(57)【要約】      （修正有）【課題】バリアント脂肪分解酵素を調製する方法の提供。【解決手段】宿主生物において、真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつコードされたアミノ酸配列において、ａ）もとの真菌脂肪分解酵素と比較して、前記アミノ酸配列における少なくとも１つのグリコシル化部位（又は１つのさらなるグリコシル化部位）の導入；ｂ）ポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での（もとのアミノ酸と比較して）さらに親水性が高い少なくとも１つのアミノ酸の導入；又はｃ）位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６若しくは３２０の１又は２以上での置換若しくは挿入に相当する位置での少なくとも１つの修飾、又は位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失を含むヌクレオチド配列を発現させることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアント脂肪分解酵素を調製する方法であって、真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６、若しくは３２０の１又は２以上における少なくとも１つの置換、或いは位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における少なくとも１つの欠失を導入する少なくとも１つの修飾を含むバリアント脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列を宿主生物において発現させることを含み、
前記バリアント脂肪分解酵素の各アミノ酸位置が、配列番号２とアラインさせた場合のアミノ酸配列の位置に対応し、前記バリアント脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２２又は配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する場合、前記修飾が位置６３での置換でなく、欠失が位置３１１〜３１２においてではなく；
前記バリアント脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２４、又は配列番号２４の位置２３〜１０６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜１０６３で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜９２９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、方法。
【請求項２】
修飾前の真菌脂肪分解酵素がグリコシル化部位を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂肪分解酵素を産生させる方法であって、配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６を含むヌクレオチド配列；又はそれと少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列；又は遺伝子コードの縮重により配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６のヌクレオチド配列と関連する核酸を宿主生物において発現させることを含む、方法。
【請求項４】
修飾が、ポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つのグリコシル化部位の導入に対応する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位に対して遠位である外部ループ中の位置に位置する１又は２以上のアミノ酸が、もとのアミノ酸よりも親水性の高いアミノ酸で置換されるように、ヌクレオチド配列が修飾される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１又は２以上の親水性アミノ酸がポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置で挿入されるように、ヌクレオチド配列が修飾される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
コードされたアミノ酸において、１又は２以上のアミノ酸が置換又は挿入されて、１又は２以上のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒが得られるように、ヌクレオチド配列が修飾され、前記ＸｘｘがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
コードされたアミノ酸配列において、１又は２以上のＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒが導入されるように、ヌクレオチド配列が修飾される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２つのグリコシル化部位が導入される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも３つのグリコシル化部位が導入される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２と比較して、タンパク質のＣ末端プロセッシングを増強するように、ヌクレオチド配列がさらに修飾される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ末端がアミノ酸位置３０６以降であり、前記位置が、アラインさせた場合の配列番号２のアミノ酸配列中の位置に対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ末端プロセッシングが、位置３０６若しくは３２０での置換又は挿入、或いは前記Ｃ末端中の１若しくは２以上のＫＥＸ２位置での欠失のうち、１又は２以上を含み、各位置が、配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ末端プロセッシングが、位置３０６若しくは３２０での置換、又は位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失の、１又は２以上を含み、各位置が、配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
位置３３、６３、７８、１９０及び３０５の１又は２以上で置換があるように、ヌクレオチド配列が修飾され、アミノ酸がＮで置換され、前記位置が、アラインされた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
位置３０６で置換があるようにヌクレオチド配列が修飾され、アミノ酸がＫ又はＲ又はＡ以外の任意のアミノ酸で置換され、前記位置が、アラインされた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
位置３０６での置換がアミノ酸Ｓでの置換である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
位置３２０で置換があるようにヌクレオチド配列が修飾され、アミノ酸がＴ以外の任意のアミノ酸で置換され、前記位置が、アラインされた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
位置３２０での置換がアミノ酸Ｅでの置換である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
宿主生物が、真菌である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
宿主生物が、トリコデルマ属由来である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
宿主生物が、トリコデルマ・リーゼイ種由来である、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法によって得られるポリペプチド。
【請求項２４】
脂肪分解酵素をコードし、かつコードされたアミノ酸配列において、位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６、若しくは３２０の１又は２以上における少なくとも１つの置換、或いは位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における少なくとも１つの欠失の導入に相当する位置での少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチド配列を含む核酸であって、各アミノ酸位置が配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応し、前記ヌクレオチド配列が配列番号２２又は配列番号２３として示される真菌脂肪分解酵素をコードする場合、前記修飾は位置６３での置換でなく、欠失は位置３１１〜３１２においてではなく；
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２４、又は配列番号２４の位置２３〜１０６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜１０６３で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜９２９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、核酸。
【請求項２５】
修飾前の真菌脂肪分解酵素がグリコシル化部位を含まない、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
ヌクレオチド配列が、ポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位に対して遠位である外部ループ中の位置に位置する１又は２以上のアミノ酸の、もとのアミノ酸よりも親水性の高いアミノ酸での置換に対応する少なくとも１つの修飾を含む、請求項２４又は２５に記載の核酸。
【請求項２７】
ヌクレオチド配列が、ポリペプチド上の表面位置で、及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置での１又は２以上の親水性アミノ酸の挿入に対応する少なくとも１つの修飾を含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載の核酸。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列が、コードされたタンパク質において１又は２以上のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒを提供するような１若しくは２以上のアミノ酸の置換又は挿入に対応する少なくとも１つの修飾を含み、前記ＸｘｘがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、請求項２４〜２７のいずれかに記載の核酸。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列が、コードされたタンパク質中への１又は２以上のＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒの導入に対応する修飾を含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の核酸。
【請求項３０】
少なくとも２つのグリコシル化部位をコードするコドンを含む、請求項２４〜２９のいずれかに記載の核酸。
【請求項３１】
少なくとも３つのグリコシル化部位をコードするコドンを含む、請求項２４〜３０のいずれかに記載の核酸。
【請求項３２】
ヌクレオチド配列が、配列番号２と比較して、タンパク質のＣ末端プロセッシングを増強するための、前記配列のＣ末端領域における修飾を含む、請求項２４〜３１のいずれかに記載の核酸。
【請求項３３】
Ｃ末端がアミノ酸位置３０６以降をコードするヌクレオチド配列から構成され、前記位置が、アラインさせた場合の配列番号２のアミノ酸配列中の位置に対応する、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
Ｃ末端領域における修飾が、位置３０６若しくは３２０での置換又は挿入、或いはコードされたタンパク質のＣ末端における１若しくは２以上のＫＥＸ２位置での欠失をもたらす１又は２以上の修飾を含み、各位置が配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する、請求項３２又は３３に記載の核酸。
【請求項３５】
修飾が、位置３０６若しくは３２０での置換、又は位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失の、１又は２以上をもたらす修飾を含み、各位置が配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する、請求項３２〜３４のいずれかに記載の核酸。
【請求項３６】
ヌクレオチド配列が位置６３、７８、１９０及び３０５の１又は２以上での置換をもたらす修飾を含み、コードされたタンパク質においてアミノ酸がＮで置換され、前記位置が、アラインさせた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項２４〜３５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
ヌクレオチド配列が、コードされたタンパク質において位置３０６での置換をもたらす修飾を含み、前記置換がＫ又はＲ又はＡ以外の任意のアミノ酸での置換であり、前記位置が、アラインさせた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項２４〜３６のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
位置３０６での置換がアミノ酸Ｓでの置換である、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
ヌクレオチド配列が、位置３２０での置換をもたらす修飾を含み、アミノ酸がＴ以外の任意のアミノ酸で置換され、前記位置が、アラインさせた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項２４〜３８のいずれかに記載の核酸。
【請求項４０】
位置３２０での置換がアミノ酸Ｅでの置換である、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６で示されるヌクレオチド配列を含む核酸；
又は配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９８％の同一性を有する核酸；
又は配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と遺伝子コードの縮重により関連する核酸を含む核酸。
【請求項４２】
配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を有する核酸を含む、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９９．５％の同一性を有する核酸を含む、請求項４１又は４２に記載の核酸。
【請求項４４】
配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９９．８％の同一性を有する核酸を含む、請求項４１〜４３のいずれかに記載の核酸。
【請求項４５】
請求項２４〜４４のいずれかに記載の核酸によってコードされるバリアントポリペプチド。
【請求項４６】
極性脂質におけるエステル結合に対して加水分解活性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸３３〜２９６と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２で示される配列と比較して、位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６、若しくは３２０の１又は２以上における少なくとも１つの置換、或いは位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における少なくとも１つの欠失を導入するように修飾されたアミノ酸配列を含むバリアントポリペプチドであって、各アミノ酸位置が配列番号２で示されるアミノ酸配列の位置に対応する、バリアントポリペプチド。
【請求項４７】
ポリペプチド上の表面位置、及び酵素の活性部位に対して遠位である外部ループ中の位置に位置する１若しくは２以上のアミノ酸が、もとのアミノ酸よりも親水性の高いアミノ酸で置換されている、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
１又は２以上の親水性のアミノ酸が、ポリペプチド上の表面位置で、及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置で挿入されている、請求項４６又は４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
１若しくは２以上のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒが得られるように、１又は２以上のアミノ酸が、置換、又は挿入され、前記ＸｘｘがＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、請求項４６〜４８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５０】
１又は２以上のＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒが導入されている、請求項４６〜４９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５１】
位置３３、６３、７８、１９０の１又は２以上での修飾が、その位置のアミノ酸のアミノ酸Ｎでの置換であり、前記位置が、アラインさせた場合に配列番号２のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項４６〜５０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５２】
少なくとも２つのグリコシル化部位が導入されている、請求項４６〜５１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５３】
少なくとも３つのグリコシル化部位が導入されている、請求項４６〜５２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５４】
バリアントポリペプチドがホスホリパーゼ活性又はガラクトリパーゼ活性を有する、請求項２３及び４５〜５３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５５】
請求項２３及び４５〜５４のいずれかに記載のポリペプチドであって、以下の修飾：
【表１】
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を除く配列番号２として示されるアミノ酸配列のアミノ酸３３〜２９６を含む、ポリペプチド。
【請求項５６】
宿主生物において翻訳後にプロセスする場合、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドを産生するプレプロポリペプチドであって、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含む、プレプロポリペプチド。
【請求項５７】
極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドであって、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むプレプロポリペプチドから得ることができる、ポリペプチド。
【請求項５８】
宿主生物由来の脂肪分解酵素の発現を増強させるための請求項２４〜４４のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項５９】
宿主生物が、真菌である、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
宿主生物が、トリコデルマ種である、請求項５８又は５９に記載の使用。
【請求項６１】
宿主生物が、トリコデルマ・リーゼイである、請求項５８〜６０のいずれかに記載の使用。
【請求項６２】
請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のポリペプチドを食料品の１又は２以上の成分に添加することを含む、食料品の作製方法。
【請求項６３】
請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のポリペプチドを生地に添加すること、及び前記生地を焼いて、ベークド製品を作製することを含む、ベークド製品の作製方法。
【請求項６４】
食料品が：卵又は卵ベースの製品；ベークド製品；麺；トルティーヤ；生地；菓子類；冷凍製品；チーズをはじめとする乳製品；ムース；植物性ホイップクリーム；並びに食用油脂；エアレイテッド（aerated）及び非エアレイテッド（non-aerated）ホイップ製品；水中油エマルジョン及び油中水エマルジョン；マーガリン；ショートニング；低脂肪及び超低脂肪スプレッドをはじめとするスプレッド；ドレッシング；マヨネーズ；ディップ；クリームベースのソース；クリームベースのスープ；飲料；スパイスエマルジョン及びソースの１又は２以上である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
リン脂質を請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のポリペプチドで処理して、リゾリン脂質を作製することを含む、リゾリン脂質を調製する方法。
【請求項６６】
糖脂質を請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のポリペプチドで処理して、リゾ糖脂質を作製することを含む、リゾ糖脂質を調製する方法。
【請求項６７】
食用油又は植物油を請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のポリペプチドで処理して、その中に存在する極性脂質の大部分を加水分解することを含む、植物油又は食用油の酵素的脱ガムのプロセス。
【請求項６８】
請求項６２又は６４に記載の方法によって得られる食料品。
【請求項６９】
請求項６３に記載の方法によって得られるベークド製品。
【請求項７０】
請求項２３、４５〜５５及び５７のいずれかに記載のバリアントポリペプチドを含むパン改善組成物又は生地改善組成物。
【請求項７１】
請求項７０に記載のパン改善組成物又は生地改善組成物を含む生地又はベークド製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規（バリアント（variant））脂肪分解酵素、及び１又は２以上の新規脂肪分解酵素をコードする１又は２以上のポリヌクレオチドに関する。本発明は、脂肪分解酵素の産生方法、及びそれらの使用にも関する。本発明はさらに、改善された食料品の調製、特に改善されたベーカリー製品の調製に関する。具体的には、本発明は脂肪分解酵素を提供し、この酵素は、ベーカリー製品をはじめとする食品に対して改善された特性を付与することができる。
【背景技術】
【０００２】
食品及び／又は飼料工業用途における脂肪分解酵素（E.C.3.1.1.x）の有効利用は長年にわたって知られている。
【０００３】
たとえば、ＥＰ０５８５９８８では、リパーゼを生地に添加すると、老化防止効果が改善されることが主張されている。リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）から得られるリパーゼは、生地に添加された場合、ショートニング／脂肪と組み合わせて使用した場合に結果として得られるパンの質を改善できることが示唆されている。ＷＯ９４／０４０３５は、生地にリパーゼを添加することによって、さらに脂肪／油を生地に追加することなく、パンの柔らかさを改善できることを教示している。Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinkiは、外因性リパーゼがパンの体積を修飾し得ることを示している。
【０００４】
小麦粉中のリパーゼの基質は、１．５〜３％の内因性小麦脂質であり、これらは極性及び無極性脂質の複雑な混合物である。極性脂質は、糖脂質とリン脂質とに分けることができる。これらの脂質は、２つの脂肪酸でエステル化されたグリセロール及び極性基で構成されている。極性基は、これらの脂質の表面活性に関与する。これらの脂質中の脂肪酸のうちの１つを酵素により切断すると、はるかに高い表面活性を有する脂質が得られる。ＤＡＴＥＭなどの、高い表面活性を有する乳化剤は、生地に添加した場合に非常に機能的であることはよく知られている。
【０００５】
脂肪分解酵素は、食物中に存在する脂質由来の１又は２以上の脂肪酸を加水分解し、その結果、食料品内で強力な乳化剤分子が形成され、これらは商業的に有益な機能をもたらす。最も重要な乳化剤特性に寄与する分子は、リゾリン脂質、リゾ糖脂質及びモノグリセリド分子などの部分加水分解産物である。極性脂質加水分解産物、すなわちリゾリン脂質及びゾ糖脂質が特に有利である。製パンにおいて、そのようなインサイチュ（in situ）由来の乳化剤は、ＤＡＴＥＭなどの添加された乳化剤と等しい機能をもたらすことができる。
【０００６】
しかしながら、脂肪分解酵素の活性は、遊離脂肪酸の蓄積をもたらすことも判明しており、これは食品において有害な機能をもたらし得る。脂肪分解酵素のこの固有の活性はそれらの機能を制限する。
【０００７】
パンの体積に対するマイナスの影響は、過剰添加で説明がつくことが多い。過剰添加はグルテン弾力性の低下に至る可能性があり、その結果、生地が硬くなりすぎ、かくして体積が減少する。それに加えて、又はその代わりに、そのようなリパーゼは生地に添加されたショートニング、油又は乳脂肪を分解し、その結果、生地及びベークド製品において異臭がする可能性がある。過剰添加及び異臭は、生地中の遊離脂肪酸、特に短鎖脂肪酸の蓄積が原因であるとされてきた。
【０００８】
原材料又は食品中に高レベルの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が存在することは、一般的に、品質上の欠陥と認識され、食品加工業者及び顧客は、通常、食品の明細に最大ＦＦＡレベルを含める。過剰なＦＦＡレベルの結果としての効果は、官能的及び／又は機能的欠陥であり得る。
【０００９】
ＷＯ２００５／０８７９１８では、新規真菌脂肪分解酵素が、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）ＣＢＳ７８２．８３などのフザリウム（Fusarium）種から同定され、これはある用途で優れた特性を有することが示された。これらの酵素は、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）において発現され、生地中のガラクト脂質及びリン脂質のｓｎ−１位置で主に脂肪酸を加水分解することが判明した。
【００１０】
