(57)【要約】本発明は、注意力欠陥・多動性モデルマウス、ならびにそれを用いた集中力障害疾病の予防及び治療用組成物のスクリーニング方法に関する。より詳細には、コバルト線を前頭葉の右側に挿入した動物モデルが注意力欠陥・多動性モデルマウスとして有用であり、前記動物モデルにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤のひとつであるエトスクシミドを投与することで、集中力障害の特徴である低い周波数の脳波、過剰行動、及び認知機能の低下が観察される結果を通じて、注意力欠陥・多動性モデルマウスを用いて集中力障害治療剤のスクリーニングに活用することができ、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害の予防及び治療に有用に使用できることを確認した。2013531994.tif 000005
2013531994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）コバルト線（ｃｏｂａｌｔ  ｗｉｒｅ）をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項２】
コバルト線が、直径４００〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項３】
コバルト線が、放射状（ｒａｄｉａｌ）方向に、右側の背側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の２．０〜３．０ｍｍ、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の１．５〜２．５ｍｍ、及び腹部方向（ｖｅｎｔｒａｌ）の１．０〜２．０ｍｍの位置に挿入することを特徴とする、請求項１に記載の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項４】
１）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法。
【請求項５】
１）被検化合物または組成物を請求項１に記載の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を、被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、脳波のスパイク（ｓｐｉｋｅ）数が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、精神分裂症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、前頭葉てんかん（Ｆｏｒｎｔａｌ  ｌｏｂｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、及び自閉症（ａｕｔｉｓｍ）からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項５に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
１）被検化合物または組成物を請求項１に記載の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの行動障害または認知機能を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、行動障害または認知機能が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
行動障害が、常同症であることを特徴とする、請求項７に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
認知機能が、恐怖学習機能記憶検査を通じて測定されることを特徴とする、請求項７に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１１】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが、α１Ｇ  Ｔ  カルシウムチャンネルであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１２】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１３】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）、テトラメスリン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｒｉｎ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、フェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ）、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピン（ｅｆｏｎｉｄｉｐｉｎｅ）と、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール（ｐｅｎｆｌｕｒｉｄｏｌ）、フルスピリレン（ｆｌｕｓｐｉｒｉｌｅｎｅ）及びバルプロエイト（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１４】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１５】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１６】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１７】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１８】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１９】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２０】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１９に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２１】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１９に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２２】
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミドであることを特徴とする、請求項１９に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２３】
集中力障害治療剤スクリーニングのための、請求項１に記載のマウスの使用。
【請求項２４】
集中力障害疾病治療剤の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
【請求項２５】
集中力障害疾病改善用健康食品の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
【請求項２６】
集中力障害疾病改善用飼料添加剤の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
【請求項２７】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項２３〜請求項２５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コバルト線を挿入して作製された注意力欠陥・多動性モデルマウス、それを用いた集中力障害疾病の予防及び治療用組成物のスクリーニング方法、及び集中力障害疾病の治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
注意力欠陥・多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ、以下ＡＤＨＤ）は、学齢期前後の児童からよく現れる精神科的疾患で、不注意（Ｉｎａｔｔｅｎｔｉｏｎ）、過剰行動（Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）、衝動性（Ｉｍｐｕｌｓｉｖｉｔｙ）が主な症状である。このような注意集中不足と過剰活動は、児童の学習障害を含む多様な心理社会的障害を伴い、青少年期の非行や逸脱行動、成人期には薬物濫用及び犯罪などを惹起させる原因になり得ることが報告された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００３】
注意力欠陥・多動性障害の原因には、遺伝的要因（非特許文献４）、鉛数値とインスタント食品の食品添加物に対する反作用と見る生化学的要因（非特許文献５）、脳に伝達する刺激を適切に選択するのに問題があるとする見解（非特許文献６）、環境的要因すなわち親子関係や親の社会的地位、妊娠中の産婦の喫煙とアルコール濫用などがある。しかし、社会心理的な要因より神経生物学的要因が重要であると考えられていて、それにしたがって注意力欠陥・多動性障害治療のための治療剤及び生物学的要因に対する研究が活発に進められている。
【０００４】
神経解剖学的には前頭葉の異常、神経生化学的には中枢神経系の神経伝達物質の異常が研究され、神経生物学的には前頭前皮質（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）、視床（ｔｈａｌａｍｕｓ）、ドーパミン中脳皮質突起（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｍｅｓｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）の機能異常に関して研究された。特に、生物学的要因の単一の神経系の発達異常よりは、高度認知機能を担当する多くの脳領域の相互関連性の異常によって招来される非均一的な疾患群である可能性が示されている（非特許文献７、非特許文献８）。最近までの注意力欠陥・多動性障害患者を対象にした構造的、機能的脳映像研究によると、概してＡＤＨＤの病態生理が前頭葉−線条体回路（ｆｒｏｎｔｏ−ｓｔｒｉａｔａｌ  ｔｒａｃｔ）の機能障害と関連していて、メチルフェニデート（ＭＰＨ）による薬物効果は、この領域でのドーパミン系の機能変化と関連していることが報告されている（非特許文献９、非特許文献１０，非特許文献１１）。しかし、注意力欠陥・多動性障害が発生する正確な原因は、明らかにされず、前記の原因が複合的に作用して発生すると推定されている（非特許文献１２）。
【０００５】
注意力欠陥・多動性障害の症状は、ドーパミン性神経調節の他にも前頭葉の神経回路を調節するノルアドレナリン性神経調節と関連がある。ＡＤＨＤの行動が、ノルアドレナリン性神経調節とドーパミン性神経調節の間に不均衡に招来されるという研究も報告されたことがある。包括的には、グルタミン酸作動性ニューロンとＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）作動性ニューロンを支配するカテコラミン類がシナプス後部に及ぼす影響力が減少することによると推定されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００６】
注意力欠陥・多動性障害の治療剤に最もよく使用される薬物は、中枢神経興奮剤であり、国内ではメチルフェニデートを成分とするリタリン、メチルフェンなどが使用されている。このような薬物は、不注意、過剰行動及び衝動性緩和に短期的な効果を示すことが知られているが、長期的な効果は検証されなかった（非特許文献１５）。
【０００７】
注意力欠陥・多動性障害のような集中力障害疾病には、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症がある。これらの共通的な特徴として、多動性症状と前頭葉で増加した低い振動数の神経振動がある（非特許文献１５）。
【０００８】
エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤であって、てんかん治療剤として使用された。その他にも、「Ｔ―タイプカルシウムチャンネルを抑制して不安障害を治療する方法（特許文献１）」で、エトスクシミドが含まれる組成物を不安障害治療に使用したことが報告されているが、集中力障害疾病の治療剤として使用されたことは報告されたことがない。前記発明に記載した不安障害は、前頭葉と扁桃体を中心に形成される恐怖に対する記憶形成に問題が起こる症状で、このような機能の異常は、恐怖障害（ｐｈｏｂｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、全般性不安障害（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ａｎｘｉｅｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、強迫障害（ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、外傷後ストレス障害（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、身体化障害（ｓｏｍａｔｏｆｏｒｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、解離性障害（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）及び虚偽性障害（ｆａｃｔｉｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）などで多く発見される。不安障害は、感情と記憶を担当する脳の構造的な問題点にしたがって発生するので、注意力欠陥・多動性障害と差異がある。前記発明は、感情と記憶を生成するメカニズムを理解して新しい治療剤を開発するのに役立つ発明である。
【０００９】
