(57)【要約】      （修正有）【課題】生体中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定すること、及び／又は、妊娠高血圧を予測する方法を提供すること。【解決手段】カイコ由来の高純度組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いてマウスモノクローナル抗体を構築することにより、生体中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定を可能とした。また、該抗体を用いたＥＬＩＳＡシステムは、これまで測定不可能であった生体中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定を初めて可能とするものであり、ｓ（Ｐ）ＲＲと疾患との関係を解明する重要な測定手段を提供する。また、本測定システムを用いた妊娠初期のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度を測定することを含む、妊娠中期と妊娠後期の妊娠高血圧症の予測方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然型可溶性（プロ）レニン受容体と結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
天然型可溶性（プロ）レニン受容体と免疫沈降させることができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
カイコ由来の組換ヒト（プロ）レニン受容体を抗原として用いて得られたことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体を含有する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤。
【請求項６】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体を含有する天然型可溶性（プロ）レニン受容体測定キット。
【請求項７】
ヒト体液中の可溶性（プロ）レニン受容体を測定するための請求項５に記載のキット。
【請求項８】
１２５〜８０００ｐｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９）の範囲の可溶性（プロ）レニン受容体又は（Ｐ）ＲＲを測定するための請求項５又は請求項６に記載のキット。
【請求項９】
更に、最低検出濃度限界が２４ｐｇ／ｍＬである、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
被験者由来のヒト体液を請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップ；及び、
該抗体と結合した天然型可溶性（プロ）レニン受容体を検出又は定量するステップ、
を備える、天然型可溶性（プロ）レニン受容体の測定方法。
【請求項１１】
妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法、又は妊娠高血圧症の発症を予測する方法であって：
（ａ）妊娠初期の患者由来の体液中の可溶性（プロ）レニン受容体を検出又は定量すること；及び、
（ｂ）測定された可溶性（プロ）レニン受容体の存在又はレベルと該患者の妊娠中期及び／又は後期における妊娠高血圧症発症との関連付けをすることを含む方法。
【請求項１２】
可溶性（プロ）レニン受容体のレベルが高い場合、該患者が妊娠中期及び／又は後期に妊娠高血圧症を発症する可能性が高いことを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法又は妊娠高血圧症の発症（ａ）該患者由来の試料を調整するステップ；
（ｂ）少なくとも１つの可溶性（プロ）レニン受容体に特異的に結合する抗体に該試料を接触させるステップ、
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して試料中の可溶性（プロ）レニン受容体のを検出又は定量するステップ；
（ｄ）可溶性（プロ）レニン受容体のレベルから妊娠高血圧症の発症を予測するステップ、ここで、可溶性（プロ）レニン受容体レベルが高いことが、被検患者が妊娠高血圧症を発症しやすいことを示す。
【請求項１４】
患者由来の体液が、血液、血漿、血清、又は尿である、請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載のキットを用いて可溶性（プロ）レニン受容体を定量することを特徴とする、請求項１１〜請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然型可溶性（プロ）レニン受容体と結合するモノクローナル抗体、該抗体を用いた可溶性（プロ）レニン受容体（以下、「ｓ（Ｐ）ＲＲ」という）測定方法及び測定キット、並びに、妊娠高血圧症の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レニン及びプロレニンの受容体である（プロ）レニン受容体（以下、「（Ｐ）ＲＲ」という）は、２００２年に同定された受容体であり、一つの膜貫通領域を有する３５０アミノ酸からなるタンパク質である（非特許文献１）。（Ｐ）ＲＲは、組織のレニン−アンジオテンシンシステム（ＲＡＳ）を調整することや（非特許文献２）、血管のＨ＋−ＡＴＰａｓｅの機能（非特許文献３）への関与が報告されている。（Ｐ）ＲＲを過剰発現させた動物モデルでは、緩徐進行性の腎障害や高血圧などと関連し、組織におけるレニン−アンジオテンシンシステムが活性化することが報告されている（非特許文献４〜６）。集団ベースの研究では、可溶性（Ｐ）ＲＲの発現レベルと腎障害又は血圧との関係について示唆されている（非特許文献７及び８）。
【０００３】
（Ｐ）ＲＲは３つの異なる分子形態で存在する：１）完全長の膜貫通（ＴＭ）タンパク質、２）ｓ（Ｐ）ＲＲ、３）膜貫通及び細胞質ドメインからなる短縮型形態（非特許文献９）。ｓ（Ｐ）ＲＲは、（Ｐ）ＲＲがフリン（ｆｕｒｉｎ）によって切断されて生じることが報告されている。ｓ（Ｐ）ＲＲは２８ｋＤａの親水性ペプチドで、細胞外領域に分泌され、最終的に血清中や尿中で検出されることが報告されている（非特許文献９及び１０）。
【０００４】
しかし、ｓ（Ｐ）ＲＲの機能については不明な点も多く、疾患等の病態とｓ（Ｐ）ＲＲとの関係を解明するためにも、生体サンプル中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定が望まれていた。
【０００５】
妊娠高血圧症候群は、妊娠８ヶ月以降の後期に約１割程度の妊婦が発症する疾患で、重症になると母子の命に関わることが知られている。通常の妊婦であれば、血圧は妊娠期間に応じて変化する。最も低い血圧は、通常妊娠２４から２６週で観察され、その後血圧は妊娠の終了まで上がり続ける（非特許文献１２）。活性化ＲＡＳが妊娠期の高血圧の発症に関与することは知られていたものの（非特許文献１３及び１４）、組織ＲＡＳと妊娠期の生理的な血圧変化との直接的な関係は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｇｕｙｅｎ  Ｇら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００２；１０９：１４１７−２７
【非特許文献２】Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ａら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００６；１７：２４９５−５０３
【非特許文献３】Ｋｉｎｏｕｃｈｉ  Ｋら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０１０；１０７：３０−４
【非特許文献４】Ｋａｎｅｓｈｉｒｏ  Ｙら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ２００６；７０：６４１−６
【非特許文献５】Ｋａｎｅｓｈｉｒｏ  Ｙら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００７；１８：１７８９−９５
【非特許文献６】Ｂｕｒｃｋｌｅ  ＣＡら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２００６；４７：５５２−６．
【非特許文献７】Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  ２００９；２２：２９４−９
【非特許文献８】Ｏｔｔ  Ｃら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１１；２１：３４７−９
【非特許文献９】Ｃｏｕｓｉｎ  Ｃら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２００９；５３：１０７７−８２
【非特許文献１０】Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ２０１０；３３：１７７−８０
【非特許文献１１】Ｂｉｓｗａｓ  ＫＢら、  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ２０１１；３４：７３５−９
【非特許文献１２】Ｗｉｌｓｏｎ  Ｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９８０；６８：９７−１０４
【非特許文献１３】Ｉｒａｎｉ  ＲＡら、Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２００８；２９：７６３−７１
【非特許文献１４】Ｉｒａｎｉ  ＲＡら、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０１１；３１：４７−５８
【発明の概要】
【０００７】
（Ｐ）ＲＲの３つの形態のうち、全長の（Ｐ）ＲＲとｓ（Ｐ）ＲＲはレニン又はプロレニンと結合することができ、（Ｐ）ＲＲ結合プロレニンとなってＲＡＳを活性化させることができる（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ  ２０１１；３４：５９９−６０５．）。全長及び短縮型（Ｐ）ＲＲがＶ−ＡＴＰａｓｅの機能の生成に影響しうる（Ｃｒｕｃｉａｔ  ＣＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；３２７：４５９−６３．）ことから、ｓ（Ｐ）ＲＲのみがＶ−ＡＴＰａｓｅとは独立して組織ＲＡＳ状態を反映させるバイオマーカーであると考えられた。また、ｓ（Ｐ）ＲＲは全長の（Ｐ）ＲＲと同様にプロレニンに結合して細胞培養液中でプロレニンの活性化を仲介することが見出され（Ｂｉｓｗａｓ  ＫＢら、  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ２０１１；３４：７３５−９）、循環しているｓ（Ｐ）ＲＲがＲＡＳの活性化を制御する可能性について検討を行った。
【０００８】