いくつかの真菌脂肪分解酵素に関する問題は、酵素の発現が限定される可能性があり、従って製造するのにコストがかかる可能性があることである。たとえば、商業的規模の活動に好適な多量での酵素の発現は制限される可能性がある。産業界では、増強された発現を示す新規脂肪分解酵素、特に、機能及び／又は活性を損なうことなくこれが達成されるものを見いだすことに関心がもたれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＥＰ０５８５９８８
【特許文献２】ＷＯ９４／０４０３５
【特許文献３】ＷＯ２００５／０８７９１８
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
意外にも、本発明の新規バリアント脂肪分解酵素は、それらの原料となる野生型酵素と比較して、増大した発現を示すことが見いだされた。特に、この増大した発現は、酵素機能及び／又は活性及び／又は適用性能を損なうことなく達成される。加えて、新規バリアント脂肪分解酵素は、野生型酵素と比較して、改善された機能及び／又は活性を示す可能性がある。
【００１４】
本発明者らは、脂肪分解酵素の活性部位（触媒トリアッド（catalytic triad））に対して遠位の外部ループ（複数可）中に位置する１又は２以上の表面アミノ酸を修飾（置換又は挿入）することにより、（もとのアミノ酸と比較して）より親水性の高いアミノ酸で表面アミノ酸を置換するか、又は親水性アミノ酸を導入するか、又はグリコシル化部位を導入して、野生型酵素と比較してバリアント酵素の発現及び／又は機能及び／又は活性を実質的かつ予想外に増大させることが可能であることを見いだした。好ましくは、表面アミノ酸を、１又は２以上のグリコシル化部位を導入する目的でＡｓｎ、Ｓｅｒ及び／又はＴｈｒ（又はそれらの組み合わせ）で置換する。その代わりに又はそれに加えて、活性部位に対して遠位の外部ループ（複数可）を、Ａｓｎ、Ｓｅｒ及び／又はＴｈｒから選択される１又は２以上のアミノ酸を挿入することにより修飾して、１又は２以上のグリコシル化部位を導入することができる。脂肪分解酵素は、典型的には、脂肪と水との間（すなわち、親水性環境と疎水性環境との間）の中間相で作用し、したがって、ある用途における脂肪分解酵素の性能は、この中間相並びに水分活性に非常に依存する。理論により拘束されることを望まないが、酵素の活性部位から離れた位置（すなわち、酵素の活性部位に対して遠位のループ中）で脂肪分解酵素の表面の親水性を変えることにより、脂肪／水中間相内の酵素の配向性を制御して、活性部位が酵素の基質、すなわち脂肪に対して向かうようにすることが可能である。したがって、脂肪分解酵素を修飾して、中間相での酵素を最適に配向させて、酵素の活性を増大させることが可能である。それに加えて、又はその代わりに、グリコシル化部位を導入することにより、宿主生物からの酵素のフォールディング及び発現及び／又は分泌を増大させ、かくしてバリアント酵素の発現を増強することが可能である。
【００１５】
それに加えて、又はその代わりに、本発明者らは、意外にも脂肪分解酵素の発現及び／又は機能性及び／又は活性を実質的に増大させる多くの特異的修飾も見いだした。これらには、グリコシル化部位の付加及び／又は酵素のＣ末端領域の安定化が含まれ得る。いくつかの実施形態では、特異的修飾は、脂肪分解酵素の機能性及び／又は活性を含まない発現を増大させる。したがって、一部の特異的修飾は、そのプロプレ配列が本明細書中では配列番号２（その成熟形態は、配列番号２のアミノ酸３１〜３０５である）として示される野生型（ＫＬＭ１）酵素と比較して、バリアント酵素の適用性能を損なうことなく発現を増大させる。
【００１６】
したがって、本発明の一態様では、宿主生物において、真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有するか、又は１つ若しくは複数の核酸付加、欠失若しくは置換により真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と異なり、かつコードされたアミノ酸配列において、ａ）もとの真菌脂肪分解酵素と比較して、アミノ酸配列における少なくとも１つのグリコシル化部位（若しくは１つのさらなるグリコシル化部位）の導入；ｂ）ポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での（もとのアミノ酸と比較して）より親水性の高い少なくとも１つのアミノ酸の導入；又はｃ）位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６若しくは３２０の１又は２以上における置換若しくは挿入に相当する位置での少なくとも１つの修飾、或いは位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失を含む含むヌクレオチド配列を発現させることを含む方法が提供され、この場合、各アミノ酸位置は、配列番号２とアラインさせた場合のアミノ酸配列の位置に対応し；ヌクレオチド配列が配列番号２２又は配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は１つ若しくは複数の核酸付加、欠失若しくは置換により配列番号２２又は配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と異なる場合、修飾は位置６３での置換でなく、欠失は位置３１１〜３１２においてではない（アミノ酸位置ナンバリングは、アラインした場合に配列番号２に関して示されるものである）。
【００１７】
当該方法は、表面位置で１又は２以上のアミノ酸を置換するか又は挿入することによって、ポリペプチド上の表面位置で少なくとも１つのアミノ酸を導入することができ、ここで、置換又は挿入は、（最初のアミノ酸と比較して）より親水性の高いアミノ酸を用いるものである。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、バリアント脂肪分解酵素を作製する方法であって、宿主生物において、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は配列番号１と１つ若しくは複数の核酸付加、欠失若しくは置換により異なり、コードされたアミノ酸配列において、ａ）アミノ酸配列中の少なくとも１つのグリコシル化部位の導入；ｂ）ポリペプチド上の表面位置で、及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つの親水性アミノ酸の導入；又はｃ）位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６若しくは３２０の１又は２以上における置換若しくは挿入に相当する位置での少なくとも１つの修飾、或いは位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失を含むヌクレオチド配列を発現させることを含む方法を提供し、ここで、各アミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する。
【００１９】
本発明は、脂肪分解酵素を作製する方法であって、宿主生物において、配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６を含むヌクレオチド配列；又はこれと少なくとも９８％（好ましくは少なくとも９９％、好適には少なくとも９９．５％、たとえば少なくとも９９．８％）の同一性を有するヌクレオチド配列；或いは配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６のヌクレオチド配列と、１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換により異なるか、又は遺伝子コードの縮重により関連する核酸を発現することを含む方法をさらに提供する。
【００２０】
脂肪分解酵素を調製する方法も提供され、この方法は、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸で宿主細胞を形質転換させ（この核酸は、配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６を含むヌクレオチド配列；又は配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６と少なくとも９８％（好ましくは少なくとも９９％、好適には少なくとも９９．５％、たとえば少なくとも９９．８％）の同一性を有するヌクレオチド配列；又は配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６のヌクレオチド配列と１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換により異なるか、又は遺伝子コードの縮重によりこれと関連する核酸を含み、宿主細胞は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することができる）、形質転換された宿主細胞を、核酸が発現される条件下で培養し、そして脂肪分解酵素を収集することを含む。
【００２１】
本発明は、本発明による核酸の増強された発現を提供し、したがって、バリアントポリペプチドを作製する改善された方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明による方法によって得られるポリペプチド（プレプロポリペプチド若しくは成熟脂肪分解酵素）を提供する。
【００２３】
さらなる態様では、脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供され、このヌクレオチド配列は、コードされたアミノ酸配列において、ａ）アミノ酸配列中の少なくとも１つのグリコシル化部位の導入；ｂ）ポリペプチド上の表面位置で、及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つの親水性アミノ酸の導入；又はｃ）位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６若しくは３２０の１又は２以上における置換若しくは挿入に相当する位置での少なくとも１つの修飾、又は位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失を含み、ここで、各アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応し、ここで、ヌクレオチド配列が配列番号２２若しくは配列番号２３として示される真菌脂肪分解酵素をコードする場合、修飾は位置６３での置換でなく、欠失は位置３１１〜３１２においてではでない（この場合、アミノ酸位置ナンバリングは、アラインした場合に配列番号２に関して示されるものである）。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は配列番号１と１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換により異なる、ヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、このヌクレオチド配列は、コードされたアミノ酸配列において、ａ）アミノ酸配列中の少なくとも１つのグリコシル化部位の導入；ｂ）ポリペプチド上の表面位置で、及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つの親水性アミノ酸の導入；又はｃ）位置３３、６３、７８、１９０、３０５、３０６若しくは３２０の１又は２以上における置換若しくは挿入に相当する位置での少なくとも１つの修飾、又は位置３１１〜３１２若しくは３０７〜３１９の１又は２以上における欠失を含み、ここで、各アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する。
【００２５】
本発明はさらに、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供し、このヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６を含む；又は配列番号８、配列番号６、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６と少なくとも９８％（好ましくは少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、例えば少なくとも９９．８％）の同一性を有するヌクレオチド配列；又は配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０若しくは配列番号２６のヌクレオチド配列と、１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換により異なるか、又は遺伝子コードの縮重により関連する核酸を含む。
【００２６】
一実施形態では、好ましいヌクレオチド配列は、配列番号８（ミュータント（mutant）５）で示されるもの、又は遺伝子コードの縮重により配列番号８と関連するヌクレオチド配列である。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、本発明による核酸又はヌクレオチド配列によってコードされるバリアントポリペプチドを提供する。
【００２８】
本発明の別の態様は、極性脂質におけるエステル結合に対して加水分解活性を有し、配列番号２のアミノ酸３３〜２９６と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は配列番号２のアミノ酸３３〜２９６とは１つ若しくは複数のアミノ酸付加、欠失若しくは置換により異なり、配列番号２で示される配列と比較して、ａ）アミノ酸配列中に少なくとも１つのグリコシル化部位を導入するか；ｂ）ポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置で少なくとも１つの親水性アミノ酸を導入するか；又はｃ）少なくとも位置３３、６３、７８若しくは１９０の１又は２以上においてアミノ酸を置換若しくは挿入するように修飾されたアミノ酸配列を含むバリアントポリペプチドを提供し、ここで各アミノ酸位置は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の位置に対応する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有し、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１若しくは配列番号２５のアミノ酸３３〜２９６（又はアミノ酸３１〜３０５）として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、宿主生物において翻訳後にプロセスされる場合、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドを産生するプレプロポリペプチドを提供し、この場合、このプレプロポリペプチドは、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一態様では、本発明はさらに、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含むプレプロポリペプチドから得ることができる。
【００３２】
宿主生物に応じて、プレプロ配列は多くの場合、翻訳後修飾を受ける。本発明の酵素に関して、生物にとって、プレプロ配列のＮ末端領域を除去すること、すなわち、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１若しくは配列番号２５のアミノ酸１〜３０の全て若しくは一部を除去することは、比較的一般的である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５のアミノ酸１〜３０として示されるものよりも若干多くのアミノ酸を除去する場合があり、例えば、アミノ酸１〜３１又は１〜３２又は１〜３３を除去する。数例では、宿主生物は、アミノ酸１〜３０として示されるアミノ酸の全て若しくは一部を含み得るか、又は完全に異なるＮ末端配列（例えば、ＥＡＥＡ若しくＥＡなど）を含み得る別のＮ末端配列を導入することができる。数例では、宿主生物によってプレプロ配列から産生される成熟酵素は、そのＮ末端でヘテロゲン（heterogen）であり得る。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾とは、プレプロ配列のＣ末端領域における修飾を意味する場合がある。例えば、アミノ酸３０６〜３４８の全部若しくは一部を、成熟形態において、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５から除去することができる。いくつかの実施形態では、宿主生物は、配列番号９、配列番号７、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５のアミノ酸３０６〜３４８として示されるものよりも若干多いアミノ酸を除去することができ、例えば、アミノ酸３０５〜３４８又は３０４〜３４８又は３０３〜３４８を除去する。数例では、宿主生物によりプレプロ配列から産生される成熟酵素は、そのＣ末端でヘテロゲンであり得る。本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含むプレプロポリペプチドから得ることができるタンパク質の全ての成熟形態、特に宿主生物トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から得られるものを包含することが想定される。
【００３３】
本発明はさらに、宿主生物由来の脂肪分解酵素の発現を増強するための本発明による核酸の使用を提供する。好適には、宿主生物は、真菌、好ましくはトリコデルマ種（Trichoderma spp.）、好ましくはトリコデルマ・リーゼイであってよい。好適には、発現は、野生型核酸（すなわち、本発明による修飾のない核酸）と比較して、約２倍〜約２５倍まで増強される。
【００３４】
本発明はさらに、食料品を作製する方法であって、本発明によるポリペプチドを食料品の１又は２以上の成分に添加することを含む方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、ベークド製品を作製する方法であって、本発明によるポリペプチドを生地に添加し、生地を焼いて、ベークド製品を作製することを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、リゾリン脂質を調製する方法であって、リン脂質を本発明によるポリペプチドで処理して、リゾリン脂質を作製することを含む方法を提供する。
【００３７】
更なる実施形態では、本発明は、リゾ糖脂質を調製する方法であって、糖脂質を本発明のポリペプチドで処理して、リゾ糖脂質を作製することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、植物油又は食用油の酵素による脱ガムのプロセスであって、食用油又は植物油を本発明によるポリペプチドで処理して、その中に存在する極性脂質の大部分を加水分解することを含むプロセスを提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる食料品又はベークド製品を提供する。
【００４０】
本発明の態様を請求項及び以下の解説で提示する。
【００４１】
本発明で使用することができるヌクレオチド配列に関する他の態様には：本発明の配列を含む構築物；本発明で使用するための配列を含むベクター；本発明で使用するための配列を含むプラスミド；本発明で使用するための配列を含む形質転換細胞；本発明で使用するための配列を含む形質転換組織；本発明で使用するための配列を含む形質転換器官；本発明で使用するための配列を含む形質転換宿主；本発明で使用するための配列を含む形質転換生物が含まれる。本発明は、宿主細胞における発現などの、ヌクレオチド配列を使用する本発明で使用するためのヌクレオチド配列を発現する方法（これを転移させる方法を含む）を包含する。本発明はさらに、ヌクレオチド配列を単離する方法、例えば宿主細胞から単離する方法も包含する。
【００４２】
本発明で使用するためのアミノ酸配列に関する他の態様には：本発明で使用するためのアミノ酸配列をコードする構築物；本発明で使用するためのアミノ酸配列をコードするベクター；本発明で使用するためのアミノ酸配列をコードするプラスミド；本発明で使用するためのアミノ酸配列を発現する形質転換細胞；本発明で使用するためのアミノ酸配列を発現する形質転換組織；本発明で使用するためのアミノ酸配列を発現する形質転換器官；本発明で使用するためのアミノ酸配列を発現する形質転換宿主；本発明で使用するためのアミノ酸配列を発現する形質転換生物が含まれる。本発明はまた、例えば宿主細胞における発現などの、アミノ酸配列を用いる本発明で使用するためのアミノ酸配列を精製する方法；（同様のものを転写させ、次いで前記配列を精製する方法を含む）も包含する。
【００４３】
参照を簡単にするために、本発明のこれらの態様及びさらなる態様を適切なセクションの見だしのもとで考察する。しかしながら、各セクションでの教示は、必ずしも特定のセクションに限定されるものではない。
［発明の詳細な開示］
【００４４】
本明細書中で用いられるアミノ酸位置への言及は全て配列番号２のアミノ酸配列を参照することによってなされる。換言すれば、アミノ酸位置のナンバリングを考慮する場合、これは、アミノ酸配列の配列番号２とのアラインメントにより、そして参照配列として配列番号２を用いて、アラインさせた配列の位置ナンバリングを参照することによって、決定することができる（配列番号２の配列（図中、ＫＬＭ１と表示）の本明細書中で教示される他の配列とのアラインメントを示す図２２を参照）。
【００４５】
好適には、本発明にしたがって用いられる宿主生物は、真菌、好ましくはトリコデルマ属由来、さらに好ましくはトリコデルマ・リーゼイ由来であってよい。
【００４６】
一実施形態では、修飾前の真菌脂肪分解酵素はグリコシル化部位を含まない。換言すれば、本発明の方法を用いて、本来又は天然にグリコシル化部位を含まない脂肪分解酵素中に少なくとも１つのグリコシル化部位を導入することができる。
【００４７】
好適には、本発明のバリアントポリペプチドは、少なくとも２つ、好適には少なくとも３つのグリコシル化部位を含み得る。
【００４８】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列又は本発明の方法で用いられるヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１若しくは配列番号２４、又は配列番号２４の位置２３〜１０６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜１０６３で示されるヌクレオチド配列若しくは配列番号２４の位置１１３〜９２９で示されるヌクレオチド配列又は記載した配列と１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換が異なるヌクレオチドと比較して、少なくとも１つの修飾を含む以外は、配列番号１若しくは配列番号２４、又は配列番号２４の位置２３〜１０６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜１０６３で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜９２９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性（好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、好適には少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の同一性）を有する。
【００４９】
一実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号２２若しくは配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する場合、又はヌクレオチド配列が配列番号２２若しくは配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列と１つ若しくは複数のヌクレオチド付加、欠失若しくは置換により異なる場合、修飾は、位置６３での置換ではなく（例えば、サブステーションＫ６３Ｎでなく）、欠失は位置３１１〜３１２においてではない。配列番号２２又は配列番号２３で示される真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中では、配列番号２４又はその一部（例えば、配列番号２４の位置２３〜１０６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜１０６３で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４の位置１１３〜９２９で示されるヌクレオチド配列）で示される。
【００５０】
一実施形態では、好ましくは、本発明による修飾は、ポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つのグリコシル化部位の導入に対応する。
【００５１】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、ポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位に対して遠位である外部ループ中の位置にある１又は２以上のアミノ酸が、もとのアミノ酸よりも親水性の高いアミノ酸で置換されるように修飾される。
【００５２】
或いは、ヌクレオチド配列は、１又は２以上の親水性アミノ酸がポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位に対して遠位の外部ループ中の位置で挿入されるように修飾することができる。
【００５３】
好ましい一実施形態では、ヌクレオチド配列は、コードされたアミノ酸において、１又は２以上のアミノが置換又は挿入されて、１又は２以上のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）が得られるように修飾される。
【００５４】
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、コードされたアミノ酸配列において、１又は２以上のＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒが導入されるように修飾される。換言すれば、本発明のヌクレオチド配列は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒの１又は２以上の、コードされたタンパク質中への導入に対応する修飾を含む。
【００５５】
本発明の方法又は核酸において好適には、少なくとも２つ、好適には少なくとも３つのグリコシル化部位を導入することができる。
【００５６】
本発明の、そして本発明の方法におけるヌクレオチド配列は、もとの脂肪分解酵素と比較して、たとえば、配列番号２又はそのアミノ酸３３〜２９６（又は３１〜３０５）を含む脂肪分解酵素と比較して、タンパク質のＣ末端プロセッシングを増強するためにさらに修飾することができる。
【００５７】
好適には、ヌクレオチド配列又はポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドを更に安定にするためのＣ末端プロセッシングを含んでもよい。
【００５８】
この場合、ポリペプチドのＣ末端はアミノ酸位置３０６以降からであると考えられ、この場合、前記位置は、アラインした場合に配列番号２のアミノ酸配列中の位置に対応する。
【００５９】
