(57)【要約】【課題】ＤＲ５抗体およびその使用の提供。【解決手段】本発明は、改良された特性を持つ抗ＤＲ５抗体、そのような抗体を含む組成物、そのような抗体を作成するための方法および手段、および特に癌の治療におけるそれらの治療的使用に関する。１つの態様において、本発明は、全長抗体１６Ｅ２の重鎖および／または軽鎖（各々、配列番号１１および１３）において少なくとも１つの突然変異を含む抗ＤＲ５抗体、またはその断片に関し、ここに、該抗体または抗体断片は少なくともＤＲ５に対する同一の親和性を示しおよび／または抗体１６Ｅ２と少なくとも同一の生物学的活性および／または効力を呈する。特別な具体例において、該抗体または抗体断片は全長抗体１６Ｅ２と同一のエピトープに本質的に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、作動性抗体を含めたＤＲ５抗体、およびそのようなＤＲ５抗体を用いる方法に一般的には関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する種々のリガンドおよび受容体は当該分野で同定されている。そのようなリガンドには、腫瘍壊死因子−アルファ（「ＴＮＦ−アルファ」）、腫瘍壊死因子−ベータ（「ＴＮＦ−ベータ」または「リンホトキシン−アルファ」）、リンホトキシン−ベータ（「ＬＴ−ベータ」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも言われる）Ａｐｏ−１リガンド、（Ａｐｏ２ＬまたはＴＲＡＩＬとも言われる）Ａｐｏ−２リガンド、（ＴＷＥＡＫとも言われる）Ａｐｏ−３リガンド、ＡＰＲＩＬ、（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ、またはＴＲＡＮＣＥとも言われる）ＯＰＧリガンド、および（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも言われる）ＴＡＬＬ−１が含まれる（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ，２：４２０−４３０（２００２）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３０５−１３０８（１９９８）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：２５５−２６０（２０００）；Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：７５０−７５３（１９９７）  Ｗａｌｌａｃｈ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ｐａｇｅｓ  ３７７−４１１；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０４：４８７−５０１（２００１）；Ｇｒｕｓｓ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，８５：３３７８−３４０４（１９９５）；Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：１８８１（１９８６）；Ｄｅａｌｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：６８９（１９８７）；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）；Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３−６８２（１９９５）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７２：８４７−８５６（１９９３）；Ａｒｍｉｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：８０−８２（１９９２），１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ  ９７／０１６３３；１９９７年７月１７日に公開されたＷＯ  ９７／２５４２８；Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：５２５−５２８（１９９８）；Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３２４０１−３２４１０（１９９７）；Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：１１８５−１１９０（１９９８）；１９９８年７月２日に公開されたＷＯ９８／２８４２６；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ９８／４６７５１；１９９８年５月７日に公開されたＷＯ／９８／１８９２１；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：２６０−２６３（１９９９）；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．，６５：６８０（１９９９）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：１７４７−１７５６（１９９９）；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１５９７８−１５９８１（１９９９））。
【０００３】
そのようなＴＮＦファミリーリガンドによって媒介される種々の細胞応答の誘導は、典型的には、それらは特異的細胞受容体に結合することによって開始される。全てではないがいくつかのＴＮＦファミリーリガンドは結合し、細胞表面「死滅受容体」を介して種々の生物学的活性を誘導して、カスパーゼ、または細胞死滅またはアポトーシス経路を行う酵素を活性化する（Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９１：４４３−４４６（１９９７）。今日同定されているＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの中にはＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、（Ａｐｏ−１またはＣＤ９５とも言われる）Ｆａｓ、（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とも言われる）ＤＲ４、（Ａｐｏ−２またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２とも言われる）ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＲＡＮＫおよびＡｐｏ−３（ＤＲ３またはＴＲＡＭＰとも言われる）Ａｐｏ−３が含まれる（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２：４２０−４３０（２００２）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３０５−１３０８（１９９８）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：２５５−２６０（２０００）；Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：７５０−７５３（１９９７）  Ｗａｌｌａｃｈ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ｐａｇｅｓ  ３７７−４１１；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０４：４８７−５０１（２００１）；Ｇｒｕｓｓ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，８５：３３７８−３４０４（１９９５）；Ｈｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９）；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：３１２７−３１３１（１９９０）；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ  ４１７，５６３；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：３５１（１９９０）；Ｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．６１：３６１（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３（１９９０）；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：２８３０−２８３４（１９９１）；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：３０２０−３０２６（１９９１）；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，８：１４０３−１４１０（１９８９）；Ｍａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１０６３−１０６８（１９９０）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９０：１７５−１７９（１９９７）；Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３２４０１−３２４１０（１９９７）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３（１９９７）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：８１５−８１８（１９９７）；Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７��：８１８−８２１（１９９７）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１１６５−１１７０（１９９７）；Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：１００３−１００６（１９９７）；Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ，２３４：１３７−１４２（１９９７）；Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：６２１６−６２２１（１９９７）；ｖｏｎＢｕｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：１３８−１４１（１９９７））。
【０００４】
これらのＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのほとんどは細胞外、膜貫通および細胞内領域を含めた細胞表面受容体の典型的な構造を共に有し、他方、他のものは、天然では、膜貫通および細胞内ドメインを欠如する可溶性蛋白質として見出される。典型的なＴＮＦＲの細胞外部分は、ＮＨ２−末端から出発し、複数のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）の反復アミノ酸配列パターンを含有する。
【０００５】
Ａｐｏ−２ＬまたはＴＲＡＩＬと言われるリガンドは、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された（例えば、Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３−６８２（１９９５）；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２６９７−１２６９０（１９９６）；ＷＯ  ９７／０１６３３：ＷＯ  ９７／２５４２８；１９９８年６月９日に発行された米国特許第５，７６３，２２３号；２００１年９月４日に発行された米国特許第６，２８４，２３６号参照）。全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸の長さのタイプＩＩ膜貫通蛋白質である。いくつかの細胞はポリペプチドの細胞外領域の酵素切断を介して該ポリペプチドの天然可溶性形態を生産することができる（Ｍａｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３７：２２１−２２９（１９９７））。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶性形態の結晶学的研究は、ＴＮＦおよび他の関連蛋白質の構造と同様なホモトリマー構造を明らかとする（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ，４：５６３−５７１（１９９９）；Ｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：２５３−２６１（１９９９）；Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：１０４８（１９９９）；Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：６３３−６４４（２０００））。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、しかしながら、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、（ホモトリマー中の各サブユニットの位置２３０における）３つのシステイン残基が一緒に亜鉛原子に配位し、および亜鉛結合がトリマーの安定性および生物学的活性で重要である点でユニークな構造的特徴を有することは見出されている（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２０６３２−２０６３７（２０００））。
【０００６】
文献においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、慢性関節リューマチのような自己免疫疾患を含めた免疫系変調において役割を演じることができるとことが報告されている［例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：２１９５−２２００（１９９８）；Ｊｏｈｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１１：６６４−６７２（１９９９）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：１３４３−１３５３（１９９９）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９１：１０９５−１１０３（２０００）］。
【０００７】
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶性形態は、結腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣および脳腫瘍、ならびにメラノーマ、白血病、および多発性ミエローマを含めた種々の癌細胞においてアポトーシスを誘導することが報告されている（例えば、Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，９４５号；２００４年６月８日に発行された米国特許第６，７４６，６６８号；Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２７：１２４−１２８（１９９８）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：１５５−１６２（１９９９）；Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：１５７−１６３（１９９９）；Ｋｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９：７３４−７４１（１９９９）；Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：２６０５−２６１２（１９９９）；Ｇａｚｉｔｔ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１３：１８１７−１８２４（１９９９）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：２３８４−２３８９（２０００）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１７５４−１７５９（２０００）参照）。ネズミ腫瘍モデルにおけるイン・ビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で、あるいは化学療法または放射線療法と組み合わされて、実質的な抗腫瘍効果を発揮することができることを示唆した（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｗａｌｚｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｇｌｉｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：６１５３−６１５８（１９９９）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２６５：１９９９（１９９９）；ＰＣＴ出願ＵＳ／００／１５５１２；ＰＣＴ出願ＵＳ／０１／２３６９１参照）。癌細胞の多くのタイプとは対照的に、ほとんどの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によってアポトーシス誘導に対して抵抗性であるように見える（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｗａｌｚｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジン−タグド可溶性形態が、非−ヒト肝細胞ではそうでないが、正常な単離されたヒト肝細胞においてイン・ビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している（Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６：５６４−５６７（２０００）；また、Ｎａｇａｔａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６：５０２−５０３（２０００）参照）。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物が、例えば、タグ分子、亜鉛含有量、および％トリマー含有量の存在または不存在に依存して、病気となった  ｖｓ  正常な細胞に対する生物化学的特性および生物学的活性の点で変化し得ると考えられている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，編集者に対するレター，７：３８３−３８５（２００１）；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒ���  Ｍｅｄ．，編集者に対するレター，７：３８５−３８６（２００１）参照）。
【０００８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは少なくとも５つの異なる受容体に結合することが判明している。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに結合する受容体のうち少なくとも２つは機能的細胞質死滅ドメインを含有する。１つのそのような受容体は「ＤＲ４」（あるいは、ＴＲ４またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１）といわれてきた（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３（１９９７）；また、１９９８年７月３０日に公開されたＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ９９／３７６８４；２０００年１２月７日に公開されたＷＯ／００／７３３４９；２００２年８月１３日に発行された米国特許第６，４３３，１４７号；２００２年１０月８日に発行された米国特許第６，４６１，８２３号、および２００２年１月２９日に発行された米国特許第６，３４２，３８３号参照）。
【０００９】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬについてのもう１つのそのような受容体はＤＲ５といわれてきた（それはＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−ＲまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとも言われてきた）（例えば、非特許文献１，非特許文献２，１９９８年１１月１９日に公開された特許文献１；１９９８年９月２４日に公開された特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；１９９８年８月２０日に公開された特許文献３；１９９８年１０月１４日に公開された特許文献４；１９９８年１０月２２日に公開された特許文献５；１９９９年１月２１日に公開された特許文献６；１９９９年２月２５日に公開された特許文献７；１９９９年３月１１日に公開された特許文献８；２００２年８月１３日に公開された特許文献９；２００１年１２月７日に公開された特許文献１０；２００１年１２月６に発行された特許文献１１；２００１年８月２日に公開された特許文献１２；２００３年７月３日に公開された特許文献１３；２００２年１０月３１日に公開された特許文献１４；２００２年４月２５日に公開された特許文献１５；２００２年２月に発行された特許文献１６；２００３年５月２７日に発行された特許文献１７；２０００年６月６日に発行された特許文献１８；２００３年１１月４日に発行された特許文献１９；２００４年６月１日に発行された特許文献２０参照）。ＤＲ４のように、ＤＲ５はその細胞外部分における３つのシステインに富むドメイン、および単一の細胞質死滅ドメインを含有し、リガンド結合に際して（または、リガンドの活性を模倣する、アゴニスト抗体のような分子への結合に際して）アポトーシスをシグナリングできると報告されている。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬおよびＤＲ５の間で形成された複合体の結晶構造はＨｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，４：５６３−５７１（１９９９）に記載されている。
【００１０】
リガンド結合に際して、ＤＲ４およびＤＲ５の双方は、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と言われる死滅−ドメイン−含有アダプター分子を介して、アポトーシスイニシエーターであるカスパーゼ−８を動員し、それを活性化することによって独立してアポトーシスをトリガーすることができる［Ｋｉｓｃｈｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：６１１−６２０（２０００）；Ｓｐｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：５９９−６０９（２０００）；Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：２４１−２４３（２０００）］。特に、ＤＲ５は、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子とは独立している「細胞−外因性」経路を通じてアポトーシスをシグナリングする（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０５−８（１９９８）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４２０−３０（２００２））。この経路の活性化は、活性化された受容体の細胞質死滅ドメインにおける、死滅−誘導シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）の迅速な形成を含む。まず、アダプター分子ＦＡＤＤはホモ親和性死滅ドメイン相互作用を介してＤＲ５に結合する（Ｋｉｓｃｈｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｓｐｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。引き続いて、ＦＡＤＤはアポトーシス−開始プロテアーゼであるカスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０を動員し、それらの誘導された近隣による活性化を媒介する。カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０は自己−プロセッシングを受け、可溶性活性カスパーゼサブユニットを細胞質に放出し、そこで、それらは同化し、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７のようなエフェクターカスパーゼを切断する。切断の結果、エフェクターカスパーゼが活性化され、それはアポトーシス細胞プログラムを行う（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３１２−６（１９９８））。
【００１１】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧとも言われる受容体にやはり結合することが報告されており、これらは、シグナリングのトランスジューサーよりはむしろ阻害剤として機能すると信じられている（例えば、（ＴＲＩＤ、ＬＩＴまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ３とも言われる）ＤＣＲ１［Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３（１９９７）；Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７；８１８−８２１（１９９７）；ＭｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２５４１７−２５４２０（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１６：３２９−３３４（１９９７）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１１６５−１１７０（１９９７）；およびＭｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：３−６（１９９８）；（ＴＲＵＮＤＤまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ４とも呼ばれる）ＤＣＲ２［Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：１００３−１００６（１９９７）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２４：４１−４５（１９９８）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：８１３−８２０（１９９７）］、およびＯＰＧ［Ｓｉｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ］。ＤＲ４およびＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２受容体はアポトーシスをシグナリングしない。
【００１２】
ＤＲ４および／またはＤＲ５受容体に結合するある種の抗体は文献で報告されている。例えば、ある哺乳動物細胞における、ＤＲ４受容体に向けられ、かつアゴニストまたはアポトーシス活性を有する抗ＤＲ４抗体は、例えば、１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ  ９９／３７６８４；２０００年７月１２日に公開されたＷＯ  ００／７３３４９；２００３年８月１４日に公開されたＷＯ  ０３／０６６６６１に記載されている。また、例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：２５９７−２６０５（１９９９）；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：４８９１−４８９８（２００１）；２００２年１２月２日に公開されたＷＯ  ０２／０９７０３３；２００３年５月２２日に公開されたＷＯ  ０３／０４２３６７；２００３年５月８日に公開されたＷＯ  ０３／０３８０４３；２００３年５月８に日に公開されたＷＯ  ０３／０３７９１３参照。ある種の抗ＤＲ５抗体は同様に記載されている。例えば、１９９８年１１月８日に公開されたＷＯ  ９８／５１７９３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：２５９７−２６０５（１９９９）；Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，７：９５４−９６０（２００１）；Ｈｙｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ”，Ａｂｓｔｒａｃｔ，２ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ，Ａｕｇ．２９−Ｓｅｐｔ．１，２００２，Ｂａｎｆｆ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ；２００３年５月８日に公開されたＷＯ  ０３／０３８０４３；２００３年５月８日に公開されたＷＯ  ０３／０３７９１３参照。加えて、ＤＲ４およびＤＲ５受容体の双方に対して交差−反応性を有するある種の抗体が記載されている（例えば、２００１年６月２６日に発行された米国特許第６，２５２，０５０号参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９８／５１７９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／４１６２９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／３５９８６号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第８７０，８２７号明細書
【特許文献５】国際公開第９８／４６６４３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９９／０２６５３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９９／０９１６５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９／１１７９１号パンフレット
【特許文献９】米国特許出願公開第２００２／００７２０９１号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００２／００９８５５０号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３１３，２６９号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００１／００１０９２４号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００３／０１２５５４０号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００２／０１６０４４６号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００２／００４８７８５号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，３４２，３６９号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，５６９，６４２号明細書
【特許文献１８】米国特許第６，０７２，０４７号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，６４２，３５８号明細書
【特許文献２０】米国特許第６，７４３，６２５号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：８１８−８２１（１９９７）
【非特許文献２】Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：８１５−８１８（１９９７）
【非特許文献３】Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：６９３−６９６（１９９７）
【非特許文献４】Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：５３８６−５３８７（１９９７）
【非特許文献５】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：１４１−１４３（１９９７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトＤＲ５に特異的に結合することができ、および／またはＤＲ５および／またはそのリガンドに関連する生物学的活性、特に、アポトーシスを変調することができ、かくして、癌または免疫関連病を含めた種々の病気および病理学的疾患の治療で有用であるＤＲ５抗体を提供する。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、全長抗体１６Ｅ２の重鎖および／または軽鎖（各々、配列番号１１および１３）において少なくとも１つの突然変異を含む抗ＤＲ５抗体、またはその断片に関し、ここに、該抗体または抗体断片は少なくともＤＲ５に対する同一の親和性を示しおよび／または抗体１６Ｅ２と少なくとも同一の生物学的活性および／または効力を呈する。特別な具体例において、該抗体または抗体断片は全長抗体１６Ｅ２と同一のエピトープに本質的に結合する。もう１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は全長抗体１６Ｅ２よりもＤＲ５に対してより高い親和性を呈し、および／または全長抗体１６Ｅ２に対して増大した生物学的活性および／または増大した能力を示す。なおもう１つの具体例において、本発明の抗ＤＲ５抗体および抗体断片はＤＲ５に対して少なくとも同一の親和性を示し、および／またはＷＯ  ９８／５１７９３に記載された単一鎖Ｆｃ抗ＤＲ５抗体と同一の生物学的活性および／または効力を呈する。
【００１７】
１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は、表１ないし７および９ないし１２のいずれかにリストされた少なくとも１つの置換を有する重鎖および／または軽鎖、またはその断片を含む。
【００１８】
もう１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は、１６Ｅ２抗体重鎖可変ドメインのフレームワークに１以上の突然変異を含む。
【００１９】
なおもう１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は、Ｑ６Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｅ１２Ｖ、Ｒ１３Ｑ、およびＫ１０５Ｑよりなる群から選択されるフレームワーク突然変異を含む。
【００２０】
さらなる具体例において、抗ＤＲ５抗体はフレームワーク突然変異Ｑ６Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｅ１２Ｖ、Ｒ１３Ｑ、およびＫ１０５Ｑの全てを含む。
【００２１】
なおさらなる具体例において、抗ＤＲ５抗体は全長抗体１６Ｅ２の重鎖（配列番号：１１）、またはその断片において少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２２】
異なる具体例において、抗ＤＲ５抗体は、配列番号：１１のアミノ酸配列、またはその断片において、Ｔ２８Ａ、Ｇ３３Ａ、Ｍ３４Ｌ、Ｍ３４Ａ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｓ、Ｍ５３Ｑ、Ｎ５３Ｙ、およびＬ１０２Ｙよりなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２３】
もう１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は、配列番号：１１のアミノ酸配列またはその断片において、突然変異Ｇ９９ＡおよびＲ１００Ａの少なくとも１つを含む。
【００２４】
なおもう１つの具体例において、抗ＤＲ５抗体は、配列番号：１１のアミノ酸配列またはその断片において、（ｉ）Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉｉ）Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｖ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；および（ｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙよりなる群から選択される突然変異の組を含む。
【００２５】
さらなる具体例において、抗ＤＲ５抗体は全長１６Ｅ２抗体の軽鎖（配列番号：１３）またはその断片において少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２６】
特別な具体例において、軽鎖はラムダ鎖である。
【００２７】
もう１つの特別な具体例において、軽鎖突然変異はＣＤＲ  Ｌ１におけるものである。
【００２８】
さらな具体例において、軽鎖突然変異はＱ２４Ａ、Ｑ２４Ｓ、Ｇ２５Ａ、Ｄ２６Ｅ、Ｓ２７Ａ、Ｌ２８Ａ、Ｒ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｙ３１Ａ、Ｙ３１Ｋ、Ｙ３２Ｈ、Ａ３３Ｇ、Ｓ３４Ａ、およびＳ３４Ｙよりなる群から選択される。
【００２９】
なおさらなる具体例において、軽鎖突然変異は配列番号：１３のアミノ酸配列における（ｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｄ２６Ｅ、Ｙ３１Ｋ、Ｓ３４Ｙ；および（ｉｉ）Ｄ２６Ｅ、Ｙ３１Ｋよりなる群から選択される。
【００３０】
異なる具体例において、軽鎖突然変異はＣＤＲ  Ｌ２におけるものである。
【００３１】
かくして、例えば、突然変異は配列番号：１３のアミノ酸配列におけるＧ５０Ａ、Ｇ５０Ｋ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ５１Ｄ、Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｌ、Ｎ５２Ｑ、Ｎ５３Ａ、Ｎ５３Ｅ、Ｎ５３Ｑ、Ｎ５３Ｓ、Ｐ５５Ａ、およびＳ５６Ａよりなる群から選択することができる。
【００３２】
もう１つの具体例において、抗体は配列番号：１３のアミノ酸配列における、（ｉ）Ｇ５０Ｋ、Ｋ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；（ｉｉ）Ｇ５０Ｓ、Ｋ５１Ｄ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；（ｉｉｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；および（ｉｖ）Ｎ５２Ｑ、Ｎ５３Ｓよりなる群から選択される突然変異の組を含有することができる。
【００３３】
さらなる具体例において、軽鎖突然変異はＣＤＲ  Ｌ３におけるものである。
【００３４】
なおさらなる具体例において、抗体は配列番号：１３におけるＮ８９Ａ、Ｎ８９Ｌ、Ｎ８９Ｑ、Ｒ９１Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９５ａＡ、Ｎ９５ａＴ、Ｎ９５ａＱ、Ｈ９５ｂＡ、Ｎ９５ｂＹ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９７Ａよりなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００３５】
あるいは、抗ＤＲ５抗体は配列番号：１３の配列において（ｉ）Ｎ８９Ｌ、Ｒ９１Ａ、Ｎ９５ａＴ、Ｈ９５ｂＹ；および（ｉｉ）Ｎ９５ａＴ、Ｈ９５ｂＹよりなる群から選択される突然変異の組を含むことができる。
【００３６】
さらなる具体例において、抗ＤＲ５抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列において（ｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｇ５０Ｋ、Ｋ５１Ｄ、Ｈ９５ｂＹ；（ｉｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｄ９２Ｓ、Ｓ９３Ｙ；および（ｉｉｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｒ９１Ａよりなる群から選択される軽鎖突然変異の組を含み、加えて、配列番号：１１のアミノ酸配列において（ｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｖ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０３Ｙ；（ｖｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；および（ｉｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙよりなる群から選択される重鎖突然変異の組、および所望により表５にリストしたフレームワーク突然変異の組を含むことができる。
