(57)【要約】  本明細書に提供されるものは、細胞中での潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染を再活性化させる方法である。この方法は、細胞を、ＮＦ−κＢ活性での第２の遅延した増加をもたらすことなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性の第１の増加をもたらす薬剤に接触させることによって、ＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することを含む。任意で、第２の薬剤は、再活性化を刺激するために用いられる。更に本明細書で提供されるものは、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌を培養する方法である。更に提供されるものは、被験者において潜伏性ヒト免疫不全ウィルス−１（ＨＩＶ−１）感染を再活性化する方法であり、この方法は、任意でプライミング剤と共に、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されるＨＩＶ−１再活性化因子を被験者に投与することを含む。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中での潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染の再活性化の方法であって、前記方法は、細胞と、ＮＦ−κＢ活性で第２の遅延した増加をもたらすことなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルで一過性の第１の増加をもたらす第１の薬剤とを接触させることによって、細胞中のＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＦ−κＢ活性での第２の遅延した増加が、サイトカイン遺伝子誘導に関連し、前記ＮＦ−κＢ活性での第２の遅延した増加の不在が、サイトカイン遺伝子誘導の不在を伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＦ−κＢ活性での調節が、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＰＨＡ−Ｌ、ＩＬ−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、又は抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との組み合わせによって生じる調節からのパターンとは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＦ−κＢ活性のレベルでの調節が、ＮＦ−κＢ  ｐ５０のレベルでの調節として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＦ−κＢ活性のレベルでの調節が、ＮＦ−κＢ  ｐ６５のレベルでの調節として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子誘導の不在が、１つ以上のＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＬ−６の誘導の不在を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＦ−κＢ活性のレベルでの調節が、ＨＩＶ複製を伴わない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がインビトロである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がインビボである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する第２の薬剤に細胞を接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の前記第１の薬剤と接触の前に、前記細胞が前記第２の薬剤と接触される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の薬剤がＰ−ＴＥＦｂを複合体から放出させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の薬剤が、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の薬剤が、アクチノマイシンＤである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクチノマイシンＤが、１５マイクログラム／キログラム／日（μｇ／ｋｇ／日）の用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）を生成するための単離されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌又はその集団。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＭａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）。
【請求項１８】
前記Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅと少なくとも９５％の配列同一性を含む、請求項１６に記載のＭａｓｓｉｌｉａ細菌。
【請求項１９】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅと少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１８に記載のＭａｓｓｉｌｉａ細菌。
【請求項２０】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株の精製した集団を含む組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＭａｓｓｉｌｉａ株によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）。
【請求項２２】
前記ＨＲＦが、５０キロダルトン（ｋＤａ）以上のポリペプチドを含む、請求項２１に記載のＨＲＦ。
【請求項２３】
前記ＨＲＦが、１００ｋＤａ以下のポリペプチドを含む、請求項２１に記載のＨＲＦ。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−７０３を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）。
【請求項２５】
Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されるＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）又はＭａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されるＨＲＦの再活性化断片を投与することを含む、被験者において潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染を再活性化させる方法。
【請求項２６】
前記ＨＲＦが、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株によって生成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＲＦが、ＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−７０３を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株によって生成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＲＦが、５０キロダルトン（ｋＤａ）以上のポリペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＲＦが、１００ｋＤａ以下のポリペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する薬剤を被験者に投与することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成される前記ＨＲＦ又は前記ＨＲＦの再活性化断片の投与前に前記被験者に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤が、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、アクチノマイシンＤである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
被験者においてＨＩＶ感染を治療する方法であり、前記方法は、
（ａ）ＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することによって、潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化する第１の薬剤を被験者に投与することであって、前記ＮＦ−κＢ活性のレベルに調節は、ＮＦ−κＢ活性での第２の遅延した増加をもたらすことなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルでの一過性の第１の増加をもたらし、
（ｂ）前記被験者に抗レトロウィルス剤を投与することであって、前記被験者への抗レトロウィルス剤の投与が前記ＨＩＶ感染を治療する、ことを含む方法。
【請求項３６】
前記抗レトロウィルス剤は、前記潜伏性ＨＩＶ感染の再活性化の後に、前記被験者に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗レトロウィルス剤は、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド同類体逆転写酵素インヒビター（ＮＡＲＴＩ）、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインインヒビター、侵入抑制因子、成熟抑制因子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法は、前記被験者において前記潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する第２の薬剤を前記被験者に投与することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の薬剤が、前記第１の薬剤の前に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の薬剤が、複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の薬剤が、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の薬剤が、アクチノマイシンＤである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の薬剤が、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌から生成されるＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）又はその再活性化断片である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株である、請求項４3に記載の方法。
【請求項４５】
ＨＩＶ再活性化因子を生成する方法であり、（ａ）培養培地中への前記ＨＲＦの分泌を可能にさせる条件下で、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌を哺乳類細胞培養培地中で培養させることと、（ｂ）Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌調整培地の単離とを含む方法。
【請求項４６】
前記哺乳類細胞培養培地が、ＲＰＭＩ  １６４０培地である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＰＭＩ  １６４０培地が、哺乳類血清、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はミオグロビンを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＰＭＩ  １６４０培地が、約１％〜約２０％の哺乳類血清、ＢＳＡ、又はミオグロビンを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳類血清が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＰＭＩ  １６４０培地が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＢＳＡが、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌの前記ＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＰＭＩ  １６４０培地が、ミオグロビンを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年５月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／３４５，９２４号の利益を主張するものである。
政府資金による研究に関する声明
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成金第ＡＩ０７７４５７号及び第ＡＩ０６４０１２号の下、政府の援助を受けてなされたものである。政府当局は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
高活性抗レトロウィルス療法（ＨＡＡＲＴ）は、患者においてＨＩＶ−１複製を検出不能なレベルまで迅速に抑制する。しかしながら、治療の中止は、有効なＨＡＡＲＴ治療の数年後であっても、ウィルス血症の即時の反跳をもたらす。これは、潜伏的にＨＩＶ−１に感染した記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の長寿命の病原巣に因る。潜伏的ＨＩＶ−１感染に対して細胞宿主として役立つ記憶Ｔ細胞の長寿命の結果として、潜伏性ＨＩＶ−１病原巣は非常に安定である。新規感染事象による病原巣のいかなる補充がない場合の自然的根絶は、約７０年間を要すると推測される。潜伏性病原巣の自然的枯渇は、達成できる可能性が低く、ＨＩＶ−１潜伏性は、治癒的ＡＩＤＳ療法に対する主要な障害を提示していると考えられている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供されるものは、細胞中での潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染の再活性化の方法である。この方法は、ＮＦ−κＢ活性の第２の遅延した増加を伴うことなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性の第１の増加を生じる第１の薬剤に細胞を接触させることによって、細胞中のＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することを含む。任意で、この方法は、細胞を第２の薬剤（例えば、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン又はアンフォテリシンＢ）に接触させることを含む。第２の薬剤は、細胞中の潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する。任意で、第２の薬剤は、第１の薬剤による潜伏性ＨＩＶ感染の再活性化のために必要とされる投与量を減少させる。
【０００５】
