(57)【要約】【課題】ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するためのＰＣＲプライマーおよびプローブ、ならびにＫＲＡＳ変異を検出するためにこれらのＰＣＲプライマーおよびプローブを使用する方法ならびに上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する癌の感受性を予測するための方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子の変異の検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを提供する。本発明はまた、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを使用してＫＲＡＳ遺伝子における変異を検出するための方法も提供する。さらに、本発明は、腫瘍からＤＮＡを入手すること、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの少なくとも１つを利用する方法を使用して、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２の中のコドン１２の変異および／またはコドン１３の変異が存在するか否かを決定することを含む、上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する患者中の腫瘍の感受性を予測する方法を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドであって：
（ａ）ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）６ＦＡＭ−ＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴ（配列番号３）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）６ＦＡＭ−ＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴ（配列番号６）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｈ）ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｉ）ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｊ）ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号１０）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｋ）ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号１１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｌ）ＧＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡ（配列番号１２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｍ）６ＦＡＭ−ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＣＡ（配列番号１３）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｎ）ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号１４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｏ）ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号１５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｐ）ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号１６）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｑ）ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号１７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｒ）ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号１８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｓ）ＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号１９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｔ）６ＦＡＭ−ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴ（配列番号２０）からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号１０）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号１１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＧＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡ（配列番号１２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号１４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号１５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号１６）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号１７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号１８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号１９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号１４）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号１５）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号１６）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号１７）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号１８）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号１９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号９）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号１０）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号１１）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
ＧＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡ（配列番号１２）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｔ）の少なくとも１つを含むキット。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）および（ｓ）の少なくとも１つ、ならびにオリゴヌクレオチド（ｃ）、（ｆ）、（ｍ）および（ｔ）の少なくとも１つを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出する方法であって、前記方法は：
（１）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに
（Ｉ）対照アッセイのための対照オリゴヌクレオチドプライマーの対、および
（ＩＩ）変異アッセイのための変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用するＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅すること、
（２）工程（１）（Ｉ）の産物が、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを決定すること；ならびに
（３）工程（１）（ＩＩ）の産物が、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを決定すること
を含み、
（Ｉ）において、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン４におけるＤＮＡ領域の増幅のためであり、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対は、請求項１に記載の配列番号１１によって表されるヌクレオチド配列からなるＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマーまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および請求項１に記載の配列番号１２によって表されるヌクレオチド配列からなるＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマーまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドであり、
（ＩＩ）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２に位置するコドン１２における変異および／またはコドン１３における変異を有するＤＮＡ領域の増幅のためであり、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）請求項１に記載される、配列番号４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるリバースプライマー、および
（ｉｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）請求項１に記載される、配列番号５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対、
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）請求項１に記載される、配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー（１３ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）請求項１に記載される、配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対；または
（Ｃ）コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対であって、
（ｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）請求項１に記載される、配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）請求項１に記載される、配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）請求項１に記載される、配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）請求項１に記載される、配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）請求項１に記載される、配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）請求項１に記載される、配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；または（ｈ）請求項１に記載される、配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つのフォワードプライマー；および