好適には、本発明において教示されるＣ末端プロセッシングは：位置３０６若しくは３２０での置換又は挿入、或いはＣ末端における１若しくは２以上のＫＥＸ２位置での欠失のうち、１又は２以上を含み、この場合、各位置は、配列番号２のアミノ酸配列の位置に対応する。好適には、Ｃ末端プロセッシングは、少なくとも１つのＣ末端ＫＥＸ２部位の除去を含み得る。理論によって拘束されることを望まないが、ＫＥＸ２部位を除去すると、タンパク質分解プロセッシングが中止されるか、又はその速度が低下し、その活性が損なわれることなく酵素の安定性が改善されると考えられる。１つのＫＥＸ２部位を位置３０６で見出すことができる（配列番号２とアラインさせた場合）。別のＫＥＸ２部位は、位置３１１〜３１２（配列番号２とアラインさせた場合）で見いだすことができる。
【００６０】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明において用いられるヌクレオチド配列は、位置３３、６３、７８、１９０及び３０５の１又は２以上において置換があるように修飾され、この場合、アミノ酸はＮで置換されている。
【００６１】
好適には、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、位置６３、７８、１９０及び３０５の１又は２以上において置換があるように修飾することができ、この場合、アミノ酸はＮで置換されている。
【００６２】
一実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、グリコシル化部位が位置１９０、１９１及び１９２で導入されるように（グリコシル化部位がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を含むように）修飾することができる。
【００６３】
別の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、グリコシル化部位が位置３３、３４及び３５で導入されるように（グリコシル化部位がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を含むように）修飾することができる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、グリコシル化部位が位置６３、６４及び６５で導入されるように（グリコシル化部位がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を含むように）修飾することができる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、グリコシル化部位が位置７８、７９及び８０で導入されるように（グリコシル化部位がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を含むように）修飾することができる。
【００６６】
グリコシル化部位は、１つのアミノ酸を修飾（例えば、挿入又は置換）することによって導入することができる。別法として、グリコシル化部位を導入するために、２以上のアミノ酸（例えば、２つ又は３つのアミノ酸）を修飾（例えば、挿入又は置換）することができる。
【００６７】
好適には、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、位置１９０で置換があるように修飾することができ、この場合、アミノ酸はＮで置換されている。
【００６８】
一実施形態では、好ましくは本発明によるヌクレオチド配列は、本明細書で配列番号８として示されるヌクレオチド配列（又は遺伝子コードの縮重により配列番号８に関連するヌクレオチド配列）の全体又は一部を含む。本発明はさらに、このヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６９】
一実施形態では、本発明のバリアントポリペプチド又は本発明で使用されるバリアントポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３３〜２９６（又は３１〜３０４若しくは３１〜３０５）で示されるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
好適には、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、位置３０６で置換があるように修飾することができ、この場合、アミノ酸は、Ｋ又はＲ又はＡ以外の任意のアミノ酸で置換され、好ましくは位置３０６の置換は、アミノ酸Ｓでの置換である。
【００７１】
好適には、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、位置３２０で置換があるように修飾することができ、この場合、アミノ酸はＴ以外の任意のアミノ酸で置換され、好ましくは位置３２０の置換は、アミノ酸Ｅでの置換である。
【００７２】
本発明によるバリアントポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるバリアントポリペプチド又は本発明の方法によって産生されるバリアントポリペプチドは、好ましくはホスホリパーゼ活性又はガラクトリパーゼ活性を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、好ましくは、バリアントポリペプチド又はこれをコードする核酸に対してなされる修飾は、少なくとも１つのグリコシル化部位（又は複数のグリコシル化部位）をバリアントポリペプチドに付加し、及び／又は、たとえばバリアントポリペプチドのＣ末端を安定化させるためのＣ末端プロセッシングに関連する修飾である。
【００７４】
好適には、ポリペプチドは、位置３３、６３、７８、１９０、好適には６３、７８又は１９０の１又は２以上における置換を含み得る。好適には、置換はＮでの置換であってよい。
【００７５】
一実施形態では、本発明によるバリアントポリペプチドは、位置３０６で少なくとも１つの置換を含み得る。好ましくは位置３０６での置換は、Ｋ又はＲ以外の任意のアミノ酸での置換である。好ましくは位置３０６での置換は、Ｋ又はＲ又はＡ以外の任意のアミノ酸での置換である。一実施形態では、位置３０６での置換は、好ましくは非荷電及び／又は親水性アミノ酸での置換である。好適には、位置３０６での置換はアミノ酸Ｓでの置換であってよい。
【００７６】
一実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列又は本発明で用いられるヌクレオチド配列は、コードされたアミノ酸配列において、修飾された位置が以下のようになるように修飾することができる：
【００７７】
【表１】
2015133976.tif 000002
【００７８】
当業者には容易に理解されるように、骨格がＫＬＭ１ｗｔ（本明細書中では配列番号２として示す）でない場合、開始アミノ酸として表中に示すアミノ酸は、配列番号２とアラインさせた場合に、同じ位置の選択的骨格が異なり得る。
【００７９】
誤解を避けるために、記号「△」は本明細書中で用いられる場合、この記号の後に記載されるアミノ酸の欠失を意味する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での、より親水性の高い（もとのアミノ酸と比較して）少なくとも１つのアミノ酸の導入は、好ましくはポリペプチド上の表面位置及び酵素の活性部位（触媒トリアッド）に対して遠位の外部ループ中の位置での少なくとも１つのグリコシル化部位（若しくは１つのさらなるグリコシル化部位）の導入による。換言すれば、グリコシル化部位を付加することにより、グリコシル化部位が付加された領域で酵素はさらに親水性が高くなる。
【００８１】
別の態様では、本発明は、食品、たとえば生地、ベークド製品、卵、卵ベースの製品、麺製品、チーズ製品、トルティーヤ製品、動物飼料製品、植物油又は食用油の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。有利には、本発明の酵素を食料品に添加することにより、遊離脂肪酸の蓄積が少なく、乳化の改善をもたらし得る。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は、前記脂肪分解酵素を生地に添加し、そして（場合によって）：生地の粘着性を低下させるため；生地の機械処理適性を改善するため；ベークド製品の焼成中の気泡形成を低減するため；パンの体積及び／又は柔らかさを改善するため；ベークド製品及び／又は生地の貯蔵寿命を延ばすため；ベークド製品及び／又は生地の老化防止効果を改善するため；ベークド製品のクラム構造を改善するため；ベークド製品の孔不均一性を減少させるため；ベークド製品の孔均一性を改善するため；ベークド製品の平均孔サイズを減少させるため；ベークド製品の風味及び／又は臭いを改善するため、ベークド製品の皮の色を改善するため、の１又は２以上のために、生地を焼いて、ベークド製品を作製することを含む、生地及び／又はベークド製品の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００８３】
さらなる態様では、本発明は、テクスチャーを改善するため、平均粒子サイズを低減するため、平均粒子分布を低減するため、熱安定性を改善するため、マイクロ波性能及び／又は安定性を改善するための、卵ベースの製品の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００８４】
本発明の別の態様では、卵又は卵ベースの製品の処理方法が提供され、この方法は、本発明によるバリアントポリペプチド酵素を卵又は卵ベースの製品に添加することを含む。
【００８５】
本発明の別の態様では、麺、又は麺生地若しくは麺ベースの製品を作製する方法が提供され、この方法は、本発明によるバリアントポリペプチド酵素を、麺、麺生地又は麺ベースの製品に添加することを含む。
【００８６】
本発明の一態様では、色／黄色の度合いを改善するため、色特性を安定化させるため、輝度を低減するため、脂肪含有量を減少させるため、テクスチャー及びバイト（bite）（かみ応え）を改善するため、水分活性を低減するため、切れを低減するため、芯の硬度を増大させるため、及び処理中の形状保持を改善するため、の１又は２以上のための、麺又は麺ベースの製品の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用が提供される。
【００８７】
本発明の別の態様では、トルティーヤ又はトルティーヤ生地を作製する方法が提供され、この方法は、本発明によるバリアントポリペプチド酵素をトルティーヤ又はトルティーヤ生地に添加することを含む。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、トルティーヤのロール適性（rollability）を改善するため
、トルティーヤの柔軟性を増大させるため、トルティーヤ及び／又はトルティーヤ生地の老化防止特性を改善するため、柔らかさを改善するため、及び／又はトルティーヤ及び／又はトルティーヤ生地における異臭を低減するための、トルティーヤ又はトルティーヤ生地の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素を提供する。
【００８９】
トルティーヤ及び／又は麺における脂肪分解酵素の機能性は、ＤＡＴＥＭなどの乳化剤との組合せによって改善される可能性がある。
【００９０】
本発明の別の態様では、ミルク、チーズミルク、チーズ又はチーズベースの製品を処理する方法が提供され、この方法はチーズ又はチーズベースの製品に本発明によるバリアントポリペプチド酵素を添加することを含む。
【００９１】
本発明はさらに、風味、テクスチャー及び／又は安定性の改善、チーズにおける脂肪分離効果の低減及び／又はチーズ生産におけるチーズ収量の増大のうちの１又は２以上のための、チーズ又はチーズベースの製品の製造における本発明のバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００９２】
本発明の別の態様では、動物の飼料を処理する方法が提供され、この方法は動物の飼料に本発明によるバリアントポリペプチド酵素を添加することを含む。
【００９３】
本発明はさらに：飼料利用及び／又は転換効率、体重増加、消化率、窒素取り込み、乾燥物質の代謝率及び食味の１又は２以上を増強するための、動物飼料の製造における本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００９４】
さらなる態様では、本発明は、リン脂質（例えば、レシチン）を酵素で処理することによって部分加水分解産物、すなわちリゾリン脂質を作製する、リゾリン脂質、例えばリゾレシチンを調製するプロセスにおける本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００９５】
本発明の別の態様では、リゾリン脂質、例えばリゾレシチンを調製するプロセスが提供され、このプロセスは、本発明によるバリアントポリペプチド酵素でリン脂質（例えばレシチン）を処理することを含む。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、糖脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）又はモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ））を本発明による脂肪分解酵素で処理することにより部分加水分解産物、すなわちリゾ糖脂質を作製する、リゾ糖脂質（たとえば、ジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）又はモノガラクトシルモノグリセリド（ＭＧＭＧ））を調製するプロセスにおける、本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【００９７】
さらなる態様では、リゾ糖脂質（たとえば、ジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）又はモノガラクトシルモノグリセリド（ＭＧＭＧ））を調製するプロセスが提供され、このプロセスは、糖脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）又はモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ））を本発明によるバリアントポリペプチド酵素で処理することを含む。
【００９８】
本発明は、植物又は食用油の酵素による脱ガムのプロセスであって、食用油又は植物油を本発明によるバリアントポリペプチド酵素で処理して、極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）の大部分を加水分解することを含むプロセスも提供する。
【００９９】
誤解を避けるために、当業者は、食用油の酵素処理を実施するのに好適な方法を知っている（例えば、ＥＰ０８６９１６７を参照）。既知酵素が本発明の酵素と置換されるという条件で、本発明を実施する際に既知方法を好適に用いることができる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、植物油又は食用油の製造において、油のトリグリセリド含有量を維持し、及び／又は遊離脂肪酸の蓄積を防止若しくは軽減しつつ、植物油又は食用油中のリン脂質の量を減少させるための、本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【０１０１】
さらなる態様では、本発明は、脂肪酸アシル基を加水分解するためのリン脂質の処理を含むプロセスにおける、本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、油を本発明による真菌脂肪分解酵素で処理して、リン脂質の大部分を加水分解し、加水分解されたリン脂質を含む水性相を油から分離することを含む、食用油中のリン脂質の含有量を減少させるためのプロセスにおける本発明によるバリアントポリペプチド酵素の使用を提供する。
【０１０３】
好ましくは、本発明によるバリアント脂肪分解酵素は極性脂質（例えば、糖脂質及び／又はリン脂質）を加水分解する。換言すれば、本発明によるバリアント脂肪分解酵素は、好ましくはホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）活性）及び／又はガラクトリパーゼ若しくはグリコリパーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性を有する。本発明によるバリアント脂肪分解酵素は、さらにトリグリセリドを加水分解することができる。換言すれば、本発明によるバリアント脂肪分解酵素はさらにトリグリセリドリパーゼ活性（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を有し得る。
【０１０４】
「グリコリパーゼ活性」という用語は、本明細書で用いられる場合、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。糖脂質及びガラクト脂質という用語は、本明細書中では交換可能に用いることができ、ＤＧＤＧ及びＭＧＤＧの加水分解を包含し、これらはそれぞれ加水分解されてＤＧＭＧ又はＭＧＭＧになる。
【０１０５】
「極性脂質」という用語は、本明細書中で用いられる場合、リン脂質及び／又は糖脂質を意味する。好ましくは、「極性脂質」という用語は、本明細書中で用いられる場合、リン脂質及び糖脂質の両方を意味する。
【０１０６】
好適には、本発明によるバリアントポリペプチドは、ホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）活性）及び／又はガラクトリパーゼ若しくはグリコリパーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性を有し得る。
【０１０７】
酵素のグリコリパーゼ活性、ホスホリパーゼ活性及びトリアシルグリセリドリパーゼ活性は、以下に示すアッセイを用いて決定することができる。
【０１０８】
ガラクトリパーゼ活性（グリコリパーゼ活性アッセイ）の測定：
基質：
０．６％のジガラクトシルジグリセリド（Sigma D4651）、０．４％のTriton-X100（Sigma X-100）及び５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７中に溶解させた。
アッセイ手順：
４００μＬの基質を１．５ｍＬのエッペンドルフ管に添加し、３７℃のエッペンドルフサーモミキサー中に５分間入れた。時間ｔ＝０分で、５０μＬの酵素溶液を添加した。また、酵素の代わりに水を用いたブランクも分析した。試料を１０＊１００ｒｐｍで３７℃のエッペンドルフサーモミキサー中で１０分間混合した。時間ｔ＝１０分で、エッペンドルフ管を９９℃の別のサーモミキサー中に１０分間入れて、反応を停止した。
試料中の遊離脂肪酸を、WAKO社製のNEFA Cキットを用いて分析した。
ｐＨ７での酵素活性ＧＬＵを、アッセイ条件下で１分あたり産生される脂肪酸（マイクロモル）として計算した。
【０１０９】
ホスホリパーゼ活性の測定（ホスホリパーゼ活性アッセイ）：
ホスホリパーゼ活性を、同等の結果をもたらす２つの異なる方法を用いて測定した。これらの方法のいずれかを用いて、本発明にしたがってホスホリパーゼ活性を測定することができる。好ましくは、任意の酵素のホスホリパーゼ活性を測定するためにＰＬＵアッセイを用いる。
【０１１０】
ホスホリパーゼ活性を測定するための「ＰＬＵアッセイ」
基質：
０．６％のＬ−αホスファチジルコリン９５％Plant（Avanti#441601）、０．４％のTriton-X100（Sigma X-100）及び５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７中に溶解させた。
アッセイ手順：
４００μＬの基質を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加し、３７℃のエッペンドルフサーモミキサー中に５分間入れた。時間ｔ＝０分で、５０μＬの酵素溶液を添加した。また、酵素の代わりに水を使用したブランクを分析した。試料を、１０＊１００ｒｐｍで、３７℃のエッペンドルフサーモミキサー中で１０分間混合した。時間ｔ＝１０分で、エッペンドルフチューブを９９℃の別のサーモミキサー中に１０分間入れて反応を停止させた。試料中の遊離脂肪酸を、WAKO社製のNEFA Cキットを用いて分析した。ｐＨ７での酵素活性ＰＬＵ−７を、アッセイ条件下で１分あたり産生される脂肪酸（マイクロモル）として計算した。
【０１１１】
ホスホリパーゼ活性の測定のための「ＴＩＰＵアッセイ」
１ＴＩＰＵ（滴定ホスホリパーゼ単位）は、アッセイ条件で１分あたり１マイクロモルの遊離脂肪酸を遊離させる酵素の量と定義される。
【０１１２】
ホスホリパーゼＡ１及びＡ２は、それぞれ位置１及び２から遊離脂肪酸を放出して、レシチンをリゾレシチンに変換するのを触媒する。ホスホリパーゼ活性は、酵素法（enzymation）中にレシチンから遊離する脂肪酸を連続して滴定することによって測定することができる。なぜなら、アルカリの消費量は、遊離する脂肪酸の量に等しいからである。
【０１１３】
基質：
４％のレシチン、４％のTriton-X100、及び６ｍＭのＣａＣｌ２：１２ｇのレシチン粉末（Avanti Polar Lipids #44160）及び１２ｇのTriton-X100（Merck 108643）を磁気撹拌しながら約２００ｍｌの脱塩水中に分散させた。３．０ｍｌの０．６ＭのＣａＣ１２（p.a.Merck 1.02382）を添加した。体積を脱塩水で３００ｍＬに調節し、エマルジョンを、Ultra Thuraxを用いて均質化した。基質は毎日新しく調製した。
【０１１４】
アッセイ手順：
酵素溶液を調製して、３００μＬの酵素を添加して、０．０６〜０．１８ｍＬ／分の滴定曲線の勾配を得た。
既知活性の対照試料を含める。
試料を脱塩水中に溶解させ、１５分間、３００ｒｐｍで撹拌した。２５．００ｍｌの基質を１０〜１５分間３７．０℃に温度調節した後、０．０５ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０に調節した。３００μＬの酵素溶液を基質に添加し、０．０５ＭのＮａＯＨでの連続滴定を、pH-Stat滴定装置（Phm290、Mettler Toledo社製）を用いて実施した。２つの活性測定をそれぞれのスケーリングで実施する。８分後、滴定をやめ、５から７分の間で滴定曲線の勾配を計算した。検出限界は、３ＴＩＰＵ／ｍｌ酵素溶液であった。
【０１１５】
計算：
ホスホリパーゼ活性（ＴＩＰＵ／ｇ酵素）を以下の方法で計算した：
【０１１６】
【数１】
2015133976.tif 000003
【０１１７】
式中：αは、５から７分の間の反応時間での滴定曲線の勾配（ｍｌ／分）である。
Ｎは使用したＮａＯＨの規定度（モル／ｌ）である。
Ｖ１は、その中に酵素を溶解させた体積（ｍｌ）である。
ｍはＶ１に添加された酵素の量（ｇ）である。
Ｖ２は基質に添加された酵素溶液の体積（ｍｌ）である。
【０１１８】
トリアシルグリセリドリパーゼ活性の測定：基質（ＬＩＰＵ）としてのトリグリセリド（トリブチリン）に基づくアッセイ：
トリブチリンに基づくリパーゼ活性は、Food Chemical Codex, Forth Edition, National Academy Press, 1996, p 803にしたがい、試料をグリシン緩衝液の代わりに脱イオン水中に溶解させ、pHstatを７の代わりに５．５に設定するという修飾を加えて測定する。１ＬＩＰＵは、アッセイ条件下で１分あたり１モルの酪酸を遊離させることができる酵素の量と定義される。
【０１１９】
「バリアント」という用語は、本明細書中で用いられる場合、天然に見いだされないタンパク質を意味する。典型的には、バリアントポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド（又はこれをコードするヌクレオチド配列）を修飾することによって作製することができる。バリアントポリペプチドは、したがって、天然又は野生型配列と比較した場合、１又は２以上のアミノ酸改変（すなわち、アミノ酸欠失、付加又は置換）を含む。
【０１２０】
好ましくは、本発明のバリアントポリペプチドは、糸状菌から得ることができる（好ましくは得られる）真菌脂肪分解酵素から得られる。さらに好ましくは、真菌脂肪分解酵素は、フザリウム種（Fusarium spp）から得ることができる（好ましくは得られる）。好ましくは、本発明による真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・ヘテロスポラム又はフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から得ることができる（好ましくは得られる）。好適には、本発明による真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）又はフザリウム・オキシスポラムから得ることができる（好ましくは得られる）（ＷＯ９８／２６０５７又はＵＳ７，４６５，５７０で教示）。
【０１２１】
一実施形態では、好ましくは、修飾は、特に骨格がフザリウム・オキシスポラム由来である場合、Ｋ６３Ｎでない。
【０１２２】
したがって、一態様では、好ましくは脂肪分解酵素及び本発明のバリアントポリペプチドは、真菌脂肪分解酵素、好ましくは糸状菌脂肪分解酵素である。
【０１２３】
好ましくは、本発明による真菌脂肪分解酵素又はバリアントポリペプチドは、フザリウムタンパク質又はその一部由来のアミノ酸と融合した、サーモミセス（Thermomyces）タンパク質由来のアミノ酸配列又はその一部を含む融合タンパク質でない。特に、好ましくは、本発明による真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・オキシスポラムタンパク質由来のアミノ酸配列又はその一部と融合したサーモミセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosa）タンパク質由来のアミノ酸配列又はその一部を含む融合タンパク質でない。
【０１２４】
好ましくは、本発明による真菌脂肪分解酵素は、サーモミセス・ラヌギノーサから得られない、及び／又はサーモミセス・ラヌギノーサから得られる酵素のバリアントでない。
【０１２５】
本発明のバリアントポリペプチドを焼成試験で試験し、フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素（配列番号２−これは、成熟配列がアミノ酸３３〜２９６（好適には、宿主生物によって、３１〜３０４又は３１〜３０５）であるプレプロ配列である。この酵素は本明細書中ではＫＬＭ１とも表示され、本明細書中で教示されるバリアントポリペプチドに関して「野生型」酵素又は骨格酵素を構成する）と比較し、非常に良好な結果を得た。
【０１２６】
バリアントポリペプチドの焼成効果は、エフ・ヘテロスポラム（F. heterosporum）ＣＢＳ７８２．８３由来の真菌脂肪分解酵素（配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（好適には、３１〜３０４又は３１〜３０５）として示されるアミノ酸配列を含む酵素；ＫＬＭ１）よりも優れていることが判明した。
【０１２７】
好適には、「食料品」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ヒト及び／又は動物の消費に好適な物質を意味する。
【０１２８】
好適には、「食料品」という用語は、本明細書中で用いられる場合、すぐに消費することができる形態の食料品を意味する場合がある。しかし、その代わりに又はそれに加えて、食料品という用語は、本明細書中で用いられる場合、食料品の調製で用いられる１又は２以上の食品材料を意味する場合がある。例としてのみ、食料品という用語は、生地から製造されるベークド物品並びに前記ベークド物品の調製で用いられる生地を包含する。
【０１２９】
