(57)【要約】  本発明は、１〜１０個のヌクレオチドからなるランダムなポリヌクレオチド配列を有する先行領域と、前記先行領域の３’末端側の、ｎｎｎｎＣＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第１の領域と、ｎｎＣＴＴＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第２の領域であって、前記第２の領域の少なくとも一部は前記第１の領域に相補的である第２の領域と、前記第１の領域と前記第２の領域との間に配置され、かつ、３〜３０個のヌクレオチドを有するランダムなポリヌクレオチド配列からなる第３の領域と、を含む、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合するアプタマーを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜１０個のヌクレオチドからなるランダムなポリヌクレオチド配列を有する先行領域と、
前記先行領域の３’末端側の、ｎｎｎｎＣＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第１の領域と、
ｎｎＣＴＴＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第２の領域であって、前記第２の領域の少なくとも一部は前記第１の領域に相補的である第２の領域と、
前記第１の領域と前記第２の領域との間に配置され、かつ、３〜３０個のヌクレオチドを有するランダムなポリヌクレオチド配列からなる第３の領域と、
を含み、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合するアプタマー。
【請求項２】
前記第１の領域が、（Ａ又はＣ）Ａ（Ａ又はＧ）ＧＣＴである、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
前記第２の領域が、（Ａ又はＣ）（Ａ又はＧ）ＣＴＴＴである、請求項１又は請求項２記載のアプタマー。
【請求項４】
前記第３の領域が、ＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＴからなるか、又は、これと１〜５個の塩基が異なるポリヌクレオチド配列からなる、請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のアプタマー。
【請求項５】
前記先行領域がＴｍ（Ａ又はＴ）（Ａ又はＣ）Ｔ（Ｔ又はＧ）からなり、かつ、ｍが１〜１０の整数である、請求項１又は請求項４記載のアプタマー。
【請求項６】
前記先行領域が、ＴＴＴＴＴＡＡＴＴ若しくはＴＴＴＴＴＡＡＴＧからなるか、又は、これらの配列のいずれかと１若しくは２個の塩基が異なるポリヌクレオチド配列からなる、請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のアプタマー。
【請求項７】
前記アプタマーが、
（１）  配列番号１〜７のポリヌクレオチド、
（２）  前記第３の領域及び前記先行領域のそれぞれにおいて１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有する、ポリヌクレオチド、又は、
（３）  前記第１の領域及び前記第２の領域において合計で１〜５個のヌクレオチドが異なり、かつ、前記第３の領域及び前記先行領域のそれぞれにおいて１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有する、ポリヌクレオチド、
のうちのいずれかである、請求項１記載のアプタマー。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項記載のアプタマーを、被検者からの体液試料と接触させることを含む、前立腺癌の診断方法。
【請求項９】
前記アプタマーとＰＳＡとの複合体を検出することを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アプタマーとＰＳＡとの複合体の量を決定することを更に含む、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合するアプタマー及びそれを用いる前立腺癌の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、主に前立腺上皮により産生される３３〜３４ｋＤａの糖タンパク質であり、前立腺癌を診断するための最も一般的な血清マーカーとして知られている。前立腺癌は、通常、循環系への高濃度のＰＳＡの放出をもたらし、また、血清ＰＳＡレベルを１０５倍まで上昇させる。よって、血清ＰＳＡの測定は、前立腺癌を患う患者の早期発見及びモニタリングに広く用いられている。一般的には、４．０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を上回る血清ＰＳＡ測定値は、陽性とみなされ、また、生検が必要であることを示している可能性がある。
【０００３】
アプタマーは、モノクローナル抗体の親和性及び特異性に匹敵する高い親和性及び特異性を有して、例えばタンパク質及び小分子などの種々の標的分子を認識することができる、核酸リガンドである。アプタマー、特にＤＮＡアプタマーは、容易かつ安価に合成され、化学的に改変される。更に、それらは、それらが標的に結合する際に構造変化が起こるよう設計することができる。これらの特徴が、ＤＮＡアプタマーを、バイオセンサーにおける分子認識要素に理想的なものにしている。アプタマーの利点を使って、アプタマーに基づく高感度検出システムが構築されている。
【０００４】
標的結合能は、アプタマーをバイオセンサーに適用するという観点から最も重要な特徴である。アプタマーは、一般的には、ランダム配列プールから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、標的結合活性に基づくＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称されるプロセスを用いて選択される。ＳＥＬＥＸは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて選択の繰り返しサイクルを行うことができるため、効率的なスクリーニング方法である。
【０００５】
このような状況下において、種々のアプタマーが、例えば、プリオン特異的タンパク質（特開２００６−４２６４５Ａ１）、血管内皮増殖因子（特開２００８−２３７０４２）及びインスリン（特開２００９−１８３１９２Ａ１）のための検出ツールとして知られている。
特に、ＷＯ２００６／０９６７５４では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することのできる安定化したアプタマー及び前立腺癌治療薬としてのそれらの使用が記載されており、また、最小化及び最適化により得られたアプタマーが、２〜１０（ｎＭ）であるＫｄ（解離定数）を有する、とのことが開示されている。
【０００６】