（ｉｉ）請求項１に記載される、配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対
から選択され、
（２）において、増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子の存在を示し；ならびに
（３）において、
（ａ）工程（１）（ＩＩ）においてコドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が使用されるときの増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２におけるコドン１３の変異の存在を示し；および／または
（ｂ）工程（１）（ＩＩ）においてコドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が使用されるときの増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２におけるコドン１２の変異の存在を示す、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において、工程（１）（ＩＩ）において使用される変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対がＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２に位置するコドン１２の変異を有するＤＮＡ領域の増幅のためであり、コドン１２のための変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、
（ｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）請求項１に記載される、配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）請求項１に記載される、配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）請求項１に記載される、配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）請求項１に記載される、配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）請求項１に記載される、配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）請求項１に記載される、配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；または（ｈ）請求項１に記載される、配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つのフォワードプライマー；および
（ｉｉ）請求項１に記載される、配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において、工程（１）（ＩＩ）において使用される変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対がＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２に位置するコドン１３の変異を有するＤＮＡ領域の増幅のためであり、コドン１３のための変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるリバースプライマー、および
（ｉｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー
を含む、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対；ならびに
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー（１３ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対
から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が、
（ｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるリバースプライマー、および
（ｉｉ）（ａ）請求項１に記載される、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において使用される変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が、
（ｉ）配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において使用される変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が、
（ｉ）配列番号４によって表されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号５によって表されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、工程（１）（ＩＩ）において、コドン１３のための変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー（１３ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、工程（２）において、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物が、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の１つのメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他のメンバーまでに及ぶか、または対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の１つのメンバーに対して相補的な領域から、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他のメンバーに対して相補的な領域までに及ぶＤＮＡ領域からなる、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、工程（３）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の１つのメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他のメンバーまでに及ぶか、または変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の１つのメンバーに対して相補的な領域から、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他のメンバーに対して相補的な領域までに及ぶＤＮＡ領域からなる、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、工程（１）において使用される、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩｓｏＴｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ活性のために必須のアミノ酸残基の酸化を介して３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が除去されているか（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｔｉｏｎ  １）または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のために必須である２８アミノ酸を遺伝的に欠失させることによる（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔR（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２０】
３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（２）において、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号１３によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
工程（２）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号３または６によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
工程（２）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号３によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（２）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
工程（２）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号３によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（２）において、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物が、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一である標識オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（１）において使用されるＤＮＡが、組織から得られたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
工程（１）において使用されるＤＮＡが、組織から得られたｃＤＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する、患者における腫瘍の感受性を予測する方法であって、
（１）腫瘍からＤＮＡを入手すること；および
（２）ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するために請求項１０〜２８のいずれか１項に記載の方法を使用して、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２中のコドン１２の変異および／またはコドン１３の変異の存在を決定すること
を含み、
コドン１２の変異および／またはコドン１３の変異の検出は、腫瘍が、コドン１２およびコドン１３において変異を有さない同じ型の腫瘍と比較して、上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する感受性を減少したことを予測する、
方法。
【請求項３０】
工程（２）がＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２における変異を決定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程（２）がＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１３における変異を決定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
