(57)【要約】本発明は、絹フィブロインのβシート形成を介してさらに安定化される、異なる化学基（例えば、PEGを機能化するチオールおよびマレイミド）を持つ化学的に反応性の活性ポリエチレングリコール（PEG）による架橋結合を介した、絹−PEGをベースとする生体材料の調製のための方法および組成物に関する。架橋結合した絹−PEG生体材料は強力な接着特性を示し、これは、絹−PEG生体材料中の絹の濃度に応じて、現在主流のPEGをベースとする封止剤と同等もしくはより優れたものとなる。さらに、絹−PEGをベースとする生体材料は細胞適合性であり、膨張挙動が低く、かつ分解時間が長く、それによりこれらは、現在利用できる組織封止剤の製品が禁忌である可能性のある場所での止血の適用に適切となる。2013536737.tif 000007
2013536737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、
βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインと
を含む組成物を混合する段階を含む、架橋結合ポリマーマトリックスを調製する方法。
【請求項２】
架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む組成物を混合する段階；および
架橋結合ポリマーマトリックスを形成するために該組成物の該成分を架橋結合する段階
を含む、架橋結合ポリマーマトリックスを調製する方法。
【請求項３】
架橋結合する段階が、混合物をアルコール処理または水アニーリング処理に曝露することを伴う、請求項2記載の方法。
【請求項４】
機能的に活性化されたPEG成分と混合する前に、絹フィブロインからセリシンを枯渇させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
マトリックスがヒドロゲルである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
各PEG成分が4アームPEGである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
PEG成分の一つがチオール基で機能的に活性化される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化され、該PEG成分の別の一つがチオール基で機能的に活性化される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物の少なくとも一つの成分が水溶液に懸濁または溶解される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも絹フィブロインが水溶液中にあり、該絹フィブロインの濃度が少なくとも約10重量％である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
水溶液が二価のイオンを含まない、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
水溶液が脱イオン水である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
各PEG成分が少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
水溶液のpHが約6から約8の範囲である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物中の各PEG成分の濃度が約2.5重量％から約15重量％の範囲である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物中の絹フィブロインの濃度が約10重量％から約30重量％の範囲である、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物中の絹フィブロインの濃度が約15重量％から約25重量％の範囲である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
架橋結合ポリマーマトリックスが前記組成物の初期重量の約70％未満膨張する、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
架橋結合ポリマーマトリックスが、混合する段階後1時間以内に実質的に膨張しない、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインが、架橋結合ポリマーマトリックスの接着強度を少なくとも約10Paまで高める、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似体、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、アプタマー、抗体またはその断片もしくは部分、抗原またはエピトープ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子または組換え型成長因子ならびにその断片および変異型、細胞接着調節物質、サイトカイン、酵素、抗生物質または抗菌性化合物、ウイルス、毒素、プロドラッグ、化学療法物質、小分子、薬物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される活性物質をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
活性物質が、始原細胞または幹細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、神経細胞、生殖細胞、結合組織細胞、ホルモン分泌細胞、腱細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、神経芽細胞、グリア芽細胞、口の細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、腎尿細管細胞、腎基底膜細胞、外皮細胞、骨髄細胞、肝細胞、胆管の細胞、膵島細胞、甲状腺の細胞、上皮小体の細胞、副腎の細胞、視床下部の細胞、下垂体の細胞、卵巣の細胞、精巣の細胞、唾液腺の細胞、脂肪細胞、前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
活性物質が抗生物質である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、セルロース、血液因子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される止血物質をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
架橋結合ポリマーマトリックスが、少なくとも10日間にわたって生理学的条件下でその当初の体積を保持する、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
請求項1〜26のいずれか一項記載の方法によって作製される、架橋結合ポリマーマトリックス。
【請求項２８】
請求項27記載の架橋結合ポリマーマトリックスを含む、組織封止剤または接着剤。
【請求項２９】
架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスを安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む組成物を対象の標的部位に投与する段階；および
該成分を架橋結合して組織封止剤または接着剤を該標的部位において形成するために該組成物の該成分を混合する段階
を含む、対象の標的部位において組織封止剤または接着剤を形成する方法。
【請求項３０】
各PEG成分が4アームPEGである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化される、請求項29または30記載の方法。
【請求項３２】
PEG成分の一つがチオール基で機能的に活性化される、請求項29〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化され、該PEG成分の別の一つがチオール基で機能的に活性化される、請求項29〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも一つの成分が水溶液に懸濁または溶解される、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも、少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインが水溶液中にある、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
水溶液が二価のイオンを含まない、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
各PEG成分が少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解される、請求項29〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物の総重量に基づく各PEG成分の重量パーセントが約2.5重量％から約15重量％の範囲である、請求項29〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物の総重量に基づく絹フィブロインの重量パーセントが約10重量％から約30重量％の範囲である、請求項29〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物の総重量に基づく絹フィブロインの重量パーセントが約15重量％から約25重量％の範囲である、請求項29〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
組織封止剤または接着剤が前記組成物の初期重量の約70重量％未満膨張する、請求項29〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が活性物質をさらに含む、請求項29〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が止血物質をさらに含む、請求項29〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
標的部位の表面が前記組成物中の成分の少なくとも一つと架橋結合する、請求項29〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
対象が移植片である、請求項29〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
対象が組織または臓器である、請求項29〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
組織または臓器が圧力感受性構造物の近傍にある、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
組織または臓器が開放性の創傷を有する、請求項46または47記載の方法。
【請求項４９】
二つのPEG成分が対象に別々に投与され、それによって、インビボにおいて組織封止剤または接着剤が形成される、請求項29〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
第一の区画が第一の機能的に活性化されたPEG成分を含み、第二の区画が架橋結合マトリックスを形成するために機能的に活性化された第一の該PEG成分と反応することができる第二の機能的に活性化されたPEG成分を含み、第一および第二の該区画の少なくとも一つが、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインをさらに含む、少なくとも二つの区画を含むハウジング
を含む、予め充填された送達装置。
【請求項５１】
第一の機能的に活性化されたPEG成分が少なくとも一つのマレイミジル基を含む、請求項50記載の送達装置。
【請求項５２】
第二の機能的に活性化されたPEG成分が少なくとも一つのチオール基を含む、請求項50記載の送達装置。
【請求項５３】
シリンジである、請求項50〜52のいずれか一項記載の送達装置。
【請求項５４】
シリンジが針をさらに含む、請求項53記載の送達装置。
【請求項５５】
シリンジがカテーテルをさらに含む、請求項53または54記載の送達装置。
【請求項５６】
少なくとも一つの送達装置に予め充填された少なくとも三つの成分を含むマトリックス形成組成物であって、少なくとも三つの該成分が、架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む、マトリックス形成組成物、ならびに
該マトリックス形成組成物を混合するための溶媒を含む少なくとも一つの容器
を含む、キット。
【請求項５７】
送達装置が少なくとも二つの別々の外筒を含み、それぞれの該外筒がマトリックス組成物の異なる成分を充填される、請求項56記載のキット。
【請求項５８】
少なくとも一つの成分が別個の送達装置に予め充填される、請求項56記載のキット。
【請求項５９】
溶媒が水溶液である、請求項56〜58のいずれか一項記載のキット。
【請求項６０】
溶媒が脱イオン水である、請求項56〜59のいずれか一項記載のキット。
【請求項６１】
PEG成分が、送達装置の別個の外筒または異なる送達装置に別々に予め充填される、請求項56〜60のいずれか一項記載のキット。
【請求項６２】
PEG成分が絹フィブロインとブレンドされる、請求項56〜61のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み入れられる2010年9月1日に出願された米国仮特許出願第61/379,065号の35 U.S.C. §119(e)に基づく恩典を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、National Institutes of Health（Tissue Engineering Resource Center）により与えられた助成金番号P41 EB002520に基づいて政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明についてある程度の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は絹−PEGが架橋結合した生体材料を調製するための方法および組成物に関する。絹−PEGをベースとする生体材料は、組織封止剤および止血剤として用いられる望ましい生物学的、物理的および機械的特性を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
止血は出血過程の停止を惹起する複雑な過程である。止血は、典型的には、例えば、損傷部分を閉じるための機械的な物質のような機械的なタンポン挿入、血餅の形成または人為的な創傷の閉鎖によって達成することができる。Wheat & Wolf, 36 Urol. Clin. North Am. 265-75 (2009)。例えば、ゼラチン、コラーゲン、セルロースまたはその他の多糖類のスポンジ、泡、または粉末として利用可能な機械的な物質は、出血部位で膨張して創傷の形に一致することによる機械的なタンポン挿入を介して止血を達成する。Spotnitz & Burks, 48 Transfusion 1502-16 (2008)。これらの材料が創傷部位に適用されると、血小板の刺激、凝集、脱顆粒および凝固因子の放出も起こり得る。Jenkins et al., 132 J. Am. Med. Assoc. 124-32 (1946)。
【０００５】
血餅の形成は、トロンビンの単独または機械的物質（例えば、ウシコラーゲンスポンジもしくはブタゼラチンマトリックス）またはフィブリン封止剤との組み合わせの使用によって、酵素的に開始または達成することができる。Spotnitz & Burks, 2008。トロンビンは、損傷部位で血小板を活性化することによって、およびフィブリノーゲンのフィブリンへの開裂によって、作用する。続いて、フィブリンは、血小板が付着して止血栓を形成する不溶性のネットワークに架橋結合する。トロンビンおよび機械的物質が組み合わせて使用されると、それらは出血を止めるために相乗的に作用することができる。Gill et al., 65 Urology 463-66 (2005)。例えば、トロンビンおよびフィブリノーゲンの混合物として調製されるフィブリン封止剤は、凝固カスケードの最終の段階を反復して血餅の形成に必要な材料を外因的に供給することができる。Lowe et al., 48 J. Cardiovasc. Surg. 323-31 (2007)。
【０００６】
