(57)【要約】  組織増加用架橋ゼラチンヒドロゲル。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性組織増加用組成物であって、当該組成物は架橋組換えゼラチン様蛋白質および架橋ヒアルロン酸を含み、組換えゼラチン様蛋白質はホモ三量体構造またはヘテロ三量体構造を有さず、組換えゼラチン様蛋白質とヒアルロン酸との質量比が６０：４０〜５：９５の範囲であり、インビボで、該組成物の分解時間が少なくとも１ヶ月である、上記生体適合性組織増加用組成物
【請求項２】
組換えゼラチン様蛋白質が、架橋前に少なくとも０．３ミリモル／ｇリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を含み、架橋後少なくとも０．１５ミリモル／ｇ遊離アミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組換えゼラチン様蛋白質がヒドロキシル化アミノ酸残基を含まない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組換えゼラチン様蛋白質が少なくとも１のＲＧＤモチーフを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
組換えゼラチン様蛋白質対ヒアルロン酸の全質量比が少なくとも１０：９０である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
架橋組換えゼラチン様蛋白質画分が、ヒアルロン酸画分よりもインビボ分解時間が高い、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が二相であり、一方相が架橋組換えゼラチン様蛋白質を含み、他相が架橋ヒアルロン酸を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の製造法であって：
（ａ）ヒアルロン酸組成物を架橋してヒドロゲルを与えること；
（ｂ）ゼラチンとゼラチン架橋剤とを含む溶液を得られたヒアルロン酸ヒドロゲルに加えること；
（ｃ）ヒドロゲルとゼラチンおよびゼラチン架橋剤溶液とを混合すること；そして
（ｄ）得られた混合物を架橋させ、二相ヒドロゲルを形成させること
を含む前記方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の皮膚充填剤としての使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の限局性線維芽細胞誘引剤としての使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の自己コラーゲン沈着を誘導するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の組織増加過程に適した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、皮下注射もしくは皮内注射による軟組織増加用組成物に関する。本発明の組成物は、修復手術もしくは形成外科におけるおよび美容皮膚学における、しわ、小じわ、皮膚ひび割れ、ニキビ跡およびその他の傷跡の充填のため、ならびに歯科における歯肉の充填のためにヒトに使用する目的がある。今日まで、多くの製品がこの目的のために使用されてきた。これらの製品は２グループに分けることができる。１グループはいわゆる永久組織増加材料であり、もう１グループは暫定的組織増加材料である。永久組織増加材料は、人体内部で分解しない生体適合性ポリマーを含む。このような製品の例は、シリコーンゲル（もしくはシリコーンオイル）やポリテトラフルオロエチレン粒子である。しかし、これらの永久組織増加材料は、慢性炎症、肉芽腫の形成や、さらに遅発性アレルギー反応に関連する。これらの永久組織増加材料は生分解性でないので、当該材料はしばしば肝臓内に見出される。一方、暫定的組織増加材料は、究極的に人体内で分解する生体適合性ポリマーを含む。生体適合性ポリマーの分解速度に応じて、美容的効果を維持するために、これらの処理を３〜１２ヶ月内に繰り返さなければならない。組織増加材料のこのグループでは、数種の異なるバイオポリマーを使用する。コラーゲン懸濁液を使用してきた。しかし、コラーゲンは１〜６ヶ月内に再吸収されるので、全く期待はずれの結果を示した。さらにアレルギー反応も、患者の約２％に認められた。使用されるコラーゲンは、しばしば、子牛源であり、アレルギー応答の可能性およびプリオン関連症状の見地から医学的リスクをもたらす。コラーゲンの使用に代わる別のバイオポリマーはヒアルロン酸であり、通常架橋されている。現在、６種のヒアルロン酸系組織増加製品がＦＤＡで承認され、米国で市場化されている。