(57)【要約】  ウイルスクリアランス試験に使用されるウイルスストックの純度及び力価は試験結果に大きく影響し、及びスケールダウンモデルが生産規模プロセスをどの程度反映しているかに影響を与える。ウイルスストック中の不純物はフィルタの汚損を早め、それによりフィルタの真のスループット能力の過小評価、及びその結果としての生産規模ユニットの不適切なサイジングを招き得るため、そのような不純物は小型のウイルス保持性フィルタの試験では特に重要である。加えて、不純物はまた、汚損のメカニズム及び続いてウイルスフィルタの流体通過が変化することにより観察されるウイルスクリアランスレベルにも影響を及ぼし得る。本明細書には、高力価を有する高純度ウイルスストックを作製、産生及び使用する方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む高純度ウイルスストック溶液の調製方法において、
（ａ）低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップと、
（ｃ）前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップであって、前記沈殿したウイルスが１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を含む、ステップと、
の逐次ステップを含み、それにより高純度ウイルスストック溶液を作製する、方法。
【請求項２】
痕跡量の不純物を除去するために前記沈殿したウイルスを処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低タンパク質条件下で調製されるウイルスサンプルが、無血清細胞培養又は限定培地細胞培養ウイルス調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップが、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過、透析、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記好適な緩衝液がトリス−ＮａＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップが、超遠心、化学誘導性沈殿、クロマトグラフィーによる結合、ポリマー誘導性凝集、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学誘導性沈殿が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導性沈殿である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスストック溶液が約６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスストック溶液が、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記さらに処理するステップが、フロースルークロマトグラフィー、膜吸着、ビーズベースのクロマトグラフィー、サイズ排除処理、又は疎水性に基づく処理を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記さらに処理するステップが、陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、哺乳動物ウイルス又はバクテリオファージ、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、パルボウイルス又はゼノトロピックマウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記パルボウイルスがマウスマイニュートウイルス（ＭＶＭ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法により作製されるウイルスストック溶液。
【請求項１６】
少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度にウイルスを精製する方法において、
（ａ）低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップと、
（ｃ）前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップであって、前記沈殿したウイルスが少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス濃度及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を有する、ステップと、
の逐次ステップを含み、それによりウイルスを少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度に精製する、方法。
【請求項１７】
痕跡量の不純物を除去するために前記沈殿したウイルスを処理するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記低タンパク質条件下で調製されるウイルスサンプルが、無血清細胞培養又は限定培地細胞培養ウイルス調製物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップが、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過、透析、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記好適な緩衝液がトリス−ＮａＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップが、超遠心、化学誘導性沈殿、クロマトグラフィーによる結合、ポリマー誘導性凝集、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
化学誘導性沈殿がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導性沈殿である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスストック溶液が約６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスストック溶液が、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記さらに処理するステップが、フロースルークロマトグラフィー、膜吸着、ビーズベースのクロマトグラフィー、サイズ排除処理、又は疎水性に基づく処理を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記さらに処理するステップが、陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが、哺乳動物ウイルス又はバクテリオファージ、又はそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスが、パルボウイルス又はゼノトロピックマウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記パルボウイルスがマウスマイニュートウイルス（ＭＶＭ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１６に記載の方法により精製されるウイルス。
【請求項３１】
ウイルスクリアランスプロセスの評価方法において、
（ａ）サンプルをウイルス溶液でスパイクするステップであって、前記ウイルス溶液が：少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス；１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度；及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を含み、それにより試験サンプルを作製する、ステップと、
（ｂ）前記試験サンプルを使用してスケール化ウイルスクリアランスプロセスを試験するステップと、
（ｃ）前記ウイルスクリアランスプロセスの結果を分析するステップと、
を含み、
ウイルスクリアランス量が前記ウイルスクリアランスプロセスのウイルス除去能力を決定し、それにより前記ウイルスクリアランスプロセスを評価する、方法。
【請求項３２】
前記試験サンプルが少なくとも１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルスを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスクリアランスプロセスが、ウイルス除去、ウイルス不活性化、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルス除去方法が、フィルタ、クロマトグラフィー媒体を含み、及び前記ウイルス不活性化方法が、低ｐＨ、高ｐＨ、紫外線（ＵＶ）照射、γ線照射、又は温度不活性化を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスが、哺乳動物ウイルス又はバクテリオファージ、又はそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスが、パルボウイルス又はゼノトロピックマウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記パルボウイルスがマウスマイニュートウイルス（ＭＶＭ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスクリアランスプロセスの評価方法において、
（ａ）サンプルをウイルス溶液でスパイクするステップであって、前記ウイルス溶液がフロースルークロマトグラフィーを含む方法により調製され、それにより試験サンプルを作製するステップと、
（ｂ）前記試験サンプルを使用してスケール化ウイルスクリアランスプロセスを試験するステップと、
（ｃ）前記ウイルスクリアランスプロセスの結果を分析するステップと、
を含み、
ウイルスクリアランス量が前記ウイルスクリアランスプロセスのウイルス除去能力を決定し、それにより前記ウイルスクリアランスプロセスを評価する、方法。
【請求項３９】
前記フロースルークロマトグラフィーが、膜又はビーズベースのマトリックスでの陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーを含む、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／３２４，２２０号明細書の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品、例えばモノクローナル抗体、組換えタンパク質、ワクチン、血液製剤及び畜産物などは、感染性ウイルスの伝染リスクを含む。これは、原料が本質的にウイルスに汚染されている可能性があることに起因する。加えて、バイオ医薬品の製造プロセスは外部的な汚染源からのウイルスに汚染され易い。結果としてバイオ医薬品の製造者は、その製造プロセスに、その製品が汚染ウイルスを含まないことを確実にするのに十分なウイルスクリアランス工程を組み込まなければならない。安全上及び規制上、バイオ医薬品の製造プロセスにこのようなウイルスクリアランス工程を組み込むことは不可避である。
【０００３】
