(57)【要約】  本願は、ドメインIIIと少なくとも１の更なるドメインとを含むか、これらのドメインからなり、天然のアルブミン誘導体又は変異体ではない、アルブミン誘導体又は変異体を開示する。本誘導体はコンジュゲートや融合ポリペプチド等に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片は、アルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体と、少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体とを含み、或いはアルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体と、少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体とからなり、ここで前記の誘導体又は変異体は、天然アルブミン誘導体又は変異体ではない、アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片又は融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記の天然の誘導体又は変異体が、ヒト；霊長類、例えばチンパンジー、ゴリラ又はマカク；ウサギ；齧歯類、例えばマウス、ラット及びハムスター；ウシ；ウマ類、例えばウマ又はロバ；ヤギ；ヒツジ；イヌ；モルモット；ニワトリ；並びにブタの何れかに由来する野生型アルブミンである、請求項１に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片又は融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記のアルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体が、ヒト血清アルブミン；霊長類血清アルブミン、例えばチンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン又はマカク血清アルブミン；ウサギ血清アルブミン；齧歯類血清アルブミン、例えばマウスアルブミン、ラット血清アルブミン及びハムスター血清アルブミン；ウシ血清アルブミン；ウマ類血清アルブミン、例えばウマ血清アルブミン又はロバ血清アルブミン；ヤギ血清アルブミン；ヒツジ血清アルブミン；イヌ血清アルブミン；モルモット血清アルブミン；ニワトリ血清アルブミン；並びにブタ血清アルブミンの何れかに由来する、請求項１又は２に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記のアルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体が、配列番号３１又は配列番号１のドメインIIIに対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記のドメインIII又はその誘導体若しくは変異体が、配列番号３１又は配列番号１のアミノ酸３８１〜５８５に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項４に記載のアルブミン誘導体又は変異体。
【請求項６】
前記の少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体が、ドメインＩ、ドメインII及びドメインIIIから選択される、請求項１〜５の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記の少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体が、ヒト血清アルブミン；霊長類血清アルブミン、例えばチンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン又はマカク血清アルブミン；齧歯類血清アルブミン、例えばウサギ血清アルブミン、マウスアルブミン及びラット血清アルブミン；ウシ血清アルブミン；ウマ類血清アルブミン；ロバ血清アルブミン；ハムスター血清アルブミン；ヤギ血清アルブミン；ヒツジ血清アルブミン；イヌ血清アルブミン；モルモット血清アルブミン；ニワトリ血清アルブミン；並びにブタ血清アルブミンの何れかに由来する、請求項６に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記のアルブミン誘導体又は変異体が、ヒト血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにウサギ血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号２５）、ウサギ血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにヒト血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号２６）、ヒツジ血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにヒト血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号２７）、ヒト血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにマウス血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号２９）、ヒト血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにヒツジ血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号２８）、又はマウス血清アルブミン由来のドメインＩ及びII並びにヒト血清アルブミン由来のドメインIII（例えば配列番号３０）からなる、請求項７に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記の少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体が、その親アルブミンの対応のドメインに対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項７に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記の少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体が、配列番号３１又は配列番号１を有するＨＳＡの対応のドメインに対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項８に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、又は融合ポリペプチドが、
（ｉ）ヒト血清アルブミンドメインＩ及びヒト血清アルブミンドメインIIからなる分子（例えば配列番号２０）、
（ii）ヒト血清アルブミンドメインII及びヒト血清アルブミンドメインIIIからなる分子（例えば配列番号２１）、
（iii）ヒト血清アルブミンドメインＩ及びヒト血清アルブミンドメインIIIからなる分子（例えば配列番号２２）、並びに
（iv）２コピーのヒト血清アルブミンドメインIIIからなる分子（例えば配列番号２４）
から選択されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる、請求項１〜１０の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、又は融合ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１のドメインIIIが、配列番号３１又は配列番号１（ＨＳＡ）内の573、500、550、417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から選択される位置に対応する位置に、１又は２以上の置換を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１（ＨＳＡ）内の位置に対応する位置における上記１又は２以上の置換が、K573Y, W, P, H, F, V, I, T, N, S, G, M, C, A, E, Q, R, L, D, K500E, G, D, A, S, C, P, H, F, N, W, T, M, Y, V, Q, L, I, R Q417A, H440A, H464Q, E492G. D494N,Q,A, E495Q,A, T496A, D494E+Q417H, D494N+T496A, E492G+V493P, P499A, E501A,Q, N503H,K, H510Q, H535Q, K536A, P537A, K538A, K541G,D, D550E,N, E492G+K573P,A,又はE492G/N503H/K573Pから選択される、請求項１２に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１４】
１又は２以上のチオール基を分子の表面に形成する１又は２以上の更なる変異を含む、請求項１〜１３の何れかに記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号３１又は配列番号１のL585C, D1C, A2C, D562C, A364C, A504C, E505C, T79C, E86C, D129C, D549C, A581C, D121C, E82C, S270C, A578C, L595LC, D1DC, A2AC, D562DC, A364AC, A504AC, E505EC, T79TC, E86EC, D129DC, D549DC, A581AC, A581AC, D121DC, E82EC, S270SC, A579AC, C360*, C316*, C75*, C168*, C558*, C361*, C91*, C124*, C169*及びC567*に対応する置換からなる群より選択される置換を有する、請求項１４に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片と、前記アルブミン部位に結合した、治療、診断、又は別の有用性を有する部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１４に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドをコードし、好ましくはプラスミド又は発現コンストラクト内に含まれてなる核酸。
【請求項１８】
請求項１７の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５の何れか一項に記載のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド又はアソシエートを含む組成物、好ましくは医薬組成物。
【請求項２０】
前記のアルブミン変異体若しくは誘導体、その融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物が、（ｉ）天然ＨＳＡ、及び／又は、天然ＨＳＡを含む融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物よりも長い血漿中半減期を有するか、（ii）天然ＨＳＡ、及び／又は、天然ＨＳＡを含む融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物よりも短い血漿中半減期を有する、請求項１〜１９の何れか一項に記載のアルブミン変異体若しくは誘導体、その融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物、或いは、前記変異体、誘導体又は融合体をコードする核酸又は宿主細胞。
【請求項２１】
前記アルブミン変異体又は誘導体の融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物が、（ｉ）天然ＨＳＡを含むアルブミン融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物よりも長い血漿中半減期を有するか、（ii）天然ＨＳＡを含むアルブミン融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物よりも短い血漿中半減期を有する、請求項１〜２０の何れか一項に記載のアルブミン変異体若しくは誘導体、その融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物、或いは、前記融合体をコードする核酸又は宿主細胞。
【請求項２２】
前記の融合体、コンジュゲート、又はアソシエートが、
（ｉ）4-1BBリガンド、５−ヘリックス、ΑヒトC-Cケモカイン、ΑヒトL105ケモカイン、ΑヒトL105ケモカイン、名称huL105_3.、γ−インターフェロン（ＭＩＧ）により誘導されるΑモノカイン、Α部分CXCR4Bタンパク質、Α血小板塩基性タンパク質（platelet basic protein：ＰＢＰ）、α１−抗トリプシン、..ACRP-30ホモログ；補体成分C1q C、アデノイド発現型ケモカイン（Adenoid-expressed chemokine：ＡＤＥＣ）、ａＦＧＦ；ＦＧＦ−１、ＡＧＦ、ＡＧＦタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンギオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシン（collapsin）特異抗体、アンチスタシン（antistasin）、抗ＴＧＦβファミリー抗体、抗トロンビンIII、APM-1；ACRP-30；ファモキシン（Famoxin）、アポリポタンパク質種、アリールスルファターゼＢ、b57タンパク質、ＢＣＭＡ、Β−トロンボグロブリンタンパク質（β−ＴＧ）、ｂＦＧＦ；ＦＧＦ２、血液凝固因子、ＢＭＰ プロセシング酵素フーリン（Furin）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、骨形態形成タンパク質−２、カルシトニン、カルパイン−１０ａ、カルパイン−１０ｂ、カルパイン−１０ｃ、ガンワクチン、カルボキシペプチダーゼ、Ｃ−Ｃケモカイン、MCP2、CCR5変異体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受容体タンパク質、CD20 Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30リガンド、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52 Mab、ケルベロス（Cerebus）タンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカインhＩＬ−8、ケモカインhMCP1、ケモカインhMCP1a、ケモカインhMCP1b、ケモカインhMCP2、ケモカインhMCP3、ケモカインhSDF1b、ケモカインMCP-4、ケモカインTECK及びTECK変異体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M1全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M10全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M3、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M8全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M9全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-414全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-426全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-M2 全長及び成熟体、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、c-kitリガンド；ＳＣＦ；マスト細胞増殖因子；ＭＧＦ；線維肉腫由来幹細胞因子、ＣＮＴＦ及びその断片（例えばCNTFAx15'（Axokine(商標)））、凝固因子（前駆体及び活性体）、コラーゲン、補体C5 Mab、結合組織活性化タンパク質−III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXCケモカイン受容体３、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、ダーベポエチン、名称エクソダス（exodus）、名称huL105_7.、DＩＬ−40、Dnase、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ受容体Mab、ENA-78、エンドスタチン（Endostatin）、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質−７８、ＥＰＯ受容体；ＥＰＯＲ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣物、ユートロピン（Eutropin）、エクソダス（exodus）タンパク質、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第Ｘ因子及び第XIII因子、FASリガンド阻害タンパク質（DcR3）、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；線維芽細胞増殖因子相同因子（Fibroblast growth factor homologous factor）−１、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；ゲロニン（gelonin）、HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；ヘパリン結合性分泌形質転換因子（Heparin binding secreted transforming factor）−２、FGF-8、FGF-9；グリア活性���因子、フィブリノゲン、flt-1、flt-3 リガンド、卵胞刺激ホルモンαサブユニット、卵胞刺激ホルモンβサブユニット、ホリトロピン、フラクタルカイン（Fractalkine）、断片化筋原線維タンパク質トロポニンＩ（fragment. myofibrillar protein トロポニンI）、ＦＳＨ、ガラクトシダーゼ、ガレクチン−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ−１、遺伝子療法薬、グリオーマ由来増殖因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン（Glycodelin）−Ａ；プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質−２（Granulocyte chemotactic protein-2：ＧＣＰ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、増殖関連オンコジーン−α（Growth related oncogene-alpha：ＧＲＯ−α）、増殖関連オンコジーン−β（ＧＲＯ−β）、増殖関連オンコジーン-γ（ＧＲＯ−γ）、hAPO-4；TROY、ｈＣＧ、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ワクチン、HER2受容体Mab、ヒルジン（hirudin）、ＨＩＶ gp120、ＨＩＶ gp41、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶプロテアーゼ阻害ペプチド、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、ＨＰＶワクチン、
ヒト6CKineタンパク質、ヒトAct-2タンパク質、ヒト脂質生成阻害因子、ヒトＢ細胞刺激因子−２受容体、ヒトβ−ケモカインH1305（MCP-2）、ヒトC-CケモカインDGWCC、ヒトCCケモカインELCタンパク質、ヒトCC型ケモカインインターロイキンC、ヒトCCC3タンパク質、ヒトCCF18ケモカイン、ヒトCC型ケモカインタンパク質、名称ＳＬＣ（secondary lymphoid chemokine：二次リンパケモカイン）、ヒトケモカインβ-8短小型、ヒトケモカインC10、ヒトケモカインCC-2、ヒトケモカインCC-3、ヒトケモカインCCR-2、ヒトケモカインCkβ-7、ヒトケモカインENA-78、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカインGROα、ヒトケモカインGROα、ヒトケモカインGROβ、ヒトケモカインHCC-1、ヒトケモカインHCC-1、ヒトケモカインI-309、ヒトケモカインIP-10、ヒトケモカインL105_3、ヒトケモカインL105_7、ヒトケモカインＭＩＧ、ヒトケモカインＭＩＧ-βタンパク質、ヒトケモカインMIP-1α、ヒトケモカインMIP1β、ヒトケモカインMIP-3α、ヒトケモカインMIP-3β、ヒトケモカインPF4、ヒトケモカインタンパク質331D5、ヒトケモカインタンパク質61164、ヒトケモカイン受容体CXCR3、ヒトケモカインSDF1α、ヒトケモカインSDF1β、ヒトケモカインZSIG-35、ヒトChr19Kineタンパク質、ヒトCKβ-9、ヒトCKβ-9、ヒトCX3C 111アミノ酸ケモカイン、ヒトDNAX インターロイキン-40、ヒトDVic-1 C-Cケモカイン、ヒトEDIRF Iタンパク質配列、ヒトEDIRF IIタンパク質配列、ヒト好酸球CC型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球発現型ケモカイン（eosinophil-expressed chemokine：ＥＥＣ）、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＩ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットC、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＩタンパク質、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＴ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＴ、ヒト胎児脾臓発現型ケモカイン、ＦＳＥＣ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体、ヒトgro-αケモカイン、ヒトgro-βケモカイン、ヒトgro-γケモカイン、ヒトＩＬ−１6タンパク質、ヒトＩＬ−１RD10タンパク質配列、ヒトＩＬ−１RD9、ヒトＩＬ−5受容体α鎖、ヒトＩＬ−6受容体、ヒトＩＬ−8受容体タンパク質hIL8RA、ヒトＩＬ−8受容体タンパク質hIL8RB、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体＃３、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体断片、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体断片＃３、ヒトインターロイキン１δ、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１８、ヒトインターロイキン１８誘導体、ヒトインターロイキン−１β前駆体、ヒトインターロイキン−１β前駆体、ヒトインターロイキン−１受容体補助タンパク質、ヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストβ、ヒトインターロイキン−１タイプ３受容体、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１１受容体、ヒトインターロイキン−１２ ４０ｋＤサブユニット、ヒトインターロイキン−１２ β-1受容体、ヒトインターロイキン−１２ β-2受容体、ヒトインターロイキン−１２ p35タンパク質、ヒトインターロイキン−１２ p40タンパク質、ヒトインターロイキン−１２受容体、ヒトインターロイキン−１３ α受容体、ヒトインターロイキン−１３ β受容体、ヒトインターロイキン−１５、クローンP1由来ヒトインターロイキン−１５受容体、ヒトインターロイキン−１７受容体、ヒトインターロイキン−１８タンパク質（ＩＬ−１８）、ヒトインターロイキン−３、ヒトインターロイキン−３受容体、ヒトインターロイキン−３変異体、ヒトインターロイキン−４受容体、ヒトインターロイキン−５、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−8）、ヒト細胞内ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ヒトＩＰ−１０及びＨＩＶ−１ gp120 超可変領域融合タンパク質、ヒトＩＰ−１０及びヒトMuc-1コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節ケモカイン（liver and activation regulated chemokine：ＬＡＲＣ）、ヒトLkn-1全長及び成熟タンパク質、ヒト乳房関連ケモカイン（mammary associated chemokine：ＭＡＣＫ）タンパク質全長及び成熟体、ヒト成熟ケモカインCkβ-7、ヒト成熟gro-α、ヒト成熟gro-γポリペプチド（敗血症治療用）、ヒトMCP-3及びヒトMuc-1コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒトMI10タンパク質、ヒトMI1Aタンパク質、ヒト単球走化性因子hMCP-1、ヒト単球走化性因子hMCP-3、ヒト単球走化性前駆タンパク質（monocyte chemotactic proprotein：ＭＣＰＰ）配列、ヒトニューロタクチン（neurotactin）ケモカイン様ドメイン、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインH174、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインIP10、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインMig、ヒトPAI-1ミュータント、ＩＬ−１6活性を有するヒトタンパク質、ＩＬ−１6活性を有するヒトタンパク質、ヒト二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトSISDタンパク質、ヒトSTCP-1、ヒト間質細胞由来ケモカイン、SDF-1、ヒトＴ細胞混合リンパ球反応性発現型ケモカイン（T cell mixed lymphocyte reaction expressed chemokine：ＴＭＥＣ）、ヒト胸腺及び活性化調節サイトカイン（thymus and activation regulated cytokine：ＴＡＲＣ）、ヒト胸腺発現型、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−β（LT-α）、ヒトタイプCCケモカインエオタキシン３タンパク質配列、ヒトタイプIIインターロイキン−１受容体、ヒト野生型インターロイキン−４（ｈＩＬ−４）タンパク質、ヒトZCHEMO-8タンパク質、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体及びその断片、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体及びその断片、
ヒアルロニダーゼ、ＩＣＥ １０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ ２０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ ２２ｋＤサブユニット、イズロン酸-2-スルファターゼ、イズロニダーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１阻害剤（ＩＬ−１ｉ）、ＩＬ−１成熟体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１１、ＩＬ−１１、ＩＬ−１2 p40サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、ＩＬ−１９、ＩＬ−１ｉ断片、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、ＩＬ−２１（ＴＩＦ）、ＩＬ−３含有融合タンパク質、ＩＬ−３ミュータントタンパク質、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ−４ムテイン（mutein）、ＩＬ−４ムテインY124G、ＩＬ−４ムテインY124X、ＩＬ−４ムテイン類、Ｉｌ−５受容体、ＩＬ−６、Ｉｌ−６受容体、ＩＬ−７受容体クローン、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−９成熟タンパク質変異体（Met117バージョン）、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子又は何れかの断片（例えば小モジュール免疫薬(商標)（small modular immunopharmaceutical：ＳＭＩＰ）又はdAb、Fab'断片、F(ab')2、scAb、scFv又はscFv断片）、例えば（これに限定されるものではないが）プラスミノーゲン、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インシュリン、インシュリン様増殖因子、インテグリンMab、インターαトリプシン阻害剤、インターαトリプシン阻害剤、インターフェロンγ誘導性タンパク質（IP-10）、インターフェロン類（例えばインターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種等）、インターフェロン（例えばインターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種等）、インターロイキン６、インターロイキン８（ＩＬ−８）受容体、インターロイキン８受容体Ｂ、インターロイキン−１α、インターロイキン−２受容体アソシエートｄタンパク質p43、インターロイキン−３、インターロイキン−４ムテイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）タンパク質、インターロイキン−９、インターロイキン−９（ＩＬ−９）成熟タンパク質（Thr117バージョン）、インターロイキン（例えばＩＬ１０、ＩＬ１１及びＩＬ２等）、インターロイキンｓ（例えばＩＬ１０、ＩＬ１１及びＩＬ２等）、日本脳炎ワクチン、カリクレイン阻害剤、ケラチノサイト増殖因子、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えばアプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質及び国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの等、アルブミン融合の有無によらず）、クニッツドメインタンパク質（例えばアプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質及び国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの等、アルブミン融合の有無によらず）、ＬＡＣＩ、ラクトフェリン、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質II、レプチン、肝臓発現型ケモカイン−１（ＬＶＥＣ−１）、肝臓発現型ケモカイン−２（ＬＶＥＣ−２）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、黄体化ホルモン、ライム病（Lyme）ワクチン、リンホタクチン（Lymphotactin）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ（n+1）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ−eyfy、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ−yl、マクロファージ由来ケモカイ���、ＭＤＣ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マスピン；プロテアーゼ阻害剤５、ＭＣＰ−１受容体、ＭＣＰ−１ａ、ＭＣＰ−１ｂ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４受容体、Ｍ−ＣＳＦ、メラノーマ阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Met117ヒトインターロイキン９、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−γ、ＭＩＲＡＰ、修飾型ランテス（Modified Rantes）、モノクローナル抗体、MP52、ミュータントインターロイキン６ S176R、筋原線維収縮性タンパク質トロポニンＩ、ナトリウム利尿ペプチド、神経増殖因子−β、神経増殖因子−β２、ニューロピリン（Neuropilin）−１、ニューロピリン−２、ニューロタクチン（Neurotactin）、ニューロトロフィン（Neurotrophin）−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−４ａ、ニューロトロフィン−４ｂ、ニューロトロフィン−４ｃ、ニューロトロフィン−４ｄ、好中球活性化ペプチド−２（Neutrophil activating peptide-2：ＮＡＰ−２）、ＮＯＧＯ−６６受容体、ＮＯＧＯ−Ａ、ＮＯＧＯ−Ｂ、ＮＯＧＯ−Ｃ、新規β-ケモカイン、名称ＰＴＥＣ、Ｎ末端修飾ケモカインGroHEK/hSDF-1α、Ｎ末端修飾型ケモカインGroHEK/hSDF-1β、Ｎ末端修飾型ケモカインmet-hSDF-1α、Ｎ末端修飾型ケモカインmet-hSDF-1β、ＯＰＧＬ、骨原性タンパク質−１；ＯＰ−１；ＢＭＰ−７、骨原性タンパク質−２、ＯＸ４０；ＡＣＴ−４、ＯＸ４０Ｌ、オキシトシン（ニューロフィジンＩ）、副甲状腺ホルモン、パッチ型、パッチ型−２、ＰＤＧＦ−Ｄ、百日咳トキソイド、下垂体発現型ケモカイン（Pituitary expressed chemokine：ＰＧＥＣ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子−２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１；PAI-1、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２；ＰＡＩ−２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２；ＰＡＩ−２、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Bv-sis、血小板由来増殖因子前駆体Ａ、血小板由来増殖因子前駆体Ｂ、血小板Mab、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、敗血症治療用ポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ミラノ」（milano）変異体、プレプロアポリポタンパク質「パリ」（paris）変異体、プレトロンビン、霊長類CCケモカイン「ILINCK」、霊長類CXCケモカイン「IBICK」、プロインシュリン、プロラクチン、プロラクチン２、プロサプチド（prosaptide）、プロテアーゼ阻害ペプチド、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTESペプチド、RANTES受容体、組換インターロイキン-16、レジスチン（Resistin）、レストリクトシン（restrictocin）、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン（ricin）、ロタウイルスワクチン、ＲＳＶ Mab、サポリン、サルシン（sarcin）、分泌及び膜貫通ポリペプチド、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエステラーゼ、血清タンパク質（例えば血液凝固因子等）、溶解性ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質−３、溶解性ＶＥＧＦ受容体、幹細胞阻害因子、ブドウ球菌（Straphylococcus）ワクチン、間質由来因子−１α、間質由来因子−１β、サブスタンスＰ（タキキニン）、T1249ペプチド、T20ペプチド、T4エンドヌクレアーゼ、TACI、Tarc、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Thr117ヒトインターロイキン９、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体１、トロンボポエチン誘導体２、トロンボポエチン誘導体３、トロンボポエチン誘導体４、トロンボポエチン誘導体５、トロンボポエチン誘導体６、トロンボポエチン誘導体７、胸腺発現型ケモカイン（Thymus expressed chemokine：ＴＥＣＫ）、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝固ペプチド、Tim-1タンパク質、ＴＮＦ−α前駆体、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−ＲII；ＴＮＦ p75受容体；デス（Death）受容体、tPA、トランスフェリン、形質転換増殖因子β、トロポニンペプチド、切断型単球走化性タンパク質２（６−７６）、切断型単球走化性タンパク質２（６−７６）、切断型RANTESタンパク質（３−６８）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレッシン（ニューロフィジンII）、ＶＥＧＦ R-3；flt-4、ＶＥＧＦ受容体；KDR；flk-1、ＶＥＧＦ-１１０、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１３８、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６２、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８２、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ；ＶＥＧＦ−Ｘ、フォン・ヴィルブラント因子、野生型単球走化性タンパク質２、野生型単球走化性タンパク質２、ＺＴＧＦ−β９；
