(57)【要約】  本発明は、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法に関する。本発明は、上記方法により入手可能な不溶性の標的タンパク質にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、前記宿主細胞を破壊し、かつ／又は前記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で前記懸濁液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％が可溶化する、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法。
【請求項２】
宿主細胞が細菌、酵母、植物又は昆虫の宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離した不溶性の標的タンパク質が、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％の純度を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
塩基が金属水酸化物及び／又はアンモニアである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
金属水酸化物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、及び水酸化カルシウム（ＣａＯＨ）からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
塩基が水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）での該塩基の最終濃度が、０．００５Ｍ〜１Ｍ、又は０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、又は０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）工程ｂ）の前での、（ｉｉ）工程ｂ）中での、及び／又は（ｉｉｉ）工程ｂ）の後での少なくとも１つの試薬の添加を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試薬が変性剤、コスモトロピック剤及び洗浄剤からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）変性剤が尿素（ＣＨ４Ｎ２Ｏ）若しくは塩酸グアニジン（ＣＨ５Ｎ３ＨＣｌ）であり、
（ｉｉ）該コスモトロピック剤がリン酸塩若しくは硫酸塩であり、又は
（ｉｉｉ）該洗浄剤がＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳ若しくはＢｒｉｊである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）尿素の最終濃度が０．１Ｍ〜１０Ｍ、若しくは１Ｍ〜５Ｍの範囲であり、又は
（ｉｉ）塩酸グアニジンの最終濃度が０．０１Ｍ〜３Ｍ、若しくは０．１Ｍ〜２Ｍの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）における該可溶化した不溶性の宿主細胞部からの該不溶性の標的タンパク質の分離が、遠心分離、沈降及び／又は濾過により達成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の後で、かつ工程ｃ）の前に前記懸濁液の均質化工程ｂ’）を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）の後に、分離した不溶性の標的タンパク質、又は遠心分離物、沈降物若しくは残余分を水溶液、有機溶液、及び／又は尿素で洗浄する工程ｄ）を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
有機溶液が、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＣＨ３ＯＨ）、ヘキサン（Ｃ６Ｈ１４）、ジエチルエーテル（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）及び／又はイソプロパノール（Ｃ３Ｈ８Ｏ）を含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質が、工程ｂ）での少なくとも１つの塩基を含む水溶液の添加の後でも１０分〜４０分の期間にわたって１５℃〜２５℃の温度で少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が依然として不溶性である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
不溶性の標的タンパク質が、少なくとも８５％の前記標的タンパク質からなるタンパク質凝集体を形成する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
不溶性の標的タンパク質が、少なくとも２つの同一の反復単位を含むシルクタンパク質、コラーゲン及びケラチンからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
シルクタンパク質が、各々が、
ｉ）ＧＰＧＸＸ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸、又はそれぞれの場合で独立してＡ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、
ｉｉ）ＧＧＸ（ここでＸは任意のアミノ酸、又はそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｎ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、及び
ｉｉｉ）Ａｘ（ここでｘは５〜１０の整数である）
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも１つ含む少なくとも２つの同一の反復単位を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
反復単位が独立して、モジュールＡ（配列番号２０）、モジュールＣ（配列番号２１）、モジュールＱ（配列番号２２）、モジュールＫ（配列番号２３）、モジュールｓｐ（配列番号２４）、モジュールＳ（配列番号２５）、モジュールＲ（配列番号２６）、モジュールＸ（配列番号２７）若しくはモジュールＹ（配列番号２８）、又はその変異体から選択される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
シルクタンパク質が少なくとも１つの非反復（ＮＲ）単位を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＮＲ単位が、ＮＲ３（配列番号４１）若しくはその変異体、又はＮＲ４（配列番号４２）若しくはその変異体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
シルクタンパク質が、ＡＤＦ−３（配列番号１）又はその変異体、ＡＤＦ−４（配列番号２）又はその変異体、ＭａＳｐ  Ｉ（配列番号４３）又はその変異体、ＭａＳｐ  ＩＩ（配列番号４４）又はその変異体、（Ｃ）ｍ、（Ｃ）ｍＮＲｚ、ＮＲｚ（Ｃ）ｍ、ＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚ、（ＡＱ）ｎ、（ＡＱ）ｎＮＲｚ、ＮＲｚ（ＡＱ）ｎ、ＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ、ＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ、（ＱＡＱ）ｏＮＲｚ、Ｙｐ、Ｘｐ、及びＫｐ（ここで、ｍは２〜６４の整数であり、ｎは６〜２４の整数であり、ｏは８〜１６の整数であり、ｐは８〜１６の整数であり、ｚは１〜３の整数であり、ＮＲは非反復単位を表す）からなる群から選択される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
シルクタンパク質が、Ｃ１６ＮＲ４、Ｃ３２ＮＲ４、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、Ｃ３２、ＮＲ４Ｃ１６ＮＲ４、ＮＲ４Ｃ３２ＮＲ４、ＮＲ３Ｃ１６ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ３２ＮＲ３、ＮＲ４（ＡＱ）１２ＮＲ４、ＮＲ４（ＡＱ）２４ＮＲ４、ＮＲ３（ＡＱ）１２ＮＲ３、ＮＲ３（ＡＱ）２４ＮＲ３、（ＱＡＱ）８又は（ＱＡＱ）１６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
シルクタンパク質が、ＴＡＧＣＹＳ１（配列番号３５）、ＴＡＧＣＹＳ２（配列番号３６）、ＴＡＧＣＹＳ３（配列番号３７）、ＴＡＧＬＹＳ１（配列番号３８）及びＴＡＧＬＹＳ２（配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ末端及び／又はカルボキシ末端のＴＡＧを更に含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
４℃〜６０℃、又は１５℃〜４０℃の温度で実施する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
１０ｋＰａ〜１０００ｋＰａ、又は５０ｋＰａ〜１５０ｋＰａの圧力で実施する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により入手可能な不溶性の標的タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法に関する。本発明は、上記方法により入手可能な不溶性の標的タンパク質にも関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞、例えば微生物細胞の懸濁液から、及び／又は他の不純物から標的タンパク質を単離するシステムが以前に開発されており、このため従来技術の知識を表す。
【０００３】
例として、イオン交換クロマトグラフィ又はサイズ排除クロマトグラフィのようなクロマトグラフィ技法を適用する、可溶性の標的タンパク質の精製及び単離のための標準的なタンパク質精製法が言及される（非特許文献１）。今日適用される他の技術はとりわけ、液液相分離及び限外濾過である（非特許文献１）。変更を加えて、これらの基本的な精製プロセスを、科学目的又は産業目的に要求されるほとんどのタンパク質を精製するように修正することができるが、それらは概して非常に費用が高く、複雑であり、また時間がかかる。
【０００４】
特にシルクタンパク質を扱う特別な方法が非特許文献２で説明されている。この文献では、標的タンパク質の沈殿工程後の宿主細胞タンパク質の熱変性を利用するが、クロマトグラフィによる精製方法を欠いた技法を、技術的用途のために組換えスパイダーシルクタンパク質の精製に適用するのに成功した。シルクタンパク質が自己凝集しやすいことから、この方法には、標的タンパク質のかなりの割合が沈殿し、喪失するために、可溶性タンパク質の精製方法には利用することができないという問題がある。
【０００５】
記載の方法はほとんどの可溶性タンパク質では上手くいくが、凝集傾向があるタンパク質を扱う際には重大な欠点が生じることが明らかである。かかる凝集傾向があるタンパク質は或る特定期間にわたって、溶液中に沈殿しやすく、安定した、多くの場合不溶性のタンパク質凝集体を生じる。これらのタンパク質凝集体は記載の可溶性タンパク質の分画精製プロセスではこれ以上単離することができない。そのため発酵時間及び／又は精製時間は一般的に不要な沈殿を避けるのに重要なパラメータである。上記タンパク質凝集体を、幾つかの洗浄剤を用いて可溶化することができることが知られているが、かかる可溶化がタンパク質収率とタンパク質の質に悪影響を与えることも知られている。加えて、長期間にわたってのタンパク質凝集体の完全な可溶化はほぼ不可能である。
【０００６】
このため、凝集傾向がある標的タンパク質、及び／又は既に凝集した標的タンパク質に対する精製／単離方法を開発する必要があり、該方法は上記標的タンパク質を完全に可溶化することなく、不溶性の宿主細胞タンパク質及び他の残余物を含む画分から、凝集傾向がある標的タンパク質の画分及び／又は凝集した標的タンパク質の画分を分離することに焦点を合わせている。かかる精製方法は高い収率及び高い質で宿主細胞、例えば微生物細胞、及び／又は他の細胞残余物の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離することを可能にするものとする。またかかる精製方法は費用対効果がよく、迅速で、簡単かつ再現性のあるものとする。
【０００７】
本発明者らは驚くべきことに、標的タンパク質が不溶性であり、全ての又はほとんど全ての他の不溶性の宿主細胞タンパク質、宿主細胞残余物、及び／又は他の潜在的に発酵に関連する不純物を可溶化するのに必要である或る特定の条件下で依然として不溶性であること、並びにこれにより、上記標的タンパク質の不要な可溶化のために又は他の交差反応のために、かなりの量の上記標的タンパク質を失うことなく、ごく少数の精製工程でこれらの標的タンパク質の分離及び精製が可能になることを見出している。
【０００８】
驚くべきことに、不溶性の標的タンパク質の好ましくは少なくとも８０％の純度までの精製は、本発明の方法に従って、可溶化した不溶性の宿主細胞部から不溶性の標的タンパク質を分離することにより達成することができる。一部の不溶性の宿主細胞部が完全に溶解せずに、懸濁液中に残っていても、これらの懸濁した宿主細胞部の比密度が不溶性の標的タンパク質のものより低いため、効率的な分離を達成することができ、これにより遠心分離、沈降及び／又は濾過による効率的な分離が可能になる。
【０００９】
本発明の方法は、既知の精製技法と比較して幾つかの顕著な利点を与える。例えば、本発明の方法は複雑な精製工程の数を減らし、そのため迅速で信頼性があり、精製方法を行うのに容易である。加えて、上記方法は高い収率及び質での不溶性の標的タンパク質の精製／単離を可能にする。上記方法は従来の方法と比較した劇的な費用の削減を可能にする。加えて、上記方法は環境にやさしい。
【００１０】
本発明の方法はごく少数の方法工程を含むが、或る特定の標的タンパク質が不溶性であり、適用される条件下で不溶性のままであることをこれまでに完全に予測することができなかった。特にバックグラウンドに対して考慮した場合、タンパク質及び細胞に接したバイオリアクター及び反応タンクを洗浄し、きれいにするのには、適用する塩基濃度（約０．１ＭのＮａＯＨ）が一般的に用いられる。このため、これらの条件を大規模で不溶性の標的タンパク質を精製するのにも適用することができることは、ほとんど自明とはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Guide to Protein Purification, Academic Press Vol. 182, 1990
【非特許文献２】Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612
【発明の概要】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ／又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％が可溶化する、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の方法により入手可能な不溶性の標的タンパク質に関する。
【００１４】
この発明の概要は必ずしも本発明の特徴を全て記載しているわけではない。
【００１５】
本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されない（なぜなら、これらの方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るものであるためである）ことを理解するべきである。本明細書で用いられる専門用語は特定の実施の形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されず、該範囲は添付の特許請求の範囲でのみ限定されることも理解すべきである。本明細書で他に特に規定されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００１６】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、"A multilingual glossary ofbiotechnological terms: （IUPAC Recommendations）", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H.編（1995）, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）で記載されるように定義される。
【００１７】
幾つかの文献が本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列寄託書等を含む）の各々が、上記又は下記に関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことの承認として解釈されない。
【００１８】
以下で本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施の形態とともに挙げるが、付加的な実施の形態を作り出すために任意の様式で及び任意の数で該要素を組み合わせることができることを理解すべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施の形態は、本発明を明示的に記載された実施の形態のみに限定するものとは解釈されるべきではない。本記載は明示的に記載された実施の形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施の形態を支持及び包含するものと理解されるべきである。さらに、本願において記載されたあらゆる要素の任意の並べ替え及び組合せは、文脈上他の意味を示していない限り、本願の記載により開示されているとみなすものとする。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解する必要がある場合を除き、「含む（comprise）」という言葉、及びその変化形（variations such as "comprises"and "comprising"）は、記載の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含する意図はあるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除する意図はないと理解される。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形（the singular forms "a","an", and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り複数の対象を含む。
【００２１】
２つ以上のポリペプチドにおける残基は、該残基がポリペプチド構造において類似の位置を占める場合、互いに「対応する」といわれる。２つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造類似性に基づきポリペプチド配列をアラインメントすることにより決定することができることが当該技術分野で既知である。かかるアラインメントツールは当業者にとって既知であり、例えばワールドワイドウェブ上で入手することができる（例えば、標準的な設定、好ましくはＡｌｉｇｎでは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、行列：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始（Gap Open）１０．０、ギャップ伸長（Gap Extend）０．５を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html））。
【００２２】
第１の態様では、本発明は、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ／又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％が可溶化する、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
【００２３】
例えば、本発明は、破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％が可溶化する、破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
【００２４】
さらに、例えば、本発明は、無傷の宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％が可溶化する、無傷の宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
【００２５】
本発明者らは驚くべきことに、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液に存在する不溶性の標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質が、無傷の宿主細胞を破壊するのに、及び／又は全ての若しくはほとんど全ての他の不溶性の宿主細胞部、例えば不溶性の宿主細胞タンパク質、宿主細胞壁、宿主細胞残余物、若しくは他の潜在的に発酵に関連する不純物（例えば発酵残余物）を可溶化するのに要求される或る特定の条件下で不溶性のままであること、並びにこれにより、上記不溶性の標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質を、かなりの量のタンパク質を失うことなく、ごく少数の精製工程で上記懸濁液から簡単に分離及び精製することができることを見出している。
【００２６】
詳細には、本発明者らは、不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質の分離が、少なくとも１つの塩基（例えばＮａＯＨ）を低濃度で（例えば０．０５ＭのＮａＯＨ）含む水溶液を、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液に添加することにより達成することができることを予期せず見出している。本発明者らは、少なくとも１つの塩基を含む水溶液が、不溶性の標的タンパク質に影響を与えることなく、宿主細胞を破壊し、かつ／又は不溶性の宿主細胞タンパク質及び残留する細胞残屑を可溶化することを発見している。
【００２７】
発明者らは、この工程の後、対象の不溶性の標的タンパク質を精製するために、可溶化した不溶性の宿主細胞部を含む液相から不溶性の標的タンパク質を含む固相を例えば遠心分離及び／又は濾過により分離すること、並びに任意で標的タンパク質沈殿物を洗浄することだけが要求されることを更に解明している。得られる精製した不溶性の標的タンパク質を更にプロセシングすることなく科学用途又は産業用途に直接使用することができる。
【００２８】
発明者らは驚くべきことに、本発明の方法を用いて、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％、最も好ましくは少なくとも９９．９％又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度を有する不溶性の標的タンパク質を単離することができることを確認している。本発明の方法で単離した不溶性の標的タンパク質の大部分は更なる精製工程を必要としない。したがって本発明の方法は、非常に費用が節約され、かつ効果的な精製方法を表す。
【００２９】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質等のシルクタンパク質又はその変異体を含む細胞を表す。上記標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質等のシルクタンパク質又はその変異体はポリヌクレオチドで、好ましくは単離ポリヌクレオチドでコードされるものとする。上記ポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれて、又は（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡに取り込まれて、宿主細胞内に見出すことができる。宿主細胞を対象の標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質等のシルクタンパク質又はその変異体をコードするポリヌクレオチドの増幅及び発現に使用することができる。
【００３０】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）その自然環境から単離した、（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された、及び／又は（ｉｉｉ）全部若しくは一部が合成されたポリヌクレオチドを表し、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子（センス鎖及びアンチセンス鎖の両方）を包含する。この用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び組換えＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドは全遺伝子又はその一部分からなり得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施の形態では、上述のポリヌクレオチドは対象の標的タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドである。「組換えポリヌクレオチド」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された又はそうでなければ操作されたポリヌクレオチドを表す。上記組換えポリヌクレオチドでコードされる標的タンパク質は組換え標的タンパク質と指定することができる。上記組換えポリヌクレオチド及び／又は上記組換え標的タンパク質を含む宿主細胞は組換え宿主細胞と指定することができる。
【００３２】
