(57)【要約】 【課題】  対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出できる、検出薄層上の光学干渉現象を用いる測色装置を提供すること。【解決手段】  本発明は対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する測色装置に関する。この装置（１）は（ｉ）基板（２）と、（ｉｉ）前記対象ポリマを含む透明検出層とを含む。この検出層（３）は、一方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに初期厚さｅを維持し、他方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を示すように構成され、前記透明検出層（３）の前記初期厚さｅ及び／又は前記第２の厚さｅ’は前記検出層（３）の界面（４、５）で反射された光ビームを再結合することにより生じる光学干渉現象により色を生じるように構成される。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する測色装置（１）であって、
（ｉ）少なくとも一つの上面（２ａ）により区切られる基板（２）と、（ｉｉ）初期厚さｅを有し、前記対象ポリマを含む透明検出層（３）とを備え、
前記透明検出層（３）は一方では前記対象水溶液を塗布して空気と検出層（３）間の第１の界面（４）を形成することを目的とする上面（３ａ）と、他方では基板（２）の前記上面（２ａ）に形成されて検出層（３）と基板（２）間の第２の界面（５）を一緒に形成する下面（３ｂ）とを含み、
前記第１の界面（４）と前記第２の界面（５）は光学反射現象を生じるように構成され、
前記検出層（３）は、一方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに前記初期厚さｅを維持し、他方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を示すように構成され、
それにより、前記透明検出層（３）の前記初期厚さｅ及び／又は前記第２の厚さｅ’は前記第１の界面（４）と前記第２の界面（５）で反射された光ビームを再結合することにより生じる光学干渉現象により色を生じるように構成される
ことを特徴とする測色装置。
【請求項２】
前記検出層（３）の前記初期厚さｅは光学干渉現象により第１の色を生じるように選択され、前記検出層は、一方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに前記第１の色を生じる前記初期厚さｅを維持し、他方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を示し、光学干渉現象により前記第１の色とは異なる第２の色を生じ、あるいは前記第１の色を消滅させるように構成される
ことを特徴とする請求項１に記載の測色装置。
【請求項３】
前記透明検出層（３）の前記初期厚さｅは７０ないし９００ｎｍの厚さの範囲から選択される均一の厚さであることを特徴とする請求項１又は２何れか一つに記載の測色装置。
【請求項４】
前記透明検出層（３）の前記初期厚さｅ及び／又は前記第２の厚さｅ’は３８０ｎｍないし７８０ｎｍの波長で最大反射率を有する光学干渉現象により色を生じるように構成されることを特徴とする請求項１ないし３の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項５】
前記透明検出層（３）は１．２ないし１．７、好ましくは１．４ないし１．６の屈折率ｎｃを有することを特徴とする請求項１ないし４に記載の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項６】
前記透明検出層（３）に含まれる前記ポリマはバイオポリマの中から選択されることを特徴とする請求項1ないし５の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項７】
前記基板（２）は透明であり、前記透明検出層（３）は前記基板（２）の屈折率ｎｓとは異なる屈折率ｎｃを有することを特徴とする請求項1ないし６の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項８】
前記基板（２）は不透明であり、反射性上面（２ａ）を有することを特徴とする請求項1ないし６の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項９】
前記透明検出層（３）に含まれるポリマは固定化された状態であることを特徴とする請求項1ないし８の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項１０】
前記透明検出層（３）は前記対象ポリマと水素架橋ネットワークを形成するナノ結晶を含むことを特徴とする請求項９に記載の測色装置。
【請求項１１】
前記ナノ結晶は多糖ナノ結晶、好ましくはセルロースナノ結晶から成ることを特徴とする請求項１０に記載の測色装置。
【請求項１２】
前記ナノ結晶は負表面電荷を有し、前記透明検出層（３）はそれぞれ前記対象ポリマを含む少なくとも二つの副層（６）から成り、前記副層（６）はポリカチオン性化合物を含む挿入された副層（７）により対として分離されることを特徴とする請求項１０又は１１の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項１３】
前記透明検出層（３）はそれぞれ少なくとも一つの対象ポリマを含む少なくとも一対の二つの副層（６、７）から成り、第１の副層（６）は一つ又はいくつかの第１の対象ポリマを備え、第２の副層（７）は一つ又はいくつかの第２の対象ポリマを含むことを特徴とする請求項１０又は１１の何れか一つに記載の測色装置。
【請求項１４】
前記透明検出層（３）は前記対象ポリマと共有結合架橋ネットワークを形成する樹脂を含むことを特徴とする請求項９に記載の測色装置。
【請求項１５】
対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する方法であって、少なくとも以下のステップを含む方法。
請求項１ないし１４の何れか一つに記載の測色装置（１）を設けるステップと、
前記対象水溶液を前記透明検出層（３）の上面（３ａ）に塗布するステップと、
前記透明検出層（３）の前記上面（３ａ）を洗浄するステップと、
前記透明検出層（３）を乾燥するステップと、
前記対象溶液の塗布個所において前記透明層（３）の色を分析するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマ、好都合にはバイオポリマ型ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する測色装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの技術及び産業分野において、ポリマに関する加水分解活性を有する酵素の同定及び研究は大きな課題となっている。
【０００３】
例えば、そのような加水分解酵素はリグノセルロース要素に富むバイオマスからバイオ燃料を生成する重要な手段である。より詳細には、植物細胞壁は交じり合ったポリマ（セルロース、ヘミセルロース、リグニン、ペクチン等）を含む複雑な構造であり、加水分解酵素は好都合には、セルロース鎖を、バイオエタノールを生成するために発酵することを目的とする糖類に分解するために使用される。
【０００４】
このために、ポリマ又はポリマの組合せに関して対象酵素又は対象酵素の組合せの加水分解活性を高速、単純かつ信頼性のある方法で検出を可能にする技術的装置を使用することは興味深い。
【０００５】
酵素活性を明らかにするために化学反応を使用する専用測色装置を実施することが特に一般的である。これを達成するために、これらの化学測色装置は着色剤又は化学検出指示薬を使用する。
【０００６】
例えば、多糖加水分解酵素の活性を定量するために古典的に使用される一つの化学的方法は「ネルソン法」という名で知られている（詳細には非特許文献１に述べられる）。
【０００７】
一つ又はいくつかのポリマに対して加水分解活性を検出する測色装置は使用するにはしばしば複雑であり、多くの操作と試薬を必要とし、一般的に読み取り装置（例えば分光器）の使用を必要とする。
【０００８】
対象媒体中の検体の存在を検出するために、いくつかの測色装置は周知の光学現象である干渉を使用する。
【０００９】
これらの装置はそのために支持基板に塗布された少なくとも一つの透明薄膜又は一つの透明薄層を備える。
【００１０】
この透明薄膜の厚さは「干渉の色」又は「干渉色」としても知られる光学干渉現象により特定の色の出現を可能にする値の範囲内にある。
【００１１】
この現象は、入射ビームの一部が空気／薄膜界面で反射され、一方入射ビームの別の部分が屈折し、次いで第２の薄膜／基板界面で反射されるという事実により説明される。
【００１２】
両反射ビームは相互作用して光波間の結合である光学干渉現象を生じ、これは強め合う干渉と弱め合う干渉のどちらかである。
【００１３】
結果として生じる色は強め合う干渉現象が最大となる波長に相当する。
【００１４】
例えば、このタイプの装置は特に有機蒸気を検出することを目的とする特許文献１に述べられている。
【００１５】
対応する装置はこのために三つの重畳層、すなわち反射基板と、検体を吸収でき、検体に曝されると光学的厚さを変化できる検出層と、上側半反射層とを含む。
【００１６】
実際には、対象検体は多孔質により反射基板を通過した後に吸着により検出層に触れる。この現象はこの検出層の厚さの変化、また当然の結果としてその干渉色の変化を生じる。
【００１７】
そのような装置は検体を検出層に固定化するための検体の検出を可能にし、この装置とその実施方法は検体タイプの検出を可能にする。
【００１８】
特許文献１による装置は検体の生物活性に従って検体を検出することを目的としていない。
【００１９】
加えて、先行実施例のこの装置は決して、対象溶液内の酵素活性の機能的検出の実施用に設計されてはいず、それに適してさえいない。詳細には、上側半反射層は、酵素による分解を受けた検出層の特にリンスによる除去に対する障害となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３１７６０号パンフレット