【００３７】
特別な具体例において、抗ＤＲ５抗体は配列番号：１１の配列における以下の突然変異：Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ、および配列番号：１３の配列におけるＱ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｒ９１Ａを含み、加えて、例えば、配列番号：１１の残基６、１１、１２、１３および１０５の少なくとも１つであり得る少なくとも１つのフレームワーク突然変異を含むことができる。
【００３８】
特殊な具体例において、抗ＤＲ５抗体はＡｐｏｍａｂｓ  １．１、２．１、３．１、４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２．１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３および９．３よりなる群から選択される。
【００３９】
特別な具体例において、抗ＤＲ５抗体はＡｐｏｍａｂｓ  ５．２、５．３、６．２、６．３、７．２、７．３、８．３および２５．３よりなる群から選択される。
【００４０】
なおもう１つの特別な具体例において、抗ＤＲ５抗体はＡｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３、特にＡｐｏｍａｂ  ７．３である。
【００４１】
なおさらなる具体例において、抗ＤＲ５抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイヤボディー、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異的抗体よりなる群から選択することができる抗体断片である。
【００４２】
他の具体例において、抗体は単一鎖抗体であり得る。
【００４３】
抗ＤＲ５抗体は、例えば、抗癌活性を有することができ、例えば、それらは癌細胞においてアポトーシスを活性化し、または刺激する能力を保有することができる。
【００４４】
癌は、例えば、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含む。
【００４５】
癌のより具体的な例は扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌種、および頭部および頸部癌を含む。
【００４６】
癌の特別な群は肺癌（例えば、非小細胞肺癌種−ＮＳＣＬＣ）；あるいは例えば、結腸直腸、膵臓または転移性腺癌であり得る腺癌を含む。血液学的癌も含まれる。
【００４７】
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体がそうであるように、ここに該範囲内にある。
【００４８】
好ましい具体例において、抗ＤＲ５抗体はＡｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３、またはその断片を含む。
【００４９】
該抗体は、ダイマー形態、および／または例えば、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域が架橋された形態であって良い。
【００５０】
他の具体例において、抗ＤＲ５抗体は、ここでは、エピトープタグ配列に融合される。
【００５１】
もう１つの態様において、本発明は異種アミノ酸配列に融合した抗ＤＲ５抗体または抗体断片を含むキメラ分子に関し、ここに、該異種アミノ酸配列は、例えば、抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃ領域のような免疫グロブリン配列を含むことができる。
【００５２】
なおもう１つの態様において、本発明は、抗ＤＲ５抗体または抗体断片をコードする単離された核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、そのような核酸分子を含む宿主細胞、および抗体および抗体断片を生産する方法に関する。
【００５３】
本発明は、さらに、ここに前記で定義した抗ＤＲ５抗体および担体を含む組成物に関する。
【００５４】
該担体は医薬上許容される担体であってよく、該組成物はさらに、追加の抗癌剤、および／またはさらなる抗ＤＲ５抗体を含むことができる。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物癌細胞を前記定義の抗ＤＲ５抗体に暴露することを含むアポトーシスを誘導する方法に関する。
【００５６】
なおさらなる態様において、本発明は、有効量の前記定義の抗ＤＲ５抗体を哺乳動物対象に投与することを含む癌の治療方法に関する。
【００５７】
全ての態様において、対象はヒト患者であり得、該癌は前記リストの癌を含めたいずれの癌でもあり得る。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は容器および該容器内に含有された組成物を含む製品に関し、ここに、該組成物は本発明の抗ＤＲ５抗体を含む。該製品は、さらに、イン・ビトロまたはイン・ビボで抗ＤＲ５抗体を用いるための指示書を含むことができる。好ましい具体例において、該指示書は癌の治療に関する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
全長抗体１６Ｅ２の重鎖および／または軽鎖（各々、配列番号：１１および１３）において少なくとも１つの突然変異を含む抗ＤＲ５抗体、またはその断片であって、ここに、該抗体または抗体断片は該全長抗体１６Ｅ２よりもＤＲ５に対してより大きな親和性を有し、および／または該全長抗体１６Ｅ２よりも大きな生物学的活性および／または効力を呈する、抗体または抗体断片。
（項目２）
前記抗体が全長抗体１６Ｅ２、またはその断片と本質的に同一のエピトープに結合する項目１記載の抗ＤＲ５抗体。
（項目３）
表１ないし７、および９ないし１２いずれかにリストされた少なくとも１つの置換を有する重鎖および／または軽鎖を含む項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目４）
全長１６Ｅ２抗体重鎖（配列番号：１１）可変ドメインのフレームワークに１以上の突然変異を含む項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目５）
前記フレームワーク突然変異がＱ６Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｅ１２Ｖ、Ｒ１３Ｑ、およびＫ１０５Ｑよりなる群から選択される項目４記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目６）
フレームワーク突然変異Ｑ６Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｅ１２Ｖ、Ｒ１３Ｑ、およびＫ１０５Ｑの全てを含む項目５記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目７）
配列番号：１１のアミノ酸配列において、Ｔ２８Ａ、Ｇ３３Ａ、Ｍ３４Ｌ、Ｍ３４Ａ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｓ，Ｎ５３Ｑ、Ｎ５３Ｙ、およびＬ１０２Ｙよりなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む項目１または６記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目８）
配列番号：１１のアミノ酸配列において、突然変異Ｇ９９ＡおよびＲ１００Ａの少なくとも１つを含む項目１または６記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目９）
配列番号：１１のアミノ酸配列において、（ｉ）Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉｉ）Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｖ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；および（ｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙよりなる群から選択される突然変異の組を含む項目６記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１０）
全長１６Ｅ２抗体の軽鎖（配列番号：１３）において少なくとも１つの突然変異を含む項目１または６記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１１）
前記軽鎖がラムダ鎖である項目１０記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１２）
前記突然変異がＣＤＲ  Ｌ１におけるものである項目１１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１３）
前記突然変異が配列番号：１３のアミノ酸配列におけるＱ２４Ａ、Ｑ２４Ｓ、Ｇ２５Ａ、Ｄ２６Ｅ、Ｓ２７Ａ、Ｌ２８Ａ、Ｒ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｙ３１Ａ、Ｙ３１Ｋ、Ｙ３２Ｈ、Ａ３３Ｇ、Ｓ３４Ａ、およびＳ３４Ｙよりなる群から選択される項目１２記載の抗ＤＲ５抗体またはその断片。
（項目１４）
配列番号：１３のアミノ酸配列における（ｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｄ２６Ｅ、Ｙ３１Ｋ、Ｓ３４Ｙ；および（ｉｉ）Ｄ２６Ｅ、Ｙ３１Ｋよりなる群から選択される突然変異の組を含む項目１２記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１５）
前記突然変異がＣＤＲ  Ｌ２におけるものである項目１１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１６）
前記突然変異が配列番号：１３のアミノ酸配列におけるＧ５０Ａ、Ｇ５０Ｋ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ５１Ｄ、Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｌ、Ｎ５２Ｑ、Ｎ５３Ａ、Ｎ５３Ｅ、Ｎ５３Ｑ、Ｎ５３Ｓ、Ｐ５５Ａ、およびＳ５６Ａよりなる群から選択される項目１５記載の抗ＤＲ５抗体。
（項目１７）
配列番号：１３のアミノ酸配列における（ｉ）Ｇ５０Ｋ、Ｋ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；（ｉｉ）Ｇ５０Ｓ、Ｋ５１Ｄ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；（ｉｉｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅ；および（ｉｖ）Ｎ５２Ｑ、Ｎ５３Ｓよりなる群から選択される突然変異の組を含む項目１５記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１８）
前記突然変異がＣＤＲ  Ｌ３におけるものである項目１１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目１９）
配列番号：１３においてＮ８９Ａ、Ｎ８９Ｌ、Ｎ８９Ｑ、Ｒ９１Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９５ａＡ、Ｎ９５ａＴ、Ｎ９５ａＱ、Ｈ９５ｂＡ、Ｎ９５ｂＹ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９７Ａよりなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む項目１８記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２０）
配列番号：１３の配列において（ｉ）Ｎ８９Ｌ、Ｒ９１Ａ、Ｎ９５ａＴ、Ｈ９５ｂＹ；および（ｉｉ）Ｎ９５ａＴ、Ｈ９５ｂＹよりなる群から選択される突然変異の組を含む項目１８記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２１）
配列番号：１３のアミノ酸配列において（ｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｇ５０Ｋ、Ｋ５１Ｄ、Ｈ９５ｂＹ；（ｉｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｄ９２Ｓ、Ｓ９３Ｙ；および（ｉｉｉ）Ｑ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｒ９１Ａよりなる群から選択される軽鎖突然変異の組を含む項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２２）
加えて、配列番号：１１のアミノ酸配列において（ｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｉｖ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉ）Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０３Ｙ；（ｖｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ；（ｖｉｉｉ）Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、Ｌ１０２Ｙ；および（ｉｘ）Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙよりなる群から選択される重鎖突然変異の組を含む項目２１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２３）
加えて、表５にリストされたフレームワーク突然変異の組を含む項目２２記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２４）
以下の突然変異：配列番号：１１の配列におけるＧ３３Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙ、および配列番号：１３の配列におけるＱ２４Ｓ、Ｋ５１Ａ、Ｒ９１Ａを含む項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２５）
加えて、少なくとも１つのフレームワーク突然変異を含む項目２４記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２６）
前記フレームワーク突然変異が配列番号：１１の残基６、１１、１２、１３および１０５の少なくとも１つである項目２５記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２７）
Ａｐｏｍａｂ  １．１、２．１、３．１、４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３および９．３よりなる群から選択される項目２４記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２８）
Ａｐｏｍａｂ  ７．３または８．３である項目２７記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目２９）
Ａｐｏｍａｂ  ７．３である項目２８記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目３０）
前記抗体はＡｐｏｍａｂ  ７．３と同一のエピトープに本質的に結合する項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目３１）
前記断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイヤボディー、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異的抗体よりなる群から選択される項目１または２９記載の抗ＤＲ５抗体。
（項目３２）
前記抗体が単一鎖抗体である項目３１記載の抗ＤＲ５抗体。
（項目３３）
前記断片がＦｖ断片である項目３１記載の抗ＤＲ５抗体。
（項目３４）
前記生物学的活性が抗癌活性である項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目３５）
前記生物学的活性が癌細胞におけるアポトーシスの活性化または刺激である項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目３６）
癌が癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病よりなる群から選択される項目３４記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目３７）
前記癌が扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非−ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および頭部および頸部癌よりなる群から選択される項目３６記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目３８）
前記癌がＮＳＣＬＣ、非−ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、または膵臓癌である項目３７記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目３９）
前記癌が腺癌である項目３６記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４０）
前記腺癌が結腸直腸、膵臓、または転移性腺癌である項目３９記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４１）
前記能力がイン・ビトロ腫瘍殺傷アッセイにおいて決定される項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４２）
キメラ、ヒト化またはヒト抗体である項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４３）
抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４４）
Ａｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３を含む項目１記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片。
（項目４５）
二量体形態である項目１記載の抗ＤＲ５抗体またはその断片。
（項目４６）
抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域で架橋された項目２記載の抗ＤＲ５抗体またはその断片。
（項目４７）
エピトープタグ配列に融合された項目１記載の抗ＤＲ５抗体または抗体断片。
（項目４８）
異種アミノ酸配列に融合された項目４４記載の抗体を含むキメラ分子。
（項目４９）
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリン配列を含む項目４８記載のキメラ分子。
（項目５０）
前記免疫グロブリン配列が抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域である項目４９記載のキメラ分子。
（項目５１）
項目１記載の抗ＤＲ５抗体の重鎖または軽鎖をコードする単離された核酸。
（項目５２）
Ａｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３の重鎖または軽鎖をコードする単離された核酸。
（項目５３）
項目５１または５２記載の核酸を含むベクター。
（項目５４）
項目５１または５２記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目５５）
前記ＤＮＡが発現される条件下で項目５４記載の宿主細胞を培養することを含む抗ＤＲ５抗体の生産方法。
（項目５６）
項目１、２８または２９記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片、および担体を含む組成物。
（項目５７）
前記担体が医薬上許容される担体である項目５６記載の組成物。
（項目５８）
さらに、追加の抗癌剤を含む項目５７記載の組成物。
（項目５９）
前記追加の抗癌剤が抗体である項目５８記載の組成物。
（項目６０）
前記抗体がさらなる抗ＤＲ５抗体、リツキサン（リツキシマブ）、および抗ＶＥＧＦ抗体よりなる群から選択される項目５９記載の組成物。
（項目６１）
前記追加の抗癌剤が化学療法剤である項目５８記載の組成物。
（項目６２）
前記化学療法剤がＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ゲムシタビン、カルボプラチン、タキソールおよびパクリタキセルよりなる群から選択される項目６１記載の組成物。
（項目６３）
前記追加の抗癌剤が図１のアミノ酸１１４ないし２８１（配列番号：１）を含むＡｐｏ２Ｌリガンドである項目５８記載の組成物。
（項目６４）
項目１、２８または２９記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片に哺乳動物癌細胞を暴露することを含むアポトーシスを誘導する方法。
（項目６５）
前記抗体がキメラ、ヒト化またはヒト抗体である項目６４記載の方法。
（項目６６）
前記哺乳動物癌細胞が、ＤＲ５を活性化する因子に暴露される項目６４記載の方法。
（項目６７）
項目１、２８または２９記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む癌の治療方法。
（項目６８）
前記哺乳動物対象がヒト患者である項目６７記載の方法。
（項目６９）
前記癌が扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非−ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および頭部および頸部癌よりなる群から選択される項目６８記載の方法。
（項目７０）
前記癌がＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、非−ホジキンリンパ腫または膵臓癌である項目６９記載の方法。
（項目７１）
前記癌が腺癌である項目６８記載の方法。
（項目７２）
前記腺癌が結腸直腸、膵臓、または転移性腺癌である項目７１記載の方法。
（項目７３）
加えて、さらなる抗癌剤を投与することを含む項目６７ないし７２いずれか１記載の方法。
（項目７４）
容器および該容器に含まれる組成物を含む製品であって、該組成物は項目１、２８または２９記載の抗ＤＲ５抗体、またはその断片を含む、製品。
（項目７５）
さらに、イン・ビトロまたはイン・ビボで前記抗ＤＲ５抗体を用いるための指示書を含む項目７４記載の製品。
（項目７６）
前記指示書が癌の治療に関する項目７５記載の製品。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２）およびその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。（配列番号：２）におけるヌクレオチド位置４４７における「Ｎ」は、該ヌクレオチド塩基が「Ｔ」または「Ｇ」であってよいことを示すのに用いる。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、全長ヒトＤＲ４受容体についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４）およびその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ヒトＤＲ４受容体についての各ヌクレオチドおよびアミノ酸配列もＰａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１（１９９７）に報告されている。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、全長ヒトＤＲ４受容体についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４）およびその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ヒトＤＲ４受容体についての各ヌクレオチドおよびアミノ酸配列もＰａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１（１９９７）に報告されている。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、全長ヒトＤＲ４受容体についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４）およびその誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ヒトＤＲ４受容体についての各ヌクレオチドおよびアミノ酸配列もＰａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１（１９９７）に報告されている。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、１９９８年１１月１９日にＷＯ  ９８／５１７９３において公開されたヒトＤＲ５受容体の４１１アミノ酸配列（配列番号：５）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、１９９８年１１月１９日にＷＯ  ９８／５１７９３において公開されたヒトＤＲ５受容体の４１１アミノ酸配列（配列番号：５）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、１９９８年１１月１９日にＷＯ  ９８／５１７９３において公開されたヒトＤＲ５受容体の４１１アミノ酸配列（配列番号：５）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、やはり１９９８年８月２０日にＷＯ  ９８／３５９８６において公開された、ヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号：７）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、やはり１９９８年８月２０日にＷＯ  ９８／３５９８６において公開された、ヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号：７）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、やはり１９９８年８月２０日にＷＯ  ９８／３５９８６において公開された、ヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号：７）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。
【図５】図５は、単一鎖抗ＤＲ５抗体１６Ｅ２（１６Ｅ２  ｓｃＦｖ）のヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す。
【図６】図６は、単一鎖抗ＤＲ５抗体１６Ｅ２（１６Ｅ２  ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列（配列番号：１０）を示し、ここに、シグナル配列および重鎖および軽鎖ＣＤＲが示される。
【図７】図７は、全長１６Ｅ２抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図８】図８は、全長１６Ｅ２抗体重鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１２）を示す。
【図９】図９は、全長１６Ｅ２抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。
【図１０】図１０は、全長６Ｅ２抗体軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１４）を示す。
【図１１Ａ】図１１ＡおよびＢは免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：１５、５３９１  ｂｐ）を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含有し（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））、それについての開始および停止コドンは太線にて、かつ下線を施して示す。
【図１１Ｂ】図１１ＡおよびＢは免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：１５、５３９１  ｂｐ）を示す。ｐＤＲ１は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含有し（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））、それについての開始および停止コドンは太線にて、かつ下線を施して示す。
【図１２Ａ】図１２ＡおよびＢは免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：１６）を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含有し（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、それについての開始および停止コドンは太線にて、かつ下線を施して示す。
【図１２Ｂ】図１２ＡおよびＢは免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：１６）を示す。ｐＤＲ２は無関係な抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含有し（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、それについての開始および停止コドンは太線にて、かつ下線を施して示す。
【図１３】図１３はＡｐｏｍａｂ  ７．３重鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す。
【図１４】図１４はＡｐｏｍａｂ  ７．３重鎖のアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【図１５】図１５は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す。
【図１６】図１６はＡｐｏｍａｂ  ７．３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【図１７Ａ】図１７ＡおよびＢは１６Ｅ２およびＡｐｏｍａｂ  ７．３重鎖の整列を示す。
【図１７Ｂ】図１７ＡおよびＢは１６Ｅ２およびＡｐｏｍａｂ  ７．３重鎖の整列を示す。
【図１８】図１８は１６Ｅ２およびＡｐｏｍａｂ  ７．３軽鎖の整列を示す。
【図１９】図１９は抗ＤＲ５抗体重鎖についての相同性モデルである。
【図２０】図２０は抗ＤＲ５抗体軽鎖についての相同性モデルである。
【図２１】図２１は、ヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおいて、全長１６Ｅ２（バージョン１）抗体と比較した、Ａｐｏｍａｂｓ  ５．３、６．３および８．３の単一腹腔内（ＩＰ）用量の抗癌活性を示す。
【図２２】図２２はヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおける、全長１６Ｅ２（バージョン１）抗体と比較した、Ａｐｏｍａｂｓ  ５．２、６．２、５．３、７．２および７．３の単一ＩＰ用量の抗癌活性を示す。
【図２３】図２３はヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおける、全長１６Ｅ２（バージョン１）抗体と比較した、Ａｐｏｍａｂｓ  ５．２、７．３および８．３の単一ＩＰ用量の抗癌活性を示す。
【図２４】図２４は、ヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおける、Ａｐｏｍａｂ  ７．３と比較したＡｐｏｍａｂｓ  ２３．３および２５．３の抗癌活性を示す。
【図２５】図２５は、ヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおける、安定した細胞系  ｖｓ  一過性細胞系に由来するＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図２６】図２６は、肺癌のＨＣＴ１５異種移植片モデルにおける、単独、およびＣＰＴ−１１と組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図２７】図２７は、ヒト肉腫のＬＳ１８０異種移植片モデルにおける単独、およびＣＰＴ−１１と組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図２８】図２８は、非−ホジキンリンパ腫のＢＪＡＢ異種移植片ＣＢ１７  ＩＣＲ  ＳＣＩＤマウスモデルにおける、単独、およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）と組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図２９】図２９は、ヒト膵臓腺癌のＢｘＰＣ３異種移植片無胸腺ヌードマウスモデルにおける、単独、およびゲムシタビンと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図３０】図３０は、ヒト肺癌のＨ４６０異種移植片モデルにおける、単独、およびカルボプラチンおよびタキソールと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図３１】図３１は、ヒト肺癌のＨ２１２２異種移植片モデルにおける、単独、およびカルボプラチンおよびタキソールと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性を示す。
【図３２】図３２は、ヒト肺癌のＨ２１２２異種移植片モデルにおけるＡｐｏｍａｂ  ７．３の用量−応答曲線を示す。
【図３３】図３３は、ヒト結腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片モデルにおける、Ａｐｏｍａｂ  ７．３と比較したＡｐｏｍａｂｓ  ２３．３および２５．３の抗癌活性を示す。
【図３４】図３４は、ヌードマウスにおけるＣｏｌｏ  ２０５ヒト結腸癌腫異種移植片に対する、Ａｐｏ２Ｌ．０単独、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単独、および種々の組合せでのそれらについてのメジアン腫瘍成長およびカプラン−メイアープロットを示す。
【図３５】図３５および３６は、無胸腺ヌードマウス異種移植片モデルにおける、ＳＫＭＥＳ−１ヒト非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）細胞に対する、Ａｐｏ２Ｌ．０単独、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単独、および種々に組み合わせたそれらに対するメジアン腫瘍成長およびカプラン−メイアープロットを示す。
【図３６】図３５および３６は、無胸腺ヌードマウス異種移植片モデルにおける、ＳＫＭＥＳ−１ヒト非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）細胞に対する、Ａｐｏ２Ｌ．０単独、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単独、および種々に組み合わせたそれらに対するメジアン腫瘍成長およびカプラン−メイアープロットを示す。
【図３７】図３７は、ヒトＣｏｌｏ  ２０５結腸癌腫異種移植片モデルにおける、Ａｐｏ２Ｌ．０単独、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単独、および種々に組み合わせたそれらについてのメジアン腫瘍成長およびカプラン−メイアープロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
Ｉ．定義
用語「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ」および「ＴＲＡＩＬ」は、本明細書中においては、相互交換的に、図１に示されたアミノ酸配列（配列番号：１）の包括的にアミノ酸残基１１４ないし２８１、包括的に残基９５ないし２８１、包括的に残基９２ないし２８１、包括的に残基９１ないし２８１、包括的に残基４１ないし２８１、包括的に残基３９ないし２８１、包括的に残基１５ないし２８１、または包括的に残基１ないし２８１を含むポリペプチド配列、ならびに前記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入および／または置換変種をいうように用いる。１つの具体例において、該ポリペプチド配列は図１の残基１１４ないし２８１を含む（配列番号：１）。所望により、該ポリペプチド配列は図１の残基９２ないし２８１または残基９１ないし２８１を含む（配列番号：１）。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは図１に示された天然ヌクレオチド配列（配列番号：２）によってコードされ得る。所望により、残基Ｐｒｏ１１９をコードするコドン（図１；配列番号：２）は「ＣＣＴ」または「ＣＣＧ」であり得る。所望により、該断片または変種は生物学的に活性であって、前記配列のいずれか１つに対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％配列同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。該定義は、その天然アミノ酸の少なくとも１つがアラニン残基のようなもう１つのアミノ酸によって置換されたＡｐｏ−２リガンドの置換変種を含む。また、該定義は、Ａｐｏ−２リガンド源から単離された、あるいは組換えおよび／または合成方法によって調製された天然配列Ａｐｏ−２リガンドも含む。本発明のＡｐｏ−２リガンドは、１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ  ９７／０１６３３、１９９７年７月１７日に公開されたＷＯ  ９７／２５４２８、１９９９年７月２２日に公開されたＷＯ  ９９／３６５３５、２００１年１月４日に公開されたＷＯ  ０１／００８３２、２００２年２月７日に公開されたＷＯ  ０２／０９７５５、２０００年１２月１４日に公開されたＷＯ  ００／７５１９１、および２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，９４５号に開示されたＡｐｏ−２リガンドまたはＴＲＡＩＬをいうポリペプチドを含む。該用語は、当該ポリペプチドのモノマー、ダイマー、トリマー、ヘキサマーまたはそれ以上のオリゴマー形態を含むＡｐｏ−２リガンドの形態をいうのに用いられる。Ａｐｏ−２Ｌ配列をいうアミノ酸残基の全てのナンバリングは、特に断りのない限り、図１に従ったナンバリングを用いる（配列番号：１）。
【００６１】
