(57)【要約】本発明は、LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、５〜30アミノ酸残基からなるペプチドのシリコン基板の官能化のための使用に関する。本発明はまた、前記特異的ペプチド自体、及び表面への前記特異的ペプチドの吸着により官能化されたシリコン基板に関する。最後に、本発明は前記官能化シリコン基板の製造方法、及び本発明のシリコン基板を含んでなる物品にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする５〜30アミノ酸残基、好ましくは８〜15アミノ酸残基、最も好ましくは12アミノ酸残基からなるペプチドのシリコン基板の官能化のための使用。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号１又は配列番号２から選択される配列からなることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする、５〜30アミノ酸残基、好ましくは８〜15アミノ酸残基、最も好ましくは12アミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号２から選択される配列からなることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
表面への請求項３又は４に記載のペプチドの吸着により官能化されていることを特徴とするシリコン基板。
【請求項６】
15nm〜200nmの範囲の孔径を有する多孔質シリコン基板であることを特徴とする請求項５に記載のシリコン基板。
【請求項７】
表面への配列番号１を含んでなるペプチドの吸着によって官能化されているｎ-ドープシリコン基板であることを特徴とする請求項５又は６に記載のシリコン基板。
【請求項８】
表面への配列番号２を含んでなるペプチドの吸着によって官能化されているｐ-ドープシリコン基板であることを特徴とする請求項５又は６に記載のシリコン基板。
【請求項９】
表面に吸着したペプチドが一端で生物学的リガンドに共有結合していることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載のシリコン基板。
【請求項１０】
生物学的リガンドが抗体、レセプタータンパク質、DNA、RNA、又はそれらの一本鎖から選択されることを特徴とする請求項９に記載のシリコン基板。
【請求項１１】
シリコン基板を、５〜30アミノ酸残基、好ましくは８〜15アミノ酸残基、最も好ましくは12アミノ酸残基からなり、LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドと接触させる工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の官能化シリコン基板の製造方法。
【請求項１２】
抗体、レセプタータンパク質、DNA、RNA、又はそれらの一本鎖から選択される生物学的リガンドを、ペプチドの一端に共有結合させる工程もまた含んでなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５〜９のいずれか１項に記載のシリコン基板を含んでなることを特徴とする超小型電子デバイス。
【請求項１４】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のシリコン基板を含んでなることを特徴とするバイオマテリアル。
【請求項１５】
薬物送達用のキャリアとしての請求項１４に記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１６】
請求項５〜８及び１０のいずれか１項に記載のシリコン基板を含んでなることを特徴とする光学又は電気バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリコン基板の官能化のための特異的ペプチドの使用、当該特異的ペプチド自体、及び表面への当該特異的ペプチドの吸着により官能化されたシリコン基板に関する。本発明はまた、前記官能化シリコン基板の製造方法、及び本発明による官能化シリコン基板を含んでなる物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリコン表面化学は、この材料の種々の現代科学技術における広範な使用に起因して、基本技術上、重要である。事実、シリコンは、豊富で安価であるので、マイクロ及びナノ-エレクトロニクスにおいて、トランジスター中及びダイオード中のように、最も使用されている半導体である。小型化は重要な要求であり、電子機能性を示す生体分子をシリコン上に堆積すると、シリコン技術における微細化(ナノメータ−への)が予見される。多くの分子の電子機能性をシリコンベースのデバイスに使用することができる。しかし、生体分子をシリコン上に制御された様式でかつナノメーターサイズの単層にグラフトすることは、ほとんど明らかになっていない。
【０００３】
シリコンを生体適合性にし、シリコン上に有機分子を堆積させるための幾つかの表面修飾法が以前に報告されている(J. M. Buriak, Chem. Rev. 2002, 102；S. F. Bent, Surf. Sci., 2002, 500；及びD. K. Aswaldら, Anal. Chim. Acta, 2006, 568)。これら方法の幾つかは、シラン化(R. Maozら, J. Colloid Interface Sci., 1984, 100；J. B. Brzoskaら, Langmuir, 1994, 10；S. R. Wassermanら, Langmuir, 1989, 5；及びN. Tillmanら, J. Am. Chem. Soc., 1988, 110)及びアルコール基の縮合(G. Clehandら, J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1995, 91)に基づく。米国特許出願2009/0036327もまた、多孔質シリコンバイオチップの３Ｄ内部表面を、生体分子相互作用に関する研究を行うに適切にする方法を記載する。当初からSi-H表面を有する多孔質シリコンバイオチップを先ずシラン化した後、非特異結合性分子を最小化する中間成分をコーティングする。しかし、これらアプローチは、表面修飾の程度を制御できず、望まない重合を導き、また特異的表面認識もしない。
【０００４】
表面近傍に荷電電極を必要とする電気化学グラフトも、シリコン上に非常に薄い(約50nmの)有機膜及び/又は単層パターンを作成するために記載された(D. K. Aswalら, Physica E 2009, 41)。しかし、この方法は、シリコン上にグラフトすべき生体分子と常には相溶性でない或る種の電解質の存在下でのみ作用する。