工程（２）がＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２における変異およびコドン１３における変異を決定する、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，１１４号の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するためのＰＣＲプライマーおよびプローブ、ならびにＫＲＡＳ変異を検出するためにこれらのＰＣＲプライマーおよびプローブを使用する方法ならびに上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する癌の感受性を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、癌の発生において重要な役割を果たすチロシンキナーゼである。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現は、転移性結腸直腸癌（ＣＲＣ）の患者からの腫瘍の８５％より多くにおいて見られた。Ｌｅｅ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｃｈｕ  Ｅ，Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ４２−６を参照のこと。ＥＧＦＲを標的とする抗癌薬物が開発されている。セツキシマブおよびパニツムマブは、転移性ＣＲＣのための二次使用において、ならびにオキサリプラチンベースの治療およびイリノテカンベースの治療と組み合わせた一次使用において、有望な治療効果を示している２つのＥＧＦＲ阻害剤である。Ｌｅｅ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｃｈｕ  Ｅ，Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７；６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ４２−６；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｍｅｄ．２００６；３８：５４５−５１を参照のこと。しかし、すべての患者がセツキシマブおよびパニツムマブに応答するわけではない。
【０００４】
Ｒａｓ遺伝子であるＨ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ（ＫＲＡＳ）、およびＮ−ｒａｓは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路に関与する低分子量ＧＴＰａｓｅをコードしている。エキソン２における決定的に重要なコドン１２、１３、または６１の１つにおけるＫＲＡＳ遺伝子の点変異は腫瘍発生を促進する。ＫＲＡＳ変異は結腸直腸腺癌の約３７％で起こる。Ｂｒｉｎｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００３；２４：７０３−１０を参照のこと。変異したＫ−ｒａｓ遺伝子と、セツキシマブ治療およびパニツムマブ治療の両方に対する応答の欠如ならびにそれらからの短い生存との間で、強い相関が示されている。ＫＲＡＳ変異の存在が、セツキシマブまたはパニツムマブに対する非応答性を高く予測するので、変異したＫＲＡＳを有する患者は、これらのＥＧＦＲ阻害剤を用いる前述の化学療法を考慮すべきである。
【０００５】
ＫＲＡＳ変異は多くの方法によって検出できる。例えば、ＤＮＡは、例えば、標準的なプロテイナーゼＫ消化およびフェノール−クロロホルム抽出によって、凍結組織サンプルから抽出され、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されてもよく、次いで、ＫＲＡＳ変異はＰＣＲ産物の配列決定によって検出できる。Ｔａｍ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；１２（５）：１６４７−５３を参照のこと。
【０００６】
ＫＲＡＳ変異はまた、増幅抵抗性変異系ＰＣＲ（ＡＲＭＳ  ＰＣＲ）を用いて検出できる。ＡＲＭＳ  ＰＣＲは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰ）または特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）とも呼ばれており、一塩基変異を検出することが可能なＰＣＲベースの方法である。Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９；１７（７）：２５０３−１６を参照のこと。ＡＲＭＳ  ＰＣＲにおいて、一方のＰＣＲプライマーの３’末端が標的変異と一致する。ＡＲＭＳ  ＰＣＲは、ミスマッチ修復のために必要とされる３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ（通常はＴａｑポリメラーゼ）を利用するので、ＡＲＭＳ  ＰＣＲは、原理的には、標的変異を伴うＤＮＡ鋳型のみを増幅する。増幅産物の存在が特定の変異の存在を示すので、ＡＲＭＳは、反応混合物の検査のみによって、例えば、アガロースゲル電気泳動のみによって、変異の検出を可能にする。Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９；１７（７）：２５０３−１６；Ｂｏｔｔｅｍａ，ＣＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３；２１８：３８８−４０２を参照のこと。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、以下から選択されるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する：
（ａ）ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号１；以下、「１３ＡＳＰリバースプライマー」または「Ｋｒａｓ３８Ａ＿２ＧＴ−Ｒ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２；以下、「Ｃ１３フォワードプライマー」または「ＫｒａｓＣ１３−Ｆ４」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）６ＦＡＭ−ＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴ（配列番号３；以下、「Ｃ１３プローブ」または「ＫｒａｓＣ１３−Ｍｃ２」とも称する）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号４；以下、「Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号５；以下、「ＫｒａｓＣ１３−Ｆ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）６ＦＡＭ−ＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴ（配列番号６；以下、「ＫｒａｓＣ１３＿Ｍｃ」とも称する）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号７；以下、「１３ＡＳＰフォワードプライマー」または「Ｋｒａｓ３８Ａ＿１ＧＡ−Ｆ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｈ）ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号８；以下、「１２ＶＡＬフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｉ）ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号９；以下、「ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｊ）ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号１０；以下、「Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｋ）ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号１１；以下、「ＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマー」または「ＫｒａｓＥｘ４＿Ｃ−Ｆ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｌ）ＧＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＡ（配列番号１２；以下、「ＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマー」または「ＫｒａｓＥｘ４＿Ｃ−Ｒ」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｍ）６ＦＡＭ−ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＣＡ（配列番号１３；以下、「ＫｒａｓＥｘ４対照プローブ」または「ＫｒａｓＥｘ４＿Ｃ−Ｍ」とも称する）のヌクレオチド配列からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｎ）ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号１４；以下、「１２ＳＥＲフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｏ）ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号１５；以下、「１２ＡＲＧフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｐ）ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号１６；以下、「１２ＣＹＳフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｑ）ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号１７；以下、「１２ＡＳＰフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｒ）ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号１８；以下、「１２ＡＬＡフォワードプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；
（ｓ）ＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号１９；以下、「Ｃ１２共通リバースプライマー」とも称する）のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｔ）６ＦＡＭ−ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴ（配列番号２０；以下、「Ｃ１２共通プローブ」とも称する）からなる標識オリゴヌクレオチドまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド。
【０００８】
本発明の１つの態様は、本発明の上記のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、（ａ）〜（ｔ）の少なくとも１つを含むキットである。
【０００９】
本発明はまた、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出する方法を提供し、上記方法は：
（１）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに
（Ｉ）対照アッセイのための対照オリゴヌクレオチドプライマーの対、および（ＩＩ）変異アッセイのための変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用するＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅すること、
（２）工程（１）（Ｉ）の産物が、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かを決定すること；ならびに
（３）工程（１）（ＩＩ）の産物が、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの対によって増幅されたエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かを決定すること
を含み、
（Ｉ）において、上記対照オリゴヌクレオチドプライマーの対は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン４におけるＤＮＡ領域の増幅のためであり、上記対照オリゴヌクレオチドプライマーの対は、配列番号１１によって表されるヌクレオチド配列からなるＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマーまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および配列番号１２によって表されるヌクレオチド配列からなるＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマーまたはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドであり、