「組換えベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージベクター等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）ベクター等の人工染色体ベクターを含む当業者に既知の任意のベクターを包含する。上記ベクターは発現ベクター及びクローニングベクターを包含する。発現ベクターはプラスミドベクター及びウイルスベクターを包含し、一般的には所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば細菌、酵母又は植物）における、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系における操作可能に連結したコード配列の発現に必要である適切なＤＮＡ配列を含有する。クローニングベクターは、或る特定の所望のＤＮＡ断片を遺伝子操作し、増幅させるのに一般的に用いられ、所望のＤＮＡ断片の発現に必要となる機能的な配列を欠いている場合がある。
【００３３】
本発明の好ましい実施の形態では、対象の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに含まれ、宿主細胞におけるその発現を調節するために発現制御配列と操作可能に連結するか、又は宿主細胞におけるその増幅を可能にするためにクローニングベクターに含まれる。対象の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むクローニングベクター又は発現ベクターは通常、形質転換又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入される。
【００３４】
本発明の好ましい実施の形態では、宿主細胞は、細菌宿主細胞若しくは酵母宿主細胞等の微生物宿主細胞、植物宿主細胞又は昆虫宿主細胞である。
【００３５】
本発明との関連では、「微生物宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物起源の細胞、例えばグラム陰性細菌細胞若しくはグラム陽性細菌細胞等の細菌細胞、例えばエシェリキア属（例えば大腸菌（Escherichia coli））、アナベナ属、カウロバクター属、グルコノバクター属、ロドバクター属、シュードモナス属、パラコッカス属、バチルス属（例えばバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis））、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、リゾビウム属（シノリゾビウム属）、フラボバクテリウム属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、メチロバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、スタフィロコッカス属若しくはストレプトミセス属の細胞、又は有子嚢胞子酵母（エンドミセス目）細胞、担子菌酵母細胞、若しくは不完全菌類（分芽菌）に属する細胞、例えばカンジダ属、ハンゼヌラ属、クリベロミセス属、サッカロミセス属（例えばサッカロミセス・セロビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、シゾサッカロミセス属、ピチア属（例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris））若しくはヤロウイア属の細胞等の酵母細胞を表す。
【００３６】
本発明との関連では、「昆虫宿主細胞」という用語は、ヨトウガ（Spodopterafrugiperda）又はキンウワバ（Trichoplusia ni）の細胞等の昆虫起源の細胞を表す。好ましくは、昆虫細胞はＳＦ９細胞、ＳＦ−２１細胞又はＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞である。ＳＦ−９細胞及びＳＦ−２１細胞はヨトウガ由来の卵巣細胞である。Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞はキンウワバ由来の卵細胞である。
【００３７】
本発明との関連では、「植物宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、タバコ、ジャガイモ又はエンドウの細胞等の植物起源の細胞を表す。
【００３８】
「無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液」という用語は、本明細書で使用される場合、無傷の又は破壊された宿主細胞を含有する不均一流体を表す。無傷の又は破壊された細胞を懸濁させる流体は、発酵培地、培養培地、水溶液、例えば緩衝水溶液、工業用Ｈ２Ｏ又は脱イオンＨ２Ｏであり得る。緩衝水溶液は例えば、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌであり得る。緩衝水溶液のｐＨは、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、より好ましくはｐＨ６．７〜ｐＨ７．２、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌでは、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５又はｐＨ８．０であり得る。緩衝水溶液は、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ〜２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、例えば１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌの溶液であるのが好ましく、上記緩衝水溶液は好ましくは、５．０〜９．０のｐＨ、より好ましくは６．０〜８．０のｐＨ、最も好ましくは６．７〜７．２のｐＨ、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌでは、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５又はｐＨ８．０を有する。培養培地は最小培地又は塩培地であり得る（例えば、Korz et al. Journal of Biotechnology 39, 1995, 59-65を参照されたい）。懸濁液中での無傷の又は破壊された宿主細胞に対する流体の割合は、例えば５％〜９５％と異なり得る。このため、「無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液」という用語は、流体と無傷の又は破壊された宿主細胞との割合が、５％：９５％、１０％：９０％、１５％：８５％、２０％：８０％、２５％：７５％、３０％：７０％、３５％：６５％、４０％：６０％、４５％：５５％、５０％：５０％、５５％：４５％、６０％：４０％、６５％：３５％、７０％：３０％、７５％：２５％、８０％：２０％、８５％：１５％、９０％：１０％、又は９５％：５％であり得る懸濁液を包含する。
【００３９】
本発明との関連では、「無傷の宿主細胞の懸濁液」という用語は、流体中、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、工業用水、脱イオン水、培養培地又は発酵培地中に懸濁した、無傷の、一般的には溶解していない宿主細胞、例えば微生物宿主細胞、植物宿主細胞又は昆虫宿主細胞を包含する。「破壊された宿主細胞の懸濁液」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞壁が破壊され又は大部分が溶解し、流体中、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、工業用水、脱イオン水、培養培地又は発酵培地中に懸濁した宿主細胞、例えば微生物宿主細胞、植物宿主細胞又は昆虫宿主細胞を包含する。「破壊された宿主細胞の懸濁液」は、（ｉ）非機械的な細胞破壊（例えば酵素による細胞溶解、細胞壁及び／若しくは細胞膜を溶解／部分的に溶解するための若しくは開裂／部分的に開裂させるための化学試薬による細胞処理、又は浸透圧を用いた細胞破砕）、（ｉｉ）機械的な細胞破壊（例えば機械による粉砕又はボールミル抽出）、（ｉｉｉ）高圧均質化、又は（ｉｖ）超音波処理により、及びそれらの組合せにより調製することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施の形態では、工程ａ）で準備される無傷の宿主細胞、例えば細菌宿主細胞等の微生物宿主細胞が、好ましくは例えば遠心分離又は濾過による培養培地からの上記細胞の分離後、５％〜２０％の、好ましくは５％、１０％、１５％又は２０％の（例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％の）含水量を有する懸濁液中に、すなわち細胞沈降物中に存在する。本発明の別の好ましい実施の形態では、破壊された宿主細胞、例えば細菌宿主細胞等の微生物宿主細胞が、好ましくは例えば遠心分離又は濾過による培養培地からの上記の破壊された、例えば溶解した若しくは超音波処理した細胞の分離後、５％〜２０％の、好ましくは５％、１０％、１５％又は２０％の（例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％の）含水量を有する懸濁液中に、すなわち細胞沈降物中に存在する。
【００４１】
工程ａ）で準備される無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液中における可溶性の宿主細胞部、例えば細胞小器官、可溶性の宿主細胞タンパク質若しくは可溶性の宿主細胞残余物の、及び／又は他の可溶性成分、例えば可溶性の発酵に関連する不純物、発酵培地の可溶性部若しくは培養培地の可溶性部の量が異なり得ることに留意すべきである。例えば、（ｉ）遠心分離若しくは濾過により培養培地若しくは発酵培地から無傷の若しくは破壊された宿主細胞を分離することにより生じた、５％〜１０％の含水量を有する無傷の若しくは破壊された宿主細胞の細胞沈降物中における、又は（ｉｉ）上記細胞沈降物を再懸濁させる水溶液中における可溶性の宿主細胞部の及び／又は他の可溶性成分の量は、（ｉ）培養培地若しくは発酵培地中の無傷の宿主細胞の懸濁液中における、又は（ｉｉ）培養培地若しくは発酵培地中の破壊された宿主細胞の懸濁液中における可溶性の宿主細胞部の及び／又は他の可溶性成分の量と比較してより低い。可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性成分は、懸濁液、例えば特に破壊された宿主細胞の細胞ペレットを、続く工程ａ）で準備される水溶液で洗浄するとともに、再懸濁させる場合には水溶液中には存在しない可能性もある。
【００４２】
「宿主細胞（例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞）の懸濁液」は、培養物において又は発酵中に宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞を培養することにより準備／作製することができる。標的タンパク質の生成を、宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞を効率的に培養することができるバイオリアクター内で行うことができる。３つの交差発酵戦略（intersecting fermentation strategies）を適用することができる：（ｉ）連続発酵、（ｉｉ）回分発酵又は（ｉｉｉ）半回分発酵。これらの発酵戦略を組み合わせることもできる。所望の標的タンパク質の最大の収率を、すなわちその高バイオマスを提供することにより得るためには、十分な栄養素を宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞に供給し、この処理を関連のプロセスパラメータ（例えば溶存酸素量、ｐＨ及び温度）の連続的なモニタリング及び適応と組み合わせることが要求され得る。標的タンパク質発現誘導系（例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導、糖又はその類似体による誘導、温度依存プロモータを用いた温度誘導、浸透圧により制御されるプロモータを用いた誘導、又は細胞内の代謝性変化により開始される誘導）を使用することができる。多くのパラメータが標的タンパク質の生成及びタンパク質の質に影響を及ぼし得る。特に不溶性の標的タンパク質の収率を増大させるために、より長期間の誘導期、インキュベーション温度の変更、栄養供給の最適化、及び／又は様々な種類の細胞ストレスを適用することができる。慎重に環境（例えば培地構成要素、発酵プロセス中の温度、発酵プロセス期間）を制御することにより、及び凝集の程度を最大とするのに適切な戦略を実行することにより、細胞の培養及び精製プロセス中に生じる標的タンパク質凝集体の量に影響を与えることも可能であり得る。
【００４３】
「宿主細胞（例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞）の懸濁液」は、例えば遠心分離又は濾過により培養培地から分離された、培養した宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞を水溶液、例えば緩衝水溶液中に、工業用水中に、又は脱イオン水中に再懸濁することにより準備／作製することもできる。植物細胞の懸濁液は、例えば上記植物細胞を上記植物から抽出することにより又は植物全体を破壊することにより植物全体から得られた植物細胞を水溶液、例えば緩衝水溶液中に、工業用水中に、又は脱イオン水中に懸濁することにより準備／作製（produced）することもできる。
【００４４】
無傷の宿主細胞の懸濁液を本発明の方法の工程ａ）で準備することができる場合、上に記載の宿主細胞懸濁液のうちの１つを直接使用することができる。破壊された宿主細胞の懸濁液を本発明の方法の工程ａ）で準備することができる場合、まず上に記載の懸濁液のうちの１つに含まれる（無傷の）宿主細胞を、例えば非機械的な細胞破壊方法又は機械的な細胞破壊方法（上記を参照されたい）を用いて破壊することができる。
【００４５】
本発明との関連では、「不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む破壊された宿主細胞の懸濁液」という用語は、破壊された宿主細胞由来の不溶性の標的タンパク質と、不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の細胞壁部又は不溶性の細胞残屑）とを直接含む懸濁液、例えば培養培地、緩衝水溶液、工業用水又は脱イオン水を表す。これと対比して、「不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の宿主細胞の懸濁液」という用語は、本明細書で使用される場合、不溶性の標的タンパク質と、不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の細胞壁又は不溶性の宿主細胞タンパク質）とが含まれる無傷の宿主細胞を含む懸濁液、例えば培養培地、水溶液（例えば緩衝水溶液）、工業用水又は脱イオン水を表す。
【００４６】
「不溶性の宿主細胞部」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞、例えば微生物、植物若しくは昆虫の宿主細胞の、又は標的タンパク質を発現するのに用いられる発現系の一部である、不溶性の宿主細胞タンパク質、細胞壁、細胞膜、細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、及び／又は不溶性の細胞質内封入体（例えばシュウ酸カルシウム又は二酸化ケイ素の結晶、デンプン、グリコーゲン又はポリヒドロキシブチレート等のエネルギー貯蔵物質の顆粒）を表す。この用語には本発明の不溶性の標的タンパク質は包含されない。「不溶性の宿主細胞部」という用語は更に、工程ａ）に存在する条件下で不溶性であり、工程ｂ）に存在する条件下で可溶化する宿主細胞部を表す。
【００４７】
「可溶性の宿主細胞部」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞、例えば微生物、植物若しくは昆虫の宿主細胞の、又は標的タンパク質を発現するのに用いられる発現系の一部である、可溶性の宿主細胞タンパク質、細胞小器官、細胞小器官の一部、及び／又は他の可溶性の細胞構成要素を表す。「可溶性の宿主細胞部」という用語は更に、工程ａ）に存在する条件下で既に可溶性であり、工程ｂ）に存在する条件下でも可溶性のままである宿主細胞部を表す。
【００４８】
「標的タンパク質」という用語は、本発明に関して使用される場合、宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞の懸濁液から単離することができる、対象のタンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質若しくは昆虫シルクタンパク質等のシルクタンパク質、コラーゲン、レシリン、又はケラチンを表す。好ましい実施の形態では、上記標的タンパク質は、組換え標的タンパク質、より好ましくは組換えポリヌクレオチドでコードされる組換え標的タンパク質である。更なる実施の形態では、組換え標的タンパク質は、スパイダーシルクタンパク質と昆虫シルクタンパク質とのハイブリッドタンパク質、スパイダーシルクタンパク質とコラーゲンとのハイブリッドタンパク質、スパイダーシルクタンパク質とレシリンとのハイブリッドタンパク質、又はスパイダーシルクタンパク質とケラチンとのハイブリッドタンパク質である。上記標的タンパク質が上記宿主細胞において組換えにより生成されるのが特に好ましい。
【００４９】
好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、宿主細胞において、又は懸濁液中で、例えば培養培地中で、水溶液（例えば緩衝水溶液）中で、工業用水中で若しくは脱イオン水中で標的タンパク質凝集体を形成する性質を有する反復単位／ドメインを含むタンパク質である。
【００５０】
別の好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、宿主細胞において、又は懸濁液中で、例えば細胞培養培地中で、水溶液（例えば緩衝水溶液）中で、工業用水中で若しくは脱イオン水中で標的タンパク質凝集体の形態で存在する。かかる標的タンパク質凝集体を、細胞足場又は他の細胞内機構に影響を与えることなく、宿主細胞において標的タンパク質の自己凝集により形成することができる。
【００５１】
特に、標的タンパク質凝集体を、細胞足場又は他の細胞内機構に影響を与えることなく、集団又は固体塊への標的タンパク質の多重コピー／単位の自己凝集により形成することができる。標的タンパク質凝集体を、懸濁液中での、例えば細胞培養培地中での、水溶液（例えば緩衝水溶液）中での、工業用水中での又は脱イオン水中での標的タンパク質の自己凝集により形成することもできる。標的タンパク質凝集体を、標的タンパク質分子間の共有結合性又は非共有結合性の相互作用を含み得る幾つかの機構により形成することができる。
【００５２】
好ましくは、標的タンパク質凝集体は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のこの標的タンパク質からなり、上記標的タンパク質の多重コピーの凝集により形成される。上記標的タンパク質凝集体は、非特異的な凝集体内で標的タンパク質が共局在化したものであるだけでなく、少なくとも８５％、又は更には１００％のこの標的タンパク質からなり、標的タンパク質の自己凝集への選好性が示されることは驚くべきことであった。
【００５３】
「不溶性の標的タンパク質」という用語、又は「不溶性の標的タンパク質凝集体」という用語は、本明細書で使用される場合、懸濁液、例えば細胞培養培地、発酵培地、水溶液（例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）等の緩衝水溶液）、工業用水又は脱イオン水に可溶性ではなく、そのため例えば遠心分離及び／又は濾過により上記懸濁液に存在する可溶性の宿主細胞部から分離することができる標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体を表す。加えて、「不溶性の標的タンパク質」という用語、又は「不溶性の標的タンパク質凝集体」という用語は、本明細書で使用される場合、懸濁液、例えば細胞培養培地、発酵培地、水溶液（例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）等の緩衝水溶液）、工業用水又は脱イオン水に不溶性である他の宿主細胞部が、塩基（例えば０．０５ＭのＮａＯＨ）を含む水溶液の上記懸濁液への添加後に可溶性になる一方で、塩基を含む水溶液の上記懸濁液への添加後でも、懸濁液、例えば細胞培養培地、発酵培地、水溶液（例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）等の緩衝水溶液）、工業用水又は脱イオン水に可溶性ではなく、そのため例えば遠心分離及び／又は濾過により上記懸濁液に存在する可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる、標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体を表す。
【００５４】
不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体は、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ〜２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、例えば１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌの緩衝水溶液に不溶性であり、上記緩衝水溶液は好ましくは、５．０〜９．０のｐＨ、より好ましくは６．０〜８．０のｐＨ、最も好ましくは６．７〜７．２のｐＨ、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌでは、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５又はｐＨ８．０を有するのが好ましい。
【００５５】
例えば本発明の方法の工程ａ）で、無傷の宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞の懸濁液を準備する場合、少なくとも１つの塩基を含む水溶液を、上記宿主細胞を不溶性の宿主細胞部へと破壊し、かつ上記不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％が可溶化するような程度まで上記不溶性の宿主細胞部を更に可溶化するのに十分な／要求される量で工程ｂ）において添加する。さらには例えば、本発明の方法の工程ａ）で、既に破壊された宿主細胞、例えば微生物、植物又は昆虫の宿主細胞の懸濁液、すなわち破壊された細胞由来の不溶性の宿主細胞部を含む懸濁液を準備する場合、少なくとも１つの塩基を含む水溶液を、不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％が可溶化するような程度まで上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な／要求される量で工程ｂ）において添加する。
【００５６】
当業者は、塩基を含む水溶液がどのくらいの量で、宿主細胞、例えば微生物、植物若しくは昆虫の宿主細胞を破壊し、かつ／又は上記不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％が可溶化するような程度まで、不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分である／要求されるかを、例えば（ｉ）選択された塩基、例えばＮａＯＨの段階希釈（dilution series）を行い、（ｉｉ）選択された塩基（例えばＮａＯＨ）を無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液に幾つかの濃度で添加し（例えば０．０１ＭのＮａＯＨ、０．０２ＭのＮａＯＨ、０．０３ＭのＮａＯＨ、０．０４ＭのＮａＯＨ、０．０５ＭのＮａＯＨ、０．０６ＭのＮａＯＨ、０．０７ＭのＮａＯＨ、０．０８ＭのＮａＯＨ、０．０９ＭのＮａＯＨ、０．１ＭのＮａＯＨ、０．２ＭのＮａＯＨ、０．３ＭのＮａＯＨ、０．４ＭのＮａＯＨ、０．５ＭのＮａＯＨ、０．６ＭのＮａＯＨ、０．７ＭのＮａＯＨ、０．８ＭのＮａＯＨ、０．９ＭのＮａＯＨ、又は１ＭのＮａＯＨという最終濃度のＮａＯＨ）、（ｉｉｉ）例えば遠心分離又は濾過により不溶性の標的タンパク質を完全に又は部分的に可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離し、（ｉｖ）例えば遠心分離物又は残余分における分離した不溶性の標的タンパク質部分内の不溶性の宿主細胞部の部分を評価し、（ｖ）不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％を可溶化するのに十分な／要求される塩基の量を求めることにより容易に利用することができる。
【００５７】
「標的タンパク質が依然として不溶性である」という用語は、本明細書で使用される場合、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、例えば或る特定の期間にわたって、及び／又は特定の温度で、塩基を含む、上記懸濁液に、例えば上記水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままであり、このため例えば濾過及び／又は遠心分離による上記標的タンパク質の分離及び単離が可能である、標的タンパク質を表す。
【００５８】
本発明の好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、より好ましくは少なくとも９０分、最も好ましくは少なくとも１８０分の期間にわたって、例えば少なくとも５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、又は１８０分にわたって、塩基を含む、上記懸濁液に、例えば上記水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００５９】
本発明の更に好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で塩基を含む、上記懸濁液に、例えば上記水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００６０】