しかし、本発明は、注意力欠陥・多動性障害に対する理解に基づいている。本発明者が発見したのは、記憶と感情の生成ではない集中力の生成過程を理解することに基づいている。集中力の生成過程は、多くの研究者らの努力にもかかわらず、まだ明らかにされたことがほとんどないのが実情である。集中力欠損障害は、注意力欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）のみならず、精神分裂症、前頭葉てんかん、自閉症などでも代表的に観察される症状である。そして、このような集中力障害は、人が社会的に適応するのに大きな障害物と作用しているのが実情である。また、過剰行動障害症状でみられる注意力欠陥・多動性と常同症（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃ）は、やはり精神分裂症でも報告されていて、前頭葉でのみ観察される低い振動数の脳波もまた、二つの疾病でともに発見されている。また、臨床事例報告書で患者において前記二つの疾病の様相が一緒に報告される場合が多くある。このような結果を基に、過剰行動障害で見られる集中力障害と精神分裂症で見られる集中力障害は、共通した機序を有していることもあり得ると予想することができる。
【００１０】
そこで、本発明者らは、コバルト線を脳に挿入した動物モデルを作製して、前記動物モデルの前頭葉で、注意力欠損障害で観察される低い周波数の電気的興奮、行動障害、及び認知機能の低下を観察し、またこのような注意力欠損障害の具体的な機序を確認するために、Ｔ−タイプカルシウムチャンネルノックアウトマウスと視床核局所的にＴ−タイプカルシウムチャンネルを除去した動物モデルを通じて、Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが過剰行動と低い振動数の周波数を調節するのに関与することを確認し、併せて本発明の注意力欠陥・多動性モデルマウスにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤であるエトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、及びフェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ）を投与することで、前頭葉で発生するスパイク（ｓｐｉｋｅ）形状の脳波が減少する結果を通じて、本発明のコバルト線が挿入された動物モデルは、注意力欠陥・多動性モデルマウスとして有用であり、これを用いて集中力障害治療剤をスクリーニングすることができ、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を注意力欠損障害治療用組成物として使用することができることを明らかにして、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許１０−０９５８２９１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙ．Ｂ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．Ｓｈｉｎ，Ｋｏｒｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｏｃｉａｌ  ｗｏｒｋ，２０００年
【非特許文献２】Ｇ．Ｄ．Ｋｅｗｌｅｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８年
【非特許文献３】Ｌ．Ｂ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２年
【非特許文献４】Ｒ．Ａ．Ｂａｒｋｌｅｙ．Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：Ａ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ．１９９０年
【非特許文献５】Ｇ．Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｎｅａｌ，Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｒｙ  ＆ Ｓｏｎｓ．１９７６年
【非特許文献６】リー・ヒョシン、情緒学習障害研究．１６
【非特許文献７】Ｙ．Ｆｒａｎｋ，Ｓ．Ｇ．Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．，２００１年
【非特許文献８】キム・ブンニョン、リー・ドンス、ゾ・スチォル、神経精神医学、２０００年
【非特許文献９】Ｍ．Ｈ．Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，２０００年
【非特許文献１０】Ｊ．Ｂ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｄ．Ｏ．Ｌｅｅら，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００３年
【非特許文献１１】Ｅ．Ｙ．Ｏｈ，Ｉ．Ｈｗａｎｇら，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｓｏｃ．  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉ．，２００３年
【非特許文献１２】Ｈ．Ｍａｎｇ，Ｈ．Ｃｈｕｎｇ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ．，２００５年
【非特許文献１３】Ｔ．Ｓａｇｖｏｌｄｅｎ，Ｔ．Ｘｕ．Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｆｕｎｃｔ．４，２００８年
【非特許文献１４】Ｅ．Ｂ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ．Ｋｉｌｌｅｅｎら，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｆｕｎｃｔ．３，２００７年
【非特許文献１５】Ｓ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ａｈｎ，Ｙ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ａｓｓｏｃ．４，ｐｐ６８３−６９９，１９９８年
【非特許文献１６】Ｃａｌｌｉｃｏｔｔら，２０００年；Ｍａｎｏａｃｈら，２０００年，Ｂａｒｒｙら，２００３年；Ｗｉｅｎｂｒｕｃｈら，２００３年；Ｖｅｒｋｈｌｉｕｔｏｖら，２００６年；Ｙｏｏｎら，２００８年；Ｋｕｍａｒｉら，２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、コバルト線（ｃｏｂａｌｔ  ｗｉｒｅ）を脳に移植した、注意力欠陥・多動性モデルマウスを提供することである。
【００１４】
また、本発明の目的は、注意力欠陥・多動性モデルマウスを用いて集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【００１５】
併せて、本発明の目的は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む、集中力障害の予防及び治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、コバルト線を脳に移植した注意力欠陥・多動性モデルを提供する。
【００１７】
また、本発明は、下記の工程を含む注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法を提供する。
１）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
で製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法。
【００１８】
また、本発明は、下記の工程を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１）被検化合物または組成物を本発明による注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、脳波のスパイク数が減少した被検化合物または組成物を選別する工程。
【００１９】
また、本発明の目的は、下記の工程を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１）被検化合物または組成物を本発明による注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの行動障害または認知機能を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、行動障害または認知機能が減少した被検化合物または組成物を選別する工程。
【００２０】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び治療用組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品を提供する。
【００２２】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤を提供する。
【００２３】
また、本発明は、集中力障害治療剤のスクリーニングのための本発明による注意力欠陥・多動性モデルマウスの使用を提供する。
【００２４】
また、本発明は、集中力障害疾病治療剤の製造のためのＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【００２５】
また、本発明は、集中力障害疾病改善用健康食品の製造のためのＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【００２６】
同時に、本発明は、集中力障害疾病改善用飼料添加剤の製造のためのＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のコバルト線を挿入した動物マウスは、集中力障害の特徴である低い周波数の増加した電気興奮、過剰行動、及び認知機能の低下が観察されるので、これを注意力欠陥・多動性モデルマウスとして有用に使用することができ、前記症状を共通して示す集中力障害疾病治療剤のスクリーニングに有用に使用することができる。また、前記注意力欠陥・多動性モデルマウスモデルに、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤のひとつのエトスクシミドを投与することで、脳波で観察されるスパイク数が減少するので、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害疾病治療用に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】注意力欠陥・多動性障害動物モデルを作製及び実験遂行期間を示した図。図１のＡは、注意力欠陥・多動性障害動物モデルの作製及び行動を測定するためにコバルト線とＥＥＧ電極棒を挿入した位置を示した図である。  コバルト線：コバルト線は５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に右側の腹側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍの位置に挿入する。  ＦＲ：右側前頭葉、  ＦＬ：左側前頭葉、  ＴＲ：右側側頭葉、  ＴＬ：左側側頭葉。  図１のＢは、コバルト線を挿入した以後、ＥＥＧ変化及び行動分析を遂行した期間を示した図である。
【図２】注意力欠陥・多動性障害動物モデルで、ＥＥＧ記録を示した図。  対照：無挿入対照群；  コバルト＿シータ：コバルト線を挿入したネズミで観察される４〜７Ｈｚの振動数の脳波、  コバルト＿スパイク：コバルト線を挿入したネズミで観察される１〜４Ｈｚの振動数のスパイク形状の脳波、  ＦＲ：右側前頭葉、及び  ＦＬ：左側前頭葉。
【図３】注意力欠陥・多動性障害動物モデルの行動変化及び認知機能変化を測定した結果。  図３のＡは、注意力欠陥・多動性障害動物モデルの行動性定量のための開放場（ｏｐｅｎｆｉｅｌｄ）での検査結果を示したグラフである。  ○対照：無挿入対照群、  ■コバルト≦６日：コバルト線挿入６日以下の注意力欠陥・多動性障害動物モデル、  ◆コバルト≦１４日：コバルト線挿入１４日以下の注意力欠陥・多動性障害動物モデル、  ▲コバルト≧２８日：コバルト線挿入２８日以上の注意力欠陥・多動性障害動物モデル。  図３のＢは、開放場テストで観察される注意力欠陥・多動性障害動物モデルの行動性をビデオを通じて観察した結果である。  対照：無挿入対照群、  コバルト：コバルト線を挿入２８日以上の注意力欠陥・多動性障害動物モデル。  図３のＣは、注意力欠陥・多動性障害動物モデルの恐怖条件付け学習テスト（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｆｅａｒ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ）結果を示したグラフである。  □対照：無挿入対照群、  ■コバルト：コバルト線を挿入２８日以上の注意力欠陥・多動性障害動物モデル、  コンテクスト：恐怖が生成された場所を憶えているかどうかをテストした群、及び  キュー：恐怖と連結した音を憶えているかどうかをテストした群。
【図４】注意力欠陥・多動性障害動物モデルマウスに、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤である、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、ゾニサミド（ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、フェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ）をそれぞれ注入した後に発生するスパイク形状の脳波を観察したグラフである。  図４のＡは、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン投与前、投与後のスパイク形状の脳波を記録した図である。  対照：食塩水を投与した対照群、  ＺＮＳ：ゾニサミドを投与した群、  ＰＨＴ：フェニトインを投与した群、  エトスクシミド：エトスクシミドを投与した群。  図４のＢは、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン投与前、投与後のスパイク形状の脳波数を計数したグラフである。  対照：食塩水を投与した対照群、  ＺＮＳ：ゾニサミドを投与した群、  ＰＨＴ：フェニトインを投与した群、  エトスクシミド：エトスクシミドを投与した群。
