(57)【要約】  少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水量流動率で、少なくとも１つの生物有機体を含む試料にフィルタ膜を通過させる工程を含む、液体試料を濾過する方法であって、フィルタ膜が、１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を含み、少なくとも１つの生物有機体が、膜の表面上に保持される、方法。本方法は、フィルタ膜の表面上に保持される、少なくとも１つの生物有機体を検出する工程を更に含む。【選択図】図１Ｂ
2013531236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水量流動率で、少なくとも１つの生物有機体を含む試料にフィルタ膜を通過させる工程であって、前記フィルタ膜は、１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を備え、それによって、前記膜の表面上に少なくとも１つの生物有機体を保持する、工程と、
前記フィルタ膜の表面上に保持される、前記少なくとも１つの生物有機体を検出する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記水量流動率が、少なくとも３００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（４３．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水量流動率が、少なくとも１０００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４４．９Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水量流動率が、少なくとも３０００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（４３４．８Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バブルポイント孔径が、０．８μｍを超えない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バブルポイント孔径が、０．２μｍを超えない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の少なくとも３０％の前記生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上に保持される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の少なくとも７０％の前記生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上に保持される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料中の少なくとも９０％の前記生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上に保持される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中の少なくとも９９％の前記生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上に保持される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中の少なくとも９９．５％の前記生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上に保持される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記フィルタ膜の表面上の原位置で検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルタ膜の表面上に保持される前記少なくとも１つの生物有機体を検出する工程が、検出アッセイを実施する前に、前記保持された生物有機体を前記膜の表面から溶出する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも５０％の前記保持された生物有機体が、前記フィルタ膜の表面から溶出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも９０％の前記保持された生物有機体が、前記フィルタ膜の表面から溶出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの生物有機体を検出する工程が、次の
前記生物有機体を、前記生物有機体に特異的に結合する抗体組成物と接触させる工程、
前記生物有機体の酵素活性を検出する工程、
前記生物有機体の生物分析物を検出する工程、
前記生物有機体によって生成される生物分析物を検出した後、前記生物有機体から核酸の一部を検出する工程、
前記生物有機体からの核酸分子の少なくとも一部を増幅する工程、
前記生物有機体のヌクレオチド配列を検出する工程のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィルタ膜が、ポリオレフィン多孔質膜、エチレン−クロロトリフルオロエチレンコポリマー多孔質膜、ポリアクリロニトリル多孔質膜、ポリカーボネート多孔質膜、ポリエステル多孔質膜、セルロースエステル多孔質膜、ポリアミド多孔質膜、ポリエーテルスルホン多孔質膜、ポリスルホン多孔質膜、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）多孔質膜、ポリアクリロニトリルナノファイバ膜、ＰＶＤＦナノファイバ膜、セルロースエステルナノファイバ膜、ポリ酢酸ビニル若しくはアルコールナノファイバ膜、又はポリビニルブチラールナノファイバ膜を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィルタ膜が、ＴＩＰＳ膜又はナノファイバ膜を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１００ｍＬの前記試料が、前記フィルタ膜を通過する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１リットルの前記試料が、前記フィルタ膜を通過する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１０リットルの前記試料が、前記フィルタ膜を通過する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記フィルタ膜の表面から回収される前記生物有機体を定量化するために、アッセイを実施する工程を更に含む、請求項１〜１１及び１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、環境試料を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、水試料を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、２４時間以内に検出される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、１２時間以内に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、３時間以内に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、２時間以内に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、１時間以内に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの生物有機体が、前記試料が前記フィルタ膜を通過した後、３０分以内に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
デバイスであって、
膜を備えるフィルタホルダと、
既知量の試料を流すように、前記フィルタホルダに取り付けられるフロート弁と、を備える、デバイスを提供する工程を更に含み、
少なくとも１つの生物有機体を含む試料にフィルタ膜を通過させる工程が、
前記フィルタホルダを試料源に取り付ける工程と、
既知量の試料が前記フィルタ膜を通って流れることを可能にする工程と、を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
デバイスであって、
膜を備えるフィルタホルダと、
既知量の試料を流すために、前記フィルタホルダに取り付けられる流量計と、を備える、デバイスを提供する工程を更に含み、
少なくとも１つの生物有機体を含む試料にフィルタ膜を通過させる工程が、
前記フィルタホルダを試料源に取り付ける工程と、
既知量の試料が前記フィルタ膜を通って流れることを可能にする工程と、を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年３月９日に作成された、ファイル名「６６３１０ＷＯ００３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１，７５２バイト）に列挙される配列に関連し、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年６月７日に出願された米国特許仮出願第６１／３５２，２２９号（代理人整理番号６６３１０ＵＳ００２）の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
膜濾過は、生物有機体の存在について液体試料を分析する、多くの方法における標準的な工程である。そのような分析は、一般に、例えば、食品の安全性、水質、並びに／又は環境監視及び／若しくは研究の利益のために実施される。０．４５μｍ以下の平均孔径を有する多くの膜（例えば、酢酸セルロース、ナイロン等の膜）は、細菌を捕捉し、適切な培地に設置されると、捕捉された細菌の成長を可能にすることができる。しかしながら、そのような膜から細菌を回収することは困難であり得る。これらの膜は、０．４５μｍ以下の平均孔径を有するにも関わらず、典型的に、膜表面に生物有機体より大きい十分な数の細孔を保有し、したがって、生物有機体が捕捉され得る蛇行状の細孔構造を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、液体試料を濾過する工程を伴う方法を提供する。一般に、本方法は、少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水量流動率で、少なくとも１つの生物有機体を含む試料にフィルタ膜を通過させる工程であって、フィルタ膜は、１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を備え、それによって、膜の表面上に少なくとも１つの生物有機体を保持する、工程と、フィルタ膜の表面上に保持される、少なくとも１つの生物有機体を検出する工程と、を含む。
【０００５】
特定の実施形態では、試料にフィルタ膜を通過させる工程は、膜を通して液体試料を引き込むために、真空等の機械力を提供する工程を含む。
【０００６】
特定の実施形態では、生物有機体は、フィルタ膜上の原位置で検出され得、一方、他の実施形態では、生物有機体は、検出される前にフィルタ膜から除去され得る。よって、一部の実施形態では、方法は、フィルタ膜から保持された生物有機体を溶出する工程を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、方法は、生物有機体の少なくとも１つを定量化する工程を更に含むことができる。
【０００８】
一部の実施形態では、液体試料は、例えば、水試料、環境試料、又は食品試料を含むことができる。
【０００９】
一部の実施形態では、方法は、試料がフィルタ膜を通過した後、２４時間以内に生物有機体を検出及び／又は定量化する工程を含むことができる。
【００１０】
上記の「本発明の概要」は、本発明が開示する各実施形態又はあらゆる実施例を説明することを意図したものではない。以下の説明は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合せにおいて使用できる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】Ｒ１９３３−１８（発生期、０．２３μｍ）膜のＳＥＭ画像。開放側（５０００ｘ）。
【図１Ｂ】Ｒ１９３３−１８（発生期、０．２３μｍ）膜のＳＥＭ画像。密接側（５０００ｘ）。
【図１Ｃ】Ｒ１９３３−１８（発生期、０．２３μｍ）膜のＳＥＭ画像。断面（５００ｘ）。
【図２Ａ】Ｒ１９３３−７（発生期、０．３４μｍ）膜のＳＥＭ画像。開放側（５０００ｘ）。
【図２Ｂ】Ｒ１９３３−７（発生期、０．３４μｍ）膜のＳＥＭ画像。密接側（５０００ｘ）。
【図２Ｃ】Ｒ１９３３−７（発生期、０．３４μｍ）膜のＳＥＭ画像。断面（５００ｘ）。
【図３Ａ】Ｒ１９３３−８Ｂ（発生期、０．５１μｍ）膜のＳＥＭ画像。開放側（５０００ｘ）。
【図３Ｂ】Ｒ１９３３−８Ｂ（発生期、０．５１μｍ）膜のＳＥＭ画像。密接側（５０００ｘ）。
