(57)【要約】本発明は、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングのための組成物及び方法に関する。本発明の態様は、緩衝溶液中に追加濃度及び／又は増加濃度の界面活性剤を含むプライミング溶液を使用する、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングのための組成物及び方法に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
増加した濃度の界面活性剤を含有するように改質された１×ＰＣＲ緩衝液を含むプライミング溶液。
【請求項２】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約１５０倍である、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項３】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約４５倍である、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項４】
前記界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤、オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤、脂肪族アルコールエトキシレート界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、ポリエチレングリコールエステル界面活性剤、アンヒドロソルビトールエステル及びそのエトキシル化誘導体界面活性剤、脂肪酸グリコールエステル界面活性剤、カルボン酸アミド界面活性剤、モノアルカノールアミン凝縮物界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項５】
前記界面活性剤がポリソルベート界面活性剤である、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項６】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ（商標）２０である、請求項５に記載のプライミング溶液。
【請求項７】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約１．０％の範囲である、請求項６に記載のプライミング溶液。
【請求項８】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約０．３％の範囲である、請求項６に記載のプライミング溶液。
【請求項９】
前記界面活性剤がオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤である、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項１０】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００である、請求項９に記載のプライミング溶液。
【請求項１１】
色素又はマーカーを更に含む、請求項１に記載のプライミング溶液。
【請求項１２】
（ａ）増加した濃度の界面活性剤を含有するように改質された１×ＰＣＲ緩衝液を含むプライミング溶液を、少なくとも１つのマイクロチャネルを有するマイクロ流体デバイスに適用することと、
（ｂ）外圧をマイクロ流体デバイスに印加して、前記プライミング溶液を前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って推進させるか又は移動させることと、
を含む、マイクロ流体デバイスをインシステムプライミングする方法。
【請求項１３】
前記外圧を印加する前に、前記プライミング溶液を毛細管圧によって前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って流すことを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約１５０倍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約４５倍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤、オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤、脂肪族アルコールエトキシレート界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、ポリエチレングリコールエステル界面活性剤、アンヒドロソルビトールエステル及びそのエトキシル化誘導体界面活性剤、脂肪酸グリコールエステル界面活性剤、カルボン酸アミド界面活性剤、モノアルカノールアミン凝縮物界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ（商標）２０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約１．０％の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約０．３％の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記界面活性剤がオクチルフェノールエトキシレートである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プライミング溶液を、シッパーを通して前記マイクロ流体デバイスに適用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記マイクロ流体デバイスを、前記プライミング溶液を適用する前に最初にプラズマで処理する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライミング溶液は色素又はマーカーを更に含み、前記方法は、前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿う前記プライミング溶液の流れをモニタリングすることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）少なくとも１つのマイクロチャネルを有するマイクロ流体デバイスをプラズマで処理することと、
（ｂ）プライミング溶液を前記マイクロ流体デバイスに適用することと、
（ｃ）外圧を前記マイクロ流体デバイスに印加して、前記プライミング溶液を前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って推進させるか又は移動させることと、
を含む、マイクロ流体デバイスをインシステムプライミングする方法。
【請求項２７】
前記外圧を印加する前に、前記プライミング溶液を毛細管圧によって前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って流すことを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライミング溶液はＰＣＲ緩衝液である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記プライミング溶液は、増加した濃度の界面活性剤を含有するように改質された１×ＰＣＲ緩衝液である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約１５０倍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
