(57)【要約】  少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水およびさらなる成分を含む組成物を使用することによる、埋め込み可能な構造体、例えばステントなどの被覆方法は、長期間使用可能なインプラントをもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面を、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を含む組成物で処理する工程を含む、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項２】
前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）がステントであり、前記表面が、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）および少なくとも１種のさらなる成分（Ｆ）を含む組成物で処理されることを特徴とする、請求項１に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項３】
前記組成物が、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）および水、さらに場合によってさらなる成分（Ｆ）を含み、この場合の前記ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）の量が、全組成物に対して０．０００１〜２０質量％である、請求項１または２に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項４】
前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）が、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水および場合によってさらなる成分（Ｆ）を含む組成物で処理されるステントであり、この場合の前記ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）の量が、全組成物に対して０．００１〜１０質量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項５】
前記ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水および少なくとも１種のさらなる薬学的に活性な化合物（Ｄ）を含む組成物を、前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面に塗布する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項６】
前記ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水、およびさらなる薬学的に活性な化合物（Ｄ）として、ヘパリン、抗生物質および細胞増殖抑制性化合物を含む群からの化合物を含む組成物を、前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面に塗布する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項７】
使用される前記ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）が融合ハイドロフォビンまたはその誘導体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項８】
少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を含む前記組成物を、前記埋め込み可能な構造体（Ｉ）の前記表面に、４℃〜９５℃の温度で、０．０１時間〜４８時間の間塗布する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法。
【請求項９】
少なくとも部分的にハイドロフォビン誘導体（Ｈ）で処理された表面を有する被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）。
【請求項１０】
前記請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によってハイドロフォビン誘導体（Ｈ）で少なくとも部分的に表面被覆されている、被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）。
【請求項１１】
当該埋め込み可能な構造体（Ｉ）が、ステント、特に胆管ステントである、請求項１０に記載の被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）。
【請求項１２】
前記組成物が、０．０００１〜２０質量％のハイドロフォビン（Ｈ）および９９．９９９〜８０質量％のさらなる成分（Ｆ）を含む、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆用組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、少なくとも０．００１〜１０質量％の少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、少なくとも５０質量％の水、および場合によってさらなる成分（Ｆ）を含む、請求項１１に記載の埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆用組成物。
【請求項１４】
ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆のために使用する方法。
【請求項１５】
ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を、ステントの被覆のために使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆された医療用具、例えば埋め込み可能な構造体（例えばステント）など、ならびに、埋め込み可能な構造体（例えばステント）およびその他の医療用具をタンパク質で被覆するための新規な方法に関する。また、本発明は、医療用具、例えばステント、吻合器および血管周囲ラップなどを、特定のタンパク質であるハイドロフォビンを単独で、またはハイドロフォビンをその他の成分、例えばヘパリンなどと組み合わせて含有する組成物で被覆するための方法にも関する。
【０００２】
