(57)【要約】      （修正有）【課題】線維性障害を予防及び／又は治療するための組成物の提供。【解決手段】下記ＳＧ００５２９等で例示されるベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体を有効成分として含み、肺線維症、全身性硬化症、強皮症、増殖性硝子体網膜症、肝硬変、膵臓及び肺の嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、注射線維症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症候群、移植片拒絶、糸球体症、びまん性実質性肺疾患、精管切除後疼痛症候群、結核、鎌状赤血球貧血により引き起こされる脾臓線維症、関節リウマチ等の線維性障害の予防及び／又は治療に有用な組成物。2015038092.tif 000012【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
望まれない細胞外基質形成により特徴付けられる疾患を予防もしくは処置する方法であって、治療的量の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩおよび式ＩＶからなる群から選択される１つ以上の組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、式Ｉ
【化１】
2015038092.tif 000010
であり、式中、
Ｒ１は、Ｈもしくはアルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アミノ、Ｏ−ヘテロシク、Ｏ−アリール、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３、ＯＳＯ２ＮＨ２もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールである）であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−ＣＨ２アリール、Ｏ−ＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アシルもしくはニトロであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ５は、Ｈ、オキソ、アリール、ヒドロキシル、アルキルもしくはＯ−アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈであり；
Ｒ７は、Ｈ、アシル、アルキル、Ｏ−アルキル、置換アルキル（該置換は、ヒドロキシルもしくはスルファモイルである）もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、Ｏ−ＰＯ３もしくはＯＳＯ３である）であり；
Ｒ８は、Ｈであり；かつ
Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記組成物が、
【化２】
2015038092.tif 000011
である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記組成物が、許容され得る送達ビヒクルをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記疾患が、線維性障害である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記線維性障害が、肺線維症、全身性硬化症、強皮症、増殖性硝子体網膜症、肝硬変、膵臓および肺の嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、注射線維症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症候群、移植片拒絶、糸球体症、びまん性実質性肺疾患、精管切除後疼痛症候群、結核、鎌状赤血球貧血により引き起こされる脾臓線維症および関節リウマチからなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
前記糸球体間質性障害が、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症候群、移植片拒絶および糸球体症からなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
前記投与が、前記１つ以上の組成物の局所、経口、経鼻、経直腸および非経口投与を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の組成物が、移植物に付随する、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の組成物が、装置に付随する、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
病理学的線維症は、組織の異常な増大、硬化および／もしくは瘢痕化により説明される。これは、コラーゲンなどの細胞外基質成分の過剰な沈着により特徴付けられる。線維症は、代表的には、炎症、組織再構築および修復プロセスが同時に起こる慢性炎症の状態から生じる。別の病原学的および臨床的兆候を有するにもかかわらず、ほとんどの慢性線維性障害は、共通して、持続性の感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的発作、放射および組織傷害などの持続性の刺激物もしくは刺激を有する。刺激物もしくは刺激は、増殖因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子および線維形成性サイトカインの産生を持続させ、このことは、正常な組織構築を徐々に再構築および破壊する結合組織要素の沈着を刺激する。特発性肺線維症、肝硬変、心血管線維症、全身性硬化症および腎炎などのいくつかの疾患では、広範な組織再構築および線維症は、最終的に臓器不全および死につながり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
発明の簡便な要旨
本発明は、線維性障害を処置するための組成物および方法に関する。本発明は、線維症を含む疾患において治療上の利点を実証するベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン化合物およびその医薬組成物に部分的に関する。
【０００３】
さらに別の実施態様では、本発明は、治療的有効量の本明細書中に記載の１つ以上の組成物を、それを必要とする被験体に投与する方法に関する。１つの局面では、標的とする被験体は、線維性障害であると診断されている。
【０００４】
発明の他の特徴および利点は、その実施態様の以下の詳細な説明により明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、コントロールの付着網膜の写真である。ＡおよびＢは、ビヒクル（Ａ）および薬物（Ｂ）を注射した正常な眼の両方における正常な網膜の形態を図示する、Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片の光学顕微鏡写真である。ＣおよびＤは、３日もしくは７日間剥離させかつビヒクル（Ｃ、Ｄ）もしくは薬物（Ｅ、Ｆ）のいずれかの眼内注射を受けた動物の眼内からの付着網膜領域のレーザー走査共焦点画像である。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、抗ビメンチン（Ｍｕｌｌｅｒ（ミュラー）細胞、緑色）、抗ＢｒｄＵ（分裂細胞、赤色）およびイソレクチンＢ４（ミクログリアおよびマクロファージ、青色）で標識した剥離網膜の網膜切片のレーザー走査共焦点画像である。
【図３】図３は、網膜剥離後に増殖するＭｕｌｌｅｒ細胞の数を図示する棒グラフである。
【図４】図４は、網膜剥離後の網膜下神経膠瘢痕の数を図示する棒グラフである。
【図５】図５は、網膜剥離後の網膜下神経膠瘢痕の長さを図示する棒グラフである。
【図６】図６は、網膜剥離後の免疫関連細胞の数を図示する棒グラフである。
【図７】図７は、剥離後の外顆粒層（ＯＮＬ）の平均厚みを図示する棒グラフである。
【図８】図８Ａは、非剥離網膜の網膜切片の写真である。図８Ｂおよび８Ｃは、化合物で処置しなかった剥離網膜の網膜切片の写真である。図８Ｄ〜８Ｆは、化合物で処置した剥離網膜の網膜切片の写真である。
【図９】図９は、剥離網膜の１ｍｍ当たりの分裂細胞の数の棒グラフである。
【図１０】図１０Ａは、非剥離網膜の網膜切片の写真である。図１０Ｂは、網膜下線維症を示す、化合物で処置しなかった剥離網膜の網膜切片の写真である。図１０Ｃは、線維症を示さない、化合物で処置した剥離網膜の網膜切片の写真である。
