(57)【要約】植物転写因子をコードする新規単離ポリヌクレオチドを、そのようなポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物と共に提供する。内因性および／または異種遺伝子の発現を調整するためにそのような構築物を用いる方法も、そのような構築物を含むトランスジェニック植物と共に開示する。2013531971.tif 000014
2013531971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421からなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下からなる群より選択される配列を含む単離ポリヌクレオチド：
（a）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の相補体；
（b）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の逆相補体；ならびに
（c）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の逆配列。
【請求項３】
転写因子をコードする、以下からなる群より選択される配列を含む単離ポリヌクレオチド：
（a）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列と少なくとも75％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（b）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列と少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（c）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（d）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（e）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の200量体であるヌクレオチド配列；
（f）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の100量体であるヌクレオチド配列；
（g）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の40量体であるヌクレオチド配列；
（h）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の20量体であるヌクレオチド配列；ならびに
（i）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列と縮重により同等であるヌクレオチド配列。
【請求項４】
SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、および1931-2106の配列の10連続残基と相補的である少なくとも10連続残基を含むオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO: 592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項７】
転写因子として機能する、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）SEQ ID NO: 592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422の配列と少なくとも75％の同一性を有する配列；
（b）SEQ ID NO: 592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422の配列と少なくとも90％の同一性を有する配列；ならびに
（c）SEQ ID NO: 592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422の配列と少なくとも95％の同一性を有する配列。
【請求項８】
請求項6および7のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項１０】
請求項9記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック細胞。
【請求項１１】
以下を5'から3'方向に含む、遺伝子構築物：
（a）遺伝子プロモーター配列；
（b）以下の少なくとも1つを含むポリヌクレオチド配列：（1）592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに（2）請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの非コード領域を含むポリヌクレオチド；ならびに
（c）遺伝子終結配列。
【請求項１２】
オープンリーディングフレームがセンス方向である、請求項11記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
オープンリーディングフレームがアンチセンス方向である、請求項11記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
請求項9および11のいずれか1項記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項１５】
請求項14記載のトランスジェニック植物細胞、またはその果実、もしくは種子、もしくは栄養体を含む、植物。
【請求項１６】
樹木植物である、請求項15記載の植物。
【請求項１７】
ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、モミジバフウ、チーク、およびマホガニー種からなる群より選択される、請求項16記載の植物。
【請求項１８】
請求項9および11のいずれか1項記載の遺伝子構築物を植物のゲノムに安定に組み入れる段階を含む、植物における遺伝子発現を修飾する方法。
【請求項１９】
植物が樹木植物である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
植物が、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、モミジバフウ、チーク、およびマホガニー種からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
以下の段階を含む、修飾された遺伝子発現を有する植物を産生する方法：
（a）請求項9および11のいずれか1項記載の遺伝子構築物によって植物細胞を形質転換して、トランスジェニック細胞を提供する段階；および
（b）トランスジェニック細胞を、再生および成熟植物の生育を行う条件で栽培する段階。
【請求項２２】
植物が樹木植物である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
植物が、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、モミジバフウ、チーク、およびマホガニー種からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
請求項9および11のいずれか1項記載の遺伝子構築物を植物のゲノムに安定に組み入れる段階を含む、植物におけるポリペプチドの活性を修飾する方法。
【請求項２５】
植物が樹木植物である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
植物が、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、モミジバフウ、チーク、およびマホガニー種からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
SEQ ID NO: 2279-2293および2296-2368からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むDNA結合ドメインを含む単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その各々の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2000年3月9日に提出された国際特許出願PCT/US00/06112号および1999年8月18日に提出された米国特許仮出願第60/149,485号に対する優先権を主張し、ならびに現在は放棄されている1999年3月11日に提出された米国特許出願第09/266,513号の一部継続出願である、2000年8月16日に提出された米国特許出願第09/640,211号、現在は米国特許第6,833,446号の一部継続出願である、現在は放棄されている2004年5月28日に提出された米国特許出願第10/856,499号の一部継続出願である、米国特許出願第12/762,984号の恩典を主張する。
【０００２】
電子提出されたテキストファイルに関する記述
本明細書と共に電子提出されたテキストファイルの内容は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター読み取り可能なフォーマットのコピー（ファイル名：ARBG_003_04US_SeqList_ST25.txt、データ記録日：2010年4月19日、ファイルサイズ、2,329キロバイト）。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、植物から単離された組成物ならびに遺伝子の転写および／または発現の修飾におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、細胞転写装置の成分である転写因子をコードする植物ポリヌクレオチド配列および遺伝子発現の修飾におけるそのようなポリヌクレオチド配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
真核細胞遺伝子発現は、部分的に、転写に関係する細胞プロセスによって調節される。転写の際に、RNAポリメラーゼの作用によって、転写されるDNA配列に対して相補的な一本鎖RNAが形成される。真核細胞における転写の開始は、転写される遺伝子の上流に位置するシス作用DNAモチーフと、トランス作用タンパク質因子とのあいだの複雑な相互作用によって調節される。シス作用調節領域には、転写開始部位の近くに位置して、それに対してRNAポリメラーゼが直接または間接的に最初に結合するプロモーターと呼ばれるDNA配列が存在する。プロモーターは、通常、近位のエレメント（たとえば、TATAボックス）およびより遠位のエレメント（たとえば、CCAATボックス）からなる。エンハンサーは、開始部位からのさらに上流および／または下流に位置しうるシス作用DNAモチーフである。
【０００５】
プロモーターおよびエンハンサーはいずれも、一般的に、その各々が転写因子として知られる1つまたは複数のトランス作用調節タンパク質によって認識されうる、いくつかの個別のしばしば重複したエレメントで構成される。発達中の全ての生物において空間的および時間的に観察される遺伝子発現の複雑なパターンの調節は、エンハンサーおよびプロモーターに結合した一般的および組織特異的転写因子とDNAとの相互作用により生じると考えられている（Izawa T, Foster R and Chua NH, J. Mol. Biol. 230: 1131-1144, 1993; Menkens AE, Schindler U and Cashmore AR, Trends in Biochem. Sci. 13:506-510, 1995）。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびラジアータパイン（Pinus radiata）などの多様な生物における発生の決定は、転写因子によって調節される。これらのDNA結合調節分子は、異なる細胞タイプの分化、たとえばシロイヌナズナの葉の突起および木部組織の分化、アフリカツメガエルの胚細胞からの内胚葉の形成、ならびに植物における環境および植物ホルモンストレスに応答した遺伝子発現の開始の原因となる遺伝子の発現を制御することが示されている（Yanagisawa S and Sheen J, The Plant Cell 10:75-89, 1998）。
【０００６】
転写因子は一般的に、配列特異的にDNAに結合して、転写の開始を活性化または抑制する。これらの相互作用の特異的機序は十分に解明されていない。少なくとも3つの異なるドメインが転写因子において同定されている。1つは、配列特異的DNA認識にとって必須であり、1つは、転写開始の活性化／抑制にとって必須であり、および1つは、タンパク質-タンパク質相互作用（二量体形成などの）の形成にとって必須である。DNA配列認識および／または転写因子二量体形成に関係する4つのモチーフまたはドメイン、すなわちジンクフィンガー；ヘリックス-ターン-ヘリックス；ロイシンジッパー；およびヘリックス-ループ-ヘリックスが今日までに同定されている。ヘリックス-ループ-ヘリックスとロイシンジッパータンパク質モチーフはいずれも、インビボでそのホモまたはヘテロ二量体の容易な形成能により、転写因子とDNAとの結合に関係している。「活性化」ドメインは、プロリン、グルタミン、または酸性アミノ酸のいずれかに富む。転写因子のこの真の陰性の領域は、TATAボックス結合転写因子TFIID、RNAポリメラーゼ、および／または転写装置に関連するもう1つのタンパク質と相互作用すると提唱されている。
【０００７】
多くの植物転写因子を、その保存されたDNA結合ドメインに基づいて異なるクラスに分類できることが、研究により示されている（Katagiri F and Chua NH, Trends Genet. 8:22-27, 1992; Menkens AE, Schindler U and Cashmore AR, Trends in Biochem. Sci. 13 :506-510, 1995; Martin C and Paz-Ares J, Trends Genet. 13:67-73, 1997）。これらのファミリーの各々のメンバーは、異なる調節シグナルによって制御される多数の遺伝子プロモーターにおいてしばしば見いだされる別個のDNA配列モチーフと相互作用および結合する。今日までに同定されているいくつかのクラスの転写因子を以下に記述する。
【０００８】
塩基性／ロイシンジッパー（bZIP）は、塩基性／ロイシンジッパー（bZIP）モチーフによって定義される保存された転写因子ファミリーである（Landschultz et al., Science 240: 1759-1764, 1988; McKnight, Sci. Am. 264:54-64, 1991 ; Foster et al, FASEB J. 8 [2]: 192-200, 1994）。遺伝子発現の転写の調節は、対応する遺伝子のプロモーター領域に存在する調節エレメントと相互作用する配列特異的転写因子の協調作用を通して、bZIPおよび他の転写因子ファミリーの双方によって媒介される。bZIP二分DNA結合構造は、アミノ酸7個の間隔で規則正しく離れているいくつかのロイシン残基を特徴とするロイシンジッパーに隣接する塩基性アミノ酸に富む領域（塩基性領域）からなる（Vinson et al., Science 246:911-916, 1989）。塩基性領域は、DNAに直接接触するが、ロイシンジッパーは、2つのαヘリックスの疎水性二量体界面の平行な相互作用を通してタンパク質単量体のホモ二量体化およびヘテロ二量体化を媒介し、その結果コイルドコイル構造を生成する（O'Shea et al, Science 243:538-542, 1989; Science 254:539-544, 1991 ; Hu et al., Science 250: 1400-1403, 1990; Rasmussen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:561-564, 1991）。
【０００９】
Dofタンパク質は、比較的新しいクラスの転写因子であり、bZIPタンパク質と、緊密に連鎖する部位に結合する他のタイプの転写因子との組み合わせ相互作用によって、部分的に植物遺伝子発現のいくつかのパターンの調節を媒介すると考えられている。この組み合わせ相互作用のそのような例は、bZIPとDof転写因子のあいだで観察されている（Singh, Plant Physiol. 118: 1111-1120, 1998）。これらのDofタンパク質は、植物において高度に保存されている1つのジンクフィンガーDNA結合ドメインを保有する（Yanagisawa, Trends Plant Sci. 1 :213, 1996）。bZIP転写因子に対するDofタンパク質の特異的結合が証明されており、この特異的相互作用によって植物プロモーター中のDNA標的配列に対するbZIP結合の刺激が起こると提唱されている（Chen et al., Plant J 10:955-966, 1996）。たとえば認識されたbZIP結合部位であるocsエレメントに緊密に連鎖するいくつかのDof-結合部位を含むことが示されているシロイヌナズナのグルタチオンS-トランスフェラーゼ-6遺伝子（GST6）プロモーターを含む、そのようなDof/bZIP相互作用の例が文献において報告されている（Singh, Plant Physiol. 118: 1111-1120, 1998）。