製造プロセスにおけるウイルスクリアランス工程の有効性評価は必須である。ウイルスクリアランス評価の目的は、潜在的なウイルス性汚染物質を不活性化及び／又は除去する工業的生産プロセスの能力を判断することである。典型的には、生産規模プロセスのスケールダウンモデルでスパイク試験を用いてウイルスクリアランス工程の評価及びバリデーションが行われる。しかしながら、試験結果には、ウイルスクリアランス試験に使用されるウイルスストックの純度及び力価が大きく影響する。ウイルスストックの純度及び力価は、スケールダウンモデルが生産規模プロセスをどの程度反映しているかに影響を与える。
【０００４】
例えば、ウイルスストック中の不純物は、ウイルスクリアランス工程で使用される小型のウイルス保持性フィルタの試験に悪影響を与える。不純物は、バリデーション用のスパイク試験で不純なウイルスストックが使用される結果として取り込まれ、生産規模プロセスでの典型的な製造プロセスを反映するものではない。不純物がある結果として、試験ユニット（例えばフィルタ）は汚損が早まり、汚損状態の変化を呈し、及びウイルスフィルタの流体通過に悪影響が及ぶ。結果的に、フィルタの真のスループット能力が過小評価され、ひいては生産規模ユニットの不適切なサイジングを招く。結果として、バリデーション試験におけるユニットの見かけの低性能を補償するため、生産規模ユニットが過大となる。これにより生産コストが増加する。加えて、これは生産プロセスにおける試験ユニットの実際のウイルス浄化能力を過小評価する。これは、多くの場合にウイルスストックの力価が試験材料にスパイク可能な最大ウイルス濃度を決定し、全てのウイルスが試験ユニットによって有効に浄化されるときのこの最大濃度が、試験ユニットのウイルスクリアランス申告値の限界を定めるためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウイルスストック（例えば、スパイク試験で使用されるもの）の現行の作製方法は、不純物含量が低いウイルスストックを作製する能力を欠いている。さらに、試験系に添加することのできるウイルススパイク量が規制ガイドラインによって制限されているため、可能な限り高力価のウイルスストックが望ましい。現行の方法は、高力価且つ高純度のウイルスストックを作製する能力を欠いている。従って、高純度で、さらに高力価でもあるウイルスストックの調製方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、高純度ウイルスストックの作製方法、並びにそのような方法で作製されたウイルス及びウイルスストックが記載される。ウイルスは、哺乳動物ウイルス、又はバクテリオファージなど、必要に応じて任意の好適なウイルスであってよい。かかるウイルスストックは、例えば評価及び／又はバリデーション試験におけるウイルススパイクとしての使用に好適である。
【０００７】
従って、本発明の一実施形態は高純度ウイルスの調製方法である。この方法は、低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップと、ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップとの逐次ステップを含み、このようにして沈殿したウイルスは高純度ウイルスである。一実施形態では、高純度ウイルスは高純度ウイルスストック溶液である。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、高純度ウイルスの調製方法はクロマトグラフィーポリッシングを含む。一実施形態では、高純度ウイルスの調製方法は、低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップと、ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップと、沈殿したウイルスをクロマトグラフィーポリッシングするステップとの逐次ステップを含み、それにより高純度ウイルスを作製する。一実施形態では、高純度ウイルスは高純度ウイルスストック溶液である。
【０００９】
一実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は５０ｕｇ／ｍｌ未満のタンパク質濃度を有する。別の実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を有する。一実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度を有する。別の実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。一実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。
【００１０】
さらなる実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。一実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。
【００１１】
さらなる実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス濃度を有する。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、ウイルスクリアランスプロセス及びそこで使用される材料を評価及び／又はバリデートする方法である。スケール化ウイルスクリアランスプロセスが試験サンプルを使用して試験され、そのウイルスクリアランスプロセスの結果が分析される。ウイルスクリアランスの量によりウイルスクリアランスプロセス及びそのウイルスクリアランスプロセスに使用される材料が評価され、及びそのバリデーションが決定される。試験サンプルからウイルスが十分に除去されて規制基準を満たす場合、そのウイルスクリアランスプロセス及びクリアランスに使用される材料がバリデートされる。
【００１３】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法は、サンプルを高純度ウイルスストック溶液でスパイクして試験サンプルを作製するステップを含む。一実施形態では、高純度ウイルス溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度、及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、サンプルをウイルス溶液でスパイクするステップを含む方法におけるウイルスクリアランスプロセスの評価及び／又はバリデーション方法であり、ウイルス溶液は、フロースルークロマトグラフィー、ビーズベースのクロマトグラフィー、サイズ排除処理、又は疎水性に基づく処理を含む方法により調製される。一実施形態では、ウイルス溶液は陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーにより調製される。別の実施形態では、ウイルス溶液は陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーにより調製される。一実施形態では、フロースルークロマトグラフィーは、膜又はビーズベースのマトリックスでの陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーを含む。
【００１５】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセス及びそこで使用される材料を評価及び／又はバリデートする方法は、少なくとも１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルスと、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度と、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度とを含む高純度ウイルスストック溶液でサンプルをスパイクするステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】一般的なウイルス産生プロトコルの概略及び特定のマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）産生プロセスの例である。
【図２】本発明の一実施形態を示すフローチャートである。
【図３】本発明の一実施形態を示す。サンプルウイルス調製方法における種々の段階で採取したサンプルの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１、１４及び１５は標準分子量マーカーである。レーン２は、培地を１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）から無血清ＤＭＥＭに交換する直前の３日目におけるＭＶＭ感染細胞培地のサンプルである。レーン３は、１４日目の感染終了時におけるプールした細胞ライセートのサンプルである。レーン４は、清澄化したライセートのサンプルである。レーン５は、ウイルスを濃縮する限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標））からのろ液のサンプルである。レーン６は、ウイルスを濃縮する限外ろ過からの希釈した保持液のサンプルである。レーン７は、超遠心によるウイルス沈殿後の上清のサンプルである。レーン８は、超遠心によるウイルス沈殿後のウイルスペレットのサンプルである。レーン９は、超遠心及び０．２２ミクロンフィルタでのろ過によるウイルス沈殿後のウイルスペレットのサンプルである。レーン１０及び１２は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）マトリックス上にＭＢＡｍ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）により架橋されたＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）を含む陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体を使用したクロマトグラフィーポリッシングの初期画分のサンプルである。レーン１１及び１３は、ＣＥＸ膜吸着体を使用したクロマトグラフィーポリッシングの後期画分である。出典Ｗｉｌｌｗａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：５６６０によるもので、分子の大きさがＭＶＭカプシドタンパク質ＶＰ１は８３ｋＤａであり、ＶＰ２は６４ｋＤａであることを示す。最終的な精製ウイルス産物における銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）により明らかな２つの主要タンパク質バンドは、既知のＭＶＭウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２と同じサイズ、且つ同じ比率であり、主な残存タンパク質が不純物ではなくウイルスである極めて高純度のウイルスストックが示唆される。図３ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対応する表であり、レーン２〜１３の各サンプルについてのＭＶＭウイルス力価（ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、タンパク質濃度（ｕｇ／ｍｌ及びｆｇ／ＴＣＩＤ５０）、及びＤＮＡ濃度（ｕｇ／ｍｌ及びｆｇ／ＴＣＩＤ５０）の計算値を含む。
【図４】本明細書に記載されるＭＶＭ作製プロセスの再現性を実証する表である。
