ライブラリおよびタグに基づくスクリーニングに関連する特許は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第２００７００２６３９７号、第２００６０２９２６０３号、第２００６０２６９９２０号、第２００６０２４６４５０号、第２００６０２３４２３１号、第２００６００９９５９２号、第２００４００４９００８号、第２００３０１４３５６１号である。
【０２５２】
ＲＴＫの所望のＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域、たとえば、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと結合するライブラリからの小分子を同定するために使用し得る他の周知の方法には、ライブラリメンバーが同定用標識でタグ付けされているライブラリを利用する方法、すなわち、標識の同定からタグ付けされた分子の構造が示されるように、ライブラリ中に存在するそれぞれの標識がライブラリ中に存在する個々の化合物構造と関連している方法が含まれる。タグを付けられたライブラリーに対する１つのアプローチは、たとえば、それぞれの全内容が、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０５８４７９  Ａ２（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）技術）ならびに米国特許第５，５７３，９０５号；第５，７０８，１５３号；第５，７２３，５９８号、第６，０６０，５９６号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９３／０６１２１；ＷＯ  ９３／２０２４２；ＷＯ  ９４／１３６２３；ＷＯ  ００／２３４５８；ＷＯ  ０２／０７４９２９、およびＷＯ  ０２／１０３００８ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻、５３８１〜５３８３頁（１９９２年））；ＮｉｅｌｓｅｎおよびＪａｎｄａ（Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６巻、３６１〜３７１頁（１９９４年））；およびＮｉｅｌｓｅｎ、Ｂｒｅｎｎｅｒ、およびＪａｎｄａ（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５巻、９８１２〜９８１３頁（１９９３年））において記載されるように、オリゴヌクレオチドタグを利用する。そのようなタグは、たとえば、タグの多くのコピーを産生し、配列決定によってタグを同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅することができる。次いで、タグの配列は、結合分子の構造を同定する（これを、純粋な形態で合成し、活性について試験することができる）。
【０２５３】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者らに周知である。本発明の部分を同定するために使用されてもよいこのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリーを含むが、これらに限定されない（たとえば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  ３７巻：４８７  ４９３頁（１９９１年）、およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：８４  ８８頁（１９９１年）を参照されたい）。化学的多様性ライブラリーを生成するための他の化学的物質は、当技術分野において周知であり、使用することができる。そのような化学的物質は、ペプトイド（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１９７３５）、コードペプチド（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（たとえば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６９０９  ６９１３頁（１９９３年））、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４巻：６５６８頁（１９９２年））、グルコース骨格を有する非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４巻：９２１７  ９２１８頁（１９９２年））、類似有機合成の小さな化合物のライブラリー（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６巻：２６６１頁（１９９４年））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：１３０３頁（１９９３年））、ならびに／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９巻：６５８頁（１９９４年））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＲｕｓｓｅｌｌ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい、すべて前掲）、ペプチド核酸ライブラリー（たとえば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（たとえばＬｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：１５２０  １５２２頁（１９９６年）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、小さな有機分子のライブラリー（たとえば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、１月１８日、３３頁（１９９３年）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号、ならびにその他同種のものを参照されたい）を含むが、これらに限定されない。先の刊行物はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。公的なデータベース、たとえばＰｕｂＣｈｅｍ（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｚｉｎｃ（ＩｒｗｉｎおよびＳｈｏｉｃｈｅｔ（２００５年）Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．  ４５巻（１号）：１７７〜８２頁）、ならびにＣｈｅｍＢａｎｋ（Ｓｅｉｌｅｒら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６巻（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３５１−Ｄ３５９）もまた、利用可能であり、一般に、小分子スクリーニングのために使用される。
【０２５４】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販で入手可能である（たとえば３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、９０５０  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．を参照されたい）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それら自体、市販で入手可能である（たとえばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍｄ．、などを参照されたい）。さらに、スクリーニング方法は、非常に十分に定義されているので、目的の標的に対する特定の化合物を同定するために専門の会社と契約することは一般的である（たとえばＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ（ｂｉｏｆｏｃｕｓ．ｃｏｍ）およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｌｅａｄ（ｑ−ｌｅａｄ．ｃｏｍ））。
【０２５５】
当技術分野において周知であり、本発明の方法に適用されてもよい小分子を選択するための他の方法は、それらの全体が全て参照によって本明細書に組み込まれるＨｕａｎｇおよびＳｔｕａｒｔ  Ｌ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（１９９７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９４巻（２５号）：１３３９６〜１３４０１頁；Ｈｕｎｇら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６７０〜６７４頁；Ｚｈａｎｇら（２００７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４巻：４６０６〜４６１１頁；またはＧｏｒｄｏｎ（２００７年）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：９〜１６頁において概説される方法のいずれかである。
【０２５６】
実験的なスクリーニング方法に加えて、本発明の小分子は、仮想スクリーニング方法を使用して選択されてもよい。仮想スクリーニング技術は、統計分析およびタンパク質ドッキングシミュレーションを使用して、ライブラリー由来のどの小分子が、タンパク質またはその中の特異的なエピトープに結合するかを予測する。最も一般には、仮想スクリーニング方法は、タンパク質の三次元構造をライブラリーにおける小分子の三次元構造と比較する。水素結合、静電力、およびファンデルワールス相互作用を含む、原子の間の結合エネルギーをシミュレートするアルゴリズムを用いることが一般的であるが、タンパク質−分子相互作用をモデル化するための異なる戦略が、使用される。典型的に、仮想スクリーニング方法は、１００万を超える化合物のライブラリーをスキャンし、おそらく強力な結合物であろう小分子の短いリストを返すことができる。本発明の小分子を同定するために使用されてもよい技術を詳述する、仮想スクリーニング方法のいくつかの概説が、入手可能である（Ｅｎｇｅｌら（２００８年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３０巻（１５号）、５１１５〜５１２３頁；ＭｃＩｎｎｅｓ（２００７年）．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  Ｏｃｔ；１１巻（５号）：４９４〜５０２頁；Ｒｅｄｄｙら（２００７年）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ８月；８巻（４号）：３２９〜５１頁；ＭｕｅｇｇｅおよびＯｌｏｆｆ（２００６年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  ３巻（４号）：４０５〜４１１頁；Ｋｉｔｃｈｅｎら（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３巻、９３５〜９４９頁）。小分子スクリーニングのさらなる例は、参照によって本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．２００５／０１２４６７８において見つけることができる。
【０２５７】
本発明の小分子は、下記の表において示される骨格構造のうちの１つを含有してもよい。表中に引用される参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それらが、示される反応に干渉したり、有意に阻害したりするべきでないという点でのみ制限され、水素、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、置換アミノ、および当技術分野において公知の他のものを含むことができる。適した置換基は、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、ニトロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アリールオキシ、アリール−Ｓ−、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、シアノ、シアネート、ニトリル、イソシアネート、チオシアネート、カルバミル、および置換カルバミルを含むが、これらに限定されない。
【０２５８】
【表６−１】
2013515776.tif 000003
【０２５９】
【表６−２】
2013515776.tif 000004
【０２６０】
【表６−３】
2013515776.tif 000005
【０２６１】
【表６−４】
2013515776.tif 000006
【０２６２】
【表６−５】
2013515776.tif 000007
ＩＩＩ．ヒト受容体チロシンキナーゼのＩｇ様ドメインと結合するペプチド性分子
本発明の別の態様では、ヒト受容体チロシンキナーゼの外部ドメイン、たとえばＩｇ様ドメインまたはヒンジ領域と結合する部分は、ペプチド性分子である。
【０２６３】
ペプチド性分子は、ＲＴＫのＩｇ様ドメインまたはそのようなドメインに由来するコンセンサス配列に基づいて設計されていてよい。
【０２６４】
具体的な実施形態では、ペプチド性分子は、以下のＤ４相互作用部位のコンセンサス配列と結合する：ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ［式中、Ｌはロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、アスパラギン、またはリシンからなる群より選択され、Ｘ２は、ロイシン、バリン、アラニン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびアルギニンからなる群より選択され、Ｘ４は、グリシン、バリン、アラニン、グルタミン酸、プロリン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ５は、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン、およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ７は、グリシン、セリン、アラニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびスレオニンからなる群より選択される。
【０２６５】
したがって、一実施形態では、本発明のペプチド性分子は、前述のコンセンサス配列（ＬＸ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｇ）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸である］と適合する配列を含むかまたはそれからなる。具体的な実施形態では、Ｘ１は、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、アスパラギン、またはリシンからなる群より選択され、Ｘ２は、ロイシン、バリン、アラニン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびアルギニンからなる群より選択され、Ｘ４は、グリシン、バリン、アラニン、グルタミン酸、プロリン、およびメチオニンからなる群より選択され、Ｘ５は、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン、およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ７は、グリシン、セリン、アラニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびスレオニンからなる群より選択される。
【０２６６】
別の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインのコンセンサス配列を含むかまたはそれからなる：Ｌ／Ｉ  Ｘ１  Ｒ  Φ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｄ／Ｅ  Ｘ５  Ｇ（配列番号１５８）［式中、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Φは疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Φはバリンであり、Ｘ１は、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニン、リシンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、リシン、グルタミン酸、グルタミンおよびバリンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびバリンからなる群より選択され、Ｘ５は、グルタミン酸、グリシン、セリンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【０２６７】
別の実施形態では、ペプチド性分子は、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーのＤ７ドメインの以下のコンセンサス配列と結合する：ＩＸ１ＲＶＸ２Ｘ３ＥＤＸ４Ｇ［式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸である］。具体的な実施形態では、Ｘ１は、グルタミン酸、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸およびリシンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびアラニンからなる群より選択される（配列番号１）。
【０２６８】
したがって、一実施形態では、本発明のペプチド性分子は、コンセンサス配列ＩＸ１ＲＶＸ２Ｘ３ＥＤＸ４Ｇ［式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｒはアルギニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｇはグリシンであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸である］と適合する配列を含むかまたはそれからなる。具体的な実施形態では、Ｘ１は、グルタミン酸、アルギニン、およびグルタミンからなる群より選択され、Ｘ２は、アルギニンおよびスレオニンからなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸およびリシンからなる群より選択され、Ｘ４は、グルタミン酸およびアラニンからなる群より選択される（配列番号１）。
【０２６９】
一実施形態では、本発明のペプチド性部分は、タンパク質ドメイン全体、たとえばＤ４またはＤ５ドメイン、たとえばヒトＫｉｔのＤ４ドメイン（残基３０９〜４１３）またはＤ５ドメイン（残基４１０〜５１９）を含み得る。さらなる例として、本発明のペプチド性部分は、Ｖ型ＲＴＫのＤ７ドメイン（またはその断片）、たとえば、ＶＥＧＦＲのＤ７ドメイン（ＶＥＧＦＲ１の残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ２の残基７２４〜７３３またはＶＥＧＦＲ３の残基７３５〜７４４）を含み得る。そのようなペプチド性分子は、ＲＴＫと結合し、ＲＴＫの活性化を妨げることによって拮抗剤として作用する（以下の実施例１６を参照）。一部の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ＩＩＩ型ＲＴＫなどのＲＴＫのドメインとわずか５０％の同一性を有していればよく、たとえば、本発明のペプチド性部分は、ＲＴＫのＤ４、Ｄ５またはＤ７ドメインと少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一であり得る。具体的な実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫのアミノ酸残基３０９〜４１３、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３、またはＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５〜７４４と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一である。類似の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫのアミノ酸残基４１０〜５１９、ＶＥＧＦＲ１のアミノ酸残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸残基７２４〜７３３、またはＶＥＧＦＲ３のアミノ酸残基７３５〜７４４と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一である。
【０２７０】
一部の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ヒトＫｉｔ受容体の特定の配列、たとえば、ヒトＫｉｔ受容体の残基３０９〜４１３、残基４１０〜５１９、３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕ、または４１８Ｔｙｒおよび５０５Ａｓｎと結合するかまたはそれを含む。他の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ＶＥＧＦ受容体の特定の配列、たとえば、ＶＥＧＦＲ１の残基７１８〜７２７、ＶＥＧＦＲ１のＡｒｇ７２０およびＡｓｐ７２５、ＶＥＧＦＲ２の残基７２４〜７３３、ＶＥＧＦＲ２のＡｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１、ＶＥＧＦＲ３の残基７３５〜７４４、またはＶＥＧＦＲ３のＡｒｇ７３７およびＡｓｐ７４２と結合するかまたはそれを含む。
【０２７１】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド性部分は、表４（以下）中に記載の小さな空洞またはポケットを構成するＫｉｔ受容体中の１つまたは複数の残基と結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）。たとえば、本発明のペプチド性分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域中の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）：Ｄ３ドメインからのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２およびＤ４ドメインからのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３。また、本発明のペプチド性分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ４ドメイン中で凹表面を構成する以下の残基のうちの１つまたは複数とも結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）：Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０。別の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、Ｋｉｔ受容体のＤ２−Ｄ３ヒンジ領域中でポケットを形成する以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）：Ｄ２ドメインからのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＤ３ドメインからのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９。
【０２７２】
本発明のペプチド性部分は、近接したアミノ酸残基または近接していないアミノ酸残基と結合して、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向でのＲＴＫの膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能し得る。また、本発明のペプチド性分子は、ホモタイプのＤ４、Ｄ５もしくはＤ７受容体の相互作用を妨げるかまたはリガンド−受容体の相互作用部位を不安定化するようにも作用し得る。一部の好ましい実施形態では、本発明のペプチド性分子は、Ｋｉｔ受容体上の以下の残基のうちの１つまたは複数と結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）：Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、Ｙ２６９、Ｔ２９５、Ｌ２２２、Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｙ２２１、Ａ３３９、Ｄ３２７、Ｄ３９８、Ｅ３３８、Ｅ３６８、Ｅ３８６、Ｆ３１２、Ｆ３２４、Ｆ３４０、Ｆ３５５、Ｇ３１１、Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｉ３７１、Ｋ３４２、Ｋ３５８、Ｌ３８２、Ｌ３７９、Ｎ３２６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、Ｎ４１０、Ｐ３４１、Ｓ３６９、Ｔ３８５、Ｖ３２５、Ｖ４０７、Ｖ４０９、Ｙ３７３、Ｙ３５０、Ｙ４０８、Ｔ３８０、Ｔ３９０、Ｒ３８１、Ｒ３５３、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ｋ４７１、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｌ４７２、Ｖ４９７、Ｆ４６９、Ａ４３１、またはＧ４３２。本発明のペプチド性部分は、表４中に同定したポケットまたは空洞を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）、あるいは、これらは、ポケットまたは空洞を形成する残基のサブセットと結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）。当業者には、一部の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、他のＩＩＩ型ＲＴＫ中の対応する残基、たとえば、類似のポケットもしくは空洞を形成する残基または構造アラインメントもしくは配列アラインメントによって同じ位置にあるものに対して容易に標的化し得ることが理解されよう。
【０２７３】
具体的な実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＩＩＩ型ＲＴＫまたはＶ型ＲＴＫ上のコンフォメーションエピトープまたは不連続エピトープと結合する。コンフォメーションまたは不連続エピトープは、ＩＩＩ型ＲＴＫ、たとえばヒトＫｉｔ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体、またはＶ型ＲＴＫ、たとえばヒトＶＥＧＦ受容体からの、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５もしくはＤ７ドメイン、またはＤ４−Ｄ５もしくはＤ３−Ｄ４ヒンジ領域からの２つ以上の残基から構成され得る。たとえば、コンフォメーションまたは不連続エピトープは、以下の表４中に記載の残基のうちの２つ以上から構成され得る。特定の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、Ｙ１２５、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。類似の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、以下のアミノ酸の群のうちの１つから選択される、２つ以上のアミノ酸から構成されるコンフォメーションエピトープと結合し得る：Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ１２７、Ａ２０７、Ｆ２０８、およびＴ２９５；Ｌ２２２、Ａ３３９、Ｆ３４０、Ｋ３４２、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｌ２２２、Ｌ２２３、Ｅ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３１２、Ｅ３３８、Ｆ３４０、およびＩ３７１；Ｒ２２４、Ｖ３０８、Ｋ３１０、Ｇ３１１、Ｆ３４０、Ｐ３４１、およびＤ３９８；Ｋ２１８、Ａ２１９、Ｓ２２０、Ｎ３６７、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｋ２１８、Ａ２２０、Ｅ３６８、およびＳ３６９；Ｇ３８４、Ｔ３８５、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、およびＫ４７１；Ｙ４０８、Ｆ４３３、Ｇ４７０、Ｋ４７１、およびＬ４７２；Ｆ３２４、Ｖ３２５、Ｎ３２６、およびＮ４１０；Ｄ３２７、Ｎ４１０、Ｔ４１１、Ｋ４１２、およびＶ４９７；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｖ４０９、およびＫ４７１；Ｌ３８２、Ｇ３８７、Ｖ４０７、およびＶ４０９；Ｙ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８、およびＹ２６９；Ｐ２０６、Ｆ２０８、Ｖ２３８、およびＳ２３９；Ｋ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、Ｆ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、およびＹ３７３；Ｇ３８４、Ｇ３８７、Ｇ３８８、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｔ４１１、Ｆ４３３、Ｆ４６９、Ｇ４７０、およびＫ４７１；Ｄ３２７、Ｔ４１１、Ｋ４１２、Ｅ４１４、Ａ４３１、Ｇ４３２、およびＫ４７１；Ｙ３５０、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６、およびＴ３９０；Ｙ３５０、Ｒ３５３、およびＦ３５５。
【０２７４】
さらなる実施形態では、本発明のペプチド性分子は、表５中に記載のペプチドから選択される２つ以上のアミノ酸残基から構成されるコンフォメーションエピトープと結合する。具体的な実施形態では、コンフォメーションエピトープは、第１のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基および第２のペプチドから選択される１つまたは複数のアミノ酸から構成され、第１および第２のペプチドは、表５中に記載のペプチドの群から選択される。したがって、本発明のペプチド性分子はコンフォメーションエピトープと結合し、第１および第２のペプチド群は以下のとおりである：Ａｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２およびＴｈｒ３０４−Ｖａｌ３０８；Ａｓｐ３０９−Ｇｌｙ３１１およびＡｒｇ２２４−Ｇｌｙ２２６；Ｔｈｒ３０３−Ｇｌｕ３０６およびＡｌａ２１９−Ｌｅｕ２２２；Ａｓｎ３６７−Ａｓｎ３７０およびＳｅｒ２１７−Ｔｙｒ２２１；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＡｓｎ３９６−Ｖａｌ３９９；Ａｌａ３３９−Ｐｒｏ３４３およびＧｌｕ３６８−Ａｒｇ３７２；Ｌｙｓ３５８−Ｔｙｒ３６２およびＶａｌ３７４−Ｈｉｓ３７８；Ａｓｐ３５７−Ｇｌｕ３６０およびＬｅｕ３７７−Ｔｈｒ３８０；Ｍｅｔ３５１−Ｇｌｕ３６０およびＨｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９；Ｈｉｓ３７８−Ｔｈｒ３８９およびＶａｌ３２３−Ａｓｐ３３２；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４９３−Ｔｈｒ５００；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｌａ４３１−Ｔｈｒ４３７；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＰｈｅ４６９−Ｖａｌ４７３；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＶａｌ３２５−Ａｓｎ３３０；Ｖａｌ４０９−Ｉｌｅ４１５およびＡｒｇ３８１−Ｇｌｙ３８７；Ｇｌｙ４６６−Ｌｅｕ４７２およびＧｌｙ３８４−Ｇｌｙ３８８；Ｖａｌ３２５−Ｇｌｕ３２９およびＴｙｒ４９４−Ｌｙｓ４９９；Ｔｈｒ４１１−ｌｅｕ４１６およびＶａｌ４９７−Ａｌａ５０２；Ｉｌｅ４１５−Ｌｅｕ４２１およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７；Ａｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＬｙｓ４８４−Ｔｈｒ４８８；およびＡｌａ５０２−Ａｌａ５０７およびＧｌｙ４４５−Ｃｙｓ４５０。本発明のペプチド性部分は、前述の第１および第２のペプチド群を形成するすべてのアミノ酸残基と結合し得るか、または、これらは第１および第２のペプチド群を形成する残基のサブセットと結合し得る。
【０２７５】
別の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、以下からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸と結合し得る（またはそれを含み得るかもしくはそれからなり得る）：Ｅ３３、Ｐ３４、Ｄ７２、Ｅ７６、Ｎ７７、Ｋ７８、Ｑ７９、Ｋ１５８、Ｄ１５９、Ｎ２５０、Ｓ２５１、Ｑ２５２、Ｔ２５３、Ｋ２５４、Ｌ２５５、Ｎ２６０、Ｗ２６２、Ｈ２６４、Ｇ２６５、Ｅ３４４、Ｎ３５２、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｔ３５６、Ｄ３５７、Ｙ３６２、Ｓ３６５、Ｅ３６６、Ｎ３６７、Ｎ３７０、およびＧ４６６。
【０２７６】
別の実施形態では、本発明のペプチド性部分は、ＶＥＧＦ受容体上の近接エピトープと結合する。一実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメイン中の２つ以上の残基から構成される。別の実施形態では、近接エピトープは、ＶＥＧＦＲ１の６７２ＶＡＩＳＳＳ６７７、ＶＥＧＦＲ１の６７８ＴＴＬＤＣＨＡ６８４、ＶＥＧＦＲ１の６８５ＮＧＶＰＥＰＱ６９１、ＶＥＧＦＲ１の７００ＫＩＱＱＥＰＧ７０６、ＶＥＧＦＲ１の７０７ＩＩＬＧ７１０、ＶＥＧＦＲ１の７１１ＰＧＳ７１３、ＶＥＧＦＲ１の７１４ＳＴＬＦＩ７１８、ＶＥＧＦＲ１の７１９ＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶ７２８、ＶＥＧＦＲ３の６８９ＶＮＶＳＤＳ６９４、ＶＥＧＦＲ３の６９５ＬＥＭＱＣＬＶ７０１、ＶＥＧＦＲ３の７０２ＡＧＡＨＡＰＳ７０８、ＶＥＧＦＲ３の７１７ＬＬＥＥＫＳＧ７２３、ＶＥＧＦＲ３の７２４ＶＤＬＡ７２７、ＶＥＧＦＲ３の７２８ＤＳＮ７３０、ＶＥＧＦＲ３の７３１ＱＫＬＳＩ７３５、およびＶＥＧＦＲ３の７３６ＱＲＶＲＥＥＤＡＧＲ７４５、ＶＥＧＦＲ２の６７８ＴＳＩＧＥＳ６８３、ＶＥＧＦＲ２の６８４ＩＥＶＳＣＴＡ６９０、ＶＥＧＦＲ２の６９１ＳＧＮＰＰＰＱ６９７、ＶＥＧＦＲ２の７０６ＴＬＶＥＤＳＧ７１２、ＶＥＧＦＲ２の７１３ＩＶＬＫ７１６、ＶＥＧＦＲ２の７１７ＤＧＮ７１９、ＶＥＧＦＲ２の７２０ＲＮＬＴＩ７２４およびＶＥＧＦＲ２の７２５ＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬ７３４からなる群より選択されるエピトープである。
【０２７７】
別の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ヒトＰＤＧＦＲβのアミノ酸残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕ、またはＰＤＧＦＲα中の対応する残基と結合するか、またはそれを含む。ヒトＰＤＧＦＲβの残基３８５Ａｒｇおよび３９０Ｇｌｕは、Ｋｉｔ受容体の残基３８１Ａｒｇおよび３８６Ｇｌｕに類似しており、ＰＤＧＦＲβのホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用を媒介する。本発明のペプチド性分子は、チロシンキナーゼの活性化に必須の距離および配向での細胞質ドメインの配置に必須の、ＩＩＩ型ＲＴＫの膜近位領域間の重要なホモタイプ相互作用（ヒトＰＤＧＦＲβの３８５Ａｒｇと３９０Ｇｌｕとの間に形成された塩橋など）を妨げることによって、受容体の活性化に対するその阻害効果を発揮し得る。本明細書中に記述した実験は、ホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用はＰＤＧＦＲβの二量体化に必要ではなく、ＰＤＧＦＲβの二量体化は受容体の活性化に必要であるが十分ではないことを示している。したがって、本発明のペプチド性分子は、ＰＤＧＦＲβの二量体化を可能にする一方で、活性化を妨げ得る。構造に基づく配列アラインメントにより、ＥＦループの大きさ、ならびにＤ４−Ｄ４境界領域を含む重要なアミノ酸は、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１Ｒ中で保存されていることが示されている。したがって、一部の実施形態では、本発明のペプチド性分子は、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４またはＤ５ドメインの保存された領域に対して標的化し得る。
【０２７８】