それらは、ＲｅｓｔｙｌａｎｅＲ（Ｍｅｄｉｃｉｓ，  Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）、ＰｅｒｌａｎｅＲ（Ｍｅｄｉｃｉｓ，Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）、Ｐｒｅｖｅｌｌ  ＳｉｌｋＲ（Ｍｅｎｔｏｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）、Ｈｙｌａｆｏｒｍ  ＰｌｕｓＲ（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、ＡｎｉｋａＲ（Ａｎｉｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＡ）、およびＪｕｖｅｄｅｒｍＲ（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）である（表１）。ＪｕｖｅｄｅｒｍＲ（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）は、ＨｙｄｒａｆｉｌｌＲとしても知られているが、重症顔面皺や襞に対して穏やかな修正のため２００６年６月にＦＤＡにより承認された。Ｊｕｖｅｄｅｒｍ充填剤は２００３年以来欧州各国やカナダで市場化されている（Ｃｏｒｎｅａｌ  ＣｒｏｕｐおよびＡｌｌｅｒｇａｎ（以前Ｉｎａｍｅｄ）によりＪｕｖｅｄｅｒｍとして市場化され、いくらかの国ではＡｌｌｅｒｇａｎ（以前Ｉｎａｍｅｄ）によりＨｙｄｒａ  ＦｉｌｌＲとして市場化された）。
【０００３】
種々のヒアルロン酸系組織増加製品を区別する特徴は、粒径、使用した架橋剤の種類、架橋程度、架橋したヒアルロン酸の割合、存在する遊離（未修正）ヒアルロン酸およびＧ’（弾性率）である。これら物理的および化学的特性のすべては、臨床的適応、注射の容易性、組織充填程度、寿命、臨床的所見、および副作用のような充填剤の臨床的特徴に影響を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、炎症やその他の望ましくない副作用のない充填作用の改良した寿命を与えることにより、現存製品の欠点を解消することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は押出可能で生体適合性組織増加用組成物に関し、当該組成物は架橋組換えゼラチン様蛋白質および架橋ヒアルロン酸を含み、組換えゼラチン様蛋白質はホモ三量体構造またはヘテロ三量体構造を有さず、組換えゼラチン様蛋白質とヒアルロン酸との質量比が６０：４０〜５：９５の範囲であり、インビボで、組成物の分解時間が少なくとも１ヶ月である。
【０００６】
一般的定義
「含む “comprising” 」という用語は、記載した部分、工程または成分の存在を特定すると解釈すべきであるが、一以上の追加の部分、工程または成分を排除しない。
【０００７】
不定冠詞 “a” や “an” により要素への言及は、一つの若しくは一つのみの要素であることを明らかに要求する文脈でない限り、二以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞 “a” や “an” は、通常、「少なくとも一つ」を意味する。
【０００８】
「増加」という用語は、本明細書中では、本発明の組成物を用いて組織を与える、供給する、増加する、または置き換えることにより、組織の損失または不存在により起因する少なくとも１種の症状、または欠陥の修復、減少、減退または軽減を意味するのに使用される。
【０００９】
「組織増加」という用語は、本明細書中では、下記の皮膚組織増加；皺（ｌｉｎｅｓ、ｆｏｌｄｓ、ｗｒｉｎｋｌｅｓ）、わずかな顔面くぼみ、口唇裂等の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）（特に、顔面や首）；老化または疾病による少しの奇形の矯正（手、脚、指およびつま先を含む）；会話のリハビリのための声帯声門の増殖；睡眠線（ｓｌｅｅｐ  ｌｉｎｅｓ）および表情線（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｎｅｓ）の皮膚充填；老化による皮膚および皮下組織損失の置換；唇増加；目尻の皺および眼の周りの輪状溝（ｏｒｂｉｔａｌ  ｇｒｏｏｖｅ）；胸部増加；顎増加；頬および鼻の増加；尿道周囲支持体（ｐｅｒｉｕｒｅｔｈｒａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ）の増量剤、例えば、過剰吸引やその他の外傷による軟質組織、皮膚もしくは皮下組織のへこみの充填；アクネもしくは傷跡および外傷性皺の充填；鼻唇間線、鼻眉間線および口下線の充填等があるが、これらに限定されない。さらに、本発明は硬質組織増加にも向けることができる。「硬質組織」という用語は、骨、軟骨および靱帯を含むがこれらに限定されない。
【００１０】
「蛋白質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、交換可能に使用され、アミノ酸類の鎖からなる分子に言及し、作用、サイズ、三次元構造や起源の特定のものへの言及ではない。
【００１１】
