(57)【要約】  本発明は、概して、ヒトＢ細胞に、特にヒトＢ細胞を不死化およびクローニングする方法に、ならびにそれに由来するモノクローナル抗体に関する。本発明はさらに、そのモノクローナル抗体を療法および診断の目的のために用いる方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化されたＢ細胞を生成する方法であって、Ｂ細胞を前記の不死化が達成されるような条件下でエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を用いて形質転換することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記のＢ細胞がＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のＢ細胞を末梢血から得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記のＢ細胞を末梢血、粘膜組織またはリンパ組織から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記のＢ細胞がＩｇＭ＋またはＩｇＡ−記憶Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに前記の不死化されたＢ細胞を培養で増加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに前記の増加された集団から望まれる抗原特異性を有する抗体を産生する細胞を分離することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに前記の分離された細胞をクローニングし、前記のクローニングされた細胞から前記の抗体またはその可変重鎖もしくは可変軽鎖をコードする核酸配列を単離することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の細胞がモノクローナルに、オリゴクローナルに、またはポリクローナルに増加される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記のＢ細胞が哺乳類のＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記のＢ細胞がヒトのＢ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年４月９日に出願された米国仮出願第６１／３２２，７２５号および２０１０年４月１０日に出願された米国仮出願第６１／３２２，８２１号からの優先権を主張し、その内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金第ＡＩ０６７８５４−０２号の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、ヒトＢ細胞に、特にヒトＢ細胞を不死化およびクローニングする方法に、ならびにそれに由来するモノクローナル抗体に関する。本発明はさらに、そのモノクローナル抗体を療法および診断の目的のために用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
例えば広いスペクトルのＨＩＶ−１分離株を中和するモノクローナル抗体の単離および特性付けは、有効なＨＩＶ−１ワクチンの設計のために重要である。しかし、そのような抗体を得る効率的な方法は見付かりにくかった。
【０００５】
中和抗体を産生するヒトＢ細胞を不死化するために、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）が用いられてきた(Traggiai et al, Nat. Med. 10(8):871 (2004) Epub 2004 July 11; Corti et al, PLoS ONE 5:e8805 (2010))。しかし、不死化の効率は低い傾向があり、不死化されたＢ細胞のクローニング効率も同様である。
【０００６】
本発明は、クローン性記憶Ｂ細胞の迅速かつ効率的な増加のための方法、抗体可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖遺伝子の単離のための方法、ならびに広く中和する抗体（例えば、広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体）を産生するＢ細胞の捕捉および増殖のための方法、を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Traggiai et al, Nat. Med. 10(8):871 (2004) Epub 2004 July 11
【非特許文献２】Corti et al, PLoS ONE 5:e8805 (2010)
【発明の概要】
【０００８】
本発明はヒトＢ細胞に関する。より具体的には、本発明はヒトＢ細胞を不死化およびクローニングする方法に、そのような細胞に由来するモノクローナル抗体に、ならびにモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ鎖をコードする核酸配列に関する。本発明はさらに、そのモノクローナル抗体を療法および診断の目的のために用いる方法に関する。