止血は、創傷部位に物理的に近い隣接組織を同時に共有結合性に結合する間に、自己架橋結合する試薬を使用することによっても達成され得る。例えば、シアノアクリレートをベースとする接着剤は、内因性のヒドロキシル基の存在下で発熱反応を介してインサイチューにて迅速に重合することができる。Wheat & Wolf, 2009; Gill et al., 2005; Lowe et al., 2007; Marcovich et al., 57 Urology 806-10 (2001)。別の市販の架橋結合性封止剤は、ウシアルブミンおよびグルタルアルデヒドをベースとして、グルタルアルデヒドはアルブミンのアミン基を創傷部位に見られる細胞外マトリックスタンパク質に連結することによって作用する。Furst & Banerjee, 79 Ann. Thorac. Surg. 1522-29 (2005)。しかしながら、グルタルアルデヒドの存在は、毒性の問題を提起する。Furst & Banerjee, 2005。化学的に架橋結合するポリエチレングリコール（PEG）をベースとする封止剤は、止血試薬としても用いられてきた。Preul et al., 107 J. Neurosurg. 642-50 (2007); Torchiana, 18 J. Cardiac. Surg. 504-06 (2003); Wallace et al., 58 J. Biomed. Mater. Res. 545-55 (2001)。しかし、COSEAL（登録商標）のような市販のPEGをベースとする封止剤は、圧力感受性の領域での限定された適用性を含む、いくつかの欠点を有する。
【０００７】
一連の止血物質および組織接着剤／封止剤はFDAに承認されており、現在、診療で使用されているが、手術室での出血の制御は依然として課題である。現在市販されている調製物は、例えば、より長い分解時間、より高い接着特性、または神経圧迫に敏感な領域のような特定の組織での適用のための膨張の抑制などのために、依然として改善が必要である。従って、当技術分野では、依然として、組織封止／接着材料としての全体的な材料の特性を改善する必要性がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、絹のβシート形成を介してさらに安定化される、異なる化学基を持つ化学的に反応性の活性ポリエチレングリコール（PEG）（例えば、チオールおよびマレイミド官能基を含むPEG）による架橋結合を介した絹−PEGをベースとする生体材料の調製のための方法、組成物、およびキットに関する。絹−PEGをベースとする生体材料は、封止剤および止血剤として使用されるための望ましい生物学的、物理的および機械的特性を有する。さらに、絹−PEGをベースとする生体材料の調製は、適用に向いた材料を作るための接着性／組織封止特性および分解性などの特性に関して調整することができる。
【０００９】
本発明の一つの局面は、絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）を含む少なくとも三つの成分および少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分を含むマトリックス形成組成物に関する。二つの機能的に活性化されたPEG成分は架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができ、本マトリックスは絹フィブロインのβシート形成によってさらに安定化することができる。典型的には、二つのPEG成分はマトリックスの形成前に予め混合されない。いくつかの態様において、各PEG成分はマトリックスの形成前に絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）とブレンドされ得る。
【００１０】
本発明の一つの局面は、架橋結合したポリマーマトリックスを調製する方法に関し、本方法は、マトリックス形成組成物を混合する工程と、架橋結合したポリマーマトリックスを形成するために組成物の成分を架橋結合する工程とを含む。組成物は、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分、および架橋結合したマトリックスをさらに安定化するためにβシートを形成することができる絹フィブロインを含む。
【００１１】
本発明の別の局面は、マトリックス形成組成物の混合から形成される架橋結合したポリマーマトリックスに関する。従って、架橋結合したポリマーマトリックスは、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応している少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分、および架橋結合したマトリックスを安定化するためにβシートを形成する絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）を含む。本明細書に記載されるいくつかの局面のいくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスはヒドロゲルであり得る。
【００１２】
いくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスを調製するために用いられる絹フィブロインはセリシンが枯渇していてもよい。
【００１３】
マトリックス形成組成物または架橋結合したポリマーマトリックス中の機能的に活性化された各PEG成分は、独立して、例えば、少なくとも2アーム、少なくとも3アーム、少なくとも4アームのPEG、少なくとも8アームのPEG、またはそれ以上の任意の数のPEGポリマー鎖（「アーム」）を持つことができる。一つの態様において、少なくとも一つのPEG成分は4アームのPEGである。別の態様において、各PEG成分は4アームのPEGである。
【００１４】
本明細書に記載されるマトリックス形成組成物または架橋結合したポリマーマトリックスのいくつかの態様において、PEG成分の少なくとも一つはマレイミジル基で機能的に活性化され得る。いくつかの態様において、PEG成分の少なくとも一つはチオールで機能的に活性化され得る。一部の態様において、PEG成分の一つはマレイミジル基で機能的に活性化され得て、別のPEG成分はチオール基で機能的に活性化され得る。PEG成分の各アームにおける官能基の数および／または種類は、同一であってもよくまたは異なってもよい。
【００１５】
本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは、それらが組織封止剤、止血剤および／または組織接着剤として用いられることを可能とし得る様々な特性を有する。例えば、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスのいくつかの態様は、例えば、生理学的な条件に曝露された際に架橋結合したポリマーマトリックスの初期重量の80重量％よりも少なく、膨張し得る。その他の態様において、例えば、架橋結合したポリマーマトリックスは創傷の治癒が生じるまでその体積を保持することができるなど、架橋結合したポリマーマトリックスは、生理学的条件下で少なくとも約10日間、その体積を保持することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは少なくとも約10Paの接着強度を持ち得る。様々な適用に応じて、いくつかの態様において、マトリックス形成組成物または架橋結合したポリマーマトリックスは活性物質または止血物質をさらに含むことができる。
【００１６】
本発明のさらに別の局面は、患者の標的部位、例えば移植片、組織、または臓器で、組織封止剤または接着剤を形成する方法に関する。本方法は、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、架橋結合したマトリックスを安定化するためにβシートを形成することができる絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）とを含む組成物を標的部位に投与する工程、ならびに成分を架橋結合して標的部位で組織封止剤または接着剤を形成するために組成物を混合する工程を含む。
【００１７】
組成物を送達するために用いられる送達装置を含むキットも本明細書に記載される。いくつかの態様において、キットはインサイチュー、インビボ、またはエクスビボの適用においてマトリックス形成組成物を治療領域に送達する注入装置を含むことができる。
【００１８】
明確にするために、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは米国特許出願第US 2008/0131509号（Hossainy et al.）に記載されるそれらとは異なる。Hossainyらに記載されるマトリックスは、少なくとも約10重量％またはそれよりも高い濃度で絹フィブロイン溶液を含む組成物からは形成されない。より重要な点として、Hossainyらは彼らの複合物マトリックスの接着強度を示していないが、本明細書の本発明者らは、約10重量％よりも低い（例えば、5重量％の）濃度の絹の溶液から形成される架橋結合したポリマーマトリックスはFDAに承認された組織封止剤であるCOSEAL（登録商標）よりも著しく低品質であるが、少なくとも約10％またはそれよりも高い絹濃度から形成されるそれらは、驚くべきことにCOSEAL（登録商標）と同等であるか、またはより優れた性能さえも発揮することを実証している（図7Bを参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図1A〜1Bは本明細書に記載される絹−PEG材料の例示的形成過程の模式図を示す。図1Aは、絹−PEG材料における2段階の加工結合過程の模式図を示す。スキームに示されるタンパク質構造は例証目的のために用いられたものであって、絹フィブロインの実際の立体配置を示すことはできない。
【図１Ｂ】図1A〜1Bは本明細書に記載される絹−PEG材料の例示的形成過程の模式図を示す。図1Bは、本発明の一つまたは複数の態様に従って絹−PEGゲル形成過程の模式図を示す。
【図２】図2は、迅速な化学的架橋結合の工程（差し込み図）および絹によるβシート形成（例えば、絹−PEGブレンド調製物における絹フィブロインのβシート形成能を評価するために、10％絹−PEG試料をエタノール（EtOH）で処理した）を含む、二段階の架橋結合モデルの確認の結果を示す。
【図３】図3A〜3BはPEGまたはPEG−絹をベースとする生体材料と共に培養した細胞の画像を示す。図3Aおよび3Bは、それぞれ、48時間細胞培養後のPEGおよび絹−PEGをベースとする生体材料の細胞適合性を示す。画像に示される細胞のほとんどまたはすべてが生存可能であった。PEGまたはPEG−絹をベースとする生体材料のいずれにも、死細胞はほとんどまたは全く検出されなかった。
【図４Ａ】図4A〜4Bは、対照のPEGに比して、絹の異なる濃度を含む絹−PEGをベースとする材料の膨張特性を示す。図4Aは、4時間の期間中における絹の記載の濃度を含む絹−PEGをベースとする材料の膨張特性を示す。
【図４Ｂ】図4A〜4Bは、対照のPEGに比して、絹の異なる濃度を含む絹−PEGをベースとする材料の膨張特性を示す。図4Bは5日間の期間中における絹−PEGをベースとする材料の膨張特性を示す。
【図５Ａ】図5A〜5Bは、対照のPEGに比して、絹の異なる濃度を含む絹−PEGをベースとする生体材料のインビトロにおける分解の結果を示す。図5Aは、1×PBS（pH 7.4）中での試料のインビトロにおける分解の結果を示す。n＝3。記載されたいずれの条件においても、顕著な分解は認められなかった。
【図５Ｂ】図5A〜5Bは、対照のPEGに比して、絹の異なる濃度を含む絹−PEGをベースとする生体材料のインビトロにおける分解の結果を示す。図5Bは、プロテアーゼXIV（1mg/ml、5U/mg）中における試料のインビトロにおける分解の結果を示す。n＝3。記載されたいずれの条件においても、顕著な分解は認められなかった。
【図６Ａ】図6A〜6Cは接着試験の結果および対応する装置を示す。図6Aは動的機械分析（DMA）測定実験装置および試料のスチールへの接着を測定する手順を例証して、試料のマウント前から測定過程中の一連の工程までのスチールの取り付け金具を示す（左から右へ）。
【図６Ｂ】図6A〜6Cは接着試験の結果および対応する装置を示す。図6Bは、腸の基質（黒色の棒グラフ）およびスチールの基質（明灰色の棒グラフ）に対するCOSEAL（登録商標）および絹約5％を含む絹−PEG試料の接着特性を比較する棒グラフを示す。N＝3。図6Bの差し込み図は、腸測定物への接着のためのDMAのセッティングを示す。記載された統計量はStudentのt検定を用いて得られた。
【図６Ｃ】図6A〜6Cは接着試験の結果および対応する装置を示す。図6Cは、腸の基質（黒色の棒グラフ）およびスチールの基質（明灰色の棒グラフ）に対するCOSEAL（登録商標）および絹約6％を含む絹−PEG試料の接着特性を比較する棒グラフを示す。
【図７Ａ】図7A〜7Eは絹−PEGをベースとする生体材料の接着を特徴決定するためのDMA測定の結果を示す。図7Aは10％絹−PEG生体材料における接着のpH依存性の結果を示す（n＝3）（ANOVA、p＝0.009）。
【図７Ｂ】図7A〜7Eは絹−PEGをベースとする生体材料の接着を特徴決定するためのDMA測定の結果を示す。図7Bは、pH 6における絹−PEG生体材料の接着の濃度依存性の結果を示す（n＝3）（ANOVA、p＝0.00002）。図中に記載された統計量はStudentのt検定を用いて得られた。
【図７Ｃ】図7A〜7Eは絹−PEGをベースとする生体材料の接着を特徴決定するためのDMA測定の結果を示す。図7Cは、水を用いて調製されたPEG単独の生体材料およびCOSEAL（登録商標）のそれと比較した、水を用いて調製された10％絹−PEG生体材料のスチールに対する接着の結果を示す。
【図７Ｄ】図7A〜7Eは絹−PEGをベースとする生体材料の接着を特徴決定するためのDMA測定の結果を示す。図7Dは、リン酸緩衝液を用いて調製されたPEG単独の生体材料およびCOSEAL（登録商標）のそれと比較した、リン酸緩衝液を用いて調製された10％絹−PEG生体材料のスチールに対する接着の結果を示す。
【図７Ｅ】図7A〜7Eは絹−PEGをベースとする生体材料の接着を特徴決定するためのDMA測定の結果を示す。図7Eは、リン酸緩衝液を用いて調製されたPEG単独の生体材料およびCOSEAL（登録商標）のそれと比較した、リン酸緩衝液を用いて調製された絹の様々な濃度を含む絹−PEG生体材料のスチールに対する接着の結果を示す。
【図８Ａ】図8A〜8Bは、COSEAL（登録商標）（図8A）または5％絹−PEG（図8B）の試料のいずれかを皮下注入した組織試料の手技後2週間のヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）染色像を示す。黒色の矢印は注入された材料を示す。白色の矢印は二つの試料における同等レベルの線維症を示して、COSEAL（登録商標）に関する既報のデータと一致する（Wallace et al., J Biomed Mater Res. 58: 545 (2001)を参照されたい）。
【図８Ｂ】図8A〜8Bは、COSEAL（登録商標）（図8A）または5％絹−PEG（図8B）の試料のいずれかを皮下注入した組織試料の手技後2週間のヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）染色像を示す。黒色の矢印は注入された材料を示す。白色の矢印は二つの試料における同等レベルの線維症を示して、COSEAL（登録商標）に関する既報のデータと一致する（Wallace et al., J Biomed Mater Res. 58: 545 (2001)を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、絹フィブロインおよび多成分性のゲル化系（例えば、二成分性のゲル化系）を含む絹含有複合物を調製するための方法、組成物およびキットに関する。二成分性のゲル化系の例には、アルギナート構築系、フィブリン膠（例えば、フィブリノーゲンおよびフィブリン）ならびにフィブリン膠様の系、自己組織化ペプチド、合成ポリマー系（例えば、PEG系）、ならびにそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。ゲル化系の成分（例えば、少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分）は、ゲルを形成するために互いに迅速に架橋結合することができ、絹フィブロインは絹βシート形成を介して架橋結合したネットワークを安定化することができる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、絹のβシート形成を介してさらに安定化される、異なる化学基を持つ化学的に反応性の活性ポリエチレングリコール（PEG）（例えば、チオールおよびマレイミド官能基を含むPEG）による架橋結合を介した、絹−PEGをベースとする生体材料の調製のための方法、組成物、およびキットに関する。架橋結合した絹−PEG生体材料は、強力な接着特性を示し、この特性は、絹−PEG材料中の絹の濃度に応じて、現在の先行するPEGをベースとした封止剤と同等またはそれよりも優れたものとなる。さらに、絹−PEGをベースとする生体材料は細胞適合性であり、膨張挙動が低く、かつ分解時間が長く、それにより、これら絹−PEGをベースとする生体材料は、現在利用可能な組織封止剤の製品が禁忌である可能性のある止血の適用に適切となる。
