(57)【要約】本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害、例えば血友病、の処置のための医薬品の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用に関する。これらのトロンボモジュリン類似体は、治療有効投薬量で、抗線溶効果を呈示する。新規タンパク質改変をそれらの同定方法とともに開示する。本発明により、例えば、本発明に従って使用することができる、特に適する医薬活性タンパク質およびペプチドが提供される。本発明の１つの実施形態に従って、ウサギ肺トロンボモジュリンと比較してトロンビンへの結合親和性低減を有する本発明のトロンボモジュリン類似体を、線溶亢進を伴う凝固障害の処置に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンに結合するとＴＭＥＭ３３８Ｌと比較して低減された補因子活性を有するトロンボモジュリン類似体であって、
ａ．）配列番号２に記載のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、または
ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、または
ｄ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、または
ｅ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になるトロンボモジュリンフラグメント
を有するが、
位置３７６（配列番号１に従って番号付けした場合）におけるフェニルアラニンが欠失されているか、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンによって置換されている、
トロンボモジュリン類似体。
【請求項２】
位置３８７（配列番号１において番号付けした場合）におけるグルタミン残基の欠失または置換をさらに含むが、該置換が、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換されている、請求項１に記載のトロンボモジュリン。
【請求項３】
位置３８８（配列番号において番号付けした場合）におけるメチオニン残基の欠失または置換をさらに含むが、該メチオニン残基が、好ましくは、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換されている、請求項１または２に記載のトロンボモジュリン。
【請求項４】
位置３８９（配列番号１において番号付けした場合）におけるフェニルアラニン残基の欠失または置換をさらに含むが、該フェニルアラニンが、好ましくは、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏで置換されている、上記請求項のいずれかに記載のトロンボモジュリン。
【請求項５】
表４に示すような１つ以上の第一および第二のアミノ酸の改変を含む、前記請求項のいずれかに記載のトロンボモジュリン。
【請求項６】
表５に示すような１つ以上の第一、第二および第三のアミノ酸の改変を含む、前記請求項のいずれかに記載のトロンボモジュリン。
【請求項７】
ａ）ＴＭ類似体が、上記請求項のうちの一項に記載のとおり定義される、または
ｂ）前記ＴＭ類似体が、治療有効投薬量で抗線溶効果を呈示することを特徴とする、
線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬品の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用。
【請求項８】
前記トロンボモジュリン類似体が、以下の特徴：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比較して減少される、トロンビンへの結合親和性、および／もしくは０．２ｎＭより大きいｋＤ値を有するトロンビンへの結合親和性、ならびに／または
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比較して低減された補因子活性、
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して増加された、ＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比、
のうちの１つ以上を呈示する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記線溶亢進を伴う凝固障害が、次のとおりの疾患の群：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠乏症、パラ血友病、第Ｉ、ＩＩ、ＶまたはＶＩＩクロッティング因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固不全、から選択される、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記トロンボモジュリン類似体が、頭蓋内または他のＣＮＳ出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸器管、腹膜後腔または軟組織における出血からなる群より選択される出血事象のうちの１つ以上を処置するために使用される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
患者が抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有する、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記患者が、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換え第ＶＩＩＩ因子または組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子、さらに好ましくはオクトコグ・アルファまたはモロクトコグ・アルファで処置される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記トロンボモジュリン類似体が、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換え第ＶＩＩＩ因子、組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子、さらに好ましくはオクトコグ・アルファまたはモロクトコグ・アルファとの組み合わせで与えられることを特徴とする、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための上記請求項のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体の使用。
【請求項１４】
前記患者が、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換え第ＶＩＩＩ因子、さらに好ましくはオクトコグ・アルファで処置される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記トロンボモジュリン類似体が、出血エピソードの時点で投与される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記トロンボモジュリン類似体が、出血リスク上昇（例えば外科手術または抜歯）に先立って投与される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記トロンボモジュリン類似体が、輸血／血漿輸血または凝固因子補充療法に抗治性がある患者に投与される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記トロンボモジュリン類似体が、多回投与で、好ましくは合計１週間未満から４週間の期間にわたって１日１回、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日ごとに、さらに好ましくは長期投与として、投与される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記トロンボモジュリン類似体が、非経口適用として、好ましくは静脈内または皮下適用として与えられる、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記トロンボモジュリン類似体が、可溶性ＴＭ類似体である、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記トロンボモジュリン類似体が、ヒト可溶性ＴＭ類似体である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、ＥＧＦ６を含有する、好ましくはフラグメントＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含む、およびさらに好ましくはＥＧＦドメイン１〜６を含む、群から選択される少なくとも１つの構造ドメインを含む、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦドメインＥＧＦ１からＥＧＦ６からなる、およびさらに好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６からなる、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記トロンボモジュリン類似体が、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１または配列番号３に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去
ｂ）Ｍ３８８Ｌ
ｃ）Ｒ４５６Ｇ
ｄ）Ｈ４５７Ｑ
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含む、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号２と少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％配列同一性の配列を含むアミノ酸配列を有する、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
前記トロンボモジュリン類似体が、天然配列の（配列番号１または配列番号３に従う）
ａａ）３４９Ａｓｐ；
ｂｂ）３５５Ａｓｎ；
ａｃ）３５７Ｇｌｕ；
ａｄ）３５８Ｔｙｒ；
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｆ）３６１Ｇｌｎ；
ａｇ）３６３Ｌｅｕ；
ａｈ）３６４Ａｓｎ；
ａｉ）３６８Ｔｙｒ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ａｍ）３８４Ｈｉｓ；
ａｎ）３８５Ａｒｇ；
ｂａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ）３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｆ）４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ）４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ；
ｂｏ）４２３Ａｓｐ；
ｂｐ）４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ）４２５Ａｓｐ；
ｂｒ）４２６Ｇｌｕ；
ｃａ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｂ）４２９Ａｓｐ；
ｃｃ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｄ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｅ）４３６Ｖａｌ；
ｃｆ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｇ）４３９Ａｓｐ；
ｃｈ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｉ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｊ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｋ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｌ）４５６Ａｒｇ；
ｃｍ）４５８Ｉｌｅ；または
ｃｎ）４６１Ａｓｐ
に対応する１つ以上の位置でのアミノ酸改変を有する、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３に従う位置３７６におけるフェニルアラニンの改変を有する、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換されている、さらに好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンで置換されている、および最も好ましくはアラニンで置換されている、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３に従う以下のアミノ酸：
ａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂ）３８８Ｍｅｔ；
ｂ）３８９Ｐｈｅ；
のうちの１つ以上の改変を有し、それによって前記アミノ酸が欠失しているか、前記アミノ酸に１つ以上の追加のアミノ酸が挿入されているか、または好ましくは前記アミノ酸が置換されている、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
前記トロンボモジュリン類似体が、その酸化形態で、好ましくはクロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されて、使用される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
前記ＴＭ類似体中のメチオニン残基のうちの１つ以上が酸化されている、好ましくは（配列番号１または配列番号３に従う）位置３８８におけるメチオニン残基が酸化されている、請求項１９に記載の使用。
【請求項３１】
線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適するトロンボモジュリンの類似体をスクリーニングする方法であって、
該トロンボモジュリンが、以下の特徴：
（ｉ）トロンビンへの結合親和性低減、
（ｉｉ）補因子活性低減、
（ｉｉｉ）ＴＡＦＩ活性化活性増加
のうちの１つ以上を呈示し、該方法は、
ａ）トロンボモジュリン配列（配列番号１または配列番号３）の、好ましくは請求項１５に記載のアミノ酸位置の、１つ以上のアミノ酸置換を行う工程；
ｂ）その改変された類似体と、対照分子、好ましくはウサギ肺ＴＭまたは可溶性ヒトＴＭ類似体、とを、以下の特性：
ｂａ）トロンビンへの結合親和性（ＫＤ値）；
ｂｂ）補因子活性；
ｂｃ）ＴＡＦＩ活性化活性またはＴＡＦＩａポテンシャル；
ｂｄ）ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比；
ｂｅ）タンパク質酸化の効果；
ｂｆ）インビトロアッセイにおける、時間での、クロット溶解に対する効果；または
ｂｇ）凝固関連動物モデルにおける効果
のうちの１つ以上に関して比較する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
治療有効量の、請求項１から２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与することを含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
【請求項３３】
処置すべき被験体の体重１ｋｇあたり０．７５μｇと１４０μｇとの間の用量の、請求項１から２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与することを含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
【請求項３４】
処置すべき被験体の体重１ｋｇあたり０．７５μｇと１４０μｇとの間の用量で線溶亢進を伴う凝固障害を処置するための、請求項１から２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の分野に関する。より詳細には、本発明は、血友病Ａまたは血友病Ｂのような血友病疾患の処置に関する。本発明は、開示に関して完全に本明細書に援用されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４２１８の優先権を主張する。
【０００２】
血友病は、血管が破壊されたときに出血を停止させるために用いられる体の血液クロッティングまたは凝固制御能力を損なう遺伝性遺伝子疾患の一群である。最も一般的な形態である血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子についての遺伝子の突然変異の結果として生じ；クリスマス病としても公知の血友病Ｂは、第ＩＸ因子についての遺伝子の突然変異の結果として生ずる。血友病Ｂは、血友病Ａと同様にＸ連鎖性であり、血友病症例のおおよそ１２％を占める。症状は、血友病Ａのものと同一である：傷害時の過剰出血；および特発性出血、とりわけ荷重関節、軟組織および粘膜へのもの。関節への反復出血は、関節置換術を多くの場合に要する痛みのあるひどい関節症を引き起こす関節血症を生じさせる結果となる。軟組織における血腫は、結果として、壊死性凝固血からなる偽腫瘍を生じさせることがあり；それらは、隣接器官を閉塞することがあり、圧迫することがあり、または隣接器官へと破裂することがあり、感染をもたらすことがある。一旦形成すると、血腫は、外科手術での処置さえ難しい。圧迫後の神経の回復は不良であり、その結果、麻痺が生ずる。胃腸管、中枢神経系または気道／腹膜後腔を巻き込むそれらの出血エピソードは、検出されなければ死に至ることもある。頭蓋内出血は、血友病での死亡の主原因である。
【０００３】
米国には１００，０００件の先天的血友病の症例があると推定される。これらのうち、おおよそ２０，０００件は、血友病Ｂの症例であり、そのような患者の血液には第ＩＸ因子が完全に無いか、血漿第ＩＸ因子成分が重度に欠乏している。したがって、この疾患は、概して毎週から年に１度または２度までの治療を必要とする、様々な重症度で存在する。完全欠乏症例には、毎週１度の補充療法が必要である；部分欠乏症例には、出血エピソードが起こったときにだけ治療が必要であり、これは、年に一度ほどの低頻度である場合もある。先天性の部分欠乏症例での出血エピソードは、一般に、傷害だけではなく一時的に獲得した感受性によって引き起こされる。十分大量の新鮮血漿または同等の量の新鮮血の静脈内注射により、欠乏被験体の欠損は一時的に修正される。この有益効果は、多くの場合、２または３週間続くが、患者の血液を用いてインビトロ試験により測定すると、凝固欠損は、ほんの２または３日間しか改善されないように見える。
【０００４】
新鮮血漿または新鮮血でのそのような治療は有効であるが、次のとおりの幾つかの重大な欠点を有する：（１）大量の新鮮血漿を容易に入手できることを必要とする；（２）血漿の投与のために入院を必要とする；（３）非常に多くの患者が反復血液または血漿注入に敏感になり、最終的には致死性輸血反応に遭遇する；（４）最高でも、血漿は、前記欠乏症を部分的に軽減できるにすぎない；および（５）長期処置または外科手術は、必要とされる大量の血液または血漿が急性および致死性の浮腫を引き起こすこととなるので不可能である。
【０００５】
改善された治療法としては、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子濃縮物での静脈内補充療法が挙げられる。しかし、この治療法にもまた、次のとおりの幾つかの不利益がある：（１）大出血エピソードを処置する場合、迅速な検出および処置後でさえ、組織損傷が残る；（２）非常に多くの患者が凝固因子に抵抗性になり、凝固因子に対する阻害抗体を発現する（いわゆるインヒビター保有血友病（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））；（３）改善されたウイルス不活化法にもかかわらず、ＨＩＶおよびＣ型肝炎などの致死性ウイルスでの汚染のリスク上昇がなおある（米国では、１０，０００人を超える血友病人口の５０％より多くが、汚染血供給からＨＩＶに罹患すると推定される）；（４）単離されたクロッティング因子、特に、組換え型クロッティング因子は、非常に高価であり、発展途上世界では一般に入手できない。
【０００６】
補充療法を超える出血の処置または防止は、難題である。なぜなら、血友病における出血は、（１）低い組織因子濃度での外因性経路によるトロンビン生成低減、（２）内因性経路によるトロンビン生成の二次的バースト低減、（３）内因性経路による線溶系の不完全ダウンレギュレーションという三重欠陥に起因し得る、複雑な病態生理学的プロセスであるからである。
【０００７】
トロンビン生成低減が、結果としてクロッティング傾向を低減させ、そのため出血リスクを上昇させるということは、一般に是認されている。しかし、過去十年での研究は、線溶の不完全なダウンレギュレートもまた血友病において一定の役割を果たし得ることを示している。結果として、血友病を、線溶亢進を伴う凝固障害として分類することもできる。
【０００８】
最近の発表は、この仮定を、第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中でクロットを形成し、組織プラスミノゲン活性化因子ｔＰＡをそれに補足したときに線溶が十分にダウンレギュレートされず、結果としてクロットが時期尚早に溶解することをインビトロで証明することによって、支持している（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、この「時期尚早の溶解」は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＡＦＩ）の活性化低減または不在に起因すること（非特許文献１）、およびＦＶＩＩＩ−ＤＰ中で、活性化ＴＡＦＩ含有混合物は、クロット溶解時間を増加させることが証明され得た。安定化されたＴＡＦＩを血友病の処置に用いることができると結論づけられた（特許文献１）。
【０００９】
ＴＡＦＩは、安定したクロットの形成に求められる線溶のダウンレギュレートに重大な役割を果たす。血漿プロカルボキシペプチダーゼＢ２またはプロカルボキシペプチダーゼＵとしても公知のＴＡＦＩは、トロンビン−トロンボモジュリン複合体に曝露されると、Ａｒｇ９２でのタンパク質分解により、線溶を阻害する塩基性カルボキシペプチダーゼ（ＴＡＦＩａまたは活性化ＴＡＦＩ）に転化される、血漿チモーゲンである。それは、プラスミノゲンの結合および活性化に重要であるＣ末端リシンおよびアルギニン残基をフィブリンから除去することによって、線溶を強力に減弱する。
【００１０】
上で論じたように、トロンビンとの複合体でのトロンボモジュリン（ＴＭ）は、ＴＡＦＩ活性化に責任を負う。トロンボモジュリンは、血管の内側を覆う内皮細胞上でトロンビン受容体として作用する膜タンパク質である。トロンビンは、マトリックスクロットを作るフィブリンにフィブリノゲンを転化させる凝固カスケードにおける中心的酵素である。最初に、局所的傷害によって少量のトロンビンがその不活性前駆体プロトロンビンから生成される。トロンビンは、血小板そして次に、第ＶおよびＶＩＩＩ因子をはじめとする一定の凝固因子を、次々に活性化する。後のほうの作用は、追加のプロトロンビン分子の大量活性化である、いわゆるトロンビンバーストを生じさせ、最終的に、安定したクロットが形成される結果となる。
【００１１】
しかし、トロンボモジュリンに結合すると、トロンビンの活性の方向が変更される：トロンビン−トロンボモジュリン複合体の主な特徴は、プロテインＣを活性化するその能力であり、このプロテインＣが、その後、必須補因子第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子をタンパク質溶解により不活性化すること（非特許文献３）、このようにして抗凝固活性をもたらすことによって、凝固カスケードをダウンレギュレートする。前記トロンビン−トロンボモジュリン複合体は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）を活性化することもでき、そのとき、該ＴＡＦＩは、線溶に拮抗する（上記参照）。
【００１２】
成熟ヒトＴＭは、５５９残基の一本のポリペプチド鎖からなり、およびアミノ末端「レクチン様」ドメインと、６回上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピートを含む「６個のＥＧＦ様リピートドメイン」と、Ｏ−グリコシル化ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質ドメインという５つのドメインからなり、これらのドメインは、次のように局在定位されている（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
【００１３】
【表３】
2013531651.tif 000002
【００１４】
ウサギＴＭのタンパク質分解性フラグメントまたは組換えヒトＴＭの欠失突然変異体を使用する様々な構造−機能研究により、最後の３回ＥＧＦ様リピートにその活性が局在定位された。ＴＡＦＩ活性化を効率的に促進することができる最小突然変異体は、上皮増殖因子−３（ＥＧＦ３）のｃループからＥＧＦ６までを含む残基を含有した。この突然変異体は、Ｃを活性化する最小突然変異体より１３残基長く、前記最小突然変異体は、ＥＧＦ３およびＥＧＦ４を接続するドメイン間ループからＥＧＦ６までの残基からなる。
【００１５】
上で論じたように、血友病などの凝固異常を処置するための補充療法は、医療ニーズを満たしていない。重要なこととして、前記補充療法に用いられる凝固因子のほかに、血友病患者を予防または処置することができる薬物を入手できない。
【００１６】
このように、線溶亢進を伴う凝固障害、特に血友病、を防止または処置するための治療法の開発が長年にわたって必要とされているにもかかわらず、進歩は遅く、安全で有効な治療法は、今でも見つかっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第０２／０９９０９８号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｒｏｚｅ  ａｎｄ  Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｂｌｏｏｄ  １９９６、８８：３８１５−３８２３
【非特許文献２】Ｍｏｓｎｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１，８６：１０３５−１０３９
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１）、６１４：３０−４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための新規手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この目的は、治療有効投薬量で抗線溶効果を呈示するトロンボモジュリン類似体を含む、哺乳類における、特にヒトにおける、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬品を提供することによって解決される。本発明に従って使用することができる、特に適する医薬活性タンパク質およびペプチドも提供する。
【００２１】
この新規アプローチは、高血漿濃度においてさえ、詳細には１５ｎＭより高い濃度、詳細には２０、３０、４０または５０ｎＭより高い（少なくとも１００ｎＭまでの）濃度においてさえ、その線溶促進活性に勝る抗線溶活性を呈示するように、トロンボモジュリンを改変することができるという驚くべき発見に基づく。それ故、これらのＴＭ類似体は、抗線溶効果を呈示し、したがって、本発明による使用に適している。最も好適な実施形態において、前記ＴＭ類似体は、さらに２００ｎＭまでまたはそれ以上の濃度で、よりいっそう好ましい３００ｎＭまたは５００ｎＭまでの濃度で、卓越抗線溶活性を有し得る。
【００２２】