他方では、ＳＥＬＥＸが、標的分子に対する高い親和性を有するアプタマーをスクリーニングすることができないことがあるということ、並びに、アプタマーがＳＥＬＥＸによりスクリーニングされる配列空間の実際のサイズ及び複雑度が、予想よりも小さいということが知られている。より高い親和性を有するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸによるスクリーニングの種々の改変方法、例えば遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）を用いたＤＮＡアプタマーの選択方法などが知られている（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、第３３巻（１２）、ｅ１０８、特開２００７−１４２９２号公報を参照のこと）。標的結合能に基づくＧＡを用いたアプタマーの選択のためには、まず、候補オリゴヌクレオチドを、ＳＥＬＥＸにより前選択する。次いで、それらのオリゴヌクレオチド配列を増幅し、ＧＡを用いてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで交叉及び変異させる。それらのＧＡ操作を行った後に、新しいセットの配列を合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイする。次いで、高い結合能を有する配列を、ＧＡの次のサイクル用に選択する。ＧＡ操作のプロセスを繰り返すことにより、ＳＥＬＥＸのみでは充分にスクリーニングできない配列空間をカバーすることができる。
【０００７】
しかしながら、アプタマーの結合能は、一般的には抗体の結合能よりも低いため、アプタマーは一般的には、診断ツールとして実用的ではなく、また、例えば、上記のＰＳＭＡ結合アプタマーは、同じ理由で前立腺癌の診断には十分でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明は、アプタマー、前立腺癌の診断方法、及び、アプタマーを調製するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、１〜１０個のヌクレオチドからなるランダムなポリヌクレオチド配列を有する先行領域と、前記先行領域の３’末端側の、ｎｎｎｎＣＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第１の領域と、ｎｎＣＴＴＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第２の領域であって、前記第２の領域の少なくとも一部は前記第１の領域に相補的である第２の領域と、前記第１の領域と前記第２の領域との間に配置され、かつ、３〜３０個のヌクレオチドを有するランダムなポリヌクレオチド配列からなる第３の領域と、を含み、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合するアプタマーを提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様は、上記のアプタマーを、被検者からの体液試料と接触させることを含む、前立腺癌の診断方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態においては、上記のアプタマーは、以下のいずれかである：
（１）  配列番号１〜７のポリヌクレオチド；
（２）  前記第３の領域及び前記先行領域のそれぞれにおいて１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有する、ポリヌクレオチド；又は
（３）  前記第１の領域及び前記第２の領域において合計で１〜５個のヌクレオチドが異なり、かつ、前記第３の領域及び前記先行領域のそれぞれにおいて１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有する、ポリヌクレオチド。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のアプタマーの予測される二次構造を示す図である。
【図２】図２は、アプタマーブロッティングによる、ニトロセルロース膜上のＰＳＡに対するＳＥＬＥＸの各ラウンドのＤＮＡライブラリーの結合アッセイの結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＡ進化の親世代におけるオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＧＡ進化の第１世代におけるオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＧＡ進化の第２世代におけるオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＧＡ進化の第３世代におけるオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＧＡ進化の第４世代におけるオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＧＡ進化の第５世代のオリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を示す図である。
【図４】図４は、ＧＡ操作により選択されたΔＰＳａｐ４＃５を用いたプレートアッセイによるＰＳＡの感知の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明にかかるアプタマーは、１〜１０個のヌクレオチドからなるランダムなポリヌクレオチド配列を有する先行領域と、前記先行領域の３’末端側の、ｎｎｎｎＣＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第１の領域と、ｎｎＣＴＴＴ（各ｎは独立してＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択される）からなる第２の領域であって、前記第２の領域の少なくとも一部は前記第１の領域に相補的である第２の領域と、前記第１の領域と前記第２の領域との間に配置され、かつ、３〜３０個のヌクレオチドを有するランダムなポリヌクレオチド配列からなる第３の領域とを含み、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合するアプタマーである。
本発明によれば、本発明のアプタマーは、前記先行領域の３’末端側の特定の配列からなる第１の領域と、ランダムなポリヌクレオチド配列からなる第３の領域を介して連結された特定の配列からなる第２の領域とを有するため、特別な二次構造と、ＰＳＡに結合する他のアプタマーよりもより高いＰＳＡに対する親和性とを有しており、また、本発明にかかるアプタマーの結合能は、抗体の結合能にほぼ等しい。
【００１４】
本発明においては、方法に関連する「工程」という語は、独立した工程を示すだけでなく、その工程の意図される効果が得られうる限り、他の工程と明確に区別できない工程も示す場合がある。
更に、本発明において数値範囲を表現するためのいかなる表記も、最小値と最大値とによって定まる範囲を示し、また、その最小値と最大値とを含む。
