(57)【要約】  本発明は、スピノシン生合成遺伝子、これらの生合成遺伝子で形質転換されたスピノシン生成微生物、これらの生合成遺伝子を用いてスピノシン殺虫性マクロライドの生成を増大させる方法、およびこれらの遺伝子またはこれらの断片を用いて、スピノシン生成微生物により生成させる生成物を変化させる方法を包含する。加えて、本発明は、スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株を、スピネトラム前駆体であるスピノシンＪおよびスピノシンＬの生成菌株へと転換するための方法および組成物も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｐｎＫ遺伝子において３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することを含む、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセス。
【請求項２】
前記改変が、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記インフレーム欠失が、５’末端のインフレーム欠失、３’末端のインフレーム欠失、およびｓｐｎＫコード領域のインフレーム欠失からなる群から選択される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記欠失が、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記挿入が、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項６】
前記点突然変異が、ｓｐｎＫ遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらす、請求項２に記載のプロセス。
【請求項７】
前記点突然変異が、５２８、５８９、６０２、６６８、７２１、７９４、８６２、８９５、９０８、９３７、および１１３１位からなる群から選択される塩基対位置において生じる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項８】
前記点突然変異が、化学的突然変異誘発の結果として生じる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ｓｐｎＫ遺伝子が、アンチセンス技術の使用を介して失効化される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記改変が、ｓｐｎＫコード領域内で生じる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
ｓｐｎＫ遺伝子において３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することを含む、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞であって、正常では著しい量のスピネトラム前駆体を生成させない原核宿主細胞である、遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１２】
スピノシンＪおよびＬの生成を維持しながら、ｓｐｎＫ遺伝子を失効化させることを含む、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換する方法。
【請求項１３】
ｓｐｎＫ遺伝子の前記失効化が、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｓｐｎＫ遺伝子の前記失効化が、リボソーム結合部位を操作することにより引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リボソーム結合部位が、ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｓｐｎＫ遺伝子の前記失効化が、ｓｐｎＫ遺伝子のプロモーターを操作することにより引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが、ｓｐｎＪ遺伝子のプロモーターと共に共転写される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記インフレーム欠失が、５’末端のインフレーム欠失、３’末端のインフレーム欠失、およびｓｐｎＫコード領域のインフレーム欠失からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記欠失が、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記点突然変異が、ｓｐｎＫ遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらす、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年５月１１日に出願された、米国特許仮出願第６１／３３３，５４０号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、分子遺伝学の技術分野を応用して、遺伝子の発現を破壊する。より具体的には、ｓｐｎＫ遺伝子における突然変異は、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換することが発見されている。
【背景技術】
【０００３】
米国特許第５，３６２，６３４号において開示されている通り、発酵生成物Ａ８３５４３とは、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）により生成させた類縁化合物のファミリーである。このファミリーの既知のメンバーは、因子または成分として言及されており、各々には、識別のための文字表記が与えられている。本明細書の以下では、これらの化合物を、スピノシンＡ、スピノシンＢなどと称する。スピノシン化合物は、クモ形類動物、線虫、および昆虫、特に、鱗翅目（Lepidoptera）種および双翅目（Diptera）種をコントロールするのに有用であり、環境に極めて調和的であり、顕著な毒性プロファイルを示す。
【０００４】
天然生成のスピノシン化合物は、１２環員の大環状ラクトン、中性糖（ラムノース）、およびアミノ糖（フォロサミン）に融合した５，６，５−三環系からなる（Kirstら（1991）を参照されたい）。アミノ糖が存在しなければ、これらの化合物は、Ａ、Ｄなどのシュードアグリコンと称され、中性糖が存在しなければ、これらの化合物は、Ａ、Ｄなどのリバースシュードアグリコンと称されてきた。より好ましい命名法では、これらのシュードアグリコンを、スピノシンＡ  １７−Ｐｓａ、スピノシンＤ  １７−Ｐｓａなどと称し、これらのリバースシュードアグリコンを、スピノシンＡ  ９−Ｐｓａ、スピノシンＤ  ９−Ｐｓａなどと称する。
【０００５】
天然生成のスピノシン化合物は、培養物ＮＲＲＬ  １８３９５、ＮＲＲＬ  １８５３７、ＮＲＲＬ  １８５３８、ＮＲＲＬ  １８５３９、ＮＲＲＬ  １８７１９、ＮＲＲＬ  １８７２０、ＮＲＲＬ  １８７４３、およびＮＲＲＬ  １８８２３からの発酵により生成させることができる。これらの培養物は、寄託され、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ａｒｅａ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．、６１６０４の保存培養物コレクションの一部となっている。
【０００６】
米国特許第５，３６２，６３４号および対応する欧州特許出願第３７５３１６Ａ１号は、スピノシンＡ、スピノシンＢ、スピノシンＣ、スピノシンＤ、スピノシンＥ、スピノシンＦ、スピノシンＧ、スピノシンＨ、およびスピノシンＪに関する。これらの化合物は、ＮＲＲＬ  １８３９５、ＮＲＲＬ  １８５３７、ＮＲＲＬ  １８５３８、およびＮＲＲＬ  １８５３９から選択された新規の微生物である、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の菌株を培養することにより生成させるといわれている。
【０００７】
ＷＯ９３／０９１２６は、スピノシンＬ、スピノシンＭ、スピノシンＮ、スピノシンＱ、スピノシンＲ、スピノシンＳ、およびスピノシンＴに関する。この文献ではまた、２つのスピノシンＪ生成菌株：ＮＲＲＬ  １８７１９およびＮＲＲＬ  １８７２０、ならびにスピノシンＱ、スピノシンＲ、スピノシンＳ、およびスピノシンＴを生成させる菌株：ＮＲＲＬ  １８８２３についても論じられている。
【０００８】
ＷＯ９４／２０５１８および米国特許第５，６７０４，４８６号は、スピノシンＫ、スピノシンＯ、スピノシンＰ、スピノシンＵ、スピノシンＶ、スピノシンＷ、およびスピノシンＹ、ならびにこれらの誘導体に関する。また、スピノシンＫ生成菌株であるＮＲＲＬ  １８７４３についても論じられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
スピノシン化合物の生成における難題は、極めて少量のスピノシンをもたらすのに、極めて大量の発酵容量が必要とされるという事実から生じる。スピノシン生成の効率を上昇させ、これにより、それらの費用を削減しながら、スピノシンの回収可能性を増大させることが極めて望ましい。
【００１０】
また、異なるスペクトルの殺虫活性を示しうる、新規のスピノシン誘導体を生成させる方法をもたらす、クローニングされた生合成遺伝子を提供すれば有利であろう。既知のスピノシンは、広範なスペクトルにわたる昆虫を阻害するが、全ての有害生物をコントロールするわけではないため、新規の誘導体が所望される。異なるパターンのコントロールは、スピノシンの生合成中間体を介してもたらすこともでき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成させるそれらの誘導体を介してもたらすこともでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるそれらの化学修飾から結果として得られる誘導体を介してもたらすこともできる。
【００１１】
また、スピノシン生合成のための酵素をコードする特定の遺伝子の部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて特異的に突然変異させた同じ遺伝子の部分で置換されているか、または他の生物に由来する遺伝子の対応する部分で置換されている、サッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）の突然変異体菌株により合成される新規の中間体を提供することも有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、スピノシンＡおよびスピノシンＤなどのスピノサド生成菌株を、スピノシンＪおよびスピノシンＬなどのスピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセスを提供する。このようなプロセスは、ｓｐｎＫ遺伝子において３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変の生成を包含しうる。改変は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して引き起こすことができる。インフレーム欠失は、遺伝子全体にわたることが可能であり、５’末端の欠失、３’末端の欠失、およびｓｐｎＫコード領域の欠失を包含しうる。このようなインフレーム欠失の１つには、配列番号９が含まれうる。点突然変異には、５２８、５８９、６０２、６６８、７２１、７９４、８６２、８９５、９０８、９３７、および１１３１位の塩基対における突然変異が含まれうるがこれらに限定されない。これらの突然変異は、ｓｐｎＫ遺伝子の翻訳に変化をもたらしうる。このような変化は、アミノ酸の変化の場合もあり、アミノ酸の置換の場合もあり、停止コドンの創出の場合もある。このような改変は、スピノシンＡおよびスピノシンＤと比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬによるスピノシン化合物の生成を結果としてもたらす。
【００１３】
本発明の特定の方法は、スピノシンＪおよびスピノシンＬの生成を維持しながら、ｓｐｎＫ遺伝子を失効化させることを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換することを包含する。正常なｓｐｎＫタンパク質活性の失効化または破壊は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して生じうる。正常なｓｐｎＫタンパク質活性の失効化または破壊はまた、プロモーター配列またはリボソーム結合部位配列に対する操作によっても引き起こされうる。
【００１４】
本発明は、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞をさらに提供する。この遺伝子改変宿主は、ｓｐｎＫ遺伝子を改変して３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させることにより生成させることができる。改変は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して引き起こすことができる。インフレーム欠失には、５’末端の欠失、３’末端の欠失、およびｓｐｎＫコード領域の欠失が含まれうる。
【００１５】
本発明はまた、ｓｐｎＫ遺伝子を改変して３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させることを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセスも提供する。このプロセスは、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入を包含しうる。このようなインフレーム欠失には、５’末端のインフレーム欠失、３’末端のインフレーム欠失、およびｓｐｎＫコード領域のインフレーム欠失が含まれうる。欠失には、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失が含まれうる。挿入には、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入が含まれうる。点突然変異は、５２８、５８９、６０２、６６８、７２１、７９４、８６２、８９５、９０８、９３７、および１１３１位の塩基対において生じうる。これらの点突然変異は、ｓｐｎＫ遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらしうる。
【００１６】
本発明はまた、ｓｐｎＫ遺伝子において３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することにより、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞であって、正常では著しい量のスピネトラム前駆体を生成させない原核宿主細胞である遺伝子改変宿主細胞も包含する。他の実施形態は、スピノシンＪおよびスピノシンＬの生成を維持しながら、ｓｐｎＫ遺伝子を失効化させることにより、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換する方法を包含する。このような方法は、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入を包含しうる。このようなインフレーム欠失には、５’末端のインフレーム欠失、３’末端のインフレーム欠失、およびｓｐｎＫコード領域のインフレーム欠失が含まれうる。欠失には、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失が含まれうる。挿入には、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入が含まれうる。点突然変異は、５２８、５８９、６０２、６６８、７２１、７９４、８６２、８９５、９０８、９３７、および１１３１位の塩基対において生じうる。これらの点突然変異は、ｓｐｎＫ遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらしうる。ｓｐｎＫ遺伝子を失効化させる他の方法は、リボソーム結合部位を操作することにより行う場合もあり、ｓｐｎＫ遺伝子のプロモーターを操作することにより行う場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｓｐｎＫ遺伝子の点突然変異の位置を示す図である。突然変異は、ｓｐｎＫ遺伝子の野生型配列（配列番号１７）内で強調表示する。
【図２】ｓｐｎＪ遺伝子、ｓｐｎＫ遺伝子、ｓｐｎＬ遺伝子、およびｓｐｎＭ遺伝子の物理的マップを示す図である。生成させたＰＣＲ産物は、染色体マップ下方の直線により示す。
【図３】本発明の実施形態に従うｓｐｎＫインフレーム欠失構築物のｓｐｎＬＭ領域内への単一交差相同組換えとしての組込みを示す図である（アステリスクは、ｓｐｎＪ遺伝子およびｓｐｎＭ遺伝子の不完全なコード配列を示す）。
【図４】本発明の実施形態に従うｓｐｎＫ遺伝子の欠失を結果としてもたらす、二重交差突然変異体を示す図である。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列はｓｐｎＫ遺伝子のインフレーム欠失を示す。
【図５】本発明の実施形態に従うｓｐｎＫ遺伝子内にインフレームのアプラマイシン耐性遺伝子カセットを含有する挿入カセット（ａａｃ（３）ＩＶ）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に従うｓｐｎＫ遺伝子のコード配列（配列番号１６）の上流に位置するリボソーム結合部位（シャイン−ダルガルノ配列と表示される）を示す図である。図中では、この配列を強調表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
クローニングされたサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のＤＮＡには、多くの使用がなされている。これらのクローニングされた遺伝子を用いて、スピノシンの収率を改善し、新規のスピノシンを生成させることができる。特定の菌株のゲノム内に、どのような酵素であれ、その菌株において律速的である酵素の遺伝子の複製コピーを組み込むことにより、収率の改善を得ることができる。必要とされる酵素が欠如するために、特定の突然変異体菌株において生合成経路が遮断される場合には、必要とされる遺伝子のコピーを組み込むことにより、所望のスピノシン生成を回復させることができる。生合成経路が破壊されている場合には、異なる前駆体菌株を創出することができる。より具体的には、ｓｐｎＫ遺伝子を破壊すると、スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成と比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬの生成が結果としてもたらされうる。
【００１９】
クローニングされたＤＮＡの断片を用い、スピノシンの生合成ステップを破壊して、新規のスピノシンを生成させることができる。このような破壊は、前駆体または「シャント」生成物（前駆体の天然生成誘導体）の蓄積をもたらしうる。破壊を実行するのに有用な断片は、遺伝子の５’末端および３’末端の両方、ならびに遺伝子の全体から塩基を削除した、遺伝子内部の断片である。このような断片を用いる相同組換えイベントは、遺伝子の２つの部分コピー：削除された塩基が５’末端から逸失している部分コピー、および削除された塩基が３’末端から逸失している部分コピーを結果としてもたらす。断片の各末端において削除される塩基数は、遺伝子の部分コピーのいずれもが活性を保持しないよう、十分に多数でなければならない。
【００２０】
本明細書では、以下の定義を用いるが、特許請求の範囲および明細書を解釈する場合に参照されるべきである。別段に言及しない限り、本明細書で参照される米国特許および米国特許出願は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【００２１】
本発明の要素または構成要素に前置される不定冠詞の「ある（a）」および「ある（an）」は、この要素または構成要素の場合の数（すなわち、出現数）に関して非制限的であることを意図する。したがって、「ある（a）」または「ある（an）」は、１または少なくとも１を包含すると読まれるべきであり、また、要素または構成要素の単数語形も、その数が明らかに単数を意味するのでない限り、複数を包含する。
【００２２】
