(57)【要約】相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、より大きな治療効果を達成するための増加した生物活性と、増大した薬理学的特性とを提供する生体分子の持続性のｉｎ  ｖｉｖｏで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2013536199.tif 000027
又は
【化２】
2013536199.tif 000028
を含む相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートであって、
Ｍは生物活性分子であり、ｘは生体分子に共役した開裂可能−連結ポリマーの数で、ｘ≧１であり、ｎはｎ≧２であり、Ｐはポリマー又はポリマー脂質であり、Ｐｎは多数のポリマー性のアーム又は部分（ｐｉｅｃｅｓ）であり、これらのタイプ及びサイズは同一又は異なってもよく、Ｌは、少なくとも１つの開裂可能な連結及び少なくとも１つの持続性の連結を含む機能連関部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、若しくは、Ｌｎは全て放出可能な結合であり、Ｒはポリマーと生体分子との間に接続した開裂不可能なスペーサーであり、Ｃは生体分子に結合できる共役基であることを特徴とする、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
コンジュゲート化ポリマーは、持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩａ）であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３】
コンジュゲート化ポリマーは、全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４】
コンジュゲート化ポリマーは、持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項５】
コンジュゲート化ポリマーは、全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項６】
前記持続性の連結は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、ウレア、エーテル、ウレタン、スルフィド、チオウレア、チオカルバメート、チオカルバミド及びジチオカルバメートからなる群から選択され、前記放出可能な結合連結は、カルボン酸エステル、カーボネート、スルホン酸エステル、リン酸エステル、アシルイミダゾ、カルバメート−イミダゾ及びジスルフィドの連結からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項７】
前記開裂可能な連結は、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で分解可能、ｐＨで誘導される加水分解可能、ｐＨで誘導される自己開裂可能、生理学的に開裂可能、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質で誘導される開裂可能、生化学反応で誘導される開裂可能又は化学的に開裂可能であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項８】
前記酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ及びスルファターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリマー性のアーム又は部分（ｐｉｅｃｅｓ）のＰｎは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、メトキシ−ポリエチレングリコール、アルキルキャップ化ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチル化グリコール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、及び、これらのコポリマー、ブロックポリマー、ターポリマー及び混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｐが、約５０から約４０，０００までの範囲の分子量を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１１】
約５０００から約４０，０００までの範囲の分子量を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする、請求項１０に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｃは、活性エステル、混合化無水物、アルキルアルデヒド、芳香族アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される共役部分（ｍｏｉｅｔｙ）であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１３】
前記活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトフェニルエステル、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、アクリルイミダゾ又はトリクロロフェニルカーボネートからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｒは、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、非タンパク質のアミノ酸は、ホモシステイン、ホモセリン又はオルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１５】
前記ｎは２（ｎ＝２）であり、前記タイプＩの相乗性開裂可能−分枝状ポリマーコンジュゲートは、
【化３】
2013536199.tif 000029
を含み、持続性−開裂可能−連結のアーム２つの分枝状ポリマー（タイプＩａ）に対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結であり、全部−開裂可能−連結のアーム２つの分枝状ポリマー（タイプＩｂ）に対して、Ｌ1及びＬ2の両方は開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１６】
前記ｎは２（ｎ＝２）であり、前記タイプＩＩの相乗性開裂可能−直鎖状ポリマーコンジュゲートは、
【化４】
2013536199.tif 000030
を含み、持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩａ）に対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結であり、全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩｂ）に対して、Ｌ1及びＬ2の両方は開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１７】
Ｐ1及びＰ2は、メトキシポリ（エチレングルコール）であり、Ｒは、
【化５】
2013536199.tif 000031
又は
【化６】
2013536199.tif 000032
によって示される構造を有するメトキシポリ（エチレングルコール）と接続したリジンであり、ａ結合は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、チオカルバメート、チオカルバミド、ウレタン及び及びジチオカルバメートからなる群から選択される持続性の連結であり、ａ結合は、α又はε−アミノ基のいずれかに結合され、ｂ結合は、カルボン酸エステル、カーボネート、及び、カルボキシ−イミダゾからなる群から選択される開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１８】
遊離のアミノは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトフェニルエステル、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、アシルイミダゾ、アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される活性化部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むスペーサーをさらに接続することを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項１９】
ｍＰＥＧ−ＯＨ又はｍＰＥＧ誘導体を用い、活性化、共役及びアシル化の操作を介してカルボキシル基に形成される開裂可能な連結と、ｍＰＥＧ求電子誘導体でのアシル化、共役及び縮合を介するアミノ基に形成される持続性の連結と、スペーサー部分（ｍｏｉｅｔｙ）の挿入及び活性化と、及び、開裂可能−持続性−混合型連結の合成のために用いれる保護、脱保護の操作とを含む、持続性−開裂可能−連結のポリマー、全部−開裂可能−連結のポリマー、及び、非対称の分枝状アームのポリマーを調製するために用いられることを特徴とする、合成方法。
【請求項２０】
前記持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体は、Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート；  ２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル）ε−スベリン酸スクシンイミジル、化合物５を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２１】
前記持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体は、Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、アミド；  ２０Ｋ  ｍＰＥＧ、エステル）ε−スベリン酸スクシンイミジル、化合物６を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２２】
前記持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体は、Ｌｙｓ（ｓ−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート；  ２０Ｋ  ｍＰＥＧ、エステル）α−スベリン酸スクシンイミジル、化合物７を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２３】
前記持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体は、Ｌｙｓ（ε−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、アミド；  ２０Ｋ  ｍＰＥＧ、エステル）α−スベリン酸スクシンイミジル、化合物８であることを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２４】
前記持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体は、３−マレイミドプロピオニルＬｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル、化合物９であることを特徴とする、請求項１７に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２５】
前記コンジュゲートは、１つの成分又は多くの成分からなる混合物であることができ、Ｍは、これらに限定されない、タンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、１本鎖抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ホルモン、神経伝達物質、炭水化物、二糖、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド、薬物、及び、低分子からなる群である、生体分子であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２６】
Ｍは、サイトカイン、エポエチンアルファ、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エタネルセプト、インターフェロン、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンアルファコン１、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、インターフェロンγ−１ｂ、インターロイキン、ＴＮＦ−α、インシュリン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラコシダーゼ、レテラプス（ｒｅｔｅｌａｐｓｅ）、ラスブリカーゼ、ラロニダーゼ、オプレルベキン、ドルナーゼα、コラゲナーゼ、アニストレプラーゼ、アガルシダーゼ、成長因子、ヘモグロビン、血液凝固因子、血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ及びＩＸなどからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２７】