（ＩＩ）において、上記変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２に位置するコドン１２における変異および／またはコドン１３における変異を有するＤＮＡ領域の増幅のためであり、上記変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）（ａ）配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる１３ＡＳＰリバースプライマー（Ｋｒａｓ３８Ａ＿２ＧＴ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるリバースプライマー、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＣ１３フォワードプライマー（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ４）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、または（ｂ）配列番号５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対、
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー（１３ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対；または
（Ｃ）コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対であって、
（ｉ）（ａ）配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；または（ｈ）配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対
から選択され、
（２）のＤＮＡ領域は、例えば、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の１つのメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他のメンバーまでに及ぶか、または対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の１つのメンバーに対して相補的な領域から、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他のメンバーに対して相補的な領域までに及ぶ、エキソン４のＤＮＡ領域であり、増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子の存在を示し；ならびに
（３）のＤＮＡ領域は、例えば、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の１つのメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他のメンバーまでに及ぶか、または変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の１つのメンバーに対して相補的な領域から、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他のメンバーに対して相補的な領域までに及ぶ、エキソン２のＤＮＡ領域であり、
（ａ）工程（１）（ＩＩ）においてコドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が使用されるときの増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２におけるコドン１３の変異の存在を示し；および／または
（ｂ）工程（１）（ＩＩ）においてコドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が使用されるときの増幅産物の検出が、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２におけるコドン１２の変異の存在を示す。
【００１０】
本発明はまた、上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対する患者における腫瘍の感受性を予測する方法を提供し、上記方法は、
（１）腫瘍からＤＮＡを入手すること；および
（２）本明細書に開示されるＤＮＡにおいてＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法を使用して、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２の変異および／またはコドン１３の変異が存在するか否かを決定することを含み、コドン１２の変異および／またはコドン１３の変異の検出は、コドン１２およびコドン１３において変異を有さない同じ型の腫瘍と比較して、上皮成長因子受容体を指向する化学療法に対して、腫瘍が低下した感受性を有するか否かを予測する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
ＫＲＡＳ遺伝子における変異の存在は、ＥＧＦＲを指向する化学療法、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害剤を用いる腫瘍治療に対する腫瘍患者の非応答性を高度に予測する。本発明は、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を正確かつ高い信頼性で検出するために、ＰＣＲにおけるプライマーまたはプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして使用して、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出する方法も提供する。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、化学合成を含む、当該分野において公知である方法によって作製できる。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ＫＲＡＳ」という用語は、他に特定されない限り、ヒトのＫｉｒｓｔｅｎ  ｒａｓ癌遺伝子をいう。ＫＲＡＳのヌクレオチド配列は周知である。ＫＲＡＳの２つのアイソフォームが存在しており、その２つのアイソフォームのヌクレオチド配列は、ＮＭ＿０３３３６０およびＮＭ＿００４９８５の下でＧｅｎＢａｎｋにおいて見い出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおけるプライマーまたはプローブとして使用されるために十分な数のヌクレオチド残基を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、標識、例えば、蛍光標識を含むように修飾されてもよい。
【００１４】
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、配列番号１（１３ＡＳＰリバースプライマー）、２（Ｃ１３フォワードプライマー）、４（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＣ−Ｒ）、５（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）、７（１３ＡＳＰフォワードプライマー）、８（１２ＶＡＬフォワードプライマー）、９（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）、１０（Ｋｒａｓ３５Ｇ＿３ＣＧ−Ｆ）、１１（ＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマー）、１２（ＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマー）、１４（１２ＳＥＲフォワードプライマー）、１５（１２ＡＲＧフォワードプライマー）、１６（１２ＣＹＳフォワードプライマー）、１７（１２ＡＳＰフォワードプライマー）、１８（１２ＡＬＡフォワードプライマー）または１９（Ｃ１２共通リバースプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと「実質的に同一」であり、実質的に同一のオリゴヌクレオチドは、対象ヌクレオチドと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、３’末端の５個のヌクレオチドにおいてはミスマッチが存在しない。
【００１５】
配列番号１（１３ＡＳＰリバースプライマー）、２（Ｃ１３フォワードプライマー）、４（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＣ−Ｒ）、５（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）、７（１３ＡＳＰフォワードプライマー）、８（１２ＶＡＬフォワードプライマー）、９（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）、１０（Ｋｒａｓ３５Ｇ＿３ＣＧ−Ｆ）、１１（ＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマー）、１２（ＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマー）、１４（１２ＳＥＲフォワードプライマー）、１５（１２ＡＲＧフォワードプライマー）、１６（１２ＣＹＳフォワードプライマー）、１７（１２ＡＳＰフォワードプライマー）、１８（１２ＡＬＡフォワードプライマー）または１９（Ｃ１２共通リバースプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象ヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドには、対象ヌクレオチドの５’末端から１個、２個、または３個のヌクレオチドが除去されているオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００１６】
配列番号１（１３ＡＳＰリバースプライマー）、２（Ｃ１３フォワードプライマー）、４（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＣ−Ｒ）、５（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）、７（１３ＡＳＰフォワードプライマー）、８（１２ＶＡＬフォワードプライマー）、９（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）、１０（Ｋｒａｓ３５Ｇ＿３ＣＧ−Ｆ）、１１（ＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマー）、１２（ＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマー）、１４（１２ＳＥＲフォワードプライマー）、１５（１２ＡＲＧフォワードプライマー）、１６（１２ＣＹＳフォワードプライマー）、１７（１２ＡＳＰフォワードプライマー）、１８（１２ＡＬＡフォワードプライマー）または１９（Ｃ１２共通リバースプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドには、対象オリゴヌクレオチドの５’末端に１個、２個、または３個のヌクレオチドが付加されているオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００１７】
配列番号１（１３ＡＳＰリバースプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号２１）、
ＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号２２）および
ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴ（配列番号２３）であり得る。
【００１８】
配列番号２（Ｃ１３フォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２４）、
ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２５）および
ＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号２６）であり得る。
【００１９】
配列番号４（Ｋｒａｓ３８Ａ＿３ＴＧ−Ｒ）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号２７）、
ＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号２８）および
ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴ（配列番号２９）であり得る。
【００２０】
配列番号５（ＫｒａｓＣ１３−Ｆ）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号３０）、
ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号３１）および
ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ（配列番号３２）であり得る。
【００２１】
配列番号７（１３ＡＳＰフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号３３）、
ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号３４）および
ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡ（配列番号３５）であり得る。
【００２２】
配列番号８（１２ＶＡＬフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号３６）、
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号３７）および
ＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号３８）であり得る。
【００２３】
配列番号９（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号３９）、
ＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号４０）および
ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴ（配列番号４１）であり得る。
【００２４】
配列番号１０（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号４２）、
ＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号４３）および
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号４４）であり得る。
【００２５】
配列番号１４（１２ＳＥＲフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号４５）、
ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号４６）および
ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号４７）であり得る。
【００２６】
配列番号１５（１２ＡＲＧフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号４８）、
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号４９）および
ＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号５０）であり得る。
【００２７】
配列番号１６（１２ＣＹＳフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号５１）、
ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号５２）および
ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴ（配列番号５３）であり得る。
【００２８】
配列番号１７（１２ＡＳＰフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号５４）、
ＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号５５）および
ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号５６）であり得る。
【００２９】
配列番号１８（１２ＡＬＡフォワードプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号５７）、
ＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号５８）および
ＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号５９）であり得る。
【００３０】
配列番号１９（Ｃ１２共通リバースプライマー）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドの例は、
ＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号６０）、
ＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号６１）および
ＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号６２）であり得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、配列番号３（Ｃ１３プローブ）、６（ＫｒａｓＣ１３＿Ｍｃ）または１３（ＫｒａｓＥｘ４対照プローブ）によって表されるヌクレオチド配列からなる対象オリゴヌクレオチドと「実質的に同一」であり、実質的に同一であるオリゴヌクレオチドは、対象オリゴヌクレオチドと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「配列同一性％」は、ヌクレオチドの挿入および欠失のための適切な考慮を伴って、それぞれのオリゴヌクレオチドセグメント、またはそれらの相補鎖を適切に整列させることによって決定される。比較される配列が同じ長さを有さないとき、「配列同一性％」とは、より長い配列中のヌクレオチド残基の総数で比較される、配列間の同一のヌクレオチド残基の数のパーセンテージをいう。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、標的ＤＮＡ配列と結合し、サンプル中の標的配列の存在および／または量を示す、様々な長さのオリゴヌクレオチドをいう。例えば、プローブは、標的ＤＮＡ配列の存在および／または量を示すための適切な条件下で、蛍光標識を含んでもよく、かつ蛍光を放出してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「６ＦＡＭ」とは、６−カルボキシフルオレセインをいう。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ」とは、一般的に、熱安定性ポリメラーゼ、および一方のプライマーが増幅される配列の一方の末端において（＋）鎖に相補的であり、他方のプライマーが、他方の末端において（−）鎖に相補的である２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＤＮＡ配列を増幅するための方法である、ポリメラーゼ連鎖反応をいう。新たに合成されるＤＮＡ鎖がさらなる鋳型として引き続き役立つことができるので、プライマーアニーリング、鎖伸長、および解離の連続した繰り返しにより、所望のＤＮＡ配列の迅速かつ高度に特異的な増幅が生じる。
【００３６】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（１）において、対象ＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲ手順を用いて増幅できる。
【００３７】
ＰＣＲは、当該分野において公知の方法のいずれかによって実行されてもよい。例えば、ＰＣＲは、分析されるＤＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、ｄＮＴＰ、Ｍｇ++、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および適切な緩衝溶液の混合物を調製すること；この混合物を初期の加熱、例えば、９５℃の温度に１０分間供すること、次いで、ＤＮＡを増幅するために適切な温度サイクルに供することを含んでもよい。例えば、各温度サイクルは、ＰＣＲ混合物を９５℃で３０秒間の間加熱すること、次いで、このＰＣＲ混合物を６０℃で１分間冷却することを含んでもよい。特定の実施形態において、ＰＣＲはＡＲＭＳ  ＰＣＲであってもよく、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）が使用され、一方のプライマーの３’末端が、検出される標的ＫＲＡＳ変異と一致する。蛍光標識プローブなどの他の技術とのＡＲＭＳ  ＰＣＲの組み合わせは、リアルタイムＰＣＲ反応における変異の検出を可能にする。
【００３８】
蛍光標識プローブを用いて、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異の存在の検出が、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００または７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ［ＴａｑＭａｎ（登録商標）］（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＨｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９９６；６：９８６−９９４）およびＧｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９９６；６：９９５−１００１）によって記載されているような同様のシステムによるなどの蛍光ベースのリアルタイム検出法を使用して行われてもよい。ＡＢＩ  ７７００またはＡＢＩ  ７９００の出力は、「Ｃｔ」または「サイクル閾値」で表現され、これは、レポーター蛍光が閾値よりも大きいＰＣＲサイクル数をいい、閾値は任意のレベルの蛍光であって、それよりも上では、検出されるシグナルが真のシグナルと見なされる。閾値は、ベースラインの変動性に基づいて選択されてもよく、各々の実験について調整できる。サンプル中の標的分子の数がより多いと、より少ないＰＣＲサイクルを用いてシグナルを生成し（より低いＣｔ）、サンプル中の標的分子の数がより少ないと、より多くのＰＣＲサイクルを用いてシグナルを生成する（より高いＣｔ）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「プライマー」とは、増幅されるＤＮＡ鋳型フラグメントの１つの鎖の最初とハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチド鎖をいい、ＤＮＡポリメラーゼが結合し、プライマーの３’末端を伸長することによって新たなＤＮＡ鎖を合成する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「上皮成長因子受容体を指向する化学療法」または「ＥＧＦＲを指向する化学療法」は、ＥＧＦＲを包含するシグナル経路を損なうかまたはそれに干渉することができる物質の投与を介した化学療法である。ＥＧＦＲを指向する化学療法には、ＥＧＦＲ阻害剤の投与が包含され得る。ＥＧＦＲ阻害剤の例としては、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどの低分子チロシンキナーゼ阻害剤、またはセツキシマブおよびパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体が挙げられる。
【００４１】
本発明の１つの態様は、ＥＧＦＲを指向する化学療法に対する、患者における腫瘍の感受性を予測することに関し、この方法は、本明細書に開示されるＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法を使用して、腫瘍から得られたＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２の変異および／またはコドン１３の変異が存在するか否かを決定することを含む。コドン１２の変異および／またはコドン１３の変異の検出は、コドン１２およびコドン１３に変異を有さない同じ型の腫瘍と比較して、ＥＧＦＲを指向する化学療法に対して、低下した感受性を腫瘍が有することを予測する。本発明の予測方法のある実施形態において、腫瘍は、肺腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、および、喫煙の経歴、特に、重度の喫煙の経歴がある患者における肺腺癌などの肺腺癌である。本発明の予測方法のある実施形態において、腫瘍は、膵臓癌、または、好ましくは、結腸直腸癌である。ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２における変異および／またはコドン１３における変異が腫瘍中で検出されるならば、ＥＧＦＲを指向する化学療法を利用しない腫瘍治療を使用することは有益である。
