(57)【要約】  可溶性二量体タンパク質に関する組成物および方法が記載されている。該二量体タンパク質は、二量体化ドメインを介して連結されている第１および第２のポリペプチド融合物を含み、それぞれのポリペプチド融合物は、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応する第１および第２の単量体ドメインを含む。該単量体ドメインは、二量体化ドメインに対してアミノ末端およびカルボキシル末端に位置し得る。あるいは、該単量体ドメインは、二量体化ドメインに対してカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにタンデムに位置し得る。該二量体タンパク質は、治療、診断および研究のための方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２を含む可溶性ポリペプチド融合物であって：
Ｐ１は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第１のポリペプチドであり；
Ｌ１は第１のポリペプチドリンカーであり；
Ｄは二量体化ドメインであり；
Ｌ２は第２のポリペプチドリンカーであり；
Ｐ２は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第２のポリペプチドであり；
該ポリペプチド融合物は、ＣＤ１５５の細胞外ドメイン（配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３）に特異的に結合することができる、融合物。
【請求項２】
アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含む可溶性ポリペプチド融合物であって：
Ｐ１は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第１のポリペプチドであり；
Ｌ１は第１のポリペプチドリンカーであり；
Ｄは二量体化ドメインであり；
Ｌ２は第２のポリペプチドリンカーであり；
Ｐ２は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第２のポリペプチドであり；
該ポリペプチド融合物は、ＣＤ１５５の細胞外ドメイン（配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３）に特異的に結合することができる、融合物。
【請求項３】
Ｐ１およびＰ２の少なくとも１つが、配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と１００％同一性を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド融合物。
【請求項４】
Ｐ１およびＰ２の少なくとも１つが、配列番号：１８の残基２３−１３９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド融合物。
【請求項５】
Ｄが免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド融合物。
【請求項６】
Ｌ１が１５から３２個のアミノ酸残基からなり、該残基の１から８個がシステイン残基である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド融合物。
【請求項７】
Ｌ２が、複数のグリシン残基を含み、少なくとも１個のセリン残基を含んでいてもよい、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド融合物。
【請求項８】
Ｌ２が、配列番号：２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド融合物。
【請求項９】
配列番号：１８の残基２３−４９３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド融合物。
【請求項１０】
配列番号：２０の残基２３−５０８または２３−５０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド融合物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
以下の作動可能に連結した成分：
転写プロモーター；
請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチド融合物をコードするＤＮＡセグメント；および
転写ターミネーター
を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを導入されている培養細胞であって、ＤＮＡセグメントを発現する、培養細胞。
【請求項１４】
ポリペプチド融合物を製造する方法であって：
請求項１２に記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養すること、ここに、該細胞はＤＮＡセグメントを発現し、コードされたポリペプチド融合物が生産される；および
該ポリペプチド融合物を回収すること
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の二量体タンパク質；および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
【請求項１６】
Ｔ細胞介在免疫障害を処置する方法であって、有効量の請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチド融合物を、該Ｔ細胞介在免疫障害を有する対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
該自己免疫疾患が、リウマチ性関節炎および多発性硬化症から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１０年６月９日に出願された米国仮出願番号第６１／３５２，８７３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞表面受容体は、同種リガンドへの結合を介して種々の生物学的効果を介在する。受容体は、一般的に、リガンド、例えば、サイトカインまたは対抗受容体を高親和性で結合し、特定の受容体サブユニットの細胞質部分を介して細胞に該結合事象を伝達する１つ以上の内在性膜タンパク質からなる。細胞表面受容体は、細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかのクラスにグループ分けされている。
【０００３】
細胞表面受容体の生理学的重要性は、免疫細胞機能を介在することにおける共刺激受容体の役割により例示される。Ｔ細胞は、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されるＭＨＣ分子および外来ペプチドによるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）関与により活性化される。プロフェッショナル(professional)ＡＰＣはまた、Ｔ細胞上の他の受容体と関与し、活性化に寄与する多くの共刺激分子を発現する。Ｔ細胞活性化を阻害することが証明された手段は、これらの共刺激分子の関与の妨害である。中でも注目すべきは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ＣＤ２８分子を介する重要な共刺激性シグナルを防止し、それによりＴ細胞応答を妨害するために使用することができる。
【０００４】
他の共刺激分子が同定されており、これらは対抗構造が発現される特殊な状況において重要である傾向がある。寄与が最近になってようやく明らかにされた１つのこのような分子は、共刺激受容体ＣＤ２２６である。ＣＤ２２６に対する対抗構造は、自己免疫または自己炎症性疾患においてリンパ球により一般的に浸潤される組織、例えば、上皮、内皮、滑膜細胞およびＣＮＳの細胞において広範に発現されるネクチンファミリータンパク質ＰＶＲ（ＣＤ１５５）およびネクチン−２（ＣＤ１１２）である。重要なことには、ＣＤ２２６を介するシグナルは、Ｔ細胞が活性化され、炎症組織における損傷を引き起こす自己免疫疾患を含む、Ｔ細胞が非プロフェッショナルＡＰＣにより刺激されている状況におけるＴ細胞活性化に重要であることが示されている（Gilfillanら J. Exp. Med. 205:2965-2973, 2008; Iguchi-Manakaら J. Exp. Med. 205:2959-2964, 2008参照）。さらに、ＣＤ２２６における多型は、最近、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病、グレーブス病およびウェゲナー肉芽腫を含む多くの自己免疫性状態を発症する危険性と関連があるとされている（International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Genes Immun. 10:11-14, 2009; Haflerら Genes Immun. 10:5-10, 2009; Maier and Hafler, Immunol. Rev. 229:322-336, 2009; Maitら “Non-synonymous variant (Gly307Ser) in CD226 is associated with susceptibility to multiple autoimmune diseases,” Rheumatology (Oxford) (March 24, 2010 [Epub ahead of print])参照）。したがって、免疫細胞機能におけるＣＤ２２６介在シグナルの妨害に関して適切な根拠が存在する。
【０００５】
ＶＳＴＭ３（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２４６６７号においてＢ７Ｒ１としても称される）は、ＣＤ２２６と同じ対抗構造であるＰＶＲおよびネクチン−２にも結合することが示されているＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。事実、ＶＳＴＭ３およびＣＤ２２６は、ＰＶＲおよびネクチン−２に対する結合に関して交差競合し、それらは同一の領域でなければ重複して結合するが、ＶＳＴＭ３の方が若干高いアフィニティーで結合するようであることが示されている。
【０００６】
多数の細胞表面受容体の可溶性形態が知られている。これらの可溶性受容体は、その細胞表面対応物のリガンド結合ドメインに対応する。例えば、天然可溶性サイトカイン受容体は、サイトカイン応答を阻害し、輸送タンパク質として働く（例えば、Aggarwal and Puri, “Common and Uncommon Features of Cytokins and Cytokin Receptors:  An Overview,” in Aggarwal and Puri, eds., Human Cytokins:  Their Role in Disease and Therapy, Blackwell Science, 1995, 3-24参照）。加えて、融合タンパク質の使用を介する可溶性受容体ポリペプチドの二量体化が、これらの可溶性受容体の結合特性を増強し得、これらの同種リガンドの治療的に有用なアンタゴニストとなることができることが見出されている。典型的なこのような二量体融合物は免疫グロブリン融合物である（例えば、Sledziewskiら 米国特許第５，１５５，０２７および５，５６７，５８４号；Jacobsら 米国特許第５，６０５，６９０号；Wallnerら 米国特許第５，９１４，１１１号；およびAshkenazi and Chamow, Curr. Opin. Immunol. 9:195-200, 1997参照）。
【０００７】
例えば、可溶性ＶＳＴＭ３は、Ｔ細胞介在疾患の動物モデルにおいて治療的に有効であることが示されている。特に、慣用の二価型における可溶性ＶＳＴＭ３−Ｆｃ二量体が、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答により測定されるとき、インビボでＴ細胞応答を阻害すること、およびかかる二量体がコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける疾患発症および進行を減少させることが見出されている（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２４６６７号参照）。可溶性ＶＳＴＭ３−ＶＡＳＰ四量体はまた、ＣＩＡモデルにおいて有効であることが示されている（Ｓｅｅ  ｉｄ）。
【０００８】
多数の細胞型の増殖および分化を含む種々の生物学的効果はまた、サイトカインと総称される小さい可溶性タンパク質によって媒介される（例えば、Araiら Annu. Rev. Biochem. 59:783, 1990; Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311, 1991; Paul and Seder, Cell 76:241, 1994参照）。サイトカイングループを構成するタンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子および他の調節分子を含む。
【０００９】
細胞表面受容体およびサイトカインの証明されたインビボ活性は、受容体およびサイトカインの生物学的活性を媒介する分子の臨床的可能性および必要性を説明する。例えば、免疫細胞応答を媒介するにおいて共刺激受容体の活性を含む炎症性受容体およびサイトカインの証明されたインビボ活性は、炎症性分子のアンタゴニストの莫大な臨床的可能性および必要性を説明する。特に、既知の融合タンパク質型と比較して改良された活性を有するこのような細胞表面受容体およびサイトカインの可溶性融合物の必要性が存在する。本明細書に記載の本発明は、これらの、および他の必要性に十分である。
【発明の概要】
【００１０】
発明の簡潔な概要
１つの局面において、本発明は、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２またはＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含む可溶性ポリペプチド融合物であって、Ｐ１は（ｉ）第１の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメント、または（ｉｉ）第１のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであり；Ｌ１は第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは二量体化ドメインであり；Ｌ２は第２のポリペプチドリンカーであり；Ｐ２は（ｉ）第２の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメント、または（ｉｉ）第２のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである融合物を提供する。関連局面において、本発明は、第１の可溶性ポリペプチド融合物および第２の可溶性ポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質であって、第１および第２の可溶性ポリペプチド融合物はそれぞれ、上記式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｐ２またはＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含む二量体タンパク質を提供する。
【００１１】
Ｐ１が第１の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであり、そして／またはＰ２が第２の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである上記可溶性ポリペプチド融合物または二量体タンパク質の１つの態様において、第１の細胞表面受容体および／または第２の細胞表面受容体は個々に、４−１ＢＢ；ＡＣＴＨ受容体；アクチビン受容体；ＢＬＴＲ（ロイコトリエンＢ４受容体）；ＢＭＰ受容体；Ｃ３ａ受容体；Ｃ５ａ受容体；ＣＣＲ１；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５；ＣＣＲ６；ＣＣＲ７；ＣＣＲ８；ＣＣＲ９；ＣＤ１９；ＣＤ２２；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ４０；ＣＤ７０；ＣＤ８０；ＣＤ８６；ＣＴＬＡ−４；ＣＤ２２６；ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）；ＣＤ１１２；ＣＤ１５５；Ｂ７Ｈ６；ＮＫｐ３０；ＩＣＡＭ；ＶＬＡ−４；ＶＣＡＭ；ＣＴ−１受容体；ＣＸ３ＣＲ１；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ２；ＣＸＣＲ３；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５；Ｄ６；ＤＡＲＣ；ＤｃＲ３；ＤＲ４；ＤＲ５；ＤｃＲ１；ＤｃＲ２；ＥＣＲＦ３；Ｆａｓ；ｆＭＬＰ受容体；Ｇ−ＣＳＦ受容体；ＧＩＴ受容体；ＧＭ−ＣＳＦ受容体；成長ホルモン受容体；ＨＶＥＭ；ＢＴＬＡ；インターフェロン−α受容体；インターフェロン−β受容体；インターフェロン−γ受容体；ＩＬ−１受容体タイプＩ；ＩＬ−１受容体タイプＩＩ；ＩＬ−１０受容体；ＩＬ−１１受容体；ＩＬ−１２受容体；ＩＬ−１３受容体；ＩＬ−１５受容体；ＩＬ−１６受容体（ＣＤ４）；ＩＬ−１７受容体Ａ；ＩＬ−１７受容体Ｂ；ＩＬ−１７受容体Ｃ；ＩＬ−１７受容体Ｄ；ＩＬ−１７受容体Ｅ；ＩＬ−１８受容体；ＩＬ−２受容体；ＩＬ−３受容体；ＩＬ−４受容体；ＩＬ−５受容体；ＩＬ−６受容体；ＩＬ−７受容体；ＩＬ−９受容体；ＩＬ−２０受容体Ａ；ＩＬ−２０受容体Ｂ；ＩＬ−２１受容体；ＩＬ−２２受容体Ａ；ＩＬ−２２受容体Ｂ；ＩＬ−２８受容体Ａ；ＩＬ−２７受容体Ａ；ＩＬ−３１−受容体Ａ；ＢＣＭＡ；ＴＡＣＩ；ＢＡＦＦ受容体；免疫調節セマフォリン受容体ＣＤ７２；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＧＰＣＲ；リポキシンＡ４受容体；リンホトキシンβ受容体；リゾリン脂質成長因子受容体；ニューロキニン１；エンドルフィンに対するオピオイドμ、δおよびκ受容体；オンコスタチンＭ受容体；オステオポンチン受容体；オステオプロテゲリン；Ｏｘ４０；ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰ受容体；ＰＡＦ受容体；ポックスウイルス；ＩＦＮα／β受容体ホモログ；ポックスウイルスＩＦＮγ受容体ホモログ；ポックスウイルスＩＬ−１β受容体ホモログ；ポックスウイルス膜結合Ｇタンパク質結合受容体ホモログ；ポックスウイルス分泌ケモカイン結合タンパク質；ポックスウイルスＴＮＦ受容体ホモログ；プロラクチン受容体；ＲＡＮＫ；ＲＯＮ受容体；ＳＣＦ受容体；ソマトスタチン受容体；Ｔ１／ＳＴ２；ＴＧＦ−ベータ受容体；ＴＮＦ受容体（例えば、ｐ６０およびｐ８０）；ＴＮＦＲＳＦ１９；ＴＰＯ受容体；ＵＳ２８；ＸＣＲ１；エリスロポエチン受容体；成長ホルモン受容体；白血病阻害因子受容体；およびＣ−ｋｉｔ受容体からなる群から選択される。Ｐ１およびＰ２の両方が細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体��しくはフラグメントであるとき、第１および第２の細胞表面受容体は同じか、または異なっていてよい。
【００１２】
Ｐ１が第１のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであり、そして／またはＰ２が第２のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである他の態様において、第１のサイトカインおよび／または第２のサイトカインは個々に、α−ＭＳＨ；９Ｅ３／ｃＣＡＦ；ＡＣＴＨ；アクチビン；ＡＫ１５５；アンギオスタチン；Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ；ＡＰＲＩＬ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＬＲ１リガンド／ＢＣＡ−１／ＢＬＣ／ＣＸＣＬ１３；ＢＭＰファミリー；ＢＲＡＫ；カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）；伝染性軟属腫ウイルスのＣＣケモカイン；ＣＣＬ２７；ＣＣＬ２８；ＣＤ１００／Ｓｅｍａ４Ｄ；ＣＤ２７リガンド；ＣＤ３０リガンド；ＣＤ４０リガンド；ＣＫβ８−１／ＭＰＩＦ−１／ＣＣＬ２３；ＣＬＦ／ＣＬＣ；ＣＳＦ−１；ＣＴ−１；ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、βＴＧおよびＮＡＰ−２／／ＣＸＣＬ７；ＣＸＣＬ１６；デフェンシン；ＥＬＣ／ＭＩＰ−３β／エクソダス(Exodus)−３／ＣＣＬ１９；ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５；エンドルフィン；エンドスタチン；エオタキシン２／ＭＰＩＦ−２／ＣＣＬ２４；エオタキシン／ＣＣＬ１１；エリスロポエチン；エクソダス−１／ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α（ＳＣＹＡ２０）；Ｆａｓリガンド；Ｆｌｔ−３リガンド；ｆＭＬＰ；フラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＣＰ−２／ＣＸＣＬ６；ＧＭ−ＣＳＦ；成長ホルモン；ＨＣＣ−１／ＣＣＬ１４；ＨＣＣ−４／ＣＣＬ１６；高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）；ヒトカテリシジン抗菌性ペプチドＬＬ−３７；Ｉ−３０９／ＣＣＬ１；ＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮωリガンド；ＩＦＮγ；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１；ＩＬ−１２；ＩＬ−１３；ＩＬ−１５；ＩＬ−１６；ＩＬ−１７Ａ；ＩＬ−１７Ｂ；ＩＬ−１７Ｃ；ＩＬ−１７Ｄ；ＩＬ−１７Ｅ；ＩＬ−１７Ｆ；ＩＬ−１８；ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−２；ＩＬ−２７；ＩＬ−３；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８；ＩＬ−９；ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０；ＩＬ−１９；ＩＬ−２０；ＩＬ−２１；ＩＬ−２２；ＩＬ−２３；ＩＬ−２４；ＩＬ−２６；ＩＬ−３１；ケラチン生成細胞成長因子；ＫＳＨＶ関連ＩＬ−６リガンド；レプチン；ロイコタクチン(Leukotactin)１／ＨＣＣ−２／ＭＩＰ−１δ／ＣＣＬ１５；ロイコトリエンＢ４；ＬＩＧＨＴ；リポキシン；リンホタクチン／ＸＣＬ１；リンホトキシンαおよびβ；リゾリン脂質成長因子；マクロファージ由来ケモカイン；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）；ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８、ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７、ＭＣＰ−４／ＣＣＬ１３、およびＭＣＰ−５／ＣＣＬ１２；メトキシエストラジオール；ＭＧＳＡ／ＧＲＯ／ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３；ＭＩＦ；ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９；ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４；ＭＩＰ−１γ／ＭＲＰ−２／ＣＣＦ１８／ＣＣＬ９／１０；Ｍｕ  Ｃ１０／ＣＣＬ６；オンコスタチンＭ；オステオポンチン；パラポックスウイルス（オルフウイルス(Orf Virus)）ＩＬ−１０ホモログ；ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＣＫ１／ＡＭＡＣ−１／ＣＣＬ１８；ＰＤＧＦ−Ａ；ＰＤＧＦ−Ｂ；ＰＤＧＦ−Ｃ；ＰＤＧＦ−Ｄ；血小板活性化因子；���小板因子４／ＣＸＣＬ４；上皮細胞増殖因子関連ポックスウイルス増殖因子；ポックスウイルス分泌補体制御タンパク質；オルフウイルスのポックスウイルス血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ホモログ；プロラクチン；ＲＡＮＫリガンド；ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５；Ｓ１００Ａ１２；ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２；ＳＥＲＰ−１、分泌ポックスウイルスセルプン；ＳＬＣ（６Ｃｋｉｎｅ）／エクソダス−２／ＴＣＡ−４／ＣＣＬ２１；ソマトスタチン；幹細胞因子；サブスタンスＰ；ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７；ＴＣＡ３／マウスＣＣＬ１；ＴＥＣＫ／ＣＣＬ２５；ＴＧＦβ；トロンボポエチン；ＴＮＦα；ＴＳＧ−６；ＴＷＥＡＫ；ワクシニアウイルスセマフォリン；ｖＣＸＣ−１およびｖＣＸＣ−２；ＶＥＧＦ；ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ；ならびにウイルスＩＬ−１０変異体からなる群から選択される。Ｐ１およびＰ２の両方がサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであるとき、第１および第２のサイトカインは同じか、または異なっていてよい。
【００１３】
１つの態様において、Ｐ１およびＰ２のそれぞれは、ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである。例えば、上記式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２またはＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを有する可溶性ポリペプチド融合物の特定の変異において、Ｐ１は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第１のポリペプチドであり、Ｐ２は配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも９５％同一性を有する第２のポリペプチドであり；該ポリペプチド融合物は、ＣＤ１５５の細胞外ドメイン（配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３）に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、少なくとも１つのＰ１およびＰ２は、配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と１００％同一性である。他の変異において、少なくとも１つのＰ１およびＰ２は、配列番号：２の残基６９に対応するアミノ酸位置に非システイン残基、例えば、チロシンを含む。例えば、特定の態様において、少なくとも１つのＰ１およびＰ２は、配列番号：１８の残基２３−１３９に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
上記ポリペプチド融合物または二量体タンパク質に従って使用するために特に適当な二量体化ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。例えば、特異的変異において、二量体化ドメインＤは、Ｆｃフラグメント、例えば、ヒトγ１Ｆｃフラグメントである。
【００１５】
上記ポリペプチド融合物または二量体タンパク質のいくつかの態様において、リンカーＬ１は１５から３２個のアミノ酸残基からなり、これらの残基の１から８個（例えば、２）はシステイン残基である。特定の変異において、Ｌ１は、免疫グロブリンヒンジ領域またはその変異体を含む。例えば、特定の態様において、Ｌ１は、免疫グロブリンヒンジ変異体（例えば、ヒトγ１ヒンジ変異体）を含み、Ｅｕ残基２２０に対応するシステイン残基は、セリンにより置換される。
【００１６】
上記ポリペプチド融合物または二量体タンパク質の使用のための特に適当なＬ２リンカーは、複数のグリシン残基を含み、所望により少なくとも１個のセリン残基を含むリンカーを含む。例えば、式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２を含むポリペプチド融合物、または第１および第２のこのようなポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質の特定の態様において、Ｌ２は、配列番号：２５に示されるアミノ酸配列を含む。式Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含むポリペプチド融合物、または第１および第２のこのようなポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質の特定の態様において、Ｌ２は式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号：２６）を含み、ｎは、３から５（３と５を含む）の整数である。
【００１７】
Ｐ１およびＰ２のそれぞれがＶＳＴＭ３の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２またはＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含むポリペプチド融合物の特異的変異において、ポリペプチド融合物は、（ａ）配列番号：１８の残基２３−４９３に示されるアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号：２０の残基２３−５０８または２３−５０７に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。同様に、本発明の二量体タンパク質の特異的変異において、第１および第２のポリペプチド融合のそれぞれは、（ａ）配列番号：１８の残基２３−４９３に示されるアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号：２０の残基２３−５０８または２３−５０７に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、上記ポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチドを提供する。関連局面において、本発明は、このようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、以下の作動可能に連結した成分：転写プロモーター；上記ポリペプチド融合物をコードするＤＮＡセグメント；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。
【００１９】
さらに他の関連局面において、本発明は、このようなベクターを含む培養細胞、ならびに上記ポリペプチドまたは二量体タンパク質を生産するための方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明の培養細胞は、以下の作動可能に連結した成分：転写プロモーター；上記ポリペプチド融合物をコードするＤＮＡセグメント；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを含み；ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチド融合物を発現する。ポリペプチド融合物を作製する方法の特定の変形において、方法は、（ｉ）ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチド融合物を発現し、コードされたポリペプチド融合物が生産される上記発現ベクターを含む細胞を培養すること；および（ｉｉ）可溶性ポリペプチド融合物を回収することを含む。同様に、二量体タンパク質を作製する方法の特定の変形において、方法は、（ｉ）ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチド融合物を発現し、コードされたポリペプチド融合物が二量体タンパク質として生産される上記発現ベクターを含む細胞を培養すること；および（ｉｉ）二量体タンパク質を回収することを含む。
【００２０】
本発明は、上記ポリペプチド融合物または二量体タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに含む。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、上記二量体ＶＳＴＭ３タンパク質を使用してＴ細胞介在免疫障害を処置する方法を提供する。該方法は、一般的に、有効量の二量体ＶＳＴＭ３タンパク質をＴ細胞介在免疫障害を有する対象に投与することを含む。本明細書に記載されている二量体ＶＳＴＭ３タンパク質での処置に適しているＴ細胞介在免疫障害は、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応を含む。特異的変異において、該方法は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）（例えば、脊髄−眼(spino-optical)ＭＳ、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ））、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、セリアック病、神経炎、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、白斑症、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症および特発性肺線維症から選択される自己免疫疾患を処置するための方法である。
