(57)【要約】      （修正有）【課題】中空糸型分離膜を用いた細胞濃縮液の製造における問題点を解決することを課題とする。具体的には、細胞懸濁液を濃縮するに際して、細胞に与えるダメージが少なく、かつ細胞を効率的に回収することができる細胞濃縮液の製造方法を提供する。【解決手段】中空糸型分離膜が充填された細胞懸濁液処理器に対し（ａ）細胞懸濁液を導入口８ａより線速度３７０〜６３０ｃｍ／分で通液し、濾過液を排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、（ｂ）細胞濃縮液を細胞懸濁液導入口８ａより線速度４０〜１５０ｃｍ／分で通液し、細胞懸濁液導出口８ｂより導出された細胞濃縮液を回収容器１０に回収する工程、とを含む細胞濃縮液の製造法。【選択図】図１
2015012837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液導入口、細胞懸濁液導出口、及び濾液用出口を有する容器内に、中空糸型分離膜が充填された細胞懸濁液処理器を用いた細胞濃縮液の製造方法であって、
（ａ）細胞懸濁液を細胞懸濁液導入口より線速度３７０〜６３０ｃｍ／分で通液し、濾過液を濾液用出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、
（ｂ）細胞濃縮液を細胞懸濁液導入口より線速度４０〜１５０ｃｍ／分で通液し、細胞懸濁液導出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、
とを含む細胞濃縮液の製造方法。
【請求項２】
細胞懸濁液処理器に充填された中空糸型分離膜の総断面積が０．５〜１．５ｃｍ２であることを特徴とする請求項１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項３】
細胞懸濁液処理器に充填された中空糸型分離膜の内径が３００〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項４】
（ｂ）の工程前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する工程を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項５】
回収容器が液体を流出入できるポートが１つ以上具備することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項６】
（ｂ）の工程後に、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出す工程を含む請求項５に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項７】
（ｂ）の工程後に、ポートを通じて薬剤を添加する工程を含む請求項５または６に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項８】
（ｂ）の工程後に、回収容器を密封し分断する工程を含む請求項１〜７のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項９】
細胞懸濁液が免疫細胞を含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項１０】
細胞回収率が８６％、且つ細胞生存率比が９５％以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸型分離膜を充填した細胞懸濁液処理器を用いて細胞懸濁液を濃縮し、回収する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、患者に投与する方法が用いられている。これら治療に用いる細胞は、治療に適した溶液に懸濁され、または適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から細胞を採取した場合、治療に十分な細胞濃度でないことがあり、また、体外で生体から採取した細胞をさらに培養した場合、組織由来の夾雑物や培地などを含んでいることが多い。したがって、生体から採取又は培養した細胞を治療に用いるためには、夾雑物や培地を取り除き、治療に適した溶液などに懸濁された状態とし（洗浄）、治療に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。
【０００３】
前記目的を解決するため、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が知られている。たとえば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、このように遠心分離を用いる方法は、装置が大型になること、細胞に負荷がかかること、及びコストが増大することにより利用できる施設が限定されてしまうことが懸念される。さらに細胞の洗浄のため、遠心により沈殿させた細胞の上清を取り除く際に、細胞が大気に開放される可能性があり、汚染等の問題が挙げられる。
【０００４】
これに対して、コンパクトで簡便な装置である中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液の分離、濾過方法が提案されている（特許文献２）。