【０００９】
本発明の目的および利点は、以下の記述から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１．未感染のＰＢＭＣ試料から分離された、ＥＢＶで形質転換されたＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞の培養上清中の総ＩｇＧおよびＩｇＭレベル。ＥＢＶ感染の後、細胞を３０細胞／ウェルでまき、ＯＤＮ２００６＋Ｃｈｋ２阻害剤またはＩＬ−２＋Ｒ８４８（表ＩＩＩ）の存在下で１４日間培養した。データはｎｇ／ｍｌで示されている。
【図２】図２．未感染のＰＢＭＣ試料から分離された、ＥＢＶで形質転換されたＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞の培養上清中の総ＩｇＧレベル。ＥＢＶ感染の後、細胞を１０または３０細胞／ウェルでまき、ＯＤＮ２００６＋Ｃｈｋ２阻害剤またはＩＬ−２＋Ｒ８４８（表ＶＩ）の存在下で１４日間培養した。データはｎｇ／ｍｌで示されている。（図２には３および１細胞／ウェルでのグラフが含まれる。）
【図３Ａ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｂ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｃ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｄ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｅ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｆ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｇ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図３Ｈ】図３．ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞に関するモノクローナル抗体の非常に効率的かつ高スループットな操作に関する方法の要約。
【図４Ａ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｂ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｃ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｄ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｅ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｆ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｇ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｈ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｉ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｊ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｋ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｌ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｍ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｎ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｏ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｐ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｑ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｒ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｓ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｔ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｕ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｖ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｗ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｘ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図４Ｙ】図４．ＣＨＡＶＩ  ００８患者からのＨＩＶ＋広く中和するヒトモノクローナル抗体の単離。
【図５】図５．ＣＨ０２１９に由来する中和抗体のクローン的関係。
