(57)【要約】本発明は、全身電離放射線と熱傷との複合曝露を受けている患者を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）全身電離放射線への曝露と（ｉｉ）熱傷との複合損傷を受けている患者を治療するための方法であって、
配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドの少なくとも５つのアミノ酸を含むペプチドまたはその医薬塩を、放射線影響および熱傷の少なくとも一方を治療するために有効な量で前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記方法は、対照と比較して前記患者の生存率を上昇させる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、対照と比較して熱傷の治癒を加速させる
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者は、胴体、背中、頭、腕、および脚の１以上に第２度の熱傷を受けている
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者は、０．２グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙの全身電離放射線に曝されている
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は、１グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙの全身電離放射線に曝されている
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は、２グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙの全身電離放射線に曝されている
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者は、累積して少なくとも２０ｃＧｙの全身電離放射線への曝露を受けている
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記全身電離放射線は、ベータ線、ガンマ線、およびＸ線からなる群から選択される
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記全身電離放射線の被曝は、核兵器、原子力施設、コンピュータ断層撮影装置、Ｘ線装置、骨髄移植コンディショニングのための照射器、原子力車両、および、放射性物質により汚染された環境からなる群から選択された放射線源への曝露により生じる
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドは、全身電離放射線の曝露から３日以内に投与される
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドまたはその医薬塩を含む
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドは、配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドまたはその医薬塩のみからなる
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、放射線および熱の複合損傷の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線が創傷治癒を遅延させることは知られており、この影響は、高レベルの放射線に曝された人々に見られる。こうした人々としては、例えば、原子力爆弾が爆発した時に広島や長崎に居た人や、チェルノブイリ原子力施設における炉心溶融の後にチェルノブイリやその周辺に居た人が挙げられる。高レベルの電離放射線に曝された人は、放射線疾患だけではなく、爆発や火災の結果としての熱による損傷も受けるおそれがある。したがって、放射線および熱の複合損傷患者の治療に使用するための治療法が必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】モルモットモデルの損傷領域におけるサイクリン陽性細胞に対するＴＢＩ線量および熱損傷サイズの効果を示す図。
【図２】モルモットモデルの損傷の縁部におけるサイクリン陽性細胞に対するＴＢＩ線量および熱損傷サイズの効果を示す図。
【図３】２００ｃＧｙのＴＢＩに続くモルモットでのＣＲＢＩのモルモットモデルにおいて、生存率に対するＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果を示す図。
【図４】ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）が熱傷の縁部の表皮基底層における増殖細胞を増加させることを示す図。
【図５】ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）が熱傷の縁部の毛包における増殖細胞を増加させることを示す図。
【図６】２００ｃＧｙのＴＢＩに続くモルモットでのＣＲＢＩのモルモットモデルにおいて、生存率に対するＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果を示す図。
【図７】２００ｃＧｙのＴＢＩに続くモルモットでのＣＲＢＩのモルモットモデルにおいて、生存率に対するＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果を示す図。