【００１０】
アラビドプシス（Arabidopsis）のG-ボックス結合因子のbZIPファミリー（たとえばGBF1、GBF2、およびGBF3を含む）は、パリンドロームG-ボックスモチーフ（CCACGTGG）と相互作用する。しかし、そのような転写因子、たとえばGBF1のDNA結合特異性は、ACGTコアに隣接するヌクレオチドの性質によって影響を受けうることが証明されている（Schindler et al., EMBO J. 11 : 1274-1289, 1992a）。インビボでの一過性のトランスジェニック植物発現試験から、最大の転写活性化にとってこれらのACGTエレメントが必要であり、多様な環境、生理学的、および環境のきっかけによって調節される多数の植物遺伝子において同定されていることが示されている。そのACGTコアモチーフに対する結合能に基づくこれらの転写因子の分類により、たとえばG-ボックスと相互作用するそれらのタンパク質とは異なるDNA結合部位の要件を示す1-結合タンパク質としてのCamV 35Sプロモーターを含む、比較的多様な群のタンパク質が得られた（Tabata et al., EMBO J. 10: 1459-1467, 1991）。このように、そのDNA結合特異性に基づいてbZIPタンパク質の個々のクラスを定義することに加えて、そのようなタンパク質はまた、そのヘテロ二量体形成特徴に従っても分類することができる（Cao et al., Genes Dev. 5: 1538-1552, 1991 ; Schindler et al., EMBO J. 11 : 1261-1273, 1992b）。
【００１１】
環境によって誘導されるプロモーターは、プロモーター活性にとって極めて重要な2つのシス作用エレメントの存在を必要とし、その1つは中等度に保存されたG-ボックス（CCACGTGG）である（deVetten et al., Plant Cell 4[10]:1295-1307, 1992）。2つのエレメントの1つに変異が起こると、プロモーターが環境の変化に応答する能力は、消失するかまたは重度に低減する。G-ボックスの近くに位置する第二のシス作用エレメントの配列は、環境によって誘導される異なるプロモーターでは保存されないが、同じシグナルによって誘導されるプロモーターでは類似である可能性がある。G-ボックスと第二のシス作用エレメントとの間隔は、極めて重要であるように思われ、各々の結合因子間の直接相互作用を示唆している（deVetten and Ferl, Int. J. Biochem. 26[9]: 1055-1068, 1994; Ramachandran et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 4[5]:642-646, 1994）。
【００１２】
ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスジッパータンパク質は、文献において記述されるさらなるクラスのbZIP転写因子を表し、たとえばMycタンパク質を含む。これらのタンパク質は、転写因子に特徴的な2つの領域、すなわちいくつかのリン酸化部位からなるN末端トランス活性化ドメインと、別個の3つのドメイン、すなわちロイシンジッパー、ヘリックス-ループ-ヘリックス、および塩基性領域を介して二量体形成および配列特異的DNA結合を媒介することが知られているC末端ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）ロイシンジッパーモチーフとを含む。
【００１３】
Myb転写因子ファミリーは、アミノ酸およそ50個の不完全なタンデムリピート2個（植物種の場合）または3個（動物種の場合）のいずれかを含む保存されたアミノ末端DNA結合ドメインを特徴とする、植物および動物の双方に見いだされる機能的に多様な転写活性化因子の群である（Rosinski and Atchley, J. Mol. Evol. 46(1):74-83, 1998; Stober-Grasser et al., Oncogene 7[3]:589-596, 1992）。代表的な植物と哺乳動物MYBタンパク質のアミノ酸配列の比較により、異なるタンパク質からの同じリピート間では、同じタンパク質のR2リピートとR3リピート間より大きい保存が存在することが示されている（Martin and Paz-Ares, Trends Genet. 13[2]:67-73, 1997）。100個より多いMYB遺伝子がシロイヌナズナ（Romero et al., Plant J. 14[3]:273-284, 1998）について報告されており、植物において現在知られている最大の調節遺伝子ファミリーを表す。DNA結合試験により、これらのタンパク質に関して認識され始めている別個であるがしばしば関連する機能と共に、植物MYBタンパク質の結合特異性には、差があるもののしばしば重なりが存在することが証明されている。MYB DNA結合ドメインにおける8個の推定の塩基接触残基を含む試験により、少なくとも6個が、今日まで同定されている全ての植物MYBタンパク質において完全に保存されており、残りの2個がこれらのタンパク質の少なくとも80％において保存されていることが判明している（Martin and Paz-Ares, Trends Genet. 13[2]:67-73, 1997）。塩基に接触していない残基を伴う変異分析は、MYBの配列特異的結合能が影響を受けて、これが植物MYBタンパク質のDNA結合特異性の差のいくつかを説明する可能性があることを示している（Solano et al., J Biol. Chem. 272[5]:2889-2895, 1997）。このサイズの大きい遺伝子ファミリーは、植物によって示される発達および代謝の適応性の基礎となる調節の柔軟性に寄与しうる。
【００１４】
ホメオティック転写因子は、動物において、たとえば昆虫および脊椎動物胚におけるパターン形成の制御、ならびに多くの組織における細胞分化の特異化を含む多数の発生プロセスに関係している（Ingham, Nature 335:25-34, 1988; McGinnis and Krumlauf, Cell 68:283-302, 1992）。ホメオドメインの二次構造は、細菌DNA結合ドメインにおいて最初に同定された特有のヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを特徴とする。このヘリックス-ターン-ヘリックス配列／構造モチーフはおよそ20個のアミノ酸に及び、鋭い90度の屈曲または折り返しによって離れている2つの短いヘリックスを特徴とする（Harrison and Aggarwal, Ann. Rev. Biochem. 59:933-969, 1990）。このヘリックスは、DNAヘリックスの主溝に結合することが示されている。
【００１５】
植物のホメオボックス遺伝子は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、パセリ、およびダイズを含む多数の植物種において同定されている。トウモロコシのホメオボックス遺伝子ファミリーメンバーの発現パターン分析により、これらの転写因子が、おそらく葉の構造の開始に関係する植物の頂端分裂組織における特異的領域の定義に関係する可能性があることが示唆されている（Jackson et al., Development 120:405-413, 1994）。そのような観察は、動物のホメオボックス遺伝子と同様に、植物のホメオボックス遺伝子が細胞の運命の決定に関係しうることを暗示している。
【００１６】
ホメオドメイン-ジッパー（HD-zip）は、さらなるホメオドメインタンパク質ファミリーを表す。これらのホメオドメイン-ジッパータンパク質（HD-zip）はいずれも、さらなるロイシンジッパー二量体形成モチーフに連結した特徴的なホメオドメインを保有する。このファミリーには、たとえば、Athb-1およびAthb-2（Sessa et al., EMBO J. 12:3507-3517, 1993）ならびにAthb-4（Carabelli et al., Plant J. 4:469-479, 1993）が挙げられる。
【００１７】
LIMドメインは、ホメオドメインなどの異なる機能のドメインに関連して、多様なタンパク質において見いだされる特殊なダブルジンクフィンガーモチーフである（ヒマワリの花粉特異的SF3転写因子：Baltz et al., Plant J. 2:713-721, 1992；または主にLIMドメインで構成される形成タンパク質：Dawid et al., Trends Genet. 14[4]: 156-162, 1998を参照されたい）。LIMドメインは、他のLIMドメインおよび多くの異なるタンパク質ドメインと特異的に相互作用する。LIMドメインは、タンパク質相互作用モジュールとして機能して、機能的複合体のメンバー間の特異的接触を媒介して、構成成分タンパク質のいくつかの活性を調整すると考えられている。LIMドメインによる核酸の結合は、構造を検討することにより示唆されているが、この可能性は未だ証明されていない。しかし、LIMドメインは、ショウジョウバエのペアード（PRD）およびグーズベリー（GSB）ホメオドメインタンパク質において最初に同定された保存された配列モチーフであるペアードボックスに関して提唱されているように、ホメオドメインと共に、発生制御遺伝子の調節領域に結合する可能性がある（Triesman et al., Genes Dev. 5:594-604, 1991）。PRDボックスはまた、ホメオドメインがなくともDNAに結合することができる。LIMドメインタンパク質は、核内、細胞質内に存在することができ、または細胞内区画を行き来することができる。動物系において、いくつかの重要なLIMタンパク質が細胞骨格に会合して、接着斑およびアクチン-マイクロフィラメント構築において役割を有することが示されている。核LIMタンパク質の中で、LIMホメオドメインタンパク質は、動物発生の際の細胞系列決定およびパターン形成において重要な機能を有する主要なサブファミリーを形成する。
【００１８】
AP2（APETALA2）およびEREBP（エチレン応答性エレメント結合タンパク質）は、その顕著な特徴が、それらがいわゆるAP2 DNA結合ドメインを含む点である、植物に対して独自の転写因子ファミリーの原型メンバーである。AP2/EREBP遺伝子は、大きいマルチジーンファミリーを形成して、それらは、花器官のアイデンティティの決定または葉上皮細胞アイデンティティの制御のような、いくつかの発生プロセスの重要な調節物質であることを始めとして、様々なタイプの生命および環境ストレスに応答するために植物によって用いられる機序の一部を形成することに至るまで、植物のライフサイクルを通して多様な役割を果たす。シロイヌナズナにおいて、ホメオティック遺伝子APETALA2（AP2）は、発生の際に3つの顕著なプロセスを制御することが示されている：（1）花器官アイデンティティの特異化および花器官形成の調節（Jofuku et al., Plant Cell 6: 1211-1225, 1994）；（2）花分裂組織アイデンティティの確立（Irish and Sussex, Plant Cell 2[8]:741-753, 1990）；ならびに（3）花ホメオティック遺伝子活性の時間的および空間的調節（Drews et al., Cell 65[6]:991-1002, 1991）。DNA配列分析は、AP2が、AP2ドメインと名付けられる別個のアミノ酸68個の反復モチーフを有するアミノ酸432個の理論上のポリペプチドをコードすることを示唆している。このドメインは、AP2機能にとって必須であることが示されており、アミノ酸68個の中に、両親媒性のαヘリックスを形成すると予測されるアミノ酸18個のコア領域を含む（Jofuku et al., Plant Cell 6: 1211-1225, 1994）。Ap2-様ドメイン含有転写因子はまた、エチレン応答性エレメント結合タンパク質（EREBP）の同定により（Ohme-Takagi and Shinshi, Plant Cell 7[2]: 173-182, 1995）、シロイヌナズナ（Okamuro et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7076-7081, 1997）およびタバコの双方において同定されている。アラビドプシスにおいて、これらのRAP2（AP2に関連する）遺伝子は、AP2様およびEREBP様と呼ばれるAP2ドメイン含有タンパク質の2つの別個のサブファミリーをコードする（Okamuro et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7076-7081, 1997）。インビトロDNA結合は、RAP2タンパク質を用いて今日まで示されていないが、AP2ドメイン内の2つの高度に保存されたモチーフYRGおよびRAYDの存在に基づいて、DNAの結合は、AP2タンパク質の結合と類似の様式で起こると提唱されている。
【００１９】
Cys2His2タイプのジンクフィンガードメインは、今日まで同定されている数千個の中で、真核細胞転写因子における最も豊富なDNA結合モチーフを表すように思われる（Berg and Shi, Science 271 [5252] : 1081-1085, 1996）。転写因子における亜鉛の構造上の役割は、転写因子IIIA（TFIIIA）に関して1983年に初めて提唱された（Hanas et al., J Biol. Chem. 258[23]: 14120-14125, 1983）。Cys2His2ジンクフィンガードメインは、C-x(2,4)-C-x(3)- [LIVMFYWC]-x(8)-H-x(3,5)-H（式中、xは可変のアミノ酸を表す）の配列のタンデムアレイを特徴とする。構造的に、ジンクフィンガーは、その後にαヘリックスが続く2つの逆平行β鎖からなる（Lee et al., Science 245 [4918] :635-637, 1989）。この構造の整列により、システインおよびヒスチジン側鎖は、金属配位ユニットに隣接して疎水性コアを形成する3つの他の保存された残基と亜鉛との配位結合を可能にする（Berg and Shi, Science 271 [5252]: 1081-1085, 1996）。Cys2His2ドメインを保有する多くのタンパク質が、DNAと配列特異的に相互作用することが示されている。特異的DNA標的に結合したマウス転写因子Zif268の結晶構造分析から、タンパク質／DNA複合体中のジンクフィンガーが二重ヘリックスの主溝に存在して、接触残基と呼ばれるアミノ酸側鎖を通してDNA塩基と相互作用することが示されている（Pavletich and Pabo, Science 252[5007]:809-817, 1991）。DNAに対するジンクフィンガードメインの方向は通常、同一であり、各々のドメインは、その大部分が1つの鎖に向けられる連続する3塩基対のサブサイトに接触する。いくつかのドメイン間相互作用があり、各々のジンクフィンガーによるDNA認識は、他のドメインに主として依存しないように思われる（Berg and Shi, Science 271 [5252] : 1081-1085, 1996）。
【００２０】
Gelinas et al.（Nature 313[6000]:323- 325, 1985）によって同定されたCCAATボックスエレメントは、転写開始部位から80 bpおよび300 bpのあいだに存在することが示されており、おそらく多数のボックス（Tasanen et al., J Biol. Chem. 267[16]: 11513-11519, 1992）または他の保存されたモチーフ（Muro et al., J. Biol. Chem. 267[18]: 12767-12774, 1992; Rieping and Schoffl, Mol. Gen. Genet. 231 [2]:226-232, 1992）との協調的相互作用により、いずれの方向でも作動しうる。CCAATボックス関連モチーフは、酵母（Hahn et al., Science 240[4850]:317-321, 1988）、ラット（Maity et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87[14]:5378-5382, 1990; Vuorio et al., J. Biol. Chem. 265[36]:22480-22486, 1990）；および植物（Rieping and Schoffl, Mol. Gen. Genet. 231 [2]:226-232, 1992; Kehoe et al, Plant Cell 6[8]: 1123-1134, 1994）を含む多様な生物における多数のプロモーターにおいて同定されている。酵母および脊椎動物の双方において、タンパク質複合体は、CCAATモチーフに結合することが示されている。酵母において、複合体は、HAP2、HAP3、およびHAP5として知られる3つのタンパク質からなる（Pinkham and Guarente, Mol. Cell. Biol. 5[12]:3410-3416, 1985）。
【００２１】