【００２２】
本発明のこれらの、および他の局面は、以下の発明の詳細な説明および図面に基づいて明らかになる。
【００２３】
定義
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての専門および科学用語は、記載されている方法および組成物に関係する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される以下の用語および句は、特に示さない限り、それらに帰せられる意味を有する。
【００２４】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」なる用語は、他に明らかに示される文脈がない限り、複数の指示対象を含む。
【００２５】
「ポリペプチド」は、天然または合成的に生産されたのいずれにせよ、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドが、一般的に「ペプチド」と称される。
【００２６】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば、炭水化物基を含む。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質に加えられ得、細胞の型で変化する。タンパク質は、本明細書においてそのアミノ酸骨格構造に関して定義され；置換基、例えば、炭水化物基は、一般的に明記されていないが、それにもかかわらず存在し得る。
【００２７】
「アミノ末端」（または「Ｎ−末端」）および「カルボキシル末端」（または「Ｃ−末端」）なる用語は、ポリペプチド内の位置を示すために、本明細書において使用される。文脈上認められるとき、これらの用語は、近接または相対位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列または部分を基準にして使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、完全ポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも位置しない。
【００２８】
「対応」なる用語は、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用されているとき、配列が最適にアラインされているとき、複数の配列における対応する位置を意味する。
【００２９】
ポリペプチドまたはタンパク質間の「非共有結合」は、水素結合、立体相互作用、疎水性相互作用およびイオン相互作用を含む。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる用語は、本明細書において同義的に使用され、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然および合成分子の組合せから製造され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語「ｂｐ」）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）またはキロベース（「ｋｂ」）として示される。文脈が許容するとき、後者２つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを示し得る。該用語が二本鎖分子において適用されるとき、全長を示すために使用され、「塩基対」なる用語と同等であると理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖が長さにおいてわずかに異なり得、それらの末端が酵素的開裂の結果として、ずれ得；したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対合し得ないことが当業者により認識される。このような非対合末端は、一般的に、２０ｎｔ長を越えない。
【００３１】
「セグメント」は、特定の特性を有するより大きな分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’の方向に読むとき、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする、より長いＤＮＡ分子、例えば、プラスミドまたはプラスミドフラグメントの一部である。また、本発明のポリペプチド融合物の文脈において、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントは、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントに加えて、本明細書に記載されている他のポリペプチドセグメント（例えば、リンカー、二量体化ドメイン）を含む、より長いポリペプチド融合物分子の一部である。
【００３２】
本明細書において使用される「単量体」または「単量体ドメイン」は、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントを意味する。
【００３３】
「発現ベクター」なる用語は、転写のために提供するさらなるセグメントに作動可能に連結した興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含む線状または環状のＤＮＡ分子を示すために使用される。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般的に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来であるか、または両方のエレメントを含み得る。
【００３４】
「プロモーター」なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を示すように当分野で認識される意味に対して本明細書において使用される。プロモーター配列は、いつもではないが一般的に、遺伝子の５’非コード領域において見出される。
【００３５】
「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの成分として、合成される細胞の分泌経路中においてより大きなポリペプチドを指向するポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列である。より大きなポリペプチドは、一般的に、分泌経路を介して輸送中に開裂され、分泌ペプチドが除去される。
【００３６】
「作動可能に連結」は、意図される目的に対して共に機能するように、２つ以上の存在物が互いに連結されて得ることを意味する。ＤＮＡセグメントを示すとき、該句は、例えば、コード配列が正しいリーディングフレームにおいて結合し、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントからターミネーターに進行することを示す。ポリペプチドを示すとき、「作動可能に連結」は、所望の機能が保持されている、共有（例えば、ジスルフィド結合による）および非共有（例えば、水素結合、疎水性相互作用または塩架橋相互作用による）結合配列の両方を含む。
【００３７】
「単離されたポリペプチド」は、夾雑細胞成分、例えば、炭水化物、脂質または天然においてポリペプチドと結合している他のタンパク質性不純物を本質的に含まないポリペプチドである。一般的に、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態、すなわち、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％以上純粋、例えば、９６％以上、９７％以上または９８％以上純粋、または９９％以上純粋におけるポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示す１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色後の単一のバンドの出現による。しかしながら、「単離」なる用語は、別の物理的形態、例えば、二量体またはグリコシル化もしくは誘導体化形態において同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３８】
「免疫グロブリン」は、脊椎動物生物体において抗体として機能する血清タンパク質である。「免疫グロブリン」または抗体、タンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）は、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧは主要なクラスを含み、血漿中に見いだされる２番目に豊富なタンパク質として通常存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と称される４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ文字γで識別される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンはγ１重鎖定常領域を含む。それぞれの免疫グロブリン重鎖は、種において所定のサブクラスに対して本質的に不変である定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる定常領域を有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は当分野で知られている。例えば、Ellisonら DNA 1:11-18, 1981; Ellisonら Nuc. Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kentenら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Senoら Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmannら Nature 332:323-327, 1988; Amsterら Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi and Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Bossら Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwellら Nature 298:380-382, 1982; van der Looら Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlinら J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogelら DNA 1:335-343, 1982; Breinerら Gene 18:165-174, 1982; Kondoら Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993；およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２２８参照。免疫グロブリン構造および機能の概要総説について、Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987;およびPadlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994参照。
【００３９】
「免疫グロブリンヒンジ」は、可変およびＣＨ１ドメインを結合している免疫グロブリン重鎖部分である。配列番号：２７内で、ヒンジは約残基９９から１１３（図１Ａにおいて示されるＥｕ残基２１６−２３０）である。
【００４０】
本明細書において使用される「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」なる用語は、同義であり、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合に関与する抗体の部分を示す。Ｆｃは、タンパク質結晶を容易に形成する抗体のフラグメントである「フラグメント結晶」を示す。タンパク質分解消化により最初に記載された別個のタンパク質フラグメントは、免疫グロブリンタンパク質の全体の一般構造を定義することができる。文献において最初に定義されているとおり、Ｆｃフラグメントは、ジスルフィド結合重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる。しかしながら、最近、該用語は、ＣＨ３、ＣＨ２および第２のこのような鎖とのジスルフィド結合二量体を形成するために十分なヒンジの少なくとも一部からなる一本鎖に適用されている。本明細書において使用されるＦｃなる用語は、天然に存在する配列の変異体を含む。
【００４１】
本明細書において使用される「二量体化ドメイン」は、２つのポリペプチドが二量体を形成するように生理学的条件下で結合するように、第２のポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチドを示す。第２のポリペプチドは、同じ、または異なるポリペプチドであってもよい。該ポリペプチドは、共有および／または非共有結合を介して互いに相互作用し得る。二量体化ドメインの例は、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１またはＣＬドメイン；ロイシンジッパードメイン（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパードメイン、例えば、Kostelneyら J. Immunol., 148:1547-1553, 1992参照；または酵母菌ＧＣＮ４ロイシンジッパードメイン）；イソロイシンジッパードメイン；二量体細胞表面受容体（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；またはインテグリンヘテロ二量体、例えば、ＬＦＡ−１またはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）の二量体領域；分泌される二量体リガンド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の二量体領域；例えば、Arakawaら J. Biol. Chem. 269:27833-27839, 1994、およびRadziejewskiら Biochem. 32:1350, 1993参照）；ならびに、ポリペプチドと少なくとも１つのシステイン残基を含む第２のポリペプチドとの間にジスルフィド結合を形成することができるように、少なくとも１つのシステイン残基（例えば、約１、２または３個から約１０個のシステイン残基）を含むポリペプチド（以下「合成ヒンジ」）を含む。本発明の好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域である。
【００４２】
「リンカー」または「ポリペプチドリンカー」なる用語は、ペプチド結合により結合され、２つの別々の、別個のポリペプチド領域を連結する２つ以上のアミノ酸を示すために、本明細書において使用される。リンカーは、一般的に、別々のポリペプチド領域が別々の機能を行うことを可能にするように設計される（例えば、他のポリペプチド領域に連結した二量体化ドメインが、別の対応する二量体化ドメインと結合し、二量体を形成する）。リンカーは、天然配列、その変異体または合成配列の一部であり得る。リンカーはまた、略語「Ｌ」を使用して本明細書において示される。「Ｌ」での下付き（例えば、「１」または「２」）の使用は、アミノ酸配列に対して同じか、または異なっていてもよいポリペプチド鎖内の複数のリンカーを区別するために、本明細書において使用される。
【００４３】
「変異体ＶＳＴＭ３遺伝子」または「変異体Ｂ７Ｒ１遺伝子」なる用語は、配列番号：２の修飾物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を示す。このような変異体は、ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）遺伝子の天然多型、ならびに配列番号：２のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子を含む。ＶＳＴＭ３遺伝子のさらなる変異体形態は、本明細書に記載されているヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変異体ＶＳＴＭ３遺伝子は、遺伝子が、ストリンジェント条件下で、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその補体と、ハイブリダイズするか否かを決定するこよにより同定することができる。
【００４４】
あるいは、変異体ＶＳＴＭ３遺伝子は、配列比較により同定することができる。２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が最大の一致に対してアラインされたとき同じであるとき、２つのアミノ酸配列は「１００％アミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が最大の一致に対してアラインされたとき同じであるとき、２つのヌクレオチド配列は「１００％ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Madison, Wisconsin）により生産された、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  バイオインフォマティクスのコンピューターの一組において含まれているもののような標準ソフトウェアプログラムを使用して行うことができる。最適なアラインメントを決定することにより２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者によく知られている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genome and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wuら (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998)参照）。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が互いに比較して少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を有するとき、該２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、「実質的に同様の配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有すると考える。配列同一性を決定するための特定の方法は以下に記載されている。
【００４５】
変異体ＶＳＴＭ３遺伝子または変異体ＶＳＴＭ３ポリペプチドを同定するために使用される特定の方法にかかわらず、変異体遺伝子によってコードされる変異体遺伝子またはポリペプチドは、抗−ＶＳＴＭ３抗体に特異的に結合する能力により機能的に特徴付けられ得る。変異体ＶＳＴＭ３遺伝子または変異体ＶＳＴＭ３ポリペプチドはまた、生物学的または生化学的アッセイ、例えば、本明細書に記載されているものを使用して、ポリペプチドがＣＤ１５５に結合する能力により機能的に特徴付けられ得る。
【００４６】
「対立遺伝子変異体」なる用語は、同じ染色体座を占める遺伝子のあらゆる２つ以上の代替形態を示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は変異を介して天然に生じ、集団内で表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントであるか（コードされたポリペプチドにおいて変化なし）、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。対立遺伝子変異体なる用語はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すために、本明細書において使用される。
【００４７】
「オルソログ」なる用語は、異なる種由来のポリペプチドまたはタンパク質の機能性対応物である１つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示す。オルソログ間の配列の違いは、種形成の結果である。
【００４８】
本明細書において使用される「Ｔ細胞介在免疫障害」なる用語は、少なくとも一部においてＴ細胞活性により介在される病理を有する何らかの疾患または障害を示す。Ｔ細胞介在免疫障害は、例えば、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、多発性硬化症）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応を含む。Ｔ細胞免疫応答により主に特徴付けられる疾患に加えて、Ｔ細胞介在免疫障害は、例えば、Ｔ−細胞依存性Ｂ細胞介在適応症、例えば、抗体介在自己免疫をさらに含む。このような疾患または障害は、本明細書にさらに記載されているとおり、本発明の二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）タンパク質を使用する処置方法に特に適している。
【００４９】
本明細書に記載されている可溶性二量体タンパク質の対象への投与による疾患の処置の文脈において「有効量」なる用語は、疾患の発生を阻害または疾患の１つ以上の症状を改善するために十分であるかかる分子の量を示す。例えば、本明細書に記載されている可溶性二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）タンパク質の対象への投与によるＴ細胞介在免疫障害の処置の特定の文脈において、「有効量」なる用語は、Ｔ細胞介在免疫障害の発生を阻害またはＴ細胞介在免疫障害の１つ以上の症状を改善するように対象におけるＴ細胞介在応答を調節するために十分であるかかる分子の量を示す。有効量の薬剤が「有効なレジメン」において本発明の方法にしたがって投与される。「有効なレジメン」なる用語は、疾患の処置または予防を成し遂げるために十分な投与される薬剤の量および投与頻度の組合せを示す。
【００５０】
標準分析方法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは、概数値であることが理解される。このような値が「約」Ｘまたは「およそ」Ｘとして示されているとき、Ｘの示す値は、正確には±１０％であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、典型的なヒト免疫グロブリンγ１重鎖の一部のアミノ酸配列（配列番号：２７）を説明する（Ellisonら Nucl. Acids Res. 10:4071, 1982に基づく）。アミノ酸配列番号は、Ｅｕ指針に基づく（Edelmanら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabatら Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991）。軽鎖定常領域（ＬＣ）および重鎖定常領域（ＨＣ）に対するジスルフィド結合に関与するＣｙｓ残基は、通常、示される。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの境界が示されている。
【００５２】
【図２】図２Ａ−２Ｃは、特定の免疫グロブリンＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を説明する。アミノ酸配列番号は、ＥＵ指針に基づく（Kabatら Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, 1991）。説明された配列は、野生型ヒト配列（「ｗｔ」；配列番号：２８）ならびにＦｃ−４８８（配列番号：２９）、Ｆｃ４（配列番号：３０）、Ｆｃ５（配列番号：３１）、Ｆｃ６（配列番号：３２）およびＦｃ７（配列番号：３３）と示される５つの変異体配列を含む。軽鎖定常領域（ＬＣ）および重鎖定常領域（ＨＣ）に対するジスルフィド結合に関与するＣｙｓ残基は、通常、示される。「．」は、その位置で野生型と同一を示す。＊＊＊は終始コドンを示し；Ｃ−末端  Ｌｙｓ残基はＦｃ６から除去されている。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの境界が示されている。
【００５３】
【図３】図３Ａ−３Ｆは、インビトロでの減少した増殖活性により測定されるとき、可溶性Ｂ７Ｒ１（ＶＳＴＭ３）タンパク質により誘導されるＴ細胞阻害を示す。実施例１３に記載されているとおり、３つのドナー由来のヒトＴ細胞を、抗−ＣＤ３抗体およびＰＶＲを発現するＰ８１５細胞の存在下で、可溶性Ｂ７Ｒ１（ＶＳＴＭ３）の非存在または存在下のいずれかでインキュベートした。３つの異なる可溶性Ｂ７Ｒ１タンパク質を、ＣＤ４＋（図３Ａ−３Ｃ）またはＣＤ８＋（図３Ｄ−３Ｆ）Ｔ細胞の増殖を阻害する能力について試験した。３つの異なる可溶性Ｂ７Ｒ１タンパク質を試験した：Ｂ７ｒ１（Ｇ２５−Ｐ１４１）  Ｃ６９Ｙ  Ｆｃ５バーベル、Ｂ７ｒ１（Ｇ２５−Ｐ１４１）  Ｃ６９Ｙ  Ｆｃ５タンデムおよびＢ７ｒ１−Ｆｃ５。
【００５４】
【図４】図４は、ｍＢ７Ｒ１−バーベルでの処置による実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）疾患スコアにおける減少を示す。ＥＡＥは、以下の実施例１４に記載されているマウスにおいて確立された。マウスを、ビヒクル単独（ＰＢＳ）、または可溶性Ｂ７Ｒ１バーベル構築物（ｍＢ７Ｒ１−バーベル）、二量体マウスＦｃ２構築物（ｍＢ７Ｒ１−Ｆｃ２）もしくはＶＡＳＰ構築物（ｍＢ７Ｒ１−ＶＡＳＰ）を含むビヒクルのいずれかで処置した（実施例１４参照）。それぞれの点は、１グループあたりｎ＝１０−１２匹のマウスに対する平均±ＳＥＭを示す。Ｂ７Ｒ１−バーベル−処置グループの疾患スコアは、ＰＢＳ−処置コントロールグループのものと異なった、＊＊反復測定ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５。
【００５５】
【図５】図５は、ｍＢ７Ｒ１−バーベルおよびｍＢ７Ｒ１−タンデムでの処置による関節炎疾患スコアにおける減少を示す。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、以下の実施例１７に記載されているマウスにおいて確立された。マウスを、ビヒクル単独（ＰＢＳ）、または可溶性Ｂ７Ｒ１バーベル構築物（ｍＢ７Ｒ１−バーベル）、タンデム構築物（ｍＢ７Ｒ１−タンデム）もしくはＶＡＳＰ構築物（ｍＢ７Ｒ１−ＶＡＳＰ）を含むビヒクルのいずれかで処置した（実施例１７参照）。それぞれの点は、１グループあたりｎ＝１５匹のマウスに対する平均±ＳＥＭを示す。Ｂ７Ｒ１−バーベル−およびＢ７Ｒ１−タンデム−処置グループの疾患スコア（足の厚さ）は、ＰＢＳ−処置コントロールグループのものと異なった、＊双方向ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
Ｉ．概観
本発明は、可溶性二量体融合タンパク質に関する組成物および方法を提供する。一般的に、本発明の二量体融合タンパク質は、二量体化ドメインを介して連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖は、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応する第１および第２のポリペプチドセグメントを含む（本明細書において「単量体」または「単量体ドメイン」としても称される）。したがって、二量体融合タンパク質は、一般的に単量体ドメインに対して四価である。それぞれのポリペプチド鎖の第１および第２の単量体ドメインは、同じか、または異なっていてよい。１つの態様において、二量体融合タンパク質の単量体ドメインは同じであり、特定の単量体ドメインに対して四価である分子を提供する。第１および第２の単量体ドメインは、それぞれ、二量体化ドメインに対してアミノ末端およびカルボキシル末端に位置し得る（本明細書において「バーベル」型としても称される）。あるいは、第１および第２の単量体ドメインは、両方とも、二量体化ドメインに対してカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにタンデムに位置し得る（本明細書において「タンデム」型としても称される）。
【００５７】
特定の局面において、本発明は、可溶性二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）融合タンパク質に関する組成物および方法ならびにＴ細胞介在免疫障害、特にＴ細胞介在自己免疫疾患の処置のためのそれらの使用を提供する。本発明において、二量体ＶＳＴＭ３融合物は、二量体化ドメインを介して連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖はＶＳＴＭ３の細胞外ドメインに対応する第１および第２の単量体ドメインを含む。したがって、二量体ＶＳＴＭ３融合物は、一般的に、ＶＳＴＭ３対抗受容体ＣＤ１５５に対する結合部位に対して四価である。ＶＳＴＭ３細胞外ドメインに対応する第１および第２の単量体ドメインは、上記に要約されたバーベルまたはタンデム型のいずれかに位置し得る。本明細書においてさらに記載されているとおり、本発明の二量体ＶＳＴＭ３融合タンパク質は、インビボでのＴ細胞介在応答の抑制ために特に有効である。
【００５８】
ＩＩ．ポリペプチド融合物および二量体タンパク質
したがって、１つの局面において、本発明は、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２およびＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄから選択される式を含む可溶性ポリペプチド融合物であって、Ｐ１は（ｉ）第１の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであるか、または（ｉｉ）第１のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであり；Ｌ１は第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは二量体化ドメインであり；Ｌ２は第２のポリペプチドリンカーであり；Ｐ２は（ｉ）第２の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであるか、または（ｉｉ）第２のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである融合物を提供する。
【００５９】
本発明の特定の態様内で、Ｐ１およびＰ２は同じであり（または同じ細胞表面受容体またはサイトカイン由来である）、ポリペプチド融合物がホモ二量体化されると、Ｐ１／Ｐ２単量体に対して四量体であるタンパク質を提供する。
【００６０】
いくつかの代替態様において、Ｐ１およびＰ２は、異なる細胞表面受容体および／またはサイトカイン由来であり、ポリペプチド融合物がホモ二量体化されると、２つの異なる単量体ドメイン（Ｐ１およびＰ２）に対して二量体であるタンパク質を提供する。例えば、いくつかのバリエーションにおいて、Ｐ１は第１の細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、Ｐ２は第１と異なっている第２の細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、融合物のホモ二量体化が２つの異なる細胞表面受容体またはその変異体もしくはフラグメントに対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。同様に、他のバリエーションにおいて、Ｐ１は第１のサイトカインに対応し、Ｐ２は第１と異なっている第２のサイトカインに対応し、融合物のホモ二量体化が２つの異なるサイトカインまたはその変異体もしくはフラグメントに対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。さらに他のバリエーションにおいて、Ｐ１は細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、Ｐ２はサイトカインに対応し（逆も同様）、融合物のホモ二量体化が細胞表面受容体およびサイトカインまたはそれらの変異体もしくはフラグメントの両方に対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。
【００６１】
さらに他の態様において、Ｐ１およびＰ２は、ヘテロ二量体細胞表面受容体の２つの異なるサブユニット由来の細胞外ドメイン、または、ヘテロ二量体サイトカインの２つの異なるサブユニットに対応する。このような態様において、ポリペプチドリンカーＬ１およびＬ２は、これらの単量体ドメインが互いに非共有結合し、単一の機能性ヘテロ二量体ユニットを形成することが可能であるように、単一のポリペプチド融合物内で単量体ドメインＰ１およびＰ２間の十分な空間および柔軟性を提供するように設計され、その結果、融合物のホモ二量体化が２つのこのような機能性ヘテロ二量体ユニットを有するタンパク質をもたらす。
【００６２】