被験者に、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されたＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）又はＨＲＦの再活性化断片を投与することにより、被験者の潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化する方法も提供される。
【０００６】
ＨＲＦを生成するための単離されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌又はその集団も提供される。
【０００７】
更に、ＨＲＦを生成する方法も提供される。この方法は、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌を哺乳類細胞培養培地中で培養することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ再活性化潜伏性ＨＩＶ−１感染からの培養上清を示す図である。図１Ａは、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ細胞培養上清（ＨＲＦ）の１０μｌで処置された潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５レポーターＴ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示している。未処置対照細胞及びＨＲＦ処置細胞がフローサイトメトリー解析にかけられ、刺激後２４時間でのＨＩＶ−１発現の直接的かつ定量的マーカーとしての増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）発現を決定した。ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットが、細胞のＦＳＣ（細胞サイズ）−ＳＳＣ（粒状性）表現型での変化の関数として細胞生存率を評価するために表示されている。図１Ｂは、観察されたＨＩＶ−１再活性化の再現性を示す柱状図である。４種の異なる潜伏感染Ｔ細胞系に関するＨＲＦ（バッチＨＲＦ１〜３）で３種の異なる調製物（５Ｆ３、８Ｅ１２、ＣＡ５及び１２Ｄ４）がテストされた。刺激に続いてのＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが、柱状図に示されている。同一の条件下で成育されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）培養の細胞培養上清が、特異性対象として使用された。
【図２】Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅが潜伏性ＨＩＶ−１感染の再活性化を仲介することを示す図である。図２Ａは、同定化かつクローン化された細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１）が、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と９９．８％を超えて同一であることを示している。ＲはＡ又はＴのいずれかを表す。図２Ｂは、血液寒天上で成長させたＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅコロニーを示す画像である。図２Ｃは、異なるＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株のＨＩＶ−１再活性化能力を示すゲルの画像及びグラフである。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株＃７０１及び＃７０３は、ＡＴＣＣから購入し、単離されたＨＲＦを含むＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅと同一条件及び細胞密度下で増殖した。培養上清を収穫し、細胞密度について正規化し、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上に装填した。蛋白質濃度及び分布を、銀染色法を用いて可視化した（左側パネル）。これらの３種の培養上清のＨＩＶ−１再活性化能力を、無菌濾過細菌上清を潜伏性ＨＩＶ−１感染ＣＡ５  Ｔ細胞上に滴下し、次いで総細胞集団中のＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定することで、細胞集団中のＨＩＶ−１再活性化のレベルを定量化することによって決定した（右側パネル）。
【図３】本発明のＨＲＦ特性の特性評価を示す図である。図３Ａは、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ培養調製物がトリプシン又はプロテイナーゼＫの漸増濃度に曝された場合、ＨＲＦのＨＩＶ−１再活性化能力が軽減されたことを立証するグラフである。トリプシン及びプロテイナーゼＫは、ＨＩＶ−１再活性化能力が細菌蛋白質に起因するものであるかどうかをテストするために用いられた。処置された上清をＣＡ５  Ｔ細胞上に移し、潜伏性ＨＩＶ−１感染を再活性化する能力を、ＥＧＦＰ発現についてのフローサイトメトリー解析によって決定した。図３Ｂは、ＨＲＦのＨＩＶ−１再活性化能力がＤＮアーゼ又はＲＮアーゼによって影響されなかったことを示す柱状図である。ＨＩＶ−１再活性化能力が細菌ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の存在に関連しているかどうかを決定するために、ＤＮアーゼ（５Ｕ及び２０Ｕ）及びＲＮアーゼ（２μｇ及び１０μｇ）を用いて、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ培養からの培養上清を処置する同様な実験を行った。図３Ｃは、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ培養上清中のＨＲＦの寸法を示している柱状図である。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ培養調製物を、表示されたｋＤａカットオフを備えるフィルターを用いて、サイズ排除濾過にかけた。各調製物についての通過液及び上清をＣＡ５  Ｔ細胞上に移し、ＥＧＦＰ陽性細胞についてのフローサイトメトリー解析によって、ＨＩＶ−１再活性化能力を決定した。
【図４】ＨＲＦ仲介再活性化が、発熱活性の結果ではないことを示す図である。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅはグラム陰性細菌であるために、ＨＩＶ−１再活性化がエンドトキシン様活性によって誘発され得るかどうかをテストした。図４Ａは、エンドトキシンの除去後のＨＲＦ調製物のＨＩＶ−１再活性化能力を立証するグラフである。ＨＲＦ調製物からエンドトキシンを除去するために、潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５レポーターＴ細胞をＨＲＦ調製物の漸増用量で刺激する前に、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ培養上清を、ポリミキシンＢ−アガロースと共にインキュベートした。ＨＩＶ−１再活性化のレベルを、刺激後４８時間のフローサイトメトリー解析を用いて、ＥＧＦＰ−陽性細胞のパーセンテージとして決定した。図４Ｂは、潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５レポーターＴ細胞及び単球細胞レポーター細胞系（ＴＨＰ８９ＧＲＰ細胞）に及ぼすＨＲＦ及びＬＰＳの漸増濃度のＨＩＶ−１再活性化能力を示すグラフである。潜伏的にＨＩＶ−１感染ＣＡ５レポーターＴ細胞を、ＨＲＦ又はＬＰＳの漸増濃度で処置した。ＬＰＳの機能性が、ＬＰＳの漸増量で潜伏的にＨＩＶ−１感染単球ＴＨＰ８９ＧＦＰ細胞を刺激することによって立証された。全ての条件に関して、ＨＩＶ−１再活性化のレベルを、フローサイトメトリー解析を用いて刺激後４８時間のＥＧＦＰ−陽性細胞のパーセンテージとして決定した。
【図５】Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅとＣＡ５  Ｔ細胞との共培養によって誘導されるＨＩＶ−１再活性化を示す図である。異なる割合でのＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅと一定数のＣＡ５  Ｔ細胞（１×１０6細胞）との混合物を２４時間共培養した。ＦＳＣ／ＳＳＣ解析の対数表現を用いることで、フローサイトメトリー解析を用いる同じＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットでＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅとＴ細胞とを可視化することが可能である。Ｔ細胞集団にゲートオンすることによって、細菌の数の関数としてのＨＩＶ−１再活性化のレベルが決定される。ドットプロットは、テストされた細菌の最大数（上四分の一）での実験条件並びに完全な再活性化を未だもたらす細菌の最低数（下四分の一）で実験条件を表している。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットは、細胞形態及び生存率でのいずれかの変化を決定するために使用された。ＥＧＦＰは、ＨＩＶ−１発現の直接的マーカーとして決定された。
【図６】ＨＲＦが、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現の準最適機能誘導を誘発することを示す図である。図６Ａは、ＮＦ−κＢ経路を経てシグナル伝達する既知のＨＩＶ−１再活性化剤に対するＨＲＦのＨＩＶ−１再活性化動態を示すグラフである。ＣＡ５  Ｔ細胞を、ＨＲＦ、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の最適な濃度で刺激し、４８時間の期間にわたるＥＧＦＰ−発現の関数としてＨＩＶ−１再活性化を解析することによって、ＨＩＶ−１再活性化動態を決定した。全ての薬剤に関するデータは、総細胞集団中のＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして示されている。図６Ｂは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲのＴＡＴ依存性活性についてのＨＲＦの能力を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＬＴＲのＴａｔ依存性活性化を仲介するＨＲＦの能力をテストするために、ＮＯＭＩ細胞（一体化されたＬＴＲ−ＥＧＦＰ構造を有するＨＩＶ−１レポーター細胞系）を、ＰＭＡ（０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（０．００３〜３０μｇ／ｍｌ）及びＨＲＦ上清（０．３〜１００μｌ）の漸増濃度で刺激した。次いでＬＴＲ誘導のレベルを、フローサイトメトリー解析により決定されたように、２４時間後に検出可能なＥＧＦＰ発現として測定した。矢印は、それぞれの刺激が潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５  Ｔ細胞系中で完全なＨＩＶ再活性化を誘発したと思われる場合の濃度を指している。図６Ｃは、２９３Ｔ細胞中のＮＦ−κＢ依存性プロモーターに及ぼすＨＲＦの効果を示す柱状図である。２９３Ｔ細胞をいくつかのＮＦ−κＢ依存性プロモーター構造でトランスフェクトし、次いでＴＨＦ−α（１０μｇ／ｍｌ）又はＨＲＦ（２５μｌ）のいずれかで刺激した。プロモーター誘導を、総ＥＧＦＰ発現（ＮＦ−κＢ：ｐＮＦ−κＢ−ｄ２ＥＧＦＰ；ＬＴＲ：ＨＩＶ−１  ＬＴＲ−ＧＦＰ；ＩＬ−８：ｐＩＬ−８  ＧＦＰ；ＴＮＦ：ヒトＴＮＦ−ＧＦＰ；ＭＳＣＶ：ネズミ幹細胞ウィルスＬＴＲ駆動ＧＦＰ；ＮＦ−κＢ反応性でない要素）として測定した。
【図７】ＮＦ−κＢ活性のＨＲＦ仲介誘導の動態を示すグラフである。Ｊｕｒｋａｔ細胞又は潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５  Ｔ細胞を、ＰＭＡ及びＨＲＦの最適な濃度で刺激し、細胞を指示された時点で収穫した。核抽出物が生じ、（図７Ａ及び７Ｃ）ＮＦ−κＢ  ｐ５０活性並びに（図７Ｂ及び７Ｄ）ＮＦ−κＢ  ｐ６５活性を、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＮＦ−κＢファミリーＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて決定した。
【図８】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＲＦ誘導ＮＦ−κＢ及びサイトカイン発現を示す図である。図８Ａは、ＰＢＭＣ中のＨＲＦ及びＰＨＡ−ＬによるＮＦ−κＢ刺激の動態を示すグラフである。ＰＢＭＣを、ＰＨＬ−Ｌ又はＨＲＦのいずれかの最適な濃度で活性化した。細胞を指示された時点で収穫した。核抽出物が生じ、ＮＦ−κＢ  ｐ５０活性並びにＮＦ−κＢ  ｐ６５活性を、ＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦ−κＢファミリーＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を用いて決定した。図８Ｂは、飽和ＨＲＦレベルの存在下でのＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１複製が、対照と比較してそれほど顕著に増加しなかったことを示す柱状図である。４人の異なる健康なドナーからのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体組み合わせで刺激し、刺激後４日目にＧＦＰレポーターウィルスで感染させた。ＨＩＶ−１複製を、ＨＲＦの不在下（Ｃ）又は存在下で５日間監視し、達成されたＨＩＶ−１感染レベルを、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージについてのフローサイトメトリー解析によって決定した。全ての感染を未処置培養中の感染レベルに正規化し、この柱状図は、４人のドナー培養で得られた平均感染レベル±標準偏差を表している。図８Ｃは、ＨＲＦが炎症誘発性サイトカイン分泌の有意なレベルを誘導しなかったことを示すグラフである。４人の健康なドナーからのＰＢＭＣを刺激せずそのままで残し（Ｃ）、又は陽性対照として抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体組み合わせで刺激し、若しくはＣＡ５  Ｔ細胞中で最大のＨＩＶ−１再活性化を誘発するであろうＨＲＦの濃度で刺激した。２４時間後に培養上清を回収し、サイトカインのパネルの濃度をＢｉｏＰｌｅｘ解析によって決定した。ＴＮＦ−αについてのサイトカイン濃度（最上部パネル）、ＩＦＮ−γについてのサイトカイン濃度（中間部パネル）、及びＩＬ−８についてのサイトカイン濃度（底部パネル）が、４人の個々のドナーについて表されている。
【図９】ＨＩＶ−１再活性化薬剤の組み合わせに関するフローサイトメトリーに基づく高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を示す図である。図９Ａは、９６ウェルプレートベースのアッセイフォーマットにおける細胞サンプルの時間分解取得を示している。それぞれのピークは、１つのウェルの蓄積された事象を示している。図９Ｂは、異なるアクチベーター（Ｊ８９ＧＦＰ：ＨＲＦ；Ｊ８９ＧＦＰ−Ｒ：抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３；Ｊ８９ＧＦＰ−Ｒ＋：ＰＭＡ）で処置された３つの集団において、自動ピーク認識が、蛍光バーコードのバックゲーティング（ＲＦＰ）に的確な効果（ＧＦＰ）を定量させること示している。図９Ｃは、ＨｙｐｅｒＣｙｔ（登録商標）オートサンプラー（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を使用する９６ウェルプレートでの高スループットフローサイトメトリー解析の結果を示している。ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ；白色）、ＨＲＦ（灰色）及びＰＭＡ（０．３ｎｇ／ｍｌ；黒色）の準最適濃度と組み合わされた各化合物によって誘導された再活性化のレベルが、ウェル番号全体にわたるパーセント再活性化としてプロットされ、左側に示されている。図中右側の記号は、各サンプルの対応する生存率を表している。各ウェルの総生存率だけがプロットされ、個々のＲＦＰバーコード化集団のそれぞれがプロットされていないことに注意されたい。
