(57)【要約】バイオフィルムを成長させやすい表面を、バイオフィルムの成長を抑制するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面上におけるバイオフィルムの成長を抑制する方法。バイオフィルムを有する表面を、表面からバイオフィルムの一部又は全部を除去するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面からバイオフィルムを除去する方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを成長させやすい表面を、バイオフィルムの成長を抑制するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面上におけるバイオフィルムの成長を抑制する方法。
【請求項２】
溶液が非分解蘚類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非分解蘚類が葉又は葉の部分の形態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非分解蘚類が圧縮された葉又は葉の部分の形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非分解蘚類を保持材内に配置する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
保持材がメッシュバッグである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶液が非分解蘚類エキスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水性系が、温泉、水泳プール、水族館、噴水デッキ、給水塔、貯留槽、池、冷却塔、水ボトル、又はトイレである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
溶液を調製し、次に表面と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
水性系中に非分解蘚類を配置することによって溶液をその場で調製する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムの成長を３０％以上抑制するのに有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムの成長を５０％以上抑制するのに有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムの成長を７０％以上抑制するのに有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
クリスタルバイオレット染色によって抑制率を測定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
蘚類又は蘚類エキスが、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
バイオフィルムを有する表面を、表面からバイオフィルムの一部又は全部を除去するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面からバイオフィルムを除去する方法。
【請求項１７】
溶液が非分解蘚類を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非分解蘚類が葉又は葉の部分の形態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
非分解蘚類が圧縮された葉又は葉の部分の形態である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
非分解蘚類を保持材内に配置する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
保持材がメッシュバッグである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
溶液が非分解蘚類エキスを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
水性系が、温泉、水泳プール、水族館、噴水デッキ、給水塔、貯留槽、池、冷却塔、水ボトル、又はトイレである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
溶液を調製し、次に表面と接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