Ｐ１および／またはＰ２が由来し得る細胞表面受容体の例は、例えば、４−１ＢＢ；ＡＣＴＨ受容体；アクチビン受容体；ＢＬＴＲ（ロイコトリエンＢ４受容体）；ＢＭＰ受容体；Ｃ３ａ受容体；Ｃ５ａ受容体；ＣＣＲ１；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５；ＣＣＲ６；ＣＣＲ７；ＣＣＲ８；ＣＣＲ９；ＣＤ１９；ＣＤ２２；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ４０；ＣＤ７０；ＣＤ８０；ＣＤ８６；ＣＴＬＡ−４；ＣＤ２２６；ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）；ＣＤ１１２；ＣＤ１５５；Ｂ７Ｈ６；ＮＫｐ３０；ＩＣＡＭ；ＶＬＡ−４；ＶＣＡＭ；ＣＴ−１受容体；ＣＸ３ＣＲ１；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ２；ＣＸＣＲ３；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５；Ｄ６；ＤＡＲＣ；ＤｃＲ３；ＤＲ４；ＤＲ５；ＤｃＲ１；ＤｃＲ２；ＥＣＲＦ３；Ｆａｓ；ｆＭＬＰ受容体；Ｇ−ＣＳＦ受容体；ＧＩＴ受容体；ＧＭ−ＣＳＦ受容体；成長ホルモン受容体；ＨＶＥＭ；ＢＴＬＡ；インターフェロン−α受容体；インターフェロン−β受容体；インターフェロン−γ受容体；ＩＬ−１受容体タイプＩ；ＩＬ−１受容体タイプＩＩ；ＩＬ−１０受容体；ＩＬ−１１受容体；ＩＬ−１２受容体；ＩＬ−１３受容体；ＩＬ−１５受容体；ＩＬ−１６受容体（ＣＤ４）；ＩＬ−１７受容体Ａ（ＩＬ−１７ＲＡ）；ＩＬ−１７受容体Ｂ（ＩＬ−１７ＲＢ）；ＩＬ−１７受容体Ｃ（ＩＬ−１７ＲＣ）；ＩＬ−１７受容体Ｄ（ＩＬ−１７ＲＤ）；ＩＬ−１７受容体Ｅ（ＩＬ−１７ＲＥ）；ＩＬ−１８受容体；ＩＬ−２受容体；ＩＬ−３受容体；ＩＬ−４受容体；ＩＬ−５受容体；ＩＬ−６受容体；ＩＬ−７受容体；ＩＬ−９受容体；ＩＬ−２０受容体Ａ（ＩＬ−２０ＲＡ）；ＩＬ−２０受容体Ｂ（ＩＬ−２０ＲＢ）；ＩＬ−２１受容体；ＩＬ−２２受容体Ａ（ＩＬ−２２ＲＡ）；ＩＬ−２２受容体Ｂ（ＩＬ−２２ＲＢ）；ＩＬ−２８受容体Ａ（ＩＬ−２８ＲＡ）；ＩＬ−２７受容体Ａ（ＩＬ−２７ＲＡ）；ＩＬ−３１−受容体Ａ（ＩＬ−２８ＲＡ）；ＢＣＭＡ；ＴＡＣＩ；ＢＡＦＦ受容体；免疫調節セマフォリン受容体ＣＤ７２；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＧＰＣＲ；リポキシンＡ４受容体；リンホトキシンβ受容体；リゾリン脂質成長因子受容体；ニューロキニン１；エンドルフィンに対するオピオイドμ、δおよびκ受容体；オンコスタチンＭ受容体；オステオポンチン受容体；オステオプロテゲリン；Ｏｘ４０；ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰ受容体；ＰＡＦ受容体；ポックスウイルス；ＩＦＮα／β受容体ホモログ；ポックスウイルスＩＦＮγ受容体ホモログ；ポックスウイルスＩＬ−１β受容体ホモログ；ポックスウイルス膜結合Ｇタンパク質結合受容体ホモログ；ポックスウイルス分泌ケモカイン結合タンパク質；ポックスウイルスＴＮＦ受容体ホモログ；プロラクチン受容体；ＲＡＮＫ；ＲＯＮ受容体；ＳＣＦ受容体；ソマトスタチン受容体；Ｔ１／ＳＴ２；ＴＧＦ−ベータ受容体；ＴＮＦ受容体（例えば、ｐ６０およびｐ８０）；ＴＮＦＲＳＦ１９；ＴＰＯ受容体；ＵＳ２８；ＸＣＲ１；エリスロポエチン受容体；成長ホルモン受容体；白血病阻害因子受容体；およびＣ−ｋｉｔ受容体を含む。
【００６３】
Ｐ１および／またはＰ２が由来し得るサイトカインの例は、例えば、α−ＭＳＨ；９Ｅ３／ｃＣＡＦ；ＡＣＴＨ；アクチビン；ＡＫ１５５；アンギオスタチン；Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ；ＡＰＲＩＬ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＬＲ１リガンド／ＢＣＡ−１／ＢＬＣ／ＣＸＣＬ１３；ＢＭＰファミリー；ＢＲＡＫ；カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）；伝染性軟属腫ウイルスのＣＣケモカイン；ＣＣＬ２７；ＣＣＬ２８；ＣＤ１００／Ｓｅｍａ４Ｄ；ＣＤ２７リガンド；ＣＤ３０リガンド；ＣＤ４０リガンド；ＣＫβ８−１／ＭＰＩＦ−１／ＣＣＬ２３；ＣＬＦ／ＣＬＣ；ＣＳＦ−１；ＣＴ−１；ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、βＴＧおよびＮＡＰ−２／／ＣＸＣＬ７；ＣＸＣＬ１６；デフェンシン；ＥＬＣ／ＭＩＰ−３β／エクソダス−３／ＣＣＬ１９；ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５；エンドルフィン；エンドスタチン；エオタキシン２／ＭＰＩＦ−２／ＣＣＬ２４；エオタキシン／ＣＣＬ１１；エリスロポエチン；エクソダス−１／ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α（ＳＣＹＡ２０）；Ｆａｓリガンド；Ｆｌｔ−３リガンド；ｆＭＬＰ；フラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＣＰ−２／ＣＸＣＬ６；ＧＭ−ＣＳＦ；成長ホルモン；ＨＣＣ−１／ＣＣＬ１４；ＨＣＣ−４／ＣＣＬ１６；高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）；ヒトカテリシジン抗菌性ペプチドＬＬ−３７；Ｉ−３０９／ＣＣＬ１；ＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮωリガンド；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１；ＩＬ−１２；ＩＬ−１３；ＩＬ−１５；ＩＬ−１６；ＩＬ−１７Ａ；ＩＬ−１７Ｂ；ＩＬ−１７Ｃ；ＩＬ−１７Ｄ；ＩＬ−１７Ｅ；ＩＬ−１７Ｆ；ＩＬ−１８；ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−２；ＩＬ−２７；ＩＬ−３；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８；ＩＬ−９；ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０；ＩＬ−１９；ＩＬ−２０；ＩＬ−２１；ＩＬ−２２；ＩＬ−２３；ＩＬ−２４；ＩＬ−２６；ＩＬ−３１；ケラチン生成細胞成長因子；ＫＳＨＶ関連ＩＬ−６リガンド；レプチン；ロイコタクチン１／ＨＣＣ−２／ＭＩＰ−１δ／ＣＣＬ１５；ロイコトリエンＢ４；ＬＩＧＨＴ；リポキシン；リンホタクチン／ＸＣＬ１；リンホトキシンαおよびβ；リゾリン脂質成長因子；マクロファージ由来ケモカイン；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）；ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８、ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７、ＭＣＰ−４／ＣＣＬ１３、およびＭＣＰ−５／ＣＣＬ１２；メトキシエストラジオール；ＭＧＳＡ／ＧＲＯ／ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３；ＭＩＦ；ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９；ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４；ＭＩＰ−１γ／ＭＲＰ−２／ＣＣＦ１８／ＣＣＬ９／１０；Ｍｕ  Ｃ１０／ＣＣＬ６；オンコスタチンＭ；オステオポンチン；パラポックスウイルス（オルフウイルス）ＩＬ−１０ホモログ；ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＣＫ１／ＡＭＡＣ−１／ＣＣＬ１８；ＰＤＧＦ−Ａ；ＰＤＧＦ−Ｂ；ＰＤＧＦ−Ｃ；ＰＤＧＦ−Ｄ；血小板−活性化因子；血小板因子４／ＣＸＣＬ４；上皮細胞増殖因子関連ポックスウイルス増殖因子；ポックスウイルス分泌補体制御タンパク質；オルフウイルスのポックスウイルス血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ホモログ；プロラクチン；ＲＡ��Ｋリガンド；ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５；Ｓ１００Ａ１２；ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２；ＳＥＲＰ−１、分泌ポックスウイルスセルプン；ＳＬＣ（６Ｃｋｉｎｅ）／エクソダス−２／ＴＣＡ−４／ＣＣＬ２１；ソマトスタチン；幹細胞因子；サブスタンスＰ；ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７；ＴＣＡ３／マウスＣＣＬ１；ＴＥＣＫ／ＣＣＬ２５；ＴＧＦβ；トロンボポエチン；ＴＮＦα；ＴＳＧ−６；ＴＷＥＡＫ；ワクシニアウイルスセマフォリン；ｖＣＸＣ−１およびｖＣＸＣ−２；ＶＥＧＦ；ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ；ならびにウイルスＩＬ−１０変異体を含む。
【００６４】
特定の細胞表面受容体の細胞外ドメインの機能性変異体またはフラグメントは、該変異体またはフラグメントが該細胞表面受容体の同種リガンドまたは対抗受容体に特異的に結合する能力を評価するための日常的な生物学的または生化学的アッセイを使用して、容易に同定することができる。同様に、特定のサイトカインの機能性変異体またはフラグメントは、該変異体またはフラグメントが該サイトカインの同種受容体に特異的に結合する能力を評価するための日常的な生物学的または生化学的アッセイを使用して、容易に同定することができる。
【００６５】
特定の参照ポリペプチド（例えば、野生型サイトカインまたは野生型細胞表面受容体の細胞外ドメイン、例えば、ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）の細胞外ドメイン）の機能性変異体は、一般的に、参照ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変異は、好ましくは重要でない特性の変異であり、すなわち、保存的アミノ酸置換（例えば、いくつかの典型的な保存的アミノ酸置換を挙げている上記表１、参照）およびタンパク質またはポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意に影響しない他の置換；小さい欠失、一般的に１から約３０個のアミノ酸の欠失；ならびに、小さいアミノ−もしくはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０−２５残基の小さいリンカーペプチド、または精製を容易にする小さい伸長（アフィニティータグ）、例えば、ポリヒスチジントラクト、タンパク質Ａ（Nilssonら EMBO J. 4:1075, 1985; Nilssonら Methods Enzymol. 198:3, 1991）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988）または他の抗原エピトープもしくは結合ドメイン（一般的に、FordらProtein Expression and Purification 2:95-107, 1991参照）による伸長である。アフィニティータグをコードするＤＮＡは、商業的供給者（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手できる。
表１：保存的アミノ酸置換
【表１】
2013531982.tif 000002
【００６６】
受容体またはサイトカインポリペプチド中の必須のアミノ酸は、当分野で知られている手順、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発にしたがって同定することができる（Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989; Bassら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991）。後者の技術において、単一のアラニン変異を分子中のあらゆる残基で導入し、得られた変異体分子を生物学的活性（例えば、リガンド結合およびシグナル変換）について試験し、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。リガンド受容体相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識化のような技術により決定される結晶構造の分析により決定される（例えば、de Vosら Science 255:306-312, 1992; Smithら J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaverら FEBS Lett. 309:59-64, 1992参照）。必須のアミノ酸の同定はまた、関連受容体またはサイトカインとの相同性の分析から推論することができる。
【００６７】
複数のアミノ酸置換は、変異誘発およびスクリーニングの既知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer Science 241:53-57, 1988またはBowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989により記載されているものを使用して作製および試験することができる。簡潔には、これらの著者らは、ポリペプチド中の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能性ポリペプチドを選択し、次に、変異誘発ポリペプチドをシーケンシングし、それぞれの位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法を記載している。使用することができる他の方法は、ファージディスプレイ、例えば、Lowmanら Biochem. 30:10832-10837, 1991；Ladnerら米国特許第５，２２３，４０９ｖ；Ｈｕｓｅ、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４）および領域特異的変異誘発（Derbyshireら Gene 46:145, 1986; Nerら DNA 7:127, 1988）を含む。
【００６８】
変異体ヌクレオチドおよびポリペプチド配列はまた、ＤＮＡシャッフリングを介して作製することができる（例えば、Stemmer, Nature 370:389, 1994; Stemmer, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91:10747, 1994；国際公開ＷＯ９７／２００７８参照）。簡潔には、変異体ＤＮＡ分子は、親ＤＮＡのランダムフラグメント化、次にＰＣＲを使用する再集合により、ランダムに導入された点変異を生じることによるインビトロ相同組換えにより作製される。該技術は、親ＤＮＡ分子のファミリー、例えば、異なる種由来の対立遺伝子変異体またはＤＮＡ分子を使用して、該プロセスにさらなる可変性を導入することにより修飾することができる。所望の活性についての選択またはスクリーニング、次に変異誘発およびアッセイのさらなる繰り返しは、望ましい変異について選択することにより配列の迅速な「進化」、そのうえ有害な変異に対して同時に選択することを提供する。
【００６９】
上記変異誘発方法は、ハイスループットスクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞におけるクローニングされた変異誘発受容体の活性を検出することができる。この点において好ましいアッセイは、以下に記載されている細胞増殖アッセイおよびバイオセンサーベースのリガンド結合アッセイを含む。活性受容体またはサイトカイン変異体をコードする変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収し、近代的装置を使用して迅速にシーケンシングすることができる。これらの方法は、興味あるポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にし、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【００７０】
以前に議論されているとおり、本発明のポリペプチド融合物は、特定のサイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインの「機能性フラグメント」に対応するポリペプチドセグメントを含むことができる。核酸分子の日常的な欠失分析を行って、所定のサイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインをコードする核酸分子の機能性フラグメントを得ることができる。一例として、配列番号：１の残基７３−４２３のヌクレオチド配列を有するＶＳＴＭ３をコードするＤＮＡ分子をＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子の欠失を得ることができる。次に、該フラグメントを適当なリーディングフレームにおいて発現ベクターに挿入し、発現されるポリペプチドを単離し、ＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合する能力について試験する。エキソヌクレアーゼ消化の１つの代替方法は、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、所望のフラグメントの生産を特定するために欠失または終始コドンを導入することである。あるいは、サイトカインまたは受容体をコードする遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成することができる。
【００７１】
この一般的なアプローチは、インターフェロンの末端のいずれか、または両方での切断における試験により例示される（Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507, 1995参照）。さらに、タンパク質の機能性分析のための標準技術は、例えば、Treuterら Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Contentら “Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2 5A synthetase induced by human interferon,” in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR TNO Meeting on Interferon Systems 65-72 (Cantell, ed., Nijhoff 1987); Herschman, “The EGF Receptor,” in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1 169-199 (Boyntonら eds., Academic Press 1985); Coumailleauら J. Biol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunagaら J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchiら Biochem. Pharmacol. 50:1295, 1995;およびMeiselら Plant Molec. Biol. 30:1, 1996により記載されている。
【００７２】
上記方法を使用して、当業者は、（ｉ）可溶性サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応する参照ポリペプチドと実質的に同一である、および（ｉｉ）参照ポリペプチドの機能性結合特性を保持する、種々のポリペプチドを調製することができる。サイトカインまたは受容体ポリペプチドの受容体−もしくはリガンド−結合特性を決定するためのアッセイ系は一般的に当分野で知られており、Ｐ１および／またはＰ２がサイトカインまたは細胞表面受容体変異体に対応する式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２およびＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄの可溶性ポリペプチド融合物の機能性結合特性の決定における使用のために、容易に適合させることができる。典型的なアッセイは、本明細書にさらに記載されている。
【００７３】
例えば、好ましいアッセイ系は、受容体ポリペプチドが受容体チップの表面上に固定される市販されているバイオセンサー装置（BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を使用する。該装置の使用は、Karlsson (J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991)およびCunningham and Wells (J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993)により記載されている。本発明の使用のために、本発明の可溶性ポリペプチド融合物（例えば、可溶性ＶＳＴＭ３ポリペプチド融合物）は、アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、フローセル内で金膜に結合しているデキストラン繊維に共有結合する。試験サンプルを、セルに通過させる。リガンド（例えば、可溶性ＶＳＴＭ３ポリペプチド融合物の場合、可溶性ＣＤ１５５またはＣＤ１１２）がサンプル中に存在するとき、それは固定化ポリペプチド融合物に結合し、金膜の表面プラズモン共鳴における変化として検出することができる媒体の屈折率の変化を引き起こす。この系は、結合親和性を計算することができるオン速度およびオフ速度の決定、ならびに結合の化学量論の評価を可能にする。
【００７４】
可溶性ポリペプチド融合物はまた、当分野で知られている他のアッセイ系内で使用することができる。このような系は、結合親和性の決定のためのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949参照）および熱量アッセイ（Cunninghamら Science 253:545-548, 1991; Cunninghamら Science 254:821-825, 1991参照）を含む。
【００７５】
１つの態様において、Ｐ１およびＰ２は、細胞表面受容体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）の細胞外ドメイン由来である。したがって、いくつかの態様において、本発明の可溶性ポリペプチド融合物は、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２およびＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄから選択される式を含み、Ｐ１はＶＳＴＭ３ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも８０％配列同一性、またはＶＳＴＭ３細胞外ドメインの機能性フラグメントと少なくとも８０％配列同一性を有する第１のポリペプチドであり；Ｌ１は第１のポリペプチドリンカーであり；Ｄは二量体化ドメインであり；Ｌ２は第２のポリペプチドリンカーであり；Ｐ２はＶＳＴＭ３ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも８０％配列同一性、またはＶＳＴＭ３細胞外ドメインの機能性フラグメントと少なくとも８０％配列同一性を有する第２のポリペプチドであり；該ポリペプチド融合物は、ＣＤ１５５ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３または配列番号：２４のアミノ酸残基２９−３４５）に特異的に結合することができる。１つの態様において、Ｐ１および／またはＰ２は、ＶＳＴＭ３ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその機能性フラグメントと少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を有する。例えば、いくつかの変異において、Ｐ１および／またはＰ２は、ＶＳＴＭ３ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその機能性フラグメントと１００％配列同一性を有する。Ｐ１および／またはＰ２は、例えば、ヒトまたはマウスＶＳＴＭ３ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、配列番号：２の残基２２−１４１または配列番号：４の残基２６−１３８）由来、またはそれらの機能性フラグメント由来であり得る。
【００７６】
例えば、１つの態様において、Ｐ１および／またはＰ２は、配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するか；または、Ｐ１および／またはＰ２は、配列番号：４のアミノ酸残基２６−１３８と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。いくつかのこのような変異において、Ｐ１およびＰ２の一方または両方は、配列番号：２のアミノ酸残基２５−１４１と１００％同一性を有するか、または、Ｐ１およびＰ２の一方または両方は、配列番号：４のアミノ酸残基２６−１３８と１００％同一性を有する。他の変異において、Ｐ１およびＰ２の一方または両方は、配列番号：２の残基６９に対応するアミノ酸位置に非システイン残基（例えば、チロシン）を含む。特に適当なＰ１および／またはＰ２ポリペプチドは、配列番号：１８の残基２３−１３９（配列番号：２０の残基２３−１３９）に示されるアミノ酸配列を有する。
【００７７】
他の態様において、Ｐ１および／またはＰ２は、配列番号：１８のアミノ酸残基２３−１３９（配列番号：２０の残基２３−１３９）と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有する。いくつかのこのような変異において、Ｐ１および／またはＰ２は、配列番号：１８の残基６７に対応するアミノ酸位置に非システイン残基を有する。例えば、特定の変異において、配列番号：１８のアミノ酸残基２３−１３９と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一性を有するＰ１および／またはＰ２ポリペプチドは、配列番号：１８のチロシン６７に対応するチロシン残基を保持する。
【００７８】
配列同一性パーセントは、慣用の方法により決定される。例えば、Altschulら, Bull. Math. Bio. 48:603, 1986およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992参照。例えば、２つのアミノ酸配列は、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよび表２（アミノ酸は標準１文字コードにより示される）に示される上記Henikoff and Henikoffの「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを使用してアラインメントスコアを最適化するようにアラインすることができる。次に、同一性パーセントを、（［同一の対応の全ての数］／［より長い配列の長さおよび２つの配列をアラインするために、より長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算する。
表２：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス
【表２】
2013531982.tif 000003
【００７９】
当業者は、２つのアミノ酸配列をアラインするために利用できる多数の確立されたアルゴリズムが存在することを認識している。Pearson and Lipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に記載されているアミノ酸配列およびそれらの推定変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを検討するために適当なタンパク質アラインメント方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:2444, 1988およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990によって記載されている。簡潔には、ＦＡＳＴＡは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、クエリー(query)配列（例えば、配列番号：２の残基２５−１４１または配列番号：１８の残基２３−１３９）および同一性の最も高い密度（ｋｔｕｐ変数が１であるとき）または同一性の対（ｋｔｕｐ＝２のとき）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することにより配列類似性を特性化する。次に、同一性の最も高い密度を有する１０個の領域を、アミノ酸置換マトリックスを使用して全ての対合アミノ酸の類似性を比較することにより再スコア化し、領域の末端を最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように「切り取る」。（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて予め決定された式により計算された）「カットオフ」値より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在するとき、切り取られた最初の領域は、該領域がギャップを有する近接のアラインメントを形成するように連結することができるか否かを決定するために試験される。最後に、２つのアミノ酸配列の最も高いスコアリング領域は、アミノ酸挿入および欠失を考慮するＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974）の修飾を使用してアラインされる。ＦＡＳＴＡ分析に対する例示的パラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１および置換マトリックス＝ｂｌｏｓｕｍ６２である。これらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修飾することによりＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【００８０】
ＦＡＳＴＡはまた、上記比率を使用して核酸分子の配列同一性を決定するために使用することができる。ヌクレオチド配列の比較のために、ｋｔｕｐ値は１から６、好ましくは３から６、より好ましくは３であってよく、他のパラメーターは上記のとおりである。
【００８１】
本発明は、配列番号：２の残基２５−１４１または配列番号：１８の残基２３−１３９（配列番号：２０の残基２３−１３９）のアミノ酸配列と比較して保存アミノ酸変化を有する可溶性ＶＳＴＭ３ポリペプチド融合を含む。例えば、アルキルアミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に置換されている、芳香族性アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列における芳香族性アミノ酸に置換されている、硫黄含有アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に置換されている、ヒドロキシ含有アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に置換されている、酸性アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列における酸性アミノ酸に置換されている、塩基性アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に置換されている、または二塩基モノカルボン酸性(monocarboxylic)アミノ酸がＶＳＴＭ３アミノ酸配列における二塩基モノカルボン酸性アミノ酸に置換されている、配列番号：２の残基２５−１４１または配列番号：１８の残基２３−１３９の１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＳＴＭ３変異体を得ることができる。一般的なアミノ酸の中で、「保存的アミノ酸置換」は、例えば、以下の群のそれぞれにおけるアミノ酸間の置換により説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。保存的アミノ酸変化の典型的な群は、上記表１においてさらに示されている。
【００８２】