【図３Ｃ】Ｒ１９３３−８Ｂ（発生期、０．５１μｍ）膜のＳＥＭ画像。断面（５００ｘ）。
【図４Ａ】Ｒ１９０１−１１（発生期、０．７４μｍ）膜のＳＥＭ画像。開放側（５０００ｘ）。
【図４Ｂ】Ｒ１９０１−１１（発生期、０．７４μｍ）膜のＳＥＭ画像。密接側（５０００ｘ）。
【図４Ｃ】Ｒ１９０１−１１（発生期、０．７４μｍ）膜のＳＥＭ画像。断面（５００ｘ）。
【図５Ａ】ＰＡＮ膜のＳＥＭ画像（１０，０００ｘ）。ＰＡＮ−１（０．６１３μｍ）。
【図５Ｂ】ＰＡＮ膜のＳＥＭ画像（１０，０００ｘ）。ＰＡＮ−２（０．５３１μｍ）。
【図５Ｃ】ＰＡＮ膜のＳＥＭ画像（１０，０００ｘ）。ＰＡＮ−３（０．３６７μｍ）。
【図６Ａ】ＭＦ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｔｙｐｅ  ＨＡＷＰ（０．４μｍ）のＳＥＭ画像（１０，０００ｘ）。膜画像は、試料を受容する側のもの。
【図６Ｂ】Ｉｓｏｐｏｒｅポリカーボネートフィルタ（０．４μｍ）のＳＥＭ画像（１０，０００ｘ）。膜画像は、試料を受容する側のもの。
【図７】管修復における稼働状態への同日復帰の代表的な方法を示す図。
【図８】環境試料の細菌試験の代表的な方法を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
我々は、本明細書において、液体試料が１つ以上の生物有機体の存在について分析され得る方法を説明する。本方法が実践される具体的な内容により、本方法は、比較的高い水量流動率を提供しながらも、液体試料に１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を有する膜を通過させる工程を伴うことができる。
【００１３】
任意に、本方法は、比較的高い割合の試料の生物有機体が、膜の細孔に埋め込まれるよりもむしろ膜の表面上に保持される工程を更に提供することができる。よって、一部の実施形態では、本方法は、膜の表面上に保持される比較的高い割合の試料の生物有機体が、膜表面から容易に回収され得る工程を更に提供する。
【００１４】
以下の用語は、示される意味を有するものとする。
【００１５】
「能動的」とは、機械化力（例えば真空）がフィルタ膜を通る液体試料の移動を推進する濾過方法を指す。
【００１６】
「生物学的分析物」とは、有機体に生じる、又はそれによって形成される分子若しくはその誘導体を指す。例えば、生物学的分析物としては、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖類、多糖類のうちの少なくとも１つ、又はその２つ以上のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的分析物の代表的な例としては、代謝産物（例えばブドウ球菌エンテロトキシン）、アレルゲン（例えばピーナッツアレルゲン）、ホルモン、毒素（例えばバチルス属下痢毒素、アフラトキシン等）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡ等）、タグ付きタンパク質、抗体、抗原、又はその２つ以上のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
「バブルポイント孔径」とは、算出された膜の平均孔径を指す。バブルポイント孔径は、液体が表面張力及び毛管力によってフィルタの細孔に維持される事実に基づく。表面張力を上回り、液体を細孔の外に押し出すために必要な最小圧力は、細孔直径の寸法である。バブルポイント孔径を算出するための式は、
【数１】
2013531236.tif 000003
であり、式中、
Ｐ＝バブルポイント圧力、
σ＝液体の表面張力（水において７２ダイン／ｃｍ）、
θ＝液体−固体接触角度（水は一般的にゼロと想定される）、及び
Ｄ＝細孔の直径である。
【００１８】
「溶出」及びその変形は、例えば、重力、手動振盪、又は渦動等の低緊縮度の物理的方法を使用して、生物有機体をフィルタ膜から除去する工程を指す。
【００１９】
「閉じ込められた」とは、例えば、生物有機体が膜内の空間に捕獲されるため、フィルタ膜から容易に溶出しないフィルタ膜によって捕獲された生物有機体を指す。
【００２０】
「受動的」とは、機械化力（例えば、真空）がフィルタ膜を通る液体試料の移動を推進しない濾過を指す。受動的濾過法は、例えば、液体のフィルタ膜を通しての移動を推進するために、重力及び／又は吸収剤による液体の吸収を使用した濾過を含む。
【００２１】
「回収される」とは、検出及び／又は更なる分析のための条件下において、フィルタ膜から溶出される生物有機体を指す。
【００２２】
「保持される」及びその変形は、濾過後にフィルタ膜表面に配置され、フィルタ膜から容易に溶出される生物有機体を指す。
【００２３】
「水量流動率」とは、圧力単位当りの単位時間につき膜の単位領域を通過する液体の体積を指す。特に記載のない限り、本明細書において、水量流動率は、平方インチの圧力（キロパスカル）当り１ポンドにつき１時間当り１平方メートルの膜を通過する液体試料がリットルで表される（Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ））。
【００２４】
用語「及び／又は」は、１つ若しくは全ての列挙した要素、又は２つ以上の列挙した要素のいずれかの組み合わせを意味する。
【００２５】
「含む」なる用語及びその変化形は、これらの用語が説明文及び「特許請求の範囲」において用いられている場合に限定的な意味を有するものではない。
【００２６】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」は、同じ意味で使用され、「１つ以上」を意味する。
【００２７】
また、本明細書における端点による数の範囲の記載には、その範囲に含まれる全ての数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などが含まれる）。
【００２８】
多くの市販の膜が、液体試料から生物有機体を濾別及び除去するために使用される。膜濾過の分野は周知である。しかしながら、既存の市販の膜は、典型的に、蛇行状の通路を有し、表面に大量の大きい細孔を保有する。捕獲された生物有機体がフィルタ膜の細孔に留まる可能性があり、したがって、捕獲された生物有機体を分析できるようにフィルタから無傷で除去することが困難なため、この特色は、濾別した生物有機体の回収を困難にする。
【００２９】
よって、我々は、２つの競合するパラメータのそれぞれが満たされるようにフィルタ膜を使用して液体試料が濾過され得る方法を説明する。第１に、本方法は、保持された生物有機体が更なる分析のために膜から容易に溶出されるように、フィルタ膜の表面上に生物有機体を保持する工程を伴う。しかしながら、高い割合の生物有機体を捕獲するように設計された既存の方法は、非常に小さい平均孔径を有する膜を使用することによってそれを行う。これは、必ずしも水流動量を制限しないが、その結果として、液体試料の所与の量が処理され得る速度を制限する。したがって、本明細書に記載される方法は、濾過方法において現在観察されるより大きい水流動量を更に提供する。
【００３０】
一部の場合において、方法は、例えば、環境試験、水質試験、水処理試験、並びに／又は修理及び／若しくは復旧した水道施設管の試験に要求され得る等の、大量の液体試料（例えば、数リットル）の濾過を伴うことができる。例えば、修理及び／又は復旧した水道配管の水質を試験するために現在の方法を使用すると、水質が給水を復旧するのに十分であると確認するのに２〜３日かかる。しかしながら、本明細書に記載される方法を使用することにより、給水を２４時間以内に復旧させられるほど十分に迅速に水質を確認することが可能であり得る。
【００３１】
他の場合において、本方法は、強化食品試料、食品加工水試料、及び／又は飲料水試料の濾過を伴うことができる。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、少なくとも２つの方式で、そのような試験に必要とされる時間を短縮することができる。第１に、本方法は、大量の液体試料の濾過及び分析が可能である。第２に、本方法は、それらが溶出により容易に回収されるように、相当な割合の捕獲された生物有機体のフィルタ膜の表面上への保持をもたらす。
【００３３】
他の用途において、本方法は、少量の液体試料（例えば、１リットル未満）の比較的迅速な濾過を伴うことができる。これらの用途においても、比較的高い水流動量と容易な回収のためのフィルタ膜上の生物有機体の保持の組み合わせは、より迅速かつ／又は単純な液体試料の濾過を促進する。これらの用途の一部において、生物有機体は、フィルタ膜から保持された生物有機体を取り除くために、単純な重力を使用して回収され得る。他の用途において、液体試料は、大幅に濃縮される、すなわち、全液体量未満のある程度の量が、フィルタ膜を通過することができる。大きな割合の生物有機体がフィルタ膜内に閉じ込められるよりむしろフィルタ膜上に保持されるため、元の試料中の生物有機体のより大きい割合が、残りの液体量中で回収され得、それによって、更なる識別及び／又は他の分析のために生物有機体を濃縮する。
【００３４】
一般に、本方法は、少なくとも１つの生物有機体を含む液体試料に１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を有するフィルタ膜を通過させ、それによって、少なくとも１つの生物有機体を膜の表面上に保持する工程を含む。本方法は、受動的濾過において、少なくとも１０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１．４Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水量流動率で、又は能動的濾過において、少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水量流動率で試料にフィルタ膜を通過させる工程を含む。本方法は、フィルタ膜の表面上に保持される、少なくとも１つの生物有機体を検出する工程を更に含む。
【００３５】
液体試料は、あらゆる適切な供給源から得ることができ、水試料を含むことができる。代表的な水試料としては、環境試料（湖、河川、蒸気、海、池等）、水道施設／水処理試料（例えば、水供給管、水処理施設、水処理排出、下水等）、飲料水試料（例えば、ボトル詰めされた水、井戸水）、又は食品試料（例えば、液体食品、例えば均質化等によって加工された食品試料等）が挙げられる。試料は、収集時に濾過され得るか、又は濾過及び更なる分析の前にある程度処理され得る。
【００３６】
生物有機体は、液体試料の検出及び／又は定量化が所望され得る、あらゆる原核生物又は真核生物有機体であり得る。したがって、生物有機体は、例えば、寄生虫、又は例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母）、藻類、若しくは細菌等の微生物を含むことができる。代表的な微生物は、例えば、大腸菌微生物を含む。代表的な細菌種は、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属（例えば、Ｅ．エロゲネス）、エンテロコッカス属（例えば、フェカリス菌）、シトロバクター属（例えば、Ｃ．フロインディー（freundii））、クレブシエラ属、シゲラ属、サルモネラ属（例えば、サルモネラ菌（S.enterica））、リステリア属、シュードモナス属等を含む。
【００３７】
本方法は、１．０μｍを超えるバブルポイント孔径を有するフィルタ膜を使用して実施され得るが、フィルタ膜は、１．０μｍを超えないバブルポイント孔径を保有することができる。代表的なフィルタ膜は、例えば、０．９５μｍを超えない、０．９μｍを超えない、０．８５μｍを超えない、０．８μｍを超えない、０．７５μｍを超えない、０．７μｍを超えない、０．６μｍを超えない、０．５μｍを超えないバブルポイント孔径を有することができる。適切なバブルポイント孔径は、少なくともある程度は、例えば、検出が所望される生物有機体のサイズ、濾過される試料の体積、及びフィルタ膜の細孔の深度により決定され得る。多重ゾーン膜に関して、バブルポイント孔径は、生物有機体を保持するように位置付けられたゾーンについて測定される。
【００３８】
代表的なフィルタ膜は、例えば、ＴＩＰＳ（熱的に誘発された相分離）プロセス、ＳＩＰＳ（溶媒誘発された相分離）プロセス、ＶＩＰＳ（気体誘発された相分離）プロセス、伸展プロセス、飛跡エッチング、又は電界紡糸（例えば、ＰＡＮ繊維膜）により作製され得る。適切な膜材料は、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン及び／又はポリプロピレン）、エチレン−クロロトリフルオロエチレンコポリマー、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、セルロースエステル、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
適切な膜は、多孔質膜又はナノファイバ膜として特徴付けされ得る。ナノファイバフィルタ膜は、例えば、１μｍ未満等の、５μｍ未満の繊維直径を有することができる。ナノファイバ膜は、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリフッ化ビニリデン、セルロースエステル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、及び／又はそれらの組み合わせから調製され得る。