水性系中に非分解蘚類を配置することによって溶液をその場で調製する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムを３０％以上除去するのに有効なものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムを５０％以上除去するのに有効なものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量が、４８時間後にバイオフィルムを７０％以上除去するのに有効なものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
クリスタルバイオレット染色によって除去率を測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
蘚類又は蘚類エキスが、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年８月３０日出願の「蘚類を用いることによるバイオフィルム形成の抑制及びバイオフィルムの除去」と題された米国仮出願６１／３７８，２３２（その内容は参照として本明細書中に包含する）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、蘚類を用いてバイオフィルムの形成を抑制する方法、及び蘚類を用いてバイオフィルムを除去する方法に関する。ミズゴケ類が好ましい。
【背景技術】
【０００３】
人工水系におけるバイオフィルムの蓄積は、数多くの重大な問題を引き起こす。具体的な系によって、これらの問題としては、健康及び感染の問題、増加する維持費用、及び相当な運転の非効率性が挙げられる。これらの系内からバイオフィルムを軽減又は除去することは困難であり、通常はきつく毒性の化学物質を用いることが必要である。
【０００４】
これまでの研究によって、ミズゴケ類が浮遊性（プランクトン様）のバクテリアの成長を大きく抑制することが示されている。米国特許７，４９７，９４７−Ｂ２、及び米国特許出願公開２００６／００３２１２４−Ａ１（いずれも参照として本明細書中に包含する）を参照。「ミズゴケ類」は、ミズゴケが多く生息する沼の中に共存している一定範囲の植物種を示す総称表現である。「ピートモス」は一般に分解又は堆肥化したミズゴケ類を指すことを留意すべきである。ミズゴケ類は、種々の製品において用いるために通常的に収穫されている。好ましくは、蘚類の茎ではなく花弁を収穫することができる。通常は、植物物質の大きな片（根、小枝等）は取り除く。スラリーから水を除去して、蘚類を乾燥する。蘚類は、包装又は輸送の前に圧縮することができる。種々の添加剤を用いて、蘚類の吸収特性又は機械的特性を変化させることができる。ミズゴケ類は容易に入手でき、比較的安価であるので、種々の製品において、主として流体を吸収するために用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，４９７，９４７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／００３２１２４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
バイオフィルムを抑制及び除去する製品に対する必要性が当該技術において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、バイオフィルムを成長させやすい表面を、バイオフィルムの成長を抑制するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面上におけるバイオフィルムの成長を抑制する方法を提供する。本発明は、バイオフィルムを有する表面を、表面からバイオフィルムの一部又は全部を除去するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面からバイオフィルムを除去する方法を提供する。溶液は、調製して系に加えるか、又は、水性系中に蘚類を配置することによって、特に保持材中に蘚類を配置して次にこれを水性系中に配置することによって、その場で調製することができる。
【０００８】
上記の一般的な記載及び下記の詳細な記載は両方とも例示及び説明のためのものであり、特許請求する発明の更なる説明を与えるように意図されると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＭＢＥＣアッセイにおいてバイオフィルムの形成を抑制する水性蘚類エキス（ＭＸ）の能力を示す。
【図２】図２は、ＭＢＥＣアッセイにおいてバイオフィルムを抑制又は除去する水性蘚類エキスの用量応答効果を示す。
【図３】図３は、ＭＢＥＣアッセイにおいてバイオフィルムを抑制又は除去する水性蘚類エキスの時間経過研究を示す。
【図４】図４は、蘚類エキスの寸法濾過フラクションのＭＢＥＣアッセイを示す。
【図５】図５は、トリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）の希釈液又は種々の濃度の蘚類エキスの中で成長させたPAO1培養物から抽出したピオシアニンの平均ＯＤを示す。