ＢＬＯＳＵＭ６２表（表２参照）は、５００を越える関連タンパク質の群の高度に保存されている領域を示す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の位置の多数のアラインメントに由来するアミノ酸置換マトリックスである（Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:10915, 1992）。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義するために使用することができる。（上記のような）化学特性に単に基づくアミノ酸置換を設計することが可能であるが、「保存的アミノ酸置換」なる用語は、好ましくは−１を越えるＢＬＯＳＵＭ６２値により示される置換を示す。例えば、置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられるとき、アミノ酸置換は保存されている。この系において、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられるが、さらに好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴付けられる。サイトカインまたは受容体ポリペプチド（例えば、ＶＳＴＭ３）の特定の変異体は、アミノ酸配列における変異が１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号：２の残基２５−１４１または配列番号：１８の残基２３−１３９）に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有することにより特徴付けられる。
【００８３】
種々の二量体化ドメインは、本明細書に記載されている二量体融合タンパク質における使用のために適当である。１つの態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は１つまたはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の１つまたは両方）を欠いている。１つまたはそれ以上のエフェクター機能を欠いている典型的なＦｃ領域は、例えば、Ｆｃ−４８８、Ｆｃ４、Ｆｃ５、Ｆｃ６およびＦｃ７を含む（図２Ａ−２Ｃ；それぞれアミノ酸残基１６からの配列番号：２９−３３参照）。
【００８４】
本発明における使用のためのポリペプチドリンカーは、天然、合成または両方の組合せであり得る。該リンカーは、２つの別々のポリペプチド領域（例えば、二量体化ドメインおよびＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）の細胞外ドメインに対応するポリペプチド）に結合し、より長いポリペプチドの別々および別個のドメインとして連結されたポリペプチド領域を維持する。リンカーは、別々の、別個のドメインが共に別々の特性を維持することが可能である（例えば、ＶＳＴＭ３の細胞外ドメインに対応するポリペプチドに連結したＦｃ領域二量体化ドメインの場合、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ）結合はＦｃ領域に対して維持され、ＶＳＴＭ３細胞外ドメインのＣＤ１５５結合特性は維持され得る）。新規連結融合ポリペプチドにポリペプチドを結合するための天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、当分野でよく知られている（例えば、Hallewellら J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989; Alfthanら Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson and Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Khandekarら J. Biol. Chem. 272, 32190-32197, 1997; Faresら Endocrinology 139, 2459-2464, 1998; Smallshawら Protein Eng. 12, 623-630, 1999；米国特許第５，８５６，４５６号参照）。
【００８５】
一般的に、リンカーポリペプチド内の残基は、全体的に親水性特性を提供し、非免疫原性およびフレキシブル(flexible)であるように選択される。本明細書において使用される「フレキシブルな」リンカーは、溶液中で実質的に安定な高次構造を欠いているものであるが、局所的安定性の領域は許される。一般的に、小さい極性親水性残基が好ましく、巨大かつ疎水性残基は望ましくない。局所的電荷地域は回避するべきである；リンカーポリペプチドが荷電残基を含むとき、それらは、通常、ポリペプチドの小さい領域内で正味の中性電荷を提供するように位置される。したがって、反対の電荷の残基に隣接して荷電残基を置くことが好ましい。一般的に、リンカーポリペプチド内での包含のために好ましい残基はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎを含み；さらに好ましい残基はＧｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒを含み；最も好ましい残基はＧｌｙおよびＳｅｒである。一般的に、Ｐｒｏ残基は疎水性および柔軟性の欠如によって、ならびにＬｙｓおよびＡｒｇ残基は潜在的免疫原性によって、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基は回避される（リンカーの免疫グロブリンヒンジ領域内に存在しない限り）。Ｃｙｓ残基は、本明細書に記載されているように、ジスルフィド結合を提供するように含まれ得る。リンカーの配列はまた、望ましくないタンパク質分解を回避するように設計することができる。
【００８６】
いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーＬ１は、１５から３２個のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなり、該残基の１から８個はシステイン残基である。本発明の好ましい態様において、それぞれのリンカーは正確に２つのシステイン残基を含む。リンカーは、ドメインがポリペプチド内の意図される機能を行うことが可能であるように、二量体化ドメインおよびＰ１ポリペプチド（例えば、ＶＳＴＭ３細胞外ドメインに対応するＰ１ポリペプチド）間の十分な空間および柔軟性を提供するように設計される。リンカー長および組成物は、所望の空間および柔軟性の程度を提供するように選択されるが、また、所望の構造を安定化させるように１つ以上の鎖間ジスルフィド結合も提供される。
【００８７】
特定のバリエーションにおいて、Ｌ１は免疫グロブリンヒンジ領域、または免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントもしくは変異体である。本発明の１つの態様において、集合された天然抗体が免疫グロブリン軽鎖とジスルフィド結合を形成する最もＮ−末端のシステイン残基（Ｅｕ残基２２０；配列番号：２７の残基１０３）は、別のアミノ酸残基（例えば、Ｓｅｒ）と置換または欠失もしくは切断のいずれかにより、ヒンジから省かれる。ヒンジ配列における他の変化もまた、作製することができる。例えば、Ｌｙｓ残基（Ｅｕ２１８；配列番号：２７の残基１０１）は、Ａｒｇに変化することができる。したがって、ポリペプチドリンカーは、他の鎖上のポリペプチドリンカーとジスルフィド結合を形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域またはそのフラグメントもしくは変異体を含むことができる。免疫グロブリンヒンジ領域は、任意の免疫グロブリン重鎖から得ることができる。ガンマ（ＩｇＧ）ヒンジ領域、例えば、γ１ヒンジは、よく特徴付けられており、本発明内で好都合に使用される。
【００８８】
典型的なＬ２ポリペプチドリンカーは複数のグリシン残基を含む。例えば、いくつかの態様において、Ｌ２ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン残基および所望により少なくとも１個のセリン残基を含む。式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２を含むポリペプチドの特定の変異において、Ｌ２は式Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号：２１）を含む。Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含むポリペプチドの特定の変異において、Ｌ２ポリペプチドリンカーは式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号：２２）を含み、ｎは３から５の整数である。式［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎを含むＬ２リンカーの特定のバリエーションにおいて、ｎは４である。
【００８９】
本発明内で使用のためのポリペプチドセグメント（例えば、ＶＳＴＭ３細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメント、免疫グロブリンヒンジ領域を含むリンカー、および二量体化ドメイン、例えば、Ｆｃフラグメント）は、様々な種から得ることができる。二量体タンパク質をヒトにおける治療に使用するとき、ヒトポリペプチド配列を使用することが好ましい。しかしながら、非ヒト配列は、変異体配列として使用することができる。他の使用、例えば、インビトロ診断使用および獣医使用において、ヒトまたは非ヒト動物由来のポリペプチド配列を使用することができるが、患者と同じ種由来の配列が、分子間反応の種特異性が存在するとき、インビボ獣医使用またはインビトロ使用に対して好ましいかもしれない。したがって、本発明内で使用のためのポリペプチドセグメントは、限定はしないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよび鳥類ポリペプチド、ならびにそれらの変異体であり得る。
【００９０】
Ｐ１およびＰ２のそれぞれがＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）の細胞外ドメインに由来する式Ｐ１−Ｌ１−Ｄ−Ｌ２−Ｐ２を含むポリペプチド融合物の特定の態様において、ポリペプチド融合物は、配列番号：１８の残基２３−４９３または１−４９３；配列番号：６の残基２２−４９８または１−４９８；配列番号：１０の残基２６−４８９または１−４８９、配列番号：１４の残基３６−５０６または１−５０６、配列番号：１６の残基３６−５０６または１−５０６、または配列番号：１８の残基２３−４９３または１−４９３に示されるアミノ酸配列を含む。Ｐ１およびＰ２のそれぞれがＶＳＴＭ３の細胞外ドメインに由来する式Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含むポリペプチド融合物の特定の態様において、、ポリペプチド融合物は、配列番号：２０の残基２３−５０８、２３−５０７、１−５０８または１−５０７；配列番号：８の残基２２−５１３、２２−５１２、１−５１３または１−５１２；配列番号：１２の残基２６−５０４、２６−５０３、１−５０４または１−５０３；または、配列番号：２０の残基２３−５０８、２３−５０７、１−５０８または１−５０７に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
本発明はまた、上記第１および第２のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質を提供する。したがって、別の局面において、本発明は、第１のポリペプチド融合物および第２のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質であって、第１および第２のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、本明細書に記載されているＰ１−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｐ２またはＰ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含む二量体タンパク質を提供する。例えば、特定の態様において、本発明の二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）タンパク質は、第１のポリペプチド融合物および第２のポリペプチド融合物を含み、第１および第２のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｐ２を含み、Ｐ１およびＰ２のそれぞれは、ＶＳＴＭ３の細胞外ドメイン由来であり、二量体タンパク質はＣＤ１５５の細胞外ドメイン（例えば、配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３）に特異的に結合することができる。他の態様において、本発明の二量体ＶＳＴＭ３タンパク質は、第１のポリペプチド融合物および第２のポリペプチド融合物を含み、第１および第２のポリペプチド融合のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含み、Ｐ１およびＰ２のそれぞれは、ＶＳＴＭ３の細胞外ドメイン由来であり、二量体タンパク質は、ＣＤ１５５の細胞外ドメインに特異的に結合することができる。
【００９２】
ＩＩＩ．ポリペプチド融合物および二量体タンパク質を作製するための材料および方法
本発明はまた、上記融合ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖分子の両方を含む。ポリペプチド融合物の種々のセグメント（例えば、二量体化ドメイン、例えば、Ｆｃフラグメント；Ｐ１およびＰ２ポリペプチドセグメント）をコードするポリヌクレオチドは、核酸の組換え操作のための既知の方法を使用して、作製され、互いに連結され、本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチドを形成することができる。
【００９３】
サイトカインおよび細胞表面受容体（例えば、ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１））をコードするＤＮＡ配列、例えば、このような受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントは、当分野で知られている。種々の二量体化ドメイン（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、Ｆｃフラグメント）をコードするＤＮＡ配列もまた、知られている。サイトカイン、細胞表面受容体および二量体化ドメインポリペプチドをコードするさらなるＤＮＡ配列は、遺伝子コードに基づいて当業者により容易に作製することができる。対応ＲＮＡ配列は、ＴのＵでの置換により作製することができる。当業者は、遺伝子コードの縮重を考慮して、多数の配列変異が与えられたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子中で可能であることを容易に認識している。このようなポリペプチドの機能性変異体およびフラグメントをコードするＤＮＡおよびＲＮＡはまた、ポリヌクレオチド配列に変異を導入するための既知の組換え方法、次に、適当なスクリーニングアッセイを使用するコードされたポリペプチドの発現および機能活性（例えば、同種受容体またはリガンドへの結合）の決定を使用して、得ることができる。
【００９４】
ＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法は、当分野でよく知られている。例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンは、興味あるポリペプチドをコードする多量のＲＮＡを生産する組織または細胞から単離されるＲＮＡから調製することができる。全ＲＮＡは、グアニジンＨＣｌ抽出を使用して調製し、次に、ＣｓＣｌ勾配中の遠心分離により単離することができる（Chirgwinら Biochemistry 18:52-94, 1979）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972)の方法を使用して全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡは、既知の方法を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製される。別法において、ゲノムＤＮＡを単離することができる。いくつかの適用（例えば、トランスジェニック動物における発現）において、ゲノムクローンを使用すること、または、少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようにｃＤＮＡクローンを修飾することが利点であり得る。ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを同定および単離するための方法はよく知られており、当業者のレベルの範囲内であり、ライブラリーのプロービングまたはプライミングのための本明細書に記載されている配列またはその部分の使用を含む。興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応により同定および単離される（「ＰＣＲ」、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許４，６８３，２０２）。発現ライブラリーは、興味あるポリペプチドに対する抗体、受容体フラグメントまたは他の特異的結合パートナーで探索することができる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、自動合成により合成することができる。短い二本鎖セグメント（６０から８０ｂｐ）の生産は、技術的に簡単であり、相補鎖を合成し、次にそれらをアニーリングすることによっって成し遂げることができる。より長いセグメント（一般的に＞３００ｂｐ）は、２０から１００ヌクレオチド長である一本鎖フラグメントからモジュール形態において集合される。ポリヌクレオチドの自動合成は当業者のレベルの範囲内であり、適当な装置および試薬は商業的供給者から利用できる。一般的に、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; Itakuraら Ann. Rev. Biochem. 53:323-356, 1984;およびClimieら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-637, 1990参照。
【００９６】
別の局面において、材料および方法は、本発明のポリペプチド融合物、例えば、ポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質を生産するために提供される。ポリペプチド融合物は、慣用の技術にしたがって遺伝的に操作された宿主細胞において生産することができる。適当な宿主細胞は、外因性ＤＮＡで形質転換もしくはトランスフェクトされ、培地で増殖することができる細胞型であり、細菌、真菌細胞および培養高等真核細胞（多細胞生物体の培養細胞を含む）、特に培養哺乳動物細胞を含む。クローン化ＤＮＡ分子を操作する、および外因性ＤＮＡを種々の宿主細胞に導入するための技術は、Sambrookら Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989、およびAusubelら eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY, 1993により記載されている。
【００９７】
一般的に、ポリペプチド融合物をコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内で、一般的に転写プロモーターおよびターミネーターを含む発現のために必要とされる他の遺伝子成分に作動可能に連結される。ベクターはまた、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカーおよび１つまたはそれ以上の複製起点を一般的に含むが、当業者は、特定の系内で、選択可能なマーカーが別々のベクターに提供され得、外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識している。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の成分の選択は、当業者のレベルの日常的な設計の事柄である。多数のこのような成分は文献に記載されており、商業的供給者を介して利用できる。
【００９８】
ポリペプチド融合物を宿主細胞の分泌経路に指向するために、分泌シグナル配列は発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列は、天然非免疫グロブリンポリペプチドのものであってよく、または別の分泌タンパク質由来のものであってよく（例えば、ｔ−ＰＡ；米国特許第５，６４１，６５５号参照）、またはデノボで合成され得る。操作された切断部位が、ポリペプチド融合物の分泌ペプチドおよび残りの結合点に含まれ、宿主細胞中のタンパク質分解プロセッシングを最適化し得る。分泌シグナル配列は、ポリペプチド融合物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結する、すなわち、２つの配列は、正しいリーディングフレームに結合させ、新たに合成されたポリペプチド融合物を宿主細胞の分泌経路に指向するように配置される。分泌シグナル配列は、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対する５’に一般的に位置するが、特定のシグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列において他に位置し得る（例えば、Welchら米国特許第５，０３７，７４３号; Hollandら米国特許第５，１４３，８３０号参照）。本発明の使用のために適当な分泌シグナル配列は、例えば、配列番号：１４のアミノ酸残基１−３５または配列番号：１８のアミノ酸残基１−２２をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９９】
宿主細胞分泌経路を介するポリペプチド融合物の発現は、二量体タンパク質の生産をもたらすことが予期される。したがって、別の局面において、本発明は、上記第１および第２のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質（例えば、第１のポリペプチド融合物および第２のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質であって、第１および第２のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ１−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｐ２を含むか、または、第１および第２のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、Ｐ２−Ｌ２−Ｐ１−Ｌ１−Ｄを含み、該二量体タンパク質はＣＤ１５５の細胞外ドメイン（例えば、配列番号：２２のアミノ酸残基２８−３４３）に特異的に結合することができる二量体タンパク質）を提供する。二量体はまた、適当な条件下で成分ポリペプチドのインキュベーション時にインビトロで集合され得る。一般的に、インビトロでの集合は、変性および還元条件下でタンパク質混合物をインキュベートすること、次にポリペプチドをリフォールディングおよび再酸化し、二量体を形成することを含む。細菌細胞において発現されるタンパク質の回収および集合は、以下に記載されている。
【０１００】
培養哺乳動物細胞は、本発明における使用のための適当な宿主である。外因性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法は、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（Wiglerら Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション（Neumannら EMBO J. 1:841-845, 1982）、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション（Ausubelら supra）およびリポソーム介在トランスフェクション（Hawley-Nelsonら Focus 15:73, 1993; Ciccaroneら Focus 15:80, 1993）を含む。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの生産は、例えば、Levinsonら米国特許第４，７１３，３３９号；Hagenら米国特許第４，７８４，９５０号；Palmiterら米国特許第４，５７９，８２１号；およびRingold米国特許第４，６５６，１３４号により記載されている。適当な培養哺乳動物細胞は、ＣＯＳ−１（ATCC No. CRL 1650）、ＣＯＳ−７（ATCC No. CRL 1651）、ＢＨＫ（ATCC No. CRL 1632）、ＢＨＫ  ５７０（ATCC No. CRL 10314）、２９３（ATCC No. CRL 1573; Grahamら J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO-K1, ATCC No. CCL 61; CHO-DG44, Urlaubら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）細胞系を含む。さらなる適当な細胞系は当分野で知られており、公の受託機関、例えば、American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから利用できる。強い転写プロモーターは、例えば、ＳＶ−４０、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルス由来のプロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号および米国特許出願公開第２００３０１０３９８６号参照。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第４，５７９，８２１および４，６０１，９７８号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、それぞれ受入番号９８６６９、９８６６８およびＰＴＡ−５２６６の下にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA USAで寄託されているｐＺＰ−１、ｐＺＰ−９およびｐＺＭＰ２１、ならびにこれらのベクターの誘導体を含む。
【０１０１】
薬剤選択は、一般的に、外来ＤＮＡが挿入されている培養哺乳動物細胞に対して選択するために使用される。このような細胞は、一般的に、「形質転換体」と称される。選択的薬剤の存在下で培養され、興味ある遺伝子をその子孫に伝えることができる細胞は、「安定な形質転換体」と称される。典型的な選択可能なマーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬剤、例えば、Ｇ−４１８などの存在下で行われる。選択系はまた、「増幅」と称されるプロセスである興味ある遺伝子の発現レベルを増加させるために使用することができる。増幅は、低レベルの選択的薬剤の存在下で形質転換体を培養し、次に高レベルの導入された遺伝子の産物を生産する細胞を選択するために選択的薬剤の量を増加することにより、行われる。典型的な増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキサートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた使用することができる。細胞表面マーカーおよび他の表現型選択マーカーは、（例えば、蛍光活性化細胞分類による）形質転換細胞の同定を容易にするために使用することができ、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、神経成長因子受容体、緑色蛍光タンパク質などを含む。
【０１０２】
昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞もまた、宿主として使用することができる。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)の使用は、Sinkarら J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987により概説されている。昆虫細胞の形質転換およびそれにおける外来ポリペプチドの生産は、Ｇｕａｒｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２２号およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３により記載されている。
【０１０３】
昆虫細胞は、一般的にキンウワバ科核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスに感染させることができる。King and Possee, The Baculovirus Expression System:  A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London; O'Reillyら Baculovirus Expression Vectors:  A Laboratory Manual, Oxford University Press., New York, 1994;およびRichardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, 1995参照。組換えバキュロウイルスはまた、Ｌｕｃｋｏｗら（J. Virol. 67:4566-4579, 1993）により記載されているトランスポゾンに基づく系の使用を介して生産することができる。転移ベクターを利用するこの系は、キット形態で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Life Technologies, Gaithersburg, MD）。転移ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Life Technologies）は、「バクミド(bacmid)」と称される大型プラスミドとして、大腸菌に維持されているバキュロウイルスゲノム中に、興味あるタンパク質をコードするＤＮＡを移動させるＴｎ７トランスポゾンを含む。Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonningら J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994;およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995参照。当分野で知られている技術を使用して、ポリペプチド融合物をコードする転移ベクターを大腸菌宿主細胞に形質転換し、該細胞は、組換えバキュロウイルスを示す分断ｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドに対してスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡを、一般的な技術を使用して単離し、ヨトウガ細胞、例えば、Ｓｆ９細胞に導入するために使用する。次に、ポリペプチド融合物を発現する組換えウイルスが生産される。組換えウイルス貯蔵物は、当分野で一般的に使用される方法により作製される。
【０１０４】
タンパク質生産のために、組換えウイルスを、宿主細胞、一般的にツマジロクサヨトウ、ヨトウガ（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはキンウワバ（例えば、HIGH FIVE cells; Invitrogen, Carlsbad, CA）由来の細胞系に感染させるために使用する。一般的にGlick and Pasternak, supra参照。米国特許第５，３００，４３５号も参照。無血清培地を使用して細胞を増殖させ、維持する。適当な培地処方は、当分野で知られており、商業的供給者から得ることができる。該細胞を約２−５×１０５細胞の接種密度から１−２×１０６細胞の密度まで増殖させ、そのときに、組換えウイルスストックを０．１から１０、さらに一般的には約３の感染の多重度（ＭＯＩ）で加える。使用される手順は、入手可能な実験マニュアル（例えば、King and Possee, supra; O'Reillyら supra.; Richardson, supra）に一般的に記載されている。