【図６Ａ】図６．ＣＨ０２１９に由来する抗体１−２７−Ｇ２、１−１９−Ｆ１０および１−２７−Ｇ１１の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖遺伝子配列およびアミノ酸配列。
【図６Ｂ】図６．ＣＨ０２１９に由来する抗体１−２７−Ｇ２、１−１９−Ｆ１０および１−２７−Ｇ１１の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖遺伝子配列およびアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、少なくとも部分的に、不死化されたＢ細胞を生成する方法に関する。その方法は、ＥＢＶを用いて標準的なプロトコルを用いてＢ細胞を形質転換することを含み得る。下記の実施例は末梢血から得られたＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞の使用を含むが、方法は他の組織からの（例えば、粘膜またはリンパ組織からの）他のＢ細胞亜集団に、および他のアイソタイプの細胞（例えばＩｇＭ＋ナイーブＢ細胞またはＩｇＡ−記憶Ｂ細胞であるが、それらに限定されない）に適用することができる。本方法は、ＣＤ４０ライゲーションおよびＥＢＶ形質転換をＴＬＲ−９ライゲーションと組み合わせる。このアプローチは、多数のＢ細胞の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。
【００１２】
本発明に従って、ＥＢＶで形質転換したＢ細胞を培養で増加させ、培養上清を望まれる抗原特異性を有する抗体の存在に関してスクリーニングすることができる（例えば、抗体の抗原特異性を病原体（例えばＨＩＶ−１またはＰＣＴ／ＵＳ０９／６３２７１において言及されている他の病原体）、化学物質または毒素に対して向けることができる）。次いで抗体産生Ｂ細胞の不死化されたクローンを分離し、望まれる抗原特異性を有する抗体が発現するような条件下でさらに培養することができる。抗体は標準的な技法を用いて培地から単離することができる。Ｂ細胞は、培養における細胞密度を変化させることにより、モノクローナルに、オリゴクローナルに、またはポリクローナルに増加することができる（例えば、主にモノクローナルな増加のために１０個以下の細胞／ウェルの細胞密度から、ポリクローナルな増加のために１００個以上の細胞／ウェルまで）。細胞を１０細胞／ウェル未満の密度でまくのが好都合である。
【００１３】
モノクローナル抗体（またはそれのＶＨおよび／またはＶＬ鎖）をコードする核酸配列を、クローニングされたＢ細胞から標準的な技術を用いて分離することができる。
本発明に従って、宿主細胞（例えば２９３Ｔ細胞）を目的のモノクローナル抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖をコードする核酸配列を含むコンストラクトを用いて、それらの配列が発現し、望まれる特異性を有する抗体が産生されるような条件下で形質移入することができる。このようにして産生された抗体は、標準的な技法を用いて（例えば宿主細胞から、またはその中で宿主細胞が培養されている培地から）単離することができる。
【００１４】
本発明の好ましい抗体はＣＨ０２１９に由来し、１−２７−Ｇ２、１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｆ１０が含まれる（図５および６参照）。
本発明の抗体は、例えば診断的に、または療法的に用いることができる。例えば、抗体はそれに対してそれらが向けられている個々のポリペプチドまたは他の抗原の同定および／または（例えば親和性精製技術を用いる）精製において有用である可能性がある。抗体は、例えば免疫アッセイ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）における試薬として用いることもできる。抗体は、検出可能な標的（例えば放射性同位体、蛍光分子または酵素）を用いて標識することができる。本明細書で開示される方法により産生された抗体は、病原体、例えばＨＩＶ−１を検出するために用いることができる。
【００１５】
本発明には、本発明の抗体およびキャリヤーを含む医薬組成物も含まれる。一部の態様において、本明細書で開示される発明の形質転換されたおよび／または活性化されたＢ細胞を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたはアジュバントも含有することができる。
【００１６】
本発明の抗体、またはその断片（例えば抗原結合断片）は、疾患の処置のために、疾患の予防のために、および／または疾患の診断のために用いることができる。一部の態様において、本明細書で開示される主題のモノクローナル抗体は、上記で記述したような医薬組成物または医薬品中で、それを必要とする対象に投与することができる。
【００１７】
適切な投与経路は、処置される、予防される、または診断される予定の疾患に依存するであろうが、ＩＶ、ＩＭ、鼻腔内または皮下が含まれ得る。粘膜組織への直接の投与も、適切である場合は達成することができる。
【００１８】
