(57)【要約】  本発明は、修飾された単一ドメイン抗原結合分子、例えばＳＤＡＢ分子、特にＴＮＦａ結合型のＳＤＡＢ分子に関する。例えばＴＮＦａ関連障害を治療するために、本明細書に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子を調製する及び使用する方法も開示する。【選択図】なし
2013536175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された単一ドメイン抗原結合分子であって、
（ｉ）１つ又は複数の標的に結合する、１つ又は複数の単一抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）非ペプチドリンカーと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のポリマー分子と、
を含み、該非ペプチドリンカーが式（Ｉ）の部分である、修飾された単一ドメイン抗原結合分子：
【化１】
2013536175.tif 000040
（式中、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して、結合又はＮＲ１から選択され、
Ｙは結合、０〜２個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレン、又はピロリジン−２，５−ジオンであり、
ＸはＯ、結合であるか、又は存在せず、
ＺはＯ、ＮＲ３、Ｓ、又は結合であり、
Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、水素又はＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は存在していないか、又は１つ若しくは複数のポリマー部分であり、
Ｒａはヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル又はＣ１〜４アルコキシから選択され、
ｍは０又は１であり、
ｎは０、１、２又は３であり、
ｐは０、１、２、３又は４である）。
【請求項２】
１つ又は複数のポリマー分子がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）モノマー又はその誘導体を含む、請求項１に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項３】
ＰＥＧポリマー分子が分岐しており、該ＰＥＧモノマーがメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）又はその誘導体である、請求項２に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項４】
ＰＥＧポリマー分子が式（ａ）〜式（ｈ）からなる群から選択される分岐ＰＥＧポリマー分子である、請求項３に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子：
【化２】
2013536175.tif 000041
【請求項５】
各ＰＥＧポリマー部分が独立して、１ＫＤａ〜１００ＫＤａの分子量を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項６】
各ＰＥＧポリマー部分が独立して、１０ＫＤａ〜５０ＫＤａの分子量を有する、請求項５に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項７】
各ＰＥＧポリマー部分が独立して、１０ＫＤａ、２０ＫＤａ、３０ＫＤａ、４０ＫＤａ及び５０ＫＤａからなる群から選択される分子量を有する、請求項５に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項８】
リンカー及びＰＥＧポリマー分子が以下からなる群から選択される構造を有する、請求項５に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子：
【化３】
2013536175.tif 000042
【請求項９】
リンカー及びＰＥＧポリマー分子が以下の式で表される、請求項８に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子：
【化４】
2013536175.tif 000043
【請求項１０】
前記単一抗原結合ドメインの少なくとも１つがヒトＴＮＦαに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１１】
一価、二価又は三価である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１２】
単一特異性、二重特異性又は三重特異性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１３】
前記単一抗原結合ドメインの１つ又は複数が、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、又はファージディスプレイによって選択されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１４】
Ｎ末端からＣ末端へと以下の順序で：抗ＴＮＦα単一抗原結合ドメイン−（任意でペプチドリンカー）−抗ＴＮＦα単一抗原結合ドメイン−非ペプチドリンカー−１つ又は複数のポリマー分子を含む一本鎖融合ポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１５】
前記単一抗原結合ドメインの１つ又は複数が、図２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１６】
前記単一抗原結合ドメインの１つ又は複数が、以下のアミノ酸配列：DYWMY（ＣＤＲ１）、EINTNGLITKYPDSVKG（ＣＤＲ２）及びSPSGFN（ＣＤＲ３）を有する３つのＣＤＲを含むか、又は１つのアミノ酸置換が存在するという点で前記ＣＤＲの１つとは異なるＣＤＲを有する、請求項１４又は１５に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１７】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ又は（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）の少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回又はそれ以上の反復を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。
【請求項１８】
以下の構造で表される、請求項１７に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子：
【化５】
2013536175.tif 000044
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、又は細胞増殖抑制剤の１つ又は複数から選ばれる第２の作用物質を更に含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
被験体において炎症状態又は自己免疫状態を改善する方法であって、該被験体に、該ＴＮＦα関連障害の症状の１つ又は複数が軽減するような量で請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子を投与することを含む、被験体において炎症状態又は自己免疫状態を改善する方法。
【請求項２２】
第２の作用物質を該修飾された単一ドメイン抗原結合分子と併せて投与することを更に含み、前記第２の作用物質がサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、又は細胞増殖抑制剤の１つ又は複数から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＮＦα関連障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、関節炎状態、乾癬性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、又は多発性硬化症の１つ又は複数から選ばれる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
修飾された単一ドメイン抗原結合分子又は第２の作用物質を皮下注射、血管注射、筋肉注射又は腹腔内注射により又は吸入により該被験体に投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する方法であって、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を被験体に投与することと、
該修飾されたＳＤＡＢ分子の１つ又は複数の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを評価することと、
を含む、修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する方法。
【請求項２６】
修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する又は選択する方法であって、
被験体において請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子の少なくとも１つのＰＫ／ＰＤパラメータに関する試験値を被験体に提示することと、
提示された該試験値を少なくとも１つの参照値と比較し、それにより該修飾されたＳＤＡＢ分子を評価する又は選択する、比較することと、
を含む、修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する又は選択する方法。
【請求項２７】
修飾されたＳＤＡＢ分子を含有するサンプルを準備することと、
捕捉検出アッセイで該サンプルを試験することと、
を更に含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
評価されるＰＫ／ＰＤパラメータが、該修飾されたＳＤＡＢ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ濃度（例えば血液、血清、血漿及び／又は組織中の濃度）；該修飾されたＳＤＡＢ分子のクリアランス（ＣＬ）；該修飾されたＳＤＡＢ分子の定常状態の体積分布（Ｖｄｓｓ）；該修飾されたＳＤＡＢ分子の半減期（ｔ１／２）；該修飾されたＳＤＡＢ分子のバイオアベイラビリティ；該修飾されたＳＤＡＢ分子の用量で正規化した最大血中濃度、最大血清濃度若しくは最大血漿濃度；該修飾されたＳＤＡＢ分子の用量で正規化した曝露量；又は該修飾されたＳＤＡＢ分子の組織対血清比の１つ又は複数から選ばれる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
修飾された単一ドメイン結合分子を評価する捕捉検出アッセイであって、固体支持体に固定化された標的と、結合した修飾された単一ドメイン抗原結合分子−標的複合体を検出するための該修飾された単一ドメイン抗原結合分子のタンパク質部分又はポリマー部分に結合する試薬とを準備することを含む、修飾された単一ドメイン結合分子を評価する捕捉検出アッセイ。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン結合分子を含有するデバイス、シリンジ又はバイアルを含み、任意で使用説明書を含む、キット又は製造物。
【請求項３１】
修飾された単一ドメイン結合分子を製造する方法であって、
単一ドメイン結合分子を準備することと、
該単一ドメイン結合分子を式（Ｉ）の非ペプチドリンカーに、少なくとも１つの化学結合が形成される条件下で接触させることと、
を含む、修飾された単一ドメイン結合分子を製造する方法：
【化６】
2013536175.tif 000045
（式中、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して、結合又はＮＲ１から選択され、
Ｙは結合、０〜２個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレン、又はピロリジン−２，５−ジオンであり、
ＸはＯ、結合であるか、又は存在せず、
ＺはＯ、ＮＲ３、Ｓ、又は結合であり、
Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、水素又はＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は存在していないか、又は１つ若しくは複数のポリマー部分であり、
Ｒａはヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル又はＣ１〜４アルコキシから選択され、
ｍは０又は１であり、
ｎは０、１、２又は３であり、
ｐは０、１、２、３又は４である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾された単一ドメイン抗原結合分子（本明細書では「ＳＤＡＢ分子」とも称される）に関する。 
【０００２】
本願は、２０１０年７月１６日付けで出願された米国仮出願第６１／３６５，３０７号に対する優先権を主張するものである。上述の出願の全文は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、主にマクロファージ及び単球により産生される分泌型及び膜結合型の炎症誘発性サイトカインである。ＴＮＦαの合成は様々な慢性的な自己免疫炎症性疾患、例えば関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病等で上方調節される。ＴＮＦαは、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）によりタンパク質切断され、その可溶型を放出することができる三量体膜貫通タンパク質として発現する。両方の型のＴＮＦαがＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）１及びＴＮＦＲ２と相互作用する。
【発明の概要】
【０００４】
修飾されたＳＤＡＢ分子は、１つ又は複数の標的と相互作用する、例えば１つ又は複数の標的に結合する１つ又は複数の単一抗原結合ドメインを含み得る。１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインの１つ又は複数が腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）に結合する。ＳＤＡＢ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその生物学的特性を増大するように修飾することができる。例えば、ＳＤＡＢ分子は、修飾されていないＳＤＡＢ分子と比較して半減期の増大、免疫原性の低減、又は少なくとも１つの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）パラメータの改善の１つ又は複数が改善するように修飾することができる。１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子には、１つ又は複数のポリマー分子、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体が含まれる。修飾されたＳＤＡＢ分子は、例えば被験体、例えばヒトへの投与に有用である。例えばＴＮＦα関連障害を治療する又は予防するための修飾されたＳＤＡＢ分子を調製する及び使用する方法も開示されている。
【０００５】
したがって一態様では、本発明は、（ｉ）１つ又は複数の標的（例えばＴＮＦα）と相互作用する、例えば１つ又は複数の標的に結合する１つ又は複数の単一抗原結合ドメインと、（ｉｉ）リンカー（例えば非ペプチドリンカー及び／又はペプチドリンカー）と、（ｉｉｉ）１つ又は複数のポリマー分子、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体とを含む修飾されたＳＤＡＢ分子を特徴とする。１つの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子のリンカーは非ペプチドリンカーである。或る特定の実施の形態では、ＳＤＡＢ分子は、第２の部分、例えばポリマー分子と例えば共有結合的に又は非共有結合的に会合させることによって修飾することができる。例えば、ＳＤＡＢ分子を好適な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧ）に共有結合的に付着させることができる。
【０００６】
１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は１つ又は複数の単一結合ドメインを含む。例えば、ＳＤＡＢ分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン（１つ、２つ、又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる）を含むポリペプチド、例えば一本鎖ポリペプチドを含み得るか、又はそれからなり得る。ＳＤＡＢ分子の例としては、自然状態で軽鎖を欠いた分子（例えばＶＨＨ、ナノボディ、又はラクダ科動物由来の抗体）が挙げられる。かかるＳＤＡＢ分子は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコ等のラクダ科動物から誘導する又は得ることができる。他の実施の形態では、ＳＤＡＢ分子は、他の自然発生的な単一ドメイン分子（例えばサメ単一ドメインポリペプチド（ＩｇＮＡＲ））及び単一ドメインスカフォールド（例えばフィブロネクチンスカフォールド）を含むが、それらに限定されない１つ又は複数の単一ドメイン分子を含み得る。
【０００７】
別の実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、１つ又は複数の単一抗原結合ドメインからなる一本鎖ポリペプチドである。ＳＤＡＢ分子は同じ標的と、例えば同じ若しくは異なるエピトープで、又は異なる標的と結合することができる。ＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインは同じ又は異なるアミノ酸配列を有し得る。幾つかの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子は、一価又は多価（例えば二価、三価又は四価）である。他の実施の形態では、ＳＤＡＢ分子は、単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性又は四重特異性）である。ＳＤＡＢ分子は、組換え型、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した（例えばファージディスプレイによって選択された）１つ又は複数の単一抗原結合ドメインを含み得る。例えば、ＳＤＡＢ分子は、１つ又は複数の標的抗原に結合する１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の単一抗原結合ドメインを含む一本鎖融合ポリペプチドであり得る。典型的には、標的抗原は哺乳動物、例えばヒトのタンパク質である。１つの実施の形態では、標的抗原はＴＮＦα、例えばヒトＴＮＦαである。
【０００８】
１つの例示的な実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、標的抗原、例えばＴＮＦαに結合する２つの単一抗原結合ドメイン（例えば２つのラクダ科動物可変領域）の一本鎖ポリペプチド融合体からなる二価分子である。修飾されたＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと以下の順序で配置され得る：ＴＮＦα結合型の単一抗原結合ドメイン−（任意で連結基、例えばペプチドリンカー）−ＴＮＦα結合型の単一抗原結合ドメイン−１つ又は複数のポリマー分子。１つの実施の形態では、単一抗原結合ドメインは標的抗原上の同じエピトープに結合する（例えば、同じ又は異なる単一抗原結合ドメインを使用する）。他の実施の形態では、ＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインは同じ又は異なる標的上の異なるエピトープに結合する。１つ又は複数の標的に対する２つ、３つ、４つ又はそれ以上の単一抗原結合ドメインの任意の順序又は組合せが本発明に包含されることが理解される。
【０００９】
他の実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子の２つ、３つ、４つ又はそれ以上が、連結基を用いて又は連結基を用いずに、遺伝子融合体又はポリペプチド融合体として会合する（例えば融合する）。連結基は当業者にとって明らかな任意の連結基であり得る。例えば、連結基は１個〜１００個の原子の長さの生体適合性ポリマーであり得る。連結基はペプチドリンカー又は非ペプチドリンカーであり得る。１つの実施の形態では、連結基はペプチドリンカーであり、例えば連結基は、ポリグリシン残基、ポリセリン残基、ポリリシン残基、ポリグルタミン酸残基、ポリイソロイシン残基若しくはポリアルギニン残基、又はそれらの組合せを含むか、又はそれらからなる。例えば、ポリグリシン連結基又はポリセリン連結基には、少なくとも５個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、３５個及び４０個のグリシン残基及びセリン残基が含まれ得る。使用することができる連結基の例としては、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回又はそれ以上の反復を有するＧｌｙ−Ｓｅｒ反復、例えば（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号７）又は（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）反復が挙げられる。幾つかの実施の形態では、連結基は以下の配列を有する：（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号９）又は（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）（ここでｎは４、５又は６である）。１つの実施の形態では、連結基は以下の配列を含む：（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）（ここでｎ＝６）。修飾されたＳＤＡＢ分子は単一抗原結合ドメインのＣ末端に連結基（例えば本明細書で「Ｃ末端連結基」と称される）を更に含み、別の部分（例えば担体分子、非ペプチドリンカー又は非ペプチド部分）へのＳＤＡＢの付着を容易にすることができる。本明細書に記載の連結基はいずれもＣ末端連結基として使用することができる。１つの実施の形態では、１つ又は複数のＧｌｙ−Ｓｅｒ反復を使用し、例えば（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ又は（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）の１つ又は複数の反復を使用する。
【００１０】
１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子（本明細書で「ＳＤＡＢ−０１」と称される）は、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば図１に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上の同一性を有するか、又は最大で２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸変化（例えば欠失、挿入又は置換（例えば保存的置換））を有するアミノ酸配列）を含むか、又はそれからなる。配列番号１の２つの単一抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列が配列番号６として与えられる（表１２を参照されたい）。他の実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢは、配列番号６、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば配列番号６のアミノ酸配列と比べて、少なくとも８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上の同一性を有するか、又は最大で６０個、４５個、３０個、１５個、１２個、９個、６個、３個のヌクレオチド変化を有するヌクレオチド配列）でコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【００１１】
更なる単一ドメイン分子の例としては、国際公開第２００６／１２２７８６号（引用することにより本明細書の一部をなす）の表１９、及び以下の表１１に開示されるアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
或る特定の実施の形態では、ＴＮＦαに結合する修飾されたＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインの少なくとも１つは、以下のアミノ酸配列：DYWMY（配列番号２）（ＣＤＲ１）、EINTNGLITKYPDSVKG（配列番号３）（ＣＤＲ２）及び／又はSPSGFN（配列番号４）（ＣＤＲ３）を有する１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲを含むか、又は３つ、２つ若しくは１つ未満のアミノ酸置換（例えば保存的置換）が存在するという点で上記ＣＤＲの１つとは異なるＣＤＲを有する。他の実施の形態では、単一抗原結合ドメインは、図１のおよそアミノ酸１〜１１５のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば図１に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上の同一性を有するか、又は最大で２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸変化（例えば欠失、挿入又は置換（例えば保存的置換））を有するアミノ酸配列）を有する可変領域を含む。幾つかの実施の形態では、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は図１に示されるＴＮＦα結合型の単一ドメイン抗体分子の１つ又は複数の生物学的活性を有する。例えば、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、図１に示されるＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子によって認識されるエピトープと同じ又は類似のエピトープと結合する（例えばその三量体形態でＴＮＦαと結合する；ＴＮＦ受容体に接するＴＮＦα部位と結合する；第１のＴＮＦモノマー（モノマーＡ）上の８８位にＧｌｎ及び９０位にＬｙｓと、第２のＴＮＦモノマー（モノマーＢ）上の１４６位にＧｌｕとを含むＴＮＦα三量体中のエピトープ、又は国際公開第２００６／１２２７８６号に開示されたエピトープに結合する）。他の実施の形態では、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子がＴＮＦαのＮ末端と結合する。他の実施の形態では、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、国際公開第２００６／１２２７８６号に開示されたＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子のいずれかと類似の活性（例えば結合親和性、解離定数、結合特異性、ＴＮＦα阻害活性）を有する。