【図１１】図１１は、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９のヒト肺線維芽細胞の分化のメディエーターへの効果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図１２】図１２は、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９のヒト肺線維芽細胞におけるシグナル伝達への効果を示すウエスタンブロットの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
ほとんどの慢性線維性障害は、共通して、持続性の感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的発作、放射および組織傷害などの持続性の刺激物もしくは刺激を有する。刺激物もしくは刺激は、増殖因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子および線維形成性サイトカインの産生を持続させ、このことは、正常な実質性組織に置き換わる結合組織要素の沈着を刺激する。特発性肺線維症、肝硬変、心血管線維症、全身性硬化症および腎炎などのいくつかの疾患では、広範な組織再構築および線維症は、最終的に臓器不全および死につながり得る（表１）。Ｗｙｎｎ，ＴＡ，“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ”，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２１４：１９９−２１０（２００８）。
【０００７】
【表１】
2015038092.tif 000002
【０００８】
本発明では、我々は、線維症の誘発は、種々の組織における同様の様式での一連の事象により起こるとの理解の下、眼および肺を含む線維症の例を記載する。我々は、ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン化合物およびその医薬組成物が、線維症を含む疾患における治療上の利点を実証することを主張する。さらに、我々は、ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン化合物およびその医薬組成物によるＡｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路の阻害が、線維症を含む疾患における治療上の利点を実証することを主張する。
【０００９】
本発明は、線維症に関連する疾患を予防および／もしくは治療するための組成物および方法に関する。本発明は、線維性疾患における治療上の利点を実証する一連の化学組成物に部分的に関する。特定の局面では、本発明は、その線維性疾患への効果を実証するベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体に関する。
【００１０】
用語「誘導体」は、当業者に理解されている。例えば、誘導体は、ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オンについて表２（下記）に図解されるような、同様の構造の別の化合物から１つ以上の工程で産生される化学物質であると理解され得る。
【００１１】
本発明は、線維性障害の処置に有用な１つ以上の組成物を含む治療用製剤に関する。線維性障害は、細胞外基質の異常な形成に起因する。線維性障害の例には、肺線維症、全身性硬化症、強皮症、増殖性硝子体網膜症、肝硬変および糸球体間質性増殖性細胞障害が挙げられる。線維性障害のさらなる例には、膵臓および肺の嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症（ｍｙｌｅｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症（炭鉱労働者の塵肺の合併症）および注射線維症（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）（これは、特に子供において、筋肉内注射の合併症として起こり得る）。さらなる線維症関連症状には、びまん性実質性肺疾患、精管切除後疼痛症候群、結核（これは、肺の線維症の原因となり得る）、鎌状赤血球貧血（これは、脾臓の線維症の原因となり得る）および関節リウマチが挙げられる。
【００１２】
肝硬変は、肝臓の瘢痕の形成をもたらす細胞外基質成分の増加により特徴付けられる。肝硬変は、肝臓の硬変症などの疾患の原因となり得る。肝臓の瘢痕の形成をもたらす細胞外基質成分の増加はまた、肝炎などのウイルス感染症によっても引き起こされ得る。
【００１３】
糸球体間質性障害は、メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起こされる。糸球体間質性過剰増殖細胞障害は、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症症候群、移植片拒絶および糸球体症などの多様なヒト腎疾患を含む。
【００１４】
本発明によれば、式Ｉ：
【化１】
2015038092.tif 000003
［式中、
Ｒ１＝Ｈもしくはアルキル；
Ｒ２＝Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アミノ、Ｏ−ヘテロシク（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃ）、Ｏ−アリール、Ｏ−置換アルキル（該置換は、例えば、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールである）、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２；
Ｒ３＝Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−ＣＨ２アリール、Ｏ−ＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アシルもしくはニトロ；
Ｒ４＝Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２；
Ｒ５＝Ｈ、オキソ、アリール、ヒドロキシル、アルキルもしくはＯ−アルキル；
Ｒ６＝Ｈ；
Ｒ７＝Ｈ、アシル、置換アルキル（該置換は、例えば、ヒドロキシルもしくはスルファモイルである）、アルキル、Ｏ−アルキルもしくはＯ−置換アルキル（該置換は、Ｏ−ＰＯ３もしくはＯＳＯ３である）；
Ｒ８＝Ｈ；かつ
Ｘ＝Ｏ、ＮもしくはＳ］
を含む医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明によれば、式ＩＩ：
【化２】
2015038092.tif 000004
［式中、
Ｒ１＝Ｈもしくはアルキル；
Ｒ２＝Ｈ、Ｏ−アルキル、ＯＨ、アミノ、Ｏ−ヘテロシク、Ｏ−アリール、Ｏ−置換アルキル（該置換は、例えば、ハロ、アリールもしくはヘテロアリール）、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２；
Ｒ３＝Ｈ、Ｏ−アルキル、Ｏ−置換アルキル（該置換は、アリールもしくはヘテロアリール）、ＯＨ、Ｏ−アシルもしくはニトロ；
Ｒ４＝Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、Ｏ）、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２；
Ｒ５＝Ｈ、アリール、ヘテロアリールもしくは置換アルキル；かつ
Ｒ６＝Ｈ、アルキルもしくはアリール］
を含む医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明によれば、式ＩＩＩ：
【化３】
2015038092.tif 000005
［式中、
Ｒ１＝アルキルもしくはＨ；
Ｒ２＝アルキルもしくはＨ；
Ｒ３＝アセチル；かつ
Ｒ４＝Ｈもしくはアルキル］
を含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明によれば、式ＩＶ：
【化４】
2015038092.tif 000006
［式中、
Ｒ１＝ＨもしくはＦ；
Ｒ２＝Ｈもしくはニトロ；
Ｒ３＝Ｈ；
Ｒ４＝Ｈ；かつ
Ｒ５＝アルキル、置換アルキルもしくはアリール］
を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明によれば、治療的有効量の表２に図示される以下の構造を有するベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体を１つ以上含む医薬組成物が提供される：
【００１９】
【表２−１】
2015038092.tif 000007