本発明の特定の観点が下記の実施例においてより詳細に記述されている。実施例の研究において、ＣＤ４０Ｌ発現Ｌ細胞が用いられたが、他のＣＤ４０Ｌ発現細胞（例えばＣＤ４０Ｌ発現２９３Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはマクロファージ、樹状細胞、ＦＤＣ、胸腺上皮および内皮細胞）、抗ＣＤ４０抗体(Galibert et al, Eur. J. Immunol. 25(3):733-737 (1995), Saeland et al, J. Exp. Med. 178(1):113-120 (1993), Bamchereau and Rousset, Nature 353(6345):678-679 (1991))またはＣＤ４０ライゲーションを誘導するための他の手段（例えばＣＤ４０作動薬）を用いることができる。実施例において用いられたＥＢＶの株はＢ９５−８であったが、他のＥＢＶの株も用いることができ、比較可能な作用を仲介する他のウイルス（例えばサルに関するヒヒヘルペスウイルス）も同様である。実施例において用いられたＴＬＲリガンドはＯＤＮ２００６(Traggiai et al, Nat. med. 10(8):871 (2004))であったが、本発明には他のＴＬＲリガンド（例えばＬＰＳ、Ｒ４８４）の使用が含まれる。Ｃｈｋ２キナーゼ阻害剤も実施例において用いられた。他の抗アポトーシス剤を用いることもできる（例えば、ＡＴＭ阻害剤、または発癌性ストレスもしくはＤＮＡ損傷応答のあらゆる阻害剤）。用いられた刺激カクテルは他の刺激計画よりもよい収量を与えたことは理解されるであろう。
【００１９】
下記の実施例で記述されるように、末梢血からのＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞を２工程のプロセスにより濃縮した：（１）ＣＤ２＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ２３５ａ＋およびＩｇＤ＋細胞の、ＰＥコンジュゲート抗体のカクテルを一次抗体として、商業的に入手可能な抗ＰＥマイクロビーズを二次抗体として用いる磁気ビーズ分離による枯渇；（２）ネガティブ選択された細胞画分に抗ＩｇＧマイクロビーズコンジュゲート抗体によるポジティブ選択を適用することによる、ＩｇＧ＋細胞の濃縮。細胞を１４日間刺激した。刺激の終了時に、細胞をＲＮＡ抽出のためにまとめてアッセイし、および／または後の処理のためにＲＮＡｌａｔｅｒ中で保存した。ＨＩＶ−１慢性および感染していない対象での繰り返し実験において、ポアソン分布の単一ヒットモデルに従って、結果としてモノクローナルな増加をもたらす細胞希釈度の決定を行った。統計モデルを、新しい（ｆｒｅｓｈ）、およびＲＮＡｌａｔｅｒ中で処理した刺激された細胞の両方から４個ずつ選択されたウェルのＶＨ鎖の配列決定により検証した。
【００２０】
その結果を図３において要約する。ポアソン分布の単一ヒットモデルは、慢性的にＨＩＶ−１に感染した対象においてモノクローナルなＢ細胞の増加は１０個以下の細胞／ウェルが培養状態に置かれた場合に起こると予測した。ＰＣＲデータは、１０細胞／ウェルにおいて、刺激後にＩｇＧを分泌しているＩｇＧ＋の試料の８７．５％（７／８）で重鎖がモノクローナルであったことを確認した。１つのウェルにおいて２つの異なるクローンが存在し、それらの一方は機能し、他方は機能しなかった。患者間の多様性を説明するため、モノクローナルな培養物を増殖させる可能性を増大させるため、細胞を８細胞／ウェルの密度でまく決定をした（ポアソン分布の単一ヒットモデルにより５０％の陽性ウェルが予測された）。
【００２１】
本明細書で開示される方法は、ヒトならびに霊長類、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ハムスター、飼い慣らされた動物（例えばイヌおよびネコ）および家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）が含まれる非ヒト哺乳類（および適切な場合にはそれらに由来する細胞（例えばＢ細胞））と関連して実施することができる。
【００２２】
本発明の特定の観点が図３および４においてより詳細に記述されている（２００９年１１月１１日に出願されたＰＣＴ  ＵＳ０９／６３２７１も参照、その全内容を本明細書に援用する）。（共に２０１０年４月９日に出願された米国仮出願第６１／３２２，６６３号および第６１／３２２，７２５号を援用する。）
【実施例】
【００２３】
実験の詳細
完全培地の調製
ＰＢＭＣ、ＥＢＶ−Ｂ細胞、Ｊ７７４Ａ．１、およびＫ６Ｈ６／Ｂ５細胞株のための完全培地（ＣＭ）
以下：
１）  １５．２％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
２）  １％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）
３）  １ｍＭピルビン酸ナトリウム
４）  １５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３
５）  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｌｕ）
６）  １００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ（Ｐｅｎ）
７）  １００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐ）
