(57)【要約】  本発明は、１つ以上の特定的な標的抗原に特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）に基づいた多量体足場を提供する。本発明はさらに、２つ以上の標的抗原に対して同時に結合する二重特異性Ｆｎ３由来結合分子、融合物、複合体およびＦｎ３に基づいた結合分子の安定性を増大するための方法を提供する。さらに、本発明は、Ｆｎ３に基づいた多量体足場を含む、予防剤、治療剤または診断剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の目的のＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）に由来する２つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）単量体足場を含んでいる組み換え多量体足場であって、ここで
（ａ）各々のＦｎＩＩＩ単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含んでおり、
（ｂ）前記ＦｎＩＩＩ単量体足場は、直列して接続され、ここで前記単量体のうちの少なくとも１つは、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含み、
（ｃ）前記組み換え多量体足場は、少なくとも１つの標的に対して特異的に結合し、かつ
（ｄ）前記標的に対する作用は、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場の作用よりも改善されている、多量体足場。
【請求項２】
前記多量体足場が、３、４、５、６、７、または８個のＦｎＩＩＩ単量体足場を含む、請求項１に記載の多量体足場。
【請求項３】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場の全てが、直鎖直列方式で接続される、請求項２に記載の多量体足場。
【請求項４】
前記少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項５】
前記多量体足場が、少なくとも２つの標的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項６】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、直接、リンカーによって、または異種部分によって、２、３、４、５もしくは６個の他のＦｎＩＩＩ単量体足場に接続される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項７】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場がリンカーによって接続される、請求項６に記載の多量体足場。
【請求項８】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、ＦｎＩＩＩ単量体足場の間にリンカーを割り込むことなく直接接続される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項９】
１つ以上の目的のＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）に由来する３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）単量体足場を含む組み換え多量体足場であって、ここで
（ａ）各々のＦｎＩＩＩ単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、
（ｂ）前記組み換え多量体ＦｎＩＩＩ足場が少なくとも１つの標的に特異的に結合し、かつ
（ｃ）前記標的に対する作用が、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場の作用よりも改善されている、多量体足場。
【請求項１０】
前記多量体足場が、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のＦｎＩＩＩ単量体足場を含む、請求項９に記載の多量体足場。
【請求項１１】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場の全てが、直鎖直列方式で接続される、請求項１０に記載の多量体足場。
【請求項１２】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１３】
前記多量体足場が、少なくとも２つの標的に結合する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１４】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、直接、リンカーによって、または異種部分によって、２、３、４、５もしくは６個の他のＦｎＩＩＩ単量体足場に接続される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１５】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場がリンカーによって接続される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１６】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、ＦｎＩＩＩ単量体足場の間にリンカーを割り込むことなく直接接続される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１７】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場における前記複数のβ鎖が、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名された７つのβ鎖を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１８】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場中の複数のループ領域が、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名された６つのループ領域を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項１９】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場について、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場のものよりも結合が改善されており、前記改善は、結合親和性および／または結合力の改善におけるものである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２０】
標的に対する結合親和性およびタンパク質安定性が、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場のものよりも改善されている、請求項１９に記載の多量体足場。
【請求項２１】
標的に対する結合力およびタンパク質安定性が、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場のものよりも改善されている、請求項１９に記載の多量体足場。
【請求項２２】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、少なくとも２つの天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２３】
前記リンカーが、ペプチドリンカーを含む、請求項６、７、１４または１５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２４】
前記ペプチドリンカーが、可塑性のペプチドリンカーである、請求項２３に記載の多量体足場。
【請求項２５】
前記リンカーが、官能性成分を含む、請求項６または１４のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２６】
前記官能性成分が、免疫グロブリンまたはそのフラグメントである、請求項２５に記載の多量体足場。
【請求項２７】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場のうちの少なくとも１つが異種部分に融合されている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２８】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場のうちの３つ以上が、リンカーによって接続され、ここで少なくとも１つのリンカーが他のリンカーとは構造的におよび／または機能的に異なる、請求項６、７、１４または１５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項２９】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場が分岐方式で接続される、請求項２、４〜８、１０または１２〜２８のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３０】
いくつかのＦｎＩＩＩ単量体足場が直鎖直列方式で接続され、いくつかのＦｎＩＩＩ単量体足場が、分岐方式で接続される、請求項２、４〜８、１０または１２〜２８のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３１】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３２】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が異なる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３３】
前記多量体足場が、受容体アゴニストである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３４】
前記多量体足場が受容体アンタゴニストである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３５】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が同じ標的に同じエピトープで結合する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３６】
少なくとも２つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、同じ標的に異なるエピトープで結合する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項３７】
前記異なるエピトープが、重複しないエピトープである、請求項３６に記載の多量体足場。
【請求項３８】
前記異なるエピトープが、重複するエピトープである、請求項３６に記載の多量体足場。
【請求項３９】
少なくとも１つのＦＯＩが、動物のＦｎＩＩＩドメイン、細菌のＦｎＩＩＩドメイン、古細菌のＦｎＩＩＩドメイン、およびウイルスのＦｎＩＩＩドメインからなる群より選択される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項４０】
少なくとも１つのＦＯＩが、配列番号１〜３４、５９、６９のいずれか１つ、および図１６に示される任意の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４１】
少なくとも１つのＦＯＩが、超好熱性古細菌由来のＦｎＩＩＩドメインである、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４２】
前記動物のＦｎＩＩＩドメインが、ヒトテネイシンＣの第三のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）またはその機能的フラグメントを含む、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４３】
前記動物のＦｎＩＩＩドメインが、ヒトフィブロネクチンの第１４のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号６９）またはその機能的フラグメントを含む、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４４】
前記動物のＦｎＩＩＩドメインが、ヒトフィブロネクチンの第１０のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号６４）またはその機能的フラグメントを含む、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４５】
各々のＦｎＩＩＩ単量体のＦＯＩが、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）またはその機能的フラグメントを含む、請求項３９に記載の多量体足場。
【請求項４６】
前記機能的なフラグメントが、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１４）のＮ末端短縮型である、請求項４２または４５のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項４７】
前記ＦｎＩＩＩ単量体足場のうちの少なくとも１つのβ鎖が、配列番号４における同族のβ鎖に対して少なくとも９０％配列同一性を有する、請求項１７に記載の多量体足場。
【請求項４８】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場について、Ａβ鎖ドメインが、配列番号４１または４２を含み、Ｂβ鎖が、配列番号４３を含み、Ｃβ鎖が配列番号４４または１３１を含み、Ｄβ鎖が配列番号４６を含み、Ｅβ鎖が配列番号４７を含み、Ｆβ鎖が配列番号４８を含み、かつＧβ鎖が配列番号５２を含む、請求項１７に記載の多量体足場。
【請求項４９】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場について、ＡＢループが、配列番号３５を含み、ＣＤループが配列番号３７を含み、かつＥＦループが配列番号３９を含む、請求項１８に記載の多量体足場。
【請求項５０】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場について、ＢＣループが、配列番号３６を含み、ＤＥループが配列番号３８を含み、かつＦＧループが配列番号３９を含む、請求項１８に記載の多量体足場。
【請求項５１】
ＡＢループが、配列番号３５を含み、ＢＣループが配列番号９７、９８、９９、１００、または１０１を含み、ＣＤループが配列番号３７を含み、ＤＥループが配列番号３８、１０２、１０３、１０４、または１０５を含み、ＥＦループが配列番号３９を含み、かつＦＧループが配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０または１１１を含む、請求項１８に記載の多量体足場。
【請求項５２】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場について、Ａβ鎖が配列番号４１または４２を含み、Ｂβ鎖が、配列番号４３を含み、Ｃβ鎖が配列番号４５または１３１を含み、Ｄβ鎖が配列番号４６を含み、Ｅβ鎖が配列番号４７を含み、Ｆβ鎖が配列番号４９、５０または５１を含み、かつＧβ鎖が配列番号５２または５３を含む、配列番号１７に記載の多量体足場。
【請求項５３】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場のＦＯＩが、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の多量体足場。
【請求項５４】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧのループに存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつここでループの長さｎは、２と２６との間の整数である、請求項１７に記載の多量体足場。
【請求項５５】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＩＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＣＶＳＬＩＳ（ＸＦＧ）ｎＫＥＣＦＴＴ、
ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧのループに存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつループの長さｎは、２と２６との間の整数である、請求項１７に記載の多量体足場。
【請求項５６】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＣＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＣＦＴＴ、
ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧのループに存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつここでループの長さｎは、２と２６との間の整数である、請求項１７に記載の多量体足場。
【請求項５７】
前記ＡＢループが配列番号３５を含み、前記ＣＤループが配列番号３７を含み、かつ前記ＥＦループが配列番号３９を含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項５８】
前記ＢＣループが配列番号３６を含み、前記ＤＥループが配列番号３８を含み、かつ前記ＦＧループが配列番号４０を含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項５９】
前記少なくとも１つのＢＣループ、ＤＥループまたはＦＧループがループ変異体である、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項６０】
前記ＢＣループが、配列番号９７、９８、または１６８を含む、請求項５９に記載の多量体足場。
【請求項６１】
前記ＤＥループが、配列番号１０２または１０３を含む、請求項５９に記載の多量体足場。
【請求項６２】
前記ＦＧループが、配列番号１０６、１０８、１０９、１６９または１７０を含む、請求項５９に記載の多量体足場。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場の増大されたタンパク質安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性（ＣＤ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、プロテアーゼ耐性、等温熱量測定（ＩＴＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、尿素変性またはグアニジン変性によって測定される、請求項２０または２１のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項６４】
少なくとも１つのＦｎＩＩＩ単量体足場が、親和性成熟されている、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の多量体足場。
【請求項６５】
組み換え多量体足場を得るための方法であって、目的の１つ以上の野性型ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の２つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）単量体足場を発現するか、融合するかまたは複合することを含み、ここで
（ａ）各々のＦｎＩＩＩ単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、
（ｂ）ＦｎＩＩＩ単量体足場は、直列して接続され、ここで前記ＦｎＩＩＩ単量体足場のうちの少なくとも１つは、１つの天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含み、
（ｃ）前記組み換え多量体足場は、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、かつ
（ｄ）前記標的に対する作用は、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場のものよりも改善されている、方法。
【請求項６６】
目的の１つ以上の野性型ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の少なくとも３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）単量体足場を発現するか、融合するかまたは複合することを含む、組み換え多量体足場を得るための方法であって、ここで
（ａ）各々のＦｎＩＩＩ単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、
（ｂ）組み換え多量体ＦｎＩＩＩ足場は、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、かつ
（ｃ）前記標的に対する作用は、同族のＦｎＩＩＩ単量体足場のものよりも改善されている、方法。
【請求項６７】
前記ＦＯＩが、配列番号１〜３４、５４、６９のうちのいずれか１つ、および図１６に示される任意の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項６５または６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
請求項６５または６６のいずれか１項に記載の方法によって生成される組み換え多量体足場。
【請求項６９】
請求項１〜６４または６８のいずれか１項に記載の多量体足場をコードする単離された核酸分子。
【請求項７０】
請求項６９に記載の核酸に対して作動可能に連結された発現ベクター。
【請求項７１】
請求項７０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７２】
核酸分子によってコードされる前記多量体足場が発現される条件下で、請求項７１に記載の宿主細胞を培養することを含む、組み換え多量体足場を産生する方法。
【請求項７３】
薬学的に許容される賦形剤中に請求項１〜６４または６８のいずれか１項に記載の組み換え多量体足場を含む組成物。
【請求項７４】
治療が必要な患者において、癌、自己免疫障害、炎症性障害、または感染を治療するための方法であって、請求項７３に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項７５】
サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、請求項１〜６４または６８の多量体ＦｎＩＩＩ足場または複合体を標識することと、標識された多量体ＦｎＩＩＩ足場または複合体とサンプルとを接触させることと、多量体ＦｎＩＩＩ足場または複合体とタンパク質との間の複合体形成を検出することとを含む、方法。
【請求項７６】
前記異種部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞毒性剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体フラグメント、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組み換えポリペプチドポリマー、サイトカインおよび上記部分のうち２つ以上の組み合わせからなる群より選択される組成物を含む、請求項２７に記載の多量体足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リストへの参照
本出願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂ出願手続き経由でテキストファイルとして本出願と一緒に提出された配列リストが、参照により組み込まれる。本リストは、「２９４３．０１１ＰＣ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」の名称の２０１１年４月１２日に作成された、２２１キロバイトのサイズのファイルである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概括的には抗体模倣薬の分野に関し、具体的には、例えば新規の結合特性を有する産物の生成に有用な、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ドメインに基づく多量体足場の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
目的の標的エピトープに特異的結合可能な生体分子は、治療、研究、および医用診断ツールとして非常に重要である。このクラスの分子のよく知られた例は、抗体である。ほとんど全ての構造のエピトープ対し、特異的、かつ親和性を有する結合をする抗体を選択可能である。しかし、古典的な抗体は、構造的に複雑なヘテロテトラマー分子であり、単純な真核系で発現させるのは困難である。結果として、ほとんどの抗体は、複雑で高価な哺乳動物細胞発現系を使って産生される。
【０００４】
比較的確定した３次元構造を有し、通常、タンパク質足場と呼ばれるタンパク質は、操作産物の設計のための試薬として使用可能である。これらの足場は、典型的には、特異的またはランダムな配列変化を受けやすい１つまたは複数の領域を含み、このような配列無作為化は、目的の産物を選択することができるタンパク質ライブラリーを作成するために行われることが多い。
【０００５】
このような足場が有用な１つの特定の領域は、抗体模倣薬の設計の分野である。抗体模倣薬、すなわち、小さい、非抗体タンパク質治療薬は、抗体および抗体断片の利点、例えば、標的への高親和性結合ならびに低免疫原性および毒性を利用するが、いくつかの不十分な点、例えば、抗体断片が凝集し、完全長ＩｇＧに比べた低安定性の傾向、を回避する。
【０００６】
これらの欠点は、抗体本来の折り畳みの部分の除去により作られる抗体断片を使って対処可能である。しかし、これは、通常は、疎水性の環境、例えば、可変および定常ドメインの間の境界に埋もれているアミノ酸残基が溶媒に曝される場合に、凝集する原因になることが多い。
【０００７】
足場に基づく抗体模倣薬の一例は、哺乳類血液および構造タンパク質、等において門およびタンパク質クラスにわたって広く認められるドメインであるフィブロネクチンのタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モジュールの構造に基づくものである。ＦｎＩＩＩドメインは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体および原核生物酵素、を含む種々のタンパク質中で発生することが多い（ＢｏｒｋａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８９９０−８８９４、１９９２；Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７、１９９７；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１９１０−１９１８、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５６５９−１５６６５、１９９０）。国際公開第２００９／０５８３７９号には、ＦｎＩＩＩドメイン、特に、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに基づいた足場について記載されている。ＦｎＩＩＩドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ順にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ鎖と名付けられた７つのベータ鎖を含み、それぞれの鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ順に、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと名付けられたループ領域により隔てられている。ＦｎＩＩＩドメインは、免疫グロブリンではないが、ヒトテネイシンＣドメインの第３のＦｎＩＩＩドメインの全体の折り畳みは、最小機能の抗体断片である重鎖の可変領域に密接に関連し、これはラクダとラマのＩｇＧの全抗原認識ユニットを含んでいる。これにより、ＦｎＩＩＩドメインのそれぞれ反対側、例えば、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメインの自然抗体のＣＤＲと類似の相対的位置に３つのフィブロネクチンループを示すことができる。
【０００８】
種々の治療および診断への適用のために強化された特異性、親和性、結合力、および安定性、を有する改善された安定な、人工の抗体様分子、ならびにこのような分子を特定するための選別方法の開発が必要である。
【０００９】
本明細書における文献の参照と考察は、それらが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、１つまたは複数の対象ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モノマー足場を含む組換え型多量体足場を提供し、ここで（ａ）各ＦｎＩＩＩモノマー足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、（ｂ）ＦｎＩＩＩモノマー足場は、タンデムに連結され、少なくとも１つのモノマーは、非天然分子内ジスルフィド結合を含み、（ｃ）組換え型多量体足場は、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、さらに（ｄ）標的に対する作用は、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善されている。
【００１１】
本発明は、また、１つまたは複数の対象ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の３つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モノマー足場を含む組換え型多量体足場を提供し、（ａ）各ＦｎＩＩＩモノマー足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、（ｂ）組換え型多量体ＦｎＩＩＩ足場は、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、さらに（ｃ）標的に対する作用は、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善されている。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、３、４、５、６、７、または８つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含む。一部の実施形態では、多量体足場中の全てのＦｎＩＩＩモノマー足場がタンデムになっている。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、非天然分子内ジスルフィド結合を含む。一部の他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つの標的に結合する。一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場は、直接に、またはリンカーによって、または異種の成分によって２、３、４、５、または６つの他のＦｎＩＩＩモノマー足場に結合される。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、７、８、９、１０、１１または１２のＦｎＩＩＩモノマー足場を含み、これは一部の実施形態では、全て直列であってもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、リンカーにより連結されている。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、ＦｎＩＩＩモノマー足場の間に挿入されるリンカーを使わずに直接結合される。一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場中の複数のベータ鎖が、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと名付けられた７つのベータ鎖を含む。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場の複数のループ領域が、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと名付けられた６つのループ領域を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明は、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場において、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも、結合親和性および／または結合力の点で結合が改善される。
【００１５】
一部の実施形態では、多量体足場の標的に対する結合親和性およびタンパク質安定性が、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善される。他の実施形態では、多量体足場の標的に対する結合力およびタンパク質安定性が同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善される。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明の多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、少なくとも２つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、多量体足場が、ペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、柔軟なペプチドリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、官能性成分を含み、免疫グロブリンまたはその断片であり得る。
【００１７】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場は、異種の成分、例えば、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、細胞障害性試薬、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記成分の２つ以上の組み合わせ、に融合される。
【００１８】
一部の実施形態では、２つ超の多量体足場中のＦｎＩＩＩモノマー足場がリンカーにより連結され、少なくとも１つのリンカーは、構造的および／または機能的に他のリンカーとは異なる。他の実施形態では、多量体ＦｎＩＩＩ足場中のＦｎＩＩＩモノマー足場は、分岐形式で連結される。他の実施形態では、一部の多量体足場中のＦｎＩＩＩモノマー足場は、直列形式で連結され、一部のＦｎＩＩＩモノマー足場は、分岐形式で連結される。
【００１９】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場は、同一であり、一部の他の実施形態では、少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場は異なる。一部の実施形態では、多量体足場は、受容体アゴニストである。他の実施形態では、多量体足場は、受容体アンタゴニストである。
【００２０】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、同じエピトープの同じ標的に結合する。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、異なるエピトープの同じ標的に結合する。一部の実施形態では、異なるエピトープは、非オーバーラップエピトープであり、他の実施形態では、異なるエピトープはオーバーラップエピトープである。
【００２１】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＦＯＩが、動物ＦｎＩＩＩドメイン、細菌性ＦｎＩＩＩドメイン、古細菌ＦｎＩＩＩドメイン、およびウイルスＦｎＩＩＩドメイン、からなる群より選択される。このうちの少なくとも１つのＦＯＩは、いずれか１つの配列番号１〜３４、５９、６９の配列、および図１６に示されるいずれかの配列からなる群より選択される配列を含んでもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＦＯＩは、超好熱性古細菌由来ＦｎＩＩＩドメインである。
【００２２】
一部の実施形態では、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）、またはその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ＦＯＩは、ヒトフィブロネクチンの第１４ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号６９）もしくはその機能性断片、またはヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号５４）もしくはその機能性断片を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、多量体足場中の各ＦｎＩＩＩモノマーに対するＦＯＩは、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）またはその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインの機能性断片は、Ｎ末端切断型（配列番号１４）である。
【００２４】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場のベータ鎖は、配列番号４中の同種のベータ鎖に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場で、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４１または４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４４または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４８を含み、さらにＧベータ鎖は配列番号５２を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場で、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、さらにＥＦループは配列番号３９を含む。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場で、ＢＣループは配列番号３６を含み、ＤＥループは配列番号３８を含み、さらにＦＧループは配列番号４０を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場で、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＢＣループは配列番号９７、９８、９９、１００、または１０１を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、ＤＥループは配列番号３８、１０２、１０３、１０４、または１０５を含み、ＥＦループは配列番号３９を含み、さらにＦＧループは配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場で、Ａベータ鎖は配列番号４１または４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４４、４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９、５０または５１を含み、さらにＧベータ鎖は配列番号５２または５３を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場のＦＯＩは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴを含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、ループの長さｎは２〜２６の整数である。
【００３０】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＩＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＣＶＳＬＩＳ（ＸＦＧ）ｎＫＥＣＦＴＴを含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、ループの長さｎは２〜２６の整数である。
【００３１】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＣＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＣＦＴＴを含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、ループの長さｎは２〜２６の整数である。
【００３２】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、配列番号３５を含むＡＢループ、配列番号３７を含むＣＤループ、および配列番号３９を含むＥＦループを含む。他の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、配列番号３６を含むＢＣループ、配列番号３８を含むＤＥループ、および配列番号４０を含むＦＧループを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、少なくとも１つのＢＣループ、ＤＥループまたはＦＧループ変異体を含む。一部の実施形態では、ＢＣループ変異体は、配列番号９７、９８、または１６８を含む。他の実施形態では、ＤＥループ変異体は、配列番号１０２、または１０３を含む。一部の他の実施形態では、ＦＧループ変異体は、配列番号１０６、１０８、１０９、１６９、または１７０を含む。一部の実施形態では、ＢＣループ、ＤＥループまたはＦＧループ変異体は、配列番号１７８、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０５、２０６、２０７、または２０８のそれぞれのＢＣ、ＤＥ、またはＦＧループのアミノ酸配列を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場のタンパク質安定性の増加は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性（ＣＤ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、プロテアーゼ耐性、等温熱量測定（ＩＴＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、尿素変性、またはグアニジン変性により測定される。
【００３５】
一部の実施形態では、多量体足場中の少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場は、親和性成熟される。
【００３６】
本発明は、また、１つまたは複数の野性型対象ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モノマー足場を発現、融合または結合させることを含む組換え型多量体足場を得る方法を提供し、（ａ）各ＦｎＩＩＩモノマー足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、（ｂ）ＦｎＩＩＩモノマー足場は、タンデムに連結され、少なくとも１つのＦｎＩＩＩモノマー足場が、１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、（ｃ）組換え型多量体足場が、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、さらに（ｄ）標的に対する結合が、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善されている。
【００３７】
本発明は、また、１つまたは複数の野性型対象ＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）由来の少なくとも３つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モノマー足場を発現、融合または結合させることを含む組換え型多量体足場を得る方法を提供し、（ａ）各ＦｎＩＩＩモノマー足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、（ｂ）組換え型多量体足場が、少なくとも１つの標的に特異的に結合し、さらに（ｃ）標的に対する結合が、同種のＦｎＩＩＩモノマー足場よりも改善されている。
【００３８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの上述の方法で使用されるＦＯＩは、配列番号１〜３４、５４、６９のいずれか、および図１６に示されるいずれかの配列からなる群より選択される配列を含む。
【００３９】
本発明は、また、上述のいずれかの多量体足場をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、ベクターが核酸に機能的に連結される。他の実施形態では、宿主細胞は、ベクターを含むことができる。
【００４０】
本発明は、また、組換え型多量体足場を産生する方法を提供し、この方法は、核酸分子にコードされた多量体足場が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【００４１】
他の実施形態では、本発明の足場は、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされ、医薬組成物が得られる。
【００４２】
本発明は、また、治療を必要としている患者の癌、自己免疫障害、炎症性疾患、または感染症の治療方法を提供し、この方法は有効量の本発明の足場を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００４３】
本発明は、また、検体中のタンパク質を検出する方法を提供し、この方法は、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場または本発明の足場を含む複合体を標識し、標識多量体ＦｎＩＩＩ足場または複合体を検体と接触させ、さらに多量体ＦｎＩＩＩ足場または複合体とタンパク質の間の複合体形成を検出することを含む。
本発明の説明のために、本発明のある特定の実施形態を図によって示す。しかし、本発明は、図に示した実施形態の厳密な配置および手段に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】直鎖、抗体様および融合体形式の多価性のＴｎ３足場を示す。多価性のＴｎ３足場は、黒色八角形ブロックで示されたスペーサーで連結された２つ以上のＴｎ３モジュールを含み、ここで、スペーサーは、例えば、リンカーであってもよい。
【図２】Ａ２からＡ９として命名されたＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的多価性のＴｎ３足場を示す。これらは、図１に示す２〜８に変化する結合価（Ｔｎ３モジュールの数）を有する３つの異なる分子形式に従って産生された。
【図３】Ａ１〜Ａ５と命名された直列構築物に対応する未精製細菌培地（右のゲル）およびアフィニティー精製した検体（左のゲル）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。これらは、大腸菌中で発現し、１〜８の変動結合価を有する。
【図４】ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する一価（Ａ１）および多価性の（Ａ２、Ａ３）Ｔｎ３足場の結合を測定下競合ＥＬＩＳＡ法の結果を示す。
【図５】ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合しない同種の対照足場（Ｂ９）に比較した、Ｈ２１２２細胞に結合するＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的な多価性足場Ａ９のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。
【図６Ａ】ＴＲＡＩＬ  Ｒ２発現細胞株Ｈ２１２２の特異的死滅に与える多価性の足場による結合価の効果を示す。
【図６Ｂ】ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２腫瘍細胞死滅の特異性を示す。
【図７Ａ】４Ｔｎ３モジュール含有のＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２細胞の死滅に与える分子形式の効果を示す。
【図７Ｂ】８Ｔｎ３モジュール含有のＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２細胞の死滅に与える分子形式の効果を示す。
【図８Ａ】直鎖状融合４価（Ａ３）および８価（Ａ５）ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的Ｔｎ３足場による、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を発現している結腸直腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５細胞の特異的死滅を示す。
【図８Ｂ】直鎖状融合４価（Ａ３）および８価（Ａ５）ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的Ｔｎ３足場による、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を発現している白血病株Ｊｕｒｋａｔ細胞の特異的死滅を示す。
【図９Ａ】マウスＣＤ４０Ｌ−特異的タンデム二価Ｔｎ３足場（Ｍ１３構築物）の設計を示す。
【図９Ｂ】精製一価Ｍ１３構築物（ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３構築物）、または２つのＭ１３モジュールを連結した１、３、５または７Ｇｌｙ４Ｓｅｒユニット（ＧＳと表示）を含むリンカーを有するタンデム二価足場のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。一価Ｍ１３構築物をレーン２で、構築物Ｃ１をレーン３と７で、構築物Ｃ２をレーン４と８で、構築物Ｃ３をレーン５と９で、および構築物Ｃ４をレーン６と１０で実行した。検体を非還元条件（レーン２〜６）または還元条件（レーン７〜１０）で試験した。
【図９Ｃ】ＭｕＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）または二価タンデム足場による、バイオセンサーチップ上に固定されたマウスＣＤ４０受容体に対するＭｕＣＤ４０Ｌ結合の競合的阻害を示す。種々の構築物に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【図９Ｄ】Ｂ細胞上のＭｕＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ８６発現に与えるＭｕＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）Ｔｎ３、二価タンデム足場、または抗体ＭＲ１（抗ＭｕＣＤ４０Ｌ抗体）の阻害効果を示す。
【図１０】細菌培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、組換えにより大腸菌中で発現した可溶性一価およびＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＣＤ４０Ｌ二重特異性タンデム二価Ｔｎ３足場構築物の発現レベルを示す。一価足場、Ａ１と７９をレーン２と３にそれぞれ示す。長さが次第に増えているＧｌｙ４Ｓｅｒアミノ酸リンカー（構築物Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８に同種）によりタンデムに連結されたＡ１と７９を含むタンデム足場構築物を、レーン４〜７に示す。発現構築物は、染色したゲル上にアステリスクで示す。
【図１１Ａ】捕捉ＥＬＩＳＡ法を使ってアッセイした二重特異性Ｔｎ３足場のＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する結合を示す。
【図１１Ｂ】捕捉ＥＬＩＳＡ法を使ってアッセイした二重特異性Ｔｎ３足場のヒトＣＤ４０Ｌに対する結合を示す。
【図１２】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ法を使ってアッセイした二重特異性タンデムＴｎ３足場Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８のＴＲＡＩＬ  Ｒ２およびＣＤ４０Ｌに対する同時結合を示す。
【図１３】グアニジン−ＨＣｌの存在下のＴｎ３足場の安定性を示す。各試験足場のＣｍ（中点値）を示す。
【図１４】より長いＦＧループを有する親のＴｎ３足場と比較した、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で分析した、異なるループ配列であるが、同じ長さのＦＧループ（９つのアミノ酸）の３つの異なるＴｎ３足場の熱安定性を示す。
【図１５】親（ＷＴ）Ｔｎ３足場に比較した、グアニジン−ＨＣｌの存在下、９アミノ酸長さのＦＧループ（Ｐ１Ｃ０１、Ａ６、および７１）を有するＴｎ３足場の安定性の増加を示す。
【図１６Ａ】構造分析に基づく１０３の異なるＦｎＩＩＩ足場の複数の配列の整列化を示す。各ＦｎＩＩＩ配列は、異なるＦｎＩＩＩの３次元構造に対応し、それぞれのタンパク質データバンク（ＰＤＢ）の構造と鎖に従って特定される（例えば、１Ｖ５Ｊ＿Ａは、１Ｖ５ＪＰＤＢ構造中の鎖Ａの配列に対応する）。各ＦｎＩＩＩ配列に対する全体配列は、Ａ鎖から出発して、Ｇ鎖で終わる４つの連続パネルに示す。ループ領域は、整列の最上部に実線で示す。配列は、グループで表示され、各グループのＡＢループを図１６Ａ、１６Ｅ、１６Ｉ、および１６Ｍに示し；各グループのＢＣとＣＤループを図１６Ｂ、１６Ｆ、１６Ｊ、および１６Ｎに示し；ＤＥとＥＦループを図１６Ｃ、１６Ｇ、１６Ｋ、および１６Ｏに示し；さらにＦＧループを図１６Ｄ、１６Ｈ、１６Ｌ、および１６Ｐに示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｂの続きである。
【図１６Ｄ】図１６Ｃの続きである。
【図１６Ｅ】図１６Ｄの続きである。
【図１６Ｆ】図１６Ｅの続きである。
【図１６Ｇ】図１６Ｆの続きである。
【図１６Ｈ】図１６Ｇの続きである。
【図１６Ｉ】図１６Ｈの続きである。
【図１６Ｊ】図１６Ｉの続きである。
【図１６Ｋ】図１６Ｊの続きである。
【図１６Ｌ】図１６Ｋの続きである。
【図１６Ｍ】図１６Ｌの続きである。
【図１６Ｎ】図１６Ｍの続きである。
【図１６Ｏ】図１６Ｎの続きである。
【図１６Ｐ】図１６Ｏの続きである。
【図１７】図１７Ａは、三重特異性／三価Ｔｎ３足場の模式的表現および発現を示す。Ｄ１−１Ｅ１１−７９足場は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）結合ドメイン（Ｄ１）、続いてＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃ結合ドメイン（１Ｅ１１）、およびヒトＣＤ４０Ｌ（７９）に特異的なＣ末端Ｔｎ３ドメインを含む。柔軟性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが各ドメインを隔てている。図１７Ｂは、発現し、精製したＤ１−１Ｅ１１−７９足場のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリス）ゲルを示す。この構築物の期待される分子量は、約３４、０８１ダルトンである。
【図１８Ａ】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合分析による、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のｈｕＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃへの同時結合を示す。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナル（ＡＳＳ）は、Ｔｒａｉｌ  Ｒ２−Ｆｃ濃度の関数として示される。
【図１８Ｂ】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合分析による、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のｈｕＣＤ４０ＬおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）への同時結合を示す。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナル（ＡＳＳ）は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）濃度の関数として示される。
【図１９】ＥＬＩＳＡによる、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＦｃおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）への同時結合を示す。
【図２０】親ＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合クローン１Ｃ１２および親和性成熟誘導体の配列整列化を示す。操作ジスルフィド結合の位置は、強調表示しており、矢印は１つのフレームワーク変異の位置を示し、さらに親和性成熟の間に生じたループの変化を強調表示ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤで示す。
【図２１】１Ｃ１２クローンおよびその親和性成熟誘導体のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを示す。
【図２２】マウス血清中のＧ６タンデム体の濃度を時間の関数として示す。
【図２３Ａ】クローンＦ４に対する操作によるカニクイザルの交差反応性の増強に対応する配列の整列化を示す。これらの全クローンの中で共通の特徴は、ＤからＧのＤＥループの前の２つのアミノ酸の変異である。
【図２３Ｂ】ヒトまたはカニクイザルＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＦｃのＦ４ｍｏｄ１コートプレートへの結合のＦ４またはＦ４ｍｏｄ１モノマーによる阻害のＥＬＩＳＡ測定を示す。
【図２４Ａ】クローンＦ４ｍｏｄ１の生殖系列化に対応する配列の整列化、特に、Ｆ４、Ｆ４ｍｏｄ１およびＦ４ｍｏｄ１２のＴＮ３生殖系列に対する比較を示す。
【図２４Ｂ】ヒトまたはカニクイザルＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＦｃのＦ４ｍｏｄ１コートプレートに対する結合のＦ４、Ｆ４ｍｏｄ１、またはＦ４ｍｏｄ１２モノマーによる阻害のＥＬＩＳＡ測定を示す。
【図２４Ｃ】Ｆ４ｍｏｄ１２タンデム６に対しＧ６タンデム６を比較したＣｏｌｏ２０５細胞死滅アッセイを示す。
【図２４Ｄ】Ｆ４ｍｏｄ１２タンデム８に対しＧ６タンデム８比較したＣｏｌｏ２０５細胞死滅アッセイを示す。
【図２５】ＴＲＡＩＬ耐性細胞株ＨＴ２９中でＦ４ｍｏｄ１２タンデム８に対しＧ６タンデム８の活性を比較したＨＴ２９細胞死滅アッセイを示す。
【図２６】Ａｎｔｉｔｏｐｅ  ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ免疫原性分析で試験したクローンに対応する配列の整列化を示す。クローンＦ４ｍｏｄ１２に関する差異を強調表示している。
【図２７Ａ】非ＳＥＣ精製Ｇ６タンデム８のＳＥＣデータを示す。
【図２７Ｂ】ＳＥＣ精製Ｇ６タンデム８のＳＥＣデータを示す。
【図２８】種々用量のＴｎ３ＴＲＡＩＬ  Ｒ２アゴニストＧ６タンデム６およびＧ６タンデム８に応答したＣｏｌｏ２０５結腸直腸癌異種移植モデルの腫瘍容量の変化を示す。
【図２９】種々用量のＴｎ３ＴＲＡＩＬ  Ｒ２アゴニストＧ６タンデム６およびＧ６タンデム８に応答したＣｏｌｏ２０５結腸直腸異種移植モデルの体重変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
定義
本発明を詳細に記載する前に、具体的な組成物またはプロセスステップを変更してもよいという理由から、本発明は、これらに限定されないことは理解されたい。本明細書および添付の請求項で使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別義が指示されない限り、複数参照対象を含むことに留意しなければならない。「ａ」（また「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では同義に使用することができる。
【００４６】
さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合は、他方を含め、または含めない、２つの特定された特徴または要素のそれぞれの特定的開示と解釈すべきである。従って、本明細書の語句、例えば、Ａおよび／またはＢ」で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、語句、例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」で使用される「および／または」という表現は、次の実施形態のそれぞれを包含することが意図されている：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【００４７】