本明細書で用いられる「含む」および「包含する」という用語は、特許請求の範囲において言及される特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を意味するが、１または複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはこれらの群の存在または付加を除外するものではない。これは、組成物、混合物、プロセス、方法、製品、または装置が「含む」かまたは「包含する」要素のリストが、これらの要素だけに限定されるものではなく、顕示的に列挙されているわけでもなく、それに固有であるわけでもない他の要素も包含しうることを意味する。本明細書で用いられる「または」とは、包含的な「または」および除外的な「または」を指す。例えば、ＡまたはＢという条件は、以下：Ａが真であり（または存在し）、かつ、Ｂが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）、かつ、Ｂが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢのいずれもが真である（または存在する）のうちのいずれか１つにより満たされる。
【００２３】
本明細書で用いられる「約」という用語は、本発明の、または用いられる成分または試薬の量を修飾することを指し、例えば、濃縮物を作製するかまたは実世界で溶液を用いるのに用いられる典型的な測定手順および液体操作手順を介して、これらの手順における偶発的な誤差を介して、組成物を作製するかまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差違などを介して生じうる、数値量の変化を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物から結果として生じる組成物についての、異なる平衡条件に起因して異なる量も包含する。「約」という用語により修飾されていようと修飾されていなかろうと、特許請求の範囲は、その量の同等量を包含する。
【００２４】
本明細書で用いられる「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、本明細書で説明され、特許請求の範囲で列挙される全ての可能な変化形を包含することを意図する。
【００２５】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、互換的に用いられ、ペプチド結合により併せて接合される２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。一態様では、この用語にまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。この定義には、例えば、１または複数のアミノ酸類似体または標識されたアミノ酸およびペプチド模倣体を含有するペプチドも包含される。ペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含みうる。
【００２６】
本明細書で用いられる「対象のペプチド」、「ＰＯＩ」、「遺伝子産物」、「標的遺伝子産物」、および「標的コード領域の遺伝子産物」という用語は、組換えにより発現する外来遺伝子を介してコードされる所望の異種ペプチド／タンパク質産物を指す。対象のペプチドは、タンパク質、融合タンパク質、酵素、ペプチド、ポリペプチド、およびオリゴペプチドが含まれるがこれらに限定されない任意のペプチド／タンパク質産物を包含しうる。対象のペプチドのサイズは、２〜３９８アミノ酸の長さの範囲にある。
【００２７】
本明細書で用いられる「遺伝子構築物」という用語は、生物の遺伝子型または表現型を変調させるのに有用な、一連の連続核酸を指す。遺伝子構築物の非限定的な例には、核酸分子、およびオープンリーディングフレーム、遺伝子、発現カセット、ベクター、プラスミドなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書で用いられる「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノムにおけるその天然の位置にある天然遺伝子を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる「外来遺伝子」とは、宿主生物において通常は見出されず、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物へと挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含みうる。
【００３０】
本明細書で特定の生物／ゲノム内の配列に関して用いられる「異種」という用語は、その配列が外来種に由来すること、または、同じ種に由来する場合は、組成および／またはゲノムの遺伝子座において、人為的な介入によりその天然形態から実質的に改変されていることを指す。したがって、例えば、異種遺伝子の発現とは、１つの生物／ゲノムに由来する遺伝子を、異なる生物／ゲノムのゲノム内に配置することにより発現させるプロセスを指す。
【００３１】
本明細書で用いられる「組換え」という用語は、例えば、化学合成により、または遺伝子操作法により単離された核酸のセグメントを操作することにより、そうしなければ分離している２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることを指す。「組換え」はまた、異種核酸を導入することにより改変された細胞もしくはベクター、またはこのようにして改変された細胞に由来する細胞への言及も包含するが、人為的な介入なしに生じる変化など、自然発生のイベントによる細胞またはベクターの変化（例えば、自発的突然変異、天然の形質転換、天然の形質導入、天然の転位）は包含しない。
【００３２】
「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、生物における遺伝物質の構造に対する科学的な改変を意味する。それは、組換えＤＮＡの生成および使用を伴う。より具体的には、それは、遺伝子操作生物または遺伝子改変生物を、自然発生生物と区別するのに用いられる。遺伝子操作は、例えば、プラスミド、ウイルス、または他のベクターを用いる、遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、形質転換など、当技術分野において知られる多くの技法を介して行うことができる。遺伝子改変生物、例えば、遺伝子改変微生物はまた、組換え生物、例えば、組換え微生物と称することも多い。
【００３３】
本明細書で用いられる「破壊された」または「破壊」という用語は、遺伝子操作を介して、または遺伝子の活性を変化させる天然の原因を介して操作または改変された遺伝子を指す。このような遺伝子活性は、増大する場合もあり、低減される場合もある。加えて、このような破壊は、タンパク質の機能を消失させる場合もある。このような低減を促進するには、例えば、遺伝子の過小発現または破壊を介するなどして、遺伝子のコピー数を低減することができる。その転写レベルが、野生型遺伝子と比較して低減される場合は、遺伝子が「過小発現する」という。過小発現は、例えば、ｍＲＮＡ量を遺伝子発現の指標として定量化するノーザンブロット解析を介して測定することができる。本明細書で用いられる通り、生成するｍＲＮＡの量が、野生型遺伝子から生成するｍＲＮＡの量と比較して、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、なおまたは５００％を超えて低減される場合は、遺伝子が過小発現する。代替的に、微弱なプロモーターを用いて、ポリヌクレオチドの発現を方向付けることもできる。別の実施形態では、遺伝子の上流にあるプロモーター、制御領域、および／またはリボソーム結合部位を変化させて、発現の低減を達成することができる。発現はまた、メッセンジャーＲＮＡの相対半減期を短縮することによっても低減することができる。別の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列に活性を低減する１または複数の突然変異を用いることにより、ポリペプチド自体の活性を低減することができる。例えば、その対応する基質に対するポリペプチドのアフィニティーを変化させると、活性の低減を結果としてもたらすことができる。同様に、ポリペプチドの相対半減期を短縮することもできる。いずれの場合にも、遺伝子発現の低減または活性の低減である低減は、細胞培養培地の組成、および／または培養に用いられる方法を変化させることにより達成することができる。本明細書で用いられる「発現の低減」または「活性の低減」とは、野生型のタンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子と比較するか、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが低減される前に存在するタンパク質の活性および／もしくは濃度と比較した、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、なおまたは５００％を超える低減を意味する。ＳｐｎＫタンパク質の活性はまた、このタンパク質に、その活性の特異的阻害剤または一般的阻害剤を接触させることによっても低減することができる。本明細書では、「活性の低減」、「活性の低減または消失」を互換的に用いる。
【００３４】
発現「制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写終結配列、上流の制御ドメイン、エンハンサーなどを集合的に指す。所望の遺伝子を転写および翻訳することが可能である限りにおいて、これらの制御配列の全てが組換えベクター内に常に存在しなくともよい。
【００３５】
「組換え」とは、２つのＤＮＡ分子間または２つのＲＮＡ分子間における、ＤＮＡ配列の部分またはＲＮＡ配列の部分の並べ替えを指す。各ＤＮＡ分子に存在する相同的または相補的なヌクレオチド配列を介してハイブリダイズする２つのＤＮＡ分子間では、「相同組換え」が生じる。
【００３６】
「厳密な条件」または「厳密な条件下におけるハイブリダイゼーション」という用語は、プローブが、その標的配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とのハイブリダイゼーションはより低度であるか、または他の配列とは全くハイブリダイズしない条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなど、核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「厳密なハイブリダイゼーション」および「厳密なハイブリダイゼーションの洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸ハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Tijssen（1993）、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes」、I部、2章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier、New Yorkにおいて見出される。一般に、高度に厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択する。Ｔｍとは、標的配列のうちの５０％が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下における）である。極めて厳密な条件は、特定のプローブのＴｍと等しく選択する。
【００３７】
サザンブロットまたはノーザンブロットのフィルターにおける、相補的残基が１００を超える相補的核酸のハイブリダイゼーションのための厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃でハイブリダイゼーションを一晩にわたって実施する場合、１ｍｇのヘパリンを伴う５０％のホルムアミドである。高度に厳密な洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間にわたる、０．１５ＭのＮａＣｌである。厳密な洗浄条件の例は、６５℃で約１５分間にわたる、０．２×ＳＳＣによる洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Sambrookら（1989）、「Molecular Cloning--A Laboratory Manual」（2版）、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、NYを参照されたい）。高度な厳密性の洗浄に先立って、低度な厳密性の洗浄を行い、バックグラウンドのプローブシグナルを除去することが多い。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための中程度な厳密性の洗浄の例は、４５℃で約１５分間にわたる、１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための低度な厳密性の洗浄の例は、４０℃で約１５分間にわたる、４〜６×ＳＳＣである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、非類縁プローブについて観察される２倍の（またはこれを超える）シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。厳密な条件下では互いとハイブリダイズしない核酸も、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーを、遺伝子コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて創出する場合に生じる。
【００３８】
本発明はまた、厳密な条件下で、好ましくは高度に厳密な条件下で、本発明のポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチドにも関する。
【００３９】
本明細書で用いられる「ハイブリダイズすること」という用語は、互いに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、なおより好ましくは、少なくとも約８５％〜９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列が、互いとのハイブリダイズを維持することが典型的である、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明することを意図する。
【００４０】
一実施形態では、本発明の核酸が、本出願において示される核酸配列またはその相補体と、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同である。
【００４１】
厳密なハイブリダイゼーション条件についての別の非限定的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、およびなおより好ましくは６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより１回または複数回にわたり洗浄することである。
【００４２】
高度に厳密な条件には、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識したＤＮＡプローブなどの標識ＤＮＡプローブを用いて、２〜４日間など、数日間にわたり、４２℃でインキュベートした後で、室温で２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより１回または複数回にわたり洗浄し、６５〜６８℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより１回または複数回にわたり洗浄することが含まれうる。特に、高度に厳密な条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを伴うかもしくは伴わない、ＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）などの溶液、または５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％のドデシル硫酸ナトリウム、０．１％のＮ−ラウロイルサルコシン、および２％のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液中で、ＤＩＧ標識ＤＮＡプローブ（例えば、ＤＩＧ標識システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより調製する）を用いる、４２℃で２時間〜４日間にわたるインキュベーションの後、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中、室温で５〜１５分間にわたりフィルターを２回洗浄し、次いで、０．５×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中、６５〜６８℃で１５〜３０分間にわたり２回洗浄することが含まれる。
【００４３】
一部の実施形態では、高度に厳密な条件下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズする、本発明の単離核酸分子が、天然核酸分子に対応しうる。本明細書で用いられる「天然」核酸分子とは、自然発生するヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子（例えば、天然タンパク質をコードするＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）を指す。
【００４４】
当業者には、厳密なハイブリダイゼーション条件および高度に厳密なハイブリダイゼーション条件にどのような条件を適用すべきかがわかるであろう。このような条件についてのさらなる指針は、当技術分野において、例えば、Sambrookら、1989、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Press、N.Y.；およびAusubelら（編）、1995、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons, N.Y.）において容易に得ることができる。
【００４５】
スピノシン生合成酵素の遺伝子を含有するＤＮＡのクローニングされた断片であれば、スピノシン生成における律速酵素をコードする遺伝子の複製を可能とするであろう。この断片であれば、コードされる活性のうちの１つが所望のスピノシンの合成を制限したとする任意の状況において、収率を増大させるのに用いうるであろう。この種類の収率の増大は、マクロシンをタイロシンへと転換する律速的メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を複製することにより、ストレプトミセス・フラヂアエ（Streptomyces fradiae）の発酵において達成された（Baltzら、1997）。
【００４６】
スピノシン生合成酵素をコードする特定の遺伝子が破壊されているサッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）の突然変異体菌株によれば、特異的な中間体（またはこれらの天然の誘導体）が合成されうるであろう。相同組換えを介して、標的遺伝子の内部断片を含有する突然変異誘発性プラスミドを組み込むことにより、このような菌株を発生させることができる。プラスミドを組み込むと、生合成遺伝子の２つの不完全なコピーが形成され、これにより、それがコードする酵素機能が消失する。突然変異体の菌株を発酵させると、この酵素またはその一部の天然の誘導体の基質が蓄積されるはずである。新規の６−デオキシエリトロマイシン誘導体を生成させるサッカロポリスポラ・エリトラエア（Saccharopolyspora erythraea）の菌株を発生させるのには、このような戦略が効果的に用いられた（WeberおよびMcAlpine、1992）。
【００４７】
二重交差相同組換えを介して、標的領域を、この標的領域を挟む非突然変異配列の間に新規の断片を含有する突然変異誘発性プラスミドとスワッピングすることによれば、このような菌株を発生させることができるであろう。このハイブリッド遺伝子であれば、活性を欠くか、または新規の酵素的形質転換を果たす、機能を変化させたタンパク質を生成させるであろう。突然変異体の菌株を発酵させれば、新規の誘導体が蓄積されるであろう。新規の無水エリトロマイシン誘導体を生成させるサッカロポリスポラ・エリトラエア（Saccharopolyspora erythraea）の菌株を発生させるのには、このような戦略が用いられた（Donadioら、1993）。