上述のような中空糸型分離膜を用いて細胞医療用途の細胞懸濁液を濃縮する際には、細胞へのダメージを軽減するために短時間で濃縮処理を行う必要があり、中空糸型分離膜の孔径を大きくした方が良いと考えられる。しかし、中空糸型分離膜の孔径を大きくすると、細胞の目詰まりや中空糸型分離膜への付着性が増し、濃縮液を調製する過程で細胞数が低下することが懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４３９６号公報
【特許文献２】特許第２９２８９１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記中空糸型分離膜を用いた細胞濃縮液の製造における問題点を解決することを課題とする。具体的には、細胞懸濁液を濃縮するに際して、細胞に与えるダメージが少なく、かつ細胞を効率的に回収することができる細胞濃縮液の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、細胞濃縮工程と、細胞回収工程の線速度をそれぞれ特定範囲に設計することで、細胞に与えるダメージが少なく、かつ細胞回収率の高い細胞濃縮液を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）細胞懸濁液導入口、細胞懸濁液導出口、及び濾液用出口を有する容器内に、中空糸型分離膜が充填された細胞懸濁液処理器を用いた細胞濃縮液の製造方法であって、
（ａ）細胞懸濁液を細胞懸濁液導入口より線速度３７０〜６３０ｃｍ／分で通液し、濾過液を濾液用出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、
（ｂ）細胞濃縮液を細胞懸濁液導入口より線速度４０〜１５０ｃｍ／分で通液し、細胞懸濁液導出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程、
とを含む細胞濃縮液の製造方法。
（２）細胞懸濁液処理器に充填された中空糸型分離膜の総断面積が０．５〜１．５ｃｍ２であることを特徴とする（１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（３）細胞懸濁液処理器に充填された中空糸型分離膜の内径が３００〜１０００μｍであることを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（４）（ｂ）の工程前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する工程を含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（５）回収容器が液体を流出入できるポートが１つ以上具備することを特徴とする
（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（６）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて細胞濃縮液を取り出す工程を含む（５）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（７）（ｂ）の工程後に、ポートを通じて薬剤を添加する工程を含む（５）または（６）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（８）（ｂ）の工程後に、回収容器を密封し分断する工程を含む（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（９）細胞懸濁液が免疫細胞を含有することを特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１０）細胞回収率が８６％、且つ細胞生存率比が９５％以上であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法によれば、細胞濃縮液中に含まれる細胞の生存率に優れ、且つ細胞の回収率を向上させることができる。さらに、本発明に係る製造方法により濃縮された細胞は治療用途として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例に用いた細胞懸濁液処理器を具備する細胞濃縮システム
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明について説明する。
【００１２】
本発明に用いる細胞懸濁液は、細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。または、前記に例示した細胞を生体外で培養した後の細胞懸濁液を使用することができる。細胞を生体外で培養するときの培養液の例としては、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が挙げられる。サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子を添加した培養液も使用できる。
【００１３】
また、ここでいう細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞または、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞が例示される。そのなかでもとくに免疫細胞に対して好適に用いることができる。ここでいう免疫細胞としては、顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等が挙げられる。
【００１４】
また、本発明に用いる細胞濃縮液は、細胞懸濁液処理器を通過することにより濃縮された細胞懸濁液のことを表す。
【００１５】