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術的科学的用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ、Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、２ｎｄ  ｅｄ．、２００２、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｅｖｉｓｅｄ、２０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、は、本発明で使用されている多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
【００４８】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で表示される。数値の範囲は、範囲を定める数値を含む。他に指示がない限り、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向へ記述される。本明細書で記載される表題は、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではなく、これら態様または実施形態は明細書全体への参照により理解することができる。従って、すぐ後で定義される用語は、明細書全体への参照によりより完全に定義される。
【００４９】
実施形態が、本明細書で用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて記載される場合はいつでも、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の用語で記載されるそれ以外の類似の実施形態もまた提供されることは理解されよう。
【００５０】
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されているそれらの一般に知られている３文字記号または１文字記号により参照される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常受け入れられている単一文字コードにより参照される。
【００５１】
本明細書で使われる「エピトープ」という用語は、本発明の足場に結合できるタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、化学的に活性な表面分子集団、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常は、特異的３次元的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶剤の存在下で前者に対する結合が失われ、後者に対しては失われないことから区別される。
【００５２】
「フィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ドメイン」、「ＦｎＩＩＩドメイン」という用語は、ヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインに相同なポリペプチドを指し、これは少なくとも７つのベータ鎖を有し、それらのベータ鎖は２つのベータシート間に分布し、それら自信で相互に詰め合わせてタンパク質のコアを形成し、さらに相互にベータ鎖を連結する溶媒露出ループを含む。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも３つのこのようなループがあり、このエッジは、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である。ある特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名された６つのループ領域に結合したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名された７つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結している。図１６は、３次元構造の分析に基づく多くのＦｎＩＩＩドメインに対するベータ鎖およびループの一次配列位置を提供する。これらの領域の別の定義が当技術分野で知られていることは留意されるべきである。しかし、これらのＦｎＩＩＩドメインに対し、Ａ鎖のＮ末端および／またはＧ鎖のＣ末端が切断型である可能性があることがわかることを除いて、別義が明確に指示されていない限り、図１６の定義が、本明細書で使用される。「フィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ドメイン」および「ＦｎＩＩＩドメイン」という用語はまた、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことが認識されている、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、もしくはタンパク質配列をＦｎＩＩＩドメイン記述Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルと比較できる当技術分野で既知の他のいずれかのプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことが認識されているタンパク質ドメインを含む。さらに、この用語は、機能性断片および操作ＦｎＩＩＩドメイン、例えば、コア操作されたＦｎＩＩＩドメインを含む（例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：３８４０２３、２００８参照）。
【００５３】
「フィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）足場」または「ＦｎＩＩＩ足場」という用語は、ＦｎＩＩＩドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを指し、少なくとも１つのループは、対象ＦｎＩＩＩドメイン／足場の非天然変異体であり、さらに前記ＦｎＩＩＩ足場、またはその機能的断片は、標的に結合できる。またこの本明細書中の「結合」という用語は、特異的結合に関するのが好ましい。本明細書で使われる「非天然変異体」は、出発タンパク質配列（例えば、対象ＦｎＩＩＩドメイン／足場）中の同種の配列由来の少なくとも１つのアミノ酸による欠失、置換または付加により変動してもよく、出発タンパク質配列は、自然ＦｎＩＩＩドメイン配列または以前同定したＦｎＩＩＩ足場配列であってもよい。ある特定の実施形態では、Ａベータ鎖は、切断されている、例えば、１つまたは複数のＡベータ鎖のＮ末端残基が欠失してもよい。ある特定の実施形態では、Ｇベータ鎖は切断されている、例えば、１つまたは複数のＧベータ鎖のＣ末端残基が欠失してもよい。ある特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩ足場は、１つまたは複数のベータ鎖の非天然変異体を含む。ある特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、下記のベータ鎖に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の配列相同性を示す：配列番号１〜３４、５４、もしくは６９のいずれかの同種のベータ鎖の一次配列、もしくは図１６のＦｎＩＩＩのいずれかのベータ鎖の一次配列、またはＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャａを含むことが認識されている、もしくはＰｆａｍスキャン、ＨＭＭＥＲ、もしくはタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルと比較できる他のいずれかのプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことが認識されているタンパク質ドメインのベータ鎖。
【００５４】
「ＤＮＡ」という用語は、２つ以上の共有結合で結合した、天然または改変デオキシリボヌクレオチドの配列を指す。
【００５５】
「融合タンパク質」という用語は、（ｉ）１つまたは複数の本発明の足場、およびこれが結合した（ｉｉ）第２の別のタンパク質（すなわち「異種の」タンパク質）を含むタンパク質を指す。
【００５６】
本明細書で使われる「異種の成分」という用語は、本発明の足場に対する組成物の追加を示すのに使われ、その組成物は、ＦｎＩＩＩドメインの通常の部分ではない。代表的異種の成分には、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機のポリマー、ならびにＦｎＩＩＩドメイン自体に固有ではない活性を提供可能な他のいずれかの組成物が含まれ、また、この活性提供可能組成物には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞障害性の試薬、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパードメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体ドメインもしくは断片（例えば、抗体可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等、が含まれる。
【００５７】
本明細書で使われる「リンカー」という用語は、２つ以上の足場を結合またはこれらを連結するいずれの分子集合体をも指す。リンカーは、足場のモジュール間の「スペーサー」として作用する機能を有する分子であってもよく、また追加の機能（すなわち、「官能性成分」）を有する分子であってもよい。「異種の成分」の定義に含まれる分子もまた、リンカーとして機能することができる。
【００５８】
「結合された（ｌｉｎｋｅｄ）」および「融合された（ｆｕｓｅｄ）」という用語は、同義に使用される。これらの用語は、化学の結合または組換え型手段を含む意味を有する全ての作用により、２つ以上の足場、異種の成分、またはリンカーを結合することを指す。
【００５９】
「多量体」「多量体足場」および「多価足場」という用語は、会合している少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含む分子を指す。多量体足場を形成する足場は、各足場を独立に機能させるリンカーを介して結合できる。「多量体」および「多価」は、本明細書では同義に使用できる。多価足場は、単一特異性でも、二重特異性でもよい。
【００６０】
「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」という用語は、多くの場合残りのタンパク質とは無関係に、安定な３次元構造に折り畳み可能なタンパク質の領域を指し、これは特有の機能を備えることができる。この構造は、元のタンパク質内のドメインの機能に関連した、酵素活性、別の分子に対する認識モチーフの形成、等の特異的機能を保持し、またはタンパク質が、タンパク質の特定の環境中で存在するために必要な構造成分を提供する。タンパク質ファミリーおよび関連タンパク質スーパーファミリーの両方の内で、タンパク質ドメインは、進化上保存領域でありうる。多量体足場の成分を記述する場合、「ドメイン」、「モノマー足場」、および「モジュール」という用語は、同義に使用される。「自然ＦｎＩＩＩドメイン」は、生体によりコードされるいずれかの非組換え型ＦｎＩＩＩドメインを意味する。
【００６１】
タンパク質配列に関連した「配列相同性」という用語は、２つ以上のタンパク質配列間の類似性、すなわち、同一または保存的アミノ酸置換であるアミノ酸残基のパーセンテージを指す。
【００６２】
本明細書で使用される「配列類似性パーセント（％）」および「相同性パーセント（％）」という用語は、等価と見なされ、最大パーセント配列類似性を得るためにアミノ酸配列を整列させ、必要に応じ、候補および／または選択配列中にギャップを導入後の、選択配列中のアミノ酸残基と同一か、またはそれの保存的置換である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【００６３】
「同一性パーセント（％）」は、本明細書では、最大パーセント配列同一性を得るためにアミノ酸配列を整列させ、必要に応じ、候補および／または選択配列中にギャップを導入後の、選択配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部とは見なしていない。
【００６４】
本明細書で使われる「保存的置換」という用語は、別の、生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例には、１つのアミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、またはメチオニンの別の疎水性残基での置換、または１つの極性残基の別の極性残基残基での置換、例えば、アルギニンのリシンによる置換およびその逆、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換およびその逆、グルタミンのアスパラギンによる置換およびその逆等が含まれる。相互に置換可能な中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが含まれる。「保存的置換」という用語は、また、ペプチドの生物学的活性が維持されることが前提として、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。。アミノ酸残基間の生物学的類似性は、限定されないが、例えば、疎水性、変異頻度、電荷、側鎖長、側鎖容積、ｐＫａ、極性、芳香族性、溶解度、表面積、ペプチド結合の幾何学的配置、二次構造性向、平均溶媒露出度、等、の特性間の類似性を指す。
【００６５】
相同性パーセント（すなわち、配列類似性）または同一性パーセントを決めるための整列化は、例えば、公になっている、または独占的アルゴリズムを使って当分野の技術範囲内の種々の方法で行うことができる。例えば、配列類似性は、対での整列化方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、もしくはＡＬＩＧＮ−２、または複数の配列整列化方法、例えば、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣｌｕｓｔａｌＷもしくはＴ−Ｃｏｆｆｅｅソフトウェアを使って決定可能である。当業者なら、比較される完全長配列に対し最適整列化特性を得るために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、適切なスコアリング関数、例えば、整列化測定用ギャップペナルティまたはスコアリングマトリクスを決定することができる。さらに、当業者は、ある特定の折り畳み、例えば、ＦｎＩＩＩ折り畳みを有するタンパク質を特定する方法、およびこのようなタンパク質のアミノ酸配列を整列させる方法には、配列−配列法、配列−プロファイル法、およびプロファイル−プロファイル法が含まれることを理解しているであろう。さらに、配列整列化は、構造的整列化法（例えば、二次または三次構造情報を使って２つ以上の配列を整列させる方法）、または配列の、構造的、および系統学的情報を組み合わせて候補タンパク質配列を特定し、これを至適に整列させるハイブリッド法を使って行うことができる。
【００６６】
「タンパク質配列」または「アミノ酸配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド中のアミノ酸成分の線状表現を意味し、その表現中で相互に隣接している残基は、ポリペプチドの一次構造中で連続している。
【００６７】
「核酸」という用語は、２つ以上の共有結合しているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または誘導体のいずれをも指す。本明細書で使われるこの用語には、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが含まれる。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同義に使われる。
【００６８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一核酸ならびに複数核酸を包含することが意図され、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドという用語は、自然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指すことが意図される。例えば、ベクター中に含まれた本発明の足場をコードする組換え型ポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞中に維持された組換え型ポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により産生されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであっても、またはこれらを含んでもよい。
【００６９】
「薬学的に許容可能な」という用語は、顕著な医学的有害結果を伴うことなく動物（例えば、哺乳動物）に投与可能な化合物またはタンパク質を指す。
【００７０】
「生理学的に受容可能な担体」という用語は、治療されている宿主に有意な顕著な影響を与えず、それとともに投与される、化合物の治療特性を維持できる担体を指す。１つの代表的な生理学的に受容可能な担体は、生理的食塩水である。他の生理学的に受容可能な担体およびその製剤は、当業者には既知であり、また、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、（１８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ）、ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（参照により本明細書に組み込まれる）、に記載されている。
【００７１】
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後改変、または機能に関わらず、アミド結合（ペプチド結合）により直鎖状に連結した２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では、同義に使用される。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはオリゴペプチドは、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、また、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれの用語に替えて、またはそれらと同義的にも用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、これに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性開裂、または非天然アミノ酸による修飾、を含む修飾産物を指すことが意図されている。ポリペプチドは、天然生物源由来でも、または組換え型技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、化学合成を含むどのような手法によっても生成可能である。
【００７２】
また、本発明のポリペプチドには、前出のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組み合わせが含まれる。変異体は、天然でも、または非天然でも発生可能である。非天然変異体は、既知の変異誘発技術を使って産生可能である。変異体ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。また、「誘導体」には、１つまたは複数の２０標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。
【００７３】
「［例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド］由来の」という用語は、タンパク質またはポリヌクレオチドが参照タンパク質またはポリヌクレオチドに関連していることを意味する。関連は、例えば、配列類似性または構造的類似性のうちの１つであり得る。タンパク質またはポリヌクレオチドは、１つまたは複数の、例えば、変異（欠失または置換）、化学操作（例えば、足場のＰＥＧまたは別のタンパク質への化学結合）、遺伝的融合（例えば、２つ以上の足場のリンカー、異種成分、またはそれらの組み合わせへの遺伝的融合）、配列または構造的類似性に基づく新規合成、または異種生物体中の組換え型産生を経由した、参照タンパク質またはポリヌクレオチド由来であってもよい。
【００７４】
「無作為の（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）」または「変異した（ｍｕｔａｔｅｄ）」は、テンプレート配列に比較して、欠失、置換または付加等の、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むことを意味する。「無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚｉｎｇ）」または「変異（ｍｕｔａｔｉｎｇ）」は、配列中へのこのようなアミノ酸変化を導入するプロセスを意味する。無作為化または変異は、一般的には、核酸コード配列の意図的な、盲検法による、または自然の配列変化により達成することができ、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、変異性ＰＣＲ、または化学ＤＮＡ合成によって発生させることができる。「無作為化」、「無作為の」、「変異」、「変異した」等の用語は、本明細書では、同義に使用される。
【００７５】
「同種の」または「同種の、非変異タンパク質」は、変異体タンパク質が無作為化または変異導入されている場合の変異体タンパク質に導入されたアミノ酸変異を除いて、変異体タンパク質に対する配列が同じタンパク質を意味する。
【００７６】
「ＲＮＡ」は、２つ以上の共有結合した天然または改変リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変ＲＮＡの一例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。
【００７７】
本明細書で使われる「本発明の足場」または「本発明の足場（複数）」という用語は、ＦｎＩＩＩ多量体足場ならびにモノマー足場を指す。「標的」という用語は、本発明の特定的な足場により認識される化合物を指す。典型的な標的には、タンパク質、多糖類、ポリヌクレオチドおよび小分子が含まれる。「標的」および「抗原」という用語は、本明細書では同義に使用される。例えば、本明細書で使われる「特異的に結合」または「特異的結合」という用語中の「特異的」という用語は、本発明の足場が１つまたは複数の抗原結合ドメインを介して１つまたは複数の抗原に結合する相対的親和性を指し、その結合は１つまたは複数の抗原結合ドメインと１つまたは複数の抗原の間の一定の相補性を必要とする。この定義に従って、ランダムな、非関連エピトープに結合するのに比べてより容易に１つのエピトープに結合する場合に、本発明の足場はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。
【００７８】
本明細書で使われる「親和性」という用語は、本発明のある特定の足場の個別エピトープに対する結合の強度の尺度を指す。
【００７９】
本明細書で使われる「結合力」という用語は、本発明の足場集団とある特定のエピトープの間の複合体の全体の安定性、すなわち、機能的に組み合わされた複数の足場の抗原との結合強度を指す。結合力は、個別の抗原結合ドメインの特異的エピトープに対する親和性、および、また本発明の足場の結合価の両方に関連する。
【００８０】
「標的に対する作用」という用語は、本発明の多量体足場の１つまたは複数の標的に対する結合、およびこのような結合から得られた生物学的効果を指す。この点に関しては、多量体足場中の複数の抗原結合ユニットは、種々の標的および／またはエピトープと相互作用でき、例えば、２つの標的を物理的により接近させ、個別の標的との相互作用を通して、代謝カスケードを開始させる、等の作用をする。
【００８１】
本明細書で使われる「結合価」という用語は、可能性のある抗原結合モジュールの数、例えば、多くの本発明の足場中のＦｎＩＩＩモジュールの数を指す。本発明の足場が２つ以上の抗原結合モジュールを含む場合は、各結合モジュールは、例えば、同じ標的または異なる標的中の、同じエピトープまたは異なるエピトープに特異的に結合できる。
【００８２】
本明細書で使われる「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。
【００８３】
本明細書で使われる「Ｔｎ３モジュール」および「Ｔｎ３足場」という用語は、ＦｎＩＩＩ足場を指し、ここで、Ａベータ鎖は配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、およびベータ鎖Ｇは配列番号５２を含み、少なくとも１つのループは、「野性型Ｔｎ３足場」のループの非天然変異体である。ある特定の実施形態では、Ｃベータ鎖中のシステイン残基（例えば、配列番号４５または１３１中のシステイン）およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステイン残基は置換されないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００８４】
本明細書で使われる「野性型Ｔｎ３足場」という用語は、配列番号１、すなわち、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩ由来の操作ＦｎＩＩＩ足場を含むＦｎＩＩＩ足場を指す。
【００８５】
「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、生化学的に鑑別可能な種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者なら、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されることをわかるであろう。抗体の「クラス」をそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡＩｇＧ、またはＩｇＥ、として決定するのは、この鎖の性質による。これらのクラスの修正版は、当業者には容易に識別可能である。本明細書で使われる「抗体」という用語には、限定されないが、無傷抗体、改変抗体、抗体ＶＬまたはＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、Ｆｃドメイン（同上参照）、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインが含まれる。
【００８６】
本明細書で使われる「改変抗体」という用語には、天然に存在しない、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全な重鎖を含まない（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディのような）抗体となるように変えられた合成型の抗体；２つ以上の抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように変えられた多選択性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性、等）が含まれる。さらに、「改変抗体」という用語には、多価型抗体（例えば、三価、四価、等の同じ抗原の３つ以上のコピーに対する抗体）が含まれる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、２０１０  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、を参照のこと）。
【００８７】
「ＴＲＡＩＬ  Ｒ２」または「ＴＲＡＩＬ  Ｒ２受容体」という用語は、本明細書では同義に使用され、完全長ＴＲＡＩＬ受容体配列および可溶の、細胞外ドメイン型の受容体を指す。これは、Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：８１８−８２１（１９９７）；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：８１５−８１８（１９９７）、米国特許第６、０７２、０４７号および同６、３４２、３６９号：国際公開第９８／５１７９３号、同９８／４１６２９号、同９８／３５９８６号、同９９／０２６５３号、同９９／０９１６５号、９８／４６６４３号、および同９９／１１７９１号；Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、７：６９３−６９６（１９９７）；Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１６：５３８６−５３８７（１９９７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：１４１−１４３（１９９７）、に記載されている。代表的完全長長さＴＲＡＩＬ受容体配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ５１７７８．１およびＯ１４７６３．２．で入手可能である。
【００８８】
「ＴＲＡＩＬ」または「ＴＲＡＩＬポリペプチド」は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を含む１つまたは複数のＴＲＡＩＬ受容体に結合するリガンド、ならびに生物学的に活性なその断片を指す。代表的ＴＲＡＩＬ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ３２７２２．１およびＰ５０５９１．１で入手可能である。
【００８９】
「ＣＤ４０Ｌ」という用語は、ＣＤ４０リガンドタンパク質を指し、ＣＤ１５４、ｇｐ３９またはＴＢＡＭとしても知られる。ＣＤ４０Ｌは、３３ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質である。さらに、より短い１８ｋＤａのＣＤ１５４の可溶型が存在する（ｓＣＤ４０Ｌとしても知られる）。代表的なヒトＣＤ４０Ｌ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３５６６２．１およびＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２９９６５で入手可能である。代表的なマウスＣＤ４０Ｌ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＩ１９２２６．１およびＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２７５４８で入手可能である。
【００９０】
「インビボ半減期」という用語は、通常の意味、すなわち、ポリペプチドの生物活性の５０％が身体／標的器官中にまだ存在している時間、またはポリペプチドの活性が初期値の５０％になる時間の意味で使用される。機能的インビボ半減期を測定する代替法として、「血清半減期」、すなわち、除去される前に、ポリペプチド分子の５０％が血漿または血流中を循環する時間を測定可能である。血清半減期の測定は、機能的インビボ半減期を測定するより簡単なことが多く、血清半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良い指標である。血清半減期の代わりの用語には、血漿半減期、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）半減期、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ）半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。保持される機能は、通常、凝血促進性、タンパク分解性、補因子結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連する他のタイプの生物活性、から選択される。
【００９１】
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関連する「増加した」という用語は、参照分子（例えば、非改変ポリペプチド）に比べて、ポリペプチドの関連する半減期が同等の条件下で測定して、統計的に有意に増加していることを示すために使用される。例えば、関連する半減期は、非改変参照分子に比べて、少なくとも約２５％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約５００％増加させることができる。他の実施形態では、半減期は、非改変参照分子に比べて、約少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍増加させることができる。
【００９２】
本明細書で使われる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、本発明の足場またはその断片を産生するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内の遺伝子の機能的存在のいかなる現れをも含み、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現および安定発現の両方を含む。それは、限定されないが、遺伝子の１つまたは複数のｍＲＮＡへの転写、およびこのようなｍＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。最終目的産物が、生化学物質である場合は、発現は、その生化学物質と任意の前駆物質の生成を含む。
【００９３】
「発現産物」は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、またはポリペプチドであってもよい。本明細書記載の発現産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または転写後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性開裂、等を受けたポリペプチドを含む。
【００９４】
本明細書で使われる「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明においては、宿主細胞中に導入し、目的の発現産物を発現させるための媒体として使用するベクターを意味するように使われる。当業者には既知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より容易に選択できる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、目的核酸のクローニング、および真核または原核細胞中に入る能力、および／または増殖する能力を促進するための適切な制限酵素部位を含む。
【００９５】
「宿主細胞」という用語は、組換ＤＮＡ技術を使って構築され、少なくとも１つの発現産物をコードするベクターを収容する細胞を指す。組換え型ホストから発現産物を単離するプロセスの記述において、明確に別義が指示されていない限り、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、同義に使用され、発現産物の源を意味する。すなわち、「細胞」からの発現産物の回収は、遠心沈殿全細胞からの回収、または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からの回収を意味する。
【００９６】
本明細書で使われる「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療上の処置および予防または防止手段の両方を指し、その目的は、対象の望ましくない生理的な変化または障害、例えば、炎症性疾患または状態の進行、を防ぐか、または遅らせる（減らす）ことである。有益なまたは所望する臨床的結果には、限定されないが、検出可能、不可能に関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延化または緩徐化、改善または疾患状態の緩和、および寛解（部分または完全）が含まれる。
【００９７】
「治療」という用語は、また、治療を受けていない場合に予想される生存に比べての生存の延長を意味する。治療を必要としている人には、既に状態または障害のある人、ならびに状態または障害になる傾向がある人、または状態または障害を予防すべき人が含まれる。
【００９８】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」という用語は、診断、予後、または治療が望まれる任意の個体、患者または動物、特に、哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象には、ヒト、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、および例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、等の、動物園の動物、スポーツ用動物またはペット動物が含まれる。
【００９９】
緒言
ヒト体液タンパク質で見出される全体の、安定な、可溶性の構造モジュール由来の、および限定されないが、好熱細菌および古細菌を含む他の天然源由来のＦｎＩＩＩ足場が、抗体由来断片および非抗体フレームワークの両方より優れたものになるように操作されている。１つの特定の足場操作の例は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合のＦｎＩＩＩ足場への導入である。一実施形態では、本発明の多量体足場は、これらのＦｎＩＩＩ足場のタンデム反復を含み、少なくとも１つのＦｎＩＩＩ足場が１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、タンデム足場はペプチドリンカーにより融合され、それにより、単一構築物としての発現を可能にする。
【０１００】
多量体足場を成すＦｎＩＩＩ足場は、相互に独立して正確に折り畳まれて、それらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれの足場ドメインは、その機能特性を保持する。多量体足場を成すＦｎＩＩＩ足場が高結合価多量体足場、例えば、６価または８価足場、に組み上げられる場合、足場は相互に独立して正確に折り畳まれてそれらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれの足場ドメインは、その機能特性を保持する。
【０１０１】
構築物の形態が直鎖状でない場合でも、例えば、モノマーＦｎＩＩＩまたは多量体ＦｎＩＩＩ足場が複雑な分岐構造（例えば、Ｆｃ融合体構築物または抗体様構築物）に組み上げられる場合でも、高結合価足場（例えば、６価または８価）を含む多量体足場は、正確に折り畳まれる。
【０１０２】
自然ＦｎＩＩＩドメイン、例えば、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメイン（１０ＦｎＩＩＩ）および大部分の天然ＦｎＩＩＩドメインは、ジスルフィド結合または遊離システインを含まない。多ドメインタンパク質が複数のシステインの導入により操作される場合、タンパク質発現の欠失、生じたタンパク質の析出、または非機能性タンパク質の産生が頻繁に発生する。これらの有害作用は、分子内のドメイン内および／またはドメイン間ジスルフィド結合の不正確な形成、および／または分子間ジスルフィド結合の不正確な形成に起因し、これは不正確なタンパク質折り畳み構造を生ずる。これらの効果は、通常、システイン、および／またはタンパク質ドメインの数が増加すると増強される。
【０１０３】
例えば、８つの野性型Ｔｎ３足場（配列番号１）を含む直鎖ＦｎＩＩＩ足場は、単一ポリペプチドアミノ酸配列に沿って１６システインを含むことになるであろう。別の代表的実施形態では、４つのＴｎ３モジュールを含む抗体様構築物（２つのＴｎ３モジュールがＩｇＧ重鎖に結合し、２つのＴｎ３がＩｇＧ軽鎖に結合している）は、４つの異なるポリペプチド鎖の中に分布した３２システインを含むことになるであろう。従って、このような数のシステインおよびこのような構造的複雑さを含む多量体ＦｎＩＩＩ足場が、正確に折り畳まれ、それぞれのＦｎＩＩＩモノマードメインに比較して、改善された安定性と標的結合特性を示すということは、全く予想できないことである。
【０１０４】
１つまたは複数の操作されたジスルフィド架橋を含むＦｎＩＩＩ足場が高結合価多量体型に組み上げられると、各個別モノマー足場は正確に折り畳まれ、結合特異性および親和性、ならびに機能特性を保持する。さらに、モノマー足場は、安定、機能的、かつ正確に折り畳まれた多量体足場を形成することができる。
【０１０５】
本発明の多量体足場の利点は、複数のエピトープに結合する能力、例えば、（ｉ）単一標的中の複数のエピトープへ結合、（ｉｉ）複数標的中の単一エピトープへ結合、（ｉｉｉ）１つの標的の複数の異なるサブユニット上に位置する複数のエピトープへ結合、または（ｉｖ）複数の標的の複数のエピトープへ結合する能力、従って、増加していく結合力である。
【０１０６】
さらに、多量体足場の柔軟性、および複数のＦｎＩＩＩモジュール間の距離をリンカーを介して変えることができる可能性により、多量体足場は、表面（同じ細胞／表面または異なる細胞／表面）上の複数の標的分子に結合可能である。
【０１０７】
２つ以上の標的に同時に結合するそれらの能力の結果として、本発明の多量体足場は、複数の経路を調節し、受容体を交差結合し、別々の細胞上の細胞表面受容体に結合し、および／または標的分子または細胞を基質に結合させるために使用することができる。
【０１０８】
ＦｎＩＩＩドメインの以前の配列解析から、ＢＣとＦＧループで大きな変動が認められ、これらのループが安定性に重要ではないことを示唆している（例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号を参照）。本発明は、改善された安定性を有するＦｎＩＩＩ足場を提供し、これは、アミノ酸配列が変動するが、対象ＦｎＩＩＩドメイン／足場よりも短い長さのＦＧループを含む。ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、低い配列類似性を示す傾向があるが、それらの全体的に見た３次元構造は類似している。従って、既知の技術、例えば、たとえ全体としての配列類似性が低い場合でも、配列解析および三次構造オーバーレイを使って、異なる種および異なるタンパク質由来のＦｎＩＩＩ足場のＦＧループの特異的位置を特定し変異を受けさせることができる。一部の実施形態では、操作されたＦＧループは、少なくとも出発ＦＧループの長さより１つのアミノ酸分短いアミノ酸配列長さを有する。ＦＧループの短縮化により安定性の増加した変異ＦｎＩＩＩ足場が生成されることが観察された。従って、本発明の別の態様では、タンパク質安定性の増加した変異体が提供される。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本発明の足場は、９アミノ酸、および１０アミノ酸のＦＧループ長さを有する自然のヒトテネイシンＣ第３ＦｎＩＩＩドメインを含む足場に比べて増加した安定性を有するＦＧループを含む。さらに、本発明は、対象ＦｎＩＩＩドメイン／足場に比べて安定性の増加したＦｎＩＩＩ足場を単離するのに有用な特定したＦＧループ長さを有する多様なＦｎＩＩＩ足場のライブラリーを提供する。
【０１１０】
さらに、本発明は、２つ以上の異なる標的に結合することのできる多特異性足場、特定的な標的に対する親和性が変異により調節される親和性成熟足場、およびを動物種間の免疫原性および／または交差反応性が変異により調節されている足場を提供する。また、本発明は、本発明の足場の産生方法、ならびに足場を望ましい物理化学的、薬理学的、または免疫学的な特性を有するように操作する方法を提供する。さらに、本発明は、このような足場の使用、および治療、予防、および診断のための使用方法を提供する。
【０１１１】
ＦｎＩＩＩ構造モチーフ
本発明の足場は、生命体およびウイルスの全ての３つのドメインにわたって、また、多数のタンパク質クラスで広く認められるドメインであるタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）フィブロネクチンモジュールの構造に基づいている。ＦｎＩＩＩドメインは、可溶性の形態で血漿中、および不溶性の形態で疎性結合組織および基部タンパク質中で見出された多ドメインタンパク質である、フィブロネクチン中で見出される。このドメインは、現在までに、配列決定された多くのタンパク質中で見つかっている。ＦｎＩＩＩドメインスーパーファミリーは、少なくとも４５の異なるタンパク質ファミリーを表し、それらの大部分は、ある方法で細胞表面結合に関与し、または受容体として機能する。ＦｎＩＩＩドメインを含有するタンパク質の具体的な例には、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内の細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、受容体タンパク質チロシンキナーゼ、および原核生物酵素が含まれる（Ｂｏｒｋａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８９９０−８８９４、１９９２；Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７、１９９７；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１９１０−１９１８、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５６５９−１５６６５、１９９０）。
【０１１２】
ＦｎＩＩＩドメインを含む天然タンパク質配列には、限定されないが、フィブロネクチン、テネイシンＣ、成長ホルモン受容体、β−共通受容体、ＩＬ−５Ｒ、テネイシンＸＢ、およびコラーゲンタイプＸＩＶが含まれる。このドメインは、天然に広く分布しているように見えるが、非常に多岐にわたるＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列の間でのアミノ酸配列類似性のパーセンテージは、非常に低い可能性がある。
【０１１３】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）由来である。１つの特定的な実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュールを含む。このドメインの全体としての３次元折り畳みは、最小の機能的抗体断片である重鎖（ＶＨ）可変領域に密接に関連している。この重鎖（ＶＨ）可変領域は、ラクダおよびラクダ科動物（例えば、ラマ）の単一ドメイン抗体では、完全抗原認識ユニットを含む。
【０１１４】
本発明のＦｎＩＩＩ足場および自然ＦｎＩＩＩドメインは、同じ３次元構造、すなわち、一方の側に３つのベータ鎖（Ａ、Ｂ、およびＥ）およびもう一方の側に４つのベータ鎖（Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ）を有し、６つのループ領域により連結されているベータサンドイッチ構造を特徴とする。これらのループ領域は、各ループのＮおよびＣ末端に連結したベータ鎖に従って命名されている。従って、ＡＢループは、ベータ鎖ＡとＢの間に位置し、ＢＣループは鎖ＢとＣの間に位置し、ＣＤループはベータ鎖ＣとＤの間に位置し、ＤＥループはベータ鎖ＤとＥの間に位置し、ＥＦループはベータ鎖ＥとＦの間に位置し、およびＦＧループはベータ鎖ＦとＧの間に位置する。ＦｎＩＩＩドメインは、無作為化に耐性のある溶媒暴露ループを有し、これは、特定的な標的に高親和性で結合可能な多様なタンパク質足場プールの生成を促進する。
【０１１５】
図１６の複数配列の整列化により、３次元構造およびアミノ酸配列の分析に基づき、多くの自然ＦｎＩＩＩドメインのベータ鎖およびループの位置が特定される。これらのＦｎＩＩＩドメインは、実質的にどの標的化合物にも、例えば、どの対象タンパク質にも結合可能であるタンパク質を設計するために利用できる。当業者なら、図１６の整列化は代表的なものであり、限定を意味するものではないことを理解するであろう。例えば、図１６の整列化は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、ＰｆａｍＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインを組み入れることにより拡張可能である。
【０１１６】
従って、タンパク質足場操作および設計は、例えば、下記に基づくことができる：
（ｉ）    図１６に示す整列された配列セット、
（ｉｉ）  図１６由来の整列された配列のサブセット、
（ｉｉｉ）３次元構造が実験的に決定されている（例えば、Ｘ線回折結晶学またはＮＭＲの使用により）、ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列を含む別々の整列されたセット、および／または
（ｉｖ）  ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列で、それらの３次元構造がまだ利用できないが、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっている配列。
【０１１７】
本発明の一態様では、ＦｎＩＩＩドメインは、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似の１つまたは複数のループを無作為化するように設計されている指向性進化に供される足場として使用される。このような指向性進化手法は、対象標的に対し高親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。さらに、一部の実施形態では、本明細書記載の足場は、確定した露出ループ（例えば、以前に無作為化され、標的との結合に基づいて選択されたループ）を、このような導入ループに結合する分子の進化を指示することを目的として、提示するために使用可能である。このタイプの選択は、いずれかの個別のＣＤＲ様ループに対して、認識分子を特定するために、または、その代わりに、２つまたは３つ全ての非線形エピトープ結合成分に組み合わされたＣＤＲ様ループの認識のために、行うことができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明の足場は、国際公開第２００９／０５８３７９号に記載のヒトテネイシンＣ構造モチーフの第３ＦｎＩＩＩドメインに基づいた分子である。特異的標的結合を付与することができる３つのループ（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと命名）のセットは、それぞれ、ＢとＣ鎖；ＤとＥ鎖、およびＦとＧベータ鎖の間をつないでいる。ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、それぞれ、９、６、および１０アミノ酸残基の長さである。これらループの長さは、抗体重鎖で見つかった同種の抗原認識ループの狭い範囲内、すなわち、それぞれ７〜１０、４〜８、および４〜２８アミノ酸長さ、に入る。同様に、第２のセットのループのＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ（それそれ７、７、および８、アミノ酸長さ）は、それぞれ、ＡとＢベータ鎖；ＣとＤベータ鎖；およびＥとＦベータ鎖の間をつないでいる。
【０１１９】
他の実施形態では、ヒトフィブロネクチン（配列番号５４）由来の第１０ＦｎＩＩＩ（「１０ＦｎＩＩＩ」）ドメインに基づいた分子を足場として使用可能である。図１６に記載のように、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメインでは、ＡＢループは配列番号５５に対応し、ＢＣループは配列番号５６に対応し、ＣＤループは配列番号５７に対応し、ＤＥループは配列番号５８に対応し、ＥＦループは配列番号５９に対応し、さらにＦＧループは配列番号６０に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：９３３−９４２、２００２、を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。
【０１２０】
さらに他の実施形態では、ヒトフィブロネクチン（配列番号６９）由来の第１４ＦｎＩＩＩ（「１４ＦｎＩＩＩ」）ドメインに基づいた分子を足場として使用可能である。図１６で定めたように、１４ＦｎＩＩＩのＡＢループは配列番号７０に対応し、ＢＣループは配列番号７１に対応し、ＣＤループは配列番号７２に対応し、ＤＥループは配列番号７３に対応し、ＥＦループは配列番号７４に対応し、さらにＦＧループは配列番号７５に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Ｃａｐｐｕｃｃｉｌｌｉら（米国特許公開第２００９／０１７６６５４号）を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。
【０１２１】
さらに他の実施形態では、テネイシン（配列番号２５６）のＦｎＩＩＩドメイン配列由来のコンセンサス配列に基づいた分子を足場として使用可能である。テネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩループは、表１で定義されており、ＡＢループは配列番号２５７に対応し、ＢＣループは配列番号２５８に対応し、ＣＤループは配列番号２５９に対応し、ＤＥループは配列番号２６０に対応し、ＥＦループは配列番号２６１に対応し、ＦＧループは配列番号２６２に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Ｊａｃｏｂｓら（国際公開第２０１０／０９３６２７号）を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。
【０１２２】
無作為化を行い、標的に対する高親和性結合で選択されると、ＦｎＩＩＩドメイン中のループは、抗体中の同種のＣＤＲループの接触と同等の標的との接触が可能である。従って、一部の実施形態では、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、単独または組み合わせて、無作為化および１つまたは複数の標的に対する高親和性結合について選択される。一部の実施形態では、この無作為化および選択プロセスは、１つまたは複数のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの無作為化と平行に行うことができ、一方、他の実施形態では、この無作為化および選択プロセスは順次行われる。
【０１２３】
本発明のモノマー足場
本発明は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖ドメインを含む組換え型、非天然ＦｎＩＩＩ足場を提供し、ここで１つまたは複数の前記ループ領域が、対象ＦｎＩＩＩドメイン／足場（本明細書では「ＦＯＩ」と呼ぶ）中の同種のループ由来の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化しており、また、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはそれ超のＦＯＩの同種のベータ鎖に対する相同性（すなわち、配列類似性）を有する。
【０１２４】
ＦＯＩは、配列、物理化学的および／または系統的特性を比較するために使われる参照である。本発明の足場の配列をＦＯＩの配列に比較する場合、同じ定義のベータ鎖およびループが利用されることは理解されよう。ＦＯＩは、自然ＦｎＩＩＩドメイン、すなわち自然ＦｎＩＩＩドメインを含む足場でも、または非天然ＦｎＩＩＩ足場でもよい。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、少なくとも１つの非天然ループを含む。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、少なくとも１つの非天然ベータ鎖を含む。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、少なくとも１つの非天然ループおよび少なくとも１つの非天然ベータ鎖を含む。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含む。特定的な実施形態では、ＦＯＩは、操作された分子内ジスルフィド結合を含むヒトテネイシンの３ＦｎＩＩＩドメイン由来の足場である野性型Ｔｎ３足場（配列番号１）を含む。
【０１２５】
特定的な実施形態では、本発明のモノマー足場は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと命名された７つのベータ鎖を含み、これらはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧと命名された６つのループ領域に結合し、少なくとも１つのループはＦＯＩ中の同種のループの非天然変異体で、さらにベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のＦＯＩの同種のベータ鎖に対する相同性（すなわち、配列類似性）を有する。
【０１２６】
特定的な実施形態では、本発明のモノマー足場は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと命名された７つのベータ鎖を含み、これらはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧと命名された６つのループ領域に結合し、少なくとも１つのループはＦＯＩ中の同種のループの非天然変異体で、さらにベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のＦＯＩの同種のドメインに対する相同性（すなわち、配列類似性）を有する。
【０１２７】
特定的な実施形態では、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）に対する相同性（すなわち、配列類似性）を有する配列を含む。
【０１２８】
一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）に対する同一性を有する配列を含む。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、また、ｎ＝２〜２６である。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＩＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＳ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、また、ｎ＝２〜２６である。
【０１３１】
一実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５から構成される。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６から構成される。一実施形態では、ＸＣＤは配列番号３７から構成される。一実施形態では、ＸＤＥは配列番号３８から構成される。一実施形態では、ＸＥＦは配列番号３９から構成される。一実施形態では、ＸＦＧは配列番号４０から構成される。
【０１３２】
一実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５を含む。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６を含む。一実施形態では、ＸＣＤは配列番号３７を含む。一実施形態では、ＸＤＥは配列番号３８を含む。一実施形態では、、ＸＥＦは配列番号３９を含む。一実施形態では、ＸＦＧは配列番号４０を含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５から構成され、ＸＣＤは配列番号３７から構成され、さらにＸＥＦは配列番号３９から構成される。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６から構成され、ＸＤＥは配列番号３８から構成され、さらにＸＦＧは配列番号４０から構成される。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５を含み、ＸＣＤは配列番号３７を含み、さらにＸＥＦは配列番号３９を含む。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６を含み、ＸＤＥは配列番号３８を含み、さらにＸＦＧは配列番号４０を含む。
【０１３５】
特定的な実施形態では、ＦＯＩは、ヒトフィブロネクチン足場の野性型第１０フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（１０ＦｎＩＩＩ）（配列番号５４）を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の野性型１０ＦｎＩＩＩ（配列番号５４）に対する類似性を有する配列を含む。
【０１３６】
一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の野性型１０ＦｎＩＩＩ（配列番号５４）に対する同一性を有する配列を含む。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列：
ＬＥＶ（ＸＡＢ）ｎＬＬＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＹＲＩＴＹＧＥ（ＸＣＤ）ｎＱＥＦＴＶ（ＸＤＥ）ｎＡＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＴＩＴＶＹＡ（ＸＦＧ）ｎＳＩＮＹＲＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、ｎ＝２〜２６である。
【０１３８】