前記Ｍは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン  ガンマ−１ｂ、及び、インターフェロン−λ（インターフェロンラムダ）を含むインターフェロンであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２８】
前記Ｍは、インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン−α−１、インターフェロンアルファコン−１及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン―αであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項２９】
前記Ｍはインターフェロン−α−２ｂであり、Ｒは、請求項１７に記載された構造のリジンであり、Ｐ１及びＰ２はｍＰＥＧであり、それぞれは約５０から４０，０００までの範囲の分子量を有し、Ｌ１結合は、アミド、カルバメート又はアミンの連結であり、Ｌ２結合は、カルボン酸エステル又はカーボネートの連結であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３０】
前記Ｍはサイトカインであり、Ｒは、請求項１７に記載された構造のリジンであり、Ｐ１及びＰ２はｍＰＥＧであり、それぞれは約５０から４０，０００までの範囲の分子量を有し、Ｌ１結合は、アミド、カルバメート又はアミンの連結であり、Ｌ２結合は、カルボン酸エステル又はカーボネートの連結であることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３１】
活性化部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する前記リジンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトフェニルエステル、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及び、アシルイミダゾの部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９又は３０のいずれかに記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３２】
活性化部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有するリジンは、特定のタンパク質のＮ末端のコンジュゲート化のためにアルキル又は芳香族アルデヒドから選択されることを特徴とする、請求項２９又は３０のいずれかに記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３３】
１つの要素、ｘ＝１を含むことを特徴とする、相乗性インターフェロンα−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）ε−スベリン酸コンジュゲート。
【請求項３４】
コンジュゲートは、ｘ＝１ないし２又はｘ＝１ないし３の組成を有する混合物を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の相乗性インターフェロンα−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）ε−スベリン酸コンジュゲート。
【請求項３５】
インターフェロンαがインターフェロンα−２ｂであることを特徴とする、請求項３３又は３４のいずれかに記載の相乗性インターフェロンα−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲート。
【請求項３６】
より大きな治療効果を達成するために、増加した生物活性と、増大した薬理学的特性とを提供する、持続性の、ｉｎ  ｖｉｖｏで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果生体分子薬物送達システムであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３７】
増加した、着実な、及び、持続した抗ウイルス活性を達成のために、増加したインターフェロン活性と、増大した薬理学的特性とを提供するためのインターフェロンαの、持続性の、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムであることを特徴とする、請求項３３に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３８】
前記Ｍは、サイトカイン又はインターロイキンであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項３９】
前記Ｍは、血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ及びＩＸであることを特徴とする、請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート。
【請求項４０】
請求項１に記載の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートの有効量の、それを必要とする被験者への投与を含むことを特徴とする、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適な治療効果を達成するために、送達される生体分子の、相乗的に増大したｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性、及び、改良した薬動力学的（ＰＫ）及び薬物動態学的（ＰＤ）な特性を提供するための、生物活性分子に持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結のポリマーを結合して製造される新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートに関する。前記相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの大の生体分子−ポリマーコンジュゲートと、小の生体分子−ポリマーコンジュゲートとのＰＫ及びＰＤの特性のメリットを統合する。さらに、本発明は新規の相乗性インターフェロン−α−ポリマー（相乗効果−ＩＮＦ−α−ポリマー）コンジュゲートに関し、より大きなインターフェロン−α関連治療を達成するために、増加した生物活性と、増大した薬理学的特性とを提供する、インターフェロンの、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素で制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。
【０００２】
「ペグ化」と呼ばれる生物活性分子へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共役は、生物活性分子、たいていタンパク質及び低分子の送達で用いられる。このプロセスの少なくとも１つのメリットは、前記生物活性分子の薬動力学的（ＰＫ）及び薬物動態学的（ＰＤ）な特性を変更すること、及び、前記生物活性分子の治療効果を改善することである。ペグ化は、タンパク質及び低分子のサイズ及び分子量を増加し、血漿中での半減期の延長をもたらす。一般的に、ペグ化は、タンパク質及び治療用分子の物理化学的特性を変える場合があり、親タンパク質及び治療用有機分子の生物活性の低下をもたらす。したがって、最大の治療効果を達成するために、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートのＰＫ及びＰＤの特性を最適化することが望ましい。
【０００３】
直鎖状及び分枝状のＰＥＧポリマーを含む従来技術では生物活性分子にＰＥＧを共有結合することが達成されている。非常に多くの場合、生物活性分子のアミノ基が結合部位として利用される。Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによる米国特許出願２００３０１９０３０４号はペグ化試薬を記載する。Ｈａｒｒｉｓらによる米国特許７，０３０，２７８号は、近位の反応基を有する特定のＰＥＧ誘導体を記載する。特定の非抗原性分枝状ポリマーコンジュゲートが、Ｍａｒｔｉｎｅｚらによる米国特許第５，６４３，５７５号に記載される。特定の多数のアームを有する（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍｅｄ）ＰＥＧポリマーが、Ｈｕａｎｇらによる米国特許出願２００５００３３０５８号に記載される。ポリペプチドを修飾するための特定の活性カーボネートが、Ｚａｌｉｐｓｋｙによる米国特許５，１２２，６１４号に記載される。コンジュゲート化のための安定な（持続性の）直鎖状ＰＥＧポリマーを利用するインターフェロンポリマーコンジュゲートが、Ｇｉｌｂｅｒｔらによる米国特許５，７１１，９４４号に記載される。コンジュゲート化のための安定な分枝状ＰＥＧポリマーを利用するインターフェロンポリマーコンジュゲートが、Ｍｉｌｔｏｎらによる米国特許５，９３２，４６２号に記載される。
【０００４】
５０，０００ダルトンよりも小さな分子量のタンパク質の薬物は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで短寿命種であり、約５−２０分間の循環半減期を有する。タンパク質のクリアランスは、腎臓での糸状体浸潤、受容体で仲介されるエンドサイトーシス、及び、末梢組織による分解、及び、組織表面又は血清プロテアーゼでのタンパク質分解を含むいくつかのメカニズムを通じて生じる。タンパク質の薬物が経口で吸収されないことを考慮すると、循環での治療用活性薬物の長期維持が、第１の臨床的重要性の望ましい特徴である。しかしながら、この条件は、低分子量のペプチド及びタンパク質薬物の単回投与後にめったに達成されない。従来技術に記載された前記目的を達成するための少なくとも１つの戦略は、前記生体分子をペグ化することである。しかしながら、従来技術のペグ化方法論の難点は、従来の持続性の分枝状又は直鎖状のＰＥＧ化合物によってペグ化されるタンパク質の生物活性を消失することである。生物活性の前記消失は、関心のある生物活性タンパク質に結合されている大きいＰＥＧポリマーによって作り出された立体障害が原因である。例えば、インタフェロン−αのコンジュゲート化に対して、持続性の分枝状ＰＥＧを用いるペガシス（Ｐｅｇａｓｙｓ）又は直鎖状ＰＥＧを用いるペグ−イントロン（Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ）のようなペグ化インターフェロンは、それぞれ、非修飾型のインターフェロンα−２ａ及びインターフェロンα−２ｂの７及び２８％の特異的抗ウイルス活性を有するのみである。多くの治療用タンパク質に対して、生物活性の顕著な消失が、ペグ化の治療適用をしばしば限定する貧弱なＰＫ−ＰＤプロファイルをもたらすことができる。ＰＥＧの数及びサイズは、タンパク質の生物活性、薬動力学的及び薬物動態学的な特性で顕著な影響を有する。
【０００５】
従来技術で答えのないままであるもう１つの問題は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療薬物の有効性を持続するポリマー性連結の制御される分解を可能にすることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に短寿命のタンパク質の半減期を延長するかどうか、したがって、臨床成果を改善するかどうかである。上記のことから、これらの欠点を克服する生体分子−ポリマーコンジュゲートを持つことが望ましい。本発明は従来技術の欠点を改善する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の少なくと１つの態様は、新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ）を提供し、それらは、開裂可能な連結を介して分枝状又は直鎖状のポリマーに共有結合した生体分子である。本明細書で用いられるところの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるとき、コンジュゲート化されていない生体分子の対応物と比較して、又は、その代替として、開裂不可能な連結を介して同一のポリマーにコンジュゲートされる生体分子と比較して、生体分子の、増大した生物活性と、改善した薬理学的特性とを提供する持続性の（ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ）、制御された持続的放出及び／又はハイブリッド相乗効果システムである。
【０００７】
本発明の少なくとも１つの態様は、式Ｉ又はＩＩを有する相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートに関し、
【化１】
2013536199.tif 000002
又は
【化２】
2013536199.tif 000003
Ｍは生物活性分子であり、
ｘは生体分子に共役した開裂可能なポリマーの数で、ｘ≧１あり、
ｎはｎ≧２であり、
Ｐは、ポリマー又はポリマー脂質であり、
Ｐnは、タイプ及びサイズが同一又は異なってもよい多数のポリマー性のアーム又は部分（ｐｉｅｃｅｓ）であり、
Ｌは、少なくとも１つの開裂可能な連結及び少なくとも１つの持続性の連結を含む機能連関部分（ｍｏｉｅｔｙ）であるか、若しくはＬnは放出可能な連結であり、及び、