この抗線溶効果を（第ＶＩＩＩ因子が枯渇している；ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）血友病患者からの血漿において、および血友病Ａを有するイヌの全血または血漿において証明した。それに加えて、そのようなトロンボモジュリン類似体を治療薬として使用できることを実証した。
【００２３】
これまで、血友病の処置のためのトロンボモジュリンの治療目的使用は、現実的な選択肢とは見なされなかった。なぜなら、ウサギ肺トロンボモジュリン（ｒｌＴＭ）から、トロンボモジュリンは、かなり低い濃度においてさえ抗線溶活性と線溶促進活性の両方を常に有することが公知であったからである（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２００６；２６：２４４５−２４５３；特に、図５を参照のこと）。１５ｎＭ未満の血漿濃度で、ｒｌＴＭは、クロット溶解時間を増加させたが、１５ｎＭより高い血漿濃度においては、溶解時間の著しい減少を明示し（Ｍｏｓｎｉｅｒら、２００１、ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ、２００６）、最終結果として線溶促進効果を有した。より高い濃度でのこの線溶促進効果により、血友病でのいかなる治療目的治療も禁じられている。可能性のある過剰投薬または感受性の個体差により、致命的に悪化する、長引く、または出血事象が引き起こされることにさえなるからである。
【００２４】
本発明によると、抗線溶効果を呈示する、したがって本発明による処置に適しているＴＭ類似体をもたらす様々な選択肢が存在する。
【００２５】
１つの実施形態では、トロンビンへの結合親和性が低減されたトロンボモジュリン類似体を使用することができる。その結果として、それらは、例えば１００ｎＭまで（図４）または５００ｎＭまで（図１０）、正常血漿およびＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を延長することができる。
【００２６】
この発見の重要性は、これらのトロンボモジュリン類似体が、高濃度においてさえ、有害な線溶促進効果なしで抗線溶効果を呈示することである。この濃度は、治療有効投薬量をはるかに超えている。したがって、これらのＴＭ類似体は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置を可能にする。
【００２７】
この理論に拘束されることなく、本発明者らは、前記ＴＭ類似体のこの治療的可能性を、前記ＴＭ類似体がトロンビンへの親和性の著しい低減を示すという事実によって説明できることを、明らかにした。これは、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１６６０３−１６６０８）によって明らかにされており、彼らは、トロンビンとウサギ肺トロンボモジュリンとの結合について観察された０．２ｎＭのＫＤ値（Ｅｓｍｏｎら、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８６、４８５：２１５−２２０）とは異なり２３ｎＭのＫＤ値を見出した。
【００２８】
それ故、本発明の１つの実施形態に従って、ウサギ肺トロンボモジュリンと比較してトロンビンへの結合親和性低減を有する本発明のトロンボモジュリン類似体を、線溶亢進を伴う凝固障害の処置に用いることができる。
【００２９】
詳細には、トロンビン結合について０．２ｎＭより高い、好ましくは、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、７．５ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２２．５ｎＭまたは２５ｎＭより高いＫＤ、およびさらに好ましくは、１０ｎＭと３０ｎＭの間の範囲の、または１０ｎＭと１００ｎＭの間の範囲の、または１００ｎＭ以上のＫＤ値を呈示するトロンボモジュリン類似体を使用することができる。特定の実施形態では、トロンビン結合について約５０、６０または７０ｎＭのＫＤを有するＴＭ類似体を使用する。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、トロンボモジュリン類似体の線溶促進活性低減は、プロテインＣを活性化する能力（いわゆる「補因子活性」）低減に起因し得る。プロテインＣ活性化は、結果として線溶のアップレギュレーションを生じさせる（Ｍｏｓｎｉｅｒら、２００１）ので、補因子活性低減は、クロット溶解時間を延長することとなる。トロンボモジュリンの補因子活性を低減させるためのいくつかの戦略、例えば、タンパク質のグリコシル化、二次もしくは三次構造を変化させること、または好ましくは、例えば１つ以上のアミノ酸の突然変異により、一次構造を変化させることなど、は、当業者に公知である。
【００３１】
さらにもう１つの実施形態では、トロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌ（この場合のＴＭＥは、６つのＥＧＦドメインのみからなる類似体を指す）と比較して低減された補因子活性を有するＴＭ類似体を使用することができる。
【００３２】
本発明によると、ＴＡＦＩ活性化は、結果として線溶のダウンレギュレーションを生じさせる（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ、２００６）ので、ＴＡＦＩを活性化する能力（いわゆる「ＴＡＦＩ活性化活性」）が増加されたトロンボモジュリン類似体も使用することができる。当業者には、タンパク質のグリコシル化、二次もしくは三次構造を変えること、または好ましくは、例えば１つ以上のアミノ酸の突然変異により、一次構造を変化させることなどの、トロンボモジュリンによるＴＡＦＩ活性化活性を増加させるためのいくつかの戦略がある。
【００３３】
特に、本発明は、ＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比がトロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して有意に増加されたトロンボモジュリン類似体にも備えている。
【００３４】
注目に値することとして、本発明に従って、凝固障害の処置に使用されるＴＭ類似体は、上で説明した特徴、すなわち、
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比較して減少される、トロンビンへの結合親和性、および／もしくは０．２ｎＭより大きいｋＤ値でのトロンビンへの結合親和性、
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比較して低減された補因子活性、または
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して増加された、ＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比、
のうちの１つ以上を有する。
【００３５】
本発明の１つの実施形態では、なんらかの凝固障害が発生しているヒト患者を処置するためにトロンボモジュリンを使用することができ、健常被験体と比較して線溶を顕著に低減させる、またはわずかにであっても低減させることができる。詳細には、前記トロンボモジュリン類似体で次のとおりの疾患を処置することができる：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠乏症、パラ血友病、第Ｉ、ＩＩ、ＶまたはＶＩＩクロッティング因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害（第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子に対する自己抗体を含む）または後天性凝固不全。
【００３６】
本発明の処置によって維持または達成することができる治療の成功が、いずれの個々の患者においてもその疾患の性質および程度に依存することは、理解されるであろう。
【００３７】
本発明の特定の実施形態は、出血を防止するための凝固障害の予防的処置、または出血が起こったとき（「要求に応じて」）の急性処置に関する。前記トロンボモジュリン類似体で処置される出血事象は、生物におけるあらゆる器官または組織において、最も重要なことに、中枢神経系において、例えば頭蓋内出血として、関節、筋肉、胃腸管、呼吸器管、腹膜後腔または軟組織において、起こり得る。
【００３８】
防止のための処置については、前記ＴＭ類似体を患者に長期間にわたって規則正しい間隔で与えてもよい。しかし、かなり限られた期間の多回投与（「亜長期処置」（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ））も可能である。
【００３９】
本発明の１つの実施形態では、前記トロンボモジュリン類似体を、より高い出血リスク（例えば外科手術または抜歯）に先立って与える。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態では、前記トロンボモジュリン類似体を、標準的な治療法（例えば、輸血もしくは血漿輸血、または凝固因子を用いる補充療法）に抗療性である患者に投与する。
【００４１】
本発明に従って、前記ＴＭ類似体を、多回投与で、好ましくは、合計１週間未満から４週間の期間にわたって１日１回、しかしまた２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日ごとに、さらに好ましくは、長期（ｃｈｒｏｎｉｃ）投与として投与することができる。それ故、本発明に従って、前記トロンボモジュリン類似体の多回投与を可能にするのに適している医薬組成物を提供する。
【００４２】
前記ＴＭ類似体を、好ましくは、非経口適用として、例えば静脈内または皮下適用により、非経口的に与える。静脈内または皮下ボーラス適用が可能である。それ故、本発明に従って、トロンボモジュリンの非経口投与に適している医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、可溶性ＴＭ類似体、詳細には細胞質ドメインが欠失されており、膜貫通ドメインが完全にまたは部分的に欠失されているＴＭ類似体である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５またはＥＧＦ６、好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ１からＥＧＦ６、さらに好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６、および最も好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ４からＥＧＦ６、および特に、上皮増殖因子−３（ＥＧＦ３）のｃループからＥＧＦ６を含むフラグメント、を含有する群から選択される少なくとも１つの構造ドメインを含む。
【００４５】
様々な形態の可溶性トロンボモジュリン、例えば、旭化成ファーマ株式会社（Ａｓａｈｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（日本、東京）によって開発されたいわゆるＡＲＴ−１２３、またはＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ａａｃｈｅｎ（ドイツ）によって現在開発中の組換え可溶性ヒトトロンボモジュリンＳｏｌｕｌｉｎは、当業者に公知である。組換え可溶性トロンボモジュリン、すなわち、アミノ酸配列の改変を伴わない可溶性トロンボモジュリンは、旭化成株式会社（Ａｓａｈｉ）特許ＥＰ０  ３１２  ５９８  Ｂ１の主題である。
【００４６】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、可溶性であり、ならびにヒトトロンボモジュリンのプロテアーゼおよび酸化耐性類似体であり、それ故、インビボで長い寿命を呈示する。Ｓｏｌｕｌｉｎはトロンビンを排他的に阻害しないので、Ｓｏｌｕｌｉｎの主な特徴は、その広い作用メカニズムに存する。Ｓｏｌｕｌｉｎは、ＴＡＦＩおよび天然プロテインＣ／プロテインＳ経路も活性化する。その低減されたトロンビン結合の結果として、Ｓｏｌｕｌｉｎは、高濃度まででも線溶を阻害する。Ｓｏｌｕｌｉｎおよびその改変は、本発明の特別な実施形態である。
【００４７】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、なかんずく、欧州特許ＥＰ  ０  ６４１  ２１５  Ｂ１、ＥＰ  ０  ５４４  ８２６  Ｂ１ならびにＥＰ  ０  ５２７  ８２１  Ｂ１の主題である。Ｓｏｌｕｌｉｎは、天然ヒトトロンボモジュリンの配列（配列番号１）と比較して、次の位置に改変を含有する：Ｇ−３Ｖ、アミノ酸１〜３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０で終結。この番号付け方式は、配列番号１および配列番号３の天然トロンボモジュリンによるものである。本発明の１つの好ましい実施形態としてのＳｏｌｕｌｉｎの配列を配列番号２に示す。
【００４８】
しかし、注目に値することとして、本発明に従って、上述の特性の、または上述の欧州特許ＥＰ  ０  ５４４  ８２６  Ｂ１、ＥＰ  ０  ６４１  ２１５  Ｂ１およびＥＰ  ０  ５２７  ８２１  Ｂ１において略述されている特性の、１つだけまたはそれ以上を含むトロンボモジュリン類似体を使用することもできる。
【００４９】
さらに、本発明に従って、上述の特性の、またはＷｎａｇら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ  ＣＨｅｍ．、２７５：２２９４２−２２９４７による発表の中で略述されている特性の、１つだけまたはそれ以上を含むトロンボモジュリン類似体を使用することができる。
【００５０】
本発明に従って利用できる特に好ましいトロンボモジュリン類似体は、次の特徴の１つ以上を有するものである：
（ｉ）それらは、酸化耐性を呈示する、
（ｉｉ）それらは、プロテアーゼ耐性を呈示する、
（ｉｉｉ）それらは、均一なＮまたはＣ末端を有する、
（ｉｖ）それらは、例えば天然トロンボモジュリン（配列番号１）のグリコシル化部位の少なくとも一部についてのグリコシル化により、翻訳後修飾されている、
（ｖ）それらは、線形二重逆数的トロンビン結合特性を有する、
（ｖｉ）それらは、比較的少量の界面活性剤中の水溶液に可溶性であり、それらには典型的に膜貫通配列が無い、
（ｖｉｉ）それらにはグリコサミノグリカン鎖が無い。
【００５１】
本発明において使用するこれらの類似体の製造は、Ｓｏｌｕｌｉｎに関する上述の欧州特許に開示されている。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、Ｓｏｌｕｌｉｎの６つＥＧＦドメインだけを、特に、ＥＧＦ４からＥＧＦ６ドメインからなるＳｏｌｕｌｉｎフラグメントを使用することができる。
【００５３】
１つの実施形態では、ＷＯ９３／２５６７５  Ａ１から公知であるような低減された補因子活性を有するトロンボモジュリン類似体を使用することができる。対照ヒト可溶性トロンボモジュリン（ＴＭＥＭ３８８Ｌ）の補因子活性の約５０％以下を有する一連のトロンボモジュリン類似体を本明細書において開示する。
【００５４】
さらに詳細には、前記トロンボモジュリン類似体は、トロンビンに結合すると、ＴＭＥＭ３８８Ｌでの結合と比較して５０％以下の改変された補因子活性を呈示し、前記類似体は、配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置：
ａｂ）３５５Ａｓｎ；
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｆ）３６３Ｌｅｕ；
ａｉ）３６８Ｔｙｒ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ａｍ）３８４Ｈｉｓ；
ａｎ）３８５Ａｒｇ；
ｂａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ）３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｆ）４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ）４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｇ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ）４３６Ｖａｌ；
ｃｊ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｌ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ）４５６Ａｒｇ；
ｃｑ）４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を有する。
【００５５】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体が最も好ましい。本発明の１つの実施形態において、ＴＭ類似体は、上記突然変異のうちの１つ以上、好ましくは１つ、を有するＳｏｌｕｌｉｎ（配列番号２）である。したがって、本発明は、上記突然変異のうちの少なくとも１つを有する、特定の実施形態では正確に１つを有する、配列番号２に記載のタンパク質にも関する。１つの実施形態において、所与の位置の１つのアミノ酸を、置換するのではなく、欠失させる。さらなる実施形態において、本発明は、上記突然変異のうちの１つを有する、Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメント、特にＥＧＦ３からＥＧＦ６ドメインまたはＥＧＦ３のｃループからＥＧＦ６からなるＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、を包含する。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントは、アミノ酸位置３７１から３８９に上記突然変異のうちの少なくとも１つ、または正確に１つ（例えば、位置３７６に突然変異）、を含有し得る。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントが位置３７６に突然変異（例えば、Ｆ３７６Ａ）を含有する場合、上記突然変異から選択される第二の突然変異の可能性がある。
【００５６】
便宜上、左の記号、例えば、ａａ）は、各改変部位について同一である。最初の文字は、ＥＧＦドメインを表し、ａは、ＥＧＦ４であり、ｂは、ＥＧＦ５であり、およびｃは、ＥＧＦ６である。第二の文字は、このリストの他の残基に対する相対的改変位置を表す。上に記載したＴＭ類似体をコードする核酸も本明細書において提供する。
【００５７】
以下の類似体は、上に与えた類似体の好ましいサブセットを構成するものであり、これらの類似体は、対照、ＴＭＥＭ３８８Ｌ、の補因子活性の２５％以下を有する。これらの類似体は、１つ以上の、好ましくは１つだけの、アミノ酸置換を有する（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｏ）４２３Ａｓｐ；
ｂｐ）４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ。
【００５８】
本発明の１つの実施形態において、前記ＴＭ類似体は、上記突然変異のうちの１つ以上、好ましくは１つ、を有するＳｏｌｕｌｉｎ（配列番号２）である。したがって、本発明は、上記突然変異のうちの少なくとも１つ、特定の実施形態では正確に１つ、を有する配列番号２に記載のタンパク質にも関する。１つの実施形態において、所与の位置の１つのアミノ酸を、置換するのではなく、欠失させる。さらなる実施形態において、本発明は、上記突然変異のうちの１つを有する、Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメント、詳細にはＥＧＦ３からＥＧＦ６ドメインまたはＥＧＦ３のｃループからＥＧＦ６からなるＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、を包含する。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントは、アミノ酸位置３７１から３８９に上記突然変異のうちの少なくとも１つ、または正確に１つ（例えば、位置３７６に突然変異）、を含有し得る。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントが位置３７６に突然変異（例えば、Ｆ３７６Ａ）を含有する場合、上記突然変異から選択される第二の突然変異の可能性がある。
【００５９】
プロテアーゼ活性、脂肪族置換、酸化耐性および一様な末端に関して上で述べた改変は、対照の補因子活性の５０％未満を有する上記類似体にもあてはまる。
【００６０】
対照の活性の３０％未満を有する、上に列挙したものが好ましい。これらの類似体は、ドメイン４における突然変異によって代表される。これらの類似体は、１つ以上（好ましくは１つだけ）のアミノ酸置換を有する（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；または
ａｌ）３７６Ｐｈｅ。
【００６１】
本発明の１つの実施形態において、前記ＴＭ類似体は、上記突然変異のうちの１つ以上、好ましくは１つ、を有するＳｏｌｕｌｉｎ（配列番号２）である。したがって、本発明は、上記突然変異のうちの少なくとも１つ、特定の実施形態では正確に１つ、を有する配列番号２に記載のタンパク質にも関する。１つの実施形態において、所与の位置の１つのアミノ酸を、置換するのではなく、欠失させる。さらなる実施形態において、本発明は、上記突然変異のうちの１つを有する、Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメント、詳細にはＥＧＦ３からＥＧＦ６ドメインまたはＥＧＦ３のｃループからＥＧＦ６からなるＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、を包含する。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントは、アミノ酸位置３７１から３８９に上記突然変異のうちの少なくとも１つ、または正確に１つ（例えば、位置３７６に突然変異）、を含有し得る。前記Ｓｏｌｕｌｉｎまたは前記Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントが位置３７６に突然変異（例えば、Ｆ３７６Ａ）を含有する場合、上記突然変異から選択される第二の突然変異の可能性がある。
【００６２】
ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して本質的に改変されていないＫＤ値を有する類似体も本明細書に記載する。ＥＧＦ５およびＥＧＦ６が、トロンビンへの高親和性結合に重要な役割を果たすことは公知であり、これに対して結合にあまり重量な役割を果たさないＥＧＦ４は、ＴＭ／トロンビン複合体への補因子活性の付与に不可欠である。この理由で、ＥＧＦリピート５および６における改変、例えば（Ｓ４０６Ａ）、を有する類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較してほぼ同じ補因子活性を有するが、低減されたＫＤを有する。低減された補因子活性を生じさせる結果となるＥＧＦリピート５および６における改変を有する類似体を下に列挙する。これらの類似体は、１つ以上、好ましくは１つだけ、のアミノ酸置換を有する（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｆ）４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ。
【００６３】
上記類似体をそれらのそれぞれのドメイン（すなわち、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５またはＥＧＦ６）によってグループ分けしてもよいし、それらのそれぞれの相対活性によってグループ分けしてもよい。例えば、対照補因子活性のおおよそ５０％を有するＥＧＦ４配列改変を有するＴＭ類似体は、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｂ）３５５Ａｓｎ；
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｆ）３６３Ｌｅｕ；
ａｉ）３６８Ｔｙｒ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ａｍ）３８４Ｈｉｓ；または
ａｎ）３８５Ａｒｇ
である。
【００６４】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。
【００６５】
対照の補因子活性の２５％未満を有するＥＧＦ４に関するものは、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；または
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
である。
【００６６】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。
【００６７】
ＥＧＦ５に関して、下記の改変は、結果として補因子活性の少なくとも５０％低減を有する類似体を生じさせた（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｆ）４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ）４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；または
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ。
【００６８】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。これらの類似体には、該類似体がＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有するものなどがある。
【００６９】
ＥＧＦ５に関して、前記類似体を、補因子活性の少なくとも７５％低減を有する類似体を生じさせる結果となる改変によって、さらにサブグループに分けることができる（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；または
ｂｍ）４１７Ａｓｐ。
【００７０】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。これらの類似体には、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有するものなどがある。上記類似体をコードする核酸も提供する。
【００７１】
ＥＧＦ６に関して、グループを下に提供する。対照の５０％未満の補因子活性を有するものは、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｇ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ）４３６Ｖａｌ；
ｃｊ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｌ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ）４５６Ａｒｇ；
ｃｑ）４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
である。
【００７２】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。
【００７３】
対照の２５％未満の補因子活性を有するものは、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
である。
【００７４】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。好ましい類似体は、可溶性、プロテアーゼ耐性、酸化耐性および一様な末端のための追加の改変を有する、上で述べたものである。これらの類似体をコードする核酸も、請求項記載の本発明の一部である。他のグループと同様に、これらの類似体は、該類似体がＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有するものを含む。
【００７５】
前記類似体を、一定の位置にアミノ酸改変を有するものによって、さらにサブグループに分けることができ、この場合、前記類似体は、前記位置に天然残基を有する類似体と比較してトロンビンへの本質的に等価のＫＤを有し、前記位置は、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｂ）３５５Ａｓｎ；または