【図１０】ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）が、再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−感染を時間依存性の様式で刺激することを示す図である。図１０Ａは、刺激されずに残された（Ｃ）又はダクチノマイシンで１８時間処置された（ＤＭ）潜伏的にＨＩＶ−１感染Ｊ８９ＧＦＰ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を示している。次いで、いずれかの集団を、ＴＮＦ−αの準最適濃度で刺激した。フローサイトメトリー解析を用いて、ＴＮＦ−α添加後２４時間のＧＦＰ陽性細胞のレベルを測定することによって、再活性化レベルを決定した。図１０Ｂは、ダクチノマイシンで様々な時間で処置され、次いでＴＮＦ−αで刺激されたＪ８９ＧＦＰ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を示している。再活性化のレベルを、ＧＦＰ発現細胞のレベルを測定することによって定量化した。
【図１１】ＨＩＶ−１再活性化のためのダクチノマイシンの最適濃度及び他の転写インヒビター又はＤＮＡインターカレーターとの比較を示す図である。ＣＡ５  Ｔ細胞を、ダクチノマイシン（ＤＭ）（図１１Ａ）、ＤＮＡインターカレーターであるダウノルビシン（ＤＲ）（図１１Ｂ）、又は転写インヒビターであるＤＲＢ（図１１Ｃ）並びにα−アマニチン（図１１Ｄ）の漸増濃度で前処置した（指示された濃度）。次いで細胞を刺激しないままで残す（白丸）か、又はＨＲＦの準最適濃度で活性化した（黒丸）。再活性化レベルを、刺激後２４時間のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして決定した。細胞の生存率は、記号の寸法と相関する（寸法範囲は５〜９５％に調節されている）。
【図１２】活性ＨＩＶ−１感染に及ぼすダクチノマイシンの効果を示す図である。最適なＨＩＶ−１再活性化剤は、新規感染のリスクを最小化するために活性ＨＩＶ−１感染を増強させるべきではない。活性ＨＩＶ−１転写に及ぼすダクチノマイシンの効果をテストするために、薬剤を慢性的に活性感染したＧＦＰ−レポーターＴ細胞であるＪＮＬＧ＃３５（黒色）及びＪＮＬＧ＃４４（白色）上に滴下した。ダクチノマイシンについての結果を、ダクチノマイシンと同様に報告された作用のメカニズムを及ぼす他の薬剤／化合物の結果と比較した。ＧＦＰ  ＭＣＦを、ダクチノマイシン（図１２Ａ）、ＤＮＡインターカレーターダウノルビシン（ＤＭ）（図１２Ｂ）及びレベッカマイシン（ＲＭ）（図１２Ｃ）、並びに転写インヒビターＩＣＲＦ−１９３（図１２Ｄ），ＤＲＢ（図１２Ｅ）及びα−アマニチン（図１２Ｆ）について薬剤濃度全体にプロットした。記号の寸法は、サンプル中のそれぞれの細胞の生存率を示している（寸法範囲は５〜９５％に調節されている）。
【図１３】潜伏性感染に及ぼすダクチノマイシンの効果を、宿主遺伝子転写の方向に対する統合の方向の関数として示す図である。ＨＩＶ−１は宿主遺伝子と同じ転写配位で、又は逆のセンス配位で一体化し得る。同じセンス配位で統合されたＨＩＶ−１を有すると決定された細胞系（ＣＡ５細胞）（図１３Ａ）及び逆センス配位でＨＩＶ−１が統合された細胞系（ＥＦ７）（図１３Ｂ）である２つの潜伏的にＨＩＶ−１感染したＴ細胞系が用いられた。細胞系のいずれに関しても、宿主遺伝子名称、統合の位置及び染色体番号が提供されている。いずれのＴ細胞系に関しても、ＴＮＦ−α処置単独により又はＴＮＦ−α刺激に続き４ｎｇ／ｍｌダクチノマイシンで１８時間前処置したことにより達成された再活性化レベルが示されている。再活性化レベルを、ＧＦＰ発現に関するフローサイトメトリー解析を使用して決定した。灰色の点線は、ＰＭＡを使用して最大で達成可能な再活性化レベルを表している。
【図１４】ダクチノマイシンが、再活性化のための潜伏的ＨＩＶ−２感染を刺激することを示す図である。Ｊ２５７４レポーターＴ細胞をＨＩＶ−２  ７３１２Ａで感染させて、潜伏感染細胞集団を確立した（９０％を超える潜伏感染細胞）。次いで細胞集団をダクチノマイシンの変化する濃度（０〜８ｎｇ／ｍｌ）で１８時間前処置し、その後未処置のまま残すか（Ｃ）、又は１０％の細胞でそれ自体によって再活性化が誘発されるＨＲＦの準最適用量で刺激した。フローサイトメトリー解析を使用して、ＧＦＰ陽性細胞のレベルを定量化することによって、ＨＲＦ活性化後２４時間で再活性化レベルを決定した。
【図１５】ＨＭＢＡが再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激することを示す図である。図１５Ａは、ＨＭＢＡが、使用されたレポーター細胞系中でＨＩＶ−１再活性化を誘発させこと、並びにＨＭＢＡが再活性化のためにＨＩＶ−１を刺激することができることを立証するＦＡＣＳ解析を示している。潜伏的ＨＩＶ−１感染ＣＡ５  Ｔ細胞系を、ＨＭＢＡの最適用量（２７％の再活性化）、ＴＮＦ−αの準最適用量（３２％の再活性化）、又はＨＭＢＡ及びＴＮＦ−αの組み合わせ（８１％の再活性化）で処置した。図１５Ｂは、ＨＭＢＡの最適用量を表すグラフを示している。ＨＭＢＡの漸増量を潜伏的にＨＩＶ感染したＣＡ５  Ｔ細胞上に滴下した。薬物仲介毒性の発生前の、ＨＩＶ−１プライミング剤としてのＨＭＢＡの最適濃度は、３〜１０ｍＭの間であった。図１５Ｃは、ＨＭＢＡが、複数の薬剤でＨＩＶ−１再活性化を刺激し得ることを証明するグラフを示している。潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５  Ｔ細胞を、ＨＭＢＡ単独、ＨＭＢＡ＋ＴＮＦ−αの、ＨＭＢＡ＋ＰＭＡ、又はＨＭＢＡ＋ＨＲＦの漸増用量で処理した。
【図１６】ダクチノマイシンが、Ｐ−ＴＥＦｂをＨＥＸＩＭ−１とのその不活性複合体から放出させることを示す図である。Ｐ−ＴＥＦｂをＨＥＸＩＭ−１とのその不活性複合体から放出させることによって、ＨＩＶ−１再活性化のためのプライミング剤として作用するダクチノマイシンの能力をテストするために、グリセロール勾配分析を実行し、潜伏感染Ｊ８９ＧＦＰ  Ｔ細胞中のＰ−ＴＥＦｂ−ＨＥＸＩＭ−１複合組成物へ及ぼすダクチノマイシンの効果を決定した。Ｊ８９ＧＦＰ細胞を未処置のまま残し、若しくは高濃度のダクチノマイシンで１時間処置し又はその生理学的に最適な濃度（０．００４μｇ／ｍｌ又は０．０１μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した。細胞溶解物をグリセロール勾配（１０〜４５％）上で分離した。各勾配分画を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ウェスタンブロットによって移動させた。図１６Ａは、複合組成物での薬剤誘導シフトを明らかにするために、抗ＣＤＫ９抗体（図１６Ｃ）によって染色されたウェスタンブロットのバンド強度の定量的分析を示している。ＩｍａｇｅＪを用いてバンド強度を決定し、相対的バンド密度として表した。図１６Ｂは、抗ＨＥＸＩＭ−１抗体（図１６Ｄ）を用いて実行された同じウェスタンブロット実験のバンド密度解析を示している。バンド密度をＩｍａｇｅＪを用いて決定し、相対的バンド密度として表した。
【図１７】ＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）による再活性化のための潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する２つの薬剤／化合物を示している。潜伏的ＨＩＶ−１感染ＣＡ５細胞を、指示された薬剤／化合物の漸増濃度で２０時間前処置した。ＡＣＭ：アクラシノマイシン；ＡｃｔＤ：アクチノマイシンＤは強いプライミング効果を有し、ＲＮＡＰ  ＩＩインヒビターＤＲＢ：５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボベンズ−イミダゾール；Ｄａｕｎｏ：ダウノルビシン；ＭＧ１３２：プロテアソームインヒビター；及びＲＮＡＰ  ＩＩインヒビターα−アミニチンは、ＤＮＡインターカレーター又は転写インヒビターのいずれかと同様なインヒビター効果を及ぼすことが報告されているが、ＨＩＶ−１再活性化へのプライミング効果を示さず、アクラシノマイシン又はダクチノミシンの適用後に観測された効果の特異性を立証した。次いで細胞をＨＲＦの準最適濃度で刺激し、ＨＩＶ−１再活性化の効果を、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージに関するフローサイトメトリー解析によって決定した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＨＩＶ−１ウィルスが休眠状態又は潜伏状態で長寿命免疫細胞のゲノム中に一体化し得るために、抗レトロウィルス療法（ＡＲＴ）は、ＨＩＶ−１感染を抑制し得るが、根絶し得ない。一体化されたウィルスは永久的に存続し、治療が中止される場合、蔓延する。潜伏性ＨＩＶ−１感染を根絶するための最も可能性のある方法は、これらのウィルスを再活性化させることである。再活性化ウィルスを有する感染した細胞は、免疫系による破壊に感受性を示すか又はウィルス細胞毒素によって破壊されると思われ、これによって、この残存するウィルス供給源を抹消する。残念なことに、潜伏性ＨＩＶ−１感染を再活性化する刺激は、アラフィラキシーショックと同等である、致命的な「サイトカイン急増」を引き起こし得る。しかしながら、本明細書に提供された方法は、致命的なサイトカイン急増を生じることなく、潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を再活性化する。
【００１０】
更に、ＨＩＶ−１再活性化化合物に関する従来の薬物スクリーニング又は患者の潜伏性ＨＩＶ−１感染を治療的に再活性化するための従来の試みは、「一薬物一標的」説の下で開発され、これは完全な化学的プローブが単一の標的に作用するという前提に基づいている。しかしながら、ＨＩＶ−１潜伏性を制御する分子メカニズムに関する研究は、複数の成分が、持続性Ｔ細胞活性化の不在下でＨＩＶ−１再活性化を誘導するために、協調した様式で誘発されねばならないことを示唆している。このことは、全ての遺伝子が他の遺伝子に関連して機能すること又は分子制御メカニズムがネットワークに関連して機能すること、並びに生物学的システムが遺伝子又はメカニズムに相互作用する活性に基づいて動的かつ可変的に応答するために、単一の標的というものは現実にはあり得ないことを考慮すべきである。したがって、本明細書に提供された方法は、潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化するために、任意で薬剤の併用を用いる。
【００１１】
本明細書に提供されるものは、新規なヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）及び新規なＨＲＦを含む組成物である。このような組成物は、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されたＨＲＦを含む培養基を包含する。更に本明細書で提供されたものは、ＨＲＦをコード化することが可能な核酸配列である。任意で、このＨＲＦは、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌から生成される。任意で、このＨＲＦは、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９を有する株名称ＨＲＦで、ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｏａｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０によって、ブダペスト条約に基づき、２０１０年５月１８日に寄託されたＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株によって生成される。任意で、このＨＲＦは、ＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−７０３を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株によって生成される。任意で、このＨＲＦは、ＮＦ−κＢ活性のレベルを調節する。選択的に、このＨＲＦは、５０キロダルトン（ｋＤａ）以上のポリペプチドを含む。任意により、このＨＲＦは、１００ｋＤａ以下のポリペプチドを含む。
【００１２】
本明細書に提供されているＨＲＦｓは、細胞毒性をほとんど又は全く示さず、３００を超える治療指数を有する。治療指数は、死亡を引き起こす治療薬剤の量に対する治療的効果をもたらす治療薬剤の量の比較である。治療指数は、集団の５０％についての最小有効治療的用量（ＥＤ50）で割られた集団の５０％についての薬物又は薬剤の致死量（ＬＤ５０）によって得られる比率である。高治療指数が好ましい。
【００１３】
細胞を第１の薬剤と接触させることにより細胞中のＮＦ−κＢ活性のレベルの調節することは、ＮＦ−κＢでの遅延した第２の増加をもたらすことなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性の第１の増加をもたらす。したがって、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性の第１の増加は、ＮＦ−κＢ活性の持続するレベルに続くことはない。ＮＦ−κＢ活性の持続したレベルは、例えば、サイトカイン遺伝子発現の誘導及び随伴する遅延増加をもたらし得る。本明細書で記載されるように、第１の薬剤は、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性第１の増加を生み出し、ＮＦ−κＢ活性のピークレベルをもたらし、このＮＦ−κＢのレベルは後に経時的に減少する。活性の第２のピークはほとんど又は全く発生しない。
【００１４】
ＮＦ−κＢ活性の遅延した第２の増加は、サイトカイン遺伝子誘導に関連し得る。ＮＦ−κＢ活性での遅延した第２の増加の不在又は減少は、実質的サイトカイン遺伝子誘導の不在をもたらす。任意で、サイトカイン遺伝子の誘導の不在は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６のうちの１つ以上の実質的誘導の不在を含む。実質的サイトカイン遺伝子誘導とは、標準統計解析を用いる対照値とは著しく異なる対照全体にわたる増加を意味する。
【００１５】
ＮＦ−κＢ活性の調節は、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＰＨＡ−Ｌ、ＩＬ−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、又は抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との組み合わせによって生じる調節とはパターンで異なる。ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＰＨＡ−Ｌ、ＩＬ−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、又は抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との組み合わせによって生じるＮＦ−κＢ活性の調節は、例えば、ＮＦ−κＢ活性の１つのパターンを生み出し得る。任意で、これらの薬剤によって生じるＮＦ−κＢ活性のパターンは、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける第１の増加で始まり、ＮＦ−κＢ活性の持続性の増加したレベルに続く。ＮＦ−κＢ活性の持続性レベルは、例えば、ＮＦ−κＢ活性の振動レベルであり得る。ＮＦ−κＢ活性の振動パターンは、ＮＦ−κＢ活性のレベルでの増加、ＮＦ−κＢ活性のレベルでの減少、並びに別の増加ではあるがパターンが持続し続けることができるものを含む。
【００１６】
任意で、潜伏性ＨＩＶ感染は、第２の薬剤の投与によって、細胞中で刺激される。第２の薬剤は、潜伏性感染に関する活性化閾値を低下させることによって、再活性化のために潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激する。次いで、再活性化因子によって、完全な再活性化が誘発され得、この再活性化因子は、低用量ではそれ自体が潜伏性感染には効果をほとんど又は全く有さず、最も重要なことは、これがサイトカイン発現又はいかなる他の有害な副作用も誘発しない又は最少のサイトカイン発現又は副作用を誘発するであろうことである。例として、第２の薬剤の投与は、細胞中での潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化するために必要とされる第１の薬剤の量（すなわち投与量）を減少させ得る。