本発明のより好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で１０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で２０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で３０分の期間にわたって、水溶液中、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で４０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で５０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で６０分の期間にわたって、又は１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で９０分の期間にわたって、塩基を含む上記溶液、例えば上記水溶液、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が不溶性のままである。
【００６１】
本発明の最も好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び／若しくは水酸化カルシウム〔Ｃａ（ＯＨ）２〕等の金属水酸化物並びに／又はアンモニア（最終濃度は０．００５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．１Ｍ、最も好ましくは０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である）を含む、上記懸濁液に、例えば上記水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００６２】
標的タンパク質は、工程ｂ）における少なくとも１つの塩基を含む水溶液の添加後に、１５℃〜２５℃の温度で１０分〜４０分の期間にわたって、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は更には１００％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％が依然として不溶性であるのが特に好ましい。標的タンパク質は、工程ｂ）における少なくとも１つの塩基を含む水溶液の添加後に、２０℃〜２５℃の温度で２０分〜３０分の期間にわたって、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は更には１００％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％が依然として不溶性であるのが特により好ましい。
【００６３】
本発明の更に好ましい実施の形態では、依然として不溶性である標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質を、フィルター、例えば孔径０．１μＭ又は０．２２μＭのフィルターを用いて、及び／又は例えば２０分間〜３０分間の３０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離／単離する。
【００６４】
別の好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、標的タンパク質凝集体（例えばスパイダーシルクタンパク質凝集体等のシルクタンパク質凝集体）の形態で依然として不溶性である。このため、「標的タンパク質凝集体が依然として不溶性である」という用語は、例えば或る特定の期間にわたって、及び／又は特定の温度で、塩基を含む、懸濁液中で、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）中で、培養培地中で、発酵培地中で、工業用水中で、又は脱イオン水中で可逆的ではないか、又は０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％超が可逆的ではなく、このため例えば濾過及び／又は遠心分離による上記標的タンパク質凝集体の分離及び単離が可能である、標的タンパク質凝集体の形成を表す。
【００６５】
「標的タンパク質凝集体が依然として不溶性である」という用語は、例えば或る特定の期間にわたって、及び／又は特定の温度で、塩基を含む、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままであり、このため例えば濾過及び／又は遠心分離による上記標的タンパク質の分離及び単離が可能である、標的タンパク質凝集体も表す。
【００６６】
本発明のより好ましい実施の形態では、標的タンパク質凝集体の形成は、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基、例えば金属水酸化物及び／又はアンモニアを含む、懸濁液中で、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）中で、培養培地中で、発酵培地中で、工業用水中で、又は脱イオン水中で可逆的ではないか、又は０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％超が可逆的ではない。
【００６７】
本発明の別の実施の形態では、標的タンパク質凝集体は、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基、例えば金属水酸化物及び／又はアンモニアを含む、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施の形態では、標的タンパク質凝集体の形成は、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で１０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で２０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で３０分の期間にわたって、水溶液中、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で４０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で５０分の期間にわたって、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で６０分の期間にわたって、又は１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃若しくは４０℃の温度で９０分の期間にわたって、塩基、例えば金属水酸化物及び／又はアンモニアを含む、懸濁液中で、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）中で、培養培地中で、発酵培地中で、工業用水又は脱イオン水中で１０％超が可逆的ではない。
【００６９】
本発明の別の実施の形態では、標的タンパク質凝集体は、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば少なくとも５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び／若しくは水酸化カルシウム（ＣａＯＨ）等の金属水酸化物並びに／又はアンモニア（最終濃度は０．００５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．１Ｍ、最も好ましくは０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である）を含む、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００７０】
より好ましい実施の形態では、標的タンパク質は、繰り返しドメイン／反復単位を有する標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質等のシルクタンパク質）であり、タンパク質凝集体を形成する性質を有する。タンパク質凝集体が形成されると、上記タンパク質凝集体は好ましくは、懸濁液に、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基、例えば金属水酸化物及び／又はアンモニアを含む、上記懸濁液に、例えば上記水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が不溶性のままである。
【００７１】
依然として不溶性である標的タンパク質凝集体、例えばスパイダーシルクタンパク質凝集体は、例えば、肉眼、光学顕微鏡若しくは電子顕微鏡を用いることにより離散した粒子として視認可能であり、かつ／又はフィルター、例えば孔径０．１μＭ若しくは０．２２μＭのフィルターにより、可溶化した不溶性の宿主細胞部から取り出す／分離することができる。
【００７２】
好ましくは、不溶性の標的タンパク質は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％、又は更には１００％、例えば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％の上記標的タンパク質からなるタンパク質凝集体を形成する。「少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％、又は更には１００％のこの標的タンパク質からなる標的タンパク質凝集体」という用語は、本発明との関連で使用される場合、標的タンパク質凝集体がこの標的タンパク質の多重コピー／単位の凝集により形成されること、及びこの凝集体が少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％、又は更には１００％の上記標的タンパク質からなることを意味する。
【００７３】
本発明の方法の工程ｂ）を標的タンパク質が依然として不溶性である期間にわたって実施するのが好ましい。
【００７４】
本発明の方法の工程ｂ）を５分〜１８０分、好ましくは１０分〜９０分、最も好ましくは１０分〜４０分の期間にわたって、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、若しくは１８０分にわたって実施するのがより好ましい。例えば、本発明の方法の工程ｂ）を、例えば２０℃〜２５℃の温度で無傷の細菌宿主細胞の培養培地由来の不溶性の宿主細胞部を可溶化するために３０分〜１８０分の期間にわたって実施する。
【００７５】
好ましくは、本発明の方法で単離／分離した不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体は、少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度を有する。
【００７６】
単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度は好ましくは、その少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が（ｉ）不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の宿主細胞タンパク質、細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑及び／又は細胞質内封入体）、及び／又は可溶性の宿主細胞部（例えば可溶性の宿主細胞タンパク質、細胞小器官及び／又は細胞構成要素の一部）を含まない、より好ましくは（ｉ）不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の宿主細胞タンパク質、細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑及び／又は細胞質内封入体）、及び／又は可溶性の宿主細胞部（例えば可溶性の宿主細胞タンパク質、細胞小器官及び／又は細胞構成要素の一部）と、（ｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（例えばミネラル及び／又は微量元素等の発酵／培養に関連する不純物）とを含まないことを意味する。
【００７７】
さらに、単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度はより好ましくは、その少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％が（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質を含まない、最も好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素とを含まない、更に最も好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素と、（ｉｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（例えばミネラル及び／又は微量元素等の発酵／培養に関連する不純物）とを含まないことを意味する。
【００７８】
代替的には、単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度は好ましくは、それが僅か５０％又は４０％、より好ましくは僅か３０％又は２０％、最も好ましくは僅か１０％、５％又は０％、例えば５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％の（ｉ）不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の宿主細胞タンパク質、細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑及び／又は細胞質内封入体）、及び／又は可溶性の宿主細胞部（例えば可溶性の宿主細胞タンパク質、細胞小器官及び／又は細胞構成要素の一部）しか含まない、より好ましくは（ｉ）不溶性の宿主細胞部（例えば不溶性の宿主細胞タンパク質、細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑及び／又は細胞質内封入体）、及び／又は可溶性の宿主細胞部（例えば可溶性の宿主細胞タンパク質、細胞小器官及び／又は細胞構成要素の一部）と、（ｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（例えばミネラル及び／又は微量元素等の発酵／培養に関連する不純物）としか含まないことを意味する。
【００７９】
さらに、単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の少なくとも５０％又は６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の純度はより好ましくは、それが僅か５０％又は４０％、より好ましくは僅か３０％又は２０％、最も好ましくは僅か１０％、５％又は０％、例えば５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％の（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質しか含まない、最も好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素としか含まない、更に最も好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素と、（ｉｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（例えばミネラル及び／又は微量元素等の発酵／培養に関連する不純物）としか含まないことを意味する。
【００８０】
当業者は本発明の方法で単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の純度を求める技法を認識している。
【００８１】
単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の純度を、（ｉ）分光分析、好ましくは質量分光分析（ＭＳ）、（ｉｉ）クロマトグラフィ、好ましくは液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、より好ましくは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、（ｉｉｉ）ゲル電気泳動、好ましくはＳＤＳゲル電気泳動、（ｉｖ）ウェスタンブロット法／イムノブロット分析、又は（ｖ）それらの組合せを用いて測定するのが好ましい。
【００８２】
クロマトグラフィ、好ましくは液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、より好ましくは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を、分光分析、好ましくは質量分光分析（ＭＳ）と組み合わせるのが好ましい。したがって単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の純度を、液体クロマトグラフィ−質量分光分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定するのが好ましく、高速液体クロマトグラフィ−質量分光分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を用いて測定するのがより好ましい。
【００８３】
好ましくは、本発明の方法で単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の純度を乾燥重量ベースで算出する、例えば乾燥重量（ｗｔ／ｗｔ）ベースで％として表す。
【００８４】
単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の乾燥重量を、（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞部、より好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞部と（ｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（上記を参照されたい）との乾燥重量に対して算出するのが特に好ましい。
【００８５】
単離した不溶性の標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の乾燥重量を、（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質、より好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素との、最も好ましくは（ｉ）不溶性及び／又は可溶性の宿主細胞タンパク質と、（ｉｉ）不溶性の細胞壁部、細胞膜部、細胞骨格部、宿主細胞残屑、細胞質内封入体、細胞小器官の可溶性部及び／又は可溶性の細胞構成要素と、（ｉｉｉ）可溶性及び／又は不溶性の懸濁液残余物（例えばミネラル及び／又は微量元素等の発酵／培養に関連する不純物）との乾燥重量に対して算出するのが更に特に好ましい。
【００８６】
工程ｂ）における塩基を含む水溶液が、７〜１４、より好ましくは９〜１３、最も好ましくは１０〜１２のｐＨを有するのが好ましい。例えば、工程ｂ）における塩基を含む水溶液は、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、又は１４のｐＨを有する。
【００８７】
本発明の好ましい実施の形態では、塩基は金属水酸化物又はアンモニアである。本発明の別の好ましい実施の形態では、金属水酸化物及びアンモニアが使用される。好ましくは、金属水酸化物は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び水酸化カルシウム（ＣａＯＨ）、又はそれらの組合せからなる群から選択される。最も好ましくは、塩基は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。
【００８８】
好ましくは工程ｂ）における塩基の最終濃度は、０．００５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．１Ｍ、最も好ましくは０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である。例えば本発明の方法の工程ｂ）における塩基の最終濃度は、０．００５Ｍ、０．０１Ｍ、０．０１５Ｍ、０．０２Ｍ、０．０２５Ｍ、０．０３Ｍ、０．０３５Ｍ、０．０４Ｍ、０．０４５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０５５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０６５Ｍ、０．０７Ｍ、０．０７５Ｍ、０．０８Ｍ、０．０８５Ｍ、０．０９Ｍ、０．０９５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、又は１Ｍである。
【００８９】
本発明の方法の好ましい実施の形態では、工程ｂ）における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び／又は水酸化カルシウム（ＣａＯＨ）の最終濃度は、０．００５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．１Ｍ、最も好ましくは０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である。例えば本発明の方法の好ましい実施の形態の工程ｂ）における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、及び／又は水酸化カルシウム（ＣａＯＨ）の最終濃度は、０．００５Ｍ、０．０１Ｍ、０．０１５Ｍ、０．０２Ｍ、０．０２５Ｍ、０．０３Ｍ、０．０３５Ｍ、０．０４Ｍ、０．０４５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０５５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０６５Ｍ、０．０７Ｍ、０．０７５Ｍ、０．０８Ｍ、０．０８５Ｍ、０．０９Ｍ、０．０９５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、又は１Ｍである。
【００９０】
本発明の方法のより好ましい実施の形態では、工程ｂ）における塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）であり、工程ｂ）における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の最終濃度は、０．００５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜０．６Ｍ、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、又は０．０４Ｍ〜０．１Ｍ、最も好ましくは０．０４Ｍ〜０．０６Ｍの範囲である。例えば、本発明の方法の好ましい実施の形態の工程ｂ）における水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の最終濃度は、０．００５Ｍ、０．０１Ｍ、０．０１５Ｍ、０．０２Ｍ、０．０２５Ｍ、０．０３Ｍ、０．０３５Ｍ、０．０４Ｍ、０．０４５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０５５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０６５Ｍ、０．０７Ｍ、０．０７５Ｍ、０．０８Ｍ、０．０８５Ｍ、０．０９Ｍ、０．０９５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、又は１Ｍである。
【００９１】
好ましくは、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液、例えば細胞培養培地、発酵培地、水溶液（例えば緩衝水溶液）、又は５％〜２０％、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％の含水量を有する懸濁液、すなわち細胞沈降物と塩基を含む水溶液との割合は、３：１〜１：２０、より好ましくは１：１〜１：１０、最も好ましくは１：２〜１：４、例えば３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０の範囲である。
【００９２】
本発明の工程ｂ）を、１０分〜３０分の期間にわたって、好ましくは２０分〜３０分の期間にわたって２０℃〜２５℃の温度で、好ましくは２０℃の温度で、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍの最終濃度で、好ましくは０．０５Ｍの最終濃度で塩基として水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む水溶液を用いて実施するのが特に好ましい。
【００９３】
単離した不溶性の標的タンパク質の収率、純度及び／又は更なる加工性を改善させるために、本方法は、（ｉ）工程ｂ）の前での、（ｉｉ）工程ｂ）中での、及び／又は（ｉｉｉ）工程ｂ）の後での、例えば工程ｂ）の前での、工程ｂ）中での、工程ｂ）の後での、工程ｂ）の前と工程ｂ）中とでの、工程ｂ）の前と工程ｂ）の後とでの、工程ｂ）中と工程ｂ）の後とでの、又は工程ｂ）の前と、工程ｂ）中と、工程ｂ）の後とでの少なくとも１つの試薬の添加を更に含むのが好ましい。
【００９４】
好ましくは、試薬は、変性剤、コスモトロピック剤及び洗浄剤からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せである。
【００９５】
したがって本発明の好ましい実施の形態では、変性剤、コスモトロピック剤及び／又は洗浄剤を（ｉ）工程ｂ）の前に、（ｉｉ）工程ｂ）中に、及び／又は（ｉｉｉ）工程ｂ）の後に添加する。
【００９６】
変性剤は不溶性の宿主細胞部の可溶化を改善し、洗浄剤は宿主細胞、例えば微生物宿主細胞、植物宿主細胞又は昆虫宿主細胞の細胞壁及び／又は細胞膜を可溶化させるのを助ける。加えて、コスモトロピック剤は標的タンパク質凝集体を安定化させるのを助ける。
【００９７】
このため、工程ｂ）の前に、工程ｂ）中に、及び／又は工程ｂ）の後に、無傷の宿主細胞、例えば細菌又は植物の宿主細胞の懸濁液に、好ましくは残留する不溶性の宿主細胞部の可溶化を更に改善する変性剤と組み合わせて、細胞壁及び／又は細胞膜を可溶化させるのを助ける洗浄剤を添加するのが好ましい。したがって、工程ｂ）の前に、工程ｂ）中に、及び／又は工程ｂ）の後に、既に破壊された宿主細胞、例えば細菌又は植物の宿主細胞の懸濁液に、好ましくは不溶性の標的タンパク質凝集体を安定化させるコスモトロピック剤と組み合わせて、残留する不溶性の宿主細胞部の可溶化を改善する変性剤を添加するのも好ましい。
