(57)【要約】本発明は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子が癌において過剰発現し、かつ癌細胞の生存に関与するという知見に基づいている。本発明は、診断マーカーとしてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を用いる、がんを診断するための、またはがんを有する対象の予後を評価／判定するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、そのような二本鎖分子を用いてがんを治療および／または予防するための方法または組成物を特徴とする。また、分子標的としてＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を用いる、肺癌を治療および予防するための候補化合物を同定する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象ががんに罹患しているかもしくはその発症リスクを有することが示されるかまたは該対象におけるがんの存在が示され、該発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、方法。
【請求項２】
前記上昇が、前記正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象由来の生物学的試料が生検試料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記がんが肺癌である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する試薬を含む、がんの診断または検出において使用するためのキット。
【請求項６】
肺癌を有する対象の予後を評価するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを検出する段階；
（ｂ）検出された該発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、患者の予後を判定する段階
を含む、方法。
【請求項７】
前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較して前記発現レベルが上昇していることにより予後不良が示される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記上昇が、前記対照レベルを少なくとも１０％上回る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされる該タンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｂ）該ポリペプチドまたはその断片と該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
ｃ）該ポリペプチドまたはその断片に結合する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項１１】
がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
ｃ）試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項１２】
がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を検出する段階；および
ｃ）試験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、該ポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項１３】
前記生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
ｃ）試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項１５】
ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物とＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物を接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階；および
（ｄ）試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項１６】
ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの前記機能的同等物がＰＩＦ１結合ドメインを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＰＩＦ１ポリペプチドの前記機能的同等物がＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが肺癌である、請求項１０〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項２０】
前記センス鎖が前記標的配列において前記アンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、請求項１９記載の二本鎖分子。
【請求項２１】
一本鎖ヌクレオチド配列によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドである、請求項１９または２０記載の二本鎖分子。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドが一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である、請求項２１記載の二本鎖分子。
【請求項２３】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれまたは両方を含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
【請求項２４】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項２３記載のベクター。
【請求項２６】
前記二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ヌクレオチド転写物である、請求項２３または２５記載のベクター。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である、請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子もしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項２９】
前記二本鎖分子が請求項１９〜２２のいずれか一項記載のものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記ベクターが請求項２３〜２７のいずれか一項記載のものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する、組成物。
【請求項３２】
前記二本鎖分子が請求項１９〜２２のいずれか一項記載のものである、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
前記ベクターが請求項２３〜２７のいずれか一項記載のものである、請求項３１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は２００９年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２７４，２４８号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、肺癌、より詳細にはその診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
原発性肺癌は、全世界におけるがん死の主要な原因である（非特許文献１）。肺の発癌に関与する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子機序は未だ不明である（非特許文献２）。過去２０〜３０年の間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む細胞傷害性剤が出現し、進行性ＮＳＣＬＣ患者に複数の治療選択肢を提供したが、これらのレジメンがもたらす生存上の恩恵は、シスプラチンに基づく治療法と比較して、限られている（非特許文献３）。これらの細胞傷害性薬に加えて、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（すなわち、ベマシズマブ／抗ＶＥＧＦ）またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（すなわち、セツキシマブ／抗ＥＧＦＲ）、およびＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する阻害薬（すなわち、ゲフィチニブおよびエルロチニブ）などのいくつかの分子標的剤が開発され、現在、臨床診療で広く用いられている（非特許文献４〜６）。それぞれの新しいレジメンは、限られた割合の患者に対してしか、生存上の恩恵をもたらすことができない。したがって、患者の大多数に適用可能であり、毒性が少ない、より効果的な分子標的剤の開発などの、新たな治療戦略が待ち望まれている。
【０００４】
肺癌の診断、治療、および／または予防のための潜在的分子標的を単離するため、２７，６４８個の遺伝子または発現配列タグ（ＥＳＴ）からなるｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１０１例の肺癌組織に由来し、レーザーマイクロダイセクションにより精製された癌細胞に対して、遺伝子発現プロファイルのゲノム全域にわたる解析が行われた（非特許文献７〜１２）。各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析と、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術および細胞増殖／浸潤アッセイの組み合わせを用いるスクリーニング系が確立された（非特許文献１３〜３７）。
【０００５】
出芽酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において、ＣＤＣ４５  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ４５−ｃｅｌｌ（ＣＤＣ４５）遺伝子は、ＤＮＡ複製の開始に必要な必須遺伝子であり、これはＭＣＭおよびＣＤＣ６タンパク質と共に、真核細胞におけるＤＮＡ複製の開始に必要な複合体を形成する（非特許文献３８）。ＣＤＣ４５Ｌと称される酵母ＣＤＣ４５遺伝子のヒト相同体は、５６６アミノ酸のタンパク質をコードし、酵母ＣＤＣ４５に対して２７．６％の同一性を示す（非特許文献３９）。ＣＤＣ４５ＬはＨｅＬａＳ３細胞において、伸長ＤＮＡポリメラーゼδおよびεと、ならびにＧＩＮＳ複合体の成分であるＰｓｆ２と、ならびに推定上の複製ＤＮＡヘリカーゼ複合体のサブユニットであるＭＣＭ５およびＭＣＭ７と、相互作用する（非特許文献４０）。がん細胞株の増殖中の細胞群において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現がより高レベルであることが報告された（非特許文献４１）。しかしながら、がんの発生および進行におけるＣＤＣ４５Ｌ活性化の役割は明らかにされていない。
【０００６】
一方、ｐｅｔｉｔｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  １（ＰＩＦ１）遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエで最初に同定され、酵母からヒトまで保存されているＳＦＩ  ５'−３'ＤＮＡヘリカーゼのメンバーとして分類された（非特許文献４２）。酵母におけるＰＩＦ１の機能は、ｍｔＤＮＡ修復、ｒＤＮＡ複製、およびテロメア長の調節に関わる（非特許文献４２、４３）。加えて、酵母ＰＩＦ１は、インビトロにおいて効率的なＤＮＡ巻き戻しのために特定のＤＮＡ構造を必要とし、かつＤＮＡを５'→３'方向に巻き戻すので、領域特異的ＤＮＡヘリカーゼであると考えられている（非特許文献４３）。ＰＩＦ１様ヘリカーゼは多くの生物に存在するが、大部分の研究は酵母種で行われており、哺乳動物細胞におけるＰＩＦ１の機能について、および発がんへの関与についてはほとんどわかっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第２００７／０１３６７１号
【特許文献２】６１／２１７，１３３
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献２】Sozzi G. European Journal of Cancer 2001;37 Suppl 7:S63-S73.
【非特許文献３】Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002;346:92-8.
【非特許文献４】Sandler A, et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50.
【非特許文献５】Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005;353:123-32.
【非特許文献６】Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23.
【非特許文献７】Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53.
【非特許文献８】Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205.
【非特許文献９】Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99.
【非特許文献１０】Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.
【非特許文献１１】Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805.
【非特許文献１２】Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.
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【非特許文献１７】Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84.
【非特許文献１８】Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25.
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【非特許文献４２】Foury F, Dyck EV. EMBO J 1985;4:3525-30.
【非特許文献４３】Bessler JB, et al. Trends Cell Biol 2001;11:60-5.
【発明の概要】
【０００９】
ヒトがんの診断、治療、および予防のための新規分子標的のスクリーニングの過程で、レーザーマイクロダイセクションと組み合わせた、肺癌２６７例のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を、２７，６４８個の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイ上で行った（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205.；Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805；Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99；Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43. Epub 2004 Oct 20；Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep; 29(3):567-75）。その結果、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子が原発性肺癌の大多数で頻繁に過剰発現していることが実証される。同様に、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子として同定されたＰＩＦ１遺伝子も、肺癌で過剰発現することが見出された。さらに、これらの遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、がん細胞増殖を効果的に抑制した。これらの結果から、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子が、がんの診断または治療のための優れた分子標的になり得ることが示唆される。
【００１０】
したがって本発明は、腫瘍において一般的に上方制御されるがん関連遺伝子ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１、ならびに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を用いてがん治療のための分子標的薬を開発するための戦略に関する。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを指標として用いて、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現するがん、例えば肺癌を診断するための方法を提供する。本発明の方法では、該遺伝子の発現レベルを測定するために、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを適切なプライマーまたはプローブによって検出することができ、あるいはＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体または抗ＰＩＦ１抗体によって検出することもできる。いくつかの態様において、がんはＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介または促進される。いくつかの態様において、がんは肺癌である。１つの態様において、がんは肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および肺大細胞癌（ＬＣＣ）、または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である。
【００１２】
本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを指標として用いて、がん、例えば肺癌を有する対象の進行を予測するための方法も提供する。
【００１３】
さらに本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を指標として用いて、がん、例えば肺癌の患者の予後を予測するための方法を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の発現レベル、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性を指標として用いて、がん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドの間の相互作用を指標として用いて、がん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害する該遺伝子に対する二本鎖分子、例えばｓｉＲＮＡ、および該二本鎖分子をコードするベクターを提供する。本発明の二本鎖分子は、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因するがん、例えば肺癌の治療または予防に有用である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子もしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、該対象におけるがんを治療または予防する方法を提供し、ここで、該二本鎖分子は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療または予防するための組成物を提供し、ここで、該二本鎖分子は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、細胞増殖および該遺伝子の発現を阻害する。
【００１９】
本発明の１つまたは複数の局面は特定の目的を満たすことができる一方、１つまたは複数の他の局面は特定の他の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されよう。各目的は、本発明のすべての局面に、あらゆる点で等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の１つの局面に関して選択的に考慮することができる。本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および以下の実施例と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明および本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の様々な局面および適用が、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明らかになるであろう。
【図１】図１は、肺腫瘍組織および細胞株におけるＣＤＣ４５Ｌの発現を示す。Ａ、Ｂ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、正常肺組織試料1例および臨床肺癌組織試料１５例（肺ＡＤＣ  ５例、肺ＳＣＣ  ５例、およびＳＣＬＣ  ５例）（Ａ）ならびに正常気道上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）および肺癌細胞株１５例（Ｂ）における、ＣＤＣ４５Ｌの発現。Ｃ、ウエスタンブロット解析により調べた、肺癌細胞株６例およびＳＡＥＣ細胞におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質の発現。Ｄ、ＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の細胞内局在性。ＣＤＣ４５Ｌは、核内で強く、細胞質内で弱く染色された。
【図２】図２は、正常組織におけるＣＤＣ４５Ｌの発現、およびＮＳＣＬＣ患者に関するＣＤＣ４５Ｌ過剰発現と予後不良との関連性を示す。Ａ、正常組織５例（心臓、肺、肝臓、腎臓、および精巣）および肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現の免疫組織化学的解析。ＣＤＣ４５Ｌは、精巣および肺癌細胞において（主に核および／または細胞質において）大量に発現したが、残り４例の正常組織ではその発現はほとんど検出できなかった。Ｂ、癌組織におけるＣＤＣ４５Ｌ発現の陽性および陰性染色の例（元の倍率×１００）。Ｃ、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現と予後不良との関連性。ＮＳＣＬＣ患者の生存のカプラン−マイヤー解析（ログランク検定によりＰ＝０．００４５）。
【図３】図３は、ＣＤＣ４５Ｌに対するｓｉＲＮＡが肺癌細胞に与える増殖抑制効果を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した、ＣＤＣ４５Ｌに対する２つの異なるｓｉＲＮＡであるｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃２、ならびに２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＥＧＦＰ）が、Ａ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）におけるＣＤＣ４５Ｌ発現に与える、遺伝子ノックダウン効果。Ｂ、Ｃ、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）のコロニー形成アッセイ（Ｂ）およびＭＴＴアッセイ（Ｃ）。カラム、３連のアッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。Ｄ、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ−＃２またはｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（トランスフェクションから４８時間後）のフローサイトメトリー解析。
【図４】図４は、ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の相互作用を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析による、正常肺組織試料1例および臨床肺癌組織試料１５例におけるＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１の発現解析。Ｂ、肺癌ＳＢＣ−３細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌと外因性ＰＩＦ１の相互作用。ＦＬＡＧタグ付ＰＩＦ１発現プラスミドをトランスフェクトしたＳＢＣ−３細胞からの細胞溶解物を用いた免疫沈降を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行った。免疫沈降物を、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いるウエスタンブロット解析に供した。ＩＢ、免疫ブロッティング；ＩＰ、免疫沈降。Ｃ、ＳＢＣ−３細胞における内因性ＣＤＣ４５Ｌおよび外因性ＰＩＦ１の免疫蛍光染色。ＣＤＣ４５Ｌ−Ａｌｅｘａ４８８、ＰＩＦ１−Ａｌｅｘａ５９４、または細胞核（４'，６'−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩［ＤＡＰＩ］）を可視化した。核および細胞質におけるＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の共局在が観察された。
【図５】図５は、ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡが肺癌細胞に与える増殖抑制効果を示す。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、２種類のｓｉ−ＰＩＦ１（ｓｉ−ＰＩＦ１−＃１およびｓｉ−ＰＩＦ１−＃２）および２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＥＧＦＰ）による、Ａ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）におけるＰＩＦ１発現に対する遺伝子ノックダウン効果。Ｂ、Ｃ、ｓｉ−ＰＩＦ１または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−３細胞（右）のコロニー形成アッセイ（Ｂ）およびＭＴＴアッセイ（Ｃ）。カラム、３連のアッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
態様の説明
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００２２】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【００２３】
矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００２４】
定義
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００２５】
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関連して用いられる「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中に含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないということを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞材料、例えば糖質、脂質、および他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドが単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から、該ポリペプチドが分離された、該ポリペプチドの調製物を含む。
【００２６】
したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）を有する、ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、いくつかの態様においてこれはまた培養培地を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満の培養培地を有する、該ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、いくつかの態様においてこれは化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に伴う化学的前駆体または他の化学物質が該タンパク質調製物の体積の（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満である該ポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、該タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。１つの態様において、本発明の抗体を含むタンパク質は単離されているかまたは精製されている。
【００２７】
「単離された」または「精製された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞材料および培養培地を実質的に含まなくてよく、または化学合成された場合には、化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まなくてよい。１つの態様において、本発明のタンパク質をコードする核酸分子は単離されているかまたは精製されている。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾された天然アミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、類似した機能を有する、化学物質を指す。