本発明のペプチド性部分は、本明細書中で同定したアミノ酸配列のうちの任意のもの（たとえば、配列番号１〜８９、９２、９３、および１０５〜１５７）を含むか、またはそれからなるペプチドであり得る。たとえば、本発明のペプチド性部分は、以下のアミノ酸配列のうちの任意のものを含むか、またはそれからなるペプチドであり得る：ＥＶＶＤＫＧＦＩＮ（配列番号２）、ＡＳＹＬ（配列番号３）、ＴＬＥＶＶ（配列番号４）、ＡＳＹＬＴＬＥＶＶ（配列番号５）、ＤＫＧ、ＲＥＧ、ＤＫＧＲＥＧ（配列番号６）、ＶＶＳＶＳＫＡＳＹＬＬ（配列番号７）、ＶＴＴＴＬＥＶＶＤ（配列番号８）、ＲＥＧＥＥＦＴＶＴＣＴＩ（配列番号９）、ＴＴＬＥ（配列番号１０）、ＴＴＬＥＡＳＹＬ（配列番号１１）、ＫＳＥＮＥＳＮＩＲ（配列番号１２）、ＮＥＳＮ（配列番号１３）、ＳＫＡＳＹ（配列番号１４）、ＮＥＳＮＳＫＡＳＹ（配列番号１５）、ＡＦＰＫＰ（配列番号１６）、ＮＳＤＶ（配列番号１７）、ＡＦＰＫＰＮＳＤＶ（配列番号１８）、ＥＳＮＩＲ（配列番号１９）、ＡＦＰＫＰＥＳＮＩＲ（配列番号２０）、ＤＫＷＥＤＹＰＫＳＥ（配列番号２１）、ＩＲＹＶＳＥＬＨＬ（配列番号２２）、ＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴ（配列番号２３）、ＧＥＮＶＤＬＩＶＥＹＥ（配列番号２４）、ＭＮＲＴＦＴＤＫＷＥ（配列番号２５）、ＫＷＥＤＹ（配列番号２６）、ＶＳＥＬＨ（配列番号２７）、ＫＷＥＤＹＶＳＥＬＨ（配列番号２８）、ＤＫＷＥ（配列番号２９）、ＬＨＬＴ（配列番号３０）、ＤＫＷＥＬＨＬＴ（配列番号３１）、ＨＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴ（配列番号３２）、ＭＮＲＴＦＴＤＫＷＥ（配列番号２５）、ＨＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴ（配列番号３２）、ＭＮＲＴＦＴＤＫＷＥＨＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴ（配列番号３３）、ＶＦＶＮＤＧＥＮＶＤ（配列番号３４）、ＶＮＴＫＰＥＩ（配列番号３５）、ＡＹＮＤＶＧＫＴ（配列番号３６）、ＶＮＴＫＰＥＩＡＹＮＤＶＧＫＴ（配列番号３７）、ＡＧＦＰＥＰＴ（配列番号３８）、ＶＮＴＫＰＥＩＡＧＦＰＥＰＴ（配列番号３９）、ＦＧＫＬＶ（配列番号４０）、ＶＮＴＫＰＥＩＦＧＫＬＶ（配列番号４１）、ＶＮＤＧＥＮ（配列番号４２）、ＶＮＴＫＰＥＩＶＮＤＧＥＮ（配列番号４３）、ＲＬＫＧＴＥＧ（配列番号４４）、ＶＮＴＫＰＥＩＲＬＫＧＴＥＧ（配列番号４５）、ＧＰＰＦＧＫＬ（配列番号４６）、ＧＴＥＧＧ（配列番号４７）、ＧＰＰＦＧＫＬＧＴＥＧＧ（配列番号４８）、ＶＮＤＧＥ（配列番号４９）、ＹＮＤＶＧＫ（配列番号５０）、ＶＮＤＧＥＹＮＤＶＧＫ（配列番号５１）、ＴＫＰＥＩＬＴＹＤＲＬ（配列番号５２）、ＤＲＬＶＮＧＭＬＱＣ（配列番号５３）、ＧＫＴＳＡＹＦＮＦＡＦＫ（配列番号５４）、ＣＰＧＴＥＱＲＣＳＡＳ（配列番号５５）、ＣＳＡＳＶＬＰＶＤＶＱ（配列番号５６）、ＤＳＳＡＦＫＨＮＧＴ（配列番号５７）、ＧＴＶＥＣＫＡＹＮＤ（配列番号５８）、ＬＮＳＳＧＰＰＦＧＫＬ（配列番号５９）、ＦＡＦＫＧＮＮＫＥＱＩ（配列番号６０）、ＴＫＰＥＩＬ（配列番号６１）、ＶＧＫＴＳＡ（配列番号６２）、ＴＫＰＥＩＬＶＧＫＴＳＡ（配列番号６３）、ＩＬＴＹＤＲＬ（配列番号６４）、ＡＹＦＮＦＡ（配列番号６５）、ＩＬＴＹＤＲＬＡＹＦＮＦＡ（配列番号６６）、ＫＨＮＧＴ（配列番号６７）、ＡＹＦＮＦＡＫＨＮＧＴ（配列番号６８）、ＧＴＥＱＲＣ（配列番号６９）、ＡＹＦＮＦＡＧＴＥＱＲＣ（配列番号７０）、ＹＨＲＫＶＲＰＶＳＳＨＧＤＦＮＹ（配列番号７１）、ＰＦＶＳ（配列番号７２）、ＫＡＦＴ（配列番号７３）、ＬＡＦＫＥＳＮＩＹ（配列番号７４）、ＬＬＥＶＦＥＦＩ（配列番号７５）、ＲＶＫＧＦＰＤ（配列番号７６）、ＫＡＳＮＥＳ（配列番号７７）、ＫＡＥＳ（配列番号７８）、ＧＴＴＫＥＫ（配列番号７９）、ＹＦＧＫＬ（配列番号８０）、ＦＶＮＮ（配列番号８１）、ＤＮＴＫＶ（配列番号８２）、ＧＧＶＫ（配列番号８３）、ＬＧＶＶ（配列番号８４）、ＹＧＨＲＫＶＲＰＦＶＳＳＳＨＧＤＦＮＹ（配列番号８５）、ＰＦＶＳ（配列番号７２）、ＫＳＹＬＦＰＫＮＥＳＮＩＹ（配列番号８６）、ＧＧＧＹＶＴＦＦＧＫ（配列番号８７）、ＤＴＫＥＡＧＫ（配列番号８８）、ＹＦＫＬＴＲＬＥＴ（配列番号８９）、およびＹＲＦ。
【０２７９】
本発明のペプチド性分子は、その安定性、生物学的利用能、または溶解性を増加させるためにさらに修飾されてもよい。たとえば、ペプチド性分子内の１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸残基と交換されてもよい。本発明のペプチド性分子に適用される用語「模倣体」は、Ｄ−ペプチド性構造の化学構造を模倣し、Ｄ−ペプチド性構造の機能的な特性を保持する分子を含むように意図される。用語「模倣体」は、下記に記載されるペプチドの「類似体」および／または「誘導体」を包含するようにさらに意図される。ペプチドアナログ、誘導体、および模倣体の設計に対するアプローチは、当技術分野において公知である。たとえば、Ｆａｒｍｅｒ，  Ｐ．Ｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｅ．Ｊ．  Ａｒｉｅｎｓ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０年、１０巻、１１９〜１４３頁；Ｂａｌｌ．  Ｊ．Ｂ．およびＡｌｅｗｏｏｄ，  Ｐ．Ｆ．（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ３巻：５５頁；Ｍｏｒｇａｎ，  Ｂ．Ａ．およびＧａｉｎｏｒ，  Ｊ．Ａ．（１９８９年）Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２４巻：２４３頁；ならびにＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｍ．（１９８９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １０巻：２７０頁を参照されたい。Ｓａｗｙｅｒ，  Ｔ．Ｋ．（１９９５年）「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｔａｙｌｏｒ，  Ｍ．Ｄ．  およびＡｍｉｄｏｎ，  Ｇ．Ｌ．（編）Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第１７章；Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．Ｂ．  ３ｒｄら（１９９５年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７巻：１１１１３〜１１１２３頁；Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．Ｂ．  ３ｒｄら（１９９４年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６巻：９９４７〜９９６２頁；およびＨｉｒｓｃｈｍａｎ，  Ｒ．ら（１９９３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５巻：１２５５０〜１２５６８頁もまた、参照されたい。
【０２８０】
本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「誘導体」は、分子上の１つまたは複数の反応基が置換基により誘導体化されたペプチド性分子の形態を指す。ペプチド誘導体の例は、アミノ酸側鎖、ペプチド主鎖、またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端が誘導体化されたペプチド（たとえばメチル化されたアミド連結を有するペプチド性化合物）を含む。本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「類似体」は、上記分子と異なるある種の化学構造もまた含有するが、上記分子の機能的な活性に必要な上記分子の化学構造をなお保持するペプチド性分子を指す。天然に存在するペプチドの類似体の例は、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を含むペプチドである。本明細書において使用されるように、本発明のペプチド性分子の「模倣体」は、上記分子の機能的な活性に必要な上記分子の化学構造が、上記分子のコンフォメーションを模倣する他の化学構造と交換されているペプチド性分子を指す。ペプチド模倣体の例は、ペプチド主鎖が１つまたは複数のベンゾジアゼピン分子により置換されているペプチド性化合物を含む（たとえばＪａｍｅｓ，  Ｇ．Ｌ．ら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０巻：１９３７〜１９４２頁を参照されたい）。
【０２８１】
本発明のペプチド性分子の類似体は、分子の特性が維持されるように、ペプチド性構造の１つまたは複数のＬ−またはＤ−アミノ酸が相同アミノ酸により置換されている分子を含むように意図される。好ましくは、保存されたアミノ酸置換は、１つまたは複数のアミノ酸残基でなされる。「保存されたアミノ酸置換」は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基とアミノ酸残基が交換される置換である。塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。本発明のペプチド性分子の構造においてなすことができる相同置換の非限定的な例は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ピリジルアラニン、もしくはＤ−ホモフェニルアラニンとのＤ−フェニルアラニンの置換、Ｄ−バリンまたは脂肪族側鎖を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸とのＤ−ロイシンの置換、ならびに／またはＤ−ロイシンまたは脂肪族側鎖を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸とのＤ−バリンの置換を含む。
【０２８２】
模倣体、特にペプチド模倣体という用語は、同配体を含むように意図される。本明細書において使用されるような用語「同配体」は、第１の構造の立体的なコンフォメーションが第２の構造に特異的な結合部位と適合するために、第２の化学構造と置換することができる化学構造を含むように意図される。この用語は、特に、当業者らに周知のペプチド主鎖修飾（つまりアミド結合模倣体）を含む。そのような修飾は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全交換、伸長、欠失、または主鎖架橋の修飾を含む。Ψ［ＣＨ２Ｓ］、Ψ［ＣＨ２ＮＨ］、Ψ［ＣＳＮＨ２］、Ψ［ＮＨＣＯ］、Ψ［ＣＯＣＨ２］、およびΨ［（Ｅ）または（Ｚ）  ＣＨ＝ＣＨ］を含む、いくつかのペプチド主鎖修飾が、公知である。上記に使用される命名法では、Ψは、アミド結合の不在を示す。アミド基に取って代わる構造は、括弧内に指定される。
【０２８３】
他の可能な修飾は、Ｎ−アルキル（もしくはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）またはラクタムおよび他の環状構造を構築するための主鎖架橋を含む。本発明の調節因子化合物の他の誘導体は、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、Ｏ修飾誘導体（たとえばＣ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミドおよびヒドラジドなどのような置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体を含む。
【０２８４】
本発明のペプチド性分子は、当技術分野において公知の標準的な方法によって作製されてもよい。ペプチド性分子、たとえばヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４ドメインまたはヒトＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインを、標準の技法を使用してヒト細胞からクローニングし、組換えベクター内に挿入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系中で発現させ得る（たとえば、酵母細胞内へのベクターのトランスフェクションによる）。その代わりに、ペプチド性分子は、Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９年）Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ  ０１９９６３０６７４；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４年）第２版、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ９１巻．  ＩＳＢＮ  ０９３５９４００３０；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５巻：２１４９〜２１５４頁などのような公知の合成方法を介して、設計され、新たに合成されてもよい。
【０２８５】
次いで、ペプチド性分子を、本明細書において記載されるアッセイのいずれか、たとえば、下記の実施例の部において記載されるものを使用して、機能的な活性について試験することができる。
【０２８６】
ＩＶ．本発明の部分を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明の部分を、本明細書中に記載のアッセイおよび当技術分野で周知のアッセイのうちの任意のものを使用して、ＲＴＫ阻害活性についてスクリーニングし得る。たとえば、受容体の内在化、受容体の自己リン酸化、および／またはキナーゼシグナル伝達を決定し得るアッセイを使用して、標的ＲＴＫ、たとえばＫｉｔ受容体またはヒトＶＥＧＦ受容体の活性化を妨げる部分を同定し得る。新しい阻害部分のスクリーニングは、当技術分野で公知の標準の方法を使用することによって、たとえば、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから利用可能）を用いてＲＴＫまたは下流分子のリン酸化状態を決定することによって達成し得る。受容体、たとえばＫｉｔ受容体またはＶＥＧＦ受容体のリン酸化状態を、たとえば、Ｃ−Ｋｉｔ［ｐＹ８２３］ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標）、カタログ番号−ＫＨＯ０４０１）、ｃ−ＫＩＴ［ＴＯＴＡＬ］ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標）、カタログ番号−ＫＨＯ０３９１）などの市販のキットを使用して決定し得る。本発明の抗体、小分子、および他の部分を、そのＲＴＫ阻害活性を決定するためにそのようなキットを使用してスクリーニングし得る。たとえば、適切なリガンドおよび本発明の部分で処理した後、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）を行って、目的のＲＴＫのリン酸化状態、したがって活性化状態を決定し得る。本発明の部分は、ＲＴＫの活性化を妨げるものとして同定される場合がある。以下の実施例１５および１６は、抗ホスホチロシン抗体を使用したＲＴＫの活性化の検出を含むアッセイを記載している。以下の実施例２０は、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）システムを使用して受容体の活性化を検出する１つの可能なアッセイを記載している。実施例２２〜２５（それに関連する方法および導入が含まれる）は、ＲＴＫの活性化状態を決定するために本明細書中で使用するさらなる方法を記載している。
【０２８７】
受容体の活性化はエンドサイトーシスおよび受容体の内在化をもたらし得るため、一部の実施形態では、受容体の内在化を妨げるその能力を測定することによって、標的ＲＴＫを阻害する本発明の部分の能力を決定することが有用である。以下の実施例２５（およびそれに関連する方法）は、ＰＤＧＦ受容体変異体の内在化および分解の測定を記載している。受容体内在化アッセイは当技術分野で周知であり、たとえば、そのそれぞれの内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｆｕｋｕｎａｇａら（２００６年）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ８０巻（１号）１７〜２３頁、Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら（２００７年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３巻、５８７〜５９６頁（ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／２００７／０４／１８／ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ＿ａｓｓａｙ．ｐｈｐ）に記載されている。受容体の内在化を決定するための１つの周知の方法は、リガンドを蛍光タンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または他の適切な標識剤でタグ付けすることである。リガンドと受容体との結合に際し、蛍光顕微鏡観察を使用して受容体の内在化を可視化し得る。同様に、本発明の部分を標識剤でタグ付けし、蛍光顕微鏡観察を使用して受容体の内在化を可視化し得る。部分が受容体の活性を阻害することができる場合、適切な対照と比較してリガンドの存在下における蛍光の内在化は低下する（たとえば、蛍光は、エンドソームまたは小胞中ではなく、部分（ｍｏｉｔｙ）が受容体と結合する細胞の周辺でのみ観察され得る）。
【０２８８】
上述のものに加えて、様々な他の受容体活性化アッセイが当技術分野で公知であり、そのうちの任意のものを使用して本発明の部分の機能を評価し得る。本発明に従って使用し得るさらなる受容体活性化アッセイは、米国特許第６，２８７，７８４号、第６，０２５，１４５号、第５，５９９，６８１号、第５，７６６，８６３号、第５，８９１，６５０号、第５，９１４，２３７号、第７，０５６，６８５号、ならびに、それだけには限定されないが、Ａｍｉｒ−Ｚａｌｔｓｍａｎら（２０００年）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５巻（６号）：３７７〜８０頁、ＮａｋａｙａｍａおよびＰａｒａｎｄｏｏｓｈ  （１９９９年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２２５巻（１〜２号）、２７、６７〜７４頁、Ｐｉｋｅら（１９８７年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４６巻：３５３〜３６２頁、Ａｔｉｅｎｚａら（２００５年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  １１巻（６号）：６３４〜６４３頁、Ｈｕｎｔｅｒら（１９８２年）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５７巻（９号）：４８４３〜４８４８頁、ＷｈｉｔｅおよびＢａｃｋｅｒ  （１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：６５〜６７頁、Ｍａｄｄｅｎら（１９９１年）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９巻：２１０〜２１５頁、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄら（１９９０年）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９０巻：２４９〜２５３頁、Ｌａｚａｒｏら（１９９１年）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９２巻：２５７〜２６１頁、ＨｕｎｔｅｒおよびＣｏｏｐｅｒ  （１９８５年）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４巻：８９７〜９３０頁、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  （１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁、ＫｎｕｔｓｏｎおよびＢｕｃｋ  （１９９１年）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２８５巻（２号）：１９７〜２０４頁、Ｋｉｎｇら（１９９３年）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５３巻：１４６５〜１４７２頁、Ｗａｎｇ．  （１９８５年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５巻（１２号）：３６４０〜３６４３頁、Ｇｌｅｎｎｅｙら（１９８８年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０９巻：２７７〜２８５頁、Ｋａｍｐｓ  （１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：１０１〜１１０頁、Ｋｏｚｍａら（１９９１年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０１巻：２８〜４３頁、Ｈｏｌｍｅｓら（１９９２年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１２０５〜１０頁、およびＣｏｒｆａｓら（１９９３年）  ＰＮＡＳ、ＵＳＡ  ９０巻：１６２４〜１６２８頁を含めた多くの科学出版物に記載されている。
【０２８９】
リガンド結合による受容体の活性化は、典型的には続く細胞内事象、たとえばＩＰ３などの二次メッセンジャーの増加を開始させ、これは次にカルシウムイオンの細胞内貯蔵を放出させる。したがって、受容体活性は、二次メッセンジャー、例えば、ＩＰ３、環状ヌクレオチド、細胞内カルシウム、もしくはＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、Ｇｒｂ２などのリン酸化されたシグナル伝達分子、または当技術分野で公知の他の可能な標的の量を測定することによって決定し得る。米国特許第７，０５６，６８５号は、受容体活性を検出するために本発明に従って使用し得るいくつかの方法を記載および言及しており、これは本明細書中に参考として組み込まれている。
【０２９０】
受容体内在化アッセイまたは受容体活性化アッセイなどの上述のアッセイの多くは、免疫学的結合アッセイを使用した標的ＲＴＫの検出または定量を含み得る（たとえば、受容体内在化アッセイ中に、細胞表面上のＲＴＫの量を検出するために放射性標識した抗体を使用する場合）。免疫学的結合アッセイは当技術分野で広く記載されている（たとえば、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号、および第４，８３７，１６８号を参照）。一般的な免疫アッセイの総説には、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３年）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１年）も参照されたい。
【０２９１】
受容体内在化研究、受容体活性化研究、または受容体検出アッセイにおいて使用し得るものなどの免疫アッセイは、しばしば、検出抗体およびＲＴＫによって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識するための標識剤を使用する（本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，０５６，６８５号を参照）。標識剤自体が、受容体を検出するために使用する抗体であってもよい（ここでいう抗体は、本発明の部分であってもなくてもよい）。あるいは、標識剤は、二次または三次抗体（たとえば標的ＲＴＫに特異的なマウスモノクローナル抗体と結合する抗マウス抗体）などの第３の薬剤であり得る。また、プロテインＡまたはプロテインＧなどの免疫グロブリン定常領域と特異的に結合することができる他のタンパク質も、免疫学的結合アッセイにおける標識剤として使用し得る。これらのタンパク質は、様々な種からの免疫グロブリン定常領域と強力な非免疫原性の反応性を示す（たとえば、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１１巻：１４０１〜１４０６頁、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら（１９８５年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５巻：２５８９  ２５４２頁を参照）。また、標識剤は、ビオチン（ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合することができる）などの検出可能な薬剤で修飾することもできる。様々な検出可能な部分が当業者に周知である。
【０２９２】
一般的に使用されるアッセイには、非競合的アッセイ、たとえばサンドイッチアッセイ、および競合的アッセイが含まれる。一般的に使用されるアッセイ様式には、試料中のタンパク質の存在を検出および定量化するために使用するウエスタンブロット（免疫ブロット）が含まれる。アッセイで使用する特定の標識または検出可能な基は、ＲＴＫを検出するために使用する免疫グロブリンまたはＲＴＫと結合してそれを不活性化するように設計されている本発明の部分の特異的結合を顕著に妨害しない限りは、本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であることができる。そのような検出可能な標識は免疫アッセイの分野において十分に開発されており、一般に、そのような方法において有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、ならびに比色標識、例えば、コロイド金または有色ガラスまたはプラスチックビーズ（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレンもしくはラテックス）が含まれる。
【０２９３】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の構成要素に直接または間接的にカップリングさせ得る。また、標識は、たとえば酵素または蛍光体とのコンジュゲーションによって、シグナル生成化合物に直接コンジュゲートさせることもできる。標識としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、たとえばルミノールが含まれる。使用し得る様々な標識またはシグナル生成系の総説には、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０２９４】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、たとえば、標識が放射性標識である場合、検出手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーなどにおける写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、これは、蛍光色素を適切な波長の光で励起させ、生じる蛍光を検出することによって検出し得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器を使用することによって、視覚的に検出し得る。同様に、酵素標識は、酵素の適切な基質を提供し、生じる反応生成物を検出することによって検出し得る。最後に、単純な比色標識は、単に標識と関連する色を観察することによって検出し得る。したがって、様々なディップスティックアッセイにおいて、コンジュゲートした金は多くの場合ピンク色を表す一方で、様々なコンジュゲートしたビーズはビーズの色を表す。
【０２９５】
本発明のさらなる態様では、本発明の部分は、標的ＲＴＫ上のエピトープと結合し、それでも受容体チロシンキナーゼの外部ドメインが二量体化することを可能にし得る。この実施形態では、部分の結合は、２つの単量体のＩｇ様ドメイン（たとえば、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼのＤ４−Ｄ４もしくはＤ５−Ｄ５ドメインまたはＶ型受容体チロシンキナーゼのＤ７−Ｄ７ドメイン）間の配置、配向および／または距離に影響を与え、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する場合がある。言い換えれば、部分は、受容体チロシンキナーゼの外部ドメインの、リガンド誘導性の二量体化を可能にするが、細胞表面境界領域での２つの外部ドメインの配置に影響を与えるか、または受容体チロシンキナーゼ中のコンフォメーション変化を変更もしくは妨げ、それによって受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する（たとえば、受容体の内在化を阻害する、および／または受容体のチロシン自己リン酸化を阻害する、および／または下流のシグナル伝達経路を活性化させる受容体の能力を阻害する）場合がある。
【０２９６】
したがって、一部の実施形態では、受容体の二量体化を可能にするが、受容体を不活性にさせる部分を同定することができるアッセイを用いることが有用である。そのようなアッセイは以下に記載されている。たとえば、実施例１８は、ＰＤＧＦ受容体を用いて実施した実験を記載しており、受容体の二量体化は架橋結合を使用して検出し、受容体の活性化はホスホチロシン特異的抗体を使用して決定する。さらに、実施例２３は、ＰＤＧＦＲの変異体は、リガンド誘導性のチロシン自己リン酸化に障害を有しており、これはリガンド誘導性の受容体の二量体化の欠損によって引き起こされていないことを示す（実施例２２〜２５への方法および導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｏｎ）も参照）。
【０２９７】
また、ＲＴＫのコンフォメーション状態は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析によっても決定し得る。タンパク質のコンフォメーションおよび相互作用を決定するための蛍光の方法論の包括的な総説は、本明細書中に参考として組み込まれているＪｏｈｎｓｏｎ  （２００５年）  Ｔｒａｆｆｉｃ．  ２００５年１２月、６巻（１２号）：１０７８〜９２頁中に見つけることができる。ＦＲＥＴアッセイでは、目的のＲＴＫを適切なＦＲＥＴ蛍光体で標識する。ＲＴＫを標識した後、標識されたＲＴＫを発現する細胞を、本発明の試験部分およびＲＴＫのリガンド（たとえばＫｉｔ  ＲＴＫのＳＣＦ）と共にインキュベートする。ＦＲＥＴ分析により、リガンド結合に関連するＲＴＫ中のコンフォメーション変化、ＲＴＫの二量体化、および／または受容体の活性化の観察が可能となる。この方法によって、当業者は、下流の活性化なしのＲＴＫの二量体化を示すタンパク質のコンフォメーション変化を直接評価し得る。ＦＲＥＴ分析を行うためにいくつかの方法が利用可能であり、変動の大部分は、様々な蛍光体またはこれらの蛍光体を目的のタンパク質内に組み込むための様々な技法の使用から生じる。ＦＲＥＴ蛍光体および分析方法は当技術分野で周知であり、ＦＲＥＴ技術の手短な総説は、Ｈｅｙｄｕｋ．  （２００２年）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １３巻（４号）．  ２９２〜２９６頁およびそれの中の参考文献中で利用可能である。以下の出版物はＦＲＥＴ方法を詳しく述べており、本明細書中に参考として組み込まれている：Ｋａｊｉｈａｒａら（２００６年）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３巻（１１号）：９２３〜９頁、Ｂｉｅｎｅｒ−Ｒａｍａｎｕｊａｎら（２００６年）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．１６巻（４号）：２４７〜５７頁、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２００７年）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４６巻（１８号）：５３４９〜５７頁、米国特許第６，６８９，５７４号、第５，８９１，６４６号、およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２００２／０３３１０２号。蛍光体がＲＴＫの機能またはＲＴＫと結合する本発明の部分の能力を妨害しない限りは、ＦＲＥＴ蛍光体を、ＲＴＫの任意のドメインまたはヒンジ領域内に組み込んで、コンフォメーション変化を検出し得る（たとえば、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶ型ＲＴＫのＤ７ドメイン）。
【０２９８】
ＦＲＥＴに有用な蛍光体は、多くの場合、以下に記述する生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に有用なものと同じである。最も一般的なＦＲＥＴ方法は、反応性システイン残基を目的のタンパク質内で操作することである。その後、蛍光体は選択されたシステイン残基と容易に反応することができる。多くの場合、融合タンパク質を構築し、目的のタンパク質を緑色蛍光タンパク質と融合させる（Ｎｅｉｎｉｎｇｅｒら（２００１年）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２巻（８号）：７０３〜７０８頁を参照）。ＦＲＥＴのさらなる方法および有用な蛍光体は、本明細書中に参考として組み込まれている、ＨｕｅｂｓｃｈおよびＭｏｏｎｅｙ  （２００７年）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２８巻（１５号）：２４２４〜３７頁、ＳｃｈｍｉｄおよびＢｉｒｂａｃｈ  （２００７年）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ９７巻（３号）：３７８〜８４頁、Ｊａｒｅｓ−ＥｒｉｊｍａｎおよびＪｏｖｉｎ  （２００６年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １０巻（５号）：４０９〜１６頁、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  （２００６年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３３５巻：１７〜２９頁、ＷａｌｌｒａｂｅおよびＰｅｒｉａｓａｍｙ  （２００５年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６巻（１号）：１９〜２７頁、ならびにＣｌｅｇｇ  ＲＭ  （１９９５年）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６巻（１号）：１０３〜１０頁に記載されている。
【０２９９】
他の実施形態では、どのＲＴＫコンフォメーションが活性化なしの二量体化の具体的な指標であるかが知られていないか、またはその決定が困難であり得る（受容体に依存する）。そのような場合、当業者は、受容体の二量体化を決定するアッセイを受容体の活性化を決定するものと組み合わせ得る。たとえば、ＲＴＫの二量体化を検出するための伝統的な架橋結合研究（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９０年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、４巻（１２号）、１７８２〜１７９０頁によって例示）を、上述の受容体活性化アッセイのうちの任意のものと組み合わせて使用し得る。また、ＦＲＥＴおよび同様の系を使用して、受容体の活性化または二量体化を直接測定してもよい。たとえば、適切なＦＲＥＴ蛍光体をＲＴＫの細胞質ドメイン内およびリン酸化標的タンパク質（すなわち下流のシグナル伝達分子）内に組み込むことによって、ＦＲＥＴは、下流のシグナル伝達分子がＲＴＫにリクルートされたか否かを決定することができる。したがって、一実施形態では、成功した本発明の部分は、架橋結合またはＦＲＥＴによって測定して受容体の二量体化を可能にするが、ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴ分析による蛍光の欠如によってまたは他の受容体活性化アッセイ（たとえば、抗ホスホチロシン抗体およびウエスタンブロットを用いた自己リン酸化アッセイ）によって検出される、受容体の活性化を妨げるものである。したがって、本明細書中に記載の技法を使用して、当業者は、部分（たとえば、小分子、ペプチド、または抗体）を容易に試験して、それらがＲＴＫ活性を阻害するか否か、およびそれらが受容体の二量体化を可能にするか否かを決定することができる。
【０３００】
具体的には、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）分析を使用して、ＲＴＫの活性を阻害する部分を同定し得る。米国特許公開第２００６０１９９２２６号、ＷＩＰＯ公開ＷＯ／２００６／０９４０７３号、およびＴａｎら（２００７年．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ７２巻：１４４０〜１４４６頁）は、ＲＴＫを活性化するリガンドを同定する方法を具体的に記載しており、したがって本明細書中に参考として組み込まれている。これらの技法は、タンパク質の相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで決定するために用いられている（すべて本明細書中に参考として組み込まれているＰｆｌｅｇｅｒら（２００６年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １  ３３７〜３４５頁、Ｋｒｏｅｇｅｒら（２００１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻（１６号）：１２７３６〜４３頁、およびＨａｒｉｋｕｍａｒら（２００４年）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６５巻：２８〜３５頁）。
【０３０１】
ＢＲＥＴは、ＲＴＫの活性化を妨げる部分についてスクリーニングすることによって、試験化合物から本発明の部分を同定するために有用である。
【０３０２】
本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２００６／０１９９２２６号に記述されているように、ＢＲＥＴに基づくアッセイを使用して、生物発光性のドナー分子（ＤＭ）を有するタンパク質と蛍光のアクセプター部分（ＡＭ）を有するタンパク質との相互作用を監視することができる。手短に述べると、ＲＴＫ−ＤＭの融合体を発現する細胞は、基質の化学エネルギーを光へと変換する。ＡＭ（たとえばシグナル伝達タンパク質−ＡＭの融合体）がＲＴＫ−ＤＭの融合体と近接して存在する場合、細胞は特定の波長の光を放射する。たとえば、ＢＲＥＴに基づくアッセイを使用して、ＲＴＫ−ルシフェラーゼの融合体とＧＦＰ−シグナル伝達タンパク質の融合体との間の相互作用を評価することができる。これは、ドナー分子を化学的エネルギー変換ではなく特定の波長の光によって励起させ得るＦＲＥＴ分析とはわずかに異なる。ＢＲＥＴ分析に使用し得るルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、米国特許第５，２２９，２８５号、第５，２１９，７３７号、第５，８４３，７４６号、第５，１９６，５２４号、第５，６７０，３５６号中に見つけ得る。代替のＤＭには、適切な基質に作用して発光シグナルを生じさせることができる酵素が含まれる。そのような酵素の具体的な例は、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼおよびベータ−グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光基質は当技術分野で周知であり、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）などの企業から市販されている。また、ＤＭは昆虫から単離または操作することもできる（米国特許第５，６７０，３５６号）。