【００４２】
本発明は、本明細書に開示されるＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出する方法を提供する。工程（１）において増幅される対象のＤＮＡは、ヒトの組織から入手されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。当該分野において公知である多くのプロセスが、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを入手するために使用できる。例えば、組織中の細胞は、例えば、界面活性剤を用いて溶解され、ＤＮＡは、高濃度の酢酸アンモニウムまたは酢酸カリウムを使用して、タンパク質および他の夾雑物を塩析し、続いて遠心分離することによって得られ、ＤＮＡは、アルコールを用いる沈殿を介して得られる。別のＤＮＡ単離方法において、細胞の溶解物中のＤＮＡは、アルコールを用いて沈殿され、次いで、塩化セシウム勾配中での遠心分離を介して精製される。細胞の溶解物中のＤＮＡはまた、固相陰イオン交換クロマトグラフィーを用いても精製できる。市販のキット、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＤＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＫｉｔまたはＱｉａｇｅｎからのＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔもまた、ゲノムＤＮＡを入手するために使用できる。ゲノムＤＮＡは、米国特許第６，２４８，５３５号および同第６，６１０，４８８号に開示される方法を用いるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離されたＤＮＡであり得、これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ゲノムＤＮＡを入手するための方法は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１０：１．９３：０．０３６）などの有機溶媒、およびグアニジニウム  イソチオシアネートなどの適切なカオトロピック剤と組織サンプルを混合すること；次いで、遠心分離によって、この混合物を、下部有機相（ＤＮＡを含有する）、中間相（ＤＮＡを含有する）、および上部水相（ＲＮＡを含有する）の３相に分離すること；中間相を取り出すこと；冷アルコールまたはイソプロパノールを用いて中間相におけるＤＮＡを沈殿させること、次いで遠心分離すること；得られたＤＮＡペレットを冷エタノールで洗浄すること、および再度遠心分離すること；ＤＮＡペレットを乾燥させること；ＴｒｉｓまたはＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）などの緩衝液にＤＮＡを再溶解することを含んでもよい。
【００４３】
ｃＤＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲおよびポリｄＴオリゴヌクレオチドなどの適切なプライマーを使用するなどして、組織から単離されたｍＲＮＡの逆転写から入手することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲは、適切な緩衝液中で、ｍＲＮＡを、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ランダムヘキサマー、およびモロニーマウス白血病ウイルスウイルス逆転写酵素と混合すること、ならびにこの混合物を熱サイクルに供することによって実施されてもよい。各熱サイクルは、２６℃で８分間、４２℃で４５分間、および９５℃で５分間を含んでもよい。ｍＲＮＡは、米国特許第６，２４８，５３５号および同第６，６１０，４８８号に開示される方法を用いてＦＦＰＥ組織から単離できる。ｍＲＮＡはまた、米国特許第６，４２８，９６３号に開示されるように、体液の水性サンプルではない組織からも単離でき、この特許の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡが単離できる組織は、結腸直腸癌、例えば、転移性結腸直腸癌、膵臓癌、または肺癌、例えば、肺腺癌および非小細胞肺癌などの腫瘍組織であってもよい。
【００４４】
パラフィン包埋組織サンプルからｍＲＮＡを単離する例示的な方法は：ａ）有機溶媒を用いて、例えば、サンプルをキシレンと激しく混合すること、続いて、チューブ中で組織をペレット化させるために十分な速度、通常は約１０，０００〜約２０，０００×ｇでの遠心分離を行うことにより、サンプルを脱パラフィン化すること；ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールなどの低級アルコールの水溶液を用いて、脱パラフィン化されたサンプルを再水和すること；ｃ）任意に、機械的な手段、超音波的な手段、または他の均質化の手段を使用して、サンプルを均質化すること；ｄ）サンプルを、グアニジニウム  チオシアネートなどのカオトロピック剤を含むカオトロピック溶液中で、約３０〜約６０分間の間、約５０〜約１００℃の範囲の温度に加熱すること；ならびにｅ）有機溶媒を用いる抽出、例えば、クロロホルム抽出、フェノール−クロロホルム抽出、エタノールもしくはイソプロパノールもしくは任意の他の低級アルコールを用いる沈殿を含む多数の方法のいずれかによって、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーによって、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動を含む電気泳動法によって、カオトロピック溶液からＲＮＡを回収することを含む。例えば、ＲＮＡは、以下のようにして回収されてもよい：１）サンプルは、２Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０および新鮮に調製したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１０：１．９３：０．０３６）を用いて、約１０秒間の間の激しく攪拌すること、次いで、約１５分間の間、氷上で冷却することによって抽出される；２）溶液は、最大速度で約７分間の間遠心分離され、上部（水）相は新しいチューブに移される；３）ＲＮＡはグリコーゲンおよびイソプロパノールで、−２０℃で３０分間沈殿される；４）ＲＮＡは、最大速度でベンチトップ遠心分離機において約７分間の遠心分離によってペレット化され；上清はデカントされ、そして廃棄され；ペレットは約７０〜７５％エタノールで洗浄される；ならびに５）サンプルは、再度、最大速度で７分間、遠心分離される。上清はデカントされ、ペレットは風乾される。次いで、ペレットは適切な緩衝液（例えば、５０μＬ  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩化物、ｐＨ  ８．０）に溶解される。
【００４５】
本発明の方法は、広い範囲の組織および腫瘍の型に適用可能であり、従って、胸部、頭頸部、肺、食道、結腸直腸、膵臓などを含む一連の癌についての予後診断の評価のために使用できる。好ましくは、本発明の方法は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および結腸直腸癌（ＣＲＣ）の予後診断に適用される。癌におけるＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２の変異および／またはコドン１３の変異は、ＥＧＦＲを指向する化学療法に対する癌の感受性の減少を示す。癌は、肺腺癌およびＮＳＣＬＣなどの肺癌、ならびに結腸直腸癌であり得る。
【００４６】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（１）において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。３’エキソヌクレアーゼ活性の欠如により、このＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端で、増幅されるべきＤＮＡとのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることが困難である。３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａｌｉｔｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９６，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１８５−１９５）；ＩｓｏＴｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｉｎから入手可能）；エキソヌクレアーゼ活性に必須であるアミノ酸残基の酸化を介して３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が除去されている（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｔｉｏｎ  １）または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のために必須である２８アミノ酸を遺伝的に欠失させることによる（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼ；および、好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられる。
【００４７】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（２）において、工程（１）（Ｉ）の産物が、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーまでに及ぶか、または対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーに相補的な領域から、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーに相補的な領域にまでに及ぶ、エキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、当該分野において公知である適切な手順を用いて決定できる。例えば、工程（１）（Ｉ）の産物がエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、工程（１）（Ｉ）の産物のＤＮＡ配列決定、および対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーまでに及ぶＫＲＡＳ遺伝子のエキソン４のヌクレオチド配列と、得られたヌクレオチド配列の比較により決定できる。
【００４８】
あるいは、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（２）において、工程（１）（Ｉ）の産物が、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーまでに及ぶか、または対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーに相補的な領域から、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーに相補的な領域にまでに及ぶ、エキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の一方のメンバーから、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対の他方のメンバーまでに及ぶＫＲＡＳ遺伝子のエキソン４配列の適切なセグメントについてのオリゴヌクレオチドプローブの使用によって決定できる。例えば、本発明の方法の工程（２）は、（ａ）ＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマーとＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマーに相補的な領域の間、または（ｂ）ＫｒａｓＥｘ４対照リバースプライマーとＫｒａｓＥｘ４対照フォワードプライマーに相補的な領域の間に位置しているエキソン４のＤＮＡ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、工程（１）（Ｉ）のＰＣＲ産物を混合することを含むことができ、エキソン４のＤＮＡ領域とのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、工程（１）（Ｉ）の産物がエキソン４のＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを示し、このことは、対象ＤＮＡがＫＲＡＳ遺伝子を含むことを示す。オリゴヌクレオチドプローブの例は、配列番号１３のヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドからなるＫｒａｓＥｘ４対照プローブである。