【００３０】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、公知の３文字表記または１文字表記により言及されてもよい。
【００３１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、広く認められた１文字コードにより言及される。アミノ酸と同様に、これには天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方が含まれる。遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。
【００３２】
本明細書で用いられる「生物学的試料」という用語は、生物全体、または、その組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体からまたはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、細胞成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドを含む、生物が増殖した培地、例えば栄養ブロスまたはゲルを指す。
【００３３】
特記しない限り、「がん」という用語は、腺癌（ＡＤＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、大細胞癌（ＬＣＣ）、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌などの、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現するがんを指す。
【００３４】
（１）遺伝子およびポリペプチド
ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３５０４．３としても入手可能である。本明細書において、「ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子」という語句は、ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子を包含し、対立遺伝子変異体および、他の動物においてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に相当するとして見出される遺伝子を含む。
【００３５】
ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３５０４．３（ＮＰ＿００３４９５．１）としても入手可能である。本発明において、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＣＤＣ４５Ｌ」と称され、場合によっては「ＣＤＣ４５Ｌポリペプチド」または「ＣＤＣ４５Ｌタンパク質」と称される。
【００３６】
ヒトＰＩＦ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示され、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５０４９．２としても入手可能である。本明細書において、「ＰＩＦ１遺伝子」という語句は、ヒトＰＩＦ１遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のＰＩＦ１遺伝子を包含し、かつ、対立遺伝子変異体および、他の動物においてＰＩＦ１遺伝子に相当するとして見出される遺伝子を含む。
【００３７】
ヒトＰＩＦ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５０４９．２（ＮＰ＿０７９３２５．２）としても入手可能である。本発明において、ＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＰＩＦ１」と称され、場合によっては「ＰＩＦ１ポリペプチド」または「ＰＩＦ１タンパク質」と称される。
【００３８】
本発明の１つの局面によれば、機能的同等物もまたＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１に含まれる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは、そのタンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の少なくとも１つの生物学的活性を保持している任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物およびＰＩＦ１の機能的同等物は、細胞増殖促進活性を保持している。加えて、ＣＤＣ４５Ｌの生物学的活性には、ＰＩＦ１に対する結合活性が含まれる。したがって好ましい態様において、ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物はＰＩＦ１結合領域を含み得る。同様に、ＰＩＦ１の生物学的活性には、ＣＤＣ４５Ｌに対する結合活性が含まれる。したがって好ましい態様において、ＰＩＦ１の機能的同等物はＣＤＣ４５Ｌ結合領域を含み得る。
【００３９】
ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物には、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸、例えば１〜５個のアミノ酸、例えば最大５％のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。同様に、ＰＩＦ１の機能的同等物には、ＰＩＦ１タンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸、例えば１〜５個のアミノ酸、例えば最大５％のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。
【００４０】
一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている（Mark DF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep;81(18):5662-6；Zoller MJ & Smith M. Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-500；Wang A, et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-3；Dalbadie-McFarland G, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov;79(21):6409-13）。当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、または置換が、タンパク質の変化によって類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であることを認識するであろう。
【００４１】
アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン）、親水性アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖である：脂肪族側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）；ヒドロキシル基含有側鎖（セリン、スレオニン、チロシン）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン）；塩基含有側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；ならびに芳香族含有側鎖（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）。さらに、機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の８群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: W.H. Freeman, c1984を参照されたい）。
【００４２】
そのような保存的改変ポリペプチドは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性のいずれか１つを保持している限り非保存的改変物も含まれる。このような改変タンパク質において変異を受けるアミノ酸の数は、一般的には１０アミノ酸またはそれ未満、例えば６アミノ酸またはそれ未満、例えば３アミノ酸またはそれ未満である。
【００４３】
１つまたは複数のアミノ酸残基の付加によって改変されたタンパク質の例は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の融合タンパク質である。融合タンパク質には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と、同じく本発明において用いることができる他のペプチドまたはタンパク質との融合物が含まれる。融合タンパク質は、当業者に周知の技術によって、例えばＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子をコードするＤＮＡを、他のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡと、フレームが一致するように連結し、該融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを宿主内で発現させることによって、作製することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と融合させるペプチドまたはタンパク質については、得られる融合タンパク質がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の目的の生物学的活性のいずれか１つを保持する限り、制限はない。
【００４４】
前記タンパク質と融合させるペプチドとして用いることのできる公知のペプチドには、例えばＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含む６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７タグ、ＨＳＶタグ、Ｅタグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、α−チューブリン断片、Ｂタグ、およびプロテインＣ断片等が含まれる。本発明のタンパク質と融合させることができるタンパク質の例には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が含まれる。
【００４５】
さらに、改変タンパク質は、多型変種、種間相同体、および、これらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされる改変タンパク質を排除しない。
【００４６】
機能的に同等なタンパク質を単離するための当技術分野で公知の方法には、例えばハイブリダイゼーション技術が含まれる（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）。当業者は、ヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質をコードするヒトＣＤＣ４５Ｌ  ＤＮＡ配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の全体または一部と高い相同性（すなわち、配列同一性）を有するＤＮＡを容易に単離して、該単離されたＤＮＡからヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質と機能的に同等のタンパク質を単離することができる。同様に、当業者は、ヒトＰＩＦ１タンパク質をコードするヒトＰＩＦ１  ＤＮＡ配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）の全体または一部と高い相同性（すなわち、配列同一性）を有するＤＮＡを容易に単離して、該単離されたＤＮＡからヒトＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等のタンパク質を単離することができる。したがって、本発明のために用いられるタンパク質には、ヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはヒトＰＩＦ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の全体または一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつヒトＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはヒトＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等である、タンパク質が含まれる。これらのタンパク質には、ヒトまたはマウスに由来するタンパク質に相当する哺乳動物相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ、またはウシ遺伝子によってコードされるタンパク質）が含まれる。ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはヒトＰＩＦ１遺伝子をコードするＤＮＡに対して高い相同性を有するｃＤＮＡを単離する際には、肺癌組織もしくは細胞株、または精巣由来の組織を用いることができる。
【００４７】
ヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはヒトＰＩＦ１遺伝子と機能的に同等のタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況下では異なる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、例えばバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【００４８】
例えば「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてプレハイブリダイゼーションを６８℃で３０分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加して、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行うことができる。低ストリンジェント条件とは、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。いくつかの態様では、高ストリンジェント条件が用いられる。高ストリンジェント条件とは、例えば、室温で２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行った後に、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行い、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を２回行うことである。しかしながら、いくつかの要素、例えば温度および塩濃度がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００４９】
ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するために、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１６）をコードするＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５）の配列情報に基づいて合成したプライマーを用いて、ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができ、プライマー配列の例は「実施例」の半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて示されている。
【００５０】
上記のハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されたＤＮＡによってコードされる、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、ヒトＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性（配列同一性とも称される）を有する。「高い相同性」（「高い配列同一性」とも称される）は典型的に、最適にアラインメントした２つの配列（ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のいずれか）間の同一性の程度を指す。典型的に、高い相同性または配列同一性は、４０％またはそれ以上、例えば６０％またはそれ以上、例えば８０％またはそれ以上、例えば８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を指す。２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の相同性または同一性の程度は、以下のアルゴリズムにより決定することができる（Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb; 80 (3):726-30）。
【００５１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムのさらなる例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは記載されている（Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3):403-10；Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、（www.ncbi.nlm.nih.gov/における）全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合に一部の正値の閾値スコアＴと一致するかまたはこれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する段階を要する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al、前記)。これら最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための元となる。
【００５２】
次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一致した一対の残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアが算出される。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アラインメントスコアが、最大達成値から数Ｘだけ低下した場合；スコアが負となる１つまたは複数の残基アラインメントの累積に起因して、累積スコアがゼロ以下になった場合；あるいは、いずれか一方の配列の末端に到達した場合。
【００５３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関する）ＢＬＡＳＴＮプログラムでは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）が２８、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9）を使用する。
【００５４】
本発明の文脈において有用なタンパク質には、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、これは、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）またはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）の生物学的活性のいずれか１つを有する限り、本発明において有用である。
【００５５】
本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質およびＰＩＦ１タンパク質の部分ペプチドの使用も包含する。部分ペプチドは、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはＰＩＦ１タンパク質に特異的なアミノ酸配列を有し、約４００個未満のアミノ酸、通常は約２００個未満のアミノ酸、多くの場合には約１００個未満のアミノ酸からなり、かつ少なくとも約７アミノ酸、例えば約８アミノ酸またはそれ以上、例えば約９アミノ酸またはそれ以上からなる。
【００５６】
本発明のスクリーニングに用いられる部分ＣＤＣ４５Ｌペプチドは、少なくともＣＤＣ４５Ｌの結合ドメインを適切に含む。さらに、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＣＤＣ４５Ｌペプチドは、ＰＩＦ１結合領域を適切に含む。そのような部分ペプチドもまた、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の「機能的同等物」という語句に包含される。同様に、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＰＩＦ１ペプチドは、少なくともＰＩＦ１の結合ドメインを適切に含む。さらに、本発明のスクリーニングに用いられる部分ＰＩＦ１ペプチドは、ＣＤＣ４５Ｌ結合領域を適切に含む。そのような部分ペプチドもまた、ＰＩＦ１タンパク質の「機能的同等物」という語句に包含される。
【００５７】
本発明の方法に用いられるポリペプチドまたは断片は、従来の精製法により天然タンパク質として天然から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学合成によって、得ることができる。例えば、合成に採用できる従来のペプチド合成法には以下が含まれる：
（１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（３）ペプチド合成, 丸善, 1975；
（４）ペプチド合成の基礎と実験, 丸善, 1985；
（５）医薬品の開発（続  第１４巻）ペプチド合成, 広川書店, 1991；
（６）国際公開公報第９９／６７２８８号；および
（７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００５８】
あるいは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を採用して、前記タンパク質を得ることもできる(例えば、Morrison DA., et al., J Bacteriol. 1977 Oct;132(1):349-51；Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983;101:347-62）。例えば、まず、目的のタンパク質を発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換し、次に該宿主細胞を培養して、該タンパク質を産生させる。より具体的には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１をコードする遺伝子を、外来遺伝子を発現させるためのベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８に、挿入することにより、宿主（例えば、動物）細胞等で発現させる。
【００５９】
前記発現のために、プロモーターを用いることができる。例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim DW, et al. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-9）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen BR. Methods Enzymol. 1987;152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe Y, et al., Mol Cell Biol. 1988 Jan;8(1):466-72）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May;84(10):3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982;1(5):385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman RJ, et al., Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):946-58）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含む、一般的に用いられている任意のプロモーターを使用することができる。
【００６０】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu G, et al., Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11;15(3):1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug;7(8):2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata MA, et al., Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25;12(14):5707-17; Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug;4(8):1641-3）、リポフェクチン法（Derijard B, et al., Cell. 1994 Mar 25;76(6):1025-37; Lamb BT, et al., Nat Genet. 1993 Sep;5(1):22-30; Rabindran SK, et al., Science. 1993 Jan 8;259(5092):230-4）等に従って、行うことができる。
【００６１】
インビトロ翻訳系を用いて、前記タンパク質をインビトロで作製することもできる。
【００６２】
本発明の文脈において、「ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子」という語句は、ヒトＣＤＣ４５Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはヒトＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の機能的同等物のいずれかを包含する。同様に、「ＰＩＦ１遺伝子」という語句は、ヒトＰＩＦ１をコードするポリヌクレオチド、またはヒトＰＩＦ１遺伝子の機能的同等物のいずれかを包含する。
【００６３】
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子は、従来のクローニング法により天然タンパク質として天然から、または選択されたヌクレオチド配列に基づいて化学合成によって、得ることができる。ｃＤＮＡライブラリ等を用いて遺伝子をクローニングするための方法は、当技術分野において周知である。
【００６４】
（２）抗体
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、かつ所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００６５】
本発明は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質またはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を使用してもよい。これらの抗体は、肺癌の診断に有用であり得る。さらに本発明は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドまたはＰＩＦポリペプチドの部分ペプチドに対する抗体を使用してもよい。
【００６６】
以下に記載するスクリーニング法では、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドのＰＩＦ結合領域、またはＰＩＦ１ポリペプチドのＣＤＣ４５Ｌ結合領域に対する抗体が好ましく用いられ得る。これらの抗体は、ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドの間の相互作用、例えば結合を阻害および／または阻止するために有用であり得、かつ、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を（過剰）発現するがん、例えば肺癌を治療および／または予防するのに有用であり得る。これらの抗体は、公知の方法によって提供される。本発明において用いられる抗体を作製するための技術については、従来の方法を用いることができる。
【００６７】
（３）二本鎖分子
本明細書で用いる場合、「二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、これには例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））が含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列に対応するリボヌクレオチド（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列に対応するリボヌクレオチド（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築することができる。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【００６９】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列を含み、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。本発明において、二本鎖ＲＮＡ分子はまた、ｓｉＲＮＡ、すなわち低分子干渉ＲＮＡも指してもよい。２本の鎖の配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含むことができる。