【０１０５】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本発明において使用することができる。この点において特定の興味ある酵母菌種は、出芽酵母、メタノール資化酵母およびメチロトローフ酵母を含む。サッカロミセス・セレビシエ細胞を外因性ＤＮＡで形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産するための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第４，５９９，３１１号；Kawasakiら米国特許第４，９３１，３７３号；Brake、米国特許第４，８７０，００８号；Welchら米国特許第５，０３７，７４３号；およびMurrayら米国特許第４，８４５，０７５号により記載されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカー、一般的に薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。出芽酵母における使用のための典型的なベクター系は、形質転換細胞をグルコース含有培地中の増殖により選択することができるＫａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）により記載されているＰＯＴ１ベクター系である。酵母における使用のための適当なプロモーターおよびターミネーターは、糖分解酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第４，５９９，３１１号；Kingsmanら米国特許第４，６１５，９７４号；およびBitter、米国特許第４，９７７，０９２号参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。米国特許第４，９９０，４４６；５，０６３，１５４；５，１３９，９３６；および４，６６１，４５４号も参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、分裂酵母、キラー酵母、クリュイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、トウモロコシ黒穂病菌、メタノール資化酵母、メチロトローフ酵母、ピチア・グイレルモンジ(Pichia guillermondii)およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含む他の酵素のための形質転換系は、当分野で知られている。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら、J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；Ｃｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号；およびＲａｙｍｏｎｄら、Yeast 14:11-23, 1998参照。アスペルギルス細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法にしたがって利用され得る。アクレモニウム・クリソゲナムを形質転換する方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号により記載されている。アカパンカビを形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号により記載されている。メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の生産は、米国特許第５，７１６，８０８；５，７３６，３８３；５，８５４，０３９；および５，８８８，７６８号に記載されている。
【０１０６】
細菌大腸菌、バチルス属および他の属の株を含む原核生物宿主細胞はまた、本発明における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、それらにおいてクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現するための技術は、当分野でよく知られている（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、参照）。細菌、例えば、大腸菌においてポリペプチド融合物を発現させるとき、該ポリペプチドは、一般的に不溶性顆粒として、細胞質内に保持され得るか、または細菌分泌配列によりペリプラズム空間に向けられ得る。前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えば、塩酸グアニジンまたはウレアを使用して、変性させる。次に、変性ポリペプチドは、変性剤を希釈することにより、例えば、ウレアの溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの組合せに対する透析、次に緩衝生理食塩水に対する透析により、リフォールディングさせ、二量体化させることができる。代替として、タンパク質は、可溶性形態において細胞質から回収され、変性剤を使用しないで単離され得る。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中で、水性抽出物として細胞から回収される。興味あるタンパク質を捕獲するために、抽出物をクロマトグラフィー媒体、例えば、固定化された抗体またはヘパリン−セファロースカラムに直接加える。分泌されたポリペプチドは、細胞を破壊し（例えば、超音波処理または浸透圧衝撃により）、タンパク質を回収することにより、可溶性かつ機能性形態においてペリプラズム空間から回収することができ、それにより変性およびリフォールディングの必要性を回避することができる。例えば、Luら J. Immunol. Meth. 267:213-226, 2002参照。
【０１０７】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で慣用の手順にしたがって培養される。規定の培地および複合培地を含む種々の適当な培地は当分野で知られており、一般的に炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はまた、必要に応じて、増殖因子または血清のような成分を含み得る。増殖培地は、一般的に、例えば、発現ベクター上で運ばれるか、または宿主細胞に共トランスフェクトされる選択可能なマーカーにより補足される必須の栄養素における薬剤選択または欠乏により、外因的に加えられたＤＮＡを含む細胞を選択する。
【０１０８】
本発明のタンパク質は、慣用のタンパク質精製方法、一般的に、クロマトグラフィー技術の組合せにより精製される。一般的に、Affinity Chromatography:  Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988; and Scopes, Protein Purification:  Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994参照。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化タンパク質Ａ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。さらなる精製工程、例えば、ゲル濾過は、所望の純度レベルを得るために、または脱塩、バッファー交換などを提供するために使用することができる。
【０１０９】
例えば、分別および／または慣用の精製方法は、組換え宿主細胞から精製された本発明のポリペプチド融合物および二量体タンパク質を得るために使用することができる。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ(chaotrope)抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。適当なクロマトグラフィー媒体は、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、専用のシリカなどを含む。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が適当である。典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチルまたはオクチル基で誘導体化されたもの、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Pharmacia）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｂｕｔｙｌ  ６５０（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia）など；またはポリアクリル酸樹脂、例えば、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ  ７１（Toso Haas）などを含む。適当な固体支持体は、使用される条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などを含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によりタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾され得る。
【０１１０】
カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒体は当分野でよく知られており、広く使用されており、商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離および精製のための特定の方法の選択は、日常的な設計の事柄であり、一つには選択される支持体の特性により決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988);およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)参照。
【０１１１】
タンパク質単離および精製におけるさらなる変形は、当業者により考案することができる。例えば、本明細書に記載されているポリペプチド融合物または二量体タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントに特異的に結合する抗体）は、免疫アフィニティー精製により多量のタンパク質を単離するために使用することができる。
【０１１２】
本発明のタンパク質はまた、特定の特性の利用により単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーは、ポリヒスチジンタグを含むものを含むヒスチジン−リッチタンパク質を精製するために使用することができる。簡潔には、ゲルを最初に二価金属イオンで充填し、キレートを形成する（Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1, 1985）。ヒスチジン−リッチタンパク質は、使用される金属イオンに依存して、異なるアフィニティーで該マトリックスに吸着させ、競合溶離、ｐＨの低下または強力なキレート化剤の使用により溶離する。精製の他の方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を含む（例えば、M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529, 1990参照）。本発明のさらなる態様において、興味あるポリペプチドおよびアフィニティータグ（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合物が、精製を容易にするために構築され得る。さらに、二量体タンパク質の受容体−またはリガンド−結合特性は、精製のために利用することができる。例えば、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質は、ＣＤ１５５をカラムに結合させ、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質を結合させるアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより単離し、次に標準クロマトグラフィー方法を使用して溶離され得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、一般的に、夾雑高分子、特に他のタンパク質および核酸に対して少なくとも約８０％純度、さらに一般的に少なくとも約９０％純度および好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％純度に精製されており、感染性および発熱性因子を含まない。本発明のポリペプチドはまた、９９．９％以上で純粋である薬学的に純粋な状態に精製され得る。特定の調製において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１１４】
ＩＶ．使用の方法および医薬組成物
本発明の二量体タンパク質は、Ｐ１およびＰ２ポリペプチドと関連する１つ以上の活性を提供するため、診断、治療または研究のために使用することができる。このような活性は、限定はしないが、受容体結合、受容体活性化およびリガンド結合を含む。当業者は、タンパク質に関する使用の範囲を容易に想像する。治療的使用は、例えば、癌または免疫学的障害の処置のための、サイトカインアンタゴニスト、および、例えば、組織増殖または治癒を促進する、または血管系または他の組織の発達を促進するために、増殖因子アゴニストとしての使用を含む。診断的使用は、例えば、放射性同位体または他の標識に対する標的化剤として、細胞表面上または生物学的液体もしくは抽出物中の分子の存在を検出するための、またはインビトロアッセイにおけるコントロールとしての使用を含む。研究において、本発明のタンパク質は、例えば、細胞を標識化するため、細胞表面受容体または可溶性分子の存在に関するアッセイするため、サイトカインもしくは受容体ポリペプチドまたはそれらの結合パートナーの生物学を試験するために使用することができる。
【０１１５】
特定の局面において、本発明は、Ｔ細胞介在免疫障害を処置する方法を提供する。該方法は、一般的に、本明細書に記載されている有効量の二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）タンパク質をＴ細胞介在免疫障害を有する対象に投与することを含む。本発明による処置に適しているＴ細胞介在免疫障害は、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応を含む。Ｔ細胞介在自己免疫疾患の例は、いくつか例を挙げると、リウマチ性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）（例えば、脊髄−眼ＭＳ、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ））、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、セリアック病、神経炎、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、白斑症、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症および特発性肺線維症を含む。
【０１１６】
治療的使用のために、本明細書に記載されている二量体タンパク質は、処置が要求される疾患または障害の管理と関連する慣用の方法論と一致する方法において送達される。本明細書の記載にしたがって、有効量の二量体タンパク質は、疾患または障害を予防または処置するために十分な時間および条件下で、このような処置を必要とする対象に投与される。
【０１１７】
本明細書に記載されている二量体タンパク質の投与の対象は、特定の疾患または障害を発症する高い危険性を有する患者ならびに既存の疾患または障害を示す患者を含む。１つの態様において、対象は、処置が要求される疾患または障害を有すると診断されている。さらに、対象は、疾患または障害における何らかの変化のために（例えば、疾患または障害の臨床症状における増加または減少のために）処置過程中、モニタリングすることができる。また、いくつかの変異において、対象は、二量体タンパク質のＰ１またはＰ２ポリペプチドセグメントに対応するサイトカインまたは受容体ポリペプチドの投与を含む処置を必要とする別の疾患または障害に罹患していない。
【０１１８】
予防適用において、医薬組成物または薬物は、疾患のリスクを除去または減少するために、または発生を遅延するために十分な量において、特定の疾患に罹患しやすい、または危険性を有する患者に投与される。治療適用において、組成物または薬物は、疾患およびその合併症の症状を治癒する、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量において、このような疾患の疑いのある、またはすでに罹患している患者に投与される。これを達成するために十分な量は、治療または薬学的有効用量または量と称される。予防および治療レジメンの両方において、薬剤は、十分な応答（例えば、不適当なＴ細胞応答の阻害）がなし遂げられるまで、通常数回投与される。一般的に、応答はモニタリングされ、所望の応答消失し始めるとき、反復投与を与える。
【０１１９】
本発明の方法による処置のための対象患者を特定するために、認められるスクリーニング方法は、特定の疾患と関連する危険因子を決定するために、または対象において特定された既存の疾患の状態を決定するために、使用され得る。このような方法は、例えば、個体が特定の疾患と診断された親族を有するか否かを決定することを含むことができる。スクリーニング方法はまた、例えば、遺伝的要素を有することが知られている特定の疾患に対する家族性状態を決定するための慣用の精密検査を含むことができる。この目的に向けて、ヌクレオチドプローブは、日常的に、興味ある特定の疾患と関連する遺伝子マーカーを有する個体を同定するために使用することができる。加えて、特定の疾患に対するマーカーを同定するために有用である多種多様の免疫学的方法は、当分野で知られている。スクリーニングは、既知の患者症状、年齢因子、関連危険因子などより示されるように実行され得る。これらの方法は、臨床医が日常的に処置のための本明細書に記載されている方法を必要とする患者を選択することを可能にする。これらの方法にしたがって、本発明の二量体タンパク質を使用する処置（例えば、不適当なＴ−細胞応答を阻害するための二量体ＶＳＴＭ３タンパク質を使用する処置）は、独立した処置プログラムとして、または他の処置の経過観察(follow-up)、補助的もしくは同等の処置レジメンとして実行され得る。
【０１２０】
投与のために、本発明の二量体タンパク質は、医薬組成物として製剤化される。二量体タンパク質を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法にしたがって製剤化することができ、それによって、治療分子は、薬学的に許容される担体と混合物として混合される。組成物の投与がレシピエント患者により耐用性であるとき、該組成物は「薬学的に許容される担体」であると称される。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適当な担体は、当業者によく知られている（例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)参照）。製剤は、１つ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質の喪失を防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。
【０１２１】
本発明の二量体タンパク質を含む医薬組成物は、有効量で対象に投与される。二量体タンパク質は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、髄腔内および経口投与経路を含む種々の投与様式により対象に投与され得る。予防および処置目的のために、二量体タンパク質は、単一ボーラス送達において、長期間にわたる連続的な送達（例えば、連続的な経皮送達）を介して、または反復投与プロトコール（例えば、毎時、毎日または毎週）において対象に投与され得る。
【０１２２】
この文脈において有効用量の決定は、一般的にヒト臨床試験によりフォローアップされる動物モデル試験に基づき、モデル対象における対象疾患または障害の発生または重症度を有意に減少させる有効用量および投与プロトコールを決定することにより導かれる。本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、処置が予防的または治療的であるか、ならびに個体における所望の応答を誘導する組成物自体の比活性およびその能力を含む多数の異なる因子に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患において、患者は非ヒト哺乳動物であり得る。一般的に、投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように、すなわち、安全性および有効性を最適化するように調節される。したがって、治療または予防的有効量はまた、望ましくない副作用よりも有益な効果が勝るものである（例えば、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質の場合、望ましくない副作用よりも二量体ＶＳＴＭ３タンパク質でのＴ−細胞性免疫応答を阻害する有益な効果が勝るとき）。本発明の二量体タンパク質、例えば、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質の投与のために、用量は、一般的に、約０．１  ｇから１００ｍｇ／ｋｇまたは１  ｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇおよびさらに通常、１０  ｇから５ｍｇ／ｋｇ対象体重の範囲である。さらに特定の態様において、薬剤の有効量は、約１  ｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０  ｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の用量は、例えば、１日あたり複数回投与または毎日、毎週、隔週もしくは毎月の投与を含む単回または複数回投与によりなし遂げることができる。例えば、特定の変形において、レジメンは、最初の投与、次に、毎週または隔週の間隔での複数回の後の投与からなる。別のレジメンは、最初の投与、次に、毎月または隔月の間隔での複数回の後の投与からなる。あるいは、投与は、疾患または障害の臨床的症状のモニタリングおよび／または疾患バイオマーカーまたは他の疾患相関関係（例えば、Ｔ細胞介在免疫障害の場合、Ｔ細胞活性）のモニタリングにより示されるとおり、不規則な基準に基づくことができる。
【０１２３】
医薬組成物の用量は、標的部位における所望の濃度を維持するために、担当医により変更され得る。例えば、静脈内送達様式が選択されるとき、標的組織における血流中の薬剤の局所濃度は、対象の状態および計画される応答に依存して、１リットルあたり約１−５０ナノモルの組成物、ときどき１リットルあたり約１．０ナノモルおよび１リットルあたり１０、１５または２５ナノモルであり得る。より高いまたはより低い濃度が、送達様式、例えば、経皮送達  対  粘膜表面に対する送達に基づいて選択され得る。用量はまた、投与製剤、例えば、鼻腔用スプレー  対  粉末、持続放出経口または注射粒子、経皮製剤などの放出速度に基づいて調節すべきである。同じ血清濃度レベルをなし遂げるために、例えば、５ナノモルの放出速度（標準条件下）を有する徐放粒子は、１０ナノモルの放出速度を有する粒子の約２倍の用量で投与される。
【０１２４】
本明細書に記載されている二量体タンパク質（例えば、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質）を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾルまたは固体形態において提供することができる。液体形態は、注射可能な溶液、エアロゾル、液滴、位相溶液および経口懸濁液により例示される。典型的な固体形態は、カプセル、錠剤および放出制御形態を含む。後者の形態は、微小浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される（例えば、Bremerら Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997; Ranade, “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Bremerら “Protein Delivery with Infusion Pumps,” in Protein Delivery: Physical Systems 239-254 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Yeweyら “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997)参照）。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相適用などを含む。
【０１２５】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象に、例えば、静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下または経口投与、吸入または鼻腔内投与を介して送達するための１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り囲む１つ以上の脂質二重層からなる微細小胞である（一般的に、Bakker-Woudenbergら Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)参照）。リポソームは、細胞膜と組成が類似であり、結果として、リポソームを安全に投与することができ、生分解性である。調製の方法に依存して、リポソームは単層または多重層であり得、リポソームは０．０２μｍから１０μｍ以上の版である直径を有するサイズで変化し得る。種々の薬剤はリポソームに封入することができ：疎水性薬剤は二重層に分配され、親水性薬剤は内部の水性腔内に分配される（例えば、Machyら Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987); Ostroら American J. Hosp. Pharm. 46:1576, 1989参照）。さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより封入された薬剤の治療的有用性をコントロールすることが可能である。
【０１２６】
リポソームは、実質的にはあらゆる型の細胞に吸着し、次に、ゆっくり封入された薬剤を放出することができる。あるいは、吸着されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイトーシス的に取り込まれ得る。エンドサイトーシスは、リポソーム脂質のリソソーム内分解および封入された薬剤の放出が続く（Scherphofら Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368, 1985参照）。静脈内投与後、小リポソーム（０．１から１．０μｍ）は、一般的に、細網内皮系の細胞に取り込まれ、主に肝臓および脾臓に位置するが、３．０μｍ以上のリポソームは肺に沈着する。細網内皮系の細胞によるより小さいリポソームのこの選択的な取込みは、化学療法剤をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために使用されている。
【０１２７】
細網内皮系は、リポソーム粒子の大量投与での飽和または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法により回避することができる（Claassenら Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984参照）。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取り込みは、細網内皮系により有意に減少した摂取をもたらすことが示されている（Allenら Biochim. Biophys. Acta 1068:133, 1991; Allenら Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993参照）。
【０１２８】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、または受容体または対抗受容体をリポソームに挿入することにより、特定の細胞または臓器を標的とするように調製することができる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは、肝臓を標的とするために使用されている（例えば、Japanese Patent 04-244,018 to Hayakawaら; Katoら Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993参照）。これらの製剤は、メタノール中ダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロールおよびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、減圧化で混合物を濃縮し、次に混合物を水で再構成することにより調製した。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的とすることが示されている（Shimizuら Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997参照）。
【０１２９】
あるいは、種々の標的対抗受容体、例えば、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質は、リポソームの表面に結合させることができる。例えば、肝臓への標的化のために、リポソームは、肝細胞の表面上で専ら発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的とするように、分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾することができる（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashiら Biol. Pharm. Bull.20:259, 1997参照）。組織標的化についてのさらなる一般的なアプローチにおいて、標的細胞を、標的細胞により発現される対抗受容体に特異的なビオチン化抗体で前標識する（Harasymら Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998参照）。遊離抗体の血漿除去後、ストレプトアビジンコンジュゲートリポソームを投与する。別のアプローチにおいて、標的抗体をリポソームに直接結合させる（Harasymら supra参照）。
【０１３０】
ポリペプチドは、タンパク質マイクロカプセル化の標準技術を使用してリポソーム内に封入させることができる（例えば、Andersonら Infect. Immun. 31:1099, 1981; Andersonら Cancer Res. 50:1853, 1990; Cohenら Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991; Alvingら “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,” in Liposome Technology (Vol. III) 317 (Gregoriadis, ed., CRC Press, 2nd ed. 1993); Wassefら Meth. Enzymol. 149:124, 1987参照）。上記のとおり、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含み得る。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含み得る（Allenら Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993参照）。
【０１３１】
分解性ポリマーミクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。ミクロスフェアは、分解性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーから調製され、タンパク質がポリマー内に封入されている（例えば、Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartusら Science 281:1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998参照）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノ粒子はまた、治療タンパク質の静脈内投与のための担体を提供することができる（例えば、Grefら Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997参照）。
【０１３２】
他の投与形態は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systemss (CRC Press 1996)により示されているように、当業者により考案することができる。
【０１３３】
例えば、二量体ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）タンパク質を含む本明細書に記載されている二量体タンパク質は、遺伝子治療の文脈において、使用することができる。遺伝子治療は、一時的または永久的に細胞表現型を変化させるための細胞への遺伝物質の移動として広義的に定義することができる。多数の方法が、腫瘍患者内の特定の位置に対する遺伝子治療を介する、サイトカイン、腫瘍抗原およびさらなる共刺激分子の送達のために開発されている（一般的に、Rosenberg (ed.), Principles and practice of the biologic therapy of cancer (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 3rd ed. 2000)参照）。これらの方法論は、本発明のポリペプチド融合物をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを使用するために適合させることができる。
【０１３４】
