(57)【要約】【課題】  抗酸化活性及びＧＬＰ−１産生作用を有する米糠抽出物を提供することを課題とする。【解決手段】  アシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有することを特徴とする米糠抽出物。 【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、
加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有することを特徴とする米糠抽出物。
【請求項２】
請求項１記載の米糠抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項３】
請求項１記載の米糠抽出物を有効成分とするＧＬＰ−１産生促進剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
米糠は玄米を精白する際に出る果皮、種皮、胚芽などの部分のことである。米糠には種々の有用な成分が含有されている。代表的な成分として、フィチン酸、イノシトール、フェルラ酸、γ-オリザノール、食物繊維、蛋白質、ビタミンB1、ビタミンB6、ビタミンE、ミネラルなどを例示することができる。これらの成分を利用した米糠の抽出物配合食品や飲料が提案されている。特許文献１（特開２００２−２０３０７号公報）には米糠中の無機質、ビタミンＢ群、食物繊維、フィチン酸及びたんぱく質を含有する水溶性米糠抽出物を有効成分とし、活性酸素消去能を有する抗酸化性組成物が記載されている。特許文献２（特開２００７−２２３９９０号公報）には玄米、白米および米糠から、亜臨界エタノール、あるいは超臨界エタノールを用いて抽出した抗酸化組成物が記載されている。特許文献３（特開２０１２−１８８５７４号公報）には脱脂米糠等を、微細化処理及び加熱処理の少なくとも何れか一方で処理してなる抗酸化物質が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−２０３０７号公報
【特許文献２】特開２００７−２２３９９０号公報
【特許文献３】特開２０１２−１８８５７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗酸化活性及びＧＬＰ−１産生作用を有する米糠抽出物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）アシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、
加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有することを特徴とする米糠抽出物。
（２）（１）記載の米糠抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
（３）（１）記載の米糠抽出物を有効成分とするＧＬＰ−１産生促進剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、抗酸化効果に優れた米糠抽出物を提供することができる。
さらに、本発明の米糠抽出物はグルカゴン様ペプチド−１；glucagon-like peptide-1(以下、ＧＬＰ−１と略記する。）の産生促進作用を有しており、ＧＬＰ−１産生促進剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の米糠抽出物が濃度依存的にヒト大腸細胞由来の培養細胞のＧＬＰ−１産生を促進することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の米糠抽出物に含まれるアシル化ステロール配糖体は、アシル基や糖鎖の異なる化合物の総称であり、天然物中には通常複数の成分の混合物として存在する。アシル化ステロール配糖体の構成糖は主にグルコースである。また構成ステロールはβ−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール等である。アシル化は主にグルコースの６位が、脂肪酸によってアシル化されており、構成脂肪酸は主にリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸であることが明らかになっている（帯大研報，10，（1977）507〜514）。
【０００９】
本発明の米糠抽出物は、上記のアシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％含有する。  
【００１０】
本発明に用いられる米糠抽出物中のアシル化ステロール配糖体の含有量の測定は以下の方法により行うことができる。
（１）米糠抽出物を適量秤取し、クロロホルム／メタノール混液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を加え、メスフラスコにてメスアップする。
（２）（１）で得られた溶液は成分濃度に応じて適宜希釈し、分析用試料溶液とする。
（３）標品はＥｓｔｅｒｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｙｌ  Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（フナコシ）とし、高速液体クロマトグラフ法によりアシル化ステロール配糖体の濃度を算出する。
（４）高速液体クロマトグラフ法による分析条件
分析装置：ＨＰＬＣ
移動相Ａ：メタノール：水  ＝  ９５：５（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：クロロホルム  ＝  １００（ｖ／ｖ）
ポンプ：Ｍｏｄｅｌ  ５８２  
ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ
分析カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｉ６０（５μｍ）
