(57)【要約】  本発明は、α−ジカルボニルトキソイド化試薬（例えば、グリオキサール、ブタンジオンおよびフェニルグリオキサール）を使用して調製されるトキソイドの使用に関する。トキソイドは、低濃度のトキソイド化試薬を用い短時間（多くの場合、わずか２４時間）で調製することが可能なため、トキソイド化試薬は、従来のホルムアルデヒドを用いたトキソイド化と比較した場合に特に有利である。ジカルボニル試薬（例えば、フェニルグリオキサール）を使用して調製されるトキソイドは、トキソイドを含有する医薬組成物およびワクチン組成物、この種の組成物およびトキソイドを用いた免疫生成される抗体を使用した処置方法、ならびにこのようにして調製された抗体もしくはこの種の抗体のフラグメントを使用した処置方法と同様に、記載され請求されている。
2013531686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トキシン内のアルギニン残基が、薬剤として使用できるように一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’のα−ジカルボニル化合物との反応を経た、トキシンから誘導されるトキソイド。
【請求項２】
α−ジカルボニル化合物がグリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４−フルオロフェニルグリオキサール、４−ニトロフェニルグリオキサールおよび４−ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項１に記載のトキソイド。
【請求項３】
α−ジカルボニル化合物がフェニルグリオキサールである、請求項２に記載のトキソイド。
【請求項４】
植物トキシンから誘導される、請求項１から３のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項５】
植物トキシンがリシンである、請求項４に記載の蛋白質トキソイド。
【請求項６】
トキシンが動物から誘導される、請求項１から３のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項７】
トキシンが蛇毒である、請求項６に記載のトキソイド。
【請求項８】
トキシンが細菌から誘導される、請求項１から３のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項９】
トキシンがボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはＳＥＢである、請求項８に記載のトキソイド。
【請求項１０】
薬剤がワクチンである、請求項１から９のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項１１】
トキシンによる中毒の予防的または治療的処置に用いられる、一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈのα−ジカルボニル化合物との反応を経た、トキシンから誘導されるトキソイド。
【請求項１２】
α−ジカルボニル化合物がグリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４−フルオロフェニルグリオキサール、４−ニトロフェニルグリオキサールおよび４−ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項１１に記載のトキソイド。
【請求項１３】
α−ジカルボニル化合物がフェニルグリオキサールである、請求項１２に記載のトキソイド。
【請求項１４】
α−ジカルボニル化合物が約０．０５ｍＭから約５ｍＭの範囲内の濃度で溶解される、請求項１１から１３のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項１５】
α−ジカルボニル化合物の濃度が約１ｍＭである、請求項１４に記載のトキソイド。
【請求項１６】
ジカルボニル化合物がｐＨ６から１４の範囲内の緩衝液に溶解される、請求項１１から１５のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項１７】
ｐＨが８である、請求項１６に記載のトキソイド。
【請求項１８】
反応を３７℃で少なくとも１時間実施する、請求項１１から１７のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項１９】
反応を３７℃で１から１６８時間実施する、請求項１１から１８のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項２０】
反応を３７℃で約２４時間実施する、請求項１９に記載のトキソイド。
【請求項２１】
トキシンが植物から誘導される、請求項１１から２０のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項２２】
トキシンがリシンである、請求項２１記載のトキソイド。
【請求項２３】
トキシンが動物から誘導される、請求項１１から２２のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項２４】
トキシンが蛇毒である、請求項２３に記載のトキソイド。
【請求項２５】
トキシンが細菌から誘導される、請求項１１から２４のいずれかに記載のトキソイド。
【請求項２６】
トキシンがボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはＳＥＢである、請求項２５に記載のトキソイド。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかに記載のトキソイドと、医薬として許容される希釈液または担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
アジュバントを更に含有する、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれかに記載のトキソイドまたは医薬組成物をアンチトキソイド抗体の生成を誘発するための有効量だけ動物に投与する工程と、前記動物から血液を採取し、前記血液から血清を分離して、前記血清から抗体を抽出する工程とを含む、抗毒素の生成方法。
【請求項３０】
抽出された抗体を、生成された特異性除去抗毒素の抗体フラグメントに断片化する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法で生成される抗毒素。
【請求項３２】
トキシン中毒の治療に有用である、請求項３１に記載の抗毒素。
【請求項３３】
請求項３１に従って生成された抗毒素を医薬的な有効量だけ個体に投与する工程を含む、中毒状態の個体を処置する方法。
【請求項３４】
請求項１から２６のいずれかに記載のトキソイド、または請求項２７および２８のいずれかに記載の医薬組成物を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、トキシンによる中毒に対してワクチン接種をする方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の抗毒素を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、ヒトを含めた中毒状態の哺乳動物を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトキソイドおよびトキシンからトキソイドを生成する方法に関する。本発明のトキソイドは、中毒の治療的または予防的療法の創出の他、トキソイドを使用してワクチン接種により生成される抗体を含む治療剤の製造に特に有効である。トキソイドワクチンおよびアンチトキソイド抗体治療、または抗毒素は、本発明の更なる態様を形成する。
【背景技術】
【０００２】
トキシンは、生細胞または生物によって生成される毒物であり、トキシンは植物、動物、微生物（細菌、ウイルス、菌類、リケッチアもしくは原虫を含むが、これらに限定されない。）のトキシン（ｔｏｘｉｃ）ポリペプチドまたは蛋白産物であると因襲的に見なされてきたが、トキシンという用語はまた、生成の起源および方法に関係なく、このようなトキシン（ｔｏｘｉｃ）ポリペプチドおよび蛋白質を模倣する組み換え済み分子または合成分子を包含する。トキシンは通常、体組織に接触または吸収されたときに、疾患を引き起こし、トキシンが抗原として作用し、酵素、細胞受容体およびこれらに類するものと相互作用する。トキシンは深刻度が多様であり、通常は軽微および急性（例えばミツバチの刺し傷）からほぼ即時致命的（例えば、ボツリヌスおよびリシントキシン）までの範囲に及ぶ。蛇毒の多くは強力なトキシンを含有している。一部のトキシンが深刻であり、しかもこの抽出または生成方法が比較的単純であることから、トキシンがテロリストまたは軍事的侵略者によって利用される恐れがあるという懸念が高まってきた。
【０００３】
トキソイドは不活化されたトキシン（つまり、毒性が消去されたトキシン）であるが、例えば、宿主動物において抗体応答を生成して、トキシンに対する免疫応答を誘発する特性を保持している。この理由から、トキソイドは多くの場合、トキシンの作用に対して哺乳動物を防御するワクチンとして、また抗毒素（即ち、トキソイドに対する免疫応答により生成された抗体または抗体産物）の調製においても利用されている。
【０００４】
トキソイドは一般的に、トキシンの化学的不活化によって、例えば、トキシン内の個々のアミノ酸残基同士の直接的な化学反応によって生成される。幾つかのトキシンのトキソイドは、主にトキシン蛋白質内のリシン残基と反応することが知られているホルムアルデヒドを用いて調製されてきた。リシンおよびボツリヌストキシンは両方ともホルムアルデヒドとの反応によってトキソイド化（不活化）に成功しており、これらのトキシンに対する現在のワクチンおよび抗毒素療法は、ホルムアルデヒドの不活化を利用して創出されている。ただし、ホルムアルデヒドによるトキソイド化は手続きが瑣末でない。トキシンは典型的には低濃度（０．２％から０．６％）のホルムアルデヒドに対して高温（典型的には３０℃から３７℃）にて長期間（通常、７日以上）透析される。例えば、ホルムアルデヒドによるリシンの不活化は、典型的には、リシン（１ｍｇ／ｍｌ）をホルムアルデヒド（３７％ｖ／ｖ）で３７℃で２１日間インキュベートすることによって行われる。このため、ホルムアルデヒドによる不活化は、製造の観点で（ラボの規模を越えて）時間もコストもかかる。
【０００５】
加えて、ホルムアルデヒドとトキシンとの反応は複雑であるため、毒性の完全な除去は達成困難な場合が多い。結果的に、ホルムアルデヒドを介して生成されたトキソイドは、適切に貯蔵しないと、活性のあるトキシンに戻る可能性があるという望ましくない特性を有する。この問題は、市販のジフテリアおよび破傷風系トキソイドワクチンにおいて、最終的な組成物中に小量のホルムアルデヒドを配合することによって克服されてきた。ただし、これは望ましい方法ではない。なぜなら、ホルムアルデヒドがヒト発癌物質の可能性があるとして分類されているためである。
【０００６】
また、ホルムアルデヒドを不活化すると、トキシンの立体配座が大きく変化し、トキソイドが免疫学的にトキシンに類似しなくなり特定の中立化エピトープを欠くことから、最終的に、有用な抗体を生成するトキソイドの能力に影響が及ぶこともよく知られている。
【０００７】
例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００４６６号明細書（国際公開第２００６／０８５０８８号として発行済み）に記述されているように、ホルムアルデヒドの代替は公知である。これらには、ボツリヌストキシンを不活性化するヨードアセトアミドの使用が記述されている。ヨードアセトアミドは強力なアルキル化剤であり、トキシン中のシステイン残基を不可逆的にアルキル化する能力を有するが、また、発癌物質の疑いがあるとして同定されてきており、光感応性化合物であることが知られているため、トキソイドの大規模生産での使用が制限される可能性がある。