米国特許第6,248,539号は、多孔質シリコンの反射干渉スペクトルの波長シフトによる小分子の検出を記載するが、この方法の実施には事前の酸化工程が必要である。
米国特許第6,358,613号は、シリコン基板をアルケン又はアルキンと溶媒可溶性ルイス酸の存在下で接触させることを含んでなるシリコン表面上に共有結合単層を形成する方法を開示する。しかし、この方法は、表面認識特性を示さない化学表面修飾法である。
【０００５】
米国特許出願2005/0266045は、誘導体化多孔質シリコンを含んでなるバイオマテリアルを開示した。安定性を増大させるために、多孔質シリコンをヒドロシリル化により誘導体化したが、金属溶液により媒介される発熱性触媒プロセスが数時間以内に起こり、しばしば処理表面上に金属残渣を生じる。この方法は、シリコン表面に共有結合した単分子層を提供する。しかし、ヒドロシリル化法は表面認識特性を欠く。
米国特許出願2008/0242552は、III-V族又はII-VI族半導体の結晶を含む、結合特異性を有する結晶-結合性ペプチドを選択するための、ファージディスプレイ技法の使用を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、従来技術の方法のいずれも、表面修飾の程度の制御に関しても、実施の容易さ及び選択性に関しても、満足できる解決法を提供していないようである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、マスクの使用を要することなく、シリコンを特異的かつ直接的に認識することができる特異的ペプチドの吸着による表面修飾を介するシリコン基板の選択的官能化の新たな方法を提供することによって、従来技術の不十分さ及び欠点を克服する。事実、本発明の特異的ペプチドは、シリコンの表面上に、この材料に対する親和性に起因して、簡単に直接吸着する。よって、提案する官能化方法は使用が容易である。
【０００８】
本発明のシリコン基板はまた、当該ペプチドにより保証される分子の秩序整列(ordered array)に起因して、検出の感度及び限界に関して従来技術に優る。また、本発明の方法は、有機分子をシリコン表面に吸着させるときに遭遇する界面の問題を解決し、よって捕捉性分子の望まない重合及び変性に関連する問題を克服する。
【０００９】
本発明は、シリコンを、この半導体に対して特異的認識を示すペプチドを介して官能化する新規方法を提供することによって先行技術の問題点を解決する。本発明のシリコン基板は、ハイブリッドナノエレクトロニクスにおいて、シリコンデバイス上に分子単層をプリントするための容易な解決法である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第１の目的は、５〜30アミノ酸残基、好ましくは８〜15アミノ酸残基、最も好ましくは12アミノ酸残基からなり、LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドの、シリコン基板の官能化のための使用に関する。
１つの好適な実施形態によれば、本発明の第１の目的は、配列番号１又は配列番号２から選択される配列からなるペプチドの使用に関する。
【００１１】
用語「同一性」とは、２つのペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、各配列(これらは比較のために整列させてもよい)中の位置を比較することによって決定することができる。BLAST(Altschulら, NAR, 1997, 25, 3389-3402)のような種々の整列アルゴリズム及び/又はプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を算出し得る。よって、本発明はまた、当初ペプチドの活性に実質的に影響しない１以上の改変を含む、上記ペプチドの任意の機能的誘導体の使用を包含する。改変としては、例えば：ペプチド鎖における１以上のアミノ酸残基の付加及び/又は欠失及び/又は置換、及び/又は異なる化学成分による１以上のアミノ酸側鎖の置換、及び/又は保護基によるＮ末端、Ｃ末端又は１以上の側鎖の保護、及び/又はアミノ酸鎖中への二重結合及び/又は環化及び/又は立体特異性の導入が挙げられる。あらゆるバリエーションが当該分野において公知であるので、当業者は、本発明による他のペプチドを作製、試験、同定及び選択することができるといえる。
【００１２】
例えば、アミノ酸を等価なアミノ酸で置換することが可能である。用語「等価なアミノ酸」は、本明細書中では、当初のペプチド構造の活性を改変することなく、該当初のペプチド構造に属するアミノ酸の１つに代えて置換し得る任意のアミノ酸を呼ぶために使用する。これら等価なアミノ酸は、置換されるべき当初アミノ酸との構造的相同性により決定し得る。説明目的の例として、例えば、ロイシンのバリン又はイソロイシンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、グルタミンのアスパラギンによる置換、又はアスパラギンのリジンによる置換(これらは逆の置換もまた同条件で可能であると理解される)と同類の置換を行うことが可能であることに言及する。
【００１３】
本発明の第２の目的は、５〜30アミノ酸残基、好ましくは８〜15アミノ酸残基、最も好ましくは12アミノ酸残基からなり、LLADTTHHRPWT(配列番号１)、SPGLSLVSHMQT(配列番号２)、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％同一性、好ましくは95〜99％同一性、より好ましくは98〜99％同一性を示す配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド自体に関する。
１つの好適な実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１又は配列番号２から選択される配列からなる。
本発明のSi-特異的ペプチドは、標準的な生化学的手順により必要な量で合成することができ、その後、種々の適用のためにシリコンの官能化に使用することができる。
【００１４】
本発明の別の目的は、本発明により規定されるペプチドの表面吸着により官能化されたシリコン基板である。
有利には、本発明のシリコン基板は、15nm以上の、好ましくは15nm〜200nmの範囲の孔径を有する多孔質シリコン基板である。