【図８】２００ｃＧｙのＴＢＩに続くモルモットでのＣＲＢＩのモルモットモデルにおいて、生存率に対するＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果を示す図。
【図９】２００ｃＧｙのＴＢＩに続くモルモットでのＣＲＢＩのモルモットモデルにおいて、生存率に対するＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果を示す図。
【図１０】ＣＲＢＩのマウスモデルにおいて（６００ｃＧｙのＴＢＩに続く７０Ｃでの１０秒熱処理）、ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）は、熱損傷の真皮および皮下におけるアポトーシスを減少させるが、熱損傷単独の部位では減少させないことを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明は、（ｉ）全身電離放射線への曝露と（ｉｉ）熱傷との複合損傷を受けている患者を治療するための方法であって、配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドの少なくとも５つのアミノ酸を含むペプチドまたはその医薬塩を、放射線影響および熱傷の少なくとも一方を治療するために有効な量で患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、対照と比較して患者の生存率を上昇させる。他の実施形態では、対照と比較して熱傷の治癒を加速させる。さらなる実施形態では、患者は、胴体、背中、頭、腕、および脚の１以上に第２度の熱傷を受けている。他の実施形態では、患者は、０．２グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙの全身電離放射線に曝されており；さらなる実施形態では、患者は、１グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙ、または２グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙの全身電離放射線に曝されている。他の実施形態では、患者は、累積して少なくとも２０ｃＧｙの全身電離放射線への曝露を受けている。なおさらなる実施形態では、全身電離放射線は、ベータ線、ガンマ線、およびＸ線からなる
群から選択される。他の実施形態では、全身電離放射線は、核兵器、原子力施設、コンピュータ断層撮影装置、Ｘ線装置、骨髄移植コンディショニングのための照射器、原子力車両、および、放射性物質により汚染された環境からなる群から選択された放射線源への曝露により生じる。他の実施形態では、ペプチドは、全身電離放射線への曝露から３日以内に投与される。さらなる実施形態では、ペプチドは、配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドまたはその医薬塩を含み、または配列番号１のペプチドまたはその医薬塩からなる。
【０００５】
本発明は、（ｉ）全身電離放射線への曝露と（ｉｉ）熱傷との複合損傷を受けている患者を治療するための方法を提供する。この方法は、配列番号１（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）のペプチドの少なくとも５つのアミノ酸を含むペプチドまたはその医薬塩を、放射線影響および／または熱傷を治療するために有効な量で患者に投与することを含む。
【０００６】
放射線が創傷治癒を遅延させることは知られており、この影響は、高レベルの放射線に曝された人に見られる。したがって、創傷治癒において効果的と示される化合物であっても、全身電離放射線への曝露に関連した創傷の治癒においては効果がない可能性がある。発明者らは、全身の電離放射線曝露および熱傷の複合患者に対しＮｌｅ  Ａ（１−７）を投与することにより、熱傷治癒反応が増大するとともにそうした患者における全生存率が上昇することによる予期しない効果が得られることを見出した。
【０００７】
当技術分野で知られているように、「Ｎｌｅ  Ａ（１−７）」は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏを持つペプチドである。種々の実施形態では、ペプチドは、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ（Ｎｌｅ  Ａ（１−５））（配列番号３）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｎｌｅ  Ａ（１−６））（配列番号２）、またはＮｌｅＡ  （１−７）の配列を含むか、これらの配列からなる。
【０００８】
本発明は、治療目的での、あるいは不慮のＸ線、ガンマ線、またはベータ粒子の曝露など、熱傷を伴う任意のタイプの電離放射線曝露に伴う使用のために適合する。本発明の方法での治療に好適な電離放射線曝露の例としては、臨床放射線療法、放射線トレーサを用いた医療診断、ウランやラドンなどの天然に発生する電離放射線源への曝露、戦時曝露（すなわち、核兵器）、原子力施設、医療機関および研究機関における職業曝露を含む不慮の曝露、骨髄移植コンディショニングのための照射器、コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）装置、Ｘ線装置、原子力車両、放射性物質により汚染された環境が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