（ii）化学療法薬、例えば：１３−シス−レチノイン酸、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン（Azacitidine）、５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、６−メルカプトプリン、６−ＭＰ、６−ＴＧ、６−チオグアニン、Ａ、アブラキサン（Abraxane）、アキュテイン（Accutane）（登録商標）、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（Adrucil）（登録商標）、アグリリン（Agrylin）（登録商標）、アラ−コート（Ala-Cort）（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ALIMTA）、アリトレチノイン（Aliトレチノイン）、アルカバン−ＡＱ（Alkaban-AQ）（登録商標）、アルケラン（Alkeran）（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン（Altretamine）、アメトプテリン、アミホスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（Anandron）（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ara-C、アラネスプ（Aranesp）（登録商標）、アレディア（Aredia）（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（Arranon）（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ATRA、アバスチン（Avastin）（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン、ベクザー（BEXXAR）（登録商標）、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、ブレノキサン（Blenoxane）（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（Busulfex）（登録商標）、C225、カルシウムロイコボリン、キャンパス（Campath）（登録商標）、カンプトサール（Camptosar）（登録商標）、カンプトセシン−１１、カペシタビン、キャラック（Carac）(商標)、カルボプラチン、カルマスティン、カルマスティンウエハー、カソデックス（Casodex）（登録商標）、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、セルビジン（Cerubidine）（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム（Citrovorum）因子、クラドリビン（Cladribine）、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、CPT-11、シクロホスファミド、シタドレン（Cytadren）（登録商標）、シタラビン、リポゾーム化シタラビン、シトサール−Ｕ（Cytosar-U）（登録商標）、シトキサン（Cytoxan）（登録商標）、ダカルバジン、ダコゲン（Dacogen）、ダクチノマイシン、ダーベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、リポソーム化ダウノルビシン、ダウノキソーム（DaunoXome）（登録商標）、デカドロン（Decadron）、デシタビン（Decitabine）、Δ−コーテフ（Delta-Cortef）（登録商標）、デルタゾン（Deltasone）（登録商標）、デニロイキンジフチトクス、デポサイト（DepoCyt）(商標)、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デキサゾン（Dexasone）、デクスラゾキサン（Dexrazoxane）、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ディオデクス（Diodex）、ドセタキセル、ドキシル（Doxil）（登録商標）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、リボゾーム化ドキソルビシン、ドロキシア（Droxia）(商標)、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−ドーム（DTIC-Dome）（登録商標）、デュラローン（Duralone）（登録商標）、エフデックス（Efudex）（登録商標）、エリガード(商標)、エレンス（Ellence）(商標)、エロキサチン(商標)、エルスパー（Elspar）（登録商標）、エムサイト（Emcyt）（登録商標）、エピルビシン、エポエチンα、エルビタックス(商標)、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール（Ethyol）、エトポホス（Etopophos）（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（Eulexin）（登録商標）、エビスタ（Evista）（登録商標）、エキセメスタン、フェアストン（Fareston）（登録商標）、フェソロデックス（Faslodex）（登録商標）、フェマーラ（登録商標）、フィルグラスチム（Filgrastim）、フロクスウリジン（Floxuridine）、フルダラ（Fludara）（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレクス（Fluoroplex）（登録商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン（Fluoxymesterone）、フルタミド（Flutamide）、フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Gemtuzumab ozogamicin）、ジェムザール（登録商標）、グリーベック(商標)、グリアデル（Gliadel）（登録商標）・ウエハー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハロテスチン（Halotestin）（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール（Hexadrol）、ヘキサレン（Hexalen）（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（Hycamtin）（登録商標）、ハイドレア（Hydrea）（登録商標）、酢酸ヒドロコート（Hydrocort Acetate）（登録商標）、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ハイドロコートン（Hydrocortone Phosphate）、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、イフェックス（Ifex）（登録商標）、ＩＦＮ−α、イホスファミド、ＩＬ−１1、ＩＬ−2、メシル酸イマチニブ、イミダゾール・カルボキシアミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂ）、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ（Kidrolase）（登録商標）、ラナコート（Lanacort）（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン（Leukeran）、ロイキン（Leukine）(商標)、ロイプロリド、ロイロクリスチン（Leurocristine）、ロイスタチン（Leustatin）(商標)、リポソーム化Ara-C、リキッド・プレド（Liquid Pred）（登録商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン（L-Sarcolysin）、リュープロン（登録商標）、リュープロン・デポー（登録商標）、Ｍ、マチュレーン（Matulane）（登録商標）、マキシデックス（Maxidex）、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドラロン（Medralone）（登録商標）、メドロール（Medrol）（登録商標）、メゲース（Megace）（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ（Mesna）、メスネックス（Mesnex）(商標)、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（Meticorten）（登録商標）、マイトマイシン、マイトマ��シン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール（Prednisol）（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスタルゲン（Mustargen）（登録商標）、ムスチン（Mustine）、ムタマイシン（Mutamycin）（登録商標）、ミレラン（登録商標）、マイロセル（Mylocel）(商標)、マイロターグ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（Neosar）（登録商標）、ニューラスタ（Neulasta）(商標)、ニューメガ（Neumega）（登録商標）、ニューポジェン（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ニランドロン（Nilandron）（登録商標）、ニルタミド、ニペント（Nipent）（登録商標）、ナイトロジェン・マスタード、ノバルデックス（Novaldex）（登録商標）、ノバントロン（Novantrone）（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー（Oncospar）（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（Ontak）（登録商標）、オンキサル（Onxal）(商標)、オプレベルキン（Oprevelkin）、オラプレッド（Orapred）（登録商標）、オラソン（Orasone）（登録商標）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合型、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（Panretin）（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペディアプレッド（Pediapred）（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ＰＥＧアスパルガーゼ、ＰＥＧフィルグラスチム、ＰＥＧイントロン(商標)、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニン・マスタード、プラチノール（Platinol）（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（Prelone）（登録商標）、プロカルバジン、プロクリット（登録商標）、プロロイキン（Proleukin）（登録商標）、カルマスティン・インプラントによるプロリフェプロスパン（Prolifeprospan）２０、ピュリネソール（Purinethol）（登録商標）、Ｒ、ラロキシフェン、レブリミド（登録商標）、リウマトレックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（Roferon-A）（登録商標）（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス（Rubex）（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、ソル・コーテフ（solu-cortef）（登録商標）、ソル・メドロール（solu-Medrol）（登録商標）、ソラフェニブ、スプリセル(商標)、STI-571、ストレプトゾシン、SU11248、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、ターグレチン（Targretin）（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（Temodar）（登録商標）、テモゾロミド、テニポシド、テスパ（TESPA）、サリドマイド、サロミド（Thalomid）（登録商標）、テラシス（TheraCys）（登録商標）、チオグアニン、チオグアニン・タブロイド（登録商標）、チオホスホアミド（phosphoamide）、チオプレックス（Thioplex）（登録商標）、チオテパ、タイス（TICE）（登録商標）、トポサール（Toposar）（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トレクサール（Trexall）(商標)、トリセノックス（登録商標）、ＴＳＰＡ、タイケルブ（TYKERB）（登録商標）、ＶＣＲ、ベクティビックス（Vectibix）(商標)、ベルバン（Velban）（登録商標）、ベルケイド（Velcade）（登録商標）、ベプシド（VePesid）（登録商標）、ベサノイド（Vesanoid）（登録商標）
、ビアドゥール（Viadur）(商標)、ビダーザ（Vidaza）（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン（Vinblastine Sulfate）、ビンカサール・Pfs（Vincasar Pfs）（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット（Vorinostat）、ＶＰ−１６、ヴューモン（Vumon）（登録商標）、ゼローダ（Xeloda）（登録商標）、ザノサール（Zanosar）（登録商標）、ゼバリン（Zevalin）(商標)、ザインカード（Zinecard）（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）；放射性医薬、例えば炭素−１１、炭素−１４、クロム−５１、コバルト−５７、コバルト−５８、エルビウム−１６９、フッ素−１８、ガリウム−６７、金−１９８、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、鉄−５９、クリプトン−８１ｍ、窒素-13、酸素-15、リン-32、レニウム-186、ルビジウム-82、サマリウム-153、セレン-75、ストロンチウム-89、テクネチウム-99m、タリウム-201、トリチウム、キセノン-127、キセノン-133、イットリウム-90；及び／又は
（iii）造影剤、例えばガドリニウム、マグネタイト、マンガン、テクネチウム、I125、I131、P32、TI201、イオパミドール、PET-FDG
から選択される１又は２以上の部分を有する、請求項１〜２１の何れか一項に記載のアルブミン変異体若しくは誘導体、その融合体、コンジュゲート、アソシエート、又は組成物、或いは、前記融合体をコードする核酸又は宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はコンピューター読取可能形態の配列表を含む。これは援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アルブミン誘導体及び変異体、及び／又は、斯かるアルブミン誘導体及び変異体を含む融合ポリペプチドに関する。
【０００３】
更に、本発明は、アルブミン誘導体及び変異体、及び／又は、斯かるアルブミン誘導体及び変異体を含む融合ポリペプチドの、薬物送達、ポリペプチド安定性及びインビボ（in vivo）半減期延長又は調節のためのツールとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルブミンは哺乳類血漿中の天然タンパク質であり、血漿において最も豊富なタンパク質である。アルブミンは、血液の所望の浸透圧を維持する上で重要な役割を果たすとともに、血流内における種々の物質の輸送にも関与している。
【０００５】
アルブミンは、インビボにおいて、その受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）「ブランベル」（Brambell）に結合し、この相互作用は、アルブミンの血漿中半減期の上昇にとって重要であることが知られている。ＦｃＲｎは、多くの細胞及び組織型で発現される膜結合タンパク質であり、アルブミンの細胞内分解速度を低減することが見出されている（Roopenian, D. C. and Akilesh, S. （2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725）。ＦｃＲｎは、ヒト等の哺乳類の血清において、ＩｇＧ及びアルブミンの双方を高レベルに維持するのに寄与している。
【０００６】
ＦｃＲｎと免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）との相互作用については、従来技術において既に特性付けがなされているのに対し、ＦｃＲｎとアルブミンとの相互作用について決定されている特性や知られている知識はより少ない。アルブミンとＦｃＲｎとの主な結合部位はドメインIII内（ＤIII：３８１〜５８５）に存在する（Andersen et al （2010) Clinical Biochemistry 43,367-372）。しかしながら、ＩｇＧ及びアルブミンの双方が、ＦｃＲｎ上の個別の部位に、非協同的にに結合することが知られている（Andersen, et al. （2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury, et al. （2006), Biochemistry 45, 4983-4990.）。
【０００７】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなるポリペプチドとして特性決定されており、その配列は Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications, pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3) に記載されている。アルブミンはＦｃＲｎに対してｐＨ依存的に結合する性質を有する。即ち、酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）では結合するが、中性を超えるｐＨ（例えばｐＨ７．４）では結合しない。
【０００８】
ＨＳＡの血漿中半減期はおよそ１９日間であることが知られている（Peters, T., Jr. (1985) Adv. Protein Chem. 37, 161-245; Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin, Academic Press, Inc., San Diego, CA. (page 245-246)); Benotti P, Blackburn GL: Crit Care Med (1979) 7:520-525）。置換Ｄ４９４Ｎを有する天然の点突然変異体は、血漿中半減期がより短い（Biochim Biophys Acta. 1991, 1097:49-54）。この単一置換により、当該変異体／ミュータントには、野生型（ｗｔ）ＨＳＡには存在しないＮ結合グリコシル化部位が生成される。上述の血漿中半減期の変化の原因が、この部位にその後生じ得るグリコシル化にあるのか、それともアミノ酸の変化それ自体にあるのかは分かっていない。
【０００９】
血漿タンパク質であるアルブミンは、長い血漿中半減期を有すると考えられ、この特性ゆえに薬物送達への使用が提案されている。アルブミンは、医薬的に有益な種々の化合物にコンジュゲートされている（国際公開第００６９９０２Ａ号）。その結果、得られたコンジュゲートの血漿中半減期は概して、有益な化合物単独の場合の血漿中半減期よりも、はるかに長くなることが見出されている。
【００１０】
更にアルブミンは、治療的に有益な種々のペプチドに融合されており（国際公開第０１／７９２７１Ａ号及び国際公開第０３／５９９３４Ａ号）。その結果、得られる融合ポリペプチドは概ね、治療的に有益なペプチドの活性を維持し、その血漿中半減期は、治療的に有益なペプチド単独の場合の血漿中半減期よりも、はるかに長くなることが見出されている。
【００１１】
Otagiri et al (2009), Biol. Pharm, Bull. 32（4), 527-534 は、７７種のアルブミン変異体が知られており、うち２５種がドメインIIIに見られる旨を開示する。カルボキシ末端の最後の１７５個のアミノ酸を欠失する天然変異体では、半減期が短縮されることが示されている（Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372）。Iwao et al. (2007) は、マウスモデルを用いて天然ヒトアルブミン変異体の半減期を研究したところ、K541E及びK560Eでは半減期が短縮され、E501K及びE570Kでは半減期が延長され、K573Eでは半減期に殆ど影響がなかったことを示した（Iwao, et. al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590）。
【００１２】
Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32 は、天然変異体Ｅ５０５Ｋを開示する。Minchiotti et al. (1990) は、天然変異体Ｋ５３６Ｅを開示する。Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418 は、天然変異体Ｋ５７４Ｎを開示する。Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417 は、天然変異体Ｄ５５０Ｇを開示する。Carlson et al （1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225- 8229 は、天然変異体Ｄ５５０Ａを開示する。
【００１３】
国際公開第２００７１１２９４０号は、少なくとも１のアルブミンドメインIIIと、少なくとも１の治療用部分とを含むコンストラクトを開示するとともに、斯かるコンストラクトの薬剤半減期延長のための使用を開示する。
【００１４】
アルブミンは多数のリガンドの結合を許容する能力を有し、これらのリガンドはアルブミンに連結される（associated with）（会合する（associates with））。この特性は、前述のようなリガンドの血漿中半減期の延長に、例えば、アルブミンに対して非共有結合的に結合する能力を有する薬剤の血漿中半減期の延長に利用されてきた。また、これは、アルブミン結合特性を殆ど、或いは全く有しない、医薬的に有益な化合物を、アルブミン結合特性を有する部分に結合させることによっても達成される。概説として Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183 、及び、本概説内で引用される文献を参照のこと。
【００１５】
米国特許第７，２５３，２５９号は、遺伝子組換技術により産生されるタンパク質であって、血清アルブミンドメインＩ、II及びIIIから選択される少なくとも１のドメインを有するが、天然アルブミンとは構造が異なるタンパク質を開示するとともに、斯かるタンパク質を製造する方法を開示する。
【００１６】
アルブミンは、医薬的に有益な種々の化合物の調製物に使用される。斯かる調製物の例としては、これに限定されるものではないが、アルブミンのナノ粒子又はマイクロ粒子が挙げられる。これらの例において、医薬的に有益な化合物、或いは斯かる化合物の混合物の送達に際しては、斯かる有益な化合物を送達手段としてアルブミンに結合させることが示されている場合、ＦｃＲｎ受容体に対するアルブミンの親和性に変更を加えることが望ましい場合がある。
【００１７】
形成されるコンジュゲート又は融合ポリペプチドの具体的な性質又は結合特性のうち、何が血漿中半減期の延長に影響を与えているのかは不明である（例えば、これに限定されるものではないが、Levemir（登録商標）, Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731）。しかし、斯かるコンジュゲート又は融合ポリペプチドを構成する、アルブミン部分及び医薬的に有益な化合物／ペプチドの選択に、直接関係しているものと思われる。所与のアルブミンドメインIII誘導体、その断片又は変異体とのコンジュゲート又は融合体又はアソシエートの血漿中半減期を制御し、当該コンジュゲート／融合体の各構成要素単独の場合と比べてより長い、或いはより短い血漿中半減期を達成できるようにすることが望ましい。これによって、治療対象とする適用の詳細に応じて、個々の医薬を個別に設計することが可能となる。
【００１８】
アルブミンは腫瘍に蓄積し、異化されることが知られている。また、関節リウマチ患者の炎症関節に蓄積することも示されている。概説として Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183 、及び、本概説内で引用される文献を参照のこと。ＦｃＲｎへの親和性を向上させたＨＳＡ変異体が得られれば、医薬的に有益な化合物の送達及び／又は標的化（例えば受動標的化）に有用であると考えられる。
【００１９】
Vania Kenanova, Tove Olafsen, Felix Bergara and Anna Wu (2009) J Nucl Med.; 50 (Supplement 2):1582) に記載のとおり、半減期の短縮や血清薬物動態の制御を達成するには、ＦｃＲｎに対して殆ど、或いは全く結合を有さないアルブミンの変異体を得ることが好ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の観点は、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドを提供する。ここで、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片は、アルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体と、少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体とを含むか、アルブミンドメインIII又はその誘導体若しくは変異体と、少なくとも１の更なるアルブミンドメイン又はその誘導体若しくは変異体とからなる。第１の観点は、野生型アルブミン自体を含まないことが好ましい。しかし、第１の観点には、野生型アルブミンと、何らかの改変（例えば、任意のアルブミン由来の１又は２以上（数個）のドメインの追加、１又は２以上（数個）の点変異、有益な部分への融合、有益な部分へのコンジュゲート、及び／又は、有益な部分との会合（association））とを含むか、或いは野生型アルブミンとこれらの改変からなるように、修飾された野生型アルブミンを含んでいてもよい。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、前記のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、配列番号３１又は配列番号１（ＨＳＡ）における位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４のうち１又は２以上（数個）の位置に対応する位置に、置換、挿入又は欠失からなる群より選択される１又は２以上（数個）の変異（最も好ましくは置換）を含むか、或いは当該変異からなる。
【００２２】
第２の観点によれば、本発明は、本発明の何れかの誘導体又は変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド、例えば、（ｉ）前記アルブミン誘導体若しくはその断片、又は、前記アルブミン誘導体若しくはその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくはその断片からなる融合ポリペプチドをコードする核酸、（ii）前記核酸を含むプラスミド、（iii）前記プラスミドを含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片と、少なくとも１の治療又は診断用部分とを含むコンジュゲートが、本発明の第３の観点を構成する。
【００２４】
本発明の第４の観点は、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片と、少なくとも１の治療用タンパク質又はペプチドとを含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片と、少なくとも１の治療用タンパク質又はペプチドとからなる、融合ポリペプチドを提供する。
【００２５】
本発明の第５の観点は、前記のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片と、当該アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片に対して非共有結合により結合又は会合した別の化合物との「アソシエート」（associate）を提供する。
【００２６】
本発明の第６の観点は、治療用、医薬用、又は別の有益なポリペプチドと、当該ポリペプチドにコンジュゲート、融合又は会合された、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドとを含むか、或いは当該有益なポリペプチドと融合ポリペプチドとからなる、組成物（好ましくは医薬組成物）に関する。
【００２７】
本発明の第７の観点は、前記誘導体又は変異体の製造方法に関する。
【００２８】
本発明の第８の観点は、画像化における前記誘導体及び／又は変異体の使用、例えば動物又はヒトにおける画像化の用途における、コンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドの使用に関する。
【００２９】
本発明の第９の観点は、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を用いた治療及び／又は使用方法に関する。
【００３０】
本発明の第１０の観点は、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、前記の誘導体若しくは変異体又はその断片のアソシエート、或いは前記のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ａ）ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴの野生型ＨＳＡ及び野生型ＨＳＡ誘導体（２０００−０．９ｎＭ）に対する（Ａ）ｐＨ６．０及び（Ｂ）ｐＨ７．４での結合。ＥＬＩＳＡ値は二重実験の平均を示す。
【図２】ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴに固定化された野生型ＨＳＡ及び野生型ＨＳＡ誘導体１μＭ（〜１４００ＲＵ）のｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合を示す代表的なセンサーグラム。（Ａ）ＤＩ−ＤII、（Ｂ）ＤＩ−ＤIII、（Ｃ）ＤII−ＤIII、（Ｄ）ＤIII、（Ｅ）ＤIII−ＤIII及び（Ｆ）野生型ＨＳＡ。
【図３】野生型ＨＳＡ及び野生型ＨＳＡドメインコンストラクトの段階希釈物（最終試料濃度それぞれ５５ｎＭ、１６６ｎＭ及び５００ｎＭ、並びに５００ｎＭ及び１５００ｎＭ）を、ｓｈＦｃＲｎ（５０ｎＭ）とプレインキュベートし、固定化されたＨＳＡ（〜２６００ＲＵ）上に注入した。注入は２５℃、流速５０μｌ／分、ｐＨ６．０で行った。
【図４−１】（ｉ）成熟ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿２＿３）、（ii）ＨＳＡのドメインＩ及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿１＿３）、（iii）ＨＳＡのドメインII及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿２＿３）、（iv）全長アカゲザル（Macaca mulatta）アルブミン（Ｍａｃ＿ｍｕｌ）、（ｖ）全長ドブネズミ（Rattus norvegicus）アルブミン（ラット）、及び（vi）全長ハツカネズミ（Mus musculus）アルブミン（マウス）のアミノ酸配列の多重アラインメント。位置５００、５５０及び５７３（全長ＨＳＡを基準とする）を矢印で示す。図４ではドメインＩ、II及びIIIをそれぞれ１、２及び３と記す。
【図４−２】同上。
【図５−１】ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギ及びヤギ由来の成熟血清アルブミン、並びにチンパンジー、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ及びブタ由来の成熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメント。ドメイン１、２及び３の開始及び終了アミノ酸（Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274（41): 29303-29310)の定義による）は、成熟ヒト血清アルブミンを基準として表示する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図６】プラスミドpDB2305の模式図。
【図７】発現プラスミドのインビボでの生成を要約する模式図。Ａ．ＰＣＲを用いて２つのＰＣＲ断片を生成した。断片１及び２は２４７塩基対（base pair：ｂｐ）を共有し、それぞれ５’及び３’末端に２１７ｂｐの、Acc65I／BamHI消化pDB3936との相同領域を有する。断片１及び２のそれぞれ３’及び５’末端は、互いに２７〜３０ｂｐの相同領域を共有する。Ｂ．精製ＰＣＲ断片をAcc65I/BamHI消化pDB3936と共に用いて、Ｓ．セレヴィシエ（S. cerevisiae）BXP10 cir0 を同時形質転換した。Ｘ＝リーダー配列。Ｙ＝アルブミンＤＩ＋ＤII。Ｚ＝アルブミンＤIII。×はインビボ組換を示す。
【図８ａ−８ｃ】１０μＭのＨＳＡドメインIII及びその変異体の、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（〜２１００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。図８ａ：ＤIII野生型及びＤIII Ｋ５７３Ｄ、図８ｂ：ＤIII野生型及びＤIII Ｋ５７３Ｈ、図８ｃ：ＤIII野生型及びＤIII Ｋ５７３Ｎ、図８ｄ：ＤIII野生型及びＤIII Ｋ５７３Ｗ、図８ｅ：ＤIII及びＤIII Ｑ５８０Ｋ。
【図８ｄ−８ｅ】同上。
【図９】アルブミン並びにその誘導体及び変異体（一部はＨＲＰとのコンジュゲート）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：（１）マーカー（SeeBlue(商標))、（２）ＨＲＰ標準（１μｇ）、（３）ＤＩ＋ＤIII＋ＤIII：ＨＲＰ（１μｇ）、（４）アルブミン標準（１μg)、（５）ＤＩ＋ＤIII−ＨＲＰ（１μｇ）、（６）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５００Ａ−ＨＲＰ（１μｇ）、（７）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−ＨＲＰ（１μｇ）、（８）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｙ−ＨＲＰ（１μｇ）、（９）ＤＩ＋ＤIII Ｄ５５０Ｎ−ＨＲＰ（１μｇ）、（１０）ＤIII＋ＤＩ−ＨＲＰ（１μｇ）、（１１）ＨＲＰとアルブミン標準との混合物（各1μg)、（１２）ＨＲＰ＋とアルブミン標準との混合物（各２μｇ）。
【図１０】１０μＭ ＨＳＡ ＤＩ＋III（及びその変異体）とＨＲＰとのコンジュゲートの、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。（１）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−ＨＲＰ、（２）野生型ＨＳＡ、（３）ＤＩ＋ＤIII ｗｔ−ＨＲＰ、及び（４）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５００Ａ−ＨＲＰ。
【図１１】ＤII＋III及びＤII＋III Ｋ５７３ＰのＮ末端に融合された１０μＭ ＩＬ−１ｒａのＨＳＡの、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（〜２１００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１２】１０μＭのＤIIIのＨＳＡタンデム反復、ＤIII融合体及びＤIII Ｋ５７３Ｐ融合体の、ｓｃＦｖ（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１３】１０μＭのＤIIIのＨＳＡタンデム反復、ＤIII融合体及びＤIII Ｄ５５０Ｎ融合体の、ｓｃＦｖ（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１４】１０μＭのＤIIIのＨＳＡタンデム反復、ＤIII融合体及びＤIII Ｋ５７３Ｐ融合体の、ＩＬ−１ra（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１５】１０μＭのＤIIIのＨＳＡタンデム反復、ＤIII融合体及びＤIII Ｄ５５０Ｎ融合体の、ＩＬ−１ra（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１６】フルオレセイン融合ＤＩ＋ＤIII変異体タンパク質のＵＶ光（Ａ）及び市販タンパク質染色（Ｂ）による可視化。アルブミン並びにその誘導体及び変異体（一部はＦ５Ｍへのコンジュゲート）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：（１）マーカー（SeeBlue(商標)）（１０μＬ）、（２）ＨＳＡ−Ｆ５Ｍ対照（１μｇ）、（３）マーカー（SeeBlue(商標)）（１０μＬ）、（４）ＤＩ＋ＤIII＋ＤIII−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（５）ＤＩ＋ＤIII ｗｔ−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（６）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５００Ａ−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（７）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（８）ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｙ−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（９）ＤＩ＋ＤIII Ｄ５５０Ｎ−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（１０）ＤIII＋ＤI−Ｆ５Ｍ（１μｇ）、（１１）マーカー（SeeBlue(商標)）（１０μＬ）。
【図１７】１０μＭの野生型ＨＳＡ、ＨＳＡ ＤＩ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−Ｆ５Ｍ、ＨＳＡ ＤＩ＋ＤIII Ｋ５００Ａ−Ｆ５Ｍの、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【図１８】１０μＭの野生型ＨＳＡ、ＨＳＡ ＤＩ＋ＤIII＋ＤIII−Ｆ５Ｍ、ＨＳＡ ＤＩ＋ＤIII−Ｆ５Ｍの、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（〜１５００ＲＵ）に対するｐＨ５．５での結合を示す代表的なセンサーグラム。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の第１の観点は、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドであって、ここで当該アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片は、第１のアルブミンドメインIII、断片、又はその誘導体若しくは変異体と、少なくとも１の第２のアルブミンドメイン、断片、又はその誘導体若しくは変異体とを含むか、或いはこれらからなる融合ポリペプチドに関する。当該誘導体又は変異体は、天然誘導体又は変異体（例えばヒト；霊長類、例えばチンパンジー、ゴリラ又はマカク；ウサギ；齧歯類、例えばマウス、ラット及びハムスター；ウシ；ウマ類、例えばウマ又はロバ；ヤギ；ヒツジ；イヌ；モルモット；ニワトリ及びブタのうち何れか由来の野生型アルブミン等）ではないことが好ましい。第１の観点は、野生型アルブミンのドメインＩ、II及びIII（又はその断片）と、任意のアルブミン（例えばヒトや本明細書開示の別の生物種由来のアルブミン等）由来の１又は２以上（数個）の更なるドメイン（又はその断片）とを含むか、或いはこれらのドメインからなるアルブミン誘導体又は変異体を、含んでいてもいなくてもよい。
【００３３】
本発明の第１の観点に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、又は融合ポリペプチドのうち一部は、アルブミンのドメインＩ（又はその断片）を含まない。本発明の第１の観点に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、又は融合ポリペプチドのうち一部は、アルブミンのドメインII（又はその断片）を含まない。本発明の第１の観点に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、又は融合ポリペプチドのうち更に別のものは、アルブミンのドメインIIIと、アルブミンのドメインＩ（又はその断片）又はドメインII（又はその断片）のうち一方又は両方を含む。
【００３４】
本発明は、第１のアルブミンドメインIIIと、少なくとも１の第２のアルブミンドメイン断片又はその誘導体若しくは変異体を含むポリペプチドが、対応するドメインIII単独の場合と比べてより強くＦｃＲｎに結合する、という発見に基づく。これは従来技術、特に国際公開第２００７／１１２９４０号公報を考慮すると、驚くべきことである。なぜなら、従来技術によれば、ドメインIIIのアミノ残基が、アルブミンとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与し、これが循環中（例えば血漿中等）のアルブミン寿命の延長に寄与していると考えられるからである。ドメインIIIはアルブミンのＦｃＲｎに対する結合に関与していることが知られている。本発明において「アルブミン」（albumin）という語は、ＨＳＡと同一及び／又は極めて類似した三次元構造を有すると共に、長い血漿中半減期を有するタンパク質を意味する。配列番号３１又は配列番号１に開示のＨＳＡ、又はその任意の天然の対立遺伝子（アレル）が、本発明に係るアルブミンとしては好ましい。当業者であれば理解するように、ＨＳＡドメインIII誘導体、その断片、変異体について記載された特性は、本発明の記載に係る別の非ヒトアルブミンについても該当し得る。
【００３５】
即ち、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、アルブミンと同様に血漿中半減期が長いという利点を有する。
【００３６】
本発明のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドのサイズは、断片のサイズ、ドメインの数、融合ポリペプチドの非アルブミン部位のサイズ等に応じて異なる。当該サイズは、原理的には、ドメインIIIのサイズより僅かに大きなサイズから、更に大きいサイズまで様々であるが、実際上は、天然アルブミンと同程度のサイズが好ましい。如何なる理論による束縛も望むものではないが、血漿中半減期を高めるためには、腎臓の閾値を越えるサイズ（例えば天然アルブミンのサイズ等）が好ましいと考えられる。即ち、本発明のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド、及び／又は、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなるコンジュゲートのサイズは、４０〜８０ｋＤａの範囲、好ましくは５０〜７０ｋＤａの範囲、より好ましくは５５〜６５ｋＤａの範囲、最も好ましくは６０ｋＤａ程度であることが好ましい。
【００３７】
本発明に係る好ましいアルブミンの１つであるＨＳＡは、５８５のアミノ酸残基からなり、分子量が６７ｋＤａのタンパク質である。天然形態ではグリコシル化されていない。ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号３１又は配列番号１に示す。当業者であれば理解するように、ＨＳＡと本質的に同一の特性を有するが、配列番号３１又は配列番号１に比べて１又は２以上（数個）のアミノ酸が異なる、天然対立遺伝子が存在する場合がある。本発明者等の理解によれば、斯かる天然対立遺伝子を、本発明に係る親アルブミンとして使用することも考えられる。
【００３８】
アルブミンは概して、およそ２０日又はそれ以上という、長い血漿中半減期を有する。例えば、ＨＳＡの血漿中半減期は１９日である。ＨＳＡの長い血漿中半減期は、その受容体ＦｃＲｎとの相互作用を介してもたらされることが知られている。しかしながら、ＨＳＡの長い半減期の背後にある正確なメカニズムの理解や知識は、本発明にとって重要ではない。
【００３９】
本発明において「アルブミン」（albumin）という語は、ＨＳＡと同一及び／又は極めて類似した三次元構造を有すると共に、長い血漿中半減期を有するタンパク質を意味する。本発明に係るアルブミンタンパク質の例としては、ヒト血清アルブミン（例えばＡＡＡ９８７９７又はＰ０２７６８−１、配列番号３１又は配列番号１（成熟）、配列番号４（未成熟））、霊長類血清アルブミン（例えばチンパンジー血清アルブミン（例えば予測配列ＸＰ＿５１７２３３．２、配列番号５）、ゴリラ血清アルブミン又はマカク血清アルブミン（例えばＮＰ＿００１１８２５７８、配列番号６）、齧歯類血清アルブミン（例えばハムスター血清アルブミン（例えばＡ６ＹＦ５６、配列番号７）、モルモット血清アルブミン（例えばＱ６ＷＤＮ９−１、配列番号8)、マウス血清アルブミン（例えばＡＡＨ４９９７１又はＰ０７７２４−１バージョン３、配列番号９）及びラット血清アルブミン（例えばＡＡＨ８５３５９又はＰ０２７７０−１バージョン２、配列番号１０）））、ウシ血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン Ｐ０２７６９−１、配列番号１１）、ウマ類血清アルブミン、例えばウマ血清アルブミン（例えばＰ３５７４７−１、配列番号１２）又はロバ血清アルブミン（例えばＱ５ＸＬＥ４−１、配列番号１３）、ウサギ血清アルブミン（例えばＰ４９０６５−１バージョン２、配列番号１４）、ヤギ血清アルブミン（例えばＡＣＦ１０３９１、配列番号１５）、ヒツジ血清アルブミン（例えばＰ１４６３９−１、配列番号１６）、イヌ血清アルブミン（例えばＰ４９８２２−１、配列番号１７）、ニワトリ血清アルブミン（例えばＰ１９１２１−１バージョン２、配列番号１８）及びブタ血清アルブミン（例えばＰ０８８３５−１バージョン２、配列番号１９）等が挙げられる。配列番号３１又は配列番号１に開示のＨＳＡ、或いはその天然対立遺伝子の何れかが、本発明に係るアルブミンとして好ましい。
【００４０】
本発明に係る親アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含むか、アルブミン若しくはその断片からなる融合ポリペプチドのアルブミン部位は、概して、配列番号３１又は配列番号１に示すＨＳＡの配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４１】
親は、配列番号３１又は配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むか、当該配列の少なくとも一部からなることが好ましい。別の実施形態によれば、親は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの少なくとも一部を含むか、当該成熟ポリペプチドの少なくとも一部からなる。
【００４２】