好適な態様では、本発明は前記定義の食料品を提供し、この場合、食料品は：卵、卵ベースの製品、たとえばこれらに限定されるものではないが、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、修飾卵黄（modified egg yolk）及びそれらから作製される製品；ベークド物品、たとえばパン、ケーキ、スイート生地製品、層状生地、液状衣用生地、マフィン、ドーナツ、ビスケット、クラッカー及びクッキー；菓子類、たとえばチョコレート、キャンディー、キャラメル、ハルワ、ガム、たとえば無糖及び加糖ガム、風船ガム、ソフト風船ガム、チューインガム及びプリン；冷凍製品、たとえばシャーベット、好ましくは冷凍乳製品、たとえばアイスクリーム及びアイスミルク；乳製品、たとえばチーズ、バター、ミルク、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、乳飲料及びヨーグルト；ムース、植物性ホイップクリーム；食用油脂、エアレイテッド（aerated）及び非エアレイテッド（non-aerated）ホイップ製品、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、マーガリン、ショートニング及びスプレッド、たとえば低脂肪及び超低脂肪スプレッド；ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルジョン及びソースの１又は２以上から選択される。
【０１３０】
一態様では、本発明による食料品は、生地製品又はパンなどのベークド製品、揚げ物、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、麺、即席麺、トルティーヤ、クラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェル、及びポテトチップなどのスナック品、並びにパスタであり得る。
【０１３１】
別の態様では、本発明による食料品は、動物飼料であり得る。
【０１３２】
一態様では、好ましくは、食料品は：卵、卵ベースの製品、たとえばマヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、修飾卵黄及びそれらから作製される製品の１又は２以上から選択される。
【０１３３】
本明細書中で言及されるいくつかの用途、特にベーカリー用途などの食物用途において、本発明による脂肪分解酵素は、たとえば、モノグリセリド、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）及びレシチンをはじめとする１又は２以上の通常の乳化剤とともに使用することができる。
【０１３４】
それに加えて、又はその代わりに、本発明による酵素は、１又は２以上の他の好適な食物等級の酵素とともに用いることができる。したがって、本発明による脂肪分解酵素に加えて、少なくとも１つのさらなる酵素をベークド製品及び／又は生地に添加することができることも、本発明の範囲内に含まれる。そのようなさらなる酵素としては、デンプン分解酵素、たとえばエンドアミラーゼ又はエキソアミラーゼ、プルラナーゼ、脱分枝酵素、ヘミセルラーゼ、たとえばキシラナーゼ、セルラーゼ、酸化還元酵素、たとえばグルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼ、たとえばマルトースを酸化するもの、たとえば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼ、及びアシルトランスフェラーゼ（たとえば、ＷＯ０４／０６４９８７で記載されているもの）が挙げられる。
【０１３５】
食品を製造する際に、本発明の脂肪分解酵素をアルファアミラーゼと組み合わせて用いることが特に好ましい。特に、アミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼ（non-maltogenic amylase）、たとえば非マルトース生成エキソアミラーゼ活性、特に、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）活性（ＷＯ０５／
００３３３９で開示されているとおり）を有するポリペプチドであってもよい。好適な非マルトース生成アミラーゼは、Powersoft（商標）（Danisco社（デンマーク）から入手可能）として市販されている。マルトース生成アミラーゼ、たとえばNovamyl（商標）（Novozymes社（デンマーク））も使用することができる。一実施形態では、アルファアミラーゼと本発明の脂肪分解酵素との併用は、生地、及び／又はベークド製品、たとえばパン、ケーキ、ドーナツ、ケーキドーナツ又はベーグルの製造において用いることができる。アルファアミラーゼと本発明の脂肪分解酵素との組み合わせは、小麦及び／又はトウモロコシトルティーヤなどのトルティーヤの製造法における使用にも好ましいと思われる。
【０１３６】
別の好適な実施形態では、本発明による脂肪分解酵素は、食品の製造においてキシラナーゼとともに用いることができる。GRINDAMYL（商標）及びPOWERBake 7000は、Danisco社から入手可能な市販のキシラナーゼ酵素の例である。キシラナーゼ酵素の他の例は、ＷＯ０３／０２０９２３及びＷＯ０１／４２４３３で見いだすことができる。
【０１３７】
好ましくは、本発明による脂肪分解酵素は、キシラナーゼ及びアルファアミラーゼと組み合わせて用いることができる。好適には、アルファアミラーゼは、マルトース生成、若しくは非マルトース生成アルファアミラーゼ（たとえば、GRINDAMYL（商標）若しくはPOWERSoft、Danisco社から市販）、又はそれらの組み合わせであってよい。
【０１３８】
本発明の脂肪分解酵素は、酸化酵素、たとえばマルトース酸化酵素（ＭＯＸ）、たとえば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）と組み合わせて用いることもできる。好適な方法は、ＷＯ０３／０９９０１６で記載されている。市販のマルトース酸化酵素GRINDAMYL（商標）及びSUREBakeは、Danisco社から入手可能である。
【０１３９】
場合によって、本発明による酵素と組み合わせたアルファ−アミラーゼ、たとえば非マルトース生成エキソアミラーゼ及び／又はマルトース生成アミラーゼ、及び／又はマルトース酸化酵素（ＭＯＸ）を、生地、ベークド製品、トルティーヤ、ケーキ、即席麺／揚げたスナック食物、又は乳製品、たとえばチーズの調製法において使用することができる。
【０１４０】
本発明による脂肪分解酵素は、典型的には、当該技術分野で公知の方法により、食料品又は他の組成物中に含められる。そのような方法には、脂肪分解酵素を食料品又は組成物に直接添加すること、脂肪分解酵素を安定剤及び／又は担体と組み合わせて添加すること、並びに脂肪分解酵素及び安定剤及び／又は担体を含む混合物を添加することが含まれる。
【０１４１】
本発明に関する使用に適した安定剤としては、これらに限定されるものではないが、無機塩（たとえば、NaCl、硫酸アンモニウム）、ソルビトール、乳化剤及び界面活性剤（たとえばTween20、Tween80、Panodan AB100（トリグリセリドを含まない）、ポリグリセロールエステル、ソルビタンモノオレエート）、油（たとえば、菜種油、ヒマワリ種子油及び大豆油）、ペクチン、トレハロース及びグリセロールが挙げられる。
【０１４２】
本発明に関する使用に適した担体としては、これらに限定されるものではないが、デンプン、粗挽き小麦粉、小麦粉、ＮａＣｌ及びクエン酸塩が挙げられる。
【０１４３】
さらに好ましい態様を、添付の請求の範囲並びに以下の説明及び実施例で記載する。
【０１４４】
［利点］
本発明の方法、本発明の核酸及び本発明のバリアントポリペプチドの１つの利点は、商業的な宿主種、たとえばトリコデルマ・リーゼイにおける核酸の発現が、野生型酵素（例えば、ＫＬＭ１；配列番号１のヌクレオチド配列によりコード）と比較して有意に改善されることである。これは、バリアントを作製するのにはるかに安価であるという利点を有する。生産量の増加は有意であり、ティー・リーゼイ（T.reesei）の野生型は非効率的に産生されるが、バリアントは典型的には改善された発現レベルを有する。典型的には、バリアントは、野生型酵素よりも約２〜約２５倍、好ましくは約６倍〜約２５倍高いレベルで発現される。
【０１４５】
本発明のバリアント酵素は、意外にも、焼成用途で用いられる場合、優れた機能を有することが判明した。本発明によるバリアント脂肪分解酵素の使用は、有利には、真菌由来の他の脂肪分解酵素、特に、LipopanF（商標）及び／又はフザリウム・ヘテロスポラム由来の野生型酵素（配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（好適には、３１〜３０４又は３１〜３０５）として示され、ＷＯ２００５／０８７９１８で教示されるアミノ酸配列を含む）と比較して、生地及び／又はベークド製品に対して有意に改善された特性をもたらす。
【０１４６】
本発明のバリアントポリペプチドの別の利点は、野生型酵素（例えば、ＫＬＭ１、配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（好適には、３１〜３０４又は３１〜３０５）として本明細書中で示されるアミノ酸配列を含む）と比較して改善されたそれらの活性及び／又は機能性である。これにより、酵素の「使用中のコスト」が減少するに至る可能性がある。たとえば、野生型酵素と比較して同じ結果／効果を達成するために、バリアントポリペプチドの必要な単位の割合は有意に減少するであろう。
【０１４７】
たとえば、バリアントポリペプチドは、野生型酵素（複数可）のレベルの約２５％〜７５％、好ましくは約２５％〜５０％、好ましくは約２５％で添加することができることが想定される。
【０１４８】
「修飾する」（又は「修飾」）という用語は、本明細書中で用いられる場合、置換すること若しくは挿入すること（又は置換若しくは挿入）を意味する。
【０１４９】
［技術的効果］
パン、蒸しパン及びアメリカパンブレッド（US white pan bread）などのベークド製品に関して、例えば、本発明の脂肪分解酵素を添加すると：改善されたパンの体積及び柔らかさ、延長された貯蔵寿命及び／又は老化防止効果、改善されたクラム構造、減少した孔不均一性、減少した平均孔サイズ、改善された風味及び／又は臭い、及び改善された皮の色の１又は２以上が起こり得る。
【０１５０】
有利には、本発明の酵素は、食料品、例えば生地及び／又はベークド製品において乳化剤の代わりに用いることができる。
【０１５１】
本発明による脂肪分解酵素は、ＤＡＴＥＭ、ＳＳＬ、ＣＳＬ、モノグリセリド、ポリソルベート及びTweenなどの乳化剤と相乗作用を有し得る。したがって、本発明による脂肪分解酵素は、１又は２以上の乳化剤と組み合わせて用いることができる。有利には、本発明による脂肪分解酵素を１又は２以上の乳化剤と組み合わせて使用すると、本発明による酵素を使用しない場合に必要な量と比べて、乳化剤の全体的な使用量が減少する可能性がある。
【０１５２】
本発明による脂肪分解酵素はまた、親水コロイド、グアー、キサンタン（xanthum）及びペクチンと、そしてヘキソースオキシダーゼなどのマルトース酸化酵素とも相乗作用を有し得る。
【０１５３】
ドーナツ、ケーキドーナツ、ベーグル、スナックケーキ及びマフィンに関して、例えば、本発明の脂肪分解酵素の使用は、１又は２以上のアルファ−アミラーゼ、マルトース生成アルファ−アミラーゼ及び非マルトース生成アルファ−アミラーゼと併用した場合、相乗効果が得られる可能性がある。
【０１５４】
ケーキ、スポンジケーキ及びパームケーキ（palm cake）に関して、例えば、本発明の脂肪分解酵素の使用は、１又は２以上の親水コロイド、例えばグアー、及び／又は１又は２以上の乳化剤、例えばＤＡＴＥＭと併用する場合、相乗効果が得られる可能性がある。
【０１５５】
ビスケットに関して、例えば、本発明による脂肪分解酵素の使用は、ロール適性及び取り扱い特性（特に冷たい場合（冷時ロール適性））の改善をもたらす。
【０１５６】
有利には、マヨネーズ及び他の卵ベースの製品では、例えば、本発明による脂肪分解酵素の使用は、テクスチャーの改善、平均粒子サイズの減少、及び／又は平均粒子分布の減少、熱安定性の改善、マイクロ波性能及び／又は安定性の改善をもたらす可能性がある。
【０１５７】
ケーキでは、本発明の使用は、有利には、柔らかさの改善、体積、保存特性（keeping properties）及び貯蔵寿命の改善をもたらす。
【０１５８】
麺又は麺製品、例えば即席麺に関して、例えば、本発明の脂肪分解酵素は以下の特性：色／黄色の度合いの改善、更に安定な色特性、輝度の低下、脂肪含有量の減少、テクスチャー及びバイト（bite）（かみ応え）の改善、水分活性の改善、切れの低減、芯の堅さの増大及び加工中の形状保持の改善、の１又は２以上をもたらし得る。
【０１５９】
好ましくは、本発明の脂肪分解酵素を用いて、麺又は麺製品、たとえば即席麺の脂肪含有量を減少させることができる。
【０１６０】
トルティーヤでは、例えば、本発明の酵素の使用は：例えば柔軟性を増大させることによるトルティーヤのロール適性の低下、老化防止特性の改善、柔らかさの改善及び／又は異臭の低減、の１又は２以上をもたらす可能性がある。
【０１６１】
有利には、改善されたロール適性及び／又は柔軟性は、トルティーヤを丸めた場合に割れる可能性の低減につながり得る。
【０１６２】
チーズ及び／又はチーズベースの製品では、例えば、本発明の酵素の使用は：風味、テクスチャー及び／又は安定性の改善、チーズにおける脂肪分離効果の減少及び／又はチーズ収量の増大、の１又は２以上をもたらす可能性がある。
【０１６３】
「脂肪分離効果」という用語は、本明細書中で用いられる場合、チーズが溶ける場合に放出される遊離油（free oil）を指す。
【０１６４】
本発明による脂肪分解酵素を用いて、低脂肪チーズを製造することができる。有利には、本発明の酵素は、乳中の脂肪の安定化及び／又は風味の増強が可能である。
【０１６５】
動物飼料では、例えば、本発明の酵素は、有利には：動物内での飼料利用／変換効率の向上、動物の体重増加の改善、飼料の消化率の改善、動物による、例えば飼料からの窒素取り込みの改善、飼料の乾燥物質の代謝率の改善及び飼料の食味の改善、の１又は２以上をもたらす可能性がある。
【０１６６】
［使用］
本発明による酵素は多くの用途がある。
【０１６７】
特に、本発明によるバリアントポリペプチドは、食料品の調製において有用であり得る。
【０１６８】
例えば、本発明によるバリアントポリペプチドは、卵又は卵ベースの製品の処理において特に有用であり得る。
【０１６９】
卵又は卵ベースの製品を本発明による真菌脂肪分解酵素で処理することにより、安定性、低温殺菌などの熱処理下での熱安定性を改善することができ、実質的に増粘をもたらす。卵ベースの製品としては、これらに限定されるものではないが、ケーキ、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム等を挙げることができる。
【０１７０】
本発明による真菌脂肪分解酵素は、パン、ケーキ、スイート生地製品、層状生地、液状衣用生地、マフィン、ドーナツ、ビスケット、クラッカー及びクッキーをはじめとする、生地から調製されるものなどのベークド製品の調製において特に有用である。
【０１７１】
本発明による真菌脂肪分解酵素は、パン改善添加剤、例えば生地組成物、生地添加剤、生地コンディショナー、プレミックス及びパン又は他のベークド製品の性質を改善するために、パン又は他のベークド製品を作製するプロセス中に小麦粉及び／又は生地に通常添加される類似の調製物において用いることもできる。
【０１７２】
したがって、本発明はさらに、本発明のバリアントポリペプチドを含むパン改善組成物及び／又は生地改善組成物；並びにそのようなパン改善及び／又は生地改善組成物を含む生地又はベークド製品に関する。
【０１７３】
パン改善組成物及び／又は生地改善組成物は、本発明による真菌脂肪分解酵素に加えて、生地及び／又はベークド製品の性質を改善するために焼成において通常用いられる他の物質を含んでもよい。
【０１７４】
パン改善組成物及び／又は生地改善組成物は、１又は２以上の通常の焼成剤（baking agent）、例えば以下の構成成分：粉乳、グルテン、乳化剤、顆粒化脂肪、酸化剤、アミノ酸、糖、塩、小麦粉又はデンプンの１又は２以上を含んでもよい。
【０１７５】
好適な乳化剤の例は：モノグリセリド、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、糖エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）及びレシチンである。
【０１７６】
パン及び／又は生地改善組成物はさらに、別の酵素、例えば１又は２以上の他の好適な食物等級の酵素、例えばデンプン分解酵素、例えばエンドアミラーゼ若しくはエキソアミラーゼ、プルラナーゼ、脱分枝酵素、ヘミセルラーゼ、例えばキシラナーゼ、セルラーゼ、酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼ、例えばマルトースを酸化するもの、たとえば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼ及びアシルトランスフェラーゼ（例えばＷＯ０４／０６４９８７で記載されているもの）を含んでもよい。
【０１７７】
「改善された特性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、本発明のバリアントポリペプチドの作用により改善される可能性がある任意の特性を意味する。特に、本発明によるバリアントポリペプチドを使用すると、以下の特性の１又は２以上が得られる：ベークド製品の体積の増大；ベークド製品のクラム構造の改善；ベークド製品における老化防止特性；生地の強度の増大、安定性の増大、粘着性の減少及び／又は機械処理適性の改善。
【０１７８】
改善された特性を、本発明によるバリアントポリペプチドを添加せずに調製した生地及び／又はベークド製品との比較によるか、又は野生型酵素（例えば、ＫＬＭ１；配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（好適には、３１〜３０４又は３１〜３０５）として本明細書中で示されるアミノ酸配列を含む）を添加して調製した生地及び／又はベークド製品との比較により評価する。
【０１７９】
「ベークド製品」という用語は、本明細書中で用いられる場合、生地から調製された製品を含む。本発明により有利に製造することができるベークド製品（ホワイト、ライト又はダークタイプにかかわらず）の例としては：典型的にはローフ又はロール又はトーストの形態のパン（白パン、全粒粉パン及びライ麦パンを含む）、フレンチバゲットタイプのパン、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クリスプブレッド（crisp bread）、パスタ、麺など、の１又は２以上が挙げられる。
【０１８０】
本発明による生地は、ふくらませた生地又はふくらませようとする生地であってよい。生地は、様々な方法で、例えば重炭酸ナトリウムなどを添加することによるか、又は好適な酵母培養菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）の培養菌を添加することによって、ふくらませることができる。
【０１８１】
本発明はさらに、パスタ生地、好ましくは、デューラム小麦粉又は同等の品質の小麦粉から調製されたパスタ生地を製造するための本発明による真菌脂肪分解酵素の使用に関する。
【０１８２】
本発明によるバリアントポリペプチドは、植物油又は食用油の酵素による脱ガムにおける使用に適している。食用油又は植物油の加工に際して、植物油又は食用油を本発明による真菌脂肪分解酵素で処理して、極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）の大部分を加水分解する。好ましくは、脂肪酸アシル基は極性脂質から加水分解される。脱ガムプロセスの結果、典型的には、極性脂質、例えば糖脂質及び／又はリン脂質の大部分（すなわち、５０％超）の加水分解により、食用油中の極性脂質、特にリン脂質の含有量が減少する。典型的には、加水分解された極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）を含む水性相を油から分離する。好適には、食用油又は植物油は当初（本発明による酵素での処理前）、５０〜２５０ｐｐｍのリン含有量を有する。
【０１８３】
更に、本発明は、チーズ製品を処理するための本発明によるバリアントポリペプチドの使用に関する。
【０１８４】
本発明によるバリアントポリペプチドは、動物飼料の調製における使用にも特に適している。
【０１８５】
当業者が認識しているように、「脱ガム」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ホスファチド（例えばレシチン、リン脂質及び吸蔵油（occluded oil））を水和性（hydratable）ホスファチドに変換することによって油を精製することを意味する。脱ガムされた油は、より流動性であり、したがって脱ガムされていない油よりも良好な取り扱い特性を有する。
【０１８６】
以下の表は、単に一般的指針としてであって、異なる用途で必要とされ得る本発明によるバリアントポリペプチドの添加量レベルの概要を提供する。この表は、例えば乳化剤と併用する場合の本発明による脂肪分解酵素の添加量レベルに関する指針を更に提供する。もちろん、当業者には明らかなように、酵素添加量、反応温度及び反応時間の最適化は、任意の所定の用途に関して、常用の実験を用いて容易に決定することができる。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
［グリコシル化］
１つのグリコシル化部位でさえも脂肪分解酵素（特に、天然にグリコシル化部位を含まないもの）、例えば本明細書中で教示される脂肪分解酵素（例えば、フザリウム・ヘテロスポラム酵素（本明細書中ではKLM1と表示する場合もある）及び／又はフザリウム・オキシスポラム脂肪分解酵素（本明細書中ではLipopan F（商標））と表示する場合もある）中に導入することにより、発現レベル及び／又は酵素の機能性及び／又は活性に対する結果が、野生型酵素と比較してはるかに改善される（特に、宿主細胞がトリコデルマ種、例えばティー・リーゼイである場合）ことが意外にも判明した。
【０１８９】
したがって、本発明は、脂肪分解酵素（特に、配列番号２のアミノ酸のアミノ酸４０〜２９０（好ましくは３５〜３００、さらに好ましくは３１〜３０５）を含むもの）又は脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、本明細書中で配列番号１として示されるヌクレオチド配列）を修飾して、配列中にアミノ酸を置換又は挿入して、付加されたグリコシル化部位を含むバリアントポリペプチドを作製することを提供する。特に、配列番号２として示される（ＫＬＭ１のプレプロ配列）又は成熟配列の配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（好適には、３１〜３０４若しくは３１〜３０５）を含む野生型酵素は、天然にはグリコシル化部位を含まない。好適には、少なくとも１つのグリコシル化部位（好適には、１又は２以上のグリコシル化部位）を導入する目的で、脂肪分解酵素を修飾して、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから選択される１又は２以上のアミノ酸を置換又は挿入する。
【０１９０】
特に、フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の野生型酵素（本明細書中ではＫＬＭ１として表示し、配列番号２として示されるプレプロ配列を有し、成熟配列は配列番号２のアミノ酸３３〜２９６（例えば、３１〜３０４又は３１〜３０５）を含む）はグリコシル化部位を有さない。少量の添加、すなわち、１つのグリコシル化部位の添加であっても、発現、機能性及び／又は活性に関してそのような重大な改善をもたらすことができることは、本発明者等にとっては意外であった。
【０１９１】
「グリコシル化部位」という用語は、本明細書中で用いられる場合、配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒを意味し、ここで、Ｘｘｘはプロリン以外のアミノ酸残基である。
【０１９２】
本明細書中でグリコシル化部位について言及する場合、潜在的なグリコシル化部位を意味する場合がある。換言すれば、本発明者等は、バリアント酵素中の適切なコンセンサス配列、すなわちＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、Ｘｘｘはプロリン以外のアミノ酸残基である）を提供し、コンセンサス配列を有するそのようなタンパク質が真菌宿主により分泌される場合、（タンパク質の三次構造がグリコシル化の有効性を調節する可能性があるが）アスパラギンのγ−アミドがグリコシル化される可能性が高い。
【０１９３】
グリコシル化は、遊離しているか、又はタンパク質及び脂質に結合しているかいずれでも、サッカリドと結合してグリカンを作製する酵素プロセスである。この酵素プロセスは、全細胞の４つの基本的成分のうちの１つを（核酸、タンパク質、及び脂質とともに）産生し、膜及び分泌されたタンパク質の構造及び機能を調節する同時翻訳及び翻訳後修飾メカニズムも提供する。粗面ＥＲ（rough ER）中で合成されるタンパク質の大部分は、グリコシル化を受ける。これは、糖化の非酵素化学反応と対照的に、酵素に誘導された部位特異的プロセスである。グリコシル化はまた、細胞質及び核においてＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾として存在する。６種類のグリカン：アスパラギン側鎖のアミド窒素に結合したＮ連結グリカン、セリン及びトレオニン側鎖のヒドロキシ酸素に結合したＯ連結グリカン；セリンのヒドロキシ酸素に結合したグリコサミノグリカン；グリカンがセラミドに結合した糖脂質、タンパク質にも脂質にも結合しないヒアルロナン、及びグリカン結合によりタンパク質を脂質に連結させるＧＰＩアンカーが産生される。
【０１９４】
本発明では、グリコシル化について言及する場合、Ｎ連結グリコシル化のみをさす。換言すれば、本発明は、Ｏ連結グリコシル化に関することを意図しない。
【０１９５】
Ｎ連結オリゴ糖に関して、１４−糖前駆体をまず、標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギンに添加する。この前駆体の構造は、ほとんどの真核細胞に共通であり、３つのグルコース、９つのマンノース、及び２つのＮ−アセチルグルコサミン分子を含む。反応の複合セットは、この分枝鎖をドリコールとよばれる担体分子と結合させ、次いでＥＲ内腔中に移行する際に、ポリペプチド鎖上の適切な位置に移す。
【０１９６】
Ｎ連結サッカリドには３つの主な種類：高マンノースオリゴ糖、複合オリゴ糖及びハイブリッドオリゴ糖がある。
【０１９７】
高マンノースは、本質的に、多数の（多くの場合、タンパク質に結合する前の前駆体オリゴ糖で見られるのと同じくらい多数の）マンノース残基を有するちょうど２つのＮ−アセチルグルコサミンである。
【０１９８】
複合オリゴ糖は、もとの２つのＮ−アセチルグルコサミンよりも多いものを含む、ほとんど任意の数の他の種類のサッカリドを含み得るので、このように命名される。
【０１９９】
タンパク質は、タンパク質の異なる部分上の両種類のオリゴによりグリコシル化することができる。オリゴ糖が高マンノースであるか、又は複合であるかは、ゴルジ中のサッカリド修飾タンパク質へのアクセス可能性に依存すると考えられる。サッカリドが比較的アクセス不可能であるならば、もとの高マンノース形態でとどまる可能性が高いであろう。アクセス可能であるならば、マンノース残基の多くは切断され、サッカリドは前述の他の種類の基の添加によって更に修飾される。
【０２００】
オリゴ糖鎖を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより、トリペプチドコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）中に存在するアスパラギンに結合させる。この配列は、グリコシル化シークオン（sequon）としても知られる。結合後、タンパク質が正しく折り畳まれたら、３つのグルコース残基を鎖から除去し、タンパク質はＥＲからの排出に利用可能である。このようにして形成された糖タンパク質を次いでゴルジに移し、ここでさらなるマンノース残基の除去が起こり得る。