患者は、本発明の方法により利益を得る任意の好適な患者であってよい。一実施形態において、患者は、ヒトなどの哺乳類、イヌやネコなどの愛玩動物、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリを含むがこれらに限定されない家畜である。
【００１０】
本明細書で使用されるように、「全身電離放射線被曝」とは、複数の器官系に影響を与える電離放射線の線源への曝露を意味する。
一実施形態では、患者は、０．２グレイ（Ｇｙ）から１２Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線に曝されている。さらなる実施形態では、患者は、以下のレベルの全身電離放射線に曝されている。すなわち、１グレイ（Ｇｙ）から１２Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；２グレイから１２Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；０．２Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；１Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；２グレイ（Ｇ）ｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；２．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；３Ｇｙから１０
Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；３．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；４Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；４．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；５．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；６Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；６．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；７Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；７．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；８Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；８．５Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；９Ｇｙから１０Ｇｙ、またはそれを超える全身電離放射線；１０Ｇｙを超える全身電離放射線、または１２Ｇｙを超える全身電離放射線に患者は曝されている。他の実施形態では、累積して少なくとも０．２０Ｇｙ（２０ｃＧｙ）の全身電離放射線への曝露を受けている。種々のさらなる実施形態では、患者は、累積して、少なくとも２５ｃＧｙ、３０ｃＧｙ、３５ｃＧｙ、４０ｃＧｙ、４５ｃＧｙ、５０ｃＧｙ、５５ｃＧｙ、６０ｃＧｙ、６５ｃＧｙ、７０ｃＧｙ、７５ｃＧｙ、８０ｃＧｙ、８５ｃＧｙ、９０ｃＧｙ、９５ｃＧｙ、１００ｃＧｙまたはそれを超える全身電離放射線への曝露を受けている。熱傷は任意の重篤度であってよく、好ましくは、任意の身体部位における中間層熱傷（すなわち、第２度の熱傷）である。身体部位には、胴体、背中、頭、腕、または脚が含まれるが、これらに限定されない。熱傷は、任意の大きさであってよく、好ましくは、少なくとも面積が３ｃｍ２であり、より好ましくは、面積が少なくとも４ｃｍ２，５ｃｍ２，６ｃｍ２，７ｃｍ２，８ｃｍ２，９ｃｍ２，または１０ｃｍ２である。さらなる実施形態では、患者は、全身の表面積の少なくとも１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７９％の面積またはそれを超える面積の熱傷を受けている。
【００１１】
好ましい一実施形態では、放射線曝露の０日，１日，２日，または３日以内に投与が実行される。好ましい他の実施形態では、一創傷につき１μｇまたはそれより多い量のペプチドが投与され、より好ましくは、一創傷につき１０μｇまたはそれより多い量のペプチドが投与される。好ましい種々の実施形態では、１０μｇ／ｃｍ２，５０μｇ／日，１００μｇ／日，２００μｇ／ｃｍ２，２５０μｇ／日，３００μｇ／ｃｍ２，３５０μｇ／ｃｍ２，４００μｇ／ｃｍ２，４５０μｇ／ｃｍ２，５００μｇ／日、またはそれよりも多い量のペプチドが投与される。
【００１２】
本明細書で使用されるように、「治療」または「治療する」とは、１以上の次のことを達成することを意味する。すなわち、（ａ）熱傷または電離放射線被曝の影響の重篤度を低下させること；（ｂ）電離放射線への曝露に特徴的な症状の発症を制限することまたは防止すること；（ｃ）電離放射線への曝露に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）対照と比較して熱傷治癒の時期を早めること；および（ｅ）生存率の上昇、である。放射線の生物学的影響は、放射線量、曝露期間、影響を受けた器官などの多くの要素に依存する。全身電離放射線への曝露の影響の非限定的な例には、吐き気、嘔吐、下痢、中枢神経系機能の障害（認知障害、発作、震え、運動失調など）、白血病、骨髄死、腸死、感染症（細菌、ウイルス、真菌などによる）、ショック、低血圧、出血、および死亡が含まれる。
【００１３】
