(57)【要約】本発明は、親油性カチオン、疎水性部分、およびＰＥＴ核を含むイメージングプローブを提供する。本発明はまた、そのようなイメージングプローブの生成のための前駆体分子、および被験体においてミトコンドリア膜電位を分析するためのプローブを用いる方法を提供する。イメージングプローブは、例えば、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）および／または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に用いてもよい。親油性カチオンは、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）であってもよく、またはそれを含んでもよい。疎水性部分は、脂肪族鎖、例えば、少なくとも５個の炭素原子を含む脂肪族鎖であってもよく、またはそれを含んでもよい。疎水性部分は、直鎖アルカン鎖、例えば、直鎖デシル鎖または直鎖ウンデシル鎖を含んでもよい。ＰＥＴ核は、例えば、１８Ｆであってもよい。
2013523702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性カチオン、疎水性部分、およびＰＥＴ核を含むイメージングプローブ。
【請求項２】
前記親油性カチオンがトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）であるか、またはトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）を含む、請求項１に記載のイメージングプローブ。
【請求項３】
前記疎水性部分が、少なくとも５個の炭素原子を含む脂肪族鎖を含む、請求項１または２に記載のイメージングプローブ。
【請求項４】
前記疎水性部分が、８〜１５個の炭素原子を含む脂肪族鎖を含む、請求項３に記載のイメージングプローブ。
【請求項５】
前記疎水性部分が直鎖アルキル鎖を含む、請求項４に記載のイメージングプローブ。
【請求項６】
前記疎水性部分が、前記親油性カチオンと前記ＰＥＴ核との間のリンカーとして働く、前述の請求項のいずれか一項に記載のイメージングプローブ。
【請求項７】
前記ＰＥＴ核が以下の群：１１Ｃ、１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１３Ｎ、または１５Ｏから選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載のイメージングプローブ。
【請求項８】
被験体においてミトコンドリア膜電位を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）前述の請求項のいずれか一項に記載のイメージングプローブを被験体に投与する工程；
（ｉｉ）該プローブを可視化する工程；および
（ｉｉｉ）ミトコンドリア膜電位を推定する工程
を含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によってミトコンドリア膜電位を分析する工程を含む、被験体において腫瘍を可視化するための方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法によってミトコンドリア膜電位を分析する工程を含む、被験体においてミトコンドリア損傷を調べるための方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法によってミトコンドリア膜電位を分析する工程を含む、ミトコンドリアのエネルギー状態における変化を伴う病状を診断および／またはモニタリングするための方法。
【請求項１２】
試験化合物を被験体に投与する工程、および請求項８に記載の方法によってミトコンドリア膜電位の任意の変化を分析する工程を含む、試験化合物のミトコンドリア電位への効果を調べるための方法。
【請求項１３】
（ｉ）請求項８に記載のミトコンドリア膜電位を分析するための方法；
（ｉｉ）請求項９に記載の被験体において腫瘍を可視化するための方法；
（ｉｉｉ）請求項１０に記載の被験体においてミトコンドリア損傷を調べるための方法；
（ｉｖ）請求項１１に記載のミトコンドリアのエネルギー状態における変化を伴う病状を診断および／またはモニタリングするための方法；
（ｖ）請求項１２に記載の試験化合物のミトコンドリア電位への効果を調べるための方法
に用いるための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のイメージングプローブ。
【請求項１４】
親油性カチオンおよび疎水性部分を含む前駆体分子であって、ＰＥＴ核のアニオン型と反応して、請求項１〜７のいずれか一項に記載のイメージングプローブを生成することができる、前駆体分子。
【請求項１５】
前記ＰＥＴ核のアニオン型と反応するメシレート基を含む、請求項１４に記載の前駆体分子。
【請求項１６】
請求項１４に記載の前駆体分子であって、該前駆体分子は、１８Ｆ−と反応して１８Ｆ−フルオロアルキルＴＰＰを形成することができるメシル化アルキルトリフェニルホスホニウム化合物である、前駆体分子。
【請求項１７】
前記ＰＥＴ核のアニオン型を請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の前駆体分子と反応させる工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のイメージングプローブを生成するための方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のイメージングプローブを生成して、被験体に投与するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）１８Ｆ−を合成する工程；
（ｉｉ）請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の前駆体分子へ１８Ｆ−を組み込んで、イメージングプローブを生成する工程；
（ｉｉ）該イメージングプローブを被験体に投与する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの取り込みを増加させるための方法であって、該イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの組織：循環比を増加させるための方法であって、該イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記イメージングプローブの疎水性が、少なくとも５個の炭素原子を有するアルキル鎖を組み込むことによって増加させられる、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インビボでのミトコンドリアのエネルギー状態（ｅｎｅｒｇｉｓａｔｉｏｎ）の可視化のための、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの技術に用いるイメージングプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ミトコンドリア機能障害は、がん、糖尿病、心不全、心血管疾患および肝疾患、ＡＩＤＳ、自己免疫障害、変性疾患、ならびに加齢の病態生理を含む幅広い範囲の病状に関与する。
【０００３】
ミトコンドリア機能障害が関与する疾患は、ミトコンドリア膜電位の著しい変化（ΔΨｍ）に関連することが多い。ミトコンドリア膜電位の変動は、がんなどのアポトーシスの抑制、またはＡＩＤＳおよび変性疾患などのアポトーシスの増強のいずれかを伴う病状における重要な特性である。それはまた、ＤＮＡ変異および酸化ストレスなどのミトコンドリア機能障害によって直接的に引き起こされる多くの疾患とも関連している。
【０００４】
したがって、患者においてミトコンドリア機能をモニタリングすることへの必要性がある。
【０００５】
ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）は、患者内の生物組織および代謝をイメージングするために広く用いられている技術である。１８Ｆなどの短命なポジトロン放出核がプローブ分子へ組み込まれ、患者へ注射される。その後、プローブは特定の組織に蓄積する。プローブの位置は、ＰＥＴスキャナーを用いてγ線放射から可視化することができ、プローブの局所的濃度は断層撮影から推定することができる。
【０００６】
テトラフェニルホスホニウムカチオンまたはトリフェニルホスホニウムカチオンなどの親油性カチオンは、原形質膜およびミトコンドリア膜を貫き、内膜にわたる負の膜電位のためにミトコンドリア内に選択的に蓄積する。
【０００７】
ミトコンドリア機能障害のイメージング（非特許文献１）、腫瘍イメージング（非特許文献２；Ｗａｎｇら（２００７）  ５０：５０５７−５０６９）、および冠動脈疾患の診断のためのイメージング（非特許文献３）のために、単純なＴＰＰカチオンに基づいたトレーサーをＰＥＴに用いることが示唆されている。
【０００８】
本発明は、公知のミトコンドリア標的化ＰＥＴプローブの改善に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｌａｂｅｌ．Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．（２００５）４８：１３１−１３７
