(57)【要約】本発明は、インフルエンザウイルス感染の予防および治療において有用なポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ｒＭＶＡ）、関連するワクチン組成物、および方法を提供する。Ｍ２インフルエンザ外部ドメインペプチドの複数のコピーをコードする単離ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含むｒＭＶＡが提供される。インフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされるまたはそれから結果として生じる疾患または症状を治療するための、インフルエンザウイルスに対して被験体に免疫応答を誘発させる方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも５つのインフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質（Ｍ２）外部ドメインペプチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のアミノ酸配列のうち任意の５つ以上を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド：
ｉ．配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；
ｉｉ．配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；
ｉｉｉ．配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；
ｉｖ．配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；
ｖ．配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；
ｖｉ．配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；
ｖｉｉ．配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；
ｖｉｉｉ．配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；
ｉｘ．配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；
ｘ．配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；
ｘｉ．配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および
ｘｉｉ．配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【請求項３】
ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドのうち任意の３つ以上を含む、単離ポリヌクレオチド：
ｉ．配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；
ｉｉ．配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；
ｉｉｉ．配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；
ｉｖ．配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；
ｖ．配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；
ｖｉ．配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；
ｖｉｉ．配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；
ｖｉｉｉ．配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；
ｉｘ．配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；
ｘ．配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；
ｘｉ．配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および
ｘｉｉ．配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドの任意の３つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド：
ｉ．配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；
ｉｉ．配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；
ｉｉｉ．配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；
ｉｖ．配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；
ｖ．配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；および
ｖｉ．配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドの任意の３つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド：
ｉ．配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；
ｉｉ．配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；
ｉｉｉ．配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；
ｉｖ．配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；
ｖ．配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および
ｖｉ．配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、前記Ｍ２外部ドメインペプチドの任意の４つ以上を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、前記Ｍ２外部ドメインペプチドの任意の５つ以上を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、前記Ｍ２外部ドメインペプチドの任意の６つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドを含む、請求項１〜５、７、および８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド：配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）、配列番号２Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）、配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）、配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）、配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）、および配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドを含む、請求項１〜４、５、７、および８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド：配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）、配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）、配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）、配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）、配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）、および配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記マトリックス２タンパク質（Ｍ２）外部ドメインペプチドの少なくとも２つは、その間にリンカーペプチドが介在せずに一緒になって融合している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記Ｍ２外部ドメインペプチドの少なくとも２つは、その間に介在するリンカーペプチドを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記リンカーペプチドは、少なくとも５つのアミノ酸を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記リンカーペプチドは、下等生物において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有する、請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記リンカーペプチドは、霊長類において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有さない、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記リンカーペプチドのうち１つ以上は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、およびその任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、配列番号２６および配列番号２７のうちの１つ以上を含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、配列番号１６［ＭＥＴＲ＿Ｃバージョン−完全長］のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、配列番号１８［ＭＥＴＲ＿Ｓバージョン−完全長］のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記コード領域は、ヒトにおける発現にコドン最適化されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記コード領域は、前記インフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質（Ｍ２）外部ドメインペプチドコード領域と作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記プロモーターは、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記コード領域は、さらなるポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記さらなるポリペプチドは、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、または前記インフルエンザポリペプチドもしくはその断片の２つ以上の組み合わせである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記さらなるポリペプチドは、ＨＡまたはその断片である、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記ＨＡは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記さらなるポリペプチドは、ＮＰまたはその断片である、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記ＮＰは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記さらなるポリペプチドは、Ｈｉｓタグ；ユビキチンタグ；ＮｕｓＡタグ；キチン結合ドメイン；ｏｍｐＴ；ｏｍｐＡ；ｐｅｌＢ；ＤｓｂＡ；ＤｓｂＣ；ｃ−ｍｙｃ；ＫＳＩ；ポリアスパラギン酸；（ＡＩａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ（配列番号２８）；ポリフェニルアラニン；ポリシステイン；ポリアルギニン；Ｂタグ；ＨＳＢタグ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）；ガラクトース結合タンパク質；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；連鎖球菌プロテインＧ；ブドウ球菌プロンテインＡ：Ｔ７ｇｅｎｅｌＯ；アビジン／ストレプトアビジン／ｉＳｔｒｅｐタグ；ｔｒｐＥ；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ｌａｃＺ（Ｄ−ガラクトシダーゼ）；Ｈｉｓパッチチオレドキシン；チオレドキシン；ＦＬＡＧ（商標）ペプチド；Ｓタグ；Ｔ７タグ；または前記ポリペプチドの２つ以上の組み合わせである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
ウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターから成る群から選択される、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ワクシニアウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
さらなるポリペプチドをさらに発現する、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記さらなるポリペプチドは、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、または前記インフルエンザポリペプチドもしくはその断片の２つ以上の組み合わせである、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記さらなるポリペプチドは、ＨＡまたはその断片である、請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
前記ＨＡは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
前記さらなるポリペプチドは、ＮＰまたはその断片である、請求項３７に記載のベクター。
【請求項４１】
前記ＮＰは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
前記ＭＶＡは、トリ細胞において複製することができる、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４３】
前記トリ細胞は、不死化されている、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記トリ細胞は、アヒル細胞である、請求項４２または４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記アヒル細胞は、バリケン属（Ｃａｉｒｉｎａ）網膜細胞株または胚由来細胞株である、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記アヒル細胞は、ＡＧＥ１ｃｒ、ＡＧＥ．ｐＩＸ、またはＥＢ６６である、請求項４４または４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドは、前記ＭＶＡのゲノムの天然に存在する欠失部位内に挿入されている、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記天然に存在する欠失部位は、欠失部位３である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドは、前記ＭＶＡのゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に挿入される、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５０】
その必要のある被験体に投与された際に、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５１】
前記免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、または体液性および細胞媒介性免疫応答の組み合わせである、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
インフルエンザウイルスと関連する疾患または状態を予防する、改善させる、または治療することができる、請求項３２〜５１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
少なくとも１つのインフルエンザタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むさらなる組換えＭＶＡをさらに含む、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
トリ細胞である、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
不死化されている、請求項５６〜５５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
アヒル細胞である、請求項５６〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記アヒル細胞は、バリケン属の網膜細胞または胚由来幹細胞である、請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
ＡＧＥ１ｃｒ、ＡＧＥ１ｃｒ．ｐＩＸ、またはＥＢ６６である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞によってコードされるポリペプチド。
【請求項６１】
インフルエンザポリペプチドを産生する方法であって、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップおよび前記ポリペプチドを回収するステップを含む、方法。
【請求項６２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項６０に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項６３】
アジュバントをさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記アジュバントは、ミョウバン、ベントナイト、ラテックスおよびアクリル粒子、プルロニックブロックポリマー、スクアレン、貯蔵物形成剤、表面活性物質、リゾレシチン、レチナール、Ｑｕｉｌ  Ａ、リポソーム、およびプルロニックポリマー製剤；マクロファージ刺激物質、代替経路補体活性化因子、非イオン性界面活性剤、細菌構成成分、アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウイルスおよびウイルスに由来する物質、毒、毒液、イミダゾキニリン化合物、ポロキサマー、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ｍＬＴ、ＣｐＧ、ＭＰＬ、カチオン脂質、Ｑｓ２１、ならびに前記アジュバントのうちの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
さらなるインフルエンザワクチンをさらに含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記さらなるインフルエンザワクチンは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のタンパク質またはその断片のうちの１つ以上をコードするＭＶＡを含む、請求項６５に記載の組成物：赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）。
【請求項６７】
前記タンパク質は、ＨＡまたはその断片である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＨＡは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記タンパク質は、ＮＰまたはその断片である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＮＰは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
（ａ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、または請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物と、（ｂ）前記ポリヌクレオチド、ベクター、ＭＶＡ、宿主細胞、ポリペプチド組成物、またはその任意の組み合わせを投与するための手段とを含むキット。
【請求項７２】
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する必要のある被験体においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量の、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物、またはその任意の組み合わせを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項７３】
前記免疫応答は、抗体応答を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫応答は、細胞媒介性免疫応答を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫応答は、細胞媒介性免疫応答および抗体応答を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫応答は、粘膜免疫応答である、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態の症状を治療する、予防する、または軽減する必要のある被験体においてインフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態の症状を治療する、予防する、または軽減するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量の、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物、またはその任意の組み合わせを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項７８】
インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態によって引き起こされる症状を和らげるまたは改善させる必要のある被験体においてインフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態によって引き起こされる症状を和らげるまたは改善させるための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量の、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物、またはその任意の組み合わせを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項７９】
ワクチン接種する必要のある被験体にインフルエンザウイルス感染に対してワクチン接種するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量の、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物、またはその任意の組み合わせを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項８０】
前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスである、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記インフルエンザＡ型ウイルスは、タイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、またはＨ９の赤血球凝集素を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記インフルエンザウイルスは、鳥または哺乳動物に由来する、請求項７２〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記被験体は、動物である、請求項７２〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記被験体は、脊椎動物である、請求項７２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記被験体は、哺乳動物である、請求項７２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記投与は、硬膜内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して実行される、請求項７２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記被験体は、インフルエンザ感染の危険性がある、請求項７２〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも１回の初回刺激免疫処置を施すステップをさらに含む、請求項７２〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記初回刺激免疫処置は、ワクチン組成物を投与することを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ワクチン組成物は、ＤＮＡワクチンまたはポリペプチドワクチンである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
少なくとも１回の追加免疫免疫処置を施すステップをさらに含む、請求項７２〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記追加免疫免疫処置は、ワクチン組成物を投与することを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ワクチン組成物は、ＤＮＡワクチンまたはポリペプチドワクチンである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ワクチン組成物は、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載のベクター、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項６０に記載のポリペプチド、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の組成物、またはその任意の組み合わせを含む、請求項９０、９１、９３、または９４に記載の方法。
【請求項９７】
インフルエンザウイルスに対するワクチンを産生するための方法であって、（ａ）請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップおよび（ｂ）前記宿主細胞からＭＶＡを単離するステップを含む、方法。
【請求項９８】
前記Ｍ２外部ドメインペプチドは、その間に介在するリンカーペプチドを有する、請求項１３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のネガティブセンスＲＮＡメンバーであり、ヒトおよび動物において疾患を引き起こす。インフルエンザ感染は、よくある感染であり、汎発流行になり得るまたは季節性のものとなり得る。インフルエンザ感染は、感染した個体の死亡にあまり至らないが、罹患すると重症となり得る。結果として、インフルエンザ流行病は実質的な経済的損失に至り得る。さらに、インフルエンザ感染は、心臓発作を起こしたことのある個体、Ｃ．Ａ．Ｒ．Ａ．患者、または高齢者などのような、ある種のグループの個体にとってより危険になり得る。
【０００２】
インフルエンザウイルスは、１）浜鳥および水鳥における異なる亜型のインフルエンザＡ型ウイルスの確立されたレザバーの存在；２）「抗原シフト」と称されるプロセスである、トリインフルエンザウイルスが他の動物（たとえばブタ）のインフルエンザウイルスと組換えを行う能力；３）「抗原ドリフト」と称されるプロセスである、ウイルスＲＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性の欠乏によって引き起こされるウイルス遺伝子産物における突然変異の蓄積、を含む因子の複雑なセットにより、再発性の様式で疾患を引き起こす（非特許文献１）。抗原シフト、抗原ドリフト、ならびにトリウイルスがブタおよびヒトなどのような他の宿主に感染する能力は、人において重症の疾患を引き起こし得る新規なウイルスをもたらす。これらの再集合および突然変異の事象は、組み合わさって、以前の感染またはワクチン接種の結果として誘発される免疫応答、特に中和抗体を回避するためのメカニズムをウイルスに提供する、ウイルスの２つの表面糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）、およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）における、十分に特徴付けられた抗原多様性を引き起こす（非特許文献２；非特許文献３；ならびに非特許文献４）。
【０００３】
ヒトの健康に対して世界的な影響を有する可能性がある特定のインフルエンザ亜型を予測するために、インフルエンザワクチン生産は、監視プログラムに依存しなければならない。不活性化または「スプリット」ビリオンから構成される、亜型と一致したワクチンを産生するために必要とされる時間は、典型的に、最低６〜８か月を必要とする。ウイルス亜型によって引き起こされる深刻なインフルエンザウイルス汎発流行に直面した際に、この遅延時間は、過度の罹患および死亡と共に、国内のまたは国際的な蔓延を可能にし得るであろう。そのため、インフルエンザウイルスの様々な亜型に有効なインフルエンザワクチンは、非常に望ましい。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、ウイルスを作製するための遺伝的な指示となる、一本鎖ＲＮＡの８つのセグメントを含有する。その表面は、２つの異なる糖タンパク質の層によって覆われている：一方は、分子赤血球凝集素（ＨＡ）から構成され、他方は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）から構成される。ウイルスカプシドは、ウイルスリボ核酸およびいくつかのいわゆる「内部」タンパク質（ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、ならびに核タンパク質（ＮＰ））で構成される。ＨＡおよびＮＡに対する抗体が、感染と戦う際に最も有効であることが従来証明されてきたので、多くの研究は、それらの分子の構造、機能、および遺伝的変異に集中してきた。
【０００５】
ＨＡおよびＮＡとは異なり、膜貫通ウイルスＭ２タンパク質の外部ドメイン（Ｍ２ｅ）は、高度に保存されており、このエピトープに対して向けられる抗体は、マウスを保護する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８）。Ｍ２タンパク質は、ウイルス感染細胞において形質膜で発現される、インフルエンザＡ型ウイルスの不可欠な膜タンパク質である。ウイルスにおけるタンパク質の低い存在量により、このエピトープに対して向けられる抗体応答の保護のメカニズムは、ウイルス中和を介して媒介されず、むしろ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性によって媒介される（非特許文献９）。
【０００６】