【００２０】
【表２−２】
2015038092.tif 000008
【００２１】
【表２−３】
2015038092.tif 000009
【００２２】
表２の個々のベンゾ［ｃ］−クロメン−６−オン誘導体は、命名「ＳＧ」とそれに続く数により特定される。あるいは、これらは、本明細書中で、命名「Ｐａｌｏｍｉｄ」とそれに続く同じ数で表される。すなわち、用語「ＳＧ」と「Ｐａｌｏｍｉｄ」とは、本願の全体にわたって互換的に用いられる。
【００２３】
表２の化合物は、抗線維症活性を示す。当業者は、本発明が、抗線維症活性を有する他のベンゾ［ｃ］−クロメン−６−オン誘導体を含むことを理解する。
【００２４】
本発明はまた、徐放のための生分解性もしくは非生分解性のフォーマットで製剤化された本明細書中に記載の１つ以上の組成物もしくはそのプロドラッグを含む、移植物もしくは他の装置に関する。非生分解性のフォーマットは、フォーマットそれ自体が分解されることなく、物理的もしくは機械的プロセスにより制御された様式で薬物を放出する。生分解性フォーマットは、体内で自然なプロセスにより次第に加水分解もしくは可溶化されるように設計され、混合された薬物もしくはプロドラッグの漸次の放出を可能にする。生分解性および非生分解性フォーマットの両方、ならびに薬物が制御放出用のフォーマットで組み合わされるプロセスは、当業者に周知である。これらの移植物もしくは装置は、送達が望まれる場所、例えば、異常な細胞外基質の部位の近傍に埋め込まれ得る。
【００２５】
本発明はまた、複合プロドラッグおよびその使用に関する。より詳細には、本発明は、関連するベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体の複合体および非特徴的な細胞外基質形成に関連する症状の予防もしくは処置におけるこのような複合体の使用に関する。
【００２６】
本発明はまた、生物学的活性修飾剤、例えば、ペプチド、抗体もしくはそれらの断片、またはメチルエステル、ホスフェートもしくはスルフェート基などのインビボ加水分解性エステル、およびアミドもしくはカルバメートに複合体化したベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体の複合プロドラッグを提供する。修飾は、ヒドロキシル基をホスフェート基で修飾することを含み得る。この誘導体は、誘導体に顕著な変化を引き起こすことにより生物活性を失わせる修飾に起因する活性を有するとは予測されない。しかしながら、この修飾は、より良い溶解度特性、すなわち、より高い水溶性を付与し、このことは血中の輸送を促進するか、もしくはより良い経口アベイラビリティーを与えてそれがその活性の部位に到達することを可能にし得る。活性を有することが必要とされるミクロ環境にそれが一旦到達すると、修飾は、天然のプロセス、すなわち、必要とされる活性の部位に存在する内因性の酵素により切断される。あるいは、修飾は、誘導体を、より良い全身濃度を与える状態にちょうど保持し得、次いで全身的循環で再び切断されることによってその活性を向上させ得る。ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体を疾患依存的に活性化されたプロドラッグに組み入れることにより、本明細書の上記で述べた１つ以上の疾患症状の処置における効力および選択性の顕著な改善が可能になる。
【００２７】
本発明の化合物に加えて、本発明の医薬組成物もまた、本明細書の上記で述べた１つ以上の疾患症状を処置するのに有用な１つ以上の薬理学的薬剤を含み得るか、もしくはそれと一緒に（同時にもしくは連続的に）共投与され得る。
【００２８】
さらに、ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグは、生分解性もしくは非分解性フォーマットに組み込まれて、徐放を可能にし得る。例えば、製剤は、送達が望まれる場所の近傍、腫瘍の部位もしくは異常な脈管構造の近傍に埋め込まれる。あるいは、医薬製剤は、特異性を提供する化学的部分を有する送達ビヒクル中に包装され得る。例えば、上記部分は、活性薬剤の望まれる部位への送達を指向および促進するような抗体もしくは他の何らかの分子であり得る。
【００２９】
本発明はまた、線維性組織の非特徴的な形成、すなわち異常な細胞外基質の形成により特徴付けられるいずれかの疾患に関連する症状の予防もしくは処置のための医薬品の製造のための、ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグの使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、本発明のベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグを、医薬上許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤と共に含む医薬組成物の提供に関する。
【００３１】
医薬組成物はまた、線維性疾患もしくは障害に関連する症状の予防もしくは治療に用いられ得る。本発明はまた、非特徴的な細胞外基質の形成により特徴付けられるいずれかの線維性疾患もしくは障害に関連する症状の予防もしくは処置方法に関し、当該方法は、そのような予防もしくは処置を必要とする被験体に、有効量の本明細書で上記した本発明のベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグを投与することを含む。上記症状の予防もしくは処置は、上記症状の寛解を含むことが理解されるべきである。
【００３２】
「有効量」とは、特定の疾患もしくは症候群に部分的にもしくは完全に関連する症候を緩和する治療的有効量を意味する。このような量は、適切に熟練した開業医により、処置すべき症状、投与の経路、および当業者に周知の他の関連する要因を考慮して容易に決定され得る。このような者は、投与の適切な用量、様式および頻度を容易に決定し得る。
【００３３】
ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグの医薬上許容され得る塩は、任意の通常の様式で調製され得る。例えば、メチルエステル、ホスフェートもしくはスルフェート基などのインビボ加水分解性エステル、およびアミドもしくはカルバメートは、任意の通常の様式で調製され得る。
【００３４】
ベンゾ［ｃ］クロメン−６−オン誘導体もしくはそのプロドラッグは、公知技術を用いて生理学上許容され得る製剤として提供され得、これらの製剤は、標準的な経路により投与され得る。組成物は、例えば、局所的、経口的、経直腸的または静脈内、皮下もしくは筋肉内経路などの非経口的手段により投与され得るが、これらに限定されない。さらに、組成物は、徐放を可能にするフォーマットに組み込まれ得、このフォーマットは、例えば、皮膚疾患もしくは加齢皮膚の部位、または異常な脈管構造の近傍などの、送達が望まれる場所の近傍に埋め込まれる。組成物の用量は、治療される症状、用いられる特定の誘導体、ならびに被験体の体重および症状、および化合物の投与の経路などの他の臨床的要因（その全ては、当業者により理解される）に依存する。例えば、当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（その全ての教示は、参照することにより本明細書中に組み込まれる）などの標準的な教科書を参照して、製剤をどのように作製すべきか、およびこれらをどのように投与し得るかを決定し得る。
【００３５】
製剤には、経口、経直腸、経鼻、吸入、局所（経真皮、経皮、経頬および舌下が挙げられるが、これらに限定されない）、経腟もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、眼内（硝子体内、結膜下、テノン嚢下、経強膜が挙げられるが、これらに限定されない）、気管内および硬膜外が挙げられるが、これらに限定されない）および吸入投与に適したものが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、単位剤形で簡便に提供され得、かつ、通常の製薬技術により調製され得る。このような技術は、活性成分と医薬上の担体もしくは賦形剤を合わせる工程を含む。製剤は、活性成分を液体担体もしくは細かく分割した固体担体またはその両方と共に均一かつ綿密に合わせ、次いで、必要に応じて、製品を成形することにより調製される。
【００３６】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが所定量の活性成分を、粉末もしくは顆粒；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型エマルジョンなどとして含む、カプセル、カシェ剤もしくは錠剤などの別々の単位として提供され得る。
【００３７】