１つの好適な実施形態において、シリコン基板の表面に吸着したペプチドは、一端で、抗体、レセプタータンパク質、DNA、RNA、又はそれらの一本鎖から選択される生物学的リガンドに共有結合している。シリコン基板の表面に吸着したペプチドはまた、有機分子、薬剤(薬物送達に使用するとき)のリンカーとして、また、ガン若しくは炎症のような種々の疾患又はヒト血清中のアレルギー診断用アレルギー性タンパク質の生物学的マーカーのリンカーとしても役立つ。
【００１５】
本発明のシリコン基板は、ｎ-ドープされたシリコン基板又はｐ-ドープされたシリコン基板であり得る。有利には、シリコン基板は、ｎ-ドープされたシリコン基板であるとき、表面上への配列番号１を含んでなるペプチドの吸着により官能化されており、ｐ-ドープされたシリコン基板であるとき、表面上への配列番号２を含んでなるペプチドの吸着により官能化されている。
【００１６】
本発明による官能化シリコン基板の製造方法が本発明の別の主題である。本発明の方法は、シリコン基板を本発明により規定されるペプチド(このペプチドがシリコン基板に吸着する)と接触させる工程を少なくとも含んでなる。
本発明の方法はまた、抗体、レセプタータンパク質、DNA、RNA、又はそれらの一本鎖から選択される生物学的リガンドを、ペプチドの一端に共有結合させる工程を含んでなる。
【００１７】
本発明の最後の目的は、本発明によるシリコン基板を含んでなる物品である。好ましくは、物品は、マイクロエレクトロニクスデバイス、バイオマテリアル、及び光学又は電気バイオセンサから選択される。
【００１８】
マイクロエレクトロニクスデバイス：
本発明は、シリコンを不動態化(passivate)し、及び/又はナノスケールの電子機能性を示す有機分子を高度に制御された様式で堆積させるユーザーフレンドリーな方法を提供するので、マイクロエレクトロニクスデバイスに関する。この適用においては、ペプチドは、導電性を示す分子の結合リンカーとして役立ち得る。ここで、導電性分子は、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリ(ｐ-フェニレンスルフィド)及びポリ(ｐ-フェニレンビニレン)のような導電性ポリマー、又は鉄を含有するフェリチンタンパク質及びヘムタンパク質(ヘモグロビン)と同類の金属イオン含有タンパク質のような導電性生体分子、又は金属ナノ粒子(例えば銀又は金)のグラフトにより人為的に導電性にされた導電性生体分子である。シリコンへの生体分子のカップリングは、シリコンベースデバイスにおけるこれら分子の電子機能性に基づく有望な適用を提供し得る。
【００１９】
バイオマテリアル:
本発明はまた、毒性を減少させ(これはバイオメディカル適用の根本である)、シリコン基板に生体適合性及び安定性を付与するペプチド-リンカーを介する新規な生物機能化法を提供する。本発明のペプチドで官能化した多孔質シリコン基板は、リガンド、又はRGD(リジン(Ｒ) グリシン(Ｇ) アスパラギン酸(Ｄ))配列(これは、バイオマテリアル適用のために、多孔質シリコン足場への細胞接着を増強することができる)を含んでなるペプチドで更に修飾される。更に、ペプチド-キャップ化リガンドは、タンパク質-様特性を、より良好な溶解性、安定性及び分子認識特性を有するシリコンナノ粒子(SiNp)に付与する。本ペプチドを使用して、薬物送達適用のために、シリコンナノ粒子に活性分子を搭載(load)することができる(薬物送達用キャリアとしての使用)。本ペプチドは、シリコンナノ粒子の自己-組織化に関して多くの可能性を提供する。
【００２０】
光学又は電気バイオセンサ：
本発明はまた、多孔質シリコン構造を有する光学若しくは電気バイオセンサ又は電界効果トランジスタのような任意のシリコンベースデバイスのための、シリコンの表面修飾に関する。この適用において、特異的ペプチドを使用して、生物学的物質の検出及び同定のための理想的な足場であると証明されている多孔質シリコン構造を官能化する。光学又は電気生物検知(biosensing)は、最も急速に成長している研究分野の１つである：分析物の認識及び検出を、シリコン基板の電気光学特性の摂動に基づいて考えられる。多孔質シリコン微小空洞共振器のような電気化学エッチングされた多孔質シリコン(PSi)デバイスは、生物検知にとって興味深い固有光学特性を示す。微小空洞構造は、カップリング性の生体分子に対して高感度である。この生体分子は、光反射率によりフォトニック多孔質シリコン構造内での反射指数変化を明らかにすることによって検知される。シリコン表面と接触するタンパク質の望まない変性を回避するために、シリコン表面を先ず、堆積領域を制御しながらリンカーで官能化しなければならない。
【００２１】
他の生物検知適用においては、ペプチドは、一端で、対応するレセプターを捕捉するために使用される抗体のような任意の種類のリガンドで修飾することができる。これらレセプターは細胞膜のものであり得、この場合、ペプチド-リガンド官能化シリコン表面は、細胞接着を促進する修飾基板として役立つ。Si-特異的ペプチドは、核酸DNA、RNA又はその一本鎖を標的に結合し、その後、ハイブリダイゼーションにより相補鎖に結合するようにも修飾することができる。これは細菌検出センサになる。
【００２２】
別の生物検知適用は、異なる疾患のバイオマーカー(例えば、唾液中のインターロイキン及びマトリクスメタロプロテイナーゼタンパク質)又はグルコース若しくは種々のイオン(例えば、カリウム及びナトリウム)のような幾つかの異なる分子で一端を修飾したペプチドによって官能化した多孔質シリコン微小空洞による、複雑な体液(血液、尿、リンパ液、唾液)についての多重検知の実施(すなわち、同時に或る数の標的分子をモニターするバイオセンサ)であり得る。特異抗体で一端を修飾したペプチドにより官能化した多重センサはまた、例えば、ヒト血清におけるアレルギー診断のために、ヒト免疫グロブリン、ピーナッツレクチン及びラクトグロブリンのようなアレルギー性タンパク質を検出することができる。
【００２３】
上記形態に加えて、本発明はまた、本発明のシリコン基板の性能を例示する実施例及び添付の図面に言及する下記の説明から明確になる他の形態を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、MALDIプレートでのSPGLSLVSHMQTペプチドの質量スペクトル(図1a))及び官能化ｐ+-Si基板の質量スペクトル(図1b))を表す。
【図２】図２は、ストレプトアビジン(STV)濃度10μM(図2a))及びストレプトアビジン(STV)濃度５μM(図2b))について、ペプチド-官能化の異なる工程で記録した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の反射率スペクトルを表す：デスオキシ化(desoxydation)(HCL)後、ビオチン化ペプチド(Ｐ)の吸着後、ウシ血清アルブミン(BSA)の吸着後、及びストレプトアビジン(STV)の捕捉後。