【０３０３】
基質に応じて、ＤＭは異なる波長で光を放射する。ＤＭの基質の非限定的な例には、セレンテラジン、ベンゾチアゾール、ルシフェリン、ギ酸エノール、テルペン、およびアルデヒドなどが含まれる。ＤＭ部分は、ＲＴＫタンパク質のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分のどちらかと融合させることができる。好ましくは、ＲＴＫ−ＤＭの融合体内でのＢＤＭドメインの配置は、ネイティブタンパク質の活性または本発明の部分の結合を変更させない。ＲＴＫ−ＤＭの融合タンパク質を、リガンド結合およびネイティブタンパク質の下流のシグナル伝達分子と相互作用する能力などの生化学的特性をそれが保持することを確実にするために、試験することができる。
【０３０４】
ＢＲＥＴ分析におけるＡＭは、移動されたエネルギーを蛍光として再放射し得る。ＡＭの例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰなどのそのアイソフォームおよび誘導体が含まれる（Ｒ．  Ｙ．  Ｔｓｉｅｎ、（１９９８年）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３巻：５０９〜５４４頁）。好ましくは、ＡＭ−タンパク質の融合体内でのＡＭドメインの配置は、ネイティブタンパク質の活性を変更させない。ＡＭ−第２のタンパク質の融合タンパク質を、ＲＴＫとの相互作用などの関連ネイティブタンパク質の生化学的特性をそれが保持することを確実にするために、試験することができる。例として、標的ＲＴＫによってリン酸化されるか、またはそれと結合することができる任意の基質への、ＧＦＰタンパク質のアミノ末端融合を使用することができる。
【０３０５】
Ｖ．本発明の部分を含有する医薬組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容されるキャリアと一緒に処方した、本発明の部分（たとえば、本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性一部分（複数可）、抗体模倣体、小分子、またはペプチド性分子）のうちの１つまたは組合せを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本発明の抗体、または免疫コンジュゲート、小分子、もしくはペプチド性分子のうちの１つまたは組合せ（たとえば２つ以上の異なる）が含まれ得る。たとえば、本発明の医薬組成物は、標的ＲＴＫ上の異なるエピトープと結合するか、または相補的活性を有する抗体および小分子の組合せ、たとえば、ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ３−Ｄ４ヒンジ領域と結合する小分子およびＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４ドメインと結合するモノクローナル抗体を含むことができる。
【０３０６】
また、本発明の医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法には、少なくとも１つの他の抗がん剤と組み合わせた、本発明の抗ＲＴＫ抗体（または小分子もしくはペプチド性分子）が含まれることができる。組合せ療法で使用することができる治療剤の例は、以下にさらに詳述されている。
【０３０７】
本明細書中で使用する「薬学的に許容されるキャリア」には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（たとえば注射または注入によるもの）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の部分を、化合物を不活性化させ得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングし得る。
【０３０８】
本発明の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容される塩が含まれ得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持しており、かつ望ましくない毒性効果を全く与えない塩をいう（たとえばＢｅｒｇｅ，  Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６巻：１〜１９頁を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの無毒性の無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにΝ，Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０３０９】
また、本発明の医薬組成物には、薬学的に許容される抗酸化剤も含まれ得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性の抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性の抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０３１０】
本発明の医薬組成物中で用い得る適切な水性および非水性のキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０３１１】
また、これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の予防は、滅菌手順によって、ならびに様々な抗細菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることによって、確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物内に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を包含させることによってもたらし得る。
【０３１２】
薬学的に許容されるキャリアには、無菌的な注射用溶液または分散液の即時調製のための、無菌的な水性溶液または分散液および無菌的な粉末が含まれる。医薬上活性のある物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。活性化合物と非適合性である場合以外は、本発明の医薬組成物における任意の慣用の媒質または薬剤の使用が企図される。また、補助活性化合物を組成物内に組み込むこともできる。
【０３１３】
治療組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序立った構造として処方することができる。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０３１４】
無菌的な注射用溶液は、所要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込み、次いで滅菌微細濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記列挙したものからの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に組み込むことによって調製する。無菌的な注射用溶液を調製するための無菌的な粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）であり、これは、事前に滅菌濾過した溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【０３１５】
単一投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置する被験体および特定の投与様式に応じて変動する。単一投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０３１６】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（たとえば治療反応）が提供されるように調節する。たとえば、単一のボーラスを投与し得、いくつかの分割した用量を期間にわたって投与し得、または、用量を治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低下もしくは増加させ得る。投与の容易性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位投薬形態で処方することが特に有利である。本明細書中で使用する単位投薬形態とは、処置する被験体の単位投薬量として適した物理的に別々の単位体をいい、それぞれの単位体は、所要の医薬キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投薬形態の仕様は、（ａ）活性化合物の特有な特徴および達成する特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するためのそのような活性化合物を混合する（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）分野に固有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０３１７】
抗体、小分子、またはペプチド性分子の投与に関して、用量は、宿主体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。たとえば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇの体重、１ｍｇ／ｋｇの体重、３ｍｇ／ｋｇの体重、５ｍｇ／ｋｇの体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇの体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。例示的な処置レジームは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回または３〜６カ月毎に１回の投与を伴う。本発明の部分の好ましい投薬レジメンには、静脈内投与によって１ｍｇ／ｋｇの体重または３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれ、抗体は以下の投薬スケジュールのうちの１つを使用して与える：（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後、３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇの体重を１回、次いで１ｍｇ／ｋｇの体重を３週間毎。
【０３１８】
あるいは、抗体、小分子、またはペプチド性分子を、持続放出処方物として投与することができ、その場合、より低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における投与した物質の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変動する場合がある。予防的な応用では、比較的低い用量を比較的低頻度の間隔で長い期間にわたって投与する。一部の患者は、その余生の間ずっと処置を受け続ける。治療的な応用では、比較的短い間隔での比較的高い用量が、疾患の進行が低下または停止されるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、必要な場合がある。それ以降、患者に予防的レジームを施すことができる。
【０３１９】
特定の患者に毒性とならずに、患者、組成物、および投与様式において所望の治療反応を得るために有効な活性成分の量を得るために、本発明の医薬組成物中の活性成分および小分子の実際の用量レベルを変動させ得る。選択された用量レベルは、用いる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、処置の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０３２０】
本発明の抗ＲＴＫ部分の「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患症状の重篤度の減少、疾患症状が無い期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の苦痛が原因の障害もしくは能力欠如の予防をもたらす。たとえば、腫瘍の処置では、「治療上有効な用量」は、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を、無処置の被験体と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系中で評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のアッセイによって、化合物の阻害、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の能力を検査することによって、評価することができる。治療上有効な量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、または他の様式で被験体において症状を改善させることができる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重篤度、および選択した特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０３２１】
本発明の抗ＲＴＫ部分を試験して、ＲＴＫの拮抗に有効であるか否かを決定し得る。抗ＲＴＫ部分を試験する１つの方法は、抗ＲＴＫ部分とＲＴＫとの間に相互作用が起こることを確認することである。たとえば、当業者は、本発明の抗体、小分子、またはペプチド性分子が、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫのＤ４もしくはＤ５ドメインまたはＶＥＧＦ受容体のＤ７ドメインと結合するか否かを試験し得る。そのような結合の試験は当技術分野で周知であり、抗ＲＴＫ部分を標識（たとえば放射性標識）するステップと、結合が起こり得る条件下で抗ＲＴＫ部分をＲＴＫと共にインキュベートするステップと、その後、複合体をゲルまたはホスフォスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）上で単離／可視化するステップとを含み得る。同様に、結合を決定するためにＥＬＩＳＡ技法を用い得る。
【０３２２】
本発明の部分がＲＴＫに拮抗しているか否かを決定するための別の方法は、ＲＴＫの細胞質ドメインのリン酸化状態を試験することである。具体的な実施形態では、有効な拮抗剤はＲＴＫの活性化および自己リン酸化を妨げる。ＲＴＫのリン酸化は、当技術分野で公知の標準の方法を使用して、たとえば、ＲＴＫのリン酸化された残基と特異的に結合する抗体を使用することによって試験し得る。リン酸化事象を検出するための他の方法には、米国特許第６５４８２６６号、もしくはＧｏｓｈｅら（２００６年）  Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．  ４巻：３６３〜７６頁、ｄｅ  Ｇｒａａｕｗら（２００６年）  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  ２７巻：２６７６〜８６頁、Ｓｃｈｍｉｄｔら（２００７年）  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ８４９巻：１５４〜６２頁に記載のもの、またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの［ガンマ−３３Ｐ］ＡＴＰを使用したキナーゼリン酸化アッセイのＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（ＳＭＰ２００）プロトコルの使用が含まれる。当業者には、これらの方法、および実施例中に示されたものを使用して、ＲＴＫによってリン酸化されており、細胞内のシグナル伝達物質であるタンパク質のリン酸化状態を決定してもよいことが理解されよう。また、そのようなタンパク質のリン酸化状態の検出は、ＲＴＫが本発明の部分によって有効に拮抗されたか否かも示す。
【０３２３】
本発明の組成物を、当技術分野で公知の様々な方法のうちの１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は所望の結果に応じて変動する。本発明の結合部分の好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口の投与経路、たとえば注射または注入によるものが含まれる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸または局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【０３２４】
あるいは、本発明の抗ＲＴＫ結合部分を、局所、表皮または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経口ではない経路を介して投与することができる。
【０３２５】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含めた徐放性処方物などの、化合物を迅速な放出から保護するキャリアを用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような処方物を調製するための多くの方法が特許取得されているかまたは一般に当業者に公知である。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０３２６】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。たとえば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、薬物を制御された速度で供給するための埋め込み型のマイクロ注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬物を投与するための治療用デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流の埋め込み型注入機器を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバ区画を有する浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。これらの特許は本明細書中に参考として組み込まれている。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に公知である。
【０３２７】
Ｖ．本発明の部分の使用方法
別の態様では、本発明は、被験体に治療上有効な量の本発明の部分を投与することを含む、被験体においてＲＴＫに関連する疾患を処置する方法を提供する。本発明の抗ＲＴＫ部分、たとえば、抗体、小分子、またはペプチド性分子は、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の診断および処置に関与する、数々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断的および治療的な利用性を有する。本発明の結合部分を、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患を処置し、妨げ、そして診断するために、培養中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト被験体にたとえばｉｎ  ｖｉｖｏで、投与することができる。
【０３２８】
本明細書中で使用する「受容体チロシンキナーゼに関連する疾患」とは、ＲＴＫの活性によって媒介されるか、または異常なＲＴＫの発現もしくは活性化に関連する疾患または状態である。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の例には、たとえば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症または疼痛に関連する疾患などの、ＦＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＮＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体−α、ＰＤＧＦ受容体−β、ＣＳＦ−１受容体、およびＦｌｔ３受容体に関連する疾患または状態が含まれる。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患の具体的な例には、それだけには限定されないが、胃腸管系間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、骨転移性乳がん、リンパ性疾患および腱鞘巨細胞腫が含まれる。受容体チロシンキナーゼに関連する疾患のさらなる例には、結腸がん（小腸がんが含まれる）、肺がん、乳がん、膵がん、黒色腫（たとえば転移性悪性黒色腫）、急性骨髄性白血病、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がんおよび前立腺がんが含まれる。本発明の方法を使用して処置し得る他のがんの例には、腎臓がん（たとえば腎細胞がん）、膠芽細胞腫、リンパ性がん、脳腫瘍、慢性または急性の白血病（急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病が含まれる）、リンパ腫（たとえば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ系統の広汎性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節腫脹（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫）、胎生期癌、上咽頭の未分化がん腫（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭がん腫、骨がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、膣がん、外陰部がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児期固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、扁平細胞がん、アスベストに誘導されるものを含めた環境誘導性がん、たとえば中皮腫、ならびに前記がんの組合せが含まれる。本発明の方法を使用して処置し得るリンパ性疾患、または「リンパ系の疾患」の例には、無フィブリノーゲン血症、貧血、再生不良性貧血、溶血性貧血、先天性非球状赤血球性貧血、巨赤芽球性貧血、悪性貧血、鎌状赤血球貧血、腎性貧血、好酸球増加��伴性血管類リンパ組織増殖症、抗トロンビンＩＩＩ欠乏症、ベルナール−スーリエ症候群、血液凝固障害、血小板障害、青色ゴムまり様母斑症候群、チェディアック−東症候群、クリオグロブリン血症、播種性血管内血液凝固、好酸球増加症、エルトハイム−チェスター病、胎児赤芽球症、エバンス症候群、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、ファンコーニ貧血、巨大リンパ節過形成、血液疾患、異常血色素症、ヘモグロビン尿症、発作性、血友病Ａ、血友病Ｂ、新生児出血性疾患、組織球症、組織球症、ランゲルハンス細胞、組織球症、非ランゲルハンス細胞、ヨブ症候群、白血球減少症、リンパ節炎、リンパ管平滑筋肉腫症、リンパ浮腫、メトヘモグロビン血症、脊髄形成異常症候群、骨髄線維症、骨髄化生、骨髄増殖性障害、好中球減少症、パラプロテイン血症、血小板貯蔵プール欠乏症、真性赤血球増加症、タンパク質Ｃ欠乏症、タンパク質Ｓ欠乏症、紫斑病、血小板減少性、紫斑病、血栓性血小板減少性、ＲＨ−同種免疫、サルコイドーシス、サルコイドーシス、球状赤血球症、脾破裂、サラセミア、血小板無力症、血小板減少症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはヴォン・ヴィレブランド病が含まれる。
【０３２９】
さらに、様々な腫瘍細胞上でのＩＩＩ型またはＶ型ＲＴＫの発現を考慮すると、本発明の結合部分、組成物、および方法を使用して、たとえば胃腸管系間質腫瘍、肥満細胞疾患、および急性骨髄性白血病を含めた腫瘍形成性障害、たとえばＫｉｔを発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる障害を有する被験体を処置することができる。腫瘍形成性障害を有する他の被験体の例には、以下に罹患している被験体が含まれる：腎臓がん（たとえば腎細胞がん）、膠芽細胞腫、脳腫瘍、慢性または急性の白血病（急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病が含まれる）、リンパ腫（たとえば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、Ｂ系統の広汎性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節腫脹（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫）、胎生期癌、上咽頭の未分化がん腫（たとえばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭がん腫、骨がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、膣がん、外陰部がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児期固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、扁平細胞がん、アスベストに誘導されるものを含めた環境誘導性がん、たとえば中皮腫、ならびに前記がんの組合せ。
【０３３０】
本明細書中で使用する用語「被験体」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれることを意図する。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい被験体には、受容体チロシンキナーゼに関連する疾患に罹患しているヒト被験体が含まれる。
【０３３１】
本発明の部分（たとえば、抗体、その抗原結合性一部分、小分子、ペプチド性分子、抗体模倣体、および組成物）は、ＲＴＫに関連する疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性もしくは二重特異性分子、小分子、またはペプチド性分子を使用して、以下の生物活性のうちの１つまたは複数をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発させることができる：ＲＴＫ（たとえば、Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦＲ）を発現する細胞の増殖を阻害および／もしくは死滅させること、ヒトエフェクター細胞の存在下でＲＴＫ（たとえば、Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦＲ）を発現する細胞の貪食もしくはＡＤＣＣを媒介すること、またはＲＴＫ、たとえばＲＴＫのＩＩＩ型もしくはＶ型ファミリーのメンバーの外部ドメインを不活性状態および／もしくは単量体状態に固定し、それによって受容体の活性に拮抗すること。
【０３３２】
本発明の抗ＲＴＫ部分をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与するための適切な経路は当技術分野で周知であり、当業者によって選択されることができる。たとえば、抗ＲＴＫ部分は、注射（たとえば静脈内または皮下）によって投与することができる。使用する分子の適切な用量は、被験体の年齢および重量ならびに結合部分の組成物の濃度および／または処方に依存する。
【０３３３】
既に記載したように、本発明の抗ＲＴＫ部分は、１つまたは他の複数の治療剤、たとえば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共に投与することができる。部分は、薬剤と連結させることができるか、または薬剤と別々に投与することができる。後者の場合（別々の投与）、結合部分は、薬剤を投与する前、後もしくはそれと同時に投与することができるか、または、他の公知治療、たとえば、抗がん治療、たとえば放射線と共に投与することができる。そのような治療剤には、とりわけ、それ単独では患者に毒性または準毒性があるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミド、ヒドロキシ尿素などの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは、１００ｍｇ／用量として４週間毎に１回静脈内投与し、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として２１日間毎に１回静脈内投与する。本発明の抗ＲＴＫ結合部分と化学療法剤の共投与は、異なる機構を介して作動し、ヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を与える、２つの抗がん剤を提供する。そのような共投与は、結合部分と非反応性にさせる、薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化が原因の問題を解決することができる。
【０３３４】
異常細胞増殖に関連する疾患の予防および／または処置で使用するために本発明の抗ＲＴＫ部分−パートナー分子のコンジュゲートを投与する場合、投与化合物の循環濃度は、約０．００１μΜ〜２０μΜまたは約０．０１μΜ〜５μΜを使用し得る。
【０３３５】
本明細書中に記載の化合物の経口投与の患者用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。患者の体重に関連して記述すると、典型的な用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、たとえば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０３３６】
少なくとも一部の実施形態では、腫瘍増殖を遅延または阻害する患者用量は、１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であることができる。たとえば、患者用量は、０．９、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５、または０．１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下（薬物のモルに言及）であることができる。好ましくは、抗ＲＴＫ部分−薬物のコンジュゲートは、１日投薬量を少なくとも５日間の期間にわたって投与した場合に腫瘍の増殖を遅延させる。
【０３３７】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを使用して、化合物（たとえば、治療剤、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）は、ＲＴＫ細胞表面受容体を有する細胞を標的とすることができ、これは、そのような化合物を抗ＲＴＫ結合部分と連結することによる。たとえば、抗ＲＴＫ部分を、本明細書中にその全体が参考として組み込まれている米国特許第６，２８１，３５４号および第６，５４８，５３０号、米国特許公開第２００３００５０３３１号、第２００３００６４９８４号、第２００３００７３８５２号および第２００４００８７４９７号中に記載されているか、またはＷＯ０３／０２２８０６号に公開されている毒素化合物のうちの任意のものとコンジュゲートさせることができる。したがって、また、本発明は、ＲＴＫを発現する細胞をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで局在化させる方法も提供する（たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子などの検出可能な標識を用いる）。
【０３３８】
また、標的特異的なエフェクター細胞、たとえば、本発明の組成物（たとえば、抗体、その抗原結合性一部分、小分子、またはペプチド性分子）と連結したエフェクター細胞は、治療剤としても使用することができる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球であることができる。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧもしくはＩｇＡ受容体保有細胞が含まれる。所望する場合は、エフェクター細胞を処置する被験体から得ることができる。標的特異的なエフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与する細胞の数は１０８〜１０９個の桁数であることができるが、治療目的に応じて変動する。一般に、量は、標的細胞、たとえばＲＴＫを発現する腫瘍細胞において局在化し、たとえば貪食によって細胞死滅をもたらすために十分なものである。また、投与経路も変動することができる。
【０３３９】
標的特異的なエフェクター細胞を用いた治療は、標的細胞を除去するための他の技法と併せて行うことができる。たとえば、本発明の部分および／またはこれらの組成物を備えたエフェクター細胞を使用した抗腫瘍治療を、化学療法と併せて使用することができる。
【０３４０】
本発明は、試料および対照試料を、ＲＴＫ結合部分、たとえばヒトモノクローナル抗体、またはヒトＲＴＫと特異的に結合する他の結合部分と、抗体または他の部分とＫｉｔなどのヒトＲＴＫまたはヒトＶＥＧＦ受容体との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、試料中のヒトＲＴＫ抗原の存在を検出する方法、またはヒトＲＴＫ抗原（たとえば、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫ、ヒトＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦＲのＩｇ様ドメイン）の量を測定する方法をさらに提供する。その後、複合体の形成を検出し、ここで、対照試料と比較した試料間の複合体形成の相違が、試料中のＲＴＫ、たとえば、ヒトＫｉｔ  ＲＴＫ、ヒトＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦＲのＲＴＫの存在の指標である。
【０３４１】
抗ＲＴＫ結合部分（たとえば、抗体、その抗原結合性一部分、小分子、またはペプチド性分子）および使用説明書を含むキットも、本発明の範囲内にある。キットは、免疫抑制試薬、細胞毒性剤もしくは放射性毒性剤などの１つもしくは複数の追加の試薬、または１つもしくは複数の追加の本発明の抗ＲＴＫ部分（たとえば、第１の抗ＲＴＫ部分とは別個のＲＴＫ抗原中のエピトープと結合する相補的な活性を有する抗ＲＴＫ結合部分）をさらに含有することができる。典型的には、キットには、キットの内容物の意図する使用を示すラベルが含まれる。用語ラベルには、キット上もしくはそれと共に提供されるか、または他の様式でキットに付随する、任意の文書または記録資料が含まれる。
【０３４２】
本発明は、さらに限定するとは解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例示されている。本出願の全体にわたって引用したすべての図およびすべての参考文献、特許、公開特許出願、および図面の内容は、明確にその全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【実施例】
【０３４３】
実施例１〜１９への導入