別の実施形態によれば、親は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの少なくとも一部の対立遺伝子誘導体又は変異体である。
【００４３】
「単離された誘導体」（isolated derivative）又は「単離された変異体」（isolated variant）という語は、人工的に修飾された誘導体又は変異体を意味する。一実施形態によれば、誘導体又は変異体は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ又はＧＰ−ＨＰＬＣにより決定される純度が、少なくとも１％、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％である。
【００４４】
「実質的に純粋な誘導体」（substantially pure derivative）又は「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）とは、天然又は組換により連結された別のポリペプチド材料の含有量が、重量比で多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６％、多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、多くとも２％、多くとも１％、又は多くとも０．５％である調製物を意味する。誘導体又は変異体の純度は、調製物中に存在する全ポリペプチド材料に対して、少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％であることが好ましい。本発明の誘導体又は変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、当該誘導体又は変異体を、周知の組換方法又は従来の通常の精製方法で調製することにより、達成することができる。
【００４５】
「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）という語は、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た、最終形態にあるポリペプチドを意味する。一実施形態によれば、成熟ポリペプチドは、アミノ酸１〜５８５である。
【００４６】
「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）という語は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一実施形態によれば、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号２のヌクレオチド１〜１７５８である。
【００４７】
「ＦｃＲｎ」という語は、ヒト新生児Ｆｃ受容体を意味する。「ｓｈＦｃＲｎ」は、ＦｃＲｎの可溶性の組換形態である。「ｓｍＦｃＲｎ」という語は、マウス新生児Ｆｃ受容体の可溶性の組換形態である。
【００４８】
本発明において、「アルブミン誘導体、その断片、又は、前記アルブミン誘導体若しくはその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくはその断片からなる融合ポリペプチド」（albumin derivative, fragment thereof or fusion polypeptide comprising or consisting of said albumin derivative or fragment thereof）という用語は、所定のアルブミンドメインを含むか、斯かるアルブミンドメインからなる、遺伝子操作による非天然分子を意味する。即ち、この用語には、天然の全長アルブミンや、全長アルブミンを含む融合ポリペプチドは含まれない。
【００４９】
「誘導体」（derivative）という語は、改変（例えば置換、挿入、及び／又は欠失）を１又は２以上（数個）の位置に含むアルブミンポリペプチドを意味する。置換（substitution）とは、ある位置を占めるアミノ酸が異なるアミノ酸によって置き換えられることを意味し、欠失（deletion）とは、ある位置を占めるアミノ酸が除去されることを意味し、挿入（insertion）とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接する位置に、１、２、又は３以上のアミノ酸が追加されることを意味する。挿入はアミノ酸のＣ側及びＮ側の何れに存在してもよいが、通常はアミノ酸のＣ側である。
【００５０】
「変異体」（variant）という語は、アルブミン若しくはアルブミン誘導体、又はその融合タンパク質であって、当該アルブミン誘導体又は融合体が、化学的手段によって改変されたものを含む。斯かる改変としては、例えば、ポリペプチドの翻訳後誘導体化又は修飾、例えばＰＥＧ化、及び／又は、（例えば非対形成システインの付与等による）所望の部分（例えば治療用部分等）のチオール基へのコンジュゲートとが挙げられる。
「変異体」（variant）という語には、本発明に係るアルブミン誘導体の融合タンパク質であって、化学的手段による改変ではない誘導体も含まれる。
「誘導体」という語と「変異体」という語とは、相互交換可能に使用される場合と、そうでない場合とがある。
【００５１】
アルブミンは、哺乳類血漿中に最も豊富に存在するタンパク質であって、多数の広範な哺乳類について、生化学的方法及び／又は配列情報により特性決定されている。アルブミンの中には）、結晶学的に特性決定され、構造が特定されたものがあり（例えばＨＳＡ等、アルブミンが３つの個別のドメイン（夫々ドメインＩ、ドメインII及びドメインIIIという）からなることが示されている。
【００５２】
本発明のドメインは、原則として、任意のアルブミンに由来するもので構わないが、好ましくは、ヒト血清アルブミン、霊長類血清アルブミン（例えばチンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン又はマカク血清アルブミン等）、齧歯類血清アルブミン（例えばウサギ血清アルブミン、マウス血清アルブミン及びラット血清アルブミン等）、ウシ血清アルブミン、ウマ類血清アルブミン、ロバ血清アルブミン、ハムスター血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン及びブタ血清アルブミン等が挙げられる。
【００５３】
本発明に係る特に好ましいアルブミンは、配列番号３１又は配列番号１中に示された配列を有するＨＳＡであり、及び本発明の好ましいアルブミンドメインは、配列番号３１又は配列番号１のアミノ酸残基１〜１９４±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインI；配列番号３１又は配列番号１のアミノ酸残基１９２〜３８７±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインII、及び配列番号３１又は配列番号１のアミノ酸残基３８１〜５８５±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIII、又は例えば互いに融合したドメイン１及び２、ドメイン２及び３若しくはドメイン１及び３などのそれらのドメインの１又は２以上（数個）の組合せである。アルブミンドメインの正確な境界線については、一般に認められている規範は存在しない。上記範囲における重複や、ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端において、±１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５のアミノ酸、好ましくは１〜１５のアミノ酸、より好ましくは１〜１０のアミノ酸、最も好ましくは１〜５のアミノ酸の変動が許容されており、各ドメインの全長としては最大３０アミノ酸、好ましくは最大２０アミノ酸、より好ましくは最大１０アミノ酸の変動が許容されているのは、こうした事実を反映したものである。よって、境界上のアミノ酸残基がどちらのドメインに属するかについては、幾分の意見の相違があるかもしれない。同じ理由から、アルブミンドメインのアミノ酸残基について、上記数値とは異なる記載が見られる場合もあろう。しかし、当業者であれば、文献の教示及び上の教示に基づいて、どのようにアルブミンドメインを同定するかを理解するはずである。非ヒトアルブミンの対応するドメインは、EMBOSS（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）パッケージのNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０又は以降に実装されているような、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を使用するＨＳＡでアライメントにより同定され得る。使用される任意パラメーターは、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸張ペナルティ０．５、及び、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（EMBOSS version of BLOSUM62）置換マトリックスである。また、別のアラインメントツールを使用してもよい。例としては、本明細書に記載のMUSCLE等が挙げられる。
【００５４】
ドメインの定義は、Dockal又はKjldsenに従って行ってもよい。Dockal等（The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274（41)： 29303-29310）は、ＨＳＡのドメインを、ドメインＩ：アミノ酸１〜１９７、ドメインII：アミノ酸１８９〜３８５、ドメインIII：アミノ酸３８１〜５８５と定義する。
【００５５】
従って、本発明では、以下のドメイン定義が好ましい。アミノ酸番号は、配列番号３１又は配列番号１（ＨＳＡ）の番号と対応する。しかしながら、これらの番号を使用することにより、当業者が、別のアルブミン配列における対応するドメインを同定できる。
【００５６】
ドメインＩは、アミノ酸１から開始してもしなくてもよく、及び任意のアミノ酸１９２、１９３、１９４、１９５、１９６又は１９７、好ましくは任意のアミノ酸１９２、１９４又は１９７で終了してもしなくてもよい。
【００５７】
ドメインIIは、アミノ酸１８９、１９０、１９１、１９２又は１９３、好ましくは任意のアミノ酸１８９、１９２又は１９３から開始してもしなくてもよく、アミノ酸３８２、３８３、３８４、３８５、３８６又は３８７、好ましくは任意のアミノ酸３８２、２８５又は３８７で終了してもしなくてもよい。
【００５８】
ドメインIIIは、アミノ酸３８１、３８２又は３８３、好ましくはアミノ酸３８１又は３８３から開始してもしなくてもよく、アミノ酸５８５で終了してもしなくてもよい。
【００５９】
非ヒトアルブミンにおけるドメインは、ＨＳＡのように同じ又は異なるアミノ酸長及び／又は残基番号を有してもよい。例えば、多重アラインメント又はペアワイズアライメントは、ＨＳＡ及びＨＳＡのドメイン１、２及び／又は３に対応するドメインを同定するために１又は２以上（数個）の別のアルブミン、断片、誘導体、変異体及び／又は融合体を使用するために調製されてもよい。適当なアライメントの例は、図５で示される。図５は、図４で記載したのと同じ方法で、ＭＵＳＣＬＥ及びＢｏｘｓｈａｄｅを使用して生成した。明確さのために、ＨＳＡ、ヒツジ、マウス、ウサギ及びヤギアルブミンの成熟配列が提供され（すなわち、番号付けは、リーダー配列及びプロ配列後、第１のアミノ酸から開始する）及び提供されるすべての別のアルブミン配列は、未成熟配列である（すなわち、リーダー配列、プロ配列（存在する場合）及び成熟アルブミン配列を含む）。ヒト、ヒツジ、ウサギ及びマウスアルブミンのためのドメイン座標の例が、実施例で示される。これらの座標は、本発明の任意の観点に適用され得る。すべてのアルブミンのためのドメイン座標は、ＨＳＡ（本明細書中で開示したように）のドメイン座標の１又は２以上（数個）に対応するアミノ酸を同定することにより、図５などの、適当なアライメントから同定され又は外挿され得る。一般的に、ドメイン座標は、位置（position）１のように成熟アルブミンの第１のアミノ酸を使用して指定され、従って、リーダー配列及び／又はプロペプチドのアミノ酸配列は、通常この点で、無視される。
【００６０】
第１のアルブミンドメインIII、断片、又はその誘導体若しくは変異体は、原則として任意のアルブミンドメインである、しかしながら、ＨＳＡドメインIII（例えば配列番号２３)、 断片、又は、その誘導体又は変異体が好ましい。
【００６１】
本明細書を通じて、ドメインI及びドメインIIを含む分子は、「ＤI−ＤII」として、若しくは「ＤI＋ＤII」として、又は「Ｄ１＋Ｄ２」として、若しくは「Ｄ１−Ｄ２」として呼ばれてもよい。同様に、ドメインI及びドメインIIIを含む分子は、任意の「ＤI−ＤIII」として、若しくは「ＤI＋ＤIII」として、又は「Ｄ１＋Ｄ３」として、若しくは「Ｄ１−Ｄ３」として呼ばれてもよい。従って、ドメインII及びドメインIIIを含む分子は、「ＤII−ＤIII」として、若しくは「ＤII＋ＤIII」として、又は「Ｄ２−Ｄ３」として、若しくは「Ｄ２＋Ｄ３」として呼ばれてもよい。さらに、「ＨＳＡ１／２−ＲＳＡ３」などの指定は、分子が、ＨＳＡドメインI、ＨＳＡドメイン２及びＲＳＡドメイン３を含む分子、そしてそれは同じくＨＳＡドメインI、ＨＳＡドメインII及びＲＳＡドメインIIIを意味する。
【００６２】
アルブミンドメインとの関係で「誘導体」（derivative)という語は、以下では親ドメインと呼ばれるその天然形態における前記アルブミンドメインと類似した１次及び／又は３次構造を有するが、それは、１又は２以上（数個）の位置で、１又は２以上（数個）のアミノ酸残基の１又は２以上（数個）の置換、挿入、及び／又は欠失を伴い前記親ドメインと異なる。誘導体は、周知技術を使用して、親ドメインをコードする核酸配列の改変及び適当な宿主生物中で改変された核酸配列の発現によりヒトの介入を通じて得られ得る。
【００６３】
「断片」（fragment)という語は、アルブミン及び／又はＦｃＲｎに結合するための能力を保持しているアルブミンの内部領域のアミノ及び／又はカルボキシル末端から欠失した１又は２以上（数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味する。断片は、ＨＳＡ由来の１の中断のない配列を含むか、斯かる配列からなり、又はそれは、ＨＳＡ由来の２又は３以上の配列を含むか、斯かる配列からなってもよい。本発明に係る断片は、少なくとも約２０アミノ酸残基又は超、好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約３００アミノ酸残基又は超、さらにより好ましくは少なくとも約４００アミノ酸残基又は超、及びもっとも好ましくは少なくとも約５００アミノ酸残基又は超のサイズを有する。
【００６４】
本発明の第１のアルブミンドメインIIIとの関係では、「断片」という語は、ＦｃＲｎを結合するための能力を維持している特定の関連のあるアルブミンドメインの一部を意味する。フラグメントは、親ドメイン由来の１の中断のない配列からなってもよく、又は親ドメイン由来の２又は３以上の配列を含むか、斯かる配列からなってもよい。本発明に係る断片は、少なくとも約２０アミノ酸残基又は超、好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸残基又は超、及び最も好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基又は超のサイズを有する。
【００６５】
少なくとも１の第２アルブミンドメイン、断片又はその誘導体若しくは変異体は、原則として任意のアルブミンドメイン、断片又はその誘導体若しくは変異体であってもよい。
【００６６】
本発明の第２のアルブミンドメインとの関係で、「断片」という語は、特定の関連のあるアルブミンドメインの一部を意味する。断片は、親ドメイン由来の１の中断のない配列からなってもよく、又はそれは、親ドメイン由来の２又は３以上の配列を含むか、斯かる配列からなってもよい。本発明に係る断片は、少なくとも約２０アミノ酸残基又は超、好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸残基又は超、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸残基又は超、及び最も好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基又は超のサイズを有する。
【００６７】
第１のアルブミンドメインIII、断片又はその誘導体若しくは変異体及び少なくとも１の第２のアルブミンドメイン、断片又はその誘導体若しくは変異体は、同じ種由来でもよく、又はそれらは、異なる種由来でもよい。例えば、第１のアルブミンドメインIII、断片又はその誘導体若しくは変異体は、ＨＳＡドメインIIIでもよく、及び少なくとも１の第２のアルブミンドメイン、断片又はその誘導体若しくは変異体は、マウス血清アルブミンドメインIIでもよく、又は第１のアルブミンドメインIII、断片又はその誘導体若しくは変異体は、ウサギ血清アルブミンドメインIIIでもよく、及び少なくとも１の第２のアルブミンドメイン、断片又はその誘導体若しくは変異体は、ヒト血清アルブミンドメインIでもよい。
【００６８】
アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、少なくとも２のアルブミンドメイン又はその断片を含むか、少なくとも２のアルブミンドメイン又はその断片からなり、及びそれは２超のドメインを含むか、斯かるドメインからなってもよい。特に、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドで組み合わされてもよいアルブミンドメイン又はその断片の数に関して上限はないが、しかしながら、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、２又は３のアルブミンドメインを含むか、斯かるアルブミンドメインからなることが好ましく、もっとも好ましくは、２のドメインである。
【００６９】
本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、アルブミンドメインI＋アルブミンドメインIII（例えば配列番号２２)、アルブミンドメインII＋アルブミンドメインIII（例えば配列番号２１)、アルブミンドメインIII＋アルブミンドメインIII（例えば配列番号２４)、アルブミンドメインIII＋アルブミンドメインI及びアルブミンドメインIII＋アルブミンドメインIIが挙げられる。
【００７０】
好ましいアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは前記アルブミン誘導体若しくは変異体を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体からなる融合ポリペプチドは、１つの種由来のアルブミンドメインIII及び異なる種由来のアルブミンドメインI若しくはIIを含むか、斯かるアルブミンドメインからなる。例は、ヒト血清アルブミン由来のドメインI及びII及びウサギ血清アルブミン由来のドメインIIIからなるアルブミン誘導体（例えば、配列番号２５）、ウサギ血清アルブミン由来のドメインI及びII及びヒト血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（例えば、配列番号２６）、ヒツジ血清アルブミン由来のドメインI及びII及びヒト血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（例えば、配列番号２７）、並びにヒト血清アルブミン由来のドメインI及びII及びマウス血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（例えば、配列番号２９）を含む。これらの誘導体は、誘導体のドメインIIIが由来する完全なアルブミンよりもＦｃＲｎに対する驚くべき結合特性を有する。
【００７１】
ヒト血清アルブミン由来のドメインI及びII及びウサギ血清アルブミン由来のドメインIIIからなるアルブミン誘導体（例えば、配列番号２５）、ヒツジ血清アルブミン由来のドメインI及びII及びヒト血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（配列番号２７）、並びにヒト血清アルブミン由来のドメインI及びII及びマウス血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（例えば、配列番号２９）は、ヒト血清アルブミンよりもＦｃＲｎに対するより強い結合を有する。ウサギ血清アルブミン由来のドメインI及びII及びヒト血清アルブミン由来のドメインIIIからなる誘導体（例えば、配列番号２６）は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎに対するより弱い結合を有する。誘導体の変異体は、本発明でまた想定され含まれる。
【００７２】
１つの実施形態によれば、アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチド中の１又は２以上（数個）のアルブミンドメインIIIは、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４の１又は２以上（数個）から選択されるＨＳＡ中の位置と対応する１又は２以上（数個）の位置について１又は２以上（数個）の改変（複数）、例えば 置換（複数）、欠失（複数）、又は挿入（複数）を含むか、斯かる改変（複数）からなる。本発明者等は、これらのアミノ酸残基が、血清アルブミン及びＦｃＲｎ受容体の相互作用のために重要であり、並びにこれらの位置の１又は２以上（数個）についての改変が、ＦｃＲｎ受容体に対する本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドの結合を改変し、並びにそれによってその血漿中半減期を改変するであろう。１又は２以上（数個）の位置での改変は、置換、挿入、及び欠失の間で独立して選択されてもよい。置換が好ましい。
【００７３】
本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は、一般的に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３、８４、８５、８６，８７，８８又は８９％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％のＨＡＳドメインIIIの配列（配列番号３１又は配列番号１に関して、本明細書中で定義されるように）に対してアミノ酸配列同一性を有するドメインIIIを有する。さらにより好ましくは、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は、一般的に、アルブミンのアミノ酸３８１〜５８５、例えば配列番号３１又は配列番号１の任意の位置、又は少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％，８８％若しくは８９％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％、配列番号４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８若しくは１９、配列番号３１若しくは配列番号１（ヒト血清アルブミン）の１又は２以上（数個）についての相当する位置のアミノ酸配列同一性を有するドメインIIIを有する。
【００７４】
更なる実施形態では、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、その親アルブミン断片又は親アルブミン若しくはその断片を含むか、親アルブミン若しくはその断片からなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりもより長い血漿中半減期を有する。本実施形態に係る例は、ＨＳＡ中のＥ４９２、Ｎ５０３、Ｄ５５０及びＫ５７３からなる群と対応する位置の１又は２以上（数個）について１又は２以上（数個）の置換を含むか、斯かる置換からなるアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドを含む。好ましくは、ＨＡＳ中のＥ４９２に対応する位置についてのアミノ酸残基は、Ｇ残基で置換され、ＨＳＡ中のＮ５０３に対応する位置についてのアミノ酸は、Ｈ又はＫ残基で置換され、ＨＳＡ中のＤ５５０に対応する位置についてのアミノ酸は、Ｅ残基で置換され、及びＨＳＡ中のＫ５７３に対応する位置についてのアミノ酸は、Ａ又はＰ残基で置換される。また、好ましくは、ＨＳＡ中のＥ４９２に対応するアミノ酸が、Ｇ残基から置換され及びＨＳＡ中のＫ５７３に対応するアミノ酸が、Ａ又はＰ残基で置換される誘導体又は変異体である。別の好ましい誘導体又は変異体は、ＨＳＡ中のＥ４９２をＨ残基で、ＨＳＡ中のＥ５０１をＰで、ＨＳＡ中のＮ５０３をＨで、ＨＳＡ中のＥ５０５をＤで、ＨＳＡ中のＴ５０６をＳで、ＨＳＡ中のＴ５４０をＳで、ＨＳＡ中のＫ５４１をＥでに対応する多くの置換を有する。
【００７５】
更なる実施形態によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、その親アルブミン断片又は親アルブミン若しくはその断片を含むか、親アルブミン若しくはその断片からなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりもより短い血漿中半減期を有する。本実施形態に係る例は、ＨＳＡ中のＱ４１７、Ｈ４４０、Ｈ４６４、Ｄ４９４、Ｅ４９５、Ｔ４９６、Ｐ４９９、Ｋ５００、Ｅ５０１、Ｈ５１０、Ｈ５３５、Ｋ５３６、Ｐ５３７、Ｋ５３８、Ｋ５４１、Ｄ５５０Ｎ、Ｄ４９４＋Ｔ４９６若しくはＥ４９２＋Ｖ４９３からなる群の１又は２以上（数個）に対応する位置についての置換を含んでいるアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドを含む。好ましい置換は、ＨＳＡ中のＱ４１７Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｈ４６４Ｑ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ又はＰ４９９Ａ、Ｋ５００Ａ、Ｅ５０１Ａ、Ｅ５０１Ｑ、Ｈ５１０Ｑ、Ｈ５３５Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ、Ｋ５４１Ａ、Ｋ５４１Ｄ又はＤ５５０Ｎと対応する置換を含む。
【００７６】
配列番号３１又は配列番号１の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群に対応する１又は２以上（数個）の位置について１又は２以上（数個）の置換、挿入又は欠失（置換が好ましい）に加えて、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、当該分子の別の位置で追加的な（更なる）置換、欠失、又は挿入を含んでもよい。斯かる更なる置換、欠失、又は挿入は、分子の別の特性、例えばこれに限定されるものではないが、改変グリコシル化；斯かるチオール基の表面の反応性基の導入、カルバモイル化部位の除去／生成等を改変するために有用であってもよい。
【００７７】
表面上の反応性性基を提供するために改変されてもよく及び本発明に有利に適用され得る残基は、未公開特許出願欧州特許出願第２００９ １５２ ６２５号で開示されている（引用により本明細書中に組み込まれる）。特に好ましい残基は、ＦｃＲｎと相互作用するための領域外のＨＳＡ中の位置に対応する位置を含む。
【００７８】
表面上の反応性性チオール基を提供するために配列番号３１中若しくは配列番号１中又は別のアルブミンについての対応する位置（例えば、配列番号４〜１９）中でなされ得る改変の例としては、Ｌ５８５Ｃ、Ｄ１Ｃ、Ａ２Ｃ、Ｄ５６２Ｃ、Ａ３６４Ｃ、Ａ５０４Ｃ、Ｅ５０５Ｃ、Ｔ７９Ｃ、Ｅ８６Ｃ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ５４９Ｃ、Ａ５８１Ｃ、Ｄ１２１Ｃ、Ｅ８２Ｃ、Ｓ２７０Ｃ、Ａ５７８Ｃ、Ｌ５９５ＬＣ、Ｄ１ＤＣ、Ａ２ＡＣ、Ｄ５６２ＤＣ、Ａ３６４ＡＣ、Ａ５０４ＡＣ、Ｅ５０５ＥＣ、Ｔ７９ＴＣ、Ｅ８６ＥＣ、Ｄ１２９ＤＣ、Ｄ５４９ＤＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ｄ１２１ＤＣ、Ｅ８２ＥＣ、Ｓ２７０ＳＣ、Ａ５７９ＡＣ、Ｃ３６０*、Ｃ３１６*、Ｃ７５*、Ｃ１６８*、Ｃ５５８*、Ｃ３６１*、Ｃ９１*、Ｃ１２４*、Ｃ１６９*及びＣ５６７*を含む。代替的に（或いは）、システイン残基は、アルブミンのＮ又はＣ末端領域に追加されてもよい。
【００７９】
１の実施形態によれば、本発明の誘導体又は変異体についての改変の数は、１〜２０アミノ酸、例えば、１〜１０及び１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の改変である。
【００８０】
アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、対応する親アルブミンドメイン（複数）、その断片、或いは、アルブミンドメイン（複数）誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミンドメイン（複数）誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドと比較して改変した血漿中半減期を有する。
【００８１】
特に好ましい実施形態によれば、親アルブミンドメイン（複数）は、ＨＳＡ由来であり、及びアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、アルブミンドメイン（複数）誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、アルブミンドメイン（複数）誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、ＨＳＡドメイン（複数）、対応する断片又はＨＳＡドメイン（複数）若しくはその断片を含むか、ＨＳＡドメイン（複数）若しくはその断片からなる融合ポリペプチドと比較して改変された血漿中半減期を有する。
【００８２】
ＦｃＲｎに対するアルブミン誘導体又は変異体の親和性が親アルブミンよりも高いか低いかを決定するための１つの方法は、以下に記載されたように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用することである。当業者は、ＦｃＲｎに対するアルブミン誘導体又は変異体の親和性が、ＦｃＲｎに対する親アルブミンの親和性よりもより高いかより低いかを決定するために、別の方法、例えば結合係数ＫＤの決定及び比較が、有用であるかもしれないことを理解するであろう。従って、本発明によれば、天然ＨＳＡのＫＤよりもより低いＫＤを有するアルブミン誘導体又はバリアントは、ＨＡＳよりもより高い血漿中半減期を有すると考えられ、及び天然ＨＳＡのＫＤよりもより高いＫＤを有するアルブミン変異体は、ＨＳＡよりもより低い血漿中半減期を有すると考えられる。
【００８３】
アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、アルブミン若しくはその断片を含むか、アルブミン若しくはその断片からなる融合ポリペプチドは、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、及び５８４からなる群から選択されるＨＡＳ（配列番号３１又は１）中の位置と対応している１又は２以上（数個）の位置で、1又は２以上（数個）の改変、例えば、置換、欠失又は挿入を含むか、斯かる改変からなる。置換は、天然のアルブミン配列におけるアミノ酸が、残る19種の天然のアミノ酸から選択される異なるアミノ酸によって置換されるものであれば、任意の置換とすることができる。誤解を避けるために、当業者は、ＨＳＡのドメイン又はアルブミン、改変アルブミンのドメイン若しくは断片中の位置を同定するために本明細書中で使用される命名法を使用できる。
【００８４】
１つの実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上（複数）の位置で改変を含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の任意の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する２つの位置で改変を含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の任意の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する３つの位置で改変を含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応するそれぞれの位置で改変を含む。
【００８５】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｑ４１７Ａ，Ｈを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４４０Ｑを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４６４Ｑを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ４９０Ｄを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９２Ｇ，Ｔ，Ｐ，Ｈを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｖ４９３Ｐ，Ｌを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ,Ｅ,Ｐを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９５Ｑ,Ａを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ４９６Ａを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｐ４９９Ａを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５００Ｅ，Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｎ，Ｗ，Ｔ，Ｍ，Ｙ，Ｖ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｒを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０１Ａ，Ｐ，Ｑを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｎ５０３Ｋ，Ｄ，Ｈを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５０４Ｅを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０５Ｋ，Ｄを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５０６Ｆ，Ｓを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５１０Ｑを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５３５Ｑを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３６Ａを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｐ５３７Ａを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３８Ａ，Ｈを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５４０Ｓを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５４１Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｎ，Ｅを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５４２Ｐ，Ｄを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｄ５５０Ｎを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７３Ｙ，Ｗ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｄを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７４Ｎを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｌ５７５Ｆを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７７Ｔ，Ｅを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７８Ｒ，Ｓを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｓ５７９Ｃ，Ｔを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８１Ｄを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８２Ｔを含む。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｇ５８４Ａを含む。
【００８６】
１の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４１７に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４１７に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａ又はＨｉｓで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｑ４１７Ａ，Ｈを含む。
【００８７】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４４０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４４０に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４４０Ｑを含む。
【００８８】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４６４に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４６４に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ４６４Ｑを含む。
【００８９】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９０に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ４９０Ｇを含む。
【００９０】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９２に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９２に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＧｌｙで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９２Ｇを含む。 
【００９１】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９３に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９３に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＰｒｏで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｖ４９３Ｐを含む。
【００９２】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９４に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９４に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａを含む。
【００９３】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９５に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９５に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＧｌｎ又はＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ４９５Ｑを含む。
【００９４】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９６に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９６に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ４９６Ａを含む。
【００９５】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置４９９に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４９９に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｐ４９９Ａを含む。
【００９６】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５００に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５００に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５００Ｅ，Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｎ，Ｗ,Ｔ，Ｍ，Ｙ，Ｖ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｒを含む。
【００９７】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５０１に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５０１に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくは親和性を低減するためにＡｌａ又はＧｌｎで及び親和性を増加するためにＰｒｏで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０１Ａ，Ｑ，Ｐを含む。
【００９８】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５０３に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５０３に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｓｐ又はＬｙｓ又はＨｉｓで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｎ５０３Ｄ，Ｋ，Ｈを含む。