【００１３】
他の実施の形態では、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、表１１に開示され、国際公開第２００６／１２２７８６号（参照することにより本明細書の一部をなす）にも開示されたＳＤＡＢ分子を１つ又は複数含む。例えば、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、国際公開第２００６／１２２７８６号の表９に開示された一価、二価、又は三価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子であり得る。ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の例としては、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ３、及びそれらのヒト化型（例えばＴＮＦ２９、ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３１、ＴＮＦ３２、ＴＮＦ３３）が挙げられるが、それらに限定されない。一価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の更なる例は国際公開第２００６／１２２７８６号の表８に開示されている。二価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の例としては、ペプチドリンカーを介して連結した２つのＴＮＦ３０  ＳＤＡＢ分子を含み、単一の融合ポリペプチド（国際公開第２００６／１２２７８６号に開示される）を形成する、ＴＮＦ５５及びＴＮＦ５６が挙げられるが、それらに限定されない。二価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の更なる例は本明細書の表１１、又は国際公開第２００６／１２２７８６号の表１９に、ＴＮＦ４、ＴＮＦ５、ＴＮＦ６、ＴＮＦ７、ＴＮＦ８）として開示されている。
【００１４】
或る特定の実施の形態では、ＳＤＡＢ分子は、１つ又は複数のポリマー分子、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体を含むように修飾される。ＰＥＧ分子（例えばＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体）は直鎖状又は分岐状であり得る。１つの実施の形態では、ＳＤＡＢはリンカー部分（例えば非ペプチドリンカー）を介して１つ又は複数のＰＥＧ分子に付着する。
【００１５】
幾つかの実施の形態では、リンカーは非ペプチドリンカーである。１つの実施の形態では、リンカーは式（Ｉ）で表される：
【化１】
2013536175.tif 000003
（式中、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立して、結合又はＮＲ１から選択され、
Ｙは結合、０〜２個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレン、又はピロリジン−２，５−ジオンであり、
ＸはＯ、結合であるか、又は存在せず、
Ｚは存在していないか、Ｏ、ＮＲ３、Ｓ、又は結合であり、
Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して、水素又はＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は存在していないか、又は１つ若しくは複数のポリマー部分であり、
Ｒａはヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル又はＣ１〜４アルコキシから選択され、
ｍは０又は１であり、
ｎは０、１、２又は３であり、
ｐは０、１、２、３又は４である）。
【００１６】
幾つかの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子の１つ又は複数のポリマー部分（例えば式（Ｉ）のＲ２）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子（例えばＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体）を含む。幾つかの実施の形態では、ＰＥＧ分子はメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）モノマー、ポリマー、又はその誘導体である。
【００１７】
幾つかの実施の形態では、ＰＥＧ分子は分岐している。幾つかの実施の形態では、ＰＥＧ分子は式（ａ）〜式（ｈ）の部分から選択される：
【化２】
2013536175.tif 000004
（ここで各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である）。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子はｍＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。
【００１８】
幾つかの実施の形態では、Ｙは結合である。幾つかの実施の形態では、Ｙはピロリジン−２，５−ジオンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは０〜２個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは１個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは１個のＲａで置換されたメチレンである。幾つかの実施の形態では、Ｒａはヒドロキシルである。
【００１９】
幾つかの実施の形態では、Ｘは結合である。幾つかの実施の形態では、Ｘは酸素（Ｏ）である。幾つかの実施の形態では、Ｘは存在しない。
【００２０】
幾つかの実施の形態では、Ｒ２は（ａ）である。
【００２１】
幾つかの実施の形態では、Ｒ２は（ｇ）である。
【００２２】
幾つかの実施の形態では、Ｗ１は結合である。幾つかの実施の形態では、Ｗ１はＮＲ１である。
【００２３】
幾つかの実施の形態では、Ｗ２は結合である。幾つかの実施の形態では、Ｗ２はＮＲ１である。
【００２４】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１は水素である。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、ＺはＯ、Ｓ又は結合である。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、ＺはＯである。
【００２７】
幾つかの実施の形態では、Ｒ３は水素である。
【００２８】
幾つかの実施の形態では、ｍは０である。幾つかの実施の形態では、ｍは１である。
【００２９】
幾つかの実施の形態では、ｎは０である。幾つかの実施の形態では、ｎは２である。幾つかの実施の形態では、ｎは３である。
【００３０】
幾つかの実施の形態では、ｐは０である。幾つかの実施の形態では、ｐは３である。
【００３１】
幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は、メトキシＰＥＧ誘導体（ｍＰＥＧ）モノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１ＫＤａ〜１００ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１０ＫＤａ〜５０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、４０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１５ＫＤａ〜３５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、３０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、２０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１７．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１２．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は７．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、５ＫＤａの分子量を有する。
【００３２】
幾つかの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、ＰＥＧ分子に連結した式（Ｉ）のリンカーを含み、以下から選択される構造を有する：
【化３】
2013536175.tif 000005
【００３３】
幾つかの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、ＰＥＧ分子に連結した式（Ｉ）のリンカーを含み、以下から選択される構造を有する：
【化４】
2013536175.tif 000006
（ここで、各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である）。幾つかの実施の形態では、各ＰＥＧ分子はｍＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。
【００３４】
幾つかの実施の形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化５】
2013536175.tif 000007
【００３５】
幾つかの実施の形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化６】
2013536175.tif 000008
【００３６】
幾つかの実施の形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化７】
2013536175.tif 000009
【００３７】
リンカー−ＰＥＧ分子はＳＤＡＢ分子と会合する（例えば結び付く）ことができ、それにより修飾されたＳＤＡＢ分子が形成する。ＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子は、Ｎ末端からＣ末端へと以下の順序で配置され得る：ＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子−ＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子−ＰＥＧ分子（例えば分岐したＰＥＧ分子）。１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化８】
2013536175.tif 000010
【００３８】
１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化９】
2013536175.tif 000011
【００３９】
１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化１０】
2013536175.tif 000012
【００４０】
修飾されたＳＤＡＢ分子の１つの例示的な実施の形態は以下の式で表される：
【化１１】
2013536175.tif 000013
【００４１】
ＳＤＡＢ分子の反応基は一般的に、ＳＤＡＢ分子に付着した求核部分を介して付着する。幾つかの実施の形態では、求核部分は硫黄（例えばシステイン残基の硫黄）である。他の実施の形態では、求核部分は窒素（例えば末端のα−アミノ基又は窒素含有アミノ酸側鎖（例えばリシン鎖のε−アミノ基）の窒素）である。他の実施の形態では、求核部分はＣ末端基である。ＳＤＡＢ分子の反応基は一般的に、リンカーに付着した求電子部分を介して付着する。幾つかの実施の形態では、求電子部分はカルボニル基（例えば活性化エステル又はアルデヒド）である。幾つかの実施の形態では、求電子部分はマレイミド基である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を作製する方法を特徴とする。本方法は、ＳＤＡＢ分子を準備すること（例えばＳＤＡＢ分子を細胞培養物（例えば組換え細胞培養物）から得ること）と、ＳＤＡＢ分子（例えば単一抗原結合ドメイン）又はリンカー（例えばＳＤＡＢ分子に付着したペプチドリンカー）を式（Ｉ）（式中、Ｙ、Ｘ、Ｗ１、Ｗ２、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｎ及びｐは上記のとおりである）のリンカー部分に、少なくとも１つの化学結合が形成される条件下で接触させることとを含む。
【００４３】
幾つかの実施の形態では、Ｙは結合である。幾つかの実施の形態では、Ｙはピロリジン−２，５−ジオンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは０〜２個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは１個のＲａで置換されたＣ１〜４アルキレンである。幾つかの実施の形態では、Ｙは１個のＲａで置換されたメチレンである。幾つかの実施の形態では、Ｒａはヒドロキシルである。
【００４４】
幾つかの実施の形態では、Ｘは結合である。幾つかの実施の形態では、Ｘは酸素（Ｏ）である。幾つかの実施の形態では、Ｘは存在しない。
【００４５】
幾つかの実施の形態では、Ｒ２は（ａ）である。
【００４６】
幾つかの実施の形態では、Ｒ２は（ｇ）である。
【００４７】
幾つかの実施の形態では、Ｗ１は結合である。幾つかの実施の形態では、Ｗ１はＮＲ１である。
【００４８】
幾つかの実施の形態では、Ｗ２は結合である。幾つかの実施の形態では、Ｗ２はＮＲ１である。
【００４９】
幾つかの実施の形態では、Ｒ１は水素である。
【００５０】
幾つかの実施の形態では、ＺはＯ、Ｓ又は結合である。
【００５１】
幾つかの実施の形態では、ＺはＯである。
【００５２】
幾つかの実施の形態では、Ｒ３は水素である。
【００５３】
幾つかの実施の形態では、ｍは０である。幾つかの実施の形態では、ｍは１である。
【００５４】
幾つかの実施の形態では、ｎは０である。幾つかの実施の形態では、ｎは２である。幾つかの実施の形態では、ｎは３である。
【００５５】
幾つかの実施の形態では、ｐは０である。幾つかの実施の形態では、ｐは３である。
【００５６】
幾つかの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子はシステイン残基を介して連結する。
【００５７】
幾つかの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子を還元した後に、式（Ｉ）のリンカー部分による処理を行う。幾つかの実施の形態では、ＳＤＡＢ分子を還元して、システイン残基の間に形成されるジスルフィド架橋を取り除く。
【００５８】
幾つかの実施の形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化１２】
2013536175.tif 000014
【００５９】
１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化１３】
2013536175.tif 000015
【００６０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物、例えば医薬組成物を特徴とする。本組成物は第２の作用物質、例えばＴＮＦα関連障害、例えば関節リウマチ（ＲＡ）（例えば中度から重度の関節リウマチ）、関節炎状態（例えば乾癬性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ））、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、及び／又は多発性硬化症を含むが、それらに限定されない炎症性障害又は自己免疫障害を治療するのに有用な治療的に又は薬理学的に活性のある第２の作用物質も含むことができる。
【００６１】
更に別の態様では、本発明は、被験体において炎症状態又は自己免疫状態を改善する方法、例えば、被験体（例えばヒト被験体）においてＴＮＦα関連障害、例えば炎症性障害又は自己免疫障害を治療する又は予防する方法を特徴とする。ＴＮＦα関連障害の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）（例えば中度から重度の関節リウマチ）、関節炎状態（例えば乾癬性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ））、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、及び／又は多発性硬化症が挙げられるが、それらに限定されない。本方法は、被験体、例えばヒト患者に、ＴＮＦα関連障害の症状の１つ又は複数が軽減するような量で本明細書に記載のＴＮＦα結合型の修飾されたＳＤＡＢ分子を単独で又はＴＮＦα関連障害を治療するのに有用な治療的に若しくは薬理学的に活性のある第２の作用物質と併せて投与することを含む。
【００６２】
１つの実施の形態では、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子（例えば修飾されたＳＤＡＢ分子を含有する組成物）は、被験体、例えばヒト被験体（例えばＴＮＦα関連障害を有する患者）に投与するのに適している。ＳＤＡＢ分子を注射（例えば皮下注射、血管注射、筋肉注射又は腹腔内注射）により又は吸入により被験体に投与することができる。
【００６３】
或る特定の実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子と第２の作用物質とを併せて、例えば同時に又は連続して投与する。１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子と第２の作用物質とを同じ組成物、例えば本明細書に記載の医薬組成物中で投与する。１つの実施の形態では、第２の作用物質は抗ＴＮＦα抗体分子又はそのＴＮＦα結合断片であり、第２のＴＮＦα抗体は本明細書に記載のＴＮＦα結合型の修飾されたＳＤＡＢ分子とは異なるエピトープと結合する。ＴＮＦα結合型の修飾されたＳＤＡＢ分子と同時に投与する又は同時に配合することができる第２の作用物質の他の非限定的な例としては、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬、及び細胞増殖抑制薬が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、更なる作用物質は関節炎に標準的な治療薬（treatment）であり、これには非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）；コルチコステロイド（プレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン及びトリアムシノロンを含む）；及び疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）、例えばメトトレキサート、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）及びスルファサラジン、レフルノミド（Ａｒａｖａ（商標））、腫瘍壊死因子阻害剤（エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））（メトトレキサートを伴う又は伴わない）及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））を含む）、抗ＣＤ２０抗体（例えばＲｉｔｕｘａｎ（商標））、可溶性インターロイキン−１受容体、例えばアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標））、金、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｉｎ（商標））、ペニシラミン、並びに細胞毒性薬（アザチオプリン、シクロホスファミド及びシクロスポリンを含む）が含まれるが、それらに限定されない。有益には、かかる併用療法では、投与する治療薬をより低い投与量で用いることができ、そのため様々な単剤療法に関連して起こり得る毒性又は合併症が避けられる。賦形剤及び／又は第２の治療薬の代替的な組合せを本明細書で与えられる指示に従って特定し、試験することができる。
【００６４】
別の態様では、本発明は、修飾されたＳＤＡＢ分子、例えば本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を評価する方法を特徴とする。本方法は、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を被験体、例えばヒト被験体（例えばＴＮＦα関連障害を有する患者）に投与することと、修飾されたＳＤＡＢ分子の１つ又は複数の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを評価することとを含む。ＳＤＡＢ分子を注射（例えば皮下注射、血管注射、筋肉注射又は腹腔内注射）により又は吸入により被験体に投与することができる。
【００６５】
関連の態様では、本発明は、修飾されたＳＤＡＢ分子（例えば本明細書に記載の修飾されたＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子）を評価する又は選択する方法を特徴とする。本方法は、
被験体、例えばヒト被験体又は動物被験体においてＳＤＡＢ分子の少なくとも１つのＰＫ／ＰＤパラメータに関する試験値、例えば平均試験値を提示することと、
提示されたその試験値、例えば平均試験値を少なくとも１つの参照値と比較し、それによりＳＤＡＢ分子を評価する又は選択する、比較することと、
を含む。
【００６６】
幾つかの実施の形態では、試験値を提示する工程は、ＳＤＡＢ分子のサンプル、例えば抗体細胞培養物のサンプルバッチを得ること、及び／又はＳＤＡＢ分子の修飾後、本明細書に記載の薬物動態パラメータの少なくとも１つに関して試験することを含む。本明細書に開示される方法はプロセスの観点から、例えばバッチ間の一貫性又は質をモニタリングする又は確保するのに有用であり得る。
【００６７】
或る特定の実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子を評価する方法は、サンプル、例えば修飾されたＳＤＡＢ分子を含有するサンプルを準備することと、捕捉検出アッセイ、例えばタンパク質検出アッセイ又は本明細書の実施例１１ｂに記載の全分子検出アッセイでサンプルを試験することとを更に含む。１つの実施の形態では、サンプルを固体支持体に固定化された標的（例えば結合型ストレプトアビジンと会合したビオチン化標的分子）に接触させ、結合したＳＤＡＢ−標的分子複合体を、修飾されたＳＤＡＢ分子のタンパク質部分と結合する試薬、例えば抗体を使用して検出する。かかるアッセイフォーマットでは、修飾されたＳＤＡＢ分子のタンパク質部分が検出される。他の実施の形態では、サンプルを固体支持体に固定化された標的（例えば結合型ストレプトアビジンと会合したビオチン化標的分子）に接触させ、結合したＳＤＡＢ−標的分子複合体を、修飾されたＳＤＡＢ分子のポリマー（例えばＰＥＧ）部分と結合する試薬、例えば抗体を使用して検出する。かかる実施の形態では、ＳＤＡＢ分子のポリマー（例えばＰＥＧ化）部分が検出される。ポリマー（例えばＰＥＧ）部分の検出によって、修飾されたＳＤＡＢ−ポリマーコンジュゲート全体が捕捉されるのが好ましいが、これはコンジュゲートを形成していない（unconjugated）ＳＤＡＢ分子が検出されないためである。
【００６８】
本方法により評価されるＰＫ／ＰＤパラメータは、修飾されたＳＤＡＢ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ濃度（例えば血液、血清、血漿及び／又は組織中の濃度）；修飾されたＳＤＡＢ分子のクリアランス（ＣＬ）；修飾されたＳＤＡＢ分子の体積分布（Ｖｄｓｓ又はＶｃ）；修飾されたＳＤＡＢ分子の半減期（ｔ１／２）；修飾されたＳＤＡＢ分子のバイオアベイラビリティ；修飾されたＳＤＡＢ分子の最大血中濃度、最大血清濃度、最大血漿濃度、若しくは最大組織濃度；修飾されたＳＤＡＢ分子の曝露量（exposure）（ＡＵＣ＝濃度時間曲線下面積）；修飾されたＳＤＡＢ分子の組織対血清、組織対血漿、若しくは組織対血液のＡＵＣ比若しくは濃度比；修飾されたＳＤＡＢ分子の無処理（intact）生成物若しくは分解生成物の尿中濃度；又は血清、血漿若しくは組織中の遊離型、結合型及び全体の標的濃度の１つ又は複数から選ぶことができる。
【００６９】
１つの実施の形態では、１つ又は複数のＰＫ／ＰＤパラメータを、修飾されたＳＤＡＢ分子を被験体に投与した後に１つ、２つ、又はそれ以上の所定の時間間隔で評価する。１つの実施の形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子の少なくとも１つのＰＫ／ＰＤパラメータが、参照基準、例えば修飾されていないＳＤＡＢ分子と比較して変化する、例えば改善する。例えば、修飾されたＳＤＡＢ分子は、修飾されていないＳＤＡＢ分子と比較して半減期及び／又はバイオアベイラビリティの増大；異なる組織分布（例えば異なる組織又は器官（例えば小腸又は大腸）への局在）の１つ又は複数を有する。或る特定の実施の形態では、ＰＫ／ＰＤパラメータは、治療に対する有効値又は適合性の評価基準を与えるのに用いられる。１つ又は複数の症状の改善、生活の質の改善、炎症性マーカーの低減を含むが、それらに限定されない有効性の他の測定を更に有効性の評価の一部として行うことができる。
【００７０】
幾つかの実施の形態では、１つ又は複数のＰＫ／ＰＤパラメータ、有効値、又は事前に選択された有効性基準を満たすかどうかの指標が、例えばコンピュータ可読媒体に記録される又は記憶される。かかる値又は事前に選択された有効性基準を満たす指標は、例えば商業的利用のために又は米国若しくは外国の規制当局に提出するために、製品説明書、公定書（例えば米国薬局方）、又は流通させることができる任意の他の文書（materials）、例えばラベルに記載することができる。
【００７１】