錠剤は、至適には、１つ以上の補助成分と共に圧縮もしくは成形することにより製造され得る。圧縮錠剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤もしくは分散剤と混合した、粉末もしくは顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を、適切な機械中で圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械中で成形することにより作製され得る。錠剤は、必要に応じて、コーティングされるかもしくは割線が施され得、かつ、その中の活性成分の遅延もしくは制御放出を提供するように製剤化され得る。
【００３８】
口経由での投与に適した製剤には、風味基剤、通常は、ショ糖およびアラビアゴムもしくはトラガカント中に成分を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリン、もしくはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ剤；ならびに投与すべき成分を適切な液体担体中に含む口腔洗浄剤が挙げられる。
【００３９】
皮膚への局所投与に適した製剤は、投与すべき成分を医薬上、薬用化粧品上もしくは化粧品上許容され得る担体中に含む軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストとして提供され得る。有望な送達系は、投与すべき成分を含む経皮パッチである。
【００４０】
直腸投与用の製剤は、例えば、カカオバターもしくはサリチレートなどを含む適切な基剤を有する坐薬として提供され得る。
【００４１】
担体が固体である経鼻投与に適した製剤には、例えば、嗅ぎ薬を服用する様式で、例えば、鼻に近づけて保持された粉末の容器から鼻の経路を通して急速に吸入することにより投与される、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗製粉末が挙げられる。担体が投与用の液体である場合の適切な製剤には、例えば、活性成分の水性もしくは油性溶液を含む経鼻スプレーもしくは点鼻薬が挙げられる。
【００４２】
経腟投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当該分野で適切であることが公知である担体などの成分を含む、腟坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡もしくはスプレー製剤として提供され得る。
【００４３】
吸入に適した製剤は、活性成分に加えて、当該分野で適切であることが公知である担体などの成分を含む、ミスト、粉塵、粉末もしくはスプレー製剤として提供され得る。
【００４４】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を被験体となるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る、水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量もしくは複数用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで提供され得、かつ、使用の直前に注射用水などの無菌の液体を添加することだけを必要とする凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）、凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）条件下で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、上記した種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００４５】
許容され得る単位用量製剤は、本明細書中で上記したように、投与される成分の１日の用量もしくは単位、１日の副用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはそれらの適切な画分を含むものである。
【００４６】
上記成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の型に関して当該分野で標準的な他の薬剤を含み得、例えば、経口投与に適したものは、香味料を含み得る。
【００４７】
本発明は、約１００％〜約９０％の純粋な異性体の組成物を含む。別の局面では、本発明は、約９０％〜約８０％の純粋な異性体の組成物に関する。さらに別の局面では、本発明は、約８０％〜約７０％の純粋な異性体の組成物に関する。さらに別の局面では、本発明は、約７０％〜約６０％の純粋な異性体の組成物に関する。なおさらなる局面では、本発明は、約６０％〜約５０％の純粋な異性体の組成物に関する。しかしながら、αもしくはβと標識された立体化学異性体は、当業者によって化学的に可能である場合は両方の任意の比での混合物であり得る。さらに、本発明には、古典的および非古典的な生物学的等電子原子による置換および置換基による置換の両方が含まれ、これらは当業者に周知である。このような生物学的等電子による置換には、例えば、＝Ｏの＝Ｓもしくは＝ＮＨでの置換が挙げられる。
【００４８】
本発明に従って用いられる公知化合物および本発明の新規化合物の前駆物質は、市販の供給源、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入され得る。本発明の他の化合物は、当業者に周知の既知方法に従って合成され得る。
【実施例】
【００４９】
実施例１：Ｍｕｌｌｅｒ細胞反応性および光受容細胞の死は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤を用いる実験的網膜剥離の後に減少する
組織の調製
成体のニュージーランド赤色有色ウサギにおいて、Ｅｉｂｌら（Ｅｉｂｌ ＫＨら、Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅｓ ｏｎ ｉｎｔｒａｒｅｔｉｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７；４８：１３０５−１１）に記載されるように網膜剥離を作製した。簡単に述べると、併用薬のキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射を、麻酔および鎮痛に用いた。さらなる鎮痛は、プロパラカインの局所的点眼により提供された。平衡塩類溶液（ＢＳＳ；Ａｌｃｏｎ，Ｆｔ．Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）中のヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の０．２５％溶液を、神経網膜とＲＰＥとの間に、ガラスピペットにより注入した。Ｈｅａｌｏｎは網膜の自発的な再付着を防ぐために必要であり、長期にわたって剥離を維持する最も希薄な溶液は０．２５％である。約１００μｍの外径を有するピペットを、毛様体扁平部の数ｍｍ下に作製した切開から眼に挿入して、ピペットが水晶体に触れるのを防いだ。約半分の下部網膜を右眼から剥離し、上部の付着領域を内部標準とした。左眼は未注射コントロールとしての役目を果たした。剥離を作製した直後、５０μｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳ）中の６００μｇのＰａｌｏｍｉｄ５２９を硝子体内注射した。剥離の３日後、実験的（右）眼に、５０μｌのＢＳＳ中の１０μｇのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）を硝子体内注射した。ＢｒｄＵを、３日間および７日間の剥離実験の両方について、第３日目に硝子体内投与したが、これは、この時点で増殖応答がその最大値であることが以前に示されたからである。剥離を有する眼内での付着網膜領域は、ＢｒｄＵで標識されたコントロール網膜の役目を果たした。第３日目のもしくは第７日目のいずれかにＢｒｄＵ注射の４時間後、ナトリウムペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｍｌ、ＩＶ）を用いて、動物を安楽死させた。３日間および７日間の実験の両方において、３匹の動物を用いた。摘出後、眼を４％パラホルムアルデヒド中で少なくとも２４時間固定した（０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．４；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）。薬物の可能性のある毒性の影響を決定するため、６匹の追加の動物に、ビヒクル（ＢＳＳ、ｎ＝３）もしくは薬物（ｎ＝３）を正常な眼に注射した。これらの動物を第１５日目に安楽死させ、眼を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、光学顕微鏡での評価のため、全眼をパラフィン中に包埋した。全ての実験手順は、Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ ＲｅｓｅａｒｃｈのためのＡＲＶＯ声明およびＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａの指針に従った。