【００９８】
本発明者らは驚くべきことに、工程ｂ）の前での、工程ｂ）中の、及び／又は工程ｂ）の後での変性剤、コスモトロピック剤及び／又は洗浄剤の添加が、単離した不溶性の標的タンパク質の純度を、おおよそ最大で５％〜２０％、例えば最大で５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９若しくは２０％、及び／又は単離した不溶性の標的タンパク質の収率を、おおよそ最大で５％〜２０％、例えば最大で５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９若しくは２０％改善させることができることを見出している。例えば、工程ｂ）の前に、工程ｂ）中に、及び／又は工程ｂ）の後に変性剤、コスモトロピック剤、及び／又は洗浄剤を添加せずに、分離工程ｃ）の後に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の純度を有する単離した不溶性の標的タンパク質は、工程ｂ）の前での、工程ｂ）中での、及び／又は工程ｂ）の後での変性剤、コスモトロピック剤、及び／又は洗浄剤の添加後に８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の純度を有し得る。
【００９９】
好ましくは、（ｉ）変性剤は尿素（ＣＨ４Ｎ２Ｏ）若しくは塩酸グアニジン（ＣＨ５Ｎ３  ＨＣｌ）であり、（ｉｉ）コスモトロピック剤はリン酸塩若しくは硫酸塩であり、又は（ｉｉｉ）洗浄剤はＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５１、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５、ＳＤＳ又はＢｒｉｊである。当業者は更に好適な変性剤、コスモトロピック剤又は洗浄剤を選択することが可能である。
【０１００】
好ましくは、リン酸塩はリン酸アンモニウム、リン酸カリウム又はリン酸ナトリウムである。リン酸塩は、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液中での、例えば水溶液、発酵培地、培養培地、工業用水又は脱イオン水中での標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体の可溶性を低減することができる。好ましくは、硫酸塩は硫酸アンモニウムである。
【０１０１】
尿素の最終濃度は、０．１Ｍ〜１０Ｍ、好ましくは１Ｍ〜５Ｍ、より好ましくは４Ｍ〜５Ｍの範囲であるのが好ましい。例えば尿素の最終濃度は、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍ、４Ｍ、４．５Ｍ、５Ｍ、５．５Ｍ、６Ｍ、６．５Ｍ、７Ｍ、７．５Ｍ、８Ｍ、８．５Ｍ、９Ｍ、９．５Ｍ又は１０Ｍである。また塩酸グアニジンの最終濃度は、０．０１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜２Ｍの範囲であるのが好ましい。例えば塩酸グアニジンの最終濃度は、０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ又は３Ｍである。
【０１０２】
本発明の好ましい実施の形態では、標的タンパク質又は標的タンパク質凝集体は、２０分〜４０分の期間にわたって２０℃〜２５℃の温度で、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は更には１００％が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（例えば０．００５Ｍ〜０．５Ｍの範囲の最終濃度で）及び塩酸グアニジン（ＣＨ５Ｎ３ＨＣｌ）（例えば０．０１Ｍ〜３Ｍの範囲の最終濃度で）又は尿素（例えば０．１Ｍ〜１０Ｍの範囲の尿素の最終濃度で）を含む水溶液に依然として不溶性である。
【０１０３】
本発明の別の好ましい実施の形態では、標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６等のスパイダーシルクタンパク質又は標的タンパク質凝集体は、２０分〜４０分の期間にわたって２０℃〜２５℃の温度で、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は更には１００％が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（例えば０．００５Ｍ〜０．２Ｍの範囲の最終濃度で）及び塩酸グアニジン（ＣＨ５Ｎ３ＨＣｌ）（例えば０．１Ｍ〜２Ｍの範囲の最終濃度で）又は尿素（例えば１Ｍ〜５Ｍの範囲の最終濃度で）を含む水性媒体に依然として不溶性である。
【０１０４】
本発明の更に好ましい実施の形態では、標的タンパク質、例えばスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６等のスパイダーシルクタンパク質又は標的タンパク質凝集体は、３０分の期間にわたって２０℃〜２５℃の温度で、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は更には１００％が、０．５Ｍの最終濃度で水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む水性媒体に依然として不溶性である。
【０１０５】
工程ｃ）における可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の分離は、遠心分離により達成されるのが好ましい。遠心分離工程は、可溶化した不溶性の宿主細胞部（例えば宿主細胞タンパク質、宿主細胞残屑）、並びに任意で可溶化した不溶性残余物（例えば発酵残余物）、可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性の不純物を含む、液相、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水からの不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体を含む固相の分離を可能にする。遠心分離工程後、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体は沈殿物として存在するが、上清は可溶化した不溶性の宿主細胞部、並びに任意で可溶化した不溶性残余物（例えば発酵残余物）、可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性の不純物を含有し、これを廃棄することができる。このため、この分離工程中に、不溶性の標的タンパク質が、可溶化した不溶性の宿主細胞部から、及び任意で液相、例えば水溶液又は培養培地に存在する又は未だに存在する可溶性の宿主細胞部から分離されることは当業者にとって明らかであるものとする。
【０１０６】
工程ｃ）における可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の分離は、濾過により達成されるのも好ましい。この分離方法では、不溶性の標的タンパク質を、不溶性の標的タンパク質、可溶化した不溶性の宿主細胞部、並びに任意で可溶化した不溶性残余物（例えば発酵残余物）、可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性の不純物を含む、液相、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水を、不溶性の標的タンパク質を保持し、可溶化した不溶性の宿主細胞部、並びに任意で可溶化した不溶性残余物（例えば発酵残余物）、可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性の不純物を通過させるフィルター膜に通すことにより濃縮する。このため、この分離工程中に、不溶性の標的タンパク質が、可溶化した不溶性の宿主細胞部から、及び任意でフィルター膜を通過する、液相、例えば水溶液又は培養培地に存在する又は未だに存在する可溶性の宿主細胞部から分離されることは当業者にとって明らかであるものとする。本発明の方法の好ましい実施の形態では、不溶性の標的タンパク質と、可溶化した不溶性の宿主細胞部とを含む、液相、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水の動きを、重力圧、真空及び／又は遠心分離により加速させる。
【０１０７】
工程ｃ）における可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質の分離は、沈降により達成されるのが更に好ましい。この分離方法では、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体を、中に該不溶性の標的タンパク質又は該不溶性の標的タンパク質凝集体が含まれる、流体相、例えば水溶液（例えば緩衝水溶液）、培養培地、発酵培地、工業用水又は脱イオン水から分離沈殿させ、壁に張り付かせる。これは不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の、それに作用する力、例えば重力に応じた流体中での動きによるものである。可溶化した不溶性の宿主細胞部、並びに任意で可溶化した不溶性残余物（例えば発酵残余物）、可溶性の宿主細胞部及び／又は他の可溶性の不純物は、溶液中に保持され、上清を形成するため、これを簡単に廃棄することができる。
【０１０８】
工程ｃ）における可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質の分離は、遠心分離、沈降及び／又は濾過の組合せ、例えば遠心分離及び濾過、沈降及び濾過、沈降及び遠心分離、又は遠心分離、沈降及び濾過により達成されるのが特に好ましい。
【０１０９】
様々な不溶性の標的タンパク質に応じて、遠心分離、沈降又は濾過に関するパラメータは変えることができる。当業者は、可溶化した不溶性の宿主細胞部を不溶性の標的タンパク質から分離／単離するために、適切な分離パラメータ、例えば加速力／Ｇ力、及び／若しくは分離に遠心分離を用いた場合の時間、分離に濾過を用いた場合のフィルター径、並びに／又は分離に沈降を用いた場合の沈降時間を容易に適合させることが可能である。
【０１１０】
好ましくは、遠心分離を、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分を溶液中に維持しながら、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％を沈降させるのに十分な加速力／Ｇ力で、及び／又はこのような遠心分離時間にわたって実施する。本発明の方法の好ましい実施の形態では、遠心分離を、３０００×ｇ〜１２０００×ｇで、例えば３０００×ｇ、３５００×ｇ、４０００×ｇ、４５００×ｇ、５０００×ｇ、５５００×ｇ、６０００×ｇ、６５００×ｇ、７０００×ｇ、７５００×ｇ、８０００×ｇ、８５００×ｇ、９０００×ｇ、９５００×ｇ、１００００×ｇ、１０５００×ｇ、１１０００×ｇ、１１５００×ｇ、若しくは１２０００×ｇで、及び／又は１０分間〜４０分間、例えば１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、２１分間、２２分間、２３分間、２４分間、２５分間、２６分間、２７分間、２８分間、２９分間、３０分間、３１分間、３２分間、３３分間、３４分間、３５分間、３６分間、３７分間、３８分間、３９分間、又は４０分間実施する。これらの遠心分離パラメータにより、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分を溶液中に維持しながらの、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の沈降が可能になる。
【０１１１】
同様のことは沈降又は濾過にも当てはまる。好ましくは、沈降を、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分を溶液中に維持し、容易に廃棄することができる状態としながら、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％を沈降させるのに十分な沈降時間にわたって実施する。本発明の方法の好ましい実施の形態では、沈降を、１時間〜２４時間、好ましくは３時間〜１５時間、より好ましくは５時間〜１０時間の期間にわたって、例えば１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、又は２４時間にわたって実施する。上述の沈降時間により、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分を溶液中に維持しながらの、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の沈降が可能になる。
【０１１２】
好ましくは、濾過を、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分がフィルター孔を通ることができる状態としながら、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％を保持させるのに十分なフィルター孔径で（with）実施する。このため、濾過を分離方法として用いる場合、フィルターの孔径は不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体よりもわずかに小さいものとする。本発明の方法の好ましい実施の形態では、濾過を、１０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜１８０ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００ｎｍ、例えば１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、又は２００ｎｍの孔径を有するフィルターを用いて実施する。これらのフィルター孔径のパラメータにより、可溶化した不溶性の宿主細胞部又は可溶化した不溶性の宿主細胞部の大部分がフィルター孔を通ることができる状態としながらの、不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更には１００％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％の保持が可能になる。
【０１１３】
好ましくは、工程ｃ）における可溶化した及び／又は不完全に可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体の分離を容易にするための、懸濁液中での既に可溶化した及び／若しくは不完全に可溶化した不溶性の宿主細胞部のブレンドを改善するために、並びに／又は既に可溶化した及び／若しくは不完全に可溶化した不溶性の宿主細胞部からのより小さい断片の形成を改善するために、本方法は、工程ｂ）の後でかつ工程ｃ）の前に、上記懸濁液の均質化、好ましくは（例えば実施例１に記載のような方法に従って）ホモジナイザーを用いた上記懸濁液の均質化、又は細胞溶解、好ましくは好適な酵素を用いた細胞溶解の工程ｂ’）を更に含む。代替的には、上記の懸濁液の均質化をボールミル又は超音波処理により実施する。
【０１１４】
細胞残屑、発酵残余物、塩基、変性剤、洗浄剤及び／又は塩等の更なる不純物を取り除くために、本発明の方法は、工程ｃ）の後に、分離した不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体、好ましくは遠心分離物、沈降物又は残余分を洗浄する工程ｄ）を更に含むのが好ましい。本発明の方法は、工程ｃ）の後に、分離した不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体、好ましくは遠心分離物、沈降物又は残余分を水溶液、有機溶液及び／又は尿素で洗浄する工程ｄ）を更に含むのがより好ましい。
【０１１５】
この更なる精製工程は、対象の不溶性の標的タンパク質を含む無傷の宿主細胞を含む培養培地が本発明の方法の工程ａ）において準備される場合に必要とされる。この工程は、水中に又は水溶液中に再懸濁した宿主細胞沈降物又は宿主細胞ペレットが本発明の方法の工程ａ）において準備される場合には必要ではない。後者の場合、宿主細胞が、培養培地又は発酵培地から、したがって全て又はほとんど全ての発酵残余物及び／又は不純物から既に分離されている、又は大部分が分離されている。
【０１１６】
好ましくは、水溶液は緩衝水溶液である。さらに、好ましくは、有機溶液は、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＣＨ３ＯＨ）、ヘキサン（Ｃ６Ｈ１４）、ジエチルエーテル（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）及び／又はイソプロパノール（Ｃ３Ｈ８Ｏ）を含有する。
【０１１７】
上述のように、本発明の方法のより好ましい実施形態では、工程ｃ）の後の工程ｄ）において、分離した不溶性の標的タンパク質又は不溶性の標的タンパク質凝集体、好ましくは遠心分離物、沈降物又は残余分を尿素で洗浄する。尿素の使用により、工程ｃ）で分離されていない残留している可能性のある宿主細胞タンパク質の更なる除去が可能になる。
【０１１８】
本発明者らは驚くべきことに、続く洗浄工程ｄ）により、単離した不溶性の標的タンパク質の純度をおよそ最大で５％〜２０％、例えば最大で５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％改善することができることを見出している。例えば、続く洗浄工程ｄ）がない場合、分離工程ｃ）の後に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の純度を有する単離した不溶性の標的タンパク質は、続く洗浄工程ｄ）の後に８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の純度を有し得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明の方法を、４℃〜６０℃、より好ましくは１５℃〜４０℃、最も好ましくは１５℃〜２５℃、又は２０℃〜２５℃、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃又は６０℃の温度で実施する。
【０１２０】
好ましくは、本発明の方法を、１０ｋＰａ〜１０００ｋＰａ、好ましくは５０ｋＰａ〜１５０ｋＰａ、例えば１０ｋＰａ、２０ｋＰａ、３０ｋＰａ、４０ｋＰａ、５０ｋＰａ、６０ｋＰａ、７０ｋＰａ、８０ｋＰａ、９０ｋＰａ、１００ｋＰａ、１５０ｋＰａ、２００ｋＰａ、２５０ｋＰａ、３００ｋＰａ、３５０ｋＰａ、４００ｋＰａ、４５０ｋＰａ、５００ｋＰａ、５５０ｋＰａ、６００ｋＰａ、６５０ｋＰａ、７００ｋＰａ、７５０ｋＰａ、８００ｋＰａ、８５０ｋＰａ、９００ｋＰａ、９５０ｋＰａ又は１０００ｋＰａの圧力で実施する。
【０１２１】
無傷の細菌宿主細胞の培養培地、細胞沈降物又は緩衝溶液から不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）を単離する方法は、
ａ）（ｉ）不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む無傷の細菌宿主細胞の培養培地、（ｉｉ）好ましくは２０％の残存含水量を有する、不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む無傷の細菌宿主細胞の細胞沈降物、又は（ｉｉｉ）上記細胞沈降物を再懸濁させた緩衝溶液を準備する工程と、
ｂ）上記細菌宿主細胞を破壊し、上記の不溶性の細菌宿主細胞部を可溶化するために、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、好ましくは０．０５Ｍの最終濃度でＮａＯＨを上記の（ｉ）培養培地、（ｉｉ）細胞沈降物又は（ｉｉｉ）緩衝溶液に添加する工程と、
ｃ）３０００×ｇ〜１２０００×ｇで遠心分離することにより（すなわち不溶性の標的タンパク質が沈殿物として存在し、かつ可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部が廃棄することができる上清中にある）、不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）を可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、ここで工程ｂ）では、標的タンパク質が依然として不溶性であり、不溶性の細菌宿主細胞部の少なくとも８０％又は８５％、好ましくは９５％が可溶化するのが好ましい。
【０１２２】
破壊された細菌宿主細胞の培養培地、細胞沈降物又は緩衝溶液から不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）を単離する方法は、
ａ）（ｉ）不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む破壊された細菌宿主細胞の培養培地、（ｉｉ）好ましくは１５％の残存含水量を有する、不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む破壊された細菌宿主細胞の細胞沈降物、又は（ｉｉｉ）上記細胞沈降物を再懸濁させた緩衝溶液を準備する工程と、
ｂ）上記の不溶性の細菌宿主細胞部を可溶化するために、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、好ましくは０．１５Ｍの最終濃度でＮａＯＨを上記の（ｉ）培養培地、（ｉｉ）細胞沈降物又は（ｉｉｉ）緩衝溶液に添加する工程と、
ｃ）３０００×ｇ〜１２０００×ｇで遠心分離することにより（すなわち不溶性の標的タンパク質が沈殿物として存在し、かつ可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部が廃棄することができる上清中にある）、不溶性の標的タンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質）を可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、ここで工程ｂ）では、標的タンパク質が依然として不溶性であり、不溶性の細菌宿主細胞部の少なくとも８０％又は８５％、好ましくは９５％が可溶化するのも好ましい。
【０１２３】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で区別なく使用され、長さ又は翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【０１２４】
上に規定されるような任意の不溶性の標的タンパク質、好ましくは不溶性の標的タンパク質凝集体を、本発明の方法で単離することができる。しかしながら、不溶性の標的タンパク質、好ましくは不溶性の標的タンパク質凝集体は、シルクタンパク質、特に少なくとも２つの同一の反復単位を含むシルクタンパク質（例えばスパイダーシルクタンパク質又は昆虫シルクタンパク質等の節足動物シルクタンパク質）、コラーゲン、レシリン及びケラチンからなる群から選択されるのが好ましい。好ましくは、コラーゲンはイガイ足糸タンパク質又はヒトコラーゲンである。好ましくは、ケラチンはヒトケラチンである。
【０１２５】
本発明との関連では、「シルクタンパク質」、「コラーゲン」、「レシリン」、又は「ケラチン」という用語は、組換え宿主細胞等の宿主細胞（例えば微生物、昆虫又は植物の宿主細胞）、又は組換え発現系等の発現系（例えば微生物、昆虫又は植物の発現系）において発現する、すなわちその自然環境から分離される組換えタンパク質等のタンパク質を表し得る。さらに本発明との関連では、「単離シルクタンパク質」、「単離コラーゲン」、「単離レシリン」、又は「単離ケラチン」という用語は、組換え宿主細胞等の宿主細胞（例えば微生物、昆虫又は植物の宿主細胞）、又は組換え発現系等の発現系（例えば微生物、昆虫又は植物の発現系）において発現する、すなわちその自然環境から分離され、上記宿主細胞又は上記発現系から単離される組換えタンパク質等のタンパク質を表し得る。上述の「発現系」及び「宿主細胞」という用語は本明細書で区別なく使用される。
【０１２６】
「シルクタンパク質」は本発明との関連で使用される場合、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の１つの同一の反復単位の多重コピー（例えばＡ２、Ｑ６又はＣ１６（ここで２、６又は１６は反復単位の数を表す））、又は２つ以上の異なる反復単位の多重コピー（例えば（ＡＱ）２４又は（ＡＱ）１２Ｃ１６）を含む又はこれからなるアミノ酸配列を有するタンパク質を更に表す。
【０１２７】
「反復単位」及び「繰り返し単位」という用語は本発明との関連では区別なく使用され得る。
【０１２８】
本発明との関連では、「シルクタンパク質」という用語は、自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列の同一コピー又は自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列の変異体の同一コピー又は両方の組合せを含む又はこれからなる少なくとも２つの同一の反復単位を含む又はこれからなるシルクタンパク質も表す。
【０１２９】
本発明との関連では、「反復単位」は、アミノ酸配列において、自然発生的なシルクポリペプチド（例えばＭａＳｐＩ、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４又はＦｌａｇ）内で反復して発生する少なくとも１つのペプチドモチーフ（例えばＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）又はＧＰＧＱＱ（配列番号４））を含む若しくはこれからなる領域（すなわち同一のアミノ酸配列）、又はそれと実質的に類似のアミノ酸配列（すなわち変動アミノ酸配列）に対応する領域を表す。この点で、「実質的に類似の」は、好ましくはそれぞれの参照となる自然発生的なアミノ酸配列の全長にわたる少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には９９．９％のアミノ酸同一性の程度を意味する。自然発生的なシルクポリペプチド内の対応するアミノ酸配列（すなわち野生型反復単位）と「実質的に類似の」アミノ酸配列を有する「反復単位」は、その性質に関しても類似している。例えば「実質的に類似の反復単位」を含むシルクタンパク質も不溶性であり、その不溶性を保持するため、これも本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる。好ましくは、「実質的に類似の反復単位」を含むシルクタンパク質は、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１０分〜９０分の期間にわたって、例えば１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、若しくは９０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基（例えば０．００５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ）を含む、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水若しくは脱イオン水に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％を超えて、若しくは更には１００％が不溶性のままである。本発明の好ましい実施の形態では、依然として不溶性である／不溶性のままである、「実質的に類似の反復単位」を含むシルクタンパク質を、濾過、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径を有するフィルター膜を用いた濾過により、及び／又は遠心分離、好ましくは１０分間〜４０分間、好ましくは２０分間〜４０分間の３０００×ｇ〜１２０００×ｇ、より好ましくは４０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により可溶化した不溶性の宿主���胞部から分離／単離する。
