(57)【要約】  本発明は、ミオスタチンに結合する、抗体などのヒト化抗原結合タンパク質、そのような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記抗原結合タンパク質を含む医薬組成物及び製造方法に関する。本発明はまた、筋肉量、筋肉強度及び筋機能の低下のいずれか一つ又はその組合せと関連する疾患の治療又は予防におけるそのようなヒト化抗原結合タンパク質の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオスタチンに特異的に結合し、液相アフィニティアッセイにおいて150pMよりも強い親和性を有するヒト化抗原結合タンパク質であって、少なくとも100時間のpKを有するヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項２】
配列番号90のCDRH3;又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖可変領域を含み、Kabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号2のCDRH2;又は前記CDRH2の変異体をさらに含む、請求項2に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項４】
CDRH1(配列番号1)又は前記CDRH1の変異体をさらに含む、請求項2又は3に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項５】
以下のCDR配列:
(a)配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;
(b)配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び
(c)配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体;
のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖可変領域を含み、Kabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項６】
(a)配列番号90のCDRH3;又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖配列であって、抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部;並びに
必要に応じて、配列番号2のCDRH2、又は前記CDRH2の変異体;及び配列番号1のCDRH1、又は前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む前記重鎖配列と、
(b)以下のCDR配列:配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖配列であって、抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む前記軽鎖配列と
を含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項７】
CDRH3変異体が、(i)配列番号3、82〜89、91若しくは92のいずれか一つであるか、又は(ii)以下のKabat置換V102Y、V102H、V102I、V102D若しくはV102Gのいずれか一つを含有する、請求項2、3、4又は6のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項８】
CDRH2変異体が、(i)配列番号93〜97、若しくは110のいずれか一つである;又は(ii)以下のKabat置換N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F若しくはN58Yのいずれか一つを含有する、請求項3、4、5又は7に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項９】
CDRL3変異体が、(i)配列番号6である;又は(ii)以下のKabat置換L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、若しくはL96Fのいずれか一つを含有する、請求項5、6、7又は8に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109である、請求項6に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
(a)重鎖の位置2のV、I若しくはG;位置4のL若しくはV;位置20のL、I、M若しくはV;位置22のC;位置24のT、A、V、G若しくはS;位置26のG;位置29のI、F、L若しくはS;位置36のW;位置47のW若しくはY;位置48のI、M、V若しくはL;位置69のI、L、F、M若しくはV;位置78のA、L、V、Y若しくはF;位置80のL若しくはM;位置90のY若しくはF;位置92のC;及び位置94のR、K、G、S、H若しくはNのいずれか一つ又はその組合せ;及び/又は
(b)軽鎖の位置2のI、L若しくはV;位置3のV、Q、L若しくはE;位置4のM若しくはL;位置23のC;位置35のW;位置36のY、L若しくはF;位置46のS、L、R若しくはV;位置49のY、H、F若しくはK;位置88のC;及び位置98のFのいずれか一つ又はその組合せ
から選択されるKabatのアミノ酸残基のいずれか一つ又はその組合せをさらに含む、請求項6又は10に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号112、113、114、115、119、120若しくは121から選択される重鎖可変領域;及び/又は配列番号116、117若しくは118から選択される軽鎖可変領域;又は前記配列に対して75%以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖可変領域変異体を含み、
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、
重鎖可変領域がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも1個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、
軽鎖可変領域がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、
請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
(a)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(b)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(c)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(d)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(e)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(f)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(g)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(h)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(i)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(j)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(j)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(k)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(l)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(m)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(n)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(o)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(p)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(q)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(r)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(s)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(t)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;又は
(u)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
重鎖及び軽鎖可変領域を好適なヒト定常領域と組み合わせる、請求項13に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号123、125、127若しくは138〜144から選択される重鎖配列;及び/又は配列番号145、146、147から選択される軽鎖配列;又は前記配列に対して75%以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖配列変異体を含み、
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、
重鎖がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、
軽鎖がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、
請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
重鎖がFc無効化されている、請求項14又は15に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
請求項1から16のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１８】
配列番号122、124、126、128〜131、135〜137の重鎖DNA配列;及び/又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列;又は
配列番号123、125、127若しくは138〜144の重鎖配列;及び/又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする重鎖又は軽鎖DNA配列変異体
を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１９】
配列番号122、124若しくは126の重鎖DNA配列及び/又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする軽鎖DNA配列変異体を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項17から19のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項20に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２２】
請求項21に記載の宿主細胞を培養する工程と、抗原結合タンパク質を回収する工程とを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と、製薬上許容し得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、筋肉質量、筋肉強度及び筋肉機能のいずれか一つ又はその組合せを低下させる疾患に罹患した対象を治療する方法。
【請求項２５】
請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、骨格筋減少症、悪液質、筋肉消耗、廃用性筋萎縮、HIV、AIDS、癌、筋骨若しくは神経に対する手術、熱傷、外傷若しくは損傷、肥満、糖尿病(II型糖尿病を含む)、関節炎、慢性腎不全(CRF)、末期腎不全(ESRD)、鬱血性心不全(CHF)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、選択的関節修復、多発性硬化症(MS)、脳卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経障害、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、骨粗鬆症、変形性関節症、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸促迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎又は脊柱側弯症に罹患した対象を治療する方法。
【請求項２６】
請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、対象における筋肉質量を増加させる、筋肉強度を増加させる、及び/又は筋肉機能を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチンと結合するヒト化抗原結合タンパク質、例えば抗体、このような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに製造方法に関する。本発明は、低減された筋肉量、筋肉強度および筋機能のいずれか１つまたは組合せに関連した疾患の治療または予防における、このようなヒト化抗原結合タンパク質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖および分化因子（ＧＤＦ−８）としても知られているミオスタチンは、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの一成員であり、筋肉量の負の調節因子である。ミオスタチンは進化を通して高度に保存されており、ヒト、ニワトリ、マウスおよびラットの配列は成熟Ｃ末端ドメインにおいて１００％同一である。ミオスタチンは、シグナル配列、プロペプチドドメインおよびＣ末端ドメインを含有する前駆体タンパク質として合成される。分泌循環型のミオスタチンは活性成熟Ｃ末端ドメインを含み、不活性型は、成熟Ｃ末端ドメインを、プロペプチドドメインおよび／または他の阻害タンパク質と関連した潜在型複合体中に含む。
【０００３】
低減された筋肉量、筋肉強度および筋肉機能に関連した多数の異なる疾患、障害および症状が存在する。運動増大およびより良好な栄養が、このような疾患の治療のための一般的療法の主力である。残念ながら、患者の一部に関しては持続性および遵守が十分でないために、身体的活性増大の利益はまず得られることはない。さらに又、運動は、ある患者にとっては難しく、痛みを伴い、あるいは不可能であり得る。さらに、筋肉に及ぼす任意の有益な作用を生じるには不十分な運動関連の筋肉性労作もあり得る。栄養的介入は、基礎を成す食餌性欠乏が存在し、患者が適切な食欲を有する場合に有効であるに過ぎない。これらの限界のため、より広範に獲得可能な利益を伴う、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか１つまたは組合せにおける低減に関連した疾患のための治療が、依然として必要とされている。
【０００４】
ミオスタチンに対する抗体が、記載されている（ＷＯ  ２００８／０３０７０６、ＷＯ  ２００７／０４７１１２、ＷＯ  ２００７／０４４４１１、ＷＯ  ２００６／１１６２６９、ＷＯ  ２００５／０９４４４６、ＷＯ  ２００４／０３７８６１、ＷＯ  ０３／０２７２４８およびＷＯ  ９４／２１６８１）。さらにまた、Wagner等（Ann Neurol. (2008) 63(5): 561-71）は、記載された抗ミオスタチン抗体のうちの１つを用いる場合、成人筋ジストロフィー（ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィーおよび肢体型筋ジストロフィー）における筋肉の強度または機能の診査終点における改善を記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３０７０６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０４７１１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００７／０４４４１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／１１６２６９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０９４４４６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／０３７８６１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０２７２４８号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９４／２１６８１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wagnerら, Ann Neurol. (2008) 63(5): 561-71
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のうちのいずれか１つまたは組合せにおける低減に関連した疾患の治療または予防のためのより有効な療法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ミオスタチンと特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能の低減のうちのいずれか１つまたは組合せに関連した疾患を治療するかまたは予防するために用いられ得る。
【０００９】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、液相アフィニティアッセイにおいて150pMより強い親和性を有するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、少なくとも100時間のpKを有する、ミオスタチンに特異的に結合する前記抗原結合タンパク質も提供する。
【００１０】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が配列番号90のCDRH3(F100G_Y変異体);又は前記CDRH3の変異体を含み、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基の少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００１１】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、以下のCDR配列:
(a)配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;
(b)配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び
(c)配列番号109のCDRL3(C91S変異体)、又は前記CDRL3の変異体
のうちの一つ、二つ又は三つを含む軽鎖可変領域を含み、Kabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方、又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００１２】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、
(a)配列番号90のCDRH3(F100G_Y変異体);又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖可変領域であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部;並びに
必要に応じて、配列番号2のCDRH2、又は前記CDRH2の変異体;及びCDRH1(配列番号1)又は前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む前記重鎖可変領域と、
(b)以下のCDR配列:配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び配列番号109のCDRL3(C91S変異体)、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖可変領域であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む前記軽鎖可変領域と
を含むヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、
配列番号112、113、114、115、119、120若しくは121から選択される重鎖可変領域;及び/又は配列番号116、117若しくは118から選択される軽鎖可変領域;又は前記配列に対して75%以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖可変領域変異体を含み、CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、
重鎖可変領域がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、
軽鎖可変領域がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。
【００１４】
本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、
(a)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(b)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(c)配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(d)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(e)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(f)配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(g)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(h)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(i)配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(j)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(k)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(l)配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(m)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(n)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(o)配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(p)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(q)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;
(r)配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域;
(s)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域;
(t)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域;又は
(u)配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域
を含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。
【００１５】
本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号123、125、127若しくは138〜144から選択される重鎖配列;及び/又は配列番号145、146、147から選択される軽鎖配列;又は前記配列に対して75%以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖配列変異体を含み、
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDEH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、
重鎖がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基;Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、
軽鎖がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基;及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。
【００１６】
本発明はまた、
配列番号122、124、126、128〜131、135〜137の重鎖DNA配列;及び/又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列;又は
配列番号123、125、127、若しくは138〜144の重鎖配列;及び/又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする重鎖若しくは軽鎖DNA配列変異体
を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本明細書に定義された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に定義された発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質の製造方法を提供するが、この方法は、上記の宿主細胞を培養する工程および抗原結合タンパク質を回収する工程を含む。本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、筋肉量、筋肉強度および／または筋肉機能を低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療方法であって、本明細書中で定義されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法も提供する。
【００１９】
本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病（例えばＩＩ型真性糖尿病）、関節炎、慢性腎不全（ＣＲＦ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、待機的関節修復、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症に苦しんでいる被験体の治療方法であって、本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および／または筋肉機能を改善する方法であって、本明細書中で定義されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか１つまたはそれらの組合せを低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療における使用のための本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００２２】
本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病（例えばＩＩ型真性糖尿病）、関節炎、慢性腎不全（ＣＲＦ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、待機的関節修復、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症の治療における使用のための本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００２３】
本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および／または筋肉機能を改善する方法における使用のための本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００２４】
本発明は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか１つまたはそれらの組合せを低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療における使用のための薬剤の製造における本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。
【００２５】
本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病（例えばＩＩ型真性糖尿病）、関節炎、慢性腎不全（ＣＲＦ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、待機的関節修復、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症の治療における使用のための薬剤の製造における本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。
【００２６】
本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および／または筋肉機能を改善する方法における使用のための薬剤の製造における本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】精製成熟ミオスタチンに関するＬＣ／ＭＳ分析を示す：予測分子量（ＭＷ）１２４０６．２５  Ｄａ、実測ＭＷ２４７９３．９８  Ｄａ。これは、９つのシステイン残基を有する予測ミオスタチン単量体とマッチングする９対のジスルフィド結合を有する二量体化分子を示す。
【図２】ＭＯＰＳ緩衝液を伴う４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを示す。レーン１：ＤＴＴを用いて低減される成熟ミオスタチン。レーン２：ＤＴＴを用いずに低減されない成熟ミオスタチン。レーン３：１２のタンパク質標準に印を付ける。
【図３Ａ】図３Ａは、Ａ２０４細胞で用量依存的に６時間後にルシフェラーゼ発現を生じる、細胞シグナル伝達のミオスタチン（R&D Systemsおよび社内ミオスタチン種）誘導性活性化を実証する用量応答曲線を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、異なる日に得られたデータにより代表されるような異なる試験状況において、Ａ２０４細胞で用量依存的にルシフェラーゼ発現を生じる、社内ミオスタチン誘導性活性化を実証する用量応答曲線を示す。
【図４】エリザによる成熟ミオスタチン、潜在型複合体および潜在型複合体から放出される成熟ミオスタチンと結合する１０Ｂ３を示す。
【図５】１０Ｂ３および１０Ｂ３キメラによるＡｃｔＲＩＩｂと結合するミオスタチンの阻害を示す。
【図６】Ａ２０４細胞におけるルシフェラーゼ発現低減を生じる、細胞シグナル伝達のミオスタチン誘導性活性化の１０Ｂ３および１０Ｂ３キメラ阻害を示す。
【図７】マウスにおける体重（Ａ）および赤身質量（Ｂ）に及ぼす１０Ｂ３のin vivo作用を示す。
【図８】マウスにおける腓腹筋（Ａ）、四頭筋（Ｂ）および長指伸筋（ＥＤＬ）（Ｃ）の筋肉量に及ぼす１０Ｂ３のin vivo作用を示す。
【図９】強縮力（Ａ）および筋肉量により補正される強縮力（Ｂ）を示す、ＥＤＬにおける筋収縮性に及ぼす１０Ｂ３のin vivo作用を示す。
【図１０】11のアフィニティ精製されたCDRH3変異体;及びH2L2-C91S、H0L0、HcLc(10B3キメラ)並びに陰性対照モノクローナル抗体のミオスタチン捕捉ELISAにおける結合活性を示す図である。
【図１１】5のアフィニティ精製されたCDRH2変異体;及びH2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S、HcLc(10B3キメラ)並びに対照抗体として用いた陰性対照モノクローナル抗体のミオスタチン結合ELISAにおける結合活性を示す図である。
【図１２】0日目から25日目までのC-26腫瘍担持マウスにおける体重に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図１３Ａ】C-26腫瘍担持マウスにおける、総体脂肪(A)、副睾丸脂肪パッド(epididymal fat pad)(B)、及び除脂肪質量(C)に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図１３Ｂ】C-26腫瘍担持マウスにおける、総体脂肪(A)、副睾丸脂肪パッド(epididymal fat pad)(B)、及び除脂肪質量(C)に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図１３Ｃ】C-26腫瘍担持マウスにおける、総体脂肪(A)、副睾丸脂肪パッド(epididymal fat pad)(B)、及び除脂肪質量(C)に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図１４】C-26腫瘍担持マウスにおける大腿中央部に対する坐骨神経の電気刺激時の収縮力により測定された、下肢筋力に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図１５】マウス前脛骨(TA)筋に対する偽手術及び腱切除術における10B3及び対照抗体の効果を示す図である。
【図１６】0日目から42日目までのステロイド誘導治療スケジュール中の体重の変化を示す図である。10B3又は対照抗体で予備治療したマウスにおいて29日目にデキサメタゾン治療を開始した。
【図１７】マウスにおけるデキサメタゾン誘導体脂肪蓄積に対する10B3又は対照抗体を用いる予備治療の効果を示す図である。
【図１８】対照抗体で治療した群における筋肉質量に対するマウスにおける坐骨神経圧壊の効果を示す図である(mIgG2a+偽;及びmIgG2a+坐骨神経(SN)圧壊)。
【図１９】偽手術した脚(A)及び坐骨神経を圧壊した脚(B)における骨格筋質量に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す図である。
【図２０】可変重鎖H0(配列番号12)に関するKabat番号を示す図である。
【図２１】可変軽鎖L0(配列番号15)に関するKabat番号を示す図である。
【図２２】ミオスタチンへの結合の特異性を決定するための一団の増殖因子へのH8L5の結合を示すグラフである。
【図２３】リポーター遺伝子アッセイを用いるA204細胞のミオスタチン及びアクチビンB刺激の中和の比較を示す図である。
【図２４】CH50 Eq EIAの結果を示す図である。
【図２５】基準線と比較したMRIにより測定した下肢全体積の変化率を示す図である。第1群を30mg/kgのIgG2aアイソタイプ対照で治療し、第2群を3mg/kgの10B3で治療し、第3群を以前に記載されたスケジュールに従って腹腔内注射により投与された30mg/kgの10B3で治療した。矢印は用量投与を示す。記号は以下の比較の統計的有意性(P<0.05)を示す:第1群と第3群、第1群と第2群及び第2群と第3群。
【図２６】(A)副睾丸脂肪パッド質量に対する治療効果を示すグラフである。誤差バーはSEMを表す。(*)は対照からの有意差(P<0.05)を示す。(B)試験の終わりに計量した腓腹筋質量に対する様々な用量のhIgG1対照、10B3.C5及びH8L5の効果を示すグラフである。(C)試験した群における平均ピーク力生成を示すグラフである。
【図２７】0.1、1.0及び10mg/kgの標的用量での腹腔内投与後のSCIDマウスにおけるH8L5の血清等価濃度を示す図である。
【図２８】図A〜Dはそれぞれ、10B3、H8L5、無効化H8L5及びAMG745のIgG1対照からの有意差(P<0.05)を表す。
【図２９】28日目に屠殺した(A)前脛骨筋、(B)大腿四頭筋、(C)長指伸筋及び(D)腓腹筋質量に対する試験の0、3、7、14及び21日目に腹腔内注射によりSCIDマウスに投与した変化する用量のBPC1036及びBPC1049の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ミオスタチン、例えばホモ二量体成熟ミオスタチンと特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ミオスタチン、例えばヒトミオスタチンと結合し、中和する。抗原結合タンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。
【００２９】
ミオスタチンおよびＧＤＦ−８はともに、以下のうちのいずれか１つを指す：全長未処理前駆体形態のミオスタチン；潜在型および非潜在（活性）型での、Ｃ末端ドメインの翻訳後切断に起因する成熟ミオスタチン。ミオスタチンという用語は、ミオスタチンに関連した１つ以上の生物学的活性を保持するミオスタチンの任意の断片および変異体も指す。
【００３０】
全長未処理前駆体形態のミオスタチンは、プロペプチド、ならびに成熟タンパク質を形成するＣ末端ドメインを、シグナル配列とともにまたは伴わずに含む。ミオスタチンプロペプチド＋Ｃ末端ドメインは、ポリタンパク質としても知られている。ミオスタチン前駆体は、単量体またはホモ二量体として存在し得る。
【００３１】
成熟ミオスタチンは、Ｃ末端ドメインとして知られているミオスタチン前駆体タンパク質のＣ末端から切断されるタンパク質である。成熟ミオスタチンは、単量体、ホモ二量体として、またはミオスタチン潜在型複合体で存在し得る。条件によって、成熟ミオスタチンは、これらの異なる型の組合せ間に平衡を確立し得る。ヒト、ニワトリ、マウスおよびラットミオスタチンの成熟Ｃ末端ドメイン配列は、１００％同一である（例えば配列番号１０４参照）。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号１０４で示されるホモ二量体成熟ミオスタチンと結合する。
【００３２】
ミオスタチンプロペプチドは、シグナル配列の切断後にミオスタチン前駆体のＮ末端ドメインから切断されるポリペプチドである。プロペプチドは、潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）としても知られている。ミオスタチンプロペプチドは、成熟ミオスタチン上のプロペプチド結合ドメインと非共有的に結合し得る。ヒトプロペプチドミオスタチン配列の一例は、配列番号１０８で提供される。
【００３３】
ミオスタチン潜在型複合体は、成熟ミオスタチンとミオスタチンプロペプチドまたは他のミオスタチン結合タンパク質との間に形成されるタンパク質の複合体である。例えば、２つのミオスタチンプロペプチド分子は、成熟ミオスタチンの２つの分子と会合して、不活性四量体潜在型複合体を形成し得る。ミオスタチン潜在型複合体は、ミオスタチンプロペプチドのうちの一方または両方の変わりに、またはそれに加えて、他のミオスタチン結合タンパク質を含み得る。他のミオスタチン結合タンパク質の例としては、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子（ＦＬＲＧ）ならびに増殖および分化因子関連血清タンパク質１（ＧＡＳＰ−１）が挙げられる。
【００３４】
ミオスタチン抗原結合タンパク質は、前駆体型、成熟型、単量体型、二量体型、潜在型および活性型のミオスタチンのうちのいずれか１つまたはいずれかの組合せと結合し得る。抗原結合タンパク質は、その単量体および／または二量体形態の成熟ミオスタチンを結合し得る。抗原結合タンパク質は、それがプロペプチドおよび／またはフォリスタチンとの複合体で存在する場合、ミオスタチンを結合することもしないこともある。代替的には、抗原結合タンパク質は、それがフォリスタチン関連遺伝子（ＦＬＲＧ）および／または増殖および分化因子関連血清タンパク質１（ＧＡＳＰ−１）との複合体で存在する場合、ミオスタチンを結合することもしないこともある。例えば、抗原結合タンパク質は、成熟二量体ミオスタチンと結合する。
【００３５】
「抗原結合タンパク質」という用語は、本明細書中で用いる場合、ミオスタチンと結合し得る抗体、抗体断片および他のタンパク質構築物、例えばドメインを指す。