一実施形態では、ＸＡＢは、１０ＦｎＩＩＩのループＡＢのアミノ酸配列（配列番号５５）である。一実施形態では、ＸＢＣは、野性型１０ＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号５６）である。一実施形態では、ＸＣＤは、野性型１０ＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号５７）である。一実施形態では、ＸＤＥは、野性型１０ＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号５８）である。一実施形態では、ＸＥＦは、野性型１０ＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号５９）である。一実施形態では、ＸＦＧは、野性型１０ＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号６０）である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＡＢのアミノ酸配列（配列番号５５）であり、ＸＣＤは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号５７）であり、さらにＸＥＦは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号５９）である。
【０１４０】
一実施形態では、ＸＢＣは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号５６）であり。ＸＤＥは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号５８）であり、さらにＸＦＧは野性型１０ＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号６０）である。
【０１４１】
特定的な実施形態では、ＦＯＩは、ヒトフィブロネクチン足場の野性型第１４タイプＩＩＩフィブロネクチンドメイン（１４ＦｎＩＩＩ）（配列番号６９）を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の野性型１４ＦｎＩＩＩ（配列番号６９）に対する類似性を有する配列を含む。
【０１４２】
一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の野性型１４ＦｎＩＩＩ（配列番号６９）に対する同一性を有する配列を含む。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列：
ＡＲＶ（ＸＡＢ）ｎＩＴＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＱＶＤＡＶＰ（ＸＣＤ）ｎＩＱＲＴＩ（ＸＤＥ）ｎＹＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＫＩＹＬＹＴ（ＸＦＧ）ｎＶＩＤＡＳＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中のアミノ酸残基を表し、ｎ＝２〜２６である。
【０１４４】
一実施形態では、ＸＡＢは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＡＢのアミノ酸配列（配列番号７０）である。一実施形態では、ＸＢＣは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号７１）である。一実施形態では、ＸＣＤは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号７２）である。一実施形態では、ＸＤＥは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号７３）である。一実施形態では、ＸＥＦは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号７４）である。一実施形態では、ＸＦＧは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号７５）である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＡＢのアミノ酸配列（配列番号７０）であり、ＸＣＤは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号７２）であり、さらにＸＥＦは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号７４）である。一実施形態では、ＸＢＣは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号７１）であり、ＸＤＥは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号７３）であり、さらにＸＦＧは野性型１４ＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号７５）である。
【０１４６】
特定的な実施形態では、ＦＯＩは、テネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩ（配列番号２５６）を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩ（配列番号２５６）に対する類似性を有する配列を含む。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超のテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩ（配列番号２５６）に対する同一性を有する配列を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列：
ＬＶＶ（ＸＡＢ）ｎＬＲＬＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＬＩＱＹＱＥ（ＸＣＤ）ｎＩＮＬＴＶ（ＸＤＥ）ｎＹＤＬ（ＸＥＦ）ｎＹＴＶＳＩＹＧ（ＸＦＧ）ｎＳＡＥＦＴＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、ｎ＝２〜２６である。
【０１４９】
一実施形態では、ＸＡＢはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのＡＢループのアミノ酸配列（配列番号２５７）である。一実施形態では、ＸＢＣはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号２５８）である。一実施形態では、ＸＣＤはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号２５９）である。一実施形態では、ＸＤＥはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号２６０）である。一実施形態では、ＸＥＦはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号２６１）である。一実施形態では、ＸＦＧはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号２６２）である。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、ＸＡＢはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＡＢのアミノ酸配列（配列番号２５７）であり、ＸＣＤはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＣＤのアミノ酸配列（配列番号２５９）であり、さらにＸＥＦはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＥＦのアミノ酸配列（配列番号２６１）である。一実施形態では、ＸＢＣはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＢＣのアミノ酸配列（配列番号２５８）であり、ＸＤＥはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＤＥのアミノ酸配列（配列番号２６０）であり、さらにＸＦＧはテネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩのループＦＧのアミノ酸配列（配列番号２６２）である。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＩＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＳ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
ＬＥＶ（ＸＡＢ）ｎＬＬＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＹＲＩＴＹＧＥ（ＸＣＤ）ｎＱＥＦＴＶ（ＸＤＥ）ｎＡＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＴＩＴＶＹＡ（ＸＦＧ）ｎＳＩＮＹＲＴ、
ＡＲＶ（ＸＡＢ）ｎＩＴＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＱＶＤＡＶＰ（ＸＣＤ）ｎＩＱＲＴＩ（ＸＤＥ）ｎＹＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＫＩＹＬＹＴ（ＸＦＧ）ｎＶＩＤＡＳＴ、および
ＬＶＶ（ＸＡＢ）ｎＬＲＬＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＬＩＱＹＱＥ（ＸＣＤ）ｎＩＮＬＴＶ（ＸＤＥ）ｎＹＤＬ（ＸＥＦ）ｎＹＴＶＳＩＹＧ（ＸＦＧ）ｎＳＡＥＦＴＴ、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、ｎ＝２〜２６であり、さらに、
ＸＡＢは、配列番号３５、５５、７０、または２５７からなる群より選択され、
ＸＣＤは、配列番号３７、５７、７２、または２５９からなる群より選択され、および
ＸＥＦは、配列番号３９、５９、７４、または２６１からなる群より選択される。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＩＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＳ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
ＬＥＶ（ＸＡＢ）ｎＬＬＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＹＲＩＴＹＧＥ（ＸＣＤ）ｎＱＥＦＴＶ（ＸＤＥ）ｎＡＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＴＩＴＶＹＡ（ＸＦＧ）ｎＳＩＮＹＲＴ、ＡＲＶ（ＸＡＢ）ｎＩＴＩＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＱＶＤＡＶＰ（ＸＣＤ）ｎＩＱＲＴＩ（ＸＤＥ）ｎＹＴＩ（ＸＥＦ）ｎＹＫＩＹＬＹＴ（ＸＦＧ）ｎＶＩＤＡＳＴ、および
ＬＶＶ（ＸＡＢ）ｎＬＲＬＳＷ（ＸＢＣ）ｎＦＬＩＱＹＱＥ（ＸＣＤ）ｎＩＮＬＴＶ（ＸＤＥ）ｎＹＤＬ（ＸＥＦ）ｎＹＴＶＳＩＹＧ（ＸＦＧ）ｎＳＡＥＦＴＴ、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、ｎ＝２〜２６であり、さらに、
ＸＢＣは、配列番号３６、５６、７１、または２５８からなる群より選択され、
ＸＤＥは、配列番号３８、５８、７３、または２６０からなる群より選択され、さらに
ＸＦＧは、配列番号４０、６０、７５、または２６２からなる群より選択される。
【０１５３】
他の実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュールを含む。さらに他の実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュール（配列番号１）を含み、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメインのベータ鎖Ｃ（配列番号４４）がＮ末端システイを含む変異ベータ鎖Ｃ（配列番号４５、または１３１）により置換され、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのベータ鎖Ｆ（配列番号４８）がＣ末端システインを含む変異ベータ鎖Ｆ（配列番号４９）により置換されている。一部の実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュールを含み、ＣおよびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、または１３１および４９）中のシステイン残基は置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、１０ＦｎＩＩＩモジュールの変異体を含み、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本発明の足場は、１４ＦｎＩＩＩモジュールの変異体を含み、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。さらに他の実施形態では、本発明の足場は、テネイシンコンセンサスＦｎＩＩＩモジュールの変異体を含み、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１５４】
他の実施形態では、天然配列は、追加のヒトテネイシンＣ由来のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、天然配列は、限定されないが、ヒトテネイシンＸＢ由来の第２９ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１１）、ヒトテネイシンＸＢ由来の第３１ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１２）、またはヒトテネイシンＸＢ由来の第３２ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１３）を含む、別のテネイシンタンパク質由来のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、天然配列は、別の生物体（例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン）由来のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。
【０１５５】
さらなる実施形態では、本発明の足場の生成に使用されるＦｎＩＩＩドメインには、例えば、動物、植物、細菌、古細菌、またはウイルス由来の関連ＦｎＩＩＩドメインが含まれる。異なる生物および親タンパク質由来の異なるＦｎＩＩＩドメインは、異なる適用に対し最も適切である可能性がある。例えば、低ｐＨで安定な足場の設計では、低ｐＨで至適に成長する生物体（限定されないが、例えば、スルホロブス・トコダイイ）由来のそのタンパク質を生成するのが最も好ましい可能性がある。別の実施形態では、関連ＦｎＩＩＩドメインは、好熱性および超好熱性生物（例えば、超好熱性細菌または超好熱性古細菌）から特定し、利用することができる。一部の実施形態では、本発明の足場を生成するために使用されるＦｎＩＩＩドメインは、超好熱性古細菌、例えば、限定されないが、それぞれ７０℃より高い温度で至適増殖を示すアーケオグロブス・フルギダスおよびスタフィロサームス・マリヌス由来のＦｎＩＩＩドメインである。他の実施形態では、天然配列は、好熱性生物体、例えば、限定されないが、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリヌス、スルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・ソルファタリカス、およびスルホロブス・トコダイイ、由来の予測ＦｎＩＩＩドメインに対応する。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の上述のような好熱性生物体由来のＦｎＩＩＩドメインまたは予想ＦｎＩＩＩドメインに対応する配列に由来するいずれかの配列に対する相同性（配列類似性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、好熱性生物由来のＦｎＩＩＩドメインは、配列番号２０〜３３のアミノ酸配列から選択される。
【０１５６】
本発明の足場の種々のベータ鎖を結合するループは、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化可能である。一実施形態では、本発明の足場は、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化された少なくとも１つのループを有する。一実施形態では、足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループが長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。一実施形態では、本発明の足場の少なくとも１つのループは、一定に保持され、他方、少なくとも１つの別のループは、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持され、他方、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性に関し無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てが無作為化され、他方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。さらに別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つのループ、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または６つ全てのループが長さまたは配列多様性に関し無作為化される。
【０１５７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のループ内の残基が一定に保持され、他方、他の残基が長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。一部の実施形態では、１つまたは複数のループ内の残基が所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定され、他方、他の残基が長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。従って、本発明の足場は、変性したコンセンサス配列および／または１つまたは複数の不変アミノ酸残基を有する１つまたは複数のループを含むことができる。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、を有する無作為化されたＡＢループを含む。ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、を有する無作為化されたＡＢループを含む。ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、を有する無作為化されたＢＣループを含む。ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、プロリンまたはアラニンを表し、さらに、（ｂ）は、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、を有する無作為化されたＢＣループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、を有する無作為化されたＢＣループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｄ）は、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、さらに、（ｆ）は、セリンまたはグリシンを表す。
【０１５９】
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘｎ、を有する無作為化されたＣＤループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、ｎ＝６、７、８、９、または１０である。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘｎ、を有する無作為化されたＣＤループを含み、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ｎ＝７、８、または９である。
【０１６０】
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、を有する無作為化されたＤＥループを含み、Ｘは任意のアミノ酸を表す。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ｂ−Ｌ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−ｃ−Ｘ、を有する無作為化されたＥＦループを含み、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ｂ）は、アスパラギン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、さらに、（ｃ）は、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、を有する無作為化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、さらに、（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（Ｘ９）、を有する無作為化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ−Ｎ−Ｐ−Ａ、を有する無作為化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、（ｂ）は、セリンまたはグリシンを表す。特定的な実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｎ−Ｐ−Ａ、を有する無作為化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表す。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つのＦＯＩの同種のＦＧループよりも短いアミノ酸残基になるように維持され、１つまたは複数の位置でさらに無作為化されているＦＧループを含む。例えば、図１６で定められたように、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインの自然ＦＧループは、１０アミノ酸残基を含み、従って、ＦＧループは、９以下のアミノ酸残基を保持することとなる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の足場は、複数のＦＯＩから選択される相同ベータ鎖から選択されたアミノ酸配列を含む１つまたは複数のベータ鎖を含むキメラ足場である。一部の実施形態では、本発明の足場は、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つが無作為化されているキメラ足場である。一部の実施形態では、本発明の足場は、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つが無作為化されているキメラ足場である。
【０１６５】
特定的な実施形態では、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つのループが無作為化され、Ａベータ鎖が配列番号４１、４２、６１、６２、７６、７７、２４８または２４９を含み、Ｂベータ鎖が配列番号４３、６３、７８、または２５０を含み、Ｃベータ鎖が配列番号４４、４５、６４、７９、１３１、または２５１を含み、Ｄベータ鎖が配列番号４６、６５、８０、または２５２を含み、Ｅベータ鎖が配列番号４７、６６、８１、または２５３を含み、Ｆベータ鎖が配列番号４８、４９、５０、５１、６７、８２、または２５４を含み、およびＧベータ鎖が配列番号５２、５３、６８、８３、または２５５を含み、ＡＢループが配列番号３５、５５、７０、または２４２を含み、ＣＤループが配列番号３７、５７、７２、または２４４を含み、さらにＥＦループが配列番号３９、５９、７４、または２４６を含む。
他の特定的な実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つのループが無作為化され、Ａベータ鎖が配列番号４１、４２、６１、６２、７６、７７、２４８または２４９を含み、Ｂベータ鎖が配列番号４３、６３、７８、または２５０を含み、Ｃベータ鎖が配列番号４４、４５、６４、７９、１３１、または２５１を含み、Ｄベータ鎖が配列番号４６、６５、８０、または２５２を含み、Ｅベータ鎖が配列番号４７、６６、８１または２５３を含み、Ｆベータ鎖が配列番号４８、４９、５０、５１、６７、８２、または２５４を含み、さらに、Ｇベータ鎖が配列番号５２、５３、６８、８３、または２５５を含み、ＢＣループが配列番号３６、５６、７１、または２４３を含み、ＤＥループが配列番号３８、５８、７３、２４５を含み、さらに、ＦＧループが配列番号４０、６０、７５、または２４７を含む。
【０１６６】
足場安定性の強化
非天然ジスルフィド結合
本発明の足場の安定性は、多くの異なる手法により高めることができる。一部の実施形態では、本発明の足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸張により安定化できる。Ｎおよび／またはＣ末端領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０超のアミノ酸により伸張することができる。他の実施形態では、本発明の足場は、本明細書記載の血清半減期を増加させる変化を導入することにより安定化できる。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、足場の疎水性のコアを安定化させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
【０１６７】
本発明の足場は、また、非天然ジスルフィド結合を操作することにより効果的に安定化できる。このように操作された足場は、多量体足場の一部として、効果的に発現させることができる。操作された足場のジスルフィド結合の正確な形成および正確な折り畳みは、足場の生物活の保存により証明される。非天然ジスルフィド結合を含む操作された足場は、少なくとも２つの標的（例えば、実施例８参照）または３つの標的（例えば、実施例１２参照）に同時に結合できるという事実は、足場の３次元構造は、操作されたジスルフィド結合によって大きく変えられていないこと、および標的結合ループの相対的位置が保存されていることの証明を提供する。一部の実施形態では、本発明の足場は、国際公開第２００９／０５８３７９号に記載のように、非天然ジスルフィド結合を含む。バイオインフォマティクス手法を利用して、ジスルフィド結合を操作するのに適した候補位置を特定できる。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。特定的な実施形態では、本発明は、ＦＯＩに比べて安定性の増加した、２つ、３つ、４つ、またはそれ超の操作された分子内のジスルフィド結合を含む足場を得る方法を提供する。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、少なくとも１つの前記非天然ジスルフィド結合がモノマー足場を安定化させる。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの同じモノマー足場内の２つのベータ鎖の間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。例えば、モノマー足場内の、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合がＡ鎖およびＢ鎖間、またはＤ鎖およびＥ鎖間、またはＦ鎖およびＧ鎖間、またはＣ鎖およびＦ鎖間のリンクを形成できる。
【０１７０】
別の実施形態では、非天然ジスルフィド結合は、単一モノマー足場内で、Ｆ鎖およびＧ鎖間の第１のリンク、ならびにＣ鎖およびＦ鎖間の第２のリンクを形成できる。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの同じモノマー足場中の２つのループの間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの同じモノマー足場のループおよびベータ鎖の間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つのモノマー足場中の同じベータ鎖内に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つのモノマー足場中の同じループ内に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの多量体足場中の２つの異なるモノマー足場の間に位置する非天然ジスルフィド結合を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含み、結合は、２つの異なる多量体足場の間に位置する、すなわち、ジスルフィド結合は、分子間ジスルフィド結合である。例えば、ジスルフィド結合は、異なる足場（例えば、２つの分離したモノマー足場、分離したモノマー足場と多量体足場、または２つの多量体足場）、足場とリンカー、足場とＦｎドメイン、または足場と抗体またはその断片、を連結できる。一部の実施形態では、本発明の足場は、足場および分離した異種の成分、足場および同じ足場に融合または複合した異種の成分、または足場および異なる足場に融合または複合した異種の成分を連結する少なくとも１つの非天然分子間ジスルフィド結合を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ超の多量体足場を形成するジスルフィド結合を含む。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明の足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸張を含んでもよい。一実施形態では、本発明の足場は、本明細書記載の血清半減期を延長するための変化を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含み、疎水性の足場のコアを安定化させる。
【０１７４】
一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、本発明の足場のベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の、配列番号１〜３４、５４、６９、もしくは２５６のいずれか１つの同種のベータ鎖に対する、図１６に示すＦｎＩＩＩドメインのいずれか１つのベータ鎖に対する、またはＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインのベータ鎖に対する、同一性を示す。
【０１７５】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらにＧベータ鎖は配列番号５２を含む。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４４を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号５０を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３を含む。さらに別の特定的な実施形態では、本発明の足場は少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは、配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号５１を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３を含む。
【０１７６】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは、配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらにＧベータ鎖は配列番号５２から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは、配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４４から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号５０から構成され、さらにＧベータ鎖は配列番号５３から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号５１から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３から構成される。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは、基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらにＧベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は基本的に少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合から構成され、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４４から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号５０から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５３から構成される。特定的な実施形態では、本発明の足場は基本的に少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合から構成され、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号５１から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５３から構成される。
【０１７８】
別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、または１３１および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７９】
別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、または１３１および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８０】
別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、または１３１および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８１】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、さらに、ＥＦループは配列番号３９を含む。
【０１８２】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＡＢループは配列番号３５から構成され、ＣＤループは配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは配列番号３９から構成される。
【０１８３】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＡＢループは基本的に配列番号３５から構成され、ＣＤループは基本的に配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは基本的に配列番号３９から構成される。
【０１８４】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＢＣループは配列番号３６を含み、ＤＥループは配列番号３８を含み、さらに、ＦＧループは配列番号４０を含む。
【０１８５】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＢＣループは配列番号３６から構成され、ＤＥループは配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは配列番号４０から構成される。
【０１８６】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＢＣループは基本的に配列番号３６から構成され、ＤＥループは基本的に配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは基本的に配列番号４０から構成される。
【０１８７】
別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８８】
別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８９】
別の具体的実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５から構成されＣベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９０】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、さらに、ＥＦループは配列番号３９を含み、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９１】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＡＢループは配列番号３５から構成され、ＣＤループは配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは配列番号３９から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９２】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＡＢループは基本的に配列番号３５から構成され、ＣＤループは基本的に配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは基本的に配列番号３９から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９３】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＢＣループは配列番号３６を含み、ＤＥループは配列番号３８を含み、さらにＦＧループは配列番号４０を含み、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９４】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＢＣループは配列番号３６から構成され、ＤＥループは配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは配列番号４０から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９５】
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＢＣループは基本的に配列番号３６から構成され、ＤＥループは基本的に配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは基本的に配列番号４０から構成され、ここで、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５、および４９）中のシステイン残基が置換できないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１９６】
足場安定性の強化：ＦＧループ長
発明者はＦＧループの長さがＦｎＩＩＩ足場の安定性に対してある種の役割を果たすことを発見した。特に、ＦＯＩのＦＧループで認められる長さより少なくとも１つのアミノ酸長さ短い非天然変異ＦＧループを含むＦｎＩＩＩ足場は、強化された安定性を有することが示されている。従って、本発明は、ＦＯＩに比較して、増加した安定性を有するフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）足場変異体を得る方法を提供し、この方法は、ＦＯＩの変異体を操作するステップを含み、変異体のＦＧループが少なくとも１アミノ酸の欠失を含み、さらに変異体がＦＯＩに比較して、増加した安定性を示す。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、本発明の足場は、ＦＯＩのＦＧループより少なくとも１つのアミノ酸残基分が短い非天然変異体ＦＧループを含む。例えば、本明細書で定義したように、ヒトテネイシンＣ第３ＦｎＩＩＩドメインの自然ＦＧループは、１０アミノ酸残基を含む。従って、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインをＦＯＩとして使って、改善された安定性を有するＦｎＩＩＩ足場を特定するために、ＦＧループは、９以下のアミノ酸残基に縮小されることになろう。
【０１９８】
ＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列間の配列類似性は、一般的には低いが、全体としての３次元構造は類似している。従って、既知の技術、例えば、配列解析および構造オーバーレイを使って、複数のＦＯＩ由来のＦｎＩＩＩドメインのＦＧループ（例えば、標的に結合するなる種、異なるタンパク質、および異なるＦｎＩＩＩ足場由来のＦｎＩＩＩドメイン）を測定可能である（例えば、図１６参照）。これらのループは、次に、変異を受けさせて、ＦＯＩ由来のＦＧループよりも少なくとも１つのアミノ酸分が短いＦＧループを得ることができる。
【０１９９】
従って、一実施形態では、本発明は、どのような特殊なＦＧループの定義が使われるかにかかわらず、ＦＯＩのＦＧループより少なくとも１つのアミノ酸分短い非天然変異体ＦＧループを含むＦｎＩＩＩ足場を包含する。
【０２００】
特定的な実施形態では、ＦＯＩの安定性は、ＦＯＩのＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸の欠失により強化される。別の実施形態では、ＦＯＩの安定性は、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０のＦＧループ中のアミノ酸の欠失により強化される。安定化ＦＯＩは、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが特に意図されている。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、安定化される前に、非天然分子内ジスルフィド結合を含んでいた。他の実施形態では、安定化ＦＯＩは、さらに、操作され、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を導入される。
【０２０１】
特定的な実施形態では、本発明は、ＦＯＩの変異体を操作することを含む、ＦＯＩに比べて増加した安定性を有するＦｎＩＩＩ足場変異体を得る方法を提供し、この足場変異体のＦＧループは、ＦＧループの少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０のアミノ酸欠失を含み、この変異体は、ＦＯＩに比べて増加した安定性を示す。ある特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩ足場変異体は、また、長さおよび／または配列に関して無作為化された少なくとも１つのループ（すなわち、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、および／またはＦＧ）を含む。足場変異体は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが、特に意図される。ある特定の実施形態では、ＦＯＩは、非天然ジスルフィド結合を含む。他の実施形態では、ＦｎＩＩＩ変異体は、さらに操作され、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を導入される。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本発明の足場は、ＦＯＩに比べて増加した安定性を有するＦｎＩＩＩ足場変異体（すなわち、安定化ＦＯＩ）であり、ＦｎＩＩＩ足場変異体は、少なくとも１つの、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０だけＦＯＩのＦＧループより短いアミノ酸残基であるＦＧループを含み、ＦｎＩＩＩ足場変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。
【０２０３】
安定性の測定
単離された多量体足場またはその一部としての本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場の安定性の増加は、当技術分野でよく知られた技術、例えば、熱（Ｔｍ）および不安定化変性（例えば、尿素、またはグアニジン塩での処理）、プロテアーゼ処理（例えば、サーモリシンでの処理）またはタンパク質の安定性測定のために技術的に受け入れられた別の方法により容易に測定可能である。タンパク質の安定性測定に使用される技術の包括的考察は、ｃａｎｂｅｆｏｕｎｄ、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．２００７、で見付けることができる。
【０２０４】
一実施形態では、本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場は、耐熱性、不安定化変性に対する耐性、プロテアーゼ処理または当技術分野でよく知られた別の安定性パラメータにより測定して、操作前の同じＦｎＩＩＩ足場（すなわち、ＦＯＩ）に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれ超の安定性の増加を示す。
【０２０５】
タンパク質の安定性は、変化する条件下でタンパク質により呈される蛍光のレベルにより測定可能である。タンパク質の相対的アンフォールド状態およびタンパク質が応力下示す内部蛍光の変化の間には正相関がある。熱アンフォールディング特性を測定する適切なタンパク質安定性アッセイには、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および円偏光二色性（ＣＤ）が含まれる。タンパク質がＤＳＣまたはＣＤで測定されたパラメータで大きなシフトを示す場合は、アンフォールド構造と相関する。このシフトが起こる温度は融解温度または（Ｔｍ）と名付けられる。
【０２０６】
一実施形態では、本発明の安定化足場は、類似条件下でのＦＯＩに比べて、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７１℃、少なくとも７２℃、少なくとも７３℃、少なくとも７４℃、少なくとも７５℃、少なくとも７６℃、少なくとも７７℃、少なくとも７８℃、少なくとも７９℃、少なくとも８０℃、少なくとも８１℃、少なくとも８２℃、少なくとも８３℃、少なくとも８４℃、少なくとも８５℃、少なくとも８５℃、少なくとも８６℃、少なくとも８７℃、少なくとも８８℃、少なくとも８９℃、少なくとも９０℃、少なくとも９１℃、少なくとも９２℃、少なくとも９３℃、少なくとも９４℃、少なくとも９４℃、少なくとも、少なくとも９５℃、少なくとも９６℃、少なくとも９７℃、少なくとも９８℃、少なくとも１００℃、少なくとも１０５℃、少なくとも１１０℃、または少なくとも１２０℃の増加した融解温度（Ｔｍ）を示す。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場は、類似条件下でのＦＯＩに比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれ超の融解温度（Ｔｍ）の増加を示す。
【０２０８】
タンパク質安定性のための別のアッセイには、タンパク質を、不安定化試薬、例えば、タンパク質内の相互作用を不安定化させる作用をする尿素またはグアニジン（例えば、グアニジン−ＨＣｌまたはグアニジンイソチオシナート）に露出させることを含む。タンパク質を漸増レベルの尿素またはグアニジンに露出する際、相対的な、固有の蛍光を測定し、５０％のタンパク質分子がアンフォールドされる値を評価する。この値は、Ｃｍ値と名付けられ、タンパク質安定性のベンチマーク値を表す。Ｃｍ値が大きければ大きいほど、タンパク質の安定性が高くなる。一実施形態では、本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場は、類似の条件下の尿素変性実験で測定したＦＯＩに比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれ超のＣｍの増加を示す。別の実施形態では、本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場は、類似の条件下のグアニジウム−ＨＣｌ変性実験で測定したＦＯＩに比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、ｏｒ少なくとも９５％またはそれ超のＣｍの増加を示す。
【０２０９】
タンパク質安定性を試験するために使用される別のアッセイは、プロテアーゼ耐性アッセイである。このアッセイでは、相対的レベルのタンパク質安定性が、経時プロテアーゼ分解に対する耐性と相関される。プロテアーゼ処理に対する耐性が大きければ大きいほど、タンパク質の安定性は高い。一実施形態では、本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場は、類似条件下でのＦＯＩに比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれ超の安定性の増加を示す。
【０２１０】
多量体足場
本発明の一態様では、タンデムに連結された少なくとも２つの本発明のＦｎＩＩＩモノマー足場を含む多量体足場が提供される。このような多量体足場は、複数の形態に組み上げることができる。一部の実施形態では、モノマー足場は、直鎖状形式で組み上げられ、また、他の実施形態では、足場は、分岐形式で組み上げられる（例えば、図１参照）。特定的な態様では、本発明は多量体足場を提供し、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場がペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。一部の実施形態では本発明の多量体足場中の各ＦｎＩＩＩ足場は異なる標的に結合し、それにより複数の機能を示し、および／または同じ標的に結合し、それにより標的結合の結合価および／または結合力を増加させる。一部の実施形態では、複数の足場が同じ標的に結合する場合に標的結合の結合価および／または結合力の増加が達成される。一部の実施形態では、結合価の増加により、標的に対する特定の作用、例えば、標的タンパク質の二量体化の増加作用が改善される。
【０２１１】
特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、タンデムに連結された少なくとも２つの本発明のＦｎＩＩＩモノマー足場を含み、各足場は、少なくとも１つの標的に結合し、各ＦｎＩＩＩ足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、少なくとも１つのループは、ＦＯＩの同種のループの非天然変異体であり、また、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、ＦＯＩの同種のベータ鎖に対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）を有する。ある特定の実施形態では、各ＦｎＩＩＩ足場は、同じＦＯＩの同種のベータ鎖に対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）である。特定的な実施形態では、各ＦｎＩＩＩ足場は、野性型Ｔｎ３足場の同種のベータ鎖（配列番号１）に対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）を有する。各ＦｎＩＩＩ足場が、異なるＦＯＩに対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）を有してもよいことが特に意図されている。例えば、本発明の多量体足場は、第１ＦｎＩＩＩ足場および第２ＦｎＩＩＩ足場を含んでもよく、この場合、第１ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、フィブロネクチンの第１４ＦｎＩＩＩドメインの同種のベータ鎖（配列番号６９）に対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）を有し、第２ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、野性型Ｔｎ３足場の同種のベータ鎖（配列番号１）に対して少なくとも５０％相同性（すなわち、配列類似性）を有する。
【０２１２】
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含み、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、野性型Ｔｎ３足場である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣ由来の別のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、別のテネイシンタンパク質由来のＦｎＩＩＩドメイン、あるいは、別の生物体（例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン）由来のテネイシンタンパク質に対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の次記のいずれかの同種のベータ鎖に対して相同性（すなわち、配列類似性）を有する：ヒトテネイシンＸＢ由来第２９ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１１）、ヒトテネイシンＸＢ由来第３１ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号１２）、ヒトテネイシンＸＢ由来第３２ＦｎＩＩＩ（配列番号１３）、ヒトフィブロネクチンの第３ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号６）、ヒトフィブロネクチンの第６ＦｎＩＩＩドメイン（配列番号７）、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、配列番号５および配列番号５４）、ヒトフィブロネクチンの第１４ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、配列番号６９および配列番号３４）、ヒト成長ホルモン受容体由来ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、配列番号８および配列番号１５）、ベータ共通受容体由来ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、配列番号９）、ＩＬ−５受容体由来ＦｎＩＩＩ（例えば、配列番号１０）、ＰＴＰＲ−Ｆ由来ＦｎＩＩＩ（例えば、配列番号１６および配列番号１７）、またはコラーゲンタイプＸＩＶ由来ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、配列番号１８）。
【０２１３】
さらに別の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含み、ＦＯＩは、任意の生物体由来ＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、天然配列は、好熱性または超好熱性生物体、例えば、限定されないが、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリヌス、スルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・ソルファタリカス、およびスルホロブス・トコダイイ、由来の予測ＦｎＩＩＩドメインに対応する。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３のいずれかの同種のベータ鎖に対して、少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の相同性（すなわち、配列類似性）を有する。
【０２１４】
一実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の次記の同種のベータ鎖に対する相同性（配列類似性）を有する：図１６に示されるＦｎＩＩＩドメインのいずれか１つ、または、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎプログラムを使って測定して、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＰＲ００８９５７フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメイン。
【０２１５】
多量体タンデム足場
一実施形態では、本発明の多量体足場は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ超の本発明のＦｎＩＩＩモノマー足場を含む。一部の実施形態では、一部のＦｎＩＩＩモノマー足場がタンデムに連結される。さらに別の実施形態では、一部のＦｎＩＩＩモノマー足場がタンデムに連結され、一部のＦｎＩＩＩモノマー足場は、タンデムに連結されない。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ超のタンデムに連結された本発明の足場を含む（例えば、図１および図２参照）。
【０２１６】
一実施形態では、多量体足場は、ＦｎＩＩＩモノマー足場間の共有結合を介して、例えば、直接ＦｎＩＩＩ足場を連結することにより、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを組み込む事により、生成される。特定の例では、共有結合足場は、ＦｎＩＩＩモノマー足場をコードする融合遺伝子を構築することにより、あるいは、システイン残基のコドンをモノマーＦｎＩＩＩ足場中へ操作して、発現産物間でジスルフィド結合形成を可能とすることにより、生成される。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の多量体足場は、いかなる介在アミノ酸の追加をも必要とせず、相互に直接連結される少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含む。別の実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカー経由でタンデムに連結されている少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介して連結されている少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ペプチドリンカーは、１〜約１０００、または１〜約５００、または１〜約２５０、または１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約２５のアミノ酸を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、ペプチドリンカーは、１〜約２０、または１〜約１５、または１〜約１０、または１〜約５のアミノ酸を含む。
【０２１８】
特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、リンカーは、官能性成分である。官能性成分は、目的の多量体足場の機能および／または特性に基づき選択される。例えば、精製に有用な官能性成分（例えば、ヒスチジンタグ）は、リンカーとして使用可能である。リンカーとして使用可能な官能性成分には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞障害剤、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパードメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体ドメインまたは断片（例えば、抗体可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等が含まれる。リンカーとして使用可能な特定のペプチドリンカーおよび官能性成分は、後程開示される。
【０２１９】
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、１つまたは複数のリンカーを介して連結されている少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含み、各ＦｎＩＩＩ足場間に挿入されるリンカーは、同じリンカーであっても、または異なるリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、複数のリンカーを含むことができ、これらは、同じリンカーでも異なるリンカーでもよい。一部の実施形態では、複数のリンカーが鎖状に連結される場合、一部または全部のリンカーが官能性成分であってよい。
【０２２０】
多量体足場結合化学量論