広範囲の埋め込み可能な構造体（例えばステント）は公知であり、特に胆管ステントが知られている。プラスチックおよび金属製のステントは、様々な目的のために使用されているが、製造コストが低く、永久的機能を持ち、使用および交換時の扱いが容易な、高品質のステントはまだ得られていない。
【０００３】
本発明は、医療用具、例えば埋め込み可能な構造体（Ｉ）などに関し、それらはハイドロフォビンで被覆され、かつ、特定の実施形態において、例えば、血管疾患の予防および治療のための、薬物または薬物の組み合わせの局所送達のために使用することができる。また、本発明は、ハイドロフォビンで被覆された、ステント、吻合器、血管周囲ラップ、縫合糸およびステープルを含む医療用具にも関する。これらの医療用具は、疾患を治療および予防し、生物への医療用具の導入に対する該生物の反応を最小限にするかまたは実質的に取り除くために使用することができる。その上、被覆された用具は、治癒および内皮形成を促進するために利用することもできる。
【０００４】
本発明はまた、医療用具、特にステントなどの埋め込み可能な構造体の被覆にも関する。本発明はまた、埋め込み可能な医療用具からの薬物、薬剤および／または化合物の溶出速度を制御するための被覆も網羅する。本発明はまた、例えば血管疾患を治療するためなどの、薬物の局所送達のための薬物送達システムにも関する。本発明はまた、ハイドロフォビンおよび疾患を治療するためにそれに付着した薬物を有する、被覆された医療用具、例えば埋め込み可能な構造体などにも関する。
【背景技術】
【０００５】
ハイドロフォビンおよび誘導体は、約１００〜１５０アミノ酸の小型タンパク質であり、スエヒロタケなどの糸状菌に生じる。それらは一般に、分子中に８個のシステイン単位（Ｃｙｓ）を有する。ハイドロフォビンは、菌類起源の中でも最も表面活性のあるタンパク質である。ハイドロフォビンは、多様なアミノ酸配列を含み、それらは、４つのジスルフィド架橋を形成することによりそれらの一次配列中の８つのＣｙｓ残基の特徴的なパターンを共有している。Ｃｙｓ残基により形成されるこれらのジスルフィド架橋は、溶液中での自発的な自己組織化を妨げる親水性−疎水性界面での制御された組織化を担うことが知られている。  
【０００６】
これらのタンパク質は、気中増殖（例えば、気菌糸、胞子およびキノコなどの子実体）、および真菌の固体担体への結合に重要であることが見出されている。ハイドロフォビンは、顕著に安定性であり、水の沸点に近い温度に耐えることができる。ハイドロフォビンは、天然源から単離することができるが、例えば国際公開第２００６／０８２２５１号または国際公開第２００６／１３１５６４号に開示されるような組換え法を用いてそれらを得ることもできる。先行技術では既に、数種類のハイドロフォビンの様々な用途への使用が提案されている。国際公開第１９９６／４１８８２号では、疎水性表面を親水化するための乳化剤および増粘剤としてのハイドロフォビンの使用が提案される。また、ハイドロフォビンを乳化破壊剤として（国際公開第２００６／１０３２５１号参照）、蒸発抑制剤として（国際公開第２００６／１２８８７７号参照）または汚染抑制剤として（国際公開第２００６／１０３２１５号参照）使用することも提案されている。異なる表面、例えばプラスチックポリマー表面、ガラス、金属表面、革、綿および紙のような天然の表面などの上への、水溶液からのハイドロフォビン誘導体の沈殿方法は、国際公開第２００６／０８２２５３号および欧州特許出願公開第１２５２５１６号に記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、医療用具のハイドロフォビンでの被覆に関する。本発明の特定の態様は、埋め込み可能な(implantable)構造体（Ｉ）の表面を、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を含む組成物で処理する工程を含む、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆のための新規な方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、埋め込み可能な構造体（Ｉ）がステントであり、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）および少なくとも１種のさらなる成分（Ｆ）を含む組成物で表面を処理することを特徴とする、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、組成物が少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）および水、および場合によってさらなる成分（Ｆ）を含む、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法に関し、それによるハイドロフォビン誘導体（Ｈ）の量は、全組成物に基づいて、０．０００１〜２０質量％、多くの場合０．００１〜１０質量％である。埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面上では、ハイドロフォビン誘導体の量は、多くの場合０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の範囲内である。
【００１０】
さらなる成分は、例えば、ポリマー添加剤、溶媒、緩衝液、薬学的に活性な物質および／または補助剤であってよい。補助剤という用語は、製薬上許容される、生理学的に不活性な配合剤、例えば結合剤、増量剤および被膜形成化合物などを包含する。随意の補助剤賦形剤のさらなる例は、付着防止剤、防腐剤、磨砕剤、滑沢剤および吸着剤である。適した物質は、当技術分野で公知である。
【００１１】
多くの場合、組成物は、水性組成物である。本発明はまた、埋め込み可能な構造体（Ｉ）がステントである埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法にも関し、該ステントは、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水および場合によってさらなる成分（Ｆ）を含む組成物で処理され、それによるハイドロフォビン誘導体（Ｈ）の量は、全組成物に基づいて、０．００１〜１０質量％である。
【００１２】
