(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進する方法を提供する。具体的には、本発明は、細胞集団を生成する方法を提供し、この細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する。
2013536685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する、細胞集団。
【請求項２】
細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地中で、多能性幹細胞集団を、細胞集団のうち８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞集団が、アクチビンＡとＷｎｔリガンドとを用い、細胞集団のうち８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞集団が、ＧＤＦ−８と、アニリン−ピリジノトリアジン、環状アニリン−ピリジノトリアジン、Ｎ−｛［１−（フェニルメチル）アゼパン−４−イル］メチル｝−２−ピリジン−３−イルアセトアミド、４−｛［４−（４−｛［２−（ピリジン−２−イルアミノ）エチル］アミノ｝−１，３，５−トリアジン−２−イル）ピリジン−２−イル］オキシ｝ブタン−１−オール、３−（｛３−［４−（｛２−［メチル（ピリジン−２−イル）アミノ］エチル｝アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル］ピリジン−２−イル｝アミノ）プロパン−１−オール、Ｎ〜４〜−［２−（３−フルオロフェニル）エチル］−Ｎ〜２〜−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２，４−ジアミン、１−メチル−Ｎ−［（４−ピリジン−３−イル−２−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−１，３−チアゾール−５−イル）メチル］ピペリジン−４−カルボキサミド、１，１−ジメチルエチル｛２−［４−（｛５−［３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル｝アミノ）フェニル］エチル｝カルバマート、１，１−ジメチルエチル｛［３−（｛５−［５−（３−ヒドロキシプロピル）−２−（メチルオキシ）フェニル］−１，３−オキサゾール−２−イル｝アミノ）フェニル］メチル｝カルバマート、１−（｛５−［６−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル］フェニル｝アミノ）ピラジン−２−イル］チオフェン−２−イル｝メチル）ピペリジン−４−オール、１−（｛４−［６−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル］フェニル｝アミノ）ピラジン−２−イル］チオフェン−２−イル｝メチル）ピペリジン−４−カルボキサミド、及び２−｛［４−（１−メチルエチル）フェニル］アミノ｝−Ｎ−（２−チオフェン−２−イルエチル）−７，８−ジヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−６（５Ｈ）−カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも１つの他の因子と、を用い、細胞集団のうち８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの他の因子が１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
グルコース濃度が５．５ｍＭを超えない、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年８月３１日に出願された、米国特許仮出願第６１／３７８，４４８号の利益を主張するものであり、当該出願を、本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進する方法を提供する。具体的には、本発明は、細胞集団を生成する方法を提供し、この細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成するものがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞はＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓の発達は、腹側芽及び背側芽の形成より先に進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を運命づける。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００７】
一例において、ホリ（Ｈｏｒｉ）ら（ＰＮＡＳ  ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生成されたことを開示している。
【０００８】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ  １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００９】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸は、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉形成に関する予定運命を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に相当する期間中に、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘導に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３０１、２００５年）。
【００１０】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。この結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１０３０，２００４）。
【００１１】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果はアクチビンＡを１ｎＭ用いた場合に観察された。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１のｍＲＮＡ発現レベルはレチノイン酸による影響を受けなかった一方で、Ｐｄｘ１の転写レベルは３ｎＭのＦＧＦ７による処理により増加したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１２】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦ−β２によってＰＤＸ１陽性細胞がより高い比率で再現性よく得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５  Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ３β［陽性］内胚葉細胞への誘導を示した（米国特許第２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
【００１４】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ、１０３巻、１６８０６頁、２００６年）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達は、前側の原始線条の生成の際に同時に必要である」と述べている。
【００１５】
しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物内の発達プログラムを正確に模倣しない恐れがある。
【００１６】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４、１９９８年）。これと同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）。単に白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；国際公開第０１／５１６１６号）。
【００１７】