免疫応答を誘発するワクチンの開発に対する主な障害は、適した送達形式の選択である。単独でまたはともに使用されるＤＮＡプラスミドワクチンおよびウイルスベクターならびに組換えタンパク質またはペプチドは、論理的なワクチン送達形式である；しかしながら、形式はそれぞれ、長所および短所を有する。たとえば、ＤＮＡワクチンは、容易に産生され、投与するのに安全であるが、とりわけ臨床試験において、効力が不足しており、大（ミリグラム）用量の投与を必要とする。非特許文献１０。ワクチンを送達するためのウイルスベクターの使用は、通常、安全性およびベクターに対する先在する免疫に関連する問題を起こしてきた。そのため、安全で有効な新しいインフルエンザワクチンを開発するための多くの必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｌｌｉｓ，  Ｍ．およびＬ．  Ｄｉ  Ｔｒａｎｉ、Ｖｅｔ．  Ｊ．  １６４巻：２０２〜２１５頁（２００２年）
【非特許文献２】Ｐａｌｅｓｅ，  Ｐ．およびＪ．Ｆ．  Ｙｏｕｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５巻：１４６８〜１４７４頁
【非特許文献３】Ｇｏｒｍａｎ，  Ｏ．Ｔ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６巻：７５〜９７頁
【非特許文献４】ＹｅｗｄｅｌＬ  Ｊ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７９巻：２４６〜２４８頁
【非特許文献５】Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｊ．  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６４巻：１３７５〜１３７７頁（１９９０年）
【非特許文献６】Ｆｒａｃｅ，  Ａ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７巻：２２３７〜２２４４頁（１９９９年）
【非特許文献７】Ｗａｎｌｉ，  Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ９３巻：１３１〜１３６頁（２００４年）
【非特許文献８】Ｆａｎ，  Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２巻：２２９３〜３００３頁（２００４年）
【非特許文献９】Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２巻：５５９８〜５６０５頁（２００４年）
【非特許文献１０】Ｌｉｕ，  Ｍ．Ａ．  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ２５３巻：４０２〜４１０頁（２００３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドは、少なくとも５つのインフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質（Ｍ２）外部ドメインペプチドを含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のアミノ酸配列の任意の５つ以上を含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）．配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【０００９】
ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドの任意の３つ以上を含む、単離ポリヌクレオチドもまた、提供される：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下の６つのＭ２外部ドメインペプチドを含む、ポリペプチドをコードするコード領域を含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；および（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）または（ｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１−Ｓ）；（ｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｉｉ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｉｖ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｖ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｖｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）のアミノ酸配列。
【００１０】
ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、互いに対して任意の順序で配置される６つのＭ２外部ドメインペプチドを含むポリペプチド、少なくとも２つのＭ２外部ドメインペプチドの間に介在する少なくとも１つのリンカーペプチド、および必要に応じて、少なくとも２つのＭ２外部ドメインペプチドの間に介在するエピトープをコードする。エピトープは、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープとすることができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ベクターは、ウイルスベクター、たとえばワクシニアウイルスベクター、たとえば改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）とすることができる。本発明のベクターは、さらなるポリペプチド、たとえばインフルエンザタンパク質またはその断片をさらに発現することができる。さらなるインフルエンザタンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、およびその２つ以上の組み合わせから成る群から選択することができる。他の実施形態では、本発明は、ベクターおよびポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを含む宿主細胞である。
【００１２】
ポリヌクレオチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、宿主細胞、またはポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物もまた、含まれる。一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、さらなるインフルエンザワクチン組成物をさらに含む。さらなるインフルエンザワクチンは、インフルエンザタンパク質またはその断片を発現するＭＶＡを含むことができる。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、その必要のある被験体においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、組成物、またはその任意の組み合わせを当該被験体に投与するステップを含む方法を含む。その必要のある被験体においてインフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態の症状を治療する、予防する、または軽減するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、組成物、またはその任意の組み合わせを当該被験体に投与するステップを含む方法もまた、提供される。本発明はまた、その必要のある被験体においてインフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態によって引き起こされる症状を和らげるまたは改善させるための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、組成物、またはその任意の組み合わせを当該被験体に投与するステップを含む方法にも関する。他の実施形態では、本発明は、その必要のある被験体にインフルエンザウイルス感染に対してワクチン接種するための方法であって、同時にまたは任意の順序で、有効量のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、組成物、またはその任意の組み合わせを当該被験体に投与するステップを含む方法を含む。
【００１４】
本明細書において使用される配列識別名は、以下のとおりである。
配列番号１：システインを有するＭ２外部ドメイン＃１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号２：システインを有するＭ２外部ドメイン＃２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号３：システインを有するＭ２外部ドメイン＃３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号４：システインを有するＭ２外部ドメイン＃４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号５：システインを有するＭ２外部ドメイン＃５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号６：システインを有するＭ２外部ドメイン＃６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号７：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号８：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号９：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号１０：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号１１：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号１２：セリン置換を有するＭ２外部ドメイン＃６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）のアミノ酸配列
配列番号１３：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のマトリックス２（Ｍ２）タンパク質をコードする核酸配列
配列番号１４：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＭ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：ＭＥＴＲ＿Ｃポリペプチドをコードする核酸配列
配列番号１６：ＭＥＴＲ＿Ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１７：ＭＥＴＲ＿Ｓポリペプチドをコードする核酸配列
配列番号１８：ＭＥＴＲ＿Ｓポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１９：ＮＰコンセンサス配列をコードする核酸配列
配列番号２０：ＮＰコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号２１〜２５：リンカーペプチド
配列番号２６〜２７：Ｔ細胞エピトープ
配列番号２８：人工配列
配列番号２９〜３０：プロモーター
配列番号３１：転写終結シグナル
配列番号３２〜５０：プライマー
配列番号５１：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質をコードする核酸配列
配列番号５２：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質をコードするアミノ酸配列
配列番号５３：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＭ２タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸配列
配列番号５４：インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＭ２タンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号５５：ＭＥＴＲ＿Ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号５６：ＭＥＴＲ＿Ｓポリペプチドのアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、組換えベクターｖＥＭ０１１の模式的なベクターマップである。略語は、以下のとおりである：用語「ＡｍｐＲ」は、細菌における選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子を示す；用語「Ｆｌａｎｋ  １／Ｆｌａｎｋ  ２  Ｄｅｌ  ＩＩＩ」は、ＭＶＡゲノムの欠失部位ＩＩＩのフランキング領域に対して相同の配列を示す；用語「Ｐｓ」は、強力な合成プロモーターを意味する；ＢｓｄＲは、ブラストサイジン抵抗性をコードする遺伝子を意味する；用語「ＧＦＰ」は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を意味する；用語「Ｆ１  Ｄｅｌ３  ｒｐｔ」は、Ｆｌａｎｋ  １  Ｄｅｌ  ＩＩＩの後方の部分のリピートを示す；用語「ＬａｃＺ」は、細菌における検出のためのＥ．ｃｏｌｉ  Ｌａｃ  Ｚ遺伝子を意味する。
【図２】図２は、インフルエンザＡ型遺伝子を含有する組換えベクターの模式的なベクターマップを示す：（Ａ）ＮＰコンセンサス配列をコードするｖＥＭ４７；（Ｂ）Ｍ２外部ドメインタンデムリピート（ＭＥＴＲ＿Ｃ）ペプチドをコードするｖＥＭ５７；（Ｃ）Ｍ２外部ドメインタンデムリピートセリン置換（ＭＥＴＲ＿Ｓ）ペプチドをコードするｖＥＭ５８；（Ｄ）インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／３４の完全長マトリックス２ドメイン（Ｐｒ８Ｍ２）をコードするｖＥＭ６１；（Ｅ）インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／３４に由来するマトリックス２ドメインの膜貫通ドメイン（Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ）をコードするｖＥＭ６２；および（Ｆ）インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／３４の赤血球凝集素タンパク質（Ｐｒ８ＨＡ）をコードするｖＥＭ６５。
【図３】図３は、様々なＭＶＡｔｏｒのＰＣＲ産物を示す：（Ａ）ＭＶＡｔｏｒ−ＮＰコンセンサス（ｍＥＭ１０）；（Ｂ）ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｃ（ｍＥＭ１８）；（Ｃ）ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｓ（ｍＥＭ１９）；ならびに（Ｄ）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２（ｍＥＭ２２）、ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ（ｍＥＭ２３）、およびＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８ＨＡ（ｍＥＭ１７）。
【図４】図４は、例示的なＰＣＲ断片の模式的な図を示す。略語は、以下のとおりである：用語「Ｆｌａｎｋ１  Ｄｅｌ３」は、挿入部位欠失３のフランキング配列１を意味する；用語「Ｐｓ」は、強力な合成ワクシニアウイルスプロモーターを意味する；用語「インフルエンザ遺伝子」は、対象の遺伝子、つまり、それぞれ、ＨＡ、ＮＰ、Ｍ２ｅ、Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ、およびＭＥＴＲをコードする遺伝子を意味する；また、用語「Ｆｌａｎｋ２  Ｄｅｌ３」は、欠失３のフランキング配列２を示す。
【図５】図５は、様々なＭＶＡｔｏｒによって発現されるインフルエンザタンパク質のウエスタンブロット解析を示す：ＭＶＡｔｏｒ−ＮＰコンセンサス（ｍＥＭ１０）、ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｃ（ｍＥＭ１８）、およびＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｓ（ｍＥＭ１９）。
【図６】図６は、ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８ＨＡに感染したＣＥＦ細胞（ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８）、偽感染ＣＥＦ細胞、およびＭＶＡｔｏｒに感染したＣＥＦ細胞（ＭＶＡｔｏｒ）についての血球吸着アッセイ（ＨＡＤ）を示す。
【図７】図７は、ＣＥＦ細胞におけるＰｒ８Ｍ２の検出のためのイムノアッセイを示す：（Ａ）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２に感染した細胞；および（Ｂ）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬに感染した細胞。
【図８】図８は、インフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒを用いる免疫後の体重変化パーセントを示す：Ｐｒ８Ｍ２（灰色、大きな塗りつぶしの丸）、Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ（黒色、アスタリスク）、ＭＥＴＲ−Ｃ（灰色、小さな中空の丸）、ＭＥＴＲ−Ｓ（灰色、塗りつぶしの菱形）、ＮＰコンセンサス（黒色、塗りつぶしの三角）、ＭＶＡｔｏｒ（黒色、大きな中空の丸）、およびＰＢＳ（黒色、塗りつぶしの小さな丸）。
【図９】図９は、免疫マウスにおけるウイルス負荷を示す。群当たり４匹のマウスのそれぞれからの肺重量は、肺重量当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を表わすために得た。
【図１０】図１０は、マウスＩｇＧ抗Ｍ２ｅ抗体（１４Ｃ２）を使用する、ＭＶＡワクチンを用いて免疫したマウス由来の血清のＥＬＩＳＡを示す。実験において使用したＭ２ｅペプチド（Ｍ２ｅ＃１（第４列）、Ｍ２ｅ＃４（第３列）、Ｍ２ｅ＃５（第２列）、およびＭ２ｅ＃６（第１列））を表１に示す。
【図１１】図１１は、鼻腔内（ＩＮ）送達（図１１Ａ）および筋肉内（ＩＭ）送達（図１１Ｂ）によってＭＶＡワクチンを用いて免疫したマウスの体重損失を示す。
【図１２】図１２は、鼻腔内送達（左側のバー）および筋肉内送達（右側のバー）によってＭＶＡワクチンを用いて免疫したマウスにおけるウイルス負荷を示す。
【図１３】図１３は、インフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒを用いる免疫後のマウスにおける体重変化パーセントを示す：ＨＡ（灰色、塗りつぶしの正方形）、ＮＰ（灰色、塗りつぶしの三角）、Ｍ２（灰色、塗りつぶしの菱形）、およびＭ２＋ＮＰ（灰色、アスタリスク）ならびに対照：ＭＶＡｔｏｒ（黒色、塗りつぶしの菱形）および非致死的Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８（黒色、塗りつぶしの丸）。
【図１４】図１４は、４２日目（抗原投与前）の血清を使用する、１ｄ２１  ＭＶＡ、２ｄ２１  ＭＶＡ、１ｄ２１  ＭＶＡ＋ＮＰ、２ｄ２１  ＭＶＡ＋ＮＰ、１ｄ２１  ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ＋ＭＶＡ−ＮＰ、２ｄ２１  ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ＋ＭＶＡ−ＮＰ、１ｄ２１非致死的Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８、および２ｄ２１非致死的Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８ＭＶＡを用いて免疫したマウスについての抗ＮＰ（ＩｇＧ抗ＮＰ）免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図１５】図１５は、Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８ウイルスを用いる抗原投与後の２日目（左側のバー）および４日目（右側のバー）の、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＨＡ、ＭＶＡ−ＮＰ、ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ、ＭＶＡ−Ｍ２ｅ＋ＮＰ、およびＡ／ＰＲ  ８／３４を用いて免疫したマウスにおけるウイルス負荷を示す。マウスのそれぞれからの肺重量は、肺重量当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を表わすために得た。
【図１６Ａ】図１６Ａは、インフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒを用いる免疫後の体重変化パーセントを示す：ＭＶＡ−ＰＲ８ＨＡ（黒色、小さな塗りつぶしの菱形）およびＭＶＡ−ＰＲ８−Ｍ２＋ＮＰ（黒色、塗りつぶしの正方形）、およびＭＶＡ−ＰＲ８−Ｃ＋ＮＰ（灰色、大きな塗りつぶしの菱形）ならびに対照：ＰＢＳ（黒色、三角）。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、表９において示されるすべてのインフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒおよび陰性対照を用いる免疫後の体重変化パーセントを示す。
【図１７】図１７は、４２日目（抗原投与前）の血清を使用する、ＣｏｎｓＮＰ、ＰＲ９Ｍ２＋ＣｏｎｓＮＰ、ＰＲ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ＋ＣｏｎｓＮＰ、ＭＥＴＲ−Ｃ＋ＣｏｎｓＮＰ、およびＭＥＴＲ−Ｓ＋ＣｏｎｓＮＰを用いて免疫したマウスについての抗ＮＰ（ＩｇＧ抗ＮＰ）免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図１８】図１８は、４２日目（抗原投与前）の血清を使用する、Ｍ２、Ｍ２−ＴＭＬ、ＭＥＴＲ−Ｃ、ＭＥＴＲ−Ｓ、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ２−ＴＭＬ＋ＮＰ、ＭＥＴＲ−Ｃ＋ＮＰ、およびＭＥＴＲ−Ｓ＋ＮＰを用いて免疫したマウスについての抗Ｍ２（ＩｇＧ抗Ｍ２ｅペプチド）免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図１９】図１９は、Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８ウイルスを用いる抗原投与後の３日目の、鼻腔内で（左側のバー）または筋肉内で（右側のバー）、ＰＢＳ（ＩＮ）、ＭＶＡｔｏｒ、ＮＰ、Ｍ２、Ｍ２ｅ−ＴＭＬ、ＭＥＴＲ−Ｃ、ＭＥＴＲ−Ｓ、ＨＡ、および致死量以下のＰＲ８（ＩＮ）を用いて免疫したマウスの肺におけるウイルス負荷を示す。マウスのそれぞれからの肺重量は、肺重量当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を表わすために得た。
【図２０Ａ】図２０Ａは、インフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒを用いる免疫後の体重変化パーセントを示す：Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲ−Ｃ（黒色、塗りつぶしの正方形）、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２（灰色、白抜きの三角）、Ｍ２＋ＮＰ（灰色、Ｘ）、Ｍ１（黒色、アスタリスク）、およびＭ１＋ＮＰ（灰色、塗りつぶしの丸）ならびに対照：Ｆｌｕｌａｖａｌ（黒色、塗りつぶしの菱形）、ＭＶＡｔｏｒ（黒色、小さな塗りつぶしの正方形）、およびＰＢＳ（黒色、塗りつぶしの三角）。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、インフルエンザタンパク質を発現するＭＶＡｔｏｒを用いて免疫したマウスについての生存パーセントデータを示す：Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲ−Ｃ（灰色、塗りつぶしの正方形）、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２（灰色、白抜きの三角）、Ｍ２＋ＮＰ（灰色、Ｘ）、Ｍ１（黒色、アスタリスク）、およびＭ１＋ＮＰ（灰色、塗りつぶしの丸）ならびに対照：Ｆｌｕｌａｖａｌ（黒色、白抜きの菱形）、ＭＶＡｔｏｒ（黒色、塗りつぶしの正方形）、およびＰＢＳ（黒色、塗りつぶしの菱形）。
【図２１】図２１は、３９日目（抗原投与前）の血清を使用する、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて免疫したマウスについての抗ＮＰ（左側半分）および抗Ｍ２（右側部分）免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。水平線は、群平均値を示す。ＩｇＧ抗Ｍ２レベルは、Ｍ１処理群について評価しなかった。
【図２２Ａ】図２２Ａは、３９日目（抗原投与前）からの血清を使用する、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて免疫したマウスについての抗Ｍ１免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。水平線は、群平均値を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、２１日目（１回目の免疫後）（左側半分）および３９日目（抗原投与前）（右側部分）からの血清を使用する、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、およびＭ１＋ＮＰを用いて免疫したマウスについての抗ＭＶＡ免疫応答を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。水平線は、群平均値を示す。
【図２３】図２３は、ｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９ウイルスを用いる抗原投与後の２日目（左側のバー）または４日目（右側のバー）の、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて免疫したマウスの肺におけるウイルス負荷を示す。
【図２４】図２４は、ｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９ウイルスを用いる抗原投与後の２日目（左側のバー）または４日目（右側のバー）の、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて免疫したマウスの鼻甲介におけるウイルス負荷を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、インフルエンザマトリックス２タンパク質外部ドメインの複数のコピーをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター（たとえばＭＶＡ）、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および関連する組成物ならびにインフルエンザウイルス感染を予防するまたは治療するためにポリヌクレオチド、ベクター（たとえばＭＶＡ）、ポリペプチド、または組成物を投与するための方法を提供する。
【００１７】
本発明を作製するおよび使用するための方法は、分子生物学、微生物学、免疫学、およびワクチン接種の通常の技術をすべて含む。そのような技術は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）および第３版（２００１年）；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１〜２５巻（Ｊ．  Ｋ．  Ｓｅｔｌｏｗ編、１９８８年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．  Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  １９８６年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、とりわけ１５４および１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編  １９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９８７年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６年）を含むが、これらに限定されない文献において記載されている。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓおよびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９７年）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）。
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」要素は、１つ以上のその要素を指すことに注意されたい、たとえば、「ポリヌクレオチド」は、１つ以上のポリヌクレオチドを示すことが理解される。そのため、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００１８】
本明細書において使用されるように、用語「単離」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体および修飾ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）が、それが天然に関連する他の生物学的物質から取り出されていることを意味する。単離ポリヌクレオチドの例は、ベクター中に含有される組換えポリヌクレオチドである。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製（部分的にもしくは実質的に）ポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるそのような分子をさらに含む。
【００１９】
本明細書において使用されるように、用語「単離ウイルス」は、ウイルス、その誘導体、または変異体が、それが天然に関連する他の生物学的物質から取り出されているまたは天然に存在しない物質を含むように組換えで操作されていることを意味する。単離ウイルスの例は、ウイルスゲノム中に組換えで挿入された、異なる種由来のポリヌクレオチドを含有するウイルスである。単離ウイルスのさらなる例は、宿主細胞において維持される異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスまたは溶液中の精製（部分的にもしくは実質的に）ウイルスを含む。
【００２０】
本明細書において使用されるように、用語「精製」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ウイルス、またはその断片、変異体、もしくは誘導体が、それが天然に関連する他の生物学的物質が実質的にないまたはたとえば、本発明のウイルスを複製するために遺伝子的に操作されている組換え宿主細胞に由来する他の生物学的物質がないことを意味する。たとえば、本発明の精製ウイルスは、少なくとも７０〜１００％純粋であるウイルス、つまり、ウイルスが全組成物の重量の７０〜１００％を構成する組成物の中に存在するウイルスを含む。いくつかの実施形態では、本発明の精製ウイルスは、７５％〜９９重量％純粋である、８０％〜９９重量％純粋である、９０〜９９重量％純粋である、または９５％〜９９重量％純粋である。本発明のウイルスの純度の相対的な程度は、周知の方法によって容易に決定される。
【００２１】