【００４９】
同様に、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（３）において、工程（１）（ＩＩ）の産物が、変異したコドン１２および／または変異したコドン１３を含有するエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、当該分野において公知である適切な手順を用いて決定でき、増幅産物は、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーまでに及ぶか、または変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーに相補的な領域から、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーに相補的な領域までに及ぶ。例えば、工程（１）（ＩＩ）の産物が、エキソン２において変異したコドン１２および／または変異したコドン１３を含有するＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、工程（１）（ＩＩ）の産物のＤＮＡ配列決定、および変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーまでに及ぶＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のヌクレオチド配列と、得られたヌクレオチド配列の比較により決定できる。
【００５０】
あるいは、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（３）において、工程（１）（ＩＩ）の産物が、変異したコドン１２および／または変異したコドン１３を含有するエキソン２のＤＮＡ領域の増幅産物を含むか否かは、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーまでに及ぶＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２配列の適切なセグメントについてのオリゴヌクレオチドプローブの使用によって決定でき、増幅産物は、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーから、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーまでに及び、または変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の一方のメンバーに相補的な領域から、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対の他方のメンバーに相補的な領域までに及ぶ。
【００５１】
例えば、工程（１）（ＩＩ）（Ａ）に列挙されるように、ＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（１）（ＩＩ）において、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対が使用されるとき、本発明の方法の工程（３）は、工程（１）（ＩＩ）のＰＣＲ産物、および（ａ）工程（１）（ＩＩ）（Ａ）（ｉ）に列挙されるリバースプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ａ）（ｉｉ）に列挙されるフォワードプライマーに相補的な領域の間、または（ｂ）工程（１）（（ＩＩ）（Ａ）（ｉｉ）に列挙されるフォワードプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ａ）（ｉ）に列挙されるリバースプライマーに相補的な領域の間に位置しているエキソン２のＤＮＡ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを混合することを含むことができ、エキソン２のＤＮＡ領域とのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、工程（１）（ＩＩ）の産物がエキソン２のコドン１３を含有するＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを示し、このことは、対象ＤＮＡがＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１３に変異を含むことを示す。オリゴヌクレオチドプローブの例は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドからなるＣ１３プローブ、および（ｂ）配列番号６によって示されるヌクレオチド配列からなるＫｒａｓＣ１３＿Ｍｃ、またはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
例えば、工程（１）（ＩＩ）（Ｂ）に列挙されるように、ＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（１）（ＩＩ）において、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対が使用されるとき、本発明の方法の工程（３）は、工程（１）（ＩＩ）のＰＣＲ産物、および（ａ）工程（１）（ＩＩ）（Ｂ）（ｉ）に列挙されるフォワードプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ｂ）（ｉｉ）に列挙されるリバースプライマーに相補的な領域の間、または（ｂ）工程（１）（（ＩＩ）（Ｂ）（ｉｉ）に列挙されるリバースプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ｂ）（ｉ）に列挙されるフォワードプライマーに相補的な領域の間に位置しているエキソン２のＤＮＡ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを混合することを含むことができ、エキソン２のＤＮＡ領域とのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、工程（１）（ＩＩ）の産物がエキソン２のコドン１３を含有するＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを示し、このことは、対象ＤＮＡがＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１３に変異を含むことを示す。オリゴヌクレオチドプローブの例は、配列番号２０のヌクレオチド配列からなるＣ１２共通プローブ、またはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
例えば、工程（１）（ＩＩ）（Ｃ）に列挙されるように、ＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法の工程（１）（ＩＩ）において、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対が使用されるとき、本発明の方法の工程（３）は、工程（１）（ＩＩ）のＰＣＲ産物、および（ａ）工程（１）（ＩＩ）（Ｃ）（ｉ）に列挙される少なくとも１つのフォワードプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ｃ）（ｉｉ）に列挙される少なくとも１つのリバースプライマーに相補的な領域の間、または（ｂ）工程（１）（（ＩＩ）（Ｃ）（ｉｉ）に列挙される少なくとも１つのリバースプライマーと、工程（１）（ＩＩ）（Ｃ）（ｉ）に列挙される少なくとも１つのフォワードプライマーに相補的な領域の間に位置しているエキソン２のＤＮＡ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを混合することを含むことができ、エキソン２のＤＮＡ領域とのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、工程（１）（ＩＩ）の産物がエキソン２のコドン１２を含有するＤＮＡ領域の増幅産物を含むことを示し、このことは、対象ＤＮＡがＫＲＡＳ遺伝子のエキソン２のコドン１２に変異を含むことを示す。オリゴヌクレオチドプローブの例は、配列番号２０のヌクレオチド配列からなるＣ１２共通プローブ、またはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
ＤＮＡのＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）（ＩＩ）は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしての１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしてのＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対、または
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしての１３ＡＳＰフォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしてのＣ１２共通リバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対
を含む、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用する。
【００５５】
ＤＮＡのＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）（ＩＩ）は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしての１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしてのＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対；ならびに
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしての１３ＡＳＰフォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしてのＣ１２共通リバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対
を含む、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用する。
【００５６】
ＤＮＡのＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）（ＩＩ）は、
（Ｃ）コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対であって、
（ｉ）フォワードプライマーとしての以下のプライマー：（ａ）配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；または（ｈ）配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対
を含む、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用する。
【００５７】
ＤＮＡのＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）（ＩＩ）は、
（Ｃ）コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーであって、
（ｉ）フォワードプライマーとしての以下のプライマー：（ａ）配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および（ｈ）配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を使用する。
【００５８】
ＤＮＡのＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）（ＩＩ）において使用される変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、
