(57)【要約】  オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、オリゴヌクレオチドの前駆体の少なくとも１つのリンインターヌクレオチド結合を硫化するために一般式（Ｉ）の硫化剤を用いるステップを含み、式中、Ｒ１は、環状炭素原子を介してＳ−原子に結合しているアリール基又はヘテロアリール基であり；Ｒ１及びＲ２は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である方法。本方法は、オリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含み得る。前記硫化剤の合成のためのプロセスも含まれる。【化１】2013531665.tif 000011
2013531665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、一般式（Ｉ）、
2013531665.tif 000010
（式中、
Ｒは、アリール基及びヘテロアリール基からなる群から選択され、環状炭素原子を介してＳ−原子に結合しており、
Ｒ1及びＲ2は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１−Ｃ２０、任意に不飽和又は芳香族の炭化水素残基である。）
で規定される硫化剤を使用して、前記オリゴヌクレオチドの前駆体の少なくとも１つのリンインターヌクレオチド結合を硫化することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒが、ハロフェニル又はアルキルフェニル、好ましくは４−ハロフェニル、特に好ましくは４−クロロフェニルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1及びＲ2が、低級アルキル又はシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）、置換フェニルを含むフェニル及びナフチル基、より好ましくはメチル基から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記硫化剤が、有機溶媒、好ましくはハロゲン化炭化水素溶媒に溶解される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記硫化剤と、硫化されるリンインターヌクレオチド結合のモル比が、１．０から２．０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの前駆体が、リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−置換リボヌクレオシド、２’−４’−ロックド−リボヌクレオシド、３’−アミノ−リボヌクレオシド、３’−アミノ−２’−デオキシリボヌクレオシドから選択されるヌクレオシドを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リンインターヌクレオチド結合が、Ｈ−ホスホン酸ジエステル結合である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カップリングが、液相で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項によって得られるオリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドを少なくとも沈殿させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドを溶媒で抽出することをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドを、好ましくは塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、アセトン及びピリジンから選択される極性有機溶媒に溶解させるステップを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
溶媒容量が、約０．５（ｎ＋１）ｍＬから約２．０（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約１．０（ｎ＋１）ｍＬ（式中、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲で用いられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドの溶液が、前記溶液が混濁するまで、好ましくは炭化水素、エーテル溶媒及びこれらの混合物から選択される非極性有機溶媒で処理される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
溶媒容量が、約１（ｎ＋１）ｍＬから約４（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約２．０（ｎ＋１）ｍＬ（式中、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲で用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記混濁溶液が、沈殿助剤で処理される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記沈殿助剤が、好ましくはセライト、チャコール、木材セルロース、及びシリカ又はアルミナなどのクロマトグラフィー固定相から選択される不活性多孔質固体の中から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記沈殿助剤が、約０．２５（ｎ＋１）ｇから約１．５（ｎ＋１）ｇ、好ましくは約０．７５（ｎ＋１）ｇ（式中、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲の量で用いられる、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記沈殿助剤を添加後、前記混合物が、非極性有機溶媒の第２の部分によって、一般に約１（ｎ＋１）ｍＬから約４（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約２．０（ｎ＋１）ｍＬ（式中、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲の前記部分の容量で処理される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記沈殿ステップで得られる固体物質が、ろ別及び洗浄される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド含有沈殿物から溶媒で抽出される、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶媒が、好ましくはアセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＦ、及び脂肪族アルコールから選択される極性有機溶媒と、水性媒体、好ましくは水との混合物を含み、前記極性有機溶媒／水性媒体の容量比が、好ましくは約０．５から約１．５、より好ましくは約０．７である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ハロゲン化スルフリル、好ましくは塩化スルフリルを、式Ｒ−Ｓ−Ｈ（式中、Ｒは、アリール、アルキルアリール、ハロアリール、ニトロアリール、アルコキシアリールからなる群から選択される芳香族である）のチオールと反応させて、式Ｒ−Ｓ−Ｗ（式中、Ｒは、上に記載されているとおりであり、Ｗは、ハロゲン、好ましくはＣｌである）の中間体生成物を生成させるステップ、及び（ｂ）前記中間体生成物を、式Ｒ1−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１−Ｃ２０、任意に不飽和又は芳香族の炭化水素残基である）のＮ−スルホニル化合物と反応させることを含む、請求項１〜２２のいずれか一項で用いられるとおりの硫化剤を合成する方法。