本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明を以下に説明する。
【００１５】
上述したように、本発明のアプタマーは、前記先行領域；前記第１の領域；前記第２の領域；及び、前記第３の領域からなり、また、前記第１の領域と前記第２の領域とにより形成されるステム部（二本鎖領域）と、前記先行領域と前記第３の領域とによりそれぞれ形成されるループ部（一本鎖領域）とを有するため、本発明のアプタマーの二次構造はヘアピン構造となっている。
【００１６】
本明細書における「ステム部」という語は、２つのポリヌクレオチドがそれらの相補性に従って全体として二本鎖領域を形成し得る領域を意味する。よって、この語は、その領域が、完全に相補的な２つのポリヌクレオチド配列からなるという場合だけでなく、それらポリヌクレオチドの少なくとも一部が相補的であって、全体として二本鎖領域が形成され得る限り、その領域が、完全には相補的でない２つのポリヌクレオチド配列からなるという場合をも含み得る。
【００１７】
前記第２の領域の配列は、二本鎖領域―すなわちステム部―を形成することができるよう選択されてもよく、また、前記第２の領域の少なくとも一部は、前記第１の領域に相補的であるヌクレオチドからなる。前記第３の領域は、３〜３０個のヌクレオチドを有するランダムなポリヌクレオチド配列からなり、一本鎖ループを形成する。これに対する具体的な理由は未解明のままであるが、本発明のアプタマーのＰＳＡに対する高い親和性はこの構造（図１を参照のこと）に起因していると考えられる。
【００１８】
前記第１の領域は、先行領域の３’末端側に配置され、前記第２の領域と共に二本鎖領域を形成する。ＰＳＡに対する結合親和性の観点から、前記第１の領域は、好ましくは（Ａ又はＣ）Ａ（Ａ又はＧ）ＧＣＴであり、また、より好ましくは、前記第１の領域は、ＡＡＡＧＣＴ、ＡＡＧＧＣＴ又はＣＡＧＧＣＴである。
ＰＳＡに対する結合親和性の観点から、前記第２の領域は、好ましくは（Ａ又はＣ、）（Ａ又はＧ）ＣＴＴＴであり、いっそうより好ましくは、前記第２の領域は、Ａ（Ａ又はＧ）ＣＴＴＴであり、更により好ましくはＡＧＣＴＴＴ又はＡＡＣＴＴＴである。
【００１９】
前記アプタマーの前記先行領域は、アプタマーの二次構造を安定化するために、１〜１０個のヌクレオチドからなるランダムなポリヌクレオチド配列を有する。ＰＳＡに対する結合親和性の観点から、前記先行領域は好ましくは、Ｔｍ（Ａ又はＴ）（Ａ又はＣ）Ｔ（Ｔ又はＧ）からなり、かつ、ｍは、１〜１０、好ましくは１〜５の整数である。より好ましい前記先行領域は、ＴＴＴＴＴＡＡＴＴ若しくはＴＴＴＴＴＡＡＴＧを有していてもよく、又は、これらと１若しくは２個の塩基が異なる、例えばＴＴＴＴＴＴＡＴＴ若しくはＴＴＴＴＴＡＣＴＧ等のポリヌクレオチド配列を有していてもよい。
【００２０】
前記第３の領域は、３〜３０個のランダムなポリヌクレオチド配列を有し、ループ部分を形成する。このループの安定性の観点から、このランダムなポリヌクレオチド配列は、好ましくは３〜２０個のヌクレオチド、より好ましくは５〜１５個のヌクレオチド、及び、更により好ましくは７〜１３個のヌクレオチドを含む。このランダムなポリヌクレオチド配列を構成するヌクレオチドの種類は限定されず、当業者であれば、前記第３の領域のためのランダムなポリヌクレオチド配列を作製することができる。ＰＳＡに対する結合親和性の観点から、前記第３の領域は、最も好ましくはＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴ（配列番号１２）であってもよく、又は、これと１〜５個の塩基が異なる、例えばＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＴ（配列番号１３）若しくはＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧ（配列番号１４）等のポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００２１】
特に、本発明のＰＳＡに結合するアプタマーは、好ましくは以下のうちのいずれかである：
（１）  配列番号１〜７のポリヌクレオチド、
（２）  前記第３の領域及び前記先行領域のそれぞれにおいて１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有する、ポリヌクレオチド、又は、
（３）  前記第１の領域及び前記第２の領域において合計で１〜５個のヌクレオチドが異なり、かつ、前記第３の領域及び前記先行領域において１〜５個のヌクレオチドがそれぞれ異なるということ以外は配列番号１〜７の配列と同一である配列を有するポリヌクレオチド。
上記（３）に記載のポリヌクレオチドは、１〜１５個のヌクレオチドにより配列番号１〜７とは異なるが、これは、この範囲の違いを有するポリヌクレオチドはＰＳＡに対して同様の結合能を有し得るためである。上記（３）又は（２）に記載の好ましいポリヌクレオチドは、前記第１の領域、前記第２の領域、前記第３の領域及び前記先行領域に関して上記に記載した好ましいポリヌクレオチドの組み合わせから選択される。
本発明のアプタマーは自動化学合成機を用いて作製してもよいため、それらは、特異的抗体よりもずっと容易かつ安価に調製することができる。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
上記アプタマーを含むＰＳＡに結合するアプタマーは、公知のＳＥＬＥＸ法により得てもよいが、好ましくは改変ＳＥＬＥＸ法を用いてもよい。ＰＳＡに結合するアプタマーを調製する好ましい方法は、
固相上に固定化されたＰＳＡを用いてＳＥＬＥＸ選択処理を行い、一本鎖ポリヌクレオチドからなる候補配列を得ること；
それら候補配列を、異なる候補配列間での交叉と、候補配列のそれぞれに対する点ランダム変異とを行うことにより改変し、改変候補配列を得ること；並びに、
ＰＳＡ結合能に基づいて改変候補配列を選り分け、前記アプタマーを得ること、
を含む方法であってもよい。
【００２４】
アプタマーを調製するための方法におけるＳＥＬＥＸ選択は当業者に公知であり、ＳＥＬＥＸ選択は公知の方法によって実施しうる。この方法では、標的分子（ＰＳＡ）を固相上に固定化し、そこに、膨大な種類のランダムな塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを加え、当該標的分子に結合するポリヌクレオチドを回収し、次いで、そのポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、その後、その増幅されたポリヌクレオチドを、再び標的分子が固定化されている担体へと加える。このプロセスを約１０回繰り返すことによって、その標的分子に対する高い結合能を有するアプタマーを濃縮し、その配列を決定して、その標的分子を認識するアプタマーを得る。
【００２５】