【図５】銅線、アルミニウム線、及びコバルト線を挿入した動物モデルマウスのスパイク形状を観察したグラフである。  図５のＡは、銅線を挿入した動物モデルマウスのスパイク形状を観察したグラフである。  Ｆ：右側前頭葉、  ＭＤ：視床核（ＭＤ）、  Ｔ：左側側頭葉。  図５のＢは、アルミニウム線を挿入した動物モデルマウスのスパイク形状を観察したグラフである。  Ｆ：右側前頭葉、  ＭＤ：視床核（ＭＤ）、  Ｔ：左側側頭葉。  図５のＣは、銅線、アルミニウム線、及びコバルト線を挿入した動物モデルと無挿入動物モデルで観察されるスパイク数を示したグラフである。  Ｃｕ：銅を挿入した群、  Ａｌ：アルミニウムを挿入した群、及び  Ｃｏ：コバルト線を挿入した群。
【図６】α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの脳波及び行動変化を測定した図である。  図６のＡは、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉及び視床核で観察される脳波を示した図及びグラフである。  Ｆ：右側前頭葉、  ＭＤ：視床核（ＭＤ）、  ＊＊：ｐ＜０．０５。  図６のＢは、開放場テストで観察されるα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの行動性をビデオを通じて観察した結果である。  Ｃａｖ３．１  ＋／＋：α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが除去されない対照群動物モデル、  Ｃａｖ３．１  −／−：α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデル、  ５分：開放場テスト開始から５分までの時間、及び  ６０分：開放場テスト開始から５５分〜６０分までの時間。
【図７】α１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを視床核（ＭＤ）に局所的に注入して、視床核局所的にα１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルを抑制した動物モデルでの脳波を測定した図である。  図７のＡは、視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉及び視床核で観察される脳波を示した図及びグラフである。  Ｆ：右側前頭葉、  ＭＤ：視床核（ＭＤ）、  ｓｈＣ：α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを抑制しない対照群ｓｈＲＮＡウイルスを視床核に入れた対照群動物モデル、  ｓｈ３．１：ｓｈＲＮＡウイルスを用いてα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを視床核局所的に除去した動物モデル。  図７のＢは、視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを抑制した動物モデルでは、低い振動数の脳波が大きく減少したことをパワースペクトル（ｐｏｗｅｒ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）分析で示した図である。
【図８】α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを視床核（ＭＤ）に局所的に注入して、視床核でのみα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを抑制した動物モデルでの行動変化を測定した図である。  図８のＡは、開放場テストで観察される視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの行動性を、ビデオを通じて観察した結果である。  ｓｈＣ：α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを抑制しない対照群ｓｈＲＮＡウイルスを視床核に入れた対照群動物モデル、  ｓｈ３．１：ｓｈＲＮＡウイルスを用いてα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを視床核局所的に除去した動物モデル、  ５分：開放場テスト開始から５分までの時間、及び  ６０分：開放場テスト開始から５５分〜６０分までの時間。  図８のＢは、開放場テストで観察される視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの行動性を示したグラフである。  ｓｈＣ：α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを抑制しない対照群ｓｈＲＮＡウイルスを視床核に入れた対照群動物モデル、  ｓｈ３．１：ｓｈＲＮＡウイルスを用いてα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを視床核局所的に除去した動物モデル、  ５分：開放場テスト開始から５分までの時間、及び  ６０分：開放場テスト開始から５５分〜６０分までの時間。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３０】
本発明は、下記の工程にしたがって作製された注意力欠陥・多動性モデルマウスを提供する。
１）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
で製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【００３１】
本発明の注意力欠陥・多動性モデルマウスは、前記の工程にしたがって作製することが好ましいが、前記の工程に限定されない。
【００３２】
前記注意力欠陥・多動性モデルマウスの作製は、ステレオタキシック（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）にマウス（１０〜２０週の間のＣ５７ＢＬ／６Ｊ）の頭を固定した後、コバルト線（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）をステレオタキシックの部品であるホルダーを用いて挿入することが好ましいが、これに限定されない。前記注意力欠陥・多動性モデルマウスの作製において、工程１）のコバルト線は、５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状（ｒａｄｉａｌ）方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）で右側の背側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の２．０〜３．０ｍｍ、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の１．５〜２．５ｍｍ、及び腹部方向（ｖｅｎｔｒａｌ）の１．０〜２．０ｍｍの位置に挿入することが好ましいが、より好ましくは、右側の背側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の２．６ｍｍ、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の１．８ｍｍ、及び腹部方向（ｖｅｎｔｒａｌ）の１．３ｍｍの位置に挿入することが好ましいが、これに限定されない。また、ＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤（ｅｐｉｄｕｒａｌ）電極棒は、前記コバルト線が挿入された右側前頭葉に挿入し、他の電極棒は左側前頭葉及び側頭葉前頭葉に挿入した。具体的に挿入位置は、右側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置であり、左側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置にそれぞれ挿入した。接地ＥＥＧは、頭蓋骨の後頭の位置に挿入することが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らは、注意力欠陥・多動性障害動物モデルを作製した（図１参照）。コバルト線を脳に挿入して作製した動物モデルで、てんかんが誘発されることが知られているが（Ｃｈａｎｇら，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４年）、これを注意力欠陥・多動性障害動物モデルとして用いたことは報告されていない。それで、本発明者らは、コバルト線を挿入したマウスを注意力欠陥・多動性障害動物として使用することができるかどうかを確認するために、集中力障害疾病で観察される特徴的な脳波、行動、及び認知機能を観察した。
【００３４】
本発明の具体的な実施例で、コバルト線を右側前頭葉に挿入したマウスの脳電図（ＥＥＧ）を分析した。前記動物モデルマウスの左、右側前頭葉及び側頭葉に挿入したＥＥＧ電極棒を通じて脳波を観察した結果、コバルト線が挿入された右側前頭葉でのみ低い振動数の脳波が増加し、より具体的に４〜７Ｈｚのシータ（ｔｈｅｔａ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）波が先に始まった後、１〜４Ｈｚのスパイク形状が観察された。このような脳波は、コバルト線が挿入されない左側前頭葉では観察されなかった（図２参照）。
【００３５】
また、本発明の具体的な実施例で、コバルト線を挿入したマウスの行動、及び認知機能変化を観察した。コバルト線を挿入した後、６日、１４日、及び２８日が経過した時点で開放場テスト（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ）を通じて行動をモニタリングした結果、対照群と比較してコバルト線を挿入したマウスで活動性が顕著に増加したことを観察することができた（図３のＡ参照）。このような傾向は、コバルト線を挿入した期間が長くなるほど増加し、より具体的に前記活動性を注意力欠乏過剰障害動物モデルの行動を記録する試験を通じて分析した結果、コバルト線を挿入したマウスの動きで反復的に一方方向に回る行動である常同症が観察されることを確認することができた（図３のＢ参照）。前記常同症は、注意力欠陥・多動性障害や精神分裂症で代表的に観察されると報告されている（Ｊｏｎｅｓ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９６５年；Ｄａｖｉｄｓら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００３年）。また、注意力欠陥・多動性障害疾病で多く観察される記憶力減退が、コバルト線を挿入したマウスでも示されるのかどうかを確認するために、恐怖条件付け学習テスト（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｆｅａｒ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ）を遂行した結果、対照群と比較してコバルト線が挿入された注意力欠陥・多動性障害動物モデルは、顕著に記憶力が減少することを観察することができた（図３のＣ参照）。したがって、本発明のコバルト線を挿入したマウスで集中力障害疾病の特徴である低い振動数の脳波、常同症、及び認知機能の低下が観察されるので、コバルト線を挿入したマウスを注意力欠陥・多動性障害モデルマウスとして有用に使用することができることが分かった。
【００３６】
また、本発明の具体的な実施例で、注意力欠陥・多動性障害動物で観察される行動障害の症状を緩和させるために、Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの抑制剤として使用されるエトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインをそれぞれ処理した結果、このような薬物を処理する前と比較して、前頭葉で観察されるスパイク数が顕著に減少することが分かった（図４参照）。Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤には、前記エトスクシミド以外にも、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される  ３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトがあり、このようなＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を本発明の注意力欠陥・多動性障害動物に投与した時、行動障害症状を緩和させることができるであろう。
【００３７】
また、本発明の具体的な実施例に使用された対照群無挿入マウスが、対照群として有用なのかどうかを確認するために、本発明者らはコバルト線以外の銅線及びアルミニウム線を、コバルト線の代わりにマウスの右側前頭葉に挿入した。その結果、図５に示されたように、コバルト線を挿入したマウスのＥＥＧで観察されるスパイク形状の脳波が観察されず、このような結果は何も挿入しない無挿入対照群と類似の結果を示した。すなわち、無挿入対照群をコバルト線を挿入したマウスに対する対照群として有用に使用することができ、本発明による動物モデルで観察されるスパイク形状の脳波は、挿入されるコバルト線にしたがって発生することを確認することができた（図５参照）。
【００３８】
また、本発明の具体的な実施例で、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを全部除去したノックアウトモデル（Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデル）と、本発明によるα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを視床核局所的に注入したモデルとで脳波及び行動変化を観察した結果、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが全部または視床核局所的に除去された時、前頭葉で低い脳波が観察されたことを確認することができた（図６〜８参照）。このような結果を通じて、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが、前頭葉関連疾病生成に重要であるということを確認することができた。
【００３９】
したがって、コバルト線を挿入した動物マウスで、集中力障害疾病の特徴である低い周波数の脳波、行動障害、及び認知機能の低下が観察されるので、これを注意力欠陥・多動性障害モデルマウスとして有用に使用することができる。
【００４０】
また、本発明は、下記の工程を含む注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法を提供する。