ダムールら（Ｄ’Ａｍｏｕｒ）は、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。ヒト胚幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化し得る（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１８】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１９】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚性幹細胞は、まず始めに酪酸ナトリウム並びにアクチビンＡを組み合わせて処理することで内胚葉へと分化された。次いで、ノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンを組み合わせて用い、細胞を培養し、ＰＤＸ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
よりβ細胞に類似している、機能性のインスリン発現細胞を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の開発が未だに強く求められている。本発明は、細胞集団の８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一実施形態では、本発明は、細胞集団を提供し、この細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、細胞集団のうち、８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地中で、多能性幹細胞集団を、細胞集団のうち８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞で示された、発現タンパク質についてのＦＡＣＳ解析を示す。
【図２】実施例２に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞におけるＣＸＣＲ４発現レベル（パネルＢ）並びに細胞数及び生存率（パネルＢ）に対する、培地中グルコース濃度の影響を示す。
【図３】実施例２に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞におけるＣＸＣＲ４発現レベル及び培養細胞外観写真（パネルＡ）並びにＳＯＸ１７発現に対する培地中グルコース濃度の影響を示す。
【図４】実施例２に開示される最初の方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞で示された遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ解析を示す。
【図５】実施例２に開示される第２の方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞で示された遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ解析を示す。
【図６】実施例２に開示される方法の第１日目〜第４日目に細胞を２４時間曝露させた後の各種培地のｐＨを示す。
【図７】実施例３に開示される第２の方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞で示される遺伝子発現に対する、培地中ｐＨの影響を示す。
【図８】実施例４に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞で示される遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。
【００２５】
定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００２６】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【００２７】
分化は、専門化されていない（「中立の」）又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導した細胞は、細胞系内でより専門化された（「分化決定された」）状況を示す細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞に由来するか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３１】
本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００３３】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が減少し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．））によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００３４】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉由来の細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００３５】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。
【００３６】
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。
【００３７】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらに開示される方法の通りに調製される（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。
【００３８】
多能性幹細胞の培養
一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、合成培地を使用することでこの操作が支持される。
【００３９】
一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４（２０００））に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに開示されている方法に従ってマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）。あるいは、多能性幹細胞は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：５４６〜５５６，２００３）に開示されているフィーダー細胞層の任意の１つの上で培養されてもよい。
【００４０】
一実施形態では、多能性幹細胞は、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２２１〜１２２７，２００５）に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態では、多能性幹細胞は、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５  ２３：３０６〜３１４，２００５）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：４３３〜４４０，２００４）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６，２００３）に開示されるヒトフィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：５４４〜５４９，２００５）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。
【００４１】
一実施形態では、多能性幹細胞は、米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６６４２０４８号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０１４７９９に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００７／００１００１１号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２３３４４６号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６８００４８０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０６５３５４号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。