合成オリゴペプチドに対するウサギのポリクローナル抗体２種を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡシステムが構築された（Ｂｉｓｗａｓ  ＫＢら、  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ２０１１；３４：７３５−９）。しかし、このＥＬＩＳＡシステムは、ＨＵＶＥＣ細胞上清中のｓ（Ｐ）ＲＲを定量的に測定するために使用できるにもかかわらず、ヒト検体のｓ（Ｐ）ＲＲを検出することができなかった。本発明者らも、独自に合成オリゴペプチドに対するウサギのポリクローナル抗体を作製し、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムを構築したが、同様に細胞上清中のｓ（Ｐ）ＲＲは測定できたものの、ヒト検体のｓ（Ｐ）ＲＲを検出することはできなかった。本発明者らはこれらの抗体が、ウェスタンブロット解析ではｓ（Ｐ）ＲＲを検出するのに対し、天然型の（Ｐ）ＲＲタンパク質への反応性が低いことを見出し、これがヒト検体のｓ（Ｐ）ＲＲを検出することができない理由であることを発見した。そこで、本発明者らは、カイコ由来の高純度組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いてマウスモノクローナル抗体を構築することにより、天然型のタンパク質への反応性に優れる抗体の取得に成功した。本発明者らは、本抗体とウサギのポリクローナル抗体を組み合わせた本ＥＬＩＳＡシステムがヒト血漿、血清及び尿中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定することが可能であることを見出した。本発明のＥＬＩＳＡシステムは、１２５〜８０００ｐｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９）の範囲のｓ（Ｐ）ＲＲ又は（Ｐ）ＲＲを測定することができ、最低検出濃度限界は２４ｐｇ／ｍＬであった。本発明のＥＬＩＳＡキットは、ウサギのポリクローナル抗体を組み合わせて作製したキットの１００倍以上であり、ヒト検体の検出に十分な感度を持ち合わせていた。
【０００９】
また、本発明者らは、本発明のキットを用いて妊婦の血中のｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を測定することにより、妊娠期間と血中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度及び血圧との関係について検討した結果、通常の妊娠期間において血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度が血圧と相関することを見出した。特に、妊娠初期（妊娠１６週と０日以前）における血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠中期及び妊娠後期における全ての血圧値（収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧）の上昇を予測可能であることを見出した。
【００１０】
即ち、本発明は、生体中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定すること、及び／又は、妊娠高血圧を予測する方法を提供することを課題とする。本発明は、カイコ由来の高純度組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いてマウスモノクローナル抗体を構築することにより、生体中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定を可能とした。また、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡシステムは、これまで測定不可能であった生体中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定を初めて可能とするものであり、ｓ（Ｐ）ＲＲと疾患との関係を解明する重要な測定手段を提供することを可能とするものである。本発明者らは具体的に現在予測の困難な妊娠高血圧症について、本ＥＬＩＳＡシステムを用いてｓ（Ｐ）ＲＲ濃度と血圧との相関について検討した結果、妊娠初期のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度が妊娠中期と妊娠後期の血圧予測に有用であることを見出した。
【００１１】
具体的には、一態様において本発明は、以下の（１）〜（１５）に記載の発明に関する。
（１）  天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体。
（２）  天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと免疫沈降させることができる、（１）に記載の抗体。
（３）  カイコ由来の組換ヒト（プロ）レニン受容体を抗原として用いて得られたことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、（１）に記載の抗体。
（５）  （１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体を含有する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤。
（６）  （１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体を含有する天然型ｓ（Ｐ）ＲＲ測定キット。
（７）  ヒト体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定するための（５）に記載のキット、あるいは、ヒト体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定することが可能な（５）に記載のキット。
（８）  １２５〜８０００ｐｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９）の範囲のｓ（Ｐ）ＲＲ又は（Ｐ）ＲＲを測定するための（５）又は（６）に記載のキット。
（９）  更に、最低検出濃度限界が２４ｐｇ／ｍＬである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載のキット。
（１０）  被験者由来のヒト体液を（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップ；及び、
該抗体と結合した天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを検出又は定量するステップ、
を備える、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲの測定方法。
（１１）  妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法、又は妊娠高血圧症の発症を予測する方法であって：
（ａ）妊娠初期の患者由来の体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを検出又は定量すること；及び、
（ｂ）測定されたｓ（Ｐ）ＲＲの存在又はレベルと該患者の妊娠中期及び／又は後期における妊娠高血圧症発症との関連付けをすることを含む方法。
（１２）  ｓ（Ｐ）ＲＲのレベルが高い場合、該患者が妊娠中期及び／又は後期に妊娠高血圧症を発症する可能性が高いことを示す、（１１）に記載の方法。
（１３）  妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法又は妊娠高血圧症の発症（ａ）該患者由来の試料を調整するステップ；
（ｂ）少なくとも１つのｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する抗体に該試料を接触させるステップ、
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して試料中のｓ（Ｐ）ＲＲのを検出又は定量するステップ；
（ｄ）ｓ（Ｐ）ＲＲのレベルから妊娠高血圧症の発症を予測するステップ、ここで、ｓ（Ｐ）ＲＲレベルが高いことが、被検患者が妊娠高血圧症を発症しやすいことを示す。
（１４）  患者由来の体液が、血液、血漿、血清、又は尿である、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）  （６）〜（９）のいずれか１項に記載のキットを用いてｓ（Ｐ）ＲＲを定量することを特徴とする、（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
【００１２】
上述の通り、本発明は、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体に関する。本発明において、「天然型ｓ（Ｐ）ＲＲ」とは、遺伝子組み換えにより大腸菌に発現させたｓ（Ｐ）ＲＲではなく、動物細胞に発現させたｓ（Ｐ）ＲＲのことである。ｓ（Ｐ）ＲＲはヒト以外の哺乳動物でも存在し、配列の保存性は高いと考えられていることから、ｓ（Ｐ）ＲＲは哺乳動物由来であれば特に限定されないが、マウス、ラット、ヒト由来等を用いることができる。本発明のモノクローナル抗体が結合するｓ（Ｐ）ＲＲは、天然で分泌されるものであってもよいし、遺伝子導入により強制発現させたものであってもよい。また、本発明のモノクローナル抗体が結合するｓ（Ｐ）ＲＲが遺伝子導入により強制発現させたものである場合、同種細胞で発現させたものであってもよいし、異種細胞で発現させたものであってもよい。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体が結合するｓ（Ｐ）ＲＲは、ヒト血液中（血清中、血漿中）又は尿中に天然で存在するｓ（Ｐ）ＲＲである。
【００１３】
また、本発明の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体において、モノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲとの結合は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよいが、好ましくは、免疫沈降又はＥＬＩＳＡであり、最も好ましくはＥＬＩＳＡである。よって、本発明の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体として、好ましくは、免疫沈降又はＥＬＩＳＡにより天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを検出可能な抗体である。より、好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト体液（好ましくは血液、血漿、血清又は尿中の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを免疫沈降又はＥＬＩＳＡにより検出可能な抗体である。
【００１４】
モノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲが結合するか否かをウェスタンブロッティン
グにより確認する場合、組換ヒト（Ｐ）ＲＲ、（Ｐ）ＲＲのｃＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞、及びその培養液を、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して抗Ｈｉｓ抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。