本発明の細胞懸濁液処理器は、図１に示すとおり例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３には濾液用出口４が備えられている。この濾液用出口は一方に備えられていても、両端に備えられていても、中央部に１箇所備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液導入口８ａ、細胞懸濁液導出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、更に頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７および開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液導出入口８ａ、８ｂと濾液用出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
【００１６】
本発明の細胞懸濁液処理器は滅菌して用いてもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
【００１７】
なお、図１に示した例では、各部分を筒状容器の胴部２、頭部３、ヘッダー部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、ヘッダー部９が筒状容器の頭部３に一体化したものや、筒状容器の胴部２と頭部３が別々のパーツから形成されている場合でも、細胞懸濁液導入口と細胞懸濁液導出口が中空糸型分離膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に細胞懸濁液導出入口と濾液用出口が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。
【００１８】
細胞懸濁液処理器の筒状容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。
【００１９】
中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。
本発明の細胞懸濁液処理器には、中空糸型分離膜を数十から数千本程度束ねたものを筒状の容器内に充填していることが好ましい。尚、本発明において、中空糸型分離膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液導入口と細胞懸濁液導出口の間に中空糸型分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
【００２０】
本発明に用いられる中空糸型分離膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系、ポリオレフィン系又はセルロース系の高分子材料が好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。
【００２１】
また、中空糸型分離膜の孔径は、０．０５μｍ以上のものが好ましく、より好ましくは０．１μｍ以上、さらに好ましくは０．２μｍ以上のものが好適に用いられる。０．０５μｍ未満であると、大きな濾過流量を得ることができない、又は不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できないため好ましくない。一方、１μｍを超えると、細胞の大きさに近い孔径が中空糸型分離膜上に存在するため、孔へのつまりがひどくなり、細胞回収率が大きく低下してしまうため好ましくない。ここで、中空糸型分離膜の孔径は、中空糸型分離膜メーカーより提示されている値であり、一般的なバブルポイント試験により測定された膜全体より気泡が出る圧力値から算出される。
【００２２】
本発明は、細胞懸濁液を細胞懸濁液導入口より線速度３７０〜６３０ｃｍ／分で通液し、濾過液を濾液用出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する細胞濃縮工程の後、細胞濃縮液を細胞懸濁液導入口より線速度４０〜１５０ｃｍ／分で通液し、細胞懸濁液導出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する細胞回収工程を含む細胞濃縮液の製造方法であり、細胞濃縮時に加え、細胞回収時の線速度をある特定の範囲に保つこと、とくに細胞濃縮工程時よりも細胞回収工程時の線速を下げることで、細胞回収率および生存比率が高い細胞濃縮液を製造できる。
【００２３】
ここでいう線速度（ｃｍ／分）とは、単位時間当たりに中空糸分離膜内側に流入する液量、すなわち流速（ｃｍ３／分＝ｍＬ／分）を中空糸型分離膜の総断面積（ｃｍ２）で除した値である。本発明の前記細胞濃縮工程において、中空糸型分離膜内側を流れる線速度は、３７０ｃｍ／分以上６３０ｃｍ／分以下であることが好ましく、３８０ｃｍ／分以上６１０ｃｍ／分以下であることがより好ましく、３９０ｃｍ／分以上５９０ｃｍ／分以下であることがさらに好ましい。線速度が３７０ｃｍ／分未満であると、細胞が中空糸膜表面に付着しやすくなってしまい回収率が低下する懸念があるうえに、濃縮処理に時間がかかりすぎて細胞へのダメージが大きくなることが懸念される。６３０ｃｍ／分を超えると、細胞懸濁液処理器にかかる圧力が大きくなりすぎて、処理器が破壊されたりすることが懸念される。
【００２４】
また、本発明の前記細胞回収工程において、中空糸型分離膜内側を流れる線速度は、４０ｃｍ／分以上１５０ｃｍ／分以下であることが好ましく、４５ｃｍ／分以上１２５ｃｍ／分以下であることがより好ましく、５０ｃｍ／分以上１００ｃｍ／分以下であることがさらに好ましい。線速度が４０ｃｍ／分未満であると、回収処理に時間がかかりすぎて細胞へのダメージが大きくなることが懸念される。また、１５０ｃｍ／分を超えると、細胞回収時に細胞に強い剪断応力が加わるため、細胞がダメージを受ける傾向が見られる。