【００４８】
スピノシン生合成遺伝子および類縁のＯＲＦがクローニングされ、各々のＤＮＡ配列が決定された。本明細書の以下では、クローニングされたこれらの遺伝子およびＯＲＦを、ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＳ、ＯＲＦＬ１５、ＯＲＦＬ１６、ＯＲＦＲ１、ＯＲＦＲ２、サッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）ｇｔｔ、サッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）ｇｄｈ、サッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）ｅｐｉ、およびサッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）ｋｒｅと名付ける。
【００４９】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）は、集合的に「スピノシン」と呼ばれる、９つの緊密な類縁化合物の混合物を生成させる。この混合物中では、スピノサド（spinsoad）として知られるスピノシンＡおよびスピノシンＤが主要な成分であり、重要な昆虫標的に対して高度な活性を示す。スピノシン混合物中の微量成分のうちの２つであるスピノシンＪおよびスピノシンＬは、第二世代のスピノシン殺虫剤であるスピネトラムの前駆体である。本発明の実施形態は、３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードするｓｐｎＫ遺伝子を操作することを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと直接的に転換することに関する。
【００５０】
スピノサドとは、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）が生成させた殺虫剤であり、主に、約８５％のスピノシンＡおよび約１５％のスピノシンＤを含む。スピノシンＡおよびスピノシンＤは、米国特許第５，３６２，６３４号において開示される通り、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）を発酵させることにより生成させる天然生成物である。スピノサドは、昆虫コントロール用生成物であるＴＲＡＣＥＲ（商標）、ＳＵＣＣＥＳＳ（商標）、ＳＰＩＮＴＯＲ（商標）、およびＣＯＮＳＥＲＶＥ（商標）を含めた、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓから市販されている複数の殺虫用製剤の有効成分である。例えば、ＴＲＡＣＥＲ生成物は、約４４％〜約４８％（ｗ／ｖ）のスピノサド、または１ガロン当たり約４ポンドのスピノサドを含む。顆粒製剤および液体製剤におけるスピノシン化合物は、クモ形類動物、線虫、および昆虫、特に、鱗翅目（Lepidoptera）種、総翅類（Thysanoptera）種、および双翅目（Diptera）種をコントロールするための使用が確立されている。本明細書ではまた、スピノシンＡおよびスピノシンＤを、スピノシンＡ／Ｄとも称する。
【００５１】
スピネトラムとは、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓが生成させた、５，６−ジヒドロ−３’−エトキシスピノシンＪ（主要成分）および３’−エトキシスピノシンＬの混合物である。この混合物は、スピノシンＪおよびスピノシンＬの混合物をエトキシル化した後で、水素化することにより調製することができる。スピノシンＪの５，６二重結合およびその３’−エトキシは、スピノシンＬおよびその３’−エトキシ誘導体のＣ−５におけるメチル基による立体障害のために、スピノシンＬおよびその３’−エトキシ誘導体の５，６二重結合およびその３’−エトキシよりはるかに容易に水素化される。米国特許第６，００１，９８１号を参照されたい。本明細書ではまた、スピノシンＪおよびスピノシンＬを、スピノシンＪ／Ｌとも称する。
【００５２】
近年、ｓｐｎＫ遺伝子は、３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードすることが示された。Kimら、JACS、132（9）:2901〜3（2010）を参照されたい。本出願人らは、インフレーム二重交差相同組換えを介して、下流の遺伝子であるｓｐｎＬおよびｓｐｎＭの転写に対して極性効果を及ぼすことなく、ｓｐｎＫ遺伝子を、スピノシン生合成遺伝子クラスターから除去しうることを見出した。これにより、スピノサド生成菌株を操作して、スピネトラム前駆体生成菌株を生成させることが可能となる。これはまた、ｓｐｎＫノックアウト菌株が、３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を喪失していることも示す。
【００５３】
本発明の実施形態は、スピノサド生成菌株において１または複数のコドンを除去することにより、ｓｐｎＫ遺伝子のインフレーム欠失を結果としてもたらす、ｓｐｎＫ遺伝子における操作を包含しうる。ｓｐｎＫ遺伝子のインフレーム欠失は、ｓｐｎＫ遺伝子の任意の部分に対する任意の切断を包含しうる。本発明によるインフレーム欠失は、欠失後にタンパク質コード配列のセグメントは除去するが、適正なリーディングフレームは保持する欠失を包含する。本発明の一部の実施形態は、「完全な欠失」である欠失、すなわち、遺伝子内に外因性ＤＮＡ配列を含有しない欠失を包含しうる。ｓｐｎＫ遺伝子のインフレーム欠失は、１〜３９７アミノ酸におけるいずれかの除去を包含しうる。この欠失は、開始コドンの除去を包含しうる。この欠失は、任意の保存的ドメインまたは任意の転写開始領域の除去をさらに包含しうる。
【００５４】
本明細書では、従来の記法を用いて、ポリヌクレオチド配列を記載する。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端を５’末端とし、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写物への５’〜３’方向におけるヌクレオチドの付加を、転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と称し、このＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖における配列であって、このＲＮＡ転写物の５’末端に５’側が位置する配列を「上流配列」と称し、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖における配列であって、このコードＲＮＡ転写物の３’末端に３’側が位置する配列を「下流配列」と称する。
【００５５】
本発明の実施形態は、スピノサド生成菌株において１または複数のコドンを除去することにより、ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端のインフレーム欠失を結果としてもたらす、ｓｐｎＫ遺伝子における操作を包含しうる。これらのコドンは、ＡＴＧコドンの第１、第２、または第３のインスタンスを包含しうるであろう。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態は、スピノサド生成菌株において１または複数のコドンを除去することにより、ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端のインフレーム欠失を結果としてもたらす、ｓｐｎＫ遺伝子における操作を包含しうる。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、遺伝子の５’末端および３’末端の両方を完全なままに残しながらの、ｓｐｎＫコード領域の単一のコドンまたは複数のコドンのインフレーム欠失を結果としてもたらす、ｓｐｎＫ遺伝子における操作を包含しうる。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、活性部位および／または基質結合部位が含まれるがこれらに限定されない複数の部位における未熟な転写の終結またはアミノ酸置換（複数可）を結果としてもたらす、単一または複数の点突然変異を包含する、ｓｐｎＫ遺伝子における操作を包含しうる。このような単一または複数の点突然変異は、ＳＡＭ結合モチーフ内で生じる可能性があり、結果として、活性部位または基質結合部位における初期の終結をもたらす。このような単一または複数の点突然変異はまた、全体のＳｐｎＫ構造に影響を及ぼすか、または適正なフォールディングに影響を及ぼしてＳｐｎＫ機能を消失させうる位置でもありうる。このような単一または複数の点突然変異は、機能的多型を検出することにより創出することもでき、突然変異誘発により創出することもできる。
【００５９】
本明細書で用いられる「機能的多型」とは、遺伝子の塩基対配列の変化であって、この遺伝子によりコードされるタンパク質の活性における質的または量的な変化（例えば、活性の特異性の変化、活性レベルの変化）をもたらす変化を指す。「機能的多型」という用語は、突然変異、欠失、および挿入を包含する。
【００６０】
一般に、対象の多型を検出するステップは、ＤＮＡを含有する生物学的試料を供給源から回収し、次いで、対象の多型を含有するＤＮＡが、生物学的試料中に存在するかまたは存在しないかを決定することにより実施することができる。
【００６１】
特定の突然変異をコードするＤＮＡの存在または非存在の決定は、適切な検出可能基で標識されたオリゴヌクレオチドプローブにより実施することもでき、かつ／またはポリメラーゼ連鎖反応もしくはリガーゼ連鎖反応などの増幅反応（次いで、この増幅反応の産物を、標識したオリゴヌクレオチドプローブまたは他の多数の技法により検出することができる）により実施することもできる。さらに、検出するステップは、対象が、特定の突然変異についてヘテロ接合であるか、またはホモ接合であるかを検出するステップも包含しうる。本発明を実施するのに用いうる多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブアッセイフォーマットが知られている。例えば、Wahlらによる米国特許第４，３０２，２０４号;Falkowらによる米国特許第４，３５８，５３５号;Rankiらによる米国特許第４，５６３，４１９号；およびStavrianopoulosらによる米国特許第４，９９４，３７３号を参照されたい。
【００６２】
選択された核酸配列または標的核酸配列の増幅は、任意の適切な手段により実施することができる。一般に、Kwohら、Am. Biotechnol. Lab. 8、14〜25（1990）を参照されたい。適切な増幅法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（一般に、G. Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、392〜396（1992）; G. Walkerら、Nucleic Acids Res. 20、1691〜1696（1992）を参照されたい）、転写ベースの増幅（D. Kwohら、Proc. Natl. Acad Sci. USA 86、1173〜1177（1989）を参照されたい）、自家持続配列複製（または「３ＳＲ」）（J. Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、1874〜1878（1990）を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼ系（P. Lizardiら、BioTechnology 6、1197〜1202（1988）を参照されたい）、核酸配列ベースの増幅（または「ＮＡＳＢＡ」）（R. Lewis、Genetic Engineering News 12 （9）、1（1992）を参照されたい）、修復鎖反応（または「ＲＣＲ」）（R. Lewis、前出を参照されたい）、およびブーメランＤＮＡ増幅（または「ＢＤＡ」）（R. Lewis、前出を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。一般には、ポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。
【００６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、既知の技法にしたがい実施することができる。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；および同第４，９６５，１８８号を参照されたい。一般に、ＰＣＲは、まず、各核酸鎖と相補的な各プライマーの伸長産物が合成されるように、核酸試料を、ハイブリダイズ条件下において、各特定の配列鎖を検出するための１つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理する（例えば、熱安定的なＤＮＡポリメラーゼの存在下において処理する）ステップであって、これらのプライマーが、各プライマーから合成される伸長産物がその相補体から分離されたときに他のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として用いられうるように、ハイブリダイズするのに十分な程度に各特定の配列鎖と相補的であるステップと、次いで、この試料を、熱変性条件下において処理し、検出される１または複数の配列が存在する場合は、それらの鋳型からプライマー伸長産物を分離するステップとを伴う。所望の程度の増幅が得られるまで、これらのステップをサイクルで反復する。増幅された配列の検出は、反応産物に、この反応産物とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）であって、検出可能な標識を保有するプローブを添加し、次いで、この標識を既知の技法に従い検出することにより実施することもでき、ゲル上で直接的に可視化することにより実施することもできる。このようなプローブは、５〜５００ヌクレオチドの長さの場合もあり、好ましくは５〜２５０核酸の場合もあり、より好ましくは５〜１００核酸の場合もあり、５〜５０核酸の場合もある。ＰＣＲ条件が、全ての対立遺伝子型の増幅を可能とする場合は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより、制限エンドヌクレアーゼ消化により、変性勾配ゲル上における電気泳動により、または他の技法によりこれらの型を識別することができる。
【００６４】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）もまた、既知の技法に従い実施することができる。例えば、R. Weiss、Science 254、1292（1991）を参照されたい。一般に、その反応は、１つの対が検出される配列の一方の鎖に結合し、他の対が検出される配列の他方の鎖に結合する、２つのオリゴヌクレオチドプローブ対により実施される。各対を併せると、対応する鎖が完全に覆われる。反応は、まず、検出される配列の鎖を変性させ（例えば、分離し）、次いで、オリゴヌクレオチドプローブの各対が併せてライゲーションされるように、これらの鎖を、熱安定性リガーゼの存在下において、オリゴヌクレオチドプローブの２つの対と反応させ、次いで、反応産物を分離し、次いで、配列が所望の程度に増幅されるまで、このプロセスをサイクルで反復することにより実施される。次いで、ＰＣＲについて上記で説明したのと同じ方法で、検出を実施することができる。
【００６５】
前出のようなＤＮＡ増幅法は、機能的多型を含有するＤＮＡには特異的に結合するが、機能的多型を含有しないＤＮＡには結合しないプローブ、プローブ対、または２つのプローブ対の使用を伴いうる。代替的に、このプローブまたはプローブ対は、機能的多型を含有するＤＮＡおよび機能的多型を含有しないＤＮＡの両方に結合しうるが、その中で検出可能な差違が確認されうる産物（例えば、機能的多型が欠失突然変異である短い産物）を生成させるかまたは増幅する（例えば、伸長産物）ことも可能であろう。このようなプローブは、標準的な技法に従い、ｓｐｎＫ遺伝子に連結された遺伝子における既知のＤＮＡ配列またはｓｐｎＫ遺伝子に連結された遺伝子と関連する既知のＤＮＡ配列から生成させることもでき、標準的な技法に従い、このような遺伝子から生成させうる配列から生成させることもできる。
【００６６】
本明細書で説明される検出するステップは、直接的に実施することもでき、間接的に実施することもできる。対立遺伝子型を間接的に決定する他の手段には、ＶＮＴＲ（可変数のタンデム反復配列）について示されている通り、特定の機能的多型に連結された多型マーカーを測定することが含まれる。
【００６７】
分子生物学は、核酸配列およびタンパク質配列を解析するための多種多様な技法を含む。これらの技法および手順の多くは、臨床診断アッセイおよび臨床診断検査の基盤を形成している。これらの技法には、核酸ハイブリダイゼーション解析、制限酵素解析、遺伝子配列解析、ならびに核酸およびタンパク質の分離および精製が含まれる（例えば、J. Sambrook、E. F. Fritsch、およびT. Maniatis、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、2版、Cold spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989を参照されたい）。
【００６８】
これらの技法の多くは、多数の試料に対して多数の操作（例えば、ピペティング、遠心分離、および電気泳動）を実施することを伴う。これらは、複雑かつ長時間を要することが多く、一般に、高度の精度を必要とする。多くの技法は、感度、特異度、または再現性の欠如により、それらの適用が制限されている。
【００６９】
核酸ハイブリダイゼーション解析は一般に、比較的大量の複雑な非標的核酸中の過剰なプローブＤＮＡにより、極めて少数の特異的標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出することを伴う。試料中の核酸の複雑性を低減することが、低コピー数（すなわち、１０，０００〜１００，０００）の核酸標的を検出するのに有用である。ＤＮＡの複雑性の低減は、標的核酸配列を増幅することによって、ある程度達成される（M. A. Innisら、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」、Academic Press、1990; SDA増幅については、Spargoら、1996、「Molecular & Cellular Probes」を参照されたい）。これは、標的核酸を増幅する結果として、非標的配列と比べて膨大な数の標的核酸配列がもたらされ、これにより、後続の標的ハイブリダイゼーションステップが改善されるからである。
【００７０】
ハイブリダイゼーションステップは、調製されたＤＮＡ試料に、標的ＤＮＡ配列とプローブとの間でハイブリダイゼーションが生じるように設定した最適の条件で、特異的なレポータープローブを接触させることを伴う。ハイブリダイゼーションは、多くのフォーマットのうちのいずれか１つにより実施することができる。例えば、多重試料による核酸ハイブリダイゼーション解析が、各種のフィルターフォーマットおよび固体支持体フォーマットにより実施されている（Beltzら、「Methods in Enzymology」、100巻、Partら編、Academic Press, New York、19章、266〜308頁、1985を参照されたい）。１つのフォーマットである、いわゆる「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは、非共有結合により標的ＤＮＡをフィルターに結合させた後で、放射性同位元素で標識したプローブ（複数可）に対する後続のハイブリダイゼーションを行うことを伴う。「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは、過去２０年間にわたり広範に用いられ、この間、多くの変化形が開発された（AndersonおよびYoung、「Nucleic Acid Hybridization--A Practical Approach」、HamesおよびHiggins編、IRL Press、Washington, D.C.、4章、73〜111頁、1985を参照されたい）。例えば、ゲノム突然変異を多重解析するため（ＮａｎｉｂｈｕｓｈａｎらによるＥＰＡ０２２８０７５）のドットブロット法、および重複するクローンを検出し、ゲノムマップを構築するため（Ｅｖａｎｓによる米国特許第５，２１９，７２６号）のドットブロット法が開発されている。
【００７１】