ａｅ）３５９Ｇｌｎ
に対応する。
【００７６】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。これらの類似体は、対照の３０％未満の改変されたｋＣａｔ／Ｋｍを有し得る。
【００７７】
以下の部位は、該位置に天然残基を有する類似体と比較して改変されたＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する、記載した類似体に及ぶものであり、この場合、前記位置は、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ａｆ）３６３Ｌｅｕ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ａｍ）３８４Ｈｉｓ；  
ａｎ）３８５Ａｒｇ；
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；または
ｂｅ）４０２Ａｓｎ
に対応する。
【００７８】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。これらは、改変されたＫＤと改変されたｋＣａｔ／Ｋｍの両方を有する類似体、特に、少なくとも２０％改変されたものを、さらに含む。
【００７９】
以下の部位は、該位置に天然残基を有する類似体と比較したとき、より低い補因子活性、および本質的に等価であるＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体を説明するものであり、この場合、前記位置は、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ）４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｇ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ）４３６Ｖａｌ；
ｃｊ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｌ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ）４５６Ａｒｇ；
ｃｑ）４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
に対応する。
【００８０】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が最も好ましい。
【００８１】
以下の位置は、結果として補因子活性の少なくとも７５％低減を生じさせるが、ｋｃａｔ／Ｋｍの変化を本質的に殆ど生じさせない改変のサブグループ分けを説明するものである（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ。
【００８２】
上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメントが最も好ましい。トロンビンへのＫＤが少なくとも３０％改変される上記改変について、さらなるサブグループに分けることができる。
本発明は、さらに方法に備えている。より具体的には、トロンビン結合について改変されたＫｄを呈示するトロンボモジュリンの類似体のスクリーニングに有用な方法を本明細書に記載し、この方法は、
ａ）一定の位置（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｇ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ）４３６Ｖａｌ；
ｃｊ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｌ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ）４５６Ａｒｇ；
ｃｑ）４５８Ｉｌｅ；
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
でアミノ酸置換を行う工程；および
ｂ）トロンビンへのＫＤを対照分子と比較する工程
を含む。
【００８３】
これらの方法の中で用いる場合、１つだけアミノ酸置換を有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が好ましい。本発明の様々な実施形態は、前記ＫＤが少なくとも３３％改変される、または前記改変がアミノ酸置換である、または前記対照分子がＴＭＥＭ３８８Ｌであるものを含む。前記方法において用いるための改変の好ましいグループ分けは、（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｃａ）４２３Ａｓｐ；
ｃｂ）４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ）４２５Ａｓｐ；
ｃｄ）４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ）４２９Ａｓｐ；
ｃｋ）４３９Ａｓｐ；
ｃｎ）４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ）４６１Ａｓｐ
である。
【００８４】
これらの方法の中で用いる場合、１つだけアミノ酸置換を有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が好ましい。
【００８５】
トロンビンに結合すると改変された補因子活性を有するトロンボモジュリンの類似体のスクリーニングに有用であるもう１つの方法であって、
ａ）一定の位置（配列番号１または配列番号３における所与のアミノ酸位置）：
ｂｂ）３５５Ａｓｎ；または
ａｅ）３５９Ｇｌｎ
でアミノ酸置換を行う工程；および
ｂ）トロンビンに結合したときの補因子活性率を対照分子の率と比較する工程
を含む方法を、本明細書に記載する。
【００８６】
これらの方法の中で用いる場合、１つだけアミノ酸置換を有するＴＭ類似体、例えばＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎフラグメント、が好ましい。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、位置３７６でのフェニルアラニン残基の改変（Ｐｈｅ３７６Ｘ；配列番号１または配列番号３）を有する。この残基を、当業者に周知である方法によって、化学的にもしくは生化学的に改変する、または検出することができる。前記フェニルアラニン残基を、好ましくは脂肪族アミノ酸で、さらに好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで、および最も好ましくはアラニンで置換する。アラニンによるＰｈｅ３７６の置換（「Ｆ３７６Ａ」）が、ＴＡＦＩ活性化活性を保ちながらトロンボモジュリン類似体の補因子活性を実質的に減少させることを実証した（図７参照）。結果として、Ｆ３７６Ａ−ＴＭ類似体は、ＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比率増加を有する。本発明の１つの実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、Ｐｈｅ３７６Ｘ、特に、Ｆ３７６Ａ置換を含有する。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、位置３８７（配列番号１または配列番号３）のグルタミン残基の改変を有する。前記グルタミン残基を、結果として生ずる突然変異体Ｇｌｎ３８７Ｘ−ＴＭ類似体の補因子活性が大きい順（図８Ａ参照）に、次のアミノ酸で好ましくは置換する：Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ。本発明の１つの実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、このＧｌｎ３８７Ｘ置換を含有する；さらなる実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎ内のこの置換は、Ｇｌｎ３８７Ｘ置換とともに、上記Ｆ３７６Ｘ置換を含有する。
【００８９】
本発明のもう１つの実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、位置３８８（配列番号１または配列番号３）のメチオニン残基の改変を有する。前記メチオニン残基を、結果として生ずる突然変異体Ｍｅｔ３８８Ｘ−ＴＭ類似体の補因子活性が大きい順（図８Ｂ参照）に、次のアミノ酸で好ましくは置換する：Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ。１つの実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、この置換とともに、上記Ｐｈｅ３７６ＸおよびＧｌｎ３８７置換の一方または両方を含有する。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態において、前記トロンボモジュリン類似体は、位置３８９（配列番号１または配列番号３）でのフェニルアラニン残基の改変を有する。前記フェニルアラニン残基を、結果として生ずる突然変異体Ｐｈｅ３８９Ｘ−ＴＭ類似体の補因子活性が大きい順（図８Ｃ参照）に、次のアミノ酸で好ましくは置換する：Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ。１つの実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、この置換を含有し、さらに、この置換と上記Ｐｈｅ３７６Ｘ、Ｇｌｎ３８７ＸまたはＭｅｔ３８８Ｘ置換のうちの１つ以上、好ましくはすべて、とを併せ持つことができる。
【００９１】
本発明のもう１つの実施形態では、３つのアミノ酸Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８およびＰｈｅ３８９からなる、ＴＭ、例えばＳｏｌｕｌｉｎ、のドメイン間ループを１つ以上のアミノ酸によって、好ましくはアラニン残基によって、部分的にもしくは完全に欠失させる、または前記ドメイン間ループに１つ以上のアミノ酸、好ましくはアラニン残基、を挿入する（図８Ｄ参照）。
【００９２】
位置Ｐｈｅ３７６、Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８またはＰｈｅ３８９での改変を有するＴＭ類似体について、該ＴＭ類似体は、完全長ＴＭ類似体であってもよいし、またはＥＧＦドメインＥＧＦ１からＥＧＦ６を含む、好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６を含む、可溶性ＴＭ類似体であってもよい。好ましい実施形態において、これらの類似体は、ＴＭ類似体Ｓｏｌｕｌｉｎに関して述べる置換を含有する。さらに好ましい実施形態において、これらのＳｏｌｕｌｉｎ由来のＴＭ類似体は、もっぱらＥＧＦ１からＥＧＦ６から、特にＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６から、またはＥＧＦ３のｃループからＥＧＦ６からなる（これら３つのフラグメントを、Ｓｏｌｕｌｉｎフラグメントと呼ぶ）。
【００９３】
本発明の１つの実施形態では、前記トロンボモジュリン類似体を酸化形態で使用する。タンパク質の制御酸化のためのいくつかの技術が当業者に公知である。前記ＴＭ類似体を、好ましくは、クロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化する。
【００９４】
本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置に使用するためのＴＭ類似体のスクリーニングに有用である方法にさらに関する。この方法は、好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ１からＥＧＦ６における、さらに好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６における、および最も好ましくはアミノ酸位置Ａｓｐ３４９とＡｓｐ４６１の間での、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によってトロンボモジュリンのアミノ酸配列を改変する第一の工程を含む。タンパク質配列を改変するためのいくつかの技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、またはランダム突然変異誘発とその後の選択によるものは、当業者に公知である。
【００９５】
第二の工程では、改変されたＴＭ類似体を、トロンビンへの結合親和性（ＫＤ値）、補因子活性、ＴＡＦＩ活性化活性もしくはＴＡＦＩａポテンシャル、ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比、タンパク質酸化の効果、インビトロアッセイにおける、時間での、クロット溶解に対する効果、または凝固関連動物モデルにおける効果からなる群より選択される特徴のうちの１つ以上について、対照タンパク質と比較する。
【００９６】
対照タンパク質として、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、前記６つのＥＧＦドメインを含むウサギ肺トロンボモジュリンまたはヒトＴＭ類似体を使用する。前記ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有することもあり、または代替的に、Ｍ３８８Ｌ置換などの１つ以上の改変を有することがある。
【００９７】
本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法にさらに関し、この方法は、治療有効量の、抗線溶効果を呈示するトロンボモジュリン類似体の投与を含む。
【００９８】
詳細には、この処置方法は、対照タンパク質と比較して次の特徴のうちの１つ以上を呈示するＴＭ類似体を含む：トロンビンへの結合親和性減少、０．２ｎＭより大きいｋＤ値でのトロンビンへの結合親和性、補因子活性の有意な低減、またはＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比率増加。対照タンパク質として、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、前記６つのＥＧＦドメインを含むウサギ肺トロンボモジュリンまたはヒトＴＭ類似体を使用する。前記ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有することもあり、または代替的に、Ｍ３８８Ｌ置換などの１つ以上の改変を有することがある。
【００９９】
さらなる実施形態において、本発明は、トロンビンに結合するとＴＭＥＭ３３８Ｌと比較して低減された補因子活性を有するトロンボモジュリン類似体であって、
ａ．）配列番号２に記載のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列、または
ｃ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列。
ｄ）配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になるトロンボモジュリンフラグメント
を有するが、
位置３７６（配列番号１に従って番号付けした場合）におけるフェニルアラニンが欠失されているか、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンによって置換されている、
トロンボモジュリン類似体に関する。
【０１００】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、前記トロンボモジュリンは、位置３８７（配列番号１において番号付けした場合）におけるグルタミン残基の欠失または置換をさらに含むが、該置換は、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換されている。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明は、位置３８８（配列番号１において番号付けした場合）におけるメチオニン残基の欠失または置換をさらに含むが、該メチオニン残基が、好ましくは、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換されている、トロンボモジュリンに関する。
【０１０２】
さらなる実施形態において、前記トロンボモジュリンは、位置３８９（配列番号１において番号付けした場合）におけるフェニルアラニン残基の欠失または置換をさらに含むが、該フェニルアラニンは、好ましくは、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏで置換されている。
【０１０３】
もう１つの実施形態において、前記トロンボモジュリンは、表４に示すような第一および第二アミノ酸改変の組み合わせを含む。
【０１０４】
さらにもう１つの実施形態において、前記トロンボモジュリンは、表５に示すような第一、第二および第三アミノ酸改変の組み合わせを含む。
【０１０５】
本発明は、トロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用にさらに関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｍ３８８Ｌ；
ｃ）Ｒ４５６Ｇ；
ｄ）Ｈ４５７Ｑ；
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、このトロンボモジュリン類似体は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）の１つ以上についての配列改変をさらに含む：
ａ）３５９Ｇｌｎ；
ｂ）３９８Ａｓｐ；
ｃ）４００Ａｓｐ；
ｄ）４０２Ａｓｎ；
ｅ）４０８Ｇｌｕ；
ｆ）４１３Ｔｙｒ；
ｇ）４１４Ｉｌｅ；
ｈ）４１５Ｌｅｕ；
ｉ）４１７Ａｓｐ；
ｊ）４３９Ａｓｎ。
【０１０６】
本発明のさらに好ましい態様では、ａ）からｊ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンで置換する。
【０１０７】
本発明は、トロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用にさらに関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｒ４５６Ｇ；
ｃ）Ｈ４５７Ｑ；
ｄ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、このトロンボモジュリン類似体は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）の１つ以上についての配列改変をさらに含む：
ａ）Ｌｅｕへの変更以外の改変を有する、３８８Ｍｅｔ、
ｂ）４１６Ａｓｐ；
ｃ）４２３Ａｓｐ；
ｄ）４２５Ａｓｐ；
ｅ）４２６Ｇｌｕ；
ｆ）４２９Ａｓｐ；
ｇ）４４０Ｌｅｕ；
ｈ）４６１Ａｓｐ。
【０１０８】
本発明の１つの態様では、ａ）からｈ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンで置換する。
【０１０９】
本発明は、トロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用にさらに関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｒ４５６Ｇ；
ｃ）Ｈ４５７Ｑ；
ｄ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、このトロンボモジュリン類似体は、３８８Ｍｅｔ残基の酸化を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１１０】
本発明は、好ましくはトロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用に関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｍ３８８Ｌ；
ｃ）Ｒ４５６Ｇ；
ｄ）Ｈ４５７Ｑ；
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、この類似体は、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換される、または欠失される、アミノ酸３８７Ｇｌｎの突然変異を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１１１】
本発明は、トロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用にさらに関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｒ４５６Ｇ；
ｃ）Ｈ４５７Ｑ；
ｄ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、この類似体は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＣｙｓからなる群より選択されるアミノ酸によって置換される、または欠失される、アミノ酸３８８Ｍｅｔの突然変異を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１１２】
本発明は、好ましくはトロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用に関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｍ３８８Ｌ；
ｃ）Ｒ４５６Ｇ；
ｄ）Ｈ４５７Ｑ；
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、この類似体は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換される、または欠失される、アミノ酸３８９Ｐｈｅの突然変異を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１１３】
本発明は、好ましくはトロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用に関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｍ３８８Ｌ；
ｃ）Ｒ４５６Ｇ；
ｄ）Ｈ４５７Ｑ；
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、この類似体は、次のアミノ酸ペア：３８６Ｃｙｓと３８７Ｇｌｎ、３８７Ｇｌｎと３８８Ｌｅｕ、３８８Ｌｅｕと３８９Ｐｈｅ、３８９Ｐｈｅと３９０Ｃｙｓ（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）のうちの１つのペアの間への疎水性アミノ酸、好ましくはＡｌａ、の挿入を含む。
【０１１４】
本発明は、好ましくはトロンボモジュリン類似体および線溶亢進を伴う凝固障害の処置のためのその医学的使用に関し、該トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、ならびに次の配列改変：
ａ）アミノ酸１〜３の除去；
ｂ）Ｍ３８８Ｌ；
ｃ）Ｒ４５６Ｇ；
ｄ）Ｈ４５７Ｑ；
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
のうちの１つ以上を含み、それによって、この類似体は、好ましくはＰｈｅ３７６Ａｌａ突然変異である、アミノ酸３７６Ｐｈｅの突然変異を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１１５】
さらに好ましい態様において、本発明は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）３５９Ｇｌｎ；
ｂ）３９８Ａｓｐ；
ｃ）４００Ａｓｐ；
ｄ）４０２Ａｓｎ；
ｅ）４０８Ｇｌｕ；
ｆ）４１３Ｔｙｒ；
ｇ）４１４Ｉｌｅ；
ｈ）４１５Ｌｅｕ，
ｉ）４１７Ａｓｐ；
ｊ）４３９Ａｓｎ
のうちの１つ以上、好ましくは正確に１つ、の配列改変を含む、配列番号２に示すとおりのＳｏｌｕｌｉｎに関する。
【０１１６】
ａ）からｊ）に列挙したとおりの上記アミノ酸を好ましくはアラニンによって置換する。
【０１１７】
１つの実施形態において、配列番号２に示すとおりのＳｏｌｕｌｉｎは、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）Ｌｅｕへの変更以外の改変を有する、３８８Ｍｅｔ、
ｂ）４１６Ａｓｐ；
ｃ）４２３Ａｓｐ；
ｄ）４２５Ａｓｐ；
ｅ）４２６Ｇｌｕ；
ｆ）４２９Ａｓｐ；
ｇ）４４０Ｌｅｕ；
ｈ）４６１Ａｓｐ
のうちの１つ以上（好ましくは１つ）における改変を含む。
【０１１８】
本発明の１つの態様では、ａ）からｈ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンによって置換する。
【０１１９】
本発明において使用する場合のＳｏｌｕｌｉｎは、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換される、または欠失される、アミノ酸３８７Ｇｌｎの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１２０】
本発明のさらなる態様において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＣｙｓからなる群より選択されるアミノ酸によって置換される、または欠失される、アミノ酸３８８Ｍｅｔの突然変異を含む（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１２１】
さらに本発明は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８９Ｐｈｅの突然変異を含むＳｏｌｕｌｉｎに関する（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１２２】
加えて、本発明の１つの実施形態において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、次のアミノ酸ペア：３８６Ｃｙｓと３８７Ｇｌｎ、３８７Ｇｌｎと３８８Ｌｅｕ、３８８Ｌｅｕと３８９Ｐｈｅ、３８９Ｐｈｅと３９０Ｃｙｓ（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）のうちの１つのペアの間への疎水性アミノ酸、好ましくはＡｌａ、の挿入を含む。
【０１２３】
Ｓｏｌｕｌｉｎを、酸化された３８８Ｍｅｔ残基を含むように改変することができる（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。さらに、それは、好ましくはＰｈｅ３７６Ａｌａ突然変異である、アミノ酸３７６Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１２４】
好ましい態様において、本発明は、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるトロンボモジュリン類似体であって、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）３５９Ｇｌｎ；
ｂ）３９８Ａｓｐ；
ｃ）４００Ａｓｐ；
ｄ）４０２Ａｓｎ；
ｅ）４０８Ｇｌｕ；
ｆ）４１３Ｔｙｒ；
ｇ）４１４Ｉｌｅ；
ｈ）４１５Ｌｅｕ；
ｉ）４１７Ａｓｐ；
ｊ）４３９Ａｓｎ
のうちの１つ以上、好ましくは１つ、の配列改変を含むことがあるトロンボモジュリン類似体に関する。
【０１２５】
本発明の１つの態様では、ａ）からｊ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンによって置換する。
【０１２６】
本発明のＴＭ類似体はまた、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になることがあるが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）Ｌｅｕへの変更以外の改変を有する、３８８Ｍｅｔ、
ｂ）４１６Ａｓｐ；
ｃ）４２３Ａｓｐ；
ｄ）４２５Ａｓｐ；
ｅ）４２６Ｇｌｕ；
ｆ）４２９Ａｓｐ；
ｇ）４４０Ｌｅｕ；
ｈ）４６１Ａｓｐ
のうちの１つ以上（好ましくは１つ）における配列改変を含むことがある。
【０１２７】
ａ）からｈ）に列挙したとおりのアミノ酸を、好ましくは、アラニンによって置換する。