種々の実施形態では、ペプチドまたはその医薬塩の量は、上述した用量を供給するために十分な量である。例示的な実施形態では、ペプチドまたはその医薬塩の量は、０．０１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから９００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから９００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから８００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから７００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから６００μｇ／ｋｇ；０．１μｇ／ｋｇから５００μｇ／ｋｇ；または０．１μｇ／ｋｇから４００μｇ／ｋｇの患者への用量を提供するために十分な量である。
【００１４】
ペプチドとの塩を形成することが可能な好適な酸には、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などの無機酸；および、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの有機酸が含まれる。ペプチドとの塩を形成することが可能な好適な塩基には、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基；および、モノ−、ジ−、トリ−アルキルアミンおよびアリールアミン（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）、ならびに任意に置換されたエタノールアミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミンなど）などの有機塩基が含まれる。
【００１５】
本発明の方法における使用のための医薬組成物は、固体形状（顆粒剤、粉末剤または座剤を含む）、または液体形状（例えば、液剤、懸濁剤、または乳剤）で構成されうる。医薬組成物は、種々の液剤中で適用されうる。本発明に従い使用するための好適な液剤としては、無菌であり、十分な量のＮｌｅ  Ａ（１−７）を溶解し、提案されている適用にとって有害ではない液剤である。この点、本発明の化合物は、非常に安定であるが、強酸および強塩基により加水分解される。本発明の化合物は、有機溶媒およびｐＨ５〜８の水溶液に可溶である。医薬組成物は、滅菌などの通常の製薬工程に供され、および／または通常のアジュバントを含みうる。一実施形態では、医薬組成物は、局所皮下投与のために調製され、ペプチドまたはその塩は、製剤の０．０００１％から１０％ｗ／ｗを構成することができ、一実施形態では、製剤の多くて５％ｗ／ｗを構成することができ、さらなる実施形態では、製剤の０．０１％から２％ｗ／ｗを構成することができる。
【００１６】
他の実施形態では、ペプチドまたはその塩は、安定した凍結乾燥ペプチド製剤として調製される。この凍結乾燥ペプチド製剤は、皮下投与に好適な、凍結乾燥前の状態に戻された本発明の医薬組成物を生成すべく、好適な希釈剤で戻されることができる。保存料を含む希釈剤（注入のための静菌水など）で戻される場合、戻された製剤は、複数目的の製剤として使用されうる。こうした製剤は、例えば、ペプチドの頻繁な皮下投与を患者が必要とするような場合に有益である。複数目的の製剤の利点は、患者にとっての使いやすさを促進すること、バイアルの内容物の完全使用を可能にすることにより廃棄物を削減すること、いくつかの用量が単一バイアルに封入されるため製造業者にとって有意なコスト節約になること（充填および輸送コストを低下させる）である。そうした戻された製剤は、他のタイプの非経口的投与での使用にとっても好適である。
【００１７】
ペプチドまたはその塩は、任意の好適な経路により投与されることができ、好適な経路には、皮膚、皮下、皮膚内、経皮（例えば徐放性ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、耳内、硬膜外、経肛門もしくは経膣（例えば座剤による）、および鼻腔内の経路、または、点滴もしくは大量瞬時投与（ボーラス注入）、または、上皮もしくは粘膜皮膚内層（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｎｉｎｇｓ）を通じた吸収が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ペプチドまたは塩は、経皮的に投与され、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）などとともに局所製剤として調合されている。一実施形態では、備蓄中における分解を防止すべく製剤は保護されている。
【００１８】
投与のため、医薬組成物は、通常、指示された経路の投与にとって適切な１以上のアジュバントと組み合わされる。化合物は、通常投与のため、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、セルロースのアルカン酸エステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア（ａｃａｃｉａ）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、および／またはポリビニルアルコールと混合されるとともに、錠剤化またはカプセル化され