【００４０】
特定のＴＩＰＳポリオレフィン膜は、それらが、各ゾーンが異なる細孔微細構造を有する、単一の均質化ゾーンの膜構造を保有するように調製され得る。他の場合において、ＴＩＰＳ膜は、各ゾーンが異なる細孔微細構造を有する、２つ以上のゾーンを含む多重ゾーン膜として調製され得る。多重ゾーンＴＩＰＳ膜は、別々のゾーンを含有することができるか、又は代替的に、２つの他の別々のゾーンの間に移行ゾーンを保有することができる。
【００４１】
代表的なフィルタ膜は、膜を含み、代表的なフィルタ膜を作製するための方法は、例えば、米国特許第４，５３９，２５６号、米国特許第４，７２６，９８９号、米国特許第４，８６７，８８１号、米国特許第５，１２０，５９４号、米国特許第５，２６０，３６０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５６５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７８０７号、２０１０年６月４日に出願された、「Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」という表題の米国仮特許出願第６１／３５１，４４１号、及び２０１０年６月４日に出願された、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」という表題の米国仮特許出願第６１／３５１，４４７号に記載されている。
【００４２】
一部の場合において、本方法は、１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）未満の水流動量で実施され得るが、能動的濾過は、少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水流動量を提供することができる。能動的濾過を使用する代表的な水流動量値は、例えば、少なくとも２５０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（３６．２Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも５００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（７２．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも７５０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１０８．７Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも１０００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４４．９Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも１２５０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１８１．２Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも１５００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（２１７．４Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも１７５０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（２５３．６Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも２０００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（２８９．９Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも２５００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（３６２．３Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、又は少なくとも３０００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（４３４．８Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）を含む。最大水流動速度は、少なくともある程度は、フィルタ膜を通る液体試料の移動を推進するために使用される機械化力の最大能力、フィルタ膜の強度及び／又は耐久性、並びにフィルタ膜のバブルポイント孔径によって決定され得る。
【００４３】
一部の場合において、本発明は、１０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１．４Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）未満の水流動量で実施され得るが、受動的濾過は、少なくとも１０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１．４Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）の水流動量を提供することができる。能動的濾過を使用する代表的な水流動量値は、例えば、少なくとも１０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１．４Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも２０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（２．９Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも２５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（３．６Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも３２Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（４．６Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも５０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（７．２Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも６０Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（８．７Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも７５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１０．９Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも８８Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１２．８Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、少なくとも９５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１３．８Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）、又は少なくとも１００Ｌ／ｍ２．ｈ．ｐｓｉ（１４．５Ｌ／ｍ２．ｈ．ｋＰａ）を含む。最大受動的水流動速度は、少なくともある程度は、フィルタ膜のバブルポイント孔径、及び／又はフィルタ膜を通して液体試料の少なくとも一部を引き込むことができるように、例えばフィルタ膜と流通連体に位置付けられる吸収材料によって生成される流動勾配によって決定され得る。
【００４４】
一部の実施形態では、本方法は、試料中の３０％を下回る生物有機体がフィルタ膜によって保持されるように実践され得るが、本方法は、フィルタ膜によって試料中の少なくとも３０％の生物有機体の保持をもたらす。代表的な方法において、試料中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の生物有機体がフィルタ膜によって保持される。
【００４５】
本方法は、フィルタ膜によって保持される少なくとも１つの生物有機体を検出する工程を更に含む。これに関して、フィルタ膜によって保持される生物有機体は、フィルタ膜と接触する生物有機体並びにフィルタ膜から結果として回収される生物有機体を含む。生物有機体は、あらゆる適切な方法によってフィルタ膜から回収され得る。本明細書に記載される方法を実践することによってフィルタ膜上に保持される生物有機体の特色の１つは、保持された生物有機体が、例えば、重力、手動振盪、及び／又は渦動等の比較的低緊縮度の物理的方法を使用して、フィルタ膜から除去され得ることである。
【００４６】
よって、一部の実施形態では、保持された生物有機体は、フィルタ膜と接触している間でも、原位置で検出され得る。しかしながら、他の実施形態では、保持された生物有機体は、フィルタ膜から除去され得、そのように回収された生物有機体が検出され得る。原位置で、又はフィルタ膜から回収された後に検出されるかどうかに関わらず、生物有機体は、微生物検出の分野の者にとってなじみのあるものを含む、あらゆる適切な方法を使用して検出され得る。適切な原位置検出法は、例えば、抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）の生物有機体特異的結合の検出を含む。他の検出法は、例えば、生物有機体によって生成された生物学的分析物の存在の検出を含むことができる。代表的な検出法は、増幅（例えばＰＣＲにより）生物有機体特異的ヌクレオチド配列の検出、ヌクレオチド配列決定、酵素アッセイ（例えば、デヒドロゲナーゼ、グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ等の検出）、生物発光アッセイ（例えば、ＡＴＰ／ＡＤＰ／ＡＭＰの検出）、タンパク質／ペプチドの検出、分光法、及び／又は蛍光（例えば、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ、自己蛍光の検出）等を含むが、これらに限定されない。フィルタ膜から回収された生物有機体の適切な検出法は、生物有機体の原位置検出に適切な方法を含み、培養物における成長の検出を更に含む。
【００４７】
一部の場合において、本方法は、フィルタ膜によって保持される生物有機体の定量化を更に含むことができる。これに関しても、フィルタ膜によって保持される生物有機体は、フィルタ膜と接触する生物有機体並びにフィルタ膜から結果として回収される生物有機体を含む。
【００４８】
よって、一部の実施形態では、保持された生物有機体は、フィルタ膜と接触している間でも、原位置で定量化され得る。しかしながら、他の実施形態では、保持された生物有機体は、フィルタ膜から除去され得、そのように回収された生物有機体が定量化され得る。原位置で、又はフィルタ膜から回収された後に定量化されるかどうかに関わらず、生物有機体は、例えば、コロニー形成単位（ｃｆｕ）検出、最確数（ＭＰＮ）分析、ＡＴＰ生物発光、酵素アッセイ、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ等の、微生物検出の分野の者にとってなじみのあるものを含む、あらゆる適切な方法を使用して定量化され得る。
【００４９】
生物有機体がフィルタ膜から回収された後に検出及び／又は定量化される実施形態では、方法は、保持された生物有機体の５０％未満をフィルタ膜から溶出した後に実施され得るが、方法は、保持された生物有機体の少なくとも５０％をフィルタ膜から溶出する工程を含む。代表的な方法において、保持された生物有機体の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％がフィルタ膜から溶出される。
【００５０】
一部の場合において、保持された生物有機体は、重力により保持された生物有機体を取り除き、それによってフィルタ膜から溶出するようにフィルタ膜を再位置付けすることによって溶出される。他の場合において、保持された生物有機体は、フィルタ膜を手動で振盪して保持された生物有機体をフィルタ膜から取り除くことにより、フィルタ膜から溶出され得る。他の場合において、保持された生物有機体は、フィルタ膜を渦動させ、保持された生物有機体をフィルタ膜から取り除くことにより溶出され得る。他の場合において、生物有機体は、以下の実施例１２に記載される気泡溶出によって、フィルタ膜から溶出され得る。
【００５１】
特定の既存の方法は、生物有機体（例えば、細菌）の最大約３０％の回収を提供し、したがって、本明細書に記載される方法を使用して観察されるものと同程度の回収を提供するものではない。
【００５２】