本発明はまた、ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水および少なくとも１種のさらなる薬学的に活性な化合物（Ｄ）を含む組成物を、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面に塗布する、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法にも関する。この方法は、清浄および給水工程などのさらなる工程を含むことができる。本発明はまた、組成物が埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面に塗布される、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法にも関し、組成物は、ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、水および、さらなる薬学的に活性な化合物（Ｄ）として、ヘパリン、抗生物質（例えばアンピシリンまたはスルバクタムまたはレボフロキサシンなど）および細胞増殖抑制性化合物（例えばアルキランチア、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤またはホルモンなど）を含む群から１種または数種の化合物を含む。ハイドロフォビンおよびヘパリンおよびその誘導体（例えばエノキサパリンなど）の組み合わせは、特に注目される。さらなる例は、ハイドロフォビンおよびクマリン誘導体、例えばワルファリン、フェンプロクモンまたはエチルビスコウマセタトなどを含む組成物である。また、さらなる薬学的に活性な化合物（Ｄ）は、ハイドロフォビンと化学的に結合させることもできる。
【００１３】
本発明はまた、使用されるハイドロフォビン誘導体（Ｈ）が融合ハイドロフォビンまたはその誘導体である、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法にも関する。本発明はまた、少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）を含む組成物を、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の表面に、４℃〜９５℃、特に２０℃〜９０℃の温度で、０．０１時間〜４８時間、特に０．１〜２０時間、多くの場合１〜１０時間の時間の間塗布する、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆方法にも関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、少なくとも部分的にハイドロフォビン誘導体（Ｈ）で処理された表面を持つ、被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）である。
【００１５】
本発明はまた、上記のような方法により、ハイドロフォビン誘導体（Ｈ）で少なくとも部分的に表面被覆されている、被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）にも関する。
【００１６】
本発明はまた、埋め込み可能な構造体（Ｉ）がステント、特に胆管ステントである、被覆された埋め込み可能な構造体（Ｉ）にも関する。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆のための組成物を提供することであり、この際、組成物は、全組成物に基づいて、０．０００１〜２０質量％のハイドロフォビン（Ｈ）および９９．９９９〜８０質量％のさらなる成分（Ｆ）を含む。さらなる成分として、溶媒水が使用される場合が多い。
【００１８】
本発明はまた、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の被覆のための組成物にも関し、この際、組成物は、少なくとも０．００１〜１０質量％の少なくとも１種のハイドロフォビン誘導体（Ｈ）、少なくとも５０質量％の水および場合によってさらなる成分（Ｆ）を含む。さらなる態様は、埋め込み可能な構造体（Ｉ）の、特にステントの被覆のためのハイドロフォビン誘導体（Ｈ）の使用である。
【００１９】
数種類の医療用具、例えば埋め込み可能な構造体（Ｉ）などは、多くの場合、使用前に被覆される。埋め込み可能な構造体の一例として、胆管ステントは、胆管に生じる閉塞を処置するために使用される。胆汁は、脂肪を消化するのを助ける物質であり、肝臓により生成され、胆管を通じて分泌され、胆嚢で貯蔵される。それは脂肪を含む食事を食べた後に小腸に放出される。胆管の狭窄を引き起こし得る状態（悪性または良性）はいくつかある。膵癌は、よくある悪性原因であり、胆嚢、胆管、肝臓および大腸の癌がさらなる例である。胆管狭窄の非癌性の原因としては、胆嚢除去のための外科手術中の胆管への傷害、膵炎（膵臓の炎症）、原発性硬化性胆管炎（胆管の炎症）、胆石、放射線療法および腹部への鈍的外傷が挙げられる。
【００２０】
胆管ステントは、多くの場合、細い管状構造であり、表面被覆することができ、胆管のより狭くなった部分を支持し、狭窄の再形成を防ぐために使用される。ステントは、例えば、プラスチックまたは金属で作製され得る。胆管ステントを設置するために使用される２つの最も一般的な方法は、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）および経皮経肝胆道造影（ＰＴＣ）である。両方の方法に関して、被覆された用具を使用することが有利でありうる。ＥＲＣＰは、膵臓、肝臓、胆嚢、および胆管の疾患を診断するために使用される画像形成技法であり、治療用具として使用することにも利点がある。内視鏡は、細い、照明つきの中空管で、観察モニタに接続されていて、患者の口の中に挿入し、食道を下り、胃を通過して小腸の上部の中に胆管が空になっている場所に達するまで挿入することができる。この時点で、カニューレと呼ばれる小型の管が内視鏡の中を通じて挿入され、造影剤を胆管の中に注入するために使用される。次に、造影剤が胆管を進む時に一連のＸ線写真を撮る。胆管狭窄が存在することをＸ線写真が示す場合、被覆されたステントを管の中に設置して閉塞を軽減することができる。これをするためには、特別な器具を内視鏡の中に挿入し、括約筋切開術を実施して胆管への接近手段を得る。一部の例では、カテーテルと呼ばれる細い柔軟な管を用いて胆管狭窄をまず拡張させ、続いて膨らませることのできるバルーン型の用具を使用する。次に、被覆されたステントを胆管の中に挿入する。被覆されたステントを適用するためのその他の方法、経皮経肝胆道造影すなわちＰＴＣは、試験を用いて、肝臓から胃腸管への胆汁の流れに影響を及ぼす閉塞を診断および処置するという点でＥＲＣＰに類似している。細い針を使用して、皮膚を通じて肝臓または胆嚢の中まで造影剤を注入する。造影剤が胆管を進む間にＸ線写真を撮る。胆管狭窄が明らかとなれば、被覆されたステントを設置することができる。中空針を胆管の中に導入し、細いガイドワイヤを針の中に挿入する。
【００２１】