【図５】本発明の一実施形態を示す。図５ＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対応する表であり、レーン２〜１１の各サンプルについてのＭＶＭウイルス力価（ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）及びタンパク質濃度（ｕｇ／ｍｌ及びｆｇ／ＴＣＩＤ５０）の計算値を含む。サンプルウイルス調製方法における種々の段階で採取したサンプルの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１及び１２は標準分子量マーカーである。レーン２は、１％ＦＢＳ含有Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭから無血清Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭに交換する直前の３日目におけるＭＶＭ感染細胞培地のサンプルである。レーン３は、１４日目の感染終了時におけるプールした細胞ライセートのサンプルである。レーン４及び５は、清澄化したライセートのサンプルである。レーン６は、ウイルスを濃縮する限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標））からのろ液のサンプルである。レーン７は、ウイルスを濃縮する限外ろ過からの希釈した保持液のサンプルである。レーン８は、超遠心によるウイルス沈殿後の上清のサンプルである。レーン９は、超遠心によるウイルス沈殿後に再懸濁したウイルスペレットのサンプルである。レーン１０は、ＣＥＸ膜吸着体を使用したクロマトグラフィーポリッシングの３番目の画分のサンプルである。レーン１１は、ＣＥＸ膜吸着体を使用したクロマトグラフィーポリッシングの２７番目の画分のサンプルである。
【図６】本明細書に記載されるとおりの方法を用いた高力価且つ高純度のウイルス作製についてのデータ表である。
【図７】試験フィルタ（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ（Ｖ−Ｐｒｏ））の水力学的性能を実証するグラフであり、本明細書に記載されるとおり調製したウイルスでスパイクしたサンプルを使用し、及び契約試験機関（ＣＴＯ）により提供された、バリデーション試験で典型的に使用される標準的なウイルス調製物でスパイクしたサンプルと比較した。ＣＴＯによるウイルス調製物には超遠心法が用いられた。本明細書に記載されるとおり調製したＭＶＭは、以前にウイルススパイクとの相互作用に起因するろ過上の課題を示したことがあるモノクローナル抗体供給液（９．１ｇ／Ｌ）にスパイクした。ＣＴＯにより作製されたＭＶＭは、２×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度にスパイクしたところ、スパイクしていない供給液ベースライン（ウイルスなし）と比較して、フィルタＶ−Ｐｒｏを通じたスループットが劇的に低下した。対照的に、本明細書に記載されるとおり調製したＭＶＭは、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌのスパイクレベルでは、また６×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌに至る１０倍高いスパイクでも、水力学的性能に何ら影響を及ぼさなかった。
【図８】異なる方法で調製した３つのＣＴＯ  ＭＶＭスパイクストックについて、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）供給液にスパイクし、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏに通して処理したときの、それらの水力学的性能を評価したグラフである。
【図９】３つの標準ＣＴＯ  ＭＶＭ調製物及び本発明の方法によるＭＶＭ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析の写真である。４〜１５％勾配ゲルにおけるタンパク質を銀染色によって可視化した。各サンプルレーンには１０μｌのサンプルを負荷した。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ＣＴＯ粗ＭＶＭ調製物（２．３×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン３：ＣＴＯ超遠心精製ＭＶＭ調製物（１．８×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン４（２．３×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）：ＣＴＯ  Ｑ膜結合／溶出精製ＭＶＭ調製物；レーン５：本発明のＭＶＭ調製物（６．５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン６：分子量マーカー。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
バイオ医薬品、例えば抗体、組換えタンパク質、ワクチン、血液製剤、血漿、及び畜産物等の、細菌、ウイルス、プリオンなどによる汚染は、十分な対処を要する深刻なリスクである。汚染は様々な形で発生し得る。例えば、原料（例えば、細胞培養物中の細胞、血液製剤等）が本質的にウイルスで汚染されているために汚染が起こり得る。バイオ医薬品の製造プロセスはまた、外因的な汚染源からもウイルスに汚染され易い（例えば、滅菌されていない、又は滅菌が不適切な材料の使用による不注意な導入）。製品の性質から、バイオ医薬品の製造者は高度に規制され、その製造プロセスに十分なウイルスクリアランス工程を組み込んで、その製品が汚染物質を含まないことを確実にするよう義務付けられている。製造プロセスには複数のウイルスクリアランス工程を組み込むことができる。バイオ医薬品製造プロセスの承認を受けるには、それらのウイルスクリアランス工程の各々をその有効性について評価し、ひいてはバリデートする必要がある。ウイルスクリアランス工程は、典型的にはウイルス除去工程又はウイルス不活性化工程のいずれかを含む。
【００１８】
ウイルス除去は、ウイルスをサンプルから物理的に除去する方法である。これは、多くの場合にナノろ過又はクロマトグラフィーのいずれかによって達成される。ナノろ過技法は、ウイルスをサイズ排除によって除去する。クロマトグラフ法がウイルスの除去に成功するかは、用いられるカラム組成及び試薬（例えば緩衝液）に依存する。
【００１９】
ウイルス不活性化は、ウイルスが最終製品に残り得るが、感染性を有しない（不活性な）形態で残る方法である。多くのウイルスが脂質又はタンパク質コートを含み、このコートを化学的に変化させて不活性化することができる。或いは、ウイルス不活性化方法によっては、ウイルスを完全に変性させる。ウイルス不活性化方法の例としては、溶媒及び／又は界面活性剤不活性化、パスツリゼーション（例えば、高温に加熱する）、ｐＨ不活性化（例えば、酸性ｐＨを使用する）、及び放射線照射（例えば、紫外線（ＵＶ）照射又はγ線照射）が挙げられる。
【００２０】
製造プロセスにおける汚染ウイルスの濃縮、すなわちウイルス汚染のリスクは極めて低いが、しかしながらウイルスは本質的に感染性であるため、１個のウイルス粒子であっても、製造プロセスのラン全てを台無しにするのに十分であり得る。このような理由から、製造プロセスにおける適切な除去又は不活性化方法を判断するために特別な方策を講じなければならない。従って、かかるウイルスクリアランス方法の有効性を評価し、バリデートする必要がある。スパイク試験は、これを目的として特別に作成された。
【００２１】
スパイク試験は、生産規模プロセスのウイルスクリアランス工程のスケールダウンモデルを使用してウイルスクリアランス工程を評価及び／又はバリデートし、及びウイルスクリアランス方法に使用される機器を評価及び／又はバリデートする。ウイルスストックの純度及び力価は、スケールダウンモデルが生産規模プロセスをどの程度反映しているかに影響を与える。ウイルスストック中の不純物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、非感染性粒子及びウイルス凝集体）は、スパイク試験の結果に悪影響を及ぼす。例えば不純物は、ウイルスを不活性化する化学物質の作用を阻害し、放射線の有効性を阻害し、標的因子のクロマトグラフ媒体との結合性を変化させる（例えば、クロマトグラフ媒体との結合が不適切に抑制される、又は結合が不適切に増加する）ことにより、又はフィルタを汚損する（例えば、塞ぐ又は目詰まりさせる）ことにより、ウイルスクリアランス速度を変化させ得る。試験ユニット（例えばフィルタ又はクロマトグラフィー媒体）の汚損が早まると、又はその汚損特性が変化を呈すると、最終的にウイルスフィルタを通過する流体が減少する。生産規模ユニットにはかかる不純物は通常存在しないため、結果としてフィルタの実際のスループット能力が過小評価される。そのため、バリデーション試験におけるユニットの見かけの低性能を補償して、生産規模ユニットが過大となる。現行の業界標準のウイルスストック（例えばスパイク試験で使用される）作製方法では、概して高不純物含量のウイルスストックが作製される。
【００２２】
加えて、また可能な限り高力価のウイルスストックが望ましい。これは一部には、試験系に添加することのできるウイルススパイク量が規制ガイドラインにより制限されているためである。従ってウイルスストックの力価が、試験材料にスパイクされるウイルスの最大可能濃度を決定する。結果として、生産プロセスでウイルスを浄化する試験ユニットの実際の能力が過小評価され得る。現行の方法は、高純度及び高力価のウイルスストックを作製する能力に欠けている。
【００２３】
本明細書に記載されるウイルス調製方法は、非常に高純度及び高力価のウイルスを作製する。これらの清浄なウイルスストックは、スケールダウンしたユニット運転の性能に影響を与えることなくウイルスクリアランス試験における高濃度スパイクが可能であるように設計される。これは小型のウイルス保持性フィルタの評価及びバリデーションに特に有用であり、このようなフィルタは、特に特定の供給材料と組み合わせたとき、ウイルスストック不純物に対して高感度であり得る。加えて、ウイルス力価が高いほど、より高いウイルス減少率を実証することができ、及びウイルスクリアランスユニット運転にとってより厳しい課題が可能となる。
【００２４】