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Nelsonet al., J. Biol. Chem. 1944, 153, 375-380
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出できる、検出薄層上の光学干渉現象を用いるそのような測色装置の必要性がある。
【００２３】
文献米国特許出願公開第２０１０／０６８７４９号明細書は一定の天然産物、例えば食料品の寿命及び／又は品質を分析するそのような測色装置を述べている。
【００２４】
この測色装置は重畳層、すなわち基板、反射器、生分解性ポリマ層及びミラーから成る。
【００２５】
この測色装置は、生分解性ポリマ層の厚さの変化が肉眼に見える色の変化を生じて酵素活性の存在を表すように構成される。
【００２６】
このために、生分解性ポリマ層は生体分子、特に酵素又は触媒代謝物により分解可能なポリマで出来ており、ミラーはナノ粒子層から成る。
【００２７】
しかしながらこの測色装置は十分に満足のいくものではなく、この特定の重畳層、詳細にはナノ粒子に基づくミラー層の存在は比較的製造するのに複雑である。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
この状況において、出願人は対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を単純、高速かつ高感度に検出できる測色装置を開発した。
【００２９】
このために、本発明による装置は酵素活性を検出するための干渉フィルタを形成する透明薄層（又は透明薄膜）を使用することに基づいている。
【００３０】
この検出層は、所望の加水分解酵素活性を備える水溶液に曝されたときに状況に従って変化、出現又は消滅する干渉色を生じ得る。
【００３１】
このために、本発明によるこの測色装置は、それが（ｉ）少なくとも一つの上面により区切られる基板と、（ｉｉ）初期厚さｅを有し、前記対象ポリマを含む透明検出層とを備えることを特徴とする。前記透明検出層は一方では前記対象水溶液を塗布して第１の空気／検出層界面を形成することを目的とする上面と、他方では基板の前記上面に形成されて第２の検出層／基板界面を一緒に形成する下面とを含む。前記二つの界面は、光学反射現象を生じる傾向がある。
前記検出層は、一方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに前記初期厚さｅを維持し、他方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を示すように構成され、前記透明検出層の前記初期厚さｅ及び／又は前記第２の厚さｅ’は前記空気／検出層界面と検出層／基板界面で反射された光ビームを再結合することにより生じる光学干渉現象により色を生じるように構成される。
【００３２】
好ましい実施例によれば、前記検出層の前記初期厚さｅは光学干渉現象により第１の色を生じるように選択され、前記検出層は、一方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに前記第１の色を生じる前記初期厚さｅを維持し、他方では、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を示し、光学干渉現象により前記第１の色とは異なる第２の色を生じ、あるいは前記第１の色を消滅させるように構成される。
【００３３】
組み合わせて考えても、互いに独立に考えてもよい発明の他の好都合な特徴は以下に明記される。すなわち、
透明検出層の前記初期厚さｅは７０ないし９００ｎｍ、好ましくは７５ないし２５０ｎｍの厚さの範囲から選択された均一厚さであり、
前記透明検出層の初期厚さｅ及び／又は第２の厚さｅ’は３８０ｎｍないし７８０ｎｍ、好ましくは４００ｎｍないし７００ｎｍの波長で最大反射率を有する光学干渉現象により色を生じ、
前記透明検出層の屈折率ｎｃは１．２ないし１．７、好ましくは１．４ないし１．６であり、
上側検出層に含まれるポリマはバイオポリマの中から、すなわち好都合には、オリゴ糖、多糖、ペプチド、蛋白質、リグニン、核酸、角皮素及び／又はコルク質から選択される。
【００３４】
特定の実施例によれば、前記基板は透明であり、透明検出層は基板屈折率ｎｓとは異なる屈折率ｎｃを有する。この場合、基板の屈折率ｎｓは好都合には透明検出層の屈折率ｎｃより大きい。
【００３５】
代替実施例によれば、前記基板は不透明であり、反射性上面を有する。
【００３６】
発明のなおもう一つの特性によれば、前記透明検出層に含まれるポリマは好ましくは酵素活性が消失した対象溶液の塗布に耐えるように固定化される。
【００３７】
この場合、上側検出層は好都合には、前記対象ポリマと水素架橋ネットワークを形成する（角質化）ナノ結晶を含む。
【００３８】
好ましくは、前記ナノ結晶は好都合には多糖ナノ結晶、好ましくはセルロースナノ結晶から成る。
【００３９】
対応するナノ結晶は好都合には負表面電荷を有する。また透明検出層はそれぞれ対象ポリマを含む少なくとも二つの第１の副層から成り、前記第１の副層はポリカチオン性化合物を含む挿入された副層により対として分離される。
【００４０】
一つの特定の実施例において、透明検出層はそれぞれ少なくとも一つの対象ポリマを含む少なくとも一対の二つの副層（好ましくは少なくとも二対の二つの重畳副層）から成り、第１の副層は第１又はいくつかの第１の対象ポリマ（好都合には多糖ナノ結晶）を備え、第２の副層は第２又はいくつかの第２の対象ポリマを含む。
【００４１】
この場合も、代替案として、透明検出層は好都合には対象ポリマと共有結合架橋ネットワークを形成する樹脂を含む。
【００４２】
この発明はまた対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する方法に関する。
【００４３】
この方法は少なくとも以下の一連のステップを含むことを特徴とする。すなわち、
上に定義された測色装置を設けるステップと、
前記対象水溶液を前記透明検出層の上面に塗布するステップと、
前記透明検出層の前記上面を洗浄して前記対象水溶液を除去するステップと、
前記透明検出層を乾燥するステップと、
前記対象溶液の塗布個所において前記透明検出層の色を分析するステップと
である。
【００４４】
この発明はまた対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する、上に定義された測色装置の使用法に関する。
【００４５】
この発明は添付図に関連する以下の説明により決して限定されることなくさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】対象水溶液の塗布前の本発明による測色装置の模式的立面図である。
【図２】加水分解酵素活性を備える対象水溶液の塗布後の図１による測色装置を示す。
【図３】対象水溶液の塗布前のいくつかの副層から成る検出薄層を備える測色装置の模式的立面図である。
【図４】加水分解酵素活性を備える対象水溶液の塗布後の図３による測色装置である。
【図５】セルロースとキシログルカンに基づく検出層に対する分解前（点線）後（実線）の干渉曲線を表わし、これらの曲線は波長（ｎｍ）依存の反射率に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
この発明は従って対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する測色装置に関する。
【００４８】
用語「検出」は対象水溶液中の加水分解酵素活性の存在の有無を判別することを指す。
【００４９】
代替又は補足的に、加水分解酵素活性の「検出」は対象水溶液中の定量的酵素活性値を決定することにある。
【００５０】
この「定量値」は毎秒１モルの基質の変化に触媒作用を及ぼす酵素量であるカタール（ｋａｔ）で表わすことができる。
【００５１】
この「定量値」は以下として表わすこともできる。すなわち、
毎分１μモルの基質の変化に触媒作用を及ぼす酵素量に対応する「国際単位」（ＩＵ）、
毎秒酵素分子当たりの変化される基質分子数（又は酵素モル当たりの変化される基質モル数）である「回転数」（ｋｃａｔ）、
毎分酵素モル当たりの変化される基質モル数である「モル活性」、
ＩＵ／ｍｇ酵素たんぱく質（又はμｋａｔ／ｍｇ）で表わされる酵素たんぱく質のミリグラム当たりの「比活性度」。
【００５２】
用語「検出」はさらに対象水溶液中の前記加水分解酵素活性を含む活性酵素の存在の有無を判別することを指す。
【００５３】
「加水分解酵素活性」は生化学加水分解反応に触媒作用を及ぼす加水分解酵素型酵素により実施される仕組みを指す。
【００５４】
このような加水分解反応を実施し易い酵素は詳細には、「ＥＣ」（「Enzyme Commission numbers（酵素番号）の略」−「Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)」）として知られる命名法のＥＣ３グループに分類される。
【００５５】
加水分解酵素型酵素の内、バイオポリマに対して加水分解活性を有する酵素に言及されてもよい。
【００５６】
バイオポリマを加水分解できるこれらの酵素の内、詳細には配糖体又はグリコシダーゼ加水分解酵素（これらの酵素は好都合にはＥＣ３．２．１に分類される）としても知られる多糖加水分解酵素に言及されてもよい。
【００５７】
用語「多糖加水分解酵素」は例えばキシラナーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、及びＣｅｌｌｕｌｙｖｅ（登録商標）を指す。
【００５８】
バイオポリマ加水分解酵素の内、例えばプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、及びリグニアーゼにも言及されてもよい。
【００５９】
「対象水溶液」はいくつかの化学種、すなわち、少なくとも（ｉ）実質的に水、好ましくは全て水から成る溶媒、及び（ｉｉ）「溶液」と呼ばれる溶液又は懸濁液状の一つ又はいくつかの化合物を含む液相から成る。
【００６０】