ワイヤは閉塞部位に導かれ、被覆されたステントがワイヤの上を前進して閉塞した胆管に設置される。
【００２２】
ステントは、その他の医学分野で使用することもできる。
【００２３】
多くの個人が、心臓およびその他の主要器官を灌流する血管の進行性閉塞に起因する循環器系疾患を患っている。それよりも深刻な血管の閉塞は、多くの場合、高血圧症、虚血傷害、卒中、または心筋梗塞を引き起こす。動脈硬化病変は、虚血性心疾患の主な原因である。経皮経管冠動脈形成術は、その目的が動脈を通る血流を増大させることである医学的処置である。経皮経管冠動脈形成術は、冠血管狭窄の主な治療である。経皮経管冠動脈形成術に関連する限界は、処置の直後に起こる可能性のある血管の突然の閉鎖、および処置の後に徐々に起こる再狭窄である。
【００２４】
多数の薬剤が、再狭窄における増殖抑制作用としてステントとともに試験され、実験動物モデルにいくらかの活性が示されている。動物モデルにおいて内膜過形成の程度を首尾よく低下させることを示した一部の薬剤には、ヘパリンおよびヘパリン断片、タキソール、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオペプチン、シクロスポリンＡ、テルビナフィン、インターフェロン−γ、ラパマイシン、ステロイド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび遺伝子ベクターが含まれる。被覆されたステントも、再狭窄を減少させるのに使用することができる。
【００２５】
これらの被覆されたステントは、多くの場合、バルーン拡張性の溝付金属管（例えばステンレス鋼）であり、それは、血管形成された冠動脈管腔内で拡張させると、動脈壁に対する剛直な足場によって構造支持をもたらす。この支持は血管内腔の開存性を維持するのに役立つ。経皮経管冠動脈形成術後のこれらの被覆されたステントの血管造影の成功の増加が示され得る。その上、ハイドロフォビンおよび最終的にさらなる化合物、例えばヘパリンおよびその誘導体などによるステントの被覆は、ステント移植の後の亜急性血栓症の低下をもたらす付加利益を有すると思われる。ハイドロフォビンおよびヘパリン（および最終的にその他の化合物）によるステントの被覆は、臨床有用性を有し得る。
【００２６】
ハイドロフォビンで被覆したステントの使用が、局所薬物送達の一方法であることも見出された。特定の薬物（または薬物の組み合わせ）が局所送達用具（例えばステント）に付着している様式は、この種類の治療の効力に役割を果たす。
【００２７】
本発明に従う典型的な一方法は、用具の表面上に被覆されているタンパク質ハイドロフォビンに薬物分子を化学的に固定することである。薬物（または薬物の組み合わせ）をステントに付着させるために利用される方法および材料は、薬物の作用を妨げるべきではない。その上、利用される方法および材料は、生体適合性であるべきであり、送達を通して、かつ長期間にわたって薬物または薬物の組み合わせを局所用具の上で維持しなければならない。局所送達用具として使用することのできる、疾患、例えば血管損傷などの予防および治療のための、特別にタンパク質被覆されたステントに対する必要性がある。
【００２８】
ステント被覆のための多様な方法および組成物が提案されている。被覆は、ステントが損傷部分（例えば、内腔壁）にもたらす刺激をそれら自体、低減することができ、従って血栓症または再狭窄の傾向を低下させることができる。あるいは、被覆は、医薬品を送達することができる。薬物の送達の機構は、例えば、バルクポリマーによる薬剤の拡散を通じて、またはポリマー構造に作られる孔を通じて、または生分解性被覆の浸食によるものである。薬物化合物はまた、タンパク質ハイドロフォビンを使用することによりステントの表面に被覆するこができる。
【００２９】
生体吸収性かつ生体安定性の組成物が、ステント用の被覆材料として報告されている。ポリマー被覆は、医薬品を封入することができる。そのような薬剤を表面に結合するその他の方法は公知である（例えば、ヘパリンコーティングステント）。これらの被覆は多くの方法でステントに塗布され、それには、浸漬法、スプレー法、またはスピンコーティング法が含まれる。ステント用の被覆として報告されている生体安定性ポリマー材料の１つのクラスは、ポリフルオロホモポリマーである。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ホモポリマーは、長年インプラントとして使用されている。これらのホモポリマーは、妥当な温度ではどの溶媒にも溶解しない、従って、小型の医療用具を、該用具の重要な特徴（例えば、ステントの溝）を維持しながら被覆することは困難である。ポリビニリデンフルオリドホモポリマーから作られていて、放出用の医薬品／治療薬または薬物を含有する被覆を含むステントが提案されている。しかし、それらは、それらを比較的高い温度にさらすことなく、高品質フィルムとして表面に適用することが困難である。
【００３０】
現在、埋め込み可能な構造体のためのハイドロフォビンまたはその誘導体を含有する被覆の開発が有利であることが見出されている。
【００３１】
これらの被覆は、ハイドロフォビンを含有する組成物を使用することにより医療用具の表面に塗布することができる。これらの被覆は、必要とするものではないが医薬品または薬物の使用を含み得る、埋め込み可能な医療用具に塗布することができる。これらの被覆された装置は、使用に効果的な物理的および機械的性質を有する。被覆された医療用具は、疾患を治療し、かつ、医療用具の埋め込みに対する生存生物の反応を最小限にするかまたは実質的に取り除くための薬物と組み合わせて使用することが有利でありうる。特定の状況では、ハイドロフォビンで被覆された医療用具を、創傷治癒および医療用具の内皮形成を促進する薬物、例えばヘパリンなどと組み合わせて開発することが有利である。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「ハイドロフォビン」または「ハイドロフォビン誘導体」は特に一般構造式（Ｉ）のポリペプチドを意味すると理解される。
【００３３】
【化１】
2013523232.tif 000002
【００３４】
上式で、Ｘは２０種の天然に存在するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれであってもよい。上式中、Ｘラジカルはいずれの場合も同じであっても異なっていてもよい。Ｘの肩の指数はそれぞれ、特定の部分配列Ｘ中のアミノ酸の数であり、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンであり、この際Ｃで示される残基のうちの少なくとも４つはシステインであり、指数ｎおよびｍは各々独立に、０〜５００の間の範囲、好ましくは１５〜３００の間の範囲の自然数である。また、式（Ｉ）のポリペプチドは、室温で、ガラス表面を被覆した後に、被覆されていないガラス表面の持つ同様の大きさの水滴の接触角と比較していずれの場合にも、少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、より好ましくは３０°の水滴の接触角の増加をもたらす性質を特徴とする。