【請求項２４】
Ｒが、ハロフェニル、好ましくは４−ハロフェニル、より好ましくは４−クロロフェニルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ1及びＲ2が、低級アルキル又はシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）、置換フェニルを含むフェニル及びナフチル基、より好ましくはメチル基から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その内容全体がすべての目的に対して参照により組み込まれる、２０１０年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／３６０３２４号明細書に対する優先権を主張するとともに、新規な硫化剤を用いることによるオリゴヌクレオチドの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、癌、ウイルス感染及び炎症性疾患などを含む様々な疾患の治療に大きな可能性を有するバイオ医薬品の一分類に属する。治療学としてのオリゴヌクレオチドの進歩への重要な手法は、とりわけ、代謝抵抗性、化学的安定性を与え、及びインビボでの作用部位への輸送を改善するためにオリゴマー骨格を修飾することを含む。修飾された骨格化学の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０８：３−２６，２００２参照）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＆  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（２）：７４−８１，２００３参照）、ホスホロチオエート（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１０（２）：１１７−２１，２０００参照）、メチルホスホネート（Ｔｈｉｖｉｙａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（３）：８２７−３８，２００２参照）、ホスホルアミデート（Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９（１）：１３１−４０，１９９９；Ｐｒｕｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０（２）：５５９−６８，２００２参照）、チオホスホルアミデート（Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０（４−７）：４０１−１０，２００１；Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１（４）：６３８−４２，２００２参照）が挙げられる。
【０００３】
リン酸エステルに未置換硫黄原子を導入するために利用できる試薬の選択肢の多さと対照的に、保護された硫黄でＨ−ホスホン酸エステルを硫化することを可能にする基の範囲は限られている（例えば、Ｄｒｅｅｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｌｅｔｔ．４８１−４８３，１９９０、米国特許第６，５０６，８９４号明細書）。実際、各ステップでクロマトグラフィー精製を用いたオリゴヌクレオチドの液相合成中のこの反応では、シアノエチルスルフィド基だけが広範に使用されてきた。その内容が参照により本特許出願に組み込まれる、本出願人の名における特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７９０２号明細書には、新規な硫化剤、これらの製造方法ならびにこれらの、Ｈ−ホスホン酸エステル法による溶液中ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの経済的で便利な合成及び精製における使用が開示されている。オリゴヌクレオチドの液相合成における重大な問題は、特にクロマトグラフィーを避けて、簡単な精製を容易にする形態で高純度生成物を与える各合成ステップにおける優れた特異性によって、高い基質転換を得る必要性に関連する。経済的な液相合成を可能にする方法がないため、液相技術は、商業規模のオリゴヌクレオチド合成に現時点で用いられないと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明により、新規な硫化剤を用いることによってオリゴヌクレオチドを合成する新規な方法が提供され、特に溶液中のオリゴヌクレオチドの経済的で効率的な合成及び精製が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は特に、オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、オリゴヌクレオチドの前駆体の少なくとも１つのリンインターヌクレオチド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を硫化するために、一般式（Ｉ）：
【化１】
2013531665.tif 000003
（式中、
Ｒは、環状炭素原子を介してＳ−原子に結合しているアリール基及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｒ1及びＲ2は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１−Ｃ２０、任意に不飽和又は芳香族の炭化水素残基である）
の硫化剤を用いるステップを含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、特に、好ましくはＨ−ホスホン酸エステル法によって行われるオリゴヌクレオチドの合成において、既存のＰ−Ｓ結合形成法を上回るいくつかの利点を有する。例えば、新規な試薬によって、例えば、オリゴヌクレオチドへ転移される残基Ｒは、オリゴヌクレオチドの結晶化又は沈殿を促進することができ、最低限のクロマトグラフィー又はそれなしで生成物の簡単な精製を可能にする。特に溶液中でオリゴヌクレオチドを合成するための経済的な方法を開発する際の重要な要因は、オリゴヌクレオチド鎖伸長の各ステップにおける転換生成物の精製である。本発明による方法は、生成物の高い収率及び純度を確保するにもかからず、各伸長サイクルは、一般に３つのステップを含み、さもなければ途中で蓄積する少量の不純物でさえも除去することが有利である。多数のステップのために、各ステップにおけるクロマトグラフィーの使用は、実際的な大規模のオリゴヌクレオチド合成において経済的に実行可能でないことがある。
【０００７】