【００２２】
マトリックス形成組成物
本発明の一つの局面は、絹フィブロインと少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分とを含む少なくとも三つの成分を含む、マトリックス形成組成物に関する。絹フィブロインは、例えば、約5重量％から約30重量％または約10重量％から約30重量％までの範囲のように、組成物中に任意の濃度で存在してよい。一つの態様において、絹フィブロインは少なくとも約10重量％の濃度で存在する。二つの機能的に活性化されたPEG成分は、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができ、本マトリックスは、絹フィブロインのβシート形成によってさらに安定化することができる。典型的には、二つのPEG成分はマトリックスの形成前に予め混合されない。いくつかの態様において、各PEG成分は、マトリックスの形成前に絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）とブレンドされ得る。
【００２３】
機能的に活性化されたPEG成分：
各PEG成分は一つまたは複数の官能基で活性化される。「活性化されたPEG成分」という用語は、共有結合を形成して、それによって架橋結合したマトリックスを形成するように同一または異なるPEG成分の他の官能基と化学的に反応することができる、二つまたはそれよりも多い官能基を有するように化学的に修飾されているPEG成分を指す。本明細書において、PEG成分は、典型的には多機能性に活性化されて、即ち、二つまたはそれよりも多い官能基を含む（例えば、二機能性に活性化される、四機能性に活性化される、または星状分岐した）。
【００２４】
PEG成分の少なくとも一つは、マルチアームのPEG誘導体（例えば、2アーム、4アーム、8アーム、および12アームなど）であり得る。いくつかの態様において、各PEG成分は、マルチアームPEG誘導体（例えば、2アーム、4アーム、8アーム、および12アームなど）であり得る。本明細書で記載される「マルチアームPEG誘導体」という用語は、少なくとも約2本、少なくとも約4本、少なくとも約6本、少なくとも約8本、少なくとも約12本のPEGポリマー鎖もしくはその誘導体（「アーム」）またはそれよりも多くを持つ分岐したポリ（エチレングリコール）を指す。マルチアームまたは分岐PEG誘導体には、フォーク型PEGおよびペンダント型PEGが含まれるが、これらに限定されるものではない。フォーク型PEGの一つの例はPEG-YCHZ2によって示すことができ、Yはリンク基であり、Zは所定の長さの原子の鎖によってCHに連結する活性化された末端基である。参照により全体が本明細書に組み入れられる国際特許出願第WO 99/45964号は、本発明のいくつかの態様において使用され得る様々なフォーク型PEGの構造を開示する。Z官能基を分岐炭素原子に連結する炭素鎖は、係留基として機能することができ、例えばアルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖、およびそれらの組み合わせを含み得る。ペンダント型PEGは、PEG鎖の末端ではなくPEGセグメントの長さに沿って共有結合により接続したカルボキシルのような官能基を有し得る。ペンダント型の反応基は、直接またはアルキレンのような連結分子を介して、PEGセグメントに接続し得る。参照により内容が全体として本明細書に組み入れられる米国特許第5,932,462号に開示されたようなさらなるマルチアームまたは分岐PEG誘導体も、本明細書の目的のために使用することができる。いくつかの態様において、マルチアームPEG誘導体は、8アーム（PPO-PEG）ブロックコポリマーおよび8アーム（PLA-PEG）ブロックコポリマーなどの多分岐PEGブロックコポリマーを内包し得るが、これらに限定されるものではない。このようなマルチアームPEGブロックコポリマーを生成するための方法は、当技術分野において周知である。例示的なマルチアームPEGブロックコポリマーおよびその作製方法については、例えば、米国特許出願第US 2005/0147681号を参照されたい。
【００２５】
本明細書に記載されるマトリックス形成組成物において、各PEG成分は同一または異なる数のアームを持つことができる。マルチアームのPEG誘導体、例えば少なくとも4アームPEG誘導体は、典型的には架橋結合反応においてより有効である。本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスの架橋結合の数または機械的な特性は、PEGのアームおよび／または官能基の数によって調節することができる。一つの態様において、4アームPEG誘導体は絹−PEGの架橋結合したマトリックスを形成するために用いられる。別の態様において、8アームPEG誘導体は絹−PEGの架橋結合したマトリックスを形成するために用いられる。いくつかの態様において、PEG成分は異なるアームの数を持つPEG誘導体の組み合わせであってもよい。PEG成分の異なるアームは、同一または異なる数またはタイプの官能基を持ってもよい。
【００２６】
架橋結合反応においてPEG成分を活性化するために、様々な官能基が用いられ得る。本明細書に記載される通り、「官能基A」および「官能基B」は、一般に、互いに化学的に反応することができ、従って、架橋結合反応におけるPEG成分の活性化のために用いられる官能基の対を指すために用いられる。例えば、官能基Aは-NH2、チオール（-SH）、-S-、-OH、-PH2、-CO-NH-NH2、およびそれらの任意の組み合わせであり得、官能基Bは-NHS、アクリラート、ビニルスルホン、マレイミド、-CO2N(COCH2)2、-CO2H、-CHO、-CHOCH2、-N=C=O、-SO2CH=CH2、-N(COCH)2、-S-S-(C5H4N)、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。当業者に公知であるその他の官能基も用いることができる。一つの態様において、PEG成分における官能基の対はチオール／マレイミドである。一つの態様において、PEG成分における官能基の対はチオール／アクリラートである。別の態様において、PEG成分における官能基の対はアミン／N-ヒドロキシサクシニミドである。いくつかの態様において、本明細書で用いられるPEG成分の対はマルチアームPEG-チオールおよびマルチアームPEG-マレイミドである。一つの態様において、本明細書で用いられるPEG成分の対は4アームPEG-チオールおよび4アームPEG-マレイミドである。
【００２７】
マトリックス形成組成物における機能的に活性化された異なるPEG成分の割合は、各PEG成分中の官能基の数に依存し得る。単なる例として、機能的に活性化された二つのPEG成分は、約10：1から約1：10まで（約10：1および約1：10を含む）、または約5：1から約1：5まで（約5：1および約1：5を含む）の範囲の割合で組み合わせられ得る。いくつかの態様において、一つのPEG成分は架橋結合反応後に過剰に存在する可能性がある。一つの態様において、機能的に活性化された二つのPEG成分は1：1の割合で混合することができる。当業者は、反応化学量論および化学反応のタイプに基づいて、機能的に活性化された異なるPEG成分の割合を決定することができる。
【００２８】
架橋結合したネットワークの形成における機能的に活性化されたPEGの反応は、PEGに接続する基の官能性に応じて、多くの異なる化学反応によって生じ得る。例えば、ゲルはマイケル型の付加反応または縮合反応によって形成され得る。一般に、マイケル型の付加反応はα、β-未飽和カルボニルと求核試薬の反応を伴う。マイケル型の付加反応はpH 6またはそれよりも高いpH、例えば、pH 6、pH 7、pH 8、pH9またはそれよりも高いpHにおいて起こり得る。マイケル付加反応は当業者に周知である。マイケル付加反応を受け得る機能化されたPEG上の部分の例には、PEG-マレイミドと組み合わされたPEG-SH、およびPEG-アクリラートと組み合わされたPEG−SHが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様において、反応は約4よりも高いpHを持つ緩衝液、様々なアミン、またはそれらの組み合わせの触媒作用的な量を用いて活性化され得る。縮合反応は、二つの分子または部分が反応して、小分子、しばしば水、メタノール、または塩化水素のようなハロゲン化水素のタイプを同時に消失することによって、互いに共有結合性に結合を形成する化学反応である。高分子化学では、一連の縮合反応が生じると、それによってモノマーまたはモノマーの鎖が互いに付加してより長い鎖を形成し得る。縮合反応を受け得る活性化されたPEGの官能基の例には、PEG-NHSエステルおよびPEG-NH2が含まれるが、これらに限定されるものではない。理論によって拘束されることを意図するものではないが、チオールと活性化されたエステルの反応からは、加水分解的に対してより不安定であるチオエステル結合が形成されるのに比して、チオエーテル結合が形成されることから、マイケル付加反応は形成される架橋結合ネットワークのより長期の安定性に貢献し得る。
【００２９】
マトリックス形成組成物中のPEG成分は、粉末、懸濁液、または溶液として提供され得、または一つの成分は粉末として提供され、かつ別の成分は懸濁液もしくは溶液として提供される。同様に、マトリックス形成組成物中の絹フィブロインも、粉末、懸濁液、または溶液として提供することができる。一つの態様において、マトリックス形成組成物中のすべての成分が粉末である。一つの態様において、少なくとも一つの成分が水溶液に懸濁または溶解される。一つの態様において、少なくとも絹フィブロインは水溶液中で提供される。一つの態様において、絹フィブロインは、絹フィブロイン溶液を調製するために水に溶解または懸濁される。別の態様において、PEG成分は、絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解され得る。いくつかの態様において、マトリックス形成組成物は、二価のイオンの非存在の水溶液、例えば一価のイオンを含む緩衝溶液に、懸濁または溶解される。一つの態様において、マトリックス形成組成物は水に懸濁または溶解される。
【００３０】
マトリックス形成組成物の成分（例えば、PEG成分および／または絹フィブロイン）は、酸性、中性、または塩基性の溶液（即ち、任意のpH）においてそれぞれに調製して保存することができる。架橋結合したポリマーマトリックスを形成するために成分を一つの組成物に混合する前に、成分のpHを、各々、架橋結合反応のための所望のpH、例えばpH 7、pH 8、pH 9、またはそれよりも高いpHを含むpH 6またはそれよりも高いpHに調整してよい。または、マトリックス形成組成物の最終的なpHは、すべての成分が一つに混合された後にpH 7、pH 8、pH 9、またはそれよりも高いpHを含むpH 6またはそれよりも高いpHに達してよい。従って、混合の結果、例えばpH 6、pH 7、pH 8、pH 9、またはそれよりも高いpHなどの所望のpHとなるように、少なくとも一つの成分を酸性の溶液として調製し、その他の成分を塩基性または中性の溶液として調製してもよい。
【００３１】
拘束されることを意図するものではないが、その他の多成分性のゲル化系（例えば、二成分性のゲル化系）は、絹フィブロインがβシートを形成して架橋結合したネットワークを安定化するのであれば、本明細書に記載されるマトリックス形成組成物において、PEGゲル化系を代替するために用いられてもよく、または含まれてもよい。二成分性のゲル化系の例には、アルギナート構築系、フィブリン膠（例えば、フィブリノーゲンおよびトロンビン）ならびにフィブリン膠様の系、自己組織化ペプチド、合成ポリマー系（例えば、PEG系）、ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
いくつかの態様において、二成分性ゲル化系はフィブリン膠を含む。フィブリン膠は二つの主な成分であるフィブリノーゲンおよびトロンビンからなる。等量ずつ混合すると、トロンビンは酵素作用によってトロンビンの濃度によって決定される速度で、フィブリノーゲンをフィブリンに転換する。生成物は、約5から約60秒の間でゲル化する生体適合性ゲルである。このような態様において、絹フィブロインは、絹βシート形成を介してフィブリンをさらに安定化することができる。フィブリン膠様の系の例には、Tisseel（商標）（Baxter）、Beriplast P（商標）（Aventis Behring）、Biocol（登録商標）（LFB, France）、Crosseal（商標）（Omrix Biopharmaceuticals, Ltd.）、Hemaseel HMN（登録商標）（Haemacure Corp.）、Bolheal（Kaketsuken Pharma, Japan）およびCoStasis（登録商標）（Angiotech Pharmaceuticals）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
いくつかの態様において、二成分性のゲル化系は合成ポリマー系である。本明細書に記載される通りのPEGに加えて、合成ポリマーのその他の例には、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアルキレンオキシド、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、それらに限定されるものではない。これらの合成ポリマー系では、合成ポリマー系の少なくとも二つの成分は、架橋結合したネットワークを形成するために合成ポリマー系のこれらの二つの成分が互いに反応するように、当技術分野において公知の反応化学を用いて機能的に活性化することができる。
【００３４】
様々な態様において、PEG成分またはその他の合成ポリマーのそれぞれの分子量は、所望の適用に応じて個々に変化し得る。いくつかの態様において、分子量（MW）は約100Da〜約100000Da、約1000Da〜約20000Da、または約5000Da〜約15000Daである。いくつかの態様において、PEG成分の分子量は約10,000Daである。
【００３５】
絹フィブロイン：
本明細書で用いられる通り、「絹フィブロイン」という用語は、カイコのフィブロインおよび昆虫またはクモの絹タンパク質を含む。例えば、Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)を参照されたい。任意のタイプの絹フィブロインを用いることができる。カイコガ（Bombyx mori）のようなカイコによって産生される絹フィブロインがもっとも一般的であり、地球に優しい再生可能な資源である。例えば、絹フィブロインはカイコガの繭からセリシンを抽出することによって得ることができる。有機体のカイコの繭は市販もされている。しかし、クモの絹（例えば、アメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）から得られる）、遺伝子組み換えによる絹、遺伝子工学により作出された絹、例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、遺伝子組み換え動物、または遺伝子組み換え植物に由来する絹（例えば、WO 97/08315；米国特許第5,245,012号を参照されたい）およびその変異型を含む、使用することができる多くの異なる絹がある。水性絹フィブロイン溶液は、当技術分野において公知の手法を用いて調製することができる。絹フィブロイン溶液を調整するために適切な過程は、例えば米国特許出願第11/247,358号；WO/2005/012606およびWO/2008/127401に開示されている。例えば、脱イオン水における絹フィブロイン溶液（約20％ w/v）の調製については実施例1を参照されたい。
【００３６】
絹フィブロイン溶液は、脱イオン水を用いてより低い濃度に希釈してよく、または例えば、所望ならば約30％（w/v）に濃縮してもよい。つまり、より低濃度の絹フィブロイン溶液は、所望の濃度になるために十分な期間、PEG、アミロース、またはセリシンのような吸湿性ポリマーに対して透析してよい。例えば、WO 2005/012606を参照されたい。
【００３７】
さらに、絹フィブロインは、絹タンパク質の物理的特性および機能性を変化させるために、例えば、ジアゾニウムもしくはカルボジイミドカップリング反応、アビジン−ビオジン相互作用、または遺伝子修飾などを介して、溶液中の活性物質を用いて化学的に修飾され得る。例えば、PCT/US09/64673；PCT/US10/41615；PCT/US10/42502；米国特許出願第12/192,588号を参照されたい。
