(57)【要約】本発明は、β細胞マーカータンパク質を対象とする抗体、特にタンパク質ＴＭＥＭ２７を対象とする抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドのエピトープを対象とする抗体。
【請求項２】
ヒトＴｍｅｍ２７ポリペプチドを対象とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
Ｔｍｅｍ２７ポリペプチド、好ましくはヒトＴｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する全細胞を用いて、適切な動物を免疫することによって作製される、請求項１〜３記載の抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメインのＣＤＲ３及びハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＬドメインのＣＤＲ３を含む、請求項１〜４記載の抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及びハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＬドメインのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５記載の抗体。
【請求項７】
ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項１〜６記載の抗体。
【請求項８】
２００９年５月２７日にDSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５を与えられたハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９によって産生され得る、請求項１〜７記載の抗体。
【請求項９】
薬剤としての使用のための、請求項１〜８記載の抗体。
【請求項１０】
ＴＭＥＭ２７切断及びそのシグナルリング経路の調節に関与する疾患、好ましくは糖尿病の治療のための薬剤の製造のための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１１】
糖尿病の治療における使用のための、請求項１〜８記載の抗体。
【請求項１２】
動物の膵臓におけるβ細胞島及びβ細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１３】
請求項１〜８記載の抗体及び該抗体に共有結合した活性化合物を含む、複合体。
【請求項１４】
活性化合物が、毒素又はｓｉＲＮＡ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子である、請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
２００９年５月２７日にDSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５を与えられた、ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９。
【請求項１６】
ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメインをコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項１７】
ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＬドメインをコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項１８】
２００９年５月２７日にDSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５を与えられたハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９によって産生される抗体をコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項１９】
請求項１６〜１８記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
本明細書、特に上記実施例に関連して前述される、発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β細胞マーカータンパク質を対象とする抗体、特にタンパク質ＴＭＥＭ２７を対象とする抗体に関する。
【０００２】
機能的なβ細胞集団の喪失が、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病両方の病因の根底にある。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるβ細胞集団の断層撮影技術は、糖尿病への進行及び治療的介入への応答を定量化するための有用な診断ならびに研究ツールを提供するであろう。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的とされた非侵襲性β細胞ｓｉＲＮＡ送達は、研究及び治療の両方にとって非常に有用であろう。
【０００３】
膜貫通タンパク質Ｔｍｅｍ２７（コレクトリン）は、それが膵臓β細胞集団及びインスリン分泌を調節している膵臓β細胞で発現している。Ｔｍｅｍ２７は、タンパク質分解的切断及び分断によって、細胞膜において不活性化されている。
【０００４】
従って、β細胞集団を定量化するための診断及び／又は研究ツールに対する需要があり、β細胞への標的とされた薬物送達のためのツールに対する需要がある。
【０００５】
本発明の目的は、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドのエピトープを対象とする抗体を提供することである。
【０００６】
好ましい実施態様では、抗体は、ヒトＴｍｅｍ２７ポリペプチドを対象とするものである。
【０００７】
更なる実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはヒト化抗体である。
【０００８】
更なる実施態様では、抗体は、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチド、好ましくはヒトＴｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する全細胞を用いて、適切な動物を免疫することによって作製される。