【０００８】
ゆえに、既存のトキソイド化試薬の欠陥を克服するトキソイド化試薬の開発に対するニーズが存続している。このようなトキソイド化試薬は、残基量のトキソイド化試薬（または、ホルムアルデヒドなどの他の試薬）をトキソイドの何らかの医薬組成物中に配合する必要がない程度に安全ならびに安定していて、トキシンがこの有毒形態に転換されてしまう危険を伴わずに、完全に不活化できれば理想的である。トキシンを完全に不活性化するのに要する時間は、ホルムアルデヒドによるトキソイド化に要する時間に比べてはるかに短く、厳しい反応条件を必要とすることなく室温で実施することが可能であれば望ましい。
【０００９】
本発明の発見者らは、トキシン（特に、蛋白質トキシン）がトキシンを一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’を有する好適な量のα−ジカルボニル化合物と反応させることによって完全に不活性化できるという驚くべき発見をした。このトキソイド調製方法は迅速であり、トキソイドは数日でなく数時間で生成される。２４時間以下でトキソイドを調製できれば好都合である。トキソイド化試薬の必要量は比較的小量であり、このような反応は、従来のホルムアルデヒドトキソイド化に用いられた濃度よりも低濃度を用いて実施することが可能である。一般式Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈ（即ち、ここでＲ’は水素である。）のα−ジカルボニルアルデヒドを使用して生成されるトキソイドは特に有効であり、このようなα−ジカルボニルアルデヒドトキソイド化試薬の例としてのフェニルグリオキサールは、安定ならびに免疫原性であり、外観上トキシンと同等な（即ち、実質的に不変の）二次構造を有する。本発明のトキソイドおよび本明細書中に例証されているトキソイドは、トキソイドが誘導されるトキシンによる中毒の予防的または治療的処置用のワクチンとして使用でき、治療用抗毒素の生成特に有用であり、ひいては中毒の処置にも使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００４６６号
【特許文献２】国際公開第２００６／０８５０８８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明の一態様では、トキシンから誘導されるトキソイドを提供する。ここで、トキシン内のアルギニン残基は、次に示す一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’のα−ジカルボニル化合物との化学反応を経る。
【００１２】
［ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’］。ここで、ＲおよびＲ’は水素（Ｈ）、アルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリール基である。
【００１３】
構造Ａ（図１を参照）。
【００１４】
ジカルボニル化合物のトキソイド化試薬は、上の一般構造に分類される化学化合物であれば、どのようなものでもよい。例えば、構造ＡにおけるＲまたはＲ’は水素であるまたは、任意のアルキル基またはアリール基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、フェニル、この他（または、これらの分枝もしくは置換型の変種）であってもよい。従って、トキソイド化試薬は好都合にも、グリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、４−フルオロフェニルグリオキサール、４−ニトロフェニルグリオキサールおよび４−ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択することができる。これらはいずれも、現在市販されている。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態は、Ｒ’が水素の場合である。かかるトキソイド化剤はケトアルデヒドの一般クラスに分類される。特に好ましいジカルボニル（ケトアルデヒド）化合物はフェニルグリオキサールである（図１）。フェニルグリオキサールは、蛋白質のアルギニル残基と選択的に反応して、（アルギニンの）グアニジン基につき２つのフェニルグリオキサール基を有する生成物を生じることが既に明らかにされてきたが、本発明者らは、フェニルグリオキサールがアルギニル残基に対する高度な特異性を有することで、生成されたトキソイドが完全ならびに不可逆的に不活性化され、トキシン／トキソイドの立体配座構造を有意に変えることなく高度に免疫原性であるという驚くべき発見をした。
【００１６】
理論に束縛されるものではないが、トキソイド化反応は２つの工程に従うと考えられている。第１の工程は、１つのグアニジンのアミノ基と、グリオキサールにおいて立体障害が最小限である炭素原子（即ち、フェニルまたは４−ヒドロキシフェニルグリオキサール内のＣＨＯ基、またはブタンジオンもしくはシクロヘキサンジオン内の２つの同一のＣ＝Ｏ基のいずれか一方）との可逆的な縮合であることが予期される。２番目の工程は、残りのグアニジンのアミノ基の２回目の縮合によってヘテロ環を生成するもので、可逆が容易でないことが予期される。
【００１７】
フェニルグリオキサール（ＰＧ）は、このような形質転換に好適な試薬である。電気陰性のフェニルカルボニル基は、求核攻撃に対して立体障害の少ないＣＨＯ基を活性化することによって、以降の環化を容易にするからである。結果的に、フェニルグリオキサールの誘導体（例えば、４−ヒドロキシフェニルグリオキサール）もまた、トキソイドの生成に使用できる。４−ヒドロキシフェニルグリオキサールは、フェニルグリオキサールに比べて反応性が低い場合があるが、水可溶性が高いため有益であろう。４位に電子求引性基を有するＰＧの他の誘導体（例えば、４−シアノ誘導体、４−フルオロ誘導体、４−トリフルオロメチル誘導体、または４−ニトロ誘導体）は、ＰＧよりも高速に反応し、トキソイドを数分で生成できる可能性を有する。
【００１８】
一般に、アルデヒド基（ＣＨＯ）を有する一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈのジカルボニルトキソイド化試薬は、ケトン基（Ｃ＝Ｏ）を有する一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’のジカルボニルトキソイド化試薬よりも迅速に反応するため、好ましい。
【００１９】
本発明のジカルボニルトキソイド化試薬（特に、フェニルグリオキサール）は、何らかの供給源から誘導されたトキシンのトキソイドを生成する際に使用できる。例えば、蛋白質トキソイドは、植物から誘導されるトキシンから生成することができる。好適な植物トキシンには、アブリンおよびリシンを挙げることができる。以降本明細書中に示すように、トキソイド化試薬は、リシンのトキソイドを調製する上で特に有効である。
【００２０】
ただし、トキシンが動物または微生物から同様に誘導し得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【００２１】
動物毒としては、具体的には、蛇毒（例えば、α−ブンガロトキシン、β−ブンガロトキシン、コブラ毒、クロトキシン、エラブトキシン、タイカトキシンおよびテクスチロトキシン）、クモ毒（例えば、アガトキシン、アトラコトキシン、グラムモトキシン、ラトロトキシン、ホニュートリアトキシン、フリクソトキシンおよびベルストキシン）、ならびにサソリ毒（例えば、マルガトキシン、イベリオトキシン、またはノキシウストキシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
微生物が産生するトキシン、ならびに、特に、細菌、菌類、藻および原生動物が排泄する外毒素はトキソイド化が可能であり、本発明の文脈ではワクチンとして用いられている。細菌により生成されるトキシンはヒトにおける疾患の主因となっているため、特定の臨床的意義を有し、感染の深刻度は、個体にとって致命的なものから下痢性疾患の根本原因のものまでに及んでおり、発展途上国においては健康上重大な問題となっている。従って、本発明のトキソイド化試薬および方法は、細菌トキシンのトキソイドの調製、薬剤として使用および抗毒素の調製に特に有用である。トキソイドの特に有用な例としては、クロストリジウム属ニューロトキシン、例えば、ボツリヌストキシンもしくはテタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシンＡ、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、大腸菌易熱性トキシン、炭疽トキシン、ＳＥＢから生成されるトキソイドが挙げられる。シガ様トキシンは、大腸菌によって産生され得る。トキシンの誘導元となる細菌は、典型的には、疾患の原因に関与する細菌、例えば、クロストリジウムテタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム−ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム−ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シゲラディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ボルデテラ−ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）またはシュードモナス−アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。以下に示すとおり、トキソイド化試薬は、臨床上重要なトキソイド（例えば、Ｃ．ディフィシール、コレラおよびジフテリア）の調製に特に有用である。
【００２３】
本明細書に記載されているトキソイド化試薬および方法は、生物兵器またはバイオテロリズム剤として使用できるトキシンからトキソイドを調製する場合に、特に有用である。この場合、本発明のトキソイドは、ワクチンとして直接用いることも、抗体応答の生成に用いることもできる。この抗体はいったん採取された後、トキソイドの誘導元となるトキシンによる中毒に対する治療的処置の基準となる。
【００２４】
結果的に、第２の態様において本発明は、一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’またはＲ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈのα−ジカルボニル化合物との化学反応を経たトキシンから誘導されるトキソイドを、トキシン（トキシンの毒作用）による中毒の予防的または治療的処置に使用することを目的として提供する。
【００２５】
α−ジカルボニル化合物は、トキソイドの調製に有用である上述の化合物のいずれかであってもよい。特に好適なジカルボニル化合物は、グリオキサール、メチルクリオキサール、ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、４−フルオロフェニルグリオキサール、４−ニトロフェニルグリオキサール、４−ヒドロキシフェニルグリオキサールおよびフェニルグリオキサールからなる群から選択されるものを含むが、これに限定されない。
【００２６】
特定の実施形態において、フェニルグリオキサールは特定のトキシンのトキソイドを調製する場合に用いられる。このトキソイドは、反応混合物から単離されてもよく、必要に応じて精製されてもよく、トキソイドの誘導元となるトキシンに対する予防的または治療的なワクチンとして直接投与することもできる。当該技術分野で一般的であるようにトキソイドは、好適な希釈剤、賦形剤、担体等を用いて医薬として許容される処方物に処方することができる。当該技術分野で理解されるように、処方物は、トキソイドの免疫原性作用を向上させるためのアジュバントを含有してもよい。