【００９９】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５０４に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５０４に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５０４を含む。
【０１００】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５０５に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５０５に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５０５Ｄを含む。
【０１０１】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５０６に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５０６に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５０６Ｓ，Ｆを含む。
【０１０２】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５１０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５１０に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＧｌｎで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５１０Ｑを含む。
【０１０３】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５３５に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５３５に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＧｌｎで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｈ５３５Ｑを含む。
【０１０４】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５３６に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５３６に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３６Ａを含む。
【０１０５】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５３７に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５３７に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｐ５３７Ａを含む。
【０１０６】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５３８に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５３８に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５３８Ｈ，Ａを含む。
【０１０７】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５４０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５４０に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｔ５４０Ｓを含む。
【０１０８】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５４１に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５４１に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＧｌｙ、Ａｓｐ又はＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５４１Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｎを含む。
【０１０９】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５４２に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５４２に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｓｐ又はＰｒｏで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｅ５４２Ｄ，Ｐを含む。
【０１１０】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５５０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５５０に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくは親和性を低減するためにＡｓｎで、好ましくは親和性を増加するためにＧｌｕで置換される。
【０１１１】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７３に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７３に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｐで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７３Ｙ，Ｗ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｄを含む。
【０１１２】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７４に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７４に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｓｎで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｋ５７４Ｎを含む。
【０１１３】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７５に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７５に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＰｈｅで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｌ５７５Ｆを含む。
【０１１４】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７７に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７７に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＴｈｒ又はＧｌｕで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７７ＴＥを含む。
【０１１５】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７８に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７８に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｒｇ又はＳｅｒで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５７８Ｒ，Ｓを含む。
【０１１６】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５７９に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５７９に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＣｙｓ又はＴｈｒで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｓ５７９Ｃ，Ｔを含む。
【０１１７】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５８０に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置４１７に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＬｙｓで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｑ５８０Ｋを含む。
【０１１８】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５８１に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５８１に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｓｐで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８１Ｄを含む。
【０１１９】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５８２に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５８２に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＴｈｒで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ａ５８２Ｔを含む。
【０１２０】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、位置５８４に対応する位置で改変を含む。別の実施形態によれば、位置５８４に対応する位置でアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで、好ましくはＡｌａで置換される。別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドの置換Ｇ５８４Ａを含む。
【０１２１】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９４及び４９６に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２２】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９２及び４９３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２３】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９４及び４１７に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２４】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９２及び５０３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２５】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９２及び５７３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２６】
別の実施形態によれば、誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９２、５０３、及び５７３に対応する位置に、例えば上述した改変を含む。
【０１２７】
１の実施形態によれば、本発明のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、配列番号３１又は配列番号１中の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群から選択されるＨＳＡ中の位置に対応する位置で１つの置換を含む。但し、当該アルブミン誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１における置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎからなる変異体ではない。本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、ＨＳＡ中の別の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置で更なる置換、挿入又は欠失を含んでもよい。
【０１２８】
別の実施形態によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、配列番号３１又は配列番号１の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２及び５８４からなる群から選択されるＨＳＡ中の位置に対応する位置で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はさらに２１以上の置換を含む。本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、ＨＳＡ中の別の位置に対応する位置で更なる置換、挿入又は欠失を含んでもよい。
【０１２９】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、その親アルブミン断片又は親アルブミン若しくはその断片を含むか、親アルブミン若しくはその断片からなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりもより長い血漿中半減期を有する。本実施形態に係る例は、配列番号３１又は配列番号１中の４９２、５０３、５４２、５５０、５７３、５７４、５８０、５８１、５８２又は５８４に対応する位置についての置換を含んでいるアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドを含む。本発明の本実施形態に係る好ましい置換は、Ｇ残基で配列番号３１若しくは配列番号１中の４９２に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換、Ｈ若しくはＫ残基で配列番号３１若しくは配列番号１中の５０３に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換、Ｅ残基で配列番号３１若しくは配列番号１中の５５０に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｌ若しくはＤで配列番号３１若しくは配列番号１中の５７３に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換、Ｎ残基で配列番号３１若しくは配列番号１中の５７４に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換又はＫ残基で配列番号３１若しくは配列番号１中の５８０に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換を含む。別の好ましい誘導体又は変異体は、Ｇ残基で配列番号３１又は配列番号１中の４９２に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換及びＡ又はＰ残基で配列番号３１又は配列番号１中の５７３に対応する位置についてのアミノ酸残基の置換を有する。別の好ましい誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１中の位置４９２に対応する位置のＨ残基による、位置５０３に対応する位置に幾つかの置換を有する。
【０１３０】
別の好ましい誘導体又は変異体は、Ｇ残基で配列番号３１又は配列番号１中の４９２に対応する位置についての置換、及びＨ又はＫに対応する配列番号３１又は配列番号１中の位置５０３に対応する位置についての置換、及びＡ又はＰ残基で配列番号３１又は配列番号１中の位置５７３についての置換を有する。
【０１３１】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むか、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片からなる融合ポリペプチドは、その親アルブミン断片又は親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドの血漿中半減期よりもより短い血漿中半減期を有する。本実施形態に係る例は、配列番号３１又は配列番号１中の４１７、４４０、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５３６、５３７、５３８、５４１、４９４＋４９６又は４９２＋４９３に対応する位置についての置換を含むアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを含む。好ましい置換は、配列番号３１又は配列番号１中のＱ４１７Ａ、Ｈ４４０Ｑ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ又はＰ４９９Ａ、Ｋ５００Ａ、Ｅ５０１Ａ、Ｅ５０１Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ、Ｋ５４１Ａ、Ｋ５４１Ｄ又はＤ５５０Ｎに対応する置換を含む。
【０１３２】
別の実施形態によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、ＦｃＲｎに結合するためのそれらの能力を失っている。この点について、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、下記のＳＰＲアッセイについて誘導体又は変異体の測定された共鳴単位が、対応する親アルブミン又はその断片の測定された共鳴単位の１０％未満の場合、ＦｃＲｎを結合するための能力を失っている。本実施形態に係る例は、配列番号３１及び配列番号１中の４６４、５００、５１０又は５３５に対応する位置で置換を有するアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを含む。好ましい置換は、配列番号３１又は配列番号１中のＨ４６４Ｑ、Ｋ５００Ａ，Ｐ，Ｃ，Ｓ，Ａ，Ｄ，Ｇ、Ｈ５１０Ｑ又はＨ５３５Ｑを含む。
【０１３３】
配列番号３１又は配列番号１中の位置４１７、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５８０、５８１、５８２及び５８４に対応する１又は２以上（数個）の位置で１又は２以上（数個）の置換に加えて、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、分子の別の位置で更なる置換、欠失又は挿入を含んでもよい。斯かる更なる置換、欠失又は挿入は、別の分子の特性、例えばこれに限定されるものではないが、グリコシル化の改変、表面へのチオール基等の反応性基の導入、カルバモイル化部位の除去／生成、等を改変するために有用であってもよい。
【０１３４】
反応性残基を表面に供するべく改変可能な残基であって、本発明に有利に適用可能な残基としては、未公開特許出願、国際公開第２０１０／０９２１３５号中で開示される（引用により含む）。特に好ましい残基は、配列番号３１又は配列番号１中の位置に対応する位置の残基を含む。
【０１３５】
表面上に反応性チオール基を提供するために配列番号３１若しくは配列番号１について又は別のアルブミン中の対応する位置についてなされ得る改変の例として、配列番号３１又は配列番号１中の次の改変：Ｌ５８５Ｃ、Ｄ１Ｃ、Ａ２Ｃ、Ｄ５６２Ｃ、Ａ３６４Ｃ、Ａ５０４Ｃ、Ｅ５０５Ｃ、Ｔ７９Ｃ、Ｅ８６Ｃ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ５４９Ｃ、Ａ５８１Ｃ、Ｄ１２１Ｃ、Ｅ８２Ｃ、Ｓ２７０Ｃ、Ａ５７８Ｃ、Ｌ５９５ＬＣ、Ｄ１ＤＣ、Ａ２ＡＣ、Ｄ５６２ＤＣ、Ａ３６４ＡＣ、Ａ５０４ＡＣ、Ｅ５０５ＥＣ、Ｔ７９ＴＣ、Ｅ８６ＥＣ、Ｄ１２９ＤＣ、Ｄ５４９ＤＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ｄ１２１ＤＣ、Ｅ８２ＥＣ、Ｓ２７０ＳＣ、Ａ５７９ＡＣ、Ｃ３６０*、Ｃ３１６*、Ｃ７５*、Ｃ１６８*、Ｃ５５８*、Ｃ３６１*、Ｃ９１*、Ｃ１２４*、Ｃ１６９*及びＣ５６７*に対応する改変を含む。或いは、システイン残基が、アルブミンのＮ又はＣ末端に付加されてもよい。
【０１３６】
第２の観点によれば、本発明は、本発明の任意のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、例えば：（ｉ）アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードしている核酸、（ｉｉ）前記核酸を含むプラスミド及び（ｉｉｉ）前期プラスミドを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、調節配列と一致する条件下、適当な宿主細胞中にコーディング配列の発現を指示する１又は２以上（数個）の調節配列と作動式に連結する本発明の誘導体又は変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトに関する。本発明の第２の観点によれば、好ましくは、親は、（ｉ）配列番号２の成熟ポリペプチドコーディング配列（配列番号３：NCBI参照配列：ＮＭ＿０００４７７．５、配列番号３はゲノムＤＮＡ）、（ｉｉ）成熟ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列（ｃＤＮＡは、配列番号２）、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の全長相補鎖と、極めて低いストリンジェンシー条件、低いストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、やや高いストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、若しくは極めて高いストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【０１３７】
配列番号２又はそのサブ配列のポリヌクレオチドは、配列番号２又はその断片のアミノ酸配列と同様に、当該技術分野で周知の方法に従って、異なる属又は種の株由来の親をコードするＤＮＡを同定し及びクローン化するための核酸プローブを設計するために使用されてもよい。特に、斯かるプローブを用い、標準的なサザンブロッティングの手順に従って、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うことにより、対応する遺伝子を同定及び単離することが可能である。斯かるプローブは、全配列よりもかなり短くてもよいが、少なくとも１４、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド又は少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡ及びＲＮＡの両方のプローブが、使用され得る。プローブは、一般的に、対応する遺伝子を検出するために標識される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジン等で）。斯かるプローブも、本発明に包含される。
【０１３８】
上述したプローブにハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡを、斯かる別の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングしてもよい。斯かる別の生物由来のゲノム又は別のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は別の分離技術により単離されてもよい。ライブラリー由来のＤＮＡ又は単離されたＤＮＡを、ニトロセルロース又は別の適当な担体材料上に移動し及び固定してもよい。配列番号２又はそのサブ配列と相同であるクローン又はＤＮＡを同定するために、担体材料が、サザンブロットで使用される。
【０１３９】
本発明の目的において、ハイブリダイゼーションによって、低いストリンジェンシー条件〜極めて高いストリンジェンシー条件下、ポリヌクレオチドが、配列番号２中に示されたポリヌクレオチドに対応する標識されたヌクレオチドプローブ、その相補鎖、又はそのサブ配列にハイブリダイズすることを意味する。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム又は当該分野で周知の別の検出方法を使用して検出され得る。
【０１４０】
１の実施形態によれば、核酸プローブは、配列番号２の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の実施形態によれば、核酸プローブは、配列番号２のヌクレオチド１〜１７５８である。別の実施形態によれば、核酸プローブは、配列番号１のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドである。別の実施形態によれば、核酸プローブは、配列番号２である。
【０１４１】
少なくとも１００ヌクレオチド長を有する長いプローブの場合、極めて低いストリンジェンシーから極めて高いストリンジェンシーまでの条件は、以下のように定義される。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、４２℃、５×ＳＳＰＥ中、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、及び、極めて低いストリンジェンシー及び低いストリンジェンシーの場合は２５％ホルムアミド、中程度のストリンジェンシー及びやや高いストリンジェンシーの場合は３５％ホルムアミド、高いストリンジェンシー及び極めて高いストリンジェンシーの場合は５０％ホルムアミドの存在下、標準的なサザンブロッティング手順に従って、好適には１２〜２４時間行う。最後に担体材料を各々１５分ずつ３回、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して、４５℃（極めて低いストリンジェンシー）、５０℃（低いストリンジェンシー）、５５℃（中程度のストリンジェンシー）、６０℃（やや高いストリンジェンシー）、６５℃（高いストリンジェンシー）、又は７０℃（極めて高いストリンジェンシー）で洗浄する。
【０１４２】
約１５ヌクレオチドから約７０ヌクレオチド長を有する短いプローブの場合、ストリンジェンシー条件は以下のように定義される。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、約５℃から約１０℃、且つ、Ｂｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390）に従って計算されたＴm以下の温度で、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ トリス〜ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ〜４０、１×デンハート液（Denhardt's solution）、１ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ リン酸一ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１ｍｌ当たり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡの存在下、標準的なサザンブロッティング手順に従って、好適には１２〜２４時間行う。最後に担体材料を、５℃から１０℃且つ計算されたＴm以下の温度で、６×ＳＣＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて１５分１回、続いて６×ＳＳＣを用いて１５分ずつ２回洗浄する。
【０１４３】
親は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号２の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して配列同一性を伴うポリヌクレオチドによりコードされてもよく、そしてそれは、アルブミンとして機能し得るポリペプチドをコードする。１つの実施態様によれば、親は、配列番号２を含むか、配列番号２からなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１４４】
本発明の第３の観点によれば、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いは、前記アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、当該技術分野内で周知の技術を使用して第２の分子とコンジュゲートされてもよい。前記第２の分子は、診断部位を含むか、斯かる部位からなってもよく、及び本実施形態によれば、コンジュゲートは、画像化などの診断ツールとして有用であってもよく、又は第２の分子は、治療用化合物であってもよく、本実施形態によれば、コンジュゲートは、コンジュゲートが、治療用化合物の治療特性と同様にそのアルブミン誘導体、断片、変異体を伴うその関連由来の改変された血漿中半減期を有する治療特性のために使用されてもよい。アルブミン及び治療用分子のコンジュゲートは、当該技術分野で公知であり及び斯かるコンジュゲートは、それ自体コンジュゲートされていない遊離状態の治療分子と比べて、長い血漿中半減期を有することが確認されている。コンジュゲートは、アルブミン誘導体、断片、又はその誘導体若しくは変異体の表面上に存在する遊離チオール基を介して好都合に結合されてもよい。本チオール基の存在は、自然（例えば、遊離チオール基が、成熟ＨＳＡのアミノ酸残基３４に相当してもよい）又は遺伝子工学及びコンジュゲーション化学についての技術分野内で周知の技術を使用して、ポリペプチド内に設計されてもどちらでもよい。或いは、コンジュゲートは、例えば、同時係属中の特許出願（EP 2009 152 625.1、引用により本明細書中に組み込まれる）中に開示されるなど、ＨＳＡドメインIII誘導体、断片、又はその変異体の表面上に提供される別の遊離チオール基を介して結合されてもよい。
【０１４５】
本発明に係るアルブミンコンジュゲーションの半減期は、コンジュゲーションパートナー分子単独の半減期よりもより長い又はより短い。本発明に係るアルブミンコンジュゲーションの半減期は、天然ＨＳＡ（本発明に係るアルブミン変異体又は誘導体の代わりに）及びコンジュゲーション分子を含んでいる類似／相当する（equivalent）アルブミンコンジュゲーションの半減期よりもより長い又はより短くてもよい。
【０１４６】
特に好ましい１の実施形態によれば、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片は、有益な治療用化合物にコンジュゲートされ、及びコンジュゲートは、それを必要とする患者における、選択された特定の治療用化合物に対して感受性の状態を処置するために使用される。斯かる治療用化合物とアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片をコンジュゲートするための技術は、当該技術分野で知られている。国際公開第２００９／０１９３１４号は、治療用化合物とポリペプチドをコンジュゲートするために適当な技術の例を開示し、そしてそれは、本発明にまた適用され得る。さらに国際公開第２００９／０１９３１４号は、置換されたトランスフェリンとコンジュゲートされてもよい化合物及び部分の例を開示し及びこれらの例は、また、本発明に適用されてもよい。国際公開第２００９／０１９３１４号の教示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１４７】
ＨＳＡは、その天然形態について、コンジュゲーションのために好都合に使用されてもよい１の遊離チオール基を含む。本実施形態内で特定の実施態様として、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を更に修飾し、表面上に追加の（更なる）遊離チオール基を供してもよい。これによってアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片のペイロードを増加させることができるという利点がある。これにより、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片の各分子に対して、２分子以上の治療用化合物をコンジュゲートさせることができる。或いは、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片の各分子に対して、２種以上の異なる治療用化合物（例えば標的化特性を有する化合物（例えば腫瘍特異的抗体）と細胞毒性薬等）をコンジュゲートさせることが可能となり、惹いては腫瘍に対して極めて特異性の高い薬を提供することが可能となる。更なる遊離チオール基を表面に供するべく修飾可能な具体的な残基については、例えば、同時係属中の特許出願である国際公開第２０１０／０９２１３５号（これは引用により組み込まれる）に開示されている。
【０１４８】
本発明の第４の観点によれば、本発明に係るアルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、非アルブミンポリペプチド融合パートナーとまた融合させてもよい。融合パートナーは、原則として任意のポリペプチドでもよいが、通常は治療又は診断特性を有するポリペプチドであることが好ましい。アルブミンを含む融合ポリペプチドは当該技術分野において公知である。アルブミン及び融合パートナーポリペプチドを含む斯かる融合ポリペプチドは、融合されていない融合パートナーポリペプチドと比較して、より長い血漿中半減期を有することが見出されている。本発明によれば、従来の対応する融合ポリペプチドと比較して、本発明に係る融合ポリペプチドの血漿中半減期を改変することが可能である。アルブミンと融合パートナーポリペプチドの融合及び適当な融合パートナーポリペプチドの例に関するさらなる教示が、国際公開第０１／７９２７１Ａ号及び国際公開第０３／５９９３４Ａ号中に見出される。本発明に係るアルブミン融合の半減期は、融合パートナーポリペプチド単独の半減期よりもより長く又はより短くてもよい。本発明に係るアルブミン融合の半減期は、天然ＨＳＡ（本発明に係るアルブミン変異体又は誘導体の代わりに）及び融合パートナーを含むか、天然ＨＳＡ及び融合パートナーからなる類似／相当するアルブミンの半減期よりもより長く又はより短くてもよい。
【０１４９】
本発明のすべての観点によれば、融合パートナーポリペプチド及び／又はコンジュゲートは、１又は２以上（数個）の：4-1BBリガンド、５−ヘリックス、ΑヒトC-Cケモカイン、ΑヒトL105ケモカイン、ΑヒトL105ケモカイン、名称huL105_3.、γ−インターフェロン（ＭＩＧ）により誘導されるΑモノカイン、Α部分CXCR4Bタンパク質、Α血小板塩基性タンパク質（platelet basic protein：ＰＢＰ）、α１−抗トリプシン、ACRP-30ホモログ；補体成分C1q C、アデノイド発現型ケモカイン（Adenoid-expressed chemokine：ＡＤＥＣ）、ａＦＧＦ；ＦＧＦ−１、ＡＧＦ、ＡＧＦタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンギオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシン（collapsin）特異抗体、アンチスタシン（antistasin）、抗ＴＧＦβファミリー抗体、抗トロンビンIII、APM-1；ACRP-30；ファモキシン（Famoxin）、アポリポタンパク質種、アリールスルファターゼＢ、b57タンパク質、ＢＣＭＡ、Β−トロンボグロブリンタンパク質（β−ＴＧ）、ｂＦＧＦ；ＦＧＦ２、血液凝固因子、ＢＭＰ プロセシング酵素フーリン（Furin）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、骨形態形成タンパク質−２、カルシトニン、カルパイン−１０ａ、カルパイン−１０ｂ、カルパイン−１０ｃ、ガンワクチン、カルボキシペプチダーゼ、Ｃ−Ｃケモカイン、MCP2、CCR5変異体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受容体タンパク質、CD20 Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30リガンド、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52 Mab、ケルベロス（Cerebus）タンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカインhＩＬ−8、ケモカインhMCP1、ケモカインhMCP1a、ケモカインhMCP1b、ケモカインhMCP2、ケモカインhMCP3、ケモカインhSDF1b、ケモカインMCP-4、ケモカインTECK及びTECK変異体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M1全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M10全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M3、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M8全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−8M9全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-414全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-426全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質PF4-M2 全長及び成熟体、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、c-kitリガンド；ＳＣＦ；マスト細胞増殖因子；ＭＧＦ；線維肉腫由来幹細胞因子、ＣＮＴＦ及びその断片（例えばCNTFAx15'（Axokine(商標)））、凝固因子（前駆体及び活性体）、コラーゲン、補体C5 Mab、結合組織活性化タンパク質−III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXCケモカイン受容体３、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、ダーベポエチン、名称エクソダス（exodus）、名称huL105_7.、DＩＬ−40、Dnase、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ受容体Mab、ENA-78、エンドスタチン（Endostatin）、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質−７８、ＥＰＯ受容体；ＥＰＯＲ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣物、ユートロピン（Eutropin）、エクソダス（exodus）タンパク質、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第Ｘ因子及び第XIII因子、FASリガンド阻害タンパク質（DcR3）、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；線維芽細胞増殖因子相同因子（Fibroblast growth factor homologous factor）−１、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；ゲロニン（gelonin）、HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；ヘパリン結合性分泌形質転換因子（Heparin binding secreted transforming factor）−２、FGF-8、FGF-9；グリア活性化因子、フィブリノゲン、flt-1、flt-3 リガンド、卵胞刺激ホルモンαサブユニット、卵胞刺激ホルモンβサブユニット、ホリトロピン、フラクタルカイン（Fractalkine）、断片化筋原線維タンパク質トロポニンＩ（fragment. myofibrillar protein トロポニンI）、ＦＳＨ、ガラクトシダーゼ、ガレクチン−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ−１、遺伝子療法薬、グリオーマ由来増殖因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン（Glycodelin）−Ａ；プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質−２（Granulocyte chemotactic protein-2：ＧＣＰ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、増殖関連オンコジーン−α（Growth related oncogene-alpha：ＧＲＯ−α）、増殖関連オンコジーン−β（ＧＲＯ−β）、増殖関連オンコジーン-γ（ＧＲＯ−γ）、hAPO-4；TROY、ｈＣＧ、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ワクチン、HER2受容体Mab、ヒルジン（hirudin）、ＨＩＶ gp120、ＨＩＶ gp41、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶプロテアーゼ阻害ペプチド、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、ＨＰＶワクチン、