ＳＥＬＥＸ選択においては、ＰＳＡの固定化は、単に、例えば風乾によるなどの物理吸着によってか、又は、周知のアミンカップリング剤等を用いてＰＳＡのカルボキシル基若しくはアミノ基を利用することによりＰＳＡを固相に共有結合させることによって行われてもよい。ＰＳＡを固定化するための固相は、ＰＳＡを吸着する、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、濾紙、又はポリスチレンマイクロタイタープレート等のウェルであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ＳＥＬＥＸ選択用のポリヌクレオチドライブラリー中のポリヌクレオチドは、約３０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒのランダムな塩基配列を有しており、自動核酸合成機により合成されるが、これは、前記アプタマーのサイズが、通常、約３０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであるためである。この場合には、それらポリヌクレオチドの全長がランダムな塩基配列であってもよいが、ＳＥＬＥＸを行う際にＰＣＲを単純化するために、それらポリヌクレオチドの両方の末端領域は既知の塩基配列であってもよい。この場合には、ＰＣＲプライマーを、これら既知配列の領域にそれぞれハイブリダイズさせることができる。それらポリヌクレオチドの両方の末端領域中に位置する当該領域のサイズは制限されず、通常は約１０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。
【００２７】
続いて、上記に記載されているようにして作製したポリヌクレオチドライブラリーを、固定化された試験物質と反応させる。好ましくは、ライブラリーとＰＳＡとの間の反応は室温で行ってもよい。反応時間は、通常は約１分〜３０分、好ましくは約１０分〜２０分であるが、これらに限定されるものではない。ＰＳＡとの反応の際には、ＰＳＡに結合するアプタマーは、ＰＳＡに結合し、固相上に固定化される。他方では、試験物質に結合しないポリヌクレオチドは、固相に結合せず、したがって、洗浄により除去される。
【００２８】
固相に結合しないポリヌクレオチドを洗浄により除去した後に、ＰＳＡに結合したアプタマーを溶出する。溶出は、例えば、固相を約６Ｍ〜８Ｍの高い濃度の尿素で処理することによって行うことができる。溶出したポリヌクレオチドは、例えばフェノール抽出及び／又はフェノール−クロロホルム抽出とエタノール沈殿といった従来の方法によって回収することができる。回収されたアプタマーは、すべて、固定化された試験物質に結合するものである。
【００２９】
続いて、回収したアプタマーを鋳型として用いてＰＣＲを行い、これらアプタマーを増幅する。自動的に合成されたポリヌクレオチドが両方の末端領域に上記のプライマー結合領域を有する場合には、それらプライマーを用いてＰＣＲを行う。そうしたプライマー結合領域がもたらされない場合には、回収したアプタマーのポリヌクレオチド配列を決定し、それぞれの末端領域に相補的な一対のＰＣＲプライマーを合成し、これらのプライマーを、ＰＣＲを行うために使用する。非対称ＰＣＲ（ＰＣＲに用いられる一対のプライマーの一方が、過剰量で使用される）を行うことにより、主に一本鎖ポリヌクレオチドを増幅することができる。あるいは、ＰＣＲにおいて用いられるプライマーのうちの１つとしてビオチン標識プライマーを使用すること；その増幅された二本鎖ポリヌクレオチドをアビジンビーズに結合させること；この状態でポリヌクレオチドをＮａＯＨ等により変性させること；及び、ビーズから分離したポリヌクレオチドを回収することにより、増幅された二本鎖ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチド（ビオチン標識されていない鎖）を回収することができる。これにより、固定化されたＰＳＡに結合するアプタマーだけが増幅され、また、固定化されたＰＳＡによく結合するもの、及び、ＰＣＲにおいて鋳型として働くものであるアプタマーの分子の数は多いため、増幅されたポリヌクレオチドのライブラリーにおけるそのパーセンテージは高くなる。
【００３０】
続いて、増幅されたアプタマーのライブラリーを上記のポリヌクレオチドライブラリーとして用いて、上記の一連の工程、すなわち、固定化された試験物質との反応；洗浄；アプタマーの溶出及び回収；並びにＰＣＲによる増幅；の一連の工程によるサイクルを約数回から十数回、繰り返す。これにより、当該試験物質によく結合するアプタマーは濃縮され、当該試験物質に対する高い結合能力を有するアプタマーを得ることができる。
【００３１】
ＳＥＬＥＸ選択の後、改変候補配列を得るために、遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）を用いて候補配列の改変を行う。改変においては、候補配列は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで進化させる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの進化の適用により、所望のアプタマーの作出の効率を上昇させることが可能である。ＧＡを用いた改変は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、３３（１２）、ｅ１０８及びＡｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．，  Ｅｄ．  ２００５年、３３、１０６１〜１０６５等に記載されている。これらの方法においては、上記ＳＥＬＥＸの第１サイクルを終えた後、得られたアプタマー（候補配列又はＳＥＬＥＸ前配列）のポリヌクレオチド配列を決定し、ＰＳＡに対するそれらの結合能力を測定し、その測定された結合能力を結合能力の順に選り分ける。アプタマーの基本構造は４つのタイプ―すなわち、ヘアピン型、バルジ型、シュードノット型、及びグアニン四重鎖型―に分類できるとのことがアプタマーに関する現在までの研究により実証されており、また、どの構造がどの塩基配列を有するアプタマーによって達成されるのか、また、どれがその基本構造の維持に必要なヌクレオチド（１又は複数）であるのかは、コンピューターによる分析によって容易に決定することができる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの進化を利用する方法においては、交叉、点変異又はそれらの組み合わせが適用される。交叉では、一対の候補配列をランダムに選択し、少なくとも１つの領域、例えば約３〜５ｍｅｒを、得られたそれぞれのアプタマーにおけるそれぞれの対応する領域間で互いに交換する。その後、交叉後の上記それぞれの領域に対して、ランダムな一塩基置換を導入する。これらの交叉及び一塩基置換の導入は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで行う。コンピューターにより作出された新しいポリヌクレオチド配列を有するアプタマーを化学的に合成して、第２のポリヌクレオチドライブラリーを得て、次いで、それを上記サイクルに使用する。第２のポリヌクレオチドライブラリーが調製される際には、結合能力に関して高い順位を有するアプタマー由来の領域を有するアプタマーは最も多い量で含まれ、その割合は順位が低くなるにつれて減少する。よって、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの交叉及びランダムな一塩基置換によって人為的に変異（variations）を導入することにより、ＳＥＬＥＸによる進化の効率を上げることができる。