「Ａｐｏ−２リガンド受容体」は、そのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、各々、図２Ａないし２Ｃ（配列番号：４および３）および３Ａないし３Ｃ（配列番号：６および５）に示される「ＤＲ４」および「ＤＲ５」として当該分野で言及される受容体を含む。Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．は「ＤＲ４」といわれるＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを記載している（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３（１９９７）；また、１９９８年７月３０日に公開されたＷＯ  ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ  ９９／３７６８４；２０００年１２月７日に公開されたＷＯ  ００／７３３４９；２００２年８月１３日に発行された米国特許第６，４３３，１４７号；２００２年１０月８日に発行された米国特許第６，４６１，８２３号、および２００２年１月２９日に発行された米国特許第６，３４２，３８３号参照）。Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：８１８−８２１（１９９７）およびＰａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：８１５−８１８（１９９７）はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬについてのもう１つの受容体を記載した（また、１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ  ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日に公開されたＷＯ  ９８／４１６２９参照）。この受容体はＤＲ５といわれる（該受容体はあるいはＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲともいわれてきた；Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：６９３−６９６（１９９７）；Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：５３８６−５３８７（１９９７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：１４１−１４３（１９９７）；１９９８年８月２０日に公開されたＷＯ  ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日に公開されたＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ  ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日に公開されたＷＯ  ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日に公開されたＷＯ  ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日に公開されたＷＯ  ９９／１１７９１；２００２年８月１３日に公開されたＵＳ  ２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日に公開されたＵＳ  ２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日に発行された米国特許第６，３１３，２６９号；２００１年８月２日に公開されたＵＳ  ２００１／００１０９２４；２００３年７月３日に公開されたＵＳ  ２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日に公開されたＵＳ  ２００２／０１６０４４６；２００２年４月２５日に公開されたＵＳ  ２００２／００４８７８５；２００３年５月２７日に発行された米国特許第６，５６９，６４２号；２０００年６月６日に発行された米国特許第６，０７２，０４７号；２００３年１１月４日に発行された米国特許第６，６４２，３５８号）。前記したように、Ａｐｏ−２Ｌに対する他の受容体はＤｃＲ１、ＤｃＲ２、およびＯＰＧを含む（Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；およびＳｉｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）��用語「Ａｐｏ−２Ｌ受容体」は、本明細書中で用いる場合、天然配列受容体および受容体変種を含む。これらの用語は、ヒトを含めた、種々の哺乳動物において発現されるＡｐｏ−２Ｌ受容体を含む。Ａｐｏ−２Ｌ受容体は、種々のヒト組織系において天然で起こるように内因的に発現され得、あるいは組換えまたは合成方法によって発現させることができる。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌ受容体」は、天然に由来するＡｐｏ−２Ｌ受容体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。かくして、天然配列Ａｐｏ−２Ｌ受容体は、ヒトを含めた、いずれかの哺乳動物からの天然に生じるＡｐｏ−２Ｌ受容体のアミノ酸配列を有することができる。そのような天然配列Ａｐｏ−２Ｌ受容体は天然から単離することができ、あるいは組換えまたは合成手段によって生産することができる。用語「天然配列Ａｐｏ−２Ｌ受容体」は、具体的には、受容体の天然に生じる切形されたまたは分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列を含有する可溶性形態）、天然に生じる変種形態（例えば、別の方式でスプライシングされた形態）、および天然に生じる対立遺伝子変種を含む。受容体変種は天然配列Ａｐｏ−２Ｌ受容体の断片または欠失突然変異体を含むことができる。図３Ａないし３Ｃは、１９９８年１１月１９日にＷＯ  ９８／５１７９３において公開されたヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列を示す。ヒトＤＲ５の転写スプライス変種は当該分野で公知である。このＤＲ５スプライス変種は、そのヌクレオチド配列（配列番号：７および８）と共に、図４Ａないし４Ｃに示され、かつ１９９８年８月２０日にＷＯ  ９８／３５９８６において公開されたヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列をコードする。
【００６２】
「死滅受容体抗体」は、本明細書中においては、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーにおける受容体に向けられ、かつアポトーシスをシグナリングすることができる死滅ドメインを含有する抗体または複数抗体を一般にはいうように用いられ、そのような抗体はＤＲ５抗体およびＤＲ４抗体を含む。
【００６３】
「ＤＲ５受容体抗体」、「ＤＲ５抗体」または「抗ＤＲ５抗体」は、ＤＲ５受容体の少なくとも１つの形態に結合する抗体、またはその細胞外ドメインをいうように広い意味で用いられる。所望により、ＤＲ５抗体は異種配列または分子に融合または連結される。好ましくは、異種配列は抗体がより高次のまたはオリゴマーの複合体を形成するのを可能とし、またはそれを助ける。所望により、ＤＲ５抗体はＤＲ５受容体に結合するが、いずれかのさらなるＡｐｏ−２Ｌ受容体（例えば、ＤＲ４、ＤｃＲ１、またはＤｃＲ２）に結合せず、またはそれと交差反応しない。所望により、該抗体はＤＲ５シグナリング活性のアゴニストである。用語「抗ＤＲ５抗体」は、文法学的に同等には具体的に、限定されるものではないが、例えば、Ａｐｏｍａｂｓ  １．１、２．１、３．１、４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３，５．３、６．３、７．３、８．３および９．３、好ましくはＡｐｏｍａｂ  ７．３のような表１１および１２にリストされた「Ａｐｏｍａｂ」抗体を含めた、実施例に記載された抗体を含む。
【００６４】
所望により、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて測定して、約０．１ｎＭないし約２０ｍＭの濃度範囲にてＤＲ５受容体に結合する。所望により、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて測定して、約０．６ｎＭないし約１８ｍＭのＩＣ５０値を呈する。
【００６５】
「ＤＲ４受容体抗体」、「ＤＲ４抗体」または「抗ＤＲ４抗体」は、ＤＲ４受容体の少なくとも１つの形態、またはその細胞外ドメインに結合する抗体をいうように広い意味で用いられる。所望により、ＤＲ４抗体は異種配列または分子に融合または連結される。好ましくは、異種配列は抗体がより高次のまたはオリゴマーの複合体を形成するのを可能とし、またはそれを助ける。所望により、ＤＲ４抗体はＤＲ４受容体に結合するが、いずれかのさらなるＡｐｏ−２Ｌ受容体（例えば、ＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２）に結合せず、またはそれと交差反応しない。所望により、該抗体はＤＲ４シグナリング活性のアゴニストである。
【００６６】
所望により、ＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて測定して、約０．１ｎＭないし約２０ｍＭの濃度範囲にてＤＲ４受容体に結合する。所望により、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて測定して、約０．６ｎＭないし約１８ｍＭのＩＣ５０値を呈する。
【００６７】
用語「アゴニスト」は、最も広い意味で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４またはＤＲ５の１以上の生物学的活性をイン・ビトロ、イン・サイチュウまたはイン・ビボにて部分的にまたは十分に増強し、刺激しまたは活性化するいずれの分子も含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをＤＲ４またはＤＲ５に結合させるそのような生物学的活性の例はアポトーシス、ならびに文献にさらに報告されたものを含む。アゴニストは直接的または間接的様式で機能することができる。例えば、アゴニストは、受容体の活性化またはシグナル変換を起こす、ＤＲ４またはＤＲ５へのその直接的結合の結果として、ＤＲ４またはＤＲ５の１以上の生物学的活性をイン・ビトロ、イン・サイチュウ、またはイン・ビボで部分的にまたは十分に増強し、刺激しまたは活性化するように機能することができる。該アゴニストが、ＤＲ４またはＤＲ５の活性化またはシグナル変換を次いで引き起こす、例えば、もう１つのエフェクター分子を刺激する結果として、ＤＲ４またはＤＲ５の１以上の生物学的活性をイン・ビトロ、イン・サイチュまたはイン・ビボで部分的にまたは十分に増強し、刺激しまたは活性化するように間接的に機能することもできる。アゴニストは、ＤＲ４またはＤＲ５の活性化または活性を増強または増大させるよう間接的に機能するエンハンサー分子として作用することができると考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物において内因性Ａｐｏ−２Ｌの活性を増強させることができる。これは、例えば、ＤＲ４またはＤＲ５を予め複合体化することによって、あるいは（Ａｐｏ−２ＬおよびＤＲ４またはＤＲ５の間で形成される天然複合体を安定化させるような）各リガンドとＤＲ４またはＤＲ５受容体との複合体を安定化させることによって達成することができよう。
【００６８】
用語「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」とは、膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないリガンドまたは受容体の形態をいう。所望により、可溶性ＥＣＤは１％未満のそのような膜貫通および細胞質ドメインを有し、好ましくは、０．５％未満のそのようなドメインを有する。
【００６９】
用語「タグドエピトープ」は、本明細書中で用いる場合、Ａｐｏ−２リガンドまたはＤＲ５受容体、あるいはその部分、あるいは「タグポリペプチド」に融合した、そのようなリガンドまたは受容体に結合する抗体のような蛋白質を含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作成することができるエピトープを供するのに十分な残基を有するが、それがリガンドまたは受容体の活性に干渉しないように十分に短い。タグポリペプチドは、好ましくは、該抗体が他のエピトープと本質的に交差反応しないようにかなりユニークである。適当なタグポリペプチドは、一般には、少なくとも６つのアミノ酸残基、および通常、約８ないし約５０アミノ酸の間の残基（好ましくは、約１０ないし約２０の間の残基）を有する。
【００７０】
「単離された」は、本明細書中で開示される種々の蛋白質を記載するのに用いる場合、天然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収された蛋白質を意味する。その天然環境の汚染成分は、典型的には、蛋白質に対する診断または治療的使用に干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、該蛋白質は、（１）スピニングカップセケネーターの使用によって、Ｎ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルー、好ましくは銀染色を用いて非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで精製されるであろう。単離された蛋白質はイン・サイチュにて組換え細胞内の蛋白質を含む。というのは、Ａｐｏ−２リガンド天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないだろうからである。しかしながら、通常、単離された蛋白質は少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００７１】
本明細書中で同定される配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、当該配列を整列させ、もし必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成したのち、かつ配列同一性の一部としていずれの同類置換も考慮せずに、比較されるリガンド、受容体または抗体配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、当該分野における技量内のものであって、比較すべき全長配列にわたって最大整列を達成するのに必要な帰属アルゴリズムを含めた、整列を測定するための適当なパラメーターを決定することができる種々の方法で達成することができる。ここでの目的では、パーセントアミノ酸同一性値は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、かつそのソースコードが、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録された、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ２０５５９にユーザードキュメンテーションに提出された配列比較コンピュータープログラム、ＡＬＩＧＮ−２を用いて得ることができる。該ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを通じて公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。次いで、パーセントアミノ酸配列同一性をより長い配列に対して計算する。従って、もしより短い配列がより長い配列に十分に含まれたとしても、該配列同一性は１００％未満となるであろう。
【００７２】
用語「対照配列」とは、特定の宿主生物における操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適している対照配列は、例えば、プロモーター、所望により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００７３】
核酸は、それがもう１つの核酸配列との機能的関係におかれる場合に「操作可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、もしそれが当該ポリペプチドの分泌に参画するプレ蛋白質として発現されるならば、ポリペプチドに対するＤＮＡに操作可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーは、もしそれが当該配列の転写に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結しており；あるいはリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするように位置していれば、コーディング配列に操作可能に連結している。一般に、「操作可能に連結している」は、連結させるべきＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合に連続しており、かつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要は無い。連結は、便宜な制限部位における連結によって達成される。もしそのような部位が存在しなければ、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用的なプラクティスに従って用いる。
【００７４】
用語「ポリオール」とは、本明細書中で用いる場合、多価アルコール化合物を広くいう。ポリオールはいずれかの水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーとすることができ、例えば、直鎖または分岐鎖を有することができる。好ましいポリオールは、１および４の間の炭素を有するアルキル基のような、化学基で、１以上のヒドロケシル位置において置換されたものを含む。典型的には、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら、当業者であれば、ＰＥＧについて本明細書中において記載されたコンジュゲーションのための技術を用い、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレンーポリプロピレングリコールコポリマーのような他のポリオールを使用できることを認識するであろう。該ポリオールは当該分野ではよく知られており、Ｎｅｋｔａｒ（登録商標）Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎのような商業的に入手可能な源からのように、公に入手可能である。
【００７５】
用語「コンジュゲート」は、一緒に接合されまたは連結した、を意味するように、その最も広い定義に従ってここでは用いられる。分子は、それらがもし接合されれば作動し、または操作される場合に「コンジュゲート」されている
ハイブリダイゼーション反応の「ストリジェンシー」は当業者によって容易に決定でき、一般には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的な計算である。一般に、より長いプローブは適当なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、他方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般には、相補的ストランドがそれらの融解温度未満の環境で存在する場合に再度アニールする変性されたＤＮＡの能力に依存する。プローブおよびハイブリダイズ可能な配列の間の所望の同一性の程度がより高ければ、用いることができる相対的温度はより高くなる。その結果、より高い相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、他方、より低い温度はよりストリンジェントでなくすることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）参照。
【００７６】
本明細書中で定義されるように、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）低いイオン強度および洗浄用の高い温度、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間に、４２℃において、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に、ホルムアミド、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／Ｐｈ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム干渉液を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドのような変性剤を使用する；あるいは（３）５５℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中での４２℃における洗浄、続いての、５５℃におけるＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣよりなる高ストリンジェンシー洗浄と共に、４２℃の、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルトの溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用するものによって確認される。
【００７７】
「中程度にストリンジェントな条件」はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されているように確認され、それは前記したものよりもよりストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６），５×デンハルトの溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション、続いての、約３７ないし５０℃における１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者であれば、必要であれば、温度、イオン強度等をどのようにして調整して、プローブの長さなどのような因子を収容するかを認識するであろう。
【００７８】
用語「アミノ酸」および「複数アミノ酸」とは、すべて、天然に生じるＬ−アルファ−アミノ酸をいう。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを含むことを意味する。該アミノ酸は一文字または三文字表示いずれかによって確認される：
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸          Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  スレオニン              Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン                  Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸            Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン                Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン                Ｌｙｓ  Ｋ  リシン
Ａｌａ  Ａ  アラニン                Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン              Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン                  Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン              Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
図面中、ある種の他の一文字または三文字表示を使用して、配列中の与えられた位置における２以上のアミノ酸またはヌクレオチドをいい、それを確認することができる。
【００７９】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、単一抗ＤＲ５モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和またはブロッキング抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を持つ抗ＤＲ５抗体をカバーする。本明細書中で用いる「抗体」は、本明細書中で記載する所望のアゴニストまたはアンタゴニスト特性のいずれかを呈する限り、無傷免疫グロブリンまたは抗体分子、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（すなわち、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二特異的抗体）および（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ´）２またはＦｖのような）免疫グロブリン断片を含む。
【００８０】
抗体は、典型的には、特異的抗原に対する結合特異性を呈する蛋白質またはポリペプチドである。天然抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロテトラマー糖蛋白質である。典型的には、各軽鎖は１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結しており、他方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖は規則的に間隔が設けられた鎖内ジスルフィドブリッジも有する。各重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）を一端に続いて、多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一端の（ＶＬ）において可変ドメイン、およびその他端において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列し、および軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は軽鎖および重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている｛Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，  １８６：６５１−６６３（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４５９２−４５９６（１９８５）｝。いずれの脊椎動物種からの抗体の軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパーおよびラムダとよばれる２つの明瞭に区別されるタイプのうちの１つに帰属させることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンは異なるクラスに帰属させることができる。免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは更にサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。
【００８１】
「抗体断片」は無傷抗体の部分、一般には、無傷抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片、ダイアボディー、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【００８２】
用語「可変」は、本明細書中においては、抗体の中で配列が異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性で用いる、可変ドメインのある部分を記載するのに用いる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインを通じて通常は均等に分布していない。それは、典型的には、軽鎖および重鎖可変ドメイン双方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域とよばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、β−シート構造の部分を連結する、ある場合にはそれを形成するループを形成する、３つのＣＤＲによって連結された、β―シート立体配置をかなり採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲはＦＲ領域によって近隣に一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する｛Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）参照｝。定常ドメインは抗体を抗原に結合させるにおいて直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の参画のような種々のエフェクター機能を呈する。
【００８３】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で用いるように、本質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在するかもしれない可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む、慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。
【００８４】
モノクローナル抗体は、本明細書中においては、起源の種、または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの表示に関わらず、定常ドメインを持つ抗ＤＲ５抗体、または重鎖と共に軽鎖、またはもう１つの種からの鎖と共に１つの種からの鎖を含む抗ＤＲ５抗体（例えば、「ヒト化」抗体）の可変（超可変を含む）ドメインをスプライシングすることによって生じたキメラ、ハイブリッドおよび組換え抗体、または異種蛋白質との融合、ならびに所望の生物学的活性または特性を呈する限り、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２およびＦｖ）を含む。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）参照。
【００８５】
かくして、修飾語「モノクローナル」は、抗体の本質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成することができ、あるいは米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたような組換えＤＮＡ方法によって作成することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生じさせたファージライブラリーから単離することもできる。
【００８６】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２または抗体の他の抗原―結合サブ配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、受容体抗体、あるいは輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列において見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに磨き、それを最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの本質的に全てを含み、ここに、ＣＤＲ領域の全てまたは本質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域の全てまたは本質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれも含むであろう。
【００８７】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産された抗体のそれに対応するアミノ酸配列を保有する、および／または当該分野で知られている、または本明細書中で開示されているヒト抗体を作成するための技術のいずれかを用いて作成されているものである。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド、または少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は当該分野で知られた種々の技術を用いて生産することができる。１つの具体例において、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここに、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）  ９５：６１５７−６１６２（１９９８））；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１））。ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作成することができる。挑戦に際して、ヒト抗体の生産が観察され、それは、遺伝子再編成、組立、および抗体レパートリーを含めた、全ての点においてヒトで観察されるのに非常に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号：第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、および以下の科学文献：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。別法として、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を生産するヒトＢリンパ球の不滅化を介して調製することができる（そのようなＢリンパ球は個体から回収することができるか、あるいはイン・ビトロにて免疫化することができる）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７９）（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５，７５０，３７３号参照。
【００８８】
用語「Ｆｃ領域」は、無傷抗体のパパイン消化によって生じさせることができる免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するのに用いられる。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域または変種Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化させることができるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、（ここでは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに従ったナンバリングシステムを用いて）約位置Ｃｙｓ２２６におけるアミノ酸残基から、または約位置Ｐｒｏ２３０から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端までのストレッチと定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般には、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、所望により、ＣＨ４ドメインを含む。
【００８９】
「Ｆｃ領域鎖」とは、本明細書中においては、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００９０】
（「Ｃγ２」ドメインとも言われる）ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約位置２３１におけるアミノ酸残基から約位置３４０におけるアミノ酸残基まで延びる。ＣＨ２ドメインは、もう１つのドメインと密接に対合していない点でユニークである。むしろ、２つのＮ−連結分岐炭水化物鎖が無傷天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。該炭水化物はドメインードメイン対合のための代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのを助けることができると推定されてきた。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，１６１−２０６（１９８５）。ＣＨ２ドメインは、本明細書中においては、天然配列ＣＨ２ドメインまたは変種ＣＨ２ドメインであってよい。
【００９１】
「ＣＨ３ドメイン」は、残基Ｃ−末端からＦｃ領域中のＣＨ２ドメインのストレッチを含む（すなわち、ＩｇＧの約位置３４１におけるアミノ酸残基から約位置４４７におけるアミノ酸残基）。ＣＨ３領域は、本明細書中においては、天然配列ＣＨ３ドメインまたは変種ＣＨ３ドメインであってよい（例えば、その１つの鎖における導入された「プロトロベランス」、およびその他の鎖中の対応する導入された「キャビティ」を持つＣＨ３ドメイン；米国特許第５，８２１，３３３号参照）。そのような変種ＣＨ３ドメインを用いて、本明細書中に記載された多特異的（例えば、二特異的）抗体を作成することができる。
【００９２】
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までのストレッチングと定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する第一および最後のシステイン残基を同一の位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。ヒンジ領域は、本明細書中においては、天然配列ヒンジ領域または変種ヒンジ領域であってよい。変種ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、一般には、ポリペプチド鎖当たり少なくとも１つのシステイン残基を保有し、従って、変種ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は２つの鎖の間でジスルフィド結合を形成することができる。好ましいヒンジ領域は、本明細書中においては、天然配列ヒトヒンジ領域、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００９３】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」はＣ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒体細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含む。そのようなエフェクター機能は、一般には、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせるべきＦｃ領域を必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当該分野で知られた種々のアッセイを用いて評価することができる。
【００９４】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。「変種Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のそれとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変種Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と、または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域における、または親ポリペプチドのＦｃ領域における、約１ないし約１０アミノ酸置換、好ましくは、約１ないし約５アミノ酸置換を有する。変種Ｆｃ領域は、本明細書中においては、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域に対して、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％配列同一性を保有し、最も好ましくはそれに対して少なくとも約９０％配列同一性、より好ましくはそれに対して少なくとも約９５％配列同一性を保有する。
【００９５】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応をいう。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞はＦｃ（ＲＩＩＩ）のみを発現し、他方、単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩおよびＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。注目する分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなイン・ビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別法として、あるいは加えて、注目する分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたもののような動物モデルにおいてイン・ビボで評価することができる。
【００９６】
「ヒトエフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、該細胞は少なくともＦｃ（ＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含む；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞はその天然源から、例えば、本明細書中に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００９７】
用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するのに用いる。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、対立遺伝子変種およびこれらの受容体のスプライスされた形態を含めたＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ，およびＦｃ（ＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。Ｆｃ（ＲＩＩ受容体はＦｃ（ＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃ（ＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、その細胞質ドメインにおいて主として異なる同様なアミノ酸配列を有する。活性化受容体Ｆｃ（ＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体Ｆｃ（ＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：２０３−２３４（１９９７）でレビューされている）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１（１９９５）にレビューされている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲは本明細書中における用語「ＦｃＲ」に含まれる。また、該用語は、母性ＩｇＧを胎児に移動させることを担う新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７（１９７６）：およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９（１９９４））。