を補ったＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
調製：
１．  ＦＣＳのボトル（５００ｍｌ／ボトル、−２０℃）を解凍し、熱非働化（ｃ’の非働化）のために５６℃で３０分間保温する
２．  ボトルを冷まし、３１ｍｌのＧｌｕ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００×、１００ｍｌ／ボトル、−２０℃）を添加する
３．  ＦＣＳ−抗生物質混合物をチューブ中に５０ｍｌ／チューブで小分けし、−２０℃で凍結させる
４．  １００ｍｌのＦＣＳ−抗生物質混合物をＲＰＭＩ  １６４０のボトル（５００ｍｌ／ボトル、４℃）に添加する
５．  ６．２ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、１００ｍｌ／ボトル、４℃）をボトル中に添加する
６．  ６．２ｍｌのピルビン酸ナトリウム（１００×、１００ｍｌ／ボトル、４℃）を添加する
７．  ６．２ｍｌのＮＥＡＡ（１００×、１００ｍｌ／ボトル、４℃）を添加する
８．ＣＭを０．２２μｍフィルターユニットを通して濾過する。
【００２４】
９．全ＣＭ：６１８．６ｍｌ
ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞刺激プロトコル
・凍結させたＰＢＭＣを標準的な操作手順により解凍する
・ＰＢＭＣをＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で１０×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌで再懸濁し、より高い１００μｌまで切り上げる（ｒｏｕｎｄ  ｕｐ）。
【００２５】
細胞を４℃で保つ。
・次のＰＥコンジュゲート抗体の（それぞれの単一ロットの力価測定により決定された）次の濃度におけるマスター混合物を調製する
・抗−ＣＤ２３５ａ  ［０．０８μｌ／１０６  ＰＢＭＣ］
・抗−ＣＤ２  ［５μｌ／１０６  ＰＢＭＣ］
・抗−ＣＤ１６  ［５μｌ／１０６  ＰＢＭＣ］
・抗−ＩｇＤ  ［５μｌ／１０６  ＰＢＭＣ］
・抗−ＣＤ１４  ［２０μｌ／１０６  ＰＢＭＣ］
・１００μｌの細胞を５ｍｌ丸底ＦＡＣＳチューブ中に小分けし、等しい体積のマスター混合物をそれぞれのチューブ中に分ける
・混合し、４℃で３０分間保温する
・２ｍｌ／チューブのＰＢＳ／１％ＢＳＡを添加する
・１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する
・ペレットを乱さずに上清を除去する
・１００μｌ／チューブのＰＢＳ／１％ＢＳＡを添加する
・２００μｌ／チューブの抗ＰＥマイクロビーズを添加する
・混合し、４℃で１５分間保温する
・２ｍｌ／チューブのＰＢＳ／１％ＢＳＡを添加する
・３００×ｇで１０分間遠心分離する
・ペレットを乱さずに上清を除去する
・細胞が塊になるのを防ぐため、チューブを十分に軽く叩いてペレットをほぐす。１ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ／チューブを添加して十分に混合する。細胞の塊に関して目視でチェックする。塊が存在する場合は、Ｐ１０００を用いて混合することによりそれらを壊す。
【００２６】
・チューブを５ｍｌチューブのためのＡｕｔｏＭＡＣＳ冷却装置中に移す。
・ＤＥＰＬＥＴＥＳプログラムを動かす
Ｂ細胞画分の処理
・通過画分のチューブを集める
・細胞を１５ｍｌコニカルチューブ（単数または複数）中で合わせて一緒にする。
【００２７】
・３００×ｇで１０分間遠心分離する
・２００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁する。
・（１０７細胞までに関して）２０μｌの抗ＩｇＧマイクロビーズを添加する
・十分に混合し、４℃で１５分間保温する
・２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡを添加する
・３００×ｇで１０分間遠心分離する
・１ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁する。
【００２８】
・チューブを１５ｍｌチューブ冷却装置中に移す
・ＰＯＳＳＥＬ＿５プログラムを動かす
・ポジティブ選択された画分を集める
・１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する
・底に触れずにＳＮを取り外す
・完全培地中で再懸濁する
・正確な細胞数および体積を決定する
・ＥＢＶ懸濁液（Ｂ９５−８；１ｍｌ／１００，０００Ｂ細胞）、ＯＤＮ２００６（２．５μｇ／ｍｌ）およびｃｈｋ２阻害剤（５μＭ）で一夜刺激する
・その間に、γ照射した（７５Ｇｙ）ＣＤ４０Ｌで形質移入したＬ細胞を９６ウェル組織培養プレート中に５，０００細胞／ウェルでまく
・一夜培養の後、ＥＢＶで形質転換された細胞の生存度をチェックする
・細胞を、ＯＤＮ２００６およびｃｈｋ２−ｉを含有する完全培地中で、８０個の生存可能な細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌ／ウェルで移す（すなわち８細胞／ウェル、それは慢性的にＨＩＶ−１に感染した対象に関して１個の活性化された細胞／ウェルに等しい）