多重試料による核酸ハイブリダイゼーション解析を実施するためのさらなる技法には、マイクロフォーマットマルチプレックスデバイスまたはマイクロフォーマットマトリクスデバイス（例えば、ＤＮＡチップ）が含まれる（M. Barinaga、253 Science、1489頁、1991; W. Bains、10 Bio/Technology、757〜758頁、1992を参照されたい）。これらの方法では通常、特定のＤＮＡ配列を、ＤＮＡチップのマイクロウェルなど、固定支持体の極めて小型の特定の領域に結合させる。これらのハイブリダイゼーションフォーマットは、従来の「ドットブロット」ハイブリダイゼーション系および「サンドウィッチ」ハイブリダイゼーション系のマイクロスケールによる変化形である。
【００７２】
マイクロフォーマットハイブリダイゼーションは、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）を実施するのに用いることができる（M. Barinaga、253 Science、1489頁、1991; W. Bains、10 Bio/Technology、757〜758頁、1992を参照されたい）。ＳＢＨは、全ての可能なｎヌクレオチドオリゴマー（ｎマー）を用いて未知のＤＮＡ試料におけるｎマーを同定し、その後、これらをアルゴリズム解析により整列させて、ＤＮＡ配列をもたらす（Ｄｒｍａｎａｃによる米国特許第５，２０２，２３１号を参照されたい）。
【００７３】
ＳＢＨを実施するには２つのフォーマットがある。第１のフォーマットは、支持体上で全ての可能なｎマーのアレイを創出し、次いで、これらを標的配列とハイブリダイズさせるステップを伴う。第２のフォーマットは、標的配列を支持体に結合させ、これを、全ての可能なｎマーにより逐次プロービングする。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（英国特許出願第ＧＢ８８１０４００号、１９８８; E. M. Southernら、13、Genomics、1008、1992）は、第１のフォーマットを用いて、ＤＮＡを解析または配列決定することを提起した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎは、ＰＣＲにより増幅したゲノムＤＮＡを用いて、既知の単一の点突然変異を同定した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎはまた、ＳＢＨのための固定支持体上で、オリゴヌクレオチドのアレイを合成する方法についても説明している。Ｄｒｍａｎａｃら（260、Science、1649〜1652、1993）は、第２のフォーマットを用いて、複数の短い（１１６ｂｐの）ＤＮＡ配列を配列決定した。標的ＤＮＡを、膜支持体に結合させた（「ドットブロット」フォーマット）。各フィルターを、２７２の標識した１０マーのオリゴヌクレオチドおよび１マーのオリゴヌクレオチドと逐次ハイブリダイズさせた。広範な厳密性条件を用いて、各ｎマーのプローブに特異的なハイブリダイゼーションを達成した。洗浄時間は、０℃〜１６℃の温度を用いて、５分間〜一晩で変化させた。大半のプローブは、１６℃で３時間にわたる洗浄を必要とした。ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、フィルターを、２〜１８時間にわたり曝露した。
【００７４】
一般に、ハイブリダイゼーションイベントを検出および解析するには、多様な方法が利用可能である。ＤＮＡプローブを標識するのに用いられるレポーター基（フルオロフォア、酵素、放射性同位元素など）に応じて、検出および解析を、蛍光測定により、比熱測定により、またはオートラジオグラフィーにより実施する。蛍光放射または粒子放出など、放出される放射線を観察および測定することにより、ハイブリダイゼーションイベントについての情報を得ることができる。検出法が、極めて高度な内在性感度を示す場合であっても、非特異的な結合物質がバックグラウンドに存在するために、ハイブリダイゼーションイベントの検出は困難である。したがって、ハイブリダイゼーションイベントの検出は、ハイブリダイゼーションがどれほど特異的かつ高感度になされうるかに依存する。遺伝子解析に関しては、特異度および感度を増大させようと試みた複数の方法が開発されている。
【００７５】
遺伝子解析の一形態は、一塩基多型または（「ＳＮＰ」）の解明を中心とする解析である。ＳＮＰの使用に好適な因子は、ヒトゲノムにおいてそれらが大量に存在すること（とりわけ、短いタンデム反復配列（ＳＴＲ）と比較して）、遺伝子のコード領域または制御領域内にそれらが高頻度で位置決定されること（タンパク質の構造または発現レベルに影響を及ぼしうる高頻度で位置決定されること）、および世代を経るに従いそれらが安定化することである（Landegrenら、Genome Research、8巻、769〜776頁、1998）。
【００７６】
ＳＮＰとは、２つの変異体において存在し、最も一般的な変異体が９９％未満の頻度で発生する、ゲノム内の任意の位置と定義される。ＳＮＰを広範な遺伝子マーカーとして用いるには、それらを、容易、迅速、正確、および費用効果的に遺伝子型決定しうることが重要である。ＳＮＰを類別するのに、現在多くの技法が利用可能であり（総説としては、Landegrenら、Genome Research、8巻、769〜776頁（1998）を参照されたい）、これらの全ては、標的の増幅を必要とする。これらには、直接的配列決定（Carothersら、BioTechniques、7巻、494〜499頁、1989）、一本鎖立体構成多型法（Oritaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、2766〜2770頁、1989）、対立遺伝子特異的増幅（Newtonら、Nucleic Acids Research、17巻、2503〜2516頁（1989））、制限消化（DayおよびHumphries、Analytical Biochemistry、222巻、389〜395頁、1994）、およびハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。それらの最も基本的な形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは、短いオリゴヌクレオチドレポーターを、マッチおよびミスマッチした標的と対比して識別することにより機能する。基本的なプロトコールに対して多くの適合形が開発されている。これらには、ライゲーション連鎖反応（WuおよびWallace、Gene、76巻、245〜254、1989）およびミニ配列決定（Syvanenら、Genomics、8巻、684〜692頁、1990）が含まれる。他の増強には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻、7276〜7280頁、1991）、分子ビーコン（TyagiおよびKramer、Nature Biotechnology、14巻、303〜308頁、1996）、熱変性曲線（Howellら、Nature Biotechnology、17巻、87〜88頁、1999）、およびＤＮＡ「チップ」（Wangら、Science、280巻、1077〜1082頁、1998）の使用が含まれる。
【００７７】
ＳＮＰを識別するのに用いうるさらなる現象は、単一の標的に対する複数の標的特異的プローブのハイブリダイゼーションに由来する、核酸相互反応エネルギーまたは塩基スタッキングエネルギーである（R. Ornsteinら、「An Optimized Potential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies」、Biopolymers、17巻、2341〜2360巻（1978）; J. NorbergおよびL. Nilsson、Biophysical Journal、74巻、394〜402頁、（1998）；ならびにJ. Pietersら、Nucleic Acids Research、17巻、12号、4551〜4565頁（1989）を参照されたい）。この塩基スタッキング現象を、本発明における固有のフォーマットで用いて、高感度のＴｍ差をもたらし、これにより、核酸試料におけるＳＮＰの直接的な検出を可能とする。
【００７８】
類縁生物における核酸配列を識別するか、またはＤＮＡを配列決定するには、さらなる方法も用いられている。例えば、Ｈｏｇａｎらによる米国特許第５，０３０，５５７号は、「プローブ」オリゴヌクレオチドに加えて、「ヘルパー」オリゴヌクレオチドを結合させ、プローブと標的核酸との間でより高いＴｍを呈示させることにより、一本鎖標的核酸の二次構造および三次構造に影響を及ぼしうることを開示した。しかし、この出願は、その手法において、ハイブリダイゼーションエネルギーを、改変されずに放置されたなら、プローブが標的とハイブリダイズすることを妨げる傾向にある、自己アニーリングするＲＮＡ鎖の二次構造および三次構造を改変するためだけに用いることに限定されていた。
【００７９】
ＤＮＡの配列決定について、例えば、K. Khrapkoら、Federation of European Biochemical Societies Letters、256巻、1、2号、118〜122頁（1989）は、連続的なスタッキングによるハイブリダイゼーションが、結果として二重鎖の安定化をもたらすことを開示した。加えて、J. Kieleczawaら、Science、258巻、1787〜1791頁（1992）は、ＤＮＡ合成をプライミングするための連続的なヘキサマーの連なりの使用であって、この連続的な連なりが、プライミングを安定化させると考えられる使用について開示した。同様に、L. Kotlerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、4241〜4245頁（1993）は、ヘキサマーによるオリゴヌクレオチドモジュールおよびペンタマーによるオリゴヌクレオチドモジュールの使用を介する、ＤＮＡ配列決定反応のプライミングにおける配列特異性について開示した。さらに、S. Parinovら、Nucleic Acids Research、24巻、15号、2998〜3004頁（1996）は、受動的ＤＮＡ配列決定マイクロチップと関連するＤＮＡ配列決定のための塩基スタッキングオリゴマーの使用について開示した。さらに、G. Yershovら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻、4913〜4918頁（1996）は、受動的マイクロチップ上のＳＢＨにおける塩基スタッキングエネルギーの適用について開示した。Ｙｅｒｓｈｏｖの例では、１０マーのＤＮＡプローブを、マイクロチップの表面に固定し、さらなる短いプローブと共に標的配列とハイブリダイズさせたところ、これらの組合せは、プローブの結合を安定化させると考えられた。このフォーマットならば、核酸配列の短いセグメントを明らかにし、ＤＮＡ配列決定を行いうるであろう。Ｙｅｒｓｈｏｖは、彼らの系では、短いプローブ（例えば、５マーのプローブ）を用いると、ミスマッチの不安定化効果が増大することについてさらに言及した。ＤＮＡ配列決定におけるこのように短いプローブの使用は、プローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体の１つの特定の位置におけるわずかに単一のミスマッチではなく、プロービングされる配列に沿ったミスマッチの存在を識別する能力をもたらした。長いプローブ（例えば、８マー、１０マー、および１３マーのオリゴ）の使用は、このような目的にはそれほど機能的でなかった。
【００８０】
核酸解析において塩基スタッキングを用いた方法のさらなる例には、Ｌａｎｅらによる米国特許第５，７７０，３６５号が含まれるが、ここでは、結合標的と共に作用して、スタッキングエネルギーを介して二重鎖の形成を安定化させる、一本鎖ループおよび二本鎖領域を有する、単分子による捕捉プローブを用いて核酸標的を捕捉する方法が開示される。
【００８１】
ヌクレオチド配列は、従来の方法に従う部位指向突然変異誘発を介して、簡便に改変することができる。代替的に、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドをデザインするオリゴヌクレオチド合成器を用いること、および好ましくは、組換えポリペプチドを生成させる宿主細胞において好適なコドンを選択することが含まれるがこれらに限定されない化学合成により、ヌクレオチド配列を調製することもできる。
【００８２】
新規のスピノシンはまた、クローニングされた遺伝子を突然変異誘発し、これらの突然変異させた遺伝子で、スピノシン生成生物における突然変異していないそれらの対応物を置換することによっても生成させることができる。突然変異誘発は、例えば、１）ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、またはＥＲドメインの機能のうちの１または複数が遮断され、菌株が、スピノシンＡの核には存在しない、二重結合、ヒドロキシル基、またはケト基を伴うラクトン核を有するスピノシンを生成させるように、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、またはＥＲドメインを欠失または不活化させること（Donadioら、1993を参照されたい）、２）異なるカルボン酸がラクトン核に組み込まれるように、ＡＴドメインを置換すること（Ruanら、1997を参照されたい）、３）菌株が、スピノシンＡの核には存在しない、飽和結合、ヒドロキシル基、または二重結合を伴うラクトン核を有するスピノシンを生成させるように、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、またはＥＲドメインを、既存のＰＫＳモジュールに付加すること、４）環状ラクトン核の炭素原子数が増大または減少するように、完全なＰＫＳモジュールに付加または置換を施すことを伴いうる。スピノシンＰＫＳローディングドメインを、異種ＰＫＳローディングドメインで置換することにより、ハイブリッドＰＫＳを創出することができる。例えば、米国特許第７，６２６，０１０号を参照されたい。スピノシンのラクトン骨格に結合している糖の修飾を介するスピノシンは、ラムノース部分および／もしくはフォロサミン部分の修飾、または異なるデオキシ糖の結合を包含しうることがさらに言及されている。スペインのＳａｌａｓの研究グループは、既存の糖分子を、異なる糖分子で置換することにより、新規のポリケチド化合物を生成させうることを示している（Rodriguezら、J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2000年7月;2巻（3号）:271〜6）。本出願全体で後出する例は、機能性を改変したスピノシンを生成させる突然変異誘発の使用を例示するのに一助となる。
【００８３】
スピノシン遺伝子のクラスター領域に由来するＤＮＡは、同種配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。したがって、本明細書でクローニングされるＤＮＡであれば、本明細書で説明される領域と重複し、また、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のゲノムにおける隣接領域に由来するいまだクローニングされていないＤＮＡも含有する、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）遺伝子ライブラリーに由来するさらなるプラスミドを位置決定するのにも用いうるであろう。加えて、本発明でクローニングされる領域に由来するＤＮＡを用いて、他の生物における、同一ではないが類似の配列を同定することもできる。ハイブリダイゼーションプローブは通常、少なくとも約２０塩基の長さであり、検出を可能とするようにこれらを標識する。
【００８４】
本発明では、多様な目的に応じて、各種の突然変異誘発を用いることができる。これらには、部位指向性無作為的点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングまたは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築物、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップトデュプレックスＤＮＡを用いる突然変異誘発など、またはこれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。さらなる適切な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主細胞株を用いる突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成を介する突然変異誘発、二本鎖切断修復などが含まれる。本発明には、キメラ構築物を伴うことが含まれるがこれに限定されない突然変異誘発も包含される。一実施形態では、配列、配列の比較、物理的特性、結晶構造などが含まれるがこれらに限定されない、天然分子または改変された天然分子もしくは突然変異した天然分子についての既知の情報によって、突然変異誘発を方向付けることができる。
【００８５】
本明細書で見出される教科書および例は、これらの手順について説明している。さらなる情報は、本明細書で引用されている以下の刊行物および参考文献： Lingら、「Approaches to DNA mutagenesis: an overview」、Anal Biochem. 254巻（2号）: 157〜178（1997）; Daleら、「Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method」、Methods Mol. Biol. 57:369〜374（1996）; Smith、「In vitro mutagenesis」、Ann. Rev. Genet. 19:423〜462（1985）; BotsteinおよびShortle、「Strategies and applications of in vitro mutagenesis」、Science 229:1193〜1201（1985）; Carter、「Site-directed mutagenesis」、Biochem. J. 237:1〜7（1986）; Kunkel、「The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis」、「Nucleic Acids & Molecular Biology」、（Eckstein, F.およびLilley, D. M. J.編、Springer Verlag、Berlin） （1987）; Kunkel、「Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:488〜492（1985）; Kunkelら、「Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection」、Methods in Enzymol. 154、367〜382（1987）; Bassら、「Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities」、Science、242:240〜245（1988）; Methods in Enzymol. 100: 468〜500（1983）; Methods in Enzymol. 154: 329〜350（1987）; ZollerおよびSmith、「Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment」、Nucleic Acids Res. 10:6487〜6500（1982）; ZollerおよびSmith、「Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors」、Methods in Enzymol. 100:468〜500（1983）; ZollerおよびSmith、「Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template」、Methods in Enzymol. 