【非特許文献２】Ｍａｄａｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．（１９９９）４０：１１８０−１１８５
【非特許文献３】Ｍａｄａｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．（２００６）４７：１３５９−１３６６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の態様の概要）
本発明者らは、驚くべきことに、イメージングプローブの疎水性が、例えば、疎水性部分を組み込むことによって、増加した場合には、これは、ミトコンドリア内の蓄積の程度を大いに増加させ、かつ循環からのプローブのクリアランスを増加させて、より大きい組織：循環比をもたらすことを見出した。
【００１１】
同時に、これらの因子は、本発明の疎水性ミトコンドリア標的化イメージングプローブが、インビボでのミトコンドリアのエネルギー状態の可視化のために現在用いられているイメージングプローブより、２０〜１００倍感度が高く、かつ組織ローディングおよびコントラスト特性がより良いことを意味する。
【００１２】
したがって、第１の態様において、本発明は、親油性カチオン、疎水性部分、およびＰＥＴ核を含むイメージングプローブを提供する。
【００１３】
イメージングプローブは、例えば、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）および／または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に用いてもよい。
【００１４】
親油性カチオンは、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００１５】
疎水性部分は、脂肪族鎖、例えば、少なくとも５個の炭素原子を含む脂肪族鎖であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００１６】
疎水性部分は、直鎖アルカン鎖、例えば、直鎖デシル鎖または直鎖ウンデシル鎖を含んでもよい。
【００１７】
ＰＥＴ核は、例えば、１８Ｆであってもよい。
【００１８】
疎水性部分は、親油性カチオンとＰＥＴ核との間のリンカーとして働いてもよい。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、以下の工程を含む、被験体においてミトコンドリア膜電位を分析するための方法を提供する：
（ｉ）本発明の第１の態様によるイメージングプローブを被験体に投与する工程；
（ｉｉ）プローブを可視化する工程；および
（ｉｉｉ）ミトコンドリア膜電位の絶対的または相対的大きさを推定する工程。
【００２０】
ミトコンドリア膜電位は、例えば、腫瘍を可視化するために、ミトコンドリア損傷を調べるために、被験体におけるミトコンドリアのエネルギー状態における変化を伴う病状を診断／モニタリングするために、または試験化合物のミトコンドリア電位への効果を調べるために、分析されてもよい。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、以下に用いる、本発明の第１の態様によるイメージングプローブを提供する：
（ｉ）ミトコンドリア膜電位を分析するための方法；
（ｉｉ）被験体において腫瘍を可視化するための方法；
（ｉｉｉ）被験体においてミトコンドリア損傷を調べるための方法；
（ｉｖ）被験体において病状を診断および／またはモニタリングするための方法；または
（ｖ）試験化合物のミトコンドリア電位への効果を調べるための方法。
【００２２】
第４の態様において、本発明は、ＰＥＴ核のアニオン型と反応して、本発明の第１の態様によるイメージングプローブを生成することができる、親油性カチオンおよび疎水性部分を含む前駆体分子を提供する。
【００２３】
前駆体分子は、ＰＥＴ核のアニオン型と反応するメシレート基を含んでもよい。例えば、前駆体分子は、１８Ｆ−と反応して１８Ｆ−フルオロアルキルＴＰＰを形成することができる、メシル化アルキルトリフェニルホスホニウム化合物であってもよい。
【００２４】
第５の態様において、本発明は、ＰＥＴ核のアニオン型を本発明の第４の態様による前駆体分子と反応させる工程を含む、本発明の第１の態様によるイメージングプローブを生成するための方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の第１の態様によるイメージングプローブを生成し、被験体に投与するための方法を提供する：
（ｉ）１８Ｆ−などのＰＥＴ核のアニオン型を合成する工程；
（ｉｉ）本発明の第４の態様のいずれかによる前駆体分子へＰＥＴ核のアニオン型を組み込んで、イメージングプローブを生成する工程；
（ｉｉ）イメージングプローブを被験体に投与する工程。
【００２６】
本発明はまた、以下を提供する：
（ｉ）イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの取り込みを増加させるための方法；および
（ｉｉ）トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの組織：循環比を増加させるための方法であって、イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、方法。
【００２７】
イメージングプローブの疎水性は、例えば、少なくとも５個の炭素原子を有するアルキル鎖の組み込みによって増加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例に用いられるＴＰＰカチオンの構造を示す図である。
【図２】図２は、ｉｖ注射後の［３Ｈ］ＭｉｔｏＱのマウス組織への取り込みの時間経過を示す図である。１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＭｉｔｏＱのボーラスを、ｉｖ尾静脈注射によってマウスに注射した。示された時間において、マウスを屠殺し、組織における［３Ｈ］ＭｉｔｏＱ含有量を決定した。データは、ｎｍｏｌ  ＭｉｔｏＱ／ｇ湿重量組織であり、１時点あたりの２匹の別々のマウスについての平均±幅である。Ａ：肝臓および腎臓、Ｂ：心臓、筋肉、脳、および白色脂肪組織（脂肪）。ＣおよびＤ：肝臓および腎臓について（Ｃ）、ならびに心臓、筋肉、脳、および白色脂肪組織（脂肪）について（Ｄ）、それぞれ、ＭｉｔｏＱの注射後の最初の１時間の観察。
【図３】図３は、ｉｖ注射後の［３Ｈ］ＴＰＰ化合物の循環からのクリアランスの時間経過を示す図である。１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＴＰＰ化合物のボーラスを、ｉｖ尾静脈注射によってマウスに注射した。示された時間において、マウスを屠殺し、血液中における［３Ｈ］ＴＰＰ含有量を決定した。データは、ｎｍｏｌ  ＴＰＰ化合物／ｍｌ血液であり、１時点あたりの２匹の別々のマウスについての平均±幅である。Ａ：［３Ｈ］ＭｉｔｏＱ；Ｂ：［３Ｈ］デシルＴＰＰおよび［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰ；Ｃ：［３Ｈ］ＴＰＭＰ。
【図４】図４は、［３Ｈ］デシルＴＰＰおよび［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの組織への取り込みの時間経過を示す図である。１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］デシルＴＰＰまたは［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰのボーラスを、尾静脈への注射によってマウスに注射した。示された時間において、マウスを屠殺し、組織における［３Ｈ］デシルＴＰＰまたは［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの含有量を決定した。データは、１時点あたりの２匹の別々のマウスについての平均±幅である。Ａ：［３Ｈ］デシルＴＰＰについて肝臓および腎臓、Ｂ：［３Ｈ］デシルＴＰＰについて心臓、筋肉、脳、および白色脂肪組織（脂肪）、Ｃ：［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰについて全ての組織。
【図５】図５は、［３Ｈ］ＴＰＭＰの組織への取り込みについての時間経過を示す図である。１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＴＰＭＰのボーラスを、尾静脈への注射によってマウスに注射した。示された時間において、マウスを屠殺し、組織における［３Ｈ］ＴＰＭＰの含有量を決定した。データは、１時点あたりの２匹の別々のマウスについての平均±幅である。Ａ：肝臓および腎臓、Ｂ：心臓、筋肉、脳、および白色脂肪組織（脂肪）。
【図６】図６は、異なる時間におけるＴＰＰ化合物の組織への取り込みの比較を示す図である。１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＭｉｔｏＱ、［３Ｈ］デシルＴＰＰ、［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰ、または［３Ｈ］ＴＰＭＰのｉｖボーラスをマウスに注射し、１５分（Ａ、Ｂ）、１時間（Ｃ、Ｄ）、または５時間（Ｅ、Ｆ）において、マウスを屠殺し、［３Ｈ］ＴＰＰ化合物の組織含有量を決定した。データは、１時点あたりの２匹の別々のマウスについての平均±幅であり、Ａ、Ｃ、およびＥにおいては、ｎｍｏｌ  ＴＰＰ化合物／ｇ湿重量組織であり、Ｂ、Ｄ、およびＦにおいては、ｎｍｏｌ  ＴＰＰ化合物／ｍｌ血液である。