【００５０】
免疫細胞化学／光学顕微鏡法
免疫細胞化学を、少しの改変を加えて、Ｅｉｂｌらに記載されるように実施した。約３ｍｍ四方の網膜組織の断片を、各眼内からの３つの剥離領域から切除した。組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすぎ、低融点アガロース（５％；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）に包埋し、ビブラトーム（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を用いて１００μｍに切り出した。切片を、ＰＢＳ中の正常なロバ血清（１：２０）、０．５％ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００および０．１％アジド（＝ＰＢＴＡ）中で一晩、４℃にて、回転装置上でインキュベートした。翌日、ＢｒｄＵの抗原回収工程として、切片を２Ｎ ＨＣＬで１時間前処理した。ＰＢＴＡ中ですすいだ後、一次抗体およびレクチンを加え、一晩、４℃にて、回転装置上で、ＰＢＴＡ中でインキュベートした。抗ＢｒｄＵ（１：２００、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）は、分裂細胞を検出するのに用い、抗ビメンチン（１：５００；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）は、Ｍｕｌｌｅｒ細胞を同定するのに用い、イソレクチンＢ４、グリフォニア・シンプリシフォリア（１：５０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）は、ミクログリアおよびマクロファージを標識するのに用いた。一次抗体をＰＢＴＡ中ですすいだ後、二次抗体（ストレプトアビジンＣＹ５、ロバ抗ラットＣＹ３およびロバ抗マウスＣＹ２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を共に、ＰＢＴＡ中それぞれ１：２００で、４℃にて、回転装置上で一晩添加した。翌日、切片をＰＢＴＡ中ですすぎ、グリセリン中の５％ｎ−プロピル没食子酸を用いて、核染色剤Ｈｏｅｓｃｈｔ（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共にスライドガラス上に載せ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ５００レーザー走査共焦点顕微鏡上で観察した。全眼のパラフィン切片を４μｍに切断し、ヘマトキシリン（Ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて対比染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡上でデジタルカメラを用いて写真撮影した。各群内の異なる３匹の動物からの全眼を包埋および切断したので、網膜の全長の検査は単一の切片で行われ、かつ、コントロールおよび実験動物からの同様の網膜領域が写真撮影のために選択された。
【００５１】
定量
実験群（ビヒクルおよび薬物処置した）のそれぞれの中の３匹の動物から、１０２４×１０２４画素解像度で少なくとも６０の単平面共焦点画像を取り込んだ。同様の網膜の位置を、全ての動物で検討した。薬物処置の増殖への効果を定量するため、抗ＢｒｄＵ標識Ｍｕｌｌｅｒ細胞核の数を、第３日目および第７日目の時点の両方からの共焦点画像を用いて、網膜１ｍｍ当たりで決定した。薬物処置の網膜下神経膠瘢痕の形成への効果を定量するため、瘢痕を、ＯＬＭ（これもまた抗ビメンチンで標識された）に対する、連続的な細胞成長が位置する強膜の面積であると定義した。瘢痕の数を計数し、それらの長さを７日間の動物の網膜１ｍｍ当たりで測定したが、これは、第３日目には瘢痕が観察されなかったからである。ＯＮＬの幅を決定するため、切片を蛍光性核色素（Ｈｏｅｓｃｈｔ）で染色し、かつ、ＯＮＬを、統計に基づくクラスター形成法（Ｂｙｕｎ Ｊ，Ｐｈ．Ｄ．学位論文、“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｉｍａｇｅｓ”．Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆ．Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、２００７年６月）により自動的に分割した。次いで、コントロール網膜のＯＮＬ幅を、ビヒクルを注射した眼および薬物を注射した眼における幅と比較した。第７日目の時点のみを検討したが、これは、このときに第３日目と比べてより多くの光受容細胞の死が起こったからである。同じ切片を用いて、上記応答の全てを定量した。
【００５２】
付着網膜の解析
パラフィン包埋した正常網膜の光学顕微法および剥離した眼内からの多様な抗体で標識した付着網膜領域の共焦点顕微法を検査し、薬物の可能性のある有害な影響を決定した（図１）。ビヒクルで処置した正常網膜と薬物で処置した正常網膜との間には、網膜の組織化における差はパラフィン切片中で観察されなかった（図１Ａ、Ｂ）。加えて、抗ビメンチンおよびイソレクチンＢ４標識は、第３日目および第７日目の時点の両方で、ビヒクルで処置した付着網膜および薬物で処置した付着網膜の間で同様であるように見えた；また、抗ビメンチン標識（緑色）は、Ｍｕｌｌｅｒ細胞内で神経節細胞層（ＧＣＬ）から外顆粒層（ＯＮＬ）に増大し、ミクログリア（青色）は、全ての群において網膜の内側部分にのみ存在した（図１Ｃ〜Ｆ）。標識パターンは、未処置の正常な眼において観察されたものと同様であり、唯一の違いは、ビヒクルを注射した眼および薬物を注射した眼の両方における硝子体内のマクロファージの存在である。最終的に、ビヒクルで処置した網膜もしくは薬物で処置した網膜のいずれにおいても抗ＢｒｄＵ標識は観察されなかった。これらのデータは、薬物が、網膜の形態に甚だしく有害な影響を引き起こさなかったこと、またＭｕｌｌｅｒ細胞もしくはミクログリアを活性化しなかったことを示す。
【００５３】
剥離網膜の解析
図１Ａ〜１Ｆは、コントロールの付着網膜の写真である。Ａ、Ｂ。ビヒクル（Ａ）および薬物（Ｂ）を注射した正常な眼の両方における正常な網膜の形態を図示するＨ＆Ｅ染色パラフィン切片の光学顕微鏡写真。Ｃ−Ｄ。３日もしくは７日間剥離させ、かつビヒクル（Ｃ、Ｄ）もしくは薬物（Ｅ、Ｆ）のいずれかの眼内注射を受けた動物の眼内からの付着網膜領域のレーザー走査共焦点画像。切片を、抗ビメンチン（Ｍｕｌｌｅｒ細胞、緑色）、抗ＢｒｄＵ（分裂細胞、赤色）およびイソレクチンＢ４（ミクログリアおよびマクロファージ、青色）で標識した。抗ビメンチン標識は、ＧＣＬからＯＮＬ内へと増大し、抗ＢｒｄＵ標識は観察されず、かつ、イソレクチンＢ４は、内側網膜中のミクログリアおよび硝子体内のマクロファージの微細なプロセスを標識した（ＯＳの青色標識は非特異的である）。ＯＳ、外節；ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＧＣＬ、神経節細胞層。バー、２０μｍ。
【００５４】
図２Ａ〜２Ｄは、実験的剥離網膜のレーザー走査共焦点画像の写真である。抗ビメンチン（Ｍｕｌｌｅｒ細胞、緑色）、抗ＢｒｄＵ（分裂細胞、赤色）およびイソレクチンＢ４（ミクログリアおよびマクロファージ、青色）で標識した網膜切片のレーザー走査共焦点画像。（Ａ）ビヒクルを注射した３日間の剥離において、抗ビメンチン標識は、ＯＮＬから外境界膜に増大し、抗ＢｒｄＵ標識は、内顆粒層（ＩＮＬ）中のＭｕｌｌｅｒ細胞核内に主に存在し、かつ、イソレクチンＢ４標識は、網膜全体にわたるミクログリア中に、および網膜下腔内のマクロファージ中に存在した。（Ｂ）ビヒクルを注射した７日間の剥離において、Ｍｕｌｌｅｒ細胞の抗ビメンチン標識は、網膜下腔（括弧）内へと増大し、抗ＢｒｄＵ標識は、網膜全体に散乱した核内におよび網膜下腔内に存在し、かつ、イソレクチンＢ４標識は、網膜下腔内の網膜およびマクロファージ中の多数のミクログリア内に見られた。Ｐａｌｏｍｉｄ５２９で３日間および７日間処置した網膜（Ｃ、Ｄ）の両方において、抗ビメンチン標識は、ＯＮＬを介して、かつ、ごく稀に網膜下腔内に増大し（括弧、Ｄ）、抗ＢｒｄＵ標識は低く、かつ、イソレクチンＢ４標識は、網膜および網膜下腔の全体にわたって存在した。偶発的なミクログリア細胞は、抗ＢｒｄＵおよびレクチンで標識されていることがわかり得る（矢印、Ｄ）。薬物処置した剥離網膜（Ｃ、Ｄ）がまた、ビヒクル処置した剥離網膜と比較してより正常な形態を保持していることも留意すること。ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＧＣＬ、神経節細胞層。バー、５０μｍ。