【００９８】
「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的の溶解をいう。補体活性化経路は、補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００９９】
「親和性成熟」抗体は、当該改変を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすその１以上のＣＤＲにおける１以上の改変を持つものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモラーまたはピコモラーでさえの親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は当該分野で知られた手法によって生産される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載する。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）：Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
【０１００】
例えば、「抗体の免疫特異的結合」において用いられる用語「免疫特異的」とは、抗体の抗原―組合せ部位およびその抗体によって認識される特異的抗原の間で起こる抗原特異的結合相互反応をいう。
【０１０１】
ここでの目的での「生物学的に活性な」および「所望の生物学的活性」は、例えば、イン・ビボまたはエクス・ビボにおける哺乳動物細胞の少なくとも１つのタイプにおける（アゴニストまたは刺激様式での、あるいはアンタゴニストまたはブロッキング様式での）アポトーシスＡｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）への結合、または、カスパーゼ３、カスパーゼ８．カスパーゼ１０またはＦＡＤＤのような細胞内シグナリング経路における１以上の分子の活性化の変調を含めた、ＤＲ５活性またはＤＲ５活性化を変調する能力を有することを意味する。そのような細胞内分子の活性化を測定するためのアッセイは当該分野で知られている。例えば、Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：７７９５−７７９８（１９９５）；Ｐｅｔｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，７：７５９−７６０（２０００）：Ｎａｇａｔａ  Ｃｅｌｌ，８８：３５５−３６５（１９９８）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３０５−１３０８（１９９９）参照。
【０１０２】
用語「アゴニスト」および「アゴニスト的」は、本明細書中で用いる場合、ＤＲ５生物的活性または活性化を直接的にまたは間接的に本質的に誘導し、促進し、または増強することができる分子をいうのに、またはそれを記載するのに用いられる。所望により、「アゴニストＤＲ５抗体」は、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）として知られたＤＲ５に対するリガンドに匹敵する活性を有する、あるいはカスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ１０またはＦＡＤＤの活性化を含むことができる１以上の細胞内シグナリング経路の活性化をもたらすＤＲ５受容体を活性化することができる抗体である。
【０１０３】
用語「アンタゴニスト」および「アンタゴニスト的」は、本明細書中で用いる場合、ＤＲ５生物学的活性またはＤＲ５活性化を直接的にまたは間接的に本質的に逆作用し、低下させ、または阻害することができる分子をいうのに、またはそれを記載するのに用いられる。所望により、アンタゴニストは、ＤＲ５活性化に由来する生物学的活性、あるいはＤＲ５、およびＡｐｏ−２リガンドのようなそのリガンドの間の複合体の形成を中和する分子である。
【０１０４】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス活性」は、広い意味で用いられ、細胞質の凝縮、原形質膜微小絨毛の喪失、核の分離、染色体ＤＮＡの分解、またはミトコンドリア機能の喪失を含めた、１以上の特徴的な細胞の変化を典型的には伴う哺乳動物における細胞死滅の秩序立ったまたは制御された形態をいう。この活性は、例えば、その全てが公知である、細胞生存性アッセイ、アネキシンＶ結合アッセイ、ＰＡＲＰアッセイ、ＦＡＣＳ分析またはＤＮＡ電気泳動によって決定し、測定することができる。所望により、アポトーシス活性はアネキシンＶまたはＰＡＲＰアッセイによって決定する。
【０１０５】
用語「癌」、「癌性」および「悪性」とは、制御されていない細胞成長によって典型的には特徴づけられる哺乳動物における生理学的な状態をいい、またはそれを記載する。癌の例は、限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、神経膠腫、肉腫、（多発性ミエローマのような）ミエローマおよび白血病を含めた癌腫を含む。そのような癌のより特別な例は扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌腫、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚癌、神経膠腫、卵巣癌、肝癌腫および肝臓腫のような肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓細胞癌腫およびウイルム腫瘍のような腎臓癌、基底細胞癌腫、メラノーマ、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、および種々のタイプの頭部および頸部癌を含む。
【０１０６】
用語「免疫関連病」は、哺乳動物の免疫系の成分が哺乳動物における罹患を引き起こし、媒介し、またはそうでなければそれに寄与する病気を意味する。また、免疫応答の刺激または介入が病気の進行に対して軽減効果を有する病気も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症病、非免疫媒介炎症病、感染症、および免疫不全病が含まれる。そのいくつかは、本発明に従って治療することができる免疫またはＴ細胞媒介である。免疫関連および炎症病の例は全身エリテマトーテス、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節傷害、全身硬化症（強皮症）、特発性炎症筋肉傷害（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身血管炎、サルコイドーシス、自己免疫溶血性貧血（免疫汎血球減少症、発作性夜行性ヘモグロビン尿症）、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グラベ病、橋本甲状線炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介腎臓病（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発性硬化症のような中枢神経系および末梢神経系の脱髄病、特発性脱髄多発性神経障害またはギュラン−バレー症候群および慢性炎症性脱髄多発性神経障害、感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎および他の非肝臓向性ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆管硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎のような肝胆管病、炎症性腸疾患（潰瘍性結腸炎：クローン病）のような炎症性かつ嚢胞性肺病、グルテン過敏性腸障害、およびホイップル病、水胞性皮膚病、多形性紅斑および接触性皮膚炎、乾癬を含めた自己免疫または免疫媒介皮膚病、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏および蕁麻疹のようなアレルギー性疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏肺炎のような肺の免疫学的病気、移植片拒絶および移植片―対―宿主病を含めた移植関連病を含む。感染症はＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、およびＥ型肝炎、細菌感染、真菌感染、原生動物感染および寄生虫感染を含む。
【０１０７】
「自己免疫疾患」は、本明細書中においては、広い一般的な意味で用いて、正常なまたは健康な組織の破壊が、自分の組織構成要素に対する個々の哺乳動物の液性または細胞性免疫応答から生起する哺乳動物における障害または疾患をいう。その例は、限定されるものではないが、エリテマトーテス、甲状腺炎、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む。
【０１０８】
「成長阻害剤」とは、本明細書中で用いる場合、細胞の成長をイン・ビトロおよび／またはイン・ビボで阻害する化合物または組成物をいう。かくして、成長阻害剤は、Ｓ期にある細胞のパーセンテージを有意に低下させるものであってよい。成長阻害剤の例は、Ｇ１阻止およびＭ−期阻止を誘導する剤のような、（Ｓ期以外の場所において）細胞周期の進行をブロックする剤を含む。古典的なＭ−期ブロッカーはビンカス（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンのようなトポＩＩ阻害剤を含む。Ｇ１を阻止する剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フロロウラシルおよびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ−期阻止に波及する。更なる情報は、「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」なる表題の、Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）により、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １、特に、１３ページに見出すことができる。
【０１０９】
本出願で用いる用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して癌細胞に対して細胞傷害性が低く、より活性な親形態へ酵素的に活性化または変換できる医薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＤ．）ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照。本発明のプロドラッグは限定されるものではないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオフォスフェート−含有プロドラッグ、スルフェート−含有プロドラッグ、ペプチド−含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸−修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベーターラクタムー含有プロドラッグ、所望により置換されていてもよいフェノキシアセタミド−含有プロドラッグまたは所望により置換されていてもよいフェニルアセタミド含有プロドラッグ、より活性な細胞傷害性遊離薬物に変換することができる５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウルジンンプロドラッグを含む。本発明で用いるためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物の例は、限定されるものではないが、後に記載する化学療法剤を含む。
【０１１０】
本発明で用いる用語「細胞傷害性剤」とは、細胞の機能を阻害し、または妨げおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。該用語は放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、およびその断片および／または変種を含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子トキシンまたは酵素的に活性なトキシンのようなトキシンを含むことを意図する。
【０１１１】
「化学療法剤」は、癌のような疾患の治療でいうような化学的化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）のようなアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボクオネ、メツレドパンおよびウレドパンのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミダイトおよびトリメチロールメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；（合成アナログトポテカンを含めた）カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含めた）ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含めた）ドゥオカルミシンン；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、チョロフォスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタニンオキサイド塩酸、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラミムスチンのようなニトロソ尿素；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシン（１Ｉおよびカリケアミシン２Ｉ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．ＥＤ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）；ジメミシンＡを含めたジメミシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連クロモプロテインエネジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノンマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシンン、イダルビシン、マルセロマイシンン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポロフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシタビン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフ��リジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵのようなピリミジンアナログ；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗アドレナル；フロリン酸のような葉酸補充物；アセグラトン；アルドフォスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アマサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エディプチニウム酢酸；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レニチナン；ロニダミン；メイタンシンおよびアンサミトシンのようなメイタンシノイド；マイトグアゾン；マイトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；マイトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルリン；ナベルリン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；および前記のいずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体を含む。また、この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレニフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲンのような腫瘍に対するホルモン作用を調節し、または阻害するように働く抗ホルモン剤；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロイドおよびゲセレニンのような抗アンドロゲン；および前記のいずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体が含まれる。
【０１１２】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとしてもう１つの細胞に作用する１つの細胞集団によって放出された蛋白質についての上位概念的用語である。そのようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；胚胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）のような糖蛋白質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長ホルモン；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベーター；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−アルファのような神経成長因子；血小板−成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータおよび−ガンマのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ―８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファ、またはＴＮＦ−ベーターのような腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子が含まれる。本発明中で用いるように、用語サイトカインは、天然源からの、または組換え細胞培養からの蛋白質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等体を含む。
【０１１３】
本明細書中で用いられる用語「治療する」、「治療」および「療法」とは、治癒的療法、予防的療法、および予防療法をいう。
【０１１４】
用語「治療上有効量」とは、哺乳動物において病気または障害を治療するのに有効な薬物の量をいう。癌の場合には、治療上有効量の薬物は癌細胞の数を低下させることができ；腫瘍のサイズを低下させることができ；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害することができ（すなわち、ある程度遅らせることができ、好ましくは停止させることができ）；腫瘍転移を阻害することができ（すなわち、ある程度遅らせることができ、好ましくは停止させることができ）；ある程度腫瘍成長を阻害することができ；および／または障害に関連する兆候の１以上をある程度軽減することができる。薬物が存在する癌細胞の増殖を妨げ、および／または該細胞を死滅させることができる程度に、それは細胞増殖抑制および／または細胞傷害性でありえる。癌療法では、イン・ビボでの有効性は、例えば、腫瘍負荷または容量、病気進行までの時間（ＴＴＰ）を評価し、および／または応答速度（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
【０１１５】
本明細書中で用いる用語「哺乳動物」とは、ヒト、高等霊長類、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを含めた哺乳動物として分類されるいずれの哺乳動物をもいう。本発明の好ましい具体例において、哺乳動物はヒトである。
【０１１６】
用語「目的的応答」は、固体腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（３）：２０５−２１６（２０００））を用いて測定して対象の治療に対する完全なまたは部分的応答と定義される。
【０１１７】
用語「応答の持続」は、本明細書中においては、最初の完全なまたは部分的な応答から、病気進行または死滅の時間までの時間をいうのに用いる。
【０１１８】
用語「進行−フリー生存」は、本明細書中においては、最初に起こる限りは、治療の初日から病気進行または死滅までの時間をいうのに用いる。
【０１１９】
用語「完全な退行（ＣＲ）」は、腫瘍容量が３つの連続測定について≦１３．５ｍｍ３であることを示すのに用いる。
【０１２０】
用語「部分的退行（ＰＲ）」は、腫瘍容量が３連続測定についてその１日の容量の≦５０％であり、これらの測定の１以上について≧１３．５ｍｍ３であることを示す。
【０１２１】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．ＤＲ５抗体
本発明の１つの具体例において、ＤＲ５抗体が提供される。例となる抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二特異的、およびホモコンジュゲート抗体を含む。これらの抗体はアゴニスト、アンタゴニストまたはブロッキング抗体でありえる。
【０１２２】
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含むことができる。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に知られている。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤および、所望であれば、アジュバントの１以上の注射によって哺乳動物において生起させることができる。典型的には、免疫化剤および／またはアジュバントは、複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫化剤はＤＲ５ポリペプチド（またはＤＲ５
ＥＣＤ）またはその融合蛋白質を含むことができる。免疫化すべき哺乳動物において免疫原性であることが知られている蛋白質へ免疫化剤をコンジュゲートするのは有用であろう。そのような免疫原性蛋白質の例は、限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログログリン、および大豆トリプシン阻害剤を含む。使用することができるアジュバントの例はフロイントの完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。免疫化プロトコルは、過度な実験なくして当業者によって選択され得る。次いで、哺乳動物から採血し、血清をＤＲ５抗体力価についてアッセイすることができる。所望であれば、抗体力価が増大し、またはプラトーとなるまで哺乳動物にブースター注射することができる。
【０１２３】
２．モノクローナル抗体
本発明の抗体は、別法として、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製することができる。ハイブリドーマー方法においては、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫化剤で免疫化して、リンパ球を誘導し、これは、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を生産し、または生産することができる。別法として、リンパ球はイン・ビトロにて免疫化することができる。
【０１２４】
免疫化剤は、典型的には、ＤＲ５ポリペプチド（またはＤＲ５  ＥＣＤ）、あるいはＤＲ５  ＥＣＤ−ＩｇＧ融合蛋白質のようなその融合蛋白質を含む。免疫化剤は、別法として、Ａｐｏ−２ＬをＤＲ−５に結合させるのに参画する１以上のアミノ酸を有するＤＲ−５の断片または部分を含むことができる。好ましい具体例において、免疫化剤はＩｇＧ配列に融合したＤＲ５の細胞外ドメイン配列を含む。
【０１２５】
一般には、ヒト起源の細胞が望まれるならば、いずれかの末梢血液リンパ球（「ＰＢＬ」）が用いられ、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれるならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球を不滅化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不滅化細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない不滅化細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養基中で培養することができる。例えば、もし親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如するならば、ハイブリドーマに対する培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテニン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、その物質はＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を妨げる。
【０１２６】
好ましい不滅化細胞は、効果的に融合し、選択された抗体−生産細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不滅化細胞系は、ネズミミエローマ系であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることができる。そのようなネズミミエローマ細胞系の例はＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）  ｐｐ．５１−６３］。
【０１２７】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養基を、次いで、ＤＲ５に対して向けられるモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）のようなイン・ビトロ結合アッセイによって測定される。そのような技術およびアッセイは当該分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定することができる。
【０１２８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈方法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法「ＧＯＤＩＮＧ，ｓｕｐｒａ」によって増殖させることができる。この目的での適当な培養基は、例えば、ダルベッコの修飾イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。別法として、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物において腹水液としてイン・ビボで増殖させることができる。
【０１２９】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような慣用的な免疫グロブリン精製手法によって、培養基または腹水液から単離し、または精製することができる。
【０１３０】
また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離し、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい源として供される。一端単離されれば、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、免疫グロブリン蛋白質を生産しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、またはミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。該ＤＮＡは、例えば、相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列で置き換えることによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１（１９８４））、あるいは非免疫風呂グロブリンインポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合させることによって修飾することもできる。そのようにして、ここに、抗ＤＲ５モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１３１】
典型的には、そのような非−免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体の定常ドメインに代えて置換され、あるいはそれらは、本発明の抗体の１つの抗原−結合部位の可変ドメインに代えて置換して、ＤＲ５に対する特異性を有する１つの抗原―結合部位および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原−結合部位を含むキメラ二価抗体を得る。
【０１３２】
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤に関係するものを含めた合成蛋白質化学における公知の方法を用いてイン・ビトロにて調製することもできる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用い、あるいはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的での適当な試薬の例はイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。
【０１３３】
単一鎖Ｆｖ断片もまた、Ｉｌｉａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４３７−４４１（１９９７）に記載されているように生産することができる。種々のリンカーを用いるそのような単一鎖断片のカップリングはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３（１９９７）に記載されている。抗体の組換え生産および操作のための種々の技術は当該分野でよく知られている。当業者によって典型的には利用されるそのような技術の例示的な例は後により詳細に記載する。
【０１３４】
（ｉ）ヒト化抗体
一般に、ヒト化抗体は、非−ヒト源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非−ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基と言われ、これは典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って行うことができる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］。
【０１３５】
従って、そのような「ヒト化抗体」はキメラ抗体であり、ここに、無傷ヒト可変ドメインの実質的な未満が非−ヒト種からの対応する配列によって置換されている。現実には、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト抗体であり、そこでは、いくらかのＣＤＲ残基および、おそらくは、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における同様な部位からの残基によって置換されている。
【０１３６】
抗体は、抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的特性を保持しつつヒト化されるのが重要である。この目標を達成するには、好ましい方法に従い、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常は入手可能であり、当業者が精通している。コンピュータプログラムが利用可能であり、これは選択された候補免疫グロブリン配列のおそらくは三次元の立体配座構造を示し、それを呈する。これらの提示の洞察は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基を選択し、コンセンサスおよび輸入配列から組み合わせることができ、従って、標的抗原に対する増加した親和性のような所望の抗体の特徴が達成される。一般に、ＣＤＲ残基が抗原結合への影響に直接的にかつほとんど本質的に関与する。
【０１３７】
（ｉｉ）ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトへテロミエローマ細胞系は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）、およびＢｒｏｄｅｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）によって記載されている。
【０１３８】
今日、内因性免疫グロブリン生産の不存在下で免疫化に際して、ヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産するのが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産が完全に阻害されると記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスへのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の結果、抗原挑戦に際してヒト抗体が生産される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，２５５−２５８（１９９３）参照。
【０１３９】
Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６［１９９７］）は、該技術をさらに改良し、「Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩ」と命名されるトランスジェニックマウスの系を創製しており、これは、抗原で挑戦した場合、高い親和性の十分にヒトの抗体を作製する。これは、メガベースのヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の、前記した内因性ＪＨセグメントへの欠失を持つマウスへの生殖系一体化によって達成された。Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩは、ほぼ６６ｖＨ遺伝子、完全なＤＨおよびＪＨ領域および３つの異なる定常領域（μ、Δおよびχ）を含有する１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を保有し、また、３２Ｖκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含有する８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を保有する。これらのマウスで生産された抗体は、遺伝子再編成、組立およびレパートリーを含めた全ての点においてヒトで観察されたものによく似ている。ヒト抗体は、ネズミ遺伝子座における遺伝子再編成を妨げる内因性ＪＨセグメントにおける欠失のため内因性抗体よりも優先的に発現される。
【０１４０】
別法として、ファージ提示技術（ＭｃＣａｆｆｐｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，５５２−５５３［１９９０］）を用いて、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからイン・ビトロにてヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たる被膜蛋白質遺伝子に枠内でクローン化され、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片として提示される。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子も選択される。かくして、ファージはＢ−細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示は種々の様式で行うことができる；それらのレビューについては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，５６４−５７１（１９９３）参照。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源はファージ提示のために用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトーリアルライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己−抗原を含めた）抗原の多様なアレイに対する抗体は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答においては、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する（体細胞過剰突然変異）。導入された変化のいくつかはより高い親和性を付与し、高い親和性の表面免疫グロブリンを呈するＢ細胞は引き続いての抗原挑戦の間に優先的に複製され、分化される。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られた技術を使用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，７７９−７８３［１９９２］）。この方法においては、ファージ提示によって得られた「初代」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を免疫化されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変種のレパートリー（レパートリー）で置き換えることによって改良することができる。この技術は、ｎＭ範囲の親和性を持つ抗体および抗体断片の生産を可能とする。（「マザーオブオールライブラリーズ」としても知られた）非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，２２６５−２２６６（１９９３）によって記載されている。遺伝子シャッフリングを用いて、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもでき、ここに、ヒト抗体は出発げっ歯類抗体と同様な親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも言われるこの方法に従って、ファージ提示技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換え、げっ歯類−ヒトキメラを生じる。抗原に対する選択の結果、機能的抗原−結合部位を回復することができるヒト可変が単離され、すなわち、該エピトープはパートナーの選択を支配する（インプリントする）。該プロセスを反復して残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換える場合、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３参照）。ＣＤＲグラフティングによるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有しない完全にヒトの抗体を提供する。
【０１４１】
後に詳細に記載するように、本発明の抗体は、所望により、モノマー抗体、ダイマー抗体、ならびに抗体の多価形態を含むことができる。当業者であれば、当該分野で知られた技術によって、かつここにＤＲ５抗体を用いてそのようなダイマーまたは多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた当該分野でよく知られている。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般的には、重鎖架橋を妨げるように、Ｆｃ領域中のいずれかの地点において切形される。別法として、関連するシステイン残基をもう１つのアミノ酸残基で置換し、あるいは架橋をさまたげるように欠失させる。
【０１４２】
（ｉｉｉ）二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルの好ましいヒトまたはヒト化抗体である。この場合には、結合特異性の１つはＤＲ５受容体に対するものであり、他の１つはいずれかの他の抗原に対するものであり、好ましくは、もう１つの受容体または受容体サブユニットに対するものである。例えば、ＤＲ５受容体およびもう１つのアポトーシス／シグナリング受容体に特異的に結合する二特異的抗体は本発明の範囲内のものである。
【０１４３】