MADSボックス転写因子は、MADSボックスとして知られるDNAの保存された領域と相互作用する。MADSボックス転写因子は全て、異なる界の至るとことで同定されているMADSドメインとして知られる保存されたDNA結合／二量体形成領域を含む（Riechmann and Meyerowitz, Biol. Chem. 378[10]: 1079-1101, 1997）。植物から単離されたMADSボックス遺伝子の多くは、主に花分裂組織または花器官において発現され、花序および花分裂組織のアイデンティティを明白にするために、または花器官のアイデンティティを決定するために役割を果たすと考えられる。花分裂組織のアイデンティティおよび分裂組織発生パターンの原因となる1つのクラスの調節遺伝子には、シロイヌナズナの遺伝子APETALA1（AP1）、APETALA2（AP2）、CAULIFLOWER（CAL）、LEAFY（LFY）およびAGAMOUS（AG）が挙げられる。LFYおよびAP1はいずれも、推定の転写因子をコードすることが示されており（Weigel et al, Cell 69:843-859, 1992）、AP1およびAGは各々MADSボックスドメインファミリーの推定の転写因子をコードする（Yanofsky et al., Nature 346:35-39, 1990）。Lfy遺伝子の変異によって、花の花序シュートへの部分的変換が起こることが示されている。
【発明の概要】
【００２２】
簡単に説明すると、本発明は、転写因子をコードする植物から単離されたポリヌクレオチドと共に、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。自然での植物発生の際の組織および時間特異的遺伝子発現パターンが転写因子によって支配されることが示されていることから、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、植物における遺伝子発現の修飾において有用に用いられうる。このように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、植物表現型の操作において用いられうる。
【００２３】
第一の局面において、本発明は、以下の調節タンパク質ファミリーからの転写因子を含む転写因子をコードする、ユーカリおよびマツから単離されたポリヌクレオチドを提供する：bZIP；G-ボックス結合因子のbZIPファミリー；ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスジッパー（bHLH）；ホメオティック／ホメオドメイン／ホメオボックス／MADS；ホメオドメインジッパー（ZIP）；LIMドメイン；AP2およびEREB；Cys2His2タイプのジンクフィンガードメイン；CCAATボックスエレメント；ならびにMYB。特異的態様において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、（a）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421において列挙される配列；（b）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の相補体；（c）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の逆相補体；（d）SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の逆配列；ならびに（e）（a）〜（d）の配列に対して本明細書において定義される60％、75％、80％、90％、または95％同一性のいずれかを有する配列、からなる群より選択されるDNA配列を含む。
【００２４】
さらなる局面において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドが提供される。特異的態様において、そのようなポリペプチドは、（a）SEQ ID NO: 592-1182、1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422に提供される配列；ならびに（b）（a）の配列に対して本明細書において定義される60％、75％、80％、90％、または95％同一性のいずれかを有する配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
もう1つの局面において、本発明は、転写因子DNA結合ドメインを含むユーカリおよびマツから単離されたポリペプチドを提供する。特異的態様において、そのようなポリペプチドは、（a）SEQ ID NO: 2279-2293および2296-2368に提供される配列：ならびに（b）（a）の配列に対して本明細書において定義される60％、75％、80％、90％、または95％同一性のいずれかを有する配列からなる群より選択されるアミノ酸を含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを単独で、または本明細書において開示される1つもしくは複数の他のポリヌクレオチドと共に、または1つもしくは複数の公知のDNA配列と共に含む遺伝子構築物、ならびにそのような構築物を含む形質転換細胞を提供する。
【００２７】
特異的態様において、本発明の遺伝子構築物は、5'から3'方向に、遺伝子プロモーター配列：本発明のポリヌクレオチドまたはその変種によってコードされるポリペプチドの少なくとも1つの機能的部分をコードするオープンリーディングフレーム；および遺伝子終結配列を含む。オープンリーディングフレームは、センスまたはアンチセンス方向のいずれの方向であってもよい。遺伝子プロモーター配列および遺伝子終結配列と共に、本発明の転写因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非翻訳もしくは非コード領域、または非翻訳領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物もまた提供される。好ましくは、遺伝子プロモーターおよび終結配列は、宿主植物において機能的である。最も好ましくは、遺伝子プロモーターおよび終結配列は、本来の遺伝子の配列であるが、コザック配列またはオメガエンハンサーなどのエンハンサーの存在下または非存在下でのカリフラワーモザイクウイルス（CMV）プロモーター、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼターミネーターなどの当技術分野において一般的に用いられる他の配列が、本発明において有用に用いられうる。1つまたは複数の所望の組織へと発現を標的化するために、組織特異的プロモーターを使用してもよい。遺伝子構築物はさらに、形質転換細胞を同定するためのマーカーを含んでもよい。
【００２８】
なおさらなる局面において、本発明の遺伝子構築物を含むトランスジェニック細胞が、そのようなトランスジェニック細胞を含む植物などの生物と共に提供される。そのようなトランスジェニック植物の果実、種子、派生物、子孫、栄養体、および他の産物も同様に、本発明によって企図されて包含される。本明細書において用いられる「栄養体」という用語は、挿し木を含む有性または無性の生殖または繁殖において用いられうる植物の任意の部分を意味する。
【００２９】
なおもう1つの局面において、本発明の遺伝子構築物を生物のゲノムに安定に組み入れる段階を含む、標的生物における遺伝子発現を修飾する方法が提供される。好ましい態様において、標的生物は植物、好ましくは樹木植物であり、より好ましくは、ユーカリおよびマツ種からなる群より選択され、ならびに最も好ましくは、ユーカリ・グランディス（Eucalyptus grandis）およびラジアータパイン（Pinus radiata）からなる群より選択される。関連する局面において、本発明の遺伝子構築物によって植物細胞を形質転換してトランスジェニック細胞を提供する段階、ならびに再生および成熟植物の生育を行う条件でトランスジェニック細胞を培養する段階を含む、修飾された遺伝子発現を有する植物などの標的生物を産生する方法が提供される。
【００３０】
本発明はさらに、本発明の遺伝子構築物を植物のゲノムに安定に組み入れる段階を含む、植物などの標的生物における転写因子の活性を修飾する方法を提供する。好ましい態様において、標的植物は樹木植物であり、好ましくはユーカリおよびマツ種からなる群より選択され、ならびに最も好ましくは、ユーカリ・グランディスおよびラジアータパインからなる群より選択される。
【００３１】
本発明の上記のおよびさらなる特色ならびにそれらを得る様式は、以下のより詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるであろう。本明細書において開示される全ての参考文献は、各々が個別に組み入れられるように、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】植物を形質転換するために用いられるバイナリベクターであり、SEQ ID: 2373に対応する、得られたプラスミドpWVK249のマップを描写する。
【図２】対照およびpWVK249形質転換ハコヤナギの木材の基礎比重のグラフを描写する。水平線は、各組の平均値を示す。対照とpWVK249株の差は、5％水準で有意であった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、植物転写因子をコードする単離ポリヌクレオチドと共に、そのようなポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを提供する。先に考察したように、転写因子は、細胞の「転写装置」の成分であり、遺伝子発現の調節に関係している。転写因子は、植物の生長および発生において、ならびに環境要因および疾患病原体などの外部刺激に対する細胞応答において極めて重要な役割を果たすことが知られている。細胞転写プロセスに関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドによる植物の形質転換は、このように、リグニン沈着、花の発達、ならびに雄性および雌性不稔性などの特性を修飾するために使用されうる。二次木部または木質における導管または繊維細胞の形成を調節する転写因子を用いて、木質の特徴を変化させることができる。転写因子がリグニン生合成に関係する遺伝子をアップレギュレートする場合、転写因子の過剰発現は、木質のリグニン量を増加させることができるが、転写因子を抑制またはノックダウンすると、木質のリグニン量を減少させることができる。ある転写因子は、リグニン形成に関係する遺伝子の発現を阻害するが、これらの調節タンパク質の1つを過剰発現させれば、リグニンの低減が起こるであろう。キンギョソウのAmMYB308を過剰発現させると、トランスジェニックタバコにおいてリグニンの低減が起こった（Tamagnone et al., Plant Cell 10: 135-154, 1998）。高いリグニンを有する木材は、燃やすまたは炭に変換させる燃料としておそらく有用であるが、低いリグニンを有する木材は、パルプ化またはエタノールへの変換にとって有用である。細胞壁生合成に関係する完全な組の遺伝子をアップレギュレートする転写因子を用いて、細胞壁の厚さおよび木材の密度を変化させることができる。転写因子の過剰発現は、細胞壁生合成遺伝子のより多くの産生または持続的な産生を引き起こすことができ、それによってより厚い細胞壁、およびより密度が高くてより強い木が得られる。Goicoecheaおよび共同研究者は、ユーカリのMYB遺伝子をタバコにおいて過剰発現させると、より厚い細胞壁および変化したリグニン組成が得られることを示した（Plant J. 43: 553-567, 2005）。
【００３４】
本発明の方法および材料を用いて、特異的転写因子の量は、植物などの標的生物のゲノムに、転写因子をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片のさらなるコピーを組み入れることによって、増加または低減されうる。同様に、転写因子の量の増加または減少は、そのような遺伝子のアンチセンスコピーによって標的植物を形質転換することによって得られうる。
【００３５】
1つの態様において、本発明は、遺伝子発現の調節に関係する植物転写因子をコードするまたは部分的にコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、林業植物起源、すなわちユーカリ・グランディスおよびラジアータパインから単離されたが、それらはまた従来の合成技術を用いて合成されうる。特異的態様において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列；SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の相補体；SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の逆相補体；SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定される配列の逆配列；上記で言及した任意のポリヌクレオチドの少なくとも明記された数の連続残基を含む配列（x量体）；上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応する伸長配列；上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応するアンチセンス配列；ならびにその用語が本明細書において記述される上記の任意のポリヌクレオチドの変種からなる群より選択される配列を含む。
【００３６】
もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを提供する。ある特異的態様において、そのような単離ポリペプチドは、SEQ ID NO: 592-1182、1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422からなる群より選択される配列を含む。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、以下の表1に示されるように植物の転写および／または発現の調節に関係することが知られている形質転換因子に対して類似性を有することを証明している。
【００３８】
（表１）
2013531971.tif 000003
2013531971.tif 000004
2013531971.tif 000005
【００３９】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、いずれもセンスまたはアンチセンス鎖である、DNAならびにHnRNAおよびmRNA分子を含む対応するRNA分子を含み、cDNA、ゲノムDNAおよび組み換え型DNAのみならず、全合成または部分合成ポリヌクレオチドを包含する。HnRNA分子は、イントロンを含み、一般的に1対1でDNA分子に対応する。mRNA分子は、イントロンが切除されているHnRNAおよびDNA分子に対応する。ポリヌクレオチドは、全遺伝子またはその任意の部分からなりうる。機能的なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドの断片を含みえて、それゆえ「ポリヌクレオチド」という定義は、そのような全ての操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを伴う技術は、当技術分野において周知であり、たとえばRobinson-Benion et al., "Antisense techniques," Methods in Enzymol. 254[23]: 363-375, 1995；およびKawasaki et al., Artific. Organs 20[8]:836-848, 1996において記述されている。
【００４０】
本明細書において用いられる「相補体」、「逆相補体」および「逆配列」という用語の定義は、以下の例によって最もよく説明される。配列5' AGGACC 3'の場合、相補体、逆相補体、および逆配列は以下のとおりである：
相補体    3' TCCTGG 5'
逆相補体  3' GGTCCT 5'
逆配列    5' CCAGGA 3'
【００４１】
好ましくは、具体的に列挙されたポリヌクレオチド配列の相補体である配列は、特異的ポリヌクレオチド配列の長さ全体にわたって相補的である。本明細書において用いられる「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される完全長のタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物であってもよく、または組み換え技術を用いて部分的もしくは完全に産生されうる。本明細書において用いられる「ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド」という用語は、本発明の部分的に単離されたDNA配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。
【００４２】