【００３８】
絹フィブロイン溶液は、本明細書に記載されるように、ポリエチレンオキシド、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、アルギナート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸などのような一つまたは複数の生体適合性ポリマー、または細胞、酵素、タンパク質、核酸、抗体、抗生物質、止血物質などのような一つまたは複数の活性物質と組み合わせることもできる。例えば、WO2004/062697およびWO2005/012606を参照されたい。
【００３９】
いくつかの態様において、絹フィブロイン溶液またはマトリックス形成組成物は、架橋結合したポリマーマトリックスに多孔性の構造を作製するために、塩粒子または水溶性の粒子のような孔形成物質（porogen）をさらに含んでもよい。このような態様において、孔形成物質は、架橋結合したポリマーマトリックスが形成された後に水または水溶液中に塩の粒子または水溶性の粒子を浸出することによって回収され得る。絹における多孔性構造作製のための方法は当業者に公知である。
【００４０】
絹の水溶液は、適切な条件において、絹のゲル、絶縁保護のコーティングまたは層、マット、スポンジ、三次元の足場、線維、およびその他の材料形態のような絹マトリックスに加工することができる。
【００４１】
架橋結合したポリマーマトリックス（例えば、絹−PEGをベースとするマトリックス）を調製する方法
本発明の別の局面は、架橋結合したポリマーマトリックスを調製する方法に関し、本方法は、本明細書に記載されるマトリックス形成組成物を混合する工程、および架橋結合したポリマーマトリックスを形成するために組成物の成分を架橋結合する工程を含む。組成物は、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分、および架橋結合したマトリックスをさらに安定化するためにβシートを形成することができる絹フィブロインを含む。組成物のPEG成分および絹フィブロインの態様は本明細書に記載されている。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書で用いられる絹フィブロインは当技術分野で公知の任意の方法、例えば、限定的されるものではないが、実施例1に記載される方法を用いてセリシンを枯渇させることができる。
【００４３】
マトリックス形成組成物の成分を混合する際に、水溶液（例えば、水、もしくはイオンを含まない水溶液）または溶媒（例えば、有機溶媒）を使用することができる。一つの態様において、マトリックス形成組成物の成分を溶解または懸濁して、混合するために、水または脱イオン水が用いられる。いくつかの態様において、マトリックス形成組成物の成分を溶解または懸濁して、混合するために、緩衝溶液を用いることができる。このような態様において、緩衝溶液は、例えば一価のイオンを含む緩衝溶液のように、二価のイオンを除外することができる。または、組成物の一つまたは複数の成分が懸濁液または溶液として提供されるならば、その他の成分は、追加の溶液または溶媒を用いてまたは用いずに懸濁液または溶液と混合してもよい。
【００４４】
絹−PEG架橋結合マトリックスを調製するために、組成物中の絹フィブロインおよびPEG成分の幅広いパーセント範囲を用いることができる（例えば、マトリックス形成組成物中の絹フィブロインおよびPEG成分の重量％またはw/v％）。例えば、溶液中の絹フィブロインの濃度は混合前に約30％（重量％またはw/v％）未満であることができる；溶液中の各PEG成分の濃度はPEG溶液の溶解性および粘度に応じて、混合前に約30％（重量％またはw/v％）未満であり得る。絹フィブロイン溶液およびPEG溶液の粘度は投与毎に選択することができる。一つの態様において、混合前の絹フィブロインの濃度は約5％から約30％、または約10％から約30％もしくは約15％から約25％の範囲であってよい。絹の濃度が10％を超えて増加すると、得られる絹−PEG架橋結合マトリックスの接着特性が増強され得る。一つの態様において、混合前の各PEG成分の濃度は約1％から約20％、または約5％から約15％までの範囲である。PEG成分の濃度が増加すると、架橋結合に必要な時間の量を短縮することができる。PEG成分の濃度は、PEGの官能基の分子量および性状などの要因にも依存し得る。従って、例えば、8アームのPEGは4アームの対応物よりも小さな重量パーセントで存在して、ほぼ等しい量の時間で同じ程度の架橋結合を得ることができる。当業者は、例えば、組織接着剤または組織封止剤などの様々な適用のために、絹フィブロインまたはPEG成分の濃度を至適化することができる。
【００４５】
PEG成分間の化学的な架橋結合は、二つまたはそれよりも多いPEG成分の官能基の間の化学的な反応を介した迅速なゲル形成を伴い得る。この段階は水溶液中の二つのPEG成分を混合後、数秒以内に生じることができ、ゲル形成のこの段階はPEG成分中での絹の存在または非存在のいずれでも生じ得る。
【００４６】
絹フィブロインは、タンパク質の大部分がアラニンおよびグリシンを豊富に含む疎水性のドメインに組織化され、大きな側鎖アミノ酸が鎖末端の親水性のブロックに集塊した、独特なアミノ酸配列を有する。構造的には疎水性のブロックは結晶性の領域へと組織化されて、親水性のブロックは非晶質の領域を形成する。Zhou et al., 44 Proteins 119-22 (2001)。絹フィブロインの結晶性領域は、分子内および分子間の水素結合および疎水性の相互作用を介して、結晶性のβシートへと組織化する能力を有する。
【００４７】
絹フィブロイン鎖のβシート形成は、脱水、機械的な力、または熱力学的な処理のような様々な処理によって誘発することができる。脱水処理は、空気中または窒素ガスのような脱水性の気体または例えばメタノールもしくはエタノールなどのアルコールもしくは塩化ナトリウムのような脱水性の溶媒の流れの中での乾燥、または水アニーリング処理を指すことができる。例えば、WO/2004/062697、WO 2008/127404を参照されたい。機械的な力は剪断力または伸長力を含み、これらは超音波処理または強振盪などの処理を介して適用され得る。米国特許出願公開第2010/0178304号；およびPCT/US2010/036841を参照されたい。βシート形成の誘発におけるその他の要因は、温度、pH、およびイオン強度の変化を含むが、これらに限定されるものではない。Wang et al., 36 Intl. J. Biol. Macromol. 66-70 (2005); Kim et al., 5 Biomacromol. 786-92 (2004); Matsumoto et al., 110 J. Phys. Chem. B 21630-38 (2006)。絹フィブロインの迅速なβシート形成を誘発するための記載された処理を行わなければ、溶液中の絹フィブロインの転移は生理学的な条件下で生じることができないか、あるいは極めてゆっくりと生じる。
【００４８】
一つの態様において、架橋結合の段階は、ランダムコイルおよびα-らせんを豊富に含む構造からβシート構造に絹フィブロインの構造転移を誘発して、架橋結合したポリマーマトリックスをさらに安定化するために、混合した成分をアルコール処理（例えば、メタノールもしくはエタノール）または水アニーリング処理に曝露する段階を伴う。
【００４９】
理論によって拘束されるものではないが、マトリックス形成組成物の架橋結合は、ゲル、マット、フィルム、スポンジ、三次元の足場、線維、およびその他の材料の形態を含む様々な材料の形態を形成することができる。
【００５０】
一つの態様において、PEG成分および絹フィブロインの架橋結合は、ヒドロゲル（「絹−PEG」ヒドロゲルと呼ばれる）を形成する。「ヒドロゲル」は一般に、親水性で、時に内部で水が分散媒である膠質ゲルとして見出されるポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルは高吸湿性であり（それらは水分を99％よりも多く含むことができる）、天然（例えば、絹）または合成のポリマー、例えばPEGで構成され得る。単に例として、絹−PEGヒドロゲルは二段階の過程で形成することができる：4アームPEG成分のマレイミドおよびチオール官能基の間の共有結合性の化学的架橋結合；ならびに形成されたネットワークをさらに安定化するための絹フィブロイン鎖間のβシート形成。生成される絹−PEGヒドロゲルは、強力な接着特性、良好な生体適合性、副産物を含まない化学、迅速な架橋結合、およびゆっくりとした生分解性という組織封止剤としての適用に望ましい特性を示す。
【００５１】
絹−PEGヒドロゲルの特性について調べるために、ヒドロゲルをインビトロにおいて特徴決定して、現在市販されているCOSEAL（登録商標）の製品を絹−PEGゲルの性能について調べるための参照として選択した。実施例1〜7；図1A〜8Bを参照されたい。
【００５２】
COSEAL（登録商標）は食品・医薬品局（FDA）の承認を得た物であり、チオール-PEG成分およびサクシニミド-PEG成分、希塩酸、ならびにリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液を含む。COSEAL（登録商標）の製品は、混合すると、止血を達成するために成分が5〜10秒以内に架橋結合を形成する二成分性（例えば、液体および粉末）のエポキシ様のシリンジを含むキットとして入手可能である。臨床試験では、患者はCOSEAL（登録商標）に対して十分な耐用性を示して、その使用では、標準的な治療法で治療された場合の26％に比して、患者の50％において浸出性の創傷が封止される。活発な出血においては、標準的な治療法で治療された3％に比して、COSEAL（登録商標）は症例の41％で有効であった。但し、この製品は、使用前の調製／再溶解が面倒であること、および膨張比が大きいことなど、一定の欠点を有する。例えば、COSEAL（登録商標）の再溶解は、成分が完全に溶解するまで2本のシリンジ間で少なくとも20回、前後に混合されるために、PEG成分は粉末として供給されなければならない。さらに、COSEAL（登録商標）の製品はその元々のサイズ／重量の約400％膨張し、従って、その適用は神経圧迫が問題とならない領域に限定される。（COSEAL（登録商標）パッケージ添付文書）
【００５３】
理論により拘束されるものではないが、絹−PEGヒドロゲルの接着特性はCOSEAL（登録商標）と同等またはそれよりも優れてさえいると考えられる。スチールの基質に対する接着傾向が生体膜（ウシの腸）に対して観察されたそれと十分な相関性を示すことを確認した上で、スチールの基質を用いて、インビトロにおける接着の特徴決定を実施した。10％〜15％ w/v絹フィブロインを含む絹−PEG試料は、COSEAL（登録商標）の対照と同等の接着値を示し、一方20％ w/v 絹フィブロインを含む絹−PEG試料は、COSEAL（登録商標）の対照に比して少なくとも約50％の接着性の向上を示した。実施例1および6、ならびに図6A〜7Eを参照されたい。いくつかの態様において、絹フィブロイン溶液の濃度を少なくとも約10重量％、少なくとも約15重量％、少なくとも約20重量％、またはそれよりも高い濃度まで高めると、得られる架橋結合したポリマーマトリックスの接着強度は、少なくとも約10Pa、少なくとも約15Pa、少なくとも約20Pa、少なくとも約30Pa、少なくとも約40Pa、少なくとも約50Pa、少なくとも約60Pa、少なくとも約70Pa、少なくとも約80Pa、少なくとも約90Pa、少なくとも約100Pa、またはそれよりも高い値まで増強することができる。
【００５４】
絹−PEGをベースとする生体材料中の絹の濃度は3重量％から50重量％、約10重量％から約40重量％、約15重量％から約40重量％、約20重量％から約30重量％までの範囲であり得る。絹の濃度が低下すると、一般に粘度の低い溶液が得られ、より少ない原料を必要とする；しかし、絹−PEG材料の接着特性は一般に、約10％またはそれよりも高い絹の濃度において一般により良好である。これらの絹の濃度において、絹の溶液の粘度は依然、注入に適切であり得る。
【００５５】
絹−PEG材料を調製する際の絹およびPEGの溶液のpHは、幅広い範囲（例えば、1〜15）であってよい。医用での使用に適した絹−PEG材料を作製するために、pHは典型的には生理学的な範囲内（例えば、6〜8）である。理論によって拘束されるものではないが、中性または若干酸性（例えば、pH 6）のpHで調製される絹−PEG材料は、より良好な接着特性を示し得る。例えば、実施例6および図7Aを参照されたい。
【００５６】
さらに、絹−PEGヒドロゲルは、顕著な膨張およびインビボにおける短い滞留時間のような、COSEAL（登録商標）に附随する欠点のいくつかを克服することができる。絹−PEG封止剤の膨張比は60〜70％の間であり、COSEAL（登録商標）は適用後すぐにそのサイズが最高400％まで増大する。実施例1および4、ならびに図4Aおよび4Bを参照されたい。絹−PEGヒドロゲルのこの特性は絹−PEGの封止剤としての適用スペクトルを拡大して、COSEAL（登録商標）の使用が禁忌である閉鎖された間隙または神経などの圧力感受性の構造物の近傍での使用を可能とすることができる。
【００５７】
絹−PEGヒドロゲルは、PEG成分間の化学的な架橋結合によって少なくともある程度は安定化され、それはCOSEAL（登録商標）と同等であり、絹フィブロインのβシート形成を伴う二次的な物理的架橋結合反応を介して時間と共にさらに強化される。これは組織封止剤としての用途において魅力的な特徴であるインビボにおける長い滞留時間を提供する。COSEAL（登録商標）は約1〜2週間で分解するが（Wallace et al., 2001）、絹−PEGをベースとする材料は著しく長い時間存在し得（Horan et al., 2005）、材料が完全に吸収される前に完全な治癒、またはより完全な治癒を可能とする。実施例1および5、ならびに図5Aおよび5Bも参照されたい。
【００５８】
PEG成分単独の化学的な架橋結合に基づくCOSEAL（登録商標）とは対照的に、絹−PEGをベースとする材料は、二重の特徴（即ち、二種類の高分子であるPEG成分および絹フィブロインの組み入れ）を示して、二段階の架橋結合メカニズムを介して形成され、これは一連の利点を提供して幅広い適用を可能とする。例えば、絹フィブロインの多用途の特性および材料の形態は、絹−PEGをベースとする材料に様々な機能性を付与する。絹フィブロインは異なる材料の形態に加工することができるので、同じく絹−PEGも当技術分野において公知の手法によってゲル、マット、スポンジ、線維、およびその他の材料の形態に加工することができる。Altman et al., 23 Biomaterials 4131-41 (2002)；Kim et al., 5 Biomacromolecules 786-92 (2004)；Li et al., 27 Biomaterials 3115-24 (2006)；Nazarov et al., 5 Biomacromolecules 718-26 (2004)を参照されたい。これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。さらに、絹−PEGをベースとする材料の細胞適合性の結果は、絹−PEGをベースとする材料が細胞伸展を促進せず、これにより本材料は抗瘢痕形成系の成分として適切となることを示している。例として、実施例1および3；ならびに図3を参照されたい。多用途の加工性と組み合わせて、この特徴は、これらの材料の適用スペクトルも拡大する（例えば、抗接着性のシートまたはフィルムの産生を可能とする）ことができる。同様に、絹−PEGをベースとする材料は出血を制御するための止血材料として適している。
【００５９】
本発明の架橋結合したポリマーマトリックス（例えば、絹−PEGをベースとするマトリックス）
本発明の別の局面は、マトリックス形成組成物の混合から形成される架橋結合したポリマーマトリックスに関する。架橋結合したポリマーマトリックスは、絹フィブロイン（例えば、少なくとも約10重量％の濃度にて）と、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応している少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分とを含み、絹フィブロインは架橋結合したマトリックスを安定化するためにβシートを形成している。
【００６０】
一つの態様において、絹−PEG生体材料は少なくとも一つの活性な物質を含むことができる。これらの材料を形成するために、絹フィブロインまたはPEG成分は、マトリックスを形成する前に活性物質と混合されてよく、またはこの活性物質は、絹−PEG生体材料が形成された後にこれに添加されても良い。
【００６１】