界面活性剤の前記濃度が、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約５倍〜約４５倍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記界面活性剤が、ポリソルベート界面活性剤、オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤、脂肪族アルコールエトキシレート界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、ポリエチレングリコールエステル界面活性剤、アンヒドロソルビトールエステル及びそのエトキシル化誘導体界面活性剤、脂肪酸グリコールエステル界面活性剤、カルボン酸アミド界面活性剤、モノアルカノールアミン凝縮物界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記界面活性剤がポリソルベート界面活性剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ（商標）２０である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約１．０％の範囲である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０５％〜約０．３％の範囲である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記界面活性剤がオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プライミング溶液は色素又はマーカーを更に含み、前記方法は、前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿う前記プライミング溶液の流れをモニタリングすることを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記プライミング溶液を、シッパーを通して前記マイクロ流体デバイスに適用する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の前記濃度が約０．０８％〜約１．０％（ｖ／ｖ）の範囲である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングのための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明の態様は、緩衝溶液中に追加濃度及び／又は増加濃度の界面活性剤を含むプライミング溶液を使用する、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングのための組成物及び方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１０年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，５４３号の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その開示内容を引用することにより、本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００３】
核酸の検出は、医療、法医科学、産業プロセス処理、作物育種及び家畜育種、並びに他の多くの分野の中核をなす。病状（例えば、がん）、感染性微生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝子系統、遺伝子マーカー等を検出する能力は、疾患の診断及び予後、マーカー利用選抜、事件現場の特徴の正確な鑑識、産業生物を増殖させる能力、及び他の多くの技法のためのユビキタス技術である。対象とされる核酸の完全性の判定は、感染症又はがんの病変に関連し得る。少量の核酸を検出する最も有力かつ基本的な技術の１つは、核酸配列の一部又は全てを何度も複製し、その後、増幅産物を分析することである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はおそらく、多数の様々な増幅技法の中で最もよく知られたものである。
【０００４】
ＰＣＲは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短い区間を増幅する有力な技法である。ＰＣＲを用いれば、単一の鋳型ＤＮＡ分子から始めて、何百万ものＤＮＡのコピーを迅速に生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの１本鎖への変性と、変性させた鎖へのプライマーのアニーリングと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長との３段階の温度サイクルを含む。このサイクルは、検出及び分析するのに十分なコピーが存在するように繰り返される。原則として、ＰＣＲの各サイクルはコピーの数を２倍にすることができると考えられる。実際のところ、各サイクル後に達成される増殖は常に２倍に満たない。さらに、ＰＣＲサイクルを続けると、必要な反応物質の濃度が減少するため、最終的に、増幅ＤＮＡ産物の構築が停止する。ＰＣＲに関する包括的な詳細については、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３を参照されたい。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲとは、近年発展している、反応が進行するのに伴い、一般にＰＣＲ１サイクルにつき１回、増幅されたＤＮＡ産物の構築を測定する一連の技法を指す。経時的に産物の蓄積をモニタリングすることにより、反応の効率を判定すると共に、鋳型ＤＮＡ分子の初期濃度を推定することが可能である。リアルタイムＰＣＲに関する包括的な詳細については、非特許文献４を参照されたい。
【０００６】
最近、ＰＣＲ及び他の増幅反応の実施に対し、いくつかのハイスループット手法、例えば、マイクロ流体デバイス内での増幅反応、並びに増幅された核酸を装置内又は装置上で検出し解析する方法を伴う手法が開発されている。マイクロ流体システムは、流体が通って流れることができる少なくとも１つのマイクロ流体チャネル（マイクロチャネルの別名でも知られる）を有するシステムであり、このマイクロ流体チャネルは、通常は約１０００マイクロメートル未満である少なくとも１つの内部断面寸法（例えば深さ、幅、長さ、直径）を有する。増幅のための試料の熱循環は通常、２つの方法のうちの一方において達成される。第１の方法では、試料溶液を装置内に装填し、従来のＰＣＲ機器と略同様に、時間とともに温度を循環的に変化させる。第２の方法では、試料溶液を空間的に異なる温度ゾーンを通して連続的にポンプ注入する。例えば、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、Hahn他の特許文献１、Enzelberger他の特許文献２、及びKnapp他の特許文献３を参照されたい。
【０００７】
マイクロ流体チップ等のマイクロ流体デバイスは一般的に、例えば、マイクロ流体チップ内のチャネル及びウェルを満たすのに用いられる混合物中に気泡が存在することを防止するために、試料分析に備えてプライミングされる。チップ内の混合物中の気泡の存在は、マイクロ流体チップを用いる化学的試料又は生体試料の試験に悪影響を及ぼす可能性がある。例えば、気泡は、チップ内の液体の流れを制御不能にする可能性がある。システムによっては、気泡は熱制御も低下させる可能性がある。マイクロ流体チップのプライミングは、不正確に又は不適切に行われると、マイクロ流体チップを用いて行われる分析を誤りのあるものにし、したがって信頼性に欠けるものにする可能性がある。試験が行われる時点ではマイクロ流体チップが適切にプライミングされているか否かが分かっていないことが多いため、不正確な試験結果の可能性を低減するために、プライミング手順が正確かつ的確であることを確かめることが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７５６８３号