【０１２８】
本発明は、さらに、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８７Ｇｌｎの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１２９】
本発明はまた、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＣｙｓからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８８Ｍｅｔの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１３０】
さらに、本発明は、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８９Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１３１】
加えて、本発明は、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸ペア：３８６Ｃｙｓと３８７Ｇｌｎ、３８７Ｇｌｎと３８８Ｍｅｔ、３８８Ｍｅｔと３８９Ｐｈｅ、３８９Ｐｈｅと３９０Ｃｙｓ（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）のうちの１つのペアの間への疎水性アミノ酸、好ましくはＡｌａ、の挿入を含むことがある。
【０１３２】
さらに、本発明は、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、酸化された３８８Ｍｅｔ残基を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１３３】
さらに、本発明は、配列番号１の残基２２７から４６２または配列番号２の残基２２４から４５９によって与えられるような６つのＥＧＦドメインから本質的になるＴＭ類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、好ましくはＰｈｅ３７６Ａｌａ突然変異である、アミノ酸３７６Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１３４】
本発明の１つの実施形態では、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるＴＭ類似体を主張するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）３５９Ｇｌｎ；
ｂ）３９８Ａｓｐ；
ｃ）４００Ａｓｐ；
ｄ）４０２Ａｓｎ；
ｅ）４０８Ｇｌｕ；
ｆ）４１３Ｔｙｒ；
ｇ）４１４Ｉｌｅ；
ｈ）４１５Ｌｅｕ；
ｉ）４１７Ａｓｐ；
ｊ）４３９Ａｓｎ
のうちの１つ以上、好ましくは１つ、の改変を含むことがある。
【０１３５】
ａ）からｊ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンによって置換することができる。
【０１３６】
本発明の１つの実施形態では、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるＴＭ類似体を主張するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）Ｌｅｕへの変更以外の改変を有する、３８８Ｍｅｔ、
ｂ）４１６Ａｓｐ；
ｃ）４２３Ａｓｐ；
ｄ）４２５Ａｓｐ；
ｅ）４２６Ｇｌｕ；
ｆ）４２９Ａｓｐ；
ｇ）４４０Ｌｅｕ；
ｈ）４６１Ａｓｐ
のうちの１つ以上、好ましくは１つ、の改変を含むことがある。
【０１３７】
ａ）からｈ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンによって置換することができる。
【０１３８】
本発明は、さらに、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８７Ｇｌｎの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１３９】
本発明はまた、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＣｙｓからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８８Ｍｅｔの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１４０】
さらに、本発明は、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失される、アミノ酸３８９Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１４１】
加えて、本発明は、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸ペア：３８６Ｃｙｓと３８７Ｇｌｎ、３８７Ｇｌｎと３８８Ｍｅｔ、３８８Ｍｅｔと３８９Ｐｈｅ、３８９Ｐｈｅと３９０Ｃｙｓ（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）のうちの１つのペアの間への疎水性アミノ酸、好ましくはＡｌａ、の挿入を含むことがある。
【０１４２】
本発明のさらなる態様において、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体を主張するが、前記フラグメントの各々は、酸化された３８８Ｍｅｔ残基を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１４３】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１の残基３１１から４６２または配列番号２の残基３０８から４５９によって与えられるようなＥＧＦドメイン３から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、好ましくはＰｈｅ３７６Ａｌａ突然変異である、アミノ酸３７６Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１４４】
本発明の好ましい態様において、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体を主張するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）３５９Ｇｌｎ；
ｂ）３９８Ａｓｐ；
ｃ）４００Ａｓｐ；
ｄ）４０２Ａｓｎ；
ｅ）４０８Ｇｌｕ；
ｆ）４１３Ｔｙｒ；
ｇ）４１４Ｉｌｅ；
ｈ）４１５Ｌｅｕ；
ｉ）４１７Ａｓｐ；
ｊ）４３９Ａｓｎ
のうちの１つ以上、好ましくは１つ、の改変を含む。
【０１４５】
ａ）からｊ）に列挙したとおりのアミノ酸をアラニンによって置換することができる。
【０１４６】
本発明の１つの態様において、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体を主張するが、これらのフラグメントの各々は、次のアミノ酸位置（この番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）：
ａ）Ｌｅｕへの変更以外の改変を有する、３８８Ｍｅｔ、
ｂ）４１６Ａｓｐ；
ｃ）４２３Ａｓｐ；
ｄ）４２５Ａｓｐ；
ｅ）４２６Ｇｌｕ；
ｆ）４２９Ａｓｐ；
ｇ）４４０Ｌｅｕ；
ｈ）４６１Ａｓｐ
のうちの１つ以上、好ましくは１つ、の改変を含む。
【０１４７】
ａ）からｈ）に列挙したとおりのアミノ酸を好ましくはアラニンによって置換することができる。
【０１４８】
本発明は、さらに、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失され得る、アミノ酸３８７Ｇｌｎの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１４９】
本発明はまた、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＣｙｓからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失され得る、アミノ酸３８８Ｍｅｔの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１５０】
さらに、本発明は、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＣｙｓもしくはＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され得る、または欠失され得る、アミノ酸３８９Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１５１】
加えて、本発明は、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体であって、次のアミノ酸ペア：３８６Ｃｙｓと３８７Ｇｌｎ、３８７Ｇｌｎと３８８Ｍｅｔ、３８８Ｍｅｔと３８９Ｐｈｅ、３８９Ｐｈｅと３９０Ｃｙｓ（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）のうちの１つのペアの間への疎水性アミノ酸、好ましくはＡｌａ、の挿入を含むものであるトロンボモジュリン類似体に関する。
【０１５２】
本発明の好ましい態様では、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体を主張するが、これらのフラグメントの各々は、酸化された３８８Ｍｅｔ残基を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１５３】
本発明は、好ましくは、配列番号１の残基３３３から４６２または配列番号２の残基３３０から４５９によって与えられるような、ＥＧＦドメイン３のｃループおよびＥＧＦドメイン４から６から本質的になるトロンボモジュリン類似体に関するが、これらのフラグメントの各々は、好ましくはＰｈｅ３７６Ａｌａ突然変異である、アミノ酸３７６Ｐｈｅの突然変異を含むことがある（番号付けは、配列番号１に示す成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列に関係づけられる）。
【０１５４】
本発明によると、配列番号２に記載のＴＭ類似体は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１５５】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、配列番号４に記載のＴＭ類似体は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１５６】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、配列番号３に記載のＴＭ類似体は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１５７】
配列番号２の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号２のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号２のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１５８】
配列番号３の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号３のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号３のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１５９】
配列番号４の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表４に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１６０】
【表４−１】
2013531651.tif 000003
【０１６１】
【表４−２】
2013531651.tif 000004
【０１６２】
【表４−３】
2013531651.tif 000005
【０１６３】
【表４−４】
2013531651.tif 000006
【０１６４】
【表４−５】
2013531651.tif 000007
【０１６５】
【表４−６】
2013531651.tif 000008
【０１６６】
本発明によると、配列番号２に記載のＴＭ類似体は、表５に示すような改変（「第一、第二および第三のアミノ酸改変」）を各々含むことがある。表５は、Ｐｈｅ３７６についてのアラニン置換（「第一のアミノ酸改変」）を示す。本発明の一定の実施形態において、前記「第一のアミノ酸改変」は、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンによって構成される。これらの改変を、表５に与えるような「第二のアミノ酸改変」および「第三のアミノ酸改変」と各々組み合わせる。本発明のこれらのさらなる実施形態を、「表５に示すような改変」と一括して約言する。
【０１６７】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、配列番号４に記載のＴＭ類似体は、表５に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１６８】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、配列番号３に記載のＴＭ類似体は、表５に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１６９】
配列番号２の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号２のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号２のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表５に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１７０】
配列番号３の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号３のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号３のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表５に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１７１】
配列番号４の６個のＥＧＦ様リピートドメイン（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置２２７から４６２）、配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３からＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３０７から４６２）または配列番号４のＥＧＦ様リピートドメイン３のｃループからＥＧＦ様リピートドメイン６（配列番号１において番号付けした場合のアミノ酸位置３３３から４６２）から本質的になる、さらにもう１つのトロンボモジュリンフラグメントの場合だが、これらのＥＧＦドメイン含有フラグメントの各々は、表５に示す２つの配列改変（「第一のアミノ酸改変」および「第二のアミノ酸改変」）を含有することがある。
【０１７２】
【表５−１】
2013531651.tif 000009
【０１７３】
【表５−２】
2013531651.tif 000010
【０１７４】
【表５−３】
2013531651.tif 000011
【０１７５】
【表５−４】
2013531651.tif 000012
【０１７６】
【表５−５】
2013531651.tif 000013
【０１７７】
【表５−６】
2013531651.tif 000014
【０１７８】
次の表は、トロンボモジュリン類似体の特定のアミノ酸改変の結果として生ずる補因子活性低減に関する概要を与えるものである。
【０１７９】
【表６−１】
2013531651.tif 000015
【０１８０】
【表６−２】
2013531651.tif 000016
【０１８１】
本発明による治療的処置
本発明の１つの態様では、ここに開示するとおりのトロンボモジュリン類似体を、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有する患者における線溶亢進を伴う凝固障害の処置に使用する。これらの抗体は、第ＶＩＩＩ因子活性を阻害することができる。典型的な症例では、それらは、血友病Ａ患者の補充療法中に同種異系抗体として生ずる。それらは、血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩ補充療法の失敗の原因になり得る。それ故、本発明の１つの態様に従って、本明細書に開示するトロンボモジュリン類似体を、第ＶＩＩＩ因子に対する非応答者である血友病患者に救急薬として使用することができる。
【０１８２】
本発明のさらなる態様に従って、第ＶＩＩＩ因子が欠乏している患者を、第ＶＩＩＩ因子と本発明のＴＭ類似体の組み合わせで処置する。第ＶＩＩＩ因子および前記ＴＭ類似体を同時に投与してもよいし、または逐次的に投与してもよい。好ましくは、組換え第ＶＩＩＩ因子または組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子、さらに好ましくは、オクトコグ・アルファまたはモロクトコグ・アルファで、前記患者を処置する。１つの実施形態では、単離されたヒト第ＶＩＩＩ因子、例えばＡａｆａｃｔ（登録商標）、を使用することができる。
【０１８３】
本発明に従って、過去に第ＶＩＩＩ因子での処置を受けたことがあるまたは第ＶＩＩＩ因子処置を現在受けている血友病患者も、処置することができる。したがって、これらの患者は、治療有効第ＶＩＩＩ因子レベルを有する。
【０１８４】
第ＶＩＩＩ抗体の存在は、トロンボエラストグラムにおける特性変化の原因となるので、本発明のさらなる態様では、請求項記載のトロンボモジュリン類似体を使用して、血友病患者を第ＶＩＩＩ因子抗体の存在についてスクリーニングすることができる（図１１Ａ対図１２Ａ参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）、正常血漿（ＮＰ）およびＮＰと混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰについてのクロット溶解プロフィールおよび溶解時間を示す図である。クロット溶解プロフィールを、０（――）、１（・・・・）、６（−−−）、１０（−・・−・・−）、５０（――  ――  ――）および１００％（−・−・−）ＮＰについて示す。クロット溶解プロフィールから、クロットがその最高光学密度の二分の一に低下した時間を使って溶解時間を決定した。挿入図に溶解時間をまとめるが、ＮＰの百分率（およびしたがって、ＦＶＩＩＩの量）が増加するにつれて溶解時間が増加する一般的な傾向がある。ＮＰを加えることの溶解時間に対する効果は、１０％ＮＰでプラトーに達する。
【図２】図２は、様々な百分率のＦＶＩＩＩを含有する血漿中でのトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化を示す図である。（Ａ）ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）を正常血漿（ＮＰ）と混合すると、ＴＡＦＩ活性化が増進される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、そのピーク（●）において５０％ＮＰ（□）および１００％ＮＰ（△）中での約６００ｐＭ  ＴＡＦＩａと比較して、３０ｐＭのＴＡＦＩａしか測定されなかった。これらの実験は、三重反復で行ったものであり、データは平均±ＳＥを表す。クロット開始時間から最終時点までの活性化プロット（Ａ）の時間経過の下の面積とここでは定義する、ＴＡＦＩａポテンシャル（Ｂ）は、ＮＰの百分率が増加するにつれて５０％ＮＰでのプラトーまで増加する。５０％ＮＰおよび１００％ＮＰのＴＡＦＩａポテンシャルは、まったく異なるそれらのそれぞれのＴＡＦＩ活性化プロットの形状にもかかわらず、類似している（それぞれ、１４，１００ｐＭ・分および１６，８００ｐＭ・分）。溶解時間（図１、挿入図）とＴＡＦＩａポテンシャルとの関係は、ＦＶＩＩＩレベルに関係するので、ｌｏｇ溶解時間のｌｏｇ  ＴＡＦＩａポテンシャルに対するプロットを用いて提示する（図２Ｂ、挿入図）。予想どおり、データは、０〜１００％  ＦＶＩＩＩを含有する血漿中での溶解時間とＴＡＦＩａポテンシャルとの強い正の相関関係を示す。警告 1 : 「■」「〓」「？」「?」が存在します。「■」「〓」「？」「?」は外字から変換された可能性がありますので注意してください。
【図３】図３は、様々な百分率のＦＶＩＩＩを含有する血漿中でのプロトロンビンの活性化を示す図である。プロトロンビン活性化の時間経過を、０（●）、１（■）、６（▲）、１０（○）、５０（□）および１００％ＮＰ（△）と混合したＦＶＩＩＩＤＰについて示す。一般に、ＮＰの百分率が増加するにつれてプロトロンビン活性化速度が増加する。５０％ＮＰで、プロトロンビン活性化は高速で起こり（各プロットの傾きを検査することによって判定）、１５分以内に終わるように見えるが、１００％ＮＰは、より長い時間にわたって、より遅いプロトロンビン活性化速度を有する。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）とｔＰＡ（図４Ａでは０．２５ｎＭ、図４Ｂでは０．７５ｎＭ、図４Ｃでは１．５ｎＭ、および図４Ｄでは３ｎＭ）両方の様々な濃度での、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化に対するｓＴＭの効果を示す図である。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での延長溶解でのＴＡＦＩａ依存性欠損は、０．２５ｎＭ  ｔＰＡを含有する血漿への１００ｎＭ  ｓＴＭの添加によって修正される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、１００ｎＭ  ｓＴＭの存在下では、ｔＰＡの濃度を増加させても、前記溶解欠損の部分的な修正しか観察されない。これらの実験では、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＰＴＣＩ）を使用して、機能性ＴＡＦＩａが無い状態を作った。したがって、溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩ比によって示される溶解の一切の増加が、ＴＡＦＩａ依存性である。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄは、正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）とｔＰＡ（図４Ａでは０．２５ｎＭ、図４Ｂでは０．７５ｎＭ、図４Ｃでは１．５ｎＭ、および図４Ｄでは３ｎＭ）両方の様々な濃度での、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化に対するｓＴＭの効果を示す図である。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での延長溶解でのＴＡＦＩａ依存性欠損は、０．２５ｎＭ  ｔＰＡを含有する血漿への１００ｎＭ  ｓＴＭの添加によって修正される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、１００ｎＭ  ｓＴＭの存在下では、ｔＰＡの濃度を増加させても、前記溶解欠損の部分的な修正しか観察されない。これらの実験では、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＰＴＣＩ）を使用して、機能性ＴＡＦＩａが無い状態を作った。したがって、溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩ比によって示される溶解の一切の増加が、ＴＡＦＩａ依存性である。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄは、正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）とｔＰＡ（図４Ａでは０．２５ｎＭ、図４Ｂでは０．７５ｎＭ、図４Ｃでは１．５ｎＭ、および図４Ｄでは３ｎＭ）両方の様々な濃度での、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化に対するｓＴＭの効果を示す図である。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での延長溶解でのＴＡＦＩａ依存性欠損は、０．２５ｎＭ  ｔＰＡを含有する血漿への１００ｎＭ  ｓＴＭの添加によって修正される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、１００ｎＭ  ｓＴＭの存在下では、ｔＰＡの濃度を増加させても、前記溶解欠損の部分的な修正しか観察されない。これらの実験では、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＰＴＣＩ）を使用して、機能性ＴＡＦＩａが無い状態を作った。したがって、溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩ比によって示される溶解の一切の増加が、ＴＡＦＩａ依存性である。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）とｔＰＡ（図４Ａでは０．２５ｎＭ、図４Ｂでは０．７５ｎＭ、図４Ｃでは１．５ｎＭ、および図４Ｄでは３ｎＭ）両方の様々な濃度での、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性化に対するｓＴＭの効果を示す図である。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での延長溶解でのＴＡＦＩａ依存性欠損は、０．２５ｎＭ  ｔＰＡを含有する血漿への１００ｎＭ  ｓＴＭの添加によって修正される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、１００ｎＭ  ｓＴＭの存在下では、ｔＰＡの濃度を増加させても、前記溶解欠損の部分的な修正しか観察されない。これらの実験では、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＰＴＣＩ）を使用して、機能性ＴＡＦＩａが無い状態を作った。したがって、溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩ比によって示される溶解の一切の増加が、ＴＡＦＩａ依存性である。
【図５】図５は、正常血漿（ＮＰ）中（Ａ）、およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中（Ｂ）、１０ｎＭ  トロンボモジュリンの存在下での（●）、またはトロンボモジュリン無しでの（○）、ＴＡＦＩ活性化およびクロット溶解プロフィールを示す図である。付随するクロット溶解プロフィールを示し（――）、無ｓＴＭについてのクロット溶解プロフィールを基準として示す（−−−）。これらの実験は、三重反復で行ったものであり、データは平均±ＳＥを表す。
【図６】図６は、トロンボモジュリンへのトロンビン結合を示す図である。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  Ｃａ２＋、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０中のトロンビン（２０ｎＭ）とＤＡＰＡ（２０ｎＭ）からなる１．５ｍＬの溶液を、同じ溶液中の１．５４μＭ  トロンボモジュリンで滴定することによって、トロンボモジュリンへのトロンビンの結合を決定した。蛍光強度を測定した（λｅｘ＝２８０ｎｍ、λｅｍ＝５４５ｎｍ）。
【図７】図７は、ＴＡＦＩおよびプロテインＣ活性化における点突然変異体の相対補因子活性を示す図である。アラニンスキャニング突然変異誘発を用いて、可溶性トロンボモジュリンの点突然変異体を調製した。ＴＡＦＩ（黒塗の棒）およびプロテインＣ（斜線で影を付けた棒）について、プロテインＣおよびＴＡＦＩ活性化の速度を（突然変異体ＴＭＥＭ３８８Ｌでの活性化速度に対して）示す。
