(57)【要約】  本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の生物学的作用を中和する結合メンバー、とりわけ抗体分子に関する。結合メンバーは、ｈＣＭＶ感染の治療および予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ｇＢタンパク質に残基１００〜４４７内の領域で結合し、残基番号付けは、完全長ｇＢ株ＡＤ１６９アミノ酸配列配列番号２３９に従って定義される、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に対する単離結合メンバー。
【請求項２】
表面プラズモン共鳴によって定められる１ｎＭ以下のＫＤでｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に対する単離結合メンバー。
【請求項３】
ＫＤが０．５ｎＭ以下である、請求項２に記載の結合メンバー。
【請求項４】
ＫＤが０．１ｎＭ以下である、請求項２または請求項３に記載の結合メンバー。
【請求項５】
結合メンバーがｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の抗原性ドメイン１（ＡＤ−１）または抗原性ドメイン２（ＡＤ−２）に結合しない、前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項６】
ｈＣＭＶの臨床分離株の５０％の中和のために必要とされる結合メンバーの濃度がヒト包皮線維芽細胞のｈＣＭＶ感染の中和についての中和アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌ以下である、前記請求項のいずれかに記載の単離結合メンバー。
【請求項７】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、ｈＣＭＶに対する単離結合メンバーであって、ＣＤＲの前記セットは、
ＨＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号３を有し、
ＨＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号４を有し、
ＨＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号５を有し、
ＬＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号９３を有し、
ＬＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号９４を有し、かつ
ＬＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号９５を有するＣＤＲのセットから２２以下のアミノ酸改変を有し、
結合メンバーは、表面プラズモン共鳴によって定められる５０ｎＭ以下のＫＤを有する、単離結合メンバー。
【請求項８】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＣＤＲの前記セットは、
ＨＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号３を有し、
ＨＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号４を有し、
ＨＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号５を有し、
ＬＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号９３を有し、
ＬＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号９４を有し、かつ
ＬＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号９５を有する
ＣＤＲのセットから２２以下のアミノ酸改変を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のｈＣＭＶに対する単離結合メンバー。
【請求項９】
Ｋａｂａｔ残基３１がＡｓｐまたはＧｌｙであり、
Ｋａｂａｔ残基３２がＨｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
Ｋａｂａｔ残基３３がＴｙｒであり、
Ｋａｂａｔ残基３４がＭｅｔ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基３５がＶａｌまたはＡｓｎである
ＨＣＤＲ１を含む、請求項７または８のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項１０】
ＨＣＤＲ１が配列番号３である、請求項９に記載の結合メンバー。
【請求項１１】
Ｋａｂａｔ残基５０がＴｒｐ、Ｓｅｒ、またはＣｙｓであり、
Ｋａｂａｔ残基５３がＧｌｎ、Ａｓｎ、またはＨｉｓであり、
Ｋａｂａｔ残基５４がＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｋａｂａｔ残基５８がＧｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、またはＨｉｓであり、
Ｋａｂａｔ残基６０がＧｌｙまたはＡｌａであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基６４がＧｌｎまたはＡｒｇである
ＨＣＤＲ２を含む、請求項７〜１０のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項１２】
ＨＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号４を有する、請求項１１に記載の結合メンバー。
【請求項１３】
Ｋａｂａｔ残基９９がＴｈｒまたはＡｌａであり、
Ｋａｂａｔ残基１００がＶａｌまたはＭｅｔであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＡｓｎまたはＴｈｒであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＳｅｒまたはＰｈｅであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＬｅｕ、Ｍｅｔ、またはＡｌａであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＳｅｒまたはＧｌｙであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＫがＨｉｓまたはＴｙｒであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＬがＡｓｎ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＭがＡｒｇ、Ｖａｌ、またはＩｌｅであり、
Ｋａｂａｔ残基１００ＮがＬｅｕまたはＭｅｔであり、
Ｋａｂａｔ残基１０１がＡｓｐまたはＧｌｙであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基１０２がＡｌａ、Ｖａｌ、またはＩｌｅである
ＨＣＤＲ３を含む、前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項１４】
ＨＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号５を有する、請求項１３に記載の結合メンバー。
【請求項１５】
ＬＣＤＲ１におけるＫａｂａｔ残基２６がＳｅｒもしくはＡｓｎである、またはＬＣＤＲ１におけるＫａｂａｔ残基２７はＳｅｒもしくはＡｒｇである、請求項７〜１４のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項１６】
ＬＣＤＲ１が配列番号９３である、請求項１５に記載の結合メンバー。
【請求項１７】
ＬＣＤＲ２におけるＫａｂａｔ残基５６がＳｅｒまたはＰｒｏである、請求項７〜１６のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項１８】
ＬＣＤＲ２が配列番号９４である、請求項１７に記載の結合メンバー。
【請求項１９】
Ｋａｂａｔ残基８９がＧｌｙまたはＡｌａであり、
Ｋａｂａｔ残基９１がＰｒｏまたはＴｒｐであり、
Ｋａｂａｔ残基９３がＡｒｇまたはＳｅｒであり、
Ｋａｂａｔ残基９４がＳｅｒまたはＡｓｐであり、
Ｋａｂａｔ残基９５ａがＳｅｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、
Ｋａｂａｔ残基９６がＶａｌまたはＴｙｒであり、かつ
Ｋａｂａｔ残基９７がＩｌｅまたはＶａｌである
ＬＣＤＲ３を含む、前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項２０】
アミノ酸配列配列番号９５を有するＬＣＤＲ３を含む、請求項１９に記載の結合メンバー。
【請求項２１】
抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ３、および／またはＣＤＲのセットを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に対する単離結合メンバー。
【請求項２２】
ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に残基１２１〜１３２および３４４〜４３８内の領域で結合し、残基番号付けが完全長ｇＢ株ＡＤ１６９アミノ酸配列配列番号２３９に従って定義される、請求項２１に記載の単離結合メンバー。
【請求項２３】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号３であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号４であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号５であり、
ＬＣＤＲ１が配列番号９３であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号９４であり、かつ
ＬＣＤＲ３が配列番号９５である、
前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項２４】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＨドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＨドメインが、配列番号２において示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項２５】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＬドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＬドメインが、配列番号９２において示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項２６】
アミノ酸配列配列番号２を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号９２を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
【請求項２７】
配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるＶＨドメインアミノ酸配列と、配列番号９２に対して少なくとも９０％同一であるＶＬドメインアミノ酸配列とを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する単離抗体分子。
【請求項２８】
抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ３、および／またはＣＤＲのセットを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に対する単離結合メンバー。
【請求項２９】
ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に残基１３３〜３４３内の領域で結合し、残基番号付けが完全長ｇＢ株ＡＤ１６９アミノ酸配列配列番号２３９に従って定義される、請求項２８に記載の単離結合メンバー。
【請求項３０】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号２４３であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号２４４であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号２４５であり、
ＬＣＤＲ１が配列番号２６３であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号２６４であり、かつ
ＬＣＤＲ３が配列番号２６５である
請求項１〜６、２８および２９のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３１】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号２４８であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号２４９であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号２５０であり、
ＬＣＤＲ１が配列番号２６８であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号２６９であり、かつ
ＬＣＤＲ３が配列番号２７０である、
請求項１〜６、２８および２９のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３２】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号２５３であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号２５４であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号２５５であり、
ＬＣＤＲ１が配列番号２７３であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号２７４であり、かつ
ＬＣＤＲ３が配列番号２７５である、
請求項１〜６、２８および２９のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３３】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号２５８であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号２５９であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号２６０であり、
ＬＣＤＲ１が配列番号２７８であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号２７９であり、かつ
ＬＣＤＲ３が配列番号２８０である、
請求項１〜６、２８および２９のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３４】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＨドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＨドメインが、配列番号２４２において示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６および２８〜３０のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３５】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＨドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＨドメインが、配列番号２４７において示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６および２８、２９および３１のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３６】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＨドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＨドメインが、配列番号２５２において示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６および２８、２９および３２のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３７】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＨドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＨドメインが、配列番号２５７において示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６および２８、２９および３３のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３８】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＬドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＬドメインが、配列番号２６２において示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６、２８〜３０および３４のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項３９】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＬドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＬドメインが、配列番号２６７において示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６、２８、２９、３１および３５のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項４０】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＬドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＬドメインが、配列番号２７２において示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６、２８、２９、３２および３６のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項４１】
結合メンバーが、抗体分子または抗体ＶＬドメインを含むその機能的断片を含み、ＶＬドメインが、配列番号２７７において示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する、請求項１〜６、２８、２９、３３および３７のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項４２】
アミノ酸配列配列番号２４２を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号２６２を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
【請求項４３】
アミノ酸配列配列番号２４７を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号２６７を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
【請求項４４】
アミノ酸配列配列番号２５２を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号２７２を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
【請求項４５】
アミノ酸配列配列番号２５７を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号２７７を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
【請求項４６】
配列番号２４２に対して少なくとも９０％同一であるＶＨドメインアミノ酸配列と、配列番号２６２に対して少なくとも９０％同一であるＶＬドメインアミノ酸配列とを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する単離抗体分子。
【請求項４７】
配列番号２４７に対して少なくとも９０％同一であるＶＨドメインアミノ酸配列と、配列番号２６７に対して少なくとも９０％同一であるＶＬドメインアミノ酸配列とを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する単離抗体分子。
【請求項４８】
配列番号２５２に対して少なくとも９０％同一であるＶＨドメインアミノ酸配列と、配列番号２７２に対して少なくとも９０％同一であるＶＬドメインアミノ酸配列とを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する単離抗体分子。
【請求項４９】
配列番号２５７に対して少なくとも９０％同一であるＶＨドメインアミノ酸配列と、配列番号２７７に対して少なくとも９０％同一であるＶＬドメインアミノ酸配列とを含む、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合する単離抗体分子。
【請求項５０】
前記請求項のいずれかに記載の結合メンバーまたは単離抗体分子と、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質への結合について競合する結合メンバーまたは抗体分子。
【請求項５１】
ＩｇＧである、請求項２６、２７、４２〜５０のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項５２】
請求項２４、２６、２７、３４〜３７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子の単離ＶＨドメイン。
【請求項５３】
請求項２５〜２７および３８〜５１のいずれかに記載の抗体分子の単離ＶＬドメイン。
【請求項５４】
請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項５５】
療法によってヒトまたは動物の体を治療する方法における使用のための、請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子を含む組成物。
【請求項５６】
ｈＣＭＶと関連する障害を治療するのに使用するための、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
ｈＣＭＶと関連する障害の治療における使用のための、請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子を含む組成物。
【請求項５８】
障害がｈＣＭＶ感染である、請求項５６に記載の組成物または請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
ｈＣＭＶ  ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質に結合する単離結合メンバーまたは抗体分子をさらに含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
個体におけるｈＣＭＶと関連する障害を治療するための方法であって、請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の結合メンバーまたは請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子を個体に投与することを含み、好ましくは、個体が易感染性の免疫系を有する、方法。
【請求項６１】
個体が、妊婦、新生児、移植レシピエント、またはＨＩＶに感染した個体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の結合メンバー、請求項５２に記載のＶＨドメイン、請求項５３に記載のＶＬドメイン、または請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項６３】
請求項６２に記載の核酸分子を用いてインビトロでトランスフェクトされるまたは形質導入された宿主細胞。
【請求項６４】
結合メンバー、抗体分子、または抗体ＶＨもしくはＶＬドメインを生成するための方法であって、結合メンバー、抗体分子、または抗体ＶＨもしくはＶＬドメインの生成のための条件下で、請求項６３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項６５】
結合メンバー、抗体分子、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを単離することおよび／または精製することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
結合メンバー、抗体分子、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを、少なくとも１つのさらなる構成成分を含む組成物に処方することをさらに含む、請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ｈＣＭＶに対する抗体抗原結合ドメインを生成するための方法であって、親ＶＨドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が表１９において示されるＨＣＤＲのセットである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む親ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を介して、親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、１つまたは複数のＶＨ／ＶＬ組合せを提供するために、このように提供されたＶＨドメインを１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせてもよく；ｈＣＭＶに対する抗体抗原結合ドメインを同定するために、親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せ（複数可）を試験することを含む、方法。
【請求項６８】
前記１つまたは複数のＶＬドメインが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む親ＶＬドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を介して提供され、親ＶＬドメインＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、表１９において示されるＣＤＲのＶＬセットであり、それぞれが親ＶＬドメインのアミノ酸配列変異体である１つまたは複数のＶＬドメインを生成する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインがＣＤＲ変異誘発によって提供される、請求項６７または請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
抗体抗原結合ドメインを、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または二特異性抗体分子もしくは多特異性抗体の構成成分として生成することをさらに含む、請求項６７〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
ｈＣＭＶに結合する結合メンバーを生成するための方法であって、ＶＨドメイン（複数可）が、交換されることとなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／もしくはＨＣＤＲ３を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／もしくはＨＣＤＲ３コード領域を欠く、ＶＨドメインをコードする開始核酸、またはそれぞれがＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供し；ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供するために、前記開始核酸または開始レパートリーを、表１９において示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／もしくはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするもしくはその変異によって生成されるドナー核酸（複数可）と、前記ドナー核酸（複数可）が、開始核酸または開始レパートリーにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域の中に挿入されるように組み合わせ；産物ＶＨドメインを生成するために前記産物レパートリーの核酸を発現させ；前記産物ＶＨドメインを、１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせてもよく；産物ＶＨドメインを含み、かつＶＬドメインを含んでいてもよい、ｈＣＭＶに対する結合メンバーを選択し、前記結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収することを含む、方法。
【請求項７２】
ドナー核酸が前記ＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３の変異によって生成される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
核酸のランダム変異によってドナー核酸を提供することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
回収された結合メンバー内に含まれる産物ＶＨドメインを抗体定常領域に結合することをさらに含む、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
産物ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または二特異性抗体分子もしくは多特異性抗体を提供することを含む、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ｈＣＭＶを中和する能力について、ｈＣＭＶに結合する抗体抗原結合ドメインまたは結合メンバーを試験することをさらに含む、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
ｈＣＭＶに結合し、ｈＣＭＶを中和する抗体分子を含む結合メンバーが得られる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
対象または試料におけるｈＣＭＶを中和するための方法であって、約０．１〜約５．０μｇ／ｍｌの濃度でｈＣＭＶ感染性を少なくとも５０％低下させるのに十分な量で、請求項１〜２５および２８〜４１のいずれかに記載の結合メンバーまたは請求項２６、２７、および４２〜５１のいずれかに記載の抗体分子を、前記対象または試料に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の生物学的作用を中和する結合メンバー、とりわけ抗体分子に関する。結合メンバーは、ｈＣＭＶ感染の治療および予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）は、地理的および社会経済的な出自に応じて、ヒト集団の４０〜８０％において、無症候性の、生涯にわたる存続を通常確立する、広く分布する病原体である。しかしながら、移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体などのような免疫不全患者においてならびにまた新生児においても、ｈＣＭＶ感染は、罹患および死亡の主な原因であり、医療制度に著しい経済的負担をかける。
【０００３】
ｈＣＭＶは、臓器移植（ＳＯＴ）および造血幹細胞移植（ＳＣＴ）の結果に影響を与える最も深刻な感染である（Razonable & Paya, 2003）。移植後に、活動性ｈＣＭＶ感染が、血清陽性ドナー由来の臓器移植を受けるｈＣＭＶ血清陽性患者または血清陰性患者のおよそ６０〜７０％において起こる（Razonable & Paya、同書）。予防手段が取られない場合、ｈＣＭＶ疾患を発症する危険性は、２０〜３０％となる。およそ２６，０００の同種異系ＳＣＴが２００８年に世界的に実行されたという事実を考慮すると（ｗｗｗ．ｃｉｂｍｔｒ．ｏｒｇ）、この療法の成功ならびに移植後の罹患および死亡の低下は、相当な財政上の意味合いを有する。ｈＣＭＶ関連性の合併症は、患者当たり２５，０００〜５０，０００ユーロの追加費用をもたらし得る。
【０００４】
さらに、移植患者におけるＨＣＭＶ感染は、移植関連性のアテローム性動脈硬化症および移植片機能損失の加速と関連する（Streblow et al., 2007）。
【０００５】
以前に言及されたように、ｈＣＭＶは、周産期の病原体として関連する。毎年、およそ１％の感受性の女性は、妊娠の間に血清変換する。これらのおよそ４０％は、彼女らの子供たちにｈＣＭＶを伝染させ、ＵＳＡにおいて毎年、４０，０００人の感染新生児をもたらす（Kenneson & Cannon, 2007）。感染した子供たちの１０〜２０％は、出生時に急性の症状を有する。これらのうち、２０％までが死亡し、残りは、典型的には、失明、難聴、および精神遅滞のような、ＣＮＳ関連性の状態を含む、中程度から重度の合併症を有する。罹患患者および彼らの家族についての衝撃的な結果に加えて、周産期感染が重症で永久的な能力障害をもたらす場合、それらの患者についての医療費は、特に深刻である。
【０００６】
現在まで、５つの抗ウイルス剤が、ｈＣＭＶ感染において使用するために承認されている：ガンシクロビル／バルガンシクロビル、シドホビル、ホスカルネット、およびホミビルセン。化合物はすべて、用量依存性の副作用および抵抗性ウイルス株の発生を欠点として持つ（Schreiber et al., 2009）。これらの薬剤はどれも、子供たちまたは妊娠中の女性における使用には許可されていない。さらに、静脈内免疫グロブリン調製物（ＩＶＩＧ）、たとえばＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）およびＣｙｔｏｔｅｃｔ（登録商標）（Ｂｉｏｔｅｓｔ）は、ｈＣＭＶ感染の危険性がある患者の予防および治療に使用される。しかしながら、移植の状況におけるこの治療の利点についての不確実性は、明白である（Sokos et al., 2002；Raanani et al., 2009）。ｈＣＭＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の養子移入は、造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）ＳＣＴ患者において成功裏に使用されてきた（Moss & Rickinson, 2005）が、この治療は、非常に高価であり、必要な専門的技術を有する少数の移植センターに限られるであろう。さらに、この種の治療は、ｈＣＭＶについて血清陽性である移植レシピエントに限定される。対照的に、ＩＶＩＧは、先天性ＣＭＶ感染の治療および予防において有効であることが報告された（Nigro et al., 2005）。しかしながら、ｈＣＭＶ治療のためのＩＶＩＧは、ｈＣＭＶ血清陽性ドナーから単離および精製されており、これらの調製物における変動的な力価をもたらし、そのため、ｈＣＭＶ特異的抗体についてのバッチ間変動をもたらす。さらに、ヒト血液由来の薬剤産物は、ヒト病原体の伝染についての危険性を常に有する。結果として、ｈＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患の予防および治療のための、ｈＣＭＶの効率的な中和を可能にする組換え抗体産物が、所望される。
【０００７】
ｈＣＭＶ感染の抗体療法に対する標的は、ｈＣＭＶビリオンの表面において発現されるタンパク質である。ｈＣＭＶビリオンエンベロープの組成は、非常に複雑であり、また、エンベロープを含む多くの構造タンパク質が同定されているが、それはなお、完全には定義されていない。ｈＣＭＶの療法のための抗体の開発の間に、抗原決定基が、表面糖タンパク質複合体ｇｐ５８／１１６（ｇＢまたはｇＣ−１）、ｇｐ４７−５２（ｇＣ−ＩＩ；ｇＭおよびｇＮ）（Shimamura et al., 2006）、ならびにｇｐ８６（ｇＨまたはｇＣ−ＩＩＩ）（Urban et al., 1996）において同定されてきた。現在まで同定された大多数の中和抗体は、ｇＢタンパク質に結合し、これは、大多数の中和エピトープを含有することが示されている（Britt et al., 1990）。ｇＢ複合体は、１３０ｋＤ前駆物質として合成され、これは、切断されて、ｇｐ５８およびｇｐ１１６と名付けられる２つの共有結合分子になる。Ｎ末端断片（ｇｐ１１６）は、２０のアミノ酸（アミノ酸６７〜８６）の抗原性ドメイン−２（ＡＤ−２）と呼ばれる１つの直線状の中和エピトープを含有し、これは、抗体媒介性の生物学的活性のための補体を必要としない（Meyer et al., 1990）。ｇＢのｇｐ５８成分は、中和ドメインＡＤ−１を保持し、これは、７４のアミノ酸（アミノ酸５５７〜６３０）を含み、立体構造エピトープに相当する可能性が高い（Ohlin et al., 1993；Wagner et al., 1992）。
【０００８】
モノクローナル抗体の出現は、最初に、ｈＣＭＶに対する様々な中和マウスモノクローナル抗体の同定をもたらした。しかしながら、マウスモノクローナル抗体は、これらのタンパク質が、外来としてヒト免疫系によって認識され、したがって、非常に短期間の後に排除され、低い臨床効果しかもたらさないまたは臨床効果をもたらさないので、ヒト療法において使用するのに適さない。キメラ抗体は、ｈＣＭＶタンパク質に対して開発されており、ＥＰ６６４８３４Ｂ（Harris et al）は、ｇＨと称される、ｈＣＭＶの８６ｋＤ糖タンパク質を標的にするキメラ抗体を記載しているが、そのような抗体は、臨床設定において成功していない。
【０００９】
ハイブリドーマの作成のためにヘテロミエローマを使用する技術は、いずれもウイルスエンベロープにおいて見出される様々なｈＣＭＶ糖タンパク質を認識する様々なヒトモノクローナル抗体を作成するために使用されてきた。ＵＳ５，０４３，２８１（Masuho et al）は、１３０，０００〜５５，０００の分子量を有するＣＭＶ抗原タンパク質を認識する中和ヒトモノクローナル抗体を記載する。ＵＳ５，７５０，１０６（Ostberg）は、ｇＨ糖タンパク質を認識する、ＳＤＺ  ＭＳＬ  １０９と称されるＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体およびこの抗体の生成のためのハイブリドーマ細胞系を記載する。ウイルス中和ヒトモノクローナル抗体のうちの１つ、ＳＤＺ  ＭＳＬ−１０９は、免疫不全患者におけるｈＣＭＶ誘発性の網膜炎について、フェーズＩ／ＩＩ臨床試験において評価されたが、効能の欠如により、臨床試験は、継続されなかった（Borucki et al., 2004；Hamilton et al., 1997；Boeckh et al., 2001）。これらの試験の失敗についての１つの妥当性のある説明は、ｈＣＭＶの抗原多様性である。ｈＣＭＶは、それが抗原多様性である点で、ヒトヘルペスウイルスの中で特有であり、エンベロープ抗原と反応するほとんどのヒトモノクローナル抗体は、株特異的な中和能力を示す。これは、ＳＤＺ  ＭＳＬ−１０９のような、ｇＨ特異的ヒトモノクローナル抗体についてとりわけ該当する。この障害は、異なる分離株の間で保存される、ｈＣＭＶ上のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体の使用によってのみ克服することができる。
【００１０】
過去においては、中和能力についての抗体のハイスループットスクリーニングが利用可能でなかったために、ｈＣＭＶ中和モノクローナル抗体の単離における進歩は、ゆっくりとしていた。さらに、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）不死化の方法は、目的の抗体を数年間生成する不死化Ｂ細胞を作成するために頻繁に使用されてきた。この技術は、抗原特異的選択を使用する健康な対象の末梢血（Casali et al., 1986）、患者由来のリンパ節、脾臓、または末梢血（Yamaguchi et al., 1987；Posner et al., 1991；Raff et al., 1988；Steenbakkers et al 1993 and 1994）などのような、ヒトＢ細胞の異なる供給源からの抗体分泌細胞の作成に成功してきた。この技術は、ＣＭＶ血清陽性血液ドナーから単離された末梢血単核細胞の不死化および３つの抗体：ＩＴＣ５２、ＩＴＣ６３ｂ、およびＩＴＣ８８の続く単離のために使用されてきた（ＷＯ  ９３／０２１９５２  Ａ１）。ＩＴＣ５２およびＩＴＣ６３ｂは、ＣＭＶ  ｇｐ５８のアミノ酸配列５５７〜６３０から成る、ＣＭＶの立体構造ＡＤ−１エピトープと反応性であり、ＩＴＣ８８は、ＣＭＶ  ｇｐ１１６のアミノ酸配列６７〜８６（ＡＤ−２）を含むＡＤ−２に対して反応性である（ＷＯ  ９３／０２１９５２  Ａ１）。
【００１１】
ＥＢＶ形質転換の方法に対する改善は、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（ＷＯ  ０４／０７６６７７  Ａ２）およびＦｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ（ＷＯ  ０７／０６８７５８  Ａ１）によって公開されており、これらの方法は、ｈＣＭＶに対する抗体の作成のために使用されてきた。ＷＯ  ０８／０８４４１０  Ａ２（Lanzavecchia & Macagno）は、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞、および樹状細胞のｈＣＭＶ感染を中和し、ｇｐＵＬ１３０およびｇｐＵＬ１３１Ａによって形成される立体構造エピトープの方に向けられる、ＥＢＶ細胞系１Ｆ１１、２Ｆ４、５Ａ２、および９Ａ１１から生成される抗体を記載する。しかしながら、線維芽細胞が感染のための標的細胞として使用される場合、これらのＥＢＶ系由来の抗体は、検出可能なｈＣＭＶ中和能力を有していない。ＷＯ  ０８／０８４４１０  Ａ２もまた、０．３〜２．０μｇ／ｍｌの範囲に及ぶ、最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）で線維芽細胞および内皮細胞のｈＣＭＶ感染を中和する抗体を生成するＥＢＶ系１０Ｃ６、５Ｆ１、６Ｂ４、および７Ｈ３に言及している。これらのＥＢＶ系から生成された抗体は、ｇＢの機能的エピトープに結合することが記載されている。しかしながら、抗体重鎖配列および軽鎖配列が、上記に言及されるＥＢＶ細胞系のいくつかから推定されたが、このデータは、公開された配列によってコードされる、組換え発現精製抗体について確認されていない。Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ＆  Ｍａｃａｇｎｏからのより最近の特許出願（ＷＯ  １０／００７４６３  Ａ１）は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａタンパク質の組合せによって決定されるエピトープに結合し、内皮、網膜、および樹状細胞のｈＣＭＶ感染を中和する抗体６Ｇ４を記載している。さらに、ＷＯ  １０／００７５３３  Ａ１（Lanzavecchia & Macagno）は、ｈＣＭＶ  ＵＬ１２８タンパク質中のエピトープ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、およびＵＬ１３０タンパク質によって形成されるエピトープ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａタンパク質によって形成されるエピトープ、またはＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａタンパク質によって形成されるエピトープに結合するｈＣＭＶ中和抗体を記載する。
【００１２】