いかなる特定の理論により拘束されることを望まないが、特定の既存の方法は、フィルタ膜が微生物のサイズより小さい細孔等級を有する時でも、微細孔フィルタ膜は、膜の表面に大量の大きい細孔を保有するため、生物有機体の十分な回収を提供するものではない場合がある。大きい細孔は、試料体積を減少させる一方で、生物有機体を保持するよりむしろ生物有機体を閉じ込めると考えられる。
【００５３】
一部の実施形態では、本方法は、より少ない体積の流体にフィルタ膜を通過させることにより実践され得るが、本方法は、少なくとも１リットルの流体にフィルタ膜を通過させる工程を含むことができる。よって、例えば、特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１リットル、少なくとも２リットル、少なくとも５リットル、少なくとも１０リットル、少なくとも１５リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも５０リットル、又は少なくとも１００リットルの流体にフィルタ膜を通過させる工程を含むことができる。
【００５４】
一部の実施形態では、本方法は、試料がフィルタ膜を通過した後２４時間を超えても、試料中の少なくとも１つの生物有機体の検出及び／又は定量化を可能であるように実践され得るが、本方法は、試料がフィルタ膜を通過した後２４時間以内に、試料から少なくとも１つの生物有機体を検出及び／又は定量化する工程を伴う。代表的な実施形態では、少なくとも１つの生物有機体は、試料がフィルタ膜を通過した後２２時間以内、２０時間以内、１８時間以内、１５時間以内、１２時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、若しくは３０分以内に検出及び／又は定量化され得る。
【００５５】
一実施形態では、例えば、流体試料は、修理した水道施設管から取得され得る。再開前に、地域条例は、例えば大腸菌等の指標微生物について水道管が試験されることを求める場合がある。現在の試験は、液体試料を取得し、試験指標を添加し、その後、試料を２４時間インキュベートし、試料中のいずれかの微生物を、その微生物が検出され得るレベルに成長させる工程を伴う。逆に、本方法は、例えば、体積が１ガロン（３．８リットル）の試料を取得し、例えば３０分にわたり液体試料を真空濾過する工程を伴うことができる。次いで、フィルタ膜上に保持された細菌を回収し、例えば３時間にわたって核酸増幅検出法を実施することができる。よって、水道管を回復させられる状態であることを示す結果は、数時間で達成され得、それによって、水道施設の稼働が遮断されることに関連する不便の程度を減少する。
【００５６】
よって、本明細書に記載される方法は、同日試験及び稼働システムへの復帰の一部として実践される。一般に、代表的な方法は、例えば、使用されていない水道管からの水試料を収集する工程と、生物有機体の存在について水試料を試験する工程と、試験が許容限界を下回るいずれかの生物有機体が存在することを示す場合において、水道管を稼働状態に復帰させる工程とを含む。
【００５７】
特定の一実施例において、大腸菌を含む水試料が濾過され、保持された大腸菌が膜から回収され得る。回収された細菌は、平板培養並びにＰＣＲによって検出された。ＳＰＡＮ  ２０改質多重ゾーンポリプロピレン熱誘発相分離（ＴＩＰＳ）膜及びナノファイバポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）フィルタの使用により、我々は、単純な溶出により６０〜７０％の添加した大腸菌を回収することができた。加えて、濾過後、膜上の細菌を短時間（１〜２時間）成長させることにより、我々は、実施例１３〜１５に示されるように、ＰＣＲを使用して、約３時間で、添加した水試料から１０ｃｆｕの大腸菌を検出することができた。
【００５８】
本明細書に開示される、別個の工程を含む任意の方法において、任意の可能な順序で工程を実施してもよい。更に、２つ以上の工程の任意の組み合わせを適宜同時に実施してもよい。
【００５９】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
ＴＩＰＳ膜の調製
Ｒ１９０１−１１膜
多重ゾーン微細孔ポリプロピレン膜（本明細書においてＲ１９０１−１１と称される）は、４０ｍｍ二軸押出機及び２５ｍｍ二軸押出機の両方を使用して、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５６５号に記載されるように調製された。２つの押出機からの溶融物流は、多重マニホールドダイを通して単一シートに流し込まれた。
【００６１】
溶融物流１．ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂ペレット（Ｆ００８Ｆ、Ｓｕｎｏｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから）及び核形成剤（ＭＩＬＬＡＤ  ３９８８，Ｍｉｌｌｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，ＳＣ）が、２５０ｒｐｍのスクリュー速度に維持された４０ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤（Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ  ＳＵＰＥＲＬＡ  Ｗｈｉｔｅ  ３１，Ｃｈｅｖｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２９．２５％／７０．７％／０．０５％であった。総押出速度は、約３０ｌｂ／時間（１３．６ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００６２】
溶融物流２．ＰＰ樹脂ペレット及びＭｉｌｌａｄ  ３９８８が、１２５ｒｐｍのスクリュー速度に維持された２５ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２９．１４％／７０．７％／０．１６％であった。総押出速度は、約６ｌｂ／時間（２．７２ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００６３】
多重ゾーンフィルムが、１７７℃に維持された多重マニホールドダイからパターン形成鋳造ホイール上に流し込まれた。鋳造ホイールの温度は、６０℃に維持され、鋳造速度は、３．３５ｍ／分（１１ｆｔ／分）であった。得られたフィルムをインラインにて溶媒中で洗浄して、フィルムの鉱物油を除去し、その後、風乾させた。洗浄したフィルムは、それぞれ、９９℃及び１５４℃で、１．８×２．８０の長さ及び横方向に順次配向された。
【００６４】
Ｒ１９０１−８Ｂ膜
多重ゾーン微細孔ポリプロピレン膜（本明細書においてＲ１９０１−８Ｂと称される）は、４０ｍｍ二軸押出機及び２５ｍｍ二軸押出機の両方を使用して、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５６５号に記載されるように調製された。２つの押出機からの溶融物流は、多重マニホールドダイを通して単一シートに流し込まれた。
【００６５】
溶融物流１．ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂ペレット（Ｆ００８Ｆ、Ｓｕｎｏｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから）及び核形成剤（ＭＩＬＬＡＤ  ３９８８，Ｍｉｌｌｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，ＳＣ）が、２５０ｒｐｍのスクリュー速度に維持された４０ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤（Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ  Ｓｕｐｅｒｌａ  Ｗｈｉｔｅ  ３１，Ｃｈｅｖｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２９．２５４％／７０．７％／０．０４５％であった。総押出速度は、約２７ｌｂ／時間（１２．２ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００６６】
溶融物流２．ＰＰ樹脂ペレット及びＭｉｌｌａｄ  ３９８８が、１２５ｒｐｍのスクリュー速度に維持された２５ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２８．１４６％／７０．７％／０．１５４％であった。総押出速度は、約９ｌｂ／時間（４．０８ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００６７】
多重ゾーンフィルムが、１７７℃に維持された多重マニホールドダイからパターン形成鋳造ホイール上に流し込まれた。鋳造ホイールの温度は、６０℃に維持され、鋳造速度は、３．５２ｍ／分（１１．５４ｆｔ／分）であった。得られたフィルムをインラインにて溶媒中で洗浄して、鉱物油希釈剤を除去し、その後、風乾させた。洗浄したフィルムは、それぞれ、９９℃及び１５４℃で、１．６×２．８５の長さ及び横方向に順次配向された。
【００６８】
Ｒ１９３３−７膜
多重ゾーン微細孔ポリプロピレン膜（本明細書においてＲ１９３３−７と称される）は、４０ｍｍ二軸押出機及び２５ｍｍ二軸押出機の両方を使用して、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５６５号に記載されるように調製された。押出機からの２つの溶融物流は、多重マニホールドダイを通して単一シートに流し込まれた。
【００６９】
溶融物流１．ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂ペレット（Ｆ００８Ｆ、Ｓｕｎｏｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから）及び核形成剤（ＭＩＬＬＡＤ  ３９８８，Ｍｉｌｌｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，ＳＣ）が、１７５ｒｐｍのスクリュー速度に維持された４０ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤（Ｋａｙｄｏｌ  ３５０  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ，Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｇｒｅａｔ  Ｌａｋｅｓ  ＬＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、３４．２４７％／６５．７％／０．０５３％であった。総押出速度は、約３２ｌｂ／時間（１４．５ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００７０】
溶融物流２．ＰＰ樹脂ペレット及びＭｉｌｌａｄ  ３９８８が、１５０ｒｐｍのスクリュー速度に維持された２５ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２９．１４％／７０．７％／０．１６％であった。総押出速度は、約６ｌｂ／時間（２．７２ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２５４℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００７１】
多重ゾーンフィルムが、１７７℃に維持された多重マニホールドダイからパターン形成鋳造ホイール上に流し込まれた。鋳造ホイールの温度は、７１℃に維持され、鋳造速度は、５．７９ｍ／分（１９．００ｆｔ／分）であった。得られたフィルムをインラインにて溶媒中で洗浄して、鉱物油希釈剤を除去し、その後、風乾させた。洗浄したフィルムは、それぞれ、９９℃及び１６０℃で、１．５×２．７０の長さ及び横方向に順次配向された。
【００７２】
Ｒ１９３３−１８膜
多重ゾーン微細孔ポリプロピレン膜（本明細書においてＲ１９３３−１８と称される）は、４０ｍｍ二軸押出機及び２５ｍｍ二軸押出機の両方を使用して、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５６５号に記載されるように調製された。押出機からの２つの溶融物流は、多重マニホールドダイを通して単一シートに流し込まれた。
【００７３】
溶融物流１．ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂ペレット（Ｆ００８Ｆ、Ｓｕｎｏｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから）及び核形成剤（ＭＩＬＬＡＤ  ３９８８，Ｍｉｌｌｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，ＳＣ）が、固体供給器を使用してホッパーに導入され、材料が、１７５ｒｐｍのスクリュー速度に維持された４０ｍｍ二軸押出機に供給された。鉱物油希釈剤（Ｋａｙｄｏｌ  ３５０  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ，Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｇｒｅａｔ  Ｌａｋｅｓ  ＬＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、３４．２４７％／６５．７％／０．０５３％であった。総押出速度は、約３２ｌｂ／時間（１４．５ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２７１℃〜１７７℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００７４】