【００４２】
一実施形態では、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０６５３５４号に開示される培養培地中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０８６８４５号に開示される培養培地中で培養されてもよい。
【００４３】
一実施形態では、多能性幹細胞は、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）に開示される方法に従って培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０１４８０７０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２４４９６２号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第２００５０８６８４５号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。
【００４４】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００４５】
他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００４６】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な希釈率にて播かれてもよい。これらの特徴のすべては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。
【００４７】
好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００４８】
多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
本発明は、多能性幹細胞集団からの、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の生成方法を提供する。一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌系マーカーを発現する細胞へと更に分化させる方法を提供する。一実施形態では、この操作は、段階的分化プロトコルを用いて実施される。このプロトコルでは、まず始めに、多能性幹細胞集団は胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。次に、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。次に、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。
【００４９】
本発明は、８０％超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。この細胞集団は更に処理されて、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成してもよい。この膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は更に処理されて、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成してもよい。
【００５０】
分化の効率は、処理した細胞集団を、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体など）に暴露することにより測定することができる。
【００５１】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、並びにイムノアッセイ、例えば、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及びインタクトな細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【００５２】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【００５３】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【００５４】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、及びＴｒａ  １−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【００５５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００５６】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００５７】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ−１  αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００５８】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３  β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００５９】
多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
本発明の一態様では、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で多能性幹細胞を培養することで、多能性幹細胞集団は胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞集団の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団への分化は、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドにより活性化処理することで実施される。
【００６０】
別の実施形態では、多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団への分化は、ＧＤＦ−８と、次の：アニリン−ピリジノトリアジン、環状アニリン−ピリジノトリアジン、Ｎ−｛［１−（フェニルメチル）アゼパン−４−イル］メチル｝−２−ピリジン−３−イルアセトアミド、４−｛［４−（４−｛［２−（ピリジン−２−イルアミノ）エチル］アミノ｝−１，３，５−トリアジン−２−イル）ピリジン−２−イル］オキシ｝ブタン−１−オール、３−（｛３−［４−（｛２−［メチル（ピリジン−２−イル）アミノ］エチル｝アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル］ピリジン−２−イル｝アミノ）プロパン１−オール、Ｎ〜４〜−［２−（３−フルオロフェニル）エチル］−Ｎ−２〜−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２，４−ジアミン、１−メチル−Ｎ−［（４−ピリジン−３−イル−２−｛［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−１，３−チアゾール−５−イル）メチル］ピペリジン−４−カルボキサミド、１，１−ジメチルエチル｛２−［４−（｛５−［３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル｝アミノ）フェニル］エチル｝カルバマート、１，１−ジメチルエチル｛［３−（｛５−［５−（３−ヒドロキシプロピル）−２−（メチルオキシ）フェニル］−１，３−オキサゾール−２−イル｝アミノ）フェニル］メチル｝カルバマート、１−（｛５−［６−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル］フェニル｝アミノ）ピラジン−２−イル］チオフェン−２−イル｝メチル）ピペリジン−４−オール、１−（｛４−［６−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル］フェニル｝アミノ）ピラジン−２−イル］チオフェン−２−イル｝メチル）ピペリジン−４−カルボキサミド、及び２−｛［４−（１−メチルエチル）フェニル］アミノ｝−Ｎ−（２−チオフェン−２−イルエチル）−７，８−ジヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−６（５Ｈ）−カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも１つの他の因子とで多能性幹細胞を処理することで実施される。使用に好適な因子の例は、米国特許出願公開第１２／４９４，７８９号に見ることができる。一実施形態では、少なくとも１つの他の因子は１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンである。