ウイルスクリアランス試験に使用される例示的ウイルスであって、本明細書に記載される方法を用いて高力価且つ高純度で作製することができるウイルスとしては、哺乳動物ウイルス及びバクテリオファージ、例えば、及び限定なしに：ＲＮＡエンベロープ型ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ゼノトロピック、アンホトロピック、及びエコトロピック組換えマウスレトロウイルス、例えばゼノトロピックマウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）、ビスナウイルスなどのレトロウイルス；ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）などのフラビウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルス；パラインフルエンザ３型（ＰＩＶ３）などのパラミクソウイルス）；ＲＮＡ非エンベロープ型ウイルス（例えば、レオウイルス３型（ｒｅｏ−３）などのレオウイルス；ポリオウイルス１型（ＰＶ−１）などのピコルナウイルス；脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルス及びＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのピコルナウイルス）；ＤＮＡエンベロープ型ウイルス（例えば、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）などのヘルペスウイルス；オルフウイルスなどのポックスウイルス）；ＤＮＡ非エンベロープ型ウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスなどのアデノウイルス；シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのポリオーマウイルス、並びにブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、パルボウイルスＢ１９、及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）（マウスマイニュートウイルス（ｍｉｃｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ）、マウスマイニュートウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＶとしても知られる）などのパルボウイルス；及びＰｈｉ−Ｘ  １７４（又はＰｈｉ−Ｘ）、シュードモナスファージＰＰ７、腸内細菌ファージＰＲ７７２、及びシュードモナスファージＰｈｉ−６などのバクテリオファージが挙げられる。
【００２５】
記載される方法は、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）に成功裏に適用された。最も小さく、且つウイルスの除去又は不活性化が最も難しいもののなかで、このパルボウイルスはウイルスクリアランス、特にバイオ医薬品のウイルスろ過の「ゴールドスタンダード」である。従って、この方法はまた他のウイルス、特に性質上ＭＶＭと同様のウイルス（例えば、細胞によって比較的高い力価で産生される非エンベロープ型ウイルス）にも適用可能である。例えば、血漿工業の重要なゴールドスタンダードウイルスであるブタパルボウイルス（ＰＰＶ）は、構造的にＭＶＭと極めて類似している。
【００２６】
実際上の理由から、評価及びバリデーションが行われるプロセス工程はスケールダウンされる。これは、ウイルススパイク試験に必要なウイルス量から、ウイルスクリアランス試験に実際の生産規模を用いることが現実的でないためである。さらに、直ちに明らかなとおり、試験のために感染性ウイルスを医薬品適正製造基準（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｃＧＭＰ）の製造設備そのものに導入することは不適切であり得る。ウイルスクリアランスは、スパイクした出発物質のウイルス負荷を、試験ユニットから得られた処理後の材料と比較してウイルスの減少率（本明細書では「ウイルス減少率」又は「ＶＲＦ」とも称される）を求めることにより計算される。
【００２７】
高純度且つ高力価のウイルスの一般的な作製手順、並びにＭＶＭに使用される具体的なウイルス精製技法を、図１に概略的に示す。
【００２８】
本発明の一実施形態は、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液の調製方法である。本明細書で使用されるとき、「高純度ウイルス」は、不純物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、脂質）の濃度が極めて低いウイルスである。一実施形態では、高純度ウイルスは、５０ｕｇ／ｍｌ未満、４５ｕｇ／ｍｌ未満、４０ｕｇ／ｍｌ未満、３５ｕｇ／ｍｌ未満、３０ｕｇ／ｍｌ未満、２５ｕｇ／ｍｌ未満、２０ｕｇ／ｍｌ未満、１５ｕｇ／ｍｌ未満、１０ｕｇ／ｍｌ未満、５ｕｇ／ｍｌ未満、又はそれ以下のタンパク質濃度を有する。
【００２９】
別の実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、又はそれ以下のタンパク質濃度を有する。
【００３０】
さらなる実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、４５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、３５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満、又はそれ以下のＤＮＡ濃度を有する。
【００３１】
さらに別の実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、上記に定義するとおりのタンパク質濃度及び上記に定義するとおりのＤＮＡ濃度を有する。一実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。別の実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。さらなる実施形態では、高純度ウイルス又は高純度ウイルスストック溶液は、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。
【００３２】
当業者は理解するであろうとおり、ＴＣＩＤ５０／ｍｌは、病原因子を接種した細胞培養物の５０％に病理学的変化を生じさせる病原因子の量の計測値であり、「組織培養感染量５０」（ＴＣＩＤ５０）と表現される。ＴＣＩＤ５０値の決定方法は当該技術分野において公知である。一般には、ウイルスストックの段階希釈物が調製され、同型細胞培養物に、例えば多ウェルフォーマット（例えば、９６ウェルプラスチックプレート）で接種される。次に、細胞培養期間後に各ウイルス希釈物について、典型的には細胞変性効果（ＣＰＥ）を調べることにより、感染した細胞培養物の数が決定される。典型的な試験では、ウイルスを高倍に段階希釈すると、粒子が存在しないために細胞培養物はいずれも感染しない。ウイルスを低倍に段階希釈すると、あらゆる細胞培養物が感染する。特定の段階希釈のウイルスで細胞培養物の半分が細胞変性効果を示すとき、それが、細胞培養物の５０％が感染するウイルスの希釈率である。この数値はデータから計算することができ、ミリリットル当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として表される。
【００３３】
一実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度を有する。
【００３４】
この方法は、低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、ウイルスサンプルを濃縮するステップと、好適な緩衝液に交換するステップと、ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップとの逐次ステップを含み、このようにして沈殿したウイルスは高純度ウイルスである。一実施形態では、高純度ウイルスは上記に記載したとおりのウイルス力価を有する。
【００３５】
低タンパク質条件下で調製されるウイルスサンプルは、任意の好適な方法を用いて実現することができる。例えば、ウイルスサンプルは、低血清培地培養、無血清培地培養、限定培地培養、又はそれらの組み合わせで培養されたウイルス感染細胞から得ることができる。一実施形態では、細胞は低血清含有細胞培養培地（例えば、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））で感染させた後、無血清細胞培養培地（例えば、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ、又はＦＢＳ不含Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ）か、又は限定無血清細胞培養培地で培養される。別の実施形態では、細胞は無血清細胞培養培地（例えば、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ、又はＦＢＳ不含Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ）、又は限定無血清細胞培養培地で感染させる。
【００３６】
ウイルスは濃縮され、細胞培地は好適な緩衝液と交換される。例えばウイルスは、好適な緩衝液、例えば、トリス−ＮａＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）緩衝液（例えば、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（例えば、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）；トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（例えば、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ｐＨ７．６）；トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（例えば、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ）；又は１０ｍＭのトリスに濃縮される。
【００３７】
一実施形態では、ウイルスサンプルは、限外ろ過（例えば、限外ろ過遠心装置）、タンジェンシャルフローろ過、透析、又はそれらの組み合わせにより濃縮される。限外ろ過では、サンプルは、流体及び小分子（例えば、直径が膜孔径より小さい塩、糖、及びタンパク質）を通過させるがウイルスは保持する膜に通して処理される。流体は、限定はされないが、遠心、蠕動ポンプ、真空及び空気圧を含む数多くの方法によって限外ろ過膜に押し通すことができる。次にウイルスは所望の量の新しい緩衝液に再懸濁される。タンジェンシャルフローろ過（クロスフローろ過としても知られる）では、供給溶液が限外ろ過膜の表面に対して垂直に流れる。ウイルスは通過しない一方で、流体及び小分子を膜に流し通す膜間差圧が作り出され、サンプル中の容量が低減される。次に、膜を通して流体を引き込み続けながら新しい緩衝液をタンジェンシャルフローろ過システムに供給することにより、緩衝液が交換され得る。透析では、サンプルが、流体及び小分子は自由に通過させるがウイルスは内部に保持する袋状の膜の中に入れられる。この「透析袋」を規定の容量オスモル濃度で多量の緩衝液中に入れることにより、サンプル中の細胞培養培地が新しい緩衝液中に希釈され、及び袋内の容量が減少して、緩衝液交換及びウイルス濃縮の双方が達成される。詳細な実施形態において、ウイルスサンプルは限外ろ過及びＴＮＥへの緩衝液交換により濃縮される。
【００３８】