【特許文献２】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sambrook及びRussell「Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.)」Vols. 1-3」（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000)）
【非特許文献２】F. M. Ausubel他編「Current Protocols in Molecular Biology」（Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.及びJohn Wiley & Sons, Inc.(2005年に増補)）
【非特許文献３】M. A. Innis他編「PCR Protocols A Guide to Methods and Applications」（Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990)）
【非特許文献４】K. Edwards他編「Real-Time PCR: An Essential Guide」（Horizon Bioscience, Norwich, U.K.(2004)）
【非特許文献５】Lagally他(Analytical Chemistry 73: 565〜570(2001))
【非特許文献６】Kopp他(Science 280: 1046〜1048(1998))
【非特許文献７】Park他（Analytical Chemistry 75: 6029〜6033(2003)）
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、不正確な試験結果の可能性を低減するとともにプライミングに必要な時間を低減する、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングのための組成物及び方法に関する。
【００１１】
一態様では、本発明は、マイクロ流体チップのドライプライミング（dry priming）のためのプライミング溶液を提供する。プライミング溶液は、高いぬれ性を有し、ＰＣＲに適合性があり、かつより高いＰＣＲ効率を可能にする。１つの実施の形態では、プライミング溶液は、増加した濃度の界面活性剤を含む従来の１×ＰＣＲ緩衝液を含む。ＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤は、界面活性剤をＰＣＲ緩衝液に添加することによって、又はＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度を増加させることによって増加される。プライミング溶液は、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングの経過を追跡するために色素を含有することもできる。
【００１２】
１つの実施の形態では、プライミング溶液（priming solution）は、１×ＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度が、１×ＰＣＲ緩衝液中に存在する特定の界面活性剤（複数の場合もあり）のＣＭＣの約５倍〜約１５０倍、好ましくは約１２倍〜約１５０倍、より好ましくは約１５倍〜約１３５倍、更により好ましくは約３０倍〜約１２０倍の範囲である、１×ＰＣＲ緩衝液である。別の実施の形態では、より低い範囲の界面活性剤濃度を有するプライミング溶液がより良い液滴形成を示す。この実施の形態では、１×ＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度は、１×ＰＣＲ緩衝液中に存在する特定の界面活性剤のＣＭＣの約５倍〜約４５倍、好ましくは約１２倍〜約４５倍、より好ましくは約１５倍〜約３０倍の範囲である。
【００１３】
１つの実施の形態では、プライミング溶液は、界面活性剤がＴｗｅｅｎ（商標）２０であり、その濃度が約０．０５％〜約１．０％、好ましくは約０．８％〜約１．０％、より好ましくは約０．１％〜約０．９％、更により好ましくは約０．２％〜約０．８％の範囲である、１×ＰＣＲ緩衝液である。別の実施の形態では、より低い範囲、例えば約０．０５％〜約０．３％、好ましくは約０．０８％〜約０．３％、より好ましくは約０．１％〜約０．２％の界面活性剤濃度を有するプライミング溶液がより良い液滴形成を示す。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、マイクロ流体デバイスをインシステムプライミング（in-system  priming）する方法を提供する。マイクロ流体デバイスは、１つ又は複数のマイクロ流体チップを含むことができる。マイクロ流体チップは少なくとも１つのマイクロチャネルを有する。本発明の１つの実施の形態によると、本方法は、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用する工程と、外圧を印加してプライミング溶液をマイクロチャネルに沿って、またマイクロ流体デバイスにおいて一緒に用いることができる異なるマイクロ流体チップの接合部を通して流すか又は移動させる工程とを含む。１つの実施の形態では、プライミング溶液はＰＣＲ緩衝液である。別の実施の形態では、プライミング溶液は本明細書において記載されるプライミング溶液である。１つの実施の形態では、本方法は、外圧を印加する前に、毛細管圧によってプライミング溶液をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに沿って流すか又は移動させる工程を更に含む。幾つかの実施の形態では、マイクロ流体デバイス又はマイクロ流体チップは、プライミング溶液を適用する前にマイクロチャネル表面の親水性を高めるためにプラズマで前処理される。
【００１５】
本発明の別の実施の形態によると、本方法は、マイクロ流体デバイス又はマイクロ流体チップをプラズマで処理する工程と、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用する工程と、外圧を印加してプライミング溶液をマイクロチャネルに沿って、またマイクロ流体デバイスにおいて一緒に用いることができる異なるマイクロ流体チップの接合部を通して流すか又は移動させる工程とを含む。プラズマ処理は、マイクロチャネル表面の親水性を高める。１つの実施の形態では、本方法は、外圧を印加する前に、毛細管圧によってプライミング溶液をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに沿って流すか又は移動させる工程を更に含む。幾つかの実施の形態では、プライミング溶液はＰＣＲ緩衝液である。他の実施の形態では、プライミング溶液は、本明細書において記載されるような増加した界面活性剤濃度を有するＰＣＲ緩衝液である。
【００１６】
上記及び他の態様及び実施形態について、添付図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プライミング溶液の表面張力の変化を、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０界面活性剤濃度の増加の関数として示す図である。
【図２】プライミング溶液の接触角の変化を、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０界面活性剤濃度の増加の関数として示す図である。
【図３】本発明の１つの実施形態による、プライミング溶液中に含有される（図の中央に白みがかった色で示されるような）蛍光色素により蛍光を発するマイクロチャネルから明らかなように、プライミング溶液がマイクロ流体チップの８つ全てのマイクロチャネルをプライミングすることを示す図である。
【図４】改質されたＰＣＲ緩衝液を用いて試験核酸を増幅する増幅曲線を示す図である。