本明細書において記述されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは全て、それらの用語が当技術分野において一般的に用いられるとおりである単離および精製される。好ましくは、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも約80％純粋であり、より好ましくは少なくとも約90％純粋であり、および最も好ましくは少なくとも約99％純粋である。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、それらが完全長のポリペプチドをコードする完全長の遺伝子を表さないという点において、「部分」配列である。そのような部分配列は、プライマーおよび／またはプローブならびに周知のハイブリダイゼーションおよび／またはPCR技術を用いて、様々なDNAライブラリを分析およびシークエンシングすることによって伸長されうる。ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、完全長のポリヌクレオチド、および／またはポリペプチドを発現することができる遺伝子、またはゲノムのもう1つの有用な部分が同定されるまで、部分配列を伸長させてもよい。完全長のポリヌクレオチドおよび遺伝子を含むそのような伸長した配列は、伸長ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の1つまたはその変種の同定された配列もしくはその変種、もしくは同定された連続部分（x量体）を含む場合、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の1つ、もしくはその変種として同定される配列、またはSEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421の配列の1つ、もしくはその変種の一部に「対応する」として記述される。そのような伸長ポリヌクレオチドは、長さ約50個から約4,000個の核酸または塩基対を有してもよく、および好ましくは長さ約4,000個未満の核酸または塩基対を有してもよく、より好ましくはなおも長さ約3,000個未満の核酸または塩基対を有してもよく、より好ましくはなおも長さ約2,000個未満の核酸または塩基対を有してもよい。何らかの状況において、本発明の伸長ポリヌクレオチドは、長さ約1,800個未満の核酸または塩基対、好ましくは約1,600個未満の核酸または塩基対、より好ましくは約1,400個未満の核酸または塩基対、より好ましくはなおも約1,200個未満の核酸または塩基対、および最も好ましくは約1,000個未満の核酸または塩基対を有しうる。
【００４４】
同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するRNA配列、逆配列、相補的配列、アンチセンス配列およびその他は、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるcDNA配列を用いてルーチンにより確認されおよび得られうる。
【００４５】
SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ORF」）または部分的オープンリーディングフレームを含みうる。オープンリーディングフレームは、当技術分野において周知の技術を用いて同定されうる。これらの技術には、たとえば、公知の開始および終止コドンの位置の分析、コドン頻度に基づく最も可能性が高い読み取り枠の同定等が挙げられる。ORF分析のための適したツールおよびソフトウェアには、たとえば、The Sanger Center, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SA, United Kingdomから入手可能なGeneWise；Computational Biology Centers, University of Minnesota, Academic Health Center, UMHG Box 43 Minneapolis MN 55455から入手可能なDiogenes；およびthe Informatics Group, Oak Ridge National Laboratories, Oak Ridge, Tennessee TNから入手可能なGRAILが挙げられる。オープンリーディングフレームおよびオープンリーディングフレームの一部は、本発明のポリヌクレオチドにおいて同定されうる。部分的オープンリーディングフレームが同定されれば、完全なオープンリーディングフレームのポリヌクレオチドが同定されるまで、当技術分野において周知である技術を用いて、ポリヌクレオチドを部分的オープンリーディングフレームの領域に伸長させてもよい。このように、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、本発明のポリヌクレオチドを用いて同定されうる。
【００４６】
オープンリーディングフレームが発明のポリヌクレオチドにおいて同定されると、オープンリーディングフレームを単離および／または合成してもよい。当技術分野において周知であるオープンリーディングフレームおよび適したプロモーター、イニシエーター、ターミネーター等を含む発現可能な遺伝子構築物を構築してもよい。そのような遺伝子構築物を、オープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドを発現させるために宿主細胞に導入してもよい。適した宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、藻類およびその他を含む様々な原核細胞および真核細胞を含みうる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現させて、その生物活性を決定するために様々なアッセイにおいて用いてもよい。対応する相互作用タンパク質または他の化合物を単離するために、および相互作用タンパク質または他の化合物のレベルを定量的に決定するために、そのようなポリペプチドを用いて抗体を作製してもよい。
【００４８】
本明細書において用いられる「変種」という用語は、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されている、特異的に同定された配列とは異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を包含する。変種は、天然に存在する対立遺伝子変種または天然に存在しない変種でありうる。変種配列（ポリヌクレオチド、またはポリペプチド）は、本発明の配列に対して好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも95％の同一性を示す。％同一性は、以下に記述されるように、比較させる2つの配列を整列させる段階、整列させた部分における同一の残基の数を決定する段階、その数を本発明の（問い合わせ）配列における残基の総数によって除する段階、およびその結果に100を乗じる段階によって決定される。例証目的に限られるが、220ヌクレオチドを有する本発明のポリヌクレオチドが、上記のパラメータを用いてBLASTNアルゴリズムによって得られたアラインメントにおける一続きの23ヌクレオチドに対して、520個のヌクレオチドを有するEMBLデータベース中の1つのポリヌクレオチド配列に対してヒットを有すると仮定する。23ヌクレオチドの領域は、21個の同一のヌクレオチド、1つのギャップ、および1つの異なるヌクレオチドを含む。この場合、EMBLライブラリにおけるそのヒットに対する本発明のポリヌクレオチドの％同一性は、21/220×100または9.5％である。EMBLデータベースにおけるポリヌクレオチド配列は、このように本発明のポリヌクレオチドの変種ではない。
【００４９】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を整列させてもよく、明記された領域における同一の残基の百分率を、公共に入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いてもう1つのヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して決定してもよい。ポリヌクレオチド配列を整列させてその類似性を同定するための2つの例示的なアルゴリズムは、BLASTNおよびFASTAアルゴリズムである。ポリヌクレオチドはまた、タンパク質配列データベースに対してヌクレオチド問い合わせ配列（両方の鎖）の6フレームの概念的翻訳産物を比較するBLASTXアルゴリズムを用いて分析してもよい。ポリペプチド配列の類似性を、BLASTPアルゴリズムを用いて調べてもよい。BLASTN、BLASTX、およびBLASTPプログラムは、NCBIアノニマスFTPサーバーにおいて、およびNational Center for Biotechnology Information (NCBI) National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894, USAから入手可能である。アルゴリズムの説明書に記述されて、アルゴリズムと共に配布されるデフォルトパラメータに設定したBLASTNアルゴリズム、バージョン2.0.4 [1998年2月24日]およびバージョン2.0.6 [1998年9月16日]は、本発明に従うポリヌクレオチド変種の決定において用いるために好ましい。BLASTPアルゴリズムは、本発明に従うポリペプチド変種の決定において用いるために好ましい。BLASTN、BLASTP、およびBLASTXを含むBLASTファミリーのアルゴリズムを用いることは、NCBIのインターネットウェブサイトにおいて記述され、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997の刊行物において記述されている。
【００５０】
コンピューターアルゴリズムFASTAは、インターネット上で、およびDavid Hudson, Assistant Provost for Research, University of Virginia, PO Box 9025, Charlottesville, VAに連絡することによってUniversity of Virginiaから入手可能である。アルゴリズムの説明書に記述され、アルゴリズムと共に配布されるデフォルトパラメータに設定したバージョン2.0u4 [1996年2月]を、本発明に従う変種の決定に用いてもよい。FASTAアルゴリズムを用いることは、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988；およびPearson, Methods in Enzymol. 183:63-98, 1990において記述されている。
【００５１】
ポリヌクレオチド配列のE値およびパーセント同一性に寄与する以下の実行パラメータは、BLASTNを用いるアラインメントおよび類似性の決定にとって好ましい：Unix実行命令：blastall -p blastn -d embldb -e 10 -GO -E0 -r 1 -v 30 -b 30 -i queryseq -o results；パラメータは：-p プログラム名[String]；-dデータベース[String]；-e期待値（E）[Real]；-Gギャップを開始させるためのコスト（ゼロは、デフォルト行動を呼び出す）[Integer]；-Eギャップを伸長させるためのコスト（ゼロはデフォルト行動を呼び出す）[Integer]；-rヌクレオチドマッチに関する報酬（blastnのみ）[Integer]；-v one-line descriptionの数（V）[Integer]；-b （B）を示すためのアラインメントの数[Integer]；-i 問い合わせファイル[File In]；および-o BLAST報告出力ファイル[File Out]オプショナルである。
【００５２】
ポリペプチド配列のE値およびパーセント同一性に寄与する以下の実行パラメータは、BLASTPを用いるアラインメントおよび類似性の決定にとって好ましい：blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 0 -E 0 -v 30 -b 30 -i queryseq -o results；パラメータは：-pプログラム名[String]；-dデータベース[String]；-e期待値（E）[Real]；-Gギャップを開始させるためのコスト（ゼロはデフォルト行動を呼び出す）[Integer]；-Eギャップを伸長させるためのコスト（ゼロはデフォルト行動を呼び出す）[Integer]；-v one-line descriptionの数（v）[Integer]；-b（b）を示すためのアラインメントの数[Integer]；-I問い合わせファイル[File In]；-o BLAST報告出力ファイル[File Out]オプショナルである。
【００５３】
BLASTN、FASTA、BLASTPまたは類似のアルゴリズムによって生じた問い合わせ配列による1つまたは複数のデータベース配列に対する「ヒット」は、配列の類似の部分を整列させて同定する。ヒットを、類似性の程度および配列のオーバーラップの長さの順に整列させる。データベース配列に対するヒットは一般的に、問い合わせ配列の配列の長さの一分画のみに対するオーバーラップを表す。
【００５４】
BLASTN、FASTA、およびBLASTPアルゴリズムはまた、アラインメントに関する「期待」値を生じる。期待値（E）は、ある大きさのデータベースを検索する場合に偶然に、ある数の連続配列を見ると「期待」することができるヒットの数を示す。期待値は、好ましいEMBLデータベースなどのデータベースに対するヒットが真の類似性を示すか否かを決定するための有意性の閾値として用いられる。たとえば、ポリヌクレオチドのヒットに割付されるE値0.1は、EMBLデータベースのサイズのデータベースにおいて、類似のスコアを有する配列の整列させた部分に対して単なる偶然に0.1のマッチを見ると期待することを意味すると解釈される。この規準により、整列させてマッチさせたポリヌクレオチド配列の部分は、同じである確率90％を有する。整列させてマッチさせた部分に対して0.01またはそれ未満のE値を有する配列に関して、EMBLデータベースにおいて偶然にマッチを発見する確率は、BLASTNまたはFASTAアルゴリズムを用いて1％またはそれ未満である。
【００５５】
1つの態様に従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの各々に関する「変種」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの各々と同数であるか、またはそれより少ない核酸またはアミノ酸を有し、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較した場合に0.01またはそれ未満のE値を生じる配列を含む。すなわち、変種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、先に記述したパラメータに設定されたBLASTN、FASTA、またはBLASTPアルゴリズムを用いて0.01またはそれ未満のE値を有すると測定される、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じである確率少なくとも99％を有する任意の配列である。
【００５６】
または、本発明の変種ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421において列挙されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの配列の相補体、逆配列、もしくは逆相補体と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする。本明細書において用いられる「ストリンジェントな条件」は、6×SSC、0.2％SDS溶液中での前洗浄；65℃、6×SSC、0.2％SDSでの終夜ハイブリダイゼーション；その後1×SSC、0.1％SDS中で65℃で各30分間の2回の洗浄後、0.2×SSC、0.1％SDS中で65℃で各30分間の2回の洗浄を指す。
【００５７】