活性物質は、絹−PEG生体材料に内包されることができる任意の材料であり得る。例えば、活性物質は、細胞（幹細胞を含む）、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、DNA、RNA、siRNA）、核酸類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、アプタマー、抗体またはその断片もしくは部分（例えば、パラトープまたは相補性決定領域）、抗体様分子、抗原もしくはエピトープ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子もしくは組換え型成長因子、ならびにその断片および変異型、細胞接着調節物質（RGDなど）、サイトカイン、酵素、小分子、薬物、色素、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤、抗生物質もしくは抗菌性化合物、抗炎症物質、抗真菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、毒素、プロドラッグ、化学療法物質、止血物質、またはそれらの組み合わせのような、治療用の物質、即ち生体材料であってよい。例えば、PCT/US09/44117；米国特許出願第61/224,618号を参照されたい。活性物質は、上記の任意の物質の組み合わせであってもよい。カプセル化された製品は、多くの生物医学的目的に使用することができるため、治療用物質もしくは生物学的材料、またはそれらの組み合わせのいずれかのカプセル化が望ましい。
【００６２】
いくつかの態様において、活性物質は、真菌、植物、動物、細菌、またはウイルス（バクテリオファージを含む）のような生物であってもよい。さらに、活性物質は、神経伝達物質、ホルモン、細胞内シグナル伝達物質、薬学的に活性な物質、有毒物質、農薬、化学的毒素、生物学的毒素、微生物、ならびにニューロン、肝細胞および免疫系細胞のような動物細胞を含んでもよい。活性物質は、薬学的な材料、ビタミン、鎮静剤、催眠剤、プロスタグランジンおよび放射性医薬品のような治療用の化合物を含むこともできる。
【００６３】
本明細書における用途に適切な例示的な細胞には、前駆細胞または幹細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、口の細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、腎尿細管細胞、腎基底膜細胞、外皮細胞、骨髄細胞、肝細胞、胆管の細胞、膵島細胞、甲状腺、上皮小体、副腎、視床下部、下垂体、卵巣、精巣、唾液腺の細胞、脂肪細胞、および前駆細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。活性物質は、上記の任意の細胞の組み合わせであってもよい。WO 2008/106485；PCT/US2009/059547；WO 2007/103442も参照されたい。
【００６４】
絹フィブロインに組み入れることができる例示的な抗体には、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ-CD3、ナタリズマブ、オファツムマブオマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラツズマブ、アルツモマブペンテテート、アルキツモマブ、アトリズマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンジチド、カツマキソマブ、デノスマブ、エドレコロマブ、エフングマブ、エルツマクソマブ、エタラシズマブ、ファノレソマブ、フォントリズマブ、ゲンツズマブオゾガミシン、ゴリムマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オレゴボマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、スレソマブ、タカツズマブテトラキセタン、テフィバズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが含まれるが、これらに限定されるものではない。活性物質は、上記の任意の抗体の組み合わせであってもよい。
【００６５】
例示的な抗生物質には、アクチノマイシン；アミノグリコシド（例えば、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン）；β-ラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸、スルバクタム）；糖ペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、ポリミキシン）；アンサマイシン；バシトラシン；カルバセファム；カルバペネム；セファロスポリン（例えば、セファゾリン、セファクロール、セフジトレン、セフトビプロール、セフロキシム、セフォタキシム、セフィペム、セファドロキシル、セフォキシチン、セフプロジル、セフジニル）；グラミシジン；イソニアジド；リネゾリド；マクロリド（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）；ムピロシン；ペニシリン（例えば、アモキシリン、アムピシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン）；オキソリン酸；ポリペプチド（例えば、バシトラシン、ポリミキシンB）；キノロン（例えば、シプロフロキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、ガチフロキサシン、レバキン、オフロキサシンなど）；スルホンアミド（例えば、スルファサラジン、トリメトプリム、トリメトプリム-スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）、スルファジアジン）；テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリンなど）；アズトレオナムのようなモノバクタム；クロラムフェニコール；リノマイシン；クリンダマイシン；エタムブトール；ムピロシン；メトロニダゾール；ペフロキサシン；ピラジナミド；チアンフェニコール；リファンピシン；チアンフェニクル；ダプソン；クロファジミン；キヌプリスチン；メトロニダゾール；リネゾリド；イソニアジド；ピラシル；ノボビオシン；トリメトプリム；ホスホマイシン；フシジン酸；またはその他の局所抗生物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。任意で、抗生物質は、フェデンシン、マゲイニンおよびニシンのような抗細菌性のペプチド、または溶菌性バクテリオファージであってもよい。抗生物質は、上記の任意の物質の組み合わせであってもよい。PCT/US2010/026190も参照されたい。
【００６６】
本明細書での用途に適した例示的な酵素には、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミロース、有機リン酸デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラッカーゼなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。成分間の相互作用も、例えば、アビジンおよびビオチンの間の特異的相互作用を介して絹フィブロインに機能性を持たせるために用いることができる。活性物質は、上記の任意の酵素の組み合わせであってもよい。例えば、PCT/US2010/042585を参照されたい。
【００６７】
治療用物質または生物学的材料を、絹−PEG生体材料に導入する場合、当技術分野で公知のその他の材料も本物質と共に加えてもよい。例えば、活性物質の増殖を促進するため（生物学的材料の場合）、絹−PEG生体材料から放出された後に本物質の機能性を促進するため、または絹−PEG生体材料に内包されている期間中にその物質の有用性を残存または保持する能力を高めるための材料を付加することが望ましい可能性がある。細胞の増殖を促進することが公知である材料には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）のような細胞培養培地、ウシ胎児血清（FBS）、可欠アミノ酸および抗生物質が含まれ、線維芽細胞成長因子（FGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF-I）、骨形成成長因子（BMP）、神経成長因子、および関連するタンパク質のような成長因子および形態形成因子が用いられ得る。成長因子は当技術分野において公知であり、例えばRosen & Thies, CELLULAR&MOLECULAR BASIS BONE FORMATION&REPAIR (R.G. Landes Co., Austin, TX, 1995)を参照されたい。絹−PEG生体材料を介する送達のためのさらなる選択肢には、DNA、siRNA、アンチセンス、プラスミド、リポソーム、および遺伝物質の送達のための関連する系；細胞のシグナル伝達カスケードを活性化するためのペプチドおよびタンパク質；石灰化または細胞からの関連する事象を促進するペプチドおよびタンパク質；絹−PEG−組織の界面を改善するための接着ペプチドおよびタンパク質；抗菌性ペプチド；ならびにタンパク質および関連する化合物が含まれる。
【００６８】
コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、アルギナート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリ酸無水物、グリセロール（PCT/US2009/060135を参照されたい）、およびその他の生体適合性ポリマー（WO 2004/0000915を参照されたい）のようなさらなる生体適合性物質も、絹−PEG生体材料にブレンドすることができる。または、絹をヒドロキシアパタイトと混合することができる（PCT/US08/82487を参照されたい）。本明細書に記載する通り、絹フィブロインは組換え由来であってよく、これは、有機−無機の複合物を形成するために用いられる線維性タンパク質ドメインおよび石灰化ドメインを含む融合ポリペプチドの包含など、絹のさらなる修飾を提供する。これらの有機−無機複合物は、用いられる線維性タンパク質融合ドメインのサイズに応じて、ナノからマクロのスケールで構築することができる。WO 2006/076711を参照されたい。米国特許出願第12/192,588号も参照されたい。
【００６９】
活性物質または生物学的材料を包埋された絹−PEG生体材料は、活性物質の長期の保存および安定化に適切であり得る。細胞および／または活性物質は、絹−PEG生体材料に組み入れられると、室温（即ち、22℃〜25℃）および体温（37℃）において少なくとも30日間、安定である（即ち、少なくとも50％の残効性を維持する）ことができる。従って、いくつかの抗生物質または止血物質のように温度感受性の活性物質は、冷蔵することなく絹−PEG生体材料中で保存することができる。重要な点として、温度感受性の生理活性物質は、絹−PEG生体材料を介して体内に（例えば、注入を介して）送達可能であり、これまで予想されていたよりもより長期間、活性を維持することができる。例えば、PCT/US2010/026190を参照されたい。
【００７０】
包埋された活性物質（例えば、治療用物質）を伴う絹−PEG生体材料は、生体送達に適切であり得る。絹フィブロインを生体送達装置として使用するための手法は、例えば米国特許出願第10/541,182号；第11/628,930号；第11/664,234号；第11/407,373号；PCT/US07/020789；PCT/US08/55072；PCT/US09/44117に見出すことができる。本発明のいくつかの態様は、医療用移植片、組織封止剤、および組織修復剤における潜在的な有用性のための薬剤送達系としての、治療用物質または生物学的材料が包埋された絹−PEG生体材料の有用性に関する。
【００７１】
絹−PEG架橋結合マトリックスの構造は、包埋された活性物質（例えば、治療用物質または生物学的材料）の送達の制御された放出を可能とする。制御された放出は、投薬量を制御された放出キネティクスで、経時的に投与することを可能とする。いくつかの例において、治療用物質または生物学的材料の送達が、例えば数週間にわたって治療が必要な部位に継続される。例えば、数日間もしくは数週間、またはより長い期間にわたる経時的な制御された放出は、好ましい治療を得るために、治療用物質または生物学的材料の継続的な送達を可能とする。制御された送達媒体は、治療用物質または生物学的材料を、体液および組織中で、例えばプロテアーゼによるインビボでの分解から保護するため、有利である。例えば、PCT/US09/44117を参照されたい。
【００７２】
絹−PEG架橋結合マトリックスからの生理活性物質の制御された放出は、例えば、約12時間または24時間よりも長期間、1カ月もしくは2カ月、または5カ月以上にわたって経時的に生じるように設計することができる。放出時間は、例えば、約12時間から24時間、または約12時間から1週間の期間を通して生じるように選択することができる。別の態様において、放出は、例えば、約1ヶ月〜2ヶ月（約1ヶ月および2ヶ月を含む）のオーダーで生じ得る。制御された放出時間は治療される状態に基づいて選択してよい。例えば、持続的な放出および高い局所投与量が望ましい場合は、特定の放出プロフィールがより有効であり得る。
【００７３】
カプセル化された生理活性物質（例えば、治療用物質）を有する絹−PEGヒドロゲルを含む薬学的調製物を調製することができる。この調製物を、絹−PEGヒドロゲル内にカプセル化されている特定の活性物質を必要とする患者に投与することができる。薬学的調製物は、局所、経口、点眼、経鼻、経皮または非経口的（静脈内、腹腔内、筋肉内、および皮下注射、ならびに鼻腔内または吸入投与）、および移植を含む、当技術分野において公知の様々な経路によって投与することができる。送達は、全身性、領域性または局所性であってよい。さらに、送達は、例えば、中枢神経系への送達のようにくも膜下腔内であってもよい。
【００７４】
治療用物質の量は、用いようとする特定の薬剤および治療しようとする医学的状態に依存する。例えば、薬剤の量は、材料の重量に基づいて、約0.001％〜約70％、または約0.001％〜約50％、または約0.001％〜約20％であってよい。体液または体組織に接触すると直ちに、薬剤が放出される。
【００７５】
望まれる場合は、活性物質を含む絹−PEGヒドロゲルは、ターゲティングリガンドまたは前駆物質ターゲティングリガンドを含むことができる。ターゲティングリガンドは、インビボおよび／またはインビトロにおいて組織および／またはレセプターへの薬学的調製物のターゲティングを促進することができる任意の材料または物質を指す。ターゲティングリガンドは、合成、半合成、または天然であってよい。ターゲティングリガンドとして用いることができる材料または物質は、例えば、抗体、抗体の断片、ホルモン、ホルモン類似体、糖タンパク質およびレクチンを含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、糖、単糖類および多糖類を含む糖類、炭水化物、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子、ならびにヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド酸構成物、ペプチド核酸（PNA）、アプタマー、およびポリヌクレオチドを含む遺伝物質を含む。本発明のその他のターゲティングリガンドは、例えば、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンおよびセレクチンである細胞接着分子（CAM）を含む。ターゲティングリガンドへの前駆物質は、ターゲティングリガンドに転換され得る任意の材料または物質を指す。このような転換は、例えば、前駆物質をターゲティングリガンドに係留する段階を伴ってよい。例示的なターゲティング前駆物質の部分は、マレイミド基、オルトピリジルジスルフィドのようなジスルフィド基、ビニルスルホン基、アジド基、およびヨードアセチル基を含む。
【００７６】
インビボでの適用のための調製において、絹−PEGヒドロゲルを含む調製物は賦形剤を含むように調製することができる。例示的な賦形剤には、望ましい特定の投与剤形に適した希釈剤、溶媒、緩衝液、またはその他の液体の媒体、溶解剤、分散物質もしくは懸濁物質、等張物質、粘性制御物質、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、保存剤、安定剤などが含まれる。調製物は増量物質、キレート化物質および抗酸化剤をさらに含んでもよい。非経口的な調製物が用いられる場合は、調製物は追加でまたは代替として、糖、アミノ酸または電解質を含んでもよい。
【００７７】