ヒト6CKineタンパク質、ヒトAct-2タンパク質、ヒト脂質生成阻害因子、ヒトＢ細胞刺激因子−２受容体、ヒトβ−ケモカインH1305（MCP-2）、ヒトC-CケモカインDGWCC、ヒトCCケモカインELCタンパク質、ヒトCC型ケモカインインターロイキンC、ヒトCCC3タンパク質、ヒトCCF18ケモカイン、ヒトCC型ケモカインタンパク質、名称ＳＬＣ（secondary lymphoid chemokine：二次リンパケモカイン）、ヒトケモカインβ-8短小型、ヒトケモカインC10、ヒトケモカインCC-2、ヒトケモカインCC-3、ヒトケモカインCCR-2、ヒトケモカインCkβ-7、ヒトケモカインENA-78、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカインGROα、ヒトケモカインGROα、ヒトケモカインGROβ、ヒトケモカインHCC-1、ヒトケモカインHCC-1、ヒトケモカインI-309、ヒトケモカインIP-10、ヒトケモカインL105_3、ヒトケモカインL105_7、ヒトケモカインＭＩＧ、ヒトケモカインＭＩＧ-βタンパク質、ヒトケモカインMIP-1α、ヒトケモカインMIP1β、ヒトケモカインMIP-3α、ヒトケモカインMIP-3β、ヒトケモカインPF4、ヒトケモカインタンパク質331D5、ヒトケモカインタンパク質61164、ヒトケモカイン受容体CXCR3、ヒトケモカインSDF1α、ヒトケモカインSDF1β、ヒトケモカインZSIG-35、ヒトChr19Kineタンパク質、ヒトCKβ-9、ヒトCKβ-9、ヒトCX3C 111アミノ酸ケモカイン、ヒトDNAX インターロイキン-40、ヒトDVic-1 C-Cケモカイン、ヒトEDIRF Iタンパク質配列、ヒトEDIRF IIタンパク質配列、ヒト好酸球CC型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球発現型ケモカイン（eosinophil-expressed chemokine：ＥＥＣ）、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＩ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットC、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＩタンパク質、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＴ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＴ、ヒト胎児脾臓発現型ケモカイン、ＦＳＥＣ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体、ヒトgro-αケモカイン、ヒトgro-βケモカイン、ヒトgro-γケモカイン、ヒトＩＬ−１6タンパク質、ヒトＩＬ−１RD10タンパク質配列、ヒトＩＬ−１RD9、ヒトＩＬ−5受容体α鎖、ヒトＩＬ−6受容体、ヒトＩＬ−8受容体タンパク質hIL8RA、ヒトＩＬ−8受容体タンパク質hIL8RB、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体＃３、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体断片、ヒトＩＬ−9受容体タンパク質変異体断片＃３、ヒトインターロイキン１δ、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１８、ヒトインターロイキン１８誘導体、ヒトインターロイキン−１β前駆体、ヒトインターロイキン−１β前駆体、ヒトインターロイキン−１受容体補助タンパク質、ヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストβ、ヒトインターロイキン−１タイプ３受容体、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１１受容体、ヒトインターロイキン−１２ ４０ｋＤサブユニット、ヒトインターロイキン−１２ β-1受容体、ヒトインターロイキン−１２ β-2受容体、ヒトインターロイキン−１２ p35タンパク質、ヒトインターロイキン−１２ p40タンパク質、ヒトインターロイキン−１２受容体、ヒトインターロイキン−１３ α受容体、ヒトインターロイキン−１３ β受容体、ヒトインターロイキン−１５、クローンP1由来ヒトインターロイキン−１５受容体、ヒトインターロイキン−１７受容体、ヒトインターロイキン−１８タンパク質（ＩＬ−１８）、ヒトインターロイキン−３、ヒトインターロイキン−３受容体、ヒトインターロイキン−３変異体、ヒトインターロイキン−４受容体、ヒトインターロイキン−５、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−8）、ヒト細胞内ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ヒトＩＰ−１０及びＨＩＶ−１ gp120 超可変領域融合タンパク質、ヒトＩＰ−１０及びヒトMuc-1コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節ケモカイン（liver and activation regulated chemokine：ＬＡＲＣ）、ヒトLkn-1全長及び成熟タンパク質、ヒト乳房関連ケモカイン（mammary associated chemokine：ＭＡＣＫ）タンパク質全長及び成熟体、ヒト成熟ケモカインCkβ-7、ヒト成熟gro-α、ヒト成熟gro-γポリペプチド（敗血症治療用）、ヒトMCP-3及びヒトMuc-1コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒトMI10タンパク質、ヒトMI1Aタンパク質、ヒト単球走化性因子hMCP-1、ヒト単球走化性因子hMCP-3、ヒト単球走化性前駆タンパク質（monocyte chemotactic proprotein：ＭＣＰＰ）配列、ヒトニューロタクチン（neurotactin）ケモカイン様ドメイン、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインH174、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインIP10、ヒト非ＥＬＲ CXCケモカインMig、ヒトPAI-1ミュータント、ＩＬ−１6活性を有するヒトタンパク質、ＩＬ−１6活性を有するヒトタンパク質、ヒト二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトSISDタンパク質、ヒトSTCP-1、ヒト間質細胞由来ケモカイン、SDF-1、ヒトＴ細胞混合リンパ球反応性発現型ケモカイン（T cell mixed lymphocyte reaction expressed chemokine：ＴＭＥＣ）、ヒト胸腺及び活性化調節サイトカイン（thymus and activation regulated cytokine：ＴＡＲＣ）、ヒト胸腺発現型、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−β（LT-α）、ヒトタイプCCケモカインエオタキシン３タンパク質配列、ヒトタイプIIインターロイキン−１受容体、ヒト野生型インターロイキン−４（ｈＩＬ−４）タンパク質、ヒトZCHEMO-8タンパク質、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体及びその断片、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体及びその断片、
ヒアルロニダーゼ、ＩＣＥ １０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ ２０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ ２２ｋＤサブユニット、イズロン酸-2-スルファターゼ、イズロニダーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１阻害剤（ＩＬ−１ｉ）、ＩＬ−１成熟体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１１、ＩＬ−１１、ＩＬ−１2 p40サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、ＩＬ−１９、ＩＬ−１ｉ断片、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、ＩＬ−２１（ＴＩＦ）、ＩＬ−３含有融合タンパク質、ＩＬ−３ミュータントタンパク質、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ−４ムテイン（mutein）、ＩＬ−４ムテインY124G、ＩＬ−４ムテインY124X、ＩＬ−４ムテイン類、Ｉｌ−５受容体、ＩＬ−６、Ｉｌ−６受容体、ＩＬ−７受容体クローン、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−９成熟タンパク質変異体（Met117バージョン）、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子又は何れかの断片（例えば小モジュール免疫薬(商標)（small modular immunopharmaceutical：ＳＭＩＰ）又はdAb、Fab'断片、F(ab')2、scAb、scFv又はscFv断片）、例えば（これに限定されるものではないが）プラスミノーゲン、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インシュリン、インシュリン様増殖因子、インテグリンMab、インターαトリプシン阻害剤、インターαトリプシン阻害剤、インターフェロンγ誘導性タンパク質（IP-10）、インターフェロン類（例えばインターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種等）、インターフェロン（例えばインターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種等）、インターロイキン６、インターロイキン８（ＩＬ−８）受容体、インターロイキン８受容体Ｂ、インターロイキン−１α、インターロイキン−２受容体アソシエートｄタンパク質p43、インターロイキン−３、インターロイキン−４ムテイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）タンパク質、インターロイキン−９、インターロイキン−９（ＩＬ−９）成熟タンパク質（Thr117バージョン）、インターロイキン（例えばＩＬ１０、ＩＬ１１及びＩＬ２等）、インターロイキンｓ（例えばＩＬ１０、ＩＬ１１及びＩＬ２等）、日本脳炎ワクチン、カリクレイン阻害剤、ケラチノサイト増殖因子、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えばアプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質及び国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの等、アルブミン融合の有無によらず）、クニッツドメインタンパク質（例えばアプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質及び国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの等、アルブミン融合の有無によらず）、ＬＡＣＩ、ラクトフェリン、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質II、レプチン、肝臓発現型ケモカイン−１（ＬＶＥＣ−１）、肝臓発現型ケモカイン−２（ＬＶＥＣ−２）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、黄体化ホルモン、ライム病（Lyme）ワクチン、リンホタクチン（Lymphotactin）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ（n+1）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ−eyfy、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ−yl、マクロファージ由来ケモカイ���、ＭＤＣ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マスピン；プロテアーゼ阻害剤５、ＭＣＰ−１受容体、ＭＣＰ−１ａ、ＭＣＰ−１ｂ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４受容体、Ｍ−ＣＳＦ、メラノーマ阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Met117ヒトインターロイキン９、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−γ、ＭＩＲＡＰ、修飾型ランテス（Modified Rantes）、モノクローナル抗体、MP52、ミュータントインターロイキン６ S176R、筋原線維収縮性タンパク質トロポニンＩ、ナトリウム利尿ペプチド、神経増殖因子−β、神経増殖因子−β２、ニューロピリン（Neuropilin）−１、ニューロピリン−２、ニューロタクチン（Neurotactin）、ニューロトロフィン（Neurotrophin）−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−４ａ、ニューロトロフィン−４ｂ、ニューロトロフィン−４ｃ、ニューロトロフィン−４ｄ、好中球活性化ペプチド−２（Neutrophil activating peptide-2：ＮＡＰ−２）、ＮＯＧＯ−６６受容体、ＮＯＧＯ−Ａ、ＮＯＧＯ−Ｂ、ＮＯＧＯ−Ｃ、新規β-ケモカイン、名称ＰＴＥＣ、Ｎ末端修飾ケモカインGroHEK/hSDF-1α、Ｎ末端修飾型ケモカインGroHEK/hSDF-1β、Ｎ末端修飾型ケモカインmet-hSDF-1α、Ｎ末端修飾型ケモカインmet-hSDF-1β、ＯＰＧＬ、骨原性タンパク質−１；ＯＰ−１；ＢＭＰ−７、骨原性タンパク質−２、ＯＸ４０；ＡＣＴ−４、ＯＸ４０Ｌ、オキシトシン（ニューロフィジンＩ）、副甲状腺ホルモン、パッチ型、パッチ型−２、ＰＤＧＦ−Ｄ、百日咳トキソイド、下垂体発現型ケモカイン（Pituitary expressed chemokine：ＰＧＥＣ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子−２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１；PAI-1、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２；ＰＡＩ−２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２；ＰＡＩ−２、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Bv-sis、血小板由来増殖因子前駆体Ａ、血小板由来増殖因子前駆体Ｂ、血小板Mab、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、敗血症治療用ポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ミラノ」（milano）変異体、プレプロアポリポタンパク質「パリ」（paris）変異体、プレトロンビン、霊長類CCケモカイン「ILINCK」、霊長類CXCケモカイン「IBICK」、プロインシュリン、プロラクチン、プロラクチン２、プロサプチド（prosaptide）、プロテアーゼ阻害ペプチド、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTESペプチド、RANTES受容体、組換インターロイキン-16、レジスチン（Resistin）、レストリクトシン（restrictocin）、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン（ricin）、ロタウイルスワクチン、ＲＳＶ Mab、サポリン、サルシン（sarcin）、分泌及び膜貫通ポリペプチド、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエステラーゼ、血清タンパク質（例えば血液凝固因子等）、溶解性ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質−３、溶解性ＶＥＧＦ受容体、幹細胞阻害因子、ブドウ球菌（Straphylococcus）ワクチン、間質由来因子−１α、間質由来因子−１β、サブスタンスＰ（タキキニン）、T1249ペプチド、T20ペプチド、T4エンドヌクレアーゼ、TACI、Tarc、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Thr117ヒトインターロイキン９、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体１、トロンボポエチン誘導体２、トロンボポエチン誘導体３、トロンボポエチン誘導体４、トロンボポエチン誘導体５、トロンボポエチン誘導体６、トロンボポエチン誘導体７、胸腺発現型ケモカイン（Thymus expressed chemokine：ＴＥＣＫ）、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝固ペプチド、Tim-1タンパク質、ＴＮＦ−α前駆体、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−ＲII；ＴＮＦ p75受容体；デス（Death）受容体、tPA、トランスフェリン、形質転換増殖因子β、トロポニンペプチド、切断型単球走化性タンパク質２（６−７６）、切断型単球走化性タンパク質２（６−７６）、切断型RANTESタンパク質（３−６８）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレッシン（ニューロフィジンII）、ＶＥＧＦ R-3；flt-4、ＶＥＧＦ受容体；KDR；flk-1、ＶＥＧＦ-１１０、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１３８、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６２、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８２、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ；ＶＥＧＦ−Ｘ、フォン・ヴィルブラント因子、野生型単球走化性タンパク質２、野生型単球走化性タンパク質２、ＺＴＧＦ−β９を含んでもよい。
【０１５０】
さらに、コンジュゲートは、１又は２以上（数個）の化学療法薬、例えば：１３−シス−レチノイン酸、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン（Azacitidine）、５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、６−メルカプトプリン、６−ＭＰ、６−ＴＧ、６−チオグアニン、Ａ、アブラキサン（Abraxane）、アキュテイン（Accutane）（登録商標）、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（Adrucil）（登録商標）、アグリリン（Agrylin）（登録商標）、アラ−コート（Ala-Cort）（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ALIMTA）、アリトレチノイン（Aliトレチノイン）、アルカバン−ＡＱ（Alkaban-AQ）（登録商標）、アルケラン（Alkeran）（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン（Altretamine）、アメトプテリン、アミホスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（Anandron）（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ara-C、アラネスプ（Aranesp）（登録商標）、アレディア（Aredia）（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（Arranon）（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ATRA、アバスチン（Avastin）（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン、ベクザー（BEXXAR）（登録商標）、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、ブレノキサン（Blenoxane）（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（Busulfex）（登録商標）、C225、カルシウムロイコボリン、キャンパス（Campath）（登録商標）、カンプトサール（Camptosar）（登録商標）、カンプトセシン−１１、カペシタビン、キャラック（Carac）(商標)、カルボプラチン、カルマスティン、カルマスティンウエハー、カソデックス（Casodex）（登録商標）、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、セルビジン（Cerubidine）（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム（Citrovorum）因子、クラドリビン（Cladribine）、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、CPT-11、シクロホスファミド、シタドレン（Cytadren）（登録商標）、シタラビン、リポゾーム化シタラビン、シトサール−Ｕ（Cytosar-U）（登録商標）、シトキサン（Cytoxan）（登録商標）、ダカルバジン、ダコゲン（Dacogen）、ダクチノマイシン、ダーベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、リポソーム化ダウノルビシン、ダウノキソーム（DaunoXome）（登録商標）、デカドロン（Decadron）、デシタビン（Decitabine）、Δ−コーテフ（Delta-Cortef）（登録商標）、デルタゾン（Deltasone）（登録商標）、デニロイキンジフチトクス、デポサイト（DepoCyt）(商標)、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デキサゾン（Dexasone）、デクスラゾキサン（Dexrazoxane）、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ディオデクス（Diodex）、ドセタキセル、ドキシル（Doxil）（登録商標）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、リボゾーム化ドキソルビシン、ドロキシア（Droxia）(商標)、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−ドーム（DTIC-Dome）（登録商標）、デュラローン（Duralone）（登録商標）、エフデックス（Efudex）（登録商標）、エリガード(商標)、エレンス（Ellence）(商標)、エロキサチン(商標)、エルスパー（Elspar）（登録商標）、エムサイト（Emcyt）（登録商標）、エピルビシン、エポエチンα、エルビタックス(商標)、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール（Ethyol）、エトポホス（Etopophos）（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（Eulexin）（登録商標）、エビスタ（Evista）（登録商標）、エキセメスタン、フェアストン（Fareston）（登録商標）、フェソロデックス（Faslodex）（登録商標）、フェマーラ（登録商標）、フィルグラスチム（Filgrastim）、フロクスウリジン（Floxuridine）、フルダラ（Fludara）（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレクス（Fluoroplex）（登録商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン（Fluoxymesterone）、フルタミド（Flutamide）、フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Gemtuzumab ozogamicin）、ジェムザール（登録商標）、グリーベック(商標)、グリアデル（Gliadel）（登録商標）・ウエハー、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハロテスチン（Halotestin）（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール（Hexadrol）、ヘキサレン（Hexalen）（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（Hycamtin）（登録商標）、ハイドレア（Hydrea）（登録商標）、酢酸ヒドロコート（Hydrocort Acetate）（登録商標）、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ハイドロコートン（Hydrocortone Phosphate）、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、イフェックス（Ifex）（登録商標）、ＩＦＮ−α、イホスファミド、ＩＬ−１1、ＩＬ−2、メシル酸イマチニブ、イミダゾール・カルボキシアミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂ）、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ（Kidrolase）（登録商標）、ラナコート（Lanacort）（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン（Leukeran）、ロイキン（Leukine）(商標)、ロイプロリド、ロイロクリスチン（Leurocristine）、ロイスタチン（Leustatin）(商標)、リポソーム化Ara-C、リキッド・プレド（Liquid Pred）（登録商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン（L-Sarcolysin）、リュープロン（登録商標）、リュープロン・デポー（登録商標）、Ｍ、マチュレーン（Matulane）（登録商標）、マキシデックス（Maxidex）、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドラロン（Medralone）（登録商標）、メドロール（Medrol）（登録商標）、メゲース（Megace）（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ（Mesna）、メスネックス（Mesnex）(商標)、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（Meticorten）（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール（Prednisol）（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスタルゲン（Mustargen）（登録商標）、ムスチン（Mustine）、ムタマイシン（Mutamycin）（登録商標）、ミレラン（登録商標）、マイロセル（Mylocel）(商標)、マイロターグ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（Neosar）（登録商標）、ニューラスタ（Neulasta）(商標)、ニューメガ（Neumega）（登録商標）、ニューポジェン（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ニランドロン（Nilandron）（登録商標）、ニルタミド、ニペント（Nipent）（登録商標）、ナイトロジェン・マスタード、ノバルデックス（Novaldex）（登録商標）、ノバントロン（Novantrone）（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー（Oncospar）（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（Ontak）（登録商標）、オンキサル（Onxal）(商標)、オプレベルキン（Oprevelkin）、オラプレッド（Orapred）（登録商標）、オラソン（Orasone）（登録商標）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合型、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（Panretin）（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペディアプレッド（Pediapred）（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ＰＥＧアスパルガーゼ、ＰＥＧフィルグラスチム、ＰＥＧイントロン(商標)、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニン・マスタード、プラチノール（Platinol）（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（Prelone）（登録商標）、プロカルバジン、プロクリット（登録商標）、プロロイキン（Proleukin）（登録商標）、カルマスティン・インプラントによるプロリフェプロスパン（Prolifeprospan）２０、ピュリネソール（Purinethol）（登録商標）、Ｒ、ラロキシフェン、レブリミド（登録商標）、リウマトレックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（Roferon-A）（登録商標）（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス（Rubex）（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、ソル・コーテフ（solu-cortef）（登録商標）、ソル・メドロール（solu-Medrol）（登録商標）、ソラフェニブ、スプリセル(商標)、STI-571、ストレプトゾシン、SU11248、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、ターグレチン（Targretin）（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（Temodar）（登録商標）、テモゾロミド、テニポシド、テスパ（TESPA）、サリドマイド、サロミド（Thalomid）（登録商標）、テラシス（TheraCys）（登録商標）、チオグアニン、チオグアニン・タブロイド（登録商標）、チオホスホアミド（phosphoamide）、チオプレックス（Thioplex）（登録商標）、チオテパ、タイス（TICE）（登録商標）、トポサール（Toposar）（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トレクサール（Trexall）(商標)、トリセノックス（登録商標）、ＴＳＰＡ、タイケルブ（TYKERB）（登録商標）、ＶＣＲ、ベクティビックス（Vectibix）(商標)、ベルバン（Velban）（登録商標）、ベルケイド（Velcade）（登録商標）、ベプシド（VePesid）（登録商標）
、ベサノイド（Vesanoid）（登録商標）、ビアドゥール（Viadur）(商標)、ビダーザ（Vidaza）（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン（Vinblastine Sulfate）、ビンカサール・Pfs（Vincasar Pfs）（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット（Vorinostat）、ＶＰ−１６、ヴューモン（Vumon）（登録商標）、ゼローダ（Xeloda）（登録商標）、ザノサール（Zanosar）（登録商標）、ゼバリン（Zevalin）(商標)、ザインカード（Zinecard）（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）；放射性医薬、例えば炭素−１１、炭素−１４、クロム−５１、コバルト−５７、コバルト−５８、エルビウム−１６９、フッ素−１８、ガリウム−６７、金−１９８、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、鉄−５９、クリプトン−８１ｍ、窒素-13、酸素-15、リン-32、レニウム-186、ルビジウム-82、サマリウム-153、セレン-75、ストロンチウム-89、テクネチウム-99m、タリウム-201、トリチウム、キセノン-127、キセノン-133、イットリウム-90；及び／又は造影剤、例えばガドリニウム、マグネタイト、マンガン、テクネチウム、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｐ３２、Ｔ１２０１、イオパミドール、ＰＥＴ〜ＦＤＧを含んでもよい。
【０１５１】
斯かるポリペプチド及び化学物質は、診断用部分、治療用部分又は有益な部分として言及されてもよい。
【０１５２】
１又は２以上（数個）の治療用ポリペプチドは、アルブミンのＮ末端、Ｃ末端に融合されてもよく、アルブミン構造中のループ内に挿入されてもよく、又はそれらの任意の組合せでもよい。融合ポリペプチドのさまざまな構成要素を分離するためのリンカー配列を含んでも含まなくてもよい。
【０１５３】
アルブミンの融合又はその断片に関する教示は、当該技術分野で公知であり、及び当業者は、斯かる教示が、本発明にまた適用され得ることを理解するであろう。国際公開第２００１／７９２７１Ａ号及び国際公開第２００３／５９９３４Ａ号は、アルブミン又はその断片と融合されてもよい治療用ポリペプチドの例をまた含み、及びこれらの例は、本発明にまた適用する。
【０１５４】
本発明に係る融合又はコンジュゲートポリペプチドのアルブミン誘導体、断片、又はその変異体部分は、一般的に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の対応するその親アルブミンの部分の配列と配列同一性を有する。
【０１５５】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る融合又はコンジュゲートポリペプチドのアルブミン誘導体、断片、又はその変異体部分は、一般的に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列番号３１又は配列番号１中に示されたＨＳＡの対応する部分の配列と配列同一性を有する。
【０１５６】
２つのアミノ酸配列の間又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、「配列同一性（sequence identity)」というパラメーターにより記載される。
【０１５７】
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ〜Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のＮｅｅｄｌｅプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意のパラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを使用して得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式：
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
に従い算出される。
【０１５８】
本発明の様々な誘導体又は変異体を記載する際に、引用の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。
【０１５９】
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ〜Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のＮｅｅｄｌｅプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意のパラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力値（-nobriefオプションを使用して得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式：
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
に従い算出される。
【０１６０】
本発明の目的においては、配列番号３１又は配列番号１に開示の成熟ポリペプチドを使用して、別のアルブミンの対応するアミノ酸残基を決定する。別のアルブミンのアミノ酸配列を、配列番号３１又は配列番号１に開示の成熟ポリペプチドとアラインし、当該アラインメントに基づき、配列番号３１又は配列番号１に開示の成熟ポリペプチドの任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を決定する。掛かる作業は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ〜Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のＮｅｅｄｌｅプログラム（好ましくはバージョン3.0.0以降）で実行して行う。
【０１６１】
別のアルブミンにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23:2947-2948）を使用する多重ポリペプチド配列のアラインメントにより行うことができる。
【０１６２】
配列番号３１又は配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、別のポリペプチド（又はタンパク質）が、従来の配列に基づく比較ではその関連性を検出できない程度にまで分化している場合（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、別の対配列比較アルゴリズムを使用することができる。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁のホモログを検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）。着目するポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上（数個）の表現がタンパク質構造データベースに存在する場合には、更に高い感度が達成可能である。例えばＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測（secondary structure prediction）、構造アラインメントプロファイル（structural alignment profiles）、及び溶媒和ポテンシャル（solvation potentials））をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列をＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。これらのアラインメントを用いれば、更に着目するポリペプチドのホモロジーを生成することができる。斯かるモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
【０１６３】
構造既知のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、幾つかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。更には、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースにクエリーすれば、可能性のある構造的ホモログを発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。別のアライメントプログラムは、ユーザーガイド（Version 3.6, September 2005）中に記載されるような初期設定で使用されてもよいＭＵＳＣＬＥ（対数予測（log-expectation）による多重配列比較、Robert C. Edgar, Version 3.6, http：//www.drive5.com/muscle; Edgar （2004) Nucleic Research 32（5), 1792-97及びEdgar （2004) BMC Bioinformatics, 5（1)：113）である。ＭＵＳＣＬＥの３．６以降のバージョンが、本発明の任意の観点のためにまた使用されてもよい。
【０１６４】
本発明のアルブミン誘導体又は変異体を記載する際に、引用の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を使用する。
【０１６５】
置換  アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。図では（「／」）も使用する。例えば「Ｅ４９２Ｔ／Ｎ５０３Ｄ」等。（「／」）は（「＋」）と相互交換可能に用いる。
【０１６６】
欠失  アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置*。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」又は「Ｇ１９５*」と表す。多重欠失は加算記号（「＋」）により区切る。例えば「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」又は「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」等。
【０１６７】
挿入  アミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸＃１、新たに挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
【０１６８】
斯かる場合において、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基の番号付けは、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。即ち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【０１６９】
【表１】
2013523145.tif 000002
【０１７０】
多重改変  多重改変を含む変異体又は誘導体は、加算記号（「＋」）により区切る。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のアルギニン及び位置１９５のグリシンの、それぞれチロシン及びグルタミン酸による置換を表す。
【０１７１】
異なる置換  ある位置に２種以上の異なる置換を導入し得る場合、これらの異なる置換はカンマにより区切る。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸による置換を表す。即ち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体又は誘導体：「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」を指す。一文字コードが、また使用される。例えば、「Ｙ１６７Ｇ＋Ｒ１７０Ｇ」、「Ｙ１６７Ｇ＋Ｒ１７０Ａ」、「Ｒ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｇ」、及び「Ｒ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ａ」等。
【０１７２】