【０１３０】
自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列と「同一の」アミノ酸配列を有する「反復単位」は例えば、ＭａＳｐ  Ｉ（配列番号４３）、ＭａＳｐ  ＩＩ（配列番号４４）、ＡＤＦ−３（配列番号１）及び／又はＡＤＦ−４（配列番号２）の１つ又は複数のペプチドモチーフに対応するシルクポリペプチドの一部分であり得る。自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に類似の」アミノ酸配列を有する「反復単位」は例えば、ＭａＳｐＩ（配列番号４３）、ＭａＳｐＩＩ（配列番号４４）、ＡＤＦ−３（配列番号１）及び／又はＡＤＦ−４（配列番号２）の１つ又は複数のペプチドモチーフに対応するが、特定のアミノ酸位置に１つ又は複数のアミノ酸置換を有するシルクポリペプチドの一部分であり得る。
【０１３１】
「反復単位」は、一般的に自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に存在すると考えられている非反復的な親水性アミノ酸ドメインを含まない。
【０１３２】
本発明による「反復単位」は、３個〜２００個又は５個〜１５０個のアミノ酸長、好ましくは１０個〜１００個又は１５個〜８０個のアミノ酸長、より好ましくは１８個〜６０個又は２０個〜４０個のアミノ酸長のアミノ酸配列を更に表す。例えば、本発明による反復単位は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、１８０個、１８５個、１９０個、１９５個又は２００個のアミノ酸長を有し得る。最も好ましくは、本発明による反復単位は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１８個、２０個、２４個、２７個、２８個、３０個、３４個、３５個又は３９個のアミノ酸からなる。
【０１３３】
本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は好ましくは、６個〜１５００個のアミノ酸、又は２００個〜１３００個のアミノ酸、最も好ましくは２５０個〜１２００個のアミノ酸、又は５００個〜１０００個のアミノ酸からなる。
【０１３４】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位、又は４個〜６０個の反復単位、より好ましくは８個〜４８個の反復単位、又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位を含む又はこれからなる。例えば、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の反復単位を含み得る又はこれからなり得る。最も好ましくは、シルクポリペプチドは、４個、８個、１２個、１６個、２４個、３２個又は４８個の反復単位を含む。上述のように、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位である。このため、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、１つの同一の反復単位の多重コピー（例えばＡ２又はＣ１６（ここで２又は１６は反復単位の数を表す））、又は２つ以上の異なる反復単位の多重コピー（例えば（ＡＱ）２４又は（ＱＡＱ）８）を含み得る。例えば、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれ得る８０個の反復単位のうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個が、同一の反復単位である。
【０１３５】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、当業者に既知の任意のシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る又はこれからなり得る。本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、節足動物シルクポリペプチド、好ましくはスパイダーシルクポリペプチド、又は昆虫シルクポリペプチドのアミノ酸配列を含む又はこれからなるのが好ましい。また本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、イガイシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る又はこれからなり得る。
【０１３６】
スパイダーシルクポリペプチドは、大瓶状腺（majorampullate gland）ポリペプチド、例えばドラグラインスパイダーシルクポリペプチド、小瓶状腺（minorampullate gland）ポリペプチド、鞭毛状ポリペプチド、凝集スパイダーシルクポリペプチド、房状スパイダーシルクポリペプチド、又は梨状スパイダーシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含む又はこれからなることが好ましい。最も好ましくは、スパイダーシルクポリペプチドは、ドラグラインスパイダーシルクポリペプチド又は鞭毛状スパイダーシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含む又はこれからなる。概してコガネグモ科及びコガネグモ上科（Araneoids）の円網を張るクモのドラグラインポリペプチド又は鞭毛状ポリペプチドのドラグラインポリペプチド又は鞭毛状ポリペプチドのアミノ酸配列を選択するのが好ましい。
【０１３７】
昆虫シルクポリペプチドは、鱗翅目の昆虫のシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含む又はこれからなることが好ましい。より好ましくは、昆虫シルクポリペプチドは、カイコガ科の昆虫、最も好ましくはカイコガ（Bombyx mori）のシルクポリペプチドのアミノ酸配列を含む又はこれからなる。
【０１３８】
好ましくは、上述のシルクポリペプチドは組換えにより生成される、すなわち組換え型のシルクポリペプチドである。例えば本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは組換え型のスパイダーシルクポリペプチド（ドラグラインスパイダーシルクポリペプチド若しくは鞭毛状スパイダーシルクポリペプチド等）、組換え型の昆虫シルクポリペプチド、又は組換え型のイガイシルクポリペプチドである。
【０１３９】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドの反復単位は、当業者に既知の自然発生的なシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる任意の領域のアミノ酸配列を含み得る又はこれからなり得る。好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドの反復単位は、節足動物シルクポリペプチド内で、より好ましくはスパイダーシルクポリペプチド又は昆虫シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含む又はこれからなる。また本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドの反復単位は、イガイシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含み得る又はこれからなり得る。
【０１４０】
スパイダーシルクの反復単位は、自然発生的な大瓶状腺ポリペプチド、例えばドラグラインスパイダーシルクポリペプチド、小瓶状腺ポリペプチド、鞭毛状ポリペプチド、凝集スパイダーシルクポリペプチド、房状スパイダーシルクポリペプチド、又は梨状スパイダーシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含む又はこれからなるのが好ましい。最も好ましくは、反復単位は自然発生的なドラグラインスパイダーシルクポリペプチド又は鞭毛状スパイダーシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含む又はこれからなる。
【０１４１】
昆虫シルクの反復単位は、鱗翅目の昆虫の自然発生的なシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含む又はこれからなるのが好ましい。より好ましくは、昆虫シルクの反復単位は、カイコガ科の昆虫、最も好ましくはカイコガの自然発生的な昆虫シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む又はこれからなる領域のアミノ酸配列を含む又はこれからなる。
【０１４２】
「コンセンサス配列」という用語は本発明との関連で使用する場合、或る特定の位置における発生頻度が高いアミノ酸（例えば「Ｇ」）を含有し、更に決定されていない他のアミノ酸をプレースホルダー「Ｘ」に置き換えたアミノ酸配列を表す。
【０１４３】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、各々が、
ｉ）ＧＰＧＸＸ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＡ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、
ｉｉ）ＧＧＸ（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｎ及びＱから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、
ｉｉｉ）Ａｘ（ここでｘは５〜１０の整数である）
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも１つ、好ましくは１つ含む、少なくとも２つの同一の反復単位を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【０１４４】
本発明の方法により単離されるシルクタンパク質が、各々がＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号１８）及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ、好ましくは１つ含む少なくとも２つの同一の反復単位を含む、又はこれからなることも好ましい。
【０１４５】
反復（ペプチド）モチーフＧＰＧＸＸ（配列番号３）及びＧＧＸ、すなわち高グリシンモチーフは、シルクポリペプチドに、このため上記モチーフを含有するシルクタンパク質から形成される糸に柔軟性を与える。詳細には、反復ＧＰＧＸＸ（配列番号３）モチーフはβ−ターンらせん構造を形成し、シルクポリペプチドに弾性を付与する。大瓶状腺シルク及び鞭毛状シルクは両方ともＧＰＧＸＸ（配列番号３）モチーフを有する。反復ＧＧＸモチーフは１つのターン当たり３つのアミノ酸を有するヘリックス構造に関連し、ほとんどのスパイダーシルクで見られる。ＧＧＸモチーフはシルクに付加的な弾性を与えることができる。反復ポリアラニンＡｘ（ペプチド）モチーフはシルクポリペプチドに強度を与える結晶性β−シート構造を形成する（国際公開第０３／０５７７２７号）。ＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号１８）及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号１９）（ペプチド）モチーフは、レジリン（国際公開第２００８／１５５３０４号）から選択されている。レジリンはほとんどの節足動物（節足動物門）で見られる弾性タンパク質である。レジリンは角皮の特定領域に位置しており、低剛性及び高強度を与える（Elvin et al., Nature（473）: 999-1002, 2005）。
【０１４６】
このため本発明の好ましい実施の形態では、シルクタンパク質は、各々がＧＰＧＡＳ（配列番号５）、ＧＰＧＳＧ（配列番号６）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＰ（配列番号８）、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＰＧＱＧ（配列番号４０）及びＧＰＧＧＳ（配列番号１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つ）、好ましくは１つ含む反復単位を含む、又はこれからなる。本発明の別の好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドは、各々がＧＧＹ、ＧＧＰ、ＧＧＡ、ＧＧＲ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＮ及びＧＧＱからなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、８つ、７つ又は８つ）、好ましくは１つ含む反復単位を含む、又はこれからなる。本発明の更に好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドは、各々がＡＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１６）及びＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）、好ましくは１つ含む反復単位を含む、又はこれからなる。
【０１４７】
本発明の別の好ましい実施の形態では、シルクタンパク質は、各々がＧＰＧＡＳ（配列番号５）、ＧＰＧＳＧ（配列番号６）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＰ（配列番号８）、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＰＧＱＧ（配列番号４０）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＹ、ＧＧＰ、ＧＧＡ、ＧＧＲ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＡＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１６）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号１８）、及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個）、好ましくは１つ含む反復単位を含む、又はこれからなる。
【０１４８】
最も好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、
（ｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＡＳ（配列番号５）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＧＧＹ及びＧＰＧＳＧ（配列番号６）、
（ｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）及びＧＰＧＧＰ（配列番号８）、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列として、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）及びＧＰＧＱＱ（配列番号４）、
（ｉｖ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＧＰ、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＧＰ、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）及びＧＧＰ、
（ｖ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＱＧ（配列番号４０）及びＧＧＲ、
（ｖｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＧＲ、ＧＧＮ及びＧＧＲ、
（ｖｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＡ及びＧＧＳ、及び／又は
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）及びＧＰＧＧＹ（配列番号７）
を含むか又はこれからなる反復単位を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【０１４９】
上述のシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位であることに留意すべきである。
【０１５０】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位、又は４個〜６０個の反復単位、より好ましくは８個〜４８個の反復単位、又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位、すなわち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の反復単位（各々が、
ｉ）ＧＰＧＸＸ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＡ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、
ｉｉ）ＧＧＸ（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｎ及びＱから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸である）、及び
ｉｉｉ）Ａｘ（ここでｘは５〜１０の整数である）
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも１つ、好ましくは１つ含む）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【０１５１】
上述のように、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位である。
【０１５２】
本発明の方法により単離されるシルクタンパク質が、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位又は４個〜６０個の反復単位、より好ましくは８個〜４８個の反復単位又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位（各々がＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号１８）及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ、好ましくは１つ含む）を含む、又はこれからなることも好ましい。
【０１５３】
このため、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は好ましくは、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位又は４個〜６０個の反復単位、より好ましくは８個〜４８個の反復単位又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位（各々がＧＰＧＡＳ（配列番号５）、ＧＰＧＳＧ（配列番号６）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＰ（配列番号８）、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＱＧ（配列番号４０）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＹ、ＧＧＰ、ＧＧＡ、ＧＧＲ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＡＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１６）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号１８）、及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個）、好ましくは１つ含む）を含む、又はこれからなる。
【０１５４】
最も好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、
（ｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＡＳ（配列番号５）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＧＧＹ及びＧＰＧＳＧ（配列番号６）を含む又はこれからなる反復単位、
（ｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）及びＧＰＧＧＰ（配列番号８）を含む又はこれからなる反復単位、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列として、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）、ＧＰＧＱＱ（配列番号４）及びＧＰＧＱＱ（配列番号４）を含む又はこれからなる反復単位、
（ｉｖ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＧＰ、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＧＰ、ＧＰＧＧＡ（配列番号９）及びＧＧＰを含む又はこれからなる反復単位、
（ｖ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＱＧ（配列番号４０）及びＧＧＲを含む又はこれからなる反復単位、
（ｖｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＧＲ、ＧＧＮ及びＧＧＲを含む又はこれからなる反復単位、
（ｖｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＡ及びＧＧＳを含む又はこれからなる反復単位、及び／又は
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でＧＰＧＧＡ（配列番号９）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＰＧＧＹ（配列番号７）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１１）及びＧＰＧＧＹ（配列番号７）を含む又はこれからなる反復単位
を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【０１５５】
上述のシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位であることに留意すべきである。
【０１５６】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、
（ｉ）反復単位として（ＧＰＧＸＸ）ｎ（配列番号３）（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＡ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸であり、ｎは２、３、４、５、６、７、８又は９である）、
ｉｉ）反復単位として（ＧＧＸ）ｎ（ここでＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｎ及びＱから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してＹ、Ｐ及びＱから選択される任意のアミノ酸であり、ｎは２、３、４、５、６、７又は８である）、及び／又は
ｉｉｉ）反復単位として（Ａｘ）ｎ（ここでｘは５〜１０の整数であり、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【０１５７】
上述のように、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つは同一の反復単位である。
【０１５８】
反復単位は独立して、モジュールＡ（配列番号２０）、モジュールＣ（配列番号２１）、モジュールＱ（配列番号２２）、モジュールＫ（配列番号２３）、モジュールｓｐ（配列番号２４）、モジュールＳ（配列番号２５）、モジュールＲ（配列番号２６）、モジュールＸ（配列番号２７）若しくはモジュールＹ（配列番号２８）、又はその変異体（すなわちモジュールＡ変異体、モジュールＣ変異体、モジュールＱ変異体、モジュールＫ変異体、モジュールｓｐ変異体、モジュールＳ変異体、モジュールＲ変異体、モジュールＸ変異体又はモジュールＹ変異体）から選択されるのが好ましい。モジュールＡ（配列番号２０）及びモジュールＱ（配列番号２２）はニワオニグモのＡＤＦ−３のアミノ酸配列をベースにしている。モジュールＣ（配列番号２１）はニワオニグモ（Araneus diadematus）のＡＤＦ−４のアミノ酸配列をベースにしている。モジュールＫ（配列番号２３）、モジュールｓｐ（配列番号２４）、モジュールＸ（配列番号２７）及びモジュールＹ（配列番号２８）はアメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）の鞭毛状タンパク質ＦＬＡＧのアミノ酸配列をベースにしている（国際公開第２００６／００８１６３号）。モジュールＳ（配列番号２５）及びモジュールＲ（配列番号２６）はレジリン（節足動物門）をベースにしている（国際公開第２００８／１５５３０４号）。