細胞濃縮工程とは具体的に、細胞懸濁液処理器内に備えられた中空糸型分離膜に流入した細胞懸濁液が内圧濾過により、濾過液が中空糸型分離膜の外側に濾別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液を細胞懸濁液導出口より流出させる工程のことである。また、細胞懸濁液導出口より流出した細胞成分が濃縮された細胞懸濁液は、再び細胞懸濁液導入口より細胞懸濁液処理器内に流入し、さらに細胞成分が濃縮される。これが繰り返されることにより、細胞懸濁液の濃縮が進むことになる。
【００２５】
なお、ここでいう濾過液とは、濾過液中の細胞数が、細胞懸濁液処理器流入前の細胞懸濁液中の細胞数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。
【００２６】
細胞回収工程とは、細胞懸濁液処理器周辺の流路を切り替えて、細胞懸濁液処理器内の細胞濃縮液を回収容器に回収する工程のことである。
【００２７】
細胞濃縮工程において中空糸型分離膜内側を流れる線速度（ｃｍ／分）を、細胞回収工程において中空糸型分離膜内側を流れる線速度（ｃｍ／分）で除した値、すなわち線速度比は、３．９以上１５以下であることが好ましく、４．９以上１４以下であることがより好ましく、５．９以上１３以下であることがさらに好ましい。前記線速度比が３．９未満であると、細胞回収時に細胞に強い剪断応力が加わる、または処理に時間がかかるため、細胞がダメージを受ける傾向が見られる。また、線速度比が１３を超えると、回収処理に時間がかかりすぎて細胞へのダメージが大きくなること、または細胞懸濁液処理器にかかる圧力が大きくなりすぎて、処理器が破損することが懸念される。
【００２８】
以下、本発明の製造方法を図１を用いて例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更することができる。
【００２９】
まず、細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液導入口８ａおよび細胞懸濁液導出口８ｂにチューブ等を取り付ける。細胞懸濁液導出口８ｂに取り付けたチューブの端には流路の切り替えが可能な二股の分岐を設け、分岐先の一方は回収容器１０に連結し、もう一方は細胞バッグなどの細胞懸濁液が入った容器１３に連結する。このとき流路は、回収容器側の二方活栓１５ａを閉じ、細胞懸濁液が入った容器側の二方活栓１５ｂおよび廃液容器側の二方活栓１５ｃを開けておく。細胞懸濁液導入口８ａに取り付けたチューブの端は細胞懸濁液が入った容器１３に連結し、細胞懸濁液が入った容器と細胞懸濁液処理器との間で細胞懸濁液が循環できるようにする。さらに取り付けたチューブ内を、液が循環できるように、ポンプなどの機械１４をこのチューブに介在させることが考えられる。また、濾液用出口４には廃液タンク１６に連絡されたチューブを連結しておくことが好ましい。細胞懸濁液処理器およびチューブ等の全体の取り付けは、クリーンベンチ等の無菌的な環境下で行われることが好ましい。また、この際に、細胞懸濁液導出口側８ｂの流路を狭くするなどして、分離膜に圧力をかけることもできるし、濾過側のチューブにポンプ等を設置して圧力をかけながら濾過を行ってもよく、一般的に中空糸型分離膜で用いられる各種濾過方法を併用することができる。
【００３０】
続く細胞回収工程は、回収容器側の二方活栓１５ａを開け、細胞懸濁液が入った容器側の二方活栓１５ｂおよび廃液容器側の二方活栓１５ｃを閉じることで流路を回収容器側に切り替えた後、細胞懸濁液処理器や容器１３に存在する細胞懸濁液を回収容器に回収する。回収容器に収集した細胞懸濁液は、その後の治療などに用いることができるよう、無菌的に細胞懸濁液を回収することが好ましい。  
【００３１】
本発明における中空糸型分離膜の総断面積とは、細胞懸濁液処理器内に備えた中空糸型分離膜の内腔の断面積の合計面積であり、（総断面積）＝（糸本数）×π×（中空糸内径）×（中空糸内径）／４で求めることができる。本発明の中空糸型分離膜の総断面積は０．５ｃｍ２以上１．５ｃｍ２以下であることが好ましく、０．６０ｃｍ２以上１．０ｃｍ２以下であることがより好ましく、０．６４ｃｍ２以上１．７７ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。０．５ｃｍ２未満の場合、細胞懸濁液を処理するのに十分な量の内側膜面積を確保できないため、処理に時間がかかってしまうなどの懸念がある。また、１．５ｃｍ２を超えると、細胞懸濁液処理器内に流入した細胞懸濁液が分散して中空糸内に流入しない懸念があり、濾過効率が低下する可能性があるため好ましくない。
【００３２】
本発明に用いる中空糸型分離膜の内径は、３００μｍ以上、１０００μｍ以下であるものが好適に用いられ、３５０μｍ以上、９００μｍ以下であるものがより好ましく、４００μｍ以上、８００μｍ以下であることが更に好ましい。３００μｍ未満であると、細胞に対して強い剪断応力が加わり、細胞が損傷する恐れがあるため好ましくない。一方、１０００μｍを超える場合は、細胞懸濁液が接触可能な表面積が小さくなるため、効率的に濾過を行うことが困難になる。
【００３３】