【図８Ａ】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの突然変異を示す図である。３つの独立したプラスミドを大腸菌において各突然変異体について構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、サンプルをウエスタンブロットで分析した（図示なし）。活性値は、３つの別のクローンからの平均値である。パネルＡ、Ｇｌｎ３８７での置換突然変異体；パネルＢ、Ｍｅｔ３８６での置換；パネルＣ、Ｐｈｅ３８９での置換突然変異体；パネルＤ、ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。ＴＭ挿入物を欠く対照プラスミド、ｐＳｅｌｅｃｔ、でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細についてはＣｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図８Ｂ】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの突然変異を示す図である。３つの独立したプラスミドを大腸菌において各突然変異体について構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、サンプルをウエスタンブロットで分析した（図示なし）。活性値は、３つの別のクローンからの平均値である。パネルＡ、Ｇｌｎ３８７での置換突然変異体；パネルＢ、Ｍｅｔ３８６での置換；パネルＣ、Ｐｈｅ３８９での置換突然変異体；パネルＤ、ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。ＴＭ挿入物を欠く対照プラスミド、ｐＳｅｌｅｃｔ、でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細についてはＣｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図８Ｃ】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの突然変異を示す図である。３つの独立したプラスミドを大腸菌において各突然変異体について構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、サンプルをウエスタンブロットで分析した（図示なし）。活性値は、３つの別のクローンからの平均値である。パネルＡ、Ｇｌｎ３８７での置換突然変異体；パネルＢ、Ｍｅｔ３８６での置換；パネルＣ、Ｐｈｅ３８９での置換突然変異体；パネルＤ、ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。ＴＭ挿入物を欠く対照プラスミド、ｐＳｅｌｅｃｔ、でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細についてはＣｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図８Ｄ】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの突然変異を示す図である。３つの独立したプラスミドを大腸菌において各突然変異体について構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、サンプルをウエスタンブロットで分析した（図示なし）。活性値は、３つの別のクローンからの平均値である。パネルＡ、Ｇｌｎ３８７での置換突然変異体；パネルＢ、Ｍｅｔ３８６での置換；パネルＣ、Ｐｈｅ３８９での置換突然変異体；パネルＤ、ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。ＴＭ挿入物を欠く対照プラスミド、ｐＳｅｌｅｃｔ、でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細についてはＣｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図９】図９は、（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２４４５−２４５３を一部変更した）トロンボモジュリンの線溶促進および抗線溶効果の略図である。低ＴＭ濃度でのクロット溶解時間の増加は、ＴＡＦＩ活性化の刺激に起因し、ＴＭの抗線溶活性を例証する。より高いウサギ肺ＴＭ濃度では、プロテインＣの活性化のためおよびＴＦＡＩ活性化の阻害のため、クロット溶解時間が減少する；これは、ウサギ肺ＴＭの線溶促進活性を例証する（太線）。１５ｎＭより上では、ウサギ肺ＴＭの線溶促進活性が抗線溶活性を超え、その結果、総合的な線溶促進効果が生ずることに留意されたい。対照的に、可溶性ＴＭ類似体は、抗線溶効果しか示さない（断続線）。
【図１０】図１０は、クロット溶解のＴＡＦＩａ依存性伝播倍数（Ｆｏｌｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）とＳｏｌｕｌｉｎ添加との関係を示す図である。クロット溶解時間の用量依存性増加は、ＴＡＦＩ活性化の刺激に起因するものであり、ＴＭの抗線溶活性を例証する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血におけるクロットの外観のＳｏｌｕｌｉｎ依存性変化を（トロンボエラストグラフィーによって測定して）示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血におけるクロット硬度のＳｏｌｕｌｉｎ依存性増加を示す図である。クロット溶解曲線下面積をトロンボエラストグラフィーにによってＳｏｌｕｌｉｎ（ｓＴＭ）濃度の関数として測定した。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血における溶解のＳｏｌｕｌｉｎ依存性依存性延長を示す図である。トロンボエラストグラフィーによってＳｏｌｕｌｉｎ（ｓＴＭ）濃度の関数として測定したクロット溶解時間。
【図１２Ａ】図１２Ａは、血友病Ａおよび阻害性抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有するイヌ科動物からの全血における溶解のＳｏｌｕｌｉｎ依存性延長を（トロンボエラストグラフィーによって測定して）示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、阻害性抗第ＶＩＩＩ因子抗体が存在する状態の血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血におけるクロット硬度のＳｏｌｕｌｉｎ依存性増加を示す図である。クロット溶解曲線下面積をトロンボエラストグラフィーによってＳｏｌｕｌｉｎ（ｓＴＭ）濃度の関数として測定した。
【図１３】図１３は、表１：各条件下での溶解時間の決定を可能にするためにＰＴＣＩの存在下での絶対溶解時間を含む、図４を作成するために使用したデータの一覧、を示す図である。すべての場合、ＴＡＦＩａ阻害因子、ＰＴＣＩ、の存在下で得たものに対しての溶解時間を表示する。ＴＡＦＩ、トロンビン活性化線溶阻害因子；ＰＴＣＩ、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子。
【図１４】図１４は、表２：ＴＭＥ（Ｓｆ９）の部位特異的突然変異体類似体のクロラミンＴ酸化、を示す図である。クロラミンＴ処理後の結果を、対照処理後の活性の百分率として表示した。＊二重反復判定の平均値およびその平均からの偏差。
【図１５】図１５は、ＳｏｌｕｌｉｎおよびＳｏｌｕｌｉｎ突然変異体、Ｐｈｅ３７６Ａｌａ（両方とも２５ｎＭで存在）によるＴＡＦＩ（上のほうのパネル）およびプロテインＣ（下のほうのパネル）の、上昇基質濃度での、活性化速度を示す図である。
【図１６】図１６は、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５および２μＭのＴＭ濃度で判定したときの、Ｐｈｅ３７６Ａｌａ突然変異体を有するＳｏｌｕｌｉｎ類似体（薄灰色棒）と比較したＳｏｌｕｌｉｎ（黒棒）についてのＴＡＦＩ活性化対プロテインＣ活性化の比を示す図である。最も右側の棒は、すべての濃度での測定値（ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）から併せた比を示す。
【図１７】図１７は、重症血友病Ａを有するイヌからの血液サンプルのトロンボエラストグラフィーを示す図である。５００μｇ／ｋｇの用量でのＳｏｌｕｌｉｎの静脈内注射後、異なる時点でサンプルを採取した。
【図１８】図１８は、重症血友病イヌからの血液におけるクロット形成および安定性の改善の鐘形濃度依存性を示す図である。Ｓｏｌｕｌｉｎを１０μｇ／ｋｇの用量で注射し、示されている時間に、トロンボエラストグラムの判定のために、血漿サンプルを採取した。各トロンボエラストグラムに、サンプル採取時間およびＳｏｌｕｌｉｎの血漿濃度を示す。
【図１９】図１９は、ＴＡＦＩ特異的トロンボモジュリン類似体に関する全体像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１８６】
本発明の実施形態
本発明の１つの態様において、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬品の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用を主張するが、前記ＴＭ類似体は、治療有効投薬量で抗線溶効果を提示することを特徴とする。
【０１８７】
本発明のさらなる態様において、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬品の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用を主張するが、前記トロンボモジュリン類似体は、以下の特徴のうちの１つ以上を提示する：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比較して減少される、トロンビンへの結合親和性、および／もしくは０．２ｎＭより大きいｋＤ値でのトロンビンへの結合親和性、ならびに／または
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比較して低減された補因子活性、
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比較して増加された、ＴＡＦＩ活性化活性の補因子活性に対する比。
【０１８８】
本発明のさらなる態様において、上で説明したトロンボモジュリン類似体の使用を主張するが、前記線溶亢進を伴う凝固障害は、次のとおりの疾患の群から選択される：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠乏症、パラ血友病、第Ｉ、ＩＩ、ＶまたはＶＩＩクロッティング因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固不全。
【０１８９】
本発明のさらなる態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、頭蓋内または他のＣＮＳ出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸器管、腹膜後腔または軟組織における出血からなる群より選択される出血事象のうちの１つ以上を処置するために使用することができる。本発明のトロンボモジュリン類似体で処置される頭蓋内出血事象は、脳実質内、脳実質外もしくはクモ膜下出血（ＳＡＨ）または硬膜外もしくは硬膜下血腫であり得る。好ましくは、ＳＡＨを有する患者を処置し、さらに好ましくは、ＳＡＨ後の動脈瘤出血を処置する。
【０１９０】
本発明の好ましい態様では、本発明によるトロンボモジュリン類似体を使用して、身体的外傷、好ましくはＣＮＳ外傷、後の線溶亢進を処置する。本明細書において定義する場合の身体的外傷は、暴力または事故からなどの突然の身体的傷害によって生ずる肉体的創傷またはショックを指す。身体的外傷は、多発外傷、頭部傷害、胸部外傷、腹部外傷、四肢外傷、顔面外傷、尿生殖系外傷、骨盤外傷および軟組織傷害を包含する。
【０１９１】
本発明のさらなる態様では、線溶亢進を伴う凝固障害の処置に使用するトロンボモジュリン類似体を、さらなる線溶阻害因子との組み合わせで与える。詳細には、標準的な血小板粘着を修正する物質、例えばＥｔａｍｓｙｌａｔｅ、を使用することができる。好ましくは、タンパク質分解酵素の阻害因子を使用することができ、これは、さらに好ましくは、アプロチニンなどのプラスミンの阻害因子である。本発明のさらにいっそう好ましい態様において、前記さらなる抗線溶薬、例えばイプシロン−アミノカプロン酸またはトラネキサム酸、は、プラスミンのリシン結合部位を遮断する。
【０１９２】
本発明の好ましい態様において、前記トロンボモジュリン類似体で処置される患者は、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有する。
【０１９３】
本発明のもう１つの態様では、前記トロンボモジュリン類似体で処置される患者を、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換え第ＶＩＩＩ因子または組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子、さらに好ましくはオクトコグ・アルファまたはモロクトコグ・アルファ、でさらに処置する。
【０１９４】
本発明の好ましい態様では、配列番号５から１１に記載のトロンボモジュリン類似体を、上で説明した用量または用量範囲で与える。
【０１９５】
本発明のさらなる態様では、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のために使用するトロンボモジュリン類似体を、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換え第ＶＩＩＩ因子または組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子、さらに好ましくはオクトコグ・アルファまたはモロクトコグ・アルファ、との組み合わせで与える。
【０１９６】
本発明の１つの態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、線溶亢進を伴う凝固障害の出血事象時に、または出血リスク増加（例えば外科手術もしくは抜歯）に先立って投与する。
【０１９７】
本発明のさらなる態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、輸血／血漿輸血または凝固因子補充療法に抗療性である患者に投与する。
【０１９８】
本発明の１つの態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、多回投与で、好ましくは、合計１週間未満から４週間の期間にわたって１日１回、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日ごとに、さらに好ましくは、長期投与として投与する。
【０１９９】
本発明の好ましい態様では、配列番号５から１１に記載のトロンボモジュリン類似体を、上で説明した投与計画に従って投与する。
【０２００】
本発明の好ましい態様では、前記トロンボモジュリンを非経口適用として与え、静脈内または皮下適用として与えるのが好ましい。
【０２０１】
本発明の１つの態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、処置する被験体において５ｎＭ／Ｌ未満の、好ましくは３ｎＭ／Ｌ未満の、およびさらに好ましくは１．５ｎＭ／Ｌ未満の血漿濃度を生じさせる量で与える。
【０２０２】
本発明のさらなる態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、前記血漿濃度が０．１ｎＭ／Ｌと５ｎＭ／Ｌの間、好ましくは０．１ｎＭ／Ｌと３ｎＭ／Ｌの間になるように用量設定する。
【０２０３】
本発明の好ましい態様では、上に開示した血漿濃度を生じさせるように、配列番号５から１１に記載のトロンボモジュリン類似体を使用する。
【０２０４】
本発明のもう１つの態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、処置する被験体に、０．１μｇ／ｋｇと１４０μｇ／ｋｇの間の用量で、好ましくは０．５μｇ／ｋｇと４０μｇ／ｋｇの間の用量で、さらに好ましくは０．５μｇ／ｋｇと４μｇ／ｋｇの間の用量で、および特に０．７５μｇ／ｋｇと    μｇ／ｋｇの間の用量で与える（ｋｇは、処置する被験体の体重のｋｇを指す）。
【０２０５】
本発明のさらなる態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、０．６、１、３または４．０ｍｇ／患者の体重調整用量に等しい、０．７５、１．４、２．５または４．０μｇ／ｋｇの用量で与える。
【０２０６】
本発明のさらなる好ましい態様では、配列番号５から１１に記載のトロンボモジュリン類似体を、上で説明した用量または用量範囲で与える。
【０２０７】
本発明のさらに好ましい態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、可溶性ＴＭ類似体である。
【０２０８】
本発明のさらにいっそう好ましい態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、ヒト可溶性ＴＭ類似体である。
【０２０９】
本発明の１つの態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、ＥＧＦ６を含有する、好ましくは、フラグメントＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含む、およびさらに好ましくはＥＧＦドメイン１〜６を含む群から選択される、少なくとも１つの構造ドメインを含む。
【０２１０】
本発明のさらなる態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、ＥＧＦドメインＥＧＦ１からＥＧＦ６からなり、およびさらに好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３からＥＧＦ６からなる。
【０２１１】
本発明の１つの態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１または配列番号３に示す）に対応するアミノ酸配列を有するとともに、次の改変のうちの１つ以上を含む：
ａ）アミノ酸１〜３の除去
ｂ）Ｍ３８８Ｌ
ｃ）Ｒ４５６Ｇ
ｄ）Ｈ４５７Ｑ
ｅ）Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結。
【０２１２】
本発明のさらなる態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、配列番号２との少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を有する。
【０２１３】
本発明の好ましい態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、天然配列の（配列番号１または配列番号３に記載の）：
ａｂ）３５５Ａｓｎ；
ａｅ）３５９Ｇｌｎ；
ａｆ）３６１Ｇｌｎ；
ａｇ）３６３Ｌｅｕ；
ａｈ）３６４Ａｓｎ；
ａｉ）３６８Ｔｙｒ；
ａｊ）３７１Ｖａｌ；
ａｋ）３７４Ｇｌｕ；
ａｌ）３７６Ｐｈｅ；
ａｍ）３８４Ｈｉｓ；
ａｎ）３８５Ａｒｇ；
ｂａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ）３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ）３９８Ａｓｐ；
ｂｄ）４００Ａｓｐ；
ｂｅ）４０２Ａｓｎ；
ｂｆ）４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ）４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ）４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ）４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ）４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ）４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ）４１６Ａｓｐ；
ｂｍ）４１７Ａｓｐ；
ｂｎ）４２０Ｉｌｅ；
ｂｏ）４２３Ａｓｐ；
ｂｐ）４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ）４２５Ａｓｐ；
ｂｒ）４２６Ｇｌｕ；
ｃａ）４２８Ｇｌｕ；
ｃｂ）４２９Ａｓｐ；
ｃｃ）４３２Ｐｈｅ；
ｃｄ）４３４Ｓｅｒ；
ｃｅ）４３６Ｖａｌ；
ｃｆ）４３８Ｈｉｓ；
ｃｇ）４３９Ａｓｐ；
ｃｈ）４４０Ｌｅｕ；
ｃｉ）４４３Ｔｈｒ；
ｃｊ）４４４Ｐｈｅ；
ｃｋ）４４５Ｇｌｕ；
ｃｌ）４５６Ａｒｇ；
ｃｍ）４５８Ｉｌｅ；または
ｃｎ）４６１Ａｓｐ
に対応する１つ以上の位置でのアミノ酸改変を有する。
【０２１４】
本発明のさらなる態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、配列番号１または配列番号３に記載の位置３７６において、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換される、さらに好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換される、および最も好ましくはアラニンで置換される、フェニルアラニンの改変を有する。
【０２１５】
本発明のさらなる態様において、前記トロンボモジュリン類似体は、配列番号１または配列番号３に記載の以下のアミノ酸：
ａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂ）３８８Ｍｅｔ；
ｂ）３８９Ｐｈｅ
のうちの１つ以上の改変を有し、それによって前記アミノ酸が欠失される、または前記アミノ酸に１つ以上の追加のアミノ酸が挿入される、または好ましくは前記アミノ酸が置換される。
【０２１６】
本発明のさらなる態様では、前記トロンボモジュリン類似体を、好ましくはクロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された、その酸化形態で使用する。
【０２１７】
本発明のさらなる態様では、トロンボモジュリン類似体を使用するが、該ＴＭ類似体中のメチオニン残基の１つ以上が酸化されており、好ましくは、（配列番号１または配列番号３に記載の）位置３８８のメチオニン残基が酸化されている。
【０２１８】
本発明のもう１つの態様では、線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適するトロンボモジュリンの類似体のスクリーニング方法を主張するが、該トロンボモジュリンは、以下の特徴：
（ｉ）トロンビンへの結合親和性低減、
（ｉｉ）補因子活性低減、
（ｉｉｉ）ＴＡＦＩ活性化活性増加
のうちの１つ以上を呈示するものであり、この方法は、
ａ）トロンボモジュリン配列（配列番号１または配列番号３）の、好ましくは請求項１５に記載のアミノ酸位置の、１つ以上のアミノ酸置換を行う工程；
ｂ）その改変された類似体と、対照分子、好ましくはウサギ肺ＴＭまたは可溶性ヒトＴＭ類似体、とを、以下の特性：
ｂａ）トロンビンへの結合親和性（ＫＤ値）；
ｂｂ）補因子活性；
ｂｃ）ＴＡＦＩ活性化活性またはＴＡＦＩａポテンシャル；
ｂｄ）ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比；
ｂｅ）タンパク質酸化の効果；
ｂｆ）インビトロアッセイにおける、時間での、クロット溶解に対する効果；
ｂｇ）凝固関連動物モデルにおける効果
のうちの１つ以上に関して比較する工程
を含む。
【０２１９】
本発明のもう１つの態様では、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法を主張し、この方法は、治療有効量の、請求項１から２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与することを含む。
【０２２０】
本発明のもう１つの態様では、位置３７６（配列番号１に記載の番号付け）において、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換される、さらに好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換される、および最も好ましくはアラニンで置換される、フェニルアラニンの改変を有する、配列番号２に記載のトロンボモジュリン類似体を主張する。
【０２２１】
本発明の好ましい態様では、図１９に与え、配列番号５から配列番号１１のアミノ酸配列によって示すとおりのトロンボモジュリン類似体を使用する。
【０２２２】
これらの好ましいＴＭ類似体は、以下のものである：
１．次のアミノ酸交換：Ｐｈｅ３７６Ａｌａ、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ、Ａｒｇ４５６Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４５７ＧｌｎおよびＳｅｒ４７４Ａｌａ、を有するａａ４からａａ４９０にわたるＴＭフラグメント（配列番号５に等しい）。
２．次のアミノ酸交換：Ｐｈｅ３７６Ａｌａ、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ、Ａｒｇ４５６ＧｌｙおよびＨｉｓ４５７Ｇｌｎ、を有するａａ２２７からａａ４６２（＝ＥＧＦ１〜６）にわたるＴＭフラグメント（配列番号６に等しい）。
３．次のアミノ酸交換：Ｐｈｅ３７６Ａｌａ、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ、Ａｒｇ４５６ＧｌｙおよびＨｉｓ４５７Ｇｌｎ、を有するａａ３３３からａａ４６２にわたるＴＭフラグメント（配列番号７に等しい）。
４．次のアミノ酸交換：Ｐｈｅ３７６ＡｌａおよびＭｅｔ３８８Ｌｅｕ、を有するａａ２２７からａａ４６２にわたるＴＭフラグメント（配列番号８に等しい）。
５．次のアミノ酸交換：Ｍｅｔ３８８Ａｌａ、Ａｒｇ４５６ＧｌｙおよびＨｉｓ４５７Ｇｌｎ、を有するａａ３３３からａａ４６２にわたるＴＭフラグメント（配列番号９に等しい）。
６．次のアミノ酸交換：Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ、Ａｒｇ４５６Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４５７ＧｌｎおよびＧｌｕ４６１Ａｌａ、を有するａａ３３３からａａ４６２にわたるＴＭフラグメント（配列番号１０に等しい）。
７．次のアミノ酸交換：Ｐｈｅ３７６Ａｌａ、Ｍｅｔ３８８Ａｌａ、Ａｒｇ４５６ＧｌｙおよびＨｉｓ４５７Ｇｌｎ、を有するａａ３３３からａａ４６２にわたるＴＭフラグメント（配列番号１１に等しい）。
【０２２３】
定義
本発明の文脈において用いる場合、「抗線溶効果」という用語は、トロンボモジュリン類似体を加えていない同じアッセイ条件と比較して（実施例Ｉにおいて説明するような）クロット溶解時間を延長するトロンボモジュリン類似体の能力を指すものとする。抗線溶効果は、ＴＭ類似体の抗線溶活性がその線溶促進活性と比較して優勢であることに起因する。
【０２２４】
本明細書において用いる場合、「線溶促進効果」という用語は、トロンボモジュリン類似体を加えていない同じアッセイ条件と比較して（実施例Ｉにおいて説明するような）インビトロアッセイにおいてクロット溶解時間を有意に低減させる該トロンボモジュリン類似体の能力を指すものとする。
【０２２５】
本明細書において用いる場合、「有意に低減させる」および「有意に延長する」という用語は、ｐ＝０．１レベルでの基礎値とは有意に異なるクロット溶解時間の延長もしくは低減を指す、および／または１０％、好ましくは２０％、さらに好ましくは３０％および最も好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％、１５０％または２００％を超える延長もしくは低減を指す。
【０２２６】