ＷＯ  ０８／０７１８０６  Ａ１（Funaro et al）は、ｈＣＭＶに結合し、中和するが、ＥＬＩＳＡによって試験された場合、抗原ｇＢまたはｇＨのどちらに対しても有意な結合を示さない抗体２６Ａ１を記載する。抗体２６Ａ１の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）は、一次線維芽細胞および内皮細胞の両方について１μｇ／ｍｌの範囲にあり、そのため、先行技術において記載される抗体によって到達される範囲にあることが報告されている。Ｆｕｎａｒｏおよび同僚によるさらなる特許出願は、ｇＨを認識する抗体１Ｆ７を記載する（ＷＯ  ０９／００３９７５  Ａ１）。抗体２６Ａ１と同様に、ＷＯ  ０８／０７１８０６  Ａ１において記載されるように、抗体１Ｆ７の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）は、一次線維芽細胞および内皮細胞の両方について１μｇ／ｍｌの範囲にあり、そのため、先行技術において記載される抗体によって到達される範囲にあることが報告されている。Ｆｕｎａｒｏおよび同僚による他の特許出願（ＷＯ  ０９／０２４４４５  Ａ１）は、どれも、ｇＢのＡＤ−２ドメイン（クローン８Ｃ１０、８Ａ１１、１０Ｂ７）またはｇＢもしくはｇＨと関連しないタンパク質（クローン３７Ｂ７）を認識する抗体８Ｃ１０、３７Ｂ７、８Ａ１１、および１０Ｂ７を記載する。Ｆｕｎａｒｏおよび同僚の特許出願（ＷＯ  ０８／０７１８０６  Ａ１およびＷＯ  ０９／００３９７５  Ａ１）におけるように、ＷＯ  ０９／０２４４４５  Ａ１において記載される抗体もまた、一次線維芽細胞および内皮細胞の両方について１μｇ／ｍｌの範囲の（１０Ｂ７、８Ａ１１、３７Ｂ７）または約１０μｇ／ｍｌのより高度の（８Ｃ１０）、そのため、先に公開されるｈＣＭＶ中和抗体の範囲の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【００１３】
さらなる最近の特許出願は、類似する特徴を有するｈＣＭＶ中和抗体を記載する。たとえば、ＷＯ  ０９／１１４５６０  Ａ２（Olsen）は、すべて、ｇＢのＡＤ−２エピトープに結合する抗体クローン２Ｆ１０、２Ｍ１６、２Ｎ９、３Ｃ２１、３Ｇ７、４Ｐ１２、５Ｐ９、９Ｃ１６を記載し、１μｇ／ｍｌの範囲で線維芽細胞のｈＣＭＶ感染の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。ＵＳ２００９０００４１９８（Nakajima et al）は、１μｇ／ｍｌまたはそれ以上（１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）の濃度で使用される場合に、線維芽細胞に対する見かけ上のｐＭ結合親和性および８０％のｈＣＭＶ中和活性を有する、ｇＢ  ＡＤ−１ドメインに対する高親和性抗体を開示する。いずれもＥｖｅｃ  Ｉｎｃ．からの２つの最近の出願であるＷＯ  １０／１１４１０５  Ａ１およびＷＯ  １０／１１４１０６  Ａ１は、ＡＤ−２およびＡＤ−１中の非連続的エピトープにそれぞれ結合する抗体を記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明において開示されるように、発明者らは、ｈＣＭＶのｇＢタンパク質に高い親和性で結合するｈＣＭＶ中和ヒト抗体を開発した。さらに、これらの抗体は、広範囲のｈＣＭＶ感受性の細胞型（線維芽細胞、内皮、上皮、および樹状細胞）を使用すると、ｈＣＭＶ中和において類似する高い効力（０．５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０）を示し、実験室株ＡＤ−１６９だけではなく、これまで試験されたすべての臨床分離株に対して高い効力を示す。さらに、本明細書において開示される抗体は、先に記載されたことがないｇＢタンパク質の新規な中和エピトープを認識し、定める。本明細書において記載される機能的研究によって決定されるそれらの高い親和性および効力ならびにそれらの新規なエピトープ結合特徴のおかげで、本発明の結合メンバーは、ヒト患者におけるｈＣＭＶ感染の治療上の治療、予防、および／または診断において使用するために特に適している。結合メンバーは、本明細書において他のところで詳細に別記されるように、ＣＭＶ感染と関連する様々な障害を治療するのに有用である。
【００１５】
発明の概要
いくつかの高度に強力で、ｇＢ特異的なｈＣＭＶ中和ヒト抗体が、本明細書において記載され、これらはまた、完全に新しいｈＣＭＶ中和エピトープを認識し、そのため、ｈＣＭＶに対して特異的な他のすべての既知の抗体と比較して、異なる治療原理によって作用する。それらの発見および機能的特徴付けは、さらに下記に開示される。実施例においてより詳細に記載されるように、５０の完全ヒトｈＣＭＶ中和抗体が、同定された。それらは、ｈＣＭＶに感染したドナーに由来する、ＥＢＶ形質転換ヒト末梢血由来Ｂ細胞から単離された。抗体１〜５０のＣＤＲ配列は、表１９および２０において詳述されるとおりである。抗体１〜４６のパネルのためのＶＨドメインおよびＶＬドメインの組合せは、表７において詳述されるとおりである。表７および１９において言及される配列はすべて、本開示の一部を形成する、添付の配列表において示される。
【００１６】
下記により詳細に記載されるように、本発明による結合メンバーは、治療上関連する濃度で、つまり、１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０により、標的細胞のｈＣＭＶ感染を中和することが示された。最も活性な結合メンバーは、さらに０．５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０でｈＣＭＶを中和する。中和能力はまた、異なるｇＢ遺伝子型を示す異なる臨床分離株により観察された（たとえばTowne and Altu；表１６）。本発明の結合メンバーは、ｈＣＭＶの１つまたは複数の活性を中和してもよい。たとえば、阻害される生物学的活性は、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞、および／または樹状細胞の感染の予防であってもよい。線維芽細胞の感染の予防は、ｈＣＭＶの組換え株、レポーター遺伝子ルシフェラーゼを発現するＡＤ１６９を利用するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）中和アッセイにおいて示された。この遺伝子修飾ｈＣＭＶ株による感染に際して、標的細胞は、ルシフェラーゼ酵素発現について陽性になり、これは、標準的なルミノメーターにおいて適切な基質変換によって検出することができる。本発明において記載される結合メンバーは、最初に、組換えルシフェラーゼ陽性ウイルス株と共にインキュベートされ、次いで、一次ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の単層上に接種された場合に、ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９の感染を中和することが示された。さらなるインキュベーションに続いて、発光は、ルミノメーターを使用して検出され、相対的光単位（ＲＬＵ）が検出された。次いで、中和の割合は、計算された。中和タイターは、標的細胞のｈＣＭＶ感染の５０％または１００％の低下を引き起こす、結合メンバー（μｇ／ｍｌ）の濃度として示される。結合メンバーは、０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜１．３μｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．１〜０．６μｇ／ｍｌの濃度でｈＣＭＶ感染の５０％の低下を引き起こしてもよい。結合メンバーは、０．１、０．５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、または２．０μｇ／ｍｌの治療上関連する濃度でｈＣＭＶ感染の５０％の低下をもたらすことが示された。
【００１７】
ｈＣＭＶの感染性の中和を決定するために使用されてもよい他の方法は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ならびにプラーク形成およびカウントに基づく目視検査を含む。
【００１８】
本明細書において記載される結合メンバーは、線維芽細胞だけではなく、内皮、上皮、および樹状細胞において同様の効能によりヒトｈＣＭＶを中和することが示された（一次包皮線維芽細胞を使用するアッセイ、実施例４において、また、実施例７において示されるように、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒトＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞、および一次樹状細胞を使用するアッセイにおいて示されるように）。
【００１９】
本発明は、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に特異的な、ｈＣＭＶに対する高親和性結合メンバーを開示する。本発明の結合メンバーは、５０ｎＭ以下の、たとえば、２５ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、７５ｐＭ、または５７ｐＭ以下のＫＤでｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合してもよい。好ましくは、結合メンバーは、１ｎＭ以下、好ましくは０．５ｎＭ未満、好ましくは０．１ｎＭ未満、より好ましくは７５ｐＭ未満のＫＤを有する。ＫＤは、表面プラズモン共鳴、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって決定されてもよい。親和性のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定は、実施例５において本明細書において記載される。
【００２０】
本明細書において別記されるように、表面プラズモン共鳴は、固体支持体に結合されたリガンドに対して、液相中の分析物を通過させることならびに分析物およびリガンドの間の結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を決定することを含む。結合メンバーが、支持体に結合されたｇＢタンパク質に対して液相中を通過する表面プラズモン共鳴が、たとえば、実行されてもよい。表面プラズモン共鳴データは、一価分析物データモデル（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅ  ｄａｔａ  ｍｏｄｅｌ）に適合されてもよい。親和性は、一価分析物データモデルを使用して、表面プラズモン共鳴によって決定される解離および結合速度定数の比ｋｄ／ｋａから計算される解離定数、ＫＤとして表現されてもよい。
【００２１】
本明細書において記載される結合メンバーは、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の特異的領域に結合することが示される。ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の既知のエピトープは、ｇＢ株ＡＤ１６９、配列番号２３９の抗原性ドメイン１（ＡＤ−１；アミノ酸５５２〜６３５の間）および／または抗原性ドメイン２（ＡＤ−２；アミノ酸６７〜８６の間）内に位置する。本発明では、発明者らは、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の２つの新しい抗原性ドメイン、抗原性ドメイン４（ＡＤ−４；ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９のアミノ酸１２１〜１３２および３４４〜４３８の間の非連続的領域）ならびに抗原性ドメイン５（ＡＤ−５；ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９のアミノ酸１３３〜３４３の間）に結合する結合メンバーを記載する。最初の実験では、本明細書において記載される６つの結合メンバー、モノクローナル組換え抗体Ａｂ−０４、Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、Ａｂ−１９、Ａｂ−２８、およびＡｂ−４２がｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の特異的領域に結合する能力について調査された。特に、これらの６つの結合メンバーのエピトープ結合特異性は、ｇＢタンパク質のＡＤ−１またはＡＤ−２エピトープのいずれかに結合する当技術分野において既知の抗ｈＣＭＶ抗体の選択と共に、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）競合アッセイにおいて最初に調査された。本発明の結合メンバーは、高い親和性でｇＢタンパク質に特異的に結合したが、ＡＤ−１およびＡＤ−２特異的抗体とｇＢ結合について競合することができなかったので、本発明の結合メンバーがｇＢタンパク質の新規な中和エピトープを認識することは明らかであった。この発見についてのさらなる支持は、アミノ酸残基１００〜４４７を含むｇＢタンパク質（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９）の切断型バージョンの発現によって得られ、これは、ＣＯＳ細胞における発現に際して本発明の結合メンバーによって認識された。
【００２２】
ＨＣＭＶ  ｇＢ（株ＡＤ１６９；配列番号２３９）の分子モデルの作成に続いて、表面に露出したタンパク質ドメインが、同定され、アミノ酸残基１２１〜１３２および３４４〜４３８の間の非連続的アミノ酸配列は、本発明の結合メンバーが結合することができる有望なエピトープであることが推定された。この推定されるエピトープが、合成アミノ酸リンカーによってつながれたアミノ酸１１６〜１３２および３４４〜４４０（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９）として発現される場合、この組換えタンパク質が、本発明の結合メンバーＡｂ−１１、Ａｂ−１４、またはＡｂ−２８によって特異的に認識されることが分かった。この新しいエピトープは、ＡＤ−４と称された。そのため、本発明の結合メンバーは、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の領域ＡＤ−１に結合しない。また、本発明の結合メンバーは、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の領域ＡＤ−２にも結合しない。対照的に、本発明の結合メンバーＡｂ−０１〜Ａｂ−４６は、アミノ酸残基１００〜４４７、好ましくはアミノ酸残基１２１〜４３８の間の、ＡＤ−４と称される（ドメインＩＩ（ＤｏｍＩＩ）とも称される）新しい立体構造エピトープに結合する。より好ましくは、本発明の結合メンバーは、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）の非連続的アミノ酸ストレッチ１１６〜１３２および３４４〜４４０、最も好ましくは、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のストレッチ１２１〜１３２および３４４〜４３８に結合する。この点では、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸ストレッチ１２１〜１３２および３４４〜４３８によって作成される非連続的エピトープが、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸ストレッチ１１６〜１３２および３４４〜４４０によって作成される非連続的エピトープと同じエピトープを構成することが本発明に従って理解されなければならない。
【００２３】
抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６はすべて、構造的に関連するＣＤＲを有し（特に、同一の長さおよび関連する配列のＨＣＤＲ３）、単一のドナーに由来し、これらの抗体分子は、もとのｇＢ反応性クローンの体細胞変異体である可能性が高く、そのため、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質上の同じまたは非常に類似する重複するエピトープに結合することが期待される。したがって、組換え抗体Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、またはＡｂ−２８を用いて得られたエピトープ特徴付けの結果は、本明細書において開示される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のすべてについて代表するものであることもまた、期待される。そのため、本発明は、抗体Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、またはＡｂ−２８によって認識される、ｇＢタンパク質の立体構造エピトープに結合する結合メンバー、好ましくは抗体およびこれらの抗体によって認識されるｇＢタンパク質の立体構造エピトープへの結合について抗体Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、またはＡｂ−２８のいずれかと競合する結合メンバーにも関する。
【００２４】
そのため、第１の実施形態では、本発明の結合メンバーは、構造モデルから推定されるアミノ酸１１６〜１３２またはアミノ酸１２１〜１３２を含む領域でｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合してもよい（実施例９）。本発明の結合メンバーはまた、構造モデルから推定されるアミノ酸３４４〜４４０またはアミノ酸３４４〜４３８を含む領域でｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合してもよい（実施例９）。所望により、結合メンバーは、アミノ酸１１６〜１３２および／またはアミノ酸３４４〜４４０に結合することに加えて、ｈＣＭＶ  ｇＢアミノ酸配列における側面に位置する残基または構造的に隣接する残基に結合してもよい。慣例によって、残基番号付けは、ｈＣＭＶ  ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）に対応する。
【００２５】
さらなる実験では、本明細書において記載される４つの結合メンバー、モノクローナル組換え抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、Ａｂ−５０が、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の特異的領域に結合する能力について調査された。特に、これらの４つの結合メンバーのエピトープ結合特異性は、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ（実施例８．３）においておよび次いで捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例１０．２）を使用して最初に調査された。これらの４つの結合メンバーが、ｇＢタンパク質のさらなる新規な中和エピトープを認識することは明らかであった。
【００２６】
ＨＣＭＶ  ｇＢ（株ＡＤ１６９；配列番号２３９）の分子モデルの作成に続いて、表面に露出したタンパク質ドメインが、同定され、アミノ酸残基１３３および３４３の間のアミノ酸配列は、本発明の結合メンバーが結合することができる有望なエピトープであることが推定された。この推定されるエピトープは、２つのサブドメインとして細分され、発現された：サブドメイン１（アミノ酸１３３〜１４４および２５１〜３４３）ならびにサブドメイン２（アミノ酸１４０〜２５５）（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９）。捕捉ＥＬＩＳＡにおいて試験された場合、サブドメイン１は、本発明の結合メンバーＡｂ−４７、Ａｂ−４９、またはＡｂ−５０によって認識された。アミノ酸１３４〜３４４（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９）の新しいエピトープ領域は、ＡＤ−５と称された。そのため、本発明の結合メンバーＡｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、またはＡｂ−５０は、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の領域ＡＤ−１に結合しない。また、本発明の結合メンバーは、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質の領域ＡＤ−２にも結合しない。対照的に、本発明の結合メンバーＡｂ−４７〜Ａｂ−５０は、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸残基１３３〜３４３の間の、ＡＤ−５と称される（ドメインＩ（ＤｏｍＩ）とも称される）新しい立体構造エピトープに結合する。
【００２７】
そのため、本発明は、抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、またはＡｂ−５０によって認識される、ｇＢタンパク質のエピトープに結合する結合メンバー、好ましくは抗体およびこれらの抗体によって認識されるｇＢタンパク質の立体構造エピトープへの結合についてこれらの４つの抗体のいずれかと競合する結合メンバーにも関する。
【００２８】
そのため、第２の実施形態では、本発明の結合メンバーは、構造モデルから推定されるアミノ酸１３３〜３４３を含む領域でｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質に結合してもよい（実施例９）。所望により、結合メンバーは、アミノ酸１３３〜３４３に結合することに加えて、ｈＣＭＶ  ｇＢアミノ酸配列における側面に位置する残基または構造的に隣接する残基に結合してもよい。慣例によって、残基番号付けは、ｈＣＭＶ  ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）に対応する。
【００２９】
本発明の結合メンバーは、抗体分子、たとえば完全ヒトアミノ酸配列を有する抗体分子を含んでいてもよい。結合メンバーは、通常、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。結合メンバーのＶＨおよびＶＬドメインはまた、本発明の一部としても開示される。ＶＨおよびＶＬのドメインのそれぞれは、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体ＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と呼ばれる３つのＨＣＤＲ領域を含む。抗体ＶＬドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と呼ばれる３つのＬＣＤＲ領域を含む。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、以下の構造において、ＣＤＲが散在する４つのフレームワーク領域、ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、ＦＷＲ３、およびＦＷＲ４を含む：ＦＷＲ１−ＣＤＲ１−ＦＷＲ２−ＣＤＲ２−ＦＷＲ３−−ＣＤＲ３−ＦＷＲ４。
【００３０】
本発明による抗体ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの例は、本開示の一部を形成する、添付の配列表において列挙されるとおりである。さらなるＣＤＲは、下記および表１９において開示される。本明細書において開示されるＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、ならびにＨＣＤＲのセットおよびＬＣＤＲのセットはすべて、本発明の態様および実施形態を示す。本明細書において記載されるように、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。したがって、重鎖ＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、軽鎖ＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。特に指定のない限り、「ＣＤＲのセット」は、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
【００３１】
典型的には、本発明の結合メンバーは、モノクローナル抗体である。
【００３２】
本発明の結合メンバーは、下記にさらに議論されるように、非抗体タンパク質足場において１つまたは複数のＣＤＲ、たとえばＣＤＲのセットによって通常提供される、非抗体分子内の抗原結合部位を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明による結合メンバーＡｂ−０１〜Ａｂ−４６は、最初に、ｈＣＭＶ感染ドナーから単離され、ＳＭ１、ＳＭ３、ＳＭ４、ＳＭ５、ＳＭ６、ＳＭ７、ＳＭ９、ＳＭ１０、またはＳＭ１１と呼ばれるＥＢＶ不死化Ｂ細胞系から単離された。これらの９つの細胞系から、ヒト抗体の３７の異なるＶＨコード配列および６２の異なるＶＬコード配列を同定することができた（表６）。ＩｇＨ鎖およびＩｇＬ鎖として、それぞれの細胞系から同定されたＶＨおよびＶＬコード配列のすべての組合せにより、理論上、２９５の異なる抗体を作成することができる。これらのうち、ルシフェラーゼ発現ｈＣＭＶ実験室株ＡＤ−１６９および一次ヒト包皮線維芽細胞を使用する第一生物学的スクリーニングアッセイにおいてｈＣＭＶ中和抗体であった４６の異なる組換え抗体が、同定された。これらの組換え抗体の６つは、高い効力（１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０）によりｈＣＭＶを中和し、１５ｎＭ以下のＫＤの高い親和性でｇＢタンパク質に結合することが分かった（下記表１３＆１５）。
【００３４】
結合メンバー可変ドメインの構造および位置は、Kabat et al., (1991)およびその改訂を参照して決定されてもよい。それぞれ、表１９および２０において指定されるＣＤＲのセットを含む結合メンバーのパネルが、本明細書において記載され、ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５を有し、ＨＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５を有し、ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２を有する。ＬＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４を有し、ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６を有し、かつＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７を有する。Ｋａｂａｔの番号付けは、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／を使用して決定された。
【００３５】
本発明の第１の実施形態の結合メンバーは、本明細書において記載される１つまたは複数のＣＤＲ、たとえばＣＤＲ３を含んでいてもよく、所望により、ＣＤＲのセットを形成するためにＣＤＲ１およびＣＤＲ２もまた含んでいてもよい。ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＣＤＲもしくはＣＤＲのセットまたは本明細書において記載されるその変異体であってもよい。
【００３６】
結合メンバーは、Ｈおよび／またはＬ  ＣＤＲの開示されるセット内に１つまたは複数のアミノ酸変異を有する、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセットを含んでいてもよい。アミノ酸変異は、あるアミノ酸の置換、欠失、または挿入である。提供される例および開示される配列に基づいて、Ｈおよび／またはＬ  ＣＤＲのセット内に、たとえば、最大２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１までの変異、たとえば置換があってもよい。さらに、ＨＣＤＲ３中に最大９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１までの変異があってもよいならびに／またはＨＣＤＲ２中に最大６、５、４、３、２、もしくは１までの変異があってもよいならびに／またはＨＣＤＲ１中に最大３、２、もしくは１までの変異があってもよいならびに／またはＬＣＤＲ３中に最大６、５、４、３、２、もしくは１までの変異があってもよいならびに／またはＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＲＤ１中に１の変異があってもよい。変異は、置換であってもよいまたはＨおよび／もしくはＬ  ＣＤＲは、所望により、Ｈおよび／もしくはＬ  ＣＤＲの開示されるセットと比較して、１つのアミノ酸の挿入もしくは欠失を含有していてもよい。
【００３７】
置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲにおける任意の場所で成されてもよい。たとえば、ＨＣＤＲ１では、置換は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５のいずれか、たとえば、Ｋａｂａｔ残基３１、３２、３４、および／または３５のいずれかであってもよく、ＨＣＤＲ２では、置換は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５のいずれか、たとえば、Ｋａｂａｔの残基５０、５３、５４、５８、６０、および／または６４のいずれかであってもよく、ならびにＨＣＤＲ３では、置換は、Ｋａｂａｔ残基９９〜１０２のいずれか、たとえば、Ｋａｂａｔ残基９９〜１００Ｃ、１００Ｅ、１００Ｆ、および／または１００Ｋ〜１０２のいずれかであってもよい。たとえば、ＬＣＤＲ１では、置換は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４のいずれか、たとえばＫａｂａｔの残基２６または２７であってもよく、ＬＣＤＲ２では、置換は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６のいずれか、たとえば、Ｋａｂａｔ残基５６であってもよく、ならびにＬＣＤＲ３では、置換は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７のいずれ、たとえば、Ｋａｂａｔ残基８９のいずれかであってもよく、位置９５Ｂに挿入があってもよい。抗体Ａｂ−２８の配列と比較した特異的アミノ酸変異についての詳細、たとえばアミノ酸置換または挿入は、それぞれＨＣＤＲおよびＬＣＤＲについて表２０ａおよび２０ｂにおいて見つけることができる。
【００３８】
たとえば、本発明は、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＣＤＲのセットは、
ＨＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号３を有し、
ＨＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号４を有し、
ＨＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号５を有し、
ＬＣＤＲ１がアミノ酸配列配列番号９３を有し、
ＬＣＤＲ２がアミノ酸配列配列番号９４を有し、かつ
ＬＣＤＲ３がアミノ酸配列配列番号９５を有する
ＣＤＲのセットから２２以下のアミノ酸改変を有する、ｈＣＭＶに対する単離結合メンバーを提供する。
【００３９】
たとえば、本発明による結合メンバーまたはＶＨドメインは、１つまたは複数の以下の変異を有する、抗体Ａｂ−２８のＨＣＤＲ１を含んでいてもよい：
Ｇｌｙと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｓｐ３１；
ＰｈｅまたはＴｙｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ｈｉｓ３２；
ＩｌｅまたはＬｅｕと交換されたＫａｂａｔ残基Ｍｅｔ３４；および
Ａｓｎと交換されたＫａｂａｔ残基Ｖａｌ３５。
【００４０】
本発明による結合メンバーまたはＶＨドメインは、１つまたは複数の以下の変異を有する、抗体Ａｂ−２８のＨＣＤＲ２を含んでいてもよい：
ＳｅｒまたはＣｙｓと交換されたＫａｂａｔ残基Ｔｒｐ５０；
ＡｓｎまたはＨｉｓと交換されたＫａｂａｔ残基Ｇｌｎ５３；
Ｔｈｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ５４；
Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＨｉｓと交換されたＫａｂａｔ残基Ｇｌｙ５８；
Ａｌａと交換されたＫａｂａｔ残基Ｇｌｙ６０；および
Ａｒｇと交換されたＫａｂａｔ残基Ｇｌｎ６４。
【００４１】
本発明による結合メンバーまたはＶＨドメインは、１つまたは複数の以下の変異を有する、抗体Ａｂ−２８のＨＣＤＲ３を含んでいてもよい：
Ａｌａと交換されたＫａｂａｔ残基Ｔｈｒ９９；
Ｍｅｔと交換されたＫａｂａｔ残基Ｖａｌ１００；
Ｔｈｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ１００Ａ；
Ｔｈｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｓｎ１００Ｂ；
Ｐｈｅと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ１００Ｃ；
ＭｅｔまたはＡｌａと交換されたＫａｂａｔ残基Ｌｅｕ１００Ｅ；
Ｇｌｙと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ１００Ｆ；
Ｔｙｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ｈｉｓ１００Ｋ；
ＳｅｒまたはＡｓｐと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｓｎ１００Ｌ；
ＶａｌまたはＩｌｅと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｒｇ１００Ｍ；
Ｍｅｔと交換されたＫａｂａｔ残基Ｌｅｕ１００Ｎ；
Ｇｌｙと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｓｐ１０１；および
ＶａｌまたはＩｌｅと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｌａ１０２。
【００４２】
本発明による結合メンバーまたはＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ残基Ｓｅｒ２６がＡｓｎと交換されたまたはＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ２７がＡｒｇと交換された、抗体Ａｂ−２８のＬＣＤＲ１を含んでいてもよい。
【００４３】
本発明による結合メンバーまたはＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ残基Ｓｅｒ５６がＰｒｏと交換された、抗体Ａｂ−２８のＬＣＤＲ２を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明による結合メンバーまたはＶＬドメインは、１つまたは複数の以下の変異を有する、抗体Ａｂ−２８のＬＣＤＲ３を含んでいてもよい：
Ａｌａと交換されたＫａｂａｔ残基Ｇｌｙ８９；
Ｔｒｐと交換されたＫａｂａｔ残基Ｐｒｏ９１；
Ｓｅｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ａｒｇ９３；
Ａｓｐと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ９４；
ＧｌｙまたはＡｌａと交換されたＫａｂａｔ残基Ｓｅｒ９５ａ；
Ｋａｂａｔ残基９５ｂに挿入されたＡｌａ；
Ｔｙｒと交換されたＫａｂａｔ残基Ｖａｌ９６；および
Ｖａｌと交換されたＫａｂａｔ残基Ｉｌｅ９７。
【００４５】
したがって、本発明の結合メンバーは、Ｋａｂａｔ残基９５ｂがＡｌａであるまたはＫａｂａｔ残基９５ｂがないＬＣＤＲ３を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／もしくはＨＣＤＲ３ならびに／または抗体１〜４６のいずれかのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／もしくはＬＣＤＲ３、たとえば、表１９または２０において示される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＣＤＲのセットを含む結合メンバーを提供する。
【００４７】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号８であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号９であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１０であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号９８であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号９９であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１００であり、抗体Ａｂ−０２のＣＤＲに相当する。
【００４８】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号１３であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１４であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号１０３であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１０４であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１０５であり、抗体Ａｂ−０４のＣＤＲに相当する。
【００４９】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号１８であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２０であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号１０８であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１０９であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１１０であり、抗体Ａｂ−１１のＣＤＲに相当する。
【００５０】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２３であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２４であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２５であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号１１３であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１１４であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１１５であり、抗体Ａｂ−１４のＣＤＲに相当する。
【００５１】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号３であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号４であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号９３であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号９４であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号９５であり、抗体Ａｂ−２８のＣＤＲに相当する。
【００５２】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２８であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２９であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３０であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号１０８であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１０９であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１１０であり、抗体Ａｂ−４２のＣＤＲに相当する。
【００５３】
結合メンバーは、これらの抗体のうちの１つのＶＨ  ＣＤＲのセットを含んでいてもよい。所望により、それはまた、これらの抗体のうちの１つのＶＬ  ＣＤＲのセットを含んでいてもよく、ＶＬ  ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲと同じまたは異なる抗体由来のものであってもよい。
【００５４】
抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインおよび／または抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインもまた、本発明によって提供される。
【００５５】
下記にさらに議論されるように、ＶＨまたはＶＬドメインのみが、抗原に結合するように使用されてもよいが、典型的には、ＶＨドメインは、抗体抗原結合部位をもたらすようにＶＬドメインと対になる。抗体Ａｂ−２８のＶＨドメインは、抗体Ａｂ−２８のＶＬドメインと対になってもよく、抗体Ａｂ−２８  ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。類似の実施形態が、本明細書において開示される他のＶＨおよびＶＬドメインについて提供される。他の実施形態では、抗体Ａｂ−２８  ＶＨは、この抗体のＶＬ以外のＶＬドメインと対になる。軽鎖混在（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）は、当技術分野において十分に確立されている（Kang et al., 1991）。さらに、類似の実施形態は、本明細書において開示される他のＶＨおよびＶＬドメインについて本発明によって提供される。
【００５６】
したがって、抗体１〜４６のいずれかのＶＨを含有するＩｇＨ鎖は、ｇＢの特異的結合メンバーを作成するために、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６のいずれかのＶＬを含有するＩｇＬ鎖と対になってもよい。
【００５７】
結合メンバーは、抗体フレームワーク内に、１つまたは複数のＣＤＲ、たとえばＣＤＲのセットを有する抗体分子を含んでいてもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子セグメント配列であってもよい。ヒト生殖系列遺伝子セグメント配列は、当業者らに知られており、たとえばＶＢａｓｅコンピレーションまたはＩＭＧＴオンラインデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から参照することができる。
【００５８】
本発明の結合メンバーは、ヒト生殖系列フレームワーク、たとえばＩＧＨＶ１−２中のＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインを有する単離ヒト抗体分子であってもよい。したがって、ＶＨドメインフレームワーク領域ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、および／またはＦＷＲ３は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−２のフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＦＷＲ４は、たとえば、配列番号１８８〜１９１から選択されるヒト生殖系列Ｊセグメントのフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＶＨ  ＦＷＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１８１であってもよい。ＶＨ  ＦＷＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１８２であってもよい。ＶＨ  ＦＷＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１８３または１８４であってもよい。
【００５９】
