(57)【要約】  本発明は、インターフェロンベータ（Interferon beta）、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域が互いに共有結合により連結されており、生体内持続性及び安定性が向上したインターフェロンベータ持続性製剤、並びにその製造方法に関する。本発明のインターフェロンベータ持続性製剤は、生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が大幅に増加するので、様々なインターフェロン適応症に有用に用いられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンベータ及び免疫グロブリンＦｃ領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性重合体により連結されたインターフェロンベータ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２】
前記インターフェロンベータのＮ末端に前記非ペプチド性重合体が連結されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項３】
前記インターフェロンベータが、インターフェロンベータ１ｂ又はインターフェロンベータ１ａである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項４】
前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ前記免疫グロブリンＦｃ領域と前記インターフェロンベータのアミノ基又はチオール基（Thiol group）に結合されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、天然アミノ酸配列、又は天然アミノ酸が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかの方法により変異した配列を有するものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される重鎖不変領域及び軽鎖不変領域の二量体からなるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含むものである請求項７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源の単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１３に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１５】
前記非ペプチド性重合体の分子量が１ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の範囲である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１６】
前記非ペプチド性重合体の分子量が１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下の範囲である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１７】
前記非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１８】
前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートである請求項１７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１９】
前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応アルデヒド基を有するものである請求項１７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２０】
ウイルス感染、自己免疫疾患、癌及び神経退行性障害からなる群から選択される疾患の治療又は予防用である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２１】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚癌、神経腫、癌腫、肉腫、腺腫及び骨髄腫からなる群から選択されるものである請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２２】
前記神経退行性障害が多発性硬化症である請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２３】
前記多発性硬化症が、再発緩和型、原發性進行型及び二次進行型多発性硬化症からなる群から選択されるものである請求項２２に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２４】
公知の抗ウイルス剤、抗癌剤、抗炎症剤、自己免疫疾患及び多発性硬化症の予防又は治療剤からなる群から選択される薬剤をさらに含むものである請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２５】
（１）両末端にアルデヒド、マレイミド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体をインターフェロンベータのアミノ基又はチオール基に共有結合により連結する段階と、
（２）前記（１）の反応混合物からＮ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したインターフェロンベータを含む連結体を分離する段階と、
（３）分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びインターフェロンベータに結合された結合体を生成する段階とを含む、請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤の製造方法。
【請求項２６】
ウイルス感染、自己免疫疾患、癌又は神経退行性障害を患う個体に有効量の請求項１に記載の持続性製剤を投与する段階を含む、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌又は神経退行性障害を有する個体の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンベータ、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域が互いに共有結合により連結されたインターフェロンベータ結合体を含む生体内持続性及び安定性が向上したインターフェロンベータ持続性製剤、並びにその製造方法に関する。本発明は、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌又は神経退行性障害を有する個体を治療する方法を提供する。本発明のインターフェロンベータ持続性製剤は、インターフェロンベータの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が大幅に増加する効果がある。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンベータは、抗ウイルス活性を有して細胞増殖を抑制すると共に、抗増殖、リンパ球細胞毒性増大、自然免疫調節、マクロファージ活性化、細胞毒性Ｔ細胞効果増加、マクロファージ効果増加などの機能を有し、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌の治療に用いられる可能性のある物質として知られている。現在、ヒトインターフェロンベータは、多発性硬化症の治療剤として組換え形態で３種類が欧州と米国でそれぞれ許可されている。１種は大腸菌から製造された非グリコシル化されたセリン１７−インターフェロンベータ１ｂであり、２種は動物細胞培養によりグリコシル化された形態のインターフェロンベータ１ａである。
【０００３】
大腸菌から製造された非グリコシル化されたセリン１７−インターフェロンベータ１ｂであるＢｅｔａｓｅｒｏｎ（製品名）は、２５０μｇの高用量で２日に１回投与する。また、動物細胞培養により製造されたグリコシル化された形態であるインターフェロンベータ１ａは、それぞれ週１回筋肉注射で投与するバイオジェン社のＡｖｏｎｅｘ（製品名）と、続いて許可されたセローノ社のＲｅｂｉｆ（製品名）である。Ｒｅｂｉｆは、Ａｖｏｎｅｘと類似し、その投与回数が週３回に増加したにもかかわらず、その薬効や製剤などの差異により許可された製品である。