【００３６】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指すよう、最も広い意味で本明細書中で用いられ、例としては、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性およびヘテロ接合抗体；単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ、Ｔａｎｄａｂｓ（商標）等が挙げられる（代替的「抗体」フォーマットの要約に関しては、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No.9, 1126-1136参照）。
【００３７】
「単一可変ドメイン」という語句は、異なる可変領域またはドメインとは関係なく、抗原またはエピトープを特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。
【００３８】
「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原と結合し得る「単一可変ドメイン」と同一であるとみなされ得る。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、しかし他の種からの単一抗体可変ドメイン、例えば齧歯類（例えば、ＷＯ  ００／２９００４に開示）、テンジクザメおよびラクダ科動物のＶＨＨｄＡｂも含み得る。ラクダ科動物のＶＨＨは、例えばラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコのような種から得られる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであって、これは、天然では軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。このようなＶＨＨドメインは、当該技術分野で利用可能な標準技法によりヒト化され、このようなドメインは、「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書中で用いる場合、ＶＨはラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは関係なく、三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性に寄与し、多くの場合、タンパク質のおよび／またはドメインの残部の機能を失うことなく、他のタンパク質に付加され、除去されまたは移動され得る。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特有の配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（例えばこの場合、1つ以上のループが抗体可変ドメインに特有でない配列に取って代わられている）、あるいは切頭化されているかあるいはＮ−またはＣ末端伸張を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を包含する。ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは関係なく、抗原またはエピトープを結合し得る。
【００４０】
抗原結合断片は、ドメインのような非抗体タンパク質足場上の1つ以上のＣＤＲの整列により提供され得る。非抗体タンパク質足場またはドメインは、その天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学処理に付されたもの、例えば、ＣＴＬＡ−４（エヴィボディ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（アヴィマー、マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥ１およびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコルピントキシンクニッツ型ドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）（その天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学処理に付された）から選択される足場の誘導体であるドメインである。
【００４１】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇひだ（fold）を有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を付与するために異種配列で置換され得る。異なる結合特異性を有するよう工学処理されたＣＴＬＡ−４分子は、エヴィボディとしても知られている。さらなる詳細に関しては、Journal of Immunological Methods 248(1-2), 31-45 (2001)を参照されたい。
【００４２】
リポカリンは、小型疎水性分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質を運搬する細胞外タンパク質の一ファミリーである。それらは、異なる標的抗原と結合するよう工学処理され得る基準構造の開口端に多数のループを伴う剛性βシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０〜１８０のアミノ酸サイズであり、リポカリンから得られる。さらなる詳細に関しては、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、ＵＳ7250297Ｂ１およびＵＳ２００７０２２４６３３を参照されたい。
【００４３】
アフィボディは、抗原と結合するよう工学処理され得る黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのプロテインＡから得られる足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３−らせん束からなる。表面残基の無作為化により、ライブラリーが生成されている。さらなる詳細に関しては、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)およびＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照されたい。
【００４４】
アビマーは、Ａドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、ジスルフィド結合構造を取る。Ａドメインのファミリーにより示される天然変異のシャッフリングにより、多様性が生成される。さらなる詳細に関しては、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照されたい。
【００４５】
トランスフェリンは、単量体血清運搬糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ中のペプチド配列、例えば１つ以上のＣＤＲの挿入により、異なる標的抗原を結合するよう工学処理され得る。工学処理化トランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。さらなる詳細に関しては、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照されたい。
【００４６】
設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、細胞骨格への内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質の一ファミリーであるアンキリンから得られる。単一アンキリン反復は、２つのαらせんおよびβターンからなる３３残基モチーフである。それらは：各反復の第一αらせんおよびβターンにおける残基を無作為化すること、；あるいは１つ以上のＣＤＲのようなペプチド配列を挿入することにより、異なる標的抗原を結合するよう工学処理され得る。それらの結合界面は、モジュールの数を増大することにより増大され得る（アフィニティー成熟の方法）。さらなる詳細に関しては、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)、PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)およびJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)、ならびにＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１を参照されたい。
【００４７】
フィブロネクチンは、抗原と結合するよう工学処理され得る足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の第１０ドメインの天然アミノ酸配列の主鎖からなる。βサンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンに当該治療用標識を特異的に認識させるよう工学処理され得る。さらなる詳細に関しては、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、ＵＳ２００８０１３９７９１、ＷＯ２００５０５６７６４およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１を参照されたい。
【００４８】
ペプチドアプタマーは、活性部位で挿入される強制可変ペプチドループを含有する定常足場タンパク質、典型的にはチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなる組合せ認識分子である。さらなる詳細に関しては、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照されたい。
【００４９】
マイクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含有する２５〜５０アミノ酸長の天然マイクロタンパク質から得られる；マイクロタンパク質の例としては、カラタＢ１およびコノトキシンおよびノッティンが挙げられる。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体的ひだに影響を及ぼさずに、２５アミノ酸までを含むよう工学処理され得る。工学処理されたノッティンドメインのさらなる詳細に関しては、ＷＯ２００８０９８７９６を参照されたい。
【００５０】
その他の結合ドメインとしては、異なる標的抗原特性を工学処理するための足場として用いられているタンパク質、例えばヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、スコルピン毒素（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が挙げられる（これらは、Chapter 7- Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)およびProtein Science 15: 14-27 (2006)で検討されている）。本発明の結合ドメインは、これらの代替的タンパク質ドメインのいずれか、ならびにドメイン上にグラフとされる本発明のＣＤＲの任意の組合せから得られる。
【００５１】
抗原結合断片または免疫学的に有効な断片は、部分的重および軽鎖可変配列を含み得る。断片は、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長である。代替的には、断片は、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５または少なくとも１００アミノ酸長である。
【００５２】
「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質に関連して本明細書中で用いる場合、抗原結合タンパク質がミオスタチンと結合し、他の（例えば、無関係な）タンパク質とは全く結合しないかまたは有意に結合しない、ということを意味する。しかしながらこの用語は、抗原結合タンパク質が密接に関連する分子（例えば、増殖および分化因子−１１）と交差反応性でもあり得る、という事実を除外しない。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、それらが密接に関連する分子、例えばＧＤＦ−１１と結合するよりも少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍以上の親和性でミオスタチンと結合し得る。
【００５３】
抗原結合タンパク質−ミオスタチン相互作用の結合親和性または平行解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であり得る。代替的には、ＫＤは、５〜１０ｎＭ；または１〜２ｎＭであり得る。ＫＤは、５００ｐＭ〜１ｎＭ、または１ｐＭ〜５００ｐＭ、または１ｐＭ〜２００ｐＭ、または１ｐＭ〜１００ｐＭであり得る。抗原結合タンパク質の結合親和性は、会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）により決定される（ＫＤ＝ｋａ／ｋｄ）。結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）により、例えば第一アミンカップリングおよびこの表面での抗体捕捉によりＣＭ５チップ上に結合されるミオスタチンを用いた抗原捕捉により、測定され得る。実施例２．３に記載されるＢＩＡｃｏｒｅ（商標）法は、結合親和性を測定するために用いられ得る。代替的には、結合親和性は、ＦＯＲＴＥｂｉｏにより、例えば第一アミンカップリングおよびこの表面での抗体捕捉によりＣＭ５針上に結合されるミオスタチンを用いた抗原捕捉により、測定され得る。しかしながら、本発明の抗原結合タンパク質とミオスタチンとの結合の性質のため、結合親和性は等級分け目的のために用いられ得る。ある実施例において、親和性は実施例１７に記載のように、溶液相親和性アッセイにより測定されうる。
【００５４】
ｋｄは、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、または１×１０−５ｓ−１以下であり得る。ｋｄは、１×１０−５ｓ−１〜１×１０−４ｓ−１；または１×１０−４ｓ−１〜１×１０−３ｓ−１であり得る。ｋｄが遅いと、抗原結合タンパク質−リガンド複合体の解離は遅くなり、リガンドの中和が改良される。
【００５５】
「中和する」という用語は、本明細書中で用いる場合、in vitroまたはin vivoでの、抗原結合タンパク質の非存在下でのミオスタチンの活性と比較して、本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の存在下ではミオスタチンの生物学的活性が低減される、ということを意味する。中和は、１つ以上の遮断型ミオスタチンがその受容体と結合して、ミオスタチンがその受容体を活性化させないようにし、ミオスタチンまたはその受容体を下方調節し、あるいはエフェクター機能性に影響を及ぼすためであり得る。中和は、遮断型ミオスタチンがその受容体と結合し、したがってミオスタチンがその受容体を活性化させないようにするためであり得る。
【００５６】
ミオスタチン活性としては、活性ミオスタチンに関連した増殖、調節および形態形成活性、例えば筋肉量、筋肉強度および筋肉機能を調整することが挙げられる。活性型ミオスタチンに関連したさらなる活性としては、筋繊維数、筋繊維サイズ、筋肉再生、筋繊維症、筋芽細胞の増殖速度、筋原性分化の調整；衛星細胞の活性化、衛星細胞の増殖、衛星細胞の自己複製；筋肉の成長および機能に関与するタンパク質の合成または異化が挙げられる。筋肉は、骨格筋であり得る。
【００５７】
生物学的活性の低減または抑制は、部分的または全体的であり得る。中和抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の非存在下におけるミオスタチン活性に比して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、ミオスタチンの活性を中和し得る。機能的検定（例えば、下記の中和検定）において、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大の５０％低減する濃度である。
【００５８】
中和は、当業者に既知の、または本明細書中に記載されるような１つ以上の検定を用いて、決定されるかまたは測定され得る。例えば、ミオスタチンと結合する抗原結合タンパク質は、サンドイッチＥＬＩＳＡで、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、ＦＭＡＴ、ＦＯＲＴＥｂｉｏ（商標）または同様のin vitro検定、例えば表面プラズモン共鳴により、査定され得る。
【００５９】
ＥＬＩＳＡベースの受容体結合検定を用いて、抗原結合タンパク質の存在下でプレート上に固定された可溶性ＡｃｔＲＩＩｂ受容体と結合するミオスタチンを測定することにより、抗原結合タンパク質の中和活性を決定し得る（さらなる詳細に関しては、実施例２．５参照）。受容体中和検定は、効力に基づいて１ｎＭより低いＩＣ５０を有する分子を識別するために利用可能である高感度法である。しかしながら、それは、結合コンピテントビオチニル化ミオスタチンの精確な濃度に対してそれ自体感受性である。それゆえ、０．１ｎＭ〜５ｎＭ、例えば、０．１ｎＭ〜３ｎＭ、または０．１ｎＭ〜２ｎＭ、または０．１ｎＭ〜１ｎＭの範囲のＩＣ５０値が得られる。
【００６０】
代替的には、細胞ベースの受容体結合検定を用いて、受容体結合、下流シグナル伝達および遺伝子活性化の抑制を測定することにより、抗原結合タンパク質の中和活性を決定し得る。例えば、中和している抗原結合タンパク質は、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定としても知られているＰＡＩ−１特異的プロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする構築物でトランスフェクトされた横紋筋肉腫細胞（Ａ２０４）におけるミオスタチン誘導性ルシフェラーゼ活性を抑制するそれらの能力により、同定され得る（さらなる詳細に関しては、実施例１．２参照）。
【００６１】
in vivo中和は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のうちのいずれか１つまたは組合せにおける変化を実証する動物における多数の異なる検定を用いて、決定され得る。例えば、体重、筋肉量（例えば赤身筋肉量）、筋肉収縮性（例えば強縮力）、握力、ぶら下がる動物の能力、および遊泳試験が、単独で、または任意の組合せで用いられて、ミオスタチン抗原結合タンパク質の中和活性を査定し得る。例えば、以下の筋肉の筋肉量が決定され得る：腓腹筋、四頭筋、三頭筋、長指伸筋（ＥＤＬ）、前脛骨筋（ＴＡ）およびヒラメ筋。
【００６２】
「得られる」という用語は、それがその物質に関する物理的起源であるという意味での供給源だけでなく、その物質と構造的に同一であるが、基準供給源に起源を有さない物質も定義するよう意図されるということは、当業者には明らかである。したがって、「ドナー抗体に見出される残基」は、必ずしも、ドナー抗体から生成されている必要はない。
【００６３】
単離されるとは、抗原結合タンパク質のような分子が、それが天然に見出され得る環境から取り出される、ということを意図する。例えば、分子は、それが常態では自然に存在する物質から精製され得る。例えば、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含有する培地に関して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上に精製され得る。
【００６４】
「キメラ抗体」は、受容体抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域に関連してドナー抗体由来の天然可変領域（軽鎖および重鎖）を含有する工学処理抗体の一型を指す。
【００６５】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのＣＤＲのうちの１つ以上を有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ以上のヒト免疫グロブリン（単数または複数）に由来する工学処理抗体の一型を指す。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するよう変更され得る（例えばQueen et al. Pro. Natl Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 (1989)、Hodgson et al. Bio/Technology, 9: 421 (1991)参照）。適切なヒト受容体抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、慣用的データベース、例えばＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、ロス・アラモスデータベースおよびスイス・プロテインデータベースから選択され得る。（アミノ酸に基づいた）ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性により特性化されるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための、重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を与え得る適切な受容体抗体は、同様の方法で選択され得る。受容体抗体重鎖および軽鎖は、同一の受容体抗体から生じる必要はない、ということに留意すべきである。従来技術は、このようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を記載している（例えばＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１参照）。
【００６６】
「ドナー抗体」という用語は、その可変領域のアミノ酸配列、１つ以上のＣＤＲ、あるいはその他の機能的断片または類似体を第一の免疫グロブリン相手に与える抗体を指す。したがって、ドナーは、変更された免疫グロブリンコード領域を提供して、抗原特異性を有する発現変更抗体を生じ、ドナー抗体に特徴的な活性を中和する。
【００６７】
「受容体抗体」という用語は、ドナー抗体に対して異種である抗体を指し、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域、および／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て（または任意部分）を、第一免疫グロブリン相手に与える。ヒト抗体は、受容体抗体であり得る。
【００６８】
「ＶＨ」および「ＶＬ」という用語は、抗原結合タンパク質のそれぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域に言及するために本明細書中で用いられる。
【００６９】
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分に、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。したがって、「ＣＤＲ」は、本明細書中で用いる場合、全３つの重鎖ＣＤＲ、全３つの軽鎖ＣＤＲ、全ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを指す。
【００７０】
本明細書全体を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基は、別記しない限り、カバット番号付与法に従って番号付けされる。同様に、実施例で用いられる「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」という用語は、カバット番号付与法に従う。さらなる情報に関しては、Kabat et al.,配列s of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。例えば図20および21は配列HO（配列番号12）およびLO（配列番号15）についての、可変重鎖および軽鎖の、それぞれのカバットナンバリングを示す。
【００７１】
可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基に関する代替的番号付与法が存在する、ということは当業者には明らかである。ＣＤＲ配列に関する代替的番号付与法、例えばChothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に記述された方法も存在する。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基がＣＤＲ配列の一部とみなされることを意味し得るし、当業者によりそのようであると理解されるべきである。したがって、「対応するＣＤＲ」という用語は、任意の番号付与法、例えば表１に記述される方法を用いてＣＤＲ配列を言及するために本明細書中で用いられる。
【００７２】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列に関するその他の番号付与法としては、「ＡｂＭ」法（バース大学）および「コンタクト」法（ロンドン大学ユニバーシティーカレッジ）が挙げられる。カバット、コチア、ＡｂＭおよびコンタクト法のうちの少なくとも２つを用いて最小重複領域が決定されて、「最小結合単位」を提供し得る。最小結合単位は、ＣＤＲの亜部分であり得る。
【００７３】
以下の表１は、各ＣＤＲまたは結合単位に関する各番号付与法を用いた一定義を表す。可変ドメインアミノ酸配列を番号付けするために、表１において、カバット番号付与スキームが用いられる。ＣＤＲ定義のいくつかは、用いられる個々の出版物によって変わり得る、ということに留意すべきである。
【表１】
2013531486.tif 000002
【００７４】
本明細書中で用いる場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原と特異的に結合し得る抗原結合タンパク質上の部位を指す。これは、単一ドメイン（例えばエピトープ結合ドメイン）または一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインであり得るし、あるいはそれは、標準抗体上で見出され得るような対合ＶＨ／ＶＬドメインであり得る。
【００７５】
「エピトープ」という用語は、本明細書中で用いる場合、抗原結合タンパク質の特定結合ドメインと接触させる抗原の部分を指す。エピトープは線状であり、抗原からの本質的に線状のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、エピトープは、立体配座的または不連続であり得る。例えば、立体配座エピトープは、構造束縛を有する一要素を要するアミノ酸残基を含む。不連続エピトープは、他の配列により分離される、すなわち、抗原の一次配列中で連続配列でないアミノ酸残基を含む。抗原の三次および四次構造の状況では、不連続エピトープの残基は、抗原結合タンパク質により結合されるべき互いにとってほぼ十分である。
【００７６】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関して、「同一の」または「配列同一性」という用語は、２つの核酸または２つのアミノ酸配列間の、必要により、最適に整列され、適切な挿入または欠失と比較された場合の、同一性の程度を示す。
【００７７】
２つの配列間の同一性％は、配列により共有される同一部分の数の一関数であり（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮する。２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定は、下記のように、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る。
【００７８】
２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０または８０、長さ重量１、２、３、４、５または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性％は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長さペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988))を用いても決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックス、またはPＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さ重量１、２、３、４、５または６で、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み入れられているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453)アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００７９】
一方法において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号４１〜５５参照）と同一であり得る、すなわち、１００％同一であり、あるいはそれは、参照配列と比較した場合、ある整数までのヌクレオチド変更を含み、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一である。このような変更は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、置換、例えば転位および転換、または挿入から選択され、この場合、上記の変更は参照ヌクレオチドの５’または３’末端位置で、あるいは、参照配列中または参照配列内の１つ以上の連続基中のヌクレオチド間に独立して点在されるそれらの末端位置の間のどこでも起こり得る。ヌクレオチド変更の数は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号４１〜５５参照）中のヌクレオチドの総数にそれぞれの同一性％（１００で割った）の数値（％）を掛けた積を、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号４１〜５５参照）中のヌクレオチドの上記総数から差し引くことにより決定され、あるいは：
nn≦Xn−（Xn・Y）
（式中、ｎｎはヌクレオチド変更の数であり、ｘｎは、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号４１〜５５参照）中のヌクレオチドの総数であり、そしてｙは、５０％に関しては０．５０、６０％に関しては０．６０、７０％に関しては０．７０、７５％に関しては０．７５、８０％に関しては０．８０、８５％に関しては０．８５、９０％に関しては０．９０、９５％に関しては０．９５、９８％に関しては０．９８、９９％に関しては０．９９、１００％に関しては１．００であり、  ・  は乗法演算子に関する記号であり、そしてｘｎとｙの任意の非整数積は、ｘｎからそれを差し引く前に、最も近い整数に切捨てられる）。
【００８０】
同様に、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば配列番号７〜４０、９８または９９参照）と同一であり得る、すなわち、１００％同一であり、あるいはそれは、参照配列と比較した場合、ある整数までのヌクレオチド変更を含み、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一である。このような変更は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換、例えば保存的および非保存的置換、または挿入から選択され、この場合、上記の変更は、参照ポリペプチドのアミノ−またはカルボキシ−末端位置で、あるいは、参照配列中または参照配列内の１つ以上の連続基中のアミノ酸間に独立して点在されるそれらの末端位置の間のどこでも起こり得る。アミノ酸変更の数は、所定の同一性％に関して、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば配列番号７〜４０、９８または９９参照）によりコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性％（１００で割った）の数値（％）を掛けて、次に、その積を、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば配列番号７〜４０、９８または９９参照）中のアミノ酸の上記総数から差し引くことにより決定され、あるいは：
na≦Xa−（Xa・Y）
（式中、ｎａはアミノ酸変更の数であり、ｘａは、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列（例えば配列番号７〜４０、９８または９９参照）中のアミノ酸の総数であり、そしてｙは、５０％に関しては０．５０、６０％に関しては０．６０、７０％に関しては０．７０、７５％に関しては０．７５、８０％に関しては０．８０、８５％に関しては０．８５、９０％に関しては０．９０、９５％に関しては０．９５、９８％に関しては０．９８、９９％に関しては０．９９、１００％に関しては１．００であり、  ・  は乗法演算子に関する記号であり、そしてｘａとｙの任意の非整数積は、ｘａからそれを差し引く前に、最も近い整数に切捨てられる）。
【００８１】
同一性％は、配列の全長全体またはその任意の断片で決定され、任意の挿入または欠失を伴う場合も伴わない場合もある。
【００８２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、各々、２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチドは、単量体または多量体であり得る。
【００８３】
あるアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされるということは、当該技術分野で周知である。アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられ、そして抗原結合タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的に全てを保持する群内の置換は、保存的置換とみなされる（以下の表２参照）。
【表２】
2013531486.tif 000003
【００８４】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合し、少なくとも100時間のpKを有するヒト化抗原結合タンパク質も提供する。
【００８５】
本発明は、ミオスタチンに結合し、配列番号90のCDRH3;又はそのCDRH3変異体(例えば、配列番号3、82〜89、91、若しくは92のいずれか一つ)を含むヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む前記配列を提供する。抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチン活性を中和することもできる。
【００８６】
例えば、本発明は、ミオスタチンに結合し、配列番号90のCDRH3;又は前記CDRH3の変異体を含むヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質が、
(a)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基;
(b)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基;
(c)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基;又は
(d)Kabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基
をさらに含む、前記配列を提供する。
【００８７】
上記のヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列は、配列番号2のCDRH2;又は前記CDRH2の変異体をさらに含んでもよい。上記のヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列は、CDRH1(配列番号1)又は前記CDRH1の変異体をさらに含んでもよい。
【００８８】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、以下のCDR配列:
(a)配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;
(b)配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び
(c)配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体;
のうちの一つ、二つ又は三つを含むヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記配列を提供する。
【００８９】
例えば、本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、配列番号109のCDRL3;又は前記CDRL3の変異体を含むヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質が、
(a)Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;
(b)Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;又は
(c)Kabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基
をさらに含む、前記配列を提供する。
【００９０】
上記のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列は、配列番号5のCDRL2;又は前記CDRL2の変異体をさらに含んでもよい。上記のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列は、CDRL1(配列番号4)又は前記CDRL1の変異体をさらに含んでもよい。
【００９１】
本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、
(a)配列番号90のCDRH3;又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部;及び
必要に応じて、配列番号2のCDRH2、若しくは前記CDRH2の変異体;及びCDRH1(配列番号1)若しくは前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む、前記重鎖配列と、
(b)以下のCDR配列:
配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体;配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体;及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ又は三つを含む軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記軽鎖配列と
を含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。
【００９２】
上記のヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3配列に加えて、CDRH1(配列番号1)、CDRH2(配列番号2)、CDRL1(配列番号4)、CDRL2(配列番号5)、及びCDRL3(配列番号6若しくは109);又はその変異体(例えば、配列番号93〜97、110のCDRH2変異体のいずれか一つ)から選択される任意の組合せの一つ若しくは複数のCDR、又は全部のCDRをさらに含んでもよい。
【００９３】
例えば、上記のヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3(配列番号90)及びCDRH1(配列番号1)、又はその変異体(例えば、CDRH3変異体3、82〜89、91、92のいずれか一つ)を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3(配列番号90)及びCDRH2(配列番号2)、又はその変異体(例えば、配列番号3、82〜89、91、92のCDRH3変異体のいずれか一つ;又は配列番号93〜97、110のCDRH2変異体のいずれか一つ)を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1(配列番号1)及びCDRH2(配列番号2)、及びCDRH3(配列番号90)、又はその変異体(例えば、配列番号3、82〜89、91、92のCDRH3変異体のいずれか一つ;又は配列番号93〜97、110のCDRH2変異体のいずれか一つ)を含んでもよい。
【００９４】
ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL1(配列番号4)及びCDRL2(配列番号5)、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL2(配列番号5)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL1(配列番号4)、CDRL2(配列番号5)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)、又はその変異体を含んでもよい。