【図５】図４に示される改質されたＰＣＲ緩衝液を用いて増幅された試験核酸の融解曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、複数の実施形態を有し、また当業者に既知の詳細については特許、特許出願及び他の引用文献に依拠する。したがって、特許、特許出願又は他の引用文献を本明細書中で引用する又は繰り返す場合、あらゆる目的でまた記載される陳述について引用することによりその全体が本明細書の一部となることを理解されたい。
【００１９】
本発明の実施は、他に指定のない限り、当業者の範囲内である、有機化学、高分子技術、分子生物学（組み換え技法を含む）、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法及び記述を採用し得る。このような従来の技法としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な技法の具体例は以下の本明細書中の実施例を参照してもたらされ得る。しかしながら、他の等価な従来の手法も当然のことながら使用することができる。このような従来の技法及び記述は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)（Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual及びMolecular Cloning: A Laboratory Manualを使用）（全てCold Spring Harbor Laboratory Press出版）、Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, N.Y., Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, IRL Press, London、Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.、並びにBerg他(2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.（あらゆる目的で引用することによりその全体が本明細書の一部となる）等の基本的な手引書に見ることができる。
【００２０】
本明細書において用いる場合、「溶液」という用語は、２つ以上の物質を含む液体を意味し、その液体は、２つ以上の物質の均質な混合物である必要はない。
【００２１】
一態様では、本発明は、マイクロ流体デバイスをプライミングするためのプライミング溶液を提供する。プライミング組成物は、高いぬれ性を有し、ＰＣＲに適合性があり、かつより高いＰＣＲ効率を可能にする。１つの実施形態では、プライミング溶液は、増加した濃度の界面活性剤を含む従来の１×（１倍）ＰＣＲ緩衝液を含む。従来のＰＣＲ緩衝液は当該技術分野において既知であり、市販されている。ＰＣＲ緩衝液は通常、１０×溶液として作製されて販売されているため、ＰＣＲ反応のための最終希釈は１×とする。当業者には既知であるように、ＰＣＲ緩衝液は、増幅反応において用いられる特定のポリメラーゼに合わせて最適化する。ＰＣＲ緩衝液の例としては、表１に記載されるＰＣＲ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、これらの緩衝液は、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４若しくは酢酸マグネシウムを、当業者に既知の濃度で含有するか、又は、使用前に当業者に既知の濃度でＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４若しくは酢酸マグネシウムを補充する。例えば、１０×ＰＣＲ緩衝液は通常、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、ホルムアミド又はグリセロール等の共溶媒を標準的な緩衝液に添加することが、当業者に既知であるように、Ｇ＋Ｃ豊富な標的を、又は強力な二次構造の領域を増幅しようとする場合に有用であり得る。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１のＰＣＲ緩衝液の例から明らかなように、各ＰＣＲ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチルアミノエタン）又はトリシン（Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン）等の、ＰＣＲ反応に適合性がある緩衝剤を、例えば１×ＰＣＲ緩衝液あたり１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度で含有している。同様に表１のＰＣＲ緩衝液の例から明らかなように、１×ＰＣＲ緩衝液は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、酢酸カリウム及びグルタミン酸カリウム又はそれらの組み合わせ等の塩を、１×ＰＣＲ緩衝液あたり１０ｍＭ〜６５ｍＭの範囲の濃度で任意選択的に含有することができる。加えて、表１のＰＣＲ緩衝液の例によって示されるように、１×ＰＣＲ緩衝液は、ＤＴＴ、ＤＭＳＯ、グリセロール、ＢＳＡ及びゼラチンを任意選択的に含有することができる。さらに、本明細書において記載するように、ＰＣＲ緩衝液は、ＭｇＣｌ２、ベタイン又はホルムアミドも任意選択的に含有することができる。表１のＰＣＲ緩衝液の例から更に明らかなように、１×ＰＣＲ緩衝液は、Ｔｗｅｅｎ（商標）界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０）又はＴｒｉｔｏｎ（商標）界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）等の界面活性剤を低濃度で任意選択的に含有することができる。例えば、１×ＰＣＲ緩衝液１の場合、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０は０．０１％の濃度で存在し、１×ＰＣＲ緩衝液１４の場合、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００は０．１％の濃度で存在する。界面活性剤のこれらのパーセンテージは、体積／体積単位に基づいている。
【００２４】
マイクロ流体デバイスをプライミングするために１×濃度で用いられる従来のＰＣＲ緩衝液は、マイクロ流体デバイスの表面を完全にプライミングするには不十分であることが分かっている。ＰＣＲ緩衝液を改質し、プライミング溶液のぬれ性を高めることによってマイクロ流体デバイスの表面を十分にプライミングすることができると仮定した。本発明によると、ＰＣＲ緩衝液のぬれ性は、界面活性剤を添加することによって、又はＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度を増加させることによって高められる。緩衝液中のより高い界面活性剤濃度は、プライミング溶液に高いぬれ性を与えるだけではなく、驚くべきことに、ＰＣＲ増幅反応におけるより高いＰＣＲ効率も可能にすることが分かった。加えて、本発明のプライミング溶液を用いる場合に、マイクロ流体デバイスをプライミングするためのリンス工程を排除することができることが分かった。リンス工程の排除によって、マイクロ流体デバイスのプライミングが簡略化される。
【００２５】
本発明の態様によると、上述したＰＣＲ緩衝液のような、当業者によって従来から用いられているＰＣＲ緩衝液を改質して、界面活性剤を含有するＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤濃度を増加させるか、又は界面活性剤を含有しないＰＣＲ緩衝液に界面活性剤を添加することで、本発明のプライミング溶液を調製する。本発明の１つの実施形態によるマイクロ流体デバイスのプライミングの場合、プライミング溶液に用いられるＰＣＲ緩衝液は１×ＰＣＲ緩衝液である。本明細書において記載されるように改質された１×ＰＣＲ緩衝液は、１×プライミング溶液と称されることがある。
【００２６】