【００３５】
Ｃ１〜Ｃ８で示されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。しかし、それらはまた同様の空間充填性を持つ他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、メチオニンまたはグリシンで置換されてもよい。
【００３６】
しかし、位置Ｃ１〜Ｃ８の、少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個、特に少なくとも７個がシステインで構成されるべきである。本発明のタンパク質において、システインは還元型で存在しても、または互いにジスルフィド架橋を形成してもよい。特に好ましいのはＣ−Ｃ架橋の分子内形成であり、特に少なくとも１個の分子内ジスルフィド架橋、好ましくは２個、より好ましくは３個、最も好ましくは４個の分子内ジスルフィド架橋を持つものが好ましい。上記の、システインを同様の空間充填性を持つアミノ酸と交換する場合、かかるＣ−位置は、互いに分子内ジスルフィド架橋を形成することができるように二つ一組で交換することが有利である。システイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンが同様にＸで示される位置で使用される場合、一般式における個々のＣ−位置の番号付けは相応して変化し得る。
【００３７】
本発明を実施するために、一般式（ＩＩ）のハイドロフォビンの使用が好ましく、
【化２】
2013523232.tif 000003
【００３８】
上式で、Ｘ、ＣおよびＸとＣの肩の指数はそれぞれ上に記載される通りであり、指数ｎおよびｍはそれぞれ０〜３５０の間、好ましくは１５〜３００の間の数字であり、加えて、該タンパク質は上記で説明した接触角の変化を特徴とし、さらに、Ｃで示される残基のうちの少なくとも６つがシステインである。より好ましくは、すべてのＣ残基がシステインである。
【００３９】
一般式（ＩＩＩ）のハイドロフォビンの使用が特に好ましく、
【化３】
2013523232.tif 000004
【００４０】
上式で、Ｘ、ＣおよびＸの肩の指数はそれぞれ上に記載される通りであり、指数ｎおよびｍはそれぞれ０〜２００の間の数字であり、加えて、該タンパク質は上記で説明した接触角の変化を特徴とし、かつ、Ｃで示される残基のうちの少なくとも６つがシステインである。より好ましくは、すべてのＣ残基がシステインである。ＸｎおよびＸｍ残基は、ハイドロフォビンとも天然に結合するペプチド配列であってもよい。しかし、ひとつの残基または両方の残基がハイドロフォビンと天然には結合しないペプチド配列であってもよい。
【００４１】
このことはまた、ハイドロフォビン中に天然に存在するペプチド配列が、ハイドロフォビン中に天然に生じないペプチド配列によって伸長されている、Ｘｎおよび／またはＸｍ残基を意味するとも理解される。
【００４２】
Ｘｎおよび／またはＸｍがハイドロフォビンと天然に結合しないペプチド配列である場合、かかる配列の長さは一般に少なくとも２０、好ましくは少なくとも３５アミノ酸である。それらは、例えば、２０〜５００、好ましくは３０〜４００、より好ましくは３５〜１００アミノ酸の配列である。ハイドロフォビンに天然に結合しないそのような残基は、以降、融合パートナーと呼ぶ。これは、タンパク質が少なくとも１種のハイドロフォビン部分、および天然にはこの形状で共に生じない融合パートナー部分で構成され得ることを表すことを意図する。融合パートナーおよびハイドロフォビン部分からなる融合ハイドロフォビンは、例えば、国際公開第２００６／０８２２５１号、国際公開第２００６／０８２２５３号、および国際公開第２００６／１３１５６４号に記載されている。
【００４３】
融合パートナー部分は多数のタンパク質から選択されてよい。単一の融合パートナーだけをハイドロフォビン部分に結合させることが可能であり、また複数の融合パートナーを１つのハイドロフォビン部分、例えば該ハイドロフォビン部分のアミノ末端（Ｘｎ）およびカルボキシル末端（Ｘｍ）に結合させることもできる。しかし、例えば、本発明のタンパク質の１つの位置（ＸｎまたはＸｍ）に２個の融合パートナーを結合させることも可能である。特に適した融合パートナーは、微生物、とりわけ大腸菌または枯草菌において天然に生じるタンパク質である。そのような融合パートナーの例としては、ｙａａｄ配列（国際公開第２００６／０８２２５１号中の配列番号１６）、ｙａａｅ配列（国際公開第２００６／０８２２５１号中の配列番号１８）、ユビキチンおよびチオレドキシンが挙げられる。
【００４４】
また、非常に適しているのは、言及される配列の一部、例えば７０〜９９％、好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％しか含まない、あるいは、個々のアミノ酸またはヌクレオチドが言及される配列と比較して変化している、これらの配列の断片または誘導体である（その場合、百分率は各々アミノ酸の数に基づく）。完全な融合パートナーの代わりに、末端切断型残基を使用することも有利でありうる。
【００４５】
特に、末端切断型残基は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸を含むことができる。さらに好ましい実施形態では、融合ハイドロフォビン、ならびにＸｎもしくはＸｍ基のうちの１つとして、またはそのような基の末端構成要素として言及される融合パートナーもまた、いわゆる親和性ドメイン（親和性タグ／親和性テイル）を有する。原則として公知の方法で、これは、特定の相補的な基と相互作用することができ、より簡便な後処理およびタンパク質の精製に役立つアンカー基を含む。そのような親和性ドメインの例には、ｋが一般に１〜１０の自然数である、（Ｈｉｓ）ｋ、（Ａｒｇ）ｋ、（Ａｓｐ）ｋ、（Ｐｈｅ）ｋまたは（Ｃｙｓ）ｋ基が含まれる。これは好ましくはｋが４〜６のいずれかの数である（Ｈｉｓ）ｋ基である。この場合、Ｘｎおよび／またはＸｍ基はこのような親和性ドメインだけで構成される可能性がある。そうでなければハイドロフォビンに天然に結合しているかまたは結合していないＸｎまたはＸｍラジカルは、末端親和性ドメインにより伸長されている。
【００４６】