【００１７】
第２の薬剤は、第１の薬剤に先行して又はそれと同時に被験者に投与され得る。第２薬剤は、例えば、ＨＥＸＩＭ−１及び７ＳＫ  ＲＮＡを含む不活性複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出させることによって、潜伏性ＨＩＶ感染を刺激することができる。任意で、第２の薬剤は、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンポテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される。
【００１８】
例えば、第２の薬剤は、ＨＲＦに限定されない方法で、再活性化されるべき潜伏性ＨＩＶ感染を刺激することができる。例としては、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、又はＷＰ６３１で潜伏性ＨＩＶ感染を刺激することは、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−２、又はＣＤ３抗体が挙げられる他の薬剤の準最適用量に潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化させることを可能にする。理論に制限されるものではないが、潜伏性ＨＩＶ感染を刺激することは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、又はＣＤ３の準最適用量によるＮＦ−κＢ活性の調節に影響を及ぼし、これが「サイトカイン急増」を誘発することを回避する。
【００１９】
また、本明細書で更に提供されるものは、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌の精製集団である。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅはグラム陰性細菌であり、日和見感染における重度免疫不全患者から初期に単離されたものである。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅは非病原性であると見なされ、土壌サンプル中、飲料水中、空気中、及び宇宙船組立品の無菌室中でさえも頻繁に見出される。任意で、精製集団は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９号を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株を含む。任意により、組成物はＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−７０３号を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株を含む。Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株はまた、例えば、ＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）を生成する。また、更に本明細書で提供されるものは、本明細書に提供されたＭａｓｓｉｌｉａ株によって生成されるＨＲＦを含む組成物である。
【００２０】
更に提供されるものは、単離されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌又はその集団である。単離されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌又はその集団は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）再活性化因子（ＨＲＦ）を生成することが可能である。任意で、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、この１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を備える。任意で、この１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％の配列同一性を備える。
【００２１】
２種の核酸間の配列同一性の類似性又は配列類似性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ著，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２頁，１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０頁，１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら著，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６頁，１９８９年に開示されたアルゴリズムによって得ることができ、これらは核酸配列化のための少なくとも材料に関して参照により本明細書に組み込まれている。
【００２２】
本明細書に提供されものは、ＨＲＦポリペプチドと、ＨＲＦｓをコード化する核酸と、ＨＲＦｓを生成可能なＭａｓｓｉｌｉａ細菌株とを含有し、任意で、１つ以上のプライミング剤と、抗レトロウィルス剤と、本明細書に記載された薬学的に許容可能な担体とを含む組成物である。本明細書で提供されている組成物は、インビトロ又はインビボでの投与に好適である。薬学的に許容可能な担体とは、生物学的に又はその他に望ましくない物質ではない、すなわち、望ましくない生物学的効果を起こすことなく又はその物質が封入される薬学的組成物の成分と有害な方法で相互作用することなく被験者に投与される物質を意味する。この担体は、活性成分の分解を最小化し、並びに被験者での副作用を最小化するよう選択される。
【００２３】
好適な担体及びその処方製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ著，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ編集（２００５年）に記載されている。典型的には、薬学的に許容可能な塩の適切量が、処方製剤を等張にさせるために用いられる。薬学的に許容可能な担体の例としては、限定されるものではないが、無菌水、生理食塩水、リンガー液のような緩衝溶液、及びデキストローズ溶液が挙げられる。この溶液のｐＨは、概ね約５〜８又は７〜７．５である。他の担体としては、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような持続性放出調製物が挙げられる。マトリックスは、成形加工品、例えばフィルム、リポソーム、又はマイクロ粒子のような形態である。特定の担体は、例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度に依存することがより好ましい可能性がある。担体は、プライミング剤、再活性化剤及び／又は抗レトロウィルス剤のヒト又は他の被験体への投与のために好適な担体であり、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸分子、及び／又はペプチド疑似体などである。
【００２４】
この組成物は、局所的治療又は全身的治療のいずれかが望ましいか、並びに治療される領域に依存するいくつかの方法で投与される。この組成物は、局所的、経口的、非経口的、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、皮内、肝臓内、頭蓋内投与、噴霧／吸引投与、又は気管支鏡法を介しての導入などが挙げられる投与の任意のいくつかの経路を介して投与される。
【００２５】
非経口投与のための調製物としては、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、若しくは不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充物、電解質補充物（例えばリンガーデキストロースをベースとしたもの）等が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような防腐剤及び他の添加剤が、任意で存在する。
【００２６】
局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座剤、スプレー、液剤、及び粉末剤が挙げられる。慣用的な薬剤学的キャリア、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤等が必要である場合又は望ましい場合もある。
【００２７】
経口投与用の組成物としては、粉末又は顆粒、水中又は非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、分包剤、又は錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が、場合によっては望ましい。
【００２８】
任意で、核酸分子又はポリペプチドが、核酸分子又はポリペプチドをコード化する核酸配列（例えば、本明細書で提供されるＭａｓｓｉｌｉａ株によって生成されたＨＲＦをコード化する核酸）を含むベクターによって投与される。例えば発現ベクターを介して、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞へ核酸分子及び／又はポリペプチドを送達させるために使用され得るいくつかの組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、大きく２つの部類に分けられ、これらはウィルス系送達システムと非ウィルス系送達システムである。このような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書で記載される組成物及び方法での使用に容易に適用可能である。
【００２９】
また、本明細書で提供されているものは、ＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）を生成する方法である。この方法は、培養培地へのＨＲＦの分泌を可能にする条件下で、哺乳類細胞培養培地中でＭａｓｓｉｌｉａ細菌を培養することと、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌調整培地を単離することとを含む。任意で、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９６９を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株を含む。任意で、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌は、ＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−７０３を有するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株を含む。任意で、哺乳類細培養基は、ＲPＭＩ  １６４０培地を含む。任意で、ＲＰＭＩ  １６４０培地は、哺乳類血清、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はミオグロビンを更に含む。任意で、ＲＰＭＩ  １６４０培地は、約１％〜２０％の哺乳類血清、ＢＳＡ、ミオグロビンを含む。哺乳類血清は、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）であることができる。ＲＰＭＩ  １６４０培地は、約５％〜約１５％のＦＢＳを含むことができる。任意で、ＲＰＭＩ  １６４０培地は、約１０％のＦＢＳを含む。任意で、ＲＰＭＩ  １６４０培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を更に含む。ＲＰＭＩ  １６４０培地は、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むことができる。任意で、ＲＰＭＩ  １６４０培地は、ミオグロビンを更に含む。ミオグロビンは、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヒト、又は任意の他の霊長類から得ることができる。任意で、ＨＲＦは、哺乳類培養培地から単離される。哺乳類培養培地からのＨＲＦの単離は、当該技術分野で既知の方法を使用して実行され、例えばＷｏｏｌｌｅｙ及びＡｌ−Ｒｕｂｅａｉ著，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０４（３）：５９０〜６００頁（２００９年）；Ｋａｌｙａｎｐｕｒ著，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７〜９６頁（２００２年）；Ｓａｎｃｈｅｚら著，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９５（２）：２２６〜９頁（２００９年）；Ｄｏｗｌｉｎｇら著，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２７（３Ａ）：１３０９〜１７頁（２００７年）及び培地の分画法に関して本明細書で教示されたような方法を参照されたい。
【００３０】
また、本明細書で更に提供されるものは、細胞中の潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染を再活性する方法である。この方法は、ＮＦ−κＢ活性での遅延した第２の増加を生じることなくＮＦ−κＢ活性のレベルでの一過性増加を生じる第１の薬剤に細胞を接触させることによって、細胞中のＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することを含む。ＮＦ−κＢ活性のレベルでの調節は、例えば、ＮＦ−κＢ  ｐ５０又はＮＦ−κＢ  ｐ６５活性のレベルでの調節として検出され得る。ＮＦ−κＢ活性のレベルでの調節は、ＨＩＶ複製の誘導をもたらさない。任意で、細胞はインビトロ又はインビボにある。
【００３１】
任意で、この方法は、潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する第２の薬剤と細胞を接触させることを含む。この第２の薬剤は、例えば複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出することができる。この複合体は、ＨＥＸＩＭ−１及び７ＳＫ  ＲＮＡを含むことができる。任意で、第２の薬剤は、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される。
【００３２】
また、本明細書に更に提供されるものは、被験者において潜伏性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染を再活性化する方法である。この方法は、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されたＨＩＶ再活性化因子（ＨＲＦ）、又はＭａｓｓｉｌｉａ細菌によって生成されたＨＲＦの再活性化断片を被験者に投与することを含む。任意で、Ｍａｓｓｉｌｉａ細菌又はＭａｓｓｉｌｉａ調整培地を被験者に直接投与することによって、若しくはそれらの分画を被験者に投与することによって、ＨＲＦが投与される。任意で、培養されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌から単離された細菌上清として、ＨＲＦが被験者に投与される。細菌上清は、当該技術分野で既知の方法又は本明細書に記載されたような方法によって、培養されたＭａｓｓｉｌｉａ細菌から単離されることができる。任意で、この方法は、被験者において潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する薬剤を被験者に投与することを含む。潜伏性ＨＩＶ感染を刺激するとは、ＨＲＦによるＨＩＶ感染のより有効な再活性化をもたらすために、薬剤が潜伏性ＨＩＶ感染を調節する又は変更することを意味する。例えば、薬剤の投与が、被験者において潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化するために必要とされるＨＲＦの量（すなわち投与量）を減少することができることである。任意で、この薬剤は、ＨＲＦの投与前に、又はＨＦＲの投与と同時に投与される。任意で、第２の薬剤は、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される。