【０００９】
更に好ましい実施態様では、抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメインのＣＤＲ３及びハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＬドメインのＣＤＲ３を含む。
【００１０】
更に好ましい実施態様では、抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及びハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＬドメインのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む。
【００１１】
更に好ましい実施態様では、抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５）から得られ得る抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むキメラ抗体である。
【００１２】
更に好ましい実施態様では、抗体は、２００９年５月２７日にDSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９９５を与えられたハイブリドーマ細胞株ＴＭＥＭ２７−８／９によって産生される。
【００１３】
第二の目的において、本発明は、ＴＭＥＭ２７切断及びそのシグナリング経路のモデュレーションに関与する疾患の治療のための薬剤の製造のための、本発明の抗体の使用に関する。疾患は、好ましくは糖尿病である。
【００１４】
更なる態様では、本発明の抗体は、活性化合物の細胞内送達のためのツールとして使用される。活性化合物は、好ましくは、抗体に共有結合している。「活性化合物」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、ペプチド又は薬学的に活性な物質（例えば、毒素、抗生物質、抗病原因子、抗原、抗体、抗体フラグメント、免疫モデュレーター、酵素もしくは治療剤）を含む、任意の適切な分子であり得る。本発明の抗体は、膵臓β細胞に特異的にターゲティングすることによって活性化合物のターゲティングされた細胞内送達を可能にするので、活性化合物の細胞内送達に好適である。
【００１５】
更なる実施態様では、本発明の抗体は、動物、好ましくはヒトの膵臓におけるβ細胞島及びβ細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのために使用され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのため適切な方法は、例えば、免疫ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影法）である。免疫ＰＥＴは、ポジトロン放出核種でラベルされたモノクローナル抗体の同時検出に基づいている。以下のポジトロン放出体が免疫ＰＥＴに使用され得る：ガリウム−６８（６８Ｇａ；ｔ１／２、１．１３時間）、フッ素−１８（１８Ｆ；ｔ１／２、１．８３時間）、銅−６４（６４Ｃｕ；ｔ１／２、１２．７時間）、イットリウム−８６（８６Ｙ；ｔ１／２、１４．７時間）、臭素−７６（７６Ｂｒ；ｔ１／２、１６．２時間）、ジルコニウム−８９（８９Ｚｒ；ｔ１／２、７８．４時間）及びヨウ素−１２４（１２４Ｉ；ｔ１／２、１００．３時間）［The Oncologist, Vol. 12, No. 12, 1379-1389, December 2007)］。
【００１６】
患者におけるＰＥＴ複合体の分布は、ＰＥＴカメラを用いた消滅光子対の検出によって、モニターされ得る。ＰＥＴカメラは、患者の体にかけられた検出器の輪からなる。体の反対側にある検出器によって２つの光子が非常に短い時間間隔内（典型的には、５〜１５ナノ秒）に記録される場合、２つの検出器の間の線に沿ったどこかで消滅事象が起こったと考えられる。すべての線の交差点を計算することによって、放射線源（放射性ラベルされたモノクローナル抗体）の位置が決定され得る。
【００１７】
「抗体」という用語は、抗体全体及び抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない、様々な形態の抗体構造を包含する。本発明による抗体は、好ましくは、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明による特徴的性質が保持される限り、更に遺伝子操作された抗体である。
【００１８】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、好ましくは、その可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。加えて、抗体フラグメントは、ＶＨドメインの特徴（すなわちＶＬドメインと共に機能的な抗原結合部位へと会合し得ること）又はＡＮＧ−２に結合するＶＬドメインの特徴（すなわちＶＨドメインと共に機能的な抗原結合部位へと会合し得ること）を有し、それによって、性質を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００１９】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００２０】
「キメラ抗体」という用語は、組み換えＤＮＡ技術によって通常調製された、１種のソース又は種からの可変領域、すなわち結合領域及び異なるソース又は種に由来する定常領域の少なくとも一部を含む抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される他の好ましい形態の「キメラ抗体」は、定常領域をもとの抗体の定常領域から改変又は変化させて、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による性質を発生させたものである。このようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、慣用の組み換えＤＮＡを含みそして遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野で周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238及び5,204,244参照。