１）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合させる工程、及び
３）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
で製造される注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法。
【００４１】
前記注意力欠陥・多動性モデルマウス作製は、ステレオタキシックにマウス（１０〜２０週の間のＣ５７ＢＬ／６Ｊ）の頭を固定した後、コバルト線（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）をステレオタキシックの部品であるホルダーを用いて挿入することが好ましいが、これに限定されない。前記注意力欠陥・多動性モデルマウス作製において、工程１）のコバルト線は、５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に右側の背側外側前頭葉の前後方向の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍの位置に挿入することが好ましいが、これに限定されない。また、ＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒は、前記コバルト線が挿入された右側前頭葉に挿入し、他の電極棒は左側前頭葉及び側頭葉前頭葉に挿入した。具体的に挿入位置は、右側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置であり、左側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置にそれぞれ挿入した。接地ＥＥＧは、頭蓋骨の後頭の位置に挿入することが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
また、本発明は、下記の工程を含む、集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法を提供する。
１）被検化合物または組成物を本発明による注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、脳波のスパイク数が減少した被検化合物または組成物を選別する工程。
【００４３】
前記集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法は、前記の工程を含むことが好ましいが、これに限定されない。前記集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法において、集中力障害疾病は、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４４】
本発明のコバルト線を挿入した動物マウスは、集中力障害の特徴である低い周波数の脳波、行動障害、及び認知機能の低下が観察される。注意力欠陥・多動性モデルマウスとして有用なので、これを集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法に活用することができる。
【００４５】
また、本発明は、下記の工程を含む、集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法を提供する。
１）被検化合物または組成物を本発明による注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの行動障害または認知機能を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、行動障害または認知機能が減少した被検化合物または組成物を選別する工程。
【００４６】
前記集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法は、前記の工程を含むことが好ましいが、これに限定されない。また、集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法において、行動障害は、開放場テスト、水迷路試験（Ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ）、新奇物質認識試験（Ｎｏｂｌｅ  ｏｂｊｅｃｔ  ｔｅｓｔ）、新奇物体認識試験（Ｎｏｂｌｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）からなる群から選択される方法を通じて行動障害を測定することが好ましいが、これに限定されない。また、集中力障害疾病治療剤スクリーニング方法において、認知機能は、恐怖学習機能記憶検査、プレパルス抑制テスト（ｐｒｅ−ｐｕｌｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、高架式十字迷路テスト（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ  ｍａｚｅ）からなる群から選択される方法を通じて認知機能を測定することが好ましいが、これに限定されない。注意力欠損障害で見られる行動及び認知障害は、計画、インパルス調節、目的管理、行動の自律調整（ｓｅｌｆ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）、集中力調節（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、及びワーキングメモリ（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ）のような管理機能に問題がある場合を称する。
【００４７】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び治療用組成物を提供する。
【００４８】
前記集中力障害疾病の予防及び治療用組成物において、集中力障害疾病は、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。また、前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されることが好ましく、エトスクシミドであることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００４９】
本発明の具体的な実施例を通じて、コバルト線を挿入した動物マウスを注意力欠陥・多動性障害モデルマウスとして有用に使用することができ、前記動物モデルにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤のひとつのエトスクシミドを投与することで、集中力障害疾病の症状が減少するので、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害疾病の予防及び治療用組成物として有用に使用することができることが分かった。
【００５０】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の治療学的に有効な量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などにしたがって変わり得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性を一緒に考慮して適正量に決定しなければならない。
【００５１】
動物実験を通じて決定した有効量から、人間に使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ'ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．（２００１年），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（１９９０年）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記述されている。
【００５２】
本発明の組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤またはふたつ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の生体内伝達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して用いることができ、必要にしたがって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて各疾患にしたがって、または成分にしたがって好ましく製剤化することができる。本発明の組成物に、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物の総重量に対して前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％で、好ましくは０．００１〜１重量％を含む。組成物は、目的とする方法にしたがって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、非経口投与することが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
非経口投与のための製剤では、それぞれ通常の方法にしたがって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水溶性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアゾールなどの外用剤及び滅菌注射製剤の形状に剤形化して使用することができ、好ましくはクリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラスマ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して使用することができるが、これに限定されるのではない。局所投与の組成物は、臨床的処方にしたがって無水型または水性型であり得る。非水溶性溶剤、懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤では、ハードファット、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００５４】
経口投与のための固形製剤では、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸薬などが含まれる。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤、エアゾールなどが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等にしたがってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日の投与量は、０．０００１ｍｇ〜３００ｍｇであって、好ましくは０．００１ｍｇ〜２００ｍｇであって、一日に１回〜数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００５５】
また、本発明は、集中力障害治療剤のスクリーニングのための本発明による集中力欠乏過剰行動障害動物モデルマウスの使用を提供する。
【００５６】
本発明の具体的な実施例で、コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植した後、脳の切開面を縫合したマウスで、集中力障害の特徴である認知機能低下、過剰行動及び前頭葉の電気的興奮が観察され、このような特徴は、コバルト線に対する対照群として銅、アルミニウム線、及び無挿入動物群で観察されなかった。すなわち、本発明にしたがって製造されたコバルト線が挿入されたマウスは、注意力欠陥・多動性モデルとして有用であり、前記動物モデルにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を投与した時、集中力障害の症状が緩和されるため、集中力障害治療剤スクリーニングのための前記動物の使用を提供することができる。
【００５７】
また、本発明は、集中力障害疾病治療剤の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【００５８】
本発明の具体的な実施例を通じて、コバルト線が挿入されたマウスモデルで、集中力障害の特徴的な脳波と行動及び認知機能の低下が観察され、このような注意力欠陥・多動性障害動物モデルにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を投与した時、多動性症状及び前頭葉の正常ではない電気的興奮が緩和されることを確認した。したがって、本発明の注意力欠陥・多動性障害動物モデルを用いてスクリーニングされたＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を、集中力障害疾病治療剤製造に有用に使用することができる。
【００５９】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品を提供する。
【００６０】
また、本発明は、集中力障害疾病改善用健康食品の製造のためのＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【００６１】
前記集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品において、集中力障害疾病は、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。また、前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されることが好ましく、エトスクシミドであることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００６２】
本発明の具体的な実施例を通じて、コバルト線を挿入した動物マウスを注意力欠陥・多動性障害モデルマウスとして有用に使用することができ、前記動物モデルにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の一種類であるエトスクシミドを投与することで集中力障害疾病の症状が減少するので、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害疾病の予防及び治療用組成物として有用に使用することができることが分かった。
【００６３】