【００２７】
従って、このようなトキソイドの生成方法は、本発明の重要な態様である。本発明のトキソイドは、トキシンが実質的に不活性化されるまでトキシンの溶液を一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’（構造Ａ）のジカルボニル化合物の溶液と単純に混合するだけで調製することができる。ジカルボニル化合物をトキシンの溶液に添加し、トキシンが実質的にまたは完全に不活性化されるまで、結果として得られた混合物を好適な温度でインキュベートするのが適切である。トキシンの活性評価のためのアッセイは、当該技術分野において周知であって、本発明の目的上、トキシンの活性は、トキシンおよび引き続いてトキソイドを、トキシンの作用を受けやすいことが周知である細胞培養液に暴露することによって評価することができる。例えば、ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性は、ベロ細胞培養物を特定の濃度のトキシンに暴露する工程と、培養液における細胞の生存能力および／または生育をモニターしてベースライン測定値を形成する工程によって定量することができる。この後、反応混合物から採取されたサンプルを定期的に暴露し、類似する細胞培養液に暴露して、再び細胞の生存能力および／または生育を測定することによって、トキシンの不活化のレベルを測定することができる。
【００２８】
本方法に用いられるジカルボニル化合物は、本明細書に記載されているいずれか１つのジカルボニル化合物であってもよい。特に好適な例は、グリオキサール、メチルクリオキサール、ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびフェニルグリオキサールからなる群から選択される。特定の実施形態において、フェニルグリオキサールは、ホルムアルデヒドがトキソイド化に要する時間よりも有意に短い反応時間で特に安定なトキソイドを生成する目的で使用される。さらに、トキソイド化反応は室温で実施できる。
【００２９】
トキシンの実質的または完全な不活化を達成するには、十分なジカルボニルトキソイド化試薬を用いて天然型トキシンと反応させなければならない。例えば、フェニルグリオキサールを用いる場合は、（天然型トキシン、即ち「ホロトキシン」において自由に利用可能なアルギニン残基の数を基準とした）化学量的な超過量を好都合に用いることによって、トキシンを実質的に、つまり完全に不活性化できることが保証される。大モル過剰のジカルボニル化合物は必要がなく、更なる精製工程を利用するだけで済む可能性が高い。等モル量のジカルボニル試薬およびトキシンを用いれば十分であり、以下に例証されているように、トキソイド化試薬の濃度が低い場合でも、きわめて有効ならびに効率的にトキソイド化が達成される。
【００３０】
結合調査（Ｈｅｒｂｅｒｔ）の促進および作用機序（Ｂｅｌｆａｎｚ；Ｗａｔａｎａｂｅ）の解明を含めた様々な理由から、蛋白質を修飾するために、以前は本明細書に記載されているようなジカルボニル試薬が用いられてきた。しかし、これらの例ではジカルボニル化合物のモル量および濃度が非常に大きく、ジカルボニル対トキシンのモル比が１００：１から３１００：１の範囲に及ぶ。このような比率は、蛋白質構造および機能の基本的な調査に有用であるが、医薬用途には適さないほど高い。本発明では、低濃度のトキソイド化試薬を利用するため、このような高濃度またはモル比を用いる必要がなく、医療用途に特に有用である。
【００３１】
ジカルボニル化合物の濃度が高いと、トキシンの立体配座に歪みまたは変化が生じる可能性があるという点では、ジカルボニルトキソイド化試薬の濃度を抑えれば、有意なメリットがある。この問題は、ホルムアルデヒドを用いてトキソイド化した場合に生じることが既に知られている。本発明の方法は、トキソイド化試薬の不活化が低濃度で発生した結果、トキシンがトキソイド化／不活性化を経た後にこの立体配座構造を維持し得るという特定の利点をもたらす。蛋白質の完全性および質を確保する上で蛋白質の三次元構造は重大な因子となるため、この方法は有益である。ワクチンおよび解毒剤の研究において、高品質な抗体産生応答が確実に行われるようにするには、元のトキシンの属性をできるだけ多く保持する抗原に対する抗体を産生することが重要である。変性蛋白質または自己会合型蛋白質に対する抗体を産生した場合、不利な免疫原性作用を誘導し、および／または生成された抗体血清の作用強度を低減し得るという余計なリスクを伴う。２番目の構造を維持することもまた、トキソイドの安定性を維持する上で重要な因子である。
【００３２】
ゆえに、本発明のトキソイドは好適には約０．０１ｍＭから約１０ｍＭ、より好ましくは約０．０５ｍＭから約５ｍＭまでの範囲、更により好ましくは約０．５ｍＭから約２．５ｍＭまでの範囲の濃度のジカルボニル化合物溶液を用いて調製される。本方法に使用されるジカルボニル化合物の特に好適な濃度は、約１ｍＭである。
【００３３】
特定の実施形態においては、１ｍＭ以下の濃度のフェニルグリオキサールをトキソイド化試薬として使用することによって、良好に折り畳まれていて、トキシンの二次構造を実質的に保持するリシントキソイドを生成する。トキソイドは２４時間で得ることができ、しかも高度に免疫原性である。
【００３４】
トキソイド化反応は中性ｐＨで実施するのが好適であり、緩衝液での処理によって、反応の間中、特定のｐＨを確実に維持できる。特定の実施形態においては、ジカルボニル化合物溶液はｐＨ６から１４までの範囲、より好ましくはｐＨ７から１０の間になるように緩衝液で処理される。また、特定の実施形態においては反応が約ｐＨ８にて維持される。
【００３５】
トキソイドは室温および室圧で調製することができる。ホルムアルデヒドを利用する先行技術の方法に比べると室温および室圧での反応の方がはるかに迅速であり、数時間で完全に不活化されたトキソイドが生成される。（ホルムアルデヒドを用いた場合は、数日または数週間を要する。）このため、本方法はトキソイドの工業生産または大量生産に特に好適なものとなっている。一方、特定の実施形態においては、反応を３７℃で少なくとも２４時間実施する。この温度は生物学的調製物をインキュベートし培養する場合に一般的に用いられている。従って、当業界において既に利用可能であり、反応を一晩で完了できるように反応を早めに完了できるという利点がある。
【００３６】
これゆえ、本方法では反応混合物を３７℃で８時間から１２０時間インキュベートするのが適切であり、好ましくは３７℃で約９６時間インキュベートする。これらの時間尺度は、トキシンを最大限のレベルで確実に不活化するのに十分であるばかりでなく、ホルムアルデヒドによるトキソイド化の現行の要件に比べてかなり短時間で済む。
【００３７】
前掲の反応条件は、上述したように、アブリンまたはリシンなどの植物から誘導されるトキシンからトキソイドを生成する用途に適している。同様に、本明細書に記載されているような動物から誘導されるトキシンを用いる場合にも同じ方法を利用できることを理解されたい。本方法は、蛇毒からトキソイドを生成する用途に特に適している。上述したように、トキシンは好適には細菌から誘導され、特に、ボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはＳＥＢからなる群から選択される。なお、この他のトキシンが本発明の方法を使用して不活化できることは、当該技術分野においてよく理解されるであろう。
【００３８】
理論に束縛されるものではないが、ジカルボニルトキソイド化試薬が選択的にアルギニン残基上のグアニジン基と反応すると考えられている。ただし、選択性のレベルは構造Ａに分類される幾つかのジカルボニル基の間で異なるようである。例えば、フェニルグリオキサールは選択的にグアニジン残基と反応してグアニジン基につき２つのフェニルグリオキサール残基を有する生成物を生じると考えられる一方、グリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオンおよびシクロヘキサジオンは、グアニジン残基内のα−またはε−アミノ基とも反応でき、またはトキシン内のこの他のアミノ酸残基とも反応できる点で選択性が低いと考えられる。こうした選択性のレベルは化合物のトキソイド化能力に影響を及ぼすものである必要はないが、このような副反応が考慮されるように相対量を調整することができる。
【００３９】
トキソイドの最終的構造は、トキソイドを薬剤もしくはワクチンとして用いるか、または抗体もしくは抗毒素の生成に用いる目的で、完全に定量する必要のない場合がある。そえゆえに、本発明は上述および以下に例証された方法で生成されたトキソイドを包含している。好適な実施形態において、トキソイドはフェニルグリオキサールを使用して生成される。この種のトキソイドの具体的な例としては、ジフテリア、コレラ、クロストリジウムディフィシレ、溶血素またはシュードモナスエキソトキシンのフェニルグリオキサールの不活化によって生成されるトキソイドが挙げられる。これらの特定のトキソイドが置換フェニルグリオキサール（例えば、シアン、フルオロ誘導体、トリフルオロメチル、ヒドロキシまたはニトロフェニルグリオキサール）および一般構造Ａに分類されるこの他化合物を使用して調製できることは、もちろん当業者に理解されるであろう。
【００４０】
当該技術分野において周知のように、本発明のトキソイドは好適には医薬組成物中に処方される。これによって、予防ワクチンとして直接投与することも、アンチトキソイド抗体の産生に用いることも可能になり、更に、採取してトキシンの毒作用または中毒の処置に露光後療法として直接使用できる。または、生成された抗体は、抗体フラグメントに加工してもよいし、ヒューマナイズしてもよく、または別の方法でヒト被験者への投与の適合性を改良するように加工することも可能である。
【００４１】
このため、更なる態様において、本発明では上述のトキソイドと医薬として許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含有する医薬組成物を検討する。好適な希釈剤、賦形剤および担体は当業者に公知である。これらは固体または液体の担体を包含することができる。好適な液体担体としては、水または生理食塩水が挙げられる。本組成物のトキソイドは乳濁液の形態に処方してもよいし、生分解性微小球またはリポソームの形態に処方するかこれらに配合することも可能である。
【００４２】
本組成物は、アジュバントを更に含有することができる。本発明の更なる態様では、上述のトキソイドと、医薬として許容される希釈剤または担体と、アジュバントとを含有するワクチン組成物を含む。
【００４３】
アジュバントの多くは、組成物を投与する対象の宿主においてアジュバントが免疫応答を促すという条件では、ワクチン組成物への配合に好適である。特に好適なアジュバントとしては、ＩＳＣＯＭｓ（商標）（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎｉｎｓ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、アルハイドロゲル、ＭＰＬ＋ＴＤＭ、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
この種の組成物およびトキソイドは、トキソイドの誘導元となるトキシンに対するワクチンとしての使用に適している。
【００４５】
加えて、または、上述のトキソイドはトキシンによる中毒を処置するための抗体製造に使用することができる。
【００４６】
結果的に、トキソイドによって生成する抗体は、本発明の更なる態様を形成する。このような抗体は、トキシンの毒作用または中毒の処置に特に有用である。
【００４７】
他の更なる態様において、本発明は抗毒素の生産方法を提供するものであって、この方法は、上述のトキソイドを、アンチトキソイド抗体を誘発するための有効量だけ動物に投与する工程と、該動物から血液を採取し、血液から血清を分離して、血清から抗体を抽出する工程とを含む。この後、当該技術分野において周知の方法を用い、抽出された抗体を精製することができる。