用語「核酸」、「ヌクレオチド」、または「核酸断片」は、ポリヌクレオチドまたは構築物中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、たとえばＤＮＡもしくはＲＮＡ断片を指す。本発明の２つ以上の核酸は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、たとえば単一のプラスミド上にまたは別々の（同一でない）ポリヌクレオチド構築物中に、たとえば別々のプラスミド上に存在することができる。さらに、任意の核酸または核酸断片はまた、単一のポリペプチド、たとえば単一の抗原、サイトカイン、調節性ポリペプチドをコードしてもよいまたは１つを超えるポリペプチドをコードしてもよい、たとえば、核酸は、２つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、核酸は、プロモーターまたは転写ターミネーターなどのような調節性エレメントをコードしてもよいまたは分泌シグナルペプチドまたは機能的ドメインなどのようなポリペプチドまたはタンパク質の特殊なエレメントまたはモチーフをコードしてもよい。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾変異体（たとえば縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明確に示される配列をも、暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択される（またはすべての）コドンのうちの第３の位置が、さまざまな塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されている配列を生成することによって達成されてもよい（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９巻：５０８１頁；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０巻：２６０５〜２６０８頁；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４年）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８巻：９１〜９８頁）。核酸という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、またはｐＤＮＡの誘導体（たとえば、（Ｄａｒｑｕｅｔ，  Ａ−Ｍら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４巻：１３４１〜１３４９頁（１９９７年）において記載されるミニサークル）を包含する。核酸は、直線状（たとえばｍＲＮＡ）、環状（たとえばプラスミド）、または分岐形態および二本鎖または一本鎖形態で提供されてもよい。核酸は、通常のホスホジエステル結合または通常でない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるなどのアミド結合）を含んでいてもよい。核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、および遺伝子という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００２２】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸または核酸断片および複数の核酸または核酸断片を包含するように意図され、ポリヌクレオチドを含む単離分子または構築物、たとえばウイルスのゲノム（たとえば非感染性ウイルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、またはｐＤＮＡの誘導体（たとえば、（Ｄａｒｑｕｅｔ，  Ａ−Ｍら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４巻：１３４１〜１３４９頁（１９９７年）において記載されるミニサークル）を指す。ポリヌクレオチドは、直線状（たとえばｍＲＮＡ）、環状（たとえばプラスミド）、または分岐形態および二本鎖または一本鎖形態で提供されてもよい。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または通常でない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるなどのアミド結合）を含んでいてもよい。
【００２３】
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を含む。したがって、本明細書において使用されるように、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語を含むが、これらに限定されない用語は、「ポリペプチド」の定義において含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと互換的に使用されてもよい。用語は、翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基もしくは遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を受けているポリペプチドをさらに含む。
【００２４】
「コドン最適化」は、天然の配列の少なくとも１つの、１つを超える、またはかなりの数のコドンをその宿主の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと交換することによる、特定の宿主細胞における発現の増強のための核酸配列の修飾として本明細書において定義される。様々な種は、特定のアミノ酸のある種のコドンについて特定のバイアスを示す。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「さらなる」は、主題の生物学的構成成分と同一でない任意の生物学的構成成分を指す。さらなる構成成分は、宿主細胞、ウイルス、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはプロモーターなどのような調節性領域であってもよい。主題の構成成分は、必要に応じて、インフルエンザウイルス、ＭＶＡ、Ｍ２外部ドメインペプチド、またはＭ２外部ドメインをコードするポリヌクレオチドに由来し得ることが認識される。たとえば、インフルエンザウイルス由来のＭ２外部ドメイン遺伝子の「さらなるポリヌクレオチド」または「さらなる核酸」または「さらなる遺伝子」または「さらなる配列」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、異なるウイルス（たとえばサイトメガロウイルス）由来のプロモーターまたは同じインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素とすることができる。インフルエンザウイルス由来のＭ２外部ドメインの「さらなるポリペプチド」、「さらなるアミノ酸配列」、「さらなる抗原」、または「さらなるタンパク質」という用語は、Ｈｉｓタグまたは任意のインフルエンザウイルスポリペプチド、その断片、変異体、誘導体、または類似体とすることができる。ある実施形態では、さらなるポリペプチドは、インフルエンザポリペプチド、その断片、変異体、誘導体、または類似体であってもよい。他の実施形態では、さらなるポリペプチドは、Ｍ２外部ドメインポリペプチド、その断片、誘導体、変異体、または類似体であってもよい。
【００２６】
本明細書において使用される用語「インフルエンザポリペプチド」または「インフルエンザ抗原」は、インフルエンザウイルス中に存在する任意の完全長もしくは成熟ポリペプチド、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの他の変異体、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの断片、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの断片の血清型変異体、対立遺伝子変異体、および他の変異体、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの誘導体、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの断片の誘導体、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの類似体、インフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの断片の類似体、ならびにインフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドを含むキメラポリペプチドおよび融合ポリペプチド、またはインフルエンザウイルス中に存在する完全長もしくは成熟ポリペプチドの１つもしくは複数の断片を包含する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、または１つもしくは複数のＲＮＡポリメラーゼサブユニット、つまりＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２である。
【００２７】
本発明に従う一実施形態では、インフルエンザウイルスポリペプチドは、インフルエンザＨＡタンパク質、その断片、変異体、誘導体、または類似体、たとえば、公知のＨＡ配列、たとえば配列番号５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ポリペプチドは、ＨＡ配列に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＨＡ配列は、ＨＡもしくは細胞外（ＥＣＤ）ドメイン（ＨＡ１およびＨＡ２）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ならびに細胞質内（ＣＹＴ）ドメインから本質的に成る完全長ＨＡタンパク質；またはＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片；またはＨＡ１、ＨＡ２、およびＴＭドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片；またはＣＹＴドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片；またはＴＭドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片；またはＨＡ１ドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片；またはＨＡ２ドメインから本質的に成る全ＨＡタンパク質の断片であってもよい。ＨＡ配列はまた、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位を含んでいてもよい。ＨＡ１／ＨＡ２切断部位は、好ましくは、ＨＡ１およびＨＡ２配列の間に位置するが、また、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド構築物の他の配列に関して任意の順序で配置することもできる。インフルエンザＨＡ配列は、病原性ウイルス株由来のものであってもよい。
【００２８】
他の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）配列、その断片、変異体、誘導体、または類似体、たとえば、公知のＮＰポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであり、当該ポリペプチドは、ＮＰポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識可能である。他の実施形態では、インフルエンザＮＰ配列は、ＮＰコンセンサス配列、たとえば配列番号２０を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
【００２９】
インフルエンザポリペプチドは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、その断片、変異体、誘導体、または類似体とすることができる。インフルエンザウイルスのエンベロープ上に位置するＮＡタンパク質は、ウイルスおよび細胞性複合糖質からの末端シアル酸残基の除去を触媒することが公知である。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＮＡタンパク質は、４５４アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１６０．１を有する。ＮＡタンパク質は、細胞質ドメイン（アミノ酸１〜６）、膜貫通ドメイン（アミノ酸７〜３５）、および細胞外ドメイン（アミノ酸３６〜４５４）から成る。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、ＮＡタンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＮＡ配列は、ＮＡから本質的に成る完全長ＮＡタンパク質であってもよい。ＮＡ配列は、ＮＡ配列の細胞外ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、または細胞質内（ＣＹＴ）ドメインを含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。インフルエンザＮＡ配列は、病原性ウイルス株由来のものであってもよい。
【００３０】
インフルエンザポリペプチドは、マトリックス１（Ｍ１）タンパク質、その断片、変異体、誘導体、または類似体とすることができる。マトリックス１タンパク質は、ウイルス複製において重大な役割を果たす。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＭ１は、２５２アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１６１．１を有する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザＭ１配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。Ｍ１配列は、ＮＡ配列の断片を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。
【００３１】
他の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、非構造（ＮＳ）タンパク質、その断片、変異体、誘導体、または類似体とすることができる。非構造タンパク質（ＮＳ）は、細胞性プレｍＲＮＡの３’末端プロセシングに必要とされる２つの細胞性タンパク質：３０ｋＤａ切断ポリアデニル化特異因子（ＣＰＳＦ４）およびポリ（Ａ）−結合タンパク質２（ＰＡＢＰＮ１）に結合し、阻害することよって、細胞性プレｍＲＮＡの転写後プロセシングを阻害する。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＮＳタンパク質は、２３０アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１６３．１を有する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザＮＳ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、ＮＳタンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＮＳ配列は、ＮＳ配列の断片を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、ＲＮＡポリメラーゼＰＡ（ポリメラーゼ酸性タンパク質）サブユニット、その断片、変異体、誘導体、または類似体である。ＰＡポリペプチドは、ウイルスＲＮＡ合成において伸長因子活性を示す。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＰＡタンパク質は、７１６アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１５７．１を有する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザＰＡ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、ＰＡタンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＰＡ配列は、ＰＡ配列の断片を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。
【００３３】
ある実施形態では、本明細書において使用されるインフルエンザポリペプチドは、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）サブユニット、その断片、変異体、誘導体、または類似体である。ＰＢ１タンパク質は、ウイルスセグメントの複製および転写を担う。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＰＢ１タンパク質は、７５７アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１５６．１を有する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザＰＢ１配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、ＰＢ１タンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＰＢ１配列は、ＰＢ１配列の断片を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。
【００３４】
さらに他の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２（ポリメラーゼ塩基性タンパク質２）サブユニット、その断片、変異体、誘導体、または類似体とすることができる。ＰＢ２タンパク質は、転写開始および細胞性ｃａｐプレｍＲＮＡがウイルス転写のためのプライマーを生成するために使用されるｃａｐスティーリング（ｃａｐ−ｓｔｅａｌｉｎｇ）メカニズムに関与する。インフルエンザウイルスＡ型／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＰＢ２は、７５９アミノ酸およびその全体が参照によって本明細書において組み込まれるＧｅｎｂａｎｋにおける受託番号ＡＡＭ７５１５５．１を有する。インフルエンザポリペプチドの非限定的な例は、公知のインフルエンザＰＢ２配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれから成り、またはそれから成り、ポリペプチドは、ＰＢ２タンパク質に特異的に結合する抗体によって認識可能である。ＰＢ２配列は、ＰＢ２配列の断片を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリペプチドであってもよい。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部と考えられてもよい、しかし、いかなるフランキング配列、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、および同種のものも、コード領域の外側にある。
【００３６】
用語「断片」、「アナログ」、「誘導体」、または「変異体」は、インフルエンザポリペプチドについて言及する場合、天然に存在するインフルエンザタンパク質の少なくともいくらかの免疫原性または抗原性を保持するあらゆるポリペプチドを含む。本発明のインフルエンザポリペプチドの断片は、タンパク質分解性断片、欠失断片、および特に、発現、精製、および  または動物への投与の間に溶解性の増加を示すインフルエンザポリペプチドの断片を含む。インフルエンザポリペプチドの断片は、被験体に送達される場合に病原性の低下を示すタンパク質分解性断片または欠失断片をさらに含む。ポリペプチド断片は、直線状および三次元エピトープを含む、天然のポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドのあらゆる部分をさらに含む。
【００３７】
ポリペプチド抗原の「エピトープ断片」は、エピトープを含有する抗原の一部である。「エピトープ断片」は、１つ以上のエピトープに加えてアミノ酸配列を含有してもよいが、含有する必要はない。
【００３８】
本明細書において使用される用語「変異体」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および／または修飾により列挙されるポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。亜型変異体などのような変異体は、天然に存在してもよい。用語「亜型変異体」は、ヒトＡ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ニワトリ／ＨＫ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）、ブタＡ／ブタ／香港／１０／９８（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ＦＰＶ／ロストック／３４（Ｈ７Ｎ１）、トリＡ／シチメンチョウ／イタリア／４６２０／９９（Ｈ７Ｎ１）、トリＡ／ＦＰＶ／ウェイブリッジ／３４（Ｈ７Ｎ７）、ヒトＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１／６８（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／滋賀／２５／９７（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／レニングラード／１３４／５７（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／アナーバー／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／ブレビグミッション／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ブタＡ／ブタ／ウィスコンシン／４６４／９８（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／オランダ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）およびヒトＡ／ワイオミング／３／２００３（Ｈ３Ｎ２）を含むがこれらに限定されない、異なるインフルエンザウイルス亜型において存在する、意図されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。亜型変異体は、天然に存在する変異体であるが、それはまた、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して産生することができる。
【００３９】
天然に存在しない変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して産生されてもよい。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、５つのアミノ酸またはそれ以下の置換、欠失、または追加によって、同定される配列と異なる。そのような変異体は、一般に、たとえば、本明細書において記載される代表的な手順を使用して、ポリペプチド配列を修飾し、修飾ポリペプチドの抗原性特性を評価することによって同定されてもよい。
【００４０】
ポリペプチド変異体は、同定されるポリペプチドと、少なくとも約６０〜７０％、たとえば７５％、８０％、８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を示す。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または追加を含んでいてもよい。ポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドについて見出されないさらなる特徴を示すように改変されているポリペプチドである。例として、融合タンパク質を含む。アナログは、本発明のポリペプチドの他の形態である。例として、活性成熟ポリペプチドを産生するためにプロタンパク質の切断によって活性化することができるプロタンパク質である。
【００４１】
変異体はまたまたはその代わりに、他の修飾を含有してもよく、それによって、たとえば、ポリペプチドは、さらなるポリペプチド、たとえば、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の移行を指示する、タンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列にコンジュゲートされてもよいまたは連結されてもよい、たとえば融合されてもよい。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製、もしくは同定の容易性のために（たとえば６−Ｈｉｓ）または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するためにリンカーまたは他の配列にコンジュゲートされてもよいまたはそれに連結されて、産生されてもよい。たとえば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域にコンジュゲートされてもよいまたは連結されてもよい。ポリペプチドはまた、ポリペプチドに対する免疫応答を付与するもしくは調整する（たとえばＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカインなど）ならびに／または抗原提示細胞もしくは他の免疫系細胞によるポリペプチドの取り込みおよび／もしくはプロセシングを増強する配列にコンジュゲートされてもよいまたは連結されてもよい。ポリペプチドはまた、単独でまたは様々なアジュバントと組み合わせて他の病原性生物に対する防御免疫を誘発することができるハイブリッド免疫原性タンパク質を生成するために、インフルエンザウイルス由来のならびに／または他の細菌および／もしくは他のウイルス由来の他のポリペプチド／エピトープにコンジュゲートされてもよいまたは連結されてもよい。
【００４２】
本明細書において使用される用語「配列同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列の間のまたは２つ以上のポリペプチド配列の間の関係を指す。一方の配列における位置が、比較配列（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の対応する位置における同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められる場合、配列は、その位置で「同一である」と表現される。「配列同一性」パーセンテージは、「同一の」位置の数を得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定することによって、計算される。次いで、「同一の」位置の数は、比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、「配列同一性」のパーセンテージを得るために１００を掛ける。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウに関して２つの最適にアライメントされた配列の比較によって決定される。比較のために配列を最適にアライメントするために、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、ギャップと称される追加または欠失を含んでいてもよいが、参照配列は、一定に保たれる。最適なアライメントは、ギャップを有していても、参照および比較配列の間で最大限の数の「同一の」位置をもたらすアライメントである。「配列同一性」および「同一」という用語は、本明細書において互換的に使用される。したがって、「配列同一性」のパーセンテージを共有する配列は、その同じパーセンテージが「同一」であることが理解される。２つの配列の間の「配列同一性」パーセンテージは、２００４年９月１日の時点でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能であったプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを使用して決定することができ、このプログラムは、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）およびＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列比較用）を組み込んでおり、このプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻（１２号）：５８７３〜５８７７頁、１９９３年）のアルゴリズムに基づく。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用する場合、２００４年９月１日の時点でデフォルトパラメーターであったパラメーターは、ワードサイズ（３）、オープンギャップペナルティー（１１）、エクステンションギャップペナルティー（１）、ギャップドロップオフ（５０）、期待値（１０）、およびマトリックスオプションを含むが、これらに限定されない任意の他の必要とされるパラメーターについて使用することができる。
【００４３】
本明細書において使用される用語「エピトープ」は、動物、たとえば哺乳動物、たとえばヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの一部を指す。本明細書において使用される「免疫原性エピトープ」は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定されるように、動物において免疫応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。本明細書において使用される用語「抗原性エピトープ」は、抗体またはＴ細胞受容体が、当技術分野において周知の任意の方法によって決定されるように、その抗原に免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）結合することができるタンパク質の一部として定義される。免疫特異的な結合は、非特異的な結合を除くが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除くものではない。免疫原性エピトープはすべて抗原性であるが、抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。
【００４４】
「有効量」は、単一の用量でのまたは一連の一部としての個体への投与の量が治療または予防に有効である量である。量は、たとえば、感染インフルエンザウイルスを用いる抗原投与の２週間後に決定されるように、その投与が未治療個体に比べてインフルエンザ感染の発生率の低下をもたらす場合、有効である。この量は、治療されることとなる個体の健康状態および身体状況、治療されることとなる個体の分類群（たとえばヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の応答性能力、所望される保護の程度、ワクチンの製剤、医学的状況の専門家的な評価、ならびに他の関連する因子に依存して変動する。有効量は、ルーチン的な試みを通して決定することができる比較的広範囲にあるであろうということが期待される。典型的に、単一の用量は、約１０μｇ〜１０ｍｇのＭＶＡ／体重ｋｇまたは同等量の組換え発現インフルエンザポリペプチドを提供するのに十分である、修飾キャリア生物または宿主細胞の量である。
【００４５】
用語「被験体」は、診断、予後、免疫、または療法が所望される任意の被験体、特に哺乳動物の被験体を意味する。哺乳動物の被験体は、ヒト、家畜、農場用の動物、クマなどのような動物園の動物、スポーツ用の動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、雌ウシなどのようなペット動物；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどのような霊長類；イヌおよびオオカミなどのようなイヌ科の動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのようなネコ科の動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのようなウマ科の動物；雌ウシ、ブタ、およびヒツジなどのような食用動物；シカおよびキリンなどのような有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのようなげっ歯動物などを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、動物は、ヒト被験体である。
【００４６】
用語「動物」は、単数の「動物」および複数の「動物」を包含するように意図され、哺乳動物および鳥ならびに魚、爬虫類動物、および両生動物を含む。動物という用語はまた、モデル動物、たとえば疾患モデル動物をも包含する。いくつかの実施形態では、動物という用語は、経済的にまたはその他に有益な動物、たとえば経済的に重要な種畜、レース用動物、ショー用動物、家宝の動物、稀なもしくは絶滅の危機に瀕した動物、またはコンパニオンアニマルを含む。特に、哺乳動物は、ヒト被験体、食用動物、またはコンパニオンアニマルとすることができる。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「その必要のある被験体」は、インフルエンザ感染の重症度を治療する、つまり、予防する、治癒する、遅延させる、もしくは軽減する、および／または特定される期間にわたりインフルエンザ感染の症状の悪化をもたらさないことが望ましい個体を指す。