幹細胞因子（ＳＣＦ）とは、受容体チロシンキナーゼＫｉｔ（ＳＣＦ受容体としても公知である）と結合してそれを活性化することによってその多様な細胞応答を媒介するサイトカインである。Ｋｉｔは、表面受容体の活性化されかつ切断された形態を捕捉したネコのレトロウイルス中のがん遺伝子として最初に発見された（Ｂｅｓｍｅｒら（１９８６年）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６０巻：１９４〜２０３頁）。ＳＣＦはマウスｓｔｅｅｌ（ＳＩ）遺伝子座によってコードされている一方で、Ｋｉｔはマウスにおける優性のｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ（Ｗ）遺伝子座によってコードされている（Ｃｏｐｅｌａｎｄら（１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６３巻：１７５〜１８３頁、Ｈｕａｎｇら（１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６３巻：２２５〜２３３頁、ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒ  （１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６３巻：１８５〜１９４頁、Ｔａｎら（１９９０年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：２０９〜２１２頁、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（１９９０年）  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １４８巻：１５８〜１６６頁、ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １６６〜１７２頁）。ＳＣＦは非共有結合性ホモ二量体として機能し、選択的ＲＮＡスプライシングおよびタンパク質分解性プロセッシングによって生じたＳＣＦの膜係留形態および可溶性形態の両方が記載されている（Ａｓｈｍａｎ（１９９９年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１巻：１０３７〜１０５１頁中に総説）。Ｋｉｔは、ＰＤＧＦ受容体−αおよびβ、ＣＳＦ−１受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体またはＦｍｓとしても公知）、ならびにＦｌｔ３受容体（Ｆｌｋ２としても公知）も含まれる、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーである（ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  （１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁、Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎら（２００１年）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：３５５〜３６５頁中に総説）。Ｋｉｔは、１個の膜貫通（ＴＭ）ドメインによって細胞質領域と接続された、グリコシル化された細胞外リガンド結合ドメイン（外部ドメイン）から構成される（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  （２０００年）  Ｃｅｌｌ  １０３巻：２１１〜２２５頁中に総説）。ＫｉｔおよびＩＩＩ型ＲＴＫの他のメンバーの外部ドメインはすべて５個のＩｇ様ドメインを含有しており、第２および第３の膜遠位ドメインはリガンド認識において役割を果たすことが示された（ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  （１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ６１巻：２０３〜２１２頁に総説）。その細胞外リガンド結合ドメインがもっぱら複数のＩｇ様反復から構成されている他のＲＴＫには、ＶＥＧＦ受容体ファミリー（７個のＩｇ様）、ＣＣＫ４受容体（７個のＩｇ様）およびＦＧＦ受容体（３個のＩｇ様）のメンバーが含まれる。Ｋｉｔの細胞質領域は、大きなキナーゼ−挿入領域を有するタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインを含有しており、これはＩＩＩ型ＲＴＫの別の特徴である。ＳＣＦとＫｉｔとの結合は、受容体の二量体化、分子間自己リン酸化およびＰＴＫの活性化をもたらす。Ｋｉｔの第４のＩｇ様ドメインが、一価または二価のどちらかのＳＣＦ結合に応答してＫｉｔの二量体化の原因となっていることが提案された（Ｌｅｖら（１９９２年ｂ）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７巻：１５９７０〜１５９７７頁、Ｂｌｅｃｈｍａｎら（１９９５年）  Ｃｅｌｌ  ８０巻：１０３〜１１３頁）。しかし、他の研究により、Ｋｉｔのリガンド誘導性の二量体化がＳＣＦの二価結合によって駆動されていることが示されている（Ｐｈｉｌｏら（１９９６年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻：６８９５〜６９０２頁、Ｌｅｍｍｏｎら（１９９７年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻：６３１１〜６３１７頁）。
【０３４４】
ＳＣＦ遺伝子座またはＫｉｔ遺伝子座を変異させたマウスの特徴づけにより、ＳＣＦおよびＫｉｔが造血細胞、メラニン形成細胞、生殖細胞および腸管のペースメーカー細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｅｌｌ）の発生に必要であることが示されている（Ａｓｈｍａｎ  （１９９９年）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１巻：１０３７〜１０５１頁中に総説）。ヒトでは、Ｋｉｔ中の機能喪失型変異は、腹側の胸部および腹部の色素脱失によって特徴づけられているまだら症体質（ｐｉｅｂａｌｄ  ｔｒａｉｔ）、白い前髪（ｗｈｉｔｅ  ｆａｒｅｆｌｏｃｋ  ｏｆ  ｈａｉｒ）、聴覚消失および便秘を引き起こす（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎら（１９９１年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８巻：１０８８５〜１０８８９頁）。Ｋｉｔの様々な機能獲得型変異が様々な種類のヒトがん中で見つかった。活性化Ｋｉｔ変異は、他のがんの中でもとりわけ、胃腸管系間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）中で見つかった。変異は、膜近位のＩｇ様ドメイン（Ｄ５）（エクソン８および９）、膜近傍（ＪＭ）ドメイン（エクソン１１）、ならびにチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメイン（エクソン１７）中で同定された（Ｆｏｒｂｅｓら（２００６年）  ＣＯＳＭＩＣ  ２００５．  ＢＲ  Ｊ．  ＣＡＮＣＥＲ、９４巻：３１８〜２２頁。Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ／を参照）。自己阻害性の束縛を解放することによって、ＪＭドメインおよびＰＴＫドメイン中の機能獲得型変異がＫｉｔの構成的な活性化をもたらしたという十分な証拠が存在するが（Ｍｏｌら（２００４年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７９巻：３１６５５〜３１６６３頁）、外部ドメインのＤ５中の機能獲得型変異の根底にある分子機構は理解されていない。ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲ、ならびにＳＣＦ、ＰＤＧＦα／β、および結合したＫｉｔ／ＳＣＦ複合体などのＲＴＫの構造をより良好に特徴づける必要性が存在する。そのような特徴づけにより、薬物、医薬品、または他の生物製剤を用いて標的化し得る領域の、情報に基づいた同定がもたらされるであろう。
【０３４５】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、Ｋｉｔの外部ドメインと結合することによってその複数の細胞応答を開始させ、チロシンキナーゼの活性化をもたらす。以下の実施例のうちの一部では、ＳＣＦ刺激の前および後のＫｉｔの外部ドメイン全体の結晶構造を記載する。構造は、Ｋｉｔの二量体化が、その唯一の役割が２つのＫｉｔ分子を一緒にすることであるＳＣＦ結合によって駆動されることを示している。受容体の二量体化に次いで、２つのＫｉｔ分子の膜近位のＩｇ様ドメインＤ４およびＤ５間の側方相互作用を可能にするコンフォメーション変化が起こる。培養細胞を用いた実験は、Ｋｉｔの活性化が、Ｄ４−Ｄ４相互作用に重要なアミノ酸中の点変異によって損なわれることを示している。さらに、様々な腫瘍発生性変異がＤ５−Ｄ５境界領域にマッピングされている。Ｋｉｔ構造の主要な特徴である、リガンド誘導性の受容体の二量体化およびＤ４−Ｄ４境界領域中の重要な残基は他の受容体中で保存されているため、本報告書中で公表するＫｉｔ刺激の機構は他の受容体の活性化にも適用され得る。これは、これらの境界領域に標的化された薬物または生物製剤を治療剤として使用できることを示している。
【０３４６】
本明細書中に記載のＳＣＦ刺激の前および後のＫｉｔの外部ドメイン全体のＸ線結晶構造の解明により、ＳＣＦ誘導性のＫｉｔの二量体化および活性化の機構に関する貴重な識見を提供された。構造は、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３と命名されたＫｉｔの最初の３個のＩｇ様ドメインがＳＣＦ結合に関与することを示している。ＳＣＦ結合の主な役割は、２つのＫｉｔ分子を架橋結合させて細胞膜上のＫｉｔの局所濃度を増加させることである。これは、Ｋｉｔの膜近位領域中の大きなコンフォメーション変化を促進し、隣接するＫｉｔ分子のＤ４またはＤ５間のホモタイプ相互作用をもたらす。２つの隣接するＫｉｔ分子のＤ４間の側方相互作用は、それぞれのＤ４プロトマーのＥＦループからの２対の塩橋を介した直接接触によって起こる。膜近位のＤ５ドメインは、隣接するＫｉｔ分子間のさらなる間接的な相互作用を提供して、さらに外部ドメインの膜近位部分を安定化させ、細胞質チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向で配置する。
【０３４７】
以下の実施例のうちのいくつかにおいて、単量体形態およびＳＣＦ誘導性のホモ二量体形態（ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体）の両方における、Ｋｉｔの外部ドメイン全体の結晶構造が記載されている。３．０Åの分解能の占有されていない単量体および３．５Åの分解能のＳＣＦ誘導性のホモ二量体の詳細な図は、Ｋｉｔおよび他のＲＴＫの活性化機構に関する新規の識見を提供する。当業者には、以下に記載の実験は他のＲＴＫを用いて実施し得ることを理解されよう。本発明の方法によって使用し得るＲＴＫ配列の例には、それだけには限定されないが、Ｋｉｔ  ｍＲＮＡのＧｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０００２２２．２（タンパク質ＮＰ＿０００２１３．１をコードしている；
【０３４８】
【化１】
2013515776.tif 000008
【０３４９】
【化２】
2013515776.tif 000009
（配列番号９２））またはＫｉｔ  ｍＲＮＡのバリアント２のＧｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１０９３７７２．１（タンパク質ＮＰ＿００１０８７２４１．１をコードしている；
【０３５０】
【化３】
2013515776.tif 000010
（配列番号９３））が含まれ、タンパク質は標準の一文字のアミノ酸コードによって指定されている。
【０３５１】
（実施例１）
ＳＣＦおよびＫｉｔの発現、精製および結晶化
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５と命名された５個のＩｇ様ドメインから構成されるＫｉｔの外部ドメイン全体を、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞中で発現させた。精製したＫｉｔ外部ドメイン単量体またはＳＣＦ誘導性のＫｉｔ外部ドメインホモ二量体（ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体）を、結晶の成長および最適化のための大規模なスクリーニング、次いでその結晶構造の決定にそれぞれ供した。
【０３５２】
タンパク質の発現および精製
Ｃ末端にポリヒスチジンタグを含有する可溶性Ｋｉｔ外部ドメイン（アミノ酸１〜５１９）を、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞（Ｓｆ９）中で発現させた。Ｋｉｔ外部ドメインをＮｉ−キレートによって、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。エンドグリコシダーゼＦ１を使用した部分的脱グリコシル化の後、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して外部ドメインをさらに精製した。ＳＣＦ（１〜１４１）を発現させ、再折り畳みさせ、以前に記載されているように精製した（Ｌａｎｇｌｅｙら（１９９４年）  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３１１巻：５５〜６１頁、Ｚｈａｎｇら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻：７７３２〜７７３７頁）。
【０３５３】
細胞系および発現ベクター
ＨＥＫ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、それぞれ１０％のＦＣＳおよび１０％のＣＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＳＣＦ刺激の前に、以前に記載されているように細胞を無血清培地中で終夜欠乏状態にした（Ｋｏｕｈａｒａら（１９９７年）  Ｃｅｌｌ  ３０巻：６９３〜７０２頁）。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って行った。完全長ＫｉｔのｃＤＮＡを、一過性のトランスフェクションのためにはＲＫ５発現ベクター内に、および安定な発現にはｐＢＡＢＥ／ｐｕｒｏベクター内にサブクローニングした（Ｋｏｕｈａｒａら（１９９７年）  Ｃｅｌｌ  ３０巻：６９３〜７０２頁）。抗Ｋｉｔ抗体は、ウサギを組換えＫｉｔ外部ドメインで免疫化することによって産生させた。モノクローナル抗Ｋｉｔ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を免疫ブロッティングに使用した。抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【０３５４】
結晶化およびデータ収集
Ｋｉｔ外部ドメイン単独またはＳＣＦとの複合体の試料を、結晶の成長および最適化のための大規模なスクリーニングに供した。約０．１２×０．１×０．０５ｍｍの寸法の脱グリコシル化された外部ドメインの結晶は、リン酸緩衝液中、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を沈殿剤として用いて（０．１ＭのＮａ−Ｐｉ緩衝液、ｐＨ６．０、０．２ＭのＫＣｌ、１２％のＰＥＧ４００）、４°で得られた。すべての結晶を、５〜１８％のグリセロールを補充したリザーバ溶液に数秒間浸し、フラッシュ冷却し、データ収集の間１００°Ｋの窒素ガス流中に保った。結晶はロンボイド空間群（ｒｈｏｍｂｏｉｄａｌ  ｓｐａｃｅ  ｇｒｏｕｐ）Ｒ３に属しており、六方格子設定で単位格子の寸法はａ＝１６２．４Åおよびｃ＝６７．１Åであり、非対称単位（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｕｎｉｔ）あたり１個の分子であった。Ｋｉｔの白金、臭素およびヨウ素誘導体は、結晶を、０．１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度範囲の重原子試薬を含有するリザーバ溶液中に、２７７Ｋで、数秒間から１０日間浸漬することによって調製した。
【０３５５】
ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の結晶は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を沈殿剤として用いて（０．２Ｍの硫酸アンモニウム、８〜１２％のＰＥＧ８０００、５〜８％のエチレングリコール、ｐＨ７．０〜８．５）、４℃で成長させ、回折データは、ＮＳＬＳ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＸ２５ビームラインで、ＡＤＳＤ  ｑｕａｎｔｕｍ−２１０ＣＣＤ検出器を用いて３．５Åの分解能まで収集された。結晶は単斜空間群Ｃ２に属しており、単位格子の寸法はａ＝２６９．５Å、ｂ＝５２．１Å、ｃ＝１８９．８Å、β＝１０８．２°であり、これは非対称単位中の２組のＳＣＦ分子およびＫｉｔ分子から構成される。すべてのデータ組は、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫおよびＨＫＬ２０００プログラムパッケージを使用して処理およびスケーリングした（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら（１９９７年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２７６巻：３０７〜３２６頁）。データ収集の統計量は表１Ａ中に要約されている。
【０３５６】
（実施例２）
構造決定
実験段階は、異常散乱を用いた多重同形置換（ＭＩＲＡＳ、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を使用することによって、および多波長異常回折（ＭＡＤ、ｍｕｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）によって、３．０Åの分解能まで計算した（表１Ａ）。生じる電子密度マップは、βサンドイッチ構造の連続的な電子密度、および明瞭な溶媒−タンパク質の境界を示した。単量体Ｋｉｔ外部ドメインの分子モデルは、実験的電子密度マップ内に手動で構築した。ネイティブデータ組を結晶学的Ｒ因子２５．４％および自由Ｒ因子２９．６％まで使用して構造を３．０Åの分解能まで精密化した（表１Ｂ）。ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体の構造は、本報告書中に記載されている単量体形態の構造およびＳＣＦの構造（Ｚｈａｎｇら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻：７７３２〜７７３７頁、タンパク質データバンクからコード：１ＥＸＺで検索可能）を検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。ネイティブデータ組を結晶学的Ｒ因子２４．９％および自由Ｒ因子２９．５％まで使用して構造を３．５Åの分解能まで精密化した（表１Ａおよび１Ｂ）。分子像はＰｙｍｏｌ（ｐｙｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）およびＣＣＰ４ＭＧ（Ｐｏｔｔｅｒｔｏｎら（２００４年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０巻：２２８８〜２２９４頁）ソフトウェアを使用して生成した。Ｋｉｔ単量体およびＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の原子座標および構造因子は、それぞれ受託コード２ＥＣ８および２Ｅ９Ｗでタンパク質データバンク（ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）に寄託されている。
【０３５７】
【表１Ａ】
2013515776.tif 000011
【０３５８】
【表１Ｂ】
2013515776.tif 000012
（実施例３）
Ｋｉｔ外部ドメインの構造の分析
外部ドメインの構造の一般的な分析
Ｋｉｔ外部ドメインは、約１７０×６０×５０Åの寸法を有する細長い蛇のような形状を示す（図１Ａ）。ＫｉｔのＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５ドメインは典型的な免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の折り畳みを示し、２つの逆平行βシートからなるβサンドイッチへとアセンブルされる、ＡＢＣＣ’ＤＥＦＧと示される８本のβストランドから構成される（図１Ａ）。Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ５はそれぞれ、Ｂ５およびＦ５（それぞれストランドＢおよびＦの第５のアミノ酸）でシステイン残基を接続する保存的なジスルフィド結合を含有しており、これは、２つのβシートを架橋してＩｇ様の折り畳みの疎水性コアの中心を形成する位置である（ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ  （１９９４年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３８巻：５２８〜５３９頁）。Ｄ２およびＤ５は２つのジスルフィド結合を含有しており、Ｄ４はシステイン残基を全く含有しないが、それにもかかわらず、Ｂ５およびＦ５での保存的なシステイン残基がそれぞれバリンおよびフェニルアラニン残基によって置き換えられていても、Ｄ４のＩｇ様の折り畳みの完全性は維持される。
【０３５９】
Ｄ１とＤ２との間の、２つのドメインの軸に沿った角度は７６°であり（図１Ａ、Ｂ）、これはインターロイキン−１β受容体の第１および第２のＩｇ様ドメインの間の配向に似ている（Ｖｉｇｅｒｓら（１９９７年）  Ｎａｔｕｒｅ、３８６巻：１９０〜１９４頁）。対照的に、Ｄ２とＤ３の間の角度は１５０°であり、Ｄ３とＤ４の間は１１９°であり、Ｄ４とＤ５の間は１６２°である。様々なＩｇ様ドメインのＡＢＥＤとＡ’ＧＦＣのβ−シートの間の配向は、Ｄ１−Ｄ２では約１８０°であり、Ｄ２−Ｄ３では約１８０°であり、Ｄ３−Ｄ４では約９０°であり、Ｄ４−Ｄ５では約１８０°である（図１）。
【０３６０】
Ｋｉｔ外部ドメインの５個すべてのＩｇ様ドメインおよびＩｇの折り畳みの標準として使用されるテロキン（Ｈｏｌｄｅｎら（１９９２年）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７巻：８４０〜８５１頁）の重ね合わせにより、等価なＣα原子で１．５〜２．９Åの二乗平均平方根（ｒ．ｍ．ｓ．）偏差が明らかとなる。テロキンと重ね合わせた場合のそのより高いｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値によって明らかとなるように、Ｄ２は、５個のＫｉｔのＩｇ様ドメインのうちで最も多岐にわたるものである（図８）。Ｉｇ様ドメイン中の主要なアミノ酸の構造上の保存およびその二次構造のトポロジーに基づいて（Ｈａｒｐａｚら（１９９４年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３８巻：５２８〜５３９頁、Ｈａｌａｂｙら（１９９９年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２巻：５６３〜５７１頁）、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４はＩサブセットに属しており、Ｄ５はＩｇＳＦのＣ２およびＩｇＣＡＭサブセットに関連している。さらに、ＩｇＳＦの構造的に保存された２０個のフィンガープリント残基のうち（Ｈａｒｐａｚら（１９９４年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３８巻：５２８〜５３９頁）、１０〜１４個の残基がＫｉｔの５個のＩｇ様ドメイン中で保存されている（表２）。
【０３６１】
【表２】
2013515776.tif 000013
ＫｉｔのＩｇ様ドメインの構造の詳細な分析
ＫｉｔのＤ１。Ｄ１の折り畳みは、２つのβシートから構成されるβサンドイッチである。１つのシートは３本のストランド、Ａ、ＢおよびＥによって形成されており、第２のシートは５本のストランド、Ａ’、Ｇ、Ｆ、ＣおよびＣ’（ＡＢＥ／Ａ’ＧＦＣＣ’）から構成される。Ｐｒｏ４１でシス−コンフォメーションによって中断された第１のストランドは、それぞれストランドＢおよびＧと対合するＡおよびＡ’の２本のより短いストランドへと分割される。Ｂ５のＣｙｓ５８をＦ５のＣｙｓ９７と接続するジスルフィド結合が２つのβシートを架橋する。ストランドＣと相互作用するかなり長いストランドＣ’は、ポリペプチド鎖のＣ末端を、ストランドＥと直接接続しているＤ１の上面に向かわせる。Ｉｇ様ドメインの命名法に基づいて、Ｄ１はＩｇＳＦのＩ２サブセットに属する（Ｃａｓａｓｎｏｖａｓら（１９９８年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５巻：４１３４〜４１３９頁）。
【０３６２】
ＫｉｔのＤ２。Ｄ２は、ストランドＢ、Ｅ、およびＤによって形成された小さなβ−シート、ストランドＡ’、Ｇ、ＦおよびＣ（ＢＥＤ／Ａ’ＧＦＣ）から構成された第２のβ−シート、ならびにストランドＥとＦとの間のクロスオーバーでの追加のヘリックス（残基１７７〜１７９）からなる。ＩｇＳＦのＩセットの１１〜２０個の特徴残基がＤ２上で同定されているが、このＩｇ様ドメインは、いくつかの様式でＩｇＳＦの標準のＩ１組と異なる。Ｄ２はＣ４位置にＬｅｕ残基を有する一方で、ＩｇＳＦの他のＩ１組は保存されたＴｒｐを有する。ストランドＢ中の水素結合のパターンは、ストランドＢおよびＢ’と呼ばれる２本の短いβストランドの形成に起因して変更されている。追加のＢ’ストランドはストランドＡとアラインメントされており、ＡＢ’トポロジーを有する短いβシートを形成する。Ｇストランドは、アミノ酸１９７〜１９９での挿入が原因で２本の短いストランド、Ｇ（下側）およびＧ’（上側）へと分割されており、これはストランドＡ’とβシートの形成をもたらす。Ｇストランド中の残基１９７〜１９９での「捻れ」によって引き起こされた水素結合パターンの破壊は、Ｓｅｒ１９７の側鎖とＣｙｓ１８６の主鎖アミドとの間の水素結合によって補償される。注目すべきは、Ｓｅｒ１９７は、ＳｅｒまたはＴｈｒ残基として、様々な種からのＫｉｔ中および他のＩＩＩ型ＲＴＫ中で保存されている。Ｄ２は、Ｃｙｓ１５１とＣｙｓ１８３との間に追加のジスルフィド結合を含有しており、これは、ＣＤループをＦストランドの末端と架橋して、ストランドＣおよびＣＤループにさらなる安定性をもたらす。追加のジスルフィド架橋は、ストランドＣおよびＦの間の低下した水素結合のネットワークを補償し得る。これら２つのＣｙｓは、ゼブラフィッシュからヒトまでのＫｉｔ中で高度に保存されている。
【０３６３】
ＫｉｔのＤ３。Ｄ３は、ＩｇＳＦのＩ１サブセットに属する２組のβシート（ＡＢＥＤ／Ａ’ＧＦＣ）から構成される。２つのβシートは、ストランドＢ上のＣｙｓ２３３およびストランドＦ上のＣｙｓ２９０の間のジスルフィド結合によって架橋されている。テロキン（ＰＤＢコード：１ＴＬＫ）およびＤ３構造の比較により、Ｄ３の９８個のアラインメントしたＣα残基について１０．４のＺスコアおよび２．０Åのｒ．ｍ．ｓ．偏差が示される。
【０３６４】
ＫｉｔのＤ４。Ｄ４は、Ｂ５およびＦ５でシステイン間の特徴的なジスルフィド結合を欠いているが、Ｄ４はＩｇＳＦトポロジーを維持する。さらに、ＩセットのＩｇＳＦの２０個のフィンガープリント残基のうち、１３個がＤ４中で保存されている。Ｄ４の構造的完全性は、Ｂ５およびＦ５にそれぞれ存在する埋没脂肪族（Ｖａｌ３３５）および芳香族（Ｐｈｅ３９２）の残基の間の相互作用によって保存されており、これはドメインの疎水性コアの一部を構成する。ＤＡＬＩを使用した構造比較により、ＫｉｔのＩｇ様ドメインのうちＤ４がテロキン（タンパク質データバンクコード：１ＴＬＫで検索）に最も類似しており、８９個のアラインメントしたＣα残基について１１．９のＺスコアおよび１．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であることが示される。Ｖａｌ３３５およびＰｈｅ３９２のＣα−Ｃα間の８．６Åの距離は、Ｂ５およびＦ５を接続するジスルフィド結合を欠くＩｇＳＦドメイン中の類似の位置の間で見られる距離の範囲内である。たとえば、やはりジスルフィド結合を欠くタイチンＩｇ様ドメインＭ５（タンパク質データバンクコード：１ＴＮＭ）は、２Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄでＤ４と重ね合わせられ、Ｂ５およびＦ５の位置の間で８．９Åの距離を有する。Ｄ４は、それぞれがアレンジＡＢＥＤ／Ａ’ＧＦＣを有する４本のストランドを含有する２つのβシートから構成される。Ａ’ストランドの第１の残基であるＴｈｒ３２１は、高度に保存されたＰｈｅ４０５の芳香環とファンデルワールス接触を形成する。注目すべきは、ドメインの上側の上に向かって折り畳まれたＣＤループが３つの主な相互作用によって安定化されることである。Ｔｈｒ３５４の側鎖は、Ｇｌｎ３４７の側鎖およびＴｒｐ３４８の主鎖カルボニルと水素結合を形成する。疎水性コアの端部に位置する疎水性残基（Ｔｒｐ３４８、Ｔｙｒ３５０、Ｔｒｐ３５９、Ｖａｌ３７７、Ｌｅｕ３７９およびＴｙｒ３９０）は、Ｐｈｅ３５５に疎水性環境を提供する。ＣＤループは注目すべき配列の保存を示さないが、このループは、すべてのＩＩＩ型ファミリーのＲＴＫ中で８個のアミノ酸を含有する。
【０３６５】
ＫｉｔのＤ５。Ｄ５はＩｇＳＦのＣ２およびＩｇＣＡＭサブセットに属しており、２０個のフィンガープリント残基のうちの１０個がこのモジュール中で保存されている。Ｄ５は、ＡＢＥＤ／ＣＦＧトポロジー、２つのβシートを架橋するＢ５のＣｙｓ４２８およびＦ５のＣｙｓ４９１の間のジスルフィド結合、ならびにＣストランドおよびＣＤループを架橋する第２のジスルフィド結合を示す。２つのジスルフィド結合はすべてのＫｉｔおよびＩＩＩ型ＲＴＫ中で保存されている。注目すべきは、Ｄ５の上半分が神経細胞接着分子の第３のＩｇに似ていることである。
【０３６６】
アキソニン−１／ＴＡＧ−１（タンパク質データバンクコード１ＣＳ６）。いくつかの特徴を、より低い程度ではあるが、テロキン（タンパク質データバンクコード１ＦＨＧ）、ＦＧＦＲ（タンパク質データバンクコード１ＣＶＳ）およびＲＴＫ  Ｍｕｓｋ（タンパク質データバンクコード２ＩＥＰ）中で同定することができる。これらには、Ｂ５をＦ５と接続するジスルフィド結合に近接した、２つのＡｌａ残基（Ａｌａ４３０およびＡｌａ４９３）が含まれて、この領域中の小さな側鎖の存在は、ドメインの上部での密な充填を可能にする。第２の特徴は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＧストランド中のＰｒｏおよびＧｌｙ残基である、それぞれＰｒｏ４１３、Ｇｌｙ４３２、Ｐｒｏ４３６およびＧｌｙ４９８の環アレンジである。第３の特徴は、ＦＧおよびＢＣループのそれぞれＶａｌ４９７およびＰｒｏ４３４の主鎖と水素結合を形成する、Ｆ９中のＡｓｎ残基（Ａｓｎ４９５）の存在である。これらが一緒になって、Ｄ５の上部のこれらの３つの特徴が、細胞接着タンパク質のＩｇ様ドメインの立体配置に類似の密に充填された立体配置をもたらす。
【０３６７】
（実施例４）
Ｋｉｔ単量体形態中のＩｇ様ドメイン間の相互作用
Ｋｉｔの５個のＩｇ様ドメイン間のドメイン間相互作用は、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体の全体的なトポロジーの維持に関与する（図１）。Ｄ２に対するＤ１の配向は、２つのＩｇ様ドメイン間の多数の相互作用によって引き起こされる大規模な埋没表面積によって決定される（図１Ｂ）。Ｄ１−Ｄ２境界領域中の１２４０Å２の埋没表面積は、５００〜８００Å２の範囲であるＫｉｔ外部ドメイン中の３つの他のＩｇ様間境界領域を含めた、竿様の多ドメインＩｇＳＦ構造のほとんどのＩｇ様ドメイン間の境界領域の埋没表面積よりもはるかに大きい（Ｓｕら（１９９８年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１巻：９９１〜９９５頁）。この境界領域は、Ｄ１のストランドＡ’およびＧ、ループＥＦおよびＣＣ’とストランドＡのＮ末端領域、ストランドＢのＣ末端、Ｄ２のループＢＣおよびＤＥとの間の疎水性かつ静電気的な相互作用によって主に形成される（図１Ｂ）。さらに、Ｄ１のストランドＧ、Ｄ１およびＤ２を接続するリンカー領域ならびにＤ２のＢＣループからのアミノ酸を含めた、Ｄ１−Ｄ２境界領域中の多くの残基が、様々な種からのＫｉｔで保存されている（図１Ｂ）。
【０３６８】
Ｄ２−Ｄ３境界領域の埋没表面積は約７８０Å２である。Ｄ２−Ｄ３境界領域は、２つの静電気的な相互作用によって囲まれた小さな疎水性パッチから構成される。この境界領域は、Ｄ２のＥＦループとＤ３のＤＥループとの間の相互作用ならびにＤ２−Ｄ３リンカー領域とＤ３のＦＧおよびＢＣループとの間の相互作用によって形成される（図１Ｃ）。Ｄ３−Ｄ４境界領域の埋没表面積は約５７０Ａ２である。Ｄ３およびＤ４は、主にＤ３のストランドＡ’およびＧとＤ４のＢＣおよびＤＥループによって相互作用する（図１Ｄ）。Ｄ３−Ｄ４境界領域の長さは、Ｄ３に対するＤ４の角度アレンジが原因で約２０Åであり、２つのＩｇ様ドメインの長軸に沿った角度は１１９°である。Ｄ４−Ｄ５境界領域は、主に疎水性相互作用によって媒介される、７６０Å２の埋没表面積を形成する（図１Ｅ）。Ｄ４のストランドＡ、ＧおよびＦと、Ｄ５のＢＣおよびＤＥループとの間、ならびにＤ４−Ｄ５リンカー領域との間の相互作用によって、この境界領域が形成される（図１Ｅ）。
【０３６９】
Ｋｉｔ単量体中のＩｇ様ドメイン間相互作用に関する詳細なドメイン毎の情報
Ｄ１−Ｄ２境界領域。Ｄ１の残基Ｉｌｅ４７、Ｉｌｅ７０、Ｌｅｕ７１、Ａｌａ８９、Ｔｙｒ１０８およびＰｈｅ１１０とＤ２のＬｅｕ１１９、Ｐｒｏ１３７、Ｌｅｕ１３８、Ｐｒｏ１４１、Ｐｒｏ１６６およびＬｙｓ１６７側鎖との間の疎水性相互作用は、ドメイン間相互作用を安定化する（図１Ｂ）。Ｄ１のＡｒｇ１１２とＤ２のＡｓｐ１４０との間の相互作用およびＤ１のＡｓｐ７２とＤ２のＡｒｇ１３５との間の相互作用を含めた疎水性パッチを取り囲む領域中には、２つの主要な静電気的な相互作用が存在する（図１Ｂ）。
【０３７０】
Ｄ２−Ｄ３境界領域。疎水性パッチは、Ａｒｇ１７７の脂肪族部分ならびにＰｒｏ２０６、Ｐｈｅ２０８、Ｖａｌ２３８およびＰｈｅ２６７の側鎖から構成される。静電気的な相互作用は、Ｄ２のＧｌｕ１２８およびＡｓｐ１２９の側鎖とＤ３のＬｙｓ２０９との間の水素結合を含む（図１Ｃ）。Ａｒｇ１７７の側鎖とＧｌｕ１２８の側鎖との間の塩橋は、Ｄ２中のＡｒｇ１７７の側鎖およびＰｒｏ２０６の側鎖ならびにＤ３中のＰｈｅ２６７の位置を安定化して、Ｄ２中のＡｒｇ１７７の側鎖の脂肪族部分に疎水性環境を作製する（図１Ｃ）。第２の静電気的な相互作用は、Ｄ２中のＡｒｇ１８１の側鎖とＤ３のＡｓｐ２６６の側鎖によって媒介される。
【０３７１】
Ｄ３−Ｄ４境界領域。Ｄ３−Ｄ４境界領域中の疎水性相互作用には、Ｄ３からのＶａｌ３０８およびＬｅｕ２２２とＤ４からのＰｈｅ３１２、Ｐｈｅ３４０、およびＩｌｅ３７１との間のものが含まれる。Ｄ３−Ｄ４境界領域は、他のＩｇ様ドメイン間の境界領域よりも小さい埋没面積を覆う（図１Ｄ）。
【０３７２】
Ｄ４−Ｄ５境界領域。Ｄ４−Ｄ５境界領域上の疎水性パッチには、それぞれＤ４のＡおよびＧストランドからのＰｈｅ３２４およびＴｙｒ４０８ならびにＤ５のＢＣループからのＰｈｅ４３３が含まれる。さらに、ファンデルワールス接触は、疎水性パッチを取り囲む境界領域の安定化に寄与し、Ｄ４のＰｈｅ３２４、Ｇｌｙ３８４、Ｔｈｒ３８９、Ｔｙｒ４０８、Ａｓｎ４１０、Ｔｈｒ４１１およびＭｅｔ３５１は、Ｄ５のＶａｌ４９７、Ｐｈｅ４３３、Ｇｌｙ４７０、Ｐｈｅ６４９およびＬｙｓ４７１と相互作用する（図１Ｅ）。
【０３７３】
（実施例５）
結合したＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の全体的な構造の分析
ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の構造は、非対称単位中の２組の１：１複合体が非結晶学的な二回回転対称性によって関連している、２：２の化学量論を示す（図２）。結晶格子中の観察されたＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体は、Ｋｉｔの二量体化が二量体ＳＣＦリガンドによって駆動されることを示す実験と一致している（Ｐｈｉｌｏら（１９９６年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻：６８９５〜６９０２頁、Ｌｅｍｍｏｎら（１９９７年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻：６３１１〜６３１７頁）。２組のＫｉｔ外部ドメインおよびＳＣＦ分子は、逆さまの文字「Ａ」に似ており、寸法は約１７０×１３０×７０Åである（図２Ａおよび図９）。
【０３７４】
Ｋｉｔと結合したＳＣＦの全体的な構造は、以前に記載されている遊離ＳＣＦの構造に類似している（Ｚｈａｎｇら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻：７７３２〜７７３７頁、Ｊｉａｎｇら（２０００年）  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９巻：３１９２〜３２０３頁）。ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体の構造は、個々のＳＣＦプロトマーが個々のＫｉｔプロトマーのＤ１、Ｄ２およびＤ３と直接結合することを示している（図２Ｂ）。その結果、単一の受容体プロトマーは、ＳＣＦプロトマー上の同様の二回（ｔｗｏ−ｆｏｌｄ）関連表面と対称な複合体を形成する。また、Ｋｉｔの二量体化は、Ｋｉｔの２つの膜近位Ｉｇ様ドメイン間のホモタイプ相互作用、すなわち、Ｄ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用によっても媒介される（図２Ｂ）。これは、Ｃ末端をそれらが膜貫通ドメインと接続される場所から互いに１５Å以内に近接させる、分子の残りの部分に対して劇的に変更されたＤ４およびＤ５の立体配置をもたらす（図２Ｂおよび図９）。また、構造は、約５０×５０×１５Åの寸法を有する複合体の中心の大きな空洞の存在によっても特徴づけられている（図２Ｂ）。結晶構造は、ＳＣＦのそれぞれのプロトマーが単一のＫｉｔ分子と排他的に結合し、受容体の二量体化がさらなる受容体−受容体の相互作用を促進するＳＣＦ二量体によって駆動されることを示している。
【０３７５】
（実施例６）
ＫｉｔのＳＣＦ結合領域の分析
ＳＣＦは、ＳＣＦの４つのヘリックスバンドルがＤ１、Ｄ２およびＤ３の長軸に垂直に配向されており、ＳＣＦおよびＫｉｔのＣ末端が逆方向を向いている立体配置で、ＫｉｔのＤ１、Ｄ２およびＤ３によって形成された凹表面と結合している（図２、３および図９）。ＫｉｔとＳＣＦプロトマーのそれぞれとの間の境界領域に埋没した溶媒接近可能な表面積のは約２０６０Å２であり、これは、公知のリガンド受容体境界領域の範囲内にある埋没表面積である。ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域を３つの結合部位に分割することが可能である（図３Ａ、Ｂ、表２、および表３）。部位−ＩはＤ１上に位置しており、部位−ＩＩはＤ２およびＤ２−Ｄ３リンカー領域中に位置しており、部位−ＩＩＩはＤ３中に位置している。部位Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの埋没表面積は、それぞれ約２８０、７７０および１０１０Å２である。
【０３７６】
部位−Ｉ
図３Ｃ中に提示するように、ＳＣＦのαＣ−β２ループはＤ１のストランドＣ’に垂直にアラインメントされている。Ｄ１のＡｓｐ７２、Ｇｌｕ７３およびＴｈｒ７４ならびにＳＣＦのＬｙｓ９９’、Ｓｅｒ１０１’およびＰｈｅ１０２’は、Ｃαに６〜８Åの距離で近接して位置しており、これは、これらの残基がＤ１とＳＣＦとの間の相互作用に参加している可能性があることを示している。αＣ−β２ループの乏しい側鎖電子密度が原因で、具体的な相互作用は定義できなかった。
【０３７７】
部位−ＩＩ
ＳＣＦ結合は、大部分が、Ｋｉｔ上の荷電表面の相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）静電気的な相互作用によって媒介される（図３Ａ、Ｂ、Ｄ）。塩橋がＫｉｔの塩基性アミノ酸Ａｒｇ１２２、Ａｒｇ１８１、Ｌｙｓ２０３およびＡｒｇ２０５とＳＣＦ上の酸性アミノ酸Ａｓｐ５４’、Ａｓｐ７７’、Ａｓｐ８４’およびＧｌｕ８８’との間に形成される。Ａｒｇ１２２のコンフォメーションは、ＫｉｔのＧｌｕ１９８とＳＣＦのＡｓｐ５４’との間の塩橋によって安定化されている。図３Ｄは、Ｄ２上の主要な相互作用する残基のうちの３つ、Ｔｙｒ１２５、Ａｒｇ１８１およびＬｙｓ２０３が同じ平面上にアラインメントされており、αＢのＡｓｐ７７’、Ａｓｎ８１’、Ａｓｐ８４’、Ｓｅｒ５３’およびＴｈｒ５７’ならびにＳＣＦのαＣと水素結合を形成することを示している。また、Ｄ２のＳｅｒ１２３およびＩｌｅ２０１とＳＣＦのＶａｌ５０’およびＴｈｒ５７’との間のファンデルワールス接触も、リガンド−受容体の複合体の形成に寄与する。しかし、他の種からのＫｉｔおよびＳＣＦ中の部位−ＩＩの残基中には注目すべき相違が存在する（図３、図８および図１０）。Ａｒｇ１８１およびＬｙｓ２０３は哺乳動物中の塩基性アミノ酸として不変である一方で、Ｔｙｒ１２５はマウスおよびラット中でフェニルアラニンによって置換されており、これはほとんどの場合に水素結合の損失をもたらす。ＫｉｔのＡｒｇ２０５は高度に保存されたアミノ酸である一方で、Ｇｌｕ８８’はマウスおよびラット中でそれぞれロイシンおよびアラニン残基によって置換されている。さらに、ヒト中のＫｉｔのＡｒｇ１２２およびＳＣＦのＡｓｐ５４’は、マウスおよびラット中でそれぞれロイシンまたはバリンによって置換されている。これらの置換は、ヒトＫｉｔに対するげっ歯類ＳＣＦの親和性の低下の原因となる可能性がある（Ｌｅｖら（１９９２年ｂ）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７巻：１５９７０〜１５９７７頁）。