本発明の抗体分子またはＶＨドメインは、重鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号１８１；ＦＷＲ２  配列番号１８２；ＦＷＲ３  配列番号１８３もしくは１８４を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０のアミノ酸改変を有する、重鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００６０】
さらに、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨドメインを含んでいてもよい。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。本発明の抗体のＶＨドメインは、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同であってもよい。好ましくは、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。
【００６１】
通常、結合メンバーはまた、ＬＣＤＲのセットを、たとえばヒト生殖系列フレームワーク、たとえばＩＧＬＶ１−５１中に含むＶＬドメインを有する。したがって、ＶＬドメインフレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＩＧＬＶ１−５１のフレームワーク領域ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、および／またはＦＷＲ３を含んでいてもよい。ＦＷＲ４は、ヒト生殖系列ＪセグメントＩＧＬＪ２（配列番号１９３）のフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＶＬ  ＦＷＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１８５であってもよい。ＶＬ  ＦＷＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１８６であってもよい。ＶＬ  ＦＷＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１８７であってもよい。
【００６２】
本発明の抗体分子またはＶＬドメインは、軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号１８５；ＦＷＲ２  配列番号１８６；ＦＷＲ３  配列番号１８７を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４のアミノ酸改変を有する、軽鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００６３】
さらに、本発明の抗体は、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬドメインを含んでいてもよい。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。本発明の抗体のＶＬドメインは、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同であってもよい。好ましくは、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＬＶ１−５１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。
【００６４】
たとえば、本発明の抗体分子は、重鎖および軽鎖フレームワーク領域のセットを含んでいてもよく、重鎖ＦＷＲ１は、配列番号１８１であり、重鎖ＦＷＲ２は、配列番号１８２であり、重鎖ＦＷＲ３は、配列番号１８３であり、軽鎖ＦＷＲ１は、配列番号１８５であり、軽鎖ＦＷＲ２は、配列番号１８６であり、軽鎖ＦＷＲ３は、配列番号１８７であるまたは１０以下、たとえば５以下のアミノ酸改変、たとえば置換を有する重鎖および軽鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００６５】
本発明による結合メンバーＡｂ−４７〜Ａｂ−５０は、最初に、３人のｈＣＭＶ感染ドナーから単離され、ＳＭ１０、ＳＭ１２、２Ｃ２、または１Ｇ２と呼ばれるＥＢＶ不死化Ｂ細胞系から単離された。これらの４つの細胞系から、ヒト抗体の４つの異なるＶＨコード配列および５つの異なるＶＬコード配列を同定することができた（表１２）。ＩｇＨ鎖およびＩｇＬ鎖として、それぞれの細胞系から同定されたＶＨおよびＶＬコード配列のすべての組合せにより、理論上、２０の異なる抗体を作成することができる。これらのうち、ルシフェラーゼ発現ｈＣＭＶ実験室株ＡＤ−１６９および一次ヒト包皮線維芽細胞を使用する第一生物学的スクリーニングアッセイにおいてｈＣＭＶ中和抗体であった４の異なる組換え抗体が、同定された。これらの組換え抗体はすべて、高い効力（０．６μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０；下記表１４）によりｈＣＭＶを中和することが分かった。
【００６６】
結合メンバー可変ドメインの構造および位置は、Kabat et al., (1991)およびその改訂に対する参照によって決定されてもよい。結合メンバーＡｂ−４６、Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、およびＡｂ−５０が本明細書において記載され、それぞれ、表１９において指定されるＣＤＲのセットを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付け方式（Kabat & Wu, 1991）によって同定され、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／を使用して決定された。
【００６７】
本発明の第２の実施形態の結合メンバーは、本明細書において記載される１つまたは複数のＣＤＲ、たとえばＣＤＲ３を含んでいてもよく、所望により、ＣＤＲのセットを形成するためにＣＤＲ１およびＣＤＲ２もまた含んでいてもよい。ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＣＤＲもしくはＣＤＲのセットまたは本明細書において記載されるその変異体であってもよい。
【００６８】
結合メンバーは、Ｈおよび／またはＬ  ＣＤＲの開示されるセット内に１つまたは複数のアミノ酸変異を有する、抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセットを含んでいてもよい。アミノ酸変異は、あるアミノ酸の置換、欠失、または挿入である。提供される例および開示される配列に基づいて、Ｈおよび／またはＬ  ＣＤＲのセット内に、たとえば、最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１までの変異があってもよい。変異は、置換であってもよいまたはＨおよび／もしくはＬ  ＣＤＲは、所望により、Ｈおよび／もしくはＬ  ＣＤＲの開示されるセットと比較して、１つのアミノ酸の挿入もしくは欠失を含有していてもよい。置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲにおける任意の場所で成されてもよい。
【００６９】
本発明は、抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／もしくはＨＣＤＲ３、ならびに／または抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＤＲ３、たとえば、表１９において示される抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のいずれかのＣＤＲのセットを含む結合メンバーを提供する。
【００７０】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２４３であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２４４であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２４５であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号２６３であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２６４であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号２６５であり、抗体Ａｂ−４７のＣＤＲに相当する。
【００７１】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２４８であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２４９であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２５０であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号２６８であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２６９であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号２７０であり、抗体Ａｂ−４８のＣＤＲに相当する。
【００７２】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２５３であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２５４であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２５５であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号２７３であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７４であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号２７５であり、抗体Ａｂ−４９のＣＤＲに相当する。
【００７３】
たとえば、本発明の結合メンバーは、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでいてもよく、ＨＣＤＲ１は、配列番号２５８であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２５９であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２６０であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号２７８であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７９であり、かつＬＣＤＲ３は、配列番号２８０であり、抗体Ａｂ−５０のＣＤＲに相当する。
【００７４】
本発明の結合メンバーは、ヒト生殖系列フレームワーク、たとえばＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９中のＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインを有する単離ヒト抗体分子であってもよい。したがって、ＶＨドメインフレームワーク領域ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、および／またはＦＷＲ３は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９のフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＦＷＲ４は、６つの重鎖Ｊセグメントのいずれかから選択されるヒト生殖系列Ｊセグメントのフレームワーク領域を含んでいてもよい（Ravetch et al., 1981を参照されたい）。
【００７５】
Ａｂ−４７またはＡｂ−５０  ＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＨＶ４−３９の重鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号２８１、ＦＷＲ２  配列番号２８２；ＦＷＲ３配列番号２８３を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１のアミノ酸改変を有する、重鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００７６】
Ａｂ−４８またはＡｂ−４８  ＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＨＶ４−５９の重鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号２８４、ＦＷＲ２  配列番号２８５、ＦＷＲ３  配列番号２８６を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３のアミノ酸改変を有する、重鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００７７】
さらに、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも７５％相同である核酸配列によってコードされるＶＨドメインを含んでいてもよい。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。本発明の抗体のＶＨドメインは、ＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％相同であってもよい。好ましくは、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＨＶ４−３９またはＩＧＨＶ４−５９生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＨＶ１−２生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。
【００７８】
本発明の結合メンバーはまた、ヒト生殖系列フレームワーク、たとえばＩＧＫＶ２Ｄ−２８またはＩＧＫＶ１Ｄ−３３中のカッパ軽鎖ＣＤＲのセットを含むＶＬドメインを含んでいてもよい。したがって、ＶＬドメインフレームワーク領域ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、および／またはＦＷＲ３は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＩＧＫＶ２Ｄ−２８またはＩＧＫＶ１Ｄ−３３のフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＦＷＲ４は、５つのカッパＪセグメントのいずれかから選択されるヒト生殖系列Ｊセグメントのフレームワーク領域を含んでいてもよい（Hieter et al., 1982を参照されたい）。
【００７９】
Ａｂ−４７またはＡｂ−４８  ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８のカッパ軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号２８７、ＦＷＲ２  配列番号２８８；ＦＷＲ３配列番号２８９を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような１もしくは２のアミノ酸改変を有する軽鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００８０】
Ａｂ−４９  ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３の軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号２９０、ＦＷＲ２  配列番号２９１、ＦＷＲ３  配列番号２９２を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸改変を有する軽鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００８１】
本発明の結合メンバーはまた、ヒト生殖系列フレームワーク、たとえばＩＧＬＶ１−４７中のラムダ軽鎖ＣＤＲのセットを含むＶＬドメインを含んでいてもよい。したがって、ＶＬドメインフレームワーク領域ＦＷＲ１、ＦＷＲ２、および／またはＦＷＲ３は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＩＧＬＶ１−４７のフレームワーク領域を含んでいてもよい。ＦＷＲ４は、４つのラムダＪセグメントのいずれかから選択されるヒト生殖系列Ｊセグメントのフレームワーク領域を含んでいてもよい（Udey & Blomberg 1987；Vasicek & Leder, 1990を参照されたい）。
【００８２】
Ａｂ−５０  ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＬＶ１−４７のラムダ軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：ＦＷＲ１  配列番号２９３、ＦＷＲ２  配列番号２９４、ＦＷＲ３  配列番号２９５を含んでいてもよく、または置換、挿入、もしくは欠失などのような１もしくは２のアミノ酸改変を有する軽鎖フレームワーク領域の当該セットを含んでいてもよい。
【００８３】
さらに、本発明の抗体は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬドメインを含んでいてもよい。好ましくは、核酸配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。本発明の抗体のＶＬドメインは、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であってもよい。好ましくは、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％相同である、より好ましくは、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３またはＩＧＬＶ１−４７生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％、９９％相同である。
【００８４】
本発明の結合メンバーは、（ｉ）ｈＣＭＶに結合し、（ｉｉ）本明細書において開示される結合メンバー、ＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、ＣＤＲ、たとえばＨＣＤＲ３、ならびに／またはＣＤＲのセットを含む任意の結合メンバーとｈＣＭＶへの結合について競合する結合メンバーであってもよい。
【００８５】
たとえば、結合メンバーの競合は、たとえば、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する結合メンバーの同定を可能にするために、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴のような結合アッセイを使用しておよび／または１つもしくは複数の他のタグ付けされていない結合メンバーの存在下において検出することができるある結合メンバーに特異的レポーター分子をタグ付けすることによって、インビトロにおいてアッセイされてもよい。そのような方法は、当業者に容易に知られており、本明細書においてより詳細に記載される（実施例を参照されたい）。したがって、本発明のさらなる態様は、ｈＣＭＶへの結合について、抗体分子、たとえば、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、ＣＤＲ、たとえばＨＣＤＲ３、またはＣＤＲのセットを含む抗体分子と競合する、抗体抗原結合部位を含む結合メンバーを提供する。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む結合メンバーをコードする配列を含む単離核酸ならびにＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む当該結合メンバーの生成をもたらす条件下で、当該核酸によってコードされる本発明のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む結合メンバーを調製し、それを回収するための方法を提供する。
【００８７】
本発明の他の態様は、本明細書において開示されるＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲ配列のいずれかをコードする単離核酸を提供する。
【００８８】
さらなる態様は、本発明の核酸を含有するまたはそれによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、本発明の結合メンバーを含有する組成物ならびに療法によるヒトまたは動物体の治療の方法を含む、ｈＣＭＶ感染に結合する、阻害する、および／または中和するための方法におけるそれらの使用を記載する。
【００９０】
本発明による結合メンバーは、ヒトまたは動物体における（たとえばヒト患者における）疾患または障害の治療（予防的治療を含んでいてもよい）の方法などのような、治療または診断の方法において使用されてもよく、これは、当該ヒトまたは動物体に、有効量の本発明の結合メンバーまたは本発明のいくつかの結合メンバーの組合せを投与することを含む。本発明に従って治療可能な状態は、本明細書において他のところで詳細に議論されるように、ｈＣＭＶが役割を果たす任意の状態を含む。
【００９１】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記にさらに詳細に記載される。
【００９２】
定義
本明細書において使用される場合の「および／または」が、他を伴うまたは伴わない２つの指定される特徴または構成成分のそれぞれの特定の開示として理解されることとなることをここで明らかにすることは好都合である。たとえば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書において個々に説明されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示として理解されることとなる。
【００９３】
ｈＣＭＶ
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の完全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１７４０３（ヒトサイトメガロウイルス株ＡＤ１６９の完全なゲノム）を有し、２２９３５４塩基対配列を含む（Chee et al., 1990; Bankier et al., 1991）。
【００９４】
ｇＢ
ｇＢ複合体は、ＣＭＶのビリオンエンベロープの表面糖タンパク質複合体である。ｇＢタンパク質の多くの異なる株がある：
ｇＢ株ＡＤ１６９−ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６４７３（配列番号２３９）
ｇＢ株Ｔｏｗｎｅ−ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３２０１（配列番号２４０）
ｇＢの既知の中和ドメインは、抗原性ドメイン１（ＡＤ−１；配列番号２３９［ＡＤ１６９］のアミノ酸５５２〜６３５）および抗原性ドメイン２（ＡＤ−２；配列番号２３９［ＡＤ１６９］のアミノ酸６７〜８６）を含む。さらなる抗原性ドメイン、ＡＤ−３もまた、存在する（配列番号２３９［ＡＤ１６９］のアミノ酸７８３〜９０６）。このドメインは、ウイルス内部に（ｉｎｔｒａｖｉｒａｌｌｙ）位置し、中和抗体の標的ではない。
【００９５】
結合メンバー
これは、互いに結合する１対の分子のうちの一方のメンバーを説明する。結合対のメンバーは、天然に誘導されてもよいまたは全体的にもしくは部分的に合成して生成されてもよい。結合対の一方のメンバーは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ；Milhavet et al., 2003を参照されたい）、アンチセンス（Opalinska & Gewirtz, 2003を参照されたい）、組換えタンパク質、抗体、またはその断片またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質であってもよい。
【００９６】
本発明における使用のためのアンチセンスまたはＲＮＡｉ阻害剤は、遺伝子発現を調整することができる、たとえば、ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質をコードする配列の発現をダウンレギュレートすることができる核酸分子を含んでいてもよい。そのような核酸分子は、アンチセンス分子、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核酸センサー分子、アロザイム、酵素核酸分子および三重鎖オリゴヌクレオチド、ならびに配列特異的な方法においてＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを媒介するのに使用することができる任意の他の核酸分子を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
対の分子のうちの一方のメンバーは、対の分子の他方のメンバーの特定の空間的なおよび極性の構造に結合し、そのため、それに相補的である、その表面上のエリアまたはくぼみを有していてもよい。結合対の種類の例は、抗原−抗体、受容体−リガンド、および酵素−基質である。
【００９８】
結合メンバーは、結合部位を有する分子を通常含む。たとえば、結合メンバーは、抗体分子または結合部位を含む非抗体タンパク質であってもよい。結合部位は、抗体フレームワーク領域上でのおよび／もしくはフィブロネクチン、シトクロムＢなどのような非抗体タンパク質足場上でのＣＤＲの配置の手段によって（Haan & Maggos 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997）または所望の標的に対する結合特異性を与えるためにタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化するもしくは変異させることによって提供されてもよい。タンパク質における新規な結合部位を遺伝子操作するための足場は、Nygren et al.、同書によって詳細に概説されている。抗体模倣物についてのタンパク質足場は、ＷＯ  ００／０３４７８４  Ａ１（Lipovsek）において開示されており、少なくとも１つのランダム化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣物）が記載されている。１つまたは複数のＣＤＲ、たとえばＨＣＤＲのセットを移植するための適した足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供されてもよい。足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質足場の利点は、それが、少なくともいくつかの抗体分子よりも小さいおよび／または生産するのが容易である足場分子中に抗原結合部位を提供し得ることである。結合メンバーの小さなサイズは、細胞に入る、組織の中に深く侵入するもしくは他の構造内の標的に達するまたは標的抗原のタンパク質のくぼみ内に結合する能力などのような、有用な生理学的特性を与えてもよい。非抗体タンパク質足場における抗原結合部位の使用は、Wess, 2004において概説されている。安定した主鎖および１つまたは複数の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ループ（複数可）のアミノ酸配列（複数可）は、標的に結合する抗原結合部位を作成するために特異的にまたはランダムに変異している。そのようなタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン、リポカリン、ならびにガンマクリスタリン（ｇａｍｍａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）および他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌタンパク質）を含む。
【００９９】
他のアプローチの例は、サイクロチドベースの合成「マイクロボディ−」−分子内ジスルフィド結合を有する小さなタンパク質、マイクロタンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）、およびアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）を含む。
【０１００】
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、本発明による結合メンバーは、たとえば、フォールドドメインなどのようなペプチドもしくはポリペプチドを形成するまたは抗原に結合するための能力に加えて、他の機能的特徴を分子に与える他のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明の結合メンバーは、検出可能な標識を保持していてもよいまたは毒素もしくは標的成分もしくは酵素にコンジュゲートされてもよい（たとえばペプチジル結合もしくはリンカーを介して）。たとえば、結合メンバーは、触媒部位（たとえば酵素ドメインにおける）および抗原結合部位を含んでいてもよく、抗原結合部位は、抗原に結合し、したがって、触媒部位を抗原に向ける。触媒部位は、たとえば切断によって、抗原の生物学的機能を阻害してもよい。
【０１０１】
言及されるように、ＣＤＲは、非抗体足場によって保持することができるが、本発明のＣＤＲまたはＣＤＲのセットを保持するための構造は、一般に、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットが、再構成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的な部分になるであろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat & Wu, (1991)およびその改訂に対する参照によって決定されてもよい。多くの学術的および商業上のオンラインリソースが、このデータベースに問い合わせるのに利用可能である。たとえば、Martin, 1996および現在、ウェブアドレスがｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌの関連するオンラインリソースを参照されたい。
【０１０２】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲによって、Kabat et al.、同書によって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すように意図される。抗体は、典型的に、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と称される３つの重鎖ＣＤＲならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。用語ＣＤＲ（複数可）は、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性によって結合を担う大多数のアミノ酸残基を含有するこれらの領域のうちの１つまたはこれらの領域のいくつかもしくはさらに全体を示すために本明細書で使用される。
【０１０３】
６つのＣＤＲ配列の中で、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、本質的に、生殖系列免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ再構成として当技術分野において既知のメカニズムのために、最も大きな規模の変異性、つまりより大きな多様性を有する。ＨＣＤＲ３は、２アミノ酸ほどの短いものもしくは２６アミノ酸ほどの長いものであってもよいまたはこれらの２つの両極端の中間の任意の長さを有していてもよい。ＣＤＲ長はまた、特定の土台となるフレームワークが適応することができる長さに従って変動してもよい。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において重要な役割を果たし得る（Segal et al., 1974; Amit et al., 1986; Chothia et al., 1987, 1989; Caton et al., 1990; Sharon 1990a, Sharon 1990b, Kabat et al., 1991）。
【０１０４】
表２０ａおよびｂにおいて示されるように、本発明の結合メンバーＡｂ−０１〜Ａｂ−４６において、ＨＣＤＲ１は、５アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５から成ってもよい。ＨＣＤＲ２は、１７アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５から成ってもよい。ＨＣＤＲ３は、２２アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２から成ってもよい。ＬＣＤＲ１は、１３アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４から成ってもよい。ＬＣＤＲ２は、７アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６から成ってもよい。ＬＣＤＲ３は、１０アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７から成ってもよい。
【０１０５】
本発明の結合メンバーＡｂ−４７〜Ａｂ−５０において、ＨＣＤＲ１は、それぞれ、７または５アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基３１〜３７または３１〜３５から成ってもよい。ＨＣＤＲ２は、１６アミノ酸長であってもよく、ＨＣＤＲ３は、１０、１５、１７、または２２アミノ酸長であってもよい。ＬＣＤＲ１は、１１アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４から成ってもよいまたは１３アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基２３〜３５から成ってもよいまたは１６アミノ酸長で、Ｋａｂａｔ残基２４〜３９から成ってもよい。ＬＣＤＲ２は、７アミノ酸長であってもよく、ＬＣＤＲ３は、９アミノ酸長であってもよい。
【０１０６】
抗体分子
これは、天然にまたは部分的にもしくは全体的に合成して生成されるかどうかに関わらず、免疫グロブリンを説明する。用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明は、天然形態をした抗体に関するものではない、すなわち、それらは、自然環境にないが、それらは、天然の供給源から単離するもしくは精製によって得るまたは他の場合には、遺伝子組換えによってもしくは化学合成によって得ることができ、そういう訳で、それらは、非天然アミノ酸を含有することができることを本明細書で理解されなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびＦｄなどのような分子を含むが、これらに限定されない。たとえばＦａｂ２、Ｆａｂ３、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）ならびにさらに二特異性および三特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む、１つまたは複数の抗体抗原結合部位を含む様々な他の抗体分子が、遺伝子操作されてきた。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法は、Hollinger & Hudson (2005)において記載されている。
【０１０７】
標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生成するために、モノクローナル抗体および他の抗体を採取し、組換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域およびフレームワーク領域に導入することを含んでいてもよい。たとえばＥＰ０１８４１８７Ａ（Kudo et al）またはＥＰ０２３９４００Ａ（Winter）を参照されたい。抗体を生成するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝子変異または他の変化にかけられてもよく、これにより、生成された抗体の結合特異性が改変されてもよいまたはされなくてもよい。
【０１０８】
抗体が多くの方法で修飾されてもよいので、用語「抗体分子」は、必要とされる特異性を有する抗体抗原結合部位を有するおよび／または抗原に結合する任意の結合メンバーまたは物質を包含するとして解釈されるべきである。したがって、この用語は、二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｃ）または三特異性抗体ならびに抗体断片および誘導体を包含し、天然または全体的にもしくは部分的合成であるかどうかに関わらず、抗体抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを含む。そのため、他のポリペプチド（たとえば、他の種に由来するまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する）に融合された、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子または等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、たとえば、ＥＰ０１２０６９４Ａ（Boss et al）およびＥＰ０１２５０２３Ａ（Cabilly et al）において記載されている。
【０１０９】
抗体工学の技術分野において入手可能なさらなる技術は、ヒトおよびヒト化抗体を単離することを可能にしてきた。たとえば、ヒトハイブリドーマは、Kontermann & Dubel (2001)によって記載されるように作製することができる。ファージディスプレイ、結合メンバーを作成するための他の確立された技術は、Kontermann & Dubel、同書およびＷＯ  ９２／０１０４７  Ａ１（McCafferty et al）などのような多くの刊行物において詳細に記載されている。
【０１１０】
マウス免疫系の無傷の他の構成成分を残しながら、マウス抗体遺伝子が不活性化されており、ヒト抗体遺伝子と機能的に交換されているトランスジェニックマウスは、ヒト抗体を単離するために使用することができる（Mendez et al., 1997）。その代わりに、Grawunder & Melchers（ＷＯ  ０３／０６８８１９  Ａ１）によって記載される方法は、異種抗体または異種結合タンパク質の生成のために、遺伝子修飾脊椎動物前駆リンパ球を作成するために使用することができる。ヒト化抗体は、たとえばＷＯ  ９１／０９９６７  Ａ１（Adair et al）において開示されるものなどのような、当技術分野において既知の技術を使用して生成することができる。さらに、ＷＯ  ０４／００６９５５  Ａ１（Foote）は、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列についての標準的なＣＤＲ構造型を、ヒト抗体配列、たとえば生殖系列抗体遺伝子セグメントのライブラリー由来の対応するＣＤＲについての標準的なＣＤＲ構造型と比較することによってヒト抗体遺伝子から可変領域フレームワーク配列を選択することに基づいて抗体をヒト化するための方法を記載する。非ヒトＣＤＲに類似する標準的なＣＤＲ構造型を有するヒト抗体可変領域は、それからヒトフレームワーク配列を選択するメンバーヒト抗体配列のサブセットを形成する。サブセットメンバーは、ヒトおよび非ヒトＣＤＲ配列の間のアミノ酸類似性によってさらにランク付けされてもよい。ＷＯ  ０４／００６９５５  Ａ１同書の方法において、上位ランキングのヒト配列は、選択されたサブセットメンバーヒトフレームワークを使用し、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＣＤＲ対応物と機能的に交換するキメラ抗体を構築するためにフレームワーク配列を提供するように選択され、それによって、非ヒトおよびヒト抗体の間のフレームワーク配列を比較する必要性を伴わないで高親和性および低免疫原性のヒト化抗体を提供する。方法に従って作製されたキメラ抗体もまた、開示される。
【０１１１】
抗体全体の断片が、抗原に結合する機能を実行することができることが示された。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインから成るｄＡｂ断片（Ward et al., 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003）；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つのドメインが抗原結合部位を形成するように結合することを可能にするペプチドリンカーによってＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結されている単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al., 1998; Huston et al 1988）；（ｖｉｉｉ）二特異性単鎖Ｆｖ二量体［ＷＯ  ９３／０１１１６１  Ａ１（Whitlow et al）］、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多特異性断片である「二重特異性抗体」（Holliger et al., 1993  ＆  ＷＯ  ９４／１３８０４  Ａ１）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィドブリッジの組み込みによって安定化されてもよい（Reiter et al., 1996）。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディもまた、作製されてもよい（Hu et al; 1996）。結合断片の他の例は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での少数の残基の追加によってＦａｂ断片と異なるＦａｂ’および定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨである。フレームワーク領域によって連結されたたった２つのＣＤＲを含有する抗体分子もまた、記載されている（Qui et al., 2007）。ＶＨまたはＶＬドメイン由来のＣＤＲ３は、フレームワーク領域を介しての、選択されたＣＤＲ１またはＣＤＲ２のＣ末端からＣＤＲ３のＮ末端への連結により、他のドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２ループに連結された。
【０１１２】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の小さな単量体抗原結合断片である、すなわち抗体重鎖または軽鎖の可変領域である（Holt et al., 2003）。ＶＨ  ｄＡｂは、ラクダ科の動物（たとえばラクダ、ラマ）において天然に存在し、標的抗原を用いてラクダ科の動物を免疫し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞由来のｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることによって生成されてもよいが、ｄＡｂはまた、細胞培養において生成することもできる。本発明の結合メンバーは、本明細書において実質的に説明されるＶＨもしくはＶＬドメインを含むｄＡｂであってもよいまたは本明細書において実質的に説明されるＣＤＲのセットを含むＶＨもしくはＶＬドメインであってもよい。
【０１１３】
本発明の抗体断片は、酵素、たとえばペプシンもしくはパパインによる消化などのような方法によっておよび／または化学的還元によるジスルフィドブリッジの切断によって、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかから開始して得ることができる。他の方法では、本発明において含まれる抗体断片は、当業者によく既知の遺伝子組換えの技術によってまたは他の場合にはペプチド合成によってもしくは核酸合成および発現によって得ることができる。
【０１１４】
本発明による機能的抗体断片は、半減期が、化学修飾によって、とりわけペグ化によってまたはたとえばリポソーム中への組み込みによって増加した、任意の機能的断片を含む。
【０１１５】