溶液又は懸濁液状の前記化合物の少なくとも一つは前記加水分解酵素活性を備える水溶液に対して前記活性を生じることができる活性酵素から成る。
【００６１】
酵素活性が望まれるポリマの例は以下に挙げられる。
【００６２】
本発明による測色装置１が図１に模式的に示される。
【００６３】
この測色装置１は二つの重畳層、すなわち（ｉ）担体の役目をして上面２ａで区切られる基板２、及び（ｉｉ）対象ポリマを備え、「ｎｃ」と表示される屈折率を有する透明検出層３を備える。
【００６４】
一般的に言えば、本明細書において、与えられた屈折率は２０℃の温度と５２０ｎｍの波長に適用される。
【００６５】
透明検出層３は二つの対向面、すなわち（ｉ）前記水溶液又は対象水溶液を塗布することを目的とする上面３ａと、（ｉｉ）基板２の前記上面２ａに形成される下面３ｂとにより区切られる。
【００６６】
透明検出層３の上面３ａは好都合には、決して付加的層（例えばナノ粒子層）で覆われないという点で自由である。
【００６７】
検出層３のこれら二つの面３ａと３ｂ間の距離は前記透明検出層３の厚さを定める。この透明検出層３は初期は、「ｅ」と称される初期厚さを含む（図１）。
【００６８】
これらの層２及び３は一緒に、検出層３のそれぞれ上面３ａと下面３ｂにおいて二つの光学界面、すなわち、
空気と検出層３間に位置する第１の界面４（屈折面を形成する）、及び
検出層３と基板２間の第２の界面５
を形成する。
【００６９】
本発明によれば、透明検出層３は試験される水溶液中の対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出できるように構成される。この検出層３は前記検出された加水分解酵素活性を光学信号に変換する手段である。
【００７０】
このために、透明検出層３は、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を消失しているときに前記初期厚さｅを維持するように構成される（図１）。この透明検出層３はまた、前記対象水溶液の塗布後、それが前記加水分解酵素活性を含むときに前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’を有するように構成される（図２）。
【００７１】
従って、対象水溶液中の加水分解酵素活性の存在は検出層３の厚さの減少（初期厚さｅから第２の厚さｅ’への）を生じ、この透明検出層３における観測可能な（オペレータにより直接、あるいは適当な装置を用いて）着色の変化をもたらす。
【００７２】
これを達成するために、透明検出層３の初期厚さｅ及び／又は透明検出層３の第２の厚さｅ’は光学干渉現象により色を発生させることができる。
【００７３】
以下に展開されるように、装置１のこれらの特性は対象酵素活性の存在下で検出層３において光学的変化が観測されることを可能にするであろう。
【００７４】
好都合には、この光学的変化は以下の現象の内の一つである。すなわち（ｉ）第１の干渉色から第２の干渉色への変化、又は（ｉｉ）干渉色の出現、又は（ｉｉｉ）干渉色の消失である。
【００７５】
実際、透明検出層３は干渉フィルタとして働く。その厚さｅ又はｅ’に応じて、透明検出層３は、好都合には可視域のいくつかの特定波長に対して光学反射及び干渉現象（強め合う／弱め合う）により色を帯びる。
【００７６】
より詳細には、光が第１の界面４（空気／検出層３）に当たったときに、ビームの一部は反射される。光の他の部分は検出層３を透過し、そこでそれは第２の界面５（検出層３／基板２）で反射される。
【００７７】
第２の界面５で反射されたビームはより長い距離を移動して光の位相ずれを生じる。移動距離が入射光の半波長の桁にあるときは、反射ビームの再結合は干渉を生じて検出層３での色の出現をもたらす。
【００７８】
検出層３において観測できるものは区別せずに「干渉色」とも「干渉の色」とも呼ばれる。
【００７９】
検出層３に関する用語「色」、特に干渉色は（好都合には人により「肉眼」で直接的に）知覚される色に適用され、（ｉ）色相（色相は色自身を特徴付ける）すなわち赤、緑、黄、青等）及び／又は（ｉｉ）明度及び／又は（ｉｉｉ）彩度を有する。
【００８０】
用語「色」、特に干渉色はまた、強め合う干渉現象が最大になる波長に適用され、場合によってはこの色は、好都合には可視域において反射曲線が最大になる波長に対応し、この色はまたその分光曲線（波長依存の反射率）により定義できる。
【００８１】
干渉、それに応じた色の出現は従って本質的に（ｉ）検出層３の厚さ及び（ｉｉ）前記検出層３を区切る二つの界面４、５での反射現象に関連する。この色はポリマの何れの化学マーキングも不要である。
【００８２】
実際に上に述べられたように、検出層３の初期厚さｅと第２の厚さｅ’に応じて、この色の変化は好都合には検出層３における干渉色の出現、消失又は変化である。
【００８３】
この「色の変化」は従って好都合には人により直接的に観測可能な（ｉ）色相及び／又は（ｉｉ）明度及び／又は（ｉｉｉ）彩度の変化である。
【００８４】
完全を期して、測色装置１の種々の態様が以下に詳細に述べられる。
【００８５】
基板
（ｉ）透明検出層用の担体を形成し、また（ｉｉ）測色装置１に当てられる光ビームの反射（全反射又は部分反射及び好都合には正反射）を保証できる材料で基板２は出来ている。
【００８６】
第１の実施例によれば、基板２は「ｎｓ」と表示される屈折率を有する透明材料から成る。好都合には、この材料は等方性均一線形媒体型の材料である。
【００８７】
この基板２の屈折率ｎｓは透明検出層３の屈折率ｎｃとは異なる。検出層３と基板２間の第２の界面５は従って屈折面を形成する。
【００８８】
詳細には、基板２の構成材料は透明検出層３の屈折率ｎｃより大きい屈折率ｎｓをもつものが選択される。
【００８９】
例えば、１．２ないし１．７の屈折率ｎｃを有する上側検出層３に対し、基板２は好都合には３ないし５の屈折率を有するシリコンの薄片（一般的に「ウエハ」と名付けられる）から成る。
【００９０】
一般的に言って、この界面５（検出層３と基板２間の）屈折率ｎｃ／ｎｓ間の差が大きければ大きいほど反射率（反射光の百分率）は大きくなる。
【００９１】
第２の実施例において、基板２は反射性の上面２ａを有する不透明材料から成る。
【００９２】
ここで、「反射」は光学的全反射又は少なくとも半反射を指す。
【００９３】
このような上側反射面２ａを得るのに適した材料はアルミ、クロム、金、ニッケル、シリコン、銀のような化学金属元素又はそれらの混合物を含む。他の適切な材料は酸化クロム及び酸化チタンのような金属酸化物を含む。
【００９４】
一般的に言って、実施例が何であれ、第２の界面５における反射率は例えば少なくとも２０％、場合によっては２０％ないし５０％であり、９０％より大きくてさえよい。
【００９５】
透明検出層
検出層３は少なくとも一つの対象ポリマ、すなわち単一ポリマ又はポリマの組合せを備える。
【００９６】
用語「ポリマ」は共重合体とホモポリマを含む。
【００９７】
ポリマは好都合にはバイオポリマ、言い換えれば「有機ポリマ」、すなわち生物組織に由来するポリマの中から選択される。
【００９８】
参考までに、これらのポリマは以下の中から選択することができる。すなわち、
オリゴ糖及び多糖（セルロース、キシレン、ペクチン、キトサン、キチン、キシログルカン、アラビノキシラン等）、
ペプチド及び蛋白質（牛又は人の血清アルブミン、グルテニン等）、
核酸、詳細にはデオキシリボ核酸、リボ核酸等）、
クチン、スベリン及びリグニン。
【００９９】
このようなバイオポリマは孤立状（すなわち、別個のポリマ鎖）であっても、塊状（すなわち混合されたポリマ鎖）であっても、結晶状（すなわち規則的に反復されるパターンに従って配列されたポリマ鎖）であってもよい。
【０１００】
検出層３は、好都合には１．２ないし１．７、好ましくは１．４ないし１．６の屈折率ｎｃを有する。
【０１０１】
検出層３の上面３ａと下面３ｂは互いに平行、あるいは少なくとも近似的に平行である。
【０１０２】
これら二つの面３ａ及び３ｂは好ましくは平面、あるいは少なくとも近似的に平面である。
【０１０３】
上に述べられたように、これら二つの面３ａ及び３ｂは、好都合には全面にわたり均一又は一定の厚さから成る初期厚さｅを定める。
【０１０４】
この初期厚さｅは７０ないし９００ｎｍ、より好ましくは７５ないし２５０ｎｍの範囲から選択される。
【０１０５】
前に指摘されたように、透明検出層３は前記酵素活性が消失している溶液の塗布時に前記初期厚さｅを維持することができる。
【０１０６】
このために、対象ポリマは好都合には固定化される。
【０１０７】
この固定化は（ｉ）共有結合又は「化学」型（収縮）、及び／又は（ｉｉ）非共有又は「物理」型（静電、水素、ファンデルワールス力）の架橋により発生できる。
【０１０８】
上の（ｉ）の場合、上側検出層３は好都合には対象ポリマと共有結合架橋ネットワークを形成する樹脂を含む。
【０１０９】
この樹脂は網状化すべきポリマに応じて選択される。
【０１１０】
そのような樹脂を選択及び実施するために、参考文献として例えば以下の文献を使用することもできる。すなわち、Ducere et al., 2005（"A capacitive humidity sensor using cross-linked cellulose acetate butyrate" Sensors and Actuators B: Chemical 106 (1), 331-334 (2005)）、Wu et al., 2009（"Molecularly imprinted organic-inorganic hybrid membranes for selective separation of phenylalanine isomers and its analogue" Separation and Purification Technology 68 (1), 97-104 (2009)）、及びSchuler et al., 2001 （"Decomposable hollow biopolymer-based capsules" Biomacromolecules 2 (3), 921-926 (2001)）。
【０１１１】
例えば、メラミン−尿素−ホルムアルデヒド樹脂（「ＭＵＦ」としても知られる）による網状化は以下の利点を提供する。すなわち、