【図７】図７は、インビボでのＴＰＰ化合物のミトコンドリア取り込みを示す図である。Ａ：１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰのボーラスを、尾静脈への注射によってマウスに注射した。１５分後、ＤＮＰ（２００μｇ／ｋｇまたは３００μｇ／ｋｇ）または生理食塩水キャリアをマウスにｉｐ注射し、さらに１５分後、マウスを屠殺し、組織における［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの含有量を決定した。データは、１条件あたりの２匹のマウスについての平均±幅である。Ｂ：ＩＡＭ−ＴＰＰが細胞内のミトコンドリア内へ取り込まれたことが示されており、そこで、ＩＡＭ−ＴＰＰはチオールタンパク質と反応して、チオエーテル付加物を形成し、その後、その付加物は、イムノブロッティングによって検出することができる。Ｃ：細胞におけるＩＡＭ−ＴＰＰのミトコンドリアへの結合の共焦点イメージ。Ｃ２Ｃ１２細胞を１μＭ  ＩＡＭ−ＴＰＰ±１０μＭ  ＦＣＣＰと３時間インキュベートした。その後、細胞を固定し、免疫蛍光共焦点顕微鏡により可視化されるＴＰＰ部分に対する抗血清で標識することにより、細胞内のＴＰＰ部分の位置を決定した。対照実験は、ＩＡＭ−ＴＰＰ結合がミトコンドリア特異的色素Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅと共局在することを確認した（データは示していない）。Ｄ：５００ｎｍｏｌのＩＡＭ−ＴＰＰのボーラスを、尾静脈への注射によってマウスに注射した。１時間後、マウスを屠殺し、肝臓および心臓のミトコンドリアを調製した。ミトコンドリア（４０μｇタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＩＡＭ−ＴＰＰで標識されているタンパク質を、ＴＰＰ部分に対する抗血清を用いるイムノブロッティングによって検出した。ＩＡＭ−ＴＰＰに曝露されていないマウス由来のミトコンドリアを対照として用いた。実験は、３匹の別々のマウスについて繰り返され、類似した結果であった。
【図８】図８は、ミトコンドリア標的化ＰＥＴプローブ１８Ｆ−フルオロウンデシルＴＰＰの合成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ））
ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）は、身体における機能的プロセスの３次元イメージまたは写真を生成する核医学イメージング技術である。そのシステムは、生物活性分子上で身体へ導入される、ポジトロン放出放射性核種（トレーサー）によって、間接的に放射される対のγ線を検出する。その後、身体内の３次元空間におけるトレーサー濃度のイメージが、コンピュータ分析によって再構築される。最新のスキャナーにおいて、この再構築は、同じ機械で、同じセッション中に患者に実施されるＣＴ  Ｘ線スキャンの助けを借りて達成されることが多い。
【００３０】
グルコース類似体フッ素−１８（Ｆ−１８）フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）は、臨床腫瘍学で広く用いられている、ＰＥＴのための生物活性分子である。このトレーサーは、グルコース使用細胞によって取り込まれ、ヘキソキナーゼによってリン酸化され、それゆえ、領域的なグルコース取り込みの観点からすれば、イメージングされたトレーサーの濃度は組織代謝活性を示す。
【００３１】
ミトコンドリアおよび／またはミトコンドリア膜電位の変化をイメージングするために、負の内膜電位（−１２０〜−１７０ｍＶ）によりミトコンドリア内に選択的に蓄積する親油性カチオンを用いることが可能である。そのような親油性カチオンには、ローダミン−１２３（Ｒｈ１２３）およびテトラフェニルホスホニウム塩が挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いられる、用語「ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）プローブ」または「イメージングプローブ」は、ポジトロン放出断層撮影法、ＳＰＥＣＴ、または任意の他のイメージング技術に用いるのに適した分子を意味し、それは、例えば注射によって、患者に投与することができ、目的の組織内に蓄積する。その後、プローブの位置および局所濃度は、ＰＥＴスキャニングおよび断層撮影法、ＳＰＥＣＴ、または別の型のイメージング技術を用いて推定することができる。
【００３３】
ミトコンドリア標的化イメージングプローブは、おそらく高いミトコンドリア膜電位のために、ミトコンドリア内に選択的に蓄積する。プローブの取り込みは、ΔΨｍ依存性であり得、それゆえに、プローブはミトコンドリアのエネルギー状態に関する情報を与えることができる。
【００３４】
本発明のプローブは、ミトコンドリアの完全性の関数である、身体における分布プロファイルを有し得る。
【００３５】
本発明のプローブは、ミトコンドリア表面電位（ΔΨｍ）の差異をイメージングし、機能障害性ミトコンドリアを有する細胞または組織をイメージングし、および機能障害性ミトコンドリアに関連した疾患または状態をイメージングまたはモニタリングするのに有用であり得る。
【００３６】
本発明のイメージングプローブは、親油性カチオン、疎水性部分、およびＰＥＴ核を含む。
【００３７】
（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））
単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）は、γ線を用いる核医学断層撮影イメージング技術である。それは、ガンマカメラを用いる通常の核医学平面イメージングと非常に似ているが、真の３Ｄ情報を提供することができる。この情報は、典型的には、患者を貫く断面スライスとして提示されるが、必要に応じて、自由に再フォーマットまたは操作することができる。
【００３８】
基本的技術は、γ放射性同位元素（放射性核種とも呼ばれる）の患者の血流への注入を必要とする。これは、特定の型の組織への化学結合特性のために、目的のリガンドへのマーカー放射性同位元素の付着を含み得る。この合体により、リガンドと放射性同位元素の組み合わせ（放射性医薬品）が、身体における目的の場所へ運ばれ、結合されることが可能になり、その後、（同位元素のγ放射により）リガンド濃度をガンマカメラによって見ることができる。
【００３９】
（親油性カチオン）
本発明のプローブの親油性カチオン部分は、高いミトコンドリア膜電位によりミトコンドリア内に蓄積する任意のカチオンであってもよい。カチオンは、それのミトコンドリアへのΔΨｍ依存性蓄積およびそれのリン脂質二重層の通過を促進する、非局在化した正電荷を有してもよい。
【００４０】
そのようなカチオンの例には、ローダミン−１２３およびホスホニウムカチオン、トリフェニルホスホニウムおよびテトラフェニルホスホニウム誘導体、アルソニウム誘導体、疎水基を有する四級アミン、例えば、テトラベンジルアンモニウム、ならびにローダミンに類似の非局在化した正電荷を有する疎水性芳香族系が挙げられる。
【００４１】
［１１Ｃ］メチルトリフェニルホスホニウム、２２３−［１８Ｆ］フルオロプロピル、および４−［１８Ｆ］フルオロベンジルトリアリールホスホニウムなどのいくつかの標識ホスホニウムカチオンがミトコンドリア標的剤として用いられている。
【００４２】
親油性カチオンは、トリフェニルホスホニウムであってもよく、それは、疎水性部分（下記参照）と連結した場合、親油性アルキルトリフェニルホスホニウムカチオンを生成する。
【００４３】
（疎水性部分）
疎水性部分は、カチオンと、例えば共有結合によって会合した場合、カチオンの全体的な疎水性を増加させる。疎水性部分を含むイメージングプローブのオクタノール／ＰＢＳ分配係数は、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０、または１０００であってもよい。メチルＴＰＰおよびデシルＴＰＰのその係数は、それぞれ、０．３５および５０００であり、数が大きければ大きいほど高い疎水性を反映する。フルオロウンデシルは７４０の値を有する。
【００４４】
疎水性部分は、例えば、脂肪族鎖であってもよい。脂肪族鎖は、少なくとも２個の炭素原子、例えば、５個から２０個、８個から１５個、または１０個から１２個の炭素原子を含んでもよい。脂肪族鎖は１０個または１１個の炭素原子を有してもよい。
【００４５】
疎水性部分は、アルキル鎖を含んでもよく、そのアルキル鎖は、実質的にもしくは完全に直鎖アルキル鎖であってもよく、またはいくつかの分岐を含んでもよい。鎖は、１個または複数のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ）を内部に、および／または末端に含んでもよい。疎水性部分は、さらに、不飽和成分（アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール）を含有してもよく、および／または１個もしくは複数の芳香族挿入物を含んでもよい。
【００４６】