【図３】図３は、種々の濃度の捕捉したストレプトアビジン(STV)分子に対する、ペプチド-官能化多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)デバイスの用量-依存性曲線を示す。
【図４】図４は、異なる工程で記録した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の反射率スペクトルを表す：(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTS)の吸着後、NHS-ビオチンの吸着後、ウシ血清アルブミン(BSA)の吸着後、及びストレプトアビジン(STV)の捕捉後。
【図５】図５は、種々の濃度の捕捉したストレプトアビジン(STV)分子に対する、APTES-シラン化多孔質シリコン微小空洞(PSM)デバイスの用量-依存性応答を表す。
【図６】図６は、ａ)裸の多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)、ｂ)脱酸素工程後のPSM、ｃ)100μMビオチン化ペプチドで修飾したPSM、ｄ)0.1％BSAで修飾したPSM、及びｅ)10μMストレプトアビジン(STV)で修飾したPSMの、AFMにより空気中タッピングモードで記録した表面トポグラフィーを示す。
【図７】図７は、ａ)〜ｂ)100μMビオチン化ペプチドで、ｃ)〜ｄ)その後0.1％BSAで、ｅ)〜ｆ)最後に10μMのストレプトアビジン(STV)で修飾した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の、AFMにより空気中タッピングモードで記録した表面トポグラフィーを示す。
【図８】図８は、シラン-グルタルアルデヒド(GTA)化学で官能化した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の用量応答曲線を示す。
【図９】図９は、ペプチド法で官能化した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の用量応答曲線を示す。
【図１０】図10は、抗体及び酵素濃度10μg.mL-1について、異なる工程で記録した多孔質シリコン微小空洞(PSM)デバイスの反射率スペクトルを表す：エッチングした時点、シラン化後、グルタルアルデヒド(GTA)カップリング後、抗-MMP-8結合後、及び最後にMMP-8捕捉後。
【図１１】図11は、抗体及び酵素濃度100ng.mL-1について、異なる工程で記録した多孔質シリコン微小空洞(PSM)デバイスの反射率スペクトルを表す：エッチングした時点、ペプチド結合後、抗-MMP-8結合後、及び最後にMMP-8捕捉後。
【実施例】
【００２５】
実施例：
３つのシリコンウェハ：ｎ-型として知られるドナー不純物をドープされたシリコン基板(n+-Si)、及びｐ-型として知られるアクセプター不純物をドープされた２つのシリコン基板(p-Si及びp+-Si)の特異的ペプチドを調べた。
シリコン基板へのペプチド接着をMALDI-TOF/TOF質量分析により評価した。
本実施例で使用したペプチドは、ビオチン化した後、ストレプトアビジン(STV)を捕捉するためのリンカーとして使用した。検出は、多孔質シリコン微小空洞のフォトニック共鳴によりモニターした。より具体的には、p+-Siの特異的ビオチン化ペプチドを使用して多孔質シリコンを官能化した後、ストレプトアビジン(STV)分子を、反射干渉スペクトルにより、空洞構造の共鳴ピークのシフトとして検出した。
本発明のシリコン基板で得られた結果を、他のシリコン基板で得られた結果と比較した：酸化多孔質シラン化も、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)を用いて行い、NHS-ビオチンを捕捉した後、ストレプトアビジン(STV)を検出した。全ての官能化工程の高解像度画像を原子間力顕微鏡観察(AFM)により提供した。
ペプチド接着はMALDI-TOF/TOF質量分析により評価した。
【００２６】
シリコン基板：
ｎ-及びｐ-ドープシリコンは、Czochralski法(A. Phys. Chem., 1918, 92, 219-221)により成長させた標準的なウェハである。ｎ-型及びｐ-型ドーピング不純物はそれぞれリン及びホウ素であり、ドーピングレベルは1015cm-3(p-Siについて)〜1019cm-3(n+-Si及びp+-Siについて)の範囲である。使用前に、シリコンウェハを、正確に５×５mm2のサンプルに切断し、次いでサンプルを、トリクロロエタン、アセトン、メタノールでの連続処理により注意深く清浄化し、脱イオン水中でリンスした後、窒素下で乾燥させた。自然酸化物を除去するため、サンプルを希フッ化水素酸(HF)(22.5mLの水中2.5mLの40％HF)で１分間脱酸素化し、次いで脱イオン水中に浸漬し、最後に窒素下で乾燥させた。
【００２７】
ペプチド-官能化シリコンについてのMALDI-TOF/TOF質量分析：
一旦清浄し脱酸素化した後、サンプルを２時間、90μMのペプチドが希釈されているPBST溶液中でインキュベートし、続いて緩衝液の痕跡、未結合で過剰のペプチドを除去するために脱イオン水での十分なリンス工程を行った。次いで、マトリクス溶液、すなわちアセトニトリル/H2O/トリフルオロ酢酸(50/50/0.1)から構成される溶媒中のα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(αCHCA)(５mg/mL)を、シリコンサンプルに加え、結晶化のために乾燥させた。サンプルをMALDIプレートに導体両面テープで固定した。対照実験のために、１μLの希釈ペプチド(水中90μM)を９μLのマトリクス溶液と混合し、ステンレス鋼サンプルプレート上に堆積したときのペプチドの質量スペクトルを測定した。シリコン表面上に(ペプチドなしで)堆積したマトリクスの質量スペクトルもまた、対象実験として記録した。
調製したサンプルを風乾させた後、ポジティブリフレクターイオンモードで20kVの加速電圧を用いて4800 Plus MALDI-TOF/TOF Proteomics Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で分析した。YAGレーザを発射頻度200Hz、波長355nmで操作した。1500レーザショットを用いて各測定について質量スペクトルを取得した。ペプチドの断片化もまたMS/MSモードで調べた。取得したスペクトルを、4000 Series ExplorerTMソフトウェア(Applied Biosystems)で加工処理した。
【００２８】
多孔質シリコンの官能化：
