(57)【要約】【課題】簡便な操作で光合成微生物に含まれる目的物質の量を測定する。【解決手段】光学測定装置１を用いた光学測定方法によれば、光合成微生物が含まれる測定対象物５０に対して光源部１０から近赤外光を照射することで検出部２０において得られた反射スペクトルに基づいて、分析部３０において、目的物質の量を算出することができる。また、上記の方法では、従来のように光合成微生物を破砕して目的物質を抽出した後にその量を測定する方法と比較して簡便な操作で測定を行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成微生物に含まれる目的物質の量を測定する光学測定方法であって、
前記光合成微生物が含まれる測定対象物に対して近赤外光を照射することで、当該測定対象物に係る拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを取得する取得工程と、
前記取得工程で得られたスペクトルに基づいて、前記目的物質の量を算出する算出工程と、
を有する光学測定方法。
【請求項２】
前記目的物質は多糖類である請求項１記載の光学測定方法。
【請求項３】
前記多糖類はグリコーゲンである請求項２記載の光学測定方法。
【請求項４】
前記取得工程において、
前記測定対象物に含まれる水分を一部除去した後に、前記測定対象物に対して近赤外光を照射する請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学測定方法。
【請求項５】
前記算出工程において、
前記拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを吸収スペクトルに変換し、当該吸収スペクトルから含有される目的物質の量を算出する請求項１〜４のいずれか一項に記載の光学測定方法。
【請求項６】
前記算出工程において、多変量解析を用いる請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学測定方法。
【請求項７】
前記取得工程で得られたスペクトルがハイパースペクトルである請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学測定方法に関するものであり、特に、光合成微生物が含まれる測定対象物について光学的に測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、光合成微生物を利用したバイオエネルギーの生産に対する関心が高まっている。特に、微細藻類は光を利用してＣＯ２から糖質エネルギーを生産することが可能であると共に、水生であるために食糧や土地利用との競合を回避することもできるため、バイオエネルギー生産のための有望な生体システムとして注目されている。バイオエネルギー生産に微細藻類を活用する方法としては、例えば、微細藻類が産生した多糖類を酵素分解することでエタノールを得る方法等が挙げられ、種々の検討が行われている（例えば、非特許文献１〜４等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Yoshihiro Izumi, Shimpei Aikawa, Fumio Matsuda, Tomohisa Hasunuma, AkihikoKondo “Aqueous size-exclusion chromatographic method for the quantification ofcyanobacterial native glycogen” Journal of Chromatography B, 930(2013) 90-97
【非特許文献２】Sang-Ho Yoo, Martin H. Spalding, Jay-lin Jane “Characterization ofcyanobacterial glycogen isolated from the wild type and from a mutant lackingof branching enzyme” Carbohydrate Research 337(2002) 2195-2203
【非特許文献３】Takashi Osanai, Akira Oikawa, Miyuki Azuma, Kan Tanaka, KazukiSaito, Masami Yokota Hirai, Masahiko Ikeuchi “Genetic Engineering of Group 2Factor SigE Widely Activates Expressions of Sugar Catabolic Genes inSynechocystisSpecies PCC 6803” The Journal ofBiological Chemistry 286(2011) 30962-30971