表現「に対応するアミノ酸位置（amino acid position corresponding to）」は、引用配列の位置であり、及び同様の表現は、引用配列中の特定の位置に対応する１次又は空間的な構造についてアミノ酸残基を同定することが意図される。当業者は、引用配列で与えられた配列をアラインし及び引用配列中の特定の位置でアラインするアミノ酸残基を同定することによって行い得ることを理解するであろう。例えば、ＨＳＡ中の位置４９２に対応する与えられたアルブミン配列中のアミノ酸残基を見出すために、与えられたアルブミン配列は、ＨＳＡでアラインされ及びＨＳＡ（配列番号３１又は配列番号１）中の位置４９２でアラインされたアミノ酸は、ＨＳＡ中の位置４９２に対応する与えられたアルブミン配列中のアミノ酸として同定される。
【０１７３】
表現Ｘｎｎｎは、ＨＳＡ中の位置ｎｎｎに対応する位置中に位置するアミノ酸残基Ｘを意味し、及び表現ＸｎｎｎＹは、アミノ酸残基ＹでＨＳＡ中の位置ｎｎｎに対応する位置中に位置する任意のアミノＸの置換を意味する。
【０１７４】
本明細書を通じて、アミノ酸位置は、成熟ヒト血清アルブミンの全長（即ち、リーダー配列なし）に関して定義される。しかしながら、相当する位置は、対（例えば、ClustalW）又は多重（例えば、MUSCLE）アライメントを使用してアミノ酸配列を比較することにより、ヒト血清アルブミンの断片中で、動物アルブミン中で、並びにその断片、融合及び別の誘導体又は変異体中で同定され得る。例えば、図４は、全長ヒト血清アルブミン中の５００、５５０及び５７３に相当する位置が、ヒト血清アルブミンの断片中及び別の種のアルブミン中で容易に同定されることを示す。位置５００、５５０及び５７３は、矢印で示す。さらに詳細を、以下の表１で提供する。
【０１７５】
【表２】
2013523145.tif 000003
【０１７６】
図４は、ＣｌｕｓｔａｌＷ１．８１フォーマットについての出力を含む初期パラメーターを使用してＭＵＳＣＬＥで生成された。生出力データは、出力フォーマット：ＲＴＦ＿ｎｅｗ；フォントサイズ：１０；コンセンサスライン：非コンセンサスライン；配列のフラクション（陰にするために一致しなければならない）：０．５；入力配列フォーマット：ＡＬＮを使用してＢｏｘｓｈａｄｅ３．２１（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）を使用して陰にした。従って、本明細書を通じて、ヒト血清アルブミンについて定義されるアミノ酸位置は、また断片、誘導体又は変異体及びヒト血清アルブミン、別の種由来の動物及び断片の融合及びその融合について相当する位置にも適用する。斯かる相当する位置は、（ｉ）その天然タンパク質中に異なる残基数及び／又は（ｉｉ）その天然タンパク質中に異なる天然アミノ酸を有する。
【０１７７】
血漿中半減期は、理想的には適当な個体についてインビボ決定を使用して決定される。しかしながら、動物又は人間において実験を行うのは、時間及び費用がかかる上に、倫理的な問題が避けられないので、血漿中半減期が延長又は短縮されたことを確認するには、インビトロアッセイを使用することが望ましい。アルブミンによるその受容体ＦｃＲｎへの結合は血漿中半減期にとって重要であり、受容体結合と血漿中半減期とは、アルブミンの受容体ＦｃＲｎに対する親和性が高いほど血漿中半減期が長くなるという相関関係にあることが考えられる。従って、本発明では、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体のＦｃＲｎに対する親和性が高いほど、血漿中半減期が増加（より長く）されたものと判断し、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体のＦｃＲｎ受容体に対する親和性が低いほど、血漿中半減期が低減（より短く）されたものと判断する。
【０１７８】
本出願では、受容体ＦｃＲｎに対するアルブミン誘導体、断片、又はその変異体の結合を、親和性（ＫＤ）という語、及び、「（より）強い」（stronger）又は「（より）弱い」（weaker）の表現を使用して表す。即ち、ＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも高い分子は、ＨＳＡよりも強くＦｃＲｎに結合し、及びＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも低い分子は、ＨＳＡよりも弱くＦｃＲｎに結合すると考えられる。
【０１７９】
「より長い血漿中半減期」又は「より短い血漿中半減期」という語、及び同様の表現は、全長アルブミン、アルブミン断片若しくは変異体若しくは誘導体又はアルブミン融合タンパク質でもよい対応する親アルブミン分子と関係があることが理解される。即ち、本発明の変異アルブミンに関するより長い血漿中半減期は、変異体が、配列番号３１又は配列番号１中の４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、及び５８４に対応する位置における改変（複数）を除いて同じ配列を有する対応するアルブミンよりもより長い血漿中半減期を有することを意味する。従って、例えば、位置５３５で変異を有する全長ヒト血清アルブミンは、位置５３５で変異を有しない全長ヒト血清アルブミンと比較されなければならない。同様に、マウスアルブミンのドメイン２及び３を含み並びに位置５８２で変異を有するマウスアルブミン断片は、マウスアルブミンのドメイン２及び３を含むが位置５８２で変異を有しないマウスアルブミン断片と比較されなければならない。
【０１８０】
「長い」又は「短い」血漿中半減期は、例えば血中では、（ｉ）血清アルブミン（又はその断片）及び／又は（ｉｉ）目的のポリペプチドと融合した血清アルブミン（又はその断片）と関連してもよい。例えば長い血漿中半減期は、血清アルブミン又は目的のポリペプチドと融合した血清アルブミンのそれよりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％より長くてもよい。長い血漿中半減期は、少なくとも５から１００日まで、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２０、２１、２８、３０、３５、４０、４２、５０、６０、７０、８０、９０、１００日を含む。短い血漿中半減期は、血清アルブミン又は目的のポリペプチドと融合した血清アルブミンのそれよりも少なくとも５％より短く、より好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％より短くてもよい。短い血漿中半減期は、多くても５、４、３、２、１、０．５又は０．２５日を含む。非融合アルブミン誘導体又は変異体の半減期は、非融合親又は天然アルブミンと比較されることが好ましい。同様に、融合アルブミン誘導体又は変異体（「アルブミン融合」）は、融合親又は天然アルブミンと比較されることが好ましい。
【０１８１】
ＦｃＲｎに対するアルブミン誘導体、断片又はその変異体の結合は、動態因子（kinetic factor）、特に「会合速度」（on-rate）（ｋａ）及び「解離速度」（off-rate）（ｋｂ）を使用してまた記載されてもよく、そしてそれは、それによってＦｃＲｎと本発明のアルブミン誘導体、断片又はその変異体との会合又は解離それぞれの反応速度を記載する。本発明者等は、さらに動態は、それによってＦｃＲｎと相互作用するアルブミン誘導体、断片又はその変異体が、血漿中半減期への影響を有するかもしれないことをさらに理解し、及び遅い解離速度を有するアルブミン誘導体、断片又はその変異体が、より早い解離速度を有する相当する分子よりもより高い血漿中半減期を有することを理解する。
【０１８２】
ＦｃＲｎ受容体に対するアルブミン誘導体、断片、又はその変異体の結合と血漿中半減期の間の相関性は、本発明の分野内の先行技術に基づいて本発明者等により理解されている。
【０１８３】
アルブミン誘導体、断片、又はその変異体の親和性が野生型アルブミンよりもより高い又はより低いかどうかを決定するための一つの方法は、以下で記載したような表面プラズモン共鳴アッセイ（SPR）を使用することである。当業者は、別の方法、例えば結合定数ＫＤの決定及び比較が、ＦｃＲｎに対するアルブミン誘導体、断片、又はその変異体の親和性が、ＦｃＲｎに対する対応する野生型アルブミンの親和性よりもより高い又はより低いかどうかを決定するために有用であることを理解するであろう。即ち、本発明に係る天然ＨＳＡのＫＤよりもより低いＫＤを有するアルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、ＨＳＡよりもより高い血漿中半減期を有することが考えられ、及び天然ＨＳＡのＫＤよりもより高いＫＤを有するアルブミン誘導体、断片又はその変異体は、ＨＳＡよりもより低い血漿中半減期を有することが考えられる。
【０１８４】
誘導体及び変異体の調製
本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、当業者に周知の技術を使用して調製され得る。１つの便利な方法は、親アルブミン、その断片又はＨＳＡドメインIII誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによる。ポリヌクレオチドは、誘導体又は変異体の発現を提供するためのさまざまな方法について操作されてもよい。ベクター内へのその挿入の前にポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依拠することが望ましい又は必要であってもよい。組換ＤＮＡ方法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は、当該技術分野において周知である。
【０１８５】
調節配列としては、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識される、プロモーター配列が挙げられてもよい。プロモーター配列は、誘導体又は変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、任意の核酸配列であってもよく、ミュータント型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよい。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得されたものでもよい。
【０１８６】
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＡ（PRA1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＢ（PRB1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（TEF1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（TEF2）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1、ADH2/TDH1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な別のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488に記載されている。
【０１８７】
調節配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適当な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
【０１８８】
酵母宿主細胞の場合に好ましいターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（TDH1）に関する遺伝子由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な別のターミネーターは、Romanos et al.,1992（同上）に記載されている。
【０１８９】
調節配列としては、適当なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列を使用することができる。
【０１９０】
本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体にシグナル配列（また「シグナルペプチド」として又は「リーダー配列」として知られている）をまた結合し、形質転換された宿主細胞の培養の間、ポリペプチドが生育培地内に分泌されるようにしてもよい。誘導体又は変異体ポリペプチドを生育培地内に分泌されるようにすると、一般的に回収及び精製が容易になるので有利である。酵母宿主のための適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α〜因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/TDH1）に関する遺伝子由来である。
【０１９１】
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、誘導体又は変異体をコードする配列の３’末端に作動式に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０１９２】
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990に記載されている。
【０１９３】
調節配列は、誘導体又は変異体のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードし及び細胞の分泌経路内に誘導体又は変異体を誘導するシグナルペプチドコーディング領域でまたあってもよい。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、誘導体又は変異体をコードするコーディング領域のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング領域が必要となるのは、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング領域を有さない場合である。或いは、誘導体又は変異体の分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング領域により、生来のシグナルペプチドコーディング領域をそのまま置換してもよい。しかしながら、発現された誘導体又は変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用してもよい。
【０１９４】
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子（MATALPHA）及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼ（SUC2）が挙げられる。別の有用なシグナルペプチドコーディング配列が、Romanos et al.,1992（同上）に記載されている。
【０１９５】
誘導体又は変異体のＮ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合には、誘導体又は変異体のＮ末端の隣にプロペプチド領域が配置され、プロペプチド領域のＮ末端の隣にシグナルペプチド領域が配置される。
【０１９６】
誘導体又は変異体ポリペプチドを調製するための技術は、国際公開第２００９０１９３１４号及びＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２（引用により本明細書中に組み込まれる）においてまた開示され及びこれらの技術は、また本発明に適用される。
【０１９７】
アルブミンはこれまで、種々の宿主において、組換えタンパク質として首尾よく発現されてきた。例としては、真菌類（例えば、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）（国際公開第０６０６６５９５号）、クリベロミセス（Kluyveromyces）（Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262）及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46）等）、細菌（Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol 105, 279-285））、動物（Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276）及び植物（例えば、これらに限定されるものではないが、ジャガイモ及びタバコ（Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 及び Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346）等）が挙げられる。本発明のＨＳＡドメインIII誘導体、断片、又はその変異体は、適当な宿主細胞において、遺伝子組換えにより作製されることが好ましい。原則として、適当な量のポリペプチドを産生することが可能な任意の宿主細胞を使用してもよく、及び平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る適当な宿主細胞を選択することが可能である。好ましい宿主生物は酵母であり、好ましくはサッカロミセス属（Saccharomycacae）より選択され、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１９８】
本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、公知の分離法（例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、及びアフィニティー分離法等）を組み合わせて使用することにより、生育培地から回収・精製してもよい。平均的な当業者の技量があれば、斯かる公知の分離工程の特定の組合せを使用して、本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体を精製することが可能である。本発明の誘導体又は変異体に適用してもよい精製技術の例としては、国際公開第００４４７７２号に教示されている手法を挙げることができる。
【０１９９】
本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、治療上有用な化合物を、それを必要とする動物又はヒト個体に送達するために使用できる。斯かる治療上有用な化合物としては、これらに限定されるものではないが、診断（例えば種々の画像化法）に使用される標識や易検出性化合物；医薬活性化合物（例えば薬物等）、又は特異的結合部分（例えば抗体等）等が挙げられる。本発明のアルブミン誘導体、断片、又はその変異体を更に、２又は３以上の異なる治療上有用な化合物（例えば抗体及び薬物）と組み合わせることにより、斯かる組み合わせ分子に所望の標的への特異的結合能を付与し、惹いては特定の標的における前記薬剤の濃度を高めることも可能である。
【０２００】
ある特定の好ましい実施態様によれば、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、有用な治療用化合物にコンジュゲートされ、斯かるコンジュゲートは、それを必要とする患者における、選択された特定の治療用化合物に対して感受性の状態を処置するために使用される。斯かる治療用化合物をアルブミン誘導体、断片、又はその変異体にコンジュゲートする手法は当該技術分野で公知である。国際公開第２００９／０１９３１４号には、治療用化合物をポリペプチドにコンジュゲートするのに適した手法の例が開示されており、斯かる手法を本発明に適用することもまた可能である。更に、国際公開第２００９／０１９３１４号には、置換トランスフェリンにコンジュゲートし得る化合物及び部分の例が開示されておりこれらの例を本発明に適用することも可能である。国際公開第２００９／０１９３１４号及びＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２の教示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０２０１】
ＨＳＡは、アルブミン誘導体若しくは変異体、その断片又はアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片を含む融合ポリペプチドが、ドメインIを含むことを提供するコンジュゲーションのために好都合に使用されてもよいドメインIにおいて、１つの遊離チオール基をその天然型中に含む。
【０２０２】
この中の特定の実施形態として、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体は、表面上に付加的なチオール基を生じるように提供された更なる修飾を含んでもよい。これによってアルブミン誘導体、断片、又はその変異体のペイロードを増加させることができるという利点がある。これにより、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体の各分子に対して、２分子以上の治療用化合物をコンジュゲートさせることができる。或いは、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体に対して、２種以上の異なる治療用化合物（例えば標的化特性を有する化合物（例えば腫瘍特異的抗体）と細胞毒性薬等）をコンジュゲートさせることが可能となり、惹いては腫瘍に対して極めて特異性の高い薬を提供することが可能となる。更なる遊離チオール基を表面に提供するために修飾可能な特定の残基については、例えば、同時係属中の特許出願（欧州特許出願第２００９ １５２ ６２５ １号、引用により本明細書中に組み込まれる）、そしてそれは引用により本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
他に好しくは、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体を含む融合ポリペプチドは、１又は２以上（数個）の治療用ポリペプチドを含む。これにおいて、ＨＳＡドメインIII誘導体、断片、又はその変異体及び１又は２以上（数個）の治療用ポリペプチドは、１つの単一（single）ポリペプチドとして生産される。
【０２０４】
１又は２以上（数個）の治療用ポリペプチドは、アルブミン誘導体、断片、又はその変異体のＮ末端、Ｃ末端と融合してもよく、アルブミン誘導体、断片、若しくはそのバリアントの構造中のループ内に挿入してもよく、これらを組み合わせてもよい。融合ポリペプチドの様々な構成成分を分離するためにリンカー配列を有してもよく又は有しなくてもよい。
【０２０５】
アルブミン又はその断片の融合に関する教示は、当該技術分野で公知であり、及び当業者は、斯かる技術が、本発明にまた適用できることを理解するであろう。国際公開第０１／７９２７１Ａ号及び国際公開第０３／５９９３４Ａ号は、ＨＳＡドメインIII誘導体、断片、又はその変異体と融合してもよい治療用ポリペプチドの例をまた含み、及びこれらの例を、本発明においてまた適用する。
【０２０６】
本発明に係るアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体又はアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン、その断片、又は親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、血漿中半減期が改変されたという利点を有する。これは、本発明に係るアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体、又はアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドを含むコンジュゲートは、特定の治療目的に応じて選択できるという利点を有する。
【０２０７】
例えば、動物又はヒトの画像化用途に使用されるコンジュゲート又は融合ポリペプチドであって、画像化部分が極めて短い半減期を有し、コンジュゲート又はアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドが、画像化目的に必要とされるよりもはるかに長い血漿中半減期を有する場合、親アルブミン又はその断片よりも短い血漿中半減期を有する本発明のアルブミン誘導体、断片又はその変異体を使用して、画像化目的には十分に長いものの、投与された特定の患者の体外に十分に排出される程度に短い血漿中半減期を有する融合ポリペプチドのコンジュゲートを提供することができるという利点がある。
【０２０８】
別の例として、それを必要とする患者において、ある特定の状態を処置又は軽減するのに有効な治療用化合物を含むコンジュゲート又は融合ポリペプチドの場合、親アルブミン又はその断片よりも長い血漿中半減期を有するアルブミン誘導体、断片、又はその変異体を使用することにより、より長い血漿中半減期を有するコンジュゲート又は融合ポリペプチドを提供できるという利点がある。即ち、本発明のコンジュゲート又は融合ポリペプチドによれば、親アルブミン又はその断片を使用した場合と比べて、必要な投与頻度を軽減することができるという点で有利である。
【０２０９】
本発明の第５の観点は、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片の「アソシエート」を提供する。この点について、「アソシエート」という語は、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、及び非共有結合によりアルブミン誘導体又は変異体又はその断片に結合又は関連付け（associated）された別の化合物とを含むか、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、及び非共有結合によりアルブミン誘導体又は変異体又はその断片に結合又は関連付け（associated）された別の化合物とからなる化合物を意味する。斯かるアソシエートの例としては、アルブミン誘導体又は変異体及びアルブミンに疎水性相互作用によって関連付けされた脂質とからなるアソシエートが挙げられる。斯かるアソシエートは当該技術分野で公知であり、周知の手法によって調製可能である。本発明に係る好ましいアソシエートの例としては、アルブミン誘導体若しくは変異体及びパクリタキセル又はパクリタキセルタンパク質結合とを含むアソシエートが挙げられる。本発明に係るアルブミンアソシエートの半減期は、「別の化合物」単独の半減期よりもより長く又はより短くてもよい。本発明に係るアルブミンアソシエートの半減期は、天然ＨＳＡ（本発明に係るアルブミン変異体又は誘導体の代わり）及び「別の化合物」を含むか、天然ＨＳＡ及び「別の化合物」からなる類似／相当するアルブミンアソシエートの半減期よりもより長く又はより短くてもよい。アソシエートの調製方法は、当業者に周知であり、例えば、リポ化合物を伴うＨＳＡの調合物（製剤）（関連付けにより）は、Hussain, R.and Siligardi, G. (2006) International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol.12, No.3, pp.311-315中に記載されている。
【０２１０】
第６の観点によれば、本発明は、治療用、医薬用又は別の有用なポリペプチドとコンジュゲートし、融合し又はアソシエートした本発明に係るアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体又はアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドを含むか、治療用、医薬用又は別の有用なポリペプチドとコンジュゲートし、融合し又はアソシエートした本発明に係るアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体又はアルブミン誘導体、断片、若しくはその変異体を含む融合ポリペプチドからなる組成物に関する。組成物は、医薬組成物であることが好ましい。組成物は、当該技術分野で公知の手法、例えば医薬分野で認められている教科書に開示の手法を用いて調製することができる。
【０２１１】
特定の態様によれば、組成物は、本発明に係るアルブミン誘導体、断片、又はその変異体並びに医薬的に有用な部分及びアルブミン結合ドメイン（albumin binding domain：ＡＢＤ）を含む化合物を含むか、本発明に係るアルブミン誘導体、断片、又はその変異体並びに医薬的に有用な部分及びアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む化合物からなる。本発明において、ＡＢＤとは、アルブミンをインビボにおいて循環型アルブミンと結合でき、これによりＡＢＤ及び前記ＡＢＤに結合された任意の化合物又は部分の循環による運搬を可能とする部位、部分又は領域を意味する。ＡＢＤは当該技術分野で公知であり、アルブミンに対して極めて強固に結合することが示されている。よって、アルブミンに結合したＡＢＤを含む化合物は、ある程度は単一の分子としての挙動を示すはずである。本発明者等は、発明に係るアルブミン誘導体、断片、又はその変異体を、医薬的に有用な部分及びＡＢＤを有する化合物と組み合わせて使用することにより、それを必要とする患者に前記化合物を単独で注射し、又は天然アルブミン又はその断片を含む製剤として投与した場合と比べて、医薬的に有用な部分及びＡＢＤを含む化合物の血漿中半減期を改変することが可能であることを見出した。
【０２１２】
従って、本発明は、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲート、或いは医薬品製剤の製造のためのアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むアソシエートの使用を管理し、ここでアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲート、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むアソシエートは、ＨＳＡ又は対応するその断片、或いはＨＳＡ又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはＨＳＡを含むコンジュゲートと比較して改変された血漿中半減期を有する。
【０２１３】
ここで、対応するＨＳＡの断片とは、比較対象となるアルブミン誘導体又は変異体の断片とアラインされ、且つ、アルブミン誘導体又は変異体の断片と同数のアミノ酸を有する、ＨＳＡの断片を意味する。同様に、対応するＨＳＡを含む融合ポリペプチド又はＨＳＡを含むコンジュゲートとは、比較対象となるアルブミン誘導体又は変異体を含むコンジュゲートの融合ポリペプチドと同じサイズ及び同じアミノ酸配列を有する分子を意味する。
【０２１４】
アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲートは、ＨＳＡ又は対応するその断片、或いはＨＳＡ又はその断片を含む融合ポリペプチドの血漿中半減期よりもより高い血漿中半減期を有することが好ましい。
【０２１５】
また、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲートは、ＨＳＡ又は対応するその断片、或いはＨＳＡ又はその断片を含む融合ポリペプチドの対応するＫＤよりも、ＦｃＲｎに対するＫＤが低い、と言い換えてもよい。アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡに対して０．９Ｘ ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡに対して０．５Ｘ ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡに対して０．１Ｘ ＫＤ未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡに対して０．０５Ｘ ＫＤ未満、よりいっそう好ましくはＨＳＡに対して０．０２Ｘ ＫＤ未満、最も好ましくはＨＳＡに対して０．０１Ｘ ＫＤ未満であることが好ましい。
【０２１６】
アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲートは、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲートであることが好ましい。
【０２１７】
本発明の第７の観点は、誘導体又は変異体又はアソシエートの製造方法に関する。本発明の誘導体又は変異体は、当業者に周知の手法を用いて調製することが可能である。１つの便宜な手法としては、親アルブミン、又はその断片、或いはアルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードする核酸をクローン化し、配列番号３１又は配列番号１中の位置４１７、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５５０、５７３、５７４及び５８０に対応する１又は２以上（数個）の位置に所望の置換（複数）を導入するよう、前記核酸を修飾し（ここで得られる誘導体又は変異体は、配列番号３１又は配列番号１における置換Ｄ４９４Ｎ、Ｅ５０１Ｋ、Ｋ５４１Ｅ、Ｄ５５０Ｇ，Ａ、Ｋ５７３Ｅ又はＫ５７４Ｎからなる誘導体又は変異体ではない）、修飾された核酸が適当な調節遺伝要素（例えばプロモーター、ターミネーター、活性化部位、リボゾーム結合部位等）と作動式に連結されるような位置に配置された適当な遺伝子コンストラクトを調製し、前記遺伝子コンストラクトを適当な宿主生物内に導入し、形質転換された宿主生物を誘導体又は変異体の発現を生じる条件下で培養し、得られた誘導体又は変異体を回収する、という手法が挙げられる。場合により、誘導体又は変異体又はアソシエートは、例えば、医薬的に許容できる賦形剤で調合される。場合により、誘導体又は変異体又はアソシエートは、単位剤形で存在する。これらの手法は何れも当該技術分野で公知であり、及び平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る具体的な誘導体又は変異体を調製するための適当な方法を設計することが可能である。
【０２１８】
本発明のポリペプチド誘導体又は変異体にシグナル配列を連結し、形質転換された宿主生物の培養時に、ポリペプチド誘導体又は変異体が生育培地中に分泌されるようにしてもよい。ポリペプチド誘導体又は変異体を生育培地中に分泌されるようにすると、一般に回収及び精製が容易になるので好ましい。
【０２１９】
ポリペプチド誘導体又は変異体を調製する手法は、国際公開第２００９０１９３１４号及びＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２（引用により本明細書中に組み込まれる）にも開示されており、及びこれらの手法を本発明にも適用してもよい。
【０２２０】
アルブミンはこれまで、種々の宿主において、組換えタンパク質として首尾よく発現されてきた。例としては、真菌類（例えば、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）（国際公開第０６０６６５９５号）、クリベロミセス（Kluyveromyces）（Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262）及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46）等）、細菌（Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285））、動物（Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276）及び植物（例えば、これらに限定されるものではないが、ジャガイモ及びタバコ（Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 及び Farran 2002, Transgenic Research 11、337-346）等）が挙げられる。本発明の誘導体及び変異ポリペプチドは、適当な宿主細胞において、遺伝子組換えにより作製されることが好ましい。原則として、適当な量のポリペプチドを産生することが可能な任意の宿主細胞を使用することができ、平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る適当な宿主細胞を選択することが可能である。好ましい宿主生物は酵母であり、好ましくはサッカロミセス属（Saccharomycacae）より選択され、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０２２１】
本発明のポリペプチド誘導体又は変異体は、公知の分離法（例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、及びアフィニティー分離法等）を組み合わせて用いることにより、生育培地から回収・精製してもよい。平均的な当業者の技量があれば、斯かる公知の分離工程の特定の組合せを使用して、本発明の誘導体又は変異体を精製することが可能である。本発明の誘導体又は変異体に適用可能な精製法の例としては、国際公開第００４４７７２号に教示されている手法を挙げることができる。
【０２２２】
本発明のポリペプチド誘導体又は変異体は、治療上有用な化合物を、それを必要とする動物又はヒト個体に送達するために使用できる。斯かる治療上有用な化合物としては、これらに限定されるものではないが、診断（例えば種々の画像化法）に使用される標識や易検出性化合物；医薬活性化合物（例えば薬物等）、又は特異的結合部分（例えば抗体等）等が挙げられる。本発明の変異体を更に、２又は３以上の異なる治療上有用な化合物（例えば抗体及び薬物）と組み合わせることにより、斯かる組み合わせ分子に所望の標的への特異的結合能を付与し、惹いては特定の標的における前記薬剤の濃度を高めることも可能である。
【０２２３】
本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、その断片、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドは、それらの血漿中半減期が、親アルブミン又はその断片、或いは親アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いは非融合、非コンジュゲート、或いは非アソシエート治療用、診断用若しくは別の有用な部分と比較して改善される利点を有する。これは、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲート、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むアソシエートの血漿中半減期が、具体的な治療目的に従って選択できる利点を有する。
【０２２４】
本発明の第８の観点は、画像化に関する。例えば、動物又はヒトの画像化目的に使用されるコンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドにおいて、画像化部分が、極めて短い半減期を有し、及びコンジュゲート又はＨＳＡを含む融合ポリペプチドが、画像化目的に必要とされるよりもはるかに長い血漿中半減期を有する場合、親アルブミン又は断片よりもより短い血漿中半減期を有する本発明のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を使用して、画像化目的には十分に長いものの、投与された特定の患者の体外に十分に排出される程度に短い血漿中半減期を有する融合ポリペプチドのコンジュゲートを提供することができるという利点がある。アルブミンを含む画像化剤の例が、国際公開第２００４／０７１５３６号に含まれている。
【０２２５】
本発明の第９の観点は、処置方法における治療及び／又は使用方法に関する。方法は、斯かる処置を必要とする患者において、ある特定の状態を処置又は軽減するのに有効な治療用化合物の使用を含み、親アルブミン又はその断片よりもより長い血漿中半減期を有するアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を使用することにより、治療用化合物単独又は天然ＨＳＡと融合、コンジュゲート又はアソシエートした治療用化合物と比較して、より長い血漿中半減期を有するアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドを提供できるという利点がある。そしてそれは、本発明に係るアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドの投与が、親アルブミン又はそのアソシエート又はその断片を使用した場合と比較して、必要な投与頻度又は用量を低減して副作用を軽減することができるという点で有利である。本発明はまた、アルブミン変異体、誘導体、融合、コンジュゲート又はアソシエートが、治療用化合物単独又は天然ＨＳＡと融合、コンジュゲート又はアソシエートした治療用化合物と比較してより短い半減期を有する方法を含む。
【０２２６】
第１０の観点は、本発明は、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体、そのアソシエート又はその断片、アルブミン断片誘導体若しくは変異体、又はそのアソシエート、或いは変異体アルブミン若しくはその断片含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。組成物は、治療用組成物であるのが好ましい。組成物は、当該技術分野で公知の手法、例えば医薬分野で認められている教科書に開示の手法を用いて調製してもよい。
【０２２７】
特定の態様によれば、組成物は、本発明に係るアルブミン誘導体又は変異体又はその断片と、医薬的に有用な部分及びアルブミン結合ドメイン（albumin binding domain：ＡＢＤ）を含む化合物とを含むか、本発明に係るアルブミン誘導体又は変異体又はその断片と、医薬的に有用な部分及びアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む化合物からなる。本発明において、ＡＢＤとは、アルブミンをインビボにおいて循環型アルブミンと結合でき、これによりＡＢＤ及び前記ＡＢＤに結合された任意の化合物又は部分の循環による運搬を可能とする部位、部分又は領域を意味する。ＡＢＤは当該技術分野で公知であり、アルブミンに対して極めて強固に結合することが示されている。よって、アルブミンに結合したＡＢＤを含む化合物は、ある程度は単一の分子としての挙動を示すはずである。本発明者等は、発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を、医薬的に有用な部分及びＡＢＤを有する化合物と組み合わせて使用することにより、それを必要とする患者に前記化合物を単独で注射し、又は天然アルブミン又はその断片を含む製剤として投与した場合と比べて、医薬的に有用な部分及びＡＢＤを含む化合物の血漿中半減期を改変することが可能であることを見出した。
【０２２８】
本発明のアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片、アルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むコンジュゲート、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、或いはアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片を含むアソシエートは、また、当該技術分野で周知の手法を用いて、ナノ又はマイクロ粒子内に組み込んでもよい。ナノ又はマイクロ粒子を調製するための好ましい方法であって、本発明に係るアルブミン誘導体若しくは変異体又はその断片に適用してもよい方法は、国際公開第２００４／０７１５３６号に開示されており、本文献は引用により本明細書中に組み込まれる。
【０２２９】
以下の定義を、また本明細書中に開示された発明に適用する。
【０２３０】
対立遺伝子：「対立遺伝子変異体（allelic variant）」という語は、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の夫々を指す。対立遺伝子変異（allelic variation）は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異とは、遺伝子の対立遺伝子変異によりコードされるポリペプチドである。