【００６１】
多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で約１日〜約７日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で約１日〜約６日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で約１日〜約５日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で約１日〜約４日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えない培地で約４日間にわたって培養することができる。
【００６２】
一実施形態では、ＧＤＦ−８は約５ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−８は約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−８は約５ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−８は約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００６３】
アクチビン−Ａは、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【００６４】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【００６５】
Ｗｎｔリガンドは、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、Ｗｎｔリガンドの濃度は約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００６６】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
一実施形態では、本発明の方法により生成された胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野の任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。
【００６７】
例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００６８】
例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００６９】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成
一実施形態において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当技術分野における任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。
【００７０】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７１】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７２】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７３】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７４】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許第６０／９５３，１７８号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７５】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。
【００７６】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化における培地及び播種プロトコルの役割
継代数４１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４１）をＴｒｙｐＬＥ（カタログ番号１２６０４−０１３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ））により剥離させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングしたディッシュ（１：３０希釈）で、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（カタログ番号１００−１８Ｂ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＮＪ））及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）に、個別の細胞として密度１００，０００個／ｃｍ２で播種した。
【００７８】
並行して、継代数４１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、Ｄｉｓｐａｓｅ（カタログ番号１７１０５−０４１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）により剥離させ、細胞コロニーとして、継代比１：３で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングしたディッシュ（１：３０希釈）内の２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加したＭＥＦ−ＣＭに播種した。単細胞に分散させた状態での細胞培養及びコロニー状態での培養のいずれについても、播種後２４時間及び４８時間で、培地を２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した新鮮なＭＥＦ−ＣＭ培地と交換した。
【００７９】
播種後７２時間で、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた：
ａ．追加で０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有させ、２％脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加えて２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日、次に追加で０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムと２％のＢＳＡ、Ｇｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１で３日間培養した（条件１）、又は
ｂ．２％脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加えて２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号２２４００−１０５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日間、次に２％のＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、更に３日間、毎日同様の培地で培地交換して培養した（条件２）。
【００８０】
４日目にＦＡＣＳ解析に備えて試料を回収した。図１では、ＣＸＣＲ４及びＣＤ９発現に関してのフローサイトメトリー結果を、Ｙ軸はＣＸＣＲ４発現をプロットしＸ軸はＣＤ９発現をプロットする分散プロット形式で示す。ＣＸＣＲ４、ＣＤ９、及びＣＤ９９（他の分化マーカー）を発現する細胞の割合を表１に要約する。細胞表面マーカーＣＸＣＲ４及びＣＤ９９の発現の増加により測定される分化は、ＭＣＤＢ−１３１培地を使用した場合に改善され、ＣＸＣＲ４及びＣＤ９９の発現は、コロニー形態で培養する形式から単細胞を培養する形式へと変化させた場合に更に上昇した。更に、これらのデータは、フローサイトメトリーにより測定されたＣＤ９の発現低下と相関した。ＣＤ９は未分化の細胞に関する細胞マーカーである。