【００４８】
用語「初回刺激する」または「初回刺激」または「初回刺激の（ｐｒｉｍａｒｙ）」および「追加免疫する」または「追加免疫」は、つまり、これらの用語が免疫学において通常有する定義に従って、それぞれ、最初のおよび続く免疫を指すために本明細書において使用される。しかしながら、ある実施形態では、たとえば、初回刺激構成成分および追加免疫構成成分が単一の製剤中にある場合、「初回刺激」および「追加免疫」組成物の両方が同時に投与されるので、最初のおよび続く免疫処置は、必要でなくてもよい。
【００４９】
用語「受動免疫」は、宿主動物が発達させる、抗原に対する免疫を指し、宿主動物は、抗原に対するそれ自体の抗体を産生するのではなく、他の動物によって産生される抗体を与えられる。用語「能動免疫」は、標的抗原の存在の結果としての宿主動物による抗体の産生を指す。
【００５０】
本明細書において使用されるように、「免疫応答」は、これらに限定されないが、抗体および／またはＴ細胞の産生によって一般に特徴付けられる、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、弱毒化されたポックスウイルス、たとえばＭＶＡ、または組成物の導入に対するレシピエントにおける応答を指す。一般に、免疫応答は、インフルエンザＭ２外部ドメインもしくはＭ２外部ドメインタンデムリピート（ＭＥＴＲ）に対して特異的な、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞またはその両方の誘発または活性化などのような細胞性応答、インフルエンザＭ２外部ドメイン特異的もしくはＭＥＴＲ特異的抗体の産生の増加についての体液性応答、または細胞性および体液性応答の両方であってもよい。本発明のＭＶＡを含むワクチンによって確立される免疫応答は、ＭＶＡが宿主細胞に入った後に、宿主細胞によって発現されるタンパク質に対する応答を含むが、これらに限定されない。本発明では、感染生物（たとえばインフルエンザＡ型ウイルス）による続く抗原投与に際して、免疫応答は、インフルエンザウイルス粒子の形成または発達を予防する。免疫応答はまた、粘膜応答、たとえば粘膜抗体応答、たとえばＳ−ＩｇＡ産生または粘膜細胞媒介性応答、たとえばＴ細胞応答を含むことができる。
【００５１】
本明細書において使用される「ワクチン」は、賦形剤、アジュバント、添加剤、および／または保護剤と組み合わせて免疫原性作用物質および薬学的に許容される希釈剤を含む組成物である。免疫原は、全感染病原体または感染病原体の分子的サブセット（限定を伴うことなくポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、合成的にまたは組換えで感染病原体によって産生される）で構成されてもよい。たとえば、本明細書において使用される「ＭＶＡワクチン」は、賦形剤、アジュバント、添加剤、および／または保護剤と組み合わせて、Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピー（たとえばＭ２ｅタンデムリピート）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む単離ＭＶＡおよび薬学的に許容される希釈剤を含む組成物を意味する。ワクチンが被験体に投与される場合、免疫原は、感染病原体を用いる続く抗原投与に際して、病気から被験体を保護するであろうまたはその作用物質によって引き起こされる病態、症状、もしくは臨床症状を軽減するであろう免疫応答を刺激する。本発明によるワクチンは、治療用のまたは予防用のものとすることができる。治療用（治療）ワクチンは、感染後に与えられ、疾患進行を軽減するまたは阻止するように意図される。予防（予防用）ワクチンは、最初の感染を予防するまたは感染の負荷を軽減するように意図される。インフルエンザ関連性疾患に対するワクチンにおいて使用される作用物質は、弱毒化されたインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルスと関連する、精製されたもしくは人工的に製造された分子、たとえば組換えタンパク質、合成ペプチド、ＤＮＡプラスミド、およびインフルエンザタンパク質を発現する組換えウイルスもしくは細菌であってもよい。ワクチンは、当業者らによって容易に理解されるように、賦形剤、希釈剤、担体、保存剤、アジュバント、もしくは他の免疫賦活薬またはその組み合わせなどのような他の構成成分をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
多価ワクチンは、２つ以上のポックスウイルス、たとえばＭＶＡから調製される任意のワクチンを指し、それらのそれぞれは、異なる抗原、たとえば異なるインフルエンザ抗原を発現する。その代わりに、多価ワクチンは、単一の単離ポックスウイルス、たとえば２つ以上の抗原、たとえば同一でないインフルエンザ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＭＶＡを含む。２つ以上の抗原、たとえばインフルエンザ抗原は、同じポリペプチドに由来してもよいが、交差反応性でない免疫応答を誘発してもよい、異なるエピトープを含有してもよい。
【００５３】
本明細書において使用される用語「免疫原性担体」は、第２のポリペプチド、たとえば抗原性エピトープまたはその断片、変異体、もしくは誘導体の免疫原性を増強する、第１のポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を指す。
【００５４】
用語「アジュバント」は、（１）特定の抗原に対する免疫応答を改変するもしくは増加させるまたは（２）薬理学的作用物質の効果を増加させるもしくは支援する能力を有する任意の物質を指す。本明細書において使用されるように、本発明のＭＶＡの発現、抗原性、または免疫原性を増加させてもよい任意の化合物は、効力のあるアジュバントである。いくつかの実施形態では、アジュバントという用語は、ＴＬＲ刺激アジュバントを指し、ＴＬＲアジュバントは、ＴＬＲ受容体（たとえばＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３）を刺激する化合物を含み、本発明のワクチン組成物に対する免疫系応答の増加をもたらす。ＴＬＲアジュバントは、ＣｐＧおよびＭＰＬを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書において使用される用語「弱毒化する」は、感染病原体、たとえばポックスウイルス、たとえばＭＶＡが、少なくとも１つの宿主細胞、たとえば任意の哺乳動物細胞、たとえば任意のヒト細胞において複製することができないようにすることを含む。弱毒化されたＭＶＡはなお、ある種の哺乳動物細胞、たとえばＢＳ−Ｃ−１およびＣＶ−１細胞において複製するための限られた能力を有していてもよい。ある種の哺乳動物細胞において複製能力がないが、ＭＶＡはなお、他の哺乳動物細胞（たとえばＢＨＫ−２１細胞）およびトリ細胞、たとえば初代または不死化ヒヨコ細胞またはアヒル細胞、たとえばＡＧＥ１ｃｒ、ＡＧＥ１ｃｒ．ｐＩＸ、またはＥＢ６６（登録商標）において複製するための完全な能力を保持していてもよい。弱毒化されたＭＶＡの細胞複製サイクルは、その生活環の任意の段階において遮断されてもよい。たとえば、弱毒化されたＭＶＡは、新しいウイルスが生成され、放出されるのを予防する、後期段階において遮断された細胞複製サイクルを有する。本明細書において使用される用語「複製する」または「複製」は、ウイルス生活環のいくつかの部分、たとえば、ウイルス遺伝子産物の転写および翻訳ならびに核酸複製を通して進行するための能力ならびにまた、いくつかの実例では、成熟感染ビリオンを産生し、または発達させる能力を指す。
【００５６】
ポリヌクレオチド
本発明は、インフルエンザウイルスに対して免疫応答を誘発するための、インフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質の外部ドメインの複数のコピーを含むポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００５７】
インフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質（「Ｍ２」）は、プロトン選択的イオンチャネルタンパク質であり、これは、インフルエンザＡ型ウイルスのウイルスエンベロープにおいて不可欠である。チャネルはそれ自体、ホモ四量体であり、その中で、ユニットが、２つのジスルフィド結合によって安定化されるヘリックスを形成する。Ｍ２タンパク質ユニットは、３つのタンパク質ドメインから成る：外部の環境に暴露される、Ｎ末端の２４アミノ酸を有する外部ドメイン、１９疎水性アミノ酸を有する膜貫通領域、およびＣ末端上に５４アミノ酸を有する細胞質ドメイン。Ｍ２タンパク質は、インフルエンザＡ型ウイルスの生活環において重要な役割を有する。このタンパク質は、ウイルスエンベロープ中に位置して、水素イオンがエンドソームからウイルス粒子（ビリオン）に入るのを可能にし、したがって、ウイルスの内部のｐＨを低下させ、これにより、リボ核タンパク質ＲＮＰからのウイルスマトリックスタンパク質Ｍ１の分離を引き起こす。これは、ウイルスの脱外被および宿主細胞の細胞質へのその内容物の暴露に重大なステップである。
【００５８】
本発明は、ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、ポリペプチドは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２のインフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質（Ｍ２）外部ドメインペプチド、その変異体、断片、誘導体、または類似体を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。その中のＭ２外部ドメインペプチドは、互いに対して任意の順序で配置させるまたは組み合わせることができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも６つのＭ２外部ドメインペプチド、その断片、変異体、断片、誘導体、または類似体を含むポリペプチドをコードするコード領域であって、少なくとも６つのＭ２外部ドメインペプチドは、互いに対して任意の順序で配置されるまたは組み合わせられる、コード領域を含む。用語「Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピー」はまた、「Ｍ２ｅタンデムリピート」、「Ｍ２外部ドメインタンデムリピート」、または「ＭＥＴＲ」として本明細書において互換的に使用される。
【００５９】
本発明に使用されるマトリックス２（Ｍ２）タンパク質は、ヒトＡ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／ベトナム／ＤＴ−０３６／２００５（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／カイツブリ／ノボシビルスク（Ｎｏｖｏｓｌｂｉｒｓｋ）／２９／２００５（Ｈ５Ｎ１）、トリＡ／インドガン／モンゴル／１／０５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ネコ／タイ／ＫＵ−０２／０４（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１）、トリＡ／ニワトリ／広東／１７４／０４（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／香港／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）、トリＡ／ウズラ／香港／Ｇ１／９７（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／アヒル／香港／Ｙ２６０／９７（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ニワトリＨＫ／ＦＹ２３／０３（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／シチメンチョウ／ドイツ／３／９１（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ニワトリ／ＨＫ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）、ブタＡ／ブタ／香港／１０／９８（Ｈ９Ｎ２）、ブタＡ／ブタ／サスカチュワン／１８７８９／０２（Ｈ１Ｎ１）、トリＡ／マガモ／アルバータ／１３０２００３／（Ｈ１Ｎ１）、トリＡ／マガモ／ＮＹ／６７５０／７８（Ｈ２Ｎ２）、トリＡ／マガモ／ポツダム／１７７−４／８３（Ｈ２Ｎ２）、トリ／Ａ／アヒル／北海道（Ｈｏｋｋａｌｄｏ）／９５／２００１（Ｈ２Ｎ２）、トリＡ／アヒル／韓国／Ｓ９／２００３（Ｈ３Ｎ２）、ブタＡ／ブタ／山東／２／０３（Ｈ５Ｎ１）、トリＡ／ニワトリ／カリフォルニア／０１３９／２００１（Ｈ６Ｎ２）、トリＡ／ウミスズメ／スウェーデン／３／２０００（Ｈ６Ｎ２）、トリＡ／ガチョウ／香港／Ｗ２１７／９７（Ｈ６Ｎ９）、トリＡ／ニワトリ／ブリティッシュコロンビア／０４（Ｈ７Ｎ３）、トリＡ／浜鳥／デラウェア／９／９６（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／アヒル／香港／Ｙ４３９／９７（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、ブタＡ／ブタ／韓国／Ｓ４５２／２００４（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ニワトリ／オランダ／１／２００３（Ｈ７Ｎ７）、トリＡ／マガモ／アルバータ／２００１（Ｈ１Ｎ１）、トリＡ／アヒル／湖南／１１４／０５（Ｈ５Ｎ１）、ブタＡ／ブタ／コートダルモール／１４８２／９９（Ｈ１Ｎ１）、ブタＡ／ブタ  ベルツィッヒ／２／２００１（Ｈ１Ｎ１）、トリＡ／シチメンチョウ／イタリア／２２０１５８／２００２（Ｈ７Ｎ３）、トリＡ／ＨＫ／２１０８／２００３（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／ＦＰＶ／ロストック／３４（Ｈ７Ｎ１）、トリＡ／シチメンチョウ／イタリア／４６２０／９９（Ｈ７Ｎ１）、トリＡ／ＦＰＶ／ウェイブリッジ／３４（Ｈ７Ｎ７）、トリＡ／ＦＰＶ／ドブソン／２７（Ｈ７Ｎ７）、ヒトＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／香港／１／６８（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／シャーロッツビル／０３／２００４（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／カンタベリー／１２９／２００５（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／滋賀／２５／９７（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／レニングラード／１３４／５７（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／アナーバー／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、ヒトＡ／ブレビグミッション／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ���カナダ／７２０／０５（Ｈ２Ｎ２）、ブタＡ／ブタ／ウィスコンシン／４６４／９８（Ｈ１Ｎ１）、ブタＡ／ブタ／テキサス／４１９９−２／９８（Ｈ３Ｎ２）、トリＡ／シチメンチョウ／オハイオ／３１３０５３／２００４（Ｈ３Ｎ２）、トリＡ／シチメンチョウ／ノースカロライナ／１２３４４／０３（Ｈ３Ｎ２）、トリＡ／ガチョウ／広東／１／９８（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／オランダ／２１９／０３（Ｈ７Ｎ７）、ヒトＡ／ウィルソン−スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、ヒトＡ／日本／３０５／５７（Ｈ２Ｎ２）、トリＡ／ニワトリ／イラン／１６／２０００（Ｈ９Ｎ２）、トリＡ／マガモ／ＭＮ／１／２０００（Ｈ５Ｎ２）、Ａ／レイデン／０１２７２／２００６（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ティルブルフ／４５２２３／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ペンシルバニア／ＰＩＴ２５／２００８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＮＹＭＣ  Ｘ−１７１Ａ（プエルトリコ／８／１９３４−ブリスベン／１０／２００７）（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／マナグア／２６／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／香港／１−１−ＭＡ−２０Ｄ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／チェコ共和国／１／１９６６（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／ニワトリ／上海／２／１９９９（Ｈ９Ｎ２））］、Ａ／ミャンマー／Ｍ１８７／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ホロホロチョウ／ニューヨーク／１０１２７６−１／２００５（Ｈ７Ｎ２）、トリＡ／バリケン／ニューヨーク／８７４９３−３／２００５（Ｈ７Ｎ２）、トリＡ／シチメンチョウ／ニューヨーク／１２２５０１−２／２００５（Ｈ７Ｎ２）、トリＡ／マガモ／イタリア／４２２３−２／２００６（Ｈ５Ｎ２）およびヒトＡ／ワイオミング／３／２００３（Ｈ３Ｎ２）を含むが、これらに限定されない任意のインフルエンザＡ型ウイルスから得ることができる。
【００６０】
一実施形態では、本発明のためのマトリックス２タンパク質の外部ドメインは、インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に由来する。インフルエンザヒトＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の完全長Ｍ２タンパク質は、９７アミノ酸を有し、配列番号１４として示される。Ｍ２タンパク質（配列番号１４）をコードする核酸は、配列番号１３として本明細書において示される。インフルエンザウイルスの表面上に暴露するＮ末端配列は、Ｎ末端メチオニンを有していない２３アミノ酸またはＮ末端メチオニンを有する２４アミノ酸（下記に示される配列番号１４の下線を引かれた配列）であり、外部ドメイン（「Ｍ２ｅ」）として同定される。
インフルエンザＡ型／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来のマトリックス２タンパク質配列（配列番号１４）
【００６１】
【化１】
2013523096.tif 000002
本明細書において使用されるＭ２外部ドメインペプチド、その変異体、誘導体、断片、または類似体は、Ｍ２外部ドメインペプチド中に位置する抗体エピトープを含むことができ、Ｍ２外部ドメインペプチドは、約８〜３９アミノ酸、約９〜３８アミノ酸、約１０〜３７アミノ酸、約１１〜３６アミノ酸、約１２〜３５アミノ酸、約１３〜３４アミノ酸、約１４〜３３アミノ酸、約１５〜３２アミノ酸、約１６〜３１アミノ酸、約１７〜３０アミノ酸、約１８〜２９アミノ酸、約１９〜２８アミノ酸、約２０〜２７アミノ酸、約２１〜２６アミノ酸、約２２〜２５アミノ酸、または約２３〜２４アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。特定の実施形態では、Ｍ２外部ドメインペプチドは、２３アミノ酸から本質的に成るまたはそれから成る。抗体エピトープの非限定的な例は、ＥＶＥＴＰＴＲＮ（配列番号１のアミノ酸５〜１２）、ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴ（配列番号１のアミノ酸１〜１０）、ＥＴＰＴＲＮＥＷＥＣＫ（配列番号２のアミノ酸７〜１７）、ＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷ（配列番号３のアミノ酸５〜１４）、およびＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮ（配列番号３のアミノ酸３〜１９）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
【００６２】
その代わりに、Ｍ２外部ドメインペプチドは、その変異体、誘導体、または類似体とすることができ、これは、配列番号１、２、３、４、５、または６から成るペプチドに特異的に結合する抗体によって認識可能である。たとえば、Ｍ２外部ドメインペプチドの変異体、誘導体、または類似体は、配列番号１、２、３、４、５、または６（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、変異体、誘導体、または類似体は、配列番号１、２、３、４、５、または６から成るペプチドに特異的に結合する抗体によって認識可能である。配列番号３から成るペプチドに特異的に結合する抗体の例は、モノクローナル抗体１４Ｃ２であり、これは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，２９０，６８６号において記載されている。Ｍ２外部ドメインペプチドの非限定的な例は、表１に列挙される。
【００６３】
【表１】
2013523096.tif 000003
さらに、本明細書において使用されるＭ２外部ドメインペプチド、変異体、断片、誘導体、または類似体は、Ｍ２外部ドメインペプチド変異体を含むことができるが、これらに限定されず、その中で、Ｍ２外部ドメインペプチド中のシステイン（Ｃ）は、セリン（Ｓ）で置換される。置換は、２つのシステインの間のジスルフィド結合形成を予防するが、Ｍ２外部ドメインペプチドの免疫原性に影響を与えない。セリン置換Ｍ２外部ドメインペプチドの非限定的な例は、表２に示される。
【００６４】
【表２】
2013523096.tif 000004
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、ならびに配列番号７、８、１１、および１２の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００６５】
本発明は、ポリペプチドをコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドの少なくとも３つを含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、互いに対して任意の順序で配置されるまたは組み合わせられる、Ｍ２外部ドメインペプチドの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２を含む。
【００６６】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列であって、ポリペプチドは、互いに対して任意の順序で配置される、以下のＭ２外部ドメインペプチドの少なくとも６つを含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。特定の実施形態では、本発明におけるＭ２外部ドメインペプチドは、互いに対して任意の順序で組み合わせられるまたは配置される以下のアミノ酸配列を含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；および（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）または（ｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１−Ｓ）；（ｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｉｉ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｉｖ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｖ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｖｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）から成る群から選択されるアミノ酸配列。特定の一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、互いに対して任意の順序で配置される以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするコード領域を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６または（ｂ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２。他の特定の実施形態では、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）配列の複数のコピーを含む本発明のポリペプチドは、配列番号１〜６を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。さらに特定の実施形態では、ＭＥＴＲ配列は、配列番号１６または配列番号５５を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
ＭＥＴＲ Ｃ配列（配列番号１６）
【００６７】
【化２】
2013523096.tif 000005
ＭＥＴＲ Ｃ配列（配列番号５５）
【００６８】
【化３】
2013523096.tif 000006
さらなる実施形態では、ＭＥＴＲ配列を含むポリペプチドは、配列番号７〜１２を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。特定の実施形態では、ＭＥＴＲ配列は、配列番号１８または配列番号５６を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
ＭＥＴＲ Ｓ配列（配列番号１８）
【００６９】
【化４】
2013523096.tif 000007
ＭＥＴＲ Ｓ配列（配列番号５６）
【００７０】
【化５】
2013523096.tif 000008
インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）コンセンサス配列をコードするコード領域を含む単離ポリヌクレオチドもまた、提供される。インフルエンザＮＰタンパク質は、インフルエンザ遺伝子（ＲＮＡ）セグメントと構造的に関連し、４９８アミノ酸の長さを有する。ＮＰの主要な機能は、ＲＮＡ転写、複製、およびパッケージングの目的でウイルスのゲノムをキャプシド形成することである。ＮＰ遺伝子は、比較的十分に保存されており、最大のアミノ酸差異は１１％未満である（Ｓｈｕ，  Ｌ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻：５０４７〜５０５３頁（１９９３年））。本発明のためのインフルエンザＮＰコンセンサス配列は、インフルエンザ配列データベース（ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／）において開示されるように、最近（２００４〜２００７）出現したウイルス由来の最も頻繁なＮＰインフルエンザＡ型配列の７００のアライメントを比較することによって得ることができる。ＮＰコンセンサス配列は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することができる。ＮＰコンセンサスの例示的な配列は、配列番号２０を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
ＮＰコンセンサス配列（配列番号２０）
【００７１】
【化６】
2013523096.tif 000009
ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、任意の２つのＭ２外部ドメインペプチドの間に介在するリンカーをさらに含む。一実施形態では、ポリペプチド中に存在する任意のＭ２外部ドメインペプチドは、そのＭ２外部ドメインペプチドおよび隣接するＭ２外部ドメインペプチドの間に介在するリンカーペプチドを有する。一般に、いかなる所与のポリペプチドも、リンカーペプチドを有していなくてもよく、１つのリンカーペプチドまたは複数のリンカーペプチドを有していてもよい。１つを超えるリンカーペプチドがポリペプチド中に存在する場合、リンカーは同じものでも異なるものでもよい。ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１のリンカーペプチドを含むことができる。リンカーペプチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５のアミノ酸とすることができる。一実施形態では、リンカーペプチドは、長さが５アミノ酸である。他の実施形態では、リンカーペプチドは、宿主に対して低いまたは最小限の免疫原性、疎水性、または親水性を有する。
【００７２】
他の実施形態では、リンカーペプチドは、下等生物において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。さらに他の実施形態では、リンカーペプチドは、霊長類において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有さない。これらのリンカーペプチドが免疫原性であり、抗体の産生をもたらす場合、それらの抗体は、宿主中で循環し、あらゆる相同抗原に結合する機会を伴うであろう。効力のある抗原が自己タンパク質である場合、免疫原性は、所望されない。効力のある抗原が病原体または他の微生物に対して相同である場合、免疫原性は有益となり得る。
【００７３】
ある実施形態では、本発明において使用されるリンカーペプチドは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種  Ｈ１６０、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  ＳＮＰＶ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  ＦＴＧ、Ｐｅｒｏｍｙｓｃｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ  ｉｎｓｉｇｎｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  Ｇ２７、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ＬＦＩ１２３８、Ｓｏｌａｒｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＷＲＩ１６３１、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｏｄｏ  ｓａｌｔａｎｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  Ｃ−２７、ベータ−プロテオバクテリアＫＢ１３、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ細菌ＧＤ  １、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｅｌａｇｉｂａｃｔｅｒ種  ＨＴＣＣ７２１１、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ  ＤＳＭ  １１３４７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＨ１１３４、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ細菌Ｙ４Ｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種  グループＩＩ  「５−ｗａｙ  ＣＧ」、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ  ＤＳＭ  １６７９５、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ  ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ  ｎｅｃｅｓｓａｒｉｕｓ  ＳＴＩＲ１、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｈｉｚｉｎｆｌａｔｕｓ、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ニワトリ／イラン／１６／２０００（Ｈ９Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／マガモＭＮ／１／２０００（Ｈ５Ｎ２））］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７株  ＥＣ４０４５、Ｓ１糖タンパク質［感染性気管支炎ウイルス］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／レイデン／０１２７２／２００６（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ティルブルフ／４５２２３／２００５（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ペンシルバニア／ＰＩＴ２５／２００８（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ＮＹＭＣ  Ｘ−１７１Ａ（プエルトリコ／８／１９３４−ブリスベン／１０／２００７）（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／マナグア／２６／２００７（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／香港／１−１−ＭＡ−２０Ｄ／１９６８（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／チェコ共和国／１／１９６６（Ｈ２Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ニワトリ／上海／２／１９９９（Ｈ９Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＢ型ウイルス（Ｂ／ミャンマー／Ｍ１７０／２００７）］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ミャンマー／Ｍ１８７／２００７（Ｈ３Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ホロホロチョウ／ニューヨーク／１０１２７６−１／２００５（Ｈ７Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／バリケン／ニューヨーク／８７４９３−３／２００５（Ｈ７Ｎ２））］、ノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／シチメンチョウ／ニューヨーク／１２２５０１−２／２００５（Ｈ７Ｎ２））］、および／またはノイラミニダーゼ［インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／マガモ／イタリア／４２２３−２／２００６（Ｈ５Ｎ２））］において見出されるアミノ酸配列に対して相同であってもよい。特定の実施形態では、本発明において使用されるリンカーペプチドは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＧＳＡＳＧ）（配列番号２１）である。