本発明のＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、食品学的に許容された担体と混合して食品組成物として提供することができる。
【００６４】
本発明のＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を食品または飲料添加物に使用する場合、前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤をそのまま添加するか、他の食品または食品成分とともに使用して、通常の方法にしたがって適切に使用することができる。前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の混合量は、その使用目的（予防、健康または治療的処置）によって、相応しく決定することができる。
【００６５】
健康及び衛生を目的とするかまたは健康調節を目的とする長期間摂取の場合、前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、安全性の面で何らの問題がないので、長期間服用が可能である。
【００６６】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート類、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがある。
【００６７】
飲料に剤形化する場合に、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤以外に添加する液体成分は特に限定されないが、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物の例としては、モノサッカライド（例、ブドウ糖、果糖など）、ジサッカライド（例、マルトース、スクロースなど）及びポリサッカライド（例、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常的な糖）、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例、レバウジオシドＡ、グリシルリチンなど）］及び合成香味料（例、サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。
【００６８】
他の態様として、本発明の食品組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。また、本発明の食品組成物は、果物及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、単独でまたは組み合わせて使用することができ、このような添加剤の割合は組成物全体の重量当たり０．００１〜５０重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００６９】
また、本発明は、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む、集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤を提供する。
【００７０】
同時に、本発明は、集中力障害疾病改善用飼料料添加剤の製造のためのＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用を提供する。
【００７１】
前記集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤において、集中力障害疾病は、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。また、前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されることが好ましく、エトスクシミドであることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００７２】
本発明の具体的な実施例を通じて、コバルト線を挿入した動物マウスを注意力欠陥・多動性障害モデルマウスにＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤のひとつのエトスクシミドを投与することで集中力障害疾病の症状が減少するので、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤として有用に使用することができることが分かった。
【００７３】
本発明の飼料組成物は、発酵飼料、配合飼料、ペレット形状及びサイレージなどの形状に製造することができ、通常的な方法にしたがって製造することができる。本発明の飼料に添加されるＴ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の有効量は、組成物の全体重量当たり０．００１〜５０重量部の範囲で選択することが好ましいが、これに限定されない。
【００７４】
以下、本発明を実施例、実験例及び製造例にしたがって詳しく説明する。
【００７５】
但し、下記の実施例、実験例及び製造例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例に限定されるのではない。
【実施例】
【００７６】
＜実施例１＞注意力欠陥・多動性障害動物モデルの作製
１０〜２０週齢になるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バイオモデルシステムパーク）を韓国科学技術研究院（ＫＡＩＳＴ）の実験動物運営委員会の規定にしたがって飼育及び取り扱った。マウスは、水と飼料に自由に近付くことができる状態で維持され、明暗周期は１２時間だった。
【００７７】
低酸素症を起こすことが報告されたコバルト線を右側前頭葉に挿入して、注意力欠陥・多動性障害動物モデルを作製した。
【００７８】
具体的に、注意力欠陥・多動性モデルマウスの作製は、０．２％アベルチン（ａｖｅｒｔｉｎ）麻酔（Ｔｒｉｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｏｌ，２０ｍｇ／ｍｌで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を通じて注入）をした後、発明者らはステレオタキシックにマウス（１０〜２０週の間のＢ６マウス）の頭を固定し、コバルト線（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）をステレオタキシック（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の部品であるホルダーを用いて挿入する。コバルト線は５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に右側の背側外側前頭葉の前後方向の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍの位置に挿入した。
【００７９】
また、ＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒は、前記コバルト線が挿入された右側前頭葉に挿入し、他の電極棒は左側前頭葉及び側頭葉前頭葉に挿入した。具体的な挿入位置は、右側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置であり、左側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置にそれぞれ挿入した。接地ＥＥＧは、頭蓋骨の後頭の位置に挿入した。
【００８０】
ＥＥＧ電極棒をコバルト線と一緒に入れて手術する場合、デンタルセメントを用いて縫合した。ＥＥＧ電極棒を入れないで行動実験のための手術の場合、手術用糸を用いて縫合した。
【００８１】
３日の回復期間が経過後、前記ＥＥＧ信号及びビデオ映像を３０日間撮影した。ＥＥＧ信号は、増幅し（Ｇｒａｓｓ  ｍｏｄｅｌ  ７Ｈ  ｐｏｌｙｇｒａｐｈ，Ｇｒａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）、５００Ｈｚのサンプリングの比率でデジタル化された（ＤＩＧＩＤＡＴＡ  １３２０Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，米国）。データを得るために、ｐＣｌａｍｐ９．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，米国）を用いた。
【００８２】
＜実施例２＞Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの作製
＜２−１＞Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの作製
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルは、α１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが、片方のクロモゾームにのみあるヘテロマウスを交配してノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，ＫＯ，−／−）マウスを作製した（Ｎｅｕｒｏｎ，２００１，Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｕｒｓｔ  Ｆｉｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｒｅｌａｙ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｂｓｅｎｃｅ  Ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｌａｃｋｉｎｇ［ａｌｐｈａ］１Ｇ  Ｔ−Ｔｙｐｅ  Ｃａ２＋  Ｃｈａｎｎｅｌｓ）。このように交配して作製したノックアウトマウスは、全身からα１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが除去された。
【００８３】
＜２−２＞視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの作製
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。合成された二重オリゴヌクレオチド（配列番号１：
2013531994.tif 000003
）をｓｈＬｅｎｔｉｓｙｎ３．４Ｇレンチウイルスベクター（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，韓国）に挿入した。前記ｓｈＬｅｎｔｉｓｙｎ３．４Ｇレンチウイルスベクターは、Ｕ６プローモーターからｓｈＲＮＡが発現され、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をシナプシン（ｓｙｎａｐｓｉｎ）プローモーターから発現するように作製された。
【００８４】
前記標的配列は、生物情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースのＣａｖ３．１を除外した他のどのようなｍＲＮＡとも一致しなかった。
【００８５】
Ｃａｖ３．１  ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドのスクランブルバージョン（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）は、配列番号２の配列（
2013531994.tif 000004
）を有し、ｓｈＬｅｎｔｉｓｙｎ３．４Ｇレンチウイルスベクター（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，韓国）に挿入して対照群として使用した。このような配列は、公知のどのような哺乳類遺伝子とも相同性を示さなかった。前記組換えレンチウイルスベクターは、商業的に生産して濃縮することができる（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  ＬｅｎｔｉＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，韓国）。
【００８６】
本発明者らは、約２×１０６形質導入単位／ｍｌの濃度でレンチウイルスを使用した。前記Ｃａｖ３．１ｓｈＲＮＡまたはスクランブル対照群を含むウイルスを有している溶液は、マイクロ注射器ポンプ（Ｅｉｃｏｍ，ＵＫ）を用いて、ｉｐｓｉ−ＭＤ（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ  ＭＤ  ｔｈａｌａｍｕｓ，ＭＤ視床核の右側にウイルスを挿入したことを意味する）で、Ｎａｎｏｆｉｌ  ３３Ｇブラントニードル及びナノフィル注射器（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，米国）を用いて注入した。
【００８７】
ウイルス形質転換を行った７日以後、コバルト線及び硬膜外麻酔剤電極棒を前記で記載したように挿入した。ＥＥＧ信号は、ビデオモニタとともに３０日間獲得した。
【００８８】
＜実験例１＞注意力欠陥・多動性障害動物モデルの脳波観察
本発明者らは、前記＜実施例１＞の、コバルト線を右側前頭葉に挿入して作製した動物モデルが、注意力欠陥・多動性障害動物モデルとして用いることができるのかどうかを確認するために、過剰行動障害疾病の特徴的な脳波を観察した。
【００８９】
前記動物モデルの脳波（ＥＥＧ）測定のために、左側、右側前頭葉と左側、右側側頭葉にＥＥＧ電極を挿入した後、３０日間脳波を観察した。コバルト線を挿入するのと同時に、ＥＥＧ電極を挿入した。コバルト線とともにステレオタキシック機械を用いて、座標を計算して位置を定めてＥＥＧ電極を挿入した。
【００９０】
具体的に、コバルト線は５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に、右側の背側外側前頭葉の前後方向の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍの位置に挿入した。また、ＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒は、前記コバルト線が挿入された右側前頭葉に挿入し、他の電極棒は左側前頭葉及び側頭葉前頭葉に挿入した。具体的に挿入位置は、右側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置であり、左側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置にそれぞれ挿入した。接地ＥＥＧは、頭蓋骨の後頭の位置に挿入した。