Ｒは、ポリマーと生体分子と間に接続された開裂不可能なスペーサーであり、
Ｃは、生体分子に結合可能な共役基である。
【０００８】
本発明の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、少なくとも４タイプのコンジュゲート、すなわち、タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ及びＩＩｂの生体分子−ポリマーコンジュゲートを含む。タイプＩａの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、分枝状ポリマー間に持続性−開裂可能−連結を含む。タイプＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、分枝状ポリマー内に全部−開裂可能−連結を含む。タイプＩＩａは、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、直鎖状ポリマー間に持続性−開裂可能−連結を含む。タイプＩＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、直鎖状ポリマー間に全部−開裂可能−連結を含む。
【０００９】
したがって、本発明の相乗性バイオコンジュゲートで用いられる、現在、開示された新規の持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結は、構成内に分枝状又は直鎖状のいずれかのポリマーを含むことができる。タイプＩは、分枝状の開裂可能な連結ポリマーであり、タイプＩＩは、直鎖状の開裂可能な連結ポリマーである。本明細書で用いられるところの開裂可能な連結は、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で開裂可能、又は、ｐＨ−依存型の加水分解可能な連結を含む。
【００１０】
タイプＩの分枝状の開裂可能な連結ポリマーは、持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩａ）及び全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩｂ）を含む。タイプＩＩの直鎖状の開裂可能な連結のポリマーは、持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩａ）及び全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩｂ）を含む。本明細書で用いられるところの持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマーは、開裂可能及び持続性の両方の連結を含み、Ｌnの連結は開裂可能−持続性−混合型−連結である。全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマーは開裂可能な連結のみを含み、Ｌnの連結は開裂可能な連結のみである。
【００１１】
血漿及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでは、持続性−開裂可能−連結のポリマータイプＩａ又はタイプＩＩａの相乗性バイオコンジュゲートは、酵素反応を介して、より小さなサイズの生物活性ポリマー−スペーサー−生体分子断片及びポリマーを含むより小さな部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）に開裂され、変換される。
【００１２】
血漿及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでは、全部−開裂可能−連結のポリマータイプＩｂ又はタイプＩＩｂの相乗性バイオコンジュゲートは、酵素反応を介して、より小さなサイズの生体分子−スペーサー断片及びポリマーを含むより小さな部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）に分解される。
【００１３】
本発明の少なくとも１つのメリットは、本発明のバイオコンジュゲートが、生物活性を発揮するための適切な立体的特徴を有するだけでなく、身体から容易に排泄されるか、若しくは除去される部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）に開裂される、多数の生物活性断片に分解されることである。対照的に、従来技術の従来のタンパク質コンジュゲートは、前記ポリマーが血漿中に安定的に留まり、結果として、分解不可能なポリマー性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の全身毒性及び望ましくない組織蓄積を増幅するように、ポリマー性アームを連結している持続性の連結を介して連結される分枝状ポリマーである。
【００１４】
本発明のもう１つの実施態様は、以下の式ＩＩＩで検討され、ここで、式ＩＩの構造内でｎ＝２である。したがって、相乗性生体分子−分枝状ポリマーコンジュゲートは、以下の構造を有する前記式ＩＩＩによって示される。
【化３】
2013536199.tif 000004
【００１５】
したがって、タイプＩａの持続性−開裂可能−連結（混合型−持続性−開裂可能−連結）の分枝状ポリマーに対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結である。
【００１６】
タイプＩｂの全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマーに対して、Ｌ1及びＬ2の両方は前記開裂可能な連結である。
【００１７】
式Ｉによる少なくとももう１つの実施態様は、ｎ＝２のとき、式ＩＶを有する構造によって示される相乗性生体分子−直鎖状ポリマーコンジュゲートである。
【化４】
2013536199.tif 000005
【００１８】
したがって、タイプＩＩａの持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマーに対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結である。
【００１９】
タイプＩＩｂの全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマーに対して、Ｌ1及びＬ2の両方は前記開裂可能な連結である。
【００２０】
新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（相乗効果バイオポリマー）は、生体分子−ポリマーコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。前記相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏの酵素反応を介して、より小さなサイズだが、より活性の高い生体分子−ポリマー断片（又は生体分子−スペーサー）コンジュゲートにゆっくりと分解される。前記相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート、及び、放出された生体分子−ポリマー断片（又は生体分子−スペーサー）コンジュゲートから生成された、増大した複合生物活性が、生体分子関連治療のための薬物相乗作用を提供する。本発明の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、最適な治療効果を達成するための生体分子の増大した薬動力学的（ＰＫ）及び薬物動態学的（ＰＤ）な特性をさらに提供する独特な生体分子の送達システムである。
【００２１】
本発明の主要なメリットの１つは、大きい生体分子−ポリマー、及び、放出されたより小さな生体分子−ポリマーコンジュゲートからの複合生物活性を通じて、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートがｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリッド相乗効果生物活性を生成できることである。それとは異なり、コンジュゲートが、血漿でポリマー性アームを放出しないように、つまり一定の生物活性を有するように、従来の分枝状ポリマー−生体分子コンジュゲートは持続性のポリマー性連結のみを含む。
【００２２】
本発明の少なくとももう１つのメリットは、有益な治療効果のための生体分子−ポリマーコンジュゲートの総合的なＰＫ−ＰＤプロファイルを最大化するために、大きい生体分子−ポリマーコンジュゲートのＰＫ特性と、小さい生体分子−ポリマー（又は生体分子−スペーサー）コンジュゲートのＰＤ特性とのメリットを統合する独特な相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートということである。
【００２３】
さらなるメリットは、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｖｏでかさばったポリマーを放出することによって、生体分子−ポリマーのサイズを低下するための連結開裂メカニズムを提供すること、つまり、毒性を低下することである。相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、血友病に対しての第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子などのような予防的治療のための従来のタンパク質−ポリマーを超えるメリットを提供する。
【００２４】
新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、血漿で増加した、着実な、及び、持続した生体分子薬物活性を達成するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのハイブリッド相乗効果生物活性及び薬理学的な特性を提供する。つまり、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、従来のポリマーコンジュゲートを超える十分な利益を提供する。
【００２５】
本発明のもう１つの態様は、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートを調製する方法を提供する。本発明のこの態様では、相乗性生体分子コンジュゲートを調製するために、上述の持続性−開裂可能−連結及び全部−開裂可能−連結のポリマーを合成する方法が記載される。もう１つの実施態様では、また、リンカーポリマーを事前に合成するための方法が記載される。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、相乗性インターフェロン−αポリマーコンジュゲート（相乗効果ＩＦＮ−αポリマーコンジュゲート）を生成するために、持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマーをインターフェロン−αに連結することに関する。新規の相乗効果インターフェロン−αポリマーコンジュゲートは、酵素反応を介してｉｎ  ｖｉｖｏで部分的なポリマー性アームを放出し、より小さいが、より高い活性のインターフェロン−αポリマーコンジュゲートに変換し、増加したインターフェロン複合生物活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な複合特性とを生じる。
【００２７】
従来のインターフェロン−α−ポリマーコンジュゲートと異なり、本発明の新規の相乗性インターフェロン−α−ポリマー（相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマー）コンジュゲートは、大きなインターフェロン−α−ポリマーコンジュゲートと、小さなインターフェロン−α−ポリマーコンジュゲートとを組み合わせた最適の薬理学的な特性をｉｎ  ｖｉｖｏで供給する、インターフェロン−αのｉｎ  ｖｉｖｏで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマーコンジュゲートは、血漿で増大した、着実な及び持続的な抗ウイルス活性を達成するために、より長いＴ1/2を有する大きいインターフェロン−α−ポリマーと、より高い生物活性を有する小さいインターフェロン−α−ポリマーとの利点を統合する。臨床的に、前記相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマーは、治療に関連したインターフェロン−αのための投与量、投与頻度、又は、疾患治療期間のその後の減少でも、より大きなウイルス学的応答の持続を実現することをもたらすことができる。したがって、前記相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマーコンジュゲートは、従来のペグ化インターフェロン−αコンジュゲートを超える顕著な臨床的メリットを提供することができる。
【００２８】
発明の詳細な説明
生体分子前駆体（Ｐｒｏｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＰＥＧコンジュゲートの発明は、米国特許出願番号１２／３０２，２３８号で言及され、その内容はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。持続性−開裂可能−連結（また、混合型−持続性−開裂可能−連結として本明細書で言及する）又は全部−開裂可能−連結の分枝状又は直鎖状のポリマーは、同一の特許出願に記載される連結を含む。本発明の少なくとも１つの態様は、開示について、ＰＫ及びＰＤの特性を増大することによって達成した、請求項に記載のリンカーによって提供したｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性の予期しない増加である。生体分子の送達に対しての従来技術の欠点の１つは、ペプチド及びタンパク質の化合物が血漿半減期が非常に短いことである。一般的に、前記短い血漿半減期は、体循環期間で生じる酵素分解と同様に、速い腎クリアランスに起因する。