二特異性または二機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子中で組み合わせられたモノクローナル抗体の第２世代を形成する（Holliger & Bohlen, 1999）。そのため、二特異性抗体は、可変領域によってコードされる２つの異なる結合特異性を有していてもよく、そのため、単一または複数の標的抗原上の２つの異なるエピトープに結合してもよい。それらの使用は、新しいエフェクター機能を動員するまたは腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的にするそれらの能力から、診断の分野および療法の分野において示されている。たとえば、抗体は、放射性同位体、細菌毒素、炎症性サイトカイン、化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ）、またはプロドラッグなどのようなさらなる細胞毒性のメカニズムを備えることができる。二特異性抗体が使用されることになっている場合、これらは、様々な方法において生産することができる従来の二特異性抗体であってもよい（Holliger & Winter, 1993）。二特異性抗体の例は、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインを使用し、短い可動性のペプチドを介して直接連結することができる、ＢｉＴＥ（登録商標）技術（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｉｎｃ．）のものを含む。これは、短い単一ポリペプチド鎖上で２つの抗体を組み合わせる。二重特異性抗体およびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用し、Ｆｃ領域を伴わないで構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を可能性として低下させる。
【０１１６】
二特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、クアドローマ（２重特異的抗原結合断片（Ｆａｂ）およびＦｃγ）として、二特異性Ｆ（ａｂ’）２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ヘテロ二量体Ｆａｂとして、二重特異性抗体として、または二特異性もしくはヘテロ二量体ｓｃＦｖとして構築することができる（Kufer et al., 2004において概説される）。さらに、２つの二特異性抗体は、四価抗体を形成するために、当技術分野において既知のルーチン的な方法を使用して連結することができる。二特異性二重特異性抗体もまた、それらを容易に構築し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現することができるので、二特異性抗体全体に対立するものとして、特に有用であってもよい。
【０１１７】
多特異性抗体に対する最近の研究は、３〜５の組換えヒトモノクローナル抗体が単一のクローン細胞によって生成される、混合物抗体の開発を導いた。構成成分の抗体は、混合物において抗体種と関連する結合部位がすべて機能的であることを保証するために、同じ免疫グロブリン軽鎖可変領域を共有する（Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（商標）；Ｍｅｒｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＢＶ；ＷＯ  ０４／１０６３７５  Ａ１）。構成成分の抗体は、ＩｇＧ全体またはＦａｂ断片または完全長免疫グロブリンおよび抗体の断片の両方の混合物などのような異なる構成を含んでいてもよい。構成成分の抗体は、ウイルスの中和における効力の増加、サイトカインおよびケモカインの中和および除去の改善、腫瘍細胞死滅およびエスケープの予防の増強、ならびにウイルス防御の活力の改善などのような優れた生物学的活性について選択される。
【０１１８】
様々な方法は、ｈＣＭＶに対する抗体を得るのために当技術分野において利用可能である。抗体は、当業者によく既知の標準的な方法に従って得ることができる、とりわけヒト起源のモノクローナル抗体であってもよい。一般に、とりわけマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片の調製のために、マニュアル「Antibodies」（Harlow & Lane, 1988）において特に記載されている技術またはKohler and Milstein, 1975によって記載されるハイブリドーマからの調製についての技術を参照することが可能である。
【０１１９】
モノクローナル抗体は、たとえば、ｈＣＭＶまたはその断片のうちの１つ、たとえば当該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するｇＢに対して免疫化された動物またはヒトのＢ細胞から得ることができる。適した断片およびそれらを含むペプチドまたはポリペプチドは、本明細書において記載されており、ｈＣＭＶに対する抗体を作成するために動物を免疫するために使用されてもよい。ｈＣＭＶまたはその断片のうちの１つは、ｈＣＭＶもしくはその断片をコードするｃＤＮＡ配列中に含有される核酸配列から開始する遺伝子組換えによっておよび／またはｈＣＭＶおよび／もしくはその断片のペプチド配列中に含まれるアミノ酸の配列から開始するペプチド合成によって、通常の作業方法に従って生成することができる。
【０１２０】
モノクローナル抗体は、たとえば、当該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有するｈＣＭＶタンパク質またはその構成成分のタンパク質のうちの１つがあらかじめ固定されているアフィニティーカラム上で精製することができる。特に、モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上でのクロマトグラフィー、それに後続してもしなくてもよいが、それ自体、残留タンパク質混在物質ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを排除することを目的とするイオン交換クロマトグラフィー、それに後続してもしなくてもよいが、二量体または他の多量体の存在による潜在的な凝集体を排除するためのセファロースゲル上での排除クロマトグラフィーによって精製することができる。これらの技術のいずれも、同時にまたは連続的に使用することができる。
【０１２１】
抗原結合部位
これは、標的抗原のすべてまたは一部に結合し、それに相補的である分子の一部を説明する。抗体分子では、それは、抗体抗原結合部位と呼ばれ、標的抗原のすべてまたは一部に結合し、それに相補的である抗体の一部を含む。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にのみ結合してもよく、その一部は、エピトープと称される。抗体抗原結合部位は、１つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよい。
【０１２２】
抗原結合部位は、ＣＤＲの天然の位置と別の抗体分子の領域において、たとえば、ＶＨもしくはＶＬドメインのフレームワーク領域においてまたはたとえばＣＨ１および／もしくはＣＨ３を含むが、これらに限定されない抗体定常ドメインにおいて遺伝子操作されてもよい。構造領域において遺伝子操作された抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲのセットによって形成される抗原結合部位に対して付加的なものまたはその代わりとなってもよい。複数の抗原結合部位が抗体分子中に存在する場合、たとえば、それらは、ｈＣＭＶ上の同じ抗原性ドメインに結合し、それによって、結合メンバーの原子価を増加させ、それによって、その結合活性を増加させてもよい。その代わりに、複数の抗原結合部位は、ｈＣＭＶ上の異なる抗原および／または１つもしくは複数の他の抗原に結合してもよく、これは、エフェクター機能を追加する、半減期を延長する、または抗体分子のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）デリバリーを改善するために使用されてもよい。
【０１２３】
単離
これは、本発明の結合メンバーまたはそのような結合メンバーをコードする核酸が、一般に、本発明に従う状態を指す。したがって、たとえば、実質的に純粋なもしくは均一な形態をした、または核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子がないもしくは実質的にない、それらの天然の環境から単離されたならびに／または精製された本発明による結合メンバー、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、およびコード核酸分子、ならびにベクターが提供されてもよい。単離メンバーおよび単離核酸は、それらが他のポリペプチドなどのような、天然に関連する物質またはそれらが天然環境またはそのような調製がインビトロでもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合、それらが調製される環境（たとえば細胞培養）において見つけられる核酸がないまたは実質的にないであろう。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに処方されてもよく、なお、実際的な目的のために単離されてもよく、たとえば、メンバーは、イムノアッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートをコートするために使用される場合、通常、ゼラチンまたは他のキャリアと混合されるであろうまたは診断もしくは療法において使用される場合、薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤と混合されるであろう。結合メンバーは、天然にまたは異種真核細胞（たとえばＣＨＯ細胞もしくはＮＳ０細胞）の系によってグリコシル化されてもよいまたはそれらは、たとえば、それらが原核細胞における発現によって生成される場合、グリコシル化されなくてもよい。
【０１２４】
抗ｈＣＭＶ抗体分子を含む不均一な調製物もまた、本発明の一部を形成する。たとえば、そのような調製物は、様々な程度のグリコシル化を有するおよび／またはピログルタミン酸残基を形成するためのＮ末端グルタミン酸の環化などのような誘導体化されたアミノ酸を有する、完全長重鎖およびＣ末端リジンを欠く重鎖を有する抗体の混合物であってもよい。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、語句「実質的に説明される」は、本明細書において記載される結合メンバーのＶＨまたはＶＬドメインの関連するＣＤＲの特徴（複数可）が、その配列が本明細書において説明される、指定される領域と同一であろうまたは高度に類似しているであろうということを指す。本明細書において記載されるように、１つまたは複数の可変ドメインの指定される領域に関しての語句「高度に類似する」は、１〜約５、たとえば、１〜３または１、２、３、もしくは４を含めて１〜４のアミノ酸置換が、ＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメインにおいて成されてもよいことが企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、既知の抗原性ドメインＡＤ−１、ＡＤ−２、およびＡＤ−３の位置を示す、ｇＢタンパク質（株ＡＤ１６９；配列番号２３９）の図式的な概観を示す（Ohlin et al., 1993; Wagner et al., 1992）。アミノ酸４６０での切断部位および角括弧によって示されるように２つの成分をともに連結するジスルフィド結合がある。シグナル：シグナル配列（アミノ酸１〜２２）、ＴＭ：膜貫通ドメイン（アミノ酸７５１〜７７１）。
【図２】図２は、調製用の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によるｇＢ特異的記憶Ｂ細胞の濃縮を示す。ｇＢ特異的ＩｇＧ陽性記憶Ｂ細胞を単離するために、抗ＣＤ２０  ＭＡＣＳ濃縮（ＭＡＣＳ＝磁気活性化セルソーティング）Ｂ細胞を、以下の抗体を用いて染色した：ａ．抗ヒトＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）；ｂ．抗ヒトＣＤ２７（記憶Ｂ細胞マーカー）；ｃ．抗ヒトＩｇＧ。さらに、Ｂ細胞は、蛍光色素を用いて標識した組換え糖タンパク質Ｂと共にインキュベートした。ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋／ＩｇＧ＋／ｇＢ＋反応性Ｂ細胞を照射フィーダー細胞上にソートし、抗体生成細胞系を、実施例１において記載されるように確立した。
【図３】図３は、ＨＣＭＶ  ｇＢのドメイン構造を示す。個々のドメインに相当する領域は、異なる濃淡で示し、開始残基の番号を示す。角括弧は、ジスルフィド結合を示す。シグナル：シグナル配列、ＴＭ：膜貫通ドメイン。
【図４】図４は、抗ｈＣＭＶ抗体およびＡｂ−５０の間の競合ＥＬＩＳＡを示す。図４ａは、抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、およびＣ２３（ｇＢ特異的対照抗体）と競合するＡｂ−５０を示す。ｇＢタンパク質への結合についての競合は、Ａｂ−５０対Ａｂ−４７およびＡｂ−４９については観察されるが、Ａｂ−４８（またはＣ２３対照抗体）については観察されない。図４ｂは、抗体ＩＴＣ５２、ＩＴＣ８８、８９−１０４、および８９−１０９と競合するＡｂ−５０を示す。結合についての競合は、Ａｂ−５０およびこれらの試験した抗体のいずれの間でも観察されない。図４ａおよび４ｂの上部を横切る点線は、０．５ｎｇ／ウェルの濃度のＡｂ−５０を示す。
【図５】図５は、ｇＢおよびｇＢ断片に対するヒト血清における抗体価を示す。ＨＣＭＶ血清陽性個体からランダムに選択された８０の血清を、組換えｇＢならびに抗原性ドメイン１（ＡＤ−１）、２（ＡＤ−２）、４（ＡＤ−４／ＤｏｍＩＩ）、および５（ＡＤ−５／ＤｏｍＩ）に対する反応性についてＥＬＩＳＡにおいて分析した。水平線は、個々の抗原についてのカットオフに相当する。
【図６】図６は、異なる抗原性領域に対する抗体価（ＥＬＩＳＡによって測定）および５０％の中和力価の間の相関を示す。ｒ：スピアマンの順位相関係数。
【図７】図７は、アフィニティー精製抗ＡＤ−４ポリクローナル抗体の特異性および中和能力を示す。ａ）ＥＬＩＳＡプレートを、それぞれｇＢ、ＡＤ−１、ＡＤ−２、およびＡＤ−４によりコートし、様々な抗体を用いて試験した。Ｅ３：アフィニティー精製ＩｇＧ画分；Ｐｒｅ：アフィニティー精製前の血清プール；Ｐｏｓｔ：アフィニティー精製後の血清プール；Ｃ２３：ヒトＡＤ−２特異的モノクローナル抗体；８９−１０４：ヒト抗ＡＤ−１特異的モノクローナル抗体；抗ＧＳＴ：ＧＳＴに特異的なマウスモノクローナル抗体。ｂ）血清プール、ヒトモノクローナル抗体Ｃ２３、およびアフィニティー精製ＡＤ−４特異的ＩｇＧ画分（Ｅ３）を使用する中和アッセイ。
【図８】図８は、ＡＤ−４および変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。哺乳動物細胞発現のために使用するＡＤ−４のアミノ酸配列を、トップのレーンに示す。アラニンに交換した残基をレーンＡ〜Ｑに示す。ダッシュは、野生型配列と同一であることを示す。
【図９】図９は、ヒトモノクローナル抗体（Ａｂ−２８、Ａｂ−１１、Ａｂ−１４）ならびにｈＣＭＶ血清陽性ドナー由来のアフィニティー精製ＩｇＧによるＡＤ−４ならびにＡＤ−４変異タンパク質の認識を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、示すＡＤ−４融合タンパク質によりコートし、ヒトモノクローナル抗体（Ａｂ−２８、Ａｂ−１１、Ａｂ−１４；図９ａ）またはアフィニティー精製ＩｇＧ画分（Ｅ３；図９ｂ）の結合を分析するために使用した。抗ＧＳＴ抗体は、抗原のコーティング効率についての対照のために使用した。
【図１０】図１０は、ヒト血清によるＡＤ−４変異体の認識を示す。血清パネル（８０の検体）を、それぞれＡＤ−４または変異体ペプチドＡＤ−４Ｇ（Ｋ３７８Ｋ３７９）、ＡＤ−４Ｈ（Ｑ３８０Ｅ３８１）、ＡＤ−４Ｅ（Ｅ３５９Ｄ３６２）、ＡＤ−４Ｉ（Ｎ３８３Ｓ３８５）、およびＡＤ−４Ｌ（Ｎ４０５Ｔ４０６）を含有するＧＳＴ融合タンパク質に対してＥＬＩＳＡにおいて試験した。それぞれの血清について、最も高いＯＤ値および最も低度なＯＤ値の間で比を計算し、倍数差としてプロットした。点線は、すべての血清試料の平均差に相当する。
【図１１】図１１は、ｇＢタンパク質抗原性ドメインおよびサブドメインの抗体認識を決定する捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。２９３Ｔ細胞を、対照（ｐｃＵＬ１３２ＳｉｇＨＡ）、ＡＤ−４＋ＡＤ−５、ＡＤ−５のサブドメイン１（ＡＤ−５−Ｓ１）、またはＡＤ−５のサブドメイン２（ＡＤ−５−Ｓ２）によりトランスフェクトした。抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０は、検出のために使用した。結果は、間接免疫蛍光法によって検出した。
【図１２】図１２は、中和抗体Ａｂ−２８および様々なヒト血清を用いる競合的中和アッセイを示す。図の左側のデータは、それらの５０％の中和活性のあたりの一定濃度で適用した、三通りの異なるｈＣＭＶ陽性血清およびｈＣＭＶ陰性血清（Ｘ軸上）を示す。図の右側の曲線は、図の左側のデータによって示される濃度と同一の一定濃度で添加したｈＣＭＶ陽性血清またはｈＭＣＶ−陰性血清との滴定Ａｂ−２８の組合せを示す。曲線はすべて、一定のＩｇＧ濃度の血清の添加と無関係のＡｂ−２８のみのＩｇＧ濃度を反映する。試料はすべて、三通り分析した。凡例：●  一定濃度のｈＣＭＶ陰性血清；▲  一定濃度のｈＣＭＶ陽性血清；■  一定濃度のＩｎｔｒａｔｅｃ（登録商標）；○  一定濃度のｈＣＭＶ陰性血清と滴定Ａｂ−２８；▽  一定濃度のｈＣＭＶ陽性血清と滴定Ａｂ−２８；□  一定濃度のＩｎｔｒａｔｅｃｔと滴定Ａｂ−２８；◇  滴定Ａｂ−２８のみ。
【図１３】図１３は、Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、およびＡｂ−２８を用いる吸着後アッセイを示す。ｈＣＭＶウイルスを、４℃で、１時間、ヒト包皮線維芽細胞に吸着させたが、侵入させず、次いで、抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、またはＡｂ−２８を添加し、４℃で、３０、８０、または１２０分間、インキュベートした。１５０〜５μｇ／ｍｌの１：２段階希釈を、それぞれの抗体について三通り実行した。Ｃ２３（ＡＤ−２特異的抗体）は、細胞へのウイルス侵入の阻害のために対照抗体として使用した。Ｘ軸はＩｇＧ濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ軸は中和％を示す。凡例：●  ３０分間のインキュベーション期間；■  ８０分間のインキュベーション期間；▲  １２０分間のインキュベーション期間。
【図１４】図１４は、ＡＤ−１およびＡＤ−２特異的抗体ならびにＡｂ−２８の間の代表的な競合的中和アッセイを示す。図１２ａおよび１２ｂにおいて示されるように、ＩＴＣ５２（ＡＤ−１特異的抗体）またはＩＴＣ８８（ＡＤ−２特異的抗体）を、それぞれＡｂ−２８の非存在下（●）または存在下（■）において滴定した。Ａｂ−２８は、０．５μｇ／ｍｌの一定濃度で滴定抗体に添加した（▲）。図１２ｃは、ＩＴＣ８８の非存在下（●）または存在下（■）において滴定したＩＴＣ５２を示し、これは、３μｇ／ｍｌの一定濃度で滴定抗体に添加した（▲）。結果はすべて、三通りの分析を示す。
【図１５】図１５は、ＡＤ−４特異的およびＡＤ−５特異的抗体の間の競合的中和アッセイを示す。このアッセイについては、１つの代表的なＡＤ−４（ＤｏｍＩＩ）特異的抗体（Ａｂ−２８）ならびに２つの代表的なＡＤ−５（ＤｏｍＩ）特異的抗体（Ａｂ−４９およびＡｂ−５０）を使用した。Ｘ軸はＩｇＧ濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ軸は中和％を示す。凡例：●  ＡＤ−５抗体（Ａｂ−４９またはＡｂ−５０）のみ；▲  ＡＤ−４抗体のみ；■  ＡＤ−５およびＡＤ−４抗体の混合。第１のウェルに１．５μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体を適用したが、混合物の開始濃度は、３μｇ／ｍｌとした。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
発明の詳細な説明
上記に言及されるように、本発明に従う結合メンバーは、ｈＣＭＶの生物学的活性を調整し、中和してもよい。高い効力の結合メンバーは、最初のスクリーニング、たとえば生物学的ｈＣＭＶ中和アッセイから直接得られてもよい。アッセイおよび効力は、より詳細に本明細書において別記される。
【０１２８】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の形質転換は、哺乳動物細胞を不死化するための確かな方法であり、多数のＥＢＶ形質転換プロトコールが開発されてきた（Rosen et al., 1977; Steinitz et al., 1977; Steinitz et al., 1980; Kozbor & Roder, 1981; Lundgren et al., 1983; Rosen et al., 1983; Steinitz et al., 1984; Lanzavecchia, 1985; Bernasconi et al., 2002; Jung et al., 2002; Traggiai et al., 2004）。この技術は、ＤＮＡおよびタンパク質単離のための永久的な供給源として果たす、ヒトリンパ球由来の細胞系を得るために使用されることが多く、遺伝子型同定のための、患者ＤＮＡの永久的な供給源を作成する主要な方法として臨床試験における広範囲の使用を見出した。ＥＢＶは、ヘルペスウイルスであり、そのゲノムは、完全に配列決定された１７２ｋｂの直線状二本鎖ＤＮＡから成る。ＥＢＶの分子生物学および病原性は、広範囲に研究されており、病原性における、多くの重大なＥＢＶおよび宿主細胞の遺伝子の役割が知られている。ＥＢＶは、ある種の哺乳動物の上皮細胞およびＢリンパ球のみに感染する。インビトロで、ＥＢＶは、多くの細胞周期調節遺伝子および免疫グロブリン遺伝子を含むＢ細胞特異的遺伝子を活性化することによってＢ細胞を不死化する。次いで、特異的な抗体を分泌する成長中のクローンは、分析のために選択されてもよい。次いで、目的の抗体は、クローニングすることができ、それらの配列は、従来の方法によって決定することができる。
【０１２９】
当該選択された結合メンバーのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、そのようなＶＨドメインを含む結合メンバーのように、単離形態で提供されてもよい。
【０１３０】
ｈＣＭＶに結合する能力について、また、たとえば本発明のＡｂ−０１〜Ａｂ−５０の任意の抗体分子（たとえばｓｃＦｖ構成および／またはＩｇＧ構成（たとえばＩｇＧ１）の）とｈＣＭＶへの結合について競合する能力についても、さらに試験されてもよい。さらに他のところで本明細書において議論されるように、ｈＣＭＶを中和する能力が、試験されてもよい。
【０１３１】
異なる結合メンバーの結合親和性および中和効力は、適切な条件下で比較することができる。
【０１３２】
アミノ酸配列が本明細書において説明されるおよび本発明の結合メンバー中に用いることができるものを含む、本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、所望の特徴を有する抗原結合メンバーについて配列改変または変異およびスクリーニングの方法の手段によって得ることができる。所望の特徴の例は、
・抗原に特異的な既知の抗体と比べた、抗原に対する結合親和性の増加
・活性が知られている場合、抗原に特異的な既知の抗体と比べた、抗原活性の中和の増加
・特定のモル比での、抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの特定の競合的能力。
・複合体を免疫沈降する能力
・たとえば直線状でスクリーニングされたペプチドを使用する直線状エピトープなどのような特定のエピトープおよび／または非連続的な残基によって形成される制限された立体構造もしくは立体構造エピトープに結合する能力
・ｈＣＭＶの新しい生物学的活性または下流分子を調整する能力を含むが、これらに限定されない。そのような方法もまた、本明細書において提供される。
【０１３３】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、ポリペプチドの６つのループによって典型的に形成される：軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からの３つおよび重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からの３つ。既知の原子構造の抗体の分析により、抗体結合部位の配列および三次元構造の関係が解明された。これらの関係は、ＶＨドメインにおける第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが、少数の主鎖立体構造または標準構造のうちの１つを有することを示唆する。特定のループにおいて形成される標準構造は、そのサイズならびにループおよびフレームワーク領域の両方における重要な部位でのある種の残基の存在によって決定されることが示された（Chothia et al., 1992; Al-Lazikani et al., 1997）。
【０１３４】
配列−構造関係に関するこの研究は、そのＣＤＲループの三次元構造を維持し、よって結合特異性を維持するのに重要である、未知の三次元構造ではなく既知の配列の抗体におけるそれらの残基の予測のために使用することができる。構造的アプローチでは、モデルは、ＷＡＭなどのような、任意の無料で入手可能なパッケージまたは市販パッケージを使用して（Whitelegg & Rees, 2000）、抗体分子から作成することができる（Chothia et al., 1986）。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ（Guex & Peitsch, 1997）などのようなタンパク質視覚化および分析ソフトウェアパッケージは、次いで、ＣＤＲにおけるそれぞれの位置で可能な置換を評価するために使用されてもよい。次いで、この情報は、活性に対して最小限のまたは有益な効果を有する可能性があるであろう置換を成すために使用されてもよい。
【０１３５】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン、および結合メンバーのアミノ酸配列内に置換を成すために必要とされる技術は、当技術分野において一般に入手可能である。活性に対する最小限のまたは有益な効果を有することが推定され得るまたは推定され得ない置換を有する変異体配列が、作製されてもよく、ｈＣＭＶに結合するおよび／もしくはそれを中和する能力についてならびに／または任意の他の所望の特性について試験されてもよい。
【０１３６】
その配列が本明細書において明確に開示されるＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体は、議論されるように、本発明に従って用いられてもよい。
【０１３７】
本発明のさらなる態様は、添付の配列表において示される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかのＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含むおよび／または添付の配列表において示される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかのＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含む抗体分子である。２つのアミノ酸配列の同一性％を計算するために使用することができるアルゴリズムは、たとえばデフォルトパラメーターを用いる、たとえばＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990）、ＦＡＳＴＡ（Pearson & Lipman, 1988）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith & Waterman, 1981）を含む。特定の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸配列改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、および／または挿入）を含んでいてもよい。
【０１３８】
改変は、１つもしくは複数のフレームワーク領域および／または１つもしくは複数のＣＤＲにおいて成されてもよい。改変は、通常、機能の損失をもたらさず、そのため、このように改変されたアミノ酸配列を含む結合メンバーは、ｈＣＭＶに結合するおよび／またはそれを中和する能力を保持していてもよい。それは、たとえば、本明細書において記載されるアッセイにおいて測定されるように、改変が成されていない結合メンバーと同じ量的な結合および／または中和能力を保持していてもよい。このように改変されたアミノ酸配列を含む結合メンバーは、ｈＣＭＶ感染性に結合するおよび／またはそれを中和する、改善された能力を有していてもよい。
【０１３９】
改変は、天然に存在しないもしくは非標準アミノ酸と１つもしくは複数のアミノ酸残基を交換すること、天然に存在しないもしくは非標準形態に１つまたは複数のアミノ酸残基を修飾すること、または配列の中に１つもしくは複数の天然に存在しないもしくは非標準アミノ酸を挿入することを含んでいてもよい。本発明の配列における改変の数および位置の例は、本明細書において別記される。天然に存在するアミノ酸は、それらの標準の一文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして同定される２０の「標準」Ｌ−アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、ポリペプチド主鎖の中に組み込まれてもよい任意の他の残基を含むまたは既存のアミノ酸残基の修飾に起因してもよい。非標準アミノ酸は、天然に存在してもよいまたは天然に存在しなくてもよい。いくつかの天然に存在する非標準アミノ酸は、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどのように、当技術分野において知られている（Voet & Voet, 2004）。それらのＮ−アルファ位置で誘導体化されるアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端にのみ位置するであろう。通常、本発明では、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。そのため、改変は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に修飾することまたはそれをＤ−アミノ酸と交換することを含んでいてもよい。アミノ酸のメチル化、アセチル化、および／またはリン酸化形態もまた、知られており、本発明におけるアミノ酸は、そのような修飾に付されてもよい。
【０１４０】
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバーにおけるアミノ酸配列は、上記に記載される非天然または非標準アミノ酸を含んでいてもよい。非標準アミノ酸（たとえばＤ−アミノ酸）は、合成の間にまたはアミノ酸配列の合成後、「オリジナルの」標準アミノ酸の修飾もしくは交換によって、アミノ酸配列の中に組み込まれてもよい。
【０１４１】
非標準および／または天然に存在しないアミノ酸の使用は、構造的および機能的多様性を増加させ、したがって、本発明の結合メンバーにおいて所望のｈＣＭＶ結合および中和特性を達成する可能性を増加させることができる。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、たとえばヒトへの投与後の、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのインビボ分解のために、標準Ｌ−アミノ酸と比較して、異なる薬物動態学的プロファイルを有することが示され、Ｄ−アミノ酸がいくつかのインビボ適用について有利であることを意味する。
【０１４２】
本発明のＣＤＲ由来の配列を保持する新規なＶＨまたはＶＬ領域は、可変ドメイン全体内で変異を作成するために、１つまたは複数の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用して作成されてもよい。そのような技術は、エラープローンＰＣＲを使用したGram et al., (1992)によって記載されている。いくつかの実施形態では、１または２のアミノ酸置換は、可変ドメイン全体またはＣＤＲのセット内で成されてもよい。使用されてもよい他の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対して変異誘発を指示することである（Barbas et al., 1994; Schier et al., 1996）。
【０１４３】
上記技術はすべて、当技術分野においてそういうものとして知られており、当業者は、当技術分野においてルーチン的な方法を使用して、本発明の結合メンバーを提供するためにそのような技術を使用することができるであろう。
【０１４４】
本発明のさらなる態様は、ｈＣＭＶに対する抗体抗原結合部位を得るための方法であって、本明細書において説明されるＶＨドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を介して、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供すること、所望により、このように提供されたＶＨドメインを１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせること、および所望により１つまたは複数の所望の特性、たとえばｈＣＭＶ活性を中和する能力を有する、ｈＣＭＶに対する結合メンバーまたは抗体抗原結合部位を同定するために、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せ（複数可）を試験することを含む方法を提供する。当該ＶＬドメインは、本明細書において実質的に説明されるアミノ酸配列を有していてもよい。本明細書において開示されるＶＬドメインの１つまたは複数の配列変異体が１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わせられる類似の方法が用いられてもよい。上記に言及されるように、本明細書において実質的に説明されるＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメイン中のＣＤＲまたはその実質的な部分として保持されてもよい。本明細書において実質的に説明されるＨＣＤＲ３配列は、本発明の実施形態を示し、これらのそれぞれは、ヒト重鎖可変ドメイン中のＨＣＤＲ３またはその実質的な部分として保持されてもよい。
【０１４５】
本発明において用いられる可変ドメインは、任意の生殖系列もしくは再構成ヒト可変ドメインから得られてもよいもしくはそれに由来してもよいまたは既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列もしくは実際の配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは、非ヒト抗体に由来し得る。本発明のＣＤＲ配列（たとえばＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ（たとえばＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーの中に導入されてもよい。たとえば、Marks et al., (1992)は、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するために、可変ドメインエリアの５’末端に向けられるまたは隣接するコンセンサスプライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用される、抗体可変ドメインのレパートリーを生成するための方法を記載する。Marks et al.は、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせる方法についてさらに記載している。類似の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャフルされてもよく、シャフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインは、本発明の結合メンバーを提供するために、同起源のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせられてもよい。次いで、レパートリーは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または共有結合ディスプレイ系などのような適した宿主系においてディスプレイされてもよい。
【０１４６】
同様に、１つもしくは複数のまたはすべての３つのＣＤＲは、ｈＣＭＶに対する結合メンバー（複数可）について次いでスクリーニングされるＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーの中に移植されてもよい。
【０１４７】
たとえば、１つもしくは複数の抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３もしくはＨＣＤＲのセットが用いられてもよいおよび／または１つもしくは複数の抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３もしくはＬＣＤＲのセットが用いられてもよい。同様に、本明細書において開示される他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲのセット、ならびにＨＣＤＲのセットおよび／またはＬＣＤＲのセットが用いられてもよい。
【０１４８】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、それらの介在フレームワーク領域と共に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含んでいてもよい。部分はまた、少なくとも約５０％のどちらかのまたは両方の第１および第４のフレームワーク領域を含んでいてもよく、５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％であり、第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常関連しないものであってもよい。たとえば、組換えＤＮＡ技術によって成される本発明の結合メンバーの構築は、クローニングまたは他の操作工程を促進するために導入されるリンカーによってコードされるＮまたはＣ末端残基の導入をもたらしてもよい。
【０１４９】
他の操作工程は、本明細書の他のところでより詳細に議論されるように、抗体定常領域、他の可変ドメイン、または検出可能な／機能的な標識を含むさらなるタンパク質配列に本発明の可変ドメインをつなぐために、リンカーの導入を含む。
【０１５０】
本発明のいくつかの態様では、結合メンバーは、１対のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列に基づく単一の結合ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、とりわけＶＨドメインが、特定の方法において標的抗原に結合することができることが知られている。どちらかの単一の結合ドメインの場合には、これらのドメインは、ｈＣＭＶに結合することができる２ドメイン結合メンバーを形成することができる相補的ドメインをスクリーニングするために使用されてもよい。これは、ＷＯ９２／０１０４７（McCafferty et al）およびMarks et al.、同書において開示されるように、いわゆる階層的２重コンビナトリアルアプローチ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｕａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して、ファージディスプレイスクリーニング方法によって達成されてもよい。
【０１５１】
本発明の結合メンバーは、抗体定常領域またはその一部、たとえばヒト抗体定常領域またはその一部をさらに含んでいてもよい。たとえば、ＶＬドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合されてもよい。同様に、ＶＨドメインに基づく結合メンバーは、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭならびにアイソタイプのサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部（たとえばＣＨ１ドメイン）に結合されてもよい。ＩｇＧ１は、そのエフェクター機能および生産の容易性により有利である。これらの特性を有し、可変領域を安定化する任意の合成または他の定常領域変異体もまた、本発明において有用であってもよい。
【０１５２】
本発明の結合メンバーはまた、二特異性または多特異性抗体などのような１対を超えるＶＨおよびＶＬドメインを含んでいてもよく、これは、本発明のさらなる態様を形成する。２対のＶＨおよびＶＬドメインを有する二特異性抗体の場合には、対のＶＨおよびＶＬドメインの一方は、本発明において記載される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかに由来してもよい。ＶＨおよびＶＬドメインの第２の対は、第１の対と同じであってもよいまたは異なっていてもよい。たとえば、ＶＨおよびＶＬドメインの対は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかまたは異なる抗体から選択されてもよい。好ましい実施形態では、第１のＶＨおよびＶＬドメインの対は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかから選択され、第２のＶＨおよびＶＬドメインの対もまた、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０から選択されるが、第１のドメイン対とは異なり、二特異性抗体は、ｈＭＣＶに結合する。さらに、第１のＶＨおよびＶＬドメインの対は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかから選択され、第２のＶＨおよびＶＬドメインの対は、異なる抗体から選択される。そのため、二特異性抗体は、ｈＣＭＶにおよび異なる抗原にまたはｈＣＭＶ上の異なるエピトープに結合してもよい。好ましくは、二特異性抗体は、ｈＣＭＶのＡＤ−４またはＡＤ−５に結合する、第１のＶＨおよびＶＬドメインの対（つまり抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかからの第１のＶＨおよびＶＬドメインの対）ならびに以下において記載されるｈＣＭＶ結合抗体から選択される第２のＶＨおよびＶＬドメインの対：ＵＳ５，０４３，２８１（Mashuho et al）、ＵＳ５，７５０，１０６（Ostberg）、ＷＯ９３／０２１９５２  Ａ１（Borrebaeck et al）、ＷＯ０８／０８４４１０  Ａ２、ＷＯ１０／００７４６３  Ａ１、およびＷＯ１０／００７５３３  Ａ２（Lanzavecchia & Macagno）、ＷＯ０８／０７１８０６  Ａ１、ＷＯ０９／００３９７５  Ａ１およびＷＯ０９／０２４４４５  Ａ１（Funaro et al）、ＷＯ０９／１１４５６０  Ａ２（Ｏｌｓｅｎ）、ＷＯ１０／１１４１０５  Ａ１およびＷＯ１０／１１４１０６  Ａ１（Takada et al）を含む。
【０１５３】
Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（商標）（Ｍｅｒｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＢＶ；ＷＯ  ０４／１０６３７５）のような当技術分野において既知の組換えヒトモノクローナル抗体の混合物などのような抗体の混合物は、ｈＭＣＶの中和において使用するのために作成されてもよい。これらの混合物は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかに由来する結合メンバーを含んでいてもよい。抗体の混合物はまた、ＡＤ−１もしくはＡＤ−２などのようなｇＢタンパク質上の異なる抗原性ドメインを認識するまたはｇＨを認識するまたはｈＣＭＶタンパク質ｇｐＵＬ１３０、ｇｐＵＬ１３１Ａ、ｇｐ１２８を認識するなどの、ｈＣＭＶに対する結合メンバーと組み合わせた抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかからの結合メンバーを含んでいてもよい。たとえば、抗体混合物は、抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかからのＶＬドメインおよび抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかから選択されるＶＨドメインおよび／または以下において記載されるｈＣＭＶ結合抗体のいずれかから選択されるＶＨドメイン：ＵＳ５，０４３，２８１（Mashuho et al）、ＵＳ５，７５０，１０６（Ｏｓｔｂｅｒｇ）、ＷＯ９３／０２１９５２  Ａ１（Borrebaeck et al）、ＷＯ０８／０８４４１０  Ａ２、ＷＯ１０／００７４６３  Ａ１、およびＷＯ１０／００７５３３  Ａ２（Lanzavecchia & Macagno）、ＷＯ０８／０７１８０６  Ａ１、ＷＯ０９／００３９７５  Ａ１およびＷＯ０９／０２４４４５  Ａ１（Funaro et al）、ＷＯ０９／１１４５６０  Ａ２（Olsen）、ＷＯ１０／１１４１０５  Ａ１およびＷＯ１０／１１４１０６  Ａ１（Takada et al）を含む。代替では、抗体混合物は、ＵＳ５，０４３，２８１（Mashuho et al）、ＵＳ５，７５０，１０６（Ostberg）、ＷＯ９３／０２１９５２  Ａ１（Borrebaeck et al）、ＷＯ０８／０８４４１０  Ａ２、ＷＯ１０／００７４６３  Ａ１、およびＷＯ１０／００７５３３  Ａ２（Lanzavecchia & Macagno）、ＷＯ０８／０７１８０６  Ａ１、ＷＯ０９／００３９７５  Ａ１およびＷＯ０９／０２４４４５  Ａ１（Funaro et al）、ＷＯ０９／１１４５６０  Ａ２（Olsen）、ＷＯ１０／１１４１０５  Ａ１およびＷＯ１０／１１４１０６  Ａ１（Takada et al）において記載されるｈＣＭＶ結合抗体のいずれかから選択されるＶＬドメインを、前に言及されるリストにおいて記載されるｈＣＭＶ結合抗体のいずれかから選択されるＶＨドメインおよび／または抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかから選択されるＶＨドメインと共に、含んでいてもよい。
【０１５４】
本発明の結合メンバーはまた、修飾Ｆｃ領域を含む抗体または断片を含んでいてもよく、修飾Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。変異体Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体により大きなまたは小さな親和性により結合するように、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子に関連して設計されてもよい。Ｆｃ領域は、ＩｇＧのパパイン消化に際して生成されるＩｇＧ  Ｃ末端ドメインに相同な天然に存在するまたは合成ポリペプチドを指す。ＩｇＧ  Ｆｃは、およそ５０ｋＤの分子量を有する。本発明の抗体および／または断片については、Ｆｃ領域全体または半減期を増強する部分のみを使用することができる。
【０１５５】
Ｆｃ領域は、所望される場合、補体を固定し、かつＦｃ受容体に高い親和性により結合するその能力を阻害するように、変異させることができる。本発明では、抗体または断片は、天然に存在するＦｃ領域が、生物学的環境において抗体または断片の半減期、たとえば血清半減期またはインビトロアッセイによって測定される半減期を増加させるように修飾されている修飾Ｆｃ領域により提供されてもよい。ＩｇＧのＦｃ領域のもとの形態を改変するための方法はまた、ＵＳ６，９９８，２５３（Presta & Snedecor）においても記載されている。グリコシル化パターンを修飾することによってまたはＦｃ領域のアミノ酸配列を修飾することによってＦｃ領域に修飾を成すことにより改変する（たとえば増強する）ことができるエフェクター機能は、抗体依存性の細胞傷害活性の増加および補体媒介性の溶解（たとえばｈＣＭＶ感染細胞の）の増加を含むＦｃ媒介性の細胞傷害活性の増加、Ｆｃ受容体、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、および／または多形核細胞に対する抗体の結合の増加；樹状細胞成熟の増加、ならびにＴ細胞のプライミングの増加を含むが、これらに限定されない。可能性のある修飾は、アラニンとの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるＩｇＧサブクラス由来の同じ位置の対応するアミノ酸残基との交換（たとえば、その位置の対応するＩｇＧ２残基とＩｇＧ１残基を交換する）を含む、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を含む。
【０１５６】
他の実施形態では、本発明のＦｃポリペプチド変異体は１つまたは複数の遺伝子操作されたグリコフォーム、つまり、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含んでいてもよい。ＩｇＧ型抗体のＦｃ領域は、ＣＨ２ドメインの残基Ａｓｎ２９７に保存Ｎ結合型グリコシル化部位を含有する。この残基に連結されるオリゴ糖のグリコシル化パターンの修飾が、Ｆｃ受容体との相互作用において、Ｆｃ領域によって媒介されるエフェクター機能を増加させることができることが示された。遺伝子操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強するまたは低下させることを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であってもよい。遺伝子操作されたグリコフォームは、当業者に既知の任意の方法によって、たとえば、遺伝子操作されたもしくは変異体発現株を使用することによって、１つもしくは複数の酵素、たとえばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとの同時発現によって、様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物（複数可）を修飾することによって作成されてもよい。
【０１５７】
遺伝子操作されたグリコフォームを作成するための方法は、当技術分野において知られており、ＵＳ６，６０２，６８４（Umana et al）；ＵＳ２００３０１５７１０８（Presta et al）；Umana et al., (1999)；Davies et al., (2001)；Shields et al., (2002)；Shinkawa et al., (2003)；ならびにＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．）およびＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリング技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、ＣＨ）に関する特許および出願において記載されるものを含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本明細書において別記されるｈＣＭＶ結合メンバーを包含し、当該結合メンバーは、１つまたは複数のエフェクター機能を増加させるように修飾された、少なくとも１つのＩｇＧ  ＣＨ２領域を含むＦｃ領域または等価な領域を含む。一実施形態では、結合メンバーは、１つまたは複数のエフェクター機能の活性が増加するようにＡｓｎ  ２９７のＮ結合型オリゴ糖のグリコシル化パターンを改変するために修飾される。他の実施形態では、結合メンバーは、１つまたは複数のエフェクター機能の活性が増加するようにＦｃ領域のアミノ酸配列を改変するために修飾される。エフェクター機能活性を測定し、それらが増加するかどうかを決定するための方法は、当技術分野においてよく知られている。
【０１５９】
本発明の結合メンバーは、検出可能なまたは機能的な標識を用いて標識されてもよい。したがって、結合メンバーまたは抗体分子は、検出可能なおよび／またはに定量化できるシグナルを得るために免疫複合体の形態で存在することができる。免疫複合体は、検出可能なまたは機能的な標識とコンジュゲートされた、本発明の抗体分子、たとえば抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかを含んでいてもよい。標識は、蛍光色素、放射標識、酵素、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、または光増感剤を含むが、これらに限定されないシグナルを生成するまたは作成するように誘発することができる任意の分子とすることができる。したがって、結合は、蛍光または発光、放射能、酵素活性、または光吸光度を検出することによって検出されてもよいおよび／または測定されてもよい。
【０１６０】
適した標識は、限定ではなく例証として、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅｓ）、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼなどのような酵素；色素；フルオレセインおよびその誘導体、ローダミン化合物および誘導体、緑色／黄色蛍光タンパク質（Ｇ／ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、ならびにフルオレサミンなどのような蛍光（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識または蛍光色素；ランタニドクリプテートおよびキレートなどのような蛍光団、たとえばユウロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒおよびＣｉｓ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、イソルミノール、ルミノール、およびジオキセタンなどのような化学発光標識または化学発光物質；ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどのようなバイオ発光標識；感作物質；補酵素；酵素基質；臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３（トリチウム）、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９、および本明細書において言及される他の放射標識を含むが、これらに限定されない放射標識；ラテックスまたはカーボン粒子などのような粒子；金属ゾル；クリスタリット；リポソーム；色素、触媒、または他の検出可能な群を用いてさらに標識されてもよい細胞など；ビオチン、ジゴキシゲニン、または５−ブロムデキシウリジンなどのような分子；たとえば、シュードモナスエキソトキシン（ＰＥまたはその細胞毒性断片もしくは変異体）、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素またはその細胞毒性断片もしくは変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ、リシンまたはその細胞毒性断片、たとえばリシンＡ、アブリンまたはその細胞毒性断片、サポリンまたはその細胞毒性断片、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性毒素またはその細胞毒性断片、およびブリオジン１（ｂｒｙｏｄｉｎ  １）またはその細胞毒性断片の群から選択される毒素成分などのような毒素成分を含む。
【０１６１】
適した酵素および補酵素はＵＳ４，２７５，１４９（Litman et al）およびＵＳ４，３１８，９８０（Boguslaski et al）において開示され、適した蛍光剤および化学発光物質は、ＵＳ４，２７５，１４９において開示され、これらは、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。標識は、特異的な同起源の検出可能な成分、たとえば標識されたアビジンもしくはストレプトアビジンまたはｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ＤＥ）のような遺伝子的に操作されたストレプトアビジンへの結合を介して検出されてもよいビオチンなどのような化学成分をさらに含む。検出可能な標識は、当技術分野において知られている従来の化学的性質を使用して、本発明の抗体に結合されてもよい。
【０１６２】
免疫複合体またはそれらの機能的断片は、当業者に既知の方法によって調製することができる。それらは、酵素または蛍光標識に、直接またはスペーサー基もしくはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などのような連結基の媒介物によってまたは治療用コンジュゲートについて上記に言及されるものなどのようなカップリング剤の存在下においてつなぐことができる。フルオレセイン型の標識を含有するコンジュゲートは、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０１６３】
直接または上記に言及されるＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのようなキレート剤を介して抗体に治療用放射性同位体をつなぐために存在する当業者に既知の方法は、診断において使用することができる放射性元素について使用することができる。クロラミンＴ法によってナトリウム１２５を用いて（Hunter & Greenwood, 1962）または他の場合には、これらの両方についてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ４，４２４，２００（Crockford & Rhodes）において記載される技術によってもしくはＵＳ４，４７９，９３０（Hnatowich）において記載されるＤＴＰＡを介して結合されたテクネチウム９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）を用いて標識を実行することが同様に可能である。
【０１６４】
標識が、外部手段によって、たとえば、外観検査、電磁放射、熱および化学試薬によって検出可能なシグナルを生成することができる多数の方法がある。標識はまた、本発明の結合メンバーに結合する他の結合メンバーまたは支持体に結合することもできる。
【０１６５】
標識は、直接シグナルを生成することができ、そのため、シグナルを生成するためにさらなる構成成分は必要とされない。多数の有機分子、たとえば蛍光剤は、紫外線および可視光線を吸収することができ、光吸収により、エネルギーがこれらの分子に移され、励起エネルギー状態までそれらを上昇させる。次いで、この吸収エネルギーは、第２の波長での光の放射によって消費される。この第２の波長の放射はまた、標識アクセプター分子にエネルギーを移してもよく、結果として生ずるエネルギーは、光の放射、たとえば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってアクセプター分子から消費されてもよい。直接シグナルを生成する他の標識は、放射性同位体および色素を含む。
【０１６６】
代わりに、標識は、シグナルを生成するために他の構成成分を必要としてもよく、次いで、シグナル生成系は、基質、補酵素、エンハンサー、さらなる酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性化体、補助因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要とされる特異的な結合物質を含んでいてもよい、測定可能なシグナルを生成するのに必要な構成成分をすべて含むであろう。適したシグナル生成系の、詳細な議論は、ＵＳ５，１８５，２４３（Ullman et al）において見つけることができる。本発明は、ｈＣＭＶに特異的な、本明細書において提供される結合メンバーの結合を引き起こすまたは可能にすることを含む方法を提供する。言及されるように、そのような結合は、インビボにおいて、たとえば、結合メンバーもしくは結合メンバーをコードする核酸の投与に続いて起こってもよいまたはそれは、インビトロにおいて、たとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、アフィニティークロマトグラフィー、免疫細胞化学、免疫沈降、中和、および生化学的もしくは細胞ベースのアッセイにおいて起こってもよい。
【０１６７】
本発明はまた、たとえばバイオセンサー系において、本発明による結合メンバーを用いることによって、直接、抗原のレベルを測定する方法をも提供する。たとえば、本発明は、ｈＣＭＶへの結合を検出するおよび／または測定するための方法であって、（ｉ）ｈＣＭＶに当該結合メンバーを暴露することおよび（ｉｉ）ｈＣＭＶへの当該結合メンバーの結合を検出することを含み、結合は、本明細書において記載される任意の方法または検出可能な標識を使用して検出される方法を提供する。本明細書において記載されるこのおよび任意の他の結合検出方法は、たとえば、検出可能な標識を視覚的に観察することによって、方法を実行する人によって直接判断されてもよい。その代わりに、本明細書において記載されるこの方法または任意の他の結合検出方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータープリントアウト、フローサイトメトリーレポート、図、チャート、結果を含有する試験管もしくは容器もしくはウェル、または方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的な表現の形態をしたレポートをもたらしてもよい。
【０１６８】
ｈＣＭＶへの結合メンバーの結合の量が、決定されてもよい。定量化は、試験試料中の抗原の量と関連してもよく、これは、診断上重要であってもよい。ｈＣＭＶ結合のスクリーニングおよび／またはその定量化は、たとえば、本明細書において言及される疾患もしくは障害ならびに／または異常なｈＣＭＶ発現および／もしくは活性を伴う任意の他の疾患もしくは障害について患者をスクリーニングする際に有用であってもよい。
【０１６９】
本発明の診断方法は、（ｉ）対象から組織または体液試料を得ること、（ｉｉ）本発明の１つまたは複数の結合メンバーに当該組織または体液試料を暴露すること、および（ｉｉｉ）対照試料と比較して、結合したｈＣＭＶを検出することを含んでいてもよく、対照と比較したｈＣＭＶ結合の量における増加は、ｈＣＭＶ発現および／または活性を示してもよい。試験されることとなる組織または体液試料は、血液、血清、唾液、尿、痰、生検材料、またはｈＣＭＶを含有することが疑われる任意の組織を含む。試験でｈＣＭＶについて陽性となった対象もまた、後に本明細書において開示される治療方法から恩恵を受けてもよい。当業者らは、本明細書において開示される方法を考慮して、それらの選好および一般知識に従って、抗原への結合メンバーの結合を決定するための適したモードを選択することができる。
【０１７０】
試料中の結合メンバーの反応性は、任意の適切な手段によって決定されてもよい。競合的結合アッセイは、放射性抗原、たとえば９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、もしくは３５Ｓなどのような同位体標識またはレポーター分子に連結された抗原もしくは類似体を使用する非放射性抗原と共に使用されてもよい。レポーター分子は、蛍光色素、蛍光体、またはスペクトルで分離される吸収もしくは放射特性を有するレーザー色素であってもよい。適した蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄならびにランタニドキレートまたはクリプテートを含む。適した発色性色素は、ジアミノベンジジンを含む。
【０１７１】
他のレポーターは、視覚的に観察される、電子的に検出される、または他の場合には記録されることとなる検出可能なシグナルを直接または間接的に引き起こすことができる、有色、磁性または常磁性、および生物学的または化学的活性作用物質であるラテックスビーズなどのような高分子コロイド粒子または粒状物質を含む。これらの分子は、たとえば、色を発生させるもしくは変化させるまたは電気的特性における変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってもよい。それらは、分子的に興奮性であってもよく、エネルギー状態の間の電子移動が、特徴的なスペクトルの吸収または放射をもたらす。それらは、バイオセンサーと共に使用される化学成分を含んでいてもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ検出系が用いられてもよい。
【０１７２】
個々の結合メンバー−レポーターコンジュゲートによって生成されるシグナルは、試料（正常および試験）における関連する結合メンバーの結合についての、定量化できる絶対的なまたは相対的なデータを誘導するために使用されてもよい。
【０１７３】
本発明の任意の態様または実施形態による結合メンバーを含むキットもまた、提供される。キットでは、結合メンバーは、たとえば下記にさらに記載されるように、試料におけるその反応性が決定されるのを可能にするように標識されてもよい。さらに、結合メンバーは、固体支持体に結合されてもよいまたはされなくてもよい。キットの構成成分は、一般に無菌であり、密閉バイアルまたは他の容器中にある。キットは、結合メンバーが有用である診断分析または他の方法において用いられてもよい。キットは、方法、たとえば本発明に従う方法における構成成分の使用のための説明書を含有していてもよい。そのような方法を支援するまたは実行することを可能にするための補助的な物質が、本発明のキット内に含まれてもよい。補助的な物質は、第１の結合メンバーに結合し、検出可能な標識（たとえば蛍光標識、放射性同位体、または酵素）にコンジュゲートされる第２の異なる結合メンバーを含む。抗体ベースのキットはまた、免疫沈降を導くためにビーズを含んでいてもよい。キットの構成成分はそれぞれ、一般に、それ自体の適した容器中にある。したがって、これらのキットは、一般に、それぞれの結合メンバーに適している別個の容器を含む。さらに、キットは、アッセイを実行するための説明書ならびにアッセイの実行から結果として生じるデータを理解するおよび分析するための方法を含んでいてもよい。
【０１７４】
本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記の結合メンバーの使用、すなわち、競合アッセイにおいて本発明によって提供される結合メンバーを用いることによって、試料中の抗原のレベルを測定するための方法をも提供する。これは、非結合抗原からの結合抗原の物理的分離が必要とされない場合であってもよい。物理的または光学的変化が結合と同時に起こるように、レポーター分子を結合メンバーに連結することが、１つの可能性としてある。レポーター分子は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成してもよく、これは定量化できてもよい。レポーター分子の連結は、直接もしくは間接的、共有結合的、たとえばペプチド結合を介して、または非共有結合的であってもよい。ペプチド結合を介しての連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果としてのものであってもよい。
【０１７５】
様々な態様および実施形態では、本発明は、たとえばＩｇＧ構成の、本明細書において定義される任意の結合メンバー、たとえば抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０のいずれかと、ｈＣＭＶへの結合について競合する結合メンバーに及ぶ。たとえば、結合メンバーの競合は、たとえば、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する結合メンバーの同定を可能にするために、１つもしくは複数の他のタグ付けされていない結合メンバー（複数可）の存在下において検出することができるある結合メンバーに特異的レポーター分子をタグ付けすることによって、インビトロにおいてアッセイされてもよい。競合は、たとえば、ＥＬＩＳＡを使用してまたは表面プラズモン共鳴によって、決定されてもよく、ｈＣＭＶが、固相に固定され、１つまたは複数の他のタグ付けされていないまたは標識されていない結合メンバーと共に第１のタグ付けされたまたは標識された結合メンバーが固相に添加される。タグ付けされた結合メンバーと競合する、タグ付けされていない結合メンバーの存在は、タグ付けされた結合メンバーによって放射されるシグナルにおける減少によって観察される。
【０１７６】
たとえば、本発明は、ｈＣＭＶ結合化合物を同定するための方法であって、（ｉ）支持体にｇＢタンパク質を固定すること、（ｉｉ）当該固定されたｇＢを、少なくとも１つの本発明によるタグ付けされたまたは標識された結合メンバーおよび１つまたは複数のタグ付けされていないまたは標識されていない試験結合化合物と同時にまたは段階的な方法で接触させること、ならびに（ｉｉｉ）タグ付けされた結合メンバー由来の結合したタグの量における減少を観察することによって、新しいｈＣＭＶ結合化合物を同定することを含む方法を含む。そのような方法は、マルチウェルまたはアレイ方式を使用して、ハイスループット方法において実行することができる。そのようなアッセイはまた、溶液中で実行されてもよい。たとえば、その全体が参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ５，８１４，４６８（Sliman et al）を参照されたい。上記に記載されるように、結合の検出は、方法を実行する人によって直接、たとえば、検出可能な標識またはその存在における減少を視覚的に観察することによって判断されてもよい。その代わりに、本発明の結合方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータープリントアウト、フローサイトメトリーレポート、または方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的な表現の形態をしたレポートをもたらしてもよい。
【０１７７】
競合アッセイもまた、エピトープ特徴付けにおいて使用することができる。ある実例では、エピトープ特徴付けは、所望により、最適化された中和および／または調整の特徴を有していてもよいｈＣＭＶ結合メンバーが結合するエピトープを同定するために使用されてもよい。そのようなエピトープは、直線状のものまたは立体構造とすることができる。立体構造エピトープは、ｈＣＭＶの少なくとも２つの異なるドメインを含むことができ、当該ドメインは、ｈＣＭＶタンパク質がフォールドしてその三次または四次構造になり、本明細書において提供されるｈＣＭＶ結合メンバーなどのような、ｈＣＭＶの阻害剤によって認識される立体構造エピトープを形成する場合、互いに近接して位置する。競合についての試験では、抗原のペプチド断片、とりわけ、対象のエピトープを含むまたはそれから成るペプチドが、用いられてもよい。どちらかの末端にエピトープ配列および１つまたは複数のアミノ酸を有するペプチドが、使用されてもよい。本発明による結合メンバーは、抗原に対するそれらの結合が、所与の配列を有するまたは含むペプチドによって阻害されるようなものであってもよい。
【０１７８】
本発明は、本発明の結合メンバーをコードする単離核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでいてもよい。１つとして、本発明は、上記に定義される本発明のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、たとえばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１をコードする核酸を提供する。
【０１７９】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態をしたコンストラクトをも提供する。
【０１８０】
本発明はまた、上記のような１つまたは複数のコンストラクトを含む組換え宿主細胞をも提供する。提供される任意のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、たとえばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１をコードする核酸は、コード核酸からの発現を含む、コード産物の生成のための方法のように、それ自体、本発明の態様を形成する。発現は、適切な条件下で核酸を含有する当該組換え宿主細胞を培養することによって好都合に達成されてもよい。本明細書において開示されるＶＨまたはＶＬドメインを含む結合メンバーを発現することによる生成に続いて、結合メンバーは、当技術分野において知られており、適切であると見なされる任意の適した技術を使用して単離されてもよいおよび／または精製されてもよい。
【０１８１】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、全体的にまたは部分的に合成であってもよい。本明細書において説明されるヌクレオチド配列に対する参照は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、指定される配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴがＵに置換された、指定される配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１８２】
さらなる態様は、本発明のＶＨおよび／またはＶＬ可変ドメインを含む結合メンバーの生成のための方法であって、コード核酸から発現を引き起こすことを含む方法を提供する。そのような方法は、当該抗体ＶＨおよび／またはＶＬ可変ドメインの生成のための条件下で組換え宿主細胞を培養することを含んでいてもよい。
【０１８３】
生成のための方法は、産物の単離および／または精製の工程を含んでいてもよい。生成のための方法は、薬学的に活性な賦形剤などのような、少なくとも１つのさらなる構成成分を含む組成物に産物を処方することを含んでいてもよい。
【０１８４】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。適した宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母、および昆虫細胞ならびにトランスジェニック植物および動物を含む。原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当技術分野において十分に確立されている。概説については、たとえばPluckthun (1991)を参照されたい。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０１８５】
培養における真核細胞における発現もまた、結合メンバーの生成のための選択肢として当業者らに利用可能である（Chadd & Chamow, 2001; Andersen & Krummen, 2002; Larrick & Thomas, 2001）。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、ＹＢ２／０ラットミエローマ細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト胎児網膜細胞、および多くの他のものを含む。
【０１８６】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む適切な調節配列を含有する適したベクターを選ぶまたは構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ファージミド、またはウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクターであってもよい（Sambrook & Russell, 2001）。たとえば核酸コンストラクトの調製における核酸の操作、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析のための多くの既知の技術およびプロトコールは、Ausubel et al., (1999)において詳細に記載されている。
【０１８７】
本発明のさらなる態様は、本明細書において開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、インビトロで維持されてもよく、組織培養において増やされてもよい。そのような宿主細胞はまた、たとえば、腹水において結合メンバーを生成するために、インビボで維持されてもよい。宿主細胞のインビボでの存在は、「イントラボディ」または細胞内抗体としての、本発明の結合メンバーの細胞内発現を可能にしてもよい。イントラボディは、遺伝子療法のために使用されてもよい。
【０１８８】
さらなる態様は、宿主細胞の中に本発明の核酸を導入することを含む方法を提供する。その導入は、任意の利用可能な技術を用いてもよい。真核細胞については、適した技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルスまたは昆虫細胞についてはバキュロウイルスまたはその任意の組合せを使用する、リポソーム媒介性のトランスフェクションおよび形質導入を含む。宿主細胞、特に真核細胞への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミドベースの系を使用してもよい。プラスミド系は、エピゾームで維持されてもよいまたは宿主細胞ゲノムまたは人工染色体の中に組み込まれてもよい。組み込みは、単一の座または複数の座での、１つまたは複数のコピーのランダムまたは標的統合によるものであってもよい。細菌細胞については、適した技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含んでいてもよい。
【０１８９】
導入に続いて、核酸からの発現を引き起こしてもよいまたは可能にしてもよい、たとえば、結合メンバーの発現のための条件下で宿主細胞を培養してもよい。発現産物の精製は、当業者に既知の方法によって達成されてもよい。
【０１９０】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）の中に組み込まれてもよい。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含によって促進されてもよい。
【０１９１】
本発明はまた、上記のような結合メンバーまたはポリペプチドを発現するために、発現系において、上記に述べられるコンストラクトを使用することを含む方法を提供する。
【０１９２】
本明細書において他のところで議論されるように、様々な障害におけるｈＣＭＶ感染の関与についての証拠がある。そのため、本発明の結合メンバーは、ｈＣＭＶ感染と関連する診断または障害の治療のための方法において使用されてもよい。そのような障害は、異型移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体などのような免疫不全患者に影響し得、たとえば、熱、肝炎、網膜炎、肺炎、骨髄抑制、脳障害、多発神経根症、免疫抑制、拒絶／移植片対宿主疾患、またはアテローム性動脈硬化症を含んでいてもよい。本発明の結合メンバーはまた、新生児において子宮内感染を治療するために使用されてもよい。しばしば、新生児は、上記に列挙される障害の徴候または症状を伴わないで生まれるが、治療がなければ、ＣＮＳ機能不全および機能障害、たとえば、これらに限定されないが、聴力損失、視力喪失、および／または精神遅滞の進行性の症状を発症し得る。
【０１９３】
したがって、本発明は、ｈＣＭＶ感染に関連する障害を治療するための方法であって、その必要性のある患者に、有効量の本発明の１つまたは複数の結合メンバーを、単独でまたは当技術分野において既知のもしくは本明細書において記載される他の適切な医薬との併用治療レジメンにおいて投与することを含む方法を提供する。
【０１９４】
ある種の障害におけるｈＣＭＶ感染の関与を立証する証拠は、本明細書において他のところで要約される。さらに、本明細書において示されるデータは、本発明の結合メンバーが、予防の治療および障害の重症度の低下を含めて、そのような障害を治療するために使用することができることをさらに示す。したがって、本発明は、本明細書において言及される障害のいずれかの少なくとも１つの症状を治療するまたはその重症度を低下させるための方法であって、その必要性のある患者に、有効量の本発明の１つまたは複数の結合メンバーを、単独でまたは当技術分野において既知のもしくは本明細書において記載される他の適切な医薬との併用治療レジメンにおいて、上記の障害のいずれかの少なくとも１つの症状の重症度が低下するように投与することを含む方法を提供する。
【０１９５】
したがって、本発明の結合メンバーは、とりわけ患者における高いウイルス量から結果として生じるｈＣＭＶ感染および／または活性を伴う疾患または障害の治療における治療剤として有用である。治療の方法は、その必要性のある患者に、有効量の本発明の結合メンバーを投与することを含んでいてもよく、ｈＣＭＶの異常な感染および／または活性は、減少する。治療のための方法は、（ｉ）たとえば、上記に記載される診断方法を使用して、ｈＣＭＶ感染レベルまたは活性を示す患者を同定することおよび（ｉｉ）患者に、有効量の本発明の結合メンバーを投与することを含んでいてもよく、ｈＣＭＶの発現および／または活性は、減少する。本発明による有効量は、治療されているｈＣＭＶ感染または特定の疾患の少なくとも１つの症状または障害の重症度を減少させるまたは和らげるように、ｈＣＭＶの発現および／または活性を減少させるが、必ずしも疾患または障害を治癒するものではない量である。
【０１９６】
本発明はまた、ｈＣＭＶ感染の少なくとも１つの影響にアンタゴナイズする方法であって、ｈＣＭＶ感染の当該少なくとも１つの影響がアンタゴナイズされるように、有効量の本発明の１つまたは複数の結合メンバーと接触させるまたはそれを投与することを含む方法をも提供する。したがって、本発明のさらなる態様は、提供される結合メンバーの投与のことを含む、治療のための方法、そのような結合メンバーを含む医薬組成物、および投与のための医薬の生産における、たとえば薬学的に活性な賦形剤と共に結合メンバーを製剤することを含む、医薬または医薬組成物を作製する方法におけるそのような結合メンバーの使用を提供する。薬学的に活性な賦形剤は、二次反応を引き起こさず、かつ、たとえば、活性化合物（複数可）の投与の促進、体内におけるその寿命および／もしくはその効能における増加、溶液中でのその溶解性における増加、または他の場合にはその保存における改善を可能にする、医薬組成物に加えられる化合物または化合物の組合せであってもよい。これらの薬学的に許容される媒体は、よく知られており、選ばれる活性化合物（複数可）の性質および投与のモードに応じて当業者によって適合されるであろう。
【０１９７】
本発明の結合メンバーは、通常、結合メンバーに加えて少なくとも１つの構成成分を含んでいてもよい医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明に従う使用のための本発明による医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に活性な賦形剤、キャリア、バッファー、安定剤、または当業者らによく既知の他の物質を含んでいてもよい。そのような物質は、無毒性であるべきであり、活性成分の効能に干渉するべきではない。キャリアまたは他の物質の厳密な性質は、下記に議論されるように、経口、気管内、吸入、局所的、膀胱内、または注射によるものであってもよい、投与のルートに依存するであろう。
【０１９８】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、液体、または半固体の形態をしていてもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどのような固体のキャリアを含んでいてもよい。液体の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油、または合成油などのような液体のキャリアを含む。生理的食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのようなグリコールもまた、含まれていてもよい。
【０１９９】
静脈内注射または罹患の部位での注射については、活性成分は、発熱物質がなく、適したｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態をしているであろう。当業者ら、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液などのような等張性の媒体を使用して、適した溶液を十分に調製することができる。
【０２００】
リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどのような酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのようなアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンなどのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのようなアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどのような糖；ナトリウムなどのような塩形成対イオン；金属複合物（たとえばＺｎタンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような非イオン性界面活性剤を含む保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて用いられてもよい。
【０２０１】
本発明の結合メンバーは、分子の物理化学的特性およびデリバリーのルートに依存して、液体、半固体、または固体形態で処方されてもよい。処方は、賦形剤または賦形剤の組合せ、たとえば、糖、アミノ酸、および界面活性剤を含んでいてもよい。液体製剤は、広範囲の抗体濃度およびｐＨを含んでいてもよい。たとえば、固体処方は、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥によって生成されてもよい。結合メンバーの製剤は、デリバリーの意図されるルートに依存するであろう。結合メンバーは、植込錠、経皮的パッチ、およびマイクロカプセル化デリバリー系を含む制御放出製剤などのように、急速な放出から結合メンバーを保護するであろうキャリアと共に調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などのような生物分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような処方の調製のための多くの方法が、当業者らに知られている（Robinson, 1978）。
【０２０２】
治療は、経口的にまたは注射によって（つまり関節内に、皮下に、腹腔内に、静脈内に、動脈内、もしくは筋肉内に）、吸入、気管内によって、膀胱内ルート（膀胱への点滴注入）によって、または局所的に（たとえば、眼内、鼻腔内、直腸、皮膚上の創傷の中に）与えられてもよい。治療は、パルス注入によって投与されてもよく、特に結合メンバーの用量の減少を伴う。投与のルートは、治療の物理化学的な特徴によって、疾患についての特有の問題によって、または効能を最適化するもしくは副作用を最小限にするための必要条件によって、決定することができる。投与の１つの特定のルートは、静脈内である。本発明の医薬組成物を投与するための他のルートは、皮下である。治療が診療所における使用に制限されないであろうということが意図される。そのため、無針デバイスを使用する皮下注射もまた、有利である。
【０２０３】
組成物は、治療されることとなる条件に依存して、同時にまたは連続的に、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。
【０２０４】
本発明の結合メンバーは、さらなる医薬成分と共に併用療法の一部として使用されてもよい。併用治療、特に、本発明の結合メンバーの、本明細書において開示される抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−５０などのような１つもしくは複数の他の抗体または以下の刊行物において記載されるｈＣＭＶ抗体のいずれか：ＵＳ５，０４３，２８１（Mashuho et al）、ＵＳ５，７５０，１０６（Ostberg）、ＷＯ９３／０２１９５２  Ａ１（Borrebaeck et al）、ＷＯ０８／０８４４１０  Ａ２、ＷＯ１０／００７４６３  Ａ１、およびＷＯ１０／００７５３３  Ａ２（Lanzavecchia & Macagno）、ＷＯ０８／０７１８０６  Ａ１、ＷＯ０９／００３９７５  Ａ１およびＷＯ０９／０２４４４５  Ａ１（Funaro et al）、ＷＯ０９／１１４５６０  Ａ２（Olsen）、ＷＯ１０／１１４１０５  Ａ１およびＷＯ１０／１１４１０６  Ａ１（Takada et al）または任意の他の薬剤との組合せは、有意な相乗的効果をもたらすように使用されてもよい。本発明の結合メンバーは、本明細書において列挙される１つまたは複数の状態の治療のために、同時にもしくは連続的にまたは他の治療剤（複数可）と組み合わせられた調製物として投与されてもよい。
【０２０５】
本発明の結合メンバーは、化学療法増感剤として使用されてもよく、それは、それによって抗ウイルス剤の治療上の効能を増加させることができ、したがって、同時にまたは連続的に、１つまたは複数の抗ウイルス剤と組み合わせた投与のために提供されてもよい。
【０２０６】
本発明による結合メンバーは、１つまたは複数の以下の抗ウイルス剤、たとえばアシクロビル、ファムシクロビル、バルガンシクロビル、ガンシクロビル、シドホビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、ザナマビル、および／またはオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍａｖｉｒ）と組み合わせてまたはそれに加えて提供されてもよい。