本発明はまた、開示の配列とは異なるが、遺伝コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同じであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。このように、保存的置換の結果として、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421において列挙されるポリヌクレオチド配列、またはその相補体、逆配列、もしくは逆相補体とは異なる配列を含むポリヌクレオチドが本発明によって企図され、本発明に包含される。加えて、配列の全長の全体で10％未満の欠失および／または挿入の結果として、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421において列挙されるポリヌクレオチド配列、またはその相補体、逆相補体、もしくは逆配列とは異なる配列を含むポリヌクレオチドも同様に、本発明によって企図され、本発明に包含される。同様に、配列の全長の全体で10％未満のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失の結果として、SEQ ID NO: 592-1182、1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422において列挙されるポリペプチド配列とは異なる配列を含むポリペプチドも、本発明によって企図され、本発明に包含される。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して明記されたパーセント同一性を有することに加えて、変種ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共通してさらなる構造および／または機能的特色を有する。本発明のポリペプチドに対して明記された同一性の程度を有するポリペプチドは、その一次構造において高い程度の類似性を共有し、実質的に類似の機能特性を有する。本発明のポリヌクレオチドに対してその一次構造において高い程度の類似性を共有することに加えて、本発明のポリヌクレオチドに対して明記された同一性の程度を有する、またはハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、好ましくは以下の特色の少なくとも1つを有する：（i）それらは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能的特性を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームもしくは部分的オープンリーディングフレームを含む；または（ii）それらは共通の同定可能なドメインを含む。このように、好ましい態様において、本発明のポリペプチドの変種は、本発明のポリペプチドの生物活性と同じ、または類似である生物活性を保有する。そのような変種ポリペプチドは、転写因子として機能して、このように植物において遺伝子発現を修飾することができる。同様に、変種ポリヌクレオチドは、転写因子として機能するポリペプチドをコードしうる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドはまた、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド、そのような配列の相補体、逆配列、および逆相補体、ならびにそれらの変種のいずれかの少なくとも明記された数の連続残基（x量体）を含むポリヌクレオチドも包含する。同様に、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: 592-1182、1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422、ならびにその変種として同定されたポリペプチドのいずれかの少なくとも明記された数の連続残基（x量体）を含むポリペプチドを包含する。本明細書において用いられる、明記された値「x」に関する「x量体」という用語は、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド、またはSEQ ID NO: 592-1182、1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、および2422として同定されるポリペプチドのいずれかの少なくとも明記された数（「x」）の連続残基を含む配列を指す。好ましい態様に従って、xの値は、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも40、より好ましくはなお少なくとも60、および最も好ましくは少なくとも80である。このように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、SEQ ID NO: 1-2372、2374、2375、2377、2378、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、および 2422として同定されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびその変種の20量体、40量体、60量体、80量体、100量体、120量体、150量体、180量体、220量体、250量体、300量体、400量体、500量体、または600量体を含む。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、以下の実施例1および2に記述されるように、ユーカリ・グランディスおよびラジアータパインから調製されたcDNAライブラリのハイスループットシークエンシングによって単離されうる。または、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421に提供される配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを、以下に詳述されるように調製して、ハイブリダイゼーションまたはPCR技術によってユーカリ・グランディスおよびラジアータパインからのcDNAまたはゲノムDNAライブラリのいずれかにおける陽性クローンを同定するために用いてもよい。プローブは、本明細書において提供される配列より短くてもよいが、長さが少なくとも約10、好ましくは少なくとも15、および最も好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであるべきである。そのようなオリゴヌクレオチドについて用いるために適したハイブリダイゼーションおよびPCR技術は、当技術分野において周知であり、Sambrookら、同書によって教示される技術を含む。陽性クローンを、制限酵素消化、DNAシークエンシングまたはその他によって分析してもよい。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、または、当技術分野において周知である技術を用いて合成してもよい。ポリヌクレオチドは、たとえば、50個までまたはそれより多くの核酸のポリヌクレオチドセグメントを得るために、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザー（たとえば、Beckman Oligo 1000M DNAシンセサイザー）を用いて合成してもよい。次に、複数のそのようなポリヌクレオチドセグメントを、分子生物学の技術分野において周知である標準的なDNA操作技術を用いてライゲートしてもよい。1つの従来のおよび例示的なポリヌクレオチド合成技術は、たとえば核酸80個を有する一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを合成する段階、および5ヌクレオチドのオーバーハングを産生するために、合成された相補的な核酸85個のセグメントにそのセグメントをハイブリダイズする段階を伴う。反対鎖上に5ヌクレオチドのオーバーハングが得られるように、次のセグメントを類似のように合成してもよい。2つの部分をハイブリダイズする場合、「付着」末端は適切なライゲーションを確保する。このようにして、本発明の完全なポリヌクレオチドをもっぱらインビトロで合成してもよい。
【００６２】
ある態様において、本発明の遺伝子構築物は、本発明のポリペプチドまたはその変種の少なくとも機能的部分をコードするオープンリーディングフレームを含む。本明細書において用いられるポリペプチドの「機能的部分」は、遺伝子発現を調節するために必須である活性部位を含むその部分、すなわち、発現させる遺伝子のプロモーターに結合することができる、または相互作用することができる分子のその部分である。本発明のあるポリペプチドのDNA結合ドメインを以下の表2に同定する。これらのDNA結合ドメインは、PROSITE 15.0パターンまたはPROSITEデータベースに記載されるプロファイル配列を用いて同定された。PROSITEは、インターネット上で入手可能であり、その使用は、Hofman et al., Nucleic Acids Res. 27:215-219, 1999；およびBairoch, Nucleic Acids Res. 20:Suppl.2013-2018, 1992において記述されている。
【００６３】
（表２）
2013531971.tif 000006
2013531971.tif 000007
【００６４】
ポリペプチドの機能的部分はまた、当技術分野において周知のプロトコールによる標的化変異誘発および修飾タンパク質産物のスクリーニングによって決定されうる（Solano et al., J Biol. Chem. 272:2889-95, 1997）。活性部位は一般的に、高い基質特異性を示すであろう。本発明のポリペプチドの一部は、合成または組み換え手段によって生成されうる。アミノ酸約100個未満を有する、および一般的にアミノ酸約50個未満を有する合成ポリペプチドが、当業者に周知の技術を用いて生成されうる。たとえば、そのようなポリペプチドは、生長しつつあるアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に付加されるMerrifield固相合成法などの市販の固相合成技術のいずれかを用いて合成されうる。Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963を参照されたい。ポリペプチドの自動合成のための設備は、Perkin Elmer/Applied BioSystems, Inc.（Foster City, CA）などの供給元から販売されており、製造元の説明書に従って操作されうる。
【００６５】
オープンリーディングフレームは、遺伝子構築物による標的植物の形質転換が野生型植物と比較してポリペプチドの量の変化を引き起こすように、遺伝子構築物においてセンスまたはアンチセンス方向に挿入されうる。センス方向のオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物による形質転換によって、一般的に選択された遺伝子の過剰発現が起こるが、アンチセンス方向のオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物による形質転換によって一般的に、選択された遺伝子の発現の低減が起こるであろう。センスまたはアンチセンス方向のいずれかの本発明のオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物によって形質転換された植物集団を、当業者に周知の技術を用いて当該遺伝子の発現の増加または低減に関してスクリーニングしてもよく、このようにして所望の表現型を有する植物を単離してもよい。
【００６６】
または、植物転写因子をコードする遺伝子の発現は、遺伝子構築物においてセンスまたはアンチセンス方向に本発明のオープンリーディングフレームの一部を挿入することによって阻害されうる。そのような部分は、完全長である必要はないが、本発明のDNA配列の少なくとも25、より好ましくは少なくとも50個の残基を含む。完全なオープンリーディングフレームに対応するより長い部分または完全長のDNAさえ使用してもよい。オープンリーディングフレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達成するために十分な配列類似性が存在する限り、内因性の配列と正確に同じである必要はない。このように、1つの種に由来する配列は、異なる種における遺伝子の発現を阻害するために用いられうる。センスまたはアンチセンス方向のいずれかに本発明のオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物によって形質転換された植物集団を、当業者に周知の技術を用いて当該遺伝子の発現の増加または低減に関してスクリーニングしてもよく、このようにして、所望の表現型を有する植物が単離されうる。
【００６７】
もう1つの態様において、本発明の遺伝子構築物は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の非翻訳もしくは非コード領域を含むDNA配列、またはそのような非翻訳領域に対して相補的なDNA配列を含む。そのような構築物において有用に使用されうる非翻訳領域の例には、イントロンおよび5'-非翻訳リーダー配列が挙げられる。そのような遺伝子構築物による標的植物の形質転換によって、たとえばNapoli et al. (Plant Cell 2:279-290, 1990)、およびde Carvalho Niebel et al. (Plant Cell 7:347-358, 1995)が考察した様式と類似の様式で、共抑制プロセスにより植物において発現されるポリペプチドの量の低減が起こる可能性がある。
【００６８】
または、ポリペプチド発現の調節は、リボザイム構築物に適切な配列または小配列（たとえば、DNAまたはRNA）を挿入することによって達成することができる（McIntyre and Manners, Transgenic Res. 5[4]:257-262, 1996）。リボザイムは、各々が本発明のポリヌクレオチドの1つによってコードされるmRNA分子において少なくとも5連続ヌクレオチドを含む、2つの領域に対して相補的なハイブリダイズ領域を含む合成RNA分子である。リボザイムは、自触反応によってmRNAを切断する非常に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を保有する。
【００６９】
本発明の遺伝子構築物はさらに、遺伝子の発現を制御する、転写されるDNA配列に機能的に連結した遺伝子プロモーター配列および遺伝子終結配列を含む。遺伝子プロモーター配列は一般的に、転写されるDNA配列の5'末端に位置し、DNA配列の転写を開始するために用いられる。遺伝子プロモーター配列は一般的に、遺伝子の5'非翻訳領域において見いだされるが、それらはオープンリーディングフレームの下流の、イントロン（Luehrsen, Mol. Gen. Genet. 225:81-93, 1991）において、またはたとえば植物防御遺伝子（Douglas et al., EMBO J. 10: 1767-1775, 1991）のようにコード領域に存在しうる。構築物が、センス方向にオープンリーディングフレームを含む場合、遺伝子プロモーター配列はまた、オープンリーディングフレームの翻訳を開始する。アンチセンス方向または非翻訳領域にオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物の場合、遺伝子プロモーター配列はRNAポリメラーゼ結合部位を有する転写開始部位のみからなりうる。
【００７０】
本発明の遺伝子構築物において有用に用いられうる多様な遺伝子プロモーター配列が当技術分野において周知である。遺伝子プロモーター配列、および同様に遺伝子終結配列は標的植物宿主に対して内因性であってもよく、または標的宿主においてプロモーターが機能的である限り、外因性であってもよい。たとえば、プロモーターおよび終結配列は、他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミドおよびその他に由来してもよい。好ましくは、遺伝子プロモーターおよび終結配列は、本発明の配列そのものに由来する。
【００７１】
プロモーターの選択に影響を及ぼす要因は、構築物の所望の組織特異性、ならびに転写および翻訳の時期を含む。たとえば、35Sカリフラワーモザイクウイルス（CaMV 35S）プロモーターなどの構成的プロモーターは、植物の全ての部分における酵素の活性に影響を及ぼすであろう。組織特異的プロモーターを用いることによって、関心対象組織に限って所望のセンスまたはアンチセンスRNAの産生が起こるであろう。誘導型遺伝子プロモーター配列を使用する遺伝子構築物の場合、RNAポリメラーゼ結合および開始の速度を、光、熱、嫌気性ストレス、栄養条件の変化およびその他などの外部刺激によって調整することができる。時間的に調節されるプロモーターは、形質転換細胞の発生の際の特異的時間でRNAポリメラーゼの結合および開始速度の調整を行うために用いることができる。好ましくは、当該酵素遺伝子からの本来のプロモーター、またはユーカリもしくはマツなどの形質転換される生物における特異的組織標的化遺伝子からのプロモーターが用いられる。本発明において有用に使用されうる遺伝子プロモーターの他の例には、マンノピンシンターゼ（mas）、オクトピンシンターゼ（ocs）、およびChua et al. (Science 244: 174-181, 1989)によって論評されるプロモーターが挙げられる。
【００７２】
転写されるDNA配列の3'に位置する遺伝子終結配列は、遺伝子プロモーター配列と同じ遺伝子に由来してもよく、または異なる遺伝子に由来してもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端などの当技術分野において公知の多くの遺伝子終結配列が本発明において有用に用いられうる。しかし、好ましい遺伝子ターミネーター配列は、本来の遺伝子に由来する配列または形質転換される標的種に由来する配列である。
【００７３】
本発明の遺伝子構築物はまた、本発明の構築物を含む形質転換細胞の検出を可能にするために、植物などの標的生物の細胞において有効である選択マーカーを含みうる。そのようなマーカーは、当技術分野において周知であり、典型的に1つまたは複数の毒素に対する抵抗性を付与する。そのようなマーカーの1つの例は、その発現によって、通常、中等度の濃度で植物細胞に対して毒性であるカナマイシンまたはヒグロマイシン抗生物質に対する抵抗性が得られるNPTII遺伝子である（Rogers et al., in Weissbach, A and Weissbach H, eds., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press Inc.: San Diego, CA, 1988）。形質転換細胞をこのようにして、当該抗生物質を含む培地での生育能によって同定することができる。または、形質転換細胞における所望の構築物の存在を、サザンおよびウェスタンブロットなどの当技術分野において周知の他の技術によって決定することができる。
【００７４】
転写開始部位は、転写される配列がそのような部位を欠損する場合に、さらに遺伝子構築物に含められる。
【００７５】
本発明の遺伝子構築物の成分を機能的に連結させる技術は当技術分野において周知であり、たとえばSambrook et al., (Molecular cloning: a laboratory manual, CSHL Press: Cold Spring Harbor, NY, 1989)によって記述される1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いることを含む。本発明の遺伝子構築物を、少なくとも1つの複製システムを有するベクター、たとえば大腸菌（E. coli）に連結してもよく、それによって各操作後、得られた構築物をクローニングおよびシークエンシングして、操作の正確性を決定することができる。