【００３３】
アクチノマイシンＤ、アンフォテリシンＢ又はアクラシノマイシンは、再活性化剤の前に又はそれと同時に投与される。任意で、アクチノマイシンＤは、再活性化剤の投与の約６〜３０時間（例えば１２〜２４時間）前に投与される。アンフォテリシンＢ又はアクラシノマイシンは、例えば再活性化剤の投与前の１２時間まで（例えば、約６時間）に又はその投与と同時に投与され得る。
【００３４】
例えば、アクチノマイシンＤは、約１５マイクログラム／キログラム／日（μｇ／ｋｇ／日）までの用量で投与される。任意で、アクチノマイシンＤは、約４００〜６００ミリグラム／１ｍ2体表面積／日（ｍｇ／ｍ2／日）の範囲で投与され得る。アクチノマイシンＤは、１〜５日間、この範囲で投与され得るが、治療は５日間の投与期間後に停止及び再開され得る。アクラシノマイシンは、最大で５日間、約１００ｍｇ／ｍ2／日の投与量で投与される。アンフォテリシンＢは、例えば、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。任意で、アンフォテリシンＢは、１ｍｇ／ｍｌの用量で投与される。
【００３５】
また、本明細書で更に提供されるものは、被験者におけるＨＩＶ感染の治療の方法である。この方法は、ＮＦ−κＢ活性のレベルを調節することによって潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化する第１の薬剤を被験者に投与すること（ここにおいて、ＮＦ−κＢ活性のレベルの調節は、ＮＦ−κＢ活性での第２の遅延した増加を生じることなく、ＮＦ−κＢ活性のレベルにおける一過性の第１の増加を生じることを含み）と、更に抗レトロウィルス剤を被験者に投与することとを含む。抗レトロウィルス剤の投与は、ＨＩＶ感染の治療をもたらす。任意で、抗レトロウィルス剤は、潜伏性ＨＩＶ感染の活性化の後に又は第１の薬剤と同時に被験者に投与される。任意で、被験者において潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する第２の薬剤を被験者は投与される。第２の薬剤は、第１の薬剤に先立って又はそれと同時に被験者に投与され得る。第２の薬剤は、例えば、ＨＥＸＩＭ−１及び７ＳＫ  ＲＮＡの不活性複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出させることによって、潜伏性ＨＩＶ感染を刺激する。任意で、第２の薬剤は、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１からなる群から選択される。
【００３６】
抗レトロウィルス剤は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド類似体逆転写酵素インヒビター（ＮＡＲＴＩ）、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインヒビター、侵入抑制因子、成熟抑制因子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３７】
上述の第２の薬剤又は治療薬のいずれか（例えば、アクチノマイシンＤ又は抗レトロウィルス剤）は、本明細書で記載されている組成物との任意の組み合わせで使用され得る。薬剤組み合わせは、同時に（混合物として）、別個ではあるが逐次的に（例えば、別個の静脈内経路を介して同一の被験者に）、又は順次に（例えば、１つの化合物又は薬剤が先ず初めに投与され、続いて第２番目の化合物又は薬剤が投与される）投与される。したがって、用語「組み合わせ」は、２つ以上の薬剤の同時的、逐次的、又は順次的投与を指すように使用される。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「蛋白質」は、ペプチド結合によって結合された２つ以上のアミノ酸を意味するために広範に使用される。蛋白質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、アミノ酸配列を指すために互換的に本明細書で使用されている。用語「ポリペプチド」は、分子を含む特定の寸法又は数のアミノ酸を示すために本明細書で使用されてはおらず、本発明のペプチドは数個までのアミノ酸残基以上のアミノ酸残基を含有し得ることが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書で記載されている方法及び薬剤は、治療的処置のために有用である。治療的処置は、ＨＩＶ感染の診断後に、本明細書で記載される薬剤の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む。用語「有効量」と「有効投与量」とは、互換的に使用される。用語「有効量」は、所望の生理学的応答を生じるために必要とされる任意の量として定義される（例えば、総細胞集団の少なくとも約５０％で、潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化する再活性化剤の有効量、潜伏性ＨＩＶ感染を再活性化するために必要な再活性化剤の有効量を減少させることによって、潜伏性ＨＩＶ感染を刺激するプライミング剤の有効量、及び４〜６ヶ月以内に検出限界以下に落ちるウィルス負荷で、６週間以内に３０〜１００倍のＨＩＶウィルス負荷での減少をもたらす抗ウィルス剤の有効量）。有効量及び薬剤を投与するためのスケジュールは、経験的に決定され得、このような決定をすることは、当該技術分野の範囲内である。投与のための投与量範囲は、所望の効果（例えば、ＨＩＶ再活性化及び／又はＨＩＶ症状の軽減）を生み出すために十分に大きな範囲である。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような実質的な重篤な副作用を起こすほど大きなものであるべきではない。ＨＲＦの投与量は、例えば、アクチノマイシンＤ、アクラシノマイシン、アンフォテリシンＢ、及びＷＰ６３１のような第２薬剤の刺激投与量で減少され得る。概して、この投与量は、年齢、病状、性、疾患の型、疾患又は疾病の程度、投与の経路、又は他の薬剤がレジメンに含まれているかどうかで変化し、当業者によって決定され得る。投与量は、あらゆる禁忌の事象において個々の医師よって調節可能である。投与用は変化可能であり、毎日１回以上の投与で１日又は数日間投与されることが可能である。医薬品の所与の部類についての適切な投与量に関して、ガイダンスが文献中で確認され得る。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「治療：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、「治療する：ｔｒｅａｔ」、又は「治療すること：ｔｒｅａｔｉｎｇ」は、疾患又は病状の影響（例えば、ＨＩＶ感染）若しくは疾患又は病状の症状を低減する又は遅延させる方法（治療がＣＤ４＋Ｔ細胞での増加及びＨＩＶ−１ウィルス負荷での減少をもたらす）を指す。したがって、開示された方法では、治療は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の確立された疾患又は病状、若しくは疾患又は病状の症状の重篤性での軽減を指す。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、被験者での疾患の１つ以上の症状での１０％の軽減がある場合の治療であると考えられる。したがって、軽減とは、固有レベル又は対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１０％〜１００％の任意のパーセント軽減であり得る。治療は、疾患、病状、若しくは疾患又は病状の症状の治癒又は完全焼灼を指す必要はないことを理解されたい。
【００４１】
本発明で開示されたものは、本発明で使用され得、関連付けて使用され得、調製で使用され得る、又は開示された方法及び組成物の生成物である材料、組成物、及び成分である。これらの材料及び他の材料は本明細書に開示されていて、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物のそれぞれの種々の個々並びに集合的組み合わせ及び置換の特定の参照は、明示的に開示され得るわけではなく、本明細書にそれぞれが具体的に意図されかつ記載されていることを理解されたい。例えば、１つの方法が開示かつ説明され、方法を含むいくつかの分子へと作製され得るいくつかの修正が説明される場合、方法の組み合わせ及び置換のそれぞれ及び全て、並びに可能である修正は、内容が特に逆のことを指示していない限り、具体的に意図されている。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせもまた、具体的に意図されかつ開示されている。この概念は、限定されるものではないが、開示された組成物を使用する方法での工程が挙げられる本開示の全ての態様に適用する。したがって、実施されることが可能な様々な追加的工程がある場合、これらの追加的工程のそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法工程又は方法工程の組み合わせで実行され得ること、並びにこのような組み合わせのそれぞれ又は組み合わせのサブセットは、具体的に意図されていて、並びに開示されているものと考慮されるべきであることを理解されたい。
【００４２】
本明細書で引用した出版物及びそこで引用される材料は、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれるものとする。
実施例
実施例１：サイトカイン遺伝子の誘導がない潜伏性ＨＩＶ−１感染の再活性化
材料及び方法
【００４３】
細胞培養及び試薬：全てのＴ細胞系、並びに潜伏的にＨＩＶ−１感染した単核細胞ＴＨＰ８９ＧＦＰ細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン２ｍＭ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。ウシ胎児血清は、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）から入手し、ＨＩＶ−１再活性化を自発的に誘発しないことを確認するために、潜伏感染細胞のパネル上でテストした（Ｊｏｎｅｓら著，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：１８１〜９頁（２００７年）；Ｋｕｔｓｃｈら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７７６〜８６頁（２００２年））。フォルボールエステル１３−フォルボール−１２ミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＬＰＳ及びポリミキシンＢ−アガロースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、一方組換え体ヒトＴＮＦ−αは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。
【００４４】
使用されたＥＧＦＰレポーターウィルスＨＩＶ−１  ＮＬＥＮＧ１−ＩＲＥＳは別に記載された（Ｋｕｔｓｃｈら著，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：８７７６−８６頁（２００２年）；Ｌｅｖｙら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：４２０４−９頁（２００４年））。レポータープラスミドｐＮＦ−κＢ−ｄ２ＥＧＦＰをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から購入した。ＬＴＲ−ＧＦＰ構造及びＩＬ−８レポーター構造は、先に記載されている（Ｃｈｏｉら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：７２４−３６頁（２００２年））。ＴＮＦ−プロモーター構造を、プライマー対５’−ＢｇｌＩＩ；５’−ＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＴ−３’（配列番号２）及び３’−ＡｇｅＩ；５’−ＧＣＣＡＡＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３）によって定義されるヒトＴＮＦ−αプロモーターエレメントをｐｄ２ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローンすることで生成した。ＭＳＣＶ−ＧＦＰを、ＥＧＦＰ遺伝子をレトロウィルスｐＭＳＣＶプロベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローニングすることで生成した。
【００４５】
フローサイトメトリー：細胞培養中の感染レベルを、ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析で監視した。フローサイトメトリー解析をＧＵＡＶＡ  ＥａｓｙＣｙｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）又はＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で実行した。
【００４６】
ＢｉｏＰｌｅｘ解析：ＰＨＡ−Ｌ又はＨＩＶ−１再活性化因子（ＨＲＦ）での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激に続いて、上清サンプルを、刺激後１２時間及び４８時間の時点で収集した。予備解析は、ピークサイトカイン分泌は２４時間周辺で見られることを示した。したがって、全てのドナーからの培養上清サンプル中のサイトカインレベルを、６つのヒトサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）の同時解析のために注文製作したＭｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｍＡＰキットを使用して、２４時間の時点で決定した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でＢｉｏＰｌｅｘ解析を実行した。
【００４７】
細胞性及び核蛋白質抽出物の調製：細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ＰＳＧを補充したＲＰＭＩ培地中で、約５×１０5細胞／ｍｌまで増殖させた。細胞を遠心分離し、新鮮な予め温めた培地中に再懸濁した。ＰＭＡ、ＨＲＦ及び／又はＪＮＫｉＶを、指示された濃度で直ちに加えた。アッセイのための最終細胞密度は１×１０6細胞／ｍｌであった。培養フラスコを、３７℃で加湿ＣＯ2インキュベーター中に保持した。それぞれの時点について、１ｍＬ細胞懸濁液を除去し、テーブルトップ遠心分離機中、最高速度で３０秒間、直ちに遠心分離した。細胞ペレットを氷冷ＰＢＳの１ｍｌで洗浄し、素早く再度遠心分離し、−８０℃で凍結させた。総蛋白質抽出物を調製するために、凍結細胞ペレットを氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中に再懸濁させて、４℃で４０分間インキュベートした。サンプルを、この時間中に１０分ごとに攪拌した。１６，０００ｇで１０分間の遠心分離後に、蛋白質含有上清を注意深く取り出した。細胞性及び核蛋白質抽出物を得るために、ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞性蛋白質試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者の使用説明書に従って使用した。抽出物の蛋白質濃度を、ＢＣＡ蛋白質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。簡単に言うと、２μｌの総細胞性蛋白質抽出物及び５μｌの核蛋白質抽出物を水と混合し、９６ウェルプレート中で２５μｌの最終容量を得た。これに、混合し製造者の使用説明書に従って調製した染色試薬２００μｌを加え、３７℃で３０分〜１時間インキュベートした。５９５ｎｍでの吸光度を、９６ウェルプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ，ＢＩＯ−Ｔｅｋ：Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して決定した。