【００９１】
コバルト線及びＥＥＧ電極を挿入した後、３〜４日の回復期を経た後、ビデオレコーディングと同時にＥＥＧレコーディングを遂行した。
【００９２】
コバルト線及びＥＥＧ電極棒を挿入した後、４日の回復期を経たＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス１０匹を、ＥＥＧチャンバー（正四角形底のボックス）に自由に歩き回れるように入れた後、ＥＥＧ信号をＧｒａｓｓ  ｍｏｄｅｌ  ７Ｈ  ｐｏｌｙｇｒａｐｈ（Ｇｒａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）を用いて増幅した後、ＤＩＧＩＤＡＴＡ  １３２０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，米国）を通じて５００Ｈｚのサンプリング速度でデジタル化した。その後、ｐＣｌａｍｐ９．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，米国）を用いてデータを得た。
【００９３】
その結果、図２に示されたように、注意力欠陥・多動性障害動物モデルでコバルト線が挿入された右側前頭葉でのみ低い振動数の脳波が増加し、１〜７Ｈｚのシータ波が始まった後、１〜４Ｈｚのスパイク形状の脳波が観察された。このようなスパイク形状の脳波は、コバルト線が挿入されない左側前頭葉では観察されなかった（図２）。
【００９４】
＜実験例２＞注意力欠陥・多動性障害動物モデルの行動変化、及び認知機能変化測定
本発明者らは、前記＜実施例１＞のコバルト線を右側前頭葉に挿入して作製した動物モデルが注意力欠陥・多動性障害動物モデルとして用いることができるのかどうかを確認するために、過剰行動障害疾病の特徴的な行動を確認した。
【００９５】
コバルト線を挿入した時間にしたがって、６日（ｎ＝５）、１４日（ｎ＝５）、及び２８日（ｎ＝９）以下に分けて、コバルト線を挿入しない対照群マウス（ｎ＝９）と行動を比較した。マウスは、開放場テストキット（アクリルで作られた四角形底の箱、４０×４０×５０ｃｍ）の中に注意深く入れた後、前記キットの中で１時間及び１／２周期の間に移動した距離をデジタルビデオ記録するために５分おきにモニタリングした。開放場テストは、１８時から２２時の間に遂行し、ビデオ映像を分析するために、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（Ｎｏｄｕｌｓ，米国）を用いた。
【００９６】
開放場テスト（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ，４０×４０×５０ｃｍ）を用いて行動症状を定量した結果、図３のＡに示したように、注意力欠陥・多動性障害動物モデルは、コバルト線を挿入した時間が長くなるほど、移動する距離が多くなり、このような傾向は、コバルト線を挿入しない対照群に比較して、顕著に増加したことを観察することができた（図３のＡ）。
【００９７】
また、コバルト線挿入後２８日が経過した注意力欠陥・多動性障害動物モデルの行動を、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（Ｎｏｄｕｌｓ，米国）を用いて分析した結果、コバルト線を挿入したマウスの動きで反復的に一方方向に回る常同症が観察された（図３のＢ）。
【００９８】
＜実験例３＞注意力欠陥・多動性障害動物モデルの認知機能変化測定
本発明者らは、前記＜実施例１＞のコバルト線を右側前頭葉に挿入して作製した動物モデルが、注意力欠陥・多動性障害動物モデルとして用いることができるのかどうかを確認するために、過剰行動障害疾病で観察される認知機能の低下が、本発明の動物モデルで観察されるのかどうかを確認するため恐怖条件付け学習テストを行なった。
【００９９】
恐怖条件付け学習テストを行なうために、一日目に特定音を与えながら電気刺激を反復的に与えてマウスが恐怖を憶えるようにした。そして、二日目に二つのテストを行なったが、一番目は一日目に電気刺激を受けたその空間に対して記憶をしているかどうか（コンテクスト）に対して確認し、二番目は電気刺激を受けた時に出た音を憶えているかどうか（キュー）をテストした。記憶の有無を確認するためにマウスの動かない時間（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を測定した。マウスは、恐怖を感じた場合には動かないので、万一ネズミが記憶している場合は、動かない時間が長く、そうでない場合は動かない時間が減ることになる。このような時間を測定して、コバルト線を挿入したマウスの認知機能を検査した。
【０１００】
その結果、図３のＣに示されたように、コバルト線が挿入された動物モデルで認知機能が低下したことを観察することができた。すなわち、コバルト線を挿入したマウスの場合、空間（コンテクスト）と音（キュー）検査の両方で動かない時間が顕著に短くなったことが見られ、このことからコバルト線を挿入したマウスは電気刺激の痛みを正しく憶えることができないでいるということが分かった。
【０１０１】
＜実験例４＞Ｔ−タイプカルシウム抑制剤の注入による注意力欠陥・多動性障害動物モデルの脳波変化
＜４−１＞エトスクシミドによる注意力欠陥・多動性障害動物モデルの脳波変化
前記＜実験例１＞で観察されたように、本発明の注意力欠陥・多動性障害動物モデルは、前頭葉で特徴的に低い振動数の電気的信号が増加した。このような電気的興奮を緩和させるために、Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの抑制剤（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，２００２）として知られたエトスクシミド（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，２００２）を過剰行動障害マウスモデルに処理した。
【０１０２】
＜４−２＞エトスクシミドによる注意力欠陥・多動性障害動物モデルの脳波変化
前記＜実験例１＞で観察されたように、本発明の注意力欠陥・多動性障害動物モデルは、前頭葉で特徴的に低い振動数の電気的信号が増加した。Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの抑制剤中の一つであるエトスクシミド（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，２００２）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ，ＺＮＳ）（Ｋｉｔｏら，１９９６）とフェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ，ＰＨＴ）（Ｌａｃｉｎｏｖａら，２０００）を過剰行動障害マウスモデルに処理した。
【０１０３】
エトスクシミド（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，米国）を１５０ｍｇ／ｋｇの濃度で、コバルト線を挿入した７〜９日経過した注意力欠陥・多動性障害動物モデルの腹腔に投与した後、１時間の間の脳波の変化を観察した。自由に動くことができる正六面体の脳波検査室の中で薬物処理の前３０分から脳波を記録し始めた。エトスクシミド投与前後の脳波で観察されるスパイク数を比較した結果、エトスクシミドを処理した場合、処理前と比較して前頭葉で観察されるスパイク数が顕著に減少した。これは、エトスクシミドは前頭葉の過剰になった電気的信号を緩和することによって、多動性症状を緩和することができることを意味する。
【０１０４】
また、ゼニサミド（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，米国）及びフェニトイン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，米国）を、それぞれ６０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇの濃度で、コバルト線を挿入後７〜９日経過した注意力欠陥・多動性障害動物モデルの腹腔に投与した後、１時間の間の脳波変化を観察した。自由に動くことができる正六面体の脳波検査室の中で薬物処理前３０分から脳波を記録し始めた。
【０１０５】
ゼニサミド及びフェニトインをそれぞれ投与前後の脳波で観察されるスパイク数を比較した結果、図４に示されたように、非特異的Ｔタイプカルシウムチャンネル抑制剤中の一つであるゼニサミド及びフェニトインを、それぞれ本発明の注意力欠陥・多動性障害動物モデルに処理した場合、処理前と比較して前頭葉で観察されるスパイクを統計的に有意に抑制するということが分かった（Ｐ＜０．０５）（図４）。
【０１０６】
＜実験例５＞コバルト線以外の物質挿入による脳波変化観察
コバルト線以外の他の金属物質による脳波変化を確認するために、本発明者らは、銅線とアルミニウム線の挿入には、前記コバルト線を挿入した方式を用いた。
【０１０７】
ステレオタキシックに、マウス（１０〜２０週の間のＢ６マウス）の頭を固定した後、コバルト線（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、銅線、及びアルミニウム線をそれぞれをステレオタキシックの部品であるホルダーを用いて挿入する。
【０１０８】
コバルト線は５００μｍ（直径）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に、右側の背側外側前頭葉の前後方向の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍである位置に挿入した。また、ＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒は、前記コバルト線が挿入された右側前頭葉に挿入し、他の電極棒は左側前頭葉及び側頭葉前頭葉に挿入した。具体的な挿入位置は、右側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置であり、左側前頭葉においては前後方向の２．８ｍｍ、側面の０．８ｍｍの位置にそれぞれ挿入した。接地ＥＥＧは、頭蓋骨の後頭の位置に挿入した。
【０１０９】
また、銅線及びアルミニウム線を、コバルト線を挿入した位置と同一な位置である放射状方向（すなわち、大脳表面に対して垂直の方向）に、右側の背側外側前頭葉の前後方向の２．６ｍｍ、側面の１．８ｍｍ、及び腹部方向の１．３ｍｍの位置に挿入した。ＥＥＧ電極棒を一緒に入れて手術した後、デンタルセメントを用いて縫合した。
【０１１０】
その結果、図５に示されたように銅線及びアルミニウム線を挿入した群では、コバルト線で観察されるスパイク形状の脳波が観察されず、このような傾向はマウス前頭葉に何も挿入しない無挿入対照群と類似だった（図５）。したがって、本発明の無挿入動物モデルマウスを、対照群として使用することができることを確認することができた。
【０１１１】
＜実験例６＞Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの脳波及び行動変化観察
＜６−１＞Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉での脳波観察
本発明者らは、前記＜実施例２−１＞のＣａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが全部除去された動物モデルを用いて、前頭葉スパイク生成の機序を研究した。
【０１１２】
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの除去されたマウスが生後１５〜２０週の時に、前記＜実施例１＞の方法と同様に、コバルト線とＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒を挿入して、脳波（ＥＥＧ）を３０日間観察した。
【０１１３】
その結果、図６のＡに示されたように、視床核で脳波を作り出すのに重要であることが知られたα１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが除去された動物モデルで、コバルト線挿入６〜７日後、前頭葉で生成される低い振動数のスパイクが顕著に減少した。α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉で観察される低い振動数の脳波の頻度数が、対照群と比較して顕著に減少していた（Ｔ検定、ｐ＜０．０５）。これを通じて、α１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが、注意力欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）などの前頭葉関連疾病生成に重要であるという事実が分かった（図６のＡ）。
【０１１４】
＜６−２＞Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉での行動変化観察
本発明者らは、前記＜実施例２−１＞のＣａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが全部除去された動物モデルを用いて、前頭葉スパイク生成の機序を研究した。
【０１１５】
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが除去されたマウスが生後１５〜２０週の時に、前記＜実施例１＞の方法と同様に、コバルト線とＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒を挿入して、脳波（ＥＥＧ）を３０日間観察した。
【０１１６】
マウスは、開放場テストキット（アクリルで作られた四角形底の箱、４０×４０×５０ｃｍ）の中に注意深く入れた後、前記キット中で１時間及び１／２周期の間に移動した距離をデジタルビデオの記録にしたがって５分おきにモニタリングした。開放場テストは、１８時から２２時の間に遂行し、ビデオ映像を分析するために、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（Ｎｏｄｕｌｓ，米国）を用いた。
【０１１７】
開放場テスト（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ，４０×４０×５０ｃｍ）を用いて行動症状を定量した結果、図６のＢに示されたように、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルは、コバルト線挿入６〜７日後の対照群動物と比較して移動する距離が多くなり、このような傾向はα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが除去されていない対照群と比較して、顕著に増加したことを観察することができた（図６のＢ）。