【００４８】
ポリクローナル抗体は、治療用抗体を生成する目的に日常的に用いられる任意の動物（例えば、ウサギ、ネズミ、ニワトリ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシなど）に免疫することによって生成することができる。動物の免疫化には、必要なアジュバントを利用することができる。都合の良いことに、ポリクローナル抗体は、同じ抗血清バッチから、または結合可能な幾つかの抗血清バッチから誘導することができる。
【００４９】
このような方法で生成された抗体は、直接使用してもよいし、または当該技術分野において周知の医薬組成物中に処方することもできる。抗体は、従来の方法を使用してヒューマナイズしてもよいし、またはキメラ抗体を含んでいてもよい。または、特異性除去抗毒素抗体フラグメントを生成する場合は、抗体を断片化する。
【００５０】
抗体のフラグメントは、誘導元となる抗体をかなりの割合で含むため、大きくなる場合がある。例えば、大フラグメントは可変領域全体と定常領域（Ｆｃ）の一部とを含む。特に、大きな抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ａｂ）２フラグメントを含むだけでなく、抗体配列の欠失突然変異体も含む場合がある。特に大きな結合フラグメントはＦ（ａｂ’）２である。
【００５１】
この種の大きい結合フラグメントもまた、従来の方法（例えば、ペプシン等の酵素による酵素消化）を使用して好適にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から誘導され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。または、抗体配列が決定されているという条件では、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用してフラグメントを生成することができる。
【００５２】
抗体の小フラグメントもまた、使用することができる。このような小フラグメントは、トキシンへの結合能を保持しているという条件では、誘導元となる抗体の有意要素が欠如した（例えば、Ｆｃ連鎖の有意部分が欠如している可能性のある）抗体フラグメントを包含する。特に抗体の小フラグメントは、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ’フラグメントの他、単鎖（ｓｃ）抗体、ＦＶ、ＶＨおよびＶＫフラグメントを含む。
【００５３】
抗体フラグメントの利点は、動物の供給源から誘導された抗体を投与するときに、望ましくない副作用のリスクを軽減できることである。
【００５４】
加えて、抗体と抗体フラグメントとの組み合わせは、本発明の特許請求の範囲内で想定される。この種の組成物は、全抗体と大フラグメントもしくは小フラグメントとの混合物、または大フラグメントもしくは小フラグメントの混合物を含み、高速ならびに持続的な抗毒素活性を提供することができるという点で有益である。
【００５５】
トキシン中毒の処置においてそのタイミングのいい機会に影響を及ぼす一因子は、抗毒素が身体中に分散してトキシンの作用部位にいくまでの速度である。全抗体および大きな抗体フラグメントはサイズが大きいため、たいていの場合は小さい抗体フラグメントよりも狭い範囲で血管外の空間に分散される。他方、小フラグメントは、血管外の空間を迅速に通過する抗毒素能力を提供し、迅速な防御を行える可能性が高い。
【００５６】
抗体およびフラグメントからトキシンへの結合は通常可逆的であり、血漿中に残存する少なくとも幾つかの機能抗体または抗体フラグメントが、放出されたトキシンに結合する場合を除き、放出されたトキシンによる「リバウンド」作用のリスクを伴う。小さな抗体フラグメントの急速なクリアランスとは、小さな抗体フラグメントの「モップアップ」への可用性が低く、放出されたトキシンを中和することを意味する。ただし、サイズが大きくクリアランス速度が遅いため、全抗体および大フラグメントは血漿における方が広範に利用可能であり、結果的に、放出されたトキシンを中和するができこれによってリバウンド作用を最小限に抑えることができる。クリアランス速度が遅く血漿中での持続期間が長いことは、全抗体および抗体の大フラグメントによって長期にわたる防御が行われることを意味する。そえゆえに、結果的に、この種の組成物の「プライムブースト」効果によって、本発明の特に好ましい実施形態が作成される。
【００５７】
トキソイドおよび生成されたアンチトキソイド抗体またはフラグメント（即ち、抗毒素）は、トキシン中毒の処置に特に有用である。
【００５８】
それゆえに、発明の更なる態様は、上に記載したトキソイドまたは本明細書に記載の医薬組成物もしくはワクチン組成物を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、トキシンによる中毒に対してワクチン接種をする方法と、上に記載したアンチトキソイド抗体（および／または抗体の組成物、ならびにフラグメントまたは大型および小型の結合フラグメント）を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、中毒の哺乳動物（ヒトを含む。）を処置する方法とを通して形成される。
【００５９】
ここで、以下の図面を参照しながら本発明について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明に係るジカルボニルトキソイド化試薬の一般的な化学構造（構造Ａ）および一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈに対応するこのような試薬の１つであるフェニルグリオキサールの化学構造を示す図である。
【図２】ベロ細胞に対する種々のトキシンの細胞毒性を示す図である。（ベロ細胞系は、アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞から誘導される。）
【図３】図３Ａはα−ジカルボニルトキソイド化剤であるフェニルグリオキサール（５ｍＭ）を３７℃にて７日間使用してトキシンをトキソイド化（不活性化）した影響を示す図である。溶血素のトキシンを用いた場合を示す。図３Ｂはα−ジカルボニルトキソイド化剤であるフェニルグリオキサール（５ｍＭ）を３７℃にて７日間使用してトキシンをトキソイド化（不活性化）した影響を示す図である。ジフテリアのトキシンを用いた場合を示す。図３Ｃはα−ジカルボニルトキソイド化剤であるフェニルグリオキサール（５ｍＭ）を３７℃にて７日間使用してトキシンをトキソイド化（不活性化）した影響を示す図である。シュードモナスエキソトキシンのトキシンを用いた場合を示す。図３Ｄはα−ジカルボニルトキソイド化剤であるフェニルグリオキサール（５ｍＭ）を３７℃にて７日間使用してトキシンをトキソイド化（不活性化）した影響を示す図である。リシンのトキシンを用いた場合を示す。図３Ｅはα−ジカルボニルトキソイド化剤であるフェニルグリオキサール（５ｍＭ）を３７℃にて７日間使用してトキシンをトキソイド化（不活性化）した影響を示す図である。クロストリジウムディフィシールのトキシンを用いた場合を示す。
【図４】図３に記載されているＰＧと同じ条件（３７℃にて７日間）の下２．５％（ｍ／ｖ）ホルムアルデヒドを用いて不活性化したときの影響を示す図である。ホルムアルデヒドの等モル濃度は０．６２５Ｍである。
【図５】図５Ａは０．５ｍＭフェニルグリオキサールが種々のトキシンに及ぼす影響を示す図である。細胞生存率の増加は、トキシンが不活性化されたことを実証している。図５Ｂは０．０５ｍＭ  ＰＧで４８時間および７日間にわたってトキソイド化されたリシンおよびジフテリアの細胞毒性を示す図である。（実線はトキシン単独、破線はトキシン＋ＰＧを示す。）
【図６】０．５ｍＭフェニルグリオキサールを用いトキシンを２４時間、４８時間および９６時間にわたってインキュベートした場合の、時間の影響を示す図である。
【図７】リシンを抗原として投与した後の、最初の３日間にわたるワクチン群間の体重の比較（ＰＧ対ホルムアルデヒド）を示す図である。
【図８】リシンを抗原として投与した後の７日目に選別されたすべての生存している動物から採取された湿潤肺重量データであり、１ｍＭ  ＰＧ群およびホルムアルデヒド（Ｆ）トキソイド群に関して経路、トキソイドおよびアジュバントの影響を比較して示した図である。
【図９Ａ】ホルムアルデヒドで調製されたリシントキソイドワクチンの接種を受けたヒツジに関するＥＬＩＳＡでの抗体滴定量を示す図である。
【図９Ｂ】フェニルグリオキサールで調製されたリシントキソイドワクチンの接種を受けたヒツジに関するＥＬＩＳＡでの抗体滴定量を示す図である。
【図１０Ａ】ベロ細胞（ジフテリア、リシンおよびＣ．ディフィシール）のトキシンの細胞毒性を示す図である。
【図１０Ｂ】コレラトキシンを用いて１時間インキュベートした後にベロ細胞の上澄みに放出されたｃＡＭＰの量（コレラトキシンの毒性評価のための比較アッセイ）を、コレラトキシンの濃度を漸増させて示した図である。
【図１１】図１１Ａは０．５ｍＭ  ＰＧで２４時間処理されたトキシンに暴露されたベロ細胞の細胞毒性を示す図である。図１１Ｂは０．５ｍＭ  ＰＧで７日間処理されたＣ．ディフィシールトキシンに暴露されたベロ細胞の細胞毒性を示す図である。図１１Ｃは０．５ｍＭ  ＰＧを用い７日間トキソイド化された４０ｎＭコレラトキシンに１時間暴露された後にベロ細胞から放出されたｃＡＭＰの濃度を、対照細胞と比較して示した図である。
【図１２】０．５ｍＭ  ＣＨＤまたは５ｍＭ  ＢＤのいずれかを用い７日間トキソイド化された４０ｎＭコレラトキシンに１時間暴露された後にベロ細胞から放出されたｃＡＭＰの濃度を、対照細胞と比較して示した図である。
【図１３】０．５ｍＭ  ＢＤまたはＣＨＤのいずれかを用い７日間処理されたトキシンに暴露された後のベロ細胞の細胞毒性を示す図である。ＢＤで処理されたジフテリアトキシンの正確なＬＣ５０は定量できなかった。
【図１４】０．５ｍＭ  ＰＧを用い、室温にて２４時間または７日間のいずれかにわたって処理されたリシンに暴露されたベロ細胞の細胞毒性を示す図である。
【図１５】グラフＡに示す高用量トキソイド（２．５μｇ／マウス）およびグラフＢに示す低用量トキソイド（０．６２５μｇ／マウス）で免疫された動物について、吸光度４５０ｎｍにおける血清抗体レベルを示した図である（ＨＤ：高用量、ＬＤ：低用量、Ｃｔｒ：未投与（ｎａｉｖｅ）対照）。
【図１６】Ｃ．ディフィシールトキシンＡで１時間インキュベートされた免疫動物の血清に暴露されたベロ細胞の中和アッセイ結果を、血清濃度を漸増させて示した図である。
【図１７】太線で示す無傷の（ｗｈｏｌｅ）天然型リシン（０．１８６ｍｇ／ｍｌ）、破線で示す１ｍＭ  ＰＧリシントキソイド（２４時間、３７℃）、細線で示す３００ｍＭホルミル化リシントキソイドのｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝液について遠紫外ＣＤスペクトルを示した図である。
【図１８】無傷の（ｗｈｏｌｅ）天然型リシンおよびリシンＰＧトキソイド１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）の遠紫外ＣＤスペクトルをＰＧ濃度（０、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０および２０．０ｍＭ）の関数として示した図である。図１８Ａは常温常圧（ＲＴＰ）で２４時間インキュベートした場合を示す。図１８Ｂは常温常圧（ＲＴＰ）で９６時間インキュベートした場合を示す。図１８Ｃは３７℃にて２４時間インキュベートした場合を示す。図１８Ｄは２３３ｎｍにおける平均残基モル楕円率をＰＧ濃度別：−□−（２４時間、常温常圧（ＲＴＰ））、−○−（９６時間、常温常圧（ＲＴＰ））および−☆−（２４時間、３７℃）に示したプロットである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性（細胞生存率アッセイ）