また、細胞回収工程の前に、希釈液を用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄することができる。具体的には細胞懸濁液を、生理食塩液や輸液などに置換することであり、濃縮工程後の細胞懸濁液を希釈液で希釈し、希釈した細胞懸濁液を再度濃縮することにより、細胞濃縮液中の蛋白質等の不要な夾雑物を好適に取り除くことができる。前記工程を繰り返すことで、不要な夾雑物の除去率を大きく向上させることができ、細胞治療用途の細胞を提供することが可能になる。洗浄の際に用いられる希釈液としては、生理食塩液、輸液、培地、蒸留水、無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、血漿等が挙げられ、特に安全性の観点から生理食塩液や輸液を好適に用いることができる。なお、希釈液の追加は無菌的に行うことが好ましい。
【００３４】
また、ここでいう細胞治療用途としては、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クーロン病等の疾患、豊胸、しわとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、樹状細胞移入療法などの免疫療法、遺伝子導入した細胞を用いる遺伝子療法などに用いることも可能であるが、これらに限定されるものではない。また、分離された細胞をスキャフォールドなどの構造材料に播種して治療に用いることも可能である。
【００３５】
また、本発明における回収容器は図１に示すとおり例示されるが、細胞濃縮液を閉鎖的に回収できるような気密性のある容器であればこれに限定されるものではなく、血液バッグ、細胞培養容器、凍結保存用バッグ、プラスチック容器等が挙げられる。また、図１の回収容器１０には混注ポート１１と瓶針接続ポート１２が設けられており、混注ポート１１にシリンジを接続して薬剤を添加したり、細胞濃縮液を全てまたはサンプリングの目的で一部回収したりすることができる。ここでいう薬剤はとくに限定されないが、例えば抗凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子、凍結保護剤などを好適に用いることが考えられる。また、回収容器上流のチューブをヒートシールすることにより回収容器を密封し、細胞懸濁液処理器から分断した後、瓶針接続ポート１２に輸液セットの瓶針を差し込めば、患者に直接細胞濃縮液を投与することもできる。
【００３６】
本発明により回収した細胞濃縮液をさらに培養してもよく、洗浄により懸濁されている液を置換しさらに培養することで、細胞数の増加、細胞の分化、形質転換、遺伝子導入などを行うことができる。細胞の増殖に用いられる培地としては、ＤＭＥＭ，α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０が挙げられ、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養してもよい。また、この場合の回収容器は、細胞培養バッグであることが好ましい。
【００３７】
本発明により回収した細胞を製薬的に許容される添加剤と混合して医薬組成物を製造してもよい。製薬的に許容される添加剤としては、例えば、抗凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
【００３８】
本発明により製造、洗浄した細胞濃縮液をさらに凍結保存してもよく、細胞へのダメージを少なくできる点から、凍結保護剤を細胞濃縮液に添加し、液体窒素を用いて凍結保存する方がよい。また、凍結保存した細胞を融解し、ヒトや動物への移植、研究に使用、または再度培養することができる。本発明により製造、洗浄した細胞は濃縮操作によるダメージが少ないことから、凍結保存や融解後の使用などにも好適に用いることができる。        
【００３９】
また、この場合の回収容器は、凍結保存用バッグであることが好ましい。
回収容器の素材としては、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好適に使用できる。回収容器の容量は、４０ｍＬ以上が好ましく、４５ｍＬ以上がより好ましく、５０ｍＬ以上がさらに好ましい。容量が４０ｍＬ未満の場合は、細胞濃縮液を全て回収できない恐れがある。容量の上限値は、回収後の用途によって異なり、細胞濃縮液にさらに培地を追加して培養する場合は、大量の培地を追加できるよう１５００ｍＬ以下であることが好ましく、凍結保存、製剤、投与目的の場合は、回収容器内の細胞濃縮液をロスなく取り出せるよう、２００ｍＬ以下であることが好ましい。
【００４０】
また、本発明においては、細胞濃縮時よりも細胞回収時の線速を下げることで、細胞濃縮液中の細胞生存率を細胞懸濁液中の細胞生存率で除した値、すなわち細胞生存比率が９５％以上を維持できることを特徴とするが、ここでいう細胞生存率比とは、回収容器に回収した細胞懸濁液中の細胞生存率を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞生存率で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど細胞に与えるダメージが少ないことを示す。細胞生存率は{細胞生存率（％）＝１００−死細胞率（％）}により算出される。死細胞率（％）は、細胞濃度が１ｍLあたり１０の６乗個になるよう調製した各細胞懸濁液１００μLに対し、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅ（ＢＤ）を１０μＬ加え１０分間室温暗所で静置させた後、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）に取り込み、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅの陽性率（％）を測定することができる。