【０２３１】
「コーディング配列」（coding sequence）という語は、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は一般的に、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により画定される。オープン・リーディング・フレームは一般的に、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、組換ポリヌクレオチドの何れでもよい。
【０２３２】
「ｃＤＮＡ」という語は、真核細胞から得られるスプライス後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写生成物がｍＲＮＡの前駆体となり、これが一連の処理工程を経て、最終的にスプライス後に成熟ｍＲＮＡを生じる。
【０２３３】
「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）という語は、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な調節配列を含む場合、核酸コンストラクトとの語は「発現カセット」（expression cassette）との語と同義となる。
【０２３４】
「調節配列」（control sequence）という語は、本発明の誘導体又は変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各調節配列は、誘導体又は変異体をコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、又は互いに同種でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付加してもよい。これにより斯かる調節配列と、誘導体及び変異体をコードするポリヌクレオチドのコーディング領域との連結が容易になる。
【０２３５】
「作動式に連結され」（operably linked）という語は、コーディング配列が調節配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の調節配列がコーディング配列に対して適当な位置に配置された構成を意味する。
【０２３６】
「発現」（expression）という語は、誘導体又は変異体の産生に関与する任意のステップを含む。斯かるステップとしては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
【０２３７】
「発現ベクター」（expression vector）という語は、誘導体又は変異体をコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする更なるヌクレオチドと作動式に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子を意味する。
【０２３８】
「宿主細胞」（host cell）という語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という語には、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
【０２３９】
「変異体」という語は、誘導体又は変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【０２４０】
「野生型アルブミン」天然生物、例えば真核生物、例えばヒトなどの哺乳類により発現されたアルブミンを意味する。
【０２４１】
「親」（parent）又は「親アルブミン」との語は、本発明のアルブミン誘導体又は変異体を産生するように改変を行う対象となるアルブミンを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドであっても、その誘導体又は変異体でもよい。
【０２４２】
本発明を以下の実施例に即して更に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２４３】
材料及び方法：
（ａ）ＥＬＩＳＡ：
ウェルを、１００−０．０４５μｇ/ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳにより希釈したＨＳＡ又は変異体により被覆し、４℃で一晩インキュベートし、そして次に、４％スキムミルク（Acumedia）により室温で１時間ブロックした。次に、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）/０．００５％ ＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳ/Ｔ）ｐＨ６．０により４度洗浄し、続いて、４％スキムミルク ＰＢＳ/０．００５％ ＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳ/Ｔ）ｐＨ６．０で希釈した、ヤギ由来のＨＲＰコンジュゲートポリクローナル抗ＧＳＴ（１：５０００；GE Healthcare）と共にプレインキュベートしたＧＳＴ融合ｓｈＦｃＲｎ（０．５μｇ/ｍｌ（FEBS J. 2008 Aug;275(16):4097-110））を、個々のウェルに添加し、そして室温で１．５時間インキュベートし、続いてＰＢＳ/Ｔ（pH 6.0）により４度、洗浄した。１００μlの基質ＴＭＢ（Calbiochem）を個々のウェルに添加し、そして４５分間インキュベートし、続いて０．２５Ｍ ＨＣｌを１００μｌ添加した。吸光度を、Sunrise TECAN分光光度計(TECAN, Maennedorf, Switzerland)を用いて４５０ｎｍで測定した。同じＥＬＩＳＡをＰＢＳ/Ｔ（ｐＨ ７．４）により反復した。
【０２４４】
（ｂ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
ＳＰＲ実験をBiacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて実施した。ＣＭ５センサーチップの流動細胞を、ｓｈＦｃＲｎ-ＧＳＴ（〜１４００−５０００ＲＵ）により、メーカー提供のプロトコールに記載のアミンカップリング化学を用いて、カップリングした。このカップリングは、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．０（GE Healthcare）中、１０μｇ/ｍｌのタンパク質の注入により実施した。リン酸緩衝液（６７ｍＭのリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ ＴＷＥＥＮ２０（ｐＨ６．０））を、実行緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。表面の再生を、ｐＨ７．４でのＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）（Biacore AB）の注入を用いて行った。固定されたｓｈＦｃＲｎ-ＧＳＴへの結合に関しては、１．０〜０．５μＭの個々のＨＳＡ誘導体又は変異体を、２５℃で一定の流速（４０μｌ/ｍｌ）で前記表面上に注入した。何れの実験でも、データをゼロ点調整し、参照細胞を減算した。データ評価を、BIAevaluation 4.1ソフトウエア(BIAcore AB)を用いて実施した。
【０２４５】
同じＳＰＲアッセイを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液ｐＨ７．４により反復した。
【０２４６】
ＳＰＲ実験を、Biacore 3000装置（GE Healthcare）を用いて実施した。ＣＭ５センサーチップの流動細胞を、メーカー提供のプロトコールに記載のようにして、アミンカップリング化学を用いて、ＨＳＡ（〜２６００ＲＵ）によりカップリングした。カップリングを、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）（GE Healthcare）中、１０μｇ/ｍｌのタンパク質を注入することにより実施した。リン酸緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）を、実行緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。表面の再生を、ｐＨ７．４でのＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）（Biacore AB）の注入を用いて行った。競争結合を、ｓｈＦｃＲｎ（５０ｎＭ）のみ、又は異なった量のＨＳＡ又はＲＳＡドメインコントラクトと共に固定されたＨＳＡ上に注入することにより測定した。何れの実験でも、データをゼロ点調整し、参照細胞を減算した。データ評価を、BIAevaluation 4.1ソフトウエア(BIAcore AB)を用いて実施した。
【０２４７】
ＨＳＡ：登録商標名ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮとして市販されている組換えヒト血清アルブミンを本実施例に使用した。
【０２４８】
別の種由来の血清アルブミン：アルブミンを、公的に入手できるデータベース（データー未記載）から提供される配列を用いて、組換えで生成した。
【０２４９】
ＦｃＲｎ：ＰＣＲ及びサブクローニング。切断された可溶性ｈＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）ＨＣ及びｈβ２ｍをコードするｃＤＮＡセグメント、Ｕ９３７細胞系（ＡＴＣＣ）ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅し、続いてフラグメントをｐＣＤＮＡ３−ＧＳＴベクター中にサブクローニングした（すべては前に記載されるように（Berntzen et al. (2005) J Immunol Methods 298:93-104））。マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Zyagen）を、下記プライマーｍＦｃＲｎＦｏｒｗ及びｍＦｃＲｎＲｅｖを用いて、ｍＦｃＲｎ ＨＣの切断されたバージョンをコードするｃＤＮＡ（生来の内因性リーダー配列、α１、α２及びα３ドメインをコードする；２９３個アミノ酸）をＰＣＲ増幅するために使用した：
mFcRnForw 5-ATT ATG AAT TCA TGG GGA TGC CAC TGC CCT GG-3
mFcRnRev  5-ATA TAC TCG AGT AGG TCC ACA GTG AGA GGC TG-3
【０２５０】
プライマーを、ｈβ２ｍをコードするｃＤＮＡ及び複製のエプスタイン・バール（Epstein  Barr）ウィルス起点（ｏｒｉＰ）をまた含むｐｃＤＮＡ３−ＧＳＴ−ｈβ２ｍ−ｏｒｉＰベクター中への日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）由来のＧＳＴタグをコードするｃＤＮＡの上流の断片のインフレーム連結を可能にするよう設計した。最終ベクターを配列決定し、そしてｐｃＤＮＡ３−ｍＦｃＲｎwt−ＧＳＴ−ｈβ２ｍ−ｏｒｉＰとして示した。
【０２５１】
可溶性ヒトＦｃＲｎ変異体（ｓｈＦｃＲｎ-ＧＳＴ）の発現及び精製−一過性トランスフェクションに関しては、ｈＦｃＲｎ及びｍＦｃＲｎコードプラスミドを、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、メーカーの説明書に従って、ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞（ＡＴＣＣ）中にトランスフェクションした。ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（BioWhittaker）中で、標準条件下で培養した。プールされた培地を濾過し、そして半自動ワークステーション及びリーダーに接続されたＧＳＴｒａｐ ＦＦカラムの５ｍｌカラム（GE Healthcare）上に適用し、及び精製をメーカーの説明書に実質的に推薦されるようにして実施した。溶出された画分をプールし、濃縮し、及びβ−メルカプトエタノール（Sigma−Aldrich）を用いて、非還元又は還元条件下で分析した。２μｇの個々の受容体のサンプルを、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Bio-Rad）上に適用した。タンパク質濃度を、NanoDrop N-1000 分光光度計(NanoDrop Technologies)を用いて決定した。
【０２５２】
ｓｈＦｃＲｎ発現プラスミドの生成、個々のヘテロダイマーの発現及び精製についての方法はまた、Berntzen et al. (2005) J. Immunol. Methods 298:93-104)及びAndersen et al. (2010)  J. Biol. Chem., 285:4826-4836に見出され得る。
【０２５３】
他方では、Ｈｉｓタグ化ｓｈＦｃＲｎ ＦｃＲｎへテロダイマーを、ＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（Germany）により生成した。前記へテロダイマーの２種のサブユニットについての配列は、配列番号３２（主要組織適合抗原複合体クラスＩ様Ｆｃ受容体の切断されたＨ鎖（ＦＣＧＲＴ））及び配列番号３３（β−２−ミクログロブリン）に見出され得る。配列番号３２及び３３は一緒に、ＦｃＲｎを形成する。可溶性受容体をＨＥＫ２９３細胞において発現し、そしてＮｉ−ＨｉＴｒａｐクロマトグラフィーカラムを用いて、培養物上清液から精製した。Ｈｉｓタグは遺伝学的に、β−２−ミクログロブリンのＣ末端に融合される。
【０２５４】
（ｃ）プラスミド及び菌株の構成
標準分子生物学手法、例えばSambrook, J. and D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載されるそれらの手法を、全体を通じて使用した。
【０２５５】
発現カセットを含むプラスミドは、表２に列挙されている。すべての発現カセットは、Ｓ．セレビシエＰＲＢ１プロモーター及び修飾されたＳ．セレビシエＡＤＨ１ターミネーター（ｍＡＤＨｔ）を含み、そしてリーダー配列［次のいずれか：融合リーダー（ＦＬ；プラスミドｐＤＢ２２４４におけるのと同じ、国際公開第００４４７７２Ａ号）、修飾された融合リーダー（ｍＦＬ；プラスミドpDB２３０５に記載されるのと同じ、引用により本明細書中に組み込まれる欧州特許出願第１７８８０８４号）、Ｓ．セレビシエ インベルターゼリーダー配列（Ｓｕｃ２ｐ: MLLQAFLFLLAGFAAKISA）又は修飾されたＳ．セレビシエ インベルターゼリーダー配列（MLLQAFFIVSIGFAAKISA）］、及びアルブミン由来のタンパク質（例えば、全長、ドメイン、変異体及び融合体、等）をコードする。図６は、典型的な発現カセットの構成要素を示すためのプラスミド地図（pDB２３０５）の例を示す。特にことわらない限り、最終発現プラスミドをインビボで生成した（即ち、Ｓ．セレビシエにおける相同組換えを通して；ギャップ修復又はインビボクローニングとして言及される手法については、Orr-Weaver & Szostak. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4417-4421を参照）。典型的には、ギャップ修復実験に関しては、１００ｎｇ Acc65I/BamHI pDB3936（国際公開第２０１０／０９２１３５号中に開示される）を、所望する最終発現プラスミドを生成するために必要とされる発現カセットを含む等モル濃度のＤＮＡフラグメントと共に混合した。それらを、下記に記載される酵母形質転換キット（Sigma）を用いて、Ｓ．セレビシエ株を同時形質転換するために直接使用した。
【０２５６】
【表３】
2013523145.tif 000004
【０２５７】
発現プラスミドをまた、インビボクローニングを使用して、等モル濃度でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）断片及びAcc65I/BamHI pDB3936（１００ｎｇ）を使用して生成した。表３は、ＰＣＲ断片及びAcc65I/BamHI pDB3936を使用して生成されたコンストラクトを列挙する。すべてのＰＣＲ反応を、Phusionポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して、メーカーの説明書に従って実施した。典型的なＰＣＲ反応混合物は、２０μｌ 緩衝液ＨＦ(５Ｘ)、２μｌ ｄＮＴＰ混合物(１０ｍＭ)、２μｌ プライマー（１０μＭ）、２μｌ プライマー（１０μＭ）、１μｌ Phusionポリメラーゼ（２Ｕ/μｌ）、１μｌ ＤＮＡ（〜５ｎｇ）又は全ＤＮＡ（〜１００ｎｇ）、７２μｌ 蒸留水である。
【０２５８】
【表４】
2013523145.tif 000005
【０２５９】
（ｉ）ヒト／動物キメラ及び動物アルブミンＤI＋ＤIIIコンストラクトの発現のためのプラスミドの構成
プラスミドを、特にことわらない限り、表２及び表３に要約する。完全長ウサギ（配列番号１４）及びマウスアルブミン（配列番号９）の発現のためのプラスミドを次の通りに調製した。ＰＲＢ１プロモーターの３’領域、修飾された融合リーダー配列、ウサギ又はマウスアルブミンをコードするＤＮＡ、及びｍＡＤＨｔの５′領域を含むＢｆｒＩ/ＳｐｈＩ合成ＤＮＡフラグメント（２．０８７ｋｂ）を、遺伝子アセンブリー（GeneArt AG, Germany）により生成した。人工ＳｐｈＩ部位を、天然に存在するＢｆｒＩ部位の上流に直接付加し、続くクローニングを補助した。合成ＳｐｈＩ ＤＮＡフラグメントをpCR-script (Agilent Technologies)中にクローン化し、pDB3248及びpDB3429を生成した。pDB2541（ＰＲＢ１プラモーター、修飾された融合リーダー及びＨＳＡをコードするＤＮＡ、並びにｍＡＤＨｔを含むサブクローニングプラスミド）を、BfrI/SphIにより消化し、ＨＳＡ、及びＰＲＢ１及びそれを端に有するｍＡＤＨｔターミネーターの一部をコードする遺伝子を除いた。このＤＮＡを、pDB3248及びpDB3429から類似BfrI/SphI断片に置換し、それぞれpDB3256及びpDB3435を生成した。pDB3256及びpDB3435をNotIにより消化し、そして２．９８９ｋｂの生成物をそれぞれ、NotI消化pSAC35（欧州特許出願第２８６４２４号に開示され、及びSleep, D., et al. (1991) Bio/Technology 9, 183 - 187により記載される；それぞれ引用により本明細書中に組み込まれる）中に連結し、それぞれpDB3257及びpDB3442を生成した。
【０２６０】
pDB3257及びpDB3442を使用して、Ｓ．セレビシエ株Ａを直接的に形質転換した（国際公開第２０１０／０９２１３５号に記載される）。
【０２６１】
ヒツジアルブミンの発現のためのプラスミドを次の通りにして調製した。２．２０７ｋｂのPstI/SphI合成ＤＮＡ断片（ＰＲＢ１プロモーターの３′領域、融合リーダー配列及びヒツジアルブミンをコードするＤＮＡ（配列番号１６）、及びｍＡＤＨｔの一部を含む）を、遺伝子アセンブリー（GeneArt AG, Germany）により生成した。合成PstI/SphI断片を、PstI/SphI消化pDB3927（国際公開第２０１０/０９２１３５号に記載される）中にクローン化し、pDB3994を生成した。
【０２６２】
最終発現プラスミドを、インビボクローニング／ギャップ修復により生成し、即ちpDB3994を、BstEII／BsrBIにより消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、及び１００ｎｇの消化物を１００ｎｇ Acc65I/BamHI消化pDB3936（国際公開第２０１０/０９２１３５号に開示される）と共に結合し、そしてそれを使用して、Ｓ．セレビシエBXP10 cir0（国際公開第２００１/０７９４８０号に記載される）を形質転換した。
【０２６３】
種々のアルブミンキメラについての発現プラスミドを、ＰＣＲ及びインビボクローニングを使用して生成した。表４は個々のコンストラクトを生成するために使用されるオリゴヌクレオチド対及び鋳型ＤＮＡを列挙し、表５はオリゴヌクレオチドの配列を提供する。すなわち、ＰＣＲを用いて、２種のＰＣＲ断片を増幅した。断片１は、ＬＥＵ２ ＯＲＦ及び３′ＵＴＲ、ＰＲＢ１プロモーター、リーダー配列（修飾された融合又は融合リーダー配列のいずれか）をコードするＤＮＡ、アルブミン（例えば、ヒト、マウス、ウサギ又はヒツジからの）のＤI＋ＤIIをコードするＤＮＡ、及びアルブミン（ヒト、マウス、ウサギ又はヒツジからの）のＤIIIの５′配列をコードする２７−３０ｂｐのＤＮＡを含む。フラグメント２は、アルブミン（例えば、ヒト、マウス、ウサギ又はヒツジからの）のＤIIIをコードするＤＮＡ、ｍＡＰＨｔターミネーター、及びpDB3936（国際公開第２０１０/０９２１３５号に開示される）におけるヌクレオチド配列と相同の２１７ｂｐのフランキング配列を含んだ。
【０２６４】
ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ 精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。図７は、インビボクローニングによる発現プラスミドの精製を要約する。即ち、精製されたＰＣＲ生成物を、Acc65I/BamHI消化されたpDB3936と共に使用して、Ｓ．セレビシエBXP10 cir0を同時形質転換した。
【０２６５】
マウスアルブミン及びウサギアルブミンＤI＋ＤIIIについての発現プラスミドを、ヒト／動物キメラ発現コントラクト（例えば、ＨＳＡ ＤI＋ＤII＋マウスＤIII、及び逆もまた同様である）を生成するための上記に記載されるそれらの方法と同一の方法により、ＰＣＲ及びインビボクローニングを使用して調製した。ＰＣＲフラグメントを生成するために使用されるオリゴヌクレオチド対（表５）及び鋳型ＤＮＡが表４に列挙される。
【０２６６】
【表５】
2013523145.tif 000006
【０２６７】
【表６】
2013523145.tif 000007
【０２６８】
（ｉｉ）ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体及びＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体融合体をコードするプラスミドの調製
最初のＨＳＡ ＤI＋ＤIII発現プラスミド／酵母株を、マウス及びウサギＤI＋ＤIII発現コンストラクトについて本明細書中に記載される方法を用いて、ＰＣＲ及びインビボクローニングにより生成した。オリゴヌクレオチドｘＡＰ０３２/ｘＡＰ０５８（表５）及びｘＡＰ０５９/ｘＡＰ０３３（表５）を用いて、それぞれ、ＰＣＲフラグメント１及び２を生成した（鋳型ＤＮＡとしてpDB2244（国際公開第００／４４７７２号に記載される）を用いる）。得られる株を、８８２２と命名した。
【０２６９】
全ＤＮＡ（即ち、ゲノム及びプラスミドＤＮＡ）を、次の通りにして酵母８８２２から抽出した。１０μｌ 無菌ループを用いて、寒天プレートから酵母細胞を削り取り、そして細胞を１．５ｍｌ マイクロチューブ中の２００μｌ 抽出緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２％ w/v ＳＤＳ］に再懸濁し、その後、８０℃で２分間、加熱した。ＤＮＡ抽出混合物を、ベンチトップマイクロ遠心分離器によって１３，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、その後、上清液を除いた。全ＤＮＡを３体積のエタノール及び０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）により−８０℃で１０分間、沈殿した。沈殿したＤＮＡを、ベンチトップマイクロ遠心分離器において１３，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、上清液を除き、そしてＤＮＡペレットを７０％ v/vエタノールにより洗浄した。ペレットを手短に空気乾燥し、その後、ＤＮＡを１００μｌ ＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０２７０】
ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体発現カセットを生成するために、オリゴヌクレオチドｘＡＰ０７５及びｘＡＰ１３８（表５）を用いて、酵母株８８２２から調製されたＤＮＡ由来の２．１ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片は、ＬＥＵ２マーカーの３′領域、ＰＲＢ１プロモーター、融合リーダーをコードするＤＮＡ及びＨＳＡ ＤI及びＤIIIを含んだ。ＰＣＲフラグメントを、NgoMIV/AvrIIにより消化し、そしてNgoMIV/AvrII消化されたpDB3927（国際公開第２０１０／０９２１３５号)、pDB4086、pDB4110及びpDB4184及びpDB4010（すべて国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載され、引用により本明細書中に組み込まれる）中に連結し、pDB4372−pDB4375及びpDB4480をそれぞれ生成した。pDB4372−pDB4375及びpDB4480をNsiI/PvuIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。最終発現プラスミドを個々のNsiI/PvuI消化したＤＮＡ及びAcc65I／BamHI消化pDB3936とＳ．セレビシエBXP10 cir0とを同時形質転換することによりインビボクローニングによって生成した。
【０２７１】
ＨＳＡ ＤI＋ＤII及びその変異体のＣ末端に対して遺伝学的に融合されるＩＬ−１ｒａ（配列番号３４）の生成のための発現カセットを含むプラスミドを、次の通りにして調製した。pDB2588（引用により本明細書中に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）を、Bsu36I/SphIにより消化し、そしてＨＳＡ ＤIIIの３′領域、ＧＳリンカー及びヒトＩＬ１−ＲＡ（Ｎ８４Ｑ）、及び修飾されたＳ．セレビシエｍＡＤＨｔの５′領域をコードする７０５ｂｐのＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。精製した断片を、Bsu36I/SphI消化pDB4372、pDB4373、pDB4374、pDB4375及びpDB4480中に連結し、pDB4382、pDB4383、pDB4385、pDB4384及びpDB4481をそれぞれ生成した。最終発現プラスミドを、NsiI/PvuIによるpDB4382−pDB4385及びpDB4481の消化、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従ってＤＮＡ精製を包含し、その後、Ｓ．セレビシエBXP10 cir0を直接的に形質転換するためのAcc65I/BamHI消化pDB3936を包含するインビボクローニングにより生成した。
【０２７２】
ＨＳＡ ＤI＋ＤIII及びＨＳＡ ＤI＋ＤIII Ｋ５７３ＰのＮ末端に対して遺伝学的に融合されるＩＬ−ｉｒａ（Ｎ８４Ｑ）の生成のための発現カセットを含むプラスミドを、上記の方法を用いて、ＰＣＲ及びインビボクローニングにより調製した。２種のＰＣＲ断片を生成するのに使用されるオリゴヌクレオチドは、表５に列挙されている。ＰＣＲ断片１を、オリゴヌクレオチドｘＡＰ３３０/ｘＡＰ３３７及び鋳型ＤＮＡとしてプラスミドpDB2590を用いて生成した。プラスミドpDB2590は、pDB2305（国際公開第２００６／０１３８５９号に記載される）と同一であるが、しかし融合リーダー、ＩＬ−１ｒａ（Ｎ８４Ｑ）、ＧＳリンカー、続いてＨＳＡをコードするＤＮＡ配列を含む。ＰＣＲ断片１は、ＬＥＵ２ ＯＲＦの上流の７７４ｂｐのヌクレオチド配列、ＰＲＢ１プロモーター、及び融合リーダー配列、ＩＬ１−ＲＡ（Ｎ８４Ｑ）、ＧＳリンカー及びＨＳＡ ＤＩの最初の２９ｂｐをコードするＤＮＡを含む。ＰＣＲ断片２（pDB4372又はpDB4374のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドｘＡＰ３３８/ｘＡＰ３３３により生成した）は、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII（ｗｔ又はＫ５７３Ｐ）をコードするＤＮＡ、ｍＡＤＨｔ、及びpDB3936におけるヌクレオチド配列と相同の２．０３１ｋｂのフランキング配列を含んだ。ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。ＰＣＲフラグメント１及び２、及びAcc65I／BamHI消化されたpDB3936によるＳ．セレビシエBXP10 cir0の同時形質転換を包含する方法により、最終発現プラスミドを、インビボで生成した。
【０２７３】
（ｉｉｉ）ＨＳＡ ＤII＋ＤIII変異体及びその融合体をコードするプラスミドの調製
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びその変異体のための発現プラスミドを次の通りにして生成した。ＨＳＡ ＤII＋ＤIII発現カセット（すなわち、ＰＲＢ１プロモーター、融合リーダー及びＨＳＡ ＤII＋ＤIIIをコードするＤＮＡ、及びｍＡＤＨｔ）を含むpDB2202をNgoMIV/AvrIIにより消化し、そして１．４０７ｋｂのフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ ゲル抽出キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。NgoMIV/AvrII断片を、NgoMIV/AvrII消化pDB3927（国際公開第２０１０／０９２１３５号に記載される）、pDB4010、pDB4110及びpDB4184（引用により本明細書中に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）中に連結し、それぞれpDB4386、pDB4482、pDB4387及びpDB4388を生成した。pDB4386−pDB4388及びpDB4482をNsiI/PvnIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。個々のNsiI/PvuI消化プラスミドＤＮＡ及びAcc65I/BamHI消化pDB3936によるＳ．セレビシエBXP10 cir0の同時形質転換を包含する方法により、最終発現プラスミドを、インビボで生成した。
【０２７４】
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びその変異体のＣ末端に遺伝学的に融合されるＩＬ−１ｒａの生成のための発現カセットを含むプラスミドを、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体コンストラクトのＣ末端に対して遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａを生成するために記載される方法に従って調製した。生成したプラスミドを、pDB4483、pDB4485、pDB4486及びpDB4484と命名した。pDB4483−pDB4486をNsiI/PvuIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。最終発現プラスミドを、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体融合コンストラクトについて記載されるようにして、インビボで生成した。
【０２７５】
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びＨＳＡ ＤII＋ＤIII Ｋ５７３ＰのＮ末端に対して遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａの生成のための発現カセットを含むプラスミドを、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII及びＨＳＡ ＤI＋ＤIII Ｋ５７３ＰのＮ末端に対して遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａの生成について記載のようにして、ＰＣＲ及びインビボクローニングを用いて調製した。ＰＣＲ断片１を、オリゴヌクレオチドｘＡＰ３３０／ｘＡＰ３３９（表５）（pDB2590を鋳型ＤＮＡとして使用した）を用いて生成し、そしてＨＳＡ ＤIIをコードするそのヌクレオチド配列（すなわち、pDB4386及びpDB4387における）と３２ｂｐのヌクレオチド配列相同性を共有した。ＰＣＲ断片２を、オリゴヌクレオチドｘＡＰ３４０／ｘＡＰ３３３（表５（鋳型ＤＮＡとしてpDB4386又はpDB4387を用いる））を用いて生成し、そしてpDB3936におけるヌクレオチド配列と２．０３１ｋｂの相同フランキング配列を共有した。ＰＣＲフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。最終発現プラスミドを、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体融合コンストラクトについて記載されるようにして、インビボで生成した。
【０２７６】
（ｉｖ）ＨＳＡ ＤIII並びにその変異体及び融合体をコードするプラスミドの調製
ＰＣＲを用いて、ＨＳＡ ＤIIIをコードする６４９ｂｐのフラグメントを生成し、成熟アルブミンタンパク質配列の位置５７３に対応するコドンで変更を行い、その結果、フェニルアラニンがリシンの代わりに組み込まれ、そして前記断片の発現プラスミドpDB4284中へのクローン化を可能にするよう前記断片を適合した（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）。特に、これはオリゴヌクレオチドｘＡＰ２６０及びｘＡＰ２５３（表５）及び鋳型ＤＮＡとしてのプラスミドpDB3927（国際公開第２０１０／０９２１３５号の記載される）を用いて達成された。ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、BglII／Bsu36Iにより消化し、その後、消化したＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製されたBglII／Bsu36I断片を、BglII/Bsu36I消化pDB4284中に連結し、pDB4460を生成した。
【０２７７】
ＨＳＡ ＤIII変異体をコードする一連の発現プラスミドを、プラスミドpDB4461−pDB4473を生成するためにＨＳＡ ＤIIIをコードするヌクレオチド配列内に突然変異を含むプラスミドpDB3927（国際公報第 ２０１０／０９２１３５号に記載される）、pDB3883、pDB4086、pDB4010、pDB4006、pDB4175、pDB4189、pDB4110、pDB4182、pDB4184、pDB4200、pDB4202及びpDB4094（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）由来の類似配列によるpDB4460由来の６６６ｂｐのAvrII/SphI断片の置換により生成した。
【０２７８】
ＨＳＡ ＤIII及びＤIII変異体のＣ末端に遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａ又はｓｃＦｖ（ＦＩＴＣ８）（配列番号３５）の生成のための発現カセットを含むプラスミドを、次の通りにして調製した。ＩＬ−１ｒａ融合体に関して、プラスミドpDB2588、pDB4288及びpDB4286（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）［ＨＳＡ ＤIII又はその変異体をコードするＤＮＡ及びＧＳリンカー及びＩＬ−１ｒａ（Ｎ８４Ｑ）をコードするＤＮＡの３′末端、及びｍＡＤＨｔの５′領域を含む］由来の１．１６４ｋｂのAvrII/SphI断片を入手し、そして続いてAvrII/SphI消化pDB4460中に連結した。これは、それぞれプラスミドpDB4474−pDB4476をもたらした。
【０２７９】
ｓｃＦｖ融合体の生成のための発現カセットを含むプラスミドを、プラスミドpDB3008（Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124に記載される）（ＨＳＡ ＤIII末端領域、ＧＳリンカー及びｓｃＦｖをコードするＤＮＡ、及びｍＡＤＨｔの５′領域を含む）由来の１．００５ｋｂのBsu36I／SphI断片の単離、及びBsu36I/SphI消化pDB4461、pDB4464及びpDB4468中へのこれの続くクローニングにより生成した。これはプラスミドpDB4477−pDB4479をもたらした。
【０２８０】
プラスミドpDB4460−pDB4479をHsiI/PvuIにより消化し、そしてＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製したＤＮＡを、Acc65I／BamH消化pDB3936と共に混合し、そしてこれを用いて、Ｓ．セレビシエ株B cir0を直接的に形質転換した。
【０２８１】
Ｓ．セレビシエ株B cir0は、Ｓ．セレビシエ株A cir0（国際公開第２０１０／０９２１３５号に記載される）の誘導体であり、そしてその構成を下記に記載する。化学的突然変異誘発に続いて、Ｓ．セレビシエｕｒａ３変異体（すなわち、ウラシルに対して栄養要求性）を単離し、そしてセレビシエ株Ａ−Ｕｒａｓと命名した。Ｓ．セレビシエ株Ａ−ｕｒａ３をpDB3837により形質転換した。pDB3837を次の通りにして生成した：ＨＯオープン・リーディング・フレームの５′及び３′領域を、それぞれプライマーＢ０１／ＢＯ２及びＢＯ３／Ｂ０４（表５）を用いて、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１（Brachmann, et al., (1998) Yeast 14, 115に記載される）ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、そして酵素NotI/MluI（5'領域断片）及びMluI/ClaI（3'領域フラグメント）により制限消化した。消化された断片を精製し、そしてNotI/ClaI消化ＰＢＳＴ＋［Sleep, D. (2001). Yeast 18: 403-421に記載される］により３工程連結を行った。ポリリンカー（ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドＢ０５及びＢＯ６から精製された、表５）を、５′及び３′領域間のＭｌｕＩ部位でクローン化し、pDB3343を生成した。Ｓ．セレビシエＵＲＡ３遺伝子を、プライマーＢ０７及びＢ０８（表５）を用いて、プラスミドＹＣｐｌａｃ５０［Rose et al. (1987). Gene 60: 237-243に記載される］からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３生成物を、ＰａｃＩ及びＰｍｅＩにより消化し、そしてPacI/PmeI消化pDB3343中に連結し、pDB3514を生成した。Ｓ．セレビシエＰＤＩ１遺伝子を含む、２．９４ｋｂのKpnI断片を、pDB2389（Finnis et al. (2010). Microbial Cell Factories 9: 87）から得、Ｔ４ポリメラーゼを用いて平滑末端化し、その後SfoI消化pDB3514中に連結した。得られるプラスミドpDB3837は、２タンデムコピーのＰＤＩ１断片を含んだ。pDB3837を用いて、Ｓ．セレビシエ株Ａ−ｕｒａ３ cir0を直接的に形質転換し、株Ｂ ｃｉｒ0を生成した。Ｓ．セレビシエ株Ｂは、ＰＤＩ１遺伝子の生来のコピー、ＨＯ遺伝子座での２コピーのＰＤＩ１遺伝子、及びこの株のゲノムにおける未知の位置での追加のコピーのＰＤＩ１遺伝子を含む。
【０２８２】
（ｖ）ＨＳＡ ＤIII及びその変異体及び融合体をコードするプラスミドの調製
ＨＳＡ ＤIII＋ＤIII及びその変異体のための発現カセットを含むプラスミドを次の通りにして生成した。オリゴヌクレオチドｘＡＰ３２３/ｘＡＰ３２４（表５）を用いてのＰＣＲを用いて、pDB4282、pDB4283及びpDB4284（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願/欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）由来の６３６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、BglII／HindIIIにより消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、その後、BglII/HindIII消化pDB4284（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願/欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）中に連結した。得られたプラスミドを、pDB4489−pDB4491と命名した。
【０２８３】
一連のＰＣＲの第２ラウンドを実施し、第２ＨＳＡ ＤIII及びその変異体をコードするＤＮＡを増幅した。オリゴヌクレオチドｘＡＰ３２４／ｘＡＰ３２５（表５）を用いて、pDB3927（引用により本明細書に組み込まれる国際公報２０１０／０９２１３５号に記載される)、pDB4010及びpDB4110（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願/欧州特許出願第１０／０６６５７２号）から、ＨＳＡ ＤIII及びその変異体をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、Bsu36Iにより消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、その後、Bsu36I消化pDB4489−pDB4491中に連結した。得られたプラスミドを、pDB4522−pDB4526と命名した。pDB4522−pDB4526をNsiI/PvuIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、その後、Acc65I/BamHI消化pDB3936と共に用い、Ｓ．セレビシエ株B cir0を形質転換した。
【０２８４】
（ｖｉ）ＨＳＡ ＤIII Ｅ４９２Ｇ＋ＤIII Ｅ４９２Ｇ（即ち、タンデムドメインIII）をコードするプラスミドの調製
ＨＳＡ ＤIII Ｅ４９２Ｇ＋ＤＩＩＩ Ｅ４９２Ｇ発現カセットを含むプラスミドを次の通りにして調製した。ＰＲＢ１プロモーターの３′領域、FIVSI修飾されたインベルターゼリーダー及びＨＳＡ ＤIII Ｅ４９２Ｇ＋ＤIII Ｅ４９２ＧをコードするＤＮＡ、及びｍＡＤＨｔの５′領域を含む１．４８８ｋｂの合成ＤＮＡ断片を、遺伝子アセンブリー（ＤＮＡ２．０、ＵＳＡ）により生成した。合成PstI/PacI断片を、PstI/PacI消化pDB4181（引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願／欧州特許出願第１０／０６６５７２号に記載される）中に連結し、pDB4112を生成した。pDB4112をBstEII/BsrBIにより消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、その後、その１００ｎｇを、１００ｎｇのAcc65I／BamHI消化pDB3936（引用により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０９２１３５号に記載される）と共に混合し、そしてそれを用いて、Ｓ.セレビシエ株B cir0を直接的に形質転換した。
【０２８５】