【００７０】
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００７１】
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドとＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有できるものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
【００７２】
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列を含み、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【００７３】
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００７４】
（ｉ）標的配列
本明細書で用いられる「標的配列」という用語は、標的遺伝子を発現する細胞に該配列を標的とする二本鎖分子が導入された場合に、該標的遺伝子のｍＲＮＡ全体の翻訳の抑制をもたらす、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列である。標的配列に相当する配列を含む二本鎖分子が、標的遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合に、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列および３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）からなってよい。
【００７５】
標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、標的配列を規定するために、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖、すなわちｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列に変換された配列が用いられる。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖、および該標的配列に対する相補配列を有するアンチセンス鎖から構成され、アンチセンス鎖はセンス鎖と相補配列においてハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。
【００７６】
本明細書において、「〜に相当する」という語句は、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて標的配列を変換することを意味する。例えば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合には、該ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は塩基「ｕ」に置き換えられる。一方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合には、該ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は塩基「ｔ」に置き換えられる。例えば、標的配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖が、ＤＮＡで構成される３'側半分の領域を有する場合、「標的配列に相当する配列」は「５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＴＣＡＡＧＴＣ−３'」である。
【００７７】
同様に、二本鎖分子のアンチセンス鎖に関して、標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて規定され得る。例えば、標的配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のアンチセンス鎖が、ＤＮＡで構成される５'側半分の領域を有する場合には、「標的配列に対する相補配列」は「３'−ＣＧＵＵＵＧＵＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＧ−５'」である。
【００７８】
一方、二本鎖分子がＲＮＡで構成される場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の標的配列に相当する配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＲＮＡ配列であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の標的配列に相当する相補配列は、「３'−ＣＧＵＵＵＧＵＧＧＡＣＧＡＧＵＵＣＡＧ−５'」のＲＮＡ配列である。
【００７９】
二本鎖分子は、標的配列に相当する配列およびそれに対する相補配列に加えて、２〜５ヌクレオチド長を有する１つもしくは２つの３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）、および／または、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結してヘアピン構造を形成するループ配列を有してよい。
【００８０】
ＣＤＣ４５Ｌ  ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写物と会合し、それによって翻訳を妨害し、したがってＣＤＣ４５Ｌタンパク質の発現を阻害することにより、該遺伝子によってコードされるＣＤＣ４５Ｌタンパク質の産生を阻害または低減する。同様に、ＰＩＦ１  ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写物と会合し、それによって翻訳を妨害し、したがってＰＩＦ１タンパク質の発現を阻害することにより、該遺伝子によってコードされるＰＩＦ１タンパク質の産生を阻害または低減する。
【００８１】
癌細胞株におけるＣＤＣ４５Ｌ遺伝子およびＰＩＦ１遺伝子の発現は、それぞれ２種類の二本鎖分子によって阻害された（図３および図５）。
【００８２】
したがって本発明は、細胞に導入された場合にがん細胞においてＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害するかまたは低下させる特性を有する、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下に記載するｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムにより設計することができる。
【００８３】
好ましい態様において、ＣＤＣ４５Ｌの標的配列には、例えば、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）または
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
が含まれる。
【００８４】
同様に、好ましい態様において、ＰＩＦ１の標的配列には、例えば、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）または
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
が含まれる。
【００８５】
言い換えれば、本発明はまた、標的配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２を含むかまたはそれらからなる、二本鎖分子も提供する。
【００８６】
具体的には、本発明は以下の二本鎖分子［１］〜［１８］を提供する：
［１］細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現ならびに細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、二本鎖分子；
［２］細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現ならびに細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子；。
［３］標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５より選択されるヌクレオチド配列に由来する約１９〜約２５個の連続したヌクレオチドを含む、［１］または［２］の二本鎖分子。
［４］約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［２］のいずれか１つの二本鎖分子。
［５］約７５ヌクレオチド長未満である、［４］の二本鎖分子。
［６］約５０ヌクレオチド長未満である、［５］の二本鎖分子。
［７］約２５ヌクレオチド長未満である、［６］の二本鎖分子。
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［７］の二本鎖分子。
［９］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一オリゴヌクレオチドからなる、［１］〜［８］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１０］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、
［９］の二本鎖分子。
［１１］ＲＮＡを含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［１１］のいずれか１つの二本鎖分子。
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１２］の二本鎖分子。
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１３］の二本鎖分子。
［１５］ＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１２］の二本鎖分子。
［１６］センス鎖における標的配列の５'末端領域、および／または、アンチセンス鎖における標的配列の相補配列の３'末端領域がＲＮＡからなる、［１５］の二本鎖分子。
［１７］ＲＮＡ領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［１６］の二本鎖分子；ならびに
［１８］１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２］のいずれか１つの二本鎖分子。
【００８７】
本発明の二本鎖分子について、以下でより詳細に説明する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。）例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、（www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlにおける）Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから利用可能である。
【００８８】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
【００８９】
標的部位の設計
１．  転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡおよび３'側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。Ｔｕｓｃｈｌらは、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するｓｉＲＮＡの設計を避けることを推奨した。
２．潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上で得られるＢＬＡＳＴを使用する（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402）。
３．合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。
【００９０】
「実施例」において設計されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の好ましい標的配列には、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）または
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
が含まれる。
【００９１】
同様に、「実施例」において設計されたＰＩＦ１遺伝子の好ましい標的配列には、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）または
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
が含まれる。
【００９２】
具体的には、本発明は、標的遺伝子を発現するがん細胞の増殖を阻害および低減する能力についてそれぞれ検討された上記の標的配列のいずれか1つを標的とする二本鎖分子を提供する。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現する癌細胞の増殖は、本発明の二本鎖分子によって阻害および低減された(図３および図５)。
【００９３】
したがって本発明は、
５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）および
５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
からなる群より選択されるCDC45L遺伝子の標的配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
【００９４】
同様に、本発明は、
５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）および
５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
からなる群より選択されるＰＩＦ１遺伝子の標的配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
【００９５】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の上記の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列のいずれか１つおよび／または該標的配列に対する相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を標的とする二本鎖分子の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列、およびそれに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上記の核酸配列における軽微な改変は許容される。本明細書において、核酸配列における「軽微な改変」とは、該配列に対する１個、２個、または数個の核酸の置換、欠失、付加、または挿入を示す。
【００９６】
１つの態様において、二本鎖分子は２つのポリヌクレオチドから構成され、一方のポリヌクレオチドは標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖を有し、もう一方のポリペプチドは該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
【００９７】
別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖と、該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖の両方を有するポリヌクレオチドから構成される。一般的に、センス鎖とアンチセンス鎖は介在鎖によって連結され、互いにハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
【００９８】
言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチド、および該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。該ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がＲＮＡであってもよく、標的配列がＤＮＡ配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「ｔ」は「ｕ」に置き換えられる。
【００９９】
本発明の１つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成されるステムループ構造を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、ループによって結合され得る。したがって本発明はまた、介在一本鎖によって連結されたかまたは介在一本鎖が隣接しているセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子も提供する。
【０１００】
本発明において、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を標的とする二本鎖分子は、標的配列として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２より選択される配列を有し得る。したがって、本発明の二本鎖分子の好ましい例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列およびそれに対する相補配列において互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に相当する配列およびそれに対する相補配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【０１０１】
本発明に従って、本発明の二本鎖分子を、実施例において利用される方法を用いてその能力について試験することができる（「実施例」におけるＲＮＡ干渉アッセイを参照されたい）。実施例では、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を、標準的な方法に従って、（例えば、ＳＢＣ−３およびＡ５４９を用いて）癌細胞株におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生を低減させる能力についてインビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞と比較した、該候補分子と接触させた細胞におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の減少を、例えば、記載されるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子ｍＲＮＡに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって、検出することができる（「実施例」の（ｂ）半定量的ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。次に、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生を低減させる配列を、細胞増殖に対する阻害効果について試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いてインビボでの能力について試験し、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。
【０１０２】
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合できる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。一部の態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドは典型的に、５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子を形成するため、または、二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するために有用である。二本鎖分子を形成するためにポリヌクレオチドを使用する場合、該ポリヌクレオチドのセンス鎖は１９ヌクレオチドより長くてよく、例えば２１ヌクレオチドより長くてよく、例えば約１９〜２５ヌクレオチド長であってよい。
【０１０４】
したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【０１０５】
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にＲＩＳＣ複合体のｍＲＮＡにおける相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的ＲＮＡはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列を用いてだけでなく、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を用いても示すことができる。
【０１０６】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有することができる。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）が含まれる。
【０１０７】
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾には、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）。
【０１０８】
別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様において、該二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換することができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらなる詳細については、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が入手可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
【０１０９】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）で作製されたハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。
【０１１０】
一部の態様において、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造を有し得る。一部の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有するが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。キメラ型二本鎖分子の一例として、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。
【０１１１】
上流部分領域とは、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を意味する。即ち、一部の態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５'−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−５'：アンチセンス鎖。
【０１１２】
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて約９〜１３ヌクレオチドのドメインであり得る。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。
【０１１３】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡで作製されたショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機序によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
【０１１４】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群より選択され得る。
【０１１５】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１標的遺伝子の発現を抑制する能力およびこれらの遺伝子を発現する細胞の阻害または低減をもたらす能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であり得る。領域［Ａ］は領域［Ａ'］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］を含むループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列からなる群より選択することができる（ウェブ上のambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１１６】
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡからなる群より選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＣＵＵＧＡＧＣＡＧＧＵＧＵＵＵＧＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−［Ｂ］−ＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＵＣＣＡＣＧＵＣＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＡＧＡＵＧＣＵＣＵＧＧＣＣＵＵＵＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；および
ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−［Ｂ］−ＣＡＣＡＡＵＣＣＡＧＧＧＵＣＡＵＧＣＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【０１１７】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを３'オーバーハングとしてセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、例えば２〜５個である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。３'オーバーハングのヌクレオチドは限定されないが、好ましくは「ｕ」または「ｔ」である。二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の３'末端に３'オーバーハングが付加される。
【０１１８】
二本鎖分子を調製する方法には、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することができる。化学合成法に従って、一本鎖のセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。あるいは、本発明の二本鎖分子またはｓｉＲＮＡ分子を、インビトロ翻訳を用いて合成してもよい。この態様においては、標的配列を含むヌクレオチド配列およびそのアンチセンスをコードするＤＮＡを、インビトロにおいて二本鎖分子へと転写する。アニーリングに関する一つの態様において、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも約３：７のモル比で、例えば約４：６のモル比で、例えば実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。
【０１１９】
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、標的配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子鋳型を、例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
【０１２０】
あるいは、二本鎖分子のコード配列を、適切な細胞内での該二本鎖分子の発現を支持する調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター）を該コード配列に隣接して含むベクター内にクローニングすることによって、その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、該二本鎖分子を細胞内で転写してもよい。二本鎖分子のコード配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターについての詳細を以下に述べる。
【０１２１】
（ｉｉ）ベクター
本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖分子を含むベクター、および該ベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。一つの態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。したがって、一つの態様において、発現ベクターは本発明の二本鎖分子をコードし、かつ該二本鎖分子の発現に適合している。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
【０１２２】
あるいは本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターを提供し、ここで該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２に対応するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子を発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、約１９〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５のヌクレオチド配列に由来する連続したヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【０１２３】