プライミング溶液中の界面活性剤の濃度は、プライミング溶液の調製に用いられる従来のＰＣＲ緩衝液に界面活性剤を添加することによって達成される。１つの実施形態では、用いられるＰＣＲ緩衝液は幾らかの界面活性剤を含有している。この実施形態では、十分な界面活性剤が添加されてその濃度が本明細書において記載されるレベルになる。この実施形態では本明細書において記載される任意の界面活性剤又は界面活性剤の混合物を添加することができるが、通常は、ＰＣＲ緩衝液中に最初に用いられたものと同じ界面活性剤を用いることができる。別の実施形態では、用いられるＰＣＲ緩衝液は界面活性剤を含有していない。この実施形態では、本明細書において記載される任意の界面活性剤又は界面活性剤の混合物を従来のＰＣＲ緩衝液に添加することができる。本明細書において記載されるように、プライミング溶液は、界面活性剤濃度を変更した１×ＰＣＲ緩衝液である。代替的に、本発明のプライミング溶液は、本明細書において示されるような緩衝液の所望の成分を有する１×ＰＣＲ緩衝液を作製することによって調製される。そのような緩衝液は、当業者に既知の方法で調製される。プライミング溶液の原液（Stock solutions）も本発明によって意図される。２×〜１００×以上等のプライミング溶液の任意の好適な原液を作製してから、使用前に１×濃度に希釈することができる。例えば、プライミング溶液の１０×原液を作製してから、マイクロ流体チップのドライプライミングにおいて用いる前に本明細書において記載される１×プライミング溶液に希釈することができる。
【００２７】
本発明の態様によると、プライミング溶液が本明細書において記載される要件を満たす限り、任意の界面活性剤又は界面活性剤の混合物をプライミング溶液において用いることができる。具体的には、プライミング溶液は高いぬれ性を有しなければならず、ＰＣＲに適合性がなければならない。加えて、プライミング溶液がＰＣＲ効率も高めれば望ましい。Ｔｗｅｅｎ（商標）界面活性剤等のポリソルベート界面活性剤、及びＴｒｉｔｏｎ（商標）界面活性剤等のオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤が、本発明によるプライミング溶液の調製において特に有用である。当業者に既知であるＴｗｅｅｎ（商標）界面活性剤のいずれか、又は当業者に既知であるＴｒｉｔｏｎ（商標）界面活性剤のいずれかを本発明に従って用いることができる。ＰＣＲ緩衝液に通常用いられるＴｗｅｅｎ（商標）２０界面活性剤及びＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００界面活性剤が本明細書において特に有用である。これらの種類の界面活性剤に加えて、用いることができる他の種類の界面活性剤としては、脂肪族アルコールエトキシレート界面活性剤、ポリオキシエチレン界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０等）、カルボン酸エステル界面活性剤、ポリエチレングリコールエステル界面活性剤、アンヒドロソルビトールエステル及びそのエトキシル化誘導体界面活性剤、脂肪酸グリコールエステル界面活性剤、カルボン酸アミド界面活性剤、モノアルカノールアミン凝縮物界面活性剤、及びポリオキシエチレン脂肪酸アミド界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において記載される界面活性剤のいずれかの混合物又は組み合わせを、本発明によるプライミング溶液の調製において用いることもできる。
【００２８】
一実施形態では、プライミング溶液中の界面活性剤の増加した濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の倍数（factor）である。当業者には既知であるように、ＣＭＣは、界面活性剤の重要な特徴であり、界面活性剤の濃度であって、この濃度を上回るとミセルが形成され、系に添加されるほとんど全ての付加的な界面活性剤がミセルになる濃度として定義される。種々の界面活性剤のＣＭＣが当業者に既知である。例えば、洗浄剤の特性及び用途（Detergents Properties and Applications）（www.sigmaaldrich.com/img/assets/15402/Detergent_Selection_Table.pdf）を参照のこと。１つの実施形態では、１×ＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度は、１×ＰＣＲ緩衝液中に存在する特定の界面活性剤のＣＭＣの約５倍〜約１５０倍、好ましくは約１２倍〜約１５０倍、より好ましくは約１５倍〜約１３５倍、更により好ましくは約３０倍〜約１２０倍の範囲である。より低い範囲の界面活性剤濃度を有するプライミング溶液がより良い液滴形成を示すことが分かっている。この実施形態では、１×ＰＣＲ緩衝液中の界面活性剤の濃度は、１×ＰＣＲ緩衝液中に存在する特定の界面活性剤のＣＭＣの約５倍〜約４５倍、好ましくは約１２倍〜約４５倍、より好ましくは約１５倍〜約３０倍の範囲である。プライミング溶液において用いるのに好適な界面活性剤の量は、本発明のプライミング溶液に有用であることが分かっている、本明細書において記載されるＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度と比較することによって、本明細書において記載されるような各界面活性剤に関して容易に決定することができる。１つの実施形態では、本明細書において記載されるように表面張力、接触角及び液滴形成を調べて、マイクロ流体デバイスをプライミングするためのプライミング溶液において用いる界面活性剤の好適な界面活性剤濃度を選択する。
【００２９】
プライミング溶液は、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングをモニタリングするために色素又はマーカーを含有することもできる。任意の好適な蛍光色素又は非蛍光色素を用いることができる。色素は、水溶液系又は有機系の一部であり得る。色素は、水のみにおいて、若しくは緩衝溶液中で用いることができるか、又は１×ＰＣＲ緩衝液中に任意選択的に含めることができる。好適な蛍光色素としては、スルホローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ＦＡＭ、フルオレセイン、ローダミン、ＣｙＤｙｅ（例えばＣｙ３及びＣｙ５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ、Ａｔｔｏ又はＫｉｔｏｎ  Ｒｅｄが挙げられるが、これらに限定されない。好適な非蛍光色素の例としては、合成又は天然の色素、食用色素、アゾ色素、並びにアントラキノン系色素及びトリアリールメタン系色素が挙げられる。幾つかの実施形態では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０及びＡｔｔｏ６４７Ｎ等の赤色蛍光色素が用いられる。プライミング溶液中に存在する色素の濃度は、色素の溶解度、量子収率、検出器の感度、及びマイクロ流体デバイス上で調べられる領域のサイズ／形状を含むがこれらに限定されないシステムの要件に基づいて調整するべきである。色素又はマーカーは、プライミング溶液中に、約５μＭ〜約５００μＭ、好ましくは約１０μＭ〜約１００μＭ、より好ましくは約３０μＭ〜約５０μＭ存在することができる。幾つかの実施形態では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７が約３０μＭ〜約５０μＭの濃度で用いられる。
【００３０】
１つの実施形態では、界面活性剤はＴｗｅｅｎ（商標）２０であり、プライミング溶液中の濃度は、約０．０５％〜約１．０％、好ましくは約０．０８％〜約１．０％、より好ましくは約０．１％〜約０．９％、更により好ましくは約０．２％〜約０．８％の範囲である。全ての界面活性剤のパーセンテージは、本明細書では体積／体積（ｖ／ｖ）として表される。より低い範囲、例えば約０．０５％〜約０．３％、好ましくは約０．０８％〜約０．３％、より好ましくは約０．１％〜約０．２％の界面活性剤濃度を有するプライミング溶液がより良い液滴形成を示すことが分かっている。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の％濃度とＣＭＣとの相関を表２に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