【０１１８】
＜実験例７＞α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの脳波及び行動変化観察
＜７−１＞α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの視床核での脳波観察
本発明者らは、視床核でα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの発現を抑制するために、前記＜実施例２−２＞のＣａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを視床核にのみ局所的に形質移入して製造した視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルを用いて、視床核スパイク生成の機序を研究した。
【０１１９】
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを視床核に形質移入してから７日が経過した後、前記＜実施例１＞の方法と同様にコバルト線とＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒を挿入して、過剰行動障害疾病の特徴的な行動を確認した。
【０１２０】
その結果、図７に示されたように、視床核で脳波を作り出すのに重要であると知られたα１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが除去された動物モデルで、前頭葉で低い振動数のスパイクが観察された。α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの前頭葉で観察される低い振動数の脳波の頻度数が、対照群と比較して顕著に減少していた（Ｔ検定、ｐ＜０．０５）。これを通じて、α１Ｇ  Ｔタイプカルシウムチャンネルが、注意力欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）などの前頭葉関連疾病生成に重要であるという事実が分かった（図７）。
【０１２１】
＜７−２＞α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルの行動変化測定
本発明者らは、視床核でα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルの発現を抑制するために、前記＜実施例２−２＞のＣａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを視床核にのみ局所的に形質移入して製造した視床核局所的α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルを用いて、視床核スパイク生成の機序を研究した。
【０１２２】
Ｃａｖ３．１  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを視床核に形質移入してから７日が経過した後、前記＜実施例１＞の方法と同様にコバルト線とＥＥＧ記録のための硬膜外麻酔剤電極棒を挿入して、過剰行動障害疾病の特徴的な行動を確認した。
【０１２３】
マウスは、開放場テストキット（アクリルで作られた四角形底の箱、４０×４０×５０ｃｍ）の中に注意深く入れた後、前記キット中で１時間及び１／２周期の間に移動した距離をデジタルビデオの記録にしたがって５分おきにモニタリングした。開放場テストは、１８時から２２時の間に遂行され、ビデオ映像を分析するために、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（Ｎｏｄｕｌｓ，米国）を用いた。
【０１２４】
開放場テスト（４０×４０×５０ｃｍ）を用いて行動症状を定量した結果、図８のＡに示されたように、α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル除去動物モデルは、対照群動物に比較して移動する距離が多くなり、このような傾向はα１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが除去されていない対照群と比較して、顕著に増加したことを観察することができた（図８のＡ）。また、このような結果をグラフで示すと図８のＢに示したとおりである（図８のＢ）。
【０１２５】
下記に、本発明の組成物のための製造例を提示する。
【０１２６】
＜製造例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
エトスクシミド      ２ｇ
乳糖                １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【０１２７】
＜１−２＞錠剤の製造
エトスクシミド          １００ｍｇ
とうもろこし澱粉        １００ｍｇ
乳糖                    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【０１２８】
＜１−３＞カプセル剤の製造
エトスクシミド          １００ｍｇ
とうもろこし澱粉        １００ｍｇ
乳糖                    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１２９】
＜１−４＞丸薬の製造
エトスクシミド    １ｇ
乳糖              １．５ｇ
グリセリン        １ｇ
キシリトール      ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法にしたがって１粒当り４ｇになるように製造した。
【０１３０】
＜１−５＞顆粒の製造
エトスクシミド    １５０ｍｇ
大豆抽出物          ５０ｍｇ
ブドウ糖          ２００ｍｇ
澱粉              ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して、６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包みに充填した。
【０１３１】
＜製造例２＞食品の製造
＜２−１＞お菓子及び粉食の製造
本発明の実施例＜１−１＞抽出物０．５〜５．０重量部を小麦粉に添加して、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
【０１３２】
＜２−２＞乳製品の製造
本発明の実施例＜１−１＞抽出物５〜１０重量部を牛乳に添加して、前記牛乳を用いてバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１３３】
＜２−３＞禅食の製造
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１３４】
黒豆、黒ごま、えごまを公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１３５】
本発明の実施例＜１−１＞抽出物を真空濃縮機で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１３６】
前記で製造した穀物類、種実類及び本発明の実施例＜１−１＞抽出物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
穀物類（玄米３０重量部、ハト麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
本発明の実施例＜１−１＞抽出物の乾燥粉末（３重量部）、
霊芝（０．５重量部）、及び
地黄（０．５重量部）。
【０１３７】
＜製造例３＞飲料の製造
本発明の実施例＜１−１＞抽出物    １０００ｍｇ
クエン酸                          １０００ｍｇ
オリゴ糖                            １００ｇ
梅濃縮液                                ２ｇ
タウリン                                １ｇ
精製水を加えて全体で                ９００ｍｌ
通常の健康飲料の製造方法にしたがって前記の成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱した後、その溶液をろ過して滅菌された２ｌの容器に取って密封滅菌した後、冷蔵保管し、本発明の健康食品製造に使用する。
【０１３８】
前記組成比は、比較的嗜好飲料に相応しい成分を好ましい実施例として混合組成したが、需要階層、需要国家、使用用途など、地域的、民族的嗜好度にしたがってその配合比を任意に変形実施してもかまわない。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
前記で詳しくみたように、本発明によるコバルト線を用いて作製したＡＤＨＤモデル動物は、集中力障害の特徴である多動性症状（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）及び前頭葉の正常ではない電気的興奮（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｈｙｐｅｒ−ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を示した。このような症状はエトスクシミドの投与によって減少するので、エトスクシミドを、過剰行動症状を共通して示す集中力障害症状の予防及び治療用組成物として有用に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月25日(2012.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）コバルト線（ｃｏｂａｌｔ  ｗｉｒｅ）をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病または多動性症状を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項２】
コバルト線が、直径４００〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項３】
コバルト線が、放射状（ｒａｄｉａｌ）方向に、右側の背側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の２．０〜３．０ｍｍ、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の１．５〜２．５ｍｍ、及び腹部方向（ｖｅｎｔｒａｌ）の１．０〜２．０ｍｍの位置に挿入することを特徴とする、請求項１に記載の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
【請求項４】
１）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
２）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
３）集中力障害疾病または多動性症状を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法。
【請求項５】
１）被検化合物または組成物を請求項１に記載の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を、被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、脳波のスパイク（ｓｐｉｋｅ）数が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、精神分裂症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、前頭葉てんかん（Ｆｏｒｎｔａｌ  ｌｏｂｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、及び自閉症（ａｕｔｉｓｍ）からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項５に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
１）被検化合物または組成物を請求項１に記載の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
２）工程１）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの行動障害または認知機能を測定する工程、及び
３）工程２）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、行動障害または認知機能が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
行動障害が、常同症または多動性症状であることを特徴とする、請求項７に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
行動障害が、多動性症状を通じて測定され、認知機能が、恐怖学習機能記憶検査を通じて測定されることを特徴とする、請求項７に記載の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１１】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１２】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）、テトラメスリン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｒｉｎ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、フェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ）、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピン（ｅｆｏｎｉｄｉｐｉｎｅ）と、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール（ｐｅｎｆｌｕｒｉｄｏｌ）、フルスピリレン（ｆｌｕｓｐｉｒｉｌｅｎｅ）及びバルプロエイト（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１３】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１４】