ＨＰＬＣ−Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＭＥＲＣＫ）
検出器：荷電化粒子検出器（コロナ  ダイオネクス社）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
カラムオーブン：４０℃（ＦＬＯ社  ｍｏｄｅｌ  ５０２）
分析時間：４０ｍｉｎ
脱泡装置：ｕｎｉｆｌｏｗｓ  Ｄｅｇａｓｙｓ  
Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＤＶ      ３００３
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント条件
以下に示すとおり
０−１５分
移動相Ａ：１％    →  ２５％、移動相Ｂ：  ９９％  →  ７５％
１５−２０分
移動相Ａ：２５％  →  ９０％、移動相Ｂ：  ７５％  →  １０％
２０−２５分
移動相Ａ：９０％、            移動相Ｂ：  １０％
２５−３０分
移動相Ａ：９０％  →  １％、  移動相Ｂ：  １０％  →  ９９％
３０−４０分
移動相Ａ：１％、              移動相Ｂ：  ９９％
【００１１】
本発明の米糠抽出物は、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％含有する。
γ−オリザノールは、米糠の脂質に含有されるフェルラ酸とステロールのエステルであり、またフェルラ酸２４−メチレンシクロアルテニル、フェルラ酸シクロアルテニル、フェルラ酸カンペステリル、フェルラ酸β−シトステリル等の混合物である。
【００１２】
本発明の米糠抽出物中のγ−オリザノールの含有量は、高速液体クロマトグラフィーにて、逆相カラムを用い、紫外線検出器で検出することができる。
【００１３】
本発明の米糠抽出物は、ステアロ・オレオ・レシチン（ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン）換算でリン脂質を１８〜２８質量％含有する。
【００１４】
本発明の米糠抽出物中のリン脂質の含量はモリブデンブルー吸光光度法により、リンの濃度を測定し、ステアロ・オレオ・レシチン量に換算して求めることができる。具体的には、米糠抽出物からＦｏｌｃｈ法で脂質を抽出し、灰化後、モリブデンブルー吸光光度法により、リンの濃度を測定する。
【００１５】
本発明の米糠抽出物は、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸を含有する。
【００１６】
前記した加水分解後のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸の量は、以下の方法により測定できる。米糠抽出物に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を加えてケン化し、三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノール溶液を添加してメチルエステル化する。ヘキサンと飽和食塩水を加えて脂肪酸のメチルエステル化物を分配抽出し、ガスクロマトグラフィーで水素炎イオン検出器を用いて定量分析する。
【００１７】
本発明に用いられる米糠抽出物は、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有する。植物ステロールの主成分は、β−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロールである。
【００１８】
加水分解後の植物ステロールの量は、以下の方法により測定できる。米糠抽出物に塩化ナトリウム水溶液、ピロガロール−エタノール溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カリウムを順次加えて、ケン化する。塩化ナトリウム水溶液とヘキサン、酢酸エチル混液を添加して、不ケン化物を分配抽出する。不ケン化物からシリカカートリッジカラムを用いて植物ステロール画分を分離し、植物ステロール画分中の植物ステロールをガスクロマトグラフィーで水素炎イオン検出器を用いて定量分析する。
【００１９】
本発明の米糠抽出物の抽出方法としては、溶媒抽出法、超臨界抽出法、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。
また、具体的な抽出操作を以下に示す。
【００２０】
＜抽出方法＞
市場に流通している米糠を選別した後に、ノルマルヘキサンなどの溶媒を用いて脱脂する。得られた油、脱脂糠等の粗原料を蒸留装置により脱溶媒し、さらにノルマルヘキサン、アセトン、エタノール、水などの溶媒によって抽出する。かくして得られた抽出液を、脱溶剤装置を用いて再度脱溶剤することで米糠抽出物を得ることができる。
【００２１】
本発明の米糠抽出物は、抗酸化効果を期待する製剤または食品として利用することができる。また、本発明の米糠抽出物は、ＧＬＰ−１の産生促進を期待する製剤または食品として利用することができる。剤型は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口摂取（投与）することができる。カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液状として摂取（投与）できる。
摂取（投与）量は、摂取（投与）方法と、対象者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、成人では体重1kg当たり通常、１日当たり有効成分として0.１〜500mgが適当である。
【実施例】
【００２２】
以下に、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
＜実施例１：米糠抽出物の調製（溶媒抽出）＞
市場に流通している米糠を選別し胚乳や異物を除いた米糠を得た。得られた選別済みの米糠１０kgに対して５０Ｌのノルマルヘキサンを用い脱脂した。この脱脂作業を１回繰り返し、脱脂米糠を得た。得られた脱脂米糠から蒸留装置により溶媒を除去した。