【００１５】
モノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲが結合するか否かを免疫沈降により確認する場合（免疫沈降により天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、免疫沈降ウェスタンブロッティング分析により確認することができる。具体的には、（Ｐ）ＲＲトランスフェクタントの上清を被検抗体と共にインキュベートし、共にプロテインＧ  セファロース（ＧＥヘルスケアジャパン）を添加する、更にインキュベートした後、遠心分離を行い、得られたペレットを三回洗浄した。次いでペレットを溶解し、抗ｓ（Ｐ）ＲＲ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行うことにより、確認することができる。
【００１６】
モノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲが結合するか否かを免疫組織化学染色により確認する場合、血管を含む組織を４％パラホルムアルデヒド中で３〜５日間固定化し、パラフィンに包埋し、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断した。組織切片からパラフィンを除去し、水和させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ギ酸で短時間処理する。内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で静置後、１０％正常ヤギ血清含有ＰＢＳで切片をブロックし、被検抗体と共に４℃で一晩静置する。その後、ビオチン化第二抗体と共に室温で３０分間静置した。免疫反応性は、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）などを用いて製造者のプロトコルに従って可視化する。３，３’−ジアミノベンジジンを色原体として使用し、切片はヘマトキシリンで対比染色することにより確認することができる。
【００１７】
モノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲが結合するか否かをＥＬＩＳＡにより確認する場合（ＥＬＩＳＡにより天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、被検モノクローナル抗体を用いて後述のＥＬＩＳＡ系を構築し、後述のＥＬＩＳＡ法を実施して、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲを検出できるか否かを測定することにより行うことができる。
【００１８】
よって、好ましくは、本発明の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体は、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと免疫沈降させることができる。ここで、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲは、前述のモノクローナル抗体が結合するｓ（Ｐ）ＲＲと同意義であり、免疫沈降させることができるか否かは、前述のモノクローナル抗体と天然型ｓ（Ｐ）ＲＲが結合するか否かを免疫沈降により確認する方法と同様の方法により確認することができる。
【００１９】
更に好ましくは、本発明の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体は、カイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いて生成された抗体である。ここで、カイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いて生成されたとは、当該モノクローナル抗体が直接的にカイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いて生成された場合のみならず、当該抗体の配列がカイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いたことにより得られた場合も含む。よって、抗体の製造におけるカイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲの使用の有無を問うものではなく、その抗体（配列）の取得過程においてカイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを用いている限り、全ての抗体を含むものである。カイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを抗原として用いた抗体の生成方法は後述する。
【００２０】
本明細書において、「モノクローナル抗体」の語は、単一クローンに由来することを意味し、完全抗体の他、抗原との結合活性を保持する限り抗体断片をも含む。完全抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体等の哺乳動物の抗体の他、キメラ抗体、ヒト化抗体などの異種に由来する配列が融合した抗体をも含む。また、抗体断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域を含む。また、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体は、好ましくは、ｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する。ここで、ｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合するとは、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲ及び組換えｓ（Ｐ）ＲＲの両方に結合することができるが、他のタンパク質とは結合しないか又は結合が弱いことを意味する。ここで、結合が弱いとは、被検抗体の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲ及び組換えｓ（Ｐ）ＲＲへの結合に比較して、他のタンパク質への結合が十分区別可能な場合を含む。本段落において説明された事項は、以下に説明する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤及び本発明の抗体を含有するｓ（Ｐ）ＲＲ測定キットが含有する抗体についても同様である。
【００２１】
好ましくは、本発明の天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に寄託されたハイブリドーマＨｕｍａｎ  ｐＲＲ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９３Ａ１Ｂ（寄託微生物の受領日２０１１年１１月１７日、受領番号はＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００）が産生するモノクローナル抗体である。例えば、本発明の抗体は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗体の抗原への作用（例えば、結合作用）を保持するポリペプチド又は抗体、９受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域を有するキメラ抗体（以下、「９３Ａ１Ｂキメラ抗体」という）、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を有する抗体であってもよい（このような抗体のうち、特に、ＣＤＲ配列以外のアミノ酸配列がヒト抗体のアミノ酸配列に由来する抗体を以下、「９３Ａ１Ｂヒト化抗体」という）（以下、これらの抗体を総称して、「９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体に基づいて作製される抗体」という）。受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を有する抗体としては、例えば、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖のＣＤＲ１（以下、「ＣＤＲＨ１」という）、ＣＤＲ２（以下、「ＣＤＲＨ２」という）及び／又はＣＤＲ３（以下、「ＣＤＲＨ３」という）、並びに／あるいは、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＬ鎖のＣＤＲ１（以下、「ＣＤＲＬ１」という）、ＣＤＲ２（以下、「ＣＤＲＬ２」という）及び／又はＣＤＲ３（以下、「ＣＤＲＬ３」という）を（好ましくは、ＣＤＲとして）有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト化抗体）であり、好ましくは、ＣＤＲが受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する又はからなるモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト化抗体）であり、最も好ましくは、抗体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する又はからなるモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト化抗体）である。また、本発明の抗体は、前述の受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体又はこれに基づいて作製される抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、またはＣＤＲを含むペプチド等）であってもよい。実施例及び図面の説明を除き、本願明細書及び請求項全体において、「９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体」とは、特に限定されない限り、前述の受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマＨｕｍａｎ  ｐＲＲ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９３Ａ１Ｂにより産生される抗体の他、当該モノクローナル抗体の断片、並びに、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に基づいて作製される抗体及び当該抗体の断片を意味する。以下に説明する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤及び本発明の抗体を含有するｓ（Ｐ）ＲＲ測定キットが含有する抗体についても同様である。
【００２２】