【非特許文献４】Yuki Yamauchi, Yuki Kaniya, Yasuko Kaneko, Yukako Hihara “PhysiologicalRoles of the cyAbrB Transcriptional Regulator Pair Sll0822 and Sll0359 inSynechocystis sp. strain PCC 6803”Journal of Bacteriology, 193(2011) 3702-3709
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のようにバイオエネルギー生産に光合成微生物を適用する場合、バイオエネルギーに活用するための物質の生産量の確認を目的として、光合成微生物の培養状況を何らかの方法で把握する必要がある。しかしながら、光合成微生物の培養状況の指標となる物質（目的物質）は光合成微生物の細胞中に存在するため、細胞を破砕して目的物質を抽出した上でその量を測定する必要があった。また、目的物質を細胞から抽出するためには、種々の煩雑な作業が必要でもあった。
【０００５】
本発明は上記を鑑みてなされたものであり、簡便な操作で光合成微生物に含まれる目的物質の量を測定することが可能な光学測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、光合成微生物が含まれる測定対象物に対して近赤外光を照射することで得られる拡散反射スペクトル又は透過スペクトルが測定対象物中の光合成微生物に含まれる目的物質の量に応じて変化することを見出し、本願発明を完成させるに至った。得られた拡散反射スペクトル又は透過スペクトルに基づいて目的物質の量を算出することで、測定対象物中の光合成微生物に含まれる目的物質の量を算出することが可能であることを見出した。また、上記の方法では、従来のように光合成微生物を破砕して目的物質を抽出した後にその量を測定する方法と比較して簡便な操作で測定を行うことができる。
【０００７】
すなわち、本発明に係る光学測定方法は、光合成微生物に含まれる目的物質の量を測定する光学測定方法であって、前記光合成微生物が含まれる測定対象物に対して近赤外光を照射することで、当該測定対象物に係る拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを取得する取得工程と、前記取得工程で得られたスペクトルに基づいて、前記目的物質の量を算出する算出工程と、を有することを特徴とする。
【０００８】
また、目的物質は多糖類である場合、目的物質の量の測定を精度よく行うことができることが確認された。さらに、多糖類はグリコーゲンである場合に本発明に係る光学測定方法を好適に用いることができる。
【０００９】
また、前記取得工程において、前記測定対象物に含まれる水分を一部除去した後に、前記測定対象物に対して近赤外光を照射する態様とすることができる。水分を一部除去した後に近赤外光を照射して拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを取得することで、得られたスペクトルにおける水分の影響を減らすことができ、より高い精度で目的物質の量を測定することが可能となる。
【００１０】
また、前記算出工程において、前記拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを吸収スペクトルに変換し、当該吸収スペクトルから含有される目的物質の量を算出する態様とすることで、吸収スペクトルへの変換の際にベースラインに係る補正を行うことができるため、より高い精度で目的物質の量を測定することが可能となる。
【００１１】
さらに、前記算出工程において、多変量解析を用いる態様とすることができる。このように多変量解析を用いてスペクトルから目的物質の量を算出することで、目的物質の量を測定することが可能となる。
【００１２】
また、前記取得工程で得られたスペクトルがハイパースペクトルである態様とすることができる。このような構成とすることで、測定対象物からのスペクトルの取得をより好適に行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡便な操作で光合成微生物に含まれる目的物質の量を測定することが可能な光学測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係る光学測定装置の概略構成図である。
