(57)【要約】【課題】本発明は、パパイア葉抽出物における免疫賦活活性分画の分離法を確立し、その所在を明らかにすることにより低分子あるいは有効化学成分を含有する組成物による免疫療法の技術開発に提供することを目的とする。【解決手段】パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物は医薬用および食品用に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物。
【請求項２】
前記高極性成分が、パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスを水とブタノールによる分配抽出により水相分画に得られる高極性成分である、請求項１に記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項３】
前記免疫賦活活性成分が、前記高極性成分を、酢酸エチルとメタノールの体積比が３：１の混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して溶出する成分である、請求項１または２に記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項４】
前記免疫賦活活性成分が、順相カラムクロマトグラフィーに付して、酢酸エチルに順次グラデイエントでメタノールを添加し極性を上げ、体積比が酢酸エチル：メタノール＝１：０、３：１、次いで１：１で溶出した場合、酢酸エチル：メタノール＝３：１に大部分が溶出する成分である、請求項３に記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項５】
前記免疫賦活活性成分が配糖体を含む成分である、請求項１から４のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項６】
前記免疫賦活活性成分が、薄層クロマトグラフィー（TLC）分析において、シリカゲルTLCプレートを用い、展開溶媒が酢酸エチル：メタノール＝１：１の条件で、Rf値が0.2-0.8、アニスアルデヒド発色試薬により茶ないし茶褐色に発色する成分である、請求項１から５のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項７】
前記免疫賦活活性成分が、NMR解析において糖、オレフィンおよび芳香環由来のシグナルを示す成分である、請求項１から７のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項８】
前記免疫賦活活性成分が、サイトカインの産生増強活性を有する成分である、請求項１から７のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項９】
サイトカインが、TNF-α、IFN-γおよびIL-12である、請求項８に記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項１０】
医薬用組成物である、請求項１から９のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項１１】
食品用組成物である、請求項１から９のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項１２】
健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品または経腸栄養食品である、請求項１から９のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【請求項１３】
ドリンク剤、散剤または錠剤の形態にある、請求項１から９のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パパイア葉から得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物に関する。更に詳細には、パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物であって、医薬用および食品用に使用できる免疫賦活化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は特に癌の治療において盛んに行われており(非特許文献１)、抗CTL4抗体であるイピリムマブが進行性メラノーマの治療に有効であるとされている(非特許文献２)。しかし、現在、免疫療法に用いられているのは生物学的製剤であり、患者に浸潤を与える方法での投与や高額な医療費が必要であり技術的な限界もあることなどから一般化されていない。この限界を打開して免疫療法をより効果的で一般化するには、経口投与により有効な化学成分を含有する組成物あるいは低分子化合物による技術開拓が必要であると考えられる。