【００５５】
第３日目にビヒクルを注射した眼からの剥離網膜領域において、抗ビメンチン標識（緑色）は、外境界膜（ＯＬＭ）に増大し、網膜内で、肥厚した、歪んだ外見をＭｕｌｌｅｒ細胞に与えた（図２Ａ；３日間付着した網膜＋ビヒクルと比較、図１Ｃ）。このとき、網膜下腔内でＭｕｌｌｅｒ細胞の増殖は観察されなかった。イソレクチンＢ４標識ミクログリア（青色）は、円形の外見を有し、かつ網膜全体に分散していたが、マクロファージ（青色）は、網膜下腔内でのみ観察された。ほとんどの抗ＢｒｄＵ標識Ｍｕｌｌｅｒ細胞核（赤色）は、内顆粒層（ＩＮＬ；図２Ａ）内で発生した。第７日目に、抗ビメンチン標識Ｍｕｌｌｅｒ細胞プロセスは、網膜下腔内に頻繁に増大した（括弧；図２Ｂ）。抗ＢｒｄＵ標識核（第３日目に「生まれた」）は、概して、外側網膜（すなわちＩＮＬに対して遠位）内および網膜下神経膠瘢痕内で発生した。
【００５６】
薬物処置した眼内での３日および７日間の剥離後、抗ＢｒｄＵ標識核の出現は非常に減少した（図２Ｃ、Ｄ）。抗ビメンチン標識は未剥離コントロールと比較して幾分か上昇し、かつ、Ｍｕｌｌｅｒ細胞は肥厚したように見えたが（図１Ｅ、Ｄと比較して）、それらはいずれの時点でも網膜下腔にほとんど増大しなかった；たとえ増大しても、それらは大きさが非常に小さかった（括弧、図２Ｄ）。加えて、Ｍｕｌｌｅｒ細胞は、ビヒクルを注射したコントロールの剥離で特徴的に観察された歪んだ外見および側方分枝を示さなかったが、このことはおそらく、網膜の全体的なより組織化された外見に貢献している。確実に、網膜は、剥離と関連する病理学の証拠を超えるいかなる証拠も示さなかった。最終的に、薬物処置した眼では、ミクログリアおよびマクロファージはより少なかった（図２Ｃ、Ｄ）。
【００５７】
定量化
第３日目の剥離時点では、抗ＢｒｄＵで標識したＭｕｌｌｅｒ細胞核の平均数は、ビヒクル処置したコントロールの眼において、網膜の１０．７９／ｍｍから薬物処置後の１．１９まで有意に減少した（図３）。第７日目の時点では、数は、コントロールにおける網膜の９．８３／ｍｍから薬物処置後の１．４９まで減少した（図３）。網膜下瘢痕の平均数は、コントロールにおける網膜の２．０３／ｍｍから、薬物処置における網膜の０．３９まで減少した（図４）。コントロールもしくは薬物処置した動物のいずれにおいても、３日間では瘢痕が存在しなかったので、第７日目の時点のみを定量した。コントロールの眼における第７日目の網膜下瘢痕の平均長は１３１．２８μｍであり、これは、薬物処置した眼において１１．０１μｍまで減少した（図５）。
【００５８】
特に、図３は、網膜剥離後に増殖するＭｕｌｌｅｒ細胞の数を図示する棒グラフである。抗ＢｒｄＵ標識Ｍｕｌｌｅｒ細胞の網膜１ｍｍ当たりの平均数は、コントロールの剥離と比較すると、第３日目および第７日目の剥離時点の両方において薬物処置後に有意に減少した。エラーバー、標準偏差。
【００５９】
特に、図４は、網膜剥離後の網膜下神経膠瘢痕の数を図示する棒グラフである。網膜１ｍｍ当たりの抗ビメンチン標識網膜下神経膠瘢痕の平均数は、ビヒクルで処置した網膜と比較すると、剥離の７日後の薬物処置した網膜において有意に減少した。エラーバー、標準偏差。
【００６０】
特に、図５は、網膜剥離後の網膜下神経膠瘢痕の長さを図示する棒グラフである。抗ビメンチン標識網膜下瘢痕の平均長は、ビヒクル処置した網膜と比較すると、剥離の７日後の薬物処置した網膜において有意に減少した。エラーバー、標準偏差。
【００６１】
わずかな免疫関連細胞（ミクログリアおよびマクロファージ）が、コントロールもしくは処置網膜のいずれかにＢｒｄＵを取り込み、それによってこの応答を定量したが、イソレクチンＢ４標識細胞の全数は、網膜１ｍｍ当たりで計数された。第７日目の時点では、細胞の全数は、コントロールの眼における網膜の平均値４３．９／ｍｍから、薬物処置した網膜における２４．５／ｍｍまで減少した（図６）。
【００６２】
特に、図６は、網膜剥離後の免疫関連細胞の数を図示する棒グラフである。網膜１ｍｍ当たりのイソレクチンＢ４標識マクロファージおよびミクログリアの平均数は、ビヒクル処置した網膜と比較すると、剥離の７日後の薬物処置した網膜において有意に減少した。エラーバー、標準偏差。
【００６３】
Ｍｕｌｌｅｒ細胞の抗ビメンチン標識により示されるように、外側網膜は、薬物処置した眼においてより組織化しているように見えたので（図２Ａ、Ｂを図２Ｃ、Ｄと比較のこと）、我々は、ＯＮＬの幅を測定することにより、より多くの光受容細胞が存在するかどうかを決定することを試みた。７日間の剥離の結果、ＯＮＬの平均厚みが、正常網膜における３４．４５μｍからビヒクル処置した剥離網膜における１９．４０μｍまで統計学的に有意に減少した（ｐ＜１．２７ Ｅ−１１；図７）。正常な付着網膜と比較したとき、薬物処置した剥離網膜におけるＯＮＬの厚みの２７．２１μｍへの統計学的に有意な減少（ｐ＜０．００１）もまた存在した。しかしながら、ＯＮＬの厚みは、ビヒクルで処置した剥離網膜よりも、薬物で処置した剥離網膜において有意に大きかった（２７．２１μｍ対１９．４０μｍ；ｐ＜８．８１ Ｅ−０６）が、このことは、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９が剥離後の光受容細胞に幾分かの救出効果を発揮することを示す。
【００６４】
特に、図７は、剥離後の外顆粒層（ＯＮＬ）の平均厚みを図示する棒グラフである。Ｐａｌｏｍｉｄ５２９で処置した７日間剥離した網膜におけるＯＮＬは、ビヒクルで処置した７日間剥離した網膜におけるよりも厚かったが、両剥離群におけるＯＮＬは、コントロール網膜と比較して有意に減少した。エラーバー、標準偏差。
【００６５】
網膜剥離の結果として起こり得る２つの可能性のある盲目の症状は、ＰＶＲおよび網膜下線維症であり、網膜の硝子体もしくは光受容細胞の表面での細胞膜の形成である。現在、唯一の治療は、膜の外科的除去である。しかしながら、これは、外科的介入を含み、また、第二の膜の再発は珍しくないので、多くの場合、恒久的な解決法ではない。理想的には、再付着手術時に薬理学的添加物を与えて膜の形成を防ぎ得るか、もしくはその代わりに膜の除去時に薬理学的添加物を与えて組織の連続する成長を防ぎ得るであろう。これまで、このプロセスを阻害するのに臨床的に有効であることが証明された薬理学的アプローチは存在しなかった。本発明では、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９の単回投与は、動物モデルにおいて剥離により誘発される増殖、その後のＭｕｌｌｅｒ細胞の網膜下腔への肥大および成長、ならびにミクログリアの活性化を減少させるのに有効である。加えて、薬物の眼内送達に伴う明らかな毒性はなく、かつ、実際には、ＯＮＬの厚みはＰａｌｏｍｉｄ５２９で処置した剥離網膜においてより大きかったが、このことは、光受容体への幾分かの神経保護の効果を示す。従って、この薬物は、増殖および／もしくは光受容細胞の死が構成要素である種々の関連するヒト網膜の疾患を処置するのに有用である。
【００６６】
代表的には、ＰＶＲは、望ましくない細胞増殖、細胞伝播および収縮を含む症状であると考えられている。実際に、ＰＶＲを有する患者から除去した膜では、分裂細胞が観察されてきた。しかしながら、動物モデルからのデータは、増殖に加えて、Ｍｕｌｌｅｒ細胞の増殖および肥大が、おそらく、種々の細胞型を含むより複雑な膜が成長し得る細胞の骨格を提供することにより、応答において役割を果たすことを示唆する。Ｍｕｌｌｅｒ細胞の成長および肥大は両方とも、剥離後の最初の数日以内に開始する。１週間後、増殖は低レベルまで減退するが、これらの細胞からのプロセスは、おそらくは網膜が剥離したままである限り、網膜下腔内で増大し続ける。これはまた硝子体における網膜上膜の成長についても真実である。しかしながら、硝子体表面でのＭｕｌｌｅｒ細胞の成長は、網膜の剥離ではなく再付着で開始するようである。再付着は、増殖性応答を有意に減少させるが、大きな膜が一般に再付着の数週〜数ヶ月後に観察されるので、硝子体網膜表面に沿った膜の成長は続いている。ＰＶＲおよび網膜下線維症が増殖および細胞成長の複雑な組み合わせであるという事実は、５−フルオロウラシルなどの増殖のみを標的とする薬物がなぜヒト患者における網膜上膜形成を減少させるのに有効でなかったかを説明し得る。それによりＰａｌｏｍｉｄが作用するＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路は、増殖および細胞伝播の両方を制御することが示されてきた。このことは、Ｐａｌｏｍｉｄが剥離のウサギモデルにおける増殖および網膜下神経膠症の両方を劇的に低減する機序を提供し得るが、その正確な作用機序は知られていない。分裂を受ける最も多数の細胞型が存在するので、ＰａｌｏｍｉｄはＭｕｌｌｅｒ細胞に直接的に作用すると推定される。増加した光受容体の生存へのＰａｌｏｍｉｄ５２９の効果は、直接的もしくは間接的であり得る。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路の活性化は、光が誘発する光受容体のアポトーシスを阻害することにより、網膜において神経保護効果を有し得ることが示されたが、このことは、薬物が実際に光受容体に直接的な効果を有し得ることを示す。