多孔質シリコン微小空洞構造体(PSM)を、0.002〜0.004Ω.cm-1の抵抗率及び結晶学的配向(100)を有する高ドープｐ-型(ホウ素をドープされた)Siウェハ(厚さ500〜550μm)を用いて、電気化学ウェットエッチング法により作製した。電解質は、容積比３/７/１のフッ化水素酸(48％)、エタノール(98％)及びグリセロール(98％)からなる。陽極酸化(anodization)時間及び電流密度は、コンピュータインターフェース電子回路により制御した。サンプルは暗所で作製し、エッチングした新鮮なサンプルをエタノールで洗浄し、ペンタンで乾燥させた。構造体は、90mA.cm-2(高いの「Ｈ」)及び40mA.cm-2(低いの「Ｌ」)の電流密度を用いて作製した。Ｈ及びＬについてそれぞれ6.4秒及び11.5秒の陽極酸化時間を、10周期(period)を有する対応する誘電体ブラッグミラー(各層の光学的厚さが波長の1/4であり、波長は740〜810nmの範囲である)の作製に使用した。
【００２９】
官能化の一方で、多孔質シリコンデバイス中での塩の結晶化を最小化するため、使用した溶媒(PBST及びPBS)は脱イオン水中に10倍希釈した(PBST/10、PBS/10)。よって、リンス工程を先ず500μLのPBS/10で行い、続いて500μLの脱イオン水での洗浄工程を行った。
SPGLSLVSHMQTペプチドは、多重ペプチド合成機を使用して、或るアミノ酸のカルボキシ基又はＣ末端を別のアミノ酸のアミノ基又はＮ末端にカップリングすることによって合成した。次いで、ペプチドを(GGGSK)リンカーで伸長させて、ペプチドのＣ末端にビオチンを結合させた。よって、得られた最終分子は、SPGLSLVSHMQT-GGGSK-ビオチンである。
【００３０】
希塩酸(HCl)(脱イオン水中1/10)での脱酸素化工程の後、多孔質シリコンサンプルを20μM又は100μMのビオチン化ペプチド(PBST/10中で希釈)中で２時間インキュベートし、続いて未結合の過剰のペプチドを除去するために十分なリンス工程を行った。次いで、サンプルをウシ血清アルブミン(PBS/10中BSA 0.1％)中で１時間インキュベートした。続く工程で、種々の濃度のストレプトアビジン(STV)(PBS/10中のBSA 0.1％に希釈)を多孔質シリコン微小空洞基板に添加し、１時間吸着させ、続いてリンス工程を行った。実験的必要性のため、窒素下での乾燥を各表面修飾工程後に行なった。全てのリンス工程を先ずPBS/10で行い、次いで脱イオン水で行って、塩結晶の形成を回避した。
【００３１】
比較のために、検知を、900℃で３分間熱酸化した多孔質シリコン微小空洞構造体でも行い、その後、サンプルを950μLのトルエン中に希釈した50μLのAPTES中で50分間インキュベートすることによりAPTESでシラン化した。次いで、サンプルを、トルエン、次いで50％エタノール、最後に脱イオン水で連続してリンスした。次いで、サンプルを115℃で15分間焼成した。次工程で、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に希釈した100μMのNHS-ビオチンをAPTESにカップリングし、続いてPBS/10中のBSA 0.1％で非特異結合部位をブロッキングした後に、種々の濃度のストレプトアビジン(STV)を捕捉するために使用した。
【００３２】
原子間力顕微鏡観察(AFM)：
AFM画像を、Asylum MFP-3Dヘッド及びMolecular Force Probe 3Dコントローラ(Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA)を用いて空気中で記録した。画像は、シリコン角型カンチレバー(cantilever)(Olympus Microcantilever, OMCL-AC240TS)を用いて、タッピングモードで取得した。高さ及び位相画像を、512×512点の走査により、１Hzの走査速度で記録した。多孔質シリコン微小空洞の再現可能画像を確保するために所与の表面積について数回のスキャンを行った。
【００３３】
反射率スペクトル：
反射率スペクトルは、修飾サンプルをタングステン光源(Bruker 66V)で垂直入射角度で照らし、シリコンダイオード検出器を用いて反射光を検出することによって測定した。この分光光度計をBruker A 510, 11°Specular Reflection Unitと連結した。100走査の蓄積から得られるスペクトルを、多孔質シリコンの各修飾後、25000〜9000cm-1の範囲において分解能２cm-1で取得した。
【００３４】
本発明の特異的ペプチドの選択：
M13バクテリオファージライブラリ(New England Biolabs)を用いるファージディスプレイ技術を実行することによって、幾つかのペプチドを選択した。ファージディスプレイ技術は、0.1％TWEEN-20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBST)中で、事前の清浄化及び希HFでの脱酸素化後の上記３タイプのシリコン基板((n+-Si)、(p-Si)及び(p+-Si))について行った。室温での１時間の撹拌後、表面を、代表的には10回、PBSTで洗浄して、未結合ファージをリンスした。次工程で、結合したファージを表面から溶出させた：グリシン-HCL(pH=2.2)溶液を10分間加え、次いで表面を新鮮な試験管に移し、Tris-HCL(pH=9.1)で中和した。各サンプルからの溶出ファージを、Escherichia coli ER2738宿主細菌細胞中に感染させて増幅させた。３回のバイオパニング後、各々の表面タイプについてモノクローナルのファージ集団を選択し、個々に分析した。最後に、10ファージを回収し、増幅させ、続いて、発現ペプチドの配列を規定するそのDNAを抽出して配列決定した。
回収したファージから抽出したペプチドの配列を表１にまとめる。
http://expasy.orgのプログラムを使用して、分子理論的モノアイソトピック分子量(MW)、等電点(pI)、不安定性指数(II)、脂肪族指数(aliphatic index；AI)、疎水性/親水性指標(hydropathicity)(Ｈ)を含む種々のペプチドの物理化学的特徴を計算した。
【００３５】
表１：種々のぺプチドの配列及び物理化学的特徴
【表１】
2013531618.tif 000002
ペプチドの不安定性指数(II)の意義：II＜40は安定なペプチドを予測し、II＞40は不安定なペプチドを予測する。
【００３６】
疎水性/親水性指標(Ｈ)は、(全アミノ酸のヒドロパシー価(J. Kyteら, J. Mol. Biol., 1982, 157:105-132)の合計/(配列中の残基数)として算出される。