本発明のベクターは、例えば、標的配列を含む配列を、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的に該配列に連結されるように発現ベクターにクローニングすることによって、作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１２４】
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR &amp; Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに仲介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子仲介性（「遺伝子銃」）または圧力仲介性の送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１２５】
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターであることができる。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスが含まれる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）が含まれる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１２６】
（ｉｉｉ）二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害または低減し、がんを治療または予防する方法
本発明において、上記の標的配列を標的とする二本鎖分子それぞれを、該標的遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖を阻害または低減する能力について調べた。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する癌細胞の増殖は、本発明の二本鎖分子によって阻害または低減された（図３および図５）。
【０１２７】
したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現を阻害することにより、細胞増殖を、すなわち、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんに由来する細胞のがん性細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子発現は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現を特異的に標的とする本発明の前述の二本鎖分子のいずれかによって、または本発明の二本鎖分子のいずれかを発現し得る本発明のベクターによって、阻害され得る。
【０１２８】
本発明の二本鎖分子およびベクターががん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力によって、それらを、がん、すなわちＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するかまたはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんを治療するための方法に使用できることが示される。したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するか、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんを有する患者を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子すなわち阻害核酸、または該分子を発現するベクターを投与することにより、正常な器官ではそれらの遺伝子がほとんど検出されなかったことから、有害作用を引き起こすことなく治療するための方法を提供する。
【０１２９】
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［２３］を提供する：
［１］少なくとも１つの二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖を阻害または低減する方法、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療もしくは予防する方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合に、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のインビボ発現を阻害するかまたは低下させる方法。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列と配列同一性を共有するか、または該標的配列に相補的であるｍＲＮＡにおいて作用する、［１］の方法。
［３］二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］の方法。
［４］複数の二本鎖分子が投与される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法；
［５］複数の二本鎖分子が同一遺伝子を標的とする、［４］の方法；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［５］のいずれか１つの方法；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］の方法；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］の方法；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］の方法；
［１０］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［９］のいずれか１つの方法；
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一オリゴヌクレオチドからなる、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１２］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［１１］の方法。
［１３］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］〜［１２］のいずれか１つの方法。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［１２］のいずれか１つの方法。
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］の方法。
［１６］センス鎖およびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１５］の方法。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１４］の方法。
［１８］センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの一方または両方の５'末端に隣接する領域がＲＮＡから作製されている、［１７］の方法。
［１９］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［１８］の方法。
［２０］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［１９］のいずれか１つの方法。
［２１］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］〜［２０］のいずれか１つの方法。
［２２］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［２１］の方法。
［２３］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および／または細胞透過剤を含む組成物中に含まれる、［１］〜［２２］のいずれか１つの方法。
【０１３０】
本発明の方法について、以下でより詳細に説明する。
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現する細胞の増殖は、該細胞をＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物と接触させることにより阻害される。該細胞をさらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、該分子に曝露されていない細胞と比較して、細胞がより低速で増殖するかまたは該細胞の生存率が低下することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイ法を用いて、測定することができる。
【０１３１】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現する限り、いかなる種類の細胞の増殖も、本発明の方法に従って抑制することができる。例示的な細胞にはがん細胞が含まれる。
【０１３２】
したがって、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子に関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現する少なくとも１つのベクター、または該分子の少なくとも１つを含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療することができる。例えば、がん患者を本発明の方法に従って治療することができる。がんの型は、診断する特定の腫瘍の型に従う標準的な方法によって同定することができる。いくつかの態様において、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、または免疫測定法により患者由来の生検材料におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の（過剰）発現を検出することによって、選択される。いくつかの態様では、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本は、当技術分野で公知の方法、例えば免疫組織化学的解析、ハイブリダイゼーション、またはＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現について確認される（「実施例」における半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、または免疫組織化学を参照されたい）。
【０１３３】
細胞増殖を阻害または低減し、それによってがんを治療する本発明の方法によれば、複数種類の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターまたはこれを含む組成物）を投与する場合、該分子のそれぞれは、同一遺伝子の異なる標的配列、または異なる遺伝子の異なる標的配列に指向し得る。例えば、本方法は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子転写物に指向する異なる二本鎖分子を利用することができる。あるいは、例えば本方法は、同一遺伝子から選択される１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。
【０１３４】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子と対応するｍＲＮＡ転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡをベクターとして細胞に導入することもできる。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ  ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用することができる。
【０１３５】
治療により臨床的恩恵、例えばＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下がもたらされる場合に、該治療は有効であると判定される。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成が遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状が予防もしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定される。
【０１３６】
本発明の方法および組成物が「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の作用を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能の回復および疾患関連の合併症の低減によって、既に確立された疾患の悪影響を低下させることを目的とした活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【０１３７】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などのいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を低下させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療の構成要素であり、かつ／または、予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定な疾患を含む。
【０１３８】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡ（遺伝子転写物）を分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
【０１３９】
当業者は、要素、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかを考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、例えば約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、例えば約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの、がん部位またはその近傍での細胞間濃度を含む。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。
【０１４０】
本発明の方法を用いて、がん；例えば、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子の過剰発現に起因するがん、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがん、例えば肺癌の増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０からなる群より、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群より選択される標的配列に向けられた二本鎖分子が、がんの治療のために有用である。
【０１４１】
がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子によって促進されるがんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
【０１４２】
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
【０１４３】
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが含まれる。一つの態様において、送達試薬はリポソームである。
【０１４４】
リポソームは、特定の組織、例えば網膜組織または腫瘍組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む。一般に脂質の選択は、要素、例えば所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
【０１４５】
一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、有用である。
【０１４６】
一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾する。一つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１４７】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１４８】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（ｌｅａｋｙ）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１４９】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、分子量約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０１５０】
一部の態様において、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１５１】
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１５２】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
【０１５３】
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１５４】
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
【０１５５】
好適な非経口投与経路には、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が含まれる。一部の態様において、二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行うことができる。
【０１５６】
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。剤の注射は、組織内へ、またはがん部位の近傍に直接行うことができる。がん部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射を施すことができる。
【０１５７】
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、例えば約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。一つの例示的な投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【０１５８】
本発明において、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分によって治療することができる。
【０１５９】
がんには、肺癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、治療されるがん性細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を（過剰）発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の該発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
ｉｉｉ）正常対照と比較してＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを有する対象に対して、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
【０１６０】
あるいは本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
【０１６１】
本発明のがん治療法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
【０１６２】
本発明に従って、対象から採取したがん細胞におけるがん細胞または組織におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１６３】
さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５）の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
【０１６４】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）その標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０１６５】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１６）の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質との結合能を保持している限り、該断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
【０１６６】
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量／レベルの増大を示すと同時に、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の高い発現レベルを示す。
【０１６７】
がん細胞における標的遺伝子、すなわちＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）よりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを決定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【０１６８】
本発明の文脈において、非がん性であることが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
【０１６９】
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。
【０１７０】
（ｉｖ）組成物
さらに本発明は、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つまたは該分子をコードするベクターを含む、薬学的組成物を提供する。具体的には、本発明は以下の組成物［１］〜［２４］を提供する：
［１］少なくとも１つの二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞の増殖を阻害または低減するため、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１遺伝子を発現するがんを治療もしくは予防するための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合に、該遺伝子のインビボ発現を阻害するかまたは低下させる組成物。
［２］二本鎖分子が、ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０の群、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２の群より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］の組成物。
［３］二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］の組成物。
［４］治療を受けるがんが肺癌である、［１］〜［３］のいずれか１つの組成物；
［５］肺癌が小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、［４］の方法；
［６］複数種類の二本鎖分子を含む、［１］〜［５］のいずれか１つの組成物；
［７］複数種類の二本鎖分子が同一遺伝子を標的とする、［６］の組成物；
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］〜［７］のいずれか１つの組成物；
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］の組成物；
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］の組成物；
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］の組成物；
［１２］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［１１］のいずれか１つの組成物；
［１３］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］〜［１２］のいずれか１つの組成物。
［１４］二本鎖分子が一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、
［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；
［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
［Ａ'］は、［Ａ］において選択される標的配列に相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である、
［１３］の組成物。
［１５］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］〜［１４］のいずれか１つの組成物；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡを含む、［１］〜［１４］のいずれか１つの組成物；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１６］の組成物；
［１８］センス鎖およびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから作製されている、［１７］の組成物；
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１８］の組成物；
［２０］センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの一方または両方の５'末端に隣接する少なくとも１つの領域がＲＮＡからなる、［１９］の組成物；
［２１］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドからなる、［２０］の組成物；
［２２］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２１］のいずれか１つの組成物；
［２３］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］〜［２２］のいずれか１つの組成物；
［２４］トランスフェクション増強剤、細胞透過剤、または薬学的に許容される担体をさらに含む、［１］〜［２３］のいずれか１つの組成物。
【０１７１】
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で用いられる「薬学的製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されるような、当技術分野における技術の範囲内である。
【０１７２】
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容される担体媒体と混合された、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つもしくはそれらをコードするベクター（例えば、０．１〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容される塩を含む。例示的な生理学的に許容される担体媒体には、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が含まれる。
【０１７３】
本発明によれば、組成物は複数種類の二本鎖分子を含んでよく、該分子のそれぞれは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の同一標的配列または異なる標的配列に指向し得る。例えば、組成物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子に指向する二本鎖分子を含み得る。あるいは、例えば組成物は、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子より選択される標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。
【０１７４】
さらに、本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含み得る。例えば、ベクターは、１種類、２種類、または数種類の本発明の二本鎖分子をコードし得る。あるいは、本発明の組成物は、それぞれが異なる二本鎖分子をコードする、複数種類のベクターを含み得る。
【０１７５】
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含まれ得る。リポソームの詳細に関しては、「（ｉｉｉ）二本鎖分子を用いて、がん細胞の増殖を阻害または低減し、がんを治療または予防する方法」の項を参照されたい。
【０１７６】
本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。
【０１７７】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いることができる。
【０１７８】