【００４１】
本発明において細胞生存率比は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましい。９５％未満の場合は、細胞濃縮工程または細胞回収工程において細胞が大きくダメージを受けており、例えば細胞治療用途として患者に投与したときに、細胞が正常に機能せず、治療効果を発揮しない可能性がある。
【００４２】
また、本発明においては、細胞濃縮時よりも細胞回収時の線速を下げることで、細胞濃縮液中に含まれる細胞数を細胞懸濁液中に含まれる細胞数で除した値、すなわち細胞回収率が８５％以上を維持できることを特徴とするが、ここでいう細胞回収率（％）とは、回収容器に回収した細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど回収効率が優れていることを示す。細胞数は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球分画の細胞濃度（個／ｍＬ）を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量（ｍＬ）と細胞濃度（個／ｍＬ）の値の積で算出することができる。
【００４３】
細胞回収率（％）は８６％以上であることが好ましく、８７％以上がより好ましく、８９％以上がさらに好ましい。８５％未満になると、細胞治療用途として患者に投与する際に必要な細胞数を確保できない可能性がある。
【実施例】
【００４４】
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。なお、実施例に記載の処理時間とは、細胞懸濁液を細胞懸濁液導入口に通液した時点から、細胞濃縮液を回収容器に回収し終わった時点までの時間（秒）のことである。
【００４５】
各実験例における細胞濃縮の方法は、各実施例に記載した細胞懸濁液処理器の入口と出口に塩ビチューブをつなげた。出口側のチューブには流路の切り替えが可能な二股の分岐を設け、一方は回収容器と接続し、もう一方は細胞懸濁液を貯留させるプラスチック容器に垂らした。細胞懸濁液処理器の入口側チューブもプラスチック容器に垂らして、プラスチック容器中の細胞懸濁液がモジュールおよびチューブを循環できるようにした。塩ビチューブにはポンプを設置し、細胞懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。二方活栓を塩ビチューブに設置し、細胞懸濁液処理器出口側の流路を切り替えられるようにした。細胞懸濁液処理器の濾液用出口にはチューブを取り付け、こちらは廃液容器に注ぐように設置した。ポンプにより流速を調整しながら、細胞懸濁液を細胞懸濁液処理器に通液し、細胞懸濁液を循環させながら濾過を行った。このとき、細胞懸濁液導入口側の流量および濾液用出口より排出される濾過流量を記録した。一定量（６０ｍＬ〜８０ｍＬ）まで濃縮した後、生理食塩液２５０ｍＬをプラスチック容器に追加し、細胞濃縮液を希釈した。続いて、これまでと同様に、ポンプで流速を調整しながら細胞懸濁液を細胞懸濁液処理器に通液し、循環させながら一定量（６０ｍＬ〜８０ｍＬ）に濃縮されるまで濾過を行った。このように、生理食塩液２５０ｍＬを用いて希釈と濃縮を繰り返し、細胞懸濁液を洗浄する操作を４回実施した。最後に回収容器側に流路を切り替えて、プラスチック容器、チューブ、中空糸型分離膜内の細胞濃縮液をポンプにより一定の流速で押し出して回収容器に回収した。続いて回収容器中の細胞濃縮液の細胞数を測定し、細胞回収率および生存率比を算出した。また、実施例に使用する細胞懸濁液は、培養したJurkat細胞を含有する細胞懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）１０００ｍＬとした。以下に実施例を示す。
【００４６】
（実施例１）    
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔品名：ＭＦ０２０  ＴＹＰＥ−１  中空糸内径５７０μｍ  孔径０．２μｍ  東洋紡社製〕を３００本用いて、細胞懸濁液処理器を作製した。作成した処理器の濾過面積は０．１２ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積０．７７ｃｍ２であった。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ/分とした。回収時の流量は、３１ｍＬ／分（線速度４０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は９４％、生存率比は１００％、処理時間は４４０秒であった。
【００４７】
（実施例２）  
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、３８ｍＬ／分（線速度５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は９０％、生存率比は９８％、処理時間は４０４秒であった。
【００４８】
（実施例３）  
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、７７ｍＬ／分（線速度１００ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８９％、生存率比は９８％、処理時間は３３４秒であった。
【００４９】
（実施例４）  