本明細書中で使用する「ゼラチン」および「ゼラチン様蛋白質」という用語は、起源が、伝統的な方法による抽出または組み換えまたは生合成のいずれかのゼラチン、あるいはゼラチンの少なくとも一構造および／または機能的特性を有するいずれかの分子に言及する。この用語は、ゼラチン製品中に含まれる二種以上のポリペプチドからなる組成物、ならびにゼラチン材料に寄与する個々のポリペプチドの双方を包含する。したがって、本発明に関連して使用されるゼラチンという用語は、ゼラチンポリペプチドならびに個々のゼラチンポリペプチドを含む双方のゼラチンを包含する。ゼラチンを誘導できるポリペプチドは、コラーゲン、プロコラーゲンならびにコラーゲンの少なくとも一つの構造的および／または機能的特性を有するその他のポリペプチドのようなポリペプチドである。このようなポリペプチドはシングルコラーゲン鎖、またはコラーゲンホモ三量体もしくはヘテロ三量体、あるいはいずれかのフラグメント、誘導体、オリゴマー、ポリマー、あるいはそのサブユニットを含有でき、少なくとも一つのコラーゲン様ドメイン（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ領域）を含有できる。「組換えゼラチン−様蛋白質」という用語は、特に、天然で見出されていない人工配列、例えば、改変コラーゲン配列、例えば、天然コラーゲン配列から、削除、追加、置換、またはその他の変更により改変した配列であるものを意図する。このような配列は、例えば、適切な改変コラーゲンポリヌクレオチド構造等から得ることができる。
【００１２】
明細書中で記載する「架橋剤」という用語は、架橋結合剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）を含む組成物を意味する。本明細書で使用する「架橋結合剤」は、有機分子における分子内および分子間共有架橋を導入することができる反応性化学化合物を意味する。
【００１３】
「ヒドロゲル」は、相当量の水を含むポリマー鎖のネットワークを意味する。用途に依存して、すなわち、活性剤の所望の放出プロフィールおよびヒドロゲルにかけられる機械的応力に依存して、幾つかのタイプのヒドロゲルを使用できる。例えば、４０〜６０％の水を含む非常に剛性で非弾性ヒドロゲル、６０〜８５％の水を含む弾性であるがなお剛性のヒドロゲル、および８５〜９９％の水を含有する軟質で非常に弾性のヒドロゲルである。
【００１４】
「ゲル強度」はヒドロゲルを変形させるのに必要な力と定義され、いわゆる貯蔵弾性率Ｇ’（単位パスカル：Ｐａ）で表現される。ヒドロゲルのゲル強度は、レオメーターにより測定できる。ゲル強度は、ヒドロゲルが弾性的変形ばかりでなく、変形の結果として破壊もしくは再構成もあり得るので、変形の程度に依存する。したがって、ゲル強度の測定は、通常、ゲルの顕微鏡的組織の破壊のなくヒドロゲルを無傷に保つために小振動を用いる振動モードで行われる。
【００１５】
「押出可能」は、塗布領域にデバイスからヒドロゲルを放出できると定義される。明らかに、押出可能であるために、材料は変形でき流動性でなければならない。適切な注射装置を使用して治療のために必要な患者にヒドロゲルを施用するとき、ヒドロゲルはいわゆる注射可能である。例えば、微細な針を具えた注射器またはアプリケーターチップを使用できる。小さな顔面皺を充填するのに２０〜３０ゲージの針が有用である。
【００１６】
インビボ分解時間は、生体内で組成物の少なくとも９０％が分解される時間である。したがって、埋め込み後に存在するものに比較して、少なくとも９０％の材料が最初の組成物としてもはや確認できない。インビボ分解時間は、組成物そのものの分解または個々の成分の分解のいずれかを意味する。
【００１７】
ヒドロゲルは、それらの組成に関して区別し得るよく分離した２種のゲルから成るとき二相と呼ばれる。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
発明者等は、架橋した組換えゼラチン様蛋白質および架橋ヒアルロン酸の混合物を含む組成物が少なくとも１ヶ月、例えば、皮膚充填として使用するような組織増加用途に有効であることを驚いたことに見出した。ここで、これらの二種間の質量比が特定の範囲内およびインビボ分解時間を構成する。理論に拘束されないが、身体により容易に吸収される、組換えゼラチン様蛋白質と、生体吸収に対してより影響の受けにくいヒアルロン酸との組み合わせ使用が、注射された材料中で線維芽細胞の活性引力および線維芽細胞内部成長をもたらすと、発明者等は確信する。これらの線維芽細胞は、組成物の充填作用を助け且つ持続させる自己コラーゲンを沈着する。
【００１９】
好ましくは、本発明組成物の弾性率Ｇ’は少なくとも５０Ｐａ、およびより好ましくはＧ’は少なくとも１００Ｐａであり、増加領域の可能性のある堅さおよび周囲の組織に対する材料の分布に悪影響を与えることなく当該組成物を注射可能にする。
【００２０】
本発明の組成物のゲル強度Ｇ’は少なくとも１００Ｐａであり、インビボ分解時間は少なくとも３ヶ月である。
本発明の組成物は組換えゼラチン様蛋白質を含む。ここで、ゼラチン様とは、蛋白質の配列がＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ（ＸａａおよびＹａａはいずれのアミノ酸であってもよい）からなる配列を残す変性を含有でき、無傷ではないが、ゼラチンの構造的および機能的特性に、特に生物学的適合性に影響を与えない。
【００２１】