うる。あるいは、本発明の化合物は、生理的食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、ヒドロキシエチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ごま油、トラガカントガム、および／または種々の緩衝液中に溶解されうる。他のアジュバントおよび投与方法は、医薬分野において周知である。担体または希釈剤は、時間遅延材料を含みうる。時間遅延材料としては、例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンの単独、またはこれらとワックス、またはこれらと当技術分野で周知の他の材料が挙げられる。好ましい実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は、局所的に投与される。熱損傷を受けた組織内にペプチドまたは医薬組成物がある期間にわたって流入することを可能にする任意の局所適用手段が使用されうる。例えば、ガーゼ包帯または細長い切れ（ｓｔｒｉｐ）を通して水溶液が熱傷組織に適用されうる。あるいは、そうした溶液は、時限潅流（ｔｉｍｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）が得られるように（リポソーム、軟膏、ミセルなどを使用して）調製されることができる。本発明のペプチドまたは医薬組成物に関係するこうした製剤の製造方法については、当技術分野における当業者には明らかである。
【００１９】
ペプチドまたはその塩は、さらに、半減期を延長するために誘導体化されることができる。この誘導体化は、例えば、ポリエチレングリコールに連結させることによる。ペプチドまたはその塩は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（生体内のＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性がある）、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の組合せ、および特定の性質を伝えるための種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−アミノ酸等）を含みうる。合成アミノ酸は、イソロイシンの代わりのノルロイシンを含む。
【００２０】
さらに、ペプチドまたはその塩は、ペプチド擬似結合（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ
ｂｏｎｄ）を有しうる。例えば、ペプチドは、還元ペプチド結合、すなわちＲ１−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、アミノ酸残基またはアミノ酸配列）を含んで生成されうる。還元ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入されうる。そうしたポリペプチドはプロテアーゼ活性に耐性があり、生体内半減期が延長される。
【００２１】
ペプチドまたはその塩は、化学的に合成されることができ、または組換え発現されることができる。いずれも、当技術分野の標準的な方法を用いて達成されうる。
Ｎｌｅ  Ａ（１−７）またはその塩は、単独の治療として、または、問題の状態を治療するために有益な他の医薬品または療法と組み合わせて投与されることができる。組み合わされるものとしては、ヒドロゲル、コラーゲンスポンジ、およびベカプレルミンゲルが含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
実施例１  放射線／身体複合損傷（ＣＲＢＩ）のためのモルモットモデル
複合損傷のためのモデルをモルモットで開発した。モデル開発では、治癒を遅延させるが死亡率が最小限である至適組合せを決定すべく、５段階の全身放射線被曝（ＴＢＩ）を、２つのサイズの熱損傷と組み合わせて（複合して）評価を行った。容認できない死亡率が存在し、特に、最も高い２段階の線量のＴＢＩで、大きい方の熱傷サイズを伴う場合に容認できない死亡率となった。ＴＢＩの治癒遅延能力を、表皮基底層および毛包バルジ（ｂｕｌｇｅ）におけるサイクリン陽性細胞の数により測定した。１４日目の動物における増殖データを示した（図１および２）。２００ｃＧｙ以上のＴＢＩ線量では、熱傷部位およびその熱傷の縁部のいずれにおいても、毛包のバルジ領域および表皮基底層における増殖細胞の数が一貫して減少した。これら２つの細胞集団は、熱損傷の再上皮形成の原因となるため、熱損傷と組み合わされた２００ｃＧｙは、いずれも、死亡率を上昇させるとともに治癒の程度を低下させる。
【００２３】
実施例２  ＣＲＢＩモデルにおけるＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の効果
続く研究では、ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の投与量−反応研究において、２００ｃＧｙのＴＢＩを１８ｍｍの熱損傷と組み合わせた。熱損傷当日、および１４日目までの毎日、種々の濃度のＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）（０〜３００μｇ／日）を熱損傷部位に適用した（図３）。モルモットにおいて、１μｇ／創傷／日およびそれを超えるＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の投与は、複合損傷に関連する死亡率を低下させた。１日あたり１０μｇおよびそれを超えるＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）の投与量では、熱傷の縁部における表皮基底層の細胞数が増加した（図４）。すべての投与量において（３μｇ／創傷／日を除く）、創傷の縁部での毛包バルジにおける増殖細胞数が増加した（図５）。