【００７４】
他の実施形態では、リンカーペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージｐｈｉ２９５８ＰＶＬ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｂｏｄｏ  ｓａｌｔａｎｓ、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５２６５、および／またはＬｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種  グループＩＩ  「５−ｗａｙ  ＣＧ」において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。特定の実施形態では、本発明において使用されるリンカーペプチドは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（ＳＧＳＧＡ）（配列番号２２）である。
【００７５】
さらに他の実施形態では、リンカーペプチドは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｏｎｔａｎａ、ポリタンパク質［Ｔｏｍａｔｏ  ｔｏｒｒａｄｏウイルス］、免疫グロブリン重鎖可変領域［Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ］、ポリタンパク質［デング熱ウイルス１］、またはオキシステロール結合タンパク質［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］において見出されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。特定の実施形態では、本発明において使用されるリンカーペプチドは、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＡＧＳＧ）（配列番号２３）である。
【００７６】
本発明において使用されるリンカーペプチドは、当技術分野において公知の任意のリンカー、たとえば、単鎖抗体、たとえばｓｃＦｖに使用されるｓｃＦｖリンカーとすることができる。一実施形態では、リンカーペプチドは、配列（Ｇｌｙ）ｎである。他の実施形態では、リンカーペプチドは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含む。他の実施形態では、リンカーペプチドは、配列（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（配列番号２４）、または（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）を含み、ｎは、１〜１０、５〜２０、１０〜３０、２０〜５０、４０〜８０、または５０〜１００の整数である。
【００７７】
本発明はまた、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーを含むポリペプチドをコードするコード領域を含む融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、１つ以上のエピトープをさらに含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２のエピトープをさらに含む。他の実施形態では、エピトープは、長さが少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５アミノ酸である。一実施形態では、ポリペプチド中に存在する任意のＭ２外部ドメインペプチドは、そのＭ２外部ドメインペプチドおよび隣接するＭ２外部ドメインペプチドの間に介在するエピトープを有する。他の実施形態では、ポリペプチドは、Ｍ２外部ドメインの間に介在する１つのエピトープまたは１つを超えるエピトープをさらに含んでいてもよい。１つを超えるエピトープが存在する場合、エピトープは同じものでも異なるものでもよい。
【００７８】
エピトープは、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープとすることができる。本発明に有用なＢ細胞エピトープは、Ｍ２タンパク質、たとえば、Ｍ２外部ドメインのＮ末端１９〜２０アミノ酸内に位置する抗体エピトープに由来してもよい。Ｂ細胞エピトープの非限定的な例は、配列番号１のアミノ酸５〜１２、配列番号１のアミノ酸１〜１０、配列番号２のアミノ酸７〜１７、配列番号３のアミノ酸５〜１４、または配列番号３のアミノ酸３〜１９である。Ｂ細胞エピトープは、Ｍ２タンパク質の他のドメイン、たとえば膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに由来することができる。その代わりに、Ｂ細胞エピトープは、任意のインフルエンザタンパク質またはその断片、たとえば赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）から得ることができる。
【００７９】
本発明において使用されるＴ細胞エピトープは、任意の数のアミノ酸を含み、任意の公知の抗原または免疫原に由来することができる。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、任意のインフルエンザタンパク質またはその断片、たとえば赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）に由来することができる。特定の実施形態では、Ｔ−ヘルパー細胞エピトープは、合計１５のアミノ酸について、各側の３つの側面に位置するアミノ酸と共に９つのコアアミノ酸を含有することができる。主要組織適合遺伝子複合体（マウスにおいてＭＨＣおよびヒトにおけるＨＬＡ）のくぼみに対するその結合は、公知の方法によって計算することができる。高スコアリングペプチドは、ＨＬＡ分子のそれらのＭＨＣに対するリガンドであることが予測される。
【００８０】
特定の実施形態では、本発明において使用されるＴ細胞エピトープは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第６，６６３，８７１号において記載されている配列番号２６、配列番号２７、またはその両方から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明は、Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピー、２つ以上のＭ２外部ドメインペプチドの間に介在する１つもしくは複数の任意選択のリンカーペプチド、および／または２つ以上のＭ２外部ドメインペプチドの間に介在する１つもしくは複数の任意選択のエピトープを含む。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも６つのＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃１、Ｍ２ｅ＃２、Ｍ２ｅ＃３、Ｍ２ｅ＃４、Ｍ２ｅ＃５、およびＭ２ｅ＃６）、任意の２つ以上の外部ドメインペプチドの間に介在する１つ以上のリンカーペプチド（たとえばＭ２ｅ＃１−Ｍ２ｅ＃２、Ｍ２ｅ＃２−Ｍ２ｅ＃３、Ｍ２ｅ＃３−Ｍ２ｅ＃４、Ｍ２ｅ＃４−Ｍ２ｅ＃５、またはＭ２ｅ＃５−Ｍ２ｅ＃６）ならびに、任意の２つ以上のＭ２外部ドメインペプチドの間に介在する１つ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ポリペプチドは、６つのＭ２外部ドメインペプチド、その間に介在する３つのリンカーペプチド、およびその間に介在する２つのエピトープを含み、
（１）第１のリンカーペプチドは、第１のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃１）および第１のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃２）の間に介在し、
（２）第２のリンカーペプチドは、第２のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃２）および第３のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃３）の間に介在し、
（３）第３のリンカーペプチドは、第３のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃３）および第４のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃４）の間に介在し、
（４）第１のエピトープは、第４のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃４）および第５のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃５）の間に介在し、
（５）第２のエピトープは、第５のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃５）および第６のＭ２外部ドメインペプチド（Ｍ２ｅ＃６）の間に介在する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドをコードするコード領域を含み、コード領域は、さらなる核酸配列をさらに含む。さらなる核酸配列は、ある実施形態では、本発明のポリペプチドに必要に応じて融合される、さらなるポリペプチドをコードすることができる。さらなるポリペプチドは、インフルエンザウイルスの少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むことができ、エピトープは、Ｂ細胞（抗体）応答、Ｔ細胞応答、またはその両方を誘発する。
【００８３】
様々なさらなる核酸は、それぞれのさらなるポリペプチドをコードするように使用することができる。一実施形態では、さらなるポリペプチドは、本発明のＭＥＴＲポリペプチドに融合される。他の実施形態では、さらなるポリペプチドは、本発明のＭＥＴＲポリペプチドに融合されないが、ＭＥＴＲポリペプチドを発現する同じベクターで産生される。さらなる核酸配列の非限定的な例は、インフルエンザタンパク質、その変異体、誘導体、類似体、または断片をコードする核酸配列である。インフルエンザタンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス１タンパク質（Ｍ１）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）、非構造タンパク質（ＮＳ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）から成る群から選択することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、さらなるポリペプチドは、安定化、分泌、または単純化された精製を付与するＮまたはＣ末端ペプチド、つまりＨｉｓタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ｃ−ｍｙｃ、ＫＳＩ、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ（配列番号２８）、ポリフェニルアラニン（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）、ポリシステイン、ポリアルギニン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤血球凝集素インフルエンザウイルス（ＨＡＩ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、連鎖球菌プロテインＧ、ブドウ球菌プロンテインＡ、Ｔ７ｇｅｎｅ１０、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ｈｉｓパッチチオレドキシン、チオレドキシン、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓタグ、およびＴ７タグから成る群から選択される。たとえばＳｔｅｖｅｎｓ，  Ｒ．Ｃ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ８巻：Ｒ１７７〜Ｒ１８５頁（２０００年）を参照されたい。異種ポリペプチドは、ＭＥＴＲ配列の運搬、移動、プロセシング、および／もしくは発現を促進する任意のプレおよび／もしくはプロ配列または微生物病原体のＴ細胞エピトープまたは他の免疫原性タンパク質および／もしくはエピトープをコードする配列を含むが、これらに限定されない任意の有用な免疫原性配列をさらに含むことができる。他の適したさらなるポリペプチドは、リーダー配列またはシグナル配列を含むことができる。
【００８５】
コドン最適化
Ｍ２外部ドメインペプチド配列の複数のコピーを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。当業者らは、たとえば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発によって、ポリペプチドをコードする核酸の修飾を容易に達成することができる。そのような修飾ポリペプチドは、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードすることができる。そのような修飾は、断片、変異体、および誘導体を含む発現ポリペプチドに、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、および／または修飾を付与する。そのような修飾は、たとえば、非修飾ポリペプチドと比較して細胞性免疫応答を増加させることによって、抗原免疫原性を増強してもよい。そのような修飾は、ポリペプチドの溶解性を増強してもよい。その代わりに、そのような修飾は、効果を有していなくてもよい。たとえば、Ｍ２外部ドメインペプチドは、特定のエピトープに対する免疫応答を増強するために、抗原提示細胞において活性なタンパク質分解酵素に対する特定の切断部位の導入、欠失、または修飾によって修飾されてもよい。
【００８６】
当業者によって十分に理解されるように、様々な核酸コード領域は、遺伝暗号の重複性により同じポリペプチドをコードするであろう。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列中の偏りは、遺伝子をコードする配列における違いを可能にする。コドンがそれぞれ、３つのヌクレオチドから成るので、ＤＮＡを含むヌクレオチドは、４つの特定の塩基に制限され、ヌクレオチドの６４の可能な組み合わせがあり、そのうちの６１が、アミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終了するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」は、表３として本明細書において複写する。その結果として、多くのアミノ酸は、１つを超えるコドンによって示される。たとえば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６のトリプレットによってコードされるのに対して、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することなく広い範囲にわたり変化することを可能にする。
【００８７】
【表３】
2013523096.tif 000010
本発明に従うポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、使用されるコドンにかかわらず、本発明の範囲内にあることが十分に理解されたい。
【００８８】
多くの生物は、成長中のポリペプチド鎖中への特定のアミノ酸の挿入をコードするのに、特定のコドンの使用についてバイアスを示す。生物の間のコドン使用頻度における差異であるコドン優先度またはコドンバイアスは、遺伝暗号の縮重によってもたらされ、多くの生物の間で十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と関連し、これは、次には、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定の運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存性であると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの現れである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物において最適な遺伝子発現に適合させることができる。
【００８９】
本発明は、本明細書において開示されるインフルエンザタンパク質、たとえばＭＥＴＲをコードするコード最適化コード領域を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るポリヌクレオチドを含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。そのような実施形態では、コドン使用頻度は、所与の原核生物または真核生物の細胞における最適化された発現に適している。
【００９０】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列の中に所与の種の遺伝子における使用に優先的なコドンを組み込むことによって調製される。インフルエンザポリペプチド、たとえばＭＥＴＲをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド発現構築物、ベクター、および宿主細胞ならびに動物においてインフルエンザ感染を治療するまたは予防するためにポリヌクレオチド発現構築物、ベクター、および宿主細胞を使用するための様々な方法もまた、提供される。
【００９１】
種々様々の動物、植物、および微生物の種に利用可能な多くの遺伝子配列を考慮すれば、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、たとえば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００６年５月３０日に訪れた）で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で、容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法において適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．ら、「Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００」  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻：２９２頁（２０００年）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５１．０から計算されたヒトについてのコドン使用頻度表は、表４として下記に複写する（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／前掲から）。これらの表は、ｍＲＮＡ命名法を使用しており、したがって、表には、ＤＮＡにおいて見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡにおいて見出されるウラシル（Ｕ）を使用する。頻度が６４のコドンすべてに対してではなくそれぞれのアミノ酸に対して計算されるように、表を適応させた。
【００９２】
【表４−１】
2013523096.tif 000011
【００９３】
【表４−２】
2013523096.tif 000012
これらのまたは同様の表を利用することによって、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列にその頻度を適用し、ポリペプチドをコードするが、所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。
【００９４】
多くの選択肢は、当業者らに周知の標準的でルーチン的な分子生物学的操作を使用して、上記に記載される方法のいずれかによって設計されるコドン最適化コード領域の合成に利用可能である。１つのアプローチでは、長さがそれぞれ８０〜９０ヌクレオチドで、所望の配列の長さにわたる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングに際して、それらが、粘着末端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される、たとえば、対におけるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、対の他のオリゴヌクレオチドに相補的である領域を越えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基にわたるように合成される。それぞれの対のオリゴヌクレオチドの一本鎖末端は、他の対のオリゴヌクレオチドの一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対を、アニールさせ、次いで、およそ５〜６のこれらの二本鎖断片を、粘着一本鎖末端を介してともにアニールさせ、次いで、それらは、ともにライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能なＴＯＰＯベクターの中にクローニングされる。次いで、構築物は、標準的な方法によって配列決定される。ともにライゲーションされた８０〜９０塩基対断片の５〜６つの断片、つまり約５００塩基対の断片から成るいくつかの構築物は、所望される全配列が、一連のプラスミド構築物中に示されるように調製される。次いで、これらのプラスミドの挿入物は適切な制限酵素を用いてカットされ、最終構築物を形成するようにともにライゲーションされる。次いで、最終構築物は、標準的な細菌クローニングベクターの中にクローニングされ、配列決定される。さらなる方法は、当業者に直ちに明らかになるであろう。さらに、遺伝子合成は、容易に市販で入手可能である。
【００９５】
ベクター
本発明は、遺伝子工学において従来使用されているベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージ、互いに対して任意の順序で配置されるインフルエンザ抗原またはＭ２外部ドメインペプチド、たとえばＭＥＴＲの複数のコピーを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００９６】
一実施形態では、ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子移入ベクターもしくは標的ベクターである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスなどのようなウイルスに由来する発現ベクターは、標的にされる細胞集団の中への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用されてもよい。当業者らに周知の方法は、組換えウイルスベクターを構築するために使用することができる；たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年）において記載される技術を参照されたい。その代わりに、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームの中に再構成することができる。本発明のポリヌクレオチド（たとえばＭ２外部ドメイン配列（ＭＥＴＲ）の複数のコピー）を含有するベクターは、細胞性の宿主のタイプに依存して変化する周知の方法によって宿主細胞の中に移入することができる。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に対して共通して利用されるのに対して、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞性の宿主に対して使用されてもよい；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲を参照されたい。一般に、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングならびに真核生物または原核細胞に入るおよび／またはそれにおいて複製するための能力を促進するための適切な制限部位を含むであろう。
【００９７】
ある実施形態では、本発明は、インフルエンザポリペプチド、たとえばＭ２外部ドメイン（ＭＥＴＲ）の複数のコピー、ＮＰ、またはその両方を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポックスウイルス、たとえばワクシニアウイルス、たとえば改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に関する。ＭＶＡは、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅのファミリーにおけるオルソポックスウイルス属のメンバーである。ポックスウイルスは、４つの属のポックスウイルス、つまりオルソポックス、パラポックス、ヤタポックス、およびモルシポックスウイルスを含む。オルソポックスウイルスは、限定を伴うことなく、痘瘡ウイルス（天然痘を引き起こす作用物質）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、およびアライグマポックスウイルスを含み、パラポックスウイルスは、限定を伴うことなく、オルフウイルス、偽牛痘、およびウシ丘疹性口内炎ウイルスを含み、ヤタポックスウイルスは、限定を伴うことなく、タナ痘ウイルスおよびヤバサル腫瘍ウイルスを含み、モルシポックスウイルスは、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）を含む。
【００９８】
ワクシニアウイルスは、ヒト天然痘疾患に対して免疫するためにまたは組換え遺伝子発現のためのもしくは組換え生ワクチンとしての潜在的な使用のためのウイルスベクターを遺伝子操作するために生ワクチンとして使用されてきた（Ｍａｃｋｅｔｔ，  Ｍ．ら、１９８２年  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７９巻：７４１５〜７４１９頁；Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｌ．ら、１９８４年  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇｉｎ  Ｒｅｖ  ２巻：３８３〜４０７頁）。遺伝子操作されたウイルスベクターは、ＤＮＡ組換え技術の援助によって、外来抗原、たとえばインフルエンザポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（遺伝子）を含有してもよい。遺伝子が、ウイルスの生活環にとって非本質的なウイルスゲノムにおける部位で統合される場合、外来遺伝子を組み込む新しく産生された組換えワクシニアウイルスは、宿主細胞に感染し、したがって、宿主細胞において外来タンパク質の発現を誘発することが可能となり得る（それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，１１０，５８７号；第８３，２８６号；および第１１０，３８５号）。このように調製される組換えワクシニアウイルス（たとえばＭＶＡ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて感染インフルエンザ疾患の予防のために生ワクチンとして本発明に従って使用される。
【００９９】
一実施形態では、本明細書において使用されるワクシニアウイルス株の例は、高度に弱毒化された改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞上でのワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のＡｎｋａｒａ株の長期の連続継代によって生成された（概説については、Ｍａｙｒ，  Ａ．ら  １９７５年  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３巻：６〜１４頁；スイス特許第５６８，３９２号を参照されたい）。ＭＶＡウイルスは、たとえば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５０８としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから公的に入手可能である。ＭＶＡは、好適な免疫原性およびトリ細胞において感染ビリオンを複製し、ならびに産生する完全な能力を維持しながら、その弱毒化、たとえば、毒力の減少およびある種の哺乳動物細胞において感染ビリオンを再生するための限られた能力によって区別される。ＭＶＡウイルスは、親のＣＶＡ株に比べて弱毒化を誘発する、そのゲノムにおける改変を有する。合計３１，０００の塩基対（そのゲノムの約１０％）になるゲノムＤＮＡの主な６つの欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ）が同定されてきた（その全体が参照によって本明細書において組み込まれるＭｅｙｅｒ，  Ｈ．ら  １９９１年  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２巻：１０３１〜１０３８頁）。結果として生じるＭＶＡウイルスは、哺乳動物細胞において非常に弱毒化されるようになった。その弱毒化により、本発明のＭＶＡは、免疫抑制性の個体においてでさえ、弱毒性となり得、感染インフルエンザ疾患に対する生ワクチンにおけるＭＶＡの使用と関連する、ほんの少しの副作用しか有していない。
【０１００】