疎水性部分は、親油性カチオンに共有結合してもよい。親油性カチオンがトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）である場合、疎水性部分は、図１に示されているように、中心のリンイオンに連結してもよい。
【００４７】
理論に縛られるつもりはないが、本発明者らは、疎水性部分を含むイメージングプローブに関連した取り込みの増加が、原形質膜のより迅速な進入、およびミトコンドリア内膜のマトリックス接面への疎水性部分の吸着の増加によるものであると考えている。
【００４８】
（ＰＥＴ核）
本発明のプローブ内に用いることができる非放射性元素およびそれらに相当するものには、Ｆ−１９（Ｆ−１８）；Ｃ−１２（Ｃ−１１）；Ｉ−１２７（Ｉ−１２５、Ｉ−１２４、Ｉ−１３１、およびＩ−１２３）；ＣＩ−３６（ＣＩ−３２、ＣＩ−３３、ＣＩ−３４）；Ｂｒ−８０（Ｂｒ−７４、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｂｒ−７７、Ｂｒ−７８）；Ｒｅ−１８５／１８７（Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８）；Ｙ−８９（Ｙ−９０、Ｙ−８６）；Ｌｕ−１７７、およびＳｍ−１５３が挙げられる。
【００４９】
あるいは、本発明のプローブは、１１Ｃ、１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１３Ｎ、または１５Ｏなどの１個または複数の放射性同位元素で標識されてもよい。
【００５０】
ＰＥＴスキャニングに用いられる放射性核種は、典型的には、炭素−１１（約２０分）、窒素−１３（約１０分）、酸素−１５（約２分）、およびフッ素−１８（約１１０分）などの短い半減期をもつ同位元素である。
【００５１】
ＰＥＴ核は１８Ｆを含んでもよい。
【００５２】
用語「ＰＥＴ核」は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、または他のイメージングプロセスに用いることができる非放射性元素または放射性核種を指す。
【００５３】
ＰＥＴ核は、親油性カチオンおよび／または疎水性部分に付着、例えば、共有結合してもよい。例えば、疎水性部分は、親油性カチオンとＰＥＴ核との間のリンカーとして働いてもよい。
【００５４】
プローブは１８Ｆ−フロオロウンデシルＴＰＰであってもよい。
【００５５】
（使用のための方法）
本発明はまた、以下の工程を含む、被験体においてミトコンドリア膜電位を分析するための方法を提供する：
（ｉ）本発明によるイメージングプローブを被験体に投与する工程；
（ｉｉ）プローブを可視化する工程；および
（ｉｉｉ）ミトコンドリア膜電位を推定する工程。
【００５６】
イメージング剤を検出およびモニタリングするために用いられるイメージング装置には、ガンマカメラ、ＰＥＴ装置、およびＳＰＥＣＴ装置などのイメージングテクノロジーが挙げられる。
【００５７】
ミトコンドリア膜電位の分析は、例えば、被験体においてミトコンドリアのエネルギー状態における変化を伴う病状を診断および／またはモニタリングするのに用いられてもよい。
【００５８】
ミトコンドリア膜電位の分析は、例えば、腫瘍を可視化するための方法、または被験体においてミトコンドリア損傷を調べるための方法に用いられてもよい。
【００５９】
プローブは、直接注射などの当技術分野において知られた任意の適切な技術によって投与されてもよい。注射は静脈内（ＩＶ）であってもよい。投与は、全身性であっても、または腫瘍などの目的の部位へ局所的であってもよい。
【００６０】
プローブは、別のプローブ、例えば、特定の組織または腫瘍を可視化する能力があるプローブと共に用いられてもよい。２つ（またはそれ以上）のプローブは、一緒に、別々に、または順次投与されてもよい。
【００６１】
本発明のイメージングプローブは、疾患または状態の進行または処置を診断、評価、またはモニタリングするために用いられてもよい。
【００６２】
本発明のイメージングプローブは、試験化合物のミトコンドリアのエネルギー状態への効果を調べるために用いられてもよい。例えば、イメージングプローブは、試験化合物と一緒に投与されてもよく、試験化合物のミトコンドリアのエネルギー状態への効果が、本発明に従った方法を用いて、インビボで、リアルタイムにアッセイされてもよい。
【００６３】
（疾患）
疾患または状態は、ミトコンドリアのエネルギー状態における変化によって特徴づけられる場合がある。例えば、ミトコンドリアのエネルギー状態における変化（より高いか、またはより低いミトコンドリア膜電位のいずれか）は、疾患の症状であり得、または疾患の原因因子であり得、もしくは原因因子の１つであり得る。
【００６４】
病因となるミトコンドリアのエネルギー状態の処置後の完全または部分的逆転は、治療効力を示している可能性がある。
【００６５】
ミトコンドリアの酸化損傷は、ミトコンドリアが活性酸素種の供給源であり、また、酸化損傷を受けやすいため、多くの病状に関与している。
【００６６】
様々ながん、糖尿病、心不全、心血管疾患および肝疾患、ＡＩＤＳ、変性疾患、免疫障害、加齢、ならびに他の筋障害を含む様々な疾患および状態は、機能障害性ミトコンドリアに関連している。
【００６７】
本発明は、ミトコンドリアによって取り込まれるプローブを提供し、その取り込みはΔΨｍに比例する。このことにより、機能障害性ミトコンドリア、例えば、活性が抑制または増強されたミトコンドリアの検出およびイメージングが可能になる。腫瘍は、一般的に、より高いミトコンドリア膜電位を有するが、組織損傷の領域はより低いΔΨｍを有する可能性がある。
【００６８】
状態および／またはそれの処置は、アポトーシスの増加または減少によって特徴づけられる場合があり、これは、本発明によるイメージングプローブを用いてモニタリングされる可能性がある。ミトコンドリア膜電位の減少は、アポトーシス促進（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）剤によって引き起こされる細胞死における初期事象である。ミトコンドリア制御性アポトーシスは、心不全における細胞消失の基礎であると考えられている。
【００６９】
本発明のイメージング方法はまた、がんおよび他の悪性腫瘍を遅延させるか、または破壊するために用いられる化学療法または放射線処置のプロトコールの効力を評価するために用いられてもよい。
【００７０】
本発明のイメージング方法は、がん、例えば、肺がん、乳がん、または前立腺がんを診断または評価するために用いられてもよい。
【００７１】
がん腫細胞におけるミトコンドリア膜電位差は、正常な上皮細胞より有意に高いことが示されている。例えば、ＣＸ−１結腸がん腫細胞系と対照のミドリザル上皮細胞系ＣＶ−１との間のΔΨｍの差は、約６０ｍＶであった（腫瘍細胞における１６３ｍＶ対正常細胞における１０４ｍＶ）。
【００７２】
（被験体）
被験体はヒト被験体または動物被験体であってもよい。被験体は、健康な被験体、または疾患を有する被験体もしくは疾患に罹るリスクがある被験体であってもよい。
【００７３】
特に、被験体は、前のセクションで言及された疾患または状態の１つを有してもよく、またはそれに罹るリスクがあってもよい。
【００７４】
被験体は、疾患についての処置を受けている最中であってもよい。本発明のイメージングプローブは、疾患または状態の進行または回復に関連しているミトコンドリアのエネルギー状態における変化を調べるために用いられてもよい。
【００７５】
被験体は、実験動物、特に前のセクションで言及された疾患または状態の１つの動物モデルであってもよい。
【００７６】
（プローブ合成）
ＰＥＴ核、例えば、１８Ｆは、ＰＥＴ核を受け取る能力があるか、または受け取るように適応させられているイメージングプローブの前駆体型へ組み込まれてもよい。
【００７７】
例えば、１８Ｆは、当技術分野において知られた方法によってサイクロトロンにおいて合成されてもよい。合成後、１８Ｆは一般的にＦ−の形をとり、それの１１０分の半減期を考慮すると、迅速に、イメージングプローブへ組み込まれ、精製され、被験体に投与される必要がある。
【００７８】
本発明はまた、ＰＥＴ核を受け取るように適応させられた前駆体分子を提供する。例えば、本発明は、ＰＥＴ核のアニオン型と反応して、本発明によるイメージングプローブを生成することができる、親油性カチオンおよび疎水性部分を含む前駆体分子を提供する。
【００７９】
前駆体分子は、例えば、求核置換を受けやすい脱離基を含んでもよい。例えば、前駆体分子は、ＰＥＴ核のアニオン型と反応する、メシレート基、トシレート基、ノシレート基、トリフラート基、またはヨード基を含んでもよい。
【００８０】
前駆体分子は、１８Ｆ−と反応して１８Ｆ−フルオロアルキルＴＰＰを形成することができる、メシル化アルキルトリフェニルホスホニウム化合物であってもよい。図８は、１８Ｆ−ウンデシルＴＰＰを形成する、メシル化ウンデシルＴＰＰ前駆体の１８Ｆ−との反応を示している。
【００８１】
本発明はまた、ＰＥＴ核のアニオン型をそのような前駆体分子と反応させる工程を含む、イメージングプローブを生成するための方法を提供する。これは、イメージングプローブの生成のための便利な１工程手順を提供する。
【００８２】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明のイメージングプローブを生成し、被験体に投与するための方法を提供する：
（ｉ）例えばサイクロトロンにおいて、１８Ｆ−を合成する工程；
（ｉｉ）１８Ｆ−を前駆体分子へ組み込んで、イメージングプローブを生成する工程；