また、別の態様において、本発明は、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体を含有する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤に関する。本薬剤に含まれる抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本薬剤が包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよいが、少なくとも１つはモノクローナル抗体又はその断片を含む。本発明の薬剤が含有する抗体又は抗体の断片は、適宜標識されていてもよい。本発明の薬剤は、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体に代えて、当該抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を包含していてもよい。本発明の薬剤が備える抗体又はその断片として、好ましくは、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体である。
【００２３】
更に、別の態様において、本発明は、本発明の抗体を含有するｓ（Ｐ）ＲＲ測定キットに関する。本発明のキットは、好ましくは、ヒト体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを測定可能なキットである。また、本発明のキットが測定可能な範囲は、５〜１０，０００ｐｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは、２４〜８０００ｐｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１２５〜８０００ｐｇ／ｍＬである。本発明のキットの、最低検出濃度限界は、好ましくは、２４ｐｇ／ｍＬである。
【００２４】
一の態様において、本発明のキットは、目的のタンパク質（ｓ（Ｐ）ＲＲ）と結合する抗体又はその断片を備える。当該抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよいが、少なくとも１つはモノクローナル抗体又はその断片を含む。また、本発明のキットが含有する抗体又は抗体の断片は、適宜標識されていてもよい。また、本発明のキットは、天然型ｓ（Ｐ）ＲＲと結合するモノクローナル抗体に代えて、当該抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含していてもよい。本発明のキットが備える抗体又はその断片として、好ましくは、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体である。
【００２５】
本発明のキットは、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。本発明のキットが、所望の測定を実施することが可能であるか否かは、当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
【００２６】
例えば、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第一抗体が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する標識化された第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。好ましくは、前記第一抗体と前記第二抗体はヒトｓ（Ｐ）ＲＲの異なる部位を認識する。
【００２７】
または、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第二抗体が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。
【００２８】
あるいは、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第一抗体が固定化した不溶性担体、及び、（ｉｉ）ヒトｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第二抗体が固定化した不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。上記のいずれのキットの例においても、第一抗体をモノクローナル抗体（好ましくは、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体）とし、第二抗体をポリクローナル抗体としてもよいし、第一抗体をポリクローナル抗体とし、第二抗体をモノクローナル抗体（好ましくは、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体）としてもよいし、あるいは、第一及び第二の両方の抗体をモノクローナル抗体としてもよい。本発明のキットにおいては、好ましくは、第一又は第二のいずれかの抗体が９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体であり、もう一方の抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００２９】
本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
【００３０】
本発明の薬剤又はキットが標識化された抗体を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【００３１】
本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明の薬剤又はキットに用いる検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のキットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００３３】
また、本発明によれば妊婦（特に妊娠初期）の体液中（血液中）のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は妊娠中期又は妊娠後期の妊娠高血圧症の予測に利用できることから、本発明のキットは、妊娠高血圧症の予測のためのキットとすることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体、当該抗体を含有する妊娠高血圧症の発症を予測するための薬剤、及び当該抗体を用いた測定キットは、生体中のｓ（Ｐ）ＲＲの測定が可能であることから、ｓ（Ｐ）ＲＲと疾患との関係を解明する重要な測定手段を提供するものである。また、本発明の妊娠高血圧症予測方法は、妊娠初期のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度から、妊娠中期と妊娠後期の血圧を予測できることから、妊婦の健康管理等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】組換えヒト（Ｐ）ＲＲ及び（Ｐ）ＲＲ形質転換体のウェスタンブロッティング解析による同定の結果を示す写真である。Ａ：カイコ由来の組換えヒト（Ｐ）ＲＲを抗ヒスチジン抗体に対してブロットした結果を示す。Ｂ：（Ｐ）ＲＲのｃＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ細胞の培養上清を２０倍濃縮したもの（左）、形質転換体の全細胞溶解物（右）について、ＰｏＡｂ−２２２を用いてブロットした結果を示す。Ｃ：（Ｐ）ＲＲのｃＤＮＡで形質転換したＣＨＯ細胞の培養上清を２０倍濃縮したもの（左）、ｓ（Ｐ）ＲＲ形質転換細胞の培養上清からｓ（Ｐ）ＲＲタンパク質をＰｏＡｂ−１４８で免疫沈降させたもの（中央）、ｓ（Ｐ）ＲＲ形質転換細胞の培養上清からｓ（Ｐ）ＲＲタンパク質を９３Ａ１Ｂで免疫沈降させたもの（右）を９３Ａ１Ｂでイムノブロットして検出した結果を示す。
【図２】ヒトｓ（Ｐ）ＲＲ  ＥＬＩＳＡシステムの特徴を示す。Ａ：ｓ（Ｐ）ＲＲを計算するための標準曲線を示す。ｓ（Ｐ）ＲＲの直線範囲は１２５から８０００（ｐｇ／ｍＬ）である。Ｂ：（Ｐ）ＲＲ  ｃＤＮＡで形質転換したＣＨＯ細胞（左）、形質転換していないＣＨＯ細胞（右）の細胞培養液中のｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を示す。Ｃ：有足細胞（左）、ｓｉＲＮＡを形質転換した有足細胞（中央）、及び培地単独（右）の（培養）培地中のｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を示す。
【図３】ｓ（Ｐ）ＲＲを血漿及び血清で測定した結果を示す。Ａ：２０人の健常人から得られた血漿中及び血清中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度を示す。サンプルはＥＬＩＳＡシステムでデュプリケートで測定し、得られた平均値を示す。Ｂ：男性と女性のＥＤＴＡ血漿サンプル中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度の比較を示す。
【図４】妊娠初期、中期、後期について、収縮期、拡張期及び平均血圧の平均値を示す。垂直線は標準偏差を示す。
【図５】各２．５ｎｇ／ｍＬの幅でｓＰＲＲレベルの割合を頻度ヒストグラムで示したグラフである。「＊」は、Ｐ＜０．０００１を示し、「＊＊」はＰ＜０．０００１を示す。「ＳＤ」は標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（抗体）
本発明の抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、（Ｐ）ＲＲタンパク質の全部、又はその一部を有するポリペプチド（例えば、配列番号３又は４に記載のペプチド）をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ（大腸菌用）、ｐｃＤＮＡ３．１（動物細胞発現用）等）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等（好ましくは、カイコ細胞）に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を適切な培地（例えば、ＬＢ培地等）で培養して発現させることにより得ることができる。また、当該配列を有するペプチドを化学合成したものを用いることも可能である。
【００３７】
上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）又は鳥類に免疫することにより行われる。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができる。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２〜５回）行うことができる。ポリクローナル抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００３８】
モノクローナル抗体の作製は、上記方法により免疫した免疫感作動物の脾臓等から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。または、本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に寄託されたハイブリドーマＨｕｍａｎ  ｐＲＲ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９３Ａ１Ｂ（寄託微生物の受領日２０１１年１１月１７日、受領番号はＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００）から入手することができる。抗体は、ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。