二特異的抗体を作成する方法は当該分野で公知である。伝統的には、二特異的抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、そこでは、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ
３０５，５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、そのうち１つのみが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じる。通常はアフィニティクロマトグラフィー工程によって成される正しい分子の精製はむしろ煩雑であり、産物の収率は低い。同様の手法が（１９９３年５月１３日に公開された）ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  １０，３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１４４】
異なるより好ましいアプローチに従うと、所望の結合特性を持つ抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。該融合は、好ましくは、ヒンジの少なくとも部分、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。融合の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡおよび、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖を別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。これは、構築で用いる３つのポリペプチド鎖の均等でない比率が最適な収率を生じる場合の具体例において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するにおいて大きな柔軟性を供する。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現の結果高い収率がもたらされる場合、あるいは該比率が特定の重要性がない場合、２つまたは全ての３つのポリペプチド鎖についてのコーディング配列を１つの発現ベクターに挿入するのが可能である。このアプローチの好ましい具体例において、二特異的抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおける（第二の結合特異性を供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この非対称構造は、望まない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二特異的化合物の分離を容易とすることが見出された。というのは、二特異的分子の１つの半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在は分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは１９９４年３月３日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／０４６９０に開示されている。
【０１４５】
二特異的抗体の作成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１，２１０（１９８６）参照。
【０１４６】
（ｉｖ）へテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内のものである。ヘテロコンジュゲート抗体が２つの共有結合された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、望まない細胞へ免疫系を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ  ９１／００３６０およびＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれかの便宜な架橋方法を用いて作成することができる。適当な架橋剤は当該分野で良く知られており、多数の架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１４７】
（ｖ）抗体断片
ある具体例において、（ネズミ、ヒトおよびヒト化抗体、および抗体変種を含めた）抗ＤＲ５抗体は抗体断片である。種々の技術が抗体断片の生産のために開発されている。伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５））。しかしながら、これらの断片は、今日、組換え宿主細胞によって直接的に生産することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片はＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９７））。もう１つの具体例において、Ｆ（ａｂ’）２は、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子の組立を促進する。もう１つのアプローチによると、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体断片の生産のための種々の技術は当業者に明らかであろう。例えば、パパインを用いて分解を行うことができる。パパイン分解の例は１２／２２／９４に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８、および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン分解は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれ、各々が単一抗原結合部位、および残存するＦｃ断片を持つ、２つの同一の抗原結合断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原組合せ部位を有し、依然として、抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【０１４８】
抗体消化で生産されたＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の付加だけ、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、ここでは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担うＦａｂ’の代わりの表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間のヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【０１４９】
（ｖｉ）抗体のアミノ酸配列変種
抗ＤＲ５抗体のアミノ酸配列変種は、抗ＤＲ５抗体へ適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような変種は、例えば、ここに、例としての抗ＤＲ５抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または残基への挿入、および／または残基の置換を含む。欠失、挿入および置換のいずれの組合せも、最終的な構築体に到達するようになされ、但し、最終構築体は所望の特徴を保有するものとする。アミノ酸変化は、グルコシル化部位の数または位置の変化のような、ヒト化または変種抗ＤＲ５抗体の翻訳後プロセスを改変することもできる。
【０１５０】
突然変異誘発のための好ましい位置である抗ＤＲ５抗体のある残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｕｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって記載されているように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここに、標的残基または基は同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、中性または負に荷電されたアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸とＤＲ５抗原との相互作用に影響する。次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置は、置換の位置の部位において、またはそのためにさらなるまたは他の変種を導入することによって精錬される。かくして、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異それ自体の性質は予め決定する必要がない。例えば、与えられた部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニングまたはランダム突然変異を標的コドンまたは領域で行い、発現された抗ＤＲ５抗体変種を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１５１】
アミノ酸配列挿入は、１００以上の残基を含有するポリペプチドへの、１つの残基からの長さの範囲のアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗ＤＲ５抗体、またはエピトープタグに融合した抗体を含む。抗ＤＲ５抗体分子の他の挿入変種は、抗体の血清半減期を増大させる酵素またはポリペプチドまたはポリオールの抗ＤＲ５抗体のＮ−またはＣ−末端への融合を含む。
【０１５２】
もう１つのタイプの変種はアミノ酸置換変種である。これらの変種は、除去された抗ＤＲ５抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基、およびその所定の場所に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発のための最も注目する部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変も考えられる。同類置換は、表１において、「好ましい置換」との見出しの元に示される。もしそのような置換の結果、生物学的活性が変化すれば、表１において「例示的置換」と呼ばれる、あるいはアミノ酸クラスへの参照において後にさらに記載されるより実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
【０１５３】
【化１】
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抗体の生物学的特性における実質的修飾は、（ａ）例えば、シートまたはラセン立体配座としての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持するに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖の特性に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１５４】
非同類置換はもう１つのクラスに代えてのこれらのクラスの１つのメンバーで交換することを含むであろう。
【０１５５】
ヒト化または変種抗ＢＲ５抗体の適当な立体配座を維持するのに関与しないいずれのシステイン残基もまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化的安定性を改良し、異常な架橋を妨げることができる。逆に、システイン結合を抗体に加えて、（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）その安定性を改良することができる。
【０１５６】
特に好ましいタイプの置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる発展のために選択された得られた変種は、それらがそれから生じる親抗体に対して改良された生物学的特性を有するであろう。そのような置換変種を生じさせるための便宜な方法はファージ提示を用いる親和性成熟である。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６ないし７部位）を突然変異させて、各部位における全ての可能なアミノ置換を生じさせる。該生じた抗体変種を、各粒子内にパッキングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合としてフィラメント状ファージ粒子から一価様式で提示される。次いで、ファージ表示変種は、ここに開示したようにそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、あるいは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体およびヒトＤＲ５の間の接触点を同定するのは有益であろう。そのような接触残基および隣接残基は、本発明中で技巧を凝らした技術に従っての置換のための候補である。一旦そのような変種が生じたならば、変種のパネルを本明細書中で記載されたスクリーニングに付し、１以上の関連アッセイにおける優れた特性を持つ抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１５７】
（ｖｉｉ）抗体のグリコシル化変種
抗体をそれらの定常領域における保存された位置でグリコシル化する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８［１９９７］；Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２［１９９７］）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は蛋白質の機能（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８［１９９６］；Ｗｉｔｔｗｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０［１９９０］）、および立体配座に影響し得る糖蛋白質の部分および糖蛋白質の提示された三次元表面の間の分子内相互作用（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，ｓｕｐｒａ；Ｗｙｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６［１９９６］）に影響する。オリゴ糖は、特異的認識構造に基づいて与えられた糖蛋白質をある分子に標的化するように働くこともできる。例えば、無ガラクトシル化ＩｇＧにおいて、オリゴ糖部位はＣＨ２空間から「飛び出し」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基はマンノース結合蛋白質に結合するように利用可能となる（Ｍａｌｈｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２３７−２４３［１９９５］）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で生産されたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトリンパ球のＣＤｗ５２抗原を認識する組換えヒト化ネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体）からのオリゴ糖のグリコペプチダーゼによる除去の結果、補体媒介溶解の完全な減少（ＣＭＣＬ）がもたらされ（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８［１９９６］）、他方、ノイラミニダーゼを用いるシアル酸残基の選択的除去の結果、ＤＭＣＬの喪失がなくなる。抗体のグリコシル化も、抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響することが報告されている。特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、ＧｌｃＮＡｃを二等分する形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼのテトラサイクリン−調節発現を伴うＣＨＯ細胞は改良されたＡＤＣＣ活性を有すると報告されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０［１９９９］）。
【０１５８】
抗体のグリコシル化変種は、抗体のグリコシル化パターンが改変される変種である。改変とは、抗体で見出される１以上の炭水化物部位を欠失することを意味し、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）、グリコシル化の程度等を変化させる。グリコシル化変種は、例えば、抗体をコードする核酸配列中の１以上のグリコシル化部位を除去し、変化させ、および／または加えることによって調製することができる。
【０１５９】
抗体のグリコシル化は典型的にはＮ−結合またはＯ−結合いずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部位の付着をいう。Ｘがプロリンを除いたいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部位の酵素的付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。Ｏ−結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも用いることができる。
【０１６０】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、便宜には、それは（Ｎ−結合グリコシル化部位のための、）前記したトリペプチド配列の１以上を含有するように、アミノ酸配列を改変することによって達成される。改変は、１以上のセリンまたはスレオニン残基の（Ｏ−結合グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への付加、またはそれによる置換によってなすこともできる。
【０１６１】
抗ＤＲ５抗体のアミノ酸配列変種をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、（天然に生じるアミノ酸配列変種の場合には）天然源からの単離、またはオリゴヌクレオチド−媒介（または部位−特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗ＤＲ５抗体のより早く調製された変種または非変種バージョンのカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１６２】
抗体の（グリコシル化パターンを含めた）グリコシル化は、基礎となるヌクレオチド配列を改変することなく改変することもできる。グリコシル化は、抗体を発現するのに用いる宿主細胞に大いに依存する。潜在的治療剤としての、組換え糖蛋白質、例えば、抗体の発現で用いる細胞型は稀には天然細胞であるので、抗体のグリコシル化パターンにおける有意な変異を予測することができる（例えば、Ｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０［１９９７］参照）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え生産の間にグリコシル化に影響する因子は成長の様式、媒体の処方、培養の密度、酸素処理、ｐＨ、精製スキーム等を含む。オリゴ糖生産に関与するある種の酵素の導入または過剰発現を含めた、特定の宿主生物で達成されるグリコシル化パターンを改変するために種々の方法が提案されている（米国特許第５，０４７．３３５号；第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはあるタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を用いて糖蛋白質から酵素的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝子工学により作成することができ、例えば、あるタイプの多糖の処理を欠陥があるものとすることができる。これらおよび同様な技術は当該分野でよく知られている。
【０１６３】
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィー、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖組成分析、系列的酵素消化、および電荷に基づいてオリゴ糖を分離するための高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを含めた、炭水化物分析の慣用的技術によって容易に分析することができる。分析目的のためのオリゴ糖を放出する方法も知られており、限定されるものではないが、（ペプチド−Ｎ−グルコシダーゼＦ／エンド−β−ガラクトシダーゼを用いて通常行われる）酵素処理、主としてＯ−結合構造を放出するために過酷なアルカリ性環境を用いる排除、およびＮ−およびＯ−結合オリゴ糖を共に放出するための無水ヒドラジンを用いる化学的方法を含む。
【０１６４】
（ｖｉｉｉ）例示的な抗体
本明細書中で開示される発明は多数の例示的な具体例を有する。本発明の種々の典型的な具体例を後に記載する。以下の具体例は説明目的のみのために提供し、断じて本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１６５】
後の実施例に記載するように、多数の抗ＤＲ５モノクローナル抗体が同定されている。１つの具体例において、本発明のＤＲ５抗体は、本明細書中で具体的に開示された抗ＤＲ５抗体のいずれかと同一の生物学的特徴を有するであろう。
【０１６６】
用語「生物学的特徴」は、ＤＲ５に特異的に結合する、あるいはＤＲ５活性化（またはＤＲ５−関連活性）をブロックし、誘導し、または増強する能力のような、モノクローナル抗体のイン・ビトロおよび／またはイン・ビボ活性または特性をいうのに用いる。ＤＲ５抗体の特性および活性は後の実施例でさらに記載する。
【０１６７】
所望により、本発明のモノクローナル抗体は、抗体１６Ｅ２、または表１１ないし１３にリストされた抗体のいずれかと同一の生物学的特徴を有し、および／または抗体１６Ｅ２、あるいは表１１ないし１３にリストされた抗体のいずれか、特に、Ａｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３と同一のエピトープに結合するであろう。これは、本明細書中に、および実施例に記載されたような種々のアッセイを行うことによって決定することができる。例えば、モノクローナル抗体が本明細書中で具体的に言及するＤＲ５抗体と同一の特異性を有するか否かを判断するために、後の実施例に記載されたもののような、競合結合アッセイまたはアポトーシス誘導アッセイにおけるその活性を比較することができる。加えて、特定の抗ＤＲ５抗体が結合するエピトープは、ＤＲ５および問題とする抗体の間の複合体の結晶学研究によって決定することができる。
【０１６８】
かくして、Ａｐｏｍａｂ  ７．３のＦａｂ断片およびＤＲ５の細胞外ドメインの間の複合体のＸ線結晶学研究は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３が、ＤＲ５受容体上のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合部位と重複し、しかしそれと異なるＤＲ５エピトープで結合することを示した。
【０１６９】
ヒト、キメラ、ハイブリッド、または組換え抗ＤＲ５抗体（並びに、例えば、本明細書中に記載されたダイアボディーまたはトリアボディー）は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片のような全長重鎖および軽鎖またはその断片、そのような軽鎖または重鎖のモノマーまたはダイマー、そのような重鎖または軽鎖がリンカー分子によって接合された、あるいはなお他のタイプの抗体ドメインと組み合わされたそのような軽鎖または重鎖の可変ドメイン（または超可変ドメイン）を有する単一鎖Ｆｖを有する抗体を含むことができる。
【０１７０】
本明細書中に記載されたＤＲ５抗体は、所望により、１以上の所望の生物学的活性または特性を保有するであろう。そのようなＤＲ５抗体は、限定されるものではないが、キメラ、ヒト化、ヒト、およびアフィニティー成熟抗体を含むことができる。前記したように、ＤＲ５抗体は、種々の技術を用いて構築し、または作成して、これらの所望の活性または特性を達成することができる。１つの具体例において、ＤＲ５抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０６Ｍ−１ないし１０７Ｍ−１の範囲、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１ないし１０１２Ｍ−１の範囲、なおより好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１ないし１０１２Ｍ−１の範囲のＤＲ５受容体結合親和性を有するであろう。ＤＲ５抗体の結合親和性は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）を含めた、当該分野で公知の技術に従ってＤＲ５抗体をテストすることによって過度の実験なくして測定することができる。
【０１７１】
もう１つの具体例において、本発明のＤＲ５抗体は、Ａｐｏ−２Ｌが結合するＤＲ５の上の同一のエピトープに結合することができ、あるいは例えば、Ａｐｏｍａｂ  ７．３と命名された抗体として、Ａｐｏ−２Ｌが結合するＤＲ５上のエピトープと合致し、またはそれと重複するＤＲ５上のエピトープに結合することができる。ＤＲ５抗体はそのように相互作用して、ＤＲ５へのＡｐｏ−２リガンド結合を妨げる立体配座を生じさせることもできる。前記したように、本発明のＤＲ５抗体のエピトープ結合特性が当該分野で知られた技術を用いて決定することができる。例えば、ＤＲ５抗体は競合阻害アッセイのようなイン・ビトロアッセイにおいてテストして、Ａｐｏ−２ＬのＤＲ５への結合をブロックし、または阻害するＤＲ５抗体の能力を測定することができる。所望により、ＤＲ５抗体を競合阻害アッセイでテストして、ＤＲ５−ＩｇＧ構築体またはＤＲ５を発現する細胞へのＡｐｏ−２Ｌポリペプチドの結合を阻害するＤＲ５抗体の能力を測定することができる。所望により、ＤＲ５抗体は、例えば、（Ａｐｏ２Ｌ、０とも言われるＰｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｓｕｐｒａに記載された１１４−２８１細胞外ドメイン配列のような）Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）の可溶性形態、およびＤＲ５  ＥＣＤ−ＩｇＧを用いるイン・ビトロ競合阻害アッセイにおいて測定することができる、少なくとも５０％だけ、好ましくは少なくとも７５％だけ、なおより好ましくは少なくとも９０％だけ、Ａｐｏ−２ＬのＤＲ５への結合をブロックまたは阻害することができるであろう。ＤＲ５抗体のエピトープ結合特性は、Ａｐｏ−２Ｌ誘導アポトーシスをブロックするＤＲ５抗体の能力をテストするためのイン・ビトロアッセイを用い、あるいは結晶学研究によって測定することもできる。
【０１７２】
さらなる具体例において、ＤＲ５抗体は、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に匹敵する活性を有するアゴニスト抗体を含むであろう。好ましくは、そのようなアゴニストＤＲ５抗体は、少なくとも１つのタイプの癌または腫瘍細胞系または原発腫瘍においてアポトーシスを誘導するであろう。アゴニストＤＲ５抗体のアポトーシス活性は、公知のイン・ビトロまたはイン・ビボアッセイを用いて決定することができる。種々のそのようなイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイの例は当該分野で良く知られている。イン・ビトロでは、アポトーシス活性はアネキシンＶ結合のような公知の技術を用いて測定することができる。イン・ビボでは、アポトーシス活性は、例えば、腫瘍負荷または容量の低下を測定することによって決定することができる。
【０１７３】
前記したように本明細書中で開示された抗体は、ある種の生理学的相互作用および／またはプロセスを変調する能力を含めた多数の特性を有する。後の実施例に示すように、本発明中に開示された抗体はＤＲ５媒介アポトーシスを誘導し、癌の種々のネズミ異種移植片モデルにおいて優れた抗腫瘍特性を示すことができる。本発明の特別な具体例において抗体のアゴニスト活性は抗体を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに架橋させることによって増強される。本発明の好ましい具体例において、この増強されたアポトーシスはＡｐｏ―２Ｌのアポトーシス活性に匹敵する。
【０１７４】
本発明のさらなる具体例は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンよりなる群から選択される、１以上の非―蛋白質性ポリマーに連結される本明細書中に開示された抗ＤＲ５受容体抗体を含む。別の具体例において、本明細書中に開示された抗ＤＲ５受容体抗体は細胞傷害性剤または酵素に連結される。なおもう１つの具体例において、本明細書中に開示された抗―ＤＲ５受容体抗体は放射性同位体、蛍光化合物またはケミルミネセント化合物に連結される。所望により本明細書中に開示された抗ＤＲ５受容体抗体はグリコシル化されているか、あるいはグリコシル化されていない。
【０１７５】
後に詳細に議論するように、本発明の抗体は、生理学的プロセスを変調する種々の方法で用いることができる。本発明の１つのそのような具体例は、図３Ａないし３Ｃに示されたＤＲ５受容体（４１１アミノ酸）または図４Ａないし４Ｃに示されたＤＲ５受容体（４４０アミノ酸）、特にその細胞外ドメインに結合する抗体を含む単離された抗ＤＲ５受容体モノクローナル抗体の治療上有効量にＤＲ５受容体を発現する哺乳動物細胞を暴露することを含む哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する方法を含む。そのような方法において、哺乳動物細胞は典型的には癌細胞である。好ましい具体例において、これらの方法で用いる抗ＤＲ５受容体抗体は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３またはＡｐｏｍａｂ  ８．３抗体のような、以下の実施例に記載されたＡｐｏｍａｂ抗体である。
【０１７６】
本発明のなおもう１つの具体例は、前記で定義されたＤＲ５受容体、またはその細胞外ドメインに結合する抗体を含む単離された抗ＤＲ５受容体モノクローナル抗体の治療上有効量にＤＲ５受容体を発現する哺乳動物細胞を暴露することを含む、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する方法である。
【０１７７】
３．トリアボディー
トリアボディーもまた本発明の範囲内にある。そのような抗体は、例えば、Ｉｌｉａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａおよびＫｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａに記載されている。
【０１７８】
４．他の修飾
ＤＲ５抗体の他の修飾が本明細書中で考えられる。本発明の抗体は（トキシン分子のような）細胞傷害性剤、あるいはプロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ  ８１−０１１４５参照）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素に抗体をコンジュゲートすることによって修飾することができる。例えば、ＷＯ  ８８−０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。）この技術は「抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法」（ＡＤＥＰＴ）ともいわれる。
【０１７９】
ＡＤＥＰＴで有用なイムノコンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用することができるいずれの酵素も含む。本発明の方法で有用な酵素は、限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルフェート、含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物の５−フルオログラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なセラチアープロテアーゼ、テルモシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよび（カテプシンＢおよびＬのような）カテプシンのようなプロテアーゼ；カスパーゼ−３のようなカスパーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なベータ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；ベータ−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ；およびそれらのアミノ窒素において、各々、フェノキシンアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼを含む。別法として（アブザイム）としても当該分野で知られた酵素活性を持つ抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる。（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ３２８；４５７、４５８（１９８７）参照）。抗体酵素コンジュゲートは、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のために本明細書中で記載したように調製することができる。
【０１８０】
酵素はヘテロ二機能的架橋試薬の使用のような、当該分野で良く知られた技術によって抗体に共有結合することができる。別法として本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合蛋白質を、当該分野で良く知られた組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３１２；６０４−６０８）（１９８４）参照）。
【０１８１】
さらなる抗体の修飾が考えられる。例えば、抗体を、種々の非蛋白質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーの１つに連結することができる。抗体は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合（例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィアー、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子、およびナノカプセル）中にて、またはマイクロエマルジョン中にて、調製されたマイクロカプセルに捕獲することもできる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ，（１９８０）に開示されている。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に一体化させることができる。本明細書中で用いるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のイン・ビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１８２】
本明細書中に開示された抗ＤＲ５抗体はイムノリポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているように、当該分野で公知の方法によって調製される。増強された循環時間を持つリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発方法によって生成することができる。リポソームを規定されたポアサイズのフィルターを通して、所望の直径を持つリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド相互交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたようにリポソームにコンジュゲートすることができる。（ドキソルビシンのような）化学療法剤は所望によりリポソーム内に含有させる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１８（１９）：１４８４（１９８９）参照。
【０１８３】
本発明の抗体は「架橋された」ＤＲ５抗体を含む。本明細書中で用いる用語「架橋された」とは、１つの（または単一の）分子を形成するための少なくとも２つのＩｇＧ分子を一緒に結合することをいう。ＤＲ５抗体は種々のリンカー分子を用いて架橋することができ、好ましくは、ＤＲ５抗体は抗ＩｇＧ分子、補体、化学的修飾または分子エンジニアリングを用いて架橋される。補体は、一旦抗体が細胞表面膜に結合すれば、抗体分子に対して比較的高い親和性を有することは当業者によって認識される。従って、補体を架橋分子として用いて、細胞表面膜に結合した２以上の抗ＤＲ５抗体をリンクさせることができる。
【０１８４】
５．組換え方法
本発明は、本明細書中に開示されたＤＲ５抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、および抗体を生産するための組換え技術も提供する。
【０１８５】
抗体の組換え生産のためには、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、抗体をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離され、配列決定される。多くのベクターは入手可能である。ベクターの成分は、一般に、限定されるものではないが以下の：シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列の１以上を含む。
【０１８６】
該方法は、ここに、抗ＤＲ５抗体の軽鎖または重鎖（あるいは軽鎖および重鎖の双方）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを供し、宿主細胞を該ベクターでトランスフェクトし、または形質転換し、組換え抗ＤＲ５抗体産物を生じるのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、キメラまたは組換え抗ＤＲ５抗体を生産する方法を含む。
【０１８７】
（ｉ）シグナル配列の成分
本発明の抗ＤＲ５抗体は、直接的のみならず、好ましくはシグナル配列である異種ポリペプチド、あるいは成熟蛋白質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換えにより生産することができる。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然の抗体シグナル配列を認識せず、プロセッシングしない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱−安定性エントロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌では、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  α−因子リーダーを含めた）α−因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ  ９０／１３６４６に記載されたシグナルによって置換することができる。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列並びにウィルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹ｇＤシグナルが入手できる。
【０１８８】
そのような前駆体領域についてのＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読枠にて連結される。
【０１８９】
（ｉｉ）複製起点成分
発現およびクローニングベクターは、共に、１以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製できるようにする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製できるようにするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウィルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム−陰性菌で適しており、２μプラスミド起源は酵母で適しており、種々のウィルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターで有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターでは必要ない（それは初期プロモーターを含有するという理由だけで、ＳＶ４０起源を典型的には用いることができる）。
【０１９０】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子を含有することができ、これが選択マーカーとも言われる。典型的な選択遺伝子は（ａ）、抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠陥を補う、または（ｃ）複合培地から利用できない臨界的栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。