【００２９】
血漿半減期を延長し、同時に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療タンパク質の効果を改善するための戦略を提供するとは予想されれない。前記予想外の観察は、請求項に記載の化合物及び構造のＰＫ及びＰＤ間で得られた重要なバランス（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｂａｌａｎｃｅ）を達成することに起因する。
【００３０】
本発明の少なくとも１つの態様は、最大のＰＫ−ＰＤプロファイルを提供できる即座に開示される構造である。結合親和性の低下によって生じる効能の低下が、延長された血漿循環時間によって生じた全体的な全身曝露の増加によって補われるように、持続性のタンパク質−ＰＥＧ連結によって提供される延長血漿半減期の特徴を統合したタンパク質−ＰＥＧ連結の持続的、かつ、遅延性の開裂がタンパク質の薬物のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を変えることを本発明は開示する。したがって、本発明は、開示されたコンジュゲートのＰＫ−ＰＤプロファイルを調和することによって関心とする生体分子の治療上の利益を総合的に増強することを開示する。この成果は、前記予測不可能な技術で前もって決して気付かない、予想外の治療上の利益を提供する。
【００３１】
タンパク質のコンジュゲート化のための、分枝状の持続性−連結（ＰＥＧ２、ＵＰＥＧ、Ｙ字型）又は直鎖状の持続性−連結のＰＥＧリンカー（ＳＣ−ＰＥＧなど）を利用する従来技術に記載された従来のペグ化方法論と異なり、本発明は、持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結を介して生物活性分子に結合した分枝状又は直鎖状のポリマーリンカーを含む相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートの４タイプを提供する。これらのコンジュゲートは、持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプ１ａ）、及び、全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩｂ）、及び、持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（タイプＩＩａ）、及び、全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマー（ＩＩｂ）と接続した生体分子を含む。
【００３２】
本発明は相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートを提供し、それらは開裂可能−連結ポリマー（タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ）に共有結合した生体分子である。相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、送達される治療剤のために、増大した生物活性と、改善した薬理学的特性とを提供するｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性の持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。
【００３３】
有機化学及びプロドラッグ科学の当業者は、持続性の（又は安定的な）連結が、共有結合及びｉｎ  ｖｉｖｏで分解不可能な共有結合であることを十分に理解するであろう。言い換えれば、これらは、血漿で容易に開裂しない加水分解不可能な連結である。しかし、放出可能な（又は開裂可能な）連結は、血漿で加水分解可能又は分解可能な連結としてみなされる。
【００３４】
本明細書で用いられるところの、持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結における開裂可能−連結とは、ｉｎ  ｖｉｖｏのとき、連結が開裂されるように連結する結合をいう。前記連結は、血漿で開裂可能な、酵素で分解可能な、ｐＨで誘導される加水分解可能な、ｐＨで誘導される自己開裂可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質で誘導される開裂可能な、生化学反応で誘導される開裂可能な又は化学的に開裂可能なものを含む。
【００３５】
開裂可能−連結ポリマーリンカーを結合することから生成される新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、上述のような以下の式Ｉ及びＩＩに対応する、本発明の少なくとも１つの開裂可能な連結を含むことができる。
【化５】
2013536199.tif 000006
又は
【化６】
2013536199.tif 000007
【００３６】
Ｍは生物活性分子であり、ｘはｘ≧１の数であり、ｎはｎ≧２として定義される数であり、Ｐは、ポリマー又はポリマー脂質であり、Ｐｎは、タイプ及びサイズが同一又は異なってもよい多数のポリマー性のアーム又は部分（ｐｉｅｃｅｓ）であり、Ｌは、ポリマーとスペーサーとの間で接続した機能的な連結か、若しくはポリマー間の連結であり、そして、Ｌは、少なくとも１つの開裂可能な連結及び少なくとも１つの持続性の連結を含む、機能連関部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、若しくはＬｎは全部−開裂可能−連結であり、Ｒは、ポリマーと生体分子との間で接続した開裂不可能な化合物又はスペーサー部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、そして、Ｒは、タイプＩの分枝状ポリマーのためにＰに連結するための少なくとも２つの官能基を有し、Ｃは生体分子に結合可能な共役基である。もう１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１つの持続性の連結及び少なくとも１つの放出可能な連結を有するための連結部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む、上述の式Ｉ及びＩＩを必要とする。
【００３７】
相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートのために用いられるポリマーは、好ましくは、水溶性である。前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオキシエチル化ポリオールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、これらのコポリマー、ブロックポリマー、ターポリマー及び混合物を含むが、これらに限定されない。また、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のようなアルキル末端を含むポリアルキレンオキシドが含まれる。
【００３８】
ポリアルキレンオキシドホモポリマーに加えて、ポリエチレンイミン、デキストラン、ＰＥＧ−脂質、ポリマー脂質、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ポリマー及び類似の種類のポリマーのような他のポリマーを用いることができる。
【００３９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、特に好ましいポリマーである。ＰＥＧの分子量は、約５０から約４０，０００までの範囲である。５，０００から４０，０００までの範囲の分子量を有するＰＥＧは、タンパク質のコンジュゲート化のために特に有用である。
【００４０】
ポリマーに接続される脂質部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及び、ポリケチド、ステロール脂質、及び、プレノール脂質、リン脂質、及び、セラミドを含むが、これらに限定されない。特に好ましいポリマー脂質は、ＰＥＧ−リン脂質及びＰＥＧ−セラミドである。持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結のポリマー脂質は生物活性分子を有するリポソーム又はナノ粒子を形成するために用いることができる。相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、リポソーム又はナノ粒子であることができる。
【００４１】
スペーサーＲは、化学品、薬物、ペプチド、アミノ酸、非タンパク質のアミノ酸、非タンパク質のアミノ酸誘導体、アミノ酸誘導体、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片、又は、これらの混合物を含むが、これらに限定されない。加えて、タイプＩの分枝状ポリマーのアミノ酸は、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸からなる群から選択される。さらに、タイプＩの分枝状ポリマーの非タンパク質のアミノ酸は、ホモシステイン、ホモセリン又はオルニチンからなる群から選択される。前記スペーサーＲは、他の化学品とさらに接続したアミノ酸又は非タンパク質のアミノ酸であることができる。
【００４２】
本明細書で用いられるところの、開裂可能な連結とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で分解可能、ｐＨ依存性の加水分解可能、ｐＨで誘導される自己開裂可能、生理学的に開裂可能、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質で誘導される開裂可能、生化学反応で誘導される開裂可能又は化学的に開裂可能である。前記開裂可能な連結は、カルボン酸エステル、カーボネート、スルホン酸エステル、リン酸エステル、アシルイミダゾ、カルバメート−イミダゾ及びジスルフィドの群を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿で連結を開裂することに関係する酵素は、加水分解酵素、還元酵素及び酸化酵素を含む。前記酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、プロテアーゼ、ジスルフィドリダクターゼ、ケトリダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ぺルオキシダーゼ、及び、アミンオキシダーゼを含むが、これらに限定されず、エステラーゼ、ホスファターゼ及びスルファターゼが特に好ましい酵素である。カルボン酸エステル及びカーボネートの連結は、エステラーゼ酵素によって開裂される。したがって、本明細書の加水分解可能な酵素という用語は、前記酵素によって分解又は開裂される全ての連結を含む。持続性の連結は、血漿で開裂不可能である。前記持続性の連結は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、ウレア、エーテル、ウレタン、スルフィド、チオウレア、チオカルバメート、チオカルバミド及びジチオカルバメートの基（ｇｒｏｕｐ）を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
Ｃの共役基は、求電子又は求核基を含む。前記求電子基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ｐ−ニトフェニルエステル、スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ウレタンスクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｕｒｅｔｈａｎｅ）、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、カーボネート、イミドエステル、無水物、混合化無水物、マレイミド、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、及び、チオジスルフィド交換試薬（ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）を含むが、これらに限定されない。前記求核官能基は、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド、カルバジン酸塩、アシルヒドラジド、セミカルバメート及びヒドラジンを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
ｘがｘ≧１であるとき、前記Ｃの共役基を介して生物活性分子に結合した開裂可能−連結ポリマーの数は、１つから多数の開裂可能なポリマーまで変更することができる。本発明の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、さまざな数の開裂可能−連結ポリマーを含む生体分子の混合物であることができる。前記混合物は、異なるｘの数を含むコンジュゲートの組み合わせであることができる。例えば、混合物は、生体分子−モノポリマー（ｘ＝１）及び生体分子−ジポリマー（ｘ＝２）の特定の百分率からなる。また、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過、血液透析濾過、透析、遠心分離などのような方法によって所望の数の開裂可能−連結ポリマーのためにさらに精製されることができる。