網状化反応は多数のバイオポリマ類を網状化できる多くの化学官能（アルコール、アミン、フェノール）を用いて生じることができ、
塗布すべき溶液の混合により単純な実施を可能にする水溶性製剤があり、
網状化は単純である。すなわち、モノマは室温で安定であり、それは膜が１時間、乾燥雰囲気中で９０℃になったときに反応し、この処理はほとんどのバイオポリマに適合する。
【０１１２】
上の（ｉｉ）の場合、固定化は対象ポリマと水素架橋ネットワーク（「角質化」現象とも呼ばれる）を形成するナノ結晶により得ることができる。
【０１１３】
これを行うために、ナノ結晶は好都合には表面に負静電荷を含む化合物から成る。このために多糖ナノ結晶、好ましくはセルロースナノ結晶を選択することが好ましい。
【０１１４】
そのようなナノ結晶は例えば、Revol et al.（Int. J. Biol. Macromol. 1992, 14, 170-172.）又はCranston et al.（Biomacromolecules, vol 7, 2006, p2522）に述べられる手順を用いて綿の酸加水分解により作成される。
【０１１５】
例えば、キシログルカンに基づく透明検出層３を安定化するために、セルロースナノ結晶が添加される。アラビノキシランに基づく透明検出層３は実際には、好都合にはメラミン−尿素−ホルムアルデヒド樹脂を用いて凝固される。
【０１１６】
さらに、検出層３は等方性均一線形媒体（又は「ＩＨＬＭ」）を形成する単一層から成っていてもよい。この場合、検出層３は好都合にはその全高に至るまで対象ポリマで構成される。
【０１１７】
あるいは、透明検出層３はいくつかの重畳副層を備えてもよく、前記副層の少なくとも一つは対象ポリマを含む。
【０１１８】
後者の場合、対象ポリマを含む副層は好都合には少なくとも検出層３の上面３ａを形成する。
【０１１９】
検出層３はそのとき好都合には少なくとも二つの副層を含み、やはり好都合には８ないし１６層の副層を含む。
【０１２０】
この配置において、検出層３は好都合には、数対の重畳副層、好都合には４ないし８対の重畳副層から成る。前記対の重畳副層は互いに同一、あるいは少なくとも近似的に同一である。
【０１２１】
いくつかの副層を有するそのような構造において、検出層３は、例えば一つのセルロースの（好都合にはナノ結晶状の）副層と一つのキシログルカンの副層を順次有する重畳副層対を形成する対象ポリマの交互配列を含んでもよい。
【０１２２】
もう一つの例において、検出層３は、順次一つの高分子電解質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン又は「ＰＬＬ」、又はポリ（アリラミン）塩酸塩又は「ＰＡＨ」）副層と対象ポリマ（例えばセルロースとキシログルカンの混合物）を含む一つの副層とを有する重畳副層対を形成する副層の交互配列を含んでもよい。
【０１２３】
副層の交互配列は詳細には、堆積方法に関して以下に展開されるように、検出層３に望まれる厚さｅを達成することを可能にする。
【０１２４】
さらに同じ静電荷を有する基板２と検出層３の場合、基板２の上面２ａは好都合には高分子電解質から成る付着副層で裏打ちされて（例えば図３に表わされ、参照番号７ｂで表示される）前記基板２と前記検出層３間の架橋界面を形成する。
【０１２５】
例えば、高分子電解質副層はポリ−Ｌ−リシン又はポリ（アリラミン）塩酸塩から成る。これは一方ではシリコンウエハから成る基板に対する事例であり、他方では共に負に帯電しているセルロースナノ結晶を含む検出層又は副層に対する事例である。
【０１２６】
製造方法
透明検出層３は一つ又はいくつかのステップで適切な技術により基板２上に堆積される。
【０１２７】
一般的に言えば、透明検出層３を構築する様々の技術がある。
【０１２８】
浸漬積層技術（又はディップコーティング）は基板をポリマ溶液に浸漬することにある。この方法は数ナノメータ厚の非常に薄い層を生じる。
【０１２９】
この技術を実施するために、以下の文献を参照することもできる。すなわち、Jean et al., 2008（Structural Details of Cellulose Nanocrystals/Polyelectrolytes Multilayers Probed by Neutron Reflectivity and AFM" Langmuir 24 (7), 3452-3458 (2008)）、又はCranston et al., 2006（"Morphological and Optical Characterization of Polyelectrolyte Multilayers Incorporating Nanocrystalline Cellulose" Biomacromolecules 2006, 7, (9), 2522-2530）。
【０１３０】
スプレイ積層（又は「スプレイコーティング」）はポリマを担体上にスプレイすることにある。スプレイ中に溶媒は部分的に蒸発し、残りは堆積後蒸発する。この技術は浸漬積層より高速であるという利点を有する。
【０１３１】
この技術は例えばWagberg et al. "The Build-Up of Polyelectrolyte Multilayers of Microfibrillated Cellulose and Cationic Polyelectrolytes" Langmuir 24 (3), 784-795 (2008)による文献に述べられる。
【０１３２】
遠心積層（又はスピンコーティング）は基板上、好ましくはその中心にポリマを含む溶液を滴下することにある。回転基板はその表面上に滴下された溶液をスピンにより拡げて過剰液体を排出し、残留溶媒は蒸発して基板上に原料のみを残す。得られた薄膜の厚さは回転速度、溶液の粘度及び／又は濃度により変化する。
【０１３３】
この最後の技術は例えばCranston et al., "Morphological and Optical Characterization of Polyelectrolyte Multilayers Incorporating Nanocrystalline Cellulose" Biomacromolecules 2006, 7, (9), 2522-2530又はCranston et al, "Birefringence in Spin-Coated Films Containing Cellulose Nanocrystals" Colloids and Surfaces A 2008, 325, (1-2), 44-51による文献に研究されている。
【０１３４】
最後の技術の枠内において、検出層３を形成するように設計された層又は副層の厚さを調節するために、好都合にはDavid et al., "Spin Coating of Thin and Ultrathin Polymer Films" Polymer engineering and science, vol. 38, No. 12, December 1998, p 2040から得られた以下の式（１）を参照することが可能である。すなわち、
2013531504.tif 000003
ただし、ｈｆ：層の厚さ
η０：溶液の初期粘度
ρ  ：液体密度
ω  ：スピン速度
【０１３５】
この原理は高分子電解質に特に有効であるが、他のタイプの相互作用を互いに有する何れの材料にも適用される。
【０１３６】
実際、検出層３は好都合には副層の重畳を形成するいくつかのステップに適用される。このような手順は例えば以下の実施例の項で展開される。
【０１３７】
このやり方を用いて、検出層３の製造と安定性が最適化できる。そのようなやり方はまたその厚さに、酵素作用後の検出層３の最終厚さｅ’を定めることを目的とする副層を導入するのに有用となり得る。
【０１３８】
酵素活性を検出する方法
実際、対象水溶液において少なくとも一つの対象ポリマに関する加水分解酵素活性を検出する方法は少なくとも以下の一連のステップを含む。
【０１３９】
図１に関連して上に定義された測色装置１を設けた後、透明検出層３の上面３ａに対象水溶液が塗布される。
【０１４０】
この水溶液は、その体積が好ましくは２０μＬないし１ｍＬである液滴として堆積される。
【０１４１】
測色装置１は次いで、詳細には検討される酵素活性に依存する適切な時間と条件の下でインキュベートされる。
【０１４２】
透明検出層３の上面３ａは次いで洗浄されて対象水溶液を除去し、酵素加水分解を経たかもしれない検出層の一部を除去する。
【０１４３】
これを行うために、酵素活性の消失した水溶液、例えば水又は適当な溶解緩衝剤を使用することが好ましい。
【０１４４】
前記透明検出層３は次いで乾燥される。
【０１４５】
最後に、前記対象溶液の塗布個所において透明検出層３の色が分析される。
【０１４６】
これを行うために、透明検出層３に光源が（又は光ビーム）が向けられる。
【０１４７】
この光源は自然光でも人工光でもよい。この光は好ましくは多色型の光であり、好ましくはまた連続スペクトル型の光である。
【０１４８】
別段に定めがない限り、測色装置１は基板２の上面２ａに対して直角に観測される。他の視角、例えば基板２の上面２ａに垂直な軸に対して３０度未満、好ましくは１５度未満を使用してもよい。
【０１４９】
前に述べられたように、対象水溶液に加水分解活性がなければ、透明検出層３は初期厚さｅを維持する。この場合、検出層３に光学的変化はない。
【０１５０】
逆に、対象水溶液中の加水分解活性の存在は透明検出層３の分解を生じ、その厚さの減少をもたらす。
【０１５１】
この場合、最初に初期厚さｅを有する透明検出層３（図１）は、前記初期厚さｅより薄い第２の厚さｅ’で終了する（図２）。
【０１５２】
この第２の厚さｅ’は好都合には０（検出層３が除去される）ないし２５０ｎｍ、好ましくは７０ないし２５０ｎｍである。
【０１５３】
初期厚さｅから第２の厚さｅ’へのこの変化は好都合には以下の光学的変化の内の一つを生じる。すなわち、
（ｉ）互いに異なる第１の干渉色から第２の干渉色への変化、
（ｉｉ）干渉色無しから干渉色出現までの変化、又は
（ｉｉｉ）ある干渉色から前記干渉色の消滅までの変化。
【０１５４】
検出層３の色は（ｉ）直接オペレータにより読み取っても、（ｉｉ）適当な読み取りシステムにより読み取ってもよい。
【０１５５】
透明検出層３の色の変化は可視光域において最も上手く観測され、従って読み取り装置を使用せずに人により検出できる。