リシン（Ｚａｎ０３０）を、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９５（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ａｌｌｅｎｂｙ，Ａ．Ｃ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｕｐｓｈａｌｌ，Ｄ．Ｇ．（１９９５）．Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｉｃｉｎ  ａｎｄ  Ａｂｒｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ．Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ７（２），２６９−２８８）の方法に従い、Ｄｅｆｅｎｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにてトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取し、調製した。これ以外のトキシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫから購入し、以下の量だけ使用した：
溶血素（１ｍｇ）
クロストリジウムディフィシール（２μｇ）
ジフテリア（１ｍｇ）
シュードモナスエキソトキシン（０．５ｍｇ）
すべてのトキシンを無菌ＰＢＳで希釈して、以下の最終濃度を得た。
溶血素                            １．０ｍｇ／ｍｌ
クロストリジウムディフィシール    ４．０μｇ／ｍｌ
ジフテリア                        １．０ｍｇ／ｍｌ
シュードモナスエキソトキシン      １．０ｍｇ／ｍｌ
リシン                            １．６ｍｇ／ｍｌ
トキシン溶液を５０μＬのアリコートで調製し、使用に必要とされるまで−８０℃にて凍結した。
【００６２】
最初に、図２に示すように、ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性を定量した。図２において、トキシンに４８時間暴露された後の細胞生存率がきわめて低いレベルであることをトキシンの濃度を漸増させて示してあるように、それぞれのトキシンがベロ細胞にとって有毒であることが明示されている。試験したすべての濃度にて、リシンおよびジフテリアがベロ細胞に対して毒性を示し、これらのトキシンの毒性限度がきわめて低いことを実証しており、注目に値する。
【００６３】
［実施例２］
トキソイド化がトキシンの活性に及ぼす影響
実施例１に記載されているジカルボニルトキソイド化試薬がトキシンを不活化（トキソイド化）する能力は、ｐＨ８．０の重炭酸塩緩衝液中に溶かし５ｍＭ濃度になるように調整されたフェニルグリオキサール（「ＰＧ」）（図３Ａ）を使用して実証されている。比較対照の目的で、ＰＧによるトキソイド化の影響を一般的に使用されているホルムアルデヒドと比較するために、ホルムアルデヒド（２．５％）を用いた不活性化も行った。トキシン溶液を３７℃にて７日間インキュベートして、ホルムアルデヒドを用い完全に不活性化を行った。
【００６４】
結果は図３に示すとおりである。図から明らかであるように、５ｍＭ  ＰＧに３７℃にて７日間暴露することによって、すべてのトキシンが完全に不活化された。対照データセットは、トキソイドに対して評価される等濃度の未処理トキシンを指す。
【００６５】
図４に示すように、７日後でさえ、必ずしもすべてのトキシンがホルムアルデヒド処理で不活化されるとは限らなかった。
【００６６】
［実施例３］
トキソイド化能力に対する濃度の影響
実施例２に記載されている実験を、０．５ｍＭおよび０．０５ｍＭなどのような低濃度のＰＧを使用して繰り返した。０．５ｍＭの濃度において完全に不活化されたトキシンは、５種類中３種類（溶血素、Ｃ．ディフィシールおよびコレラ）であった。このことは図５Ａに示すとおりである。０．０５ｍＭ  ＰＧでは、（図５Ｂに示すとおり）トキソイド化の影響がまったく観測されなかった。このことは、少なくとも０．５ｍＭを超える濃度において、ＰＧが効力のあるトキソイド化剤であることを実証している。
【００６７】
［実施例４］
フェニルグリオキサールを用いた場合のトキシンの不活性化の速度
上述のアッセイおよび方法を使用して、リシンおよびジフテリアのトキシンが完全に不活性化されるまでに要する時間の長さを評価した。ただし、トキシンおよびＰＧのインキュベーションは２４時間、２８時間および９６時間後に終了させた。結果は図６に示すとおり、わずか２４時間後でも０．５ｍＭ  ＰＧがリシンおよびジフテリアのトキシンの両方を完全に不活化できることがはっきり証明されている。このことは、ＰＧが低濃度のトキソイド化試薬を用いかなり短い時間で完全に不活性化する点で、従来のホルムアルデヒド処理よりも有意に優れていることを示唆している。
【００６８】
［実施例５］
Ｃ．ディフィシールトキシンの不活化
実施例４に記載されている実験をＣ．ディフィシールに対して実施したが、４８時間後に不活性化が完了しなかった。しかしながら、７日後には完全に不活性化が観測された。このことは、従来のホルムアルデヒドで処理した場合（３週間）よりも所要期間が大幅に短縮されることを表している。これらの結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
［実施例６］
代替のリシントキソイドとアジュバントとの組み合わせを使用して達成される防御の質
リシントキソイドを上述の説明に従って調製した。トキソイドが防御免疫応答を誘発する能力は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを５×ＬＣｔ５０のエアロゾル化したリシンに暴露した後、新規なリシンワクチン候補（フェニルグリオキサール（ＰＧ）ホロトキシントキソイド）の免疫原性および防御作用を、標準リシンワクチン処方物（ホルムアルデヒドで不活化されたリシンホロトキシン）と比較することで実証された。ワクチン候補を皮下経路または筋内経路のいずれかを介して投与し、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（２０％ｖ／ｖ）またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（５μｇ／動物）のいずれかで処方した。リシンを抗原として投与する前に、ワクチン抗原に対する体液性抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）応答を測定した。トキシンを抗原として投与した後の最大７日間、生存率、体重の変化、ならびにリシン中毒の徴候および症状を測定して、防御の質もモニターした。２０ｍＭ  ＰＧトキソイドは、投与経路またはアジュバントタイプに関係なく、防御免疫応答の誘発に失敗した。このトキソイドは、食塩対照と同様に無効であった。１ｍＭ  ＰＧトキソイドを用いた免疫によって、血液中のリシン特異的ＩｇＧ１の濃度上昇によって特徴付けられる強力なＴｈ２型応答が誘発され、暴露の後に、ホルムアルデヒドトキソイド（Ｆトキソイド）を用いた場合に見出されるのと同様な高度な防御が行われた。ＦトキソイドおよびＰＧトキソイドの両方の皮下免疫および処方は、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いた場合に、筋内ルートおよびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘを用いた場合より防御の質が低いことが見出された。この実験は、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘを用いて処方されたＰＧでトキソイド化されたリシンホロトキシンが、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで処方される現行のＦトキソイドと少なくとも同等であり、特定の特性に関しては優れている可能性があることを示す。
【００７１】
リシンの精製
天然リシンは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  １９９５（上記）の方法に従いトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取されて組織内で調製された。種子を塩化ナトリウムで均質化し、次にＨＣｌでｐＨ４．８に酸性化した。この後に、４℃にて一晩撹拌する。翌日、ホモジェネートを遠心分離し、種子破片および石油エーテルで澄ませた上澄みを取り除いた。続いて、結果として生じた可溶性蛋白質を遠心分離（３００ｇ）により沈殿させた後、過剰量の硫酸アンモニウムを加えて、沈殿物を回収した。沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、濾過して、透析によって残留硫酸アンモニウムを取り除き、それから、使用前まで２０ｍｌのアリコート中に貯蔵する。使用する当日に天然トキシン溶液を１３，４００ｇにて５分間遠心分離し、新たに形成された固体破片を取り除いてから、結果として得られた溶液を吸入検査用に調製した。酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）での検査用に、（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，上記）に記載されている完全な方法に従い、精製リシンホロトキシンを調製した。
【００７２】
トキソイド
Ｆトキソイドを調製し、ホルムアルデヒド（３７％ｖ／ｖ）をリシン（１ｍｇ／ｍｌ）に加えた後、最終濃度２．５％ｖ／ｖ（０．６２５Ｍホルムアルデヒドと等量）を得た。この混合物を３７℃にて３週間インキュベートしてから、最終濃度が０．１Ｍになるまでリシンを添加した。この後、ＰＤ１０クロマトグラフィカラムを使用して溶液を脱塩して生理食塩水にした。等量のトキシン（２ｍｇ／ｍｌ）およびフェニルグリオキサール（ｐＨ８の２ｍＭまたは４０ｍＭ重炭酸塩緩衝液）を添加してＰＧトキソイドを調製すると、１ｍＭおよび２０ｍＭフェニルグリオキサール中で最終濃度１ｍｇ／ｍｌのトキシンが得られる。次いで、溶液を室温および圧力にて９６時間インキュベートした。インキュベーション後に、ＰＤ１０クロマトグラフィカラムを使用してＰＧトキソイドを脱塩して生理食塩水にした。各トキソイドの蛋白質濃度は、以前に公開された方法（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １７（１９９９）２５６２−２６６８）を使用して測定された。両方のトキソイドのアリコートは、使用するまで−８０℃で冷凍貯蔵された。
【００７３】
動物群
雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｇａｔｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ：体重２０ｇ）を、生理食塩水、Ｆトキソイド、１ｍＭ  ＰＧトキソイドおよび２０ｍＭ  ＰＧトキソイドからなる４つのワクチン群（ｎ＝２４頭の動物／群）に分けた。これらのすべての群からの動物を、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（２０％ｖ／ｖ）またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）（５ｕｇ／動物）のいずれかを用いて処方された群に更に分けて、皮下（ｓ．ｃ．）または筋内（ｉ．ｍ．）の２経路のうちの一方を介して投与した。これにより、合計１６群（ｎ＝６頭の動物／群）が得られた。０日目および２１日目にマウスにワクチン処方物（５μｇ／ｋｇ体重）を注射し、３５日目にすべての動物を５×ＬＣｔ５０のエアロゾル化した天然リシンに暴露させた。トキシンを抗原として投与する２４時間前に、尾静脈血液サンプル（１００μＬ）を採取し、４℃で一晩インキュベートしてから、１３，４００ｇにて１分間遠心分離した。分離された血清を除去して−２０℃で貯蔵してから、リシン特異的ＩｇＧｌおよびＩｇＧ２ａ濃度を測定する。