より具体的には、薬学的に許容される担体として用いることができる材料の例には、ラクトース、グルコース、およびスクロースのような糖；コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油のような油；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような無毒の適合性潤滑剤；例えば、トレハロース、マンニトールおよびポリエチレングリコールのように約70,000kDよりも小さな分子量のポリオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、米国特許第5,589,167号を参照されたい。例示的な界面活性剤には、Tween界面活性剤のような非イオン性の界面活性剤、ポリソルベート20または80などのようなポリソルベート、およびポロキサマー184または188のようなポロキサマー、ならびにその他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーなどが含まれる。適切な緩衝液には、Tris、クエン酸、コハク酸、酢酸またはヒスチジンの緩衝液が含まれる。適切な防腐剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンズアルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。その他の添加物にはカルボキシメチルセルロース、デキストランおよびゼラチンが含まれる。適切な安定化物質には、ヘパリン、ペントサンポリサルフェート、およびその他のヘパリノイド、ならびにマグネシウムおよび亜鉛のような二価の陽イオンが含まれる。調製者または当業者の判断に基づいて、着色物質、放出物質、コーティング物質、甘味料、香料および芳香物質、防腐剤、ならびに抗酸化剤も本組成物に存在してよい。
【００７８】
様々な態様において、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは特定の条件下で膨張する可能性がある。例えば、生理学的条件に曝露すると、架橋結合したポリマーは、架橋結合したポリマーマトリックスの初期の重量またはサイズの90重量％未満、80重量％、70重量％未満、60重量％未満、50重量％未満、40重量％未満、またはそれよりも低い値だけ膨張する可能性がある。本明細書で用いられるように、「生理学的な条件」とは、典型的にはインビボにおいて生存可能な対象または有機体（例えば、哺乳動物の対象）に存在する温度、pH、イオン強度、粘度、および／またはその他の生物学的パラメータを指す。本明細書で用いられる通り「架橋結合したポリマーマトリックスの初期の重量またはサイズ」という用語は、生理学的な条件に曝露する前に固体の状態（ゲルの状態を含む）において架橋結合したポリマーマトリックスの重量またはサイズ（例えば、体積）を指すことができる。いくつかの態様において、本明細書で用いられる通り、「架橋結合したポリマーマトリックスの初期の重量またはサイズ」という語句は、それぞれのマトリックス形成組成物の重量またはサイズ（例えば、体積）を指すことができる。本明細書で記載されるこのような架橋結合したポリマーマトリックスの膨張比は、FDAの承認を得た組織封止剤であるCOSEAL（登録商標）（対象への投与後直ちにその当初のサイズ／重量の約400％膨張する）よりも著しく小さい。従って、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは、神経圧迫が問題となるような例えば神経の近傍など、圧力感受性の領域の近傍の組織または臓器の領域に用いる場合、COSEAL（登録商標）よりも優れた生体材料であり得る。
【００７９】
いくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスは、特定の条件下でその体積を保持することができる。例えば、インビボにおいて適用すると、架橋結合したポリマーマトリックスは、一定期間、その当初の体積の少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約90％を保持することができる。本明細書で用いられるように「当初の体積」という用語は、インビボにおける適用前の架橋結合したポリマーマトリックスの体積またはサイズを指すことができる。いくつかの態様において、本明細書で用いられるように「当初の体積」という用語は、架橋結合したポリマーマトリックスの対象への投与体積を指すことができる。様々な態様において、架橋結合したポリマーマトリックスは、少なくとも約5日、少なくとも約10日、少なくとも約15日、少なくとも約20日、少なくとも約1カ月、少なくとも約2カ月、少なくとも約3カ月、少なくとも約4カ月、少なくとも約5カ月、少なくとも約6カ月、少なくとも約1年、少なくとも約2年、またはそれよりも長い期間、当初の体積の少なくとも一部を保持することができる。いくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスは、創傷の治癒が完了するまで、例えば、連続したバリア（例えば、完全な皮膚）を形成するために創傷の側面または輪郭が再結合するまで、当初の体積の少なくとも一部を保持することができる。
【００８０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスは接着能を持つことができる。所望の適用に応じて、架橋結合したポリマーマトリックスの接着強度は、これらに限定されるものではないが、例えば、架橋結合したポリマーマトリックスを調製するために用いられる絹フィブロインの濃度、pH値および／または溶媒などの様々な要因によって調整することができる。いくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスは、少なくとも約5Pa、少なくとも約10Pa、少なくとも約15Pa、少なくとも約20Pa、少なくとも約30Pa、少なくとも約40Pa、少なくとも約50Pa、少なくとも約60Pa、少なくとも約70Pa、少なくとも約80Pa、少なくとも約90Pa、少なくとも約100Pa、またはそれよりも高い接着強度を有するように適合させることができる。いくつかの態様において、架橋結合したポリマーマトリックスは、例えば少なくとも約10Paなど、COSEAL（登録商標）のそれと同等の接着強度を有するように適合させることができる。本明細書で用いられるように「接着強度」という用語は、一般に、架橋結合したポリマーマトリックスとその架橋結合したポリマーマトリックスが適用された基質の間の接触を切断するための引っ張り力の強さを指す。いくつかの態様において、基質は組織または臓器の少なくとも一部の表面であり得る。いくつかの態様において、基質は移植片の表面であり得る。別の態様において、基質は金属（例えば、スチールの表面）またはプラスチックの表面であり得る。異なる材料間の接着強度を測定するための方法は当技術分野において周知である。接着強度を測定するための例示的な方法も実施例1に含まれる。
【００８１】
本明細書に記載される架橋結合したポリマーマトリックスの適用
絹−PEGヒドロゲルは、強力な接着特性、良好な生体適合性、副産物を含まない化学的性質、迅速な架橋結合、およびゆっくりとした生分解性という組織封止剤または接着剤として適用に望ましい特性を示す。
【００８２】
従って、絹−PEGヒドロゲルは、例えば、対象の開放性の創傷など、対象の標的部位において組織の封止剤または接着剤を形成する方法に用いることができる。本方法は、架橋結合したマトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、架橋結合したマトリックスを安定化するためにβシートを形成することができる絹フィブロインとを含む少なくとも一つの組成物を、対象の標的部位（例えば、開放性の創傷）に投与する工程、ならびに成分を架橋結合して標的部位（例えば、創傷）において組織封止剤または接着剤を形成するために組成物の成分を混合する工程を含む。
【００８３】
一つの態様において、二つのPEG成分は、対象の傷ついた部位に別々に投与されて、それによってインビボにおいて組織封止剤を形成する。絹−PEGをベースとする組織封止剤は、組織または臓器であり得る創傷への適用後直ちに形成され得る。このような態様において、架橋結合したポリマーマトリックスまたは組織封止剤はインサイチューにおいて形成される。その他の態様において、架橋結合ポリマーマトリックスは、例えば、移植による対象への適用前に形成されてもよい。
【００８４】
絹−PEGをベースとする組織封止剤は、移植片において、または、移植片と周辺の組織または臓器を架橋結合するために形成されることもできる。対象において組織封止剤を形成する際に、創傷のある部位の表面を少なくとも一つの成分と架橋結合してもよい。
【００８５】
いくつかの態様において、本明細書に記載される少なくとも一つの活性物質は、PEG成分および／または絹フィブロインの対象の標的部位への投与の前に、投与と同時に、または投与の後に送達されてもよい。いくつかの態様において、活性物質は本明細書に記載されるマトリックス形成組成物の少なくとも一つの成分と混合することができる。いくつかの態様において、活性物質は本明細書に記載されるマトリックス形成組成物の成分とは別に送達されてもよい。
【００８６】
治療される創傷には開放性もしくは閉鎖性、または起源において急性もしくは慢性のいずれも含まれる。一つの態様において、絹−PEGをベースとする組織封止剤は開放性の創傷を治療するために用いられる。開放性の創傷には、切開創または切開された創傷；裂傷または何らかの鈍的外傷によって生じる不規則な裂傷のような創傷；剥離；皮膚の最上層（表皮）が擦り取られる表層の創傷のような擦過傷（擦り傷）；皮膚を穿刺する物質によって生じる傷のような穿刺による創傷；皮膚に侵入し出てくる物質によって生じる貫通による創傷；および銃創が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書において治療されるべき創傷は、挫傷、血腫、挫滅による損傷、慢性または急性の創傷のような閉鎖性の創傷も含み得る。
【００８７】
止血物質は典型的には出血を停止するために作用して、組織封止剤は組織中の欠陥部位に結合して閉鎖することができるので、創傷部位で形成される絹−PEGをベースとする組織封止剤は止血物質をさらに含んでもよい。従って、絹−PEGをベースとする組織封止剤に止血物質を組み合わせることは、組織の再建を促進することに加えて、出血を予防または止めるための外科的修復中に望ましい特徴を示すことができる。本明細書での使用に適した例示的な止血物質には、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、セルロース、出血因子、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
絹−PEGをベースとする組織封止剤は、顕著な膨張などの、市販の組織封止剤に附随する欠点のいくつかを克服することができる。本明細書に記載される通り、絹−PEG封止剤の膨張比は、例えば、COSEAL（登録商標）に比して著しく低い。従って、絹−PEGヒドロゲルは閉鎖された間隙または神経のような圧力感受性の構造物の近傍で使用することができる。
【００８９】
いくつかの態様において、架橋結合ポリマーマトリックス（例えば、絹−PEGをベースとするマトリックス）は細胞もしくは薬剤送達のため、または細胞が増殖するためのプラットフォームとして使用することができる。
【００９０】
本発明は、本明細書に記載されるすべての方法を実施するためのマトリックス形成組成物および説明書を含むキットおよび装置をさらに提供する。本明細書に記載されるマトリックス形成組成物は、絹フィブロインと少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分とを含む少なくとも三つの成分を含む。組成物の絹フィブロインおよびPEG成分の態様は本明細書に記載される。
【００９１】
キットは、止血物質のような一つまたは複数の活性物質をさらに含むことができる。キットは一つまたは複数の容器または混合ツール（例えば、バイアル、アンプル、シリンジ、またはその他の適切な保存容器）を含むことができる。絹フィブロイン、PEG成分、活性物質、または架橋結合に必要である可能性のある試薬は、別々に封入された各成分と共に、または混合物（例えば、PEGを絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解してもよい）として容器または混合ツールに封入することができる。
【００９２】
いくつかの態様において、マトリックス形成組成物は、例えば、二連の注射外筒の注入装置のような送達装置に予め充填してもよい。このような態様において、単なる例として、絹フィブロインと混合された一つのPEG成分を送達装置の一方の注射外筒に予め充填してもよく、絹フィブロインと任意で混合される別のPEG成分を送達装置の別の注射外筒に予め充填してもよい。注射外筒内部の成分は粉末として存在してよく、この粉末は使用時に溶液に懸濁されるか、または溶液に予め懸濁されてもよい。その他の態様において、マトリックス形成組成物の成分は、別々の送達装置、例えばシリンジに予め充填することができる。
【００９３】
本発明を実施するためのキットの使用に関するキット内の説明書は、一般に、本発明の方法を実施するためにキットの内容をどのように使用するかが記載される。説明書は、試料の情報（例えば、剤形、サイズ）、絹−PEG架橋結合マトリックスを形成するために必要な工程、および条件などを含み得る。キット内に提供される説明書は、ラベルまたは添付文書での書面による説明書（例えば、キット内に含まれる1枚の紙）、または機械で読み取り可能な説明書（例えば、磁気的または光学的記録ディスクに保存された説明書）を含む。
【００９４】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されるものではなく、従って、変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の態様のみを説明する目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は専ら特許請求の範囲によって定義される。
【００９５】
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、単数形は、文脈からそうでないことが明示される場合を除いて、複数の指示物を含み、逆も同様である。操作上の例における以外、または特記される場合は、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表すすべての数値は、「約」という用語によってすべての場合において修正されるものとして理解されるべきである。
【００９６】
特定されるすべての特許およびその他の刊行物は、例えば、このような刊行物において説明される方法であって、本発明に関連して用いられる可能性がある方法を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に特別に組み入れられる。これらの刊行物は、単にそれらの開示が本出願の出願日よりも前であるために示されるものである。先行発明という理由で、またはその他の何らかの理由において、本発明者らがこのような開示に先行する権利が与えられないということを承認するものとして解釈されるべきではない。これらの資料の内容に関する日付または表示に関する記述はすべて本発明者らに利用可能な情報に基づくものであり、これらの資料の日付または内容の正確さに関して何ら承諾をなすものではない。
【００９７】
別途定義される場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を持つ。本発明の実践または試験においては公知の任意の方法、装置および材料が用いられ得るが、この点に関しての方法、装置および材料は本明細書において説明される。
【００９８】
次の実施例は本発明のいくつかの態様および局面を例証する。当業者には、本発明の精神または範囲を変更することなく様々な修正、追加、置き換えなどが実施可能であり、このような修正および変更は以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲に内包されることは、明らかである。以下の例は、いかなる点においても本発明を制限するものではない。
【００９９】
本発明は以下の番号を振った項目のいずれか一つにおいて定義され得る：
1．架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、
βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインと
を含む組成物を混合する段階を含む、架橋結合ポリマーマトリックスを調製する方法。
2．架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む組成物を混合する段階；および
架橋結合ポリマーマトリックスを形成するために該組成物の該成分を架橋結合する段階