（ｉｉｉ）任意で、イメージングプローブを精製する工程；および
（ｉｉ）任意で精製されたイメージングプローブを被験体に投与する工程。
【００８３】
プローブは、それの合成後にできる限り早く、被験体に投与されるべきである。
【００８４】
（取り込みおよび循環からのクリアランスの増加）
本発明者らは、疎水性部分のミトコンドリア標的化イメージングプローブへの包含により、それの組織への取り込み、およびそれが循環からクリアランスされる程度が増加することを見出した。バックグラウンドの循環に対する取り込みはより大きくなり、より大きい組織／循環比をもたらす。このことにより、インビボでミトコンドリアのエネルギー状態における変化を検出および可視化するためのこれらのプローブの感度が非常に増強する。
【００８５】
したがって、本発明は、イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの取り込みを増加させるための方法を提供する。
【００８６】
取り込みの速度および／または程度は、疎水性部分を欠く対応する化合物の取り込みと比較した場合、５〜５０倍、１０〜４０倍、または２０〜３０倍増加する可能性がある。
【００８７】
特に、腎臓、筋肉、心臓、肝臓、および脂肪などの特定の組織への取り込みが増加する可能性がある。
【００８８】
例えば、投与から１時間後と５時間後との間の取り込みの差を測定してもよい。
【００８９】
本発明はまた、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを含むイメージングプローブの組織：循環比を増加させるための方法であって、イメージングプローブの疎水性を増加させる工程を含む、方法を提供する。
【００９０】
組織：循環比は、組織（例えば、腎臓、肝臓、筋肉、または心臓）における化合物の濃度を循環（例えば、血液）における化合物の濃度と比較することによって得ることができる。
【００９１】
イメージングプローブの循環からのクリアランスは、疎水性部分を欠く対応するイメージングプローブのクリアランスと比較した場合、５〜５０倍、１０〜４０倍、または２０〜３０倍増加する可能性がある。組織／循環比は、疎水性部分を欠く対応する化合物のものより少なくとも５０倍、８０倍、または１００倍高い可能性がある。
【００９２】
疎水性部分を有するイメージングプローブの例は、１８Ｆ−フルオロウンデシルＴＰＰであり、疎水性部分を欠く対応するイメージングプローブは、１８Ｆ−ＴＰＰまたは１８Ｆ−ＴＰＭＰである。ＰＥＴ核は、プローブの取り込みまたはクリアランスに影響する可能性が低いため、ＰＥＴは、疎水性部分およびＰＥＴ核を欠く対応する分子（例えば、ＴＰＰまたはＴＰＭＰ）と比較されてもよい。
【００９３】
したがって、少なくとも５個、例えば、８個から１５個の炭素原子を有するように、トリフェニルホスホニウム親油性カチオンのアルキル側鎖を導入し、またはそのアルキル側鎖の長さを増加させることによって、疎水性を増加させてもよい。アルキル基に側鎖を付加すること、その鎖に芳香族基を付けること、およびトリフェニルホスホニウム部分上のフェニル環に側鎖を付加することによっても疎水性を増加させてもよい。
【００９４】
これから、実施例を用いて本発明をさらに記載するつもりであり、その実施例は、当業者が本発明を実施するのを助ける役割を果たすものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【００９５】
（実施例１−ｉｖ注射後のミトコンドリア標的化アルキルＴＰＰ化合物の器官分布の動態の調査）
どれくらい迅速にアルキルＴＰＰ化合物が身体内に分布するかを決定するために、ミトコンドリア標的化抗酸化剤ＭｉｔｏＱの取り込みをまず、静脈内（ｉｖ）注射後に評価した（図２）。これを行うために、１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＭｉｔｏＱのボーラスを、尾静脈注射によってマウスに投与し、様々な器官における［３Ｈ］ＭｉｔｏＱの量をその後の４８時間に渡って測定した（図２）。注射１時間後に測定した場合、肝臓および腎臓によるＭｉｔｏＱの大量の取り込みがあった（図２Ａ）。この時点において、心臓による取り込みはそれほど大量ではなく、筋肉および脂肪組織による取り込みはより少なく、脳による取り込みはほとんどなかった（図２Ｂ）。このＭｉｔｏＱの器官への迅速な取り込みは、それの血液からの初期の減少によって反映された（図３Ａ）。その後、組織によって蓄積された［３Ｈ］ＭｉｔｏＱは、肝臓については約２時間の半減期、腎臓については約４時間の半減期、および心臓については約１５時間の半減期で徐々に喪失した。４８時間以内に、これらの組織から投与された放射能のほとんど完全なクリアランスがあり、ｉｖ注射から２４時間後に約８０％のＭｉｔｏＱが排除されたという他の研究と一致した。［３Ｈ］ＭｉｔｏＱの組織への最初の取り込みを評価するために、注射後の最初の１時間にわたるそれの組織分布に焦点をあてた（図２ＣおよびＤ）。これは、ＭｉｔｏＱの組織への取り込みが非常に速く、測定可能な最も早い時点である、注射後５分において、それの最大値に達したことを示した。まとめて考えると、これらのデータは、ＭｉｔｏＱが血液からたいていの器官へ迅速に取り込まれるが、異なる器官による取り込みの程度において有意な差異があることを示している。
【００９６】
ＭｉｔｏＱの循環から器官への迅速な取り込みが、全てのアルキルＴＰＰカチオンの一般的な性質であるのか、またはＭｉｔｏＱに特異的であるのかを見るために、３つのアルキルＴＰＰカチオンである、［３Ｈ］デシルＴＰＰ、［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰ、および［３Ｈ］ＴＰＭＰのｉｖ注射後の器官分布を次に評価した。これらの化合物は、相対的に親水性の［３Ｈ］ＴＰＭＰ（オクタノール／ＰＢＳ分配係数０．３５）から疎水性の［３Ｈ］デシルＴＰＰおよび［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰ（それぞれ、５０００および７４０±１００のオクタノール／ＰＢＳ分配係数）まで、疎水性に幅があった。４８時間にわたる［３Ｈ］デシルＴＰＰの組織分布は図４ＡおよびＢに示されており、５時間にわたる［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの組織分布は図４Ｃに示されている。それらの取り込みプロファイルは、ＭｉｔｏＱのそれと類似しており、肝臓、腎臓、および心臓への迅速な取り込みがあり、続いて、肝臓および腎臓から両方の化合物について約３時間の半減期で喪失した。ＭｉｔｏＱの場合のように、心臓からの喪失はよりゆっくりとしており、［３Ｈ］デシルＴＰＰおよび［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰ、それぞれについて約１５時間および約２１時間の半減期であった。［３Ｈ］デシルＴＰＰおよび［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの血液からのクリアランス（図３Ｂ）は、［３Ｈ］ＭｉｔｏＱのそれ（図３Ａ）と定性的に類似していたが、それらの血液濃度はより低かった。［３Ｈ］ＴＰＭＰの器官分布を、ｉｖ注射後の５時間、測定した（図５Ａ、Ｂ）。［３Ｈ］ＴＰＭＰ分布は、ＭｉｔｏＱ、デシルＴＰＰ、およびフルオロウンデシルＴＰＰのそれらと定性的に類似しており、肝臓、心臓、腎臓、および脂肪への迅速な取り込みがあった。しかしながら、ＴＰＭＰ取り込みの程度は、一般的に、脳を除いて、ＭｉｔｏＱ、デシルＴＰＰ、およびフルオロウンデシルＴＰＰのそれより少なかった。［３Ｈ］ＴＰＭＰの肝臓および腎臓からの喪失についての半減期は、他のＴＰＰ化合物と類似して、それぞれ、約３時間および約２時間であった。しかしながら、ＴＰＭＰの心臓からの喪失についての半減期は、約２時間であり、他のアルキルＴＰＰ化合物よりも有意に短かった。［３Ｈ］ＴＰＭＰの血液からのクリアランスは、より疎水性の高いアルキルＴＰＰ化合物のそれと定性的に類似していたが、血液中の［３Ｈ］ＴＰＭＰの濃度はより高く留まった（図３Ｃ）。残りの組織からの［３Ｈ］ＴＰＭＰクリアランスについての半減期と他のアルキルＴＰＰ化合物のクリアランスについての半減期とを比較することは、取り込まれた化合物が少量であるため、技術的に困難であったが、脂肪および筋肉の両方については、ＴＰＭＰのクリアランスについての半減期は約１〜２時間と見積もられ、一方、デシルＴＰＰおよびフルオロウンデシルＴＰＰについてのそれらは、約７〜１２時間と有意に長かった。まとめて考えると、これらの実験は、全てのアルキルＴＰＰ化合物の血液から器官への大量かつ迅速な取り込みがあったことを示した。
【００９７】
（実施例２−ある時間にわたる、アルキルＴＰＰ化合物の器官への取り込みの程度の比較）
図２、４、および５におけるデータは、評価された４つのＴＰＰ化合物の器官分布が定性的に類似していることを示している。しかしながら、化合物の様々な器官への取り込みの程度の間に有意な定量的差があった。これらの差を評価するために、本発明者らは、ｉｖ注射後の１５分、１時間、および５時間における４つのＴＰＰ化合物の組織含有量をプロットした（図６Ａ、Ｃ、Ｅ）。筋肉、脂肪、および脳へ取り込まれた量は、他の器官より低かったが、これらのデータはまた、各パネル内に拡大された挿入図として提示されている。この分析は、腎臓、心臓、および筋肉について、取り込みの程度が、デシルＴＰＰ、フルオロウンデシルＴＰＰ＞ＭｉｔｏＱ＞ＴＰＭＰの順番であり、これらの差は、注射後１〜５時間に最も明らかであった。これらの差の大きさは大きく、例えば、注射後１時間のデシルＴＰＰ、ＭｉｔｏＱ、およびＴＰＭＰの心臓への取り込みは、１７：６：１の比であり、５時間では、この比は３２：１０：１であった。ＭｉｔｏＱ、デシルＴＰＰ、およびフルオロウンデシルＴＰＰについての器官分布は類似しており、取り込みは腎臓＞肝臓＞心臓＞筋肉、脂肪＞脳の順番であった。ＴＰＭＰの器官分布は、この化合物について肝臓への取り込みが腎臓より多かったこと、および脳へのより多い取り込みがあったことを除けば、３つのより疎水性の高い化合物のそれと大まかに類似している。