【００７４】
リシン特異的血清抗体の測定結果
リシン特異的血清に対する抗体レベルＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを、間接ＥＬＩＳＡを使用して定量し、精製マウス免疫グロブリン（ＩｇＧｌまたはＩｇＧ２ａ）の標準曲線との照合によってサンプルを分析した。９６ウェルマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＨＢポリスチレン製平底マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ））のＡ列に、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）（１ウェルあたり１００μＬ）を塗布した。残りのウェルにＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ精製リシンホロトキシン（１ウェルあたり１００μＬ）を塗布し、これらのプレートを４０Ｃで一晩インキュベートした。次の日に、自動プレート洗浄器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ）を使用して１ウェルあたり３００μＬの洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有する１倍濃度のＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、ウェルをＰＢＳ中１００μＬの１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｔｔｏ（脱脂乾燥粉ミルク粉末（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ））を加えて３７℃にて１時間ブロックした。ブロック後、連続希釈法（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を使用して開始濃度１０μｇ／ｍｌにてＡ列に精製マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）の標準曲線を作成した。血清サンプル（希釈剤：ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｔｔｏ）を繰り返し分析し、プレート（列ＣからＨ）全体を順次に希釈した。事前に同定された標準品質の対照血清サンプル（リシンに暴露後のマウスプール血清）も分析し、ブランクには希釈液のみを用いてプレート間変動性（列Ｂ）を確認する。プレートを３７℃にて１時間インキュベートしてから、洗浄した（上述）。ヤギ抗マウスＩｇＧ１：ＨＲＰ（希釈液中１／２０００の濃度に希釈）およびＩｇＧ２ａ：ＨＲＰ（希釈液中１／１０００の濃度に希釈）（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用い３７℃にて１時間にわたって、リシン特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの検出を行った。最終的な洗浄工程を実施した後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６スルホン）酸）とＨ２Ｏ２（０．０１％ｖ／ｖ）からなる比色基質をクエン酸リン酸緩衝液に添加した。プレートを３７℃にて３０分間インキュベートして顕色させた。４１４ｎｍにてプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  プレートリーダー）を読み、分析した。
【００７５】
サンプル抗体レベルを標準曲線と比較して定量し、相対μｇ／ｍｌ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａとして表した。用語ｒｅｌａｔｉｖｅは、抗動物種（ａｎｔｉ  ｓｐｅｃｉｅｓ）免疫グロブリンとそれぞれの標的に結合しているリシン特異的免疫グロブリンとの間に結合動力学の差異があり得るという理解を意味する。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔプレートリーダーにて４つのパラメータロジスティック（ＰＬ）曲線（処方物：ｙ：＝ｂ＋（α−ｂ）／（１＋ｘｃ）ｄ；ここで、ａ＝最大値シグナル、ｂ＝極小波長シグナル、ｃ＝変曲点における濃度、ｄ＝勾配）を使用して、サンプルを分析した。４ＰＬ曲線の線形部分からサンプルＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを読んだ。ここで、平行は最良適合であった。品質管理データで定量されたプレート間変動性は３０％ＣＶ未満であった。
【００７６】
吸入誘発
Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ定出力ネブライザーを使用してエアロゾル濃度が６．３６μｇ蛋白質／リットルの空気（５×ＬＣｔ５０）を生成し、天然リシンのＰＢＳ溶液（２０μｇ／ｍｌフルオレセイン含有）からリシンエアロゾルを生成した。ＬＣｔ５０はあらかじめ組織内での検査によって定義された。動物暴露システムは、横の長さ１．４メートルのガラスチューブに１２ポート（両方の側部に沿って６ポートずつ）を設けて構成されている。動物をプレチスモグラフィチューブ（リアルタイム呼吸モニター用）にローディングして、ポートに繋いだ。動物の頭がエアロゾルストリームに投入され、首の回りにぴったりと嵌入されたラテックス隔膜は体内に毒物が到達するのを防いでいる。エアロゾル濃度を見積もるために、フルフローインライングラスファイバーフィルターでエアロゾルを捕捉し、各分析（ｒｕｎ）後に回収した。このフィルターを５０ｍｌのＰＢＳ中で機械的に振盪して崩壊させた。フィルター停止のアリコートを採取し、１３，４００ｇにて５分間遠心分離して、上澄みの適切な希釈度を蛍光定量的に測定した（励起５１３ｎｍおよびエミッション４８７ｎｍ）。エアロゾル中のトキシン濃度を、捕獲されたフルオレセインの量、当初のサンプル中のフルオレセイン対トキシンの既知の比率に、暴露時間（１０分）および動物の鼻を通して排出された空気の全容量に基づいて計算した。動物ごとの吸入量を（リアルタイムプレチスモグラフィデータに基づく）吸入容積およびエアロゾル濃度から計算した。
【００７７】
暴露後、動物を吸入ラインから取り出し、収容ケージに戻した。生存率、体重、ならびにリシン中毒の徴候および症状を７日間にわたって毎日記録した。７日目に生き残っていたすべての動物に過剰量のペントバルビタールナトリウム（Ｅｕｔｈａｔａｌ）（０．７ｍｌ／ｋｇ）を投与して殺し、肺を取り除いて体重を計測した。
【００７８】
統計分析
一元配置分散分析法を実施して、毎分換気量に対する経路、アジュバントおよびトキソイドの効果を確証した。循環血中のリシン特異的抗体濃度（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）ならびに体重（時間に対する反復計測）に対して３とおりの分散分析方法を実施することによっても、経路、アジュバントおよびトキソイドの効果を確証した。ボンフェローニ事後試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ−ｔｅｓｔ）を使用して、群間の有意性も更に同定した。
【００７９】
フィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）および序数ロジスティック回帰分析（ｏｒｄｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施し、生存率、ならびにリシン中毒の徴候および症状に対する経路、アジュバントおよびトキソイドの効果をそれぞれ確証した。生存率、体重の変化、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ濃度間の相関は、ピアソンランク試験（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用して実施された。
【００８０】
あらゆる場合において、０．０５未満のｐ値は有意であると見なされた。
【００８１】
結果
抗体応答
吸入されたリシン暴露される前に得られた循環血中リシン特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルは、表２で概説したとおりである。トキソイドの投与経路またはアジュバントタイプに関係なく、２０ｍＭ  ＰＧトキソイドは整合的または強健な免疫応答の開始に失敗した。つまり、生理食塩水対照に対して得られたほどの統計的有意性はない。
【００８２】
Ｆトキソイドおよび１ｍＭ  ＰＧトキソイドは、強力なリシン特異的ＩｇＧｌ応答を誘発し、ＩｇＧｌ濃度は、Ｆトキソイドを投与された動物における方が一般的に高くなった。更なる調査では、ルート、トキソイドおよびアジュバントの複合的な相互作用が観測された。筋内経路でトキソイを投与した場合は一般的に、抗体応答が強化される。Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘが存在する場合も、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌが存在する場合に比べて抗体レベルが高まる。
【００８３】
両方のトキソイドとＩｓｃｏｍａｔｒｉｘとの処方物は、経路に関係なく緩和なＴｈ１型応答を誘発した。このことは、ＩｇＧ２ａの血中循環レベルの増大によって示された。
【００８４】
吸入データ
生存率において観測された差異を、吸入されたトキシンのレベルの増加に起因したものでないことを確認するために、毎分換気量、更にはトキシンの総吸入量に関してすべての群を比較した。リシンエアロゾルを抗原として投与する間、どの群の間でも統計的な有意差は観測されなかった（範囲：４７．８ｍｌ．ｍｉｎ−１から６７．５ｍｌｓ．ｍｉｎ−１、ｐ＝０．７７）。
【００８５】
【表２】
2013531686.tif 000004
【００８６】
生存率
５×ＬＣｔ５０のエアロゾル化した天然リシンに暴露された後のすべての動物を、７日間にわたって毎日をモニターした。死亡を記録し表４に示した。すべての対照（アジュバントを含む生理食塩水）動物は３日から５日の間に死亡した。このデータは、２０ｍＭ  ＰＧトキソイド群に対して確認されたデータと有意差はなかった。
【００８７】
Ｆトキソイドまたは１ｍＭ  ＰＧトキソイドのいずれかのワクチンの接種を受けた動物は、リシンを抗原として投与された後の生存率が対照動物に比べて有意に高かったが、ワクチンの接種を受けた動物同士の間では有意差がなかった。一方、個体群を更に詳細に調査したところ、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで処方された１ｍＭ  ＰＧトキソイドを皮下経路で免疫された動物のうち、生き残ったのは５０％にすぎなかった。生存率を循環血中のリシン特異的ＩｇＧ１濃度（データ不表示）と比較すると、有意な正相関（ｐ＜０．０５）が観測された。このことは、死亡した動物は防御抗体の濃度が最低であった傾向にあることを示している。
【００８８】
【表３】
2013531686.tif 000005
【００８９】
【表４】
2013531686.tif 000006
【００９０】
体重