得られた脱脂米糠８kgに対し、５０Ｌの割合でエタノールを用いて７０±３℃の温度条件にて１時間還流抽出した。これを３回繰り返し、得られた抽出液について、脱溶剤装置を用いてエタノールを除去した。米糠抽出物中のアシル化ステロール配糖体、γ−オリザノール、ステアロ・オレオ・レシチン換算のリン脂質の濃度並びに、加水分解前の質量に対する、加水分解後のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、植物ステロールの濃度を下記の表１に示す。
【００２４】
＜比較例１：米糠抽出物の調製（溶媒抽出）＞
市場に流通している米糠を選別し胚乳や異物を除いた米糠を得た。得られた選別済みの米糠１０kgに対して５０Ｌのノルマルヘキサンを用い脱脂した。この脱脂作業を３回繰り返し、脱脂米糠を得た。得られた脱脂米糠から蒸留装置により溶媒を除去した。
得られた脱脂米糠８kgに対し、５０Ｌの割合でアセトンを用いて５０±３℃の温度条件で１時間還流抽出した。これを３回繰り返し、得られた抽出液について、脱溶剤装置を用いてアセトンを除去した。米糠抽出物中のアシル化ステロール配糖体、γ−オリザノール、ステアロ・オレオ・レシチン換算のリン脂質の濃度並びに、加水分解前の質量に対する、加水分解後のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、植物ステロールの濃度を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
＜過酸化物価試験＞
三角フラスコ（２００ｍＬ）に下記に示した過酸化物価（以下、POV）と採取量の関係に準じ、実施例１、比較例１の米糠抽出物を採取した。これにクロロホルム１５ｍＬを加え溶解した。さらに、酢酸１５ｍＬおよびヨウ化カリウム飽和溶液１ｍＬを加え、５分間放置し、水７５ｍＬを加え激しく振り混ぜたのち、１％でんぷん溶液を数滴加え、０．０１mol/Lチオ硫酸ナトリウム溶液にて滴定し、無色になる点を終点とする。本試験と平行して空試験を行う。POV＝（a-b）×Ｆ×１０/Ｓ  （a:本試験の滴定量、b：空試験の滴定量、F：０．０１ｍｏｌ/Lチオ硫酸ナトリウム溶液の力価、S:試料の採取量）の式から、POVを求めた。なお、あらかじめ予備試験によりＰＯＶの概算値を求めておき、下記の表２の採取量の範囲で測定試料を秤量するようにした。過酸化物価測定結果を表３に示す。 
【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
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【００２９】
実施例１の米糠抽出物は顕著な抗酸化効果を示した。
【００３０】
＜ＤＰＰＨラジカル消去活性試験＞
96wellに100%エタノールで3段階に濃度調整したサンプル（実施例１または比較例１）を150μLずつ分注した。次に各wellに200μmol/LのDPPHエタノール溶液を90μL加えて反応させ、2分後の520nmの吸光度（OD）を分光光度計で測定した。なお、DPPH溶液の代わりにエタノールを加えたものを各サンプル濃度のブランク、サンプルの代わりにエタノールを加えたものをコントロール、DPPHおよびサンプルを加えずエタノールだけを加えたものをコントロールブランクとした。各濃度のDPPH消去率（％）を以下の式から算出し、DPPHラジカル50%消去能を持つサンプル濃度（EC50）を求めた。
消去率（%）＝（１−（サンプルOD−ブランクOD）/（コントロールOD−コントロールブランクOD））×100
結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
実施例１の米糠抽出物は顕著な抗酸化効果を示した。
【００３３】
＜ＧＬＰ−１産生試験＞
次の方法でＧＬＰ−１産生促進作用を試験した。
【００３４】
［培養細胞を用いたＧＬＰ−１産生試験］
NCI-H716細胞(ヒト結腸がん由来細胞)1×105cellsを75cm2 の細胞培養フラスコに播種し、10% FBS含有RPMI1640培地で14日間、37℃、5％ＣＯ２条件下で、培養を行った。なお NCI-H716細胞は、ATCC（American Type Culture Collection）から入手した。培養後、マトリゲルを塗布した24 well plateに4×104cells/wellとなるように播種し、10%FBS含有DMEM培地で1日間培養を行った。
その後、Hanks緩衝液で2回洗浄し、試験試料を添加し、無血清DMEM培地で2時間培養を行った。培養終了後、培養液中に産生されたGLP-1量を 「GLP-1 ELISA kit (Glucagon-Like Peptide-1  Cat＃EGLP-35K：Millipore社)」を用いて測定した。なお、コントロールは 1％DMSOとし、陽性対照として用いたオレオイルエタノールアミド(ＯＥＡ)は、ＧＬＰ−１産生促進作用を有することが知られている化合物である。このＯＥＡを50μMとなるように添加した。
【００３５】
[試験物質]
実施例1で得られた米糠抽出物を試験に用いた。米糠抽出物の濃度が1000μg/ml/1％DMSO(ジメチルスルフォキシド)となるように、DMEM(FBS-,PS-)培地で溶解し、最終培養液中の米糠抽出物の濃度は、250μｇ／ｍｌ、500μｇ／ｍｌ、1000μｇ／ｍｌになるように添加した。
【００３６】
[結果]
ＧＬＰ−１測定結果は、１％ＤＭＳＯのみの場合に得られる測定値を１としたときの相対値として求めた。測定結果を図１に示す。実施例１の米糠抽出物にＯＥＡと同等以上のＧＬＰ−１産生促進作用が確認され、さらに濃度依存性も認められた。
この試験から、本発明の米糠抽出物はＧＬＰ−１産生促進作用を有しており生体機能維持上有用であることが明らかとなった。
【図１】
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