【００９８】
アルキルＴＰＰ化合物は、ネルンスト式によって記載されているように、原形質膜電位およびミトコンドリア膜電位に応答して組織へ蓄積される。その結果として、その化合物の組織中のミトコンドリア内の濃度は、ミトコンドリア膜電位および原形質膜電位により、ならびに循環中の化合物の濃度により、決定される。これらの膜電位は本明細書に報告された全ての実験について類似しているため、化合物の組織への取り込みの程度の主要な決定因子は、化合物の血中濃度である。これによる器官取り込みの変動を補正するために、本発明者らはまた、器官内の化合物の濃度対循環中の化合物の濃度の比を決定し、ｉｖ注射後１５分、１時間、および５時間におけるこれらのデータが示されている（図６Ｂ、Ｄ、およびＦ）。これらのデータは図６Ａ、Ｃ、およびＥの所見を裏付け、取り込みの程度が、デシルＴＰＰ、フルオロウンデシルＴＰＰ＞ＭｉｔｏＱ＞ＴＰＭＰの順番であったことを確認している。例えば、注射後１時間のデシルＴＰＰ、ＭｉｔｏＱ、およびＴＰＭＰについての心臓／血液比は、１０９：１１：１の比であり、５時間ではこの比は、２４８：２６：１であった。１つの例外は、ＭｉｔｏＱおよびＴＰＭＰの肝臓／血液比は類似したが、デシルＴＰＰおよびフルオロウンデシルＴＰＰについてのそれらは有意に大きかったことである。加えて、全ての４つの化合物について脳／血液比の間にほとんど差がなく、このことは、図６Ａ、Ｃ、およびＥに見られたＴＰＭＰの明らかなより高い取り込みは、脳自体におけるＴＰＭＰの存在ではなく、閉じ込められた血液中のＴＰＭＰの存在により生じている可能性があることを示唆する。まとめて考えると、図６のデータは、全ての４つの化合物についての器官分布が定性的に類似していることを示している。デシルＴＰＰおよびフルオロウンデシルＴＰＰは、ＭｉｔｏＱより有意に高い程度で取り込まれ、ＭｉｔｏＱは、ＴＰＭＰよりはるかに高い程度で取り込まれ、かつ保持される。
【００９９】
（実施例３−インビボでのミトコンドリアによるアルキルＴＰＰ化合物の取り込み）
実施例１および２の結果は、アルキルＴＰＰ化合物が、インビボで器官へ迅速に取り込まれることを示している。ＴＰＰ化合物のミトコンドリアおよび細胞への取り込みは、ミトコンドリア膜電位および原形質膜電位によるものであり、蓄積された化合物の大部分がミトコンドリア内にあることが示されている。したがって、いったんアルキルＴＰＰ化合物が組織内に蓄積されたならば、それらは、膜電位によって、主にミトコンドリア内に局在化される。これらの実験においてこれが当てはまるか否かを見るために、インビボでのアルキルＴＰＰ化合物の取り込みがミトコンドリア膜電位を低下させることによって減少するか否かを次に決定した。これを行うために、［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰをマウスにｉｖ注射し、１５分後、様々な投与量のミトコンドリアの脱共役剤の２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）または生理食塩水キャリアをマウスにさらに注射し、さらに１５分後、器官によって蓄積された［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの程度を測定した（図７Ａ）。用いられたその量のＤＮＰは、毒性なしに、インビボでミトコンドリアの部分的脱共役を引き起こすことが示されている。本発明者らの実験は、ＤＮＰが［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰの器官への取り込みを用量依存性様式で最高４０％減少させたことを示した（図７Ａ）。これらの所見は、インビボでの器官内のアルキルＴＰＰ化合物の取り込みの程度がミトコンドリア膜電位によって決定されるということと一致している。
【０１００】
インビボでのミトコンドリア内のアルキルＴＰＰ化合物の局在化を直接示すことは、ミトコンドリア単離に必要とされる組織ホモジナイゼーションにおけるそれらの急速な再分布のために技術的に難しい。これまでこの問題を克服するために、修飾アルキルＴＰＰ化合物の４−ヨードブチルＴＰＰ（ＩＢＴＰ）および１０−ヨードデシルＴＰＰ（ＩＤＴＰ）が用いられている。これらの化合物は、他のアルキルＴＰＰ化合物と同じようにミトコンドリアによって蓄積されるが、いったんミトコンドリアマトリックス内に入ると、ヨード部分が、ミトコンドリアのチオールタンパク質によって置換されて、安定なチオエーテル付加体を形成し、その付加体は、ＴＰＰ部分に対する抗体を用いて可視化することができる。ＩＢＴＰおよびＩＤＴＰのタンパク質チオールとの反応の速度が比較的遅いため、よりチオール反応性の高いヨードアセトアミド（ＩＡＭ）部分に付着したＴＰＰ化合物（ＩＡＭ−ＴＰＰ；図７Ｂ）を用いるようにこのアプローチを広げた。ＩＡＭ部分のチオール反応性の増強が、器官からクリアランスされる前に、インビボでのＩＡＭ−ＴＰＰのミトコンドリアタンパク質チオールとの反応を促進することにより、この分子がミトコンドリアによって蓄積され、そこでミトコンドリアのチオールタンパク質を標識するはずであるということがその意図であった（図７Ｂ）。単離されたミトコンドリアとのインキュベーションにより、ＩＡＭ−ＴＰＰはタンパク質チオールと迅速に反応し、ＩＢＴＰについて以前示されたように、抗ＴＰＰ抗体を用いて検出することができた（データは示していない）。ＩＡＭ−ＴＰＰの細胞とのインキュベーション、続いて免疫細胞化学法による分析により、ミトコンドリア内のＩＡＭ−ＴＰＰの脱共役剤感受性局在化が示され（図７Ｃ）、ＩＡＭ−ＴＰＰがミトコンドリアタンパク質を標識したことを確認した。その後、ＩＡＭ−ＴＰＰのボーラスをマウスにｉｖ注射で投与し、１時間後、心臓および肝臓からミトコンドリアを単離した。ＴＰＰ部分に選択性の抗血清を用いるこれらのミトコンドリア画分のウェスタンブロットにより、心臓および肝臓のミトコンドリアタンパク質のＩＡＭ−ＴＰＰによる標識が示された（図７Ｄ）。まとめて考えると、これらのデータは、ｉｖ注射後、アルキルＴＰＰ化合物が、ミトコンドリア膜電位によって、組織内のミトコンドリアによって迅速に取り込まれることを示している。
【０１０１】
このように、アルキルＴＰＰ化合物は、組織において治療的有効量の化合物を与えるｉｖ投与から５分以内にインビボで多くの器官によって蓄積されることが示されている。この組織への取り込みは、その化合物のミトコンドリアへの膜電位依存性蓄積によるものであった。
【０１０２】
この研究における興味深い所見は、デシルＴＰＰおよびフルオロウンデシルＴＰＰ化合物が、ＴＰＭＰよりはるかに大量に組織へ取り込まれたことであった。これは、ミトコンドリア内膜のマトリックス接面への、より長い鎖のアルキルＴＰＰカチオンのより多い吸着による。重要なことには、ＴＰＰカチオンの取り込みの程度の、側鎖を変化させることによる増強は大きく、１０〜３０倍であった。器官内のアルキルＴＰＰ化合物の絶対的レベルを上昇させることに加えて、アルキル側鎖をフルオロウンデシル部分またはデシル部分に変更することは、ＴＰＭＰと比較して１００倍を超えて、アルキルＴＰＰ化合物の器官／血液濃度比を大いに増強した。この性質は、がんおよび細胞死に関連したミトコンドリア分極の変化を評価するためにインビボでミトコンドリア機能を評価する、より効果的なＰＥＴプローブの設計に有用である。本明細書に示されたデータは、長鎖の疎水性アルキルＴＰＰカチオンに基づいたＰＥＴプローブが、ＴＰＭＰと類似した、今日までＰＥＴプローブとして開発されているアルキルＴＰＰカチオンより、有意に良い組織ローディングおよびコントラスト特性を有する可能性があることを示唆している。この点において、フルオロウンデシルＴＰＰに関して得られたデータは、１９Ｆ原子がＰＥＴ活性１８Ｆによって容易に置換され、かつフルオロウンデシルＴＰＰの取り込みがインビボでミトコンドリア分極の程度に応答することができるため、特に興味深い。
【０１０３】
（実施例４−動物モデルにおいて腫瘍およびミトコンドリア損傷を可視化するための１８Ｆ−ウンデシルＴＰＰの使用）
様々なサイズの腫瘍が移植されている免疫不全マウスモデルを用いる。その後、１８Ｆ−ウンデシルＴＰＰをマウスに投与し、腫瘍を、ＰＥＴを用いて可視化する。
【０１０４】
心臓または腎臓虚血再灌流モデルもまた用いて、１８Ｆ−ウンデシルＴＰＰが、組織内の損傷したミトコンドリアを可視化するために用いられ得ることを示す。
【０１０５】
最後に、血液脳関門の損傷モデルを用いて、本発明のプローブが、この損傷後に脳へ取り込まれるか否かを調べ、それによって、血液脳関門が損なわれているか否かを示す。
【０１０６】
（材料および方法）
（化学合成）