別の態様では、本発明は、検出方法、又は捕捉検出アッセイ、例えば本明細書の実施例１１ｂに記載のタンパク質検出アッセイ若しくは全分子検出アッセイを特徴とする。本方法又は本アッセイは、修飾されたＳＤＡＢ分子を含有するサンプルを準備すること（例えばＳＤＡＢ分子の投与後に被験体から得られるサンプルを得ること）と、サンプルを固体支持体に固定化された標的（例えばＴＮＦα）（例えば結合型ストレプトアビジンと会合したビオチン化標的分子）に接触させることと、結合したＳＤＡＢ−標的複合体を、修飾されたＳＤＡＢ分子のタンパク質部分又はポリマー（例えばＰＥＧ）部分と結合する試薬、例えば抗体を使用して検出することとを含む。その試薬がＳＤＡＢ分子のタンパク質部分と結合するアッセイフォーマットでは、修飾されたＳＤＡＢ分子のタンパク質部分が検出される。その試薬が修飾されたＳＤＡＢ分子のＰＥＧ部分と結合するアッセイフォーマットでは、ＳＤＡＢ分子のポリマー（例えばＰＥＧ化）部分が検出される。ＰＥＧ部分の検出によって、修飾されたＳＤＡＢ−ポリマーコンジュゲート全体が捕捉されるのが好ましいが、これはコンジュゲートを形成していないＳＤＡＢ分子が検出されないためである。
【００７２】
別の態様では、本発明は、ＳＤＡＢ分子又は本明細書に記載の組成物の入ったデバイス、シリンジ又はバイアルを含むキット又は製造物を特徴とする。キット又は製造物は任意で使用説明書を含んでいてもよい。或る特定の実施の形態では、シリンジ又はバイアルは、ガラス、プラスチック又はポリマー材料、例えば環状オレフィンポリマー又はコポリマーで構成される。他の実施の形態では、その配合物が注射用デバイス（例えば注射用シリンジ、例えば充填済み注射用シリンジ）内に存在し得る。シリンジは個人による投与に、例えば自己注射器（例えばペン型注射器デバイス）及び／又は使用説明書を含む単回バイアルシステムとして適合し得る。１つの実施の形態では、注射用デバイスは、任意で使用及び投与の説明書を備える、充填済みペン型自己注射用デバイス又は他の好適な自己注射用デバイスである。
【００７３】
或る特定の実施の形態では、注射（例えば皮下注射、血管注射、筋肉注射、関節内注射又は腹腔内注射）による投与（例えば自己投与）の説明書が事前にパッケージングされたキット又は製造物（例えば単回又は複数回の用量単位の充填済みペン型注射器又はシリンジ）を被験体、例えば患者又はヘルスケア提供者に与える。
【００７４】
他の実施の形態では、本発明は本明細書に記載の配合物の鼻腔投与、経皮投与、静脈内投与用のデバイスを特徴とする。例えば、本明細書に記載の配合物の投与用の経皮パッチが提供される。更に他の場合では、本明細書に記載の配合物の投与用の静脈注射バッグが提供される。幾つかの実施の形態では、生理食塩水又は５％デキストロースの入った静脈注射バッグが提供される。
【００７５】
別の態様では、本発明は、修飾されたＳＤＡＢ分子、例えばＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子を必要とする患者（例えばヒト患者)に、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子又は組成物をどのように投与するかを指示する方法を特徴とする。本方法は、（ｉ）患者に本明細書に記載のＳＤＡＢ分子の少なくとも１つの単位用量を与えることと、（ｉｉ）患者に例えば注射（例えば皮下注射、血管注射、筋肉注射又は腹腔内注射）によって少なくとも１つの単位用量を自己投与するように指示することとを含む。１つの実施の形態では、患者はＴＮＦα関連障害、例えば本明細書に記載の炎症性障害又は自己免疫障害を有する。
【００７６】
別の態様では、本発明はレシピエントに本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子の投与を指示する方法を特徴とする。本方法は、レシピエント（例えばエンドユーザー、患者、医師、開業薬局若しくは薬卸売業者、販売業者、又は病院の院内薬局、養護施設の診療所、又はＨＭＯ）に配合物を患者にどのように投与するかを指示することを含む。
【００７７】
別の態様では、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を流通させる方法が提供される。本方法は、患者を少なくとも６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月又は３６ヶ月治療するために、レシピエント（例えばエンドユーザー、患者、医師、開業薬局若しくは薬卸売業者、販売業者、又は病院の院内薬局、養護施設の診療所、又はＨＭＯ）に十分な単位投与量のＳＤＡＢ分子が入ったパッケージを与えることを含む。
【００７８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の修飾されたＳＤＡＢ分子を含有する本明細書に記載の配合物のパッケージ又はパッケージのロットの質を（例えばパッケージの使用期限が切れているかどうかを判断するために）評価する方法又はプロセスを特徴とする。本方法はパッケージの使用期限が切れているか否かを評価することを含む。使用期限は、事前に選択された事象、例えば製造、検査又は包装から少なくとも６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月又は４８ヶ月であり、例えば２４ヶ月又は３６ヶ月を超えるものである。幾つかの実施の形態では、分析の結果を受けて、決定を下すか又は手段を講じる、例えば製品の使用期限が切れているか否かに応じて、パッケージ中のＳＤＡＢ分子を使用するか若しくは廃棄する、分別する（classified）、選別する（selected）、発売するか若しくは発売を控える、出荷する、新たな場所に移す、市場に出す、販売する、又は販売を計画する、市場から回収する、又は販売の計画を中止する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、規制上の要件、例えば規制当局、例えばＦＤＡの承認後要件に準拠する方法を特徴とする。本方法は、本明細書に記載のように、パラメータに関する抗体配合物の評価を与えることを含む。承認後要件には、上記のパラメータの１つ又は複数の評価基準が含まれ得る。本方法は、任意で観察される溶液パラメータが事前に選択された基準を満たすか否か、又はパラメータが事前に選択された範囲内にあるかどうかを判断すること；任意で分析の値若しくは結果を記憶すること、又は例えばその値若しくは結果を規制当局に伝送することにより規制当局と連絡を取り合うことも任意で含む。
【００８０】
別の態様では、本発明は、事前に選択された特性、例えば本明細書に記載の特性を有する、例えば販売規格、表示要件、又は公定書要件を満たす、修飾されたＳＤＡＢ分子、例えばＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子のバッチを作製する方法を特徴とする。本方法は、修飾されたＳＤＡＢ分子を含有する試験サンプルを準備することと、本明細書に記載の方法に従って試験サンプルを分析することと、試験配合物が、事前に選択された基準を満たす、例えば参照値、例えば本明細書で開示される１つ又は複数の参照値との事前に選択された関係性を有するか否かを決定することと、製品のバッチを作製するために試験サンプル調製物を選択することとを含む。
【００８１】
別の態様では、本発明は、修飾されたＳＤＡＢ分子、例えばＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の配合物の複合バッチであって、各バッチに関する１つ又は複数のパラメータ（例えば、本明細書に記載の方法によって決定された値又は溶液パラメータ）が、事前に選択された所望の参照値又は基準、例えば本明細書に記載の範囲又は基準から、事前に選択された範囲よりも小さく変化する、配合物の複合バッチを特徴とする。幾つかの実施の形態では、配合物の１つ又は複数のバッチに関する１つ又は複数のパラメータを決定し、その決定を受けてバッチ（単数又は複数）を選択する。幾つかの実施の形態は、決定の結果を事前に選択された値又は基準、例えば参照基準と比較することを含む。他の実施の形態は、例えば値又はパラメータの決定の結果に基づき、投与するバッチの用量を調整することを含む。
【００８２】
本明細書に言及される特許公報、特許出願、特許及び他の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【００８３】
他に特に規定がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似の又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。加えて、材料、方法及び実施例は例示的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
【００８４】
本発明の他の特徴及び利点は詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＳＤＡＢ−０１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。太字のＣＤＲは単一抗原結合ドメイン構成要素に相当し、それぞれが配列番号１のアミノ酸１〜１１５のアミノ酸配列を有する。フレキシブルリンカーは小文字で示されている。部位特定的なＰＥＧ化を支持する改変Ｃ末端システインも太字で示している。
【図２】ＳＤＡＢ−０１分子に用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量４００００、２×２０ｋＤａ）を示す図である。ＰＥＧ活性化基はマレイミドである。
【図３】ＳＤＡＢ−０１の概略図である。
【図４】Ａは直鎖ｍＰＥＧ−マレイミド（対照２）及び２つの分岐ｍＰＥＧ−マレイミド（［配列番号１］−ＰＥＧ４０及びＳＤＡＢ−０１）の構造を示している。ＢはＳＤＡＢ−０１及び［配列番号１］−ＰＥＧ４０のサイズを比較したスキャン図である。
【図５】膜結合型のＴＮＦαを発現するＣＨＯ−ＴＮＦ−Ｄ１３（ｐＷ２１２８）細胞上でのＳＤＡＢ−０１の細胞表面染色のＦＡＣＳ（「蛍光活性化細胞分類」）スキャン図である。細胞をＳＤＡＢ−０１、ビオチン化抗ＰＥＧ及びストレプトアビジン−ＰＥで順番に染色し（灰色の領域）、又はストレプトアビジン−ＰＥで偽染色した（白色の領域）。
【図６】ヒトＴＮＦα又はアカゲザルＴＮＦαを用いた細胞毒性アッセイにおける非ＰＥＧ化ＳＤＡＢポリペプチドの対照３及び対照４と比較したＳＤＡＢ−０１の用量応答曲線を示す図である。
【図７】ＳＤＡＢ−０１に対するＴＮＦα結合曲線を示す図である。０．１９５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度の（ａ）ヒト、（ｂ）アカゲザル（rhesus macaque）、（ｃ）ラット及び（ｄ）マウスのＴＮＦα、並びに（ｅ）０．１９５ｎＭ〜４００ｎＭの範囲のウサギＴＮＦαを固定化したＳＤＡＢ−０１に対して注入した。それぞれのデータ集合は少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
【図８】実験１におけるネズミ気嚢モデルでの総白血球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図９】実験１におけるネズミ気嚢モデルでの好中球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図１０】実験２におけるネズミ気嚢モデルでの総白血球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図１１】実験２におけるネズミ気嚢モデルでの好中球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図１２】実験３におけるネズミ気嚢モデルでの総白血球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図１３】実験３におけるネズミ気嚢モデルでの好中球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果を示すグラフである。
【図１４】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルによる処理を１週間に２回受けた動物での週ごとの体重を示すグラフである。
【図１５】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルによる処理を１週間に２回受けた動物での週ごとの平均疾患重症度スコアを示すグラフである。
【図１６】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルを１週間に２回投与した動物での処理後７週目の疾患重症度を示すグラフである。
【図１７】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルを１週間に２回投与した動物での処理後７週目の顕微鏡を用いた群平均重症度スコアを示すグラフである。
【図１８】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルを１週間に２回投与した動物での処理後７週目の顕微鏡を用いた群平均重症度スコアと疾患重症度スコアとの比較を示すグラフである。
【図１９】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルによる処理を１週間に２回受けた動物での週ごとの体重を示すグラフである。
【図２０】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルによる処理を１週間に２回受けた動物での週ごとの平均疾患重症度スコアを示すグラフである。
【図２１】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルを１週間に２回投与した動物での処理後７週目の疾患重症度スコアを示すグラフである。
【図２２】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルによる１週間に２回の処理後の顕微鏡を用いた群平均重症度スコアを示すグラフである。
【図２３】１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、１ｍｇ／ｋｇの対照ＳＤＡＢ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体、又は１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルを１週間に２回投与した動物での処理後７週目の顕微鏡を用いた群平均重症度スコアと疾患重症度スコアとの比較を示すグラフである。
【図２４】雄のカニクイザルにおける３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与又は単回ＳＣ投与後のＳＤＡＢ−０１の血清濃度−時間プロファイルの平均（±ＳＤ）を示すグラフである。
【図２５】マウス、ラット又はカニクイザルへの単回ＩＶ投与後のＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチドの用量で正規化した血清濃度の平均（±ＳＤ）を示すグラフである。ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ（黒丸）、ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ（白丸）、又はＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ（黒三角）を単回ＩＶボーラス投与でＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウス（Ａ；２×２０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートでは２ｍｇ／ｋｇ及び他の２つのコンジュゲートでは３ｍｇ／ｋｇ）、スプラーグドーリーラット（Ｂ；２ｍｇ／ｋｇ）、又はカニクイザル（Ｃ；３ｍｇ／ｋｇ）に投与した。マウス及びサルのＰＫ研究では（Ａ及びＣ）、非標識試験物質を使用し、ラットＰＫ研究では（Ｂ）、１２５Ｉで標識した試験物質を使用した。単発サンプリングをマウスに用い（１つの時点当たりｎ＝３）、逐次サンプリングをラット（１つの化合物当たりｎ＝５〜７）及びサル（１つの化合物当たりｎ＝３）に用いた。血清濃度を特定の免疫測定法（マウス及びサル、ｎｇ／ｍＬ単位で）又はガンマ線計測（ラット、ｎｇ×当量／ｍＬ単位で）により決定した。その寿命はマウス、ラット及びサルでそれぞれ、１４日、２４日及び５６日〜６２日であった。定量限界（ＬＯＱ）を下回る個々の動物の濃度の値を平均及びＳＤの算出のためにゼロとして扱った。データはそれぞれの時点の（すなわち１ｍｇ／ｋｇ用量での）用量で正規化した濃度の平均（±ＳＤ）を示している。０ｎｇ／ｍＬの（すなわち全ての動物でＬＯＱを下回る）平均血清濃度のデータ点は対数目盛に示していない。
【図２６】マウスへの０．３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後の１２５Ｉで標識したＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチドの平均組織曝露量及び平均血清曝露量（ＡＵＣ０〜１６８ｈｒ）を示すグラフである。Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスに、１２５Ｉで標識したＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ（黒色のバー）又はＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖４０ｋＤａ  ＰＥＧ（灰色のバー）を０．３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラス投与で投与した。血清サンプル及び組織サンプル（１つの時点当たりｎ＝８〜１２）を７日間（１６８時間）にわたって回収し、組織及び血清中の放射性当量（ＲＥ）濃度をガンマ線計測により決定した。血清（μｇ×当量／ｍＬ単位で）及びそれぞれの組織（μｇ×当量／ｇ単位で）中のＡＵＣ０〜１６８ｈｒ（時間０〜１６８時間の濃度時間曲線下面積）を、スパースサンプリング方法を用いた非コンパートメント分析によって決定し、９５％信頼区間（９５％  ＣＩ、グラフ上の誤差バー）を、平均の標準誤差を用いて算出した。アステリスク（＊）は２つの構築物間でのＡＵＣ０〜１６８ｈｒの統計的に有意な差異を示している（ｐ＜０．０５）。
【図２７】ＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチドのカチオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）プロファイルを示すグラフである。それぞれの材料のタンパク質濃度を、配合バッファーを用いて１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、１０μＬをＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０カラムに注入した。移動相Ａは１０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ４．０）であった。移動相Ｂは１０ｍＭのギ酸アンモニウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ４．０）であった。タンパク質コンジュゲートを０．７５ｍＬ／分の流速で塩化ナトリウムの線形勾配（Ｂを４０分で０％から４０％）を用いて溶出した。２８０ｎｍでの吸光度をモニタリングした。
【図２８】ＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチドのマルチアングル光散乱によるサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）プロファイルを示すグラフである。ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ（破線）、ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ（点線）、又はＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ（実線）を２．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、それぞれのサンプルを１００μＬ、３０℃に保持したＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６移動相カラムに注入した。保持時間（線図）、総質量（黒丸）、ＰＥＧ質量（白三角）及びタンパク質質量（×）を、Wyatt TechnologiesのＡＳＴＲＡ  Ｖ  ｖ５．３．４．１４を用いて決定した。
【図２９】流体力学半径（Ｒｈ）及び二乗平均平方根半径（ＲＭＳ又はＲｇ）の決定を示すグラフである。ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ（破線及び白四角）、ＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ（緑色の線及び記号）、又はＴＮＦα  ＳＤＡＢポリペプチド１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ（点線及び白三角）を２．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、それぞれのサンプルを１００μＬ、３０℃に保持したＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６移動相カラムに注入した。保持時間（実線及び黒丸）、Ｒｈ（Ａ）及びＲＭＳ（Ｂ）の分析を、Wyatt TechnologiesのＡＳＴＲＡ  Ｖ  ｖ５．３．４．１４を用いて行った。
【図３０】標的としてＣＳＦＥで標識したＣＨＯ−ＴＮＦＤ１３（ｐＷ２１２８）細胞、及びエフェクターとしてヒトＮＫ細胞を用いて、ＳＤＡＢ−０１のＡＤＣＣ活性と比較した、対照１、対照２、対照３、及び対照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。ＡＤＣＣ活性（％）の値は７ＡＡＤ＋である標的細胞の％として算出される。プロットした値は、試験薬を用いた７ＡＡＤ＋標的細胞（％）からエフェクター細胞のみの存在下での７ＡＡＤ＋標的細胞（％）を減算したものである。このプロットは実施した４つの個々のＡＤＣＣアッセイを代表するものであり、ＳＤＡＢ−０１にはＡＤＣＣ活性がないことを実証していた。
【図３１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの仔ウサギ補体の存在下におけるＣＨＯ−ＴＮＦ−Ｄ１３（ｐＷ２１２８）株に対するＳＤＡＢ−０１のＣＤＣ活性と比較した、対照１、対照２、対照３、及び対照ＩｇＧ１抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。細胞毒性を死滅細胞による７ＡＡＤの取込みにより評価し、プロットした値は、補体のみの存在下での７ＡＡＤ＋細胞の％から試験薬及び対照を用いた７ＡＡＤ＋細胞の％を減算したものである。サンプルをアダリムマブ、インフリキシマブ及びＳＤＡＢ−０１に対して二重で作製した。このプロットは、実施した３つの個々のアッセイを代表するものであり、ＳＤＡＢ−０１にはＣＤＣ活性がないことを実証していた。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明は、修飾された単一ドメイン抗原結合分子（本明細書では「ＳＤＡＢ分子」とも称される）に関する。修飾されたＳＤＡＢ分子は、１つ又は複数の標的と相互作用する、例えば１つ又は複数の標的に結合する１つ又は複数の単一抗原結合ドメインを含み得る。一実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインの１つ又は複数が腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）に結合する。ＳＤＡＢ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその生物学的特性を増大するように修飾することができる。例えば、ＳＤＡＢ分子は、修飾されていないＳＤＡＢ分子と比較して半減期の増大、免疫原性の低減、又は少なくとも１つの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）パラメータの改善の１つ又は複数が改善するように修飾することができる。一実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子には、１つ又は複数のポリマー分子、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体が含まれる。修飾されたＳＤＡＢ分子は、例えば被験体、例えばヒトへの投与に有用である。ＴＮＦα関連障害を治療する又は予防するための修飾されたＳＤＡＢ分子を調製する及び使用する方法も開示されている。
【００８７】
本発明をより容易に理解するために、初めに或る特定の用語を定義する。更なる定義は発明を実施するための形態にわたって説明される。
【００８８】
本明細書に使用される場合、不定冠詞（the articles "a" and "an"）は冠詞の文法上の対象物が１つ又は２つ以上（例えば少なくとも１つ）であることを指す。
【００８９】
「又は（若しくは）」という用語は、文脈上、他にはっきりと示されていなければ、本明細書では「及び／又は」という用語を意味するのに用いられ、その用語と区別なく用いられる。
【００９０】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では区別なく用いられる。
【００９１】
「約」及び「およそ」は一般的に、測定の性質又は正確性を前提として、測定される量に対して許容可能な程度の誤差を意味するものとする。誤差の程度の例は、与えられる値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００９２】
ヌクレオチド配列に関連して、「実質的に同一な」という用語は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造的ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能性ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列にアラインしたヌクレオチドと同一のヌクレオチドを十分な又は最低限の数含有する第１の核酸配列、例えば参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を表すのに本明細書で用いられる。
【００９３】