ベクター、たとえば、本発明のＭＶＡは、その複製が感染の後期において遮断されるので、ヒト細胞において限られた複製を行ってもよい。限られた複製は、成熟感染ビリオンへの構築を予防する。しかしながら、本発明のベクター、たとえば、ＭＶＡは、非許容細胞においてでさえ高レベルでウイルス組換え遺伝子を発現させることができ、また、効率的で安全な遺伝子発現ベクターとしても役立つことができる。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、インフルエンザポリペプチド、たとえばＭＥＴＲをコードする単離ポリヌクレオチド配列は、天然に存在する欠失、たとえば欠失Ｉ、欠失ＩＩ、欠失ＩＩＩ、欠失ＩＶ、欠失Ｖ、もしくは欠失ＶＩまたはポリヌクレオチドの５’もしくは３’末端のＭＶＡゲノム中に存在する他の非本質的な部位に隣接するＭＶＡフランキング配列に融合される。ＭＶＡゲノムの非本質的な領域は、遺伝子間領域および天然に存在する欠失領域ならびに複製に必要とされない他の遺伝子、たとえばｔｋ遺伝子を含む。１つ以上のインフルエンザ抗原、たとえばＭＥＴＲをコードするポリヌクレオチド配列を保持するＤＮＡ配列は、直線状または環状で、ポリメラーゼ連鎖反応産物またはプラスミドとすることができ、少なくとも１つのインフルエンザポリペプチドをコードするコード領域に適切に作用可能に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）プロモーターなどのような調節性配列をさらに含んでいてもよい。調節性エレメントの非限定的な例は、ＥＰ−Ａ−１９８，３２８において記載されるワクシニア１１  ｋａ遺伝子および７．５ｋＤａ遺伝子の調節性エレメント（ＥＰ−Ａ−１１０，３８５）を含み、これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、インフルエンザポリペプチド抗原、たとえばＭＥＴＲをコードするコード配列と作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含有する組換えＭＶＡを提供する。特定の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーター（たとえばワクシニアウイルスまたは改変ワクシニアＡｎｋａｒａウイルスプロモーター）である。さらに特定の実施形態では、プロモーターは、合成プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、強力なプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、強力な合成プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号２９）を有するＰＳプロモーターである（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，  ＳｉｓｌｅｒおよびＭｏｓｓ（１９９７年）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３巻：１０９４〜１０９７頁）。さらに特定の実施形態では、プロモーターは、配列ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴ（配列番号３０）を有する修飾Ｈ５プロモーターである（Ｒｏｓｅｌら（１９８６年）．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０巻（２号）：２３６〜２４９頁）。
【０１０３】
ポックスウイルス転写制御領域は、プロモーターおよび転写終結シグナルを含む。ポックスウイルスにおける遺伝子発現は、一時的に調節され、初期、中間、および後期遺伝子についてのプロモーターは、様々な構造を有する。ある種のポックスウイルス遺伝子は、恒常的に発現され、これらの「初期−後期」遺伝子についてのプロモーターは、ハイブリッド構造を有する。合成初期−後期プロモーターもまた開発されてきた。Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６６巻：１３５〜８頁（１９９７年）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３巻：１０９４〜７頁（１９９７年）を参照されたい。そのため、本発明では、任意のポックスウイルスプロモーター、たとえば初期、後期、または恒常的プロモーターが、使用されてもよい。
【０１０４】
初期プロモーターの非限定的な例は、７．５ｋＤプロモーター（後期プロモーターでもある）、ＤＮＡ  ｐｏｌプロモーター、ｔｋプロモーター、ＲＮＡ  ｐｏｌプロモーター、１９ｋＤプロモーター、２２ｋＤプロモーター、４２ｋＤプロモーター、３７ｋＤプロモーター、８７ｋＤプロモーター、Ｈ３’プロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｄ１プロモーター、Ｄ４プロモーター、Ｄ５プロモーター、Ｄ９プロモーター、Ｄ１２プロモーター、Ｉ３プロモーター、Ｍ１プロモーター、およびＮ２プロモーターを含む。たとえばＭｏｓｓ，  Ｂ．、「Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」  ＩＮ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、２０８８頁（１９９０年）を参照されたい。ワクシニアウイルスおよび他のポックスウイルスにおいて転写される初期遺伝子は、転写終結シグナルＴＴＴＴＴＮＴ（配列番号３１）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドとすることができる。転写は、通常、このシグナルのおよそ５０ｂｐ上流で終結する。したがって、異種遺伝子がポックスウイルス初期プロモーターから発現されることになっている場合、それらの遺伝子についてのコード領域におけるこのシグナルの発生をなくすことに注意しなければならない。たとえばＥａｒｌ，  Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（６４巻：２４４８〜５１頁（１９９０年）を参照されたい。
【０１０５】
後期プロモーターの例は、限定を伴うことなく、７．５ｋＤプロモーター、ＭＩＬプロモーター、３７ｋＤプロモーター、１１ｋＤプロモーター、１１Ｌプロモーター、１２Ｌプロモーター、１３Ｌプロモーター、１５Ｌプロモーター、１７Ｌプロモーター、２８ｋＤプロモーター、Ｈ１Ｌプロモーター、Ｈ３Ｌプロモーター、Ｈ５Ｌプロモーター、Ｈ６Ｌプロモーター、Ｈ８Ｌプロモーター、Ｄ１１Ｌプロモーター、Ｄ１２Ｌプロモーター、Ｄ１３Ｌプロモーター、Ａ１Ｌプロモーター、Ａ２Ｌプロモーター、Ａ３Ｌプロモーター、およびＰ４ｂプロモーターを含む。たとえばＭｏｓｓ，  Ｂ．、「Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ＩＮ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、２０９０頁（１９９０年）を参照されたい。後期プロモーターは、見たところでは、初期プロモーターによって認識される転写終結シグナルを認識しない。
【０１０６】
本発明において使用される恒常的プロモーターの非限定的な例は、ＨａｍｍｏｎｄおよびＣｈａｋｒａｂａｒｔｉによって記載される合成初期−後期プロモーター、ＭＨ−５初期−後期プロモーター、および７．５ｋＤまたは「ｐ７．５」プロモーターを含む。
【０１０７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよびさらなる核酸配列を含むベクター、たとえばＭＶＡに関する。さらなる核酸配列は、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーをコードするポリヌクレオチド配列が挿入される部位と同じまたは異なる挿入部位に挿入することができる。さらなる核酸配列は、さらなるポリペプチドをコードするコード領域を含むことができる。さらなる核酸配列は、プロモーターにさらにつなぐことができる。一実施形態では、本発明のベクター、たとえばＭＶＡは２つ以上の抗原または免疫原をコードし、一方の抗原は、ＭＥＴＲまたはＮＰコンセンサスであり、他方の抗原は、さらなるポリペプチドである。さらなるポリペプチドは、本明細書において使用されるインフルエンザタンパク質、その変異体、断片、誘導体、または類似体とすることができる。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明のベクター、たとえばＭＶＡは、少なくとも２つのインフルエンザ抗原、たとえばＭＥＴＲおよびＨＡ、ＭＥＴＲおよびＮＰ、ＨＡおよびＮＰならびに少なくとも３つのインフルエンザ抗原、たとえばＭＥＴＲ、ＨＡ、およびＮＰを発現する。ある実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８つのインフルエンザ抗原を発現する。
【０１０９】
本発明はまた、ベクター、たとえばＭＶＡを産生するための方法であって、相同組換えを可能にするために、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）構築物をベクター、たとえばＭＶＡに感染した宿主細胞の中に導入するステップを含む方法もまた提供する。一度、ＭＥＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物が宿主細胞の中に導入され、外来ＤＮＡ配列がウイルスＤＮＡと組換えられたら、結果として生じる組換えＭＶＡウイルスは、ＭＥＴＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、たとえば、マーカーの援助によって、公知の技術によって結果として生じるＭＶＡを単離することをも提供する。ＭＥＴＲポリペプチド遺伝子を保持するＤＮＡ構築物はまた、トランスフェクションによって、たとえば、リン酸カルシウム沈降の手段によって（Ｇｒａｈａｍら  １９７３年  Ｖｉｒｏｌ  ５２巻：４５６〜４６７頁；Ｗｉｇｌｅｒら  １９７９年  Ｃｅｌｌ  １６巻：７７７〜７８５頁）、エレクトロポレーションの手段によって（Ｎｅｕｍａｎｎら  １９８２年  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １巻：８４１〜８４５頁）、マイクロインジェクションによって（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎら  １９８３年  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１巻：４８２〜４９２頁）、リポソームの手段によって（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら  １９８３年  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１巻：５１２〜５２７頁）、スフェロプラストの手段によって（Ｓｃｈａｆｆｈｅｒ  １９８０年  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７巻：２１６３〜２１６７頁）、または当業者らに公知の他の方法によって、ＭＶＡ感染細胞の中に導入されてもよい。トランスフェクション方法について本明細書において列挙される参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１１０】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、いくつかの周知の技術、たとえばＫ１Ｌ遺伝子ベースの選択プロトコールによって単離することができる。非限定的な例として、ＤＮＡ構築物は、両方とも、ＭＶＡゲノム内の非本質的な部位、たとえば天然に存在する欠失、たとえば欠失ＩＩＩの側面に位置するＤＮＡ配列が側面に位置する、マーカーとしてのワクシニアウイルスＫ１Ｌタンパク質またはＫ１Ｌ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびＭＥＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有してもよい。
【０１１１】
本発明に使用される宿主細胞は、真核細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞を含むが、これらに限定されない。真核細胞の非限定的な例は、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、ＢＳＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２６）、ＣＶ−１（ＥＣＡＣＣ  ８７０３２６０５）、またはＭＡ１０４（ＥＣＡＣＣ  ８５１０２９１８）である。一実施形態では、宿主細胞は、ニワトリ細胞、アヒル細胞、またはウズラ細胞を含むが、これらに限定されないトリ細胞である。トリ細胞の非限定的な例は、ニワトリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ９細胞、ＱＴ６細胞、ＱＴ３５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ニワトリ胚由来ＬＳＣＣ−Ｈ３２細胞、ニワトリＤＦ−１細胞、または初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞である。他の実施形態では、本発明において宿主細胞として使用されるトリ細胞は、不死化されている。不死化トリ細胞は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２００８／０２２７１４６  Ａ１号および国際特許出願公開ＷＯ２００７／０５４５１６  Ａ１において記載されるＡＧＥ１ｃｒ細胞およびＡＧＥ１ｃｒ．ｐＩＸ細胞を含むが、これらに限定されない不死化アヒル細胞であってもよい。本発明において有用な他の不死化アヒル細胞は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２０１０／０６２４８９  Ａ１において記載される胚由来幹細胞、たとえばＥＢ６６（登録商標）細胞を含む。他の有用なトリ細胞株は、すべて、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００６／１０８８６４６  Ａ２、米国特許出願公開２００６／０２３３８３４  Ａ１、ならびに米国特許第５，８３０，５１０号および第６，５００，６６８号において記載されている。
【０１１２】
ポリペプチド
本発明はまた、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーを含むポリペプチドをも含む。一実施形態では、本発明は、互いにそれぞれの任意の順序で配置される以下のインフルエンザウイルスマトリックス２タンパク質外部ドメインペプチドの少なくとも５つを含む単離ポリペプチドである：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【０１１３】
一実施形態では、本発明は、互いにそれぞれの任意の順序で配置される以下のＭ２外部ドメインペプチドの少なくとも３つを含む単離ポリペプチドを提供する：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。他の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のＭ２外部ドメインペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質であり、インフルエンザウイルスに対して免疫応答を誘発する。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、互いにそれぞれの任意の順序で配置される以下のＭ２外部ドメインペプチドの少なくとも３つを含む：（ａ）（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；および（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）または（ｂ）（ｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１−Ｓ）；（ｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｉｉ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｉｖ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｖ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｖｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、互いにそれぞれの任意の順において配置される以下の６つのアミノ酸配列を含む：（ａ）（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；および（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；または（ｂ）（ｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１−Ｓ）（ｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｉｉ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｉｖ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｖ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｖｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２０のＮＰコンセンサス配列を含む。
【０１１５】
本発明のポリペプチドは、さらなるポリペプチドをさらに含む融合タンパク質とすることができる。さらなるポリペプチドの非限定的な例は、さらなるインフルエンザポリペプチド、その変異体、誘導体、類似体、または断片である。さらなるポリペプチドは、免疫原性また抗原性であってもよく、任意の公知の抗原とすることができる。
【０１１６】
組成物
組成物、たとえば、免疫学的有効量の単離ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含有する医薬またはワクチン組成物は、さらに本発明の実施形態となる。そのような組成物は、たとえばリポペプチド（たとえばＶｉｔｉｅｌｌｏ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５巻：３４１頁、１９９５年）、たとえばポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロスフェア中にカプセル化されたポリペプチド（たとえばＥｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８巻：２８７〜２９４頁、１９９１年：Ａｌｏｎｓｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２巻：２９９〜３０６頁、１９９４年；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３巻：６７５〜６８１頁、１９９５年を参照されたい）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含有されるポリペプチド組成物（たとえばＴａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４巻：８７３〜８７５頁、１９９０年；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１３巻：２３５〜２４３頁、１９９８年を参照されたい）；複数の抗原ペプチド系（ＭＡＰｓ）（たとえばＴａｍ，  Ｊ．  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５巻：５４０９〜５４１３頁、１９８８年；Ｔａｍ，  Ｊ．Ｐ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６巻：１７〜３２頁、１９９６年を参照されたい）；ウイルスまたは合成起源の粒子（たとえばＫｏｆｌｅｒ，  Ｎ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９２巻：２５頁、１９９６年；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，  Ｊ．  Ｈ．ら、Ｓｅｍ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３０巻：１６頁、１９９３年；Ｆａｌｏ，  Ｌ．  Ｄ．，  Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ７巻：６４９頁、１９９５年）；アジュバント（たとえば不完全フロイントアジュバント）（Ｗａｒｒｅｎ，  Ｈ．  Ｓ．、Ｖｏｇｅｌ，  Ｆ．  Ｒ．、およびＣｈｅｄｉｄ，  Ｌ．  Ａ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４巻：３６９頁、１９８６年；Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．  Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１巻：２９３頁、１９９３年）；またはリポソーム（Ｒｅｄｄｙ，  Ｒ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８巻：１５８５頁、１９９２年；Ｒｏｃｋ，  Ｋ．  Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １７巻：１３１頁、１９９６年）を含んでいてもよい。組成物は、医薬、抗原性、免疫原性、またはワクチン組成物とすることができる。
【０１１７】
本発明の組成物、たとえばワクチン組成物は、公知の方法に従って製剤することができる。たとえば、適した調製方法は、両方とも、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．  Ｏｓｏｌ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０年）およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）において記載されている。組成物は、水溶液として投与されてもよいが、それはまた、エマルション、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態、または当技術分野において公知の任意の他の形態として製剤することができる。さらに、組成物は、たとえば、希釈剤、結合剤、安定剤、および保存剤を含む薬学的に許容される添加剤を含有していてもよい。一度、製剤されたら、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。治療されることとなる被験体は、動物、特にヒトとすることができる。
【０１１８】
本発明の組成物におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡの濃度は、広く、つまり、約０．１重量％未満〜通常、約２重量％または少なくとも約２重量％〜２０重量％〜５０重量％以上まで変化することができ、主として、選択される投与の特定のモードに従って、液量、粘性などによって選択されるであろう。
【０１１９】
一実施形態では、本発明の組成物は、互いにそれぞれの任意の順序で配置される複数のコピー、以下のＭ２外部ドメインペプチドを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む単離ポリヌクレオチドのたとえば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２を含む：（ｉ）配列番号１（Ｍ２ｅ＃１＿Ｃ）；（ｉｉ）配列番号２（Ｍ２ｅ＃２＿Ｃ）；（ｉｉｉ）配列番号３（Ｍ２ｅ＃３＿Ｃ）；（ｉｖ）配列番号４（Ｍ２ｅ＃４＿Ｃ）；（ｖ）配列番号５（Ｍ２ｅ＃５＿Ｃ）；（ｖｉ）配列番号６（Ｍ２ｅ＃６＿Ｃ）；（ｖｉｉ）配列番号７（Ｍ２ｅ＃１＿Ｓ）；（ｖｉｉｉ）配列番号８（Ｍ２ｅ＃２＿Ｓ）；（ｉｘ）配列番号９（Ｍ２ｅ＃３＿Ｓ）；（ｘ）配列番号１０（Ｍ２ｅ＃４＿Ｓ）；（ｘｉ）配列番号１１（Ｍ２ｅ＃５＿Ｓ）；および（ｘｉｉ）配列番号１２（Ｍ２ｅ＃６＿Ｓ）。他の実施形態では、本発明の組成物、たとえばワクチン組成物は、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーまたはＮＰコンセンサス配列をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上のベクター、たとえばＭＶＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｍ２外部ドメインペプチドの複数のコピーを含む本発明のポリペプチドを含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを有する宿主細胞は、Ｅｋｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７３巻：３３７５〜３３８２頁、２００４年において記載されるように、組成物中に組み込まれる。
【０１２１】
ある種の組成物は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡの前に、その後に、またはそれと同時に１つ以上のアジュバントをさらに含むことができる。種々様々の物質は、様々なメカニズムを通してアジュバント活性を有することが示されてきた。本発明に従って免疫応答を増強するそれらの能力についてスクリーニングされてもよい、可能性のあるアジュバントは、ミョウバン、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子などのような不活性担体；ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）（ブロックコポリマーＣＲＬ−８９４１、スクアレン（代謝可能な油）、および微小粒子シリカ安定剤）などのようなプルロニックブロックポリマー、フロイントアジュバントなどのような貯蔵物形成剤（ｄｅｐｏｔ  ｆｏｒｍｅｒ）、サポニン、リゾレシチン、レチナール、Ｑｕｉｌ  Ａ、リポソーム、およびプルロニックポリマー製剤などのような表面活性物質；細菌性脂質多糖体などのようなマクロファージ刺激物質；キトサンなどのようなポリカチオンポリマー；インスリン、チモサン、内毒素、およびレバミソールなどのような代替経路補体活性化因子；ならびにポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）トリ−ブロックコポリマー、サイトカイン、および増殖因子などのような非イオン性界面活性剤；細菌構成成分（たとえば内毒素、特に超抗原、外毒素、および細胞壁構成成分）；水酸化アルミニウムなどのようなアルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウイルスおよびウイルス由来物質、毒、毒物（ｖｅｎｏｍ）、イミダゾキニリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｉｌｉｎｅ）化合物、ポロキサマー、ｍＬＴ、ならびにカチオン脂質を含むが、これらに限定されない。参照によって本明細書において組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９００５は、アジュバントとしての腸内毒素原性のＥ．ｃｏｌｉの熱不安定毒素の突然変異形態（「ｍＬＴ」）の使用を記載する。参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，０５７，５４０号は、アジュバント、Ｑｓ２１を記載している。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）刺激アジュバントである。たとえばＳｃｉｅｎｃｅ  ３１２巻：１８４〜１８７頁（２００６年）を参照されたい。ＴＬＲアジュバントは、ＴＬＲ（たとえばＴＬＲ１〜ＴＬＲ１７）を刺激する化合物を含み、本発明のワクチン組成物に対する免疫系応答の増加をもたらす。ＴＬＲアジュバントは、ＣｐＧ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）およびＭＰＬ（Ｃｏｒｉｘａ）を含むが、これらに限定されない。ＣｐＧアジュバントの一例は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ９８／０１８８１０、米国特許出願公開第２００２／０１６４３４１Ａ号、米国特許第６，７２７，２３０号、および国際特許出願公開ＷＯ９８／３２４６２において記載されるＣｐＧ７９０９である。
【０１２２】
アジュバントの投薬量は、特定のアジュバントに従って変動し得る。たとえば、いくつかの態様では、投薬量の範囲は、ＣｐＧについて１０μｇ／用量〜５００μｇ／用量または５０μｇ／用量〜２００μｇ／用量を含むことができる。投薬量の範囲は、ＭＰＬについて２μｇ／用量〜１００μｇ／用量または１０μｇ／用量〜３０μｇ／用量を含むことができる。投薬量の範囲は、水酸化アルミニウムについて１０μｇ／用量〜５００μｇ／用量または５０μｇ／用量〜１００μｇ／用量を含むことができる。初回刺激−追加免疫レジメンにおいて、本明細書において別記されるように、アジュバントは、初回刺激免疫処置、追加免疫免疫処置、またはその両方で使用されてもよい。
【０１２３】
ある種のアジュバント組成物では、アジュバントは、サイトカインである。本発明のある種の組成物は、１つもしくは複数のサイトカイン、ケモカイン、またはサイトカインおよびケモカインの産生を誘発する化合物または１つもしくは複数のサイトカイン、ケモカイン、またはサイトカインおよびケモカインの産生を誘発する化合物をコードするポリヌクレオチドを含む。サイトカインの例は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ）、インターフェロンオメガ（ＩＦＮ）、インターフェロンタウ（ＩＦＮ）、インターフェロンガンマ誘発因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化に際して調節、正常Ｔ細胞が発現し、推定上分泌する）、マクロファージ炎症タンパク質（たとえばＭＩＰ−１アルファおよびＭＩＰ−１ベータ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、およびＦｌｔ−３リガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
アジュバントが抗原に対する免疫応答を増加させる能力は、免疫媒介性の反応における有意な増加または疾患症状における低下によって典型的に示される。たとえば、体液性免疫における増加は、抗原に対して産生される抗体の力価における有意な増加によって典型的に示され、Ｔ細胞活性における増加は、細胞増殖、細胞傷害性、またはサイトカイン分泌の増加において典型的に示される。アジュバントはまた、たとえば、主として体液性のまたはＴｈ２の応答を主として細胞性のまたはＴｈ１の応答に変化させることによって、免疫応答を変えてもよい。所与の抗原に対する免疫応答は、当業者らに周知のおよび／または本明細書において別記される様々なイムノアッセイによって試験されてもよい。
【０１２５】
さらに、Ｍ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）ポリペプチドの複数のコピーは、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、または他の病原体由来のトキソイドなどのような細菌トキソイドにコンジュゲートされてもよい。さらに、ＭＥＴＲポリペプチドは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型細菌由来の莢膜多糖などのような細菌多糖にコンジュゲートされてもよい。
【０１２６】
固体組成物については、たとえば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、およびその他同種のものを含む、従来の無毒性固体担体が、使用されてもよい。経口投与については、薬学的に許容される無毒性組成物は、先に列挙されるそれらの担体などのような、通常用いられる賦形剤のいずれかおよび一般に、１０〜９５％の活性成分、すなわち、多くの場合２５％〜７５％の濃度の本発明の１つ以上のポリペプチドを組み込むことによって形成される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、多価ワクチンに関する。たとえば、本発明の多価ワクチンは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含むことができ、十分な量でその必要のある被験体に投与される場合に、ポリヌクレオチドもしくはベクター、たとえばＭＶＡは、２つ以上のインフルエンザエピトープをコードするまたはポリペプチドは、２つ以上のインフルエンザエピトープを含む。２つ以上のインフルエンザエピトープは、同じまたは異なる抗原に由来してもよい。ある実施形態では、多価ワクチンは、インフルエンザマトリックス２タンパク質およびさらなるインフルエンザタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘発する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の２つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含む。特定の実施例として、本発明は、ＭＶＡの２つ以上の集団を含む組成物を含むことができ、第１のＭＶＡは、本発明のＭ２外部ドメインペプチド（ＭＥＴＲ）の複数のコピーをコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを含み、第２のＭＶＡは、さらなる抗原、たとえば、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、さらなる抗原は、ＨＡ、ＮＰコンセンサス、その変異体、誘導体、類似体、または断片である。他の実施形態では、第２のＭＶＡにおけるさらなる抗原は、第１のＭＶＡにおいて発現されるＭＥＴＲ配列と同一でないＭ２ｅ外部ドメインの複数のコピーを含むポリペプチドである。