本発明のフレームにおいて、「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に、核酸塩基に連結された糖単位を含む、インターヌクレオチド結合によって連結されているヌクレオシド単量体単位のオリゴマーを意味する。「インターヌクレオチド結合」は、特に、２つのヌクレオシド部分間の化学的結合、例えば、典型的には自然に見出される核酸中に存在しているホスホジエステル結合、又は典型的には合成核酸及び核酸アナログ中に存在している他の結合を指す。このようなインターヌクレオチド結合は、例えば、ホスホ又はホスファイト基を含んでもよく、ホスホ又はホスファイト基の１個以上の酸素原子が、置換基で修飾、あるいは別の原子、例えば、硫黄原子、又はモノ−アルキルアミノ基もしくはジ−アルキルアミノ基の窒素原子で置き換えられている結合を含んでもよい。典型的なインターヌクレオチド結合は、リン酸又はその誘導体のジエステル、例えば、リン酸エステル、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、ホスホルアミデート、チオホスホルアミデートである。
【０００８】
「ヌクレオシド」という用語は、特に、糖に連結した核酸塩基からなる化合物を意味すると理解される。糖としては、限定されるものではないが、フラノース環、例えば、リボース、２’−デオキシリボース及び非フラノース環、例えば、シクロヘキセニル、アンヒドロヘキシトール、モルホリノが挙げられる。ヌクレオシドに含まれる糖の以降に示される修飾、置換及び位置は、フラノース環に関して検討されるが、同じ修飾及び位置は、他の糖環の類似の位置にも適用される。糖は追加的に修飾されていてもよい。糖の修飾の非限定的な例としては、特に、例えば、水素；ヒドロキシ；アルコキシ（メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトシキエチル、アルコキシ、フェノキシなど）；アジド；アミノ；アルキルアミノ；フルオロ；クロロ及びブロモを含むフラノシル糖環の、例えば、２’−又は３’−位、特に２’−位における修飾、２’−４’−及び３’−４’−連結フラノシル糖環修飾、例えば、Ｓ、ＣＨ2、ＮＲ、ＣＨＦ又はＣＦ2による環４’−Ｏの置換を含むフラニシル糖環における修飾を挙げることができる。
【０００９】
「核酸塩基」という用語は、特に、相補的な核酸塩基又は核酸塩基アナログと対になることができる窒素含有ヘテロ環部分を意味すると理解される。典型的な核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアミン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む天然核酸塩基、ならびに他の合成及び天然核酸塩基を含む修飾核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン、ならびにフッ素化塩基を含む天然核酸塩基である。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。他の潜在的に好適な塩基としては、普遍的塩基、疎水性塩基、入り交ざった（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基及びサイズ拡大塩基が挙げられる。
【００１０】
「オリゴヌクレオチド」は典型的には、約２から約５０の連続サブユニットを有するヌクレオシドサブユニットポリマーを指す。ヌクレオシドサブユニットは、様々なサブユニット間結合によって連結され得る。さらに、「オリゴヌクレオチド」は、糖骨格（例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート）、糖（例えば、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅなどの２’置換基）、塩基、ならびに３’及び５’末端に対する、当業者に公知の修飾を含む。典型的には、本発明において、オリゴヌクレオチドは、２から３０のヌクレオチドを含む。好ましくは、それは、３から３０のヌクレオチドを含む。本発明の異なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−置換リボヌクレオシド、２’，−４’−ロックド−リボヌクレオシド、３’−アミノ−リボヌクレオシド、３’−アミノ−２’−デオキシリボヌクレオシドから選択されるヌクレオシドを包含する。
【００１１】
「アリール基」という用語は、特に、６から２４個の炭素原子、好ましくは６から１２個の炭素原子を含む芳香族炭素環系を意味することが意図される。アリール基は、非置換であっても、例えば、アリールもしくはヘテロアリール、アルキル基、シクロアルキル、又は官能基で置換されていてもよい。好ましくは、アリール基は、アルキル又はハロゲンで４位において置換されている。
【００１２】
「ヘテロアリール」という用語は、特に、そのうちの少なくとも１個がヘテロ原子である、５から２４個の原子、好ましくは５から１２個の原子を含む芳香族炭素環系を意味することが意図される。ヘテロ原子は、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選択されることが多い。それは、より多くの場合Ｎ、Ｏ及びＳから選択される。
【００１３】
「アルキル基」という用語は、特に、１から２０個の炭素原子、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐のアルキル置換基を意味することが意図される。このような置換基の具体的な例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル及びベンジルである。
【００１４】
「シクロアルキル基」という用語は、特に、３から１０個の炭素原子、好ましくは５、６又は７個の炭素原子を含む少なくとも１つの飽和炭素環を含む置換基を意味することが意図される。このような置換基の具体的な例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルである。
【００１５】
「官能基」という用語は、特に、ヘテロ原子を含む又はそれからなる置換基を意味することが意図される。ヘテロ原子は、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｓｎ、Ａｓ及びＳｅならびにハロゲンから選択されることが多い。それは、より多くの場合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びハロゲン、特にハロゲンから選択される。
【００１６】
官能基は、一般に１，２、３、４、５又は６個の原子を含む。
【００１７】
官能基として、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、メルカプト基、アミノ基、ニトロ基、カルボニル基、アシル基、任意選択的にエステル化されたカルボキシル基、カルボキサミド基、尿素基、ウレタン基、及びカルボニル基を有する上述の基のチオール誘導体、ホスフィン、ホスホネート又はホスフェート基、スルホキシド基、スルホン基ならびにスルホネート基を挙げることができる。
【００１８】
「有機残基」という用語は、特に、ヘテロ原子、例えば、特にホウ素、ケイ素、窒素、酸素又は硫黄原子及びハロゲン原子を有し得る直鎖又は分岐のアルキル又はアルキレン基、シクロアルキル基、ヘテロ環ならびに芳香族系を意味することが意図される。有機残基は、二重結合又は三重結合、及び官能基を有していてもよい。
【００１９】
有機残基は、少なくとも１個の炭素原子を含む。それは、少なくとも２個の炭素原子を含むことが多い。それは、好ましくは少なくとも３個の炭素原子を含む。より特に好ましくは、それは、少なくとも５個の炭素原子を含む。