【０１５６】
この場合、検出層３の初期厚さｅ及び／又は第２の厚さｅ’は、その最大反射率が３８０ｎｍないし７８０ｎｍ、好ましくは４００ｎｍないし７００ｎｍの波長に位置する干渉色を得るように選択される。
【０１５７】
より一般的には、光学変化は好都合には、結果の読み取りと解釈を容易にする色相の変化である。
【０１５８】
オペレータにより直接行われるこの読み取りを容易にするために、対象溶液の塗布個所近傍の同じ検出層３に基準水溶液が塗布されてもよい。この基準水溶液は好都合には、酵素活性を消失した（例えば、好都合には過熱による酵素活性の不活性化により）水溶液からなる。
【０１５９】
対象水溶液の塗布個所と基準水溶液の塗布個所間の異なる色は前記対象溶液中の酵素活性の存在を示す。また、対象溶液の塗布個所と「基準」個所間の同一色は対象溶液中に何れの酵素活性もないことを示す。
【０１６０】
必要であれば、特に測色装置が紫外（ＵＶ）線、赤外線、近赤外線のような他の光源に曝されたときに透明検出層中に色の変化を観測するために読み取り装置が使用される。
【０１６１】
そのために、測色装置１の分析用に読み取り装置、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）、デジタルカメラ等を含む光検出器が使用されてもよい。
【０１６２】
この場合、測色装置１は、好都合には光学的読み取り装置、光源及び随意には色変化を分析する手段を含む自動測色システムにおいて使用される。
【０１６３】
酵素活性は次いで（ｉ）対象溶液と「基準」溶液により得られた色、あるいは（ｉｉ）対象水溶液の塗布前後に得られた色を比較することにより求めることができる。
【０１６４】
この場合、読み取り装置は、好都合には検出層３での可視反射スペクトルを判定する手段である。好都合には、例として、前記検出層３における最大反射率波長が（ｉ）対象溶液と「基準」溶液間、あるいは（ｉｉ）対象水溶液の塗布前後で異なるときに光学的変化があると見なすことができる。
【０１６５】
対象水溶液の塗布前後の異なる色は前記対象水溶液中の酵素活性の存在を示す。対象水溶液の塗布前後の同一又は近似的に同一の色は前記対象水溶液中に酵素活性がないことを示す。
【０１６６】
さらに、対象水溶液中の酵素活性に対する定量値を決定するために、単純には、例えば対象水溶液の希釈、及び／又は検出層のインキュベーション時間及び／又は構造を適合することで十分である。そのとき、最終色は前記定量値に依存すると見なすことができる。
【０１６７】
特定の実施態様
図１による第１の実施例において、透明検出層３は好都合には、一つ又はいくつかのステップで堆積された等方性均一線形媒体（又は「ＩＨＬＭ」）から成る。
【０１６８】
この場合、検出層３の減少厚さ（図１の初期厚さｅから図２の最終厚さｅ’への）は本質的にはインキュベーション時間に依存する。
【０１６９】
代わりに図３に示されるように、透明検出層３は以下の４つの副層６及び７の重畳から成っていてもよい。すなわち、
それぞれが、好都合にはアニオン性ナノ粒子により固定化された対象ポリマを備える二つの副層６ａ及び６ｂ、及び
それぞれがポリカチオン性化合物を含む二つの他の副層７ａ及び７ｂ。
【０１７０】
各副層６、７は等方性均一線形媒体（又は「ＩＨＬＭ」）を形成する。
【０１７１】
これらの副層６及び７は交互に堆積されて、詳細には検出層３の上面３ａを形成するポリマの副層６を有する重畳副層対６ａ、７ａ及び６ｂ、７ｂを形成する。
【０１７２】
この構造は特に、厚い個々の副層を得る難しさを克服することを目的とし、副層の交互配列は所望の初期厚さｅを得ることを可能にする。
【０１７３】
例えば、ポリカチオン性副層７はポリ（アリラミン）塩酸塩又はポリ−Ｌ−リシンから成る。
【０１７４】
この場合、検出層３の減少した厚さ（図３の初期厚さｅから図４の最終厚さｅ’への）は好都合には検出層３の上面３ａを形成する単層または複数層のポリマの副層６ａに依存する。
【０１７５】
言い換えれば、加水分解酵素活性は好ましくは検出層３の上面３ａを最初に形成する（図４に示されるように）ポリマの副層６ａの全面的分解を保証する。この酵素作用の後、検出層３の上面３ａは直接下にあるポリカチオン性副層７ａの上面から成る。
【０１７６】
この実施例は初期厚さｅや酵素活性の存在下で生じる最終厚さｅ’の試験を可能にするという利点を有する。
【０１７７】
やはり代案として図３に従って、透明検出層３は以下の副層６及び７の重畳を備えてもよい。すなわち、
それぞれが第１又はいくつかの第１の対象ポリマを有する二つの副層６ａ及び６ｂ、及び
それぞれが第２又はいくつかの第２の対象ポリマを有する二つの他の副層７ａ及び７ｂ。
【０１７８】
これらの副層６及び７は交互に堆積されて重畳副層対６ａ、７ａ及び６ｂ、７ｂを形成する。
【０１７９】
例えば、第１の対象ポリマはセルロースナノ結晶から成り、第２の対象ポリマはキシログルカンから成る。
【０１８０】
一般的に言えば、本発明による測色装置は従って対象ポリマに関して加水分解活性を検出するように構成されてもよい。
【０１８１】
この装置の利点は（ｉ）使用するのに複雑な装置を必要としないこと、（ｉｉ）高い小型化能力を有すること、及び（ｉｉｉ）高速分析システムに組み込めることである。
【０１８２】
詳細には検出層の厚さと反応時間に適合することにより加水分解活性の半定量的測定に使用できることも興味深い。
【０１８３】
例えば、水溶液中のこの種の加水分解活性の半定量的測定の一つの可能な方法は好都合には以下のステップを含む。すなわち、
その透明検出層が前記加水分解活性の存在下で加水分解を行うのに適した少なくとも一つの対象ポリマから成る、本発明による測色装置を設けるステップと、
前記測色装置の前記透明検出層の上面に前記対象水溶液を塗布するステップと、
前記透明検出層の前記上面を洗浄するステップと、
前記透明検出層を乾燥するステップと、
この前記水溶液中の加水分解活性を半定量評価するために前記対象溶液の前記塗布個所において前記検出透明層の色を分析し、一つ又はいくつかの基準個所（例えば較正範囲）と比較するステップと
である。
【０１８４】
本発明によるこの測色装置はまた決定されたポリマに関する比加水分解活性の同定を可能にするという利点を提供する。
【０１８５】
例えば、水溶液中のこの種の比加水分解活性を同定する一つの可能な方法は好都合には以下のステップを含む。すなわち、
その透明検出層が前記加水分解活性の存在下で加水分解を行うのに適した少なくとも一つの対象ポリマから成る、本発明による測色装置を設けるステップと、
前記測色装置の前記透明検出層の上面に前記対象水溶液を塗布するステップと、
前記透明検出層の前記上面を洗浄するステップと、
前記透明検出層を乾燥するステップと、
前記対象溶液の前記塗布個所における前記透明検出層の色を分析するステップと、
前記塗布個所の色を基準個所と比較して前記加水分解活性の有無を判定するステップと、
比較により、前記試験される水溶液が適切に前記透明検出層の色を変化することが明らかになれば、前記水溶液、又はその中に含まれる酵素を確実に選択するステップと
である。
【０１８６】
この発明はまた以下に展開される実施例により説明される。
【実施例１】
【０１８７】
基板上の透明検出層の作成とその安定性の検討
装置
使用される種々の製品は以下を含む。すなわち、
高粘度小麦アラビノキシラン（ＡＸ−ＭＶ）、４７ｃＳｔ（メガザイム社により販売）と、
中粘度小麦アラビノキシラン（ＡＸ−ＭＶ）、２２ｃＳｔ（メガザイム社により販売）と、
ポリ（アリラミン）塩酸塩（ＰＡＨ）（シグマ社により販売）と、
Cranston et al.(Biomacromolecules, vol 7, 2006, p2522) に述べられる手順を用いて綿の酸加水分解により作成されたセルロースナノ結晶（Ｃ）（ヒゲ結晶とも呼ばれる）と、
タマリンドの種から抽出されたキシログルカン（ＸＧ）（Silvestre Virginie, 2004 thesis, Nantes University）と、
メラミンホルムアルデヒド樹脂（ＭＵＦ）レジメンＡＱ−７５５０（イネオスメラミン社により販売）（この樹脂は最初に６４０μＬの市販溶液から１０％に希釈され、１０−２モル／ＬのＨＣｌ、５ｍＬまで補充される）と、
その上面が研磨されたシリコンウエハと
である。
【０１８８】
方法
１．１．薄層の作成
１．１．１．スピン層形成による構築
担体は７０％硫酸Ｈ２ＳＯ４と３０％過酸化水素Ｈ２Ｏ２から成る腐食性混合物中で３０分間クリーニングされる。
【０１８９】
支持体は次いで二つの連続する水槽内でリンスされ、窒素中で乾燥される。
【０１９０】
全ての試験に対して秒当たり１４００ｒｐｍの同一加速度により２０００ＲＰＭの回転速度でスピン層形成装置、ＳＰＩＮ１５０  ＮＰＰ（ＳＰＳ欧州）により層は作成される。
【０１９１】
１．１．２．セルロース／キシログルカン層
セルロース／キシログルカン層はセルロース分解活性を検出するように設計される。キシログルカンとセルロースはセルラーゼに敏感であることが知られている（それらは同じ骨格を有する）。
【０１９２】
シリコンウエハはスピン層形成装置に入れられる。
【０１９３】
ＰＡＨ（０．５ｇ／Ｌ）がシリコンウエハの中心に置かれ、５分間静止状態に置かれる。
【０１９４】
シリコンウエハは選択された速度で１分間回転され、次いで１分間水中でリンスされる。
【０１９５】
次いで、５ｇ／Ｌのセルロースナノ結晶と５ｇ／Ｌのキシログルカンを含むセルロース／キシログルカン溶液が中心に置かれ、５分間静止状態に置かれる。キシログルカンとセルロースナノ結晶は乾燥後混合物を固定化することができるネットワークを生成できる非共有相互作用を確立できる。
【０１９６】
シリコンウエハは次いで３分間回転され、３分間リンスされる。
【０１９７】
これらのステップは２回繰り返されて二対の副層（一つはＰＡＨ副層、一つはセルロース／キシログルカン混合物の副層）を有する膜を得る。
【０１９８】
１．１．３．アラビノキシラン膜（ＡＸ）
アラビノキシラン膜は樹脂あり（１０及び１５ｇ／ＬのＡＸ）、あるいは樹脂なし（５、１０及び１５ｇ／ＬのＡＸ）で作成された。
【０１９９】