【０１２８】
ある実施形態では、本発明の多価ワクチン組成物は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含み、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡは、十分な量でその必要のある被験体に投与された際に、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発し、ポリペプチドは、１つ以上のさらなる生物および／またはウイルス、たとえばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ミクソウイルス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、たとえばＮ．ｇｏｎｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙ、鼠径部肉芽腫、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｉ型およびＩＩ型、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、モルシポックスウイルス属のポックスウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス、または水痘帯状疱疹ウイルスに対する免疫応答を誘発する。
【０１２９】
本発明の多価ワクチンは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡおよび適合するワクチンを含むことができ、本発明のワクチンおよび適合するワクチンの両方は、類似する患者集団、たとえば免疫不全集団、子供、幼児、または高齢者を対象とする。
【０１３０】
治療／予防およびレジメンの方法
被験体におけるインフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染と関連する状態を治療するまたは予防するための方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含有する組成物をその必要のある被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。ある実施形態では、被験体は、脊椎動物、たとえば哺乳動物、たとえば霊長類、たとえばヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、被験体、たとえば宿主動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法であって、任意の１つ以上の本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含有する有効量の組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、動物は、インフルエンザウイルスに対する暴露前にまたはインフルエンザウイルス症状にかかる前に健康な動物において１つ以上のインフルエンザウイルス種に対する免疫を確立しまたは増強し、したがって、疾患を予防するまたは疾患症状の重症度を軽減するために、予防的に、たとえば予防用ワクチンとして、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物を用いて治療することができる。１つ以上の本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物はまた、動物の免疫系をさらに刺激し、したがって、その暴露と関連する症状を軽減するまたはなくすために、既にインフルエンザウイルスに暴露されているまたは既にインフルエンザウイルス関連の症状に罹患している動物を治療するために使用することもできる。本明細書において定義されるように、「動物の治療」は、動物においてインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる症状、たとえばインフルエンザの重症度を予防する、治癒する、遅延させる、または軽減するためのおよび／または特定される期間にわたり症状の悪化をもたらさないための、１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、またはポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡを含む組成物の使用を指す。本発明の任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物は、インフルエンザウイルス感染に対する完全な保護を提供することまたはインフルエンザウイルス感染に関連する症状をすべて完全に治癒するもしくはなくすことは必要とされない。本明細書において使用されるように、「治療用および／または予防の免疫を必要性とする動物」は、インフルエンザウイルス感染に関連する症状の重症度を治療する、つまり、予防する、治癒する、遅延させる、もしくは軽減するおよび／または特定される期間にわたり症状の悪化をもたらさないことが望ましい動物を指す。
【０１３２】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含む医薬組成物を用いる治療は、必要に応じて、別々にまたは他の治療と同時に行うことができる。
【０１３３】
治療用の適用では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物は、症状および／または合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に阻止するために、インフルエンザウイルス由来のポリペプチドに対する有効なＣＴＬ応答を誘発するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的に有効な用量」または「ユニット用量」として定義される。この使用に有効な量は、たとえば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物、投与の様式、治療されている疾患の段階および重症度、患者の体重および健康状態の全身状態、ならびに指示する医師の判断に依存するであろう。一般に、ＭＶＡワクチンについての最初の免疫処置についての範囲は（治療用または予防用の投与のためのものである）、約１００ｐｆｕ〜約１×１０１５ｐｆｕのＭＶＡ、いくつかの実施形態では、約１０５ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕのＭＶＡであり、その後に、患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性を測定することによって、患者の応答および状態に依存し、数週間〜月にわたる追加免疫レジメンに従って、約１０３ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕの追加免疫投薬量、いくつか実施形態では、１０６ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕのＭＶＡが続く。代替の実施形態では、一般に、ヒトについて、最初の免疫処置についての用量範囲は（治療用または予防用の投与のためのものである）、７０ｋｇの患者について約１０ｐｆｕ〜約１×１０２０ｐｆｕのＭＶＡ、いくつか実施形態では、１０００ｐｆｕ、５×１０４ｐｆｕ、１０５ｐｆｕ、５×１０５ｐｆｕ、１０６ｐｆｕ、５×１０６ｐｆｕ、１０７ｐｆｕ、５×１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、５×１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、または１０１０ｐｆｕであり、その後に、患者の血液中の特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）活性を測定することによって、患者の応答および状態に依存し、数週間〜数か月にわたる追加免疫レジメンに従って、同じ用量範囲での追加免疫投薬量が続く。本発明の特定の非限定的な実施形態では、およそ１０ｐｆｕ〜約１×１０１５ｐｆｕまたはいくつかの実施形態では、１０４ｐｆｕ〜約１×１０１０ｐｆｕまたは１０７ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕの本発明のＭＶＡまたはその断片、誘導体、変異体、もしくはアナログが、宿主に投与される。
【０１３４】
本発明の非限定的な実施形態では、有効量の本発明の組成物は、投与前の抗体力価の少なくとも２または３倍までの抗体力価の上昇をもたらす。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡおよび組成物は、一般に、深刻な疾患状態、すなわち、生命を脅かすまたは可能性として生命を脅かす状況において用いられてもよいことに、留意しなければならない。そのような場合、外来性の物質の最小化およびポリペプチドの相対的な無毒性の性質を考慮して、治療する医師が、実質的な過剰量のこれらのポリペプチド組成物を投与することが可能であり、望ましく思われてもよい。
【０１３６】
治療用の使用については、投与は、インフルエンザウイルス感染の第１の徴候時に始められるべきである。少なくとも症状が実質的に緩和されるまで、かつその後のある期間、追加免疫用量がこれに続く。慢性感染では、初回用量、その後に続く追加免疫用量が必要とされてもよい。
【０１３７】
本発明の組成物を用いる感染した個体の治療は、急性的に感染した個体において感染の消失を促進してもよい。進行性の慢性感染に感受性の（またはそれを起こしやすい）それらの個体について、組成物は、急性から慢性感染への進展を予防する方法において特に有用である。感受性の個体が、本明細書において記載されるように、たとえば感染前にまたはその間に同定される場合、組成物は、彼らを対象とし、より多くの集団への投与の必要性を最小限にすることができる。
【０１３８】
特に、本発明の組成物は、筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心臓組織、たとえば心筋層、心内膜、および心膜、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵臓組織、腎臓組織、胆嚢組織、胃組織、腸の組織、睾丸の組織、卵巣の組織、子宮の組織、膣の組織、直腸の組織、神経系組織、眼組織、腺の組織、舌組織、または結合組織、たとえば軟骨を含むが、これらに限定されない動物の任意の組織に投与されてもよい。
【０１３９】
さらに、本発明の組成物は、肺、口、鼻腔、胃、腹膜腔、腸、任意の心腔、静脈、動脈、毛細管、リンパの腔、子宮腔、膣腔、直腸の腔、関節腔、脳において脳室、脊髄中の脊柱管、目の腔、唾液腺の管の管腔、または肝臓を含むが、これらに限定されない、脊椎動物の任意の内部の腔へ投与されてもよい。本発明の組成物が唾液腺の管の管腔または肝臓に投与される場合、所望のポリペプチドは、ポリペプチドが唾液腺および肝臓のそれぞれから脊椎動物の血流の中に送達されるように、唾液腺および肝臓のそれぞれにおいてコードされる。血流の中に所望のポリペプチドを放出するための唾液腺、肝臓、および膵臓を使用する胃腸系の分泌器官への投与のためのある種のモードは、両方がそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，８３７，６９３号および第６，００４，９４４号において開示される。
【０１４０】
ある実施形態では、本発明の１つ以上の組成物は、本明細書において記載される方法によって動物に送達され、それによって、有効な免疫応答および／または有効な治療用のもしくは予防の免疫応答を達成する。投与の任意のモードは、そのような応答を必要とする動物において、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を生成するおよび／またはインフルエンザウイルスに対する予防的にまたは治療的に有効な免疫応答を生成するのに十分な量で、モードが所望の組織において所望のポリペプチドの送達および／または発現をもたらす限り、使用することができる。開示される方法によれば、本発明の組成物は、粘膜送達、経皮的送達、皮下注射、静脈内注射、経口投与、肺投与、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与、または硬膜内注射を介してによって投与することができる。投与の他の適したルートは、気管内、経皮的、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、管内（たとえば膵臓の中への）、および実質内（つまり任意の組織の中への）投与を含むが、これらに限定されない。経皮的送達は、皮内（たとえば真皮または表皮の中に）、経皮的（たとえば経皮）、および経粘膜投与（つまり皮膚または粘膜組織の中へのまたはそれを通しての）を含むが、これらに限定されない。腔内投与は、経口、膣、直腸、鼻、腹膜、または腸の腔の中への投与ならびに鞘内（つまり脊柱管の中への）、室内（つまり脳室または心室の中への）、心房内（つまり心房の中への）、およびクモ膜下（つまり脳のクモ膜下腔の中への）投与を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
投与の任意のモードは、そのような応答を必要とする動物において、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を生成するおよび／またはインフルエンザウイルスに対する予防的にまたは治療的に有効な免疫応答を生成するのに十分な量で、モードが所望の組織において所望のポリペプチドの送達および／または発現をもたらす限り、使用することができる。本発明の投与手段は、針注射、カテーテル注入、微粒子銃注射器、粒子加速器（たとえば「遺伝子銃」または空気「無針」注射器）、Ｍｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，  Ｈ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１巻、１１〜２２頁（１９９４年））、Ｐｉｇｊｅｔ（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，  Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５巻、１９０８〜１９１６頁（１９９７年））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｄａｖｉｓ，  Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２巻、１５０３〜１５０９頁（１９９４年）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，  Ｒ．ら、Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４巻、１０９〜１１８頁（１９９８年））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ（Ｌｉｎｍａｙｅｒ，  Ｉ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ９巻：２９４〜２９７頁（１９８６年））、Ｍｅｄｉ−ｊｅｃｔｏｒ（Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｊ．およびＲｏｅｄｌ、Ｅ．  Ｊ．  Ｏｃｃｕｐ．  Ｍｅｄ．  ２１巻：８２１〜８２４頁（１９７９年））、ゲルフォーム（ｇｅｌｆｏａｍ）スポンジデポー剤、他の市販で入手可能なデポー剤物質（たとえばヒドロゲル）、浸透性ポンプ（たとえばＡｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉａｌ）固体（錠剤またはピル）医薬製剤、局所的スキンクリーム、およびデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）、ポリヌクレオチドコート縫合糸の使用（Ｑｉｎ，  Ｙ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５巻、２１９３〜２２０３頁（１９９９年））、または手術の間の局所的な適用を含む。投与のある種のモードは、筋肉内の針ベースの注射およびカテーテル注入を介しての肺適用である。この段落において引用される参考文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１４２】
本発明に従うポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物を用いる免疫処置に際して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＨＴＬ（ヘルパーＴリンパ球）および／またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）を産生することによってワクチンに応答する。したがって、宿主は、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫を持つようになるまたは進行中の慢性感染の発症に対して少なくとも部分的に抵抗性になる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物は、インフルエンザウイルス感染に対する動物の保護に十分な細胞媒介性免疫応答を刺激する。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、または組成物は、体液性免疫応答を誘発する。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡは、体液性および細胞媒介性応答の両方を刺激し、それらの組み合わせは、インフルエンザウイルス感染に対する動物の保護に十分である。
【０１４４】
さらに他の実施形態では、Ｔ細胞応答を誘発する構成成分は、対象の標的抗原に対する抗体応答を誘発する構成成分と組み合わせられる。したがって、本発明のある実施形態では、本発明のワクチン組成物は、対象の標的抗原に対する中和抗体応答を誘発するまたは促進するポリペプチドまたはポリヌクレオチドと組み合わせられる。そのような組成物の一実施形態は、ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（たとえば、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，７３６，１４２号において記載される）と共に、本発明に従うクラスＩエピトープを含む。
【０１４５】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、たとえばＭＶＡ、またはポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくはベクター、たとえばＭＶＡを含む組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動物の細胞の中に組み込むことができ、抗原性の量のインフルエンザＭ２由来ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて産生される。この方法による組成物の投与に際して、ＭＥＴＲポリペプチドは、免疫応答を誘発するのに十分な量で動物において発現される。そのような免疫応答は、たとえば、診断アッセイにおいてまたは検査室試薬として使用するための、インフルエンザウイルスに対する抗体を生成するために使用されてもよい。
【０１４６】
本発明は、動物においてインフルエンザウイルスに対する保護のおよび／または治療用の免疫応答を生成する、増強する、または調整するための方法であって、治療用のおよび／または予防の免疫を必要とする動物に、本明細書において記載される１つ以上の組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、所与の宿主生物、たとえばヒトにおける発現のために最適化された、本発明のポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドを含有する組換えＭＶＡまたはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を含む。組換えＭＶＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動物の細胞の中に組み込まれ、免疫学的有効量のインフルエンザウイルスポリペプチドまたは断片もしくは変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて産生される。この方法による組成物の投与に際して、インフルエンザウイルス由来のポリペプチドは、治療的にまたは予防的に有効な量で動物において発現される。
【０１４７】
本発明の組成物は、それが投与されている動物の生活環の間の任意の時間に動物に投与することができる。たとえば、組成物は、誕生の直後に与えることができる。ヒトにおいて、本発明の組成物の投与は、他のワクチンが投与されている間に、たとえば誕生時に、２か月、４か月、６か月、９か月で、１年で、５年で、または思春期の始めに、行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与は、免疫抑制治療の開始前に行うことができる。
【０１４８】
さらに、本発明の組成物は、任意の所望の免疫または投与レジメンにおいて、たとえば、単一の投与においてまたはその代わりに、毎年のワクチン接種などのような定期的なワクチン接種の一部としてまたは初回刺激−追加免疫治療法におけるように使用することができ、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、同じまたは異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与の前またはその後に投与される。
【０１４９】
最近の研究は、初回刺激−追加免疫プロトコールが、多くの場合、ワクチンを投与するための適した方法であることを示した。初回刺激−追加免疫プロトコールでは、本発明の１つ以上の組成物は、「初回刺激追加免疫」レジメンにおいて利用することができる。「初回刺激追加免疫」レジメンの例は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれるＹａｎｇ，  Ｚ．ら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７巻：７９９〜８０３頁（２００２年）において見出されてもよい。非限定的な実施例では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含む１つ以上のワクチン組成物は、動物に送達され、インフルエンザＭ２ポリペプチドに対する動物の免疫応答を初回刺激し、次いで、第２の免疫原性組成物は、追加免疫ワクチン接種として利用される。
【０１５０】
他の非限定的な実施例では、初回刺激組成物および追加免疫組成物は、単一の組成物または単一の製剤において組み合わせられる。たとえば、単一の組成物は、初回刺激構成成分としての、たとえば、インフルエンザタンパク質、その断片、変異体、誘導体、もしくは類似体をコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドもしくはベクターまたはインフルエンザタンパク質、その断片、変異体、誘導体、もしくは類似体を含む単離ポリペプチドおよび追加免疫構成成分としての本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクター、たとえばＭＶＡを含むことができる。この実施形態では、初回刺激構成成分および追加免疫構成成分がともに混合される場合、組成物は、単一のバイアル中に含有されてもよい。一般に、ポリヌクレオチド由来のポリペプチドの発現のピークレベルは、投与後のもっと後になるまで（たとえば７〜１０日）生じないので、ポリヌクレオチド構成成分は、単離ポリペプチド構成成分に対する追加免疫を提供してもよい。初回刺激構成成分および追加免疫構成成分の両方を含む組成物は、「コンビナトリアルワクチン組成物」または「単一製剤異種初回刺激−追加免疫ワクチン組成物」と本明細書において呼ばれる。さらに、初回刺激組成物は、追加免疫組成物の前にまたは追加免疫組成物が作用するのにより長くかかると予想される場合、追加免疫組成物の後でさえ、投与されてもよい。
【０１５１】
他の実施形態では、初回刺激組成物は、追加免疫組成物と同時であるが、初回刺激構成成分および追加免疫構成成分が分離されている別々の製剤において、投与されてもよい。
【０１５２】
キット
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくはベクター、たとえばＭＶＡまたは組成物は、本発明の組換えＭＶＡまたは組成物を投与するための手段と一緒に、キットの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、キットは、ワクチン投与についての説明書をさらに含むことができる。
【０１５３】
典型的に、キットは、たとえばユニット剤形の、容器中の本発明の所望の組成物（複数可）および投与についての説明書を含むであろう。本発明の組成物を投与するための手段は、たとえば、無菌注射器、エアロゾルアプリケーター（たとえば鼻もしくは肺投与の吸入器もしくは任意の他の手段）、ゲル、クリーム、経皮的パッチ、経粘膜パッチ（または頬側もしくは舌下投与の任意の他の手段）、または経口錠剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物を投与するための２つ以上の手段、たとえば２つ以上の注射器を含有する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、キットは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または組成物を含む１つを超える容器を含んでいてもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、キットは、本発明の初回刺激構成成分を含有する容器および本発明の追加免疫構成成分を含む別々の容器を含んでいてもよい。
【０１５５】
必要に応じて、通知または印刷された説明書は、そのような容器（複数可）と関連させることができる。たとえば、そのような印刷された説明書は、医薬品または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態とすることができ、この通知は、本発明のヒト投与についての製造、使用、または販売についての機関による承認を表わす。「印刷された説明書」は、たとえば、本、小冊子、パンフレット、またはリーフレットのうちの１つとすることができる。
【０１５６】
キットはまた、キットの構成成分を保存するための保存ユニット（たとえば投与の手段、本発明の組換えＭＶＡまたは組成物を含む容器、印刷された説明書など）を含むことができる。保存ユニットは、たとえば、本発明において使用するに適したバッグ、ボックス、エンベロープ、または任意の他の容器とすることができる。たとえば、保存ユニットは、本発明の方法を施すのに必要であってもよいそれぞれの構成成分を収容するのに十分に大きい。
【０１５７】
本発明はまた、その必要のあるヒトなどのような動物に本発明の組換えＭＶＡまたは組成物を送達するための方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物を投与することが許可された管理者（たとえば医師、医師助手、ナースプラクティショナー、薬剤師、獣医）の識別をコンピューター読み取り可能なメディアに登録するステップ、（ｂ）本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物の付随する危険性に関するカウンセリング情報をヒトに提供するステップ、（ｃ）付随する危険性にもかかわらず本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物を受けるためのヒトからのインフォームドコンセントを得るステップ、および（ｅ）本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物をヒトが入手するのを許可するステップを含む方法をも含むことができる。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１）
組換えベクターの構築
インフルエンザＡ型遺伝子Ｐｒ８ＨＡ（配列番号５１〜５２）、ＮＰコンセンサス（配列番号１９〜２０）、Ｐｒ８Ｍ２（配列番号１３〜１４）、Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ（配列番号５３〜５４）、ＭＥＴＲ＿Ｓ（配列番号１７〜１８および５６）、ならびにＭＥＴＲ＿Ｃ（配列番号１５〜１６および５５）の配列を、ｖＥＭ１１組換えベクター中にクローニングした（図１）。結果として生じる組換えベクターｖＥＭ４７（ＮＰコンセンサス配列をコード）、ｖＥＭ５８（ＭＥＴＲ＿Ｓペプチドをコード）、ｖＥＭ５７（ＭＥＴＲ＿Ｃペプチドをコード）、ｖＥＭ６１（Ｐｒ８Ｍ２をコード）、ｖＥＭ６２（Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬをコード）、およびｖＥＭ６５（Ｐｒ８ＨＡをコード）を図２Ａ〜Ｆに示す。
【０１５９】
（実施例２）
組換えウイルスの相同組換えおよび単離
修飾ＭＶＡウイルスベクター、ＭＶＡｔｏｒ（商標）（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中へのインフルエンザ遺伝子の挿入のために、ＣＥＦ細胞を、ＭＶＡｔｏｒにより感染させ、続いて、図２Ａ〜Ｆに示す組換えベクターによりトランスフェクトした。それぞれのベクター当たり並行して２〜３のセットアップを実行した。最初に、５×１０５ＣＥＦ細胞を６つのウェルプレートのウェル当たりに接種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。翌日に、細胞密度は、ウェル当たり１０６細胞であることが想定された。ＭＶＡｔｏｒ標準物質は、５００μｌが５×１０４ＴＣＩＤ５０を含有し、つまり、１×１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの作用濃度で、０．０５のｍｏｉをもたらすように、１ｍｌ当たり４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２．５μｇのゲンタマイシンを含有するＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ中に希釈した。感染のために、増殖培地を細胞から除去し、５００μｌの希釈ＭＶＡｔｏｒ標準物質をウェル当たりに追加し、揺らしながら室温で１時間、インキュベートした。ウイルス接種材料を除去し、細胞をＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭを用いて洗浄した。感染細胞を２．０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ中に残し、トランスフェクション反応をセットアップした。
【０１６０】
トランスフェクション反応は、無菌５ｍｌ  ＰＳチューブ中に設定した。およそ１．０〜２．０μｇ  ＤＮＡの組換えベクターおよび６μｌトランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ）を、供給者によって提供されるＦｕＧＥＮＥ  ＨＤの標準的なプロトコールに従って実行したトランスフェクションに使用した。細胞は、インキュベーター中で３７℃および５％ＣＯ２で４８時間、インキュベートした。
【０１６１】
インキュベーション後に、細胞は、細胞内のＭＶＡｔｏｒおよび組換えベクターの存在を示す蛍光細胞についてスクリーニングした。細胞は、蛍光焦点についてスクリーニングし、最も効率的なｇｆｐ発現を有するセットアップを、選択的条件下での組換えＭＶＡｔｏｒの２〜３回の継代培養のために使用した。この継代培養のために、感染トランスフェクト細胞は、セルリフターを使用することによって培地の中にこすり取り、１．５ｍｌバイアルに移動させた。ウイルスは、ＥＰＤＤ−ＳＯＰ−ＥＱＵ−０３３によって超音波処理により遊離した。１／１０〜１／２のトランスフェクションセットアップは、１２ウェルプレート中に接種した新鮮なＣＥＦ細胞上で平板培養し、１ｍｌまで充填し、１ｍｌ当たり５μｇのブラスチシジンを追加した。
【０１６２】