【００７６】
本発明の遺伝子構築物は、植物を含むがこれらに限定されない多様な標的生物を形質転換するために用いられうる。本発明の構築物を用いて形質転換されうる植物には、単子葉被子植物（たとえば、イネ科植物、トウモロコシ、穀草、オートムギ、コムギ、およびオオムギ）、および双子葉被子植物（たとえば、アラビドプシス、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）、および裸子植物（たとえば、ヨーロッパアカマツ；Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996）；ホワイトスプルース（Ellis et al., Biotechnology 11 :84-89, 1993）；およびカラマツ（Huang et al., In Vitro Cell 27:201-207, 1991）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の遺伝子構築物は、その幹が何年ものあいだ生存して、木質組織を加えることによって毎年直径が増加する高木または低木として本明細書において定義される樹木植物を形質転換するために使用される。好ましくは、標的植物は、ユーカリおよびマツ種からなる群より選択され、最も好ましくはユーカリ・グランディスおよびラジアータパインからなる群より選択される。本発明の遺伝子構築物によって有用に形質転換されうる他の種には：パイヌス・バンクシアナ（Pinus banksiana）、パイヌス・ブルチア（Pinus brutia）、パイヌス・カリバエ（Pinus caribaea）、パイヌス・クラウサ（Pinus clausa）、パイヌス・コントルタ（Pinus contorta）、パイヌス・コウルテリ（Pinus coulteri）、パイヌス・エチナタ（Pinus echinata）、パイヌス・エルダリカ（Pinus eldarica）、パイヌス・エリオチ（Pinus ellioti）、パイヌス・ジェフレイ（Pinus jeffreyi）、パイヌス・ラムベルチアナ（Pinus lambertiana）、パイヌス・モンチコラ（Pinus monticola）、パイヌス・ニグラ（Pinus nigra）、パイヌス・パルストルス（Pinus palustrus）、パイヌス・ピナステル（Pinus pinaster）、パイヌス・ポンデローサ（Pinus ponderosa）、パイヌス・レシノサ（Pinus resinosa）、パイヌス・リギダ（Pinus rigida）、パイヌス・セロチナ（Pinus serotina）、ストローブマツ（Pinus strobus）、パイヌス・シルベストリス（Pinus sylvestris）、テーダマツ（Pinus taeda）、パイヌス・ビルギニアナ（Pinus virginiana）などのマツ；アビエス・アマビリス（Abies amabilis）、アビエス・バルサメア（Abies balsamea）、アビエス・コンコロル（Abies concolor）、アビエス・グランディス（Abies grandis）、アビエス・ラシオカルパ（Abies lasiocarpa）、アビエス・マグニフィカ（Abies magnifica）、アビエス・プロセラ（Abies procera）、カメシパリス・ラウソニオナ（Chamaecyparis lawsoniona）、カメシパリス・ノートカテンシス（Chamaecyparis nootkatensis）、カメシパリス・シオイデス（Chamaecyparis thyoides）、エンピツビャクシン（Huniperus virginiana）、ラリキス・デシデュア（Larix decidua）、ラリキス・ラリシナ（Larix laricina）、ラリキス・レプトレピス（Larix leptolepis）、ラリキス・オクシデンタリス（Larix occidentalis）、ラリキス・シベリカ（Larix siberica）、リボセドラス・デクレンス（Libocedrus decurrens）、オウシュウトウヒ（Picea abies）、エンゲルマントウヒ（Picea engelmanni）、カナダトウヒ（Picea glauca）、マリアナトウヒ（Picea mariana）、コロラドトウヒ（Picea pungens）、ピセア・ルベンス（Picea rubens）、シトカトウヒ（Picea sitchensis）、シュードツガ・メンジエシ（Pseudotsuga menziesii）、セコイア・ギガンテア（Sequoia gigantea）、���コイア・センペルビレンス（Sequoia sempervirens）、タキソジウム・ジスチクム（Taxodium distichum）、カナダツガ（Tsuga canadensis）、アメリカツガ（Tsuga heterophylla）、ツガ・メルテンシアナ（Tsuga mertensiana）、ニオイヒバ（Thuja occidentalis）、ツジャ・プリカタ（Thuja plicata）などの他の裸子植物；ならびにユーカリプタス・アルバ（Eucalyptus alba）、ユーカリプタス・バンクロフチ（Eucalyptus bancroftii）、ユーカリプタス・ボチロイデス（Eucalyptus botyroides）、ユーカリプタス・ブリッジシアナ（Eucalyptus bridgesiana）、ユーカリプタス・カロフィラ（Eucalyptus calophylla）、ユーカリプタス・カマルデュレンシス（Eucalyptus camaldulensis）、ユーカリプタス・シトリオドラ（Eucalyptus citriodora）、ユーカリプタス・クラドカリクス（Eucalyptus cladocalyx）、ユーカリプタス・コキフェラ（Eucalyptus coccifera）、ユーカリプタス・クルチシ（Eucalyptus curtisii）、ユーカリプタス・ダルリンプレアナ（Eucalyptus dalrympleana）、ユーカリプタス・デグルプタ（Eucalyptus deglupta）、ユーカリプタス・デラガテンシス（Eucalyptus delagatensis）、ユーカリプタス・ジベルシカラー（Eucalyptus diversicolor）、ユーカリプタス・デュニイ（Eucalyptus dunnii）、ユーカリプタス・フィチフォリア（Eucalyptus ficifolia）、ユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、ユーカリプタス・ゴンフォセファラ（Eucalyptus gomphocephala）、ユーカリプタス・グニイ（Eucalyptus gunnii）、ユーカリプタス・ヘンリイ（Eucalyptus henryi）、ユーカリプタス・レボピネア（Eucalyptus laevopinea）、ユーカリプタス・マカルスリ（Eucalyptus macarthurii）、ユーカリプタス・マクロリンカ（Eucalyptus macrorhyncha）、ユーカリプタス・マクラタ（Eucalyptus maculata）、ユーカリプタス・マルギナタ（Eucalyptus marginata）、ユーカリプタス・メガカルパ（Eucalyptus megacarpa）、ユーカリプタス・メリオドラ（Eucalyptus melliodora）、ユーカリプタス・ニコリイ（Eucalyptus nicholii）、ユーカリプタス・ニテンス（Eucalyptus nitens）、ユーカリプタス・ノバ-アングリカ（Eucalyptus nova-anglica）、ユーカリプタス・オブリクア（Eucalyptus obliqua）、ユーカリプタス・オブツシフロラ（Eucalyptus obtusiflora）、ユーカリプタス・オレアデス（Eucalyptus oreades）、ユーカリプタス・パウシフロラEucalyptus pauciflora）、ユーカリプタス・ポリブラクテア（Eucalyptus polybractea）、ユーカリプタス・レグナンス（Eucalyptus regnans）、ユーカリプタス・レシニフェラ（Eucalyptus resinifera）、ユーカリプタス・ロブスタ（Eucalyptus robusta）、ユーカリプタス・ルディス（Eucalyptus rudis）、ユーカリプタス・サリグナ（Eucalyptus saligna）、ユーカリプタス・シデロキシロン（Eucalyptus sideroxylon）、ユーカリプタス・スツアルチアナ（Eucalyptus stuartiana）、ユーカリプタス・テレチコルニス（Eucalyptus tereticornis）、ユーカリプタス・トレリアナ（Eucalyptus torelliana）、ユーカリプタス・ウルニゲラ（Eucalyptus urnigera）、ユーカリプタス・ウロフィラ（Eucalyptus urophylla）、ユーカリプタス・ヴィミナリス（Eucalyptus viminalis）、ユーカリプタス・ヴィリディス（viridis）、ユーカリプタス・ワンドゥー（Eucalyptus wandoo）、およびユーカリプタス・ユーマンニ（Eucalyptus youmanni）などのユーカリ（Eucalypt）；ならびにこれらの任意の種のハイブリッドが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００７７】
標的植物のゲノムに遺伝子構築物を安定に組み入れる技術は、当技術分野において周知であり、これには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる導入、電気穿孔、プロトプラスト融合、生殖器官への注入、未成熟胚への注入、高速発射物導入およびその他が挙げられる。技術の選択は、形質転換される標的植物に依存するであろう。たとえば、双子葉植物およびある単子葉植物および裸子植物は、たとえば、Bevan（Nucleic Acids Res. 12:8711-8721, 1984）によって記述されるアグロバクテリウムTiプラスミド技術によって形質転換されうる。本発明の遺伝子構築物を導入するための標的には、葉組織、解離した細胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域などの組織；子葉、胚軸、およびその他が挙げられる。ユーカリおよびマツを形質転換するための好ましい方法は、花粉を用いるバイオリスティック法（たとえば、Aronen, in Finnish Forest Res. Papers 595:53, 1996を参照されたい）または容易に再生可能な胚組織である。
【００７８】
細胞を形質転換すると、本発明の遺伝子構築物をそのゲノムに組み入れた細胞は、先に考察したカナマイシン抵抗性マーカーなどのマーカーによって選択されうる。次に、トランスジェニック細胞を適切な培地において培養して、当技術分野において周知の技術を用いて植物全体を再生してもよい。プロトプラストの場合、適切な浸透圧条件下で細胞壁を再形成させる。種子または胚の場合、適切な発芽またはカルス開始培地を使用する。外植体の場合、適切な再生培地を用いる。植物の再生は、多くの種に関して十分に確立されている。森林樹木の再生に関する論評に関しては、Dunstan et al., "Somatic embryogenesis in woody plants," in Thorpe TA, ed., In vitro embryogenesis of plants (Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture, 20[12]:471-540, 1995)を参照されたい。トウヒを再生するための特異的プロトコールは、Roberts et al. ("Somatic embryogenesis of spruce," in Redenbaugh K, ed., Synseed: applications of synthetic seed to crop improvement, CRC Press: 23:427-449, 1993)によって考察されている。所望の表現型を有する形質転換植物を、当技術分野において周知の技術を用いて選択してもよい。得られた形質転換細胞を、当技術分野において周知の方法を用いて有性または無性生殖させて、トランスジェニック植物のその後に続く世代を得てもよい。
【００７９】
先に考察したように、標的細胞におけるRNAの産生は、プロモーター配列を選択することによって、または機能的コピーの数もしくは標的宿主のゲノムに組み入れられるDNA配列の組み込み部位を選択することによって制御することができる。標的生物を、本発明の1つより多くの遺伝子構築物によって形質転換してもよく、それによって1つより多くの転写因子の活性を調整してもよく、たとえば1つより多くの組織における、または標的生物の発生の際の1つより多くの時期で遺伝子発現に影響を及ぼしてもよい。同様に、本発明のポリペプチドをコードする1つより多くのオープンリーディングフレーム、またはそのようなポリペプチドをコードする遺伝子の1つより多くの非翻訳領域を含む遺伝子構築物を組み立ててもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、転写因子をコードする他の公知の配列と組み合わせて使用されうる。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、RNA干渉（RNAi）およびクエリング（quelling）などの標的遺伝子の産物の合成を遮断するために転写後に操作する方法によって、遺伝子発現を特異的に抑制するために用いられうる。遺伝子抑制技術の論評に関しては、Science, 288: 1370-1372, 2000を参照されたい。例示的な遺伝子サイレンシング法はまた、WO 99/49029およびWO 99/53050に提供される。転写後の遺伝子サイレンシングは、配列関連遺伝子の転写物の急速な分解が起こる配列特異的RNA分解プロセスによってもたらされる。研究により、二本鎖RNAが配列特異的遺伝子サイレンシングのメディエータとして作用しうるという証拠が提供されている（たとえば、Montgomery and Fire, Trends in Genetics, 14:255-258, 1998による論評を参照されたい）。自己相補的領域を有する転写物を産生する遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングにおいて特に有効である。この転写後遺伝子サイレンシング経路の独自の特徴は、サイレンシングが開始される細胞に、サイレンシングが限定されないことである。遺伝子サイレンシング効果は、生物の他の部分にも広がって、生殖系列を通して数世代にわたって伝播する可能性すらある。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドは、従来の当技術分野において公知の方法によって林業用樹木組織などの植物組織に送達することができる、遺伝子サイレンシング構築物および／または遺伝子特異的自己相補的RNA配列を生成するために用いられうる。遺伝子構築物において、イントロン配列が転写物のプロセシングの際に除去されて、センスおよびアンチセンス配列がスプライス結合配列と共に結合して二本鎖RNAを形成するように、センスおよびアンチセンス配列を、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位と共に適切なスプライシング方向でイントロン配列に隣接する領域に置くことができる。または、様々な長さのスペーサー配列を用いて、構築物中の配列の自己相補性領域を分離してもよい。遺伝子構築物転写物のプロセシングの際に、イントロン配列はスプライシングにより除去されて、センスおよびアンチセンス配列はスプライス結合配列と共に二本鎖RNAを形成することができる。選択したリボヌクレアーゼは、二本鎖RNAに結合してこれを切断し、それによって特異的mRNA遺伝子配列の分解に至る事象のカスケードを開始して、特異的遺伝子をサイレンシングする。または、自己相補的RNA配列を発現させるために遺伝子構築物を用いるのではなくて、遺伝子特異的二本鎖RNAセグメントを1つまたは複数の標的領域に送達して、細胞質にインターナライズさせて、遺伝子サイレンシング効果を発揮させる。本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシングRNA配列は、所望の表現型を有する遺伝子改変植物を作製するためのみならず、遺伝子を特徴付けするため（たとえば、配列のハイスループットスクリーニングにおいて）および無傷の生物におけるその機能を調べるために有用である。
【００８２】
SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421、ならびにそれらの配列の変種に対して相補的であるおよび／またはそれらに対応するオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも同様に、本発明によって包含される。そのようなオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、関心対象ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である。本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的にヌクレオチド6個から60個を含むポリヌクレオチド配列の比較的短いセグメントを指し、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるためのプローブ、およびポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅において用いるためのプライマーの双方を包含する。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーまたはその相補体が、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として記載される配列の1つまたは明記された配列の1つの変種の中に含まれる場合、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として記載される配列の1つ、またはその変種を含む本発明のポリヌクレオチドに「対応する」として記述される。