【０２０１】
本発明では、脂肪分解（骨格）酵素、例えばＫＬＭ１若しくはLipopan Fなどの野生型
酵素又はこれをコードするヌクレオチド配列を修飾して、１又は２以上のアミノ酸を置換又は挿入し、形成されるバリアントポリペプチドが少なくとも１つのグリコシル化部位（又は骨格酵素と比較して少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位）を含むようにすることについて議論する場合、１又は２以上のコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）が導入されるような、骨格酵素中のアミノ酸の置換又は骨格中への１又は２以上のアミノ酸の挿入を意味する。
【０２０２】
一実施形態では、好適には、修飾は、骨格配列中の１つのアミノ酸の置換又は導入であり得る。たとえば、骨格配列は以下のもの：Ｙｙｙ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＹｙｙ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｚｚｚ（ここで、ＸｘｘはＰｒｏではなく、ＹｙｙはＡｓｎではなく、ＺｚｚはＳｅｒ又はＴｈｒでない）を含み得、単に、アミノ酸ＹｙｙのＡｓｎでの置換、及びＺｚｚのＳｅｒ若しくはＴｈｒのいずれかでの置換、或いはＹｙｙ後へのＡｓｎの挿入又はＺｚｚ前へのＳｅｒ若しくはＴｈｒの挿入を必要とする可能性がある。
【０２０３】
或いは、骨格中の２又は３個のアミノ酸を変えて、１つのグリコシル化コンセンサス配列を生成させることができる。例えば、骨格を修飾して、３個のアミノ酸をＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）で置換するか又は挿入することができる。
【０２０４】
好適には、１より多いグリコシル化部位（潜在的なグリコシル化部位）を骨格配列中に挿入して、バリアントポリペプチドが１より多いグリコシル化部位（骨格配列と比較して１より多いさらなるグリコシル化部位）を含むようにすることができる。明らかに、バリアントポリペプチド中のグリコシル化部位（又は潜在的なグリコシル化部位）の総数は、骨格酵素中のグリコシル化部位の数、そして付加されたグリコシル化部位の数に依存するであろう。誤解を避けるために、野生型ＫＬＭ１酵素（配列番号２で示される）は、グリコシル化部位を含まず、したがってバリアントポリペプチド中のグリコシル化部位の数は、付加されるグリコシル化部位の数によって決定される。
【０２０５】
［Ｃ末端の安定化］
好適には、本発明によるバリアントポリペプチドは、好ましくはポリペプチドをさらに安定にするためのＣ末端プロセッシングを含み得る。好適には、Ｃ末端プロセッシングは、Ｃ末端ＫＥＸ２部位の除去を含み得る。理論によって拘束されることを望まないが、ＫＥＸ２部位の除去により、タンパク質分解プロセッシングが中断又は減速し、その活性が損なわれることなく酵素の安定性が改善されると考えられる。１つのＫＥＸ２部位を位置３０６（配列番号２とアラインさせた場合）で見出すことができる。別のＫＥＸ２部位を位置３１１〜３１２（配列番号２とアラインさせた場合）で見出すことができる。
【０２０６】
好適には、ポリペプチドのＣ末端はアミノ酸位置３０６以降で開始する。
【０２０７】
［活性部位に対して遠位の外部ループ］
本出願では、アミノ酸修飾（例えば、置換及び／又は挿入）は、親水性アミノ酸を導入するか又は１又は２以上のグリコシル化部位を導入するかのいずれかのために、ポリペプチドの活性部位に対して遠位の外部ループ中に位置するポリペプチドの表面アミノ酸に対してなされることが教示されている。
【０２０８】
修飾の部位を選択する場合、好ましくは、部位はａ）表面位置、ｂ）非保存的アミノ酸、及びｃ）活性部位（触媒トリアッド）又は活性部位リッド（lid）のすぐ近くでない位置である。
【０２０９】
「外部ループ」という用語は、タンパク質の三次構造において、ループ中のタンパク質の外表面上に露出しているアミノ酸の部分を意味する。外部ループは酵素の触媒トリアッド又はリッド領域の形成に関与しない。
【０２１０】
「活性部位」という用語は、本明細書中で用いられる場合、触媒トリアッドという用語と同義である。誤解を避けるために、本明細書中で教示される脂肪分解酵素中の触媒トリアッドは、複数の位置にある。ＫＬＭ１酵素の触媒トリアッドは、Ｓ１７４、Ｄ２２８及びＨ２８７から形成される。
【０２１１】
好ましくは、外部ループは、Ｓｅｒｌ７４のα−炭素から約１５A超、好ましくは約１
６Å超、例えば約１７Å超、約１８Å超、約１９Å超、好ましくは約２０Å超である。誤解を避けるために、触媒トリアッド及び酵素のリッド領域はどちらもＳｅｒｌ７４のα−炭素から１５Å未満である。
【０２１２】
一実施形態では、ポリペプチドの活性部位に対して遠位の外部ループは、以下のアミノ酸領域（アミノ酸位置は配列番号２で示されるナンバリングにしたがう−すなわち、脂肪分解酵素を本明細書中で示される配列番号２とアラインさせることによって得られる）：５４〜６６、７５〜７９、９９〜１０３、１２７〜１３５、１６２〜１６７、１８８〜１９５及び２１３〜２２１の１又は２以上に対応する。
【０２１３】
「活性部位に対して遠位の」という用語は、タンパク質の活性部位から遠いか又はある距離を置いていることを意味する。好ましくは、外部ループは、Ser１７４のα−炭素から少なくとも約１５Å、好ましくは約１６Å超、例えば約１７Å超、約１８Å超、約１９Å超、好ましくは約２０Å超である。
【０２１４】
［親水性アミノ酸］
側鎖の極性に応じて、アミノ酸はそれらの親水性又は疎水性特性が異なる。他のアミノ酸よりも親水性が高いアミノ酸を選択することは、当業者には慣例である。いずれにしても、下記表に指針を提示する：
【０２１５】
【表３】
2015133976.tif 000005
【０２１６】
［脂肪分解酵素］
好ましくは、本発明による脂肪分解酵素又はバリアント脂肪分解酵素は、極性脂質中のエステル結合に対する加水分解活性を有する。
【０２１７】
好ましくは、本発明による脂肪分解酵素又はバリアント脂肪分解酵素は、極性脂質（例えば、糖脂質及び／又はリン脂質）を加水分解する。換言すれば、本発明によるバリアント脂肪分解酵素は、好ましくはホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）活性）及び／又はガラクトリパーゼ若しくはグリコリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性を有する。本発明によるバリアント脂肪分解酵素は、トリグリセリドをさらに加水分解し得る。換言すれば、本発明によるバリアント脂肪分解酵素は、トリグリセリドリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）をさらに有し得る。
【０２１８】
「グリコリパーゼ活性」という用語は本明細書中で用いられる場合、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。糖脂質及びガラクト脂質という用語は、本明細書中では交換可能に用いることができ、ＤＧＤＧ及びＭＧＤＧの加水分解を含み、これらは加水分解されて、それぞれＤＧＭＧ又はＭＧＭＧになる。
【０２１９】
「極性脂質」という用語は、本明細書中で用いられる場合、リン脂質及び／又は糖脂質を意味する。好ましくは、「極性脂質」という用語は、本明細書中で用いられる場合、リン脂質及び糖脂質の両方を意味する。
【０２２０】
好適には、本発明によるバリアントポリペプチドは、ホスホリパーゼ活性（例えば、ホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）活性）及び／又はガラクトリパーゼ若しくはグリコリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性を有し得る。
【０２２１】
酵素のグリコリパーゼ活性、ホスホリパーゼ活性及びトリアシルグリセリドリパーゼ活性は、本明細書で前述のアッセイを用いて測定することができる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明による修飾の前に脂肪分解酵素はグリコシル化部位を含まない。
【０２２３】
一実施形態では、本発明による修飾前の脂肪分解酵素（すなわち、真菌脂肪分解酵素）は、アルファ／ベータヒドロラーゼのファミリー２３、さらに詳細にはサブファミリー２３．０１に属するものである（シュツットガルト大学から得られるリパーゼエンジニアリングデータベースによる分類−http://www.led.uni-stuttgart.de/を参照）。このデータベースは、同じａ／ｂヒドロラーゼフォールドを共有する関連したタンパク質の配列及び構造に関する情報を集積する。
【０２２４】
［単離された］
一態様では、好ましくは、配列は単離された形態である。「単離された」という用語は、当該配列が、天然に関連し、天然で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０２２５】
一実施形態では、本発明のポリペプチド及び／又はヌクレオチド配列は単離されている。
【０２２６】
［精製された］
一態様では、好ましくは、配列は精製された形態である。「精製された」という用語は、比較的純粋な状態であること、例えば少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度又は少なくとも約９８％の純度であることを意味する。
【０２２７】
一実施形態では、本発明のポリペプチド及び／又はヌクレオチド配列は精製されている。
【０２２８】
［ヌクレオチド配列］
本発明の範囲は、本明細書中で定義されるような特定の性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２２９】
「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中で用いられる場合、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにそのバリアント、相同体、断片及び誘導体（例えば、その部分）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換え起源であり得、センス又はアンチセンス鎖であるかどうかによらず、二本鎖又は一本鎖であり得る。
【０２３０】
本発明に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくは、ＤＮＡ、さらに好ましくは本発明をコードするｃＤＮＡ配列を意味する。
【０２３１】
好ましい実施形態では、本発明の範囲自体に関連する場合、及び本発明の範囲自体により含まれる場合のヌクレオチド配列は、その自然の環境中にある場合、及びこれもまたその自然の環境中にあるその自然に関連する配列（複数可）と結合する場合の本発明による天然のヌクレオチド配列を含まない。参照しやすいように、本発明者等は、この好適な実施形態を「非天然のヌクレオチド配列」と呼ぶ。この点に関して、「天然のヌクレオチド配列」という用語は、その天然の環境中にあり、自然に関連する全プロモータと機能的に連結する場合の全ヌクレオチド配列を意味し、このプロモータもその天然の環境にある。しかし、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列を、その天然の生物におけるヌクレオチド配列の発現後に単離及び／又は精製することができる。しかし、好ましくは、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列を、その天然の生物においてヌクレオチド配列により発現することができるが、この場合、ヌクレオチド配列は、その生物に自然に関連するプロモータの制御下にない。
【０２３２】
［ヌクレオチド配列の調製］
典型的には、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、全体又は一部において、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて合成することができる（Caruthers MH et al.,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照）。
【０２３３】
本明細書中で定義される特定の性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列は、前記酵素を産生する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製することができる。ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製については様々な方法が当該技術範囲内で周知である。一例として、好適な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されたら、より多くの配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術を用いることができる。
【０２３４】
更なる例として、当該酵素を産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを構築することができる。酵素のアミノ酸配列又は酵素のアミノ酸配列の一部が既知である場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成することができ、生物から調製されたゲノムライブラリーから酵素コードクローンを同定するために用いることができる。或いは、別の既知酵素遺伝子に対して相同性の標識されたオリゴヌクレオチドプローブ含有配列を用いて、酵素コードクローンを同定することができる。後者の場合、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用する。
【０２３５】
或いは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミドなどの発現ベクター中に挿入し、酵素−陰性菌を結果として得られるゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、次いで形質転換菌を、酵素の基質（例えば、グルコシダーゼ（マルターゼ）産生酵素についてマルトース）を含む寒天プレート上に蒔き、それによりクローンに同定しようとする酵素を発現させることによって、酵素をコードするクローンを同定することができる。
【０２３６】
更に別の選択肢において、酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法、例えばBeucage S. L. et al, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869により
記載されているホスホルアミダイト法、又はMatthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801-805により記載されている方法により、合成的に調製することができる。ホスホルアミダイト法では、オリゴヌクレオチドを、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲートし、そして適切なベクター中にクローニングする。
【０２３７】
ヌクレオチド配列は、標準的技術にしたがって合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源（必要に応じて）の断片をライゲートすることによって調製される、混合ゲノム及び合成起源、混合合成及びｃＤＮＡ起源、又は混合ゲノム及びｃＤＮＡ起源のものであってよい。それぞれのライゲートされた断片は、全ヌクレオチド配列の様々な対に対応する。ＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４，６８３，２０２又はSaiki R K et al.,(Science(1988)239, pp 487-491）で記載されているようにして、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【０２３８】
遺伝子コードにおける縮重のために、もとのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の一部又は全部について、トリプレットコドン使用が変更され、それにより、もとのヌクレオチド配列との相同性は低いが、もとのヌクレオチド配列によりコードされるのと同じアミノ酸配列又はバリアントアミノ酸配列を産生するヌクレオチド配列を容易に作製することができる。例えば、大部分のアミノ酸について、遺伝子コードの縮重は、トリプレットコドンの第３位（ゆらぎ（wobble）位置）（参考のために、Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7を参照）にあり、したがって、第３位のすべてのトリプレットコドンが「ゆらいだ」ヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列と約６６％同一である。しかし、改変されたヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列と同じ第１アミノ酸配列又はバリアント第１アミノ酸配列をコードするであろう。
【０２３９】
したがって、本発明はさらに、トリプレットコドンをコードするが、もとのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと同じポリペプチド配列又はバリアントポリペプチド配列をコードする少なくとも１つのアミノ酸についての別のトリプレットコドン用法を有する任意のヌクレオチド配列に関する。
【０２４０】
更に、特定の生物は、典型的には、アミノ酸をコードするためにどのトリプレットコドンが使用されるかについての傾向を有する。好ましいコドン使用表は広く入手可能であり、コドン最適化遺伝子を調製するために使用することができる。そのようなコドン最適化技術は、異種宿主における導入遺伝子の発現を最適化するために慣例的に用いられる。
【０２４１】
［アミノ酸配列］
本発明の範囲は、本明細書中で定義される特定の性質を有する酵素のアミノ酸配列も包含する。
【０２４２】
本明細書中で用いられる場合、「アミノ酸配列」という用語は「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの場合では、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの場合では、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。
【０２４３】
アミノ酸配列は好適な供給源から調製／単離することができ、合成的に作製することができるか、又は組換えＤＮＡ技術の使用により調製することができる。
【０２４４】
本発明に含まれる酵素は、他の酵素とともに使用することができる。したがって、本発明は、酵素の組み合わせも対象とし、ここで、この組み合わせは、本発明の酵素と、本発明による別の酵素であり得る別の酵素とを含む。
【０２４５】
好ましくは、アミノ酸配列は、本発明の本質的な範囲に関連するか又は含まれる場合、天然の酵素でない。この点に関して、「天然の酵素」という用語は、その天然の環境中にある全酵素であって、その天然のヌクレオチド配列によって発現された場合を意味する。
【０２４６】
［配列同一性又は配列相同性］
ここでは、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有するものを意味する。ここでは、「相同性」という用語は、「同一性」と同等に考えることができる。
【０２４７】
相同性アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能的活性を保持及び／又は酵素の活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコードするはずである。
【０２４８】
本発明に関連して、相同性配列は、対象配列と少なくとも７５、８５又は９０％同一であり得、好ましくは少なくとも９５、９８％又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を包含すると考えられる。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して検討することもできるが、本発明に関連して、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
【０２４９】
本発明に関連して、相同性配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８５又は９０％同一であり得、好ましくは少なくとも９５、９８％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと考えられる。典型的には、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して検討することができるが、本発明に関連して相同性を配列同一性に関して表すことが好ましい。
【０２５０】
相同性比較は、目視により、又はさらに一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列間の相同性（％）を計算することができる。
【０２５１】
相同性（％）は、隣接する配列、すなわち、他の配列とアラインさせた１つの配列にわたって計算することができ、１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、１つの残基を一度に、直接比較する。これは、「アンギャップト（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップトアラインメントは、比較的短い残基にわたってのみ実施される。
【０２５２】
これは、非常に簡単で一貫した方法であるが、例えば、それ以外では同じである配列対において、１つの挿入又は欠失のために、後続アミノ酸残基がアラインメントから外され、従って全体的なアラインメントを実施する場合に相同性（％）が大きく減少する可能性があることを考慮していない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して不当にペナルティーを与えることなく、可能な挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントを与えるように設計される。このことは、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入して、局所的相同性を最大限にすることを試みることによって達成される。
【０２５３】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントにおいて存在する各ギャップに、「ギャップペナルティー」を割り当て、同じ数の同一アミノ酸に関して、できるだけ少ないギャップを有する配列アラインメント（２つの比較される配列間のより高度な相関性を反映する）は、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するであろう。ギャップの存在については比較的高いコストを課し、ギャップ中のその各後続残基についてはより小さなペナルティーを課す、「アフィンギャップコスト」が、典型的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップ評価法である。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生じる。ほとんどの配列プログラムは、ギャップペナルティーを修正することが可能である。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【０２５４】
したがって、最大相同性（％）の算出には、ギャップペナルティーを考慮して、最適アラインメントの生成がまず必要である。そのようなアラインメントを実施するために適したコンピュータプログラムは、Vector NTI Advance（商標）11 (Invitrogen社)である。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例としては、これらに限定されるものではないが、BLASTパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed -Chapter 18を参照）、及びFASTA（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）が挙げられる。BLASTとFASTAとは、どちらもオフラインとオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60を参照）。しかし、いくつかの用途については、Vector NTI Advance（商標）11プログラムを使用するのが好ましい。BLAST 2 Sequencesと呼ばれる新規手段も、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；及びFEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8を参照）。
【０２５５】
最終相同性（％）を同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングの対比較に基づかない。そうではなく、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、基準化された（scaled）類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス（プログラムのBLASTスイート用デフォルトマトリックス）である。Vector NTIプログラムは周知のデフォルト値又は提供される場合はカスタムシンボル比較表（詳しくはユーザーマニュアルを参照）を一般に使用する。いくつかの用途に関して、Vector NTI Advance（商標）11パッケージのデフォルト値を使用するのが好ましい。
【０２５６】
或いは、相同性のパーセンテージは、CLUSTALと同様にして、アルゴリズムに基づき、Vector NTI Advance（商標）11（Invitrogen社）で複数のアラインメント機能を用いて計算することができる（Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244）。
【０２５７】
ソフトウェアにより最適アラインメントが得られたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果をもたらす。
【０２５８】
配列同一性を決定する場合、ギャップペナルティーを用いるならば、好ましくは、プログラムのデフォルトパラメータがペアワイズアラインメントに用いられる。例えば、以下のパラメータがBLAST2のペアワイズアラインメントの現行のデフォルトパラメータである：
【０２５９】
【表４】
2015133976.tif 000006
【０２６０】
一実施形態では、好ましくは、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ２（blastn）と前記定義のスコアリングパラメータを用いて決定することができる。
【０２６１】
本発明の目的に関して、同一性の程度は、同じである配列エレメントの数に基づく。アミノ酸配列についての本発明による同一性の程度は、好適には、Vector NTI Advance（商標）11（Invitrogen社）などの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。ペアワイズアラインメントに関して、使用されるスコアリングパラメータは、好ましくはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ存在ペナルティー（Gap existence penalty)は１１、ギャップ伸長ペナルティー(Gap extension penalty)は１である。