154:329〜350（1987）; Taylorら、「The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA」、Nucl. Acids Res. 13: 8749〜8764（1985）; Taylorら、「The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA」、Nucl. Acids Res. 13: 8765〜8787（1985）; NakamayeおよびEckstein、「Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis」、Nucl. Acids Res. 14: 9679〜9698（1986）; Sayersら、「Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis」、Nucl. Acids Res. 16:791〜802（1988）; Sayersら、「Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide」（1988）、Nucl. Acids Res. 16: 803〜814; Kramerら、「The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction」、Nucl. Acids Res. 12: 9441〜9456（1984）; KramerおよびFritz、「Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA」、Methods in Enzymol. 154:350〜367（1987）; Kramerら、「Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations」、Nucl. Acids Res. 16: 7207（1988）; Fritzら、「Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro」、Nucl. Acids Res. 16: 6987〜6999（1988）; Kramerら、「Point Mismatch Repair」、Cell 38:879〜887（1984）; Carterら、「Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors」、Nucl. Acids Res. 13: 4431〜4443（1985）; Carter、「Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors」、Methods in Enzymol. 154: 382〜403（1987）; EghtedarzadehおよびHenikoff、「Use of oligonucleotides to generate large deletions」、Nucl. Acids Res. 14: 5115（1986）; Wellsら、「Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin」、Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415〜423（1986）; Nambiarら、「Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein」、Science、223: 1299〜1301（1984）; SakamarおよびKhorana、「Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein （transducin）」、Nucl. Acids Res. 14: 6361〜6372（1988）; Wellsら、「Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites」、Gene 34:315〜323（1985）; Grundstromら、「Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis」、Nucl. Acids Res. 13: 3305〜3316（1985）; Mandecki、「Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83:7177-7181（1986）; Arnold、「Protein engineering for unusual environments」、Current Opinion in Biotechnology 4:450〜455（1993）; Sieberら、Nature Biotechnology、19:456〜460（2001）; W. P. C. Stemmer、 Nature、370、389〜91（1994）；ならびにI. A. Lorimer、I. Pastan、Nucleic Acids Res. 23、3067〜8（1995）において見出される。上記の方法のうちの多くについてのさらなる詳細は、各種の突然変異誘発法に伴うトラブルシューティングの問題に有用なコントロールについてもまた説明している、Methods in Enzymology、154巻において見出すことができる。
【００８６】
本明細書では、「相同性」または「パーセント同一性」という用語が互換的に用いられる。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適比較を目的として整列することが、本明細書で定義される（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列によるアライメントを最適とするため、第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、これらの分子はこの位置において同一である。２つの配列間におけるパーセント同一性とは、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一である位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置×１００）。２つの配列は長さが同じであることが好ましい。
【００８７】
当業者は、２つの配列間における相同性を決定するのに、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であることを承知しているであろう。例えば、２つの配列間における配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットのａｃｃｅｌｒｙｓウェブサイトにおいて、より具体的には、http://www.accelrys.comにおいて入手可能である）中のＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol.（48）: 444〜453（1970））によるアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間におけるパーセント同一性を決定する。当業者は、これらの異なるパラメータはいずれも、若干異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを用いても、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性はそれほど変化しないことを理解するであろう。
【００８８】
さらに別の実施形態では、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップの重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットのａｃｃｅｌｒｙｓウェブサイトにおいて、より具体的には、http://www.accelrys.comにおいて入手可能である）中のＧＡＰプログラムを用いて、２つのヌクレオチド配列間におけるパーセント同一性を決定する。別の実施形態では、ギャップ長ペナルティーを１２とし、ギャップペナルティーを４として、ＰＡＭ１２０による重みづけ残基表を用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）（インターネットのｖｅｇａウェブサイトにおいて、より具体的には、ＡＬＩＧＮ−ＩＧＨ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、より具体的には、http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgiにおいて入手可能である）に組み込まれている、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（CABIOS、4: 11〜17（1989））によるアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間におけるパーセント同一性を決定する。
【００８９】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公開データベースに対する検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに用いることができる。このような検索は、Altschulら（1990）、J. Mol. Biol. 215:403〜10によるＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて実施することができる。スコア＝１００、ワード長＝１２とするＢＬＡＳＴＮプログラムによりＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。スコア＝５０、ワード長＝３とするＢＬＡＳＴＸプログラムによりＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアライメントを得るには、Altschulら、（1997）Nucleic Acids Res. 25（17）: 3389〜3402において説明されている通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸプログラムおよびＢＬＡＳＴＮプログラム）のデフォルトのパラメータを用いることができる（インターネットのｎｃｂｉウェブサイトにおいて、より具体的には、http://www.ncbi.nlm.nih.govにおいて入手可能である）。
【００９０】
本発明の他の実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子における操作であって、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失を包含することが可能であり、これによりｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊しうる操作を包含しうる。このような欠失には、１〜１１９４ヌクレオチドのうちのいずれかの位置が含まれうる。このような欠失は、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームに影響を及ぼし、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株の生成をもたらす。
【００９１】
本発明の他の実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子における操作であって、ｓｐｎＫコード領域において単一または複数のヌクレオチドの挿入（複数可）を包含することが可能であり、これによりｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する操作を包含しうる。このような挿入は、ｓｐｎＫ遺伝子の正常なリーディングフレームに影響を及ぼし、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株の生成をもたらす。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子における操作であって、ＳｐｎＫタンパク質の生成を消失させるか、またはこれに著しく干渉する、アンチセンスまたはセンス技術の使用を包含する操作を包含しうる。当業者は、アンチセンス効果および共抑制効果をどのようにして達成するかについて承知している。例えば、共抑制による阻害は、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（Trends Biotechnol. 8（1990）、340〜344）、Ｎｉｅｂｅｌら（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197（1995）、91〜103）、Ｆｌａｖｅｌｌら（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197（1995）、43〜46）、ＰａｌａｑｕｉおよびＶａｕｃｈｅｒｅｔ（Plant. Mol. Biol. 29（1995）、149〜159）、Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら（Mol. Gen. Genet. 248（1995）、311〜317）、ｄｅ  Ｂｏｒｎｅら（Mol. Gen. Genet. 243（1994）、613〜621）において説明されている。
【００９３】
したがって、本発明は、遺伝子サイレンシングの方法であって、サッカロポリスポラ・スピノーサ（S. spinosa）などの生物において、センス標的化配列またはアンチセンス標的化配列に対する、５’側または３’側の逆方向反復配列を有する核酸であって、センス標的化配列またはアンチセンス標的化配列は、抑制される標的遺伝子と実質的な配列同一性を示すが、逆方向反復配列は、配列により標的遺伝子と類縁であるわけではない核酸を発現させることを介する方法をさらに提供する。別の実施形態では、異種逆方向反復配列を、５’側および３’側の標的化配列で挟む。
【００９４】
遺伝子サイレンシング構築物は、最適の生物、例えば、細菌細胞、真菌細胞、真核細胞、例えば、植物細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。
【００９５】
本発明で用いるのに適する発現ベクターには、原核生物ベクターおよび真核生物ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、またはバクテリオファージ）が含まれ、哺乳動物ベクターおよび植物ベクターが含まれる。適切な原核生物ベクターには、アクチノミセス（Actinomyces）属におけるＤＮＡ操作に一般的に用いられるプラスミド（例えば、ｐＳＥＴ１５２、ｐＯＪ２６０、ｐＩＪ１０１、ｐＪＶ１、ｐＳＧ５、ｐＨＪＬ３０２、ｐＳＡＭ２、ｐＫＣ１２５０）などであるがこれらに限定されないプラスミドが含まれる。このようなプラスミドは、Ｋｉｅｓｅｒら（「Practical Streptomyces Genetics」、2000）により開示されている。他の適切なベクターには、大腸菌（E. coli）における複製が可能なプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＰＡＣＹＣ  １８４、ｉｔＶＸ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）など）などのプラスミドが含まれうる。このようなプラスミドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、2版、Sambrook、Fritsch、およびManiatis編、Cold Spring Harbor Laboratory（1989）を参照）により開示されており、このようなベクターの多くが市販されている。バチルス（Bacillus）属のプラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが含まれ、Ｇｒｙｃｚａｎ（「The Molecular Biology of the Bacilli」、Academic Press、NY（1982）、307〜329頁）により開示されている。適切なストレプトミセス（Streptomyces）属のプラスミドには、ｐｌｉ１０１（Kendallら、J. Bacteriol. 169:4177〜4183、1987）が含まれ、適切なストレプトミセス（Streptomyces）属のバクテリオファージには、ΨＣ３１（Chaterら、Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology、Akademiai Kaido、Budapest、Hungary（1986）、45〜54頁）などが含まれるがこれに限定されない。シュードモナス（Pseudomonas）属のプラスミドは、Ｊｏｈｎら（Rev. Infect. Dis. 8:693〜704、1986）およびＩｚａｋｉ（Jpn. J. Bacteriol. 33:729〜742、1978）により総説されている。
【００９６】
特定の遺伝子の発現抑制は、特定の目的により適合した遺伝子操作生物の探索および開発のいずれにも重要なツールである。遺伝子サイレンシングは、それらのいずれもが、トランス遺伝子ならびに内因性遺伝子の発現を低減する、そのプロモーターに対してアンチセンス方向にある（Sheehyら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、85: 8805  8808（1988）; Smithら、Nature、334:724  726（1988））か、またはそのプロモーターに対してセンス方向にある（Napoliら、 Plant Cell、2:279  289（1990）; van der Krolら、Plant Cell、2:291  299（1990）；米国特許第５，０３４，３２３号；米国特許第５，２３１，０２０号；および米国特許第５，２８３，１８４号）、対象の遺伝子に対応するトランス遺伝子を導入することにより達成することができる。
【００９７】
転写後の遺伝子サイレンシングは、アンチセンスＲＮＡの小型（２０〜２５ヌクレオチド）断片であって、ＲＮＡ鋳型から合成することができ、プロセスの特異性の決定因子および可動性の決定因子を表すアンチセンスＲＮＡの小型断片の蓄積を伴うことが報告されている（HamiltonおよびBaulcombe、Science、286:950  952（1999））。ある範囲の生物では、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）の導入が、遺伝子サイレンシングをもたらす重要な構成要素であることが明らかとなっている（Fireら、Nature、391:806  811（1998）; TimmonsおよびFire、Nature、395:854（1998）；ＷＯ９９／３２６１９; KennerdellおよびCarthew、Cell、95:1017  1026（1998）; Ngoら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、95:14687  14692（1998）; Waterhouseら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、95:13959  13964（1998）；ＷＯ９９／５３０５０; CogoniおよびMacino、Nature、399:166  169（1999）; Lohmannら、Dev. Biol. 214:211  214（1999）; Sanchez-AlvaradoおよびNewmark、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、96:5049  5054（1999））。細菌では、レポーターのトランス遺伝子およびウイルス遺伝子のいずれもが、導入されたトランス遺伝子による転写後の遺伝子サイレンシングを受けるので、抑制される遺伝子が、内因性の細菌遺伝子でなくともよい（Englishら、Plant Cell 8:179  188（1996）; Waterhouseら、前出）。しかし、上記の場合の全てにおいて、導入されるトランス遺伝子と、抑制される遺伝子との間では、ある程度の配列類似性が好ましい場合がある。
【００９８】