【００２０】
有機残基は、一般に最大１００個の炭素原子を含む。それは、最大５０個の炭素原子を含むことが多い。それは、好ましくは最大４０個の炭素原子を含む。より特に好ましくは、それは、最大３０個の炭素原子を含む。
【００２１】
「アルキレン基」又は「シクロアルキレン基」という用語は、特に、上に定義されたとおりのアルキル又はシクロアルキル基から誘導される二価の基を意味することが意図される。
【００２２】
有機残基が、１つ又は任意選択的により多くの二重結合を有する場合、それは、多くの場合２から２０個の炭素原子、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の炭素原子を含むアルケニル又はシクロアルケニル基から選択される。このような基の具体的な例は、ビニル、１−アリル、２−アリル、ｎ−ブタ−２−エニル、イソブテニル、１，３−ブタジエニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル及びスチリルである。
【００２３】
有機残基が、１つ又は任意選択的により多くの三重結合を有する場合、それは、多くの場合２から２０個の炭素原子、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の炭素原子を含むアルキニル基から選択される。このような基の具体的な例は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、ｎ−ブタ−２−イニル及び２−フェニルエチニルである。
【００２４】
有機残基が、１つ又は任意選択的により多くの芳香族系を有する場合、それは、多くの場合６から２４個の炭素原子、好ましくは６から１２個の炭素原子を含むアリール又はアルキルアリール基である。このような基の具体的な例は、フェニル、１−トリル、２−トリル、３−トリル、キシリル、１−ナフチル及び２−ナフチルである。
【００２５】
「ヘテロ環」という用語は、特に、その少なくとも１個がヘテロ原子である、３、４、５、６、７又は８個の原子から構成される少なくとも１つの飽和又は不飽和環を含む環系を意味することが意図される。ヘテロ原子は、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選択されることが多い。それは、より多くの場合Ｎ、Ｏ及びＳから選択される。
【００２６】
このようなヘテロ環の具体的な例は、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、ペルヒドロキノリン、ペルヒドロイソキノリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、イミダゾリン、チアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピラン、テトラヒドロピラン及びジオキサンである。
【００２７】
以上に定義されたとおりの有機残基は、非置換であっても、官能基で置換されていてもよい。本明細書で先に示された官能基に対する同じ定義が同様に適用されることが理解される。
【００２８】
本発明による方法の好ましい実施形態において、Ｒは、非置換又は置換フェニル基であり、好ましくは、Ｒは、ハロフェニル又はアルキルフェニルである。Ｒは、特に４−ハロフェニル基又は４−アルキルフェニル基、一般には４−（Ｃ1−Ｃ4−アルキル）フェニル基であり；Ｒは、より好ましくは４−ハロアルキル基であり、特に４−クロロフェニル基であり；Ｒ1及びＲ2は、独立に、Ｃ１−Ｃ２０の飽和、不飽和、ヘテロ環式又は芳香族の炭化水素残基である。
【００２９】
上述のとおり、Ｒ1及びＲ2は、同じか又は異なることができる。
【００３０】
Ｒ1が飽和炭化水素残基である場合、それは、好ましくは直鎖、分岐又は環状のアルキル残基から選択される。Ｒ1は、例えば、独立に、低級アルキル又はシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）残基から選択され得る。特定の飽和炭化水素残基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ．ブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル又はｎ−プロピル基が好ましい。メチル基が、より特に好ましい。Ｒ1が芳香族残基である場合、それは、好適には５から１４個の原子を有する芳香族系から選択される。特定の芳香族残基は、そのフェニル基が、例えば、アリールもしくはヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環又はヘテロ置換基、例えば、ハロゲン、アミン、エーテル、カルボキシレート、ニトロ、チオール、スルホン酸及びスルホンで置換され得る、フェニル及びナフチル基から選択される。また、ナフチル基は、例えば、アリールもしくはヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、又はヘテロ置換基、例えば、ハロゲン、アミン、エーテル、カルボキシレート、ニトロ、チオール、スルホン酸及びスルホンで置換されていることもできる。Ｒ1が芳香族残基である場合、フェニル基が好ましい。
【００３１】
Ｒ1がヘテロ環残基である場合、それは、環状炭素原子を介してＮに結合している少なくとも１個の環状Ｎ、Ｏ又はＳ原子を有するヘテロ環から選択されることが多い。このようなヘテロ環残基の特定の例としては、ピリジン及びフランが挙げられる。
【００３２】
Ｒ2が飽和炭化水素残基である場合、それは、好ましくは直鎖、分岐又は環状のアルキル残基から選択される。Ｒ2は、例えば、独立に、低級アルキル又はシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）残基から選択され得る。特定の飽和炭化水素残基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ．ブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル又はｎ−プロピル基が好ましい。メチル基が、より特に好ましい。Ｒ2が芳香族残基である場合、それは、好適には５から１４個の原子を有する芳香族系から選択される。特定の芳香族残基は、そのフェニル及びナフチル基が、例えば、アリールもしくはヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環又はヘテロ置換基、例えば、ハロゲン、アミン、エーテル、カルボキシレート、ニトロ、チオール、スルホン酸及びスルホンで置換され得る、フェニル及びナフチル基から選択される。Ｒ2が芳香族残基である場合、フェニル基が好ましい。
【００３３】
好ましい実施形態において、Ｒ1及びＲ2は、同一であり、かつメチルを意味する。
【００３４】
Ｒ2がヘテロ環残基である場合、それは、環状炭素原子を介してスルホニル基（Ｓ（Ｏ）2）に結合している少なくとも１個の環状Ｎ、Ｏ又はＳ原子を有するヘテロ環から選択されることが多い。このようなヘテロ環残基の特定の例としては、ピリジン及びフランが挙げられる。
【００３５】
特定の態様において、Ｒ2は、式（ＩＩ）
【化２】
2013531665.tif 000004