ＨＳＡ ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩ及びその変異体のＣ末端に遺伝学的に融合されるＩＬ−１ｒａ又はｓｃＦｖ（ＦＩＴＣ８）の生成のための発現カセットを含むプラスミドを次の通りにして調製した。pDB4522、pDB4523及びpDB4524をAvrII/SphIにより消化し、そして個々の反応性からの７．５６４ｋｂをＱｉａｇｅｎ ゲル抽出キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。pBD4474−pDB4479をAvrII/SphIにより消化し、そして１．１６４ｋｂ及び１．４６４ｋｂのフラグメント（それぞれ、ＩＬ−１Ｒａ及びｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含む）を、Ｑｉａｇｅｎ ゲル抽出キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製した。pDB4474−pDB4479からの精製されたAvrII/SphIフラグメントを、AvrII/SphI消化pDB4522−pDB4524中に連結し、pDB4527−pDB4531及びpDB4533を生成した。pDB4527−pDB4531及びpDB4533をNsiI/PvaIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、その後、Acc65I/BamHI消化pDB3936と共に使用し、Ｓ. セレビシエ株B cir0を直接的に形質転換した。
【０２８６】
（ｖｉｉ）ＤIII＋ＤI及びＤIII＋ＤIIをコードするプラスミドの調製
ＨＳＡ ＤIII＋ＤI及びＤIII＋ＤIIのための発現カセットを含むプラスミドを次の通りにして生成した。オリゴヌクレオチド対ｘＡＰ２９０／ｘＡＰ２９１及びｘＡＰ２９２／ｘＡＰ２９３（表５）を用いて、それぞれＨＳＡ ＤＩ（ＰＣＲ断片＝６１６ｂｐ）及びＨＳＡ ＤII (ＰＣＲ生成物＝６２８ｂｐ)をコードするＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとしてpDB3927（国際特許出願第２０１０／０９２１３５号に記載される）を用いて、ＰＣＲ増幅した。両ＰＣＲ断片を、Bsu36I/HindIIIにより消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、次にBsu36I/HindIII消化pDB4478中に連結し、pDB4487及びpDB4488を生成した。pDB4487及びpDB4488をNsiI/PvuIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、次に、Acc65I/BamHI消化pDB3936と共に用い、Ｓ.セレビシエ株B cir0を直接的に形質転換した。
【０２８７】
（ｖｉｉｉ）ＤIII＋ＤIII＋ＤIIIをコードするプラスミドの調製
ＨＳＡ ＤIII＋ＤIII＋ＤIII（すなわち、三重ドメインIII）のための発現コンストラクトを次の通りにして調製した：ＨＳＡ ＤIIIをコードするＤＮＡを含む６１５ｂｐのBsu36I ＤＮＡ断片をpDB4527から得、そしてBsu36I消化pDB4522中に連結し、pDB4534を生成した。pDB4534をNsiI/PvuIにより消化し、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＴ精製キットを用いて、メーカーの説明書に従って精製し、次に、Acc65I/BamHI消化pDB3936と共に用い、Ｓ.セレビシエ株B cir0を直接的に形質転換した。
【０２８８】
（ｄ）Ｓ．セレビシエの形質転換
Ｓ．セレビシエ株を、ＹＥＰＤプレート（１％（w/v）酵母抽出物、２％（w/v）バクトペプトン、２％（w/v）グルコース、1.5％寒天）上に画線培養し、そして形質転換の前、３０℃で４日間、増殖した。１μgの完全なプラスミド（すなわち、環状プラスミド）、又はギャップ修復のためのBstEII/BsrBI又はNsiI/PvuI消化ＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合体含有プラスミド及びAcc65I/BomHI消化pDB3936（１００ｎｇ）を用いて（等モル濃度で）、改良されたリチウムアセテート法を用いるSigma Yeast Transformationキット（Sigma yeast transformation キット, YEAST-1, プロトコール2; Ito 等. (1983) J. Bacteriol., 153, 16; Elble, (1992) Biotechniques, 13, 18）により、Ｓ. セレビシエを形質転換した。前記プロトコールを、ヒートショックの前、室温で４時間、前記形質転換物をインキュベートすることにより、わずかに変更した。ヒートショックに続いて、細胞を手短に遠心分離し、その後、１Ｍ ソルビトール ２００μlに再懸濁し、次にＢＭＭＤ寒天プレート上に展開した。ＢＭＭＤの組成はSleep et al., (2001), Yeast, 18, 403に記載される。プレートを３０℃で４日間インキュベートし、その後、個々のコロニーを、新しいＢＭＭＤプレート上にパッチした。酵母株番号を、表１に詳述する。
【０２８９】
ストックを次の通りにして個々の酵母株について調製した：ＢＭＭＤブイヨンに各酵母パッチをヘビーループ（heavy loop）により接種し、そして２００rpmでのオービタル振盪下で、３０℃で２４時間、増殖した。細胞をSorval RT600遠心分離機により１９００×ｇで５分間遠心分離して収穫し、１５ｍｌの上清液を除去し、トレハロース４０％（ｗ／ｖ）で置換した。細胞を再懸濁し、低温用バイアル（１ｍｌ）に移して−８０℃で貯蔵した。
【０２９０】
（ｅ）Ｓ．セレビシエの振盪フラスコ増殖
ＢＭＭＤ（レシピ、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを有さない０．１７％（ｗ／ｖ）の酵母窒素塩基（Difco）、３７．８ｍＭ 硫酸アンモニウム、２９ｍＭ クエン酸、１４２ｍＭ オルトリン酸水素ニナトリウム二水和物ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）グルコース）培地（１０ｃｍｌ）に、個々の酵母株を接種し、そして２００ｒｐｍでのオービタル振盪下で、３０℃で９６時間、増殖した。個々の開始培養物のアリコート（４ｍｌ）を用いて、２×２００ｍｌのＢＭＭＤ培地を接種し、そして２００mrpmでのオービタル振盪下で、３０℃で３６時間、増殖した。細胞を、GF-Dプレフィルター（Whatman）を備えた０．２μｍ 真空フィルター膜（Stericup, Millipore）を用いた濾過により回収し、上清液を精製のために取得した。
【０２９１】
（ｆ）初期濃度
取得された培養物上清液を、トランスメンブラン圧２０ｐｓｉ及び循環速度１８０ｍｌ・分-1で、Omega 10KD（０．０９３ｓｑ．ｍ２）フィルター（LV Centramate（商標）カセット, Pall Filtron）を備えたPall Filtron LVシステムを用いた接線流濾過（Tangential Flow Filtration）を用いて濃縮した。
【０２９２】
（ｇ）振盪フラスコからのアルブミン誘導体及びその融合体の精製
振盪フラスコ（培養物上清液又は濃縮培養物上清液の何れか）から、アルブミン親和性マトリックス（AlbuPure（登録商標）- ProMetic BioSciences, Inc.）を用いた単一クロマトグラフィー工程を用いて、アルブミン誘導体、変異体及びその融合体を精製した。クロマトグラフィーは常時一定線速度２４０ｃｍ／時で実施した。培養物上清液又は濃縮された培養物上清液を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で前平衡化された層高６ｃｍ、２．０ｍｌの充填層に負荷した。負荷後、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液、次に５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）（１０ＣＶ）で洗浄した。生成物を、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタノエート（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、３０ｍＭ オクタン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、１００ｍＭ オクタン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、又は２００ｍＭ チオシアン酸カリウムのいずれかにより溶出した。カラムを、０．５Ｍ ＮａＯＨ（３ｃｖ）及び２０ｍＭ ＮａＯＨ（３．５ｃｖ）で清浄した。個々のアルブミン変異体からの溶出物画分を濃縮し、そして任意のダイアフィルトレーションカップ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたＶｉｖａｓｐｉｎ２０ １０，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳを用いて、１０体積のトリス緩衝溶液（２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に対してダイアフィルトレートした。精製されたアルブミン変異体を、下記のようにして（セクション（ｊ））、ＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化した。
【０２９３】
（ｈ）２Ｌ及び１０Ｌ発酵
−１０Ｌ発酵
形質転換体を、１０ＬのSartorius Biostat C発酵器を用い、３０℃で流加発酵（fed-batch fermentation）として培養した。ｐＨをモニターし、そしてアンモニア又は硫酸の添加により適切に調節した。アンモニアをまた、培養物のための窒素源として利用した。溶解酸素レベルをモニターし、撹拌速度に反映させて、２０％以上の飽和レベルを維持した。接種物を緩衝化最少培地を含む振盪フラスコにおいて増殖した。バッチ相に関しては、培養物を、２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む発酵培地（発酵器体積の約５０％）中に接種した。供給段階は、溶解酸素レベルの急激な上昇により自動的に開始した。供給速度を所定の名目増殖速度に調節することにより、スクロースを増殖制限濃度に維持した。供給物の構成は５０％（ｗ／ｖ）スクロースを含む発酵培地であった。何れもCollins（Collins, S.H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, pp. 61-77）に記載のとおりである。
【０２９４】
−２Ｌ発酵
形質転換体を、流加発酵として培養した。流加発酵を、３０℃で２ＬのPierre Guerin Tryton発酵器において実施した。ｐＨをモニターし、そしてアンモニア又は硫酸の添加により適切に調節した。アンモニアをまた、培養物のための窒素源として利用した。溶解酸素レベルをモニターし、撹拌速度に反映させて、２０％以上の飽和レベルを維持した。接種物を緩衝化最少培地を含む振盪フラスコにおいて増殖した。バッチ相に関しては、培養物を、２％（w/v）スクロースを含む発酵培地（発酵器体積の約５０％）中に接種した。供給段階は、酸素消費レベルの急激な上昇により自動的に開始した。供給速度を所定の名目増殖速度に調節することにより、スクロースを増殖制限濃度に維持した。供給物の構成は５０％（w/v）スクロースを含む発酵培地であった。何れもCollins（Collins, S.H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, pp. 61-77）に記載のとおりである。
【０２９５】
（ｉ）発酵物からのアルブミン誘導体及びその融合体の精製
アルブミン誘導体及びその融合体を、Sorvall RC 3C 遠心分離機(DuPont)を用いての遠心分離による分離の後、高細胞密度流加発酵上清液から精製した。培養物上清液を、上記のようにして、注文合成されたアルブミン親和性マトリックス（AlbuPure（登録商標）- ProMetic BioSciences, Inc.）を充填した層高１１ｃｍ、充填層２２ｍｌのカラムを通してクロマトグラフィー処理した。生成物を、１２０ｃｍ/時の流速で、上記溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出物画分をＧＰ−ＨＰＬＣ（下記）により、及び純度についての還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。個々のアルブミン変異体からの溶出物画分を、ＧＰ−ＨＰＬＣ（下記のようにして）及び還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、そして必要なら、さらに、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により充填された、層高９０ｃｍ×充填層４８８ｍｌのカラムを用いて実施し、そしてトリス緩衝溶液（２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）において４ｍｌ／分で行われる調製用ゲル濾過により分離した。ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）又はＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）の何れか及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００クロマトグラフィーからの溶出物画分を、任意のダイアフィルトレーションカップ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたＶｉｖａｓｐｉｎ２０ １０，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ、又は20ｐｓｉのトランスメンブラン圧及び１８０ｍｌ／分の再循環速度を伴って、Ｏｍｅｇａ 10KD (０．０９３sq.m2)フィルター (LV CentramateTM cassette, Pall Filtron)を固定したＰａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ ＬＶシステムを用いてのタンジェンシャルフロー濾過のいずれかを用いて濃縮した。Ａｌｂｕｐｕｒｅ（登録商標）クロマトグラフィーのみ由来するそれらの溶出物に関して、濃縮の後、ダイアフィルトレーションを、１０体積のトリス緩衝溶液（２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）に対して実施した。精製したアルブミン変異体を、下記のようにして、ＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化した。
【０２９６】
受容体（ｓｈＦｃＲｎ）結合特性及び/又は別の分析のためにアッセイされるべきすべてのタンパク質を、上記のようにしてＧＰ−ＨＰＬＣにより定量化し、そしてそれらの相対的消衰係数を補正した。
【０２９７】
（ｊ）ＧＰ−ＨＰＬＣによるアルブミン誘導体、変異体、融合体及びそのコンジュゲートの定量分析
精製したアルブミン誘導体、変異体、融合体及びそのコンジュゲートを、次の通りにしてＧＰ−ＨＰＬＣ及び定量化により分析した。長さ７．８ｍｍ ｉｄ×３００ｍｍのTSK G3000SWXLカラム（Tosoh Bioscience）及び長さ６．０ｍｍ ｉｄ×４０ｍｍのTSK SWガードカラム（Tosoh Bioscience）に、それぞれ２５μｌを注入した。サンプルを、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、 ０．０５％ (w/v) アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０、1ｍｌ／分でクロマトグラフィー処理した。サンプルを、２８０ｎｍのＵＶ検出により、ピーク面積に基づき、既知濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）の組換ヒトアルブミン標準を基準として定量化し、相対的消衰係数を補正した。
【０２９８】
（ｋ）アルブミン及びその誘導体及び変異体に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲーション
アルブミン及びその誘導体及び変異体を、上記のようにして（セクション（ｇ）及び（ｉ））、精製し、濃縮し、そしてトリス緩衝溶液（ＴＢＳ）（ｐＨ７．２−７．３）による緩衝液交換を行った。
【０２９９】
ＨＲＰを、２ｍｇ／ｍｌ ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）マレイミド活性化ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP、Thermo Scientific）と共にインキュベートし、ドメイン１における遊離スルフィドリルと反応させ、分子にコンジュゲートした。ＨＲＰをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）に溶解し、そしてインキュベーションは、アルブミン又はその変異体又は誘導体に関して、約２倍モル過剰のＨＲＰを提供した。この混合物を４℃で少なくとも２４時間インキュベートした。次に、反応混合物をＧＰ−ＨＰＬＣを用いて分析し、コンジュゲートが生じたことを確かめた。ＧＰ−ＨＰＬＣ分析は、上記に記載される（セクション（ｊ））。
【０３００】
非コンジュゲート種（ＤI＋ＤIII、ＤI＋ＤIII＋ＤIII又はドメイン変異体及び未反応ＨＲＰ）を、対応するコンジュゲート種から分離するために、まずサンプルを濃縮し（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、１０，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）そして次に、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００、１０／３００ ＧＬカラム(GE Healthcare)にそれぞれ負荷し、そしてＴＢＳにおいて４５ｃｍ／時の流速で通過させた。溶出ピークを分別し、そしてＧＰ−ＨＰＬＣにより分析した。コンジュゲート種を含む画分をプールし、濃縮し、そして続いて、ＧＰ−ＨＰＬＣ及び非還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析し、コンジュゲート種を示した。
【０３０１】
（Ｉ）アルブミン及びその誘導体及び変異体へのフルオレセイン−５−マレイミド（Ｆ５Ｍ）のコンジュゲーション
フルオレセイン−５−マレイミド（Thermo Scientific;Ｆ５Ｍ）を、ジメチルホルムアミドに溶解し、１．２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。次に、これをさらに、１８ｍｌ ＰＢＳ（約６．５のｐＨに調節されている）に希釈した。ＨＳＡ ＤI＋ＤIII変異体を添加し、最終混合物において約２０倍の最終モル過剰を得た。次に、これらのサンプルをインキュベートし、暗室において４℃で一晩コンジュゲートさせることにより、Ｆ５Ｍ上のマレイミド基を、両アルブミン種に存在する遊離スルフィドリルと優先的に反応させた。
【０３０２】
一晩のインキュベーションの後、反応混合物のアリコートを、ＴＢＳに対して広範囲にわたってダイアフィルトレートし、非コンジュゲートＦ５Ｍを除去した（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、１０，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）。コンジュゲートを、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、コンジュゲート化フルオレセイン：：ＤI＋ＤIII及びそこにおける変異体の紫外線可視化により確認した。
【０３０３】
実施例１．アルブミン誘導体又は変異体の構成
アルブミン誘導体若しくは変異体又は断片の結合を実証するために、以下のコンストラクトを、ＨＳＡから開始して生成した。見出し「突然変異／コンストラクト」下に引用される位置は、配列番号３１における位置を言及する。
【０３０４】
【表７】
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【０３０５】
実施例２．可溶性ＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）へのアルブミン変異体の結合
３種の確立されたＦｃＲｎ結合アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ及びＤｙｎａｂｅａｄ結合アッセイを用いた。前記アッセイ間には次の主な差異が存在する：
ＥＬＩＳＡシステムにおいては、ＨＳＡをウェルに直接、被覆し、そして可溶性ｈＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ)−ＧＳＴを溶液で添加するが、ＳＰＲアッセイにおいては、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴをＣＭ５チップに固定し、ＨＳＡを溶液で注入する。ｐＨは、両システムにおいて変更可能である。
ＦｃＲｎ Ｄｙｎａｂｅａｄ結合アッセイは、ストレプタビジンカップリングビーズ上に捕獲される部位特異的ビオチニル化ｓｈＦｃＲｎに基づく。ＧＳＴタグ化ＨＳＡを溶液で添加し、そして結合をニワトリＨＲＰコンジュゲート抗ＧＳＴ Ａｂを用いて検出する。
【０３０６】
さらに、競合結合を、ｓｈＦｃＲｎ（５０ｎＭ）単独で、又は異なった濃度のＨＳＡ （５５−５００ｎＭ）、ＨＳＡ ＤI−ＤII（５００＋１５００ｎＭ）、ＨＳＡ ＤII−ＤIII（５００＋１５００ｎＭ）、ＨＳＡ ＤI−ＤIII（５００＋１５００ｎＭ）、ＨＳＡ ＤIII(５００＋１５００ｎＭ)及びＨＳＡ ＤIII−ＤIII（５００＋１５００ｎＭ)と一緒に注入することにより測定した。注入を２５℃及び５０μｌ／分の流速で実施した。実施例２の変異体を、ＥＬＩＳＡ（結果を、図１に示す）を用いて、及びＳＰＲ（結果を図２及び表７に示す）及び競合ＳＰＲに基づくアッセイ（結果を図３に示す）を用いて、ＦｃＲｎ結合について分析した。ＳＰＲ及び競合ＳＰＲに基づくアッセイを、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴを用いて実施した。
【０３０７】
ＨＳＡドメインとのshFcRn相互作用の動態（kinetics）を計算し、そして下記に示した（表７）。
【０３０８】
【表８】
2013523145.tif 000009
【０３０９】
ＳＰＲ結果は、ＤI＋III、ＤII＋III、ＤIII、ニ重ＤIII及び全長アルブミンがｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎを結合することを示す（図２）。対照的に、ＥＬＩＳＡデータは、ＤIII ｗｔが、固定される場合、ｓｈＦｃＲｎと相互作用しないことを示した。ＤIII−ｓｈＦｃＲｎ会合/解離速度は速く、そして従って動態値は直接的には決定されないが、しかしながら定常状態親和性定数の計算は、ＤIIIが全長ＨＳＡよりも低いｓｈＦｃＲｎを結合し、そして結合親和性の３倍の低下が存在することを示す。このデータは、ＨＳＡの別の部分がドメインIIIのｓｈＦｃＲｎへの最適な結合のために重要であることを示唆し、これはさらに、ＤI−ＤIII及びＤII−ＤIIIを分析する場合、支持する。ＤII−ＤIIIは、その結合親和性は全長アルブミンについて測定される結合親和性に比較して低くなるが、ｓｈＦｃＲｎを結合する。ＤI−ＤIIIはまた、ＤII−ＤIIIよりも高い親和性でｓｈＦｃＲｎを結合し、両者はドメインIII単独に関してよりも高い親和性を有し、このことは再び、ＨＳＡの別の部分がｓｈＦｃＲｎ受容体への最適結合のために重要である本知見を支持する。比較ＳＰＲアッセイは、ニ重ドメインIIIコンストラクトが、アッセイにおいてｗｔアルブミンと競合し、この競合はＤI＋III、ＤII＋III及びＤIIIよりもより効果的であるが、しかしｗｔアルブミン、すなわちＨＳＡほど効果的でないことを示す。
【０３１０】
実施例３．ｓｈＦｃＲｎへのドメインスワップ誘導体の結合
次のドメインスワップ誘導体を、前記方法セクション（上記）に従って生成した：
ＨＳＡ１／２−ＲＳＡ３      ：ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）ドメインI及びII及                                びＲＳＡ（ウサギ血清アルブミン）ドメインIII
ＲＳＡ１／２−ＨＳＡ３      ：ＲＳＡドメインI及びII及びＨＳＡドメインIII
ＳＳＡ１／２−ＨＳＡ３      ：ＳＳＡ（ヒツジ血清アルブミン)ドメインI及びII                                  及びＨＳＡドメインIII
ＨＳＡ１／２−ＳＳＡ３      ：ＨＳＡドメインI及びII及びＳＳＡドメインIII
ＨＳＡ１／２−ＭＳＡ３      ：ＨＳＡドメインI及びII及びＭＳＡ（マウス血清ア                                ルブミン）ドメインIII
ＭＳＡ１／２−ＨＳＡ３      ：ＭＳＡドメインI及びII及びＨＳＡドメインIII。
【０３１１】
例として、使用されるドメインを表８に示す：
【表９】
2013523145.tif 000010
それらをさらに、図５のアラインメントに示す。
【０３１２】
実施例３の誘導体又は変異体を、ＳＰＲを用いて、ｓｈＦｃＲｎ結合(ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ)について分析し、そして結果を下記（表９）に示す。
【表１０】
2013523145.tif 000011
【０３１３】
ＳＳＡ（配列番号１６）及びＳＳＡドメインIII（配列番号２８）を含む誘導体、並びにＭＳＡ１／２−ＨＳＡ３（配列番号３０）は、この実験においてはＦｃＲｎを結合しなかった。
【０３１４】
ＨＳＡ ＤI＋ＤII＋ＲＳＡ ＤIII及びＨＳＡ ＤI＋ＤII＋ＭＳＡ ＤIIIは、ＨＳＡ、ＭＳＡ及びＲＳＡと比較して、ｓｈＦｃＲｎについての親和性を高めた。データはまた、様々な種のアルブミンＤI＋ＤIIが異なった種由来のアルブミンＤIIIの親和性を調節できる（即ち、増加し又は低減する）ことを示した。
【０３１５】
実施例４．ｓｈＦｃＲｎへのＨＳＡ誘導体ＤI＋ＤIII及びその融合体の結合
ＨＳＡ誘導体ＤI＋ＤIII及びその融合体（表１０）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。
【０３１６】
ＳＰＲアッセイを、Biacore X 及び Biacore 3000 装置(G E Healthcare)を用いて実施した。ＣＭ５チップを、アミンカップリング化学により、メーカーの説明書（１６００−２５００ＲＵ）に従って、ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（GeneArt)とカップリングした。カップリングを、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（GE Healthcare）にＳｈＦｃＲｎを希釈することにより行った。リン酸緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ５．５±０．２５）を、実行緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。再生を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液ｐＨ７．４を用いて行った。固定されたｓｈＦｃＲｎへの結合のために、ＨＳＡ誘導体又は変異体を、２５℃、一定流速（３０μｌ／分）で活性細胞表面上に９０秒間、注入した。ｐＨ７．４での結合アッセイに関して、ＨＢＳ−ＥＰ（GE Healthcare）を、希釈及び実行緩衝液として使用した。何れの実験でも、データをゼロ点調整し、参照細胞を減算した。データ判断及び動態値の決定に関しては、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを、動態結合モデリングのために使用した。
【０３１７】
分子を結合するｓｈＦｃＲｎの動態値を表１０に示す。
【表１１】
2013523145.tif 000012
【０３１８】
ｗｔ ＤI＋ＤIII及びその誘導体はｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合し、即ち、結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。結果は、ＤI＋ＤIII誘導体及びその融合体のｓｈＦｃＲｎに対する結合の階層がＫ５７３Ｙ ＞ Ｋ５７３Ｐ ＞ ｗｔ ＞ Ｄ５５０Ｎ（最高→最低の親和性）であったことを示す。弱い結合を、ｐＨ５．５又はｐＨ７．４のいずれかで、ＤI＋ＤIII Ｋ５００Ａ（ＩＬ−１Ｒａに融合及び非融合）とｓｈＦｃＲｎとの間で検出した。
【０３１９】
実施例５．ｓｈＦｃＲｎへのＨＳＡ誘導体ＤII＋ＤIII及びその融合体の結合
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びその融合体（表１１）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び解釈を、実施例４に従って実施した。
【表１２】
2013523145.tif 000013
【０３２０】
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII誘導体及びその融合体のすべては、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎと相互作用し（データ未記載）、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。ＨＳＡ ＤI＋ＤIII誘導体（融合及び非融合）の結合の階層は、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII誘導体及びその融合体（実施例４）について記載されるその結合の階層と同一であり、即ちＫ５７３Ｙ ＞ Ｋ５７３Ｐ ＞ ｗｔ ＞ Ｄ５５０Ｎ（ｓｈＦｃＲｎについて最高→最低の親和性）であった。
【０３２１】
実施例６．ＨＳＡ誘導体ＤIII及びその誘導体のｓｈＦｃＲｎへの結合
非融合ＤＩＩＩ誘導体（表１２ａ）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【表１３ａ】
2013523145.tif 000014
【０３２２】
ＨＳＡ ＤIII誘導体のすべては、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎと相互作用（データ未記載）、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。ｓｈＦｃＲｎへの結合の階層は、ＤIII Ｋ５７３Ｙ、ＤIII Ｋ５７３Ｐ、ＤIII Ｋ５７３Ｆ、ＤIII Ｋ５７３Ａ、ＤIII Ｅ４９２Ｇ、ＤIII Ｄ５５０Ｎ、wt ＤIII、ＤIII Ｅ４９２/Ｎ５０３Ｋ、ＤIII Ｋ５００Ａ（ｓｈＦｃＲｎについて、最高→最低の親和性）である。
【０３２３】
動態値が決定されていないＤIII誘導体を、ｗｔ ＤIIIと比較して結合応答（ＲＵｓ）について分析した。結合をｐＨ７．４で検出せず、ｐＨ５．５のみで検出した。結果を表１２ｂに示す。高いＲＵ値は、より強い結合を示す。従って、ｗｔ ＨＳＡと比較して、表１２ｂにおいて試験された変異体のすべては、ｓｈＦｃＲｎに対して弱い結合性を示す。ｗｔ ＨＳＡ ＤIII及びその誘導体は、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合する。ＨＳＡ ＤIII Ｋ５７３Ｄ、ＤIII Ｋ５７３Ｈ、ＤIII Ｋ５７３Ｎ、ＤIII Ｋ５７３Ｗ及びＤIII Ｑ５８０Ｋについての代表的センサーグラムが、図８に示される。
【０３２４】
【表１３ｂ】
2013523145.tif 000015
【０３２５】
提供される結合応答（ＲＵ値）は、注入が停止した点で記録される相対的絶対値を表し、そして最大複合体が、注入期間の間、形成した。より高いＲＵ値はより高い親和性に等しい。
【０３２６】
実施例７．ＩＬ−１ｒａ又はｓｃＦｖに対して遺伝学的に融合するＨＳＡ誘導体のｓｈＦｃＲｎへの結合
分子（表１３）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び判断を実施例４に従って実施した。
【表１４】
2013523145.tif 000016
【０３２７】
結果は、ＩＬ−１ｒａに対して遺伝学的に融合するＨＳＡ ＤIII誘導体のｓｈＦｃＲｎへの結合の階層がＤ５５０Ｎ ＞ Ｋ５７３Ｐ ＞ ｗtであることを示す。対照的に、ｓｃＦｖに対して遺伝学的に融合するＨＳＡ ＤIII誘導体のｓｈＦｃＲｎへの結合の階層はＫ５７３Ｐ ＞ Ｄ５５０Ｎ ＞ ｗｔである。
【０３２８】
実施例８．アルブミン及びアルブミン誘導体へのホースラディッシュペルオキシダーゼの結合
ＨＲＰを、前記方法（上記）に従ってアルブミン誘導体にコンジュゲートし、アルブミン変異体（表１４）を形成した。分子をＧＰ−ＨＰＬＣ（結果未記載）及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９）により分析し、分子が予測される分子量のものであり、そして従って、コンジュゲーションが生じ、所望する分子を生成したことを確認した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【表１５】
2013523145.tif 000017
【０３２９】
図１０は、ｗｔ ＨＳＡ ＤI＋ＤIII及び野生型ＨＳＡについての結合応答と比較して、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−ＨＲＰ変異体及びｓｈＦｃＲｎ相互作用についての増加した結合応答を確認する。さらに、図１０は、ＤＩ＋ＤIII Ｋ５００Ａ−ＨＲＰ及びｓｈＦｃＲｎの結合相互作用が、ｗｔ ＨＳＡ ＤI＋ＤIII及び野生型ＨＳＡに比較して、低減することを示す。
【０３３０】
ＤI＋ＤIII ｗｔ及びその変異体は、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合し、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。コンジュゲートＤI＋ＤIII変異体は、非コンジュゲートＤI＋ＤIII（実施例４）に見出される同じ親和性調節（affinity modulation）を示す。
【０３３１】
実施例９：ＨＳＡ ＤII＋ＤIIIのＮ末端に対して遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａと相互作用するｓｈＦｃＲｎの結合分析
ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びＨＳＡ ＤII＋ＤIII Ｋ５７３Ｐに対して遺伝学的に融合するＩＬ−１ｒａ（表１５）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【０３３２】
【表１６】
2013523145.tif 000018
【０３３３】
提供される結合応答（ＲＵ値）は、注入が停止した点で記録される相対的絶対値を表し、そして最大複合体が前記注入期間の間、形成した。より高いＲＵ値はより高い親和性に等しい。
【０３３４】
ＨＳＡ ＤII＋ＤIIIにＮ末端融合するＩＬ−１ｒａ及びＫ５７３Ｐ ＤII＋ＤIIIにＮ末端融合するＩＬ−１ｒａは、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合し、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。図１１は、ＤII＋ＤIIIへのＮ末端融合が、ｓｈＦｃＲｎへの分子の結合を妨げないで、解離時間を長くすることを示す。結果は、野生型ＨＳＡ ＤII＋ＤIII及びＨＳＡに比較して、ｓｈＦｃＲｎとＫ５７３Ｐ変異体との間の増加した結合応答を示す。
【０３３５】
実施例１０：ＤIIIのタンデム反復及びその誘導体の融合体である分子とのｓｈＦｃＲｎ相互作用の結合分析
ＨＳＡ誘導体及びその融合体（表１６）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び解釈を、実施例４に従って実施した。
【０３３６】
【表１７】
2013523145.tif 000019
【０３３７】
提供される結合応答（ＲＵ値）は、注入が停止した点で記録される相対的絶対値を表し、そして最大複合体が前記注入期間の間、形成した。より高いＲＵ値はより高い親和性に等しい。
【０３３８】
タンデムＤIII融合体は、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合する（すなわち、ｐＨ５．５で結合するが、ｐＨ７．４では結合しない）。結合応答（表１６）は、タンデムＤIII融合体に関して、次の順序を示す：
（ｉ）ＩＬ−１ｒａ融合体：ＤIII Ｄ５５０Ｎ＋ＤIII Ｄ５５０Ｎ−ＩＬ−１ra、ＤIII Ｋ５７３Ｐ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−ＩＬ−１ra、wt ＤIII−ＩＬ−１ra（最高→最低親和性)；
（ｉｉ）ｓｃＦｖ融合体：ＤIII Ｋ５７３Ｐ＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−ｓｃＦｖ、Ｄ５５０Ｎ＋ＤIII Ｄ５５０Ｎ−ｓｃＦｖ wt ＤIII−ｓｃＦｖ（最高→最低親和性)。
【０３３９】
実施例１１：ＤI＋ＤIII ｗｔ及びその誘導体へのフルオレセイン−５−マレイミド（Ｆ５Ｍ）のコンジュゲート
コンジュゲートＨＳＡ誘導体及び変異体（表１７）を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。分子を、ＧＰ−ＨＰＬＣ（結果未記載）及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６）により分析した。コンジュゲーションを、コンジュゲートＤI＋ＤIII ｗｔ及び変異体のＵＶ可視化により確認した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【０３４０】
【表１８】
2013523145.tif 000020
【０３４１】
ＮＤ：弱い結合のために測定されなかった。提供される結合応答（ＲＵ値）は、注入が停止した点で記録される相対的絶対値を表し、そして最大複合体が前記注入期間の間、形成した。より高いＲＵ値はより高い親和性に等しい。
【０３４２】
図１７は、野生型ＨＳＡではなくＨＳＡ ＤI＋ＤIII−Ｆ５Ｍについての結合応答と比較して、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−Ｆ５Ｍ変異体及びｓｈＦｃＲｎ相互作用についての増加した結合応答を確認する。さらに、図１７は、ＤI＋ＤIII Ｋ５００Ａ−Ｆ５Ｍ及びｓｈＦｃＲｎの結合相互作用が、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII Ｋ５７３Ｐ−Ｆ５Ｍ及び野生型ＨＳＡと比較して、有意に低減することを示す。
【０３４３】
ＤI＋ＤIII ｗｔ及びその変異体は、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合し、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。コンジュゲートＤI＋ＤIII変異体は、非コンジュゲートＤI＋ＤIII変異体及び全長ＨＳＡ（実施例４）に見出される同じ親和性調節を示す。
【０３４４】
実施例１２：ＤI＋ＤIII ｗｔへのフルオレセイン−５−マレイミド（Ｆ５Ｍ）のコンジュゲーション
コンジュゲートＨＳＡ誘導体（表１８）、を、前記方法セクション（上記）に従って調製した。分子を、ＧＰ−ＨＰＬＣ（結果未記載）及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６）により分析した。コンジュゲーションを、コンジュゲートＤI＋ＤIII ｗｔ＋ＤIII ｗｔのＵＶ可視化により確認した。ＳＰＲ分析及び判断を実施例４に従って実施した。
【０３４５】
【表１９】
2013523145.tif 000021
【０３４６】
提供される結合応答（ＲＵ値）は、注入が停止した点で記録される相対的絶対値を表し、そして最大複合体が前記注入期間の間、形成した。より高いＲＵ値はより高い親和性に等しい。
【０３４７】
図１８は、ｗｔ ＨＳＡではなくＨＳＡ ＤI＋ＤIII−Ｆ５Ｍについての結合応答と比較して、ＨＳＡ ＤI＋ＤIII ｗｔ＋ＤIII ｗｔ−Ｆ５Ｍ変異体及びｓｈＦｃＲｎの相互作用についての増加した結合応答を確認する。
【０３４８】
コンジュゲートＤI＋ＤIII ｗｔ及びＤＩ＋ＤIII ｗｔ＋ＤIII wtは、ｐＨ依存性態様でｓｈＦｃＲｎに結合し、即ち結合をｐＨ５．５で検出したが、ｐＨ７．４では検出しなかった。
【０３４９】
実施例１３：ＨＳＡ誘導体ＤIII＋ＤI及びＤI＋ＤIIIとのｓｈＦｃＲｎ相互作用の結合分析
ＨＳＡ誘導体（表１９）を、前記方法セクション（上）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【０３５０】
【表２０】
2013523145.tif 000022
【０３５１】
表１９は、ＨＳＡ誘導体ＤIII＋ＤIが、ＨＳＡ ＤI＋ＤIIIに比較して、ｓｈＦｃＲｎに対する親和性を低減したことを示す。
【０３５２】
実施例１４：野生型アルブミンと比較してアルブミン誘導体ＤI＋ＤIIIとのｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ相互作用の結合分析
ｗｔアルブミン種及びそのＤI＋ＤIII誘導体（表２０）を、前記方法セクション（上）に従って調製した。ＳＰＲ分析及び判断を、実施例４に従って実施した。
【０３５３】
【表２１】
2013523145.tif 000023
【０３５４】
結果は、ＭＳＡ ＤI−ＤIII及びＲＳＡ ＤIIIの両者がｓｈＦｃＲｎに対して、ｗｔ ＭＳＡ、ｗｔ ＨＳＡ及びＨＳＡ ＤI−ＤIIIよりも高い結合親和性を有することを示す。すべてのＤI−ＤIII変異体は、ｐＨ依存性態様で固定されたｓｈＦｃＲｎに対して結合する（即ち、ｐＨ６．０で結合するが、ｐＨ７．４では結合しなかった）。ＨＳＡ ＤI−ＤIIIは、ＨＳＡ ｗｔと比較して、わずかに低減した親和性を伴ってｓｈＦｃＲｎを結合したが、しかしながらＲＳＡ及びＭＳＡ ＤI−ＤIIIアルブミン誘導体は、ＨＳＡ ｗｔと比較して、卓越した結合親和性を示した。
【図１】
2013523145.tif 000024
【図２】
2013523145.tif 000025
【図３】
2013523145.tif 000026
【図４−１】
2013523145.tif 000027
【図４−２】
2013523145.tif 000028
【図５−１】
2013523145.tif 000029
【図５−２】
2013523145.tif 000030
【図５−３】
2013523145.tif 000031
【図５−４】
2013523145.tif 000032
【図６】
2013523145.tif 000033
【図７】
2013523145.tif 000034
【図８ａ−８ｃ】
2013523145.tif 000035
【図８ｄ−８ｅ】
2013523145.tif 000036
【図９】
2013523145.tif 000037
【図１０】
2013523145.tif 000038
【図１１】
2013523145.tif 000039
【図１２】
2013523145.tif 000040
【図１３】
2013523145.tif 000041
【図１４】
2013523145.tif 000042
【図１５】
2013523145.tif 000043
【図１６】
2013523145.tif 000044
【図１７】
2013523145.tif 000045
【図１８】
2013523145.tif 000046
【配列表】
2013523145000001.app
【国際調査報告】
2013523145.tif 000047
2013523145.tif 000048
2013523145.tif 000049