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、例えば２５〜７５％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための薬学的組成物は、上記のようにリポソーム中に封入される０．０１〜２０重量％、例えば１〜１０重量％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数、および噴霧剤を含み得る。必要に応じて、担体、例えば鼻腔内送達の場合はレシチンを含めることもできる。
【０１７９】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的有効成分を含み得る。例えば、本組成物は、がんを治療するために従来用いられている化学療法薬を含み得る。
【０１８０】
本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療するための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんを治療するための薬学的組成物の製造のための、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における、該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用であって、該分子が、互いにハイブリダイズして該二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする、使用に関する。
【０１８１】
あるいは、本発明はさらに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現するがんの治療に使用するための、本発明の二本鎖核酸分子を提供する。
【０１８２】
本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される担体を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に製剤化する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつ有効成分として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする。
【０１８３】
本発明はまた、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を（過剰）発現するがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、ここで、該有効成分が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子を過剰発現する細胞における該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、または１２の配列を標的とする。
【０１８４】
（４）ＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがんを診断するための方法
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現は、対応する正常組織と比較して、肺癌組織において特異的に上昇することが見出された（図１、図２）。さらに、ＰＩＦ１遺伝子の発現もまた、対応する正常肺組織と比較して、肺癌組織において特異的に上昇することが見出された（図４）。したがって、本発明において同定された遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子によって仲介されるがんのマーカーとしての診断的有用性を有し、かつ、がんに罹患している疑いのある患者に由来する試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現を測定することにより、これらのがんを診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定することにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるがんを診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断可能なＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１促進性のがんには、肺癌が含まれる。肺癌には、非小肺癌、小肺癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および肺大細胞癌（ＬＣＣ）が含まれる。本発明に従って、対象の状態を調べるための中間結果が提供され得る。そのような中間結果を付加的な情報と組み合わせて、医師、看護師、または他の実施者が、対象が疾患に罹患していると診断するのを補助することができる。あるいは、本発明を用いて対象由来の組織中のがん性細胞を検出し、該対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
【０１８５】
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［１５］を提供する：
［１］ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１によって仲介または促進されるがんを診断する方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子および／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した発現レベルの上昇を疾患と関連づける段階
を含む、方法。
［２］対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象ががんに罹患しているかもしくはその発症リスクを有することが示されるかまたは該対象におけるがんの存在が示される方法、
［３］発現レベルが正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、［１］または［２］の方法。
［４］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか１つによって検出される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法。
［５］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、ならびに
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質の１つまたは複数の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、［１］〜［３］のいずれか１つの方法。
［６］がんが、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因するか、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１によって仲介もしくは促進される、［１］〜［５］のいずれか１つの方法。
［７］がんが肺癌である、［１］〜［６］のいずれか１つの方法。
［８］肺癌が非小細胞肺癌または小細胞肺癌である、［７］の方法。
［９］発現レベルが、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードする遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、［４］または［５］の方法。
［１０］発現レベルが、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することにより測定される、［４］または［５］の方法。
［１１］生物学的試料が生検試料、痰、または血液を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１２］対象由来の生物学的試料が上皮細胞、血清、または胸水を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つの方法。
［１３］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１］〜［１３］のいずれかの方法。
［１５］対象由来の生物学的試料が肺組織を含む、［１］〜［１０］のいずれかの方法。
【０１８６】
がんを診断する方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の方法によって診断される対象は、哺乳動物であってよい。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
本発明の方法を実施する際には、診断される対象から生物学的試料を採取して、診断を行う。ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を測定のための生物学的試料として用いることができる。生物学的試料には、身体組織ならびに体液、例えば血液、例えば血清、痰、尿、および胸水が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、生物学的試料は、上皮細胞、例えば癌性上皮細胞、または癌性と疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞群を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後生物学的試料として用いることができる。
【０１８８】
本発明に従って、対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンブロット解析）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するためであってよい。当業者は、ＣＤＣ４５Ｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００３５０４．３）またはＰＩＦ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２５０４９．２）の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、適切な標識、例えば色素、蛍光物質、および同位体でプローブを標識することができ、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出することができる。
【０１８９】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写産物を定量することができる。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で用いられるプライマー（ＣＤＣ４５ＬについてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ＰＩＦ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１９０】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。
【０１９１】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。タンパク質検出のためのこのような種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。
【０１９２】
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色が観察されることにより、該タンパク質の存在量の増加、および同時にＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の高い発現レベルが示される（「実施例」における免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析を参照されたい）。
【０１９３】
さらに、診断の精度を向上させるために、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。
【０１９４】
生物学的試料中のＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応する（例えば正常細胞または非がん性細胞内の）がんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇したと見なすことができる。
【０１９５】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している一名／複数名の対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルを、複数の参照試料から測定された複数の対照レベルと比較することもできる。いくつかの態様では、患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルが用いられる。いくつかの態様では、疾患状態が判明している群におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルの基準値が用いられる。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。
【０１９６】
本発明の文脈において、がん性でないと判明している生物学的試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。例えば、癌性器官と同じ器官から採取された正常組織を診断することができる。したがって、正常肺組織を、肺癌を診断するための正常対照として診断することができる。一方、対照レベルががん性生物学的試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。
【０１９７】
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象を、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有すると診断することができる。さらに、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象が、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１によって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。そのようながんは肺癌を包含する。
【０１９８】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの差を、細胞のがん性状態および非がん性状態によって発現レベルが相違しないことが既知である対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
あるいは、本発明は、対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象由来の肺組織試料中の癌細胞を検出または同定するための方法を提供し、ここで、該発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該組織中の癌細胞の存在または疑いが示される。
【０２００】
対象が疾患に罹患していると診断する際、医師、看護師、または他の医療実施者を補助するために、そのような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。言い換えれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明に従って、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関して疑いがある場合には、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および該対象の臨床経過等を含む該疾患の別の局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血中の診断用肺腫瘍マーカーは、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間結果として役立つ。
【０２０１】
あるいは、本発明は、がんの診断用の診断試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
【０２０２】
具体的には、そのような試薬は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する抗体である。
【０２０３】
言い換えれば、本発明はまた、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子またはＰＩＦ１遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する試薬を含む、がんの診断または検出において使用するためのキットも提供する。
【０２０４】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１は有用な診断マーカーであるだけでなく、がん療法のための適切な標的であることが、明らかになっている。したがって、本発明によって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療を達成することができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療とは、がん細胞におけるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の活性および／または発現の抑制または阻害を指す。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療のために、任意の抗ＣＤＣ４５Ｌ剤または抗ＰＩＦ１剤を用いることができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を標的とするがん治療のために、剤を用いることができる。本発明において、抗ＣＤＣ４５Ｌ剤または抗ＰＩＦ１剤は、有効成分として以下の物質を含む：
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター。
【０２０５】
したがって好ましい態様において、本発明は、（ｉ）対象が治療すべきがんを有するかどうかを診断しかつ／または（ｉｉ）がん治療のために対象を選択する方法を提供し、該方法は、
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルががん性対照レベルと類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
【０２０６】
（５）ＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがんの予後を評価する方法
本発明は、ＣＤＣ４５Ｌの（過剰）発現がＣＤＣ４５Ｌ仲介性のがん、例えば肺癌を有する患者の予後不良と有意に関連しているという発見に一部基づいている。したがって本発明は、患者の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを検出し；検出された発現レベルを対照レベルと比較し；かつ、対照レベルに対する発現レベルの上昇が予後不良（生存率低下）を示すと判定することによって、がん、例えばＣＤＣ４５Ｌによって仲介されるかまたはその過剰発現に起因するがん、例えば肺癌を有する患者の予後を判定または評価する方法を提供する。
【０２０７】
本明細書において、「予後」という用語は、症例の性質および症状によって示される、疾患の推定される転帰および該疾患からの回復見込みに関する予想を指す。したがって、あまり好ましくない、ネガティブな、または不良な予後は、短い治療後生存期間または低い生存率によって定義される。逆に、ポジティブな、好ましい、または良好な予後は、長い治療後生存期間または高い生存率によって定義される。
【０２０８】
「予後を評価する」という用語は、患者のがんの将来の転帰（例えば、悪性度、がんが治癒する見込み、推定生存期間等）を予測する、予想する、または所与の検出もしくは測定と関連づける能力を指す。例えば、経時的なＣＤＣ４５Ｌの発現レベルの測定によって、患者の転帰（例えば、悪性度の上下、がんのグレードの上下、がんが治癒する見込み、生存期間等）を予測することが可能になる。
【０２０９】
本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、がん、進行、特にがんの再発、転移拡散、および疾患再発の予測および尤度解析を包含することが意図される。予後を評価するための本発明の方法は、治療的介入、診断基準、例えば病期分類、ならびに、新生物性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む、治療様式に関する判断において臨床的に用いられることが意図される。
【０２１０】
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［６］を提供する：
［１］肺癌を有する対象の予後を評価するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌの発現レベルを検出する段階；
（ｂ）検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、患者の予後を判定する段階
を含む、方法；
［２］対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較して発現レベルが上昇していることにより予後不良が示される、［１］の方法；
［３］対照レベルが予後不良対照レベルであり、発現レベルが該対照レベルと類似していることにより予後不良が示される、［１］の方法；
［４］上昇が、前記対照レベルを少なくとも１０％上回る、［２］の方法；ならびに
［５］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法によって測定される、［１］〜［４］のいずれか１つの方法；
［６］対象由来の生物学的試料が肺癌組織または肺癌細胞を含む、［１］〜［５］のいずれか１つの方法。
【０２１１】
本方法に用いられる患者由来の生物学的試料は、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子が試料中で検出され得る限り、評価される対象に由来する任意の試料であってよい。いくつかの態様において、生物学的試料は肺細胞（肺から採取された細胞）を含む。さらに、生物学的試料には、体液、例えば痰、血液、血清、血漿、胸水等が含まれる。さらに、試料は組織から精製または採取された細胞であってよい。生物学的試料は、治療前、治療中、および／または治療後を含む様々な時点で、患者から採取することができる。例えば、評価される対象から採取された肺癌細胞は、好ましい生物学的試料である。
【０２１２】
本発明に従って、患者由来の生物学的試料中で測定されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復、および／または生存率に関する予後がより不良であり、かつ臨床転帰不良の可能性がより高いことが示された。したがって、本発明の方法によれば、比較に用いられる「対照レベル」は、例えば、治療後にがんの良好なまたはポジティブな予後を示した個体または個体群において、任意の種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後良好対照レベル」と称される。あるいは、「対照レベル」は、治療後にがんの不良なまたはネガティブな予後を示した個体または個体群において、あらゆる種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後不良対照レベル」と称される。「対照レベル」は、単一の参照群に由来する単一の発現パターンであるか、または複数の発現パターンに由来する。したがって対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん患者またはがん患者群におけるあらゆる種類の治療の前に検出されたＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。いくつかの態様において、がんは肺癌である。いくつかの態様では、疾患状態が判明している患者群におけるＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルの基準値が用いられる。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。
【０２１３】
対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん患者（対照または対照群）から、あらゆる種類の治療前に予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。
【０２１４】
あるいは、対照レベルは、対照群から予め採取し保存しておいた試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞または患者に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することができる。いくつかの態様では、患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルが用いられる。
【０２１５】
本発明に従って、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが予後良好対照レベルに類似していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、予後良好対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。一方、予後不良対照レベルと比較してＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルが低下していることにより、患者の予後がより好ましいことが示され、該発現レベルが予後不良対照レベルと類似していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後がより好ましくなく不良であることが示される。例えば、治療後に癌の良好なまたは不良な予後を示した対象から採取された肺癌細胞は、それぞれ予後良好対照レベルまたは予後不良対照レベルの好ましい生物学的試料である。
【０２１６】
生物学的試料中のＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルは、該発現レベルが対照レベルと１．０倍、１．５倍、２．０倍、５．０倍、１０．０倍、またはそれ以上異なる場合に、変化した（すなわち、上昇または低下した）と見なすことができる。
【０２１７】
試験生物学的試料と対照レベルとの間の発現レベルの差は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、がん性細胞と非がん性細胞との間で発現レベルが相違しないことが既知であるポリヌクレオチド、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを正規化することができる。
【０２１８】
当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物学的試料中の遺伝子転写物を検出することによって、発現レベルを測定することができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
【０２１９】
例えば、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の転写産物は、該遺伝子転写物に対するＣＤＣ４５Ｌ遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析により、検出することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイを使用することができる。別の例として、例えばＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に特異的なプライマーを用いる、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）といった増幅に基づく検出法を、該検出に使用することができる（「実施例」における（ｂ）半定量的ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーは、ＣＤＣ４５Ｌの全配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製することができる。例えば、実施例で用いられるプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）を、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０２２０】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いられる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別々の状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。通常、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３においてナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することもできる。
【０２２１】
あるいは、本発明の評価のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５Ｌタンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製することができる。
【０２２２】
ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色の観察により、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の存在の増加、およびそれと同時にＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の高発現レベルが示される。
【０２２３】
さらに、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、そのような細胞増殖活性を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えば、ＣＤＣ４５Ｌを発現する細胞を調製し、生物学的試料の存在下で培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。