溶融物流２．ＰＰ樹脂ペレット及びＭｉｌｌａｄ  ３９８８が、１５０ｒｐｍのスクリュー速度に維持された２５ｍｍ二軸押出機に導入された。鉱物油希釈剤が、貯蔵部から押出機の中に個別に供給された。ＰＰ／希釈剤／核形成剤の重量比は、２８．９８％／７０．７％／０．３２％であった。総押出速度は、約６ｌｂ／時間（２．７２ｋｇ／時間）であり、押出機の８つのゾーンは、２６０℃〜１９４℃の低下する温度プロファイルを提供するように設定された。
【００７５】
多重ゾーンフィルムが、１７７℃に維持された多重マニホールドダイからパターン形成鋳造ホイール上に流し込まれた。鋳造ホイールの温度は、５２℃に維持され、鋳造速度は、５．８４ｍ／分（１９．１５ｆｔ／分）であった。得られたフィルムをインラインにて溶媒中で洗浄して、鉱物油希釈剤を除去し、その後、風乾させた。洗浄したフィルムは、それぞれ、９９℃及び１６０℃で、１．７×２．７５の長さ及び横方向に順次配向された。
【００７６】
（実施例２）
ＴＩＰＳ膜の表面コーティング
界面活性剤を２−プロパノール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）に溶解することによって、４重量％のＳＰＡＮ２０（Ｕｎｉｑｅｍａ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）溶液が調製された。
【００７７】
ＴＩＰＳ微細孔膜は、上記の界面活性剤溶液を用いてポリエチレン（ＰＥ）袋の中で飽和された。膜は即時に飽和され、余分な表面溶液は、ＰＥ袋を擦ることによって除去された。膜は袋から取り出され、膜を完全に乾燥させるために空気に曝された。乾燥させた膜は、室温でＰＥ袋に保管された。
【００７８】
（実施例３）
ＴＩＰＳ膜の表面改質
ＴＩＰＳ膜は、２０１０年６月４日に出願された、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」という表題の米国仮特許出願第６１／３５１，４４７号に記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された。
【００７９】
５重量％のＥＶＡＬ保存液は、７０〜８０℃の温度の水浴で、４４モル％のエチレン含量（ＥＶＡＬ４４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のエチレン−ビニルアルコールコポリマー（ＥＶＡＬ）をエタノール（ＡＡＰＥＲ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｈｅｌｂｙｖｉｌｌｅ，ＫＹ）／水溶媒混合物（７０容量％エタノール）に溶解することによって作製された。
【００８０】
上記の保存液から、エタノール／水混合溶媒（７０容量％エタノール）中に、１重量％のＥＶＡＬ４４、２重量％のＳＲ＠６１０（Ｓａｒｔｏｍｅｒ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）、１重量％の反応性光開始剤ＶＡＺＰＩＡ（米国特許第５，５０６，２７９号に開示される、２−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロパノイル）フェノキシ］エチル−２−メチル−２−Ｎ−プロペノイルアミノプロパノエート）を含有する溶液を作製した。
【００８１】
ＴＩＰＳ微細孔膜は、厚手のＰＥ袋中で、上記のコーティング溶液で飽和された。飽和した膜がＰＥ袋から取り出された後、ペーパータオルで拭き取ることによって、余分な表面溶液を除去する試みがなされた。室温で１０〜１２時間、溶媒を蒸発させることによって、膜を乾燥させた。その後、乾燥させた膜は、２０重量％のＮａＣｌ水性溶液で飽和された。その後、膜は、コンベヤベルト上で、Ｈ−バルブを備えた窒素不活性フュージョンＵＶシステムに通された。ベルトの速度は、１分間当り２０フィート（ｆｐｍ）（６．１メートル／分）であった。膜は、膜の反対側が光源に面する状態で、同じ速度で再びＵＶシステムに送られた。硬化した膜試料を、過剰な脱イオン水中で洗浄し、完全に乾燥するまで、９０℃で１〜２時間乾燥させた。乾燥させた膜は、室温でＰＥ袋に保管された。
【００８２】
（実施例４）
ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）膜の調製
韓国特許出願第ＫＲ２００４００４０６９２号に開示されるように、様々なＰＡＮ膜を作製した。１０．５重量％のポリアクリロニトリル（Ｍｗ．１５０，０００）は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）中で調製された。シリンジポンプを使用して、一定流量のＰＡＮポリマー溶液（５０μＬ／分／穴）が、高電圧電源に接続されたシリンジの中に供給された。９０〜１００Ｋｖの電気力を導入して、空気中にポリマー溶液を放出させ、ＰＡＮナノファイバを形成するように静電気力を形成した。電界紡糸プロセス後、収集したＰＡＮナノファイバは、綿に似たかさばりを有し、フィルム及び／又は膜の様ではなかった。かさばりを減少させ、電界紡糸したＰＡＮナノファイバの構造の完全性を増加するために、後処理（高温圧延プロセス）が、１４０℃及び１０〜２０ｋｇｆ／ｃｍ３（９８．１〜１９６．１Ｎ／ｃｍ３）圧力で実行された。ＰＡＮナノファイバは、室温で、ＰＥ袋にロールとして保管された。
【００８３】
（実施例５）
膜の特徴付け
ａ）流水速度の測定
ダイパンチを使用して４７ｍｍの膜のディスクが切り取られ、膜ディスクはＧｅｌｍａｎ磁気ホルダ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に載置された。ホルダの活性膜の直径は３４ｍｍであった。１００ｍＬの水をホルダに添加し、真空ポンプ（ＧＡＳＴ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｎｔｏｎ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、約２３．５水銀インチの真空圧（７９．６ｋＰａ）を適用し、水を膜に引き込んだ。水が膜を通過する時間は、ストップウォッチで記録された。流水速度（流動率）は、時間、真空圧、及び膜の面積を使用して計算され、Ｌ／（ｍ２．ｈ．ｐｓｉ）（Ｌ／（ｍ２．ｈ．ｋＰａ））で表された。
【００８４】
ｂ）バブルポイント孔径の測定
膜のバブルポイント孔径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６−０３に従い測定された。イソプロパノール若しくはＦＣ−４３（３Ｍ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ）、又は液体ｇａｌｗｉｃｋ（ＰＭＩ，Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を用いて、膜を予め湿潤し、試験ホルダに載置した。加圧した窒素ガスは、他方側で検出されるガス流が１００％に達するまで、膜の一方の側に徐々に適用された。膜を通る１００％の圧力のガス流が記録され、バブルポイント孔径を計算するために使用された。
【００８５】
ＴＩＰＳ膜の処理条件を以下の表１に要約する。
【００８６】
様々な膜の水流動速度及びバブルポイント孔径を以下の表２に示す。
【００８７】
【表１】
2013531236.tif 000004
【００８８】
【表２】
2013531236.tif 000005
【００８９】
ｃ）膜の走査型電子顕微鏡検査
ＰＡＮ膜において、試料のそれぞれからのフィルタがアルミニウム片上に載置された。ＴＩＰＳ膜において、「密接」表面及び「開放」表面の両方を観察するために、試料のそれぞれからの２つの切片が取り出され、アルミニウム片上に載置された。ＴＩＰＳ膜のそれぞれの断面も、液体窒素下で引裂することにより調製された。それらは、追加の片上に載置された。全ての試験片は、金／パラジウムでスパッタ被覆され、ＪＥＯＬ  ７００１Ｆ電界放射型走査電子顕微鏡を使用して検査された。デジタル顕微鏡写真は、試料の表面形態を撮像するために使用される技法である、二次電子撮像（ＳＥＩ）の産物であった。全ての顕微鏡写真は、片の表面又は切片面に垂直である視野角（公称）で撮られた。画像は、様々な倍率で撮像され、倍率は、示される画像上に表示される。「密接」表面及び「開放」表面（側面又はゾーンとも称される）は、各断面の画像に表示される。長さの標識も、図１〜６の各顕微鏡写真の下部分に示される。
【００９０】
（実施例６）
実施例に使用された細菌
実施例で使用された様々な細菌（表３）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。
【００９１】
【表３】
2013531236.tif 000006
【００９２】
菌株の純粋培養物をトリプチソイブロス（ＴＳＢ，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に播種し、３７℃で一晩成長させた。培養物は、水試料に添加するための、所望量の１ｍＬ当りのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を得るために、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄリン酸緩衝液（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に系列的に希釈された。細菌は、製造者の指示に従い、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート（３Ｍ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上で適切な希釈剤を平板培養することにより定量化され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダー（３Ｍ  Ｃｏ．）を使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。
【００９３】
（実施例７）
直接成長後の濾過による添加した水試料からの大腸菌の回収
大腸菌を、３７℃で一晩、トリプチソイブロス（ＴＳＢ）中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから４７ｍｍの膜を切り取り、フリット底の漏斗を備える減菌ガラスフィルタホルダアセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に設置した。フィルタホルダは、４Ｌの真空濾過フラスコに接続された。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ（モデル番号４２０−３９０１、Ｂａｒｎａｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は無菌的に取り出され、血液寒天又はトリプチソイ寒天のプレート（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）上に設置され、３７℃で一晩インキュベートされた。膜上に成長しているコロニーを数え、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。得られた結果を以下の表４に示す。試験した全ての膜は、７３％を超える回収率を示し、より小さい孔径膜（＜０．５μｍ）は、９０％を超える回収率を示した。
【００９４】
【表４】
2013531236.tif 000007
【００９５】
（実施例８）
濾過後の溶出による添加した水試料からの大腸菌の回収
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから４７ｍｍの膜を切り取り、減菌真空濾過装置上に設置した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、５ｍＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加され、室温で１〜２分間渦動（Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）された。溶液は、製造者の指示に従い、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート（３Ｍ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダー（３Ｍ  Ｃｏ．）を使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。得られた結果を以下の表５に示す。結果は、典型的な実験を表す。約１００ｃｆｕの大腸菌を添加した１０００ｍＬの水試料からの回収率は、２８．６％〜７２．９％の範囲であった。処理されたＴＩＰＳ膜及び１つのＰＡＮ膜（ＰＡＮ−３）において、回収率は、４５％から７２．９％まで変動した。ＴＩＰＳ膜のＲ１９３３−１８／ＳＰＡＮ（０．２μｍ）は、１リットルの水を濾過するのに２５分かかるほど流動速度が低かった。Ｒ１９３３−７／ＳＰＡＮ（０．３４μｍ）は、流動速度は良好であった。両方の膜とも、濾過された細菌の良好な回収率を示した。２つの市販の膜において、回収率は、２８．６〜３５．７％の範囲であった。