したがって、いくつかの態様において、対象における疾患または障害は、本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードする核酸の投与により処置される。例えば、１つの態様において、対象におけるＴ細胞介在応答は、本明細書に記載されているＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）ポリペプチド融合物をコードする核酸の投与により阻害される；このようなＶＳＴＭ３をコードする核酸を使用して、Ｔ細胞介在免疫障害は、一般的に上記のとおりに処置することができる。核酸治療の場合、本明細書に記載されているポリペプチド融合物は、上記対象に直接投与される本発明の二量体タンパク質と同様の様式において治療効果を発揮する二量体タンパク質を形成するように、細胞から発現され、分泌される（例えば、ＶＳＴＭ３をコードする核酸の場合、ＶＳＴＭ３本明細書に記載されているポリペプチド融合物は、対象に直接投与される二量体ＶＳＴＭ３タンパク質と同様の様式においてＴ細胞介在効果を阻害する二量体ＶＳＴＭ３タンパク質を形成するように、発現され、分泌される）。あるいは、本発明のポリペプチド融合物は、（例えば、機能性膜貫通ドメインまたはＧＰＩ結合で）タンパク質が発現される細胞の表面との結合を維持する形態において発現され得る；このような態様は、局所的治療効果（例えば、二量体ＶＳＴＭ３タンパク質の発現を介するＴ細胞介在応答の局所的阻害）を維持するように、特定の細胞または組織に対する標識化を容易にするために特に有用である。
【０１３５】
治療方法における使用のためのポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードする核酸セグメントは、一般的に、患者の意図される標的細胞におけるＤＮＡセグメント発現を可能にする調節要素、例えば、プロモーターおよびエンハンサーに連結される。例えば、血液細胞における発現のために、ＶＳＴＭ３ポリペプチドの発現を介するＴ細胞介在応答の阻害のために望ましいとき、軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー因子またはＣＭＶ主要中間体早期プロモーターおよびエンハンサーが、発現を指向するために適当である。連結された調節要素およびコード配列は、しばしば、ベクターにクローニングされる。
【０１３６】
レトロウイルス系（例えば、Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109, 1993参照）；アデノウイルスベクター（例えば、Bettら J. Virol. 67, 5911, 1993参照）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Zhouら J. Exp. Med. 179, 1867, 1994参照）、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含むｐｏｘファミリー由来のウイルスベクター、アルファウイルス属由来のウイルスベクター、例えば、シンドビスおよびセムリキ森林熱ウイルス由来のもの（例えば、DubenskyらJ. Virol. 70, 508-519, 1996参照）およびパピローマウイルス（Oheら Human Gene Therapy 6, 325-333, 1995；ＷＯ９４／１２６２９（Wooら）；Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622, 1996）を含む多くのウイルスベクター系が利用できる。
【０１３７】
本発明のポリペプチド融合物をコードするＤＮＡまたはそれを含むベクターは、リポソーム中にパッケージングすることができる。適当な脂質および関連アナログは、ＵＳ５，２０８，０３６、５，２６４，６１８、５，２７９，８３３および５，２８３，１８５により記載されている。ポリペプチド融合物をコードするベクターおよびＤＮＡはまた、粒子担体に吸着または結合し得、これらの例は、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を含む（例えば、McGeeら J. Micro Encap., 1996参照）。
【０１３８】
遺伝子治療ベクターまたは裸のＤＮＡは、個々の患者への投与、一般的に全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、経鼻、胃内、皮内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用（例えば、ＵＳ５，３９９，３４６参照）により、インビボで送達することができる。ＤＮＡはまた、遺伝子銃を使用して投与することができる（Xiao & Brandsma, supra参照）。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、微細金属ビーズの表面上に沈殿する。微粒子銃は、衝撃波または膨張ヘリウムガスで加速させ、いくつかの細胞層の深さまで組織を貫通する。例えば、Agacetus, Inc. Middleton WIにより製造されたAccelTM Gene Delivery Deviceが適当である。あるいは、裸のＤＮＡは、ＤＮＡを皮膚上に化学的または機械的刺激で付けることにより、皮膚を介して血流に簡単に通過させることができる（例えば、ＷＯ９５／０５８５３参照）。
【０１３９】
本明細書に記載されている医薬組成物はまた、併用療法の文脈において使用され得る。「併用療法」なる用語は、本明細書に記載されている少なくとも１つの治療有効用量の二量体タンパク質および別の治療剤を対象に投与することを示すために、本明細書において使用される。
【０１４０】
医薬組成物は、本明細書に記載されているポリペプチド融合物、二量体タンパク質またはポリヌクレオチドを含む容器を含むキットとして提供され得る。治療分子は、例えば、単回または複数回投与用の注射可能な溶液の形態において、または、注射前に再構成される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生機または治療タンパク質もしくはポリヌクレオチドの投与用の噴霧器を含むことができる。このようなキットは、医薬組成物の指示および用法の書面情報をさらに含み得る。例えば、ＶＳＴＭ３（Ｂ７Ｒ１）組成物を含むキットの特定の態様において、このような情報は、ＶＳＴＭ３組成物がＶＳＴＭ３に対する既知の過敏症を有する患者には禁忌であることの記載を含み得る。
【０１４１】
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
マウスＢ７Ｒ１バーベル（ｍＢ７Ｒ１−バーベル）の構築および発現
ｍＢ７Ｒ１−ｍＦｃ２−ｍＢ７Ｒ１（天然ｍＢ７Ｒ１リーダー配列を有するｍＢ７Ｒ１−バーベル；配列番号：９に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：１０に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、２つの工程プロセスを使用する相同組換えを介して構築された。
【０１４３】
工程１
最初に、融合タンパク質ｍＢ７Ｒ１−ｍＦｃ２（マウスＦｃフラグメント（ｍＦｃ２）に融合したマウスＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ））に対する配列を含むＤＮＡフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するＰＣＲ増幅により作製した。ｍＢ７Ｒ１−ｍＦｃ２フラグメントはｐＺＭＰ４２に配列重複を有し、プライマーｚｃ６０６３９（配列番号：３６）、ｚｃ６０６４３（配列番号：３７）およびｚｃ６０６４５（配列番号：３８）を使用して作製した。このフラグメントを、以下のＰＣＲ条件で作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１４４】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１４５】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０１４６】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、１０μｌの挿入ＤＮＡおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106)を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０１４７】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１４８】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。
【０１４９】
構築の第２の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。
【０１５０】
工程２
構築の第２の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントの作製を含む。ｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントはフラグメントの５’末端に加えられたＢｓｐＥＩ制限切断部位およびフラグメントの３’末端に加えられたＢｓｕ３６Ｉ部位を有し、プライマーｚｃ６０６４２（配列番号：３９）およびｚｃ６０６４１（配列番号：４０）を使用して作製した。該フラグメントを、以下のＰＣＲ条件を使用して作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１５１】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１５２】
第１の工程からの構築物および第２の工程のｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントの両方を、ＢｓｐＥＩおよびＢｓｕ３６Ｉを使用して消化した。第１の工程の構築物および第２の工程のｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントに対する消化されたＤＮＡを１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、ＤＮＡのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、２つの精製されたＤＮＡ調製物を互いに連結した。
【０１５３】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、１μｌのライゲーション調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１５４】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。このクローンは、＃１８６３と称した。
【０１５５】
天然シグナル配列を有するｍＢ７Ｒ１−バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：９および１０に示される。ｍＢ７Ｒ１−バーベルの成熟形態は、配列番号：１０のアミノ酸２６−４８９（配列番号：９のヌクレオチド７６−１４６７によってコードされる）に対応する。
【０１５６】
ｍＢ７Ｒ１−バーベルの発現
３セットの２００μｇの構築物＃１８６３をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０１５７】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０１５８】
実施例２
ヒトＢ７Ｒ１バーベル（Ｂ７Ｒ１−バーベル）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５−Ｂ７Ｒ１（天然Ｂ７Ｒ１リーダー配列を有するＢ７Ｒ１−バーベル；配列番号：５に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：６に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、２つの工程プロセスを使用する相同組換えを介して構築された。
【０１５９】
工程１
最初に、融合タンパク質Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５（エフェクター機能を有さないＦｃフラグメントＦｃ５に融合したヒトＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ））に対する配列を含むＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ増幅および組換えにより作製した。Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントおよびＦｃ５フラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントはＦｃ５に配列重複を有し、プライマーｚｃ５３０５１（配列番号：４１）およびｚｃ６０３８５（配列番号：４２）を使用して作製した。Ｆｃ５をコードするフラグメントは、Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤへの５’重複、ＧＧＧＳＧリンカー、ＢｓｐＥＩ部位および下流ＢｇｌＩＩ部位を含む複数のクローニング領域、ならびにｐＺＭＰ４２ベクター配列との配列重複を有し、プライマーｚｃ６０３８６（配列番号：４３）、ｚｃ５９４３３（配列番号：４４）およびｚｃ５９４３４（配列番号：４５）を使用して作製した。これらの２つのフラグメントを、以下のＰＣＲ条件で作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１６０】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１６１】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０１６２】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、１０μｌの挿入ＤＮＡおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106)を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０１６３】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１６４】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。
【０１６５】
該構築物を＃１７９５と称し、構築の第２の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。
【０１６６】
工程２
構築物＃１７９５を、ｐＺＭＰ４２においてヒトＢ７Ｒ１バーベルベクターを構築する第１の工程として構築した。＃１７９５は、リンカー配列からなる３’付加ならびに制限酵素認識部位ＢｓｐＥＩおよびＢｇｌＩＩを含む多数のクローニング領域を含むベクターｐＺＭＰ４２中にＢ７Ｒ１−Ｆｃ５フラグメントを含む。
【０１６７】
構築の第２の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントの作製を含む。Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントはフラグメントの５’末端に加えられたＢｓｐＥＩ制限切断部位およびフラグメントの３’末端に加えられたＢｇｌＩＩ部位を有し、プライマーｚｃ５９４３５（配列番号：７７）、ｚｃ６０３９２（配列番号：７８）およびｚｃ５９４３４（配列番号：４５）を使用して作製した。フラグメントを、以下のＰＣＲ条件を使用して作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１６８】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１６９】
構築物＃１７９５および第２の工程のＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントの両方を、ＢｓｐＥＩおよびＢｇｌＩＩを使用して消化した。構築物＃１７９５および第２の工程のＢ７Ｒ１  ＥＣＤフラグメントに対する消化されたＤＮＡを１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704) を使用して、ＤＮＡのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、２つの精製されたＤＮＡ調製物を互いに連結した。
【０１７０】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、１μｌのライゲーション調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１７１】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。このクローンを＃１８１２と称した。
【０１７２】
天然シグナル配列を有するＢ７Ｒ１−バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：５および６に示される。Ｂ７Ｒ１−バーベルの成熟形態は、配列番号：６のアミノ酸２２−４９８（配列番号：５のヌクレオチド６４−１４９４によってコードされる）に対応する。
【０１７３】
Ｂ７Ｒ１−バーベルの発現
３セットの２００μｇの構築物＃１８１２をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０１７４】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０１７５】
実施例３
マウスＢ７Ｒ１タンデム（ｍＢ７Ｒ１−タンデム）の構築および発現
ｍＢ７Ｒ１ｍ−ｍＢ７Ｒ１−ｍＦｃ２（天然ｍＢ７Ｒ１リーダー配列を有するｍＢ７Ｒ１−タンデム；配列番号：１１に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：１２に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、ｍＦｃ２挿入物（実施例１の工程１に記載されている構築物）を含む発現ベクターｐＺＭＰ４２の以前に修飾されたバージョンにライゲーションを介して構築された。
【０１７６】
ｍＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むＤＮＡフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。フラグメントは、５’末端に操作されたＥｃｏＲＩ部位、ｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤ、およびＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有し、プライマーｚｃ６０６３９（配列番号：３６）、ｚｃ６０６４０（配列番号：４６）およびｚｃ６０６４４（配列番号：４７）を使用して作製した。第２のＤＮＡフラグメントは、３’末端上に第１のフラグメントのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、ｍＢ７Ｒ１  ＥＣＤ、およびフラグメントの３’末端上にＢｇｌ  ＩＩ部位に重複で作製し、プライマーｚｃ６０６４２（配列番号：４８）およびｚｃ２８８４４（配列番号：４９）を使用して作製した。
【０１７７】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１７８】
これらの２つのＤＮＡフラグメントを、重複ＰＣＲを使用して単一のフラグメントに融合した。２つのゲル精製フラグメントをＰＣＲチューブに加え、プライマーｚｃ６０６３９（配列番号：３６）およびｚｃ２８８４４（配列番号：４９）を使用して増幅した。得られたフラグメントは、コア配列ｍＢ７Ｒ１−ｍＢ７Ｒ１の側面に５’ＥｃｏＲＩ部位および３’Ｂｇｌ  ＩＩ部位を含んだ。
【０１７９】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１８０】
精製されたフラグメントおよび修飾されたベクターｐＺＭＰ４２の両方を、ＥｃｏｒＩおよびＢｇｌＩＩを使用して消化し、興味あるバンドを単離し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して精製した。次に、精製されたフラグメントを、ｍＢ７Ｒ１−ｍＢ７Ｒ１フラグメントが修飾されたｐＺＭＰ４２ベクターに含まれるｍＦｃ２とインフレームであるように、当分野で知られている方法を使用して連結した。得られた構築物は、ｍＢ７Ｒ１−ｍＢ７Ｒ１−ｍＦｃ２からなるタンパク質を発現する。
【０１８１】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（特許公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）
【０１８２】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、１μｌのライゲーションＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１８３】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。最終クローンを構築物＃１８６４と称した。
【０１８４】
天然シグナル配列を有するｍＢ７Ｒ１−タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１１および１２に示される。ｍＢ７Ｒ１−タンデムの成熟形態は、配列番号：１２のアミノ酸２６−５０４または２６−５０３（それぞれ、配列番号：１１のヌクレオチド７６−１５１２または７６−１５０９によってコードされる）に対応する。
【０１８５】
ｍＢ７Ｒ１−タンデムの発現
３セットの２００μｇの構築物＃１８６４をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０１８６】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０１８７】
実施例４
ヒトＢ７Ｒ１タンデム（Ｂ７Ｒ１−タンデム）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１−Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５（天然Ｂ７Ｒ１リーダー配列を有するＢ７Ｒ１−タンデム；配列番号：７に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：８に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、発現ベクターｐＺＭＰ４２にＢ７Ｒ１−Ｆｃ５挿入物を含む構築物＃１７９５（実施例２の工程１に記載されている構築物）を称される以前に作製された構築物にライゲーションを介して構築された。構築は２つの工程プロセスで行った。
【０１８８】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（特許公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０１８９】
工程１
Ｂ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むＤＮＡフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。フラグメントは、５’末端に操作されたＥｃｏＲＩ部位、Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤ、ＢｓｐＥＩ部位を含むＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有し、プライマーｚｃ５３０５１（配列番号：４１）、ｚｃ６２５２９（配列番号：５０）およびｚｃ６２５３０（配列番号：５１）を使用して作製した。このフラグメントを、以下のＰＣＲ条件で作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１９０】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１９１】
構築物＃１７９５および精製されたＰＣＲフラグメントの両方を、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩを使用して消化した。構築物＃１７９５およびＰＣＲフラグメントに対する消化されたＤＮＡを１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704) を使用して、ＤＮＡのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、２つの精製されたＤＮＡ調製物を互いに連結した。
【０１９２】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、１μｌのライゲーションＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１９３】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。構築の第２の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。
【０１９４】
工程２
構築の第２の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するＢ７Ｒ１−Ｆｃ５フラグメント（エフェクター機能を有さないＦｃフラグメントＦｃ５に融合したヒトＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ））の作製を含む。Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５  フラグメントはフラグメントの５’末端に加えられたＢｓｐＥＩ制限切断部位およびフラグメントの３’末端に加えられたＢｇｌ  ＩＩ部位を有し、プライマー  ｚｃ６２５３１（配列番号：５２）およびｚｃ６２５３２（配列番号：５３）を使用して作製した。フラグメントを、以下のＰＣＲ条件を使用して作った：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０１９５】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０１９６】
第１の工程からの構築物および第２の工程のＢ７Ｒ１−Ｆｃ５フラグメントの両方を、ＢｓｐＥＩおよびＢｇｌＩＩを使用して消化した。第１の工程の構築物および第２の工程のＢ７Ｒ１−Ｆｃ５フラグメントに対する消化されたＤＮＡを１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704) を使用して、ＤＮＡのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、２つの精製されたＤＮＡ調製物を互いに連結した。
【０１９７】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、１μｌのライゲーション調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０１９８】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。該クローンを＃１９１４と称した。
【０１９９】
天然シグナル配列を有するＢ７Ｒ１−タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：７および８に示される。Ｂ７Ｒ１−タンデムの成熟形態は、配列番号：８のアミノ酸２２−５１３または２２−５１２（それぞれ、配列番号：７のヌクレオチド６４−１５３９または６４−１５３６によってコードされる）に対応する。
【０２００】
Ｂ７Ｒ１−タンデムの発現
３セットの２００μｇの構築物＃１９１４をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０２０１】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０２０２】
実施例５
ｏｔＰＡ  リーダー配列を使用してＧ２５成熟開始を有するヒトＢ７Ｒ１バーベル（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベル）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−Ｆｃ５−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベル；配列番号：１３の残基１０６−１５１８に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：１４の残基３６−５０６に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、結合されると、Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルに対する配列を含む３つのＤＮＡフラグメント、および発現ベクターｐＺＭＰ４２を使用する相同組換えを介して構築した。
【０２０３】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルフラグメントを、鋳型としてＢ７Ｒ１−バーベルの以前に作製されたクローンを使用して３つのフラグメントのＰＣＲ増幅により作製した。第１のフラグメントは、ベクターに対する５’フランキング配列、最大残基Ｃ６９までの第１のＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）モジュールの部分、およびＣ６９の後ろの残基の重複を含むオリゴｚｃ６４２３０（配列番号：５４）およびｚｃ６４２１９（配列番号：５５）を使用して作製した。第２のフラグメントは、フランキング配列から第１のフラグメントに、第１のＢ７Ｒ１モジュールの残基Ｃ６９を介して、Ｆｃ５の末端までにわたるオリゴｚｃ６４２１５（配列番号：５６）およびｚｃ６４２１６（配列番号：５７）を使用して作製した。最終フラグメントは、オリゴｚｃ６４２２８（配列番号：５８）、ｚｃ６４２２０（配列番号：５９）、ｚｃ６４２２４（配列番号：６０）、ｚｃ６４２３１（配列番号：６１）、ｚｃ６４２２５（配列番号：６２）、ｚｃ６４２２１（配列番号：６３）、ｚｃ６４２２６（配列番号：６４）、ｚｃ６４２２２（配列番号：６５）、ｚｃ６４２２３（配列番号：６６）、ｚｃ６４２５８（配列番号：６７）およびｚｃ５９４３４（配列番号：４５）を使用する重複ＰＣＲを介して合成的に作製した。酵母組換えにより集合させたとき、３つのフラグメントの融合物は、ｐＺＭＰ４２ベクターの５’重複、ｏｔＰＡリーダー配列、第２のＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］モジュールに融合したＦｃ５に融合した第１のＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］モジュール、およびｐＺＭＰ４２ベクター配列の３’重複を含む。それぞれのフラグメントを作製するために使用されたＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０２０４】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０２０５】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０２０６】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、３μｌのそれぞれの挿入ＤＮＡフラグメントおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106)を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０２０７】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０２０８】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。該クローンを構築物＃２０２４と称した。
【０２０９】
ｏｔＰＡシグナル配列を有するＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１３および１４に示される。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルの成熟形態は、配列番号：１４のアミノ酸３６−５０６（配列番号：１３のヌクレオチド１０６−１５１８によってコードされる）に対応する。
【０２１０】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルの発現
３セットの２００μｇの構築物をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０２１１】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０２１２】
実施例６