【０１５９】
このため本発明の好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドの反復単位は、モジュールＡ：ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＳＧＱＱ（配列番号２０）、モジュールＣ：ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号２１）、モジュールＱ：ＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱ（配列番号２２）、モジュールＫ：ＧＰＧＧＡＧＧＰＹＧＰＧＧＡＧＧＰＹＧＰＧＧＡＧＧＰＹ（配列番号２３）、モジュールｓｐ：ＧＧＴＴＩＩＥＤＬＤＩＴＩＤＧＡＤＧＰＩＴＩＳＥＥＬＴＩ（配列番号２４）、モジュールＳ：ＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＱＧＱＧＱＧＱＧＱＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号２５）、モジュールＲ：ＳＡＡＡＡＡＡＡＡＧＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＤＴＹＧＡＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号２６）、モジュールＸ：ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＳＧＧＡＧＧＳ（配列番号２７）若しくはモジュールＹ：ＧＰＧＧＡＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹ（配列番号２８）、又はそれらの変異体からなる。
【０１６０】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、２個〜（to）８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位又は４個〜６０個の反復単位、より好ましくは８個〜４８個の反復単位又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位、すなわち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の反復単位（独立して、モジュールＡ（配列番号２０）、モジュールＣ（配列番号２１）、モジュールＱ（配列番号２２）、モジュールＫ（配列番号２３）、モジュールｓｐ（配列番号２４）、モジュールＳ（配列番号２５）、モジュールＲ（配列番号２６）、モジュールＸ（配列番号２７）若しくはモジュールＹ（配列番号２８）、又はその変異体（すなわちモジュールＡ変異体、モジュールＣ変異体、モジュールＱ変異体、モジュールＫ変異体、モジュールｓｐ変異体、モジュールＳ変異体、モジュールＲ変異体、モジュールＸ変異体又はモジュールＹ変異体）から選択される）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位（モジュール）であることに留意すべきである。
【０１６１】
このため、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、（ｉ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）及び／又はモジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｉｉ）モジュールＣからなる反復単位（複数も可）及び／又はモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｉｉｉ）モジュールＱからなる反復単位（複数も可）及び／又はモジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｉｖ）（ａ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱからなる反復単位（複数も可）、（ｂ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｃ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱからなる反復単位（複数も可）、（ｄ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｖ）（ａ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｂ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｃ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｄ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｖｉ）（ａ）モジュールＣからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱからなる反復単位（複数も可）、（ｂ）モジュールＣからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｃ）モジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱからなる反復単位（複数も可）、（ｄ）モジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）、又は（ｖｉｉ）（ａ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）、モジュールＱからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｂ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）、モジュールＱからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｃ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）、モジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｄ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）、モジュールＱからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｅ）モジュールＡからなる反復単位（複数も可）、モジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｆ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）、モジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣからなる反復単位（複数も可）、（ｇ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）、モジュールＱからなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）、（ｈ）モジュールＡ変異体からなる反復単位（複数も可）、モジュールＱ変異体からなる反復単位（複数も可）及びモジュールＣ変異体からなる反復単位（複数も可）を含む、これから本質的になる、又はこれからなるのが好ましい。
【０１６２】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドが少なくとも２つの同一の反復単位を含む又はこれからなるという条件で、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ、モジュールＹ、又はその変異体（すなわちモジュールＡ変異体、モジュールＣ変異体、モジュールＱ変異体、モジュールＫ変異体、モジュールｓｐ変異体、モジュールＳ変異体、モジュールＲ変異体、モジュールＸ変異体又はモジュールＹ変異体）を各々の任意の組合せ及び任意の数で互いに組み合わせることもできる、すなわち例えば、モジュール（反復単位）Ａをモジュール（反復単位）Ｑと組み合わせることができ（すなわち組合せＡＱ）、モジュール（反復単位）Ｃをモジュール（反復単位）Ｑと組み合わせることができ（すなわち組合せＣＱ）、モジュール（反復単位）Ｑをモジュール（反復単位）Ａ及びモジュール（反復単位）Ｑと組み合わせることができ（すなわち組合せＱＡＱ）、モジュール（反復単位）Ａをモジュール（反復単位）Ａ及びモジュール（反復単位）Ｑと組み合わせることができる（すなわち組合せＡＡＱ）。例えば、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、Ａｎ、（ＡＡ）ｎ、（ＡＱ）ｎ、（ＱＡ）ｎ、Ｑｎ、（ＱＱ）ｎ、（ＱＡＱ）ｎ、（ＡＱＡ）ｎ、Ｃｎ、（ＣＣ）ｎ、（ＣＣＣ）ｎ、（ＣＱ）ｎ、（ＱＣ）ｎ、（ＱＣＱ）ｎ、（ＣＱＣ）ｎ、（ＡＡ）ｎＱｎ、（ＱＱ）ｎＡｎ、（ＡＡＡ）ｎＱｎ、（ＱＱＱ）ｎＡｎ、（ＡＱＱ）ｎ、（ＱＱＡ）ｎ、Ｋｎ、ｓｐｎ、Ｓｎ、Ｒｎ、Ｘｎ、Ｙｎ、（Ｋｓｐ）ｎ、（ｓｐＫ）ｎ、（ＸＹ）ｎ、（ＹＸ）ｎ、（ＸＸ）ｎ、（ＹＹ）ｎ、（ＸＸＸ）ｎ、（ＹＹＹ）ｎ、（ＡＸ）ｎ、（ＸＡ）ｎ、（ＣＸ）ｎ、（ＸＣ）ｎ、（ＱＸ）ｎ、（ＸＱ）ｎ、（ＹＱ）ｎ、（ＱＹ）ｎ、（ＳＳ）ｎ、（ＳＲ）ｎ、（ＲＳ）ｎ又は（ＲＲ）ｎ（ここでｎは少なくとも２、好ましくは４、８、９、１０、１２、１６、２０、２４又は３２である）を含み得る又はこれからなり得る。シルクポリペプチドが（ＡＱ）１２からなる場合、シルクポリペプチドには、モジュール（反復単位）Ａが１２回存在し、モジュール（反復単位）Ｑも１２回存在し、そのためシルクポリペプチドは２４個のモジュール（反復単位）からなることに留意する。（ＡＱ）１２からなるシルクポリペプチドのモジュール（繰り返し単位）の配置は以下のとおりである：ＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱＡＱ。さらに、シルクポリペプチドのモジュール（繰り返し単位）のシルクポリペプチドが（ＱＡＱ）８からなる場合、シルクポリペプチドには、モジュール（繰り返し単位）Ａが８回存在し、モジュール（反復単位）Ｑが１６回存在し、そのためシルクポリペプチドは２４個のモジュール（反復単位）からなることに留意する。（ＱＡＱ）８からなるシルクポリペプチドのモジュール（繰り返し単位）の配置は以下のとおりである：ＱＡＱＱＡＱＱＡＱＱＡＱＱＡＱＱＡＱＱＡＱＱＡＱ。
【０１６３】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドはまた、（Ａ＊Ｑ）ｎ、（ＡＱ＊）ｎ、（Ａ＊Ｑ＊）ｎ、（Ｑ＊Ａ）ｎ、（ＱＡ＊）ｎ、（Ｑ＊Ａ＊）ｎ、（ＱＡＱ＊）ｎ、（ＱＡ＊Ｑ）ｎ、（Ｑ＊ＡＱ）ｎ、（ＱＡ＊Ｑ＊）ｎ、（Ｑ＊Ａ＊Ｑ）ｎ、（Ｑ＊ＡＱ＊）ｎ、（Ｑ＊Ａ＊Ｑ＊）ｎ、（ＡＱＡ＊）ｎ、（ＡＱ＊Ａ）ｎ、（Ａ＊ＱＡ）ｎ、（ＡＱ＊Ａ＊）ｎ、（Ａ＊Ｑ＊Ａ）ｎ、（Ａ＊ＱＡ＊）ｎ、（Ａ＊Ｑ＊Ａ＊）ｎ（ここでｎは少なくとも２、好ましくは４、８、９、１０、１２、１６、２０、２４又は３２であり、＊はモジュール変異体、すなわちモジュールＡ変異体又はモジュールＱ変異体を示す）を含み得る又はこれからなり得る。
【０１６４】
「互いに組み合わせた」又は「互いに連結した」という用語は、本発明との関連では、複数のモジュール（反復単位）が互いに直接組み合わされている若しくは連結されていることを意味し得る、又は本発明との関連では、複数のモジュール（反復単位）が１つ又は複数のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わされている若しくは連結されていることを意味し得る。好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドに含まれるモジュール（反復単位）が互いに直接組み合わされている若しくは連結されている。他の好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドに含まれるモジュール（反復単位）が、１個〜２５個又は１個〜２０個のスペーサーアミノ酸を介して、より好ましくは１個〜１５個又は１個〜１０個のスペーサーアミノ酸を介して、最も好ましくは１個〜５個のスペーサーアミノ酸を介して、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わされている又は連結されている。上記スペーサーアミノ酸はタンパク質において自然発生的な任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、上記スペーサーアミノ酸はプロリンではない。アラニン又はグリシン等の非荷電アミノ酸が特に好ましい。上記スペーサーアミノ酸は、不溶性であり、その不溶性を保持するというシルクタンパク質の性質を変えることのないアミノ酸であることが好ましく、そのため上記シルクタンパク質を未だに、本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる。上記スペーサーアミノ酸は、立体障害を引き起こさないアミノ酸、例えばアラニン又はグリシン等のサイズが小さいアミノ酸であるのが更に好ましい。より好ましい実施の形態では、シルクポリペプチドは、互いに直接組み合わせられるモジュール、及び１個〜２５個又は１個〜２０個のスペーサーアミノ酸を介して、より好ましくは１個〜１５個又は１個〜１０個のスペーサーアミノ酸を介して、最も好ましくは１個〜５個のスペーサーアミノ酸を介して、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わせられるモジュールを含む。
【０１６５】
モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体は参照（野生型）モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹとは異なり、該変異体はそれらからアミノ酸配列における最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸変化（すなわち置換、付加、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により誘導される。代替的に又は付加的に、このようなモジュール変異体は、変異体の誘導元である参照（野生型）モジュールに対する或る特定の程度の配列同一性を特徴とし得る。このため、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体は、各参照（野生型）モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹに対する少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には９９．９％の配列同一性を有する。好ましくは配列同一性は、各参照（野生型）モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２７個、２８個、３０個、３４個、３５個又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたる、好ましくは全長にわたるものである。
【０１６６】
配列同一性は、各参照（野生型）モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの全長にわたって少なくとも８０％、全長にわたって少なくとも８５％、全長にわたって少なくとも９０％、全長にわたって少なくとも９５％、全長にわたって少なくとも９８％、又は全長にわたって少なくとも９９％であるのが特に好ましい。配列同一性は、各参照（野生型）モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ若しくはモジュールＹのうちの少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８０％、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８５％、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９０％、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９５％、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９８％、又は少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２４個、２８個若しくは３０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９９％であるのが更に特に好ましい。
【０１６７】
モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１６８】
さらに、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体又は断片は、変異体又は断片の元となるアミノ酸配列に関する修飾が、不溶性であり、その不溶性を保持するというシルクタンパク質の性質を変えることなく、そのため上記シルクタンパク質を未だに、本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる場合にのみ、本発明との関連においてモジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体又は断片とみなされる。好ましくは、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体又は断片を含むシルクタンパク質は、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１０分〜９０分の期間にわたって、例えば１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、若しくは９０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基（例えば０．００５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ）を含む、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水又は脱イオン水に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％を超えて、又は更には１００％が不溶性のままである。本発明の好ましい実施の形態では、依然として不溶性である／不溶性のままである、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹの変異体又は断片を含むシルクタンパク質を、濾過、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径を有するフィルター膜を用いた濾過により、及び／又は遠心分離、好ましくは１０分間〜４０分間、好ましくは２０分間〜４０分間の３０００×ｇ〜１２０００×ｇ、より好ましくは４０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離／単離する。
【０１６９】
このため本発明の好ましい実施の形態では、反復単位は独立して、モジュールＡＣ（配列番号２９）、モジュールＡＫ（配列番号３０）、モジュールＣＣ（配列番号３１）、モジュールＣＫ１（配列番号３２）、モジュールＣＫ２（配列番号３３）又はモジュールＣＫＣ（配列番号３４）から選択される。モジュールＡＣ（配列番号２９）、モジュールＡＫ（配列番号３０）、モジュールＣＣ（配列番号３１）、モジュールＣＫ１（配列番号３２）、モジュールＣＫ２（配列番号３３）及びモジュールＣＫＣ（配列番号３４）は、ニワオニグモのＡＤＦ−３のアミノ酸配列をベースとするモジュールＡ、及びニワオニグモのＡＤＦ−４のアミノ酸配列をベースとするモジュールＣの変異体である（国際公開第２００７／０２５７１９号）。モジュールＡＣ（配列番号２９）では、２１位のアミノ酸Ｓ（セリン）がアミノ酸Ｃ（システイン）に置き換えられており、モジュールＡＫ（配列番号３０）では、２１位のアミノ酸Ｓがアミノ酸Ｋ（リジン）に置き換えられており、モジュールＣＣ（配列番号３１）では、２５位のアミノ酸Ｓがアミノ酸Ｃに置き換えられており、モジュールＣＫ１（配列番号３２）では、２５位のアミノ酸Ｓがアミノ酸Ｋに置き換えられており、モジュールＣＫ２（配列番号３３）では、２０位のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）がアミノ酸Ｋに置き換えられており、モジュールＣＫＣ（配列番号３４）では、２０位のアミノ酸Ｅがアミノ酸Ｋに置き換えられており、２５位のアミノ酸Ｓがアミノ酸Ｃに置き換えられている（国際公開第２００７／０２５７１９号）。
【０１７０】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドにおける反復単位は、モジュールＡＣ：ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＣＧＱＱ（配列番号２９）、モジュールＡＫ：ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＫＧＱＱ（配列番号３０）、モジュールＣＣ：ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＣＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号３１）、モジュールＣＫ１：ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＫＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号３２）、モジュールＣＫ２：ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＫＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号３３）、又はモジュールＣＫＣ：ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＫＮＱＧＰＣＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号３４）からなる。
【０１７１】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドが、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位又は４個〜６０個の反復単位、好ましくは８個〜４８個の反復単位又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位、すなわち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の反復単位（独立して、モジュールＡＣ（配列番号２９）、モジュールＡＫ（配列番号３０）、モジュールＣＣ（配列番号３１）、モジュールＣＫ１（配列番号３２）、モジュールＣＫ２（配列番号３３）又はモジュールＣＫＣ（配列番号３４）から選択される）を含む、これから本質的になる、又はこれからなることも好ましい。例えば、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、モジュールＣＣ４、モジュールＣＣ８、モジュールＣＣ１６、モジュールＣＣ３２、モジュールＡＣ５、モジュールＡＣ８又はモジュールＡＣ１０を含み得る又はこれからなり得る。本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位（モジュール）であることに留意すべきである。
【０１７２】
例えば、シルクポリペプチドは、モジュールＣＣ４、モジュールＣＣ８、モジュールＣＣ１６、モジュールＣＣ３２、モジュールＡＣ５、モジュールＡＣ８又はモジュールＡＣ１０を含み得る又はこれからなり得る。
【０１７３】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドが少なくとも２つの同一の反復単位を含む又はこれからなるという条件で、モジュールＡＫ、モジュールＣＣ、モジュールＣＫ１、モジュールＣＫ２及びモジュールＣＫＣを互いに組み合わせることもできる、すなわち例えば、モジュール（反復単位）ＡＫをモジュール（反復単位）ＣＣと組み合わせることができ（すなわち組合せＡＫＣＣ）、モジュール（反復単位）ＣＫ１をモジュール（反復単位）ＣＫ２及びモジュール（反復単位）ＣＫＣと組み合わせることができる（すなわち組合せＣＫ１ＣＫ２ＣＫＣ）。このため、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドはまた、モジュール（ＡＫ）ｎ、モジュール（ＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＫ１）ｎ、モジュール（ＣＫ２）ｎ、モジュール（ＣＫＣ）ｎ、モジュール（ＡＫＡＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＫ１ＣＫ２）ｎ、モジュール（ＣＫ２ＣＫ１）ｎ、モジュール（ＣＫ１ＣＫ２ＣＫ１）ｎ、モジュール（ＣＫ２ＣＫ１ＣＫ２）ｎ、モジュール（ＣＫ１ＣＫ２ＣＫＣ）ｎ、モジュール（ＣＫＣＣＫ２ＣＫＣ）ｎ又はモジュール（ＣＫＣＣＫ２ＣＫ１）ｎ（ここでｎは少なくとも２、好ましくは４、５、６、７、８、１０、１２、１６又は２０である）を含み得る又はこれからなり得る。「互いに組み合わせた」という用語は上で定義される。