（式中、Ｒx及びＲｙは、独立に、アルキル又は（ヘテロ）アリールから選択される）に相当する。好ましくはＲx及び／又はＲyは、アルキル基である。この場合、Ｒx及び／又はＲyは、例えば、低級アルキル又はシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）残基から選択される。特定のアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ  ブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル又はｎ−プロピル基が好ましい。特定の好ましい態様において、Ｒx及びＲｙは、両方とも、特に前に本明細書で定義されたとおりのアルキル基である。Ｎ，Ｎ−ジメチル又はＮ，Ｎ−ジエチル基がより特に好ましい。この実施形態の別の態様において、Ｒx及びＲyは、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される追加の環状ヘテロ原子を任意選択的に有する３から８員環を一緒に形成する。特定の例としては、Ｎ−ピペリジル又はＮ−ピロリジル基が挙げられる。
【００３６】
記載の置換基は、例えば、ハロゲンもしくはアルコキシ置換基で任意選択的に置換されていてもよいか、又はそれらは、例えば、カテナリーヘテロ原子（ｃａｔｅｎａｒｙ  ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍｓ）、特に酸素をアルキル鎖中へ含むことによって修飾されていてもよいことも理解される。
【００３７】
本発明による硫化剤は、特に、オリゴヌクレオチド中式Ｐ−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒは、上に記載されたとおりである）のＳ−保護ホスホルチオエートインターヌクレオチド結合を形成するために、特に効率的な硫黄転移を可能にする。本発明による硫化剤は、それから保護基が選択的かつ効率的に開裂され得る保護硫黄を導入する。
【００３８】
本発明による方法において、硫化剤と硫化されるリンインターヌクレオチド結合の量とのモル比は、一般に少なくとも１．０、多くの場合１．０から４．０、より多くの場合１．０から２．０、好ましくは１．０５から２．０である。
【００３９】
本発明の特定の態様は、オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、オリゴヌクレオチドの前駆体の少なくとも１つのリンインターヌクレオチド結合を硫化するために、一般式（Ｉ）：
【化３】
2013531665.tif 000005
（式中、
Ｒは、アリール基及びヘテロアリール基からなる群から選択され；これは、環状炭素原子を介してＳ−原子に結合しており、
Ｒ1及びＲ2は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１−Ｃ２０、任意に不飽和又は芳香族の炭化水素残基である）
の硫化剤の溶液を用いるステップを含む方法に関する。
【００４０】
本発明による方法で用いられる硫化剤についての上記の定義及び選択は、硫化剤が溶液中にある場合に同様に適用される。
【００４１】
本発明の目的上、「溶液」という用語は、溶媒として知られる別の物質中に溶解した、溶質として知られる１種以上の物質、特に硫化剤からなる均一混合物を意味することが意図される。
【００４２】
本発明の目的上、均一混合物は、互いに視覚的に区別ができない２種以上の化合物の混合物である。
【００４３】
本発明の目的上、「硫化剤の溶液」は、特に、有機溶媒（「有機溶液」）又はこの混合物から選択される溶媒中の硫化剤の溶液を意味することが理解される。
【００４４】
用いられる有機溶媒は、例えば、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むアミド溶媒などの窒素含有溶媒；例えば、ピリジンを含むＮ−ヘテロ環溶媒；例えば、アセトニトリルを含むニトリル溶媒；ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素タイプの溶媒；例えば、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及びクロロホルムを含む塩素化炭化水素溶媒などのハロゲン化炭化水素タイプの溶媒、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）及び酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステルならびにジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びＭＴＢＥなどのエーテルから選択され得る。好ましくは、有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素溶媒、ピリジン及びアセトニトリルから選択される。好ましくは、硫化剤は、ハロゲン化炭化水素溶媒中に溶解される。より好ましくは、有機溶媒は、塩素化炭化水素タイプの溶媒から選択される。良好な結果は、ジクロロメタンによって得られる。
【００４５】
驚くべきことに、硫化剤は、有機溶媒中に効率的に溶解され、それにより濃有機溶液を与え得ることが見出された。その結果として、有機溶媒のより低い消費は有利にも、本発明の方法を、より経済的でかつ環境的により優しく、より安全にする。
【００４６】
本発明による方法において、溶液中の硫化剤含有量は、一般に硫化剤及び有機溶媒の合計質量に対して１質量％に等しいか又は少なくとも１質量％である。好ましい実施形態において、硫化剤含有量は、硫化剤及び非プロトン性極性有機溶媒の合計質量に対して１質量％に等しいか又は少なくとも１質量％である。一部の実施形態において、溶液中の硫化剤含有量は、硫化剤及び好ましくは非プロトン性極性有機溶媒である有機溶媒の合計質量に対して１質量％を超える。硫化剤含有量は、２０質量％以上であることが多い。好ましくは硫化剤含有量は、４０質量％以上である。溶液中の硫化剤含有量は、一般に硫化剤及び好ましくは非プロトン性極性有機溶媒である有機溶媒の合計質量に対して最大６０質量％である。具体的な好ましい実施形態において、本発明による方法で用いられる硫化剤は、ハロゲン化炭化水素溶媒、特に塩素化炭化水素溶媒、例えば、塩化メチレン中に溶解され、ハロゲン化炭化水素溶媒中硫化剤含有量は、前に本明細書で記載されたとおりである。
【００４７】
本発明による方法において、前駆体のリンインターヌクレオチド結合は、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから選択される２つの反応物質間のカップリング反応によって形成される。このようなカップリング反応に関する情報は、例えば、特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７９０２号明細書に見出すことができ、及び以下の実施例で例証することができる。
【００４８】
したがって、本発明は、別の具体的な態様において、以下のステップ、すなわち、
（ａ）前駆体のリンインターヌクレオチド結合が、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから選択される２つの反応物質間で形成されるカップリングステップ、及び
（ｂ）上に記載されたとおりの式（Ｉ）の硫化剤が、リンインターヌクレオチド結合を硫化するために用いられる硫化ステップ
を含むオリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。
【００４９】
本明細書で記載される本発明の最も好ましい態様において、リンインターヌクレオチド結合は、Ｈ−ホスホン酸ジエステル結合である。
【００５０】