【０００４】
非グリコシル化されたインターフェロンは、非常に不安定であり、熱変性に対する感受性の増加と疎水性凝集による沈殿が発生するという問題がある。一方、グリコシル化されたインターフェロンは、生体内での半減期が非グリコシル化されたインターフェロンより相対的に長いことが知られており、その半減期は投与方法により２日（静脈注射）から１週間（筋肉注射）であることが知られている。しかし、インターフェロンベータの適応症は慢性治療を要するので、インターフェロンベータの不安定性を補完できる１週間以上の長期持続性製剤が求められている。そこで、インターフェロンベータの血中安定性を増加させて血中薬物濃度を長期間にわたって高く持続させ、薬効を最大化しようとする努力が続けられてきた。このようなインターフェロンベータの持続性製剤は、インターフェロンベータの安定性を向上させると共に、薬物の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００５】
インターフェロンベータを安定化させて疎水性凝集を抑制する方法として、ポリエチレングリコール（PEG）などの溶解度の高い高分子物質をペプチド表面に化学的に付加させる方法が用いられてきた。ＰＥＧは、特に副作用を起こすことなく、標的インターフェロンベータの特定部位に結合することにより、ペプチドの分子量を増加させて腎臓によるクリアランスや凝集を防止し、安定性を向上させて生体内半減期を増加させる効果がある。例えば、ＷＯ９９／５５３７７は、インターフェロンベータ１ａのシステイン残基のスルフヒドリル基（-SH）に２０ＫＤａの大きさのＰＥＧを結合させることにより、中性ｐＨにおける溶解度を向上させ、安定性を増加（凝集を減少）させ、免疫原性を低下させることを開示している。ＵＳ０９６２９７８Ｂ２は、インターフェロンベータ１ａのＮ末端に２０、３０、４０ＫＤａのＰＥＧを結合させることを開示している。また、米国特許出願公開第２００４／０１２６３６１号明細書は、インターフェロンベータ１ｂのＮ末端に１０又は３０ＫＤａのＰＥＧを結合させることを開示している。これらの方法は、ＰＥＧの分子量を増加させることによりペプチド薬物の生体内の持続時間を延長させることはできるが、分子量が増加するにつれてペプチド薬物の力価が著しく低下すると共に、インターフェロンベータとの反応性が低下し、収率の低下により製造コストが増加するという問題がある。
【０００６】
米国特許出願公開第２００５／９０８６２６号明細書にはインターフェロンベータ１ａと（γ4）Ｆｃとのペプチドリンカーを用いた融合タンパク質が記載されており、国際公開第２００１／０３７３７号にはインターフェロンベータ１ａと、ＩｇＧ１Ｆｃ、ＩｇＧ４Ｆｃ、ＩｇＧ１ＣＨとの融合タンパク質が記載されている。米国特許第６００７３５Ｂ２号明細書においては、インターフェロンベータ１ａとＩｇＧ１Ｆｃ断片との直接融合と、Ｇ４Ｓリンカーを用いた融合を比較している。米国特許出願公開第２００６／０２２８３３２号明細書にはインターフェロンベータ１ａと免疫グロブリン断片（Fc）との融合タンパク質が記載されており、国際公開第２００４／０２０４０５号にはインターフェロンベータとｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（mTf）の融合タンパク質が記載されている。これらの融合タンパク質は、低いペグ化（pegylation）収率と非特異性の問題を克服できるが、血中半減期の増加効果が予想したほど画期的でなく、場合によっては力価が低いという問題がある。血中半減期の増加効果を最大化するために様々な種類のペプチドリンカーが用いられてきたが、免疫反応を誘発する恐れがあった。
【０００７】
他の試みもなされてきた。米国特許出願公開第２００４／０１１５１６８Ａ１号明細書にはインターフェロンベータ１ａの糖鎖部分にＰＥＧを結合させるＧｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ方法が記載されているが、やはりペグ化収率が低いという問題があり、韓国特許１０−０５４１８５０にはインターフェロンベータ１ａ変異体を用いて糖鎖を付加することのできる７位のアミノ酸を部分的に置換し、少なくとも１つの糖鎖を付加する方法が記載されているが、天然型アミノ酸置換による生体内安定性が問題となる恐れがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、本出願人はインターフェロンベータの血中半減期の増加と生体内活性の維持を同時に最大化する方法として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及びインターフェロンベータを共有結合により部位選択的に互いに連結させる製造方法を用いた。その結果、インターフェロンベータ結合体の血中半減期が画期的に増加し、公知のペグ化インターフェロンベータより血中半減期の増加効果がはるかに改善された。さらに、結合体の低い溶解性と多量の投与量を欠点とするが、生産が容易で製造コストが低いという利点を有する、グリコシル化されていないインターフェロンベータ１ｂのＦｃ結合体は、グリコシル化されたインターフェロンベータ１ａのＦｃ結合体と比較して、血中半減期及び力価が同等又はより高いことが確認された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、インターフェロンベータの生体内活性を維持しながらも血中半減期を延長させて一層優れたインターフェロンベータ持続性製剤及びその製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のインターフェロンベータ薬物結合体は、ペプチドの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が大幅に増加するという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】インターフェロンベータ１ｂ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体をＲＰ ＨＰＬＣで分析した結果である。
【図２】インターフェロンベータ１ｂ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図３】インターフェロンベータ１ａ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図４】インターフェロンベータ１ｂ−２０ｋＤａ ＰＥＧ結合体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図５】インターフェロンベータ１ｂ−２０ｋＤａ ＰＥＧ結合体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記目的を達成するための一態様として、本発明は、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を介して、インターフェロンベータ及び免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合により連結されたインターフェロンベータ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したインターフェロンベータの持続性製剤を提供する。
【００１３】
本発明のインターフェロンベータは、抗ウイルス活性を有して細胞増殖を抑制すると共に、抗増殖、リンパ球細胞毒性増大、自然免疫調節、マクロファージ活性化、細胞毒性Ｔ細胞効果増加、マクロファージ効果増加などの機能を有し、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌及び多発性硬化症の治療に用いられるタンパク質である。インターフェロンベータは、インターフェロンベータ１ｂ、インターフェロンベータ１ａ又はその類似型であることが好ましい。
【００１４】
本発明のインターフェロンベータはＮ末端特異的結合体であることが好ましい。本発明者らは、Ｎ末端に結合させることにより活性が増加することを確認した。
【００１５】
本発明において、「活性」という用語は、インターフェロンベータがインターフェロンベータ受容体に結合してインターフェロンベータとして機能することを意味する。
【００１６】
このようなＮ末端特異的結合体の製造はｐＨ調整により行われ、好ましいｐＨ範囲は４．５〜７．５である。