【００２１】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンの特異性と比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体を指す。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植して「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270参照。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上記した抗原を認識する配列を示すものに相当する。本発明によって包含される他の形態の「ヒト化抗体」は、定常領域をもとの抗体の定常領域から更に改変又は変化させて、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による性質を発生させたものである。
【００２２】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、当技術水準で周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体は、免疫されると、内因性免疫グロブリン産生がない場合にフルレパートリー又は選択のヒト抗体を産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても産生され得る。このような生殖系突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーにおいても産生され得る（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985);及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明によるキメラ抗体及びヒト化抗体に関して既に述べたように、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、定常領域において改変されて、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」、すなわちＦｃ部分の変化又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、本発明による性質を発生させたこのような抗体も含む。
【００２３】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的結合できるポリペプチド決定基を含む。ある実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルのような分子の化学活性表面基を含み、ある実施態様では、特有の三次元構造特性及び又は特有の電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
【００２４】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書において使用される場合、抗体を抗原に結合させることに直接的に関与する一組の軽鎖及び重鎖ドメインの各々を意味する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用しており、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持されており、他の鎖からのＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、従って本発明の更なる目的を提供する。
【００２５】
「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合の責任を担う抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義された通りの超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の性質を特徴づける。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準定義、及び／又は「超可変ループ」由来の残基に従って決定される。
【００２６】
「Ｔｍｅｍ２７ポリペプチド」という用語は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類種に由来する天然のＴｍｅｍ２７ポリペプチド及びＴｍｅｍ２７変異体を指すのに使用される。Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドは、ヒト組織種を含む様々なソースから単離され得るか、又は組み換え及び／もしくは合成方法によって調製され得る。ヒトＴｍｅｍ２７ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７において与えられる。
【００２７】
更なる目的において、本発明は、本発明の抗体及び該抗体に共有結合した活性化合物を含む複合体を提供する。
【００２８】
好ましい実施態様では、活性化合物は、毒素又はｓｉＲＮＡ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子である。
【００２９】
本発明の抗体をｓｉＲＮＡ分子の末端基に共有結合させることによって、Ａ−Ｘ−Ｙの形態のｓｉＲＮＡ−抗体複合体を調製する方法であって、前記方法は：所定のｓｉＲＮＡ分子を選択する段階；及び、ｓｉＲＮＡ分子を本発明の抗体と共有結合させる段階を含み、ここで、Ａは本発明の抗体であり、Ｘはリンカー介在型共有結合であり、及びＹはｓｉＲＮＡ分子である。
【００３０】
ｓｉＲＮＡ−抗体複合体を調製する方法は、ｓｉＲＮＡの官能基を活性化する段階、及び活性化された官能基を抗体に共有結合させる段階を含み得る。活性化される官能基は、アミン基、チオール基、リン酸基又はそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの官能基を活性化する物質は、１−エチル−３，３−ジエチルアミノプロピルカルボジイミド、イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド、ジクロロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−マレイミドプロピル−オキシルスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオプロピオナート、又はそれらの組合せを含む。本発明のｓｉＲＮＡ抗体複合体を調製するための更なる方法は、Handbook of Cell Penetrating Peptides, Chapter 18, Second Edition, April 2006, Editor: Ulo Langelにおいて見出すことができる。