【０３７８】
部位−ＩＩＩ
ＳＣＦのＮ末端セグメントはＤ３のストランドＤと相互作用する（図３Ａ、Ｅ）。水素結合がＳＣＦのＡｓｎ１０’の側鎖とＳｅｒ２６１の主鎖アミドおよびカルボニル基との間、ならびにＤ３上のＡｓｐ２６０およびＴｒｐ２６２の側鎖との間に形成される。さらに、ＳＣＦのＴｈｒ９’およびＡｓｎ１１’は、ＫｉｔのＳｅｒ２６１およびＨｉｓ２６３の側鎖および主鎖アミドとそれぞれ結合する。ＳＣＦの変異分析により、Ａｓｎ１０’をアラニンまたはグルタミン酸残基で置換することでＫｉｔに対するＳＣＦの結合親和性が約１０分の１になり、Ａｓｎ１０’（または他の種中のＡｓｐ）が生物活性に必要であることが示されている（Ｈｓｕら（１９９８年）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７巻：２２５１〜２２６２頁）。様々な種からのＳＣＦ中の受容体結合境界領域の比較は、Ａｓｎ１０’（またはＡｓｐ）が高度に保存された残基であることを示している（図８）。さらなる重要な相互作用は、ＳＣＦのＡｓｎ６’およびＡｒｇ７’によって、ＫｉｔのＤ３上のＴｙｒ２５９、Ｔｈｒ２６９、Ｓｅｒ２４０、Ｖａｌ２４２、Ｓｅｒ２４１、Ｓｅｒ２４４とのファンデルワールス接触を介して媒介されている。
【０３７９】
【表３】
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（実施例７）
Ｋｉｔ／ＳＣＦ構造および結合に関連するコンフォメーション変化の分析
Ｋｉｔのリガンド結合ドメインはＳＣＦ結合の準備がある
Ｋｉｔ単量体形態の個々のＤ１、Ｄ２、およびＤ３の構造とＳＣＦ誘導性のホモ二量体形態の対応する構造との重ね合わせにより、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３中の８２、９２、および１００個のアラインメントしたＣα残基についてそれぞれ０．５、０．８、および１．１Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値が明らかとなる。同様に、Ｋｉｔ単量体のＤ１−Ｄ２−Ｄ３領域全体の構造とＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体中の対応する構造との重ね合わせにより、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３領域の２７４個のアラインメントしたＣα残基について１．１Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が明らかとなる。著しいことに、ＫｉｔのＳＣＦ結合ポケットの構造には顕著な主鎖変化が存在しない（図３および図１１）。しかし、いくつかの軽微な構造変化がＳＣＦ結合の際にＳＣＦ結合間隙（ｃｌｅｆｔ）中で検出された。ＳＣＦ結合の後に、Ｄ２のストランドＧ、Ｆ、およびＣの上半分（アミノ酸１６７〜１８７および１４３〜１６６）中で構造変化が見られる（図１Ａ、２Ａ）。これらのストランドはＳＣＦ結合境界領域の反対側に位置しており、ＳＣＦとのどのような直接接触の媒介にも関与していない。全体的に、Ｋｉｔ単量体の構造とＳＣＦで占有されたＫｉｔの二量体の構造との比較は、ＫｉｔのＤ１−Ｄ２−Ｄ３領域を、ＳＣＦ結合、次いで二量体ＳＣＦ分子によって駆動されるＫｉｔの二量体化の準備がある機能的単位としてみなし得ることを示している。
【０３８０】
Ｋｉｔと結合したＳＣＦ分子中のコンフォメーション変化
Ｋｉｔと結合したＳＣＦの全体的な構造は遊離ＳＣＦの構造と類似しているが、２つのプロトマー間の角度、接続ループのコンフォメーション、および分子の柔軟なＮ末端の構造には注目すべき相違が存在する（図４）。ＳＣＦ二量体の公開されている構造（タンパク質データバンク中で受託コード１ＥＸＺおよび１ＳＣＦ）の比較により、遊離ＳＣＦホモ二量体の２つのプロトマー間の角度（αＣヘリックス間の角度）が様々な構造中で２°〜６°変動し得ることが示されており、これは、特定の度合の柔軟性がＳＣＦ二量体中に存在することを示唆している。ＳＣＦプロトマーと結合したＫｉｔと遊離ＳＣＦのものとの間の角度の差異の範囲は、３〜９°増加していた。図４は、ＳＣＦプロトマー間の角度が５°増加している、Ｋｉｔと結合したＳＣＦ構造を示す。
【０３８１】
図４Ｂは、Ｃｙｓ４’からＡｓｎ１１’の遊離ＳＣＦのＮ末端がランダム−コイルの立体配置を有することを示す（Ｚｈａｎｇら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻：７７３２〜７７３７頁）。最初の４個のアミノ酸の欠失が、Ｋｉｔに対するＳＣＦの結合親和性の約２５％の低下をもたらすことも示され、これは、Ｃｙｓ４’とＣｙｓ８９’との間のジスルフィド架橋がＳＣＦの機能的完全性の維持に役割を果たすことを示唆している（Ｌａｎｇｌｅｙら（１９９４年）  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３１１巻：５５〜６１頁）。また、図４Ｂは、Ｋｉｔと結合したＳＣＦのＮ末端領域のＴｈｒ９’およびＡｓｎ１０’は、受容体結合の際にそのＣα位置が３〜５Å移動される、コンフォメーション変化を受けることも示している（図４Ｂ）。Ｎ末端のＣｙｓ４’とαＣヘリックスでのＣｙｓ８９’との間のジスルフィド架橋は、ＳＣＦのＮ末端中で起こるコンフォメーション変化の媒介において重要な役割を果たすと考えられる。遊離ＳＣＦ中のＣｙｓ２４’の位置は、Ｃα位置の１．２Åの二乗平均平方根偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）によって明らかとなるように、受容体の占有の際に変更されない。最後に、遊離ＳＣＦのαＣ−β２は、不秩序であるか、またはＫｉｔと結合したＳＣＦ中のαＣ−β２ループの構造とは異なる構造を有する。図４Ｃは、ＳＣＦのαＣ−β２ループが受容体結合の際に、ＳＣＦ−Ｋｉｔの境界領域の部位−Ｉの確立に重要な変化である大きなコンフォメーション変化を受けることを示す。
【０３８２】
ＳＣＦと結合したＫｉｔ中のＤ４およびＤ５の配向の大きな再構成
Ｋｉｔ単量体形態の個々のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５の構造とＳＣＦ誘導性のホモ二量体形態中の対応する個々のＩｇ様ドメインとの重ね合わせにより、ＳＣＦ結合後のＫｉｔのＩｇ様ドメインの構造中の軽微な変化が明らかとなる。対照的に、Ｋｉｔ単量体形態のＤ３−Ｄ４−Ｄ５領域とホモ二量体形態中の対応する領域との重ね合わせにより、Ｄ４およびＤ５の互いに対するおよびＫｉｔのリガンド結合領域に対する配向の大きな構造変化が明らかとなる（図５Ａおよび図１２）。単量体Ｋｉｔの個々のドメインＤ３、Ｄ４、およびＤ５のそれぞれは、ＳＣＦで占有されたＫｉｔ中のその対応物と重ね合わせることができ、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５の９８、１０１、および８５個のＣａ原子についてそれぞれ０．９、０．９および１．９Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値である。しかし、Ｋｉｔ単量体のＤ３構造とリガンドで占有されたホモ二量体形態中のＤ３構造との重ね合わせにより、ＳＣＦと結合したＫｉｔ中のＤ４およびＤ５の配向の劇的な移動が明らかとなる（図５Ａ）。リガンド結合領域に対するＤ４およびＤ５の再配向は、それぞれＤ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域を通った、Ｄ３をＤ４と接続するリンカー中の軸に沿った回転、およびＤ４をＤ５と接続するリンカー中の軸に沿った回転によって起こる（図５Ａ）。遊離Ｋｉｔおよびリガンドと結合したＫｉｔの比較は、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ４はＤ３に対して２２°回転し、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ５はＤ４に対して２７°回転することを示す（図５Ａ）。ＳＣＦで占有されたＫｉｔ中のＤ４およびＤ５の再構成は、２つの隣接するＫｉｔ分子のＤ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用によって媒介される受容体−受容体の相互作用をもたらす（図５Ｂ）。Ｄ５のＤＥループのコンフォメーションはＳＣＦで占有された外部ドメイン中で変更されている。受容体の二量体化によって駆動されたＤ４およびＤ５の再配向は、Ｄ５のＤＥループに新しい立体配置を課す（図５Ａ）。
【０３８３】
Ｋｉｔホモ二量体中のＤ４：Ｄ４相互作用
２つの隣接するＫｉｔ分子のＤ４間のホモタイプ相互作用は、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体中のＤ４−Ｄ４境界領域によって媒介される。Ｄ４−Ｄ４境界領域は、それぞれのＫｉｔプロトマーのＤ４のＡＢＥＤストランドによって形成された２つのβシートによって媒介されて、それぞれのプロトマーのＡｒｇ３８１が互いに向かい合わせになっており、３６０Ａ２の埋没表面積をもたらす、ほぼ平面状のアレンジを形成する。図６Ａは、Ａｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６がＫｉｔの二量体の二回回転軸を横断して塩橋およびファンデルワールス接触を形成することを示している。さらに、それぞれのプロトマーのＡｒｇ３８１の側鎖は、隣接するＫｉｔ分子の対応する残基の主鎖カルボニルと水素結合を形成する。
【０３８４】
構造に基づく配列解析により、Ｄ４−Ｄ４境界領域がＣＳＦ１Ｒ、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβを含めたほとんどのＩＩＩ型ＲＴＫ中で保存されていることが示されている（図６Ｂおよび図８）。ＰＤＧＦＲα中では、Ｇｌｕ３８６は、塩橋パートナーとしても機能することができる残基であるアスパラギン酸によって置き換えられている。一対の塩基性残基（Ａｒｇ３８１）および酸性残基（Ｇｌｕ３８６）が、様々な種のＩＩＩ型ＲＴＫ中で厳密に保存されている。また、Ｄ４−Ｄ４境界領域中に見つかる配列モチーフも、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）を含めたＶ型ＲＴＫ（ＶＥＧＦＲファミリー）のすべてのメンバーの膜近位の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）中で保存されている。ＶＥＧＦＲでは、塩基性残基（Ａｒｇ）および酸性残基（Ａｓｐ）がＥＦループ中に位置する。ＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４−Ｄ４境界領域に関与するコア配列モチーフはＶＥＧＦＲの異なるＩｇ様ドメイン中に位置しているが（すなわち、Ｄ７対ＩＩＩ型のＤ４）、ＫｉｔのＤ４−Ｄ４境界領域中で見られるものに類似の受容体−受容体の相互作用は、ＲＴＫのＶＥＧＦＲファミリーのすべてのメンバー中で同様のＤ７−Ｄ７境界領域を介しても起こることが可能である（図６Ａ）（Ｒｕｃｈら（２００７年）  Ｎａｔｕｒｅ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４巻：２４９〜２５０頁）。
【０３８５】
Ｋｉｔホモ二量体中のＤ５−Ｄ５相互作用
図２Ｂおよび図５Ｂ、６Ｃは、ＳＣＦ−Ｋｉｔの２：２複合体中では、隣接するＤ５プロトマーは平行であり、互いに密接に近接しており、細胞膜に対して垂直である可能性の高い配向にあることを示している。Ｄ５のβ−シートトポロジーは、ストランドＡがストランドＡおよびＡ’に分割されているほとんどのＩセットのＩｇＳＦとは異なる、非定型のアレンジに従う。Ｄ５のストランドＡはストランドＢと対合し、ＡＢＥＤ／ＣＦＧのβシートトポロジーをもたらす。その結果、２つのβシート（ＡＢＥＤ／ＣＦＧ）の端に位置するストランドＡおよびＧは、Ｃα中で互いから６．５〜１１．５Åの距離でほぼ平行である。さらに、１つのプロトマーのストランドＡおよびＧは、隣接するＤ５のストランドＡおよびＧと二回回転対称性で向き合っている。２つの隣接するＫｉｔプロトマーのＡｓｎ５０５の側鎖は互いから約４．２Åであるが、２つのアスパラギン間の間接的な相互作用を媒介し得る水または金属イオンは、この弱い電子密度の領域中で検出することができなかった。さらなるＤ５−Ｄ５の相互作用が２つの隣接するＫｉｔ分子のＴｙｒ４１８によって媒介される（図６Ｃ）。隣接するＴｙｒ４１８側鎖のヒドロキシル基間の相互作用は、水分子によって媒介されることができる。また、これは、隣接するＤ５ドメインの相対的な位置は、隣接するプロトマーのＴｙｒ４１８およびＡｓｎ５０５によって形成される間接的な相互作用によって媒介されることも示唆している。Ｄ５のＧストランドは、短いリンカーを介してＫｉｔの膜貫通ドメインに接続されている。
【０３８６】
（実施例８）
受容体活性化の機構
Ｋｉｔ外部ドメイン単量体およびＳＣＦ誘導性の二量体の構造は、その細胞外ドメイン中に５または７個のＩｇ様ドメインを含有するＫｉｔおよび他のＲＴＫのリガンド誘導性の活性化の機構に関する新規の識見を提供する。Ｋｉｔ外部ドメイン単量体のＤ１、Ｄ２およびＤ３の構造とＳＣＦ誘導性の外部ドメイン二量体中の対応する領域との比較により、ＳＣＦ結合後のＳＣＦ結合ポケットならびにＤ１、Ｄ２およびＤ３の他の部分においてごくわずかな構造変更が示される。その明白に異なる生化学的機能に基づいて、本発明者らはＫｉｔの外部ドメインを３つの独立した機能的単位へと分割した。第１の単位は、３つの膜遠位Ｉｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、およびＤ３から構成される。Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３領域は、特定のＳＣＦ結合単位として機能する別のモジュールとして機能する。ＳＣＦ結合単位は柔軟な接合部（Ｄ３−Ｄ４境界領域）によってＤ４と接続されており、これは第２の独立した単位であり、追加の柔軟な接合部（Ｄ４−Ｄ５境界領域）によってＤ５（第３の独立した単位として定義される）と接続されている。Ｄ４およびＤ５の機能は、それぞれ、２つの隣接するＫｉｔ外部ドメインの膜近位領域を一緒にしてその間の相互作用を安定化する、側方のＤ４−Ｄ４およびＤ５−Ｄ５の相互作用を媒介することである。
【０３８７】
この視点によれば、Ｋｉｔの二量体化は、その唯一の機能がＳＣＦと結合して２つのＫｉｔ分子を一緒にすることである、二価ＳＣＦ結合によって駆動される。ＳＣＦ誘導性のＫｉｔの二量体化には、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３のＳＣＦ結合単位の位置に対するＤ４およびＤ５の配向の大きな変化が続く。本明細書中に提示するデータは、Ｄ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５の境界領域での柔軟な接合部が、受容体の二量体化の際に大きなコンフォメーション変化をもたらす側方相互作用を可能にすることを示している。二量体化は、Ｋｉｔ中のコンフォメーション変化を誘導するのではなく、柔軟に接合された単量体から強固な二量体への遷移において特定のコンフォメーションを選択し得る。これは、Ｋｉｔの２つの隣接するＤ４および２つの隣接するＤ５間の複合体形成にまで至り、Ｄ５のＣ末端を、２つの隣接するＫｉｔ分子の膜貫通ドメインが互いに１５Å内である細胞膜での点に持って行く。実際、ＫｉｔのＳＣＦ誘導性のチロシン自己リン酸化（図７Ｂ）および下流のシグナル伝達経路の刺激は、ＫｉｔのＤ４内のＡｒｇ３８１またはＧｌｕ３８６のどちらかの点変異によって強く損なわれる。また、ＰＤＧＦ受容体活性化および下流のシグナル伝達経路の刺激は、ＰＤＧＦＲのＤ４中の同様の点変異によっても損なわれる。本明細書中に提示するデータは、Ｋｉｔの膜近位領域間のホモタイプ相互作用が主にＤ４−Ｄ４境界領域によって媒介されること、およびＤ５−Ｄ５境界領域が、細胞表面境界領域での２つのＫｉｔ外部ドメインの正確な配置を促進することで協力的な二次的な役割を果たすことを示している。
【０３８８】
ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体は、以下の特徴を伴って、静電場の強力な分極を示す：（ｉ）全体的な負荷電表面、（ｉｉ）ＳＣＦ（陰性）およびリガンド結合Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３単位（陽性）の間の相補性、ならびに（ｉｉｉ）Ｄ４−Ｄ４境界領域の真上およびその周辺の強力に負に分極した表面（図６Ｄ、３Ｂおよび図１３）。このデータは、ＳＣＦとＫｉｔとの結合は少なくとも２つのステップで起こることを示している。最初に、ＳＣＦとＤ１−Ｄ２−Ｄ３との間の静電引力は、ＳＣＦをＫｉｔ上の対向するリガンド結合領域に沿ってアラインメントさせる。また、静電引力は、操縦効果（Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）が原因で、より速いＳＣＦの会合速度ももたらし得る（Ｍｕｅｌｌｅｒａら（２００２年）  Ｂｉｏｃｈｉｎａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．  １５９２巻：２３７〜２５０頁）。続いて、ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体形成は、結合されたＳＣＦ分子中のコンフォメーション変化によって媒介されるものを含めた、さらなる相互作用によって安定化される。また、Ｄ４上の強力に分極した静電的表面は、隣接するＫｉｔ受容体のＤ４ドメイン間の反発を誘導することによって、Ｋｉｔを単量体の不活性の立体配置に維持することにおいても役割を果たし得る（図６Ｄ）。隣接する受容体のＤ４に対するＤ４およびＤ５に対するＤ５の結合親和性は、おそらく細胞表面上の局所的受容体濃度がＳＣＦに駆動される受容体の二量体化および次元性（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ）の効果によって増加される前は、Ｋｉｔ外部ドメイン二量体化を促進するためには低すぎる。そのような局所濃度の閾値に達した後は、隣接するＤ４間の引力が静電反発力に打ち勝って、２つの隣接するＤ４単位が互いに結合できる程度までになる。興味深いことに、Ｄ４−Ｄ４境界領域を維持する主な相互作用、すなわち隣接するＫｉｔ分子中のＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間の二重塩橋も、静電気的相互作用によって媒介される。
【０３８９】
ＫｉｔおよびＣ−カドヘリンの外部ドメインは（Ｂｏｇｇｏｎら（２００２年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻：１３０８〜１３１３頁）、それぞれ５個のタンデムのＩｇ様ドメインから構成され、どちらも同様な細長いトポロジーを示し、Ｋｉｔは１７０Åであり、Ｃ−カドヘリンは１８５Åである。さらに、細菌接着分子インベイシンは著しく類似した細長い構造およびＩｇ様ドメイン間トポロジーを示す（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら（１９９９年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６巻：２９１〜２９５頁）。Ｋｉｔ外部ドメインは、細胞−細胞の相互作用を媒介するタンパク質をコードしていた共通の先祖遺伝子から進化した可能性がある。古典的−カドヘリンは、その最も膜遠位のＩｇ様ドメインを、細胞−細胞の相互作用を媒介するホモタイプの結合に利用するが、Ｋｉｔの外部ドメインは、膜固定または可溶性のＳＣＦアイソフォームと結合して受容体の二量体化および活性化を誘導する細胞シグナル伝達受容体として機能するように進化している（図７Ｃ）。
【０３９０】
Ｋｉｔ構造の特徴であるリガンド結合および受容体の二量体化は他の受容体中で保存されているため、本明細書中に記載のＫｉｔの活性化の機構は、多くの受容体の活性化の一般的な機構であり得る（図７Ｃ）。さらに、本明細書中に記載の構造情報は、がんおよび活性化された受容体によって駆動される他の疾患を処置するための新規な治療的介入の設計に適用することができた。
【０３９１】
（実施例９）
ヒト疾患におけるＫｉｔの変異の分析
様々なヒト疾患がＫｉｔ遺伝子中の変異によって引き起こされる。ヒトでは、Ｋｉｔの外部ドメイン中の機能喪失型変異はまだら症体質を引き起こす（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎら（１９９６年）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０７巻：７０３〜７０６頁、Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００５年）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２４巻：６７０〜６７２頁）。Ｋｉｔ遺伝子座中のこれらのエクソン−２およびエクソン−３の点変異の結果、Ｃｙｓ１３６がアルギニン残基で置き換えられ、Ａｌａ１７８がスレオニン残基によって置換される。どちらの変異も、Ｋｉｔ上のＳＣＦ結合部位の重要な構成要素であるＤ２中で起こる（図７Ａ）。まだら症のＣｙｓ１３６Ａｒｇの変異は、Ｄ２の構造的および機能的完全性の維持において重要な役割を果たす重要なジスルフィド結合の損失、したがってＳＣＦを認識するその能力の損失を引き起こす。Ａｌａ１７８は、Ｄ２のＥＦループ中、Ｄ２−Ｄ３境界領域の非常に近くに位置する（図７Ａ）。まだら症のＡｌａ１７８Ｔｈｒの変異は、Ｄ２−Ｄ３境界領域の完全性の維持に必要な相互作用ならびにＤ２および／またはＤ３とＳＣＦとの結合に必要な相互作用を破壊し得る（図７Ａ）。
【０３９２】
Ｋｉｔ遺伝子座中の様々な機能獲得型変異が、ＧＩＳＴ、ＡＭＬおよびＳＣＬＣを含めた様々ながん中で見つかった（Ｆｏｒｂｅｓら（２００６年）  ＣＯＳＭＩＣ  ２００５．  ＢＲ  Ｊ．  ＣＡＮＣＥＲ、９４巻：３１８〜２２頁。Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ／を参照）。多くの腫瘍発生性変異がＫｉｔのＪＭおよびＰＴＫドメイン中で同定された。また、集合的に活性化された形態のＫｉｔの形成をもたらすインフレーム欠失、点変異、インフレーム重複および挿入を含めた、様々な腫瘍発生性変異もＫｉｔ外部ドメイン中で見つかった（図７Ａ）。Ａｓｐ４１９の損失または置換のどちらかを含むエクソン−８でのインフレーム欠失および挿入変異がＡＭＬに罹患している患者において記載されている一方で、Ａｌａ５０２〜Ｔｙｒ５０３およびＡｌａ５０２〜Ｐｈｅ５０６の配列の重複がＧＩＳＴにおいて同定された（図７Ａ）。Ａｓｐ４１９は、Ｄ５のストランドＡおよびＡＢループを接続する領域中に位置し、Ａｌａ５０２−Ｔｙｒ５０３は、ＫｉｔのＤ５のストランドＧ上に位置する。興味深いことに、Ｋｉｔ外部ドメイン中に見つかった事実上すべての活性化させる腫瘍発生性変異は、Ｄ５−Ｄ５境界領域にマッピングされた（図７Ａ）。腫瘍発生性のＤ５変異の作用様式の最ももっともらしい解釈は、これらの変異が、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）を増加させるもしくは解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を減少させる、またはＤ５−Ｄ５の相互作用の増強を促進する様式で両方のプロセスの速度を変更させることによって、隣接するＤ５ドメイン間の結合親和性およびホモタイプの相互作用を増強させるということである。
【０３９３】
上記分析は、Ｄ４およびＤ５領域が治療剤を標的化する良好な候補であることを示している。Ｋｉｔの二量体化／活性化を促す、またはより好ましくは二量体化／活性化を妨げるために、薬物、医薬品、または生物製剤を使用してＫｉｔと結合させ得る。
【０３９４】
（実施例１０）
Ｋｉｔ外部ドメインの発現、精製および部分的脱グリコシル化
Ｃ末端にさらに５個のヒスチジン残基を含有する、ヒトＫｉｔのアミノ酸１〜５１９をコードしているＤＮＡ構築体（Ｌｅｍｍｏｎら（１９９７年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻：６３１１〜６３１７頁）を、ｐＦａｓｔＢａｃ１内にライゲーションさせた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）。外部ドメインＫｉｔタンパク質を発現するバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃの指示マニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載の手順に従って調製した。昆虫Ｓｆ９細胞を、１０％の熱失活させたウシ胎児血清を補充したＧｒａｃｅの昆虫培地の１５Ｌ培養物中で、Ｗａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬＬＣ、システム２０／５０）を用いて２〜３×１０６個の細胞／ｍｌまで成長させ、その後、Ｋｉｔ外部ドメイン遺伝子を保有する組換えバキュロウイルスで感染させた。外部ドメインＫｉｔはヒトＫｉｔからのシグナル配列を含有していたが、タンパク質は外に分泌されずに昆虫細胞中に蓄積された。７２時間後、細胞を収穫し、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＮＤＰ−４０および２ｍＭのＰＭＳＦを含有する１．４リットルの５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８中で、２０分間、氷上で溶解した。遠心分離および濾過の後、Ｋｉｔの外部ドメインを、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いたゲル濾過を使用して精製した。２５ｍＭのＮａＣｌおよび１％のグリセロールを含有する２５ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．５中の精製したＫｉｔ外部ドメインを、１２時間、４℃で、Ｋｉｔ溶液に１０：１ｗ／ｗの最終比で加えた組換えエンドグリコシラーゼＦ１を用いて処理した。その後、エンドヌクレアーゼＦ１で処理したＫｉｔの外部ドメインを、事前に平衡化した１６／１０ＭｏｎｏＱカラム上に載せ、４００ｍＭのＮａＣｌおよび１％のグリセロールを含有する軽度の（ｓｈａｌｌｏｗ）勾配のトリス緩衝液、ｐＨ８．５で溶出させた。脱グリコシル化されたＫｉｔ外部ドメインの画分をプールし、遠心濃縮器を使用して３５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。精製した部分的に脱グリコシル化された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｌｙａｔｅｄ）Ｋｉｔ外部ドメイン調製物をアリコートに分割し、液体Ｎ２中でフラッシュ凍結した。この手法を使用して、約１０ｍｇの部分的に脱グリコシル化されたＫｉｔ外部ドメインが１５リットルの培養細胞から精製された。ＳＣＦ（１〜１４１）を以前に記載されているように発現させ、再折り畳みさせ、精製した（Ｚｈａｎｇら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻：７７３２〜７７３７頁）。また、Ｋｉｔの外部ドメイン（アミノ酸１〜５１４）も、以前に記載されているように、バキュロウイルス系を使用してＳｆ９昆虫細胞中で分泌形態として発現させ、精製した（Ｌｅｍｍｏｎら（１９９７年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻：６３１１〜６３１７頁）。
【０３９５】
（実施例１１）
構造の決定および精密化
実験段階は、Ｋｉｔ外部ドメイン単量体の結晶の多波長異常回折（ＭＡＤ）および異常散乱を用いた多重同形置換（ＭＩＲＡＳ）の組合せを使用して決定した。重原子の検索および位相調整はＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら（１９９８年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４巻：９０５〜９２１頁）およびＳＨＡＲＰ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅら（２００３年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５９巻：２０２３〜２０３０頁）のプログラムスイートを使用して実施した。１つの主要部位および２の副部位が白金誘導体（Ｋ２Ｐｔ（ＮＯ２）４）で検出され、１つの主要部位および５の副部位がヨウ素に浸漬した結晶で検出された。ＭＡＤ位相は、白金誘導体について、３つの波長で、ＣＮＳを使用して３．３Åの分解能まで計算した。ＭＩＲＡＳ位相は、白金およびヨウ素誘導体について、ＣＮＳおよびＳＨＡＲＰを使用して３．０Åの分解能まで計算した。溶媒フリッピング密度の改変により、連続的な電子密度および非常に明瞭な溶媒−タンパク質の境界を有する、解釈可能な品質の電子密度マップがもたらされた。Ｄ２中のストランド（ｓｔａｎｄ）Ｆ、Ｇ、Ｃの上半分およびＣＤループ、ならびにＤ５中のＣＤループ、ストランドＤ、ＤＥループ、ＥＦループおよびストランドＦの下半分を含めた乏しい電子密度品質の領域は、ＭＩＲＡＳおよびＭＡＤの位相調整によって計算した電子密度マップを比較することによって確認した。データ収集および位相調整の統計量は表１Ａおよび１Ｂ中に要約されている。Ｋｉｔの分子モデルは、ＣＯＯＴを使用して実験的電子密度マップ内に手動で構築した（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ  （２００４年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０巻：２１２６〜２１３２頁）。自由Ｒ因子の計算には、精密化中にデータの５％を除外した。精密化は、ＣＮＳを使用してネイティブデータに対して３．０Åの分解能まで実施した。精密化の最終段階では、並進／振動／回転（ＴＬＳ、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ／ｓｃｒｅｗ）精密化をＣＣＰ４プログラムスイート中のＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら（１９９７年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３巻：２４０〜２５５頁）によって実施し、ＴＬＳＭＤウェブサーバーを使用して３つのＴＬＳ群を生成した（Ｐａｉｎｔｅｒら（２００６年）  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ  ３９巻：１０９〜１１１頁）。
【０３９６】
ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の構造は、ＰＨＡＳＥＲを使用した分子置換によって解いた（ＭｃＣｏｙら（２００５年）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６１巻：４５８〜４６４頁）。Ｋｉｔ外部ドメインおよびＳＣＦのＤ１Ｄ２Ｄ３Ｄ４の明瞭な分子置換解は、ＰＨＡＳＥＲを使用して、ＫｉｔおよびＳＣＦのＤ１Ｄ２Ｄ３およびＤ４をそれぞれネイティブデータ組に対する検索モデルとして使用して見つけた。Ｋｉｔ（Ｄ１Ｄ２Ｄ３Ｄ４）−ＳＣＦ複合体の構造を２０〜４Åの剛体精密化に供し、４３．８％のＲｃｒｙｓｔがもたらされた。モデルの再構築および精密化は、ＣＮＳを使用して、それぞれ３１．６％および３４．０％のＲｃｒｙｓｔおよびＲｆｒｅｅ値まで行った。Ｄ５の領域中の連続的な電子密度が２σ２Ｆｏ−Ｆｃおよび３σＦｏ−Ｆｃマップ中で見つかった。ＣＯＯＴを使用してＤ５のストランドをマップ内に手動で引き、次いでそれぞれのステップ後に精密化を適用した。初期精密化の全体にわたって、非結晶学的対称性（ＮＣＳ）の束縛（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）が残基に課されていた。さらなる精密化をネイティブＸ線回折データに対して３．５Åの分解能まで行った。ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体分子のほぼ全体を構築した後、ＮＣＳの束縛を解放し、低下したＲおよびＲｆｒｅｅの値ならびに改善された電子密度がもたらされた。精密化の最終段階では、ＮＣＳの束縛は完全に解放されていた。モデルの立体化学はＰＲＯＣＨＥＣＫで分析した（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９３年）  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ  ２６巻：２８３〜２９１頁）。精密化の統計量の要約を表１Ｂ中に示す。
【０３９７】
（実施例１２）
ＳＣＦの放射標識およびリガンド置換アッセイ
Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、製造者の指示に従って、ヒトＳＣＦ（１０μｇ）を１ｍＣｉの１２５Ｉ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識した。置換結合アッセイには、ＷＴ  ＫｉｔまたはＫｉｔ変異体を発現する３Ｔ３細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で成長させた。細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＰＨ７．４および０．１％のＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＢＳＡ）で３回洗浄し、その後、１時間、室温で、２ｎｇの１２５Ｉで標識したＳＣＦと共に、漸増濃度のネイティブＳＣＦの存在下でインキュベートした。その後、細胞を冷ＤＭＥＭ−ＢＳＡで３回洗浄し、０．５ｍｌの０．５ＭのＮａＯＨ中で１時間、室温で溶解させ、１００μｌの細胞溶解液を１０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｆｌｕｏｒシンチレーション溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に添加して、ＬＳ６５００シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞に関連した放射能を測定した。
【０３９８】
（実施例１３）
保存分析
ヒトＳＣＦおよびＫｉｔのアミノ酸配列を、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して非重複データベース（ｎｒ）を相同配列について検索するためのクエリとして使用した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５巻：４０３〜４１０頁）。ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＳＣＦ配列またはＫｉｔ配列に対する配列アラインメントを行い（Ｈｉｇｇｉｎｓ  （１９９４年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５巻：３０７〜３１８頁）、その後、ＫｉｔのＩｇ様ドメイン中の２０種の主要な残基のＩｇＳＦの折り畳みの制約に基づいて手動で調節した。ＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体の結晶構造によって明らかとなったアミノ酸配列のアラインメントをＣｏｎｓｕｒｆ３．０サーバーに送り（Ｌａｎｄａｕら（２００５年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３巻：Ｗ２９９〜３０２頁）、アラインメントのそれぞれの位置の最大尤度の正規化された進化率を生成した。ここでは、低い発散率が高い配列保存に対応する。Ｃｏｎｓｕｒｆの出力と同様、連続的な保存スコアは、可視化のために、ビン９が最も保存された（えび茶色）位置を含有し、ビン１が最も可変性（シアン色）の位置を含有するように、９種のビンの別々のスケールに分配されている。
【０３９９】
（実施例１４）
タンパク質の発現、精製および抗体の作製
ヒトＫｉｔの第４のＩｇ様ドメイン（残基３０９〜４１３、ＫｉｔのＤ４）をコードしているＤＮＡを、ＰＣＲ反応を使用して完全長ヒトＫｉｔのｃＤＮＡから増幅させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．Ｃｏｌｉコドンプラス細胞を、ＫｉｔのＤ４の合成を指示する細菌発現ベクター（ｐＥＴ−ＮｕｓＡヒスチジンタグ付き）で形質転換させ、次いで終夜１６℃でインキュベートした。金属キレート化親和性カラム（Ｎｉ−ＮＴＡ、ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＫｉｔ  Ｄ４−ＮｕｓＡの融合タンパク質をＢＬ２１溶解物から精製し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳｏｕｒｃｅＱカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。その後、ＮｕｓＡおよびヒスチジンタグをＤ４から切断するために、Ｋｉｔ  Ｄ４−ＮｕｓＡを、終夜４℃でＴＥＶプロテアーゼと共にインキュベートした。ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＫｉｔのＤ４の追加の精製ステップを実施した。
【０４００】
ヒトＫｉｔの第５のＩｇ様ドメイン（残基４１０〜５１９、ＫｉｔのＤ５）をＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させ、細菌封入体から、６．０Ｍの塩酸グアニジンを含有する１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０を使用した再折り畳みステップを使用して精製した。再折り畳みさせたＫｉｔのＤ５を陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑセファロースカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製し、次いで、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した精製および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳｏｕｒｃｅＱカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した追加の精製ステップを行った。