【００１７】
本発明において、「Ｎ末端」という用語は、「Ｎ末端領域」という用語と混用される。
【００１８】
持続型インターフェロンベータの製造に用いられる免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、全免疫グロブリン分子に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の製造、精製及び収率の面で有利である。アミノ酸配列が抗体毎に異なることから高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなるという効果も期待することができる。
【００１９】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を含むタンパク質を意味する。重鎖不変領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分をさらに含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００２０】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）をも含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番アミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられる。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際公開第９７／３４６３１号、国際公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
【００２１】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9）。最も一般的な交換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の双方向の交換である。
【００２２】
場合によっては、Ｆｃ領域はリン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００２３】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００２４】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの他の動物の生体内から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらの断片は、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。
【００２５】
ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え型免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（c1q）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低下又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとして本発明の目的に適する。
【００２７】
本発明において、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、「非グリコシル化（Aglycosylation）」とは、原核生物、好ましくは大腸菌から産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
【００２８】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
【００２９】
本発明において、「組み合わせ（combination）」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合して二量体又は多量体を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなる群から選択される２つ以上の断片から二量体又は多量体を製造することができる。
【００３０】
本発明において、「ハイブリッド（hybrid）」とは、２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が単鎖免疫グロブリンＦｃ領域内に存在することを意味する用語である。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
【００３１】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞毒性（CDC, Complement dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。
【００３２】
本発明の薬物のキャリアとして最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００３３】
本発明において、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。
【００３４】
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸, polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸, polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に知られたこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明に含まれる。
【００３５】
従来のインフレームフュージョン（inframe fusion）方法で製造された融合タンパク質に用いられていたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待したほど得られないということである。しかし、本発明においては、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いるので、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば限定されることなく用いられる。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜９０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜８０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜７０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜６０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜５０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜４０ｋＤａの範囲、より好ましくは１〜３０ｋＤａの範囲、最も好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【００３６】
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合される反応基を有する。
【００３７】
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド（succinimide）誘導体からなる群から選択されることが好ましい。前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端又は三末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
【００３８】
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化してもよく、商業的に入手可能な変形した反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明のタンパク質結合体を製造してもよい。
【００３９】
本発明の持続性製剤は、生体内持続性及び安定性を維持する上で優れた効果がある。本発明の具体的な実施例によれば、本発明のインターフェロンベータ持続性製剤は、天然型インターフェロンベータに比べて半減期が約１０倍増加した（表１）。