【００２４】
実施例３  モルモットにおいて、ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）が開始されうる時点の決定
治療を遅延させ且つ死亡率をなお低下させることのできる期間の長さを評価すべく、このモデルにおいて第２の研究を実施した。本研究では、モルモットは、２００ｃＧｙのＴＢＩおよび２時間後の熱損傷を受けた。プラセボでの治療を０日目に始めた。１日あたり１０μｇまたは１００μｇのＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）を、０，１，２，３，または４日目に開始した。０，１，２，または３日目に治療を始めた場合、生存率はおよそ４０〜６０％に増加した。これに対し、プラセボで治療された動物における生存率は１４％にであった（図６〜９）。しかしながら、治療の開始を４日目まで遅延させた場合には、効果が低下した。
【００２５】
方法
これらの研究のため、体重がおよそ５００グラムの雄のハートレイ系モルモットを、チャールズリバー研究所（チャールズリバー、マサチューセッツ州）から購入した。モルモットを、ＵＳＣの動物施設（ｖｉｖａｒｉｕｍ）において１２時間：１２時間（明：暗）のサイクルの状態下に収容した。動物は、セシウム１３７照射器を用いた２００ｃＧｙのＴＢＩを受けた。その１から２時間後、モルモットは、熱損傷を受けた。ロジャーら，１９９７ａ，ｂ，２００１年に記載されるようにして熱損傷を生じさせるとともに術後ケアを実行した。簡単に言えば、麻酔後、７５℃の水浴中で温められた直径１８ｍｍの中実の真鍮棒で、それぞれのモルモットに２つの熱傷を生じさせた。真鍮の棒の一端を、モルモットの背中に５０秒間置いた。
【００２６】
それぞれの熱傷を、０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中のＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）を含む、または含まない２％のＨＥＣ（局所的な薬剤適用のためのビヒクル）で治療するとともに個々に包帯などで手当てをした。下記に示すとおり、ＴＢＩおよび熱傷後、種々の時間で治療を始めた。
【００２７】
熱損傷後の１４日目において、モルモットを安楽死させ、熱傷領域を一括切除する。この組織を１０％緩衝液で処理されたホルムアルデヒド溶液中に一晩置いた。損傷部位における増殖細胞の数により治癒を測定した。
【００２８】
免疫組織学染色を、アビジンビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法で実行した。ＰＢＳでの最終リンスの後、切片を、０．０３％過酸化水素を含むＰＢＳ中の０．０６％  ３，３’−ジアミノベンジジン中で５分間インキュベートした。修正されたハリスのヘマトキシリン・エオジンで対比染色を実行した後、切片を乾燥させ、パーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）とともにカバーガラスで封入した。
【００２９】
オリンパスＶａｎｏｘ  ＡＨ−２解剖顕微鏡および１００ｘの拡大率で、生検材料の各切片を、熱傷の縁部領域と実際の熱傷領域とに分割した。熱傷と熱傷の縁部との全領域を包埋するとともに組織学的に調査した。各切片において、４〜６の連続した中倍率視野（ｍｐｆ、１００ｘ）を評価した。ＭＩＢ−１抗体で染色された細胞は、明瞭な褐色を呈し
た。生検材料の毛包中に位置するすべての染色細胞を計数した。ＭＩＢ−１染色細胞を計数するべく、スライド上の各切片を、個々の中倍率視野（ｍｐｆ）へと分割した。その後、各視野について、熱傷の縁部の切片であるか熱傷領域自体の一部の切片であるかを決定した。縁部であることは、切片の縁部に沿った褐色の上皮細胞を示す陽性染色により示された。熱傷領域であることは、縁部に沿った褐色染色細胞がないことにより示された。毛包内に位置する褐色の細胞を、ｍｐｆ倍率下で一つずつ計数した。次のｍｐｆに進むべく標識点を設け、続いてスライドを次の隣接する視野に移動した。
【００３０】
結果
治療を遅延させ且つ死亡率をなお低下させることのできる期間の長さを評価すべく、このモデルにおいて第２の研究を実施した。本研究では、モルモットは、２００ｃＧｙのＴＢＩおよび２時間後の熱損傷を受けた。プラセボでの治療を０日目に始めた。１日あたり１０または１００μｇのＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）を、０，１，２，３，または４日目に開始した。０，１，２，または３日目に治療を始めた場合、生存率は、プラセボで治療された動物における１４％に対しておよそ４０〜６０％に増加した（図７）。しかしながら、治療の開始を４日目まで遅延させた場合には、効果が低下した。
【００３１】
実施例４
熱損傷のみを受けたマウスは、全身表面積の７％に７０Ｃ１０秒間での熱処理を受けて（ケラミン／キシラジン麻酔下）熱損傷を受けた。複合損傷を受けたマウスは、６Ｇｙの線量でセシウム照射器による全身被曝を受けるとともに２時間後に同じ熱損傷を受けた。提示するデータのため、治療を熱損傷の直後に開始して、創傷にテガダームで包帯をした。治療を、創傷につき１ｍｇ／ｍｌの濃度で毎日実施した。７日目に動物を安楽死させた。真皮組織におけるアポトーシスを、ＴＵＮＥＬアッセイにより測定した。データを図１０に示す。ＮｏｒＬｅｕ３−Ａ（１−７）は、放射線が関与する創傷治癒の遅延を軽減するさらなる系を提供する。
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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