前出の例では、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下において、ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲ（「非翻訳領域」）、コード領域、および３’−ＵＴＲからなるセンストランス遺伝子を導入すると、トマト植物体集団のうちの１５％において、ＡＣＣオキシダーゼの酵素活性が低減される（Hamiltonら、Plant J. 15:737  746（1998）；ＷＯ９８／５３０８３）。しかし、このＡＣＣオキシダーゼの５’−ＵＴＲの一部である逆方向反復配列およびセンス反復配列を構築物に組み入れたところ、植物体のうちの９６％において抑制が観察された（Hamiltonら、前出）。加えて、配列がトランス遺伝子のコード領域とは類縁であるが、トランス遺伝子の５’−ＵＴＲとは類縁でない別のＡＣＣオキシダーゼ遺伝子が抑制されたことから、転写物の任意の部分による二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の全体を標的としてこれを分解することが示される。加えて、ウイルス遺伝子もしくはレポーター遺伝子のコード領域の逆方向反復配列を含有する構築物を導入することにより、または標的遺伝子のコード領域のセンス転写物およびアンチセンス転写物を発現する植物を併せて交配することによっても、高頻度かつ高レベルの転写後遺伝子サイレンシングが見出されている（Waterhouseら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、95:13959  13964（1998）））。同じ植物の異なるプロモーターの制御下において、センストランス遺伝子およびアンチセンストランス遺伝子を発現させることによっても同様の結果が得られた（ChuangおよびMeyerowitz、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、97:4985  4990（2000））。
【００９９】
本発明の他の実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子における操作であって、遺伝子サイレンシングを包含する操作を包含しうる。「遺伝子サイレンシング」という語句は、特定の遺伝子産物の発現が、低減されるかまたは弱められるプロセスを指す。遺伝子サイレンシングは、多様な経路を介して生じうる。別段に指定されない限り、本明細書で用いられる遺伝子サイレンシングとは、低分子の阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、宿主タンパク質（例えば、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））と共に作用して、配列依存的な形でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解すると定義されているが特徴づけは部分的にとどまるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の結果として生じる、遺伝子産物発現の低減を指す。遺伝子サイレンシングのレベルは、ノーザンブロット解析、Ｂ−ＤＮＡ法、転写感受性のレポーター構築物、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）、および関連する技法を介する転写物レベルの測定が含まれるがこれらに限定されない各種の手段により測定することができる。代替的に、サイレンシングのレベルは、特定の遺伝子によりコードされるタンパク質レベルを評価することによっても測定することができる。これは、ウェスタン解析を含めた多数の研究を実施することにより達成することもでき、例えば、蛍光特性を有するレポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ）または酵素活性を有するレポータータンパク質（例えば、アルカリホスファターゼ）の発現レベルを測定することにより達成することもでき、いくつかの他の手順を介して達成することもできる。
【０１００】
さらなる実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子の活性部位または基質結合部位における単一または複数のアミノ酸置換（複数可）であって、ｓｐｎＫ遺伝子を失効化し、結果として、スピノシンＪ／Ｌを生成させるアミノ酸置換（複数可）を包含する。一般に、当業者は、それらの活性に不適切な形で有害な影響を及ぼすことなく、本発明のペプチドのアミノ酸配列に、わずかな欠失または置換を引き起こしうることを理解するであろう。したがって、このような欠失または置換を含有するタンパク質およびペプチドが、本発明のさらなる態様である。アミノ酸の置換（substitutions）または置換（replacements）を含有するペプチドでは、ペプチド配列のうちの１または複数のアミノ酸を、１または複数の他のアミノ酸で置換することができ、この場合、このような置換は、この配列の機能に影響を及ぼさない。このような変化は、アミノ酸が、本質的に同じ機能特性を有する他のアミノ酸で置換されるように、電荷密度、疎水性／親水性、サイズ、および立体構成などの物理的特徴におけるアミノ酸間の既知の類似性により方向付けることができる。例えば、Ａｌａは、ＶａｌまたはＳｅｒで置換することができ；Ｖａｌは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくは、ＡｌａまたはＬｅｕで置換することができ；Ｌｅｕは、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＩｉｅ、好ましくは、ＶａｌまたはｌＩｅで置換することができ；Ｇｌｙは、ＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくは、Ｐｒｏで置換することができ；Ｐｒｏは、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくは、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＳｅｒで置換することができ；Ｃｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくは、ＰｒｏまたはＭｅｔで置換することができ；Ｍｅｔは、ＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくは、Ｃｙｓで置換することができ；Ｈｉｓは、ＰｈｅまたはＧｉｎ、好ましくは、Ｐｈｅで置換することができ；Ｐｈｅは、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＴｒｐ、好ましくは、ＨｉｓまたはＴｙｒで置換することができ；Ｔｙｒは、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくは、ＰｈｅまたはＴｒｐで置換することができ；Ｔｒｐは、ＰｈｅまたはＴｙｒ、好ましくは、Ｔｙｒで置換することができ；Ａｓｎは、ＧｉｎまたはＳｅｒ、好ましくは、Ｇｌｎで置換することができ；Ｇｌｎは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＳｅｒ、好ましくは、ＡｓｎまたはＳｅｒで置換することができ；Ｓｅｒは、ＧＩｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、またはＡｌａで置換することができ；Ｔｈｒは、ＧｌｎまたはＳｅｒ、好ましくは、Ｓｅｒで置換することができ；Ｌｙｓは、ＧｉｎまたはＡｒｇで置換することができ；Ａｒｇは、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、好ましくは、ＬｙｓまたはＡｓｐで置換することができ；Ａｓｐは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ、好ましくは、ＡｒｇまたはＧｌｕで置換することができ；Ｇｌｕは、ＡｒｇまたはＡｓｐ、好ましくは、Ａｓｐで置換することができる。引き起こされた変化は、日常的な方法でスクリーニングして、機能に対するそれらの影響を決定することができる。
【０１０１】
本発明の他の実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子における操作であって、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の操作を包含する操作を包含しうる。ｓｐｎＫ遺伝子コード配列の上流に位置するリボソーム結合部位（シャイン−ダルガルノ配列と名付けられる）は、ｓｐｎＫ遺伝子が破壊され、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株が生成するように操作することができる。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子の複数のシグナル伝達経路に影響を及ぼす酵素的阻害であって、その結果として、スピネトラム生成菌株を生成させうる阻害を包含しうる。標的と関連する酵素活性を検出する方法は、酵素結合アッセイの使用を包含しうる。
【０１０３】
本発明の別の実施形態は、ｓｐｎＫ遺伝子をコードするプロモーター配列の中断を包含する。このような中断は、切断、欠失、点突然変異、および挿入が含まれるがこれらに限定されない任意の種類の操作を介することが可能である。このような操作は、フレーム内の場合もあり、フレーム外の場合もある。このような操作は、結果として、スピネトラム生成菌株を生成させる。
【０１０４】
以下の非限定的な例では、本発明をより詳細に説明する。
［実施例］
【実施例１】
【０１０５】
ｓｐｎＫ遺伝子における点突然変異の生成
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のＡおよびＤの生成菌株をランダム突然変異誘発することにより、ｓｐｎＫ遺伝子内に点突然変異を生成した（Kieserら、2000）。スピノシンＡおよびスピノシンＤではなく、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる突然変異体菌株を、ｓｐｎＫ遺伝子のＰＣＲ増幅の後で、ＤＮＡ配列決定を介してさらに特徴づけた。ｓｐｎＫ遺伝子は、ＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、ｓｐｎＫＦ（配列番号１：GGGAATTCCATATGTCCACAACGCACGAGATCGA）およびｓｐｎＫＲ（配列番号２：GCCGCTCGAGCTCGTCCTCCGCGCTGTTCACGTCS）によりＰＣＲ増幅した。結果として得られるＰＣＲ産物を、ＭｏＢｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）を用いて精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、ＴＡクローニングベクターへとクローニングした。ＰＣＲ産物を含有すると推定される細菌コロニーを、制限酵素消化を介して単離および確認した。陽性のプラスミドクローンに対するＤＮＡ配列決定は、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて、製造元のプロトコールにより説明される通りに実施した。製造元のプロトコールにより説明される通りに、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＤＴＲ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、反応物を精製した。Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥＱ（商標）２０００  ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて配列反応物を解析し、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてヌクレオチドの特徴づけを実施した。配列決定の結果により、ｓｐｎＫ遺伝子配列内の点突然変異の位置が確認された。結果として得られる点突然変異を、表１に列挙し、図１では影を付す。
【０１０６】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のｓｐｎＫ突然変異体菌株の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画した。エーテル層は、Ｎ２流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンｄ６中に溶解させ、ＮＭＲ用試験管へと移し、１ＤプロトンＮＭＲを収集した。これらのＮＭＲプロファイルを、スピノシン基準物質のＮＭＲと比較した。ＮＭＲの結果は、Ａ／Ｄに対して過剰なＪ／Ｌの存在を示した。点突然変異を含有する菌株の発酵は、スピノシンＡおよびスピノシンＤを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）と比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬを含有するスピノシン混合物を生成させた。
【０１０７】
【表１】
2013531976.tif 000002
【実施例２】
【０１０８】
ｓｐｎＫ欠失突然変異の生成
ｓｐｎＫインフレーム欠失ベクターの構築
スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株のゲノムＤＮＡを用いて、１，５９５ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した（Hopwoodら、1985）。この断片は、ｓｐｎＫ遺伝子の開始コドンの範囲にあり、ｓｐｎＪコード領域は含有したが、ｓｐｎＪ遺伝子の５’末端は伴わなかった（図２）。ＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ならびにフォワードプライマー＃１（配列番号３：CGGTGCCCGAATTCCATGACCCG）およびリバースプライマー＃１（配列番号４：GTGCGTTCTAGACATATGAGCTCCTCATGGCTG）を用いて、ＰＣＲ反応を完了した。
【０１０９】
第２のＰＣＲ反応を完了し、これにより、１，９５１ｂｐのＤＮＡ断片を生成させた（この断片は、ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端、完全なｓｐｎＬ遺伝子、およびｓｐｎＭ遺伝子の５’末端を含有した）（図２）。ＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲキットならびにフォワードプライマー＃２（配列番号５：GTGCCATCTAGACTGGACGACATATTGCACCTG）およびリバースプライマー＃２（配列番号６：GAATGCGAAGCTTACGATCTCGTCGTCCGTG）を用いて、ＰＣＲ反応を完了した。製造元の指示書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。
【０１１０】
１，５９５ｂｐのＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより消化した。１，９５１ｂｐのＰＣＲ断片を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。制限酵素消化が完了したら、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、断片を精製した。ＦａｓｔＬｉｎｋ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、消化された断片を、プラスミドｐＯＪ２６０の対応するＥｃｏＲＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位へとライゲーションし、大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へと形質転換した。制限酵素消化およびＤＮＡ配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングした。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）において、後に続くｓｐｎＫのインフレーム欠失に用いた。プラスミドｐＯＪ２６０内で結果として得られる、欠失させたｓｐｎＫ遺伝子断片の配列を、表２に示す。
【０１１１】
【表２】
2013531976.tif 000003
2013531976.tif 000004
【０１１２】
したがって、ｓｐｎＫ遺伝子における１つの欠失には、配列：ATGTCTAGACTGGACGACATATTGCACCTGGCCGACGTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA（配列番号９）が含まれるであろう。
【０１１３】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ欠失ベクターのコンジュゲーション
ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物を、大腸菌（E. coli）のコンジュゲーションドナー菌株であるＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２へと形質転換した。陽性の形質転換菌株を同定し、これらを用いて、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地（適切な抗生剤を含有する）のフラスコに接種して、２２５ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩にわたり増殖させた。プラスミドの識別確認は、プラスミドＤＮＡを単離し、大腸菌（E. coli）のドナー菌株からの制限酵素消化を完了することにより実施した。このクローンの忠実性が適正であることを確認したら、残りの培養物を、将来の使用のために、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存した。
【０１１４】
ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明される方法に従って実施した。ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択した。
【０１１５】
トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのｓｐｎＫ領域の増幅
Ｒ６培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認した。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種した。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートした。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、製造元の指示書に従い、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ’ｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ、ＭＤ）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを、ＳｐｎＫ  Ｄｅｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  １Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７：GTTCACGGTGATTCCGGTGACTCG）プライマーおよびＳｐｎＫ  Ｄｅｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  １Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号８：ACCTGCACTGCTTCCTGGAGCTTC）プライマーと共に用いて、ＰＣＲを実施した。加えて、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）親対照菌株から単離したゲノムＤＮＡ、およびｓｐｎＫインフレーム欠失構築物のプラスミドＤＮＡを、対照のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅の結果を配列決定した。配列決定データは、ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＬＭ領域へと組み込まれることを示した（図３）。染色体内のｓｐｎＬＭ領域において、ベクター骨格であるｐＯＪ２６０の上流に、ｓｐｎＪ遺伝子、ｓｐｎＫ遺伝子、ｓｐｎＬ遺伝子の完全コピー、切断型ｓｐｎＭ遺伝子が組み込まれ、このベクター骨格の下流に、切断型ｓｐｎＪ遺伝子、ならびに完全ｓｐｎＬ遺伝子およびｓｐｎＭ遺伝子が組み込まれた。
【０１１６】
二重交差ｓｐｎＫインフレーム欠失突然変異体の単離
アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるＢＨＩ寒天プレートに接種し、２９℃で１４日間にわたりインキュベートした。Hopwoodら（1985）に従い、プレートから胞子を回収し、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存した。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレート１０枚へと接種し、プレートを、２９℃で１４日間にわたりインキュベートした。このステップを３回にわたり反復した。２０％グリセロールを用いて、胞子調製物を、１０−６倍まで希釈し、希釈された胞子を、１０枚のＢＨＩ寒天プレートへと播種した。プレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のＢＨＩ寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと継ぎ合わせた。全てのプレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンを含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択した。
【０１１７】
二重交差突然変異体の同定および検証
ＰＣＲを介して、二重交差突然変異体を確認した。プライマーであるＳｐｎＫ  Ｄｅｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  １Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７）およびＳｐｎＫ  Ｄｅｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  １Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号８）を、ｓｐｎＬ遺伝子およびｓｐｎＪ遺伝子内で結合するようにデザインして、ＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いるＰＣＲ増幅に用いる。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定した。ｓｐｎＫ遺伝子の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し（図４）、ＰＣＲ産物のサイズに基づいてこれらを選択した。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列は、ｓｐｎＫ遺伝子のインフレーム欠失を示す。
【０１１８】
振とうフラスコ発酵を介する二重交差突然変異体によるスピノシン生成
二重交差突然変異体の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画した。エーテル層は、Ｎ２流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンｄ６中に溶解させ、ＮＭＲ用試験管へと移し、１ＤプロトンＮＭＲを収集した。これらのＮＭＲプロファイルを、スピノシン基準物質のＮＭＲプロファイルと比較した。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる。ＮＭＲの結果は、Ａ／Ｄに対して過剰なＪ／Ｌの存在を示した。
【実施例３】
【０１１９】
ｓｐｎＫ挿入突然変異の生成
ｓｐｎＫ遺伝子における挿入突然変異を介して、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の突然変異体を生成させる。ｓｐｎＫ遺伝子内のインフレームのアプラマイシン耐性遺伝子カセット（ａａｃ（３）ＩＶ）、ならびにｓｐｎＪ遺伝子およびｓｐｎＬ遺伝子の上流および下流にこれらを中断なしに挟み込む配列を含有するＤＮＡ断片を構築する（図５）。ａａｃ（３）ＩＶ遺伝子断片をプラスミドへとクローニングし、大腸菌（E. coli）のコンジュゲーションドナー菌株であるＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２へと形質転換する。陽性の形質転換菌株を同定し、これらを用いて、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地（適切な抗生剤を含有する）のフラスコに接種して、２２５ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩にわたり増殖させる。プラスミドの識別確認は、プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化を完了することにより実施する。アプラマイシン挿入カセットを含有するプラスミドが適正であることを確認したら、残りの培養物を、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存する。
【０１２０】
大腸菌（E. coli）ドナー細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明される方法に従って実施する。大腸菌（E. coli）からのアプラマイシン遺伝子カセットの移送、および、その後におけるこのプラスミドの、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）ゲノムへの組込みは、アプラマイシンに対する耐性を用いて選択する。
【０１２１】
単一の初代トランスコンジュゲート体をＲ６培地において増殖させ、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートする。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、製造元の指示書に従い、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ’ｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ、ＭＤ）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施する。ＴＯＰＯ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｌｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、所望のＰＣＲ産物を、プラスミドへとクローニングする。制限酵素消化を介して、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローニングされたＰＣＲ産物を含有すると推定される細菌コロニーを単離および確認する。陽性のプラスミドクローンに対するＤＮＡ配列決定を実施する。配列決定の結果は、アプラマイシン挿入カセットが、二重交差相同組換えを介して、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のｓｐｎＫ遺伝子内に組み込まれることを示す。相同組換えを介して生じる挿入は、ｓｐｎＫ遺伝子の転写を破壊し、これにより、ｓｐｎＫ遺伝子の機能を消失させる。
【０１２２】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のｓｐｎＫ突然変異体菌株の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、Ｎ２流下における蒸発により乾燥させる。次いで、試料をアセトンｄ６中に溶解させ、ＮＭＲ用試験管へと移し、１ＤプロトンＮＭＲを収集する。これらのＮＭＲプロファイルを、スピノシン基準物質のＮＭＲプロファイルと比較する。ＮＭＲの結果は、Ａ／Ｄに対して過剰なＪ／Ｌの存在を示す。挿入突然変異を含有する菌株の発酵は、スピノシンＡおよびスピノシンＤを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）と比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬを含有するスピノシン混合物を生成させる。
【実施例４】
【０１２３】
ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列の破壊
ｓｐｎＫ遺伝子の上流に位置するシャイン−ダルガルノ配列（図６）を破壊すると、これにより、結果として、ｓｐｎＫ  ｍＲＮＡの翻訳が低減される。実施例２において説明したのと同様のプロトコールを用いて、欠失させたｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列を含有するサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の突然変異体菌株を生成させる。ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列の上流および下流に位置する、少なくとも１，５００ｂｐの２つの断片を、ＰＣＲ増幅する。これらの断片は、以下の配列：５’−ＡＧＧＡＧＣＴＣ−３’を含有しない。２つの断片は、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションに用いられうる、ｐＯＪ２６０などのプラスミド内に併せてライゲーションする。
【０１２４】
所望のプラスミドを、大腸菌（E. coli）のコンジュゲーションドナー菌株であるＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２へと形質転換する。陽性の形質転換菌株は、制限酵素消化を介して確認する。プラスミドを含有する大腸菌（E. coli）株が適正であることを確認したら、Matsushimaら（1994）において説明される方法に従い、大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションを実施する。大腸菌（E. coli）ドナー細胞からのプラスミドの移送、および、その後におけるこのプラスミドの、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）ゲノムへの組込みは、抗生剤に対する耐性を用いて選択する。
【０１２５】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の染色体へのプラスミドの組込みは、特定のゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅することにより分子的に特徴づけられる。略述すると、ゲノムＤＮＡを単離し、ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列を含有する挿入をＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定する。配列決定データは、ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＪＫ領域へと組み込まれることを示す。
【０１２６】
実施例２で説明したプロトコールを用いて、破壊されたｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列を含有する二重交差突然変異体を得る。抗生剤を含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖することが不可能なコロニーであって、ベクター骨格において存在するマーカーにより選択されるコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択する。ｓｐｎＫ遺伝子およびｓｐｎＪ遺伝子内に結合するようにデザインされたプライマーを用いる。ＴＯＰＯ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、結果として得られるＰＣＲ産物を、プラスミドへとサブクローニングする。制限酵素消化を介して、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローニングされたＰＣＲ産物を含有する細菌コロニーを単離および確認する。陽性のプラスミドクローンに対するＤＮＡ配列決定を実施する。配列決定の結果は、ｓｐｎＫシャイン−ダルガルノヌクレオチド配列が、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のゲノムから破壊されていることを示す。サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）のｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列突然変異体菌株の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、Ｎ２流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンｄ６中に溶解させ、ＮＭＲ用試験管へと移し、１ＤプロトンＮＭＲを収集する。ＮＭＲの結果は、Ａ／Ｄに対して過剰なＪ／Ｌの存在を示す。これらのＮＭＲプロファイルを、スピノシン基準物質のＮＭＲプロファイルと比較する。欠失させたｓｐｎＫシャイン−ダルガルノ配列突然変異体を含有する菌株の発酵は、スピノシンＡおよびスピノシンＤを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）と比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬを含有するスピノシン混合物を生成させる。
【実施例５】
【０１２７】
アンチセンスＲＮＡによるｓｐｎＫ遺伝子の下方制御を介する３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ発現の低減
ｓｐｎＫ遺伝子のコード配列と相補的なａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を生成させるように、プラスミドをデザインする。結果として得られるｓｐｎＫ遺伝子発現の下方制御は、結果として、ｓｐｎＫ遺伝子の活性を低減する。
【０１２８】
ｓｐｎＫ遺伝子のコード配列をＰＣＲ増幅し、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の染色体に組み込むため、ｐＯＪ２６０などのプラスミドへとクローニングする。代替的に、ｓｐｎＫコード配列を、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）の細胞質ゾル内で安定的に維持および複製されるプラスミドへとクローニングすることもできる。結果として得られるプラスミドを、強力な構成的細菌プロモーターを用いてｓｐｎＫ遺伝子のアンチセンス鎖を発現させることにより、ｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡを生成させるように構築する。このｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡプラスミドを、大腸菌（E. coli）のコンジュゲーションドナー菌株であるＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２へと形質転換する。陽性の形質転換菌株は、制限酵素消化を介して確認する。プラスミドを含有する大腸菌（E. coli）株が適正であることを確認したら、Matsushimaら（1994）において説明される方法に従い、大腸菌（E. coli）ドナー細胞からの、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのプラスミドのコンジュゲーションを実施する。大腸菌（E. coli）からサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡプラスミドの移送は、抗生剤に対する耐性を用いて選択する（この耐性は、ｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡプラスミドにおいてコードされる）。トランスコンジュゲート体からゲノムＤＮＡを単離し、これをＰＣＲ増幅の鋳型として用いて、プラスミドの存在を確認する。
【０１２９】
ｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡプラスミドを含有する、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）菌株の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、Ｎ２流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンｄ６中に溶解させ、ＮＭＲ用試験管へと移し、１ＤプロトンＮＭＲを収集する。ＮＭＲの結果は、Ａ／Ｄに対して過剰なＪ／Ｌの存在を示す。これらのＮＭＲプロファイルを、スピノシン基準物質のＮＭＲプロファイルと比較する。ｓｐｎＫ  ａｓＲＮＡプラスミドを含有する菌株の発酵は、スピノシンＡおよびスピノシンＤを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）と比較して、スピノシンＪおよびスピノシンＬを含有するスピノシン混合物を生成させる。
【実施例６】
【０１３０】
さらなるｓｐｎＫ欠失突然変異の生成
実施例６．１：ｓｐｎＫ遺伝子５’末端欠失ベクターの構築
スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株のゲノムＤＮＡ（Hopwoodら、1985）をＰＣＲ増幅して、２つのＤＮＡ断片を生成させた。第１の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に位置する。第２の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、ｓｐｎＫ遺伝子の塩基対６１のすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、ＰＣＲ増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるＰＣＲ産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドｐＯＪ２６０の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌（E. coli）コンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびＤＮＡ配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）において、ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端を欠失させるのに用いる。プラスミドｐＯＪ２６０内で結果として得られる、欠失させたｓｐｎＫ遺伝子断片の配列を、表３に示す。したがって、ｓｐｎＫ遺伝子の開始コドンの欠失には、配列：（配列番号１０）が含まれるであろう。
【０１３１】
【表３】
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2013531976.tif 000006
2013531976.tif 000007
【０１３２】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ欠失ベクターのコンジュゲーション
ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端欠失構築物を保有する大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明され、実施例２で例示される方法に従って実施する。ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。
【０１３３】
トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのｓｐｎＫ領域の増幅
Ｒ６培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートする。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムＤＮＡを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅産物の結果を配列決定する。配列決定データは、ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＪＫ領域へと組み込まれることを示す。
【０１３４】
ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端二重交差欠失突然変異体の単離
アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるＢＨＩ寒天プレートに接種し、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら（1985）に従い、プレートから胞子を回収し、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと接種し、プレートを、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。２０％グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、ＢＨＩ寒天プレートへと播種する。プレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のＢＨＩ寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンを含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択する。
【０１３５】
二重交差突然変異体の同定および検証
ＰＣＲを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、ｓｐｎＪ遺伝子およびｓｐｎＫ遺伝子内で結合するようにデザインして、ＰＣＲ増幅に用いる。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。ｓｐｎＫ遺伝子の５’末端の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、ＰＣＲ産物のサイズに基づいてこれらを選択する。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列は、ｓｐｎＫ遺伝子のＡＴＧ開始コドンおよび５’末端の欠失を示す。
【０１３６】
振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成
二重交差突然変異体の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる。
【０１３７】
実施例６．２：ｓｐｎＫインフレーム欠失ベクターの構築
スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株のゲノムＤＮＡを用いて、２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（Hopwoodら、1985）。第１の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、第１の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ上流に位置する。第２の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、第１の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、ＰＣＲ増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるＰＣＲ産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドｐＯＪ２６０の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌（E. coli）コンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびＤＮＡ配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）において、ｓｐｎＫ遺伝子の第１の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインをインフレーム欠失させるのに用いた。プラスミドｐＯＪ２６０内で結果として得られる、欠失させたｓｐｎＫ遺伝子断片の配列を、表４に示す。したがって、ｓｐｎＫ遺伝子の欠失には、配列：配列番号１１が含まれるであろう。
【０１３８】
【表４】
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2013531976.tif 000009
2013531976.tif 000010
【０１３９】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ欠失ベクターのコンジュゲーション
ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明され、実施例２で例示される方法に従って実施する。ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。
【０１４０】
トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのｓｐｎＫ領域の増幅
Ｒ６培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートする。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムＤＮＡを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＫ領域へと組み込まれることを示す。
【０１４１】
二重交差ｓｐｎＫインフレーム欠失突然変異体の単離
アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるＢＨＩ寒天プレートに接種し、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら（1985）に従い、プレートから胞子を回収し、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと接種し、プレートを、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。２０％グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、ＢＨＩ寒天プレートへと播種する。プレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のＢＨＩ寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンを含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択する。
【０１４２】
二重交差突然変異体の同定および検証
ＰＣＲを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、ｓｐｎＫ遺伝子内で結合するようにデザインして、ＰＣＲ増幅に用いる。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。ｓｐｎＫ遺伝子における第１の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、ＰＣＲ産物のサイズに基づいてこれらを選択する。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列は、ｓｐｎＫ遺伝子における第１の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を示す。
【０１４３】
振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成
二重交差突然変異体の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる。
【０１４４】
実施例６．３：ｓｐｎＫインフレーム欠失ベクターの構築
スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株のゲノムＤＮＡを用いて、２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（Hopwoodら、1985）。第１の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、第２の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ上流に位置する。第２の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、第２の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、ＰＣＲ増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるＰＣＲ産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドｐＯＪ２６０の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌（E. coli）コンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびＤＮＡ配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）において、ｓｐｎＫ遺伝子の第２の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインをインフレーム欠失させるのに用いた。プラスミドｐＯＪ２６０内で結果として得られる、欠失させたｓｐｎＫ遺伝子断片の配列を、表５に示す。したがって、ｓｐｎＫ遺伝子の欠失には、配列：配列番号１２が含まれるであろう。
【０１４５】
【表５】
2013531976.tif 000011
2013531976.tif 000012
2013531976.tif 000013
【０１４６】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ欠失ベクターのコンジュゲーション
ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明され、実施例２で例示される方法に従って実施する。ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。
【０１４７】
トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのｓｐｎＫ領域の増幅
Ｒ６培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートする。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムＤＮＡを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、ｓｐｎＫインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＫ領域へと組み込まれることを示す。
【０１４８】
二重交差ｓｐｎＫインフレーム欠失突然変異体の単離
アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるＢＨＩ寒天プレートに接種し、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら（1985）に従い、プレートから胞子を回収し、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと接種し、プレートを、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。２０％グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、ＢＨＩ寒天プレートへと播種する。プレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のＢＨＩ寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンを含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択する。
【０１４９】
二重交差突然変異体の同定および検証
ＰＣＲを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、ｓｐｎＫ遺伝子内で結合するようにデザインして、ＰＣＲ増幅に用いる。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。ｓｐｎＫ遺伝子における第２の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、ＰＣＲ産物のサイズに基づいてこれらを選択する。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列は、ｓｐｎＫ遺伝子における第２の推定Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を示す。
【０１５０】
振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成
二重交差突然変異体の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる。
【０１５１】
実施例６．４：ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端欠失ベクターの構築
スピノシンＡおよびスピノシンＤの生成菌株のゲノムＤＮＡを用いて、２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（Hopwoodら、1985）。第１の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、ｓｐｎＫ遺伝子の塩基対１１４１のすぐ上流に位置する。第２の増幅断片は、約１，５００ｂｐの長さであり、ｓｐｎＫ遺伝子の終始コドンのすぐ下流に位置し、ｓｐｎＬ遺伝子の一部を包含する。当業者に知られる方法を用いて、ＰＣＲ増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるＰＣＲ産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドｐＯＪ２６０の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌（E. coli）コンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびＤＮＡ配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）において、ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端を欠失させるのに用いた。プラスミドｐＯＪ２６０内で結果として得られる、欠失させたｓｐｎＫ遺伝子断片の配列を、表６に示す。したがって、ｓｐｎＫ遺伝子の欠失には、配列：配列番号１３が含まれるであろう。
【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）へのｓｐｎＫ欠失ベクターのコンジュゲーション
ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端欠失構築物を保有する大腸菌（E. coli）細胞の、サッカロポリスポラ・スピノーサ（Saccharopolyspora spinosa）とのコンジュゲーションは、Matsushimaら（1994）において説明され、実施例２で例示される方法に従って実施する。ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。
【０１５４】
トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのｓｐｎＫ領域の増幅
Ｒ６培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのナリジクス酸を補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、ＢＨＩプレートから、５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンで補充したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地へと接種する。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、２９℃で７２時間にわたりインキュベートする。７２時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムＤＮＡを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムＤＮＡを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、ｓｐｎＫＬ領域へと組み込まれることを示す。
【０１５５】
二重交差ｓｐｎＫ３’末端欠失突然変異体の単離
アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるＢＨＩ寒天プレートに接種し、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら（1985）に従い、プレートから胞子を回収し、２０％のグリセロール中、−８０℃で保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと接種し、プレートを、２９℃で１４日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。２０％グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、ＢＨＩ寒天プレートへと播種する。プレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のＢＨＩ寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のＢＨＩ寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを２９℃で１０日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。５０μｇ／ｍＬのアプラマイシンを含有するＢＨＩ寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、ＰＣＲを用いる検証のために選択する。
【０１５６】
二重交差突然変異体の同定および検証
ＰＣＲを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、ｓｐｎＫ遺伝子およびｓｐｎＬ遺伝子内で結合するようにデザインして、ＰＣＲ増幅に用いる。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、ＰＣＲ産物のサイズに基づいてこれらを選択する。ＰＣＲ断片のサイズおよびＤＮＡ配列は、ｓｐｎＫ遺伝子の３’末端の欠失を示す。
【０１５７】
振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成
二重交差突然変異体の発酵は、Ｂｕｒｎｓら（ＷＯ２００３０７０９０８）により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Ｂａｌｔｚら（米国特許第６，１４３，５２６号）により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンＪおよびスピノシンＬを生成させる。
【０１５８】
言及された全ての特許および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。前出は、本発明を例示するものであり、これを限定するものとしてはみなさないものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲により規定されるが、これらの特許請求の範囲の同等物もその中に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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