【００９５】
ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3(配列番号90)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)、又はその変異体(例えば、配列番号3、82〜89、91、92のCDRH3変異体のいずれか一つ)を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3(配列番号90)、CDRH2(配列番号2)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)、又はその変異体(例えば、配列番号3、82〜89、92、92のCDRH3変異体のいずれか一つ;又は配列番号93〜97、110のCDRH2変異体のいずれか一つ)を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3(配列番号90)、CDRH2(配列番号2)、CDRL2(配列番号5)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)、又はその変異体(例えば、配列番号3、82〜89、91、92のCDRH3変異体のいずれか一つ;又は配列番号93〜97、110のCDRH2変異体のいずれか一つ)を含んでもよい。
【００９６】
ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1(配列番号1)、CDRH2(配列番号2若しくは95)、CDRH3(配列番号90)、CDRL1(配列番号4)、CDRL2(配列番号5)及びCDRL3(配列番号6若しくは109)を含んでもよい。例えば、ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1(配列番号1)、CDRH2(配列番号95)、CDRH3(配列番号90)、CDRL1(配列番号4)、CDRL2(配列番号5)及びCDRL3(配列番号109)を含んでもよい。
【００９７】
CDR変異体は、少なくとも一個のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列であって、前記改変がアミノ酸配列の化学的又は部分的変化であってもよく(例えば、10個以下のアミノ酸)、その改変により、変異体が未改変の配列の生物学的特性を保持することができる、前記アミノ酸配列を含む。例えば、変異体はミオスタチンに結合する機能的変異体である。CDRアミノ酸配列の部分的変化は、一個から数個のアミノ酸の欠失若しくは置換、又は一個から数個のアミノ酸の付加若しくは挿入、又はその組合せ(例えば、10個以下のアミノ酸)によるものであってよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸置換、付加又は欠失を含んでもよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、一個、二個又は三個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含んでもよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に一個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含んでもよい。アミノ酸残基中の置換は、例えば、一個の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換するなど、保存的置換であってよい。例えば、ロイシンをバリン又はイソロイシンで置換することができる。
【００９８】
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、限定数の主鎖立体配座のうちの１つを構造的に示す傾向がある。ＣＤＲの特定の基準構造クラスは、ＣＤＲの長さとループパッキングの両方により限定され、ＣＤＲおよびフレームワーク領域の両方における重要位置に置かれる残基により決定される（構造的決定残基またはＳＤＲ）。MartinとThornton（1996; J Mol Biol 263: 800-815）は、「重要残基」基準鋳型を限定するために、自動式方法を生み出した。クラスター分析を用いて、ＣＤＲ組に関する基準クラスを限定し、次いで、埋め込まれた疎水性物質、水素結合残基、ならびに保存グリシンおよびプロリンを分析することにより、基準鋳型が同定される。配列を重要残基鋳型と比較して、同一性あんたは類似性マトリックスを用いて各鋳型をスコアリングすることにより、抗体配列のＣＤＲが基準クラスに割り当てられ得る。
【００９９】
カバット番号前のアミノ酸が配列番号１４または２４の元のアミノ酸配列であり、カバット数の末尾のアミノ酸配列が置換アミノ酸であるＣＤＲ基準の例としては、以下のものが挙げられる：
ＣＤＲＨ１基準：  Ｙ３２Ｉ、Ｙ３２Ｈ、Ｙ３２Ｆ，  Ｙ３２Ｔ、Ｙ３２Ｎ、Ｙ３２Ｃ、Ｙ３２Ｅ、Ｙ３２Ｄ、Ｆ３３Ｙ、Ｆ３３Ａ、Ｆ３３Ｗ、Ｆ３３Ｇ、Ｆ３３Ｔ、Ｆ３３Ｌ、Ｆ３３Ｖ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｖ、Ｍ３４Ｗ、Ｈ３５Ｅ、Ｈ３５Ｎ、Ｈ３５Ｑ、Ｈ３５Ｓ、Ｈ３５Ｙ、Ｈ３５Ｔ；
ＣＤＲＨ２基準：  Ｎ５０Ｒ、Ｎ５０Ｅ、Ｎ５０Ｗ、Ｎ５０Ｙ、Ｎ５０Ｇ、Ｎ５０Ｑ、Ｎ５０Ｖ、Ｎ５０Ｌ、Ｎ５０Ｋ、Ｎ５０Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｉ５１Ｖ、Ｉ５１Ｔ、Ｉ５１Ｓ、Ｉ５１Ｎ、Ｙ５２Ｄ、Ｙ５２Ｌ、Ｙ５２Ｎ、Ｙ５２Ｓ、Ｙ５３Ａ、Ｙ５３Ｇ、Ｙ５３Ｓ、Ｙ５３Ｋ、Ｙ５３Ｔ、Ｙ５３Ｎ、Ｎ５４Ｓ、Ｎ５４Ｔ、Ｎ５４Ｋ、Ｎ５４Ｄ、Ｎ５４Ｇ、Ｖ５６Ｙ、Ｖ５６Ｒ、Ｖ５６Ｅ、Ｖ５６Ｄ、Ｖ５６Ｇ、Ｖ５６Ｓ、Ｖ５６Ａ、Ｎ５８Ｋ、Ｎ５８Ｔ、Ｎ５８Ｓ、Ｎ５８Ｄ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｇ、Ｎ５８Ｆ、Ｎ５８Ｙ；
ＣＤＲＨ３基準：  Ｖ１０２Ｙ、Ｖ１０２Ｈ、Ｖ１０２Ｉ、Ｖ１０２Ｓ、Ｖ１０２Ｄ、Ｖ１０２Ｇ；
ＣＤＲＬ１基準：  Ｄ２８Ｎ、Ｄ２８Ｓ、Ｄ２８Ｅ、Ｄ２８Ｔ、Ｉ２９Ｖ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｌ、Ｎ３０Ｙ、Ｎ３０Ｖ、Ｎ３０Ｉ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｆ、Ｎ３０Ｈ、Ｎ３０Ｇ、Ｎ３０Ｔ、Ｓ３１Ｎ、Ｓ３１Ｔ、Ｓ３１Ｋ、Ｓ３１Ｇ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｎ、Ｙ３２Ａ、Ｙ３２Ｈ、Ｙ３２Ｓ、Ｙ３２Ｒ、Ｌ３３Ｍ、Ｌ３３Ｖ、Ｌ３３Ｉ、Ｌ３３Ｆ、Ｓ３４Ａ、Ｓ３４Ｇ、Ｓ３４Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｓ３４Ｖ、Ｓ３４Ｆ；
ＣＤＲＬ２基準：  Ａ５１Ｔ、Ａ５１Ｇ、Ａ５１Ｖ；
ＣＤＲＬ３基準：  Ｌ８９Ｑ、Ｌ８９Ｓ、Ｌ８９Ｇ、Ｌ８９Ｆ、Ｑ９０Ｎ、Ｑ９０Ｈ、Ｓ９１Ｎ、Ｓ９１Ｆ、Ｓ９１Ｇ、Ｓ９１Ｒ、Ｓ９１Ｄ、Ｓ９１Ｈ、Ｓ９１Ｔ、Ｓ９１Ｙ、Ｓ９１Ｖ、Ｄ９２Ｎ、Ｄ９２Ｙ、Ｄ９２Ｗ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｓ、Ｄ９２Ｒ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｈ、Ｄ９２Ａ、Ｅ９３Ｎ、Ｅ９３Ｇ、Ｅ９３Ｈ、Ｅ９３Ｔ、Ｅ９３Ｓ、Ｅ９３Ｒ、Ｅ９３Ａ、Ｆ９４Ｄ、Ｆ９４Ｙ、Ｆ９４Ｔ、Ｆ９４Ｖ、Ｆ９４Ｌ、Ｆ９４Ｈ、Ｆ９４Ｎ、Ｆ９４Ｉ、Ｆ９４Ｗ、Ｆ９４Ｐ、Ｆ９４Ｓ、Ｌ９６Ｐ、Ｌ９６Ｙ、Ｌ９６Ｒ、Ｌ９６Ｉ、Ｌ９６Ｗ、Ｌ９６Ｆ。
【０１００】
ＣＤＲ毎に、重鎖または軽鎖可変領域毎に、重鎖または軽鎖毎に、および抗原結合タンパク質毎に、多重変異体ＣＤＲ基準位置が存在し、したがって、置換の任意の組合せが本発明のヒト化抗原結合タンパク質において存在し得るが、但し、ＣＤＲの基準構造は維持される。
【０１０１】
ＣＤＲ変異体の他の例としては、以下のものが挙げられる（カバット番号付与スキームを使用。この場合、カバット数の前のアミノ酸は配列番号１４または２４の元のアミノ酸配列であり、そしてカバット番号の末尾のアミノ酸配列は置換アミノ酸である）：
Ｈ２：  Ｇ５５Ｄ、Ｇ５５Ｌ、Ｇ５５Ｓ、Ｇ５５Ｔ、Ｇ５５Ｖ；
Ｈ３：  Ｙ９６Ｌ、Ｇ９９Ｄ、Ｇ９９Ｓ、Ｇ１００Ａ＿Ｋ、Ｐ１００Ｂ＿Ｆ、Ｐ１００Ｂ＿Ｉ、Ｗ１００Ｅ＿Ｆ、Ｆ１００Ｇ＿Ｎ、Ｆ１００Ｇ＿Ｓ、Ｆ１００Ｇ＿Ｙ、Ｖ１０２Ｎ、Ｖ１０２Ｓ；
Ｌ３：  Ｃ９１Ｓ。
【０１０２】
例えば、ミオスタチンと結合する本発明のヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号９０のＣＤＲＨ３を含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はさらに、配列番号２、９３〜９７のいずれか１つのＣＤＲＨ２を含み得る。特に、ＣＤＲＨ２は、配列番号９５であり得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号１０９のＣＤＲＬ３も含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はさらに、ＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）およびＣＤＲＬ２（配列番号５）のいずれか１つ、またはこれらの組合せ、またはこれら全てを含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチン活性を中和しうる。
【０１０３】
ＣＤＲを含むヒト化抗原結合タンパク質は、１０Ｂ３または１０Ｂ３キメラ（重鎖：配列番号７または２５、軽鎖：配列番号８）により実証された効力の１０倍以内、または５倍以内の、ＥＣ５０により実証されるようなミオスタチンとの結合に関する効力を示し得る。ミオスタチンとの結合に関する効力は、ＥＣ５０により実証されるように、ＥＬＩＳＡ検定により実行され得る。
【０１０４】
上記のように、ＣＤＲの特定基準構造クラスは、ＣＤＲの長さおよびループパッキングの両方により限定され、ＣＤＲおよびフレームワーク領域の両方における重要位置に置かれる残基により決定される。したがって、配列番号１〜６で列挙されるＣＤＲ、配列番号８２〜９７および配列番号１０９および１１０で列挙されるＣＤＲのほかに、本発明の抗原結合タンパク質の基準フレームワーク残基は、以下のものを包含し得る（カバット番号付与法を使用）：
重鎖：位置２のＶ、ＩまたはＧ；位置４のＬまたはＶ；位置２０のＬ、Ｉ、ＭまたはＶ；位置２２のＣ；位置２４のＴ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＳ；位置２６のＧ；位置２９のＩ、Ｆ、ＬまたはＳ；位置３６のＷ；位置４７のＷまたはＹ４７；位置４８のＩ、Ｍ、ＶまたはＬ；位置６９のＩ、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＶ；位置７８のＡ、Ｌ、Ｖ、ＹまたはＦ；位置８０のＬまたはＭ；位置９０のＹまたはＦ；位置９２のＣ；および／または位置９４のＲ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、ＨまたはＮ；および／または
軽鎖：位置２のＩ、ＬまたはＶ；位置３のＶ、Ｑ、ＬまたはＥ；位置４のＭまたはＬ；位置２３のＣ；位置３５のＷ；位置３６のＹ、ＬまたはＦ；位置４６のＳ、Ｌ、ＲまたはＶ；位置４９のＹ、Ｈ、ＦまたはＫ；位置７１のＹまたはＦ；位置８８のＣ；および／または位置９８のＦ。
【０１０５】
上記のフレームワーク位置のいずれか１つ、任意の組合せまたは全てが、本発明のヒト化抗原結合タンパク質中に存在し得る。重鎖または軽鎖可変領域毎に、重鎖または軽鎖毎に、およびヒト化抗原結合タンパク質毎に、多重変異体フレームワーク基準位置が存在し、したがって、任意の組合せが本発明の抗原結合タンパク質において存在し得るが、但し、フレームワークの基準構造は維持される。
【０１０６】
例えば、重鎖可変フレームワークは、位置２のＶ、位置４のＬ、位置２０のＶ、位置２２のＣ、位置２４のＡ、位置２６のＧ、位置２９のＦ、位置３６のＷ、位置４７のＷ、位置４８のＭ、位置６９のＭ、位置７８のＡ、位置８０のＭ、位置９０のＹ、位置９２のＣ、および位置９４のＲを含み得る。例えば、軽鎖可変フレームワークは、位置２のＩ、位置３のＱ、位置４のＭ、位置２３のＣ、位置３５のＷ、位置３６のＦ、位置４６のＳ、位置４９のＹ、位置７１のＹ、位置８８のＣ、および位置９８のＦを含み得る。
【０１０７】
ヒト化重鎖可変ドメインは、配列番号１０のヒト受容体可変ドメイン配列と、フレームワーク領域において７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有する受容体抗体フレームワーク内の配列番号１〜６で列挙されるＣＤＲ；上記の配列番号８２〜９７および１１０のＣＤＲを含み得る。ヒト化軽鎖可変ドメインは、配列番号１１のヒト受容体可変ドメイン配列と、フレームワーク領域において７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有する受容体抗体フレームワーク内の配列番号４〜６で列挙されるＣＤＲならびに上記の配列番号１０９で列挙される変異体ＣＤＲ；対応するＣＤＲ；結合単位；またはその変異体を含み得る。配列番号１０および配列番号１１の両方において、ＣＤＲＨ３／ＣＤＲＬ３の位置は、Ｘにより示されている。配列番号１０および配列番号１１における１０Ｘ残基は、ＣＤＲの場所に関するプレースホルダーであり、各ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の数の測定値ではない。
【０１０８】
本発明はまた、ミオスタチンに結合し、配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つから選択される重鎖可変領域を含むヒト化抗原結合タンパク質も提供する。抗原結合タンパク質は、配列番号116、117又は118のいずれか一つから選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。任意の重鎖可変領域を、任意の軽鎖可変領域と組み合わせてもよい。抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチンを中和することもできる。
【０１０９】
ヒト化抗原結合タンパク質は、以下の重鎖及び軽鎖可変領域の組合せのいずれか一つを含んでもよい:H3L4(配列番号112及び配列番号116)、H3L5(配列番号112及び配列番号117)、H3L6(配列番号112及び配列番号118)、H4L4(配列番号113及び配列番号116)、H4L5(配列番号113及び配列番号117)、H4L6(配列番号113及び配列番号118)、H5L4(配列番号114及び配列番号116)、H5L5(配列番号114及び配列番号117)、H5L6(配列番号114及び配列番号118)、H6L4(配列番号115及び配列番号116)、H6L5(配列番号115及び配列番号117)、H6L6(配列番号115及び配列番号118)、H7L4(配列番号119及び配列番号116)、H7L5(配列番号119及び配列番号117)、H7L6(配列番号119及び配列番号118)、H8L4(配列番号120及び配列番号116)、H8L5(配列番号120及び配列番号117)、H8L6(配列番号120及び配列番号118)、H9L4(配列番号121及び配列番号116)、H9L5(配列番号121及び配列番号117)、又はH9L6(配列番号121及び配列番号118)。
【０１１０】
抗体重鎖可変領域は、配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つに対して75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上又は100%の同一性を有してもよく、本明細書で定義されるCDRH1、CDRH2、及びCDRH3、又は変異体が存在し;並びに重鎖可変領域はKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む。例えば、CDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号2又は95であり、CDRH1は配列番号1である。
【０１１１】
例えば、重鎖可変領域は、
(a)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基;Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基;
(b)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基;
(c)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基;又は
(d)Kabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基
をさらに含んでもよい。
【０１１２】
抗体軽鎖可変領域は、配列番号116、117又は118のいずれか一つに対して75%以上、80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上、98%以上、99%以上、又は100%の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRL1、CDRL2、及びCDRL3、又は変異体が存在し;並びに軽鎖可変領域はKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む。例えば、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、CDRL3は配列番号109である。
【０１１３】
例えば、軽鎖可変領域は、
(a)Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;
(b)Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;又は
(c)Kabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基
をさらに含んでもよい。
【０１１４】
任意の重鎖可変領域を、任意の軽鎖可変領域と組み合わせてもよい。
【０１１５】
配列番号112〜121の配列の同一性%は、配列の全長にわたって決定することができる。
【０１１６】
抗体重鎖可変領域は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つの変異体であってよい。抗体軽鎖可変領域は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号116、117又は118のいずれか一つの変異体であってもよい。
【０１１７】
例えば、上記のカノニカルCDR及びカノニカルフレームワーク残基置換は、少なくとも75%同一であるか、又は最大30個のアミノ酸置換を含む変異体配列として重鎖又は軽鎖可変領域変異体中に存在してもよい。
【０１１８】
任意の重鎖可変領域を、好適なヒト定常領域と組み合わせることができる。任意の軽鎖可変領域を、好適な定常領域と組み合わせることができる。
【０１１９】
本発明はまた、ミオスタチンに結合し、配列番号123、125、127、又は138〜144のいずれか一つから選択される重鎖を含むヒト化抗原結合タンパク質も提供する。ヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号145、146、又は147のいずれか一つから選択される軽鎖を含んでもよい。任意の重鎖を、任意の軽鎖と組み合わせることができる。抗原結合タンパク質は、ミオスタチンを中和することもできる。
【０１２０】
ヒト化抗原結合タンパク質は、以下の重鎖及び軽鎖の組合せのいずれか一つを含んでもよい:H3L4(配列番号138及び配列番号145)、H3L5(配列番号138及び配列番号146)、H3L6(配列番号138及び配列番号147)、H4L4(配列番号139及び配列番号145)、H4L5(配列番号139及び配列番号146)、H4L6(配列番号139及び配列番号147)、H5L4(配列番号140及び配列番号145)、H5L5(配列番号140及び配列番号146)、H5L6(配列番号140及び配列番号147)、H6L4(配列番号141及び配列番号145)、H6L5(配列番号141及び配列番号146)、H6L6(配列番号141及び配列番号147)、H7L4(配列番号142及び配列番号145)、H7L5(配列番号142及び配列番号146)、H7L6(配列番号142及び配列番号147)、H8L4(配列番号143及び配列番号145)、H8L5(配列番号143及び配列番号146)、H8L6(配列番号143及び配列番号147)、H9L4(配列番号144及び配列番号145)、H9L5(配列番号144及び配列番号146)、H9L6(配列番号144及び配列番号147)、H7無効化L4(配列番号123及び配列番号145)、H7無効化L5(配列番号123及び配列番号146)、H7無効化L6(配列番号123及び配列番号147)、H8無効化L4(配列番号125及び配列番号145)、H8無効化L5(配列番号125及び配列番号146)、H8無効化L6(配列番号125及び配列番号147)、H9無効化L4(配列番号127及び配列番号145)、H9無効化L5(配列番号127及び配列番号146)、又はH9無効化L6(配列番号127及び配列番号147)。
【０１２１】
抗体重鎖は、配列番号に対して75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上又は100%の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRH1、CDRH2及びCDRH1、又は変異体が存在し;並びに重鎖はKabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む。例えば、CDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号2又は95であり、CDRH1は配列番号1である。
【０１２２】
例えば、重鎖は、
(a)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基;Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基;
(b)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基
(c)Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基;又は
(d)Kabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基
をさらに含んでもよい。
【０１２３】
抗体軽鎖は、配列番号のいずれか一つに対して75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上又は100%の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRL1、CDRL2及びCDRL3、又は変異体が存在し;並びに軽鎖はKabatの位置71のチロシン残基;並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む。例えば、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、CDRL3は配列番号109である。
【０１２４】
例えば、軽鎖は、
(a)Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;
(b)Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基;又は
(c)Kabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基
をさらに含んでもよい。
【０１２５】
配列番号の配列の同一性%は、配列の長さにわたって決定することができる。
【０１２６】
抗体重鎖は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号のいずれか一つの変異体であってもよい。抗体軽鎖は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号のいずれか一つの変異体であってもよい。
【０１２７】
例えば、上記の基準ＣＤＲおよび基準フレームワーク残基置換は、少なくとも７５％同一であるか、または３０個までのアミノ酸置換を含有する変異体配列として、変異体重鎖または軽鎖可変領域中にも存在し得る。
【０１２８】
上記のような抗原結合タンパク質、例えば、１つ以上のアミノ酸の化学的修飾および／または挿入、欠失または置換による配列の部分的変更を有する変異体、あるいは上記の配列のいずれかと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するものは、１０Ｂ３または１０Ｂ３キメラ（重鎖：配列番号７または２５、軽鎖：配列番号８）により実証された効力の１０倍以内、または５倍以内の、ＥＣ５０により実証されるようなミオスタチンとの結合に関する効力を示し得る。ミオスタチンとの結合に関する効力は、ＥＣ５０により実証されるように、ＥＬＩＳＡ検定により実行され得る。
【０１２９】
本発明の抗原結合タンパク質は、中和されたＦｃであり得る。Ｆｃ中和を達成する一方法は、重鎖定常領域の位置２３５および２３７（ＥＵインデックス番号付与法）のアラニン残基の置換を包含する。例えば、抗原結合タンパク質は、中和されたＦｃであり、配列番号１２３（ヒト化重鎖：Ｈ７＿Ｇ５５Ｓ−Ｆ１００Ｇ＿Ｙ  Ｆｃ（中和））；または配列番号１２５（ヒト化重鎖：Ｈ８＿Ｇ５５Ｓ−Ｆ１００Ｇ＿Ｙ  Ｆｃ（中和））または配列番号１２７（ヒト化重鎖Ｈ９＿Ｇ５５Ｓ−Ｆ１００Ｇ＿Ｙ  Ｆｃ（中和））の配列を含み得る。代替的には、抗原結合タンパク質は、中和されたＦｃであり、位置２３５および２３７のアラニン置換を含まない。
【０１３０】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質が結合するミオスタチンのエピトープは、立体配座的または不連続的エピトープであり得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質はミオスタチン上の線状エピトープと結合し得ず、例えば、抗原結合タンパク質は、ミオスタチンの還元または変性試料と結合し得ない。立体配座的または不連続的エピトープは、ミオスタチン受容体結合部位と同一であるか、類似するか、または重複し得る。エピトープは、ミオスタチンがその成熟形態であり、別のミオスタチン分子との二量体（ホモ二量体）の一部として存在する場合、利用可能であり得る。エピトープは、ミオスタチンがその成熟形態であり、そして記載されるような他のミオスタチン結合分子との四量体の一部として存在する場合も、利用可能であり得る。エピトープは、２つのミオスタチンポリペプチドを横断して分布され得る。この型の不連続エピトープは、各ミオスタチン分子からの配列を含み得る。配列は、二量体の三次および四次構造の状況では、エピトープを形成するのに互いに十分に近く、抗原結合タンパク質により結合され得る。立体配座的および／または不連続的エピトープは、既知の方法により、例えばＣＬＩＰＳ（商標）（Pepscan Systems）により同定され得る。
【０１３１】
Pepscanの足場上化学結合型免疫原性ペプチド（ＣＬＩＰＳ）技法を用いた１０Ｂ３Ｃのミオスタチン結合部位のその後の分析は、ミオスタチンの「ＰＲＧＳＡＧＰＣＣＴＰＴＫＭＳ」アミノ酸配列がキメラ抗体のための結合部位であり得る、ということを示唆する。Pepscan法は、束縛ペプチドを用いる。
【０１３２】
ヒト化抗原結合タンパク質は、ヒトにおいて、またはネズミ動物モデルにおいて、in vivoで少なくとも６時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日または少なくとも９日の半減期を有し得る。
【０１３３】
ヒト化抗原結合タンパク質が結合するミオスタチンポリペプチドは、組換えポリペプチドであり得る。ミオスタチンは溶液中に存在し得るし、あるいは固体表面に付着され得る。例えばミオスタチンは、ビーズ、例えば磁気ビーズに付着され得る。ミオスタチンは、ビオチニル化され得る。ミオスタチンに接合されるビオチン分子は、固体表面にビオチンストレプトアビジンをカップリングすることにより固体表面にミオスタチンを固定するために用いられ得る。
【０１３４】
ヒト化抗原結合タンパク質は、ラット、マウス、霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界ザルまたは大型類人猿）またはヒトに由来し得る。抗原結合タンパク質は、ヒト化またはキメラ抗体であり得る。
【０１３５】
ヒト化抗原結合タンパク質は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのものであり得る定常領域を含み得る。定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体のものであり得る。抗原結合タンパク質定常領域は、ＩｇＧ１であり得る。
【０１３６】
抗体のＦｃエフェクター部分に対する突然変異的変化を用いて、ＦｃＲｎおよび抗体間の相互作用の親和性を変えて、抗体代謝回転を調整し得る。抗体の半減期は、in vivoで延長され得る。これは、最大投与量および最大投与頻度が長期間in vivoＩＣ５０を維持する結果として達成され得る場合、患者集団に有益である。ミオスタチンは可溶性標的であるため、抗体のＦｃエフェクター機能は、全部または一部、除去され得る。この除去は、安全性プロフィール増大を生じ得る。
【０１３７】
定常領域を含むヒト化抗原結合タンパク質は、低減されたＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能性を有し得る。定常ドメインは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の天然中和定常領域、あるいは突然変異化ＩｇＧ１定常ドメインを含み得る。適切な修飾の例は、ＥＰ０３０７４３４に記載されている。Ｆｃ中和を達成する一方法は、重鎖定常領域の位置２３５および２３７（ＥＵインデックス番号付与法）でのアラニン残基の置換を含む。
【０１３８】
抗体が増強されたエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を有するよう、ヒト化抗原結合タンパク質は、突然変異化定常ドメインから選択される１つ以上の修飾を含み得る。適切な修飾の例は、Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604、Lazar et al. PNAS (2006) 103: 4005-4010ならびにＵＳ６７３７０５６、ＷＯ２００４０６３３５１およびＷＯ２００４０２９２０７に記載されている。
【０１３９】
ヒト化抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を有するよう、抗原結合タンパク質は、変更されたグリコシル化プロフィールを有する定常ドメインを含み得る。変更されたグリコシル化プロフィールを有する抗原結合タンパク質を産生するための適切な方法の例は、ＷＯ２００３／０１１８７８、ＷＯ２００６／０１４６７９およびＥＰ１２２９１２５に記載されている。
【０１４０】
本発明は、本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。核酸分子は、（ｉ）１つ以上のＣＤＲＨ、重鎖可変配列または全長重鎖配列；および（ｉｉ）1つ以上のＣＤＲＬ、軽鎖可変配列、または全長軽鎖配列をコードする配列を含み、同一核酸分子上に（ｉ）および（ｉｉ）を有する。代替的には、本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、（ａ）１つ以上のＣＤＲＨ、重鎖可変領域、または全長重鎖配列；あるいは（ｂ）1つ以上のＣＤＲＬ、軽鎖可変配列、または全長軽鎖配列をコードする配列を含み、（ａ）および（ｂ）は別個の核酸分子上にある。
【０１４１】
重鎖をコードする核酸分子は、配列番号122, 124, 126, 128-131, 135-137を含み得る。軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号132, 133または134を含み得る。
【０１４２】
あるいは、重鎖をコードする核酸分子は、配列番号123, 125, 127, または138-144の重鎖アミノ酸配列をコードする可変重鎖ＤＮＡ配列を含み得る。軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号145, 146または147の軽鎖アミノ酸配列をコードする軽鎖DNA配列を含み得る。
【０１４３】
抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、次の１以上の重鎖および軽鎖組合せを含みうる：H3L4 (配列番号128および配列番号132), H3L5 (配列番号128および配列番号133), H3L6 (配列番号128および配列番号134),  H4L4 (配列番号129および配列番号132),  H4L5 (配列番号129および配列番号133),  H4L6 (配列番号129および配列番号134),  H5L4 (配列番号130および配列番号132),  H5L5 (配列番号130および配列番号133),  H5L6 (配列番号130および配列番号134),  H6L4 (配列番号131および配列番号132),  H6L5 (配列番号131および配列番号133),  H6L6 (配列番号131および配列番号134), H7L4 (配列番号135および配列番号132), H7L5 (配列番号135および配列番号133), H7L6 (配列番号135および配列番号134), H8L4 (配列番号136および配列番号132), H8L5 (配列番号136および配列番号133), H8L6 (配列番号136および配列番号134), H9L4 (配列番号137および配列番号132), H9L5 (配列番号137および配列番号133), H9L6 (配列番号137および配列番号134), H7非機能化L4 (配列番号122および配列番号132), H7非機能化L5 (配列番号122および配列番号133), H7非機能化L6 (配列番号122および配列番号134), H8非機能化L4 (配列番号124および配列番号132), H8非機能化L5 (配列番号124および配列番号133), H8非機能化L6 (配列番号124および配列番号134), H9非機能化L4 (配列番号126および配列番号132), H9非機能化L5 (配列番号126および配列番号133), またはH9非機能化L6 (配列番号126および配列番号134)。
【０１４４】
本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子を含む発現ベクターも提供する。本明細書中に記載されるような発現ベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。
【０１４５】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、適切な宿主細胞中で産生され得る。本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の産生方法は、本明細書中に記載されるような宿主細胞を培養するステップ、ならびに抗原結合タンパク質を回収するステップを包含し得る。組換え形質転換、トランスフェクト化または形質導入宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含み得る（上記発現カセットは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む）。代替的には、組換え形質転換、トランスフェクト化または形質導入宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含み（第一発現カセットは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む）、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第二カセットを含み得る。安定的に形質転換された宿主細胞は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖をコードする１つ以上の発現カセットを含むベクターを含み得る。例えば、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第一ベクター、ならびに重鎖をコードする第二ベクターを含み得る。
【０１４６】
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類であり得る。このような細胞株の例としては、ＣＨＯまたはＮＳ０が挙げられる。宿主細胞は、非ヒト宿主細胞であり得る。宿主細胞は、非胚性宿主細胞であり得る。宿主細胞は、培地、例えば無血清培地中で培養され得る。抗原結合タンパク質は、宿主細胞により倍地中に分泌され得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、ヒト化抗原結合タンパク質を含有する上記培地に関して、少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）に精製され得る。
【０１４７】
ヒト化抗原結合タンパク質および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が、提供され得る。医薬組成物を使用説明書と一緒に含むkit-of-partsが提供され得る。便益のために、キットは、予定量の試薬を、使用説明書とともに含み得る。
【０１４８】
抗体構造
無傷抗体
ほとんどの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと呼ばれる２つの型のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は、５つの異なるクラス  ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＧおよびＩｇＡは、さらに、サブクラス  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に細分され得る。種変異体は、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットに伴って存在する。
【０１４９】
可変領域のより多く保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。無傷重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＣＤＲにより連結される４つのＦＲを含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより極く近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０１５０】
定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、しかし、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に参加すること、Ｆｃγ受容体との結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による半減期／清掃率、ならびに補体カスケードのＣ１ｑ成分による補体依存性細胞傷害を示す。
【０１５１】
ヒトＩｇＧ２定常領域は、古典的経路により補体を活性化するかまたは抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を本質的に欠くことが報告されている。ＩｇＧ４定常領域は、古典的経路により補体を活性化する能力を欠くことが報告されており、抗体依存性細胞性細胞傷害を弱く媒介するだけである。これらのエフェクター機能を本質的に欠いている抗体は、「非溶解性」抗体と呼ばれ得る。
【０１５２】
ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に既知の多数の方法により産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞株を用いて、ハイブリドーマ法により作製され得る（Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001および Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照）。代替的方法としては、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用（これらはともに、ヒト可変領域レパートリーを利用する）が挙げられる（Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455；Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23参照）。
【０１５３】
そのマウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに置き換えられたトランスジェニックマウスのいくつかの系統が、目下利用可能である（Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727； Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851； Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156参照）。抗原投与時に、このようなマウスは、当該抗体が選択され得るヒト抗体のレパートリーを産生し得る。