【０２２４】
さらに、評価の精度を向上させるために、ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現レベルに加えて、その他の肺細胞関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。そのような他の肺癌関連遺伝子には、国際公開公報第２００４／０３１４１３号および国際公開公報第２００５／０９０６０３号に記載されているものが含まれる。
【０２２５】
本発明の方法に従ってがんの予後について評価を受ける患者は哺乳動物であってよく、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
【０２２６】
あるいは、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果もまた提供され得る。そのような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実施者が対象の予後を評価、判定、または推定するのを補助することができる。予後を評価するために、本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮され得るさらなる情報には、対象の臨床症状および身体状態が含まれる。
【０２２７】
あるいは、本発明は、がんの予後を評価するための試薬を調製するための試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、該試薬は、
（ａ）ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌを検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される。
【０２２８】
具体的には、そのような試薬は、ＣＤＣ４５Ｌポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに結合する抗体である。
【０２２９】
（６）がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキット
本発明は、がんを診断するためまたはがんの予後を評価するためのキットを提供する。本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターで治療可能ながんに罹患している対象を判定するためのキットを提供し、これはまた、がん治療の有効性を評価および／またはモニタリングするのにも有用であり得る。いくつかの態様において、がんは、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１によって仲介されるか、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に起因し、例えば肺癌である。具体的には、本キットは、患者由来の生物学的試料中のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、該試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０２３０】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、または該ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡに特異的であるプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０２３１】
プローブまたはプライマーは、特定のサイズのものであってよい。サイズは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドからなる群より選択され、プローブおよびプライマーは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドのサイズ範囲であってよい。
【０２３２】
一方、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するのに適した試薬には、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。さらに、直接連結または間接標識技術により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識および、抗体を標識してその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０２３３】
さらに、例えば、生物学的試料中の発現したＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質による細胞増殖活性を測定することにより、生物学的活性を測定することができる。例えば、患者由来の生物学的試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。必要に応じて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０２３４】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。さらに、キットは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子に対するプローブまたはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、予後良好または予後不良である患者から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器内に含まれ得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。
【０２３５】
本発明の１つの態様として、試薬がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を固体基質上、例えば多孔性ストリップ上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定領域または検出領域には、核酸（プローブ）をそれぞれ含む複数の部位が含まれ得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより大量、以降の部位ではより少量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０２３６】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１陽性血液試料を回収することによって調製することができ、次にそれらのＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１レベルを分析する。あるいは、精製されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を含まない血清に添加して、陽性試料すなわちＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１標準物質を形成することもできる。本発明において、精製されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１レベルは、例えばカットオフ値を上回る。
【０２３７】
（７）スクリーニング法
ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはその断片、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、該遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変更する剤または化合物をスクリーニングすることが可能である。そのような剤または化合物は、がん、特に肺癌を治療または予防するための医薬として用いることができる。したがって本発明は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはその断片、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、がんを治療または予防するための候補剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０２３８】
本発明のスクリーニング法によって単離される剤または化合物は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現または該遺伝子の翻訳産物の活性を阻害することが予想される物質であり、したがって、例えば、がん（特に、肺癌および食道癌）などの細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するための候補である。すなわち、本発明の方法によってスクリーニングされた剤または化合物は、臨床的利点を有すると考えられ、動物モデルまたは試験対象においてがん細胞増殖を予防する能力についてさらに試験することができる。
【０２３９】
（Ｉ）スクリーニング用の試験化合物
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤は、複数の化合物を含む任意の化合物または組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
【０２４０】
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。
【０２４１】
アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２−１０３３６０号）の表面に提供され得る。
【０２４２】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる化合物に含まれる。
【０２４３】
さらに、スクリーニングした試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験剤または試験化合物の調製において有用である。
【０２４４】
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物とは、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質またはパートナーに対する結合活性が欠如したＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の部分ペプチドに特異的に結合する、抗体または非抗体結合タンパク質でもあり得る。そのような部分タンパク質または抗体は、本明細書に記載の方法（定義または抗体の（１）がん関連遺伝子およびがん関連タンパク質、ならびにこれらの機能的同等物を参照されたい）によって調製することができ、かつ、それらがタンパク質とその結合パートナーとの結合を遮断する能力について試験することができる。試験剤または試験化合物のライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤または化合物のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
【０２４５】
（ｉ）分子モデリング
試験剤／試験化合物のライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、阻害される標的分子の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤／試験化合物とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０２４６】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）コンピュータが必要である。
【０２４７】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
【０２４８】
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay &amp; Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry &amp; Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis &amp; Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
【０２４９】
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，  Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０２５０】
後述のように、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１活性のインヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定されたインヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた候補インヒビターすなわち「試験剤／試験化合物」のライブラリを、がんの治療および／もしくは予防ならびに／またはがんの術後再発の防止に関するＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の活性を妨害する該ライブラリの試験剤または試験化合物を同定するための本発明の方法を用いて、スクリーニングすることができる。
【０２５１】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１活性の既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築することができる。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０２５２】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（ｒａｎｄｏｍ  ｂｉｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０２５３】
（ｉｉｉ）その他の候補
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott &amp; Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
【０２５４】
アプタマーは、特定の分子標的に強く結合する核酸から構成される巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249: 505-510 (1990））は、アプタマー選択のためのＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリ｛例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０２５５】
（ＩＩ）スクリーニング法
（ｉ）一般的スクリーニング法
ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子、該遺伝子によってコードされるタンパク質、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、該遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変更する化合物を同定することができる。本発明において、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子は、がんにおいて過剰発現することが見出され、がん細胞の増殖および／または生存に関与することが実証された。したがって、該遺伝子の発現または該遺伝子によるポリペプチドの生物学的活性を変更する化合物は、がんの候補治療薬となり得る。
【０２５６】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合するアンタゴニストは、がんの細胞増殖を仲介する生物学的活性を阻害することができ、よってそれらはがんを治療するための候補である。したがって本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する剤または化合物を同定することにより、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現するがんを治療または予防するための潜在的候補を同定するための方法を提供する。
【０２５７】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質とその結合パートナーとの（例えば、ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の相互の）間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。例えばインビトロアッセイ系、例えば細胞系として、スクリーニングを行うことができる。より具体的には、まず、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１タンパク質、あるいはその結合パートナーのいずれか一方を、支持体に結合させ、それに対してもう一方のタンパク質を試験化合物と共に添加する。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を支持体に結合させ、それに対して結合パートナーポリペプチドを試験化合物と共に添加する。次に、この混合物をインキュベーションし、洗浄し、支持体に結合しているもう一方のタンパク質を検出および／または測定する。
【０２５８】
本発明の文脈において、２つのタンパク質間の「結合の阻害」とは、タンパク質間の結合を少なくとも低減させることを指す。したがって、場合によっては、試験剤または化合物の存在下における試料中の結合対のパーセンテージは、適切な（例えば、試験化合物で処理していないか、または、非がん試料に由来するかもしくはがん試料に由来する）対照と比較して低下する。結合しているタンパク質の量の減少とは、対照試料中で結合している対の例えば９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、またはそれ以下であってもよい（例えば、０％）。
【０２５９】
タンパク質を結合させるために使用できる支持体の例には、例えば、不溶性多糖類、例えばアガロース、セルロース、およびデキストラン；ならびに合成樹脂、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンが含まれ；例えば、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ等）を用いることができる。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填することができる。あるいは、磁気ビーズの使用もまた当技術分野において公知であり、これにより、ビーズに結合しているタンパク質を、磁力によって容易に単離することが可能になる。
【０２６０】
支持体に対するタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの慣行的方法に従って行うことができる。あるいは、タンパク質を、該タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させることができる。さらに、支持体に対するタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンによって行うこともできる。
【０２６１】
固定化されたポリペプチドが合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露された場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および該タンパク質に結合するタンパク質のみならず化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するためのコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いたスクリーニングの方法（Wrighton et al., Science 273: 458-63 (1996)；Verdine, Nature 384: 11-3 (1996)）は、当業者に周知である。
【０２６２】
さらに、本発明のスクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦの発現レベルを抑制する剤または化合物もまた、がんの候補治療薬として同定することができる。ポリペプチドまたはその機能的同等物の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、レポーターアッセイを用いることができる。適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製することができる。該遺伝子の転写調節領域が当業者に公知である場合には、以前の配列情報を用いることによって、レポーター構築物を調製することができる。転写調節領域が同定されていない場合には、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントを、該遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリから単離することができる。具体的には、スクリーニングに必要なレポーター構築物は、関心対象のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列を連結することによって調製することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、例えば１０００ｂｐ、例えば５０００または１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することもでき、ＰＣＲにより増殖させることもできる。転写調節領域を同定するための方法、およびまたアッセイプロトコールも周知である（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０２６３】
さらに、本発明のスクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦタンパク質の生物学的活性を阻害する剤または化合物を、がんの候補治療薬として同定することもできる。
【０２６４】
様々なロースループットおよびハイスループットの酵素アッセイ形式が当技術分野で公知であり、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性の検出または測定のために容易に適合させることができる。ハイスループットアッセイのために、基質を好都合に固体支持体上に固定化することができる。反応後、上記の方法によって、該ポリペプチドによって変換された基質を固体支持体上で検出することができる。あるいは、接触段階を溶液中で行うことができ、その後、基質を固体支持体上に固定化することができ、該ポリペプチドによって変換された基質を検出することができる。このようなアッセイを容易にするために、固体支持体をストレプトアビジンでコーティングしかつ基質をビオチンで標識することができ、または、固体支持体を基質に対する抗体でコーティングすることができる。当業者は、スクリーニングの所望のスループット容量に応じて、適切なアッセイ形式を決定することができる。
【０２６５】
本発明のアッセイはまた、ハイスループットスクリーニングを容易にする自動化手順にも適している。いくつかの周知のロボットシステムが、液相化学のために開発されている。これらのシステムには、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（大阪、日本）によって開発された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および化学者によって行われる手作業での合成操作を模倣するロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。上記装置のいずれも、本発明と共に使用するのに適している。本明細書で考察したように該装置が動作するような性質、および（必要であれば）該装置に対する改良の実施は、関連技術分野の当業者には明白であろう。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリがそれ自体で市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等を参照されたい）。
【０２６６】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルおよび／または生物学的活性の抑制ががん細胞の増殖の抑制をもたらすことが明らかとなる。したがって、化合物または剤がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現および／または活性を抑制する場合、該抑制は対象における潜在的治療効果を示す。本発明において、潜在的治療効果とは、合理的に予想される臨床的利点を指す。本発明において、そのような臨床的利点には、
（ａ）ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１遺伝子の発現の低下、
（ｂ）対象におけるがんの大きさ、有病率、もしくは転移能の低下、
（ｃ）がんの形成の妨害、または
（ｄ）がんの臨床症状の妨害もしくは緩和
が含まれる。
【０２６７】
（ｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の過剰発現は癌において検出されたが、正常組織では検出されなかった。さらに、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドは、がん細胞増殖に関与することが実証された。したがって、これらの遺伝子は、がんの治療および診断のための優れた分子標的であり得る。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合する剤または化合物は、これらのポリペプチドの生物学的活性を阻害する可能性がある。そのような化合物は、肺癌を治療もしくは予防するための医薬、または、肺癌を診断するためおよび肺癌患者の予後を評価するための検出剤として用いられる。
【０２６８】
具体的には、本発明は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いて、がんを診断する、治療する、または予防するのに有用な剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング法の１つの態様は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたは断片と該試験剤または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片に結合する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む。
【０２６９】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０２７０】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）ｂ）の結合レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
【０２７１】
あるいは、本発明に従って、がんの治療または予防に対する試験剤または試験化合物の潜在的治療効果を評価または推定することもできる。いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防、または該がんの阻害に対する、試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）剤または化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該試験剤または試験化合物が該ポリペプチドに結合する場合に示される潜在的治療効果を、該剤または化合物と関連付ける段階
を含む。
【０２７２】
本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
【０２７３】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
スクリーニングのために使用されるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０２７４】
例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いてＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって実施することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
【０２７５】
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が含まれる。
【０２７６】
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
【０２７７】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
【０２７８】
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもでき、該抗体は上述のように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを、エピトープ、例えばＧＳＴとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
【０２７９】
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
【０２８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドに結合したタンパク質は、一般的な染色法、例えばクマシー染色または銀染色では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０２８１】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウエスト−ウエスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞（例えば肺癌細胞株）からｃＤＮＡライブラリを調製する段階、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識することができる。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用することができる。