【００８３】
2つの一本鎖配列は、適切なヌクレオチド挿入および／または欠失によって最適に整列させて比較した1つの鎖のヌクレオチドが他の鎖のヌクレオチドの少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％から95％、およびより好ましくは少なくとも98％から100％と対を形成する場合に、実質的に相補的であると言われる。または、第一のDNA鎖がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第二のDNA鎖に選択的にハイブリダイズする場合に、実質的な相補性が存在する。相補性を決定するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約1 M未満、より通常、約500 mM、および好ましくは約200 mM未満の塩条件を含む。ハイブリダイゼーション温度は、5℃もの低さでありうるが、一般的に約22℃より高く、より好ましくは約30℃より高く、および最も好ましくは約37℃より高い。より長いDNA断片は、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要としうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブの組成、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度などの他の要因によって影響を受ける可能性があることから、パラメータを組み合わせることは、いずれか1つのみの絶対的な測定より重要である。植物または植物材料を含む試料もしくは産物からのDNAは、ゲノムDNA、または試料中に存在するRNAからcDNAを調製することに由来するDNAのいずれかでありうる。
【００８４】
DNA-DNAハイブリダイゼーションに加えて、DNA-RNAまたはRNA-RNAハイブリダイゼーションアッセイも同様に可能である。第一の場合、発現された遺伝子のmRNAが、ゲノムDNAまたは試料のmRNAに由来するcDNAの代わりに検出されるであろう。第二の場合では、RNAプローブを用いることができるであろう。加えて、標的配列に特異的にハイブリダイズするDNAの人工的アナログも同様に用いることができるであろう。
【００８５】
特異的態様において、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列と相補的な、少なくとも約6連続残基、より好ましくは少なくとも約10連続残基、および最も好ましくは少なくとも約20連続残基を含む。本発明のプローブおよびプライマーは、長さが約8から100塩基対、好ましくは長さが約10から50塩基対、またはより好ましくは長さが約15から40塩基対でありうる。プローブは、DNA-DNAハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、アニーリングおよび融解温度、およびループ形成の可能性ならびに当技術分野において周知であるその他の要因を考慮に入れて、当技術分野において周知の技法を用いて容易に選択することができる。プローブおよびPCRプライマーを設計するために適したツールおよびソフトウェアは、インターネット上で入手可能である。プローブを設計するために、および特にPCRプライマーを設計するために適した例示的なソフトウェアプログラムは、Premier Biosoft International, 3786 Corina Way, Palo Alto, CA 94303-4504から入手可能である。PCRプライマーを設計するための好ましい技術はまた、Dieffenbach and Dyksler, PCR primer: a laboratory manual, CSHL Press: Cold Spring Harbor, NY, 1995においても開示されている。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、キットの形で提供されうる。そのようなキットは一般的に、各々のプローブがポリヌクレオチド配列に対して特異的である、多数のDNAまたはオリゴヌクレオチドプローブを含む。本発明のキットは、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド配列を含む、本発明のポリヌクレオチドに対応する1つまたは複数のプローブまたはプライマーを含みうる。
【００８７】
ハイスループットアッセイにとって有用な1つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、各々のプローブが固相基質の表面上の既定の空間的に位置特定可能な位置で固定されるアレイフォーマットで多数のプローブを含む。本発明において有用に使用されうるアレイフォーマットは、たとえばその開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,412,087号、第5,545,531号、およびPCT公開番号WO 95/00530において開示される。
【００８８】
植物の育種および品質管理操作などの応用では、多数の種子ロットおよび植物苗木を同定すること、望ましくない植物材料に関して試料もしくは産物を調べること、検疫目的等のために植物または植物材料を含む試料もしくは産物を同定すること、または植物または植物材料を含む試料もしくは産物の真の起源を確認することが必要であることから、ハイスループットスクリーニングシステムの重要性は明らかである。植物をタグ付けするための識別番号として用いられる本発明のポリヌクレオチドの有無に関するスクリーニングは、植物育種における遺伝子流動の量、散布された花粉による遺伝子移入等を後に検出するために貴重である。
【００８９】
このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、異なる材料を含む異なる試料または産物において、迅速にしかも費用効果的に、本発明のポリヌクレオチドの有無（または混合物の場合には相対量）を調べるために使用されうる。本発明を用いて調べられうる植物種の例には、マツおよびユーカリ種などの林業種、他の樹木種、穀物およびまぐさ植物を含む農業用植物、ならびに園芸植物が挙げられる。
【００９０】
本発明のもう1つの局面は、本発明のポリヌクレオチドのコレクションを伴う。本発明のポリヌクレオチド、特にSEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド、ならびにその変種およびx量体のコレクションを、保存媒体に記録および／または保存してもよく、その後分析、比較等の目的のためにアクセスしてもよい。適した保存媒体には、磁気ディスケット、磁気テープ、CD-ROM保存媒体、光学保存媒体、およびその他などの磁気媒体が挙げられる。適した保存媒体ならびに情報を記録および保存する方法のみならず、そのような媒体に記録されるポリヌクレオチド配列などの情報にアクセスする方法は、当技術分野において周知である。保存媒体に保存されるポリヌクレオチド情報は、好ましくはコンピューター読み取り可能であり、ポリヌクレオチド情報を分析および比較するために用いられうる。
【００９１】
このように、本発明のもう1つの局面は、本発明のポリヌクレオチドのコレクション、特にSEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド、ならびにその変種のみならず、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421のポリヌクレオチドのx量体、ならびにSEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421のポリヌクレオチドを含むまたはそれらに対応する伸長配列、プローブ、およびプライマーのコレクションを記録する保存媒体を伴う。1つの態様に従って、保存媒体は、少なくとも20、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも100、および最も好ましくは少なくとも200個の本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、SEQ ID NO: 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、および2421として同定されるポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの変種のコレクションを含む。
【００９２】
以下の実施例は説明するために提供され、制限するためではない。
【実施例】
【００９３】
実施例1
ユーカリ・グランディスからのcDNAクローンの単離および特徴付け
ユーカリ・グランディスcDNA発現ライブラリ（成熟したシュート芽、早材篩部、花組織、葉組織（独立した2つのライブラリ）、細根、構造根、木部、または早材木部のいずれかから調製した）9個を構築して以下のようにスクリーニングした。
【００９４】
Chang et al. (Plant Molecular Biology Reporter 11 : 113-116, 1993)のプロトコールを用いて植物組織から全RNAを抽出した。Poly(A) Quik mRNA単離キット（Stratagene, La Jolla, CA）、またはDynal Beads Oligo (dT)25（Dynal, Skogen, Norway）のいずれかを用いて、mRNAを全RNA調製物から単離した。逆転写酵素合成の後にZAP Express cDNA合成キット（Stratagene）を用いて製造元のプロトコールに従って、得られたcDNAクローンをラムダZAPに挿入することによって、精製mRNAからcDNA発現ライブラリを構築した。得られたcDNAを、ライブラリに応じて5μlのライゲーション反応からのアリコート（1〜5μl）を用いてGigapack II Packaging Extract（Stratagene）を用いてパッケージングした。ExAssistヘルパーファージ（Stratagene）と共にXL1-Blue MRF'細胞、およびXLOLR細胞（Stratagene）を用いて、ライブラリのmass excisionを行った。切り出したファージミドをNZYブロス（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）によって希釈して、X-galおよびイソプロピルチオ-β-ガラクトシド（IPTG）を含むLB-カナマイシン寒天プレートにおいて平板培養した。
【００９５】
平板培養してDNAミニプレップのために採取したコロニーの中で、99％がシークエンシングにとって適したインサートを含んだ。カナマイシンを有するNZYブロス中で陽性コロニーを培養して、cDNAを、アルカリ溶解およびポリエチレングリコール（PEG）沈殿によって精製した。1％アガロースゲルを用いて、染色体の混入に関してシークエンシング鋳型をスクリーニングした。Turbo Catalyst 800機器（Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA）を用いて、製造元のプロトコールに従って色素プライマー配列を調製した。
【００９６】
陽性クローンのDNA配列を、Perkin Elmer/ Applied Biosystems Division Prism 377シークエンサーを用いて得た。cDNAクローンを最初に5'末端からシークエンシングして、いくつかの場合において、同様に3'末端からもシークエンシングした。いくつかのクローンに関して、エキソヌクレアーゼIII欠失分析を用いてpBK-CMVにおいて異なるサイズのサブクローンのライブラリを得るか、または関心対象遺伝子の同定された領域に対して設計された遺伝子特異的プライマーを用いて直接シークエンシングすることによって、内部配列を得た。
【００９７】
決定されたcDNA配列を、コンピューターアルゴリズムFASTAおよび／またはBLASTNを用いて、EMBLデータベース（1999年7月中期まで）における公知の配列と比較した。重複配列の多数のアラインメントを用いて、信頼できるコンセンサス配列を構築した。決定されたcDNA配列を、SEQ ID NO: 1-331、1183-1536、1896-1901、1905、1906、1908-1910、1932-1968、2001-2036、2074-2079、および2104に提供する。他の植物種からの公知の配列に対する類似性に基づいて、単離されたDNA配列を、先の表1に詳述するように、コードする転写因子として同定した。SEQ ID NO: 1-331、1896-1901、1905、1906、1908、1909、1910、1932-1968、2001-2036、2074- 2079、および2104のDNA配列に対応する予想されるアミノ酸配列をそれぞれ、SEQ ID NO: 592-922、1914-1919、1923、1924、1926-1928、2108-2142、2175-2210、2247-2252、および2276に提供する。
【００９８】
実施例2
ラジアータパインからのcDNAクローンの単離および特徴付け
ラジアータパインのcDNA発現ライブラリ（シュート芽組織、懸濁培養細胞、早材木部（独立した2つのライブラリ）、針葉束分裂組織、雄球花、根（不明の系列）、細根、構造根、雌球花、錐原基、受容雌錐（female receptive cone）および木部（独立した2つのライブラリ）のいずれかから調製した）14個を構築して、実施例1において先に記述したようにスクリーニングした。
【００９９】
陽性クローンのDNA配列を、Perkin Elmer/ Applied Biosystems Division Prism 377シークエンサーにおいてフォワードおよびリバースプライマーを用いて得て、決定した配列を、先に記述したデータベースにおける公知の配列と比較した。
【０１００】
他の植物種からの公知の配列との類似性に基づいて、単離されたDNA配列（SEQ ID NO: 332-591、1537-1894、1895、1902-1904、1907、1911、1912、1931、1969-2000、2037-2073、2080-2103、2105、および2106）を、上記の表1で詳述したようにコード転写因子として同定した。SEQ ID NO: 332-591、1895、1902-1904、1907、1911、1912、1931、1969-2000、2037-2073、2080-2103、2105、および2106のDNA配列に対応する予想アミノ酸配列をそれぞれ、SEQ ID NO: 923-1182、1913、1920-1922、1925、1929-1930、2107、2143-2174、2211-2246、2253-2275、2277、および2278に提供する。
【０１０１】
実施例3
植物における遺伝子発現を修飾するためのMyb転写因子遺伝子の使用
ユーカリ・グランディスMyb転写因子遺伝子によるタバコ植物の形質転換を以下のように行う。SEQ ID NO:2076のMyb転写因子のコード領域を含むDNA配列を含むセンスおよびアンチセンス構築物を含む遺伝子構築物を構築して、公表された方法（An G, Ebert PR, Mitra A, Ha SB, "Binary vectors," in Gelvin SB and Schilperoort RA, eds., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, 1988を参照されたい）を用いる直接形質転換によって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに挿入した。センスDNAの構築物を、pART7プラスミドにおけるcDNAインサートのクローニングによりPBK-CMVプラスミドからの直接クローニングによって作製し、次にこれをNotI酵素によって切断して、35S-Insert-OCS 3'UTRをpART27植物発現ベクターに入れる（Gleave, Plant Molecular Biology 20: 1203-1207, 1992を参照されたい）。トランスジェニック構築物の存在および完全性を、制限酵素消化およびDNAシークエンシングによって確認する。
【０１０２】