【０２６２】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度を、少なくとも２０の隣接するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０の隣接するヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０の隣接するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０の隣接するヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０の隣接するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００隣接するヌクレオチドにわたって決定する。
【０２６３】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度を、全配列にわたって決定することができる。
【０２６４】
配列は、サイレント変化をもたらし、その結果、機能的に等価な物質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有する可能性がある。物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、マイナスに荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；プラスに荷電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ；そして類似した親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【０２６５】
たとえば、下表にしたがって、保存的置換を行うことができる。第二列の同じブロック中のアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置き換えることができる：
【０２６６】
【表５】
2015133976.tif 000007
【０２６７】
本発明は、起こり得る相同性置換（置換（substitution)及び置き換え（replacement）はどちらも、本明細書中では、存在するアミノ酸残基を、別の残基と交換することを意味するために用いられる）、すなわち、塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性などの同種置換も包含する。非相同性置換、すなわち１つのクラスの残基から別のものへ、或いはオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然のアミノ酸を含むものに関する置換も起こり得る。
【０２６８】
置き換えは、非天然のアミノ酸により行うこともできる。
【０２６９】
バリアントアミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入することができる好適なスペーサー基を含み得る。さらなる変化形は、ペプトイド形態での１又は２以上のアミノ酸の存在を含み、当業者にはよく理解されるであろう。誤解を避けるために、α−炭素置換基が、α−炭素ではなく、残基の窒素原子上にある、バリアントアミノ酸残基を表すために、「ペプトイド形態」が用いられる。ペプトイド形態でペプチドを調製するためのプロセスは、当該技術分野で公知である（たとえば、Simon RJ et al., PNAS(1992)89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995)13(4), 132-134）。
【０２７０】
本発明で用いられるか、又は本明細書中で定義される特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は修飾ヌクレオチドをそれらの中に含み得る。オリゴヌクレオチドに対する様々な種類の修飾が当該技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格及び／又は分子の３’及び／又は５’末端でのアクリジ鎖若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明のために、本明細書中で記載されるヌクレオチド配列は、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾することができると理解される。ヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増大させるために、そのような修飾を実施することができる。
【０２７１】
本発明は、本明細書中で検討される配列、又はそれらの任意の誘導体、断片若しくは誘導体に対して相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に対して相補的であるならば、その配列をプローブとして用いて、他の生物などにおける類似したコーディング配列を同定することができる。
【０２７２】
本発明の配列と１００％相同性でないが、本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチドを、多くの方法で得ることができる。本明細書中で記載される配列の他のバリアントは、たとえば、ある範囲の個体、例えば異なる集団からの個体から作製されるＤＮＡライブラリーをプローブすることによって、得ることができる。加えて、他のウイルス／細菌相同体、又は細胞相同体、特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）で見られる細胞相同体を得ることができ、そのような相同体及びそれらの断片は、一般的に、本明細書中の配列リストに示される配列に選択的にハイブリダイズすることができるであろう。そのような配列は、他の動物種から作製されるｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリーをプローブし、そしてそのようなライブラリーを、添付した配列リスト中の配列のいずれか１つの全部若しくは一部を含むプローブを用いて、中〜高ストリンジェンシー条件下でプローブすることによって得ることができる。同様の考えは、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子バリアントを得る際にも当てはまる。
【０２７３】
バリアント及び株／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードするバリアント及び相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する変性ＰＣＲ（degenerate PCR）を用いて得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかのバリアント／相同体からアミノ酸配列をアラインさせることによって、予想することができる。配列アラインメントは、当該技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて実施することができる。たとえば、GCG Wisconsin PileUpプログラムが広く用いられている。
【０２７４】
変性ＰＣＲで使用されるプライマーは、１又は２以上の変性位置を含み、既知配列に対して１つの配列プライマーを用いて配列をクローニングするために用いられるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【０２７５】
或いは、そのようなポリヌクレオチドは、特性化された配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてのコドン優先性を最適化するために、サイレントコドン配列変化が必要な場合に有用であり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、又はポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を改変するために、他の配列変化が望ましい場合がある。
【０２７６】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を用いて、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー、例えば放射性若しくは非放射性標識を用いた通常の手段によって啓示的（revealing）標識で標識されたプローブを作製することができるか、或いはポリヌクレオチドをベクター中にクローニングすることができる。そのようなプライマー、プローブ及び他の断片は、長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、たとえば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであり、本明細書中で用いられる場合、本発明のポリヌクレオチドという用語に含まれる。
【０２７７】
ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチド及び本発明によるプローブは、組換え的に、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段により作製することができる。それらは、標準的技術によってクローニングすることもできる。
【０２７８】
一般的に、プライマーは、所望の核酸配列の段階的製造（一度に１つのヌクレオチド）を含む合成手段によって産生される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当該技術分野で容易に利用可能である。
【０２７９】
更に長いポリヌクレオチドは、組換え手段を用いて、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて産生される。これは、クローニングするのが望ましい脂質ターゲティング配列の領域に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、プライマーを動物若しくはヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）増幅された断片を単離し、そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なクローニングベクター中にクローニングすることができるように、好適な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０２８０】
［ハイブリダイゼーション］
本発明は、本発明の配列に対して相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列のいずれかにハイブリダイズすることができる配列の使用も包含する。
【０２８１】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書中で用いられる場合、「核酸のストランドが、塩基対合により相補ストランドと結合するプロセス」並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施される増幅のプロセスを包含する。
【０２８２】
本発明はまた、本明細書中で検討される対象配列、又はそれらの任意の誘導体、断片若しくは誘導体に対して相補性である配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０２８３】
本発明はまた、本明細書中で検討されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に対して相補性である配列も包含する。
【０２８４】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmelにより教示されるように、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）、以下で説明するような所定の「ストリンジェンシー」を付与する。
【０２８５】
最高ストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのTmより５℃低い）で起こり；高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃〜１０℃低い温度で起こり；中ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で起こり；そして低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で起こる。当業者らには理解されるように、最高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて、同一ヌクレオチド配列を同定することができ、一方、中（又は低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて、類似若しくは関連するポリヌクレオチド配列を同定することができる。
【０２８６】
好ましくは、本発明は、高ストリンジェンシー条件又は中ストリンジェンシー条件下で、本明細書で定義されるような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に対して相補性である配列の使用を包含する。
【０２８７】
更に好ましくは、本発明は、高ストリンジェンシー条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ７．０｝）下で、本明細書中で定義される特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に対して相補性である配列の使用を包含する。
【０２８８】
本発明は、本明細書中で検討されるヌクレオチド配列（本明細書中で検討されるものの相補的配列を包含する）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用にも関する。
【０２８９】
本発明は、本明細書中で検討されるヌクレオチド配列（本明細書中で検討されるものの相補的配列を包含する）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用にも関する。
【０２９０】
中〜最高ストリンジェンシー条件下で本明細書において検討されるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列の使用も本発明の範囲内に含まれる。
【０２９１】
好適な態様では、本発明は、本明細書中で検討されるヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ）下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用を対象とする。
【０２９２】
さらに好適な態様では、本発明は、本明細書中で検討されるヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列に、高ストリンジェンシー条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）下で、ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用を対象とする。
【０２９３】
［生物学的に活性な］
好ましくは、バリアント配列等は、本明細書中で提示される配列と、少なくとも同程度に生物学的に活性である。
【０２９４】
本明細書中で用いられる場合、「生物学的に活性な」とは、天然に存在する配列に類似した構造的機能（しかし同程度までの必要はない）、及び／又は類似した調節機能（しかし同程度までの必要はない）、及び／又は類似した生化学的機能（しかし同程度までの必要はない）を有する配列を指す。
【０２９５】
［組換え］
一態様では、本発明で使用される配列は、組換え配列、すなわち組換えＤＮＡ技術を用いて調製された配列である。
【０２９６】
これらの組換えＤＮＡ技術は当業者の能力範囲内である。そのような技術は、文献で説明されている（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press）。
【０２９７】
［合成的］
一態様では、本発明で使用される配列は、合成配列、すなわちインビトロで化学的に又は酵素的合成により調製された配列である。これらに限定されるものではないが、メチロトローフ酵母ピキア属（Pichia）及びハンセヌラ属（Hansenula）などの宿主生物に最適のコドン使用で作製される配列が含まれる。
【０２９８】
［酵素の発現］
本発明で用いられるヌクレオチド配列は、組換え複製可能なベクター中に組み入れることができる。このベクターを用いて、ヌクレオチド配列を、適合する宿主細胞中及び／又は適合する宿主細胞から、酵素形態で複製及び発現することができる。
【０２９９】
発現は、制御配列、例えば調節配列を用いて制御することができる。
【０３００】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞により産生される酵素は、使用される配列及び／又はベクターに応じて、分泌され得るか、又は細胞内に含まれ得る。コーディング配列は、特定の原核又は真核細胞膜を通って物質コーディング配列の分泌を行うシグナル配列を用いて設計することができる。
【０３０１】
［発現ベクター］
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロで発現が可能な構築物を意味する。
【０３０２】
好ましくは、発現ベクターは、好適な宿主生物のゲノム中に組み込まれる。「組み込まれる」という用語は、好ましくは、ゲノム中への安定な組込みを対象とする。
【０３０３】
本発明のヌクレオチド配列は、ベクター中で存在してもよく、このベクター中で、ヌクレオチド配列は、好適な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現ができる調節配列と機能的に連結される。
【０３０４】
本発明で使用されるベクターは、以下で記載されるように好適な宿主細胞に形質転換して、本発明のポリペプチドの発現をもたらすことができる。
【０３０５】
ベクター、例えばプラスミド、コスミッド、又はファージベクターの選択は、多くの場合、導入される宿主細胞に依存するであろう。
【０３０６】
本発明用のベクターは、抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与える遺伝子などの１又は２以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。別法として、選択は、同時形質転換によって達成することができる（ＷＯ９１／１７２４３で記載されているとおり）。
【０３０７】
ベクターを、たとえばＲＮＡの産生のためにインビトロで用いることができるか、又は宿主細胞をトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染するために用いることができる。
【０３０８】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクター中に導入し、ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることにより、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０３０９】
ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の複製の起源である。
【０３１０】
一実施形態では、pTrex3発現ベクターを実施例において記載されるように使用することができる。
【０３１１】
［調節配列］
いくつかの用途で、本発明で用いられるヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞によるなど、ヌクレオチド配列の発現ができる調節配列と機能的に連結される。一例として、本発明は、そのような調節配列に機能的に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象とする。すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【０３１２】
「機能的に連結した」という用語は、記載された成分が意図される方法で機能することを可能にするような関係にある近位を指す。コーディング配列に「機能的に連結した」調節配列を、コーディング配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートする。
【０３１３】
「調節配列」という用語は、プロモーター及びエンハンサー及び他の発現調節シグナルを包含する。
【０３１４】
「プロモーター」という用語は、当該技術分野の通常の意味で用いられ、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０３１５】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の増強された発現は、異種調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダー及びターミネーター領域の選択によって達成することもできる。
【０３１６】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモータと機能的に連結される。
【０３１７】
細菌、真菌の又は酵母宿主中のヌクレオチド配列の転写を行うために適したプロモーターの例は、当該技術分野で周知である。
【０３１８】
［構築物］
「構築物」という用語（「接合体」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義である）には、プロモーターに直接的又は間接的に結合した、本発明による使用のためのヌクレオチドが含まれる。
【０３１９】
間接的結合の一例は、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの好適なスペーサー基を、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との中間に提供することである。直接的又は間接的結合を包含する、本発明に関連した「融合した」という用語についても同じことが当てはまる。場合によっては、この用語は、通常、野生型遺伝子プロモーターと関連し、両方がそれらの天然の環境にある場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを対象としない。
【０３２０】
構築物は、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含むか又は発現する可能性さえある。
【０３２１】
いくつかの用途に関して、好ましくは、本発明の構築物は、少なくともプロモーターに機能的に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む。
【０３２２】
［宿主細胞］
「宿主細胞」という用語は、本発明に関連して、前述のヌクレオチド配列又は発現ベクターのいずれかを含み、本明細書中で定義されるような特定の性質を有する酵素の組換え産生において用いられる任意の細胞を含む。
【０３２３】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明の酵素を発現するヌクレオチド配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターと適合性であるように選択され、たとえば、原核（たとえば、細菌）、真菌、酵母又は植物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞でない。
【０３２４】
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌種である。
【０３２５】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現されたタンパク質のさらなるプロセッシングの望ましさに応じて、酵母又は他の真菌などの真核生物宿主が好ましい可能性がある。しかし、いくつかのタンパク質は、酵母細胞から十分に分泌されないか、又は数例では適切に処理（例えば、酵母における超グリコシル化）されないかのいずれかである。これらの場合、異なる真菌宿主生物を選択しなければならない。
【０３２６】
好適な宿主細胞（例えば、酵母、真菌及び植物宿主細胞）の使用により、本発明の組換え発現産物に関して最適の生物学的活性を付与する必要があり得る場合、翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、ラピデーション及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）ができる。
【０３２７】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損又はプロテアーゼマイナス株であり得る。
【０３２８】
宿主細胞の遺伝子型を修飾して発現を改善することができる。
【０３２９】
宿主細胞修飾の例としては、プロテアーゼ欠損、稀少ｔＲＮＡの補足、及びジスルフィド結合形成を増強するための細胞質における還元可能性の修飾が挙げられる。
【０３３０】
例えば、宿主細胞大腸菌（E. coli）は、Kane（Curr Opin Biotechnol(1995), 6, 494-500 “Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E, coli”）で例示／記載されるように異種タンパク質の発現を改善するために稀少ｔＲＮＡを過剰発現することができる。宿主細胞は、多くの還元酵素が欠失している可能性があり、したがって、Bessette（Proc Natl Acad Sci USA(1999), 96, 13703-13708 “Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm”）で例示／記載されるように、安定なジスルフィド結合の形成に好ましい。
【０３３１】
好ましい実施形態では、宿主細胞は真菌宿主細胞であり、好ましくは糸状菌宿主細胞、好ましくはトリコデルマ属由来である。好ましい実施形態では、好ましくは、宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイである。
【０３３２】
本発明のバリアントポリペプチドの発現は、ティー・リーゼイを宿主細胞として用いることにより、実質的に増大させることができることが意外にも判明した。
【０３３３】
本発明の前に、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素（すなわち、ｗｔ ＫＬＭ１）が、酵母ハンセヌラ・ポリモルファにおける発現によって産生されている。大規模酵素産生のための産生を基準化する目的で別の発現系を考慮する場合、ティー・リーゼイにおける発現が考慮された。しかし、ｗｔ ＫＬＭ１酵素はティー・リーゼイにおいて
効率的に産生されない。
【０３３４】
しかし、意外にも、本発明によるバリアントポリペプチドは、ティー・リーゼイにおいて有意に改善された発現レベル（野生型ＫＬＭ１酵素よりも１２〜２５倍良好）を有することが判明した。これは、酵素の商業的な規模での産生において有意なコストの減少をもたらし得る重大な改善である。
【０３３５】
一実施形態では、本発明は、トリコデルマ・リーゼイにおいてバリアント脂肪分解酵素を発現するための方法であって、極性脂質中のエステル結合に対して加水分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、本発明によるヌクレオチド配列）で形質転換し、そしてティー・リーゼイを培養してヌクレオチド配列の発現を得、そしてポリペプチドを収集することを含む方法を提供する。