【０１５４】
ファージ表示技法は、ヒト抗原結合タンパク質（およびその断片）を産生するために用いられ得る。McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 および Griffiths et al. (1994) EMBO 13: 3245-3260を参照されたい。
【０１５５】
親和性成熟の技法（Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783）を用いて、結合親和性を改良し得るが、この場合、一次ヒト抗体の親和性は、順次、ＨおよびＬ鎖可変領域を天然変異体に取り替えて、改良された結合親和性に基づいて選択することにより改良される。「エピトープ刷り込み」のようなこの技法の変異体も、目下、利用可能である。ＷＯ  ９３／０６２１３；Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266を参照されたい。
【０１５６】
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて産生される。慣用的手法を用いて（例えば、抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、抗体をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの典型的供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に入れられ、これは次に、別の状況では抗体の合成を得るために免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞中にトランスフェクトされる。ＤＮＡは、ヒトＬおよびＨ鎖に関するコード配列を対応する非ヒト（例えばネズミ）ＨおよびＬ定常領域の代わりに置換することにより修飾され得る（例えば、Morrison (1984) PNAS 81: 6851参照）。
【０１５７】
免疫原性の大きな減少は、ヒトフレームワーク（「受容体フレームワーク」）および定常領域上に非ヒト（例えば、ネズミ）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲをグラフトして、ヒト化抗体を生成することによってのみ、達成され得る（Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525;および Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536参照）。しかしながら、ＣＤＲグラフト化は、それ自体、抗原結合特性の完全保持を生じ得ず、そしてしばしば、有意の抗原結合親和性が回収されるべきものである場合、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基（時として「復帰突然変異」と呼ばれる）は、ヒト化分子中に保存される必要がある、ということが見出されている（Queen et al. (1989) PNAS 86: 10,029-10,033； Co et al. (1991) Nature 351: 501-502参照）。この場合、非ヒトドナー抗体との最大配列相同性を示すヒト可変領域が、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、データベースから選択される。ヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体からなされ得る。必要な場合、ドナー抗体からの重要な残基は、ヒト受容体フレームワーク中で置換されて、ＣＤＲ立体配座を保存し得る。抗体のコンピューターモデル化を用いて、このような構造的に重要な残基を同定する手助けをし得る（ＷＯ９９／４８５２３参照）。
【０１５８】
代替的には、ヒト化は、「張り合わせ（veneering）」のプロセスにより達成され得る。独特のヒトおよびネズミ免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計学的分析は、曝露残基の精確なパターンはヒト抗体とネズミ抗体とで異なり、ほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基に対する強い選択性を有する、ということを明示した（Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498;および Pedersen et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973参照）。したがって、ヒト抗体中に通常見出されるものと異なるそのフレームワーク領域中の曝露残基を置き換えることにより、非ヒトＦｖの免疫原性を低減することが可能である。タンパク質抗原性は表面接触可能性と相関し得るため、表面残基の置き換えは、マウス可変領域をヒト免疫系に対して「見えないように」するのに十分であり得る（Mark et al. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134も参照）。抗体の表面のみが変更され、支持残基は妨害されないままであるため、ヒト化のこの手法は「張り合わせ」と呼ばれる。さらなる代替的アプローチとしては、ＷＯ０４／００６９５５に記述されたもの、ならびに細菌発現系を用いて、配列中のヒト生殖系列に近接した抗体を産生するHumaneerig（商標）（Kalobios）の手法が挙げられる（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California）。
【０１５９】
二重特異性抗原結合タンパク質
二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なるエピトープに関する結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。このような抗原結合タンパク質の製造方法は、当該技術分野で既知である。伝統的に、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え的産生は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖の同時発現に基づいており、この場合、２つのＨ鎖は異なる結合特異性を有する（Millstein et al. (1983) Nature 305: 537-539; ＷＯ  ９３／０８８２９；およびTraunecker et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659参照）。ＨおよびＬ鎖の無作為取り合わせのため、１０個の異なる抗体構造の考え得る混合物が産生され、このうちの１つだけが所望の結合特異性を有する。代替的アプローチは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域と融合することを包含する。軽鎖結合に必要な部位を含有するＣＨ１領域は、縮合物のうちの少なくとも１つに存在し得る。これらの融合物をコードするＤＮＡ、ならびに所望により、Ｌ鎖は、別個の発現ベクター中に挿入され、次いで、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトされる。しかし、２つまたは３つ全ての鎖に関するコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕における第一結合特異性を有するＨ鎖、ならびに他方の腕における第二結合特異性を提供するＨ−Ｌ鎖対で構成される（ＷＯ  ９４／０４６９０参照）。Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210も参照されたい。
【０１６０】
抗原結合断片
定常領域を欠く断片は、古典的経路により補体を活性化する能力、または抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を欠く。伝統的に、このような断片は、例えばパパイン消化による無傷抗体のタンパク質分解的消化により産生される（例えばＷＯ  ９４／２９３４８参照）が、しかし、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接産生されることもある。ＳｃＦｖの産生に関しては、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426を参照されたい。さらに、抗原結合断片は、下記のような種々の工学処理技法を用いて産生され得る。
【０１６１】
Ｆｖ断片は、それらの２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂ断片より低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの会合を安定化するために、それらは、ペプチド(Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuber et al. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367)および「ノブ・イン・ホール（knob in hole）」突然変異(Zhu et al. (1997) Protein Sci., 6: 781-788)と結び付けられてきた。ＳｃＦｖ断片は、当業者に周知の方法により産生され得る（Whitlow et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105およびHuston et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217参照）。ＳｃＦｖは、細菌細胞、例えば大腸菌中で、または真核生物細胞中で産生され得る。ＳｃＦｖの１つの欠点は生成物の一価性であり、これは、多価結合によるものである結合活性増大ならびにそれらの短い半減期を妨げる。これらの問題を克服するための試みとしては、化学的カップリング(Adams et al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034; and McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8: 301-314)により、あるいは非対合Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの自発性部位特異的二量体化(Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204参照)により、付加的Ｃ末端システインを含有するＳｃＦｖから産生される二価（ＳｃＦｖ’）２が挙げられる。代替的には、ＳｃＦｖは、「ダイアボディ」を形成するためにペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮することにより、多量体を形成するよう強いられ得る（Holliger et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448参照）。さらに、リンカーの縮小は、ＳｃＦｖ三量体(「トリアボディ」、Kortt et al. (1997) Protein Eng 10: 423-433参照)および四量体(「テトラボディ」、Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168参照)を生じ得る。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体」（Pack et al. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584参照)および「ミニボディ」(Hu et al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061参照) を形成するためにタンパク質二量体化モチーフを用いた遺伝子融合によっても達成され得る。第三ペプチドリンカーにより２つのＳｃＦｖ単位を連結することにより、ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム(（ＳｃＦｖ）２)も産生され得る（Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582参照）。二重特異性ダイアボディは、短いリンカーによりもう一つの抗体のＶＬドメインに連結された一抗体からのＶＨドメインからなる２つの一本鎖融合生成物の非共有的会合により、産生され得る（Kipriyanov et al. (1998) Int. J. Can 77: 763-772参照）。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、上記のようなジスルフィド架橋または「ノブ・イン・ホール」突然変異の導入により、あるいは２つのハイブリッドＳｃＦｖ断片がペプチドリンカーにより連結される一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）の形成により、増強され得る（Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188参照）。四価二重特異性分子は、例えば、ＳｃＦｖ断片を、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂ断片に融合することにより入手可能である（Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163参照）。代替的には、四価二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合により作製されている(Alt et al. (1999) FEBS Lett 454: 90-94参照)。らせん−ループ−らせんモチーフを含有するリンカーを用いたＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化によるより小さな四価二重特異性分子(ＤｉＢｉミニ��体、 Muller et al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49参照)、あるいは分子内対合を防止する配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子(タンデムダイアボディ、Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56参照)も、形成され得る。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片の化学的カップリングにより、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化により、作製され得る(Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225；およびKostelny et al. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553参照)。単離ＶＨおよびＶＬドメイン(Domantis plc)MO 入手可能である（ＵＳ６，２４８，５１６；ＵＳ６，２９１，１５８；およびＵＳ６，１７２，１９７参照）。
【０１６２】
ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて形成される２つの共有的に結び付けられた抗体からなる（例えば、ＵＳ４，６７６，９８０参照）。
【０１６３】
その他の修飾
本発明の抗原結合タンパク質は、それらのエフェクター機能を増強するかまたは変えるために、他の修飾を含み得る。抗体のＦｃ領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との間の相互作用は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体の固定、食作用ならびに抗体の半減期／クリアランスを包含する抗体のエフェクター機能を媒介する、と考えられる。抗体のＦｃ領域に対する種々の修飾は、所望の特性に依って実行され得る。例えば、別の状況では溶解性である抗体を非溶解性にさせるＦｃ領域における特異的突然変異は、ＥＰ０６２９  ２４０およびＥＰ０３０７  ４３４に詳述されており、あるいは、血清半減期を増大するために抗体中にサルベージ受容体結合エピトープを組み入れ得る（ＵＳ５，７３９，２７７参照）。ヒトＦｃγ受容体としては、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎが挙げられる。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604は、共通組のＩｇＧ１残基が全てのＦｃγＲｓを結合するのに関与するが、一方、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通組の範囲外の別個の部位を利用する、ということを実証した。ＩｇＧ１残基の一群は、アラニン：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９に変更された場合、全てのＦｃγＲとの結合を低減した。全てがＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン中に存在し、ＣＨ１およびＣＨ２をつなぐヒンジの近くに群をなす。ＦｃγＲＩは結合のためにＩｇＧ１残基の共通組のみを利用するが、しかしＦｃγＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、共通組のほかに、別個の残基と相互作用する。いくつかの残基の変更は、ＦｃγＲＩＩ（例えばＡｒｇ−２９２）またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、Ｇｌｕ−２９３）との結合のみを低減した。いくつかの変異体は、ＦｃγＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩとの改良された結合を示したが、しかし、他の受容体との結合に作用しなかった（後Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＩＩとの結合を改良したが、しかしＦｃγＲＩＩＩとの結合は作用を受けなかった）。他の変異体は、ＦｃγＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩとの改良された結合を示し、他の受容体との結合の低減を伴った（例えば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＩＩＩとの結合を改良し、ＦｃγＲＩＩとの結合を低減した）。ＦｃγＩＩＩａに関して、最良の結合ＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４でのアラニン置換を併有した。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスおよび組織全体の経細胞輸送の両方に関与すると考えられる（Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57；およびGhetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766参照）。ヒトＦｃＲｎと直接的に相互作用するよう決定されたヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が挙げられる。この節に記載された位置のいずれかでの置換は、抗体の血清半減期増大および／またはエフェクター特性変更を可能にし得る。
【０１６４】
その他の修飾としては、抗体のグリコシル化変異体が挙げられる。それらの定常領域中の保存位置での抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に及ぼす顕著な作用を有することが知られている（例えばBoyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318参照）。１つ以上の炭水化物部分が吹かされ、置換され、欠失されまたは修飾される抗体またはその抗原結合断片のグリコシル化変異体が、意図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的付着のための潜在的部位を作製し、したがって、抗体のグリコシル化を操作するために用いられ得る。Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876では、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα，２，３シアリルトランスフェラーゼを用いて、再ガラクトシル化および／または再シアリル化の工程を通して、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化が増大された。末端シアリル化の増大は、免疫グロブリンの半減期を増大すると考えられる。抗体は、大半の糖タンパク質と同様に、典型的には糖型の混合物として産生される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳類細胞中で産生される場合に、特に明白である。限定された糖型物質を製造するために、種々の方法が開発されてきた（Zhang et al. (2004) Science 303: 371； Sears et al. (2001) Science 291: 2344； Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727参照）。抗体(例えば、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１)は、本明細書中で用いられる場合、限定数(例えば、７以下、例えば５以下、例えば２または１)の糖型物質(単数または複数)を含み得る。
【０１６５】
抗体は、非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンとカップリングされ得る。タンパク質とＰＥＧとの共役は、タンパク質の半減期を増大するための、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を低減するための確立された技法である。異なる分子量およびスタイル（線状または分枝鎖）を有するＰＥＧ化の使用は、無傷抗体ならびにＦａｂ’断片を用いて研究されてきた（Koumenis et al. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95参照）。
【０１６６】
製造方法
抗原結合タンパク質は、トランスジェニック生物、例えばヤギ(Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157参照)、ニワトリ(Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55参照)、マウス(Pollock et al.参照)または植物(Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590参照)中で産生され得る。
【０１６７】
抗原結合タンパク質は、化学合成によっても産生され得る。しかしながら、抗原結合タンパク質は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技法を用いて産生される。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単離され、複製可能ベクター、例えば、さらなるクローニング（増幅）または発現のためのプラスミド中に挿入される。一発現系は、グルタミン酸合成酵素系（例えば、Lonza Biologicsにより販売されている）であり、特にこの場合、宿主細胞はＣＨＯまたはＮＳ０である。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慣用的手法（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）を用いて、容易に単離され、シーケンシングされる。用いられ得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、この中で、典型的にはプラスミドが用いられ得る。一般的に、このようなベクターはさらに、シグナル配列、複製の起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列（発現を促すために抗原結合タンパク質ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される）を包含する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター中に挿入され、そして同時にまたは順次、同一宿主中に（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔または形質導入により）導入されるか、あるいは所望により、上記の導入前に、重鎖および軽鎖はともに同一ベクター中に挿入され得る。
【０１６８】
コドン最適化は、宿主細胞により産生されるタンパク質の総レベルが、野生型配列によりトランスフェクトされる場合のレベルと比較して、コドン最適化遺伝子でトランスフェクトされる場合により大きくなるよう意図して、用いられ得る。いくつかの方法が発表されている（Nakamura et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; Ｗ０９８／３４６４０；  Ｗ０９７／１１０８６）。遺伝暗号の冗長性のために、本明細書中に開示されるもの（特に、所定の宿主細胞中での発現のために最適化されたコドン）に代わるポリヌクレオチドも、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質をコードし得る。その本発明の抗原結合タンパク質のコドン使用頻度は、転写体および／または生成物収量を増大するために宿主細胞のコドン偏位を受け入れるよう修飾され得る（例えば、Hoekema et al Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24）。コドンの選択は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。
【０１６９】
シグナル配列
抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として産生され得る。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシングされるはずである。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性腸毒素ＩＩリーダーであり得る。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであり得る（例えばＷＯ９０／１３６４６参照）。哺乳類細胞系では、ウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルおよびネイティブ免疫グロブリンシグナル配列が適切であり得る。典型的には、シグナル配列は、リーディングフレーム中で、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡと結紮される。配列番号９で示されるようなシグナル配列が用いられ得る。
【０１７０】
複製の起点
複製の起点は当該技術分野で周知であり、ほとんどのグラム陰性細菌に関してはｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母に関しては２μプラスミド、そしてほとんどの哺乳類細胞に関しては種々のウイルス起点、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶが適している。一般的に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターのためには必要でないが、しかし早期プロモーターを含有するため、ＳＶ４０が用いられ得る。
【０１７１】
選択マーカー
典型的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、あるいは（ｂ）栄養要求性欠損を補足し、または複合培地中で利用可能でない栄養素を供給する、あるいは（ｃ）両方の組合せであるタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止することを包含し得る。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時送達された選択マーカーにより付与される薬剤抵抗性のために生き残る。一例は、ＤＨＦＲ選択マーカーであって、この場合、形質転換体はメトトレキサートの存在下で培養される。細胞は、漸増量のメトトレキサートの存在下で培養されて、当該外因性遺伝子のコピー数を増幅し得る。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択のために、特に有用な細胞株である。さらなる一例は、グルタミン酸合成酵素発現系（Lonza Biologics）である。酵母に用いるための選択遺伝子の一例は、ｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38参照）。
【０１７２】
プロモーター
抗原結合タンパク質を発現するための適切なプロモーターは、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばＴａｃが挙げられる。酵母細胞における発現に適したプロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導可能な酵素プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、ならびに窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。
【０１７３】
哺乳類細胞系における発現のためのプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、最初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびに早期または後期シミアンウイルス４０が挙げられる。もちろん、プロモーターの選択は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性に基づいている。最初のプラスミドは、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、κＣ領域をネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーと一緒に含み、二番目のプラスミドは、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含み得る。
【０１７４】
エンハンサー要素
例えば高等真核生物に関して適切である場合、ベクター中でプロモーター要素に操作可能的に連結されるエンハンサー要素が用いられ得る。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質およびインスリンからのエンハンサー要素が挙げられる。代替的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサー要素、例えばＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０で）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミＩｇＧ２ａ遺伝子座を用い得る（ＷＯ０４／００９８２３参照）。エンハンサーは、プロモーターに対して蒸留の部位でベクター上に置かれ得る。代替的には、エンハンサーは、他の場所に、例えば非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に置かれ得る。エンハンサーの選択および位置決めは、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。
【０１７５】
ポリアデニル化／終結
真核生物系において、ポリアデニル化シグナルは、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。このようなシグナルは、典型的には、オープンフレームワークの３’に配置される。哺乳類系では、非限定例としては、成長ホルモンに由来するシグナル、伸長因子１αおよびウイルス（例えばＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルス長末端反復が挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルとしては、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、典型的には必要とされず、その代わりに、より短く、より限定されたターミネーター配列を用いることが常である。ポリアデニル化／終結配列は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。
【０１７６】
その他の方法／収量を高めるための要素
上記のほかに、収量を高めるために用いられ得るその他の特徴としては、クロマチンリモデリング要素、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン修飾が挙げられる。
【０１７７】
宿主細胞
抗原結合タンパク質をコードするクローニングまたは発現ベクターのための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。適切な原核生物細胞としては、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌属、例えば大腸菌（例えば、ＡＴＣＣ  ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア族、例えばセラチア・マルセセンス、および赤痢菌属、ならびにバスラス属、例えば枯草菌およびバシラス・リケニフォルミス（ＤＤ２６６  ７１０参照）、シュードモナス属、例えば緑膿菌、およびストレプトミセス属が挙げられる。酵母宿主細胞のうち、出芽酵母、分裂酵母、クルイベロミセス（例えば、ＡＴＣＣ  １６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）、メタノール資化酵母（ＥＰ  １８３０７０、Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192も参照）、カンジダ属、トリコデルマ・リーシア（ＥＰ  ２４４２３４）、ペニシリン、トリポクラジウム属およびアスペルギルス属宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランスおよびクロカビも意図される。
【０１７８】
高等真核生物宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚性腎臓細胞株  ２９３、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  ＮＯ：  ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ  １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞  ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＮＯ：ＣＣＬ  ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株、例えばＤＧ４４（Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556参照）、特に、懸濁培養用に適応されたＣＨＯ細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばＮＳ０（ＵＳ  ５，８０７，７１５参照）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が挙げられる。
【０１７９】
このような宿主細胞はさらにまた、抗原結合タンパク質の質、機能および／または収量を改変するために、工学処理され、または適応され得る。非限定例としては、特異的改変（例えば、グリコシル化）酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンが挙げられる。
【０１８０】
細胞培養方法
抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に既知の任意の方法により培養され得る。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトルまたは中空繊維系中で培養され得るが、しかし、大量生産のためには、撹拌タンク反応器が、特に懸濁培養のために用いられる。撹拌タンクは、例えばスパージャー、そらせ板または低剪断翼を用いて、曝気のために適応され得る。気泡塔およびエアリフト反応器に関しては、空気または酸素気泡による直接曝気が用いられ得る。宿主細胞が無血清培地中で培養される場合、曝気工程の結果としての細胞損傷を防止するのに役立つよう、細胞保護剤、例えばプルロニックＦ−６８を、培地は補足される。宿主細胞特性によって、微小担体が足場依存性細胞株のための増殖基質として用いられ得るか、あるいは細胞は懸濁培養に適応され得る（これが典型的）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、種々の操作方式、例えばフェドバッチ、反復バッチ処理（Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109参照）、延長バッチ法または還流培養を利用し得る。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞は血清含有培地、例えばウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で培養され得るが、しかし、例えばこのような宿主細胞は、Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163に開示されているような合成無血清培地、あるいは市販の培地、例えばＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭまたはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Cambrex NJ, USA）中で、必要な場合には、エネルギー源、例えばグルコースおよび合成成長因子、例えば組換えインスリンを補足して、培養される。宿主細胞の無血清培養は、それらの細胞が無血清条件で増殖するよう順応されることを必要とし得る。一順応アプローチは、血清含有培地中でこのような宿主を培養し、そして、宿主細胞が無血清条件で順応することを習得するよう、繰り返し、培地の８０％を無血清培地に交換することである（例えば、Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers参照）。
【０１８１】
培地中に分泌される抗原結合タンパク質は、種々の技法を用いて回収され、精製されて、意図された使用に適した精製度を提供し得る。例えば、ヒト患者の治療のための抗原結合タンパク質の使用には、典型的には、（粗製培地と比較して）少なくとも９５％の純度、さらに典型的には９８％または９９％またはそれ以上の純度を要する。培地からの細胞破砕屑は、典型的には、遠心分離を用いて除去され、その後、例えば微細濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いて、上清を清澄化する。種々の他の技法、例えば透析およびゲル電気泳動、ならびにクロマトグラフィー技法、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（任意に、アフィニティータグ系、例えばポリヒスチジンを包含する）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、  ＵＳ５，４２９，７４６参照）が利用可能である。抗体は、種々の清澄化ステップ後、プロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉され得る。さらなるクロマトグラフィーステップ、例えばイオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈降がその後に続き得る。種々のウイルス除去ステップも用いられ得る（例えば、ＤＶ−２０フィルターを用いるナノ濾過）。これらの種々のステップ後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の抗原結合タンパク質を含む精製（例えばモノクローナル）調製物が提供される。このような調製物は、凝集型の抗原結合タンパク質を実質的に含有しない。
【０１８２】