【図６】図６は、トリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）の希釈液又は種々の濃度の蘚類エキスの中で成長させたPAO1培養物から抽出したピオシアニンの平均ＯＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明においては、蘚類を用いてバイオフィルムの成長を抑制するか又はそれを除去することができる。好ましい態様においては、蘚類は、蘚類が水性雰囲気中で崩壊するのを抑止するメッシュ材料内に被包又は封入する。好ましいメッシュ材料としては、約０．１〜１ｍｍの範囲のメッシュサイズを有する、ナイロン又はポリプロピレンのようなポリマーを含むものが挙げられる。ポリマーは、安価であり、分解に対して抵抗性である可能性があるので、一般に好ましい。
【００１１】
米国の北部ミネソタの沼から収穫することができるS. papillosum、及びDobson, Westland,ニュージーランドのSutton's Mossから圧縮板として商業的に入手できるS. cristatumが、本発明において用いるのに好適である。これらの種の蘚類は、これら単独か、或いは本発明の装置及びシステム内で一緒に用いることができる。通常は及び好ましくは、蘚類は清浄化して、泥のような小さい粒子、並びに根及び葉のようなより大きい屑片を除去する。商業的に入手できる蘚類は、種子を破壊するために、製造者によって包装する前に燻蒸処理することができる。
【００１２】
好ましい態様においては、蘚類を機械的手段によって所望の寸法及び形状に切断する。蘚類は次に好ましくは、オートクレーブ処理によるか、エチレンオキシドへの曝露によるか、或いは当業者に公知の他の手段によって滅菌する。滅菌によって蘚類中の生きている有機体が破壊され、これによって、望ましくないか又は外部からのバクテリアの問題が本発明の装置を用いる環境中に導入されることが回避される。その後に蘚類は使用可能状態になる。
【００１３】
本発明は、バイオフィルムを成長させやすい表面を、バイオフィルムの成長を抑制するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面上におけるバイオフィルムの成長を抑制する方法を提供する。蘚類又は蘚類エキスは、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００１４】
蘚類は、葉又は葉の部分の形態であってよく、圧縮葉又は葉の部分の形態であってよい。一態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムの成長を３０％以上抑制するのに有効なものである。他の態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムの成長を５０％以上抑制するのに有効なものである。一態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムの成長を７０％以上抑制するのに有効なものである。一態様においては、抑制率はクリスタルバイオレット染色によって測定する。
【００１５】
本発明は、バイオフィルムを有する表面を、表面からバイオフィルムの一部又は全部を除去するのに有効な量の非分解蘚類又は非分解蘚類エキスを含む溶液と接触させることを含む、水性系中の表面からバイオフィルムを除去する方法を提供する。蘚類又は蘚類エキスは、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００１６】
蘚類は、葉又は葉の部分の形態であってよく、圧縮葉又は葉の部分の形態であってよい。一態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムを３０％以上除去するのに有効なものである。他の態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムを５０％以上除去するのに有効なものである。一態様においては、非分解蘚類又は非分解蘚類エキスの量は、４８時間後にバイオフィルムを７０％以上除去するのに有効なものである。一態様においては、除去率はクリスタルバイオレット染色によって測定する。
【００１７】
溶液は、調製して系に加えるか、又は、水性系中に蘚類を配置することによって、特に保持材中に蘚類を配置して次にこれを水性系中に配置することによって、その場で調製することができる。保持材は、ポリマーマトリクス、バイオマトリクス、膜、ゲル、又はヒドロゲルであってよい。蘚類は、メッシュバッグ内に被包することができる。
【００１８】
蘚類は圧縮することができ、片の形態であってよい。蘚類は、オートクレーブ処理によって滅菌するか、化学的処理によって滅菌するか、或いはエチレンオキシドによる処理によって滅菌することができる。蘚類は、酸性溶液、特に酢酸の溶液で洗浄することができる。蘚類は、酸性溶液で洗浄し、次に塩溶液で洗浄することができる。水性系は水を含む任意の系であってよい。水は、温泉、水泳プール、水族館、噴水デッキ、給水塔、貯留槽、池、冷却塔、水ボトル、又はトイレにおけるものであってよい。
【００１９】