【００４６】
持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結のポリマーに結合したＭの生物活性分子（生体分子）は、タンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、１本鎖抗体、モノクローナル抗体、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ホルモン、神経伝達物質、炭水化物、糖、二糖、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、アミノ酸、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド、低分子薬物などを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
相乗性生体分子−ＰＥＧのためのＰＥＧの持続性−開裂可能−連結及び全部−開裂可能−連結を適用するための可能性のある生体分子は、サイトカイン、エポエチンアルファ、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エタネルセプト、インターフェロン、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンアルファコン１、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、インターフェロンγ−１ｂ、インターロイキン、ＴＮＦ−α、インシュリン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラコシダーゼ、レテラプス（ｒｅｔｅｌａｐｓｅ）、ラスブリカーゼ、ラロニダーゼ、オプレルベキン、ドルナーゼα、コラゲナーゼ、アニストレプラーゼ、アガルシダーゼ、成長因子、ヘモグロビン、血液凝固因子、血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ及びＩＸなどを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
上述したように、本発明は、分枝状及び直鎖状の開裂可能−連結ポリマーと結合した４タイプの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ）を含む。タイプＩａの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマーを含む。タイプＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマーを含む。タイプＩＩａの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、前記持続性−開裂可能−連結の直鎖状ポリマーを含む。タイプＩＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマーを含む。
【００４９】
例えば、ｎ＝２の場合には、開裂可能−連結の分枝状ポリマー（タイプＩ）と結合した相乗性コンジュゲートは、式ＩＩＩによって表される。
【化７】
2013536199.tif 000008
【００５０】
持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマーと結合したタイプＩａの相乗性コンジュゲートに対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結である。
【００５１】
ｘ＝１の場合には、前記タイプＩａの相乗性コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿で酵素制御分解反応によってＰ1−Ｌ1−Ｒ−Ｃ−Ｍ及びＰ2にゆっくりと変換される。この独特な相乗性生体分子−ポリマーは、酵素分解の結果として形成される大きいサイズの相乗性生体分子−ポリマーと、小さく断片化した生体分子−ポリマーコンジュゲートとを含む、２つの複合活性生体分子−ポリマーコンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで提供する。
【００５２】
全部−開裂可能−連結の分枝状ポリマーと結合したタイプＩｂの相乗性コンジュゲートに対して、Ｌ1及びＬ2の両方は開裂可能な連結である。
【００５３】
ｘ＝１のとき、前記タイプＩｂの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御された反応を介してｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿でＲ−Ｃ−Ｍ、Ｐ1及びＰ2にゆっくりと変換される。この相乗性生体分子−ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子−ポリマーと、小さく断片化した生体分子−スペーサーコンジュゲートとを含む、複合生体分子−ポリマーコンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで提供する。
【００５４】
一般的に、大きい分子サイズの生体分子−ポリマーコンジュゲートは、血漿循環時間がより長いが、生物活性が低い。小さい分子サイズの生体分子のポリマーコンジュゲートは、血漿循環時間がより短いが、生物活性が増加する。
【００５５】
従来の分枝状又は直鎖状のポリマーコンジュゲートと異なり、独特のタイプＩａ（ｎ＝２）又はＩｂ（ｎ＝２）の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、大きな断片化した生体分子−ポリマーコンジュゲートと、小さな断片化した生体分子−ポリマーコンジュゲートとによって生成される２つの生物活性を統合し、したがって、増加した複合生物活性をｉｎ  ｖｉｖｏで提供する。さらに、血漿での生物活性は、大きいサイズの相乗性コンジュゲートから放出された小さいサイズの生体分子−ポリマーコンジュゲートからの生物活性をゆっくりと増加するために持続され得る。
【００５６】
大きい分子サイズの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、薬物吸収、分布、分布体積（Ｖｄ）及び血漿半減期を含む、よりよいＰＫ特性を提供する。相乗性生体分子−ポリマーからの小さい分子サイズの、分解された生体分子−ポリマー又は生体分子−スペーサーコンジュゲートは、より良い薬物動態学的な特性を達成するためのより高い生物活性を有する。したがって、相乗性生体分子−ポリマーは、増大した複合生物活性と、相乗的に改善したバイオコンジュゲートの薬動力学的及び薬物動態学的な特性をｉｎ  ｖｉｖｏで提供するために、大きいサイズの生体分子−ポリマー及び小さいサイズの生体分子−ポリマーのコンジュゲートの多数（ｎ＞２）又は２つ（ｎ＝２）のコンジュゲート性能のメリットを統合する。
【００５７】
ｎ＞２又はｘ＞２に対して、相乗性生体分子−ポリマーは、増加した複合生物活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な複合特性とをｉｎ  ｖｉｖｏで提供するために、大きいサイズの生体分子−ポリマー及び小さいサイズの生体分子−ポリマーのコンジュゲートの多数のコンジュゲート効果のメリットを統合する。本発明によると、本発明のコンジュゲート由来のより小さなＰＥＧポリマーは、それらは結合部位で立体障害をより少なく示すため、天然型と比較してより長い血漿半減期を有し、さらに、標的部位でより有効である。さらに、大きいサイズの生体分子−ＰＥＧコンジュゲート及びより小さなサイズの生体分子−ＰＥＧコンジュゲートの血漿濃度によって示される、調和したＰＫ−ＰＤの関係は、ｉｎ  ｖｉｖｏで総合的な生物活性を増大する。前記柔軟性は、血流の循環に不適当である従来技術のポリマーよりも顕著に優れている。
【００５８】
ｎ＝２の場合に、関裂可能−連結の直鎖状ポリマーと結合した相乗性コンジュゲート（タイプＩＩ）は式ＩＶによって示され、
【化８】
2013536199.tif 000009
Ｐ1及びＰ2は同一又は異なるポリマーのタイプ及びサイズでもよく、Ｌ1の連結は、持続性又は開裂可能な連結であることができ、Ｌ2の連結は開裂可能である。開裂可能なスペーサーは、Ｐ1及びＰ2の間に埋め込まれてもよい。前記開裂可能なスペーサーの化合物は、式Ｉ及びＩＩに記載されるような放出可能な連結Ｌを含む。
【００５９】
持続性−開裂可能−連結の分枝状ポリマーと結合したタイプＩＩａの相乗性コンジュゲートに対して、Ｌ1は持続性の連結であり、Ｌ2は開裂可能な連結である。
【００６０】
ｘ＝１の場合に、タイプＩＩａの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御されるメカニズムを介して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰ1−Ｌ1−Ｒ−Ｃ−Ｍ及びＰ2にゆっくりと変換される。この独特な相乗性生体分子−ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子−ポリマーと、小さく断片化した生体分子−ポリマーコンジュゲートとを含む、２つの活性生体分子−ポリマーコンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで提供する。
【００６１】
全部−開裂可能−連結の直鎖状ポリマーと結合したタイプＩＩｂの相乗性コンジュゲートに対して、Ｌ1及びＬ2の両方は開裂可能な連結である。
【００６２】
ｘ＝１の場合に、タイプＩＩｂの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御される反応を介してｉｎ  ｖｉｖｏでＲ−Ｃ−Ｍ＋Ｐ1＋Ｐ2にゆっくりと変換される。この相乗性生体分子−ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子−ポリマーと、小さい生体分子−スペーサーコンジュゲートとを含む、複合生体分子−ポリマーコンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで提供する。
【００６３】
ｘ＝１及びｎ＝２のとき、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿で、持続性−開裂可能−連結の分枝状又は直鎖状のポリマーを有する相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプ１ａ又はＩＩａ）は、式Ｉ及び式ＩＩのＰ2及びＰ1−Ｌ1−Ｒ−Ｃ−Ｍ断片に分解される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの相乗性コンジュゲートは、大きいサイズの相乗性コンジュゲートと、放出された小さいサイズの生体分子ポリマーとの両方を含むハイブリッド生物活性コンジュゲートであり、したがって、ハイブリッド相乗効果活性と、相乗的で増大したＰＫ及びＰＤの特性とを提供する。
【００６４】
同じ方法で、ｘ＝１及びｎ＝２のとき、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿で、全部−開裂可能−連結の分枝状又は直鎖状のポリマーを有する相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプＩｂ又はＩＩｂ）は、式Ｉ及び式ＩＩのＰ2及びＰ1及びＲ−Ｃ−Ｍ断片に分解される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの前記相乗性コンジュゲートは、大きいサイズの相乗性コンジュゲートと、放出された小さいサイズの生体分子−スペーサーコンジュゲートとの両方を含むハイブリッド生物活性コンジュゲートであり、したがって、ハイブリッド相乗効果活性と、相乗的で増大した薬動力学的及び薬物動態学的的な特性とを提供する。
【００６５】
持続性のポリマーの連結を有する従来の分枝状ポリマーコンジュゲートと対照的に、本発明の独特の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ）は、持続性の同期された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムであり、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿の酵素で制御される様式で薬物相乗作用を提供するためにｉｎ  ｖｉｖｏで前記ハイブリッド活性生体分子を供給する。タイプＩａ及びＩＩａの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、酵素反応を介して血漿でより小さな生体分子−ポリマー断片に変換される。タイプＩｂ及びＩＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、酵素で制御される反応を介して、スペーサーを含む生物活性分子に変換される。新規の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、ｉｎ−ｖｉｖｏでハイブリッド生体分子−ポリマーコンジュゲートから生成した多数の効果を統合し、したがって、増大した複合生物活性と、ＰＫ及びＰＤの相乗効果特性とを提供する。
【００６６】