【００８１】
興味深いことに、図１において、クラスタ又はコロニー形式の形態のいずれかでＭＣＤＢ−１３１を使用した場合、どちらのマーカーも陰性（ＣＸＣＲ４−／ＣＤ９−）である細胞はより少なくなることが示された。すなわち、ＭＣＤＢ−１３１培地で処理した培養物中には、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現していない細胞は、より少なかったことが示された。総じて、これらのデータは、Ｈ１ヒト胚性幹細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地よりもＭＣＤＢ−１３１培地の存在下でより効率的に分化し、かつＭＣＤＢ−１３１の分化は、細胞をコロニー形式で播種及び培養するよりも、単細胞として播種及び培養することでより改善され得ることを意味する。
【００８２】
【表１】
2013536685.tif 000003
【００８３】
（実施例２）
ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるグルコースの役割
グルコースは可溶性のヘキソース糖であり、Ａｍｅｓ’培地；イーグル基本培地（ＢＭＥ）；Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ変法ＢＧＪｂ培地；Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地；ＣＭＲＬ−１０６６培地；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ−１２栄養培地（５０：５０）；Ｃｏｏｎ’ｓ変法Ｆ−１２培地；Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地；Ｈ−Ｙ培地（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標））；Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）；ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ改変培地；ＭＣＤＢ培地；培地１９９；イーグル最少培地（ＥＭＥＭ）；ＮＣＴＣ培地；ＨａｍＦ−１０栄養培地；ＨａｍＦ−１２栄養培地；Ｋａｉｇｈｎ変法ＨａｍＦ−１２栄養培地（Ｆ１２Ｋ）；ＲＰＭＩ−１６４０；無血清／無タンパク質ハイブリドーマ培地；Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地ＭＢ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ並びに各種専用培地など、ほとんどすべての細胞培養培地に添加される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ−ｅｘｐｅｒｔ／ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００８４】
細胞培養培地に含まれるグルコース濃度は異なる。ＭＣＤＢ系の培地では、グルコースは３．９〜１０ｍＭの範囲の濃度で含有され、ほとんどの培地は１ｇ／Ｌ（５．５ｍＭ）〜１０ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）の範囲の濃度でグルコースを含有するのに対し、ＲＰＭＩ−１６４０はグルコースを１１ｍＭ含有する。１０ｍＭのグルコース濃度は、細胞培養系では、糖尿病条件と類似する。ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞及び分子に影響を及ぼすものと同様の工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても生じ得ることから、この濃度の類似性は重要である。本質的に糖尿病性のものである条件下で細胞を増殖させると、細胞及び細胞産物は糖化及び糖酸化（glyoxidation）過程により変更を受け、グルコースに介在される酸化及びカルボニルストレスにより損傷を受ける恐れがある。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ−ｅｘｐｅｒｔ／ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００８５】
現在、胚性内胚葉の生成に使用されている培地としては、例えば２５ｍＭのグルコースを含有しているＩｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｋｕｂｏら；Ａｐｒｉｌ  １，２００４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２）、１１ｍＭのグルコースを含有しているＲＰＭＩ（Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｄｅｃ；２３（１２）：１５３４〜４１）又は１７．５ｍＭのグルコースを含有しているＤＭＥＭ−Ｆ１２が挙げられる。これらの各培地のグルコース濃度は糖尿病性の条件と同様１０ｍＭを超える。これらを踏まえ、我々は、高グルコース培養培地により細胞に生じ得るストレスを減少させるために、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる際にグルコース濃度を１０ｍＭよりも低くすることを試みた。グルコース濃度が１０ｍＭよりも低い培地としては、例えば、基本的にグルコース濃度が５．５ｍＭであるＭＣＤＢ−１３１が挙げられる。
【００８６】
継代数４１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４１）をＴｒｙｐＬＥ（カタログ番号１２６０４−０１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）により剥離させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングしたディッシュ（１：３０希釈）で、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（カタログ番号１００−１８Ｂ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ））及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ））を添加したＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）に、個別の細胞として密度１００，０００個／ｃｍ２で播種した。播種後２４時間及び４８時間の時点で、培地を２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有させた新鮮なＭＥＦ−ＣＭと交換した。７２時間後、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた。
【００８７】
ａ．２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）と使用濃度のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）と２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）と、０、５、１０、１５、２０、又は２５ｍＭのいずれかの濃度のグルコース（カタログ番号Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）培地で１日培養し、次に
ｂ．２％のＢＳＡと重炭酸ナトリウムとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと、０、５、１０、１５、２０、又は２５ｍＭのいずれかの濃度のグルコースを添加したＭＣＤＢ−１３１培地で更に３日間培養した。
【００８８】