組換えＭＶＡｔｏｒをプラーク精製するために、組換えＭＶＡｔｏｒは、選択的条件（Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ  １ｍｌ当たり５μｇ／ｍｌブラスチシジン）下で、それぞれ６ウェルプレートおよび９６ウェルプレート中の段階希釈溶液中に接種した。単一の蛍光プラークを、１００μｌピペットを使用することによって単離した。単離したウイルスは、１．５ｍｌのバイアルに移動させ、超音波処理によって遊離した。ウイルスは、空ベクターに対してＰＣＲによって分析し（下記に記載されるように）、最も弱い空ベクターシグナルを示す分離株を、１２ウェルプレート中に接種した新鮮なＣＥＦ細胞上で継代培養する。分離株に空ベクターがなくなるまで、プラーク精製を繰り返した。純粋なクローンを単離するとすぐに、ウイルスをブラスチシジンなしで継代培養し、選択／レポーターカセットを欠く非蛍光ウイルスを単離した。
【０１６３】
選択カセットの削除のために、純粋な組換えウイルスをブラスチシジンなしで継代培養した。蛍光を有していないプラークを単離し、ゲノム中の期待されるインフルエンザＡ型遺伝子の挿入について試験した。次いで、組換えＭＶＡｔｏｒを、３×Ｔ１７５まで増幅させ、詳細な予備試験を、以下のウイルス株において実行した（ＰＣＲ、配列決定、発現、力価）：（１）ＭＶＡｔｏｒ−ＮＰコンセンサス（ｍＥＭ１０）、Ｐ２１ｐｐ８、（２）ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｃ（ｍＥＭ１８）、Ｐ１４ｐｐ８、（３）ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｓ（ｍＥＭ１９）、Ｐ１８ｐｐ１３、（４）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２（ｍＥＭ２２）、Ｐ１３ｐｐ３、（５）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ（ｍＥＭ２３）、Ｐ１４ｐｐ３、および（６）ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８ＨＡ（ｍＥＭ１７）。ウイルス株は、１００％正確な配列読み取りを有し、残存性の空ベクターがなく、機能的であることが示された。
【０１６４】
選択／レポーターカセットを欠く純粋な組換えＭＶＡｔｏｒの単離後に、ウイルスは、Ｔ２２５フラスコ上で増幅させた。１０のＴ２２５フラスコ初代ＣＥＦ細胞を、それぞれの個々の組換えＭＶＡｔｏｒの増幅のために、総量４０のＴ２２５フラスコにおいて１：４に分割した。２日間のインキュベーション後に、１つのフラスコの細胞を、トリプシン処理し、カウントした。３９のＴ２２５フラスコは、０．１のｍｏｉにより感染させ、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。フラスコを収集し、すべてのフラスコの内容物をプールした。ホモジナイゼーションプールウイルス株は、フローセルデバイスを使用して、超音波処理により実行した。精製する必要があったウイルス株を含有するフラスコは、氷上に置き、フローセルに接続した。超音波フローセルデバイスは、以下のように設定した：１００％までの振幅、サイクル１、５０ｍｌ／分のポンプ速度、つまり０．８、およびスイッチオン。調査後に、株を精製まで凍結させた。
【０１６５】
力価を考慮し、精製した株を希釈し、１ｍｌ当たり１０９のＴＣＩＤ５０（公称力価）を含有するバイアル当たり６００μｌの最終充填容量まで充填した。充填により、ウイルスごとに以下の量のバイアルがもたらされた：（１）９１×ＭＶＡｔｏｒ−ＮＰコンセンサス（ｍＥＭ１０）；（２）３５×ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｃ（ｍＥＭ１８）、（３）２９×ＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｓ（ｍＥＭ１９）、（４）５６×ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２（ｍＥＭ２２）、（５）３８×ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ（ｍＥＭ２３）、および（６）３０×ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８ＨＡ（ｍＥＭ１７）。バイアルはすべて、さらなる使用、つまり試験または輸送まで−７０℃で保存した。ウイルスごとの１つのバイアルを、−７０℃試料アーカイブにおいてアーカイブした。
【０１６６】
（実施例３）
空ベクターコンタミネーションの排除のためのＰＣＲ
残存性の非組換えＭＶＡｔｏｒが、精製ウイルス株の充填バイアルからうまく除かれていることを確認するために、精製し、充填した、ｍＥＭ１０についてのＭＶＡｔｏｒ−ＮＰ、ｍＥＭ１８についてのＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｃ、ｍＥＭ１９についてのＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ＿Ｓ、ｍＥＭ２２についてのＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２、またはｍＥＭ２３についてのＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ＿ＴＭＬ由来のＤＮＡを単離し、ＰＣＲのために使用した。組換えウイルスについての陽性対照として、組換えベクターｖＥＭ４７を使用した（ｖＥＭ４７）。空ベクターについての陽性対照として、ＭＶＡｔｏｒから単離したＤＮＡを使用した（ＭＶＡ）。陰性対照として、Ｈ２ＯおよびＣＥＦ細胞を使用した。
【０１６７】
（実施例４）
挿入部位のインフルエンザ遺伝子およびフランキング配列についての配列決定
それぞれのウイルスのＤＮＡを単離し、全挿入部位を、プライマー５’−−ｇｇａｇｃｔｃｃａｃｔａｔｔｔａｇｔｔｇｇｔｇｇｔｃｇｃｃ−３’（配列番号３２）（ｏＶＩＶ４７）および５’−ｃｇｇｇｔａｃｃｃｔａｇｔｔｔｃｃｇｇｔｇａａｔｇｔｇ−３’（配列番号３３）（ｏＶＩＶ８９）を使用し、ＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーを使用して、挿入されたインフルエンザ遺伝子および相同組換えに使用されたフランキング配列を増幅する（図４）。
【０１６８】
ＰＣＲ断片を精製し、配列決定のためにＧＡＴＣに送った。配列決定のために、プライマーは、下記に提供されるように、ＰＣＲ断片全体をカバーするように選んだ。
【０１６９】
【表５−１】
2013523096.tif 000013
【０１７０】
【表５−２】
2013523096.tif 000014
【０１７１】
【表５−３】
2013523096.tif 000015
（実施例５）
インフルエンザポリペプチドの発現分析
ウエスタンブロットは、ＭＶＡｔｏｒ−ＮＰならびに両方のＭＶＡｔｏｒ−ＭＥＴＲ構築物の発現を分析するために実行した（ＭＥＴＲ＿Ｃポリペプチドについての配列番号１６およびＭＥＴＲ＿Ｓポリペプチドについての配列番号１８）。６ウェルプレートにおいて、６×１０５細胞を、ウェルの適切な量でウェル当たりに接種した。ウェルの量は、以下のように決定した：組換えＭＶＡｔｏｒ試料およびＭＶＡｔｏｒ対照およびＣＥＦ対照の数。細胞は、標準的なプロトコールに従って、１のｍｏｉを使用し、それぞれ、ＭＶＡｔｏｒおよびＭＶＡｔｏｒ−ＮＰ／−ＭＥＴＲ＿Ｓ、−ＭＥＴＲ＿Ｃを感染させた。感染の２４時間後に、ウェル当たり３００μｌ  ＲＩＰＡバッファー（氷上であらかじめ冷却）を追加し、プレートを氷上で５分間、インキュベートした。細胞をＲＩＰＡバッファーの中にこすり取り、細胞懸濁液を、１．５ｍｌのバイアル中にそれぞれ移動し、氷上に置いた。０．５μｌの量のプロテアーゼ阻害剤カクテルをそれぞれのバイアルに追加した。試料当たり６０μｌの容量を新しい１．５ｍｌバイアルの中に移動し、２２μｌローディング色素および８μｌ  ２−メルカプトエタノールを追加した。インフルエンザウイルス陽性対照については、５μｌの不活性化インフルエンザウイルスを使用した。８μｌの容量のＲＩＰＡバッファーを追加した。試料はすべて、５分間、氷上でインキュベートした。その後、試料はすべて、サーモミキサーにおいて９５℃で１０分間、加熱した。
【０１７２】
血球吸着アッセイ（ＨＡＤ）は、ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８ＨＡの発現を分析するために実行した。この目的のために、ＣＥＦ細胞を、それぞれ、ＭＶＡｔｏｒおよびＭＶＡｔｏｒ−ＨＡ（ｍＥＭ１７）により感染させた。細胞の他のセットは偽感染させた。感染の２４時間後に、細胞は、ヒト血液の１％赤血球希釈液と共にインキュベートした（図６）。
【０１７３】
免疫学的検定は、ＭＶＡｔｏｒ−Ｍ２およびＭＶＡｔｏｒ−Ｍ２ｅ−ＴＭＬの発現を分析するために実行した（図７）。細胞は、ＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２（図７Ａ）およびＭＶＡｔｏｒ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ（図７Ｂ）により感染させた。並行して、細胞はＭＶＡｔｏｒにより感染させたまたは感染を伴うことなくインキュベートした。
【０１７４】
（実施例６）
ＭＶＡワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効能−体重およびウイルス負荷
ＭＥＴＲ−Ｃ（配列番号１６）またはＭＥＴＲ−Ｓ（配列番号１８）を発現するＭＶＡｔｏｒを、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効能について試験した。ＭＶＡワクチンの効能は、１）対照群と比較した、抗原投与群におけるマウスの体重減少または死亡および２）肺におけるウイルス負荷を評価することによって観察した。群のマウス（群当たり８匹のマウス）を、ＭＶＡワクチンを用いて２度、筋肉内で免疫した：（１）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２（インフルエンザＡ型ウイルスプエルトリコ  １９３４  Ｈ１Ｎ１（Ｐｒ８）の完全長Ｍ２を発現するＭＶＡ構築物）；（２）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ（Ｍ２の天然の膜貫通領域（ＴＭＬ）を発現するＭＶＡ構築物）；（３）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｃ（システインを有するＭＥＴＲポリペプチドを発現するＭＶＡ構築物）；（４）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｓ（システインがセリンと置換されたＭＥＴＲポリペプチドを発現するＭＶＡ構築物）；（５）ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ（ＮＰコンセンサス配列を発現するＭＶＡ構築物）；（６）ＭＶＡｔｏｒ（ＭＶＡベクターのみ）；および（７）陰性対照としてのＰＢＳ。
【０１７５】
免疫処置の３週間後に、マウスは、マウス１匹当たり６２９  ＴＣＩＤ５０の５０μＬのインフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４、Ｈ１Ｎ１）により肺内で感染させた。マウスは、体重低下について毎日モニターした。データは、抗原投与前の体重と比較した平均値±ＳＥＭ（パーセンテージ）とする。体重低下が２５％に達した場合、マウスは安楽死させられた。その結果として、陰性対照マウスは、体重減少を受けて、死亡した。体重減少は、ＭＶＡ−Ｍ２ｅＴＭＬ構築物（１４％）を受けたマウスにおいて測定可能であったが、ＭＥＴＲ構築物は、完全長Ｍ２（Ｐｒ８Ｍ２）と同様に、７％のみの体重減少しかもたらさなかった。
【０１７６】
感染したマウス肺からインフルエンザウイルスの定量的回収を実行し、ウイルス負荷は、先のワクチン接種による免疫の有益性を決定するために比較した。
【０１７７】
個々のマウス肺を含有する４本のクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）の群を−８０℃から取り出し、解凍するために氷上に置いた。それぞれの肺を量った。Ｌ−１５−２ｘ  ＰＳＫ培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ＋４ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋２×抗菌性抗真菌剤）を、肺重量が全容量の１０％と等しくなるように、それぞれのチューブに移動させた。それぞれの肺は、完了するまで（３０秒間〜１分間）、Ｐｏｗｅｒ  Ｇｅｎ  １２５および使い捨てのホモジナイザーを使用してホモジナイズした。肺ホモジネートは、４℃、３００００ｒｐｍで、２０分間、遠心沈殿させた。肺ホモジネート上清を等分した；ＴＣＩＤ５０のための２００μＬおよび４００μＬの２つの一定分量をドライアイス中で直接凍結させる。これらの一定分量を−８０℃で保存した。
【０１７８】
肺ホモジネートをボルテックスし、２０μＬは、トリプシン（ＴＰＣＫ）および４ｍＭグルタミンおよび２×抗菌性抗真菌剤を含有する無血清ＭＥＭの１８０μＬ中に４×１０５細胞の、１８〜２４時間、あらかじめ平板培養したＭＤＣＫ細胞を含有する４つのウェルに追加した。段階１０倍希釈は、列Ａから２０μＬを列Ｂにおける培地の１８０μＬに移動させ、列Ｈまで継続することによって、プレートで実行した。インフルエンザウイルスＡ型／ＰＲ／８／３４株ＡＴＣＣ  ＶＲ−９は、陽性対照として、３枚に１つのアッセイプレートの４つのウェルにおいてＭＤＣＫ細胞を感染させるために使用した。陽性対照Ａ／ＰＲ／８／３４の供給源は、温度が故障していた−８０℃フリーザーで保存された３つのバイアル供給源由来のものとした。感染したＭＤＣＫ細胞は、４日間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。プレートは、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＭＤＣＫ細胞は、０．１％シチメンチョウ赤血球細胞と共に３０分間、４℃でインキュベートした。非付着性のシチメンチョウ赤血球細胞は、４回、ＰＢＳを用いて力強く洗浄し、感染したＭＤＣＫ細胞は、接着性赤血球細胞によって目に見えた。ｌｏｇ  １０  ＴＣＩＤ５０力価は、ＭＤＣＫ細胞の感染ウェルをカウントすることから計算した。結果は、それぞれのマウスについての肺組織のグラム重量で割った、Ｌｏｇ  １０  ＴＣＩＤ５０の真数の計算によってＴＣＩＤ５０／グラム重量肺組織を表現した。平均値、標準偏差、および％として表現する変動係数を、それぞれの群について決定した。
【０１７９】
（実施例７）
免疫したマウスにおけるＭ２ｅに対する抗体応答
免疫した動物の抗体力価を試験するために、マウスを、ＭＶＡワクチンを用いて筋肉内で１回、２回、または３回、免疫した：（１）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２、（２）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ；（３）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｃ、（４）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｓ、（５）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２＿ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ；（６）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ＋ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ；（７）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ＋ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ；（８）ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ、（９）対照群、（１０）挿入物を有するＭＶＡウイルス（インフルエンザ抗原を発現せず）；（１１）ＰＲ８感染性インフルエンザウイルスを使用する致死量以下の感染（ＭＶＡワクチンなし）；および（１２）陽性対照としてのＰＢＳ。最終免疫後に、マウスに、感染性インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｒ／８／３４）を使用して抗原投与した。Ｍ２  ＥＬＩＳＡを実行するために、Ｍ２ｅ領域から成るビオチン化ペプチドを、アビジンの形態を介してＥＬＩＳＡプレート上に固定した。Ｍ２外部ドメインタンデムリピート（ＭＥＴＲ）内で示される６つのペプチドのうちで、代表的な抗Ｍ２ｅ力価は、インフルエンザＡ型プエルトリコ  １９３４  Ｈ１Ｎ１に相当するペプチド４のＥＬＩＳＡプレートコートを使用することによって得た。ペプチド＃４（配列番号４）認識についての血清力価は、表６に要約する。
【０１８０】
【表６】
2013523096.tif 000016
図１０において示されるように、複数のＭ２ｅ領域を発現するＭＶＡ−ＭＥＴＲワクチンは、ＭＶＡ−Ｍ２ワクチンよりも高度な力価血清レベルのＩｇＧ抗Ｍ２ペプチドを生成した。
【０１８１】
さらなる研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＭＶＡワクチンを用いて、肺（ＩＮ）に対して鼻腔内でまたは筋肉内で（ＩＭ）、２度、免疫した。（１）インフルエンザＡ型ウイルスプエルトリコ  １９３４  Ｈ１Ｎ１の致死量以下の用量（陽性対照）、（２）ＭＶＡ−ＨＡ（完全長ＨＡを発現するＭＶＡ構築物）；（３）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｓ（セリン置換を有するＭＥＴＲを発現するＭＶＡ構築物）；（４）ＭＶＡ−Ｍ２（完全長Ｍ２を発現するＭＶＡ構築物）；（５）ＭＶＡ−ＭＥＴＲ−Ｃ（天然のシステインを有するＭＥＴＲを発現するＭＶＡ構築物）；（６）ＭＶＡ−Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ（Ｍ２の天然の膜貫通領域（ＴＭＬ）を含有したＭＶＡ構築物；（７）ＰＢＳ（陰性対照）；（８）ＭＶＡ−ＣｏｎｓＮＰ（ＮＰコンセンサスを発現するＭＶＡ構築物）；および（９）ＭＶＡｔｏｒのみ（陰性対照）。免疫血清は、ワクチンの第２の免疫処置の２１日後に得、４つのペプチドのうちの１つを用いてコートしたＥＬＩＳＡによって試験した。それぞれ、インフルエンザＡ型ウイルスタンパク質の異なる株に相当する：Ｍ２ｅ＃１  Ｈ５  １９９９〜２００８（図の後方から２番目のバー）；Ｍ２ｅ＃４  Ｈ１およびＨ３ヒト（図の後方のバー）；Ｍ２ｅ＃５  Ｈ９およびＨ６（図の前方から２番目のバー）；Ｍ２ｅ＃６  Ｈ７およびＨ３、Ｈ８、Ｈ１０、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ９（図の前方のバー）。
【０１８２】
【表７】
2013523096.tif 000017
免疫した鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）免疫したマウスにおける体重変化を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。
【０１８３】
鼻腔内で（ＩＮ）または筋肉内で（ＩＭ）免疫したマウスにおけるウイルス負荷を測定した。ＭＶＡワクチンを用いて２回免疫したマウスの肺組織におけるウイルス量は、インフルエンザＡ型ウイルスを用いる抗原投与の３日後に測定した。データを図１２に示す。
【０１８４】
（実施例８）
ＮＰおよびＭ２で免疫したマウスにおける低用量のＨ１Ｎ１  ＰＲ８の抗原投与に対する免疫応答
相同な低用量インフルエンザ感染（Ｈ１Ｎ１  Ｐｒ８）に対するＮＰ＋Ｍ２ワクチン接種の効能をマウスにおいて試験した。この研究のためのマウスは、表８において要約されるような保存インフルエンザ抗原を含有するＭＶＡｔｏｒベースのワクチンを用いて、０日目および２１日目に筋肉内で免疫した。
【０１８５】
【表８】
2013523096.tif 000018
マウスは、４２日目に、鼻腔内投与したＨ１Ｎ１  ＰＲ８（＜２  ＬＤ５０）を用いて抗原投与した。体重、生存、およびウイルス量（２および４日目）を分析した。
【０１８６】
図１３において示されるように、ＨＡ、ＮＰ、Ｍ２＋ＮＰ、および非致死的免疫群は、体重損失から保護された。Ｍ２免疫群では、１０匹のマウスのうちの６匹は、８日目までに＜２０％の体重を失った。ＭＶＡｔｏｒ免疫群では、１０匹のマウスのうちの１０匹は、８日までに＜２０％の体重を失った。すべての処理および対照群について１００％生存していた。
【０１８７】
さらなる研究において、抗ＮＰ免疫応答は、組換えＮＰ（ＩｍＧｅｎｅｘ）コートプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡ結果は、１ｄ２１  ＭＶＡ、２ｄ２１  ＭＶＡ、１ｄ２１  ＭＶＡ＋ＮＰ、２ｄ２１  ＭＶＡ＋ＮＰ、１ｄ２１  ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ＋ＭＶＡ−ＮＰ、２ｄ２１  ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ＋ＭＶＡ−ＮＰ、１ｄ２１非致死的Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８、および２ｄ２１非致死的Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８について図１４に示す。「１ｄ２１」は、単一のワクチン接種後に測定した免疫応答を指し、「２ｄ２１」は、ワクチン構築物の２回の用量後に測定した免疫応答を指す。これらの結果は、抗ＮＰ免疫応答が２回の免疫後に観察されたことを示す。
【０１８８】
ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＨＡ、ＭＶＡ−ＮＰ、ＭＶＡ−Ｍ２ｅＡ、ＭＶＡ−Ｍ２ｅ＋ＮＰ、またはＡ／ＰＲ／８／３４を用いて筋肉内で（ＩＭ）免疫したマウスの肺組織におけるウイルス量を、Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８ウイルスを用いる抗原投与の２および４日後に測定した。ウイルス量の結果を図１５に示す。ＭＶＡ−ＨＡを用いて免疫した動物は、２日目および４日目の両方で肺の量において２〜３ｌｏｇの低下を有した。結果は、ＮＰ＋Ｍ２を用いて免疫した動物が２日目に肺ウイルス量における２−ｌｏｇの低下を示したことを示す。しかしながら、ＮＰまたはＭ２抗原を受けた群のいずれにおいても４日目に肺におけるウイルス複製の有意な減少はなかった。
【０１８９】
（実施例９）
ＮＰおよびＭ２で免疫したマウスにおける、致死的な用量のＨ１Ｎ１  ＰＲ８抗原投与に対する免疫応答
相応する致死的な用量のインフルエンザ感染（Ｈ１Ｎ１  Ｐｒ８）に対するＮＰ＋Ｍ２ワクチン接種の効能をマウスにおいて試験した。この研究のためのマウスは、表９において要約されるような保存インフルエンザ抗原を含有するＭＶＡｔｏｒベースのワクチンを用いて、０日目および２１日目に鼻腔内で（ＩＮ）または筋肉内で（ＩＭ）免疫した。
【０１９０】
【表９】
2013523096.tif 000019
マウスは、４２日目に、鼻腔内投与したＨ１Ｎ１  ＰＲ８（３  ＬＤ５０）を用いて抗原投与した。赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）（抗原投与前）、体重、生存、およびウイルス量（３日目）を分析した。
【０１９１】
「ＰＲ８」を略称されるインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１  プエルトリコ  ８／１９３４は、マウス適応インフルエンザウイルスであり、この研究のためにＨＡＩアッセイにおいて使用した。ＨＡＩ前に、ＰＲ８は、シチメンチョウ赤血球細胞を使用して、赤血球凝集素能力についてアッセイし、その後、ＨＡＩを実行するために１ｍＬ当たり８赤血球凝集素ユニット（希釈係数１０２４）の適切な濃度に希釈した。ＨＡＩのために、２５μＬのマウス血清を、３７℃で、３０分間、７５μＬ受容体破壊酵素（ＲＤＥ）と共にインキュベートし、その後に続いて、通常生理食塩溶液において２５０μＬまで希釈し（血清の１／１０希釈）、使用まで４℃で保存した。
【０１９２】
血清は、３つまたは４つの血清のプールにおいてＨＡＩ手順を使用して試験した。血清（２５μＬ）は、２５μＬ  ＰＢＳにおいて連続２倍希釈で希釈し、これに、２５μＬの希釈インフルエンザウイルスを追加し、室温で３０分間、インキュベートした。シチメンチョウ赤血球細胞（５０μＬ、洗浄し、希釈する）を追加し、室温で６０分間、インキュベートし、その後に、赤血球凝集の阻害についての評価を続けた。ＨＡＩ結果を表１０に示す。
【０１９３】
【表１０】
2013523096.tif 000020
図１６Ａおよび１６Ｂにおいて示されるように、ＮＰ＋Ｍ２免疫群は、体重損失から保護された。免疫した群はすべて、死亡から１００％保護されたが、ＭＶＡｔｏｒおよびＰＢＳの対照群は、０％（０／１０）の生存をもたらした。
【０１９４】
さらなる研究において、抗ＮＰおよび抗Ｍ２免疫応答は、それぞれ、組換えＮＰ（ＩｍＧｅｎｅｘ）およびＭ２ペプチド＃４（配列番号４）コートプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって試験した。抗ＮＰ  ＥＬＩＳＡ結果は、ＣｏｎｓＮＰ、Ｐｒ８Ｍ２＋ＣｏｎｓＮＰ、Ｐｒ８Ｍ２ｅ−ＴＭＬ＋ＣｏｎｓＮＰ、ＭＥＴＲ−Ｃ＋ＣｏｎｓＮＰ、およびＭＥＴＲ−Ｓ＋ＣｏｎｓＮＰについて図１７に示す。抗Ｍ２  ＥＬＩＳＡ結果は、Ｍ２、Ｍ２−ＴＭＬ、ＭＥＴＲ−Ｃ、ＭＥＴＲ−Ｓ、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ２−ＴＭＬ＋ＮＰ、ＭＥＴＲ−Ｃ＋ＮＰ、およびＭＥＴＲ−Ｓ＋ＮＰについて図１８に示す。これらの結果は、抗ＮＰおよび抗Ｍ２免疫応答が、ワクチン接種した動物において生成されたことを示す。
【０１９５】
ＰＢＳ  ＩＮ、ＭＶＡｔｏｒ、ＮＰ、Ｍ２、Ｍ２ｅ−ＴＭＬ、ＭＥＴＲ−Ｃ、ＭＥＴＲ−Ｓ、ＨＡ、および致死量以下のＰＲ８  ＩＮを用いて鼻腔内で（ＩＮ）または筋肉内で（ＩＭ）免疫したマウスの肺組織におけるウイルス量は、抗原投与の３日後にＨＩＮ１  ＰＲ８ウイルスを用いて測定した。ウイルス量の結果を図１９に示す。これらの結果は、ＮＰ、Ｍ２、Ｍ２ｅ−ＴＭＬ、ＭＥＴＲ−Ｃ、およびＭＥＴＲ−Ｓを用いて鼻腔内で免疫した動物が、肺におけるウイルス複製から部分的に保護されたことを示す。筋肉内ＮＰまたはＭ２抗原を受けた群において肺におけるウイルス複製の有意な減少はなかった。
【０１９６】
（実施例１０）
ＮＰ、Ｍ２、およびＭ１で免疫したマウスにおける致死的な用量のＨ１Ｎ１ブタの抗原投与に対する免疫応答
相同で致死的な用量のインフルエンザ感染（ｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９）に対するＮＰ＋Ｍ２＋Ｍ１ワクチン接種の効能をマウスにおいて試験した。この研究のためのマウスは、表１１において要約されるような保存インフルエンザ抗原を含有するＭＶＡｔｏｒベースのワクチンを用いて、０日目および２１日目に筋肉内で免疫した。
【０１９７】
【表１１】
2013523096.tif 000021
マウスは、４２日目に、鼻腔内投与したｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９（約２０  ＬＤ５０）を用いて抗原投与した。赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）（抗原投与前）、体重、生存、およびウイルス量（２および４日目）を分析した。
【０１９８】
ＨＡＩアッセイは、実施例９において上記に記載されるように実行した。ＨＡＩ結果を表１２に示す。
【０１９９】
【表１２】
2013523096.tif 000022
Ｆｌｕｌａｖａｌ用量をマウス：１５０μＬ、ＩＭ（３つのウイルスのそれぞれについて４．５μｇ  ＨＡ）；ヒト用量：５００μＬ、ＩＭ（３つのウイルスのそれぞれについて１５μｇ  ＨＡ）に与えた。群１（Ｆｌｕｌａｖａｌ）および群８（ＰＢＳ）についてあらかじめ採血した試料はすべて、検出限界未満（＜２０）であった。群８（ＰＢＳ）についての３９日目（抗原投与前）の試料はすべて、両方のＨ１Ｎ１汎発流行ウイルスについて検出限界未満であった。
【０２００】
図２０Ａにおいて示されるように、ＮＰ＋Ｍ２免疫処置は、体重損失から保護した。しかしながら、Ｍ１がＮＰ＋Ｍ２に追加された場合、有意なさらなる有益性は観察されなかった。図２０Ｂは、ワクチン接種したマウスについての生存結果を示す。この研究について生存結果を下記表１３に示す。
【０２０１】
【表１３】
2013523096.tif 000023
これらの結果は、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２およびＭ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲ−Ｃを受けた群における死亡がＰＢＳの群よりも有意に（ｐ＝０．００３５）低かったことを示す。
【０２０２】
さらなる研究において、抗ＮＰおよび抗Ｍ２免疫応答は、それぞれ、組換えＮＰ（ＥＰＤＵ）およびＭ２ペプチド＃４（配列番号４）コートプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって試験した。抗ＮＰおよび抗Ｍ２  ＥＬＩＳＡ結果は、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌについて図２１に示す。これらの結果は、ワクチン接種が強力な抗ＮＰおよび抗Ｍ２免疫応答を誘発したことを示す。
【０２０３】
抗Ｍ１および抗ＭＶＡ免疫応答は、それぞれ、組換えＭ１およびＭＶＡ  ＣＴ８４コートプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって試験した。抗Ｍ１および抗ＭＶＡ  ＥＬＩＳＡ結果は、ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌについて図２２Ａ〜Ｂに示す。これらの結果は、ワクチン接種が抗Ｍ１免疫応答を誘発しなかったことを示す。
【０２０４】
ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて筋肉内で（ＩＭ）免疫したマウスの肺組織におけるウイルス量は、ｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９ウイルスを用いる抗原投与の２および４日後に、測定した。肺におけるウイルス複製の結果を図２３に示す。結果は、試験したワクチンが、肺におけるウイルス複製を低下させなかったことを示す。
【０２０５】
ＰＢＳ、ＭＶＡｔｏｒ、Ｍ１＋ＮＰ＋ＭＥＴＲＣ、Ｍ１＋ＮＰ＋Ｍ２、Ｍ２＋ＮＰ、Ｍ１、Ｍ１＋ＮＰ、およびＦｌｕｌａｖａｌを用いて筋肉内で（ＩＭ）免疫したマウスの鼻甲介におけるウイルス量は、ｓＨ１Ｎ１  Ａ／Ｍｘ／４１０８／０９ウイルスを用いる抗原投与の２および４日後に測定した。肺におけるウイルス複製の結果を、図２４に示す。結果は、すべてのワクチン接種した群における鼻甲介におけるウイルス量の部分的な低下を示す。ワクチンへのＭ１の追加は、鼻甲介におけるウイルス量の低下を増加させなかった。
【図１】
2013523096.tif 000024
【図２Ａ−Ｆ】
2013523096.tif 000025
【図３Ａ−Ｂ】
2013523096.tif 000026
【図３Ｃ−Ｄ】
2013523096.tif 000027
【図５】
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【図２１】
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【図４】
2013523096.tif 000030
【図６】
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【図７】
2013523096.tif 000032
【図８】
2013523096.tif 000033
【図９】
2013523096.tif 000034
【図１０】
2013523096.tif 000035
【図１１】
2013523096.tif 000036
【図１２】
2013523096.tif 000037
【図１３】
2013523096.tif 000038
【図１４】
2013523096.tif 000039
【図１５】
2013523096.tif 000040
【図１６Ａ】
2013523096.tif 000041
【図１６Ｂ】
2013523096.tif 000042
【図１７】
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【図１８】
2013523096.tif 000044
【図１９】
2013523096.tif 000045
【図２０Ａ】
2013523096.tif 000046
【図２０Ｂ】
2013523096.tif 000047
【図２２Ａ】
2013523096.tif 000048
【図２２Ｂ】
2013523096.tif 000049
【図２３】
2013523096.tif 000050
【図２４】
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【配列表】
2013523096000001.app
【国際調査報告】
2013523096.tif 000052
2013523096.tif 000053