少なくとも１つの実施態様では、本発明の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏでかさばったポリマーを放出することによって生体分子−ポリマーのサイズを低下させるための開裂可能な連結を提供し、したがって、毒性は低下する。相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、血友病に対しての第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、多発性硬化症に対してのインターフェロン−β、ゴーシェ病及び他の遺伝性疾患に対してのグルコセレブロシダーゼなどのような可能性のある予防的治療のための従来のタンパク質−ポリマーを超えるメリットを提供する。
【００６７】
本発明のもう１つの態様では、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、非経口、経鼻、直腸、経口又は局所のような多くの経路によって投与できる。非経口投与とは、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内の注射又は他の適切な注入手法のいずれかをいう。
【００６８】
本発明のより好ましい実施態様では、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートに結合した開裂可能−連結ポリマーは、以下の明確な特徴を有する。
１．  前記ポリマーは、少なくとも１つの開裂可能な連結及び１つの持続性の連結か、若しくは、全部−開裂可能−連結を含む。
２．  結合したポリマー性の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のサイズは、同程度であるか、若しくは同程度ではない。
３．  結合したポリマー部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のタイプは、同一であるか、若しくは異なる。例えば、ＰＥＧ及びＰＥＩ（ポリエチレンイミン）部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む開裂可能−連結ポリマーは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はＤＮＡの供給のために用いられてもよい。
【００６９】
相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートの構成に対して、本発明は、開裂可能−連結ポリマーのために同一又は異なるタイプ及びサイズのポリマーを用いる選択肢を提供し、したがって、タンパク質のコンジュゲート化を最適化するために、適切な連結、ポリマータイプ及びポリマーサイズを選択することで有意義なメリットを提供する。
【００７０】
ペグ化に対して、ポリエチレングリコールは、コンジュゲート化のために用いられるポリマーである。分枝状のアーム２つのＰＥＧポリマーの持続性−開裂可能−連結を有するタイプＩの相乗性生体分子−ＰＥＧコンジュゲートは、以下の式Ｖとして記載される。
【化９】
2013536199.tif 000010
【００７１】
本式において、ＰＥＧ（Ａ）及びＰＥＧ（Ｂ）のポリマーは、同一又は異なる分子量であってもよい。
【００７２】
タイプＩａの相乗性生体分子−ＰＥＧコンジュゲートに対して、α結合は持続性の連結であり、β結合は開裂可能な連結である。タイプＩａの相乗性生体分子−ＰＥＧは、酵素反応を介してｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は血漿で、より小さな生体分子−スペーサー−ＰＥＧ（Ａ）コンジュゲートにゆっくりと変換される。
【００７３】
タイプＩｂの相乗性生体分子−ＰＥＧに対して、α結合及びβ結合の両方は、血漿で開裂可能な連結である。前記連結は、異なるタイプの放出可能な官能基であることができる。
【００７４】
対称なアームを有する従来の分枝状ＰＥＧリンカーと異なり、本発明は、対称又は非対称の開裂可能な−分枝状の、及び、開裂可能な−持続性の−分枝状のＰＥＧリンカーのいずれかを合成するための方法を提供する。本発明の合成方法論は、タンパク質のコンジュゲート化のための所望の持続性の開裂可能なＰＥＧ及び全部開裂可能なＰＥＧポリマーを合成するために、さまざまな連結及び異なるサイズのＰＥＧポリマーを選択することで有意義なメリットを提供する。加えて、同一の方法論は、所望のポリマー、連結断片及びポリマーサイズのための従来の分枝状ポリマーの合成のために適用できる。
【００７５】
混合型−持続性−開裂可能−連結を含む開裂可能な分枝状ＰＥＧポリマーリンカーはＰＥＧ（Ａ、α；Ｂ、β）として表され、Ａ及びＢはＰＥＧポリマーのサイズを示し、α及びβは連結のタイプである。例えば、Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート；２０Ｋ  ｍＰＥＧ、エステル）スベリン酸スクシンイミジル（化合物５）は、カルバメート、及び、１０ＫＤａ及び２０ＫＤａのＰＥＧポリマーそれぞれと接続したエステルの連結を含む、持続性−放出可能−連結の分枝状の３０ＫＤａのポリマーである。また、ＰＥＧ化合物１０のアスパラギン酸（カルバメート；エステル）及び化合物１１のグルタミン酸（カルバメート；エステル）は、混合型−持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧポリマーである。
【００７６】
タイプＩＩの相乗性生体分子−ＰＥＧは、直鎖状だが、開裂可能なＰＥＧ連結で結合した生体分子である。生体分子に結合したＰＥＧポリマーの数は、１本のポリマー鎖から複数のポリマー鎖に変化できる。２つのＰＥＧポリマーを含む直鎖状のＰＥＧ鎖と接続したタイプＩＩの相乗性生体分子−ＰＥＧの式は以下のように示される。
【化１０】
2013536199.tif 000011
【００７７】
上記式において、ＰＥＧ（Ａ）及びＰＥＧ（Ｂ）は、同一又は異なる分子量であってもよい。スペーサー又は主成分分子（ｂａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が、生体分子及びＰＥＧ（Ａ）の間に埋め込まれる。
【００７８】
タイプＩＩａの相乗性生体分子−ＰＥＧに対して、α結合は持続性の連結であり、β結合は開裂可能な連結である。開裂可能なスペーサーは、ＰＥＧ（Ａ）及びＰＥＧ（Ｂ）の間に埋め込まれてもよい。開裂可能なスペーサー化合物は、式Ｉ及びＩＩで示されるような放出可能な連結Ｌを含む。タイプＩＩａの相乗性生体分子−ＰＥＧは、酵素反応を介して血漿でより小さな生体分子−スペーサー−ＰＥＧ（Ａ）コンジュゲートにゆっくりと変換される。
【００７９】
タイプＩＩｂの相乗性生体分子−ＰＥＧに対して、α結合及びβ結合の両方は、開裂可能な連結である。前記連結は、異なるタイプの開裂可能な連結であることができる。
【００８０】
ＰＥＧ化合物の混合型の機能的な連結は、符号：α、β、γ、σなどで示される。
【００８１】
タイプＩｂ及びタイプＩＩｂの両方の相乗性生体分子−ＰＥＧに対して、生体分子−スペーサーコンジュゲートの構成の、α及びβの両方の結合は、血漿で開裂可能である。生体分子とＰＥＧ（Ａ）との間のスペーサーは、特別な使用のために設計することができる。スペーサーは、血液脳関門を透過するための薬物、アミノ酸、ペプチド又はエンハンサーか、若しくは生体分子の効能を改善するエンハンサーであることができる。
【００８２】
ＰＥＧ（Ａ）又はＰＥＧ（Ｂ）は、約５０から約４０，０００までの間の分子量を有する。バイオコンジュゲートに接続したＰＥＧポリマーは、約１００から約２００，０００までの間の分子量を有する。好ましい実施態様では、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートに対して、ＰがＰＥＧであり、ＰＥＧ（又はｍＰＥＧ）の分子量は、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００又はそれらを混合した範囲内である。
【００８３】
本発明の１つの態様は、Ｒのスペーサーが、式ＶＩ及びＶＩＩによって示される構造を有する、持続性−開裂可能−連結のアーム２つの分枝状メトキシポリ（エチレングリコール）に接続したリジンであることである。
【化１１】
2013536199.tif 000012
又は
【化１２】
2013536199.tif 000013
【００８４】
ａ結合は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、チオカルバメート、チオカルバミド、ウレタン及びジチオカルバメートからなる群から選択される持続性の連結を指定し、ａ結合は、α又はεのアミノ基のいずれかに接続され、ｂ結合は、カルボン酸エステル、カーボネート及びカルボキシル−イミダゾ（ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｉｍｉｄａｚｏ）からなる群から選択される開裂可能な連結であり、混合型の連結ａ及びｂはそれらの混合物であり、ｍＰＥＧ（Ａ）又はｍＰＥＧ（Ｂ）は約５０から４０，０００までの分子量を有し、リジン混合型の連結の二置換ｍＰＥＧは、約１００から８０，０００までの分子量を有する。
【００８５】
タンパク質のコンジュゲート化のために、リジン−ｍＰＥＧ（Ａ）−ｍＰＥＧ（Ｂ）ポリマーの遊離のアミノは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトフェニルエステル、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、アシルイミダゾ、アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される活性化される部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むスペーサーをさらに接続する。
【００８６】
もう１つの実施態様では、前記ａ連結はアミン結合であり、前記α又はεの第１アミノ基は、フォーク状ポリマーを形成するための求電子基、すなわち、２つのポリマー鎖と接続したα又はεのアミンを含む第２ポリマーとの反応を受けることができる。
【００８７】
化合物５及び７の両方は３０ＫＤａの分枝状カルバメートエステルの混合型連結のＰＥＧ誘導体であり、化合物５及び７の違いは、１０ｋのＰＥＧ持続性カルバメートの連結部位である。化合物５及び７の１０ｋのＰＥＧカルバメート連結部位は、それぞれ、リジン−α及びリジン−εである。
【００８８】
化合物６及び８の両方は３０ＫＤａの分枝状エステル−アミドの混合型連結のＰＥＧ誘導体であり、化合物６及び８の違いは、１０ｋのＰＥＧ持続性アミドの連結部位である。化合物６及び８の１０ｋのＰＥＧアミドの連結部位は、それぞれ、リジン−α及びリジン−εである。
【００８９】
化合物９は、タンパク質のサルファ（チオ）部分（ｍｏｉｅｔｙ）のコンジュゲート化のためのマレイミド共役基を含む、３０ＫＤａの分枝状エステル−カルバメートの混合型連結のＰＥＧである。
【００９０】
化合物１０及び１１は、ＰＥＧポリマーを連結するための主成分化学品としてアスパラギン酸及びグルタミン酸を用いる分枝状エステルアミドの混合型連結のタイプである。
【００９１】
タンパク質のコンジュゲート化のためのさまざまな求電子及び求核官能基（式中のＣの共役基）は、実施例に記載された方法として、合成、活性化又は挿入することができる。
【００９２】
本発明は、生体分子のコンジュゲート化のための持続性−開裂可能−連結及び全部−開裂可能−連結のポリマー誘導体と、非対称性の分枝状アームポリマーとの合成の方法論を提供する。前記合成の方法論は、持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結のポリマーの合成のための保護、脱保護、活性化及び挿入の方法及び操作を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
また、本発明は、適合した持続性のＰＥＧのサイズ、適合した放出可能なＰＥＧのサイズ、適合した持続性の連結、適合した放出可能な連結、適合した混合型のＰＥＧ及びポリマーのリンカー及び適合した異なる混合型のポリマーを選択、最適化及び合成するための完全な道具箱を提供する。
【００９４】
また、本発明は、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートを調製するための方法を提供する。コンジュゲート化のために、開裂可能−連結のポリマーは、アミノ、チオ、アルデヒド、カルボキシル及びＮ末端からなる群から選択される活性部位を有する生体分子に一般的に接続される。
【００９５】
好ましい実施態様では、最適な生体分子はインターフェロンである。本明細書で用いられるところの「インターフェロン」という用語とは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン  ガンマ−１ｂ、及び、インターフェロン−λ（インターフェロンラムダ）をいう。インターフェロン−αは、インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン−α−１、インターフェロンアルファコン−１及びコンセンサスインターフェロンを含む。インターフェロンはサイトカインとして知られる糖タンパク質の広い分類に属し、広範な感染及び増殖性疾患に対する治療能を有する。インターフェロンは、抗ウイルス、免疫調節及び抗腫瘍の活性のような生物学的効果を有するタンパク質であるアルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）を含む。組換えＩＦＮ−αは、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、有毛細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、悪性黒色腫、及び、慢性骨髄性白血病を含む、多くの疾患を治療するための治療剤として用いられている。