前記合成方法のステップ（ａ）は、好ましくはＨ−ホスホン酸モノエステル塩を、遊離ヒドロキシ基を有する保護ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとカップリングさせることによってＨ−ホスホン酸ジエステル結合を形成するステップを含む。カップリングは、好ましくは液相で行われる。
【００５１】
ステップ（ａ）は、好ましくは非プロトン性極性有機溶媒、例えば、ハロゲン化溶媒又は窒素含有溶媒、より具体的にはＮ−ヘテロ環溶媒又は塩素化炭化水素、さらにより具体的にはアセトニトリル及びピリジン、好ましくはピリジン中で行われる。Ｈ−ホスホン酸ジエステルを形成する反応は、好ましくはカルボン酸ハライド、特に塩化ピバロイルによって活性化される。
【００５２】
ステップ（ａ）は、一般に−４０℃から３０℃、好ましくは０℃から２０℃の温度で行われる。
【００５３】
本発明による工程であるステップ（ａ）において、及びこの特定の実施形態において、液体反応媒体は、一般に反応媒体の合計質量に対して少なくとも１０質量％のＨ−ホスホン酸オリゴヌクレオチドを含有する。好ましくは、この含有量は、少なくとも２０質量％である。液体反応媒体は、一般に反応媒体の合計質量に対して最大５０質量％のＨ−ホスホン酸オリゴヌクレオチドを含有する。
【００５４】
ステップ（ａ）のカップリング生成物、特にＨ−ホスホン酸エステルは、単離され、その後にステップ（ｂ）で硫化され得る。それはまた、好ましくはステップ（ｂ）で単離なしに用いられ得る。形成されたジエステルの硫化は、好適には上記されたとおりの適当な溶媒中に溶解させて、又は反応混合物から形成されたジエステルを予備精製した後に、硫化反応剤のその場の（ｉｎ−ｓｉｔｕ）添加によって行われ得る。
【００５５】
ステップ（ｂ）は、好ましくは非プロトン性極性有機溶媒、例えば、ハロゲン化炭化水素溶媒、特に塩化メチレンなどの塩素化炭化水素溶媒を含む溶媒中で行われる。特定の態様において、ステップ（ｂ）は、ハロゲン化炭化水素溶媒及び窒素含有溶媒、より具体的にはＮ−ヘテロ環溶媒、好ましくはピリジンを含む溶媒混合物中で行われる。とくにステップ（ａ）のカップリング生成物が単離なしで硫化される場合、ピリジン／塩化メチレン混合物が、より特に好ましい。
【００５６】
ステップ（ｂ）は、一般に−４０℃から３０℃、好ましくは０℃から２０℃の温度で行われる。
【００５７】
ステップ（ｂ）において、硫化剤と硫化されるインターヌクレオチド結合の量とのモル比は、一般に少なくとも１、多くの場合１．５から４．０、好ましくは２．０から３．０である。
【００５８】
一実施形態において、ステップ（ｂ）では、硫化剤と硫化されるリンインターヌクレオチド結合の量とのモル比は、一般に少なくとも１、多くの場合１．０から４．０、好ましくは１．０から２．０、非常に好ましくは１．０５から２である。
【００５９】
非常に満足いく結果は、前記硫化剤と、インターヌクレオチド結合の、及びリンインターヌクレオチド結合の量とのモル比が、それぞれ、１．０から２．０の好ましい範囲にある場合にも得ることができる。
【００６０】
ステップ（ｂ）において、中間体Ｈ−ホスホン酸ジエステルは、好ましくは活性剤、特に塩基によって活性化される。好適な塩基としては、アルキルアミン、特に第三級アルキルアミンが挙げられ、ジイソプロピルエチルアミンが好ましい。本発明の第２の特定の目的は、上に記載されたとおりの硫化剤の合成のためのプロセスであって、（ａ）ハロゲン化スルフリル、好ましくは塩化スルフリルを、式Ｒ−Ｓ−Ｈ（式中、Ｒは、アリール、アルキルアリール、ハロアリール、ニトロアリール、アルコキシアリールからなる群から選択される芳香族である）のチオールと反応させて、式Ｒ−Ｓ−Ｗ（式中、Ｒは、上に記載されたとおりであり、Ｗは、ハロゲン、好ましくはＣｌである）の中間体生成物を生成させるステップ、及び（ｂ）前記中間体生成物を式Ｒ1−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は、独立に、有機残基、好ましくはＣ１−Ｃ２０の、任意選択的に不飽和又は芳香族の炭化水素残基である）のＮ−スルホニル化合物と反応させるステップを含むプロセスに関する。
【００６１】
硫化剤は、上に記載されたとおりのオリゴヌクレオチドを合成する方法で用いられ得る。本発明による方法について上に記載された定義及び選択は、本発明のプロセスに同様に適用される。特に、Ｒは、好ましくはハロフェニル、より好ましくは４−ハロフェニル、特には４−クロロフェニルである。Ｒ1及びＲ2は、好ましくは低級アルキルもしくはシクロアルキル（Ｃ１−Ｃ７）、置換フェニルを含むフェニル及びナフチル基、より好ましくはメチル基から選択される。また、ナフチル基は、置換されていてもよい。フェニル及びナフチル基の好ましい任意選択的な置換基は、上述のとおりである。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ2は、メチルである。
【００６２】
硫化剤の合成のための本発明によるプロセスにおいて、ステップ（ａ）の反応は、一般に非プロトン性有機溶媒、例えば、ハロゲン化溶媒など、特に四塩化炭素などの塩素化溶媒中で行われる。
【００６３】
硫化剤の合成のための本発明によるプロセスにおいて、ステップ（ａ）の反応は、一般に−８０℃から３０℃の温度で行われる。
【００６４】
硫化剤の合成のための本発明によるプロセスにおいて、ステップ（ｂ）の反応は、一般に非プロトン性極性有機溶媒、例えば、ハロゲン化炭化水素溶媒など、特に塩化メチレンなどの塩素化炭化水素溶媒中で行われる。
【００６５】
硫化剤の合成のための本発明によるプロセスにおいて、ステップ（ｂ）の反応は、一般に−２０℃から５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で行われる。
【００６６】
第３の態様において、本発明は、前に本明細書で記載されたとおりの本発明の方法によって得られるオリゴヌクレオチドを精製する方法に関する。この態様の一実施形態において、この方法は、オリゴヌクレオチドを沈殿させるステップを含む。より具体的な実施形態において、この方法は、特に沈殿ステップから回収された固体物質から、溶媒によってオリゴヌクレオチドを抽出するステップをさらに含む。抽出のための好適な溶媒としては、極性有機溶媒が挙げられる。
【００６７】
この精製は、記載された方法によって得られる保護オリゴヌクレオチドの沈殿と抽出との技術を組み合せることによって有効に行われ得ることが見出された。沈殿の正確な条件は、オリゴヌクレオチドの所与の配列及び長さによって決定され得る。沈殿法は、一般に（ａ）オリゴヌクレオチドを極性有機溶媒に溶解させるステップ及び（ｂ）溶液が混濁するまで非極性有機溶媒を加えるステップを含む。
【００６８】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、一般に沈殿によって単離及び精製され得ることが見出された。
【００６９】
ステップ（ａ）においてオリゴヌクレオチドを溶解させるために用いられる溶媒は、好ましくは塩化メチレン及びクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、アセトニトリル及びピリジンなどの窒素含有溶媒、ならびにアセトンなどのカルボニル含有溶媒から選択される。
【００７０】
一般に、ステップ（ａ）において、溶媒容量は、約０．５（ｎ＋１）ｍＬから約２．０（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約１．０（ｎ＋１）ｍＬ（ここで、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲で用いられる。
【００７１】