α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１５】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１６】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
【請求項１７】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１３に記載の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
【請求項１８】
α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項１９】
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１８に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２０】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ８０７５、エホニジピンと、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｇｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋からなる群から選択される３価の金属イオン、Ｎｉ２＋、Ｕ−９２０３２（７−［［４−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−１−ピペラジニル］メチル］−２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］４−（１−メチルエチル）−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１８に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【請求項２１】
前記α１Ｇ  Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミドであることを特徴とする、請求項１８に記載の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明のコバルト線を挿入した動物マウスは、集中力障害の特徴である低い周波数の増加した電気興奮、過剰行動、及び認知機能の低下が観察されるので、これを注意力欠陥・多動性モデルマウスとして有用に使用することができ、前記症状を共通して示す集中力障害疾病治療剤のスクリーニングに有用に使用することができる。また、前記注意力欠陥・多動性モデルマウスモデルに、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤のひとつのエトスクシミドを投与することで、脳波で観察されるスパイク数が減少するので、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を含む組成物を集中力障害疾病治療用に有用に使用することができる。
[本発明1001]
1）コバルト線（ｃｏｂａｌｔ  ｗｉｒｅ）をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
2）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
3）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウス。
[本発明1002]
コバルト線が、直径400〜500μｍであることを特徴とする、本発明1001の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
[本発明1003]
コバルト線が、放射状（ｒａｄｉａｌ）方向に、右側の背側外側（ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ）前頭葉の前後方向（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の2．0〜3．0ｍｍ、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の1．5〜2．5ｍｍ、及び腹部方向（ｖｅｎｔｒａｌ）の1．0〜2．0ｍｍの位置に挿入することを特徴とする、本発明1001の注意力欠陥・多動性モデルマウス。
[本発明1004]
1）コバルト線をマウスの脳の右側前頭葉側面に移植する工程、
2）コバルト線を移植した後、前記マウスの脳を縫合する工程、及び
3）集中力障害疾病を示すマウスを選別する工程
によって製造される、注意力欠陥・多動性モデルマウスを製造する方法。
[本発明1005]
1）被検化合物または組成物を本発明1001の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
2）工程1）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を測定する工程、及び
3）工程2）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を、被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、脳波のスパイク（ｓｐｉｋｅ）数が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
[本発明1006]
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、精神分裂症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、前頭葉てんかん（Ｆｏｒｎｔａｌ  ｌｏｂｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、及び自閉症（ａｕｔｉｓｍ）からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、本発明1005の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
[本発明1007]
1）被検化合物または組成物を本発明1001の注意力欠乏行動モデルマウスに投与する工程、
2）工程1）の、投与された注意力欠乏行動モデルマウスの行動障害または認知機能を測定する工程、及び
3）工程2）の注意力欠乏行動モデルマウスの脳波を被検化合物または組成物を投与しない対照群と比較して、行動障害または認知機能が減少した被検化合物または組成物を選別する工程
を含む、集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
[本発明1008]
行動障害が、常同症であることを特徴とする、本発明1007の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
[本発明1009]
認知機能が、恐怖学習機能記憶検査を通じて測定されることを特徴とする、本発明1007の集中力障害疾病治療剤のスクリーニング方法。
[本発明1010]
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1011]
Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが、α1Ｇ  Ｔ  カルシウムチャンネルであることを特徴とする、本発明1010の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1012]
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、本発明1010の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1013]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）、テトラメスリン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｒｉｎ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、フェニトイン（Ｐｈｙｅｎｙｔｏｉｎ）、ＳＵＮ−Ｎ8075、エホニジピン（ｅｆｏｎｉｄｉｐｉｎｅ）と、Ｙ3＋、Ｌａ3＋、Ｃｅ3＋、Ｎｄ3＋、Ｇｄ3＋、Ｈｏ3＋、Ｅｒ3＋、Ｙｂ3＋からなる群から選択される3価の金属イオン、Ｎｉ2＋、Ｕ−92032（7−［［4−［ビス（4−フルオロフェニル）メチル］−1−ピペラジニル］メチル］−2−［（2−ヒドロキシエチル）アミノ］4−（1−メチルエチル）−2，4，6−シクロヘプタトリエン−1−オン）、ペンフルリドール（ｐｅｎｆｌｕｒｉｄｏｌ）、フルスピリレン（ｆｌｕｓｐｉｒｉｌｅｎｅ）及びバルプロエイト（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1010の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1014]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1010の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1015]
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
[本発明1016]
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、本発明1014の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
[本発明1017]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ8075、エホニジピンと、Ｙ3＋、Ｌａ3＋、Ｃｅ3＋、Ｎｄ3＋、Ｇｄ3＋、Ｈｏ3＋、Ｅｒ3＋、Ｙｂ3＋からなる群から選択される3価の金属イオン、Ｎｉ2＋、Ｕ−92032（7−［［4−［ビス（4−フルオロフェニル）メチル］−1−ピペラジニル］メチル］−2−［（2−ヒドロキシエチル）アミノ］4−（1−メチルエチル）−2，4，6−シクロヘプタトリエン−1−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1014の集中力障害疾病の予防及び改善用健康食品。
[本発明1018]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミド、ゾニサミド、及びフェニトインからなる群で選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1014の集中力障害疾病の予防及び治療用組成物。
[本発明1019]
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分として含む、集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
[本発明1020]
集中力障害疾病が、注意力欠陥・多動性障害、精神分裂症、前頭葉てんかん、及び自閉症からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、本発明1019の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
[本発明1021]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ8075、エホニジピンと、Ｙ3＋、Ｌａ3＋、Ｃｅ3＋、Ｎｄ3＋、Ｇｄ3＋、Ｈｏ3＋、Ｅｒ3＋、Ｙｂ3＋からなる群から選択される3価の金属イオン、Ｎｉ2＋、Ｕ−92032（7−［［4−［ビス（4−フルオロフェニル）メチル］−1−ピペラジニル］メチル］−2−［（2−ヒドロキシエチル）アミノ］4−（1−メチルエチル）−2，4，6−シクロヘプタトリエン−1−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1019の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
[本発明1022]
前記Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、エトスクシミドであることを特徴とする、本発明1019の集中力障害疾病の予防及び改善用飼料添加剤。
[本発明1023]
集中力障害治療剤スクリーニングのための、本発明1001のマウスの使用。
[本発明1024]
集中力障害疾病治療剤の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
[本発明1025]
集中力障害疾病改善用健康食品の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
[本発明1026]
集中力障害疾病改善用飼料添加剤の製造のための、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤の使用。
[本発明1027]
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤が、ミベフラジル、テトラメスリン、エトスクシミド、ゾニサミド、フェニトイン、ＳＵＮ−Ｎ8075、エホニジピンと、Ｙ3＋、Ｌａ3＋、Ｃｅ3＋、Ｎｄ3＋、Ｇｄ3＋、Ｈｏ3＋、Ｅｒ3＋、Ｙｂ3＋からなる群から選択される3価の金属イオン、Ｎｉ2＋、Ｕ−92032（7−［［4−［ビス（4−フルオロフェニル）メチル］−1−ピペラジニル］メチル］−2−［（2−ヒドロキシエチル）アミノ］4−（1−メチルエチル）−2，4，6−シクロヘプタトリエン−1−オン）、ペンフルリドール、フルスピリレン及びバルプロエイトからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、本発明1023〜本発明1025のいずれかの使用。
【国際調査報告】
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