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、同じエピトープに対し特異的な足場を含む。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、異なるエピトープに対し特異的な足場を含み、異なるエピトープは、同じまたは異なる標的上の異なるエピトープであり得る。
【０２２１】
特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、同じ標的分子上の２つ以上の異なるエピトープ（例えば、非オーバーラップエピトープ）に結合する。別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、異なる標的分子上の２つ以上の異なるエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、同じ標的上の２つ以上の異なるエピトープに結合し、さらに、１つまたは複数の異なる標的分子上の少なくとも１つのエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、多量体標的分子上の同じエピトープに結合する。さらに別の実施形態では、多量体足場の足場は、隣接する標的分子上の同じエピトープに結合する。特定の実施形態では、多量体足場の足場は、隣接細胞表面上の標的分子の２つ以上のコピー上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多量体足場の足場は、同じまたは異なる結合親和性および／または結合力で、同じ標的または異なる標的中の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合することができる。
【０２２２】
別の実施形態では、本発明の多量体足場中のモノマー足場は、所望の効果を（例えば、相乗的に）達成する、または強化するように作られた特異的結合パターンに従って特異的標的に結合することができる。例えば、直鎖多量体足場中のＦｎＩＩＩ足場は、ある特定のパターンに従って単一標的または複数標的に結合できる。例えば、６モジュール直鎖多価性足場中のＦｎＩＩＩ足場は、２つの標的ＡとＢに、ＡＡＡＢＢＢパターン、ＡＡＢＢＡＡパターン、ＡＢＡＢＡＢパターン、ＡＡＡＡＢＢパターン、等に従って結合でき；３つの標的に、ＡＡＢＢＣＣパターン、ＡＢＣＡＢＣパターン、およびＡＢＣＣＢＡパターン、等に従って結合でき；４つの標的に、ＡＢＣＤＤＡパターン、ＡＢＣＡＤＡパターン、等に従って結合できる；等である。さらに、本発明の多量体足場が、複数の操作された（例えば、ジスルフィド操作された、ループ操作された、またはジスルフィドおよびループ両方の操作された）および操作されていない足場を含む場合、このようなモノマー足場は、ある特定のパターンに従って配置し、ある特定の生物学的効果を達成する、または強化することができる。モノマー足場のこのような組み合わせは、コンビナトリアルケミストリー的に組み立てられ、その後、当技術分野で既知の方法を使って評価できる。
【０２２３】
一部の実施形態では、分岐構築物中の多量体足場、例えば、Ｆｃ融合体または抗体様形式の多量体足場は、特定のパターンに従って単一標的または複数の標的に結合できる。例えば、ある特定の実施形態では、抗体様形式足場中のＩｇＧ重鎖に融合した直鎖形式足場は、第１の標的に結合でき、一方、抗体様形式足場中のＩｇＧ軽鎖に融合した多価性の直鎖構築物は、第２の標的に結合できる。別の実施形態では、抗体様形式足場のＩｇＧ重鎖に融合した直鎖形式足場は、特定の親和性で標的に結合でき、一方、抗体様形式足場のＩｇＧ軽鎖に融合した直鎖形式足場は、異なる親和性で同じ標的に結合できる。一部の実施形態では、抗体の「Ｙ」の左アーム中の鎖に融合した足場は、第１の標的に結合することができ、一方、抗体の「Ｙ」の右側の鎖に融合した足場は、第２の標的に結合することができる。
【０２２４】
融合体
本発明は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含む多量体足場をさらに提供し、少なくとも１つのモノマー足場が異種の成分に融合可能である。これに関連して、異種の成分は、スペーサーとして足場の連結に使用されないが、本発明の多量体足場に追加の機能性を与えることができ得る。例えば、一部の実施形態では、細胞表面上の標的に結合する多量体足場を細胞障害剤に融合して、標的特異的細胞殺作用を促進できる。さらなる融合体は、後程開示される。一部の実施形態では、異種の成分は、リンカーとして機能可能である。
【０２２５】
本発明は、１つまたは複数の異種の成分に複合化した、または融合した本発明の足場の使用を包含し、異種の成分には、限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬）、合成薬剤、無機分子、および有機分子が含まれる。本発明は、異種のタンパク質またはポリペプチドまたはその断片に組換えにより融合した、または化学的に複合した足場の使用を包含する。複合には、共有結合および非共有結合による複合の両方が含まれる。一部の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、または少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドに融合、または化学的に複合して、融合タンパク質を生成可能である。
【０２２６】
足場の１つまたは複数の異種の成分に対する融合または複合は、直接、すなわち、足場と異種の成分の間にリンカー無しで、または、１つまたは複数の本明細書記載のリンカー配列を介してであり得る。一部の実施形態では、足場は、インビトロでまたはインビボで、足場を標的細胞中の特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または複合することにより、異種のポリペプチドに特定の細胞型を標的にさせるのに使用できる。異種のポリペプチドに融合または複合した足場は、また、当技術分野で既知の方法を使ったインビトロイムノアッセイおよび精製法に使用可能である。例えば、国際公開第９３／２１２３２号；欧州特許第４３９、０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９、１９９４；米国特許第５、４７４、９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２、１９９２；およびＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２、１９９１、を参照のこと。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
一部の実施形態では、足場は、限定されないが、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域、等の免疫グロブリンまたはそのドメインに、例えば、ＮまたはＣ末端を介して、足場に融合または複合することにより、ヒト免疫応答と一体化することができる。Ｆｃ融合分子は、免疫応答の補体成分を活性化し、タンパク質足場の治療効果を高める。同様に、足場と補体タンパク質、例えば、ＣＩｑの間の融合体は、細胞を標的化するのに使用可能である。足場と毒素の間の融合体は、本明細書記載のように特定の抗原を含む細胞を特異的に破壊するのに使用可能である。
【０２２８】
種々の出版物には、ＦｃＲｎ結合親和性が保存されているが、他のＦｃ受容体に対する親和性は大きく減らされている抗体と分子を融合することにより（例えば、国際公開第９９／４３７１３号参照）、または分子を抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合することにより（例えば、国際公開第００／０９５６０号；米国特許第４、７０３、０３９号参照）、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの分子中へ導入して、半減期を変更できる生理学的に活性な分子を得る方法に関し記載されている（例えば、国際公開第９７／４３３１６号；米国特許第５、８６９、０４６号；同５、７４７、０３５高；国際公開第９６／３２４７８号；および同９１／１４４３８号を参照）。生理的に活性な分子の半減期を延長する具体的な技術と方法は、また、米国特許第７、０８３、７８４号で見付けることができる。特に、本発明の足場は、ＩｇＧ由来のＦｃ領域に融合でき、Ｆｃ領域は、アミノ酸残基変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ（アミノ酸位置はＫａｂａｔナンバリングスキーマに従い命名）を含むことが意図されている。一部の実施形態では、本発明の多量体足場の半減期は、多量体足場を本質的に不定形の組換え型ポリペプチド（例えば、ＸＴＥＮ（登録商標）ポリペプチド）と遺伝的に融合することにより、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合することにより、延長される。
【０２２９】
一部の実施形態では、本発明の足場は、インビボ、または血清半減期を増加または延長する分子と融合できる。一部の実施形態では、本発明の足場は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、その新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ）またはその断片、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質および血流中および／またはその組織浸透中のその半減期を増やす他の因子に融合または複合される。これらのいずれの融合体も、標準的な方法、例えば、公に利用可能な遺伝子配列を使って構築された組換え型融合体遺伝子由来の融合タンパク質の発現により、生成可能である。
【０２３０】
さらに、本発明の足場は、マーカー配列、例えば、精製促進用ペプチドに融合できる。一部の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ポリヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）、例えば、他のベクターも多くが市販されているが、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ、９１３１１）で提供されるｔａｇのオクタヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−８−ｔａｇ）またはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−６−ｔａｇ）等がある。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４、１９８９、に記載のように、例えば、ポリ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製法を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７、１９８４を参照）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＧＦＰタグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ＥＣＳタグ、ＧＳＴタグ、またはＯＬＬＡＳタグが含まれる。
【０２３１】
本発明の足場を含むさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術により生成可能である。ＤＮＡシャフリングは、本発明の足場の活性を変えるために採用できる（例えば、高い親和性と低い解離速度を有する足場）。一般的記述には、米国特許第５、６０５、７９３号；同５、８１１、２３８号；同５、８３０、７２１号；同５、８３４、２５２号；および同５、８３７、４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３、１９９７；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２、１９９８；Ｈａｎｓｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６、１９９９；およびＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−３１３を参照のこと（これらそれぞれの特許と論文は、参照によってその全体が組み込まれる）。足場、またはそのコードされた足場は、変異性ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または組換え前の他の方法を使って無作為変異誘発を受けることにより改変できる。特異的標的に結合する、足場をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分は、１つまたは複数の異種の分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、断片、部分、ドメイン、断片、等と組換え可能である。
【０２３２】
抗体様多量体足場
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＦｎＩＩＩを含み、少なくとも１つの足場は、限定されないが、無傷抗体、抗体可変ドメイン、ＣＨｌドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、Ｆｃドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン、を含む抗体（例えば、ＩｇＧ）のドメインまたは断片に融合されている。
【０２３３】
一部の実施形態では、本発明の足場は、抗体のドメインまたは断片に融合可能である。抗体のドメインまたは断片は、下記のＦｃドメインと同様に、本発明の多量体足場の形成を促進する二量体化または多量体化ドメインを提供することにより多量体足場の結合力および／または親和性をさらに増強する。
【０２３４】
一部の実施形態では、２つのＦｎＩＩＩドメインを含むただ１つの多量体タンデム足場が抗体のドメインまたは断片に複合または融合される。例えば、単一多量体タンデム足場が、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端に融合できる。一部の実施形態では、多価性の足場が、１つまたは複数のＦｎＩＩＩ足場を、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖および／または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合または複合することにより生成される。一部の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部または全部の足場は、同じである。一部の他の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部のまたは全部の足場は、異なる。
【０２３５】
一部の実施形態では、抗体様多価性の足場生成用に使用する本発明の足場は、同じ数のＦｎＩＩＩモジュールを含んでもよい。他の実施形態では、抗体様多価性の足場生成用に使用する本発明の足場は、異なる数のＦｎＩＩＩモジュールを含んでもよい。例えば、四価のＦｎＩＩＩ足場は、例えば、直鎖型四価のＦｎＩＩＩ足場を単一位置に融合することにより、または１つのＦｎＩＩＩモノマー足場を１つの位置および３量体直鎖型ＦｎＩＩＩ足場を別の位置に融合することにより、または２つの２量体ＦｎＩＩＩ直鎖型足場を２つの異なる位置に融合することにより、または４つのＦｎＩＩＩモノマー足場をそれぞれ単一位置に融合することにより、形成可能である。
【０２３６】
特定的な実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場は、抗体のドメインまたは断片に融合した４つの多量体直鎖足場を含み、各多量体直鎖足場は、リンカーを介してタンデムに連結している２つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含む（図１）。他の実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つのまたは少なくとも８つの抗体のドメインまたは断片に融合した本発明のモノマーまたは多量体ＦｎＩＩＩ足場を含む。
【０２３７】
１つの特定的な実施形態では、四価のＦｎＩＩＩ足場は、１つの足場を抗体のドメインまたは断片のそれぞれの軽鎖および重鎖のＮ末端に融合することにより生成できる（例えば、図２のＡ９構築物参照）。
【０２３８】
抗体様形式の多価性ＦｎＩＩＩ足場は、本発明の足場の任意の組み合わせを抗体のドメインまたは断片または改変抗体に融合することにより生成できる。改変抗体の例には、ドメイン欠失した抗体、ミニボディ、（例えば、米国特許第５、８３７、８２１号参照）、四価ミニボディ、四価抗体（例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−１６３、１９９７；国際公開第９５／０９９１７号参照）、熱安定化抗体、ヒト化抗体、等が含まれる。
【０２３９】
図１に従って抗体様多価性の足場の生成に使用されるそれぞれの本発明の直鎖足場は、同じリンカーおよびリンカー分布、または異なるリンカーおよび異なるリンカー分布を含んでもよい。
【０２４０】
Ｆｃ融合多量体足場
一部の実施形態では、本発明の多量体足場はＦｃドメインに結合した複数のモノマーまたは多量体足場を含む。本発明の多量体足場のＦｃドメインを含む抗体断片への融合は、多量体ＦｎＩＩＩ足場の二量体の形成を促進する二量体化ドメインを提供することにより、多量体ＦｎＩＩＩ足場の結合力および／または活性をさらに増強する。
【０２４１】
一部の実施形態では、ただ１つの多量体ＦｎＩＩＩ足場がＦｃドメインに融合される。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、Ｆｃドメインに融合した２つの多量体ＦｎＩＩＩ足場を含み、各多量体ＦｎＩＩＩ足場は、１つまたは複数のリンカーを介して連結された２つ以上のＦｎＩＩＩ足場を含む（図１）。一特定的な実施形態では、Ｆｃドメインに融合した多量体ＦｎＩＩＩ足場は、直鎖形式足場である。
【０２４２】
一特定的な実施形態では、２つのタンデムＦｎＩＩＩドメインを含む２つの直鎖形式ＦｎＩＩＩ足場がＦｃドメインに融合され、４の結合価を有する多量体足場を生成する（例えば図２のＡ７構築物参照）。別の特定的な実施形態では、２つの直鎖形式足場で、４つのＦｎＩＩＩモノマー足場を含むそれぞれがＦｃドメインに融合されて、結合価８のＦｎＩＩＩ多量体足場を生成する（例えば、図２のＡ８構築物参照）。
【０２４３】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＦｎＩＩＩ足場は、同じ数のＦｎＩＩＩモジュールを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＦｎＩＩＩ足場は、異なる数のＦｎＩＩＩモジュールを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＦｎＩＩＩ足場は、同じリンカーを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＦｎＩＩＩ足場は、異なるリンカーを含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、異なる本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場が、ヘテロ二量体の形成を助けるＦｃドメイン変異の使用により二量体化できる。例えば、国際公開第９６／２７０１１号参照。これは、第１Ｆｃドメインの界面由来の１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換されている方法について記載している。大きなアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖で（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖に対する同じまたは類似のサイズの補償的「空洞」が第２のＦｃドメインの界面上に形成される。これが、望ましくない最終産物、例えば、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を増加させる機序を提供する。
【０２４５】
Ｆｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）は、抗体のエフェクター機能を強化または低下させる（例えば、米国特許第５、６２４、８２１号；同５、８８５、５７３号；同６、５３８、１２４号；同７、３１７、０９１号；同５、６４８、２６０号；同６、５３８、１２４号；国際公開第０３／０７４６７９号；同０４／０２９２０７号；同０４／０９９２４９号；同９９／５８５７２号；米国特許公開第２００６／０１３４１０５号；同２００４／０１３２１０１号；同２００６／０００８８８３号、参照）、および抗体の薬物動態学的特性（例えば、半減期）を変えることができる（米国特許第６、２７７、３７５号および同７、０８３、７８４号参照）ことが知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の多選択性ＦｎＩＩＩ足場は、改変されたＦｃ領域を含むＦｃドメインを含み、多量体ＦｎＩＩＩ足場の機能的および／または薬物動態学的特性を変えるために、１つまたは複数の変化がＦｃ領域でなされている。
【０２４６】
エフェクター機能および／または抗炎症性活性を増加、または減少させるようにＦｃ領域のグリコシル化を修飾できることも知られている（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０、１９９９；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４、２００１；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３、２００３；米国特許第６、６０２、６８４；６、９４６、２９２号；同７、０６４、１９１号；同７、２１４、７７５号；同７、３９３、６８３号；同７、４２５、４４６号；同７、５０４、２５６号；米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；同２００３／０００３０９７号；同２００９／００１０９２１号；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ、Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｋｅｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３：６７０−６７３、２００６；Ｓｃａｌｌｏｎｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．４４（７）：１５２４−３４、２００７、を参照のこと）。従って、一実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含み、多量体足場の細胞障害性および／または抗炎症性特性が変えられる。
【０２４７】
多量体足場トポロジー
当業者なら、上記図１、図２で、および本明細書全体で考察される多量体足場は、単に説明用の例であることをわかるであろう。図１と図２で示す構築物トポロジーまたは形式は、一部の実施形態では、本発明の足場がＦｃドメインおよび抗体のポリペプチド成分のＮ末端に融合されることを示している。本発明の足場は、任意の適切な空間配置のＦｃドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のＣ末端に融合可能である。例えば、一部の実施形態では、四価の足場は、ＦｎＩＩＩモノマー足場を抗体の各重鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩモノマー足場を各軽鎖のＣ末端ドメインに融合させることにより、ＦｎＩＩＩモノマー足場を抗体の各軽鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩモノマー足場を各重鎖のＣ末端に融合することにより、またはＦｎＩＩＩモノマー足場を抗体の各重鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩモノマー足場を各軽鎖のＮ末端に融合させることにより、作成できる。モノマーおよび／または多量体ＦｎＩＩＩ足場は、可変領域および定常領域の両方を含む完全長重鎖および／または軽鎖に融合できる。あるいは、モノマーおよび／または多量体ＦｎＩＩＩ足場は、定常領域のみを含む切断型重鎖および／または軽鎖に融合できる（例えば、図２のＡ９構築物、等）。
【０２４８】
多量体足場は、図１に示す形式を構成要素として使って、作成できる。例えば、抗体様およびＦｃ融合体形式は、より単純な直鎖形式モジュールを含む組み合わせである。従って、一部の実施形態では、図１の構成要素を組み合わせて、さらに複雑な多量体足場形式を作成できる。
【０２４９】
図１と２は、また、一部の実施形態で、本発明の多量体足場は、直鎖でも、分岐でもよく、異なるレベルの分岐を示してもよいことを示している。例えば、Ｆｃ形式は、一次分岐形式の一例を提供し、一方、抗体様形式は、二次分岐形式の一例を提供する。より高次の分岐構築物は、抗体様形式またはＦｃ融合体形式中の直鎖形式構成要素をＦｃ融合体形式構成要素または抗体様構成要素で置き換え、それらをＦｃまたは抗体のポリペプチド成分のＣ末端またはＮ末端に連結することにより得られる。
【０２５０】
図１と２、および表１は、一部の実施形態では、多量体足場中のリンカーは、構造的に、および機能的に多様であってよく、複数の結合点を提供することができるという事実を示している。例えば、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）１−Ａｌａリンカーにより連結されている第４および第５ＦｎＩＩＩモジュールを除いて、Ａ４およびＡ５構築物中の全てのＦｎＩＩＩモジュールは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３Ａｌａリンカーにより連結されている。例えば、Ａ７構築物では、第１と第２ＦｎＩＩＩドメインおよび第３と第４ＦｎＩＩＩドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３Ａｌａリンカーにより連結されており、一方、第２と第３ＦｎＩＩＩドメインは、官能性成分リンカーとしてＦｃドメインにより連結されている。
【０２５１】
図１のＦｃ融合体は、一部の実施形態では、モノマーまたは多量体ＦｎＩＩＩ足場は、官能性成分リンカーのポリペプチドのＮ末端に融合できることを例示している。一部の実施形態では、本発明のモノマーまたは多量体ＦｎＩＩＩ足場は、Ｆｃ融合体形式の構築物中のＦｃドメインのＣ末端に容易に融合できる。
【０２５２】
同様に、抗体様形式構築物中の抗体または改変抗体は、また、官能性成分リンカーでもある。この事例では、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３Ａｌａもしくは（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）１−Ａｌａの場合のような２つの結合点の代わりに、またはＦｃドメインの場合のような４つの可能な結合点の代わりに、図１の抗体様の例に示される抗体は、６つの可能な結合点を提供する。図１の抗体様形式は、一部の実施形態では、官能性成分リンカー中のＮ末端結合点のみが、本発明のＦｎＩＩＩドメインにより結合されることを例示している。抗体様形式構築物では、一部または全部の本発明の足場が、抗体または改変抗体ドメインの重鎖および軽鎖のＣ末端に容易に融合できる。他の場合も融合化学量論が適用でき、すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ超の本発明の足場を、抗体または改変抗体に融合できる。
【０２５３】
図１と２は、また、一部の実施形態では、多量体ＦｎＩＩＩ足場は、他のＦｎＩＩＩ多量体足場を組み合わせることにより生成できることを示している。例えば、図２のＦｃ形式Ａ６、Ａ７、およびＡ８足場は、多量体足場が２つのポリペプチド鎖で形成されているホモ２量体ＦｎＩＩＩ足場であり、ポリペプチド鎖はそれぞれＦｃドメインに融合した直鎖形式ＦｎＩＩＩ足場を含み、それらは次いで分子間ジスルフィド結合を介して連結される。図１と２の抗体様形式足場は、ヘテロテトラマーＦｎＩＩＩ足場の例であり、２つの異なる型の足場（ＦｎＩＩＩモノマー足場をＩｇＧ軽鎖定常領域に融合して形成された２つのＦｎＩＩＩ足場、およびＦｎＩＩＩモノマー足場をＩｇＧのＣＨ１−ヒンジ領域−Ｆｃ領域に融合することにより形成された２つのＦｎＩＩＩ足場）に対応する４つのポリペプチドが分子間ジスルフィドを介して連結されている。
【０２５４】
本発明の足場の生成
本明細書記載のＦｎＩＩＩ足場は、新しいまたは改良された標的結合タンパク質を進化させるいずれの技術においても使用可能である。一特定例では、標的は、固体支持体、例えば、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウエル、上に固定され、標的は、候補足場ベース結合タンパク質ライブラリーと接触させられる。このようなライブラリーは、これに限定されないが、Ｔｎ３モジュールを含むＦｎＩＩＩドメインから、ＣＤＲ様ループの配列および／または長さの無作為化を使って構築されたクローンから構成できる。一実施形態では、ライブラリーは、ファージ、ファージミド、ウイルス、細菌性、酵母、もしくは哺乳動物細胞ディスプレイであっても、リボソームディスプレイライブラリーであってもよい。所望により、このライブラリーは、例えば、Ｓｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６、２５８、５５８号；同６、２６１、８０４号；同５、６４３、７６８号；および同５、６５８、７５４号、に記載された技術により生成されるＲＮＡタンパク質融合体ライブラリーであってもよい。あるいは、それは、ＤＮＡタンパク質ライブラリー（例えば、国際公開第２０００／０３２８２３号に記載の）であってもよい。
【０２５５】
この点については、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、よく知られた技術の１つであり、大きなオリゴペプチドライブラリーを選別し、標的に特異的に結合することができるこれらのライブラリーの成員を特定することを可能とする。ファージディスプレイは、バクテリオファージ粒子表面のコートタンパク質への融合体として、変異体ポリペプチドが提示される技術である（Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質変異体（または無作為にクローン化されたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーから、高親和性で標的分子に結合する配列を素早く、かつ、効率的に選別できるという事実にある。ペプチド（Ｃｗｉｒｌａ、Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８）またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ、Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ、Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３）のファージディスプレイライブラリーが、特異的結合特性を有するものを目的として、数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドを選別するために使用されてきた（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８）。ランダム変異体のファージライブラリーの選別には、大量の変異体を構築し増殖させる戦略、標的受容体を使った親和性精製手法、および結合濃縮の結果を評価する手段が必要である（例えば、米国特許第５、２２３、４０９号、同５、４０３、４８４号、同５、５７１、６８９号、および同５、６６３、１４３号、参照）。
【０２５６】
大抵のファージディスプレイ方法は、繊維状ファージを使っているが、ラムダ形ファージディスプレーシステム（国際公開第９５／３４６８３号；米国特許第５、６２７、０２４号）、Ｔ４ファージディスプレーシステム（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５（１１）：４７７０−４７７７（１９９７）；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９５（２）：３０３−３１１（１９９７）；Ｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、１０：１７３（１９９５））およびＴ７ファージディスプレーシステム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７：２２８−２５７（１９９３）；米国特許第号５、７６６、９０５号）も知られている。
【０２５７】
今や、基本的ファージディスプレイ概念に関し、多くの他の改良と変形物の開発が進められている。これらの改善は、選択標的分子への結合に関して、ディスプレーシステムのペプチドライブラリーを選別する能力、およびこれらのタンパク質を所望の特性に関し選別する潜在力を有する機能的タンパク質を提示する能力を強化する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発され（国際公開第９８／１４２７７号）、さらに、ファージディスプレイライブラリーが、二分子相互作用（国際公開第９８／２０１６９号；同９８／２０１５９号）および制約を受けたらせん状ペプチドの特性を解析し制御する（国際公開第９８／２００３６）ために使用されている。国際公開第９７／３５１９６号には、親和性リガンドを単離する方法が記載され、これは、ファージディスプレイライブラリーが、その中でリガンドが標的分子に結合する１つの溶液、およびその中で親和性リガンドが標的分子に結合しない第２の溶液と接触させ、選択的に結合リガンドを単離する方法である。国際公開第９７／４６２５１号には、ランダムファージディスプレイライブラリーをアフィニティー精製した抗体でバイオパニングし、次に、結合ファージを単離した後、マイクロプレートウエルを使ってマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法が記載されている。また、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａの親和性タグとしての使用が、報告されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：１８７）。国際公開第９７／４７３１４号には、コンビナトリアルライブラリー（ファージディスプレイライブラリーでもよい）を使った酵素特異性を鑑別するための基質サブトラクションライブラリーの使用について記載されている。ファージディスプレイを使った洗浄剤としての使用に適した酵素の選択方法が国際公開第９７／０９４４６号に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法が、米国特許第５、４９８、５３８号、同５、４３２、０１８号、および国際公開第９８／１５８３３号に記載されている。
【０２５８】
ペプチドライブラリーの生成およびこれらのライブラリーの選別方法は、また、米国特許第５、７２３、２８６号、同５、４３２、０１８号、同５、５８０、７１７号、同５、４２７、９０８号、同５、４９８、５３０号、同５、７７０、４３４号、同５、７３４、０１８号、同５、６９８、４２６号、同５、７６３、１９２号、および同５、７２３、３２３号に記載されている。
【０２５９】
バイオインフォマティクス手法は、天然ＦｎＩＩＩドメインのループ長さおよび多様性の優先傾向を測定するために使用可能である。この分析を使って、ループ長さおよび配列多様性に対する優先傾向を、「制限された無作為化」手法の開発に採用できる。この制限された無作為化では、相対的ループ長さおよび配列の優先傾向が、ライブラリー戦略の開発に組み込まれる。ループ長さおよび配列多様性分析をライブラリー開発に一体化することが、制限された無作為化（すなわち、アミノ酸が入ることができる無作為化ループ内の特定の位置が限定されている）につながる。
【０２６０】
本発明は、また、本発明の非天然ＦｎＩＩＩ足場の多様な集団を含む組換え型ライブラリー（以降、「本発明のライブラリー」と呼ぶ）を提供する。一実施形態では、本発明のライブラリーは、複数のループ領域に連結した複数のベータ鎖ドメインを含む非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、１つまたは複数の前記ループが、ＦＯＩ中の同種のループ由来の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、さらに、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖が、ＦＯＩの同種のベータ鎖配列に対し少なくとも５０％の相同性（すなわち、配列類似性）を有する。組換え型ライブラリーの生成に有用なＦＯＩ配列の非制限的例は、表１および図１６に提供されている。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明のライブラリー非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、ヒトフィブロネクチンの第１４ＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。
【０２６２】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、野性型Ｔｎ３足場である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、ヒトテネイシンＣ由来の追加のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、別のテネイシンタンパク質由来のＦｎＩＩＩドメイン、あるいは、別の生物体（例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン）由来のテネイシンタンパク質に対応するタンパク質配列である。
【０２６３】
さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＯＩは、任意の生物体由来のＦｎＩＩＩドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、天然配列は、好熱性または超好熱性生物体由来の予測ＦｎＩＩＩドメインに対応する。例えば、超好熱性生物体は、超好熱性古細菌、例えば、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリヌス、スルホロブス・アシドカルダリウス、スルホロブス・ソルファタリカス、およびスルホロブス・トコダイイ、であってもよい。
【０２６４】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場のベータ鎖は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の次記のベータ鎖に対する相同性（配列類似性）を有する：配列番号１〜３４、５４、６９または図１６に示された配列のいずれかの同種のベータ株ドメイン、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインのベータ鎖。
【０２６５】
上で詳細に説明したように、足場の種々のベータ鎖を連結するループは、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化できる。一実施形態では、本発明のライブラリーは、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化されている少なくとも１つのループを有するＦｎＩＩＩ足場を含む。一実施形態では、ＦｎＩＩＩ足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループが、長さおよび／または配列多様性に関して無作為化されている。一実施形態では、少なくとも１つのループが、一定に保持され、一方、少なくとも１つの追加のループが、長さおよび／または配列多様性に関して無作為化されている。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持され、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性に関し無作為化されている。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てが無作為化され、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てが長さおよび／または配列多様性に関して無作為化されている。
【０２６６】
上で詳細に説明したように、驚くべきことに、ＦＯＩのＦＧループ中のものより、少なくとも１つのアミノ酸分短い長さのＦＧループが、安定性の増加を示すということが明らかになった。従って、本発明は、ＦｎＩＩＩ足場を含む本発明のライブラリーを提供し、ここで、ＦＧループの長さが少なくとも１つのアミノ酸分だけ、ＦＯＩの同種のＦＧループよりも短く保持されていることを除いて、少なくとも１つのループが長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。例えば、図１６で定義されているように、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインの自然ＦＧループは、１０アミノ酸残基を含み、従って、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインがＦＯＩの場合、ＦＧループの配列は無作為化されてもよいが、ＦＧループは、９アミノ酸残基以下に保持されることになる。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、各足場は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名された、６つのループ領域に結合した７つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名されている；また、少なくとも１つのループは、ＦＯＩループの非天然変異体であり、ＦＧループは、ＦＯＩの同種のＦＧループよりも少なくとも１つのアミノ酸分短い。
【０２６８】
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦＧループの長さが、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０のアミノ酸残基分ＦＯＩの同種のＦＧループより短く維持されていることを除いて、１つまたは複数のループ（すなわち、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ）のアミノ酸配列が、長さおよび／または配列多様性に関し無作為化される。
【０２６９】
特定の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、各ベータ鎖は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ超の下記のベータ鎖に対する相同性（配列類似性）を有する：配列番号１〜３４、５４、６９のいずれか１つの同種のベータ鎖、図１６に示されたＦｎＩＩＩドメインのいずれかのベータ鎖、またはＰｆａｍ＿スキャン、ＨＭＭＥＲ、またはいずれかの他のタンパク質配列をＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００４１フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインシグネチャを含むとわかっているドメインのベータ鎖。
【０２７０】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４４を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号５０を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３を含む。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号５１を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３を含む。
【０２７１】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４４から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号５０から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号５１から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５３から構成される。
【０２７２】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４４から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号５０から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５３から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号５１から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５３から構成される。
【０２７３】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、さらにＥＦループは配列番号３９を含む。
【０２７４】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＡＢループは配列番号３５から構成され、ＣＤループは配列番号３７から構成され、さらにＥＦループは配列番号３９から構成される。
【０２７５】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらにＧベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＡＢループは基本的に配列番号３５から構成され、ＣＤループは基本的に配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは基本的に配列番号３９から構成される。
【０２７６】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＢＣループは配列番号３６を含み、ＤＥループは配列番号３８を含み、さらに、ＦＧループは配列番号４０を含む。
【０２７７】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＢＣループは配列番号３６から構成され、ＤＥループは配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは配列番号４０から構成される。
【０２７８】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＢＣループは基本的に配列番号３６から構成され、ＤＥループは基本的に配列番号３８、さらに、ＦＧループは基本的に配列番号４０から構成される。
【０２７９】
別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらにベータ鎖Ｇは配列番号５２を含み、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８０】
別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、さらに、ベータ鎖Ｇは配列番号５２から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８１】
別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、さらに、ベータ鎖Ｇは基本的に配列番号５２から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８２】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含みさらに、ＥＦループは配列番号３９を含み、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８３】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＡＢループは配列番号３５から構成され、ＣＤループは配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは配列番号３９から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８４】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＡＢループは基本的に配列番号３５から構成され、ＣＤループは基本的に配列番号３７から構成され、さらに、ＥＦループは基本的に配列番号３９から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８５】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含み、ＢＣループは配列番号３６を含み、ＤＥループは配列番号３８を含み、さらに、ＦＧループは配列番号４０を含み、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８６】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は配列番号５２から構成され、ＢＣループは配列番号３６から構成され、ＤＥループは配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは配列番号４０から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８７】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖ドメインは基本的に配列番号４２から構成され、Ｂベータ鎖は基本的に配列番号４３から構成され、Ｃベータ鎖は基本的に配列番号４５、または１３１から構成され、Ｄベータ鎖は基本的に配列番号４６から構成され、Ｅベータ鎖は基本的に配列番号４７から構成され、Ｆベータ鎖は基本的に配列番号４９から構成され、Ｇベータ鎖は基本的に配列番号５２から構成され、ＢＣループは基本的に配列番号３６から構成され、ＤＥループは基本的に配列番号３８から構成され、さらに、ＦＧループは基本的に配列番号４０から構成され、また、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２８８】
上で詳細に説明したように、ループ内の１つまたは複数の残基が一定に保持でき、一方、他の残基は、長さおよび／または配列多様性に関して無作為化される。任意選択で、または、代わりに、ループ内の１つまたは複数の残基が、所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定でき、一方、他の残基は、長さおよび／または配列多様性に関して無作為化される。従って、本発明のライブラリーは、変性したコンセンサス配列および／または１つまたは複数の不変のアミノ酸残基を有する１つまたは複数のループを含むことができるＦｎＩＩＩ足場を含む。一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＡＢループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＡＢループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
【０２８９】
別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、プロリンまたはアラニンを表し、また、（ｂ）は、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、また、（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｄ）は、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、また、（ｆ）は、セリンまたはグリシンを表す。
【０２９０】
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＣＤループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘｎ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、また、ｎ＝６、７、８、９、または１０である。別の実施形態では、本発明の足場は、ＣＤループを含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘｎ、ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、ｎ＝７、８、または９である。
【０２９１】
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＤＥループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。
【０２９２】
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＥＦループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−ｂ−Ｌ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−ｃ−Ｘ、ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ｂ）は、アスパラギン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、また、（ｃ）は、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。
【０２９３】
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦＧループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、また、（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦＧループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（Ｘ９）、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。
【０２９４】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場は、Ｔｎ３モジュールを含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、ＦｎＩＩＩ足場は、Ｔｎ３モジュールを含み、Ｃベータ鎖（配列番号４５、または１３１）中のシステイン、およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステインが置換できないことを除いて、Ｔｎ３モジュールの１つまたは複数のベータ鎖が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２９５】
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、足場が、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、また、ｎ＝２〜２６およびｍ＝１〜９である。
【０２９６】
本発明は、本発明のライブラリー、特に、ＦＧループが同種のＦＯＩのＦＧループに比較して少なくとも１つのアミノ酸分短くなるように維持されているＦｎＩＩＩ足場を含むライブラリーを選別することにより、標的に結合し、ＦＯＩに比較して増加した安定性を有する組換え型ＦｎＩＩＩ足場を特定する方法をさらに提供する。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、ＦＯＩに比べて増加したタンパク質安定性を有し、特異的に標的に結合する組換え型ＦｎＩＩＩ足場を特定する方法は、以下を含む：
ａ．足場：標的リガンド複合体形成に適切な条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させ、ライブラリーが、ＦＯＩの同種のＦＧループよりも少なくとも１つのアミノ酸分短く維持されているＦＧループを有するＦｎＩＩＩ足場を含む；
ｂ．その複合体から標的リガンドに結合する足場を得る；
ｃ．ステップ（ｂ）で得られた足場の安定性がＦＯＩのそれより大きいかどうかを測定する。
【０２９８】
一実施形態では、ステップ（ａ）で、本発明の足場ライブラリーを固定化標的と共にインキュベートする。一実施形態では、ステップ（ｂ）で、足場：標的リガンド複合体を洗浄して非特異的結合物質（ｂｉｎｄｅｒ）を除去し、最も強固な結合物質を極めてストリンジェントな条件で溶出し、ＰＣＲにかけて配列情報を取り出す。ステップ（ｃ）の安定性の測定に有用な方法は、上に記載した。ステップ（ｂ）で得られた結合物質および／または配列情報は、本明細書に開示の方法または当業者に既知の方法を使って新しいライブラリーの構築に使用可能であり、さらなる配列の変異誘発を行って、または行わないで、選択プロセスを反復するめに使用可能できることが特に意図されている。一部の実施形態では、いくつかの選択のラウンドを、抗原に対する充分な親和性を有する結合物質が得られるまで行うことができる。
【０２９９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明および上述の足場を含むライブラリーをコードする単離核酸分子コレクションである。
【０３００】
本発明の足場は、国際公開第２００９／０５８３７９号に記載のＮＨＴコドンスキームによりコードされたコドンを含んでも、あるいは、ＮＮＫ混合コドンスキームによりコードされたコドンを含んでもよい。
【０３０１】
本発明の足場は、親和性成熟に供してもよい。この当技術分野で受け入れられたプロセスでは、特定の結合タンパク質が、特定の標的に対する増加した親和性に対して選択されるスキームににさらされる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５（１１）：６０３７−４２、参照）。結果として得られる本発明の足場は、親和性成熟前の足場と比べて少なくとも同等の大きさの結合特性を示しうる。
【０３０２】
本発明は、また、足場：標的複合体を形成するために、標的に結合可能なタンパク質足場のアミノ酸配列を特定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、以下を含む：ａ）固定された、または分離可能な標的と本発明のライブラリーを接触させる；ｂ）遊離足場から足場：標的複合体を分離する；ｃ）低下した多様性を有することにより、また、標的に結合可能な提示足場の濃縮によって、（ａ）におけるものとは区別される新規ポリペプチドディスプレイライブラリーを生成するために、（ｂ）の分離した足場を複製させる；ｄ）任意選択で、（ａ）、および（ｂ）のステップを（ｃ）の新規ライブラリーを使って、繰り返す；およびｅ）（ｄ）由来の種の提示足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推定する。
【０３０３】
別の実施形態では、本発明の足場は、ライブラリー選別による特定後に、さらに無作為化できる。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書記載の方法を使ってライブラリーから特定された足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループのさらなる無作為化を含む。別の実施形態では、さらに無作為化された足場が、その後の標的に結合できる足場を特定する方法に供される。この方法は、（ａ）前記のさらに無作為化された足場を固定された、または分離可能な標的と接触させること、（ｂ）さらに無作為化された足場：標的複合体を遊離足場から分離すること、（ｃ）（ｂ）の分離された足場の複製をさせ、さらに、任意選択で（ａ）〜（ｃ）ステップを繰り返すこと、および（ｄ）前記のさらに無作為化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推測すること、を含む。
【０３０４】
さらなる実施形態では、さらに無作為化された足場は、最初のライブラリーで以前無作為化されている、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの無作為化されたループを含む。別のさらなる実施形態では、さらに無作為化された足場は、最初のライブラリーで以前無作為化されていない、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの無作為化されたループを含む。
【０３０５】
本発明は、また、少なくとも１つまたは複数の標的に結合する少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を得る方法を提供する。この方法は、協動して特定の応答を誘発するように作用する試薬の選別を可能とする。２つ以上の足場の協動が必要なアゴニスト活性が要求される場合（例えば、限定されないが、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する受容体のアゴニズム）、このような選別を使用するのは、好都合であろう。この方法は、多量体複合体を形成するためにライブラリーを再編成することなく協動試薬の選別を可能とする。一実施形態では、本発明の方法は、足場：標的リガンド複合体の形成を可能とする条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させること、前記足場を架橋試薬（少なくとも２つの同じまたは異なる足場を近接近状態に結合させる試薬と定義される）と結合させ、足場の架橋を検出可能な応答を誘発すること、および複合体から、前記標的に結合する足場を得ること、を含む。さらなる実施形態では、架橋試薬は、足場特異的抗体、またはその断片、エピトープタグ特異的抗体、またはその断片、二量体化ドメイン、例えば、Ｆｃ領域、コイルドコイルモチーフ（例えば、これに限定されないが、ロイシンジッパー）、化学架橋剤、または当技術分野で既知の別の二量体化ドメイン、である。