本発明に従って使用されるハイドロフォビンはまた、それらのポリペプチド配列中で、例えばグリコシル化、アセチル化、さもなければ、例えばグルタルアルデヒドを用いる化学的架橋により修飾することができる。ハイドロフォビンはまた、多糖類、例えばヘパリンなどと架橋を形成することもできる。
【００４７】
医療用具を埋め込むことによりコーティングが悪影響を受けない、被覆された用具を開発することが有利であることが見出された。その上、そのようなハイドロフォビンで被覆された用具は、標的部位に医療用具を容易かつ正確に位置づけるための手段を医師に提供する。  
【００４８】
また、医療用具からの薬物（例えば、ヘパリンなど）の溶出速度の正確な制御を可能にする医療用具用のハイドロフォビン被覆を開発することが有利であることも見出された。
【００４９】
細胞増殖に影響を及ぼす様々な分子機構を介して作用する１以上の薬剤の放出をもたらす、ハイドロフォビンで被覆された用具もまた、本発明の対象である。
【００５０】
試験目的のために、市販の胆管プラスチックステントに、ハイドロフォビンを単独で、またはハイドロフォビンを抗生物質および／またはヘパリンとともに被覆した。ヒト胆汁中で２８日間インキュベートした後、被覆されたステント表面の目詰まりを起こす物質が減少したかどうかを調べた。ハイドロフォビンを用いるプラスチックステントの被覆は、ステント表面の付着物質を有意に減少させたことが見出された。
【００５１】
また、ハイドロフォビンで被覆されたステントと、アンピシリン／スルバクタムまたはレボフロキサシンとの結合も試験した。ハイドロフォビン、またはハイドロフォビンとヘパリンを用いる胆管プラスチックステントの被覆は、目詰まり過程を遅延させるために有望な方法であることが見出された。
【００５２】
臨床状況がより長期間にわたるステント留置を必要とする場合、内視鏡によるステント交換が必要である場合が多いが、より長い開存率を持つハイドロフォビンで被覆された胆管ステントの開発が特に有用であることが見出された。インビトロモデルにおいて、市販の胆管プラスチックステントの、ハイドロフォビンでの様々な被覆を試験した。目詰まり過程の低下が見出された。さらに、プラスチックステントの性能をさらに改良するために、抗生物質およびヘパリンをこのタンパク質ハイドロフォビンに結合させた。この考えは、極めて小さな糸状物質が目詰まり過程において重要な役割を果たしているらしいことを示す走査電子顕微鏡試験の結果から生まれたものである。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００５３】
以下の試験のために、直径１０フレンチ、フラップ間の長さ８ｃｍを有する胆管プラスチックステント（ポリエチレン、Ｃｏｔｔｏｎ−Ｌｅｕｎｇ（登録商標）型、Ｆａ．Ｃｏｏｋ（登録商標）、Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用した。
【００５４】
非被覆プラスチックステントと、ハイドロフォビンで被覆したステントを、ヒト胆汁中に２８日間入れた。その後、該ステントを、走査電子顕微鏡を用いて調べた。
【００５５】
被覆手順を開始する前に、ステントを（最終の走査電子顕微鏡検査に適した）１ｃｍの小片に切断した。表面の修飾および／または様々な活性の標的化は、化学修飾されたハイドロフォビンを用いる被覆により実施した。
【００５６】
このタンパク質「Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」の生成および特性は、Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ  Ｗ、Ｓｕｂｋｏｗｓｋｉ  Ｔ、Ｂｏｌｌｓｃｈｗｅｉｌｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｇａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ｉｎ  Ｅｕｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、２００９に記載されている。
【００５７】
最初の実験において、１４個の非被覆ステントを使用した。１１個のステントを一般的な被覆技術により、ハイドロフォビンタンパク質（Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＢＡＳＦ  ＳＥ）で被覆し、３個のステントをハイドロフォビン（Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとアンピシリン＋スルバクタム（Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｈａｒｍａ）の組み合わせ）で被覆した。さらに、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／レボフロキサシン（Ｔａｖａｎｉｃ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、およびＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／ヘパリンの組み合わせを試験した。
【００５８】
１０ｍｇハイドロフォビン（Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）／ｍＬ滅菌蒸留水溶液を調製した後、タンパク質を被覆緩衝液：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ステントを１ｍＬのＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶液中で８０℃にて一晩インキュベートし、蒸留水中で３回洗浄し、乾燥させた。
【実施例２】
【００５９】
表面上のハイドロフォビンの検出
Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの被覆は、タンパク質のＨｅｘａ−Ｈｉｓタグに対する特異的抗体によって検出した。
【００６０】
−ＴＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中１％ブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ  １９２１６７３）中での被覆および非被覆ステントのインキュベーション；室温にて１時間
−ＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄
−ＴＴＢＳ緩衝液／０．０１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７８８８）で１：２０００に希釈した抗−ポリ−Ｈｉｓ−ＰＯＤ抗体複合体（Ｓｉｇｍａ  Ａ７０５８）でのインキュベーション；室温にて１時間
−ＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄
−ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄
−１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９で洗浄
−ペルオキシダーゼ基質の添加：
１００μＬ  ＤＭＳＯ中、ＴＭＢ−基質１錠（Ｓｉｇｍａ  Ｔ５５２５）
１０ｍＬ  ０．１Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
１４．７μＬ  ３％Ｈ２Ｏ２
−室温で５分間インキュベーション
−４０５ｎｍで検出。
【実施例３】
【００６１】
ハイドロフォビンおよびヘパリンを用いるプラスチックステントの被覆
ヘパリンを、ステントのＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ被覆に結合させた。１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ２９３３）中の、ヘパリン（ヘパリンナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｈ４７８４）およびカップリング試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ  ７７５０）１ｍｇ／ｍＬの混合物を、新たに調製した。ヘパリンの終濃度は５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、および５０００Ｕ／ｍＬであった。ステントを、ローテータ中で、１ｍＬのカップリング溶液とともに、室温にて２時間インキュベーションした後、滅菌蒸留水で３回の洗浄工程により、反応を停止させた。
【００６２】
遊離カルボキシル基を介して、ヘパリンはＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａのアミノ基に結合した。ＥＤＣは、第一級アミンの結合のためのカルボキシル基の活性化剤として用いて、アミド結合をもたらした。
【実施例４】
【００６３】
Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよびアンピシリン＋スルバクタム（Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｈａｒｍａ）で被覆したステント
Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）を滅菌蒸留水に溶解させ、総濃度（アンピシリン＋スルバクタム）を１００ｍｇ／ｍＬとした。ステントの表面でのＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの反応は、蒸留水中で、Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）を総終濃度１００μｇ／ｍＬ、グルタルジアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ  ３４、０８５−５）を終濃度０．０５％になるよう添加することにより実施した。室温にて一晩インキュベーションした後、ステントを滅菌蒸留水で３回洗浄した。アンピシリンは、Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）中の２つの活性化合物のうちの１つとして、反応条件下で結合することができた。アンピシリンの一級アミノ基およびＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの利用可能なアミノ基が、グルタルジアルデヒドによって架橋された。
【実施例５】
【００６４】
Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよびレボフロキサシン（Ｔａｖａｎｉｃ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）で被覆したステント
Ｔａｖａｎｉｃ（登録商標）を、終濃度１．３ｍｇ／ｍＬとなるように１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．５に希釈し、ＥＤＣ（終濃度１．６ｍｇ／ｍＬ）と混合した。Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで被覆されたステントとの反応は、室温にて２．５時間実施した。最後に、ステントを滅菌蒸留水で３回洗浄した。
【００６５】
レボフロキサシンは、アミドを生成することによりＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａに結合した。レボフロキサシンのカルボキシル基は、ＥＤＣにより、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａのアミノ基に架橋した。
【実施例６】
【００６６】
ヒト胆汁中でのインキュベーション
被覆したステントをすべて、ヒト胆汁（経皮経肝的ドレナージから採取、患者は胆汁の使用に関しての説明に同意した）を満たした管の中で２８日間貯蔵した。図１に示される装置を使用することにより、この管を２ｒｐｍ（毎分回転数）の速度で転回させた。
【００６７】
この図１において、略語Ｔはヒト胆汁貯蔵ステントと一体になっている管であり、Ｂは緩やかに振り子運動をする板、Ｅは電気モータである。該装置におけるこの処置は、胆汁の流れをシミュレーションするために行った。インキュベーションは３７℃の一定温度で実施した。
【実施例７】
【００６８】
走査電子顕微鏡
２８日間のインキュベーションの後、すべてのステントを滅菌蒸留水で洗浄し、４％緩衝化グルタルアルデヒド中で固定し、貯蔵した。段階系列アルコールで脱水した後、すべてのサンプルを臨界点乾燥機で乾燥させ、接着用ホイルを用いてスタブに接着し、１５ｎｍ金−パラジウムを用いてスパッタ法で被覆した。走査電子顕微鏡検査を、デジタル出力のＰｈｉｌｉｐｓ電界放射型走査電子顕微鏡を用いて行った。
【００６９】
第一に、非被覆ステントの結果を、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで被覆したステントの結果と比較した。その後、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで被覆したステントを、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよび抗生物質薬剤化合物またはヘパリンで被覆したステントと比較した。