【００３２】
好ましくは、改変における交叉とランダムな単一変異とを組み合わせて、ＰＳＡに対するより高い結合能を有する改変候補配列を含む第２のポリヌクレオチドライブラリーを得てもよい。この場合には、これら改変候補配列は、交叉による改変又は点ランダム変異による改変のいずれかを行うこと、ＰＳＡ結合能に基づいて改変配列から第１の改変候補配列を選択すること、その第１の改変候補配列を、交叉による改変又は点ランダム変異による改変のうちの、最初に改変配列を得た際に行わなかった方を行うことにより改変すること、並びに、交叉による改変又は点ランダム変異による改変のうちの、最初に改変配列を得た際に行わなかった方を行うことにより改変された第１の改変候補配列である複数の改変候補配列からＰＳＡ結合能に基づいて選択すること、によって得られる複数の改変候補配列であってもよい。
【００３３】
高い結合能を有するＰＳＡに結合するアプタマーを効率的に得るためには、アプタマーを調製するための方法は、実際にＳＥＬＥＸ前候補配列として使用された際に、高い結合能力を有するアプタマーの製造が結果としてもたらされたという証明済みの歴史をもったポリヌクレオチド配列を使用するものであることが好ましく、この方法は、配列番号８〜１１を有するポリヌクレオチド配列を含む４つの予備配列に関して、配列間での交叉及びそれぞれの配列の点ランダム変異からなる群より選択される少なくとも１種類の改変を行うこと；並びに、それら予備配列のＰＳＡ結合能よりも高いＰＳＡ結合能を有する標的配列を、少なくとも１種類の改変により得られた改変配列から選択すること、を含む方法であってもよい。配列番号８〜１１のポリヌクレオチド配列の結合能は、本明細書に記載されているように実証されており、結合能は、ＳＥＬＥＸ選択のみによって得たポリヌクレオチドよりも高い。よって、配列番号８〜１１のポリヌクレオチド配列を用いて改変から得られる配列は、その後、これらのポリヌクレオチド配列のＰＳＡに対する結合能に基づいて選り分けられるため、ＰＳＡに結合するアプタマーを確実に得ることができる。
【００３４】
【表２】
2013531969.tif 000004
【００３５】
あるいは、高い結合能を有するＰＳＡに結合するアプタマーを効率的に得るためには、アプタマーを調製するための方法は、高い結合能力を有するアプタマーの製造が結果としてもたらされたという証明済みの歴史をもった他のポリヌクレオチド配列を使用するものであることが好ましく、この方法は、配列番号１０を有するポリヌクレオチド配列を含む基本配列番号２に関して、配列間での交叉及びそれぞれの配列の点ランダム変異からなる群より選択される少なくとも１種類の改変を行うこと；並びに、配列番号１０を有する標準配列のＰＳＡ結合能よりも高いＰＳＡ結合能を有する標的配列を、少なくとも１種類の改変により得られた改変配列から選り分けること、を含む方法であってもよい。配列番号１０のポリヌクレオチド配列のＰＳＡに対する結合能は、抗体のＰＳＡに対する結合能と同じくらい高いことが本明細書において実証されているため、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を用いて選り分けることから得られるアプタマーは、前立腺癌の診断のツールとして有望に使用され得る。
【００３６】
好ましくは、上記の方法において交叉又は点変異を含むＧＡを用いた改変は、標的配列を効率的に得るために繰り返されてもよい。改変の繰り返しは、単に、上記の工程の実行を含むものであってもよい。
【００３７】
本発明の前立腺癌の診断方法は、上記のアプタマーを、被検者からの体液試料と接触させることを含む方法である。この前立腺癌の診断方法によれば、高い結合能でＰＳＡに結合する少なくとも１つのアプタマーが検出ツールとして使用されるため、診断は、ＰＳＡに対する抗体を用いた診断と同じくらい信頼性が高い。更に、本発明のアプタマーは自動化学合成機により作製することができるため、抗体よりもずっと容易かつ安価に調製することができる。したがって、本発明にかかる前立腺癌の診断は、従来の方法によるよりも費用をかけずに行うことができる。
【００３８】
当該前立腺癌の診断方法は、試料中の標的物質としてのＰＳＡの検出又は決定により行うことができる。よって、好ましくは、当該方法は、上記のアプタマーを被検者からの体液試料と接触させること、及び、前記アプタマーとＰＳＡとの複合体を検出すること又は前記アプタマーとＰＳＡとの複合体の量を決定することを含む。
体液試料としては、血清、血漿、又はそれらの希釈物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。被検者からの体液試料を上記アプタマーと接触させる。これは、当該試料をアプタマー溶液と混合し、その結果として生じた混合物をインキュベートすることにより行うことができる。試料中のＰＳＡの検出又は決定は、通常の公知方法によって行ってもよい。例えば、イムノクロマトグラフィ又はＥＬＩＳＡなどのようなイムノアッセイを、抗体の代わりに前記アプタマーを用いて行うことが可能である。更に、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いた検出方法又はアプタマーブロッティング法等を、本発明の診断に適用させてもよい。あるいは、ＷＯ２００５／０４９８２６及びＷＯ２００７／０８６４０３に記載されている検出法又はアッセイ法は、本発明のアプタマーを用いて有用であろう。
【００３９】
上記のアプタマーを用いる前立腺癌の診断は、自動検出装置を用いて機械的に行われてもよい。この実施形態においては、被検者からの体液試料とアプタマーとを含む検出試料を保持する試料保持部、その検出試料中のＰＳＡとアプタマーとの複合体を検出することができる検出部、及び、検出部からの検出の結果を表示する表示部、を有する検出装置が提供され得る。この検出装置によれば、前立腺癌の診断は、より容易に行われ得る。
【００４０】
試料保持部は、検出試料を保持することができるいかなる形態を有していてもよい。検出試料は、検出部に提供された際に被検者からの体液とＰＳＡに結合するアプタマーとを含んでいてもよいので、検出試料は、被検者からの体液とアプタマーとの混合物として、又は、体液若しくはアプタマーを含み、かつ、試料保持部から提供された後に検出装置にて互いに混合される別々の液体として、試料部に提供されてもよい。
【００４１】
検出部は、ＰＳＡとアプタマーとの間の結合を検出することができる構成を有しており、ＰＳＡ及びアプタマーの特異的検出方法に応じて選択されてもよい。検出方法の例としては、上述した例えばイムノクロマトグラフィ、ＥＬＩＳＡ又はＳＰＲ等のイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、検出部の例としては、蛍光光度計又はＳＰＲ装置等が挙げられるが、これらに限定されない。更に、検出部は、検出結果を検出データに変換する計算部を有する。よって、検出の結果はデータへと変換され得る。
【００４２】
表示部は、検出部により得られた結果から作成された検出データを、ディスプレイに出力する。このディスプレイは、そうした目的のために使用されるいかなる公知のディスプレイであってもよい。