ｏｔＰＡ  リーダー配列を使用してＧ２５成熟開始およびＣ６９Ｙ変異を有するヒトＢ７Ｒ１バーベル（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｆｃ５−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル；配列番号：１３の残基１０６−１５１８に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：１６の残基３６−５０６に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、結合されると、Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルに対する配列を含む３つのＤＮＡフラグメント、および発現ベクターｐＺＭＰ４２を使用する相同組換えを介して構築した。
【０２１３】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルフラグメントを、鋳型としてＢ７Ｒ１−バーベルの以前に作製されたクローンを使用して３つのフラグメントのＰＣＲ増幅により作製した。第１のフラグメントは、ベクターに対する５’フランキング配列、最大残基Ｃ６９までの第１のＢ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）モジュールの部分、およびＣ６９の後ろの残基の重複を含むオリゴｚｃ６４２３０（配列番号：５４）およびｚｃ６４２１８（配列番号：６８）を使用して作製した。第２のフラグメントは、フランキング配列から第１のフラグメントに、第１のＢ７Ｒ１モジュールの残基Ｃ６９を介して、Ｆｃ５の末端までにわたるオリゴｚｃ６４２１５（配列番号：５６）およびｚｃ６４２１６（配列番号：５７）を使用して作製した。最終フラグメントは、オリゴｚｃ６４２２８（配列番号：５８）、ｚｃ６４２２０（配列番号：５９）、ｚｃ６４２２４（配列番号：６０）、ｚｃ６４２２７（配列番号：６９）、ｚｃ６４２２５（配列番号：６２）、ｚｃ６４２２１（配列番号：６３）、ｚｃ６４２２６（配列番号：６４）、ｚｃ６４２２２（配列番号：６５）、ｚｃ６４２２３（配列番号：６６）、ｚｃ６４２５８（配列番号：６７）およびｚｃ５９４３４（配列番号：４５）を使用する重複ＰＣＲを介して合成的に作製した。酵母組換えにより集合させたとき、３つのフラグメントの融合物は、ｐＺＭＰ４２ベクターの５’重複、ｏｔＰＡリーダー配列、第２のＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］モジュールに融合したＦｃ５に融合した第１のＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］モジュール、およびｐＺＭＰ４２ベクター配列の３’重複を含む。それぞれのフラグメントを作製するために使用されたＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０２１４】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０２１５】
該挿入物は、Ｂ７Ｒ１  ＥＣＤモジュールの修飾を含む。残基Ｃ６９は、チロシン（Ｙ）に変異されていた。成熟タンパク質のＮ−末端開始はまた、ヒト予測開始（アミノ酸残基２２）からアミノ酸残基２５（Ｇ２５）を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。
【０２１６】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０２１７】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、３μｌのそれぞれの挿入ＤＮＡフラグメントおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106) を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０２１８】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０２１９】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。該クローンを構築物＃２０２６と称した。
【０２２０】
ｏｔＰＡシグナル配列を有するＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１５および１６に示される。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］−バーベルの成熟形態は、配列番号：１６のアミノ酸３６−５０６（配列番号：１５のヌクレオチド１０６−１５１８によってコードされる）に対応する。
【０２２１】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルの発現
３セットの２００μｇの構築物をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０２２２】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０２２３】
実施例７
ＥＭＩＬ  リーダー配列を使用してＧ２５成熟開始およびＣ６９Ｙ変異を有するヒトＢ７Ｒ１バーベル（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｆｃ５−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル；配列番号：１７の残基６７−１４９７に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：１８の残基２３−４９３に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルに対する配列を含むＤＮＡフラグメント、および発現ベクターｐＺＭＰ４２を使用する相同組換えを介して構築した。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルフラグメントはプライマーｚｃ６５０３０（配列番号：７０）、ｚｃ６５０２９（配列番号：７１）、およびｚｃ５９４３４（配列番号：４５）を使用するＰＣＲ増幅により作製した。
【０２２４】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルフラグメントを、鋳型として構築物＃２０２６と称されるＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルの以前に作製されたクローンを使用して３つのフラグメントのＰＣＲ増幅により作製した。該フラグメントはｐＺＭＰ４２ベクター配列との５’重複、「ＥＭＩＬ」と称されるリーダー配列（配列番号：１７の残基１−６６；配列番号：１８の残基１−２２に示されるコードされたアミノ酸配列）、Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルセグメント（配列番号：１７の残基６７−１４９７；配列番号：１８の残基２３−４９３に示されるコードされたアミノ酸配列）、ならびにｐＺＭＰ４２ベクター配列との３’重複を含む。使用されたＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０２２５】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０２２６】
該挿入物は、Ｂ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）モジュールの修飾を含む。残基Ｃ６９は、チロシン（Ｙ）に変異されていた。成熟タンパク質のＮ−末端開始はまた、ヒト予測開始（アミノ酸残基２２）からアミノ酸残基２５（Ｇ２５）を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。
【０２２７】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０２２８】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、１０μｌの挿入ＤＮＡおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106) を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０２２９】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０２３０】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。該クローンを構築物＃２０６５と称した。
【０２３１】
ＥＭＩＬシグナル配列を有するＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１７および１８に示される。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルの成熟形態は、配列番号：１８のアミノ酸２３−４９３（配列番号：１７のヌクレオチド６７−１４９７によってコードされる）に対応する。
【０２３２】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルの発現
３セットの２００μｇの構築物をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０２３３】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０２３４】
実施例８
ＥＭＩＬ  リーダー配列を使用してＧ２５成熟開始およびＣ６９Ｙ変異を有するヒトＢ７Ｒ１タンデム（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデム）の構築および発現
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｆｃ５（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデム；配列番号：１９の残基６７−１５２４に示されるポリヌクレオチド配列；配列番号：２０の残基２３−５０８に示されるコードされたポリペプチド配列）を含む発現プラスミドは、Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］（配列番号：２０の残基２３−１３９）に対する配列を含むＤＮＡフラグメント、Ｆｃ５をコードするＤＮＡフラグメント、および発現ベクターｐＺＭＰ４２を使用する相同組換えを介して構築した。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］フラグメントはオリゴｚｃ６５０３０（配列番号：７０）、ｚｃ６５０２９（配列番号：７１）、ｚｃ６５０５０（配列番号：７２）、ｚｃ６５０５１（配列番号：７３）、およびｚｃ６５０５２（配列番号：７４）を使用する一連のＰＣＲ増幅により作製した。Ｆｃ５フラグメントはオリゴｚｃ６５０５３（配列番号：７５）およびｚｃ６５０５４（配列番号：７６）を使用して作製した。
【０２３５】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］フラグメントを、鋳型として構築物＃２０２６と称されるＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｆｃ５−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］（Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル）（実施例６参照）の以前に作製されたクローンを使用して３つのフラグメントのＰＣＲ増幅により作製した。第１の反応は、オリゴｚｃ６５０３０（配列番号：７０）、ｚｃ６５０２９（配列番号：７１）およびｚｃ６５０５０（配列番号：７２）を使用して５’ＥＭＩＬリーダー配列を有する１つのＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］ユニットを増幅した。第２の反応は、オリゴｚｃ６５０５１（配列番号：７３）およびｚｃ６５０５２（配列番号：７４）で第２のＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］ユニットを増幅した。最終反応は、オリゴｚｃ６５０３０およびｚｃ６５０５２で第１の２つの増幅された産物に対する重複ＰＣＲを使用して、単一の融合Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］フラグメントを作製した。該フラグメントはｐＺＭＰ４２ベクター配列との５’重複、「ＥＭＩＬ」と称されるリーダー配列（配列番号：１９の残基１−６６；配列番号：２０の残基１−２２に示されるコードされたアミノ酸配列）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して連結されたＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］の２つの連続コピー（配列番号：１９の残基６７−８２８；配列番号：２０の残基２３−２７６に示されるコードされたアミノ酸配列）、およびＦｃ５の５’末端の３’重複を含む。使用された全ての反応に対するＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：１サイクル、９４℃、５分；３５サイクル、９４℃、１分、次に、５８℃、２分、次に、７２℃、３分；１サイクル、７２℃、１０分。
【０２３６】
Ｆｃ５をコードする第２のフラグメント（配列番号：１９の残基８２９−１５２４；配列番号：２０の残基２７７−５０８に示されるコードされたアミノ酸配列）は、プライマーｚｃ６５０５３（配列番号：７５）およびｚｃ６５０５４（配列番号：７６）を使用して作製した。このフラグメントはＦｃ５フラグメントおよびベクターｐＺＭＰ４２の３’重複を含む。
【０２３７】
ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、QIAQUICKTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704)を使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。
【０２３８】
該挿入物は、Ｂ７Ｒ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）モジュールの修飾を含む。残基Ｃ６９は、チロシン（Ｙ）に変異されていた。成熟タンパク質のＮ−末端開始はまた、ヒト予測開始（アミノ酸残基２２）からアミノ酸残基２５（Ｇ２５）を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。
【０２３９】
プラスミドｐＺＭＰ４２は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびｏｔＰＡシグナルペプチド配列；Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、および膜貫通ドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメント、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーター；大腸菌複製起点；ならびにサッカロミセス・セレビシエにおいて選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築した（米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２３２４１４号  Ａ１）（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５２６６として称され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）。
【０２４０】
ＰＣＲフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ４２をＢｇｌＩＩで切断した。１００マイクロリットルのコンピテント酵母（サッカロミセス・セレビシエ）細胞を、５μｌのＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］フラグメントＤＮＡ、５μｌのＦｃ５フラグメントＤＮＡおよび１００ｎｇのカットされたｐＺＭＰ４２ベクターと独立して組み合わせて、混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、および２５μＦの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)セットを使用して電気パルスを行った。６００μｌの１．２Ｍのソルビトールをキュベットに加え、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上の１００μｌおよび３００μｌアリコート中に置き、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを０．１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中でボルテックスにより再懸濁し、１０ユニットのザイモリエイスを有する０．１ｍＬのＰ１（QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106）を加えた（Zymo Research, cat# E1002）。酵母懸濁液を水浴中で３７℃で１０分間インキュベートした。試薬Ｐ２を加える工程で開始する標準QIAPREP(登録商標) Spin Miniprep Kit protocol (Qiagen, cat# 27106) を使用して、酵母由来のＤＮＡを単離した。
【０２４１】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌの細胞を使用して行った。細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のBACTOTM Tryptone (Difco, Detroit, MI)、０．５％の酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を加え、次に、細胞を２つのＬＢ  ＡＭＰプレート上の５０μｌおよび２００μｌのアリコート（ＬＢ培養液(Lennox)、１．８％のBACTOTM Agar(Difco)、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）中に置いた。
【０２４２】
構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む１つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。該クローンを構築物＃２０６６と称した。
【０２４３】
ＥＭＩＬシグナル配列を有するＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１９および２０に示される。Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデムの成熟形態は、配列番号：２０のアミノ酸２３−５０８または２３−５０７（それぞれ配列番号：１９のヌクレオチド６７−１５２４または６７−１５２１によってコードされる）に対応する。
【０２４４】
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデムの発現
３セットの２００μｇの構築物をそれぞれ、３７℃で３時間２００ユニットのＰｖｕ  Ｉで消化し、次に、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温で５分間インキュベートした。チューブを１４，０００ＲＰＭで１０分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で７５０μｌのＺＦ１培地に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷やした。５×１０６  ＣＨＯ  ＤＸＢ１１  ５ｘＳＡ細胞をそれぞれの３つのチューブ中で遠沈し、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した：９５０μＦ、大容量、および３００Ｖ。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＺＦ１培地で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬの振とうフラスコに置いた。フラスコを、３７℃で、６％ＣＯ２および１２０ＲＰＭでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。
【０２４５】
該細胞系を栄養素選択、次に、２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。
【０２４６】
実施例９
ヒトおよびマウスＢ７Ｒ１タンデムおよびバーベルタンパク質の精製
ヒトおよびマウス可溶性Ｂ７Ｒ１細胞外ドメインを、一時的および安定な発現のために２つの立体配置タンデムおよびバーベルにおけるヒトＦｃ（上記実施例参照）と融合した。ヒトＢ７Ｒ１  Ｆｃ融合タンパク質はトランスフェクト２９３またはＣＨＯ細胞から生産し、マウスタンパク質はトランスフェクトＣＨＯ細胞から生産した。トランスフェクションは、当分野で知られている方法を使用して行った。ヒト形態がより高い収量をなし遂げるように操作される（ヒト形態を、天然Ｂ７Ｒ１細胞外ドメインのグリシン２５（Ｇ２５）での成熟開始を有するように、ならびに位置６９（Ｃ６９Ｙ）にてシステインをチロシン変異へ組換えるように操作した；上記例えば、実施例７および８参照）まで、マウスタンパク質はヒト形態より高いレベルで一貫して生産された。全ての形態を、アフィニティー捕獲、次に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用するバッファー交換のための濃縮からなる同じプロセスを使用して精製した。ヒトおよびマウスＢ７Ｒ１  Ｆｃ融合タンパク質の両方において、精製は１．５から１０Ｌのラボベンチ規模で行った。
表３：ヒトおよびマウスＢ７Ｒ１タンデムおよびバーベルの精製
【表３】
2013531982.tif 000004
【０２４７】
細胞培養上清を回収し、０．２μｍフィルターを使用して無菌濾過した。タンパク質を、タンパク質ＡセファロースまたはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  サイズ排除クロマトグラフィー（全て、GE Healthcare, Piscataway, NJ.から）の組合せにより濾過された媒体から精製した。規模に依存して、５から１５７ｍｌのタンパク質Ａカラムを、３カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム、２５０ｍＭの硫酸アンモニウム  ｐＨ３バッファーで再溶離し、２０ＣＶの２５ｍＭのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム、２５０ｍＭの硫酸アンモニウム  ｐＨ７．２で平衡にした。ＣＨＯ培養上清を４℃で一晩２４−４２ｃｍ／ｈｒでタンパク質Ａカラムに直接負荷し、上清中のＢ７Ｒ１  Ｆｃ融合タンパク質を捕獲した。負荷完了後、カラムを少なくとも１０ＣＶの平衡バッファーで洗浄した。次に、カラムを少なくとも１０ＣＶの２５ｍＭのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム、２５０ｍＭの硫酸アンモニウム  ｐＨ７．２バッファーで洗浄し、次に、結合タンパク質をクエン酸−リン酸−硫酸アンモニウムバッファーを使用して形成されたｐＨ７．２からｐＨ３の２０ＣＶ勾配で９２−１４９ｃｍ／ｈｒで溶離した。溶離されたタンパク質を即座に中和するために、画分を含む対象を２．０ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を含むチューブに回収した。画分を、溶離プロフィールにおけるＡ２８０屈折に基づいてプールした。
【０２４８】
次に、アフィニティープールを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３０Ｋ  ＮＷＭＬ遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または３０ｋＤ  ＭＷカットオフ膜での撹拌セルのいずれかを使用して、限外ろ過によるサイズ排除カラムで＜３％の容量に濃縮下。次に、濃縮物を、２８ｃｍ／ｈｒで３５ｍＭのリン酸ナトリウム、１２０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．３において再平衡した適当なサイズのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上に注入した。精製されたＢ７Ｒ１  Ｆｃ融合タンパク質を含む画分をＡ２８０に基づいてプールし、０．２μｍフィルターを介して濾過し、内容物およびエンドトキシンについてアッセイし、−８０℃でアリコートとして冷凍した。最終精製されたタンパク質の内容物を、理論的消滅係数を使用してＡ２８０での吸光度により決定した。全プロセス回収は、マウスタンパク質に対して１０−１４ｍｇ／Ｌおよびヒト構築物に対して６−６６ｍｇ／Ｌで変化した。
【０２４９】
精製されたＢ７Ｒ１タンデムおよびバーベルタンパク質の分析
組換えＢ７Ｒ１Ｆｃ融合タンパク質は、タンパク質に対して０．１％  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ２５０  染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（4-12% BisTris, Invitrogen, Carlsbad, CA）および抗−ＩｇＧ−ＨＲＰでの免疫ブロット法により特徴付けられた。精製されたタンパク質を、Invitrogen Novex’s Xcell II mini-cellを使用して電気泳動し、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、２００ｍＭのグリシン、および２０％メタノールを含むバッファー中で６００ｍＡで環境温度で４５分間でニトロセルロース（0.2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA）に移した。次に、フィルターを室温で１５分間５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＩｇｅｐａｌ（ＴＢＳ）の１０％の脱脂粉乳でブロックした。ニトロセルロースを迅速に濯ぎ、ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１０，０００）を加えた。ブロットを穏やかな振とうにて４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳ中でそれぞれ１０分間で３回洗浄し、次に、迅速にＨ２Ｏ中で濯いだ。ブロットを市販されている化学発光基質試薬（Roche LumiLight）を使用して現し、シグナルをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ装置およびソフトウェア（GE Healthcare）を使用して捕獲した。精製されたＢ７Ｒ１マウスおよびヒトタンデムおよびバーベルＦｃ融合タンパク質は、ウェスタンブロットおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルの両方において、非還元条件下で約１６０ｋＤａおよび還元条件下で約６４ｋＤａの２つのバンドとして現れ、予想通りグリコシル化二量体形態を示唆した。該タンパク質は、正しいＮＨ２末端、正しいアミノ酸組成物を有し、ＳＥＣ  ＭＡＬＳを使用してグリコシル化の質量およびパーセントについてよく特徴付けられた。
【０２５０】
実施例１０
Ｂ７Ｒ１融合タンパク質の動的光散乱（ＤＬＳ）分析
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、プレートリーダーフォーマットにおけるＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌｕｓ装置（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)で２１℃、５℃および３７℃でのヒトおよびマウスＢ７Ｒ１融合構築物の短期安定性および凝集モニタリングした。マウスとヒト型を比較するこれらの最初の試験の結果として、元のヒト対応物に対する変異ヒトバーベルおよびタンデム構築物の安定性を比較するために、さらなる実験を行った。
【０２５１】
１．分析技術における背景
ＤＬＳは、マイクロ秒の時間規模にわたって散乱光強度の時間依存性変動を測定する。強度におけるこれらの変動は、ブラウン運動によって溶液中に拡散している粒子の結果であり、拡散速度はサイズと関連する。ＤＬＳ生データは、拡散係数（Ｄｔ）が得られる自己相関関係プロットとして獲得される。多重種類、例えば、大型オリゴマーまたは凝集体での単量体が存在するとき、拡散係数の分布はＤｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（v. 6.0, Wyatt Technology）による解析後に見られる。次に、流体力学的半径（または、Ｓｔｏｋｅｓ  ｒａｄｉｕｓ）  Ｒｈを、溶液中の粒子の拡散速度およびサイズ間の理論的関連を示すＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ関連を使用するソフトウェアにより得る。
【０２５２】
ＤＬＳは非常に少量の大型種類に極度に感受性であり、全サンプルの０．０１％に至るまでのタンパク質凝集体を容易に定量するために使用することができる。
【０２５３】
２．分析パラメーターの記載
サンプル調製
サンプルを−８０℃保存から回復させ、１ｍｇ／ｍＬでの分析のために室温で３０分間、または次に２５ｍｇ／ｍＬ分析のために１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎユニットにおける回転濃縮工程で解凍した。次に、２００μｌのアリコートを１．５ｍＬの微量遠心チューブに移し、環境温度で５分間Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機において１４Ｋｒｐｍで遠心した。遠心分離後、２０μｌのサンプルを、それぞれのサンプルに対するトリプリケートにおいてスキャンするために、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４ウェルガラス底プレートに移した。一滴のシリコーン油カバーを、分析中、それぞれのウェルに加えた。両方のサンプル濃度を、元の製剤バッファーのみの中で試験した。
【０２５４】
分析パラメーター
データを、それぞれ１５秒の単位において６０秒間それぞれのウェルにおいて収集した。サンプルを、２１℃示度のために室温で２時間、５℃で一晩、次に３７℃で２時間インキュベーション後にスキャンした。新たに調製されたサンプルでの３７℃での別々の経時的実験もまた、より高い温度で時間とともに凝集をモニタリングするために行った。
【０２５５】
３．結果の要約
ＤＬＳサイズ分布分類の鍵
「単一モード」および「多モード」なる用語は、検出されるビン（またはピーク）の数を示す。「単分散」および「多分散」なる用語は、それぞれのビン内の種類のサイズの変動性を示す。例えば、サンプルを、２つ以上の密接に関連した種類、例えば、単量体／二量体／トリマーを含む検出された単一モード／多分散＝１つのビンとして分類した。
【０２５６】
マウスおよびヒト型間の観察される違い
精製されたマウスＢ７Ｒ１の最初の型の分析は、全４つの立体配置、すなわち、Ｆｃ（配列番号：３４）、ＶＡＳＰ（配列番号：３５）、バーベル（配列番号：１０残基２６−４８９；構築物１８６３）およびタンデム（配列番号：１２残基２６−５０４または２６−５０３；構築物１８６４）型が全３つの温度で安定であったことを示した。３７℃で不安定性は観察されなかった。逆に、バーベル（配列番号：６残基２２−４９８；構築物１８１２）およびタンデム（配列番号：８残基２２−５１３または２２−５１２；構築物１９１４）分子のヒト形態は、ヒトＦｃ（Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５；配列番号：７９）およびＶＡＳＰ（Ｂ７Ｒ１−ＶＡＳＰ；配列番号：８１）構築物と同様に、３７℃で著しい不規則な凝集および不安定性を示した。該凝集は２時間以内に観察され、可逆性ではなく、会合／凝集がアンフォールディング経路を介して生じることを示した。３７℃でのヒトＢ７Ｒ１の不安定性は、低および高濃度の両方で観察され、ロット間分析と一貫していた。
【０２５７】
ヒトバーベルおよびタンデム型の変異の効果
ヒトＢ７Ｒ１バーベルおよびタンデム分子の変異型−Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル（配列番号：１８残基２３−４９３；実施例７参照）およびＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデム（配列番号：２０残基２３−５０８または２３−５０７；実施例８参照）もまた、ＤＬＳを使用して分析した。データを、３７℃でさらなる経時的試験で全３つの温度で収集した。
【０２５８】
１ｍｇ／ｍＬで、両方の変異型は、平均半径のわずかな増加により示されるとおり、観察されたごくわずかな多重合で２１℃および５℃で短期安定性を示す。５９ｎｍ半径の大型種類は３７℃でＴ＝４ｈｒで観察されたが、サンプルの微量成分（０．１重量％）であり、環境温度に冷却時に可逆的に解離された。
【０２５９】
２５ｍｇ／ｍＬのより高い濃度で、両方の型は、小さい、密接に関連した種類、例えば、二量体／トリマーの量においてわずかな増加を示す、わずかにより大きい平均半径および増加した多分散性を有したが、該サンプルは単一モードおよび単分散（すなわち、１つのビンが検出される）を維持し、ＨＭＷ凝集体を含まなかった。