【００７０】
以下の結果が見出された。
【００７１】
ａ）非被覆ステント
２８日間のインキュベーション後、走査電子顕微鏡による観察から、非被覆ステントの内面および外表面に同じような量の付着物質が明らかとなった。この物質は、ステント内部表面でより密集していることが見出され、一方、外表面ではより起伏に富んでいた。付着物質の組成に関して差はなかった。この成分は、主に様々な量の細菌を含む無定形物質と、細菌の近くの、さらにそれらの発生とは無関係な非常に小さな構造物であった。
【００７２】
ｂ）Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで被覆したステント
本試験で使用した化学修飾ハイドロフォビンは、アスペルギルス・ニデュランスのハイドロフォビン  ＤｅｗＡ、Ｎ末端融合タンパク質ｙａａｄ、およびＣ末端Ｈｅｘａ−Ｈｉｓタグからなる。このタグ配列に対する特異的抗体のために、表面のタンパク質の「ウエスタンブロット様」検出を実施することができた。酵素ＰＯＤ（抗体と結合）は、特異的基質の色の生成により検出することができた。
【表１】
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非被覆ステントと比較して、付着物質の程度の低下が、走査電子顕微鏡で低倍率で見ることができる。
非被覆ステントが実証した成分は、被覆したステント上にも存在する（無定形物質、細菌ならびに細菌の近くおよび遠位の非常に小さな構造物）。（ハイドロフォビンの）非常に薄い層はステント表面に近接して検出可能であった。
【００７３】
ｃ）Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよびアンピシリン＋スルバクタム（Ｕｎａｃｉｄ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｈａｒｍａ）で被覆したステント
より高い倍率でも、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ単独で被覆したステントと比較して付着物質の減少は示されなかった。反対に、細菌の量は、一部のステントセグメント上でむしろ顕著であると思われた。
【００７４】
ｄ）Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよびレボフロキサシン（Ｔａｖａｎｉｃ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）で被覆したステント
ステントの走査電子顕微鏡検査から、アンピシリン＋スルバクタムで被覆したステントとの差異はないことが明らかになった。従って、この群では、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ単独で被覆したステントとも差異はないと思われた。
【００７５】
ｅ）Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ヘパリン（濃度：５０Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌおよび５０００Ｕ／ｍｌ）で被覆したステント
Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよび最も低濃度のヘパリンで被覆したステントは、Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ単独で被覆したステントと同様の走査電子顕微鏡結果であった。Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよび最高濃度のヘパリンで被覆したステントは、最小量の付着物質を持つステントとして浮上した。Ｈ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａおよび中間濃度のヘパリンで被覆したステントも良好な結果を示した。
【００７６】
実験は、インビトロモデルにおいて、非被覆プラスチックステントと比較して、ハイドロフォビンＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａでのプラスチックステントの被覆が付着物質の減少をもたらしたことを示した。ハイドロフォビンと高濃度のヘパリンの結合は、付着プロセスをさらに減少させた。
【００７７】
プラスチックステントが疎水性表面を有するため、ハイドロフォビンで被覆した後は、それらの表面は親水性となる。
【００７８】
これらの特性は、目詰まり過程の抑制に関して、胆管プラスチック内部人工器官の表面を最適化するために有望である。特に有用なハイドロフォビンの１つはＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａであり、文献に記載されている。さらに、このＨ＊ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａに薬物を結合させることが可能である。
【００７９】
インビトロモデルにおいて付着の減少をもたらした機構を研究した。走査電子顕微鏡を用いる最近の研究では、様々なステント留置期間後の、胆管および膵臓ステントの極めて均質な目詰まりパターンが認められた。目詰まり過程において重要な事象は、ステント内部表面への極めて小さな糸状物質の付着、および、これらの極めて小さな糸状物質による目詰まり物質の固定化である。ステントの被覆のインビトロ試験は、付着物質の量の減少をもたらした。
【００８０】
ヘパリンの高濃度ハイドロフォビンとの結合は、付着物質を減少させることが見出された。このことは、動物実験でも確認することができる。
【００８１】
ステント開通性を改善するために、様々な種類のプラスチックを検討した。親水性のハイドロマー−被覆が施され、一見したところ滑らかな表面を有するプラスチックステントでさえも、長期にわたるステント開通性をもたらさなかった。側孔はステントの目詰まりを促進する疑いがあるとされてきたが、同じことは側孔のないステント（Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍステント）にも当てはまった。
【００８２】
本発明に従う組成物で処理されたステントは、滑らかな表面を有し、長期にわたるステント開通性をもたらす。
【図１】
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【国際調査報告】
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