【００３９】
（ヒト型キメラ抗体作製）
本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、ｓ（Ｐ）ＲＲと結合する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００４０】
（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を有する抗体（ヒト化抗体）の作製）
本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、ｓ（Ｐ）ＲＲと結合する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
【００４１】
（ヒト抗体）
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、Ｓ（Ｐ）ＲＲ又は本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
【００４２】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗Ｓ（Ｐ）ＲＲ抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチド）を免疫することにより、抗ｓ（Ｐ）ＲＲヒト抗体を得ることができる。
【００４３】
（抗体断片の作製）
Ｆ（ａｂ’）２断片（分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明のＩｇＧ抗体（例えば、９３Ａ１Ｂモノクローナル抗体）をペプシンで処理することにより、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。Ｆａｂ’断片は、上述の方法により得られたＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡから得ることができる。Ｆａｂ断片（Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明の抗体をパパインで処理することにより、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の抗体のＦａｂをコードするＤＮＡから得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドとして設計することにより得ることができる。
【００４４】
（標識）
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００４５】
（キット）
また、本発明は、ｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する抗体を含有するｓ（Ｐ）ＲＲ測定キットに関する。具体的には、本発明は、ｓ（Ｐ）ＲＲと特異的に結合する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする免疫化学測定のキットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体（又は標識化した抗体）を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
【００４６】
例えば、本発明のキットは、抗ｓ（Ｐ）ＲＲモノクローナル抗体固相化プレート、ビオチン標識抗ｓ（Ｐ）ＲＲポリクローナル抗体溶液、ストレプトアビジンＰＯＤ溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、２Ｍ  ＨＣｌ、標準物質（ｓ（Ｐ）ＲＲペプチド）を備えるキットとして製造することができる。また、別の例として、本発明のキットは、抗ｓ（Ｐ）ＲＲモノクローナル抗体、抗ｓ（Ｐ）ＲＲモノクローナル抗体結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットとして製造することができる。当該キットにおいて、テストプレートは、検体を挿入する検体採取部、抗ｓ（Ｐ）ＲＲモノクローナル抗体結合金コロイドを含む感作金コロイド塗布部、抗ｓ（Ｐ）ＲＲモノクローナル抗体を含む判定部（テストライン）、抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体を含む判定部（リファレンスライン）、吸収剤、及び、メンブレンフィルターを備えていてもよい。
【００４７】
（妊娠高血圧症発症予測方法）
一の態様において、本発明は、妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法又は妊娠高血圧症の発症を予測する方法であって：
（ａ）妊娠初期の患者由来の体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを検出又は定量するステップ；及び、
（ｂ）測定されたｓ（Ｐ）ＲＲの存在又はレベルと該患者の妊娠中期及び／又は後期における妊娠高血圧症発症との関連付けをするステップを含む方法に関する。本明細書の全体に亘って、「妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法」は、「妊娠高血圧症の発症を予測する方法」と読み替えてもよい。
【００４８】
本明細書において、「妊娠高血圧症の発症」とは、妊娠中期及び／又は後期に妊娠高血圧症と診断される症状を示すことを意味する。具体的には、妊娠２０週以降に血圧が上昇（高血圧）、あるいは高血圧の症状と共に尿中にタンパク質（蛋白尿）が検出されることを意味する。「妊娠高血圧症」には、妊娠高血圧（高血圧のみ）、妊娠高血圧腎症（高血圧＋蛋白尿）、加重型妊娠高血圧腎症（妊娠前からの高血圧＋妊娠後蛋白尿）、子癇（高血圧＋けいれん）を含む。
【００４９】
本明細書において、「妊娠初期」とは、妊娠１カ月〜４カ月を意味し、「妊娠中期」とは、妊娠５カ月〜７カ月を意味し、「妊娠後期」とは、妊娠８カ月〜１０カ月を意味する。
【００５０】
本発明の方法において、「患者由来の体液中のｓ（Ｐ）ＲＲの検出又は定量」は、抗体分子を用いた公知の方法に基づき行うことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。
【００５１】
よって、より具体的には、本発明の妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
（ａ）該患者由来の試料を調整するステップ；
（ｂ）少なくとも１つのｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する抗体に該試料を接触させるステップ、
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して試料中のｓ（Ｐ）ＲＲのを検出又は定量するステップ；
（ｄ）ｓ（Ｐ）ＲＲのレベルから妊娠高血圧症の発症を予測するステップ、ここで、ｓ（Ｐ）ＲＲレベルが高いことが、被検患者が妊娠高血圧症を発症しやすいことを示す。
【００５２】
本明細書において、「少なくとも１つのｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する抗体に該試料を接触させるステップ」及び「該タンパク質の該抗体への結合を検出して試料中のｓ（Ｐ）ＲＲのを検出又は定量するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより実施する場合には、固相に固定化されたｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する抗体に被験試料を接触させ、洗浄後、ｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する標識抗体を添加して非結合抗体を洗浄により除去した後、当該抗体の標識を検出又は定量することにより行うことができる。また、イムノクロマトにより行う場合には、固定化されていないｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する標識抗体に被験試料を接触させた後、当該混合物をｓ（Ｐ）ＲＲに特異的に結合する別の抗体が特定部位に固定化された担体と接触させ、当該部位における標識抗体の集積を検出又は定量することにより行うことができる。
【００５３】
これらの方法においては、予め適宜既知の濃度に段階希釈されたｓ（Ｐ）ＲＲ標準物質を用いて検量線を作成し、検体中の測定値から当該検量線を基にｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を計算して求めてもよい。また、必要に応じて、被験者由来の体液に加えて、妊娠していない対象由来の体液、あるいは妊娠高血圧症を発症しなかった患者由来の体液又は発症しないと信じられている患者由来の体液をネガティブコントロールとして、同様にｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を測定してもよいし、かつ／あるいは、妊娠高血圧症を発症した患者又は発症することが知られている患者由来の体液をポジティブコントロールとして、同様にｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を測定してもよい。検出又は定量は、妊娠高血圧症発症との関連付けがそれぞれｓ（Ｐ）ＲＲの存在により行われるのか又はレベルにより行われるのかに応じて決定してもよい。例えば、妊娠高血圧症発症との関連付けがｓ（Ｐ）ＲＲの存在／不存在に依存する場合には、存在／不存在を検出することが望ましい。また、妊娠高血圧症発症との関連付けがｓ（Ｐ）ＲＲのレベルに依存する場合には、ｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを定量することが望ましい。また、妊娠高血圧症発症との関連付けが発症指標としてのｓ（Ｐ）ＲＲの閾値レベルを超えるか否かに依存する場合には、閾値レベルを超えるｓ（Ｐ）ＲＲ濃度を検出してもよいし、ｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを定量した上で閾値レベルを超えるか否かを判定してもよい。なお、本明細書において、レベルとは、数値化される指標を意味し、例えば、濃度あるいはその代わりとして用いることができる指標を意味する。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。
【００５４】