抗CD3/CD28抗体で共刺激を行ったT細胞を用いた免疫細胞療法は癌の治療に期待されている(非特許文献３−６)。しかし、十分な応用性と効果を持つものではない事も指摘されており未だ試験的な段階である(非特許文献７)。免疫細胞療法をより効果的にするには自然な状態でのT細胞の活性化、すなわち抗CD3/CD28抗体-共刺激によるシグナル活性化を生体内で低分子化合物を用いて行うなどの技術開拓が必要であると考えられる。
【０００３】
他方、パパイア（Carica Papaya)は、現在では熱帯全域に分布し、その葉には抗酸化作用のあるビタミンＣ、タンニンをはじめ、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ、サポニン、鉄分などが含まれ、消化補助、抗炎症効果、寄生虫駆除効果などが報告されている（非特許文献８）。更に、パパイア葉水溶性抽出物に腫瘍細胞増殖抑制効果が認められ (特許文献１)、この水溶性抽出物には抗CD3/CD28抗体共刺激によるT細胞活性化を増強する効果のあることが示唆され、この抽出物の試験管の実験ではIL-2、IL-4などの産生は抑制するが、TNF-α、IFN-γ、IL-12などの抗腫瘍に働くサイトカイン産生を増強することが報告されている（非特許文献９）。しかし実用化のためには免疫賦活活性分画の分離法を確立し、活性成分の所在を明らかにする必要がある。また、健常人におけるパパイアの実を摂取後にregulatory T細胞が増加し、IL-1βなどのサイトカインを抑制するという報告もある(非特許文献１０)が、いかなる成分かは検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2008-214299号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Topalian SL, Weiner GJ, Pardoll DM. Cancer immunotherapy comes of age. J Clin Oncol 2011;29(36):4828-4836
【非特許文献２】Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 2011;480:480-489
【非特許文献３】Lum LG, LeFever AV, Treisman JS, Garlie NK, Hanson JP Jr. Immune modulation in cancer patients after adoptive transfer of anti-CD3/anti-CD28-costimulated T cells-phaseI clinical trial. J Immunother 2001;24(5):408-419
【非特許文献４】Kalamasz D, Long SA, Taniguchi R, Buckner JH, Bonyhadi M. Optimization of human T-cell expansion ex vivo using magnetic beads conjugated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. J Immunother 2004;27(5):405-418
【非特許文献５】Bonylandi M, Frohlich M, Rasmussen A, Ferrand C, Grosmaire L, Robinet E, Leis J, Maziarz RT, Tiberghien P, Berenson RJ. In vitro engagement of CD3 and CD28 corrects T cell defects in chronic lymphotic leukemia.. J Immunol 2005;174(4):2366-2375
【非特許文献６】Garlie NK, LeFever AV, Siebenlist RE, Levine BL, June CH, Lum LG. T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potent immunotherapy for cancer. J Immunother 1999;22(4):336-345
【非特許文献７】Oelke M, Krueger C, Schneck J. Technological advances in adoptiv immunotherapy, Drugs Today 2005;41(1);13-21
【非特許文献８】Hsu S. Green tea and the skin. J Am Acad Dermatol 2005; 52(6): 1049-1059
【非特許文献９】Otsuki N, Dang NH, Kumagai E, Kondo A, Iwata S, Morimoto C. Aqueous extract of Carcia papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects. J Ethnopharmacology 2010; 127:760-767