【０３０６】
本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を検出する方法を提供する。ライブラリー選別により得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、診断法のために、このような足場をアッセイに使用し、検体中の特異的標的を検出することが可能である。一実施形態では、化合物の検出方法は、化合物：足場複合体を形成可能とする条件下で、検体中の前記化合物を本発明の足場に接触させること、さらに、前記足場を検出し、それにより、検体中の前記化合物を検出する、を含む。さらなる実施形態では、足場は、標識（すなわち、放射標識、蛍光、酵素結合または比色標識）して、化合物の検出を促進する。
【０３０７】
本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を捕捉する方法を提供する。ライブラリー選別から得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、精製の目的で検体中の特異的標的を捕捉するために、アッセイ中でこのような足場の使用が可能である。一実施形態では、検体中の化合物の捕捉方法は、化合物：足場複合体の形成を可能とする条件下で、試料中の前記化合物を本発明の足場を接触させること、および前記複合体を試料から取り出し、それにより、前記検体中の前記化合物を捕捉すること、を含む。さらなる実施形態では、足場が固定され、化合物：足場複合体の取り出しを促進する。
【０３０８】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーから単離された足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、またはそれ超の無作為化ループを含む。一部の実施形態では、単離足場ループ配列は、ドナー足場から受け側足場の任意のループと入れ替えできる（例えば、ドナー足場由来のＦＧループ配列は受け側足場の任意のループに移すことができる）。特定的な実施形態では、単離ループ配列は、受け側足場の同種のループに移すことができる（例えば、ドナー足場由来のＦＧループ配列は、ＦＧループ位置の受け側足場に移すことができる）。一部の実施形態では、単離ループ配列は、種々の受け手足場とランダムに「組み合わせて（ｍｉｘ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ）」使うことができる。
【０３０９】
他の実施形態では、単離足場配列は、ループ配列により特定できる。例えば、ライブラリーは、特定の標的に対し選別するために使用され、特異的結合物質のコレクションが単離される。無作為化ループ配列は、足場背景とは独立して特異的配列として特徴付け出来る（すなわち、標的Ｘに結合する足場で、前記足場は配列番号ＸのＦＧループ配列を含む）。別の代替の実施形態では、足場が標的Ｘに結合する２つのループ配列を示す場合は、ループ配列は、足場配列が無い場合の結合標的Ｘとして特徴付け出来る。言い換えれば、特定の標的に結合するライブラリーから単離された足場は、足場骨格とは独立した標的に結合する可変ループ配列として発現できることが意図されている。この過程は、抗体の可変領域のＣＤＲの概念と類似であろう。
【０３１０】
タンデム反復の生成
タンデム構築物の結合は、限定されないが、ＩＩ型およびＩＩＳ型制限酵素を含む当技術分野で既知の制限酵素を使って、制限酵素部位でのオリゴヌクレオチドの連結反応により形成できる。ＩＩ型制限酵素は、それらの認識配列内で切断し、一方、ＩＩＳ型制限酵素は、それらの認識配列の外側で切断し片側を残す。一実施形態では、タンデム反復を生成するため、切断によりそれらの認識部位が切り離され、２つのサブユニットの接合部で認識部位を生成しないで連結できる末端を残すように、ＩＩＳ型酵素が配置される。連結反応の後に、ＩＩ型およびＩＩＳ型部位の両方は末端に残る。再度ＩＩＳ型制限酵素で切断して連結することにより別のサブユニットを付加できる。あるいは、クローンをＩＩ型制限酵素で切断し、ベクターに連結できる。
【０３１１】
本発明の多量体足場は、Ｃ末端および／またはＮ末端の位置に、および／または本明細書記載のドメイン間にリンカーを含んでもよい。さらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つのポリペプチド足場を含む本発明の足場は、二量体化ドメインに融合または複合してもよい。二量体化ドメインには、限定されないが、以下から選択される抗体成分が含まれる：
（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；
（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；
（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ’断片；
（ｖ）抗体単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；
（ｖｉ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９））；
（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；
（ｖｉｉｉ）ヒンジ部でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ’断片を含むを含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；
（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））；
（ｘ）同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（欧州特許第４０４、０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）；
（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；および米国特許第５、６４１、８７０号）；
（ｘｉｉ）完全長抗体；および
（ｘｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含み、さらに全ての、または一部のヒンジ部および／またはＣＨ１領域を含むＦｃ領域。種々の結合価、親和性、および空間配向スキームが、以下の実施例で例示されている。
【０３１２】
足場の産生
本発明の足場の組み換え体発現には、足場をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作成が必要である。足場をコードするポリヌクレオチドが得られると、足場産生用ベクターが当技術分野でよく知られた技術を使って組換えＤＮＡ技術により産生可能である。従って、ヌクレオチド配列をコードする足場を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質調製方法が本明細書で記載される。当業者によく知られた方法を使用して足場ポリペプチドコード配列および適切な転写および転写調節シグナルを含むベクターを構築できる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換え技術が含まれる。本発明は、従って、本発明の足場をコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーターに機能的に連結された複製可能なベクターを提供する。
【０３１３】
発現ベクターを従来の技術を使って宿主細胞に導入し、その後、形質移入された細胞を従来の技術により培養して本発明の足場を産生する。従って、本発明は、本発明の足場をコードし、異種のプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。適切な宿主細胞には、限定されないが、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）等の微生物が含まれる。
【０３１４】
種々の宿主発現ベクター系が本発明の足場の発現に利用可能である。このような宿主発現系は、対象のコード配列を産生し、その後精製できるように使われる媒体を表すが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された、またはこれを形質移入された場合は、本発明の足場をその場発現可能な細胞も表す。これらには、足場コード配列を含む組換え型バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）；足場コード配列を含む組換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス、ピキア）；足場コード配列を含む組換え型ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え型ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または足場コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）由来の、または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組み換え体発現構築物含有哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）、が含まれる（これらに限定されない）。
【０３１５】
本発明の足場をコードする遺伝子の挿入物を含む発現ベクターは、次の３つの一般的手法により特定できる：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。一つ目の手法では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクター中の存在が、それぞれ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする挿入された遺伝子に相同な配列を含むプローブを使って、核酸ハイブリダイゼーションにより検出可能である。２つ目の手法では、ベクター中への抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入により生じた特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の封入体形成、等）の存在または非存在に基づいて、組換えベクター／宿主系を、特定または選択できる。例えば、足場をコードするヌクレオチド配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、足場をコードする遺伝子を含む組換え体挿入物は、マーカー遺伝子機能の非存在により特定可能である。３つ目の手法では、組み換え体発現ベクターは、組換え型により発現した遺伝子産物（例えば、足場またはその多量体）をアッセイすることにより特定できる。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系におけるタンパク質物理的または機能的特性、例えば、結合特性、アゴニストまたはアンタゴニスト足場特性、に基づいてもよい。
【０３１６】
本発明の足場の産生に有用な方法が、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号に開示されている。
【０３１７】
足場の精製
本発明の足場が組み換え体発現により産生されると、当技術分野で既知のタンパク質のいずれかの精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質精製用のいずれかの他の標準的な方法により精製できる。
【０３１８】
本発明の足場の非常に安定な性質により、様々な精製スキームが可能となる。例えば、本発明の足場により示される熱安定性は、足場を含む未精製ライセートを加熱して変性により宿主細胞タンパク質を取り出すことを可能とする。本発明の足場により示される高プロテアーゼ耐性は、いずれかの精製ステップの前に、未精製ライセート中の宿主細胞タンパク質の急速分解を可能とする。また、一部の本発明の足場により示されるｐＨ耐性は、いずれかの精製ステップの前に、ｐＨを下げるか、または上げることにより、未精製ライセート中の宿主細胞タンパク質の選択的析出を可能とする。上記のいずれかの組み合わせは、未精製ライセートから大部分の宿主細胞タンパク質を取り出すために使用可能である。
【０３１９】
研究室での本発明の足場の産生は、米国特許公開第２０１０／０２９８５４１Ａ１号に記載のように、分析的規模のリアクターまたは生産規模のリアクターで足場を産生できるように、スケールアップできる。
【０３２０】
分泌足場の拡張可能な産生
本発明の足場は、細胞内で、または分泌型として産生できる。一部の実施形態では、分泌足場は、正しく折り畳まれ、完全に機能する。分泌足場の産生は、ＰｔａｃプロモーターおよびｏｐｐＡシグナルの使用を含む。原核生物宿主細胞中で発現した足場は、原核生物宿主細胞の細胞周辺腔や培地中に分泌される。本発明の足場は、原核細胞の細胞培地または細胞周辺腔中へのペプチドおよび／またはタンパク質の分泌のための担体分子として作用可能である。
【０３２１】
大量に足場を得るために、本発明の足場は、拡張可能プロセス（以降、「本発明の拡張可能プロセス」と呼ぶ）により産生出来る。一部の実施形態では、足場は、本発明の足場をスケールアップして分析規模のバイオリアクター（例えば、限定されないが、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、３０Ｌ、または５０Ｌバイオリアクター）で産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。他の実施形態では、本発明の足場をスケールアップして生産規模のバイオリアクター（例えば、限定されないが、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌ）で産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、研究室で行った産生プロセスに比べて、生産効率の低下をほとんど、または全く生じない。
【０３２２】
一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約１０ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌまたはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。
【０３２３】
他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｍ／Ｌ、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌまたはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。
【０３２４】
他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約１０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１７５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ〜約１７５ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約１５０ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約１２５ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約１７５ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約１５０ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約１２５ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ〜約１７５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約１５０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約１２５ｍｇ／Ｌ、または約５０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌの生産効率で多量体足場を産生する。
【０３２５】
一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ、約１５．０ｇ／Ｌ、約１７．５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、またはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。
他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、またはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。
【０３２６】
リンカー
本発明の足場は、タンパク質および／または非タンパク質リンカーにより連結され、各リンカーは、少なくとも２つの本発明の足場に融合される。２つ以上の本発明の足場が連結される場合の特定のケースに対する適切なリンカーの選択は、種々のパラメータに依存し、これには、例えば、ＦｎＩＩＩモノマードメインの性質、タンパク質分解および酸化に対するペプチドリンカーの安定性、ガイド多量体折り畳みのガイドに対する立体構造による制約、および／または足場の所望する生物活性に関連する立体構造による制約が含まれる。
【０３２７】
適切なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組み合わせから構成できる。リンカーの組み合わせは、ホモマーであっても、ヘテロマーであってもよい。一部の実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場は、複数の本発明のＦｎＩＩＩ足場を含み、全てのリンカーは同じである。他の実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場複数の本発明のＦｎＩＩＩ足場を含み、少なくとも１つのリンカーは、残りのリンカーとは機能的にまたは構造的に異なる。一部の実施形態では、リンカーは、標的に対する結合に直接関与することにより、それ自体で、多量体ＦｎＩＩＩ足場の活性に寄与できる。
【０３２８】
一部の実施形態では、タンパク質リンカーは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーポリペプチドは、主に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。例えば、一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ペプチドリンカー中に存在するアミノ酸残基の合計数に基いて計算して）少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％のＧｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａおよび／またはＴｈｒ残基のみから構成される。
【０３２９】
リンカーポリペプチドは、２つ以上の本発明のモノマー足場または２つ以上の本発明の多量体足場を、目的活性を保持できるように、相互に対し正しい立体構造を呈するような方法で連結するのに適する長さを持たねばならない。
【０３３０】
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜約１０００アミノ酸残基、１〜約５０アミノ酸残基、１〜２５アミノ酸残基、１〜２０アミノ酸残基、１〜１５アミノ酸残基、１〜１０アミノ酸残基、１〜５アミノ酸残基、１〜３アミノ酸残基を含む。本発明は、ポリペプチドリンカー配列をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組み合わせをさらに提供する。ポリペプチドリンカーに組み入れるために選択されるアミノ酸残基は、本発明の多量体足場の活性または機能と大きく干渉しない特性を有すべきである。従って、ポリペプチドリンカーは、全体として、本発明の多量体足場の活性また機能と一致しない、または内部折り畳みと干渉する、または本発明の多量体足場の特異的標的に対する結合を大きく妨害する可能性のあるＦｎＩＩＩモノマードメインの１つまたは複数のアミノ酸残基と結合を形成する、または他の相互作用を形成する電荷を示すべきではない。
【０３３１】
一部の実施形態では、多量体足場の最大の安定性および／または活性を与えるリンカーを得るために無作為化が使われる。このプロセスでは、最初に、立体構造的に、柔軟なリンカーを使用して、適切な本発明の足場の組み合わせを見つけ出し、得られた多量体足場は、その後、ポリペプチドリンカーアミノ酸残基を無作為化することにより最適化される。
【０３３２】
ポリペプチドを新規連結融合体ポリペプチドに連結するための、天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献でよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、５２６０−５２６８；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８、７２５−７３１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５、１０９−１１６；Ｋｈａｎｄｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、３２１９０−３２１９７；Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９、２４５９−２４６４；Ｓｍａｌｌｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２、６２３−６３０；米国特許第５、８５６、４５６号）。
【０３３３】
従って、２つ以上の本発明の足場を融合しているリンカーは、天然リンカー（例えば、Ｇｅｏｒｇｅ  ＆  Ｈｅｒｉｎｇａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：８７１−８７９、２００２、を参照）、人工リンカー、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同じである。他の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は異なる。
【０３３４】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、立体構造の柔軟性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜２５のグリシン残基、５〜２０のグリシン残基、５〜１５のグリシン残基または８〜１２のグリシン残基を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５０％のグリシン残基、少なくとも７５％のグリシン残基、少なくとも８０％のグリシン残基、または少なくとも８５％のグリシン残基を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、グリシン残基のみを含む。特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｘアミノ酸配列を含み、ｘは正の整数である。別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ａ）ｘ配列を含み、ｘは正の整数である。別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｔ）ｘ配列を含み、ｘは正の整数である。さらに別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ａ−Ｍ−Ａ−Ｓ）ｘ配列を含み、ｘは、正の整数である。
【０３３５】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、本質的に構造不定の天然または人工ポリペプチドである（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０、２００９、を参照；また、Ｓｉｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３、２００７、も参照のこと）。
【０３３６】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列中に１つまたは複数のプロリンアミノ酸残基を含むことにより、ポリペプチドリンカーの立体構造の柔軟性が制限される。従って、本発明の別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも１つのプロリン残基を含むことができる。例えば、ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列を有し、そのアミノ酸残基の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、は、プロリン残基である。本発明の一特定実施形態では、ポリペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。
【０３３７】
一部の実施形態では、アルファらせん形成リンカー、例えば、Ａｌａ−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ）ｎ−Ａｌａ直鎖リンカー（ｎ＝２〜５）（例えば、Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１４：５２９−５３２、２００１、を参照）、またはアルファらせんバンドルリンカー（例えば、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：１４７−１５２、１９９７、を参照）を使用可能である。他の実施形態では、Ｓｅｒリッチリンカー、例えば、（Ｓｅｒ４−Ｇｌｙ）ｎ（ｎ＞１）または（Ｘ４−Ｇｌｙ）ｎ（２つまでのＸはＴｈｒで、残りのＸはＳｅｒであり、ｎ＞１である）（米国特許第５、５２５、４９１号参照）を使用可能である。他の実施形態では、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｎ、またはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒリンカーが使われる。
【０３３８】
ペプチドリンカーは、非ポリペプチド成分に結合させる基を含むアミノ酸残基が導入されるように修飾可能である。そのようなアミノ酸残基の例は、システイン残基であってよく（非ポリペプチド成分が、その後、それに対し結合される）、またはアミノ酸配列がインビボＮ−グリコシル化部位を含んでもよい（それにより、糖成分（インビボで）をペプチドリンカーに結合させる）。さらなる選択肢は、進化したｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを使って、非天然アミノ酸をモノマードメインまたはリンカー中に遺伝的に組み込むことである（例えば、米国特許公開第２００３／００８２５７５号参照）。例えば、ケトチロシンの挿入は、発現モノマードメインまたは多量体に対する部位特異的カップリングを可能にする。
【０３３９】
一部の実施形態では、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は同じである。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なる。
【０３４０】
足場の標識または複合
本発明の足場は、非複合型で用いられてもよいし、あるいは、標的検出を容易にするために、または画像化もしくは治療のために、種々の異種部分のうちの少なくとも１つに対して複合されてもよい。足場は、精製が行われるとき、精製の前にまたは後のいずれに標識されてもまたは複合されてもよい。
【０３４１】
多くの異種部分は、本発明の足場が連結され得る適切な官能基を欠く。従って、いくつかの実施形態では、エフェクター分子が、リンカーを通じて足場に結合され、ここでこのリンカーは、複合体のための反応性基を含む。いくつかの実施形態では、本発明の足場に対して複合された異種部分は、リンカーとして機能し得る。他の実施形態では、この部分は、切断可能または切断不能であり得るリンカーを介して足場に複合される。一実施形態では、切断可能な連結分子は、酸化還元切断可能連結分子であり、その結果その連結分子は、細胞質および他の領域と遊離スルフヒドリル基を有する高濃度の分子のような、より低い酸化還元電位で、環境中で切断可能である。酸化還元電位における変化に起因して切断され得る連結分子の例としては、ジスルフィドを含有する分子が挙げられる。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、本発明の足場は、複合体のための反応性基を得るように操作される。このような足場では、Ｎ末端および／またはＣ末端はまた、複合のための反応性基を提供するように機能し得る。他の実施形態では、Ｎ末端は、１つの部分（例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ）に複合され得るが、Ｃ末端は、別の部分（例えば、限定されるものではないが、ビオチン）に複合され、または逆もまた真である。
【０３４３】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、ここでカップリング剤、カップリングまたは活性化部分を有する場合と有さない場合がある（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジンまたはマレイミド部分）。「ＰＥＧ」という用語は、５００〜１５０，０００Ｄａの間の分子量のポリエチレングリコール（その類似体を含む）を意図し、そこで、例えば、末端のＯＨ基が、メトキシ基（ｍＰＥＧと呼ばれる）で置換されている。
【０３４４】
本発明の足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化され得る。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド反復ユニットの直線の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトンにおよぶそれらの分子量によって分類される。特定の実施形態では、使用されるＰＥＧは、５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンにおよぶ分子量を有する。本発明の足場に結合されるＰＥＧ類は、分岐されてもまたは未分岐であってもよい（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら、１９９５  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ６：６２−６９を参照のこと）。ＰＥＧ類は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．および他の会社から市販される。このようなＰＥＧ類としては限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシナート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシナート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が挙げられる。
【０３４５】
簡潔に述べると、使用される親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧは、メトキシ基またはエトキシ基のような非反応性の基によって末端でキャップされる。その後、ポリマーは、適切な活性化剤、例えば、ハロゲン化シアヌル（例えば、塩化シアヌル、臭化シアヌルまたはフッ化シアヌル）、カルボニルジイミダゾール、無水物試薬（例えば、ジハロコハク酸無水物、例えば、ジブロモコハク酸無水物）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンゾイルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などとの反応によってその末端で活性化される。この活性化ポリマーは次いで、本明細書に記載のようなポリペプチドと反応されて、ポリマーで誘導体化されたペプチドが生成される。あるいは、本発明の足場中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化されてもよく、または２つの基は、公知のカップリング方法を用いて共同カップリング反応で連結されてもよい。本発明のポリペプチドは、当業者に公知であってかつ用いられる無数の他の反応スキームを用いてＰＥＧで誘導体化され得る。
【０３４６】
他の実施形態では、本発明の足場、その類似体または誘導体は、診断剤または検出剤に複合され得る。このような足場は、臨床試験手順の一部として疾患の発生または進行をモニタリングまたは診断するために、例えば、特定の治療の有効性を決定するために有用であり得る。このような診断および検出は、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む検出可能物質；補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン；発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルミノール；生物発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射性物質、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、ガドリニウム（１５９Ｇｄ、１５３Ｇｄ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、ランタン（１４０Ｌａ）、イッテルビウム（１７５Ｙｂ、１６９Ｙｂ）、ホリミウム（１６６Ｈｏ）、イッテリウム（９０Ｙ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、プラセオジウム（１４２Ｐｒ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、コバルト（５７Ｃｏ）、亜鉛（６５Ｚｎ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、リン（３２Ｐ）、クロム（５１Ｃｒ）、マンガン（５４Ｍｎ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、スズ（１１３Ｓｎ）、およびインジウム（１１７Ｉｎ）；陽電子放出金属（ポジトロン放出断層撮影を用いる）、非放射性常磁性金属イオン、および特定の放射性同位体に対して放射線標識または複合される分子を含む検出可能な物質対して足場をカップリングすることによって達成され得る。
【０３４７】
本発明はさらに、治療部分に複合させた足場の使用を包含する。足場は、細胞毒素（例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えばα線放射体）などの治療部分に複合されてもよい。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞にとって有害である任意の因子が挙げられる。治療部分としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびルムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（従来名はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（従来名はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、オーリスタチン分子（例えば、オーリスタチンＰＨＥ、ブリオスタチン１、およびソラスタチン（ｓｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０；Ｗｏｙｋｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：３８０２−８（２００２）、Ｗｏｙｋｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３５８０−４（２００１）、Ｍｏｈａｍｍａｄら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １２：７３５−４０（２００１）、Ｗａｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６６：７６−８０（１９９９）、Ｍｏｈａｍｍａｄら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３６７−７２（１９９９）（それらは全て、参照により本明細書に組み入れられるものとする）を参照のこと）、ホルモン（例えば、グルココルチコイド、プロゲステロン、アンドロゲンおよびエストロゲン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（例えば、エトポシドまたはトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、化合物ＳＴ１５７１、メシル酸イマチニブ（Ｋａｎｔａｒｊｉａｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８（７）：２１６７−７６（２００２））、細胞傷害剤（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体）、ならびに、米国特許第６，２４５，７５９号、同第６，３９９，６３３号、同第６，３８３，７９０号、同第６，３３５，１５６号、同第６，２７１，２４２号、同第６，２４２，１９６号、同第６，２１８，４１０号、同第６，２１８，３７２号、同第６，０５７，３００号、同第６，０３４，０５３号、同第５，９８５，８７７号、同第５，９５８，７６９号、同第５，９２５，３７６号、同第５，９２２，８４４号、同第５，９１１，９９５号、同第５，８７２，２２３号、同第５，８６３，９０４号、同第５，８４０，７４５号、同第５，７２８，８６８号、同第５，６４８，２３９号、同第５，５８７，４５９号に開示される化合物；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｒ１１５７７７、ＢＭＳ−２１４６６２、および、例えば米国特許第６，４５８，９３５号、同第６，４５１，８１２号、同第６，４４０，９７４号、同第６，４３６，９６０号、同第６，４３２，９５９号、同第６，４２０，３８７号、同第６，４１４，１４５号、同第６，４１０，５４１号、同第６，４１０，５３９号、同第６，４０３，５８１号、同第６，３９９，６１５号、同第６，３８７，９０５号、同第６，３７２，７４７号、同第６，３６９，０３４号、同第６，３６２，１８８号、同第６，３４２，７６５号、同第６，３４２，４８７号、同第６，３００，５０１号、同第６，２６８，３６３号、同第６，２６５，４２２号、同第６，２４８，７５６号、同第６，２３９，１４０号、同第６，２３２，３３８号、同第６，２２８，８６５号、同第６，２２８，８５６号、同第６，２２５，３２２号、同第６，２１８，４０６号、同第６，２１１，１９３号、同第６，１８７，７８６号、同第６，１６９，０９６号、同第６，１５９，９８４号、同第６，１４３，７６６号、同第６，１３３，３０３号、同第６，１２７，３６６号、同第６，１２４，４６５号、同第６，１２４，２９５号、同第６，１０３，７２３号、同第６，０９３，７３７号、同第６，０９０，９４８号、同第６，０８０，８７０号、同第６，０７７，８５３号、同第６，０７１，９３５号、同第６，０６６，７３８号、同第６，０６３，９３０号、同第６，０５４，４６６号、同第６，０５１，５８２号、同第６，０５１，５７４号および同第６，０４０，３０５号に開示されるもの）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン；イリノテカン；ＳＮ−３８；トポテカン；９−アミノカンプトテシン；ＧＧ−２１１（ＧＩ  １４７２１１）；ＤＸ−８９５１ｆ；ＩＳＴ−６２２；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；ＸＲ−５０００；サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）；ＵＣＥ６；ＵＣＥ１０２２；ＴＡＮ−１５１８Ａ；ＴＡＮ−１５１８Ｂ；ＫＴ６００６；ＫＴ６５２８；ＥＤ−１１０；ＮＢ−５０６；ＥＤ−１１０；ＮＢ−５０６；およびレベッカマイシン）；ブルガレイン（ｂｕｌｇａｒｅｉｎ）；Ｈｏｅｓｃｈｔ色素３３３４２およびＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８などのＤＮＡマイナーグルーブ結合物質；ニチジン（ｎｉｔｉｄｉｎｅ）；ファガロニン（ｆａｇａｒｏｎｉｎｅ）；エピベルベリン；コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）；β−ラパコン；ＢＣ−４−１；ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体およびプロドラッグ（例えば、Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ８：８３７−８５５（１９９７）；およびＭｏｒｅａｕ，Ｐ．，ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：１６３１−１６４０（��９９８）を参照のこと）、ビホスホネート（例えば、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート（ｏｌｐａｎｄｒｏｎａｔｅ）、リセドロネート、ピリドロネート（ｐｉｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、ゾレンドロネート）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、スタチン（例えば、ロバスタチン、シムバスタチン、アトロバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（商標））、プラバスタチン、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（商標））、セリバスタチンおよびアトロバスタチン）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２７７，８３２号、第５，９９８，５９６号、第５，８８５，８３４号、第５，７３４，０３３号および第５，６１８，７０９号に開示されるもの）、免疫調整物質（例えば、抗体およびサイトカイン）、抗体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、リン酸フルダラビンおよび２−クロロデオキシアデノシン）。
【０３４８】
さらに、足場は、所与の生物学的応答を改変させる治療部分または薬物成分と複合させることができる。治療部分および薬物成分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、酵素、抗体、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、コレラ毒素もしくはジフテリア毒素）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ）、インターフェロン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン）、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス誘発剤（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７−１５７４）およびＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと）、血栓症剤（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）もしくは抗血管新生剤（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンもしくは凝集経路の成分（例えば、組織因子）；または生物学的応答調節物質、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」）；または凝集剤、例えば、カルシウム、ビタミンＫ、組織因子（例えば、限定するものではないが、ハーゲマン（Ｈａｇｅｍａｎ）因子（第ＸＩＩ因子）、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、凝集タンパク質−ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質、フィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖由来のフィブリノペプチドＡおよびＢ、フィブリンモノマー）を挙げることができる。
【０３４９】
さらに、足場は、α線放射体（例えば２１３Ｂｉ）などの放射性金属イオンのような治療部分に、または放射性金属イオン（限定されるものではないが、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍなどを含む）をポリペプチドと複合させるのに有用な大環状キレート剤に複合させてもよい。特定の実施形態では、その大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これはリンカー分子を介して足場に結合させることができる。そのようなリンカー分子は当該分野で一般に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（それぞれ、参照によりそれらの全体が援用される）に記載されている。
【０３５０】
治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐ．ｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）のＡｒｎｏｎら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐ．ｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐ．ｐ．４７５−５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐ．ｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；およびＴｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８に記載されている。同様のアプローチが本発明の足場での使用について適合され得る。
【０３５１】
本発明の足場に複合される治療部分または薬物は、対象の特定の障害に対して所望の予防効果または治療効果を達成するように選択すべきである。医師または他の医療従事者は、足場に複合させようとする治療部分または薬物を決定する際に、以下を考慮すべきである：疾患の性質、疾患の重症度、および対象の状態。
【０３５２】
足場のアッセイ
本発明の足場は、当該分野で公知の任意の方法によって標的に対する特異的な結合についてアッセイされ得る。用いられ得る代表的なアッセイとしては限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイのような技術を用いる、競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは、当技術分野で通常行われ、かつ公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０３５３】
抗原に対する足場の結合親和性および他の結合特性は、当該技術分野において公知の種々のインビトロアッセイ法によって決定することができ、これには、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、および他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）が挙げられる。これらのおよび他の方法では、色素生産、蛍光、発光、または同位体標識が含まれるが、これらに限定されない、検査されている１つ以上の成分に対する標識を利用し、および／または種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論についての詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，編集，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本発明の足場は、特定の反応速度で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、１×１０−２Ｍ、１×１０−３Ｍ、１×１０−４Ｍ、１×１０−５Ｍ、１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、または１×１０−１５Ｍ未満という解離定数すなわちＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有し得る。特定の実施形態では、本発明の足場は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（登録商標）によって、または当該分野で公知の他のアッセイによって決定して、５００μＭ、１００μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、またはそれより小さいＫｄを有する。
【０３５５】
別の実施形態では、本発明の親和性は、会合定数（Ｋａ）を単位として記載され、この定数は、少なくとも１×１０２Ｍ−１、１×１０３Ｍ−１、１×１０４Ｍ−１、１×１０５Ｍ−１、１×１０６Ｍ−１、１×１０７Ｍ−１、１×１０８Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１  １×１０１１Ｍ−１  １×１０１２Ｍ−１、１×１０１３Ｍ−１、１×１０１４Ｍ−１、１×１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×ｌ０１５Ｍ−１というｋｏｎ／ｋｏｆｆ比として算出される。
【０３５６】
ある特定の実施形態では、本発明の足場が、標的エピトープから解離する速度が、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１、または１０−１０ｓ−１未満というｋｏｆｆを有する。
【０３５７】
ある特定の他の実施形態では、本発明の足場が標的エピトープと会合する速度が、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。この場合、本発明の足場は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１というｋｏｎ速度で標的に結合する。
【０３５８】
本発明の足場はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合され得る。このような固体支持体としては限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０３５９】
可溶性の分泌されたポリペプチドを検出するためのアッセイ
特定の実施形態では、本発明は、培養培地で分泌される可溶性組み換えポリペプチドを検出するための改善されたＥＬＩＳＡ法を提供する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、組み換えＦｎＩＩＩ型変異体である。一実施形態では、可溶性の組み換えフィブロネクチンＩＩＩ型変異体を検出するための方法は以下を包含する：
（ａ）発現されたポリペプチドを含有する培養培地と、ポリペプチドに結合する固定化された抗体とを反応させることと、
（ｂ）ポリペプチドと酵素に複合された標的とを結合に関して安定な条件下で反応させることと、
（ｃ）結合した複合標的をシグナルが生成される基質に対して反応させることと、
（ｄ）シグナル強度を測定することと。
【０３６０】
別の実施形態では、この方法は以下を包含する：
（ａ）発現された変異体を含む培養培地と、変異体に結合する抗体とを反応させることであって、ここでこの抗体は固体支持体に固定されていることと；
（ｂ）この固定された支持体を緩衝液で洗浄することと；
（ｃ）この変異体と、結合対の第一の成員に複合された標的とを反応させることと；
（ｄ）固定された支持体を緩衝液で洗浄することと；
（ｅ）この第一の成員と結合対の第二の成員とを反応させることであって、ここでこの第二の成員が酵素に複合されることと；
（ｆ）上記酵素と基質とを反応させることであって、ここでシグナルが生じることと；
（ｇ）このシグナルの強度を測定することであって、ここでシグナル強度が結合親和性と関連することと。一実施形態では、この方法は、分泌されたポリペプチドまたは分泌された変異体を粗培養培地中で検出することを包含する。
【０３６１】
特定の実施形態では、この方法は、粗培養培地中で分泌されたポリペプチドまたは分泌された変異体を検出することを包含する。特定の実施形態では、シグナル強度は、４０％未満まで、３０％未満まで、２０％未満まで、または１９％未満まで変化する。
【０３６２】
一実施形態では、ＥＬＩＳＡ法は、少なくとも９６ウェルのアッセイプレートを用いて、ハイスループットまたは超ハイスループットの形式で行う。特定的な実施形態では、３８４ウェルのアッセイプレートまたは１５３６ウェルアッセイプレートを用いる。
【０３６３】
別の実施形態では、この方法は、限定されるものではないが、以下を含む、異種アミノ酸配列を含む変異体を検出する：ポリ（ｈｉｓ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｍｙｃタグ、またはＶ５タグ。
【０３６４】
さらに別の実施形態では、結合対の第一の成員は、ビオチンであり、結合対の第二の成員はストレプトアビジンまたはアビジンである。
【０３６５】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、限定されるものではないが、薬学的に許容される担体と一緒に処方された、本発明の足場または多量体足場の１つまたは組み合わせを含んでいる医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、限定されるものではないが、本発明の２つ以上の異なる足場のうちの１つまたは組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する足場の組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明の多量体足場を含む。
【０３６６】
本発明の医薬組成物はまた、他の薬剤との組合せなどの併用療法において投与してもよい。例えば、併用療法は、免疫療法、化学療法、放射線治療、または薬物療法であってよい、少なくとも１つの他の療法と組合わせた本発明の足場を含んでもよい。
【０３６７】
本発明の医薬化合物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などのような非毒性の無機酸から誘導されるもの、ならびに脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性の有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属から誘導されるもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
【０３６８】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、酪酸ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、酪酸ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガラート、α−トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤；ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。
【０３６９】
本発明の医薬組成物中で使用され得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散物の場合、必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持してもよい。
【０３７０】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の防止を、滅菌手順によって、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によって両方で確保することができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を前記組成物中に含有させることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬製剤の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によりもたらしてもよい。
【０３７１】
医薬組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で滅菌され、かつ安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度にとって好適な他の秩序構造として処方してもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合、必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持してもよい。多くの場合、前記組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含有させるのが好適であろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、この組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。
【０３７２】
滅菌注射可能溶液を、好適な溶媒中の必要な量の活性化合物を、上記に列挙された成分の１つまたは組合せと混合した後、必要に応じて、滅菌微小濾過することにより調製することができる。一般的には、分散物を、基本的な分散媒体および上記に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を包含させることにより調製する。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末と、任意のさらなる所望の成分とをもたらす減圧乾燥および凍結−乾燥（凍結乾燥）である。
【０３７３】
一実施形態においては、本発明の組成物（例えば、液体処方物）は、内毒素および／または関連する発熱物質を実質的に含まない無発熱処方物である。内毒素としては、微生物内に限定され、微生物が破壊されるか、または死んだ場合に放出される毒素が挙げられる。発熱物質としては、細菌および他の微生物の外膜に由来する熱誘導性温度安定性物質（糖タンパク質）も挙げられる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与した場合、発熱、低血圧およびショックを引き起こすことがある。可能性のある有害な効果に起因して、静脈内投与された薬剤溶液から、少量の内毒素でも除去するのが有利である。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬剤適用のために、１時間に体重１キログラムあたり、１用量あたり５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療タンパク質を、体重１キログラムあたり、数百〜数千ミリグラムの量で投与する場合、微量の内毒素でも除去するのが有利である。一実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。別の実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、または約５ＥＵ／ｍｇ未満、または約１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０３７４】
薬学的な用法および用量
本発明の足場を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、足場を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。治療剤および診断剤の処方物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態で、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより調製してもよい（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，およびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓら（編）、（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）、（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）、（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０３７５】