本明細書において、妊娠高血圧症の発症を予測するために、測定されたｓ（Ｐ）ＲＲの発現レベルと患者の発症と関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者におけるｓ（Ｐ）ＲＲの存在又はレベルを、妊娠高血圧症を発症した患者又は発症することが知られている患者（ポジティブコントロール）、あるいは、妊娠高血圧症を発症しなかった患者又は発症しないと信じられている患者（ネガティブコントロール）におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルと比較することを意味する。比較対象となる患者におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に発症の有無が判明している患者由来の妊娠初期の試料におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを測定することにより、あるいは、他の指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。本発明のｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを利用して、患者が妊娠中期及び／又は後期に妊娠高血圧症を発症する可能性を予測することができる。発症因子と発症との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮｅｗＹｏｒｄ，  １９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００５５】
例えば、本発明の方法により検出されたｓ（Ｐ）ＲＲは、その存在／不存在により患者の妊娠高血圧症の発症と関連付けることができる。また、別の例として、本発明のｓ（Ｐ）ＲＲについて発症指標としての閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００５６】
あるいは、関連付けは、妊娠高血圧症の発症の可能性の高さに関するいくつかのグループ群（クラス）を設定し、患者由来の試料におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルから、当該クラスのうち一つのクラスに分類し、分類されたクラスに属する患者に特異的な妊娠高血圧症に関する既知の性質（妊娠高血圧症の発症率等）から当該患者の妊娠高血圧症の発症の可能性を予測することにより関連付けてもよい。
よって、より具体的には、本発明は以下の方法を含む：妊娠高血圧症の発症を予測するための情報を得る方法又は妊娠高血圧症の発症を予測する方法であって：
（ａ）妊娠初期の患者由来の体液中のｓ（Ｐ）ＲＲを定量すること；及び、
（ｂ）測定されたｓ（Ｐ）ＲＲのレベルと該患者の妊娠中期及び／又は後期における妊娠高血圧症発症との関連付けをすることを含む方法、
ここで、前記関連付けは、以下の方法を含む：
（ｃ）定量されたｓ（Ｐ）ＲＲのレベルから、妊娠高血圧症の発症クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は定量されたｓ（Ｐ）ＲＲのレベルに依存している；及び
（ｄ）分類された当該一つの反応クラスに属する妊娠高血圧症の発症に特異的な既知の性質から当該患者の妊娠高血圧症の発症を予測すること。
本明細書において、「妊娠高血圧症の発症クラスのうち一つのクラスに分類する」とは、被験患者由来の試料におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルに応じて当該被験患者をグループ分けすることを意味する。当該グループ分けは、絶対的又は相対的な指標により振り分けることができる。例えば、対象患者のｓ（Ｐ）ＲＲの定量値から、当該患者を予め決められたｓ（Ｐ）ＲＲの定量値を示すグループに振り分けることにより行ってもよいし、又は、対象患者を含む不特定の患者群におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルを定量した上で、相対的な定量レベルの差から、患者を２以上のグループに分けてもよい。また、クラス分けは、妊娠していない対象におけるｓ（Ｐ）ＲＲのレベルとの差の大小を指標として行ってもよい。好ましくは、比較した場合にｓ（Ｐ）ＲＲの定量値が多い（レベルが高い）ほど妊娠高血圧症の発症の可能性が高いクラスに分類される。
【００５７】
発症予測の判定は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。発症予測の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、発症予測の判定結果は、本発明のｓ（Ｐ）ＲＲレベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００５８】
本発明の方法は、妊娠高血圧症の発症を予測するものであり、発症の予測は妊娠高血圧に罹患するする危険性を判断するものである。本発明において使用する患者由来の試料としては、ｓ（Ｐ）ＲＲを検出することができる体液を使用することができ、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の予測方法における分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００５９】
また、ｓ（Ｐ）ＲＲは、患者の妊娠高血圧症発症の指標となることから、妊娠高血圧症治療薬のスクリーニングにおいて、患者の発症の改善の指標として用いることができる。例えば、被験者に被験薬を投与し、又は、高血圧モデル動物に被験薬を投与し、一定時間後のｓ（Ｐ）ＲＲレベルを測定することにより、当該治療薬が妊娠高血圧症の発症を改善するものであるか否かを判定することができる。より具体的には、添加又は投与により、ｓ（Ｐ）ＲＲレベルが減少する被験薬を、妊娠高血圧症を改善又は発祥を抑制する治療薬として選別することができる。
【００６０】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、以下の実施例に記載するプロスペクティブコホート研究は、東京女子医科大学の倫理委員会の承認を受けて行った。
【００６１】
（実施例１）ヒト血中ｓ（Ｐ）ＲＲ測定法の確立
（１）組換ヒト（Ｐ）ＲＲの調製
抗原として大量の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを取得するため、該タンパク質をバキュロ−ウイルス−カイコ発現系（シスメックス社、兵庫、日本）を用いて発現させた。手順の詳細は既に報告された通りである（Ｋｉｙｏｎｏ  Ｍら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８３，１１２７−１１３１（２００９））。簡単に説明すると、（Ｐ）ＲＲ移入ベクターｐＭ０３（シスメックス社）を構築した。（Ｐ）ＲＲをコードするｃＤＮＡは以前報告されたプラスミドベクターであるｐＣＡＧＧＳ−ｈＰｒｏＲｅｎＲｃ（Ｋａｎｅｓｈｉｒｏ  Ｙら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １８，１７８９−９５（２００７））から得た。この移入ベクターをＢｍＮＰＶ（ＣＰｄ  ｓｔｒａｉｎ、シスメックス社）と共にＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ培養細胞（ＢｍＮ細胞）にコトランスフェクトした。ＢｍＮ細胞中の（Ｐ）ＲＲ−Ｈｉｓタグ遺伝子を含む組換バキュロウイルスを増幅させた後、蚕の蛹に感染させた。注入の６日後、蛹を５２ｍＬの均質化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％  グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフッ化物、１０ｍＭ  ベンズアミド）中でホモジナイズし、４℃、１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、１％のトリトンＸ−１００を含む５２ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁させた。４℃で１時間攪拌後、上清を４℃、１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを１％のＮ−ラウロイルサルコシンを含む溶解緩衝液５２ｍＬに再懸濁させた。懸濁液を上述と同じ手順で再度、攪拌、遠心分離して上清を回収した。回収した上清をＮｉ−アガロースカラムに添加し、該カラムを洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン）で洗浄した。（Ｐ）ＲＲ−Ｈｉｓタグタンパク質は溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶出させた。溶出液は濃縮し、２０ｍＭ  ＮａＰ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン、ｐＨ７．５で置換した。
【００６２】
（２）ヒト（Ｐ）ＲＲ発現ＣＨＯ細胞の構築
Ａ−５４９細胞から、ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  Ｑｕｉｃｋ  ＰｒｅｐＴＭ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケアジャパン、東京、日本）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥヘルスケアジャパン）を用いてｃＤＮＡを生成させた。それぞれ、順にＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの制限酵素切断部位を有する、フォワードプライマー：５’−ＡＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＧ−３’（配列番号１）、及びリバースプライマー：５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴ−３’（配列番号２）を用いて、ヒト（Ｐ）ＲＲ  ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ増幅に続いて、ＰＣＲ産物はＥこＲＩ及びＸｈｏＩで消化され、ｃ末にヒスチジンタグを有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入された。続いて、得られたプラスミド構造物をリポフェクトアミン２０００（インビトロゲン、カリフォルニア、米国）を用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）にトランスフェクトし、安定発現株を１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＰＡＡラボラトリーズ、パシング、オーストラリア）で選択した。
【００６３】
（３）抗（Ｐ）ＲＲ抗体の調製
ウサギを人工ペプチドであるＳＶＴＬＲＱＬＲＮＲＬＦＱＥＮＳＶＬ（配列番号３）、及びＩＧＫＲＹＧＥＤＳＥＱＦＲＤＡＳＫＩ（配列番号４）とキャリアタンパク質であるウシサイクログロブリンの結合物で免疫した。これらのペプチド配列は、ヒト（Ｐ）ＲＲタンパク質のそれぞれ１４８番目のセリン（Ｓ１４８）から１６５番目のロイシン（Ｌ１６５）、及び２２２番目のイソロイシン（Ｉ２２２）から２３９番目のイソロイシン（Ｉ２３９）に対応する配列である。免疫したウサギの血清から、各抗原を結合させた活性化チオールセファロース４Ｂビーズカラム（アマシャム  バイオサイエンス社）を用いて、これらの配列に対するイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇフラクションを得た。得られた精製ＩｇＧはＰｏＡｂ−１４８及びＰｏＡｂ−２２２と名付けた。続いて、組換ヒト（Ｐ）ＲＲをマウスに注射した。免疫マウスから得られた脾細胞をメラノーマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。大腸菌でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ融合蛋白質として発現させたｓ（Ｐ）ＲＲをグルタチオンセファロース４Ｂビーズ上のクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアジャパン）により精製した。ＥＬＩＳＡを用いてハイブリドーマ細胞の上清の抗体を精製ＧＳＴタグ化ｓ（Ｐ）ＲＲとの反応性でスクリーニングし、幾つかの陽性クローンを限界希釈法により選択した。得られた単一クローン９３Ａ１Ｂを本実験に用いた。このハイブリドーマは、「Ｈｕｍａｎ  ｐＲＲ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９３Ａ１Ｂ」として、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に寄託した。寄託微生物の受領日は２０１１年１１月１７日であり、受領番号はＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２００である。