【非特許文献１０】Abdullah M, Chai PS, Loh CY, Chong MY, Quay HW, Vidyadaran S, Seman Z, Kandiah M, Seow HE. Carica papaya increases regulatory T cells and reduces IFN-γ+CD4+T cells in healthy human subjects. Mol Nutr Food Res 2011;55(5):803-806
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
免疫療法はとくに癌領域で盛んに行われているが十分な効果と応用性を得るには至っていない。免疫療法には生物学的製剤が用いられているが免疫療法の限界を打開するには低分子化合物やそれを含有する組成物を用いた技術開拓が必要であると考えられる。抗CD3/CD28抗体共刺激でのT細胞活性化による免疫細胞療法はその治療効果が期待されているが未だ試験段階である。この方法論を一般化するには低分子化合物あるいは有効な化学成分を含有する組成物を用いて体内で抗CD3/CD28抗体共刺激で活性化されるシグナルを賦活するなどの技術開発が必要であると考えられる。
これまでにパパイア葉水溶性抽出物にはヒト末梢単核細胞の抗CD3/CD28抗体共刺激によるT細胞の活性化を増強する組成が含有されることが報告されてきた。しかし、実用化のためには免疫賦活化組成物を含有する分画の分離法を確立し、所在を明らかにする必要がある。
本発明ではこのパパイア葉抽出物における免疫賦活活性分画の分離法を確立し、その所在を明らかにすることにより低分子あるいは有効化学成分を含有する組成物による免疫療法の技術開発に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
課題解決のためにパパイア葉水溶性成分のカラム分画を行い、ヒト末梢血単核細胞における抗CD3/CD28抗体共刺激でのサイトカイン産生を指標として免疫賦活効果を有する成分の分離法を確立し、活性分画の所在を明らかにした。すなわち、パパイア葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付すことにより、免疫賦活活性成分が得られることに見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の（１）から（１０）の発明を包含するものである。
【０００８】
（１）パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物。
（２）前記高極性成分が、パパイア（Carica papaya）葉の水溶性抽出エキスを水とブタノールによる分配抽出により水相分画に得られる極性成分である、上記（１）に記載の免疫賦活化用組成物。
（３）前記免疫賦活活性成分が、前記高極性成分を、酢酸エチルとメタノールの体積比が３：１の混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して溶出する成分である、上記（１）または（２）に記載の免疫賦活化用組成物。
（４）前記免疫賦活活性成分が、順相カラムクロマトグラフィーに付して、酢酸エチルに順次グラデイエントでメタノールを添加し極性を上げ、体積比が酢酸エチル：メタノール＝１：０、３：１、次いで１：１で溶出した場合、酢酸エチル：メタノール＝３：１に大部分が溶出する成分である、上記（３）に記載の免疫賦活化用組成物。
（５）前記免疫賦活活性成分が配糖体を含む成分である、上記（１）から（４）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（６）前記免疫賦活活性成分が、薄層クロマトグラフィー（TLC）分析において、シリカゲルTLCプレートを用い、展開溶媒が酢酸エチル：メタノール＝１：１の条件で、Rf値が0.2-0.8、アニスアルデヒド発色試薬により茶ないし茶褐色に発色する成分である、上記（１）から（５）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（７）前記免疫賦活活性成分が、NMR解析において糖、オレフィンおよび芳香環由来のシグナルを示す成分である、上記（１）から（７）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（８）前記免疫賦活活性成分が、サイトカインの産生増強活性を有する成分である、上記（１）から（７）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（９）サイトカインが、TNF-α、IFN-γおよびIL-12である、上記（８）に記載の免疫賦活化用組成物。
（１０）医薬用組成物である、上記（１）から（９）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（１１）食品用組成物である、上記（１）から（９）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（１２）健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品または経腸栄養食品である、上記（１）から（９）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