また本発明のポリペプチドには、上述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体又は変異体、及びそれらの任意の組合せも含まれる。本発明のタンパク質に言及する場合、「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、対応する天然の抗体又はポリペプチドの機能特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、タンパク質分解断片及び欠失断片に加えて、本明細書の他の箇所で述べられている特異的な抗体断片も含まれる。本発明のポリペプチドの変異体には、上記の断片の他に、アミノ酸の置換、欠失又は挿入によりアミノ酸配列が変化したポリペプチドも含まれる。変異体は自然発生的であっても、又は自然発生的でなくてもよい。自然発生的ではない変異体は当該技術分野で既知の突然変異誘発技法を用いて生成することができる。変異体ポリペプチドは、保存的な又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を含み得る。本発明の断片の誘導体は、天然ポリペプチドには見られない更なる特徴を示すように変化しているポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも表すことができる。本明細書に使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」は機能的側基の反応により化学的に誘導体化された１つ又は複数の残基を有する主題となるポリペプチドを表す。「誘導体」には、２０種の標準アミノ酸の１つ又は複数の自然発生的なアミノ酸誘導体を含有するそれらのポリペプチドも含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換することができ、リシンを５−ヒドロキシリシンに置換することができ、ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換することができ、セリンをホモセリンに置換することができ、リシンをオルニチンに置換することができる。
【００９４】
「機能的変異体」という用語は、自然発生的な配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、又は実質的に同一のヌクレオチド配列でコードされ、自然発生的な配列の１つ又は複数の活性を有することが可能なポリペプチドを指す。
【００９５】
配列間の相同性又は配列同一性（それらの用語は本明細書では区別なく用いられる）の算出は以下のとおりに行われる。
【００９６】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性（パーセント）を決定するために、それらの配列を最適比較目的でアライメントする（例えばギャップを最適アラインメントのために第１のアミノ酸配列又は核酸配列及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の片方又は両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。典型的な実施形態では、比較目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％若しくは６０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、又は１００％である。それから、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占有される場合、それらの分子はその位置では同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。
【００９７】
２つの配列間の同一性（パーセント）は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列が共有する同一の位置の数に応じたものである。
【００９８】
配列の比較及び２つの配列間の同一性（パーセント）の決定を、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性（パーセント）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイトと、１、２、３、４、５又は６のレングスウェイトとを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（(1970) J. Mol. Biol.48:444-453）アルゴリズムを使用して決定される。更に別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性（パーセント）は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスと、４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウェイトと、１、２、３、４、５又は６のレングスウェイトとを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）においてＧＡＰプログラムを使用して決定される。典型的なパラメータ集合の１つ（他に特に規定がない場合に使用するもの）は、１２のギャップペナルティと、４のギャップ伸長（extend）ペナルティと、５のフレームシフトギャップペナルティとを用いるＢｌｏｓｓｕｍ  ６２である。
【００９９】
２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性（パーセント）を、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅと、１２のギャップ長ペナルティと、４のギャップペナルティとを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17)のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【０１００】
本明細書に記載の核酸配列及びタンパク質配列を、公開データベースの検索を行い、例えば他のファミリー成員又は関連配列を同定するための「クエリ配列」として使用することができる。かかる検索を、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行い、本発明で特徴付けられる核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行い、本発明で特徴付けられるタンパク質（配列番号１）分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップド（gapped）アラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Altschul etal., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【０１０１】
「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基へと置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０１０２】
本発明の様々な態様を以下で更に詳細に記載する。
【０１０３】
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子には、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子が含まれる。例としては、重鎖可変ドメイン、自然状態で軽鎖を欠いた結合分子、ナノボディ（商標）、従来の四鎖抗体から誘導される単一ドメイン、改変ドメイン、及び抗体から誘導されるもの以外の単一ドメインスカフォールドが挙げられるが、それらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は当該技術分野のもののいずれであっても、又は任意の将来の単一ドメイン分子であってもよい。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、それらに限定されない任意の種から誘導することができる。この用語には、ラクダ科動物及びサメ以外の種由来の自然発生的な単一ドメイン抗体分子も含まれる。
【０１０４】
一態様では、ＳＤＡＢ分子は、例えばサメの血清中で見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプから誘導されるように、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域から誘導することができる。ＮＡＲの可変領域から誘導される単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を作製する方法が、国際公開第０３／０１４１６１号及びStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
【０１０５】
別の態様によれば、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠いた重鎖として知られる自然発生的な単一ドメイン抗原結合分子である。かかる単一ドメイン分子は、例えば国際公開第９４０４６７８号及びHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている。明確にするために、軽鎖を自然状態で欠いた、重鎖分子から誘導されるこの可変ドメインは、本明細書ではＶＨＨ又はナノボディ（商標）として知られ、四鎖免疫グロブリンの従来のＶＨとは区別する。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科動物種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルカパ及びグアナコのラクダ科動物種から誘導することができる。ラクダ科動物以外の他の種で、自然状態で軽鎖を欠いた重鎖分子を作製することができ、かかるＶＨＨは本発明の範囲内にある。
【０１０６】
ＳＤＡＢ分子は、以下でより詳細に記載されるように、組換え型、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した（例えばファージディスプレイによって選択された）ものであり得る。
【０１０７】
「抗原結合」という用語は、標的抗原又はそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含むポリペプチドの一部、例えば本明細書に記載の単一ドメイン分子を含むことが意図される。タンパク質（又はタンパク質模倣体）に関連して、抗原結合部位は典型的には、標的抗原に結合する界面を形成する１つ又は複数のループ（少なくとも４つのアミノ酸又はアミノ酸模倣体の１つ又は複数のループ）を含む。典型的には、ポリペプチドの抗原結合部位、例えば単一ドメイン抗体分子は、少なくとも１つ若しくは２つのＣＤＲ、又はより典型的には少なくとも３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを含む。
【０１０８】
「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、ヒト又は動物起源のＶＬドメイン又はＶＨドメインに同一である又は実質的に同一であるとして当該技術分野で理解されることが多い。免疫グロブリン可変ドメインを或る特定の種、例えばサメ及びラマで展開させ、ヒト又は哺乳動物のＶＬ又はＶＨとはアミノ酸配列が異なるものにすることができることが認識されている。しかしながら、これらのドメインは主に抗原結合にかかわるものである。「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は典型的に、少なくとも１つ若しくは２つのＣＤＲ、又はより典型的には少なくとも３つのＣＤＲを含む。
【０１０９】
「定常免疫グロブリンドメイン」又は「定常領域」は、ヒト又は動物起源のドメインであるＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４と同一の又は実質的に類似の免疫グロブリンドメインを含むことが意図される。例えば Charles A Hasemann and J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structureand Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition,209, 210-218 (1989)を参照されたい。「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む定常免疫グロブリンドメイン、又はそれらと実質的に類似の免疫グロブリンドメインのＦｃ部分を指す。
【０１１０】
或る特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、一価又は多重特異性分子（例えば二価分子、三価分子又は四価分子）である。他の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、単一特異性分子、二重特異性分子、三重特異性分子又は四重特異性分子である。分子が「単一特異性」又は「多重特異性」、例えば「二重特異性」であるかどうかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を表す。多重特異性分子は、本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は標的ポリペプチドに加えて、異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体材料にも特異的であり得る。
【０１１１】
本明細書に使用される場合、「価数」という用語は、ＳＤＡＢ分子に存在する可能性のある結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインが１つのエピトープと特異的に結合する。ＳＤＡＢ分子が２つ以上の結合ドメインを含み、それぞれの結合ドメインが同じエピトープと特異的に結合する場合、２つの結合ドメインを有する抗体に対しては「二価単一特異性」と称し、又はそれぞれの結合ドメインが異なるエピトープと特異的に結合する場合、２つの結合ドメインを有するＳＤＡＢ分子に対しては「二価二重特異性」と称する。ＳＤＡＢ分子は二重特異性であり、それぞれの特異性に対して二価でもあり得る（「二重特異性四価分子」と称する）。二重特異性二価分子及びそれらを作製する方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、並びに米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号及び同第２００２／０１５５５３７号（それら全ての開示は引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。二重特異性四価分子及びそれらを作製する方法は、例えば国際公開第０２／０９６９４８号及び国際公開第００／４４７８８号（それらの開示は引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。一般的には、ＰＣＴ国際公開第９３／１７７１５号、国際公開第９２／０８８０２号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／０５７９３号、Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。
【０１１２】
或る特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、相補性可変ドメイン、又は１つ若しくは複数の標的抗原に結合する免疫グロブリン定常（例えばＦｃ）領域を欠いた１つ又は複数の単一ドメイン分子を含む一本鎖融合ポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドで認識される標的抗原の例としては腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が挙げられる。或る特定の実施形態では、抗原結合単一ドメイン分子は、そのドメインをＰＥＧ、例えば分岐ＰＥＧ分子と会合させる、例えば共有結合的に付着させることにより修飾される。
【０１１３】
ＴＮＦα
腫瘍壊死因子アルファは、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症等の炎症性障害に関連することが当該技術分野で知られている。ＴＮＦα及び受容体（ＣＤ１２０ａ及びＣＤ１２０ｂ）の両方が極めて詳細に研究されている。ＴＮＦαはその生物学的活性形態では三量体である。抗ＴＮＦα抗体を用いてＴＮＦαの作用に拮抗するという戦略が幾つか開発されており、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）及びＨｕｍｉｒａ（商標）等が現在市販されている。ＴＮＦαに対する抗体分子が知られている。ＴＮＦα結合型の単一ドメイン抗原結合分子の多くの例が、国際公開第２００４／０４１８６２号、国際公開第２００４／０４１８６５号、国際公開第２００６／１２２７８６号（その内容の全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に開示されている。単一ドメイン抗原結合分子の更なる例が、米国特許出願公開第２００６／２８６０６６号、米国特許出願公開第２００８／０２６０７５７号、国際公開第０６／００３３８８号、米国特許出願公開第０５／０２７１６６３号、米国特許出願公開第０６／０１０６２０３号（その内容の全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に開示されている。他の実施形態では、ＴＮＦαに対する単一特異性、二重特異性、三重特異性及び他の多重特異性の単一ドメイン抗体及びＰＥＧである。
【０１１４】
本明細書に使用される場合、「ＴＮＦ」、「ＴＮＦα」及び「ＴＮＦ−アルファ」という用語は区別なく用いられ、同じ意味を有する。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、本明細書の表１１及び国際公開第２００６／１２２７８６号に開示されたＳＤＡＢ分子を１つ又は複数含む。例えば、ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子は、国際公開第２００６／１２２７８６号に開示された一価、二価、又は三価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子であり得る。ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の例としては、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ３、それらのヒト化型（例えばＴＮＦ２９、ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３１、ＴＮＦ３２、ＴＮＦ３３）が挙げられるが、それらに限定されない。一価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の更なる例は国際公開第２００６／１２２７８６号の表８に開示されている。二価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の例としては、ペプチドリンカーを介して連結し、単一の融合ポリペプチドを形成する２つのＴＮＦ３０  ＳＤＡＢ分子を含み、ＴＮＦ５５及びＴＮＦ５６が挙げられる（国際公開第２００６／１２２７８６号に開示される）が、それらに限定されない。二価のＴＮＦα結合型のＳＤＡＢ分子の更なる例は、国際公開第２００６／１２２７８６号の表１９に、ＴＮＦ４、ＴＮＦ５、ＴＮＦ６、ＴＮＦ７、ＴＮＦ８）として開示されている。
【０１１６】
他の実施形態では、ＳＤＡＢ分子の単一抗原結合ドメインの２つ以上が、連結基を用いて又は連結基を用いずに、遺伝子融合体又はポリペプチド融合体として融合する。連結基は当業者にとって明らかな任意の連結基であり得る。例えば、連結基は１個〜１００個の原子の長さの生体適合性ポリマーであり得る。一実施形態では、連結基は、ポリグリシン残基、ポリセリン残基、ポリリシン残基、ポリグルタミン酸残基、ポリイソロイシン残基若しくはポリアルギニン残基、又はそれらの組合せを含むか、又はそれらからなる。例えば、ポリグリシンリンカー又はポリセリンリンカーには、少なくとも５個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、３５個及び４０個のグリシン残基及びセリン残基が含まれ得る。使用することができるリンカーの例としては、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回又はそれ以上の反復を有するＧｌｙ−Ｓｅｒ反復、例えば（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）反復が挙げられる。幾つかの実施形態では、リンカーは以下の配列を有する：（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号９）又は（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）（ここでｎは４、５又は６である）。
【０１１７】
１つの例示的な実施形態では、標的抗原、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する２つの単一ドメイン抗体分子（例えば２つのラクダ科動物可変領域）の一本鎖ポリペプチド融合体、及び分岐ＰＥＧ分子から構成される抗原結合ポリペプチドは、トランスジェニックマウスモデルにおいて既に罹患した（established）関節炎に対する用量依存的な治療効果を有することが示された。ＳＤＡＢ−０１は、ヒト化した二価二重特異性のＴＮＦα阻害性の融合タンパク質である。このタンパク質に対する抗原は腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）である。
【０１１８】
対応する発現ベクターのＤＮＡ配列から予測されるＳＤＡＢ−０１ポリペプチド鎖の完全アミノ酸配列を図１に示す（残基は、配列番号１の残基番号１としてＮＨ２末端から数える）。ＤＮＡ配列でコードされた最後のアミノ酸残基はＣ２６４であり、タンパク質のＣＯＯＨ末端を構成する。ジスルフィド結合したＳＤＡＢ−０１（翻訳後修飾は伴わない）予測分子量は約２７０００Ｄａである。ナノエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析により主要なアイソフォームで観察される分子量は６７０００Ｄａに相当し、それにより翻訳後修飾が存在しないことが確認される。特有の生化学特徴は以下のとおりである：２６４個のアミノ酸、２７３６５Ｄａの分子量、ＰＩ＝８．６７及びＵＶ＝Ｅｃ＝２８０ｎｍで１．８３。
【０１１９】
図１において、相補性決定領域（ＣＤＲ）は太字で示す。これらの結合ドメインを結ぶアミノ酸リンカーは小文字で示す。
【０１２０】
ＳＤＡＢ分子の調製
ＳＤＡＢ分子は、組換え型、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した（例えばファージディスプレイによって選択された）１つ又は複数の単一ドメイン分子からなり得る。抗体及びＳＤＡＢ分子を生成し、それらを組換えにより修飾する技法は当該技術分野で既知であり、以下で詳細に記載されている。
【０１２１】
当業者にとって既知の多くの方法が抗体を得るのに利用可能である。例えば、モノクローナル抗体を、既知の方法に従ってハイブリドーマの生成により作製することができる。それから、このようにして形成されたハイブリドーマを、標準的な方法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析を用いてスクリーニングし、特定の抗原に特異的に結合するＳＤＡＢ分子を産生する１つ又は複数のハイブリドーマを同定する。任意の形態の特定の抗原、例えば組換え抗原、その自然発生型、任意の変異体又は断片、及びその抗原ペプチドを免疫原として使用することができる。
【０１２２】
抗体及びＳＤＡＢ分子を作製する例示的な１つの方法は、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えばLadner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号、Smith (1985)Science 228:1315-1317、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９２／１５６７９号、国際公開第９３／０１２８８号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／０９６９０号及び国際公開第９０／０２８０９号に記載されている。
【０１２３】
ディスプレイライブラリの使用に加えて、特定の抗原を用いて、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスター又はラットに免疫を付与することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きい断片を用いて、マウス抗体産生が欠損しているマウス株を遺伝子操作で作り出す（engineer）ことが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子から誘導される抗原特異的なモノクローナル抗体を作製する及び選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21、米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号、１９９６年１０月３１日付けで公開された国際公開第９６／３４０９６号及び１９９６年４月２９日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号を参照されたい。
【０１２４】
別の実施形態では、ＳＤＡＢ分子を非ヒト動物から得て、それから当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法を用いて、修飾された、例えばヒト化、脱免疫化、キメラＳＤＡＢ分子を作製することができる。キメラ抗体及びキメラＳＤＡＢ分子を作製する多様なアプローチが記載されている。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 :6851, 1985、Takeda et al., Nature 314:452, 1985、Cabillyet al.の米国特許第４，８１６，５６７号、Boss et al.の米国特許第４，８１６，３９７号、Tanaguchi et al.の欧州特許第１７１４９６号、欧州特許第０１７３４９４号、英国特許第２１７７０９６号を参照されたい。ヒト化抗体及びヒト化ＳＤＡＢ分子は、例えばヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現するが、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを用いても作製することができる。Winterは、本明細書に記載のヒト化抗体及びヒト化ＳＤＡＢ分子を調製するのに使用することができる例示的なＣＤＲグラフト化方法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体の全てのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えることができ、又はＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置き換えることができる。ヒト化抗体及びＳＤＡＢ分子と所定の抗原との結合に要求される数のＣＤＲを置き換えるだけでもよい。