細菌系は、抗原結合断片の発現のために用いられ得る。このような断片は、細胞内に、ペリプラズム内に集中し、または細胞外に分泌され得る。不溶性タンパク質は、当業者に既知の方法に従って、抽出され、再フォールディングされて、活性タンパク質を形成し得る（Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20; and Cupit et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277参照）。
【０１８３】
脱アミド化は、アミド官能基が除去される化学反応である。生化学では、その反応は、アミノ酸のアスパラギンおよびグルタミンのアミド含有側鎖を損傷するため、タンパク質の分解において重要である。脱アミド化反応は、タンパク質の有用な寿命を限定し得ると考えられ、それらは、治療用タンパク質の製造中に生じる最も一般的な翻訳後修飾のうちの１つでもある。例えば、in vitroまたはin vivoの生物学的活性の低減または損失が組換えヒトＤＮＡアーゼおよび組換え可溶性ＣＤ４に関して報告されているが、一方、他の組換えタンパク質は影響を及ぼされないと思われる。ミオスタチンと結合する本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の能力は、脱アミド化を誘導するストレス条件下では影響を及ぼされないと思われる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の生物学的活性、ならびにそれらの有用な寿命は、脱アミド化により影響されるとは考えられない。
【０１８４】
医薬組成物
疾患、障害および症状という用語は、互換的に用いられる。本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の精製調製物は、本明細書中に記載されるヒト疾患の治療に用いるために医薬組成物中に組み入れられ得る。医薬組成物は、ミオスタチンが疾患に寄与するかまたはミオスタチンの活性の中和が有益である疾患の治療に用いられ得る。治療的有効量の本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、ミオスタチン中和に応答する疾患の治療に用いられ得る。
【０１８５】
薬学的調製物は、ヒト化抗原結合タンパク質を、製薬上許容可能な担体と組合せて含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、単独で、または医薬組成物の一部として、投与され得る。
【０１８６】
典型的には、このような組成物は、許容可能な薬学的実行により知られており、求められるような製薬上許容可能な担体を含む（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.参照）。このような担体の例としては、滅菌担体、例えば生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられ、任意に適切な緩衝液で５〜８の範囲内のｐＨに緩衝される。
【０１８７】
医薬組成物は、注射または連続注入（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内）により投与され得る。このような組成物は、適切には、可視的粒状物質を含有しない。医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの抗原結合タンパク質、例えば５ｍｇ〜１ｇの抗原結合タンパク質を含み得る。代替的には、組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば５ｍｇ〜５０ｍｇを含み得る。
【０１８８】
このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。医薬組成物は、単位投薬形態で１ｍｇ〜１０ｇの抗原結合タンパク質を、任意に使用説明書と一緒に含み得る。医薬組成物は、当業者に周知であるかまたは明らかな方法に従って、投与前に再構成するために凍結乾燥（フリーズドライ）され得る。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する場合、このアイソタイプの抗体の銅媒介性分解の程度を低減するために、銅のキレート剤、例えばクエン酸塩（例えばクエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンが医薬組成物に付加され得る（ＥＰ０６１２２５１参照）。医薬組成物は、可溶化剤、例えばアルギニン塩基、洗剤／抗凝集剤、例えばポリソルベート８０、ならびに不活性ガス、例えばバイアル上部空間の酸素に取って代わるための窒素も含み得る。
【０１８９】
抗原結合タンパク質を投与するための有効用量および治療レジメンは、一般的には、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、そして治療されるべき疾患または障害といったような因子に左右され得る。このような因子は、主治医の権限内である。適切な用量を選択するに際しての指針は、例えばSmith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出され得る。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、治療的有効量で投与され得る。
【０１９０】
被験体に投与される抗原結合タンパク質の投与量は、一般的に、１μｇ〜１５０ｍｇ／被験体の体重１ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜２５ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０  ｍｇ／ｋｇである。例えば、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇ／ｋｇであり得る。抗原結合タンパク質は、非経口的に、例えば皮下に、静脈内に、または筋肉内に投与され得る。
【０１９１】
所望により、有効１日用量の治療用組成物が、例えば２、３、４、５、６回またはそれ以上の回数に分けて、適切な間隔で、任意に単位剤形で、投与され得る。例えば、用量は、１４または２８日毎に１回、各投与日に多数回用量投与形態で、皮下投与され得る。
【０１９２】
用量の投与は、静脈内注入により、典型的には１５分〜２４時間、例えば２〜１２時間、または２〜６時間の期間に亘ってなされ得る。これは、有毒副作用の低減を生じ得る。
【０１９３】
用量の投与は、必要に応じて１回以上、例えば１日３回、毎日１回、２日毎に１回、週１回、２週間に１回、月１回、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、または１２ヶ月毎に１回、繰り返され得る。抗原結合タンパク質は、維持療法により、例えば６ヶ月以上の期間の間、週１回、投与され得る。抗原結合タンパク質は、間欠療法により、３〜６ヶ月の期間投与され、次に、３〜６ヶ月間は用量投与せず、その後、３〜６ヶ月間、抗原結合タンパク質を投与するといった周期で用量投与される。
【０１９４】
投与量は、抗ミオスタチン抗原結合タンパク質を標的にする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、生物学的試料中で投与後の循環抗ミオスタチン抗原結合タンパク質の量を測定することにより、決定され、または調整され得る。投与量を決定し、または調整する他の手段、例えば薬理学の生物学的マーカー（「バイオマーカー」）、筋肉量および／または機能、安全性、耐容性および治療反応の測定（これらに限定されない）が利用され得る。抗原結合タンパク質は、被験体におけるミオスタチン活性を下方調節するために有効な量で、有効な期間、投与され得る。
【０１９５】
抗原結合タンパク質は、特定部位を標的として治療を向けるような方法で、被験体に投与され得る。例えば抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋中に、局所的に注射され得る。
【０１９６】
ヒト化抗原結合タンパク質は、本明細書中で記載される疾患の治療に用いられる１つ以上の他の治療的に活性な薬剤、例えばミルタザピン(レメロン、ジスピン：Organon)、酢酸メゲストロール(メガス: BMS)、ドロナビノール(マリノール:Solvay Pharmaceutical Inc.)、オキサンドロロン(オキサンドリン: Savient)、テストステロン、組換え成長ホルモン(例えば、ソマトロピン(セロスチム: Serono)、ニュートロピン(Genentech)、ヒューマトロープ(Lilly)、ゲノトロピン(Pfizer)、ノルディトロピン(Novo)、サイゼン(Merck Serono)およびオムニトロープ(Sandoz))、シプロヘプタジン(ペリアクチン: Merck)、オルニチンオキサグルタレート(Cetornan)、メチルフェニデート(リタリン: Novartis)、ならびにモダフィニル(プロビジル: Cephalon)、オルリスタット(アライ: GSK)、シブトラミン(メリディア、リダクティル)、リモナバン(アコンプリア、モナスリム、スリモナ)と組合せて用いられ得る。このような組合せは、ミオスタチンが疾患に清、またはミオスタチンの活性を中和することが有益である疾患の治療に用いられ得る。
【０１９７】
ヒト化抗原結合タンパク質が他の治療的に活性な薬剤と組合せて用いられる場合、個々の成分は、一緒に、または別々に、順次または同時に、別個のまたは併合製剤処方物中で、任意の適切な経路により、投与され得る。別々にまたは順次投与される場合、抗原結合タンパク質および治療的に活性な薬剤（単数または複数）は、任意の順序で投与され得る。
【０１９８】
上で言及された組合せは、上記のような組合せを、任意に製薬上許容可能な担体または賦形剤と一緒に含む単一製剤処方物の形態で用いるために示され得る。
【０１９９】
同一処方物中に組合される場合、構成成分は安定であり、互いに、そして処方物の他の構成成分と相溶性であって、投与のために処方され得る、と理解される。別々に処方される場合、それらは、任意の便利な処方物中に、例えば当該技術分野の抗原結合タンパク質に関して既知の方法で、提供され得る。
【０２００】
同一疾患に対して活性である第二治療薬と組合せる場合、各構成成分の用量は、抗原結合タンパク質が単独で用いられる場合とは異なり得る。適切な用量は、当業者には容易に理解されるであろう。ヒト化抗原結合タンパク質および治療的に活性な薬剤（単数または複数）は、相乗的に作用し得る。言い換えれば、抗原結合タンパク質と治療的活性薬剤（単数または複数）とを組合せて投与すると、各々の単独の作用の合計よりも大きい作用を、本明細書中に記載される疾患、障害または症状に及ぼし得る。
【０２０１】
医薬組成物は、他の薬剤とともに抗原結合タンパク質からなる構成要素を有し、任意に使用説明書を伴うキットを含み得る。便宜のために、キットは、予定量での試薬を、使用説明書とともに含み得る。
【０２０２】
「個体」、「被験体」および「患者」という用語は、互換的に本明細書中で用いられる。被験体は、典型的にはヒトである。被験体は、哺乳類、例えばマウス、ラットまたは霊長類（例えば、マーモセットまたはサル）でもあり得る。被験体は、非ヒト動物であり得る。抗原結合タンパク質は、獣医的用途も有し得る。治療されるべき被験体は、農場動物、例えば雌ウシまたは雄ウシ、ヒツジ、ブタ、去勢雄ウシ、ヤギまたはウマであり、あるいは飼育動物、例えばイヌまたはネコであり得る。動物は、任意の齢、または成熟成体動物であり得る。被験体が実験室動物、例えばマウス、ラットまたは霊長類である場合、動物は、筋肉消耗、筋疾患または筋肉損失に関連した疾患または症状を誘導するよう処置され得る。
【０２０３】
処置は、治療的、予防的または防止的であり得る。被験体は、それを必要としているものであり得る。処置を必要としているものとしては、将来的に疾患を発症する恐れがあるもののほかに、既に特定の医学的疾患に罹患している個体を含み得る。
【０２０４】
したがって、本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、予防的または防止的処置のために用いられ得る。この場合、疾患の１つ以上の局面または症候の開始を防止するかまたは遅延するために、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質が投与される。被験体は、無症候性であり得る。被験体は、疾患に対する遺伝的素因を有し得る．このような個体に、予防的有効量の抗原結合タンパク質が投与される。予防的有効量は、本明細書中に記載される１つ以上の局面または症候の開始を防止するかまたは遅延する量である。
【０２０５】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、治療方法にも用いられ得る。「治療」という用語は、疾患の少なくとも１つ以上の局面または症候の緩和、低減または防止を包含する。例えば、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載される疾患の１つ以上の局面または症候を改善し、または低減するために用いられ得る。
【０２０６】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、治療的、予防的または防止的処置のための有効量で用いられる。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の治療的有効量は、疾患の１つ以上の局面または症候を改善するかまたは低減するために有効な量である。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載される疾患を処置し、防止し、または治癒するためにも用いられ得る。
【０２０７】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、一般的に、被験体の健康に及ぼす有益な作用を有し、例えばそれは、被験体の想定寿命を増大し得る。
【０２０８】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、完全な治癒に作用する必要はなく、あるいは疾患の全ての症候または症状発現を根絶して、実行可能な治療的処置を施す必要はない。関連分野で認識されているように、治療薬として用いられる薬剤は、所定の疾患状態の重症度を低減し得るが、しかし疾患の全ての症状発現をなくして有用な治療薬としてみなされる必要はない。同様に、予防的に施される処置は、実用可能な予防薬を生じさせるために疾患の開始を防止するに際して完全に有効である必要はない。単に、（例えばその症候の数または重症度を低減することにより、あるいは別の処置の有効性を増大することにより、あるいは別の有益な作用を生じさせることにより）疾患の衝撃を低減すること、あるいは被験体において疾患が生じるかまたは悪化する見込みを低減することで、十分である。
【０２０９】
障害、疾患または症状としては、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病（例えばＩＩ型真性糖尿病）、関節炎、慢性腎不全（ＣＲＦ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、待機的関節修復、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎および脊柱側彎症が挙げられる。
【０２１０】
加齢性筋消耗（筋疾患とも呼ばれる）または筋肉減少症は、年齢に伴って起こる筋肉量および筋肉強度の進行性損失である。この症状は、筋肉破壊増大のほかに、筋肉の合成および修復低減の結果と考えられる。加齢性筋消耗では、個々の繊維が失われるため、筋繊維の束は縮小し得る。さらに、このような被験体における廃用性筋萎縮のため、筋繊維も小さくなる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、筋肉減少症を処置するために用いられ得る。
【０２１１】
加齢性筋消耗は中年に開始し、残りの人生を通して加速する。当該症状に関して最も一般的に用いられる定義は、四肢骨格筋量／身長２（ｋｇ／ｍ２）が若年成体に関する平均値の２標準偏差未満というものである。この障害は、移動性低減、機能的能力障害および独立性の損失を引き起こし得る。
【０２１２】
廃用性筋萎縮は、多数の異なる症状、疾患または障害、例えば不動化、術後外科学、透析、救命救急診療（例えば、熱傷、ＩＣＵ）、筋肉または骨に対する外傷または損傷と関連づけられ得る。廃用性萎縮は、長期間の筋肉廃用をもたらす多数の原因または出来事に起因し得る。筋萎縮は、筋繊維のサイズおよび／または数および／または機能の低減を包含する。
【０２１３】
悪液質は、体重の損失、筋肉量の損失、筋萎縮、疲労、衰弱、ならびに積極的に体重を落とそうとしていない個体における食欲の損失のいずれか１つまたは組合せに関連した症状である。悪液質は、種々の他の障害、例えば本明細書中に記載される疾患のうちのいずれか１つと関連し得る。例えば、悪液質は、癌、感染症（後、ＨＩＶまたはＡＩＤＳによる）、腎不全、自己免疫病、ならびに薬剤またはアルコール中毒と関連し得る。さらに、心臓悪液質は、例えば、心筋梗塞を起こしたことがある患者、またはうっ血性心不全を有する患者において、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いて処置され得る。したがって、癌悪液質を有する患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。
【０２１４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者は、疾患の軽度、中等度または重殿症候を示し得る。ＣＯＰＤは、気腫および気管支炎を有する患者を包含する。気腫を有する患者は、一般的に、非常に痩せているかまたはひ弱であり、彼等の疾患は一般的に回復不能であると考えられる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、患者の根底にある肺機能を改善することがより難しいため、気腫を有する患者を処置するために用いられ得る。気管支炎を有する患者は、筋肉を欠くこともあるがしかし、一般的により強健であり、その疾患はある程度の回復可能性を有すると考えられる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、任意に患者の根底にある肺機能の処置と組合せて、気管支炎を有する患者を処置するために用いられ得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置は、気腫または気管支炎を有する患者における呼吸に関与する筋肉の機能を改善することに及ぼす直接的作用を有し得る。
【０２１５】
癌患者はしばしば筋消耗を示すが、これは、入院、感染、脱水、股関節部骨折、そして最終的には死をもたらし得る。例えば、筋肉量の１０％損失は、癌患者の劇的に低い予後に関連し得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置は、癌患者の全身状態を改善して、例えば、完全化学療法または化学療法のより攻撃的使用を可能にし、そして患者の生活の質を改善し得る。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いて、癌悪液質を処置し得る。
【０２１６】
癌としては、例えば前立腺、膵臓、肺、頭および首、結腸直腸の癌、およびリンパ腫が挙げられる。例えば、前立腺癌では、被験体は転移性前立腺癌を有し得るし、および／またはアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）を受けているかもしれない。癌を有する被験体は、局所進行型または転移性癌、例えば早期転移性癌を有し得る。したがって、前立腺癌後にＡＤＴを受けている患者は、本発明の抗原結合タンパク質により処置され得る。
【０２１７】
慢性腎不全（ＣＲＦ）または末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。例えば、患者は、透析前処置されて、透析の開始を遅延し得る。代替的には、１年以上、２年以上、または３年以上の間透析を続けてきた患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の使用は、短期的に、または抗原結合タンパク質の長期使用により長期的に、筋消耗を防止し、処置し得る。
【０２１８】
筋肉、骨または神経に対する外傷または損傷の例としては、股関節部骨折および急性膝損傷が挙げられる。股関節部骨折を有する患者は、しばしば骨折前に筋萎縮を有し、筋萎縮は、多数の患者において股関節部骨折への重要な誘因である。股関節部骨折後、不使用のために筋肉強度は失われ、そしてしばしば、股関節部骨折患者は歩行移動または機能が骨折前のレベルに戻らない。さらに、多くの股関節部骨折患者は、ＣＯＰＤ、ＥＳＲＤおよび癌といった症状にも悩まされ、これらは有意の筋消耗に関与し、そして股関節部骨折を受け易くする。したがって、患者は、股関節部骨折の恐れがある場合、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。これらの患者は直ちに手術を受けなければならないため、股関節部骨折に伴ってかなりの治療的緊急性が存在する。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による術後処置は、筋肉の量および強度の損失を小さくし、および／または筋肉の量および強度の回復を改善することにより、股関節部骨折患者の回復を手助けし得る。股関節部骨折の恐れがある被験体、または股関節部骨折を有する被験体は、本発明の抗原結合タンパク質で処置され得る。
【０２１９】
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、手術前に患者の筋肉を構築するために予定手術患者を処置するのに役立ち得る。
【０２２０】
筋ジストロフィーは、進行性筋衰弱を引き起こす遺伝的、遺伝性筋疾患の一群を指す。筋ジストロフィーは、進行性骨格筋衰弱、筋肉タンパク質の欠陥、ならびに筋肉細胞および組織の死を特徴とする。筋ジストロフィーの例としては、Duchenne型（ＤＭＤ）、Becker型、四肢帯型（ＬＧＭＤ）、先天性、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨＤ）、筋緊張性、眼球咽頭性、およびEmery-Dreifuss型が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、Duchenne型、Becker型または四肢帯型筋ジストロフィーを処置するために用いられ得る。さらにまた、局所性萎縮よりむしろ散在性筋萎縮が、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。特に、筋緊張性ジストロフィーは、より局部化された筋萎縮／機能不全、ならびに本疾患における骨格／骨および心臓問題の役割のため、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処理され得る。
【０２２１】
肥満は、健康が負の影響を及ぼされ得る程度まで過剰体脂肪が蓄積した症状である。それは一般に、体格指数（ＢＭＩ＝体重を身長の二乗で割った値）３０ｋｇ／ｍ２以上、と定義される。これは、肥満と、体重超過（ＢＭＩ＝２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２と定義される）とを区別する。肥満は、種々の疾患、例えば心臓血管性疾患、２型真性糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸、癌および骨関節炎と関連し得る。その結果、肥満は平均余命を低減することが判明している。肥満のための典型的処置としては、食餌療法、身体運動および外科手術が挙げられる。肥満は、筋肉量を壮大氏、その結果、基礎代謝率を増大し得る本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。例えば、血清の化学的性質およびインスリン感受性の改善は、このような処置に起因し得る。
【０２２２】
筋肉量、筋肉強度および筋肉機能における低減の典型的局面または症候としては、全身性衰弱、疲労、身体活動の低減、転倒し易いこと、機能的無能力、自立性の損失、移動性低減のための抑うつ、食欲損失、栄養失調、および異常な体重減少のいずれか１つまたはいずれかの組合せが挙げられる。
【０２２３】
当該疾患は、高レベルのミオスタチンと関連し得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、ミオスタチンのレベルおよび／またはミオスタチンの活性を調整するために用いられ得る。
【０２２４】
多重終点を用いて、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能の変化を実証し得る。このような終点としては、簡易身体能力バッテリー、レッグプレス、directed quality of life survey、日常生活動作（ＡＤＬ）、機能的自立度評価表（ＦＩＭ）、機能検査およびスケール（例えば、歩行検査、階段上がり、自転車作業計）、強度検査およびスケール（例えば、握力検査、徒手筋力検査スケール）、生体インピーダンス分析、筋電図、動力計、二重エネルギーＸ線吸収測定、コンピューター断層撮影検査、磁気共鳴画像法、筋組織学、血液／生化学検査、人体測定学、皮膚厚測定、体格指数査定、ならびに体重モニタリングが挙げられる。筋肉強度は、両側足筋肉、首筋肉または腹筋を用いて査定され得る。
【０２２５】
簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）は、起立平衡、歩行速度ならびに椅子から立ち上がる能力の測定により査定される（０〜４のスケールで等級分けする）下肢機能の多成分測定である。歩行検査は、ある距離を患者が歩くのに要する時間としての下肢機能の評価である。レッグプレスは、重量を用いて足の強度を測定し、力を査定する。多重スケールおよびシステムは、患者の生活の質を定性的に評価するために、当該技術分野で用いられる。二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）は、概算骨格筋量の測定である。
【０２２６】
筋肉量、および筋肉強度および筋肉機能の変化を実証するために、動物における多数の検定も用いられ得る。例えば、握力検査は、握力計を引張る動物の力を測定する。傾斜面試験は、それ自身を保留する動物の能力を測定する。遊泳試験は、代表的活動性、例えば遊泳を通した機能的能力を測定するが、これは人における歩行検査と同様である。後肢発揮力検査（ＨＥＦＴ）は、尾に刺激を適用後に発揮される最大力を測定する。動物におけるその他の身体能力検査としては、歩行速度および回転かご運動が挙げられる。これランの検査／モデルは、単独で、または任意の組合せで用いられ得る。
【０２２７】
高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性インスリン抵抗性マウスモデルは、肥満に関するモデルとして用いられ得る。
【０２２８】
糖質コルチコイドは、膨大な一連の慢性炎症性疾病、例えば全身性紅斑性狼瘡、サルコイドーシス、関節リウマチおよび気管支喘息の治療に一般に用いられる。しかしながら、高用量の糖質コルチコイドはヒトおよび動物における筋萎縮を引き起こす。同様に、副腎皮質ホルモン過剰症は、クッシング病における筋萎縮に重要な役割を果たす。デキサメタゾン（ｄｅｘ）誘導性筋萎縮は、筋肉ミオスタチンｍＲＮＡおよびタンパク質発現の用量依存性の顕著な誘導に関連する（Ma K, et al. 2003 Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E363-E371）。ミオスタチン発現増大は、糖質コルチコイドが重要な役割を果たす固定化および熱傷損傷のような筋萎縮のいくつかのモデルでも報告されている（Lalani R, et al. 2000 J Endocrinol 167: 417-428；Kawada S, et al. 2001 J Muscle Res Cell Motil 22: 627-633；およびLang CH, et al. 2001 FASEB J 15: NIL323-NIL338）。したがって、糖質コルチコイド誘導性筋消耗のマウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。
【０２２９】
ヒト廃用性筋萎縮は一般に、整形外科的障害、例えば関節の慢性骨関節炎、または骨折の治療のためのギプス固定化に関連して、ならびにその他の医療的または外科的理由のための長期安静の状況において起こる。廃用性筋萎縮は、筋肉強度の低減および無能力化を生じる。身体のリハビリテーションは、依然として唯一の治療選択肢であり、それはしばしば、長期間を要し、筋肉を正常のサイズまたは強度に常に戻すわけではない。したがって、筋萎縮を誘導するために坐骨神経破砕を用いるマウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。
【０２３０】
癌患者の有意部分は、脂肪組織の進行性萎縮および筋消耗のために体重損傷に悩まされる。癌死の約２０％が筋肉損失により引き起こされる、と見積もられる。筋消耗は一般的に、多くの疾患症状における死亡率の良好な予測子である。ＡＩＤＳ、飢餓および癌に関する調査からのデータは、個々の前疾病除脂肪体重の３０〜４０％より多い損失は致命的であるということを示す（DeWye WD.. In Clinics in Oncology. Edited by Calman KC and fearon KCH. London: Saunders, 1986, Vol. 5, no 2, p.251-261；Kotter DP, et al. 1990 J Parent Enteral Nutr 14: 454-358；およびWigmore SJ, etal. 1997 Br J Cancer 75: 106-109）。したがって、筋消耗に関与するシグナル伝達経路の抑制による筋萎縮の考え得る軽減は、非常に魅力的である。したがって、Ｃ−２６腫瘍保有マウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。
【０２３１】
診療所では、腱切除は、筋腱間単位における先天性および／または後天性変形のための腱の外科的横切開を指すが、しかし、腱連続性の損失は、外傷または変性筋骨格性疾患中にも起こり得る。腱切除は、静止張力の即時損失、筋節短縮、ならびに筋肉量および力発生能力のその後の減少を生じる（Jamali et al. 2000 Muscle Nerve 23: 851-862）。したがって、骨格筋萎縮を誘導するマウス腱切除モデルを用いて、本発明の抗原結合タンパク質を試験し得る。
【０２３２】
記載される抗原結合タンパク質は、短期、長期および／または予防的療法のために用いられ得る。短期療法は、筋力を急速に構築し、患者を適切なレベルの機能的能力にし、次いで、これは、運動または長期療法により維持され得る。長期療法は、経時的に筋肉強度を維持するかまたは徐々に構築するために用いられ得る。予防的療法は、記載された患者集団において典型的には経時的に起こる筋肉の量および強度の減少を防止するために用いられ得る。余り重症でない筋消耗における早期介入は筋肉機能の維持のみを必要とするため、筋肉機能の改善は、上首尾の処置を明示する必要が常にあるわけではない。
【０２３３】
記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉の強度、量および機能を増大するための化粧用途も有し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、宇宙飛行士に関する宇宙飛行および訓練運動中の用途も有し得る。
【０２３４】
記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋に及ぼす直接的生物学的作用を有し得る。代替的には、記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋に及ぼす間接的な生物学的作用を有し得る。
【０２３５】
例えば、該ヒト化抗原結合タンパク質は筋組織学、筋肉量、筋肉繊維数、筋肉繊維サイズ、筋肉再生および筋線維症の１以上に対して影響を有しうる。例えば、筋肉量は、増大され得る。特に、被験体の除脂肪量は増大され得る。以下の筋肉：四頭筋、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋（ＴＡ）および長指伸筋（ＥＤＬ）のいずれか１つまたは組合せの量は、増大され得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋繊維数および／または筋繊維サイズを増大し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉再生を増強しおよび／または筋繊維症を低減する。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋芽細胞の増殖速度を増大し、および／または筋原性分化を活性化し得る。例えば、ヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉前駆体細胞の増殖および／または分化を増大し得る。
【０２３６】
記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、衛星細胞に及ぼす以下の作用の１つまたは組合せを有し得る：増殖を活性化し、増大する、そして自己再生を促進する。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、ミオスタチンレベルを調整し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、被験体の体重を増大し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋収縮性を増大し、および／または筋肉機能を改善し得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、骨密度を増大し得る。
【０２３７】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉の増殖、機能および収縮性に関与するタンパク質の合成および／または異化作用を調整し得る。例えば、筋肉関連タンパク質、例えばミオシン、ジストロフィン、ミオゲニンのタンパク質合成は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の使用により上方調節され得る。例えば、筋肉関連タンパク質、例えばミオシン、ジストロフィン、ミオゲニンのタンパク質異化作用は、本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質の使用により下方調節され得る。
【０２３８】
診断的使用方法
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、診断目的のためにin vitroまたはin vivoで生物学的試料中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。例えば、抗ミオスタチン抗原結合タンパク質は、培養細胞中、組織中または血清中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。組織は、先ず、ヒトまたは動物身体から除去され得た（例えば、生検）。慣用的イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学、または免疫沈降法が用いられ得る。
【０２３９】
ミオスタチンの存在またはレベルを疾患と相関させることにより、当業者は関連疾患を診断し得る。さらに、被験体におけるミオスタチンのレベル増大の検出は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置に応答する患者集団を示し得る。ミオスタチンレベルにおける低減の検出は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置された被験者における筋肉の強度、量および機能の増大の生物学的作用を示し得る。
【０２４０】
抗原結合タンパク質は、１つ以上の抗原結合タンパク質、検出可能ラベル、ならびにキットの使用のための使用説明書を含む診断キット中に提供され得る。便宜のために、キットは、予定量での試薬を、使用説明書とともに含み得る。
【０２４１】
本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、それを必要とする被験体に投与され得る。核酸分子は、適切な足場またはドメイン、可変ドメインまたは全長抗体中でＣＤＲを発現し得る。核酸分子は、ヒトまたは動物細胞中での発現を可能にするベクター中に含まれ得る。核酸分子またはベクターは、製薬上許容可能な賦形剤および／または上記のような１つ以上の治療的に活性な薬剤とともに投与するために処方され得る。
【０２４２】
（実施例）
１．組換えタンパク質の生成
１．１  成熟二量体ミオスタチンの精製
ＨｅｘａＨｉｓＧＢ１Ｔｅｖ／（Ｄ７６Ａ）マウスミオスタチンポリタンパク質配列（配列番号１０１）を、ＣＨＯ分泌系中で発現させた。ＧＢ１タグ（配列番号１０２）はＷＯ２００６／１２７６８２に記載されており、高レベルでのミオスタチンの発現を可能にすることが判明したが、これは、Ｆｃタグを用いた構築物と比較して、ミオスタチンの適正なフォールディングを可能にした。ヒトおよびマウス成熟ミオスタチンの配列は１００％同一であるため、マウスポリタンパク質配列（配列番号１０３）を用いて、成熟ミオスタチン配列（配列番号１０４）を生成した。ミオスタチン任意の潜在的分解を低減するために、マウスポリタンパク質配列を、領域「ＤＶＱＲＡＤＳＳＤ」におけるＤ７６Ａ突然変異を用いて工学処理した。
【０２４３】
０．５Ｍ  ＮａＣｌを有する５０  トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中で、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）を用いたＣＨＯ培地から、発現されたＨｅｘａＨｉｓＧＢ１Ｔｅｖ／（Ｄ７６Ａ）マウスミオスタチンポリタンパク質（シグナル配列なし）を捕捉した。Ｎｉ溶出液は、フリン切断緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に交換し、その後、室温で一晩、１：２５Ｖ／Ｖのフリン／タンパク質比でフリン（配列番号１０５で示されるフリンの発現社内配列）で切断した緩衝液であった。フリンは、プロペプチドと成熟ミオスタチンとの間（「ＴＰＫＲＳＲＲ」と「ＤＦＧＬＤＣＤ」との間）のポリタンパク質を切断して、プロペプチドおよび成熟ミオスタチンを生成する。
【０２４４】
フリン切断反応の全混合物を６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ中に入れて、凝集塊を解離した。４０分で、１５〜６０％緩衝液Ｂ勾配で６０℃で、Ｃ８ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ２０８ＴＰ、Grace, Deerfield, IL, USA）を用いて混合物から、成熟ミオスタチンを単離した（Ｃ８  ＲＰ−ＨＰＬＣ緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）。ピークの直ぐ前の分画（成熟ミオスタチンを含有する）をプールし、その後のin vitro検定に用いた。図１は成熟ミオスタチンに関するＬＣ／ＭＳ分析を示し、図２は還元および非還元ミオスタチン試料を用いたＮｕＰＡＧＥゲルを示す。
【０２４５】
１．２  組換えミオスタチンのin vitro生物学的活性
ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定（Thies et al., (2001) Growth Factors 18(4) 251-259）を用いて、横紋筋肉腫細胞（Ａ２０４）におけるミオスタチンのin vitro活性を査定した。２０４細胞（LGC Promochem  ＨＴＢ−８２）を、ＤＭＥＭ  高グルコース（フェノールレッドなし）(Invitrogen)、５％活性炭処理済みＦＣＳ(Hyclone)および１×グルタマックス(Invitrogen)中で増殖させた。次に、細胞をトリプシン処理して懸濁液を生成し、Geminiトランスフェクション試薬（社内試薬、特許ＷＯ２００６／０５３７８２に記載）を用いて、ＰＡＩ−１プロモーターの１２×ＣＡＧＡボックスの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＬＧ３プラスミドでトランスフェクトした。９６ウェルFluoronuncプレート(VWR)のウェル当たり４０，０００細胞で細胞を植えつけて、定住させて、一晩増殖させた。翌日、ともに配列番号１０４で示される配列を有するR&D Systemsミオスタチン(７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ)または社内ミオスタチン(１．１に上記)である組換え成熟ミオスタチンを、連続希釈により各ウェルの培地に付加し、細胞を放置して、さらに６時間インキュベートした後、ＳｔｅａｄｙＬｉｔｅ(Perkin Elmer LAS)を付加して、これを、室温で２０分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５読取器(Molecular Devices)で読み取った。ルシフェラーゼ発現を生じる細胞シグナル伝達のミオスタチン活性化を実証する用量応答曲線を、図３Ａに示す。R&D Systemsおよび社内成熟二量体ミオスタチン種はともにＡ２０４細胞を活性化して、用量依存的にルシフェラーゼシグナルを生じる、ということが明白に認められ得る。社内精製ミオスタチンは、検定における選択的により低いバックグラウンドならびにR&D Systemsミオスタチンを上回る改善された動的範囲を実証する。
【０２４６】