（１３）ドリンク剤、散剤または錠剤の形態にある、上記（１）から（９）のいずれかに記載の免疫賦活化用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で得られるパパイア葉の免疫賦活活性成分は、ヒト末梢血単核細胞を抗CD3/CD28抗体共刺激におけるT細胞の活性化を増強する作用を有する。したがって、本発明で得られるパパイア葉の免疫賦活活性成分を含有する組成物は広くは癌や免疫不全状態などの免疫療法を化学物質を用いて行う技術開拓に応用できると考えられる。さらには、これまでin vitroで抗CD3/CD28抗体共刺激によるT細胞の賦活を行っていた免疫細胞療法の賦活化を体内で行う技術開拓にも貢献できると考えられる。本発明では、パパイア葉の水溶性抽出エキスからの免疫賦活化分画の分離法を確立し、所在を明らかにすることにより、化学物質を用いた免疫療法の技術開発を可能ならしめるものである。さらに免疫賦活化分画は水溶性であるために経口投与で吸収される可能性が高く、パパイアは食品であるために副作用の可能性は低いと考えられる。したがって、パパイア葉水溶性分画由来の免疫賦活化組成物の応用においては医薬品開発の直面する2つの大きな課題である経口投与の可否、毒性の有無においてハードルは低いと考えられる。また、本発明で得られるパパイア葉の免疫賦活活性成分を含有する組成物は、免疫賦活化するための健康食品などに用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、乾燥パパイア葉からの水溶性抽出エキスの調製スキームを示す。
【図２】図２のAはパパイア葉水溶性抽出エキスのカラム分画スキーム（カラム分画−１）を示し、Bは各分画のTLC分析結果を示し、CはTLC分析により明確な成分スポットが検出された分画の免疫賦活化アッセイ結果を示す。
【図３】図３のAは、パパイア葉水溶性抽出エキスのカラム分画スキーム（カラム分画−２）を示し、Bは各分画（２F1および２F2）のTLC分析結果を示し、Cは各分画（２F1および２F2）の免疫賦活化アッセイ結果を示す。
【図４】図４は、免疫活性のある2F2分画の1H-NMR解析結果を示す。
【図５】図５は、免疫賦活活性のある2F2分画のHPLC測定結果を示す。
【図６】図６は、免疫賦活活性のある2F2分画のPDA解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明では有効成分として、パパイア（Carcia papaya）葉の水溶性抽出エキスの高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付して得られる免疫賦活活性成分を用いる。
パパイア葉の水溶性抽出エキスは、パパイア（Carcia papaya）葉を乾燥し、得られる乾燥物を、例えばイオン交換水に入れ、数時間、例えば１時間から３時間程度沸騰させ、沸騰させた後は、６０℃から７０℃程度の温度に保ち、得られる水抽出液を濾過し、濾過液を減圧濃縮することにより、水溶性抽出エキスが得ることができる。
【００１２】
水溶性抽出エキスの高極性成分は、水溶性抽出エキスを水とブタノールによる分配抽出により水相分画に得ることができる。具体的には、水溶性抽出エキスを水やイオン交換水に溶解し、水やイオン交換水と等容量のブタノールで分配抽出して、より具体的には、例えば、水溶性抽出エキス6.5gを、水やイオン交換水100mlに溶解し、ブタノール100mlで1回分配抽出して、極性の低い成分を除き、水相分画を必要に応じて濃縮することにより水溶性抽出エキスの高極性成分を得ることができる。
【００１３】
次いで、高極性成分を酢酸エチルとメタノールの混合溶媒を用いた順相カラムクロマトグラフィーに付すことにより免疫賦活活性成分を得ることができる。具体的には、高極性成分を、酢酸エチルとメタノールの体積比が好ましくは３〜１：１、より好ましくは、３：１の混合溶媒を用い、シリカゲルなどを担体とする順相カラムクロマトグラフィーに付して溶出する成分から、免疫賦活活性成分を得ることができる。より具体的には、高極性成分を、順相カラムクロマトグラフィーに付して、酢酸エチルに順次グラデイエントでメタノールを添加し極性を上げ、体積比が酢酸エチル：メタノール＝１：０、３：１、次いで１：１で溶出させて、酢酸エチル：メタノール＝３：１に溶出する成分から、免疫賦活活性成分を得ることができる。
【００１４】
かくして得られる免疫賦活活性成分は、TLC分析ではアニスアルデヒドの検出（Seigler DS, Pauli GF, Nahrstedt A, Leen R. Cyanogenic allosides and glucosides from Passiflora edulis and Carcia papaya. Phytochemistry 2002; 60: 873-882）により発色するために配糖体を含有するものである。免疫賦活活性成分のTLC分析では、シリカゲルTLCプレート（例えば、シリカゲルTLCプレートF254）を用い、展開溶媒が酢酸エチル：メタノール＝１：１にてRf値0.5-0.75を示し、アニスアルデヒド発色試薬により茶ないし茶褐色に発色する。また、免疫賦活活性成分はサイトカイン産生に対する増強効果を示す。より具体的には、例えば、ヒト末梢血単核細胞においてTNF-α、IFN-γおよびIL-12の産生を増強する効果を発揮することができる。免疫賦活活性成分は、NMR解析において糖、オレフィンおよび芳香環由来のシグナルを示す。