【０１２５】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接はかかわらないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の同等の配列に置きかえることにより生成することができる。ヒト化抗体又はその断片を生成する方法の例は、Morrison (1985) Science 229:1202-1207、Oi etal. (1986) BioTechniques 4:214、並びに米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，８５９，２０５号及び米国特許第６，４０７，２１３号で与えられる。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部をコードする核酸配列を単離する、操作する、及び発現することを含む。かかる核酸を、上記のように所定の標的に対するＳＤＡＢ分子を産生するハイブリドーマから、及び他の供給源から得ることができる。それから、ヒト化ＳＤＡＢ分子をコードする組換えＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１２６】
或る特定の実施形態では、ヒト化ＳＤＡＢ分子を、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖系列の置換及び／又は復帰突然変異の導入最適化する。かかる変異した免疫グロブリン分子は、当該技術分野で既知の幾つかの技法のいずれかにより作製することができ（例えばTeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983、Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983、Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982）、ＰＣＴ国際公開第９２／０６１９３号又は欧州特許第０２３９４００号）の教示に従って作製することができる。
【０１２７】
ＳＤＡＢ分子のヒト化に関する技法は国際公開第０６／１２２７８６号に開示されている。
【０１２８】
ＳＤＡＢ分子を、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失、又は国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に開示の方法による「脱免疫化」により修飾することもできる。要するに、ＳＤＡＢ分子の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ、これらのペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープを表す（国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に規定されているとおりである）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用することができ、加えて国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に記載されるように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースでＶＨ配列及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは１８種の主なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、そのため潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的なＴ細胞エピトープを、可変ドメインにおける少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は単一アミノ酸置換により排除することができる。典型的には、保存的置換が行われる。排他的なものではないが多くの場合、ヒト生殖系列の抗体配列の位置に共通するアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖系列の配列は例えば、Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798、Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242、Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817、及びTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリがヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリを与える（Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge, UKによってまとめられている）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載のようにヒトのコンセンサスフレームワーク領域も使用することができる。
【０１２９】
ＳＤＡＢ分子の作製
ＳＤＡＢ分子を、タンパク質を産生するように遺伝子操作した生存宿主細胞によって作製することができる。タンパク質を産生するように細胞を遺伝子操作する方法は当該技術分野で既知である。例えば、Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology(Wiley, New York)を参照されたい。かかる方法は、タンパク質をコードし、タンパク質の発現を可能にする核酸を生存宿主細胞に導入することを含む。それらの宿主細胞は培養液中で成長した細菌細胞、真菌細胞又は動物細胞であり得る。細菌宿主細胞としては、大腸菌細胞が挙げられるが、それに限定されない。好適な大腸菌株の例としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、及び外来ＤＮＡを切断しない任意の大腸菌株が挙げられる。使用することができる真菌宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichiapastoris）及びアスペルギルス細胞が挙げられるが、それらに限定されない。使用することができる動物細胞株の幾つかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３及びＷＩ３８である。新たな動物細胞株を、当業者に既知の方法を用いて（例えば形質転換、ウイルス感染、及び／又は選抜によって）樹立することができる。任意で、宿主細胞によってタンパク質を培地へと分泌させることができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子を細菌細胞、例えば大腸菌細胞において作製することができる。例えば、ディスプレイエンティティとバクテリオファージタンパク質（又はその断片）との間に抑制性終止コドンを含むファージディスプレイベクターにおいてＦａｂが配列によりコードされている場合、ベクターの核酸を、終止コドンを抑制することのできない細菌細胞に導入することができる。この場合、Ｆａｂはｇｅｎｅ  ＩＩＩタンパク質に融合せず、ペリプラズム及び／又は培地へと分泌される。
【０１３１】
ＳＤＡＢ分子は真核細胞でも作製することができる。一実施形態では、抗体（例えばｓｃＦｖ）をピチア属（例えば、Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251: 123-35を参照されたい）、ハンゼヌラ属（正：Hansenula）又はサッカロミセス属等の酵母細胞で発現させる。
【０１３２】
一実施形態では、ＳＤＡＢ分子を哺乳動物細胞において作製する。クローン抗体又はその抗原結合断片を発現するための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えばKaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ球細胞株、例えばＮＳ０骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、並びにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳房上皮細胞である。
【０１３３】
ＳＤＡＢ分子をコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、更なる配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば典型的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を与える。
【０１３４】
ＳＤＡＢ分子の組換え発現のための例示的なシステムにおいて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションによってｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がそれぞれ、エンハンサー／プロモーター調節因子（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等から誘導されるもの、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節因子又はＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節因子）に操作可能に連結し、遺伝子の高い転写レベルを誘導する。組換え発現ベクターもＤＨＦＲ遺伝子を保有し、それによりメトトレキサート選択／増幅を用いてベクターがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能になる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体の重鎖及び軽鎖を発現させることができ、無傷抗体が培養培地から回収される。標準的な分子生物学的技法を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトして、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養して、抗体分子を培養培地から回収することができる。例えば、一部のＳＤＡＢ分子をアフィニティクロマトグラフィによって単離することができる。
【０１３５】
ＳＤＡＢ分子はトランスジェニック動物によっても作製することができる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法を記載している。乳汁特異的なプロモーターと、抗体分子をコードする核酸と、分泌のためのシグナル配列とを含む導入遺伝子が構築される。かかるトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳汁は、その中に対象の抗体が分泌されている。抗体分子を乳汁から精製するか、又は用途によっては直接使用することができる。
【０１３６】
ＳＤＡＢ分子の結合特性を、任意の方法、例えば以下の方法：ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ｘ線結晶構造解析、配列分析及びスキャニング突然変異誘発の１つによって測定することができる。
【０１３７】
ＳＤＡＢ分子と標的（例えばＴＮＦα）との結合相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析することができる。ＳＰＲ又は生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、いかなる相互作用体も標識することなく、リアルタイムで生体特異的な相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象の指標となる）により、表面付近の光の屈折率の変化が起こる。生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定される屈折率の変化によって検出可能なシグナルが発生する。ＳＰＲを使用する方法は、例えば米国特許第５，６４１，６４０号、Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag、Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345、Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705、及びBIAcore International AB (Uppsala, Sweden)によって与えられるオンラインリソースに記載されている。
【０１３８】
ＳＰＲからの情報を用いて、平衡解離定数（Ｋｄ）、及び分子と標的との結合に関する反応速度パラメータ（Ｋｏｎ及びＫｏｆｆを含む）の正確かつ定量的な評価基準を与えることができる。かかるデータを用いて、異なる分子を比較することができる。ＳＰＲからの情報を用いて、構造と活性との関係性（ＳＡＲ）を展開することもできる。例えば、異なる抗体分子の反応速度パラメータ及び平衡結合パラメータを評価することができる。特定の結合パラメータ、例えば高い親和性及び小さい（slow）Ｋｏｆｆと相関する、所定の位置での変異体アミノ酸を同定することができる。この情報を構造モデリングと（例えば相同性モデリング、エネルギー最小化、又はｘ線結晶構造解析若しくはＮＭＲによる構造決定を用いて）組み合わせることができる。結果として、タンパク質とその標的との間の物理的相互作用の理解を系統立てて説明し、他の設計プロセスを導くのに使用することができる。
【０１３９】
修飾されたＳＤＡＢ分子
ＳＤＡＢ分子は、フレームワーク領域の１つにおいて少なくとも１つのアミノ酸位置が、自然発生的なドメイン、例えばＶＨドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し得る。
【０１４０】
一部のＳＤＡＢ分子、例えばヒト化ＳＤＡＢ分子のアミノ酸配列は、フレームワーク領域の少なくとも１つにおいて少なくとも１つのアミノ酸位置が、自然発生的なドメイン、例えば自然発生的なＶＨＩ−Ｉドメインのアミノ酸配列とは異なり得ることを理解されたい。
【０１４１】
本発明はＳＤＡＢ分子の誘導体の配合物も含む。かかる誘導体は一般的に、修飾によって、特にＳＤＡＢ分子及び／又は本発明で開示されるＳＤＡＢ分子を形成するアミノ酸残基の１つ若しくは複数の化学的及び／又は生物学的（例えば酵素）修飾によって得ることができる。
【０１４２】
かかる修飾の例、並びにこのようにして修飾することができるＳＤＡＢ分子配列内のアミノ酸残基（すなわちタンパク質骨格又は側鎖上のアミノ酸残基）、かかる修飾を導入するのに使用することができる方法及び技法、並びにかかる修飾の潜在的用途及び利点の例が当業者にとって明らかであろう。
【０１４３】
例えば、かかる修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分のＳＤＡＢ分子への又はＳＤＡＢ分子上への（例えば共有結合的な連結による又は任意の他の好適な方法での）導入、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能基を与える１つ又は複数の官能基、残基又は部分のＳＤＡＢ分子への導入を含み得る。かかる官能基の例は当業者にとって明らかであろう。
【０１４４】
例えばかかる修飾は、ＳＤＡＢ分子の半減期、溶解性及び／又は吸収を増大する、ＳＤＡＢ分子の免疫原性及び／又は毒性を低減する、ＳＤＡＢ分子の任意の望ましくない副作用を排除する若しくは軽減する、及び／又はＳＤＡＢ分子に他の有益な特性を与える、及び／又はＳＤＡＢ分子の望ましくない特性を低減する、又は上述の２つ以上の任意の組合せを与える、１つ又は複数の官能基の（例えば共有結合による又は任意の他の好適な方法での）導入を含み得る。かかる官能基及びそれらを導入する技法の例は当業者にとって明らかであり、概して上記で引用される一般的な背景技術において言及されるあらゆる官能基及び技法と、それ自体が医薬タンパク質の修飾で、特に抗体又は抗体断片（ＳｃＦｖ抗体及び１４８単一ドメイン抗体を含む）の修飾で知られている官能基及び技法とを含み得る。それらに関しては、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co.,Easton, PA (1980)を参照する。かかる官能基は例えば、同様に当業者にとって明らかであるように、本発明で特徴付けられるＳＤＡＢ分子に直接（例えば共有結合的に）、又は任意で好適なリンカー若しくはスペーサーを介して連結することができる。
【０１４５】
非ペプチドリンカー
本明細書に記載のＳＤＡＢ分子において、１つ又は複数のＳＤＡＢ分子及び／又はタンパク質と、１つ又は複数の許容可能なポリマーとが、互いに直接連結することができ、及び／又は１つ若しくは複数の好適なリンカーを介して互いに連結することができる。
【０１４６】
或る特定の用語が本明細書で規定される。
【０１４７】
「アルコキシル」又は「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用される場合、酸素ラジカルが付着した以下に規定のアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。
【０１４８】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基を含む飽和脂肪族基のラジカルを指す。好ましい実施形態では、直鎖アルキル又は分岐鎖アルキルは、１２個以下、（他に特に述べられていなければ）例えば１個〜１２個、１個〜８個、１個〜６個、又は１個〜４個の炭素原子をその骨格に有する。アルキル部分の例としては、メチル、エチル、プロピル（例えばイソプロピル）、ブチル（例えばイソブチル又はｔ−ブチル）が挙げられる。
【０１４９】
「アルキレン」という用語は、二価アルキル、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。
【０１５０】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のいずれかのラジカルを指す。
【０１５１】
一実施形態では、好適な許容可能なポリマーを本明細書に記載のＳＤＡＢ分子に「連結させる」のに用いられるリンカー部分は式（Ｉ）の部分で表される：
【化１４】
2013536175.tif 000016
【０１５２】
幾つかの実施形態では、リンカーは以下の式で表される：
【化１５】
2013536175.tif 000017
【０１５３】
２つ以上のリンカーを本明細書に記載のＳＤＡＢ分子に使用する場合、これらのリンカーは同じであっても、又は異なっていてもよい。当業者であれば、本発明のＳＤＡＢ分子での使用に最適なリンカーを認識するとともに理解するであろう。
【０１５４】
ＰＥＧ化
医薬タンパク質の半減期を増大するのに及び／又は免疫原性を低減するのに広く用いられる技法の１つは、好適な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧ）の付着を含む。一般的に、任意の好適な形態のＰＥＧ化、例えば当該技術分野において抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含むが、それらに限定されない）に使用されるＰＥＧ化を使用することができる。例えば、Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)、Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)、Harris and Chess, Nat Rev. Drug. Discov., 2, (2003)、及び国際公開第０４／０６０９６５号を参照する。タンパク質のＰＥＧ化のための様々な試薬が、例えばNOF America Corporationから市販されてもいる（例えばＰＥＧの式Ｂに関するもの）。典型的には、部位特異的なＰＥＧ化が特にシステイン残基を介して用いられる（例えば、Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)を参照されたい）。例えばこのために、ＰＥＧをＳＤＡＢ分子において自然発生するシステイン残基に付着することができ、ＰＥＧの付着のために１つ又は複数のシステイン残基が好適に導入されるように、ＳＤＡＢ分子を修飾することができる。さらに、いずれもタンパク質工学の技法を用いて、ＰＥＧ化のために１つ若しくは複数のシステイン残基が好適に導入されるように、本明細書に記載のＳＤＡＢ分子を修飾することができるか、又はＰＥＧ化のために１つ若しくは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を本発明のＳＤＡＢ分子のＮ末端及び／又はＣ末端に融合することができる。
【０１５５】
ＰＥＧ化に関連して、本発明は概して、上記ＰＥＧ化が、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増大し、（２）免疫原性を低減し、（３）ＰＥＧ化に関してそれ自体が既知の１つ又は複数の更なる有益な特性を与え、（４）ＳＤＡＢ分子の親和性には本質的に影響を与えず（例えば以下の実施例に記載されるような好適なアッセイにより決定されるように、９０％を超えて、５０％を超えて、又は１０％を超えて、上記親和性を低減しない）、及び／又は（４）ＳＤＡＢ分子の他の所望の特性のいずれにも影響を与えないように、１つ又は複数のアミノ酸位置でＰＥＧ化している任意のＳＤＡＢ分子も包含することに留意されたい。好適なＰＥＧ基及び好適なＰＥＧ基を特異的に又は非特異的に付着させる方法は当業者にとって明らかであろう。
【０１５６】
ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは、１ＫＤａ以上、例えば１０ＫＤａ以上及び２００ＫＤａ未満、例えば９０ＫＤａ未満の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは、１ＫＤａ〜１００ＫＤａの範囲の分子量を有し得る。典型的には、ＳＤＡＢ分子には、５０００を超える、例えば１００００を超える、及び２０００００未満、例えば１０００００未満の、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量を有するＰＥＧを使用する。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは１０ＫＤａ〜５０ＫＤａの範囲の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは１５ＫＤａ〜４５ＫＤａの範囲の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは２０ＫＤａの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは４０ＫＤａの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＡＢ分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるＰＥＧは１０ＫＤａの分子量を有し得る。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧはメトキシＰＥＧ誘導体（ｍＰＥＧ）モノマー、ポリマー又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１ＫＤａ〜１００ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１０ＫＤａ〜５０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、４０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１５ＫＤａ〜３５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、３０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、２０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１７．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１２．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、１０ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は７．５ＫＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子は独立して、５ＫＤａの分子量を有する。
【０１５８】
別の通常あまり典型的ではない修飾は、ＳＤＡＢ分子を発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、通常翻訳時修飾及び／又は翻訳後修飾の一部としてＮ連結型グリコシル化又はＯ連結型グリコシル化を含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、ＰＥＧ分子は分岐している。幾つかの実施形態では、ＰＥＧ分子は式（ａ）〜式（ｈ）の部分から選択される：
【化１６】
2013536175.tif 000018
（ここで各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である）。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子はｍＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、ＰＥＧ分子に連結した式（Ｉ）のリンカーを含み、以下から選択される構造を有する：
【化１７】
2013536175.tif 000019