【０１７４】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、２個〜８０個の反復単位、３個〜８０個の反復単位又は４個〜６０個の反復単位、好ましくは８個〜４８個の反復単位又は１０個〜４０個の反復単位、最も好ましくは１６個〜３２個の反復単位、すなわち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の反復単位（独立して、モジュールＡ（配列番号２０）若しくはその変異体、モジュールＣ（配列番号２１）若しくはその変異体、モジュールＱ（配列番号２２）若しくはその変異体、モジュールＫ（配列番号２３）若しくはその変異体、モジュールｓｐ（配列番号２４）若しくはその変異体、モジュールＳ（配列番号２５）若しくはその変異体、モジュールＲ（配列番号２６）若しくはその変異体、モジュールＸ（配列番号２７）若しくはその変異体、モジュールＹ（配列番号２８）若しくはその変異体、モジュールＡＣ（配列番号２９）、モジュールＡＫ（配列番号３０）、モジュールＣＣ（配列番号３１）、モジュールＣＫ１（配列番号３２）、モジュールＣＫ２（配列番号３３）、又はモジュールＣＫＣ（配列番号３４）から選択される）を含む、これから本質的になる、又はこれからなるのが更に好ましい。この場合も、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドに含まれる反復単位のうち少なくとも２つが同一の反復単位（モジュール）であることに留意すべきである。
【０１７５】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドが少なくとも２つの同一の反復単位を含む又はこれからなるという条件で、モジュールＡＫ、モジュールＣＣ、モジュールＣＫ１、モジュールＣＫ２及びモジュールＣＫＣを、モジュールＡ、モジュールＣ、モジュールＱ、モジュールＫ、モジュールｓｐ、モジュールＳ、モジュールＲ、モジュールＸ又はモジュールＹと互いに組み合わせることもできる、すなわち例えば、モジュール（反復単位）ＡＫをモジュール（反復単位）Ｃと組み合わせることができ（すなわち組合せＡＫＣ）、又はモジュール（反復単位）ＣＣをモジュール（反復単位）Ｃと組み合わせることができる（すなわち組合せＣＣＣ）。このため、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドはまた、モジュール（ＡＱＡＫ）ｎ、モジュール（ＱＡＫ）ｎ、モジュール（ＱＡＫＱ）ｎ、モジュール（ＡＫＱＡ）ｎ、モジュール（ＡＫＱＡＫ）ｎ、モジュール（ＣＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＣＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＣＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＱ）ｎ、モジュール（ＱＣＣ）ｎ、モジュール（ＱＣＣＱ）ｎ、モジュール（ＣＣＱＣ）ｎ、モジュール（ＣＱＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＱＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＫ１）ｎ、モジュール（ＣＫ１Ｃ）ｎ、モジュール（ＣＫ１ＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＫ１Ｃ）ｎ、モジュール（ＣＫＣＣＫＣＣ）ｎ、モジュール（ＣＣＫＣＣＫＣ）ｎ、モジュール（ＣＫＣＱ）ｎ、モジュール（ＱＣＫＣ）ｎ、モジュール（ＱＣＫＣＱ）ｎ、モジュール（ＡＫＣＫ１Ｑ）ｎ、モジュール（ＱＣＫ２ＡＫ）ｎ、又はモジュール（ＣＫ１ＣＫ２Ｃ）ｎ（ここでｎは少なくとも２、好ましくは４、５、６、７、８、１０、１２、１６又は２０である）を含み得る又はこれからなり得る。「互いに組み合わせた」という用語は上で定義される。
【０１７６】
例えば、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、モジュールＣ１６ＣＣ、モジュールＣＣＣ１６、モジュールＣ８ＣＣＣ８、モジュールＣ８ＣＣ８、モジュールＣＣ８Ｃ８、モジュールＣ４ＣＣ８Ｃ４、モジュールＣＣ４Ｃ８ＣＣ４、モジュールＣＣ（ＡＱ）２４又はモジュール（ＡＱ）２４ＣＣを含む又はこれからなる。
【０１７７】
本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、少なくとも１つの非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のＮＲ単位、好ましくは１個のＮＲ単位を更に含むことができる。本発明との関連では、「非反復（ＮＲ）単位」という用語は、明らかな反復パターンを示さない、自然発生的なシルクポリペプチドに存在するアミノ酸の領域（非反復単位又はＮＲ単位）を表す。好ましくは、非反復単位のアミノ酸配列は、自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはＡＤＦ−３（配列番号１）若しくはＡＤＦ−４（配列番号２）の非反復アミノ酸配列に、又はそれと実質的に類似のアミノ酸配列に相当する。
【０１７８】
非反復単位のアミノ酸配列は、自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはＡＤＦ−３（配列番号１）若しくはＡＤＦ−４（配列番号２）の非反復カルボキシ末端アミノ酸配列に、又はそれと実質的に類似のアミノ酸配列に相当するのが特に好ましい。より好ましくは、非反復単位のアミノ酸配列は、アミノ酸５１３〜アミノ酸６３６を含むＡＤＦ−３（配列番号１）若しくはアミノ酸３０２〜アミノ酸４１０を含むＡＤＦ−４（配列番号２）の非反復カルボキシ末端アミノ酸配列に、又はそれと実質的に類似のアミノ酸配列に相当する。
【０１７９】
この関連で「実質的に類似の」は、好ましくは２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個又はそれ以上のアミノ酸にわたる、より好ましくは自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはＡＤＦ−３（配列番号１）又はＡＤＦ−４（配列番号２）の各参照非反復（カルボキシ末端）アミノ酸配列の全長にわたる少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は更には９９．９％のアミノ酸同一性の程度を意味する。
【０１８０】
自然発生的なドラグラインポリペプチド（すなわち野生型非反復（カルボキシ末端）単位）内の、好ましくはＡＤＦ−３（配列番号１）又はＡＤＦ−４（配列番号２）内の対応する非反復（カルボキシ末端）アミノ酸配列と「実質的に類似の」アミノ酸配列を有する「非反復単位」は、その性質に関しても類似している。例えば「実質的に類似の反復単位」を含むシルクタンパク質も不溶性であり、その不溶性を保持するため、これも本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる。好ましくは、「実質的に類似の非反復単位」を含むシルクタンパク質は、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１０分〜９０分の期間にわたって、例えば１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、若しくは９０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基（例えば０．００５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ）を含む、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水又は脱イオン水に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％を超えて、又は更には１００％が不溶性のままである。本発明の好ましい実施の形態では、依然として不溶性である／不溶性のままである、「実質的に類似の非反復単位」を含むシルクタンパク質を、濾過、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径を有するフィルター膜を用いた濾過により、及び／又は遠心分離、好ましくは１０分間〜４０分間、好ましくは２０分間〜４０分間の３０００×ｇ〜１２０００×ｇ、より好ましくは４０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離／単離する。
【０１８１】
最も好ましくは、非反復（ＮＲ）単位は、ＮＲ３（配列番号４１）若しくはその変異体、又はＮＲ４（配列番号４２）若しくはその変異体である。ＮＲ３（配列番号４１）単位はニワオニグモのＡＤＦ−３のアミノ酸配列をベースとしており、ＮＲ４（配列番号４２）単位はニワオニグモのＡＤＦ−４のアミノ酸配列をベースとしている（国際公開第２００６／００８１６３号）。
【０１８２】
ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体は、参照ＮＲ３（配列番号４１）単位又はＮＲ４（配列番号４２）単位とは異なり、該変異体はそれらからアミノ酸配列における最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個又は３０個のアミノ酸変化（すなわち置換（exchanges）、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により誘導される。代替的に又は付加的に、このようなＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体は、変異体の誘導元である参照ＮＲ３単位又はＮＲ４単位に対する或る特定の程度の配列同一性を特徴とし得る。このため、ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体は、各参照ＮＲ３単位又はＮＲ４単位に対する少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には９９．９％の配列同一性を有する。好ましくは配列同一性は、各参照ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたる、好ましくは全長にわたるものである。
【０１８３】
配列同一性は各参照ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の全長にわたって少なくとも８０％、全長にわたって少なくとも８５％、全長にわたって少なくとも９０％、全長にわたって少なくとも９５％、全長にわたって少なくとも９８％、又は全長にわたって少なくとも９９％であるのが特に好ましい。配列同一性は各参照ＮＲ３単位若しくはＮＲ４単位のうちの少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８０％、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８５％、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９０％、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９５％、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９８％、又は少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個若しくは８０個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９９％であるのが更に特に好ましい。
【０１８４】
ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個又は６０個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１８５】
さらに、ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体又は断片は、変異体又は断片の元となるアミノ酸配列に関する修飾が、不溶性であり、その不溶性を保持するというシルクタンパク質の性質を変えることなく、そのため上記シルクタンパク質を未だに、本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる場合にのみ、本発明との関連においてＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体又は断片とみなされる。好ましくは、ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体又は断片を含むシルクタンパク質は、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１０分〜９０分の期間にわたって、例えば１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、若しくは９０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基（例えば０．００５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ）を含む、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水又は脱イオン水に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％を超えて、又は更には１００％が不溶性のままである。本発明の好ましい実施の形態では、依然として不溶性である／不溶性のままである、ＮＲ３単位又はＮＲ４単位の変異体又は断片を含むシルクタンパク質を、濾過、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径を有するフィルター膜を用いた濾過により、及び／又は遠心分離、好ましくは１０分間〜４０分間、好ましくは２０分間〜４０分間の３０００×ｇ〜１２０００×ｇ、より好ましくは４０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離／単離する。
【０１８６】
好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、ＡＤＦ−３（配列番号１）又はその変異体、ＡＤＦ−４（配列番号２）又はその変異体、ＭａＳｐ  Ｉ（配列番号４３）又はその変異体、ＭａＳｐ  ＩＩ（配列番号４４）又はその変異体、（Ｃ）ｍ、（Ｃ）ｍＮＲｚ、ＮＲｚ（Ｃ）ｍ、ＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚ、（ＡＱ）ｎ、（ＡＱ）ｎＮＲｚ、ＮＲｚ（ＡＱ）ｎ、ＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲｚ、（ＱＡＱ）ｏ、ＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ、（ＱＡＱ）ｏＮＲｚ、Ｙｐ、Ｘｐ及びＫｐ（ここで、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８）の整数であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）の整数であり、ｏは８〜１６（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６）の整数であり、ｐは８〜１６（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６）の整数であり、ｚは１〜３（すなわち１、２又は３）の整数であり、ＮＲは非反復単位を表す）からなる群から選択される。上述の式は以下のうちの１つにより定義される。
（ｉ）式（Ｃ）ｍでは、配列番号２１によるアミノ酸配列で表される、数「ｍ」のＣモジュール、すなわち２個〜６４個のＣモジュールが互いに組み合わせられ、
（ｉｉ）式（Ｃ）ｍＮＲｚでは、配列番号２１によるアミノ酸配列で表される、数「ｍ」のＣモジュール、すなわち２個〜６４個のＣモジュールが互いに組み合わせられ、上記Ｃモジュールはさらに、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４と組み合わせられ、
（ｉｉｉ）式ＮＲｚ（Ｃ）ｍでは、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４が存在し（ｚ＝１）、又は互いに組み合わせられ（ｚ＝２又は３）、上記非反復（ＮＲ）単位（複数も可）はさらに、配列番号２１によるアミノ酸配列で表される、数「ｍ」のＣモジュール、すなわち２個〜６４個のＣモジュールと組み合わせられ、
（ｉｖ）式ＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚでは、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４が存在し（ｚ＝１）、又は互いに組み合わせられ（ｚ＝２又は３）、上記非反復（ＮＲ）単位（複数も可）はさらに、配列番号２１によるアミノ酸配列で表される、数「ｍ」のＣモジュール、すなわち２個〜６４個のＣモジュールと組み合わせられ、上記モジュールＣはさらに、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４と組み合わせられ、
（ｖ）式（ＡＱ）ｎでは、数「ｎ」のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ、すなわち６個〜２４個のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ（ここでモジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列により表され、モジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされ、
（ｖｉ）式（ＡＱ）ｎＮＲｚでは、数「ｎ」のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ、すなわち６個〜２４個のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ（ここでモジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列により表され、モジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされ、上記ＡモジュールとＱモジュールとの組合せはさらに、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４と組み合わせられ、
（ｖｉｉ）式ＮＲｚ（ＡＱ）ｎでは、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４が存在し（ｚ＝１）、又は互いに組み合わせられ（ｚ＝２又は３）、上記非反復（ＮＲ）単位（複数も可）はさらに、数「ｎ」のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ、すなわち６個〜２４個のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ（ここでモジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列により表され、モジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列により表される）と組み合わせられ、
（ｖｉｉｉ）式ＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲＺでは、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４が存在し（ｚ＝１）、又は互いに組み合わせられ（ｚ＝２又は３）、上記非反復（ＮＲ）単位（複数も可）はさらに、数「ｎ」のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ、すなわち６個〜２４個のＡモジュールとＱモジュールとの組合せ（ここでモジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列により表され、モジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列により表される）と組み合わせられ、上記ＡモジュールとＱモジュールとの組合せはさらに、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４と組み合わせられ、
（ｉｘ）式（ＱＡＱ）ｏでは、数「ｏ」のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ、すなわち８個〜１６個のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ（ここでモジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列で表され、モジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列で表される）が互いに組み合わされ、
（ｘ）式（ＱＡＱ）ｏＮＲｚでは、数「ｏ」のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ、すなわち８個〜１６個のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ（ここでモジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列で表され、モジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列で表される）が互いに組み合わされ、上記Ｑモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せはさらに、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４と組み合わせられ、
（ｘｉ）式ＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏでは、数「ｚ」の非反復（ＮＲ）単位、すなわち１個〜３個の非反復（ＮＲ）単位、例えば配列番号４１によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ３又は配列番号４２によるアミノ酸配列で表される非反復（ＮＲ）単位ＮＲ４が存在し（ｚ＝１）、又は互いに組み合わせられ（ｚ＝２又は３）、上記非反復（ＮＲ）単位（複数も可）はさらに、数「ｏ」のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ、すなわち８個〜１６個のＱモジュールと、Ａモジュールと、Ｑモジュールとの組合せ（ここでモジュールＱは配列番号２２によるアミノ酸配列で表され、モジュールＡは配列番号２０によるアミノ酸配列で表される）と組み合わせられ、
（ｘｉｉ）式Ｙｐでは、配列番号２８によるアミノ酸配列で表される、数「ｐ」のＹモジュール、すなわち８個〜１６個のＹモジュールが互いに組み合わされ、
（ｘｉｉｉ）式Ｘｐでは、配列番号２７によるアミノ酸配列で表される、数「ｐ」のＸモジュール、すなわち８個〜１６個のＸモジュールが互いに組み合わされ、
（ｘｉｖ）式Ｋｐでは、配列番号２３によるアミノ酸配列で表される、数「ｐ」のＫモジュール、すなわち８個〜１６個のＫモジュールが互いに組み合わされる。
【０１８７】
より好ましくは、
（ｉ）（Ｃ）ｍＮＲｚ若しくはＮＲｚ（Ｃ）ｍにおけるｚは１であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、（Ｃ）ｍＮＲｚ若しくはＮＲｚ（Ｃ）ｍにおけるｚは２であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、若しくは（Ｃ）ｍＮＲｚ若しくはＮＲｚ（Ｃ）ｍにおけるｚは３であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、
（ｉｉ）（ＡＱ）ｎＮＲｚ若しくはＮＲｚ（ＡＱ）ｎにおけるｚは１であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）の整数であり、（ＡＱ）ｎＮＲｚ若しくはＮＲｚ（ＡＱ）ｎにおけるｚは２であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）の整数であり、若しくは（ＡＱ）ｎＮＲｚ若しくはＮＲｚ（ＡＱ）ｎにおけるｚは３であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）の整数であり、
（ｉｉｉ）ＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ若しくは（ＱＡＱ）ｏＮＲｚにおけるｚは１であり、ｏは８〜１６（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６）の整数であり、ＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ若しくは（ＱＡＱ）ｏＮＲｚにおけるｚは２であり、ｏは８〜１６（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６）の整数であり、若しくはＮＲｚ（ＱＡＱ）ｏ若しくは（ＱＡＱ）ｏＮＲｚにおけるｚは３であり、ｏは８〜１６（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６）の整数であり、
（ｉｖ）ＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚにおけるｚは１であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、ＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚにおけるｚは２であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、若しくはＮＲｚ（Ｃ）ｍＮＲｚにおけるｚは３であり、ｍは２〜６４（すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４）の整数であり、又は
（ｖ）ＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲｚにおけるｚは１であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４）の整数であり、ＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲｚにおけるｚは２であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４）の整数であり、又はＮＲｚ（ＡＱ）ｎＮＲｚにおけるｚは３であり、ｎは６〜２４（すなわち６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４）の整数であり、