n+-Siについては、適合した特異的ペプチドはLLADTTHHRPWTである(出現頻度(apparition frequency)28.5％)。
p+-Siについては、適合した特異的ペプチドはSPGLSLVSHMQTである(出現頻度44.4％)。
【００３７】
MALDI-TOF/TOF質量分析によるペプチド接着の評価：
p+-Si表面に関するSPGLSLVSHMQTペプチド(以下、ペプチドＰと呼ぶ)の親和性は、MALDI-TOF/TOF質量分析により評価した。清浄化し、脱酸素化したp+-Si表面をＰペプチドで官能化し、続いてマトリクス堆積を行い、質量分析機で測定した。ペプチドＰの正確な質量を決定するために、ペプチド溶液(シリコンなし)のスペクトルを先ず記録した。図1a)に示す。得られた1256.6の質量対電荷比(m/Z)値は、このペプチドの理論的[M+H]+質量と一致する。1273.5の質量を有する酸化ペプチドの小さなピークも存在する。
シリコン表面をＰペプチド官能化した後、脱イオン水でリンスしたときは、m/Z 1254〜1270の領域にピークが観察された。図1b)に示す。これは、表面上へのＰペプチドの不可逆的接着を示唆している。ペプチド単独について得られるものと比較して若干低い値は、シリコン基板の厚さに起因する。
【００３８】
ペプチド-官能化多孔質シリコン微小空洞(PSM)デバイスによるストレプトアビジン(STV)検出：
使用したPSM基板は高ドープp+-Si(結晶学的表面(100))ウェハから製造したので、p+-Si(100)について得られた特異的ペプチドを使用して、PSMを官能化した。全ての官能化工程を、孔が分子を捕捉したときの基板の有効な光学的厚さの変化によって引き起こされる干渉ピークのシフトとして測定される反射率スペクトルによりモニターした。裸のPSMサンプルで測定された反射率スペクトルと比較すると、脱酸素化により、酸処理下の孔開口効果に起因する約5.5nmのシフトが明らかになる。にもかかわらず、スペクトルの全体形状は変化しないので、脱酸素化の間、構造体自体は攻撃されないようである。濃度100μMのビオチン化特異的ペプチドで官能化したときは、より長波長へのスペクトルシフトが、BSAの吸着の間に観察される。次いで、ストレプトアビジン(STV)を捕捉する。PSM上への10μMのストレプトアビジン(STV)の添加により、約14nmシフトする(図２)。
測定は種々の濃度のストレプトアビジン(STV)で行った。また、低濃度のペプチド溶液(20μM)を使用してPSMを官能化し、種々の濃度のストレプトアビジン(STV)を捕捉させた。測定したシフトを表２にまとめる。
【００３９】
表２：反射率スペクトルによりモニターした、ペプチド-官能化法によるPSMサンプルに吸着した分子の濃度及びシフト
【表２】
2013531618.tif 000003
【００４０】
20及び100μMペプチドの両濃度について得られたシフトに考慮すべき差異は存在しない。実際、シリコン上へのペプチドの接着は、20μMで飽和することが報告されている。BSAの吸着は、ΔλBSA = ３〜４nmのシフトを生じる。これは、むしろ、全ての測定について一貫している。これに対し、漸増濃度のストレプトアビジン(STV)を捕捉したときには、ΔλSTVの徐々の増加が観察される。試験した最低濃度は10nMのストレプトアビジン(STV)であり、これにより0.30nmシフトする。
用量-応答曲線も図３に示した。実験結果の多項式線でのフィッティングにより、ストレプトアビジン(STV)の検出は、高濃度で飽和し始める(16〜17nmのシフト)ことが示される。最小及び最大の検出限界は、多孔質シリコン自体(すなわち、作製、多孔度、官能化法、及び検出タンパク質のサイズ及びタイプ)により影響されることが知られている。Q = λ/Δλとして定義されるデバイスの品質(Ｑ)ファクターもまた重要な役割を演じ、よって官能化及び検出の前後で良好なＱファクターを維持することが重要である。高いＱファクター値は、小さな波長シフトの分解能を増大させる。PSMのＱファクターは、これら構造体の高い多孔度に起因して約40である。
【００４１】
シラン化PSMデバイスによるストレプトアビジン(STV)検出：
ストレプトアビジン(STV)検知の検出限界を、本発明のペプチド-官能化デバイスにより得られるものと比較するために、APTESシラン化化学によるPSMの官能化を証拠として(as witness)実行した。最初のスペクトルは酸化PSMに相当し、清浄工程後に記録したスペクトルが続く。清浄工程は約４nmのシフトを導く(図５)。シラン化は約９nmのシフトを生じ、NHS-ビオチン(100μM)の結合により再び、ΔλNHS-ヒ゛オチン = ＋1.6 nmのシフトをする。BSAの吸着は約18nmのシフトを導く。最後に、10μM濃度のストレプトアビジン(STV)の捕捉により約16.55nmシフトする。通常、全てのリンスを、先ずPBS/10、次いで脱イオン水による２工程で行った。
【００４２】
表３：反射率スペクトルによりモニターした、APTES官能化によるPSMサンプルに吸着した分子の濃度及びシフト
【表３】
2013531618.tif 000004
【００４３】
表３は、ストレプトアビジン(STV)濃度を変化させた種々の実験について測定した、各官能化工程後のPSMの反射率スペクトルシフトをまとめている。APTES-シラン化により誘導されるシフトは、＋8.79nmから＋14.59nmまで変化する。このことは、APTES分子が種々の量で吸着し、及び/又は凝集する傾向にあることを示唆し得る。BSA吸着後に得られるΔλBSA値に大きな振動もまた観察することができる。この値は、ペプチド官能化法で観察される値より遥かに高く、平均シフト約３nmを記録した。この重要な相違は、使用したペプチドが、多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の内部表面をほとんど完全に覆っており、そのことによりBSA結合が排除される一方、シラン化はそうでないことを示唆する。２つの官能化法の相違は、低濃度(25〜100nM)のストレプトアビジン(STV)を捕捉するときのような後続の分子検知においてもまた、小さなシフトが記録されるという結果をまねく。この観察は、サンプルをストレプトアビジン(STV)溶液中でインキュベートし、続いてリンスしたとき表面の少量のBSAが除去されることにより解釈することができる。この手順は、粗い層を形成することにより秩序様式で結合していない幾らかの過剰なBSAを除去することができる。このこともまた、BSAが吸着したときに生じる大きなシフトを説明する。＋0.39nmの小さなシフトが得られたのは、250nM濃度のストレプトアビジン(STV)でのみである。
【００４４】