【０１９１】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の成長を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は薬物抵抗性を付与する蛋白質を生産し、かくして、選択された方法で生存する。そのような優性選択の例は薬物ネオマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンを用いる。
【０１９２】
哺乳動物細胞についての適当な選択マーカーのもう１つの例は、細胞成分の同定が、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどのような抗体核酸を採用するのを可能とするものである。
【０１９３】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、メトトレキセート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含有する培養基中で形質転換体の全てを培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠乏したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【０１９４】
別法として、抗ＤＲ５抗体、野生型ＤＨＦＲ蛋白質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のようなもう１つの選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換された、または供に形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８のような選択マーカーについての選択剤を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号参照。
【０１９５】
酵母で用いるための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠如する酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１についての選択マーカーを供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１病巣の存在は、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠乏酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）はＬｅｕ２遺伝子を担う公知のプラスミドによって補われる。
【０１９６】
加えて、１．６μｍで環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターをＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換で用いることができる。別法として、組換え子ウシキモシンの大規模な生産のための発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓで報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）
（ｉｖ）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。原核生物宿主を用いるのに適したプロモーターはｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適当である。細菌系で用いるプロモーターは、抗ＤＲ５抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０１９７】
プロモーター配列は真核生物についても知られている。本質的に全ての真核生物遺伝子は、そこで転写が開始される部位からほぼ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０ないし８０塩基上流に見出されるもう１つの配列では、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこでは、Ｎはいずれかのヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、ＡＡＴＡＡＡ配列があり、これはコーディング配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルとなりえる。これらの配列のすべては真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１９８】
酵母宿主で用いられる適当な促進配列の例はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、チオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素についてのプロモーターを含む。
【０１９９】
成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現で用いられる適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、ＥＰ７３，６５７に記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターで有意に用いられる。
【０２００】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗ＤＲ５抗体は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、（アデノウィルス２のような）アデノウィルス、ウシパピロマウィルス、鳥類肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび最も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され、但し、そのようなプロモーターは宿主細胞系に適合するものとする。
【０２０１】
ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、便宜には、ＳＶ４０ウィルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。ヒトサイトメガロウィルスの即時型プロモーターは、便宜にはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られる。ベクターとしてウシパピロマウィルスを用いる哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純疱疹ウィルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についてはＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）参照。別法として、ラウス肉腫ウィルスロングターミナルリピートをプロモーターとして用いることができる。
【０２０２】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗ＤＲ５抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大される。多くのエンハンサー配列は、今日、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウィルスからのエンハンサーを用いるであろう。その例は、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオ−マーエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための促進エレメントについてはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは抗体−コーディング配列に対して５’または３’側の位置にてベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置させる。
【０２０３】
（ｖｉ）転写終止成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）で用いる発現ベクターは、転写の終止に、およびｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列も含むであろう。そのような配列は、通常、真核生物またはウィルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、場合によっては３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ  ９４／１１０２６およびそこに開示された発現ベクター参照。
【０２０４】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中において、ベクター中のＤＮＡをクローニングし、または発現させるための適当な宿主細胞は前記した原核生物、酵母、または高等真核細胞である。この目的のための適当な原核生物はグラム−陰性またはグラム−陽性生物のようなユーバクテリア、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）のようなＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）のような他の株は適当である。これらの例は限定的であるというよりはむしろ説明的である。
【０２０５】
原核生物に加えて、フィラメント状真菌または酵母のような真核生物微生物は、ＤＲ５抗体−コーディングベクターのための適当なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または通常のベーカーズ酵母はより下等な真核生物宿主微生物の中で最も普通に用いられる。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのようなＫ．ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；および例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主のようなフィラメント状真菌のような多数の他の属、種および株が通常入手でき、ここに有用である。
【０２０６】
グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウィルス株および変種、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ハエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株が公に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変種およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株、およびそのようなウィルスは、本発明に従い、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのためにウィルスとして用いることができる。
【０２０７】
綿、トウモロコシ、じゃがいも、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養も宿主として利用することができる。
【０２０８】
しかしながら、脊椎動物細胞に最大の興味が示され、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖はルーチン的手法となった。有用な哺乳動物宿主細胞系の例はＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓細胞（２９３、または懸濁培養における増殖のためにサブクローンされたまたは２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０）；マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝臓腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）；およびミエローマーまたはリンパ腫細胞（例えば、Ｙ０，Ｊ５５８Ｌ，Ｐ３およびＮＳ０細胞）である（米国特許第５，８０７，７１５号参照）。
【０２０９】
宿主細胞は、抗体の生産のために前記した発現またはクローニングベクターで形質転換し、適切には、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために修飾された慣用的な栄養媒地中で培養される。
【０２１０】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生産するのに用いる宿主細胞は種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコウの修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような商業的に入手可能な培地は宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；または米国再発行特許３０，９８５に記載された培地のいずれも宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要であれば、（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子のような）ホルモンおよび／または他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩のような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物）、（マイクロモラー範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）微量元素、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を補足することができる。いずれの他の必要な補足物も、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることもできる。温度、ｐＨなどのような培養条件は発現のために選択された宿主細胞で従前に使用されてきたものであり、当業者に明らかであろう。
【０２１１】
（ｉｘ）精製
組換え技術を用いる場合、抗体はペリプラズム空間中で細胞内で生産でき、あるいは直接的に培地に分泌され得る。もし抗体が細胞内で生産されれば、最初の工程として、粒状デブリス、宿主細胞または溶解された断片いずれかを、例えば、遠心または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペニプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法を記載する。簡単に述べれば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で３０分間に渡って解凍する。細胞デブリスは遠心によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般には、まず、商業的に入手可能な蛋白質濃度フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を前記工程のいずれかに含めて、蛋白質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて、不慮の汚染物の成長を妨げることができる。
【０２１２】
細胞から調整された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適当性は、抗体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃ領域の種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスイソタイプで、およびヒトγ３で推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが付着されるマトリックスは最もしばしばはアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御されたポアのガラスおよびポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成することができるよりもより速い流速およびより短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）は精製で有用である。イオン交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭでのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオンまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のような蛋白質精製のための他の技術も、回収すべき抗体に応じて利用可能である。
【０２１３】
Ｂ．ＤＲ５抗体についての使用
本発明のＤＲ５抗体は種々の用途を有する。
【０２１４】
ＤＲ５はアポトーシルシグナリングを媒介することが知られている。いくつかのタイプの正常な細胞はＤＲ５を発現するが、この受容体を通じてのアポトーシスシグナリングは主として腫瘍細胞に制限されるように見え、これは、ＭＹＣまたはＲＡＳのようなオンコジーンによるそれらの形質転換の関係で死滅受容体−媒介アポトーシスに対してより罹患性となる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：５０１−１２（２９９４）；Ｎｅｓｔｅｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：３９２２−７（２００４））。ＤＲ５はヒト癌細胞系ならびに原発腫瘍によって頻繁に発現される。かくして、抗ＤＲ５抗体は癌の診断および治療において用途を見出す。例えば、ＤＲ５アゴニスト的抗体は、ヒトを含めた哺乳動物において癌を治療するのに用いることができる。これらの方法において、ＤＲ５抗体、好ましくはアゴニスト的抗体は、単独で、あるいはなお他の治療剤または技術と組み合わせて哺乳動物に投与される。該癌は固体腫瘍、特に、効果的な知られた療法がない以前の療法で進められた進行したまたは転移性固体腫瘍を含めた、いずれのタイプのＤＲ５−発現癌でもあり得る。癌の特殊なタイプは限定されるものではないが、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、卵巣癌、乳がん、非−ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、神経膠芽腫またはメラノーマ、好ましくは結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ、またはＮＨＬを含む。
【０２１５】
加えて、ＤＲ５抗体は、ヒトを含めた哺乳動物における免疫−関連病のような他のＤＲ５−関連病理学的疾患の診断および治療で有用である。
【０２１６】
本明細書中で記載された種々の病理学的疾患の哺乳動物における診断は技量がある実行者によってなすことができる。例えば、哺乳動物における癌または免疫関連病の診断または検出を可能とする診断技術が当該分野で利用できる。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診、血液分析、ｘ線、ＮＭＲなどを含めた技術を介して同定することができる。
【０２１７】
免疫関連病は容易に同定することもできる。
【０２１８】
全身エリテマトーテスにおいては、病気の中枢的なメディエーターは自己蛋白質／組織に対する自己反応性抗体の生産、および免疫媒介炎症の引き続いての発生である。腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、目、中枢神経系、心血管系、胃腸管、骨髄および血液を含めた多数の器官および系が臨床的に影響される。
【０２１９】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節軟骨に対する得られた負傷を持つ複数の関節の滑膜を主として含む慢性全身性自己免疫炎症病である。病因はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対して向けられた自己−抗体の生産に関連し、関節流体および血液中の高レベルを達成する免疫複合体が結果として形成される。関節におけるこれらの複合体は滑液へのリンパ球および単球の顕著な浸潤、および顕著な滑液変化を；もし多数の好中球の添加にて同様な細胞によって浸潤されるならば関節空間／流体を誘導することができる。侵された組織は主として、しばしば、対称パターンの関節である。しかしながら、間接外疾病もまた２つの主な形態で起こる。１つの形態は継続する進行性関節病を伴う関節外病変、および肺線維症、血管炎および皮膚潰瘍の典型的な病変の発生である。関節外疾病の第２の形態はいわゆるフェルティ症候群であり、これは、時々、関節病が休止し始めた後にＲＡ病のコースにおいて後期に起こり、好中球減少症、血小板減少症および脾臓肥大の存在を含む。これには、梗塞、皮膚潰瘍および壊疽の形成と共に複数器官における血管炎が伴い得る。患者は、しばしば、侵された関節に重なる皮下組織においてリウマチ様小節を発生し；後期段階の小節は混合された炎症性細胞浸潤物によって囲まれた壊死中心を有する。ＲＡにおいて起こり得る他の発現は心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質肺炎、乾性角結膜炎、およびリウマチ様小節を含む。
【０２２０】
若年性慢性関節炎は、しばしば、１６歳未満に起こる慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡに対していくらか同様性を有し；リウマチ因子陽性であるいくらかの患者は若年性慢性関節リウマチとして分類される。該病気は３つの主なカテゴリー：少数関節、多関節および全身性に分類される。該関節は重症であり、典型的には破壊的であり、関節強直および成長遅延に導く。他の発現は前部ブドウ膜炎および全身アミロイドーシスを含むことができる。
【０２２１】
脊椎関節傷害はいくらかの共通する臨床的特徴、およびＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現を伴う通常の関連を持つ障害の群である。該障害は：強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患に関連する関節炎、乾癬に関連する脊椎炎、若年性脊椎関節障害および未分化脊椎関節傷害を含む。識別する特徴は、脊椎炎を伴うまたは伴わない仙腸骨炎；炎症性非対称性関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（クラスＩ  ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の血清学的に定義される対立遺伝子）との関連；目の炎症、および他のリウマチ疾患が関連する自己抗体の不存在を含む。該病気の誘導に対して鍵として最も考えられる細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球、クラスＩ  ＭＨＣ分子によって提示される抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、あたかもそれがＭＨＣクラスＩ分子によって発現される外来性ペプチドであるかのように、クラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ―Ｂ２７に対して反応することができる。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープは細菌または他の微生物抗原性エピトープを模倣することができ、かくして、ＣＤ８＋Ｔ細胞が応答を誘導できると仮定されている。
【０２２２】
全身性硬化症（強皮症）は未知の病因を有する。該病気のホールマークは皮膚の硬化であり；これは、活性な炎症プロセスによって誘導されるようである。強皮症は局所的または全身的であり得；血管病巣は通常であり、微小血管系における内皮細胞の負傷は全身硬化症の発生における初期の重要な事象である；血管の負傷は免疫に媒介され得る。免疫学的基礎は、皮膚病巣における単核細胞浸潤物の存在、および多くの患者における抗―核抗体の存在によって意味される。ＩＣＡＭ−１は、しばしば、皮膚病巣における線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレートされ、これは、これらの細胞とＴ細胞との相互作用が該病気の病因において役割を有し得ることを示唆する。関連する他の器官は：胃腸管；異常な蠕動／運動をもたらす平滑筋萎縮および線維症；腎臓：結果としての低下した腎臓皮質血流、蛋白尿症、高窒素血症および高血圧における結果を伴う小さな弓状および葉間動脈に影響する同心内皮下の血管内膜の増殖；萎縮、間質線維症；炎症；肺：間質肺炎および間質線維症；および心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症を含む。
【０２２３】
皮膚筋炎、多発性筋炎その他を含めた特発性炎症筋肉傷害は、筋肉衰弱をもたらす未知の病因の慢性筋肉炎症の障害である。筋肉負傷／炎症は、しばしば、全身性かつ進行性である。自己抗体はほとんどの形態に関連する。これらの筋炎―特異的自己抗体は、蛋白質合成に関与する成分、蛋白質およびＲＮＡの機能に対して向けられ、それを阻害する。
【０２２４】
シェーグレン症候群は、免疫―媒介炎症、および涙腺および唾液腺の引き続いての機能的破壊によるものである。該病気は炎症性結合組織疾患に関係し、またはそれが伴い得る。該病気は、その双方が小さなＲＮＡ−蛋白質複合体であるＲｏおよびＬａ抗原に対する自己抗体生産に関係する。病巣の結果、胆管硬変、末梢または感覚神経障害、および触知可能紫斑病を含めた他の発現または関連と共に、乾性角結膜炎、口内乾燥症をもたらす。
【０２２５】
全身性血管炎は、原発性病巣が炎症である病気、および冒された血管によって供給される組織に対して虚血症／壊死／変性をもたらす血管に対する引き続いての損傷、およびいくつかの場合には、究極的な末端―器官機能障害を含む。血管炎は、特に、免疫複合体の形成にも関連する病気における、慢性関節リウマチ、全身性硬化症などのような他の免疫―炎症媒介病に対する二次的な病巣または後遺症としても起こり得る。原発性全身血管炎群における病気は：全身性壊死性血管炎：結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎および肉芽腫症、多発性血管炎；ウェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；および巨細胞動脈炎を含む。雑多な血管炎は：ムコ皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳまたはカワサキ病）、摘出ＣＮＳ血管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（ブエガー病）および皮膚壊死性小静脈炎を含む。リストした血管炎のタイプのほとんどの病因メカニズムは、主として、血管壁における免疫グロブリン複合体の沈積、およびＡＤＣＣ補体活性化または双方いずれかを介する炎症性応答の引き続いての誘導によるものであると考えられる。
【０２２６】
サルコイドーシスは、身体中のほとんどいずれの組織にもおける類上皮肉芽腫の存在によって特徴付けられる未知の病因の疾患である；肺の関与は最も普通である。病因は該病気の部位における活性化されたマクロファージおよびリンパ系細胞の執拗な存在が関与し、これらの細胞型によって放出される局所的におよび全身的に活性な産物の放出から得られる引き続いての慢性後遺症が伴う。
【０２２７】
自己免疫溶血性貧血、免疫汎血球減少症、および発作性夜行ヘモグロビン尿症を含めた自己免疫溶血性貧血は、赤血球細胞（および、ある場合には、同様に血小板を含めた他の血液細胞）の表面に発現される抗原と反応する抗体の生産の結果であり、補体媒介溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃ―受容体―媒介メカニズムを介するそれらの抗体被覆細胞の除去の反映である。
【０２２８】
他の臨床的状況での血小板減少症紫斑病、および免疫―媒介血小板減少症を含めた自己免疫血小板減少症において、血小板破壊／除去は、血小板への抗体または補体いずれかの付着、および補体溶解、ＡＤＣＣまたはＦＣ−受容体媒介メカニズムによる引き続いての除去の結果として起こる。
【０２２９】
グラベ病、橋本甲状線炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎を含めた甲状腺炎は、甲状腺に存在し、しばしばそれに対して特異的な蛋白質と反応する抗体の生産を伴う甲状腺抗原に対する自己免疫応答の結果である。自然発生モデル：ラット（ＢＵＦおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満ニワトリ株）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（チロイドペルオキシダーゼ）での動物の免疫化を含めた実験モデルが存在する。
【０２３０】
Ｉ型真性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病は、膵臓島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己―抗体および自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。インスリンまたはインスリン受容体に対する抗体もまたインスリン非応答性の表現型を生じさせることができる。
【０２３１】
糸球体腎炎および管間質腎炎を含めた免疫媒介腎臓病は、直接的に、腎臓抗原に対する自己反応性抗体またはＴ細胞の生産の結果としての、あるいは間接的には、他の非―腎臓抗原に対して反応性である腎臓における抗体および／または免疫複合体の沈積の結果としての、腎臓組織に対する抗体またはＴリンパ球媒介負傷の結果である。かくして、免疫複合体の形成をもたらす他の免疫媒介病は、間接的な後遺症としての免疫媒介腎臓病をやはり誘導し得る。直接的および間接的双方の免疫メカニズムの結果炎症応答が起こり、これは、結果としての器官機能損傷および、ある場合には、腎臓不全への進行を伴い、腎臓組織において病巣の発生を生じ／誘導する。液性および細胞性双方の免疫メカニズムは、病巣の病因に関与し得る。
【０２３２】
多発性硬化症；特発性脱髄多発性神経障害またはギャラン―バール症候群；および慢性炎症性脱髄多発性神経障害を含めた、中枢および末梢神経系の脱髄性病は、自己免疫基礎を有し、稀突起神経膠細胞に対して、またはミエリンに対して直接的に引き起こされた損傷の結果として神経脱髄をもたらすと考えられている。ＭＳにおいては、病気の誘導および進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球―依存性である脱髄性病であり、再発―軽減コースまたは慢性進行コースいずれかを有する。病因は未知であり；しかしながら、ウイルス感染、遺伝的素因、環境、および自己免疫性はすべて寄与する。病巣は圧倒的にＴリンパ球媒介ミクロ膠細胞および浸潤性マクロファージの浸潤物を含有し；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における支配的な細胞型である。稀突起神経膠細胞死滅および引き続いての脱髄のメカニズムは知られていないが、Ｔリンパ球が駆動するようである。
【０２３３】
好酸球肺炎；特発性肺線維症、および過敏肺炎を含めた炎症性および線維症性肺病は、脱調節免疫―炎症応答が関係し得る。その応答の阻害は治療的に有用であろう。
【０２３４】
水泡性皮膚病、多形性紅斑、および接触性皮膚炎を含めた自己免疫または免疫媒介皮膚病は、その形成がＴリンパ球依存性である自己抗体によって媒介される。
【０２３５】
乾癬はＴリンパ球―媒介炎症病である。病巣はＴリンパ球、マクロファージおよび抗原処理細胞、およびいくらかの好中球の浸潤物を含有する。
【０２３６】
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏；および蕁麻疹を含めたアレルギー疾患はＴリンパ依存性である。これらの病気は、圧倒的に、Ｔリンパ球誘導炎症、ＩｇＥ媒介―炎症または双方の組合せによって媒介される。
【０２３７】
移植片拒絶、および移植片―対―宿主病（ＧＶＨＤ）を含めた移植関連病はＴリンパ球―依存性であり；Ｔリンパ球機能の阻害は軽減される。
【０２３８】
免疫および／または炎症応答の介入が利点を有する他の病気は、限定されるものではないが、（限定されるものではないが、ＡＩＤＳ  Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎を含めた）ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、および原生動物および寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（または誘導体／アゴニスト）を治療的に利用して、感染剤に対する免疫応答を増強させることができる）、免疫不全の病気（ＭＬＲを刺激する（分子／誘導体／アゴニスト）を治療的に利用して、（ＨＩＶ感染におけるように）遺伝性、後天性、感染誘導、または（化学療法からの）医原性免疫不全の疾患に対する免疫応答を増強させることができる）および新形成を含めた感染症である。
【０２３９】
該抗体は好ましくは担体；好ましくは医薬上許容される担体中にて哺乳動物に投与される。適当な担体およびそれの処方はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｓｌｏ  ｅｔ  ａｌ．典型的には、適当な量の医薬上許容される塩を処方で用いて、処方を等張とする。担体の例は生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。該溶液のｐＨは好ましくは約５ないし約８、より好ましくは約７ないしは７，５である。更なる担体は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような維持放出調製物を含み、そのマトリックスは成型製品、例えば、フィルム、リポソームまたはミクロ粒子の形態である。ある種の担体は、例えば、投与の経路および投与すべき抗体の濃度に依存してより好ましいであろうことは当業者に明らかであろう。
【０２４０】
抗体は注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内）によって、または効果的な形態における血流へのその総括を確実とする注入のような他の方法によって哺乳動物に投与することができる。また、抗体は摘出された組織灌流のような摘出灌流技術によって投与して、局所的治療効果を発揮することもできる。局所または静脈内注射が好ましい。
【０２４１】
抗体を投与するための有効量およびスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定を成すのは当該分野における技量内のものである。当業者であれば、投与しなければならない抗体の用量は、例えば、抗体を受ける哺乳動物、投与の経路、用いる抗体の特定のタイプ、および哺乳動物に投与される他の薬物に依存して変化するであろうことを理解するであろう。適当な用量を選択するにおけるガイダンスは、抗体の治療的使用に関する刊行物、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）  ｃｈ．２２およびｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９に見出される。単独で用いる抗体の典型的な一日の用量は、前記した因子に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／体重以上の範囲であろう。
【０２４２】
抗体は、有効量の１以上の他の治療剤と組み合わせて哺乳動物に投与することもできる。癌の治療において、これは特に当てはまる。というのは、多くの腫瘍はｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化を介して化学療法または放射線療法に対して抵抗性を獲得するからである。ＤＲ５はｐ５３から独立してアポトーシスを刺激するので、それは単一の剤としてのみならず、例えば、化学療法（化学療法剤）、放射線療法、免疫アジュバント、成長阻害剤、細胞傷害性剤、および／またはサイトカインのような他のタイプの癌治療と組み合わせても臨床的に有用であると予測される。哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている他の剤も使用することができ、そのような剤はＴＮＦ―アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンドおよびＡｐｏ−２リガンド並びにアポトーシスを誘導できる他の抗体を含む。１以上の他の療法は（ＤＲ５抗体以外の）治療的抗体を含むことができ、そのような抗体は（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツマブ）Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のような）抗―Ｈｅｒ受容体抗体、抗―ＶＥＧＦ抗体、（ＲＩＴＵＸＡ（登録商標））（リツキシマブ）、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のような）抗―ＣＤ２０抗体、および抗―ＣＤ４抗体のような、Ａｐｏ−２リガンドに対する他の受容体に対する抗体、またはＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）（Ｉｍｍｕｎｅｘ）のような他のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対する抗体を含むことができる。
【０２４３】
本発明によって考えられる化学療法は、当該分野で知られており、かつ商業的に入手できる、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、ロイコボリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチンおよびカルボプラチンのような化学物質を含む。そのような化学療法についての調製および投与スケジュールは製造業者の指示に従って、あるいは技量のある実践者によって経験的に決定されるように用いることができる。そのような化学療法についての調製および投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
【０２４４】
化学療法は、好ましくは、前記したもののような医薬上許容される担体中にて投与される。化学療法の投与の態様はＤＲ５抗体で使用したのと同一とすることができるか、あるいはそれは異なる態様を介して哺乳動物に投与することができる。例えば、ＤＲ抗体は注射することができ、他方、化学療法は哺乳動物に経口投与される。
【０２４５】
放射線療法は、当該分野で通常に使用され、かつ当業者に知られたプロトコルに従って哺乳動物に投与することができる。そのような療法はセシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト放射線を含むことができる。放射線療法は全身照射とすることができ、あるいは身体中のまたはその上の特異的部位または組織に直接的に向けることができる。典型的には、放射線療法は約１ないし約２週間の時間にわたってパルス状に投与される。しかしながら、放射線療法はより長い時間にわたって投与することができる。所望により、放射線療法は単一の用量、または複数の順次の用量として投与することができる。
【０２４６】
抗体は１以上の他の治療剤と順次にまたは同時に投与することができる。抗体および治療剤の量は、例えば、いずれのタイプの薬物を用いるか、治療すべき病理学的疾患、および投与の経路に依存するが、一般には、もし各々を個々に投与するよりも少量であろう。
【０２４７】
哺乳動物への抗体の投与に続き、哺乳動物の生理学的疾患は技量がある実践者によく知られた種々の方法でモニターすることができる。
【０２４８】
アンタゴニストまたはブロッキングＤＲ５抗体を療法で用いることもできると考えられる。例えば、ＤＲ５抗体を（前記したような）哺乳動物に投与して、Ａｐｏ−２ＬへのＤＲ５受容体結合をブロックし、かくして、Ａｐｏ−２Ｌ療法の間に投与されるＡｐｏ−２Ｌの生物学的利用性を増大させて、癌細胞においてアポトーシスを誘導できよう。
【０２４９】
本発明のＤＲ５抗体の治療効果はイン・ビトロアッセイにて、イン・ビボ動物モデルを用いて調べることができる。種々のよく知られた動物モデルを用いて、例えば、癌または免疫―関連疾患の発生および病因における本明細書中で同定されたＤＲ５抗体の役割を更に理解し、候補治療剤の効率をテストすることができる。そのようなモデルのイン・ビボ性質は、それらを、ヒト患者における応答を特に予測できるものとする。
【０２５０】
免疫関連病の動物モデルは非―組換えおよび組換え（トランスジェニック）動物を共に含む。非―組換え動物モデルは、例えば、げっ歯類、例えば、ネズミモデル、を含む。そのようなモデルは標準的な技術、例えば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、および腎臓カプセル下での移植を用いて同系マウスに細胞を導入することによって作成することができる。
【０２５１】
例えば、移植片―対―宿主病のための動物モデルは知られている。移植片―対―宿主病は、免疫コンピテント細胞を免疫抑制または許容患者に移植される場合に、起こる。ドナー細胞は宿主抗原を認識し、それに応答する。該応答は生命を脅かす重症炎症から下痢および体重喪失の温和な症例まで変化し得る。移植片―対―宿主病モデルは、ＭＨＣ抗原および従たる移植片抗原に対するＴ細胞の反応性を評価する手段を提供する。適当な手法はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ４．３に詳細に記載されている。
【０２５２】