治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清もしくは組織回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、生体マトリックス中の標的細胞の接近性などのいくつかの要因に依存する。ある特定の実施形態においては、投与計画は、許容し得るレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の量は、部分的には、特定の実体および治療される症状の重篤度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の好適な用量を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照のこと）。
【０３７６】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響することが当該分野で公知であるかもしくは疑われるか、または処置に影響すると予測される、パラメーターまたは要因を用いて、医師が行う。一般的には、用量は最適用量をいくらか下回る量で始まり、その後、任意の負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで、用量を少しずつ増加させる。重要な診断尺度としては、例えば、炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの症状の尺度が挙げられる。
【０３７７】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を取得するために変化させてもよい。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と共に用いられる他の薬剤、化合物および／もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康および以前の病歴、ならびに医学界で周知の同様の要因などの様々な薬物動態要因に依存するであろう。
【０３７８】
本発明の足場は、連続注入により、または例えば、１日、１週間、もしくは週に１〜７回の間隔の用量により提供してもよい。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、鼻内、直腸内、筋肉内、脳内的に、または吸入により提供してもよい。特定的な１つの用量プロトコールとは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むプロトコールである。合計週用量は、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇであってよい（例えば、Ｙａｎｇら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照のこと）。低分子治療剤、例えば、ペプチド模倣物質、タンパク質足場、天然生成物、または有機化合物の望ましい用量は、体重に基づいてモル／ｋｇとして、抗体またはポリペプチドとほぼ同じである。
【０３７９】
低分子または足場治療剤の望ましい血漿濃度は、体重に基づいてモル／ｋｇとして、抗体とほぼ同じである。この用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであってよい。対象に投与される用量の回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上であってよい。
【０３８０】
本発明の足場については、患者に投与される用量は、患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。用量は、患者の体重１ｋｇあたり、０．０００１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｍｇ、０．０００１〜２ｍｇ、０．０００１〜１ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．７５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．２５ｍｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ、０．００１〜０．５ｍｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇであってもよい。
【０３８１】
本発明の足場の用量は、キログラム（ｋｇ）で表した患者の体重に、ｍｇ／ｋｇで表した投与される用量をかけたものを用いて算出してもよい。本発明の足場の用量は、患者の体重１ｋｇあたり、１５０μｇ以下、１２５μｇ以下、１００μｇ以下、９５μｇ以下、９０μｇ以下、８５μｇ以下、８０μｇ以下、７５μｇ以下、７０μｇ以下、６５μｇ以下、６０μｇ以下、５５μｇ以下、５０μｇ以下、４５μｇ以下、４０μｇ以下、３５μｇ以下、３０μｇ以下、２５μｇ以下、２０μｇ以下、１５μｇ以下、１０μｇ以下、５μｇ以下、２．５μｇ以下、２μｇ以下、１．５μｇ以下、１μｇ以下、０．５μｇ以下、または０．５μｇ以下であってもよい。
【０３８２】
本発明の足場の単位用量は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇであってもよい。
【０３８３】
本発明の足場の用量は、対象中で少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成してもよい。あるいは、本発明の足場の用量は、対象中で少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成してもよい。
【０３８４】
本発明の足場の用量を反復してもよく、投与を少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月、または少なくとも６ヶ月離してもよい。
【０３８５】
特定の患者のための有効量は、処置する状態、患者の全体の健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤度などの要因に応じて変化してもよい（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照のこと）。
【０３８６】
本発明の組成物はまた、当該分野で公知の種々の方法のうちの１つ以上を用いて１つ以上の投与経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および／または方式は、所望の結果に依存して変化する。本発明の足場についての選択される投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、脳内、眼内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入、または持続放出系もしくはインプラントが挙げられる（例えば、Ｓｉｄｍａｎら（１９８３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６；Ｌａｎｇｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ（１９８２）Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５；Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４；米国特許第６，３５０４６６号および第６，３１６，０２４号を参照のこと）。あるいは、本発明の組成物は、非経口投与を介して、例えば、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、経鼻的、口腔内、経膣的、直腸的、舌下または局所的に投与されてもよい。必要に応じて、この組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む処方物の使用による、肺投与を使用してもよい。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号、および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６、およびＷＯ９９／６６９０３（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照のこと。一実施形態においては、本発明の抗体、併用療法、または組成物を、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（商標）肺薬剤送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を用いて投与する。
【０３８７】
本発明の足場を制御放出系または持続放出系で投与する場合、ポンプを用いて制御放出または持続放出を達成してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５、１９８２；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５１Ａを参照のこと）。ポリマー材料を用いて、本発明の治療剤の制御放出または持続放出を達成してもよい（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；また、Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７  １：１０５も参照のこと）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３も参照のこと。
【０３８８】
持続放出処方物中で用いられるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニル酢酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態においては、持続放出処方物中で用いられるポリマーは、不活性であり、滲出し得る不純物を含まず、保存の際に安定であり、無菌性であり、生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに置いて、このようにして、ほんの少量の全身用量が必要となるようにしてもよい（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上掲、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。
【０３８９】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説において考察されている。当業者には公知の任意の技術を用いて、本発明の１種以上の足場を含む持続放出処方物を製造することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４、ならびにＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。
【０３９０】
本発明の足場を局所投与のために、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者には周知の他の形態で処方してもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）を参照のこと。噴霧不可能な局所剤形については、局所適用と適合する担体もしくは１種以上の賦形剤を含み、いくつかの例においては、水より高い力学的粘性を有する、粘性から半固体もしくは固体の形態を典型的には使用する。好適な処方物としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば、浸透圧などの様々な特性に影響させるための補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、もしくは塩）と混合される溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、粉末、塗布剤、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、活性成分を、いくつかの例においては、固体または液体の不活性担体と共に、加圧された揮発性物質（例えば、フロンなどの気体推進剤）との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填した噴霧可能なエアロゾル調製物が挙げられる。必要に応じて、湿潤剤または保湿剤を、医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加成分の例は、当該分野で周知である。
【０３９１】
本発明の足場を鼻内投与する場合、それをエアロゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で処方してもよい。特に、本発明に従う使用のための予防剤または治療剤を、好適な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）の使用と共に、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー提供物の形態で都合良く送達してもよい。加圧エアロゾルの場合、投与単位を、一定量を送達するための弁を設けることにより決定してもよい。化合物の粉末混合物とラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤とを含む、吸入器または通気器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を処方してもよい。
【０３９２】
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射性物質との同時投与または治療のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（編）、（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．を参照のこと）。
【０３９３】
有効量の治療剤は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％まで症状を低減し得る。
【０３９４】
本発明の足場と共に投与してもよいさらなる療法（例えば、予防剤または治療剤）を、対象に同時に投与してもよい。「同時に」という用語は、正確に同時的な療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定されず、むしろ本発明の足場を含む医薬組成物を、順次に、および本発明の足場が他の療法（単数または複数）と一緒に作用して、それらを別の方法で投与した場合よりも増加した利益を提供し得るような間隔内で対象に投与することを意味する。例えば、それぞれの療法を、同時に、または異なる時点で任意の順序で順次に対象に投与してもよい；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い間隔で投与して、所望の治療効果または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の好適な形態で、および任意の好適な経路により、別々に対象に投与してもよい。様々な実施形態においては、療法（例えば、予防剤または治療剤）を、１５分未満、３０分未満、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１〜２時間空けて、約２〜３時間空けて、約３〜４時間空けて、約４〜５時間空けて、約５〜６時間空けて、約６〜７時間空けて、約７〜８時間空けて、約８〜９時間空けて、約９〜１０時間空けて、約１０〜１１時間空けて、約１１〜１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて対象に投与する。２種以上の療法を、１回の同じ患者訪問内で投与してもよい。
【０３９５】
本発明の足場および他の療法を、周期的に投与してもよい。周期的療法は、一定の期間、第１の療法（例えば、第１の予防剤もしくは治療剤）を投与した後、一定の期間、第２の療法（例えば、第２の予防剤もしくは治療剤）を投与し、必要に応じて、一定の期間、第３の療法（例えば、予防剤もしくは治療剤）などを投与し、この順次投与、すなわち、サイクルを繰り返して、療法の１つに対する耐性の発生を低下させ、療法の１つの副作用を回避するか、もしくは低下させ、および／または療法の効力を改善することを包含する。
【０３９６】
ある特定の実施形態においては、本発明の足場を、インビボでの適切な分布を確保するように処方してもよい。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを通過する（それが所望される場合）ことを確保するために、それらを例えば、リポソーム中で処方してもよい。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１個以上の部分を含み、かくして、標的化された薬剤送達を増強してもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。標的化部分の例としては、葉酸もしくはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられる；また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照のこと。
【０３９７】
併用療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与してもよい。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中で対象に同時に投与してもよい。予防剤または治療剤は、同じ投与経路によって対象に投与してもよいし、または異なる投与経路によって対象に投与してもよい。
【０３９８】
足場の使用方法
本発明の足場は、インビトロまたはインビボにおいて、診断上および治療上の有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエキソビボで、または対象中に、例えば、インビボで投与して、様々な障害を治療、予防または診断してもよい。
【０３９９】
本発明はまた、本発明の足場を用いる方法も提供する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染性疾患などの疾患、疾患の障害または障害に関連する１つ以上の症状の予防、診断、管理、処置または改善のための本発明の足場の使用を包含する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染性疾患を含む、疾患、障害または感染に関連する１つ以上の症状の予防、管理、処置または改善のための部分（例えば、治療剤または薬物）と複合されるかまたは融合された本発明の足場の使用も包含する。
【０４００】
また、多くの細胞表面受容体は、サブユニットの交差結合の結果として活性化または不活性化する。本発明のタンパク質を用いて、細胞表面受容体の交差結合によって標的細胞中での応答を刺激または阻害してもよい。別の実施形態においては、本発明の本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を遮断してもよい。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を強化してもよい。別の実施形態においては、同じ抗原に対する特異性を共有するか、または２個の異なる抗原に結合する結合ドメインを含んでいる本発明の足場を用いて、細胞表面受容体のホモまたはヘテロ二量体を架橋することが可能な場合がある。別の実施形態においては、本発明のタンパク質を用いて、特定の細胞表面受容体にリガンド、またはリガンド類似体を送達してもよい。
【０４０１】
本発明はまた、伝統的な抗体では容易に達成されないエピトープを標的化する方法も提供する。例えば、一実施形態においては、本発明の足場を用いて、隣接する抗原を最初に標的してもよく、結合の間、別の結合ドメインが潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）抗原に関与してもよい。
【０４０２】
本発明はまた、異なる細胞型を一緒にするために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明のタンパク質は、１個の結合ドメインを有する標的細胞に結合し、別の結合ドメインを介して別の細胞を動員してもよい。別の実施形態においては、第１の細胞は癌細胞であり得、第２の細胞はＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞である。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、おそらく免疫応答を増進する、抗原提示細胞とＴ細胞のような２種の異なる細胞間の相互作用を強化してもよい。
【０４０３】
本発明はまた、癌またはその症状を改善、処置、または予防するために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳、または中枢神経系の癌の治療において有用である。
【０４０４】
本発明はまた、細胞集団を枯渇させるために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、以下の細胞型の枯渇において有用である：好酸球、好塩基球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、単球および腫瘍細胞。
【０４０５】
本発明はまた、サイトカインを不活性化、阻害または枯渇させるために足場を用いる方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、以下のサイトカインのうちの少なくとも１つのの不活性化、阻害または枯渇において有用である：ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｃ５ａ、ｆＭＬＰ、インターフェロンα（サブタイプ１、２ａ、２ｂ、４、４ｂ、５、６、７、８、１０、１４、１６、１７および２１）、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、インターロイキンＩＬ−１−３３、ＣＣＬ１−２８、ＣＸＣＬ１−１７、およびＣＸ３ＣＬ１．
【０４０６】
本発明はまた、ウイルス、真菌、真核微生物、および細菌などの様々な感染性因子を不活性化するために足場を用いる方法も提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を用いて、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ、またはインフルエンザウイルスを不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ナグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）またはチネア（Ｔｉｎｅａ）属の成員などの真菌の病原体を不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、およびエントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）属の成員などの真核微生物を不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ビブロ（Ｖｉｂｒｏ）およびナイセリア（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ）属の成員などの細菌病原体を不活性化してもよい。
【０４０７】
本発明はまた、診断試薬として足場タンパク質を用いる方法も提供する。本発明のタンパク質は、異なる抗原を同時に効率的に捕捉する必要があるキットまたは試薬において有用であり得る。
【０４０８】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的のために、例えば、限定されるものではないが、癌などの広範な種々の慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として有用である。本発明の方法に従って予防、管理、処置または改善され得る癌の例としては、限定されるものではないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が挙げられる。さらなる癌としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病および骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病、限定されるものではないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病；真性赤血球増加症；限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症；良性モノクローナル免疫グロブリン血症；重鎖疾患；骨の癌ならびに限定されるものではないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、真珠腫誘導性骨肉腫、骨のパジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫などの結合組織肉腫；限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；限定されるものではないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様性乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、パジェット病（若年性パジェット病を含む）および炎症性乳癌などの乳癌；限定されるものではないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌；限定されるものではないが、甲状腺乳頭癌もしくは濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；限定されるものではないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは島細胞腫瘍などの膵臓癌；限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症などの下垂体癌；限定されるものではないが、虹彩黒色腫、脈絡膜メラノーマ、および毛様体メラノーマ、および網膜芽細胞腫などの眼メラノーマなどの眼の癌；扁平上皮細胞癌、腺癌、およびメラノーマなどの膣癌；扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌などの頸部癌；限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質性腫瘍などの卵巣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌などの食道癌；限定されるものではないが、腺癌、菌状肉芽腫（ポリープ）性、潰瘍性、表在拡大型、びまん性、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；直腸癌；限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓癌、腺癌などの胆嚢癌；限定されるものではないが、乳頭状、結節性、および広範性などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、巨細胞癌および小細胞肺癌などの肺癌；限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）などの精巣癌；限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺癌；陰茎癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌などの口腔癌；基底細胞癌；限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌などの咽頭癌；限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌およびメラノーマ、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌；限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂および／もしくは尿管）などの腎臓癌；ウィルムス腫瘍；限定されるものではないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる（そのような障害に関する概説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＭｕｒｐｈｙら、１９９７，Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ，Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｉｎｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを参照のこと）。
【０４０９】
また、アポトーシスの異常により引き起こされる癌を本発明の方法および組成物により治療することもできることが企図される。そのような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を有する癌、乳腺、前立腺および卵巣のホルモン依存的腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症などの前癌病変、ならびに骨髄異形成症候群が挙げられる。
【０４１０】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的にとって、例えば、限定されるものではないが、自己免疫疾患および／または炎症性疾患などの、様々な慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として有用である。本明細書に記載の本発明の組成物および方法は、自己免疫障害および／または炎症性障害の予防または治療のために有用である。自己免疫障害および／または炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、抗リン脂質症候群、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アナフィラキシーショック、自己免疫アジソン病、円形脱毛症、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、角膜および他の組織の移植、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、円板状ループス、心内膜炎、内毒素性ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、血管腫、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型もしくは免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、血管新生緑内障、臓器虚血、尋常性天疱瘡、腹膜炎、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、再還流傷害、水晶体後部線維増殖症、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症、腐敗症、シェーグレン症候群、脊髄損傷、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、甲状腺過形成、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫が挙げられる。
【０４１１】
炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性のウイルスもしくは細菌感染の結果生じる慢性炎症が挙げられる。本発明の組成物および方法を、上記疾患を予防、管理または治療するのに用いられる１種以上の従来の療法と共に用いてもよい。
【０４１２】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的のために、例えば、限定されるものではないが、ウイルス、細菌および真菌の疾患を含む感染性疾患を含む、広範な慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として多くの目的について有用である。
【０４１３】
ウイルス病原体の例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス科（例えば、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、単純ヘルペスウイルス５、および単純ヘルペスウイルス６）、レビウイルス科（例えば、レビウイルス、腸内細菌相ＭＳ２、アロレウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、コルドポックスウイルス科、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モラシポックスウイルスおよびエントモポックスウイルス科）、パポバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、肺炎ウイルス科（例えば、肺炎ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）、およびメタニューモウイルス（例えば、トリ肺炎ウイルスおよびヒトメタニューモウイルス）、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えば、ヒトＡ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルスおよびアプトウイルス）、レオウイルス科（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、ファイトレオウイルスおよびオリザウイルス）、レトロウイルス科（例えば、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、トリＣ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルス群、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型およびヒト免疫不全ウイルス２型）、スプマウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）およびルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エファメロウイルス、サイトラブドウイルスおよびネクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピイウイルスおよびラッサ熱ウイルス）、ならびにコロナウイルス科（例えば、コロナウイルスおよびトロウイルス）が挙げられる。
【０４１４】
細菌病原体の例としては、限定されるものではないが以下が挙げられる：限定されるものではないが、アクアスピリルム科（Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾルピリルム科（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクテリア科（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、バルトネラ種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ブデロビブリオ科（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、クラミジア・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター・エロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エルウィニア種（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ハフニア種（Ｈａｆｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モルガネラ種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロテウス・バルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ガルジネラ科（Ｇａｒｄｉｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ハロバクテリウム科（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ヘリコバクター科（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎａｌｌａｃｅａｅ）、リステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、メチロコッカス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、オセアノスピリルム科（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ニューモコッカス種（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、スピリルム科（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スピロソマセア科（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａｃｅａｅ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓ）（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびパイロゲネスブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ））、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、腸炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ファシエ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｅ）および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、バンピロビブリオ（Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒｉｏ）、ヘリコバクター科（Ｈｅｌ���ｃｏｂａｃｔｅｒ）、ならびにバンピロビブリオ科（Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒｉｏ）。
【０４１５】
真菌の病原体の例としては、限定されるものではないが：アブシディア種（例えば、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）およびアブシディア・ラモサ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ））、アスペルギルス種（例えば、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ））、バシディオボールス・ラナルム（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｒａｎａｒｕｍ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ種（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ケル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｒｒ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・クイレルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｑｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、コニジオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）種、クリプトコッカス・ネオフォルムス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍｓ）、カニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）種、皮膚糸状菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、石膏状小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、ムコール・プシルス（Ｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シュードアレシェリア・ボイディ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ）、ライノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｅｂｅｒｉ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、クモノスカビ種（例えば、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・オリザ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびリゾプス・ミクロスポルス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、スポロトリクス・シェンキ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）ならびに接合菌（Ｚｙｇｏｒｎｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、不完全菌（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、および卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）などの分類が挙げられる。
【０４１６】
別の実施形態においては、本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその１つ以上の症状を予防、管理、処置または改善する方法であって、それを必要とする対象に、予防上または治療上有効用量の本発明の１種以上の足場を、外科手術と組合わせて、単独で、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物療法／免疫療法および／もしくは放射線療法の投与とさらに組合わせて投与することを含む上記方法を提供する。これらの実施形態に従えば、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその１つ以上の症状を予防、管理、処置または改善するのに利用される本発明の足場を、部分（例えば、治療剤もしくは薬剤）に複合させるか、または融合させてもさせなくてもよい。
【０４１７】
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその１つ以上の症状をまたは１つ以上の症状を予防、管理、処置または改善する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の１つ以上の足場を、癌治療剤ではない１種以上の治療剤（非癌治療剤とも言う）と組合わせて投与することを含む上記方法を提供する。そのような薬剤の例としては、限定されるものではないが、制吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤、例えば、抗生物質、抗炎症剤、および抗ウイルス剤が挙げられる。制吐剤の非限定例としては、メトピマジンおよびメトクロプラミドが挙げられる。抗真菌剤の非限定例としては、アゾール剤、イミダゾール、トリアゾール、ポリエン、アンホテリシンおよびリリミジンが挙げられる。抗細菌剤の非限定例としては、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、レファンピン、ポリミキシン、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ケトカナゾール、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンが挙げられる。抗ウイルス剤の非限定例としては、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスリジン、トリフルリジンおよびリバビリン）、フォスカレット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−α、βまたはγおよびＡＺＴが挙げられる。抗炎症剤の非限定例としては、非ステロイド系抗炎症剤（「ＮＳＡＩＤ」）、ステロイド系抗炎症剤、β−アゴニスト、抗コリン剤およびメチルキサンチンが挙げられる。
【０４１８】
別の実施形態においては、本発明は、癌細胞表現型を阻害し得る組成物を含む。一実施形態においては、癌細胞表現型は、細胞増殖、細胞接着、細胞接着の喪失、受容体発現の減少（例えば、限定されるものではないが、Ｅｐｈ受容体など）、受容体発現の増大（例えば、限定されるものではないが、Ｅｐｈ受容体）、転移能力、細胞周期阻害、受容体チロシンキナーゼ活性化／阻害などである。
【０４１９】
一実施形態においては、本発明は、慢性炎症を処置し得る組成物を含む。上記組成物は、破壊または脱活性化のための免疫細胞の標的化において用いられ得る。この組成物は、活性化Ｔ細胞、休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、または樹状細胞の標的化において有用である。上記組成物は、免疫細胞機能を低下または除去し得る場合もある。
【０４２０】
別の実施形態においては、本発明は、血管形成を阻害するか、または低下させることができる組成物を含む。別の実施形態においては、血管形成は、腫瘍増殖、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、シェーグレン症候群などに関連する。
【０４２１】
別の実施形態においては、本発明は、胃腸管の疾患の処置にとって有用な組成物を含む。本発明の足場は、低いｐＨ条件下で高レベルの安定性を示す。低いｐＨでの安定性によって、上記組成物が、過敏性腸症候群、胃食道逆流、腸偽閉塞、ダンピング症候群、難治性悪心、消化性潰瘍、虫垂炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、ヘリコバクターピロリ疾患、クローン病、ウイップル病、セリアック病、憩室炎、憩室症、嚥下障害、裂孔ヘルニア、感染性食道障害、しゃっくり、反芻などのような様々な胃腸障害のための経口投与にとって好適であることが示唆される。
【０４２２】
本発明はさらに、組み合わせ（併用、ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）の組成物および疾患またはその症状の予防、処置、軽減、または改善におけるそのような組成物の使用方法を提供する。本発明の足場を、疾患またはその症状の予防、処置、軽減または改善にとって好適な従来の療法と組合わせてもよい。例示的な従来の療法を、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２および第５７版、２００３）に見出すことができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を、化学療法、放射線療法、外科手術、生物剤（抗体もしくはペプチド）を用いる免疫療法、低分子、または当該分野で公知の別の療法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、組み合わせの両方は一緒に行われる。他の実施形態においては、組み合わせ療法を別々に投与する。
【０４２３】
本発明はまた、疾患を診断する方法も提供する。疾患と関連する特定の標的に結合する本発明の足場を、上記疾患を診断するために用いられる方法に組み入れることができる。一実施形態においては、本発明の足場を、対象における疾患を診断するための方法において用い、その方法は、該対象からサンプルを取得し、標的：足場相互作用を形成させる条件下でこのサンプル中で標的と足場とを接触させ、標的：足場複合体を特定し、それによってサンプル中の標的を検出することを含む。
【０４２４】
いくつかの実施形態においては、標的は疾患と関連する抗原である。別の実施形態においては、標的はサイトカイン、炎症メディエーター、および細胞内抗原、自己抗原、非自己抗原、核内抗原、細胞表面抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌の抗原である。他の実施形態においては、診断しようとする疾患は、本明細書に記載のものである。
【０４２５】
本発明はまた、特定の標的を画像化する方法も提供する。一実施形態においては、緑色蛍光タンパク質、他の蛍光タグ（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなど）、ビオチン、または放射性核種などの画像化剤に複合された本発明の足場を、特定の標的の存在、位置、または進行を画像化するための方法において用いてもよい。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、インビトロで行う。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、インビボで行う。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、ＭＲＩ、ＰＥＴ走査、Ｘ線、蛍光検出により、または当該分野で公知の他の検出方法により行う。
【０４２６】
本発明はまた、本発明の足場を用いて疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法も提供する。一実施形態においては、疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法を、本明細書に提供されるように、本発明の足場で画像化すること、診断すること、または化合物／標的と本発明の足場とを接触させる方法により達成する。
【０４２７】
キット
また、本発明の組成物（例えば、足場）と使用説明書とを備えるキットも、本発明の範囲内に含まれる。このキットはさらに、少なくとも１種の追加試薬、または１種以上の追加の本発明の足場を含んでもよい。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される用途を指示するラベルを含む。ラベル（標識）という用語は、キット上で、もしくはキットと共に供給されるか、またはさもなければキットに付随する、任意の文書、もしくは記録された資料を包含する。
【０４２８】
等価物
当業者であれば、日常的なものを超えない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【０４２９】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に援用されると示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用されるものとする。本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に援用される、２０１０年４月１３日出願の米国特許仮出願第６１／３２３，７０８号に対する優先権の恩典を請求する。さらに、２００８年１０月１０日に出願され、国際公開番号ＷＯ２００９／０５８３７９として公開された、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８号は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される。
【０４３０】
例示的実施形態
１．直列に接続された少なくとも２つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）足場を含む多量体足場であって、ここで各々のＦｎＩＩＩ足場は、標的に結合し、ここで各々のＦｎＩＩＩ足場が以下を含む：
Ｉ．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと命名された７つのβ鎖ドメイン；
ＩＩ．６つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される；
ここで各々のβ鎖は、目的のＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）の同族のβ鎖に対して少なくとも５０％の相同性を有し、かつ少なくとも１つのループは、ＦＯＩ中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつ
ここでこの標的に関する結合親和性および／または結合活性、ならびに／あるいは多量体足場の生物学的活性は、対応する単量体ＦｎＩＩＩ足場のものよりも改善される。
２．上記標的に対する結合親和性および／または結合活性が改善されている、実施形態１の多量体足場。
３．上記標的に対する結合親和性および／または結合活性、ならびに多量体足場の生物学的活性が改善されている、実施形態１の多量体足場。
４．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも５０％の相同性を有する。
５．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つのＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも６０％の相同性を有する。
６．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも７０％の相同性を有する。
７．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも８０％の相同性を有する。
８．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９０％の相同性を有する。
９．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）、１〜１５、３０〜４８または６３に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９５％の相同性を有する。
１０．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜１５、３０〜４８または６３のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９８％の相同性を有する。
１１．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも６０％の相同性を有する。
１２．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも７０％の相同性を有する。
１３．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも８０％の相同性を有する。
１４．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９０％の相同性を有する。
１５．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９５％の相同性を有する。
１６．実施形態１、２または３の多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場の各々のβ鎖が、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも９８％の相同性を有する。
１７．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場について、Ａβ鎖ドメインは、配列番号４１、４２、６１、６２、７６または７７を含み、Ｂβ鎖は、配列番号４３、６３、または７８を含み、Ｃβ鎖は、配列番号４４、６４、または７９を含み、Ｄβ鎖は、配列番号４６、６５、または８０を含み、Ｅβ鎖は、配列番号４７、６６、または８１を含み、Ｆβ鎖は、配列番号４８、６７、または８２を含み、かつＧβ鎖は、配列番号５２、６８、または８３を含む。 
１８．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで少なくとも２つの上記ＦｎＩＩＩ足場について、Ａβ鎖は、配列番号４１、４２、６１、６２、７６または７７を含み、Ｂβ鎖は、配列番号４３、６３、または７８を含み、Ｃβ鎖は、配列番号４４、６４、または７９を含み、Ｄβ鎖は、配列番号４６、６５、または８０を含み、Ｅβ鎖は、配列番号４７、６６、または８１を含み、Ｆβ鎖は、配列番号４８、６７、または８２を含み、Ｇβ鎖は、配列番号５２、６８、または８３を含む。
１９．実施形態１７または１８の多量体足場であって、ＡＢループは、配列番号３５、５５、または７０を含み、ＣＤループは、配列番号３７、５７、または７２を含み、かつＥＦループは配列番号３９、５９、または７４を含む。
２０．実施形態１７または１８の多量体足場であって、ＢＣループは、配列番号３６、５６、または７１を含み、ＤＥループは、配列番号３８、５８、または７３を含み、かつＦＧループは配列番号３９、５９、または７３を含む。
２１．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで少なくとも１つの上記ＦｎＩＩＩ足場について、Ａβ鎖ドメインは、配列番号４１または４２を含み、Ｂβ鎖は、配列番号４３を含み、Ｃβ鎖は、配列番号４５、または１３１を含み、Ｄβ鎖は、配列番号４６を含み、Ｅβ鎖は、配列番号４７を含み、Ｆβ鎖は、配列番号４９または５１を含み、かつＧβ鎖は、配列番号５２または５３を含む。
２２．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで少なくとも２つの上記ＦｎＩＩＩ足場について、Ａβ鎖は、配列番号４１または４２を含み、Ｂβ鎖は、配列番号４３を含み、Ｃβ鎖は、配列番号４５、または１３１を含み、Ｄβ鎖は、配列番号４６を含み、Ｅβ鎖は、配列番号４７を含み、Ｆβ鎖は、配列番号４９または５１を含み、かつＧβ鎖は、配列番号５２または５３を含む。
２３．配列番号１〜１６、２１または２２のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つは、以下のアミノ酸配列を含み：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはそれぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループに存在するアミノ酸残基を表しし、ここでＸ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつここでｎ＝２〜２６である。
２４．実施形態１〜１６、２１、２２または２３のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも２つは、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴを含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはそれぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループに存在するアミノ酸残基を表し、ここでＸ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつここでｎ＝２〜２６である。
２５．実施形態２１〜２４のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＡＢループは、配列番号３５を含み、上記ＣＤループは、配列番号３７を含み、かつ上記ＥＦループは配列番号３９を含む。
２６．実施形態２１〜２４のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＢＣループは、配列番号３６を含み、上記ＤＥループは、配列番号３８を含み、かつ上記ＦＧループは配列番号４０を含む。
２７．実施形態２１〜２５のいずれか１つの多量体足場であって、ここで（ＸＦＧ）ｎｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、または９である。
２８．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２７のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＢＣループは、以下の配列を含み：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ａ）は、プロリンまたはアラニンであり、かつここで（ｂ）は、アラニンまたはグリシンである。