２つの異なる官能化PSMデバイスについて検出限界を決定するために、測定データの統計学的分析を行った。ストレプトアビジン(STV)についての検出限界(LoD)は、式 LoD = 3σ/s (式中、σはバックグランドの相対標準偏差であり、ｓは測定により規定される回帰線の傾きである)から算出した。異なる官能化デバイスについて得られたLoD値、相対標準偏差(σ％)及び相関係数(R2)を表４に列挙する。
【００４５】
表４：異なる官能化デバイスについて算出した検出限界(LoD)値、相対標準偏差(σ％)、相関係数(R2)及び回帰式
【表４】
2013531618.tif 000005
【００４６】
結果は、最低の検出限界がPSMデバイスにより得られることを示す。更に、PSMデバイスによるストレプトアビジン(STV)検出について、最適ペプチド濃度(20μM)を決定することができる。より高いペプチド濃度を使用すると、バックグランドσが増加し、より高いLoD値を導く。この効果は、シラン化PSMデバイスについて、更により強調される。
結果は、検知用PSiベースデバイスの表面修飾の重要性を証明する：ペプチド官能化は、シラン化PSMから得られるものより21倍低い検出限界を導く。更に、シラン化PSMデバイスのSTV検知用量-応答曲線(図５)について、重大な誤差(特に、より高濃度(１μMより高い))に気付く。ペプチド-官能化PSMでの検知は、図３に記載される用量-応答曲線で小さなエラーバーにより示されるように、非常に再現性がよい。
【００４７】
更に、PSMをシラン化する場合、幾つかの実験で、スペクトルの大きさが低下し、形状も若干変わる。このことは、シラン化後の乾燥プロセス間にクラックが生じた可能性がある表面からの散乱喪失に帰することができる。したがって、シラン化後に更に吸着を続ける場合、低いタンパク質濃度では、再現性のシフト及び有益な情報を得ることは困難である。対照的に、ペプチド-官能化PSMで行った実験では、得られた全てのスペクトルが正確に同じであり、ペプチドの吸着が微小空洞構造に影響を及ぼさないことを示唆する。
【００４８】
官能化PSMデバイスについての形態学的研究：
異なる官能化工程についての形態学的研究を、多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)の表面修飾についての有益な情報を導く原子間力顕微鏡観察により行った。第一に、裸のサンプル(清浄化前)の画像を空気中タッピングモードで記録した(図6a))。HCl清浄化工程後の多孔度の増大(より多く、より大きな孔)に気付く(図6b))。ビオチン化ペプチドをサンプルに添加すると、表面全体を覆う薄層の形成が、側面計断面(profilometric section)からも観察される(図6c))。BSAとのインキュベーション後、形成した層は高度に秩序化しており(図6d))、孔は、ペプチド吸着後のものより小さくなり、深さも浅くなる(図6c))。最後に、最終工程では、図6e)がストレプトアビジン(STV)層の形成を証明する：側面計断面は層がより厚くなることを示す。
【００４９】
より高解像度で画像化すると、表面での分子の組織化を観察することができる(図７)。ビオチン化ペプチドの吸着後、厚さが５nmを決して超えることのない分子層の形成を観察することができる(図7a)及び図7b))。小縮尺画像もまた、BSA分子がビオチン上に秩序化された様式で結合することを証明する(図7c)及び7d))。最後に、ストレプトアビジン(STV)を捕捉したとき、孔の周りの分子層は、より厚くなるが、依然として数ナノメーターを超えない(図7e)及び図7f))。AFM画像は、ペプチド官能化を行うと、多孔質シリコン表面上に秩序化されたタンパク質単層が形成されることを証明する。一方、多孔質シリコン基板がシラン化化学により官能化されると、重合化及び凝集物の形成が観察される。
【００５０】
本発明によるペプチドの吸着によって修飾されたセンサは、従来のシラン化センサより高感度を示す。得られた結果は、ペプチド-官能化多孔質シリコン微小空洞を用いるストレプトアビジン(STV)検知は、通常のシラン化法により官能化したデバイスで行った検知と比較して21倍良好であることを証明する。更に、APTES-シラン化多孔質シリコンデバイスでなされた観察とは対照的な、本発明によるペプチド-官能化PSMデバイスで行った反射率測定の再現性及び生物機能化の全工程後の微小空洞構造の無傷状態(intact state)もまた明らかになった。高解像度原子間力顕微鏡画像は、本発明によるペプチド-ルートの官能化を行うと、秩序化されたナノメーターサイズの分子層が形成されることを証明する。
【００５１】
多孔質シリコンに吸着させた光合成細菌の反応中心：
光合成反応中心(RC)は、光エネルギーの化学エネルギーへの変換を行う重要なタンパク質である。光エネルギーの化学エネルギーへの変換の最初の工程は、電荷対の化学ポテンシャルの形成である。これは、水素イオンの膜間化学ポテンシャルを生み出す条件である。この反応中心タンパク質は、「天然の太陽光発電所」又は「天然のソーラーコーム(solar comb)」とも呼ばれ、地球上の全生命のエネルギー(化石燃料を含む)を保証するにもかかわらず、そのサイズは細胞中で僅かナノメーター(約10nm)であり、ナノの効率でのみ働く(１光子が僅か１回の電荷分離を行う)。反応中心のエネルギー変換の利用は、移動の量子効率が、例えば太陽エネルギーの使用時には、100％であるので、真の挑戦である。反応中心と半導体タイプの材料との組合せは、最終的に、反応中心を安定化し、電子輸送に必要なタンパク質内での電荷分離プロセスを最適化し得る。多孔質基板上へのRCの固定化はまた、高濃度のRCマトリクスを作製する良い方法であり得る。RC連結前の多孔質シリコン(PSi)の適切な官能化はまた、光変換効率を維持し、生物学的システムの効率の低下を回避してその安定性を拡大させ、使用可能性を拡張することに寄与する。
【００５２】
本実施例では、多孔質シリコン上への細菌反応中心の結合を２つの方法により行った：
−  シラン-グルタルアルデヒド(GTA)化学による共有結合、及び
−  Si材料に対して高い結合親和性を示すペプチドでの官能化の後。多孔質シリコン上へのRCの吸着は、分子結合が生じたときの屈折率変化に起因する、使用したPSi微小空洞の鏡面反射率スペクトルの赤色シフトによりモニターした。測定したシフトは固定化した反応中心の量に依存する。より多くの分子が結合すればするほど、反射率スペクトルのシフトはより重大になる。図８及び９は、RC結合を共有結合により行ったとき(図８)及びSi-特異的SPGLSLVSHMQTペプチドを用いるペプチド結合により行ったとき(図９)に、RC濃度の関数として測定したスペクトルシフトを説明する。両方のグラフで、相対濃度0.1は600nMに相当する。得られた用量応答曲線は、PSi構造体の検出可能な最低濃度及び検知分解能を示唆する。SPGLSLVSHMQTペプチドにより結合すると、多孔質シリコン微小空洞(PSM)によるRC捕捉は、シラン-グルタルアルデヒド(GTA)化学により修飾した多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)で得られるものと比較して、より大きなスペクトルシフトを生じることが証明された。このことは、ペプチドリンカーが、細菌反応中心のためのより良好な結合条件を提供することを強く示唆する。