（Ａ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対であって、
（ｉ）配列番号１によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしての１３ＡＳＰリバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしてのＣ１３フォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第１の対、
（Ｂ）コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対であって、
（ｉ）配列番号７によって表されるヌクレオチド配列からなる、フォワードプライマーとしての１３ＡＳＰフォワードプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなる、リバースプライマーとしてのＣ１２共通リバースプライマーもしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１３変異型オリゴヌクレオチドプライマーの第２の対；ならびに
（Ｃ）コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマーであって、
（ｉ）フォワードプライマーとしての以下のプライマー：（ａ）配列番号８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＶＡＬフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＳＥＲフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｃ）配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＲＧフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｄ）配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＣＹＳフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｅ）配列番号１７によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＳＰフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｆ）配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（１２ＡＬＡフォワードプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；（ｇ）配列番号９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（ＫｒａｓＭ３５Ｔ＿１ＧＡ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；および（ｈ）配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｋｒａｓ３５Ｔ＿３ＣＧ−Ｆ）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）配列番号１９によって表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドリバースプライマー（Ｃ１２共通リバースプライマー）もしくはこれと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド
を有する、コドン１２変異型オリゴヌクレオチドプライマー
を含む。
【００５９】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、工程（１）において、ＤＮＡ、対照オリゴヌクレオチドプライマーの対、および変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴａｑＭａｎ  １０００  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ／Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ  Ｐａｃｋ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手できる１００ｍＭ  総ｄＮＴＰの混合物である反応ミックスＡとともに混合される。
【００６０】
対象ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、この方法はまた、対象ＤＮＡに加えて、鋳型を含まない対照（ＮＴＣ）とも呼ばれるＤＮＡ陰性対照にも適用される。この方法は、対照ＤＮＡに適用され、この方法の別個の実行はまた、並行様式でＮＴＣに実質的に同時に適用され、ＮＴＣにおいて、対照ＤＮＡの代わりに、ＤＮＡを含有しない液体サンプルが工程（１）において使用される。換言すれば、ＤＮＡを含有しない液体サンプルは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび工程（１）に列挙されているプライマーを使用するＰＣＲに供される。この方法は、対象ＤＮＡの代わりに、ＤＮＡを含有しない液体サンプルが使用されるときに、工程（２）および（３）において増幅産物を生じないはずである。ＤＮＡを含有しない液体サンプルは、液体媒体中にＤＮＡが存在しない以外は、対象ＤＮＡを保持するために使用される、同じ液体媒体、例えば、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．０などの適切な緩衝液であるべきである。例えば、対象ＤＮＡはＦＦＰＥ組織から得られる場合、ＤＮＡ陰性対照またはＮＴＣ実行のためのＤＮＡを含有しない液体サンプルは、グアニジニウム  イソチオシアネートを含有するがＤＮＡを含有しない、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ  ８．０であり得る。
【００６１】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、リアルタイムＰＣＲが使用されてもよく、リアルタイムＰＣＲは、以下のサイクリングパラメーターを用いて実施できる：
第１段階：５０℃で１５秒間、１サイクル；
第２段階：９５℃で１０分間、１サイクル；ならびに
第３段階：９５℃で１５秒間および６０℃で１分間、４２サイクル。
【００６２】
リアルタイムＰＣＲを使用して、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、ＤＮＡは、対照アッセイおよび変異アッセイにおいて（本発明のＫＲＡＳ変異を検出する方法の、工程（１）（Ｉ）および工程（１）（ＩＩ）のそれぞれにおいて）、ＰＣＲを用いて増幅され、増幅産物は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して同定でき、次いで、この方法はさらに、変異Ｃｔ、対照Ｃｔ、およびデルタＣｔの値を決定すること、ならびに、デルタＣｔ値を、表２に開示された所定のデルタＣｔ値と比較することによってＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異の存在を決定することを含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「変異Ｃｔ」とは、変異アッセイのためのＣｔをいい、ＤＮＡは、本発明のＫＲＡＳ変異を検出するための方法の工程（１）（ＩＩ）に記載されるように、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を用いて増幅され、変異型オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対は、エキソン２のコドン１２または１３の変異に特異的である。「変異Ｃｔ」は、変異アッセイからのレポーター蛍光が閾値よりも大きいＰＣＲサイクル数である。本明細書で使用される場合、「対照Ｃｔ」という用語は、対照アッセイのためのＣｔをいい、ＤＮＡは、本発明のＫＲＡＳ変異を検出するための方法の工程（１）（Ｉ）に記載されるように、対照オリゴヌクレオチドプライマーの１つの対を用いて増幅される。対照Ｃｔは、対照アッセイからのレポーター蛍光が閾値よりも大きいＰＣＲサイクル数である。この閾値は、工程（１）（Ｉ）におけるＫｒａｓＥｘ４フォワード対照プライマーおよびＫｒａｓＥｘ４リバース対照プライマーの使用に伴って、ｇＤＮＡの対照アッセイのための２７．０〜２９．０の間のＣｔ値を提供するための点に設定でき、Ｐｒｏｍｅｇａから商業的に入手可能なｇＤＮＡ（＃Ｇ３０４１）が、工程（１）において、対象または試験ＤＮＡの代わりに使用される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「デルタＣｔ（ΔＣｔ）」とは、変異Ｃｔと対照Ｃｔの間の差をいい、すなわち、
ΔＣｔ＝［変異Ｃｔ］−［対照Ｃｔ］
である。
【００６５】
ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のある実施形態において、この方法は、対照ＤＮＡの試験サンプルに適用され、別個に、この方法はまた、並行様式でＤＮＡ陰性対照（ＮＴＣ）サンプルにも適用できる。ＮＴＣサンプルおよび対象ＤＮＡの試験サンプルの各々は２連で実行でき、ＮＴＣサンプルおよび試験サンプルの各々の２連の実行のための変異Ｃｔの平均値および対照Ｃｔの平均値が計算され、そしてＮＴＣサンプルおよび試験サンプルの各々についてのデルタＣｔもまた、平均変異Ｃｔおよび平均対照Ｃｔから計算される。リアルタイムＰＣＲが対象ＤＮＡの試験サンプルに対して使用されるとき、ＮＴＣに対して並行実行するとともに、この方法は、ＮＴＣのために表１に列挙された受容判断基準以上である平均Ｃｔ値を与えるべきである。
【００６６】
表１
ＮＴＣサンプルのための平均Ｃｔの受容判断基準
使用したプライマー                          ＮＴＣ
ＫｒａｓＥｘ４                                ３７
１２ＳＥＲフォワード（ＡＧＴ）                ４０
１２ＡＲＧフォワード（ＣＧＴ）                ４０
１２ＣＹＳフォワード（ＴＧＴ）                ４０
１２ＡＳＰフォワード（ＧＡＴ）                ４０
１２ＡＬＡフォワード（ＧＣＴ）                ４０
１２ＶＡＬフォワード（ＧＴＴ）                ４０
１３ＡＳＰリバース（ＧＡＣ_Ｒ）               ４０
【００６７】
ＮＴＣについての平均Ｃｔ値が表１に列挙されるＣｔ受容判断基準以上である場合、ＤＮＡにおけるＫＲＡＳ変異を検出するための本発明の方法のこれらの実施形態において、対象ＤＮＡの試験サンプルについての平均Ｃｔ値が、使用される特異的プライマーについて表２に列挙される最大Ｃｔ値以下である場合には、対象ＤＮＡの試験サンプルに対する方法の結果が受容可能であると見なされる。
【００６８】
表２
試験サンプルについてのＣｔ受容判断基準
使用したプライマー                    最大Ｃｔ                      最大ΔＣｔ
ＫｒａｓＥｘ４                        ３０                          Ｎ／Ａ
１２ＳＥＲフォワード                  ３７．４                      ６．５
１２ＡＲＧフォワード                  ３５．９                      ６．６
１２ＣＹＳフォワード                  ３６．８                      ６．７
１２ＡＳＰフォワード                  ３６．０                      ６．８
１２ＡＬＡフォワード                  ３７．７                      ６．６
１２ＶＡＬフォワード                  ３８．４                      ６．７
１３ＡＳＰリバース                    ３６．７                      ６．７
【００６９】
これらの実施形態において、デルタＣｔ値が、使用された特異的変異型プライマーについて表２に列挙された最大デルタＣｔ値よりも低いとき、ＫＲＡＳ変異は、使用された特異的変異型プライマーに対応するコドンにおいて、対象ＤＮＡの試験サンプルに存在するものと決定される。
【配列表】
2013523178000001.app
【国際調査報告】
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