【０３３６】
［生物］
本発明に関連した「生物」という用語は、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる生成物を含み得、及び／又は生物中に存在する場合、本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能にする、任意の生物を含む。
【０３３７】
好適な生物は、原核生物、真菌、酵母又は植物を含み得る。
【０３３８】
本発明に関連して「トランスジェニック生物」という用語は、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる生成物を含み、及び／又はプロモーターが生物内で本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能にすることができる、任意の生物を包含する。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物のゲノム中に組み入れられる。
【０３３９】
「トランスジェニック生物」という用語は、天然の環境中にある天然のヌクレオチドコーディング配列であって、それらが、これもまたその天然の環境中にある天然のプロモータの制御下にある場合のヌクレオチドコーディング配列は対象としない。
【０３４０】
したがって、本発明のトランスジェニック生物は、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、又はそれらの産物のいずれか１つ、又はそれらの組み合わせを含む生物を包含する。
【０３４１】
例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下で本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【０３４２】
［宿主細胞／生物の形質転換］
先に述べたように、宿主生物は原核生物又は真核生物であり得る。好適な原核宿主の例としては、大腸菌及び枯草菌（Bacillus subtilis）が挙げられる。
【０３４３】
原核宿主の形質転換に関する教示は、当該技術分野で十分に文書化され、たとえば、Sambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照。原核宿主が用いられる場合、ヌクレオチド配列は、好適には、形質転換前に（例えばイントロンの除去により）修飾する必要がある場合がある。
【０３４４】
糸状菌細胞は、当該技術分野で公知の様々な方法（例えば、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換とそれに続いて公知方法での細胞壁の再生を含むプロセス）を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルス属（Aspergillus）の使用は、ＥＰ０２３８０２３に記載されている。一実施形態では、好ましくはトリコデルマ・リーゼイが宿主生物である。
【０３４５】
別の宿主生物は植物であり得る。植物を形質転換するために使用される一般的な技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)及びChristou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文で見いだすことができる。植物形質転換に関するさらなる教示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５で見いだすことができる。
【０３４６】
真菌、酵母及び植物に関する一般的な教示を以下のセクションで記載する。
【０３４７】
［形質転換された真菌］
宿主生物は、真菌（例えば糸状菌）であり得る。好適なそのような宿主の例としては、サーモミセス属、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属、ペニシリウム属（Penicillium）、ムコール属（Mucor）、ノイロスポラ属（Neurospora）、トリコデルマ属などに属する任意のメンバーが挙げられる。一実施形態では、好ましくはトリコデルマが宿主生物であり、好ましくはティー・リーゼイである。
【０３４８】
糸状菌の形質転換に関する教示は、ＵＳ−Ａ−５７４１６６５で概説され、ここでは糸状菌の形質転換及び真菌の培養に関する標準的技術は当該技術分野で周知であることが記載されている。エヌ・クラッサ（N.crassa）に適用される技術の広範囲の総説は、たとえば、Davis and de Serres, Methods Enzymol(1971)17A:79-143で見いだされる。
【０３４９】
糸状菌の形質転換に関するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７で概説されている。
【０３５０】
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al.(2002)Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4):273-306で概説されている。
【０３５１】
［形質転換された酵母］
別の実施形態では、トランスジェニック生物は酵母であり得る。
【０３５２】
酵母における異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Methods Mol Biol(1995), 49:341-54、及びCurr Opin Biotechnol(1997)Oct;8(5):554-60に記載されている。
【０３５３】
これに関して、サッカロミセス・セレビシエ種又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はハンセヌラ・ポリモルファなどの酵母（FEMS Microbiol Rev(2000 24(l):45-66を参照）)を異種遺伝子発現のビヒクルとして用いることができる。
【０３５４】
サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の概説は、E Hinchcliffe E Kenny(1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, Eds., 2nd edition, Academic Press Ltd.）により記載されている。
【０３５５】
酵母の形質転換に関して、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセス属（Saccharomyces）は、Hinnen et al.,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929);Beggs, J D(1978, Nature, London, 275, 104)；及びIto, H et al(1983, J Bacteriology 153, 163-168）の教示にしたがうことにより調製することができる。
【０３５６】
形質転換された酵母細胞は、栄養要求性マーカー優性抗生物質耐性マーカーなどの種々の選択マーカーを用いて選択することができる。
【０３５７】
［形質転換された植物／植物細胞］
本発明に好適な宿主細胞は植物であり得る。一般的な技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)及びChristou(Agro-Food-Industry
Hi-Tech March/ April 1994 17-27)による論文で見いだすことができる。
【０３５８】
［培養及び産生］
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、コードされた酵素の産生を引き起こし、細胞及び／又は培養培地からの酵素の回収を促進する条件下で培養することができる。
【０３５９】
細胞を培養するために用いられる培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、酵素の発現を得るために適した任意の通常の培地であってよい。
【０３６０】
組換え細胞によって産生されるタンパク質は、細胞の表面上で提示される可能性がある。
【０３６１】
酵素は宿主細胞から分泌される可能性があり、周知の手順を用いて培養培地から通常どおり回収することができる。
【０３６２】
［分泌］
多くの場合、酵素をより容易に回収することができる培養培地中に発現宿主から酵素が分泌されるのが望ましい。本発明にしたがって、分泌リーダー配列を、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列も本発明に関連して用いることができる。
【０３６３】
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えばアスペルギルス由来の１８及び２４アミノ酸の両バージョン）ａ−因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）及びハンセヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチラス（Bacillus））由来のものである。
【０３６４】
一例として、大腸菌における異種タンパク質の分泌は、Methods Enzymol(1990)182:132-43で概説されている。
【０３６５】
［検出］
アミノ酸配列の発現を検出し、測定するための種々のプロトコルが当該技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）が挙げられる。
【０３６６】
様々な標識及び接合技術が当業者には公知であり、種々の核酸及びアミノ酸アッセイで用いることができる。
【０３６７】
Pharmacia Biotech社(Piscataway, NJ)、Promega社(Madison, WI)、及びUS Biochemical社(Cleveland, OH)などの多くの企業がこれらの方法のための商業的なキット及びプロトコルを提供している。
【０３６８】
好適なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又は発色剤並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７；ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２；ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０；ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５；ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７；ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０３６９】
さらに、組換え免疫グロブリンをＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７で示されるようにして作製することができる。
【０３７０】
［融合タンパク質］
本発明による使用のためのアミノ酸配列はたとえば、抽出及び精製を助けるために、融合タンパク質として作製することができる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及び（β−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質パートナーと関心のあるタンパク質配列との間にタンパク質分解性切断部位を含めて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも好都合であり得る。
【０３７１】
好ましくは、融合タンパク質はタンパク質配列の活性を損なわない。
【０３７２】
大腸菌における遺伝子融合発現系は、Curr Opin Biotechnol(1995)6(5):501-6で概説されている。
【０３７３】
本発明の別の実施形態では、アミノ酸配列を異種配列にライゲートして、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質の活性に影響を及ぼし得る薬剤のペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用であり得る。
【０３７４】
［大規模用途］
本発明の好ましい一実施形態では、アミノ酸配列を大規模用途のために用いる。
【０３７５】
好ましくは、アミノ酸配列を大量に、宿主生物の培養後の全細胞培養体積１リットルあたり、１ｇ〜約２５ｇ、好ましくは２．５ｇ超〜約１８ｇ、好ましくは８ｇ超の量で産生される。
【０３７６】
［食物／食料品］
本発明の組成物は、食物若しくは食料品として、又は食物若しくは食料品の調製において用いることができる。ここで、「食物」又は「食料品」という用語は、広義で用いられ、ヒト用の食物並びに動物用の食物（すなわち、飼料）を対象とする。好適な態様では、ヒトの消費用の食物である。
【０３７７】
食物は、使用及び／又は適用様式及び／又は投与様式によって、溶液の形態であってもよいし、又は固体としてであってよい。
【０３７８】
［食物成分］
本発明の組成物は、食物成分として用いることができる。
【０３７９】
本明細書中で用いられる場合、「食物成分」という用語は、機能的食物又は食料品に添加することができる配合物を包含し、低レベルで、例えば、酸性化又は乳化を必要とする様々な製品において用いることができる配合物を包含する。
【０３８０】
食物成分は、使用及び／又は適用様式及び／又は投与様式によって、溶液の形態であってもよいし、或いは固体としてであってもよい。
【０３８１】
［食品］
本発明の組成物は、食品、例えば：菓子製品、乳製品、家禽製品、魚加工品及びベーカリー製品の１又は２以上の調製において用いることができる。
【０３８２】
本発明はまた、食物又は食物成分の調製法であって、本発明による脂肪分解酵素を別の食物成分と混合することを含む方法も提供する。
[実施例]
【０３８３】
本発明を、例示のみにより記載し、ここでは、以下の図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【０３８４】
【図１】配列番号１、フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３（野生型）由来の脂肪分解酵素をコードする合成ＤＮＡ断片を示す；
【図２】フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ ７８２．８３（野生型）由来の脂質分解酵素の配列番号２のタンパク質プレプロ配列を示し、このプロプレ配列は、酵素の成熟形態が配列番号２のアミノ酸３１〜３０５を含み、好ましくは配列番号２のアミノ酸３１〜３０５からなるように、翻訳修飾を受ける。しかし、いくつかの宿主生物では、タンパク質はＮ−末端でプロセッシングされるので、多くのさらなるアミノ酸がＮ末端又はＣ末端上に付加される。したがって、酵素の成熟形態は、少なくとも配列番号２のアミノ酸３１〜３０５を含む酵素であってよい。酵素の成熟形態は、本明細書ではＫＬＭ１と称する場合がある。この酵素は野生型酵素であると見なされる；
【図３】配列番号３、図２３においてグラフィック形態で示される発現ベクターpTrex3のＤＮＡ配列を示す；
【図４】「ｍｕｔ３」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号４を示す；
【図５】「ｍｕｔ３」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号５を示す；
【図６】「ｍｕｔ４」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号６を示す；
【図７】「ｍｕｔ４」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号７を示す；
【図８】「ｍｕｔ５」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号８を示す；
【図９】「ｍｕｔ５」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号９を示す；
【図１０】「ｍｕｔ３４５」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号１０を示す；
【図１１】「ｍｕｔ３４５」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号１１を示す；
【図１２】「ｍｕｔ３４５９」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号１２を示す；
【図１３】「ｍｕｔ３４５９」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号１３を示す；
【図１４】「ｍｕｔ９」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号１４を示す；
【図１５】「ｍｕｔ９」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号１５を示す；
【図１６】「ｍｕｔ１０」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号１６を示す；
【図１７】「ｍｕｔ１０」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号１７を示す；
【図１８】「ｍｕｔ１１」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号１８を示す；
【図１９】「ｍｕｔ１１」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号１９を示す；
【図２０】「ｍｕｔ１２」で示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号２０を示す；
【図２１】「ｍｕｔ１２」で示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号２１を示す；
【図２２】ポリペプチドバリアント（プレプロ配列）及び野生型酵素（本明細書中では、ａ）配列番号２（ＫＬＭ １ｗｔのプレプロ配列として表示される）、ｂ）ＥＰ０８６７１６７で教示されるようなフザリウム・オキシスポラムリパーゼ（本明細書中では配列番号２２として示す；この酵素は、本明細書中では、Lipopan F（商標）又は「F.ox EP」と称する場合がある）の酸配列；並びにＵＳ７，４６５，５７０で教示されるようなフザリウム・オキシスポラムリパーゼ（本明細書中では配列番号２３として示す；この酵素は、本明細書中ではLipopan F（商標）又は「F.ox US」と称する場合がある）のさらなるアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２３】フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ ７８２．８３（配列番号１のＤＮＡ配列）由来のリパーゼをコードする合成ＤＮＡ断片がSacII及びAscIで消化され、そしてSacII及びAscI制限部位間でクローニングされた、発現ベクターpTrex3の構造をグラフィック形態で表す；
【図２４】野生型脂肪分解酵素及びマイクロリットルプレート中で４つの単一部位グリコシル化ミュータントの発現を示す；
【図２５】流加バッチ発酵（１８４時間）における野生型ＫＬＭ１脂肪分解酵素、Ｃ末端プロセッシング部位ミュータント及び２つの単一部位グリコシル化ミュータントの発現を示す；
【図２６】ＤＧＧＲアッセイ（実施例１）において測定されたＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素のＣ末端プロセッシング部分において多重にグリコシル化及び／又は修飾されたミュータントの発現レベルを示す。活性を、ｗｔ脂肪分解酵素の活性に対して表す；
【図２７】ＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素のＣ末端プロセッシング部分において多重にグリコシル化及び／又は修飾されたミュータントの発現レベルを示す。ＫＬＭ１：野生型脂肪分解酵素。５、３４５、３４５９、９、１０、１１及び１２：クアッド欠失ティー・リーゼイ株において発現されたミュータントＭＵＴ５、ＭＵＴ３４５、ＭＵＴ３４５９、ＭＵＴ９、ＭＵＴ１０、ＭＵＴ１１、ＭＵＴ１２。１１ε及び１２ε：ティー・リーゼイのエンド−Ｔ欠失株において発現されたＭＵＴ１１及びＭＵＴ１２；
【図２８】第１焼成試験の結果を示し、脂肪分解酵素（ＫＬＭ１、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５及びＭｕｔ９）並びに添加量（ＴＩＰＵ／ｋｇ小麦粉）の関数としてのパンの体積（ｍｌ／ｇ）を示す；
【図２９】第２の焼成試験から得られる結果、脂肪分解酵素（ＫＬＭ１、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５及びＭｕｔ９）並びに添加量（ＴＩＰＵ／ｋｇ小麦粉）の関数としてのパンの体積（ｍｌ／ｇ）を示す；
【図３０】ＥＰ０８６７１６７で教示されるフザリウム・オキシスポラムリパーゼ（本明細書では配列番号２２として表し；この酵素は、本明細書ではLipopan F（商標）又は「F.ox EP」と称する場合がある）のアミノ酸配列を示す；
【図３１】Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ３４５、Ｍｕｔ３４５９及びＭｕｔ１１についての焼成試験の結果、様々な添加量（ｍｇ／ｋｇ小麦粉）の様々なバリアントとともに焼成されたパンの相対的なパンの体積（％）を表すグラフを示す；
【図３２】ＫＬＭ１脂肪分解酵素の残基３３〜２９６の相同性モデル（濃い線）をサーモミセスリパーゼ（ｐｄｂエントリー１ＤＴ３）の構造（淡い線）と比較する立体図を示す。２つの構造は、サーモミセスリパーゼにおいて見いだされる二次構造の一般的な特性に関連した位置で見いだされる相同性モデルの触媒トリアッドと二次構造の高度の保存を共有する；
【図３３】棒線画で示される触媒トリアッドに対する位置６３、７８及び１９０での相対的な置換（空間を埋める表示で示す）を示す立体視図を示す。これらの位置は、触媒トリアッドに対して遠位であるループ中で見いだされることがわかる；
【図３４】相同性モデルに基づくＫＬＭ１脂肪分解酵素における遠位ループの位置を示す立体図を示す。これらのループは、空間を埋める表示で示された位置６３、７８及び１９０での置換の位置を組み入れ、棒線画で示された触媒トリアッドに対して遠位である。これらのループは、残基５４〜６６、７５〜７９、９９〜１０３、１２７〜１３５、１６２〜１６７、１８８〜１９５及び２１３〜２２１を含む；
【図３５】ＵＳ７，４６５，５７０で配列番号１として教示されるようなフザリウム・オキシスポラムリパーゼのアミノ酸配列（本明細書中では配列番号２３として示す）を示し；この酵素は、本明細書中では、Lipopan F（商標）又は「F.ox US」と称する場合がある；
【図３６】ＥＰ０８６７１６７で教示されるようなフザリウム・オキシスポラムリパーゼのヌクレオチド配列（本明細書中では配列番号２４で示される）を示し、この酵素は、本明細書中ではLipopan F（商標）又は「F.ox EP」と称する場合がある；
【図３７】「ｍｕｔ１」と表示されるポリペプチドバリアントのタンパク質プレプロ配列である配列番号２５を示し；そして
【図３８】「ｍｕｔ１」と表示されるポリペプチドバリアントのＤＮＡ配列である配列番号２６を示す。
【実施例１】
【０３８５】
１，２−Ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタリック−レゾルフィンエステルを用いたリパーゼアッセイ（ＤＧＧＲアッセイ）。
４部の緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、０．４ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ２、１．２ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ２、２％のアラビアゴム）及び１部の基質（６６４μＭのジメチルスルホキシド中１，２−Ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−グルタリック−レゾルフィンエステル（ＤＧＧＲ、Fluka社製））を混合することにより、基質溶液を調製した。リパーゼの好適に希釈したアリコートを、マイクロタイタープレートのウェル中の２００μｌの基質溶液に添加した。ＤＧＧＲの加水分解の結果、５７２ｎｍでの吸収に変化が起こり、これを、マイクロタイタープレートリーダーを用いてリアルタイムで追跡した。
【実施例２】
【０３８６】
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３（ＫＬＭ１）由来の野生型脂肪分解酵素の発現  
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素（ＤＮＡ配列−配列番号１；配列番号２のプレプロタンパク質配列）をコードする合成ＤＮＡ断片を、SacII及びAscIで消化し、発現ベクターpTrex3のSacII及びAscI制限部位間でクローニングした。
pTrex3は、以下の機能的領域を含む：
１．ティー・リーゼイｃｂｈＩプロモータ及びコーディング領域の一部。このＤＮＡ配列は、コーディング領域の約１５００ｂｐ上流の天然に存在するＸｂａＩ部位から始まり、ＣＢＨＩのシグナルペプチドに対応するｃｂｈ１遺伝子コーディング配列内の天然に存在するＳｆｉｌ部位で終わる。
２．操作されたＡｓｃＩ部位と、それに続くティー・リーゼイｃｂｈＩ転写ターミネーター領域（約０．３６ｋｂ）
３．ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子のプロモータ、コーディング領域及びターミネーターを含むアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ゲノムＤＮＡの２．７５ｋｂ断片。天然のＸｂａＩ部位はこの断片の３’−末端付近に存在する。
４．ｃｏｌＥ１複製起源及びアンピシリン耐性遺伝子を含む細菌ＤＮＡの約３．２ｋｂ断片。
【０３８７】
図２３は、グラフィック形態でｐＴｒｅｘ３の構造を示す。ｐＴｒｅｘ３のＤＮＡ配列を配列番号３として記載する（図３を参照）。
【０３８８】