【００４８】
相対的ＮＦ−κＢ活性の直接的定量：核抽出物中のＮＦ−κＢ活性を、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手したＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＮＦ−κＢファミリーＥＬＩＳＡキットを用いて、製造者の使用説明書に従って定量した。
【００４９】
細菌単離及び同定：血液寒天プレート上での数ラウンドのクローニングの次に、フェノール抽出物を使用して、単一クローンからの細菌染色体ＤＮＡを単離した。簡単に言うと、遠心分離により細胞をペレット状にして、クロロホルム：メタノール（３：１）中に再懸濁し、攪拌した。同じ容量のＴＲＩＳ緩衝フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、ＧＴＣ緩衝液を添加する前に、混合物を攪拌した。混合の後に、サンプルを攪拌し、９，０００ｇで２０分間遠心分離した。上部相を注意深く取り出し、イソプロパノールによってＤＮＡを沈殿させて、７０％エタノールで洗浄し、真空遠心分離機中で１５分間乾燥させて、精製水１００μｌ中に再懸濁させた。プライマー対（１６ＳｒＲＮＡｆｏｒ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４）；１６ＳｒＲＮＡｒｅｖ：５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号５））を使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させた。これらと次のプライマーを、１６Ｓ  ｒＲＮＡを配列化するために使用した（Ｍａｓｓ１６ｓＦ＃２  ５’−ＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６）；ＭａｓｓＲＮＡ５  ５’−ＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号７）；及びＭａｓｓＲＮＡ４  ５’−ＧＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号８））。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、細菌をＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ（ＮＩＨ  ＢＬＡＳＴ）として同定した。３つのヌクレオチドを除いては、単離されたＨＲＦを生成するＭａｓｓｉｌｉａ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、遺伝子配列ＡＹ１５７７５９及びＡＹ１５７７６１（Ｌａ  Ｓｃｏｌａら著，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２８４７〜５２頁（１９９８年））にそれぞれ対応するＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−７０１）及び（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−７０３）の配列と同一であった。
【００５０】
細菌の成長：種々の供給源からの細菌を、５％ヒツジ血液を含有するＴＳＡ  ＩＩ寒天プレート上で単離した。次いで細菌単離物を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で成長させた。３７℃での２日間のインキュベーション後、細菌をペレット状にし、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させて、光学密度（ＯＤ６００）を８にして、小分けし、−８０℃で凍結させた。別に特記しない限り、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅは、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で成長させた。典型的には、培地を凍結保存からのＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅで接種し、０．０１のＯＤ６００にした。３７℃で４８時間後に、培養を３，２００ｇで遠心分離し、培養培地から細菌を分離した。細菌を新鮮な培地中に再懸濁させて、ＯＤ６００を８とし、参照及び保存培養として使用するために凍結させた。次いで上清を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、低蛋白質結合能力を有する０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを通過させることによって無菌化した。ＨＲＦ活性を、ＣＡ５細胞中で潜伏性ＨＩＶ−１感染を再活性化するその能力によって決定した。少なくとも６０％のＣＡ５細胞中での６μｌの再活性化感染の上清のみを、ＨＲＦ特性を試験するために用いた。
【００５１】
ＨＦＲ特性評価：ＨＲＦの化学的性質を決定するために、培養濾液を含有する１００μｌのＨＲＦを、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼの異なる量で、３７℃で１５分間処置した。酵素を、９５℃で５分間不活性化した。標準プロトコルを用いて、硫酸アンモニウム沈殿法によってＨＲＦを濃縮した。簡単に言うと、ＨＲＦ沈降のための最適な濃度を、２０％、４０％、６０％又は８０％（ｗ／ｖ）の最終濃度に硫酸アンモニウムを添加することによって決定した。４℃で１４時間後、沈降した蛋白質を、１６，０００ｇで４０分間の遠心分離によって回収した。ペレットをＰＢＳ緩衝液中で再構成させた。上清からの硫酸アンモニウムと沈降した蛋白質を、製造元の推薦に従って、３ｋＤａ分子量カットオフメンブレン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させることによって除去した。サンプルの７５％の容量がフィルターを通過した時点で、新鮮な氷冷ＰＢＳを加えた。この手法を４回繰り返した。潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５細胞は、ＨＩＶ−１再活性化のいかなる兆候も示さず、細胞培養基中で５％（ｗ／ｖ）までの硫酸アンモニウムに耐性を示した。分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）濾過手法の結果として、細胞培養中の最も高い可能性のある硫酸アンモニウム濃度は濾過としての０．３％であって、洗浄は２５６倍の希釈をもたらした。１０ｍｌの細菌培養濾液から６０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムによって、蛋白質が沈降した。ペレットを２５０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。上記のように、硫酸アンモニウムをＭＷＣＯ濾過により除去した。ペレットを２５０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。ＢＣＡ蛋白質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造業者の推薦に従って、蛋白質濃度を決定した。次いで、標準プロトコルにより、１０％のポリアクリルアミドゲル上で、１５μｇの蛋白質を分離した。
結果
【００５２】
細菌が分泌する新規ＨＩＶ−１再活性化蛋白質の同定：最初の時点で未知の細菌の細胞培養上清濾液中の蛋白質ＨＩＶ−１再活性化活性を同定した。その中でＧＦＰ発現が、ＨＩＶ−１発現の直接的かつ定量的マーカーとしての役割を果たす潜伏的ＨＩＶ−１感染レポーターＴ細胞系へのこの培養上清の添加（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：３０７８〜９３頁（２００９年））の際に、ＨＩＶ−１再活性化の高レベルが観測された。フローサイトメトリーＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって見られるような細胞生存率に及ぼす影響は観測されなかった（図１Ａ）。この細菌をクローンし、血液寒天プレート上で単離し、１６Ｓ  ｒＲＮＡが、この細菌をＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅと同定した（１，４００塩基対（ｂｐ）までにわたる９９％を超える配列相同性；図２Ａ）。単離されたＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅは、株名称ＨＲＦで、ＡＴＣＣにより２０１０年５月１８日に寄託された。この株は、ＡＴＣＣ受付番号ＰＴＡ−１０９６９と命名された。単離された細菌は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ），Ｈａｒｔｍａｎ  ＤｅＢｏｎｄ（ＨｄＢ）又はブレイン−ハートインフュージョン培地中で成育しない。後者はＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅのための推薦された成育培地である。ＡＴＣＣで寄託されているＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株のいくつかは、ＨＩＶ−１再活性化能を全く生み出さないか、又は非常に低いＨＩＶ−１再活性可能を生じるかのいずれかであり、これは、蛋白質を培養上清中に分泌するためのこれらの株の全体の減少した活性に関連している（図２Ｃ）。
【００５３】
ＨＲＦ活性は、クロロホルム及びアセトニトリル沈降によって、上清から取り除かれることが可能であった。ＨＲＦ活性は、４０％を超える硫酸アンモニウム溶液中で沈降し、水性溶液中で完全に再構成され得た。ＨＲＦ活性は、トリプシン及びプロテイナーゼＫ消化に感受性であった（図３Ａ）。ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼによる上清の処置は、ＨＲＦのＨＩＶ−１再活性化能力を阻害しなかった（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＨＲＦがポリペプチドであることを示唆していて、サイズ排除ＨＰＬＣ及び分子量サイズ排除濾過によって決定されたように、このポリペプチドは、５０〜１００ｋＤの範囲の分子量を有する（図３Ｃ）。
【００５４】
潜伏性ＨＩＶ−１感染に及ぼすＨＲＦ効果の初期特徴：先に開発された４種のテストされた潜伏感染レポーターＴ細胞系において、ＨＲＦが潜伏性ＨＩＶ−１感染を効果的に再活性化することが確認された（図１Ｂ）（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：３０７８〜９３頁（２００９年）；Ｊｏｎｅｓら著，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：１８１〜９頁（２００７年）；Ｋｕｔｓｈら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７７６〜８６頁（２００２年））。他のグラム陰性細菌、例えば緑膿菌又は大腸菌の培養からの培養上清は、これらの細胞系に及ぼす再活性化効果を有さなかった。細菌培養濾液のポリミキシンＢでの処置又はポリミキシンＢ−アガロースカラム上でのエンドトキシン除去によって立証されたように（図４Ａ）、再活性化は、濃度依存的様式で起こり、任意のエンドトキシン汚染によって誘発されなかった。更に、ＨＲＦが、潜伏的にＨＩＶ−１感染したレポーターＴ細胞系及び単核細胞レポーター細胞系（ＴＨＰ８９ＧＦＰ）における潜伏性ＨＩＶ−１感染を再活性化するが（Ｋｕｔｓｃｈら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７７６〜８６頁（２００２年））、リポ多糖、プロトタイプエンドトキシンは、潜伏的にＨＩＶ−１感染した単核細胞ＴＨＰ８９ＧＦＰ細胞におけるＨＩＶ−１感染だけを再活性化した（図４Ｂ）。
【００５５】
単離されたＭａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ株は、他の細菌（例えば、緑膿菌）とは対照的に、Ｔ細胞培養を過成長させず、細胞によって大抵は排除された。共培養においては、１×１０6個の潜伏感染Ｔ細胞の集団のうちのわずか５００個ほどの少ない細菌がＨＩＶ−１再活性化を誘発したが、一方では２５倍を超える細菌が、Ｔ細胞培養の生存率を阻害しないままであった（図５）。
【００５６】
ＨＲＦがＮＦ−κＢ活性スパイクを誘発する：ＨＲＦは、ＴＮＦα又はＰＭＡのそれと匹敵する効力で、潜伏性ＨＩＶ−１プロウィルスを活性化した。再活性化動態は、ＴＮＦ−αのそれと同様であり、ＰＭＡによる刺激に続いて見られる再活性化動態よりは迅速性で劣った。しかしながら、これらの非治療薬剤とは対照的に、ＨＲＦは、細胞培養中で細胞毒性がはるかに低く、３００を超える治療指数を示した。
【００５７】
ＮＦ−κＢ経路は、ＨＩＶ−１活性化にとって重要であると認識されているために、ＮＦ−κＢ活性化を誘発するためのＨＲＦの能力が検討された。ＨＲＦが、ＮＯＭＩレポーターＴ細胞中の一体化されたＬＴＲ−ＧＦＰ構造のＴａｔ非依存性活性を刺激する能力を有することが初めに決定された。これらの細胞において、ＴＮＦ−αとＰＭＡの双方ともに、潜伏感染細胞における有効なＨＩＶ−１再活性化を誘発するために必要な濃度に相関する濃度で、一体化されたＬＴＲ−ＧＦＰ構造のＴａｔ非依存性活性を刺激した。ＮＯＭＩ細胞において、ＨＲＦは、ＧＦＰ発現での適度な増加を生み出し、これは、潜伏感染Ｔ細胞でのＨＩＶ−１再活性化を誘発するために要求されるＨＲＦ濃度を超えるＨＲＦ濃度でのみで観察された（図６Ｂ）。更に、ＨＲＦは、ＮＦ−κＢ応答性ＩＬ−８−又はＴＮＦ−α−プロモーター、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ−ＧＦＰ構造及び２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた３つのコンセンサスＮＦ−κＢ部位の制御下にあるＧＦＰ構造が存在する構造によって駆動される弱いＧＦＰ発現を誘導した（Ｃｈｏｉら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：７２４〜３６頁（２００２年）；Ｏｃｈｓｅｎｂａｕｅｒ−Ｊａｍｂｏｒら著，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４０：９１〜１００頁（２００６年））。対照として、全てのプロモーターは、ＴＮＦ−αによって効果的に誘導された。ＴＮＦ−α及びＨＲＦのいずれも、ＮＦ−κＢ応答性要素を欠如するネズミ幹細胞ウィルスＬＴＲの制御下で構造のＧＦＰ発現に影響を及ぼさなかった（図６Ｃ）。
【００５８】
これらの機能的結果とは対照的に、分子レベルでの強力かつ速い動態によるＨＲＦは、ＮＦ−κＢ  ｐ５０及びｐ６５活性化を誘導した。Ｊｕｒｋｅｔ細胞中のＨＲＦ仲介ＮＦ−κＢ活性化は、ＰＭＡ刺激と比較した場合、ｐ５０については３倍までの増加の大きさ、並びにｐ６５についても３倍までの増加の大きさを有した。しかしながら、親型Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞中のＨＲＦ誘導ＮＦ−κＢ活性は、ＰＭＡ刺激ＮＦ−κＢ活性化と比較して、持続性で劣った（図７）。持続性ＮＦ−κＢ活性化の欠如は、なぜ細胞性プロモーターだけが弱く誘導されるかの理由を、及びなぜＨＲＦがＴａｔ非依存性ＨＩＶ−１  ＬＴＲ活性の低いレベルを誘導するかの理由を説明することができた（図６Ｂ）。しかしながら、このような低レベルＬＴＲ活性でも、Ｔａｔ発現を開始させるには十分であると思われる。初期低レベルＴａｔ生成は次いで完全なＴａｔ転写活性化を誘導し、これによって、完全なＨＩＶ−１発現への半永久的増加を促進する。ＴａｔはＮＦ−κＢ活性を刺激することが報告されているために、このことがまた、持続性高ＮＦ−κＢ活性へと導くべきであり、これは、効果的なＨＩＶ−１再活性化のための必須条件として初期に定義されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：６０４３〜５６頁（２００７年））。