１つの実施形態では、本発明によるプライミング溶液は表３に示される成分を含む。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
第２の態様では、本発明は、マイクロ流体デバイスをインシステムプライミングする方法を提供する。マイクロ流体デバイスは、１つ又は複数のマイクロ流体チップを含むことができる。１つの実施形態によると、本方法は、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用する工程と、外圧を印加してプライミング溶液をマイクロ流体チャネルに沿って、またマイクロ流体デバイスにおいて一緒に用いることができる異なるマイクロ流体チップの接合部（複数の場合もあり）を通して移動させるか又は流す工程とを含む。１つの実施形態では、本方法は、外圧を印加する前に、毛細管圧によってプライミング溶液をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに沿って移動させるか又は流す工程を更に含む。本発明のプライミング溶液を用いる場合に、マイクロ流体デバイスをプライミングするためのリンス工程を排除することができることが分かった。リンス工程の排除によって、マイクロ流体デバイスのプライミングが簡略化される。
【００３５】
本発明のプライミング溶液を用いてマイクロ流体デバイスをドライプライミングすることができる。マイクロ流体デバイスは当該技術分野において既知であり、通常は１つ又は複数のマイクロ流体チップを含み、通常はシッパー又はピペットを使用する。マイクロ流体チップは少なくとも１つのマイクロチャネルを含み、マイクロ流体チップの寸法内に任意の数のチャネルを含むことができる。当該技術分野において知られているマイクロ流体デバイスの例としては、Chow他（米国特許第６，４４７，６６１号）、Kopf-Sill（米国特許第６，５２４，８３０号）、Spaid（米国特許第７，１０１，４６７号）、Dubrow他（米国特許第７，３０３，７２７号）、Schembri（米国特許第７，３９０，４５７号）、Schembri（米国特許第７，４０２，２７９号）、Takahashi他（米国特許第７，６０４，９３８号）、Knapp他（特許文献３）、及びHasson他（米国特許出願公開第２０１０／０１９１４８２号）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特許又は特許出願公開のそれぞれは、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３６】
本発明のプライミング溶液は、これらのマイクロ流体デバイスに加えて、同時係属中の出願：２０１０年４月１２日に出願された米国特許出願第１２／７５８，４８２号（米国特許出願公開第２０１１／０００８２２３号）、２０１０年４月１２日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０７６２号（国際公開第２０１０／１１８４２７号）、２０１０年４月１２日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３０７６６号（国際公開第２０１０／１１８４３０号）、流体混合及びチップインターフェースのための方法、装置及びシステムを記載している、２０１０年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，７２２号、並びに、複数の核酸アッセイを迅速に連続処理するシステム及び方法を記載している、２０１０年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，８２４号に記載されているマイクロ流体デバイスをプライミングするのに用いることができる。これらの同時係属中の出願のそれぞれは、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３７】
さらに、本発明のプライミング溶液は、当該技術分野において知られているマイクロ流体プライミング装置又はモジュールとともに用いることができる。当該技術分野において知られているマイクロ流体プライミング装置又はモジュールの例としては、Frye他（米国特許第６，２７２，９３９号）、Barth他（米国特許第６，８４３，２８１号）、Lee他（米国特許出願公開第２００３／０２３０４８８号）、Boronkay他（米国特許出願公開第２００６／０１６３０７０号）及びKennedy他（米国特許出願公開第２００６／０２１１１３４号）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特許又は特許出願公開のそれぞれは、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３８】
１つの実施形態によると、本発明のインシステムプライミング方法は、マイクロ流体デバイスをドライプライミングする方法を含む。このドライプライミングは、Shuck（米国特許第７，２５０，９９９号）によって記載されているようなウェットプライミング（wet priming）とは対照的である。本発明の１つの実施形態によると、プライミング溶液を最初にマイクロ流体デバイスに、又はマイクロ流体デバイスの構成部品のチップ又はモジュールに適用する。
【００３９】
使用される適用方法は、用いられるマイクロ流体デバイスのタイプに依存する。１つの実施形態では、マイクロ流体デバイスは反転したシッパーを含む。この実施形態では、プライミング溶液の液滴が、通常はロボット制御されるピペットによって反転したシッパーの頂部に適用される。この実施形態の場合、良好な液滴形成を示すプライミング溶液、すなわち、本明細書において記載されるような本発明による少量の界面活性剤を含むプライミング溶液を用いることが望ましい。別の実施形態では、マイクロ流体デバイスはシッパーアセンブリを含む。この実施形態では、プライミング溶液は、シッパーアセンブリのリザーバー又はウェルに添加される。プライミング溶液は、リザーバー又はウェル内のプライミング溶液と接触するシッパーによってマイクロ流体デバイスに適用される。この実施形態の場合、液滴形成はそれほど重要ではないため、本明細書において記載されるような本発明による任意の量の界面活性剤を含有するプライミング溶液を使用することができる。更なる実施形態では、マイクロ流体デバイスは単に、プライミング溶液が添加されるウェルを含む。ウェルは、プライミング溶液がマイクロチャネル内に引き込まれるようにマイクロチャネルと接触する。この実施形態の場合、液滴形成はそれほど重要ではないため、本明細書において記載されるような任意の量の界面活性剤を含有するプライミング溶液を使用することができる。
【００４０】
プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用した後で、外圧をマイクロ流体デバイスに印加し、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルに沿って推進させるか又は移動させる。正圧又は負圧であり得る外圧の印加は、プライミングされるマイクロ流体デバイスの構造に幾分依存する。通常、負圧をマイクロ流体デバイスの排出ウェル及び廃棄物ウェルに印加する。外圧は通常、プライミング溶液が廃棄物ウェル内に現れるまで印加され、すなわち、外圧は、プライミング溶液がマイクロチャネルを通って完全に推進されるか、流されるか又は移動されるまで印加される。１つの実施形態では、約−１４．７ｐｓｉ（−１．０１２３２８ｂａｒ）〜約−０．０１ｐｓｉ（−０．０００６８９ｂａｒ）、好ましくは約−１０．０ｐｓｉ（−０．６８９５４８ｂａｒ）〜約−０．１ｐｓｉ（−０．００６８９ｂａｒ）、より好ましくは約−１．２ｐｓｉ（−０．０８２７３７ｂａｒ）〜約−０．４ｐｓｉ（−０．０２７５７９ｂａｒ）、最も好ましくは約−１．０ｐｓｉ（−０．０６８９４８ｂａｒ）の負圧が排出ウェルに印加され、約−１４．７ｐｓｉ（−１．０１２３２８ｂａｒ）〜約−０．０１ｐｓｉ（−０．０００６８９ｂａｒ）、好ましくは約−１０．０ｐｓｉ（−０．６８９５４８ｂａｒ）〜約−０．１ｐｓｉ（−０．００６８９ｂａｒ）、より好ましくは約−１．２ｐｓｉ（−０．０８２７３７ｂａｒ）〜約−０．４ｐｓｉ（−０．０２７５７９ｂａｒ）、最も好ましくは約−１．０ｐｓｉ（−０．０６８９４８ｂａｒ）の負圧が廃棄物ウェルに印加される。１つの実施形態では、マイクロ流体システムは、溶液がピペット先端によってシッパーまで送達され、次に、負圧が排出ウェル及び廃棄物ウェルに印加されて液体をマイクロチャネルを通して引き込むか又は移動させるように設計されている。この実施形態では、正圧はシッパーを通して直接印加することはできない。しかし、正圧は、この実施形態の場合はマニホールドを入口上に接続することによって印加することができる（例えばシッパーアセンブリ）。次に、マニホールドに接続される蠕動ポンプが静圧を増大させてプライミング溶液を装置に押し通す。約０．００１ｐｓｉ（０．００００６８９ｂａｒ）〜約１５０ｐｓｉ（１０．３４２１２ｂａｒ）、好ましくは約０．０１ｐｓｉ（０．０００６８９ｂａｒ）〜１５ｐｓｉ（１．０３４２１２）の正圧を用いることができ、より好ましい圧力は０．１ｐｓｉ（０．００６８９５ｂａｒ）〜約１．５ｐｓｉ（０．１０３４２１ｂａｒ）の範囲である。別の実施形態では、プライミング溶液を廃棄物ウェルに手動で送達し、次に、正圧を廃棄物ウェルに印加してプライミング溶液をマイクロチャネルを通してシッパーまで、また排出ウェルまで推進させる。この実施形態では、プライミング溶液を次に、マイクロ流体デバイスを使用する前にウェルから手動で除去しなければならない。この実施形態では、正圧の範囲及び値は上述したとおりである。
【００４１】
１つの実施形態では、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用した後で、外圧が印加される前に、プライミング溶液は最初に毛細管圧によってマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルに沿って流されるか又は移動される。プライミング溶液は、移動し続けるか又は流れ続ける限り、毛細管圧によってマイクロチャネルを通して流されるか又は移動される。１つの実施形態では、毛細管圧による移動が停止すると、次に外圧を印加し、溶液をマイクロチャネルに沿って、またマイクロ流体デバイス内に存在する場合には異なるチップの接合部（複数の場合もあり）を通して更に推進するか又は流す。１つの実施形態では、毛細管圧によるプライミング溶液の流れ又は移動は、約３０秒〜約５分間、好ましくは約３０秒〜約２分間起こる。プライミング溶液が毛細管圧によってマイクロチャネルに沿って流れた後で、上述したように外圧を印加する。
【００４２】
１つの実施形態では、プライミング溶液は本明細書において記載されるような色素又はマーカーを含む。色素又はマーカーの存在は、マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングをモニタリングするのに有用である。インシステムプライミングのモニタリングは、プライミング制御システムによって行うことができる。プライミング制御システムは光学システムを含むことができる。光学システムは、撮像素子（例えばＣＭＯＳカメラ）と、照明手段（例えば蛍光色素を励起させるＬＥＤ又は可視色素の白色光）とを含むことができる。プライミング制御システムは、プライミングの進行に関する情報を収集するために光学システムを用いることができる。１つの実施形態では、プライミング制御システムは、プライミング溶液を追跡する色素又はマーカーをモニタリングして、毛細管圧に起因する移動が停止した時を判断することができる。別の実施形態では、プライミング制御システムは、プライミング溶液を追跡する色素又はマーカーをモニタリングして、プライミングが成功したか否かを判断することができる。色素を用いて、マイクロ流体チップの或る特定の機能部がプライミングされたか否かを判断することができる。１つの実施形態では、マイクロ流体システム内のＬＥＤを用いて、マイクロチャネル内のプライミング溶液中の色素に光を当てる。
【００４３】
マイクロ流体デバイスのインシステムプライミングを更に改善するために、装置をプラズマで前処理して、マイクロチャネル表面の親水性を高めることができる。プラズマ処理は、プライミングの成功率を高めるだけでなくプライミング時間も低減する。この実施形態によると、マイクロチャネルを有する完全に作製されたマイクロ流体デバイス全体がプラズマで処理される。完全に作製されたマイクロ流体デバイスは、単一のマイクロ流体チップ若しくはモジュール、又は複数のマイクロ流体チップ若しくはモジュールから構成することができる。マイクロ流体デバイスは、目的のアッセイを行うためにシステム内に配置される前に処理される。プラズマ発生器は当該技術分野において既知であり、Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＰＤＣ１００）、プラズマ反応器７９０シリーズ（Plasma-Therm,Inc.、Florida, USA）、マイクロ波プラズマ発生器（１３．５６ＭＨｚ）（Plasma Technology、Rottenburg, Germany）が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施形態では、プラズマをマイクロ流体デバイスに印加し、このマイクロ流体デバイスのウェル、リザーバー及びマイクロチャネルの全てが、マイクロ流体デバイスの表面の全てを処理するのに十分な時間、典型的には高出力で約４分〜約７分、より典型的には高出力で約５分間、開放される。生成された酸素プラズマはチャネル、ウェル等の表面に浸透し、その表面にシラノール基を導入して表面特性を親水性に変化させる。本発明によるマイクロ流体デバイスのプライミングは、プラズマ前処理によってより迅速に行うことができる。
【００４４】
本発明の別の実施形態によると、マイクロ流体デバイス、又はマイクロ流体デバイスの構成部品のチップ若しくはモジュールは、本明細書において記載されるように最初にプラズマで処理される。次に、本明細書において記載されるようにプライミング溶液をマイクロ流体デバイス、又はマイクロ流体デバイスの構成部品のチップ若しくはモジュールに適用する。幾つかの実施形態では、プライミング溶液はＰＣＲ緩衝液である。他の実施形態では、プライミング溶液は、本明細書において記載されるような増加した界面活性剤濃度を有するＰＣＲ緩衝液である。プライミング溶液を適用した後で、本明細書において記載されるように外圧を印加してプライミング溶液をマイクロチャネルを通して移動させる。１つの実施形態では、プライミング溶液をマイクロ流体デバイスに適用した後で、プライミング溶液は、外圧が印加される前に、本明細書において記載されるように最初に毛細管圧によってマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルに沿って流されるか又は移動される。この実施形態では、毛細管圧による移動が停止すると、次に外圧を印加し、溶液をマイクロチャネルに沿って、またマイクロ流体デバイス内に存在する場合には異なるチップの接合部を通して更に推進するか又は流す。１つの実施形態では、プライミング溶液は本明細書において記載されるような色素又はマーカーを含む。色素又はマーカーの存在は、本明細書において記載されるようなマイクロ流体デバイスのインシステムプライミングをモニタリングするのに有用である。
【００４５】