ウイルスサンプル中のウイルスの沈殿は、任意の好適な方法によって実現することができる。例えば、超遠心、化学誘導性沈殿、クロマトグラフィーによる結合、ポリマー誘導性凝集、又はそれらの組み合わせ。超遠心技法が当該技術分野では標準的である。例えばウイルスサンプルを、標準的な装置を使用して、約４℃、少なくとも約２５，０００ＲＰＭ（１１２６００×ｇ）で少なくとも約４時間超遠心し、チューブの底にあるペレットとして収集することができる。チューブの底に高密度媒体の「クッション」（例えば、グリセロール）を入れてからサンプルを添加してもよく、それによりウイルスは、チューブの底のペレットに至るまでにこの高密度層を通過しなければならず、一方で不純物は通過しない。ウイルスはまた、塩化セシウム又はイオジキサノールなどの密度勾配媒体を通して遠心し、当該の密度勾配に沿った何らかの点における濃縮層としてウイルスを収集することもできる。化学剤を使用するウイルス沈殿は、ウイルスを結合し、且つ不溶性の凝集体を形成する任意の薬剤であってよい（例えば、任意の好適な分子量（ＭＷ）、例えば約ＭＷ６，０００〜約ＭＷ１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。クロマトグラフィーによる結合は、ウイルスを結合するのに適したクロマトグラフ媒体を使用して実現することができる（例えば、アガロース、コントロールドポアグラス又は膜媒体でのＱ型又はＳ型ケミストリー）。ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるには、誘導的に凝集する可溶性ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリビニルアルコールなどのスマートポリマー）もまた使用することができる。一実施形態では、ウイルスは超遠心法によって沈殿される。
【００３９】
一実施形態では、この方法は、沈殿したウイルスのクロマトグラフィーポリッシングをさらに含む。本明細書で使用されるとき、「クロマトグラフィーポリッシング」は、ウイルスの大部分を通過させる一方で、不純物をその静電荷又は疎水性に基づき保持する媒体にサンプルを通過させることにより、痕跡量の不純物を除去することを指す。クロマトグラフィーポリッシングは、典型的にはウイルス沈殿によって除去されない不純物を除去する。一実施形態では、ウイルスはフロースルークロマトグラフィーポリッシング（例えば、陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体、又はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）などの陰イオン交換媒体を使用する）に供される。かかるクロマトグラフィーポリッシングは、タンパク質、核酸、脂質、及び糖などの不純物を、その静電荷に基づきウイルスサンプルから除去する。他のクロマトグラフィーポリッシング方法、例えば他の膜吸着体（例えば、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ）；適切なケミストリー（ウイルス及び緩衝液条件に依存してＳ又はＱ）によるビーズベースのクロマトグラフ媒体；サイズ排除媒体；疎水性に基づく媒体）を用いることができる。当業者は理解するであろうとおり、使用するクロマトグラフィーポリッシング装置の選択は、精製するウイルスの性質、除去すべき汚染物質、及び精製のスケールに依存する。
【００４０】
本明細書に記載される方法の一実施形態では、ウイルスは結合することなしにクロマトグラフィーポリッシング媒体を通って流れる一方、不純物は媒体に結合し、従ってサンプルから除去される。緩衝液条件は、ウイルスの通過及び不純物の除去を最大化するように（例えば、塩含有量及び／又はｐＨ値を変えて）調整されてもよい。一実施形態では、ＴＮＥ緩衝液、ｐＨ７中のＭＶＭを陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着装置に通過させることにより、タンパク質及びＤＮＡ不純物を膜に吸着させて除去し、一方でウイルスの大部分は通過する。
【００４１】
別の実施形態では、クロマトグラフィーポリッシングは、ウイルスを精製して高純度ウイルスを作製するための任意のウイルス調製及び精製方法に適用される。例えば、本明細書に記載されるものに加え、クロマトグラフィーポリッシングによりさらに精製することができる他のウイルス調製及び精製方法は、超遠心ペレット形成、勾配精製、限外ろ過により調製されるウイルスを含む。クロマトグラフィーポリッシングはまた、細胞残屑を除去するため清澄化によってのみ処理された未精製のウイルス調製物からのウイルス精製にも用いることができる。かかるウイルス調製物は、例えば、用いられる具体的なウイルス、緩衝液条件、及び方法の規模に適切なクロマトグラフ媒体を使用して、フロースルー方式で精製されてもよい。一実施形態では、超遠心ペレット形成により濃縮したウイルス（例えば、ＭＶＭ）を陽イオン交換（ＣＥＸ）膜に通過させる。一実施形態では、ＣＥＸ膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）マトリックス上にＭＢＡｍ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）により架橋されたＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）を含む。ウイルス（例えば、ＭＶＭ）は著しい結合なしに膜を通過する一方、タンパク質及びＤＮＡなどの不純物は膜に結合して、ウイルスサンプルから除去される。
【００４２】
本明細書に記載される方法は、ウイルスストック中の不純物の存在を大幅に低減する。例えば、ウイルスストック中の不純物の総量が大幅に減少する。「不純物の総量」とは、不純物の分量が減少する（例えば、標準アッセイ、例えば、タンパク質定量用のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、ＤＮＡ定量用のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）などにより決定するとき、タンパク質、ＤＮＡなどの不純物のマイクログラム数又はフェムトグラム数が約９０〜約９９％だけ低下する）ことを意味する。加えて、不純物の数が大幅に減少する。例えば、タンパク質ゲル上で同定可能なタンパク質不純物は、タンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色法などの方法により決定するときの数百、数千、又は数万種の異なるタンパク質とは対照的に、僅か数種（例えば、２、３、５、１０、又は２０種）の異なるタンパク質であり得る。不純物はウイルス調製物の汚染物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、非感染性粒子及びウイルス凝集体である。
【００４３】
一実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度、及び１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質を有する。
【００４４】
一実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度、及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度を有する。
【００４５】
一実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度、及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を有する。
【００４６】
一実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度；１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度；及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を有する。
【００４７】
当業者は理解するであろうとおり、本明細書に記載される方法を適用することにより、多くのウイルスを、少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度に精製することができる。従って、一実施形態では、低タンパク質条件下で調製されたウイルスサンプルを得るステップと、ウイルスサンプルを好適な緩衝液中に濃縮するステップと、ウイルスサンプル中のウイルスを沈殿させるステップとの逐次ステップを含む、少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度にウイルスを精製する方法であり、ここで沈殿したウイルスは少なくとも１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス濃度を有し、従ってウイルスは少なくとも１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度に精製される。
【００４８】
一実施形態では、この方法はウイルスを少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度に精製する。
【００４９】
別の実施形態では、この方法はウイルスを少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度、及び１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質に精製する。
【００５０】
一実施形態では、この方法はウイルスを少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度、及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度に精製する。
【００５１】
一実施形態では、この方法はウイルスを少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度、及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度に精製する。
【００５２】
一実施形態では、この方法はウイルスを少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上の濃度；１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度；及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度に精製する。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載される方法によって作製される高純度ウイルス又は高純度ウイルスストックである。一実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製される高純度ウイルス又は高純度ウイルスストックを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる組成物である。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態は、ウイルスクリアランスプロセス及びそのクリアランスプロセスで使用されるウイルスクリアランスユニット運転（例えば、ダイレクトフロー若しくはタンジェンシャルフローのいずれかの方式の平膜型又は中空糸型ランのフィルタ；陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性交換、混合方式クロマトグラフィー、プロテインＡなどのアフィニティークロマトグラフィー又は他のリガンドベースの吸着を含むクロマトグラフィー工程；低ｐＨ、溶媒／界面活性剤、放射線照射（γ線又は紫外線）、熱処理などのウイルス不活性化方法）を評価及び／又はバリデートする方法である。
【００５５】