体重の変化の測定は、動物の健康状態を示す良い指標であり、Ｆトキソイドおよび１ｍＭ  ＰＧトキソイドによる防御の質の違いを見分ける助けにもなり得る。リシンを抗原として投与した後の最初の３日間にわたるワクチン群間の体重の比較は、図７に示すとおりである。この期間を超えると、生存率レベルの違いからデータを解釈しづらくなる可能性がある。生理食塩水および２０ｍＭ  ＰＧトキソイドワクチンの接種を受けた動物は、トキシンに暴露された後で同様に応答した。両方の動物の体重は、暴露前の当初より最高２０％減少した。単に群ごとに（即ち、すべて１ｍＭ  ＰＧ対すべてＦトキソイドの動物）データを分析してみると、Ｆトキソイドまたは１ｍＭ  ＰＧトキソイドのいずれか一方を投与された動物は対照に比べて体重の減少が少なかった。ただし、このことはＦトキソイドデータセットに関してのみ有意であった。１ｍＭ  ＰＧデータセットが有意水準に達しなかった理由は、このワクチンが皮下経路で投与されたときに作用が乏しいことに起因する。
【００９１】
体重の変化と、循環血中のリシン特異的ＩｇＧ１抗体（ｐ＜０．００１）および生存率（ｐ＜０．０５）（データは非公開）の両方との間には、有意な負の相関係数が存在する。ただし、あらゆる場合において皮下経路でワクチンを投与された動物は、最初の３日間で連続的に体重が減少した。
【００９２】
筋内経路でワクチンを投与された動物は、体重が回復し始めるのがより速やかで、２日目以後に平均体重が増大した。
【００９３】
中毒の徴候および症状
生存中のすべての動物におけるリシン中毒の徴候および症状を最高７日間にわたって評価したが、群間の比較はすべての動物が生きている場合に３日目に行った（表５）。動物は暴露されてから２４時間以内にリシン毒作用による徴候を示し始めた。対照群および２０ｍＭ  ＰＧトキソイド群においては死亡に至るまでにリシン中毒の徴候の強度が漸増した。
【００９４】
Ｆトキソイドまたは１ｍＭ  ＰＧトキソイドを受けている動物は中毒の徴候および症状が有意に少なかったが、１ｍＭ  ＰＧトキソイドを投与された群は、Ｆトキソイド群と比べてはっきりした中毒の徴候を有する傾向があった。リシン中毒の徴候および症状と、循環血中のリシン特異的抗体（データは非公開）との間には、有意な（ｐ＜０．０１）相関がある。このことは、血中の抗体濃度が低いほど防御の質が乏しいことを示している。
【００９５】
【表５】
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【００９６】
肺湿潤重量
トリシンを抗原として投与されてから７日後に選別された生存中のすべての動物からの肺の重量を計り、データを組み合わせて経路、アジュバントおよびトキソイドの影響を比較した。１ｍＭ  ＰＧトキソイド群とＦトキソイド群とでは、肺湿潤重量に統計的な差異がない。経路およびアジュバントの影響は、図８に示すとおりである。ワクチンを皮下経路から接種され、ならびにａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いた処方を受けた生存中の動物は、ワクチンが筋内経路から接種されたかまたはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘを用いた処方を受けた動物に比べて肺が有意に重かった。このことは、動物がワクチンを皮下経路で投与されならびにａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いた処方を受けた場合、吸入したリシンに対してなされる防御は最小限になるという観測を裏づける。肺湿潤重量は、リシン特異的ＩｇＧ１抗体の血中循環のレベルに対して負の相関（ｐ＜０．００１）を示すだけでなく、リシンを抗原として投与されてから３日後の体重の変化（％）に対しても負の相関（ｐ＜０．０００１）を示す。これとは逆に、毒性の徴候および症状に対しては、有意な正の相関（ｐ＜０．０００１）が観測された。
【００９７】
考察
この研究では、先に特徴を述べてきたトキソイド化アプローチ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで処方されたＦトキソイド）を使用して、代替のトキソイド化工程（フェニルグリオキサールを利用する工程）の可能性を調査し、新規なリシンワクチン候補を生成する。１ｍＭ  ＰＧを使用して調製されたトキソイドをＢａｌｂ／Ｃマウスに免疫すると、免疫スケジュール全体を通じてすべての動物が十分な耐容性を示した。高濃度の循環血中リシン特異的ＩｇＧｌ抗体を誘導した結果、大多数（２０／２４）の動物が、超致死用量のエアロゾル化トキシンに暴露された後も生き残った。以降の７日間の観察期間を通じて、これらの動物が示した中毒の徴候および症状は最小限で、体重の変化は、食塩水を免疫された動物に対して観測されたほどは明確でなかった。これらの観察結果は、Ｆトキソイドについて得られた結果（生存率２３／２４）と同等であり、ＰＧを用いリシンホロトキシンを化学修飾することによって生成されるトキソイドは、ワクチン接種検査においてリシン暴露による外傷および死亡を防ぐための代替アプローチとなり得るというここでの議論を裏づけている。
【００９８】
リシン中毒後に肺を損傷作用および死亡から防御できるライセンス可能な製品は一切ないが、免疫学を基礎にした幾つかの方策が探究されていて、これらの方策にはリシン特異的抗毒素およびワクチンの使用が含まれている。初期の臨床試験に存在する現行ワクチンの候補は、リシンＡ鎖の短縮形態または変異形態である。ラボでの初期試験では、Ａ鎖候補によって開始された防御免疫応答が、ホルマリン系リシンホロトキソイドによる防御免疫応答ほど強力でなかったことが一貫して見出された。しかし、ホルムアルデヒド系トキソイドに関しては、幾つかの欠点が同定された。これらの欠点としては、トキシンの不活化が不完全であることおよびトキソイドが活性トキシンに転換されてしまう可能性のあることが挙げられる。この上、長時間のインキュベーションおよび高濃度のホルムアルデヒドによって、蛋白質の三次構造に変化が起こる可能性がある。サブユニットワクチンアプローチに対する現実的代案としてリシントキソイドを重視する必要があるなら、これらの問題を克服しなければならない。
【００９９】
これまで、新規アプローチにてＰＧを用いリシンをトキソイド化することの有用性を探索してきた。フェニルグリオキサールは、リシンＡ鎖を含む蛋白質中のアルギニン残基の役割を研究するための調査ツールとしてよく使用される、反応性ケトアルデヒドである。他のトキソイド化手順では、免疫原性の低下を伴わずにトキシンを不活性化できるかどうかが探索されたが、これらの成功の程度は多様であることが示された。我々のラボでの最近の研究によると、１ｍＭを超える濃度では、ＰＧ系リシントキソイドの蛋白質の三次構造が変更され得る。このことは、トキソイドの免疫原性に対して大きな影響力を有する。この研究では２０ｍＭ  ＰＧトキソイドが免疫反応を誘発しなかったため、生理食塩水を用いた場合と同様、吸入されたトキシンの致死作用から動物を防御する効果はなかった。１ｍＭ  ＰＧでは、リシンの構造完全性は維持されるが、蛋白質の細胞毒性は除去される。このＰＧトキソイドは免疫原性が高度であり、Ｆ（ホルムアルデヒド）トキソイドと同等な防御免疫応答を誘発し得ることも見出された。
【０１００】
リシンの吸入が死を招く原因は、重篤な肺損傷によって肺水腫が生じ、結果として生じる呼吸不全に陥るためである。この研究で、（７日目に初めて生存者から採取された）肺湿潤重量は、ＰＧトキソイドおよびＦトキソイドを投与された後も変化がなかった。一方、筋内経路でＩｓｃｏｍａｔｒｉｘを投与された動物の方が、表肺湿潤重量が有意に軽く、リシンの損傷作用に対する防御がより強力であることが判る。一般的には、特異的抗体がリシンを中和することによって防御が遂行されると考えられている。我々のデータはこの見解を裏づけ、循環血中のリシン特異的抗体の濃度が高いことと肺の損傷が少ないこととの間の相関を示している。この相関は中毒の徴候および症状、ならびに体重減少（％）の裏づけにもなっている（表３）。徴候および症状に関して、高感度な健全性指標として、毒物学者が久しく用いてきたのは体重である。この研究では、無防備な動物が、リシンを抗原投与されてから３日後には当初の体重の最高１／５を失った。２０ｍＭ  ＰＧトキソイドをワクチン接種された動物は、生理食塩水対照群とほぼ同じレベルで体重が減少した。この体重減少と以後の死は、接種されたワクチンが予防ワクチンでなかったことを示唆している。他の調査結果に対するこの相関は、リシンにおける大きな構造変化が、２０ｍＭ  ＰＧと共にインキュベートしたことに起因することを立証している。防御の欠如は、結果として得られた構造に変化が生じリシンの適切な抗原性を改変したことを強く示唆している。
【０１０１】
ワクチン投与によって誘導される免疫応答は動物間で異なるだけでなく、経路の関数としても変化することが、研究によって判ってきた。従って、必要とされる応答のタイプおよび大きさを決定する際には、経路の選択を慎重に考慮する必要がある。免疫細胞プロフィールは公知のとおり部位ごとに異なり、外因性抗原に暴露されると、局所Ｔ細胞およびＢ細胞、ならびに分泌されたサイトカインのパターンが更に変化する可能性がある。組織サイトカインプロフィールによってＴｈ１／Ｔｈ２バランスが示され、更に免疫応答の特徴が決定される。本研究においては原発性ワクチンとブースターワクチンとを同じ経路で投与したが、筋内経路の方が有効であった。この理由は定かでないが、免疫学的応答において、異なるコンパートメントからの退化、提示およびドレナージが重要である。幾つかの研究によって、免疫プロトコール中にワクチン接種の経路を変えると、免疫応答を相乗作用で広範化し改善できることも示されてきた。ＰＧトキソイドに関してこのことは未調査であるが、特に吸入されたリシンに対する防御は最も懸念されるため、粘膜免疫は付加的な経路として考慮されている。
【０１０２】
重要なトキシン（例えば、リシン）に対抗する有効なワクチンが必要とされている。トキソイドの免疫学的特性を増強するためにアラム（ａｌｕｍ）を使用した１９２６年度の最初の研究以来、ワクチン接種後の免疫応答の誘発および増強におけるアジュバントの役割が知られるようになった。アジュバントは、免疫系をＴｈ１またはＴｈ２免疫にバイアスして抗原に対して有意に免疫応答を増強する化合物として定義できる。ヒト用途に使用されるアジュバントは厳しい要件を果たす必要があるため、適切なアジュバントの可給度は制限される。
【０１０３】
現在、アルミニウム系化合物は、ヒトワクチンまたは獣医学的ワクチンに広く使用されている唯一のアジュバントであり、新規なアジュバント処方物を評価するためのベンチマーク（または、基準）となっている。本研究における処方物（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合されたＦトキソイドおよび１ｍＭ  ＰＧトキソイド）はＴｈ２型応答の誘発に有効であった。ただし、処方物中にＩｓｃｏｍａｔｒｉｘを使用したため、同じ用量の抗原に対してきわめて高度なＴｈ２型応答が誘発された。同時に誘発されたＴｈ１型応答は緩和であった。
【０１０４】
Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘは、種々のサイトカインを誘発させるための既知の強力な免疫調節物質であり、サイトカインは抗体および細胞性免疫応答の両方を媒介して、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の数を増加させる。Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘアジュバントのこれらの特性は、Ｔヘルパー細胞応答をより効率的に発生させ、Ｂ細胞によって媒介される抗体応答を増強し得る。
【０１０５】
これらの結果によると、フェニルグリオキサールを使用してリシンを化学的にトキソイド化することによって、防御免疫応答を誘発できる構造的に安定なワクチンの候補が生成される。この応答の有効性は、現行のホルムアルデヒド系トキソイドと同等に有効であり、筋内経路から投与し、ならびにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを用いて処方した場合、ヒト用途のリシンワクチンの開発にとって望ましいアプローチとなり得る。