ｐＴｒｅｘ３中の脂肪分解酵素遺伝子（ｐＴｒｅｘ３（ＫＬＭ１））をクローニングすることから得られるベクターを、XbaI及びSspIで消化し、脂肪分解発現カセット及びａｍｄＳマーカーを含む４．５ｋｂのXbaI−XbaIのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。精製された断片を用いて、ティー・リーゼイのクアッド欠失株（ΔｃｂｈＩ、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、ＷＯ０５／００１０３６に記載）の胞子をエレクトロポレーションによって形質転換した（A. N. Miasnikov, S. Kim. Transformation of T. reesei spores by electroporation. Poster No 598. Abstracts of 25th Fungal Genetics Conference at Asilomar. March 17-22, 2009, p 266）。形質転換体を、唯一の窒素源としてアセトアミドを含む培地（アセトアミド  ０．６ｇ／ｌ；塩化セシウム  １．６８ｇ／ｌ；グルコース  ２０ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム  １５ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム七水和物  ０．６ｇ／ｌ；塩化カルシウム二水和物  ０．６ｇ／ｌ；硫酸鉄（II）５ｍｇ／ｌ；硫酸亜鉛  １．４ｍｇ／ｌ；塩化コバルト（II）１ｍｇ／ｌ；硫酸マンガン（II）１．６ｍｇ／ｌ；寒天  ２０ｇ／ｌ；ｐＨ４．２５）上で選択した。形質転換されたコロニーが約１週間で出現した。個々の形質転換体を新しいアセトアミド選択プレート上に移し、２〜４日間増殖させた。選択培地上で安定した増殖を示す単離株を用いて、底部にマイクロフィルターを備えたマイクロタイタープレート（Millipore Multiscreen-GV（商標））のウェル中の０．２ｍｌのグルコース−ソホロース培地（１％のソホロース、０．６％のグルコース、０．６％のグリシン、３．３％のＰＩＰＰＳ緩衝液、０．４７％の(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．５％のＫＨ２ＰＯ４、０．３％のクエン酸、０．１％のＭｇＳＯ４、５００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４、４０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４、８ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、２ｍｇ／ｌのホウ酸）に接種した。プレートを、４〜６日間、２５〜２８℃、純粋な酸素雰囲気中でインキュベートした。培養培地をろ過により分離し、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）又はＤＧＧＲアッセイによって分析した。多くの形質転換体はＳＤＳゲル上に新しいタンパク質バンドを生成した。このバンドの推定分子量（約２８ｋＤａ）は、Ｎ末端及びＣ末端（Nagao et al. J. Biochem. 124, 1124-1129(1998)）処理ＫＬＭ１リパーゼの予想される分子量（２８．６ｋＤａ）に相当する。２８ｋＤａのバンドを生じる形質転換体クローンの培養培地も実質的なリパーゼ活性を含んでいた（ＤＧＧＲアッセイで測定）。本質的に、形質転換においてレシピエントとして使用した非形質転換ティー・リーゼイ株の培養培地中で検出可能なリパーゼ活性は無かった。
【実施例３】
【０３８９】
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素のミュータント形態の発現
脂肪分解酵素遺伝子のミュータント形態を、標準的ＰＣＲベースの技術を用いて構築した。ミュータント遺伝子のＤＮＡ及びタンパク質配列並びに脂肪分解酵素のプレプロ形態を表１により示すように記載する。全ミュータントは、Ｒ３０６Ｓ変異を有する（ミュータント０）。ミュータント１、３、４及び５は、異なる位置で導入された１つのＮ連結グリコシル化部位コンセンサス配列を有する（野生型脂肪分解酵素（ＫＬＭ１）はＮ−結合グリコシル化部位を有さない）。ミュータント９は２つのアミノ酸残基の欠失を有する（Ｋ３１１Ｒ３１２）。全ての他のミュータントは複数のグリコシル化部位を含む。
【０３９０】
【表６】
2015133976.tif 000008
【０３９１】
野生型酵素（ＫＬＭ１；配列番号２）と比較した、ミュータント又はバリアント脂肪分解酵素のそれぞれにおける修飾を以下で表２に示す。すべてのナンバリングは、ｗｔプレプロＫＬＭ１（本明細書中では配列番号２として示す）の配列に従う。
【０３９２】
【表７】
2015133976.tif 000009
【０３９３】
脂肪分解酵素遺伝子のミュータント形態の全てを野生型脂肪分解酵素遺伝子と同じ方法でpTrex3中にクローニングした（SacII及びAscI制限部位を用いる）。ティー・リーゼイの形質転換、形質転換体の選択及び培養を実施例２で記載したように実施した。ミュータントのそれぞれを発現する少なくとも５０の安定な形質転換体を分析した。最高レベルのリパーゼを産生する各種類の１つの形質転換体を選択した。
【実施例４】
【０３９４】
ティー・リーゼイのエンドＴ遺伝子の破壊カセットの構築
特許出願ＷＯ２００６／０５０５８４の情報を用いて、エンドＴ遺伝子を、ティー・リーゼイのゲノム配列で同定した（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html
）。その５’フランキング領域（１．９Ｋｂ）を、プライマーＳＫ９１５（５’-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-３’）及びＳＫ９１６（５’-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-３’）を用いたＰＣＲによって増幅した。３’フランキング領域（１．７Ｋｂ）を、プライマーＳＫ９１７（５’-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-３’）及びＳＫ９１８（５’-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-３’）を用いたＰＣＲにより増幅した。PfuII Ultra（Stratagene社製）を全てのＰＣＲ反応においてポリメラーゼとして使用した。ＰＣＲ反応の産物を、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen社製）を用い、マニュアルに記載されたプロトコルに従うことにより精製した。両方の増幅されたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼAscIで消化し、続いてQIAquickキットを用いた消化ＤＮＡの精製を行った。２つのＤＮＡ断片を混合し、プライマーＳＫ９１５及びＳＫ９１８との融合ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。この反応の産物である３．６ｋｂのＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてpCR-Blunt II TOPOベクター中にクローニングした。結果として得られるプラスミド（pCR-BluntII-TOPO（５’−３’フランク））の構造を制限分析によって確認した。クロリムロンエチルに対する耐性を付与するティー・リーゼイアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子のミュータント形態（ＷＯ２００８／０３９３７０）を、ＰＣＲプライマーＳＫ９４９（５’-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-３’）及びＳＫ９４６（５’-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-３’）並びにpTrex-Glucoamylaseベクター（ＷＯ２００８／０３９３７０、実施例２）をテンプレートとして用いて増幅した。ＰＣＲ反応の産物を、QIAquickキットで精製し、AscIで消化し、再度精製し、同じ酵素で消化し同様に精製したpCR-BluntII-TOPO（５’−３’フランク）とライゲートした。結果として得られるプラスミドpCR-BluntII-TOPO（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中の挿入物の配向性を制限分析により証明した。ティー・リーゼイ染色体配列のさらなる断片（「３’−リピート」と称する）を、同じ技術並びにプライマーＭＣ４０（５’-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-３’）及びＭＣ４１（５’-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGTGAAGTCGTATAAG-３’）を用いて増幅した。この配列は、pCR-BluntII-TOPO（５’−３’フランク）内に含まれる３’−フランク部分のさらに下流のティー・リーゼイ染色体上に位置する。０．４６ｋｂのこのＰＣＲ産物（３’−リピート）を、In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit（Clontech社製）を用いてpCR-BluntII-TOPO（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中のＡＬＳ遺伝子の上流にクローニングした。pCR-BluntII-TOPO（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）を、３’リピートの挿入のためにPasI及びBstEIIで消化した。結果として得られる構築物pCR-BluntII-TOPO（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’リピート−３’フランク）を、プライマーＳＫ１００８（CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC）及びＳＫ１００９：（CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATCAC）を用いたＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。７．５ｋｂのＤＮＡ産物を、Invitrogen社製の対応するキットを用いて、pCR-BluntII-TOPOベクター中にクローニングした。結果として得られるプラスミドをAsiSIで消化し、７．５ｋｂのＤＮＡ断片（エンド−Ｔ欠失カセット）を分取アガロースゲ���電気泳動法により精製した。
【実施例５】
【０３９５】
ティー・リーゼイにおけるエンド−Ｔ遺伝子の破壊及び結果として得られるミュータントの脂肪分解酵素発現構築物での形質転換
ティー・リーゼイのクアッド欠失株（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２）はＷＯ０５／００１０３６で記載されている。この株を、（実施例４の）欠失カセットで、 Penttila et al. （Penttila M. et al.1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164）により記載された形質転換法を用いて形質転換した。形質転換体を、２００ｐｐｍのクロリムロンエチルを含有するModified Vogel’s培地上で選択した（ＷＯ２００８／０３９３７０）。形質転換体を液体培地中で培養し、培養上清をＳＤＳゲル電気泳動法により分析した。ゲル上のほとんどのタンパク質の移動度の上方へのシフトを示す２つのクローン（＃１１及び＃７４）を特定した。染色体ＤＮＡをこれらの２つの株並びにティー・リーゼイの親クアッド欠失株から単離した。ＰＣＲ分析を、これらのＤＮＡ調製物に関して、プライマー対ＭＣ４２＋ＭＣ４８（５’-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-３’及び５’-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-３’）並びにＭＣ４５＋ＭＣ５０（５’-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-３’及び５’-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-３’）を用いて実施した。予想されるサイズ（２．９及び２．３ｋｂ）の産物は、クローン＃７４から単離されたＤＮＡを用いて得られた。このクローンを連続した２回の精製に付した（１つの胞子の子孫の単離による）。ＤＮＡを精製された形質転換体＃７４から単離した。ＰＣＲ分析を繰り返し、エンド−Ｔ遺伝子の成功した欠失を確認した。結果として得られたティー・リーゼイのミュータント株を、pTrex3（ＭＵＴ１０）、pTrex3（ＭＵＴ１１）及びpTrex3（ＭＵＴ１２）で形質転換した。形質転換体のスクリーニング及び胞子精製を、実施例３において記載されるようにして実施した。
【実施例６】
【０３９６】
１つの操作されたグリコシル化部位を有するフザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素のミュータント形態の産生
野生型脂肪分解酵素並びにミュータント３、４及び５を発現する最もよく選択された形質転換体（実施例２及び３を参照）を、４日間、マクロタイタープレート中で前述（実施例２中）のようにして培養した。これらのミュータントのうちの２つ並びに野生型脂肪分解酵素及びＭＵＴ０（Ｒ３０６Ｓ変異のみを有する）の産生も、標準的流加−バッチプロセス（ＷＯ２００４／０３５０７０）を用いて発酵装置中で試験した。操作されたグリコシル化部位を含む３つのミュータントは全て、特に発酵装置中で長時間（１８４時間）流加−バッチ培養の条件下で、野生型脂肪分解酵素よりも高いレベルで発現された（図２４及び図２５並びに表３を参照）。
【０３９７】
【表８】
2015133976.tif 000010
【０３９８】
［実施例６］
複数のグリコシル化部位及びＣ末端タンパク質分解プロセッシング部位の修飾を有するフザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素のミュータント形態の産生
ミュータントＭＵＴ３４５、ＭＵＴ３４５９、ＭＵＴ９、ＭＵＴ１０、ＭＵＴ１１及びＭＵＴ１２をコードする遺伝子（表１）を実施例２で記載するようにしてティー・リーゼイのクアッド欠失株において発現させた。ミュータントＭＵＴ１１及びＭＵＴ１２をコードする遺伝子をティー・リーゼイのエンド−Ｔ欠失株において更に発現させた（実施例５を参照）。少なくとも５０の安定な形質転換体を、実施例２で記載するようにして脂肪分解酵素産生についてスクリーニングした。典型的には、形質転換体の各セットは、脂肪分解酵素を（所定のミュータントについて最高の）類似したレベルで発現する５〜６個のクローンを含む。１つのそのような形質転換体を各タイプのミュータントについて選択した。選択された最良の形質転換体を全て、１つの実験ではＭＴＰ中で７日間培養し、SDS PAGE及び活性アッセイによって分析した（実施例１を参照）。結果（図２５及び表４）は、試験したミュータント全てが、野生型脂肪分解酵素よりも高いレベルで発現されることを示す。１群としての多重にグリコシル化されたミュータントは、１つの操作されたＮ連結グリコシル化部位のみを有するＭＵＴ５と比較して、発現レベルの実質的な改善を示さない。注目に値する例外は、ＭＵＴ１２であり、これはＭＵＴ５又はこのシリーズの他のミュータントの約２倍多い組換えタンパク質を産生する。
【０３９９】
【表９】
2015133976.tif 000011
【実施例７】
【０４００】
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３の脂肪分解酵素のミュータント形態の応用
脂肪分解酵素のバリアントの機能を評価するために、これらを後述のようにパイロット焼成用途で評価した。
【０４０１】
［材料及び方法］
［酵素］
以下の酵素を焼成試験に使用した（表５）。
【０４０２】
【表１０】
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【０４０３】
［酵素アッセイ（ＴＩＰＵ）］
使用した酵素のホスホリパーゼ活性測定を、以下のアッセイを用いて実施した：
１ＴＩＰＵ（滴定ホスホリパーゼ単位）は、アッセイ条件で１分あたり１マイクロモルの遊離脂肪酸を遊離させる酵素の量と定義される。
ホスホリパーゼＡ１及びＡ２は、レシチンからリゾレシチンへ変換して、それぞれ位置１及び２で遊離脂肪酸を放出するのを触媒する。ホスホリパーゼ活性は、酵素法の間にレシチンから遊離される脂肪酸の連続滴定によって測定することができる。なぜなら、アルカリの消費は遊離する脂肪酸の量に等しいからである。
［基質］
４％のレシチン、４％のTriton-X100、及び６ｍＭのＣａＣｌ２：１２ｇのレシチン粉末（Avanti Polar Lipids#44160）及び１２ｇのTriton-X100（Merck 108643）を磁気撹拌しながら約２００ｍｌの脱塩水中に分散させた。３．０ｍｌの０．６ＭのＣａＣ１２（p.a. Merck 1.02382）を添加した。体積を脱塩水で３００ｍＬに調節し、Ultra Thuraxを用いてエマルジョンを均質化した。基質を毎日新しく調製した。
［アッセイ手順］
酵素溶液を調製して、３００μＬの酵素を添加して０．０６〜０．１８ｍｌ／分で滴定曲線の傾斜を得た。
既知活性の対照試料が含まれる。
試料を脱塩水中に溶解させ、１５分間、３００ｒｐｍで撹拌した。２５．００ｍｌの基質を３７．０℃に１０〜１５分間調節した後、０．０５ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０に調節した。３００μＬの酵素溶液を基質に添加し、０．０５ＭのＮａＯＨでの連続滴定を、ｐＨ−Ｓｔａｔ滴定装置（Phm 290, Mettler Toledo社製）を用いて実施した。２つの活性測定を各スケーリングで実施する。８分後、滴定をやめ、５から７分の間で滴定曲線の勾配を計算した。検出限界は、３ＴＩＰＵ／ｍｌ酵素溶液であった。
［計算］
ホスホリパーゼ活性（ＴＩＰＵ／ｇ酵素）を以下の方法で計算した：
【０４０４】
【数２】
2015133976.tif 000013
【０４０５】
（式中：
αは、５から７分の間の反応時間での滴定曲線の勾配（ｍｌ／分）である。
Ｎは使用したＮａＯＨの規定度（ｍｏｌ／ｌ）である。
Ｖ１は、その中に酵素を溶解させた体積（ｍｌ）である。
ｍは、Ｖ１に添加された酵素の量（ｇ）である。
Ｖ２は、基質に添加された酵素溶液の体積（ｍｌ）である）。
【０４０６】
［焼成プロトコル］
［レシピ］
【０４０７】
【表１１】
2015133976.tif 000014
【０４０８】
装置：
ミキサー：Diosna社製
加熱キャビネット
成形：Glimekラウンダー
プルーフィングキャビネット
オーブン：／MIWE社製
［手順］
１．すべての乾燥成分をボウル中で１分間混合し、水を添加する。
２．混合プログラム：２分間  遅−５．５分間  速
３．生地温度は約２６℃でなければならない。
４．１３５０ｇを計る−成形
５．加熱キャビネット中で１０分間３０℃にて休ませる。
６．「Glimekラウンダー」（機械の表にしたがって設定）で成形する。
７．３４°、８５％ＲＨで４５分間試験する。
８．焼成
９．焼成後、ロールを２５分間冷却した後、計量し、体積を測定する。
【０４０９】
［焼成試験］
野生型−及びバリアントリパーゼを用いて２つの焼成試験を実施した。試験設定を表６及び表７に記載する。
【０４１０】
【表１２】
2015133976.tif 000015
【０４１１】
【表１３】
2015133976.tif 000016
【０４１２】
［脂質修飾の分析］
生地を試験後に集め（焼成レシピを参照）、直ちに凍結させた。その後、凍結生地試料を凍結乾燥し、コーヒーミルで粉砕した。生地試料から脂質を抽出し、以下のプロトコルにより分析した：
【０４１３】
［脂質抽出］
６．０ｍＬの水飽和ブタノール：エタノール（８５：１５（ｖ／ｖ））を１ｇの試料に添加し、次いで１５秒間ボルテックスで混合した後、３５ｒｐｍでローターミキサーに５分間入れた。その後、試料を９７℃の水浴中に１０分間入れ、続いてローターミキサーで３５ｒｐｍにて１時間混合した。試料を次いで１３７０ｇで１０分間遠心分離した。抽出された脂質を含む有機相である上清を次いで新しいガラス管に移した。
【０４１４】
ＨＰＴＬＣのために、１．５ｍＬの抽出された脂質を７０℃、窒素カバー下で蒸発させ、次いで４００μＬのヘキサン：イソプロパノール（３：２（ｖ／ｖ））中に再分散させた。３μＬの再分散され抽出された脂質をTLCプレートに適用した（以下を参照）。
【０４１５】
［ＨＰＴＬＣ手順］
乾燥（１６０℃、２０〜３０分）により、ＨＰＴＬＣプレート（２０×１０ｃｍ、Merck no. 1.05641）を活性化し、標準及び試料を、Automatic HPTLC Applicator（ATS4, CAMAG社製）を用いて適用した。Automatic Developing Chamber（ADC2, CAMAG社製）（７ｃｍ）を用いてプレート溶出を実施した。溶出後、プレートを乾燥し（１６０℃、１０分）、冷却し、展開液（１６％Ｈ３ＰＯ４中６％酢酸銅）中に浸漬した（１０秒）。乾燥（１６０℃、６分）後、ＴＬＣスキャナー（TLC Scanner 3、CAMAG社製）を用いてプレートを目視で評価した。
【０４１６】
［結果］
第１焼成試験から得られた結果を表８及び図２８で表す。
【０４１７】
【表１４】
2015133976.tif 000017
【０４１８】
図２８は、第１焼成試験の結果を示し、これは脂肪分解酵素（ＫＬＭ１、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５及びＭｕｔ９）並びに添加量（ＴＩＰＵ／ｋｇ小麦粉）の関数としてのパンの体積（ｍｌ／ｇ）を示す。
【０４１９】
表８及び図２８からわかるように、３つの脂肪分解バリアントは全て野生型（ＫＬＭ１）よりも有意に少ない酵素添加量でパンの体積を増大させた。第１焼成試験で得られた結果に基づいて、第２焼成試験を実施し、野生型リパーゼ（ＫＬＭ１）よりも少ない脂肪分解バリアントを添加した。この実験から得られた結果を表９及び図２９に示す。
【０４２０】
【表１５】
2015133976.tif 000018
【０４２１】
図２９は、第２の焼成試験から得られた結果、脂肪分解酵素（ＫＬＭ１、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５及びＭｕｔ９）及び添加量（ＴＩＰＵ／ｋｇ小麦粉）の関数としてのパンの体積（ｍｌ／ｇ）を示す。
【０４２２】
第２の焼成試験からわかるように、脂肪分解酵素バリアントは、はるかに低い活性を有する野生型脂肪分解酵素を添加した場合と同程度のパンの体積を促進し、このことは、製パンにおけるそれらの性能が野生型脂肪分解酵素よりも優れていることを示す。
【０４２３】
バリアント脂肪分解酵素及び野生型（ＫＬＭ１）の前記焼成性能は、脂質分析により示される脂質修飾とうまく相関した。３つのバリアント脂肪分解酵素はすべて、ガラクト脂質フラクション（ジ−ガラクトシル−ジ−グリセリド（ＤＧＤＧ））の有意に高度の修飾を促進し、結果としてリゾ成分（ジ−ガラクトシル−モノ−グリセリド（ＤＧＭＧ））を生じた。
【０４２４】
前記試験に加えて、Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ３４５、Ｍｕｔ３４５９及びＭｕｔ１１について同じ方法及び材料を用いて焼成試験をさらに実施し、図３１はこの試験の結果、すなわち、異なるバリアントを異なる添加量（ｍｇ／ｋｇ小麦粉）で用いて焼いたパンの相対的なパンの体積（％）を示す。
【０４２５】
これらのデータからわかるように、バリアント脂肪分解酵素の焼成性能は、はるかに低い活性を有する野生型脂肪分解酵素を添加した場合と同程度又はより良好なパンの体積を促進し、このことは、製パンにおけるそれらの性能が野生型脂肪分解酵素（ＫＬＭ１）よりも優れていることを示す。
【実施例８】
【０４２６】
ＫＬＭ１脂肪分解酵素の相同性モデル
ＫＬＭ１脂肪分解酵素の３Ｄ構造を示す３Ｄモデルを、修飾の部位を特定するために作成した。
【０４２７】
脂肪分解酵素のアミノ酸配列（本明細書中では配列番号２（ＫＬＭ１）として示す）をProtein Data Bank(www.rcsb.org)中の全ての既知酵素構造と比較し、最も高い配列相同
性を有する機知構造はサーモミセス・ラヌギノーサリパーゼエントリー１ＤＴ３であることが判明した。ＫＬＭ１脂肪分解酵素のアミノ酸配列は、タンパク質データバンク構造中に存在する２６９残基にわたって４０％の配列同一性しか共有しない。
【０４２８】
Chemical Computing Group of Montreal社（Quebec Canada）製のコンピュータプログラムスイートＭＯＥ（著作権）の相同性モデリング機能を用いて、ＭＯＥプログラムスイートにおいてプログラムデフォルトを使用して、KLM1脂肪分解酵素の残基３３〜２９６のモデルを作製した。結果として得られたモデルを図３２においてサーモミセスリパーゼの基本構造と比較した。全体として、全体的なフォールドと、サーモミセスリパーゼトリアッドに重ねたKLM1脂肪分解酵素の触媒トリアッド残基、Ｓ１７４、Ｄ２２８及びＨ２８７とは非常によく一致する。
【０４２９】
KLM1の触媒トリアッドはＳ１７４、Ｄ２２８及びＨ２８７である。
【０４３０】
図３２は、KLM1脂肪分解酵素の残基３３〜２９６（濃い色の線）の相同性モデルと、淡い色の線で表したサーモミセスリパーゼ（ｐｄｂエントリー１ＤＴ３）の構造とを比較する立体図を示す。２つの構造は、サーモミセスリパーゼで見られる二次構造の共通の特性に対する位置で見られる相同性モデルの触媒トリアッドを有する二次構造の高い保存性を共有する。
【０４３１】
３つの置換（すなわちＫ６３、Ｇ７８及びＡ１９０）の位置は相同性モデル中に位置していた。
【０４３２】
Ｋ６３Ｎ、Ｇ７８Ｎ及びＡ１９０Ｎは、触媒トリアッドに対して遠位であるループ中にグリコシル化部位を導入する。触媒トリアッドに対するこれらの部位の位置を図３３に示す。位置６３での置換は、Ｃ５４とＣ６６との間のジスルフィド結合により形成されるループ中にある。位置７８は、位置７５が末端である予想されるらせんと、残基７９から始まる中央混合βシートのβ鎖との間の隣接するループ中で見いだされる。位置１９０は、残基１８８から、らせんの末端及び中央混合βシートの別のβ鎖の始まりである残基１９５に伸びる別のループ中で見出される。
【０４３３】
図３３は、棒線画で示された触媒トリアッドに対する位置６３、７８及び１９０（空間を埋める表示で示す）での置換の相対的位置を示す立体図を示す。これらの位置は、触媒トリアッドから遠位であるループ中で見いだされることがわかる。
【０４３４】
位置６３、７８及び１９０で置換を有するループに加えて、酵素の活性部位に対して類似した近位を共有するモデルにおいて幾つかの他のループを見出すことができる。これらのループのうちの３つはループ７５〜７９及びループ１８８〜１９５の間で見られ、これらは、中心シートの２つのβ鎖間、別のジスルフィド結合ループを形成するＣ１２９〜Ｃ１３５間及びらせんの末端と中央らせんの別の鎖の始まりとの間に存在する１６２〜１６７間に存在する残基９９〜１０３により形成される。らせんと、中央らせん残基２１３〜２２１の鎖との間にもう一つ別のループがある。触媒トリアッドに対するこれらのループの位置を図３４に示す。
【０４３５】
図３４は、相同性モデルに基づくＫＬＭ１脂肪分解酵素中の遠位のループの位置を示す立体図を示す。これらのループは、空間を埋める表示で示された位置６３、７８及び１９０での置換の位置を組み入れ、棒線画として示した触媒トリアッドに対して遠位である。これらのループは、残基５４〜６６、７５〜７９、９９〜１０３、１２７〜１３５、１６２〜１６７、１８８〜１９５及び２１３〜２２１を含む。
【０４３６】
前記明細書中で記載の全ての刊行物は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。記載された方法及び本発明の系の種々の修飾及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、請求される本発明は、そのような具体的な実施形態に不必要に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジーの分野の熟練した人々には明らかな、本発明を実施するために記載された様式の種々の修飾は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2015133976.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015133976.tif 000030
【図１１】
2015133976.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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