本発明の文脈において用いる場合、「処置する」、「処置すること」または「処置」という語は、本発明のＴＭ類似体またはそれらを含む任意の組成物を使用して、出血事象を予防的に防止する、または出血事象を軽減する、改善するもしくは停止させることを指す。これらの語は、そうでないと明確に言及されていない限り、軽減、寛解または防止ばかりでなく治癒または修復も包含する。また、本明細書において用いる場合、「患者」という語は、ヒトを含めて、哺乳類を指す。
【０２２７】
本明細書において用いる場合、「線溶亢進を伴う凝固障害」という用語は、線溶の著しい増加が出血事象を引き起こす、悪化させるまたは長引かせる、血液の凝固性に影響を及ぼす疾患としての凝固障害を指すものとする。
【０２２８】
本発明の文脈において用いる場合、「トロンボモジュリン類似体」という用語は、膜結合または可溶性トロンボモジュリンと同じ特徴的生物活性を有する、タンパク質とペプチドの両方を指す。生物活性は、トロンビンの受容体として作用し、ＴＡＦＩの活性化を増加させる能力、または天然トロンボモジュリンに随伴する他の生物活性である。
【０２２９】
本明細書において用いる「結合親和性」という用語は、トロンボモジュリン類似体とトロンビンの間の親和性の強度を指し、会合定数ＫＤによって記載される。トロンビンとトロンボモジュリンの間の結合親和性についてのＫＤ値は、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または動態（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定することができる。好ましくは、本発明の実施例ＩＩにおいて説明するような動態アッセイを用いて、結合親和性を分析する。
【０２３０】
「ＫＤ」は、ＴＭ類似体とトロンビンの間の相対結合親和性を指す。ＫＤ値が高いほど、低い結合親和性を表す。ＫＤを決定するための的確なアッセイおよび手段を実施例ＩＩにおいて提供する。
【０２３１】
本明細書において用いる場合、「補因子活性」という用語は、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのプロテインＣを活性化する能力を強化する、トロンボモジュリン類似体の能力を指す。補因子活性を測定するために用いるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＩＩにおいて与える。
【０２３２】
本明細書において用いる場合、「ＴＡＦＩ活性化活性」という用語は、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのＴＡＦＩを活性化する能力を強化する、トロンボモジュリン類似体の能力を指す。ＴＡＦＩ活性を測定するために用いるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＶにおいて与える。
【０２３３】
「Ｋｍ」は、ミカエリス定数を指し、異なる基質濃度で測定する触媒の速度測定による標準的な手法で導出される。Ｋｍは、反応速度がその最大値の半分であるときの基質濃度に等しい。本発明のＴＭ類似体についての「Ｋｍ」は、トロンビン濃度を一定のレベル（例えば、１ｎＭ）に保持すること、およびそのＫＤに依存して飽和レベル（例えば、１００ｎＭ以上）のＴＭを使用することによって決定する。漸増濃度（例えば、１〜６０μＭ）のプロテインＣを使用して反応を行う。その後、ラインウィーバー・バークプロッティングまたは非線形回帰分析を用いてＫｍおよびｋｃａｔを決定する。
【０２３４】
「ＴＭＥ」は、６回ＥＦＧリピート（配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸２２７から４６２）からなるＴＭの類似体を指す。
【０２３５】
「ＴＭＥＭ３８８Ｌ」は、（配列番号３に基づき）位置３８８における天然メチオニンのロイシン残基による置換を有する、６回ＥＧＦリピート（ａａ２７７から４６２）からなるＴＭの類似体を指す。
【０２３６】
「治療有効量」という用語は、出血事象などの、線溶亢進を伴う凝固障害に随伴する症状を低減させることとなる活性成分の量と定義する。「治療に有効な」はまた、無処置と比較した障害重症度、発生の頻度または継続期間の一切の改善を指す。
【０２３７】
本発明の文脈において用いる場合、「配列改変」という用語は、一次アミノ酸配列の、特にアミノ酸置換、欠失または挿入による、改変に関する。そうでないと明確に定義されていない場合、この用語は、アミノ酸の別のアミノ酸による置換を意味し、前記別のアミノ酸は、その極性、親水性もしくは疎水性の特性、酸性もしくは塩基性の特性、サイズまたは芳香族性の点でそれぞれ最初のアミノ酸と実質的に異なる。
【０２３８】
アミノ酸の一般クラス、すなわち、酸性、塩基性、極性、非極性、負電荷を有する、正電荷を有する、芳香族および脂肪族アミノ酸のクラスを考慮すると、配列改変の本発明の場合の概念は、好ましくはあるアミノ酸の、異なるアミノ酸クラスの別のアミノ酸での置換を求める。好ましい態様では、アミノ酸を、置換すべきアミノ酸の「反対の特徴」を有する置換基として選択する。次のアミノ酸（ａａ）置換を特に提案する：酸性ａａ対塩基性ａａ、極性ａａ対非極性ａａ、負の電荷を有するａａ対正の電荷を有するａａ、芳香族ａａ対脂肪族ａａ。
【０２３９】
本発明の配列改変の特別な実施形態は、脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）によるアミノ酸の置換であり、アラニンでの置換が最も好ましい。
【０２４０】
本発明の場合の配列改変は、非天然アミノ酸での置換も含むことがある。「非天然アミノ酸」は、２０の一般アミノ酸のうちの１つまたはピロリシンまたはセレノシステインではないアミノ酸をを指す。「非天然アミノ酸」という用語は、天然にコードされているアミノ酸（２０の一般アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインを含むが、これらに限定されない）の改変によって天然に存在するが、それら自体が翻訳複合体により成長ポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸を含むが、これらに限定されない。天然にコードされない天然に存在するアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシン、オルチニン、タウリンが挙げられるが、これらに限定されない。前記配列改変は、アミノ酸への他の基の連結も含む。これらの基としては、アミノ酸の化学的性質を好ましくは変化させる、アセタート、ホスファート、様々な脂質および炭水化物が挙げられる。前記配列改変は、それぞれのアミノ酸の、好ましくはＭｅｔまたはＣｙｓ残基の、酸化または還元をさらに含む。
【実施例】
【０２４１】
（実施例Ｉ）
ヒト血漿でのクロット溶解アッセイ
インビトロクロット溶解のモデルを用いて、正常血漿と第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の混合物中でのクロット溶解時間を減少させるまたは増加させる可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）の能力を試験した。
【０２４２】
１．試験システム
血漿組成物中で、トロンビン（第ＩＩａ因子）、塩化カルシウムおよびホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン（ＰＣＰＳ）小胞を混合することにより、インビトロでクロッティングを開始させた。凝固および線溶の時間経過を濁度アッセイで判定し、機能アッセイを用いて「ＴＡＦＩａポテンシャル」を判定した。
【０２４３】
２．実験手順
材料。トロンビンおよびフィブリノゲンは、フィブリノゲン調製についてβ−アラニン沈殿後に４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００の添加により溶液を２％ＰＥＧ−８０００ではなく１．２％ＰＥＧ−８０００を含む水にしたことを除いて、Ｗａｌｋｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：５２０１−５２１２）に記載されたとおりに調製した。プロトコルのこの変更により、フィブリノゲンのより大きな収量が可能になった。ＴＡＦＩａアッセイにおいて使用したＱＳＹ−ＦＤＰ（クエンチャー、ＱＳＹ９  Ｃ５−マレイミド、に共有結合で連結されているフィブリン分解産物）およびＴＡＦＩａ標準物質は、記載された（Ｋｉｍら、２００８；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７２：３２−４０；Ｎｅｉｌｌら、２００４；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３０：３３２−３４１）とおりに調製し、組換えヒトＰｇ（Ｓ７４１Ｃ）およびフルオレセイン誘導体（５ＩＡＦ−Ｐｇ）は、Ｈｏｒｒｅｖｏｅｔｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９７；２７２：２１７６−２１８２）によって記載されたとおりに調製した。Ｓ５２５Ｃ−プロトロンビンは、Ｂｒｕｆａｔｔｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１７６６３−１７６７１）によって以前に記載されたとおりに精製して５−ヨードアミドフルオレセイン（５ＩＡＦ）で蛍光標識した。ＱＳＹ９  Ｃ５−マレイミドおよび５−ヨードアミドフルオレセインは、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．（カナダ、オンタリオ州、バーリントン）から購入した。プラスミンは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国、ヴァーモント州、エセックス・ジャンクション）から購入し、組換えヒト可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ；ｓＴＭ）は、Ｐａｉｏｎ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ（ドイツ、アーヘン）から提供された。正常ヒトプール血漿（ＮＰ）は、カナダ、オンタリオ州、キングストンのＫｉｎｇｓｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＫＧＨ）における血液バンクで健常ドナーから得、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（カナダ、オンタリオ州、ハミルトン）から購入した。ＴＡＦＩ欠乏血漿（ＴＤＰ）は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：１０２１−１０３０）によって記載されたとおりに、固定化抗ヒトＴＡＦＩモノクローナル抗体のカラムでの正常血漿のアフィニティークロマトグラフィーによって調製した。プラスミン阻害因子Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン（ＶＦＫｃｋ）、トロンビン阻害因子Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡｃｋ）およびジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＰＴＣＩ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入した。組織型プラスミノゲン活性化因子（Ａｃｔｉｖａｓｅ；ｔＰＡ）は、ＫＧＨ（カナダ、オンタリオ州、キングストン）の薬局から購入した。すべての他の試薬は、分析品質のものであった。
【０２４４】
３．方法。
【０２４５】
ＴＡＦＩ活性化の程度を判定するためのクロット溶解アッセイおよびサンプルの調製。
【０２４６】
ＦＶＩＩＩ−ＤＰとＮＰを、ＮＰの最終百分率が０、１、６、１０、５０または１００％（０〜１００％ＮＰ）になるように混合した。混合前に、各血漿を３２の光学密度に希釈し、２０ｎＭ  トロンビンの存在または不在下、１．５ｎＭ  ｔＰＡと４０μＭ  ＰＣＰＳと２０ｍＭ  ＣａＣｌ２と含有する同体積の溶液に添加し（最終濃度：０．７５ｎＭ  ｔＰＡ、２０μＭ  ＰＣＰＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、±１０ｎＭ  トロンビン）、それらのサンプルを多数のエッペンドルフ管に分割し、３７℃の水浴中に入れた。これらの管の中で、トロンビンおよびプラスミンをそれぞれ選択的に阻害するための１０μＭ  ＰＰＡｃｋおよび１０μＭ  ＶＦＫｃｋの添加により、様々な時点でクロッティングおよび溶解を停止させた。サンプルを激しく混合し、その後、３０秒間、１６０００ｇ（室温）で遠心分離し、直ちに氷上に置いて、ＴＡＦＩａの熱不活性化を防止した。各サンプルの上清を、ＴＡＦＩ欠乏血漿で５倍系列希釈し、Ｋｉｍら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８；３７２：３２−４０）によって記載された機能性アッセイを用いてＴＡＦＩａを測定した。カバー付き９６ウェルプレートで同じ実験を行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国、カリフォルニア州、サニーヴェール）を用いて４００ｎｍで濁度を経時的にモニターして、凝固および線溶のタイミングを判定した。可溶性トロンボモジュリン（０〜１００ｎＭ）の存在または不在下、４つのｔＰＡ濃度（０．２５、０．７５、１．５および３ｎＭ）で同様の実験を行って、ＴＡＦＩ活性化および溶解時間に対するｓＴＭの効果を判定した。これらの実験を５μＭ  ＰＴＣＩの存在下でも行って、正常およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿における溶解のＴＡＦＩａ依存性延長を証明した。
【０２４７】
正常およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿におけるプロトロンビン活性化の時間経過の判定。
【０２４８】
正常およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿（０〜１００％ＮＰ）にプロトロンビン誘導体（５ＩＡＦ−ＩＩ；最終３００ｎＭ）ならびに２０μＭ  ＰＣＰＳおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を１０ｎＭ  トロンビンの存在下で追加して、クロッティングを開始させた。これらの実験を、不透明、プラスチックカバー付き９６ウェルプレートで行った。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＧｅｍｉｎｉＸＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国、カリフォルニア州、サニーヴェール）を用いて、それぞれ４９５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起および発光波長を用い、５３０ｎｍ発光カットオフフィルターを用いて、３７℃で経時的に蛍光強度をモニターした。ベースライン蛍光と、完全プロトロンビン活性化と相関する最大蛍光とを表すように蛍光を正規化（０〜１）した。
【０２４９】
ＴＡＦＩａポテンシャルの判定。
【０２５０】
ＴＡＦＩａプロット下面積を、実験の経過にわたってＴＡＦＩａの効果を定量するためのパラメータとして選択した。このパラメータを、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９３；８５：５−１１）によって定義された「トロンビンポテンシャル」と類似に「ＴＡＦＩａポテンシャル」と呼んだ。トロンビンポテンシャル同様、ＴＡＦＩａポテンシャルは、分解する基質の量に比例し、数学的には次のように説明される：
【０２５１】
【数１】
2013531651.tif 000017
【０２５２】
（式中、ｄＳ／ｄｔは、基質消費速度であり、Ｓは、基質である）。
Ｓが、一定である（すなわち、Ｓの制限消費）ならば、
【０２５３】
【数２】
2013531651.tif 000018
【０２５４】
【数３】
2013531651.tif 000019
【０２５５】
ある区間０からｔについては、
【０２５６】
【数４】
2013531651.tif 000020
【０２５７】
方程式（４）中の右側の積分が、ＴＦＡＩａプロット下面積であることを具体的に表すと、
【０２５８】
【数５】
2013531651.tif 000021
【０２５９】
【数６】
2013531651.tif 000022
【０２６０】
４．結果
クロット溶解時間は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿への正常血漿の添加によって増加される。
【０２６１】
１０ｎＭ  第ＩＩａ因子、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０μＭ  ＰＣＰＳ小胞でクロッティングを開始させて、クロット構造がＦＶＩＩＩ濃度に非感受性であるモデルを作った。クロット構造は、ＦＶＩＩＩ濃度に関係なく同様であるので、ｔＰＡ依存性（０．７５ｎＭ）クロット溶解に対するＦＶＩＩＩの効果を判定することができる。この溶解モデルを使用すると、正常血漿の百分率が増加するにつれて溶解時間が増加した。図１は、０〜１００％正常血漿添加に伴うＦＶＩＩＩ−ＤＰについてのクロット溶解プロフィールを示すものであり、それらの溶解時間を図１（挿入図）にまとめる。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での溶解時間は、３７分であり、それを正常血漿の添加によっておおよそ５０％増加させることができる。
【０２６２】
ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに１０％正常血漿で十分である。
【０２６３】
１０％正常血漿で、ＦＶＩＩＩ−ＤＰに関連した溶解時間短縮は、正常血漿中で観察される溶解時間に修正された（図１、挿入図参照）。
【０２６４】
ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに５０％のＴＡＦＩａポテンシャルで十分である。
【０２６５】
ＴＡＦＩ活性化を正常血漿、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿および混合血漿中で測定して、活性化の時間経過に対するＦＶＩＩＩの効果を定量した。機能性アッセイを用いて、クロッティングおよび溶解の時間経過にわたってＴＡＦＩａを測定した。結果を図２に提示する。トロンビン、カルシウムイオンおよびＰＣＰＳを使用してＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でクロッティングを開始させたとき、おおよそ３０ｐＭ  ＴＡＦＩａが５分後に測定された。正常血漿の百分率が増加するにつれて、ＴＡＦＩａのピーク濃度も増加した。ＦＶＩＩＩ−ＤＰに１０％正常血漿を追加することによって溶解時間は修正されたが、これは、ＴＡＦＩ活性化の完全修正には十分でなかった。ＴＡＦＩａ時間経過プロット下面積（図２Ａ）を計算することにより、正常血漿および５０％正常血漿中で最初の５０分にわたってほぼ同じＴＡＦＩａポテンシャル（図２Ｂ）が達成された（それぞれ、１６８００ｐＭ・分および１４１００ｐＭ・分）が、１０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ血漿は、正常血漿中でのＴＡＦＩａポテンシャルの５０％のＴＡＦＩａポテンシャルしか有さないと判定された。
【０２６６】
溶解時間とＴＡＦＩａポテンシャルの間には強い相関関係がある。
【０２６７】
溶解時間とＴＡＦＩ活性化の間の関係を範囲０〜１００％ＦＶＩＩＩにわたって定量するために、ｌｏｇ溶解時間対ｌｏｇ  ＴＡＦＩａポテンシャルをプロットした（図２Ｂ、挿入図）。予想どおり、データは、０〜１００％ＦＶＩＩＩを含有する血漿中で、溶解時間とＴＡＦＩａポテンシャルの間の強い正の相関関係を示す。トロンビンはＴＡＦＩの活性化因子であるので、血漿中でのプロトロンビン活性化を分析することによって、図２ＡにおけるＴＡＦＩ活性化プロフィールを合理化することができる（図３）。正常血漿の百分率が増加するにつれて、プロトロンビン活性化速度も増加する（これは、図３における曲線の傾きを調査することによって判定することができる）という一般的な傾向がある。正常血漿では例外が起きる。正常血漿中でのプロトロンビン活性化速度は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ中より遅い。速度は、正常血漿中のほうが遅いが、プロトロンビン活性化は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での長さの約二倍の長さにわたって持続する。すべての実験において、プロトロンビン活性化のタイミングは、ＴＡＦＩ活性化と十分に一致する。正常血漿は、トロンビンを添加せず、カルシウムイオンおよびＰＣＰＳを使用することによってもクロッティングされた。カルシウム誘導凝固は、直ぐには起こらない；クロットが正常血漿中で形成するために、おおよそ１５分かかる。この時、プロトロンビン活性化は伝播期に入り、結果として、ＴＡＦＩが活性化される。クロット形成との関連でのＴＡＦＩ活性化の程度およびタイミングは、クロッティングが、添加されたトロンビンの存在下で開始されようと、不在下で開始されようと、同じであり、このことは、ＴＡＦＩ活性化が、インサイチューで生成されるトロンビンの結果であり、クロッティングを誘導するために添加されるトロンビンの結果ではないことを示唆している。トロンビンの存在下では、トロンビン不在下での１４，１５０ｐＭ・分と比較して、１６，８００ｐＭ・分のＴＡＦＩａポテンシャルがあった。
【０２６８】
可溶性トロンボモジュリンは、正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿中でのクロット溶解を延長する。
【０２６９】
正常血漿中で、ピークＴＡＦＩａレベルおよびＴＡＦＩａポテンシャルは、ｓＴＭの不在下でのそれぞれ６００ｐＭおよび１６８００ｐＭ・分から、１０ｎＭ  ｓＴＭの存在下でのそれぞれおおよそ６０００ｐＭおよび１５０，０００ｐＭ・分へと増加した。ＴＡＦＩ活性化のこの増加は、結果として溶解時間の７０％増加を生じさせた。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での溶解の相対的延長に対する１０ｎＭ  ｓＴＭの効果は、ｓＴＭの存在下でＦＶＩＩＩ−ＤＰをクロッティングさせて溶解したときに溶解が６５％延長された正常血漿と同様であった。１０ｎＭ  ｓＴＭの存在下で、７５０ｐＭ  ＴＡＦＩａは、ｓＴＭの不在下での３０ｐＭと比較してピークＴＡＦＩａ濃度で存在した。クロット開始からクロット溶解時間までの時間、ＴＡＦＩａポテンシャルは、ｓＴＭの不在下での６００ｐＭと比較して、１０ｎＭ  ｓＴＭの存在下で１２８００ｐＭ・分であると測定された。
【０２７０】
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿中でのクロット溶解時間の増加は、ｔＰＡおよびｓＴＭ濃度に依存する。
【０２７１】
溶解時間に対するＴＡＦＩ活性化の効果を、一定の範囲のｔＰＡおよびｓＴＭ濃度にわたって分析して、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での溶解欠損を、ＴＡＦＩ活性化を刺激することによって修正できるかどうかを判定した。図４にまとめた溶解時間は、ＴＡＦＩａの阻害因子であるＰＴＣＩを含有する同様の実験からの溶解時間に関連したものである。ＰＴＣＩの存在下では、機能性ＴＡＦＩａは無いので、図４に提示する相対溶解時間は、ＴＡＦＩａ依存性溶解延長の代表である。１ｎＭ  ｓＴＭを正常血漿に添加したとき、ｔＰＡの最低濃度（０．２５ｎＭ）で、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長（２倍）が観察された。ＦＶＩＩＩ−ＤＰへのｓＴＭの追加は、溶解時間の用量依存的延長を生じさせた（図４）。１００ｎＭ  ｓＴＭをＦＶＩＩＩ−ＤＰに添加したとき、溶解時間は、正常血漿中で見られるものと完全に相関した。ｔＰＡ濃度が増加するにつれて、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長を達成するために、より高い濃度のｓＴＭを必要とした。例えば、１．５ｎＭ  ｔＰＡ（図４）が存在するとき、正常血漿中でのＴＡＦＩａ依存性溶解延長を最大にするために２５ｎＭ  ｓＴＭを必要とし、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では１００ｎＭ  ｓＴＭを必要とする。また、これらのクロット溶解実験においてｔＰＡを増加させるにつれて、ＴＡＦＩａは、溶解時間に対して、よりいっそう大きい効果がある（０．２５ｎＭ  ｔＰＡでの２．３倍と比較して１．５ｎＭ  ｔＰＡでは５．２倍まで）ようである。ｔＰＡ濃度を増加させるにつれて、いずれのＴＦＡＩａ依存性溶解延長を達成するために必要とされるｓＴＭの濃度も増加するようである。０．２５ｎＭ  ｔＰＡでは、正常血漿中で溶解延長を達成するためにｓＴＭを必要としなかったが、３ｎＭ  ｔＰＡを正常血漿に添加したとき（図４）には溶解延長を達成するために２５ｎＭ  ｓＴＭを必要とした。実際の溶解時間が、ｔＰＡおよびｓＴＭによっていかなる影響を受けるのかを明らかにするために、ＴＡＦＩａ阻害正常およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿中での溶解時間を表１に提示する。
【０２７２】
トロンボモジュリンは、正常血漿中でも、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中でも、ＴＡＦＩ活性化を非常に大幅に促進し、溶解を延長する。
【０２７３】
正常血漿中でのＴＡＦＩ活性化が、１０ｎＭ  ｓＴＭの存在下（●；そのピークレベルで６０００ｐＭ  ＴＡＦＩａ）では、ｓＴＭ不在（○；６００ｐＭ  ＴＡＦＩａ；図５Ａ参照）と比較して有意に増加されることを証明する。付随するクロット溶解プロフィールは、１０ｎＭ  ｓＴＭの添加が、結果として溶解時間の７０％増加を生じさせたことを示している。１０ｎＭ  ｓＴＭを追加したＦＶＩＩＩ−ＤＰ中で、ＴＡＦＩａは、ｓＴＭ不在下での３０ｐＭと比較してそのピークで７５０ｐＭであると測定された（図５Ｂ参照）。ＴＡＦＩ活性化の増加は、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ欠如ｓＴＭと比較して６０％溶解延長を生じさせる結果となった。
【０２７４】
（実施例ＩＩ）
トロンビンとトロンボモジュリンとの結合親和性の分析
蛍光動態アッセイを用いて、ＫＤ値として表される親和性をトロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合について判定した。
【０２７５】
１．試験システム
トロンビンとトロンボモジュリン類似体の間の結合についての親和性を、蛍光動態アッセイを用いて判定し、ＫＤ値として表した。
【０２７６】
２．実験手順
材料。
【０２７７】
ヒトトロンビンは、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１４４７７−１４４８４）によって記載されたとおりに血漿から単離した。組換え可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）は、ＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ（ドイツ、アーヘン）から入手した。すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａから分析品質で入手した。
【０２７８】
方法。
【０２７９】
トロンビンのトロンボモジュリンおよびＴＡＦＩへの結合の測定
トロンビンのトロンボモジュリンへの結合を、平衡結合アッセイとして測定した。０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ７．４中の、トロンビン（２０ｎＭ）、トロンボモジュリン（１．５４μＭ）およびＤＡＰＡ（２０ｎＭ、ダンシルアルギニンＮ−３−（エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド、蛍光性、可逆的トロンビン阻害因子）を含有する溶液を、トロンボモジュリンを欠く他は同じ溶液に、少しずつ継続的に添加した。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒモデルＬＳ５０Ｂ分光蛍光計のサンプル区画内のマグネットスターラーを取り付けたキュベットに添加した。強度値をそれぞれ２８０および５４５ｎｍの励起および発光波長で継続的に記録した。発光ビームには４３０ｎｍカットオフフィルターを使用した。データを次のように分析した。蛍光の強度、Ｉ、をトロンビン−ＤＡＰＡ（Ｔ・Ｄ）およびトロンビン−トロンボモジュリン−ＤＡＰＡ（Ｔ・ＴＭ・Ｄ）からの強度の合計であると仮定した。すなわち、Ｉ＝ｉ１・［Ｔ・Ｄ］＋ｉ２・［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］、この式中、ｉ１およびｉ２は、Ｔ・ＤおよびＴ・ＴＭ・Ｄについての蛍光係数である（励起は、２８０ｎｍにおいてであったので、遊離ＤＡＰＡからの発光は無視できた）。ＴＭは、プロテインＣ活性化およびＴＡＦＩ活性化のいずれについてのＫｍも感知できるほどには改変しない（Ｂａｊｚａｒら、１９９６；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６６０３−１６６０８参照）ため、トロンビン−ＤＡＰＡ相互作用の親和性を改変しないと仮定できる。