【００５９】
実際に、ＨＲＦ刺激に続く潜伏性ＣＡ５  Ｔ細胞中での動的ＮＦ−κＢ活性プロファイルは、親型Ｊｕｒｋａｔ細胞に初めの４時間に見られるものと同一であり、その後ＨＲＦ誘導ＮＦ−κＢ  ｐ５０活性は、上昇レベルで安定化し、このことはＴａｔ蛋白質発現に似た第２の活性化メカニズムの開始を示唆している。
【００６０】
ＨＲＦはＰＢＭＣ中でＮＦ−κＢを刺激するが、ＨＲＦはＰＢＭＣ中でのサイトカイン誘導の適切なレベルを促進することに失敗する：ＰＢＭＣ中での潜伏性ＨＩＶ−１感染の再活性化に着眼した任意の刺激的アプローチに関する重要な問題の１つは、ＨＩＶ−１活性化が高サイトカイン血症へと強力に導くことが予想されるサイトカイン発現の誘導から切り離し得るかどうかという疑問である。これをテストするために、ＨＲＦ刺激が、Ｊｕｒｋａｔ細胞中で観察されたＮＦ−κＢ活性の同じ高ピークを誘導することが初めに決定された。実際には、初代Ｔ細胞培養を活性化するために通常使用される植物レクチンであるＰＨＡ−Ｌと比較する場合、ＨＲＦは、Ｊｕｒｋａｔ細胞で見られるものに匹敵するような（図７）、非常に高いが短い寿命のＮＦ−κＢ  ｐ５０及びｐ６５活性ピークを誘導した（図８Ａ）。飽和ＨＲＦレベルの存在下でのＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製は、感染後５日間のＨＩＶ−１複製レベルを追跡する実験で顕著には増加しなかった。しかしながら、ＰＢＭＣのＨＲＦ刺激がＮＦ−κＢ活性を誘導する一方で、ＨＲＦは炎症誘発性サイトカイン分泌（ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γ）の有意なレベルを誘導しなかった（図８Ｃ）。これらのデータは、プロモーター構造を使用する結果（図６Ｃ）を立証し、並びにＨＲＦ刺激が最小の細胞性プロモーター活性化のみをもたらすことを示唆している。
実施例２：ＨＩＶ−１再活性化剤の組み合わせ：ダクチノマイシンが、再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激する。
材料及び方法
【００６１】
細胞培養、プラスミド及び試薬：全てのＴ細胞系を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ  １６４０中に維持した。潜伏感染Ｊ８９ＧＦＰ細胞、ＣＡ５  Ｔ細胞、及びＥＦ７  Ｔ細胞は、先に記載されている（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら著，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３０７８−９３頁（２００９年））。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）から入手し、使用されるＦＢＳバッチがＨＩＶ−１再活性化を同時に誘発しないことを確認するために、潜伏感染細胞のパネル上でテストした（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら著，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３０７８−９３頁（２００９年）；Ｋｕｔｓｃｈら著，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：８７７６−８６頁（２００２年））。フォルボールエステル１３−フォルボール−１２−ミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ラバッカマイシン及びオキサリプラチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、一方組換え体ヒトＴＮＦ−αは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ダウノルビシン、α−アマニチン、ＩＲＣＦ−１９３及びカンプトテシンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｅｎ  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。５，６−ジクロロ−β−ドリボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）は、ＡＬＥＸＩＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＲＦＰバーコード化Ｊ８９ＧＦＰ細胞集団の生成のために、レトロウィルスＭＳＣＶ−ＤｓＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓプラスミドを用いた。
【００６２】
Ｊ２５７４レポーターＴ細胞：Ｊ２５７４レポーターＴ細胞を、その中でＨＩＶ−１  ＬＴＲがＧＦＰの発現を制御するＨＩＶ−１レポーター構造（ｐ２５７４）で、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をレトロウィルス形質導入することによって生成した。ＨＩＶ−１  ＬＴＲとＧＦＰ遺伝子は２，５００塩基対（ｂｐ）スペーサー要素で分離されている。２９３Ｔ細胞をｐ２５７４でトランスフェクトし、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｒｅｖ−ｔａｔをトランスに供給することによって、レンチウィルス粒子を生成した。ＶＳＶ−Ｇをウィルスのエンベロープの蛋白質として使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞のレンチウィルス形質導入に続いて、ＧＦＰを同時に発現した全ての細胞を、細胞選別法によって取り除いた。次いでＧＦＰ陰性集団をＰＭＡで活性化し、誘導可能なＬＴＲ−ＧＦＰ−ＬＴＲ統合事象が存在すると思われる全ての細胞を同定した。刺激後にＧＦＰ陽性に転じた細胞を、細胞選別法によって再度選択した。この集団におけるＧＦＰ発現は、ＧＦＰ陰性レポーター細胞の集団を数日間放置した後に自然に無くなった。この集団についての創始細胞の量が、５０，０００を超える個々の統合事象を示すように計算される。
【００６３】
グリセロール勾配沈降分析：１，０００万個のＪ８９ＧＦＰ又はＣＡ５  Ｔ細胞を未処置のまま残すか、又は０．００４μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍＬのダクチノマイシンで１８時間又は１時間それぞれ処置した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞溶解緩衝液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ８３４０；ＳＩＧＭＡ））中、氷上で３０分間、細胞溶解し、続いて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。蛋白質溶解物の同一量を、ＳＷ−Ｔｉ５５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒｔｅｎＭｉａｍｉ，ＦＬ）の溶解緩衝液中、４５，０００ｒｐｍで１６時間、５ｍｌの１０〜４５％のグリセロール勾配で分画した。分画物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割し、フッ化ポリビニリデン膜に移した。ウェスタンブロット法に使用された抗体は、それぞれウサギ抗−Ｃｄｋ９（ｓｃ−４８４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及びウサギ抗−ＨＥＸＩＭＩ（ａｂ２５３８８；Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＭＡ）であった。
【００６４】
フローサイトメトリー：細胞培養中の感染レベルを、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析によって監視した。ＦＣＭ解析を、ＧＵＡＶＡ  ＥａｓｙＣｙｔｅ（ＧＵＡＶＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｔｅｎ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及びＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で実施した。細胞選別実験を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。データ解析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又はＧＵＡＶＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＵＡＶＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）のいずれかを使用して実施した。
【００６５】
高スループット薬剤スクリーニング：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターと組み合わされたＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを使用して、ＨＴＳデータ取得を、図１に記載されたように実施した。統計的に有意なデータ解析を実行するために、十分に高い細胞計数を確実にするように、ライフゲート内での２，０００計数までの取得にシステムを調節した。このアッセイは、ＰＭＡを活性化剤として用いる、０．８３のＺ因子によって特徴付けられる。１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを用いての３つの集団についての最高に達成可能なＨＩＶ−１再活性化レベルは、９０±３％であった。ＨｙｐｅｒＶｉｅｗ（商標）Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ；Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を用いて、データ解析を実施した。ヒットの判定は、自己定義されたカラーコードによってＨＩＶ−１発現レベルでの変化を示すようプログラムされているヒートマップを使用して、可視的に実行され得る。ＨｙｐｅｒＶｉｅｗによって発生したデータを、統計的解析のために、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（ＴＩＢＣＯ；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）又はエクセル（マイクロソフト社；Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）に移した。
【００６６】
薬剤スクリーニングの目的のための化合物プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎプラットフォーム（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、親型８０，０００の化合物ライブラリー（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ；Ｓａｎ  Ｄｉａｇｏ，ＣＡ）から生成した。更に、既知の分子機能を有する薬剤／化合物の研究所内収集も使用した。
結果
【００６７】
薬剤スクリーニングアッセイ：高品質高スループット薬剤スクリーニング（ＨＴＳ）は、インビボでの治療標的を９６ウェル以上のプレート系アッセイフォーマット中に限定する主要な要素を圧縮する。この場合、単一の化合物に対して優れたＨＩＶ−１再活性化能力を有する薬剤の組み合わせを直接的に同定するために、ＨＴＳが開発された。同定される薬剤の組み合わせは、モジュレーター化合物及び温和なアクチベーターからなるものに着眼した。弱いヒットでも検出するために、フローサイトメトリーは最も敏感に読み取り可能なものを選択され、並びにアッセイは、先に報告された潜伏的ＨＩＶ−１感染Ｊ８９ＧＦＰ  Ｔ細胞（Ｋｕｔｓｈら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７７６〜８６頁（２００２年））に基づいた。Ｊ８９ＧＦＰ細胞を、ＧＦＰレポーターウィルスで潜伏的に感染させた。潜伏性状態では、細胞はＧＦＰを発現しないが、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８  ｍＡｂ組み合わせ、ＴＮＦ−α又はＰＭＡのような刺激による再活性化に続いて、細胞は、ＨＩＶ−１発現の直接的かつ定量的マーカーとしてのＧＦＰの高レベルを発現することを開始する。標的とする薬剤効果のための特異的シグナルとして用いられるＧＦＰによって、Ｊ８９ＧＦＰ細胞は、レトロウィルスＤｓＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓ（ＲＦＰ）ベクターで形質導入され、３つの別個のＪ８９ＧＦＰ集団（Ｊ８９ＧＦＰ、Ｊ８９ＧＦＰ−Ｒ、Ｊ８９ＧＦＰ−Ｒ＋＋）を生成し、これはＲＦＰに基づく蛍光バーコードによって識別可能である（図９Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞中のＭＳＣＶ−ＬＴＲ駆動遺伝子発現は、長期間の細胞培養で安定性を維持し、蛍光強度での変化による活性化に応答しないために、レトロウィルス形質導入が、ＭＳＣＶ−ＬＴＲに基づくレトロウィルスベクターを使用して、ＲＦＰを発現するために実施された。後者の特性は、化合物添加に続く蛍光バーコードの完全性を維持した。
【００６８】
モジュレーター化合物のためのスクリーニング：ＨＴＳアッセイの品質を限定するように設計された制限されたスクリーニング成果では、限定された活性を備える薬剤／化合物の広範な選択を保持する２，０００の化合物ライブラリーを使用した。薬剤スクリーニングは、単一の９６−ウェルプレート内の３つの所定のアクチベーター（ＰＭＡ、ＯＫＴ３、及びＨＲＦ（Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（１７）：８７１２〜２０頁（２０１０年））の準閾値濃度によって、再活性のために潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激することが可能であるモジュレーター化合物を同定するように設計した。最終化合物濃度を、我々の８０，０００の小さな化学的分子ライブラリー（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ）から誘導された化合物について５μＭで選択した。研究所内のライブラリーでの化合物濃度は、それぞれの化合物の既知の有効濃度に従って変化した。
【００６９】
モジュレーター化合物スクリーニングについて、１×１０5／ウェルのＪ８９ＧＦＰ、Ｊ８９ＧＦＰ−Ｒ及びＪ８９ＧＦＰ−Ｒ＋＋細胞のいずれかを保持する３つの個々の９６−ウェルプレートを調製した。化合物を個々のウェルに装填し、６時間後に、個々のプレートをアクチベーターとしてのＰＭＡ、ＯＫＴ３又はＨＩＶ−１再活性化因子（ＨＲＦ）の準最適濃度のいずれかで刺激した。それぞれのアクチベーターの濃度を、それ自体による最小ＨＩＶ−１再活性化効果を有するか又はＨＩＶ−１再活性化効果を全く有さないように調節した。化合物の添加から２４時間後に、ロボットのプラットフォームを用いて、３つの対応する個々の９６−ウェルプレートを合わせた。このプレートを、時間分解データ取得が可能であるＨｙｐｅｒＣｙｔ高スループットオートサンプラーを使用して、直ちに高スループットフローサイトメトリー解析にかけた（図９Ａ）。このセットアップにおいて、個々のサンプルについてのデータは、単一ファイルとして収集されず、時間分解データとして収集された。個々のデータセットの分離は、特殊化された解析ソフトウェア（ＨｙｐｅｒＶｉｅｗ（登録商標）Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して達成された。サンプルの細胞密度及び要求された事象の量の関数として、この技法は非常に高速で即時の多重パラメータ解析を可能にする。確立されたＲＦＰバーコードは、高スループットを達成するためのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーと一体化されたＮｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを使用する単一解析用ランで、ウェル当たりの数個の薬剤組み合わせの試験を引き続き可能にする。実験のセットアップでは、ＨＴＳフローサイトメトリーを蛍光バーコードと組み合わせることによって（図９Ｂ）、集団当たり２×１０3細胞が取得される場合、１つの９６−ウェルプレート又は２８８の薬剤組み合わせが８分以内で解析される。以下のパラメータが、主要薬剤スクリーニング中に、各プレートで決定された：各集団についてのＨＩＶ−１転写活性、ベースラインＧＦＰ発現における化合物誘導の変化、個々の蛍光痕跡によって特性化されたような各細胞集団の細胞密度（抗増殖化合物効果）、及びＦＳＣ／ＳＳＣプロットにおけるライフゲート解析によって決定されたような全体の細胞生存率（化合物毒性）。９６−ウェルサンプルプレートの結果が、図９Ｃに示されている。このシステムでのフローサイトメトリーに基づく薬剤スクリーニングの主要な利点は、使用された化合物での重度の毒性にもかかわらず、的確な効果が敏感に検出されることである。ＲＦＰバーコードによって決定される１つの集団内の活性感染（ＧＦＰ陽性）に対する潜伏性（ＧＦＰ陰性）が存在する細胞の比を決定することによってヒットが同定され得るために、アッセイは、解析される細胞の量に大きく非依存性となった。的確な効果は、大容量の化合物毒性の存在下においても検出された。