【０４０１】
単離されたＤ４、Ｄ５、またはＫｉｔ外部ドメイン全体（アミノ酸１〜５１９、Ｋｉｔ  ＥＣ）、またはヒトＫｉｔのＣ末端領域からの断片（残基８７６〜９７６）を含有するＧＳＴ−融合タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を、実施例１中で列挙した方法などの当技術分野で周知の技法を使用して作製した。たとえば、Ｋｉｔ外部ドメインに対するポリクローナル抗体は、ウサギを精製したＫｉｔ外部ドメインで免疫化し、生じた抗体を標準の方法によって収集することによって作製し得る。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いた精製に供した抗体調製物を使用して、実施例１５および図１４などの、Ｋｉｔの活性化に対する抗体の効果を試験した実験を行った。
【０４０２】
（実施例１５）
ＫｉｔのＤ５ドメインに対する抗体を使用したＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化の阻害
ヒトＫｉｔを発現する３Ｔ３細胞を、Ｋｉｔの単離された組換えＤ５に対して作製した漸増濃度のポリクローナルウサギ抗体を含有する緩衝溶液と共にインキュベートした（図１４）。対照として、細胞を、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞中で産生させたＳＣＦに対するウサギポリクローナル抗体またはＫｉｔ外部ドメイン全体に向けられたウサギポリクローナル抗体で処理した。細胞溶解液を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔ抗体または抗ｐＴｙｒ抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した（図１４）。
【０４０３】
この実験は、抗Ｄ５抗体がＫｉｔのＳＣＦ誘導性のチロシン自己リン酸化を遮断することを示している。
【０４０４】
（実施例１６）
単離された組換えＫｉｔのＤ４ドメインによるＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化の阻害
Ｋｉｔを発現する３Ｔ３細胞を、１０分間、２３℃で、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で発現させた漸増濃度の精製した組換えＤ４と共にインキュベートし、次いでＳＣＦインキュベーションを行った。刺激していない細胞または刺激した細胞の溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔ抗体または抗ｐＴｙｒ抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した（図１５）。
【０４０５】
この実験は、単離されたＤ４の存在がＫｉｔのＳＣＦ誘導性のチロシン自己リン酸化を妨害することを示している。
【０４０６】
（実施例１７）
ＳＣＦ誘導性のＫｉｔ刺激実験
ヒトＫｉｔを発現する３Ｔ３細胞を、１０％の仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で成長させた。ＳＣＦ刺激の前に、Ｙｕｚａｗａら（２００７年）  Ｃｅｌｌ、１３０巻：３２３頁に記載のように、細胞を無血清培地中で終夜欠乏状態にした。欠乏状態にした細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１％のＢＳＡを含有する冷ＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで、図１４または図１５に示すように、漸増濃度の抗体またはＫｉｔ−Ｄ４と共に１０分間、２３℃でインキュベートした。細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦで１０分間、２３℃で刺激し、冷ＰＢＳで３回洗浄した。刺激していない細胞またはＳＣＦで刺激した細胞の溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔ抗体または抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
【０４０７】
（実施例１８）
ＰＤＧＦ受容体βのＰＤＧＦ誘導性の活性化およびＰＤＧＦＲβを介したシグナル伝達はＰＤＧＦＲβのＤ４中の重要なアミノ酸中の点変異によって妨げられる。
【０４０８】
ＷＴ  ＰＤＧＦＲβまたはＤ４中の重要なアミノ酸における点変異体（Ｋｉｔ外部ドメインＸ線結晶構造におけるＤ４−Ｄ４境界領域との配列類似度に基づく）のどちらかを発現するＰＤＧＦＲ−／−マウスに由来するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して、Ｒ３８５またはＥ３９０の変異が、ＰＤＧＦ誘導性の受容体活性化（図１６Ａ）、またはＰＤＧＦ誘導性のＭＡＰキナーゼ応答およびＡｋｔ刺激（図１６Ｂ）を妨げることを示した。さらに、共有結合性架橋結合剤を用いた架橋結合実験を使用して、本発明者らは、Ｅ３９０Ａ点変異がＰＤＧＦ誘導性の受容体の二量体化を妨害しないことを示す。しかし、活性化状態で細胞表面上に存在するＷＴ  ＰＤＧＦＲβの共有結合的に架橋結合した二量体とは異なり、Ｅ３９０Ａ変異体の共有結合的に架橋結合した二量体は不活性である（図１６Ｃ）。この実験は、Ｄ４中の重要なＥ３９０残基の変異がＰＤＧＦＲの活性化に必須のＤ４−Ｄ４相互作用を妨げることを示している。しかし、ＰＤＧＦＲのＰＤＧＦ誘導性の二量体化は、受容体の活性化を妨げるＤ４中の点変異によって影響を受けず、これは、Ｄ４−Ｄ４が、外部ドメインの膜近位領域の配置を媒介してＰＤＧＦＲのチロシンキナーゼドメインの活性化を可能にすることにおいて重要な役割を果たすことを示している。
【０４０９】
したがって、本発明の一実施形態には、ＰＤＧＦＲ中の残基Ｒ３８５またはＥ３９０と結合する、またはそれを標的とする部分が含まれる。これらの部分は、受容体の二量体化を保存したままで受容体を不活性化させるために用い得る。また、本実施例は、１つのＲＴＫの結晶構造、この場合はＫｉｔの外部ドメイン（ｅｃｏｄｏｍａｉｎ）の結晶構造に基づく情報を、他のＲＴＫに容易に移すことができることも示している。ここでは、ＫｉｔのＤ４ドメインの知識は、ＰＤＧＦ受容体の活性化に重要であったアミノ酸を同定することにおいて正しかった。ＰＤＧＦＲに関するより詳細な実験の組は実施例２２〜２５に記載されている。
【０４１０】
（実施例１９）
Ｋｉｔ外部ドメインの分子表面分析
本明細書中に記載のＳＣＦ結合の前および後のＫｉｔの外部ドメイン全体の結晶構造の決定により、ＳＣＦ誘導性の受容体の二量体化に次いで、２つの隣接するＫｉｔ分子の膜近位のＩｇ様ドメインＤ４およびＤ５間のホモタイプの側方相互作用が起こることが示されている。ホモタイプのＤ４およびＤ５の相互作用は、２つの隣接する受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインを、チロシン自己リン酸化およびキナーゼ活性化を可能にする距離および配向に配置する。また、本明細書中ではＤ４ホモタイプ相互作用に重要な単一アミノ酸残基の変異は、ＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化およびＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦ受容体活性化を損なわせたことも示されている（実施例２２〜２５を参照）。
【０４１１】
本明細書中に記載の構造分析は、ＲＴＫの外部ドメイン（たとえば、Ｄ３、Ｄ４、もしくはＤ５領域）によって形成される空洞の浅い領域中のコンフォメーションエピトープもしくは非近接エピトープと結合するモノクローナル抗体などの阻害性部分、またはＫｉｔおよび他のＩＩＩ型ＲＴＫの外部ドメインのＤ３−Ｄ４およびＤ４−Ｄ５ヒンジ領域と結合する小分子インヒビターをどのように設計するかについての新しい識見を提供する。外部ドメイン中の４つの領域を最初に標的とした：（Ａ）Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域と結合し、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向での膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能する、本発明の部分を作製し得る（図１７を参照）、（Ｂ）Ｄ４−Ｄ５ヒンジ領域と結合し、チロシンキナーゼの活性化を可能にする距離および配向での膜近位領域の配置に必要な挙動を妨げる分子ウェッジとして機能する部分を作製し得る（図１８を参照）、（Ｃ）Ｄ４：Ｄ４境界領域と結合してホモタイプのＤ４受容体の相互作用を妨げる部分を作製し得る（図１９を参照）、（Ｄ）Ｄ２−Ｄ３ヒンジ領域で凹表面と結合して、リガンド−受容体の相互作用の不安定化をもたらす部分を作製し得る（図２０を参照）、ならびに（Ｅ）ペプチド領域と結合して、様々な近接したおよび近接していないエピトープをＫｉｔの表面上に形成する部分を作製し得る（表５）。
【０４１２】
ＫｉｔおよびＳＣＦ−Ｋｉｔ複合体（ＰＤＢコード：２ＥＣ８および２Ｅ９Ｗ）の外部ドメインの分子表面を、タンパク質の表面トポグラフィーのコンピュータ図解（ＣＡＳＴｐ、Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）サーバーを使用して分析して、タンパク質の三次元構造上の凹表面領域の位置に関する情報を提供し、描写および測定を可能にする（Ｄｕｎｄａｓら、（２００６年）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３４巻：Ｗ１１６〜Ｗ１１８頁）。Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ．（２００２年）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）を使用して、同定された空洞を可視化し、そして調べた。
【０４１３】
（Ａ）Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域中の空洞（図１７）
いくつかの空洞が外部ドメイン単量体の構造中のＤ３−Ｄ４境界領域上に点在している。空洞の画定に関与しているアミノ酸は、表４中に要約されている。２つのＫｉｔ受容体間のホモタイプ相互作用の形成の際、Ｄ３−Ｄ４ヒンジ領域が変更され、Ｄ３からのＫ２１８、Ｓ２２０、Ｙ２２１、Ｌ２２２、およびＤ４からのＦ３４０、Ｐ３４１、Ｋ３４２、Ｎ３６７、Ｅ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７１、Ｙ３７３の残基によって作製される浅い空洞の形成がもたらされる。図１７は、占有されていない単量体（図１７Ａ）およびＳＣＦと結合した二量体（図１７Ｂ）のＤ３−Ｄ４ヒンジ領域のリボン図、ならびにＤ３−Ｄ４ポケットのメッシュ表示を示す。
【０４１４】
（Ｂ）Ｄ４−Ｄ５ヒンジ領域中の空洞（図１８）
小さな空洞は、Ｋｉｔ単量体中のＤ４のＡＢループおよびＥＦループ、Ｄ４−Ｄ５接続リンカーならびにＤ５のＤＥループおよびＦＧループの一部によって形成される。前述の空洞を画定する残基は表４中に要約されている。空洞の形状および大きさは、Ｋｉｔ外部ドメイン二量体構造中で変化している。Ｄ４のＥＦループおよびストランドＧ、Ｄ４−Ｄ５リンカーならびにＤ５のストランドＢおよびＤＥループによって形成される主要な空洞は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の形成に重要な領域であるＤ４のＥＦループの下に位置する。空洞の近くに位置するＤ５のＤＥループは、結合していないＫｉｔ構造および占有されたＫｉｔ構造の両方に由来するより低い品質の電子密度によって明らかとなるように、より高い柔軟性を有し得ることに留意されたい。図１８は、占有されていない単量体（図１８Ａ）およびＳＣＦ−二量体（図１８Ｂ）のリボン図、ならびにＤ４−Ｄ５ヒンジ領域の周りの浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【０４１５】
（Ｃ）Ｄ４ホモタイプ相互作用を媒介する領域における空洞
ＫｉｔのＤ４のＣＤループおよびＥＦループによって形成される凹表面は、Ｄ４ホモタイプ境界領域の真上に位置する。Ｄ４からの残基Ｙ３５０、Ｒ３５３、Ｆ３５５、Ｋ３５８、Ｌ３７９、Ｔ３８０、Ｒ３８１、Ｌ３８２、Ｅ３８６およびＴ３９０は、外部ドメイン二量体構造中の凹表面に約１３０Ａ２の表面積を提供する。Ｄ４ホモタイプ境界領域中で重要な役割を果たすＧｌｕ３８６の側鎖は、表面の中心に向かって突出する。凹表面の特徴は、荷電残基（Ｇｌｕ３８６およびＬｙｓ３５８）によって囲まれた小さな疎水性パッチである。表面の大きさおよび接近可能性は、ホモタイプのＤ４：Ｄ４相互作用の際に変更され、ドメインの上に向かって折り畳まれるＣＤループのコンフォメーション中で変化が起こる。凹表面の形成に関与する残基は表４中に要約されている。図１９Ａは、リガンドで占有されたＫｉｔのＤ４（示さず）上に重ねたＫｉｔの占有されていないＤ４ドメイン（金色）のリボン図、ならびにリガンドで占有された外部ドメインの構造（緑色）および占有されていない外部ドメインの構造（赤色）の間のＣＤおよびＥＦループの異なるコンフォメーションを示す。Ｄ４：Ｄ４相互作用の重要な残基をスティックモデル形態で示す。図１９Ｂおよび１９Ｃは、占有されていないＫｉｔ構造（図１９Ｂ）およびＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造（図１９Ｃ）のリボン図ならびにＤ４ホモタイプ境界領域の上側の浅い空洞のメッシュ表示を示す。
【０４１６】
（Ｄ）リガンド結合Ｄ２およびＤ３領域での凹表面
浅い凹表面が、Ｄ２およびＤ３ドメインのリガンド結合表面の一部上に位置する。小さなポケットに関与する残基は、Ｄ２からのＹ１２５、Ｇ１２６、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｋ２０３、Ｖ２０４、Ｒ２０５、Ｐ２０６およびＦ２０８ならびにＫｉｔのＤ３ドメインからのＶ２３８、Ｓ２３９、Ｓ２４０、Ｓ２４１、Ｈ２６３、Ｇ２６５、Ｄ２６６、Ｆ２６７、Ｎ２６８およびＹ２６９である。ポケットは、親水性残基によって囲まれた小さな疎水性パッチによって作製される。占有されていないおよびＳＣＦで占有されたＫｉｔ構造の間で大きな変更はなく、全体的な埋没表面積は約５００Ａ２である。図２０Ａおよび２０Ｂは、占有されていないＫｉｔ（Ａ）およびＳＣＦと結合したＫｉｔ（Ｂ）のリボン図ならびにＤ２−Ｄ３ポケットのメッシュ表示を示す。
【０４１７】
【表４−１】
2013515776.tif 000015
【０４１８】
【表４−２】
2013515776.tif 000016
（Ｅ）ＫＩＴチロシンキナーゼの構造解析を上述のように実施した。分析により、本発明の部分の標的であり得る連続および不連続エピトープがどちらも明らかとなった。表５中、エピトープ１、４、５、６、８、１２〜１６、１９、２２〜２３、および３１〜３９は連続エピトープである。これらのエピトープは、ＫＩＴタンパク質中の連続したアミノ酸から構成される。表５中のエピトープ２、３、７、９〜１１、１７、１８、２０、２１、２４〜３０、および４０〜４３は、ＫＩＴタンパク質の折り畳みによって近接させられるＫＩＴタンパク質の少なくとも２つのペプチドから構成される不連続なコンフォメーションエピトープである。
【０４１９】
【表５−１】
2013515776.tif 000017
【０４２０】
【表５−２】
2013515776.tif 000018
【０４２１】
【表５−３】
2013515776.tif 000019
【０４２２】
【表５−４】
2013515776.tif 000020
（実施例２０）
ＲＴＫ活性アッセイ
目的のＲＴＫを含有する細胞を、受容体および本発明の部分に対する活性化リガンドに曝露させる。目的のＲＴＫは、標準の分子生物学的方法（たとえば抗体精製）によって単離し得る。精製後、ＲＴＫと結合する抗体（本発明の部分ではなく、精製に使用する単なる構造結合剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｎｄｅｒ））を９６ウェルのマイクロタイター（ｍｉｃｔｒｏｔｉｔｅｒ）プレート上に事前にコーティングする。その後、ＲＴＫおよび較正した標準物質を別々のウェルに加え、ＲＴＫタンパク質を捕捉させる。次に、ホスホ部位（たとえば、ｃ−ＫｉｔのｐＹ８２３または活性化の際にリン酸化されるＫｉｔの他の残基、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）系はウサギ抗体を使用する）に特異的であり得る検出抗体を加える。抗体−Ｋｉｔの複合体は、標識または酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼがｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）系中で使用されている）とコンジュゲートさせた二次抗体（たとえば、ウサギ由来の一次抗体を検出するためには抗ウサギＡｂ）、次いで比色基質を使用して検出する。その後、停止溶液を加え、プレートを読み取る（たとえば、４５０ｎｍの光源および検出器を使用する）。ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＩＳＡ（商標）の詳細なプロトコルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｃｆｍ？ｐａｇｅｉｄ＝１１６５５；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｆ１０２７＿ＢＮ＿ｐＥＬＩＳＡ１００６．ｐｄｆ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｆ１０２８＿ＢＮ＿ｐＥＬＩＳＡ１００６．ｐｄｆ  Ｃ−ＫＩＴ［ｐＹ８２３］ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ，ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標））カタログ番号−ＫＨＯ０４０１；ｃ−Ｋｉｔ［ＴＯＴＡＬ］ＥＬＩＳＡ  ΚＩＴ、ＨＵ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標））カタログ番号−ＫＨＯ０３９１）から入手可能である。
【０４２３】
（実施例２１）
受容体内在化アッセイ
目的のＲＴＫを発現する細胞は、最初に適切なリガンドと共にインキュベート（たとえば、Ｋｉｔを発現する細胞をＳＣＦと共にインキュベート）して、受容体の内在化を誘導する。受容体の内在化の過程は、細胞を冷ＰＢＳで洗浄することによって停止される。その後、リガンドを解離させるために十分な塩濃度および／またはｐＨレベルを有する溶液で細胞を洗浄することによって、残りの表面結合リガンドを除去する。その後、細胞を適切な緩衝液に再懸濁させる。細胞はこの時点で内在化した受容体を含有し、したがって、より少ない量の受容体が細胞表面上に残っている。
【０４２４】
細胞を適切なリガンドおよび本発明の試験部分に曝露させる、同様の実験の別の組を実行する。試験部分が標的ＲＴＫの活性化を妨げる場合は、受容体の内在化が阻害される。上記実験（受容体の活性化が起こったもの）中で記載した細胞と比較した場合、これらの細胞は、減少した内在化および細胞表面上により多い量の受容体を示す。また、細胞を緩衝液または薬物を可溶化するための一般的なビヒクルであるエタノール溶液のみで処理する対照群も設定する。
【０４２５】
上記実験における細胞表面上の受容体の量の決定は、細胞を受容体に特異的なマウス抗体と共にインキュベートし、次いで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光体とコンジュゲートしている抗マウス抗体とインキュベートすることによって達成し得る。その後、蛍光顕微鏡検査技法を使用して、細胞表面上の受容体の量を可視化および定量し得る。
【０４２６】
細胞表面受容体を定量または可視化するための代替技法は当技術分野で周知であり、様々な蛍光および放射性の技法が含まれる。たとえば、一方法は、細胞を放射標識した抗受容体抗体と共にインキュベートすることを含む。あるいは（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｔｉｖｅｌｙ）、受容体の天然リガンドを蛍光分子または放射性標識とコンジュゲートさせ、細胞と共にインキュベートし得る。さらなる受容体内在化アッセイは当技術分野で周知であり、たとえば、そのそれぞれの内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｊｉｍｅｎｅｚら（１９９９年）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ５７巻（１０号）：１１２５〜１１３１頁、Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら（２００７年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １３巻（５号）：５８７〜５９６頁、およびＣｏｎｗａｙら（２００１年）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １８９巻（３号）：３４１〜５５頁に記載されている。
【０４２７】
実施例２２〜２５への導入
一般に受け入れられている受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の活性化の機構は、リガンド誘導性の受容体の二量体化が触媒コアの活性化ループ中の重要な調節性チロシン残基のトランス自己リン酸化を促進することであり、これはチロシンキナーゼの活性化に必須のステップである。これに次いで、様々なシグナル伝達タンパク質のＳＨ２（Ｓｒｃ相同性２）の結合部位またはＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメインとして役割を果たす細胞質ドメイン中の複数のチロシン残基の自己リン酸化が起こり、これは、動員および／またはチロシンリン酸化の際に、様々な細胞内区画にシグナルを調節された様式で伝達する（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  （２０００年）  Ｃｅｌｌ  １０３巻、２１１〜２２５頁、Ｐａｗｓｏｎ，  Ｔ．およびＮａｓｈ，  Ｐ．  （２００３年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００巻、４４５〜４５２頁、およびＨｕｎｔｅｒ，  Ｔ．  （２０００年）  Ｃｅｌｌ  １００巻、１１３〜１２７頁）。
【０４２８】
すべてのＲＴＫは二量体化によって活性化されるが、様々なＲＴＫファミリーが、リガンド誘導性の受容体の二量体化および活性化のために様々な分子戦略を利用するように進化している（Ｂｕｒｇｅｓｓ，  Ａ．  Ｗ．ら（２００３年）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １２巻、５４１〜５５２頁、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．ら（２０００年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６巻、７４３〜７５０頁）。ＰＤＧＦ、ＳＣＦ、ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌを含めたＩＩＩ型ＲＴＫのすべてのリガンドは、２つの隣接する受容体分子の等価な部位との二価結合によってその同族受容体を架橋結合することができる二量体分子である。ＰＤＧＦプロトマーは、分子の一方の末端に特徴的なシステインノットを有する、中心の４本鎖のβ−シートから構成される。２つのＰＤＧＦプロトマーは逆平行の様式で配置されており、２つの鎖間ジスルフィド架橋によって互いに連結されている（Ｏｅｆｎｅｒ，  Ｃ．ら（１９９２年）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１巻、３９２１〜３９２６頁）。対照的に、それぞれのＳＣＦ、ＣＳＦまたはＦｌｔ３Ｌプロトマーは、短いヘリックスの折り畳みから構成されており、非共有結合性相互作用によって互いに接続されている（Ｊｉａｎｇ，  Ｘ．ら（２０００年）  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９巻、３１９２〜３２０３頁、Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．ら（２０００年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７巻、７７３２〜７７３７頁、Ｐａｎｄｉｔ，  Ｊ．ら（１９９２年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８巻、１３５８〜６２頁、およびＳａｖｖｉｄｅｓ，  Ｓ．  Ｎ．ら（２０００年）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７巻、４８６〜４９１頁）。その多様な折り畳みにもかかわらず、２つの増殖因子の亜型は、事実上同一の様式でその同族ＲＴＫと結合してそれを活性化させ、活性化されたリガンド／ＲＴＫの２：２複合体の形成をもたらす（Ｓａｖｖｉｄｅｓ，  Ｓ．  Ｎ．ら（２０００年）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７巻、４８６〜４９１頁）。すべてのＩＩＩ型ＲＴＫは、５個のタンデムのＩｇ様ドメインを含有する細胞外リガンド結合領域、次いで１個の膜貫通ヘリックス、ならびに自己リン酸化および異種プロテインキナーゼによるリン酸化の標的となる調節領域と隣接した大きなキナーゼ挿入領域を有する細胞質チロシンキナーゼドメインから構成される（Ｈｕｂｂａｒｄ，  Ｓ．  Ｒ．  （１９９９年）  Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７１巻、３４３〜３５８頁）。
【０４２９】
ＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦＲβ）の活性化の機構は、関連する受容体チロシンキナーゼＫｉｔの細胞外領域の結晶構造に基づいて設計した変異体受容体の特性を分析することによって調査した。これらの実験に基づいて、Ｄ４（細胞外領域の第４のＩｇ様ドメイン）中のＡｒｇ３８５またはＧｌｕ３９０を変異させたＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ誘導性の活性化が損なわれ、様々なＰＤＧＦ誘導性の細胞応答の機能障害をもたらしたことが示された。また、これらの実験は、Ａｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０の間の塩橋によって媒介されている可能性が高いホモタイプのＤ４の相互作用が、ＰＤＧＦＲβおよびすべてのＩＩＩ型ＲＴＫの活性化において重要な役割を果たすことも示している。また、化学的架橋剤を使用して、ＰＤＧＦで刺激した細胞を共有結合的に架橋結合させて、ＰＤＧＦＲβのＧｌｕ３９０Ａｌａ変異体が典型的なＰＤＧＦ誘導性の受容体の二量体化を受けることも示した。しかし、リガンドで刺激した細胞の表面上に活性状態で発現されるＷＴ  ＰＤＧＦＲとは異なり、ＰＤＧＦ誘導性のＧｌｕ３９０Ａｌａの二量体は不活性である。Ｄ４ホモタイプ相互作用の媒介に必要な保存されたアミノ酸はＰＤＧＦＲβの活性化（およびＩＩＩ型ＲＴＫにおける同様の相互作用）に不可欠である一方で、これらの相互作用はＰＤＧＦＲβの二量体化には不要である。さらに、ＰＤＧＦＲβの二量体化は、チロシンキナーゼの活性化に必要であるが十分ではない。
【０４３０】
ＫｉｔのＤ４ドメインと同様、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβのＤ４ドメインは、Ｉｇ様ドメイン中のＢ５およびＦ５中に位置するシステイン残基を架橋する特徴的なジスルフィド結合を欠く。図２１中に提示するアミノ酸配列アラインメントは、ＩセットのＩｇＳＦの折り畳みの２０個のフィンガープリント残基のうちの１３個がＰＤＧＦＲのＤ４ドメイン中で保存されており、フィンガープリント残基に相当するストランドの数および長さがＫｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびＣＳＦ１ＲのＤ４ドメイン中で高度に保存されていることを示している。これは、本発明のインヒビターを、すべてのＩＩＩ型ＲＴＫを含めた様々な受容体分子を阻害するように設計し得ることを示している。
【０４３１】
ＫｉｔのＤ４ドメインは、それぞれがアレンジＡＢＥＤ／Ａ’ＧＦＣを有する４本のストランドを含有する２つのβシートから構成されており、ホモタイプのＤ４接触は、２つの隣接するＫｉｔ分子から突出するＤ４のＥＦループによって媒介される。本明細書中に開示したＫｉｔ構造は、ＥＦループ中のＡｒｇ３８１およびＧｌｕ３８６がＫｉｔの二量体の二回回転軸を横切って塩橋およびファンデルワールス接触を形成することを示している。さらに、それぞれのプロトマーのＡｒｇ３８１の側鎖は、隣接するＫｉｔ分子の対応する残基の主鎖カルボニルと水素結合を形成する。構造に基づく配列アラインメントにより、ＥＦループの大きさ、ならびにＤ４−Ｄ４境界領域を構成する重要なアミノ酸は、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１Ｒ中で保存されていることが示されている。ＰＤＧＦＲαでは、Ｇｌｕ３８６は、塩橋パートナーとしても機能し得る残基であるアスパラギン酸によって置き換えられている。さらに、塩基性および酸性（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）残基の対がＴａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓからＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎの範囲の様々な種のＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ中で厳密に保存されており（図２１）、この領域の機能的重要性のさらなる支持を提供している。したがって、様々なアミノ酸配列を有するＲＴＫ、たとえばＩＩＩ型ＲＴＫまたは本明細書中に記載のものと同様の機能のバリアントドメインを標的とした本発明の部分も、本発明の範囲内にある。
【０４３２】
実施例２２〜２５に関連する方法
配列アラインメントおよび相同性モデリング
アミノ酸配列アラインメントを、ＣＯＮＳＥＱサーバーを使用して（Ｂｅｒｅｚｉｎ，  Ｃ．ら（２００４年）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０巻、１３２２〜１３２４頁）、ならびにＩｇＳＦの折り畳み特徴に従って（Ｈａｒｐａｚ，  Ｙ．およびＣｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  （１９９４年）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３８巻、５２８〜５３９頁）およびヒトＫｉｔ構造のＤ４のＩｇの折り畳みのコア残基に従って（Ｙｕｚａｗａ，  Ｓ．ら（２００７年）  Ｃｅｌｌ  １３０巻、３２３〜３３４頁）行った。それぞれの配列の受託コードは、ＰＤＧＦＲαはヒト（Ｐ１６２３４）、マウス（Ｐ２６６１８）、ニワトリ（Ｑ９ＰＵＦ６）、カエル（Ｐ２６６１９）およびフグ（Ｑ８ＡＸＣ７）、ＰＤＧＦＲβはヒト（Ｐ０９６１９）、イヌ（Ｑ６ＱＮＦ３）、マウス（Ｐ０５６２２）、フグ（Ｐ７９７４９）、およびＫｉｔはヒト（Ｑ９６ＲＷ７）である。ＰＤＧＦＲβのＤ４の相同性モデルは、Ｄ４  Ｋｉｔ構造（ＰＤＢコード：２Ｅ９Ｗ）に基づいて、ＷＨＡＴ  ＩＦサーバー（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｒ．ら（１９９８年）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４巻、５２３〜５２８頁）を使用して作成した。図はＰｙＭＯＬを使用して作成した（Ｄｅｌａｎｏ，  Ｗ．Ｌ．、ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）。
【０４３３】
試薬および抗体
Ｌ−ヒスチジノールおよび抗ｆｌａｇ抗体はＳｉｇｍａから購入した。ＭＡＰＫに対する抗体、ホスホ−ＭＡＰＫに対する抗体、Ａｋｔに対する抗体、ホスホ−Ａｋｔに対する抗体、およびホスホリパーゼＣγに対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）抗体はＵｐｓｔａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものであった。抗ユビキチン抗体（Ｐ４Ｄ１）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅからのものであった。ＰＤＧＦＲβに対する抗体は、ウサギをＰＤＧＦＲβの細胞質ドメインからの合成ペプチドで免疫化することによって産生させた。ＰＤＧＦ  ＢＢのｃＤＮＡはＳｔｕａｒｔ  Ａａｒｏｎｓｏｎから得た。ＰＤＧＦ  ＢＢはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、以前に記載されているように細菌中で産生させた（Ｈｏｐｐｅ，  Ｊ．ら（１９９０年）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８７巻、２０７〜２１４頁）。１２５Ｉ放射性核種はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから購入した。Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬およびＩＯＤＯ−ＧＥＮで事前にコーティングされたヨウ素化チューブはＰｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｃｅ）からのものであった。ＦＩＴＣ−ファロイジンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【０４３４】
細胞系およびレトロウイルス感染
ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲα／β）をどちらも欠損したマウス胚に由来する線維芽細胞は、Ｐｈｉｌｉｐ  ＳａｒｉａｎｏおよびＡｎｄｒｉｕｓ  Ｋａｚｌａｕｓｋａｓによって提供された。ＰＤＧＦＲβのｃＤＮＡはＤａｎｉｅｌ  ＤｅＭａｉｏによって提供された。ＰＤＧＦＲβのｃＤＮＡをｐＬＸＳＨＤレトロウイルスベクター内にサブクローニングし、ｆｌａｇタグを受容体のＣ末端に付加した。Ｄ４中のすべての変異体は、部位特異的変異誘発によって、製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）に従って作製した。ＷＴおよび変異体ＰＤＧＦＲβをコードしているレトロウイルスは、２９３ＧＰＧ細胞中で産生させた（Ｏｒｙ，  Ｄ．  Ｓ．ら（１９９６年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３巻、１１４００〜１１４０６頁）。感染後、細胞をＬ−ヒスチジノールで選択し、選択された細胞のプールを実験に使用した。
【０４３５】
免疫沈降および免疫ブロッティング
刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２５ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、５μｇのアプロチニンおよびロイペプチンを含有する緩衝溶液（ｐＨ７．５）で溶解した。等量の細胞溶解液を示した抗体で免疫沈降させ、免疫ペレット（ｉｍｍｕｎｏｐｅｌｌｅｔ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。様々な抗体を用いて膜を免疫ブロットした。デンシトメーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してフィルムを走査し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。
【０４３６】
ＰＤＧＦＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ
細胞を１６時間血清欠乏させ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＦ、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦならびに１％のＮＰ４０を含有する溶解緩衝液に可溶化した（ｓｏｌｕｂａｌｉｚｅｄ）。溶解物を抗ＰＤＧＦＲβ抗体で免疫沈降させ、免疫ペレットを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＡＴＰおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する反応緩衝液中で、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。膜をストリッピング（ｓｔｒｉｐ  ｏｆｆ）し、抗ｆｌａｇタグ抗体で再ブロッティングして、全ＰＤＧＦＲβレベルを決定した。
【０４３７】
受容体二量体の化学的架橋結合
細胞を８０％コンフルエントに達するまで１５０ｍｍのプレート中で成長させ、１６時間血清欠乏させた後、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７）を含有するＤＭＥＭ中の示した濃度のＰＤＧＦと共に４℃でインキュベートした。９０分後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で大規模に洗浄した。プレートを室温に移し、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を０．５ｍＭの最終濃度まで加えた。３０分後、１０ｍＭのトリス緩衝液と共に１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで大規模に洗浄することによって、架橋結合反応をクエンチした。５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２５ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、５μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび５μｇ／ｍｌのロイペプチン（ｐＨ７．４）中の細胞溶解液を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ニトロセルロース膜を、ｆｌａｇタグに対する抗体または抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）抗体を用いて免疫ブロットして、全受容体およびリン酸化された受容体のレベルをそれぞれ検出した。