たばこ（ニコチアナ・タバクムcvサムスン（Nicotiana tabacum cv. Samsun））葉の切片を、Horsch et al.（Science 227: 1229-1231, 1985）の方法を用いてセンスおよびアンチセンス構築物によって形質転換する。シロイヌナズナ（生態型：コロンビア）の植物全体を、真空浸潤法（Bechtold et al., C.R. Acad. 316: 1194-1199, 1992）、またはフローラルディップ技法（Clough and Bent, The Plant Journal 16:735-743, 1998）のいずれかを用いて、センスおよびアンチセンス構築物によって形質転換する。適切な構築物を含む形質転換植物を、サザンブロット実験を用いて確認する。形質転換植物におけるユーカリのMyb転写因子遺伝子の発現を、Myb転写因子遺伝子のセンスおよびアンチセンス構築物によって作製した各々の独立した形質転換植物株からの全RNAを単離することによって確認する。RNA試料をノザンブロット実験において分析して、各々の形質転換株におけるトランスジーンの発現レベルを決定する。センスおよびアンチセンス構築物によって作製された各々の形質転換植物株に関して、ユーカリのMyb転写因子遺伝子および内因性のMyb転写因子遺伝子によってコードされるMyb転写因子の発現レベルを、野生型対照植物のレベルと比較する。
【０１０３】
植物内で転写因子が異所で構成的に発現される場合に一般的に観察される可能性がある致死性表現型を阻止するために、構成的または細胞特異的プロモーターの制御下で、MYB転写因子（MYB TF）の5'末端DNA結合ドメインを発現する構築物を生成することができる。切断されたMYB TFの異所発現が、内因性のMYB TFおよびトランスジーン産物に関する植物内での競合的シナリオを作製するという仮説が立てられる。関連する活性化ドメインを有しないこのDNA結合ドメイン産物が結合すると、内因性のTFが適切なシスエレメントに結合する能力を阻害するかまたは重度に低減させ、および下流の遺伝子の転写活性化を阻害して、それによってノックアウト様の表現型効果が起こる。
【０１０４】
SEQ ID NO:2076に与えられるユーカリ・グランディス転写因子は、他の植物種からのMYB転写因子遺伝子とアミノ酸配列同一性を有する。この遺伝子は、ユーカリ・グランディスの花芽に由来するcDNAライブラリから同定された。PROSITEおよびInterProなどの公共に入手可能なツールを用いるアミノ酸配列の分析により、SEQ ID NO:2076に存在する推定のDNA結合ドメインが容易に同定された（Jin and Martin, Plant Mol. Biol. 41 :577-885, 1999を参照されたい）。同定されたDNA結合ドメインのアミノ酸配列をSEQ ID NO:2346および2347に示す。
【０１０５】
従来の制限酵素に基づくプロトコールを用いてクローニングを容易にするために5'および3'末端の双方にXbaI制限部位を付加して、および3'末端のみに終止コドン（TAG）を付加する目的で、隣接する推定のDNA結合ドメインを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
2013531971.tif 000008
によって1つの断片として増幅した。これらのプライマーは、SEQ ID NO:2076の21番目から424番目のヌクレオチドを増幅した。得られたDNA結合ドメイン断片を、35S構成的プロモーターの下で植物内で発現させるために、pART7/pART27植物バイナリベクターシステム（Gleave, Plant Mol. Biol. 20: 1203-1207, 1992）においてクローニングした。
【０１０６】
バイナリベクターを、シロイヌナズナに関して記述された（Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998）標準的なフローラルディップ技法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる形質転換によって、シロイヌナズナに導入した。
【０１０７】
得られたT2植物トランス株（以下の表1を参照されたい）の表現型分析は、DNA結合ドメイン（センス方向）の過剰発現に関連する植物内でのMYB TF活性のダウンレギュレーションにより、紡錘形の花序のとう立ちを伴う矮性表現型（野生型（WT）またはpART27空ベクター対照と比較して高さのおよそ40％減少）が起こることを示した。花の発達および成熟は時間的レベルでは影響を受けなかった。しかし、重度の生長遅延を示す株では花の異常の証拠が観察された。他のトランス株の全体的な表現型分析から、野生型またはpART27空ベクター対照と比較して有意ではない表現型が得られ、この観察された表現型が、仮説どおりDNA結合ドメインのセンス発現によることを示している。T2の観察は、構築物あたり独立して5個の形質転換株からの植物15個について行った。
【０１０８】
（表３）35S::ユーカリ・グランディスMYB TF DNA結合ドメインまたは全ORFの表現型分析
2013531971.tif 000009
【０１０９】
35S::MYB DNA結合ドメイン（センス方向）構築物によって形質転換してフロログルシノールおよびMauleによって染色した植物の組織の組織学分析は、空ベクターによって形質転換した対照と比較した場合に、明白な木部細胞の崩壊を伴う、形態学的異常および導管構造の木化を示した。SEQ ID NO:2076のDNA結合ドメインによって形質転換した植物からの花序とう立ち部分は、維管束の細胞集団が低減されて、維管束自体のおおまかなサイズが全体的に低減されたと決定された。
【０１１０】
組織学データは、SEQ ID NO:2076の結合ドメインの導入（センス方向）によって、導管構造の発達の乱れが起こることを示した。MW2株2（15の個々の子孫）のT3世代を詳しく分析したところ、異常な表現型が安定に受け継がれ、分析した植物15例中11例が、紡錘形の表現型を表すことが示された。
【０１１１】
これらの試験は、SEQ ID NO:2076の配列が転写因子をコードすること、およびSEQ ID NO:2076の結合ドメインを含む遺伝子構築物のセンス方向での植物への導入を用いることにより、植物の表現型の修飾に成功する可能性があることを証明している。
【０１１２】
実施例4
木材の品質を変化させるためのトランスジェニックハコヤナギにおけるSHAQKY MYB転写因子の発現
SEQ ID NO:1953に対応するユーカリ由来cDNAを分析して、完全なDNA配列SEQ ID NO:2371を得た。このcDNAは、MYB転写因子ファミリーの異なるメンバーである、完全長のタンパク質配列SEQ ID NO:2372をコードする。MYBドメインにおけるより通常のR2R3リピートの代わりに、このタンパク質は、SHAQKYモチーフの変種を含む1つのMYBリピートを含む（Mercy et al., J. Exp. Bot. 54: 1117-1119, 2003）。cDNAを、制限酵素消化およびライゲーションなどの標準的な方法を用いてバイナリ形質転換ベクター中の発現カセットにおいてクローニングした。発現カセットにおいて用いたプロモーターは、テーダマツの4CLプロモーターであり、これは木部選択的発現を示すことが証明されている（米国特許第6,252,135号）。得られたプラスミドpWVK249のマップを図1に示す。pWVK249の完全なDNA配列はSEQ ID NO:2373であり、cDNAはプラスミドの8537番目から9774番目の領域に対応する。プラスミドのT-DNA領域（左側と右側境界のあいだ）もまた、形質転換植物のカナマイシン選択のためのNPTIIカセットを含む。
【０１１３】
プラスミドをアグロバクテリウム株GV2260に移入して、次にこれを用いて、Che et al. (Plant Biotech. J. 1 : 311-319. (2003))と類似の方法で、東部ハコヤナギ（アメリカクロヤマナラシ（Populus deltoides））を形質転換した。シュートの生成、根の発達、土壌への移植および寒さに曝して強くした後、形質転換ハコヤナギ植物を圃場試験に移して、そこで3年間生長させた。レポーター遺伝子によって形質転換した対照木を試験に含めた。収穫後、樹木からの木材を、密度、またはより厳密に言えば基礎比重（basic gravity）に関して特徴付けした。
【０１１４】
基礎比重の決定は、体積およそ10から25 cm3の木材の小片について行った。基礎比重は、（完全に乾燥させた場合の木材重量）÷（飽和させた場合に木によって置換される水の重量）として計算した。pWVK249株の半数が対照試料のいずれよりも大きい基礎比重を有することが見いだされた。結果を図2に示す。pWVK249の組の平均値は、対照の平均値よりおよそ4％大きく、最もよい株は、対照の平均値より密度が10％大きい。
【０１１５】
類似の結果を、ポプラ属（アスペンおよびハコヤナギ）の他のメンバー、ユーカリ属のメンバー、および他の堅木についても見いだすことができる。木材密度の増加はまた、本発明の方法を用いてマツおよび他の針葉樹についても達成されうる。本明細書において用いられる導管選択的プロモーターを、他の公知の導管選択的プロモーターに置換することができる。導管選択的プロモーターの例は、米国特許第7,442,786号に見いだすことができる、ラジアータパインセルロースシンターゼおよびユーカリ・グランディスアラビノガラクタンタンパク質である。
【０１１６】
実施例5
木材性質を変化させるためのトランスジェニックマツにおけるSHAQKY MYB転写因子の発現
SEQ ID NO:2373に提供される構築物を、Connett-Porceddu et al.（2007年1月2日に公表された米国特許第7,157,620号）によって記述されるように、テーダマツの胚形成カルス培養物に形質転換する。胚を発芽させて、土壌に植える。苗木の高さがおよそ6インチになると、戸外に移して保護されない条件に馴化させ、2から3ヶ月後、それらを圃場試験においておよそ10フィート×8フィートの間隔で定植する。少なくとも2年間生長させた後、植物を収穫して、木材を収集し、増加量を決定するために、基礎比重の測定を行う。
【０１１７】
実施例6
トランスジェニック樹木におけるマツ転写因子の過剰発現
SEQ ID NO 341、377、388、396、413、434、454、458、462、497、504、573、1551、1675、および1910に対応するマツ由来cDNAを分析して、完全長またはほぼ完全長の転写物と同等のDNA配列を得た。cDNAを、本来のクローンの配列と重なり合う部分的シークエンシングcDNA（発現された配列タグまたはEST）の検索によって選択した。重なり合うESTの各組（またはクラスタもしくはコンティグ）を調べることによって、転写物の5'末端の最も近くで始まるcDNAを同定することが可能であった。
【０１１８】
樹木の生長および発達に及ぼすこれらの遺伝子の過剰発現の効果を証明するために、完全長のcDNAをバイナリ形質転換ベクターにおいてクローニングした。多様な基本ベクターを、過剰発現カセットの構築に用いた。ベクターpOX1（SEQ ID NO:2423）は、挿入された配列を作動させるために、導管選択的マツ4CLプロモーターを用いた。ベクターpOX28（SEQ ID NO:2424）は、挿入された配列を作動させるために、構成的なマツポリユビキチンプロモーターを用いた。pAGSM49（SEQ ID NO:2425）は、花粉形成を防止するためのカセットを加えることによって、pOX28から誘導した。pAGSM50は、pAGSM49と非常に類似であり、マルチクローニング領域のみが異なった。pOX28およびpAGSM49において、マルチクローニング領域配列は、
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であり、pAGSM50において、クローニング領域配列は、
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であった。プラスミドは全て、形質転換植物のカナマイシン選択のためにT-DNA領域にNPTIIカセットを含んだ。
【０１１９】
SEQ ID NO: 2385を、先に提供したベクターとは異なる3つの基本ベクターにおいてクローニングして、SEQ ID NO: 2426、2427、および2428を生じた。
【０１２０】
SEQ ID NO: 2387をpOX28（SEQ ID NO: 2424）およびpAGSM49（SEQ ID NO: 2425）においてクローニングした。
【０１２１】
SEQ ID NO: 2389を、pAGSM50においてクローニングした。
【０１２２】
SEQ ID NO: 2391を、pOX28（SEQ ID NO: 2424）およびpAGSM49（SEQ ID NO: 2425）においてクローニングした。
【０１２３】
SEQ ID NO: 2393をpAGSM50においてクローニングした。
【０１２４】
SEQ ID NO: 2395をpOX1（SEQ ID NO: 2423）においてクローニングした。
【０１２５】
SEQ ID NO: 2401を、pOX28（SEQ ID NO: 2424）およびpAGSM49（SEQ ID NO: 2425）においてクローニングした。
【０１２６】
SEQ ID NO: 2403を、pOX1（SEQ ID NO: 2423）およびpOX28（SEQ ID NO: 2424）においてクローニングした。
【０１２７】
SEQ ID NO: 2409を、pOX1（SEQ ID NO: 2423）およびpOX28（SEQ ID NO: 2424）においてクローニングした。
【０１２８】
SEQ ID NO: 2411を、pOX1（SEQ ID NO: 2423）においてクローニングした。
【０１２９】
以下の表4は、部分的および完全長の配列ならびに完全長の配列の予想される翻訳産物の対応を示す。
【０１３０】
（表４）
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【０１３１】
実施例7
トランスジェニック樹木におけるマツ転写因子の発現の低減
完全長のcDNA、SEQ ID NO: 2393、2395、2397、2399、2405、2407、および2421の各々に関して、cDNAの断片を、PCR、制限酵素消化、およびライゲーションなどの標準的な方法を用いてバイナリ形質転換ベクター中の推移的（transitive）RNAiカセットにおいてクローニングした。推移的RNAiでは、RNA依存的RNAポリメラーゼが標的配列の中に伸長することができ、標的配列と相同性を有するsiRNAが生成されるように、非標的配列の逆方向反復を標的遺伝子のセグメントの3'に連結させる（Filichkin et al., Plant Biotechnol. J. 5: 615-626, 2007）。基本の推移的RNAiベクターの配列をSEQ ID NO: 2429として提供する。表5は、完全長のSEQ ID NOの一覧であり、構築物において用いられる各々の完全長の配列のセグメントに関する終点を提供する。
【０１３２】
（表５）
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【０１３３】
断片を、5'末端でBamHI制限部位を付加するように、および3'末端でSpeI制限部位を付加するように設計したプライマーを用いて、PCRによって増幅した。精製された断片を、ベクターのBamHIとSpeI部位のあいだ（SEQ ID NO: 2429の9297番目の位置から9644番目の位置）に挿入した。標的遺伝子断片を挿入する前にベクターの制限酵素消化を行うと、9320〜9642番目の位置を含む短い「スタッファー」断片が欠失した。推移的RNAiカセットを作動させるために用いられるプロモーターは、テーダマツの4CLプロモーターであった。プラスミドのT-DNA領域（左側および右側境界のあいだ）も同様に、形質転換植物のカナマイシン選択のためのNPTIIカセットを含んだ。
【０１３４】
SEQ ID NO: 2415を標的とする抑制構築物を、強い構成的プロモーターによって作動する標的遺伝子の逆方向反復を含むように構築した。cDNA断片の逆方向反復は、2つの反復配列間に非コードDNAの短いスペーサーを含んだ。同様に、スペーサーとしてイントロン、たとえばSEQ ID NO: 2384において用いられたシロイヌナズナのYABBY遺伝子からのイントロンを用いることも可能であろう。SEQ ID NO: 2415の断片の逆方向反復を有するプラスミドの配列を、SEQ ID NO: 2430として提供する。
【０１３５】
記述の抑制プラスミドの各々を、電気穿孔によってアグロバクテリウムに導入した後、Connett-Porceddu et al.（2007年1月2日に公布された米国特許第7,157,620号）によって記述される胚形成マツカルス培養物において形質転換させた。トランスジェニック植物を産生して、温室または圃場試験のいずれかの土壌で生長させて、新規表現型の存在に関して特徴付けした。
【０１３６】
標的遺伝子の発現に及ぼす抑制プラスミドの効果を、存在する標的遺伝子RNAの量を決定することによって特徴付けする。RNAハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、または定量的逆転写PCR（qPCRまたはRT-PCR）などの方法を一般的に用いて、特異的遺伝子に関するRNAレベルを測定する。Applied BiosystemsのTaqManアッセイは、標的遺伝子のレベルを内部標準と比較することができるリアルタイム型のPCRである。
【０１３７】
SEQ ID NO: 1-2430を添付の配列表に記載する。添付の配列表において用いられる、記号「n」および「Xaa」を含むヌクレオチドおよびアミノ酸配列のコードは、WIPO Standard ST.25 (1998)、別紙2、表1と一致する。
【０１３８】
本発明は、理解を明快にする目的で、説明および例によっていくぶん詳細に記述してきたが、変化および改変を行うことができ、それらも特許請求の範囲によってのみ制限されると意図される本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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