代替的方法では、Ａ２０４細胞（LGC Promochem  ＨＴＢ−８２）を、ＭｃＣｏｙｓ培地(Invitrogen)および１０％熱不活性化ＦＢＳ(Invitrogen)中で増殖させた。次に、細胞を、バーゼン液（Invitrogen）およびＴｒｙｐＬＥ（Invitrogen）の１：１混合物で引き離して、ＤＭＥＭ  高グルコース（フェノールレッドなし）、５％活性炭処理済みＦＣＳ(Hyclone)および２ｍＭグルタマックス(Invitrogen)（検定培地）中に再懸濁した。１４×１０６細胞を、懸濁液中で、ＰＡＩ−１プロモーターの１２×ＣＡＧＡボックスの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＬＧ３プラスミド  １８．２μｇを、１ｍＭのGeminiトランスフェクション試薬（社内試薬、特許ＷＯ２００６／０５３７８２に記載）  １８２μｌと混合することにより、トランスフェクトした。細胞をＴ１７５培養フラスコに移して、一晩インキュベートした。翌日、R&D Systemsミオスタチン(７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ)または社内ミオスタチン(１．１に上記)である組換え成熟ミオスタチンを、連続希釈により、あるいは２０μｌの最終容積中の試験抗体の連続希釈の存在下で一定濃度で、９６ウェル黒色FluoroNUNC検定プレート(VWR)に付加した。ミオスタチン抗体混合物を、３０分間、予備インキュベートした。トランスフェクト化細胞を、バーゼン液：ＴｒｙｐＬＥを用いてフラスコから引き離して、２．２×１０５細胞／ｍｌで検定培地中に再懸濁し、１８０μｌ／ウェルで検定プレート中に分配した。プレートをさらに６時間インキュベートした後、ＳｔｅａｄｙＬｉｔｅ試薬(Perkin Elmer LAS)を付加して、これを、室温で２０分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５読取器(Molecular Devices)で読み取った。ルシフェラーゼ発現を生じる細胞シグナル伝達の成熟二量体ミオスタチン活性化を実証する用量応答曲線を、図３Ｂに示す。異なる日に得られたデータにより示されるように異なる試験状況で、社内ミオスタチン種はＡ２０４細胞を活性化して、用量依存的に且つ再現可能的に、ルシフェラーゼシグナルを生じる。
【０２４７】
２．  モノクローナル抗体の生成およびマウスモノクローナル抗体１０Ｂ３の特性化
２．１  モノクローナル抗体
成熟ミオスタチン（実施例１に記載したように調製）を各々に腹腔内注射することにより、ＳＪＬ／Ｊマウス（Jackson Laboratories）を免疫化した。免疫化前に、ミオスタチンをクリプトスポリジウム・パルブム（C. parvum）と接合させて、マウスを接合体（２．５μｇのミオスタチンを１０μｇのクリプトスポリジウム・パルブムに接合）で、さらに７．５μｇの可溶性ミオスタチンで免疫化した。マウスからの脾臓細胞を取り出し、Ｂリンパ球を、ＰＥＧ１５００（Boehringer）の存在下で、Ｐ３Ｘ６３ＢＣＬ２−１３細胞（社内で生成、Kilpatrick et al., 1997 Hybridoma 16(4) pages 381-389参照）由来のマウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成した。限界希釈（E Harlow and D Laneに記載された方法を使用）により、個々のハイブリドーマ細胞株をクローン化した。単一クローンを含有するウェルを顕微鏡で同定し、活性に関して上清を試験した。
【０２４８】
最初に、ＦＭＡＴサンドイッチ検定フォーマットで組換えミオスタチンに対する結合活性に関して、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。これらの陽性物の二次スクリーニングを、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）法を用いて完了して、組換えミオスタチン（R&D Systems、７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ）および社内発現された精製ミオスタチン（上記１．１参照）との結合を検定した。
【０２４９】
ミオスタチン結合検定から同定された陽性物を、限界希釈によりサブクローン化して、安定モノクローナル細胞株を生成した。無血清条件下で細胞工場で増殖させたこれらのハイブリドーマからの免疫グロブリンを、固定化プロテインＡカラムを用いて精製した。次いで、これらの精製モノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）によりミオスタチン結合に関して再スクリーニングした。
【０２５０】
モノクローナル抗体１０Ｂ３を、組換えミオスタチンと結合される潜在的抗体として同定した。
【０２５１】
２．２  モノクローナル抗体１０Ｂ３のシーケンシングおよび１０Ｂ３キメラのクローニング
総ＲＮＡを１０Ｂ３ハイブリドーマ細胞から抽出して、予定アイソタイプ（ＩｇＧ２ａ／κ）によりリーダー配列および抗体定常領域に特異的なプライマーを用いた逆転写により、重鎖および軽鎖可変ドメインのｃＤＮＡを生成した。可変重鎖および軽鎖ドメインのｃＤＮＡを、次に、シーケンシングのためにプラスミド中にクローン化した。１０Ｂ３  ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号７で示される。１０Ｂ３  ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号８で示される。１０Ｂ３に関するカバットＣＤＲ配列を、表３および表４に示す。
【表３】
2013531486.tif 000004
【０２５２】
【表４】
2013531486.tif 000005
【０２５３】
１０Ｂ３ネズミモノクローナル抗体からの可変領域（ＶＨ：配列番号７；ＶＬ：配列番号８）を取り、これらをヒトＩｇＧ１／ｋ野生型定常領域上にグラフトすることにより、キメラ抗体を構築した。単一配列（配列番号９で示される）を、これらの構築物の構築に用いた。
【０２５４】
要するに、クローン化ネズミ可変領域をＰＣＲにより増幅して、哺乳類発現ベクター（Ｒｌｄ＿Ｅｆ１およびＲｌｎ＿Ｅｆ１）中へのクローニングを要する制限部位に導入した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳｐｅ  Ｉ部位を設計して、ＶＨドメインを枠で囲み、ヒトγ１野生型定常領域を含有するベクター（Ｒｌｄ＿Ｅｆ１）中へのクローニングを可能にした。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｓｉＷ  Ｉ部位を設計して、ＶＬドメインを枠で囲み、ヒトκ定常領域を含有するベクター（Ｒｌｎ＿Ｅｆ１）中へのクローニングを可能にした。正しいＶＨ（配列番号２５）およびＶＬ（配列番号８）配列を有するクローンを同定し、ＣＨＯＫ１細胞上清中での発現のためにプラスミドを調製した（標準分子生物学技法を使用）。免疫化プロテインＡカラムを用いて細胞上清から抗体を精製し、２８０ｎｍで吸光度を読み取ることにより定量した。
【０２５５】
その結果生じたキメラ抗体を、１０Ｂ３キメラ（１０Ｂ３ＣまたはＨＣＬＣ）と名づけた。１０Ｂ３キメラ抗体は、配列番号２６で記述されるような重鎖アミノ酸配列を有する。１０Ｂ３キメラ抗体は、配列番号２７で記述されるような軽鎖アミノ酸配列を有する。
【０２５６】
２．３  組換えミオスタチンとの結合
サンドイッチＥＬＩＳＡにおける１０Ｂ３および１０Ｂ３キメラ（１０Ｂ３Ｃ）結合ミオスタチン（R&D Systems、７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ）。プレートを１０ｎｇ／ウェルでミオスタチンで被覆し、遮断溶液（ＰＢＳ、０．１％Tweenおよび１％ＢＳＡ）で遮断した。洗浄（ＰＢＳ、０．１％Tween）後、抗体を、３７℃で２時間、希釈シリーズ全体で、インキュベートし、プレートを再び洗浄した後、抗マウスＨＲＰまたは抗ヒトＨＲＰ（それぞれ、Dako、 Ｐ０１６１およびSigma、Ａ−８４００）とともに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、呈色反応が起こるまでＯＰＤ基質（Sigma、Ｐ９１８７）を付加し、反応を、Ｈ２ＳＯ４の付加により停止させた。プレートを４９０ｎｍの吸光度で読み取り、ＥＣ５０を確定した（表５参照）。
【表５】
2013531486.tif 000006
【０２５７】
組換えミオスタチンに対する１０Ｂ３マウス親および１０Ｂ３Ｃの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（表面プラズモン共鳴）分析により査定した。捕捉表面の使用により、分析を実行した；１０Ｂ３マウス親に第一級アミンをカップリングさせることにより、抗マウスＩｇＧをＣ１チップとカップリングさせた；そして、１０Ｂ３キメラに対する第一級アミン結合により、プロテインＡ表面をＣ１上に作製した。
【０２５８】
捕捉後、６４ｎＭ、１６ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭ、０．２５ｎＭおよび０．０６２５ｎＭで表面全体に組換えミオスタチンを通して、緩衝液注射（すなわち０ｎＭ）を二重参照のために用いた。各分析物注射の間に再生ステップを置き、この後、新しい抗体捕捉事象を生じた後、次のミオスタチン注射を実行した。１：１モデルおよび二価モデル（Ｔ１００  機械分析ソフトウェアに固有）の両方を用いて、データを分析した（表６参照）。両捕捉表面は、１００ｍＭリン酸を用いて再生され得る。運転緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用いて、分析温度として２５℃を用いて、作業を実行した。
【表６】
2013531486.tif 000007
【０２５９】
１０Ｂ３の結合能力をさらに分析するために、ＥＬＩＳＡベースの検定を実行して、結合が純成熟ミオスタチンに特異的であるか、あるいは、ミオスタチンプロペプチドのＡｒｇ７５およびＡｓｐ７６間のＢＭＰ−１切断後に、潜在型複合体、ならびに潜在性複合体から放出される成熟ミオスタチンを含めた他のミオスタチン抗原を用いて結合が既に起きているか否かを確定した（Wolfman et al (2003) PNAS 100: pages 15842-15846）。
【０２６０】
ＨｅｘａＨｉｓＧＢ１Ｔｅｖ／ヒトミオスタチンプロペプチド配列（配列番号１０６）を用いて、ヒトミオスタチンプロペプチドの精製を実行した。この配列を、ＣＨＯ分泌系で発現させて、発現タンパク質を、ＣＨＯ培地からのＮｉ−ＮＴＡ（GE Healthcare, NJ）により捕捉した。ＨｅｘａＨｉｓＧＢ１タグを、Ｔｅｖプロテアーゼ（社内で発現、配列番号１０７で示される配列）により切断した。Ｔｅｖプロテアーゼは、配列番号１０６のタグおよびプロペプチド間（「ＥＮＬＹＦＱ」および「ＥＮＳＥＱＫ」間）を切断して、配列番号１０８の配列を生じる。
【０２６１】
非通過画分中のタグ切断ヒトミオスタチンポリタンパク質を用いて、６ＭグアニジンＨＣｌの存在下で、Ｎｉ−ＮＴＡ上に、切断タグおよび非切断ｈｅｘａＨｉｓＧＢ１Ｔｅｖ／ヒトミオスタチンポリタンパク質を補足した。通過画分を、１×ＰＢＳ緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム(GE Healthcare, NJ)上に適用し、凝集二量体および単量体形態をカラム上で分離した。ヒトミオスタチンプロペプチド（配列番号１０８）二量体型を、潜在型複合体形成に用いた。
【０２６２】
室温で２時間、３：１（ｗ／ｗ）比での６ＭグアニジンＨＣｌ中の精製ヒトミオスタチンプロペプチド（配列番号１０８）および成熟ミオスタチン（配列番号１０４）の混合物により、ミオスタチン潜在型複合体を調製し、その後、４℃で一晩、１×ＰＢＳ中に透析して、１×ＰＢＳ緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム(GE Healthcare, NJ)上に載せた。ミオスタチンプロペプチドおよび成熟ミオスタチンの両方を含有するピークでの分画を、プールした。ＬＣ／ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、潜在型複合体を確証した（データは示されていない）。ＢＭＰ−１消化のために、１５０μｌのヒトミオスタチン潜在型複合体（１．５ｍｇ／ｍｌ）を、２２５μｌのＢＭＰ−１（０．２１７ｍｇ／ｍｌ）、７５μｌの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１５０μｌの：２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、４μＭ  ＺｎＣｌ２および０．０４％Ｂｒｉｊ３５とともにインキュベートした。反応物を、３０℃で一晩インキュベートした。ＢＭＰ−１タンパク質を、ＣＨＯ分泌系を用いて、社内発現させた（配列番号１１１で示される配列）。
【０２６３】
ＰＢＳ中で４℃で一晩、１００ｎｇ／ウェルで、ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Costar）のウェル上に、ミオスタチン抗原を被覆した後、室温で３０分間、遮断（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ）した。プレートを洗浄し（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡおよび０．１％  Tween２０）、その後、洗浄緩衝液中の１０Ｂ３の希釈シリーズを付加し、室温で２時間、インキュベートした。プレートを再び洗浄後、洗浄緩衝液中で１：１０，０００希釈したペルオキシダーゼ接合Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ロバ抗マウスＩｇＧ(Jackson Laboratories カタログ番号７１５−０３６−１５１)を付加し、室温で１時間、インキュベートした。最終洗浄ステップ後に、ＴＭＢ基質を付加し、生じた比色測定的変化を、硫酸で停止させて、プレートを４５０ｎｍで読み取った。図４は、１０Ｂ３が成熟二量体ミオスタチン、潜在型複合体（四量体）、ならびにＢＭＰ−１節団子に潜在型複合体から放出されるミオスタチンを結合し得る、ということを示す。１０Ｂ３はプロペプチド二量体と結合しない、ということも判明した（データは示されていない）。
【０２６４】
２．４  ミオスタチン上の１０Ｂ３結合エピトープの粗製地図作成
１０アミノ酸重複する（オフセット  ４アミノ酸）ビオチニル化１４ｍｅｒペプチドを、ミオスタチンアミノ酸配列を基礎にして合成して、１０Ｂ３（供給：Mimotopes, Australia）により認識される結合エピトープの位置をマッピングした。
【０２６５】
ＳＲＵ  ＢＩＮＤ読取機（SRU Biosystems）で、作業を実行した。ストレプトアビジン・バイオセンサープレートを洗浄し、基線を読み取り、ストレプトアビジン被覆バイオセンサープレート上にビオチニル化ペプチドを捕捉した。プレートを再び洗浄し、新たに基線読み取りを行なって、次に、抗体を付加し、結合をモニタリングした。
【０２６６】
１０アミノ酸重複する（オフセット  ４アミノ酸）１４ｍｅｒ特注人工ペプチド配列の詳細を、表７に示す。
【表７】
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【０２６７】
１４ｍｅｒペプチド結合データの分析は、１０Ｂ３がミオスタチン内の任意の線状エピトープを結合し得ない、ということを実証した。しかしながら、対照抗ミオスタチン抗体は、ペプチド組内のエピトープを結合することが示された（データは示されていない）。
【０２６８】
Pepscanの足場上での化学的連結免疫原ペプチド（ＣＬＩＰＳ）技法を用いた１０Ｂ３Ｃのミオスタチン結合部位のその後の分析は、ミオスタチンの「ＰＲＧＳＡＧＰＣＣＴＰＴＫＭＳ」アミノ酸配列がキメラ抗体に関する結合部位であり得る、ということを示唆する（データは示されていない）。
【０２６９】
２．５  ミオスタチンＡｃｔＲＩＩｂ受容体結合の無能力化（非機能化）
炭酸塩緩衝液中で、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌで、ＥＬＩＳＡプレートのウェル中に組換え可溶性ＡｃｔＲＩＩｂ（R&D Systems ３３９−ＲＢＢ）を被覆した。標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従って、プレートを遮断し（２．３に上記した遮断溶液を参照）、洗浄した。平行して、２ｎＭビオチニル化ミオスタチン（社内、１．１に記載。ビオチニル化物質）を、１０Ｂ３、１０Ｂ３Ｃおよび陰性対照（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）からなる抗体希釈シリーズとともに、３７℃で２時間、予備インキュベートした。次に、ビオチニル化ミオスタチン：抗体反応物を、３７℃で１時間、ＡｃｔＲＩＩｂ被覆プレートに付加した。標準洗浄手順を実行後、１：１０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲＰ接合体（Dako  Ｐ０３９７）を付加して、さらに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、ＯＰＤ基質（Sigma）および酸停止溶液処置後、４９０ｎｍの吸光度で検定した。ミオスタチン活性の抑制に関する抑制曲線およびＩＣ５０値を、それぞれ、図５および表８に示す。
【表８】
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【０２７０】
受容体無能力化検定は、効力に基づいて１ｎＭより低いＩＣ５０を有する分子を識別するために利用可能な最高感度方法である。しかしながら、それは、結合コンピテントビオチニル化ミオスタチンの精確な濃度に対してそれ自体感受性である。それゆえ、異なる場合に、同一方法を用いて、１０Ｂ３に関して、他のＩＣ５０値、例えば０．１３ｎＭ、０．１０８ｎＭ、０．１０９ｎＭまたは０．３８４ｎＭが確定された（表８の値に留意、１３２ｎｇ／ｍｌ＝０．８８ｎＭ）。
【０２７１】
２．６  in vitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制
１．２で上記したミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定を用いて、ミオスタチンの活性に及ぼす抗ミオスタチン抗体のin vitro作用を査定した。２．８ｎＭ（細胞活性化検定におけるＥＤ７０と等価）の濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の１０Ｂ３または１０Ｂ３Ｃ抗体（０．１〜２０ｎＭ）とともに３７℃で予備インキュベート氏、その後、トランスフェクト化Ａ２０４細胞に付加するよう、検定を修正した。ルシフェラーゼ値を読み取り、これから、図６に示した抑制曲線を作成した。表９は、当該検定およびＡＮＯＶＡ分析を３回反復した後に抗体に関して確定したＩＣ５０値を示す。データは、明らかに、Ａ２０４筋肉細胞株のミオスタチン活性化の用量依存的抑制を実証するが、一方、対照抗体は、ミオスタチン活性の抑制を示さなかった。
【表９】
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【０２７２】
２．７  １０Ｂ３のin vivo効力
親１０Ｂ３の効力を実証するために、８週齢雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける３５日試験を５週間実行した。３、１０または３０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射により、１、４、８、１５、２２および２９日目に、処置群（１０匹／群）に用量投与したが、一方、対照群には、ＰＢＳまたはアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ２ａ）を投与した。試験完了時に、動物の総体重（Ａ）および総除脂肪筋肉量（Ｂ）を、それぞれ、動物を計量することおよびＱＭＲＩ分析により決定した（図７）。動物の選択時（３５日目）に、個々の筋肉（腓腹筋（Ａ）、四頭筋（Ｂ）および長指伸筋（ＥＤＬ）（Ｃ））を、筋肉量決定のために動物から切り出した（図８）。筋肉機能に及ぼす作用を確定するために、ex-vivo収縮性試験をいいＤＬ筋で実施した（図９）が、この場合、筋肉の強直力（図９Ａ）および筋肉量１ｍｇ当たりの強直力（図９Ｂ）を確定した。
【０２７３】
３０ｍｇ／ｋｇ用量を用いた処置軍において、１０Ｂ３に対する明らかな用量依存的応答が観察されたが、これは、３５日試験後の体重および除脂肪筋肉量における最も有意の改善を表す（それぞれ、８％および８．５％）。筋肉量の分析は、腓腹筋、四頭筋およびＥＤＬで同じ傾向を実証し、これらは全て、筋肉量の用量依存的増大を示し、さらにまた、３０ｍｇ／ｋｇ用量投与群は最大有意を示した。
【０２７４】
さらにまた、試験（記載せず）は、握力の有意の改善が３５日といった早期時点では観察され得ない、ということを実証した。しかしながら、ex-vivo収縮性試験は、ＥＤＬの強直力測定において有意の改善が実証され得る、ということを実証する。さらに、改善は、筋肉量と関係がないことが実証された。したがって、１０Ｂ３は、存在する筋肉量の機能を改善する能力を示す。
【０２７５】
３．  １０Ｂ３のヒト化
３．１  配列解析
１０Ｂ３可変領域の配列と、他のネズミおよびヒトの免疫グロブリン配列との間で比核を行なった。これは、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ならびに視覚的検査により実行した。
【０２７６】
１０Ｂ３  ＶＨに関する適切なヒト受容体フレームワークを同定した（ＩＧＨＶ１＿１８およびＪＨ３ヒトＪセグメント配列）：配列番号１０。１０Ｂ３  ＶＬに関する適切なヒト受容体フレームワークを同定した（ＩＧＫＶ１＿１６およびＪＫ２ヒトＪセグメント配列）：配列番号１１。配列番号１０では、受容体フレームワークのＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２が存在し、ＣＤＲＨ３はＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸにより表される。配列番号１１では、受容体フレームワークのＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２が存在し、ＣＤＲＬ３はＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸにより表される（１０Ｘ残基は、ＣＤＲの場所に関するプレースホルダーであり、各ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の数の測定値ではない）。
【０２７７】
ＣＤＲグラフト化において、満足すべき結合を得るために、受容体フレームワーク中のオーソログの代わりに含まれあるべきドナー抗体からの１つ以上のフレームワーク残基を要することは、典型的である。１０Ｂ３中の以下のネズミフレームワーク残基は、ＣＤＲグラフト化（ヒト化）バージョンの抗体の設計において潜在的に重要であると、確認された（位置は、カバット等の番号付与法に従う）：
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【０２７８】
異なる復帰突然変異を有する３つのヒト化ＶＨ構築物を設計して、満足すべき活性を有するヒト化抗体を得た。これらに、Ｈ０〜Ｈ２の番号を付す。Ｈ０（配列番号１２）は、ＣＤＲのカバット定義を用いて特定される受容体配列中への１０Ｂ３  ＶＨ  ＣＤＲのＣＤＲグラフトからなる。Ｈ１（配列番号１３）はＨ０と同一であるが、しかし、位置１０５のアミノ酸がグルタミンの代わりにトレオニンである復帰突然変異を有する。Ｈ２（配列番号１４）はＨ０と同一であるが、しかし位置２８のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンである復帰突然変異を有する。
【０２７９】
全てのヒト化ＶＨ領域（および対応する重鎖）に関して、フレームワーク４の配列（ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）が修飾され、それによりメチオニンアミノ酸残基（カバット位置１０８）がロイシンアミノ酸に代わって置換された、ということに留意されたい。これはヒト化ＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列中のＳｐｅ１クローニング部位の含入に起因する。
【０２８０】
異なる復帰突然変異を有する４つのヒト化ＶＬ構築物を設計して、満足すべき活性を有するヒト化抗体を得た。これらに、Ｌ０〜Ｌ３の番号を付す。Ｌ０（配列番号１５）は、ＣＤＲのカバット定義を用いて特定される受容体配列中への１０Ｂ３  ＶＬ  ＣＤＲのＣＤＲグラフトからなる。Ｌ１（配列番号１６）はＬ０と同一であるが、しかし、位置１６のアミノ酸がグリシンの代わりにアルギニンである復帰突然変異を有する。Ｌ２（配列番号１７）はＬ０と同一であるが、しかし位置７１のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンである復帰突然変異を有する。Ｌ３（配列番号１８）はＬ０と同一であるが、しかし位置１００のアミノ酸がグルタミンの代わりにアラニンである。
【０２８１】
様々な復帰突然変異を有する五つのさらなるヒト化VH構築物を設計して、満足な活性を有するヒト化抗体を取得した。これらのものはH0及びH3〜H6と番号付けられる。H0(配列番号12)は、CDRのKabatの定義を用いる、特定のアクセプター配列中への10B3 VHCDRのCDR移植からなる。H3(配列番号112)はH0と同一であるが、以下の復帰突然変異を有する:位置28のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンであり、位置48のアミノ酸がメチオニンの代わりにイソロイシンであり、位置67のアミノ酸がバリンの代わりにアラニンであり、及び位置69のアミノ酸がメチオニンの代わりにロイシンである。H4(配列番号113)はH0と同一であるが、以下の復帰突然変異を有する:位置28のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンであり、位置71のアミノ酸がトレオニンの代わりにバリンであり、及び位置73のアミノ酸がトレオニンの代わりにリジンである。H5(配列番号114)はH3及びH4の復帰突然変異を組み合わせたものである。H6(配列番号115)はH5と同一であるが、以下の復帰突然変異を付加したものである:位置20のアミノ酸がバリンの代わりにイソロイシンであり、及び位置66のアミノ酸がアルギニンの代わりにリジンである。さらに、H3〜H6 VH構築物は、位置100G(Kabatの番号付け)のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンであるCDRH3中に単一の点突然変異を提供する。
【０２８２】
全てのヒト化VH領域(及び対応する重鎖)について、フレームワーク4の配列(WGQGTMVTVSS)が改変されており、それによってメチオニンアミノ酸残基(Kabatの位置108)はロイシンアミノ酸残基に置換されていることに留意されたい。これは、ヒト化VH領域をコードするDNA配列中へのSpe1クローニング部位の含有の結果生じるものである。
【０２８３】
様々な復帰突然変異を有する三つのさらなるヒト化VL構築物を設計して、満足な活性を有するヒト化抗体を取得した。これらのものはL0及びL4〜L6と番号付けられる。L0(配列番号15)は、CDRのKabatの定義を用いる、特定のアクセプター配列中への10B3 VLCDRのCDR移植からなる。L4(配列番号116)はL0と同一であるが、位置69のアミノ酸がトレオニンの代わりにグルタミンであり、及び位置71のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンである復帰突然変異を有する。L5(配列番号117)はL0と同一であるが、位置71のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンであり、及び位置46のアミノ酸がセリンの代わりにトレオニンである復帰突然変異を有する。L6(配列番号118)はL4及びL5の復帰突然変異を組み合わせたものである。さらに、L4〜L6は、位置91のアミノ酸がシステインの代わりにセリンであるCDRL3中に単一の点突然変異を提供する。
【０２８４】
10B3の軽鎖は、CDRL3中のKabatの位置91にシステイン(C)残基を有する。対形成していないシステインは化学的に反応し、抗体プロセスの発達中に改変を誘導し、生成物の異種性の可能性及び親和性の変動の可能性をもたらし得る。さらに、この残基は、免疫グロブリンの折畳みを作るのに必須である可変領域中の他のシステインとの誤った対形成に起因する誤った折畳み又は凝集を促進し得る。かくして、C91を有するヒト化抗体を、セリン(S)に置換した。
【０２８５】
(3.2 10B3のヒト化)
H0〜H2及びL0〜L3:ヒト化VH及びVL構築物を、Rld Ef1及びRln Ef1哺乳動物発現ベクター中へのクローニングのための制限部位並びにシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドのde novo構築により調製した。ヒトIgG1野生型定常領域を含有するRld Ef1中へのクローニングのためのシグナル配列(配列番号9)を含有するVHドメインを構成するために、Hind III及びSpe I制限部位を導入した。ヒトκ定常領域を含有するRln Ef1中へのクローニングのためのシグナル配列(配列番号9)を含有するVLドメインを構成するために、Hind III及びBsiW I制限部位を導入した。これは本質的にWO 2004/014953に記載の通りである。
【０２８６】
H3〜H6及びL4〜L6:ヒト化VH及びVL構築物を、部位特異的突然変異誘発及びpTT発現ベクター(National Research Council Canada、改変マルチクローニング部位(MCS)を有する)中へのクローニングのための制限部位並びにシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドのde novoでの構築により調製した。ヒトIgG1野生型定常領域を含有するpTT中へのクローニングのためのシグナル配列(配列番号9)を含有するVHドメインを構成するために、Hind III及びSpe I制限部位を導入した。ヒトκ定常領域を含有するpTT中へのクローニングのためのシグナル配列(配列番号9)を含有するVLドメインを構成するために、Hind III及びBsiW I制限部位を導入した。
【０２８７】
(4. ヒト化抗体の開発可能性分析)
10B3キメラの重鎖及び軽鎖とヒト化抗体の両方における潜在的な脱アミド化部位のためのin silicoでの分析により、重鎖CDRH2中のKabatの位置54のアスパラギン(N54)が脱アミド化のための高い能力を有するものと同定された。この残基をさらに特性評価するために、本発明者らは、N54がアスパラギン酸(D)又はグルタミン(Q)アミノ酸残基に置換された10B3キメラ抗体及びヒト化H2L2抗体を作製した。
【０２８８】
10B3キメラの軽鎖及びヒト化抗体は、CDRL3中のKabatの位置91にシステイン(C)残基を有する。対形成していないシステインは化学的に反応し、抗体プロセスの発達中に改変を誘導し、生成物の異種性の可能性及び親和性の変動の可能性をもたらし得る。さらに、この残基は、免疫グロブリンの折畳みを作るのに必須である可変領域中の他のシステインとの誤った対形成に起因する誤った折畳み又は凝集を促進し得る。この残基をさらに特性評価するために、本発明者らは、C91がセリン(S)アミノ酸残基に置換された10B3キメラ抗体及びヒト化H2L2抗体を作製した。
【０２８９】
さらに、本発明者らはまた、重鎖CDRH2中で行われた脱アミド化置換と、軽鎖CDRL3中の位置91での置換とを組み合わせた。これらの分析の一部として作製された抗体を、表10に例示する。
【表１０】
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【０２９０】
５.  ＣＤＲＨ３変異体ヒト化抗体
５．１  ＣＤＲＨ３変異体ヒト化抗体の構築
代替的アミノ酸残基への各残基のＣＤＲＨ３（配列番号３）の部位特異的突然変異誘発を、基本分子として抗体Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ（可変配列：それぞれ配列番号１４および２４；全長配列：それぞれ配列番号３０および４０）を用いて実行した。全長ＤＮＡ発現構築物、例えばＨ２およびＬ２−Ｃ９１Ｓ塩基配列（それぞれ配列番号４５および５５）に関するヒト定常領域を、ｐＴＴベクター（National Research Council Canada、  修飾化多クローニング部位（ＭＣＳ）を有する）を用いて産生した。
【０２９１】
約３００のＣＤＲＨ３変異体を生成し、約２００の変異体をその後の分析で試験した（５．２および５．３参照）。
【０２９２】
５．２  ＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ細胞におけるＣＤＲＨ３変異体発現
約２００のＣＤＲＨ３変異体のそれぞれ重鎖および軽鎖をコードするｐＴＴプラスミドを、一時的にＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ細胞中に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。重鎖は、変異体ＣＤＲＨ３配列を伴うＨ２の塩基配列を有し、軽鎖は、上記と同様に、Ｌ２−Ｃ９１Ｓの塩基配列を有する。抗体を、組織培養上清から直接査定した。
【０２９３】
５．３  組織培養上清に関する初期スキャン−ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６
ＣＤＲＨ３スクリーニングに関する初期動態分析を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（Biorad Laboratories）で実行した。残基Ｒ９５〜Ｐ１００＿Ｂに関して、プロテインＡ／Ｇ捕捉表面（Pierce  ２１１８６）を用いて分析を実行し、残基Ａ１００＿Ｃ〜Ｖ１０２に関しては抗ヒトＩｇＧ表面を用いた（ＢＩＡｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００８−３９）。ＧＬＭチップ（BioRad, Laboratories １７６−５０１２）上に捕捉分子を固定するために第一アミンカップリングを用いて、両捕捉表面を同様に調製した。当該特定変異体を発現する一次的トランスフェクションからの組織培養上清からのプロテインＡ／Ｇ抗ヒトＩｇＧ表面（突然変異化される残基によって）上に、ＣＤＲＨ３変異体を直接捕捉した。捕捉後、社内組換えヒトミオスタチン（上記１．１参照）を、２５６ｎＭ、３２ｎＭ、４ｎＭ、０．５ｎＭおよび０．０６２５ｎＭで、分析物として用い、緩衝液注射単独（すなわち０ｎＭ）は、結合曲線を二重参照するために用いた。ミオスタチン結合事象後、捕捉表面を再生した：プロテインＡ／Ｇ捕捉表面に関しては、１００ｍＭリン酸を用いて捕捉表面を再生した；抗ヒトＩｇＧ表面に関しては、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて捕捉表面を再生した；再生は、別の周期の捕捉および結合分析のために準備された予備捕捉抗体を除去した。次に、ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアに固有の１：１モデル（質量運搬）に、データを適合させた。ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡｃｏｒｅ／ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００６−６９）を用いて作業を実行し、分析温度は２５℃であった。
【０２９４】
相互作用の性質のため結果を解釈することは難しかったが、これは、１：１モデルが相互作用を適切に説明するとは考えらないが、しかしながらセンサーグラムを判定することにより、基本分子を上回る親和性改善を示し得る構築物を選択することは可能であった。基本分子より良好な動態プロフィールを有すると思われる同定された１１のＣＤＲＨ３を有するために、スクリーニングを判定した。１１のＣＤＲＨ３変異体の重鎖を、以下の表１１に記載する（カバット番号付与法を使用）。変異体の全てが、軽鎖Ｌ２−Ｃ９１Ｓを有した（可変配列：配列番号２４；全長配列：配列番号４０、全長ＤＮＡ配列：配列番号５５）。基本分子より良好な動態プロフィールを有することが確認されたさらなるＣＤＲＨ３変異体は、Ｆ１００Ｇ＿Ｓ（配列番号１１０）であったが、しかしこれはさらに分析されなかった。
【表１１】
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【０２９５】
コード（すなわちＨ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｙ９６Ｌ）による抗体への言及は、適切な細胞株中で、軽鎖および重鎖をコードする第一および第二プラスミド、例えばｐＴＴ５＿Ｈ２＿Ｙ９６Ｌ配列を含有するプラスミド、ならびにｐＴＴ５＿Ｌ２−Ｃ９１Ｓ配列を含有するプラスミドの同時トランスフェクトおよび発現により生成される抗体を意味する。
【０２９６】
５．４  ＣＤＲＨ３変異体の選択パネルの発現
表１１に記述された１１のＣＤＲＨ３変異体の重鎖および軽鎖を、ＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ細胞中で発現させて（５．２に記載）、固定化プロテインＡカラム（GE Healthcare）を用いてアフィニティー精製して、２８０ｎｍでの吸光度を読み取ることにより定量した。
【０２９７】
５．５  ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）による組換えミオスタチンとの結合
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６上での初期スクリーニングからの構築物の選択が上首尾であったか否かを判断するために、オフ速度等級分け実験を精製組換え抗体に関して実施した。用いられる抗体の濃度で、ぞれぞれ約６０共鳴単位（ＲＵ）、２５０ＲＵおよび１０００ＲＵの最大結合シグナルを生じる異なる密度（低、中、高）でカップリングする第一アミンにより、ミオスタチン（組換え社内、上記１．１参照）を、ＣＭ５チップ（Biacore/GE Healthcare ＢＲ−１０００−１４）上に共有的に固定した。抗体の単一濃度、２５６ｎＭを緩衝液注射で用いて、結合相互作用を二重参照した。ミオスタチン表面の各密度に対する抗体全ての相互作用に関して、ＢＩＡｃｏｒｅ３００機に固有のソフトウエアを用いて、解離の初期速度（オフ速度）を算定した。再生は、１００ｍＭリン酸を用いることによるものであり、２５℃でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて、検定を実行した。
【０２９８】
試験した全ての構築物は、オフ速度がＨ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓより遅いという点で、基本分子（Ｈ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓ）より良好なオフ速度（解離速度定数）を示す、ということが判明した。高密度表面では、上位５つの構築物は、１０Ｂ３キメラを除いて、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿Ｉ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｗ１００Ｅ＿Ｆ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｇ９９Ｓ、およびＨ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿Ｆであった。
【０２９９】
５．６  ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）による組換えミオスタチンとの結合の完全動態分析
ミオスタチン（組換え社内、上記１．１参照）を、それぞれ約１５ＲＵ、３７ＲＵおよび５００ＲＵの最大結合シグナルを出す表面を生じる低、中および高密度で、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ(Biacore/GE Healthcare ＢＲ−１００６−６８)上に固定した。ＣＤＲＨ３変異体を、２５６ｎＭ、６４ｎＭ、１６ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭで全３つの表面全体に通して、緩衝液注射（すなわち０ｎＭ）を二重参照のために用い、再生は１００ｍＭリン酸を用いた。Ｔ１００ＢＩＡｃｏｒｅ機に固有の二価モデルにデータを適合させて、ＨＢＳ−ＥＰを用いて、２５℃で作業を実行した。
【０３００】
概して、基本Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓに対する適合は、全３つの密度表面でＣＤＲに比して不十分であった。したがって、精確な基線値は得るのが難しかった。３つの表面のうち、最高密度表面は、基本抗体およびＣＤＲ変異体間に最良の分離を生じたが、しかしこれもまた、基本Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ分子に対する適合は不十分であった。しかしながら、この表面は、構築物間にほとんどの分離を生じ、ならびに結合活性結合および再結合事象がより高頻度で、それゆえ親和性における小さな差を「拡大し得る」ため、真の二価結合のための最良の表面を間違いなく提供する表面であると予測される。概して、主に、特に高密度表面での優れた（すなわち、より遅い）オフ速度のため、ＣＤＲ変異体は全て、基本Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓより良好であると思われた。
【０３０１】