検出デバイスを用いることにより、被検者からの体液中のＰＳＡの検出を、自動検出によって行ってもよい。この実施形態においては、検出方法は、以下の工程を含む：被検者からの体液を回収するための工程；上記のアプタマーを用いて体液試料中のＰＳＡの量を計算して、検出結果データを作成するための工程；及び、その検出結果データを表示部に出力するための工程。よって、ＰＳＡを容易に検出することができ、それらの結果に基づいて前立腺癌の診断を行うことができる。
【００４３】
本発明のアプタマーは被検者からの体液試料中のＰＳＡを高い信頼性で検出することができるため、当該アプタマーを、ＰＳＡ検出用キットの１つの成分として使用してもよい。この実施形態においては、上記のアプタマーを含むアプタマー溶液を含む第１の容器、アプタマー溶液又は被検者からの体液試料を希釈するのに使用できる希釈剤を含む所望により設けられる第２の容器、及び、当該アプタマーを用いたＰＳＡの検出の手順を説明する文書、を含むＰＳＡ検出キットが提供され得る。よって、ＰＳＡの検出を容易に行うことができる。
【００４４】
保持部材の構成は、それがアプタマーを保持することができる限り特に限定されず、キット中に含まれるアプタマーの形態を考慮して適宜選択されてもよい。例えば、キットがアプタマーを溶液中に含有する場合には、保持部材は、液体を保持することができる容器であってもよい。更に、キットがアプタマーを固定化された固相として含有する場合には、保持部材は、固定化された固相を保持することができるプレート又は容器であってもよい。
加えて、当該キットは、ＰＳＡに対する結合能力を有しない他のアプタマーを、ＰＳＡ検出方法用の陰性対照として含んでいてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されない。特に断りのない限り、実施例における「％」は、重量（質量）パーセンテージを指す。
【００４６】
材料
ヒト精液から精製されたＰＳＡはシグマアルドリッチ社及びＳｃｉｐａｃ社から購入した。合成オリゴヌクレオチドはインビトロジェン社、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社及びオペロンバイオテクノロジー株式会社から購入した。ニトロセルロース膜はＧＥヘルスケア社から購入した。ヒト血清はニッスイ社から購入した。ＫＡＰＡ２ＧファーストＰＣＲキットはカパ・バイオシステムズ社から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄはアプライドバイオシステムズ社から購入した。ｐＧＥＭベクターはプロメガ社から購入した。アビジン固定化ゲルビーズはＰｉｅｒｃｅ社から購入した。ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体はＤａｋｏ社から購入した。イモビロンウェスタンケミルミネッセンスＨＲＰ基質はミリポア社から購入した。ＰｏｌｙＳｏｒｐ  ９６ウェルポリスチレンプレートはＮｕｎｃ社から購入した。ブロッキング試薬Ｎ１０２はＮｏｆ社から購入した。ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質はロシュ社から購入した。ＳＡセンサーチップはＢｉａｃｏｒｅ社から購入した。他の試薬は、分析グレードのものであった。
【００４７】
ＳＥＬＥＸによるＰＳＡ結合アプタマーの選択
両末端において３ｍｅｒのチミン−（Ｔ３−）リンカーを介して２０ｍｅｒのプライマー結合配列に連結された２４ｍｅｒのランダム化された領域を含有するＦＩＴＣ標識一本鎖ＤＮＡライブラリー（５’−ＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴ（Ｎ２４）ＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣ−３’：配列番号１５）を使用した。このライブラリーを、フォワードプライマー（５’−ＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＡＣ−３’：配列番号１６）とリバースプライマー（５’−ＧＴＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧ−３’：配列番号１７）とを用いて増幅した。このＤＮＡライブラリーを９５℃で１０分間加熱し、次いで、ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中で３０分間にわたって徐々に２５℃に冷却し、構造をフォールディングした。ＰＳＡ（１μｇ）をニトロセルロース膜上にスポットし、風乾させた。ニトロセルロース膜に対するＤＮＡの非特異的結合を減少させるために、このＰＳＡがスポットされた膜を０．５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）緩衝液中１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、この膜を、ＤＮＡライブラリーとともに、ＴＢＳＴ緩衝液中で１時間、室温にてインキュベートした。洗浄後、この膜のＰＳＡをスポットしたエリアを切り出し、ＰＳＡ結合オリゴヌクレオチドをフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。回収したオリゴヌクレオチドは、ＦＩＴＣ標識フォワードプライマー、ビオチン標識リバースプライマー及びＫＡＰＡ２ＧファーストＰＣＲキットを用いてＰＣＲにより増幅した。アビジン固定化ゲルビーズを用いて、スクリーニングの次のサイクル用の一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製した。第３ラウンド後に、その選択されたＤＮＡライブラリーを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭベクターにサブクローニングし、次いで各クローンの配列を分析した。
【００４８】
スクリーニングの各ラウンドのＤＮＡライブラリーのＰＳＡ結合能は、既述されたようなアプタマーブロッティング法（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、２００８；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）によって評価した。これについて、以下の章で簡単に説明する。
【００４９】
ＰＳＡへのアプタマーの結合アッセイ
（１）アプタマーブロッティングアッセイ
ＦＩＴＣ標識アプタマーを上述のようにしてフォールディングした。ＰＳＡがスポットされた膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中４％（ｖ／ｖ）スキムミルクでブロッキングし、ＦＩＴＣ標識アプタマーとともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、この膜を、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体とともに室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＳＡがＤＮＡライブラリーに結合したスポットを、イモビロンウェスタンケミルミネッセンスＨＲＰ基質で可視化し、Ｔｙｐｈｏｏｎ８６００（ＧＥライフサイエンス）で検出した。