【００６７】
Ｐａｌｏｍｉｄ５２９は、硝子体中で少なくとも３ヶ月の想定半減期を有し、剥離後７日間の増殖および瘢痕形成への効果の観察を可能にする。５−フルオロウラシルなどの薬物の急速なクリアランスは、ＰＶＲの防止におけるその無効性に寄与し得る。網膜下瘢痕の平均数がＰａｌｏｍｉｄ５２９の添加により約４倍減少した一方、その長さは２０倍超減少した。このことは、薬物がＭｕｌｌｅｒ細胞の網膜下腔への成長を減少させただけでなく、この腔に到達するプロセスの実際の拡大もまた減少させたことを示す。このことは、網膜内のＭｕｌｌｅｒ細胞が、処置眼において分枝および蛇行がより少なく見えるという知見と相関し（図２Ｃ、Ｄ参照）、このことは、Ｐａｌｏｍｉｄの細胞増大（この場合は細胞肥大と言い換えられる）への効果の結果を示す。臨床的には、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９は、瘢痕の形成を予防し得、かつ、既に存在する瘢痕の全体的な成長を減少させ得る。最終的に、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９はまた、ミクログリア／マクロファージ応答も減少させ、また、これらの細胞は活性化されたとき高度に遊走性になるので、これもまた薬物の抗増大効果の結果であり得る。
【００６８】
要約すると、本明細書中に存在するデータは、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９が、網膜剥離により誘発される増殖および神経膠細胞成長、ならびに光受容細胞の死を低減するのに有効な薬物であることを示し、従って裂孔原性網膜剥離の修復の全体的な結果を改善するための新規な手段を表す。
【００６９】
実施例２：Ｍｕｌｌｅｒ細胞の増殖および神経膠瘢痕の形成は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤であるＰａｌｏｍｉｄ５２９を用いて、実験的網膜剥離後に低減される。
【００７０】
方法：実験的網膜剥離を、有色ウサギの右眼で作製した。５０μｌのＰＢＳ中の６００μｇのＰａｌｏｍｉｄ５２９、もしくはＰＢＳ単独を第０日目（網膜剥離直後）に硝子体内注射した。各ウサギは、第３日目に、１０μｇのＢｒｄＵを硝子体内に投与された。動物を第３日目もしくは第７日目に屠殺し、このとき、組織をパラホルムアルデヒド内に固定し、アガロース中に包埋し、１００ミクロンに切断した。切片を抗ＢｒｄＵで標識して分裂細胞を検出し、抗ビメンチンで標識してＭｕｌｌｅｒ細胞を同定した。標識をＯｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ共焦点顕微鏡で画像化し、得られたデジタル画像を分析して、増殖細胞の数ならびに網膜下神経膠瘢痕の数および長さを決定した。
【００７１】
結果：コントロールの剥離では、Ｍｕｌｌｅｒ細胞はＢｒｄＵ標識細胞の大部分を占め、かつ、これらは、網膜下腔内へと成長することにより神経膠瘢痕を形成する細胞である。データは、第３日目（図８Ａ〜８Ｆ）および第７日目（図１０Ａ〜１０Ｃ）の時点の両方における１ｍｍ当たりのＢｒｄＵ標識Ｍｕｌｌｅｒ細胞の数の統計学的に有意な減少を示す。コントロールもしくは薬物で処置した動物のいずれにおいても、第３日目の時点で神経膠瘢痕は観察されなかったが、第７日目に、網膜下瘢痕の数および大きさが有意に減少していた。
【００７２】
結論：データは、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９９が、網膜剥離のウサギモデルにおいてＭｕｌｌｅｒ細胞の増殖および神経膠瘢痕の成長の効果的な抑制因子であることを示す。従って、Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害することは、剥離により誘発される増殖を減少させるためのストラテジーであり、かつ、増殖性硝子体網膜症などの関連するヒトの疾患の新規な治療法を表す。
【００７３】
実施例３：ヒト肺線維芽細胞の分化およびそれにおけるシグナル伝達のメディエーターへのＰａｌｏｍｉｄ５２９の効果
トランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１）およびアルファ−トロンビン（α−トロンビン）は、線維性疾患の病変形成に関与することが知られている。肺線維症のインビトロモデルにおいて、ＴＧＦ−β１は、ＳＭ−アルファアクチン（ＳＭ−α−アクチン）などの収縮性平滑筋（ＳＭ）特異的タンパク質の発現により特徴付けられるヒト肺線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を刺激する。ＴＧＦ−β１はまた、ヒト肺線維芽細胞におけるＳＭ−α−アクチンの発現を刺激し、これは血清応答因子（ＳＲＦ）の発現および活性の著明な誘発と並行する。マーカーとしてのＳＭ−αアクチンによる増加した収縮性遺伝子の発現、増加したＳＲＦ、増加した結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）および増加したマトリックス遺伝子（例えば、フィブロネクチン）は、筋線維芽細胞分化の間に観察される効果の例である。筋線維芽細胞分化は、ＴＧＦ−β１での刺激により誘発され、それによって分化のマーカーを増加する。
【００７４】
Ｐａｌｏｍｉｄ５２９は、ヒト肺線維芽細胞において、ＣＴＧＦ（３０μＭのＰａｌｏｍｉｄ５２９で１８％）、ＳＲＦ（３０μＭのＰａｌｏｍｉｄ５２９で２９％）およびＳＭ−α−アクチン（３０μＭのＰａｌｏｍｉｄ５２９で６５％）のＴＧＦ−β１が刺激する増加を阻害する。図１１を参照のこと。
【００７５】
図１１は、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９のヒト肺線維芽細胞の分化の媒介因子への効果を示す。ヒト肺線維芽細胞は、ＴＧＦ−β１刺激の前に、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９で３０分間前処理した。ＣＴＧＦ、ＳＲＧ、ＳＭ−α−アクチンおよびβ−アクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロットを示す。走査ソフトウェアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて、本文中に記載の阻害率を数値計算するために、ウエスタンブロット上のバンドをデジタル化した。β−アクチンレベルは、全て互いに１１％以内であったので、いずれの試料においても有意な変化を示さなかった。
【００７６】
図１１に示すように、筋線維芽細胞の活性化は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路におけるシグナル伝達タンパク質の活性化により、少なくとも部分的に誘発される。α−トロンビンによるヒト肺線維芽細胞の刺激は、リン酸化ＡＫＴのレベルを、基底レベルのそれに対して増加させなかったが、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９は、α−トロンビンの存在下もしくは非存在下（ＡＫＴリン酸化の基底レベル）でのＡＫＴリン酸化の両方を１５％減少することができた。ＴＧＦ−β１は、ＡＫＴリン酸化を、基底レベルに対して１９％刺激することが示されている。Ｐａｌｏｍｉｄ５２９は、ＴＧＦ−β１により刺激されるＡＫＴのリン酸化を２７％阻害した（ＡＫＴリン酸化の基底レベルを１３％含む、図１２参照）。
【００７７】
図１２は、ヒト肺線維芽細胞におけるＰａｌｏｍｉｄ５２９のシグナル伝達への効果を示す。ヒト肺線維芽細胞を、３０μＭのＰａｌｏｍｉｄ５２９の存在下、ＴＧＦ−β１もしくはα−トロンビンのいずれかで１時間刺激して、シグナル伝達タンパク質を活性化させる。ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）およびＡＫＴレベルは、ウエスタンブロットにより測定する。走査ソフトウェアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて、本文中に記載の阻害率を数値計算するために、ウエスタンブロット上のバンドをデジタル化した。ＡＫＴレベルは、全て互いに１０％以内であったので、いずれの試料においても有意な変化を示さなかった。