【００７０】
ダクチノマイシンが、有効な再活性化のために潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激する：最初に限定された２，０００の化合物スクリーニング中に、合計で１３のモジュレーター化合物が同定された。これらの化合物の８０％の調節活性が、確認分析によって確かめられた。興味深いことに、ＨＩＶ−１再活性化を直接的に誘発した先の薬剤スクリーニングで同定された化合物は、細胞毒性副作用の発生に関連する濃度で、ほとんどが排他的にそれらの活性を及ぼした。驚くべきことに、この薬剤スクリーニングで同定された化合物のいくつかは、いかなる細胞毒性副作用も不在の下で、それらの刺激活性を及ぼした。ＨＩＶ−１潜伏性は、限定された分子標的を提供せず、並びに薬剤スクリーニングが表現型での変化に基づいたために、それぞれの同定されたヒットについての作用のメカニズムは、個々に決定されねばならなかった。本明細書に記載されているように、強力なモジュレーター活性を有する同定されたヒットの１つのダクチノマイシンは、潜伏性ＨＩＶ−１感染へのその刺激効果を及ぼした（図１０）。潜伏感染対照細胞に対しては、ダクチノマイシンは、それ自体によるＨＩＶ−１再活性化能力を表さなかった。しかしながら、アクチベーター（ここではＴＮＦ−α）の準最適濃度との組み合わせで、それは再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染を強力に刺激した。活性化刺激の添加の前のダクチノマイシンについての前処置期間の至適処置期間を決定した。この目的のために、ダクチノマイシンを、潜伏的にＨＩＶ−１感染した細胞とＪ８９ＧＦＰ  Ｔ細胞に２、６、又は１８時間添加した。次いで細胞を、ＴＮＦ−αの準最適濃度で刺激した。この実験は、最適な前処置時間は、再活性化刺激の添加前の１８時間であることを示した。
【００７１】
ダクチノマイシンの最適濃度を同定するために、ＣＡ５  Ｔ細胞を、ダクチノマイシンの漸増濃度（０．０００１及び１μｇ／ｍｌ）で前処置し、次いでそれを未処置のまま放置するか、又はＨＲＦ又はＴＮＦ−αの準最適濃度で刺激した。ＨＲＦによる刺激についての代表的結果が図３に示されている。選択されたＨＲＦ濃度は、それ自体による最小のＨＩＶ−１再活性化効果を有する（バックグラウンドにわたって１５％再活性化）。アクチベーター添加後２４時間に、細胞生存率を同時決定することが可能なフローサイトメトリー解析を用いて、ＨＩＶ−１再活性化のレベルをＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして決定した。この実験は、両Ｔ細胞系で、ダクチノマイシンは、約４ｎｇ／ｍｌ（３．１８ｎＭ）の濃度で、潜伏性ＨＩＶ−１感染に対するその最適なプライミング効果を及ぼし、このプライミング効果は、０．５ｎｇ／ｍｌの低い濃度でも観測された。最適前処置時間は１８時間であった。最大再活性化効果は、刺激後４８時間に見られた。ＴＮＦ−α又はＰＭＡの低濃度が再活性化剤として使用された場合に、ダクチノマイシンのプライミング効果がまた観測された。
【００７２】
ダクチノマイシンがその的確な薬剤効果を及ぼす１つの機能は、ＤＮＡインターカレーションである。このために、ダウノルビシン、レベッカマイシン、オキサリプラチン又はアマサクリンのような他のＤＮＡインターカレーターの潜伏性ＨＩＶ−１感染に及ぼす効果をテストし、ダクチノマイシンによって及ぼされる潜伏性ＨＩＶ−１感染に対するプライミング効果が、ＤＮＡインターカレーターとして作用するためのそれ自体の能力に関連しているかどうかを決定した。ＤＮＡインターカレーターをＣＡ５  Ｔ細胞上に滴下し、ＨＲＦの準最適化用量による再活性化の誘発前に、種々の時間でインキュベートした。この実験は、この効果はダクチノマイシンに特異的であり、他のテストされたＤＮＡインターカレーターによって再現されなかった（１８時間の前処置でのダウノルビシンについてのデータは図１１Ｂに示されている）。このデータは、ＤＮＡインターカレーションが、再活性化のために潜伏性ＨＩＶ−１を刺激するためにダクチノマイシンによって必要とされる作用の主要モードであることは示唆していない。
【００７３】
ダクチノマイシンの第２番目に報告された阻害的機能は、ＲＮＡＰ  ＩＩを遮断するその能力であり、すなわち、ＤＮＡ中に挟まるためのその能力に関連すると思われる活性である。したがって、転写インヒビターであるα−アマニチン、ＩＲＣＦ−１９３、カンプトテシン、又は５，６−ジクロロ−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）を、再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激するそれらの能力についてテストした。無効な前処置時間によって、可能性のある化合物の効果が見落とされないことを再度確実にするために、全ての実験を、２時間及び１８時間の前処置時間を用いて実施した。いずれのインヒビターも潜伏性ＨＩＶ−１感染にプライミング効果を及ぼさなかった。ＤＲＢ及びα−アマニチンについてのデータが図１１Ｃ及び１１Ｄに示されている。転写インヒビターについて予想されたように、いずれかの薬剤の高濃度が、ＨＲＦ又はＴＮＦ−αによって誘発されたＨＩＶ−１再活性化を阻害することが確認され、並びにこの阻害活性は、細胞性転写機構の一般的阻害によって誘発される可能性がある細胞毒性の高レベルと相関した。
【００７４】
高濃度（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ以上）でのダクチノマイシンはまた、ＲＮＡＰ  ＩＩインヒビターとしてのその機能と一致している、ＨＩＶ−１発現及び再活性化のインヒビターとしての作用を開始することに注目すべきである。この効果は、薬剤毒性が発生時に観察され、これらのダクチノマイシンの濃度がまた、一般的転写に影響を及ぼすことを開始することを示唆している。（図１１Ａ参照。）
【００７５】
活性ＨＩＶ−１感染へのダクチノマイシンの影響：潜伏性ＨＩＶ−１感染事象を再活性化することによるＨＩＶ−１病原巣の根絶は、全ての新規の感染を防止するであろう治療条件下で達成されなければならない。このことは、ＨＩＶ−１再活性化剤の適用中に侵入抑制因子又は一体化抑制因子での標準ＡＲＴの増強によって達成され得る可能性が高い。それでも、新規の感染の危険性を最小にするために、活性ＨＩＶ−１感染を増強させないＨＩＶ−１再活性化薬剤を開発することは有益である可能性が高い。活性感染でプライミング効果が認められないことを確証するために、ダクチノマイシン及び一連の他のＤＮＡインターカレーター（ダウノルビシン、レベッカマイシン）並びに転写インヒビター（ＩＣＲＦ−１９３、ＤＲＢ、α−アマニチン）の効果を、活性ＨＩＶ−１感染でテストした（１２図）。この目的のために、それぞれの化合物を、２種の慢性的に活性感染したＴ細胞系（ＪＮＬＧ＃３５及びＪＮＪＧ＃４４）に、関連する濃度の範囲にわたって滴下した。これらのクローン細胞系は、ＧＦＰレポーターウィルスに感染している。化合物の添加後４８時間に、ＨＩＶ−１転写に及ぼす各化合物の効果を、ＧＦＰ平均チャンネル蛍光強度（ＭＣＦ）を定量するフローサイトメトリー解析によって決定した。ダクチノマイシンは、ＨＩＶ−１再活性化に関連する濃度で、活性感染を増強せず、むしろ活性感染を阻害した（図１２Ａ）。興味深いことに、ＨＩＶ−１再活性化を誘発しなかったいくつかの薬剤が、ＤＮＡインターカレーターのダウノルビシン又はレベッカマイシンのように、活性ＨＩＶ−１転写を増強した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。これは、報告されたＮＦ−κＢ活性を刺激するための能力の結果である可能性が高い。いずれの場合も、テストされた転写インヒビターの効果は、細胞毒性効果の不在下で顕著であった。
【００７６】
要約すると、これらのデータは、ダクチノマイシンが、活性ＨＩＶ−１感染を増強させることなく、ＨＩＶ−１再活性化のためのそのプライミング効果を達成したことを立証した。ダクチノマイシンの提案されたプライミング効果が、活性ＨＩＶ−１発現に及ぼす観察された効果を有するＤＮＡインターカレーターのような又は転写インヒビターのようなものであるという兆候はないために、これらのデータは、ダクチノマイシンのプライミング効果が、作用の異なるメカニズムによって達成されるものであることを更に示唆した。
【００７７】
潜伏性ＨＩＶ−１感染を制御する転写干渉効果へのダクチノマイシンの潜在的影響：宿主遺伝子の転写方向に対する一体化された潜伏性ウィルスの配向のセンスを観察し、配向が、再活性化のために潜伏性感染を刺激するダクチノマイシンの能力に影響を及ぼすかどうかを決定した。潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５  Ｔ細胞において、ウィルス及び宿主遺伝子を同一の転写方向で配向し、一方ＥＦ７細胞では、ウィルスを宿主遺伝子中に、逆転写方向で一体化させた（図１３Ａ及び１３Ｂ）。図１３に示されるように、それぞれの一体化シナリオで、ダクチノマイシンはそのプライミング効果を及ぼし、このことは、このプライミング効果が、潜伏性感染の制御に追加し得る転写干渉効果によって起こる可能性が低いことを示唆している。このデータは、ダクチノマイシン処置が、直接的ＬＴＲ活性化又は促進された伸長効力に導くことを、むしろ示唆した。
【００７８】
ダクチノマイシンは、潜伏性ＨＩＶ−２感染にプライミング活性を及ぼす：次に、プライミング効果がＨＩＶ−１に特異的であるかどうか又は潜伏性ＨＩＶ−２感染に対するプライミング効果があるかどうかを決定するために、潜伏性ＨＩＶ−１感染について観察されたプライミング効果を検討した。潜伏性ＨＩＶ−２感染を刺激するダクチノマイシンの能力を決定するために、ＧＦＰレポーターＴ細胞の潜伏的にＨＩＶ−２感染した集団をテストした。簡単に言うと、潜伏性ＨＩＶ−２感染集団を作り出すために、Ｊ２５７４レポーター細胞をＨＩＶ−２  ７３１２Ａで感染させて、蛍光活性化細胞選別法を用いて、活性的に感染したＧＦＰ陽性細胞を除去することによって、潜伏的ＨＩＶ−２感染細胞の集団を生成した。残存するＧＦＰ陰性集団では、ＰＭＡ刺激によって明らかにであるように、９０％を超える細胞が潜伏感染ものであった。ダクチノマイシンは、２〜８ｎｇ／ｍｌの範囲で、再活性のために潜伏性ＨＩＶ−２感染を効果的に刺激した（図１４）。対照集団におけるバックグラウンド活性感染は１％であり、更にＨＲＦの準最適用量の添加は、細胞の１０％でＨＩＶ−２再活性化をもたらした。潜伏的ＨＩＶ−２感染細胞集団の共刺激は、９０％に至る再活性化レベルをもたらした。これらのデータは、ダクチノマイシンが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の双方によって共用される転写制御の成分にプライミング効果を及ぼすことを示した。
【００７９】
ダクチノマイシンは、ＨＥＸＩＭ−１との不活性複合体からＰ−ＴＥＦｂを放出させる：潜伏性ＨＩＶ−１感染に及ぼすダクチノマイシンのプライミング効果が転写伸長のレベルで誘発されることをデータが示しているので、ダクチノマイシンがプラスの転写伸長因子（Ｐ−ＴＥＦｂ）を、ＨＥＩＭ−１とのその不活性複合体から放出させる能力を検討した。ＲＮＡＰ  ＩＩへのＰ−ＴＥＦｂ結合は、効果的な伸長を誘発する上で必須であり、ＨＩＶ−１  ＬＴＲと結合したＲＮＡＰ  ＩＩ複合体でのＰ−ＴＥＦｂの存在（サイクリンＴ１及びＣＤＫ９の複合体）が、効果的な転写伸長には必須条件であると立証されている。ＨＥＸＩＭ−１との不活性複合体からのヘキサメチレンビスアセタミド（ＨＭＢＡ）仲介Ｐ−ＴＥＦｂ放出は、ＨＩＶ−１再活性化を誘発する。ＨＭＢＡは、潜伏的にＨＩＶ−１感染したＣＡ５  Ｔ細胞においてＨＩＶ−１再活性化のいくつかのレベルを誘発させたが、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ又はＨＲＦのようなアクチベーターと比較した場合、再活性化のレベルは低かった（＜４０％）。３ｍＭでは、１５％の細胞でＨＩＶ−１は再活性化され、９ｍＭでは再活性化が３５％の細胞で誘発されたが、この濃度では、再活性化は化合物毒性の発生に相関した。それでも、準毒性濃度でのＨＭＢＡは、準最適活性化ＴＮＦ−α濃度による完全な再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染の刺激において、相対的に強力であった（図１５）。
【００８０】
ＨＥＸＩＭ−１とＰ−ＴＥＦｂとの複合体からのＰ−ＴＥＦｂ（ＣＤＫ９及びサイクリンＴ１との複合体）の放出によって、ダクチノマイシンが再活性化のための潜伏性ＨＩＶ−１感染を刺激するという見解をテストするために、潜伏的にＨＩＶ−１感染したＪ８９ＧＦＰ又はＣＡ５  Ｔ細胞を、１．０μｇ／ｍｌのダクチノマイシンで１時間、又は生理学的に最適な濃度である０．００４μｇ／ｍｌで１８時間処置した。次いで、細胞溶解物をグリセロール勾配（１０〜４５％）上で分離し、Ｐ−ＴＥＦｂ／ＨＥＸＩＭ−１複合体の組成での可能な変化を明らかにした。より高いグリセロール含量を有するグリセロール勾配分画で確認される、ＨＥＸＩＭ−１との不活性複合体（巨大複合体）からのＰ−ＴＥＦｂの放出は、より低いグリセロール含量を有する勾配分画で認められるより小さな複合体（ＣＤＫ９／ＣｙｃＴ１）へとシフトすることによって示される。それぞれの勾配分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ウェスタンブロットにかけた。Ｊ８９ＧＦＰ細胞を使用するこれらの実験の結果は、図１６に示されている。抗ＣＤＫ９抗体での染色は、１μｇ／ｍｌのダクチノマイシンで１時間のＪ８９ＧＦＰの処置は、ＰＴＥＦｂをＨＥＸＩＭ−１とのその複合体から定量的に放出させることを明らかにした。巨大複合体から小複合体までに存在するＣＤＫ９のシフトもまた、ＨＩＶ−１再活性化のための最適条件を示す処置条件下（０．００４μｇ／ｍｌのダクチノマイシンで１８時間）で検出された。抗ＨＥＸＩＭ−１抗体を使用して、同様な結果が得られた。しかしながら、ＨＥＸＩＭ−１に関しては、０．００４μｇ／ｍｌのダクチノマイシンで１８時間の最適条件で、小複合体に対するシフトは観測されなかった。小複合体に対するシフトを誘導するための最小のダクチノマイシン濃度は、０．０１μｇ／ｍｌのダクチノマイシンであった。ＣＤＫ９以外にも、対照細胞においても、ＨＥＸＩＭ−１が小複合体分画中に見出され、このことは、遊離ＨＥＸＩＭ−１が多量に存在していることを示唆し、このことは、Ｐ−ＴＥＦｂを不活性化することによって、転写の制御因子としての役割を果たすという見解と一致する。潜伏感染ＣＡ５  Ｔ細胞を使用して、同様の結果が得られた。要約すると、この実験は、ダクチノマイシンのプライミング効果が、Ｐ−ＴＥＦｂとＨＥＸＩＭ−１と複合体からのＰ−ＴＥＦｂの放出によって誘導され、これが潜伏性ＨＩＶ−１  ＬＴＲで見られる休止期のＲＮＡＰ  ＩＩ複合体による転写の伸長に導くことを示唆した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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