皮膚同種異系移植片拒絶についての動物モデルは、抗―ウイルスおよび腫瘍免疫性におけるそれらの役割の指標となり、および尺度となるイン・ビボ組織破壊を媒介するＴ細胞の能力をテストする手段である。最も普通の認められたモデルはネズミ尾―皮膚移植片を用いる。反復された実験は、皮膚同種異系移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞およびキラー―エフェクターＴ細胞によって媒介されるが、抗体によっては媒介されないことを示した。｛Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ．ａｎｄ  Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，８８９−９９２｝。適当な手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ  ４．４において詳細に記載されている。本発明の組成物をテストするのに用いることができる他の移植片拒絶モデルは、Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ，（１９９４）５８：２３およびＴｉｎｕｂｕ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，（１９９４）４３３０−４３３８によって記載された同種異系心臓移植モデルである。
【０２５３】
遅延型過敏についての動物モデルは、同様に細胞媒介免疫機能のアッセイを提供する。遅延型過敏は、抗原での攻撃後に時間が経過した後までピークが到達しない免疫によって特徴付けられるＴ細胞媒介イン・ビボ免疫応答である。これらの応答は多発性硬化症（ＭＳ）および実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳについてのモデル）のような組織特異的自己免疫疾患で起こる。適当な手法はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ  ４．５に詳細に記載されている。
【０２５４】
関節炎についての動物モデルはコラーゲン―誘導関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織学的および免疫学的特徴を有し、ヒト自己免疫関節炎についての認められたモデルである。マウスおよびラットモデルは滑膜炎、軟骨および軟骨下骨の侵食によって特徴付けられる。本発明のＤＲ５抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前記ｕｎｉｔｓ１５．５に記載されたプロトコルを用いて自己免疫関節炎に関する活性についてテストすることができる。また、Ｉｓｓｅｋｕｔｚ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９６）８８：５６９に記載されたＣＤ１８およびＶＬＡ−４インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いるモデルも参照されたし。
【０２５５】
喘息のモデルが記載されており、そこでは、動物をオボアルブミンで感作し、次いで、エアロゾルによって送達された同一蛋白質で該動物を攻撃することによって、抗原−誘導気道過敏、肺好酸球増加症および炎症が誘導される。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、非−ヒト霊長類）は、エアロゾル抗原での攻撃に際して、ヒトにおいてアトピー性喘息と同様な兆候を示す。ネズミモデルは、ヒト喘息の特徴の多くを有する。喘息の治療における活性および有効性についての本発明の組成物をテストするための適当な手法は、Ｗｏｌｙｎｉｅｃ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９８）１８：７７７およびそこで引用された文献によって記載されている。
【０２５６】
加えて、本発明のＤＲ５抗体は、乾癬のような病気についての動物モデルでテストすることができる。本発明のＤＲ５抗体はＳｃｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，（１９９７）３：１８３によって記載されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスにおいてテストすることができ、そこでは、マウスは乾癬に似た組織病理学的皮膚病巣を示す。もう１つの適当なモデルは、、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，（１９９５）  １４６：５８０によって記載されたように調製されたヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。
【０２５７】
種々の動物モデルが、候補治療組成物の安全性および抗癌活性をテストするのによく知られている。これらは、無胸腺ヌードマウスまたはｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスへのヒト腫瘍異種移植、またはｐ５３ノックアウトマウスのような遺伝的ネズミ腫瘍モデルを含む。
【０２５８】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を生産するための標準的な技術を用い、本明細書中で同定された分子のコーディング部分を注目する動物のゲノムに導入することによって作成することができる。トランスジェニック操作のための標的として供することができる動物は、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非−ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、およびカニクイザルのようなサルを含む。そのような動物へ導入遺伝子を導入するための当該分野で知られた技術は前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系へのレトロウイルス−媒介遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６１４８−６１５［１９８５］）；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６，３１３−３２１［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．，３，１８０３−１８１４［１９８３］）；精子−媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ
ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５７，７１７−７３［１９８９］）を含む。レビューについては、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号参照。
【０２５９】
本発明の目的では、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部分にのみ導入遺伝子を運ぶものを含む（「モザイク動物」）。導入遺伝子は単一導入遺伝子として、またはコンカタマーにて、例えば、ヘッド−ツー−ヘッドまたはヘッド−ツー−テイル縦列いずれかにて組み込むことができる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入は、例えば、Ｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６２３２−６３６（１９９２）の技術に従うことによっても可能である。
【０２６０】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は標準的な技術によってモニターすることができる。例えば、サザーンブロッド分析またはＰＣＲ増幅を用いて、導入遺伝子の組込みを確認することができる。次いで、イン・サイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学のような技術を用い、ｍＲＮＡ発現のレベルを分析することができる。動物は、例えば、特異的組織への免疫細胞の浸潤を判断するための組織学的調査によって免疫疾患病理学の兆候について、または癌性または悪性組織の存在についてさらに調べることができる。
【０２６１】
別法として、ポリペプチドをコードする内因性遺伝子、および動物の胚細胞に導入された同一ポリペプチドをコードする改変されたゲノムＤＮＡの間の相同組換えの結果として、本明細書中で同定されたポリペプチドをコードする欠陥があるまたは改変された遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、そのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの部分を欠失し、あるいは組込みをモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子で置き換えることができる。典型的には、（５’および３’両末端における）数キロベースの改変されていないフランキングＤＮＡをベクターに含める［例えば、相同組換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）参照］。ベクターを（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞系に導入し、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌仮腹動物に移植し、胚を出産させる、「ノックアウト」マウスを作成することができる。それらの生殖細胞に相同組換えＤＮＡを保有する子孫は標準的な技術によって同定することができ、これを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種することができる。ノックアウトマウスは、例えば、ある種の病理学的疾患に対して防御するそれらの能力について、およびポリペプチドの不存在による病理学的疾患のそれらの発生について特徴付けることができる。
【０２６２】
本発明のもう１つの具体例において、診断アッセイにおいて抗体を使用する方法を提供する。例えば、抗体を診断アッセイで使用して、特異的細胞および組織においてＤＲ５の発現または過剰発現を検出することができる。イン・ビボイメージングアッセイ、イン・ビトロ競合結合アッセイ、直接的または間接的サンドイッチアッセイ、および不均一または均一相いずれかで行われる免疫沈澱アッセイのような、当該分野で知られた種々の診断アッセイ技術を用いることができる［Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）  ｐｐ．１４７−１５８］。診断アッセイで用いる抗体は検出可能な部位で標識することができる。検出可能な部位は、直接的にまたは間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生じさせることができるべきである。例えば、検出可能な部位は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンのような蛍光またはケミルミネセント化合物、あるいはアルカリ性ホスファターゼ、ベーター−ガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であってよい。Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４−１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９−２３０（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７−４１２（１９８２）によって記載された方法を含めた、検出可能な部位へ抗体をコンジュゲートさせるための当該分野で公知のいずれの方法を使用することもできる。
【０２６３】
ＤＲ５抗体は組換え細胞培養または天然源からのＤＲ５のアフィニティー精製でも有用である。このプロセスにおいて、ＤＲ５に対する抗体は、当該分野で良く知られた方法を用い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙のような適当な支持体に固定する。次いで、免疫化抗体を、精製すべきＤＲ５を含有する試料と接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合したＤＲ５を除いて試料中の本質的に全ての物質を除去するであろう適当な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を、抗体からＤＲ５を放出するもう１つの適当な溶媒で洗浄する。
【０２６４】
本発明のさらなる具体例において、病理学的疾患を治療し、またはＤＲ５を検出し、または精製するのに有用な物質を含有する製品およびキットが提供される。該製品は標識を備えた容器を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアルおよび試験管を含む。容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。容器は、病理学的疾患を治療するのに、またはＤＲ５を検出し、または精製するのに有効な活性な剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性な剤はＤＲ５抗体であり、好ましくは、ＤＲ５に対して特異的なモノクローナル抗体を含む。容器上の標識は、組成物が病理学的疾患を治療し、またはＤＲ５を検出し、または精製するのに用いられることを示し、また、前記したもののようなイン・ビボまたはイン・ビトロいずれかの使用のための指示書も示すことができる。
【０２６５】
本発明のキットは前記した容器、および緩衝液を含む第二の容器を含む。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および添付文書を含めた、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を使用のための指示書と共に含むことができる。
【０２６６】
以下の実施例は説明目的のためだけに供し、断じて本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０２６７】
本明細書で引用された全ての特許および文献はここに引用してその全体を援用する。
【実施例】
【０２６８】
実施例で言及した商業的に入手可能な試薬は、特に断りの無い限り、製造業者の指示書に従って用いた。ＡＴＣＣアクセション番号によって、以下の実施例において、および明細書を通じて確認される細胞の源はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａである。本明細書中で開示された多数の試薬およびプロトコルは、その内容をここに引用してその全体を援用する、ＷＯ
９９／３７６８４、ＷＯ  ００／７３３４９、ＷＯ  ９８／３２８５６、ＷＯ  ９８／５１７９３、およびＷＯ  ９９／６４４６１にさらに議論される。
【０２６９】
（実施例１）
抗ＤＲ５抗体変種の設計およびテスト
抗ＤＲ５抗体１６Ｅ２はヒト抗体ファージ−ディスプレイライブラリーからのｓｃＦｖとして誘導し、これは、１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ  ９８／５１７９３（実施例１４参照）に記載されている。ｓｃＦｖ  １６Ｅ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、各々、図５（配列番号：９）および図６（配列番号：１０）に示す。図６において、シグナル配列および重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域が確認される（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域には下線を施す）。
【０２７０】
材料および方法
全長抗ＤＲ５抗体１６Ｅ２の構築
以下に記載する実験では、全長ＩｇＧが望まれた。従って、１６Ｅ２の可変ドメインを、全長ＩｇＧ１抗体の哺乳動物細胞発現に適した従前に記載されたｐＲＫベクターにクローン化した（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．２：３−１０（１９９０））。Ｋａｂａｔデーターベース（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に対する１６Ｅ２可変ドメインのアミノ酸配列の比較は、１６Ｅ２の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、ヒトラムダ軽鎖遺伝子ファミリーに由来することを示した。従って、１６Ｅ２の可変ドメインを、まず、ラムダ定常ドメインを含有するベクターにサブクローンした。ＰＣＲプライマーは制限酵素部位ＳｆｉＩおよびＭｓｃＩを加えるように設計し、次いで、増幅された可変ドメインをこれらの２つの酵素で消化した。この断片を、ラムダ定常ドメインを含有する同様に消化されたベクターに挿入した。このベクターはＩｇＧ発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦａｄｓの発現用に設計したので、コーディング領域の５’末端において制限部位ＡｇｅＩ、および３’末端においてＨｉｎｄＩＩＩを加えるためのプライマーを用いて再度ＰＣＲ増幅した。次いで、このＡｇｅＩないしＨｉｎｄＩＩＩ断片を同様に消化されたベクターｐＤＲ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。プラスミドｐＤＲ１の全配列を図１１に示す（配列番号：１５）。
【０２７１】
バージョン１の重鎖については、ｓｃＦｖ  １６Ｅ２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインを、５’−末端においてＰｖｕＩＩ部位を、およびドメイン３’−末端においてＡｐａＩ部位を加えるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲ−増幅した。次いで、完全な重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）の発現のために、この断片を、ベクターｐＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位にクローン化した。プラスミドｐＤＲ２の全配列を図１２に示す（配列番号：１６）。
【０２７２】
全長抗体１６Ｅ２重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、各々、図７ないし１０に示す（配列番号：１１ないし１４）。特に、図７および８（配列番号：１１および１２）は全長１６Ｅ２重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示し、図９および１０（配列番号：１３および１４）は、全長１６Ｅ２軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。全長１６Ｅ２抗体の重鎖および軽鎖は、以後、「バージョン１」ともいう。
【０２７３】
ＩｇＧ変種の構築
変種は、部位特異的突然変異誘発を用いて別々に軽鎖または重鎖上に構築した（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））。軽鎖バージョン１をコードするプラスミドｐＤＲ１、または重鎖バージョン１をコードするｐＤＲ２を、デオキシウリジン−含有一本鎖ＤＮＡ鋳型の調製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換した（ＢｉｏＲａｄ，Ｊｏｙｃｅ  ａｎｄ  Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｇ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：６３６−６４３（１９８４））。突然変異誘発反応のアリコットを、二本鎖ＤＮＡの精製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。各変種については、軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡを、ＡＢＩ３７７×１、またはＡＢＩ３７３０×１自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を用いて完全に配列決定した。
【０２７４】
各ＩｇＧ変種については、軽鎖発現プラスミドおよび重鎖発現プラスミドをアデノウイルス−形質転換ヒト胚腎臓細胞系２９３に共トランスフェクトすることによって一過性トランスフェクションを行った（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，，３６：５９−７４（１９７７））。簡単に述べれば、トランスフェクションの前日に２９３細胞を分割し、血清−含有培地中で平板培養した。翌日、リン酸カルシウム沈殿を、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅＴＭＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に、軽鎖および重鎖の二本鎖ＤＮＡから調製し、プレートに滴下した。細胞を３７℃にて一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄し、無血清培地中で４日間培養し、その時点で、条件培地を収穫した。プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂを用い、抗体を培養上清から精製し、次いで、緩衝液を１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。蛋白質の濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、または定量的アミノ酸配列によって決定した。
【０２７５】
エレクトロケミルミネセントＤＲ５−結合アッセイ
抗ＤＲ５抗体の相対的結合は、液相競合ＥＬＩＳＡ様式で決定した。ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いてＤＲ５−Ｆｃ融合蛋白質をビオチニル化し、標準抗体（バージョン１またはＡｐｏｍａｂ７．３いずれか）を、製造業者の指示に従って、ＯＲＩ−ＴＡＧ  ＮＨＳエステル（ＩＧＥＮ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で標識した。結合アッセイを行うために、テスト抗体試料をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）中に系列希釈した。等容量（各々２５μｌ）の抗体試料（５０，０００ないし０．８５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度）、ＯＲＩ−ＴＡＧ標準抗体（１５０ｎｇ／ｍｌ）およびビオチオル化ヒトＤＲ５−Ｆｃ（１５ｎｇ／ｍｌ）を９６ウエルポリプロピレンプレートに加え、穏やかに攪拌しつつ、室温にて１．５時間インキュベートした。次いで、磁気ストレプトアビジンビーズ（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を加え（２５μｌ／ウエル）、プレートをさらに３０分間前記したようにインキュベートした。アッセイ緩衝液を加えて、最終容量をウエル当たり２５０μｌとし、ＯＲＩＧＥＮ  Ｍ３８４機器（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてプレートを読んだ。試料曲線の４つのパラメーターフィットを用い、ＩＣ５０値を計算した。
【０２７６】
バイオアッセイ：腫瘍細胞増殖阻害／殺傷
各抗体変種の見掛けの能力を、イン・ビトロ腫瘍細胞−殺傷アッセイで決定した。Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌腫細胞系を、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。標準（バージョン１またはＡｐｏｍａｂ７．３いずれか）および試料の２倍系列希釈を、１０マイクログラム／ｍｌの架橋抗体（抗ヒトＦｃ、ヤギアフィニティ−精製Ｆ（ａｂ’）２）を含むまたは含まない培地を含有する９６−ウエル組織培養プレートで行った。次いで、細胞（２０，０００／ウエル）をプレートに加えた。プレートを３７℃にて合計４８時間インキュベートした。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを最後の３時間のインキュベーションのためにウエルに加えた。５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍの発光にて、蛍光をフルオロメーターを用いて読んだ。４パラメーター曲線−フィッティングプログラムを用いてデータを解析した。
【０２７７】
結果
この研究の全体的目標は、安全性を危うくすることなく、改良された生化学特性および改良された効率を持つ抗ＤＲ５抗体を開発することであった。
【０２７８】
いくつかの化学的または熱的安定性を改良するためのＤＲ５重鎖および軽鎖におけるアミノ酸置換；折畳み；いずれの残基が結合または折畳みで重要であり、従って、より大きなアフィニティーのために変化するかを決定するためのＣＤＲ残基のアラニンスキャンニング；および改良されたアフィニティーを持つクローンを同定するためのＣＤＲのファージ−ディスプレーライブラリーの使用を含めた、いくつかのアプローチを用いて所望の改良を達成した。フレームワーク領域の変化も、免疫原性および生物学的活性に対するそれらの可能な効果について実験した。
【０２７９】
相同性モデル（図１９および２０）を、これらの変化の多くの選択の助けとして用いた。
【０２８０】
重鎖変種
シリーズ１
重鎖のバージョン２はバージョン１からの５つの変化を含有する。これらの変化（Ｑ６Ｅ，Ｖ１１Ｌ、Ｅ１２Ｖ、Ｒ１３Ｑ、およびＫ１０５Ｑ）は可変ドメインのフレームワークにあり、これを加えて、フレームワークをヒトＶＨＩＩＩコンセンサス配列により近くした。表１に、重鎖ＣＤＲにおける変化を伴って構築された第一の変種が示される。これらの突然変異体についてのｓｓＤＮＡ鋳型はバージョン２であった。位置１０２におけるＬｅｕからＴｙｒへの変化を行って、パッキングおよびかくして安定性を改良した。この変化と組み合わせて、Ａｓｎ５３をＧｌｎまたはＴｙｒに変化させて、潜在的脱アミノ化部位を除去した。Ｍｅｔ３４をＬｅｕに変化させて、潜在的酸化部位を除去した。これらの重鎖変種を元の軽鎖と共に発現させて、バージョン２０−２３を得た（表１）。バージョン２におけるように、３つの突然変異Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｑ、およびＬ１０２Ｙを含有する重鎖、およびフレームワーク変化を、引き続いて、「三重の重いもの」またはＴＨ１といい、他方、３つの突然変異Ｍ３４Ｌ、Ｎ５３Ｙ、およびＬ１０２Ｙを持つ重鎖、およびバージョン２のフレームワークを同様にＴＨ２という。
【０２８１】
【化２】
2015133985.tif 000003
Ｍ３４Ｌ突然変異（すなわち、ｖ２０と比較したｖ２１、ｖ２２と比較したｖ２３、表１）の付加にて結合およびイン・ビトロ細胞−殺傷活性の喪失があったので、Ｋａｂａｔデーターベースをスキャンニングすることによって示唆されたいずれかのアラニンまたは他の残基を置換する一連のさらなる突然変異を、鋳型としての重鎖バージョン２０を用いて重鎖ＣＤＲ１で行った。これらの重鎖を軽鎖バージョン１で発現させた。突然変異させたアミノ酸、ｖ１に対する得られた結合、およびこれらのバージョンについてのバイオアッセイデータを表２に示す。Ｇｌｙ３３からＡｌａへ変化させると、結合の増強並びに改良された能力が得られた。３つの突然変異Ｇ３３Ａ、Ｎ５３ＱおよびＬ１０２Ｙを含有するこの重鎖をＴＨ３という。同様に、Ｇ３３Ａ、Ｎ５３Ｙ、およびＬ１０２Ｙを有するＴＨ４を構築した。Ｔｈｒ２８をＡｌａに変化させると、やはり、ｖ１と比較して増強された活性が得られ、Ｔ２８Ａ、Ｎ５３Ｑ、Ｌ１０２Ｙを含有する重鎖をＴＨ９という。ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ４およびＴＨ９におけるＣＤＲ変化を表５にまとめる。これらの５つの重鎖を、それらを軽鎖組合せで共発現させた後にさらに調べた（下記参照）。
【０２８２】
【化３】
2015133985.tif 000004
Ａｌａ−スキャンニングＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３
重鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各アミノ酸の寄与をさらに解明するために、これらの残基の各々に代えてのアラニン置換で突然変異体を構築した。アラニン置換をコードする合成オリゴヌクレオチドでの部位特異的突然変異誘発は、鋳型としての重鎖バージョン１を用いて行った。これらの重鎖は、バージョン１軽鎖を用いて発現させた。得られた抗体の見掛けのアフィニティーおよび能力の変化を表３および４に示す。Ｇｌｙ９９ＡｌａおよびＡｒｇ１００Ａｌａは、各々、改良された活性を示し、従って、これらの変化を用いて、重鎖のさらなる組合せ突然変異体を構築した。
【０２８３】
【化４】
2015133985.tif 000005
【０２８４】
【化５】
2015133985.tif 000006
シリーズ２
バージョンＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３およびＴＨ４と同一のＣＤＲを用いる重鎖の第二のシリーズを構築し、そこでは、フレームワーク残基Ｅ６、Ｌ１１、Ｖ１２、Ｑ１３およびＱ１０５を、バージョン１で見出されるアミノ酸、すなわち、Ｑ６、Ｖ１１、Ｅ１２、Ｒ１３およびＫ１０５に戻した。これらの重鎖をＴＨ５、ＴＨ６、ＴＨ７、およびＴＨ８という（表５参照）。
【０２８５】
【化６】
2015133985.tif 000007
軽鎖変種
軽鎖ＣＤＲのアラニン−スキャンニング
軽鎖のＣＤＲ残基の結合および生物学的活性に対する寄与を良好に理解するために、部位特異的突然変異誘発を用いて各アミノ酸をアラニンに変化させた。軽鎖変種の各々を、前記したように、ＩｇＧの一過性発現のために重鎖ｖ１と組み合わせた。軽鎖ＣＤＲ  ａｌａスキャンの結果を表６にまとめる。興味深いことには、多くの他の抗体と対照的に、ＣＤＲ  Ｌ１は抗原結合において重要な役割を演じるように見える。この軽鎖はラムダ鎖であり、図２０に示したモデルは、ＣＤＲ１がアルファらせんを形成し得ることを示唆する。Ｌ２およびＬ３におけるアラニンへの置換は、結合を無くするＣＤＲ２におけるＧ５０Ａを例外としてより許容される。逆に、いくつかのａｌａ置換、特に、Ｒ９１ＡおよびＫ５１Ａは結合および生物活性を改良した。
【０２８６】
【化７】
2015133985.tif 000008
遺伝子ファミリー残基スワップ
第二のタイプの向けられた突然変異体を用いて、軽鎖を調べた。このアプローチにおいて、該モデルにおいて、ループのいずれか側にあるように見え、かくして、抗原結合に直接的に関与するというよりはむしろ支持する役割を演じるであろうＣＤＲ残基を、他の密接に関連するラムダ遺伝子ファミリーにおける対応する位置での残基に代えて交換した。ｖ１重鎖を用いてこれらの突然変異体も発現させ、結果を表７にまとめる。ＣＤＲ  Ｌ２においては、Ｇ５０Ｋ、Ｋ５１Ｄの組合せは結合および生物活性双方において有意な改良を与え、４つの突然変異Ｇ５０Ｋ、Ｋ５１Ｄ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５３Ｅを含む組合せのｖ１よりも改善される。１つの残基置換のみに関係する同一領域における他のより保存された変化は許容されなかった。
【０２８７】
【化８】
2015133985.tif 000009
抗体−ファージライブラリーでのアフィニティー選択
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の各々については、ファージディスプレイライブラリーを別々に構築し、ＤＲ５−Ｉｇに対する増大したアフィニティーを持つクローンについて選択した。モデル（図２０）精査は、ＣＤＲのいずれの残基が暴露されるようであるかを示し、これらの残基をランダム化のために選択した。バージョン１の全ラムダ軽鎖およびＶＨドメインを、Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５−４２８（２００２）において参照され、およびＳｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：６１０−６１６（２００２）にさらに記載されたファージ−ディスプレーベクターｐＳ１６０２にクローン化した。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発をライブラリーの構築で用いた。一本鎖ＤＮＡ調製のためにｖ１ファージミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＣＪ２３６に形質転換し、ランダム化のために選択された各部位においてＴＡＡコドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いてライブラリー鋳型を作成した。次いで、縮重コドンＮＮＳ（ここに、ＮはＧ、Ａ，ＴおよびＣの均等な混合物であり、他方、ＳはＧおよびＣと同等な混合物である）を用いるオリゴを用いて、ライブラリーを構築した。停止鋳型オリゴＣＡ９４５およびライブラリーオリゴＣＡ９４６を用いてＣＤＲＬ１を突然変異した。停止鋳型オリゴＣＡ９４７およびライブラリーオリゴＣＡ９４８を用いてＣＤＲＬ１を突然変異させた。停止鋳型オリゴＣＡ９４９およびライブラリーオリゴＣＡ９５０を用いてＣＤＲＬ３を突然変異した。ライブラリーの構築を表８にまとめる。
【０２８８】
【化９】
2015133985.tif 000010
ランダム突然変異反応の産物をＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションし、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージと共に１４ないし１６時間増殖させることによって増幅した。ライブラリーのサイズを系列希釈によって見積もり、もし最初の形質転換がカルベニシリンプレート上であれば平板培養によって評価し、それは１．９×１０９ないし２．２×１０９クローン８であった。
【０２８９】
ビオチニル化ＤＲ５−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を用い、ライブラリーを溶液中で４ラウンドの間選択した。ほぼ１０１１ファージを、回転ホイール上でＰＢＳ中の３％無脂肪ドライミルク、０．２％Ｔｗｅｅｎの１ｍｌ溶液で（ファージブロック）で室温にて１時間ブロックした。ＤＲ４−ＩＧおよびＣＤ４−ＩＧを各々１マイクロモラーにてブロック溶液に加えて、非特異的結合を減少させた。次いで、ビオチニル化抗原を１００ｎＭにて第一ラウンドの間加え、結合を２時間進行させた。引き続いてのラウンドのパニングにおいて、抗原濃度を１０．５および１ナノモラーまで降下させた。
【０２９０】
抗原―結合ファージの捕獲のためストレプトアビジン―被覆磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）をまずファージブロックで３回洗浄し、次いで、１ｍｌファージブロックで室温にて１時間ブロックした。磁石を用いてビーズを濃縮し、抗原―ファージ溶液に１５分間で加えた。次いで、磁石を用いて、ビーズ―抗原―ファージ複合体を溶液から引き出した。次いで、これらの粒子をファージブロックで３回、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ）で３回、ＰＢＳで１回洗浄した。ファージを１００マイクロリットルの０．１Ｍ  ＨＣｌでビーズから１０分間溶出させ、ＮａＯＨで中和した。溶出したファージを用いてＸＬ１Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉを感染させ、引き続いてのラウンドの間前記したように増殖させた。洗浄のストリンジェンシーは各ラウンドで増大させた。
【０２９１】
各ライブラリーからのクローンを配列決定した。Ｌ１ライブラリーについては、野生型配列のみが得られ、このＣＤＲは抗原の結合または抗体の立体配座で重要であり、可能なラセンにおける少数の突然変異が許容できるという考えを支持する。Ｌ２におけるライブラリーでは、コンセンサス配列は見出されず、複数のＣＤＲＬ２配列がＤＲ５への結合で許容できることを示唆する。Ｌ３ライブラリーでは、いくつかの配列は複数回出現し、これらの配列は、オリゴ−指向性突然変異誘発を用いて全長軽鎖ベクターにグラフトした。共トランスフェクションのために重鎖バージョン１を用い、ＩｇＧの発現は再度２９３細胞におけるものであった。表９は、全長抗体として発現されたＬ３配列、および結合およびバイオアッセイの結果を記載する。バージョン６９および７０に取り込まれた、テストされた配列のうち２つは、バージョン１と比較して改良された結合および生物活性を持つ抗体を与えた。
【０２９２】
【化１０】
2015133985.tif 000011
組合せ軽鎖
前記したように、突然変異は、イン・ビトロにて結合および腫瘍細胞殺傷を個々に増強させた軽鎖ＣＤＲの各々において同定された。次いで、これらの突然変異を組み合わせて、ＣＤＲの各々において改良を施したいくつかの軽鎖を作成した。これらを「３重の軽い１」につきＴＬ１、ＴＬ２、およびＴＬ３と命名し、表１０に記載する。かくして、ＴＬ１は、バージョン２６で確認されたＬ２突然変異およびバージョン２９におけるＬ３突然変異と組み合わせたバージョン４４で確認されたＬ１突然変異を含有する。同様に、ＴＬ２はｖ６５からのＬ２突然変異およびｖ６９からのＬ３突然変異と共にバージョン４４からのＬ１突然変異を含有し、他方、ＴＬ３はｖ４４からのＬ１をｖ６５からのＬ２およびｖ７４からのＬ３と組み合わせる。
【０２９３】
【化１１】
2015133985.tif 000012
さらなるＡｐｏｍａｂ抗体を表１２に示す。
【０２９４】
【化１２】
2015133985.tif 000013
Ａｐｏｍａｂ発現
３重重鎖、および３重軽鎖を誘導した後、２９３細胞において３つの軽鎖の各々を９つの重鎖の各々で共にトランスフェクトし、次いで、前記したように得られた抗体を精製することによって、９×３グリットの組合せ抗体を作製した。これらのＡｐｏｍａｂでのイン・ビトロ実験は、いくつかのバージョンがバイオアッセイにおいてかなり優れていることを示した。従って、イン・ビボマウス腫瘍モデル実験に適した材料を調製した。
【０２９５】
Ａｐｏｍａｂの回収および精製
収穫された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）からのＡｐｏｍａｂ抗体を回収し、精製するための方法を以下に記載する：
ＰｒｏｓｅｐプロテインＡクロマトグラフィー−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から生じさせた収穫された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）を１．５Ｍトリス塩基でｐＨを７．０に調整し、次いで、２５ｍＭ  Ｎａｃｌ／２５ｍＭトリス／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で平衡化されたＰｒｏｓｅｐプロテインＡカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に付加した。非−結合蛋白質を流動させ、平衡緩衝液で洗浄し、続いて、平衡緩衝液中の０．５Ｍ  ＴＭＡＣでの第２の洗浄工程、および平衡緩衝液での第３の洗浄によって除去した。０．１Ｍ酢酸の溶出工程を用い、Ａｐｏｍａｂ抗体をプロテインＡカラムから溶出させる。カラム溶出物をＡ２８０によってモニターする。Ａｐｏｍａｂ抗体ピークをプールする。
【０２９６】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流動クロマトグラフィー−ＰｒｏｓｅｐプロテインＡからのＡｐｏｍａｂ抗体のプールを１．５Ｍトリス塩基でｐＨを５．５に調整し、次いで、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．１で平衡化されたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流動のカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に付加する。試料を付加した後、カラムをＡ２８０においてベースラインまで平衡緩衝液で洗浄する。平衡緩衝液、ｐＨ８中の０ないし０．２Ｍ塩化ナトリウムの直線状１２カラム−用量グラジエントを用いることによって、Ａｐｏｍａｂ抗体をカラムから溶出させる。カラム溶出物をＡ２８０によってモニターする。画分を収集し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって測定して、適切に折りたたまれたＡｐｏｍａｂ抗体を含有するものをプールする。
【０２９７】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流動クロマトグラフィー−次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分のプールを、５０ｍＭ塩化ナトリウム／２５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のカラムに付加する。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、Ａｐｏｍａｂ抗体をカラム流出物中に収集する。
【０２９８】