５％の樹脂を有する１５ｇ／Ｌのアラビノキシラン溶液の作成は例えば以下のように得られる。すなわち、２０ｇ／Ｌのアラビノキシラン３．７５ｍＬが採取され、１０％の樹脂３７．５μＬが添加され、この混合物は超純水で５ｍＬまで補充される。添加される樹脂量は所望の濃度（５、１０、１５及び２０％）に合うように調整される。
【０２００】
１０ｇ／Ｌのアラビノキシランを含む溶液は上に述べられた原理に従って１５ｇ／Ｌの溶液から作られる。
【０２０１】
実際には、ＰＡＨ溶液はシリコンウエハの中心に置かれて５分間静止状態に置かれる。次いで、シリコンウエハは３分間回転され、３分間リンスされる。最後に、アラビノキシラン溶液が中心に置かれ、５分間静止状態に置かれ、３分間回転される。
【０２０２】
１．２．干渉計による厚さ測定
シリコンウエハ上に堆積された表面の厚さを測定するために、ＵＶ−可視Ｓｐｅｃｏｒｄ  Ｓ６０００分光光度計が用いられる。
【０２０３】
シリコンウエハは二つのミラーの前にある支持台に置かれる。光は第１のミラーで反射され、サンプルに送られ、次いで第２のミラーまで反射され、検出器に送られる。
【０２０４】
反射光による膜厚測定は膜と光の相互作用に基づく周知の技術である。それは種々の界面での部分的反射及び透過から生じる干渉に依存する。
【０２０５】
分光光度計により対処される波長範囲（１８２ｎｍないし１０１９ｎｍ）にわたりスペクトルが記録される。
【０２０６】
スペクトルの取得と膜厚の計算はＷｉｎＡｓｐｅｃｔのソフトウェアを使用する。
【０２０７】
１．３．安定性試験
まず、ポリマが堆積されるシリコンウエハが水中に浸漬され、次いで乾燥される。
【０２０８】
第２に、（ｉ）イオン力の効果を評価する食塩水（０．１モル／ＬのＮａＣｌ）、及び（ｉｉ）ｐＨの効果を評価する酸性及び塩基性溶液（ｐＨ２のＨＣｌ及びｐＨ１２のＮａＯＨ）を用いて検出層の耐性が試験される。
【０２０９】
各溶液の液滴が基板の上に堆積され、３分間静止状態に置かれる。
【０２１０】
装置は水中でリンスされ、次いで乾燥される。
【０２１１】
検出層は安定性試験の各ステップで写真撮影される。
【０２１２】
結果：検出層の安定性
効率的であるためには、薄層は酵素がない場合は一貫して安定していなければならない。検出層はまた水でリンスされねばならず、被検水溶液中で安定していなければならない。
【０２１３】
二つの場合が区別される。すなわち、
セルロース／キシログルカン混合物：膜は網状化剤の添加無しに安定であり、薄層に対するイオン力とｐＨの効果のみが試験された。
アラビノキシラン：膜は単独で安定していない（層中のポリマ鎖の低凝集の故に色を消失させるには単純な水洗で十分である）。
【０２１４】
ｐＨ及びイオン力に関してアラビノキシランに基づく検出層を安定化させるためにホルムアルデヒド／尿素樹脂の添加が試験され、次いで必要な樹脂量が最適化された。
【０２１５】
２．１．セルロース／キシログルカン
安定性試験時に、ＮａＣｌ（０．１モル／Ｌ）、ＨＣｌ（ｐＨ２）及びＮａＯＨ（ｐＨ１２）の液滴がそれぞれ検出層上に堆積され、３分間そこに放置され、検出層は次いで水でリンスされる。
【０２１６】
試験前後で表面の色が変化しないことが観測される。
【０２１７】
従って、セルロースとキシログルカンの二重層は被検媒体に対して安定している。
【０２１８】
２．２．アラビノキシラン
アラビノキシラン層の安定性に関して以下のいくつかのパラメータの影響が調査された。すなわち、アラビノキシランのタイプ（高粘度（ＨＶ）と中粘度（ＭＶ））、濃度（１５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌ）及びアラビノキシラン溶液中の網状化樹脂百分率（５ないし２０％）。
【０２１９】
２．２．１．アラビノキシランのタイプの効果
厳しい条件下で安定性試験を行う前に、層は水に浸された。
【０２２０】
このために１５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの中粘度を有するアラビノキシラン層が２０％の樹脂で検討された。それらを水に浸した後、層は均一なままであることが観測された。
【０２２１】
１５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの高粘度を有するアラビノキシラン層が次いで２０％の樹脂で検討された。それらを水に浸した後、厚さの減少に起因し、ポリマの損失に関連し得る色の変化が観測される。さらに、これらの層が中粘度アラビノキシラン層より均一でないことが観測される。
【０２２２】
従って高粘度アラビノキシラン層は安定していない。これは、アラビノキシランの分子密度が高いために凝集体を形成することに関連することが考えられる。これは樹脂が網状化することを困難にする。
【０２２３】
２．２．２．樹脂の濃度と百分率の層安定性への効果
前の結果を踏まえて、２０００ｒｐｍの回転速度と１０及び１５ｇ／Ｌの濃度の溶液から作られた中粘度アラビノキシラン層に対して試験が行われる。
【０２２４】
層の安定性を判定するために二つのパラメータ、すなわちイオン力とｐＨ（酸性及び塩基性）が使用された。
【０２２５】
０．１モル／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ２のＨＣｌ及びｐＨ１２のＮａＯＨの溶液が同じ方法で薄層上に堆積された。
【０２２６】
キシラナーゼが酢酸塩緩衝剤中で希釈されるので、緩衝剤がポリマ層を分解するかどうかをチェックする必要がある。この酢酸塩緩衝剤は従ってアラビノキシラン層に対しても試験される。
【０２２７】
安定性試験は１５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜について種々の樹脂濃度（５％、１０％、１５％及び２０％）に対して行われた。
【０２２８】
特に５％、１０％及び１５％樹脂濃度に対して色の変化が堆積個所において観測される。この色の変化は樹脂百分率が増すと見えにくくなる。
【０２２９】
残りの検討において、対象層は、溶液中でリンスされないが酵素活性を示す程度に安定していなければならない。
【０２３０】
これら二つの基準に対処するために、１５％の樹脂を含む層を選択することが推奨される。
【０２３１】
１５ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン層は２０％の樹脂百分率に対して安定しており、１０ｇ／Ｌのアラビノキシラン層は１５及び２０％の樹脂百分率に対して安定している。
【０２３２】
１５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌのアラビノキシランの二つの中粘度サンプルに対して、樹脂濃度に関わらず、酸性溶液に対応する永続的な染みがあることが観測された。それは、アラビノキシランが酸の存在下で加水分解されたことに起因すると考えられる。それは、予防策を取って低酸性媒体中の酵素を使用しなければならないことを意味する。
【０２３３】
酢酸塩緩衝剤が薄層を分解しないことは注目に値する。これは従って、酵素に対する最適条件であるｐＨ５の酢酸塩緩衝剤中で酵素を希釈できることを意味する。
【０２３４】
２．３．結論
セルロース／キシログルカン層は酸ｐＨとアルカリｐＨの食塩の存在下で安定している。
【０２３５】
高粘度アラビノキシラン層は水に浸された後は均一でないが、中粘度アラビノキシラン膜は安定している。
【０２３６】
アラビノキシランの中粘度層に対して樹脂濃度が増加するにつれ、これらの染みがあまり見えなくなることが観測される。従って、１５％樹脂の中粘度アラビノキシラン膜を用いて検討を継続することが決断される。
【０２３７】
同様の試験はまた２４時間の安定性を明らかにした。
【実施例２】
【０２３８】
酵素活性の測定
上の実施例１に由来する装置による酵素活性の検出は従来の「ネルソン」法と比較される。
【０２３９】
以下に検討される酵素は以下から成る。すなわち、
βキシラナーゼＭ１（８０００  Ｕ、２１６Ｕ／ｍｇ、２３００Ｕ／ｍＬ、メガザイム社により販売）、及び
完全に精製されていないトリコデルマ・リーゼイに由来するｃｅｌｌｕｌｙｖｅ（理論的活性は４８８０ｎｋａｔ／ｇ、４９ｍｇ／ｇ）（Ｌｙｖｅｎ社により販売）。
【０２４０】
１．ネルソン法
ネルソン法は多糖の加水分解中に遊離された還元末端を酵素により定量することを可能にする。定量は間接的であり、アルカリ媒体では沸点において、還元末端の疑似アルデヒド基は第２銅イオンを第１銅イオンに還元する。後者はヒ素−モリブデン試薬と反応して、その光学濃度（「ＯＤ」）が還元単糖の量に直線的に変化する青色を生じる。末端の数は１０分のインキュベーションの後に定量される。
【０２４１】
ネルソンの定量は二段階で行われる。すなわち、
還元末端での濃度に従ってこの方法の応答を定める較正線の決定。この段階は単糖類（グルコースとキシロ−ス）に対して行われる。
溶液中のポリマについて検討しようとする酵素活性の定量。それぞれアラビノキシランとキシログルカンに対するキシラナーゼとセルロースの活性が測定される。
【０２４２】
１．１．装置
溶液Ａ：
２００ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４
２５ｇの無水Ｎａ２ＣＯ３
２５ｇのＮａ−Ｋの重酒石酸塩
２０ｇの無水ＮａＨＣＯ３
溶液Ｂ：
３０ｇのＣｕＳＯ４・５ Ｈ２Ｏ
４滴の高濃度Ｈ２ＳＯ４
Ｈ２Ｏ適量２００ｍＬ
溶液Ｃ：２５ｍＬの溶液Ａ＋１ｍＬの溶液Ｂ
溶液Ｄ：
８００ｍＬのＨ２Ｏ中で溶解された５０ｇの（ＮＨ４）６ ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ
速やかに注入された４２ｍＬの高濃度Ｈ２ＳＯ４
小量の水で溶解された６ｇのＮａ２ ＨＡｓＯ４・７Ｈ２Ｏ
Ｈ２Ｏ適量１Ｌ
【０２４３】
１．２．標準範囲の作成
２５０μｇ／ｍＬの単糖母液の作成
この場合、キシログルカンに対する基準としてグルコース母液が使用される。キシロース母液は二つの高及び中粘度アラビノキシラン溶液に対する基準となるであろう。
【０２４４】
０ないし２５０μｇ／ｍＬの種々の母液希釈が行われる。各濃度に対して光学濃度が測定されて標準範囲を得る。
【０２４５】
１．３．酵素活性の定量
酵素反応
サンプルを作成するために、１３５μＬの母液と１５μＬの酵素溶液が管に入れられ、４０℃で１０分間インキュベートされる。
【０２４６】
１０分後、１００μＬのサンプルを１００μＬの溶液Ｃに加えて酵素活性が停止される。