蘚類は、（ｉ）非分解蘚類を乾燥し；そして（ｉｉ）蘚類を滅菌する；ことによって調製することができる。この方法には、蘚類を圧縮し、蘚類を圧縮して蘚類を片に切断し、オートクレーブ処理、化学的処理、又はエチレンオキシドによる処理によって蘚類を滅菌することを更に含ませることができる。蘚類はミズゴケ類であってよい。蘚類は、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００２０】
蘚類は、（ｉ）非分解蘚類を酸性溶液と接触させ；そして（ｉｉ）蘚類を乾燥させる；ことによって調製することができる。この方法には、工程（ｉ）の後に、非分解蘚類を塩溶液と接触させることを含ませることができる。一態様においては、酸性溶液は酢酸の溶液である。蘚類はミズゴケ類であってよい。蘚類は、sphagnum papillosum、sphagnum cristatum、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【実施例】
【００２１】
材料及び方法：
材料：
Pseudomonas aeruginosaの２種類の菌株：700888及びBAA-47(PAO1)を、ATCC, Manassas, Virginia,米国から入手した。全ての培養物を成長させ、Bactoトリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey,米国）中に保持した。ミズゴケ類(S. cristatum)をSutton's Moss,ニュージーランドから入手した。
【００２２】
蘚類エキス：
２５％のＴＳＢ中に蘚類（１ｇ／２０ｍＬ）を２時間浸漬することによって、水性蘚類エキス（ＭＸ）を調製した。真空濾過によって液体ＭＸを蘚類から抽出し、ｐＨを７．０に調節し、濾過滅菌した。２５％ＴＳＢ中の未希釈（１／１）又は種々の濃度に希釈したＭＸを、下記に記載するように試験するために用いた。
【００２３】
ＭＢＥＣアッセイ：
Innovotech, Edmonton, Alberta,カナダからの９６ウェルＭＢＥＣハイスループット（ＨＴＰ）アッセイシステムを用いて、バイオフィルムを成長させ、分析した。バイオフィルム抑制の研究に関しては、１３５μＬのＴＳＢ試料を、１５μＬの接種物と一緒に９６ウェルプレートのウェルに加え、プレートを固定蓋で覆った。他に示さない限りにおいては、バイオフィルムは、オービタルシェーカー上で２４時間培養した。バイオフィルム除去の研究に関しては、１５０μＬのＴＳＢ接種物をウェル毎に加えて、バイオフィルムを２４時間成長させ、次にペグを試料プレートに移して更に２４時間インキュベートした。インキュベートの後、ペグをすすぎ、０．１％のクリスタルバイオレットで染色し、ＭｅＯＨ中に溶解し、５５０ｎｍにおいてプレートリーダーで読み取った。対象ウェルと比べた処理ウェルの平均ＯＤ値から、バイオフィルム形成の抑制率又はバイオフィルムの除去率を計算した。
【００２４】
培養物中のピオシアニンの測定：
ＭＸ又は対照培地の希釈液にPAO1を接種し、Ｔ２５フラスコ内で振盪しながら３０℃において一晩培養した。２４時間後、チューブ内において５ｍＬの培地を３ｍＬのクロロホルムと混合し、３０秒間渦流混合した。チューブを５分間遠心分離し、ピオシアニン検出のためにクロロホルム底層を６９０ｎｍにおいて分光光度計で読み取った。
【００２５】
実施例１：
上記記載のSphagnum cristatumを用いて、水溶液中のエキスを生成させた。P. aeruginosa（ATCC 700888）の標準接種物を調製し、これを用いて９６ウェルのＭＢＥＣプレートのペグ上にバイオフィルムを生成させた。ＭＢＥＣハイスループット（ＨＴＰ）アッセイ装置はInnovotech Inc., Edmonton, Alberta,カナダによって製作されており、使用指示書（参照として本明細書中に包含する）に実質的にしたがってアッセイを行った。使用指示書の写しは、２０１０年８月３０日出願の米国仮出願６１／３７８，２３２において見ることができる。種々の濃度の濾過滅菌エキスを調製し、ＭＢＥＣアッセイ装置に加えた。プレートを振盪機上において３０℃でインキュベートした。接種後２４時間及び４８時間において、クリスタルバイオレット染色、次にメタノール抽出、及びプレートリーダー上での染色の定量を用いてバイオフィルムの測定を行った。結果は、２４時間及び４８時間の両方の時点において、バイオフィルムの形成が大きく抑制されたことを示した。
【００２６】
下記表１は、２４時間の時点におけるバイオフィルム形成に対するミズゴケ類の効果を示し、表２は、４８時間の時点におけるバイオフィルム形成に対するミズゴケ類の効果を示す。表１及び２は、処理（ミズゴケ類のｍｇ／ｍＬ）、平均光学密度（ＯＤ）、標準偏差（ＳＤｎ）、及び抑制率を示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
【表２】
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【００２９】
上記の結果は、２４時間及び４８時間の両方の時点におけるバイオフィルム形成の大きな抑制を示した。ミズゴケ類エキスは、２４時間及び４８時間の時点においてバイオフィルムの蓄積をそれぞれ最大で６１％及び８４％まで抑制することができた。この抑制は、４８時間にわたって維持される抑制効果と共に用量依存性であった。