上記に考察したとおり、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする一つの方法は、スケールダウンしたウイルスクリアランスプロセスモデル（本明細書では「スケール化ウイルスクリアランスプロセス」とも称される）におけるウイルススパイク試験である。このウイルススパイク試験の目的は、製品（バイオ医薬品など）の製造プロセスからのウイルス浄化におけるウイルスクリアランスユニットの有効性を評価することである。ウイルス力価が高いほど、より高いウイルス減少率を実証することができ、及びウイルスクリアランスユニット運転にとってより厳しい課題が可能となる。しかしながら、スパイク試験では、サンプル製品の組成が容認し難いほど変化することがないように、スパイク材料を少量、典型的には供試サンプルに対して１０％以下（ｖｏｌ／ｖｏｌ）にとどめることが望ましい。従って、高ウイルス力価のウイルススパイクを使用することが望ましい。ウイルスクリアランスプロセス及び／又はウイルスクリアランスプロセスで使用されるウイルスクリアランスユニットのバリデーション又は評価において使用するサンプルは、任意の好適な製造プロセス供給液サンプルである。例えば、好適なサンプルは、バイオ医薬品の製造で作製される製品を代表するものである。例としては、抗体、組換えタンパク質、ワクチン、コンジュゲートタンパク質、血液製剤、血漿、及び畜産物等を含むサンプル溶液が挙げられる。
【００５６】
従って、一実施形態は、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法であり、この方法は、サンプルを高純度ウイルス溶液でスパイクするステップを含む。一実施形態では、試験サンプルを作製する高純度ウイルス溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を有する。一実施形態では、高純度ウイルスストック溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ乃至少なくとも、又は少なくともほぼ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス濃度の高純度ウイルスを有する。スケールダウンしたウイルスクリアランスプロセスモデルであるスケール化ウイルスクリアランスプロセスは試験サンプルを使用して試験され、ウイルスクリアランスプロセスの結果が分析され、このようにしてウイルスクリアランスの量によりウイルスクリアランスプロセスが評価され、及びそのバリデーションが決定される。
【００５７】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質を含む。別の実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度を含む。さらなる実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。さらに別の実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルスを含む。
【００５８】
別の実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質を含む。
【００５９】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度を含む。
【００６０】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。
【００６１】
一実施形態では、ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス；１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度；及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。
【００６２】
ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法の一実施形態では、試験サンプルは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の上記の高純度ウイルス溶液のいずれか一つでスパイクされる。ウイルスクリアランスプロセスを評価及び／又はバリデートする方法の別の実施形態では、試験サンプルは、上記の高純度ウイルス溶液のいずれか一つからの、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルスでスパイクされる。
【００６３】
試験サンプルからウイルスが十分に除去されて規制基準を満たす場合、それらのデータをウイルスクリアランスプロセスバリデーションに適用することができる。一実施形態では、スケール化ウイルスクリアランスプロセスはフィルタを含む。
【００６４】
さらなる実施形態は、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法である。この方法は、上記に記載したとおりの高純度ウイルス溶液でサンプルをスパイクするステップを含む。一実施形態では、試験サンプルを作製する高純度ウイルスは、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のタンパク質濃度、及び５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０未満のＤＮＡ濃度を含む。別の実施形態では、高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス乃至少なくとも、又は少なくともほぼ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス、又はそれ以上を含む。ウイルスクリアランスプロセスで使用されるウイルスクリアランスユニットのスケールダウンモデルであるウイルスクリアランスユニットは試験サンプルを使用して試験され、ウイルスクリアランスユニットの結果が分析され、このようにしてウイルスクリアランスユニットの有効性がウイルスクリアランスの量により決定される。
【００６５】
一実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質を含む。別の実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度を含む。さらなる実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。さらに別の実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルスを含む。
【００６６】
別の実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び１００ｕｇ／ｍｌ、９０ｕｇ／ｍｌ、８０ｕｇ／ｍｌ、７０ｕｇ／ｍｌ、６０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度のタンパク質を含む。
【００６７】
一実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度を含む。
【００６８】
一実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス、及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。
【００６９】
一実施形態では、ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法で使用される高純度ウイルス溶液は、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルス；１００ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、９０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、８０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、７０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、６０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、４０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いタンパク質濃度；及び３０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、２０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１０ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、１ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、０．５ｆｇ／ＴＣＩＤ５０、又はそれ以下より低い、又はほぼそれより低いＤＮＡ濃度を含む。
【００７０】
ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法の一実施形態では、試験サンプルは、少なくとも、又は少なくともほぼ１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の上記の高純度ウイルス溶液のいずれか一つでスパイクされる。ウイルスクリアランスユニットを評価及び／又はバリデートする方法の別の実施形態では、試験サンプルは、上記の高純度ウイルス溶液のいずれか一つからの、少なくとも、又は少なくともほぼ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５×１０１１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、又はそれ以上のウイルスでスパイクされる。
【００７１】
試験サンプルからウイルスが十分に除去されて規制基準を満たす場合、ウイルスクリアランスユニットがバリデートされる。一実施形態では、ウイルスクリアランスユニットはフィルタを含む。
【００７２】
包括的なスケールダウンウイルスクリアランス試験で達成されるウイルス除去は、医薬品申請の規制上の届出時に報告されるウイルスクリアランス申告に加えられ得る。
【実施例】
【００７３】
実施例１：３２４Ｋ細胞によるＭＶＭ増殖（図２〜図４を参照）
材料：
増殖細胞系：３２４Ｋ細胞（シミアンウイルス４０で形質転換されたヒト線維芽細胞）、ストックから新しく解凍したもの。
感染：ＡＴＣＣ（カタログ番号ＶＲ−１３４６）ウイルスストックから得たマウスマイニュートウイルス（ＭＶＭ）を使用して３２４Ｋ宿主細胞を感染させた。
培地：１０％ウシ胎仔血清「ＦＢＳ」含有ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、及びＦＢＳ不含ＤＭＥＭ。全て、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＬのＬ−グルタミン、０．２単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。ＦＢＳ不含ＤＭＥＭは、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＬのＬ−グルタミン、０．１単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。
再懸濁緩衝液：ＴＮＥ（１０ｍＭのトリス［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）。