【図１】
2015038092.tif 000013
【図２】
2015038092.tif 000014
【図３】
2015038092.tif 000015
【図４】
2015038092.tif 000016
【図５】
2015038092.tif 000017
【図６】
2015038092.tif 000018
【図７】
2015038092.tif 000019
【図８】
2015038092.tif 000020
【図９】
2015038092.tif 000021
【図１０】
2015038092.tif 000022
【図１１】
2015038092.tif 000023
【図１２】
2015038092.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月5日(2014.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2015038092.tif 000025
［式中、
Ｒ１は、Ｈもしくはアルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アミノ、Ｏ−ヘテロシクリル、Ｏ−アリール、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３、ＯＳＯ２ＮＨ２もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールである）であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−ＣＨ２アリール、Ｏ−ＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アシルもしくはニトロであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ５は、Ｈ、オキソ、アリール、ヒドロキシル、アルキルもしくはＯ−アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈであり；
Ｒ７は、Ｈ、アシル、アルキル、Ｏ−アルキル、置換アルキル（該置換は、ヒドロキシルもしくはスルファモイルである）もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、Ｏ−ＰＯ３もしくはＯＳＯ３である）であり；
Ｒ８は、Ｈであり；かつ
Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳである］、
式ＩＩ
【化２】
2015038092.tif 000026
［式中、
Ｒ１は、Ｈもしくはアルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｏ−アルキル、ＯＨ、アミノ、Ｏ−ヘテロシクリル、Ｏ−アリール、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３、ＯＳＯ２ＮＨ２もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールである）であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｏ−アシル、ニトロもしくはＯ−置換アルキル（該置換は、アリールもしくはヘテロアリールである）であり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアリールもしくは置換アルキルであり；かつ
Ｒ６は、Ｈ、アルキルもしくはアリールである］、
式ＩＩＩ
【化３】
2015038092.tif 000027
［式中、
Ｒ１は、アルキルもしくはＨであり；
Ｒ２は、アルキルもしくはＨであり；
Ｒ３は、アセチルであり；かつ
Ｒ４は、Ｈもしくはアルキルである］、
式ＩＶ
【化４】
2015038092.tif 000028
［式中、
Ｒ１は、ＨもしくはＦであり；
Ｒ２は、Ｈもしくはニトロであり；
Ｒ３は、Ｈであり；
Ｒ４は、Ｈであり；かつ
Ｒ５は、アルキル、置換アルキルもしくはアリールである］、
【化５】
2015038092.tif 000029
、および、それらの医薬上許容され得る塩からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、望まれない細胞外基質形成により特徴付けられる疾患の予防剤または処置剤。
【請求項２】
前記化合物が、式Ｉ
【化６】
2015038092.tif 000030
［式中、
Ｒ１は、Ｈもしくはアルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アミノ、Ｏ−ヘテロシクリル、Ｏ−アリール、Ｏ−Ａｃ、Ｏ−ＰＯ３、Ｏ−ＳＯ３、ＯＳＯ２ＮＨ２もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールである）であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−ＣＨ２アリール、Ｏ−ＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アシルもしくはニトロであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、ＣＨ２アリール、置換アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＣＨ２アリール、ＯＣＨ２ヘテロアリール、Ｏ−アシル、ＯＰＯ３、ＯＳＯ３もしくはＯＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ５は、Ｈ、オキソ、アリール、ヒドロキシル、アルキルもしくはＯ−アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈであり；
Ｒ７は、Ｈ、アシル、アルキル、Ｏ−アルキル、置換アルキル（該置換は、ヒドロキシルもしくはスルファモイルである）もしくはＯ−置換アルキル（該置換は、Ｏ−ＰＯ３もしくはＯＳＯ３である）であり；
Ｒ８は、Ｈであり；かつ
Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳである］
またはその医薬上許容され得る塩である、請求項１に記載の予防剤または処置剤。
【請求項３】
前記化合物が、
【化７】
2015038092.tif 000031
またはその医薬上許容され得る塩である、請求項１に記載の予防剤または処置剤。
【請求項４】
前記化合物が、
【化８】
2015038092.tif 000032
である、請求項１に記載の予防剤または処置剤。
【請求項５】
許容され得る送達ビヒクルをさらに含む、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の予防剤または処置剤。
【請求項６】
前記疾患が、線維性障害である、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の予防剤または処置剤。
【請求項７】
前記線維性障害が、肺線維症、全身性硬化症、強皮症、増殖性硝子体網膜症、肝硬変、膵臓および肺の嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、注射線維症、糸球体間質性障害、びまん性実質性肺疾患、精管切除後疼痛症候群、結核、鎌状赤血球貧血により引き起こされる脾臓線維症および関節リウマチからなる群から選択される、請求項６に記載の予防剤または処置剤。
【請求項８】
前記糸球体間質性障害が、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症候群、移植片拒絶および糸球体症からなる群から選択される、請求項７に記載の予防剤または処置剤。
【請求項９】
局所、経口、経鼻、経直腸または非経口投与用の、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の予防剤または処置剤。
【請求項１０】
移植物に付随する、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の予防剤または処置剤。
【請求項１１】
装置に付随する、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の予防剤または処置剤。
【外国語明細書】
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