【０４３８】
ＰＤＧＦ誘導性のアクチン細胞骨格再構成
ＭＥＦをサブコンフルエントまでガラス製カバーガラス上で２４時間平板培養し、次いで終夜血清欠乏させた。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで２、５、１０、もしくは３０分間処理したか、または未処理のままにした。細胞をＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎで透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ）し、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で３０分間染色した。カバーガラスをＰｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントし、画像をＮｉｋｏｎの蛍光顕微鏡で得た。それぞれのカバーガラス上の約４００個の細胞を分析し、アクチン環形成を示す細胞の百分率を計算し、直線的に提示した。
【０４３９】
ＰＤＧＦ結合および内在化実験
Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＤＧＦを標識した後、Ｉｏｄｏ−ｇｅｎヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、製造者の指示に従ってヨウ素化した。細胞を２４ウェルプレート上にプレートし、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で８０％コンフルエントまで成長させた。細胞を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）および０．１％のＢＳＡを含有する冷ＤＭＥＭで２回洗浄した。三連のウェルを、５ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ＰＤＧＦと共に、漸増量のネイティブＰＤＧＦの存在下でインキュベートした。結合を２５℃で１時間進行させた。その後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、０．５ＭのＮａＯＨに可溶化した。ＬＳ６５００シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して試料の放射性含有量を決定し、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析した。
【０４４０】
内在化の実験には、細胞を２４ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエントまで成長させ、終夜欠乏状態にした。細胞をＤＭＥＭ／０．１％のＢＳＡ／５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中の５ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ＰＤＧＦと共に９０分間４℃でインキュベートした。非結合のリガンドは氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄することによって除去した。事前に温めたＤＭＥＭ／０．１％のＢＳＡ／５０ｍＭのＨｅｐｅｓを細胞に加え、３７℃で示した時間の間インキュベートした。細胞表面と会合したリガンドを、ＰＢＳ（ｐＨ３）および０．１％のＢＳＡを含有する氷冷酸性緩衝液で１０分間収集した。内在化したリガンドは、０．５ＭのＮａＯＨで可溶化させることによって収集した。分解された１２５Ｉ−ＰＤＧＦの量は、インキュベーション培地を１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、上清をＴＣＡ可溶性画分について計数することによって決定した。細胞表面と会合した、内在化および放出された放射能は、液体シンチレーションカウンターによって決定した。表面結合した、細胞内および分解されたＰＤＧＦの量は、氷上で９０分間インキュベートした後の（ｔ＝０分間）、細胞に関連した全放射能のパーセントとして表した。それぞれの時点は三連で行い、結果を平均±ＳＥとして表した。
【０４４１】
（実施例２２）
ＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦ受容体活性化はＤ４ドメイン中の変異によって損なわれる。
【０４４２】
図２１Ａに提示するアミノ酸配列アラインメントは、ＰＤＧＦＲのＥＦループ中のＡｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０が、隣接するＫｉｔ受容体間のホモタイプのＤ４の相互作用の媒介に関与しているＫｉｔのＡｒｇ３８１とＧｌｕ３８６との間に形成された塩橋と同様にして、ホモタイプのＤ４の相互作用を媒介し得ることを示している。同様の機構がＰＤＧＦＲβによって用いられているか否かを調査するために、Ａｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０を、それぞれ単独で（Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０Ａ）または組み合わせて（Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡ）、アラニン残基によって置換した。また、ループ領域中の追加の保存されたＬｙｓ３８７残基もアラニン（Ｒ３８５Ｋ３８７Ｅ３９０／ＡＡＡ）残基によって置換して、ＰＤＧＦ誘導性のＰＤＧＦＲβの活性化の制御におけるその潜在的な役割を検査した。野生型および変異体ＰＤＧＦＲβを、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβをどちらも欠損したマウス胚（ＭＥＦ）に由来する線維芽細胞中で安定に発現させた（Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．  （１９９４年）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８巻、１８８８〜１８９６頁、Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．  （１９９７年）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４巻、２６９１〜２７００頁、およびＡｎｄｒｅｗｓ，  Ａ．ら（１９９９年）  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４０巻、２６８３〜２６８９頁）。発現レベルについて一致した野生型または変異体ＰＤＧＦＲβを発現するＭＥＦを以下に記載の実験に使用した。刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞からの細胞溶解液を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、次いで抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
【０４４３】
続いて膜をストリッピングし、抗ＰＤＧＦＲ抗体で再ブロッティングして、ＰＤＧＦＲの発現を定量した。図２２Ａ中に提示する実験は、ＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ誘導性のチロシン自己リン酸化が、ＰＤＧＦＲβのＥ３９０Ａ、Ｒ３８５Ａ、（Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡ）、および（Ｒ３８５Ｋ３８７Ｅ３９０／ＡＡＡ）変異体を発現する細胞中で強く損なわれていることを示しており、チロシン自己リン酸化の規模および動態はどちらもそれぞれ低下および減弱されていた。これらの実験は、Ｄ４のＥＦループ中のＡｒｇ３８５およびＧｌｕ３９０がＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ誘導性の刺激において重要な役割を果たすことを示しており、これは、Ｋｉｔ構造中で同定されたものに類似の塩橋の対が活性化されたＰＤＧＦＲおよび他のＩＩＩ型ＲＴＫ中に存在することを示している。リガンド−受容体の複合体内の隣接する受容体のＤ４ドメイン間の直接相互作用が、ＩＩＩ型ＲＴＫのリガンド誘導性の活性化に利用される共通の機構を表している可能性がある。ＰＤＧＦ誘導性の受容体自己リン酸化は、Ｒ３８５Ａ、（Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡ）または（Ｒ３８５Ｋ３８７Ｅ３９０／ＡＡＡ）変異体を発現する細胞と比較して、Ｅ３９０Ａを発現する細胞中でより強く損なわれていることが、一貫してかつ再現可能に観察されている。これらの変異体間の相違に関与している正確な機構は明らかではないが、Ｄ４境界領域での正の局所的表面荷電が、リガンド刺激の前に隣接する受容体のＤ４を離して維持するための静電反発力を生じ得ることが可能である。アラニン残基によるＡｒｇ３８５の置換は塩橋形成を妨げる一方で、この変化は、Ｄ４−Ｄ４境界領域中の正味の正電荷も減少させて、ＰＤＧＦＲの活性化のより弱い阻害をもたらし得る。
【０４４４】
ＰＤＧＦＲのＤ４ドメイン中の変異が変異体ＰＤＧＦＲβの細胞膜発現およびリガンド結合親和性に影響を与え得たか否かの可能性を検査するために、野生型または変異体ＰＤＧＦＲβを発現する細胞に対する定量的ＰＤＧＦ結合実験を次に行った。野生型、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０Ａまたは（Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡ）のＰＤＧＦＲβ変異体を発現する細胞を、１２５Ｉ−ＰＤＧＦを含有する緩衝溶液と共に、９０分間、４℃で、漸増濃度のネイティブＰＤＧＦの存在下でインキュベートした。細胞と結合した放射能は、シンチレーションカウンターを使用して測定した。野生型および変異体ＰＤＧＦＲβの置換曲線のＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ４を用いた曲線の当てはめによって分析した（図２２Ｂ）。また、トランスフェクトされたＭＥＦ中で発現される野生型および変異体ＰＤＧＦＲβの量も、ＰＤＧＦＲに対する抗体または抗タグ抗体を用いた全細胞溶解液の免疫ブロッティングによって比較した（図２２ＡおよびＣ）。まとめると、これらの実験は、類似量の野生型または変異体ＰＤＧＦＲβがトランスフェクトされた細胞の細胞表面上で発現されることを示している。さらに、類似のＩＣ５０値（１２５Ｉ−ＰＤＧＦの結合の５０％を置換するＰＤＧＦ濃度）が、野生型（３．７ｎＭ）、Ｒ３８５Ａ（６．０ｎＭ）、Ｅ３９０Ａ（２．８ｎＭ）またはＲＥ／ＡＡ（３．０ｎＭ）変異体を発現する細胞で得られた。また、野生型および変異体の受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏチロシンキナーゼ活性を比較することによる、変異体ＰＤＧＦＲβの固有のチロシンキナーゼ活性が有害な影響を受けたか否かの可能性も検査した。この実験では、血清欠乏させた細胞からの細胞溶解液を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降に供し、固定したＰＤＧＦＲを１ｍＭのＡＴＰおよび１０ｍＭの塩化マグネシウムの存在下のｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイに供した。インキュベーション後、試料を、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。図２２Ｃ中に提示する実験は、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ変異がＰＤＧＦＲの固有のチロシンキナーゼ活性に影響を与えないことを示している。総合すると、これらの実験は、ＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ誘導性の刺激に影響を与えるＤ４中の変異が、細胞表面のＰＤＧＦＲβ（ＰＤＦＧＲβ）の発現を変更させず、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＦＧＲβ）のリガンド結合親和性に影響を与えず、変異体ＰＤＧＦＲβの固有のチロシンキナーゼ活性を変更させないことを示している。
【０４４５】
（実施例２３）
ＰＤＧＦ受容体のＤ４点変異体はＰＤＧＦで刺激した細胞の表面上に不活性の二量体（ｄｉｍｍｅｒ）の形態で発現される
受容体の二量体化は受容体チロシンキナーゼの活性化の根底にある重要な機構として確立されているため、本発明者らは、ＰＤＧＦ刺激に応答した変異体ＰＤＧＦＲβのチロシン自己リン酸化の低下が受容体の二量体化の欠損によって引き起こされるか否かを調査した。化学的架橋剤は、生細胞の細胞表面上の野生型および様々なＥＧＦ受容体変異体を含めたいくつかの細胞膜受容体のリガンド誘導性の二量体化を監視および追跡するために、以前に使用されている（Ｃｏｃｈｅｔ，  Ｃ．ら（１９８８年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３巻、３２９０〜３２９５頁）。この実験では、野生型ＰＤＧＦＲβまたはＥ３９０Ａ変異体を発現する細胞を終夜血清欠乏させ、次いで、ＰＤＧＦで９０分間、４℃でインキュベートした。数回の洗浄を使用して非結合のＰＤＧＦを除去し、細胞をＰＢＳ中の０．５ｍＭのスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）と共に３０分間、２５℃でインキュベートした。刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞からの細胞溶解液を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＰＤＧＦＲの二量体化の状態を監視するための抗ｆｌａｇ抗体またはＰＤＧＦＲの活性化の状態を監視するための抗ホスホチロシン抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した（図２３）。
【０４４６】
図２３中に示した実験は、刺激していない細胞の溶解物では、ＰＤＧＦＲ単量体に対応する１８０ｋＤａの見かけの分子量でＳＤＳゲル上を移動するバンドが、野生型ＰＤＧＦＲβまたはＥ３９０Ａ変異体のどちらかを発現する細胞からの溶解物中で検出されたことを示している。ＰＤＧＦ刺激の際、ＰＤＧＦＲ二量体に対応する３６０ｋＤａの見かけの分子量でＳＤＳゲル上を移動する追加のバンドが、野生型ＰＤＧＦＲβを発現する細胞およびＥ３９０Ａ変異体を発現する細胞の両方で検出された。しかし、抗ホスホチロシン抗体を用いた試料の免疫ブロッティングは、野生型ＰＤＧＦＲの二量体に対応するバンドは強くチロシンリン酸化されている一方で、Ｅ３９０Ａ変異体の二量体に対応するバンドの非常に弱いチロシンリン酸化が検出されたことを示している（図２３）。
【０４４７】
この実験は、Ｅ３９０Ａ変異体のリガンド誘導性のチロシン自己リン酸化の障害は、リガンド誘導性の受容体の二量体化の欠損によって引き起こされていないことを示す。また、この実験は、共有結合的に架橋結合した野生型ＰＤＧＦＲβはＰＤＧＦで刺激した細胞の細胞表面上に活性二量体の形態で表示されている一方で、Ｅ３９０Ａ変異体はＰＤＧＦで刺激した細胞の表面上に不活性の二量体の形態で表示されていることも示している。前述のデータは、ＰＤＧＦＲ中のＤ４ホモタイプ相互作用は受容体の二量体化に不要であり、ＰＤＧＦ誘導性の受容体の二量体化はチロシンキナーゼの活性化に必要であるが十分ではないことを示している。
【０４４８】
（実施例２４）
Ｄ４  ＰＤＧＦ受容体変異体を発現する細胞中での細胞シグナル伝達の刺激障害
ＰＤＧＦ刺激に応答した細胞シグナル伝達に対する、ＰＤＧＦＲのＤ４変異の影響を検査した。ＷＴまたはＰＤＧＦＲのＤ４変異体のどちらかを発現する、刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞からの溶解物を、抗ホスホリパーゼＣγ（抗ＰＬＣγ）抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＰＬＣγ抗体または抗ｐＴｙｒ抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した。図２４Ａ中に提示する実験は、ＰＬＣγのチロシンリン酸化が、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０Ａ、ＲＥ／ＡＡまたはＲＫＥ／ＡＡＡのＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞中で激しく損なわれていることを示す。さらなるＰＤＧＦ誘導性の細胞応答の刺激障害が、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体を発現する細胞中で観察されている。図２４Ｂ中に提示する実験は、ＭＡＰ−キナーゼ応答およびＡｋｔ刺激が、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡまたはＲ３８５Ｋ３８７Ｅ３９０／ＡＡＡのＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞において、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦ中のＰＤＧＦによって誘導された類似の応答と比較して強く損なわれていたことを示す。全体的に、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５Ｅ３９０／ＡＡ（すなわちＲＥ／ＡＡ）またはＲ３８５Ｋ３８７Ｅ３９０／ＡＡＡ（すなわちＲＫＥ／ＡＡＡ）のＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞では、約１０倍高い濃度のＰＤＧＦが同様のレベルのＭＡＰキナーゼ応答およびＡｋｔ刺激に必要であった。
【０４４９】
培養線維芽細胞のＰＤＧＦ刺激の特徴の１つは、ＰＤＧＦで刺激した細胞の背面上の膜ひだ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｕｆｆｌｅ）および環状アクチン環構造の典型的な形成である。図２５中に提示する実験は、アクチン環形成のＰＤＧＦ刺激がＰＤＧＦＲのＤ４変異体を発現するＭＥＦ中で損なわれていることを示す。５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで２分間刺激した後に、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦの約８３％が環状アクチン環形成を示した一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体細胞の５％のみが同様の環状アクチン環形成を示した。さらに、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦではＰＤＧＦ刺激の２〜５分後にピークとなる一過性の環状アクチン環形成は、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲＥ／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞中で弱く検出された。
【０４５０】
（実施例２５）
Ｄ４  ＰＤＧＦ受容体変異体の内在化および分解の低下
また、ＰＤＧＦの内在化、ＰＤＧＦＲの分解およびＰＤＧＦＲのユビキチン化に対するＰＤＧＦＲのＤ４変異の効果も検査した。ＷＴ  ＰＤＧＦＲまたはＰＤＧＦＲのＤ４変異体を発現するＭＥＦを５ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉで標識したＰＤＧＦで９０分間、４℃で処理し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）で手短に洗浄して、培地中の過剰のリガンドを除去した。事前に標識した細胞を３７℃まで温めて、リガンド−受容体の複合体のエンドサイトーシスを４時間までの様々な時間間隔で開始させた。培地中の細胞表面と結合した、細胞内および分解された１２５Ｉ−ＰＤＧＦを収集し、シンチレーションカウンターを使用して定量し、４℃で９０分間インキュベートした後の（ｔ＝０）、細胞に関連した全１２５ＩＰＤＧＦ放射能のパーセントとして表した（平均±ＳＤ）。図２６Ａ中に提示する実験は、ＷＴ  ＰＤＧＦＲを発現するＭＥＦと結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態が、Ｅ３９０Ａ、Ｒ３８５ＡまたはＲ３８５Ｅ３９０／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞と結合した、１２５Ｉで標識したＰＤＧＦの内在化の動態よりもはるかに速いことを示す。３０分後、１２５Ｉ−ＰＤＧＦの約７５〜８０％が細胞表面から除去され、ＷＴ受容体を発現する細胞内に蓄積されていたのに対し、変異体受容体を発現する細胞においてはそれは５０％未満であった。
【０４５１】
１２５Ｉ−ＰＤＧＦの低分子量分解生成物は３０分後に検出可能となった。分解された１２５Ｉ−ＰＤＧＦの放出は、ＷＴ細胞よりもＥ３９０Ａ変異体細胞中ではるかに遅かった（図２６Ａ）。ＰＤＧＦの内在化および分解の低下は、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体の分解の低下に反映されていた。分解実験中の新しいＰＤＧＦＲ分子の生合成を防ぐために、ＷＴまたはＲ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡもしくはＲ３８５Ｅ３９０／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体を発現する細胞を最初にシクロヘキシミドと共に３０分間インキュベートした。刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞の溶解物を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷＴまたはＰＤＧＦＲのＤ４変異体のＣ末端に付着したタグに向けられた抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。図２６Ｂ中に提示する実験は、Ｒ３８５Ａ、Ｅ３９０ＡまたはＲ３８５Ｅ３９０／ＡＡ  ＰＤＧＦＲ変異体の分解の動態が強く減弱されたことを示し、ＷＴ  ＰＤＧＦＲの半分がＰＤＧＦ刺激の１．５時間以内に分解された一方で、ＰＤＧＦＲのＤ４変異体の半減期は約４〜６時間まで伸びていた。図２６Ｃ中に提示する実験は、Ｅ３９０Ａ  ＰＤＧＦＲのユビキチン化のＰＤＧＦ誘導性の刺激も、同様の条件下でＷＴ  ＰＤＧＦＲと比較して強く低下したことを示す。まとめると、これらの実験は、ＰＤＧＦＲの内在化およびユビキチン媒介性のＰＤＧＦＲの分解がＰＤＧＦＲのＤ４中の変異によって損なわれることを示している。
【０４５２】
実施例２２〜２５の考察
ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｆｌｔ３およびＫｉｔを含めたＩＩＩ型ＲＴＫのすべてのメンバーの細胞外ドメインは、５個のＩｇ様ドメインから構成され、そのうち、最初の３個は二量体リガンド分子の結合部位として機能し、これは結合の際に受容体の二量体化および活性化を刺激する。分子構造としては、ＩＩＩ型ＲＴＫのリガンド結合特徴および受容体の二量体化の機構は高度に保存されており、ＳＣＦ刺激の前および後のＫｉｔの完全な細胞外ドメインの結晶構造によって明らかとなるＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化の機構は、すべてのＩＩＩ型ＲＴＫの活性化の一般的な機構を表す。さらに、その細胞外ドメイン中にＩｇ様ドメインを含有するＲＴＫの系統学的分析は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）を含めたファミリーであるＩＩＩ型およびＩＶ型ＲＴＫの共通の進化的起源を示している。さらに、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦはどちらも同じシステインノットファミリーに属しており、同様のトポロジー、大きさおよび受容体結合戦略を共有するホモ二量体増殖因子である。したがって、その細胞外ドメインのＸ線構造解析によって明らかとなるＫｉｔの活性化の顕著な特徴（本明細書中で初めて開示される）は、Ｖ型ＲＴＫのリガンド誘導性の活性化にも当てはまり得る。
【０４５３】
Ｋｉｔの構造解析により、２つの隣接するＤ４ドメインのＧｌｕ３８６とＡｒｇ３８１との間に形成された塩橋の対が、ＳＣＦ誘導性のＫｉｔ活性化に必須のホモタイプのＤ４の相互作用の媒介に関与していることが示されている。ＩＩＩ型ＲＴＫのアミノ酸配列の比較は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびＣＳＦ１ＲのＤ４のＥＦループ領域中に同一の配列モチーフが存在することを示しており（図２１）、類似の塩橋もＩＩＩ型ＲＴＫのＤ４間に形成されている証拠を提供している。実際、ＰＤＧＦＲβのＤ４ドメインのＡｒｇ３８５またはＡｓｐ３９０をアラニンによって置換することで、ＰＤＧＦＲβの活性化のＰＤＧＦ刺激が損なわれ、ＷＴ  ＰＤＧＦＲβを発現する細胞においてＰＤＧＦによって刺激される様々な細胞応答の機能障害がもたらされた。Ｋｉｔ構造の分析によって明らかとなったリガンド誘導性のＫｉｔ活性化の機構は、すべてのＩＩＩ型ＲＴＫの活性化に当てはまる。Ｄ４ホモタイプ相互作用に関与している配列モチーフと同一である配列モチーフは、ＲＴＫのＶＥＧＦＲファミリー（ＩＶ型）の３つすべてのメンバーの膜近位の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）のＥＦループ中でも同定されている。Ｋｉｔおよび他のＩＩＩ型ＲＴＫ中のホモタイプのＤ４の相互作用の媒介に関与している保存された配列モチーフはＩＶ型ＲＴＫのＤ７ドメイン中に位置するが、ＶＥＧＦＲのＤ７は、ＩＶ型ＲＴＫの膜近位領域間のホモタイプ相互作用の媒介においてＤ４と同様の役割を果たす可能性が高い。実際、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインの構造の電子顕微鏡分析により、ＶＥＧＦと結合したＶＥＧＦＲ２の二量体中のＤ７間の直接接触が明らかとなっている（Ｒｕｃｈ，  Ｃ．ら（２００７年）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４巻、２４９〜２５０頁）。膜近位のＩｇ様ドメイン間の直接接触は、ＩＩＩ型およびＩＶ型ＲＴＫのどちらにもよっても用いられている一般的な機構を表す。
【０４５４】
様々な受容体変異体を探求した研究、またはＫｉｔ（Ｂｌｅｃｈｍａｎら（１９９５年）  Ｃｅｌｌ  ８０巻、１０３〜１１３頁）、ＰＤＧＦ受容体（Ｍｉｙａｚａｗａ，  Ｋ．ら（１９９８年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻、２５４９５〜２５５０２頁）および他のＩＩＩ型ＲＴＫの個々のＩｇ様ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた研究は、Ｋｉｔが一価ＳＣＦリガンドによって刺激される場合にも、Ｄ４が受容体の二量体化の媒介において役割を果たすことを提案している（Ｌｅｖ，  Ｓ．ら（１９９２年）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７巻、１５９７０〜１５９７７頁）。しかし、ＳＣＦ結合のマイクロ熱量測定（ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）および最初の３個のＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）または５個すべてのＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）のどちらかから構成されるＫｉｔの精製した細胞外ドメインに対するＳＣＦの化学量論を用いた定量分析により、Ｄ４およびＤ５がＫｉｔの二量体化のＳＣＦ刺激に不要であることが示されている。言い換えれば、これらの報告は、Ｋｉｔの二量体化は、Ｋｉｔと結合するＳＣＦの二量体性質によって主に駆動されることを示している（Ｌｅｍｍｏｎ，  Ｍ．  Ａ．ら（１９９７年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻、６３１１〜６３１７頁）。
【０４５５】
しかし、本明細書中に提示する研究は、隣接する受容体間のホモタイプのＤ４の（およびホモタイプのＤ５も）相互作用は、受容体の二量体化において役割を果たすのではなく、チロシンキナーゼの活性化をもたらす、２つの受容体の膜近位領域の、その細胞質ドメイン間の相互作用を可能にする距離および配向での正確な配置に必要であることを示している。したがって、部分、たとえば本発明のモノクローナル抗体は、受容体の二量体化を妨害するのではなく、チロシンキナーゼの活性化に必須の距離および配向での細胞質ドメインの配置に必要な、ＩＩＩ型ＲＴＫの膜近位領域間において重要なホモタイプ相互作用を妨げることによって、受容体の活性化に対するその阻害効果を発揮する。
【０４５６】
本明細書中に提示した実験は、ＰＤＧＦＲβ、Ｋｉｔおよび他のＩＩＩ型ＲＴＫの二量体化はリガンド結合によって完全に駆動されており、リガンド結合の唯一の役割は、細胞膜中のその局所濃度を増加させるために２つの受容体分子を架橋結合することであることを示している。ホモタイプのＤ４の相互作用の媒介に関与している２つの塩橋（３６０Å２の埋没表面積の境界領域を有する）は、リガンドに媒介される受容体の二量体化の支持なしでは受容体の相互作用を支持するためには弱すぎ、これは、Ｋｉｔの場合は様々な強力な相互作用によって媒介されており、全埋没表面積はそれぞれのＳＣＦプロトマーについて２０６０Å２である。細胞１個あたり２０，０００個の受容体を発現する刺激していない細胞の、細胞膜中の受容体の見かけの濃度は、約１〜３μΜであると推定されている（Ｋｌｅｉｎ，  Ｐ．ら（２００４年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１巻、９２９〜９３４頁、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ，  Ｓ．  （１９４３年）  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １５巻、１頁）。ＳＣＦなどの二量体リガンドと結合する際、２つの占有された受容体は７５Åの距離で一緒に保たれる。これらの条件下では、最近傍手法に対して平均距離を使用して計算した、細胞膜中の見かけの受容体濃度は、２桁より多く増加して、４〜６×１０−４Ｍとなる。この計算は、２つの塩橋によって媒介されるものなどの、１０−４〜１０−５Ｍの範囲の解離定数を有する弱い相互作用さえも、２つの隣接する受容体の膜近位領域間の会合および直接接触を媒介できることを示している。細胞膜中の高い局所濃度が、Ｄ４およびＤ５を受容体分子の残りの部分と接続する接合部の柔軟性とあいまって、受容体の膜近位領域を正確な配向および距離（Ｋｉｔの場合は１５Å）に配置する、ホモタイプのＤ４ならびにホモタイプのＤ５の接触の移動および形成を可能にし、これは、隣接する細胞質ドメイン間の相互作用、チロシン自己リン酸化、およびチロシンキナーゼ活性の刺激を可能にする。
【０４５７】
最後に、刺激していないまたはＰＤＧＦで刺激した細胞上のＷＴまたは変異体受容体を共有結合的に架橋結合させるために化学的架橋剤を適用することにより、Ｅ３９０Ａ  ＰＤＧＦＲβ変異体がＷＴ受容体のＰＤＧＦ誘導性の二量体化に類似のＰＤＧＦ誘導性の二量体化を受けることが、本明細書中で示されている。しかし、ＰＤＧＦで刺激した細胞の細胞表面上で活性化された二量体の形態で発現されるＷＴ  ＰＤＧＦＲβとは対照的に、Ｅ３９０Ａ変異体は、ＰＤＧＦで刺激した細胞の表面上で不活性の二量体の形態で発現される。この実験は、ホモタイプのＤ４−Ｄ４相互作用はＰＤＧＦＲβの二量体化に不要であり、ＰＤＧＦＲβの二量体化は受容体の活性化に必要であるが十分ではないことを示している。
【０４５８】
（実施例２６）
Ｄ４−Ｄ４境界領域の破壊は、腫瘍発生性ＫＩＴの活性化を克服する
野生型（ＷＴ）ＫＩＴ、Ｄ５のＡｌａ５０２およびＴｙｒ５０３が重複している腫瘍発生性ＫＩＴ変異体（Ｄ５−反復変異体）、またはＤ５のＡｌａ５０２およびＴｙｒ５０３が重複しており（Ｄ５−反復）、かつＤ４のＧｌｕ３８６がＡｌａ残基によって置換されている追加の点変異を有するＫＩＴ変異体（Ｄ５−反復／Ｅ３８６Ａ変異体）を安定に発現するマウス３Ｔ３細胞を、１、５または１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで５分間、３７℃で刺激した。
【０４５９】
刺激していないかまたはＳＣＦで刺激した細胞の溶解物を、抗ＫＩＴ抗体を用いた免疫沈降、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｋｉｔまたは抗ホスホチロシン（抗ｐＹ）抗体のどちらかを用いた免疫ブロッティングに供した。
【０４６０】
図２７中に提示する実験は、野生型ＫＩＴへのＳＣＦ刺激が、ＳＣＦ刺激に応答した、ＫＩＴの増強されたチロシン自己リン酸化によって明らかとなるＫＩＴの活性化の増強をもたらすことを示している。また、この実験は、ＫＩＴの腫瘍発生性のＤ５−反復変異体が構成的にチロシン自己リン酸化されている（すなわちＳＣＦ刺激の非存在で活性化される）ことも示す。対照的に、Ｄ４中に追加の点変異（正常な受容体タンパク質のバックグラウンドにおいてＫＩＴのＳＣＦ活性化を損なわせることが示されている）を保有するＤ５−反復／Ｅ３８６Ａ変異体は、腫瘍発生性のＤ５−反復変異によって媒介されるＫＩＴの構成的なチロシン自己リン酸化を遮断する。
【０４６１】
この実験は、Ｄ５中の腫瘍発生性変異および恐らくはＫＩＴ分子の様々な一部分中の他の腫瘍発生性変異によるＫＩＴの活性化の媒介における、Ｄ４−Ｄ４ホモタイプ相互作用の重要性についての遺伝的な妥当性確認を提供する。さらに、この実験は、本発明の部分、たとえば、抗体もしくはその抗原結合性一部分、小分子またはペプチド性分子による薬理学的介入によるＤ４−Ｄ４境界領域の破壊が、Ｄ５中の腫瘍発生性変異、ＫＩＴ分子の他の一部分中の腫瘍発生性変異ならびに腫瘍発生性ＩＩＩ型およびＩＶ型ＲＴＫの活性を遮断するという考えに対する、さらなる妥当性確認を提供する。
【０４６２】
（実施例２７）
Ｄ４ホモタイプ相互作用の媒介に関与するＫＩＴの特徴的なモチーフに対応する合成ペプチドに向けられた抗体はインタクトなＫＩＴタンパク質を認識する
本実施例では、３つの異なるＫＩＴ抗原に対するウサギポリクローナル抗体を産生させた：
【０４６３】
１．ヒトＫＩＴの完全長細胞外ドメイン（アミノ酸１〜５１０）。
２．アミノ酸３０８〜４１１から構成されるＫＩＴのＩｇ様ドメイン４（Ｄ４）（ＫＩＴ−Ｄ４）
３．ＫＬＨとコンジュゲートした、ＫＩＴのＤ４の特徴的なモチーフ（ＳＥＬＨＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴＹＴ）を含めたアミノ酸３７５〜３９１に対応する１７ｍｅｒペプチド。
【０４６４】
ウサギを２週間間隔で３つの抗原のそれぞれを用いて免疫化し、試験採血を分析した。提示した結果は、３回目の免疫化の後に収集した血清試料からのものである。
【０４６５】
野生型ヒトＫＩＴを発現する３Ｔ３細胞の溶解物を、以下の抗体のうちの１つを含有する３０μｌの血清と共にインキュベートした：１．完全長ＫＩＴの細胞外ドメインに向けられた抗ＫＩＴ。２．ＫＩＴ−Ｄ４に向けられた抗Ｄ４、および３．ＫＩＴのＤ４のアミノ酸３７５〜３９１に対応するペプチドに向けられた抗ペプチド。野生型ＫＩＴを発現する３Ｔ３細胞の溶解物を、抗体のそれぞれと共に、プロテインＡセファロースと一緒に２時間、４℃でインキュベートし、その後、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および５％のグリセロールを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースに移し、図２８に記載のように抗体のそれぞれを用いて免疫ブロットした。図２８中に提示したデータは、ＫＩＴの二量体をその活性化された立体配置に配置するために必須のＤ４のホモタイプ相互作用領域に向けられた抗ペプチド抗体を含めた抗体のそれぞれが、実験の免疫沈降および免疫ブロットステップにおいてインタクトなネイティブＫＩＴを認識することを示している。
【０４６６】
意外なことに、この実験は、抗ペプチド抗体が、ＫＩＴのインタクトな細胞外またはＤ４領域に向けられた抗体と同じ効率で野生型ＫＩＴを認識することを示している。
【０４６７】
（実施例２８）
細胞外の膜近位ドメイン間の直接接触がＶＥＧＦ受容体活性化および細胞シグナル伝達に必要である
ＳＣＦと複合体形成したＫＩＴの細胞外領域の構造分析により、ホモタイプの受容体接触の形成ならびにリガンド誘導性のＫＩＴ活性化および細胞シグナル伝達に関与している第４のＩｇ様ドメイン（Ｄ４）のＥＦ−ループ中の配列モチーフが明らかとなった。同一のモチーフがＶＥＧＦＲ１、２および３の最も膜近位の第７のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）中で同定された。本実施例は、Ｄ７中の重要な残基（Ａｒｇ７２６またはＡｓｐ７３１）中に変異を保有するＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２を介したリガンド誘導性のチロシン自己リン酸化および細胞シグナル伝達が強く損なわれていることを示している。また、ＶＥＧＦＲ２のＤ７の結晶構造が２．７Åの分解能まで記載されている。この構造は、ホモタイプのＤ７接触が、一方のプロトマーのＡｒｇ７２６と他方のプロトマーのＡｓｐ７３１との間に形成された塩橋およびファンデルワールス接触によって媒介されることを示している。Ｄ７二量体の構造は、ＳＣＦと複合体形成したＫＩＴ細胞外領域の結晶構造で見られるＤ４二量体の構造に非常に類似している。２つの構造中のＥＦループおよび塩橋の位置はほぼ同一であり、そのＣ末端間の距離はどちらの構造中でも約１５Åである。構造および機能の両方におけるＶＥＧＦＲのＤ７とＫＩＴのＤ４との間の高い類似度は、ＩＩＩ型ＲＴＫおよびＶ型ＲＴＫの先祖の起源が共通であることのさらなる証拠を提供する。また、これはＲＴＫの活性化の保存的な機構および病理学的に活性化されたＲＴＫの薬理学的介入の新規標的も明らかにする。