装置：ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）マトリックス上にＭＢＡｍ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）により架橋されたＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）を含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）−７０  １００ｋＤａ遠心限外ろ過装置、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ（商標）Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ０．２２μｍフィルタ。
【００７４】
方法：
本明細書に記載されるウイルスストック調製方法のなかの複数の段階でアッセイを実施した。この例では、図２において赤色で示す点でアッセイを実施した。各サンプルについてのアッセイパネルは以下のとおりであった：ウイルス力価（下記参照）、ＢＣＡタンパク質含量（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）前のサンプルに対しては無し）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡ含量、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色。各サンプル点で、アッセイのために１ｍｌのサンプルを取った。
【００７５】
ウイルス力価測定：特に注記しない限り、各力価測定につき５０μｌのサンプルを１０−２希釈物にした（すなわち、４．９５ｍｌの培地となるよう希釈した）。例外的にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）ろ液は、無希釈サンプルから出発してアッセイした。全てのサンプルは力価測定まで４℃で保存し、次に力価測定後に−８０℃で保存した。
【００７６】
３２４Ｋ宿主細胞系成長：新しく解凍した作業用ストックバイアルからＴ１５０フラスコ３０本の３２４Ｋ細胞をコンフルエントになるまで成長させた。成長培地：１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ。
【００７７】
成長及び感染スケジュール：０日目：３２４Ｋ感染−トリプシンを使用して３２４Ｋ細胞を剥がす。懸濁細胞をプールし、１５００ＲＰＭ１０分間でペレット化する。デカントし、培地を廃棄する。５０ｍｌの１％ＦＢＳ含有完全ＤＭＥＭに再懸濁することにより、細胞を洗浄する。上記のとおり細胞をペレット化する。デカントし、培地を廃棄する。再懸濁細胞を単一の滅菌容器にプールし、細胞を計数する。得られた細胞カウントは２．０２Ｅ＋０６細胞／ｍｌで合計６０．０ｍｌであった。細胞の総数は１．２Ｅ＋０８細胞であった。従って、コンフルエントなＴ１５０当たりの細胞数は、９．２Ｅ＋０６細胞であった。１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中２．０×１０５細胞／ｍｌの密度の６５０ｍｌの細胞容量を調製した。具体的には、６０ｍｌの細胞懸濁液を５９０ｍｌの１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに添加した（総容量＝６５０ｍｌ）。細胞密度計数値：２．７Ｅ＋０５細胞／ｍｌ。ＭＶＭは、０．００２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩで懸濁細胞に直接添加した。これは細胞１ｍｌ当たり５００ＴＣＩＤ５０×６５０ｍｌを添加することが必要である＝合計３．３×１０５のＴＣＩＤ５０を添加。ＭＶＭストック力価：１×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ。３．３×１０５ＴＣＩＤ５０÷ストック力価＝６５０ｍｌ細胞に０．００３３ｍｌ＝３．３μｌのＭＶＭストックを添加した（３３μｌの１／１０希釈ストックを添加してもよい）。細胞懸濁液を完全に混合した。２０ｍｌの細胞／ウイルス懸濁液を３０本のＴ１５０フラスコに移した（フラスコ１〜３０と名付けた）。目標の播種＝４．０×１０６細胞／Ｔ１５０フラスコ。実際の播種５．４Ｅ６細胞／Ｔ１５０。細胞を３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。３〜４日目：無血清培地に交換する。３〜４日目の各々にフラスコの１／２ずつ培地を交換する：３日目、フラスコ１〜１５の培地を交換する；４日目、フラスコ１５〜３０の培地を交換する。
【００７８】
培地交換手順：各フラスコ中の培地を共通のプールにデカントする。一日の収集ごとに一つのプールが作られる：フラスコ１〜１５からの培地ｄ３  ｍ／ｃ（３日目培地交換）；フラスコ１５〜３０からの培地ｄ４  ｍ／ｃ。デカントした各培地プールをアッセイする。各フラスコを２０ｍｌのＤＭＥＭ［ＦＢＳ不含］で洗浄する。洗浄培地を流し捨てて廃棄する。培地を２０ｍｌのＤＭＥＭ［ＦＢＳ不含］に取り換え、次に細胞インキュベーションを続行する。
【００７９】
約１４日目：ライセートを回収する。細胞が完全なＣＰＥ（ウイルスにより誘導される溶解）を示すとき、フラスコを３つのプールにデカントすることによって細胞ライセートを回収する。ライセートｄ３  ｍ／ｃ；ライセートｄ４  ｍ／ｃ。各ライセートプールをアッセイする（ウイルス力価のみ）。ライセートを単一のプールに加え合わせる。加え合わせたライセートプールをアッセイする（ウイルス力価のみ）。ライセートは、さらなるステップにより処理するまで、４℃で保存する。
【００８０】
清澄化：２０００×ｇで１５分間スピンすることにより、ライセートを遠心する。デカントして上清を保存する（ペレットは廃棄する）。０．２２μｍ  ＧＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌｕｓ（ＰＶＤＦ）Ｓｔｅｒｉｃｕｐで上清をろ過する。清澄化したライセートの総容量：５３２．６ｍｌ（空のＳｔｅｒｉｃｕｐと満杯のＳｔｅｒｉｃｕｐとの重量を比較することにより決定される）。清澄化したライセートをアッセイする。
【００８１】
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）による濃縮：遠心機を４℃に予冷却する。４つのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ  １００ｋＤａ装置に各７０ｍｌの清澄化ライセートを負荷する＝合計２８０ｍｌ。保持液容量＝１〜２ｍｌまでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）チューブをスピンする（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ卓上遠心機、ローター：２２８、温度：４℃、速度：２３９０×ｇ、総スピン時間（スピン１）：１３分間）。ろ液を共通のろ液プールに保存する。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）チューブに装置当たり約７０ｍｌ超のライセートを補給する（前の保持液の上に注入する）。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）チューブを再度上記のとおり保持液容量＝１〜２ｍｌまでスピンする。総スピン時間（スピン２）：１６．４５分間。ろ液を、前のスピンからの前のろ液と加え合わせる。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）ろ液をアッセイする（それにより任意のウイルス漏出を検出し、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）プロセスにより除去されたタンパク質及びＤＮＡを可視化／定量化する）。任意の残った清澄化ライセートを取りのける。約７０ｍｌのＴＮＥを充填することにより、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）チューブを洗浄する。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）チューブを再度上記のとおり保持液容量＝１〜２ｍｌまでスピンする。総スピン時間（スピン３−洗浄）：１３分間）。洗浄ろ液を廃棄する。装置コアを反転させて保持液を遠心（ローター：２２８、温度：４℃、速度：１０００×ｇ、時間：２分間）により収集する。保持液を共通のプールに混ぜ合わせる（３１ｍＬになるようにする、従って１ｍＬサンプルを取ることができる）。
【００８２】
超遠心：３０ｍｌの超遠心チューブをキャップと共に秤量する。空のチューブ重量：８６．６３８ｇ。ＴＮＥを使用して保持液プール容量を３１ｍｌにする（従って１ｍｌをアッセイ用に取り除いた後にキャップを被せると、超遠心チューブは満杯になる）。希釈した保持液をアッセイする。この時点における予想ウイルス濃縮率は、清澄化ライセートから１８Ｘである。希釈した保持液プールを３０ｍｌ超遠心チューブに移す。チューブを完全に満たすのに必要であれば、ＴＮＥを添加する。キャップを被せた満杯の超遠心チューブを秤量する。満杯のチューブ重量：１１５．６９２ｇ。希釈した保持液総容量（満杯−空の重量）：２９．０５４ｍｌ。超遠心機を４℃に予冷却する。ウイルスチューブと同じ重量のバランスチューブを作製する。ウイルスを超遠心する（超遠心ローター：ＳＷ２８、温度：４℃、速度：２５，０００ＲＰＭ（１１２６００×ｇ）、時間：４時間）。上清をチューブから慎重にデカントする。上清をアッセイする。ペレットを、上下にピペッティングすることにより１５ｍｌのＴＮＥに再懸濁する。再懸濁したウイルスを新しいチューブに収集する。超遠心チューブを別の１５ｍｌのＴＮＥで、上下にピペッティングすることによってリンスする。リンス液を最初のペレット再懸濁液と加え合わせて３０ｍｌのウイルスプールを形成する。再懸濁したペレットプールをアッセイする。
【００８３】
滅菌ろ過：０．２２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘシリンジフィルタを使用してフィルタを滅菌する。０．２２μｍ後のろ液をアッセイする。
【００８４】
ＣＥＸ膜吸着処理：３０ｍｌのウイルスプールをＣＥＸ膜吸着装置に通過させる。ＣＥＸ手順：ＣＥＸ装置を３０ｐｓｉで１０分間、ＭｉｌｌｉＱにより予め湿潤させる。装置の予備湿潤を緩衝液で繰り返す。予備湿潤後、装置を圧力源から取り外し、疎水性ＭｉｌｌｅｘをＶ−Ｓｈｉｅｌｄベントに取り付ける。滅菌シリンジを使用して、ＣＥＸ装置内の残りの容量を徐々に追い出す。装置に全圧力を加えないよう注意し、膜層間にいくらかの液体は残さなければならない。シリンジポンプを使用して、シリンジ直径及び流量（２ｍＬ／分）を設定する。シリンジにウイルス調製物を負荷し、シリンジ中の空気を全て取り除く。予め湿潤させたＣＥＸをシリンジに取り付け、シリンジポンプホルダに固定する。ＣＥＸ装置の出口側に取り付けられたチュービングを使用して、シリンジポンプを始動させ、滅菌容器にろ液を収集する。全ての材料がＣＥＸに押し通された後、ポンプを停止させ、シリンジを取り外し、及びチュービング内の容量を収集容器内に排出させる。ＣＥＸろ液を、２ｍｌシロバイアル（ｃｙｒｏｖｉａｌ）に１〜１４の番号を付した１ｍｌアリコートとして収集する。ＣＥＸ処理したウイルス画分２（初期画分）及び１４（後期画分）をアッセイする。
【００８５】
ウイルス保存：バイアルをイソプロパノール／ドライアイス浴に浸漬することにより、スナップ凍結する。直ちにサンプルを−８０℃の貯蔵室に移す。
【００８６】