・１００μｌ／ウェル中に５０００個のＣＤ４０Ｌ  Ｌ細胞を含有する９６ウェルプレート中に、１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液を小分けする（１プレート／細胞濃度）（合計６プレート、すなわち３プレート／細胞の小分け）
・３７℃で１４日間保温する
Ｂ細胞のＥＢＶによる形質転換
ＩｇＧ記憶Ｂ細胞に関して
１）ＥＢＶ感染の前日に、照射したＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞（７，５００ｃＧｒａｙ）を調製し、細胞を９６ウェルプレート（丸底）の中に５，０００細胞／ウェル（１００μｌ／ウェル）で分配する。
【００２９】
２）完全培地（ＣＭ）中の記憶Ｂ細胞を１２００ＲＰＭ（３００ｇ）で４℃において５分間遠心分離する。
３）ペレットを、ＯＤＮ２００６（５．０μｇ／ｍｌ）およびＣｈｋ２阻害剤ＩＩ（１０μＭ）を含有する１ｍのＣＭ中で再懸濁する（１×１０５細胞／ｍｌ）。
【００３０】
４）ＥＢＶ懸濁液（Ｂ９５−８細胞上清＊、−８０℃の冷凍庫または液体Ｎ２タンク中で保管）を１ｍｌ／１×１０５記憶Ｂ細胞で添加する。
５）ＯＤＮ２００６およびＣｈｋ２阻害剤ＩＩの終濃度はそれぞれ２．５および５μＭである。
【００３１】
６）細胞を５％ＣＯ２培養器中で３７℃において一夜培養する。
７）培養後、生存可能な細胞を数え、それらを５μｇ／ｍｌ  ＰＳ２００６（ＯＤＮ２００６）および１０μＭ  Ｃｈｋ２阻害剤ＩＩを含有するＣＭ中で８０個の生存可能な細胞／ｍｌで再懸濁する。
【００３２】
８）細胞を、照射したＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞を有する９６ウェルプレートの中に８細胞／ウェル（１００μｌ／ウェル）で分配する。
９）細胞を５％ＣＯ２培養器中で３７℃において培養する。
【００３３】
１０）７日目に、それぞれのウェルから９０μｌの上清を採取し、２．５μｇ／ｍｌ  ＰＳ２００６（ＯＤＮ２００６）および５μＭ  Ｃｈｋ２阻害剤ＩＩを含有する１００μｌの新しいＣＭで置き換える。
【００３４】
１１）１４日目に、機能アッセイのためにそれぞれのウェルから１００μｌの上清を集める。
１２）結合アッセイのためにそれぞれのウェルからさらに２０μｌの上清を集める。
【００３５】
１３）ＲＮＡＬａｔｅｒ中での保管のために、混合してそれぞれのウェルから３０μｌの細胞を集める。
１４）２．５μｇ／ｍｌのＯＤＮ２００６および５μＭのＣｈｋ２阻害剤ＩＩを含有する１６０μｌの新しいＣＭを添加する。この時に、ＯＤＮ２００６は必要ではない可能性がある。
【００３６】
・Ｂ９５−８（マーモセットＢ細胞株；ノースカロライナ大学チャペルヒル校）
・ＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞（ヒトＣＤ４０Ｌで形質転換したマウス線維芽細胞）
・ＯＤＮ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；ｔｌｒｌ−ｈｏｄｎｂ−５）
・Ｃｈｋ２阻害剤ＩＩ（ＥＭＤ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；２２０４８６）
ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒプロトコル
凍結
９６ウェル培養プレートで、細胞を１００μｌ／ウェルの上清中で培養する（すなわち、必要であれば過剰な上清を除去する）
１５０μｌ／ウェルのＲＮＡｌａｔｅｒを添加し、−８０℃で凍結させる
解凍
・その手順全体を通してＰＢＳを冷やしておく
・９６ウェルプレートを解凍し、それを氷上に置いておく
・細胞をウェルからＲＮアーゼフリーの無菌のエッペンドルフチューブ（３００μｌ）中に移す
・無菌のＰＢＳをそれぞれのチューブに１．５ｍｌまで添加する。
【００３７】
・微量遠心機において３００×ｇで１０分間遠心分離する。
・緩衝液を吸引し、２１０μｌのＰＢＳ中で再懸濁する
・１０μｌを取り出し、１０μｌのトリパンブルーを添加し、血球計算板で数える
・細胞を氷上に置いておき、可能な限り早くＲＮＡ抽出を実施する
あるいは、細胞をＦＳＣおよびＳＳＣゲーティング（ＰＩ無し）を用いて単一細胞選別してＰＣＲプレート中に、マスター混合物を含有するウェル中に入れることができる
Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換に関する条件の最適化−実験＃５（９６ウェル形式）
Ｉ．目的：
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による形質転換の効率を向上させることおよび限界希釈法無しでモノクローナルＥＢＶ−Ｂ細胞株を得ること
ＩＩ．試料：
カスタマイズしたＭｉｌｔｅｎｙｉキットを用いることにより凍結／解凍されたＰＢＭＣから分離された記憶Ｂ細胞
ＩＩＩ．方法：