【００３１】
更なる目的において、本発明は、本発明の抗体又は複合体、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
より良好な投与のために、組成物は、上記有効成分に加えて、少なくとも１種類の薬学的に許容しうる担体を更に含み得る。このような担体の例は、食塩水、滅菌水、リンガー溶液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン（水性）溶液、グリセロール、エタノール及びそれらの混合物を含む。必要であれば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等の典型的な添加物が添加され得る。更に、組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤等の更なる添加物を加えることによって、水溶液、懸濁液、乳剤等の形態で注射用に薬学的に調製され得る。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔投与、心臓内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、舌下投与及び局所投与を含む、様々な投与経路を介して、身体と接触され得る。
【００３４】
このような臨床投与のために、本発明の医薬組成物は、従来の技術を使用して、適切な製品として調製され得る。
【００３５】
抗体は、例えば、U.S. Patent No. 4,816,567に記載されているような組み換え方法及び組成物を使用して、作製され得る。一実施態様では、本明細書において記載される抗ＴＭＥＭ２７抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター、を含み（例えば、トランスフォーメーションされている）。一実施態様では、宿主細胞は真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＴＭＥＭ２７抗体を作製する方法が提供され、ここで、前記方法は、抗体の発現に好適な条件下で、上記に提供されるように抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、及び場合により宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収する段階を含む。
【００３６】
本発明の抗体の組み換え作製に関して、例えば上記のように、抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【００３７】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、本明細書において記載される原核又は真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において作製され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、U.S. Patent Nos. 5,648,237, 5,789,199及び5,840,523参照。（また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体フラグメントの発現を記載するCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003も参照）、245〜254ページ。発現後、抗体は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
【００３８】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングする方法は、当業者に知られている。例えば、可変重鎖及び軽鎖ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）に関する遺伝情報は、免疫グロブリン特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ハイブリドーマ細胞から増幅され得る（Methods Mol Med. 2004;94:447-58）。次いで、可変重鎖及び軽鎖ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードする核酸は、宿主細胞における発現に好適なベクターにクローニングされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、β細胞ＴＭＥＭ２７タンパク質レベルが糖尿病の進行と相関することを示す。７もしくは９週齢のｌｅａｎ又はＺＤＦラットに由来する膵臓のパラフィン切片を、インスリン（赤）、グルカゴン（青）及びＴＭＥＭ２７（緑）に対する抗体で染色した。インスリン抵抗性だが正常血糖である７週齢ＺＤＦラットの膵臓切片において、ＴＭＥＭ２７の発現が増加しており、これは、β細胞集団の拡大と相関している。
【図２】図２は、ＩＩ型糖尿病患者においてＴＭＥＭ２７タンパク質レベルが減少していることを示す。正常血糖ドナー及びＩＩ型糖尿病患者に由来する膵臓のパラフィン切片の免疫組織化学染色は、ＴＭＥＭ２７（緑）がグルカゴン（赤）と共局在化しておらず、ＩＩ型糖尿病の島で大きく減少していることを示している。
【図３】図３は、ドキシサイクリン依存的方法でヒトＴＭＥＭ２７の誘導発現を可能にするＩＮＳ−１安定細胞株のウエスタンブロットを示す。ドキシサイクリンによって、ｈＴＭＥＭ２７タンパク質が用量依存的に誘導され得た。