【００４０】
本発明の持続性製剤は、インターフェロンベータが標的組織に送達されるものであれば、いかなる一般的な経路を介して投与してもよい。投与方法は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などであるが、これらに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。持続性製剤は、注射剤の形態で投与されることが好ましい。また、本発明の持続性製剤は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。
【００４１】
本発明の結合体を含む持続性製剤は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、経口投与の場合は結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、注射剤の場合は緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、局所投与用の場合は基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いてもよい。本発明の持続性製剤は、前述した薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造してもよい。例えば、持続性製剤は、経口投与の場合は錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造してもよい。持続性製剤は、注射剤の場合は使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造してもよい。また、持続性製剤は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化してもよい。
【００４２】
製剤化に適する担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム又は鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料及び防腐剤をさらに含んでもよい。
【００４３】
本発明の持続性製剤は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、並びに疾患の重篤度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。本発明の持続性製剤は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の持続性製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
【００４４】
本発明の持続性製剤は、インターフェロンベータの生体内持続性及び安定性を非常に高く維持するので、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌及び神経退行性障害からなる群から選択される疾患の治療又は予防に効果的である。
【００４５】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚癌、神経腫、癌腫、肉腫、腺腫及び骨髄腫を含む。
【００４６】
前記神経退行性障害は、多発性硬化症、より具体的には再発緩和型、原發性進行型及び二次進行型多発性硬化症を含む。
【００４７】
本発明の他の態様として、本発明は、（１）両末端にアルデヒド、マレイミド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてインターフェロンベータのアミノ基又はチオール基に共有結合により連結する段階と、（２）前記（１）の反応混合物からＮ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したインターフェロンベータを含む連結体を分離する段階と、（３）分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びインターフェロンベータに結合された結合体を生成する段階とを含むインターフェロンベータ持続性製剤の製造方法を提供する。
【００４８】
本発明のさらに他の態様として、本発明は、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌又は神経退行性障害を患う個体に有効量の前記持続性製剤を投与する段階を含む、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌又は神経退行性障害を有する固体の治療方法を提供する。
【００４９】
ここで、個体はヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタなどの哺乳類であってもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
ペグ化されたインターフェロンベータ１ｂの精製
本出願人が自家生産したインターフェロンベータ１ｂ（ハンミ−インターフェロンベータ１ｂ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度にし、３．４ｋＤａ ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＡＬＤ２ ＰＥＧをインターフェロンベータのＮ末端にペグ化させるために、インターフェロンとＰＥＧのモル比が１：１５となるようにＰＥＧを添加して完全に溶解させた。その後、還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を２０ｍＭとなるように加え、常温で９０分間反応させた。その後、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で１０倍に希釈し、ＳＰ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。ＳＰ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。モノペグ化されたインターフェロンを精製するために、ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％となるように４０カラム体積流してモノペグ化されたインターフェロンベータ１ｂを精製した。
【００５２】
［実施例２］
インターフェロンベータ１ｂ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
実施例１の方法を用いて得たペグ化されたインターフェロンベータ１ｂを免疫グロブリンＦｃとカップリングさせた。インターフェロンベータと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０とし、全タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍＬとして４℃で１６時間反応させた。ここで、還元剤として２０ｍＭとなるようにＮａＣＮＢＨ３を加えた。その後、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で１５倍に希釈し、ＳＰ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。ＳＰ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。カップリングタンパク質を溶出するために、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％の線形勾配で４０カラム体積流して溶出した。ＳＰ ＨＰカラムで未反応の免疫グロブリンＦｃを除去した。前記ＳＰ ＨＰで溶出したカップリングタンパク質溶液を０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で２０倍に希釈し、Ｑ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。Ｑ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４が含まれる２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。インターフェロンベータ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃを精製するために、０．０５％ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４が含まれる２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％の線形勾配で４０カラム体積流した。前記Ｑ ＨＰカラムで精製されたインターフェロンベータ１ｂ−免疫グロブリンＦｃ結合体をＲＰ−ＨＰＬＣで分析して図１に示す。