組換えゼラチンの使用は、動物源由来の慣用的製造ゼラチンに比べて医学的利点を有する。安全の問題、例えば、潜在的免疫源（例；抗原反応やアレルギー反応）に関する問題をもたらす。天然由来ゼラチン混合物を完全に特性化し、精製し、または成功裡に再生成することができないことも、医薬業界で進行中の関心事である。抽出および精製工程からの細菌汚染やエンドトキシン負荷に関しても追加の安全面での関心がある。
【００２２】
組み換え技術は、例えば、低免疫原性、改良した細胞接着および／または制御した生分解性のような優れた特性を示すゼラチン様蛋白質の設計を可能にする。EP 0926543、EP 1014176およびWO 01/34646号公報、特に、EP 0926543およびEP 1014176号公報は、メチロトローフィック酵母、特に、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用する組換えゼラチンおよびその生成方法を記載する。
【００２３】
組換えゼラチンの別の重要な利点は、一定の所望特性を創生するためにアミノ酸配列を操作することができることである。これらの特性の例は、（ｉ）架橋可能なアミノ酸の量（例えば、（ヒドロキシ）リシンの量）、（ｉｉ）グリコシレーションパターン（例えば、一定の三量体中のトレオニンおよび／またはセリンアミノ酸の不存在はグリコシレーションの不存在をもたらす）、（ｉｉｉ）組換えゼラチンのサイズ、（ｉｖ）組換えゼラチンの電荷密度を補正できる（例えば、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｄ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸のような荷電アミノ酸を導入したり、除外したりできる）、または（ｖ）生分解性をメタロプロテアーゼの分裂サイトの存在もしくは不存在により補正できる等である。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、組換えゼラチン様蛋白質がさらにＲＧＤモチーフに富んだ組換えゼラチン様蛋白質を含む組成物を提供する。本発明との関係でＲＧＤ−富化ゼラチンはＷＯ０４／０８５４７３号およびＷＯ０８／１０３０４１号に記載されており、当該特許文献を参照のため本明細書に含める。
【００２５】
組換えゼラチン様蛋白質において、好ましくは、アミノ酸の総数に関連したＲＧＤモチーフの割合は、少なくとも０．４であり、ＲＧＤ富化ゼラチンが３５０個のアミノ酸を含む場合、３５０アミノ酸の各ストレッチは少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含有する。
【００２６】
したがって、本発明の組成物では、好ましくは、組換えゼラチン様蛋白質は少なくとも一つのＲＧＤモチーフを含む。
別の好適実施態様では、組換えゼラチン様蛋白質は、ヒドロキシプロリン残基を有しない。プロリンのヒドロキシル化は、コラーゲンのホモ−もしくはヘテロ−三量体螺旋の形成に必要であり、ゼラチンのゲル化において役割を果たし、現発明の組成物に望ましくない特徴である。特に、１０％未満、より好ましくは５％未満の組換えゼラチン様蛋白質のアミノ酸残基はヒドロキシプロリンである。好ましくは、組換えゼラチン様蛋白質はヒドロキシプロリンを含まない。ヒドロキシプロリンを含まない組換えゼラチンのＷＯ０２／０７００００Ａ１に記載されている別の利点は、天然ゼラチンと対照的に、ＩｇＥに関連する免疫反応を示さないことである。本発明の組成物では、組換えゼラチン様蛋白質がヒドロキシル化アミノ酸残基を含まないことも好適である。
【００２７】
別の好適な実施態様では、組換えゼラチン様蛋白質は、細胞結合を増強するためおよび／またはEP1608681およびEP1368056（これらを参照として本明細書に含める）に開示されているもののような可及的に少ない免疫原性を備える機能化組換えゼラチン様蛋白質を含む。上述したように、組換えゼラチン様蛋白質の重要な一特性は、架橋可能なアミノ酸の量、例えば、（ヒドロキシ）リジン基の量およびアスパラギン酸やグルタミン酸から誘導されるカルボン酸の量のようなものである。
【００２８】
好適な実施態様では、本発明は、組換えゼラチン様蛋白質が、架橋前少なくとも０．３０ミリモル／ｇ、より好ましくは、少なくとも０．４０ミリモル／ｇ、特に少なくとも０．６０ミリモル／ｇ、そして、特に好ましくは０．８０ミリモル／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン（好ましくはリシン）残基を含む組成物を提供する。より好ましくは、本発明は、架橋前、少なくとも０．３０ミリモルリシン／ｇおよび／またはヒドロキシリシン（好ましくはリシン）残基、および架橋後、少なくとも０．１５ミリモル／ｇ遊離アミン基を含む組成物を提供する。
【００２９】
さらに別の実施態様では本発明の組成物で使用する組換えゼラチン様蛋白質は５を超える、好ましくは６を超える、そして最も好ましくは７を超える等電点示す組換えゼラチンである。本発明の目的は、生理学的条件下で正味の正電荷を持つゼラチン様蛋白質を提供することである。理論に束縛されるものではないが、本発明の組成物中のこの正電荷組換えゼラチン様蛋白質は、細胞（全体的に負電荷膜を有する）の引力、相互作用および結合を助けると考えられる。これは、組織増加において利点のある特徴である。