【図４ａ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｂ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｃ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｄ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｅ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｆ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｇ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｈ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｉ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｊ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図４ｋ】図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【図５】図５は、ＦＤＡ承認のヒト組織マイクロアレイの免疫組織化学染色を示す。Alexa488結合抗ＴＭＥＭ２７（クローン８／９）を用いて、ヒト組織マイクロアレイのパラフィン切片を染色した。
【図６ａ】図６ａ及び６ｂは、ヒト及びサルの膵臓の免疫組織化学染色を示す。Alexa488結合抗ＴＭＥＭ２７（８／９）を用いて、ヒト及びサルの膵臓のパラフィン切片を染色した。
【図６ｂ】図６ａ及び６ｂは、ヒト及びサルの膵臓の免疫組織化学染色を示す。Alexa488結合抗ＴＭＥＭ２７（８／９）を用いて、ヒト及びサルの膵臓のパラフィン切片を染色した。
【図７】図７は、ＩＩ型糖尿病のサルにおいてＴＭＥＭ２７タンパク質レベルが減少していることを示す。正常血糖又はＩＩ型糖尿病のサルに由来する膵臓のパラフィン切片の免疫組織化学染色は、ＴＭＥＭ２７（緑）がインスリン（赤）と共局在化しており、ＩＩ型糖尿病のサルの島で大きく減少していることを示している。
【図８】図８ａ〜８ｉは、ＩｇＧが、ＴＭＥＭ２７を認識する抗体に特異的なｓｉＲＮＡ細胞取り込みを仲介していることを示す。
【図９ａ】図９ａ及び９ｂは、表面免疫染色からの定量した蛍光及び細胞内に蓄積したｓｉＲＮＡマーカーＣｙ５を示す。
【図９ｂ】図９ａ及び９ｂは、表面免疫染色からの定量した蛍光及び細胞内に蓄積したｓｉＲＮＡマーカーＣｙ５を示す。
【００４０】
実験の部
ドキシサイクリン依存的方法でヒトＴＭＥＭ２７の誘導性発現を可能にするＩＮＳ−１安定細胞株の生成
１０mMヘペス（ｐＨ７．３）、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（Brunschwig AG、スイス）、５０μM  β−メルカプトエタノール、１mMピルビン酸ナトリウム、５０μg/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンが補充された１１mMグルコース（Invitrogen、スイス）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＩＮＳ−１Ｅ細胞を培養した。ヒトＴＭＥＭ２７  ｃＤＮＡ（5183554, Invitrogen）をｐＴＲＥ２ベクター（631008, Clontech）にサブクローニングし、これを、Wangらによって記載された以下の手順に従って、ＩＮＳ−１由来安定細胞株のトランスフェクション及び生成に使用した。ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７＊Ｆ２クローンは最も高い誘導性を示し、最も低いバックグラウンドが選択される。図３におけるウエスタンブロッティングによって示されるように、ｈＴＭＥＭ２７タンパク質は、ドキシサイクリンによって用量依存的に誘導され得た。
【００４１】
図３：表示した濃度のドキシサイクリン存在下で、細胞を２４時間培養した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ヒトＴＭＥＭ２７モノクローナル抗体（クローン３／３）を用いて免疫ブロット法を実施した後、化学発光検出した。
【００４２】
全細胞免疫化を使用したマウス抗ＴＭＥＭ２７モノクローナル抗体の生成
ＩＮＳ−ｈ−ＴＭＥＭ２７クローンＦ２  ＩＮＳ−１細胞を用い、生存細胞を繰返し注射することによって、スイスアルビノマウスの免疫化を実施した。動物が、ｈＴＭＥＭ２７に対する特異的な免疫応答を示すとすぐに、脾臓細胞を取り出し、G. Kohler and C. Milstein (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256:495-497に従って、Ａｇ８細胞に融合させた。
【００４３】
ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーション
【００４４】
ＩＮＳ−ｈ−ＴＭＥＭ２７クローンＦ２  ＷＴ細胞をＰＤＬ被覆スライドグラス上で生育し、３７℃でインキュベーションした。
【００４５】
ｍＡｂを誘導培地（完全培養培地＋５００ng/mlドキシサイクリン）に異なる濃度で添加：０．６ml／ウェル及び３３℃で２４時間インキュベーション。次いで、細胞をダルベッコＰＢＳ（＋Ｃａ２＋／＋Ｍｇ２＋）で１回洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定する。
【００４６】
図４ａ〜４ｋは、ＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa488−ＩｇＧ及びＴＭＥＭ２７−８／９−Alexa555−Ｆａｂの、生存ＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７細胞とのインキュベーションの結果を示す。
【００４７】
ＴＭＥＭ２７は、ヒト及びサルの膵島のβ細胞に局在する
スライドを組み立てるのにホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片を使用した。キシロール（ｘ２）、１００％ＥｔＯＨ、９５％ＥｔＯＨ、８０％ＥｔＯＨ、７０％ＥｔＯＨ及び１Ｘ  ＰＢＳにスライドを連続して浸して（各々３分間）、試料を脱水した。１Ｘクエン酸塩緩衝液にスライドを浸し、（８５０ワットの）マイクロ波中でそれらを３分間煮沸することによって、抗原回復を実施した。スライドを水で２回すすいだ後、１Ｘ  ＰＢＳに溶かした１００μLの０．２％トリトンを用いて、細胞を室温で１０分間透過処理した。１Ｘ  ＰＢＳで３回洗浄した後、１Ｘ  ＰＢＳに溶かした２％ＢＳＡを用いて、室温で３０分間から１時間ブロッキングした。抗体インキュベーション（３７℃で１〜２時間又は４℃でＯ／Ｎ）の前に、１Ｘ  ＰＢＳで更に３回洗浄。更に３回洗浄、及びＤＡＰＩ染色（暗所において室温で５〜１０分間）。最後の３回洗浄、及びカバーガラスを組み立て。