【００９６】
【表５】
2013531236.tif 000008
【００９７】
（実施例９）
濾過後の溶出による添加した水試料からの細菌の回収に対する様々な抽出剤の効果
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから４７ｍｍの膜を切り取り、真空濾過装置上に設置した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、５ｍＬの様々な抽出剤が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加され、室温で１〜２分間渦動（Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ，Ｒ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）された。溶液は、製造者の指示に従い、３Ｍ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。得られた結果を以下の表６に示す。０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の使用は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又は水より良好な回収率を示した。Ｔｗｅｅｎ−２０を用いた回収率は、３５％〜７７％の範囲であり、一方、ＰＢＳを用いた回収率は、３３％〜７９％であった。減菌ＭＩＬＬＩ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及びＴｒｉｔｉｏｎ−Ｘ−１００を用いた回収率は、わずか１１％〜４６％であった。
【００９８】
【表６】
2013531236.tif 000009
【００９９】
（実施例１０）
細菌の回収に対するＴｗｅｅｎ−２０濃度の効果
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから４７ｍｍの膜を切り取り、真空濾過装置上に設置した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、５ｍＬの様々な濃度のＴｗｅｅｎ−２０が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加され、室温で１〜２分間渦動（Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）された。溶液は、製造者の指示に従い、３Ｍ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。得られた結果を以下の表７に示す。０．１％又は０．２％のＴｗｅｅｎ−２０の使用が、試験された膜の全てにおいて最高の回収率をもたらした。
【０１００】
【表７】
2013531236.tif 000010
【０１０１】
（実施例１１）
膜からの細菌の回収における様々な方法の効果
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから４７ｍｍの膜を切り取り、真空濾過装置上に設置した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、５ｍＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加された。超音波処理器（Ｂｒａｎｓｏｎ  ２２００，Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｓｂｕｒｙ，ＣＴ）を使用して、５分間、管を音波処理し、室温で、１〜２分間渦動（Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）されるか、又は１０分間、振盪機（Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗｉｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｓｈａｋｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  Ｉｎｎｏｖａ  ４０００）で振盪された。溶液は、製造者の指示に従い、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。得られた結果を以下の表８に示す。
【０１０２】
【表８】
2013531236.tif 000011
【０１０３】
（実施例１２）
気泡溶出を使用した膜からの細菌の回収
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１００ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を５０ｍＬの減菌水に添加した。シート又はディスクから２５ｍｍの膜を切り取り、２５ｍｍ  Ｓｗｉｎｎｅｘフィルタホルダ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に設置した。フィルタホルダを真空マニホールド（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に取り付け、５０ｍＬシリンジをフィルタホルダの他の端に取り付けた。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して添加した水試料を濾過した。膜を備えたフィルタホルダをＨＳＣ  ４０卓上型濃縮機（ＩｎｎｏｖａＰｒｅｐ，Ｄｒｅｘｅｌ，ＭＯ）に取り付けた。システムは、抽出剤溶液の気泡を生成し、気泡（１ｍＬの０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に膜を通過させることによって、細菌が溶出された。
【０１０４】
抽出された溶液は、製造者の指示に従い、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。得られた結果を以下の表９に示す。気泡溶出法は、少量で生物有機体を溶出する利点を提供し、溶出した材料を更に濃縮することなく容易に核酸を抽出することができる。
【０１０５】
【表９】
2013531236.tif 000012
【０１０６】
（実施例１３）
添加した水試料からの細菌の回収後の成長
大腸菌、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ、及びエンテロコッカス・フェカリスを、３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１０ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１０ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、１０ｍＬのテリフィックブロス（ＴＢ）又はトリプチソイブロス（ＴＳＢ）が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加され、Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗｉｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ振盪機のＭｏｄｅｌ  Ｉｎｎｏｖａ  ４０００で、３７℃で２時間、３００ｒｐｍで攪拌された。約１０ｃｆｕ（１００μＬの１０２ｃｆｕ／ｍＬ）を１０ｍＬのＴＢに添加することによって対照管を設定し、同様に成長させた。２時間後、管からの成長培地は、（大腸菌については）３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で、そして（Ｓ．エンテリカ及びエンテロコッカス・フェカリスについては）生菌計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。細胞の投入数は、増加倍率を計算するために使用された。
【０１０７】
【表１０】
2013531236.tif 000013
【０１０８】
【表１１】
2013531236.tif 000014
【０１０９】
【表１２】
2013531236.tif 000015
【０１１０】
【表１３】
2013531236.tif 000016
【０１１１】
【表１４】
2013531236.tif 000017
【０１１２】
【表１５】
2013531236.tif 000018
【０１１３】
（実施例１４）
添加した水試料からの大腸菌群の回収後の成長
大腸菌、エンテロバクター・エロゲネス、エンテロバクター・クロアカ、シトロバクター・フロインディー、及びシトロバクター・ブラアキイを、３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１００ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約４０ｃｆｕを得るように０．４ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通して溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、１０ｍＬのテリフィックブロス（ＴＢ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はトリプチソイブロス（ＴＳＢ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）が入った減菌ポリスチレン５０−ｍＬ遠心管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に添加され、Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗｉｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ振盪機のＭｏｄｅｌ  Ｉｎｎｏｖａ  ４０００で、３７℃で２．５又は３時間、３００ｒｐｍで攪拌された。約４０ｃｆｕ（４００μＬの１００ｃｆｕ／ｍＬ）を１０ｍＬのＴＢに添加することによって対照管を設定し、同様に成長させた。インキュベーション期間後、管からの成長培地は、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。細胞の投入数は、増加倍率を計算するために使用された。
【０１１４】
【表１６】
2013531236.tif 000019
【０１１５】
【表１７】
2013531236.tif 000020
【０１１６】
（実施例１５）
ＰＣＲによる大腸菌の検出のためのプライマー及びプローブの開発
ｕｉｄＡ（ｂ−グルクロニダーゼをコードする）及びｔｕｆＡ（タンパク質鎖伸長因子ＥＦ−Ｔｕをコードする）の２つの大腸菌遺伝子を標的遺伝子として選択した。ＰＣＲプライマー及びプローブは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な全ての配列のアライメントに基づき設計された。設計されたプライマーは、
ｕｉｄＡ：順方向プライマー５’−ＴＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧ−３’（配列番号１）
逆方向プライマー５’−ＣＧＴＡＡＧＧＧＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号２）
プローブ５’−６−ＦＡＭ−ＡＧＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣ−３’−Ｉｏｗａｂｌａｃｋ  ＦＱ（配列番号３）
ｔｕｆＡ：順方向プライマー：５’−ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＧ−３’（配列番号４）
逆方向プライマー：５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＧＣ−３’（配列番号５）
プローブ：５’−６−ＦＡＭ−ＴＧＡＡＴＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧ−３’−Ｉｏｗａｂｌａｃｋ  ＦＱ（配列番号６）であった。
【０１１７】