【図２】化学測定によるグリコーゲン濃度が既知の測定対象物に係る吸収スペクトルである。
【図３】化学測定によるグリコーゲン濃度と、吸収スペクトルから算出したグリコーゲン濃度との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１６】
本発明に係る光学測定方法を実施する光学測定装置について説明する。図１は、本実施形態に係る光学測定装置１の構成を示す図である。図１に示される光学測定装置１は、測定台４０上に配置された測定対象物５０に近赤外光を照射し、その拡散反射光を検出部２０で検出することで、測定対象物５０に係る測定を行う装置であり、光源１０と、検出部２０と、分析部３０と、測定台４０と、を備える。
【００１７】
この光学測定装置１により測定が行われる測定対象物５０は、例えば、水溶液、ペレット、粉末等であって、この測定対象物５０には光合成微生物が含まれる。光合成微生物としては、例えば、藍藻（シアノバクテリア）、珪藻、緑藻等の微細藻類が挙げられる。本実施形態に係る光学測定装置１は、測定対象物５０に含まれた光合成微生物における多糖類の量を測定することで、光合成微生物の培養状況を確認することを測定の目的の１つとしている。
【００１８】
なお、光合成微生物として挙げられる微生物は培養槽等の水中で生存するため、光合成微生物を培養槽から取り出したものを測定対象物５０とすると、水分が多量に含まれる。したがって、少なくとも一部の水分を除去し、測定対象物５０に含まれる水分の割合を小さくすることが好ましい。図１では、光合成微生物が含まれる液体をろ紙によって濾すことで光合成微生物がろ紙表面に回収されたものを測定対象物５０としている。
【００１９】
光源１０は、近赤外光を測定対象物５０が配置される領域に対して照射する。光源１０としては、ハロゲンランプ等を用いることができる。また、種光源及び非線形媒質を備え、種光源から出射される光を非線形媒質に入力し、非線形媒質中における非線形光学効果によりスペクトルを広帯域に広げてスーパーコンティニウム（ＳＣ）光として出力するＳＣ光源を光源１０として用いることもできる。ＳＣ光源を光源１０として用いた場合、ハロゲンランプと比較してＳＣ光源による加熱が低減されるため、光合成微生物が含まれる測定対象物５０の測定に好適に用いられる。さらに、光源１０は強度を変調する機能を有していてもよい。
【００２０】
なお、本実施形態において光源１０が照射する近赤外光とは、波長範囲が８００ｎｍ〜２５００ｎｍの光である。本実施形態では、１０００ｎｍ〜２４００ｎｍの波長範囲で測定を行うことが好ましい。
【００２１】
検出部２０は、光源１０から照射される近赤外光が測定対象物５０の表面で拡散反射された後に検出部２０の配置される方向へ出力された光を拡散反射スペクトルとして検出する。検出した拡散反射スペクトルの情報は分析部３０へ送られる。検出部２０としては、例えば、水銀、カドミウム及びテルルからなるＭＣＴ検出器、ＩｎＧａＡｓ検出器等を用いることができる。
【００２２】
また、検出部２０は、ハイパースペクトル画像を取得するハイパースペクトルセンサであってもよい。一画素がＮ個の波長データにより構成されている画像であり、画素毎にそれぞれ複数の波長に対応した反射強度データからなるスペクトル情報が含まれている。すなわち、ハイパースペクトル画像は、画像を構成する画素毎に、それぞれ複数波長の強度データを持つという特徴から、画像としての二次元的要素と、スペクトルデータとしての要素をあわせ持った三次元的構成のデータである。なお、本実施形態では、ハイパースペクトル画像とは、１画素あたり少なくとも５つの波長帯域における強度データを保有している画素によって構成された画像のことをいう。以下の実施形態では、検出部２０がハイパースペクトルセンサである場合について説明をする。
【００２３】
分析部３０は、検出部２０から送られる拡散反射スペクトルの情報を受け取り、演算処理等を行う。分析部３０により、吸収スペクトルの導出、拡散反射スペクトルの２階微分スペクトルの導出、吸収スペクトルの２階微分スペクトルの導出等が行われる。さらに、光合成微生物に係る評価を行うための統計処理等が分析部３０において行われる構成としてもよい。また、検出部２０がハイパースペクトルセンサである場合、各画素に係るスペクトルの情報が分析部３０に対して送られるので、分析部３０においてこれらのスペクトル情報についての演算を行う構成とすることもができる。
【００２４】
測定台４０は、測定対象物５０となる食品を配置する台である。この測定台４０は、光源１０から照射する近赤外光を透過する材料からなることが好ましい。