【００３０】
別の実施態様は、少なくとも２５ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも３５ｋＤａ、そして最も好ましくは、少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する、本発明の組成物に使用する組換えゼラチン様蛋白質を提供する。
【００３１】
組換えゼラチン様蛋白質は、当業者に周知であるような架橋剤および架橋技術を使用して架橋することができる。
適切な架橋剤には、例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのようなアルデヒド化合物、カルボジイミド、ジ−アルデヒドジイソシアネート、例えば、ジアセチルやクロロペンタンジオンのようなケトン化合物、ビス（２−クロロエチルウレア）、２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン、米国特許第３，２８８，７７５号明細書に開示されている反応性ハロゲン含有化合物、ピリジン環が、米国特許第４，０６３，９５２号や同第５，５２９，８９２号明細書に開示されているサルフェートまたはアルキルサルフェート基を持つカルバモイルピリジニウム化合物、ジビニルスルホン等、ならびに、例えば、２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−ｓ−トリアジンのようなＳ−トリアジン誘導体等がある。好適な実施態様では、本発明の組成物の架橋組換えゼラチン様蛋白質は、水溶性カルボジイミドで架橋することにより形成される。さらにより好適な実施態様では、架橋組換えゼラチン様蛋白質は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＥＤＡＣ）を使用して架橋する。架橋反応条件は、使用される架橋剤に依存して変動し、当業者に周知である。
【００３２】
架橋組換えゼラチン様蛋白質は、２以上の形態の組換えゼラチン様蛋白質を架橋することにより形成することもできる。
好ましくは、少なくとも５０％（重量）の架橋組換えゼラチン様蛋白質は、少なくとも１のＲＧＤモチーフを含み、より好ましくは、少なくとも７０％（重量）の架橋組換えゼラチン様蛋白質は、少なくとも１のＲＧＤモチーフを含み、少なくとも９０％（重量）の架橋組換えゼラチン様蛋白質が少なくとも１のＲＧＤモチーフを含むのが特に好適である。
【００３３】
本発明の組成物の特徴は、組織増加のための非生分解性組成物が肉芽腫の発現をもたらすので、使用されるゼラチンが生分解性であるべきである。さらに、生分解性は、組織の再生において別の重要な刺激因子である。先験的に組換えゼラチン様蛋白質は、天然ゼラチンの分解をもたらすのと同じメカニズムかどうかは明らかでない。天然ゼラチンおよびコラーゲンがヒト体内でプロテアーゼ、より特定的にはマトリックス−メタロプロテインナーゼ（ＭＭＰ）により分解されることは知られている。マトリックス−メタロプロテインナーゼ（ＭＭＰ）は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。ＭＭＰ’ｓはメトジンシン科（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）として知られているプロテアーゼの上科に属する。集合的に、これらのプロテアーゼは総ての種類の細胞外マトリックス蛋白質を分解できるが、しかし、多くの生物活性分も処理できる。ＭＭＰ’ｓの重要なグループはコラゲナーゼである。これらのＭＭＰ’ｓは、３重らせん線維コラーゲンを特有の３／４および１／４フラグメントに分解できる。これらのコラーゲンは骨や軟骨の主要成分であり、ＭＭＰ’ｓはコラーゲンを分解できる唯一の公知のほ乳類酵素である。伝統的に、コラゲナーゼは、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）およびＭＭＰ−１８（コラゲナーゼ４）である。ＭＭＰ’ｓの別の重要なグループは、ゼラチナーゼにより形成される。これらのＭＭＰ’ｓの主要基質は、タイプＩＶコラーゲンおよびゼラチンであり、これらの酵素は触媒ドメイン中に挿入された追加のドメインの存在により区別される。このゼラチン結合領域は、亜鉛結合モチーフ直前に位置し、触媒ドメインの構造を崩壊させない別の折りたたみ単位を形成する。このサブグループの２メンバーはＭＭＰ−２（７２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ａ）およびＭＭＰ−９（９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ｂ）である。しかし、国際特許出願ＷＯ／２００８１０３０４５号公報は、ＭＭＰの公知の開裂部位を含まない組み換えゼラチンがヒトマトリックスメタロプロテナーゼ１（ＭＭＰ１）による酵素的分解性であったことを開示する（参照として明細書中に含める）。予測されるより明らかに多くの種類の組み換えゼラチンが分解されうる。したがって、架橋組み換えゼラチン様蛋白質を含む組成物は、分解するにつれて、先ず自家移植性細胞外マトリックスにより徐々に置き換えられる細胞足場機能を与える組成物に望ましい漸次生分解性要求を発揮し得る。