【０２０７】
本発明の結合メンバーおよび１つまたは複数の上記のさらなる医薬成分は、医薬の生産において使用されてもよい。医薬は、個体への別々のまたは組合せの投与のためのものであってもよく、したがって、組み合わせられた調製物としてまたは別々の調製物として結合メンバーおよびさらなる構成成分を含んでいてもよい。別々の調製物は、別々の連続的なまたは同時の投与を促進するために使用されてもよく、異なるルート、たとえば経口および非経口投与による構成成分の投与を可能にしてもよい。
【０２０８】
本発明に従って、提供される組成物は、哺乳動物に投与されてもよい。投与は、通常、「治療有効量」であり、これは、患者に対して利点を示すのに十分である。そのような利点は、少なくとも１つの症状の少なくとも回復であってもよい。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、治療されているものの性質および重症度、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物のデリバリーの部位、結合メンバーのタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング、ならびに医師らに既知の他の因子に依存するであろう。治療の指示、たとえば投薬などに関する決定は、一般医および他の医師の責任の範囲内にあり、治療されている疾患の症状の重症度および／または進行に依存してもよい。抗体の適切な用量は、当技術分野においてよく知られている（Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991）。投与される医薬のタイプに適切なように、本明細書においてまたはPhysician's Desk Reference (2009)において示される特定の投薬が使用されてもよい。本発明の結合メンバーの治療有効量または適した用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することによって決定することができる。ヒトへのマウスおよび他の試験動物における有効投薬量の外挿のための方法が、知られている。厳密な用量は、抗体が、診断、予防のためのものかまたは治療のためのものかどうか、治療されることとなるエリアのサイズおよび位置、抗体の厳密な性質（たとえば抗体全体または断片）、ならびに抗体に付加される任意の検出可能な標識または他の分子の性質を含む多くの因子に依存するであろう。典型的な抗体用量は、全身適用については１００μｇ〜１ｇ、局所適用については１μｇ〜１ｍｇの範囲にあるであろう。最初のより高い負荷投与量、その後に続く１回または複数回のより低度の用量が、投与されてもよい。典型的に、抗体は、抗体全体、たとえばＩｇＧ１アイソタイプとなるであろう。これは、成人患者の１回の治療のための用量であり、これは、子供、幼児、および新生児について比例して調節されてもよく、また、分子量に比例して他の抗体の構成について調節されてもよい。治療は、医師の判断で、毎日、週２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返されてもよい。治療は、皮下投与については２〜４週間ごと、静脈内投与については４〜８週間ごとであってもよい。治療は、定期的であってもよく、投与の間の期間は、約２週間以上、たとえば約３週間以上、約４週間以上、または月に一度であってもよい。治療は、移植外科手術の前および／もしくは後に提供されてもよいならびに／または外科治療の解剖の部位に直接投与されてもよいもしくは適用されてもよい。
【０２０９】
本発明のｈＣＭＶ結合メンバーは、上記に議論されるように、当技術分野において以前に開示されたｈＣＭＶに対する抗体と比較して、投薬および投与の必要量の点から利点を提供してもよい。たとえば、抗ｈＣＭＶ治療薬の用量がより低度である場合、低用量が皮下注射および静脈内注射を促進するという点で、有意な利点があり得る。皮下投薬が、用量当たりに必要とされる結合メンバー、たとえば抗体分子の量によって制限され得ることは、当業者らによく知られている。これは、皮膚における１つの部位に注射することができる容量によって制限される皮下注射のためである。１．２ｍｌ以下の皮下注射容量が、典型的に利用される。５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度での皮下注射のための結合メンバーを製剤することが、ますます難しいものとなり得るので、このルートを介しての１００ｍｇを上回る用量は、通常、複数回の注射を必要とし、患者をより不快にする。したがって、たとえばより強力なｈＣＭＶ結合メンバーのより低度な用量は、それが投与のルートを広げるので有利である。
【実施例】
【０２１０】
実施例１：  ｈＣＭＶ特異的記憶Ｂ細胞のＦＡＣＳソーティングおよびＩｇＧ陽性記憶Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換
ドナーのインフォームドコンセントを得た後に、末梢血（３００ｍｌ）を健康なｈＣＭＶ血清陽性血液ドナーから収集し、この血清を、高いｇＢ結合力価および効率的なｈＣＭＶ中和活性についてあらかじめスクリーニングした。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｆｌｏｔ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。抗ヒトＣＤ２２マイクロビーズ（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢ細胞濃縮後に、Ｂ細胞を以下の試薬を用いて標識した：ａ．抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ｂ．抗ヒトＣＤ２７−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ｃ．抗ヒトＩｇＧ−ｂｉｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）；ｄ．ストレプトアビジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）、およびｅ．Ｃｙ５標識糖タンパク質Ｂ（１×１０６  Ｂ細胞当たり１００ｎｇ）。ｇＢ特異的ＩｇＧ陽性記憶Ｂ細胞は、以下の４つの基準を満たした細胞をソートすることによって単離した：ＦＩＴＣ＋／ＰＥ＋／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０＋およびＣｙ５＋（図２を参照されたい）。その代わりに、Ｂ細胞を以下の試薬を用いて標識した：ａ．抗ヒトＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ｂ．抗ヒトＣＤ２７−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ｃ．抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ｄ．Ｃｙ５標識糖タンパク質Ｂ（１×１０６  Ｂ細胞当たり１００ｎｇ）。これらのｇＢ特異的ＩｇＧ陽性記憶Ｂ細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ）を使用して分析したまたは基準ＰｅｒＣＰ＋／ＰＥ＋／ＦＩＴＣ＋およびＣｙ５＋を満たした細胞をソートすることによって単離した。
【０２１１】
細胞は、ＭｏＦｌｏ（商標）セルソーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、照射フィーダー細胞（ヒト包皮線維芽細胞、ＨＦＦ）のコンフルエントな層を含有する９６ウェル平底マイクロプレートにおいて、５または１０細胞／ウェルの濃度でソートした。ソートした細胞は、先に記載されるように、ＥＢＶ含有細胞培養上清（ＥＢＶ産生細胞系Ｂ９５−８の３０％上清）およびＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６（２，５μｇ／ｍｌ）の存在下において、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、および１０％ウシ胎児血清（熱失活）（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地において成長させた（Rosen et al., 1977; Steinitz et al., 1977; Bernasconi et al., 2002; Jung et al., 2002; Traggiai et al., 2004）。３週間後に、作成した細胞系由来の培養上清は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ｇＢ特異性についてスクリーニングした。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）は、４℃で１６時間、炭酸バッファー、ｐＨ９．６中０．５μｇ／ｍｌ糖タンパク質Ｂを用いてコートした。ｇＢコートプレートは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー）を補足したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて６回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎおよび２％ウシ胎児血清（ＥＬＩＳＡバッファー）を補足したＰＢＳを用いて２時間ブロックした。ウェル当たり５０μｌの培養上清を室温で１時間、インキュベートし、もう１回の洗浄工程後に、結合した抗体は、ペルオキシダーゼとつながれたＦｃγ断片特異的二次抗体を使用して明らかにした（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）。１時間のインキュベーション期間後に、非結合二次抗体は、洗浄によって除去し、酵素活性は、０．０５Ｍリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、０．０５％  Ｈ２Ｏ２中０．０４ｍｇ／ｍｌの濃度で、５０μｌ／ウェル  ｏ−フェニルジアミンを使用して、決定した。室温での１０分間のインキュベーション後に、反応は、５０μｌ／ウェル  ２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させ、光学濃度（ＯＤ）は、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標）１９０  ＥＬＩＳＡ光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４９２ｎｍで測定した。ソフトウェアＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を分析のために使用した。
【０２１２】
実施例２：  インビトロｈＣＭＶ中和アッセイ
ｇＢ特異的培養上清は、ｈＣＭＶゲノム中にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現カセットを含有し、標的細胞の感染に際してルシフェラーゼ酵素の発現をもたらすｈＣＭＶ組換え株ＡＤ１６９（ＨＢ１５−ＵＬ８４ｐｒｌｕｃ）を使用して、中和活性についてスクリーニングした（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｔａｍｍｉｎｇｅｒ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙにより親切にも提供された）。ウイルス上清における感染力価は、Mahy & Kangro (1996)において記載されるように、９６ウェルプレート上で一次線維芽細胞（ＨＦＦまたはＭＲＣ−５細胞のいずれか）においてＴＣＩＤ５０アッセイによって決定した。ルシフェラーゼベースの中和アッセイについて、等容量のｇＢ特異的培養上清および力価ＡＤ１６９△Ｌｕｃ上清（３００ｐｆｕ）を、９６Ｕ底マイクロプレートにおいて１時間、３７℃でインキュベートした。抗体ウイルス混合物を、先に接種したＨＦＦ単層上に移した。４時間の３７℃でのさらなるインキュベーション後に、抗体ウイルス混合物を完全培地と交換した。３７℃でのさらに４２時間のインキュベーションに続いて、細胞をウェル当たり１００μｌ  Ｇｌｏ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて溶解させた。３０μｌのそれぞれの溶解ウェルを、白色９６ウェルＬＩＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の中に配置した。ウェル当たり、５０μＬアッセイバッファー（１５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭグリシルグリシン、１Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．５Ｍ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加した。ウェル当たり５０μＬのＤ−ルシフェリン（Ｐ．Ｊ．Ｋ．、Ｋｌｅｉｎｂｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液（２５ｍＭグリシルグリシン、１Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．５Ｍ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンにおいて）の注入および化学発光の検出は、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実行した。ＭｉｃｒｏＷｉｎ２０００ソフトウェア（Ｍｉｋｒｏｔｅｋ  Ｌａｂｏｒｓｙｓｔｅｍｅ、Ｏｖｅｒａｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を分析のために使用した。ルミノメーターによって測定した相対的な光単位（ＲＬＵ）は、以下の計算を使用して、中和パーセントで表した。
中和％＝１００×（Ｖ０−Ｖｎ）／Ｖ０
式中、Ｖｎは、ウイルスおよび抗体を含有するウェルにおけるＲＬＵを示し、Ｖ０は、ウイルスのみを含有したウェルにおけるＲＬＵを示す。第１のスクリーニングは、ｈＣＭＶ感染性を中和した９つのｇＢ特異的培養上清を明らかにし、第２のスクリーニングは、ｈＣＭＶ感染性を中和した３つのさらなるｇＢ特異的培養上清を明らかにした。９つのＥＢＶ不死化記憶Ｂ細胞系およびそれらによって生成された中和抗体は、ＳＭ１、ＳＭ３、ＳＭ４、ＳＭ５、ＳＭ６、ＳＭ７、ＳＭ９、ＳＭ１０、およびＳＭ１１と命名した（下記表１を参照されたい）。３つのさらなるＥＢＶ不死化記憶Ｂ細胞系およびそれらによって生成された中和抗体は、ＳＭ１２、２Ｃ２、および１Ｇ２と命名した（下記表１を参照されたい）。
【０２１３】
５０％中和タイター（ＩＣ５０）は、ｈＣＭＶ感染の５０％の低下をもたらす抗体の濃度として示す。同様に、９０％中和タイター（ＩＣ９０）は、ｈＣＭＶ感染の９０％の低下をもたらす抗体の濃度として示す。抗体の中和活性を計算するために、培養上清のＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートは、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を用いてコートした。ＥＬＩＳＡバッファー中のＳＭ抗体培養上清の２倍段階希釈溶液を、既知濃度のポリクローナルＩｇＧ標準物質と比較した（１１．１ｍｇ／ｍｌストック濃度；カタログ番号：００９−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）。試料のＩｇＧ濃度は、ＥＬＩＳＡソフトウェアＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して計算した。ＥＢＶ系細胞培養上清のＩｇＧ濃度に関連する中和活性を、下記表１中に示す。
【０２１４】
【表１】
2013515469.tif 000002
【０２１５】
ＥＢＶ系上清のＩｇＧ濃度を決定し、６つの細胞系上清についてさらなる中和アッセイを実行した；これらの上清は、０．５〜２．３μｇ／ｍｌの間のＩＣ５０値を示した（表２；下記を参照されたい）。中和アッセイは、完全培地中の抗体上清の２倍段階希釈溶液をウイルスの添加前に三通り調製したという変更を伴って、上記の段落において記載されるように実行した。
【０２１６】
【表２】
2013515469.tif 000003
【０２１７】
中和抗体を生成するＥＢＶ不死化記憶Ｂ細胞系は、さらなる処理のために必要とされるまで、ペレットにし、−８０℃で凍結させた。
【０２１８】
実施例３：  抗ｈＣＭＶ  ＥＢＶ細胞系由来の抗体可変領域のクローニング
実施例３．１〜３．４において、９つのＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系由来の抗ｈＣＭＶ中和抗体（ＳＭ１、３〜７、９〜１１）の可変領域は、セミネステッドＰＣＲ（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）によって増幅し、適切な免疫グロブリン定常領域を含有するｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングした。これらのコンストラクトは、続いて、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために使用し、発現させた抗体は、第１のスクリーニングのために、懸濁アレイ技術および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（実施例５）および中和アッセイ（実施例４）を使用して試験した。実施例３．５〜３．７において、４つのＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系由来の抗ｈＣＭＶ中和抗体（ＳＭ１０、ＳＭ１２、２Ｃ２、および１Ｇ２）の可変領域は、ネステッドＰＣＲによって増幅し、Tiller et al., 2008において記載される方法に従って適切な免疫グロブリン定常領域を含有する発現ベクターにおいてクローニングした。これらのコンストラクトは、続いて、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするために使用し、発現させた抗体は、最初のスクリーニングの一部として中和アッセイ（実施例４）において試験した。
【０２１９】
用語「可変領域」は、重鎖についてのＶＤＪ再構成遺伝子および軽鎖についてのＶＪ再構成遺伝子を意味する。
【０２２０】
３．１  ＲＮＡ精製および第１鎖ｃＤＮＡ合成
ＥＢＶ形質転換記憶Ｂ細胞系ＳＭ１、３〜７、および９〜１１の凍結細胞ペレットを、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に全ＲＮＡ精製に付した。細胞ペレットは、−８０℃のフリーザーから取り出し、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）を用いて直ちに溶解させた。室温での５分間のインキュベーション後に、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）当たり０．２ｍｌのクロロホルム（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、チューブを、１分間、穏やかに混合した。溶解物は、氷上で３分間インキュベートし、４℃で１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。水性の上部の相を新鮮なチューブに移し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）当たり０．５ｍｌのイソプロパノール（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。室温での１０分間のインキュベーション後に、チューブを４℃で１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は、廃棄し、ＲＮＡペレットは、１ｍｌの７０％エタノール（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて洗浄した。ペレットは、室温で１０〜１５分間、空気乾燥させ、３０〜５０μｌのＲＮアーゼなしの再蒸留水（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって、また、５５℃での１０分間のインキュベーションによって、溶解させた。ＲＮＡ濃度は、ＵＶ分光測光法によって測定し、ＲＮＡ試料は、−８０℃で保存した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、製品のマニュアルに従って、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行した。
【０２２１】
３．２  セミネステッドＰＣＲ
ヒト抗体の可変コード領域をセミネステッドＰＣＲによって増幅した。セミネステッドＰＣＲは、両方とも同じプログラム（ＴＤＮＰＣＲ１；下記の表４ａ）を用い、異なる５’フォワードプライマーおよび同じ３’リバースプライマーミックス（下記表５；ともにすべてＪ−セグメントプライマー）を用い、２つの連続ＰＣＲ（ＰＣＲパラメーターは下記表３に示す）を動かすことによって実行した。第１のＰＣＲのための鋳型として、１μｌｃＤＮＡを使用した。第２のＰＣＲについては、第１のＰＣＲ由来の１μｌのＰＣＲ産物を使用した（希釈せずまたは第１のＰＣＲ後のＤＮＡ収率に依存して１：１０〜１：１００に希釈）。すべてのＥＢＶ系のｃＤＮＡを、すべてのＶＨ、Ｖκ、およびＶλプライマーの組合せを使用して増幅した。異なる５つのフォワードプライマーを、カッパ軽鎖可変領域を増幅するために、５つのリバースプライマーと組み合わせて使用した（表５ａ）。異なる３つのフォワードプライマーを、ラムダ軽鎖可変領域を増幅するために、４つの異なるリバースプライマーと組み合わせて使用した（表５ｂ）。異なる６つのフォワードプライマーを、重鎖可変領域を増幅するために、４つの異なるリバースプライマーと組み合わせて使用した（表５ｃ）。
【０２２２】
すべてのＥＢＶ系において、１つを超える重鎖可変領域および１つを超える軽鎖可変領域を増幅した。増幅した可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（重鎖およびカッパ軽鎖）を用いてまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩ（ラムダ軽鎖）を用いて消化し、実施例３．４において記載されるように、ヒトγ１、κ、またはλについて一致する一定のコード領域を既に含有するｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にクローニングした。
【０２２３】
推定される長さの結果として生じるＰＣＲ産物は、ＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に平滑末端でライゲーションし、配列分析後に、可変領域は、実施例３．４において記載されるようにｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にさらにサブクローニングした。
【０２２４】
しかしながら、増幅したλ軽鎖可変領域の収率をさらに増加させるために、ＰＣＲ条件をさらに最適化した（ＰＣＲプログラムＦＷＵＷＰＣＲ、下記表４ｂを参照されたい）。
【０２２５】
【表３】
2013515469.tif 000004
【０２２６】
【表４】
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【０２２７】
【表５−１】
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【０２２８】
【表５−２】
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【０２２９】
【表５−３】
2013515469.tif 000008
【０２３０】
３．３  ベクター骨格調製物
増幅した可変領域は、適切な免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域を含有するｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にクローニングした。重鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトｐｄ１６１２−Ｊｅ（ｐＣＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−Ｃγ）は、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩを用いて消化し（６５０５ｂｐおよび７２７ｂｐの２本のバンドを生成する）、ＣＩＰを用いて脱リン酸し、６５０５ｂｐ断片をゲル精製した。ラムダ軽鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトｐｄ１８６４−Ｊｅ（ｐＣＤＮＡ３−２−４  Ｖλ２−ＡｖｒＩＩ（−）は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて消化し（５８５８ｂｐおよび３９４ｂｐの２本のバンドを生成する）、ＣＩＰを用いて脱リン酸し、５８５８ｂｐ断片をゲル精製した。カッパ軽鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトｐｄ７０３−Ｊｅ（ｐＣＤＮＡ３−ＩＴＣ８８  Ｖκ）は、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩを用いて消化し（６０５０ｂｐおよび３９２ｂｐの２本のバンドを生成する）、ＣＩＰを用いて脱リン酸し、６０５０ｂｐのバンドをゲル精製した。
【０２３１】
３．４  挿入調製物
増幅した抗体可変領域のＰＣＲ産物は、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（重鎖およびカッパ軽鎖可変領域）またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩ（ラムダ軽鎖可変領域）を用いて消化し、次いで、酵素メーカーによって推奨されるようにＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、適切な免疫グロブリン定常領域を含有するｐＣＤＮＡ３ベクターの中にインフレームでライゲーションした。ＤＮＡライゲーションは、１６℃で一晩実行した。この方法に対する例外として、抗体可変領域、ＳＭ１  Ｖλ１、ＳＭ４  Ｖλ１、およびＳＭ９  Ｖλ２のＰＣＲ産物は、最初に、平滑末端ライゲーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のユーザーマニュアルに従ってＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に平滑末端でライゲーションした。様々なミニプレップの配列を分析した後に、真のＶλ配列を含有する特有のクローンを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて消化し、可変領域をゲル精製し、適切なｐＣＤＮＡ３ベクターの中にサブクローニングした（ｐｄ  １８６４−Ｊｅ；下記を参照されたい）。１μｌのそれぞれのライゲーションをＤＨ１０Ｂ細胞の中にエレクトロポレーションした（１９００Ｖ／５ミリ秒）。次いで、２００μｌのエレクトロポレーションした細菌を、ＬＢ寒天＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上で平板培養した。それぞれのコンストラクトから、約１０のコロニーを採集し、一晩成長させ、ミニプレップを実行した（それぞれのコロニーはまた、ＬＢ寒天＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上に画線した）。陽性クローンを同定するための対照の消化は、重鎖またはカッパ軽鎖を有するコンストラクトについてはＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（Ｈ／Ｅ）を用い、ラムダ軽鎖を有するコンストラクトについてはＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩ（Ｈ／Ａ）を用いて実行した。陽性クローンは、プライマー１７９−Ｊｅ（配列：５’  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＴＧ  ３’；配列番号１９６）を用いてＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２３２】
上記されるように、少数の可変領域は、最初にｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター骨格の中にクローニングした。配列分析後に、陽性クローンは、上記に記載されるようにｐＣＤＮＡ３ベクターの中にサブクローニングした。挿入調製物については、Ｐｄ１８８７−Ｊｅ（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＳＭ９  Ｖλ１＿ＪＬ７  ＃２）およびｐｄ１８８８−Ｊｅ（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＳＭ１  Ｖｌ１＿Ｊｌ７  ＃４）は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて消化した。可変領域（３９４ｂｐ）は、ゲル精製し、ｐＣＤＮＡ３の中にライゲーションした。１μｌのそれぞれのライゲーションをＤＨ１０Ｂ細胞の中にエレクトロポレーションした（１９００Ｖ／５ミリ秒）。２５０μｌのエレクトロポレーションした細菌を、ＬＢ寒天＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上で平板培養した。それぞれのライゲーション由来の５つのコロニーを採集し、ミニプレップを実行し、ＤＮＡは、陽性クローンを同定するためにＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて消化した。
【０２３３】
ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞からクローニングした抗体重鎖（ＨＣ）可変領域および軽鎖（ＬＣ）可変領域の数の概要を、下記表６において示す。４６の中和抗体（最終欄）は、１８の特有の重鎖および１８の特有のラムダ軽鎖の異なる組合せの結果である。
【０２３４】
【表６】
2013515469.tif 000009
カッパ軽鎖との重鎖の組合せのどれも、ｈＣＭＶ中和抗体をもたらさなかった。重鎖はすべて（ＶＨ１ファミリー；リーダー配列を含む１５１のアミノ酸）、１つのＶ生殖系列遺伝子：ＩＧＨＶ１−１に由来する。ラムダ軽鎖はすべて（Ｖλ１ファミリー；リーダー配列を含む１２８のアミノ酸）、１つのＶ生殖系列遺伝子：ＩＧＶλ１５１に由来する。ｈＣＭＶ中和抗体のこれらの可変領域は、表６において太字で示す。他のＶ生殖系列遺伝子に由来する重鎖および軽鎖もまた、回収されたが、中和抗体の生成をもたらさなかった。中和抗体をもたらす、すべての重鎖およびラムダ軽鎖の組合せの大要を、下記表７において示す。１４９〜１５０頁の表１９は、下記表７において示される中和抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲについて、添付の配列表の配列番号を要約する。
【０２３５】
【表７】
2013515469.tif 000010
【０２３６】
３．５  ＲＮＡ精製および第１鎖ｃＤＮＡ合成
ＥＢＶ形質転換記憶Ｂ細胞系ＳＭ１０、ＳＭ１２、２Ｃ２、１Ｇ２由来の凍結細胞ペレットのＲＮＡ精製は、メーカーのマニュアルに従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した。ｃＤＮＡ合成は、メーカーの説明書に従ってＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実行した。
【０２３７】
３．６  ネステッドＰＣＲ
上記の実施例３．５において合成したｃＤＮＡから、ヒト抗体の可変コード領域を、鋳型として１〜２μｌのｃＤＮＡから開始し、２つの連続ＰＣＲ（ＰＣＲパラメーターは下記表８において示す）を実行することによってネステッドＰＣＲによって増幅した。両方のＰＣＲ反応は、同じプログラム（表９）を用い、異なる５’フォワードプライマーおよび３’リバースプライマー（表１０）を用いて実行した。鋳型として、第１のＰＣＲラウンドについては、５０ｎｇの鋳型ｃＤＮＡを使用し、第２のＰＣＲラウンドについては、第１のＰＣＲラウンド由来の１〜２μｌのＰＣＲ産物（ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製）を使用した。すべてのＥＢＶ系のｃＤＮＡは、表１０ａにおいて示される、第１のＰＣＲラウンドについてのＶＨ、Ｖκ、およびＶλプライマーの組合せならびに表１０ｂにおいて示される、第２のＰＣＲラウンドについてのＶＨ、Ｖκ、およびＶλプライマーの組合せを使用して増幅した。ＰＣＲの第２ラウンドについては、「最良適合」プライマーを、ＰＣＲの第１のラウンドから得られた配列について選択した（表２、Tiller et al.、同書）。
【０２３８】
【表８】
2013515469.tif 000011
【０２３９】
【表９】
2013515469.tif 000012
【０２４０】
【表１０−１】
2013515469.tif 000013
【０２４１】
【表１０−２】
2013515469.tif 000014
【０２４２】
３．７  発現ベクタークローニング
クローニング前に、一定分量のＶＨ、Ｖκ、およびＶλ鎖第２ＰＣＲ産物を、メーカーの説明書に従ってＱＵＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、それぞれフォワードまたはリバースプライマーを用いて配列決定した（表１０）。配列は、最も高い同一性を有する生殖系列Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントを同定するために、ＩｇＢＬＡＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって分析した。
【０２４３】
ＥＢＶ系由来の増幅した可変領域は、ＡｇｅＩ／Ｓａｌｌ（γ１重鎖）、ＡｇｅＩ／ＢｓｉＷＩ（κ軽鎖）、またはＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ（λ軽鎖）を用いて消化し、ヒトＩｇγ１、Ｉｇκ、またはＩｇλ定常領域の上流にマウスＩｇ遺伝子シグナルペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４０７６１０）およびマルチクローニングサイトを含有する、ヒトＩｇγ１、Ｉｇκ、およびＩｇλ発現ベクターの中にクローニングした。転写を駆動するためのヒトＣＭＶプロモーターおよび選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子もまた、発現ベクター中に存在する。ライゲーションは、１Ｕ  Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７．５μｌの消化精製ＰＣＲ産物、および２５ｎｇ直線化ベクターを有する２０μｌの全容量において実行した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、エレクトロポレーションによりまたは熱ショック形質転換により、９６ウェルプレートにおいて２μｌのライゲーション産物を用いて４２℃で形質転換した。コロニーは、それぞれ、５’Ａｂｓｅｎｓｅフォワードプライマー（５’−ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ−３’；配列番号３１５）および３’ＩｇＧ内部リバースプライマー（５’−ＧＴＴ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  Ｃ−３’；配列番号３１６）、３’Ｃκ４９４リバースプライマー（５’  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  Ｔ  ３’；配列番号３１７）、または３’Ｃλリバースプライマー（５’  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ３’；配列番号３１８）を使用し、ＰＣＲによってスクリーニングした。期待されるサイズのＰＣＲ産物は、もとのＰＣＲ産物との同一性を確認するために配列決定した。
【０２４４】
ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞からクローニングした抗体重鎖（ＨＣ）可変領域および軽鎖（ＬＣ）可変領域の数の概要を、下記表１１において示す。４つの中和抗体（最終欄）は、４つの特有の重鎖および特有のラムダまたはカッパ軽鎖の組合せの結果である。重鎖は、２つのＶ生殖系列遺伝子：ＩＧＨＶ４−３９およびＩＧＨＶ４−５９に由来する。カッパ軽鎖は、２つのＶ生殖系列遺伝子：ＩＧＫＶ２Ｄ−２８およびＩＧＫＶ１Ｄ−３３に由来し、ラムダ軽鎖は、Ｖ生殖系列遺伝子：ＩＧＬＶ１−４７に由来する。Ｖ生殖系列遺伝子ＩＧＬＶ３−１０に由来するラムダ軽鎖は、重鎖と対になった場合に、抗原認識をもたらさなかった。中和抗体重鎖および軽鎖の組合せを、下記表１２において記載する。
【０２４５】
【表１１】
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【０２４６】
【表１２】
2013515469.tif 000016
【０２４７】
１４９頁の表１９は、上記表１２において示される中和抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲについて、添付の配列表の配列番号を要約する。
【０２４８】
実施例４：  組換え抗体の発現および精製
クローニング抗ｈＣＭＶ抗体のさらなる特徴付けには、それらの発現および続く精製を必要とした。４６の組換え抗体（Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６）は、ＣＨＯ細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）の一時的なトランスフェクションによって発現させた。手短に言えば、細胞は、２％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＳＦ−ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、皿当たり２．２×１０６細胞の密度で細胞培養皿（直径１０ｃｍ；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、ＧｍｂＨ）に接種した。２４時間後に、トランスフェクション混合物は、１ｍｌ  ＭＥＭ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、皿当たり、重鎖についての６．４５μｇの発現プラスミド、軽鎖についての６．４５μｇの発現ベクター、および１２．９μｌのＭＡＴｒａトランスフェクション試薬（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ＤＥ）と混合することによって調製した。このトランスフェクション混合物は、室温で２０分間、インキュベートした。接種した細胞の培地は、１０ｍｌのＭＥＭと交換し、トランスフェクション混合物を細胞に滴下した。続いて、培養皿は、１５分間、磁性プレート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）上でインキュベートした。次いで、培地を吸引し、極めて低いレベルのウシＩｇＧ（Ｌｏｎｚａ）を含有する２％のＦＣＳを有する１０ｍｌのＳＦ−ＩＭＤＭ培地を細胞に添加した。２４時間後に、培地を新しくした。さらに２日後に、培地を新しくし、組換え抗体を含有する上清は、５分間、２４４ｇでの遠心分離によって採取した。３日後に、調整細胞培養上清を、遠心分離によって再び採取し、きれいにした抗体含有上清をプールした。
【０２４９】
Ｖｉｖａｃｅｌｌ  ７０限外ろ過デバイス（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、１時間、１，０００ｇおよび２０℃での遠心分離によって、調整細胞培養上清を１００倍に濃縮するために使用した。組換え抗体の精製のために、プロテインＡ  ＨＰ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化し、３００μｌの濃縮物をロードした。カラムは、蓋により密閉し、室温で回転ミキサーでインキュベートした。１時間後に、スピンカラムは、１５０ｇで１分間、遠心分離した。４００μｌの結合バッファーを用いるカラムの洗浄および１分間１５０ｇでの遠心分離後に、ローディングプロセスは、全濃縮物をロードするまで、さらに３回、繰り返した。最終のローディング工程後に、カラムは、４００μｌ結合バッファーおよび続く１分間の１５０ｇでの遠心分離の適用によって４回洗浄した。結合した組換え抗体は、２００μｌ溶出バッファー（１００ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．５）の添加および１分間、１５０ｇでの遠心分離によって、スピンカラムから２回溶出した。溶出液は、３０μｌの中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を用いて直ちに中和した。バッファーは、ＰＢＳおよび続く２分間の１５０ｇでの遠心分離によりあらかじめ平衡化したＺｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上に組み合わせた溶出液をロードすることによって交換した。精製した組換え抗体は、特徴付けの研究のためのさらなる処理まで、４℃でタンパク質ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において保存した。
【０２５０】
生成した抗体培養上清は、実施例１および５において記載されるように、ＥＬＩＳＡによってまたはＢｉａｃｏｒｅによってｇＢ認識について分析した。実施例２および５において説明されるように、ＩｇＧ濃度を決定した後に、ｇＢ特異的培養上清は、一次線維芽細胞ＨＦＦを使用し、実施例２（ルシフェラーゼアッセイ）において記載されるルシフェラーゼアッセイを使用して、中和活性について分析した。効率的な５０％中和活性を示す７つの抗ｈＣＭＶ抗体を、さらなる実験のために選んだ（下記表１３を参照されたい）。
【０２５１】
【表１３】
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【０２５２】
４つの組換え抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０の発現のために、Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、同書による方法に従った。手短に言えば、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）を、１０％熱失活ＦＣＳ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、３５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン（Ｍｅｒｃｋ）、および１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎｅ）（ＳＥＲＶＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ）を補足したＤＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）において標準的な条件下で、７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、ＧｍｂＨ）中で培養した。指数関数的に成長する２９３Ｔ細胞の一時的なトランスフェクションは、８０％の細胞培養密度でＣａＰＯ４沈降によって実行した。等量（それぞれ１２．５〜２０μｇ）の重鎖および対応する軽鎖発現ベクターＤＮＡを、１ｍｌの滅菌水中で混合し、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２を２５０ｍＭの濃度まで滴下した。等容量の２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を、ゆっくりとしたボルテックス下でカルシウム−ＤＮＡ溶液と混合し、沈降物の形成を可能にするために１分間、室温でインキュベートした（１分間ＲＴ＋１分間３７℃）。沈降混合物を培養皿に均一に分布させた。細胞は、６〜８時間後に１０ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄し、上清を採取する前に、１５ｍｌ  ＤＭＥＭにおいて６〜７日間培養した。
【０２５３】