故に、［Ｔ・Ｄ］＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
および［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
（これらの式中、ＫＤＡＰＡは、トロンビン−ＤＡＰＡ相互作用についての解離定数である）。
したがって、
Ｉ＝ｉ１・（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）。
【０２８０】
ｆおよびｂを、それぞれ、遊離しているおよびトロンボモジュリンに結合しているトロンビンの画分と定義し、［Ｔ］０がトロンビンの全濃度である場合には、ｆ＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／［Ｔ］０、ｂ＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／［Ｔ］０およびｆ＋ｂ＝１。このとき蛍光強度は、Ｉ＝ｉ１・ｆ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２・ｂ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）によって与えられる。Ｉ０を、トロンボモジュリンを添加しなかったときの初期強度と定義すると、ｆ＝１およびＩ０＝ｉ１［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）。同様に、Ｉｍａｘをトロンボモジュリンでのトロンビンの飽和時の強度と定義すると、ｂ＝１およびＩｍａｘ＝ｉ２［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）。故に、Ｉ＝Ｉ０・ｆ＋Ｉｍａｘ・ｂ。次に、１−ｂをｆに代入することにより：Ｉ＝Ｉ０＋（Ｉｍａｘ−Ｉ０）・ｂまたはΔＩ＝ΔＩｍａｘ・ｂが得られる。初期強度に正規化することにより、（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・ｂが得られる。ＤＡＰＡが、ＴおよびＴ・ＴＭを等しい親和性で結合するならば、ＴＭは、ＴおよびＴ・Ｄを等しい親和性で結合する。
【０２８１】
したがって、ＫＴＭをトロンビン−トロンボモジュリン相互作用についての解離定数と定義すると、［Ｔ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ］；［Ｔ・Ｄ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］；および（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）・［ＴＭ］＝ＫＴＭ（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）。すぐ前の式は、ｆ・［ＴＭ］＝ＫＴＭ・ｂと同一である。ｆ＝１−ｂおよび［ＴＭ］＝［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０で、この場合の［ＴＭ］０はトロンボモジュリンの全濃度であるので、次の方程式が得られる：（１−ｂ）（［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０）＝ＫＴＭ・ｂ。これは、ｂに関する二次方程式であり、上の式中のｂを解き、そのｂに（ΔＩ／Ｉ０）を代入すると、次の方程式が得られる：（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・０．５・（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０−（（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０）２−４・［Ｔ］０・［ＴＭ］０）１／２）。このすぐ前の方程式は、蛍光強度値、トロンボモジュリンおよびトロンビンの設定濃度、トロンビン−トロンボモジュリン相互作用についての解離定数、およびトロンボモジュリンとトロンビン−ＤＡＰＡの相互作用の表れである蛍光強度増分値の間の関係を表す。［ＴＭ］０を独立変数とし、ＫＴＭおよびΔＩｍａｘをベストフィットパラメータとして用いて、非線形回帰分析により上の方程式に強度データをフィッティングした。
【０２８２】
３．結果
トロンビンは、ＫＤ＝２３±１４ｎＭの親和性で可溶性トロンボモジュリンに結合する。
【０２８３】
可溶性トロンボモジュリンへのトロンビンの結合を、ＤＡＰＡの蛍光の摂動によって測定した。図６に示したように、滴定曲線は、０ｎＭと７５ｎＭの間の可溶性トロンボモジュリンの濃度範囲について相対蛍光の増加を示した。データ分析により、可溶性トロンボモジュリンへのトロンビン結合は、ＫＤ＝２３±１４ｎＭを特徴とすることが判明した。
【０２８４】
（実施例ＩＩＩ）
突然変異トロンボモジュリン類似体についての補因子活性の分析
蛍光動態アッセイを用いて、ＫＤ値として表される親和性をトロンビンとトロンボモジュリン類似体の間の結合について判定した。
【０２８５】
１．実験手順
材料および方法。
【０２８６】
プロテインＣのトロンビン媒介活性化のために補因子として作用するＴＭ突然変異体の能力をショッケート（ｓｈｏｃｋａｔｅ）中で直接アッセイした。組換えヒトプロテインＣは、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（マサチューセッツ州、フレーミングハムのＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）からのものであり、記載されているとおりに精製した（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０；８：６５５−６６１）。２５μＬの各ショッケートと同量の組換えヒトプロテインＣ（０．３μＭの最終濃度）およびヒトアルファトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ミズーリ州、セントルイス）とを１ｎＭの最終濃度でマイクロタイタープレートにおいて混合した。使用したすべての試薬を、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有する、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／３．７５ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  ＮａＮ３（ｗ／Ｖ）で希釈した。混合物を１時間、３７℃でインキュベートし、８００単位／ｍＬでの２５μＬのヒルジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ミズーリ州、セントルイス）の添加によって反応を停止させた。活性化されたプロテインＣの量を、１００μＬの色素産生性基質Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６）（１ｍＭ）の付加によって決定した。プレートリーダーを使用して時間に伴う４０５ｎｍでの吸光度によってその変化を測定する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して１５分間、１０秒ごとに吸光度を測定することによって各サンプルについてのデータをミリＯＤ単位／分として記録し、決定する。すべてのアッセイは、三重反復のショッケートサンプル、すなわち、ｐＳＥＬＥＣＴ−１ベクター（無ＴＭ）、ｐＴＨＲ２１１（野生型）またはｐＭＪＭ５７（３８８のメチオニンがロイシンに可変されたｐＴＨＲ２１１）のいずれかでトランスフェクトされた各々のＤＨ５アルファ細胞、を内部対照として含有した。ＴＭ突然変異体の補因子活性を、ｐＭＪＭ５７について得られたものの平均として表した。
【０２８７】
統計的分析。
【０２８８】
各突然変異体を少なくとも２回（２つの陽性クローンだけを単離した突然変異体については３回）活性についてアッセイし、スチューデントｔ検定を用いる差の有意性の決定にすべてのデータを含めた。プレート間の変動率は、１６．７％であった（ｎ＝１８）。
【０２８９】
ウエスタンブロット分析
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ショッケートを１０％  Ｔｒｉｓ−ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて製造業者の仕様書（Ｎｏｖｅｘ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州、サンディエゴ）に従って還元条件下で泳動させた。１０ｍＭ  ジチオトレイトールを含有するサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００２５％ブロモフェノールブルー）中でショッケートを１０分間沸騰させること、続いて５０ｍＭ  ヨードアセトアミドとともにインキュベートすることによって、還元されアルキル化されたサンプルを調製した。
【０２９０】
転写バッファー（１９２ｍＭ  グリシン、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、２０％メタノール）中、４℃で、ニトロセルロースフィルターにタンパク質を転写した。そのニトロセルロースフィルターをブロッキングバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、中の１％ウシ血清アルブミン、０．９％  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３）でブロックし、その後、そのブロッキングバッファー中でマウスポリクローナル抗血清（ヒトトロンボモジュリンの還元されアルキル化されたＥＧＦドメインに対して産生されたもの）とともにインキュベートした。洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．９％  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）での洗浄後、そのフィルターを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するブロッキングバッファー中でビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、バーリンゲーム）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、イリノイ州、アーリントンハイツ）を製造業者の仕様書に従って使用してタンパク質を検出した。
【０２９１】
（実施例ＩＶ）
ＴＡＦＩおよびプロテインＣ活性化についてのトロンボモジュリン類似体の分析
蛍光動態アッセイを用いて、ＫＤ値として表される親和性をトロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合について判定した。
【０２９２】
１．実験手順
タンパク質および試薬
Ｓｏｌｕｌｉｎ（残基４〜４９０）、ＴＭＥ（残基２２７〜４６２）、ＴＭＥｃループ３〜６（残基３３３〜４６２）およびＴＭＥｉ４〜６（残基３４５〜３６２）を含む、トランケート型のトロンボモジュリンを、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２；１８５：５６７−５７６）によって記載されたとおりに調製した。Ｓｆ９細胞をＴＭ構築物でトランスフェクトし、アニオン交換、ゲル濾過およびトロンビン親和性を利用するクロマトグラフィー手順の組み合わせによりタンパク質を培地から単離した。純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によって評定して、９５％以上であった。ヒト血漿ＴＡＦＩは、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５：２７０：１４４７７−１４４８４）によって記載されたとおりに単離した。ヒトプロテインＣおよびトロンビンは、ＢａｊｚａｒおよびＮｅｓｈｅｉｍ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）によって記載されたとおりに調製した。トロンビン阻害因子ダンシルアルギニンＮ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）は、Ｎｅｓｈｅｉｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７９；１８：９９６−１００３）によって記載されたとおりに合成した。アラニンスキャニングの結果として生ずる点突然変異をＴＭＥＭ３８８Ｌ構築物から生じさせた。タンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現させた。ペリプラズム抽出物の手順および調製は、Ｎａｇａｓｈｉｍａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）によって記載されている。ＨＥＰＥＳ、塩基性カルボキシペプチダーゼ基質ヒプリルアルギニン、シアヌル酸クロリド、および１，４−ジオキサンは、Ｓｉｇｍａから入手した。すべての他の試薬は、分析品質のものであった。
【０２９３】
トロンボモジュリン類似体の点突然変異でのプロテインＣおよびＴＡＦＩ活性化速度の測定。
【０２９４】
ＴＡＦＩの活性化のために、各ペリプラズム抽出物の２０μＬアリコートを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中、５分間、室温でトロンビン（最終１３ｎＭ）とともにプレインキュベートした。その後、その混合物を、精製された組換えＴＡＦＩ（最終１８ｎＭ）および基質、ヒプリル−アルギニン（最終１．０ｍＭ）、とともに６０μＬの最終体積で６０分間インキュベートした。ヒプリル−アルギニンの馬尿酸への加水分解、続いて８０μＬのリン酸バッファー（０．２Ｍ、ｐＨ８．３）および６０μＬのジオキサン中３％シアヌル酸（ｗ／ｖ）での馬尿酸の色原体への転化を測定することによって、活性化ＴＡＦＩの量を定量した。入念に混合した後、透明な上清の吸光度を３８２ｎｍで測定した。各突然変異体についてのトロンビン不在下で生じたバックグラウンド吸光度を引くことによって、ＴＡＦＩのトロンビン依存性活性化量を計算した。ＴＭＥＭ３８８Ｌ−アラニン突然変異体によるプロテインＣの活性化は、次のようにアッセイした。
【０２９５】
すべてのサンプルおよび試薬をＡＰＣアッセイ希釈液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５％ＢＳＡ）で希釈した。サンプルおよびＴＭ標準物質（０〜１ｎＭ）を６０分間、６０μＬの全体積で３７℃で９６ウェルプレートにおいて０．５μＭ  プロテインＣおよび１ｎＭ  トロンビンとともにインキュベートしてＡＰＣを生じさせ、その後、２０μＬのヒルジン（０．１６Ｕ／μＬ、５７０ｎＭ）で失活させた。形成されたＡＰＣの量を、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州、メンローパーク）を使用して４０５ｎｍで１分間隔でＳ−２２６６（１００μＬの１ｍＭ）の加水分解をモニターすることによって、決定した。１Ｕの活性は、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分（３７℃）を生じさせる。
【０２９６】
すべてのアッセイは、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクター（無ＴＭＥ）、野生型ＴＭＥ（Ｍ３８８）またはＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）のいずれかでトランスフェクトされたＤＨ５α細胞の抽出物を内部対照として含有した。ＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）アラニン突然変異体の補因子活性をＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）の活性の百分率として表した。抽出物の３つの独立した調製物を使用して、各ＴＭ突然変異体をプロテインＣおよびＴＡＦＩ活性化の両方について二重反復でアッセイした。
【０２９７】
２．結果
ＴＭ突然変異体を用いて得た結果（図７）は、８つの突然変異体のうちの５つが、実質的に低減された補因子活性を有することを示す。これら５つの突然変異体からの４つの突然変異体は、付随するＴＡＦＩ活性化活性低減も示す。Ｆ３７６Ａでの突然変異だけは、結果として、プロテインＣ活性化の甚大な喪失を生じさせたが、ＴＡＦＩ活性化に関してはささやかな低減しか生じさせなかった。興味深いことに、ＴＡＦＩおよびプロテインＣ活性化のためのＰｈｅ３７６の重要性の相違は、プロテインＣがトロンビン−トロンボモジュリン複合体の基質であるときにトロンボモジュリン構造に対する要件がより制約されることを示唆している。
【０２９８】
（実施例Ｖ）
プロテインＣ活性化のためのＭｅｔ特異的ＴＭ突然変異体の酸化に関しての分析
トロンボモジュリン類似体の特定のメチオニン突然変異体を使用して、プロテインＣ活性化アッセイを使用して、これらの残基の補因子活性化についての役割をタンパク質酸化に関しても分析した。
【０２９９】
１．実験手順
タンパク質および試薬。
【０３００】
ヒト組換えプロテインＣは、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．（マサチューセッツ州、ボストン）からのものであった。ウシトロンビンは、Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（テキサス州、ダラス）からのものであった。Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドは、Ｇｌａｓｅｒら（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９７５；５：３３３−３４８）によって記載されたとおりに調製した。ヒトアルファ−トロンビン（４，０００ＮＩＨ  Ｕ／ｍｇ）、ウシ血清アルブミン（第Ｖ因子）およびクロラミンＴは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）からのものであった。
【０３０１】
ＴＭＥ（Ｓｆ９）の発現。
【０３０２】
すべての手順を４℃で行った。ＴＭの６回ＥＧＦ様リピート（アミノ酸２２７〜４６２）をコードするＤＮＡ配列を昆虫プロテアーゼ、ヒポデルミンＡ、シグナル配列に連結し、そのハイブリッド遺伝子を、バキュロウイルスシャトルベクターｐＴＭＨＹ１０１における多角体遺伝子プロモーターの制御下に置いた。標準的な技術を用いて、組換えウイルスを産生させた。記載の突然変異体類似体を、ミューテーター部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）の使用により調製し、同方法によりバキュロウイルス系での発現のためにウイルスを調製した。
【０３０３】
精製およびクロラミンＴでの酸化
ＴＭＥ（Ｓｆ９）の分泌突然変異体を含有する成長培地を遠心分離によって清澄化し、凍結乾燥させ、１：１０体積の０．２％ＮＥＭ−Ａｃ、ｐＨ７および０．００８％Ｔｗｅｅｎ  ８０に再び溶解した。アリコートを５μＬのＨ２Ｏまたは５μＬの１００ｍＭ  クロラミンＴのいずれかで処理し、２０分間、室温でインキュベートし、希釈によって酸化剤を除去し、ＮＡＰ−５カラム（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）で脱塩し、次のようにプロテインＣの活性化についてアッセイした。
【０３０４】
ＴＭ補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
すべてのサンプルおよび試薬をＡＰＣアッセイ希釈液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５％ＢＳＡ）で希釈した。サンプルおよびＴＭ標準物質（０〜１ｎＭ）を６０分間、６０μＬの全体積で３７℃で９６ウェルプレートにおいて０．５μＭ  プロテインＣおよび１ｎＭ  トロンビンとともにインキュベートしてＡＰＣを生じさせ、その後、２０μＬのヒルジン（０．１６Ｕ／μＬ、５７０ｎＭ）で失活させた。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州、メンローパーク）を使用して４０５ｎｍで１分間隔でＳ−２２６６（１００μＬの１ｍＭ）の加水分解をモニターすることによって、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性は、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分（３７℃）を生じさせる。
【０３０５】
２．結果
Ｍｅｔ３８８の酸化によるＴＭ補因子活性低減
突然変異体および野生型ＴＭＥ（Ｓｆ９）を昆虫細胞において発現させ、クロラミンＴで処理し、補因子活性についてアッセイし、結果を比較した（表２）。ＴＭＥをクロラミンＴなどの酸化剤で処理すると、ＴＭＥは、その補因子活性のおおよそ８５％を失う（表２参照）。Ｍｅｔ２９１およびＭｅｔ３８８の部位特異的突然変異は、ＴＭＥ（Ｓｆ９）の不活性化が単一のメチオニンの酸化に起因することを明示する。Ｍｅｔ３８８を保持する誘導体は、クロラミンＴによって同様の程度（＞８０％）不活性化されたが、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ突然変異体は、耐性であった。Ｍｅｔ２９１が置換されている突然変異体は活性であったが、酸化的不活性化に対して耐性ではなかった。
【０３０６】
（実施例ＶＩ）
ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループ（Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８、Ｐｈｅ３８９）の突然変異を有するＴＭ類似体の分析
トロンボモジュリン類似体の特定の突然変異体を使用して、これらの残基の役割およびそれらの酸化を、プロテインＣ活性化アッセイを用いて分析した。
【０３０７】
１．実験手順
プラスミド構築。ＥＧＦ様ドメイン（ＴＭＥ）のみからなるトロンボモジュリンフラグメントを大腸菌において次のように発現させた：プライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＣＧ−３’および５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣ−３’を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、ヒトゲノムＤＮＡから完全長ＴＭのＴＭＥ（残基２２７〜４６２）をコードするＤＮＡフラグメントを得た。このフラグメントを、β−ラクタマーゼプロモーター、およびｐＫＴ２７９におけるシグナル配列の制御下に置いた。次に、その結果として生じたプラスミドのＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩフラグメント、およびｆ１複製起点を含有するｐＧＥＭ３ｚｆ−のＳｃａＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクターのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩおよびＳｃａＩ−ＳａｃＩ部位にそれぞれ挿入して、大腸菌発現プラスミドｐＴＨＲ２１１を構築した。改変部位インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｏｒ）突然変異誘発キットに関して説明されている部位特異的突然変異誘発手順を用い、一本鎖ｐＴＨＲ２１１  ＤＮＡ鋳型を用いて、位置３８７、３８８または３８９にＴＭ突然変異体をコードするプラスミドを構築した。前記部位特異的突然変異の各プライマーを制限分析によって確認した。
【０３０８】
前記突然変異体の補因子活性を測定するために、突然変異タンパク質を発現している個々の大腸菌培養物を遠心分離し、洗浄し、２０％スクロース、３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で細胞ペレットをインキュベートした（１０分、４℃）。０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で処理した細胞ペレットの遠心分離（１０分、４℃）によってショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイでアッセイした。データは、３つの独立したクローンの各々からの結果の平均値である。
【０３０９】
ＴＭ補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
すべてのサンプルおよび試薬をＡＰＣアッセイ希釈液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５％ＢＳＡ）で希釈した。サンプルおよびＴＭ標準物質（０〜１ｎＭ）を６０分間、６０μＬの全体積で３７℃で９６ウェルプレートにおいて０．５μＭ  プロテインＣおよび１ｎＭ  トロンビンとともにインキュベートしてＡＰＣを生じさせ、その後、２０μＬのヒルジン（０．１６Ｕ／μＬ、５７０ｎＭ）で失活させた。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州、メンローパーク）を使用して４０５ｎｍで１分間隔でＳ−２２６６（１００μＬの１ｍＭ）の加水分解をモニターすることによって、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性は、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分（３７℃）を生じさせる。
【０３１０】
２．結果
ループ間ドメインの突然変異によるＴＭの補因子活性低減
部位特異的突然変異誘発を用いて、アミノ酸改変、位置３８７、３８８または３８９での欠失または挿入のいずれかを有するＴＭ突然変異体を発現させた（図８）。突然変異体ＴＭの補因子活性は、３つの独立したクローンから得た平均値であり、それをＴＭＥ（Ｓｆ９）ＷＴについて判っている活性の百分率として表す。位置３８８におけるすべての新規突然変異体についてのおよび位置３８７における選択された突然変異体についてのＴＭに対するポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロットでのゲルスキャンを行った。これらのスキャンによってほぼ等量のＴＭが得られた。これは、発現の差が、観察される活性の差の原因となり得ないことを示している。加えて、位置３８７（図８Ａ）、３８８（図８Ｂ）、３８９（図８Ｃ）での独立した置換、またはドメイン間ループ内のどこかでの挿入および欠失（図８Ｄ）は、一般にＡＰＣアッセイにおいて野生型ＴＭＥより不良な補因子である類似体を生じさせる結果となる。Ｇｌｎ３８７がＴｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａによって置換されている類似体は、＞７０％補因子活性を保持するが、Ｇｌｕ残基での置換は、これを対照の５８％に低減させ、およびすべての他のアミノ酸は、結果として＞５０％損失を生じさせる。Ｍｅｔ３８８のＬｅｕでの置換だけは、結果として、野生型より実質的に高い補因子活性（１．８倍）を生じさせる。ＧｌｎおよびＴｙｒを除いてＭｅｔ３８８のすべての他の置換は、結果として、補因子活性の＞５０％損失を生じさせる。ＴＭ補因子活性は、Ｐｈｅ３８９のアミノ酸置換に対してあまり感受性でなく、この位置での点突然変異で、対照において見出される活性の＞７０％を保持するものは無い。３０％活性を保持したＭｅｔ３８８Ｐｒｏを除いて、いずれの位置でのＰｒｏまたはＣｙｓ置換も、その活性を＞１０％に低減させた。個々のアミノ酸の欠失または４つの可能な位置の各々へのＡｌａの挿入のいずれかによってＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの長さを変えることにより、結果として、野生型ＴＭＥの活性の１０％未満を有する突然変異体が得られる。