【００１５】
パパイア葉から得られる免疫賦活活性成分を有効成分として含有する免疫賦活化用組成物は、免疫機能改善用の医薬として用いることができる。医薬として用いるには、この免疫賦活活性成分を、必要に応じて乾燥させた後に、散剤、錠剤などに通常使用される賦形剤等に加えて常法により散剤、錠剤などの形態にして用いることができる。
【００１６】
本発明の免疫賦活化用組成物は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品などとして用いることもできる。例えば、免疫賦活活性成分に、通常使用される配合物、例えば、安定化剤、保存剤、着色剤、香料、ビタミンなどを添加して、通常の方法により、ドリンク剤、粉末剤、液剤、錠剤、散剤などの形態に加工して、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品などとして用いることもできる。
【００１７】
パパイア葉から得られる免疫賦活活性成分を免疫機能改善用の医薬として用いる場合には、例えば、免疫賦活活性成分を乾燥重量として換算して、一日当たり通常1mgから1000mgの量を１ヶ月から３ヶ月わたって毎日服用するのが好ましい。また、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品などとして食用する場合にも、同様に、一日当たり通常1mgから1000mgの量（を１ヶ月から３ヶ月わたって毎日食用するのが好ましい。
【実施例】
【００１８】
実施例１
パパイア葉からの水溶性抽出エキスの調製
図１に示した、乾燥パパイア葉からの水溶性抽出エキスの調製スキームに沿って、以下の工程１から３により、パパイア葉から水溶性抽出エキスを得た。
【００１９】
工程１: パパイアの乾燥葉25gを500mlのイオン交換水に入れ、1時間100℃で加熱した。100℃の温度調節はシリコンオイルバスを用いて行った。
工程２：さらに水温を80℃に保ち2時間加熱を行った。
工程３：水抽出液をろ過し、ろ過液を減圧濃縮することにより乾燥固形物約6.5gを得た。
【００２０】
実施例２
パパイア葉からの水溶性抽出エキスのカラム分離−１と免疫賦活活性
図２に示した、パパイア葉水溶性抽出エキスのカラム分離−１と免疫賦活活性に沿って、実施例１で得た水溶性抽出エキスから高極性成分を得た後に、カラム分離を行い、各分画の免疫賦活活性を測定した。
【００２１】
すなわち、パパイア葉水溶性抽出エキス6.5gをイオン交換水100mlに溶かしブタノールで分配抽出を行った。ブタノール抽出相および水抽出相を減圧濃縮した結果、ブタノール相乾固物1g、水相乾固物5.5gを得た。水相乾固物5.5gをメタノールに懸濁し逆相カラム（ワコーゲル（登録商標）100C18）に吸着させ、酢酸エチル：メタノール(体積比＝1:1)で溶出した。その結果、F1(0.4g), F2(2.7g), F3(0.2g), F4(0.1), F5(0.1g) および分離されずに溶出されたフラクション4gを得た。この分離できていないフラクション4gをさらに順相カラムを用いて分離を進めた。この4gをメタノールに懸濁し順相カラム（ワコーゲルC200）に吸着させたのち、順次、酢酸エチル：メタノール(容量比＝3:1), (体積比＝2:1), (体積比＝1:1)で溶出した。その結果、酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1)部溶出により F6(0.5g), F7(0.1g), F8(0.05g)を得た。酢酸エチル：メタノール(体積比＝2:1)溶出によりF9(0.5g), F10(0.4g), F11(0.13g)を得た。酢酸エチル：メタノール(1:1)溶出によりF12(0.11g), F13(0.6g), F14(0.43g) を得た（図２A）。
【００２２】
これらの分画をTLCで分離しリン酸モリブデン酸で発色させた結果、F1, F3, F6, F7, F10, F11において明確な成分のスポットが確認された（図２B）。したがって、これらの分画におけるサイトカイン産生を測定した。
【００２３】
各分画の乾固物を0.1g/3 mlの濃度に希釈。0.3μl/200μl/wellおよび3μl/200μl/wellの2濃度で各分画を単離したヒト抹消血単核細胞に添加しTNF-αの産生量を測定した(n=1)。その結果、サンプル添加量3μl/200μl/well の条件でF7に強いTNF-α産生作用があり、F6にも弱いTNF-α産生効果が認められた(図２C)。
【００２４】
実施例３
パパイア葉からの水溶性抽出エキスのカラム分離−２と免疫賦活活性
図３に示した、パパイア葉水溶性抽出エキスのカラム分離−２と免疫賦活活性に沿って、実施例１で得た水溶性抽出エキスから高極性成分を得た後に、カラム分離を行い、各分画の免疫賦活活性を測定した。