４日目に、ＦＡＣＳ解析、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析、並びにＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）（Ｇｕａｖａ（登録商標），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）による細胞計数のために、試料を回収した。実施例１で得られた結果と同じく、多能性幹細胞から胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた細胞は、胚体内胚葉系に関連するマーカーを強く発現していた（図２Ａ）。培地に添加されるグルコース濃度が０、５、１０、１５、２０、又は２５ｍＭ（それぞれ最終濃度：５．５、１０．５、１５．５、２０．５、２５．５，又は３０．５ｍＭ）である場合、図２Ｂに示す通り、更に１０ｍＭのグルコース（最終グルコース濃度１５．５ｍＭ）で処理した試料において、細胞数の最も穏やかな増加が観察された。図２Ａに示す通り、更に５ｍＭグルコース（最終グルコース濃度１０．５ｍＭ）を添加した場合、細胞ではＣＸＣＲ４発現の中程度の増加が観察された。しかしながら、細胞数及びＣＸＣＲ４の増加は、合計細胞生存率の低下により相殺された（図２Ｂ）。
【００８９】
基本濃度のグルコース（５．５ｍＭ）では、培養物中のほとんどすべての細胞がＳＯＸ１７陽性であり、細胞は培養皿中に均一に分散していた（図３Ａ及びＢ）。グルコース濃度を増加させると、細胞は、ＳＯＸ１７の高発現を維持しつつもクラスタを形成するようになったことが観察された。これらのクラスタを形成している細胞は、基本濃度のグルコースで培養した細胞集団と比べ、培養皿表面に不均一に分散していた。この影響は、クラスタを形成した細胞において、未分化細胞の細胞マーカーＣＤ９及びＯＣＴ４、並びに胚体外外胚葉の細胞マーカーＳＯＸ７の発現が僅かに上昇し、かつホメオボックスＨＢ９（ＨＬＸＢ９）としても公知である膵臓ホメオボックス１（ＭＮＸ１）の遺伝子発現が減少したことと相関した（図４）。
【００９０】
５．５ｍＭ（低）又は２５ｍＭ（高）のいずれかの濃度でグルコースを含有させたＤＭＥＭ（カタログ番号１０５６７−０１４及び２１０６３−０２９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で分化させた培養物においても、グルコース濃度に相関して同様の影響が観察された。上記のように、対照については、細胞は単細胞として播種し、ＭＥＦ馴化培地で３日間培養し、５．５ｍＭ若しくは２５ｍＭのグルコースを添加したＭＣＤＢ−１３１培地、又は２％の脂肪酸不含ＢＳＡと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａとを添加した高若しくは低グルコースＤＭＥＭ培地で１日分化させ、続いて２％脂肪酸不含ＢＳＡと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加した日用培養培地と交換して更に３日間培養した。
【００９１】
ＭＣＤＢ−１３１培地により得られた結果、すなわち、グルコース濃度を上昇させることで、低濃度のグルコースで培養した場合と比較して胚胎内胚葉形成が阻害されるという結果と同様、ＤＭＥＭ中のグルコース濃度を上昇させた場合にｈＥＳ細胞の分化が低下することが観察された。胚体内胚葉への分化後のフローサイトメトリーによると、５．５ｍＭグルコースを含有している培地では細胞の８８．６％はＣＸＣＲ４陽性であったのに対し、２５ｍＭグルコースを含有している培地ではＣＸＣＲ４陽性細胞は８０％であった。加えて、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＳＯＸ１７）により測定したところ、高グルコースの細胞供給培地では、低グルコースの細胞供給培地と比べ、胚体内胚葉への分化マーカーが減少した一方で、未分化の細胞（ＯＣＴ４）又は別の分化運命（ＣＤＸ２）に関するマーカーが増加していた（図５）。この影響は、４日間の分化工程において分化を開始して４８時間後に培地ｐＨが低下したと我々が指摘する培地ｐＨの変化に少なくとも部分的に起因した。更に、胚体内胚葉生成の開始及び終了時の培養培地のｐＨが高くなる程（８．１＞ｐＨ＞７．６）（図６）、より完全に胚体内胚葉へと変換された。
【００９２】
要約すると、我々の示す結果により、細胞の８０％超が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成するにあたり、基本濃度のグルコース（５．５ｍＭ）を分化培地に含有させれば十分であることが示される。分化培地に含まれるグルコース濃度を１０．５ｍＭに増加させた場合、この濃度は同様の集団を生成するのに十分な濃度であったものの、グルコース濃度が１０．５ｍＭを超えると、多能性／未分化度を示すＣＤ９若しくはＯＣＴ４などのマーカーの発現が増加する、又は別の分化運命／胚体外外胚葉に関連付け得られるＳＯＸ７若しくはＣＤＸ２などのマーカーの発現が増加する恐れがある。
【００９３】
（実施例３）
ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるｐＨ調整の役割
継代数４６のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４６）を、Ｄｉｓｐａｓｅ（カタログ番号１７１０５−０４１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）により剥離させ、細胞コロニーとして、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）コーティングしたディッシュ内の、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加したＭＥＦ−ＣＭに継代比１：３で播種した。次の通りに胚体内胚葉（ＤＥ）への分化を開始するまで、毎日この培地を２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した新鮮なＭＥＦ−ＣＭと交換した：
ａ．２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加えて２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）培地で１日培養し、続いて２％のＢＳＡとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１で更に３日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した；又は
ｂ．更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有させ、２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加え２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＭＣＤＢ１３１培地で１日間培養し、続いて更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムを含有させ、２％のＢＳＡとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１で更に３日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。
【００９４】
４日目に、ＦＡＣＳ解析、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析、並びにＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）（Ｇｕａｖａ（登録商標），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）による細胞計数のために、試料を回収した。実施例２で示す通り、我々は、分化培地のｐＨを比較的より酸性のもの（ｐＨ７．６未満）にすることで、分化指向性が低下しかつ他の分化指向性が増加することに起因して、ＣＸＣＲ４発現が低下し得ることに気づいた。
【００９５】
この効果がｐＨによるものなのか試験するために、我々は公開濃度の１ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有させたＭＣＤＢ−１３１基本培地で細胞を分化させ、並びに重炭酸塩濃度３．７ｇ／ＬのＤＭＥＭで細胞を分化させた。細胞表面マーカーＣＸＣＲ４の発現の増加とＣＤ９の発現の低下により分化を測定したところ、緩衝剤を使用することで分化が改善されることが観察された。緩衝剤として３．７ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを添加したＭＣＤＢ−１３１培地で分化させた細胞では、重炭酸ナトリウムを基本濃度（１ｇ／ｌ）で含有させたＭＣＤＢ−１３１で分化させた細胞と比較して、有意にＣＸＣＲ４の発現レベルが高くかつＣＤ９の発現レベルは低かった（図７Ａ及びＢ）。これは、ＭＣＤＢ−１３１培地のｐＨが７．５であり、かつ２．７ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを添加することでｐＨが７．６に上昇していたことに一部起因する。