［３Ｈ］ヨウ化ＴＰＭＰ（６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製であった。［３Ｈ］ＭｉｔｏＱおよび［３Ｈ］デシルＴＰＰ調製物を合成し、＞９７％放射性純度までＨＰＬＣ精製した。１１−フルオロウンデシルトリフェニルホスホニウムメシレート（フルオロウンデシルＴＰＰ）を合成するために、アルゴンで洗い流され、スクリューキャップで密封されたＫｉｍａｘチューブ（１５ｍｍ×１５０ｍｍ）中の１１−ブロモウンデカノール（７５２．１ｍｇ、２．９９ｍｍｏｌ）、フッ化テトラブチルアンモニウム（２．３４ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）、およびＨ２Ｏ（１６２μＬ）の混合物を８０℃で１時間、撹拌した。反応物を少し冷却し、ペンタン（２５ｍＬ）中へ抽出した。有機層をＨ２Ｏ（３０ｍＬ）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、−ＣＨ２Ｆ  （４．５）  ｖｓ  ＝ＣＨ２  （４．９−５）共鳴の１Ｈ  ＮＭＲ積分から約７％の１１−フルオロウンデカ−１−エンを含有する茶色がかった油として１１−フルオロ−１−ウンデカノールが得られた（４１６ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  ４．４６  （２Ｈ，  ｄ，ｔ  Ｊ＝４７．３，  ６．２  Ｈｚ，  −ＣＨ２Ｆ），３．６６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  −ＣＨ２ＯＨ），１．２−１．８  （１８Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。１９Ｆ  ＮＭＲ  −２１８．５  （ｔ，ｔ  Ｊ＝４７．５，  ２４．６  Ｈｚ）  ｐｐｍ。無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の粗１１−フルオロ−１−ウンデカノール（３３３ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３５１ｍｇ、３．４７ｍｍｏｌ、４８４μＬ、２当量）の溶液を約１０℃で１０分間、撹拌した。その後、温度を１０℃未満に維持しながら、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（２３０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ、１５６μＬ）の溶液を加えた。添加後、反応物を室温まで温め、２時間、撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）での希釈によって反応を生じさせ、有機層をＨ２Ｏ（１２．５ｍＬ）、１％ＮａＨＣＯ３水溶液（１２．５ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１２．５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、茶色がかった油（４４４ｍｇ）が得られた。５％エーテル／石油エーテルで調製されたシリカゲル６０Ａ  ４０〜６３μｍ（２０ｇ）でのカラムクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。純粋な生成物を２０％エーテル／石油エーテルで溶出し、減圧下で濃縮し、透明な油として１１−フルオロウンデシルメシレートが得られた（２７９．５ｍｇ、５９％）。１Ｈ  ＮＭＲ  ４．４３  （２Ｈ，  ｄ，ｔ  Ｊ＝４７．４，  ６．２  Ｈｚ，  −ＣＨ２Ｆ），４．２２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．６  Ｈｚ，  −ＣＨ２Ｏ），３．００  （３Ｈ，ｓ，  ＣＨ３ＳＯ２），１．６−１．８  （４Ｈ，  ｍ），１．２−１．４  （１４Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。１９Ｆ  ＮＭＲ  −２１８．４  （ｔ，ｔ  Ｊ＝４７．４，  ２４．９  Ｈｚ）  ｐｐｍ。見出された質量スペクトル：２９１．１４０６。Ｃ１２Ｈ２５ＦＯ３Ｓ２Ｎａ必要：２９１．１４０１。アルゴンで洗い流し、スクリューキャップで密封された、磁気撹拌棒を有する１０ｍｍ×１００ｍｍ  Ｋｉｍａｘチュー��内で、精製された１１−フルオロウンデシルメシレート（２７９．５ｍｇ、１．０４１ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５８２ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）とを組み合わせた。反応物を加熱し、９０℃で４日間、撹拌した。その後、反応生成物を最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、減圧下で濃縮し、粗製油（０．８４２ｇ）が得られた。粗生成物を最小量のＣＨ２Ｃｌ２（約１ｍＬ）中に再溶解し、エーテル（約５０ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を、冷水浴に置き、透明な液体をデカントした。この溶解／沈殿プロセスを繰り返し、やや不透明な粘着性油として１１−フルオロウンデシルトリフェニルホスホニウムメシレートが得られた（４０７．１ｍｇ、７４％）。１Ｈ  ＮＭＲ：  ７．６９−７．８１  （１５Ｈ，  ｍ），４．４１  （２Ｈ，  ｄ，ｔ  Ｊ＝４７．４，  ６．２  Ｈｚ，  −ＣＨ２Ｆ），３．６  （２Ｈ，  ｍ，  −ＣＨ２Ｐ），２．７３  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＨ３ＳＯ２），１．５−  １．８  （６Ｈ，  ｍ），１．２−１．４  （１２Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。３１Ｐ  ＮＭＲ：  ２４．７８  ｐｐｍ。１９Ｆ  ＮＭＲ：  −２１８．４  （ｔ，ｔ  Ｊ＝４７．４，  ２４．９  Ｈｚ）  ｐｐｍ。見出されたＭＳ：４３５．２６２７、Ｃ２９Ｈ３７ＦＰ＋必要：４３５．２６１。
【０１０７】
［３Ｈ］フルオロウンデシルＴＰＰメシレートを合成するために、アルゴンで洗い流し、スクリューキャップで密封された、磁気撹拌棒を有する５００μＬマイクロ反応チューブ内で、１１−フルオロウンデシルメシレート（６．８ｍｇ、２５．３μｍｏｌ）と［３Ｈ］トリフェニルホスフィン（３．２ｍｇ、１２．２μｍｏｌ、３７２μＣｉ）を組み合わせた。反応物を加熱し、９０℃で４日間、撹拌した。その後、反応生成物をＣＨ２Ｃｌ２（４０μＬ）中に溶解し、キャップ付き遠心管中のジエチルエーテル（２ｍＬ）に加えた。懸濁物を約１６０×ｇで１０分間、遠心分離し、溶媒をデカントした。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（４０μＬ）中に溶解し、エーテル（２ｍＬ）に加え、上記のように遠心分離した。溶媒のデカンテーションにより、油として生成物（１９６μＣｉ）が得られた。１：９のメタノール／ＣＨ２Ｃｌ２におけるシリカゲルでのＴＬＣにより、放射能の９９％がＲｆ０．２から０．５に含有されることが示された。
【０１０８】
［５−（２−ヨード−アセチルアミノ−ペンチル）−トリフェニル−ホスホニウムメシレート（ＩＡＭ−ＴＰＰ）を合成するために、０℃における５−アミノペンチルトリフェニルホスホニウムブロミド臭化水素（０．０５０ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液をトリエチルアミン（１５ｍＬ、０．１０８ｍｍｏｌ）に加え、溶液を５分間、撹拌した。溶液を−７８℃まで冷却し（アセトン／ドライアイス）、固体ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（０．０３０ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を一度に加えた。溶液を２０分間、撹拌し、溶媒を−７８℃、減圧下で除去した。残留物をアセトン（３ｍＬ）中に溶解し、その後、ヨウ化ナトリウム（１００ｍｇ）を加え、溶液を室温で２時間、撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、固体をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に再溶解し、蒸留水および１０％ナトリウムメシレート水溶液で順次洗浄した。有機画分を、減圧下で容積減少させ（１ｍＬ）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）への添加によって沈殿させた。溶解／沈殿手順を２回繰り返して、いかなる残留ｐ−ニトロフェノールも除去した。最終固体を水中に溶解し、凍結乾燥して、黄色の多量の固体０．０４６５ｇ（７８％）が得られた。見出された質量スペクトル（高分解能＋ｖｅ）５１６．０９３８、Ｃ２５Ｈ２８ＩＮＯＰ＋は、５１６．０９４８を必要とする。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  １．５−１．８  （ｍ，  ６Ｈ），２．６９  （ｓ，  ３Ｈ），３．１６  （ｍ，  ２Ｈ），３．３９−３．５０  （ｍ，  ２Ｈ），３．６７  （ｓ，  ２Ｈ），７．７０−７．９５  （ｍ，  １５Ｈ）  ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  −１．８，２２．７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４９Ｈｚ），２３．１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２Ｈｚ），２８．５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １７Ｈｚ），２９．２，３９．５，４０．１，１１９．９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８７Ｈｚ），１３１．５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３Ｈｚ），１３４．８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０Ｈｚ），１３６．３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３Ｈｚ），１７１．４  ｐｐｍ。３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  −  ２４．８  ｐｐｍ。