【００２５】
すなわち、実施例２において、順相カラムクロマトにおける酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1)分画に免疫賦活化活性が認められたため、次に順相カラムクロマトにより酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1)により溶出される成分を分画した。
【００２６】
パパイア葉からの水溶性抽出エキス7.3gをイオン交換水100mlに溶かしブタノールで分配抽出を行った。ブタノール抽出相および水相を減圧濃縮し、ブタノール相乾固形物1.3g、水相乾燥固形物5.7gを得た。水相乾燥固形物をメタノールで懸濁し、順相カラム（ワコーゲルC200）に吸着させた。酢酸エチル(1.5L)、酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1) (5L)、酢酸エチル：メタノール(体積比＝1:1) (1.5L)でカラムを順次溶出後、残りの吸着成分を水500mlで溶出した。それぞれの溶出液を減圧濃縮した結果、酢酸エチル分画 (0.51g)、酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1)溶出より2F1分画(0.48g)および2F2分画(0.39g)、酢酸エチル：メタノール(1:1)分画(0.54g)、水溶出分画(3.76g)を得た（図３A）。
パパイア(C.papaya)には配糖体が成分として含有され、検出にはアニスアルデヒドが使用されている（Seigler DS, Pauli GF, Nahrstedt A, Leen R. Cyanogenic allosides and glucosides from Passiflora edulis and Carcia papaya. Phytochemistry 2002; 60: 873-882）。そこで酢酸エチル：メタノール(体積比＝3:1)溶出分画2F1, 2F2をTLCで分離し、アニスアルデヒド発色の可否を確認した。そこ結果、図3Bに示すように2F1, 2F2ともにアニスアルデヒドで検出された。
【００２７】
次に2F1,および2F2のサイトカイン産生に対する効果を検討した。2F1, 2F2分画の濃度は実施例2で行った希釈において3μl/200μl/wellの条件でヒト末梢血単核細胞(2x105)に添加した。その結果、2F2を添加したヒト末梢血単核細胞においてTNF-α、IFN-γ、IL-12の産生が増強された(n=3)。
【００２８】
実施例４
2F2分画の1H-NMR解析
2F2分画を重メタノールに(CD3OD)に溶解したのち、溶液を石英ウールでろ過し、全量を5 mm径のNMR試料管に移し測定試料とした。INOVA600型(varian)により599.5MHzにおいて測定した。
2F2分画に免疫賦活活性が認められたのでこの分画の1H-NMR解析を行った。その結果、3-4.2 ppmに強い糖由来シグナルがこの分画の特徴として示された。その他に、0.8-3.0 ppmに飽和脂肪酸由来の弱いシグナルが、5.0-6.0 ppmにオレフィン由来の弱いシグナルが、6.4-8.4 ppmに芳香環由来の弱いシグナルが示された（図４）。
【００２９】
実施例５
2F2分画のHPLC解析およびPDA解析
HP1100 HPLCシステム(Agilent Technologies Inc)および Zorbax Sil 4.6x250mm カラム(Agilent Technologies Inc)を用いて測定を行った。移動相は(a)酢酸エチル/メタノール=900/100 (vol比)および(b)酢酸エチル：メタノール=100/900 (vol比)を用い、グラジエント条件は0, 30, 45分におけるBのvol%が0, 100, および100で行った。結果を図５に示した。
272nm 保持時間9.9分、および21.7分ピークのPDA解析を行い、結果を図６に示した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明では、パパイア葉の水溶性抽出エキスからの免疫賦活化分画の順相カラムクロマトによる分離法を確立し所在を明らかにした。免疫賦活化分画の1H-NMR解析では強い糖由来シグナルが検出されており、HPLC解析ではグラジエント条件で保持時間9.9分に大きなピークが、21.7分に小さなピークが観察された。これらのピークはPDA解析により複数のピークから形成されることが示された。したがって、本発明により確立された方法で分離される免疫賦活化分画には糖由来の構造を有する成分を中心として複数の成分の含有される。
本発明の結果により広くは低分子化合物を用いての免疫療法の技術開発、さらには生体内でCD3/CD28シグナルの活性化を行う免疫細胞療法の技術開発に対して素材提供ができる。
【図１】
2015038043.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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