（ここで、各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である）。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子はｍＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は、ＰＥＧ分子に連結した式（Ｉ）のリンカーを含み、以下から選択される構造を有する：
【化１８】
2013536175.tif 000020
（ここで、各ＰＥＧ分子は独立して、ＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である）。幾つかの実施形態では、各ＰＥＧ分子はｍＰＥＧモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化１９】
2013536175.tif 000021
【０１６２】
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化２０】
2013536175.tif 000022
【０１６３】
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のリンカーは以下の式で表されるＰＥＧ分子に連結する：
【化２１】
2013536175.tif 000023
【０１６４】
リンカー−ＰＥＧ分子はＳＤＡＢ分子と会合する（例えば結び付く）ことができ、それにより修飾されたＳＤＡＢ分子が形成する。ＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子は、Ｎ末端からＣ末端へと以下の順序で配置され得る：ＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子−ＴＮＦα結合型の単一ドメイン分子−ＰＥＧ分子（例えば分岐したＰＥＧ分子）。一実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化２２】
2013536175.tif 000024
【０１６５】
一実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化２３】
2013536175.tif 000025
【０１６６】
一実施形態では、修飾されたＳＤＡＢ分子は以下の式で表される：
【化２４】
2013536175.tif 000026
【０１６７】
修飾されたＳＤＡＢ分子の１つの例示的な実施形態は以下の式で表される：
【化２５】
2013536175.tif 000027
【０１６８】
ＳＤＡＢ分子の反応基は一般的に、ＳＤＡＢ分子に付着した求核部分を介して付着する。幾つかの実施形態では、求核部分は硫黄（例えばシステイン残基の硫黄）である。他の実施形態では、求核部分は窒素（例えば末端のα−アミノ基又は窒素含有アミノ酸側鎖（例えばリシン鎖のε−アミノ基）の窒素）である。他の実施形態では、求核部分はＣ末端基である。ＳＤＡＢ分子の反応基は一般的に、リンカーに付着した求電子部分を介して付着する。幾つかの実施形態では、求電子部分はカルボニル基（例えば活性化エステル又はアルデヒド）である。幾つかの実施形態では、求電子部分はマレイミド基である。
【０１６９】
投与及び治療方法
ＳＤＡＢ分子を被験体（例えばヒト被験体）に単独で、又は第２の作用物質、例えば治療的に若しくは薬理学的に活性のある第２の作用物質に併せて投与し、ＴＮＦα関連障害、例えば炎症性障害又は自己免疫障害を治療する又は予防する（例えばＴＮＦα関連障害に関連する１つ又は複数の症状を低減する又は改善する）ことができる。「治療する」という用語は、障害に関連する状態、症状若しくはパラメータを改善するのに、又は障害の進行を統計学的に有意な程度まで若しくは当業者に検出可能な程度まで抑えるのに効果的な量、方法及び／又は様式で療法剤（therapy）を投与することを指す。治療に使用する場合、治療は被験体の障害若しくは状態を改善する、治癒する、維持する、又は障害若しくは状態の期間を低減することができる。治療上の使用では、被験体には症状の部分的な又は全体的な兆候があり得る。典型的な場合、治療は被験体の障害若しくは状態を医師が検出可能な程度まで改善するか、又は障害若しくは状態の悪化を防ぐ。効果的な量、方法又は様式は被験体に強く依存して変化し得るとともに被験体に合わせられ得る。
【０１７０】
本明細書に使用される場合、「被験体」及び「患者」という用語は区別なく用いられる。本明細書に使用される場合、「被験体（"subject" and "subjects"）」という用語は、動物、例えば非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）及び霊長類（例えばサル、例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジー及びヒト）を含む哺乳動物を指す。
【０１７１】
治療することができる免疫障害の非限定的な例としては、自己免疫障害、例えば関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ループス関連関節炎又は強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹様皮膚炎を含む）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；炎症状態、例えば皮膚の炎症状態（例えば乾癬）；急性炎症状態（例えば内毒素血症、敗血症（sepsis and septicemia）、毒素性ショック症候群及び感染性疾患）；移植片拒絶反応及びアレルギーが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、ＴＮＦα関連障害は、関節障害、例えば関節リウマチ、若年性関節リウマチ（ＲＡ）（例えば中度から重度の関節リウマチ）、骨関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）；若しくは乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、及び／又は多発性硬化症の１つ又は複数から選ばれる障害である。
【０１７２】
或る特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子（又は配合物）を第２の治療薬と併せて投与する。例えば、ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子では、第２の作用物質は抗ＴＮＦα抗体又はそのＴＮＦα結合断片であり得る。ここで第２のＴＮＦα抗体は配合物のＴＮＦα結合ＳＤＡＢ分子とは異なるエピトープ特異性を有する。ＴＮＦα結合型のＳＤＡＢと同時に配合することができる作用物質の他の非限定的な例としては、例えばサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬、及び細胞増殖抑制薬が挙げられる。一実施形態では、更なる作用物質は関節炎に標準的な治療薬であり、これには非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）；コルチコステロイド（プレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン及びトリアムシノロンを含む）；及び疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）、例えばメトトレキサート、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）及びスルファサラジン、レフルノミド（Ａｒａｖａ（商標））、腫瘍壊死因子阻害剤（エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））（メトトレキサートを伴う又は伴わない）及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））を含む）、抗ＣＤ２０抗体（例えばＲｉｔｕｘａｎ（商標））、可溶性インターロイキン−１受容体、例えばアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、金、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｉｎ（商標））、ペニシラミン、並びに細胞毒性薬（アザチオプリン、シクロホスファミド及びシクロスポリンを含む）が含まれるが、それらに限定されない。かかる併用療法はより低い投与量の投与治療薬を有益に利用することができ、それにより様々な単剤療法に関連する可能性のある毒性又は合併症が回避される。
【０１７３】
ＳＤＡＢ分子を液体溶液（例えば注射溶液及び注入溶液）の形態で投与することができる。かかる組成物を非経口形式（例えば皮下注射、腹腔内注射又は筋肉注射）によって、又は吸入によって投与することができる。「非経口投与」及び「非経口投与する」という語句は、本明細書で使用される場合、通常注射による腸内投与及び局所投与以外の投与形式を意味し、皮下投与又は筋肉投与、並びに静脈内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、表皮下、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨下での注射及び注入を含む。一実施形態では、本明細書に記載の配合物を皮下投与する。
【０１７４】
医薬組成物又は医薬配合物は滅菌されており、製造及び保存の条件下で安定である。医薬組成物は投与に関する規制基準及び産業基準を満たすように試験することもできる。
【０１７５】
医薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高いタンパク質濃度に好適な他の規則構造として配合することができる。滅菌済みの注射溶液は、要求に応じて、適切な溶媒中で要求される量の本明細書に記載の作用物質を上で挙げられた成分の１つ又は組合せと組み合わせて、その後滅菌ろ過することにより調製することができる。概して、分散液は基本となる分散媒と上で列挙されたものの中の要求される他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに本明細書に記載の作用物質を組み込むことによって調製する。溶液の適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合、要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に包含させることにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０１７６】
組成物／配合物
ＳＤＡＢ分子の配合物には、ＳＤＡＢ分子と、抗凍結剤として働くことができる化合物と、バッファーとが含まれる。配合物のｐＨは概して、ｐＨ５．５〜７．０である。幾つかの実施形態では、配合物を液体として保存する。他の実施形態では、配合物を液体として調製し、それから例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾燥させた後、保存する。乾燥した配合物を乾燥化合物として、例えばエアロゾル若しくは粉末として使用するか、又は例えば水、バッファー若しくは他の適切な液体を用いてその元の濃度若しくは別の濃度へと再構成することができる。
【０１７７】
ＳＤＡＢ分子精製プロセスは、ＳＤＡＢ分子が凍結液体としての長期保存に、及び続くフリーズドライ（例えばヒスチジン／スクロース配合物を用いたフリーズドライ）に好適な配合物に導入されるように設計する。配合物は特定濃度のタンパク質を用いて凍結乾燥する。それから凍結乾燥した配合物を必要に応じて好適な希釈剤（例えば水）で再構成し、元の配合成分を所望の濃度、概して凍結乾燥前の濃度と比較して同じ又は高い濃度まで再溶解させることができる。
【０１７８】
凍結乾燥した配合物を再構成し、初めにフリーズドライした液体の体積と比べての凍結乾燥物に添加される水又は希釈剤の量に応じて、元の（すなわち凍結乾燥前の）濃度とは異なる濃度を有する配合物を作製することができる。好適な配合物は抗体の完全性の１つ又は複数のパラメータをアッセイすることにより同定することができる。
【０１７９】
製造品
本願は本明細書に記載の配合物を含み、配合物の使用説明書を備える製造品も提供する。
【０１８０】
被験体への投与に、例えば医薬品として用いられる配合物は滅菌されていなければならない。これは当該技術分野で既知の方法を用いて、例えば液体の配合、又は凍結乾燥及び再構成の前又は後の滅菌ろ過膜によるろ過によって達成される。代替的には、構造が損傷を受けない場合、配合物の成分をオートクレーブにより滅菌し、それからろ過滅菌した又は放射線滅菌した成分と組み合わせて、配合物を作製することができる。
【０１８１】
医薬品配合物を、例えば皮下注射用シリンジ又はマルチチャンバシリンジを含むシリンジ等の経皮送達デバイスを用いて投与することができる。一実施形態では、デバイスは針付きの又は針が内蔵された充填済みシリンジである。他の実施形態では、デバイスは針の付いていない充填済みシリンジである。針は充填済みシリンジとともにパッケージングされていてもよい。一実施形態では、デバイスは自己注射デバイス、例えば自己注射器シリンジである。別の実施形態では、注射デバイスはペン型注射器である。更に別の実施形態では、シリンジは固定（staked）針シリンジ、ルアーロックシリンジ、又はルアースリップシリンジである。他の好適な送達デバイスは、ステント、カテーテル、顕微針及び埋込み型制御放出デバイスを含む。組成物は例えばインラインフィルターを備える又は備えていない、ＩＶチューブ（tubings）を含む標準的なＩＶ機器を用いて静脈投与することができる。
【０１８２】
或る特定の実施形態では、シリンジは自己注射器デバイスとの使用に好適である。例えば、自己注射器デバイスは、単回バイアルシステム、例えば溶液送達用のペン型注射器デバイスを含み得る。かかるデバイスは、例えばBecton Dickensen（Franklin Lakes, N.J.）、Ypsomed（Burgdorf, Switzerland（www.ypsomed.com））、Bioject（Portland,Oreg.）、National Medical Products、Weston Medical（Peterborough, UK）、Medi-Ject Corp（Minneapolis, Minn.）、及びZogenix, Inc（Emeryville,CA）により作製又は開発された、ＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（商標）、Ｂ−Ｄ（商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（商標）、及びＯｐｔｉＰｅｎ（商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ  Ｐｅｎ（商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ｐｅｎ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標），Ｉｊｅｃｔ（商標）、Ｊ−ｔｉｐ  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（商標）、ＤｏｓｅＰｒｏ（商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（商標）のように、製造業者から市販されている。広く認められている二重バイアルシステムを含むデバイスは、再構成溶液の送達のためにカートリッジ中で凍結乾燥した薬剤を再構成するペン型注射器システム、例えばＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（商標）を含む。
【０１８３】
製造品は配合物を含有するのに好適な容器を含み得る。好適な容器としては、デバイス、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、ネブライザー（例えば超音波ネブライザー又は振動メッシュネブライザー）、静脈注射溶液バッグ、又は吸入具（例えば定量吸入具（ＭＤＩ）又は乾燥粉末吸入具（ＤＰＩ））が挙げられるが、それらに限定されない。容器は、ガラス、金属、又はポリカーボネート、ポリスチレン若しくはポリプロピレン等のプラスチックのような任意の好適な材料からなり得る。
【０１８４】
概して容器は、配合物から相当量のタンパク質を吸収せず、配合物の成分との反応性がない材料の容器である。
【０１８５】
本明細書に記載の製造品はパッケージング材料を更に含み得る。パッケージング材料は、使用又は投与に関する情報に加えて、例えば規制当局が要求している、製品を使用することができる条件に関する情報を備える。例えばパッケージング材料は、本明細書に記載の配合物を含有する充填済みシリンジを注射する方法、又は特定の期間内で、例えば２時間〜２４時間又はそれ以上の期間で、凍結乾燥した配合物を水性希釈剤で再構成し、溶液を形成する方法について、患者に指示を与えることができる。本発明で請求される配合物はヒト医薬製品用途に有用である。
【０１８６】
或る特定の実施形態では、配合物をネブライザーとして投与することができる。ネブライザーの例としては、非限定的な例であるが、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー及び振動メッシュネブライザーが挙げられる。これらの類は液体からエアロゾルを作製するのに異なる方法を用いる。概して、これらの配合物中でタンパク質の完全性を維持することができる任意のエアロゾル発生デバイスは、本明細書に記載の配合物の送達に好適である。
【０１８７】
他の実施形態では、医薬組成物は医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、医薬組成物は無針の皮下注射デバイス、例えば米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、又は同第４，５９６，５５６号で開示されたデバイスを用いて投与することができる。既知のインプラント及びモジュールの例としては、米国特許第４，４８７，６０３号（制御速度で医薬を分配する埋込み型マイクロ注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４８６，１９４号（皮膚を通して医薬（medicants）を投与する治療用デバイスを開示している）、米国特許第４，４４７，２３３号（医薬を正確な注入速度で送達する医薬注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２２４号（連続薬剤送達のための可変流量の埋込み型注入装置を開示している）、米国特許第４，４３９，１９６号（多重チャンバコンパートメントを備える浸透圧薬剤送達システムを開示している）、及び米国特許第４，４７５，１９６号（浸透圧薬剤送達システムを開示している）が挙げられる。治療用組成物は皮下投与又は筋肉投与のための生分解性又は非生分解性の持続放出配合物の形態であってもよい。例えば、米国特許第３，７７３，９１９号及び同第４，７６７，６２８号、並びにＰＣＴ国際公開第９４／１５５８７号を参照されたい。連続投与は、埋込み型ポンプ又は外付けポンプを用いても達成することができる。投与は断続的に、例えば１日１回の注射で、又は低用量で連続して、例えば持続放出配合物で実施することもできる。ＳＤＡＢ分子の投与に最適合化するように、送達デバイスに改良を加えることができる。例えばシリンジをＳＤＡＢ分子の保存及び送達に最適な程度までシリコン処理することができる。当然ながら、多くの他のかかるインプラント、送達システム及びモジュールも既知である。
【０１８８】
本発明は第１の作用物質及び第２の作用物質を投与するデバイスも特徴とする。デバイスは、例えば医薬調製物を保存するための１つ又は複数のハウジングが含むことができ、単位用量の第１の作用物質及び第２の作用物質を送達するように構築することができる。第１の作用物質及び第２の作用物質を同じコンパートメント又は別々のコンパートメントに保存することができる。例えば、本デバイスでは作用物質を組み合わせた後、投与を行うことができる。第１の作用物質及び第２の作用物質を投与するのに異なるデバイスを使用することも可能である。
【０１８９】
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載されているが、決してその範囲を限定する意図はなく、またそのように解釈されるものではない。
【実施例】
【０１９０】
実施例１．抗ＴＮＦα構成要素の生成及びＳＤＡＢ−０１の遺伝子操作
ＳＤＡＢ−０１二価ヒト化ＳＤＡＢポリペプチドを、４つのグリシン及び１つのセリンの６つの反復からなる３０個のアミノ酸のフレキシブルリンカーを介した２つの同一のＴＮＦα抗原結合ドメイン（配列番号１のアミノ酸１〜１１５）の遺伝子融合によって構築した。部位特異的なＰＥＧ化の準備をするために、遊離システインを３つのグリシンアミノ酸リンカーに続くＣ末端で遺伝子操作した（図１）。タンパク質をＣＨＯ哺乳動物発現系で産生し、プロテインＡ親和性捕捉により精製した。それからＣ末端システインをジチオスレイトール処理により還元し、活性化２×２０ｋＤａ分岐ＰＥＧ（図２）のマレイミド官能基と反応させた。最終生成物を遊離ＰＥＧ及びごく一部の非ＰＥＧ化タンパク質から更に精製するとともに、特性化した。
【０１９１】
それによりＳＤＡＢ−０１は、３０個のアミノ酸のフレキシブルリンカーで隔てられた配列番号１のアミノ酸１〜１１５のアミノ酸配列を有する２つの同一のヒト化抗ＴＮＦα特異的なＳＤＡＢ分子と、マレイミドで誘導体化した４０ｋＤａ（２×２０ｋＤａ）の分岐ポリエチレングリコールを有する特異的にＰＥＧ化したＣ末端システイン部位（２×２０  ＰＥＧ）との遺伝子融合体を含む（図３）。図４Ａは直鎖ｍＰＥＧ−マレイミドと、ＳＤＡＢ−０１を含む２つの分岐ｍＰＥＧ−マレイミドとを示す。図４ＢはＳＤＡＢ−０１と［配列番号１］−ＰＥＧ４０とのサイズを比較するスキャン図である。
【０１９２】
解析的な分析によって、直鎖４０Ｋ  ｍＰＥＧ−マレイミドＳＤＡＢと分岐４０Ｋ  ｍＰＥＧ−マレイミドＳＤＡＢとの間のＰＥＧ化効率が同程度であることが示された。直鎖４０Ｋ  ｍＰＥＧ−マレイミド又は分岐４０Ｋ  ｍＰＥＧ−マレイミドのいずれかでＰＥＧ化した抗ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子は同程度の生体活性を示した。見掛けの電荷及び形状は、２つの分岐４０Ｋ  ｍＰＥＧ−マレイミド材料（分岐ＰＥＧの式Ａ及び分岐ＰＥＧの式Ｂ）の間でほぼ同程度であるように見える。
【０１９３】
長さを最適化したフレキシブルリンカーを介した２つの同一のＴＮＦα抗原結合ドメイン（配列番号１のアミノ酸１〜１１５）の二価フォーマットとしてのＳＤＡＢ−０１の構築は、細胞ベースのＴＮＦα中和アッセイにおいてその一価フォーマットと比較してその効力を約５０倍改善させた。遺伝子操作したＣ末端システインの部位特異的なＰＥＧ化は、薬剤候補に、その効力に影響を与えることなくｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長した所望の薬物動態プロファイルを与えた。
【０１９４】
実施例２．フローサイトメトリーによるＳＤＡＢ−０１と膜結合型のＴＮＦαとの結合特性化
ＳＤＡＢ−０１は、ヒトＴＮＦαを発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株にその細胞表面上で結合することがフローサイトメトリーによって実証されている。１３アミノ酸の欠失が部位特異的な突然変異誘発によりヒトＴＮＦαコード領域に導入され、タンパク質切断が低減し、ＴＮＦαの培地への放出が起こった。安定したＣＨＯ株をこの構築物を用いて生成した。細胞表面上のＴＮＦαの発現は、特異的な抗ヒトＴＮＦα抗体を用いるフローサイトメトリーにより実証された。ＳＤＡＢ−０１を用いて、細胞株ｐＷ２１２８  ＣＨＯ−ＴＮＦ−Ｄ１３を染色し、その後ビオチン化抗ＰＥＧ抗体を用いて二次染色を行い、それからストレプトアビジン−ＰＥを用いる三次染色によって検出し、細胞表面結合がもたらされることを実証した（図５）。
【０１９５】
実施例３：ヒトＴＮＦ又はアカゲザルＴＮＦに対するＳＤＡＢ−０１の親和性
ヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαとの抗ＴＮＦα  ＳＤＡＢ−０１結合の詳細な特性化を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器で表面プラズモン共鳴を用いて実施した。ビオチン化ＳＤＡＢ−０１をストレプトアビジンセンサーチップ表面上に捕捉し、様々な濃度のヒトＴＮＦα又はアカゲザルＴＮＦαをこの実験で試験した。ＴＮＦαタンパク質を注入し、１００μＬ／分で１．５分、会合させ、２０分解離させた。速度定数及びＫｄを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ４．１の１：１結合モデルを用いて全体的適合により決定した。速度定数で示されるデータは少なくとも２つの独立した実験による平均及び標準偏差である。Ｋｄは会合速度及び解離速度（on and off rates）の平均から算出した。ヒトＴＮＦα又はアカゲザルＴＮＦαに対するＳＤＡＢ−０１の親和性を表１に示す。
【０１９６】
表１．Ｂｉａｃｏｒｅにより決定されるヒトＴＮＦα又はアカゲザルＴＮＦαに対するＳＤＡＢ−０１の親和性
【表１】
2013536175.tif 000028
【０１９７】
実施例４：細胞ベースの細胞毒性アッセイにおけるＳＤＡＢ−０１の特性化
ヒトＴＮＦα又はアカゲザルＴＮＦαを用いたＬ９２９細胞ベースの細胞毒性アッセイにおける、ＳＤＡＢ分子対照４及び非ＰＥＧ化ＳＤＡＢ分子対照３と比較したＳＤＡＢ−０１の生体活性の評価。ＳＤＡＢ−０１のＴＮＦα（０．５ｎｇ／ｍｌ）の細胞毒性を中和する能力を細胞ベースの用量応答アッセイで評価した。ＳＤＡＢ−０１及び非ＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子である対照３を同じ実験でアッセイした。用量応答曲線を図６に示し、ＥＣ５０の結果を表２にまとめる。
【０１９８】
表２．ＳＤＡＢ対照４、ＳＤＡＢ−０１及び非ＰＥＧ化ＳＤＡＢ対照３の生体活性
【表２】
2013536175.tif 000029
【０１９９】
これらの結果は、ＳＤＡＢ−０１がＬ９２９細胞ベースのアッセイにおいてヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαの両方を中和することが可能であることを示している。それらの結果は、ＰＥＧ化がＳＤＡＢ−０１の中和活性に関して顕著な効果を有しないことも示している。
【０２００】
実施例５．様々な種のＴＮＦαとのＴＮＦα  ＳＤＡＢ−０１結合反応速度の比較
本研究の目的は、ＳＤＡＢ−０１と、ヒト、アカゲザル、ラット、マウス及びウサギを含む様々な種のＴＮＦαとの間の結合速度及び平衡解離定数を研究して、有効性モデル、薬物動態モデル及び毒物学モデルに使用することができる、これらの異なる種間で結合親和性を比較する方法を理解することであった。Ｂｉａｃｏｒｅ機器を用いて、表面プラズモン共鳴によりリアルタイムで結合する反応速度を測定した。速度定数は直接測定し、平衡解離定数はＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアｖ４．１を用いて結合速度から誘導した。