【００６４】
（４）ウェスタンブロッティング及び免疫沈降分析
カイコ由来の組換ヒト（Ｐ）ＲＲを同定し、（Ｐ）ＲＲ組換体の発現を確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。組換ヒト（Ｐ）ＲＲ、（Ｐ）ＲＲのｃＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞、及びその培養液は、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して抗Ｈｉｓ抗体及びＰｏＡｂ−２２２によるウェスタンブロット分析に使用した。
抗体が溶液中の条件下で天然のｓ（Ｐ）ＲＲと反応する能力を有するか否かを確認するため、免疫沈降ウェスタンブロッティング分析を行った。抗体の反応性は免疫沈降ウェスタンブロッティングにより評価した。（Ｐ）ＲＲトランスフェクタントの上清をＰｏＡｂ−１４８又は９３Ａ１Ｂと共にインキュベートし、共にプロテインＧ  セファロース（ＧＥヘルスケアジャパン）を添加した。更にインキュベートした後、遠心分離を行い、得られたペレットを三回洗浄した。次いでペレットを溶解し、９３Ａ１Ｂを用いてウェスタンブロット分析を行った。
【００６５】
（５）ｓ（Ｐ）ＲＲの定量のためのＥＬＩＳＡシステムの構築
ｓ（Ｐ）ＲＲ濃度を測定するため、ＰｏＡｂ−１４８及び９３Ａ１Ｂを組み合わせたサンドイッチｓ（Ｐ)ＲＲ  ＥＬＩＳＡシステムを構築した。ＰｏＡｂ−１４８は捕捉抗体として、９３Ａ１Ｂは検出抗体として用いた。
（５−１）標準物質
組換ヒト（Ｐ）ＲＲタンパク質の純度は、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ（富士フィルム、東京、日本）により濃度的に証明され、タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを指標とした電気泳動により決定した。更に、ｓ（Ｐ）ＲＲ  ｃＤＮＡがトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清をＥＬＩＳＡシステムの標準物質（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔａｎｄａｒｄ）として用いた。
【００６６】
（５−２）サンドイッチＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（９６穴）の各穴に、０．５μｇの精製ＰｏＡｂ−１４８を含有する１００ｍＭのカーボネート緩衝液（ｐＨ９．５）を１００μＬ添加し、４℃で一晩静置して該プレートをコートした。その後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、２００μＬの１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳを各穴に加えて、４℃で一晩静置してブロックした。ＰＢＳ−Ｔにより二度洗浄後、被験サンプルと標準物質である組換ｓ（Ｐ）ＲＲを１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔで段階希釈した溶液１００μＬ／穴を、コートされたマイクロタイタープレートに加え、４℃で一晩静置した。本試験はデュプリケートで行った。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合９３Ａ１ＢマウスＩｇＧ  Ｆａｂ’を各穴に添加し、４℃で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで穴を５回洗浄後、１００μＬの新たに調製したテトラメチルベンジジン溶液を各穴に基質として添加し、暗室、室温で３０分間静置した。１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。溶液の４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｅ−Ｍａｘ；モレキュラーデバイス、カリフォルニア、米国）で測定した。
【００６７】
（５−３）ＥＬＩＳＡの精度・回収率評価
イントラアッセイ（ｉｎｔｒａ  ａｓｓａｙ）及びインターアッセイ（ｉｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）でＥＬＩＳＡの精度を評価するために、３つの品質管理（ＱＣ）を構築して、高、中、低レンジの標準カーブをカバーした。イントラアッセイ精度は、各ＱＣサンプルを一枚のプレートで測定することを２４回繰り返して決定し、インターアッセイ精度は、各ＱＣサンプルについて、６つの異なるプレートを用いた５重（穴）測定を行うことにより決定した。更に、血液サンプル中の回収率を評価するため、異なる既知の濃度の組換（Ｐ）ＲＲをヒト血漿、血清又は１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＴＩＬ培地に添加したサンプルを測定し、測定濃度と理論濃度の差から回収率を評価した。キットの感度は米国臨床検査標準委員会評価プロトコル（ＮＣＣＬＳ法）で示されたガイドラインに従って決定した。
【００６８】
（６）培養液中及び健常人の血液サンプル中の（Ｐ）ＲＲの検出と定量
ＥＬＩＳＡアッセイが天然のｓ（Ｐ)ＲＲに対して定量的であるか否かを決定するため、２つの実験を行った。一つ目はｓ（Ｐ）ＲＲ  ｃＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ細胞の培養培地、及び、形質転換されていないＣＨＯ細胞の培養培地におけるｓ（Ｐ）ＲＲを測定した。（Ｐ）ＲＲ形質転換細胞、及びＣＨＯ細胞の各々５×１０４細胞を、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ）を含むＴＩＬ培地（免疫生物研究所、群馬、日本）に播種し、２４時間後に無血清のＴＩＬ培地と交換した。３日間培養後、各穴の上清を回収し、測定した。
また、ヒトＡＴＰ６ＡＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びコントロールｓｉＲＮＡは、それぞれサーモサイエンティフィック社及びアンビオン社から購入した。これらのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入はリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（インビトロジェン社）を用いて行った。ｓｉＲＮＡを形質転換した、又は形質転換していないヒト有足細胞株の培養培地を以下の方法で調整し、同様に測定した。不死化ヒト有足細胞株は温度感受性ＳＶ４０  Ｔ−遺伝子及びテロメラーゼ遺伝子を形質転換することにより構築した（Ｓａｌｅｅｍ  ＭＡら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１３：６３０−６３８，２００２）。有足細胞は３３℃で増殖させ、３７℃に変更して１４日以上経過後に分化させた。実験のため、６〜１０回継代細胞を細胞プレート上に播種し３７℃、５％ＣＯ２条件下、１０％ウシ胎児血清（ギブコ、東京、日本）又は１ｍｇ／ｍＬエンドトキシンフリーウシ血清アルブミン、及びインスリン−トランスフェリン亜セレン酸ナトリウム添加剤（シグマ）を含有する標準ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ、東京、日本）中で少なくとも１４日間、細胞が分化し樹状の形態を呈するまで培養した。有足細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で１４日間培養後、実験に使用した（Ｓａｋｏｄａ  Ｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，２３：５７５−５８０，２０１０）。
本発明のＥＬＩＳＡキットは培地中のＦＢＳ由来のｓ（Ｐ）ＲＲをも検出してしまうことから、コントロールとして非培養培地のｓ（Ｐ）ＲＲも測定した。
更に、健常人のＥＤＴＡ血漿及び血清中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度を決定した。血液サンプルは、株式会社ベリタス（東京、日本）より購入した。統計分析は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ＡＮＯＶＡとｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ  ｔｅｓｔを用いて行った。
【００６９】
（７）結果
（７−１）ウェスタンブロッティング及び免疫沈降分析
組換ヒト（Ｐ）ＲＲ、（Ｐ）ＲＲのｃＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞、及びその培養液をウェスタンブロッティングした結果を図１Ａ及びＢに示す。（Ｐ）ＲＲの分子量は３５ｋＤａと見積もられ、その可溶化形態は２９ｋＤａと見積もられた。ウェスタンブロットの結果から、これらの見積りに該当するタンパク質を確認することができた。また、免疫沈降ウェスタンブロッティングの結果を図１Ｃに示す。ＥＬＩＳＡに用いたＰｏＡｂ−１４８抗体及び９３Ａ１Ｂ抗体はいずれもｓ（Ｐ）ＲＲ形質転換体を培養した培地由来のｓ（Ｐ）ＲＲを免疫沈降させることができた。
【００７０】
（７−２）ＥＬＩＳＡの標準曲線と精度・回収率評価
ｓ（Ｐ）ＲＲ  ＥＬＩＳＡシステムの標準用量反応曲線は、ｌｏｇ／ｌｏｇスケールで１２５から８０００ｐｇ／ｍＬの範囲に亘って直線を示し、その直線性は極めて優れていた（Ｒ２＝０．９９）（図２Ａ）。また、３つのＱＣ用サンプル（高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、低濃度（Ｌ））決定した精度の結果を表１及び表２に示す。また、回収率評価の結果を表３に示す。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
表１にも示される通り、イントラアッセイ精度のＣＶは高濃度サンプルで３．１％、中濃度サンプルで５．４％、低濃度サンプルで５．５％を示した。また、表２に示すインターアッセイの結果では、ＣＶは高濃度サンプルで３．０％、中濃度サンプルで２．４％、低濃度サンプルで７．５％を示した。これらの結果から、本ＥＬＩＳＡシステムは精度の観点から十分信頼性のおけるものであることが証明された。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