【０２６０】
これらの２つの型のバーベルは、わずかにより安定であると考慮されたが＊、しかしながら、どちらのサンプルもＴ＝１８時の最終測定までの短期間にわたって３７℃で有意な不安定性を示さなかった。
【０２６１】
結論
Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルおよびＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデムは、元のヒト構築物で観察される凝集問題の完全な改善で、低および高濃度の両方で３７℃で安定性における所望の増加を示した。
【０２６２】
実施例１１
ヒトＢ７Ｒ１構築物に対する結合アッセイ
Ｂ７Ｒ１受容体含有タンパク質に対する細胞ベースの結合アッセイを、既知のＰＶＲ（ポリオウイルス受容体；ＣＤ１５５）−Ｂ７Ｒ１受容体−リガンド対を使用して確立した。Ｐ８１５細胞（マウス肥満細胞腫細胞系、ＡＴＣＣ）を、標準技術を使用して、ネオマイシン（Ｇ４１８）選択マーカーを含むヒトＰＶＲ発現ベクターをトランスフェクトした。Ｇ４１８選択下での増殖後、ｈＰＶＲの発現をフローサイトメトリーにより確認した。空のベクターを有するＰ８１５細胞の平行トランスフェクション（コントロール）をＧ４１８選択下で増殖し、フローサイトメトリーによりｈＰＶＲの発現を有さないことを確認した。
【０２６３】
４つのヒトＢ７Ｒ１受容体含有タンパク質：Ａ１６４８．１、アミン結合を介してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７で直接標識されているｈＢ７Ｒ１−ＶＡＳＰ分子（配列番号：８１）；Ａ２６４８Ｆ、ｈＢ７Ｒ１−Ｆｃ２二量体（配列番号：７９）；Ａ２７５１Ｆ、ｈＢ７Ｒ１−「バーベル−Ｆｃ」タンパク質（配列番号：１８残基２３−４９３）；Ａ２７５２Ｆ、ｈＢ７ｒ１−「タンデムＦｃ」タンパク質（配列番号：２０残基２３−５０８または２３−５０７）を、ｈＰＶＲを発現するＰ８１５細胞に結合する能力について試験した。後者３つを、Ｚｅｎｏｎ−ＰＥ  マウスＩｇＧ標識化キット（Invitrogen）で直接標識した。ウェルあたり１００，０００個のｈＰＶＲを発現する細胞またはネガティブコントロール細胞を、９６−ウェルＵ底プレートに置いた。プレートをＲＴで３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。細胞を、５μｇ／ｍＬで開始する上記タンパク質の滴定で、１００μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ（ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム）に再懸濁し、０コントロールを含む６点曲線のために０．０６μｇに至るまでの３倍連続希釈で滴定した。タンパク質／細胞を氷上で１時間インキュベートし、次に細胞を全３回の洗浄のために１５０μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａで洗浄した。最終洗浄後、細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ：Ｃｙｔｏｆｉｘ（Becton Dickenson）の１５０μｌの１：１混合物に再懸濁した。細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ装置（Becton Dickenson）におけるフローサイトメトリーにより分析した。全データ点をトリプリケートで行った。全ｈＢ７Ｒ１含有タンパク質は、ｈＰＶＲを発現するＰ８１５細胞への用量依存性結合を示した。ネガティブコントロール細胞への結合はなかった。
【０２６４】
実施例１２
ヒトＢ７Ｒ１構築物に対する競合アッセイ
ヒトＢ７Ｒ１含有構築物の競合的結合を測定するために細胞ベースのアッセイを確立した。ウェルあたり１００，０００個の上記ｈＰＶＲを発現するＰ８１５細胞を９６−ウェルＵ底プレートに置いた。プレートをＲＴで３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。細胞を、１：１００希釈の市販されている「Ｆｃ−ｂｌｏｃｋ」（Becton Dickenson）を含む５０μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ（ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム）に再懸濁し、バックグラウンド結合を最小限にした。氷上で１０分インキュベーション後、ヒトＢ７ｒ１含有タンパク質の滴定を含む５０μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａを、３０μｇ／ｍＬから０．０４２μｇ／ｍに至るまでの滴定の「３×」濃度で加えた。この添加の直後、３μｇ／ｍＬのＡ１４７６−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（アミン結合を介してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で直接標識されているｈＢ７ｒ１−Ｆｃ２）を含む５０μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａを、穏やかなピペッティングにより混合されたそれぞれのウェルに加えた。染色を氷上で１時間続行した。インキュベーション後、細胞を全３回の洗浄のために１５０μｌのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａで洗浄した。最終洗浄後、細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ：Ｃｙｔｏｆｉｘ（Becton Dickenson）の１５０μｌの１：１混合物に再懸濁した。細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ装置（Becton Dickenson）におけるフローサイトメトリーにより分析した。全データ点をトリプリケートで行い、ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアでの４−パラメーター非曲線回帰曲線フィットを使用して計算した。
【０２６５】
全ｈＢ７Ｒ１含有タンパク質−Ｂ７Ｒ１−ＶＡＳＰ（配列番号：８１）；Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ２二量体（配列番号：７９）；Ｂ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベル（配列番号：１８残基２３−４９３）；およびＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデム（配列番号：２０残基２３−５０８または２３−５０７）は、標識化ｈＢ７Ｒ１−Ｆｃ２結合に対して用量依存的競合を示した。ｈＰＶＲ発現に対してネガティブである「ＷＴ」Ｐ８１５細胞への結合はなかった。２つの異なる実験からのＩＣ５０は、以下の表４に示されている。
表４：ＰＶＲ  Ｐ８１５細胞へのＢ７Ｒ１−Ｆｃ２結合に対する競合
【表４】
2013531982.tif 000005
【０２６６】
実施例１３
ヒトＢ７Ｒ１タンデムおよびバーベルタンパク質の生物学的活性
Ｔ細胞は、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されるＭＨＣ分子および外来ペプチドによるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）関与により活性化される。プロフェショナルＡＰＣはまた、Ｔ細胞上の他の受容体に関与し、活性化に寄与する多くの共刺激分子を発現する。該プロセスは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する抗体を「提示する」Ｆｃ受容体を発現する細胞により模倣することができる。次に、共刺激分子の提示は、Ｆｃ受容体を発現する細胞のトランスフェクションにより選択される分子を提供することにより、若干制御することができる。我々は、Ｆｃ受容体を発現し、抗−ＣＤ３抗体と有効に架橋するマウス肥満細胞腫細胞系Ｐ８１５を使用する。野生型Ｐ８１５細胞および抗−ＣＤ３抗体はヒトＴ細胞を刺激することができるが、ＰＶＲが共刺激性シグナルを送達するＴ細胞上のＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）と関与するため、Ｐ８１５細胞が、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）も発現する場合は、刺激のレベルが増強される。可溶性Ｂ７Ｒ１は、この相互作用を阻害し、ＣＤ２２６介在共刺激シグナルをブロックする。
【０２６７】
ヒトＴ−細胞をネガティブ選択（Pan T cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）により末梢血から単離し、ＣＦＳＥ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で標識した。Ｔ−細胞を、増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｌ−グルタミン、１０％のＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ＨＥＰＥＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ；Invitrogen, Carlsbad, CA）中、ウェルあたり１００，０００個の細胞で９６ウェルプレートのそれぞれのウェル中に置いた。ウェルを、以下のさらなる試薬を用いて、または用いないでトリプリケートにおいて構成した：ウェルあたり５０，０００個の細胞でのＰ８１５細胞またはウェルあたり５０，０００個の細胞の全長ヒトＰＶＲ（Ｐ８１５／ＰＶＲ）でトランスフェクトされ、安定に発現するＰ８１５細胞、５０ｎｇ／ｍｌでの抗−ＣＤ３（BD Bioscience, San Diego, CA）、０．６−５μｇ／ｍｌでのＢ７Ｒ１融合タンパク質。この系において、Ｐ８１５細胞上のＦｃ−受容体は、Ｔ細胞に対するアゴニスト抗−ＣＤ３Ｍａｂと架橋し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して準最適な一次刺激を提供し、ＰＶＲはＣＤ２２６の関与を介して共刺激する。可溶性Ｂ７Ｒ１の付加は、ＰＶＲへ結合し、ＣＤ２２６活性化をブロックすることにより共刺激を阻害するはずである。サンプルを３７℃で４日間インキュベートし、回収し、典型的な染色プロトコールにしたがって、フルオロクロム結合型抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８（BD Bioscience, San Diego, CA）で染色した。Ｔ細胞をフローサイトメトリー（LSRII, BD Bioscience, San Diego, CA）により分析し、細胞増殖をＣＦＳＥ希釈物により測定した。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に対する効果を、これらの特定の集団のゲーティングすることにより独立してモニタリングした。
【０２６８】
本実施例において、タンパク質の２つの四量体型を試験し、以下のタンパク質ロットを含むＦｃ−二量体タンパク質と比較した：
Ｂ７ｒ１（Ｇ２５−Ｐ１４１）Ｃ６９Ｙ  Ｆｃ５バーベル（配列番号：１８残基２３−４９３）；本明細書においてＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−バーベルとも称される；実施例７参照）；
Ｂ７ｒ１（Ｇ２５−Ｐ１４１）Ｃ６９Ｙ  Ｆｃ５タンデム（配列番号：２０残基２３−５０８または２３−５０７）；本明細書においてＢ７Ｒ１［Ｇ２５−Ｐ１４１］［Ｃ６９Ｙ］−タンデムとも称される；実施例８参照）；および
Ｂ７ｒ１（Ｇ２５−Ｐ１４１）Ｃ６９Ｙ  Ｆｃ５（二価二量体）（配列番号：８０）。
【０２６９】
図３Ａ−３Ｆは、減少した増殖活性により測定される、可溶性Ｂ７Ｒ１タンパク質により誘導されるＴ細胞阻害のレベルを示す。Ｂ７Ｒ１−Ｆｃ５タンパク質による比較的小さい阻害があった。対照的に、タンデムおよびバーベルタンパク質の両方は、全３つの血液ドナーならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞型の両方に対して全用量範囲にわたって有意な阻害を誘導し、タンデムがバーベルよりもわずかに大きい活性を示した。これは、これらのタンパク質がインビトロでＴ細胞増殖の有効な阻害剤であり、二量体型よりも優れていることを示し、それらがまた、臨床状況において二価二量体よりも優れているはずであるということをさらに示唆する。
【０２７０】
実施例１４
可溶性Ｂ７Ｒ１受容体（バーベル構築物）は、多発性硬化症のマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける疾患発症および進行を減少させる
Ａ）マウスアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
メカニズムを試験し、多発性硬化症に対する可能性のある治療の効果を評価するために、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の動物モデルを一般的に使用する。慢性進行性ＥＡＥモデルにおいて、８から１０週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River Laboratories）を、０日目に完全フロイントアジュバント中で乳化されたミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドで皮下に、次に、０日目に百日咳毒素の腹腔内送達および２日目に静脈内百日咳毒素で免疫化した。約８から２３日以内に、動物は、このモデルの特徴である体重減少およびまひの症状を示し始める。疾患の程度は、以下に詳細にあるとおり、マウスの体重を計り、それぞれのマウスに対して臨床スコア（０−８）を割り当てることにより、マウスにおいて毎日評価する。免疫化した以外は未処置マウスにおける疾患症状の典型的なパターンは、体重減少およびまひのうちの１つである。
【０２７１】
可溶性Ｂ７Ｒ１受容体バーベル構築物（ｍＢ７Ｒ１−バーベル；配列番号：１０の残基２６−４８９）、二量体マウスＦｃ２構築物（配列番号：３４）、ＶＡＳＰ構築物（配列番号：３５）またはビヒクル（ＰＢＳ）を、−１日目に始まってマウスに投与した。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、それぞれのＢ７Ｒ１分子は１回の投与につきマウス１匹あたり１５０μｇで投与された。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。
【０２７２】
Ｂ）疾患のモニタリング
動物は、ＭＯＧ３５−５５免疫化後、約８から２３日間、まひおよび体重減少の症状を示し始め得る。多数の動物は免疫化の１１−１７日以内に症状を発症するが、中にはこれより遅く、または早く症状を示し得る。
【０２７３】
全ての動物を、毎日、観察し、体重を計り、臨床スコアを割り当て、疾患の状態を評価した。
Ｃ）臨床スコア
０＝正常；健常
１＝わずかに尾脆弱（尾の先端がねじ曲がっていない）
２＝尾まひ（尾を直立させ続けることができない）
３＝尾まひおよび中程度のよたよた歩き
４＝尾まひおよび重度のよたよた歩き
５＝尾まひおよび１つの肢のまひ
６＝尾まひおよびいずれか２つの肢のまひ
７＝四肢不全まひ（全４つの肢のまひ）
８＝瀕死または死
【０２７４】
サイトカインの血清レベルおよび疾患の他のメディエーターのレベルをモニタリングするために、血液を実験中および最後に回収した。安楽死のとき、血液を血清のために回収した。
【０２７５】
Ｄ）結果
ｍＢ７Ｒ１−バーベルを与えたマウスのグループ（ｎ＝それぞれ１０−１２）は、反復測定、二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析されるとき、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置されたマウスと比較して、臨床スコアにおいて有意な減少（ｐ＜０．０５）により証明されるとおり、時間とともに疾患重症度において有意な減少（ｐ＜０．０５）により特徴付けられた（図４参照）。二量体マウスＦｃ２またはＶＡＳＰ構築物で処置されたマウスのグループは、疾患進行における遅延により示されるように、疾患から若干保護される傾向にあった。しかしながら、これらの２つのグループおよびビヒクル−処置グループ間の違いは、二元ＡＮＯＶＡにより有意差がなかった。経時的に疾患スコアの合計として分析されるとき（曲線下面積計算または「疾患暴露」と同様に）、Ｂ７Ｒ１−バーベル構築物で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスよりも有意により低い平均「疾患暴露」指数を有した（〜２．３倍より低い累積スコア；ｐ＜０．０５）。二量体マウスＦｃ２またはＶＡＳＰ構築物のそれぞれで処置されたマウスのグループは、ＰＢＳ処置グループよりも〜２５％より低い累積スコアを有したが、該差異は統計的差異ではなかった。Ｂ７Ｒ１−バーベル構築物および二量体マウスＦｃ２構築物のそれぞれで処置されたマウスは疾患発症のより低い発生率を有し、マウスのＢ７Ｒ１−バーベル−および二量体マウスＦｃ２−処置グループの両方の〜２５％が疾患から保護され、〜１７％のＶＡＳＰ−処置マウスが疾患から保護され、〜８％のみのＰＢＳ−処置マウスが保護された。さらに、Ｂ７Ｒ１−バーベルを投与されたマウスに対する疾患発症の平均日数は１９日であり、二量体マウスＦｃ２−処置マウスに対して１７．６日であり、ＶＡＳＰ−処置マウスに対して１６．５日であったが、ＰＢＳ−処置マウスに対する疾患発症の平均日数はより短く（１３．７日）、疾患発症が可溶性Ｂ７Ｒ１分子、とりわけＢ７Ｒ１−バーベル処置で遅延されたことを示した。
【０２７６】
総合すれば、これらの結果は、Ｂ７Ｒ１−バーベルのインビボ投与がヒト多発性硬化症のモデルであるＥＡＥにおける疾患発症および重症度の減少において有効であったことを示す。他の可溶性Ｂ７Ｒ１分子で有効性が観察される傾向にあったが、バーベル構築物が、この実験において統計的に有意差を示す唯一の可溶性受容体であった。これらの結果は、可溶性Ｂ７Ｒ１バーベル構築物がヒト多発性硬化症を処置することにおいて有効であることを示す。
【０２７７】
実施例１５
Ｂ７Ｒ１タンデム構築物は、多発性硬化症のモデルとしての再発寛解型（ＲＲ）マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における疾患発症および進行を減少させる
Ａ）マウスアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
メカニズムを試験し、多発性硬化症に対する可能性のある治療の効果を評価するために、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の動物モデルを一般的に使用する。再発寛解型ＥＡＥモデルにおいて、９から１０週齢メスＳＪＬマウス（Jackson or Charles River Labs）を、静脈内百日咳毒素なしで完全フロイントアジュバント中で乳化されたプロテオリピドペプチド（ＰＬＰ）で皮下に免疫化した。約１４から１８日以内に、動物は、このモデルの特徴である体重減少およびまひの症状を示し始めた。疾患の程度は、以下に詳細にあるとおり、マウスの体重を計り、それぞれのマウスに対して臨床スコア（０−８）を割り当てることにより、マウスにおいて毎日評価した。免疫化した以外は未処置マウスにおける疾患症状の典型的なパターンは、体重減少およびまひのうちの１つ、次に、疾患症状寛解の期間、ならびにその後の疾患症状の再発である。疾患症状の再発および寛解のパターンが続いて起こり、再発寛解型疾患として知られるこの種の多発性硬化症を有するヒトにおいても見られる。
【０２７８】
可溶性Ｂ７Ｒ１受容体タンデム構築物（ｍＢ７Ｒ１−タンデム；配列番号：１２の残基２６−５０４または２６−５０３）、可溶性Ｂ７Ｒ１受容体バーベル構築物（ｍＢ７Ｒ１−バーベル；配列番号：１０の残基２６−４８９）、ビヒクル（ＰＢＳ）または臨床的に関連したポジティブコントロール（マウス特異的ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）を、疾患の最初のピークを越えた２日後に処置を開始するような治療投与レジメンにおいて投与した。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、ｍＢ７Ｒ１−タンデム、ｍＢ７Ｒ１−バーベルおよびｍＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は投与あたりマウスあたり１５０μｇで投与された。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。
【０２７９】
Ｂ）疾患のモニタリング
動物は、ＰＬＰ免疫化後、約８から２３日間、まひおよび体重減少の症状を示し始め得る。この実験における多数の動物は免疫化の１４−１８日以内に症状を発症した。
【０２８０】
全ての動物を、毎日、観察し、体重を計り、臨床スコアを割り当て、疾患の状態を評価した。
Ｃ）臨床スコア
０＝正常；健常
１＝わずかに尾脆弱（尾の先端がねじ曲がっていない）
２＝尾まひ（尾を直立させ続けることができない）
３＝尾まひおよび中程度のよたよた歩き
４＝尾まひおよび重度のよたよた歩き
５＝尾まひおよび１つの肢のまひ
６＝尾まひおよびいずれかの２つの肢のまひ
７＝四肢不全まひ（全４つの肢のまひ）
８＝瀕死または死
【０２８１】
Ｄ）結果
Ｂ７Ｒ１−タンデムで処置されたマウスのグループ（ｎ＝それぞれ１２−１３）は、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置されたマウスと比較して、臨床スコアおよび体重減少において有意な減少（ｐ＜０．０５）により証明されるとおり、寛解相への疾患重症度において有意な減少（ｐ＜０．０５）により特徴付けられた。さらに、Ｂ７Ｒ１−タンデムで処置されたマウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）処置マウスと比較して、疾患再発の有意に低い（ｐ＜０．０５）発生率を有した。これは、疾患再発がこの疾患モデルおよびヒトにおける再発寛解型ＭＳの特徴であるため、非常に重要な結果である。Ｂ７Ｒ１−バーベル分子で処置されたマウスのグループは、ポジティブコントロールｍＣＴＬＡ４−Ｉｇで処置されたマウスのグループと同様の疾患スコアおよび再発率を有した。マウスのＢ７Ｒ１−バーベルもｍＣＴＬＡ４−Ｉｇ処置グループも、マウスのＰＢＳ−処置グループと比較して、有意に異なる疾患スコアまたは再発率を有さなかった。
【０２８２】
総合すれば、これらの結果は、Ｂ７Ｒ１−タンデムのインビボ投与がヒト再発寛解型多発性硬化症のモデルであるＰＬＰ  ＥＡＥにおける疾患発症および重症度の減少において有効であり得ることを示す。これらの結果は、可溶性Ｂ７Ｒ１−タンデム構築物がヒト多発性硬化症を処置することにおいて有効であることを示す。
【０２８３】
実施例１６
Ｂ７Ｒ１−タンデムは、Ｔ細胞養子移植大腸炎および乾癬のマウスモデルにおける疾患発症および進行を減少させる
Ｔ細胞養子移植大腸炎モデル
小さい組織適合不一致または先天性免疫不全マウスへのナイーブＴ細胞の養子移植は、大腸炎（Leachら 1996; Powrieら 1997）ならびに乾癬に似た皮膚損傷（Schonら 1997; Davenportら 2002）の発症を引き起こす。免疫不全Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウスへのＢＡＬＢ／ＣまたはＢ１０．Ｄ２マウス由来の２０万個という低量のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の移植は、体重減少、潜血存在便および皮膚損傷の発症をもたらす。これらのマウスにおける症状は、コロニー毎で変化する。
【０２８４】
大腸炎／乾癬のこのモデルは、ヒトクローン病および乾癬といくつかの類似性を有し、ヒトにおけるこれらの疾患のための治療の有効性を試験するために広範囲に使用されている。この実験において、マウス（５  Ｂ１０．Ｄ２  メスマウスドナー；  ２０  Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ  メスレシピエント）を、それぞれ、Jackson LaboratoriesまたはCharles River Laboratoriesから得る。５  Ｂ１０．Ｄ２  マウスから脾臓を回収する。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、当分野で知られている標準方法論を使用してプールされた脾臓から単離する。Ｔ−細胞の純度を、フローサイトメトリーにより評価する。
【０２８５】
Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウスは、静脈内注射を介して脾臓由来の５×１０５−１０×１０５のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ−細胞を受ける。全てのマウスを、１週間に少なくとも５回体重を計り、体重減少について注意深く観察する。臨床大腸炎スコア（便の硬さおよび便の血液）を１週間に少なくとも１日とる。マウスをまた、１週間に少なくとも５日モニタリングし、乾癬の症状および程度（脱毛、引っかき傷および脱毛症）に対するスコアを割り当てる。
【０２８６】
可溶性Ｂ７Ｒ１受容体タンデム構築物（Ｂ７Ｒ１−タンデム）またはビヒクル（ＰＢＳ）を、０日目に（細胞移入の日）開始してマウスに投与する。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、Ｂ７Ｒ１−タンデムは１回の投与につきマウス１匹あたり１５０μｇで投与する。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。
【０２８７】
試験の最後に、組織サンプル（例えば大腸および皮膚）を大腸炎および乾癬それぞれの組織学的証拠のために提出し、血清をサイトカインおよびケモカインレベルの分析のために回収した。
【０２８８】
結果
Ｂ７Ｒ１−タンデムを受けるマウスのグループ（ｎ＝それぞれ１０）は、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置されたマウスと比較して、大腸炎および乾癬の臨床スコアおよび体重減少において有意な減少（ｐ＜０．０５）により証明されるとおり、疾患重症度において有意な減少（ｐ＜０．０５）により特徴付けられる。さらに、Ｂ７Ｒ１−タンデムで処置されたマウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）処置マウスと比較して、大腸炎および乾癬の病理学的／組織学的証拠をあまり有さない。
【０２８９】
総合すれば、これらの結果は、Ｂ７Ｒ１−タンデムのインビボ投与がマウスＴ細胞移入モデルにおける大腸炎および乾癬の減少において有効であり得ることを示し、該可溶性受容体がヒト炎症性腸疾患および／または乾癬を処置することにおいて有効であり得ることを示唆する。
【０２９０】
実施例１７
Ｂ７Ｒ１可溶性受容体（バーベルおよびタンデム構築物）は、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける疾患発症および進行を減少させる
Ａ）マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデル
２週齢メスＤＢＡ／１Ｊマウス（Jackson Labs）を、１５匹のマウス／グループの３つのグループに分類し、予防用量のＰＢＳ、Ｂ７Ｒ１バーベルタンパク質またはＢ７Ｒ１タンデムタンパク質に指定した。２１日目に、全ての動物に、完全フロイントアジュバント（Chondrex, Redmond, WAにより調製された）中で製剤化された５０−１００μｌの１ｍｇ／ｍＬのトリ由来のタイプＩＩコラーゲンの皮内尾注射を与え、３週間後、０日目に、それらに、不完全フロイントアジュバントにおいて調製されたことを除いて同じ注射を与えた。Ｂ７Ｒ１−バーベル（ｍＢ７Ｒ１−バーベル；配列番号：１０の残基２６−４８９）、Ｂ７Ｒ１−タンデム（ｍＢ７Ｒ１−タンデム；配列番号：１２の残基２６−５０４または２６−５０３）、Ｂ７Ｒ１−ＶＡＳＰ（ｍＢ７Ｒ１−ＶＡＳＰ；配列番号：３５）またはビヒクル（ＰＢＳ）を、−１日目に開始して３週間一日おきに腹腔内注射として投与した。グループに投与あたり動物あたり１５０μｇのＢ７Ｒ１−バーベルまたはＢ７Ｒ１−タンデムタンパク質を与え、コントロールグループにビヒクルコントロールＰＢＳ（Life Technologies, Rockville, MD）を与えた。動物は第２のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、多数の動物は１−２週間以内に炎症を発症した。疾患の程度は、キャリパーを使用して足の厚さを測定することにより、それぞれの足に対して臨床スコア（０−３）を割り当てることにより、それぞれの足において評価した（以下参照）。
【０２９１】
Ｂ）疾患のモニタリング
動物は、第２のコラーゲン注射後すぐに足の炎症の症状を示し始め得、いくつかの動物は、第２のコラーゲン注射前に足指の炎症の症状を有し始め得る。多数の動物はブースト注射の１−２週間以内に関節炎を発症するが、中にはより長い期間を必要とし得る。このモデルにおける疾患の発生率は一般的に９０−１００％であり、０−５匹の非応答動物（観察の６週間後に決定された）が一般的に６０匹の動物を使用する試験において見られる。
【０２９２】
全動物を毎日観察し、それぞれの足に対する定性臨床スコアを割り当てることにより行われるそれらの足における疾患の状態を評価した。毎日、それぞれの動物は、臨床的疾患の状態にしたがって４つの足をスコア化された。臨床スコアを決定するために、足は、足指、足自体（前肢末梢環節または足状部）および足首または足関節の３つの領域を有すると考えることができる。これらの領域に関する炎症の程度および重症度は、腫れに関するそれぞれの足指の観察；裂けた爪または足指の発赤；任意の足における浮腫または発赤の何らかの証拠の表記；腱および骨の洗練された解剖的境界の喪失の表記；何らかの浮腫または発赤に関する足首または足関節の評価；および炎症が脚の上付近にまで伸長しているときの表記を含んで書き留められる。１、２または３の足スコアは、第１に、重症度の全体の印象、第２に、どれほど多くの領域が含まれるかに基づいた。臨床スコアのために使用されるスケールは以下に示される。
Ｃ）臨床スコア
０＝正常
０．５＝１つ以上の足指が関与しているが、足指のみが炎症している
１＝足指を含み得る足（１つの領域）に関与している軽度の炎症
２＝複数の足指および／または足首／足関節（２つの領域）を含み得る足における中程度の炎症
３＝足、足首／足関節、および複数または全ての足指（３つの領域）における重度の炎症
【０２９３】
抗−コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清ケモカインおよびサイトカインレベルをモニタリングするために、血液を実験の最後に回収した。
【０２９４】
Ｂ７Ｒ１−バーベルおよびＢ７Ｒ１−タンデム分子を受けたマウスのグループは、ＰＢＳを受けるマウスと比較して、実験過程にわたって有意に少ない関節炎および足の炎症により特徴付けられた（ｐ＜０．０５）（図５参照）。さらに、Ｂ７Ｒ１−タンデムを受けたマウスは、Ｂ７Ｒ１−ＶＡＳＰタンパク質を受けたマウスと比較して、実験過程にわたってさらに少ない関節炎および足の炎症を有する傾向にあった（ｐ＝０．０９）。ＩＬ−６およびケモカインＭＣＰ−１、ＩＰ−１およびＫＣの血清レベルは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、Ｂ７Ｒ１−バーベルおよびＢ７Ｒ１−タンデム分子で処置されたマウスにおいてより低かった。グループ間の抗−コラーゲン抗体の血清レベルにおける有意差はなかった。これらの結果は、Ｂ７Ｒ１−バーベルおよびＢ７Ｒ１−タンデムが炎症、ならびにこの関節炎のモデルと関連する疾患進行を減少させることができることを示し、Ｂ７Ｒ１バーベルまたはＢ７Ｒ１可溶性受容体のタンデム構築物がヒト関節炎の処置において有効であり得ることを示唆する。
【０２９５】
前記から、本発明の特定の態様は、説明の目的のために本明細書に記載されているが、種々の修飾が本発明の精神および範囲から逸脱することなく作ることができることが理解される。したがって、本発明は、特許請求の範囲を除いて限定されない。本明細書において引用されている全ての出願、特許および特許出願は、全ての目的のためにそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる。
【図１Ａ】
2013531982.tif 000006
【図１Ｂ】
2013531982.tif 000007
【図２Ａ】
2013531982.tif 000008
【図２Ｂ】
2013531982.tif 000009
【図２Ｃ】
2013531982.tif 000010
【図３Ａ】
2013531982.tif 000011
【図３Ｂ】
2013531982.tif 000012
【図３Ｃ】
2013531982.tif 000013
【図３Ｄ】
2013531982.tif 000014
【図３Ｅ】
2013531982.tif 000015
【図３Ｆ】
2013531982.tif 000016
【図４】
2013531982.tif 000017
【図５】
2013531982.tif 000018
【配列表】
2013531982000001.app
【国際調査報告】
2013531982.tif 000019
2013531982.tif 000020
2013531982.tif 000021