【００５３】
［実施例３］
ペグ化されたインターフェロンベータ１ａの精製
インターフェロンベータ１ａ（GEMA Biotech社）をペグ化するために、バッファ組成を０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１００ｍＭ ＮａＣｌに変更した。インターフェロンベータ１ａを１ｍｇ／ｍＬの濃度にし、インターフェロンベータのＮ末端にペグ化させるために、インターフェロンとＰＥＧのモル比が１：２０となるように３．４ｋＤａ ｂｕｔｙｒＡＬＤ２ ＰＥＧを添加して完全に溶解させた。その後、ペグ化反応のための還元剤として２０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を用い、常温で９０分間反応させた。その後、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で１０倍に希釈し、ＳＰ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。ＳＰ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。モノペグ化されたインターフェロンを精製するために、ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％となるように４０カラム体積流して精製した。３．４ｋＤａ ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＡＬＤ２ ＰＥＧをインターフェロンベータ１ａと反応させ、モノペグ化されたインターフェロンベータを精製した。
【００５４】
［実施例４］
インターフェロンベータ１ａ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
実施例３で精製したモノペグ化（mono-peylation）されたインターフェロンベータを免疫グロブリンＦｃとカップリングさせた。インターフェロンベータと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５０とし、全タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍＬとして常温で２時間反応させた。ここで、還元剤として２０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を加えた。その後、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で１５倍に希釈し、ＳＰ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。ＳＰ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。カップリングタンパク質を溶出するために、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％の線形勾配で４０カラム体積流して溶出した。ＳＰ ＨＰカラムで未反応の免疫グロブリンＦｃを除去した。前記ＳＰ ＨＰで溶出したカップリングタンパク質溶液に２Ｍ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅを１．５Ｍ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅとなるように徐々に攪拌しながら加え、ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ（1ml, GE Healthcare社）カラムに注入した。ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯカラムは、５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）、１．５Ｍ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅバッファで平衡が保たれたカラムであり、流速は３ｍＬ／ｍｉｎとした。カップリングタンパク質を溶出するために、５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファを０〜１００％の線形勾配で９０カラム体積流して精製した。
【００５５】
［実施例５］
インターフェロンベータ１ｂ−２０ｋＤａ ＰＥＧの製造
ハンミインターフェロンベータ１ｂを１ｍｇ／ｍＬの濃度にし、２０ｋＤａ ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＡＬＤ ＰＥＧをインターフェロンベータのＮ末端にペグ化させるために、インターフェロンとＰＥＧのモル比が１：１５となるようにＰＥＧを添加して完全に溶解させた。ペグ化バッファとしては、０．０５％ｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４が含まれる１００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と５ｍＭ ＮａＣｌを用いた。ペグ化反応のための還元剤として２０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を用い、常温で９０分間反応させた。その後、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で１０倍に希釈し、ＳＰ ＨＰカラム（Hitrap 5mL, GE Healthcare社）に注入した。ＳＰ ＨＰカラムは、０．０５％ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）で平衡が保たれたカラムであり、流速は５ｍＬ／ｍｉｎとした。モノペグ化されたインターフェロンを精製するために、ｚｗｉｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔが含まれる２０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（pH6.0）と１Ｍ ＮａＣｌを０〜４０％となるように４０カラム体積流してモノペグ化されたインターフェロンベータ１ｂを精製した。
【００５６】
［実施例６］
インターフェロンベータ１ａ−２０ ｋＤａの製造
インターフェロンベータ１ａ（GEMA Biotech社）を１ｍｇ／ｍＬの濃度にし、インターフェロンベータのＮ末端にペグ化させるために、インターフェロンとＰＥＧのモル比が１：５となるように２０ｋＤａ ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＡＬＤ ＰＥＧを添加し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファ（pH6.5）に完全に溶解した。還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を２０ｍＭとなるように加え、常温で１８時間反応させた。その後、濃縮してＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（120mL, GE Healthcare社）に注入した。カラムは、１５０ｍＭ ＮａＣｌが含まれる３０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファ（pH6.5）で平衡が保たれたカラムであり、流速を１ｍＬ／ｍｉｎとしてモノペグ化インターフェロンベータ１ａを精製した。
【００５７】
［実施例７］
持続型インターフェロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びＰＫの測定