ウイルスサンプルを解凍し、フィルタ分粒により凝集を調べる：ウイルスのアリコートを３７℃の水浴で解凍する。解凍したウイルスをアッセイする。解凍した各アリコートを０．１μｍシリンジフィルタに通過させる。０．１μｍフィルタでろ過したウイルスをアッセイする。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
【表２】
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【００８９】
結論
３２４Ｋ細胞は未処理のライセートで約７．７ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌを産生した。血清を除去しても、これまでにＦＢＳ含有調製物で認められたものから力価は低下しなかった。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）によりウイルスのほとんどを回収することが可能であったが、夾雑タンパク質は除去されなかった。遠心により残りのウイルスのほとんどが回収され、著しく高純度となった。再懸濁したペレットをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＥＸ膜吸着体に通過させると、残りの夾雑物のほとんどが除去された。全てこの方法を用いて実施した評価ラン１〜４について、一貫した結果が認められた。
【００９０】
実施例２：Ａ９細胞によるＭＶＭ増殖（図５〜図７参照）
３２４Ｋ宿主細胞の代わりにＡ９細胞（ＡＴＣＣ）を、及びＤＭＥＭの代わりにＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号１２４９１−０１５）を用いて、実施例１の方法を繰り返した。ＣＥＸ後の画分は、２ｍｌ画分ではなく１ｍｌ画分で収集した。その他の点ではプロトコルは同じであった。結果を図５Ａ、図５Ｂ及び図６に示す。
【００９１】
結果
感染後細胞進行の観察：２日目：１００％コンフルエント；４日目：９０％コンフルエント−１０％剥離；７日目：６０％溶解；８日目：６０〜７０％溶解；９日目：８日目に同じ；１０日目に回収。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【００９４】
結論
Ａ９細胞は未処理の細胞ライセートで９．７５ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌを産生した。産物の力価が高いことで、最終ウイルスストックの濃度は１０．５ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌになった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、Ａ９増殖からのウイルス産物が３２４Ｋライセートより多いタンパク質を有することが示された。しかしながら、最終ウイルスストック中により多いタンパク質が現れたにもかかわらず（これはウイルスタンパク質であり得る）、タンパク質／感染性ウイルスにより計測するときの最終純度は、約２〜５ｆｇタンパク質／ＴＣＩＤ５０であった。培地がなお無血清であり、且つ細胞タンパク質バックグラウンドは同等であると想定してよいことを考えると、これはウイルスタンパク質（従ってより高いウイルス力価の結果）であり得る。
【００９５】
実施例３：種々の標準ＣＴＯスパイクストック溶液の水力学的性能に関する評価（図８〜図９を参照のこと）
異なる方法で調製した３つのＣＴＯ  ＭＶＭスパイクストックを、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）供給液にスパイクしてＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏに通して処理したときのその水力学的性能について評価した。粗調製物を清澄化のみ行い細胞残屑を除去し、さらなる精製に供した。感染細胞培養ライセート中のウイルスを超遠心によりペレット化し、上清を廃棄し、次にウイルスをＰＢＳに再懸濁することにより、超遠心調製物を精製した。清澄化した感染細胞培養ライセートを、正電荷Ｑケミストリーによる膜吸着体に通すことにより、膜結合／溶出精製した調製物を作製した。ウイルスが膜と結合し、次にそれを、４００ｍＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液で溶出した。超遠心及び膜結合／溶出精製方法により作製されたＭＶＭ調製物は、ＣＴＯからスパイク試験で使用する顧客向けに販売されている。
【００９６】
３つのいずれのストックも、目標スパイクレベルは１．４×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。各条件はデュプリケートで実行した（ラン＃１及びラン＃２）。スパイク後の供給液で達成された実際の力価は、粗産物：２×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；超遠心後：４×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；及び膜結合／溶出精製後：６×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。特に、膜結合／溶出精製調製物の水力学的性能は未精製の粗ウイルスの性能に等しいものであった。この比較では、３つのＣＴＯ調製物のなかで超遠心調製物が最良の性能で、スループットはスパイクしていない供給液と（４×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌのスパイクレベルで）同様であった。しかしながら、上記の例において説明したとおり、本発明のウイルス調製物はＣＴＯウイルス調製物と比べて著しく良好な性能を示した（例えば、図７を参照のこと）。
【００９７】
【表５】
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【００９８】
タンパク質はＭｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイにより定量した。＊ｎ．ｄ．未検。粗ウイルスストック中に存在する培地成分はＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイを妨げる。ＤＮＡはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより定量した。表５から分かるとおり、ＣＴＯウイルス調製物は著しく高いタンパク質及びＤＮＡ含量を有する。
【００９９】
タンパク質／ウイルスの量は、ウイルス調製物がフィルタ汚損を引き起こす可能性と直接相関することが分かっている。上記で実施したアッセイに加え、３つの標準的なＣＴＯ  ＭＶＭ調製物及び本発明の方法によるＭＶＭ調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び銀染色分析によって分析した。図９は、銀染色した４〜１５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。各サンプルレーンには１０μｌのサンプルを負荷した。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ＣＴＯ粗ＭＶＭ調製物（２．３×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン３：ＣＴＯ超遠心精製ＭＶＭ調製物（１．８×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン４：ＣＴＯ  Ｑ膜結合／溶出精製ＭＶＭ調製物（２．３×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン５：本発明の方法を使用したＭＶＭ調製物（６．５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）；レーン６：分子量マーカー。
【０１００】
図９に示されるとおり、ＣＴＯウイルス調製物の各々は、存在するタンパク質の総数（各レーンのタンパク質のバンド数及びタンパク質のスミアを参照のこと）、並びにサンプル当たりのタンパク質の総量（総染色量として実証される）が著しく高かった。それに比べて本発明の方法は、本明細書に記載されるとおり、定量的にも定性的にも最小限のタンパク質含量のウイルス調製物を生じた。
【０１０１】
実施例４：フロースルーＭＶＭウイルスストック精製に使用される様々な陽イオン交換培地の比較
ＭＶＭウイルスストック（先にＴＮＥへの緩衝液交換及び超遠心により精製したもの）を様々な陽イオン交換培地に通過させた。次にフロースルー材料をウイルス力価及びタンパク質含量について、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイによって製造者のプロトコルに従いアッセイした。表６に掲載する装置は全て、多量のタンパク質不純物を除去し、一方でウイルス調製物の力価は維持した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＥＸ（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）マトリックス上にＭＢＡｍ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）により架橋されたＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）を含む膜吸着体）及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）は、双方とも陽イオン交換膜吸着体である。Ｐｒｏ  Ｒｅｓ−Ｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は単分散ポリメタクリレートの強力な陽イオン交換樹脂である。
【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
表６に示されるとおり、本明細書に記載されるとおりの方法を用いて高純度ウイルス溶液を作製するために、フロースルー方式で様々な陽イオン交換培地を使用することができる。
【０１０４】
実施例５：陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体を使用して処理した様々な緩衝液中のＭＶＭストック
様々な緩衝液中のＭＶＭストックを、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）マトリックス上にＭＢＡｍ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）により架橋されたＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）を含む陽イオン交換（ＣＥＸ）膜吸着体を使用して、フロースルー方式で処理した。表７に示されるとおり、これらの条件の各々において、ウイルス価の大きい損失なしにタンパク質不純物の除去が達成された。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は、全体として参照により援用される。
【０１０７】
本発明は、その例示的実施形態を参照して詳細に図示及び説明されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、それらの実施形態において形態及び詳細の様々な変更が行われ得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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