【００９６】
本発明の少なくとも１つの態様は、相乗性インターフェロンＰＥＧ（相乗効果ＩＦＮ−ＰＥＧ）コンジュゲートを生成するために、インターフェロンを共役するための持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧポリマーを提供する。本発明の新規の相乗効果ＩＦＮ−ＰＥＧコンジュゲートは、インターフェロンの、独特なｉｎ  ｖｉｖｏで酵素で制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。相乗効果ＩＦＮ−ＰＥＧは、インターフェロンの増加した複合抗ウイルス活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な特性とを提供するため、大きい分子のＩＦＮ−ＰＥＧコンジュゲートと、放出されたより小さな分子のＩＦＮ−ＰＥＧコンジュゲートとのメリットを統合する。
【００９７】
インターフェロン−αに対して、本発明の独特な相乗性インターフェロン−α−ＰＥＧ（相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマー）コンジュゲートは、インターフェロン−αを送達するために、酵素反応メカニズムを介して、制御され、同期された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムをｉｎ  ｖｉｖｏで提供する高度なインターフェロン−αの薬物送達技術である。相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマーは、持続的な吸収、増大した抗ウイルス活性、持続的な抗ウイルス活性、延長した循環半減期、低減した免疫原性及び毒性、及び、増大した効能を達成するために、増大したインターフェロン−αの生物活性と、ハイブリッド相乗効果の薬理学的特性とを提供する。さらに、相乗効果ＩＦＮ−α−ポリマーの持続した抗ウイルス活性と、増大したＰＫ及びＰＤの特性とは、薬効を増加し、臨床的に、Ｃ型ウイルス患者に対して、ウイルス学的応答のより大きな持続と、その後の投与量、投与頻度又は疾患治療期間の低減との達成をもたらすことができる。
【００９８】
相乗性インターフェロン−α−３０ｋＰＥＧ（α−１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲート［相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）］（実施例６）は、開裂可能な２０ｋ  ｍＰＥＧエステルの連結と、持続性の１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート連結とを含む。コンジュゲートのエステルの連結は、より小さいが、より活性の高いα−インターフェロン−ε−アミド−リジン−α−カルバメート−１０ｋｍＰＥＧコンジュゲートを生成するために、ｉｎ  ｖｉｖｏの血漿酵素エステラーゼによってゆっくりと加水分解される。
【００９９】
この独特な酵素で制御された持続的放出の本発明の相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートは、相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートと、放出されたＩＦＮ  α−１０ｋ  ＰＥＧ断片との増大した複合活性によるｉｎ  ｖｉｖｏで増加した抗ウイルス効果を提供する。皮下投与の場合には、より大きな分子サイズを有する相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートは、より少ない分布体積で分配され、早期に肝臓に送達されるようなメリットを有し、したがって、より長い血漿半減期を有する。しかしながら、酵素的な加水分解を通じて相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートからゆっくりと生成されるＩＦＮ  α−１０ｋ  ＰＥＧ断片は、より高い抗ウイルス活性を有する。相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）のハイブリッド相乗効果システムは、増加した及び持続した血清抗ウイルス活性を達成するための相乗作用を提供する。
【０１００】
インターフェロンに結合される持続性の開裂可能なＰＥＧポリマーの数は、１つ（ｘ＝１）から多数の分枝状ポリマー（ｘ＞１）までの変えることができる。本発明の相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）を含む相乗性インターフェロン−ＰＥＧコンジュゲートは、１つの開裂可能−連結ポリマーか、若しくはさまざまな数の開裂可能−連結ポリマー、好ましくはｘ＝１ないし２か、若しくはｘ＝１ないし３のインターフェロンの混合物を含むインターフェロンであることができる。
【０１０１】
本発明の相乗性インターフェロン−ＰＥＧコンジュゲートでは、接続された持続性−開裂可能−連結又は全部−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧポリマーに対するＰＥＧ（又はｍＰＥＧ）の好ましい分子量は、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００Ｄａ又はこれらを混合したものである。相乗性インターフェロン−ＰＥＧコンジュゲートに対して、結合されるＰＥＧポリマーの好ましいサイズは、約１０，０００から約６０，０００Ｄａまでである。
【０１０２】
相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートのアプローチは、インターフェロン及びインターロイキンを含むサイトカインに対して特に有益である。
【０１０３】
タイプＩａ及びＩＩａの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、より小さなサイズだが、より活性の高い生体分子−ポリマーコンジュゲート断片をｉｎ  ｖｉｖｏで提供するために、一部分のポリマー部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）をゆっくりと放出することができる。タイプＩｂ及びＩＩｂの相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、非常により小さいが、より活性の高い生体分子−スペーサーコンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで生成するために、全てのポリマー部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）をゆっくりと放出することができる。したがって、相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート（タイプ１ａ、ＩＩａ、Ｉｂ又はＩＩｂ）の量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでゆっくりと減少し、ｉｎ  ｖｉｖｏの酵素で制御されるメカニズムを介して、より小さなサイズの生体分子−ポリマー又は生体分子−スペーサーコンジュゲートの同期した持続的放出を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏのハイブリッド生体分子−ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートの複数の効果を統合し、したがって、増大した複合生物活性と、相乗性ＰＫ及びＰＤの特性とを提供する。
【０１０４】
実施例
以下の例は本発明の特定の態様を例示し、これらに限定するものではない。
【実施例１】
【０１０５】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル１
ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）が、氷水浴で冷却した無水ジクロロメタン中の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ（１ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１１７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）溶液に添加され、混合液は窒素下で攪拌され、一晩室温に温められた。Ν，Ν’−ジシクロヘキシル尿素が濾過によって反応混合液から除去された。濾液は真空で乾燥された。残渣は無水ジクロロメタンに溶解され、白色固体がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿された。白色固体の生成物１が収集され、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄された。
【実施例２】
【０１０６】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル３
４ｍＬのトリフルオロ酢酸が、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル１（０．８ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）溶液に添加された。反応は１時間室温で攪拌され、白色固体がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（７０ｍＬ）によって沈殿された。固体の生成物Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル２が収集され、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルによって洗浄された。
【０１０７】
無水塩化メチレン（９ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル２（０．３５ｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）、１０Ｋ  ｍＰＥＧ  スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ−ｍＰＥＧ）（２２５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１１０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）溶液が、窒素下の室温で一晩攪拌された。反応混合液は、真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮された。生成物Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル３は、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿され、濾過され、そして、収集された。生成物３は、クロマトグラフィーによってさらに精製できる。
【実施例３】
【０１０８】
３０ｋ  Ｄａ  Ｌｙｓ（α−１０ｋＰＥＧ  カルバメート、２０ｋＰＥＧエステル）スベリン酸スクシンイミジルエステル５
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル３（０．５ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）は、１１ｍＬのジクロロメタン／ジエチルアミン（５：６）混合液に溶解され、反応混合液は室温で３．５時間攪拌された。固体の生成物４は、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（７０ｍＬ）を添加することによって沈殿され、濾過され、そして、収集された。
【０１０９】
無水塩化メチレン（７ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（３ｍＬ）の混合液中のＬｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル４（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（２６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）溶液が、窒素下の室温で９時間攪拌された。反応混合液は真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮され、白色固体がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿された。固体の生成物５が収集され、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルによって洗浄された。
【実施例４】
【０１１０】
Ｌｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、アミド）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステルスベリン酸スクシンイミジル６