【００３４】
ヒアルロン酸すなわちヒアルロナンは、天然由来線状ポリサッカライドである。ヒアルロナンは皮膚組織、結合組織、上皮組織、および神経組織に見出すことができる。それは総ての隙間に遍在し、該組織は、注射前皮膚アレルギー試験を必要とせず、組織増加に使用するのに非常に都合良い。このグリコサミノグリカンは、水中その容積の１，０００倍結合能力を示し、皮膚に容積を加えるのに完全な物質である。ヒトにおいて、皮膚中の天然由来ヒアルロン酸の量は年齢と共に少なくなり、組織弾性および水和の減少をもたらす、老化特徴や皺形成の進行に重要な役割を果たす。ヒアルロン酸は、例えば、雄鶏トサカのような動物誘導軟膏組織から単離し精製できる。しかし、好ましくは、ヒアルロン酸成分は例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のような、ヒアルロン酸を生成する微生物の発酵により生成される。さらに好ましくは、ヒアルロン酸は、組換えヒアルロン酸シンターゼを発現する遺伝子技術である適切な微生物の発酵により生成される。
【００３５】
未修正天然ヒアルロン酸の半減期はおおよそ２４時間であり、その後、酵素により分解され、肝臓中で副成物、水、二酸化炭素に代謝される。皮膚中では、ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼによりおよびフリーラジカルにより分解される。
【００３６】
ヒアルロン酸は架橋剤および当業者に周知であるような技術を使用して架橋することができる。適切な架橋剤には：例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのようなアルデヒド、カルボジイミド、ジ−アルデヒドジイソシアネート、例えば、ジアセチルやクロロペンタンジオンのようなケトン、ビス（２−クロロエチルウレア）、２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン、米国特許第３，２８８，７７５号明細書に開示されている反応性ハロゲン含有化合物、ピリジン環が、米国特許第４，０６３，９５２号や同第５，５２９，８９２号明細書に開示されているサルフェートまたはアルキルサルフェート基を持つカルバモイルピリジニウム化合物、ジビニルスルホン等、ならびに、例えば、２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−ｓ−トリアジンのようなＳ−トリアジン誘導体等がある。
【００３７】
好適な実施態様では、ヒアルロン酸は１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）により架橋される。
ゼラチンおよびヒアルロン酸を架橋前に混合できる。しかし、好ましくは、ヒアルロン酸を、ゼラチン成分と混合する前に架橋する。
【００３８】
本発明の組成物では、架橋組換えゼラチン様蛋白質画分は、架橋ヒアルロン酸画分よりもインビボでより高い分解性を示す。
本発明の組成物では、好ましくは、組換えゼラチン様蛋白質対ヒアルロン酸の全体質量比は、３０：７０〜５：９５の範囲、より好ましくは、２０：８０〜５：９５の範囲、そしてさらにより好ましくは、少なくとも１０：９０の比である。
【００３９】
本発明の組成物は均一であること（すなわち、ゼラチンとヒアルロン酸との双方が分子レベルで混合される）ができ、あるいは不均一であることができる。さらに好ましくは、識別することができる組成物により特徴とされる二相またはそれ以上の相を含む不均一性組成物である。このような不均一組成物の例は、ヒアルロン酸ヒドロゲル連続体中の組換えゼラチン様蛋白質ヒドロゲル粒子である。別の例は、互いに結合したヒアルロン酸相および互いに連結したゼラチン含有層が互いに混合した二連続構造である。さらに別の例は、ヒアルロンヒドロゲル酸相と混合した、均一または不均一ゼラチン−ヒアルロン酸ヒドロゲル相である。識別し得る相自体は、純粋な組換えゼラチン様蛋白質またはヒアルロン酸から構成することができるが、組換えゼラチン様蛋白質およびヒアルロン酸の均一または不均一混合物であることもできる。種々の相の混合比は、線維芽細胞活性および生分解性に関して、ヒドロゲル全体の所望の機能特性に依存して変動できる。
【００４０】
好ましくは、本発明の組成物は二相であり、一相は架橋組換えゼラチン様蛋白質を含み、他相は、架橋ヒアルロン酸を含む。
本発明の第２の態様は、本発明の第１態様の生体適合性組成物を製造する方法を提供する。
【００４１】
好ましくは、本発明の第１態様組成物は：
（ａ）ヒアルロン酸を架橋してヒドロゲルを与えること；
（ｂ）ゼラチンとゼラチン架橋剤とを含む溶液を得られたヒアルロン酸ヒドロゲルに加えること；
（ｃ）ヒドロゲルとゼラチンおよびゼラチン架橋剤とを混合すること；
（ｄ）得られた混合物を架橋させ、二相ヒドロゲルを形成させること
を含む方法を使用して製造する。
【００４２】
本発明の第３態様は、組織増加のための本発明の第１態様で記載した組成物の使用を提供する。好ましくは、本発明の第１態様で記載した組成物は、組織増加用の医薬の製造のために使用する。
【００４３】