この検定に関与する方法のため、バイオセンサーチップ表面との標的抗原の共有的カップリングでは、得られる実際の親和性は、in vivoで観察され得る神話性を反映し得ない。しかしながら、このデータは、等級分け目的のために有用である。この検定の高密度表面からのデータを用いて、全体的親和性（）に基づいた上位５つの構築物は、キメラ１０Ｂ３を除いて、Ｆ１００Ｇ＿Ｙ、Ｐ１００Ｂ＿Ｉ、Ｐ１００Ｂ＿Ｆ、Ｆ１００Ｇ＿ＮおよびＷ１００Ｅ＿Ｆであった。しかしながら他の構築物親和性はすべて、Ｆ１００Ｇ＿Ｙの２倍以内であった。
【０３０２】
５．７  ミオスタチン捕捉ＥＬＩＳＡ
１１のアフィニティー精製ＣＤＲＨ３を、ミオスタチン捕捉ＥＬＩＳＡにおける結合活性に関しても分析した。
【０３０３】
ミオスタチンに対する２．５  μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体（R&D Systems ＡＦ７８８）を用いて、４℃で一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆した。次いで、このプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Tween２０）中で３回洗浄し、室温で１時間、遮断溶液（ＰＢＳ、０．１％Tween２０＋１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］）で遮断した。次に、ミオスタチンを１時間の間に遮断緩衝液中に１μｇ／ｍｌで付加した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、抗体を適切な濃度範囲（約１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）に滴定して、プレートに付加し、室温で１時間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ接合抗体（Sigma  Ａ７１６４、メーカーの仕様説明書に従って用いた）を用いて、１０Ｂ３キメラ（ＨｃＬｃ）またはＨ０Ｌ０のようなヒト化またはキメラ抗体の結合を検出した。次に、プレートを洗浄緩衝液中で３回洗浄し、ＯＰＤ基質（メーカーの使用説明書に従って用いた）とともに展開させて、プレート読取機で４９０ｎｍで読み取った。
【０３０４】
Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ、Ｈ０Ｌ０、ＨｃＬｃ（１０Ｂ３キメラ）および陰性対照モノクローナル抗体を対照抗体として用いた実験を、図１０に示す。全１１のＣＤＲＨ３変異体抗体が、このＥＬＩＳＡにおいて組換えミオスタチンと結合した。Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿Ｉ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｖ１０２Ｎ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ  ＿Ｇ１００Ａ＿Ｋ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿ＦおよびＨ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙは、基本Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１ＳおよびＨ０Ｌ０より良好なミオスタチンに関する結合活性を有する傾向があった。
【０３０５】
５．８  ミオスタチン競合ＥＬＩＳＡ
３つの異なるミオスタチン競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＤＲＨ３変異体をさらに調べた。１０Ｂ３ネズミｍＡｂと競合する能力に関して、精製抗体を分析した。
【０３０６】
５．８．１  捕捉方法としてのポリクローナルＡｂの使用
５．７に記述されたプロトコールを用いて、各ウェルに１０Ｂ３（最終濃度  ０．３μｇ／ｍｌ）を付加し、適切な濃度範囲（約１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）に滴定された抗体と混合した。抗マウスＨＲＰ接合抗体（DAKO  Ｐ０２６０、メーカーの仕様説明書に従って用いた）を用いて、１０Ｂ３抗体の結合を検出した。ＥＬＩＳＡデータから得られた等級分けを、表１２に示す。
【０３０７】
５．８．２  捕捉方法としてのビオチニル化ミオスタチンの使用
５．７に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、４℃で一晩、５μｇｌ／ｍｌのストレプトアビジンで被覆した。ビオチニル化ミオスタチンを０．３μｇ／ｍｌ遮断緩衝液で１時間の間、付加し、その後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１０Ｂ３（最終濃度  ０．２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに付加し、適切な濃度範囲（約１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）に滴定された抗体と混合した。抗マウスＨＲＰ接合抗体（DAKO  Ｐ０２６０、メーカーの仕様説明書に従って用いた）を用いて、１０Ｂ３抗体の結合を検出した。ＥＬＩＳＡデータから得られた等級分けを、表１２に示す。
【０３０８】
５．８．３  捕捉方法としてのミオスタチンの使用（直接捕捉）
６．７に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、４℃で一晩、０．２μｇｌ／ｍｌのミオスタチン（組換え社内、上記１．１参照）で被覆した。１０Ｂ３（最終濃度  ０．３μｇ／ｍｌ）を各ウェルに付加し、適切な濃度範囲（約１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）に滴定された抗体と混合した。抗マウスＨＲＰ接合抗体（DAKO  Ｐ０２６０、メーカーの仕様説明書に従って用いた）を用いて、１０Ｂ３抗体の結合を検出した。ＥＬＩＳＡデータから得られた等級分けを、表１２に示す。
【０３０９】
ＣＤＲＨ３変異体はすべて、１０Ｂ３に対して競合し得る。異なる競合ＥＬＩＳＡの各々からの５つの最も強力な分子を、表１２に列挙する。
【表１２】
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【０３１０】
この節における分析、ならびに５．６および５．７節における前のＢＩＡｃｏｒｅデータに基づいて、変異体Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿Ｆ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｐ１００Ｂ＿Ｉ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙ、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｖ１０２ＮおよびＨ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｖ１０２Ｓを、さらなる分析のために選択した。
【０３１１】
５．９  in vitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制
５．８の５つの選択ＣＤＲＨ３変異体を、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定（上記１．２参照）で試験して、in vitro効力を査定した。５ｎＭの濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の抗体とともに３７℃で予備インキュベートした後、トランスフェクト化Ａ２０４細胞に付加した。細胞を３７℃でさらに６時間インキュベートした後、相対ルシフェラーゼ発現を、冷光により確定した。その結果生じたＩＣ５０を、表１３に示す。
【表１３】
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【０３１２】
データは、試験した全ての抗体が１０Ｂ３キメラと同様の効力でミオスタチンを無能力化し、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙが最高の効力を有したが、しかしこの検定においてはそれほど有意にではなかった、ということを実証する。
【０３１３】
６．  Ｆｃ無能力化定常領域変異体の構築および発現
in vivoでの抗ミオスタチンの作用様式はミオスタチンの単純結合および無能力化であるので、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ応答を発揮するために分子がそのＦｃ機能を保有するということは必要でない。さらに、Ｆｃ機能の無能力化は、注入関連免疫反応への可能性に対して軽減する手助けをし得る。Ｆｃ機能を無能力かする突然変異は、以下の置換（ＥＵ番号付与系を使用）を包含する：Ｌｅｕ２３５Ａｌａ；およびＧｌｙ２３７Ａｌａ。
【０３１４】
標準分子生物学技法を用いて、ＣＤＲＨ３変異体Ｈ２＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙの可変重鎖領域に関する配列をコードする遺伝子を、現存する構築物から、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ無能力化定常領域を含有する発現ベクターに移した。重鎖（配列番号９８、Ｈ２＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙ＿Ｆｃ  無能力化)および軽鎖(配列番号４０、Ｌ２−Ｃ９１Ｓ）をコードする全長ＤＮＡ発現構築物を、ｐＴＴベクターを用いて産生した。重鎖の詳細は、表１４中に示される。
【表１４】
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【０３１５】
Ｆｃ無能力化（非機能化）定常領域の作用を、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定（１．２で上記）で分析した。その結果生じたＩＣ５０データを、表１５に示す。
【表１５】
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【０３１６】
これらのデータは、上記のような「Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙ  Ｆｃ無能力化」のＦｃ機能を無能力化をすることが、ミオスタチンを無能力化する抗体の効力に有意の影響を及ぼさない、ということを実証する。
【０３１７】
７．  ＣＤＲＨ２変異体ヒト化抗体
７．１  ＣＤＲＨ２変異体ヒト化抗体の構築
実施例４で上記したように、重鎖ＣＤＲＨ２中のカバット位置５４でのアスパラギン（Ｎ５４）は、脱アミド化のための効力を有する。この潜在的危険を軽減するために、この配列にG55で突然変異導入して、Ｈ２＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙの多数のＣＤＲＨ２変異体を生成した。これらは全て、ＣＤＲＨ２（配列番号２）で異なり、Ｈ２＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙ重鎖をコードするｐＴＴベクターを用いた部位特異的突然変異誘発により生成した。軽鎖（配列番号４０  Ｌ２−Ｃ９１Ｓ）を、重鎖の各々を用いて発現した。これらの構築物は、Ｆｃ領域で無能力化されなかった。
【０３１８】
７．２  ＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞中でのＣＤＲＨ２変異体発現
５．２で上記したように、重鎖および軽鎖をそれぞれコードするｐＴＴプラスミドを、一時的に、ＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ細胞中で同時トランスフェクトした。さらに、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙを陽性対照として発現した。ＨＥＫ  ２９３細胞上清中で産生される抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅにより組換えミオスタチンとの結合に関して分析した。ＣＤＲＨ２変異体のスクリーニングは、全て組換えミオスタチンと結合する、ということを示した。
【０３１９】
得られた親和性データおよび潜在的脱アミド化危険度に関するin silico分析を用いて、５つのＣＤＲＨ２変異体のパネル（表１６に列挙）を、大規模発現、精製およびさらなる分析のために選択した。
【表１６】
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【０３２０】
7.3 CDRH2 変異体の特徴付け
５つの抗体すべてを、ミオスタチン結合ELISAにより結合活性について分析した。96ウェルELISAプレートを４℃で一晩、10ng／ウェル組換えミオスタチンでコーティングした。次いでこのプレートを洗浄バッファー(PBS, 0.1% Tween-20)中で３回洗浄した。ウェルをブロック溶液(PBS, 0.1% Tween-20 + 1%ウシ血清アルブミン[BSA])で室温で１時間ブロッキングした後、洗浄バッファーで３回洗浄した。次に抗体を適当な濃度範囲まで滴定しきり（約10〜0.01μl）、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。抗ヒトカッパ軽鎖HPRコンジュゲート化抗体(Sigma Aldridge によるA7164, この試薬は製造業者の指示に従って使用した)を用いて、ヒト化またはキメラ抗体、例えば10B3キメラまたはH0L0の結合を検出した。次いでプレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、OPD基質（Sigma社より。製造業者の指示書に従い使用した）で発色させ、プレートリーダーで490nmで読み取った。
【０３２１】
図１１は、H2L2-C91S _F100G_Y, H2L2 C91S, HcLc (10B3C)、および陰性対照ｍＡｂ；ならびに全５つのＣＤＲＨ２変異体抗体に関する結果を示す。ＣＤＲＨ２変異体は、H2L2-C91S _F100G_Yの場合より良好なまたは同様のミオスタチンに対する結合活性を有した。
【０３２２】
７．４  ＣＤＲＨ２変異体ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅによりミオスタチン結合親和性における任意の変化を確定するためにも、ＣＤＲＨ２変異体を試験した。プロテインＡを、Ｃ１  ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ上に固定し、精製抗体を低密度で捕捉し、したがって、ミオスタチンの最大結合は３０共鳴単位未満を生じた。２５６ｎＭのみの濃度で捕捉抗体表面全体にミオスタチンを通した；緩衝液注射（すなわち０ｎＭ）を、結合データを二重参照するために用いた。プロテインＡ表面の再生は、１００ｍＭリン酸を用いた。Ｔ１００  ＢＩＡｃｏｒｅ分析ソフトウェアにともに固有の二価モデルおよび２状態モデルにデータを適合させた。しかしながら、ミオスタチンは二量体であるため、二価モデルデータにより重きを置いた。ＨＢＳ−ＥＰを用いて、２５℃で作業を実行した。
【０３２３】
用いたモデルは、in vivoでの真の結合を反映せず、モデルそれ自体は相互作用を精確に反映せず、したがって、算定値は等級分けのみに関してであった。データは、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙと比較して、ＣＤＲＨ２変異体は親和性に非常に有意に影響を及ぼすわけではなく、二価モデルによる最悪の構築物（Ｈ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓ＿Ｇ５５Ｌ  Ｆ１００Ｇ＿Ｙ）は全体的親和性の６．８倍の悪化を示す、ということを示唆する。
【０３２４】
７．５  in vitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制
in vitro無能力化検定に及ぼすＣＤＲＨ２変異体の作用も、Ａ２０４ルシフェラーゼ検定を用いて調べた（節１．２に記載）。抑制曲線のＩＣ５０値を、表１７に示す。
【表１７】
2013531486.tif 000020
【０３２５】
データは、全てのＣＤＲＨ２変異体抗体が、この検定において、Ｈ２Ｌ２−Ｃ９１Ｓ＿Ｆ１００Ｇ＿Ｙと同様の効力で、Ａ２０４細胞のミオスタチン誘導性活性化を抑制する、ということを示す。
【０３２６】
７．６  Ｆｃ無能力化ＣＤＲＨ２変異体
Ａ２０４検定において最高の見掛けの効力を有する開発可能性増強分子であるＨ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓ＿Ｇ５５Ｓ  Ｆ１００Ｇ＿Ｙを、配列番号９９で例示されるように、（ＥＵ番号付与系を用いて、以下の置換を作ることによって：Ｌｅｕ  ２３５  Ａｌａ；およびＧｌｙ  ２３７  Ａｌａ）Ｆｃ無能力化した。受容体結合検定（実施例２．５）を用いて、この新規の分子Ｈ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓ＿Ｇ５５Ｓ  Ｆ１００Ｇ＿Ｙ−Ｆｃ無能力化が、Ｈ２Ｌ２  Ｃ９１Ｓ＿Ｇ５５Ｓ  Ｆ１００Ｇ＿Ｙに比して、わずかに改善された効力を有する、ということを実証した（表１８参照）。
【表１８】
2013531486.tif 000021
【０３２７】
８．  １０Ｂ３処置はＣ２６腫瘍保有マウスにおける筋消耗を減じた
最新の研究において、体重変化、筋肉の量および機能に及ぼす１０Ｂ３処置の作用を、癌悪液質試験のために広範に用いられる前臨床モデルである結腸−２６腫瘍保有マウスで試験した。
【０３２８】
３８匹の８週齢雄ＣＤ２Ｆ１マウスを、無作為に４群に分けた：ｍＩｇＧ２ａ（ｎ＝９）、１０Ｂ３（ｎ＝９）、ｍＩｇＧ２ａ＋Ｃ−２６（ｎ＝１０）および１０Ｂ３＋Ｃ−２６（ｎ＝１０）。結腸−２６（Ｃ−２６）腫瘍細胞を、１×１０６細胞／マウスで２０匹のマウスに皮下移植した。数時間後、動物に抗体注射を開始した。マウスに、マウスＩｇＧ２ａ対照抗体または１０Ｂ３を、３０ｍｇ／ｋｇの用量で、０、３、７、１４、２１日目に腹腔内注射した。実験全体を通して、体重および脂肪量をモニタリングした。２５日目の屠殺直前に、中大腿部の坐骨神経の電気刺激時の収縮力を測定することにより、下肢筋肉強度を査定した。腫瘍重量、ならびに個々の筋肉量および精巣上体脂肪パッド量を、実験終了時に確定した。
【０３２９】
図１２は、０日目から２５日目までのＣ−２６腫瘍保有マウスにおける体重に及ぼす抗体処置の作用を示す。腫瘍保有マウスは、腫瘍移植後２１日目に劇的に体重を失い始める。１０Ｂ３による処置は、腫瘍保有マウスにおける体重損失を有効に軽減した。１０Ｂ３で処置した腫瘍保有マウスの平均体重は、ｍＩｇＧ２ａ対照抗体で処置した腫瘍保有マウスより８％高かった。１０Ｂ３処置群とｍＩｇＧ２ａ対照処置群との間に腫瘍サイズの有意差は認められなかった（ＩｇＧ２ａ：２．２ｇ対１０Ｂ３：１．９ｇ）。
【０３３０】
図１３は、Ｃ−２６腫瘍保有マウスにおける総体脂肪（Ａ）、精巣上体脂肪パッド（Ｂ）および除脂肪筋肉量（Ｃ）に及ぼす抗体処置の作用を示す。腫瘍保有マウスは、有意に低い総体脂肪を有した（図１３Ａ）。精巣上体脂肪パッドは、１０Ｂ３およびｍＩｇＧ２ａ対照処置腫瘍保有マウスの両方において、ほぼ完全に消失した（図１３Ｂ）が、これは、１０Ｂ３が体脂肪損失に対して腫瘍保有動物を防御しない、ということを示唆する。
【０３３１】
図１３Ｃに示したように、１０Ｂ３処置は、正常動物ならびに腫瘍保有マウスの両方において、除脂肪筋肉量の有意の（ｐ＜０．０１）増大を生じる。対照ＩｇＧ２ａで処置した腫瘍保有マウスは、腫瘍除去後、有意に低い除脂肪筋肉量を有した。これに対比して、１０Ｂ３で処置した腫瘍保有マウスは、ＩｇＧ２ａ処置腫瘍保有マウスより有意に（ｐ＜０．０１）高い除脂肪筋肉量を有した。実際、１０Ｂ３処置腫瘍保有マウスと正常動物との間の除脂肪筋肉量に有意差は認められなかった。
【０３３２】
表１９は、筋肉量に及ぼす抗体処置の作用を示す。予測どおり、腫瘍保有マウスは、ＴＡ、ＥＤＬ、四頭筋、ヒラメ筋および腓腹筋の有意の損失を有した（表１９）。１０Ｂ３処置は、正常動物において筋肉損失を減じた。１０Ｂ３で処置した腫瘍保有マウスでは、ＴＡ、ＥＤＬ、四頭筋、ヒラメ筋および腓腹筋の重量は、ＩｇＧ２ａで処置した腫瘍保有マウスの場合より、それぞれ、１７．８％、１１．３％、１６．９％、１３．４％および１４．６％多かった。
【０３３３】
表１９：10B3処置は、腫瘍を保有するマウスにおける筋喪失を緩和した。データは、平均筋肉量（mg）+/-SEMである。上付の＊および＃記号は、それぞれ、IgG2a群からおよびC-26+IgG2a群からのスチューデントT検定による有意差（p<0.05）を示す。
【表１９】
2013531486.tif 000022
【０３３４】
図１４は、下肢筋肉強度に及ぼす抗体処置の作用を示す。これは、中大腿部の坐骨神経の電気刺激時の収縮力を測定することにより査定した。腫瘍移植の２５日後、下肢筋肉収縮力は、対照抗体群の２０％、有意に（ｐ＜０．００１）低減された。１０Ｂ３処置は、対照郡と比較して、健常動物および腫瘍保有マウスにおいて、最大収縮力をそれぞれ１０．２％および１７．５％増大した（ｐ＜０．０５）。１０Ｂ３処置腫瘍保有マウスと健常対照との間で、最大力測定値に有意差は認められなかった。したがって、１０Ｂ３処置は、健常および腫瘍保有マウスの両方において、筋肉機能を改善した。
【０３３５】
データは、１０Ｂ３またはそのヒト化抗体処置が癌悪液質に関連した筋肉損失および機能的低下を減じ得た、ということを示す。
【０３３６】
９．  マウス腱切除モデルにおける骨格筋萎縮に及ぼす１０Ｂ３処置の作用
ここで、マウス腱切除モデルにおける筋肉量に及ぼすミオスタチン抗体１０Ｂ３の作用を確定した。
【０３３７】
若い成体雄Ｃ５７ＢＬマウスを、ｍＩｇＧ２ａまたは１０Ｂ３処置群（ｎ＝６／群）に無作為に分けて、１、４、８および１５日目に、３０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内投与した。用量投与前の午前中（０日目）に、全マウスに以下の外科的プロトコールを施した：前脛骨筋（ＴＡ）腱を、左足ではその遠位着生点で分離し（腱切除）、一方、右ＴＡ腱は全て露呈したが、しかし無傷のままであった（擬似）。３週間後（２１日目）、マウスを安楽死させて、ＴＡ筋肉量の変化を査定した。
【０３３８】
１０Ｂ３の３週処置は、マウスにおける擬似手術および腱切除術の両方の後、ＴＡ筋肉量を有意に増大した（図１５）。興味深いことに、１０Ｂ３の作用は、無傷擬似状態（＋１４％）と比較して、腱切除（＋２１％）の存在下でより顕著であった。
【０３３９】
これらのデータは、１０Ｂ３またはそのヒト化抗体処置が、外傷／損傷に関連した筋肉損失および機能的低下を減じ得た、ということを示す。
【０３４０】
(10. 糖質コルチコイドにより誘導された筋肉消耗における10B3の有効性)
糖質コルチコイドは、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、及び気管支喘息などの多くの慢性炎症性疾患の治療において一般的に用いられている。しかしながら、高用量の糖質コルチコイドの投与は、ヒト及び動物において筋肉の萎縮を引き起こす。同様に、副腎皮質機能亢進症は、クッシング病における筋肉萎縮において主要な役割を果たす。デキサメタゾン(dex)により誘導された筋肉萎縮は、筋肉ミオスタチンのmRNA及びタンパク質発現の用量依存的な顕著な誘導と関連する(Ma Kら、2003 Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E363〜E371)。ミオスタチン発現の増加は、糖質コルチコイドが主要な役割を果たす、運動不足及び熱傷などの筋肉萎縮のいくつかのモデルにおいても報告されている(Lalani Rら、2000 J Endocrinol 167:417〜428; Kawada Sら、2001 J Muscle Res Cell Motil 22:627〜633;及びLang CHら、2001 FASEB J 15:NIL323〜NIL338)。
【０３４１】
本研究では、本発明者らは10B3治療がマウスにおいてステロイドにより誘導される筋肉減少を防止するかどうかを調査した。
【０３４２】
50匹の10週齢のC57BLマウスを3群に分割し、0、3、7、14、21及び28日目にPBS(n=10)、30mg/kgのmIgG2a(n=20)又は30mg/kgの10B3(n=20)を腹腔内投与した。次いで、それぞれの抗体治療群を、28日目に二つのサブグループにさらに分割した:mIgG2a+ビヒクル(n=10)、10B3+ビヒクル(n=10)、mIgG2a+デキサメタゾン(n=10)、10B3+デキサメタゾン(n=10)。29日目から42日目まで、ビヒクルとしてのPBS中の0.1% DMSO(PBS+ビヒクル、mIgG2a+ビヒクル、10B3+ビヒクル)又は1mg/kg/日のデキサメタゾン(mIgG2a+dex、10B3+dex)を1日1回、マウスに皮下注射した。この期間に、マウスは35日目にPBS、mIgG2a又は10B3の腹腔内注射をもう一回受けた。42日間の実験の終わりに、総体脂肪及び除脂肪質量をQNMR走査により測定した。マウスを安楽死させ、個々の骨格筋を切断し、重量を計測した。
【０３４３】
図16は、0日目〜42日目までの治療スケジュール中の体重の変化を示す。デキサメタゾン治療を29日目に開始した。13日間のデキサメタゾン治療は、対照抗体で予備治療された動物において体重の減少を引き起こした。デキサメタゾンにより誘導される体重の減少は、10B3を用いる予備治療によって弱まった。
【０３４４】
表20は、デキサメタゾンにより誘導される筋肉減少に対する10B3又は対照抗体を用いる予備治療の効果を示す。対照抗体で予備治療された動物は、デキサメタゾン注射の13日後に長指伸筋(EDL)、前脛骨筋(TA)、及び腓腹筋の有意な筋肉萎縮(P<0.05)を示した。対照抗体治療群における大腿四頭筋質量は、デキサメタゾン治療の後に7%減少した。しかしながら、それは統計的に有意なものではなかった。興味深いことに、デキサメタゾン治療は、ヒラメ筋における有意な筋肉減少を引き起こさなかった。対照的に、10B3で予備治療された動物におけるデキサメタゾン治療は、TA、EDL、大腿四頭筋及び腓腹筋における有意な萎縮を引き起こさなかった(10B3+veh対10B3+dex、p>0.05、従って、非有意である)。
【表２０】
2013531486.tif 000023
【０３４５】
図17は、デキサメタゾンにより誘導される体脂肪蓄積に対する10B3又は対照抗体を用いる予備治療の効果を示す。対照抗体で予備治療された動物は、体脂肪蓄積の有意な増加を示した(P<0.05)。しかしながら、10B3で予備治療された動物においてはデキサメタゾン治療後に体脂肪率(%)の有意な増加はなかった(10B3+veh対10B3+dex、p>0.05、従って、非有意である(NS))。
【０３４６】
これらの結果は、10B3又はそのヒト化抗体を、糖質コルチコイドにより誘導される筋肉消耗の治療に用いることができることを示唆している。例えば、糖質コルチコイド療法を行っている患者における筋肉消耗の予防的治療が有利であり得る。
【０３４７】
(11. 坐骨神経圧壊モデルにおける10B3治療により弱められた筋肉萎縮)
ヒト廃用性筋萎縮は一般に、骨折の治療のため、並びに他の医学的又は外科的理由のためのベッドでの長期療養の状況における関節の慢性変形性関節症又はギプス固定などの整形外科障害と関連して生じる。廃用性筋萎縮は、筋肉強度の低下及び身体障害をもたらす。身体リハビリテーションが依然として唯一の治療選択肢であり、それには長い期間を要することが多く、常に筋肉を正常なサイズ又は強度に回復させるわけではない。
【０３４８】
ここで、本発明者らは、マウスにおける廃用性萎縮の予防における10B3の有効性を評価するための神経損傷モデルを用いた。
【０３４９】
39匹の8週齢のオスのC57BLマウスを4群に無作為に分割した:mIgG2a+偽(n=9)、10B3+偽(n=10)、mIgG2a+坐骨神経圧壊(n=10)及び10B3+坐骨神経圧壊(n=10)。0、3、7、14、21及び28日目に、30mg/kgのmIgG2a対照又は10B3抗体をマウスに腹腔内投与した。抗体治療の三週間後、マウスをイソフルランで麻酔し、大腿中央部の右坐骨神経を露出させ、無傷のままにするか(偽群)又は止血鉗子を用いて10秒間圧壊することにより損傷させた(神経圧壊群)。手術の一週間後(28日目)、マウスは最後の抗体注射を受けた。神経圧壊手術の10日後にマウスを安楽死させ、後肢の筋肉質量を評価した。
【０３５０】
図18は、対照抗体で治療した群における筋肉質量に対する坐骨神経圧壊の効果を示す(mIgG2a+偽、及びmIgG2a+坐骨神経(SN)圧壊)。坐骨神経圧壊損傷は、長指伸筋(EDL)、前脛骨筋(TA)、腓腹筋及びヒラメ筋の質量の偽対照と比較してそれぞれ22%、37%、41%及び29%の有意な減少(p<0.01)をもたらした。坐骨神経損傷は大腿四頭筋質量に影響しなかった(データは示さない)。
【０３５１】
図19Aは、偽手術した脚における骨格筋質量に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す。偽手術群においては、10B3治療はTA、EDL、腓腹筋及び大腿四頭筋の質量を、IgG2a対照群と比較した場合、それぞれ7%、10%、12%及び13%有意に増加させた。しかしながら、10B3治療は、ヒラメ筋における有意な質量変化を引き起こさなかった。
【０３５２】
図19Bは、坐骨神経を圧壊した脚における骨格筋質量に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す。10B3で治療された動物は、IgG2a対照治療動物よりも有意に多い筋肉を保持した。10B3で治療された神経損傷された動物のTA、EDL、腓腹筋及びヒラメ筋は全て、IgG2a対照群のものよりも多い質量(それぞれ、11%、16%、9%及び10%)を示した。10B3治療はまた、偽手術した動物及び神経圧壊した動物の両方において総体重を増加させた(データは示さない)。
【０３５３】
これらの結果は、10B3又はそのヒト化抗体がヒト廃用性筋萎縮の予防及び/又は治療のための能力を有し得ることを証明している。
【０３５４】
(実施例12:H2L2変異体のin vivoでの有効性)
7〜8週齢のオスのSCIDマウスにおける筋肉増殖に対する、完全に機能するWT Fcドメイン又はFc無効化突然変異を有するH2L2抗ミオスタチン変異体の効果を、3、10及び30mg/kgの用量を用いて比較した。マウス親分子10B3を陽性対照として使用し、また、3、10及び30mg/kgで投与し、無関係のマウスIgG2aアイソタイプ対照を30mg/kgで投与した。投与群あたり10匹の動物が存在した。0、3、7、14及び21日目に腹腔内注射により分子を投与した。試験の28日目に、動物を屠殺し、解剖し、以下の筋肉の重量を測定した:前脛骨筋(TA)、大腿四頭筋、長指伸筋(EDL)及び腓腹筋(図29)。
【０３５５】
10B3陽性対照群は対照動物と比較して筋肉質量の10%を超える増加を示した一方、二つのH2L2変異体は測定された筋肉組織に対して顕著により低い効果を示したが、増加した筋肉質量に対する用量依存的傾向が観察されたが、いくつかの筋肉群においてはいくらかの統計的に有意な効果が観察されたことがわかった。
【０３５６】
(13. ヒト化抗体の発現及び特性評価)
(抗体の調製)
ヒト化VH構築物(H3、H4、H5及びH6)並びにヒト化VL構築物(L4、L5及びL6)を、pTT哺乳動物発現ベクター中で調製した。これらの分析の一部として生成された抗体を表21に例示する。表20中の抗体をコードする重鎖及び軽鎖発現プラスミドを、293fectin(Invitrogen、12347019)を用いてHEK 293 6E細胞中に同時トランスフェクトした。24時間後、トリプトン供給液をそれぞれの細胞培養液に添加し、48〜72時間後に細胞を収穫した。結合アッセイにおいて試験する前にプロテインAカラムを用いて抗体を精製した。
【０３５７】
ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の両方における潜在的な脱アミド化部位に関するin silicoでの分析により、重鎖CDRH2中のKabatの位置54のアスパラギン(N54)が脱アミド化のための高い能力を有するものと同定された。この潜在的な危険性を軽減するために、Kabatの位置55のアミノ酸(G55)を部位特異的突然変異誘発によりセリンに置換した。
【０３５８】
三つのヒト化VH構築物を作製した。これらのものはH7(配列番号119)、H8(配列番号120)及びH9(配列番号121)と番号付けられる。H7、H8及びH9はそれぞれH4、H5及びH6と同一であるが、位置55のアミノ酸がグリシンの代わりにセリンである点突然変異を有する。
【表２１】
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【０３５９】
【表２２】
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【０３６０】
(14. ミオスタチン中和アッセイ)
(14.1 組換え可溶性ActRIIb)
組換え可溶性ActRIIb(R&D Systems 339-RBB)を、炭酸バッファー中、1μg/mlでELISAプレートのウェル中で4℃で一晩被覆した。0.1%tween 20及び0.1% BSAを含有するPBSでプレートをブロックし、標準的なELISAプロトコルに従って洗浄した。同時に、2nMのビオチン化ミオスタチン(内製試薬、上記)を、表21及び22の抗体の連続希釈液と共に37℃で30分間予備インキュベートした。次いで、ビオチン化ミオスタチン:抗体反応液を、ActRIIb被覆プレートに37℃で1時間添加した(50μl/ウェル)。標準的な洗浄手順を行った後、ウェルあたり50μlの1:200希釈されたストレプトアビジン-HRPコンジュゲート(R&D Systems. #890803)を添加し、次いで、37℃でさらに1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、490nmの吸光度で以下の基質(R&D Systems、#DY999)でアッセイし、酸停止溶液処理を行った。結果を、少なくとも3回の反復のIC50平均値で示し、それと共に信頼区間を以下の表23に示す。
【表２３】
2013531486.tif 000026
【０３６１】
これらのデータは、ActRIIb-Fcタンパク質へのミオスタチンの結合の中和に関するIC50の範囲を示す。効力は重鎖によって大きく決定され、H7、H8及びH9が最も低いIC50値を与える。
【０３６２】
(14.2 リポーター細胞バイオアッセイ)
ミオスタチン応答性リポーター遺伝子アッセイ(Thiesら(2001)Growth Factors 18(4) 251〜259)を用いて、横紋筋肉腫細胞(A204)中でのミオスタチンのin vitroでの活性を評価した。A204細胞(LGC Promochem HTB-82)を、10%ウシ胎仔血清(Gibco)を含有するRPMI 1640培地(Hyclone)中で増殖させた。細胞をトリプシン処理して、懸濁液を作製し、FuGene 6(Roche)を用いてPAI-1プロモーターの12xCAGAボックスの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するpLG3プラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞を収穫し、洗浄し、20% DMSO、80%ウシ胎仔血清中に2x107細胞/mlで再懸濁し、分注し、-80℃で凍結した。
【０３６３】
A204細胞の凍結バイアルを解凍し、50mlの温めた培地(1%ウシ胎仔血清[Invitrogen、16000-044]を含有する、HEPES及びL-グルタミン[Invitrogen、12430-047]を含む高グルコースDMEM)中に懸濁した。細胞を沈降させ、1.3x106細胞/mlで30nMミオスタチンを含有する10mlの培地中に再懸濁した。細胞を96穴プレート(Greiner、655083)に、ウェルあたり50μl添加した。表21及び22に記載の抗体を、1%ウシ胎仔血清及び2nMミオスタチンを含有するDMEM/高グルコース培地中で連続希釈し、100μlの試験サンプルをアッセイプレートに移した。アッセイプレートを37℃で5時間インキュベートした。次いで、100μlのSteadyGlo試薬(Promega)を各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした後、Viewluxプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて発光測定を行った。結果を表24に示す。
【表２４】
2013531486.tif 000027
【０３６４】
これらのデータは、上記で試験した抗ミオスタチンヒト化抗体は全部、リポーター遺伝子でトランスフェクトされたA204細胞中でルシフェラーゼ応答を刺激するその能力に関してミオスタチンを中和することができることを示している。
【０３６５】
(15. 結合特異性)
ELISAを行って、H8L5が任意の他の増殖因子及び特に、提唱されたエピトープ配列の周囲でいくらかの相同性を共有することが知られるTGFファミリーの他のメンバーに結合することができるかどうかを決定した。ELISAプレートを0.5μg/mlの様々な増殖因子で被覆し、標準的なELISA条件下でH8L5中で滴定することにより、H8L5が結合することができる試験された唯一の他の因子がGDF-11であり、50%の結合を得るのに必要とされる濃度はミオスタチンよりも3倍低いと結論付けられた(図22)。SPRデータは、H8L5が、より弱い親和性にも拘らず、アクチビンBに結合する(ミオスタチンに対するその親和性よりも12倍以上弱い)ことを示唆していた。
【０３６６】
(16. リポーター遺伝子アッセイにおけるアクチビンbの中和)
PAI-1プロモーターの12xCAGAボックスの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むpLG3プラスミドでA204細胞をトランスフェクトし、一晩インキュベートした。様々な濃度のH8L5及び40nMのアクチビンBを含有する溶液を調製し(20xのその最終アッセイ濃度)、30分間予備インキュベートした。次いで、20μlのこれらの試験溶液をアッセイプレート中に入れ、180μlのトランスフェクトされた細胞をアッセイ培地中に2.22x105/mlで添加した。細胞を37℃で6時間インキュベートした。次いで、50μlのSteadyLite(Perkin Elmer)試薬を添加した。プレートをrtで20分間、振とうしながら(450rpm)インキュベートし、発光モードでTecan Ultraプレートリーダー上で読み取った。H8L5はIC50>1.5μMを有するアクチビンBの非常に弱い阻害剤であることが示された(図23)。
【０３６７】
(17 Kinexa法による結合親和性の決定)
Kinexa(Sapidyne Instruments)液相アフィニティを用いて、様々な抗ミオスタチン分子に対する全体の親和性を決定した。吸着(ポリメチルメタクリレートビーズ-PMMA)又はアミンカップリング(NHS-活性化セファロースビーズ)により、ミオスタチンビーズを調製した。試験した様々な抗ミオスタチン分子は、様々な濃度のミオスタチンで被覆したビーズの作製を必要とした。アッセイの液相部分については、固定された濃度の抗体を、広範囲のミオスタチン濃度と共にインキュベートし、分析を進行させる前に少なくとも2h、r.t.でインキュベートすることにより平衡に到達させた。次いで、ミオスタチンビーズを用いて、ミオスタチンビーズマトリックスに結合している遊離抗体により液相サンプル中に存在する遊離抗体の量を決定した後、蛍光染料で標識された好適な二次抗体(試験される構築物に依存して抗ヒト又は抗マウス)を用いて検出した。結合曲線を、装置に固有のKinexa Pro分析ソフトウェアを用いて適合させた。次いで、様々な出発濃度の抗体を用いる複数回の実行をコンパイルし、n-曲線分析ソフトウェアを用いて分析して、親和性のより正確な決定を得た。
【表２５】
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【０３６８】
(18. Fc無効化定常領域変異体の構築及び発現)
in vivoでの抗ミオスタチンの作用様式はミオスタチンの単純な結合及び中和であるので、分子がADCC及びCDC応答を惹起するためにそのFc機能を保持することは必須ではない。さらに、無効化Fc機能は、注入関連免疫反応の可能性を軽減するのに役立ち得る。無効化Fc機能への突然変異は、EU番号付け系を用いる以下の置換:Leu 235 Ala;及びGly 237 Alaを含む。
【０３６９】
標準的な分子生物学技術を用いて、ヒト化VH構築物H7、H8及びH9の可変重鎖領域の配列をコードする遺伝子を、存在する構築物から、hIgG1 Fc無効化定常領域を含有する発現ベクターに移した。これらの分析の一部として作製された抗体を表26に例示する。
【表２６】
2013531486.tif 000029
【０３７０】
任意の無効化重鎖を、任意の軽鎖と対形成させることができる。
【０３７１】
(19 Fc受容体及びC1Qへの抗体の結合)
Fc R及びC1qに対する結合分析を、ProteOn XPR36を用いて実行した。試験抗体(H8L5及びFc無効化H8L5)を、一次アミンカップリングによりGLCバイオセンサーチップ上に固定した。Fc Rは2048nM、512nM、128nM、32nM及び8nMで用いたが、C1qは512nM、128nM、32nM、8nM及び2nMで用いた。バッファー注入(すなわち、0nM)を用いて、結合センサーグラムを二重参照(double reference)した。相互作用の性質に起因して(すなわち、すぐに結合する/すぐに離れる)、再生は必要なく、結合センサーグラムは20minの解離時間及びその後のバッファー注入の使用により基準線に戻った。各受容体群及びC1q結合のための全体的なR-maxを用いて、ProteOnの分析ソフトウェアに固有の平衡化モデルにデータを適合させた(すなわち、Fc R 2a His及びArg多型を一緒に分析し、Fc R 3a及びVal多型を一緒に分析したが、C1qは別々に分析した)。表27に提示されたこれらのデータは、Fc無効化突然変異が、無効化突然変異を含まない同じ抗体と比較して、Fc受容体及びC1qへの無効化抗体の結合を効率的に弱めることを説明することを示していた。