記憶Ｂ細胞を感染のためにＯＤＮ２００６（２．５μｇ／ｍｌ）＋Ｃｈｋ２阻害剤（２−アリールベンズイミダゾール（２−ａｒｙｌｂｅｎｚａｍｉｄａｚｏｌｅ）；５μＭ）またはＩＬ−２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）＋Ｒ８４８（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下でＥＢＶ懸濁液（Ｂ９５−８；１ｍｌ／１００，０００Ｂ細胞）と共に培養した。一夜培養の後、細胞を同じ濃度の上記の薬物を含有する培地中で再懸濁し、９６ウェルプレート（丸底）中に３０細胞／ウェルで分配した。細胞を、表ＩＩＩにおいて示したように、γ照射したフィーダー細胞と共培養した。ＥＢＶ感染の２週間後、それぞれのウェルを顕微鏡下で調べ、生きたリンパ芽細胞系（ＬＣＬ）の塊を含有するウェルの数を決定して全体の形質転換効率を概算した。加えて、培養上清中の総ＩｇＧのレベルをＩｇＧ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）ＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＩｇＧ産生Ｂ細胞の形質転換効率を決定した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
【表２】
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【００４０】
【表３】
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【００４１】
【化１】
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【００４２】
Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換に関する条件の最適化  実験＃６（９６ウェル形式）
ＩＶ．目的：
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による形質転換の効率を向上させることおよび限界希釈法無しでモノクローナルＥＢＶ−Ｂ細胞株を得ること
Ｖ．試料：
カスタマイズしたＭｉｌｔｅｎｙｉキットを用いることにより凍結／解凍されたＰＢＭＣから分離された記憶Ｂ細胞
ＶＩ．方法：
記憶Ｂ細胞を感染のためにＯＤＮ２００６（２．５μｇ／ｍｌ）＋Ｃｈｋ２阻害剤（２−アリールベンズイミダゾール（２−ａｒｙｌｂｅｎｚａｍｉｄａｚｏｌｅ）；５μＭ）またはＩＬ−２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）＋Ｒ８４８（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下でＥＢＶ懸濁液（Ｂ９５−８；１ｍｌ／１００，０００Ｂ細胞）と共に培養した。一夜培養の後、細胞を同じ濃度の上記の薬物を含有する培地中で再懸濁し、９６ウェルプレート（丸底）中に１０または３０細胞／ウェルで分配した。細胞を、表ＩＶにおいて示したように、γ照射したフィーダー細胞と共培養した。ＥＢＶ感染の２週間後、我々はそれぞれのウェルを顕微鏡下で調べ、生きたリンパ芽細胞系（ＬＣＬ）の塊を含有するウェルの数を決定して全体の形質転換効率を概算した。加えて、培養上清中の総ＩｇＧのレベルをＩｇＧ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）ＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＩｇＧ産生Ｂ細胞の形質転換効率を決定した。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
【表５】
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【００４５】
【表６】
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【００４６】
【化２】
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【００４７】
【化３】
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【００４８】
【化４】
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【００４９】
【表７−１】
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【００５０】
【表７−２】
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【００５１】
【表８】
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【００５２】
【化５】
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【００５３】
【化６】
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【００５４】
【化７】
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【００５５】
【化８】
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【００５６】
【化９】
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【００５７】
【化１０】