【００５３】
ヒト抗体で官能化した多孔質シリコン微小空洞デバイスによるマトリクスメタロプロテイナーゼ検知：
本実施例は、細胞外マトリクスタンパク質を分解し、多様な生理学的及び病理学的プロセス(胚発生、創傷修復、炎症性疾患及びガンを含む)で鍵となる役割を演じる主要な酵素であるマトリクスメタロプロテイナーゼの検出に関する。
多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)を、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)の特異的検知用の支持材料として使用した。本実施例では、コラゲナーゼ-タイプMMP-8(これは、歯科矯正治療の間に歯の移動を予測する、歯肉滲出液中の炎症マーカーである)を検出する。歯科矯正治療の間、唾液中のMMP-8の存在は歯の移動と直接関連するので、MMP-8変動のモニタリングは基本である。使用容易な、高感度の、強固で安価なバイオセンサとしてのPsi多孔質足場の使用は、MMP-8のインサイチュ検出についての有望な適用を導き得る。
【００５４】
多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)を、低濃度(下限100ng/mLまで)のMMP-8の検知に使用した。PSMデバイスは、２つの異なる官能化法により官能化した：
−  方法１：PSiのシラン化
熱酸化多孔質シリコンサンプルを、アルコキシシランたるアミノプロピル-トリエトキシシラン(APTES)を用いて修飾した。シラン分子は末端(-OCH2CH3)に結合して、固体表面を活性化する。-NH2末端は、興味対象の分子と反応する、曝されている遊離基である。PSi構造体をAPTES/トルエン溶液(５％v/v)中に90分間浸漬させた。シラン化表面をトルエン、エタノール及びエタノール/H2O(1:1)で強力にリンスすることにより、非特異的シラン結合を排除した。サンプルをN2流下で乾燥させ、オーブン(Memmert UM200)中110℃で15分間焼成させた。スルフヒドリル及びアミン基の高い反応性に起因して、APTES-PSi修飾サンプルを表面処理の直後に使用した。MMPタンパク質のPSMへの架橋は、アミノシラン及びタンパク質の化学官能性に基づいて、上記の二工程接合プロトコルにより行った。2.5％v/v濃度のグルタルアルデヒド(GTA)溶液を用いて、アミノシランAPTESのアミン基をタンパク質結合に向けて活性化した。グルタルアルデヒド(GTA)の起こるべき自己凝集は、調製直後の溶液を用いて減少させた。次いで、GTA-APTES-PSM修飾サンプルをPBS緩衝液でリンスし、N2流下で乾燥させた。グルタルアルデヒド(GTA)溶液中でのシラン化PSM-基板のインキュベーション時間は、分子重合を低下させるために、20分間を超えなかった。
【００５５】
−  方法２：ペプチド結合
希HCl(脱イオン水中1/10)での脱酸素化後、多孔質シリコンサンプルを20μMのビオチン化SPGLSLVSHMQTペプチド(PBST/10中に希釈)中で２時間インキュベートし、続いて十分なリンス工程で未結合で過剰なペプチドを除去した。次いで、サンプルをウシ血清アルブミン(PBS/10中BSA 0.1％)中で１時間インキュベートした。次工程で、種々の濃度のマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)溶液(PBS/10中に希釈)をPSM基板に加え、１時間吸着させ、続いてリンス工程を行った。各表面修飾工程後、窒素での乾燥を行った。全てのリンス工程を、先ずPBS/10で、次いで脱イオン水で行い、窒素でサンプルを乾燥させたときの結晶形成を回避した。
結果を図10及び11に示す。
【００５６】
酸化多孔質シリコン構造体のシラン化、続くグルタルアルデヒド(GTA)化学は、分子捕捉において非常に一貫性のない結果を生じることが分かった。これに対して、裸の多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)に結合したSi-特異的SPGLSLVSHMQTペプチドの使用は、ストレプトアビジン(STV)で予め修飾した抗-MMP-8ヒト抗体を接着させる良好な代替法であることが判明した。ペプチド官能化多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)を更に使用して、シラン化構造体と比較して遥かに高い検出感度でMMP-8を検知した。
結果は、多孔質シリコン微小空洞基板(PSM)を、(特に低濃度の)抗体による特異的検出に使用するときの、適用した官能化手順の重要性を明らかにする。
【図６ａ）】
2013531618.tif 000006
【図６ｂ）】
2013531618.tif 000007
【図６ｃ）】
2013531618.tif 000008
【図６ｄ）】
2013531618.tif 000009
【図６ｅ）】
2013531618.tif 000010
【図７ａ）】
2013531618.tif 000011
【図７ｂ）】
2013531618.tif 000012
【図７ｃ）】
2013531618.tif 000013
【図７ｄ）】
2013531618.tif 000014
【図７ｅ）】
2013531618.tif 000015
【図７ｆ）】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013531618.tif 000021
【図８】
2013531618.tif 000022
【図９】
2013531618.tif 000023
【図１０】
2013531618.tif 000024
【図１１】
2013531618.tif 000025
【配列表】
2013531618000001.app
【国際調査報告】
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2013531618.tif 000027
2013531618.tif 000028
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