【００４８】
図５：ＦＤＡ承認のヒト組織マイクロアレイの免疫組織化学染色。Alexa488結合抗ＴＭＥＭ２７（クローン８／９）を用いて、ヒト組織マイクロアレイのパラフィン切片を染色した。
【００４９】
抗ＴＥＭＥＭ２７は、ヒト及びサルβ細胞を特異的に染色する。
【００５０】
図６ａ、６ｂ及び７：ヒト及びサル膵臓の免疫組織化学染色。Alexa488結合ＴＭＥＭ２７（クローン８／９）を用いて、ヒト及びサル膵臓のパラフィン切片を染色した。
【００５１】
ＴＭＥＭ２７抗体をビヒクルとして使用する、細胞ｓｉＲＮＡ取り込みの定量。
ｓｉＲＮＡ調製。
オリゴリボヌクレオチド合成
ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）技術に従って、固相上で、ABI 394 synthesizer（Applied Biosystems）を用いて、１０μmolスケールでオリゴリボヌクレオチドを合成した。ＲＮＡ配列情報に関しては表１を参照。コントロールされた多孔性ガラス（ＣＰＧ、５２０Å、７５μmol/gの充填量、Prime Synthesis、アストン、ペンシルベニア州、米国から入手）で作成された固体支持体上で、合成を実施した。通常のＲＮＡホスホロアミダイト、２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト及び補助試薬は、Proligo（ハンブルグ、ドイツ）から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−（アセチル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（イソブチリル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトは、Ｎ４−（ｔ−ブチルフェノキシアセチル）保護された２’−Ｏ−メチル−シチジンを除いて、通常のＲＮＡアミダイトと同じ保護基を担持していた。すべてのアミダイトを、無水アセトニトリル（１００mM）に溶解し、分子ふるい（３Å）を添加した。オリゴマーの５’末端にスルフヒドリルリンカーを作製するために、Glen Research（Sterling、ヴァージニア、米国）の１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイトリンカーを使用した。ｍＡｂの結合の前に、ＴＣＥＰを使用してジスルフィドリンカーを還元した（下記参照）。Ｃｙ５結合のために、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（Glen Research）を使用して、オリゴリボヌクレオチドの５’末端にＣ−６アミノリンカーを装備した。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中５００mM）を活性化溶液として使用した。結合時間は６分間であった。ホスホロチオアート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３−エトキシ−１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＥＤＩＴＨ、Link Technologies、ラナークシャイア、スコットランドから入手）の１００mM溶液を使用した。対応するＮＨＳエステル（GE Healthcare、ミュンヘン、ドイツから入手）、及びＣ６アミノリンカーを有するオリゴリボヌクレオチドを使用して、Ｃｙ５蛍光色素を５’末端に付加した。
【００５２】
支持体結合オリゴマーの切断及び脱保護
固相合成の終了後、乾燥固体支持体を１５mLチューブに移し、メタノール中のメチルアミン（２Ｍ、Aldrich）を用いて４５℃で１８０分間処理した。遠心分離の後、上清を新しい１５mLチューブに移し、１２００μL  Ｎ−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ、Fluka, Buchs、スイス）でＣＰＧを洗浄した。洗浄は、メタノールメチルアミン溶液と組み合わせ、４５０μLトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ−３ＨＦ、Alfa Aesar、カールスルーエ、ドイツ）を加えた。この混合物を１５０分間６５℃にした。室温まで冷却した後、０．７５mL  ＮＭＰ及び１．５mLのエトキシトリメチルシラン（Fluka, Buchs、スイス）を加えた。１０分後、沈殿したオリゴリボヌクレオチドを遠心分離によって回収し、上清を捨て、１mL緩衝液Ａ（以下参照）中で固体を再構成した。
【００５３】
オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴリボヌクレオチドを、AKTA Explorer system（GE Healthcare）上で、準備の22x 250 mm DNA Pac 100 column（Dionex、イドシュタイン、ドイツ）を使用した強陰イオン交換（ＳＡＸ）ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは、１０mM  ＮａＣｌＯ４、１mM  ＥＤＴＡ、１０mMトリス（ｐＨ７．４）、６Ｍ尿素及び２０％アセトニトリルからなった。緩衝液Ｂは、緩衝液Ａ中の５００mM  ＮａＣｌＯ４を有した。４．５mL／分の流速を使用した。２６０及び２８０nmにおけるＵＶトレースを記録した。５５分間以内で２０％Ｂから４５％Ｂの勾配を使用した。適切な画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）及び７０％エタノールで沈殿させた。
【００５４】
ラベルした粗オリゴマーを、AKTA Explorer system（GE Healthcare）上で、XTerra Prep MS C8 10x 50 mm column（Waters、エシュボルン、ドイツ）を使用するＲＰ  ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは、１００mM  トリエチルアンモニウムアセテート（Biosolve、ヴァルケンスワールド、オランダ）であり、緩衝液Ｂは、緩衝液Ａ中に５０％アセトニトリルを含んでいた。５mL／分の流速を使用した。２６０、２８０及び６４３nm（Ｃｙ５の場合）におけるＵＶトレースを記録した。５８カラム容量（ＣＶ）以内で５％Ｂから６０％Ｂの勾配を採用した。適切な画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）及び７０％エタノールで沈殿させた。