【００３０】
実施例２：
図１に示すデータは、ＭＢＥＣアッセイにおいてバイオフィルムの形成を抑制するＭＸの能力を示す。ＭＢＥＣアッセイにおけるPA700888バイオフィルム形成の開始時において、１／１のＭＸを加えた。２４時間後にバイオフィルムの内容物を分析した。データは対照試料に対する抑制率（％）として表す。PA700888を用いる反復実験によって、ＭＸはバイオフィルムの形成を対照試料に対して平均で、クリスタルバイオレットで染色した場合（細胞様内容物）には６５％、アルシアンブルーで染色した場合（マトリクス内容物）には８６％抑制したことが示された。
【００３１】
実施例３：
図２に示すように、ＭＢＥＣアッセイにおいて、バイオフィルム形成の開始時において、或いは形成されたバイオフィルムに対して、種々の濃度のＭＸを加えた。ＭＸ添加の２４時間後に、クリスタルバイオレット染色によってバイオフィルム内容物を分析した。データは、対照試料に対する抑制率（％）、或いは対照試料に対する除去率（％）として表す。図２に示す用量応答研究からの結果は、バイオフィルムの形成、及び形成されたバイオフィルムの除去に対するＭＸの用量依存性効果を示す。
【００３２】
実施例４：
図３に示すように、ＭＢＥＣアッセイにおいて、バイオフィルム形成の開始時において、或いは形成されたバイオフィルムに対して、１／１のＭＸを加えた。ＭＸの添加後の種々の時間において、クリスタルバイオレット染色によってバイオフィルム内容物を分析した。データは、対照試料に対する抑制率（％）、或いは対照試料に対する除去率（％）として表す。図３に示す時間経過研究によって、バイオフィルムの抑制及び除去の両方がＭＸによって１２時間にわたって増大することが示される。抑制率及び除去率は１２時間の時点においてピークになり、一定に維持される。
【００３３】
実施例５：
図４は、蘚類エキスの寸法濾過フラクションのＭＢＥＣアッセイを示す。１００、１０、５、１、及び０．５ｋｄａの寸法フラクションを調製し、実施例１と同じようにしてＭＢＥＣアッセイにおいて試験した。図４において、影付きの棒は寸法限界より大きいフラクションに関する結果を示し、影なしの棒は寸法限界より小さいフラクションに関する結果を示す。
【００３４】
実施例６：
図５は、トリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）の希釈液中で成長させたPAO1培養物から抽出したピオシアニン（Pseudomonas aeruginosaによって産生される毒性因子）の平均ＯＤを示す。ピオシアニンの減少率（％）も示す。結果は２４時間の時点において測定した。図５を作成するために用いた結果を下表３に示す。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
実施例７：
実施例７は実施例６の実験の繰り返しである。図６に示すように、PAO1によるピオシアニン産生に対するＭＸ投与の効果を測定した。ピオシアニンは、バイオフィルム形成において役割を果たすと考えられている毒性因子である。種々の濃度のＭＸの存在下でPAO1を成長させ、ピオシアニンレベルを分光光度測定で求めた（図６）。ＭＸの存在下で成長させたPAO1は、ピオシアニンの用量依存性の減少を示した。
【００３７】
ＭＸの希釈液を精製ピオシアニン（Sigma P0046）と直接混合した場合には、ＭＸによるピオシアニン顔料の減少はなく、これにより、ＭＸはピオシアニンを直接的には減少させないことが示される。ＭＸ寒天プレート上で成長させた培養物も、対照試料に対してピオシアニン顔料の減少を示した。
【００３８】
以下の結論に達した。第１に、ミズゴケ類のエキスによってP. aeruginosaバイオフィルムの形成が抑制され、P. aeruginosaバイオフィルムの除去が促進される。第２に、バイオフィルム形成の抑制、及び形成されたバイオフィルムの除去は、用量及び時間依存性である。第３に、生物化学的研究によって、抑制活性は、おそらくは複数の化合物の組合せによるものであることが示される。第４に、ミズゴケ類エキスによるバイオフィルムの抑制には、ピオシアニンのようなバイオフィルム表現型を制御する役割を果たす毒性因子の変調が含まれる可能性がある。第５に、バイオフィルムの天然の植物性抑制剤を用いることは、きつい毒性の方法の使用に対する有用な代替法にすることができる。
【００３９】
上記の記載及び図面は本発明の幾つかの態様を記載する目的で与えるものであり、いかなるようにも発明の範囲を限定することは意図しない。発明の精神又は範囲から逸脱することなく種々の修正及び変更を行うことができることは、当業者に明らかになるであろう。而して、本発明は、特許請求の範囲及びそれらの均等範囲内に含まれるならば本発明の修正及び変更をカバーすると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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