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、１１５ｍＬ／分（線速度１５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は９１％、生存率比は９７％、処理時間は３１０秒であった。
【００５０】
（実施例５）
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４８２ｍＬ／分（線速度６３０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、３８ｍＬ／分（線速度５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は９０％、生存率比は９６％、処理時間は３９６秒であった。
【００５１】
（実施例６）  
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が２９９ｍＬ／分（線速度３９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、３８ｍＬ／分（線速度５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８７％、生存率比は９５％、処理時間は５４０秒であった。
【００５２】
（実施例７）  
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が２８３ｍＬ／分（線速度３７０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、３８ｍＬ／分（線速度５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８６％、生存率比は９８％、処理時間は５５４秒であった。
【００５３】
（実施例８）
実施例１と同様の分離膜を用いた。用いた中空糸の本数は２５０本とし、作成した処理器の濾過面積は０．１０ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積０．６４ｃｍ２であった。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が３７７ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、６４ｍＬ／分（線速度１００ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８９％、生存率比は９８％、処理時間は４０４秒であった。
【００５４】
（比較例１）
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、１４９ｍＬ／分（線速度１９５ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８４％、生存率比は９７％、処理時間は３００秒であった。
【００５５】
（比較例２）
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が４５２ｍＬ／分（線速度５９０ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、２９９ｍＬ／分（線速度３９０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は８３％、生存率比は９４％、処理時間は２８２秒であった。
【００５６】
（比較例３）
実施例１と同様の細胞懸濁液処理器を用いた。濃縮条件は、細胞懸濁液導入口への流量が１４９ｍＬ／分（線速度１９５ｃｍ／分）、濾液用出口より排出される濾過流量２００ｍＬ／分とした。回収時の流量は、３８ｍＬ／分（線速度５０ｃｍ／分）とした。その結果、細胞回収率は７４％、生存率比は９８％、処理時間は９４０秒であった。
【００５７】
【表１】
2015012837.tif 000003
【００５８】
表１より、細胞懸濁液を線速度３７０〜６３０ｃｍ／分で通液し、濾過液を濾液用出口より排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、および細胞濃縮液を線速度４０〜１５０ｃｍ／分で通液し、細胞懸濁液導出口より導出された細胞濃縮液を回収容器に回収する工程を含む細胞濃縮液の製造方法とすることで、高い細胞回収率および生存比率で細胞濃縮液を製造できることは明らかである。
【００５９】
以上のように、細胞濃縮時よりも細胞回収時の線速を下げることで、プラスチック容器、チューブ、中空糸型分離膜内に残存する細胞懸濁液を、細胞に与えるダメージが少なく、かつ効率的に細胞を回収することができる。さらに、細胞濃縮後に生理食塩液で洗浄することで、細胞懸濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を効率良く取り除くことができる。したがって、本発明の方法により製造された細胞濃縮液を用いれば、無菌的な操作処理で目的細胞だけを短時間で効率的に濃縮、回収することができるので、細胞治療用途の細胞も提供できる。
【符号の説明】
【００６０】
１．筒状容器
２．胴部
３．頭部
４．濾液用出口
５．中空糸型分離膜の束
６．開口端（点線部）
７．樹脂層部（斜線部）
８ａ．細胞懸濁液導入口
８ｂ．細胞懸濁液導出口
９．ヘッダー部
１０．回収容器
１１．混注ポート
１２．瓶針接続ポート
１３．細胞懸濁液が入った容器
１４．ポンプ
１５ａ．回収容器側の二方活栓
１５ｂ．細胞懸濁液が入った容器側の二方活栓
１５ｃ．廃液容器側の二方活栓
１６．廃液容器
【図１】
2015012837.tif 000004