【０４６８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの３つのメンバーと結合してそれを活性化することによって、血管およびリンパ管の発生および恒常性を調節する（Ｏｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、７巻（５号）：３５９〜３７１頁（２００６年））。ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）は、Ｖ型ＲＴＫのメンバーであり、これは、７個のＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ７）から構成される大きな細胞外領域、１個の膜貫通（ＴＭ）ヘリックス、ならびにチロシンキナーゼ活性および追加の調節配列を有する細胞質領域を含有するファミリーである。ＶＥＧＦＲ外部ドメインの第２および第３のＩｇ様ドメイン、Ｄ２およびＤ３は、ＶＥＧＦサイトカインファミリーの５個のメンバー（すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ））の結合部位として機能する（Ｂａｒｌｅｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻（１６号）：１０３８２〜１０３８８頁（１９９７年）、およびＳｈｉｎｋａｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７３巻（４７号）：３１２８３〜３１２８８頁（１９９８年））。これらの増殖因子は、共有結合されたホモ二量体である。それぞれのプロトマーは、４本のストランドのβ−シートから構成され、これは、逆平行の様式において構造に構成されており、システインノット増殖因子と命名されている（Ｗｅｉｓｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、９１巻（５号）：６９５〜７０４頁（１９９７年））。システインノットサイトカインファミリーの他のメンバーには、神経増殖因子（ＮＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が含まれる。しかし、ＰＤＧＦＲ  ＲＴＫ（ＩＩＩ型）ファミリーの外部ドメインは５個のＩｇ様反復から構成されており、そのうちのＤ１、Ｄ２、およびＤ３は、ＰＤＧＦＲならびにファミリーの他のメンバー（すなわち、ＫＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、およびＦｌｔ３）のリガンド結合領域として機能する。構造的および生化学的実験により、細胞外領域とのＳＣＦ結合がＫＩＴの二量体化を誘導し、このステップには、隣接するＫＩＴ分子の２つの膜近位Ｉｇ様ドメインＤ４およびＤ５のホモタイプ接触が続くことが示されている（Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、１３０巻（２号）：３２３〜３３４頁（２００７年））。野生型および腫瘍発生性ＫＩＴ変異体の生化学的研究は、ホモタイプのＤ４およびＤ５の接触が、ＫＩＴの二量体の細胞質領域を、トランス自己リン酸化、キナーゼ活性化および細胞シグナル伝達を促進する距離および配向で配置することにおいて重要な役割を果たすことを示している。
【０４６９】
本実施例では、構造的および生化学的な証拠は、ＶＥＧＦ受容体の外部ドメインの最も膜近位のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）間のホモタイプ接触が、ＶＥＧＦ受容体を介したＶＥＧＦ誘導性の活性化および細胞シグナル伝達において重要な役割を果たすことを示している。
【０４７０】
ＶＥＧＦＲ２のＤ４およびＤ７の配列解析
Ｉｇ様ドメイン間のホモタイプ接触の媒介に関与している進化的に保存された配列モチーフ（Ｌ／ＩｘＲΦｘｘｘＤ／ＥｘＧ）は、ＫＩＴのＤ４の構造に基づく配列アラインメントによって同定された（Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、１３０巻（２号）：３２３〜３３４頁（２００７年））。同様のモチーフがＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＣＳＦ１ＲのＤ４ならびにＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の最も膜近位のＩｇ様ドメイン（Ｄ７）中で見つかった（図２９）。Ｌ／ＩｘＲΦｘｘｘＤ／ＥｘＧモチーフはＤ７のβΕストランドおよびβＦストランドを連結するループ領域に位置しており、これは、ホモタイプのＤ４のＫＩＴ接触に必要な塩橋の媒介に関与していると示されている領域である。ＡｒｇおよびＡｓｐは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方においてウニからヒトまで進化的に保存されており（図２９）、ＶＥＧＦＲ活性におけるこれらの残基の機能的重要性を示している。しかし、ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲのＤ４とは対照的に、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のＤ７は、位置Ｂ５およびＦ５に、βストランド間のジスルフィド結合を形成する２つの保存的なシステイン残基を含有し、この相互作用は、ＩセットのＩｇ様ドメインの疎水性コアに寄与する（ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２３８巻（４号）：５２８〜５３９頁（１９９４年））。
【０４７１】
ＰＤＧＦＲおよびＫＩＴのＤ４と同様、ＶＥＧＦＲ２のＤ４は、位置Ｂ５およびＦ５でのβストランド間のジスルフィド結合の形成に関与している保存されたシステインを欠く。ＶＥＧＦＲ２のＤ４では、βＣをβΕと接続する領域は、他の典型的なＩセットＩｇドメインと比較してより短く、これは、この領域がβストランドのうちの１本を欠いていることが原因の可能性がある。アミノ酸配列分析により、ＶＥＧＦＲ２のＤ４がミオメシンドメインＤ１３（２Ｒ１５）およびテロキン（１ＴＬＫ）と相同的であり、配列同一性はそれぞれ３０％および３３％であることが示された。手動の配列アラインメントにより、ＶＥＧＦＲ２のＤ４とＰＤＧＦＲαのＤ４との間に２０％の配列同一性が明らかとなった。ＫＩＴのＤ４およびＰＤＧＦＲのＤ４はどちらも、Ｄ／Ｅ−ｘ−Ｇ／Ａ／Ｄ−ｘ−Ｙ−ｘ−ＣモチーフからなるβＦ中の「Ｙ−コーナーモチーフ」の周りに保存された「Ｄ／Ｅ−ｘ−Ｇ」アミノ酸を含有する（Ｈｅｍｍｉｎｇｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、３巻（１１号）：１９２７〜１９３７頁（１９９４年））（Ｄ４中で、Ｃｙｓ残基は疎水性アミノ酸によって置き換えられている）。Ｄ４中で、１つの分子上のＧｌｕ残基と第２のＫＩＴ分子の−５位のＡｒｇ残基との間に塩橋が形成されている（図２９Ｂ）。Ａｓｐ残基がＶＥＧＦＲ２のＤ４中に見つかるが、−５位のＡｒｇの代わりに、このＩｇ様ドメインは、Ａｓｐ残基に対して−２および−６の位置に逆の荷電を有する一対のアミノ酸を含有する（図２９Ｂ）。Ｄ４間の直接接触がＶＥＧＦＲ２の外部ドメインのＶＥＧＦ−Ａ誘導性の二量体の電子顕微鏡観察（ＥＭ）画像で観察されているが（Ｒｕｃｈら、Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１４巻（３号）：２４９〜２５０頁（２００７年））、ＶＥＧＦＲ２のＤ４の機能は未だ不明確である。したがって、Ｄ７は、ＶＥＧＦＲ２のＤ４よりも、ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲのＤ４中の対応する配列とＥＦループ領域が類似している。
【０４７２】
ホモタイプのＤ７接触がリガンド誘導性のＶＥＧＦＲ２の活性化に必須である
この配列解析およびＫＩＴとの比較により、ＶＥＧＦＲ２の残基Ｒ７２６およびＤ７３１は受容体間の塩橋形成を媒介することができ、リガンドに対する応答を変更し得ることが示唆される。リガンド誘導性のＶＥＧＦＲ２の活性化およびシグナル伝達におけるＤ７領域中の保存的な残基の役割を調査するために、Ａｒｇ７２６、Ａｓｐ７３１または両方のアミノ酸をＡｌａ残基によって置き換えた（Ｒ７２６Ａ、Ｄ７３１ＡおよびＲＤ２Ａ）ＶＥＧＦＲ２変異体を作製した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴ  ＶＥＧＦＲ２またはＤ７の変異を保有するＶＥＧＦＲ２の発現を指示するｐＣＤＮＡ３発現ベクターで一過的にトランスフェクションした。２４時間のインキュベーションの後、トランスフェクションした細胞を終夜欠乏状態にした後にＶＥＧＦ−Ａ刺激を行った。刺激していないかまたはＶＥＧＦ−Ａで刺激したかまたは刺激していない細胞のＶＥＧＦＲ２のチロシン自己リン酸化およびＭＡＰＫの応答を、それぞれ抗ホスホチロシン抗体（抗ｐＴｙｒ）または抗ホスホ（ｐｈｏｓｈｏ）−ＭＡＰＫ抗体を使用して分析した。図３０Ａは、受容体間の塩橋形成の媒介に関与していると予測されるＡｒｇまたはＧｌｕ残基の変異がＶＥＧＦ−Ａ誘導性のＶＥＧＦＲ２の自己リン酸化およびＭＡＰＫ刺激を顕著に低下させたことを示す。
【０４７３】
ＶＥＧＦＲ２の比較的弱いキナーゼ活性を克服するために、キメラ受容体手法を用いた（Ｆａｍｂｒｏｕｇｈら、Ｃｅｌｌ、９７巻（６号）：７２７〜７４１頁（１９９９年）およびＭｅｙｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８１巻（２号）：８６７〜８７５頁（２００６年））。ＰＤＧＦＲの膜貫通および細胞質領域（アミノ酸５２８〜１１０６）と接続されたＶＥＧＦＲ２の外部ドメイン（アミノ酸１〜７６１）から構成されるキメラ受容体を調製し、ＶＥＧＦ−Ａ誘導性のＶＥＧＦＲ２の活性化におけるＤ７によって果たされる役割をさらに調査するために使用した。キメラＶＥＧＦＲ２／ＰＤＧＦＲまたはＤ７の変異を保有するキメラＶＥＧＦＲ２／ＰＤＧＦＲを安定に発現するＶＥＧＦ−Ａで刺激したかまたは刺激していないＮＩＨ−３Ｔ３細胞からの溶解物を、抗ＰＤＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、次いで、抗ｐＴｙｒ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。図３０Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ刺激に応答したキメラＶＥＧＦＲ２／ＰＤＧＦＲの堅調なチロシン自己リン酸化を示している（図３０Ｂ、ＷＴ）。対照的に、Ｄ７の変異（Ｒ７２６Ａ、Ｄ７３１Ａ、ＲＤ２Ａ）を保有するキメラ受容体のＶＥＧＦ−Ａ誘導性のチロシン自己リン酸化は強く損なわれた（図３０Ｂ）。また、ＰＤＧＦＲのＴＭおよび細胞内領域と融合したＶＥＧＦＲ１の細胞外領域から構成されるキメラ受容体も作製した。野生型キメラ受容体を安定に発現する３Ｔ３細胞は、リガンド刺激に応答した自己リン酸化を示した（図３０Ｃ、ＷＴ）。対照的に、キナーゼ活性のリガンド誘導性の刺激は、Ａｒｇ７２０、Ａｓｐ７２５または両方のアミノ酸中に変異を保有するキメラ受容体、それぞれＲ７２０Ａ、Ｄ７２５ＡおよびＲＤ２Ａを発現する３Ｔ３細胞中で強く損なわれた（図３０Ｃ）。前述のデータは、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫの膜近位のＩｇ様ドメイン間のホモタイプ接触がリガンド誘導性の受容体活性化および細胞シグナル伝達に必須であることを示している。
【０４７４】
共有結合性架橋結合剤を利用して、リガンドで刺激した細胞の架橋結合、次いでリガンドで刺激したかまたは刺激していない細胞からの溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、リガンド誘導性の受容体の二量体化に対するＤ７の変異の効果を調査した（たとえばＣｏｃｈｅｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻（７号）：３２９０〜３２９５頁（１９８８年）を参照）。この実験により、キメラ受容体のＶＥＧＦ−Ａ誘導性の二量体化がＤ７の変異によって影響を受けなかったことが示された（データ示さず）。ＰＤＧＦＲおよびＫＩＴの以前の報告と同様（Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、１３０巻（２号）：３２３〜３３４頁（２００７年）およびＹａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５（２２０巻：７６８１〜７６８６頁（２００８年））、Ｄ７に媒介されるホモタイプ接触は受容体の活性化に必要であるが、受容体の二量体化には必要ではない。さらに、リガンド誘導性の受容体の二量体化は、チロシン自己リン酸化および受容体の活性化に必要であるが十分ではない。対照的に、Ｄ３９２Ａ変異またはＡｓｐ３８７およびＡｒｇ３９１がどちらもＡｌａ残基によって置換された変異（ＤＲ２Ａ）を含めた、ＶＥＧＦＲ２のＤ４中の変異を保有するキメラ受容体のＶＥＧＦ−Ａ誘導性のチロシン自己リン酸化は変わらないまま保たれ（図３０Ｄ）、これは、異なる境界領域がＶＥＧＦ−Ａ誘導性のＶＥＧＦＲ２外部ドメインの二量体のＥＭ画像で見られたＤ４相互作用の媒介に関与している可能性があることを示している（Ｒｕｃｈら、Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１４巻（３号）：２４９〜２５０頁（２００７年））。
【０４７５】
分析用遠心分離を利用して、単離されたＤ７領域の二量体化の解離定数を決定した。４×１０−５、８×１０−５および１．６×１０−４Ｍのタンパク質濃度を使用して行った分析用遠心分離実験は、単離されたＤ７が１０−４Ｍもの高い濃度の溶液中で単量体のまま保たれたことを示し、Ｄ７の二量体化の解離定数が１０−４Ｍを超えることを示している。同様の高い解離定数が、ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲの単離されたＤ４またはＤ５の二量体化について判明した。ＳＣＦまたはＰＤＧＦ誘導性の二量体化の後、細胞膜中の２つの隣接するＫＩＴまたはＰＤＧＦＲプロトマーの局所濃度は４〜６×１０−４Ｍの範囲であることが、以前に示されている。このことは、低下した次元性と共に、細胞膜中で低い親和性で互いに結合するＩｇ様ドメインの対間の効率的な側方相互作用および安定なホモタイプ接触の形成を可能にする。さらに、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫ中の膜近位のＩｇ様ドメイン間のホモタイプ接触は、隣接する受容体のＴＭおよび細胞質領域の間で協力的な様式で起こるさらなる側方相互作用によって支持されている。
【０４７６】
ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインＤ７の構造
リガンド誘導性のＶＥＧＦＲ２の活性化においてＤ７によって果たされる役割の根底にある分子基盤を決定するために、このＩｇ様ドメインの結晶構造を決定した。結晶が空間群Ｉ２１２１２１で得られ、１個のＤ７分子／非対称単位および２８個の水分子であった。Ｄ７の構造はＶＥＧＦＲ２のアミノ酸６６７〜７５６からなり、Ｘ線を２．７Åの分解能まで回析する。構造は、テロキン（ＰＤＢコード：１ＴＬＫ）の構造に基づいたモデルを用いた分子置換によって決定した（Ｈｏｌｄｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻（３号）：８４０〜８５１頁（１９９２年））。複合体中のＤ７の２つのコピーは互いに非常に類似しており、ｒ．ｍ．ｓ．偏差は０．１Åである。Ｄ７は、１つ目はストランドＡ、Ｂ、ＤおよびＥを含み、２つ目はストランドＡ’、Ｇ、ＦおよびＣを含む、２つの４本のストランドのシートによって形成されたβ−サンドイッチからなる典型的なＩｇＳＦの折り畳みをとる。受容体チロシンキナーゼＭｕＳＫの細胞外領域からのＩｇ様ドメインＩｇ１およびＩｇ２の構造と同様に、Ａストランドの最初の半分はＢストランドと水素結合を形成し、Ａ’ストランドはＧストランドと水素結合を形成する（Ｓｔｉｅｇｌｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３６４巻（３号）：４２４〜４３３頁（２００６年））。ストランドβΕとβＦとの間のクロスオーバー接続には、残基７２９〜７３１での単一のヘリックスターンが含まれる。ＶＥＧＦＲ２のＤ７は、βΒのＣｙｓ６８８とβＦのＣｙｓ７３７との間の保存的なジスルフィド結合、およびジスルフィド結合に対して充填されて疎水性コアを形成する特徴的なトリプトファン残基を含めた、ＩｇＳＦの折り畳みのいくつかの特徴を示す。ＤＡＬＩ（Ｈｏｌｍら、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第５章、ユニット５  ５（２００６年））を使用した構造比較は、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインのうち、とりわけＤ７がテロキン（ＰＤＢコード：１ＴＬＫ）に最も類似していることを示し（Ｈｏｌｄｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２２７巻（３号）：８４０〜８５１頁（１９９２年））、８９個のアラインメントしたＣβ残基について１３．４のＺスコアおよび１．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．である。Ｄ７は、Ｉセットを定義するＶ−フレームプロフィール中の２０個の主要な位置のうちの１６個を含有する（ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２３８巻（４号）：５２８〜５３９頁（１９９４年））。追加の露出された交差ストランドジスルフィド結合は、βＦ（Ｃｙｓ７４０）およびβＧ（Ｃｙｓ７４５）中に位置するＣｙｓの対によって形成される。この特長は、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３中では高度に保存されているが、ＶＥＧＦＲ１中ではそうではない。
【０４７７】
結晶構造は、ホモタイプのＤ７接触がそれぞれのプロトマーのＤ７のＡＢＥＤストランドによって形成された２つのβシートによって媒介されており、一方のプロトマーのＡｒｇ７２６が他方のＡｓｐ７３１に向かっており、約３６０Ａ２の埋没表面積をもたらすことを示している。図３１Ｂは、Ａｒｇ７２６およびＡｓｐ７３１が塩橋およびファンデルワールス接触を形成することを示す。Ｄ７二量体の構造は、ＫＩＴの細胞外二量体構造（ＰＤＢコード：２Ｅ９Ｗ）で見られるホモタイプのＤ４接触に非常に類似している（Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、１３０巻（２号）：３２３〜３３４頁（２００７年））。さらに、ＶＥＧＦＲ２のＤ７は静電場の強力な分極を示しており、Ｄ７−Ｄ７境界領域に沿った正荷電の中心分離帯を例外として全体的に負荷電の表面である（図３１Ｃ）。強力に荷電した境界領域は、リガンド刺激の前の単量体受容体分子の異常な会合を防止し得る。
【０４７８】
ＤＡＬＩ（Ｈｏｌｍら、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第５章、ユニット５  ５（２００６年））を使用したＫＩＴのＤ４の構造とＶＥＧＦＲ２のＤ７の構造との比較は顕著な類似度を示し、８３個のアラインメントしたＣα残基について１０．４のＺスコアおよび１．８Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であった。２つの構造中のＥＦループの位置はほぼ同一であり、Ｃ末端間の距離はＤ４およびＤ７の二量体構造のどちらについても約１５Åである（図３３）。構造および機能の両方におけるＶＥＧＦＲのＤ７とＫＩＴのＤ４との間の高い類似度は、ＲＴＫの活性化の十分に保存された機構を示唆しており、ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫの先祖の起源が共通であるさらなる証拠を提供する。興味深いことに、ショウジョウバエ（Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ、１０８巻（６号）：８６５〜８７６頁（２００２年））、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６巻（２４号）：１３６０３〜１３６１０頁（１９９９年））、ホヤ（Ｓａｔｏｕら、Ｄｅｖ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．、２１３巻（５〜６号）：２５４〜２６３頁（２００３年））およびウニ（Ｄｕｌｏｑｕｉｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３４巻（１２号）：２２９３〜２３０２頁（２００７年））のゲノムは、その細胞外領域中に７個のＩｇ様ドメインを含有する、単一のＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様ＲＴＫのファミリーを含有する。ＩＩＩ型およびＶ型ＲＴＫ遺伝子は、脊椎動物において機能的に分離されたが、染色体中で互いに隣接して位置する（Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、３８３巻（１０号）：１５７３〜１５７９頁（２００２年）およびＧｒａｓｓｏｔら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、２３巻（６号）：１２３２〜１２４１頁（２００６年））。ヒトでは、クラスＩＩＩおよびクラスＶのＲＴＫの遺伝子は、染色体上の３つのクラスター、４ｑ１２（ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲαおよびＶＥＧＦＲ２）、５ｑ３３（ＦＭＳ、ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦＲ３）ならびに１３ｑ１２（ＦＬＴ３およびＶＥＧＦＲ１）中に見つかる。クラスＩＩＩおよびクラスＶのＲＴＫの系統発生は、これら８個のＲＴＫが２回のシス複製および２回のトランス複製によって生じたことを示唆している（Ｇｒａｓｓｏｔら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、２３巻（６号）：１２３２〜１２４１頁（２００６年））。また、ＥＦ−ループ領域中の高度に保存されたモチーフも、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの２つのＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様受容体遺伝子であるＶＥＲ３およびＶＥＲ４のＤ７中で同定されている。同様のモチーフがウニのＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様受容体のＤ７中で見つかっているが、ショウジョウバエのＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様受容体中では見つかっていない。興味深いことに、ホヤのＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様受容体の１０個のＩｇ様ドメインのうちの３個が典型的なＥＦ−ループモチーフを含有する。ＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ様ホヤ受容体のＤ３、Ｄ６およびＤ９の間のホモタイプ接触が、その細胞外領域中に１０個のＩｇ様ドメインを含有するＲＴＫのリガンド誘導性の活性化に必要であり得る。
【０４７９】
本実施例中に提示した実験は、ＩＩＩ型ＲＴＫおよびＶ型ＲＴＫが、共通の機構によって活性化されることを示しており、この共通の機構において、膜近位のＩｇ様ドメインによって媒介されたホモタイプ接触は、２つの受容体単量体のＴＭおよび細胞質領域を近接させて正しい配向にさせて、効率的なトランス自己リン酸化、キナーゼ活性化および細胞シグナル伝達を可能にすることを確実にする。リガンド誘導性の受容体の二量体化と膜近位のＩｇ様ドメイン間の複数の低親和性のホモタイプの会合との組合せが、リガンド誘導性の膜貫通シグナル伝達の単純であるが効率的な機構を提供する。さらに、個々のＩｇ様ドメインの互いに対する低い結合親和性が、リガンド結合の前の、受容体単量体の偶然の受容体の活性化を防止する。ホモタイプ接触領域は、病理的ＲＴＫの活性化および細胞シグナル伝達の薬理学的介入の理想的な標的を提供する。
【０４８０】
ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のＤ７領域の近接エピトープ
構造に基づく配列アラインメントを行った。このアラインメントにより、本発明の部分によって認識され得るＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のＤ７領域上の潜在的な近接エピトープが明らかとなった（表８）。エピトープは、ストランドＢ、Ｄ、Ｅ、Ａ’Ｂループ、ＣＤループ、ＤＥループおよびＥＦループ中に位置する。これらのエピトープは、ホモタイプのＤ７接触を媒介する境界領域中に位置する。
【０４８１】
【表８】
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実施例２８の材料および方法
１．タンパク質の発現、精製および結晶化
Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグを含有するＶＥＧＦＲ２のＤ７（アミノ酸６５７〜７６５）を、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で、ＰＥＴ２８ａベクターを使用して発現させた。封入体を収集し、６Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ８．０）中に可溶化させた。Ｄ７は、タンパク質を１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２ｍＭの還元グルタチオンおよび０．２ｍＭの酸化グルタチオンを含有する再折り畳み緩衝液中に、８０〜１００μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度まで滴下して希釈することによって、再折り畳みさせた。再折り畳みは４℃で４８時間、撹拌しながら実施した。０．４５μｍのフィルターユニットを使用した濾過によって再折り畳み溶液を清澄化し、ＦａｓｔＱセファロースカラム、次いでサイズ排除（Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。トロンビン消化によってＮ末端の６×Ｈｉｓタグを除去した。Ｄ７タンパク質を、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）および２００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中で１５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化および最適化のための広範囲なスクリーニングに供した（Ｈａｍｐｔｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、結晶スクリーニング）。３００×７５×２０μΜの適切な寸法の外部ドメインＤ７の結晶を、０．２Ｍのコハク酸および１６％のＰＥＧ３３５０中、４℃で成長させた。すべての結晶を、５〜１８％のグリセロールを補充したリザーバ溶液に数秒間浸し、フラッシュ冷却し、データ収集の間１００Ｋの窒素ガス流中に保った。結晶はＩ２１２１２１空間群に属しており、単位格子の寸法は、ａ＝３９．４７６Å、ｂ＝７６．９９１Å、およびｃ＝１０２．０３４Åであり、１個の分子／非対称単位であった。回折データは、ＮＳＬＳ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＸ２９Ａビームラインで、ＡＤＳＤ  ｑｕａｎｔｕｍ−２１０ＣＣＤ検出器を用いて２．７Åの分解能まで収集された。すべてのデータ組は、ＨＫＬ２０００プログラムパッケージを使用して処理およびスケーリングした（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７６巻（パートＡ）：３０７〜３２６頁（１９９７年））。データ収集の統計量は表７中に要約されている。構造は、Ｐｈａｓｅｒを用いて、ＭＵＳＫ（２ＩＥＰ）（Ｓｔｉｅｇｌｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３６４巻（３号）：４２４〜４３３頁（２００６年））、テロキン（１ＴＬＫ）（Ｈｏｌｄｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻（３号）：８４０〜８５１頁（１９９２年））およびＫＩＴのＤ４（２Ｅ９Ｗ）（Ｙｕｚａｗａら、Ｃｅｌｌ、１３０巻（２号）：３２３〜３４４頁（２００７年））からのＩｇドメインの構造に基づいたモデルを検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。結晶学的Ｒ因子２２．７％および自由Ｒ因子２７．７％を用いて構造を２．７Åの分解能まで精密化した（表７）。ＶＥＧＦＲ２のＤ７の原子座標をタンパク質データバンクに受託コードＸＸＸで寄託した。分子像はＰｙｍｏｌおよびＣＣＰ４ＭＧソフトウェア（Ｐｏｔｔｅｒｔｏｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６０巻（パート１２パート１）：２２８８〜２２９４頁（２００４年））を使用して生成した。
【０４８２】
【表７】
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２．アミノ酸配列アラインメント
ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアミノ酸Ｄ７の配列アラインメントを行い（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２（２２０巻：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））、その後、２０種の主要な残基についてのＩセットＩｇＳＦの折り畳みの制約に基づいて手動で調節した。ヒトＶＥＧＦＲのアミノ酸配列を、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して非重複データベース（ｎｒ）を相同配列について検索するためのクエリとして使用した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁（１９９０年））。アミノ酸配列のアラインメントおよびＤ７のＰＤＢファイルをＣｏｎｓｕｒｆ３．０サーバーに供して（Ｌａｎｄａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（ウェブサーバー号）、Ｗ２９９〜３０２頁（２００５年））、アラインメントのそれぞれの位置の最大尤度の正規化された進化率を生成し、ここで、低い発散率が高い配列保存に対応する。Ｃｏｎｓｕｒｆの出力と同様、連続的な９個の保存スコアは、可視化のために、ビン９が最も保存的な（えび茶色）位置を含有し、ビン１が最も可変性（シアン色）の位置を含有するように、９個のビンの別々のスケールに分配されている。
【０４８３】
３．ＶＥＧＦＲ発現ベクターおよびキメラ受容体の作製
ヒトＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のｃＤＮＡはＭａｓａｂｕｍｉ  Ｓｈｉｂｕｙａ博士によって提供していただいた（Ｓａｗａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、９７巻（３号）：７８５〜７９１頁（２００１年））。ＶＥＧＦＲ２のｃＤＮＡをＰＣＲおよびＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位内への挿入によってｐｃＤＡＮ３発現ベクター内にサブクローニングした。ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のどちらかの細胞外領域から構成されるキメラ受容体をＰＤＧＦＲ−βの膜貫通および細胞質領域と融合させた。ｆｌａｇタグをＣ末端に付加し、キメラ受容体をｐＬＸＳＨＤレトロウイルス発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。
【０４８４】
４．細胞系および発現ベクター
ＶＥＧＦＲ１／２−ＰＤＧＦＲキメラ受容体を安定に発現する３Ｔ３細胞系を、以前に記載されているようにレトロウイルス感染によって作製した（Ｙｕｚａｗａら、２００７年およびＣｏｃｈｅｔら、１９８８年）。細胞をＬ−ヒスチジノールで選択し、同様の発現レベルに関して適合したプールを実験に使用した。
【０４８５】
ＨＥＫ２９３細胞を１μｇのＤＮＡで一過的にトランスフェクションし、ＶＥＧＦ刺激の前に終夜血清欠乏させた。細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで処理し、細胞溶解物をＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２に対する抗体で免疫沈降させ、次いで抗ｐＴｙｒ抗体（ＰＹ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて免疫ブロットした。全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、それぞれ抗ホスホＭＡＰＫおよび抗ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた免疫ブロットに供した。
【０４８６】
ＶＥＧＦは、以前に記載されているように、ｓｆ９細胞中でバキュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１を使用して産生させた（Ｃｏｈｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、７巻（２号）：１３１〜１３８頁（１９９２年））。ＶＥＧＦは、ヘパリンセファロースビーズを使用して、クーマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ実験によって＞８０％の純度まで精製した。
【０４８７】
５．分析用超遠心分離
沈降速度実験は、高分子アセンブリ分析用超遠心分離センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）（生化学学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、テキサス大学健康科学センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）、テキサス州Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）のＢｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉを用いて行った。２５ｍＭのトリス、ｐＨ８および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中の４×１０−５Ｍ、８×１０−５Ｍ、および１．６×１０−４Ｍの濃度のＤ７タンパク質を、５０，０００ｒｐｍで２０℃の遠心分離に供した。速度データは、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ分析と組み合わせた二次元スペクトル分析を用いて分析した。
【０４８８】
均等物
当業者は、日常的な実験を使用して、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することも、確認することもできるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2013515776.tif 000025
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
2013515776.tif 000028
【図２Ｂ】
2013515776.tif 000029
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2013515776.tif 000031
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2013515776.tif 000033
【図４Ａ】
2013515776.tif 000034
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2013515776.tif 000038
【図６Ａ】
2013515776.tif 000039
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図９】
2013515776.tif 000043
【図１１Ａ】
2013515776.tif 000044
【図１１Ｂ】
2013515776.tif 000045
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１７Ａ】
2013515776.tif 000050
【図１７Ｂ】
2013515776.tif 000051
【図１８Ａ】
2013515776.tif 000052
【図１８Ｂ】
2013515776.tif 000053
【図１９Ｂ】
2013515776.tif 000054
【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
2013515776.tif 000056
【図２０Ｂ】
2013515776.tif 000057
【図２１Ｂ】
2013515776.tif 000058
【図２３】
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【図３１Ａ】
2013515776.tif 000060
【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
2013515776.tif 000063
【図３Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2013515776.tif 000068
【図８Ｂ】
2013515776.tif 000069
【図１０】
2013515776.tif 000070
【図１３】
2013515776.tif 000071
【図１４】
2013515776.tif 000072
【図１５】
2013515776.tif 000073
【図１６】
2013515776.tif 000074
【図１９Ａ】
2013515776.tif 000075
【図２１Ａ】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2013515776.tif 000081
【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
2013515776000001.app
【国際調査報告】
2013515776.tif 000089
2013515776.tif 000090
2013515776.tif 000091