本発明の第４態様は、皮膚充填剤として本発明の第１態様で記載した組成物の使用を提供する。好ましくは、本発明の第１態様で記載した組成物は、皮膚充填剤として使用するための医薬の製造のために使用する。
【００４４】
本発明の第５態様は、インビボ自己細胞外マトリックス沈着の限局性線維芽細胞誘引剤として本発明の第１態様で記載した組成物の使用を提供する。好ましくは、本発明の第１態様で記載した組成物は、インビボ自己細胞外マトリックス沈着の限局性線維芽細胞誘引剤および誘導剤として使用するための医薬の製造のために使用する。
【００４５】
本発明の第６態様は、自己コラーゲン沈着を誘導するために本発明の第１態様で記載した組成物の使用を提供する。好ましくは、本発明の第１態様で記載した組成物は、自己コラーゲン沈着を誘導するための医薬の製造のために使用する。
【００４６】
本発明により製造した組成物は、例えば、皮膚襞(fold)増加、軟組織割れ目(void)充填ブレブ(bleb)創造、尿失禁治療用尿道括約筋増加、一側性声帯襞麻痺治療、および胃食道逆流症の治療のようなその他の組織増加応用に使用するための用途を見出すこともできる。幾つかの実施態様では、現在記載されている生体適合性組成物は骨割れ目充填として作用し得る。
【００４７】
本発明を下記の非制限的実施例によりさらに詳細に説明をする。実施例中、特に別記しない限り総ての部および百分率は重量である。
【実施例】
【００４８】
組み換えゼラチン様蛋白質／ＨＡゲルの製造
低バイオバーデンを確実にするために、総てのゲルおよび溶液を層流キャビネット中で調製した。溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、ガラス製品を使用前オートクレーブ中に入れた。
【００４９】
ゲル１、２および３は架橋精製ヒアルロン酸（ＨＡ）ゲルだった。ゲル１は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ、Ｆｌｕｋａ）を使用して１％水酸化ナトリウム中の１０％ＨＡ溶液（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ  ｓｐ．Ｆｕｌｋａ＃１３５１０５８由来のヒアルロン酸塩）を架橋することにより得た。ＢＤＤＥは、０．５μモルＢＤＤＥ／ｇＨＡで使用した。ゲルを室温で２４時間架橋した。１Ｍ塩酸を用いて中和させた後、ゲルを、ｐＨ７．４リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液で２．６％に稀釈し、４８時間リン酸ナトリウム生理食塩水に対して透析した。最後に、ゲルを、ミクロナイザーを使用してつぶした（ＩＫＡ、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５）。
【００５０】
ゲル２および３は、０．４２μモルＢＤＤＥ／ｇＨＡを使用して１２％ＨＡ溶液から出発することにより得た。ゲル２は微細化しなかったが、ゲル３は、調製後微細化した。
組み換えゼラチン様蛋白質として、国際特許出願ＷＯ２００８１０３０４１に記載された通りにして製造した組み換えゼラチンＣＢＥ３を使用した（当該特許文献を参照として本明細書に含める）。組み換えゼラチン様蛋白質／ヒアルロン酸（ＲＧ／ＨＡ）混合ゲル(ゲル４および５）を得るために、精製ＣＢＥ３溶液を、次のようにしてＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）により別々に架橋した。１０％ＣＢＥ３溶液から出発して組み換えゼラチンゲルを調製し、２．０ミリモルＥＤＣ／ＲＧによりｐＨ４．７で架橋した。ゲル５について、より固いゲルを２０％ＣＢＥ３溶液から出発して調製し、５．３μモルＥＤＣ／ＲＧによりｐＨ４．７で架橋した。双方のゲルを２４時間架橋させ、続いて、粒子が２．５Ｇ注射針を通るに足る小ささまで微細化するまでつぶした（メタノール中で測定した粒径は２００−２５０μｍ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ型）。つぶしたＲＧゲルを２４時間リン酸塩緩衝液に対して透析し、それぞれ２．０％ＲＧおよび６．７％ＲＧをもつＲＧゲルを得た。次いで、ＲＧ／ＨＡ混合ゲル４および５を、該ＲＧゲルとＨＡゲル１をスパーテルを使用して３：７の容積比で均一混合することにより得た。
【００５１】
先ず、ゲル１と同量のＢＤＤＥを用いて１０％ＨＡゲルを調製することによりＲＧ−ＨＡ混合ゲル６−８を調製した。２４時間後、ＨＡゲルのｐＨを、２．２５ｍｌ  １Ｍ  ＨＣｌ／１０ｇＨＡゲルの添加により低下させた。次いで、２ｍｌ  ５０％ＥＤＣ／１０ｇゼラチン溶液を加えてある２０％ＲＧ溶液（ｐＨ７．４）を調製した。最終ＨＡ／ゼラチン比に応じて、６．０１ｇ、２．５６ｇ、または１．２８ｇのいずれかを、１２．２５ｇＨＡゲルに加えた。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘを使用して混合ゲルを均一にした。続いて、ｐＨを、０．２ｍｌ  ０．５Ｍ硫酸の添加により低下させ、ＥＤＣ架橋を開始した。３０分間４０℃で架橋を進行させた。ｐＨ７．４リン酸塩緩衝液を用いて４０ｍｌにゲルを稀釈し、次いで、３日間ｐＨ７．４リン酸塩緩衝液に対して透析した。