を含む、架橋結合ポリマーマトリックスを調製する方法。
3．架橋結合する段階が、混合物をアルコール処理または水アニーリング処理に曝露することを伴う、項目2記載の方法。
4．機能的に活性化されたPEG成分と混合する前に、絹フィブロインからセリシンを枯渇させる、項目1〜3のいずれか一項記載の方法。
5．マトリックスがヒドロゲルである、項目1〜4のいずれか一項記載の方法。
6．各PEG成分が4アームPEGである、項目1〜5のいずれか一項記載の方法。
7．PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化される、項目1〜6のいずれか一項記載の方法。
8．PEG成分の一つがチオール基で機能的に活性化される、項目1〜7のいずれか一項記載の方法。
9．PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化され、該PEG成分の別の一つがチオール基で機能的に活性化される、項目1〜8のいずれか一項記載の方法。
10．前記組成物の少なくとも一つの成分が水溶液に懸濁または溶解される、項目1〜9のいずれか一項記載の方法。
11．少なくとも絹フィブロインが水溶液中にあり、該絹フィブロインの濃度が少なくとも約10重量％である、項目10記載の方法。
12．水溶液が二価のイオンを含まない、項目10または11記載の方法。
13．水溶液が脱イオン水である、項目12記載の方法。
14．各PEG成分が少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解される、項目1〜13のいずれか一項記載の方法。
15．水溶液のpHが約6から約8の範囲である、項目1〜14のいずれか一項記載の方法。
16．前記組成物中の各PEG成分の濃度が約2.5重量％から約15重量％の範囲である、項目1〜15のいずれか一項記載の方法。
17．前記組成物中の絹フィブロインの濃度が約10重量％から約30重量％の範囲である、項目1〜16のいずれか一項記載の方法。
18．前記組成物中の絹フィブロインの濃度が約15重量％から約25重量％の範囲である、項目1〜17のいずれか一項記載の方法。
19．架橋結合ポリマーマトリックスが前記組成物の初期重量の約70％未満膨張する、項目1〜18のいずれか一項記載の方法。
20．架橋結合ポリマーマトリックスが、混合する段階後1時間以内に実質的に膨張しない、項目19記載の方法。
21．少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインが、架橋結合ポリマーマトリックスの接着強度を少なくとも約10Paまで高める、項目1〜20のいずれか一項記載の方法。
22．前記組成物が、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似体、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、アプタマー、抗体またはその断片もしくは部分、抗原またはエピトープ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子または組換え型成長因子ならびにその断片および変異型、細胞接着調節物質、サイトカイン、酵素、抗生物質または抗菌性化合物、ウイルス、毒素、プロドラッグ、化学療法物質、小分子、薬物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される活性物質をさらに含む、項目1〜21のいずれか一項記載の方法。
23．活性物質が、始原細胞または幹細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、神経細胞、生殖細胞、結合組織細胞、ホルモン分泌細胞、腱細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、神経芽細胞、グリア芽細胞、口の細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、腎尿細管細胞、腎基底膜細胞、外皮細胞、骨髄細胞、肝細胞、胆管の細胞、膵島細胞、甲状腺の細胞、上皮小体の細胞、副腎の細胞、視床下部の細胞、下垂体の細胞、卵巣の細胞、精巣の細胞、唾液腺の細胞、脂肪細胞、前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞である、項目22記載の方法。
24．活性物質が抗生物質である、項目22記載の方法。
25．前記組成物が、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、セルロース、血液因子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される止血物質をさらに含む、項目1〜24のいずれか一項記載の方法。
26．架橋結合ポリマーマトリックスが、少なくとも10日間にわたって生理学的条件下でその当初の体積を保持する、項目1〜25のいずれか一項記載の方法。
27．項目1〜26のいずれか一項記載の方法によって作製される、架橋結合ポリマーマトリックス。
28．項目27記載の架橋結合ポリマーマトリックスを含む、組織封止剤または接着剤。
29．架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスを安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む組成物を対象の標的部位に投与する段階；および
該成分を架橋結合して組織封止剤または接着剤を該標的部位において形成するために該組成物の該成分を混合する段階
を含む、対象の標的部位において組織封止剤または接着剤を形成する方法。
30．各PEG成分が4アームPEGである、項目29記載の方法。
31．PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化される、項目29または30記載の方法。
32．PEG成分の一つがチオール基で機能的に活性化される、項目29〜31のいずれか一項記載の方法。
33．PEG成分の一つがマレイミジル基で機能的に活性化され、該PEG成分の別の一つがチオール基で機能的に活性化される、項目29〜32のいずれか一項記載の方法。
34．少なくとも一つの成分が水溶液に懸濁または溶解される、項目29〜33のいずれか一項記載の方法。
35．少なくとも、少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインが水溶液中にある、項目34記載の方法。
36．水溶液が二価のイオンを含まない、項目35記載の方法。
37．各PEG成分が少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロイン溶液に懸濁または溶解される、項目29〜36のいずれか一項記載の方法。
38．前記組成物の総重量に基づく各PEG成分の重量パーセントが約2.5重量％から約15重量％の範囲である、項目29〜37のいずれか一項記載の方法。
39．前記組成物の総重量に基づく絹フィブロインの重量パーセントが約10重量％から約30重量％の範囲である、項目29〜38のいずれか一項記載の方法。
40．前記組成物の総重量に基づく絹フィブロインの重量パーセントが約15重量％から約25重量％の範囲である、項目29〜39のいずれか一項記載の方法。
41．組織封止剤または接着剤が前記組成物の初期重量の約70重量％未満膨張する、項目29〜40のいずれか一項記載の方法。
42．前記組成物が活性物質をさらに含む、項目29〜41のいずれか一項記載の方法。
43．前記組成物が止血物質をさらに含む、項目29〜42のいずれか一項記載の方法。
44．標的部位の表面が前記組成物中の成分の少なくとも一つと架橋結合する、項目29〜43のいずれか一項記載の方法。
45．対象が移植片である、項目29〜44のいずれか一項記載の方法。
46．対象が組織または臓器である、項目29〜45のいずれか一項記載の方法。
47．組織または臓器が圧力感受性構造物の近傍にある、項目46記載の方法。
48．組織または臓器が開放性の創傷を有する、項目46または47記載の方法。
49．二つのPEG成分が対象に別々に投与され、それによって、インビボにおいて組織封止剤または接着剤が形成される、項目29〜48のいずれか一項記載の方法。
50．第一の区画が第一の機能的に活性化されたPEG成分を含み、第二の区画が架橋結合マトリックスを形成するために機能的に活性化された第一の該PEG成分と反応することができる第二の機能的に活性化されたPEG成分を含み、第一および第二の該区画の少なくとも一つが、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインをさらに含む、少なくとも二つの区画を含むハウジング
を含む、予め充填された送達装置。
51．第一の機能的に活性化されたPEG成分が少なくとも一つのマレイミジル基を含む、項目50記載の送達装置。
52．第二の機能的に活性化されたPEG成分が少なくとも一つのチオール基を含む、項目50記載の送達装置。
53．シリンジである、項目50〜52のいずれか一項記載の送達装置。
54．シリンジが針をさらに含む、項目53記載の送達装置。
55．シリンジがカテーテルをさらに含む、項目53または54記載の送達装置。
56．少なくとも一つの送達装置に予め充填された少なくとも三つの成分を含むマトリックス形成組成物であって、少なくとも三つの該成分が、架橋結合マトリックスを形成するために互いに反応することができる少なくとも二つの機能的に活性化されたPEG成分と、βシートを形成して該架橋結合マトリックスをさらに安定化することができる少なくとも約10重量％の濃度の絹フィブロインとを含む、マトリックス形成組成物、ならびに
該マトリックス形成組成物を混合するための溶媒を含む少なくとも一つの容器
を含む、キット。
57．送達装置が少なくとも二つの別々の外筒を含み、それぞれの該外筒がマトリックス組成物の異なる成分を充填される、項目56記載のキット。
58．少なくとも一つの成分が別個の送達装置に予め充填される、項目56記載のキット。
59．溶媒が水溶液である、項目56〜58のいずれか一項記載のキット。
60．溶媒が脱イオン水である、項目56〜59のいずれか一項記載のキット。
61．PEG成分が、送達装置の別個の外筒または異なる送達装置に別々に予め充填される、項目56〜60のいずれか一項記載のキット。
62．PEG成分が絹フィブロインとブレンドされる、項目56〜61のいずれか一項記載のキット。
【実施例】
【０１００】
実施例1：例示的な材料および方法
材料：
4アームのポリエチレングリコールマレイミド（4アームPEG-マレイミド）および4アームのポリエチレングリコールチオール（4アームPEG-SH）は、Nanocs Inc., New York, NYから購入した。カイコの繭は、School of Materials Engineering, Soochow University, Suzhou, Chinaから入手した。
【０１０１】
絹フィブロイン溶液の調製：
絹フィブロイン水溶液は既述の通り得た。Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139-48 (2001)を参照されたい。つまり、カイコガの繭を洗浄して、小片に刻んだ。その後のデガミングの過程において、カイコガの繭をNa2CO3の0.2M 水溶液中で30分ないし60分間煮沸して、生の絹フィブロインフィラメントに結合した水溶性の糖タンパク質を絹の線維から回収した。続いて、20％（w/v）の絹フィブロイン溶液を生成するために、絹フィブロインを9M LiBr溶液中、60℃で1時間、溶解した。LiBrを除去するために、溶液をSlide-A-Lyzer（登録商標）3500 MWCO透析カセット（Pierce Chemicals, Rockford, IL）で水に対して72時間、透析した。
【０１０２】
ゲルの形成およびβシート含有量の測定：
絹−PEGをベースとするヒドロゲルは、表1または2に示されている調製物を用いて、溶媒としてpH 6〜8の1×PBS（この範囲は架橋結合反応のpH特異性に基づいて評価された）を用いて調製した。いくつかの態様において、本明細書で用いられるPBSは、カルシウムイオンのような二価のイオンを含まない。例えば、PEG成分のみを含む対照試料の調製のため、4アームPEG-SHおよび4アームPEG-マレイミドを、それぞれ、10％の濃度に達するように1×PBS（pH 6〜8）に各々溶解した。続いて、異なるPEG成分を含む二つの各溶液を一つに混合した。同様に、「X％ 絹−PEG」（Xは絹の濃度の値を示す）と記載される絹−PEGをベースとする試料の調製のため、絹フィブロインを濃度X％に達するように1×PBS（pH 6〜8）に溶解し、続いて、4アームPEG-SHおよび4アームPEG-マレイミドをそれぞれ、X％絹フィブロイン溶液に溶解し、各PEG成分の最終濃度は溶液全体の10％に達した。続いて、異なるPEG成分を含む二つの絹の各溶液を一つに混合した。
【０１０３】
ゲル化は、改変した試験管転倒法により評価した。Shu et al., 3 Biomacromol. 1304-11 (2002)を参照されたい。具体的には、二つまたはそれ以上の成分を混合した後に上下転倒したバイアル／試験管の底部に材料の流動性または液体の蓄積が観察されない場合、ゲルが形成されたと判断した。溶液の混合は、室温で軽くボルテックスにかけることによって達成した。
【０１０４】
βシートの形成を評価するために、試料に1×PBS（pH 7.4）を重層するかまたは例えば無水エタノールなどのアルコールで処理して、37℃で15分間インキュベートし、FTIR（Equinox 55 ATR-FTIR, Bruker Optics Inc., Billerica, MA）で分析した。
【０１０５】
（表１）例示的な絹−PEG材料調製物の調製
2013536737.tif 000003
【０１０６】
（表２）例示的な絹−PEG材料調製物の最終組成物
2013536737.tif 000004
【０１０７】
COSEALの調製：
COSEALは製造業者の説明書に従って調製した。キットは、シリンジ内に粉末として提供される二つの合成ポリエチレングリコール（PEG）、および2本のシリンジ（1本は希塩酸、1本はリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液）を含む液体ポーチを含んだ。2本のシリンジは、粉末のシリンジが正しい液体（例えば、緩衝液）と混合されることを可能とするように設計されたハウジングへと予め組み立てられて供給された。続いて、プランジャーを力強く押し込むことによって、液体を粉末内に移動させた。固体が完全に溶解するまで、内容物を少なくとも20回、シリンジ間で前後に混合した。続いて、溶解した粉末の入ったシリンジおよびもう一方の液体（例えば、希塩酸）の入ったシリンジを、二つの溶液が同時に分散することを可能とする提供されたエポキシ様のアダプターにセットした。分散した液体の架橋結合およびゲル化は5〜10秒以内に起こる。
【０１０８】
膨張比の測定：
絹−PEGをベースとするゲルを、Transwell（登録商標）の8μmポアメンブレンを持つインサート（Corning Inc., Corning, NY）に予めキャストして（例えば、溶媒への最大表面アクセスを確保するため）、重量を測定した後、1×PBS（pH 7.4）を重層した。次に、ゲル試料を含むプレートを37℃で50rpmにてインキュベートした。時々、過剰な溶媒を除去するために、ゲル試料内の緩衝液をデカントで捨ててゲルを吸い取った。次いで、残ったゲルおよびインサートの重量を測定した。
【０１０９】
インビトロにおける分解：
絹−PEGをベースとするゲルは、膨張比の測定における絹−PEGをベースとするゲルの調製のための手順と同様に調製した。ゲル重量のわずかな変化の検出を可能とするために、体積を増加させた。分解は、1×PBS（pH 7.4）中の予めキャストしたゲル0.1mLを、1mg/ml（5U/mg）のプロテアーゼXIV（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を加えた場合または加えない場合について、37℃において50rpmでインキュベートして測定した。次に、約10日間ないし2週間、インキュベート後のゲルを毎日重量測定することによって、ゲル材料の分解を測定した。
【０１１０】
接着試験：