プライマー及びプローブは、ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡによって合成された。設計されたプライマーは２５０〜５００ｎＭで、プローブは１２５〜２５０ｎＭで、１０μＬの２×ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び５μＬのＤＮＡテンプレートを用いて、使用された。加えて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ（大腸菌の定量化の標準キット）及びＢｉｏＧｘ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ（大腸菌種Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）からの大腸菌の検出のために市販の試薬が、製造者の指示に従い使用された。
【０１１８】
大腸菌細胞は、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄリン酸緩衝液に系列的に希釈され、ＤＮＡテンプレートは、１００μＬのＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ試料調製試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２５μＬの細菌希釈液と混合し、１０分間沸騰させることにより調製された。沸騰させた懸濁液を冷却し、２分間１４，０００ＲＰＭで回転させ、上清を清浄な管に移行した。５μＬのＤＮＡ試料を、２０μＬの反応ミックス（プライマー、プローブ、及び酵素ミックス）を含有する９６ウェルＰＣＲプレートに添加した。以下の条件を用いて、ＡＢＩ  ７５００配列検出システムを使用して、熱循環を行った：変性のために９５℃で２分間、その後、９５℃で２０秒間、及び６０℃で１分間の４０サイクル。以下に示すように、ＰＣＲを用いた検出の限度は、約１００ｃｆｕであった。
【０１１９】
【表１８】
2013531236.tif 000021
【０１２０】
（実施例１６）
ＰＣＲによる添加した水試料からの細菌の検出
大腸菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で成長させた。約１０ｃｆｕ／ｍＬを得るように培養物を希釈し、約１０ｃｆｕを得るように１ｍＬの溶液を１０００ｍＬの減菌水に添加した。約２０水銀インチの真空圧（６７．７ｋＰａ）で、ＡＩＲ  ＣＡＤＥＴ  Ｖａｃｕｕｍ／Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、様々な膜を通してこの溶液を濾過した。膜は、減菌的に取り出され、１０ｍＬのＴＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が入った５０−ｍＬ管に添加され、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ振盪機のＭｏｄｅｌ  Ｉｎｎｏｖａ  ４０００で、３７℃で２時間、３００ｒｐｍで攪拌された。約１０ｃｆｕ（１００ｕＬの１０２ｃｆｕ／ｍＬ）を１０ｍＬのＴＢに添加することによって対照管を設定し、同様に成長させた。全ての試料は、重複して設定された。２時間後、１組の管の成長培地が、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌／大腸菌群計数プレート上で平板培養され、３７℃で一晩インキュベートされた。プレートは、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダーを使用して読み取られ、コロニー形成単位（ｃｆｕ）が決定された。
【０１２１】
もう一方の組の管から細胞を含有する成長培地を、５０００ｒｐｍで２０分間回転させ、細胞をペレット化した。ＤＮＡは、製造者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  ＤＮＡ抽出キットを使用して抽出され、ＤＮＡは、１０μＬで溶出された。５μＬの抽出したＤＮＡは２０μＬのＰＣＲアッセイミックスに添加され、ＰＣＲは、ｕｉｄＡ遺伝子（プライマー設計キット）のプライマー及びプローブを用いて、上述のように行われた。濾過から後続の成長及びＰＣＴによる検出までの全プロセスには、約４時間かかった。
【０１２２】
以下に示すように、増加倍率は、５倍〜１８倍まで変動した。１０ｃｆｕの大腸菌を添加した１０００ｍＬの水試料から、改質されたＴＩＰＳ膜は、９〜１８倍の増加を示し、ＰＣＲで陽性であった。市販の膜は、わずか５〜６倍の増加しか示さず、標的ＤＮＡのいかなる増幅も示さなかった。
【０１２３】
【表１９】
2013531236.tif 000022
【０１２４】
（実施例１７）
ポリプロピレン膜を有する袋の調製及び評価
４重量％（重量％）界面活性剤溶液は、ソルビトールモノラウレート（ＳＰＡＮ  ２０、Ｃｒｏｄａ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ  ＤＥから入手可能）を２−プロパノール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）に溶解することにより調製された。Ｒ１９３０−１０、Ｒ１９０１−１１、及びＲ１９０１−８Ｂ膜（表１）は、それらを飽和するのに十分な界面活性剤溶液と共にポリエチレン（ＰＥ）袋に個別に設置された。膜は、すぐに飽和した。余分な界面活性剤溶液は、袋を擦って、溶液を袋の外に押し出すことにより除去された。膜を袋から取り出し、室温で風乾させた。処理された膜及び未処理の膜の特性は、表２に示される特性を特徴とした。密接ゾーンの厚さは、より小さい孔径を有する層のおおよその厚さを指す。乾燥させた膜は、使用するまでプラスチックの袋に保管された。
【０１２５】
膜は、図９及び図１０に示される袋濃縮デバイス（bagconcentration device）として構築された。各膜を含む袋は、同じ様式で構築された。８インチ（２０．３ｃｍ）×８インチ（２０．３ｃｍ）のＺＩＰＬＯＣポリエチレン袋（Ｓ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）は、封止端に沿って切られ、２つに分けられた。乾燥させた膜の単一層は、３辺が５インチ（１２．７ｃｍ）の四角側と２．７インチ（６．９ｃｍ）の二等辺側とを有する五角形に切られた。膜は、不織シートに面する多重ゾーン膜の開放側と同じ寸法を有するポリプロピレン不織シート（ＴＹＰＡＲ，Ｒｅｅｍａｙ  Ｉｎｃ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）の上に積み重ねられた。次いで、積重体は、四角形状がＺＩＰＬＯＣの封止部分に面した状態でＺＩＰＬＯＣ袋の１つの内表面上に設置され、ｖ字形状を形成する三角が袋の底付近に設置され、膜の密接側が袋の内表面に面した。膜の４つの端及び不織布の五角形は、五角形の５インチ（１２．７ｃｍ）側が、開いたままの袋の上部でＺＩＰＬＯＣ封止部分に面してパウチを形成するように、ＺＩＰＬＯＣ袋に熱封止された。次いで、袋の対向壁に面する不織布が濃縮袋を形成するように、ＺＩＰＬＯＣ袋の２つの側が熱封止された。
【０１２６】
３．８ｇの超吸収性ヒドロゲル粒子（ポリアクリレート−ポリアルコール）をパウチの外側の各袋に設置することにより、各袋を評価した。各試験において、１．１２５ｍＬの酸化エチレン／酸化プロピレン界面活性剤であるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ６４（ＰＬ６４、ＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから入手可能）を添加することによりブロスを調製し、０．４５ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＱｕｉｃｋ−Ｅｎｒｉｃｈ  ＴＳＢ（３Ｍ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）として得た２２５ｍＬの減菌トリプチソイブロス（ＴＳＢ）に添加し、０．５％のＰＬ６４及び０．２％のＢＳＡの最終濃度とした。次いで、ブロスは、約１０５ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍＬのリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ３３０９０）を含有する２２５μＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄリン酸緩衝液を播種された。その後、細菌ブロスは、濃縮袋（膜の密接側）のパウチに注がれ、約３ｍＬの溶液がパウチに残るまで（２０〜３０分）、室温で、ベンチの上に垂直に立てたままにし、吸収時間が記録された。残りの液体は、体積を測定するために、ピペットで取り除かれて１５ｍＬの目盛り付き遠心管に移行された。次いで、各濃縮された試料は、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液で１０倍希釈され、１００μＬの希釈剤は、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｕｍプレート（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡから入手したＭＯＸプレート）上で平板培養され、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１２７】
対照は、初期濃度を表す。対照試料は、評価アッセイと同様の様式で調製されたが、濃縮されなかった。個別の対照群は、各組の膜で試験された、例えば、対照１は、ＳＰＡＮ  ２０処理された膜と同じ時に試験され、対照２は、ＰＥＧ処理された膜と同じ時に試験された。
【０１２８】
各評価は、再び複製され、細菌濃度は、濃縮後の２つの異なる個別の計数を表す。濃縮係数は、細菌の初期濃度で最終濃度を割ったものである。ＳＰＡＮ  ２０処理された膜の試験結果を表２０に示す。
【０１２９】
【表２０】
2013531236.tif 000023
【０１３０】
（実施例１８）
ポリプロピレン膜を有する袋の調製及び評価
５重量％のエチレンビニルアルコールコポリマーの保存液は、７０〜８０℃の温度の水浴で、４４モル％のエチレン含量（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから製品番号４１４１０７で入手した、４４％エチレン含量ポリ（ビニルアルコールコ−エチレンポリマー））を有するエチレン−ビニルアルコールコポリマー（ＥＶＡＬ４４）をエタノール（ＡＡＰＥＲ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｈｅｌｂｙｖｉｌｌｅ，ＫＹ）／水溶媒混合物（７０容量％エタノール）に溶解することによって調製された。
【０１３１】
上記の保存液から、エタノール／水混合溶媒（７０容量％エタノール）中に、１重量％のＥＶＡＬ４４、２重量％のポリエチレングリコール（６００）ジアクリレート（Ｓａｒｔｏｍｅｒ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡから製品番号ＳＲ６１０で入手）、１重量％反応性光開始剤ＶＡＺＰＩＡ（米国特許第５，５０６，２７９号に開示される、２−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロパノイル）フェノキシ］エチル−２−メチル−２−Ｎ−プロペノイルアミノプロパノエート）を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティング溶液を作製した。
【０１３２】
微細孔膜のＲ１９３３−７及びＲ１９３３−１８（表１）は、厚手のＰＥ袋中で、ＰＥＧコーティング溶液で飽和され、袋から取り出された。ペーパータオルで飽和した膜の表面を拭きとることにより余分な溶液を除去した。１０〜１２時間、室温で膜を風乾させた。次いで、乾燥させた膜を２０重量％のＮａＣｌ水性溶液で飽和し、余分な溶液を除去した。次いで、膜は、ＵＶ硬化システム（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤからのＨ−バルブを備えたフュージョンＵＶシステム）のコンベアベルト上に設置され、不活性窒素雰囲気チャンバ内で硬化された。ベルトの速度は、１分間当り２０フィート（ｆｐｍ）（６．１メートル／分）であった。膜を反転させ、膜の反対側が光源に面する状態で、同じ速度で再びＵＶシステムに通した。硬化した膜を、過剰な脱イオン水中で洗浄し、完全に乾燥するまで、９０℃で１〜２時間乾燥させた。永久的な処理をした乾燥させた膜は、室温でＰＥ袋に保管された。
【０１３３】
袋濃縮デバイスは、実施例１７に記載するように調製された。
【０１３４】
（実施例１９）
ポリアクリロニトリル膜を有する袋の調製及び評価
韓国特許出願第ＫＲ２００４００４０６９２号に開示されるように、様々なポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）ポリマー膜（ＰＡＮ−１、ＰＡＮ−２、ＰＡＮ−３、ＰＡＮ−４、及びＰＡＮ−５）を作製した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）中の１０．５重量％のポリアクリロニトリル（ＭＷ．１５０，０００）ポリマーの溶液は、ポリマーを液体に分散させることによって調製された。一定流量のＰＡＮポリマー溶液（５０μＬ／分／穴）が、高電圧電源に接続されたシリンジに送られた。９０〜１００Ｋｖの電気力が、空気中にポリマー溶液を放出させるシリンジに導入され、電界紡糸ＰＡＮナノファイバを形成した。ファイバはウェブ上に収集され、分厚いバットを形成した。かさばりを減少させ、電界紡糸したＰＡＮナノファイバの構造の完全性を増加するために、後処理が、１４０℃及び約１０〜２０ｋｇｆ／ｃｍ３（９８．１〜１９６．１Ｎ／ｃｍ３）の圧力で圧延することにより実行された。他の後続の処理は使用されなかった。膜は、室温でＰＥ袋に保管された。膜は、ＰＡＮ−４、ＰＡＮ−２、及びＰＡＮ−５において、それぞれ、０．２μｍ、０．５３μｍ、及び０．７３μｍの孔径を有した。袋濃縮デバイスは、実施例１７に記載するように調製された。