インターフェロンベータ持続性製剤の効力及び薬物動態学的因子を測定する方法としてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性を測定する方法を用いた。通常は、インターフェロンベータのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定方法としてＷＩＳＨ ｃｅｌｌ（ATCC）が用いられ、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔを確認する試験が行われる。ＷＩＳＨ ｃｅｌｌにインターフェロンベータと持続型インターフェロンベータ試験物質を濃度別に処理し、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓからのｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ能力をＥＣ５０値で測定してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定した。
【００５８】
また、インターフェロンベータ及び持続性製剤を投与した動物（Normal S.D rat）の血漿を分離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定と同じ方法であるＣＰＥ ａｓｓａｙ法で薬物動態学的因子を算出した。
【００５９】
【表１】
2013523724.tif 000003
【００６０】
表１に各物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性と血中半減期を示す。ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性は、全体的にインターフェロンベータ１ａ（Avonex）の値で比較し、ハンミ−インターフェロンベータ１ｂ−Ｆｃ結合体は、結合体製造前のハンミ−インターフェロンベータ１ｂに比べて同等以上の力価を有することが確認された。天然型インターフェロンベータ１ｂの場合、Ｔ１／２が４．２８時間と血中で短い持続力を有することが確認された。インターフェロンベータ１ｂ−Ｆｃ結合体は、インターフェロンベータ１ａ−Ｆｃ結合体より、血中半減期は短いが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ力価は高いことが確認された。また、インターフェロンベータ−Ｆｃ結合体は、インターフェロンベータ−２０ｋＤａ ＰＥＧ結合体より長い血中半減期を示す。
【図２】
2013523724.tif 000004
【図３】
2013523724.tif 000005
【図４】
2013523724.tif 000006
【図５】
2013523724.tif 000007
【図１】
2013523724.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月3日(2012.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンベータ及び免疫グロブリンＦｃ領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性重合体により連結されたインターフェロンベータ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２】
前記インターフェロンベータのＮ末端に前記非ペプチド性重合体が連結されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項３】
前記インターフェロンベータが、インターフェロンベータ１ｂ又はインターフェロンベータ１ａである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項４】
前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ前記免疫グロブリンＦｃ領域と前記インターフェロンベータのアミノ基又はチオール基（Thiol group）に結合されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、天然アミノ酸配列、又は天然アミノ酸が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかの方法により変異した配列を有するものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される重鎖不変領域及び軽鎖不変領域の二量体からなるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含むものである請求項７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源の単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１３に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１５】
前記非ペプチド性重合体の分子量が１ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の範囲である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１６】
前記非ペプチド性重合体の分子量が１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下の範囲である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１７】
前記非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１８】
前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル及びスクシンイミジルカーボネートからなる群から選択されるものである請求項１７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項１９】
前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応アルデヒド基を有するものである請求項１７に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２０】
ウイルス感染、自己免疫疾患、癌及び神経退行性障害からなる群から選択される疾患の治療又は予防用である請求項１に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２１】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚癌、神経腫、癌腫、肉腫、腺腫及び骨髄腫からなる群から選択されるものである請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２２】
前記神経退行性障害が多発性硬化症である請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２３】
前記多発性硬化症が、再発緩和型、原發性進行型及び二次進行型多発性硬化症からなる群から選択されるものである請求項２２に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２４】
公知の抗ウイルス剤、抗癌剤、抗炎症剤、自己免疫疾患及び多発性硬化症の予防又は治療剤からなる群から選択される薬剤をさらに含むものである請求項２０に記載のインターフェロンベータの持続性製剤。
【請求項２５】
（１）両末端それぞれにアルデヒド、マレイミド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体をインターフェロンベータのアミノ基又はチオール基に共有結合により連結する段階と、
（２）前記（１）の反応物からＮ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したインターフェロンベータを含む反応物を分離する段階と、
（３）分離した反応物の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びインターフェロンベータに結合されたインターフェロンベータ結合体を生成する段階とを含む、請求項１のインターフェロンベータの持続性製剤の製造方法。
【国際調査報告】
2013523724.tif 000009
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