培養上清は、実施例１において記載されるようにＥＬＩＳＡによってｇＢ認識について分析した。実施例２において説明されるように、ＩｇＧ濃度を決定した後に、ｇＢ特異的培養上清は、一次線維芽細胞ＨＦＦを使用し、ルシフェラーゼアッセイ（実施例２において記載される）を使用して、中和活性について分析した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の５０％中和活性は、下記表１４において示す。
【０２５４】
【表１４】
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【０２５５】
実施例５：  抗ｈＣＭＶ抗体の特徴付け
５．１：懸濁アレイ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））を使用するｈＣＭＶ抗体の定量
ヒトＩｇＧを含有する細胞培養上清は、アッセイバッファー（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃  １１１２５８９）中で希釈し、希釈液は、９６ハーフウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３  ８８４）中で二通り評価した。手短に言えば、２５μｌ試料は、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的（Ｃａｌｔａｇ、Ｃａｔ＃Ｈ１０５００）をアミン結合によってロードした１２００Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＣＯＯＨビーズを含有する５μｌと共に１時間、暗中で（２０℃、６５０ｒｐｍ）インキュベートした。標準曲線は、２つ組の２５μｌの１：３希釈系列（０．０８〜６０ｎｇ／ｍｌ）のＣｈｒｏｍＰｕｒｅヒトＩｇＧ全分子（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ  Ｃａｔ＃  ００９−０００−００３）を使用して作成した。検出は、Ｒ−ＰＥ（５μｇ／ｍｌ；ＪＩＲ  Ｃａｔ＃  １０９−１１６−０９８）により標識した３０μｌ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的の添加および１時間のさらなるインキュベーションによって行った。次いで、プレートは、以下の設定を使用し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００機器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、読み取り、分析した：１００ビーズ、５０μｌ試料サイズ。
【０２５６】
５．２：懸濁アレイ技術を使用するｇＢタンパク質（ｈＣＭＶ）の定量
ｇＢ（ｈＣＭＶ）を含有する細胞培養上清は、アッセイバッファー（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃  １１１２５８９）中で希釈し、希釈液は、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ＃  ＭＡＢＶＮ  １２５０）において三通り評価した。手短に言えば、２５μｌ試料は、社内で以前に同定された、中和しないが、非常に高い親和性ｈＣＭＶ特異的抗体であるヒト抗ｈＣＭＶ−ＩｇＧ抗体  ＶＨ３／６５−Ｖκ１／１９をアミン結合によってロードした１５００Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＣＯＯＨビーズを含有する５μｌと共に１．５時間、暗中で（２０℃、６５０ｒｐｍ）インキュベートした。標準曲線は、三通りの２５μｌの１：３希釈系列（６〜１４５８ｎｇ／ｍｌ）のｇＢを使用して作成した。プレートは、バキュームマニホールドを使用して、２回（ウェル当たり１００μｌ  ＰＢＳ）洗浄し、検出のために、５０μｌビオチン化抗ｈＣＭＶ−ＩｇＧ抗体ＩＴＣ５２（５μｇ／ｍｌ；社内で作成；Ohlin et al., 1993）をさらに１．５時間、添加した。２回の洗浄工程（それぞれ１００μｌ  ＰＢＳを用いる）後、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００機器（設定：１００ビーズ、４０μｌ試料サイズ）を使用して、プレートを読み取り、分析する前に、Ｒ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃  Ａ２６６０）により標識した５０μｌ／ｍｌ  １．２μｇ  Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを３０分間、添加した。
【０２５７】
５．３：Ｂｉａｃｏｒｅ
タンパク質間相互作用は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００制御ソフトウェアｖ２．０．１を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ）を使用して、表面プラズモン共鳴技術によって分析した。相互作用はすべて、Ｐ２０（０．０５％）と共に１×ＤＰＢＳ中で２５℃で分析した。結合相互作用はそれぞれ、少なくとも２回アッセイした。ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質は、標準的なアミン結合手順を介してＣＭ５センサーチップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセルにつないだ。カルボキシメチル化デキストランマトリックスは、メーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の説明書に従って、０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化した。２つのフローセルを活性化し、ｇＢタンパク質を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を用いて５０μｇ／ｍｌまで希釈し、結合実験（５，０００共鳴単位）または反応速度実験（２，０００共鳴単位）についての結合の適切なレベルに達するまで、５μｌ／分の流速で注入した。非反応性の基は、１Ｍ  エタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５の注入によって不活性化した。対照フローセルは、したがって、ｐＨ４．０で、オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、ｌｏｔ．ＪＦ１２４２６０）を用いて調製した。結合実験前に、フローセルは、ランニングバッファーを用いて徹底的に洗浄した。
【０２５８】
結合分析については、抗ｇＢ特異的抗体を含有する細胞培養上清は、２％の極めて低いＩｇＧをＳＦ−ＩＭＤＭにおいて希釈することによって２．５μｇ／ｍｌ  ＩｇＧに調節し、１０μｌ／分で、０．０２％  ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳにおいて９０秒間、注入した。９０秒間の解離時間後に、結合安定性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン２．０．１を使用してプロットした。
【０２５９】
反応速度分析については、抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、Ａｂ−２８、Ａｂ−４２、および陽性対照としてのＩＴＣ８８のＦａｂ断片は、メーカー（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の標準的なプロトコールに従って固定パパインを使用して、プロテインＡ精製ヒトＩｇＧから調製した。切断産物は、銀染色と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥによってかつＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズアレイＦａｂ／Ｆｃ検出によって確認した。反応速度分析については、流速は、７０μｌ／分まで上げ、３つのブランク曲線（ゼロ濃度）をそれぞれのランに導入した。表面は、１０ｍＭグリシン／ｐＨ２．０のＨＣｌを用いて再生した。結合曲線は、Ｒｍａｘのグローバルフィットと共にラングミュア１：１モデルを適用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０．１を使用して評価した。
【０２６０】
【表１５】
2013515469.tif 000019
【０２６１】
実施例６  異なるｈＣＭＶ  ｇＢ遺伝子型の中和
ｈＣＭＶ研究所株および臨床分離株は、いくつかのｇＢ遺伝子型において分類された（Chou and Dennison, 1991）。抗ＨＣＭＶ抗体の５０％中和活性は、読取りとして間接免疫蛍光法を使用し、さらなる異なるｈＣＭＶ  ｇＢ遺伝子型を使用して決定した。ウイルス株Ｔｏｗｎｅ、ＡＤ１６９、および臨床分離株Ａｌｔｕは、ｇＢ−遺伝子型１、ｇＢ−遺伝子型２、およびｇＢ−遺伝子型３としてそれぞれ分類される。ウイルス株はすべて、標準的な手順によってヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上で増やし、ウイルス上清における感染性のタイターは、Mahy & Kangro (1996)において記載される方法によって決定した。間接免疫蛍光法アッセイは、Andreoni et al. (1989)において記載されるように実行した。手短に言えば、６つのモノクローナル抗体（抗体Ａｂ−０４、Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、Ａｂ−１９、Ａｂ−２８、およびＡｂ−４２）の２倍段階希釈溶液を、３７℃で１時間、それぞれのＨＣＭＶ  ｇＢ遺伝子型の力価量（３００ｐｆｕ）と共にインキュベートした。インキュベーション後に、ウイルス−抗体混合物は、９６ウェルマイクロプレートにおいてコンフルエンスまで成長させＨＦＦ培養物に添加した。試料はすべて、三通り試験した。ウイルス上清は、３７℃での４時間のインキュベーション後に、ＨＦＦから除去し、完全培地と交換した。さらに１６〜２０時間のインキュベーション期間後に、細胞は、洗浄し、エタノールを用いて固定した。感染細胞は、ｈＣＭＶの主要最初期（ＩＥ）タンパク質、ＵＬ１２３に対して特異的なモノクローナル抗体ｐ６３−２７およびＣｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を使用して染色した。広範囲な洗浄に続いて、ＩＥ陽性の核を蛍光顕微鏡下でカウントし、中和パーセントを以下のように計算した：
中和％＝１００×（Ｖ０−Ｖｎ）／Ｖ０
式中、Ｖｎは、ウイルスおよび抗体を含有するウェルにおけるＩＥ陽性の核の数であり、Ｖ０は、ウイルスのみと共にインキュベートしたウェルにおけるＩＥ陽性の核の数である。一般に、感染用量は、ウェル当たり１０００の感染細胞を生成するように調節した。下記表１６は、異なるｇＢ遺伝子型を示すｈＣＭＶに対する様々な組換え抗体の５０％中和活性を概説する。試験したモノクローナル抗体は、同等の効率により、ｈＣＭＶ  ｇＢ遺伝子型１、２、および３を中和することが分かった。
【０２６２】
【表１６】
2013515469.tif 000020
【０２６３】
実施例７：  組換え抗体の内皮、上皮、および樹状細胞へのｈＣＭＶ侵入の中和
先の実施例において記載される中和アッセイはすべて、標的細胞として線維芽細胞を使用して実行した。以前に同定された中和組換え抗体が内皮、上皮、および樹状細胞の感染を中和することもできるかどうかを調査するために、内皮および上皮親和性ＨＣＭＶ分離株ＴＢ４０Ｅ（寛大にもＤｒ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｓｉｎｚｇｅｒ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙからの贈与である）を利用した。ＴＢ４０Ｅは、ＨＦＦにおいて増やし、ウイルス上清における感染性の力価は、Mahy & Kangro (1996)によって記載されるように決定した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＥＧＭ−２ＭＶキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を補足した内皮細胞基本培地ＥＢＭ−２において培養し、継代４〜７で実験のために使用した。ヒトＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０２）は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地：２．５ｍＭグルタミン、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、ピリドキシンＨＣｌ、５５ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（熱失活）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補足した栄養素混合物Ｆ１２、１：１混合物において増やした。一次樹状細胞（ＤＣ）は、以下のように単離した：ＨＣＭＶ血清陰性血液ドナーの精製末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、３７℃で、２時間、自己由来の血清（２％  ｖ／ｖ、熱失活）の存在下において、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地においてインキュベートした。インキュベーション期間に続いて、非接着細胞は、細胞培養培地を用いて洗浄することによって除去し、接着単球は、単離２および４日後の、ＩＬ−４（２５ｕ／ｍｌ）およびｇｍ−ＣＳＦ（８００ｕ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加後にＤＣに分化した。６日目に、中和アッセイは、上記に記載されるように、３７℃で１時間、抗体およびウイルスをインキュベートすることによって実行した。ＤＣの感染は、５００倍高い量のウイルス粒子を必要とした。抗体ウイルス混合物をＤＣに添加し、１２時間のさらなるインキュベーション期間を続けた。氷冷メタノールを用いる固定および透過処理後に、感染細胞は、ＨＣＭＶの主要最初期（ＩＥ）タンパク質、ＵＬ１２３に対して特異的であるモノクローナル抗体Ｅ１３（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡｂＤ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して染色した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）は、読取りとして使用した。ＦｌｏｗＪｏ  ５．７．２．（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）およびＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の両方を分析のために使用した。結果は、表１７ａおよび１７ｂにおいて概説する。
【０２６４】
内皮および上皮細胞を用いる中和アッセイは、読取りとして間接免疫蛍光法アッセイを使用し、実施例６において記載されるように実行したが、その方法に対して以下のように変更した：ＨＵＶＥＣは、感染前に３７℃で１時間、ｈＦＧＦ−Ｂを有しておらず、ＥＧＭ−２ＭＶキットを補足したＥＢＭ−２においてインキュベートした。これは、感染に対する阻害効果を示したＦＧＦ関連性のヘパリンを除去するのに必要であった。さらに、１０倍高い量のウイルス粒子（３０００ｐｆｕ）を、ＨＵＶＥＣおよびＡＲＰＥの両方の感染のために適用した。
【０２６５】
試験した抗体はすべて、ＨＦＦの中和に対する同等の効率により、内皮、上皮、および樹状細胞の感染を中和することが観察された（下記表１７ａおよび１７ｂを参照されたい）。
【０２６６】
【表１７−１】
2013515469.tif 000021
【０２６７】
【表１７−２】
2013515469.tif 000022
【０２６８】
実施例８：  ｈＣＭＶ中和抗体のエピトープ特徴付け
８．１  新規な抗ｈＣＭＶ抗体のＢｉａｃｏｒｅによるエピトープ結合競合アッセイ
エピトープ競合分析のために、抗体Ａｂ−０２（１８’９００ＲＵ）、Ａｂ−０４（１６’８００ＲＵ）、およびＡｂ−２８（１８’３００ＲＵ）を標準的なアミン結合を介してＣＭ５センサーチップのフローセルにつなげた。したがって、対照フローセルは、関連性がないヒトＩｇＧ１抗体（１２’５００ＲＵ）を使用して調製した。結合実験前に、フローセルは、ランニングバッファーを用いて徹底的に洗浄した。ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質は、およそ１３μｇ／ｍｌ  ｇＢを含有した、安定性ｇＢ産生ＣＨＯ細胞系６−Ｈ５（ロット０８０５２７  ＫＳ）の上清から５μｌ／分の流速で１８０秒間、固定抗ｇＢ抗体上に捕捉させた。二次参照抗体ＩＴＣ４８（ｇＢエピトープＡＤ−１を認識する）、ＩＴＣ５２（ｇＢエピトープＡＤ−１を認識する）、およびＩＴＣ８８（エピトープｇＢ  ＡＤ−２を認識する）は、１０００ｎＭの濃度で適用した。結合は、３０μｌ／分の流速で、０．０２％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳにおいて分析した。表面は、ｐＨ１．８の１０ｍＭグリシンを用いて再生した。結合曲線は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０．１を使用して評価した。結果は、下記表１８において要約し、「＋」は、二次結合抗体が、固定捕捉抗体と同時にｇＢタンパク質に結合することができたことを示す。
【０２６９】
参照抗体が試験した抗体と同時にｇＢタンパク質に効率的に結合することができたので、試験した抗体（固定捕捉抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、およびＡｂ−２８）はすべて、ＩＴＣ４８、ＩＴＣ５２、ＩＴＣ８８参照抗体によって認識されるｇＢエピトープＡＤ−１およびＡＤ−２以外のｇＢエピトープに結合するようである。
【０２７０】
【表１８】
2013515469.tif 000023
【０２７１】
８．２  新規な抗ｈＣＭＶ抗体によって認識されるエピトープの分析
本発明の抗体がｇＢ上の既知の抗原性ドメイン、抗原性ドメイン１（ＡＤ−１）および抗原性ドメイン２（ＡＤ−２）を認識するかどうかをさらに調査するために、ＥＬＩＳＡを実行した。この目的のために、ＡＤ−１（原核生物により（ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃａｌｌｙ）発現させた融合タンパク質）およびＡＤ−２（合成ペプチド、ｐｅｐ９０、アミノ酸配列：ＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶ（配列番号１９７）、Meyer et al., 1992）は両方とも、ＥＬＩＳＡプレート上に１μｇ／ｍｌでコートした。ウェル当たり５０μｌの非希釈上清を室温で１時間、インキュベートした。ＥＬＩＳＡは、上記の実施例１において記載されるように実行した。ＥＬＩＳＡ分析は、本発明の抗体がＡＤ−１特異的でも、ＡＤ−２特異的でもないことを明らかにし、それによって、実施例８．１のＢｉａｃｏｒｅ競合アッセイを確認した。
【０２７２】
本発明の抗体によって認識されるエピトープを明確に同定するために、ｇＢのアミノ酸１００〜４４７をコードする哺乳動物発現ベクターを構築した。この領域は、ＡＤ−１およびＡＤ−２  ｇＢエピトープの中間のアミノ酸をすべて含む。この発現コンストラクトを用いるＣｏｓ−７細胞の一時的なトランスフェクションは、メーカーの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実行した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞は、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、固定し、冷メタノールを用いて透過処理した。ＰＢＳを用いる洗浄後に、細胞は、湿った空気中で、３７℃で、４５分間、一次抗体（試験抗体または対照抗体）と共にインキュベートした。さらなる洗浄工程に続いて、スライドは、湿った空気中で、３７℃で、４５分間、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧまたはＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）と共にインキュベートした。ＰＢＳを用いるスライドの洗浄後に、封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）（ＬＩＮＡＲＩＳ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｂｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＤＡＰＩを使用してカバーガラスを適用した。
【０２７３】
抗体結合は、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ）によって立証した。組換え中和モノクローナル抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、Ａｂ−２８は、アミノ酸１００〜４４７を包含する切断型ｇＢタンパク質（ＡＤ１６９；配列番号２３９）と特異的に反応することが示された。そのため、組換え中和モノクローナル抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−０４、Ａｂ−２８の抗体結合ドメインは、ｇＢのアミノ酸１００〜４４７（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９の番号付け）によってコードされる領域内に位置することが明確に同定された。これは、本発明のモノクローナル抗体Ａｂ−０１〜Ａｂ−４６が、先に同定された先行技術におけるヒトモノクローナル抗体によって認識されるｇＢタンパク質の既知のＡＤ−１およびＡＤ−２エピトープとではなく、ｇＢタンパク質の新規な抗原性エピトープと反応することを明白に実証する。
【０２７４】
８．３：抗ｈＣＭＶ抗体との競合ＥＬＩＳＡ
ｇＢタンパク質への結合について、多くの抗ｈＣＭＶ抗体対抗ｈＣＭＶ抗体Ａｂ−５０の潜在的な競合を決定するために、実施例１において記載されるものと同様の方法を使用してＥＬＩＳＡを実行した。手短に言えば、抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、Ｃ２３（対照）、ＩＴＣ５２（特異的ＡＤ−１）、ＩＴＣ８８（特異的ＡＤ−２）、８９−１０４（ｇＨ特異的）、または８９−１０９（ｇＨ特異的）の連続的な希釈液は、調査する抗体のいずれかによるｇＢの早まった結合を予防するために、９６ウェルプレートにおいて、一定の濃度のＡｂ−５０と共に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにおいてあらかじめインキュベートした（ウェル当たり０．５ｎｇ；「抗体混合物」と称される）。さらに、ウェル当たり５ｎｇの濃度のＡｂ−５０のみの５つのウェルは、潜在的な競合抗体を有していないＡｂ−５０のＯＤ４５０を決定するために調製した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）は、４℃で、１６時間、炭酸バッファー、ｐＨ９．６中、ウェル当たり２５ｎｇのｇＢタンパク質によりコートした。ｇＢコートプレートは、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー）を補足したＰＢＳを用いて３回洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）を用いて２時間ブロックし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーを用いて再び３回洗浄した。次いで、プレートは、３７℃で、１時間、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにおいて希釈した５０μｌ抗体混合物と共にインキュベートした。さらなる洗浄工程に続いて、Ａｂ−５０の結合は、ペルオキシダーゼとつながれた抗λ特異的二次抗体を使用して明らかにした（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）。１時間のインキュベーション期間後に、非結合二次抗体は、洗浄によって除去し、酵素活性は、ウェル当たり１００μｌの濃度でテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂの１：１のミックス（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して決定した。室温での５分間のインキュベーション後に、反応は、ウェル当たり１００μｌ  １Ｍリン酸を用いて停止した。吸収（光学濃度（ＯＤ））は、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで検出し、ソフトウェアＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を分析のために使用した。
【０２７５】
競合が試験抗体およびＡｂ−５０の間に存在する場合、Ａｂ−５０のみと比較した場合に、それぞれの抗体混合物におけるＯＤ４５０シグナルの低下が観察された。さらに、ｇＢへの、試験したすべての抗体の結合を視覚化するために同一のＩｇＧ濃度を用いてｇＢ  ＥＬＩＳＡを実行した。本明細書で、検出は、ペルオキシダーゼとつながれたＦｃγ断片特異的二次抗体を使用して実行した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）。結果は、図４において示され、Ａｂ−５０が、抗体Ａｂ−４７およびＡｂ−４９と、ｇＢタンパク質への結合について競合することを実証する。Ａｂ−４８およびＡｂ−５０の間で競合は観察されなかった（図４ａ）。さらに、ｇＢタンパク質への結合についての競合は、Ａｂ−５０および抗体ＩＴＣ５２（ＡＤ−１特異的）、ＩＴＣ８８（ＡＤ−２特異的）、８９−１０４（ｇＨ特異的）、８９−１０９（ｇＨ特異的）の間で観察されず（図４ｂ）、Ａｂ−５０がこれらの抗体以外のｈＣＭＶ上の異なるエピトープを認識し、そのため、ｇＢタンパク質上のＡＤ−１またはＡＤ−２に結合しないことを示した。
【０２７６】
実施例９：  ｈＣＭＶ  ｇＢの構造モデル
現在ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質について入手可能な構造の情報がないので、融合後（ｐｏｓｔｆｕｓｉｏｎ）立体構造を示す可能性が高い、ＨＳＶ−１  ｇＢの結晶構造に基づくＨＣＭＶ  ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）の外部ドメインの三量体立体構造の三次元モデルを作成した（Heldwein et al., 2006）。ｈＣＭＶ  ｇＢ融合後構造のこのモデルは、ＨＳＶ−１  ｇＢの鋳型構造との配列アライメントに基づいて（Heldwein et al.、同書）、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲを使用し、標準的な相同性モデリング手順によって作成した（Eswar et al., 2006）。
【０２７７】
糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、すべてのヘルペスウイルスエンベロープ糖タンパク質の中で最も保存されており、ＨＳＶ−１およびＨＣＭＶ  ｇＢのタンパク質配列は、２８％の同一性および４０％の類似性を共有する。ｈＣＭＶ  ｇＢ単量体は、９０６のアミノ酸（ｇＢ株ＡＤ１６９；配列番号２３９）から成り、これらのうちの外部ドメインほぼ全体（残基Ｔｙｒ８９〜Ｖａｌ７００）がモデルに含まれる（図３）。ＨＳＶ−１  ｇＢ構造に基づいて先に定義された個々のドメインＩ〜Ｖは、ＨＣＭＶ  ｇＢの相同性モデルから明確に同定することができる。ドメインＩ（ＤｏｍＩ）（Ｉｌｅ１３３〜Ｔｈｒ３４３）は、三量体界面の一部を構成し、膜の近くに配置している。非連続的ＤｏｍＩＩは、残基Ｌｅｕ１２１〜Ａｓｎ１３２およびＣｙｓ３４４〜Ｓｅｒ４３８から構成される（図３）。残基Ｖａｌ３０６〜Ｇｌｕ３１７およびＬｅｕ４３９〜Ｈｉｓ４６８を含む可動性ループは、それらがＨＳＶ−１  ｇＢの鋳型構造において解明されていないので、モデルに含まれていない。ＤｏｍＩＩＩは、３つの非連続的セグメント、Ｓｅｒ９５〜Ｃｙｓ１１１、Ａｓｎ４７７〜Ｓｅｒ５４９、およびＬｅｕ６３８〜Ｓｅｒ６４６を含む（図３）。ＨＳＶ−１  ｇＢにおいてのように、その長いαヘリックス形態は、他の単量体由来のそれぞれのセグメントと共に、三量体の界面を形成する。ＤｏｍＩＶ（Ｔｙｒ８９〜Ｃｙｓ９４およびＣｙｓ５５０〜Ａｓｐ６３７）は、分子の上部に位置し、ＡＤ−１エピトープを含有するが、ＤｏｍＶ（Ｍｅｔ６４７〜Ａｓｐ６９８）は、細胞外部分および膜貫通ヘリックスの間の架橋エレメントに相当する。ＨＣＭＶ  ｇＢ単量体の全体的な構造およびまた三量体におけるサブユニットの配置は、したがって、配列類似性の程度から期待されるように、ＨＳＶ−１  ｇＢに高度に類似することが示唆される。
【０２７８】
ＨＳＶ−１（Heldwein et al.、同書）およびＥＢＶ（Backovic et al., 2009）由来のｇＢ−タンパク質の２つの結晶構造が、既に存在するので、ＨＳＶ−１  ｇＢ結晶構造を、モデルリング研究のための鋳型に選んだ。これらの両方のタンパク質は、３０％の配列同一性を示し、高度に類似する三次構造を示す。既知の構造のこれらの２つのタンパク質に対するｈＣＭＶ  ｇＢの配列同一性は、２８〜３３％であり、ｈＣＭＶ  ｇＢもまた、同じ三次元フォールドを共有することを強く示唆する。ＨＳＶ−１  ｇＢは、結晶構造の解像度がＥＢＶ  ｇＢよりも著しくよいので、モデルリング鋳型に選んだ。ＨＣＭＶ  ｇＢの結果として生じるモデルは、好都合の局所的な形状を示すことが分かり、立体的な衝突は検出されなかった。さらに、対のシステインは、ジスルフィド結合の距離に位置し、全体的な構造の特徴だけではなく、局所的な構造の詳細もまた、モデルによって正確に反映されることを示した。このモデルはまた、単一の連続的ペプチド鎖としてのＤｏｍＩＩの発現を可能にしたコンストラクトの設計のための基礎を提供した。一次アミノ酸配列において非連続的であるこのドメインについては、下記実施例１０においてに記載されるように、ドメインの２つの部分を結び付けるように５残基リンカーを設計した。
【０２７９】
実施例１０：  ヒト血清によるｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質認識
抗体結合についてＤｏｍＩおよびＤｏｍＩＩを調査するために、真核細胞においてどちらかのドメインの合成を可能にした発現プラスミドを構築した。両方の場合において、クローニング戦略は、検出を促進するために、それぞれのペプチドのアミノ末端へのＨＡエピトープタグの付加を伴った。
【０２８０】
実施例１０．１：  ｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質ＤｏｍＩＩの発現およびヒト血清による認識
ｈＣＭＶ  ｇＢの構造モデルに基づいて、組換え発現ｇＢ  ＤｏｍＩＩが自然感染の間に免疫原性となるかどうかを分析した。この目的のために、哺乳動物細胞におけるＤｏｍＩＩの発現を可能にした真核生物発現ベクターを構築した。ＤｏｍＩＩは、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸１２１〜１３２およびアミノ酸３４４〜４３８によって生成される非連続的エピトープである。ＤｏｍＩＩを発現させるために、ｇＢ特異的残基１２１〜１３２および３４４〜４３８をコードするヌクレオチド配列は、可動性の５アミノ酸リンカー（Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ；配列番号３１９）をコードするヌクレオチドストレッチによってつないだ。このヌクレオチド配列は、ｈＣＭＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐＵＬ１３２の真のシグナル配列（アミノ酸１〜２７；配列番号３２０；Spaderna et al., 2005）、これに続くインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号３２１）を含有する発現ベクターｐｃＵＬ１３２ｓｉｇＨＡ、ｐｃＤＮＡ３．１ベースのベクターの中に挿入した。ヌクレオチド配列をコードするＤｏｍＩＩは、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを使用して、ＨＡタグ配列の下流に挿入した。プラスミドからの正確なタンパク質発現により、ＨＡタグ付きＤｏｍＩＩ融合タンパク質が生じ、これは、小胞体およびトランスゴルジネットワークを通して輸送され、したがって、グリコシル化によって適切に修飾される。リンカーによりつながれた非連続的ＤｏｍＩＩについてのコード領域は、化学的に合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０２８１】
抗体認識についてＤｏｍＩＩペプチドを分析するために、ＤｏｍＩＩは、Ｃｏｓ７細胞において一時的に発現させ、ランダムに選択したｈＣＭＶ血清陽性ドナー由来の１３の血清を使用し、間接免疫蛍光法において反応性について分析した。２４ウェルプレートにおいてガラス製カバーガラス上で成長させたＣｏｓ７細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＤｏｍＩＩをコードする、０．８μｇの発現プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞は固定し、氷冷メタノールを用いて透過処理した。次いで、患者血清は、一次抗体として添加した。非結合血清抗体は、ＰＢＳを使用する３回の洗浄工程によって除去した。ヒト血清由来の一次抗体の結合は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とコンジュゲートされた適切な二次抗体を用いて検出した。細胞核の対比染色は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて行った。画像は、Ｖｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ電荷結合デバイスカメラ（Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を取り付けたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡を使用して収集した。画像は、ＭｅｔａＶｉｅｗソフトウェアおよびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ使用して処理した。抗体：対照：ｇＢ特異的ヒトモノクローナル抗体Ｃ２３（ＴＩ−２３；  Meyer et al., 1990）、ｇＮ特異的マウスモノクローナル抗体１４−１６Ａ（Mach et al., 2000）、ｇＨ特異的マウスモノクローナル抗体ＳＡ４（Urban et al., 1992）、マウス抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびマウス抗ＧＳＴ（ＢＩＯＺＯＬ、Ｅｃｈｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。全ｇＢ（アミノ酸１〜９０６）を発現するプラスミドは、さらなる対照として提供した。血清はすべて、全ｇＢと陽性反応を示したが、１３の血清のうちの４つの血清のみが、ＤｏｍＩＩに対して陽性に染色された。これは、ＤｏｍＩＩが天然ｈＣＭＶ感染の間に抗体を誘発するのを担うことを実証する。
【０２８２】
ヒト血清のより大きなパネル上でｇＢ  ＤｏｍＩＩに対して向けられた抗体を含有する患者血清の頻度（frequency）を試験し、それを、ｇＢの既知の抗原性ドメイン、ＡＤ−１およびＡＤ−２に対する抗体を含有する血清の頻度と比較するために、ＤｏｍＩＩコード配列は、ＧＳＴ融合タンパク質として細菌で発現させ、精製し、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤｏｍＩＩ  ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質の発現のためのプラスミドは、発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して作成した。プラスミドＤＮＡは、ＧＳＴ融合タンパク質の発現のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用した。それぞれの融合タンパク質は、メーカーの説明書に従って誘発し、タンパク質の可溶性形態をＥ．ｃｏｌｉ溶解物から精製した。親和性マトリックスを調製するために、２．６ｍｇの精製ＤｏｍＩＩ  ＧＳＴ融合タンパク質を、結合バッファーに対して透析し、メーカーの説明書に従ってＡｍｉｎｏＬｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）にコンジュゲートした。ＰＢＳを用いて１：３（ｖ／ｖ）に希釈した４ｍｌのｈＣＭＶ高度免疫グロブリン調製物は、２ｍｌの抗原につながれたビーズを通過させ、その後に続いて、ＰＢＳを用いて広範囲に洗浄した。結合したＩｇＧは、１ｍｌの画分において０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ３．０を用いて溶出し、画分をＰＢＳに対して透析した。全ＩｇＧ濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定した。手短に言えば、ポリスチレン９６ウェルプレートは、−４℃で、一晩、０．５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６において１００ｎｇ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＵＳＡ）を用いてコートした。５０μｌの容量において溶出された画分の段階ｌｏｇ２希釈液を添加し、結合したＩｇＧは、ポリクローナルペルオキシダーゼコンジュゲートヤギＦ（ａｂ）２断片抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＵＳＡ）を使用することによって検出した。既知濃度を有するヒトＩｇＧ調製物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＵＳＡ）は、標準物質として使用した。
【０２８３】
ＤｏｍＩＩ  ＧＳＴ融合タンパク質の純度は、以下のＰＡＧＥのタンパク質のクーマシー染色から評価されるように＞９０％であった。ｈＣＭＶ血清陽性個体由来の合計８０のランダムに選択された血清は、市販で入手可能な試験によって決定されるように分析した。ｈＣＭＶ陰性ドナー由来の１０の血清は、陰性対照として提供した。ｈＣＭＶ血清陽性個体由来の血清パネル内で、ｇＢに対する反応性は、１００％であり、このタンパク質の高い免疫原性を強調した（図５）。発明者らの先の観察と一致して、ｇＢのＡＤ−１との陽性反応もまた、１００％であった。血清の５７％は、ＡＤ−２に対する抗体を含有した（Schoppel et al., 1996）。ＤｏｍＩＩ融合タンパク質は、血清の９４％によって認識された。したがって、ＤｏｍＩＩは、ｇＢのもう１つの高度に免疫原性のドメインに相当する。原核生物により発現させた融合タンパク質を抗原として使用することができたので、これは、タンパク質グリコシル化が、抗体結合にとって不可欠ではないことを示唆するであろう。ＤｏｍＩＩ結合抗体の分析のための最初に使用した免疫蛍光法分析およびＥＬＩＳＡの間の認識頻度における差異は、アッセイの異なる感度のためかもしれない。ｇＢ抗原性ドメインの命名法（ｎｏｍｅｍｃｌａｔｕｒｅ）における一貫性のために、ＤｏｍＩＩは、ＡＤ−４と示した。
【０２８４】
実施例１０．２：  ＨＡタグを有するｈＣＭＶ  ｇＢタンパク質ＤｏｍＩの発現およびヒト血清による認識
ＤｏｍＩを発現させるために、ｇＢ株ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸１３２〜３４３をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターｐｃＵＬ１３２ｓｉｇＨＡ（上記に記載される）の中に挿入し、ベクターｐｃＡＤ−５を作成した。抗体認識についてＤｏｍＩペプチドを分析するために、ＤｏｍＩは、Ｃｏｓ７細胞において一時的に発現させ、上記の実施例１０．１において記載されるのと同じ方法を使用して間接免疫蛍光法によって反応性について分析した。
【０２８５】
ヒト血清におけるＤｏｍＩ特異的抗体は、捕捉ＥＬＩＳＡにおいて測定した。組換え抗体生成のために、７５ｃｍ２フラスコ中の２９３Ｔ細胞は、リン酸カルシウム沈降により、２０μｇのプラスミドｐｃＡＤ−５  ＤＮＡを用いてトランスフェクトした。フラスコは６日間インキュベートし、次いで、細胞およびそれらの上清を採取した。捕捉ＥＬＩＳＡのために、ＥＬＩＳＡプレートは、上記実施例８．３において記載されるように、１２５ｎｇ／ウェルのマウス抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）によりコートし、洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで、３７℃で、２時間、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ＨＡタグ付きＤｏｍＩを含有）の上清と共にインキュベートした。次いで、プレートは、すすぎ、３７℃で、２時間、１：５０希釈液においてヒト血清と共にインキュベートした。非結合抗体は、洗浄によって除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトまたは抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１時間、適切な希釈で添加した。次いで、プレートは、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液Ｂ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）において１：１に希釈した１００μｌ  ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を５分間添加した。反応は、１００μｌ  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の添加によって停止し、ＯＤ４５０は、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定した。プレートは、上記実施例１０．１において記載されるように洗浄し、現像した。抗体はすべて、２％ＦＣＳを用いてＰＢＳにおいて希釈した。間接免疫蛍光法によって分析した抗体結合により、試験した４つの抗体（Ａｂ−４７、Ａｂ−４８、Ａｂ−４９、およびＡｂ−５０）が、ＤｏｍＩ特異的ペプチドと反応性であることが確認された（結果示さず）。
【０２８６】
中和抗体に対する新しい標的としてＤｏｍＩを同定したので、４人の個体由来のクローン抗体上清は、ｈＣＭＶ感染個体におけるＤｏｍＩ特異的抗体の全体的な頻度についての情報を得るために再試験した。ＤｏｍＩ特異的記憶Ｂ細胞の頻度は、様々なドナーの間で多様であったが、試験したＤｏｍＩ抗体の１００％（６／６）が、中和活性を示した（結果示さず）。
【０２８７】
ＤｏｍＩ抗体の認識の頻度についての情報を得るために、抗体反応性は、ｈＣＭＶ感染個体のより大きな血清パネルにおいてＤｏｍＩに対して決定し、既知の抗原性ドメインと比較した。上記実施例１０．１において記載されるように、ｈＣＭＶ血清陽性個体由来の合計８０のランダムに選択された血清を分析した（図５）。ＤｏｍＩは、血清の５７％によって認識され、そのため、このドメインが、感染の間に高い頻度により抗体を誘発する、ｇＢタンパク質上の抗原性ドメインに相当することを示す。
【０２８８】
ｇＢ抗原性ドメインの命名法における一貫性のために、ＤｏｍＩは、ＡＤ−５と示した。
【０２８９】
実施例１１：  ＡＤ−４（ＤｏｍＩＩ）抗体価およびヒト血清における中和能力の間の相関