【００２５】
上記の構成を有する光学測定装置１による光学測定方法には、光合成微生物が含まれる測定対象物に対して近赤外光を照射することで、当該測定対象物に係る拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを取得する取得工程と、取得工程で得られたスペクトルに基づいて、目的物質の量を算出する算出工程と、が含まれる。具体的には、光源１０から測定対象物５０へ向けて近赤外光Ｌ１が照射される。光源１０から照射された近赤外光Ｌ１は、測定対象物５０へ入射する。測定対象物５０で拡散反射した近赤外光のうち、光路Ｌ３方向に進む光は、検出部２０へ到達する。検出部２０では拡散反射スペクトルが取得される（取得工程）。検出部２０で得られた拡散反射スペクトルは、分析部３０へ送られ、分析部３０において、目的物質の量の算出に係る処理が行われる（算出工程）。なお、光合成微生物に含まれる目的物質としては、例えば、多糖類又は油脂が挙げられる。その中でも多糖類に好適に用いられ、さらに、多糖類の一つであるグリコーゲンは近赤外光の照射により得られるスペクトルからその量を好適に算出することができる。
【００２６】
ここで、測定対象物５０として光合成微生物が含まれるものを用いて、多糖類の一種であるグリコーゲンの含有量を測定した例について、図２及び図３を用いて説明する。
【００２７】
図２では、グリコーゲンを生成する微細藻類の一種であるA. platensisが混合された液体から水分を一部除去した後に測定対象物５０として測定をすることで得られた吸収スペクトルを示している。図２に示す吸収スペクトルは、グリコーゲン含有量が異なる複数種類の光合成微生物を含む培養液をそれぞれろ過したものを測定対象物５０として準備し、この測定対象物５０の拡散反射スペクトルを測定した。そして測定結果から吸収スペクトルを導出し、グリコーゲン含有量に応じたピークの変化を調べたものである。測定対象物５０は、具体的には以下の方法で準備した。すなわち、育成中の微細藻を培養槽から取り出し、ろ紙で濾すことで微細藻の周辺の水分を除去し、さらにろ紙とろ紙上の光合成微生物とを乾燥させたものを測定対象物５０として準備した。準備した測定対象物５０におけるグリコーゲン含有量（濃度）はそれぞれ３．９４、６．０４、７．２９、８．２８、２６、２６．７（光合成微生物に対する重量％）であり、測定波長は１２００ｎｍ〜２２００ｎｍの範囲とした。図２に示す吸収スペクトルは、ハイパースペクトルセンサである検出部２０から送られてくる画素毎のスペクトルデータについて分析部３０で平均を求めたもの、すなわち全画素平均の吸収スペクトルを示している。
【００２８】
図２に示すように、波長１６３０ｎｍ、１８４０ｎｍ、及び２１００ｎｍ付近においてグリコーゲン濃度に応じて吸光度が大きくなるピークがあることが確認された。したがって、グリコーゲン濃度とこれらのピークにおける吸光度との対応関係を予め求めておくことで、グリコーゲン濃度が未知の試料について、近赤外光による吸収スペクトルを取得し、上記の特定の波長付近における吸光度に基づいて試料のグリコーゲン濃度を算出する構成を実現することができる。
【００２９】
次に、従来の方法により測定されたグリコーゲン濃度と、吸収スペクトルに基づいて算出されたグリコーゲン濃度との対応関係について検討した結果を図３に示す。具体的には、図２での吸収スペクトルの取得に用いた測定対象物５０（グリコーゲン濃度が３．９４、６．０４、７．２９、８．２８、２６、２６．７の５種類であり、これらの濃度は従来の化学処理により求められた濃度である。）のハイパースペクトル画像を取得後、画素毎に吸収スペクトルを求め、各吸収スペクトルにおける波長１６３０ｎｍ、１８４０ｎｍ、及び２１００ｎｍ付近のピークの吸光度からグリコーゲン濃度を算出した結果を示した。図３では横軸が従来の方法である化学処理により求められたグリコーゲン濃度であり、縦軸が近赤外光を照射することにより得られた吸収スペクトルのピークの吸光度から算出したグリコーゲン濃度である。図３では、各画素の結果を全てプロットした後、プロットされたデータから重回帰分析を行い、１次関数で近似をした結果を示している。
【００３０】
図３に示すように、化学測定により得られたグリコーゲン濃度が高い測定対象物５０ほど、各画素にて得られた吸収スペクトルから算出されるグリコーゲン濃度も高くなり、化学測定により求められるグリコーゲン濃度と、吸収スペクトルから算出されるグリコーゲン濃度との間で高い相関があることが確認された。
【００３１】