COSEAL（登録商標）および絹−PEGをベースとする生体材料の、腸またはスチールに対する接着力を評価および比較するために、TA Instruments (Delaware, U.S.A.)のRSA IIIを用いたマルチプルエクステンションモード（MEM）で、動的機械分析（DMA）を実施した。すべての測定において、取り付け具の間のギャップは1mmに設定し、最大許容引っ張り力は2gまたは0.05Nとした。使用したスチール取り付け具は直径8mmであった。すべての運転において、試料平衡の工程に続いて、低歪み振幅（1Hzにおいて1％〜5％の歪み）にて歪み制御方式の動的時間依存性測定を実施した。次いで、完全に材料−基質の密封が破綻するまで、5mm/分の一定トランスデューサー速度にて過渡引っ張り試験を収集した。各試料の接着を特徴決定するために、3回の測定の平均値を求めた。COSEAL（登録商標）または絹−PEGをベースとする生体材料の腸粘膜に対する接着の測定には、ソーセージのケーシングを使用した。測定のためのソーセージケーシングは、Whole Foods Market (Woburn, MA)から入手して、小さな長方形に刻み、次にこれをスチールのプレートに載せた。試験はすべて、常温常湿で実施して、組織の試料は実験に必要となるまで無菌のPBS中に維持した。組織片を手に取って湿った状態（PBSの存在下）でカットし、その後、取り付け具にセットして試験まで30秒ないし1分間、固化させた。
【０１１１】
細胞適合性アッセイ：
初代ヒト頸部線維芽細胞の8回継代細胞（3x105個/ウェル）を、組織培養プレートを用いて無血清の条件下で培養した。ウェルを、1×PBS（pH 6）中で調製したPEG単独のヒドロゲルおよび10％絹−PEGヒドロゲル（表1または2に示す）でコーティングした。続いて、ゲルの試料を含むプレートを、37℃／5％ CO2にて48時間インキュベートした。細胞生存性は、LIVE/DEAD（登録商標）Cell Viability Assays (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いることによって評価した。100倍の倍率の蛍光顕微鏡（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用いて画像を収集した。
【０１１２】
皮下注入：
試料（各200μL）をBALB/cマウス（n＝4）の背部に皮下注入して、局所の組織の反応および分解時間を2週間にわたってフォローした。組織学的評価に備えて注入部位の組織を加工して、ヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）で染色した。動物試験はTufts IACUCに承認されたプロトコールに従って実施された。
【０１１３】
統計学的解析：
数値は平均値±標準偏差（S.D.）として表し、Studentのt検定（両側、タイプ3）を用いて比較し、p＜0.05またはp＜0.01を統計学的有意と見なして、p＜0.005は極めて有意と見なした。多重データ比較にはANOVA一因子解析を用いた。
【０１１４】
実施例2．ゲルの形成およびβシート含有量の測定
絹−PEGをベースとするヒドロゲルにおける様々な調製物は、表1または2に記載の通り得られた。図1Aまたは1Bに示す通り、架橋結合したポリマーマトリックスを形成するために2段階のゲル化の過程が生じ得る。第一のフェーズは二つのPEG間の化学反応を介した迅速なゲル形成を伴い得る。この工程は、それぞれ、4アームPEG-SHおよび4アームPEG-マレイミドを含む二つの試料を混合後、数秒以内のゲル形成によって確認されて、ゲル形成のこの工程は試料中の絹の存在下または非存在下において生じた（Vanderhooft et al., 8 Biomacromolecules 2883-89 (2007))。（図2の差し込み図）。
【０１１５】
ブレンドしたPEG調製物中での絹のβシート形成を評価するため、対照（PEG単独）および絹含有（10％絹−PEG）の試料をエタノール（βシート形成を惹起する外的促進物質として公知）で処理し、対照試料をバックグラウンドとして用いてFTIRによりモニターした。アルコール処理（例えば、エタノール処理）の結果として特徴的なβシートのピーク（1625cm-1）の出現が観察され、ブレンドされた形成物中の絹フィブロインはβシート形成能を維持しており（図2）、しかも、形成される絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスは絹フィブロインのβシート形成によってさらに安定化されることが示された。生理学的条件下（アルコール処理を伴わない）では、24時間後に対照試料（PEG単独）または絹含有試料（例えば、10％絹−PEG）にβシートは検出されず、これにより絹のβシート形成を介したさらなるネットワーク安定化は、仮に生じたとしても、時間の点ではゆっくりと生じる（データは示さず）ことが示される。注意すべき点として、エタノールは下記の実施例に記載される実験では使用されなかった。
【０１１６】
実施例3．絹−PEGをベースとする生体材料の生体適合性
絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスの生体適合性は、絹−PEGゲルを型にはめて、事前の洗浄を行わずにそれらに細胞を播種することによって評価した。このような実験条件は、マトリックス形成組成物中の異なる成分（絹、異なるPEG成分）がインビボにおいて追加の洗浄工程を行うことなく架橋結合する状況を密接に擬似することができる。対照試料および絹−PEG試料において48時間培養した初代頸部線維芽細胞は高い生存性を示したが、絹マトリックスに関する既報のデータ（Sofia et al., 2001）と一致して、双方の材料において球形の形態を示した（図3A〜3B）。この形態は、例えば、ポリマーマトリックスに細胞特異的な接着部位がないことによって説明され得る。材料のこのような特性は、インビボにおける外科的な細胞接着の防止および瘢痕組織形成の予防に用いられ得る。図3A〜3Bに示す通り、対照試料および絹−PEG材料の双方の全体の細胞数はほぼ等しかった。画像の視野（図3A〜3B）が最小限のバックグラウンド蛍光に基づいて選択されたことを考慮すると、対照試料および絹−PEG材料の局所的な細胞数は同一ではない。
【０１１７】
実施例4．絹−PEGをベースとする生体材料の膨張挙動
絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスの生理学的条件下での膨張挙動を評価するために、試料をTranswell（登録商標）のインサートにキャストして、緩衝生理食塩液を重層して静かに振盪しながら37℃でインキュベートした。2時間以内に対照試料（PEG単独）および10％絹−PEG試料がそれぞれの当初のサイズの最大約70％だけ膨張し、20％絹−PEGの試料は最大約60％だけ膨張したのみであった（図4A〜4B）。試料の膨張はインキュベート5日目までモニターしたが、最初に観察された値からの変動は、その後は観察されなかった。10および20％試料の間の膨張比の差は、試料調製物および膨張アッセイの装置に関する可能性がある。試料は水、例えば脱イオン水に溶解したが、膨張に関するアッセイは生理学的条件を擬似するためにPBSにて実施した。20％絹試料は10％絹試料に比して水が少なく、従って、イオン平衡後の10％試料の最終重量値は20％試料よりも高い値であった。
【０１１８】
実施例5．絹−PEGをベースとする生体材料の安定性および分解性
絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスの安定性についても、プロテアーゼXIVの存在下および非存在下で分解実験を実施することによって評価した。哺乳動物の系は絹特異的な分解酵素を発現しないので、プロテアーゼXIVが品質保証された絹分解酵素として一般的に用いられている。Horan et al. Biomaterials 26: 3385 (2005)。インビボでの事象の発生には湿潤状態でのシナリオがより関連するので、試料の乾燥重量の分解は避けた。分解をモニターして、分解パーセントは、膨張した試料の重量／サイズ（最大重量／サイズ記録値）に対する最終の重量／サイズ記録値を正規化することによって求めた。試料の初期の膨張は、プロテアーゼ非存在の対照（PBS単独）およびプロテアーゼ存在の双方の条件で認められた。プロテアーゼ非存在下の対照実験では、いずれの試料（対照（PEG単独）、10％絹−PEG、および20％絹−PEGの試料）においても14日間の実験過程中、顕著な加水分解は認められなかった（図5A）。同様に、プロテアーゼXIVの存在下では、絹の低濃度（3％および6％ w/v）において絹マトリックスに関する刊行済みの報告（Horan et al., 26 Biomaterials 3385-93 (2005)）に一致する若干の分解（約10％）が14日目までに認められたものの、顕著な酵素分解は、14日間の実験過程中、いずれの試料（対照、10％絹−PEG、および20％絹−PEGの試料）にも認められなかった（図5B）。これらの結果は、絹−PEGヒドロゲルがインビボにおいて非常にゆっくりと分解されて、分解前に数ヶ月間存在することを示している。Horan et al., 2005。この材料の特徴は、傷を負った部位において組織接着剤の消失前に創傷の治癒が完全に生じ得ることを保証できることである。
【０１１９】
実施例6．絹−PEGをベースとする生体材料の接着特性
絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスの接着能を、DMA測定装置においてCOSEAL（登録商標）と比較した。絹−PEG材料の接着性は、例えば、図6Aに示す装置を用いて封止剤と基質の間の接触を切断するために必要な引っ張り力に基づいて測定することができる。接着のための生体膜モデルとしてウシの腸（ソーセージケーシング）が用いられた。しかし、生体膜は非常に腐敗しやすく、取り扱いに不便である。スチールは腸のより使いやすい代替であり、腸で得られる接着傾向はスチールで得られる接着傾向と同等であった。全体的な接着の値は腸よりもスチールにおいて大幅に低い（COSEAL（登録商標）および絹含有試料の双方において約1/8倍）ものの、結果は、双方の基質における同様の接着傾向がCOSEAL（登録商標）および絹−PEGゲルで見出され得ることを示した（図6B〜6C）。従って、スチールは、COSEAL（登録商標）および絹−PEGゲルの接着特性を比較するための基質として用いることができる。
【０１２０】
理論によって拘束されることを意図するものではないが、PEG上にあるチオールおよびマレイミド官能基の間の化学反応はpH感受性である（塩基性のpH値はチオエーテルよりもジスルフィド結合の形成に有利である）ため、次に絹含有PEG試料（例えば、10％絹−PEG試料）および対照における接着のpH依存性を調べることが求められた。COSEAL（登録商標）の成分の一つはやや酸性のpH値を持ち、これはCOSEAL（登録商標）の二つの成分を混合した後に約7に中和されることが明らかにされた。絹−PEG材料調製物において試験したpH値は生理学的な範囲内（6.0〜8.0）であり、1×PBS pH 6.0において調製された絹-PEG材料はより高い接着特性を示した。pH 6（1×PBS）で調製された絹−PEG試料について、スチールに対する接着値はCOSEAL（登録商標）の値と同等であり、pH 7またはpH 8の緩衝液中で調製された絹−PEG試料のスチールに対する接着値はCOSEAL（登録商標）の方が上回っていた（図7A）。いくつかの態様において、本明細書で用いられるPBSはカルシウムイオンのような二価のイオンを含まない。絹−PEG材料が化学的に架橋結合した後にはβシート形成のpH依存性は検出されず（データは示さない）、これは、pH値は物理的な架橋結合の工程（例えば、βシート形成）よりも化学的な架橋結合の工程に対してより大きな影響を及ぼし得ることを示している。低いpHは4アームPEG-SHのフリーチオール官能基の保存を促進することができ、つまり、低いpHは、チオールが4アームPEG-SHの4アームPEG-マレイミドのマレイミド官能基との反応能を低下させる分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することを阻止すると考えられている。
【０１２１】
絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスの接着能に対する、絹の濃度の影響についても分析した。COSEAL（登録商標）、10％絹−PEG、および15％絹−PEGの試料において、同等の接着値が得られた。5％絹−PEG試料ではより低い接着性（p＜0.005）が観察され、20％絹−PEG試料はCOSEAL（登録商標）よりも優れており（p＜0.005）、接着性の点で約50％の向上を示した（図7B）。これらの結果は、10％ w/vまたはそれよりも高い絹フィブロインを含む絹−PEG架橋結合ポリマーマトリックスが、組織封止剤としての適用により適切であり得るということを示していると思われる。
【０１２２】
絹−PEG材料の接着能に対する溶媒の影響を評価するために、評価目的のためにカルシウムイオンのような二価のイオンを含む1×PBS（pH 7.4）または水（例えば、脱イオン水）で試料を調製した。記載したすべての調製物（対照、3％絹、6％絹、および10％絹）において、CoSealはスチールに対してより優れた接着性を示した（その他のすべての試料の2 Pa〜4 Paに対して、CoSealでは約10 Paの垂直応力）（図7D〜7E）。しかし、水（例えば、脱イオン水）で調製された試料はスチールに対して強い接着性を示した。例えば、水中でキャストされた10％絹−PEG試料について評価したところ、COSEAL（登録商標）と同等のスチールに対する接着値が得られた（図7C）。10％絹含有試料を水を用いて調製した場合、絹含有PEG試料においてCOSEAL（登録商標）と同等のスチールに対する接着特性が見出された。このように、絹−PEG試料の調製に用いられる溶媒（例えば、水対リン酸緩衝生理食塩液）は、材料の接着特性に影響を及ぼす可能性がある。理論によって拘束されることを意図するものではないが、生理食塩液中にCa2+のような二価のイオンが存在すると、絹において時期尚早の段階でβシート形成が惹起されて（Kim et al. Biomacromolecules. 5:786 (2004)参照）、材料の接着性が低下する可能性がある。しかし、水をベースとする試料中にイオンが存在しないと、材料の膨張特性が変化する可能性がある。従って、いくつかの態様において、絹−PEG生体材料の調製において用いられる水溶液は水、例えば脱イオン水とすることができる。その他の態様において、絹−PEG生体材料の調製に用いられる水溶液は、例えば一価のイオンのみを含む緩衝系など、二価のイオンを除外してよい。
【０１２３】
実施例7：絹−PEGをベースとする生体材料のインビボにおける適合性
絹−PEGブレンドのインビボにおける適合性を評価した。続いて、材料（COSEAL（登録商標）および絹−PEGをベースとする材料、例えば5％絹／PEG）を、BALB/cマウスの背部に皮下注入して、2週間後に組織学的な解析のために回収した。双方の材料が固有の組織と十分に一体化し、COSEAL（登録商標）についてこれまでに報告された顕著な炎症性反応は惹起されず、通常のレベルの線維症が惹起された（図8）。Wallace et al. J Biomed Mater Res. 58: 545 (2001)を参照されたい。
【０１２４】
マウスにおける皮下注入において、絹をベースとする封止剤の組織適合性はCoSealと同等であった。双方の材料が2週間後にも依然、存在した。先行の試験は、予め作製されたゲルのウサギにおける皮下移植において、COSEAL（登録商標）が約2週間後に完全に分解または吸収されることを報告した。Wallace et al. J Biomed Mater Res. 58: 545 (2001)を参照されたい。分解速度に認められた相違は、異なる実験条件（移植対注入；予め作製されたゲル対インサイチューでの架橋結合；ウサギ対マウス）に起因する可能性がある。それにも関わらず、本明細書に示されるデータは、絹−PEGをベースとする複合物のいくつかの態様が、出血の制御において止血および／または封止特性を有し得ることを示している。
【０１２５】
参考文献
2013536737.tif 000005
2013536737.tif 000006
【０１２６】
開示される態様に対する様々な変更および修正は当業者には明らかであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく加えられ得る。さらに、特定されるすべての特許および刊行物は、例えばこのような刊行物において説明される方法であって、本発明に関連して用いられる可能性がある方法を、説明および開示する目的のために、参照により本明細書に特別に組み入れられる。これらの刊行物は、単にそれらの開示が本出願の出願日よりも前であるために示されるものである。先行発明という理由で、またはその他の何らかの理由において、本発明者らがこのような開示に先行する権利が与えられないということを承認するものとして解釈されるべきではない。これらの資料の内容に関する日付または表示に関する記述はすべて、本発明者らに利用可能な情報に基づくものであり、これらの資料の日付または内容の正確さに関して何ら承諾をなすものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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