【００５５】
最後に、精製したオリゴマーを、Sephadex G-25（GE Healthcare）を含むカラム上で、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。溶液の濃度は、ＵＶ光度計（Beckman Coulter、クレーフェルト、ドイツ）で２６０nmにおける吸光測定によって測定した。アニーリングまでは、個々の鎖を、冷凍溶液として−２０℃にて保存した。
【００５６】
ｓｉＲＮＡを生成するためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルのＲＮＡ溶液を組み合わせることによって、相補鎖をアニーリングした。混合物を凍結乾燥し、適切な容量のアニーリング緩衝液（１００mM  ＮａＣｌ、２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）で再構成して、所望の濃度を得た。この溶液を、９５℃の水浴に入れ、これを３時間以内に室温まで冷した。
【００５７】
【表１】
2013501023.tif 000002
小文字：２’ＯＭｅヌクレオチド；ｓ：ホスホロチオエート結合；ｄＴ：デオキシチミジン；（Ｃ６ＳＳＣ６）：Ｃ−６ジスルフィドリンカー；（ＮＨＣ６）：Ｃ−６アミノリンカー；（Ｃｙ５）：シアニン５色素
【００５８】
抗体−ｓｉＲＮＡ複合体調製
抗体のマレイミド活性化：モノクローナル抗体ＴＭＥＭ２７−８／９を、１０倍モル過剰量のＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎマレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート）と反応させた後、脱塩によって過剰量（未反応）の試薬を除去した。
【００５９】
ｓｉＲＮＡ活性化：単一デオキシチミジンに対するＣ６ＳＳＣ６−リンカーを有するＣｙ５ラベルしたｓｉＲＮＡを、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン）で還元し、ジスルフィド結合を選択的に還元した。
【００６０】
次いで、スルフヒドリル含有ｓｉＲＮＡを加えて、モノクローナル抗体に既に付加しているマレイミド基と反応させた。次いで、ｓｉＲＮＡ上の未反応の遊離スルフヒドリルを、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）を用いてブロッキングし、１００ｋＤカットオフ濃縮操作を使用したサイズ排除によって、最終生産物を精製した。
【００６１】
最終的なラベリング比を、ナノドロップ（２８０nmにおけるＩｇＧ吸着、６５２nmにおけるＣｙ５、消衰係数Ｃｙ５：２５０’０００）で決定する。
【００６２】
試料の調製
１日目：天然のネイティブＩＮＳ−１Ｅ細胞又はＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７＊Ｆ２細胞を、９６ウェルプレートに５０，０００／ウェルで播種した。
【００６３】
３日目：培地を、５００ng/mlドキシサイクリン（Sigma-Aldrich）を含む培養培地又は非誘導性対照試料用の培養培地と交換した。
【００６４】
４日目：Ｉ−緩衝液を調製し、３７℃に加熱した（１ｘ  ＨＢＳＳ、２０mMヘペス、０．１％ＢＳＡ、３回蒸留水（ｐＨ７．０）で調製）。ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５に結合された抗体の溶液（ＴＭＥＭ抗体に関しては抗体あたり平均２．４分子のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５でラベルされた６７nM抗体、ｍＧｌｕＲ７対照抗体複合体に関しては分子比２．２）、又はｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５と混合された抗体の溶液（６７nM抗体及び１６０nM  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５）のいずれかを調製し、３７℃で５分間平衡化した。細胞培養培地を徐々に吸引し、６０μl／ウェルの抗体溶液と交換し、３７℃の温度で１時間インキュベーションした。
【００６５】
細胞表面の免疫染色に関して、Ａｌｅｘａ６４７ヤギ抗マウス二次抗体の１：４００溶液を氷冷ＰＢＳで調製した。ウェルを９０μl／ウェル氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。プレートを氷浴に移し、６０μl／ウェルの氷冷抗体溶液をウェルに加え、プレートを６０分間インキュベーションした。ウェルを室温で９０μl／ウェルＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１００μl／ウェルの４％ホルムアルデヒドを加え、ウェルを室温で１５分間インキュベーションした。溶液を２μg/ml  CellMaskBlueを含む６０μlＰＢＳ／ウェルと交換し、室温で２０分間インキュベーションした。細胞を室温で９０μl／ウェルＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中の３μMヘキスト及び４％ホルムアルデヒドの溶液を加え、ウェルを室温で１５分間インキュベーションした。細胞を室温でＰＢＳで１回洗浄し、１５０μlＰＢＳ／ウェル中に置いた。
【００６６】
細胞内レベルの免疫染色の定量
Evotec Technologies、ハンブルグ、ドイツのOpera QEHS HCS readerを使用して、抗体及びｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５の細胞内局在性を定量した。この装置は倒立共焦点蛍光顕微鏡を備え、透明底マイクロタイタープレートで調製した試料から自動的に画像取得を行うように設定する。リーダーには、所定の種類の対象物の位置を識別する画像分析用のソフトウェア“Accapella”を組み込み、ここで画像分析法（スクリプト）が作成され得る。
【００６７】