【００５０】
（２）プレートアッセイ
プレートアッセイの使用のために、２４ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、その５’末端にてＴ５−リンカーを介してＦＩＴＣ標識し、その３’末端にてＴ３を付加し、その結果、３２ｍｅｒの全長となった。５μｇ／ｍＬの終濃度となる１００μＬ量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中ＰＳＡを９６ウェルポリスチレンプレートに加えた。穏やかに振とうしながら３７℃で２時間のインキュベーション後、上清を除去し、各ウェルをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した。各ウェルを、１００μＬの５倍希釈ブロッキング試薬Ｎ１０２で満たし、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートし、次いで、３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識アプタマーは、フォールディングについて上述したようにしてＴＢＳ緩衝液中で熱処理した。各ウェルに、１００μＬ量のＴＢＳＴ緩衝液中ＦＩＴＣ標識アプタマー（５μＭ）を加え、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄後、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体を各ウェル加え、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを５回洗浄し、ＢＭケミルミネッセンスＨＲＰ基質を加え、次いで、ＨＲＰ活性を、以下のマルチラベルカウンター：Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯ  ＭＸ（パーキンエルマー社）により測定した。
【００５１】
ＧＡを用いたＰＳＡ結合能の改善
ＧＡを用いた配列コントロールの第１サイクルでは、ＳＥＬＥＸにより得られた５つのアプタマーのオリゴヌクレオチド配列を、同じ出現率でｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで複製し、異なる配列とランダムに対にして、１０対作成した。各対の配列を、ランダムな１点で交叉させ、また、１つの配列あたり２塩基の変異をランダムに導入して、新しい２０個の配列のセットを作製した。それら２０個の配列のＰＳＡ結合能を、上記のようにしてプレートアッセイによって評価し、それら配列を、それらのＰＳＡ結合能に従って順位付けした。次世代を作製するために、より高いＰＳＡ結合能を示す配列を選択し、順位に応じた種々の出現率で複製した。３サイクルのＧＡ操作の後に、最も高いＰＳＡ結合能を示すオリゴヌクレオチドを見出した。次いで、次世代の作製のために、そのオリゴヌクレオチド配列にランダムな一塩基変異を導入した。
【００５２】
プレートアッセイによるＰＳＡの感知
ＰＳＡの検出のためのプレートアッセイは、以下の改変と共に、上述のようにして行った。１０ｎＭ〜５００ｎＭの種々の終濃度の１００μＬ量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中ＰＳＡを９６ウェルポリスチレンプレートに加え、穏やかに振とうしながら３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング試薬Ｎ１０２でのブロッキングの後に、あらかじめ熱処理によりフォールディングさせた１００μＬ量の４μＭのＴＢＳＴ緩衝液中ＦＩＴＣ標識ΔＰＳａｐ４＃５を各ウェルに加え、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体でのインキュベーション後に、ＨＲＰからの化学発光を測定した。
【００５３】
結果
１．  ＳＥＬＥＸによるＰＳＡ結合アプタマーの選択
ＧＡを用いた後選択のための候補としてのＰＳＡ結合アプタマーを見出すために、ＳＥＬＥＸを行った。ＰＳＡをニトロセルロース膜上に固定化し、ＰＳＡに結合したＤＮＡライブラリーを精製し、ＦＩＴＣ標識フォワードプライマーとビオチン標識リバースプライマーとを用いてＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡライブラリーを、第１ラウンドでは１μＭ、第２ラウンドでは４００ｎＭ及び第３ラウンドでは３９０ｎＭの濃度で、その膜とともにインキュベートした。ＳＥＬＥＸの第３ラウンドでは、ＰＳＡへのＤＮＡライブラリーの結合を表すニトロセルロース膜上の小さなスポットが確認された（図１）。よって、このＤＮＡライブラリー中のオリゴヌクレオチド配列を分析した。第３のライブラリーからの１２個の異なるクローンの配列決定を行い、１１個の異なる配列を得た（表３）。得られたオリゴヌクレオチド配列のＰＳＡ結合能を、アプタマーブロッティング法によって調べた。その結果、ＰＳａｐ＃４−３（配列番号２０）、ＰＳａｐ＃４−４（配列番号２１）、ＰＳａｐ＃４−６（配列番号２３）、ＰＳａｐ＃４−９（配列番号２５）及びＰＳａｐ＃４−１１（配列番号２７）と名付けられた５つのクローンが、膜上のＰＳＡへの結合を示した。表３において、プライマー結合部位は、下線の付いた文字で示されている。
【００５４】
【表３】
2013531969.tif 000005
【００５５】
ＧＡを用いたＰＳＡ結合能の改善
高いＰＳＡ結合能を有するアプタマーが、ＰＳＡ感知における認識要素としてのその使用に必要であるが、ライブラリーにおける配列多様性の制限及び上記のＰＣＲバイアスのため、ＳＥＬＥＸは、高親和性アプタマーをスクリーニングすることができないことがある。
候補物によるＧＡを用いたアプタマーのＳＥＬＥＸ後スクリーニングを行うために、ＳＥＬＥＸによって前選択した５つの配列を「親」として使用し、ＧＡを用いて２０個のオリゴヌクレオチド配列のセットを作製した。これらのオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＳＡ結合能をプレートアッセイにより評価した。ＰＳＡ結合能は、ポリスチレンプレートのウェル上に固定化されたＰＳＡに対するオリゴヌクレオチドの結合を表したＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体からの検出化学発光によって測定した（ｎ＝２）。シグナル強度は、第１世代の１位のオリゴヌクレオチドのシグナル強度で標準化した。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、ＰＳＡ結合能に従って順位付けし、オリゴヌクレオチド配列の次のセットを作製するために、上位４つに順位付けされた配列を選んだ。オリゴヌクレオチド合成、プレートアッセイ及びＧＡを用いたオリゴヌクレオチド配列の進化というサイクルを３回繰り返したが、ここで、このプロセスを、ＰＳＡ結合アプタマーのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの進化であると我々が考える場合には１サイクルは１世代に対応する。１サイクルのＧＡ操作の後に、４つの第２世代配列（配列番号８〜１１）が得られた。合計３サイクルのＧＡ操作の後、第４世代を作製するために、第３世代の最も高いＰＳＡ結合能を示した配列において、ランダムな一塩基変異を導入した。次世代を作製するために選択された、上位に順位付けされた配列の数、及び、対にするために複製するためのオリゴヌクレオチド配列の出現率は、各世代で様々である（表４）。