【０１０９】
公開されたオクタン−１−オール分配係数は以下の通りである：ＴＰＭＰ、０．３５；ＭｉｔｏＱ、２７６０；デシルＴＰＰ、５０００。フルオロウンデシルＴＰＰ（７４０±１００）およびＩＡＭ−ＴＰＰ（１９±１）についてのオクタン−１−オール分配係数は、前に記載されているように、本研究において決定された。
【０１１０】
（化合物のマウスへの投与）
雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス（２０〜２５ｇ）を、標準実験動物用飼料および水に随意にアクセスできる状況で、１２時間の明／暗サイクルで維持した。週齢８〜１０週間の時点で、マウスを拘束チューブ内に置き、１０％ＤＭＳＯを追加した１００μＬの滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｎｍｏｌの［３Ｈ］化合物（約４００〜５００ｎＣｉ）を尾静脈注射によりｉｖ注射した。比放射能を計算するために、注射された［３Ｈ］化合物溶液の試料を保持し、その後、それを用いて、化合物の組織含有量を決定した。注射後の示された時間において、マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、約１００〜２００μＬの血液試料を心穿刺によって得た。その後、器官を取り出し、血液を除去し、氷上のあらかじめ冷却されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、秤量し、処理するまで−８０℃で保存した。採取された組織は、心臓、腎臓、肝臓、脳、骨格筋（腓腹筋）、および白色脂肪組織（皮下）であった。この量のＭｉｔｏＱおよび他のＴＰＰカチオンの注射は、無毒であることが以前に示された（本明細書においても当てはまる）。病状または苦痛がないことを確実にするために、注射後、マウスをモニタリングし、全ての手順をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔａｇｏ動物倫理委員会の承認下で実行した。
【０１１１】
（［３Ｈ］化合物の組織からの抽出）
組織を室温で解凍し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移した。氷冷メタノール（約４℃；１ｍＬ／１００ｍｇ組織湿重量）を組織に加え、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて、組織をホモジナイズした（氷上２×３０秒）。ホモジネートを１ｍＬバッチとして１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、遠心分離した（１０，０００×ｇ、４℃で８分間）。メタノール抽出物を２０ｍｌのガラスシンチレーションバイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ）へデカントし、Ｎ２流下、メタノールを蒸発させた。さらなる氷冷メタノール（１ｍＬ／１００ｍｇ）を組織ホモジネートペレットに加えて、１分間ボルテックスし、上記のように遠心分離し、メタノール抽出物を、新しい２０ｍＬガラスシンチレーションバイアルへデカントし、蒸発させた。この手順をさらに３回繰り返し、組織試料あたり５つの抽出物が得られた。５番目の抽出物における放射能の量は、常に無視できた。シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＯｐｔｉＰｈａｓｅ  ＨｉＳａｆｅ  ＩＩ；１０ｍＬ）を各バイアルに加え、適切なクエンチ補正を用いるシンチレーションカウンター（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ  １２１７  Ｒａｃｋｂｅｔａ）において３Ｈ  ＤＰＭ含有量を測定し、試料あたりの放射能の総量を計算した。その後、注射された［３Ｈ］化合物の比放射能を用いて、モル化合物／ｇ湿重量組織として組織含有量取り込みを計算した。ｉｖ注射後の最初の５時間について、時間に対するｌｎ［ＴＰＰ化合物］の傾きとして測定された、［３Ｈ］化合物の器官からの喪失についての一次速度定数から、器官における化合物の半減期を決定した。肝臓、腎臓、および心臓について、蓄積された大量の放射能のため、この手順は堅調であった。しかしながら、他の器官によって蓄積された放射能はより低量であったため、評価がより変わりやすく、それゆえ、それらの器官については、推定値のみが提供されている。
【０１１２】
（ＩＡＭ−ＴＰＰミトコンドリア取り込みの分析）
インビボでのミトコンドリアによるＩＡＭ−ＴＰＰの取り込みを評価するために、１００μＬ滅菌ＰＢＳ中の５００ｎｍｏｌのＩＡＭ−ＴＰＰをマウスに上記のように尾静脈によるｉｖで注射した。１時間後、マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、ホモジナイゼーション、続いて分画遠心によって肝臓および心臓のミトコンドリアを調製し、標準としてウシ血清アルブミンを用いるビシンコニン酸アッセイによってタンパク質含有量を決定した。１２．５％アクリルアミドゲル上での還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により、ミトコンドリアタンパク質（４０μｇ）を分離し、ニトロセルロースに転写し、ＴＰＰ部分に対するウサギ抗血清、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した二次抗ウサギＩｇＧを用いて、増強化学発光による検出でＴＰＰ結合タンパク質を検出した。ＩＡＭ−ＴＰＰの細胞内のミトコンドリアへの取り込みを評価するために、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞系（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を追加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地）中、６ウェル培養皿における２２ｍｍガラスカバースリップにおいて半コンフルエンスまで増殖させた。その後、これらの細胞を、１μＭ  ＩＡＭ−ＴＰＰ±１０μＭ  ＦＣＣＰを含む、ＦＣＳ欠損／Ｘ％  ＦＣＳのＤＭＥＭを用いて３時間インキュベートした。いくつかのインキュベーションについて、１００ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、インキュベーションの最後の３０分間、加えた。インキュベーションの終わりに、ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、免疫細胞化学法および共焦点顕微鏡のために処理した。Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ結合体化抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の二次抗体と共にＴＰＰ部分に対するウサギ抗血清を用いて、細胞内のＴＰＰを可視化した。共焦点顕微鏡を用いてイメージが得られた。
【０１１３】
上記本明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられている。記載された本発明の方法および系の様々な改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、主張されている本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されているはずである。実際、ミトコンドリア生物学、放射線学、または関連分野の業者にとって明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【図１】
2013523702.tif 000003
【図２】
2013523702.tif 000004
【図３】
2013523702.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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