【０２８２】
「標識」および「検出可能な標識」という用語は、本明細書において、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を指すために用いられる。このような標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびその他、ＥＬＩＳＡで一般的に用いられるもの）、および例えばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のビーズなどの比色標識が含まれる。このような標識の使用を開示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が含まれる。このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、感光フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、蛍光マーカーは、放出された光を検出するための光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を与えて該酵素の該基質に対する作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、着色標識を可視化するだけで検出される。
【０２８３】
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
【０２８４】
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０２８５】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化することができ、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験化合物を該カラムにアプライする。本明細書における試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０２８６】
本発明において結合した化合物を検出または定量するための手段として、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサを使用することができる。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
【０２８７】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
【０２８８】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを抑制することにより、細胞増殖が低下することが明示される。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１と結合する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物ががんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけられ得る。
【０２８９】
（ｉｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片の生物学的活性を指標として用いて、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０２９０】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［４］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現するがんの治療または予防に有用な剤または化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリヌクレオチドまたはその機能的同等物もしくは断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出されたレベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階；
（ｄ）該ポリペプチドの生物学的活性を低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［２］生物学的活性が細胞増殖促進活性である、［１］の方法；
［３］ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの生物学的活性がＤＮＡ複製活性またはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合活性である、［１］の方法；ならびに
［４］ＰＩＦ１ポリペプチドの生物学的活性がヘリカーゼ活性、テロメラーゼ阻害活性、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに対する結合活性である、［１］の方法。
【０２９１】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補剤もしくは候補化合物、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階、および
ｃ）ｂ）の生物学的活性を該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
【０２９２】
あるいは、いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対する、または該がんの阻害に対する、試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。
【０２９３】
本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
【０２９４】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
【０２９５】
ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、細胞増殖活性（細胞増殖促進活性）、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１に対する互いの結合活性が含まれる。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質の場合、生物学的活性にはＤＮＡ複製活性が含まれる。ＰＩＦ１タンパク質の場合、生物学的活性には、ヘリカーゼ活性およびテロメラーゼ阻害活性が含まれる。例えば、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
【０２９６】
このスクリーニングにより単離された化合物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）のインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０２９７】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質は、癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有する（図３および図５）。したがって、本発明のスクリーニング法において、この生物学的活性を用いて、これらのタンパク質の生物学的活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。そのような化合物は、がん、例えば肺癌を治療するための潜在的候補であると考えられる。
【０２９８】
本発明の方法において検出される生物学的活性が細胞増殖促進活性である場合、これは、例えば、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞を調製し、その細胞を試験化合物の存在下で培養し、細胞増殖の速度を決定すること、および細胞周期を測定すること等によって、ならびにコロニー形成活性を測定すること、例えば「実施例」に示されるＭＴＴアッセイ、コロニー形成アッセイ、またはＦＡＣＳによって、検出することができる。
【０２９９】
本明細書において定義される「生物学的活性を抑制する」という用語は、化合物非存在下と比較した、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性の少なくとも１０％の抑制、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、例えば少なくとも９０％の抑制を指す。
【０３００】
好ましい態様では、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドを発現しない対照細胞が用いられる。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞、およびＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的断片を発現しない対照細胞を培養する段階；
ｂ）該タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階；ならびに
ｃ）対照細胞において検出された、および試験剤または試験化合物の非存在下で検出された増殖と比較して、該タンパク質を発現する細胞において生物学的活性を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む。
【０３０１】
細胞増殖促進活性に加えて、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその断片がスクリーニングに用いられる場合には、ＤＮＡ複製活性またはＰＩＦ１ポリペプチドに対する結合活性を指標として用いることもできる。同様に、ＰＩＦ１ポリペプチドまたはその断片がスクリーニングに用いられる場合には、ヘリカーゼ活性、テロメラーゼ阻害活性、またはＣＤＣ４５Ｌポリペプチドに対する結合活性を指標として用いることもできる。これらの生物学的活性は、当技術分野で周知の方法によって検出することができる。
【０３０２】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性の抑制によって、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の生物学的活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療剤を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の生物学的活性を抑制する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。
【０３０３】
（ｉｖ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現を変更する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１に特異的な二本鎖分子によるＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現の低下は、癌細胞増殖の阻害を引き起こした（図３および図５）。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを指標として用いるスクリーニングを介して、がんの治療または予防において用いられ得る化合物を同定することができる。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは例えば、
（ａ）試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択する段階
を含み得る。
【０３０４】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、または、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、ならびにＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１関連疾患、例えば肺癌を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０３０５】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは例えば、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含み得る。
【０３０６】
あるいは、本発明に従って、がんの治療または予防に対する試験剤または試験化合物の潜在的治療効果を評価または推定することができる。いくつかの態様において、本発明は、ＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防、または該がんの阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果を評価もしくは推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験剤または試験化合物がＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを低下させる場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。
【０３０７】
本発明において、治療効果をＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０３０８】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
ＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１を発現する細胞には、例えば、肺癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞（例えばＡ５４９およびＳＢＣ−３）を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」という用語は、化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルの少なくとも１０％の低下、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、例えば少なくとも９５％のレベル低下を指す。本明細書における化合物には化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを低下させる化合物は、がん、例えば肺癌の治療または予防のために使用される候補剤または候補化合物として選択することができる。
【０３０９】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）候補化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる該候補化合物を選択する段階
を含むことができる。
【０３１０】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＣＤＣ４５Ｌおよび／もしくはＰＩＦ１に関連する疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、ならびにＣＤＣ４５Ｌおよび／またはＰＩＦ１に関連する疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０３１１】
別の局面によると、本発明は、
ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
【０３１２】
あるいは一部の態様において、本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防または該がんの阻害における試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）潜在的治療効果と該試験剤または試験化合物とを関連付ける段階であって、試験剤または試験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合に該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。
【０３１３】
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
【０３１４】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣＸの転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＣＸの転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流まで、例えば１０００ｂｐまで、例えば５０００または１００００ｂｐ上流までの領域であるが、これに制限されるものではない。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０３１５】
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の少なくとも１０％の低下、例えば少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、例えば少なくとも９５％の低下を指す。
【０３１６】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３１７】
本発明において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを抑制することにより、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１の発現レベルを阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療薬を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質の発現レベルを阻害する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。
【０３１８】
（ｖ）ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の結合を指標として用いるスクリーニング
本発明において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質がＰＩＦ１１タンパク質と相互作用することが確認された（図４Ｂ）。したがって、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質のそのような結合を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。これらのタンパク質はがん細胞の増殖に関与しているため、そのような化合物はがん治療に対する潜在的治療効果を有する可能性がある。したがって本発明は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質のそのような結合を指標として用いて、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合の阻害について化合物をスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１遺伝子を発現するがん細胞、例えば肺癌細胞の増殖を阻害または低減するための候補化合物、およびがん、例えば肺癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０３１９】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣ４５ＬポリペプチドとＰＩＦ１ポリペプチドとの間の結合を妨げる剤または化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［２］がんの治療または予防に有用な候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
［３］ＣＤＣ４５Ｌの機能的同等物がＰＩＦ１結合ドメインを含む、［１］または［２］の方法。
［４］ＰＩＦ１の機能的同等物がＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、［１］または［２］の方法。
［５］がんが肺癌である、［１］の方法。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＣＤＣ４５ＬもしくはＰＩＦ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
より具体的には、本方法は
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）ｃ）の結合レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、がんの治療もしくは予防、またはがんの阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果を評価または推定する方法も提供し、該方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドまたはその機能的同等物をＰＩＦ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出された結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）試験剤または試験化合物が結合レベルを低下させた場合に示される潜在的治療効果を、該試験剤または試験化合物と関連付ける段階
を含む。
【０３２０】
本発明において、治療効果は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルを低下させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質の結合レベルを低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
【０３２１】
本発明の文脈において、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１ポリペプチドの機能的同等物とは、それぞれＣＤＣ４５Ｌポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）またはＰＩＦ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と同等の生物学的活性を有する、ポリペプチドである（（１）遺伝子およびポリペプチドを参照されたい）。より具体的には、ＰＩＦ１ポリペプチドの機能的同等物は、ＣＤＣ４５Ｌ結合ドメインを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片である。同様に、ＣＤＣ４５Ｌポリペプチドの機能的同等物は、ＰＩＦ１結合ドメインを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片である。
【０３２２】
ＰＩＦ１に対するＣＤＣ４５Ｌの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法、ウエスト−ウエスタンブロッティング解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）、アフィニティークロマトグラフィー、および表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを用いて行うことができる（（ｉ）一般的スクリーニング法、および（ｉｉ）ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１タンパク質に結合する化合物のスクリーニングを参照されたい）。
【０３２３】
スクリーニングに用いるポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然源由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであってよい。任意の前述の試験化合物をスクリーニングに用いることができる。
任意の前述の試験化合物を使用することができる（（１）スクリーニング用の試験化合物を参照されたい）。
【０３２４】
いくつかの態様において、本方法は、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質もしくはＰＩＦ１タンパク質に対する候補化合物の結合を検出する段階、またはＰＩＦ１タンパク質に対するＣＤＣ４５Ｌタンパク質の結合のレベルを検出する段階をさらに含む。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質および／またはＰＩＦ１タンパク質を発現する細胞には、これらの２つの遺伝子を発現する限り、例えば、がん、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞を本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。あるいは、これら２つの遺伝子を発現するように、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１タンパク質の発現ベクターの両方または一方を細胞にトランスフェクトすることもできる。ＣＤＣ４５Ｌタンパク質のＰＩＦ１タンパク質に対する結合は、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体および抗ＰＩＦ１抗体を用いる免疫沈降アッセイによって検出することができる（図４）。
【０３２５】
本発明において、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を抑制することにより、細胞増殖が低減することが明らかとなる。したがって、ＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療薬を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、化合物がＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の結合を阻害する、がんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。
【０３２６】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３２７】
特記しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
【実施例】
【０３２８】
材料および方法
癌細胞株および組織試料。本研究で使用したヒト肺癌細胞株は、以下の通りであった：肺腺癌（ＡＤＣ）であるＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、Ａ５４９、およびＰＣ１４；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）であるＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、およびＬＵ６１；肺大細胞癌（ＬＣＣ）であるＬＸ１；ならびに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であるＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＤＭＳ２７３、およびＤＭＳ１１４。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適切な培地中で単層で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。正常対照として使用したヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃによる最適化培地（ＳＡＧＭ）中で培養した。原発性肺癌試料は、他で記載されている通りにインフォームドコンセントを得て、以前に入手していた（非特許文献８、１２）。臨床病期は、ＵＩＣＣ  ＴＮＭ分類（Sobin L WC. TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition. Anonymous. New York: Wiley-Liss. 2002）に従って判断した。組織マイクロアレイにおける免疫染色に使用した、ホルマリン固定した原発性肺腫瘍および隣接する正常肺組織試料は、北海道大学およびその提携病院（札幌、日本）で根治的手術を受けた２６７名の患者（ＡＤＣ  １５９例、ＳＣＣ  ８９例、ＬＣＣ  １６例、ＡＳＣ  ３例；女性患者９０名および男性患者１７７名；２６〜８４歳の範囲で年齢中央値は６５．０歳、腫瘍サイズｐＴ１  １１４例、ｐＴ２  １２５例、ｐＴ３  ２８例；リンパ節状態ｐＮ０  ２０８例、ｐＮ１  ２３例、ｐＮ２  ３６例）から入手していた。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
【０３２９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。各試料由来のｍＲＮＡの合計３μｇアリコートを、ランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＣＤＣ４５Ｌ、ＰＩＦ１に特異的な合成プライマーの以下のセットを用いて、または内部対照としてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った：
ＣＤＣ４５  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ４５−ｌｉｋｅ（ＣＤＣ４５Ｌ）、５'−ＣＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および５'−ＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＰＩＦ１  ５'−ｔｏ−３'  ＤＮＡ  ヘリカーゼ類似体（サッカロミセス・セレビシエ）（ＰＩＦ１）、５'−ＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５'−ＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＴＴＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＡＣＴＢ、５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。ＰＣＲ反応は、産物強度が増幅の直線相の範囲内に確実に入るように、サイクル数を最適化した。