２９．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２７のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＢＣループは、以下の配列を含み：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、かつここで（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。
３０．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２７のいずれか１つの多量体であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＢＣループは、以下の配列を含み：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ｄ）は、プロリン、グルタミン酸塩またはリジンを表し。ここで（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、かつここで（ｆ）はセリンまたはグリシンを表す。
３１．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２８〜３０のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＦＧループは、以下の配列を含み：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ａ）は、アスパラギン、トレオニン、またはリジンを表し、かつここで（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。
３２．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２８〜３０のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＦＧループは、以下の配列を含み：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ−Ｎ−Ｐ−Ａ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリジンを表し、かつここで（ｂ）は、セリンまたはグリシンを表す。
３３．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２８〜３０のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＦＧループは、Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｎ−Ｐ−Ａの配列を有する１１アミノ酸を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、かつここで（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリジンを表す。
３４．実施形態１〜１９、２１、２２、２３、２４、２５または２７〜３３のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＤＥループは、以下の配列を含み：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表す。
３５．実施形態１〜１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２６のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＡＢループは、以下の配列を含み：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここで（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
３６．実施形態１〜１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２６のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＡＢループは、以下の配列を含み：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸，ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここで（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
３７．実施形態１〜１８、２０、２１、２２、２３、２４、２６または３５〜３６のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＣＤループは、７、８または９残基を含み、ここでＣＤループ中の各々の残基は、無作為であり、かつここで各々の残基は、アスパラギン、アスパラギン酸，ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってもよい。
３８．実施形態１〜１８、２０、２１、２２、２３、２４、２６または３５〜３７のいずれか１つの多量体足場であり、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも１つのＥＦループは、配列Ｘ−ｂ−Ｌ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−ｃ−Ｘを有する８残基を含み、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸，ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ここで（ｂ）は、アスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグリシンを表し、かつここで（ｃ）は、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。
３９．前述の実施形態１〜３８のいずれか１つの多量体足場であって、ここで多量体足場が少なくとも３つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４０．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも４つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４１．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも５つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４２．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも６つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４３．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも７つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４４．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも８つのＦｎＩＩＩ足場を含む。
４５．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、８つを超えるＦｎＩＩＩ足場を含む。
４６．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場の少なくとも１つが、異種部分に融合される。
４７．実施形態４６の多量体足場であって、ここで上記異種部分が、以下からなる群より選択される：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞毒性剤、放射性核種、画像化剤、ビオチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体のＦｃ領域、抗体の軽鎖定常領域、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、トランスフェリン、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、核酸、組み換えポリペプチドポリマー、またはサイトカイン。
４８．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、上記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、イムノサイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である。
４９．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、受容体アンタゴニストである。
５０．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、標的と５００μＭ未満のＫＤで結合する。
５１．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、標的と１００μＭ未満のＫＤで結合する。
５２．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで２つ以上のＦｎＩＩＩ足場が同じ標的に同じエピトープで結合する。
５３．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、２つ以上のＦｎＩＩＩ足場が同一である。
５４．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、２つ以上のＦｎＩＩＩ足場が同一でない。
５５．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、同じ標的上の少なくとも２つの異なる非重複性エピトープで結合する。
５６．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで２つ以上のＦｎＩＩＩ足場が、同じ標的に非重複のエピトープで結合する。
５７．実施形態１〜５２のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場は、細胞表面上の標的分子の２つ以上のコピー上の同じエピトープに結合する。
５８．実施形態１〜５１、または５４のいずれか１つの多量体足場であって、ここで２つ以上のＦｎＩＩＩ足場が異なる標的に結合する。
５９．実施形態１〜５１、または５４のいずれか１つの多量体足場であって、ここで多量体足場が、少なくとも２つの異なる標的に結合する。
６０．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここでＦｎＩＩＩ足場のうちの少なくとも２つが、ペプチドリンカーによって直列で接続される。
６１．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、上記リンカーが、１〜約１０００アミノ酸を含む。
６２．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、１〜約５０アミノ酸を含む。
６３．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、１〜２５アミノ酸を含む。
６４．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、１〜１５アミノ酸を含む。
６５．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、１〜５アミノ酸を含む。
６６．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、可塑性ペプチドリンカーであり、これが少なくとも５０％グリシン残基を含んでいる。
６７．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカー配列は、以下からなる群の１つ以上の配列を含み：（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｘ、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｘ、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ａ）ｘ、（Ｇ−Ａ）ｘ、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｔ）ｘ、および（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ａ−Ｍ−Ａ−Ｓ）ｘ、ここでｘは、正の整数である。
６８．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、官能基である。
６９．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場であって、ここで少なくとも１つのＦｎＩＩＩ足場が、ＩｇＧドメインまたは全長のＩｇＧ軽鎖または重鎖に対して作動可能に連結される。
７０．実施形態６９の多量体足場であって、ここで上記ＩｇＧドメインは、以下からなる群より選択される：
Ｉ．Ｆｃ領域；
ＩＩ．ＣＨ１領域；
ＩＩＩ．ＣＨ２領域；
ＩＶ．ＣＨ３領域；
Ｖ．ヒンジ領域；
ＶＩ．Ｃカッパ領域；
ＶＩＩ．Ｃラムダ領域；
ＶＩＩＩ．ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域；および
ＩＸ．可変領域。
７１．前述の実施形態のいずれか１つの多量体足場をコードする単離された核酸分子。
７２．実施形態７１の核酸に対して作動可能に連結された発現ベクター。
７３．実施例７２のベクターを含んでいる宿主細胞。
７４．核酸分子によってコードされる多量体足場が発現される条件下で実施形態７３の宿主細胞を培養することを包含する、多量体足場を製作する方法。
７５．発現される多量体足場が培養培地中に分泌される、実施形態７４の方法。
７６．培養培地からタンパク質を得ることをさらに包含する、実施形態７５の方法。
７７．薬学的に許容される賦形剤中に実施形態１〜７０のいずれか１つの多量体足場を含んでいる組成物。
７８．実施形態７７の組成物の有効量を投与することを包含する、患者における癌の増殖を処置または阻害するための方法。
７９．実施形態７８の方法であって、上記癌が、以下からなる群より選択される：扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、または肝細胞癌。
８０．実施形態７７の組成物の有効量を投与することを包含する、患者において自己免疫障害、炎症性障害、または呼吸器感染を処置するための方法。
８１．上記呼吸器感染が、ウイルスまたは細菌によって生じる、実施形態８０の方法。
８２．前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスまたはヒトメタ肺炎ウイルスである実施形態８１の方法。
８３．実施形態８０の方法であって、上記炎症性障害は、ぜんそく、慢性のウイルスまたは細菌の感染から生じる慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患；脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、肺線維症、敗血性ショック、未分化関節症または未分化脊椎関節症である。
８４．実施形態８０の方法であって、前記自己免疫障害は、加齢性黄斑変性症、同種移植片拒絶、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アナフィラキシーショック、自己免疫アジソン病、円形脱毛症、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、角膜および他の組織の移植、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、円板状ループス、心内膜炎、内毒素性ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、血管腫、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型もしくは免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、血管新生緑内障、臓器虚血、尋常性天疱瘡、腹膜炎、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、再灌流傷害、水晶体後部線維増殖症、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、腐敗症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、シェーグレン症候群、脊髄損傷、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、甲状腺形成不全、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫などの血管炎である。
８５．多様なフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）足場のライブラリーであって以下を含み：
Ｉ．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのβ鎖ドメイン；
ＩＩ．６つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名され；
ここで各々のβ鎖は、目的のＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）の同族のβ鎖に対して少なくとも５０％の相同性を有し、かつ少なくとも１つのループは、ＦＯＩ中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつここでこのＦＧループは、ＦＯＩ中の同族のＦＧループよりも少なくとも１アミノ酸短い。
８６．多様なフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）足場のライブラリーであって以下を含む：
Ｉ．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのβ鎖ドメイン；
ＩＩ．６つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される；
ここで各々のβ鎖ドメインは、目的のＦｎＩＩＩドメイン（ＦＯＩ）の同族のβ鎖に対して少なくとも５０％の相同性を有し、かつ少なくとも１つのループは、ＦＯＩ中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつここでこのＦＧループは、９より多くないアミノ酸からなる。
８７．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも５０％の相同性を有する。
８８．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも６０％の相同性を有する。
８９．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の相同性を有する。
９０．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも８０％の相同性を有する。
９１．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９０％の相同性を有する。
９２．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで天然のＦｎＩＩＩドメインの各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９５％の相同性を有する。
９３．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９８％の相同性を有する。
９４．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも６０％の相同性を有する。
９５．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の相同性を有する。
９６．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも８０％の相同性を有する。
９７．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９０％の相同性を有する。
９８．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９５％の相同性を有する。
９９．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号１〜３４、５４、６９、または表１６（図１６）に示される配列のいずれかに対して少なくとも９８％の相同性を有する。
１００．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここでＡβ鎖ドメインが、配列番号４１、４２、６１、６２、７６または７７を含み、Ｂβ鎖が、配列番号４３、６３または７８を含み、Ｃβ鎖が、配列番号４４、６４、または７９を含み、Ｄβ鎖が、配列番号４６、６５または８０を含み、Ｅβ鎖が、配列番号４７、６６、または８１を含み、Ｆβ鎖が、配列番号４８、６７、または８２を含み、かつＧβ鎖が、配列番号５２、６８、または８３を含む。
１０１．実施形態１００のライブラリーであって、ＡＢループが配列番号３５、５５、または７０を含み、ＣＤループが配列番号３７、５７または７２を含み、かつＥＦループが配列番号３９、５９、または７４を含む。
１０２．実施形態１００のライブラリーであって、ＢＣループが配列番号３６、５６、または７１を含み、ＤＥループが配列番号３８、５８または７３を含み、かつＦＧループが配列番号４０、６０、または７５を含む。
１０３．実施形態８５または８６のライブラリーであって、Ａβ鎖ドメインが配列番号４１または４２を含み、Ｂβ鎖が配列番号４３を含み、Ｃβ鎖が配列番号４５または１３１を含み、Ｄβ鎖が配列番号４６を含み、Ｅβ鎖が配列番号４７を含み、Ｆβ鎖が配列番号４９または５１を含み、かつＧβ鎖が配列番号５２または５３を含む。［この実施形態はＴｎ３β鎖について配列番号を列挙する］
１０４．実施形態８５または８６のライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場が、以下のアミノ酸配列を含み：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループに存在するアミノ酸残基を表し、ここでＸ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、かつここでｎ＝３〜２６であり、かつｍ＝１〜９である。
１０５．実施形態１０３または１０４のライブラリーであって、ここで上記ＡＢループが配列番号３５を含み、上記ＣＤループが配列番号３７を含み、かつ上記ＥＦループが配列番号３９を含む。
１０６．実施形態１０３または１０４のライブラリーであって、ここで、上記ＢＣループがＢＣループが配列番号３６を含み、上記ＤＥループが配列番号３８を含み、かつ上記ＦＧループが配列番号４０を含む。
１０７．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＢＣループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ａ）は、プロリンまたはアラニンであり、かつここで（ｂ）は、アラニンまたはグリシンを表す。
１０８．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＢＣループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、かつここで（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。
１０９．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＢＣループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ｄ）は、プロリン、グルタミン酸塩またはリジンを表し、ここで（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、かつここで（ｆ）は、セリンまたはグリシンを表す。
１１０．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＦＧループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表す。
１１１．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＦＧループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、ここでＸは、任意のアミノ酸を表し、ここで（ａ）は、アスパラギン、トレオニン、またはリジンを表し、かつここで（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。
１１２．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０５のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＤＥループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘであり、ここでＸは、任意のアミノ酸を表す。
１１３．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０６のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＡＢループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸，ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここで（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
１１４．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０６のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＡＢループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａであり、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここで（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
１１５．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０６のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＣＤループのアミノ酸配列が７、８または９残基を含み、ここで上記ＣＤループ中の各々の残基が、無作為化され、かつここで各々の残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってもよい。
１１６．実施形態８５、８６、１００、１０１、１０３または１０６のうちのいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場のＥＦループのアミノ酸配列が以下の配列を含み：Ｘ−ｂ−Ｌ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−ｃ−Ｘ、ここでＸは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ここで（ｂ）は、アスパラギン、リジン、アルギニン，アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、かつここで（ｃ）は、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。
１１７．実施形態８５〜１１６のいずれか１つのライブラリーであって、ここで上記ライブラリーは、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、酵母または哺乳動物細胞の表面に提示される。
１１８．実施形態８５〜１１７のいずれか１つのライブラリーからフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）足場を特定するための方法であって、ここで上記ＦｎＩＩＩ足場は、ＦＯＩに比較して増大したタンパク質安定性を有し、かつ標的に結合し、以下を包含する：
Ｉ．標的リガンドと、実施形態８５〜１１７のいずれか１つのライブラリーとを、足場：標的リガンド複合体を形成するのに適切な条件下で接触させることと；
ＩＩ．上記複合体から、標的リガンドに結合する足場を得ることと；
ＩＩＩ．工程（ＩＩ)で得られた足場の安定性がＦＯＩのものより大きいか否かを決定することと；
を包含する。
１１９．実施形態１１８の方法であって、工程（ＩＩ）で得られた足場のうちの少なくとも１つのループを無作為化する工程と、さらに無作為化された足場を用いて工程（Ｉ）および（ＩＩ）を繰り返す工程とをさらに包含する。 
１２０．対象のＦｎＩＩＩ足場（ＦＯＩ）に比較して安定性の増大したフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）足場変異体を得るための方法であって、ＦＯＩの変異体を操作することであって、ここで上記変異体のＦＧループが少なくとも１アミノ酸の欠失を含み、この変異体が、ＦＯＩに比較して安定性の増大を示すことを包含する。
１２１．実施形態１２０の方法であって、ここで、上記ＦＧループの長さおよび配列が、ＦＯＩのアミノ酸配列と、少なくとも１つの天然のＦｎＩＩＩドメインのアミノ酸配列とを整列させることによって操作の前に決定される。
１２２．実施形態１２０の方法であって、ここで上記ＦＧループの長さおよび配列は、ＦＯＩのアミノ酸配列上の少なくとも１つの天然のＦｎＩＩＩドメインの三次元構造をモデリングすることによって操作の前に決定される。
１２３．実施形態１１８〜１２２のいずれか１つの方法であって、上記タンパク質安定性は、融点、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性（ＣＤ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、プロテアーゼ耐性、等温熱量測定（ＩＴＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、内部蛍光および／または生物学的活性によって測定される。
１２４．実施形態１１８〜１２３のいずれか１つの方法であって、ここで安定性が、ＦＯＩに比較してＣｍで少なくとも１０％まで増大する。
１２５．実施形態１１８〜１２４のいずれか１つの方法であって、ここで安定性が、ＦＯＩに比較してＣｍで少なくとも２０％まで増大する。
１２６．実施形態１１８〜１２５のいずれか１つの方法であって、ここで安定性が、尿素変性によって測定される。
１２７．実施形態１１８〜１２５のいずれか１つの方法であって、ここで安定性が、グアニジン変性によって測定される。
１２８．実施形態１１８〜１２７のいずれか１つの方法であって、ここで上記足場が、ＦＯＩに比較してプロテアーゼ感受性で少なくとも１０％の減少を示す。
１２９．実施形態１１８〜１２８のいずれか１つの方法であって、ここで上記足場が、ＦＯＩに比較して増大した融点を示す。
１３０．実施形態１１８〜１２９の組み換え足場であって、ここで上記融点が、ＦＯＩに比較して少なくとも２度まで上昇されている。
１３１．実施形態１１８〜１３０のいずれか１つの方法であって、ここでＦＯＩが、配列番号１〜３４、５４、６９または表１６（図１６）に示される配列のいずれかを含む。
１３２．実施形態１１８〜１３１のいずれか１つの方法であって、ここでＦＯＩが、配列番号１を含む。
１３３．実施形態１１８〜１３１のいずれか１つの方法であって、ここで、ＦＯＩが配列５４または６９。
１３４．実施形態１１８〜１３３のいずれか１つの方法によって生成される、増大したタンパク質安定性を有するフィブロネクチンＩＩＩ型足場であって、ここで上記足場は、以下の安定性の増大を示す：（ａ）尿素変性実験で測定して、Ｃｍで少なくとも１０％の増大；（ｂ）グアニジン変性実験で測定して、Ｃｍで少なくとも１０％の増大；（ｃ）プロテアーゼ感受性の少なくとも１０％の増大、または（ｄ）ＦＯＩの融点に比較して、増大した融点。
【表１】
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【実施例】
【０４３１】
ここで本発明を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示される技術の結果として証明される任意のかつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０４３２】
実施例１
種々の多価Ｔｎ３形式（フォーマット）のデザイン
Ｔｎ３足場の多価形式が設計された。この多価形式は、それら自体に融合されるか、オリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合されるか、またはそれら自体におよびオリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合される、１つ以上のＴｎ３モジュールを含むことが図１に示される。各々の場合に、得られた分子実体は、少なくとも２つのＴｎ３モジュールを含む。お互いに対する、または他のタンパク質モチーフに対するＴｎ３モジュールを接続するポリペプチドリンカーが構築されても、または未構築であってもよく、機能はある場合とない場合がある。多価Ｔｎ３足場タンパク質のこれらの例示的な分類が、特に提供される：（ｉ）直線の（Ｌ）多価タンパク質であって、ポリペプチドリンカーを介してお互いに対して融合されたＴｎ３モジュールを含有する多価タンパク質；（ｉｉ）抗体様（Ｉｇ）多価タンパク質であって、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖に融合された１つ以上の直鎖的に融合されたＴｎ３モジュールを含む多価タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）Ｆｃ含有多価タンパク質であって、抗体Ｆｃ領域に融合された１つ以上の直鎖状に融合されたＴｎ３モジュールを含む、多価タンパク質（図１）。
【０４３３】
実施例２
多価ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３含有タンパク質の発現および精製
ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２の結合特異性を有する一連の８つの多価Ｔｎ３モジュール（足場タンパク質を含む）（「Ｔｎ３タンパク質」または「Ｔｎ３足場」とも呼ばれる）を調製した。実施例は、実施例１に記載の３つの多価形式の各々から調製し、これらのタンパク質の全てが、２つ以上のＴＲＡＩＬ  Ｒ２−結合Ｔｎ３モジュールＡ１（クローン１Ｅ１１、Ｇ６または１Ｃ１２）を示した。ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的な多価Ｔｎ３タンパク質については、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合しなかった対応する対照のＴｎ３タンパク質（クローンＤ１、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体に特異的なＴｎ３ドメイン）も生成され、これは、成分Ｔｎ３モジュールの配列および結合特異性においてのみ異なる。Ｔｎ３クローンＤ１は、Ｔｎ３タンパク質であって、ここで１Ｅ１１クローンのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、そえぞれ配列番号９９、３８、および１０７に対応する配列を有する別のループで置き換えられる（表４を参照のこと）。発現された多価Ｔｎ３タンパク質構築物の配列同一数を表２に示しており、全ての可能な構築物は、表３および図２に模式的に示される。クローンのループ配列を表４に示す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０４３４】
発現構築物の調製：用いられた酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のものであり、ＤＮＡ精製キットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）のであり、ＤＮＡプライマーは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のであった。２つ以上の直鎖状に融合されたＴ３モジュールをコードする発現構築物の調製は、以下のとおりであった。ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３モジュールをコードするＤＮＡ（例えば、１Ｅ１１、配列番号１３４；Ｇ６，配列番号１３８；など）は、プライマー「Ｔｎ３  ｇｌｙ４ｓｅｒ１モジュールフォワード」（配列番号１１２）および「Ｔｎ３  ｇｌｙ４ｓｅｒ２モジュールリバース」（配列番号１１３）（表５）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０４３５】
ＰＣＲ産物の浄化後、増幅されたＤＮＡを２つに分け、ここで、半分はＢｐｍＩで消化し、残りの半分はＡｃｕＩで消化した。消化したサンプルを、ＰＣＲ浄化キットを用いて精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結して、２つのＴｎ３モジュール（Ａ２）をコードするＤＮＡ産物を作製した。この物質を、アガロースゲル電気泳動によって精製して、再度２つに分けた。ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩでの消化、続いてＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）への連結によって（ＷＯ２００９／０５８３７９Ａ２，実施例１８に記載）、タンパク質Ａ２についての細菌発現構築物を得た。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への未消化生成物の連結によって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。４つのＴｎ３モジュール（Ａ３）をコードするＤＮＡフラグメントを作製するために、ＴＯＰＯクローニングされたＡ２のＤＮＡを、プライマー「モジュール  ａｍｐ  フォワード」（配列番号１１４）および「モジュール  ａｍｐ  リバース」（配列番号１１５）（表５）でＰＣＲ増幅し、精製して、ＡｃｕＩまたはＢｐｍＩでの消化のために２つに分けた。Ａ３発現構築物を作製するためのプロセスの残りは、Ａ２構築物を作製するために用いたものと同じであって、ここでＡ３をコードするＤＮＡを、Ａ２構築ブロックからアセンブルした。再度、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にアセンブルされたＡ３のＤＮＡの同時的なクローニングによって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。
【０４３６】
Ａ４およびＡ５細菌発現構築物の調製のために、アダプターモジュールを、Ａ３発現構築物内のマルチ−Ｔｎ３コード配列の３’末端に導入した。この目的を達成するために、Ａ３発現ベクターを最初に、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、切り出したフラグメントを、オリゴヌクレオチド「ｐＳｅｃフォワード中のインサートＢａｍＨＩ（ｉｎｓｅｒｔ  ＢａｍＨＩ  ｉｎ  ｐＳｅｃ  ｆｏｒｗａｒｄ）」（配列番号１１６）および「ｐＳｅｃリバース中のインサートＢａｍＨＩ（ｉｎｓｅｒｔ  ＢａｍＨＩ  ｉｎ  ｐＳｅｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ）」（配列番号１１７）（表５）を含有する二重カセットで置き換えた。対応するｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ構築物由来のＡ２およびＡ３配列のＰＣＲ増幅を、プライマー「モジュールインサートＢａｍＨＩフォワード（モジュール  ｉｎｓｅｒｔ  ＢａｍＨＩ  ｆｏｒｗａｒｄ）」（配列番号１１８）および「モジュールａｍｐリバース（モジュール  ａｍｐ  ｒｅｖｅｒｓｅ）」（配列番号１１５）（表５）で行った。増幅された生成物を、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで二重消化して、同時に消化したＡ３発現構築物中にクローニングした。
【０４３７】
タンパク質Ａ６−Ａ９を、ＷＯ２００９／０５８３７９（Ａ２）の実施例１６に記載されるように、２９３Ｆ細胞の一過性のトランスフェクションによって発現した。簡潔に述べると、発現ベクターを、細菌発現構築物からＴｎ３モジュール（単数または複数）をＰＣＲ増幅すること、ならびにＦｃ融合物もしくは抗体タンパク質の発現のために、Ｆｃ領域、カッパ軽鎖定常領域および／またはＣＨ１ヒンジＣＨ２−ＣＨ３重鎖定常領域をコードする自家ベクター中にこれらをクローニングすることによって生成した。タンパク質Ａ９については、Ｔｎ３モジュールは、ヒトのＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖中の抗体可変領域を置き換える。タンデム構築物のＦｃ融合物を作製するための適合するＮｈｅＩおよびＫａｓＩ部位を付加するプライマーを表５に示す。
【表５】
2013523179.tif 000013
【０４３８】
タンパク質の発現および精製：多価または直鎖状のＴｎ３タンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＭＤ／Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で発現され、Ｈｉｓ−タグ化タンパク質は、Ｎｉ  ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養培地から精製した。驚くべきことに、分子量の大きな相違にもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉ中で中レベルから高レベルで発現されるこれらの構築物の全てが、培地中に効率的に分泌された（表６および図３）。
【０４３９】
Ｆｃ融合および抗体様タンパク質（Ａ６−Ａ９）を発現するために、２９３Ｆ細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収は、６日および１０日に行い、タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０４４０】
全ての精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘで、ＭＥＳ緩衝液中の４〜１２％のビストリスゲル上で還元剤なしで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて可視化した。サイズ排除クロマトグラフィーもまた用いて、精製されたタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のいずれかで除去し、総タンパク質の１０％未満の最終レベルにした。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ膜を備えるＡｃｒｏｄｉｓｃユニット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を、製造業者が示すとおり用いて、細菌発現したタンパク質調製物からエンドトキシンを除去した。
【表６】
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【０４４１】
実施例３
一価および多価のＴｎ３タンパク質についてのＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合親和性
一連のＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的Ｔｎ３タンパク質の結合親和性に対するＴｎ３の価数の影響を測定するために、競合的ＥＬＩＳＡ実験を行った。９６ウェルのＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を、Ａ９（１Ｃ１２）（配列番号１５４＋配列番号１４５）ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的な足場を用いて、抗体様の形式で、ＰＢＳ中で、２μｇ／ｍｌで、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡでブロックした。Ａ１（１Ｅ１１単量体）、および線形方式のＡ２（１Ｅ１１二価）またはＡ３（１Ｅ１１四価）多量体足場の希釈物を、このコーティングしたプレート上で０．７５ｎＭのビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃとともに、２時間室温で、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｍｇ／ｍｌＢＳＡｎ中でインキュベートして、洗浄した。結合したビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２  Ｆｃを、ストレプトアビジンＨＲＰ、ＴＭＢで検出して、酸で中和した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。データを図４に示す。結合親和性（ＩＣ５０）を、表７に示しており、ビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃの最大結合を５０％まで減少するために必要な競合するタンパク質の濃度として算出した。
【０４４２】
Ａ２およびＡ３についてのＩＣ５０値は、モノマーＡ１のものよりも少なくとも３０倍低く、かつこのアッセイの限界である（すなわち、ビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃの濃度にほぼ等しい）。固定されたＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３に対するビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃの結合は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合構築物によって置き換えた。
【０４４３】
単量体のＡ１タンパク質に対して、二価および四価のＡ２およびＡ３タンパク質は、３０〜４０倍高い親和性でＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに結合し、これは、多重Ｔｎ３モジュールがその結合活性を保持し、かつ結合活性効果を通じて高い親和性に寄与することを示すものである。一価および二価または四価のＴｎ３タンパク質の間の親和性における真の差異は、Ａ２およびＡ３についてのＩＣ５０値がこのアッセイで用いられるビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃの濃度とほぼ等しかったと仮定すれば（０．７５ｎＭ）、３０〜４０倍大きいものであり得る。
【表７】
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【０４４４】
実施例４
細胞結合の確認のためのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーを用いて、Ｈ２１２２細胞の表面上で発現される内因性ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する多価ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質の結合の特異性を確認した。付着性のＨ２１２２細胞（非小細胞細胞肺癌腺癌細胞株）を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて組織培養フラスコから剥がした。細胞を、完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）ですすぎ、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に約２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｔｎ３タンパク質Ａ９（１Ｅ１１）（配列番号１５８＋配列番号１５９）、四価抗体様の形式の多量体足場、または形式の適合した対照のＴｎ３タンパク質Ｂ９（クローンＤ１）を、４０ｎＭの濃度でＰＢＳ中で／２％ＦＢＳ中で調製した。
【０４４５】
細胞を、１ウェルあたり７５μｌで９６ウェルのＵ底（丸底）プレートに播いて、タンパク質試料を、１ウェルあたり２５μｌで添加した（１０ｎＭの最終濃度まで）。プレートを、４℃で約１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ／２％ＦＢＳで３回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８複合した添加された二次抗体を添加して（１００μｌ／ウェル）、プレートを４℃で約３０分間インキュベートして、上記のように洗浄した。細胞を、１００μｌのＰＢＳ／２％  ＦＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメトリー分析を、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的な  Ｔｎ３タンパク質とインキュベートした場合の傾向的に標識したＨ２１２２細胞での対照に対するシフト（増大）によって、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質が、細胞性ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合し得ることが確認された（図５）。
【０４４６】
実施例５
ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質によるＨ２１２２細胞のアポトーシスに対する価数および形式（フォーマット）の効果
アポトーシス性の細胞死は、細胞表面ＴＲＡＩＬ  Ｒ２の架橋によって、癌細胞株で誘導され得る。この効果は、生存細胞の数を測定する細胞アッセイで決定され得る。この目的を達成するために、肺癌細胞株Ｈ２１２２細胞を、９６ウェルプレート中に、１０，０００細胞／ウェルの密度で、７５μｌの完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）中でプレートした。一晩３７℃でインキュベーションした後、培地に、連続希釈のＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的な（クローン１Ｅ１１）または負の対照（クローンＤ１）Ｔｎ３タンパク質を含有する２５μｌの追加の培地を補充した。全ての処置は、二重のウェルで行った。市販のＴＲＡＩＬリガンド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、ＴＲＡＩＬ受容体−誘導性の細胞死の正の対照として用いた。７２時間後、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、製造業者の指示に従って用いて、培養中の生存細胞の数の指標であるＡＴＰレベルをアッセイした。アッセイの発光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定した。細胞生存の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均の発光で除すことによって決定した。阻害対化合物濃度の用量応答プロットを作製し、細胞殺傷力価（ＥＣ５０）は、細胞生存度の５０％を阻害するのに必要なタンパク質の濃度として決定した。
【０４４７】
多価ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質のプロアポトーシス性の活性に対する価数の影響を試験するために、Ｈ２１２２細胞を、一価のＴｎ３タンパク質Ａ１（クローン１Ｅ１１）、および一連の直鎖状に融合されたＴｎ３タンパク質Ａ２−Ａ５（各々のクローン１Ｅ１１）（２、４、６または８のＴｎ３モジュールを含む）で処理した。一価および二価のＴｎ３タンパク質は、殺傷活性をまったくまたはほとんど示さなかったが、４、６および８のＴｎ３モジュールを含有するタンパク質は、Ｈ２１２２細胞生存度を強力に阻害し、ここで力価は、価数の関数として増大した（図６Ａ；表８）。タンパク質Ａ３（四価）は、ＴＲＡＩＬ、天然のＴＲＡＩＬ  Ｒ２リガンドに対して類似の力価を有するが、タンパク質Ａ４（六価）およびＡ５（八価）は、１〜２対数強力であった。このアッセイから、所定の分子フォーマットについて、細胞殺傷は、アッセイがもはや識別できない点まで高い価数で改善することが明らかである。
【表８】
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【０４４８】
細胞生存度の阻害が、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合に依存することを示すため、１００ｐＭのタンパク質Ａ５（クローンＧ６）（すなわち、１６７×ＥＣ５０）を、Ｈ２１２２細胞と共に、可溶性のＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃタンパク質の存在下でインキュベートした。可溶性のＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃによる細胞殺傷の用量依存性の抑制は、細胞殺傷が、細胞表面ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するタンパク質Ａ５結合に依存することを示すものである（図６Ｂ）。クローン１Ｅ１１ループを含むタンパク質Ａ５で同様の結果が示された（データ示さず）。
【０４４９】
結合モジュールの数に加えて、多価Ｔｎ３タンパク質の活性はまた、個々の結合単位を示すために用いられる分子フォーマットによって影響され得る。活性に対する分子フォーマットの効果を試験するために、Ｈ２１２２細胞を、同じ数のＴｎ３結合モジュールの同じ数を提示する種々のＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質で処理した。四価タンパク質Ａ３、Ａ７およびＡ９（各々クローン１Ｅ１１）が、Ｈ２１２２細胞の殺傷を誘導する能力を、細胞生存度アッセイで試験し、同様に、八価のＴｎ３タンパク質Ａ５およびＡ８（各々クローン１Ｅ１１）の対も試験した。不活性な一価および二価のタンパク質を、負の対照ルとして、およびＴＲＡＩＬを正の対照として含めた（図７；表９および表１０）。図７Ａでは、４の価数で試験した３つの構築物について、Ａ３（直鎖状フォーマット）およびＡ７（Ｆｃ融合物フォーマット）が、それらの細胞殺傷活性において同様であり、かつＡ９よりもＨ２１２２細胞を殺傷するのに強力であることが明らかである（抗体様の融合形式）。これによって、Ｔｎ３モジュールの空間的配向が、生理活性にかなりの影響を有し得、ここでＡ３は、Ｈ２１２２細胞生存度を阻害するのにおいてＡ９タンパク質よりも約１５０倍強力であることが明確に示される（表９）。図７Ｂによって、八価のＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合性Ｔｎ３タンパク質、Ａ５（直鎖状）およびＡ８（Ｆｃ融合物）の両方の形式とも、Ｈ２１２２細胞の生存度を阻害するのに同様の有効性を有することが示される。これらの構築物についてのＥＣ５０データを、表９に示す。親和性、価数および空間的定位を繊細に調節する能力によって、所望の治療結果を正確に操作する能力に関してかなりの柔軟性が得られる。
【表９】
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【表１０】
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【０４５０】
実施例６
細胞株Ｃｏｌｏ２０５およびＪｕｒｋａｔにおける用量依存性の細胞殺傷
多価ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質が、Ｈ２１２２以外の癌細胞株を殺傷し得ることを示すために、他のＴＲＡＩＬ  Ｒ２発現性の細胞株も試験した。結腸直腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（図８Ａ）およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病株（図８Ｂ）を、それらが、タンパク質Ａ３（四価、直鎖状形式）（配列番号１４３）およびＡ５（八価、直鎖状フォーマット）（配列番号１４５）（各々クローンＧ６）によって殺傷され得る能力について試験した。各々の細胞株を、Ａ３、Ａ５、正の対照ＴＲＡＩＬ、または負の対照タンパク質Ｂ５（配列番号１４８）（これは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合しない）とともにインキュベートして、細胞生存度アッセイを、Ｈ２１２２について記載されるとおり行った。これらの細胞株の各々において、Ａ５は、細胞生存度の極度に強力な阻害を示す。より低い価数のＡ３タンパク質はまた、Ａ５よりも低い価数ではあるが、細胞殺傷を誘導する。従って、構築物の価数が高いほど、大きい活性を示す。予想どおり、ＴＲＡＩＬはまた、細胞生存度を阻害し得るが、八価の負の対照タンパク質Ｂ５（ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合しない）は阻害し得ない。
【表１１】
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【表１２】
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【０４５１】
実施例７
マウスのＣＤ４０Ｌ特異的な二価のタンデム足場のデザイン、発現および活性
二価のマウスＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３タンパク質（表１３）を、一対の同一のＴｎ３モジュールを融合することによって調製した。Ｍ１３は、マウスＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３タンパク質である。Ｍ１３配列は、Ｔｎ３の配列に対応し、ここでは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの配列が、それぞれ、配列番号１００、１０４および１１０に対応する配列を有する別のループで置き換えられる（表４を参照のこと）。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（ＧＳ）ユニットの１（構築物Ｃ１（Ｍ１３））、３（構築物Ｃ２（Ｍ１３））、５（構築物Ｃ３（Ｍ１３））、または７（構築物Ｃ４（Ｍ１３））コピーを含むリンカーを用いて、１３〜４３アミノ酸の総リンカー長を得た（図９Ａおよび表３を参照のこと）。
【表１３】
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【０４５２】
簡潔に述べると、発現構築物を、以下のとおり生成した：フラグメントＡは、Ｔｎ３遺伝子の上流のｐＳｅｃベクターに特異的なプライマー、およびプライマー「１−３  ＧＳリンカー  リバース」（配列番号１２３）を用いる、実施例１に記載されるｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）ベクター中にクローニングされたマウスＣＤ４０Ｌ結合因子ｐＳｅｃ−Ｍ１３のＰＣＲ増幅によって生成した（用いられるＴｎ３特異的プライマーの配列については表１４を参照のこと）。フラグメントＢ１ＧＳおよびＢ３ＧＳは、それぞれ、プライマー「１ＧＳリンカー」（配列番号１２１）または「３ＧＳリンカー」（配列番号１２２）、およびＴｎ３遺伝子の下流のｐＳｅｃベクターに特異的なプライマーを用いて同じテンプレートのＰＣＲ増幅によって生成した。フラグメントをゲル精製して、フラグメントＡおよびＢ１ＧＳ、またはフラグメントＡおよびＢ３ＧＳを混合して、タンデム構築物を、２つのｐＳｅｃベクター特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応において重複ＰＣＲによって生成した。この生成物を、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）ベクター中に、実施例１に記載のようにクローニングして戻し、２つの構築物を得た：Ｃ１（Ｍ１３）およびＣ２（Ｍ１３）。５および７のＧＳリンカー構築物を生成するために、プライマー「ＧＳ  Ｌ  Ａｍｐ  フォワード」（配列番号１２６）および「ＧＳ  Ｌ  Ａｍｐ  リバース」（配列番号１２７）を用いて、それぞれ、オリゴヌクレオチド「５ＧＳリンカー」（配列番号１２４）および「７ＧＳリンカー」（配列番号１２５）のＰＣＲ増幅によって生成されたリンカー挿入物を、ＰｓｔＩおよびＸｍａＩで消化して、ＰｓｔＩおよびＸｍａＩを用いてｐＳｅｃＭ１３−１ＧＳ−Ｍ１３を切断することによって生成したベクターフラグメント中にクローニングして、構築物Ｃ３（Ｍ１３）およびＣ４（Ｍ１３）を得た。
【表１４】
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【０４５３】