ＵＦ／ＤＦ形成−Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのプールを、分子量カットオフ約１０，０００ダルトンを有する膜上で限外濾過によって濃縮する。次いで、濃縮されたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦプールを１０容量の１０ｍＭヒスチジン／８％スクロース、ｐＨ６で透析濾過する。透析濾過されたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプールを１０％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０でコンディショニングして、０．０２％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０の最終濃度を達成する。処方されたバルクを滅菌０．２２μｍフィルターを通し、２ないし８℃または−７０℃で貯蔵する。Ａｐｏｍａｂ抗体の最終純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびアミノ酸配列分析によって決定する。
【０２９９】
配列決定は、ＡＢＩ３７００またはＡＢＩ３７３０  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ配列決定マシーンで行う。配列決定クロマトグラムは、シーケンサー（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）配列分析ソフトウェアを用いて分析する。
【０３００】
Ａｐｏｍａｂのイン・ビトロ活性のテスト
Ａｐｏｍａｂでのイン・ビボ実験を開始する前に、各ロットを前記したようにイン・ビトロ活性でテストした。これらの結果を表１３に示す。
【０３０１】
【化１３】
2015133985.tif 000014
（実施例２）
Ｃｏｌｏ  ２０５ヒト結腸癌腫異種移植片モデルおよび結腸直腸癌の他の異種移植片モデルにおけるＡｐｏｍａｂ抗腫瘍活性の評価
本実施例および引き続いての実施例で用いた通常に使用される略語は以下の通りである：
ＣＲ  完全な退行
ＰＲ  部分的退行
ＭＴＤ  最大許容用量
ＭＴＶ  メジアン腫瘍容量
ＮＴＲ  非−処理関連死滅
ＬＴＴＦＳ  長期腫瘍−フリー生存体
ＰＢＳ  リン酸−緩衝化生理食塩水
ｑ３ｄ×４  合計４用量にて３日間毎に１回
ｑｄ×１  １日目に与えた１つの用量
ｑｄ×５  ５日間毎日１回
ＴＦＳ  腫瘍−フリー生存体
ＴＲ  処理関連死滅
ＴＴＥ  終末点までの時間
Ｔ−Ｃ  処理されたおよび対照動物のメジアンＴＴＥ値の間の日数で表した差
ＴＧＤ  腫瘍成長遅延；Ｔ−Ｃ；通常は対照の％として表す、対照群と比較した処理群についてのメジアンＴＴＥの増加
２×Ｖ０までの時間  倍化時間（ＤＴ）；その間に腫瘍の容量が倍化する時間
Ｌｏｇ細胞殺傷＝
【０３０２】
【化１４】
2015133985.tif 000015
処理の時間における現実の腫瘍容量の対数ｌｏｇ１０（Ｖｐｒｅ）、およびｌｏｇ１０（Ｖｐｏｓｔ）の間の差（Ｃｈｅｎｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：１４５７−１４６６（１９９７）
６ないし８週齢雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、右後ろ側の側腹部に、０．２ｍｌ容量／マウスにてマウス当たり５００万Ｃｏｌｏ  ２０５細胞を皮下接種した。全てのマウスの耳に確認のためにタグを付した。一旦腫瘍の容量がほぼ１００ないし２００ｍｍ３となれば、Ｃｏｌｏ  ２０５腫瘍−担持マウスをランダムにグループ分けし、処理を投与した。
【０３０３】
処理方法は、３ｍｇ／ｋｇ／マウスまたは１０ｍｇ／ｋｇ／マウスの、ビークル対照または標準およびテスト抗体の用量での、腹腔内単一用量であった。いくつかの場合には、３または４匹のマウスをビヒクルおよび１０ｍｇ／ｋｇ群から安楽死させ、血清薬物濃度および腫瘍組織学実験のために、処理から５分、２４時間または４８時間後に、血清および腫瘍を集めた。残りのマウスにおいては、腫瘍測定を、最初の２週間の間は１週間につき２回、次いで、他の４週間の間は１週間につき１回行った。
【０３０４】
Ｃｏｌｏ  ２０５異種移植無胸腺ヌードマウスモデルで得られた結果を図２１ないし２５に示す。
【０３０５】
図２１は、Ａｐｏｍａｂ  ５．３、６．３および８．３の各々が、テストされた全ての用量において平均腫瘍で容量を低下させるのにかなり効率的であり、それらの効力は抗体１６Ｅ２バージョン１のそれと本質的に同一であったことを示す。
【０３０６】
Ａｐｏｍａｂ  ５．２、６．２、５．３、７．２および７．３の単一腹腔内用量の効力を、Ｃｏｌｏ  ２０５異種移植無胸腺ヌードマウスモデルでテストし、結果を図２２に示す。テストしたすべてのＡｐｏｍａｂは腫瘍容量を低下させるのにかなり効果的であり、それらの効力は抗体１６Ｅ２バージョン１のそれと本質的に同一であった。
【０３０７】
同様に、図２３に示される結果は、Ａｐｏｍａｂ  ５．２、７．３および８．３が結腸直腸癌のこのモデルにおいて腫瘍容量を低下させるにおいて効果的であったことを示す。この実験においては、Ａｐｏｍａｂおよび１６Ｅ２に１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量で投与したが、そうでなければ前記したように処理した。Ａｐｏｍａｂ  ７．３および８．３の効力は特に顕著であり、２０日間のテスト期間の間にいずれの逆行も示さない。
【０３０８】
図２４に示すように、Ａｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性は、Ｃｏｌｏ  ２０５異種移植片モデルにおいてＡｐｏｍａｂ  ２３．３および２５．３の活性をはるかに凌いだ。
【０３０９】
図２５は、Ｃｏｌｏ  ２０５マウス異種移植片モデルにおいて、安定なおよび一過性細胞系に由来するＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗腫瘍活性を比較するアッセイの結果を示す。簡単に述べれば、６ないし８週齢の雌無胸腺ヌードマウスに、前記したように、右後側の側腹部領域に、０．２ｍｌ容量／マウスにて５００万Ｃｏｌｏ  ２０５細胞／マウスを皮下接種した。用量を図面中に示す。図２５におけるデータは、各々、安定および一過性細胞系に由来するＡｐｏｍａｂ  ７．３がＣｏｌｏ  ２０５マウス異種移植片モデルにおいて同等に効果的であることを示す。
【０３１０】
図２６は、結腸直腸癌のＨＣＴ１５異種移植片モデルにおける、単一療法としての、８０ｍｇ／ｋｇ  ＣＰＴ−１１（イリノテカン、結腸直腸癌の治療のための公知の薬物）との組合せ療法としての、Ａｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ用量）の抗癌活性をテストする実験の結果を示す。示された結果によって証明されるように、Ａｐｏｍａｂ  ７．３およびＣＰＴ−１１の双方は単独で投与した場合に効果的であるが、２つの組合せは優れた効果を示し、単一療法として投与されたＡｐｏｍａｂ  ７．３およびＣＰＴ−１１双方の活性を凌ぐ。
【０３１１】
ＣＰＴ−１１（イリノテカン）と組み合わせてＡｐｏｍａｂ  ７．３で処理した肉腫ＬＳ１８０異種移植片を担うヌードマウスにおける代表的な実験の結果を図２７に示す。再度、組合せ療法は単一剤としてのＡｐｏｍａｂ  ７．３またはＣＰＴ−１１いずれかの投与に対して優れていることが判明し、差は統計学的に有意であった（第２のパネル）。比較した全ての対についてＴｕｋｅｙ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｐ＜０．０５。
【０３１２】
（実施例３）
非−ホジキンリンパ腫のＢＪＡＢ異種移植片モデルにおけるＡｐｏｍａｂ  ７．３抗癌活性の評価
単独での、およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）（４ｍｇ／ｋｇ，ｑ１  ｗｋ）と組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ１  ｗｋ）の抗癌活性を、非−ホジキンリンパ腫のＢＪＡＢ異種移植片モデルで評価した。リンパ腫細胞はＳＣＩＤマウスにおいて良好に成長することが知られているが、６ないし８週齢ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をこの実験で用いた。処理パラメーターおよび結果を図２８に示す。Ａｐｏｍａｂ
７．３およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）組合せとして投与した場合、相乗的な活性を示した。
【０３１３】
（実施例４）
ヒト膵臓腺癌のＢｘｐｃ３異種移植片モデルにおけるＡｐｏｍａｂ  ７．３抗癌活性の評価
雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でのヒト膵臓腺癌のＢｘＰＣ３異種移植片モデルにおける単独での、およびゲムシタビン（１６０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）と組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）の抗癌活性を調べた。処理パラメーターおよび結果を図２９に示す。データは、単一療法として投与されたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性がゲムシタビンの効力よりもはるかに優れていたことを示す。Ａｐｏｍａｂ  ７．３およびゲムシタビンの組合せ投与の結果、効力がさらに改良された。
【０３１４】
（実施例５）
ヒト肺癌のＨ４６０異種移植片モデルにおける単独での、およびカルボプラチンおよびタキソールと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３抗癌活性の評価
単独での、およびカルボプラチンおよびタキソールと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ，１×  ｗｋ，ＩＰ）の抗癌活性を、ビークル対照に対して、およびカルボプラチンおよびタキソールの組合せに対して評価した。６０匹の無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、右後側の側腹部領域にて、０．２容量／マウスにて５００万Ｈ４６０細胞／マウスを皮下接種した。全てのマウスの耳に確認のためにタグを付した。腫瘍を１００ないし２００ｍｍ３の平均腫瘍容量に到達させ、図３０に示したように処理した。簡単に述べれば、マウスを４つの群に分けた。群１はビークル−処理対照群であった（１０ｍＭヒスチジン８％スクロースおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ６））。群２は１０ｍｇ／ｋｇ／マウス用量、ＩＰにてＡｐｏｍａｂ  ７．３で１週間に１回２週間処理した。群３にはカルボプラチン（０日において１００ｍｇ／ｋｇ／マウス、ＩＰ、単一用量）＋タキソール（６．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス、皮下、２週間の間５連続日にて毎日）を投与した。群４はＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス用量、ＩＰ、２週間の間、１週間に１回）＋カルボプラチン（０日において１００ｍｇ／ｋｇ／マウス、ＩＰ、単一用量）＋タキソール（６．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス、皮下、２週間の間、５連続日）を受けた。単一療法として投与されたＡｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性は、カルボプラチン＋タキソールの組合せのそれと匹敵した。Ａｐｏｍａｂ  ７．３＋カルボプラチン＋タキソールの組み合わせ投与は、他の処理様式と比較した場合に優れていることが判明した。
【０３１５】
（実施例６）
ヒト肺癌のＨ２１２２異種移植片モデルにおける単独での、およびカルボプラチンおよびタキソールと組み合わせたＡｐｏｍａｂ  ７．３抗癌活性の評価
この実験においては、雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１０マウス／群）に、右後側の側腹部領域において、０．２ｍｌ容量／マウスにて５００万Ｈ２１２２細胞／マウスを皮下接種した。全てのマウスの耳に確認のためにタグを付した。腫瘍を１００ないし２００ｍｍ３の平均腫瘍容量に到達させ、４つの群にランダムにグループ分けし（６匹マウス／群）、図３１に示したように処理した。群１はビークル−処理対照群（１０ｍＭヒスチチジン、８％スクロースおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ６））であった。群２にはカルボプラチン（０日において１００ｍｇ／ｋｇ／マウス、ＩＰ、単一用量）＋タキソール（６．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス、皮下、２週間の間に５連続日の間毎日）を投与した。群３はＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス用量、ＩＰ、２週間の間、１週間に１回）を受けた。群４はＡｐｏｍａｂ
７．３（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス用量、ＡＰ、２週間の間、１週間に１回）＋カルボプラチン（０日において１００ｍｇ／ｋｇ／マウス、ＩＰ、単一用量）＋タキソール（６．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス、皮下、２週間の間、５連続日の間に毎日）を受けた。図３１に示すように、カルボプラチン＋タキソールの組合せは、ビヒクル−処理対照群に対して有意な抗癌活性を示さなかった。際立って対照的に、単一療法として投与されたＡｐｏｍａｂ  ７．３は顕著な抗腫瘍活性を示した。Ａｐｏｍａｂ  ７．３で処理した全ての６匹のマウスは、７０日の処理期間の間にいずれの逆行もなくして完全な応答（ＣＲ）を示した。同一の活性が、Ａｐｏｍａｂ  ７．３＋カルボプラチン＋タキソール組合せで処理された群で見出された。
【０３１６】
このモデルにおけるＡｐｏｍａｂ  ７．３の最大有効用量を決定するために、６ないし８週齢の雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、右後側の脇腹部領域にて、０．２ｍｌ容量／マウスにて５００万Ｈ２１２２細胞／マウスを皮下接種した。全てのマウスの耳に確認のためにタグを付した。腫瘍を１００ないし２００ｍｍ３の平均腫瘍容量に到達させ、ランダムにグループ分けし（１３匹のマウス／群）、以下に記載するように処理した。処理群から排除したいずれのマウスも安楽死させた。
【０３１７】
グループＡはビークル−処理対照群（０．５Ｍアルギニンスクシネート、２０ｍＭトリス、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２）であった。ビヒクルは１週間の間、１週間に５回ＩＰにて投与した。群Ｂには１ｍｇ／ｋｇ／マウス単一ＩＶ用量にてＡｐｏｍａｂ  ７．３を投与した。群Ｃには３ｍｇ／ｋｇ／マウス単一ＩＶ用量にてＡｐｏｍａｂ  ７．３を投与した。群Ｄには１０ｍｇ／ｋｇ／マウス単一ＩＶ用量にてＡｐｏｍａｂ  ７．３を投与した。最初の処理から４８時間後に、群Ｂ、ＣおよびＤの各々から３匹のマウスを安楽死させ、それらの腫瘍を以下のように集めた。１つの腫瘍が組織学的実験のために１０％ホルマリン中で保存された。１つの腫瘍はＲＮＡ実験のために液体窒素中で凍結させた。１つの腫瘍はウェスタンブロットのために液体窒素中で凍結させた。腫瘍の実験は最初の２週間の間は１週間に２回次いで、次の４週間の間には１週間に１回行った。６週間の最後において、または腫瘍が８００ないし１０００ｍｍ３の近似的容量に到達するまでにすべての残りのマウスを安楽死させた。図３２の最初のパネルに示された容量応答曲線は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３はテストした全ての用量において効果的であったが、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量は１ｍｇ／ｋｇ用量に対して（統計学的に有意ではないが）顕著な改良を示した。比較した全ての対についてＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  Ｐ＜０．０５（図３２の第２のパネル参照）。
【０３１８】
（実施例７）
ヒト結腸直腸癌のＣｏｌｏ  ２０５異種移植片モデルにおけるＡｐｏｍａｂ  ２３．３、２５．３および７．３の抗癌活性の評価
この実験においては、雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、右後側の側腹部領域において、０．２ｍｌ容量／マウスにて５００万Ｃｏｌｏ  ２０５細胞／マウスを皮下接種した。全てのマウスの耳に確認のためにタグを付した。腫瘍を１００ないし２００ｍｍ３の平均腫瘍容量に到達させ、７つの群（１０匹のマウス／群）にランダムにグループ分けし、図３３に示すように処理した。群１はビークル−処理対照群（１０ｍＭヒスチジン、８％スクロースおよび０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ６））であった。群２にはＡｐｏｍａｂ  ７．３の単一３ｍｇ／ｋｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。群３にはＡｐｏｍａｂ  ７．３の単一１０ｍｇ／ｋｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。群４にはＡｐｏｍａｂ  ２３．３の単一３ｍｇ／ｋｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。群５にはＡｐｏｍａｂ  ２３．３の単一１０ｍｇ／ｍｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。群６にはＡｐｏｍａｂ  ２５．３の単一３ｍｇ／ｋｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。群７にはＡｐｏｍａｂ  ２５．３の単一１０ｍｇ／ｋｇ／マウスｉ．ｖ．用量を投与した。処理から２４時間後に、全てのマウスの体重を計った。腫瘍は最初の２週間の間は１週間に２回、次いで、次の４週間の間は毎週測定した。６週間後に、あるいは腫瘍が＞１０００ｍｍ３のサイズに到達すれば、マウスを犠牲にした。
【０３１９】
結果を図３３に示す。２５日データによって示されるように、Ａｐｏｍａｂ  ７．３およびＡｐｏｍａｂ  ２５．３は共にこのモデルにおいて有意な抗癌活性を示した。
【０３２０】
（実施例８）
ヌードマウスにおけるＣｏｌｏ  ２０５ヒト結腸癌腫異種移植片に対するモノクローナル抗体Ａｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性の評価
動物
雌無胸腺ヌードマウス（ｎｕ−ｎｕ，Ｈａｒｌａｎ）は実験の１日において１１または１２週齢であった。マウスに水、および１８．０％粗製蛋白質、５．０％粗製脂肪、および５．０％粗製ファイバーよりなるＮＩＨ３１修飾および照射Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）を自由にあたえた。マウスは、２１ないし２２℃および４０ないし６０％湿度の、１２時間の明サイクルでの静的ミクロイソレーター中の照射されたＡＬＰＨＡ−Ｄｒｉ（登録商標）ｂｅｄ−ｏ’ｃｏｂｓ（登録商標）実験室動物ベッディングに収容した。
【０３２１】
腫瘍移植
異種移植片は、培養されたＣｏｌｏ  ２０５ヒト結腸癌腫細胞から開始した。腫瘍細胞を、１０％加熱−不活化胎児ウシ血清、１００ユニット／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸、０．２５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ、および２５μ／ｍＬのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．０７５％炭酸水素ナトリウムを補足したＲＰＭＩ−１６４０中で中期対数相まで増殖させた。細胞培養を、５％ＣＯ２および９５％空気の雰囲気中にて、３７℃の湿潤化インキュベーター中の細胞培養フラスコに維持した。腫瘍細胞移植の日に、Ｃｏｌｏ  ２０５細胞を収穫し、５×１０６細胞／ｍＬの濃度にて、ＰＢＳ中の５０％マトリゲルマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁させた。各テストマウスは、右側腹部に１×１０６のＣｏｌｏ  ２０５細胞を皮下移植し、腫瘍の成長を平均サイズが１００ないし３００ｍｍ３に到達するまでモニターした。実験の１日と命名される１３日後に、個々の腫瘍容量は１２６ないし２８８ｍｍ３の範囲であり、動物を、１８８ｍｍ３の平均腫瘍容量を持つ１０匹のマウスより各々がなる６の群に分類した。
【０３２２】
テスト材料および処理
テスト材料を投与の間に氷上で維持し、投与溶液は引き続いて４℃で貯蔵した。ビヒクル対照群（群１）においては、マウスは、５日間、続いて残りの２日の間毎日１回、次いで、さらに５日の間毎日１回腹腔内投与されたビヒクルを受けた。テスト群（群２ないし４）において、動物をＡｐｏ２Ｌ．０リガンド（５／２／５スケジュールにて６０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）、Ａｐｏｍａｂ  ７．３（３ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．１、８日）および抗ＶＥＧＦネズミモノクローナル抗体Ｂ２０−４．１（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．１および８日）で処理した。群５および６は、各々、Ｂ２０−４．１と、Ａｐｏ２Ｌ．０との、およびＢ２０−４．１とＡｐｏｍａｂ  ７．３との組合せを受けた。各用量は、動物の体重のスケールで、２０ｇ体重当たり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の容量で送達した。
【０３２３】
終点
腫瘍はキャリパーを用いて毎週２回測定した。その腫瘍が２０００ｍｍ３の容量に到達した場合、あるいは６８日における実験の結論において、いずれが早くくるかに拘わらず、各動物を安楽死させた。１０００ｍｍ３の終点腫瘍容量は、２０００ｍｍ３のサイズを達成しなかった腫瘍の数のため、腫瘍成長遅延の分析のため選択した。各マウスについての終点までの時間（ＴＴＥ）は、次の方程式から計算した：
【０３２４】
【化１５】
2015133985.tif 000016
式中、ｂは切片であって、ｍは形質転換された腫瘍成長データ組の対数の直線回帰によって得られた線の傾きである。データ組は、実験終点の容量を凌いだ最初の観察、および終点容量の達成直前の３つの連続的観察よりなるものであった。終点に到達しなかった動物には、実験の最終日に等しいＴＴＥ値を割り当てた。転移による処理−関連死滅または非−処理関連死滅を被る動物には、死滅の日と同等なＴＴＥ値を割り当てた。非−処理関連死滅または未知の原因の死滅を被る動物はＴＴＥ計算から除外した。
【０３２５】
処理の結果は、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）によって評価され、これは、日数で表した、対照群に対する処理群における終点までのメジアン時間（ＴＴＥ）の増加：
ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ、
または
対照群のメジアンＴＴＥのパーセンテージ：
【０３２６】
【化１６】
2015133985.tif 000017
として定義され、
式中：
Ｔ＝処理群についてのメジアンＴＴＥ、
Ｃ＝対照群についてのメジアンＴＴＥ。
【０３２７】
処理は、動物において腫瘍の部分的退行（ＰＲ）または完全な退行（ＣＲ）を引き起こし得る。ＰＲ応答において、腫瘍容量は実験のコースの間における３連続測定についてその１日の容量の５０％以下であり、これらの３つの測定の１以上につき１３．５ｍｍ３と同等であるかあるいはそれよりも大である。ＣＲ応答において、腫瘍容量は実験のコースの間におけるこれらの３つの測定の１以上につき１３．５ｍｍ３未満である。実験の最後においてＣＲ応答を持つ動物は、加えて、腫瘍−フリー生存体（ＴＦＳ）として分類される。退行応答をモニターし、記録する。
【０３２８】
サンプリング
腫瘍試料は、各群において動物から終点に採取した。これらの動物はサンプリング直前に頸部脱臼によって安楽死させた。群当たり３匹の動物の腫瘍を収穫し、二分し、１０％中性緩衝化ホルマリン中で室温にて１２ないし２４時間維持した。
【０３２９】
統計学的およびグラフ解析
Ｌｏｇｒａｎｋ検定を用いて、処理および対照群のＴＴＥ値の間の差の有意性を分析した。両側統計分析を有意性レベルＰ＝０．０５にて行い、結果は０．０１≦Ｐ≦０．０５において有意とみなし、Ｐ＜０．０１においてかなり有意とみなした。
【０３３０】
メジアン腫瘍成長曲線は時間の関数としての群メジアン腫瘍容量を示す。動物が腫瘍サイズによる実験を出ると、動物について記録された最終の腫瘍容量は、引き続いての時点において群メジアン腫瘍容量を計算するのに用いられるベータに含まれた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを構築して、時間の関数としての実験で残る動物のパーセンテージを示した。これらのプロットはＬｏｇｒａｎｋ検定と同一のデータ組を用いた。
【０３３１】
結果
図３４は、本実験における各群についての、群メジアン腫瘍成長曲線（上方パネル）およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット（下方パネル）を示す。ビヒクル−処理対照マウスのメジアンＴＴＥは１０．０日であり、（１０のうち）１つの腫瘍は１０００ｍｍ３終点腫瘍容量を達成しなかった。１日および８日に１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で投与されたＢ２０−４．１は、統計学的に有意ではなかった中程度の１９．９−日（１１３％）ＴＧＤを生じた。Ａｐｏ２Ｌ．０およびＡｐｏｍａｂ  ７．３単一療法はＣｏｌｏ  ２０５に対して効果的であり、各々、２８．４日（１９０％）および５３．０日（３５５％）の腫瘍成長遅延を生じた。Ａｐｏ２Ｌ．０またはＡｐｏｍａｂ  ７．３いずれかへのＢ２０−４．１の添加は、ＴＧＤまたは退行応答に関して処置の有効性を改良しなかった。
【０３３２】
（実施例９）
単一療法としての、およびＳＫＭＥＳ−１ヒトＮＳＣＬＣに対するカルボプラチン＋パクリタキセルと組み合わせた、モノクローナル抗体Ａｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性の評価
単一療法としての、およびＳＫＭＥＳ−１ヒトＮＳＣＬＣに対するカルボプラチン＋パクリタキセルと組み合わせた、Ａｐｏ２Ｌ．０リガンドおよびＡｐｏｍａｂ  ７．３のイン・ビボ抗腫瘍活性をテストした。
【０３３３】
動物
雌無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ，Ｈａｒｌａｎ）は９ないし１０週齢であり、実験の１日に１７．４ないし２５．４ｇの範囲の体重を有した。動物に水、および１８．０％粗製蛋白質、５．０％粗製脂肪、および５．０％粗製ファイバーよりなるＮＩＨ  ３１修飾および照射Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）を自由に与えた。マウスは、２１ないし２２℃および４０ないし６０％湿度にて、１２時間明サイクルでの静的マイクロアイソレーターにおける照射されたＡＬＰＨＡ−Ｄｒｉ（登録商標）ｂｅｄ−ｏ’ｃｏｂｓ（登録商標）実験室動物ベッディングに収容した。
【０３３４】
腫瘍移植
異種移植片は、ＰＲＣにおいて系列的移植によって維持されたＳＫＭＥＳ−１肺腫瘍から開始した。各テストマウスは右側腹部において皮下移植された１ｍｍ３  ＳＫＭＥＳ−１腫瘍断片を受け、腫瘍成長をモニターした。実験の１日と命名される１３日後に、個々の腫瘍容量は６３ないし１４４ｍｍ３の範囲であり、動物は、各々が、１０匹のマウスよりなる４つの群、および各々が９匹のマウスよりなる２つの群に分類された。平均腫瘍容量は９３ないし９５ｍｍ３であった。
【０３３５】
テスト材料および処理
全てのテスト材料は、２０ｇ体重当たり０．１ｍＬ（５ｍＬ／ｋｇ）の用量を準備するのに供され、受領に際して−８０℃で貯蔵した。テスト材料は投与の初日に解凍し、投与の間は氷上に維持し、次いで、引き続いて４℃にて貯蔵した。カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）注射、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）で希釈して、１０ｇ体重当たり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の容量の所望の用量を得た。パクリタキセル（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を１０×ストック溶液から投与の各々の日にＤ５Ｗで希釈して、所望の用量が２０ｇ体重当たり０．１ｍＬで送達されるように、９０％Ｄ５Ｗ中に５％エタノールおよび５％クレモフォールＥＬ（５％ＥＣビヒクル）よりなるビヒクルを得た。
【０３３６】
群１（ビヒクル対照）マウスは５日間毎日１回腹腔内投与（ｉ．ｐ．ｑｄ×５）を受け、腫瘍成長対照として供した。群２および３におけるマウスは、各々、Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．  ｑｄ×５）およびＡｐｏｍａｂ  ７．３（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｑｄ×１）での単一療法を受けた。群４におけるマウスはカルボプラチン（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｔ．ｑｄ×１）＋パクリタキセル（６．２５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．  ｑｄ×５）の組合せを受けた。群５および６におけるマウスが、各々、Ａｐｏ２ＬまたはＡｐｏｍａｂ  ７．３と組み合わせたカルボプラチン＋パクリタキセルを受けた。各用量は先のセクションで確認される容量で投与され、動物の体重に対するスケールとした。
【０３３７】
終点、サンプリングおよび統計学的解析
先の実施例８に記載したように、終点を決定し、サンプリングおよび統計学的解析を行った。
【０３３８】
結果
図３５および３６は、各々、Ａｐｏ２Ｌ．０およびＡｐｏｍａｂ  ７．３で処理した群についての、群メジアン腫瘍成長曲線およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【０３３９】
全てのビヒクル−処理対照マウスの腫瘍は１５００ｍｍ３終点容量となるように成長し、メジアンＴＴＥは１８．９日であった。従って、この４５日の実験で達成可能な最大ＴＧＤは２６．１日（１３８％）であった。対照群についての、メジアン腫瘍成長曲線およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、図３５および３６の上方および下方パネルに含められる。
【０３４０】
Ａｐｏ２Ｌ．０処理群（群２）では、メジアンＴＴＥは２２．９日であり、これは、４．０−日（２１％）ＴＧＤおよび統計学的に有意でない活性に対応した。図２８（上方パネル）は、群２におけるメジアン腫瘍容量が処理期間の間に収縮し、次いで、迅速な腫瘍成長が復帰したことを示す。
【０３４１】
群３のメジアンＴＴＥは２．０日であり、これは７．１−日（３８％）ＴＧＤおよびかなり統計学的に有意な活性（Ｐ＝０．００５）に対応する。退行応答は記録されず、全ての腫瘍は１５００ｍｍ３の終点容量を達成した。群３のメジアン腫瘍成長曲線は、対照に対する腫瘍成長における初期遅延を示唆する。
【０３４２】
カルボプラチン＋パクリタキセルで処理した群４マウスのメジアンＴＴＥは２６．５日であり、７．６−日（４０％）ＴＧＦおよび統計学的に有意な活性（Ｐ＝０．０１）に対応した。全ての群４腫瘍は１５００ｍｍ３終点容量まで成長し、退行応答は記録されなかった。群４マウスについてのメジアン腫瘍成長曲線は、対照マウスに対する腫瘍成長における中程度の遅延を示す（図３５および３６、上方パネル参照）。
【０３４３】
Ａｐｏ２Ｌ．０、カルボプラチンおよびパクリタキセルの三重組合せでの処理は３２．７日のメジアンＴＴＥを生じ、１３．９−日（７３％）ＴＧＤ、および群１に対するかなり有意な活性（Ｐ＝０．００２）に対応する。この三重組合せでの３２．７−日メジアンＴＴＥは、Ａｐｏ２Ｌ．０単一療法群または化学療法対照処理の１６．５−日メジアンＴＴＦよりも長かったが、その差はＬｏｇｒａｎｋ分析によると統計学的有意性は達成しなかった。統計学的有意性の欠如にもかかわらず、メジアン腫瘍成長曲線は、Ａｐｏ２Ｌ．０単一療法、またはカルボプラチン＋パクリタキセル化学療法いずれかと比較して群５組み合わせでのより大きな活性を示した（図２８、上方パネル参照）。
【０３４４】
Ａｐｏｍａｂ  ７．３（群６）、カルボプラチンおよびパクリタキセルの三重組合せでの処理の結果、３／１０ＴＲ死滅がもたらされ、従って、この群はＴＧＤについては評価可能でなかった。しかしながら、メジアン腫瘍成長曲線は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単一療法、またはカルボプラチン＋パクリタキセル化学療法いずれかと比較して群６組合せでのより大きな活性を示した（図３７、上方パネル参照）。
【０３４５】
結論
本実験における比較的高い死亡率にもかかわらず、データは、Ａｐｏ２Ｌ．０およびＡｐｏｍａｂ  ７．３のいずれかが、カルボプラチンおよびパクリタキセルでの処理に対して抗腫瘍利点を付け加えることができることを示唆する。
【０３４６】
（実施例１０）
ヒトＣｏｌｏ  ２０５癌腫異種移植片モデルにおける、単一療法としての、および抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせた、モノクローナル抗体Ａｐｏｍａｂ  ７．３の抗癌活性の評価
動物
雌無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ，Ｈａｒｌａｎ）は実験の１日に７ないし８週齢であった。動物には水、および１８．０％粗製蛋白質、５．０％粗製脂肪、および５．０％粗製ファイバーよりなるＮＩＨ  ３１修飾および照射Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）を自由に与えた。マウスは、２１ないし２２℃および４０ないし６０％湿度において、１２時間の明サイクルでの静的マイクロアイソレーターにおける照射ＡＬＰＨＡ−Ｄｒｉ（登録商標）ｂｅｄ−ｏ’ｃｏｂｓ（登録商標）実験室動物ベッディングに収容した。
【０３４７】
腫瘍細胞培養
ヒトＣｏｌｏ  ２０５結腸癌腫細胞を、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸、０．２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ、および２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。培地は１０％加熱−不活化胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン、および１ｍＭ炭酸水素ナトリウムを補足した。腫瘍細胞は５％ＣＯ２および９５％空気の雰囲気中で、３７℃の湿潤化インキュベーター中の組織培養フラスコで培養した。
【０３４８】
イン・ビボ移植
移植で用いたヒトＣｏｌｏ  ２０５癌腫細胞はｌｏｇ相増殖の間に収穫し、５×１０６細胞／ｍＬにて５０％マトリゲル中に再懸濁させた。各マウスは右側腹部に１×１０６細胞（０．２ｍＬ細胞懸濁液）で皮下注射した。腫瘍を毎週２回モニターし、次いで、その容量が１００ないし３００ｍｍ３に近づくにつれて毎日モニターした。実験の１日において、動物を、１０８．０ないし２２０．５ｍｍ３の腫瘍サイズを持つ処理群、および１４９．８ｍｍ３の群平均腫瘍サイズに分類した。腫瘍の重量は、１ｍｇが１ｍｍ３の腫瘍容量と同等であると仮定して見積もることができる。
【０３４９】
テスト材料および処理
テスト材料は投与のために供した。投与溶液は４℃にて貯蔵した。
【０３５０】
マウスは群当たり１０匹のマウスにて６つの群に分類した。全ての処理は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
【０３５１】
Ａｐｏ２Ｌ．０およびそのビヒクルは、各々、１ないし５日に毎日１回投与した（ｑｄ×５）。Ａｐｏｍａｂ  ７．３およびネズミ抗ＶＥＧＦ抗体抗Ｇ６は、各々、１日に１回与えた（ｑｄ×１）。対照群１マウスはＡｐｏ２Ｌ．０のためのビヒクルで処理した。群２は６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０単一療法を受けた。群３は３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏｍａｂ  ７．３単一療法を受けた。群４は５ｍｇ／ｋｇのＢＹ４単一療法を受けた。群５および６は、各々が５ｍｇ／ｋｇの抗Ｇ６と組み合わせた、各々、６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０および３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏｍａｂ  ７．３を受けた。全ての群において、０．２ｍｌ／２０ｇマウスの投与容量を各動物の体重を基準とした。
【０３５２】
終点、サンプリングおよび統計学的解析
先の実施例８に記載したように、終点を決定し、およびサンプリングおよび統計学的解析を行った。
【０３５３】
結果
結果は図３７に示し、そこでは、上方パネル中の曲線は群メジアン腫瘍容量を示し、それに対して、下方パネル中のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットは、時間に対する、各群で残る評価可能な動物のパーセンテージを示す。
【０３５４】
対照群１マウスはＡｐｏ２Ｌ．０ビヒクルを受け、全ての処理群についての対照として供した。全ての１０匹のマウスにおける腫瘍は１５００ｍｍ３終点容量まで成長し、メジアンＴＴＥは２０．８日であった。従って、この６１−日実験における最大可能ＴＧＤは１９３％であった。
【０３５５】
群２は６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０単一療法を受けた。この処理はビヒクル対照群に対してかなり有意な抗―腫瘍活性（Ｐ＜０．００１）、および５３．６日にメジアンＴＴＥを生じた。このメジアンＴＴＥは３２．８−日のＴ−Ｃおよび１５８％ＴＧＤに対応する。５匹のマウスについての６１日におけるメジアン腫瘍容量は１，２１０ｍｍ３であった。１つのＬＴＴＦＳを記録した。
【０３５６】
群３は３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏｍａｂ  ７．３単一療法を受けた。この処理はかなり有意な活性（Ｐ＜０．００１）を生じ、最大可能１９３％ＴＧＤおよび７７６ｍｍ３のＭＴＶ（６）を伴った。１つのＬＴＴＦＳ、１つの一過性ＣＲ応答、および３つのＦＲ応答を記録した。
【０３５７】
群４は５ｍｇ／ｋｇの抗Ｇ６単一療法を受けた。この処理は、８６％ＴＧＦおよび１，２２４ｍｍ３と共にかなり有意な活性（Ｐ＜０．０１）を生じた。退行応答は記録されなかった。
【０３５８】
群５は５ｍｇ／ｋｇの抗Ｇ６と組み合わせた６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０を受けた。組合せ処理は１３８％ＴＧＤを生じた。抗腫瘍活性はビヒクル処理に対してかなり有意（Ｐ＜０．００１）であったが、双方の単一療法に対しては有意でなかった。群５において、ＭＴＶ（３）は１，０８０ｍｍ３であり、１つのＰＲ応答を記録した。
【０３５９】
群６は３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏｍａｂ  ７．３および５ｍｇ／ｋｇの抗Ｇ６での組合せ処理を受けた。この処理は最大可能１９３％ＴＧＤを生じた。抗腫瘍活性はビヒクル処理に対してかなり有意（Ｐ＜０．００１）であり、抗Ｇ６単一療法に対して有意であったが、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単一療法に対して有意でなかった。群６においては、ＭＴＶ（８）は２０８ｍｍ３であり、５つのＰＲ応答を記録した。
【０３６０】
結論
腫瘍は３ｍｇ／ｋｇ  ｑｄ×１  Ａｐｏｍａｂ  ７．３での単一療法に強く応答した（群３）。この処理はビヒクル対照群に対してかなり有意な活性、および最大可能１９３％ＴＧＤを生じた。７７６ｍｍ３のＭＴＶを持つ６１日まで生存した６匹のマウスの中で、５匹の動物は腫瘍退行を経験した。この単一療法は１つのＬＴＴＦＳ、１つの一過性ＣＲ応答、および３つのＰＲ応答を生じた。メジアン腫瘍容量は１５日後まで増大しなかった（図３７）。
【０３６１】
Ａｐｏｍａｂ  ７．３およびネズミ抗ＶＥＧＦ抗体抗Ｇ６での組合せ療法は、Ａｐｏｍａｂ  ７．３または抗Ｇ６単独いずれかで観察されたよりも強い活性を生じた。この組合せ処理は８匹の６１−日生存体を生じ、実験の最低ＭＴＶである２０８ｍｍ３を生じた。メジアン腫瘍成長曲線は、３３日まで腫瘍の低下または静止、続いての非常に遅い腫瘍成長を示す（図３７）。該組合せは抗Ｇ６単一療法よりも有意に強い活性を生じたが、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単一療法の結果とは有意に異ならなかった。加えて、該組合せは５匹のＰＲ生存体を生じ、他方、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単一療法で得られた５つの退行応答は１つの一過性ＣＲおよび１つのＬＴＴＦＳを含む。
【０３６２】
全ての療法はよく許容された。体重の喪失または他の明白な毒性は実験で観察されなかった。
【０３６３】
まとめると、Ａｐｏｍａｂ  ７．３／抗Ｇ６組合せ療法は、対応する単一療法のいずれかでの処理よりもより多い６１−日生存体およびより低いＭＴＶを生じた。しかしながら、Ａｐｏｍａｂ  ７．３／抗Ｇ６組合せは、Ａｐｏｍａｂ  ７．３単一療法で観察された治癒的活性は生じなかった。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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