【０３１１】
（実施例ＶＩＩ）
イヌ科動物血友病血漿における線溶の分析
インビトロクロット溶解のモデルおよびトロンボエラストグラフィーを用いて、血友病Ａを有するイヌの全血または血漿において、クロット溶解時間を減少または増加させる可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）の能力を試験した。
【０３１２】
材料および方法
クロット溶解アッセイ
クロット溶解アッセイは、本発明の実施例Ｉにおいて説明したとおりに行った。
【０３１３】
トロンボエラストグラフィー
トロンボエラストグラフィーは、Ｐｒａｓａｄら、２００８；Ｂｌｏｏｄ  １１１：６７２−６７９に記載されたとおりに行った。イヌ科動物血友病全血（±第ＶＩＩＩ因子中和抗体）（３２０μＬ）を、９０ｎＭ  トロンビン、９ｎＭ  ｔＰＡおよび０〜３９０ｎＭ  ｓＴＭが入っているＨａｅｍｏｓｃｏｐｅ  ＴＥＧ（登録商標）５０００（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、ブレーントリー）のチャネルに添加した。入念に混合した後、ピンをシートさせ、凝固および線溶を継続的にモニターした。Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ  ＴＥＧ（登録商標）５０００は、ピンによってクロットに接続されているワイヤーのトルクを測定することにより、クロット時間、クロット動態、クロット強度およびクロット安定性（線溶）の測定を可能にする。クロットが形成するにつれて、ピンのトルクが増加し、このトルクは、振幅（出力）の増加によって表される。同様に、線溶中のクロットの分解は、結果として、トルクの減少および振幅の減少を生じさせる。
【０３１４】
Ｑｕｅｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｏｇ  ｃｏｌｏｎｙにおいて一部のイヌが発生させた阻害抗体（阻害因子）は、Ｇｉｌｅｓら、１９８４；Ｂｌｏｏｄ  ６３：４５１−４５６によっておよびＴｉｎｌｉｎら、１９９３；Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６９：２１−２４によって以前に記載されている。
【０３１５】
阻害因子を有する血友病イヌ血漿を、＞１５０ベセスダ単位（＞５Ｂ．Ｕ．は、第ＶＩＩＩ因子補充療法で処置不能と見なされる）の阻害因子力価を有するイヌから採血した。
【０３１６】
結果
Ｓｏｌｕｌｉｎは、５００ｎＭの濃度においてさえクロット溶解を延長した。
【０３１７】
イヌ科動物血友病血漿において、Ｓｏｌｕｌｉｎは、クロット溶解時間を用量依存的に増加させ、クロット溶解時間は、２５ｎＭ  Ｓｏｌｕｌｉｎの存在下でおおよそ２倍延長し、試験した最高用量に相当する２００〜５００ｎＭ  Ｓｏｌｕｌｉｎでおおよそ９倍延長のプラトーに達した（図９参照）。
【０３１８】
結論：血友病血漿中、非常に高濃度においてさえ、Ｓｏｌｕｌｉｎの著しい抗線溶効果は、血友病におけるトロンボモジュリン類似体の効能のある安全な使用を強く論証する。
【０３１９】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血におけるクロット溶解を延長する。
【０３２０】
トロンボエラストグラムにおいて、トーションワイヤーの最大振幅は、最大クロット強度の尺度である。これらの実験では（図１１Ａ参照）、９０ｎＭ  トロンビンおよび９ｎＭ  ｒｔ−ＰＡが入っているキュベットにイヌ科動物血友病全血を移入することによって、逐次的なクロット形成および溶解を誘導した。Ｓｏｌｕｌｉｎは、０〜３９０ｎＭの濃度で存在した。おおよそ±８５ｍｍの振幅がＳｏｌｕｌｉｎ不在下で観察された。１００および２５０ｎＭの濃度でのＳｏｌｕｌｉｎは、クロット溶解を完全に阻止した：振幅は、より大きく、８０から９０分（実験の終わり）までの間、変わらなかった。３９０ｎＭへのＳｏｌｕｌｉｎ濃度のさらなる増加は、対照実験（無Ｓｏｌｕｌｉｎ）より大きい振幅および遅いクロット溶解をなお伴った（図１１Ａ）。
【０３２１】
この実験では、クロット溶解曲線下面積（ＡＵＣＬ）をクロット硬度の定量に用い、それによって１００および２５０ｎＭでのＳｏｌｕｌｉｎは、このパラメータを５倍より大きく増加させた（図１１Ｂ）。同実験でのクロット溶解時間の延長を図１１Ｃにプロットする。溶解時間は、Ｓｏｌｕｌｉｎ不在下での２０分から、１００および２５０ｎＭ  Ｓｏｌｕｌｉｎでの３時間へと増加された。
【０３２２】
結論：トロンボエラストグラフィーによって示されたＳｏｌｕｌｉｎの抗線溶効果は、上のクロット溶解アッセイの結果と一致する。さらに、Ｓｏｌｕｌｉｎは、クロット硬度を増加させるようである。
【０３２３】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、抗第ＶＩＩＩ因子抗体の存在下で血友病Ａを有するイヌ科動物からの全血におけるクロット溶解を延長する。
【０３２４】
これらのトロンボエラストグラフィー実験は、高力価の抗第ＶＩＩＩ因子抗体（＞１５０ベセスダ単位）を含有することが分かっている血液を用いて、上で説明したように行った：９０ｎＭ  トロンビンおよび９ｎＭ  ｒｔ−ＰＡが入っているキュベットにイヌ科動物血友病全血を移入することによって、逐次的なクロット形成および溶解を誘導した。Ｓｏｌｕｌｉｎは、０〜３５１０ｎＭの濃度で存在した。Ｓｏｌｕｌｉｎ無しで、おおよそ±２０ｍｍの振幅が観察された（図１２Ａ参照）。Ｓｏｌｕｌｉｎ用量は、１００および２５０ｎＭの濃度で振幅を用量依存的におおよそ±６０ｍｍへと増加させ、３９０ｎＭでおおよそ±９０ｍｍの振幅に達した。
【０３２５】
さらに、Ｓｏｌｕｌｉｎは、クロット溶解時間を、対照でのおおよそ１８分から３９０ｎＭ  Ｓｏｌｕｌｉｎでのおおよそ４６分へと用量依存的に延長した（図１２Ａ参照）。クロット硬度増加も、弾性曲線下面積の１０倍より大きい強化によって示される（０ｎＭ  Ｓｏｌｕｌｉｎを３９０ｎＭと比較；図１２Ｂ参照）。
【０３２６】
結論：抗第ＶＩＩＩ因子抗体によって第ＶＩＩＩ因子活性の事実上完全な阻害は低減したが、クロット溶解を延長するＳｏｌｕｌｉｎの能力を抑制することはできなかった。別の角度から見ると、この実験は、クロット溶解を延長するＳｏｌｕｌｉｎの効力を増すには、血友病全血（抗体不在、図１１Ａ参照）中の残留第ＶＩＩＩ因子活性の存在で十分であることを示している。
【０３２７】
これは、第ＶＩＩＩ因子で処置した血友病患者における請求項記載のトロンボモジュリン類似体の使用を支持する。さらに、血友病に罹患しており、機能性第ＶＩＩＩ因子濃度をなお有する患者も、請求項記載のトロンボモジュリン類似体で処置できた。最後に、第ＶＩＩＩ因子を欠く患者または抗第ＶＩＩＩ因子抗体の高い力価を示す患者も、請求項記載のトロンボモジュリン類似体での処置の対象となる。
【０３２８】
（実施例ＶＩＩＩ）
種々のＴＭ類似体についてのＴＡＦＩ活性化対プロテインＣ活性化の比
図１９に示すおよび配列番号５〜１１に与えるようないくつかのＴＭ類似体を生成した。Ｐｈｅ３７６Ａｌａ交換を有するＳｏｌｕｌｉｎ類似体を、Ｓｏｌｕｌｉｎとの比較で、プロテインＣおよびＴＡＦＩ活性化についてインビトロで試験した。
【０３２９】
材料および方法
ＴＭ補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
選択された突然変異を有するＳｏｌｕｌｉｎをコードするＤＮＡフラグメントを合成し、ｐＧＡＥｘベクター（標準的なＨＥＫ２９３由来のベクター）にクローニングした。ｐＧＡＥｘベクターは、ＨＥＫ２９３細胞についての標準的なプロモーター、リーダーおよび排出配列、ならびに該タンパク質のＣ末端にＨｉｓ−６タグを含む。ＨＥＫ２９３細胞をｐＧＡＥｘ−Ｓｏｌｕｌｉｎベクターでトランスフェクトし（一過性トランスフェクション）、１リットルスケールで浮遊培養した。トランスフェクションの６日後、タンパク質をＮｉ−ＨｉＴｒａｐカラム（ＰＢＳ中の２０〜５００ｍＭ  イミダゾールの線形勾配、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）によって回収した。精製のターゲットは、Ｈｉｓ−６タグであった。透析（ＰＢＳに対して１６時間）後、タンパク質を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色によってタンパク質を定量した。その後、タンパク質同一性をウエスタンブロット（標識抗Ｈｉｓ−６抗体）によって検証した。
【０３３０】
ＴＭ補因子（ＡＰＣアッセイ）およびＴＡＦＩ活性の測定
それぞれ０から２μＭ  ＴＡＦＩまたはプロテインＣ、０．５ｎＭ  トロンビン、５ｍＭ  塩化カルシウムおよび２５ｎＭ  ＳｏｌｕｌｉｎまたはＳｏｌｕｌｉｎ  Ｐｈｅ３７６Ａｌａ類似体、それぞれ、を含有するアッセイバッファー中で、ＴＭ類似体を試験した。
【０３３１】
ＴＡＦＩ実験についてはＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）で、またはプロテインＣについてはヒルジンで、反応を失活させた。
【０３３２】
ＴＡＦＩａおよび活性化プロテインＣ活性を、それぞれ、Ｎ−（４−メトキシフェニルアゾホルミル）−Ａｒｇ−ＯＨ（ＡＡＦＲ）およびピロＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（Ｓ−２３６６）を使用して判定した。基質加水分解速度を１セットの標準物質と比較することによって、１０分間で生成されたＴＡＦＩａまたはａＰＣの量を決定した。標準物質を使用して、本発明者らは、ＩＩａ−ｓＴＭによるＴＡＦＩおよびプロテインＣ活性化の動態を判定した。
【０３３３】
結果
Ａｌａに対するＰｈｅ３７６の交換は、ＴＡＦＩ対プロテインＣ活性化速度の比率増加をもたらし、基質濃度が低いほど増加は顕著である。ミカエリス・メンテン定数をＴＡＦＩの活性化について決定できた（図１５、上方パネル）が、そのような定数をプロテインＣ活性化からは導出できなかった（図１５、下方パネル）。
【０３３４】
様々な基質濃度でのＳｏｌｕｌｉｎおよびＰｈｅ３７６ＡｌａによるＴＡＦＩおよびプロテインＣ（ＴＡＦＩ／プロテインＣ）の活性化速度の比を図１６にて例証する。Ｓｏｌｕｌｉｎの高いＴＡＦＩ／ＰＣ比を、Ｐｈｅ３７６からＡｌａへのアミノ酸交換によってさらに改善することができた。
【０３３５】
結論：
ＴＡＦＩ優先性の尺度として用いることができる、ＴＡＦＩ／プロテインＣ比の増加が、妥当な基質（ＴＡＦＩまたはプロテインＣ）濃度で起こった。これは、ＴＡＦＩ（約７５〜２２０ｎＭ）とプロテインＣ（約７０ｎＭ）両方の生理濃度に近い、試験した最低濃度（２５０ｎｍ）で最も顕著であり、およびＳｏｌｕｌｉｎとその変異体の両方が優先的ＴＡＦＩ活性化に適しているという主張を確証する。その一方で、特に、Ｐｈｅ３７６ＡｌａによるプロテインＣ活性化は、それが生理プロテインＣ濃度（約７０ｎＭ）でなんらかの感知可能な程度にプロテインＣ活性化を強化し得る可能性が低いと考えなければならないほど遅いことが判明した。それ故、ＴＡＦＩ活性化を依然として可能にするが、生理学的条件下でプロテインＣ活性化を実際には妨げる、ＴＡＦＩ活性化能とプロテインＣ活性化能両方のかなり大きな低減に、Ｐｈｅ３７６Ａｌａにおける追加の突然変異の関連効果を見ることができる。
【０３３６】
さらに、これらの結果は、単一アミノ酸突然変異のおよび特にＰｈｅ３７６Ａｌａの総合的重要性を裏付ける。この突然変異の有益効果は、ＥＧＦ１からＥＧＦ６にわたるＳｏｌｕｌｉｎフラグメントについて観察されるばかりでなく、Ｎ末端レクチン様ドメイン、６つのＥＧＦドメインおよびＯ結合型グリコシル化ドメインを含む、完全長可溶性トロンボモジュリンについても観察されるからである。
【０３３７】
（実施例ＩＸ）
血友病のイヌモデルにおける線溶のインビボ分析
研究の目的
第ＶＩＩＩ因子（ｆＶＩＩＩ）の回復は、血友病Ａを有する患者の処置の頼みの綱である。大部分の症例において有効な処置を施している間にかなり多数の患者が中和抗ｆＶＩＩＩ抗体を発生させるが、今までのところ、利用できる補助治療選択肢でこの問題を克服できない。ｆＶＩＩＩ療法の他の不利な面としては、複雑な用量決定、ならびに静脈内投与および定期的なモニタリングの必要が挙げられる。
【０３３８】
なんと言ってもｆＶＩＩＩの十分な量で生成できないことが一番だが、それに加えて、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）の抑制されない活性もこの病態の一因となるという証拠が、益々増えている。通常、クロットの成長および成熟は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化によりｔＰＡから保護される。これは、血管損傷閉鎖の過程で発生するトロンビンと内皮細胞膜に重要なタンパク質であるトロンボモジュリンとで形成される複合体によって活性化される。トロンビン／トロンボモジュリン複合体は、血漿チモーゲンであるＴＡＦＩをその活性形態（ＴＡＦＩａ）に転化させ、このＴＡＦＩａが、カルボキシ末端リシンおよびアルギニンをクロットフィブリンから除去することにより、ｔＰＡの、プラスミノゲンを結合してこの高次構造でそのプラスミノゲンを活性化する能力を損なわせる働きをする。ｔＰＡ効力のこの制御は、不十分なトロンビン生成に、およびおそらくチモーゲン、ＴＡＦＩ、の利用率減少にも起因して、血友病Ａでは不完全である。それ故、血友病Ａの顕著な特徴の１つは、ｔＰＡによる時期尚早のクロット溶解である。
【０３３９】
インビトロ研究により、Ｓｏｌｕｌｉｎは、血友病患者からの血漿における時期尚早のクロット溶解を、ｔＰＡ濃度に依存して、部分的にまたは完全に修正できることが判明した。十分に確立された血友病イヌモデルを使用して、このインビトロ効力をインビボで確認することができるかどうかを試験することが、本研究のねらいである。この動物モデルをこの目的に使用することを正当化するために、予備実験によって、ヒト血漿のように血友病イヌ血漿が、Ｓｏｌｕｌｉｎに時期尚早のクロット溶解を修正させることを確かめた。
【０３４０】
研究物質
同定：  Ｓｏｌｕｌｉｎ
物理的状態：  透明無色溶液、ｐＨ７．０
解離バッファー：  リン酸ナトリウム、１３．４；塩化カリウム、２．７；塩化ナトリウム、１３７（すべて、ｍｍｏｌ／Ｌで）；マンニトール、５％
バイアルの内容物：  １ｍＬ中３ｍｇのＳｏｌｕｌｉｎ（３ｍｇ／ｍＬ）
バイアルの取り扱い：  エタノールを使用してバイアルセプタムをふき、その後、そのセプタムを通して滅菌針を挿入して、必要量を抜き取る。残りの量が入っているバイアルを冷蔵庫に保管する。
保管条件および時間：  冷蔵庫内で２〜６℃で保管すること。残りの量を冷蔵庫で２８日間保存することができる。この期間内に、それらをさらなる実験に使用できるが、イヌごとに別のバイアルを使用することを推奨する。
【０３４１】
投薬する製剤の調製
オリジナルのＳｏｌｕｌｉｎバイアル（単数または複数）から適切な量を取り、０．９％ＮａＣｌを補足して３ｍＬの投薬量にする。
最終投薬製剤を実験日ごとに新たに調製することとなる。
【０３４２】
動物：種および管理
この研究は、「治癒される」ＦＶＩＩＩ遺伝子療法イヌを特徴とする、血友病Ａを有するイヌ（血友病Ａイヌ）で行った。イヌ科動物ＦＶＩＩＩ遺伝子療法後、これらのイヌは、検出不能な血漿ＦＶＩＩＩレベル（＜１％）を有したが、それらの全血クロット時間の短縮を示し、処置後少なくとも３年間はさらなる特発性出血エピソードを経験しなかった（標準頻度  おおよそ５／年）。これらのイヌは、遺伝子導入後に部分的な表現型修正を示すと考えることができる。それらは、滅多に出血しない重症血友病Ａ患者（血漿ＦＶＩＩＩ＜１％）のおおよそ１０％において実証されている臨床像を最もよく再現する。そのようなプロフィールは、低用量ＦＶＩＩＩ予防プロトコルの転帰も反映している。これらの動物の年齢および体重は、それぞれ、おおよそ３歳および１０〜１５ｋｇであった。血友病体質を除いて健常な動物のみをこの研究に組み入れた。
【０３４３】
実験手順
予備研究（薬物動態およびインビトロ効力）
第一段階として、Ｓｏｌｕｌｉｎの薬物動態を、凝固／線溶に対する薬力学的効果とともに、血友病イヌにおいて調査した。イヌ血漿および薬物動態モデリングに関して入手できるインビトロ効力データに基づき、Ｓｏｌｕｌｉｎを３ｍＬの体積での０．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内ボーラス注射によって投与した。
【０３４４】
第一のイヌにおいて得た結果に従って、第二のイヌを同じように、または適合した用量のＳｏｌｕｌｉｎで処置した。その後、主研究の開始または薬物動態のさらなる調査を決定した。
【０３４５】
血液サンプルの調製
異なる２セットの血液サンプルを対側脚から採取した（下の表を参照のこと）。
【０３４６】
クエン酸バッファーを用いて全血を採集し（最終量：９部の血液と混合した１部の３．１３％クエン酸ナトリウム）、直ぐに処理した（下の調製を参照のこと）。個々の分割についての指示に応じて近接した時間関係でアッセイしない限り、それらに適切なラベルを貼って、さらに使用するまで−８０℃で保管した。
【０３４７】
【表７】
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【０３４８】
サンプル１
捨てるべき最初の１ミリリットルを上の表に示されている時点で採取し、クエン酸処理し、５つの部分に分割した。
【０３４９】
１４ｍＬのクエン酸処理済み全血を分割部分１（トロンボエラストグラフィー×５ｍＬ  全血）および分割部分２（全血クロッティング：２ｍＬ  全血）に分配した。
【０３５０】
残りの量を１５００ｇで１５分間、遠心分離した。得られた上清を３つの部分（分割部分３、Ｓｏｌｕｌｉｎ濃度、０．５ｍＬ  血漿；分割部分４、活性化ＴＡＦＩ、０．５ｍＬ血漿；分割分５、ＰＴ／ａＰＰＴ、０．５ｍＬ  血漿）に分割し、さらなる使用まで−８０℃で保管した。
【０３５１】
サンプル２：
サンプル２（２ｍＬ；最初の１ｍＬを捨てる）をサンプル１側とは反対側の脚から採取し、クエン酸処理した。サンプリング時間は、上の表に示されている。
【０３５２】
このサンプルは、トロンビン生成ポテンシャルの判定のためのものであり、特別な予備知識を要する。接触活性化を避けることが重要であり、これは、サンプルをできるだけ太い針で（好ましくは、蝶形針からではなく）採血すべきであることを意味する。
【０３５３】
必要血漿量は、０．５ｍＬである。トロンビン生成ポテンシャルのための血漿調製を詳細に説明する：
第一の遠心分離段階：
○  次の遠心分離パラメータを入れる：
−  分解力：９
−  ローター速度  ｒ＝１５６ｍｍで３７９０
−  継続時間：５分。
○  サンプルを５分間、２５００ｇで遠心分離する
（Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ３５Ｒについては、ｒ＝１５６ｍｍで３７９０ｒｐｍの設定でこれに達する）
○  プラスチック製使い捨てパスツールピペットを使用して、ラベルを貼ったプラスチック製遠心管に血漿上清を移す。バッフィーコート上に０．５ｃｍ血漿を残し、バッフィーコートから一切細胞を吸い上げないように注意する。
【０３５４】
第二の遠心分離段階：
○  次の遠心分離パラメータを適用する：
−  温度：１８℃
−  遠心分離速度：ｒ＝１５６ｍｍで１１０００ＲＰＭ
−  継続時間：１０分
○  １００００ｇで１０分間、血漿を遠心分離する。
【０３５５】
（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ３０ＲＦについては、ｒ＝１５６ｍｍで１１０００ｒｐｍの設定でこれに達する）
○  遠心管の内容物をラベルを貼った管に１回の移動で（沈殿物と上清を混合しないように）注入するまたはピペットで移す。
○  適用可能な場合には、いくつかの同じ血漿の内容物を１本の大きなプラスチック製の管に併せる。
【０３５６】
薬物動態および薬力学アッセイ
トロンボエラストグラフィー：クエン酸処理済み全血でトロンボエラストグラフィーを行った。３４０μＬの全血を、Ｉｎｎｏｖｉｎの１／１５０００希釈物（１８倍）、２７０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１８ｎＭ  ｔＰＡの２０μＬ溶液が入っているＨａｅｍｏｓｃｏｐｅ  ＴＥＧ（登録商標）５０００（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．マサチューセッツ州、ブレーントリー）のチャネルに添加する。入念に混合した後、ピンをシールし、凝固および線溶を継続的にモニターした。Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ  ＴＥＧ（登録商標）５０００は、ピンによってクロットに接続されているワイヤーのトルクを測定することにより、クロット時間、クロット動態、クロット強度およびクロット安定性（線溶）の測定を可能にする。
【０３５７】
全血クロッティング時間：全血クロッティング時間は、クエン酸処理済み全血をガラス製試験管の中で３７℃でインキュベートし、クロット形成を継続的にモニターすることによって決定する。
【０３５８】
薬物動態。イヌ血漿について検証されたＥＬＩＳＡを用いて、血漿濃度を決定した。この研究は、スポンサーの責任のもとで行われることとなる。結果を最終報告にまとめる。
【０３５９】
活性化ＴＡＦＩ。Ｋｉｍら（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００８）、３７２（１）：３２−４０）の方法を用いてＴＡＦＩａを判定した。簡単に言うと、共有結合で連結されたクエンチャー部分（ＱＳＹ−ＦＤＰ）を含有するフィブリン分解産物は、蛍光標識プラスミノゲン（Ｆ−Ｐｇ）に結合する。Ｆ−ＰｇをＱＳＹ−ＦＤＰに結合すると、蛍光が消光される。ＴＡＦＩａを添加すると、Ｆ−Ｐｇ結合部位が除去され、Ｆ−ＰｇがＱＳＹ−ＦＤＰから放出されて、蛍光が増加する結果となる。この蛍光増加の速度は、ＴＡＦＩａ濃度に比例する。既知濃度のＴＡＦＩａでスパイクした血漿を用いて、標準曲線を生成し、それを使用して血漿サンプル中のＴＡＦＩａ濃度を決定した。
【０３６０】
凝固アッセイ。希釈ＰＴ（ｄＰＴ）およびａＰＴＴアッセイを行った。希釈ＰＴアッセイは、試験乏血小板血漿の１／５希釈物を必要とする。ＴｒｉｎｉＣＬＯＴ  ＰＴ  ＨＴＦトロンボプラスチン試薬をその血漿に添加し、その後、１８０秒のインキュベーションの後、サンプルを再石灰化する。ａＰＴＴは、ＴｒｉｎｉＣＬＯＴ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＡＰＴＴ試薬で行った。この場合も、１８０秒のインキュベーションを行い、その後、サンプルを再石灰化させる。すべての研究をＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ  ＭＡＸ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）自動凝固計で行った。
【０３６１】
内因性トロンビンポテンシャル。内因性トロンビンポテンシャルは、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（ＣＡＴ）アッセイを用いて９６ウェルプレート蛍光計で判定した。ＣＡＴアッセイは、ＣｏａｇＳｃｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．（オランダ、マーストリヒト）の知的所有権を伴う方法である。
【０３６２】
簡単に言うと、ＣＡＴアッセイは、クロッティングしている血漿中のトロンビンの濃度を経時的に測定する。クエン酸処理済み血漿を、組織因子とリン脂質とを含有するＰＰＰ試薬で誘発する。塩化カルシウムと蛍光原基質とを含有する別の試薬（ＦｌｕＣａ）でその血漿を再石灰化する。この基質をトロンビンによって蛍光体に転化させ、その蛍光を蛍光計で追跡する。同時に、同じ血漿の別のサンプルを、トロンビンキャリブレーターの存在下で測定する（校正されたトロンビン活性量）。これらの並行測定の結果を比較することにより、トロンビン濃度の経時的計算が可能になる。
【０３６３】
主研究（表皮出血アッセイ（ｃｕｔｉｃｌｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ））
【０３６４】
動物数、研究薬および用量レベル
３匹の血友病イヌを研究して、血液凝固および線溶に対するＳｏｌｕｌｉｎの効果を試験した。８．１で説明した予備研究に従って選択した用量で静脈内ボーラス注射によってＳｏｌｕｌｉｎ投与した。
【０３６５】
麻酔および支持的投薬
前投薬：  ヒドロコルチゾン  １００ｍｇおよびＢｅｎａｄｏｒｙｌ  ５０ｍｇ  ＩＶ
維持：  １〜２％イソフルラン
外科手術後の疼痛管理：  ブプレノルフィン
【０３６６】
時間経過および手順
実験の経過は、下の表で見られる。麻酔１５分後、ベースライン表皮試験を行い、その後、１５分間観察する。その後、名目上、麻酔３０分後に、イヌに、その実際の体重に基づいてＳｏｌｕｌｉｎの静脈内ボーラス注射を施す。Ｓｏｌｕｌｉｎへの３０分の暴露の後、第二の表皮アッセイを反対側の足で行う。その後、１５分観察するので、合計麻酔時間は、おおよそ７５分である。
【０３６７】
表皮出血試験のために、イヌを側横臥位に置き、表皮出血時間アッセイに用いることとなる鉤爪の根本の周辺を刈り取ることによって、爪床周辺のすべての毛を除去する。シリコーングリースをその鉤爪に塗布して、血液が爪の下に戻らないようにする。表皮の頂端を見えるようにし、ばね押し式の刃がスライドするギロチンクリッパーを使用して背側爪溝の近位で爪を切断する。その後、その動物の足を手術台の端から出るように置き、切断した表皮から血液を自由落下させる。その後の各１５分間の血液滴下数を記録し、それらの１５分の累積スコアに換算する。１５分間観察した後、表皮がまだ出血しているならば、硝酸銀の局所塗布によって傷害部位を焼灼する。
【０３６８】
経験を積んだ同じ獣医看護士がすべてのアッセイを行う。
【０３６９】
結果および考察
重症血友病Ａを有するイヌをインビボで研究した。実施例ＶＩＩに提示したインビトロ実験において有効であることが判明した数百ｎＭのＳｏｌｕｌｉｎ濃度によって導いた５００μｇ／ｋｇの用量を第一のイヌに注射して、Ｓｏｌｕｌｉｎのインビトロでの添加後に観察されたトロンボエラストグラムの改善をインビボで確認できるかどうかを見た。予想に反して、この用量は、効力がなかったばかりでなく、クロット形成および強度を猛烈に阻害すらした（図１７）。この効果は、投与３０分後に発現し、２時間の時点で維持されていた。
【０３７０】
その日の終わりに、クロット形成の減少はまだ顕性であったが、阻害はゆっくりと静まったようであった。２４時間試験には技術的欠陥があったので、この実験を失敗と見なすことができた。そうであっても、動物が回復するかどうかを見るために４８時間の時点で最終サンプルを採血することを決断した。こういう状態であると思われたのだが、多少驚いたことに、ベースライントロンボエラストグラムのわずかな改善傾向がなおあるように思われた。この考えに励まされて、サンプルをＳｏｌｕｌｉｎの７２時間後に調査し、かなり予想外に、クロット形成および強度の明確な改善が認められた。これは、インビトロ研究から予期されたものよりはるかに低い用量が有効であり、しかも、用量が多いほど高い血漿濃度が確立され、この高い血漿濃度がクロットの特性を劣化させることとなるので、求められているものであるという結論につながり、この仮説をさらなる重症血友病イヌにおいて試験した（図１８）。
【０３７１】
第二のイヌには、第一のものよりはるかに低い用量のＳｏｌｕｌｉｎ（１０μｇ／ｋｇ）を施した。この実験は、血漿濃度が高いほど、クロットの特性の改善に効果がないが、０．２ｎＭほども低い濃度でそれを改善できるという仮説を裏付けた。
【０３７２】
表の説明
表１：各条件下での溶解時間の決定を可能にするためにＰＴＣＩの存在下での絶対溶解時間を含む、図４を作成するために使用したデータの一覧。すべての場合、ＴＡＦＩａ阻害因子、ＰＴＣＩ、の存在下で得たものに対しての溶解時間を表示する。ＴＡＦＩ、トロンビン活性化線溶阻害因子；ＰＴＣＩ、ジャガイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害因子。
【０３７３】
表２：ＴＭＥ（Ｓｆ９）の部位特異的突然変異体類似体のクロラミンＴ酸化
クロラミンＴ処理後の結果を、対照処理後の活性の百分率として表示した。＊二重反復判定の平均値およびその平均からの偏差。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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