オリゴヌクレオチドの溶液は、溶液が混濁するまで、好ましくは炭化水素、例えば、ヘキサンなどのアルカン溶媒、１種又は複数種のエーテル溶媒、特にＭＴＢＥ、及びこれらの混合物、例えば、好ましくはヘキサン／ＭＴＢＥ混合物から選択される非極性有機溶媒で処理される。別の特定の実施形態において、混濁溶液はその後、沈殿助剤で処理される。
【００７２】
この場合、沈殿助剤は、一般に不活性多孔質固体から選択され、好ましくはセライト、チャコール、木材セルロース、及びシリカ又はアルミナなどのクロマトグラフィー固定相から選択される。セライトは、珪藻土としても知られている。
【００７３】
この場合、沈降助剤は、一般に約０．２５（ｎ＋１）ｇから約１．５（ｎ＋１）ｇ、好ましくは約０．７５（ｎ＋１）ｇ（ここで、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲の量で用いられる。
【００７４】
好ましくは、沈殿助剤を添加後、混合物は、前に本明細書で記載されたとおりの非極性溶媒の第２の部分で処理される。部分の容量は、一般に約１（ｎ＋１）ｍＬから約４（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約２．０（ｎ＋１）ｍＬ（ここで、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲である。
【００７５】
沈殿後、特に沈殿助剤が用いられる場合、得られた混合物は、一般に、例えば、好ましくは濾過などの固／液分離操作にかけられる。好ましくは、沈殿ステップで得られる固体物質は、ろ別及び洗浄される。オリゴヌクレオチドは一般に、固／液分離操作から回収される固体から、特に溶媒、特に、好ましくはアセトンなどのカルボニルタイプの溶媒、アセトニトリルなどの窒素含有溶媒又はホルムアミドタイプの溶媒、テトラヒドロフランなどの極性エーテル、塩化メチレン及びクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、又は脂肪族アルコールで抽出することによって沈殿助剤から回収される。極性有機溶媒は、好ましくはアセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び脂肪族アルコールから選択される。
【００７６】
上記沈殿処理から得られるオリゴヌクレオチドは、有機溶媒と水との間に分配することによってさらに精製され得る。このステップは通常、生成物から、水層に溶解する極性不純物を分離する。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好適には有機溶媒、特にアセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び脂肪族アルコールから選択される極性有機溶媒に溶解される。この実施形態において、溶媒は、好ましくは、好ましくはアセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＦ、及び脂肪族アルコールから選択される極性有機溶媒と、水性媒体との混合物を含む。
【００７７】
用いられる有機溶媒の容量は、一般に２．０（ｎ＋１）ｍＬから８．０（ｎ＋１）ｍＬ、好ましくは約４．０（ｎ＋１）ｍＬ（ここで、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である）の範囲である。溶液は、水性媒体、特に水で処理される。用いられる水性媒体の容量は、一般に有機溶媒の約０．５容量当量から有機溶媒の約１．５容量当量、通常は有機溶媒の約０．７容量当量である。水性媒体で処理後、オリゴヌクレオチド含有層は、一般に分離され、必要に応じてさらに処理されて、精製オリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００７８】
一般に、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合上の保護Ｒ基の開裂は、オキシム化処理（ｏｘｉｍａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって行われ得る。アルドキシムの好適な例は、例えば、Ｅ−２−ニトロベンズアルドキシム、Ｅ−４−ニトロベンズアルドキシム及びｓｙｎ−ピリジン−２−カルボキサルドキシムから選択される。前記開裂は、一般にホスホジエステルインターヌクレオチド結合をもたらす。
【００７９】
したがって、本発明による方法は、少なくとも１つのホスホジエステルインターヌクレオチド結合を含むオリゴヌクレオチドの製造に特に有用である。
【００８０】
参照により本明細書に組み込まれる特許、特許出願、及び刊行物のいずれかの開示が、用語を不明瞭にし得る程度に本出願の記載と矛盾する場合は、本記載が優先するものとする。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を例証することが意図されるが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８２】
これらの実施例において及び本明細書を通して、用いられる略語は、以下のとおりに定義される。
【００８３】
ＣＨ2Ｃｌ2は、ジクロロメタンであり、ＤＩＰＥＡは、ジイソプロピルエチルアミンであり、ＭＴＢＥは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、ＨＣｌは、塩酸であり、Ｎａ2ＳＯ4は、硫酸ナトリウムであり、Ｎ2は窒素であり、ＳＯ2Ｃｌ2は、塩化スルフリルであり、ＮａＨＣＯ3は、炭酸水素ナトリウムであり、ＣＤＣｌ３は、重水素化クロロホルムであり、ＴＨＦは、テトラヒドロフランであり、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドであり、ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００８４】
Ａｐ、Ｇｐ，Ｔｐは、それぞれ、前述のとおりのＡ、Ｇ及びＴ核酸塩基に結合した、前述のとおりの２−デオキシリボース核酸塩基であり、ここで、Ａ、Ｇ及びＴは、以下のとおりに保護される：
【００８５】
ＤＭＴｒは、それに結合される場合、前述のとおりの対応するオリゴヌクレオチドの５−Ｏ’に結合した、当業者に知られているビスパラ−メトキシトリチル保護基である。Ｌｅｖは、前述のとおりの対応するオリゴヌクレオチドの３−Ｏ’に結合した、当業者に知られているペンタン１，４−ジオン保護基である。
【００８６】
実施例１：４−（クロロフェニル）−（Ｎ，Ｎ−メチル−メシル）−スルフェンアミドの合成
【化４】
2013531665.tif 000006
（ａ）４−クロロベンゼンスルフェニルクロリド２の調製
１７０ｍＬの無水四塩化炭素中４−クロロチオフェノール、１（２０．１５ｇ、０．１３９ｍｏｌ）の溶液を、磁気撹拌機、熱電対、添加漏斗、窒素ライン、加熱マントル、凝縮器、及び酸性ガス（ＳＯ2及びＨＣｌ）を吸収する苛性スクラバーを備えた０．５Ｌの三つ口丸底フラスコに入れた。この溶液に触媒量のピリジン（３ｍＬ）を加え、フラスコの内容物を約１０℃に冷やした。塩化スルフリル（５５．２ｇ、０．４０９ｍｏｌ）を１の溶液にゆっくり加え、反応混合物を３時間穏やかに還流させた。得られた赤色の溶液を室温に冷却し、ガラスウールを通して急速に濾過し、ロータリエバポレータで濃縮して、粘性の赤色油として２３ｇの４−クロロベンゼンスルフェニルクロリド、２を得た。この粗物質を４の調製に直ちに用いた。
【００８７】
（ｂ）４−クロロフェニル−（Ｎ，Ｎ−メチル−メシル）−スルフェンアミド（４）