【０３７２】
(20 CH50 EIAアッセイにおけるFc機能の特性評価)
C1qに対する親和性のこの変化の補体を固定する抗体の能力への影響を調査するために、CH50 Eq EIAキットを用いた。これらの実験により、H8L5が濃度依存的様式でヒト血清に曝露された場合、終末補体複合体(TCC)を産生することができることが示された。それは見たところ、組換えミオスタチンに結合した場合により多くのTCCを生成し、Fc無効化等価物よりもさらに多くのTCCを生成することができる(ミオスタチンの存在下又は非存在下;図24)。図24Aは、15%のヒト血清を用いて得られた結果を示し、図24Bは25%のヒト血清を用いて得られた結果を示す。これから、免疫複合体クリアランスの補体媒介性機構が必要であり、H8L5はそのFc無効化等価物よりも好ましいものであるべきであると結論付けられた。
【０３７３】
(21:H8L5変異体のin vivoでの有効性)
約24gの重さの11週齢のオスのC.B-17 SCIDマウスに、0、3、7、14及び21日目に、以下の抗体:30mg/kgのhIgG1対照抗体、30mg/kgの10B3、3、10、30及び60mg/kgの10B3H8L5又は10B3H8L5 Fc無効化抗体を腹腔内投与した(投与量は20ml/kgであった)。数匹のマウスには30mg/kgのhIgG1、又は1、3、10及び30mg/kgのAMG745を4週間にわたって週に2回腹腔内投与した。AMG745は、WO 2007/067616 A2に公開された配列を用いて調製した。28日目に、個々の骨格筋(TA、腓腹筋、大腿四頭筋及びEDL)を切断し、その重量を記録した。図28(A〜D)は、試験した筋肉の質量に対する治療の効果を示す。10B3を用いる治療は、TA、大腿四頭筋、EDLにおいて有意な質量増加を引き起こし(p<0.05)、腓腹筋においては有意な増加を引き起こさなかった(p>0.05)。いずれかのヒト化抗体(H8L5又は無効化H8L5)を用いる治療は、いくつかの用量群において有意な増加で個々の筋肉質量に対する効果をもたらした。AMG745治療は、1mg/kgの最少用量以外の全ての用量レベルで大腿四頭筋、腓腹筋における有意な質量増加をもたらした。図28を参照されたい。
【０３７４】
(22 磁気共鳴画像化を用いる筋肉応答の経時的試験における10B3の効果)
この試験は、3群の動物、すなわち、二つの10B3治療群(3及び30mg/kg)、並びにアイソタイプ一致対照群(30mg/kg)からなっていた。最初の3週間にわたって5回、動物に投与し、ウシ筋肉容量のMRI決定を0日目(1回目の投与)に実施し、その後12週間にわたって毎週実施した。アイソタイプ対照群と比較して、30mg/kgの10B3で治療された動物のウシ筋肉容量及び体重の両方の有意な増加が、投与期間中に観察された;30mg/kg及び3mg/kg投与群と対照群とのウシ筋肉容量の差異率は、それぞれ、約15%及び5%未満であった(図25)。しかしながら、重要なことに、高用量群と対照群との筋肉容量の有意な差異(P<0.05)は9週間の洗い出し期間を通じて維持されたが、投与の中止後4週間では、二つの群の体重間に統計的な差異はなかった。また、第3週(最後の投与)及び第4週で、対照群と比較して、3mg/kgの10B3群においてウシ筋肉容量の有意な増加が観察されたが、その後は観察されなかった。注目すべきことに、試験の経過を通じて、低用量の10B3で治療された動物と対照動物との間で体重の有意な差異はなかった。
【０３７５】
(23 SCIDマウスにおけるH8L5に関する用量応答試験)
H8L5の効力を、用量応答を規定するために様々な範囲の用量で8週齢のSCIDマウスにおいて評価した。30mg/kgの10B3又は0.1、0.3、1.0、3.0若しくは10.0mg/kgのH8L5を、0、3、7、14及び21日目に動物に腹腔内注射により投与した。動物を28日目に屠殺した。筋肉及び他の組織を切り出し、重量を計測した。低用量(0.1及び0.3mg/kg)では、H8L5は副睾丸脂肪パッド質量を有意に増加させた(p<0.05)(図26A)。1mg/kgを超える用量レベルでは、H8L5は個々の骨格筋質量の有意な増加を引き起こした(図26B)。後肢坐骨神経の電気刺激によりin situで測定されたピーク筋収縮力は、1〜10mg/kgの用量レベルのH8L5で治療された群における対照と比較して、19〜24%増加した(p<0.05)(図26C)。
【０３７６】
この試験は、H8L5がこのモデルにおける強力な同化剤であることを確認するものである。最少有効用量は、重量計測した全ての筋肉の質量及び血清中の遊離ミオスタチンの中和の有意な増加に基づいて、1mg/kgである。重要なことに、筋肉質量の増加は、in vivoでの収縮性測定による最大力生成の有意な増加をもたらし、1mg/kgの用量で対照動物に対して有意な改善が観察された。
【０３７７】
(24. SCIDマウスにおける腹腔内投与に関するH8L5のPK)
H8L5の薬物動態挙動を、0.1、1及び10mg/kgの単回腹腔内(IP)注射後にメスのC.B-17 SCIDマウスにおいて決定した。以下の採取スケジュール:2、6、12、24、48、72、192、336、504及び672時間に従って採取時間点あたり3匹の動物からの代替スパースサンプリング(sparse sampling)設計に従って血清サンプルを採取した。Gyrolab platform:ビオチン化ミオスタチン捕捉試薬及びDylight Alexa標識ヤギ抗ヒトIgG検出抗体を用いてサンプルをH8L5について分析した。WinNonLin、Enterprise version 4.1を用いる非コンパートメント薬物動態分析により、PK分析を実施した。
【０３７８】
0.1、1.0及び10mg/kgの標的用量でのSCIDマウスへの腹腔内投与後のH8L5に関する血清濃度-時間データから誘導された薬物動態パラメータの概要を下記表29に提示する。
【０３７９】
2013531486.tif 000030
【０３８０】
配列表
配列番号1 (CDRH1)
GYFMH
配列番号2 (CDRH2)
NIYPYNGVSNYNQRFKA
配列番号3 (CDRH3)
RYYYGTGPADWYFDV
配列番号4 (CDRL1)
KASQDINSYLS
配列番号5 (CDRL2)
RANRLVD
配列番号6 (CDRL3)
LQCDEFPLT
配列番号7 (マウスモノクローナル10B3 VH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号8 (マウスモノクローナル10B3および10B3キメラVL)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLELK
配列番号9 (人工的シグナル配列)
MGWSCIILFLVATATGVHS
配列番号10 (VHのためのヒトアクセプターフレームワーク)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXXXXXXXXXXWGQGTMVTVSS
配列番号11 (VLのためのヒトアクセプターフレームワーク)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK
配列番号12 (ヒト化VH : H0)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号13 (ヒト化VH : H1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号14 (ヒト化VH : H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号15 (ヒト化VL : L0)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号16 (ヒト化VL : L1)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号17 (ヒト化VL : L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号18 (ヒト化VL : L3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIK
配列番号19 (10B3キメラVH : N54D)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYDGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号20 (10B3キメラVH : N54Q)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYQGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号21 (10B3キメラVL : C91S)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELK
配列番号22 (ヒト化VH : H2 : N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYDGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号23 (ヒト化VH : H2 : N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号24 (ヒト化VL : L2 : C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号25 (10B3キメラVH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号26 (10B3キメラ重鎖)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号27 (10B3キメラ軽鎖)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号28 (ヒト化重鎖: H0)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号29 (ヒト化重鎖: H1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号30 (ヒト化重鎖: H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号31 (ヒト化軽鎖: L0)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号32 (ヒト化軽鎖: L1)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号33 (ヒト化軽鎖: L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号34 (ヒト化軽鎖: L3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号35 (10B3キメラN54D 重鎖)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYDGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号36 (10B3キメラN54Q 重鎖)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYQGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号37 (10B3キメラC91S 軽鎖)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号38 (ヒト化重鎖: H2 N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYDGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号39 (ヒト化重鎖: H2 N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号40 (ヒト化軽鎖: L2 C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号41 (10B3キメラ重鎖, DNA配列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号42 (10B3キメラ軽鎖, DNA配列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTGTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号43 (ヒト化重鎖: H0, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号44 (ヒト化重鎖: H1, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGAACGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号45 (ヒト化重鎖: H2, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号46 (ヒト化軽鎖: L0, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAG
GACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号47 (ヒト化軽鎖: L1, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGCGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号48 (ヒト化軽鎖: L2, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号49 (ヒト化軽鎖: L3, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCGCGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号50 (10B3キメラN54D 重鎖, DNA配列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACGATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号51 (10B3キメラN54Q 重鎖, DNA配列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACCAAGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号52 (10B3キメラC91S 軽鎖, DNA配列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号53 (ヒト化重鎖: H2 N54D, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACGACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号54 (ヒト化重鎖: H2 N54Q, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACCAGGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号55 (ヒト化軽鎖: L2 C91S, DNA配列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号56 (人工ミオスタチン線状ペプチド1)
DFGLDCDEHSTESRGSG
配列番号57 (人工ミオスタチン線状ペプチド3)
SGSGDCDEHSTESRCCRY
配列番号58 (人工ミオスタチン線状ペプチド5)
SGSGHSTESRCCRYPLTV
配列番号59 (人工ミオスタチン線状ペプチド7)
SGSGSRCCRYPLTVDFEA
配列番号60 (人工ミオスタチン線状ペプチド9)
SGSGRYPLTVDFEAFGWD
配列番号61 (人工ミオスタチン線状ペプチド11)
SGSGTVDFEAFGWDWIIA
配列番号62 (人工ミオスタチン線状ペプチド13)
SGSGEAFGWDWIIAPKRY
配列番号63 (人工ミオスタチン線状ペプチド15)
SGSGWDWIIAPKRYKANY
配列番号64 (人工ミオスタチン線状ペプチド17)
SGSGIAPKRYKANYCSGE
配列番号65 (人工ミオスタチン線状ペプチド19)
SGSGRYKANYCSGECEFV
配列番号66 (人工ミオスタチン線状ペプチド21)
SGSGNYCSGECEFVFLQK
配列番号67 (人工ミオスタチン線状ペプチド23)
SGSGGECEFVFLQKYPHT
配列番号68 (人工ミオスタチン線状ペプチド25)
SGSGFVFLQKYPHTHLVH
配列番号69 (人工ミオスタチン線状ペプチド27)
SGSGQKYPHTHLVHQANP
配列番号70 (人工ミオスタチン線状ペプチド29)
SGSGHTHLVHQANPRGSA
配列番号71 (人工ミオスタチン線状ペプチド31)
SGSGVHQANPRGSAGPCC
配列番号72 (人工ミオスタチン線状ペプチド33)
SGSGNPRGSAGPCCTPTK
配列番号73 (人工ミオスタチン線状ペプチド35)
SGSGSAGPCCTPTKMSPI
配列番号74 (人工ミオスタチン線状ペプチド37)
SGSGCCTPTKMSPINMLY
配列番号75 (人工ミオスタチン線状ペプチド39)
SGSGTKMSPINMLYFNGK
配列番号76 (人工ミオスタチン線状ペプチド41)
SGSGPINMLYFNGKEQII
配列番号77 (人工ミオスタチン線状ペプチド43)
SGSGLYFNGKEQIIYGKI
配列番号78 (人工ミオスタチン線状ペプチド45)
SGSGGKEQIIYGKIPAMV
配列番号79 (人工ミオスタチン線状ペプチド47)
SGSGIIYGKIPAMVVDRC
配列番号80 (人工ミオスタチン線状ペプチド49)
SGSGGKIPAMVVDRCGCS
配列番号81 (人工ミオスタチン線状ペプチド)
CCTPTKMSPINMLY
配列番号82 (CDRH3変異体Y96L)
RLYYGTGPADWYFDV
配列番号83 (CDRH3変異体G99D)
RYYYDTGPADWYFDV
配列番号84  (CDRH3変異体G99S)
RYYYSTGPADWYFDV
配列番号85 (CDRH3変異体G100A_K)
RYYYGTKPADWYFDV
配列番号86 (CDRH3変異体P100B_F)
RYYYGTGFADWYFDV
配列番号87 (CDRH3変異体P100B_I)
RYYYGTGIADWYFDV
配列番号88 (CDRH3変異体W100E_F)
RYYYGTGPADFYFDV
配列番号89 (CDRH3変異体F100G_N)
RYYYGTGPADWYNDV
配列番号90 (CDRH3変異体F100G_Y)
RYYYGTGPADWYYDV
配列番号91 (CDRH3変異体V102N)
RYYYGTGPADWYFDN
配列番号92 (CDRH3変異体V102S)
RYYYGTGPADWYFDS
配列番号93 (CDRH2変異体G55D)
NIYPYNDVSNYNQRFKA
配列番号94 (CDRH2変異体G55L)
NIYPYNLVSNYNQRFKA
配列番号95 (CDRH2変異体G55S)
NIYPYNSVSNYNQRFKA
配列番号96 (CDRH2変異体G55T)
NIYPYNTVSNYNQRFKA
配列番号97 (CDRH2変異体G55V)
NIYPYNVVSNYNQRFKA
配列番号98 (ヒト化重鎖: H2_F100G_Y Fc 非機能化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号99 (ヒト化重鎖: H2_G55S - F100G_Y Fc 非機能化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号100 (VLのためのヒトアクセプターフレームワーク)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK
配列番号101 (HexaHisGB1Tev/ (D76A)マウスミオスタチンポリタンパク質)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQEGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
配列番号102 (GB1タグ)
DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
配列番号103 (マウスミオスタチンポリタンパク質(D76A))
EGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
配列番号104 (成熟ミオスタチン)
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
配列番号105 (Furin発現構築物)
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACENLYFQG
配列番号106 (HexaHisGB1Tev/ヒトミオスタチンプロ-ペプチド)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
配列番号107 (Tevプロテアーゼ発現構築物)
MHGHHHHHHGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQC
GSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNE
配列番号108 (ヒトミオスタチンプロ-ペプチド)
ENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
配列番号109 (CDRL3変異体C91S)
LQSDEFPLT
配列番号110 (CDRH2変異体F100G_S)
RYYYGTGPADWYSDV
配列番号111 (BMP-1発現構築物)
MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRPLDLADYTYDLAEEDDSEPLNYKDPCKAAAFLGDIALDEEDLRAFQVQQAVDLRRHTARKSSIKAAVPGNTSTPSCQSTNGQPQRGACGRWRGRSRSRRAATSRPERVWPDGVIPFVIGGNFTGSQRAVFRQAMRHWEKHTCVTFLERTDEDSYIVFTYRPCGCCSYVGRRGGGPQAISIGKNCDKFGIVVHELGHVVGFWHEHTRPDRDRHVSIVRENIQPGQEYNFLKMEPQEVESLGETYDFDSIMHYARNTFSRGIFLDTIVPKYEVNGVKPPIGQRTRLSKGDIAQARKLYKCPACGETLQDSTGNFSSPEYPNGYSAHMHCVWRISVTPGEKIILNFTSLDLYRSRLCWYDYVEVRDGFWRKAPLRGRFCGSKLPEPIVSTDSRLWVEFRSSSNWVGKGFFAVYEAICGGDVKKDYGHIQSPNYPDDYRPSKVCIWRIQVSEGFHVGLTFQSFEIERHDSCAYDYLEVRDGHSESSTLIGRYCGYEKPDDIKSTSSRLWLKFVSDGSINKAGFAVNFFKEVDECSRPNRGGCEQRCLNTLGSYKCSCDPGYELAPDKRRCEAACGGFLTKLNGSITSPGWPKEYPPNKNCIWQLVAPTQYRISLQFDFFETEGNDVCKYDFVEVRSGLTADSKLHGKFCGSEKPEVITSQYNNMRVEFKSDNTVSKKGFKAHFFSEKRPALQPPRGRPHQLKFRVQKRNRTPQENLYFQGWSHPQFEKGTDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
配列番号112 (ヒト化VH : H3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKARATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号113 (ヒト化VH : H4)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号114 (ヒト化VH : H5)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号115 (ヒト化VH : H6)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号116 (ヒト化VL : L4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号117 (ヒト化VL : L5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号118 (ヒト化VL : L6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK
配列番号119 (ヒト化VH : H7)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号120 (ヒト化VH : H8)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号121 (ヒト化VH : H9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSS
配列番号122 (ヒト化HC: H7 Fc 非機能化, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号123 (ヒト化HC: H7 Fc 非機能化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号124 (ヒト化HC: H8 Fc 非機能化, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号125 (ヒト化HC: H8 Fc 非機能化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号126 (ヒト化HC: H9 Fc 非機能化, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号127 (ヒト化HC: H9 Fc 非機能化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号128 (ヒト化HC: H3, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号129 (ヒト化HC: H4, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号130 (ヒト化HC: H5, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号131 (ヒト化HC: H6, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号132 (ヒト化LC: L4, DNA配列)
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCCAGGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号133 (ヒト化LC: L5, DNA配列)
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号134 (ヒト化LC: L6, DNA配列)
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCCAGGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号135 (ヒト化HC: H7, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号136 (ヒト化HC: H8, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号137 (ヒト化HC: H9, DNA配列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号138 (ヒト化重鎖: H3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKARATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号139 (ヒト化重鎖: H4)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号140 (ヒト化重鎖: H5)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号141 (ヒト化重鎖: H6)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号142 (ヒト化重鎖: H7)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号143 (ヒト化重鎖: H8)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号144 (ヒト化重鎖: H9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNYNQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号145 (ヒト化軽鎖: L4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号146 (ヒト化軽鎖: L5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号147 (ヒト化軽鎖: L6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【図１】
2013531486.tif 000031
【図２】
2013531486.tif 000032
【図３Ａ】
2013531486.tif 000033
【図３Ｂ】
2013531486.tif 000034
【図４】
2013531486.tif 000035
【図５】
2013531486.tif 000036
【図６】
2013531486.tif 000037
【図７】
2013531486.tif 000038
【図８】
2013531486.tif 000039
【図９】
2013531486.tif 000040
【図１０】
2013531486.tif 000041
【図１１】
2013531486.tif 000042
【図１２】
2013531486.tif 000043
【図１３Ａ】
2013531486.tif 000044
【図１３Ｂ】
2013531486.tif 000045
【図１３Ｃ】
2013531486.tif 000046
【図１４】
2013531486.tif 000047
【図１５】
2013531486.tif 000048
【図１６】
2013531486.tif 000049
【図１７】
2013531486.tif 000050
【図１８】
2013531486.tif 000051
【図１９】
2013531486.tif 000052
【図２０】
2013531486.tif 000053
【図２１】
2013531486.tif 000054
【図２２】
2013531486.tif 000055
【図２３】
2013531486.tif 000056
【図２４】
2013531486.tif 000057
【図２５】
2013531486.tif 000058
【図２６】
2013531486.tif 000059
【図２７】
2013531486.tif 000060
【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月31日(2013.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオスタチンに特異的に結合し、液相アフィニティアッセイにおいて150pMよりも強い親和性を有し、かつ、少なくとも100時間のPK T1/2を有するヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項２】
配列番号90のCDRH3を含む重鎖可変領域を含み、Kabatの位置28のセリン残基;並びにKabatの位置48のイソロイシン；Kabatの位置67のアラニン残基;Kabatの位置69のロイシン残基；Kabatの位置71のバリン残基;及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号95のCDRH2をさらに含む、請求項2に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号1のCDRH1をさらに含む、請求項2又は3に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項５】
以下のCDR配列:
(a)配列番号4のCDRL1;
(b)配列番号5のCDRL2;及び
(c)配列番号109のCDRL3;
のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖可変領域を含み、
Kabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基をさらに含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項６】
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109である、請求項1〜5のいずれか１項に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記抗原結合タンパク質が、
配列番号120の重鎖可変領域; および／または配列番号117の軽鎖可変領域; または前記配列と75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖可変領域; ここでCDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号95であり、CDRH1は配列番号1であり、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、かつCDRL3は配列番号109である; 
を含み、かつ
ここで該重鎖可変領域はさらに、Kabat位置28にセリン残基を有し;並びに位置48におけるイソロイシン、Kabat位置67におけるアラニン残基、位置69におけるロイシン、Kabat位置71におけるバリン残基、およびKabat位置73におけるリシン残基、の少なくとも１つ、またはその組合せ、またはその全てを有するものであり、かつ
ここで該軽鎖可変領域はさらにKabat位置71におけるチロシン残基、およびKabat位置46におけるトレオニン残基を含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号120の重鎖可変領域および配列番号117の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項９】
可変重鎖及び軽鎖領域を好適なヒト定常領域と組み合わせる、請求項8に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
定常領域がIgG4である、請求項９に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗原結合タンパク質が、
配列番号143の重鎖配列、および／もしくは配列番号 146の軽鎖配列; または前記配列と75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖配列を含み、
ここでCDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号95であり、CDRH1は配列番号1であり、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、かつCDRL3は配列番号109であり、ならびに
ここで該重鎖はさらに、Kabat位置28にセリン残基を有し、ならびに位置48におけるイソロイシン、Kabat位置67におけるアラニン残基、位置69におけるロイシン、Kabat位置71におけるバリン残基、およびKabat位置73におけるリシン残基の少なくとも１つ、またはその組合せ、またはその全てを含むものであり、かつ
ここで該軽鎖はさらにKabat位置71においてチロシン残基を、およびKabat位置46においてトレオニン残基を含む、
請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
重鎖がFc無効化されている、請求項9, 10または11に記載のヒト化抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１４】
ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子であって、
配列番号136の重鎖DNA配列、および／または配列番号133の軽鎖DNA配列、または前記配列と75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖DNA配列を含み、
ここで該DNA配列は、
CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、かつCDRL3が配列番号109であり、かつ
該重鎖がさらにKabat位置28にセリン残基を有し、かつ、位置48におけるイソロイシン;Kabat位置67におけるアラニン残基;位置69におけるロイシン;Kabat位置71におけるバリン残基; およびKabat位置73におけるリシン残基の少なくとも１つ、またはその組合せ、またはその全てを含むものであり、かつ
該軽鎖がさらにKabat位置71のチロシン残基およびKabat位置46のトレオニン残基を含む、タンパク質をコードする、
前記核酸分子。
【請求項１５】
請求項13または14に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項15に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１７】
請求項16に記載の宿主細胞を培養する工程と、抗原結合タンパク質を回収する工程とを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
請求項1から12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と、製薬上許容し得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項1から12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項18に記載の組成物を投与する工程を含む、筋肉質量、筋肉強度及び筋肉機能のいずれか一つ又はその組合せを低下させる疾患に罹患した対象を治療する方法。
【請求項２０】
請求項1から12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項18に記載の組成物を投与する工程を含む、骨格筋減少症、悪液質、筋肉消耗、廃用性筋萎縮、HIV、AIDS、癌、筋骨若しくは神経に対する手術、熱傷、外傷若しくは損傷、肥満、糖尿病(II型糖尿病を含む)、関節炎、慢性腎不全(CRF)、末期腎不全(ESRD)、鬱血性心不全(CHF)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、選択的関節修復、多発性硬化症(MS)、脳卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経障害、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、骨粗鬆症、変形性関節症、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸促迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎又は脊柱側弯症に罹患した対象を治療する方法。
【請求項２１】
請求項1から12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項18に記載の組成物を投与する工程を含む、対象における筋肉質量を増加させる、筋肉強度を増加させる、及び/又は筋肉機能を改善する方法。
【国際調査報告】
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