同一のＴｎ３足場を含む一価および二価のタンデム構築物を、実施例２に記載のように、組み換え的に発現して、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。図９Ｂは、還元条件および非還元条件下での精製タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０４５４】
二価タンデムＭ１３−Ｍ１３構築物の結合有効性を試験して、それらを、一価のＭ１３足場と比較するために、それらが、バイオセンサーチップ上に固定されたマウスＣＤ４０受容体に対するマウスＣＤ４０Ｌ結合の競合的阻害を試験した。
【０４５５】
簡潔に述べると、ＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラ融合の形態であるマウスＣＤ４０受容体のフラグメントを、約３０００という応答ユニットの密度でＧＬＣチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に固定した。競合結合アッセイについて、一価のＭ１３または異なるリンカー長を有するＭ１３のタンデム二価構築物の３倍連続希釈を、２０分間、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２００および０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳ中に含まれる固定濃度のＥ．ｃｏｌｉ生成組み換えマウスＣＤ４０Ｌ（０．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。次いで、これらの試料を、３０μＬ／分の流速でＧＬＣチップ上に３００秒間注入して、結合したＣＤ４０Ｌのレベルをセンサーグラム内で固定の時点で記録して、任意の競合因子の非存在下で、結合したタンパク質の対応するレベルと比較した。各々の結合測定の後、残りのＣＤ４０Ｌを、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を注入することによってチップ表面から脱着させた。非特異的な結合の効果を、チップのインタースポットからセンサーグラムを差引きすることによって修正した。マウスＣＤ４０Ｌの５０％を置き換えるのに必要なＴｎ３構築物の濃度に対応するＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。
【０４５６】
図９Ｃに示されるとおり、Ｍ１３単量体についての最大半減阻害濃度（ＩＣ５０）は７１ｎＭであったが、二価タンデム構築物Ｃ１（Ｍ１３）についてのＩＣ５０は２９ｎＭであった。５または６ｎＭという同様のＩＣ５０値が、より長いリンカーを含む二価構築物について得られた（それぞれ、構築物Ｃ２（Ｍ１３）、Ｃ３（Ｍ１３）およびＣ４（Ｍ１３））。このアッセイで用いられるＣＤ４０Ｌの濃度に起因して、これは、このアッセイで観察できるＩＣ５０の下限である。この二価構築物は全てが、一価の構築物に比較して低いＩＣ５０値を有し、このことは、単一のＭ１３  Ｔｎ３モジュールに比較して二価タンデム構築物の結合活性の増強を示した。これらの二価構築物におけるリンカー長は、アッセイ力価に対してある程度の効果を示し、ここでは最短のリンカー長の構築物が中間の力価を有するが、２３以上のアミノ酸のリンカーを有するこれらの構築物は、このアッセイで等価である。
【０４５７】
細胞に基づいた活性において二価タンデムＴｎ３構築物の活性を試験し、それらを一価のＭ１３足場と比較するために、Ｂ細胞上のマウスＣＤ４０Ｌ−誘導性のＣＤ８６発現の阻害を試験した。対照として、市販の抗マウスＣＤ４０Ｌ特異的な抗体（ＭＲ１）を、平行して試験した。
【０４５８】
このアッセイは、健常なボランティア由来の血液から調製したＰＢＭＣを利用する。簡潔に述べると、新鮮に吸引した血液を、ヘパリンを含むＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製試験管中に収集した。遠心分離後、ＰＢＭＣを含有する細胞層を、収集して、ＰＢＳを用いて２回、およびＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて１回洗浄した。細胞を、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％熱不活化ウシ胎仔血清を補充、１％Ｐ／Ｓ）中に、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０４５９】
マウスＣＤ４０Ｌ−発現性のＴｈ２細胞株Ｄ１０．Ｇ４．１を、洗浄して、完全ＲＰＭＩ  １６０培地中に、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０４６０】
Ｍ１３、Ｍ１３−Ｍ１３タンデム二価構築物Ｃ１−Ｃ４、またはＭＲ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０６５０８）を、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で連続希釈した（１：３）。各々の希釈物の５０μｌサンプルを、９６ウェル丸底組織培養プレート中のウェルに添加した。次いで、各々のウェルに５０μｌのＤ１０．Ｇ４．１細胞（５×１０４）を入れて、混合後、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１００μｌの再懸濁したＰＢＭＣ（５×１０５細胞）を、各々のウェルに添加して、３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。
【０４６１】
ＰＢＭＣを収集して、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８６（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号５５５６６０）およびＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１９（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号５５５４１２）が含有されるＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４，１％ＢＳＡ，０．１％アジ化ナトリウム）４℃で３０分間、暗所で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液中での２回洗浄後、次に試料を、ＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。ＣＤ１９ゲートしたＢ細胞上のＣＤ８６発現を評価した。ＣＤ８６発現の分析は、試験タンパク質の関数として、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
【０４６２】
図９Ｄに示されるとおり、二価Ｍ１３−Ｍ１３タンデム構築物は全てが、ＭＲ１抗体（１００ｐＭ）のＩＣ５０に匹敵する、１００〜２００ｐＭというＩＣ５０でＣＤ８６発現を阻害し、Ｍ１３一価足場自体よりも約３対数強力であった。生化学的アッセイとは異なり、この細胞に基づいたアッセイでは、リンカー長の効果は観察されず、そして、１３〜４３アミノ酸長におよぶリンカーを有する二価構築物は全てが、一価のタンパク質に対して等価な増強された力価を示す。
【０４６３】
実施例８
二重特異性のタンデム足場の発現
ＴＲＡＩＬ  Ｒ２およびヒトＣＤ４０Ｌ（ＨｕＣＤ４０Ｌ）に特異性を有する二重特異性のＴｎ３構築物を生成するために、２つのＴｎ３モジュール（１つは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に特異性を有するもの（クローン１Ｅ１１）、および１つは、ヒトＣＤ４０Ｌに特異性を有するもの（クローン７９））を２つのモジュールを分ける可変長のリンカーと一緒に融合した（表３および表１５）。クローン７９タンパク質の配列（配列番号１８４）は、Ｔｎ３モジュールの配列に対応し、ここでＢＣ、ＤＥ、およびＥＦループは、それぞれ、配列番号１０１、１０５および１１１に対応する別のループで置き換えた。１および３個のＧｌｙ４Ｓｅｒ（ＧＳ）リピートを有するリンカーを含む、タンデム二重特異性の足場についての発現構築物（それぞれ、構築物Ｃ６およびＣ８）は、Ｔｎ３変異体Ａ１および７９を担持するプラスミドを、最初にＰＣＲテンプレートとして用いたこと以外は、実施例７に記載のとおり生成した。構築物Ｃ５（ヒトテネイシンＣにおける第二および第三のＦｎＩＩＩドメインを連結する天然の配列由来の短いリンカーを含み、これは、第三のＦｎＩＩＩドメインのＡβ鎖の一部と解釈され得るが、足場結合には必要ではない）、および構築物Ｃ７は、「０  ＧＳリンカー  リバース」を、「１−３  ＧＳリンカー  リバース」の代わりにＣ５に用いたこと以外は、表１７に列挙される追加のプライマーを用いて、Ｃ６およびＣ８と同様の方法で生成した。
【表１５】
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【表１６】
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【０４６４】
一価、ならびにタンデム二重特異性のＴｎ３足場を、実施例２に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ培地で組み換え的に発現させた。可溶性構築物の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。図１０は、試験した構築物について許容できる発現レベルを示す。
【０４６５】
実施例９
二重特異性のタンデム足場の特異的な結合
ＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する二重特異性のＴｎ３構築物の結合を測定するために、捕獲ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。簡潔に述べると、８×Ｈｉｓ−タグ化タンパク質構築物：Ａ１、７９、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８（詳細に関しては、表１５を参照のこと）を、Ｅ．ｃｏｌｉ培地から、抗Ｈｉｓ抗体コーティングしたウェル上に以下のとおり捕捉した。９６−ウェルのＭａｘｉＳｏｒｂプレートを、Ｑｉａｇｅｎ抗Ｈｉｓ抗体を用いて２μｇ／ｍｌで一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０および４％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（ＰＢＳＴ４％乳）を含有するＰＢＳで１．５時間ブロックした。コーティングしたプレートを、ＰＢＳＴで洗浄して、可溶性の発現されたタンパク質を含有する希釈した細菌培地（３０倍希釈）を添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、捕捉された構築物を含有するウェルを、種々の濃度のビオチニル化ＴＲＡＩＬ  Ｒ２（図１１Ａ）またはＥ．ｃｏｌｉ産生のＨｉｓタグ化ＨｕＣＤ４０Ｌとビオチニル化抗Ｈｉｓ抗体とのプレインキュベーションによって生成された複合体（図１１Ｂ）のいずれかとともに１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、結合したＴＲＡＩＬ  Ｒ２またはＨｕＣＤ４０Ｌ／抗Ｈｉｓ抗体複合体を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＲＰＮ１２３１Ｖ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１０００×ワーキング希釈液）を用いて２０分間検出し、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によって比色分析によって検出した。吸光度は、４５０ｎｍで読んだ。
【０４６６】
ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する二重特異性のタンデムＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的な足場の結合、およびＨｕＣＤ４０Ｌに対する二重特異性のタンデムＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的な足場の結合を、それぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３ドメインに融合されるＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なＴｎ３ドメインを含む、Ｃ５〜Ｃ８と命名された二重特異性のタンデム足場は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに結合した；しかし、単量体の／一価特異的なＴｎ３構築物Ａ１および７９は、それらの既知の特異性に従ってＴＲＡＩＬ  Ｒ２またはＨｕＣＤ４０Ｌのいずれかに結合したが、両方の標的には結合しなかった。
【０４６７】
ＴＲＡＩＬ  Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに対するタンデムＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的構築物の同時結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを用いて決定した。タンパク質Ａ１、７９、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８を含有するＥ．ｃｏｌｉ培地の希釈物を、１０ｎＭのＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃ融合タンパク質、５０ｎＭのビオチニル化  ＨｕＣＤ４０Ｌ（Ｅ．ｃｏｌｉで産生）、ストレプトアビジンＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）およびプロテインＡ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）が含有されるＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ＋０．１％ＢＳＡとともにインキュベートした。試料を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー中での読み取りの前に暗所で１時間インキュベートした。ドナービーズ集団を、６８０ｎｍのレーザーで励起して、一重項酸素の放出を生じた。一重項酸素は、寿命が限られており、基底状態に戻る前に拡散によって最大２００ｎｍまで移動することを可能とする。一重項酸素は、アクセプタービーズを励起させて、５２０〜６２０ｎｍの光の放射を生じる（これは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定される）。ドナーおよびアクセプタービーズが近位である場合のみ、シグナルが生成される。従って、シグナルの増大は、２種のビーズが、２つの標的と同時に相互作用する分子によって一緒にされる場合に観察される。いずれの標的に対する結合も存在しなければ、シグナルは検出されないはずである。
【０４６８】
図１２に示すとおり、タンデム二重特異性構築物は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに同時に結合して、強力なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを生成した；しかし、一価のＴｎ３足場、Ａ１および７９は、シグナルを生成せず、このことは、それらが、両方の標的を同時に結合することによってドナーおよびアクセプタービーズを近位にし得ないことを示す。
【０４６９】
実施例１０
９アミノ酸長のＦＧループを有するＴｎ３足場の安定性の増大
Ｔｎ３安定性に対するＦＧループ長の影響を測定するために、ｐＨ７．０での塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）による６つのＨｕＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３足場の折り畳みを、内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。これらのＴｎ３単量体の足場は、９、１０または１１アミノ酸のＦＧループ長を含んだ。種々の濃度の塩酸グアニジンを含有する０．０５ｍｇ／ｍＬのＴｎ３足場のサンプルを、ｐＨ７．０で５０ｍＭのリン酸ナトリウム中で調製した。蛍光放射スペクトルは、Ｈｏｒｉｂａ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４スペクトロフルオロメーターで、２８０ｎｍの励起波長で得た。３６０ｎｍの相対的な蛍光放射強度を、各々のタンパク質についてＧｕＨＣｌ濃度の関数としてプロットした。各々の足場は、固有のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのループ配列を含んだ。クローンＡ３（配列番号１８５；本実施例のＡ３単量体足場は、表３に提供されるようにＡ３と命名された構築物とは別であることに注意）、７１（配列番号１８６）、７９（配列番号１８４）、１２７（配列番号１８７）、２５２（配列番号１８８）、および２３０（配列番号１８９）は、ｐＨ７．０で３．０ＭのＧｕＨＣｌ（親のＴｎ３の５０％未折り畳みを発揮するのに必要なＧｕＨＣｌ濃度（Ｃｍ）である）中で５０％を超えて未折り畳みであった。クローンＡ３，７９、１２７、２５２および２３０のＣｍ値は、それぞれ、２．２Ｍ、２．７Ｍ、２．４Ｍ、２．７Ｍ、２．４Ｍであった。これらのクローンについてのＦＧループ長は、それぞれ、１１、１１、１１、１０および１１アミノ酸であるが、親のＴｎ３のＦＧループ長は、１０アミノ酸である。驚くべきことに、クローン７１（９アミノ酸というＦＧルループ長を有する唯一の変異体）は、親のＴｎ３足場、または試験した他の５つの変異体よりも有意に高い安定性である、４．２ＭというＣｍを示した。結果を図１３に示す。
【０４７０】
Ｔｎ３クローン７１の安定性の増強が、その配列に内因性であるか、または短縮されたＦＧループ長の結果であるかを決定するため、このクローンおよび２つの通過の単量体のＴｎ３足場タンパク質、（Ａ６（配列番号１９０；本実施例におけるＡ６単量体の足場は、表３に提供されるようにＡ６と命名された構築物とは別であることに注意）およびＰ１Ｃ０１（配列番号１９１））、であって９アミノ酸のＦＧループ長を有する（ただし、異なるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列）を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析し、１０アミノ酸長さであるＦＧループを含む親のＴｎ３足場と比較した。Ｔｎ３タンパク質サンプルは、１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で分析した。全ての場合に、熱未折り畳みの中点は、１０残基のＦＧループを有する親（ＷＴ）Ｔｎ３に比較して９残基ＦＧループを有するクローンについて高かった。熱未折り畳みは、同じサンプルを冷却して再加熱した場合、上書き可能なサーモグラムによって証明されるとおり、可逆性であるか、または部分的に可逆性（クローンＡ６）であった。図１４に示されるとおり、親のＴｎ３についての融点（Ｔｍ）は７２．１℃であって、Ｐ１Ｃ０１については、Ｔｍは７５．２℃であって、Ａ６については、Ｔｍは７７．５℃であって、かつ７１については、Ｔｍは７４．４℃であった。
【０４７１】
これらの知見を、塩酸グアニジン安定性実験において同じＴｎ３タンパク質変異体を試験することによって、裏付けた。ｐＨ７．０での塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）による親の（ＷＴ）Ｔｎ３、Ｐ１Ｃ０１、Ａ６、および７１の未折り畳みを、上記のように内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。図１５に示されるとおり、図１４のＤＳＣデータと一致して、Ｔｎ３クローンＡ６、７１、およびＰ１Ｃ０１は全てが、親の（ＷＴ）Ｔｎ３足場よりも有意に高いＧｕＨＣｌ濃度で未折り畳みの中点を有し、このことは、９アミノ酸長である（すなわち、親のＴｎ３足場の長さよりも短い）ＦＧループを有するＴｎ３タンパク質の安定性が増強されることを示す。
【０４７２】
実施例１１
ＦＧループ長の安定性分析
上記のように、予備的分析によって、９残基というＦＧループ長を有するＴｎ３分子が、それより長いＦＧループを有するＴｎ分子よりも有意に安定であることが示された。これらの研究では、本発明者らは、１セットのランダムなＴｎ３で安定性分析を行って、熱安定性に対するＦＧループ長の効果を評価した。
【０４７３】
Ｔｎ３ライブラリーを、ｐＳＥＣ発現ベクター中にサブクローニングした。このライブラリーは、種々の配列であって同様に種々のただし規定の長さのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを有するＴｎ３をコードする。これらの研究の焦点であるＦＧループは、９、１０または１１残基長であってもよい。ＢＣループは、９、１１、または１２残基長であってもよい。このライブラリーのＤＥループは、６残基という固定長を有する。サブクローニングされたライブラリーを用いて、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、これからプラスミドプールを精製して、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換するのに用いた。ＢＬ２１コロニーを、配列決定して、全長Ｔｎ３をコードする９６クローンを特定した。この最終の９６クローンを、９６ディープ−ウェルプレート中に５００μｌのスケールで、標準のＭａｇｉｃ  Ｍｅｄｉａ発現（接種後２４時間３７℃で振盪する）を用いて増殖して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。中度〜高度の発現レベルを有する２９個のランダムなクローンを、５０ｍＬ規模の発現までスケールアップして、標準的な固定金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。全てのタンパク質が何であるかは、質量分析法によって確認した。
【０４７４】
ランダムなクローンを、ＤＳＣによって安定性に関して分析した。簡潔に述べると、ＤＳＣ測定は、ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ）で行った。タンパク質を、十分な透析を通じてＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）に交換して、ＤＳＣ分析のために０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調節した。サンプルを、２０〜９５℃で、９０℃／時間のスキャン速度で、反復スキャンなしで、スキャンした。結果を表１８に示す。
【表１７】
2013523179.tif 000025
【０４７５】
この研究では、ループ長ＦＧ９またはＦＧ１０および１１を有するＴｎ３の熱安定性を比較した。この傾向は、長さ９のＦＧループを有するＴｎ３ドメインが、ループ長ＦＧ１０または１１を有するものよりも熱安定性であることを示す。対照の野生型Ｔｎ３ドメイン（１０残基のＦＧループを有する）は、上記のサンプルと平行して行った場合、７２℃のＴｍを有した。各々のループ長で見られるＴｍ値の範囲によって、他の要因もまた、Ｔｎ３ドメイン熱安定性を決定するのにある役割を果たすことが示される。
【０４７６】
実施例１２
三重特異性のＴｎ３の生成および特徴付け
これらの実験では、３つの異なる標的に結合特異性を有するＴｎ３分子を生成して、特徴付けた。Ｄ１、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体に特異的なＴｎ３ドメインは、それぞれ、１Ｅ１１（ＴＲＡＩＬ受容体２に特異的なＴｎ３ドメイン）、および７９（ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３ドメイン）に連結された（図１７Ａ）。この構築物は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現され、標準的な方法を用いて精製された（図１７Ｂを参照のこと）。
【０４７７】
三重特異性の構築物が、同時に３つ全ての標的の対に結合し得るかを確認するために、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎおよびＥＬＩＳＡ実験の両方を行った。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ実験については、三重特異性のＴｎ３、３つの総標的分子のうちの２つのサブセット（１つは、ビオチニル化、他方は、抗体Ｆｃ領域を含む）、プロテインＡドナービーズ、およびストレプトアビジンアクセプタービーズを、上記のように、３８４ウェルのホワイトオプティプレート（ｗｈｉｔｅ  Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）中で合わせた。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルは、ストレプトアビジンドナービーズおよびプロテインＡアクセプタービーズがお互いに近位にある（お互いに２００ｎｍ）である場合にのみ観察され得、近位であることは、このアッセイでは、三重特異性の分子による架橋を通じて達成される。Ｄ１−１Ｅ１１−７９が同時に、ｈｕＣＤ４０Ｌおよび  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに（図１８Ａ）、ならびに同時にｈｕＣＤ４０Ｌおよび  Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）に（図１８Ｂ）結合する能力は、以下のようにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによって確認された：３８４−ウェルのホワイトオプティプレート中で、以下の成分を総容積３０μｌ中で合わせた：２０ｍＭの精製したＤ１−１Ｅ１１−７９、５０ｍＭのビオチニル化−ｈｕＣＤ４０Ｌ，（０、１、２．５、５、１０、または４２ｎＭ）ＴｒａｉｌＲ２−Ｆｃ（図１８Ａ）または（０、１、２．５、５、１０、または４２ｎＭ）Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（図１８Ｂ）、５μｌの各々の１／５０希釈のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロテインＡアクセプタービーズおよびストレプトアビジンドナービーズ。暗所での１時間のインキュベーション後、プレートを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上で、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎモードで読んだ。
【０４７８】
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）およびＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃは両方とも、Ｆｃドメインを含むので、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いても、三重特異性の構築物に対するこれらの分子の同時の結合を示すことはできなかった。その代わり、ＥＬＩＳＡ実験を行った。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌで１００μｌ）でコーティングして、４％ミルクでブロックし、次いで、種々の濃度の三重特異性構築物を添加した。ビオチニル化Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、第二の標的リガンドを、添加して、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの添加によって検出した（図１９）。Ｄ１−１Ｅ１１−７９はまた、図１９のＥＬＩＳＡの結果によって示されるように、同時にＴＲＡＩＬ  Ｒ２−ＦｃおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の両方に結合し得ることが示された。従って、この構築物は、同時にその標的の３つ全ての対に結合し得ると本発明者らは、結論し得る。
【０４７９】
実施例１３
リードの単離
アゴニストＴｎ３を開発する最初の工程は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に結合し得、かつ多価形式に連結された場合アポトーシス経路に関与するように２つ以上のＴＲＡＩＬ  Ｒ２細胞外ドメインに結合し得るＴｎ３単量体を単離することである。全ての結合因子がアゴニストとして機能し得るのではないので、本発明者らは、結合因子のパネルを最初に単離することを決め、次いで、インビトロの細胞殺傷アッセイで二次的に作用薬についてスクリーニングした。本発明者らは、最初に、結合因子の最初のパネルを単離するために、組み換えＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃ上で、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに変化を有するＴｎ３の大きいファージ提示ライブラリーをパニングした。このライブラリーの基礎として選択したＴｎ３足場は、テネイシンＣからの天然の３番目のＦｎＩＩＩドメインではないが、安定性を改善するために操作されたジスルフィドを有するバージョンであった。自家のＴｎ３／遺伝子３融合ファージディスプレイライブラリーを構築した（これは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ中に無作為化を含んでいた）。複数の結合因子が、ファージＥＬＩＳＡによって見出され、ここでは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を直接、プレート上にコーティングして、１：３希釈したファージのＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）１％ミルク中での結合を、抗Ｍ１３−ペルオキシダーゼ複合抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって検出した。ほとんどの結合因子は、ループの１つの望ましくない遊離のシステインを有し、さらなる研究については選択されなかった。不対のシステインを欠くクローンのサブセットを、Ｆｃ融合物または抗体様構築物のいずれかを生じる発現ベクター中にクローニングし（図１）、細胞殺傷のために腫瘍細胞株Ｈ２１２２において試験した（データ示さず）。Ｆｃ融合形式では、その融合したＴｎ３にかかわらず、細胞を殺傷することができなかったが、抗体様の形式では、２つ以上の結合因子について応答を引き出した。
【０４８０】
実施例１４
親和性成熟
クローン１Ｃ１２（配列番号１３２）（図２０を参照のこと）は、最初のスクリーニングアッセイにおける最高の細胞殺傷を示し、従って、親和性成熟のために選択された。親和性成熟は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発または無作為化を含むオリゴヌクレオチドによるＰＣＲのいずれかを用いるループの一部の飽和突然変異誘発、アセンブリおよびファージディスプレイベクターへの連結によって行った。１回目および３回目は、それぞれＢＣおよびＦＧループの一部の飽和突然変異誘発から構成され、２回目は、３つ全てのループの一部の別個の飽和突然変異誘発、パニング、遺伝子シャッフリング、次いでシャッフリングされた変異体のパニングを組み合わせて、最高の親和性のアウトプットクローンを得た。親和性成熟したクローンのプールは、ファージから直接ＰＣＲによって、またはＱｉａｇｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて一本鎖ＤＮＡを調製することおよび次いでＰＣＲよってパニング後に回収した。ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ〜ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）消化して、本発明者らの自家の発現ベクターｐＳＥＣ中にクローニングした。これらのクローンを、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で発現させて、ゲル上で泳動して、発現がクローンの間で大きく異ならなかったことを確認した。改善されたクローンを、競合ＥＬＩＳＡによって特定し、ここではプレートを、四価の抗体様の１Ｃ１２（配列番号１５４および１５５）でコーティングして、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ中で、Ｔｎ３の希釈の存在下で０．７５ｎＭのＴＲＡＩＬ  Ｒ２ビオチンの結合の阻害を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定した。ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加して、酸で中和した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。
【０４８１】
親和性測定は、ＧＬＣセンサーチップを備えるＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で２５℃で行った。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４を含有するＰｒｏｔｅＯｎリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を泳動緩衝液として用いた。ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を、チップ上に固定し、Ｔｎ３結合因子（１Ｃ１２（配列番号１３２）、１Ｅ１１（配列番号１３４）、Ｇ３（配列番号１３３）、Ｃ４（配列番号１３５）、およびＧ６（配列番号１３８））の２倍の１２ポイントの連続希釈を、３６μＭ〜７００ｎＭにおよぶ出発濃度で、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，ｐＨ７．４中で調製した。各々の濃度の試料を、６つの分析物チャネル中に、３０μｌ／分の流速で３００秒間注入した。Ｋｄは、ＰｒｏｔｅＯｎソフトウェア中で平衡分析設定を用いることによって決定した。各々の回の最良のクローンの配列を図２０に示す。３回の親和性成熟後の親和性の総改善は、ほぼ２ケタの大きさであって、最良のクローンは、４０〜５０ｎＭの範囲の親和性を有した（表１９）。
【表１８】
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【０４８２】
実施例１５
抗体様の形式での力価に対するＴｎ３親和性の効果
力価に対する個々のＴＮ３サブユニットの親和性の効果を評価するため、表１９のクローンの全てを、図１に示される抗体様の構築物中に再フォーマットした。抗体様のタンパク質を発現するために、２９３Ｆ細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収を、６日目および１０日目に行って、タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。全ての精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビストリスゲル上で、ＭＥＳ緩衝液中で、還元剤なしで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて可視化した。
【０４８３】
サイズ排除クロマトグラフィーも用いて、精製したタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で取り除いて、１０％未満の総タンパク質という最終レベルにした。ＭｕｓｔａｎｇＥ膜を備えるＡｃｒｏｄｉｓｃユニット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を、製造業者が示したとおり用いて、細菌が発現したタンパク質調製物から内毒素を取り除いた。
【０４８４】
次いで、Ｈ２１２２細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存度アッセイを用いて、アゴニストの抗体様の構築物に対する感度について試験した。このアッセイでは、蛍光は、９６ウェルプレートの所定のウェル内のＡＴＰのレベルに対して直接比例し、これが次に、代謝的に活性な生存細胞の量と直接比例する。Ｈ２１２２細胞株については、細胞を、９６ウェルプレート中に、１０，０００細胞／ウェルの密度で、７５μｌの完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）中でプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、培地に２５μｌの追加の培地（ＴＲＡＩＬ  Ｒ２特異的なまたは負の対照のタンパク質の連続希釈を含有）を補充した。全ての処理は、二重のウェルで行った。市販のＴＲＡＩＬ  リガンド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、ＴＲＡＩＬ受容体誘導性の細胞死についての正の対照として用いた。
【０４８５】
７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを、製造業者の指示に従って用いた。アッセイの発光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定した。細胞生存度の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均の発光で除すことによって決定した。
【０４８６】
２つの可変量が効力を決定する：ある構築物が細胞の生存度を５０％まで阻害する濃度（ＥＣ５０）および細胞生存度の最大阻害。図２１は、一般的な傾向として、Ｔｎ３単量体の親和性が大きいほど、抗体様構築物のＥＣ５０が低くなることを示す。なぜなら、Ｇ６は、１Ｅ１１よりも低いＥＣ５０を有し、かつ１Ｅ１１は、１Ｃ１２よりも低いＥＣ５０を有するからである。
実施例１６
直鎖状のＴｎ３の薬物動態
１つのタンデム（直列）あたりのＴｎ３モジュールの数の関数として直鎖状のＴｎ３タンデム半減期を決定するため、Ｇ６単量体（配列番号１３８）、Ｇ６タンデム４（配列番号１４３）、Ｇ６タンデム６（配列番号１９２）、およびＧ６タンデム８（配列番号１４５）を、マウスに注射し、Ｔｎ３の血清濃度をＥＬＩＳＡによってモニターした。投与の経路は、腹腔内（ＩＰ）注射であった。実験デザインを、表２０に示す。マウスを、１時点あたり１５０μＬ採血した。Ｔｎ３を、ＥＬＩＳＡによって血清中で検出し、ここでは自家で生成したＴＲＡＩＬ  Ｒ２コーティングしたプレートを、ＰＢＳＴ１％ミルク中で希釈した血清とともにインキュベートした。最初のＥＬＩＳＡを行って、所定の時点について、アッセイの動的な範囲内にシグナルがあるように正確な希釈範囲を決定した。結合したＴｎ３を、ＰＢＳＴ１％ミルク中のウサギからのポリクローナル抗Ｔｎ３血清の１，０００希釈中の１（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）で、続いて、ロバ抗ウサギＨＲＰのＰＢＳＴ１％ミルク中の１０，０００希釈中の１（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。各々の構築物について、標準曲線を作製し、統計学的分析を、自家の統計学的プログラムを用いて行った。
【０４８７】
「最大血漿濃度」（「Ｃｍａｘ」）という用語は、患者に対する試験物質の投与後、血漿中のタンデムＴｎ３の最高の観察された濃度を指す。
【０４８８】
「Ｔｍａｘ」という用語は、最大血漿濃度Ｃｍａｘまでの時間を指す。
【０４８９】
「曲線下面積」（「ＡＵＣ」）という用語は、時間に対する血漿中のタンデムＴｎ３の濃度のプロットにおける曲線下の面積である。ＡＵＣは、時間間隔の間の即時的血漿濃度（Ｃｐ）の積分の指標であり得、質量＊時間／容積の単位を有する。しかし、ＡＵＣは通常は、時間間隔ゼロから無現まで示される。従って、本明細書において用いる場合、「ＡＵＣｉｎｆ」とは、無限の時間間隔にまたがるＡＵＣを指す。
【０４９０】
「生物学的半減期」（「Ｔ１／２」）という用語は、タンデムＴｎ３の血漿濃度がそのもとの値の半分になるのに必要な時間として規定される。
【０４９１】
「ＣＬ／Ｆ」という用語は、用量／ＡＵＣｉｎｆとして算出される見かけの総身体クリアランスを指す。
【０４９２】
生物学的半減期（Ｔ１／２）は、直鎖状分子についてタンデムＴｎ３の数が増大するとともに増大する。７つのＴｎ３を付加して単量体からタンデム８を作製することで、半減期はほぼ５０％まで増大した。価数の増大は、Ｔｍａｘには影響しなかった。しかし、価数が１から８へ増大することによって、それぞれ、ＣｍａｘおよびＡＵＣｉｎｆにおいて、約１０倍および７倍の増大が生じた。さらに、価数が１から８まで増大する場合、クリアランスにおける約７倍の低下（ＣＬ／Ｆ）が観察された。
【表１９】
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【表２０】
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【０４９３】
実施例１７
ｃｙｎｏ交差反応性の操作された増強
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）での前臨床毒性試験のために、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＴＲＡＩＬ  Ｒ２（ｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２）と交差反応する抗ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｔｎ３を開発することが所望される。本発明者らの最初の親和性成熟したリードクローンは、ｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２との交差反応が乏しいが、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する相同性は８８％である。交差反応性は、クローンＦ４（配列番号１３７）に基づくライブラリーを作製することによって増強されたが、このクローンは、親和性成熟から生じたクローンの間で最高のｃｙｎｏ交差反応性を有するクローンであった。
【０４９４】
２つのライブラリーを、飽和突然変異誘発によって作製した：１つは、ＦＧループ単独に多様性を有し、１つは、ＢＣおよびＦＧループに多様性を有した。低誤差率変異原性ＰＣＲをまた用いて、増強されたｃｙｎｏＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合に有益であり得るループの外側の変異を可能にした。４回のファージパニングを、自家で製造したｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２で行い、アウトプットを、ｐＳＥＣ発現ベクター中にクローニングした。ＥＬＩＳＡフォーマットにおける最初のヒットのスクリーニングのために、Ｔｎ３は、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に分泌され、抗ｈｉｓタグ抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて上清から捕捉された。
【０４９５】
捕捉されたＴｎ３に対する、溶液中のヒトまたはｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃのいずれかの結合を、抗ヒト−Ｆｃ−ＨＲＰによって検出した。ｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに対する有意な結合を有し、かつヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに対する結合を失うと思われなかったクローンを、引き続くスクリーニングＥＬＩＳＡのために選択して、ここではヒトまたはｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃのいずれかを、プレート上にコーティングして、Ｔｎ３上清を、滴定し、次いで抗ｈｉｓタグＨＲＰで検出した。クローンからクローンへの発現レベルの変化のレベルが低いため、およびまた溶液中に有する二価ＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃからの結合活性は、Ｔｎ３親和性における相違をマスクできなかったので、このＥＬＩＳＡによって、親和性識別が可能になった。１つの変異、ＤＥループの前のＤからＧの２つのアミノ酸の変異は、全ての操作されたｃｙｎｏ交差反応性クローンに存在したことが見出された（図２３Ａ）。このＤからＧへの変異を、もとのＦ４に操作して、Ｆ４ｍｏｄ１という名称のクローン（配列番号１９３）を作製し、ｃｙｎｏについての交差反応性は、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する犠牲的結合なしに大きく改善された（図２３Ｂ）。このＥＬＩＳＡでは、精製されたＦ４またはＦ４ｍｏｄ１による、Ｆ４ｍｏｄ１コーティングしたプレートに対する０．７５ｎＭのヒトまたはｃｙｎｏのＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃの結合の阻害を測定した。
【０４９６】
ｃｙｎｏのＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃに対するｃｙｎｏの交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに対するその結合の１０倍内であることが望ましい。また、ｃｙｎｏのＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃに対するｃｙｎｏの交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２−Ｆｃに対するＦ４の結合の１０倍内であることも望ましい。ｃｙｎｏ  ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０は、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０よりも３倍未満異なる。さらに、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０は、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するＦ４結合についてのＩＣ５０よりも６倍強い。従って、Ｆ４ｍｏｄ１は、意図される交差反応性の要件を満たす。
【０４９７】
実施例１８
増強されたｃｙｎｏ交差反応性クローンの生殖細胞系列の操作
クローンＦ４ｍｏｄ１をさらに操作して可能性のある免疫原性の危険性を低減するために生殖細胞系列から本質的でない変異を排除した。１２の異なる改変のパネルを作製して、ヒトおよびｃｙｎｏの両方のＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する結合に対して所定の変異からの効果があったか否かを決定した。図２４Ａは、最終クローンＦ４ｍｏｄ１２（配列番号１９４）の比較を示しており、これは、他の構築物に対して、結合に影響しない全ての試験した生殖細胞系列変異を組み込む、すなわち、Ｔｎ３生殖細胞系列、もとのＦ４親、およびクローンＦ４ｍｏｄ１（最初の増強された操作されたｃｙｎｏ交差反応性）。
【０４９８】
Ｆ４ｍｏｄ１２のアミノ酸配列は、天然のＴｎ３配列ＳＱで開始して、Ｌで終わり、ＡからＴへのフレームワーク２変異の逆転を有し、かつＤＥループの最後の２つのアミノ酸のＴＡからＮＱの逆転を有する。図２４Ｂは、Ｆ４、Ｆ４ｍｏｄ１、およびＦ４ｍｏｄ１２が全て、ヒトＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するそれらの結合においてお互いの６倍内であることを示す。Ｆ４ｍｏｄ１およびＦ４ｍｏｄ１２は、ｃｙｎｏのＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対するそれらの結合においてお互いの２倍内であることも示される。
【０４９９】
Ｆ４ｍｏｄ１２は、タンデム６（配列番号１６７）およびタンデム８（配列番号１６６）構築物中に再フォーマットされて、試験されたＧ６タンデム６（配列番号１４４）およびタンデム８（配列番号１４５）に対する力価の損失がないことが確認された。図２４Ｃおよび図２４Ｄによって、遺伝子操作された生殖細胞系列について、Ｃｏｌｏ２０５細胞株におけるＧ６タンデムと比較して増強されたｃｙｎｏ交差反応性Ｆ４ｍｏｄ１２タンデムは力価の損失がないことが示される。
【０５００】
実施例１９
ＴＲＡＩＬ耐性細胞株におけるＧ６タンデム８の活性
複数の細胞株が、ＴＲＡＩＬによる殺傷に耐性である。従って、本発明者らは、ＴＲＡＩＬ感受性細胞株におけるＴＲＡＩＬに対するＧ６タンデム８構築物の力価の増強が、ＴＲＡＩＬ耐性細胞株におけるＧ６タンデム８の力価に現れるか否かを評価した。いくつかの癌細胞株におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で決定した。簡潔に述べると、細胞を、９６−ウェルプレート上にプレートして、一晩接着させ、次いで、種々の濃度の組み換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ模倣Ｇ６タンデム８が含まれる培地（１０％ＦＢＳ含有）で処理した。４８〜７２時間後、細胞生存度を、製造業者のプロトコールに従って決定した。図２５は、ＴＲＡＩＬ耐性細胞株ＨＴ２９について、Ｇ６タンデム８が、強力な細胞殺傷活性を示すが、ＴＲＡＩＬは示さないことを示す。表２２は、Ｇ６タンデム８が細胞殺傷活性を多くの、ただし全てではない試験したＴＲＡＩＬ耐性細胞株で有することを示す。
【表２１】
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【０５０１】
実施例２０
ＴＲＡＩＬ  Ｒ２結合単量体の免疫原性研究
免疫原性は、いずれの治療タンパク質にとっても、それがヒト由来である場合でさえ、あり得る問題である。免疫原性応答は、炎症をもたらし得る中和抗体を通じて有効性を限定し得る。免疫応答の発達における最も重要な要因の１つは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激し得るエピトープの存在である。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ試験（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、試験タンパク質とともにインキュベートして、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２分泌をモニターする（Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．１０：２１９−２２７，２００７；Ｊａｂｅｒ  ＆  Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．４３：１２５６−１２６１，２００７；．Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ３：９９１−１０００，２００５；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２４：５６０−７２，２００４）。ＰＢＭＣは、世界の集団で発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプを表すドナーのプールから単離される。
【０５０２】
図２６に示されるＴｎ３単量体を、発現し（ＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨリンカー−Ｈｉｓタグ）、精製し、ＳＥＣによって単量体であることを確認し、上記のように内毒素除去のために濾過した。試験した全ての非野生型クローンは、ｃｙｎｏ交差反応性を増強するための操作の回からであった（図２３Ａ）。しかし、これらのクローンは、Ｆ４ｍｏｄ１バックグラウンドにおける結合に影響を示さなかった生殖細胞系列に対して変異を有した。これらのクローンをＥＬＩＳＡで試験して、生殖細胞系列の変異が結合に影響しなかったことを確認した。Ｔ細胞増殖アッセイおよびＩＬ−２分泌アッセイの両方で、２を超える刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）（ＳＩ）が、所定のドナーについての陽性応答として以前に確立された。平均のＳＩ，または陽性応答集団のＳＩの平均は、応答の強度の指標である。強力な応答を誘導することが公知の対照タンパク質である、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を両方のアッセイに含んだ。
【０５０３】
表２３は、全ての試験タンパク質についての平均ＳＩを示しており、これは、ＫＬＨについて有意に低く、かつ陽性平均ＳＩについての２というカットオフよりもそれほど高くなかった。さらに、試験タンパク質についての応答の頻度は、極めて低かった（９０％という過剰で応答した対照を除けば、全ての試験したタンパク質について１０％以下）。Ａｎｔｉｔｏｐｅによる以前の研究では、１０％未満というＥｐｉＳｃｒｅｅｎ応答は、臨床の免疫原性の危険性が低い指標であることが明らかになった。従って、試験した全てのＴｎ３が１０％以下の応答頻度を有するという本発明者らの観察によって、臨床上の免疫原性のリスクが低いことが示される。
【０５０４】
【表２２】
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【０５０５】
実施例２１
未精製および精製したＧ６タンデム８  Ｔｎ３の凝集状態
複数のシステインを含むタンパク質、例えば、内部ジスルフィド結合を含むタンデムリピートからできたタンパク質は、適切なジスルフィド対合を示さない場合が多いことは当該分野で公知である。ジスルフィドのスクランブリングは、培地中への発現を減少または排除し得る。タンパク質が培地中へ発現する場合、これは不適切に折り畳まれたタンパク質と、分子間の、ならびにミスマッチの分子間のジスルフィド対（凝集をもたらす）との混合物である場合がある。本発明者らのＳＥＣデータによって、細菌発現培地中のタンデムタンパク質のほとんどが、単量体の適切に折り畳まれた状態であることが明らかになった。Ｈｉタグ化Ｇ６タンデム８タンパク質のＮｉ−ＮＴＡ精製後、タンパク質のうち約１５％が凝集した。観察された凝集は、２ｍＭのＤＴＴによる還元によって、４％まで低下し（図２７Ａ）、このことは、ほとんどの凝集がジスルフィド媒介性であったことを示す。凝集物のほとんどを、上記のように、ＳＥＣ精製によって除去した（図２７Ｂ）。
【０５０６】
実施例２２
Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌異種移植片モデルにおけるＴＲＡＩＬ模倣物、Ｇ６ＴＮ６およびＧ６ＴＮ８の腫瘍増殖阻害の決定
ＴＲＡＩＬ  Ｔｎ３模倣物、Ｇ６タンデム６（Ｇ６ＴＮ６）（配列番号１４４）およびＧ６タンデム８（Ｇ６ＴＮ８）（配列番号１４５）の抗腫瘍活性を、Ｃｏｌｏ２０５、すなわちヒト結腸直腸癌異種移植片モデルで評価した。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で、５％ＣＯ２下で３７℃で半接着単層培養物として維持した。トリプシン処理によって回収した細胞を、ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）中で３×１０７細胞／ｍＬという最終濃度に再懸濁した。無胸腺雌性ヌードマウスに各々、右わき腹の皮下に（ＳＣ）３×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を注射した。本研究は、腫瘍が平均で約１７７ｍｍ３に達した時点で開始した。研究デザインは、表２４にまとめる。ＴＲＡＩＬを、ストック溶液から２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ３００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ７）で希釈して、体重に応じて（１０ｍＬ／ｋｇ）全部で５用量を毎日、表２４に示す用量で、静脈内に（ＩＶ）投与した。Ｇ６タンデム６（Ｇ６ＴＮ６）およびＧ６タンデム８（Ｇ６ＴＮ８）を、各々ストック溶液からＰＢＳで希釈して、体重に応じて（１０ｍＬ／ｋｇ）全部で５用量を毎日、表２４に示す用量で、静脈内に（ＩＶ）投与した。腫瘍容積および体重の測定を記録した。腫瘍の測定は、電子カリパスを用いて行い、そして腫瘍容積（ｍｍ３）は、腫瘍容積＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２という式を用いて算出した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ＴＧＩパーセント＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００として算出し、ここでＴ＝最終投与後の処置群の最終腫瘍容積であり、かつＣ＝最終投与後の対照群の最終腫瘍容積である。
【０５０７】
投与段階（ｄｏｓｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）（ＤＰ）の間（図２８）、３ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ６は、それぞれ、９２％（ｐ＜０．０００１）および９３％（ｐ＜０．０００１）の有意なＴＧＩを生じた（表２５）。同様に、最終濃度のための等モル調節後、２．２５ｍｇ／ｋｇおよび２５．５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８によって、それぞれ９３％（ｐ＜０．０００１）および９４％（ｐ＜０．０００１）という有意なＴＧＩが生じた（表２５）。３０ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬは、６０％のＴＧＩを生じた（ｐ＜０．００１）、（表２５）。
【０５０８】
再増殖段階（ｒｅｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）（ＲＰ）の３４日まで（図２８）、３ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ６は、なんらＣＲ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ：完全退縮）を生じなかったが、２．２５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８は、９０％のＣＲを生じた。３０ｍｇ／ｋｇというより高用量では、Ｇ６ＴＮ６は、５０％のＣＲを達成した。他方では、２５．５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８は、１００％のＣＲを生じた（表２６）。両方の用量からの結果によって、Ｇ６ＴＮ８は、Ｇ６ＴＮ６に比較して大きい有効性を生じたことが示唆される。しかし、両方とも特定の用量で有効性を示した。さらに重要なことに、両方の構築物とも、なんらＰＲもＣＲも生じなかったＴＲＡＩＬを有意にしのいだ。
【０５０９】
図２９に示すとおり、この研究の投与および再増殖段階の間、全ての用量でＧ６ＴＮ６およびＧ６ＴＮ８の両方にいかなる体重減少も観察されなかった。
【表２３】
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【０５１０】
【表２４】
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【表２５】
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【０５１１】
実施例２３
追加の標的の結合
特定の標的に結合するＦｎＩＩＩ足場は、本明細書に記載されるか、および／または当該分野で公知の方法によって生成され得る（例えば、ＷＯ２００９／０５８３７９を参照のこと）。あるいは、本明細書に記載される足場は、「ループグラフティング（ｌｏｏｐ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）」に供され、ここでは、公知の結合特異性の足場のループ配列を、所望の足場のβ鎖配列にグラフトする（例えば、Ｔｎ３足場のβ鎖配列、または図１６に示される配列）。表２７は、所望のβ鎖に対するグラフトのためのループ配列、例えば、表１に示されるものの非限定的な例を提供する。
【表２６】
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【０５１２】
前述の実施例は、本発明および本発明の方法の実施の種々の態様を例示説明する。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図していない。従って、前述の本発明は、理解の明確化の目的で例示説明および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、それに対して多くの変化および改変が、添付の特許請求の趣旨からも範囲からも逸脱することなくなされ得ることが容易に理解される。
【０５１３】
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって本明細書に援用されると詳細にかつ個々に示されるかのように、本明細書に参照によってここに援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１６Ｎ】
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【図１６Ｏ】
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【図１６Ｐ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013523179.tif 000093
2013523179.tif 000094