本実施例における定量に使用したスクリプトは、細胞表面領域上の及び細胞内細胞質領域に局在する免疫染色それぞれの強度を同定するように開発した。分析は、ＤＮＡ特異的蛍光色素分子ならびに同種細胞染料CellMaskBlue、Alexa488及びｓｉＲＮＡラベルＣｙ５でラベルされた二次抗体で染色された試料の３つの並行取得した画像に基づいている。各画像から対象物を同定する。ＤＮＡ染色及びCellMaskBlue染色に特異的な最初の画像に基づき、より明るいヘキスト染色から核の数、位置、大きさ及び形を、そしてCellMaskBlue染色から細胞質の輪郭を決定した。Alexa488二次抗体に選択的な二番目の画像から、細胞表面の免疫染色の面積を決定し、強度を定量した。三番目から、細胞の細胞質領域中のＣｙ５染色の強度を同定し、蛍光強度を定量した。
【００６８】
図８は、プロトコルに記載される通りの二次染色及び固定のために洗浄して氷に移す前の、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５に結合した６７nM一次抗体、又は６７nM一次抗体及び１６０nM  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５の混合物と一緒に３７℃でインキュベーションしたＩＮＳ−ｈＴＭＥＭ２７＊Ｆ２細胞の画像を示す。各列は、ウェルにおける同一視野の並行取得した画像を含む。パネルＡ〜Ｆは、ドキシサイクリンで誘導された細胞である。パネルＧ〜Ｉは、パネルＡ〜Ｃにおける試料として調製された試料の画像であるが、非誘導性細胞を使用するものは除く。パネルＪ〜Ｌは、ＴＭＥＭ２７抗体ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５複合体を、ｍＧｌｕＲ７レセプターを認識する抗体に結合したｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５と交換した点を除いて、パネルＡ〜Ｃにおける試料として調製された試料の画像である。
【００６９】
パネルＡ、Ｄ、Ｇ及びＪは、CellMaskBlue及びヘキスト染色に選択的なフィルター設定で取得した画像を示す：レーザー４０５nm、ロングパス６５０フィルターによって反射され、ショートパス５６８フィルター及びバンドパス４５５／７０フィルターを透過した発光。パネルＢ、Ｅ、Ｈ及びＫは、Alexa488二次抗体を用いた細胞表面染色に選択的なフィルター設定で取得した画像を示す：レーザー４８８nm、ＬＰ６５０及びＬＰ５６８によって反射され、ＢＰ５３５／６０を透過した発光。パネルＣ、Ｆ及びＩは、ｓｉＲＮＡラベルＣｙ５に選択的なフィルター設定で取得した画像を示す：レーザー６３５nm、ＬＰ６５０を通過し、ＢＰ６９０／５０を透過した発光。画像の強度スケーリングは、同一のカメラで取得した画像と同様である。
【００７０】
画像は、ＴＭＥＭ２７抗体が、膜に埋め込まれたヒトＴＭＥＭ２７の認識を通じて、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを仲介し得ることを明示している。
【００７１】
図９は、定量した細胞表面二次抗体免疫染色及びＣｙ５の細胞質領域強度を示す。試料を、ドキシサイクリン誘導性ヒトＴＭＥＭ２７発現（黒色のバー）及び非誘導性（白色のバー）細胞で調製し、異なる組み合わせのｓｉＲＮＡ及び抗体と一緒に１時間インキュベーションした。ｘ軸の左から右に：ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５（抗体あたり平均２．４分子）に結合した６７nM  ＴＭＥＭ２７８／９一次抗体、６７nM  ＴＭＥＭ２７８／９一次抗体及び１６０nM  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５の混合物、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５（抗体あたり平均２．２分子）に結合した６７nM  ｍＧｌｕＲ７一次抗体、そして最後に、プロトコルに記載される通りの二次染色及び固定のために洗浄して氷に移す前の、ｓｉＲＮＡ又は抗体なしで緩衝液と一緒に３７℃で１時間インキュベーションした試料。
【００７２】
パネル９ａ：細胞表面膜領域における二次抗体免疫染色の平均画素強度。パネル９ｂ：Ｃｙ５の細胞質領域における平均画素強度。
【００７３】
ここまで本発明の好ましい実施態様を示しかつ記載してきたが、本発明はこれに限定されず、以下の特許請求の範囲の範囲内で様々に具現かつ実施され得ることが明確に理解されよう。
【図４ａ】
2013501023.tif 000003
【図４ｂ】
2013501023.tif 000004
【図４ｃ】
2013501023.tif 000005
【図４ｄ】
2013501023.tif 000006
【図４ｅ】
2013501023.tif 000007
【図４ｆ】
2013501023.tif 000008
【図４ｇ】
2013501023.tif 000009
【図４ｈ】
2013501023.tif 000010
【図４ｉ】
2013501023.tif 000011
【図４ｊ】
2013501023.tif 000012
【図４ｋ】
2013501023.tif 000013
【図８Ａ】
2013501023.tif 000014
【図８Ｂ】
2013501023.tif 000015
【図８Ｃ】
2013501023.tif 000016
【図８Ｄ】
2013501023.tif 000017
【図８Ｅ】
2013501023.tif 000018
【図８Ｆ】
2013501023.tif 000019
【図８Ｇ】
2013501023.tif 000020
【図８Ｈ】
2013501023.tif 000021
【図８Ｉ】
2013501023.tif 000022
【図８Ｊ】
2013501023.tif 000023
【図８Ｋ】
2013501023.tif 000024
【図８Ｌ】
2013501023.tif 000025
【図１】
2013501023.tif 000026
【図２】
2013501023.tif 000027
【図３】
2013501023.tif 000028
【図５】
2013501023.tif 000029
【図６ａ】
2013501023.tif 000030
【図６ｂ】
2013501023.tif 000031
【図７】
2013501023.tif 000032
【図９ａ】
2013501023.tif 000033
【図９ｂ】
2013501023.tif 000034
【配列表】
2013501023000001.app
【国際調査報告】
2013501023.tif 000035
2013501023.tif 000036
2013501023.tif 000037