粗Ｎ−メチル−メシルアミン、３（１６．６ｇ、０．１５２ｍｏｌ）を、１Ｌの一口丸底フラスコに入れ、ロータリエバポレータで無水アセトニトリル（１×１５０ｍＬ）とともに共蒸発させた。残渣を１２０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、この溶液に無水ピリジン（１４．５ｇ、０．１８３ｍｏｌ）及び１２ｇのモレキュラーシーブを加えた。フラスコは、熱電対、磁気撹拌機、窒素ライン及び冷却用氷浴を備えていた。フラスコの内容物を１０分間撹拌し、次いで、約０℃に冷やした。
【００８８】
８０ｍＬの無水ジクロロメタン中粗４−クロロベンゼンスルフェニルクロリド、２の溶液を、アミン３が入っているフラスコ中にゆっくりと導入し、それにより、温度を約０℃に維持した。添加を終了後、冷却用浴を取り除き、得られた濁った無色の混合物を周囲温度で一晩撹拌した。
【００８９】
反応を、冷飽和重炭酸水素ナトリウム溶液（０．４Ｌ）でクエンチし、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ロータリエバポレータで濃縮後、合計で４０ｇの暗色油を得た。この油を最少量のジクロロメタン（約２０ｍＬ）に再溶解させ、短い（約２ｃｍ）のシリカゲルパッドによって濾過した。このパッドを、ＭＴＢＥ−ヘキサン＝１：１の混合物（約１Ｌ）で洗浄した。ろ液の濃縮後、オフホワイトの半固体を得た。この残渣に、ＭＴＢＥ−ヘキサン＝１：２の混合物（約０．５Ｌ）を加え、得られた懸濁液を氷上で冷やした。沈殿物を濾過し、最初にＭＴＢＥとヘキサンとの冷混合物（１：２；５０ｍＬ）、次いでヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、続いて恒量が得られるまで乾燥させた。所望の化合物４を、白色の結晶固体として７５％収率（２４．２４ｇ）で得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、δ）：７．３８（ｍ、４Ｈ）、３．３２（ｓ、３Ｈ）、３．００（ｓ、３Ｈ）
13Ｃ  ＮＭＲ  ＡＰＴ（ＣＤＣｌ3、δ）：１３４．６４（ｕｐ）、１３４．３２（ｕｐ）、１２９．４５（ｄｏｗｎ）、１２８．６３（ｄｏｗｎ）、４２．０２（ｄｏｗｎ）、３７．９１（ｄｏｗｎ）。
【００９０】
実施例２：異なる硫化剤を用いるＤＭＴｒＯ−Ｔｐ（ｓ）Ｔ−Ｌｅｖの調製
【化５】
2013531665.tif 000007
６０ｍＬのピリジン中トリエチルアンモニウム５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−チミジン−３’−Ｈ−ホスホネート（４．２６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）及び３’−Ｏ−レブリニルチミジン（１．７０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液を、蒸発乾固させた。残渣に、無水ピリジン（１２．５ｍＬ）を加え、得られた溶液をアルゴン下０℃で撹拌した。塩化ビバロイル（１．２４ｍＬ、１０．０ｍｏｌ）を３分間かけてゆっくりと加えた。この混合物を０℃で５分間さらに撹拌した。無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）又は無水ピリジン中６ｍｍｏｌの硫化剤（それぞれの硫化剤及び用いた量は、表１に示す）の溶液、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を２分間かけて加えた。冷浴を取り除き、混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。反応混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、冷水（１００ｍＬ）、続いて飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、濃縮した。残渣を１０ｍＬのジクロロメタン及び０．１ｍＬのトリエチルアミン中に溶解させ、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝２：１、１６ｍＬ）、続いてセライト（７．５ｇ）を撹拌下１５分間かけてゆっくりと加えた。混合物を撹拌し、追加の溶液Ａ（１６ｍＬ）を１５分かけてゆっくりと加えた。３０分間さらに撹拌後、混合物を濾過した。その固形物をＣＨ2Ｃｌ2／溶液Ａ、１：４ｖ／ｖの混合物（５０ｍＬ×２）で洗浄した。次いで、固形物をジクロロメタン（５０ｍＬ×３）で洗浄した。ジクロロメタンろ液を濃縮した。残渣を４０ｍＬのアセトニトリル中に溶解させ、氷−水浴中で撹拌し、次いで、水（３６ｍＬ）を２０分間かけて加えた。底部の有機層を、ジクロロメタン（８０ｍＬ）と、飽和炭酸水素ナトリウム（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）の混合物との間で分離及び分配した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、濃縮して、白色固体として所望の生成物を得た。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２３．３、２３．２。結果を表１にまとめる。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
実施例３：以下のスキームに示すとおりの５’−ＯＨ完全保護三量体の完全脱保護
【化６】
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完全保護三量体１（７．０９ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加ピリジンの蒸発によって無水にさせる。残渣に、１，２，４−トリアゾール（６９０．７ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、４Åモレキュラーシーブ（２．０ｇ）及び無水ピリジン（２５．０ｍＬ）を加える。この混合物を撹拌し、Ｎ2下０℃に冷却し、ｔｅｒｔ−ブチルアミン（２．１９ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を加える。次いで、得られた混合物を室温で４時間撹拌する。この溶液に、ｓｙｎ−２−ピリジンアルドキシム（２．４４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、続いて、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（６．０９ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）を加える。室温で１５時間撹拌後、モレキュラーシーブを濾過し、ピリジン（１０．０ｍＬ）で洗浄する。ろ液を濃縮する。残渣を２８％アンモニア水（２５．０ｍＬ）中に溶解させる。得られた溶液を５５℃で１５時間加熱する。冷却後、混合物を、逆（ｒｅｖｅｒｓａｌ）Ｃ１８クロマトグラフィーで濃縮及び精製する。得られた生成物を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ−１２０（ｐｌｕｓ）イオン交換樹脂（ナトリウム型）のカラム（１００ｇ）に適用する。カラムを水で溶出させ、所望の画分を合わせ、凍結乾燥させて、所望の生成物２を得る。
【国際調査報告】
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