文献におけるデータは、ｇＢが、自然感染の間の中和抗体の誘発に関して有力な抗原の１つであるという仮定を支持し、抗ｇＢ力価および中和能力の間の相関が、報告されている（Marshall et al., 1992）。多くの異なるエピトープに対して向けられる様々な異なる抗体特異性についてこの相関が存在するかどうかまたは限られた数のドメインが担うかどうかは不明瞭である。Ａｄ−４（ＤｏｍＩＩ）特異的抗体が、所与の血清の全体的な中和能力に有意に寄与するかどうか調査するために、発明者らは、血清パネルにおいて中和力価を決定し、それぞれ、組換えｇＢ、ＡＤ−１、ＡＤ−２、およびＡＤ−４に対するＥＬＩＳＡ力価にそれを関連づけた。タンパク質は、０．５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６においてまたは６Ｍ尿素（ＡＤ−１）において２５ｎｇ〜２００ｎｇ（抗原に依存）の間で希釈し、５０μｌは、４℃で、マイクロタイタープレートを一晩コートするために使用した。続く工程はすべて、室温で実行した。反応ウェルは、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を補足したＰＢＳを用いてすすぎ、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳを用いて２時間、ブロックした。プレートは、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を補足したＰＢＳを用いて再びすすぎ、２時間、モノクローナル抗体、ヒト血清、ポリクローナル溶出抗体画分、またはマウス血清（５０μｌ／ウェル）と共にインキュベートした。非結合抗体は、洗浄によって除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトまたは抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１時間、適切な希釈で添加した。プレートは、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液Ｂ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）において１：１に希釈した１００μｌ  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質を５分間添加した。反応は、１００μｌ  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の添加によって停止し、ＯＤ４５０は、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定した。すべての抗体の希釈は、２％ＦＣＳを用いてＰＢＳにおいて行った。ｇＢ融合タンパク質を含むすべてのアッセイにおいて、それぞれの原核生物融合パートナーは、並行してアッセイし、光学濃度は、ｇＢ融合タンパク質を用いて得られた値から引いた。
【０２９０】
先に報告されるように、ＥＬＩＳＡにおけるｇＢの認識および中和能力の間に相関があった（Marshall et al.、同書）。分析はまた、ＡＤ−２ではなく、ＡＤ−１およびＡＤ−４（ＤｏｍＩＩ）に対する中和能力および抗体結合力価の間の統計的に有意な相関をも示した（図６）。
【０２９１】
実施例１２：  ＡＤ−４（ＤｏｍＩＩ）は、自然感染の間のウイルス中和抗体を誘発する
ＡＤ−４が自然感染の間にウイルス中和抗体を誘発するかどうかという問題をより詳細に調査するために、発明者らは、２つのアプローチを使用した：第１に、発明者らは、親和性マトリックスとして精製ＡＤ−４−ＧＳＴ（ＤｏｍＩＩ  ＧＳＴ）融合タンパク質を使用して、プールしたヒトＩｇＧ調製物からポリクローナル抗ＡＤ−４抗体を単離した。期待されるように、プールしたヒトＩｇＧ調製物は、Ｃｏｓ−７細胞におけるそれぞれの糖タンパク質複合体の一時的発現に続いて、間接免疫蛍光法分析において、多くの異なるｈＣＭＶ特異的エンベロープ糖タンパク質と反応性の抗体を含有した。第２に、発明者らは、ＡＤ−４への結合について、本発明において開示されるｇＢ特異的ヒトモノクローナル抗体を試験した。組換え抗体はすべて、Ｃｏｓ７細胞において一時的に発現させたＡＤ−４タンパク質を使用し、間接免疫蛍光法においてＡＤ−４に結合することが分かった。そのため、ＡＤ−４は、本発明において開示されるヒトモノクローナル抗体によって認識される立体構造エピトープに相当する。
【０２９２】
ＡＤ−４特異的抗体の単離のためのマトリックスを調製するために、２．６ｍｇの精製ＡＤ−４−ＧＳＴ融合タンパク質は、セファロースに共有結合し、４ｍｌのヒトＩｇＧ調製物からＡＤ−４−特異的ＩｇＧをアフィニティー精製するために使用した。合計１２７μｇのＩｇＧを得た。ＥＬＩＳＡ試験により、アフィニティー精製ＩｇＧ画分（Ｅ３）が、ＡＤ−１およびＡＤ−２ではなく、ＡＤ−４およびｇＢに対して特異的結合を示すことを確認した（図７ａ）。ｈＣＭＶ上のさらなる中和関連抗原に対して向けられる抗体によるアフィニティー精製ＡＤ−４抗体のコンタミネーションをさらに除くために、発明者らは、ｇＨまたはｇＭ／ｇＮ複合体；自然感染の間に中和抗体を誘発することが既知のウイルスエンベロープタンパク質を一時的に発現するＣｏｓ７細胞を用いて間接免疫蛍光法分析を実行した（Shimamura et al., 2006; Urban et al., 1996）。精製ポリクローナル抗ＡＤ−４  ＩｇＧ画分は、非ｇＢエンベロープ複合体に対して特異的な検出可能な抗体を含有しなかった。さらに、ＩｇＧ画分は、ＩｇＭがなかった（示さず）。次いで、アフィニティー精製ＩｇＧ調製物（Ｅ３）を中和アッセイにおいて試験した。ウイルス感染性の５０％中和は、およそ０．２μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で達成され、これは、本発明において開示される強力なｇＢ特異的ヒトモノクローナル抗体の範囲内にある（図７ｂ）。それに比べて、アフィニティー精製ＩｇＧ画分が由来するもとの血清プールは、およそ２００μｇ／ｍｌ  ＩｇＧで入力ウイルスの５０％の中和を示した（図７ｂ）。要約すると、これらのデータは、ＡＤ−４が、ｇＢの高度に免疫原性のドメインに相当するというだけではなく、それがまた、ウイルス中和抗体の標的でもあるというさらなる証拠を提供する。
【０２９３】
実施例１３：  ヒト組換え抗体結合の特異性
１３．１：ヒト組換え抗体に結合するＡＤ−４の優れた（fine）特異性
ＡＤ−４のサイズ（＞１００アミノ酸）は、エピトープに結合するいくつかの抗体を含むのに十分に大きい。中和および非中和抗体が結合することができるすぐ近くのエピトープは、ｇＢのＡＤ−１およびＡＤ−２について見つけられており、有効なウイルス中和を回避するためのメカニズムとして示唆されてきた。したがって、ＡＤ−４内の潜在的なエピトープについてのよりさらに多くの情報を得ることは興味深い。アミノ末端のアミノ酸１２１〜１３２またはカルボキシ末端の最後の５つのアミノ酸の省略によってＡＤ−４を短くするための最初の試みは、抗体結合の完全な損失をもたらし、全ドメインのみが抗体結合構造を形成することができることを示した。ＡＤ−４内の可能性として重大な抗体接触残基を同定するために、それぞれにおいて２つの隣接する表面暴露残基をアラニンに交換したＡＤ−４変異体ペプチドを発現した多くの（ｎ＝１７）真核生物発現プラスミドを構築した（図８）。残基の表面露出は、実施例９において記載されるように、ｈＣＭＶ  ｇＢモデルから同定した。
【０２９４】
それぞれの変異体ＡＤ−４タンパク質の一時的発現に続いて、ヒトモノクローナル抗体Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、およびＡｂ−２８を間接免疫蛍光法において試験した場合、２つのパターンの認識が見つけられた。抗体Ａｂ−２８は、ＡＤ−４変異タンパク質すべてに結合したのに対して、残りの抗体は、リジン残基３７８および３７９をアラニンと交換した変異体を認識しなかった。これは、本明細書において開示される組換えヒトモノクローナル抗体によってＡＤ−４が認識されることを証明する。
【０２９５】
さらに、これらのデータは、ＡＤ−４内のジリジン配列（Ｋ３７８Ｋ３７９）が重大な抗体結合部位に相当することを示す。しかしながら、間接免疫蛍光法において得られたシグナルは、定量化するのが難しく、ＡＤ−４Ｇ変異体ペプチドとの反応の欠如が、アッセイの検出限界未満の抗体の結合の低下を単に反映していた可能性があった。したがって、より多くの量的データを得、かつ間接免疫蛍光法によって得られた結果を確認するために、５つのＡＤ−４変異タンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製し、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。ＧＳＴ融合タンパク質の純度は、図５において上記に示される野生型ＡＤ−４に対するすべてのペプチドに対して同等であった。ＡＤ−４Ｇ（Ｋ３７８Ｋ３７９）変異体に加えて、融合タンパク質は、立体的に隣接する残基に影響するＡＤ−４Ｈ（Ｑ３８０Ｅ３８１）、ＡＤ−４Ｅ（Ｅ３５９Ｄ３６２）、およびＡＤ−４Ｉ（Ｎ３８３Ｓ３８５）ならびにより離れた位置の変異体ＡＤ−４Ｌ（Ｎ４０５Ｔ４０６）を含んだ。ＥＬＩＳＡによって得られた結果は、免疫蛍光法データに従った。ＡＤ−４Ｇを例外として、変異タンパク質は、同等の効率によりモノクローナル抗体によって認識された。しかしながら、ＡＤ−４Ｇは、抗体Ａｂ−２８によって認識されたのみであった（図９ａ）。興味深いことには、アフィニティー精製ＩｇＧ画分は、すべてのＡＤ−４融合タンパク質と同様の反応性を示し、ＡＤ−４Ｇ変異とは無関係に大多数の抗体が結合したことを示した（図９ｂ）。アフィニティー精製ＩｇＧ調製物は、未知数のドナーの血清プールに由来し、したがって、ＡＤ−４エピトープの認識における個体差は、平均されることが期待されるであろう。
【０２９６】
潜在的なＡＤ−４エピトープ特異性のより多くの情報を得るために、発明者らは、位置３７８および３７９の２つのリジンもまた、個々のヒト血清において存在する抗体との反応性にとって重要な残基であるかどうかを試験した。この目的のために、５つのＡＤ−４変異体ペプチドは、上記のような同じ血清パネルを用いて試験し、商はそれぞれの血清についての最も低度のおよび最も高度の吸光度の間で計算した。図１０において理解することができるように、ほとんどの血清は、同様の効率により５つのＡＤ−４ペプチドを認識し、１〜５倍の低い最大の差異をもたらした。しかしながら、５つの血清は、１０〜１００倍の範囲の最大の差異を示した。興味深いことには、差異は、１つの例外を除いて変異タンパク質ＡＤ−４Ｇの認識の低下のためであった。最も高い最大差異を有する血清は、変異タンパク質ＡＤ−４Ｈ（Ｑ３８０Ｅ３８１）への結合の低下を示し、これは、ＡＤ−４の３Ｄモデルにおいて、ＡＤ−４Ｇにおけるジリジンモチーフ（Ｋ３７８Ｋ３７９）のすぐ近くに位置する。したがって、少数の血清の結合は、３７８および３８１の間のもとのｇＢペプチド配列にほぼ完全な依存を示したが、個々のヒト血清によるＡｄ−４の認識は、この配列に非常に非依存性であった。この結果に従って、抗原としてＡＤ−４Ｇ変異タンパク質を使用してアフィニティー精製したＩｇＧ画分が、ＡＤ−４変異タンパク質のＥＬＩＳＡにおける類似する認識パターンおよびＡＤ−４野生型に対して精製したＩｇＧと同等の中和力価を有するという発見があった。
【０２９７】
１３．２：ＡＤ−５（ＤｏｍＩ）に結合するヒト組換え抗体の優れた特異性
ＡＤ−４とは対照的に、ＡＤ−５は、原核生物発現後に正確にフォールドせず、そのため、アフィニティー精製のための抗原を生成することができなかったので、上記実施例１３．１において記載されるものに類似する実験は、ＡＤ−５（ＤｏｍＩ）を用いて実行することができなかった。しかしながら、ＡＤ−５は、２つのドメインに細分することが可能であり、これらを、次いで、抗体認識について試験した。構造の情報に基づいて、ＡＤ−５は、ｇＢタンパク質ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸１３３〜１４４および２５１〜３４３を含んだサブドメイン１（ＡＤ−５−Ｓ１）ならびにｇＢタンパク質ＡＤ１６９（配列番号２３９）のアミノ酸１４０〜２５５を含んだサブドメイン２（ＡＤ−５−Ｓ２）に分けた。
【０２９８】
本発明において記載されるＡＤ−５抗体がこれらのサブドメインを認識したかどうかを決定するために、実施例１０．２において記載されるように、捕捉ＥＬＩＳＡを実行し、２９３Ｔ細胞は、サブドメインＡＤ−５−Ｓ１およびＡＤ−５−Ｓ２ならびにＡＤ−４＋ＡＤ−５を用いてトランスフェクトした。組換えＡＤ−５抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０を、患者血清の代わりに検出のために使用した。実行した間接免疫蛍光法の結果は、抗体Ａｂ−４７およびＡｂ−５０がＡＤ−５−Ｓ１を認識したことを示した（結果示さず）。捕捉ＥＬＩＳＡからの結果は、図１１において示され、これらは、抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のすべてが、ｇＢ  ＡＤ−４＋ＡＤ−５を認識し、抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４９、およびＡｂ−５０が、ｇＢ  ＡＤ−５、特にＡＤ−５−Ｓ１を認識することを示す。抗体Ａｂ−４７〜Ａｂ−５０のどれも、ｇＢ  ＡＤ−５−Ｓ２を認識しなかった。これらの結果から、そのため、抗体Ａｂ−４７、Ａｂ−４９、およびＡｂ−５０は、ＡＤ−５−Ｓ１に、つまり、ｇＢタンパク質（株ＡＤ１６９；配列番号２３９）のアミノ酸１３３〜１４４および２５１〜３４３内に位置する、ｇＢタンパク質上のエピトープを認識することを推定することができる。
【０２９９】
実施例１４：  ｈＣＭＶ  ｇＢの融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）立体構造のモデル
ＨＳＶ−１  ｇＢに従ってモデル化したｈＣＭＶ  ｇＢの構造内で、ＡＤ−４は、分子の真中の突出部に位置する。ジリジンモチーフは、表面に容易に到達できる。３Ｄ空間における、抗体に結合するＡＤ−４の配向に関するデータがない限り、このタンパク質立体構造における抗体結合が、隣接するタンパク質とのｇＢの相互作用に影響を及ぼし得ることを予測することができる。ｈＣＭＶを含む多くのヘルペスウイルスについて、ｇＢが融合プロセスの間に適切に機能するためにさらなるエンベロープ糖タンパク質と相互作用する必要があることが知られている（Avitabile et al., 2009; Patrone et al., 2007）。しかしながら、おそらく、ＨＳＶ−１  ｇＢは、融合後立体構造に相当する。この仮定は、融合後および融合前構造の両方が入手可能であるＶＳＶ−Ｇに対するＨＳＶ−１  ｇＢの構造の相同性に基づく（Roche et al., 2006 & 2007）。融合前形態がビリオンについて一般的であり、融合後形態は、主として、いくつかの、今までのところ未同定の細胞コンパートメントにおいて存在するように考えられる。見たところでは、ＡＤ−４特異的抗体は、それらが、ｇＢの細胞およびウイルス形態に結合するので、両方のｇＢ立体構造を認識することができる。ＶＳＶ−Ｇについては、融合前および融合後形態が個々のタンパク質ドメインの広範囲な構造の再構成を示すので、発明者らは、融合前三量体内のＡｄ−４の潜在的な局在化および抗体結合にとって重要な残基の位置に対するより多くの見識を得るためにＨＣＭＶ  ｇＢの融合前形態をモデル化した。
【０３００】
単一のｈＣＭＶ  ｇＢドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを融合後モデルから得、ＭｕｌｔｉＰｒｏｔアルゴリズム（Shatsky et al., 2004）を使用して、ＶＳＶ−Ｇの融合前構造（Roche et al., 2007）上に重ねた。ｈＣＭＶ  ｇＢドメインＶおよびドメインＩＩＩの残基Ｌｅｕ４６９〜Ａｒｇ４９６は、それらが球状ではなく、ＶＳＶ−Ｇ鋳型中に存在する等価な構造がないので、を除いた。個々に適合させたドメインの間の連結ループは、ＭｏｄＬｏｏｐ（Fiser et al., 2003）を用いてモデル化した。三量体融合前モデルは、ＶＳＶ−Ｇ融合前形状を適用することによって得た。
【０３０１】
ｈＣＭＶ  ｇＢの融合後立体構造は、ＨＳＶ−ｇＢの相同結晶構造に基づいて容易にモデル化することができるが、分子のこのファミリーの融合前立体構造についてのさらに入手可能な実験的な構造の情報はない。ＶＳＶ−Ｇの２つの立体構造から、個々のタンパク質ドメインは、それらのフォールドを保つが、ドメインの相対的な配置は、融合前および融合後状態の間の遷移に際して劇的に変化することが知られている。融合前三量体内のＡｄ−４の潜在的な局在化および抗体結合にとって重要な残基の位置に対するさらなる見識を得るために、ｈＣＭＶ  ｇＢ融合前立体構造の仮説のモデルを作成した。この目的のために、個々のドメインフォールドを、融合後モデルから得、ＶＳＶ−Ｇ由来の糖タンパク質Ｇの融合前構造からのドメイン配置についての情報を用いた（Roche et al.、同書）。結果として生じるモデルは、立体的な衝突を示さず、連結配列は、この選択的形状におけるドメインを結び付けるのに十分に長く、このドメイン配置が、ｈＣＭＶ  ｇＢにおいて構造的に実現可能であることを示唆する。ｈＣＭＶ  ｇＢ融合前構造のドメイン配置は、それぞれの融合後結晶構造に基づいて作成されたＥＢＶ  ｇＢ融合前立体構造の先のモデルに高度に類似した（Backovic et al., 2009）。
【０３０２】
ｈＣＭＶ  ｇＢの融合前および融合後立体構造の間の重要な差異は、タンパク質の先端の部分の組成において見つけられる。融合後立体構造では、この領域は、ＡＤ−１が位置するドメインＩＶによって形成される。対照的に、融合前モデルでは、ＤｏｍＩＩ／ＡＤ−４は分子の上部に位置し、ジリジンモチーフ（Ｌｙｓ３７８、Ｌｙｓ３７９）は、ＤｏｍＩＩ／ＡＤ−４の先端の表面上の中央の位置に位置する。したがって、ｇＢの融合前形態に結合したＩｇＧ分子の空間的な構成は、融合後形態と異なるであろう、また、標的細胞の構成成分へのｇＢの結合に干渉するかもしれない。非ｇＢ分子との相互作用のブロックは別として、ＤｏｍＩＩ／ＡＤ−４に結合したＩｇＧ分子はまた、適切な機能に必要となり得る、タンパク質内の立体構造変化をも抑制することができるかもしれない。
【０３０３】
実施例１５：  ヒト血清の存在下における中和アッセイ
臨床設定では、本発明の抗体は、静脈注射の手段によって予防的にまたは治療上投与されてもよい。そのため、抗体機能がヒト血清における抗体の存在によって損なわれる可能性を除く必要がある。異なる３つのタイプの血清を検査した：ｈＣＭＶ特異的抗体に対して陰性の血清、ｈＣＭＶ特異的抗体に対して陽性の血清、およびＩｎｔｒａｔｅｃｔ（登録商標）（Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ）、ＣＭＶ特異的抗体が豊富なｈＣＭＶ血清調製物。第１に、それぞれの分析した血清のＩｇＧ濃度および５０％中和活性を滴定によって決定した。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレートは、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を用いてコートした。ＥＬＩＳＡバッファー中の血清の２倍段階希釈溶液を、既知濃度のＩｇＧ標準物質と比較した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）。ＩｇＧ濃度は、ＥＬＩＳＡソフトウェアＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ３．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して計算した。血清の５０％中和活性は、実施例２において上記に記載されるように、ルシフェラーゼベースの中和アッセイを実行することによって決定した。
【０３０４】
次に、実施例２において先に記載される競合的中和アッセイにおいて、抗体Ａｂ−２８は、一定の濃度の血清の添加前に、それが５０％中和点と交差するように滴定した。ｈＣＭＶ特異的抗体に対して陰性または陽性であった血清およびＩｎｔｒａｔｅｃｔ（登録商標）は、それらのそれぞれの５０％中和活性のあたりの一定の濃度で滴定したＡｂ−２８に添加した。図１２において示されるように、血清抗体によるＡｂ−２８中和効力の阻害はないように見えた。滴定したＡｂ−２８にｈＣＭＶ陰性血清を添加した後に、曲線は、Ａｂ−２８のみの曲線と同一に見えた。この結果は、Ａｂ−２８中和能力を損ない得る非特異的な試薬がヒト血清中にないことを示す。Ａｂ−２８にｈＣＭＶ陽性血清またはＩｎｔｒａｔｅｃｔ（登録商標）を添加する場合、Ａｂ−２８および血清中和活性の両方の増強が観察された。血清中和活性は、Ａｂ−２８の存在下において約２０〜４０％増加し、Ａｂ−２８の中和能力は、ｈＣＭＶ陽性血清またはＩｎｔｒａｔｅｃｔ（登録商標）の添加後に約１５％増加した。
【０３０５】
実施例１６：  吸着後中和アッセイ
本発明の抗体が、細胞へのウイルス侵入の初期の段階をブロックし得るかどうかを決定するために、発明者らは、吸着後中和アッセイを実行した。中和アッセイの方法は、実施例２において記載されるものと同様としたが、最初に、ウイルスおよび細胞の膜の融合ではなくウイルス吸着のみを可能にするために、ＨＦＦおよびルシフェラーゼ発現ｈＣＭＶを４℃で１時間、インキュベートした。この吸着期間後に、吸着していないウイルスは、１×ＰＢＳを用いて洗浄した。抗体は、別々のプレートにおいて１５０μｇ／ｍｌの非常に高いＩｇＧ濃度〜５μｇ／ｍｌまで滴定し、次いで、あらかじめ吸着させたウイルス−細胞混合物に添加した。抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−２８、Ａｂ−０４、および対照抗体Ｃ２３（Ｔ１２３；親切にもＴｅｉｊｉｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｊａｐａｎからの贈与）をこの実験のために使用し、抗体はそれぞれ、あらかじめ吸着させたウイルス−細胞混合物と共に４℃で、３０、８０、または１２０分間、インキュベートした。ＡＤ−２特異的抗体Ｃ２３は、細胞へのウイルス侵入を阻害することが示されている（Ohizumi et al., 1992）。３０、８０、または１２０分間のインキュベーション期間後に、プレートはもう一度洗浄し、次いで、３７℃で４８時間、インキュベートした。この時点から、アッセイは、実施例２のように継続した。結果は、図１３において示され、以下のように要約される。３０分間のインキュベーション期間後に、少なくとも１００μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体は、ウイルス感染性の５０％の低下を達成するために必要とされた。他方、Ｃ２３は、３０分間のインキュベーション後に、５μｇ／ｍｌの非常に低い濃度でさえウイルス侵入を阻害するように見えた。８０分後に、２０μｇ／ｍｌのＡｂ−０２およびＡｂ−２８のみが、５０％の中和のために必要とされた。しかしながら、Ａｂ−０４については、５５μｇ／ｍｌが、ウイルス感染性を５０％中和するために必要とされた。対照抗体Ｃ２３の８０分間の曲線は、期待される結果を示さなかった。この抗体が、より長いインキュベーション後に、少なくとも同じくらい良好であった、そうでなければより良好であったことが期待されるであろう。また、平均値の標準誤差は、８０分間のインキュベーション期間でＣ２３について非常に分散しており、そのため、この時点は結果から除いた。１２０分間、抗体と、あらかじめ吸着させたウイルスをインキュベートする場合、たった約５〜１５μｇ／ｍｌのそれぞれの抗体またはＣ２３が、ウイルス感染性の５０％の低下に必要とされる。結論として、抗体Ａｂ−０２、Ａｂ−２８、およびＡｂ−０４は、既に吸着しているウイルスの細胞への侵入を予防することができる。
【０３０６】
実施例１７：  他のｇＢ特異的抗体との競合的中和アッセイ
中和および非中和抗体の間のｇＢエピトープ結合について競合は、ＡＤ−１特異的抗体について報告されている（Ohlin et al., 1993）。本発明の抗体および他のｇＢ特異的抗体の間の可能性のある競合的である、または相乗的でさえある効果を調査するために、競合的中和アッセイは、本発明の抗体の中和活性に対するＡＤ−１（ＩＴＣ５２）およびＡＤ−２特異的（ＩＴＣ８８）抗体の影響を決定するために実行した。これを行うために、一方の抗体を滴定し、他方の抗体は、その５０％中和活性のあたりの一定の濃度で添加した。これらの競合的中和アッセイは、抗体のそれぞれ：Ａｂ−１１、Ａｂ−１４、Ａｂ−１９、Ａｂ−２８、Ａｂ−０４、Ａｂ−４２を用いて行った。異なる２つのアプローチを比較し、それによって、試験抗体は、滴定し、ＩＴＣ５２もしくはＩＴＣ８８は、一定の濃度で添加したまたはＩＴＣ抗体は、滴定し、試験抗体は、一定の濃度で添加した。ＩＴＣ５２は非中和抗体であるので、それは、中和抗体ＩＴＣ８８を添加したのと同じ濃度である３μｇ／ｍｌの濃度で添加した。試験した他の抗体が同様に作用したので、Ａｂ−２８についてのデータのみを示す。また、代替のアプローチが同等の結果を示したので、１つのアプローチのみを示す、すなわち、一定の濃度でＡｂ−２８を残し、ＩＴＣ抗体を滴定する（図１４）。
【０３０７】
結果は、ＡＤ−１特異的抗体ＩＴＣ５２の高濃度の存在下において、Ａｂ−２８の中和活性のわずかな機能障害があるように見えることを示す。この効果は、試験したそれぞれの抗体について観察され、さらに独立した実験において再現した（データ示さず）。しかしながら、高濃度のＩＴＣ５２は、ＩＴＣ８８の中和活性を減少させないように見える。Ａｂ−２８およびＩＴＣ８８はともに、中和活性の改善をもたらした。これは、混合した場合とは対照的に、ＩＴＣ８８のみの第２のデータポイントで特に明らかである。Ａｂ−２８の存在下におけるＩＴＣ８８の中和活性の４０％の増加は、このポイントで観察され、Ａｂ−２８はまた、それだけよりも、ＩＴＣ８８により約１５％の中和の増加をも示す。
【０３０８】
異なるＡＤ−４特異的抗体およびＡＤ−１またはＡＤ−２−特異的抗体の間の潜在的な阻害性、相加的、または相乗的効果を分析する上記の実験に加えて、発明者らはまた、ＡＤ−４（ＤｏｍＩＩ）およびＡＤ−５（ＤｏｍＩ）特異的抗体の間で類似する効果を観察することができるかどうかを調査した。Ａｂ−２８（ＡＤ−４特異的）は、第１のウェルにおいて、５０：５０の比で、Ａｂ−５０またはＡｂ−４９（ＡＤ−５特異的）のいずれかと混合し、ルシフェラーゼ発現ｈＣＭＶを添加する前に１：２段階希釈を継続した。これらの抗体混合物の中和活性は、それぞれの抗体の単一の滴定と比較した（図１５）。ＡＤ−４およびＡＤ−５−特異的抗体の間のわずかな相加的効果のみが観察され、阻害性または相乗的効果は観察されなかった。この実験は、さらに２回繰り返し、同等の結果を伴った（データ示さず）。
【０３０９】
【表１９−１】
2013515469.tif 000024
【０３１０】
【表１９−２】
2013515469.tif 000025
【０３１１】
【表２０−１】
2013515469.tif 000026
【０３１２】
【表２０−２】
2013515469.tif 000027
【０３１３】
配列
結合メンバーのＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＣＤＲ配列を添付の配列表に示す。ここに、配列番号は下記の通り対応する。
1            SM5-1 VH ヌクレオチド
2            SM5-1 VH アミノ酸
3            SM5-1 VH CDR 1 aa
4            SM5-1 VH CDR 2 aa
5            SM5-1 VH CDR 3 aa
6            SM4-10 VH ヌクレオチド
7            SM4-10 VH アミノ酸
8            SM4-10 VH CDR 1 aa
9            SM4-10 VH CDR 2 aa
10            SM4-10 VH CDR 3 aa
11            SM6-5 VH ヌクレオチド
12            SM6-5 VH アミノ酸
13            SM6-5 VH CDR 1 aa
14            SM6-5 VH CDR 2 aa
15            SM6-5 VH CDR 3 aa
16            SM1-6 VH ヌクレオチド
17            SM1-6 VH アミノ酸
18            SM1-6 VH CDR 1 aa
19            SM1-6 VH CDR 2 aa
20            SM1-6 VH CDR 3 aa
21            SM3-1 VH ヌクレオチド
22            SM3-1 VH アミノ酸
23            SM3-1 VH CDR 1 aa
24            SM3-1 VH CDR 2 aa
25            SM3-1 VH CDR 3 aa
26            SM11-17 VH ヌクレオチド
27            SM11-17 VH アミノ酸
28            SM11-17 VH CDR 1 aa
29            SM11-17 VH CDR 2 aa
30            SM11-17 VH CDR 3 aa
31            SM11-21 VH ヌクレオチド
32            SM11-21 VH アミノ酸
33            SM11-21 VH CDR 1 aa
34            SM11-21 VH CDR 2 aa
35            SM11-21 VH CDR 3 aa
36            SM6-11 VH ヌクレオチド
37            SM6-11 VH アミノ酸
38            SM6-11 VH CDR 1 aa
39            SM6-11 VH CDR 2 aa
40            SM6-11 VH CDR 3 aa
41            SM4-3 VH ヌクレオチド
42            SM4-3 VH アミノ酸
43            SM4-3 VH CDR 1 aa
44            SM4-3 VH CDR 2 aa
45            SM4-3 VH CDR 3 aa
46            SM5-3 VH ヌクレオチド
47            SM5-3 VH アミノ酸
48            SM5-3 VH CDR 1 aa
49            SM5-3 VH CDR 2 aa
50            SM5-3 VH CDR 3 aa
51            SM5-9 VH ヌクレオチド
52            SM5-9 VH アミノ酸
53            SM5-9 VH CDR 1 aa
54            SM5-9 VH CDR 2 aa
55            SM5-9 VH CDR 3 aa
56            SM1-7 VH ヌクレオチド
57            SM1-7 VH アミノ酸
58            SM1-7 VH CDR 1 aa
59            SM1-7 VH CDR 2 aa
60            SM1-7 VH CDR 3 aa
61            SM1-8 VH ヌクレオチド
62            SM1-8 VH アミノ酸
63            SM1-8 VH CDR 1 aa
64            SM1-8 VH CDR 2 aa
65            SM1-8 VH CDR 3 aa
66            SM3-4 VH ヌクレオチド
67            SM3-4 VH アミノ酸
68            SM3-4 VH CDR 1 aa
69            SM3-4 VH CDR 2 aa
70            SM3-4 VH CDR 3 aa
71            SM6-23 VH ヌクレオチド
72            SM6-23 VH アミノ酸
73            SM6-23 VH CDR 1 aa
74            SM6-23 VH CDR 2 aa
75            SM6-23 VH CDR 3 aa
76            SM11-18 VH ヌクレオチド
77            SM11-18 VH アミノ酸
78            SM11-18 VH CDR 1 aa
79            SM11-18 VH CDR 2 aa
80            SM11-18 VH CDR 3 aa
81            SM11-19 VH ヌクレオチド
82            SM11-19 VH アミノ酸
83            SM11-19 VH CDR 1 aa
84            SM11-19 VH CDR 2 aa
85            SM11-19 VH CDR 3 aa
86            SM11-20 VH ヌクレオチド
87            SM11-20 VH アミノ酸
88            SM11-20 VH CDR 1 aa
89            SM11-20 VH CDR 2 aa
90            SM11-20 VH CDR 3 aa
91            SM5-1 VL ヌクレオチド
92            SM5-1 VL アミノ酸
93            SM5-1 VL CDR 1 aa
94            SM5-1 VL CDR 2 aa
95            SM5-1 VL CDR 3 aa
96            SM4-10 VL ヌクレオチド
97            SM4-10 VL アミノ酸
98            SM4-10 VL CDR 1 aa
99            SM4-10 VL CDR 2 aa
100            SM4-10 VL CDR 3 aa
101            SM6-5 VL ヌクレオチド
102            SM6-5 VL アミノ酸
103            SM6-5 VL CDR 1 aa
104            SM6-5 VL CDR 2 aa
105            SM6-5 VL CDR 3 aa
106            SM1-6 VL ヌクレオチド
107            SM1-6 VL アミノ酸
108            SM1-6 VL CDR 1 aa
109            SM1-6 VL CDR 2 aa
110            SM1-6 VL CDR 3 aa
111            SM3-1 VL ヌクレオチド
112            SM3-1 VL アミノ酸
113            SM3-1 VL CDR 1 aa
114            SM3-1 VL CDR 2 aa
115            SM3-1 VL CDR 3 aa
116            SM5-6 VL ヌクレオチド
117            SM5-6 VL アミノ酸
118            SM5-6 VL CDR 1 aa
119            SM5-6 VL CDR 2 aa
120            SM5-6 VL CDR 3 aa
121            SM6-48 VH ヌクレオチド
122            SM6-48 VH アミノ酸
123            SM6-48 VH CDR 1 aa
124            SM6-48 VH CDR 2 aa
125            SM6-48 VH CDR 3 aa
126            SM4-3 VL ヌクレオチド
127            SM4-3 VL アミノ酸
128            SM4-3 VL CDR 1 aa
129            SM4-3 VL CDR 2 aa
130            SM4-3 VL CDR 3 aa
131            SM5-9 VL ヌクレオチド
132            SM5-9 VL アミノ酸
133            SM5-9 VL CDR 1 aa
134            SM5-9 VL CDR 2 aa
135            SM5-9 VL CDR 3 aa
136            SM4-12 VL ヌクレオチド
137            SM4-12 VL アミノ酸
138            SM4-12 VL CDR 1 aa
139            SM4-12 VL CDR 2 aa
140            SM4-12 VL CDR 3 aa
141            SM5-5 VL ヌクレオチド
142            SM5-5 VL アミノ酸
143            SM5-5 VL CDR 1 aa
144            SM5-5 VL CDR 2 aa
145            SM5-5 VL CDR 3 aa
146            SM3-2 VL ヌクレオチド
147            SM3-2 VL アミノ酸
148            SM3-2 VL CDR 1 aa
149            SM3-2 VL CDR 2 aa
150            SM3-2 VL CDR 3 aa
151            SM3-4 VL ヌクレオチド
152            SM3-4 VL アミノ酸
153            SM3-4 VL CDR 1 aa
154            SM3-4 VL CDR 2 aa
155            SM3-4 VL CDR 3 aa
156            SM4-1 VL ヌクレオチド
157            SM4-1 VL アミノ酸
158            SM4-1 VL CDR 1 aa
159            SM4-1 VL CDR 2 aa
160            SM4-1 VL CDR 3 aa
161            SM4-5 VL ヌクレオチド
162            SM4-5 VL アミノ酸
163            SM4-5 VL CDR 1 aa
164            SM4-5 VL CDR 2 aa
165            SM4-5 VL CDR 3 aa
166            SM4-7 VL ヌクレオチド
167            SM4-7 VL アミノ酸
168            SM4-7 VL CDR 1 aa
169            SM4-7 VL CDR 2 aa
170            SM4-7 VL CDR 3 aa
171            SM6-6 VL ヌクレオチド
172            SM6-6 VL アミノ酸
173            SM6-6 VL CDR 1 aa
174            SM6-6 VL CDR 2 aa
175            SM6-6 VL CDR 3 aa
176            SM6-51 VL ヌクレオチド
177            SM6-51 VL アミノ酸
178            SM6-51 VL CDR 1 aa
179            SM6-51 VL CDR 2 aa
180            SM6-51 VL CDR 3 aa
181 VH FWR1
182 VH FWR3
183 VH FWR3 (*02,*03,*04)
184 VH FWR4 (*01)
185 VL FWR1
186 VL FWR2
187 VL FWR3
188 IGHJ6*02 aa
189 IGHJ3*02 aa
190 IGHJ5*01 aa
191 IGHJ5*02 aa
192 IGLJ1*01 aa
193 IGLJ2*01 aa
194 IGLJ3*01 aa
195 IGLG3*02 aa
196 プライマー 179-Je
197 合成ペプチド
198 プライマー 074-Je
199 プライマー 075-Je
200 プライマー 076-Je
201 プライマー 150-Je
202 プライマー 151-Je
203 プライマー 077-Je
204 プライマー 078-Je
205 プライマー 007-Je
206 プライマー 152-Je
207 プライマー 153-Je
208 プライマー 066-Je
209 プライマー 067-Je
210 プライマー 068-Je
211 プライマー 069-Je
212 プライマー 070-Je
213 プライマー 258-Je
214 プライマー 259-Je
215 プライマー 260-Je
216 プライマー 261-Je
217 プライマー 262-Je
218 プライマー 263-Je
219 プライマー 264-Je
220 プライマー 265-Je
221 プライマー 266-Je
222 プライマー 267-Je
223 プライマー 84-B
224 プライマー 155-Je
225 プライマー 85-B
226 プライマー 161-Je
227 プライマー 162-Je
228 プライマー 154-Je
229 プライマー 001-Je
230 プライマー 158-Je
231 プライマー 003-Je
232 プライマー 159-Je
233 プライマー 156-Je
234 プライマー 157-Je
235 プライマー 062-Je
236 プライマー 063-Je
237 プライマー 065-Je
238 プライマー 064-Je
239 gB strain AD169
240 gB strain Towne
241 SM10 VH ヌクレオチド
242 SM10 VH アミノ酸
243 SM10 VH CDR 1 aa
244 SM10 VH CDR 2 aa
245 SM10 VH CDR 3 aa
246 SM12 VH ヌクレオチド
247 SM12 VH アミノ酸
248 SM12 VH CDR 1 aa
249 SM12 VH CDR 2 aa
250 SM12 VH CDR 3 aa
251 2C2 VH ヌクレオチド
252 2C2 VH アミノ酸
253 2C2 VH CDR 1 aa
254 2C2 VH CDR 2 aa
255 2C2 VH CDR 3 aa
256 1G2 VH ヌクレオチド
257 1G2 VH アミノ酸
258 1G2 VH CDR 1 aa
259 1G2 VH CDR 2 aa
260 1G2 VH CDR 3 aa
261 SM10 VL ヌクレオチド
262 SM10 VL アミノ酸
263 SM10 VL CDR 1 aa
264 SM10 VL CDR 2 aa
265 SM10 VL CDR 3 aa
266 SM12 VL ヌクレオチド
267 SM12 VL アミノ酸
268 SM12 VL CDR 1 aa
269 SM12 VL CDR 2 aa
270 SM12 VL CDR 3 aa
271 2C2 VL ヌクレオチド
272 2C2 VL アミノ酸
273 2C2 VL CDR 1 aa
274 2C2 VL CDR 2 aa
275 2C2 VL CDR 3 aa
276 1G2 VL ヌクレオチド
277 1G2 VL アミノ酸
278 1G2 VL CDR 1 aa
279 1G2 VL CDR 2 aa
280 1G2 VL CDR 3 aa
281 IGHV4-39 FWR1
282 IGHV4-39 FWR2
283 IGHV4-39 FWR3
284 IGHV4-59 FWR1
285 IGHV4-59 FWR2
286 IGHV4-59 FWR3
287 IGKV2D-28 FWR1
288 IGKV2D-28 FWR2
289 IGKV2D-28 FWR3
290 IGKV1D-33 FWR1
291 IGKV1D-33 FWR2
292 IGKV1D-33 FWR3
293 IGLV1-47 FW1
294 IGLV1-47 FW2
295 IGLV1-47 FW3
296 プライマー 5’Ig L VH 4/6
297 プライマー 5’Ig L Vκ 1/2
298 プライマー 5’Ig L Vλ 3
299 プライマー 5’Ig L Vλ 1
300 プライマー 3’Ig Cγ CH 1
301 プライマー 3’Ig Cκ 543
302 プライマー 3’Ig Cλ 鎖
303 プライマー 5’Ig AgeI VH4
304 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 2-24
305 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 2-28
306 プライマー 5’Ig AgeI Vλ 3
307 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 1-5
308 プライマー 5’Ig AgeI VH 4-39
309 プライマー 5’Ig AgeI Vλ 1
310 プライマー 3’Ig Sall JH
311 プライマー 3’Ig BsiWI Jκ 2
312 プライマー 3’Ig Sall JH 6
313 プライマー 3’Ig Bsi WIJκ 1/4
314 プライマー 3’Ig XhoI Cλ
315 プライマー 5’無し
316 プライマー 3’IgG 内部
317 プライマー 3’Cκ494
318 プライマー 3’Cλ
319 合成リンカー
320 gpUL132 シグナル配列
321 HA エピトープタグ
【０３１４】
参考文献
上記のどこかでの引用を含め、本明細書のどこかで引用した全ての参考文献は、出典明示により、全体として、全ての目的で、本明細書の一部とされる。
【０３１５】
【表２１】
2013515469.tif 000028
2013515469.tif 000029
2013515469.tif 000030
2013515469.tif 000031
2013515469.tif 000032
2013515469.tif 000033
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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