本実施例では、エステル−α−アミド−混合型−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体６が、１０ｋダルトンＳＣ−ＰＥＧが１０ｋダルトンｍＰＥＧ−ＳＣＭ（ｍＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチル）に置換されることを除いては、実施例１、２及び３に記載された方法で合成された。
ｍＰＥＧ−ＳＣＭ：ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2−ＣＯ2−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル。
【実施例５】
【０１１１】
Ｌｙｓ（ε−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０ＫｍＰＥＧエステルα−スベリン酸スクシンイミジル７
本実施例では、エステル−ε−カルバメート−混合型−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体７は、Ｆｍｏｃステップの非ブロック化が、ｔ−Ｂｏｃステップの非ブロック化の前に行われたことを除いては、実施例１、２及び３に記載された方法で合成された。
【実施例６】
【０１１２】
Ｌｙｓ（ε−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、アミド）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステルα−スベリン酸スクシンイミジル８
本実施例では、エステル−ε−アミド−混合型−連結の分枝状ＰＥＧ誘導体８は、１０ｋダルトンＳＣ−ＰＥＧが、１０ｋダルトンｍＰＥＧ−ＳＣＭ（ｍＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチル）に置換されることを除いては、実施例５に記載された方法で合成された。
ｍＰＥＧ−ＳＣＭ：ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2−ＣＯ2−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル。
【実施例７】
【０１１３】
３−マレイミドプロピオニルＬｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル９
７ｍＬの無水塩化メチレン／ジメチルホルムアミド（５：２）混合溶媒中のＬｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル４（０．３ｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシシンイミドエステル（１８．６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（７．１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）溶液が、窒素下、室温で一晩攪拌された。反応混合液は真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮され、白色固体がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（８０ｍＬ）を添加することによって沈殿された。固体の生成物９は収集され、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルによって洗浄された。
【０１１４】
３０ｋＤａ  ３−マレイミドプロピオニルＬｙｓ（α−１０Ｋ  ｍＰＥＧ、カルバメート）−２０Ｋ  ｍＰＥＧエステル
相乗性生体分子−ＰＥＧコンジュゲートを生成するためのスルフヒドリル（チオ）含有生体分子との共役に用いられる。
【実施例８】
【０１１５】
相乗性インターフェロンα−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲートの調製
５ｍＬの２ｍＭ酢酸５ｍＬ中の組換えインターフェロンα（２．８ｍｇ／ｍＬ）は、２ｍＬの３５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８と混合された。平衡化後、８２ｍｇのＬｙｓ（α−１０ｋＰＥＧカルバメート、２０ｋＰＥＧエステル）スベリン酸スクシンイミジルエステル５、活性化３０，０００ダルトンの混合型−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧがＩＦＮ−α溶液に徐々に添加され、室温で３時間攪拌された。モノ、ジ及びトリＰＥＧ分枝状ポリマー（組成物ｘ＝１ないし３）を含むＩＦＮ−α反応混合液は、３０ｋダルトンの分子量分画膜（ザルトリウス・ステディム・ビバスピン２０）を用いて濃縮され、所望の相乗性インターフェロンα−２ｂ−３０ｋＰＥＧコンジュゲートを収集するために、サイズ排除又はイオンクロマトグラフィーによってさらに精製された。収集された相乗性インターフェロンα−モノ３０ｋＰＥＧコンジュゲートは、３０ｋダルトンの分子量分画膜（ザルトリウス・ステディム・ビバスピン２０）を用いて濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で確認された。
【０１１６】
インターフェロン−α−２ｂ−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲートの分解と、１０ｋ  ＰＥＧ−インターフェロンの放出とに対しての実験は、ヒトの血漿で３７°Ｃで行われた。持続性のカルバメート及び放出可能なエステルの連結を含む、相乗性インターフェロンα−３０ｋＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲートは、ヒト血漿で３７°Ｃで０．５から３６時間までの範囲のさまざまな時間インキュベーションされた。一定分量の血漿サンプルは回収され、アセトニトリル、又は、アセトニトリル／メタノールの有機溶媒で処理され、ボルテックスされ、遠心分離され、そして、濃縮された。その後、溶液残渣は、１０ｋ  ＰＥＧ−インターフェロン−α−２ｂの放出を確かめるため、サイズ排除クロマトグラフィーによって、若しくは銀又はヨウ素染色でｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析された。
【実施例９】
【０１１７】
生物学的データ
本実施例では、ＩＦＮ  α−２ｂ、ＩＦＮ−１２ｋＰＥＧ*及び実施例８からの相乗性３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧ  カルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗ウイルス活性が、ＥＭＣＶで感作されたＮｅｗ  Ｗｉｓｈ細胞を用いるＣＰＥアッセイで決定された。この細胞変性効果アッセイは、ウイルスに誘導された細胞溶解でのインターフェロンの阻害効果を測定する。アッセイのエンドポイントは、ウイルスで誘導された標的細胞を５０％保護するＩＦＮの希釈物である。インターフェロンの存在量は、インターフェロンの参照基準と比べて決定される。相乗性３０Ｋ  ＩＦＮ  α−２ｂ−ＰＥＧの抗ウイルス活性は、ＩＦＮα−２ｂの抗ウイルス活性の約１２％であった。結果が表１に記載される。
【０１１８】
【表１】
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【実施例１０】
【０１１９】
薬動力学的パラメーター
本実施例では、さまざまな薬動力学的データがＢＡＬＢ／Ｃマウスへの皮下注射後にもたらされた。薬動力学的パラメーターは、３日間にわたって取られた時点の同一量のインターフェロンを摂取しているマウス４匹の血液から得られた平均値を用いて決定された。ＩＦＮ−α−２ｂ−１２ｋＰＥＧ＊及び相乗効果−３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧに対して、血液サンプルは、注射後１、６、２４、４８及び７２時間で取り出された。ＩＦＮα−２ｂに対して、血液サンプルは、注射後１、３、６及び２４時間で取られた。その後、ＰＫパラメーターが、時間に対する抗ウイルス活性のプロットから評価され、評価された。比較薬動力学的パラメーターが表に記載される。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
皮下注射の場合に、薬動力学的データは、３０ｋダルトンの分子量の混合型−持続性−開裂可能−連結の分枝状ＰＥＧポリマーとともに調製された相乗効果３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧは、哺乳類において、天然のインターフェロンα−２ｂや、従来のＰＥＧリンカーと結合したＩＦＮ  α−２ｂ−１２ｋＰＥＧよりも非常に優れていることを表す。相乗効果３０ｋＩＦＮ  α−２ｂ−ＰＥＧの血清半減期は、非修飾型のインターフェロンα−２ｂや、ＩＦＮ  α−２ｂ−１２ｋＰＥＧそれぞれの血清半減期と比較して７１及び３．３倍で予想外に長い。相乗性３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧのハイブリッド相乗作用は、非修飾型のインターフェロンα−２ｂと比較して、５０倍をこえる血漿ＡＵＣの予想外の顕著な増加をもたらす。ましてやなおさら予想外だったのは、相乗効果３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧでさえも、ＩＦＮα−２ｂ−１２ｋＰＥＧと比較して、２．６倍の予想外に長いＡＵＣを有する。
【０１２２】
本発明の相乗効果ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートの薬動力学的は、大きいＩＦＮ−３０ｋＰＥＧコンジュゲートと、小さい１０ｋ  ＩＦＮ−α−ＰＥＧコンジュゲートとの２つのＰＫ特性を統合し、時間に対する血清抗ウイルス活性の非常に均一なプロファイルを提供する。
ｐＫのデータは、継続的な抗ウイルス保護を提供するｉｎ  ｖｉｖｏで増加した、持続した、及び、着実なインターフェロン活性のレベルを示す。また、持続した抗ウイルス活性、より長い血清半減期、及び、より大きなＡＵＣは、相乗作用ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートは、より効果があり、臨床的に、より大きく持続したウイルス学的応答の達成をもたらすことができることを示す。
【０１２３】
明らかに、相乗性３０ｋＩＦＮα−２ｂ−ＰＥＧ（１０ｋ  ｍＰＥＧカルバメート、２０ｋ  ｍＰＥＧエステル）コンジュゲートは、哺乳類で非修飾型のＩＦＮα−２ｂ及びＩＦＮα−２ｂ−１２ｋＰＥＧを超える確かなメリットを有する。相乗性ＩＦＮ−α−３０ｋＰＥＧ（α、β）コンジュゲートは、Ｃ型肝炎に対して投与量、投与頻度、又は治療期間の低減をもたらすことができる総合的な薬動力学的及び薬物動態学的な特性を予想外に改善する。
ＢＯＣ：ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｍＰＥＧ20K：ｍＰＥＧ分子量２０Ｋダルトン
ｍＰＥＧ10K：ｍＰＥＧ分子量１０Ｋダルトン
【０１２４】
【化１３】
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【０１２５】
【化１４】
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【０１２６】
【化１５】
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【０１２７】
【化１６】
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【０１２８】
【化１７】
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【０１２９】
【化１８】
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【０１３０】
【化１９】
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【０１３１】
【化２０】
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【０１３２】
【化２１】
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【０１３３】
【化２２】
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【０１３４】
【化２３】
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【０１３５】
本発明の開裂可能−連結−ポリマーのリンカーに結合することによって効果的に修飾することができるタンパク質、高分子及び低分子の治療剤を含む数千の生体分子が存在することが強調されるべきである。本発明の相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲートは、
増加した及び持続した生物活性、増大したＰＫ及びＰＤの特性、延長した循環半減期、低減した毒性、及び、増大した効能などの従来のペグ化生体分子コンジュゲートを超える多くの可能性のある臨床的メリットをもたらすことができる、生体分子の独特な、酵素で制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。
【国際調査報告】
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