【００９６】
更に、分化の終了時には、ｐＨ指示薬のフェノールレッドを含有させた未分化培地で増殖させた培養物の培地では、有意に黄色みが増し、酸性が増していたのに対し、重炭酸ナトリウムを添加し緩衝化させた培地で培養させた培養物は赤色を保持していた。これらの結果により、培地のｐＨを７．６以上に上昇させることで多能性幹細胞から胚体内胚葉へのより効率的な分化が促進され、また、培地のｐＨを上昇させかつ安定させるには、重炭酸塩系の緩衝剤の代わりに、限定するものではないが、ＣＯ２濃度を増加させたインキュベータ、並びにＨＥＰＥＳ又はリン酸などのその他の可溶性緩衝系を使用することができることが示される。
【００９７】
（実施例４）
ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるＲＰＭＩ−１６４０又はＭＣＤＢ−１３１培地並びにＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのアクチビンＡ及びＧＤＦ−８の役割
継代数４７のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ｐ４７）をＴｒｙｐＬＥ（カタログ番号１２６０４−０１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）により剥離させ、単細胞として、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティングしたディッシュ（１：３０希釈）内の、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（カタログ番号１００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）及び３μＭのＨ−１１５２，ｇｌｙｃｙｌ（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤，カタログ番号５５５５５４，ＥＭＤ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を添加したＭＥＦ−ＣＭ（マウス胚性線維芽細胞馴化培地）に、密度１００，０００個／ｃｍ２で播種した。
【００９８】
播種後７２時間で、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた：
ａ．更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有させ、２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加え２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日間培養し、次に更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムと２％のＢＳＡとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＭＣＤＢ−１３１で３日間培養した。
【００９９】
ｂ．更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有させ、２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）、１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加え２．５μＭのＧＳＫ３Ｂ阻害剤１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンを添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日間培養し、次に、更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムと２％のＢＳＡとＧｌｕｔａｍａｘと１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８を添加したＭＣＤＢ−１３１で３日間培養した。又は
ｃ．更に０．００２５ｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有させ、２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１ＸのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）と１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＭＣＤＢ−１３１（カタログ番号１０３７２−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で４日間培養した。又は
ｄ．２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加え２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号２２４００−１０５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日間培養し、次に２％のＢＳＡと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、更に３日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。
【０１００】
ｅ．２％の脂肪酸不含ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）と１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に加え２．５μＭのＧＳＫ３Ｂ阻害剤１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンを添加したＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号２２４００−１０５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で１日間培養し、次に２％のＢＳＡと１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、更に３日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。
【０１０１】
４日目に、ＦＡＣＳ解析並びにｑＲＴ−ＰＣＲに備えて試料を回収した。表２に、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９、及びＣＤ９９（その他の分化マーカー）を発現する細胞の割合を要約した。細胞表面マーカーＣＸＣＲ４の発現の増加により測定された分化は、ＲＰＭＩ−１６４０を使用した場合よりもＭＣＤＢ−１３１培地を使用した場合の方が改善され、ＣＸＣＲ４の発現は、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａを使用した場合よりも、ＧＤＦ−８とＧＳＫ３Ｂを組み合わせて使用した場合に更に上昇した。ＭＮＸ−１遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＭＣＤＢ−１３１培地を使用した場合に、ＲＰＭＩ−１６４０よりも分化が改善され、また、ＧＤＦ−８とＧＳＫ３Ｂ阻害剤と組み合わせて使用した場合に、アクチビンＡとＷｎｔ３ａを併用した場合よりも分化が改善されるという同様の結果が観察された（図８）。更に、これらのデータは、フローサイトメトリーによって測定された、未分化の細胞に関する細胞マーカーのＣＤ９発現の低下（表２）、又はｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された、ＯＣＴ４及びＣＤ９の発現の低下（図８）と相関した。これらのデータは、Ｈ１ヒト胚性幹細胞の分化は、ＲＰＭＩ−１６４０培地よりもＭＣＤＢ−１３１培地の存在下でより効率的であり、かつＭＣＤＢ−１３１での分化効率は、細胞をＧＤＦ−８とＧＳＫ３Ｂ阻害剤の存在下で分化させることで、アクチビンＡとＷｎｔ３ａを用い分化させた場合よりも更に改善できることを意味する。
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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