【０１３５】
袋は、３．９グラムのヒドロゲルが各袋に使用されたことを除き、実施例１７に記載されるのと同じ手順に従い評価された。試験結果を表２１に示す。
【０１３６】
【表２１】
2013531236.tif 000024
【０１３７】
（実施例２０）
ナイロン膜を有する袋の調製
製品番号０８０ＺＮ（０．８μｍ）及び０６０６ＳＮ（０．６μｍ）のナイロン膜液体フィルタは、３Ｍ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴから入手した。
【０１３８】
袋濃縮デバイスは、実施例１７に記載するように調製された。
【０１３９】
（実施例２１）
ポリカーボネート膜を有する袋の調製
０．８μｍ及び０．６μｍポリカーボネート膜フィルタは、ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ（Ｈｏｐｋｉｎｓ，ＭＮ）から入手した。袋濃縮デバイスは、実施例１７に記載するように調製された。
【０１４０】
（実施例２２）
ポリエーテル／ポリスルホン（ＰＥＳ）膜を有する袋の調製
０．８μｍ及び０．６μｍのポリエーテル／ポリスルホン（ＰＥＳ）膜は、ＧＥ  Ｏｓｍｏｓｉｃｓ（Ｈｏｐｋｉｎｓ，ＭＮ）から入手した。袋濃縮デバイスは、実施例１７に記載するように調製された。
【０１４１】
（実施例２３）
膜の評価
０．６μｍのナイロン膜（実施例２０）を含有する袋及び０．８μｍのポリカーボネート膜（実施例２１）を含有する袋は、４．０グラムのヒドロゲルが各袋に使用されたことを除き、実施例１７に記載される手順に従い評価された。０．６μｍのナイロン膜を含有する袋も、使用された界面活性剤が、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ６４の代わりに０．０１％のフルオロ界面活性剤（３Ｍ  Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０，３Ｍ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）であったことを除き、上述のように調製されたＴＳＢブロスを使用して評価された。試験結果を表２２に示す。
【０１４２】
【表２２】
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【０１４３】
０．８μｍのナイロン膜（実施例２０）を含有する袋及び０．８μｍのＰＥＳ膜（実施例２２）を含有する袋は、以下を除き、実施例１７に記載される手順に従い評価された。各袋に使用されたヒドロゲルの量は、約４．０グラムであった。袋の内部にイソプロピルアルコールを噴霧し、袋を開いたままにし、４５分間袋を紫外線光で照射することにより、袋の内部が減菌された。トリプチソイブロスは、３グラムの酵母抽出物を含む３０グラムのＴＳＢを１リットルの脱イオン水に溶解することにより調製された０．６％の酵母抽出物を含有した。表２３に示される２つの界面活性剤のうちの１つが、０．２％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ６４及び０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のブロスに添加された。得られたブロス（２２５ｍＬ）は、約１×１０７ｃｆｕ／ｍＬのリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  ３３０９０）を含有する２２５μＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液を播種され、良く混合された。次いで、ブロスを、試料濃縮袋のパウチに注ぎ、５０〜９０分間垂直に立てておいた。濃縮された試料を収集し、測定し、３ｍＬに順次Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液に１０倍希釈した。次いで、各試料の１ｍＬの第３希釈物がＡＣ  ＰｅｔｒｉｆｉｌＭプレート（３Ｍ，Ｃｏ．Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上で平板培養された。プレートは、３７℃で２４時間インキュベートされ、コロニーが数えられた。表２３は細菌の回収結果を示す。
【０１４４】
【表２３】
2013531236.tif 000026
【０１４５】
（実施例２４）
フロート弁及び容器を備えた大規模な水試料収集システム
４ガロン（１５．１リットル）のプラスチック製カーボイ（Ｐ／Ｎ  ０７３００４，ＵＳ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｍａ  ＯＨ）を使用して、大規模な試料量収集システムを組み立てた。４７ｍｍのフィルタホルダ（カタログ＃  ＥＷ−０６６２３−２２，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）が、適切な管継手（Ｍｅｎａｒｄｓ，Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＭＮ）を使用して、１／２インチ（１．２７ｃｍ）のフロート弁（Ｈｕｄｓｏｎ  Ｖａｌｖｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｋｅｒｓｆｉｅｌｄ，ＣＡ）に取り付けられた。フロート弁は、要求量に達した時に、フロートが水の流動を停止させるために上昇するようにカーボイの開口部に嵌め付けられた。フィルタホルダを水源に取り付けることができるように、フィルタホルダの他の端部に適切な管継手が取り付けられた。４７ｍｍの膜フィルタがフィルタホルダに設置され、デバイスは水源（蛇口）に取り付けられた。水源を開き、水に膜を通過させた。容器が満たされたら（１０リットル）、フロート弁が水の流動を止めた。蛇口を閉め、フィルタホルダを取り外し、膜フィルタを除去し、更なる分析のために処理した。膜は、血液寒天（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）又はトリプチソイ寒天のプレート（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に設置され、プレートは、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされた。コロニー形成単位を数え、１０リットルの水中の細菌のレベルを決定した。
【０１４６】
（実施例２５）
流量計を備えた大規模な水試料収集システム
適切な管継手（Ｍｅｎａｒｄｓ，Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＭＮ）を使用して、流量計（カタログ＃  ＷＵ−０５６１０−０１，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）を４７ｍｍのフィルタホルダ（カタログ＃  ＥＷ−０６６２３−２２，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）に取り付けることにより、大規模な試料量収集システムを組み立てた。フィルタホルダを水源に取り付けることができるように、フィルタホルダの他の端部に適切な管継手が取り付けられた。４７ｍｍの膜フィルタがフィルタホルダに設置され、デバイスは水源（蛇口）に取り付けられた。水源を開き、水に膜を通過させた。フィルタを通過する水の量を決定するために流量計の数値が使用され、水の流動が要求量（１０リットル）に達した時、水の流動を手動で止めた。フィルタホルダを取り外し、膜フィルタを除去し、更なる分析のために処理した。膜は、血液寒天（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）又はトリプチソイ寒天のプレート（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に設置され、プレートは、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされた。コロニー形成単位を数え、１０リットルの水中の細菌のレベルを決定した。
【０１４７】
（実施例２６）
管修復のプロセスの説明
細菌試験のプロセスは、図７及び図８に図示される。１〜１０リットルの水試料は、好ましい膜フィルタを使用して処理される。保持された細菌は溶出されるか、又はＰＣＲ、等温増幅、イムノアッセイ等のアッセイによる検出のために更に成長させることができる。迅速な検出は、短時間（例えば、８時間未満）で細菌の存在又は不在を決定することができ、復旧した管の迅速な稼働状態への復帰を可能にする。
【０１４８】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び出版物、並びに電子的に存在する資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）などに登録されているヌクレオチド配列寄託、並びにスイスポート（SwissProt）、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列寄託、並びにジェンバンク及びリファレンス・シーケンスの注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参照によりその全体が組み込まれる。本出願の開示内容と本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例はあくまで理解を助けるために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、図示及び説明された厳密な詳細に限定されるものではなく、当業者には明らかな変形例は特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるものとする。
【０１４９】
特に指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲に使用されている成分量、分子量等を表す全ての数は、全ての例において、用語「約」により修飾されていることを理解されたい。したがって、別途指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明により得ることが求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、また特許請求の範囲と等価物の原則を制限しようとするものではないが、それぞれの数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数値を考慮して、通常の数値のまるめ方を適用することによって解釈されるべきである。
【０１５０】
本発明の広い範囲を示している数値範囲及びパラメータは全て近似値であるけれども、具体的な実施例を示している数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、数値は全て、それぞれの試験測定値における標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本質的に含むものである。
【０１５１】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであって、特に断らない限り、見出しの後に続く文面の意味を限定するために使用されるものではない。
【図１Ａ】
2013531236.tif 000027
【図１Ｂ】
2013531236.tif 000028
【図１Ｃ】
2013531236.tif 000029
【図２Ａ】
2013531236.tif 000030
【図２Ｂ】
2013531236.tif 000031
【図２Ｃ】
2013531236.tif 000032
【図３Ａ】
2013531236.tif 000033
【図３Ｂ】
2013531236.tif 000034
【図３Ｃ】
2013531236.tif 000035
【図４Ａ】
2013531236.tif 000036
【図４Ｂ】
2013531236.tif 000037
【図４Ｃ】
2013531236.tif 000038
【図５Ａ】
2013531236.tif 000039
【図５Ｂ】
2013531236.tif 000040
【図５Ｃ】
2013531236.tif 000041
【図６Ａ】
2013531236.tif 000042
【図６Ｂ】
2013531236.tif 000043
【図７】
2013531236.tif 000044
【図８】
2013531236.tif 000045
【配列表】
2013531236000001.app
【国際調査報告】
2013531236.tif 000046
2013531236.tif 000047