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【００５８】
【化１１】
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【００５９】
結果
この方法を用いて、慢性的にＨＩＶ−１に感染した対象から広く中和する抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体を単離した。対象はクレードＡ  ＨＩＶ−１ウイルスに感染しており、広い血清中和を示した。おおよそ２０，０００，０００個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を集め、濃縮および一夜ＥＢＶ形質転換の後におおよそ３０，０００個の生存可能なＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞を得た。細胞を８細胞／ウェルの密度で培養した。
【００６０】
刺激の終了時に、３，６００個の培養物を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて総ＩｇＧ産生、クレードＢ伝染始祖ｇｐ１４０  Ｅｎｖ６３５２１への結合（ＥＬＩＳＡ）、および中和するのが難しいＨＩＶ−１  ＣＡＰ４５株の中和（３層（ｔｉｅｒ）、クレードＣ；ＴＺＭ−ｂｌアッセイ(Li et al, J. Virol. 80:11776-11790 (2006))に関してスクリーニングした。それぞれのウェルからの細胞の分割量（Ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、（１）上清の収集および液体窒素での凍結のためにさらに増加し、（２）ＲＮＡｌａｔｅｒ中で凍結させた。
【００６１】
この実験において、予想されたように、１７９９／３６００の培養物（５０％）がＩｇＧを分泌した。それらの内で、２４の培養物がｇｐ１４０  Ｅｎｖ６３５２１に結合し（１．３３％）、２６のクローンがＨＩＶ−１  ＣＡＰ４５の５０％より多くを中和した（範囲：５１．２〜８５．６％）。ｇｐ１４０  Ｅｎｖ６３５２１に結合した１つのクローンのみがＨＩＶ−１  ＣＡＰ４５も中和した。
【００６２】
興味深いことに、ＨＩＶ−１  ＣＡＰ４５を中和した３つのクローンはＩｇＡおよびＩｇＭアイソタイプのものであった。これは、完全な純化ではなく、ＩｇＧ分泌記憶Ｂ細胞に関する濃縮が存在した（８０〜９０％の純度）という考えと一致している。
【００６３】
２０の最もよく中和した試料（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒｓ）の回収の日に凍結させたバルク細胞（ｂｕｌｋ  ｃｅｌｌｓ）からのＶＨおよびＶＬ鎖を増幅し、３７％がモノクローナルであり５２．６％がオリゴクローナル（培養物あたり２または３種類の機能する配列）であることが分かった。さらに１週間増加させて培養物からの上清に対して、中和の広さ（ＣＡＰ４５が含まれる５種類の中和するのが難しいウイルス、および陰性対照としてＳＶＡ）および伝染始祖（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｕｎｄｅｒ）エンベロープ（Ｅｎｖ６３５２１が含まれる３種類のエンベロープ）に対する結合の広さに関するチェックを行った。２つのクローン（１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｂ７）がウイルスの３／４を５０％を超えて中和することが分かった。クローン１−２７−Ｇ１１は２つのＶＨ鎖しか有していなかった。モノクローナル抗体を回収するために、ＶＨおよびＶＬ鎖を形質移入系において発現させている。いずれの中和クローンも伝染したエンベロープには結合しなかったが、以前に同定された２４種類の伝染したｇｐ１４０  Ｅｎｖ６３５２１に結合するクローンの内の９種類（３７．５％）はＥｎｖ１０８６ＣおよびＥｎｖ００ＭＳＡにも結合した。
【００６４】
上記で引用した全ての文書および他の情報源を、そのまま本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図４Ｒ】
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【図４Ｓ】
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【図４Ｔ】
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【図４Ｕ】
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【図４Ｖ】
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【図４Ｗ】
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【図４Ｘ】
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【図４Ｙ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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