【０２４７】
白色基準の作成は酵素が不活性化されたときのＯＤを測定することを可能にする。白色基準は１０μＬの酵素と９０μＬの母液が加えられた１００μＬの溶液Ｃから成る。
【０２４８】
測色反応
サンプルは熱湯槽に１５分間入れられる。
【０２４９】
サンプルは次いで冷却され、溶液Ｄが加えられて（１００μＬ）白色とサンプル間の異なる色を得る。
【０２５０】
プレートが１０分間撹拌し続け、次いで１ｍＬの水が加えられる。
【０２５１】
最後に、プレート読み取り装置により６００ｎｍで光学濃度を読み取るために各穴の２５０μＬが９６個の穴を有するプレートに移される。
【０２５２】
結果を表わすために、標準範囲の濃度はμモルで表わさねばならない。
【０２５３】
活性を計算するために以下の式（１）が使用される。
ａ＝DeltaDO/勾配×150/15×1000/t×dil            （１）
ただし、ａ：酵素活性（ｎｋａｔ／ｍＬ）、
ＤｅｌｔａＤＯ：サンプルと白色間の光学濃度差、
勾配はμモルで表わされ、
１５０は反応媒体の総量であり、
１５は酵素試験量の体積であり、
ｔはインキュベーション時間（秒）（この実験ではｔ＝６００秒）であり、
ｄｉｌは酵素反応が生じた酵素の希釈である。
【０２５４】
測定が有効であるために許容できる最小のＯＤ変動は０．１である。
【０２５５】
最小活性を計算するために用いられる式（２）は以下の通り。
Delta(a)＝Delta（DeltaDO）/勾配×150/15×1000/t        （２）
【０２５６】
計算はキシロ−スとグルコースの標準範囲に対して行われた。
【０２５７】
これらの結果に基づいて、この方法を用いる最低の測定可能な活性が３ｎｋａｔ／ｍＬであることが演繹できる。
【０２５８】
２．検出層上の酵素活性の評価
被検酵素溶液の液滴と基準溶液（希釈され、１１０℃で１時間加熱された１ｍＬの酵素溶液）の液滴が検出層上に３分間堆積される。
【０２５９】
本発明による装置は水中でリンスされ、乾燥される。
【０２６０】
検出層は酵素試験の各ステップで写真撮影される。
【０２６１】
第１の試験はＣｅｌｌｕｌｙｖｅに対する１２５μｇ／ｍＬの酵素溶液（０．６ｎｋａｔ／ｍＬ）を用いて行われ、溶液はキシラナーゼ（１９ｎｋａｔ／ｍＬ）に対して２０００分の１に希釈される。
【０２６２】
次いで酵素溶液は酵素活性が最早表面上に見えなくなるまで希釈される。
【０２６３】
３．結果
３．１ネルソン法
較正線
まず、測定された光学濃度と還元末端における濃度の関係を決定するための二つの標準範囲が設定される。
【０２６４】
グルコースの標準範囲はキシログルカンに対する基準であり、キシロ−スの標準範囲はアラビノキシランに対する基準である。
【０２６５】
較正線は所定の期間で遊離還元末端（従って酵素により行われた切断）の数を決定することにより酵素の活性を計算することを可能にする。
【０２６６】
Ｃｅｌｌｕｌｙｖｅ活性の測定
キシログルカンに対するＣｅｌｌｕｌｙｖｅの活性が調査された。Ｃｅｌｌｕｌｙｖｅは、大量のセルロース酵素を分泌できる真菌であるトリコデルマ・リーゼイに由来する。
【０２６７】
およそ２．４ｎｋａｔ／ｍＬの理論的活性を有する０．５ｍｇ／ｍＬのＣｅｌｌｕｌｙｖｅの母液が作成された。
【０２６８】
較正線から、７ｎｋａｔ／ｍＬの酵素活性が決定された。この結果は理論的活性とわずかに異なるが、同じ桁を有する。
【０２６９】
キシラナーゼ活性の測定
二つの基板、すなわち高及び中粘度アラビノキシラン上のキシラナーゼの活性が確認された。
【０２７０】
供給業者により提出された純粋のキシラナーゼの活性はおよそ３８，０００ｎｋａｔ／ｍＬと推定される。
【０２７１】
２０００分の１ないし１０００分の１に希釈された溶液に対して得られた結果に基づいて純粋のキシラナーゼの活性が計算された。
【０２７２】
得られた結果は下の表１に示される。
【表１】
2013531504.tif 000004
【０２７３】
およそ３２，０００ｎｋａｔ／ｍＬの値が見出されたが、これは供給業者により与えられた値と同じ桁を有する。
【０２７４】
３．２．検出層上の酵素活性
セルロース／キシログルカン
上に実施例１で展開されるように、セルロース／キシログルカン検出層はポリ（アリラミン）塩酸塩（ＰＡＨ）の副層と交互に堆積された綿セルロースナノ結晶（Ｃｔ）及びキシログルカン（ＸＧ）の混合物の副層により形成される。
【０２７５】
得られた層は１７５ｎｍの全厚を有し、淡黄色である。
【０２７６】
最初に、ネルソン法で用いられたものと同じＣｅｌｌｕｌｙｖｅの濃度（１２５μｇ／ｍＬ又は０．６ｎｋａｔ／ｍＬ）が用いられた。
【０２７７】
酵素溶液の液滴が堆積され（０．６ｎｋａｔ／ｍＬ）、不活性化された酵素の液滴も堆積される（基準：１１０℃に１時間加熱された１ｍＬの希釈酵素溶液）。
【０２７８】
セルロースの液滴の堆積、リンス及び乾燥後、酵素が堆積された個所に青色が出現し、層厚が減少したことを示唆する。
【０２７９】
この厚さの減少は干渉法と原子間力顕微鏡法により確認された。酵素作用の前後の干渉曲線の測定（図５）は明らかに、その領域での干渉現象（酵素作用の前の）が酵素の作用により消滅したことを示す。この結果は、検出層の厚さが１５０ｎｍ未満であることを示唆する。
【０２８０】
水洗後に層は変化しないけれども、酵素作用によりその厚さはかなり減少した。酵素作用後の層の粗さは著しく小さいままであることに注目のこと。それを確認する理論はないけれども、（ｉ）構造中に浸透することなく層の浸食により酵素が機能するか、（ｉｉ）ＰＡＨが酵素の作用に対する障壁となるのではないかと思われる。
【０２８１】
ここで、この装置が固体基板に対する酵素の作用を検討する好機になり易いことが分かる。この装置はまた不均一な媒体中のモデルシステムの再構築を可能にするはずである。
【０２８２】
次いで、酵素は酵素活性検出閾値を決定するために数回希釈される。被検溶液は以下の表２に提示される。
【表２】
2013531504.tif 000005
【０２８３】
実際に、希釈すればするほど（Ｓ１からＳ４に）、元の色と比較して色変化が顕著ではなくなることが分かる。従って、希釈すればするほど、ポリマ膜は分解されない。
【０２８４】
３分後に目視検出できる最小活性は０．０６ｎｋａｔ／ｍＬ（Ｓ１）である。
【０２８５】
しかしネルソン法は３ｎｋａｔ／ｍＬの最小活性を検出することを可能にする。本発明による装置による試験は従ってネルソン法より２０倍敏感である。
【０２８６】
さらに、ネルソン法は１０分のインキュベーション時間を必要とするが、本発明による試験は３分しか必要でない。これもまた、本発明による方法がより高速であることを証明している。
【０２８７】
アラビノキシラン（ＨＶ−ＭＶ）
ここでも、ネルソン法と同じ酵素濃度（２０００分の１又は１９ｎｋａｔ／ｍＬに希釈されたキシラナーゼ）が使用される。
【０２８８】
酵素溶液（１９ｎｋａｔ／ｍＬ）の液滴と不活性化された酵素（基準）が１５ｇ／Ｌ（青色）と１０ｇ／Ｌ（灰褐色）のアラビノキシラン膜上に堆積される。
【０２８９】
次いで、インキュベーションとリンス後、酵素が堆積された個所では色が消滅するが、基準個所では色が不変のままであることが分かる。
【０２９０】
セルロースとキシログルカンに基づく層と同様に、酵素活性が有効に検出される。
【０２９１】
１０ｇ／Ｌのアラビノキシランに対し、検出層の初期の色（灰褐色）がシリコンウエハのものと比較的似ているので、酵素活性はより見にくい。色相のレベル変化はほとんどない、あるいは皆無である。
【０２９２】
次いで、最小検出閾値を決定するために酵素の希釈により他の試験が行われた。被検溶液は以下の表３に提示される。
【表３】
2013531504.tif 000006
【０２９３】
まず、１５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜に作用するキシラナーゼの種々の希釈液が調査される。
【０２９４】
１５ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜に関し、酵素溶液の活性が１．９ｎｋａｔ／ｍＬ（Ｓ１）であるときに色が消滅する。１．９×１０−２ｎｋａｔ／ｍＬ（Ｓ３）までの酵素活性に対し色の変化はなお識別される。
【０２９５】
従って、アラビノキシランによる試験はネルソン法より１５０倍敏感である。
【０２９６】
１０ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜厚は１５ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜のものより小さく、酵素は１０ｇ／Ｌのアラビノキシラン膜をより容易に分解する。
【０２９７】
１０ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜に対し、色変化は１５ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜に対するより見にくい。これは、１０ｇ／Ｌの中粘度アラビノキシラン膜の膜厚がより小さく、色がシリコンウエハのものに近いという事実による。
【０２９８】
４．結論
ネルソン法により決定された酵素活性は供給業者により与えられた活性に対応する。
【０２９９】
本発明による装置による試験に対し、ネルソン法に対して使用されるものと同じ酵素濃度が使用された。酵素活性は実際に観測された。
【０３００】
本発明による装置により酵素活性の検出閾値を決定するために希釈が行われた。
【０３０１】
得られた結果は、本発明による装置がネルソン法により測定されるものより２０ないし１５０倍少ない酵素活性を３倍少ない時間で検出できることを示す。
【実施例３】
【０３０２】
酵素活性検出
装置
酵素活性検出に関する補足試験が実施例１に詳述される手順に従って堆積された検出層を含む装置により行われた。
【０３０３】
以下（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４と呼ばれる使用される第１の装置は各副層対が以下から成る４対の副層から成る青色検出層を含む。すなわち、
０．５ｇ／Ｌの濃度で堆積されたＰＡＨの副層、及び
それぞれ５ｇ／Ｌ及び１ｇ／Ｌの濃度で堆積されたセルロースナノ結晶及びキシログルカンの混合物から成る副層。
【０３０４】