【０２０１】
ＴＮＦα結合の評価のために、ＳＤＡＢ−０１を６０ＲＵ〜７５ＲＵの密度でセンサーチップ表面上に固定化した。ヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαが速い会合速度及び非常に遅い解離速度でＳＤＡＢ−０１に同じように結合した（図７ａ、図７ｂ）。ＳＤＡＢ−０１との結合がヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαの濃度に依存し、飽和に達した。最高濃度では、結合が平衡に達した。ＳＤＡＢ−０１とヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαとの高親和性の結合に対して、ラットＴＮＦα及びマウスＴＮＦαとＳＤＡＢ−０１との結合はごく僅かなものであった（図７ｃ、図７ｄ）。試験した最高濃度、１００ｎＭでラットＴＮＦα結合及びマウスＴＮＦα結合では、結合に関して非常に低いシグナルが観察され、５ＲＵ未満の結合応答にしか達しなかった（図７）。試験した最高濃度、最大１００ｎＭでの見掛けの速い解離速度及び飽和の欠如が弱い結合の指標である。ラットＴＮＦα又はマウスＴＮＦαでは、飽和がなく、結合速度が測定するには速すぎたため、平衡解離定数を算出することが不可能であった。このことは、幾らかのごく僅かな結合が存在するが、ラットＴＮＦα及びマウスＴＮＦαはＳＤＡＢ−０１と極めて弱く結合することを示唆している。ウサギＴＮＦαとＳＤＡＢ−０１との結合は、試験した最高濃度の４００ｎＭのウサギＴＮＦαであっても観察されなかった（図７）。これらのデータは、ＳＤＡＢ−０１は、ヒトＴＮＦαと同程度にアカゲザルＴＮＦαと結合するが、マウス、ラット又はウサギではＴＮＦαリガンドと係合しないことを示している。
【０２０２】
ＳＤＡＢ−０１とのヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαの結合の間の会合速度定数及び解離速度定数を１：１の結合モデルを用いて図７に示される結合から算出した（表３）。ヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαは非常に類似した会合速度及び解離速度を有し、それぞれ１９．５＋４．１７ｐＭ及び３４．１＋７．２３ｐＭというほぼ同一のＫｄ値が得られた。
【０２０３】
表３．ＳＤＡＢ−０１とヒトＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαとの結合親和性
【表３】
2013536175.tif 000030
【０２０４】
実施例６．ＳＤＡＢ−０１に対する補体依存性の細胞毒性及び抗体依存性の細胞毒性の欠如
ＳＤＡＢ−０１はヒトＴＮＦα及びサルＴＮＦαに対する高い中和効力を示す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣの両方が、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能である。代替的な補体カスケードにおいて第１のタンパク質であるＣ１ｑが２つ以上のＩｇＧ分子上でＦｃ領域のＣＨ２ドメインと結合する場合、ＣＤＣが生じ得る。このことが下流の補体経路成分を誘発し、最終的に細胞の表面上に膜傷害複合体の形成をもたらし、細胞が溶解する。ＡＤＣＣは、細胞表面上でＴＮＦαに結合した抗ＴＮＦα抗体のＦｃ領域と、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ及び好中球等の免疫エフェクター細胞上で発現したＦｃγＲとの間の相互作用によって標的細胞の死滅を誘発し得る。本研究の目的は、ＳＤＡＢ−０１によるＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性に関して試験し、それを抗ＴＮＦα抗体対照１及び抗ＴＮＦα抗体対照２、抗ＴＮＦα抗体対照３と比較することであった。抗体対照１及び抗体対照２はヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有し、そのためエフェクター機能を有し得る。抗体対照３及びＳＤＡＢ−０１はＦｃ領域を欠いている。
【０２０５】
本分析によって、ＳＤＡＢ−０１及び抗体対照３は、抗体対照１及び抗体対照２と比較してＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性を全く有していないことが実証された（図３０及び図３１）。抗体のＦｃ領域は、分子がＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性を媒介するのに必要とされ、抗体対照３及びＳＤＡＢ−０１はＦｃ領域を欠いている。そのためＳＤＡＢ−０１は、細胞毒性となり得るエフェクター機能活性を引き起こすことなく、細胞表面上でＴＮＦαと結合するとともに中和する可能性がある。
【０２０６】
実施例７：好中球浸潤に対するＳＤＡＢ−０１の効果
これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究の目的は、ネズミ気嚢モデルにおいて様々な用量のＳＤＡＢ−０１の組換えヒトＴＮＦαにより誘導される細胞浸潤を低減する能力を評価することであった。
【０２０７】
Tessier et al.（Jour of Immunol.159:3595-3602, 1997）によって、ＴＮＦαのマウス気嚢への注入が気嚢への白血球の集積を誘導することがこれまでに示されている。ＳＤＡＢ−０１は、ＴＮＦαと結合し、ＴＮＦαの効果を中和するように設計された。ＳＤＡＢ−０１がｉｎ  ｖｉｖｏモデルでの細胞集積に対する効果を有するか否かを試験するために、ＳＤＡＢ−０１をマウスに投与した後、ＴＮＦαを気嚢に注入した。細胞を気嚢から回収し、ＴＮＦα投与後６時間で差次的にカウントした。
【０２０８】
嚢液を各実験の終了時に（ＴＮＦαの投与後６時間で）回収し、細胞数をＣｅｌｌ  Ｄｙｎｅで決定した。実験１の結果を図８及び図９に示す。
【０２０９】
０．１８ｍｇ／ｋｇで投与したＳＤＡＢ−０１は、１０ｎｇの組換えヒトＴＮＦαにより誘導される気嚢への細胞浸潤を有意に低減した。０．１８ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１によって好中球の集積も有意に阻害された。リンパ球及び単球の浸潤は６時間の時点では微量成分の細胞浸潤であり、この細胞浸潤は本研究ではＳＤＡＢ−０１による影響を受けなかった。
【０２１０】
実験２は実験１と同じプロトコルを用いて行った。その結果を図１０及び図１１に示す。その結果は実験１で観察されたものと一致していたが、本実験では好中球の浸潤が０．１８ｍｇ／ｋｇ及び０．０９ｍｇ／ｋｇの用量のＳＤＡＢ−０１の両方で有意に阻害された。総細胞浸潤は０．０９ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１のみで有意に低減し、単球浸潤又はリンパ球浸潤では有意な低減は観察されなかった。
【０２１１】
実験３では、ＳＤＡＢ−０１を先に行ったものと同じ用量で投与した。図１２及び図１３に示されるように、総白血球浸潤の有意な低減が０．０９ｍｇ／ｋｇ用量で観察され、両方の用量のＳＤＡＢ−０１で好中球浸潤の有意な低減が観察された。リンパ球は０．０９ｍｇ／ｋｇ用量で有意に低減したが、０．１８ｍｇ／ｋｇ群では有意に低減しなかった。試験したいずれの用量でも単球浸潤に対する効果はなかった。
【０２１２】
要約すると、０．０９ｍｇ／ｋｇ用量で有意ではない正の傾向が与えられた１つの研究を除いて、両方の濃度のＳＤＡＢ−０１で対照群と比較しての好中球浸潤の有意な阻害が観察された（表４）。
【０２１３】
表４：ＳＤＡＢ−０１を用いたネズミ気嚢実験の概要
【表４】
2013536175.tif 000031
【０２１４】
０．０９ｍｇ／ｋｇと低い用量のＳＤＡＢ−０１の投与が、１０ｎｇの組換えヒトＴＮＦαにより誘導される細胞浸潤及び好中球浸潤を有意に低減した。試験したいずれの用量でもリンパ球浸潤及び単球浸潤にはほとんど効果がなかった。これらのデータは、ＳＤＡＢ−０１が組換えヒトＴＮＦα刺激により引き起こされる好中球の浸潤を一貫して遮断することができることを示している。
【０２１５】
実施例８：関節炎のＴｇ１９７ヒトＴＮＦαトランスジェニックマウスモデルにおけるＳＤＡＢ−０１の有効性
ＳＤＡＢ−０１の治療効果を関節リウマチのＴＮＦαトランスジェニックマウスモデルで評価した。このモデルでは、ＴＮＦαトランスジェニックマウスは、４週齢〜７週齢で１００％の発生率で慢性多発性関節炎を発症する。この疾患はヒトＴＮＦαの過剰発現に依拠する。様々な処理用量（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ）のＳＤＡＢ−０１の効果を治療投与計画で研究した。１００％のマウスが疾患の徴候を示した場合に、動物を無作為に群に割り当てた。群に割り当てた後、ＳＤＡＢ−０１、抗ＴＮＦα抗体対照２、対照抗体又はビヒクルによる処理を開始し、１週間に２回、７週間継続した。全ての動物に、疾患症状の視覚的兆候に関して盲検で１週間ごとスコアリングを行った。研究の終了時に、後肢を摘出し、処理して、疾患の指標に関して顕微鏡によって評価した。
【０２１６】
実験１では、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＤＡＢ−０１による処理は、ビヒクル処理群と比較して用量依存的に関節炎の更なる発症を予防することによる顕著な効果を示した。より高い用量のＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）による処理は、両方の対照群と比較して組織病理学的スコアの顕著な改善を示した。そのため、臨床的に顕微鏡によって評価した、対照処理群と比較して関節炎の改善を示した最小治療用量は、１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１であった。
【０２１７】
実験２では、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＤＡＢ−０１による処理は、臨床スコア及び組織病理スコアの両方で退行を示し、確立された関節炎に対する治療効果を示した。そのため、臨床的に顕微鏡によって評価した、対照処理群と比較して関節炎の改善を示した最小治療用量は１ｍｇ／ｋｇであった。
【０２１８】
要約すると、ＳＤＡＢ−０１による抗ＴＮＦα処理は、疾患の増悪の予防、並びに臨床スコア及び組織病理スコアの両方での退行から明らかなように、確立された関節炎に対する用量依存的な治療効果を示した。この処理の結果は、Ｔｇ１９７マウス関節炎モデルにおいて、対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現した（recapitulated）ことから、ヒトＴＮＦαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった。
【０２１９】
実験設計
ＳＤＡＢ−０１及び抗破傷風毒素（対照）抗体は、標準的な方法によってPfizerで調製された。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ｃ）、抗ＴＮＦα抗体、ロット番号７ＨＤ９８０１６）を、MedWorld Pharmacy（カタログ番号ＮＤＣ  ５７８９４−０３０−０１）から購入した。
【０２２０】
ヒトＴＮＦ−グロビンハイブリッド導入遺伝子（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンドで維持される）が同型の雄のＴｇ１９７マウスを（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１雌と交配させた。異型のトランスジェニック子孫を本研究に使用した。１００％のマウスが関節炎の兆候を示した場合、全てのマウスを処理群に無作為に割り当てた。動物を処理群に割り当てた日から、マウスで腹腔内注射によるＰＦ−０５２３０９０５、対照抗体（抗破傷風毒素抗体）、インフリキシマブ、又はビヒクル対照（１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、５％スクロースバッファー、ロット番号Ｃ−５１６８３、Ｄ−２０２１６）の投与を開始した。投与用量及び投与頻度は各実験のサブセクションに記載されている。各マウスの両後肢を規定の間隔で以下のように疾患の進行に関して評価した：
０  関節炎なし（正常な外観及び屈曲）。
０．５  関節炎の発症（軽度の関節腫脹）。
１  軽度の関節炎（関節の歪み）。
１．５  上記のような指の変形を伴い、屈曲に対する強度が弱い。
２  中度の関節炎（重度の腫脹、関節変形、屈曲に対する強度がない）。
２．５  上記のような肢の指の変形。
３  重度の関節炎（屈曲及び重度の運動障害で検出される関節強直）。
【０２２１】
それから各マウスに０〜３の平均スコアを割り当てた。疾患の進行をモニタリングするために、同様に関節炎を患っていたＴｇ１９７マウスの４匹の同腹子を処理開始点である６週齢で屠殺した。本研究の終了時に、全てのマウスを屠殺し、足関節の組織病理学的分析を行った。実験マウスのスコアを４匹の同腹子のスコアと比較した。組織病理スコアを、以下のように０〜４で顕微鏡によって盲検で評価した：
０  検出可能な病変なし
１  滑膜の過形成及び多形核浸潤の存在
２  パンヌス及び線維組織の形成、並びに局所的な軟骨下（正：subchondral）骨侵食
３  軟骨破壊及び骨侵食
４  広範な軟骨破壊及び骨侵食。
【０２２２】
実験１
実験１では、様々な用量のＳＤＡＢ−０１の有効性を関節リウマチの治療的なＴＮＦαトランスジェニックネズミモデルで評価した。マウスを関節炎の兆候に関して１週間に２回モニタリングした。１００％のマウスが疾患の兆候を示した場合、全ての動物を処理群に無作為に割り当てた。異型のＴｇ１９７マウスをそれぞれ８匹のマウスの群に分けた。１週間に２回のＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、インフリキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（ヒスチジン／スクロースバッファー、１０ｍＬ／ｋｇ）による処理を開始した。処理を７週間継続し、関節の形態の肉眼的変化（関節炎スコア）及び各動物の平均体重を週ごとに記録した。ＣＯ２を用いて安楽死させた後、血清を回収し、各動物の２つの後肢を組織学的評価のために処理した。
【０２２３】
実験１では、ＳＤＡＢ−０１の投与は、ビヒクル処理群と比較して体重減少の改善（図１４）及び疾患の進行の抑制（図１５）により極めて顕著な効果を示した。インフリキシマブは臨床スコアを安定させる上でＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）投与と同一であった。
【０２２４】
スコアリングの最終日に評価した疾患の重症度を図１６に示す。疾患症状が低減した動物の数は、ビヒクル又は対照抗体と比較してＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）及びインフリキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した群で最大であった。
【０２２５】
各マウスの２つの後肢のそれぞれに由来するヘマトキシリン及びエオシンで染色した一切片を盲検で顕微鏡によって評価した。確立された関節炎に対するＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）による処理は、疾患の増悪を抑え、組織病理学的スコアの退行を段階的にもたらすことによって有効性を示した。この処理の結果は、対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現したことからヒトＴＮＦαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった（図１７、図１８）。
【０２２６】
実験２
実験２では、１週間に２回、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１による処理の効果を反復し、１週間に２回、０．０３ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１、並びに１週間に２回、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブを含んでいた。ＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）の投与は体重減少を改善することにより顕著な効果を示した（図１９）。しかしながら、ビヒクル処理群と比較して１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量しか疾患の進行を抑えるのに成功しなかった（図２０）。ＳＤＡＢ−０１（０．３ｍｇ／ｋｇ）又はインフリキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）による処理によって、ビヒクル処理群又は対照抗体処理群のいずれかと比較して、臨床評価の中程度であるが有意ではない改善がもたらされた。
【０２２７】
スコアリングの最終日に評価した疾患の重症度を図２１に示す。疾患症状が低減した動物の数は、ビヒクル対照と比較してＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）及びインフリキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した群で最大であった。
【０２２８】
各マウスの２つの後肢のそれぞれに由来するヘマトキシリン及びエオシンで染色した一切片を盲検で顕微鏡によって評価した。ＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）による処理は、疾患の増悪を抑え、組織病理学的スコアの退行を段階的にもたらすことによって確立された関節炎に対する有効性を示した（図２２）。この処理の結果は、ヒト対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現したことからヒトＴＮＦαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった。ビヒクル処理群のスコアと対照抗体処理群のスコアとに有意な差がなかったことから、３つのより高い用量のＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）は、両方の対照群と比較しての組織病理スコアの有意な低減で明らかなように効果的であった（図２３）。したがって臨床的に顕微鏡によって評価された最小有効用量は、１ｍｇ／ｋｇのＳＤＡＢ−０１であった。
【０２２９】
３つのより高い用量のＳＤＡＢ−０１（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）による処理によって、組織病理スコアの改善がもたらされた。これらのスコアは、本研究の開始時に回収した対照同腹子のスコアよりも有意に小さかった。
【０２３０】
１ｍｇ／ｋｇのＭＥＤでは、定常状態（出血終了時（end-bleed））の血清ＳＤＡＢ−０１の実測濃度の平均は４．８１μｇ／ｍＬであり、これはＴｇ１９７マウスへの１ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ投与後のＳＤＡＢ−０１の薬物動態プロファイルに基づき予測された７．７０μｇ／ｍＬの定常状態（出血終了時）の血清濃度と比較して２倍差内にあった。定常状態（出血終了時）の血清ＳＤＡＢ−０１濃度の平均は、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量群でそれぞれ０．２１μｇ／ｍＬ、４２．１μｇ／ｍＬ及び１２０μｇ／ｍＬであった。０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇ用量群では、１匹を除いて全ての動物が０．０４９μｇ／ｍＬの定量限界未満の血清ＳＤＡＢ−０１濃度を有していた。
【０２３１】
実施例９．ピチア・パストリスで発現した二価ＳＤＡＢ分子のＰＥＧ化
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を中和画分に添加し、ＳＤＡＢ分子のカルボキシ末端のシステイン間で形成される潜在的なジスルフィド架橋を還元した。１０ｍＭの最終濃度のＤＴＴ及び４℃で一晩のインキュベーションが最適であることが見出された。還元を分析用のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により評価した。それから、２５ｍｌの還元型のＳＤＡＢ分子を７５ｍｌのダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）に添加し、Ｄ−ＰＢＳで平衡状態にしたＳｕｐ７５  １０／３００  ＧＬカラムに注入した。
【０２３２】
非還元型のＳＤＡＢ分子及びＤＴＴをＤ−ＰＢＳで平衡状態にしたＨｉｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５調製グレードのカラムでの分取ＳＥＣにより取り除いた。
【０２３３】
還元型のＳＤＡＢ分子の濃度を、２８０ｎｍで吸光度を測定することにより決定した。Ｕｖｉｋｏｎ  ９４３  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｂｅａｍ  ＵＳ／ＶＩＳ分光光度計を使用した。吸光度（absorption）を２４５ｎｍ〜３３０ｎｍの波長スキャンで測定した。Ｑｕａｒｔｚ  Ｓｕｐｒａｓｉｌでできた２つの精密セルを使用した。初めに、ブランクの吸光度を、９００μｌのＤ−ＰＢＳを充填した２つのセルを配置することにより２８０ｎｍで測定した。サンプルを１００μｌのサンプルを第１のセルに添加し、読み取る前にそれを混合することにより希釈した（１／１０）。サンプルの吸光度を２８０ｎｍで測定した。濃度は以下の式で算出した：
【０２３４】
ＳＤＡＢ分子をＰＥＧ化するために、５×モル過剰の新たに作製した１ｍＭのＰＥＧ４０溶液を還元型のＳＤＡＢ分子溶液に添加した。
【０２３５】
ＳＤＡＢ分子−ＰＥＧ混合物を穏やかにかき混ぜながら室温で１時間、インキュベートし、その後４℃に移行した。ＰＥＧ化を分析用ＳＥＣで評価した。その後、２５μｌのＳＤＡＢ分子を７５μｌのＤ−ＰＢＳに添加し、Ｄ−ＰＢＳで平衡状態にしたＳｕｐ７５ＨＲ  １０／３００カラムに注入した。ＰＥＧ化ＳＤＡＢ分子をカラムの排除体積範囲（７５ＫＤａ超）で溶出させた。
【０２３６】
ＰＥＧ化ＳＤＡＢ分子と非ＰＥＧ化ＳＤＡＢ分子とをカチオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ−バッファーＡは２５ｍＭのクエン酸であり、バッファーＢはＰＢＳ中の１ＭのＮａＣｌであった）で分離した。サンプルを希釈し、電気伝導率を５ｍＳ／ｃｍとし、ｐＨを４．０に調整した。カラムを平衡状態にし、サンプル適用後、バッファーＡで十分に洗浄した。ＰＥＧ化ＳＤＡＢ分子を３ＣＶ勾配で溶出した。
【０２３７】
回収したＳＤＡＢ分子では、Ｄ−ＰＢＳで平衡状態にしたＨｉｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅカラムでのＳＥＣによりＤ−ＰＢＳへとバッファーを交換した。続いてアニオン交換カラムを通すことによってＳＤＡＢ分子をＬＰＳフリーにした。このカラムを１ＭのＮａＯＨで洗い流し（sanitized）、その後内毒素フリーＤ−ＰＢＳで平衡状態にした。
【０２３８】
ビオチン化
ＳＤＡＢ分子をビオチン化するために、１０ｍＭのストック溶液の５×モル過剰のビオチンを還元型のＳＤＡＢ分子に添加した。ビオチンＳＤＡＢ分子混合物を穏やかにかき混ぜながら室温で１時間インキュベートし、それから４℃で保存した。
【０２３９】
ビオチン化ＳＤＡＢ分子の純度を分析用ＳＥＣにより制御した。続いて、２５μｌのビオチン化ＳＤＡＢ分子を７５μｌのＤ−ＰＢＳに添加し、Ｄ−ＰＢＳで平衡状態にしたＳｕｐ７５ＨＲ  １０／３００カラムに注入した。得られたクロマトグラムは、ＳＤＡＢ分子ビオチンが更に精製する必要がないことを示しており、遊離スルフヒドリルの酸化によるＳＤＡＢ分子の二量化は検出することができなかった。脱塩カラムであるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５微細カラムを通すことによりＤ−ＰＢＳへのバッファーの交換を行った。
【０２４０】
アニオン交換カラムを通すことによって、ＳＤＡＢ分子−ビオチンをＬＰＳフリーにした。カラムを１ＭのＮａＯＨで一晩洗い流し、それからＤ−ＰＢＳで平衡状態にした。
【０２４１】
実施例１０ａ．単回の静脈投与及び皮下投与後の雄のカニクイザルにおけるＳＤＡＢ−０１の薬物動態
第１の研究では、ＳＤＡＢ−０１は、３ｍｇ／ｋｇ（タンパク質含有量ベースで）で単回のＩＶボーラス注射又はＳＣボーラス注射によって、雄のカニクイザル（１群当たりｎ＝３：ＩＶではサルＳＡＮ１〜３、ＳＣではサルＳＡＮ４〜６）に投与した。ＰＫ分析のために血清サンプルを投与前（０時間）及び投与後０．０８３時間〜１５３６時間で、それぞれの動物から回収した。更なる血清サンプルを投与前（０時間）及び投与後３３６時間、６７２時間、１００８時間及び１５３６時間で採取し、抗ＳＤＡＢ−０１抗体の形成を評価した。血清ＳＤＡＢ−０１濃度を、限定（qualified）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定し、結果を用いて、ＳＤＡＢ−０１に関する薬物動態パラメータを決定した。抗ＳＤＡＢ−０１抗体の存在を、限定ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【０２４２】
ＩＶ投与又はＳＣ投与後の雄のカニクイザルにおけるＳＤＡＢ−０１の平均血清濃度−時間プロファイルを図２４に示す。サルにおけるＩＶ投与又はＳＣ投与後のＳＤＡＢ−０１の平均薬物動態パラメータを表５にまとめる。
【０２４３】
表５：３ｍｇ／ｋｇ（タンパク質含有量ベースで）の単回のＩＶ投与又はＳＣ投与後の雄のカニクイザル（１つの処理群当たりｎ＝３）におけるＳＤＡＢ−０１の平均（±ＳＤ）
薬物動態パラメータ
【表５】
2013536175.tif 000032
【０２４４】
ＳＤＡＢ−０１は３ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与後に注射部位から十分に吸収された。３匹の雄のカニクイザルにおける３ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与後、３１．７±２．７２μｇ／ｍＬの平均最大血清濃度（Ｃｍａｘ）が投与後７２時間で観察され、それによりＳＣ注射後のＳＤＡＢ−０１の吸収が緩やかなプロセスであることが示された。３匹のサルでの終末相半減期は１１０時間〜１３１時間の範囲であり、平均値は１２３時間（およそ５日間）であった。ＳＣ投与後に観察される相対的に短いｔ１／２は、抗ＳＤＡＢ−０１抗体の形成によるものであり得る。
【０２４５】