【００５６】
【表４】
2013531969.tif 000006
【００５７】
各世代の各オリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能を表５及び図３に示す。ＧＡ操作のサイクルが継続するにつれ、オリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能は改善された。これは、ＧＡを用いたこれらアプタマーのＰＳＡ結合能の改善を指し示すものであった。第１世代オリゴヌクレオチドは、ＳＥＬＥＸにより得られた親オリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能よりも１０倍まで高いＰＳＡ結合能を示した。それらオリゴヌクレオチドの順位付け後、第２世代の作製のために、上位７つのオリゴヌクレオチド配列を選択した。それら上位７つの配列を、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、ＰＳＡ結合能に応じて５：４：３：２：２：２：２：２の異なる出現率で複製し、対となった異なる配列と交叉させ、次いで、１つの配列あたり２塩基の変異をランダムに加えた。第２世代オリゴヌクレオチドは、第１世代オリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能よりも１．６倍まで高いＰＳＡ結合能を示し、また、ＳＥＬＥＸにより得られた親オリゴヌクレオチドよりも１６倍高いＰＳＡ結合能を示した。
【００５８】
更に、第３世代の作製のために、上位４つのオリゴヌクレオチド配列（配列番号８〜１１）を第２世代から選択した。それら上位４つの配列の複製に関する出現率を６：５：５：４に固定して、第３世代を作製した。これらの複製された配列を、ランダムに対となった異なる配列と交叉させた。次いで、ランダムな一塩基変異を各配列に導入し、第３世代として２０個のオリゴヌクレオチド配列のセットを作製した。結果として、第３世代においてΔＰＳａｐ３’＃４（配列番号２）と名付けられた１つの配列は、ΔＰＳａｐ２＃２（配列番号８）、ΔＰＳａｐ２＃１８（配列番号９）、ΔＰＳａｐ２＃１６（配列番号１０）及びΔＰＳａｐ２＃１（配列番号１１）を用いて得た。そのΔＰＳａｐ３’＃４と名付けられた配列は、第２世代オリゴヌクレオチドのＰＳＡ結合能よりも高いＰＳＡ結合能を示した。それは、有意に高いＰＳＡ結合能を示し、ＳＥＬＥＸにより得られた親オリゴヌクレオチドよりも４０倍高かった。したがって、ΔＰＳａｐ３’＃４の配列においていかなる交叉もせずにランダムな一塩基変異を導入することにより、第４世代としての２０個の異なるオリゴヌクレオチド配列のセットが作製された。第４世代では、ΔＰＳａｐ４＃５（ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ：配列番号１）が、最も高いＰＳＡ結合能を示し、親オリゴヌクレオチドよりも４８倍高かった。表５を参照のこと。
【００５９】
【表５】
2013531969.tif 000007
【００６０】
プレートアッセイによるＰＳＡの感知
プレートアッセイを行い、第４世代の１位のオリゴヌクレオチドとしてＧＡを用いて選択されたΔＰＳａｐ４＃５を用いてＰＳＡ濃度を測定した。このアッセイでは、種々の濃度のＰＢＳ緩衝液中ＰＳＡをポリスチレンプレートの各ウェルに加えて、ＰＳＡを固定化した。次いで、ＰＳＡ濃度は、ポリスチレンプレートのウェル上に固定化されたＰＳＡに対するＦＩＴＣ標識ΔＰＳａｐ４＃５の結合を表したＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体からの化学発光を検出することによって測定した（ｎ＝２）。その結果、１０ｎＭ〜２００ｎＭ（図５）に相当する、ポリスチレンプレートに固定化された０．３μｇ／ｍＬ〜６μｇ／ｍＬの濃度のＰＳＡ濃度に応じて、ＰＳＡへのΔＰＳａｐ４＃５の結合を表すＨＲＰ化学発光シグナルがもたらされた。ΔＰＳａｐ４＃５の、ＰＳＡとの相互作用についての結合解離定数（ＫＤ）は、５４ｎＭであると見積もられた。ＫＤのこの値は、ＰＳＡに結合する抗体の値とほぼ同じである。
【００６１】
一般的な抗体のＫＤ値は、１×１０−６〜１×１０−８であると言われている。ＨＲＰを用いた結合の試験の結果からは、表５に示されている、ΔＰＳａｐ４＃５からΔＰＳａｐ２＃１６までの１０００ＣＰＳを超えるＨＲＰの測定値が、明確に、抗体と同じ結合能力を示している。
【００６２】
更に、ΔＰＳａｐ４＃５は、最も高い結合能力を有する。ΔＰＳａｐ４＃５（Ｔｍ：５７．２℃、ΔＧ＝−４．７４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）とΔＰＳａｐ３’＃０４（Ｔｍ：３９．６℃、ΔＧ＝−１．６３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の構造を比較することにより、アプタマーの結合能は、第１のステム領域に１つの点変異を導入することによって改善され得ると思われるが、この位置に限定されない。
【００６３】
本発明によれば、ＰＳＡに結合するアプタマーが提供される。前立腺癌の診断法は、これらのアプタマーを用いて、高い信頼性で、かつ容易に実施されうる。
【００６４】
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願及び技術規格は、それぞれの文献、特許出願又は技術規格が、参照により組み入れられると具体的かつ個々に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2013531969.tif 000008
【図２】
2013531969.tif 000009
【図３Ａ】
2013531969.tif 000010
【図３Ｂ】
2013531969.tif 000011
【図３Ｃ】
2013531969.tif 000012
【図３Ｄ】
2013531969.tif 000013
【図３Ｅ】
2013531969.tif 000014
【図３Ｆ】
2013531969.tif 000015
【図４】
2013531969.tif 000016
【配列表】
2013531969000001.app
【国際調査報告】
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2013531969.tif 000018
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