【０３３０】
ウエスタンブロッティング。細胞を、溶解緩衝液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中で溶解した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として用いたＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、各溶解物のタンパク質含有量を測定した。各溶解物１０μｇを１０〜１２％変性ポリアクリルアミドゲル（３％ポリアクリルアミドスタッキングゲルを含む）上で分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に電気泳動により転写した。ＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を一次抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。免疫反応性タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで洗浄した後、高感度化学発光キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて反応物を発色させた。市販のウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体はＡＴＬＡＳ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢ（カタログ番号ＨＰＡ０００６１４）から購入し、肺癌細胞株の溶解物を用いたウエスタンブロット解析により、ヒトＣＤＣ４５Ｌに特異的であることが判明した。
【０３３１】
免疫組織化学および組織マイクロアレイ。パラフィンブロック中に包埋した臨床試料中のＣＤＣ４５Ｌタンパク質を調べるため、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ｐＨ９）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて、切片を以下の様式で染色した。簡潔に説明すると、スライドをＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に浸漬し、抗原回復のために、オートクレーブ中で１０８℃で１５分間煮沸した。内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、３μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体（ＡＴＬＡＳ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢ；カタログ番号ＨＰＡ０００６１４）を各スライドに添加し、切片を二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｇ）、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と共にインキュベーションした。基質−色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。
【０３３２】
他で記載されている通りに、２６７例のホルマリン固定した原発性ＮＳＣＬＣを用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した（Chin SF, et al. Molecular Pathology 2003;56:275-9.、Callagy G, et al. Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34.、Callagy G, et al. J Pathol 2005;205:388-96.）。スライド上の対応するＨ＆Ｅ染色切片による視覚的配置に基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ、または５つの組織コア（直径０．６ｍｍ；深さ３〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、レシピエントパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアを各症例から穿孔し、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学的解析に使用した。３名の独立した研究者が、臨床病理学的データの事前知識を持たずに、ＣＤＣ４５Ｌ陽性度を半定量的に評価した。各腫瘍組織コア内の染色の強度はほとんど均一であったため、核および細胞質内のＣＤＣ４５Ｌ染色の強度は、陰性（腫瘍細胞内の染色は認識不可能）または陽性（腫瘍細胞の核および細胞質内で認識可能な褐色染色）として記録することによって評価した。３名の検閲者全員が症例を独立に陽性と規定した場合にのみ、該症例を陽性と認定した。
【０３３３】
統計解析。ＳｔａｔＶｉｅｗ統計プログラム（ＳａＳ）を用いて、統計解析を行った。手術日からＮＳＣＬＣに関連する死亡時点まで、または最終経過観察時点までの腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびＣＤＣ４５Ｌ発現に関して、カプラン−マイヤー曲線を算出した；ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、考えられる予後因子、例えば年齢、性別、ｐＴ分類、およびｐＮ分類との関連性を、一度に１つの因子を考慮して解析した。次に、多変量Ｃｏｘ解析を、Ｐ値０．０５未満の開始レベルを満たしたありとあらゆる変数と共に、常にＣＤＣ４５Ｌ強発現を強制的にモデルに当てはめる後退（段階）法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はＰ＜０．０５の終了レベルを超えなかった。
【０３３４】
ＣＤＣ４５Ｌ相互作用タンパク質の同定。細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下で、最終容量２ｍｌの免疫沈降緩衝液（０．５％ＮＰ４０，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）中、１００μｌのプロテインＧ−アガロースビーズと共に４℃で１時間インキュベーションすることにより、前もって清澄化した。１，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離した後、上清をウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体または対照標準ウサギＩｇＧと共に４℃で４時間インキュベーションした。さらに、３０μｌのプロテインＧ−アガロースビーズを各上清に添加し、さらに２時間インキュベーションした。５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、各試料からビーズを回収し、１ｍｌの免疫沈降緩衝液で６回洗浄した後、それらを５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に再懸濁して５分間煮沸し、次にタンパク質を５％〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体で免疫沈降させた抽出物中に特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出して、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ、ＳＨＩＭＡＺＵ  ＢＩＯＴＥＣＨ）による解析に供した。ＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１との間の相互作用を確認するため、他で記載される通りに免疫沈降実験を行った（非特許文献１８、２３）。
【０３３５】
免疫細胞化学的解析。細胞をカバーガラス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）上にプレーティングし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で３分間の透過処理を行った。非特異的な結合を、ＣＡＳＢＬＯＣＫ（ＺＹＭＥＤ）により室温で１０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した一次抗体と共に室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）により室温で６０分間染色した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、各標本を、４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で封入し、スペクトル共焦点スキャンシステム（ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で可視化した。
【０３３６】
ＲＮＡｉアッセイ。製造業者のプロトコールに従って２４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（１００ｎＭ）を肺癌細胞株、Ａ５４９およびＳＢＣ−３にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養し、トランスフェクションの７日後に、コロニー数をギムザ染色によって計数し、細胞の生存率を臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液；Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって評価した。ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１発現の抑制を確認するために、上記のＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１に特異的な合成プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡｉのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
ｃｏｎｔｒｏｌ−１（ＬＵＣ：ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子）、５'−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
ｃｏｎｔｒｏｌ−２（ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰの変異体）、５'−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１、５'−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＧＣＵＣＡＡＧＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２、５'−ＧＧＡＣＧＵＧＧＡＵＧＣＵＣＵＧＵＧＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
ｓｉ−ＰＩＦ１＃１、５'−ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＵＵＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
ｓｉ−ＰＩＦ１＃２、５'−ＧＧＣＡＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡＵＵＧＵＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【０３３７】
フローサイトメトリー。Ａ５４９細胞を細胞３．５×１０５個／１００ｍｍディッシュの密度でプレーティングし、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中で回収し、７０％冷エタノール中で３０分間固定した。１００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した後、細胞をＰＢＳ中の５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ上でフローサイトメトリーを行い、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．）により解析した。ゲートをかけていない少なくとも１０，０００個の細胞から選択された細胞を、ＤＮＡ含量について解析した。
【０３３８】
結果
肺癌および正常組織におけるＣＤＣ４５Ｌ発現。癌の存在の早期検出、および癌細胞の生物学的特徴に基づいた新規治療の開発に適用可能となり得る新規分子を同定するため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、臨床肺癌のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を行った（非特許文献７〜１２）。スクリーニングした２７，６４８個の遺伝子またはＥＳＴのうち、調べた臨床肺癌試料の大多数において、ＣＤＣ４５Ｌ転写物の発現の上昇（３倍またはそれ以上）が明らかになった。その過剰発現は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により、肺癌組織１５例のうち１２例において、および肺癌細胞株１５例のうちすべてにおいて確認された（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０３３９】
続いて、抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いるウエスタンブロット解析により、癌細胞株６例のうちすべてにおいてＣＤＣ４５Ｌタンパク質の過剰発現が確認されたが、正常気管支上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）ではバンドは検出されなかった（図１Ｃ）。次に、肺癌細胞株Ａ５４９における内因性ＣＤＣ４５Ｌの細胞内局在性を調べるために免疫蛍光解析を行い、核におけるその強い染色および細胞質における弱い染色が認められた（図１Ｄ）。プローブとしてＣＤＣ４５Ｌ  ｃＤＮＡを用いるノーザンブロッティングにより、調べた正常組織１６例のうち精巣のみにおいて、２．２ｋｂのバンドが同定された（データは示さず）。さらに、抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、正常組織５例（心臓、肺、肝臓、腎臓、および精巣）におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質発現レベルを、肺癌における発現レベルと比較した。ＣＤＣ４５Ｌは、精巣および肺癌細胞の核および細胞質において大量に発現していたが、残り４例の正常組織ではその発現はほとんど検出できなかった（図２Ａ）。
【０３４０】
ＣＤＣ４５Ｌ発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性。肺発癌におけるＣＤＣ４５Ｌの生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、本発明者らは、外科切除を受けたＮＳＣＬＣ患者２６７名からの組織切片を含む組織マイクロアレイにおいて免疫組織化学染色を行った。ＣＤＣ４５Ｌに特異的なポリクローナル抗体によるＣＤＣ４５Ｌ染色は、主に腫瘍細胞の核および細胞質で観察されたが、正常肺細胞では検出されなかった（図２Ｂ）。ＮＳＣＬＣ  ２６７例のうち、ＣＤＣ４５Ｌ染色は１７１例（６４．０％）で陽性、９６例（３６．０％）で陰性であった（詳細を表１Ａに示す）。次いで本発明者らは、ＣＤＣ４５Ｌ陽性度の状態を臨床病理学的因子と比較し、ＮＳＣＬＣにおけるＣＤＣ４５Ｌ発現が、高齢（＞＝６５歳；Ｐ＝０．０４１７、フィッシャーの直接確率検定；表１Ａ）、男性（Ｐ＝０．０００８）、非ＡＤＣ組織像（Ｐ＜０．０００１）、およびより大きな腫瘍サイズ（ｐＴ２〜３；Ｐ＝０．００６６）と有意に関連していることを見出した。ＣＤＣ４５Ｌ陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値は、ＣＤＣ４５Ｌ陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値よりも有意に短かった（ログランク検定によりＰ＝０．００４５；図２Ｃ）。また本発明者らは単変量解析も適用して、患者の予後と、年齢（＜６５歳対＞＝６５歳）、性別（女性対男性）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ）、ｐＴステージ（腫瘍サイズ；Ｔ１対Ｔ２＋Ｔ３）、ｐＮステージ（リンパ節状態；Ｎ０対Ｎ１＋Ｎ２）、およびＣＤＣ４５Ｌ状態（陰性対陽性）を含むいくつかの因子との間の関連性を評価した（表１Ｂ）。パラメータのすべてが予後不良と有意に関連していた。多変量解析において、ＣＤＣ４５Ｌ状態は、本研究に参加した外科的治療を受けた肺癌患者の独立予後因子として統計学的に有意なレベルに達しなかったが（Ｐ＝０．４３３２）、ｐＴステージおよびｐＮステージならびに年齢は該レベルに到達し、これによって、肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌ発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性が示唆された。
【０３４１】
（表１Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤＣ４５Ｌ陽性度と患者の特徴との関連性（ｎ＝２６７）
2013501501.tif 000002
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌および大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定）
【０３４２】
（表１Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
2013501501.tif 000003
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌および大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定）
【０３４３】
癌細胞の増殖に対するＣＤＣ４５Ｌの効果。ＣＤＣ４５Ｌが肺癌細胞の増殖および／または生存に必須であるかどうかを評価するため、ＣＤＣ４５Ｌ配列に特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを構築し、ＣＤＣ４５Ｌを高レベルで内因的に発現する肺癌細胞株、Ａ５４９（腺癌）およびＳＢＣ−３（小細胞肺癌）にトランスフェクトした。ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２構築物を使用した場合に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりノックダウン効果が確認された（図３Ａ）。その後のＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイにより（図３Ｂおよび３Ｃ）、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃１およびｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトした細胞における生細胞数およびコロニー数の急激な減少が明らかになった。この効果の機序をさらに明らかにするため、本発明者らは、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトしたＡ５４９細胞を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ｓｉ−ＣＤＣ４５Ｌ＃２をトランスフェクトした細胞のサブＧ１比率が、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ）で処理したものよりも有意に高いことを見出した（図３Ｄ）。このデータから、ＣＤＣ４５Ｌノックダウンにより肺癌細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆された。
【０３４４】
ＣＤＣ４５Ｌと相互作用するタンパク質としてのＰＩＦ１の同定。肺発癌におけるＣＤＣ４５Ｌ過剰発現の生物学的機序を解明するため、本発明者らは、肺癌細胞においてＣＤＣ４５Ｌと相互作用すると考えられるタンパク質の同定を試みた。ＳＢＣ−３細胞由来の細胞抽出物を、ウサギ抗ＣＤＣ４５Ｌポリクローナル抗体またはウサギＩｇＧ（対照）で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、タンパク質複合体を銀染色した。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体による免疫沈降物中には見られるが、ウサギＩｇＧによる免疫沈降物中には見られないタンパク質バンドを切り出し、トリプシン消化し、質量分析による解析に供した。抽出されたタンパク質バンド由来のペプチドは、ＰＩＦ１のものと一致した。本発明者らは次に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により原発性ＮＳＣＬＣ組織および肺癌細胞株を再度調べ、ＮＳＣＬＣ臨床試料１５例のうち９例および調べた肺癌細胞株１５例のすべてにおいてＰＩＦ１発現の上昇を見出したが、その発現は、正常肺組織および正常気管支上皮由来細胞、ＳＡＥＣではほとんど検出されなかった（図４Ａ）。ＣＤＣ４５Ｌ遺伝子の発現パターンは、ＰＩＦ１遺伝子の発現パターンとの良好な一致を示し、このことにより、これら２つの遺伝子が肺癌細胞において同時活性化される可能性があることが示唆された。肺癌細胞におけるＣＤＣ４５ＬとＰＩＦ１の考えられる相互作用を確認するため、ＦＬＡＧタグ付ＰＩＦ１タンパク質を発現するように設計されたプラスミド（ｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＰＩＦ１−ＦＬＡＧ）を構築し、ＳＢＣ−３細胞にトランスフェクトし、次に抗ＦＬＡＧ抗体で該タンパク質を免疫沈降させた。抗ＣＤＣ４５Ｌ抗体を用いた沈降物のウエスタンブロット解析から、内因性のＣＤＣ４５Ｌが外因性のＰＩＦ１と共沈することが示された（図４Ｂ）。免疫細胞化学的解析から、核および細胞質における内因性ＣＤＣ４５Ｌと外因性ＰＩＦ１の共局在が確認された（図４Ｃ）。
【０３４５】
癌細胞の増殖に対するＰＩＦ１の効果。ＰＩＦ１の発現が肺癌細胞の増殖および／または生存において役割を果たしているかどうかをさらに評価するため、本発明者らは、ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡを用いて、肺発癌におけるＰＩＦ１機能の生物学的意義を調べた。ＰＩＦ１に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉ−ＰＩＦ１＃１およびｓｉ−ＰＩＦ１＃２）をＡ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞にトランスフェクトすると、内因性ＰＩＦ１タンパク質の発現は効果的に抑制されたが、対照ｓｉＲＮＡでは効果は認められなかった（図５Ａ）。ＰＩＦ１の発現低下と一致して、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞は、細胞生存率およびコロニー数の有意な減少を示した（図５Ｂおよび５Ｃ）。これらの結果から、ＰＩＦ１もまた、肺癌細胞の増殖および／または生存において重要な役割を果たし得るという可能性が強く支持された。
【０３４６】
考察
良好な生存率をもたらしかつ重篤な有害作用をほとんどもたらさない新規分子標的抗がん薬の開発は、極めて重要である。したがって本発明は、現在の治療法（Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205.、Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99.、Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.、Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006;28:799-805.、Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.、Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84.）よりも有害反応が少なく、より有効な抗がん効果を有する小分子化合物を開発するための治療標的を同定するのに有効な系を確立した。
【０３４７】
ＣＤＣ４５Ｌは複製開始タンパク質であることが知られているが、臨床がんにおけるその関与は示されていなかった。最近になって、複製因子の調節について理解が進んだことにより、可能な増殖マーカーおよび治療標的の新規供給源が提供された。例えば、セリンスレオニンキナーゼＣＤＣ７は活性化されてＭＣＭタンパク質をリン酸化し、それによって付加的な因子を動員して、ＤＮＡ複製の開始に必須であるＤＮＡの巻き戻しおよびＤＮＡポリメラーゼの結合を促進する。強力なＣＤＣ７キナーゼインヒビターであるＰＨＡ−７６７４９１で処理すると、複数のがん細胞型においてアポトーシス細胞死の誘導が起こり、かつ前臨床がんモデルにおいて腫瘍増殖の阻害が起こった（Montagnoli A, et al. Nat Chem Biol 2008;4:357-65.）。ＤＮＡ複製の開始を制限しかつ抗腫瘍活性を示す別の選択的ＣＤＣ７キナーゼインヒビターであるＢＭＳ−８６３２３３は、難治性血液がん患者における臨床試験の準備中である（//clinicaltrials.gov/show/NCT00838890）。さらに、バイオマーカーの観点では、ＭＣＭタンパク質、ＣＤＣ６、およびジェミニン（ＧＭＮＮ）が、乳癌、前立腺癌、肺癌、脳癌、子宮癌、および腎癌を含む様々な型の癌を有する患者についての予後バイオマーカーとして免疫組織化学的に調べられた（Gonzalez MA et al., Nat Rev Cancer 2005;5:135-41.）。上記の実施例で示した特異的ｓｉＲＮＡで肺癌細胞を処理すると、ＣＤＣ４５Ｌの発現が低下し、ひいてはアポトーシスが生じた。さらに、実施例における組織マクロアレイ実験による臨床病理学的な証拠から、ＣＤＣ４５Ｌを発現する腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者は、ＣＤＣ４５Ｌ発現が陰性であるＮＳＣＬＣ患者よりも短い癌特異的生存期間を示すことが実証された。インビトロおよびインビボアッセイによって得られた結果から、過剰発現したＣＤＣ４５Ｌは、肺癌細胞の悪性度の高い表現型を誘導する重要な分子であることが実証される。本発明者らの知る限り、これは、がんバイオマーカーとしてのＣＤＣ４５Ｌ発現の予後値を示す初めての研究である。
【０３４８】
本発明はまた、肺癌におけるＣＤＣ４５Ｌタンパク質とＰＩＦ１タンパク質との間の相互作用を同定した。ＰＩＦ１は、酵母からヒトまで保存されているＳＦＩ  ５'−３'  ＤＮＡヘリカーゼのメンバーとして分類されており、主に酵母におけるＤＮＡ複製の因子として報告されている（非特許文献４２、４３）。実施例において、ＰＩＦ１もまた、肺癌の大多数において高度にトランス活性化されており、特異的ｓｉＲＮＡで肺癌細胞を処理すると、増殖活性の抑制が生じた。これらのデータから、ＰＩＦ１もまた肺発癌において重要な役割を果たすことが示された。
【０３４９】
サッカロミセス・セレビシエＰＩＦ１ヘリカーゼは、ＤＮＡ複製においてＤＮａ２ヘリカーゼ／ヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼδと共に機能する（Budd ME et al., Mol Cell Biol 2006;26:2490-500.）。一方、ＣＤＣ４５ＬはＭＣＭ２−７複合体、ＧＩＮＳ複合体、およびＤＮＡポリメラーゼδと相互作用し、伸長機序において前進するＤＮＡポリメラーゼδおよびεを複製ヘリカーゼによって架橋することにより、ＤＮＡ複製の伸長において重要な役割を果たす（非特許文献３９）。本明細書において提供されるデータに基づいて、ＣＤＣ４５Ｌ−ＰＩＦ１複合体およびＣＤＣ４５Ｌ発現を標的とすることは、がん細胞の増殖および／または生存を抑制するための新規なアプローチである。
【０３５０】
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイとの組み合わせを用いる、本明細書に記載されるがんの遺伝子発現解析により、がんの予防および治療の標的として特定の遺伝子が同定された。この差次的に発現する遺伝子、すなわちＣＤＣ４５Ｌの発現に基づいて、本発明は、がんを同定および検出するため、ならびに予後を評価するための新規分子診断マーカーを提供する。さらに、その翻訳産物がＣＤＣ４５Ｌと相互作用する遺伝子として同定されたＰＩＦ１は、癌における過剰発現が確認された。したがって本発明はまた、ＣＤＣ４５ＬまたはＰＩＦ１を用いる新規診断戦略も提供する。
【０３５１】
さらに、本明細書に記載されるように、ＣＤＣ４５ＬおよびＰＩＦ１はがん細胞の生存に関与する。したがって本発明はまた、がんを治療および予防するための新規分子標的を提供する。それらは、有害作用のない新規治療薬および予防剤を開発するのに有用であり得る。
【０３５２】
本明細書に記載される方法は、がんを予防、診断、および治療するためのさらなる分子標的の同定にも有用である。本明細書において提供されるデータは、がんの包括的理解を高め、新規診断戦略の開発を促進し、かつ治療薬および予防剤のための分子標的の同定に手掛かりを与える。そのような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、がんの診断、治療、および最終的には予防の新規戦略を開発するための指標を提供する。
【０３５３】
本明細書で引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
【０３５４】
さらに、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、本質的に前述の説明は、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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