ＮＲは非反復単位、好ましくはＮＲ３又はＮＲ４を表す。
【０１８８】
最も好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクタンパク質は、Ｃ１６ＮＲ４、Ｃ３２ＮＲ４、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、Ｃ３２、ＮＲ４Ｃ１６ＮＲ４、ＮＲ４Ｃ３２ＮＲ４、ＮＲ３Ｃ１６ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ３２ＮＲ３、ＮＲ４（ＡＱ）１２ＮＲ４、ＮＲ４（ＡＱ）２４ＮＲ４、ＮＲ３（ＡＱ）１２ＮＲ３、ＮＲ３（ＡＱ）２４ＮＲ３、（ＱＡＱ）８又は（ＱＡＱ）１６である。
【０１８９】
ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体は、参照（野生型）ＡＤＦ−３（配列番号１）、ＡＤＦ−４（配列番号２）、ＭａＳｐ  Ｉ（配列番号４３）、又はＭａＳｐ  ＩＩ（配列番号４４）のポリペプチドとは異なり、該変異体はそれらからアミノ酸配列における最大１５０個（最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個又は１５０個）のアミノ酸変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により誘導される。代替的に又は付加的に、このような変異体は、変異体の誘導元である参照（野生型）ポリペプチドに対する或る特定の程度の配列同一性を特徴とし得る。このため、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体は、各参照（野生型）ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩのポリペプチドに対する少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には９９．９％の配列同一性を有する。好ましくは配列同一性は、各参照（野生型）ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩのポリペプチドの少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１５０個、１８０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたる、好ましくは全長にわたるものである。
【０１９０】
配列同一性は、各参照（野生型）ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩのポリペプチドの全長にわたって少なくとも８０％、全長にわたって少なくとも８５％、全長にわたって少なくとも９０％、全長にわたって少なくとも９５％、全長にわたって少なくとも９８％、又は全長にわたって少なくとも９９％であるのが特に好ましい。配列同一性は、各参照（野生型）ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩのポリペプチドのうちの少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８０％、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも８５％、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９０％、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９５％、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９８％、又は少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個若しくは３００個のアミノ酸の連続ストレッチにわたって少なくとも９９％であるのが更に特に好ましい。
【０１９１】
ＡＤＦ−３（配列番号１）ポリペプチドの断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２０個、１５０個、１７０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３２０個、３５０個、３７０個、４００個、４２０個、４５０個、４７０個、５００個、５２０個、５５０個、５７０個、６００個又は６１０個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１９２】
ＡＤＦ−４（配列番号２）ポリペプチドの断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２０個、１５０個、１７０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個又は３９０個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１９３】
ＭａＳｐ  Ｉ（配列番号４３）ポリペプチドの断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６２０個、６４０個、６６０個、６７０個、６８０個又は６９０個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１９４】
ＭａＳｐ  ＩＩ（配列番号４４）ポリペプチドの断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５２０個、５４０個、５６０個又は５７０個のアミノ酸の欠失を有する。欠失は内部にあってもよい。
【０１９５】
さらに、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体又は断片は、変異体又は断片の元となるアミノ酸配列に関する修飾が、不溶性であり、その不溶性を保持するというシルクタンパク質の性質を変えることなく、そのため上記シルクタンパク質を未だに、本発明の方法の工程ｃ）において可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離することができる場合にのみ、本発明との関連においてＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体又は断片とみなされる。好ましくは、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体又は断片は、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水に、又は脱イオン水に不溶性であり、１０分〜９０分の期間にわたって、例えば１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、若しくは９０分にわたって、及び／又は４℃〜６０℃の温度で、例えば４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、若しくは６０℃で、塩基（例えば０．００５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ）を含む、水溶液、例えば緩衝水溶液に、培養培地に、発酵培地に、工業用水又は脱イオン水に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％を超えて、又は更には１００％が不溶性のままである。本発明の好ましい実施の形態では、依然として不溶性である／不溶性のままである、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ  Ｉ又はＭａＳｐ  ＩＩの変異体又は断片を、濾過、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの孔径を有するフィルター膜を用いた濾過により、及び／又は遠心分離、好ましくは１０分間〜４０分間、好ましくは２０分間〜４０分間の３０００×ｇ〜１２０００×ｇ、より好ましくは４０００×ｇ〜８０００×ｇでの遠心分離により可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離／単離する。
【０１９６】
別の実施の形態では、シルクタンパク質は、
（ｉ）アミノ酸配列ＧＣＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３５）からなるＴＡＧＣＹＳ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６）からなるＴＡＧＣＹＳ２、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＣＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３７）からなるＴＡＧＣＹＳ３、
（ｉｖ）アミノ酸配列ＧＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３８）からなるＴＡＧＬＹＳ１、及び
（ｖ）アミノ酸配列ＧＫＧＧＧＧＧＧ（配列番号３９）からなるＴＡＧＬＹＳ２
からなる群から選択されるアミノ末端及び／又はカルボキシ末端ＴＡＧを更に含む。
【０１９７】
これらのＴＡＧは、システイン及び／又はリジンを含有し、物質とシルクタンパク質とをその単離後に共有結合的に連結するのに使用することができる。好ましくは、共有結合的に連結／カップリングする物質は、ポリペプチド、脂質、色素、共役金属、活性炭、及び作用物質からなる群から選択される。
【０１９８】
最も好ましくは、本発明の方法により単離されるシルクポリペプチドは、ＴＡＧＣＹＳ１Ｃ１６、Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ１、ＴＡＧＣＹＳ１Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ１、ＴＡＧＣＹＳ２Ｃ１６、Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ２、ＴＡＧＣＹＳ２Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ２、ＴＡＧＣＹＳ３Ｃ１６、Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ３、ＴＡＧＣＹＳ３Ｃ１６ＴＡＧＣＹＳ３、ＴＡＧＬＹＳ１Ｃ１６、Ｃ１６ＴＡＧＬＹＳ１、ＴＡＧＬＹＳ１Ｃ１６ＴＡＧＬＹＳ１、ＴＡＧＬＹＳ２Ｃ１６、Ｃ１６ＴＡＧＬＹＳ２、又はＴＡＧＬＹＳ２Ｃ１６ＴＡＧＬＹＳ２を含む又はこれからなる。
【０１９９】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の方法により入手可能な不溶性の標的タンパク質に関する。
【０２００】
更なる態様では、本発明は、タンパク質溶液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法であって、
ａ）不溶性の標的タンパク質を含むタンパク質溶液を準備する工程と、
ｂ）少なくとも１つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ／又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記溶液に添加する工程と、
ｃ）該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程ｂ）では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも８０％が可溶化する、タンパク質溶液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
【０２０１】
好ましくはタンパク質溶液は、不溶性の標的タンパク質を発現するトランスジェニック動物、例えばヤギ、ヒツジ又はウシ由来の乳である。定義、工程ｂ）で添加される塩基の選択、用いられる試薬、プロセスの条件及びパラメータ、並びに単離可能な標的タンパク質に関しては、本発明の第１の態様に関して上記で為された説明を参照する。
【０２０２】
本発明の様々な変更形態及び変形形態は、本発明の範囲を逸脱することなく当業者にとって明らかであろう。本発明を特定の望ましい実施形態に関連して説明しているが、特許請求の範囲に記載の本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されないことが理解されるものとする。実際、関連の技術分野の当業者にとって自明である、記載の本発明を実施するための形態の様々な変更形態は、本発明に包含されることが意図される。
【０２０３】
添付の図面及び以下の実施例は本発明を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲により示されるような本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】相分離を視覚化した図である。細胞残余物は完全に溶解するが、Ｃ１６標的タンパク質は依然としてペレット画分に不溶性である。様々な作用物質の添加がＣ１６標的タンパク質ペレットの相分離の結果に影響を及ぼす。図１は、実施例２に記載のような一段階の精製を示す。細胞残屑を、Ａ：０．０５ＭのＮａＯＨ；Ｂ：０．０５ＭのＮａＯＨ及び４．８Ｍの尿素、Ｃ：０．０５ＭのＮａＯＨ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｄ：４．８Ｍの尿素、Ｅ：２Ｍの塩酸グアニジン、Ｆ：０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０とともに４５分間インキュベートした。インキュベーション及びその後の遠心分離工程の後、Ａ、Ｂ及びＣの沈降物は、ほとんど全てが高純度のＣ１６標的タンパク質からなる白色ペレットを示す。サンプルＤ、サンプルＥ及びサンプルＦでは、はっきりした相分離は観察されなかった。
【図２】実施例２に従って精製された組換えスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６のイムノブロット分析（ウェスタンブロット法）の結果を示す図である。Ｃ１６をロードしたレーン２は単一のタンパク質シグナルを示す（レーン１はＣ１６陽性対照）。タンパク質分解を観察することはできなかった。標的タンパク質の特異的検出は、ＳＥＲＶＡＧｅｌ（商標）ＴＧ１０（４３２１０）の同封されたプロトコルに従って共役型のＴ７タグペプチドにより媒介される。詳細：レーン１：０．５μｇの陽性対照Ｃ１６（Huemmerich et. al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612に従って精製）；レーン２：５μｇのＣ１６（実施例２に従って精製）。抗体：Ｔ７タグ（商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、カタログ番号：６９０４８−３、Novagen；ＰＶＤＦ膜：Ｒｏｔｉ（商標）Ｆｌｕｏｒｏ−ＰＶＤＦ、ＰＶＭ０２０Ｃ−０９９、Roth；イムノブロット分析（ウェスタンブロット法）をＳＥＲＶＡＧｅｌ（商標）ＴＧ１０（４３２１０）の同封されたプロトコルに従って実施した。ブロッキング溶液：１×ＰＢＳバッファー中の５％粉乳、インキュベーション３０分；検出を同封されたプロトコルに従ってＬｕｍｉ−ｌｉｇｈｔＰｌｕｓ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１２０１５１９６００１、Rocheを用いて達成した。
【図３】１０μｇのＣ１６タンパク質をロードした、実施例２に記載のプロセスに従って精製された組換えスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析（銀染色）（レーン２）が単一のタンパク質シグナルを示すことを示す図である（レーン１はＣ１６タンパク質陽性対照）。図１によると、コンタミネーションを観察することはできなかった。レーン１：１０μｇのＣ１６陽性対照（Huemmerich et. al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612に従って精製）；レーン２：１０μｇのＣ１６（実施例２に記載のように精製）。ＳＤＳ−Ｐａｇｅを同封されたプロトコルに従ってＳＥＲＶＡＧｅｌ（商標）ＴＧ１０（４３２１０）を用いて実施した。染色を同封されたプロトコルに従ってＳＥＲＶＡ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（３５０７６）を用いて達成した。
【図４】実施例２に従って精製された組換えスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。クロマトグラムは１５．０５７分での単一のはっきりしたピークを示す（２８０ｎｍの波長で検出される標的タンパク質Ｃ１６として同定される）。コンタミネーションを観察することはできなかった。カラムのパラメータ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ（商標）ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ、Tosoh Bioscience、番号０８５４１、内径：７．８ｍｍ、長さ：３０．０ｃｍ。流量は０．５ｍｌ／分で一定であった。
【図５】Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612による精製方法と実施例２による精製方法とを、精製されたＣ１６タンパク質（標的タンパク質）の量に関して比較した図である。本方法（実施例２を参照されたい）に従って精製された場合の標的タンパク質Ｃ１６の収率（８９％）は、Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612による方法の収率（１０．４％）と比較して有意に高かった（およそ９倍）ことが示された。図５は、実施例２に従って精製された標的Ｃ１６タンパク質の収率を示す。精製方法（Huemmerich et. al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612）と実施例２に記載のような精製方法との両方を精製されたＣ１６タンパク質の量に関して比較した。
【図６】実施例２に記載のように０．０５Ｍの水酸化ナトリウムで処理した精製された組換えスパイダーシルクタンパク質Ｃ１６の安定性アッセイの結果を示す図である。５分〜２４時間の期間の０．０５Ｍの水酸化ナトリウムとのインキュベーション後に有意なタンパク質分解を観察することはできなかった。標的タンパク質の同定はＨＰＬＣ実行における蛍光検出器により媒介される（励起波長：２７５ｎｍ、発光波長：３０５ｎｍ；勾配：アイソクラチック（isocratic）、溶出液：１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５））。サンプルをインキュベーションの様々な時点（５分、１０分、２０分、３０分、１時間、３時間、７時間及び２４時間）で採取した。それぞれのクロマトグラムのデータをわずかな差異のより良好な検出のために１００％に対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２０５】
標的タンパク質を分離するために、発明者らは、ニワオニグモ（European garden cross spider Araneus diadematus）由来のドラグラインシルクタンパク質ＡＤＦ−４から誘導される合成シルクポリペプチドＣ１６を例示的に設計した。該タンパク質は、ＡＤＦ−３及び／又はＡＤＦ−４、並びにそれらの変異体が効率的な集合挙動を示すというこれまでの観察結果に基づいて選択された。
【０２０６】
実施例Ｉ：微生物細胞の懸濁液の調製
微生物細胞を室温で９００バールの圧力でホモジナイザー［APV Gaulin GmbH、ＬＡＢ６０−１５  ＲＢＦＩ］を用いて２回溶解／破壊した。得られる細胞残屑溶液を９０００×ｇで３０分間、２０℃で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞残屑沈降物を一段階の精製に用いた。
【０２０７】
実施例ＩＩ：Ｃ１６の単離
微生物細胞溶液の調製による細胞残屑沈降物（実施例１）の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物（湿重量）と０．０５ＭのＮａＯＨとの比率は１：３（ｗ／ｗ）であった。本実施例では、細胞残屑沈降物は５グラムと測定された。したがってサンプル添加物の重量は１５グラムと算出された。本実験の添加物は、Ａ：０．０５ＭのＮａＯＨ；Ｂ：０．０５ＭのＮａＯＨ及び４．８Ｍの尿素、Ｃ：０．０５ＭのＮａＯＨ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｄ：４．８Ｍの尿素、Ｅ：２Ｍの塩酸グアニジン、又はＦ：０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０であった。全てのサンプルを十分にかき混ぜながら２０℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを８０００×ｇで、３０分間、２０℃で遠心分離した（図１を参照されたい）。Ａ、Ｂ及びＣの沈降物は、ほとんど全てが高純度のＣ１６標的タンパク質からなる白色ペレットを示した。サンプルＤ、サンプルＥ及びサンプルＦでは、はっきりした相分離は観察されなかった。
【０２０８】
この工程の後、凝集したＣ１６タンパク質（標的タンパク質）はペレット画分に存在し、上清は廃棄した。Ｈ２Ｏによる２回の更なる洗浄工程（８０００×ｇ、３０分、２０℃での遠心分離）を実施し、Ｃ１６標的タンパク質の純度を増大させた。このようにして得られたＣ１６標的タンパク質を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析（銀染色）［染色を同封されたプロトコルに従ってＳＥＲＶＡ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（３５０７６）を用いて実行した］（図３を参照されたい）、イムノブロット分析（ウェスタンブロット法）［イムノブロット分析（ウェスタンブロット法）をＳＥＲＶＡＧｅｌ（商標）ＴＧ１０（４３２１０）の同封されたプロトコルに従って実施した。ブロッキング溶液：１×ＰＢＳバッファー中の５％粉乳、インキュベーション３０分；検出を同封されたプロトコルに従ってＬｕｍｉ−ｌｉｇｈｔＰｌｕｓ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１２０１５１９６００１、Rocheを用いて達成した］（図２を参照されたい）、及びＨＰＬＣ分析［カラムのパラメータ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ（商標）ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ、Tosoh Bioscience、番号０８５４１、内径：７．８ｍｍ、長さ：３０．０ｃｍ。流量は０．５ｍｌ／分で一定であった］（図４を参照されたい）において分析した。
【０２０９】
実施例ＩＩＩ：標準的なプロセスと比較したＣ１６の単離：
微生物細胞の調製による細胞残屑沈降物の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物（湿重量）と０．０５ＭのＮａＯＨとの比率は１：３（ｗ／ｗ）であった。本実施例では、細胞残屑沈降物は１キログラムと測定された。したがって０．０５ＭのＮａＯＨの重量は３ｋｇと算出された（総重量：４ｋｇ）。サンプルを混合しながら２０℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを８０００×ｇで、３０分間、２０℃で遠心分離した。この工程の後、Ｃ１６標的タンパク質はペレット画分に存在し、上清は廃棄した。Ｈ２Ｏによる２回の更なる洗浄工程（８０００×ｇ、３０分、２０℃での遠心分離）を実施し、Ｃ１６標的タンパク質の純度を増大させた。本実施例では、精製されたＣ１６標的タンパク質の量を、Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612に記載されたような精製方法のものと比較した。本方法と対比して、Huemmerich et al.による精製は、微生物細胞の調製による細胞破壊後に上清を用いて実施された。
【０２１０】
【表１】
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【０２１１】
精製されたＣ１６標的タンパク質の量に関して、実施例２に記載のように精製した場合に標的タンパク質Ｃ１６の収率は有意に高かった（およそ９倍）ことが示された（表１、図５を参照されたい）。
【０２１２】
実施例ＩＶ：Ｃ１６のタンパク質安定性
標的タンパク質Ｃ１６を含有する微生物細胞溶液を０．０５ＭのＮａＯＨで処理した。実施例１及び実施例２に記載のように、微生物細胞を、室温で９００バールの圧力でホモジナイザー［APV Gaulin GmbH、ＬＡＢ６０−１５  ＲＢＦＩ］を用いて２回溶解した。得られる細胞残屑溶液を９０００×ｇで３０分間、２０℃で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞残屑沈降物を一段階の精製に用いた。微生物細胞溶液の調製による細胞残屑沈降物（実施例１）の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物（湿重量）と０．０５ＭのＮａＯＨとの比率は１：３（ｗ／ｗ）であった。
【０２１３】
サンプルをインキュベーションの様々な時点（５分、１０分、２０分、３０分、１時間、３時間、７時間及び２４時間）で採取した。それぞれのクロマトグラムのデータをわずかな差異のより良好な検出のために１００％に対して正規化した。図６に示すように、５分〜２４時間の期間の０．０５ＭのＮａＯＨとのインキュベーション後に有意なタンパク質分解は起こらない。機器パラメータ：ＴＳＫ−Ｇｅｌ（商標）ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ、内径：７．８ｍｍ、長さ：３０．０ｃｍ。流量：０．５ｍｌ／分、蛍光検出：励起波長：２７５ｎｍ、発光波長：３０５ｎｍ；勾配：アイソクラチック、溶出液：１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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