【００５２】
ＲＧ−ＨＡ混合ゲル９−１１を、ゲル６−８と精製ＨＡゲル３とを３：７の容積比で混合することにより得、表１に記載したように全ゼラチンおよびＨＡ濃度に装填した。
最終的に、総てのゲルを注射器に移し、冷凍試料を、ガンマー線（７ｋＧ）により、ドライアイス上で冷凍を維持しながら殺菌した。ゼラチン、ＨＡ濃度、および各ゲルの質量比を表１にまとめた。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
ＭＴＳ細胞毒性分析
ヒドロゲルの細胞毒性を評価するためにＭＴＳ分析を行った。９６−ウエルプレートにＰＫ−８４細胞(ウエル当たり５，０００細胞）を接種した。２４時間後、培地を上記調製したゲルの抽出物と置換した。抽出物は、３７℃２４時間細胞培養培地中でゲルを振とうすることにより調製した。次いで、抽出物の添加２４時間後、ミトコンドリア基質ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］を加えた。可溶性ホルマザン生成物の形成を光度計を使用して４９０ｎｍで測定した。
【００５５】
動物
動物実験を体重２５０±１０ｇの雄性ＡＯラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ、Ｈｏｒｓｔ、オランダ）を用いて行った。規則的明暗サイクル、実験室不断食餌および酸性化水供給を行う標準的実験室条件下に収容した。総ての動物実験は動物実験地方委員会により承認された。
【００５６】
インビボ実験手順
イソフラン／Ｎ２Ｏ／Ｏ２麻酔下に動物を置き、その背部を剃毛し滅菌した。続いて、各ゲル１００μｌをラットの背部の異なる部位に皮下注射した。２週および４週後一般的麻酔下にゲルおよび周囲の組織を生体から分離し(各時間当たりｎ＝３）、その後、ラットを頸椎脱臼により殺した。
【００５７】
組織化学
生体分離後、分離物を、２％グルタルアルデヒド溶液中で固定し、プラスチック中に埋め込んだ。２μｍの切片をトルイジンブルーを用いて染色し、光学顕微鏡により分析した。
【００５８】
コラーゲン沈着の測定のため、２μｍ切片をピクロシリウス溶液を用いて染色した（ピクリン酸飽和水溶液中の０．１％シリウスレッド、５０℃で２４時間）。続いて、当該切片を水道水で５分間洗浄し、マイヤーズヘマトキシリンで対比染色し、試薬等級エタノール中で脱水し、キシレン中で清澄化させ、樹脂状培地中に配置した。
【００５９】
免疫組織化学
−２５℃で分離物(５μｍ）の切片の切断し、アセトンを用いて固定した。その後、１０％ウサギ血清を用いて予備インキュベートし、続いて、それぞれ、マクロファージおよび巨大細胞の検出のためＣＤ６８（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ）および血管の検出のためコラーゲンＩＶ（ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ６３１１−１００）に対して抗体を用いてインキュベートした。ゲル中にコラーゲンが沈着することを決定するために、コラーゲンＩ（ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ６３０８−１００）およびコラーゲンＩＩＩ（ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ６３１０−１００、Ａｂｃａｍ）について染色を行った。第１抗体を用いるインキュベート後、内因性ペルオキシダーゼ活性をＨ２Ｏ２処理により遮断し、それに続いて、適切な第２抗体（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を用いてインキュベートした。次いで、スライドを３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）で染色し、ヘマトキシリンで対比染色し、Ｋａｉｓｅｒｓグリセリンを用いて埋め込んだ。
【００６０】
統計分析
総てのデータを平均±ＳＤとして表した。類似変動を推測する両側スチューデントｔ−検定を使用してデータを分析した。差異をｐ＜０．０５有意性で考慮した。
【００６１】
結果
【００６２】
【表２】
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【００６３】
明らかに、組み換えゼラチン様蛋白質のＨＡゲルへの付加は、組織内部成長（主に線維芽細胞）、血管新生、およびゲル内部のコラーゲン沈着、およびゲルの分解速度の程度に顕著な効果を示す。一般に組み換えゼラチン様蛋白質の付加はより強い組織内部成長、血管新生および自己コラーゲン沈着を誘引し、および分解速度を増加させる。これらの作用はゼラチン量の増加に伴って増加もする。ゲル９−１１のような二相混合物は、ストロマ様組織内部成長、血管新生、およびコラーゲン沈着が、精製ＨＡゲルと比較して非常に増加させるので利益のある挙動を示し、一方、４週後、わずかであるが分解を速めることが観察された。後者は、特に、持続させた皮膚充填目的に適している。
【国際調査報告】
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