本発明の態様は、以下の非限定的な例によって説明することができる。ＰＣＲ増幅反応に通常用いられる、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、２％  ＤＭＳＯ及び０．０４％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含む１×ＰＣＲ緩衝液を調製した。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０の濃度がＴｗｅｅｎ（商標）２０の元の濃度の２×、５×、１０×及び２０×である改質した１×ＰＣＲ緩衝液を調製した。したがって、改質した１×ＰＣＲ緩衝液中のＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度はそれぞれ０．０８％、０．２％、０．４％及び０．８％であった。改質した１×ＰＣＲ緩衝液中のＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度の増加を、１×ＰＣＲ緩衝液の表面張力及び接触角を低減するそれらの能力に関して試験した。改質した１×ＰＣＲ緩衝液中のＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度の増加の倍数に対する表面張力の変化を図１に示す。改質した１×ＰＣＲ緩衝液中のＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度の増加の倍数に対する接触角の変化を図２に示す。図２における測定は、液滴をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）表面上に滴下した１分後に行った。改質した１×ＰＣＲ緩衝液の表面張力及び接触角の変化を、優れたぬれ性を有することが知られているCanon製のインクと比較した。改質した１×ＰＣＲ緩衝液は、表面張力及び接触角に加えて、液滴形成についても試験した。他の界面活性剤の好適な濃度は、表面張力、接触角及び液滴形成を本明細書において記載されるＴｗｅｅｎ（商標）の濃度と比較することによって求めることができる。
【００４６】
図１及び図２に示されるように、１０×及び２０×のＴｗｅｅｎ（商標）２０  １×ＰＣＲ緩衝液の表面張力及び接触角はCanon製のインクに近い。２×及び５×のＴｗｅｅｎ（商標）２０  １×ＰＣＲ緩衝液はより良い液滴形成を示す。これらの試験に基づいて、５×Ｔｗｅｅｎ（商標）２０溶液を、その高いぬれ性及びより良い液滴形成に起因して、反転したシッパーを用いるマイクロ流体デバイス又はマイクロ流体チップのプライミングにおける試験に選択した。図３は、図の中央の蛍光を発するマイクロチャネル（白みがかった色として見える）によって示されるように、５×溶液が反転したシッパーを使用するシステムにおけるマイクロ流体チップのプライミングに成功したことを示している。この試験では、プライミング溶液が赤色の蛍光色素（例えばＡｌｅｘａ６４７）を含有し、赤色の励起ＬＥＤがオンになっていたためマイクロチャネルは赤色の蛍光を発した。観察された蛍光は、全てのマイクロチャネルのプライミングが成功したことを示している。この実施形態ではプライミングプロセスをモニタリングするために赤色蛍光色素が含まれていたが、他の色素（蛍光色素及び他の色素）も意図される。
【００４７】
ＰＣＲに対する界面活性剤濃度の増加の効果を試験するために、界面活性剤濃度を変更した緩衝液を用いて試験核酸を増幅した。この実験では、２×、５×、１０×及び２０×のＴｗｅｅｎ（商標）２０濃度を試験するのに２×ＰＣＲ緩衝液を用いた。増幅は、Roche社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。試験核酸は分子量が標準的な核酸とした。増幅には以下の条件を用いた：増幅前（pre-amplification）：９５℃で１分間；４０サイクルの増幅：９５℃で５秒間、６２℃で５秒間及び７２℃で５秒間；増幅後（post-amplification）：３７℃で１０秒間及び９５℃で１０秒間。熱融解を、１℃／秒を用いて５５℃から９５℃まで上昇させることによって行った。増幅及び熱融解分析に対するＴｗｅｅｎ（商標）２０の濃度の増加の効果をそれぞれ図４及び図５に示す。図４に示されるように、増幅反応は、最大増幅に達するのに必要とされるサイクルがより少ないことによって明らかなように、界面活性剤の増加によってより効率的になる。図５は、界面活性剤の増加によってより良い融解曲線が得られることを示している。これらの結果は、界面活性剤濃度の増加を含むように改質されたＰＣＲ緩衝液がＰＣＲに適合性があるとともにＰＣＲ反応の効率を高めることを実証するものである。
【００４８】
本発明を説明する文脈における（中でも、添付の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（“a”and "an"）」及び「前記／該（"the"）」という用語並びに類似の指示語の使用は、本明細書中に他に指定されるか又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「挙げられる（含む）（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、特に断りのない限り、非限定（open-ended：オープンエンド）用語（すなわち、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるものとする。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に他に指定のない限り、この範囲内にある各別個の値について個々に言及する省略方法として機能するよう意図されるものに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。それゆえ例えば、１０〜１５の範囲を開示する場合には、１１、１２、１３及び１４も開示される。更に、本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に他に指定のない限り、この範囲内にあるあらゆる別個の範囲について言及する省略方法として機能するよう意図されるものに過ぎず、各別個の範囲は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。それゆえ例えば、１０〜１５の範囲を開示する場合には、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１５、１３〜１４及び１４〜１５の範囲も開示される。本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中に提示されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「等（such as）」）の使用は、他に主張のない限り、単に本発明をより良く明白にする（illuminate）ように意図されるものに過ぎず、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言葉は、特許請求がされていない任意の要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとは解釈されるべきでない。
【００４９】
当然のことながら、本発明の方法及び組成は、様々な実施形態の形で組み込むことができ、そのほんの一部が本明細書中に開示されているに過ぎない。それらの実施形態の変形形態は、上述の説明を読めば当業者には明らかになり得る。本発明者らは、熟練者がこのような変形形態を必要に応じて採用するものと見込んでおり、また本発明者らは、本明細書中に詳細に記載したものとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法により認められるような、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の変更形態及び均等物を全て含む。その上、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに否定されない限り、その全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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