本検出層は１６０ｎｍと推定される初期厚を有する。
【０３０５】
以下（Ｃ５／ＸＧ１）８と呼ばれる使用される第２の装置は各副層対が以下から成る８対の副層から成る青色検出層を含む。すなわち、
５ｇ／Ｌの濃度で堆積されたセルロースナノ結晶の副層、及び
１ｇ／Ｌの濃度で堆積されたキシログルカンの副層。
【０３０６】
本検出層は９０ｎｍと推定される初期厚を有する。
【０３０７】
被検酵素は、その初期活性が４８８０ｎｋａｔ／ｇであるいくつかのセルラーゼの混合物から成るＬｙｖｅｎ社のＣｅｌｌｕｌｙｖｅ  ＴＲ酵素の混合物から成る。
【０３０８】
この酵素溶液はこれら二つの装置により、それぞれ０．６ｎｋａｔ／ｍＬ、０．２４ｎｋａｔ／ｍＬ、０．１２ｎｋａｔ／ｍＬ、０．０６ｎｋａｔ／ｍＬ、０．０２４ｎｋａｔ／ｍＬ及び０．００６ｎｋａｔ／ｍＬの異なる濃度で試験された。
【０３０９】
結果
異なる濃度の酵素溶液の液滴は５０℃のオーブンに３、５、１０及び１５分間入れられた検出層上に堆積される。
【０３１０】
膜（Ｃ５／ＸＧ１）８及び（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４の外観が酵素感度試験の前後で比較される。検出層の色が変化したときに活性が検出される。
【０３１１】
サンプル（Ｃ５／ＸＧ１）８に対し、種々の時間に以下が観測された。すなわち、
３分で、検出された活性は０．６、０．２４及び０．１２ｎｋａｔ／ｍＬの活性であり、シリコンウエハの表面は０．６ｎｋａｔ／ｍＬで見える。
５分で、０．０６ｎｋａｔ／ｍＬの活性が識別でき、基板表面は０．６及び０．２４ｎｋａｔ／ｍＬの活性に対して影響を受ける。
１０分で、０．０６ｎｋａｔ／ｍＬの活性がはっきりと見え、表面は最初の３つの濃度に対して影響を受ける。
１５分で、酵素活性があらゆる濃度に対して検出され、最初の４つの濃度に対してウエハ表面が見え、０．０２４ｎｋａｔ／ｍＬの活性は青い染みを形成する。
【０３１２】
サンプル（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４に対し、種々のインキュベーション時間に以下が観測された。すなわち、
３分で、検出された活性は０．６及び０．２４ｎｋａｔ／ｍＬの活性である。
５分で、０．１２ｎｋａｔ／ｍＬの活性も検出される。
１０分で、０．０２４ｎｋａｔ／ｍＬの活性も識別できる。
１５分で、０．０２４ｎｋａｔ／ｍＬの濃度での浸食がなお見られる。
【０３１３】
目視試験は明らかに、酵素の作用が時間に依存することを示す。
【０３１４】
実際、高酵素活性レベル又は低活性レベルを有し、しかし長いインキュベーション時間のサンプルに対し、シリコンウエハの表面は見える。
【０３１５】
さらに、中間色の染み（薄青色又は暗青色）は、時間及び／又は濃度がシリコンウエハへの浸食を許さないときに現れる。
【０３１６】
サンプル（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４に対し、あらゆる濃度及び時間において酵素浸食後に得られた色は多かれ少なかれ濃青色である。
【０３１７】
従って、浸食は膜（Ｃ５／ＸＧ１）８の厚さ全体にわたり、３分でシリコンウエハの表面を露わにする。しかしながら、サンプル（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４に対し、浸食は、ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１の３．５二重層と等価な１２０ｎｍの厚さ、つまりＰＡＨの堆積後の厚さに相当する暗青色と同じ深さレベルで停止するように見える。
【０３１８】
これらの結果によれば、何れの理論にも結び付かないが、膜（ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１）４に対する酵素の浸食がＰＡＨ層により停止することはあり得ると思われる。ＰＡＨは従って、セルロースとキシログルカンのみを浸食して膜（Ｃ５／ＸＧ１）８と同様にシリコンウエハの表面に到達できない酵素に対する障壁の役目をする。
【０３１９】
これらの構造のそれぞれは従って利点を提供する。
【０３２０】
構造ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１はその厚さを変化させることにより試験の終わりに所望される色の選択を可能にする。しかしながら、最終の色が同じであるので浸食の「強さ」を定量化することはできないであろう。
【０３２１】
構造ＰＡＨ−Ｃ５／ＸＧ１は酵素の浸食をより明確に示す。実際、条件が組み合わされたときに検出層全体が浸食され、検出層の色変化により不完全な浸食を見ることを可能にする。
【０３２２】
二つの状況において、検出は実施例２による試験時より５０倍敏感である。
【実施例４】
【０３２３】
酵素活性検出
装置
酵素活性検出に関する補足試験が実施例１に詳述される手順に従って堆積された検出層を含む装置により行われた。
【０３２４】
以下（Ｃ５−ＸＧ１）５及び（Ｃ５−ＸＧ１）８と表示される使用される二つの装置はそれぞれ５及び８対の副層から成る検出層を備える。
【０３２５】
各副層対は以下を備える。すなわち、
５ｇ／Ｌの濃度で堆積されたセルロースナノ結晶の副層、及び
１ｇ／Ｌの濃度で堆積されたキシログルカンの副層。
【０３２６】
膜はそれぞれ以下を示す。すなわち、
膜（Ｃ５−ＸＧ１）５に対し、褐色及び７０ｎｍ近辺の厚さ、及び
膜（Ｃ５−ＸＧ１）８に対し、青色及び３．２８ｎｍの標準偏差を有する１２７．５ｎｍ近辺の厚さ。
【０３２７】
被検酵素は、その初期活性が４８８０ｎｋａｔ／ｇであるいくつかのセルラーゼの混合物から成るＬｙｖｅｎ社のＣｅｌｌｕｌｙｖｅ  ＴＲ酵素の混合物から成る。
【０３２８】
この酵素溶液は以下のそれぞれの濃度、すなわち１００ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ及び０．１ｍｇ／Ｌで二つの装置により試験された。
【０３２９】
結果
異なる濃度の酵素溶液の２μＬ液滴は５０℃のオーブンに１０、３０及び６０分間入れられた検出層上に堆積される。
【０３３０】
膜（Ｃ５−ＸＧ１）５及び（Ｃ５−ＸＧ１）８の外観は酵素感度試験の前後で比較される。検出層の色が変化したときに活性が検出される。
【０３３１】
サンプル（Ｃ５−ＸＧ１）８に対し、１０分の反応後、基板は１００ｍｇ／Ｌ及び５０ｍｇ／Ｌの濃度に対して見え、膜の全分解を示唆する。さらに、以下のより低い濃度、すなわち２５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び１５ｍｇ／Ｌのいくつかに対し膜の色は褐色に変わり、１０ｍｇ／Ｌの濃度からはそれは不変のままである。
【０３３２】
３０分の反応後、１５及び１０ｍｇ／Ｌの濃度の酵素溶液によるサンプル（Ｃ５−ＸＧ１）８の分解ははっきりと見える。
【０３３３】
反応時間の６０分への増加は、最低の濃度（１ｍｇ／Ｌ及び０．１ｍｇ／Ｌ）が必ずしも色変化を生じないという点において検出を顕著に改善しない。
【０３３４】
一方、１０ｍｇ／Ｌの濃度の酵素溶液による分解が３０分のインキュベーション時間と比較して６０分のインキュベーションに対して増加することでは注目に値する。これは３０分後に見える褐色が６０分で基板の灰色に置き換わるからである。
【０３３５】
サンプル（Ｃ５−ＸＧ１）５に対する試験は同様の特性を示す。唯一の相違は１０ｍｇ／Ｌの濃度の酵素溶液から生じ、３０分後のサンプル（Ｃ５−ＸＧ１）５に対して分解は完全であるが、上に明記されたサンプル（Ｃ５−ＸＧ１）８に対して分解はほんの部分的であった。
【０３３６】
これらの結果は、膜の反応時間と厚さが試験時の感度と応答を最適化するために重要なパラメータであることを示す。
【０３３７】
さらに、検出層の反応時間と厚さの組合せは酵素活性の半定量評価に対して調整可能なパラメータである。例えば、その濃度が１０ｍｇ／Ｌである酵素溶液は１０分のインキュベーション後に検出されないが、３０分のインキュベーション後には確実な結果を生じる（サンプル（Ｃ５−ＸＧ１）８に対して部分分解が得られることを念頭に置くこと）。
【実施例５】
【０３３８】
さらなるバイオポリマの処方と分解
本発明による方法の他のバイオポリマへの適用可能性を評価するために、活性検出の確認として色の消滅を用いたいくつかのバイオポリマ／酵素対の評価概要が作成された。
【０３３９】
実施例１ないし３に従って、色を強調するために、バイオポリマ層のものより高い屈折率を有するシリコン基板上に堆積が行われた。
【０３４０】
それぞれの場合、基準として水、及び熱的に不活性化された酵素溶液（この溶液は数分間沸騰してから堆積される）が使用される。
【０３４１】
以下に与えられる全ての結果に対し、酵素溶液、不活性化された酵素溶液、及び水溶液が室温で３０分間インキュベートされた。
【０３４２】
ウシアルブミン血清の堆積トリプシンによる分解
０．１ｇ／ＬのＭＵＦ樹脂を含む１０ｇ／Ｌの溶液をスピン層形成することによりウシアルブミン血清の層が得られた。層は９０℃で１時間網状化された。
【０３４３】
チトサンと混合されたウシアルブミン血清の堆積、トリプシンによる分解
網状化を助けるためにチトサン（１０ｇ／Ｌ）と混合された１０ｇ／ＬのＢＡＳ溶液をスピン層形成することによりウシアルブミン血清の層が得られた。層は０．１ｇ／ＬのＭＵＦ樹脂溶液を添加した後に９０℃で１時間網状化することにより固定化された。
【０３４４】
ペクチンの堆積とペクチン分解混合物による分解
ＭＵＦ樹脂を５重量％含む１０ｇ／Ｌの溶液をスピン層形成することによりペクチン層が得られた。層は９０℃で１時間網状化された。
【０３４５】
結果
三つの場合全てにおいて、インキュベーションとリンス後、活性酵素溶液が堆積された個所にのみ色変化がある。
【符号の説明】
【０３４６】
１  測色装置
２  基板
２ａ  基板上面
３  透明検出層
３ａ  検出層上面
３ｂ  透明検出層下面
４  空気と検出層間の界面
５  検出層と基板間の界面
６ａ  副層
６ｂ  副層
７ａ  副層
７ｂ  副層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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