表３にも示す通り、回収率はヒトＥＤＴＡ血漿サンプルの５０回希釈で８６．８％以上、ヒト血清サンプルで９１．２％以上、１０％ＦＣＳ添加ＴＩＬ培地ではほぼ１００％の回収率であった。アッセイの感度は、ＮＣＣＬＳ法により２４ｐｇ／ｍＬと計算された。
【００７６】
（７−３）培養液中及び健常人の血液サンプル中の（Ｐ）ＲＲの検出と定量
ｓ（Ｐ）ＲＲ形質転換細胞の培養上清中におけるｓ（Ｐ）ＲＲの濃度は１２６．３ｎｇ／ｍＬであり、ＣＨＯ細胞の培養液における濃度である５．６ｎｇ／ｍＬよりは非常に高い値となった（図２Ｂ）。
また、ｓｉＲＮＡを形質転換した、又は形質転換していないヒト有足細胞株の培養培地についてｓ（Ｐ）ＲＲを測定した結果を図２Ｃに示す。グラフ中、点々のある範囲は、培地中に含まれるｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を示す。各培養培地の測定値から、当該範囲を差し引いた値が実際の各細胞から放出されたｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を示すと考えられる。ｓｉＲＮａを形質転換していない有足細胞株の培養上清におけるｓ（Ｐ）ＲＲの濃度は８．４ｎｇ／ｍＬであり、これはｓｉＲＮＡを形質転換した有足細胞の培養上清の結果である０．４ｎｇ／ｍＬと比較して非常に高い値となった。
健常人から得られた、ヒトＥＤＴＡ血漿及び２０の血清サンプル（男性１０人、女性１０人）におけるｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を測定した結果を図３に示す。ＥＤＴＡ血漿サンプルは、１５．２から３５．１ｎｇ／ｍＬの範囲であり、平均値は２２．３ｎｇ／ｍＬであった。一方で、血清サンプルは１２．６から３３．１ｎｇ／ｍＬの範囲であり、平均値は２２．３ｎｇ／ｍＬであった（図３Ａ）。ＥＤＴＡ血漿と血清の間には相関が認められた（Ｒ＝０．７５７）。男性と女性の間で顕著な違いは見られなかった（図３Ｂ）。
【００７７】
また、同様にヒト尿、マウス血漿、マウス血清、ラット血漿、ラット血清をサンプルとして濃度測定試験及び回収試験を行った結果、同様にｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を測定可能であることが示された（結果は非図示）。
【００７８】
（８）結論
これらの結果から、本発明のｓ（Ｐ）ＲＲ定量システムは、ヒトを対象として利用可能であることが示された。
【００７９】
（実施例２）妊婦におけるｓ（Ｐ）ＲＲ測定
（１）対象とする妊婦とサンプル取得方法
２０１０年１月から２０１０年１２月までの間に東京女子医大に最初に診察に訪れた妊娠１６週と０日の妊婦が本試験に登録された。全ての参加者の出産予定日（ＥＤＤ）は超音波により確認した。治験対象患者選定基準は正常な血圧（ＢＰ)（収縮期血圧＜１４０ｍｍＨｇ、かつ、拡張期血圧＜９０ｍｍＨｇ）とした。基準を満たした４２３人の患者が本試験に登録された。６人の患者は早期流産のため、３４人の患者は試験への参加を拒否したか他院で出産したため、合計４０人の患者が試験から除外された。最後に、３８３人の患者が本試験で分析された。妊娠中に亘って、出産前の３回の検診において血漿サンプルを得た。最初のサンプルは、妊娠１６週と０日よりも前（妊娠初期）に、二番目のサンプルは、妊娠１６週と０日から妊娠２７週と６日の間（妊娠中期）に、三番目のサンプルは妊娠２８週と０日以降（妊娠後期）に得た。各血液サンプリングにおいて、座位の状態で右腕を心臓と同じ高さにして５分間休息の後、自動血圧計（オムロン  ＢＰ２０３ＲＶＩＩＩ  オシロメーター；オムロンコーリン株式会社、東京、日本）を用いて血圧を測定した。血漿サンプルを用いて、ｓ（Ｐ）ＲＲの濃度を妊娠初期に３１１人の患者で測定し、妊娠中期に２８９人の患者で測定し、妊娠後期に３１３人の患者で測定した。血圧データは、妊娠初期に３８３人すべての患者で、妊娠中期に３８２人の患者で、妊娠後期に３６５人の患者で測定した。試験参加者の臨床特性を表１に示す。
【００８０】
【表４】
2015038041.tif 000005
【００８１】
（２）分析方法
連続型変数（妊娠各期間の血圧、血漿中ｓ（Ｐ)ＲＲ濃度）の比較には、ペアｔ検定を用いた。多重比較の調整にはボンフェロー二の補正を適用した。ｓ（Ｐ）ＲＲの妊娠中の血圧予測能を評価するため、妊娠初期のｓ（Ｐ）ＲＲと、妊娠初期、中期、及び後期の血圧との相関を単変量及び多変数回帰により調べた。同様に、妊娠中期のｓ（Ｐ）ＲＲと、妊娠中期及び後期の血圧、並びに、妊娠後期のｓ（Ｐ）ＲＲと、妊娠後期の血圧との関係についても調べた。全ての分析はＳＴＡＴＡソフトウェア（バージョン１１．０；Ｓｔａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，テキサス州）により行った。
【００８２】
（３）結果
（３−１）血圧
図４は妊娠各期における収縮期血圧、拡張期血圧及び平均血圧の経時変化を示す。収縮期血圧の平均値（±ＳＤ）は、妊娠初期、中期、及び後期において、それぞれ１０９±１１．５、１０７±１０．５、及び１１１．２±１０．９（ｍｍＨｇ）であった。拡張期血圧の平均値（±ＳＤ）は、妊娠初期、中期、及び後期において、それぞれ６４．４±８．５、６２．５±７．５、及び６５．８±８．１（ｍｍＨｇ）であった。平均（±ＳＤ）血圧は、妊娠初期、中期、及び後期において、それぞれ７９．３±９．０、７７．５±７．９、及び８０．９±８．４（ｍｍＨｇ）であった。血圧が測定されていた時の妊娠初期、中期、及び後期の平均妊娠期間（±ＳＤ）は、それぞれ、１１．８±１．５、２４．８±１．４、及び３５．６±０．９週であった。全ての血圧測定（収縮期、拡張期、及び平均）において、血圧は妊娠中期が妊娠初期又は妊娠後期と比較して有意に低かった。妊娠後期の血圧は妊娠初期の血圧と比較して有意に高かった。
【００８３】
（３−２）ｓ（Ｐ）ＲＲ濃度
ｓ（Ｐ）ＲＲ濃度に対する頻度ヒストグラムを図５に示す。この頻度ヒストグラムから、ｓ（Ｐ）ＲＲレベルが、通常、妊娠期の全てに亘って分布していることが示された。ｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は妊娠初期及び中期と比較して、妊娠後期で有意に高い濃度を示した。
【００８４】
（３−３）ｓ（Ｐ）ＲＲ濃度と血圧との相関
表５は血漿中の可溶性プロレニン受容体（ｓＰＲＲ）レベルと血圧との関連を単変量及び多変数回帰した結果を示す。非調整モデルでは、妊娠初期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度が優位に妊娠中期の収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧値と相関した（それぞれ順に、ＣＥ  ０．１６ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．００９、０．３２；ＣＥ  ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０４、０．２６；及びＣＥ  ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０４、０．２７）。更にｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は同様に妊娠後期の平均血圧と有意に相関した（ＣＥ  ０．１３ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．００９、０．２５）が、妊娠初期のどの血圧とも相関しなかった。妊娠中期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は妊娠中期及び後期のどの血圧値とも相関しなかった。最後に、妊娠後期のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠中期の収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧と有意に相関した（それぞれ順に、ＣＥ  ０．２１ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０７、０．３４；ＣＥ  ０．１６ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０６、０．２６；及びＣＥ  ０．１８ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０７、０．２８）。
【００８５】
調整モデルでは、妊娠初期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠中期の収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧を有意に予測可能なものであった（それぞれ順に、ＣＥ  ０．１８ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０５、０．３２、ｐ＝０．００８；ＣＥ  ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０４、０．２６、ｐ＝０．００１；及びＣＥ  ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０４、０．２７、ｐ＝０．００１）。妊娠中期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠中期及び後期のどの血圧とも相関しなかった。妊娠後期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠後期の収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧と有意に相関した（それぞれ順に、ＣＥ  ０．１８ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０３、０．３２、ｐ＝０．０１５；ＣＥ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０４、０．２５、ｐ＝０．００８；及びＣＥ  ０．１５ｍｍＨｇ、９５％ＣＩ：０．０５、０．２６、ｐ＝０．００１）。
【００８６】
【表５】
2015038041.tif 000006
【００８７】
これらの結果から、妊娠初期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は、妊娠中期及び後期の全ての血圧値（収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧）の上昇の予測評価に利用可能であることが示された。一方で、妊娠中期のｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は妊娠後期の血圧とは相関しなかった。また、妊娠後期ではｓ（Ｐ）ＲＲ濃度は全ての血圧値（収縮期血圧、拡張期血圧、及び平均血圧）と有意に相関していることが示された。よって、特に、妊娠初期の血漿中のｓ（Ｐ）ＲＲが妊娠中期及び後期の血圧上昇のマーカーとして有用であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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