すなわち、上記の光学測定装置１を用いた光学測定方法によれば、光合成微生物が含まれる測定対象物５０に対して光源部１０から近赤外光を照射することで検出部２０において得られた拡散反射スペクトルに基づいて目的物質の量を算出することができる。また、上記の方法では、従来のように光合成微生物を破砕して目的物質を抽出した後にその量を測定する方法と比較して簡便な操作で測定を行うことができる。
【００３２】
バイオエネルギーに活用するための物質の生産を目的として光合成微生物を培養する場合、培養期間は概ね十数日である。本実施形態に係る光学測定方法を用いて光合成微生物の培養状況をグリコーゲンの量を指標として確認をする場合、ほぼリアルタイムで状況の確認を行うことができる。さらに、このようにほぼリアルタイムで培養状況の確認を行うことができる場合、グリコーゲンの量、すなわち、光合成微生物の培養状況に応じて、培養条件のフィードバック制御が可能となるため、培養条件をより好適な方向へ導くことができる。
【００３３】
また、上記の光学測定方法では、測定対象物５０に含まれる水分をろ紙を用いて一部除去した後に、測定対象物５０に対して近赤外光を照射する態様とされている。このように、水分を一部除去した後に近赤外光を照射して拡散反射スペクトル又は透過スペクトルを取得することで、得られたスペクトルにおける水分の影響を減らすことができ、より高い精度で目的物質の量を測定することが可能となる。また、光合成微生物は表面を乾燥しても死滅しないことから、ろ紙を用いて水分を除去した上でスペクトルを取得する処理を行ったとしても、光合成微生物を培養槽に戻すことで培養を継続することができる。
【００３４】
なお、水分を除去する方法は、ろ紙を用いたろ過に限定されず、例えば培養槽内に光合成微生物が集合した領域を形成し、その領域から光合成微生物を取り出して測定を行う等の方法を用いることもできる。また、測定対象物５０から水分が除去されたほうが得られたスペクトルにおける水分の影響を低減することができるが、水分の除去に時間がかかる場合、目的物質の測定に係る時間（特に測定対象物５０の準備にかかる時間）が長くなる。
【００３５】
また、上記の光学測定方法では、算出工程において、拡散反射スペクトルを吸収スペクトルに変換し、吸収スペクトルから目的物質の量を算出する態様としている。このような態様とすることで、吸収スペクトルへの変換の際にベースライン成分の除去等のベースラインに係る補正を行うことができるため、より高い精度で目的物質の量を測定することが可能となる。
【００３６】
さらに、算出工程においては、多変量解析の一つである重回帰分析を用いる態様とすることで、目的物質の量をより高い精度にて目的物質の量の算出することが可能となる。なお、算出工程において用いることができる多変量解析としては、重回帰分析のほかに、主成分分析等が挙げられる。
【００３７】
以上、本発明における好適な実施形態を具体的に示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、種々の変更が可能である。例えば上記実施形態では、拡散反射スペクトルを吸収スペクトル変換した後に目的物質の量を算出する構成について説明したが、拡散反射スペクトルではなく透過スペクトルを取得して、透過スペクトルから吸収スペクトルを算出して、目的物質の量を算出する構成としてもよい。
【００３８】
また、上記では、吸収スペクトルを用いて評価を行ったが、拡散反射スペクトル（又は透過スペクトル）から直接目的物質の量を算出する構成としてもよい。さらに、吸収スペクトル、拡散反射スペクトル、透過スペクトルのいずれかの２階微分スペクトルを求めた後にこれを用いて目的物質の量を算出する構成としてもよい。すなわち、近赤外光を照射して得られるスペクトルから目的物質の量を算出する方法については種々の手法を用いることができる。
【００３９】
また、上記実施形態において、光源１０が照射する近赤外光の波長範囲は適宜変更することができる。例えば、特定の異物の検出や、食品中の特定の成分の成分量の測定を目的として、光源１０から照射する近赤外光の波長範囲を短くすることのほか、複数の波長範囲を選択して測定することもできる。なお、波長範囲を短くする場合は、吸収ピークを有すると考えられる波長の前後少なくとも１００ｎｍの範囲の近赤外光を照射することによって、より正確な測定を行うことができる。
【符号の説明】
【００４０】
１…光学測定装置、１０…光源、２０…検出部、３０…分析部、４０…測定台、５０…測定対象物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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