抗ＳＤＡＢ−０１抗体に関して陽性であるＳＣ処理群由来の２匹のサル。３匹のサルの平均ＡＵＣは８９５８μｇ・ｈｒ／ｍＬであった。サルにおけるＳＣ投与後のバイオアベイラビリティは、ＩＶ処理サル及びＳＣ処理サルの両方での抗ＳＤＡＢ−０１抗体の形成のために本研究からは正確に決定することができない。しかしながら、ＳＣ投与とＩＶ投与との間のＡＵＣ０〜∞比を用いることで推測値を得ることができ、この推測値はおよそ６９．３％であることが見出された。この値はサルでのＳＤＡＢ−０１のバイオアベイラビリティを低く推測する又は高く推測する場合があることから、使用には注意が必要である。
【０２４６】
まとめると、抗ＳＤＡＢ−０１抗体の形成は抗ＳＤＡＢ−０１を投与した動物の５０％（３／６）で検出された。抗ＳＤＡＢ−０１抗体の発生率は、３ｍｇ／ｋｇのＩＶ群の動物で３３．３％（１／３）であり、３ｍｇ／ｋｇのＳＣ群の動物で６６．７％（２／３）であった。抗体（２．１９〜２．５２のｌｏｇ力価）をサルＳＡＮ１（ＩＶ処理群）及びサル５（ＳＣ処理群）での投与後１００８時間及び１５３６時間で検出した。抗体（１．７１のｌｏｇ力価）をサルＳＡＮ４（ＳＣ処理群）での投与後１５３６時間で検出した。全ての投与前サンプルが陰性であることから、これらの動物はＳＤＡＢ−０１に対する免疫応答を有していると考えられた。循環レベルのＳＤＡＢ−０１は抗ＳＤＡＢ−０１抗体の検出を妨げる可能性があることに留意されたい。
【０２４７】
ＳＤＡＢ−０１の半減期は抗ＳＤＡＢ−０１抗体形成に関して陽性であったサルにおいてより短く、それにより抗ＳＤＡＢ−０１抗体の形成が、サルにおけるＳＤＡＢ−０１の薬物動態に対して影響を与えることが示唆された。
【０２４８】
第２の研究では、雄及び雌のカニクイザル（１群当たりｎ＝１２）に、単回の５ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量、１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量及び１００ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量のＳＤＡＢ−０１を投与し、血清濃度を、限定ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＳＤＡＢ−０１の５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後、平均ＡＵＣ０〜∞、ＣＬ及びｔ１／２値はそれぞれ、２４６００μｇ・ｈ／ｍＬ及び３９５０００μｇ・ｈ／ｍＬ、０．２１０ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ及び０．２６３ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、並びに１４９時間及び１４４時間であった。全身曝露（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０〜∞、及びＡＵＣ０〜１６８）は、用量が増大するにつれておよそ用量に比例して増大した。単回の１００ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与後、平均Ｔｍａｘ、ＡＵＣ０〜∞及びｔ１／２値はそれぞれ、１５０時間、３５２０００μｇ・ｈ／ｍＬ及び１６５時間であった。ＳＣ投与後のバイオアベイラビリティ（１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与及びＳＣ投与の後の平均ＡＵＣ０〜∞値を用いて推測した）は８９％であった。抗ＳＤＡＢ−０１抗体の発生率は、５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）用量群、１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）用量群、及び１００ｍｇ／ｋｇ（ＳＣ）用量群それぞれで動物１２匹中４匹（３３．３％）、動物１２匹中１匹（８．３％）、及び動物１２匹中１匹（８．３％）であった。
【０２４９】
実施例１０ｂ．ＳＤＡＢ−０１（ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子２×２０ＰＥＧ）、ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子４×１０ＰＥＧ、及びＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖１×４０ＰＥＧの血清薬物動態の比較
ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物、ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物、及びＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物の血清ＰＫプロファイルを２ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ（タンパク質含有量ベースで）の単回ＩＶ投与後のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウス、スプラーグドーリーラット、及びカニクイザルで検査した。血清濃度を特異的ＥＬＩＳＡ（マウス及びサル）又はガンマ線計測（ラット）のいずれかを用いて決定した。
【０２５０】
検査した３種全てで、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物は、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比較して有意に高い暴露量（ＡＵＣ）を有していた（ｐ＜０．０５）（図２５及び表６〜表８）。特に、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比べての分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物に関する平均用量で正規化したＡＵＣ０〜∞の相対的増大は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ約９４％、１０２％及び１３６％であった。したがって、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物の総身体クリアランス（ＣＬ）は、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比較してより低く、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧの排除半減期（ｔ１／２）は、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比較してより長いと考えられた。特に、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物に関する平均ＣＬ値の相対的低減は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ約４８％、５０％及び６６％であり、平均ｔ１／２値の相対的増大は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ４３％、２６％、５４％であった。
【０２５１】
ラット及びサルにおいて、分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物は、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比較してより高い平均血清ＡＵＣ０〜∞及びより低いＣＬも有していたが、マウスではそうではなかった（表６〜表８）。ラット及びサルでは、直鎖構築物と比べての分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物に関するＰＫパラメータの変化の程度は、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物に関するＰＫパラメータの変化の程度と比較してあまり顕著なものではなかった（ＡＵＣ０〜∞の４３％〜５１％の増大及びＣＬの３５％〜４５％の低減）。
【０２５２】
表６．Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスへの単回ＩＶ投与後のＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の薬物動態パラメータ。
【表６】
2013536175.tif 000033
【０２５３】
雄のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスに単回ＩＶボーラス用量の指定の試験物質を投与した。血清サンプルを１回の投与後５分〜１４日目で各マウス（１つの時点当たりｎ＝３）から採取し、血清濃度を特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＫパラメータを、スパースサンプリング法を用いた非コンパートメント分析により決定し、ＡＵＣｌａｓｔ／投与の値の統計分析を、ＡＮＯＶＡを用いてダネット事後検定により行った。直鎖１×４０  ＰＥＧ群を対照として用いた。
【０２５４】
アスタリスク（＊）は直鎖ＰＥＧ群と比べての統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
Ｃ５分＝ＩＶ投与後、最初のサンプリング時点である５分での濃度。
ＣＬ＝血清濃度ベースの総身体クリアランス。
Ｖｄｓｓ＝定常状態での分布体積。
ｔ１／２＝排除半減期。
ＡＵＣ０〜∞＝時間０〜無限大での濃度時間曲線下面積。
ＡＵＣｌａｓｔ＝時間０〜定量可能な濃度が見られるサンプリング時間での濃度時間曲線下面積。
【０２５５】
表７．スプラーグドーリーラットへの単回ＩＶ投与後の１２５Ｉで標識したＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ）
【表７】
2013536175.tif 000034
【０２５６】
雄のスプラーグドーリーラットに、単回ＩＶボーラス用量の指定の１２５Ｉで標識した試験物質を与え、血清サンプルを投与後５分〜２４日目で採取し、血清中の放射性当量（ＲＥ）濃度を、ガンマ線計測により決定した。ＰＫパラメータを、非コンパートメント分析によりそれぞれ個々の動物で算出した（２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物及び４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物ではｎ＝７及び１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物ではｎ＝５）。ＡＵＣ０〜∞、ＡＵＣ０〜∞／投与、ＣＬ、Ｖｄｓｓ及びｔ１／２の値の統計分析を、ＡＮＯＶＡを用いてダネット事後検定により行った。直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ群を対照として用いた。アスタリスク（＊）は直鎖ＰＥＧと比べての統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【０２５７】
表８．カニクイザルへの単回ＩＶ投与後のＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ）
【表８】
2013536175.tif 000035
【０２５８】
雄のカニクイザルに、単回ＩＶボーラス用量の指定の試験物質を投与し、血清サンプルを２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物、４×１０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物及び１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物でそれぞれ、５分〜６２日目、５７日目及び５６日目で採取し、血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＫパラメータを非コンパートメント分析によりそれぞれ個々の動物で算出した（１つの構築物当たりｎ＝３）。急激な濃度低下を伴うデータ点をＰＫ算出には使用しなかった（２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物を投与した３匹のサルの内の１匹）。ＡＵＣ０〜∞、ＡＵＣ０〜∞／投与、ＣＬ、Ｖｄｓｓ及びｔ１／２の値の統計分析を、ＡＮＯＶＡを用いてダネット事後検定により行った。直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ群を対照として用いた。アスタリスク（＊）は直鎖ＰＥＧ群と比べての統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【０２５９】
更なる研究をＳＤＡＢ−０１構築物のみで行った：
【０２６０】
初めに、マウス及びサルの血清サンプルを、２つの異なる免疫測定法フォーマットを用いて分析した：全分子対分子のタンパク質部分を測定する免疫測定法。タンパク質検出アッセイは、ビオチン化標的分子を利用することによりタンパク質部分を介してＰＥＧ化薬剤コンジュゲートを捕捉した。ポリクローナル抗薬剤抗体検出器は分子のタンパク質部分とも結合し、そのためアッセイは遊離タンパク質及びＰＥＧ化タンパク質を検出した。全分子検出アッセイはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイと同じ捕捉モードを使用したが、モノクローナルウサギ抗ＰＥＧ抗体を介してＰＥＧ部分によって検出が起こった。この検出抗体はＰＥＧ分子のメトキシ基に特異的である。このアッセイフォーマットはＰＫプロファイルにはほとんど影響を与えず、マウス及びサルの動物モデルでパラメータを算出した。
【０２６１】
第２に、ＳＤＡＢ−０１の薬物動態プロファイルを、マウスへの単回ＳＣ投与又はＩＰ投与後に検査した。雄のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスへの単回の２ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与又は３ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後、Ｔｍａｘは２４時間であり、ｔ１／２値はそれぞれ、５２．４時間（およそ２．２日）及び５７．７時間（およそ２．４日）であった。ＩＰ投与又はＳＣ投与後のバイオアベイラビリティはそれぞれ、６８．７％及び５６．６％であった。雄のＴｇ１９７マウスへの単回の０．３ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後、Ｔｍａｘ、ｔ１／２及びＡＵＣ０〜∞の値はそれぞれ、６時間、２４．６時間及び１６５μｇ・ｈ／ｍＬであった。１ｍｇ／ｋｇへのＩＰ用量の増大によって、暴露量がおよそ用量に比例して増大し（ＡＵＣ０〜∞＝５２８μｇ・ｈ／ｍＬ）、Ｔｍａｘ（６時間）及びｔ１／２（２１．４時間）の値は、０．３ｍｇ／ｋｇで観察されたものと同程度であった。
【０２６２】
実施例１０ｃ．ＳＤＡＢ−０１（ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子２×２０  ＰＥＧ）及びＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖１×４０  ＰＥＧの生体分布
ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物及びＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物の生体分布を、０．３ｍｇ／ｋｇ（タンパク質含有量ベースで）の１２５Ｉで標識した試験物質の単回ＩＶ投与後にＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスにおいて７日間（１６８時間）にわたって検査した。血清及び組織での放射性当量（ＲＥ）濃度を、ガンマ線計測を用いて決定し、血清及び組織での暴露量（ＡＵＣ０〜１６８ｈｒ）及び組織対血清（Ｔ／Ｓ）ＡＵＣ比を算出した。
【０２６３】
非放射性標識ＰＥＧコンジュゲートによるＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスでの先の研究の観察結果と同様に、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物は、直鎖１×４０ｋＤａ構築物と比較して約８０％高いＡＵＣ０〜１６８ｈｒを有していた（ｐ＜０．０５）（図２６）。分岐構築物は、試験した全てではないが幾つかの組織で有意に高い暴露量も有していた（図２６）。特に、直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物と比べての分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物に関するＡＵＣ０〜１６８ｈｒの増大は、心臓、肺、筋肉、皮膚及び胃でそれぞれ７２％、１１５％、４３％、５５％及び８０％であった。Ｔ／Ｓ  ＡＵＣ比（表９）及びＴ／Ｓ濃度比（データは示していない）は、これらの組織に関して２つの構築物間でおよそ同様のものであった。
【０２６４】
血清、心臓、肺、筋肉、皮膚及び胃に対して、脂肪、腎臓、肝臓及び脾臓のＡＵＣ０〜１６８ｈｒは２つの構築物で同程度であり、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ構築物でより低いＴ／Ｓ  ＡＵＣ比（表９）及びＴ／Ｓ濃度比（データは示していない）をもたらした。
【０２６５】
ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖１×４０  ＰＥＧ及びＳＤＡＢ−０１の両方で、投与後１週間（１６８時間）以内に総投与放射能のおよそ６０％が尿中に排出され、尿中に排出される放射能のほとんど（およそ７０％）が遊離ヨウ素に起因するものであった。
【０２６６】
表９．Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスへの単回の０．３ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後の１２５Ｉで標識したＰＥＧ化ＴＮＦαナノボディの組織対血清（Ｔ／Ｓ）ＡＵＣ比
【表９】
2013536175.tif 000036
【０２６７】
Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊマウスに、１２５Ｉで標識したＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧ（黒色のバー）又はＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の直鎖４０ｋＤａ  ＰＥＧ（灰色のバー）の単回の０．３ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス投与を行った。血清サンプル及び組織サンプル（１つの時点当たりｎ＝８〜１２）を７日間（１６８時間）にわたり回収し、組織及び血清での放射性当量（ＲＥ）濃度を、本明細書に記載のようにガンマ線計測によって決定した。血清のＡＵＣ０〜１６８ｈｒ（μｇ×当量／ｍＬ単位で）及び各組織のＡＵＣ０〜１６８ｈｒ（μｇ×当量／ｇ）を、スパースサンプリング法を用いた非コンパートメント分析により決定し、組織対血清（Ｔ／Ｓ）ＡＵＣ比（ＡＵＣ０〜１６８ｈｒ、組織／ＡＵＣ０〜１６８ｈｒ、血清）を算出した。
【０２６８】
実施例１１．ＳＤＡＢ分子及び対照分子の生物物理学的分析
３つのＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子４０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートの異なるＰＫプロファイルに対する潜在的原因を調べるために、更なる生物物理学的分析を実施した。
【０２６９】
ＣＥＸ−ＨＰＬＣを行い、３つの構築物の電荷不均一性をモニタリングした。代表的なクロマトグラフィプロファイルを図２７に示す。かなりの量の電荷不均一性が全てのＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子コンジュゲートで観察された。直鎖ＰＥＧコンジュゲートの主ピークは、２つの分岐コンジュゲート（２×２０ｋＤａ及び４×１０ｋＤａ）と比較した場合により遅い保持時間で溶出し、そのことにより直鎖コンジュゲートは分岐コンジュゲートと比較して表面上により多くの正電荷を有することが示唆された。２つの分岐コンジュゲート（２×２０ｋＤａ及び４×１０ｋＤａ）に関する主ピークの保持時間は同様のものであった。比較すると、非コンジュゲートタンパク質は、全ての試験したＰＥＧ化コンジュゲートよりもかなり遅く溶出し、そのことにより非コンジュゲートタンパク質が更に大きい正の表面電荷密度を有することが示された。非コンジュゲートタンパク質の理論等電点は９を超え、そのためこのタンパク質はｐＨ４．０であるＣＥＸ泳動バッファー中で正味の正電荷を有すると予測される。
【０２７０】
サイズ分布及び質量分布を、ＵＶ吸光度によってモニタリングされる多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、示差屈折率（ｄＲＩ）、及びオンラインの準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によるＳＥ−ＨＰＬＣを用いて決定した。ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子−ＰＥＧコンジュゲートでのＰＥＧが２８０ｎｍで吸収しないことから、ＵＶ検出及びｄＲＩ検出によるＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて、コンジュゲートにおけるタンパク質及びＰＥＧの分布を決定することが可能である。算出したタンパク質及びＰＥＧの質量分布は３つ全てのコンジュゲートで互いに一致していた（表１０及び図２８）。
【０２７１】
分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳで、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲート及び直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートよりも著しく遅い溶出体積を有しており、そのことにより分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートが他の２つのコンジュゲートと比較して流体力学的により小さいことが示された（図２９）。４×１０ｋＤａ分岐ＰＥＧコンジュゲートのより小さい流体力学半径（Ｒｈ、測定されるサンプルと同じ拡散係数を有する球体の半径として定義される）はＱＥＬＳ測定によって確認された（表１０）。
【０２７２】
ＭＡＬＳによって測定される散乱光の角度依存性を用いて、二乗平均平方根（ＲＭＳ）半径の分布を決定することができる。ＲＭＳ半径（旋回の半径、Ｒｇとも称される）は、任意の所与の時点での分子の全ての部分のその質量の中心からの二乗平均平方根距離の測定結果であり、分子が専有する平均体積についての情報を与える。分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲート及び分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートの両方が、直鎖ＰＥＧコンジュゲートよりも小さいＲｇ（ＲＭＳ半径）を有していた（表１０及び図２９）。
【０２７３】
最後に、立体配座情報を、ＲＭＳ／Ｒｈ（Ｒｇ／Ｒｈ）比を算出することにより得ることができる：比の値が大きければ、分子がより伸長する又は拡張する。ＲＭＳ／Ｒｈ比は直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲート、分岐２×２０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲート及び分岐４×１０ｋＤａ  ＰＥＧコンジュゲートでそれぞれ、１．７７、１．４５及び１．３７であり、それにより直鎖１×４０ｋＤａ  ＰＥＧを有するコンジュゲートは、分岐ＰＥＧを含有するより小型のコンジュゲートよりも拡張した立体配座を有することが示された（表１０）。ＰＥＧ化コンジュゲートを分析するのに用いたＳＥ−ＨＰＬＣ法は、非コンジュゲートタンパク質の比較（side-by-side）分析には好適ではないことに留意されたい。
【０２７４】
表１０．ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析によるＰＥＧ化ＴＮＦα  ＳＤＡＢ分子の算出された重量
【表１０】
2013536175.tif 000037
【０２７５】
全てのサンプルを２．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬの各サンプルを３０℃に保持したＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラム（０．５ｍＬ／分で４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２））に注入した。モル質量、Ｒｈ及びＲＭＳを、Wyatt TechnologiesのＡＳＴＲＡ  Ｖ  ｖ５．３．４．１４を用いて決定した。
【０２７６】
３つ全てのＳＤＡＢ  ＰＥＧコンジュゲート及び非ＰＥＧ化タンパク質は、細胞ベースのバイオアッセイ（Ｕ９３７細胞でのＴＮＦα誘導性のアポトーシスをベースとする）においてＰＥＧ化参照材料と比べて９２％以上の生体活性を有し、それによりＰＥＧ化がタンパク質の活性を変えなかったことが示唆された。
【０２７７】
表１１．タンパク質配列
【表１１】
2013536175.tif 000038
【０２７８】
表１２．ｃＤＮＡ配列
【表１２】
2013536175.tif 000039
【０２７９】
均等物
本明細書で引用される参考文献は全て、それぞれ個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的で引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとなるように具体的にかつ個々に示されていた場合と同じ程度に、あらゆる目的で引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【０２８０】
本発明は本明細書に記載の特定の実施形態によっては範囲が限定されないものとする。実際、本明細書に記載のもの以外の本発明で特徴付けられる様々な変更が、上述の記載及び添付の図面から当業者にとって明らかとなるであろう。かかる変更は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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