【０１０６】
［実施例７］
ＰＧトキソイドが治療用抗体を生成する能力
本発明の方法およびジカルボニルトキソイド化試薬を使用して調製されたトキソイドの免疫原性を評価するために、６匹のヒツジの群に、１００μｇのトキソイドおよびフロイント完全アジュバントを含有する医薬品組成物を免疫した。この後、６週目、１２週目、１８週目、２４週目および３０週目に、同じ量のトキソイドおよびフロイント不完全アジュバントで効果を高めた。リシンを上述のホルムアルデヒドまたはフェニルグリオキサールでトキソイド化された。結果は図９に示すとおりである。当分野で公知のように、標準ＥＬＩＳＡアッセイで測定される抗体価は、アンチトキソイド抗体に特異的である。図９Ａは、従来のホルムアルデヒドの不活性化を用いて調製されたキソイドから得られた結果である。フェニルグリオキサールを不活性化して得られた同等な結果は図９Ｂに示すとおりである。
【０１０７】
１００μｇのトキソイドのワクチン接種した場合でさえ、フェニルグリオキサールを用いて調製されるトキソイドの免疫原性は、従来のホルムアルデヒドの不活化によって調製されるトキソイドと少なくとも同等である。事実上、週単位で見た場合、５０週後に、ＰＧトキソイドからの抗体滴定量が最大の約８０ｍｇ／ｍｌに達した一方、ほぼ同じ期間を通してホルムアルデヒドトキソイドからの抗体滴定量は最大約４５ｍｇ／ｍｌに達した。ＰＧで調製されたトキソイドはホルムアルデヒドで調製されるトキソイドに勝るとはいかないまでも少なくとも同じ程度であり、少なくとも免疫原性および防御はホルムアルデヒドトキソイドと同じ程度で、毒性が低く、しかも２４時間以下というかなりの短期間に低濃度でトキシンを完全に不活化できるという更なる利点を有することが実証された。
【０１０８】
［実施例８］
細胞死を引き起こさない付加的なトキシンから調製されたトキソイド；コレラトキシンの細胞毒性
ジフテリアトキシンおよびコレラトキシンは両方とも、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫから購入した。クロストリジウムディフィシール（Ｃ．ディフィシール）トキシンＡはＱｕａｄｒａｔｅｃｈ  Ｌｔｄ，Ｅｐｓｏｍ，Ｓｕｒｒｅｙから購入した。リシントキシンは実施例１に記載されている方法と同様にＤｓｔｌにてトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取されて組織内で調製した。すべてのトキシンを滅菌水で再構成し、下記の最終濃度を得た：
コレラ                                          ２．０ｍｇ／ｍｌ
クロストリジウムディフィシールトキシンＡ        １．０ｍｇ／ｍｌ
ジフテリア                                      １．０ｍｇ／ｍｌ
リシン                                          １．６ｍｇ／ｍｌ
トキシン溶液を５０μｌアリコートに分け、使用するまで、Ｏリングで密封されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブで−８０℃にて凍結する。
【０１０９】
ベロ細胞におけるジフテリアトキシン、リシントキシンおよびＣ．ディフィシールトキシンの細胞毒性は、前と同様に定量された。結果は図１０Ａに示すとおりである。４８時間の暴露後にベロ細胞の生存率が濃度依存的に低下したことに示されているように、これらのトキシンのそれぞれはベロ細胞培養液中で細胞毒性を呈することが見出された。ＷＳＴ−１試薬を用い３時間インキュベートし、プレート上で４５０ｎｍにおける測定値を読み生存率を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０を使用したデータに適合する４つのパラメータロジスティックを使用して、感受性細胞の５０％を死に至らしめる濃度（ＬＣ５０）を計算した。これらの値は図１０Ａに示すとおり、Ｃ．ディフィシール＝７ｐＭ、リシン＝０．９ｐＭ、ジフテリア＝０．２ｐＭである。
【０１１０】
コレラトキシンは細胞死を引き起こさないため、同じ細胞毒性アッセイを使用してこの影響を調査することはできない。ベロ細胞をコレラトキシンに暴露すると環状ＡＭＰが増加することは知られているので、ベロ細胞内の環状ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）を測定する際は、代替アッセイを使用した。ベロ細胞を３とおりの濃度のコレラトキシン（１０ｎＭ、２０ｎＭおよび４０ｎＭ）と共に１時間インキュベートした。塩酸を使用して細胞を溶解させ、結果として得られた上澄みを市販の環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）ＥＬＩＳＡキットで分析（ｒｕｎ）し、変化を測定した。図１０に示す結果は、コレラトキシンを用い１時間インキュベートした後にベロ細胞のｃＡＭＰレベルが用量依存的に増加したことを示している（図１０Ｂを参照）。
【０１１１】
［実施例９］
様々なα−ジカルボニル試薬がトキソイドを産生する能力
一般構造Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｈのα−ジカルボニルトキソイド化試薬が実施例８に記載されているトキシンを不活化する能力（トキソイド）は、フェニルグリオキサール（ＰＧ）、２，３−ブタンジオン（ＢＤ）および１，２−シクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫから購入した。）を使用して実証された。ｐＨ８．３の重炭酸塩緩衝液中に含有されているＰＧおよびＣＨＤの濃度が０．５ｍＭになるように、またＢＤの濃度が５ｍＭになるようにジカルボニル試薬を調製した。トキシン活性に対する影響を調べるために、ベロ細胞生存率アッセイを使用して残留毒性を評価する前に、トキシン溶液（最終濃度７５ｎｍ）を各ジカルボニル試薬と共に、３７℃にて数とおりの期間でインキュベートした。
【０１１２】
ＰＧによるトキソイド化の結果
ＰＧによるトキソイド化の結果は以下に示すとおりである。図１１Ａは、リシントキシンおよびジフテリアトキシンが０．５ｍＭ  ＰＧに３７℃にて２４時間暴露された後、完全に不活化されたが、Ｃ．ディフィシールトキシンＡは完全に不活性化されなかったことを示している。図１１Ｂに示すように、これらの条件の下では、このトキシンが唯一７日間のインキュベーション後に完全にトキソイド化された。これらの条件の下では、コレラトキシンも部分的に不活化されると考えられる。このことは、ベロ細胞中のｃＡＭＰレベルが、０．５ｍＭ  ＰＧで７日間トキソイド化された４０ｎＭのコレラトキシンに１時間暴露された後、４０ｎＭのコレラトキシンのみに１時間暴露された細胞と比較して大幅に低減していることから判る（図１１Ｃを参照のこと）。このトキシンに関しては、他のトキソイド化の時点を調査対象外とした。以上から、０．５ｍＭの濃度のＰＧは、有効なトキソイド化剤であることと、従来のホルムアルデヒド処置よりも有意に優れることが実証される。このことは、リシントキシンおよびジフテリアトキシンが、わずか２４時間でトキソイド化を完了する（つまり、ホルムアルデヒドを用いた場合に３週間から４週間の暴露を必要とするのとは対照的に、はるかに迅速に作用する。）という点から言える。
【０１１３】
ＣＨＤおよびＢＤによるトキソイド化の結果
３７℃にて０．５ｍＭ  ＣＨＤに７日間暴露すると、コレラトキシンが不活化された（図１２）。一方、リシントキシンまたはジフテリアトキシンは不活化されなかった（Ｃ．ディフィシールは試験対象外）（図２．５を参照）。
【０１１４】
ジフテリアトキシンおよびコレラトキシンを５ｍＭ  ＢＤに（３７℃にて）７日間暴露して不活化した。リシンの毒性は緩和されたが、完全には不活性化されなかった（Ｃ．ディフィシールは試験対象外）。これらのデータは、ＰＧが他の２つのジカルボニルトキソイド化試薬に比べてはるかにトキソイド化剤としての有効性が高いことを示している。
【０１１５】
［実施例１０］
フェニルグリオキサール（ＰＧ）のトキソイド化能力に対する温度の影響
リシントキシンをトキソイド化するＰＧの能力に対して温度が及ぼす影響が、評価された。すべての予備実験をインキュベーション温度３７℃で実施し、これによって、リシンが２４時間で不活性化されることが示された。ＰＧが室温（約２０℃）でトキソイド化されるかどうかを調査するための実験を実施した。ＰＧ（０．５ｍＭ）をｐＨ８．３の重炭酸塩緩衝液中で、７５ｎＭリシントキシン溶液と共に室温にて２４時間または７日間のいずれかにわたってインキュベートした。ベロ細胞生存率アッセイを使用して、ＰＧで処理したリシンの残差活性を評価した。図１４に示すように、室温で２４時間０．５ｍＭ  ＰＧに暴露した後、リシンの毒性が１／１０００に低減されたことが見出された。一方、同じ条件の下での７日間処置によってリシンが完全にトキソイド化されたことを確認した。より高濃度のＰＧを使用することによって、より迅速に（７日未満に）トキソイド化することが事実上十分可能である。この点においても、トキシンの不活化に３７℃の温度を要する従来のホルムアルデヒド処理に比べて、ＰＧの方が優れている。
【０１１６】
［実施例１１］
ＰＧトキソイドおよびリシントキソイドの安定性に対してｐＨおよび貯蔵温度が及ぼす影響
ＰＧでトキソイド化されたリシンの安定性を、−２０℃および４℃の２とおりの貯蔵温度ならびに３とおりの貯蔵用緩衝液にて時系列で評価した。０．５ｍＭ  ＰＧを含有するｐＨ８．３重炭酸塩緩衝液中で、３７℃にて７日間リシンをトキソイド化した。続いて、ＮＡＰＳ１０カラムを使用して過剰なＰＧを取り除き、トキソイド化されたトキシンをｐＨ８の重炭酸塩緩衝液、ｐＨ５の酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、またはｐＨ７のＰＢＳのいずれかで溶出させた。これらのサンプルを４℃または−２０℃のいずれかで貯蔵してから１か月、２か月、３か月および６か月後に、ベロ細胞生存率アッセイを使用して細胞毒性を評価した。データは表６に示すとおりである。結果は４℃および−２０℃の両方で３とおりの貯蔵用緩衝液のいずれにおいてもトキソイドがきわめて安定していることを示している。ならびに、貯蔵用緩衝液中に過剰なＰＧの存在を必要としなくてもトキソイドの安定性が維持されることが実証されている。この点は、過剰なホルムアルデヒドを転換防止に必要とするホルムアルデヒドトキソイドに比べて有意に利点である。４℃で安定していることもまた、ＰＧトキソイドの貯蔵および輸送が容易になるという点で有利である。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
［実施例１２］
インビボモデルにおいてＰＧトキソイドを使用して達成される防御の質
ＰＧトキソイドがインビボにて防御免疫応答を誘発する能力は、３ＬＤ５０のＣ．ディフィシールトキシンＡに暴露されたＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＰＧ  Ｃ．ディフィシールトキソイドの免疫原性および防御作用を検査して、防御免疫応答を調査した。トキシンを抗原として投与した後の最大７日間、生存率、体重の変化、ならびにＣ．ディフィシール中毒の徴候および症状を測定して、防御の質をモニターした。トキソイドに対する特異的抗体のレベルおよび中和能力は、インビトロで評価した。
【０１１９】
雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｇａｔｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ：体重２０ｇ）を、ビヒクル対照（ＰＧのみ）、低用量（６２５ｎｇのトキソイド）、高用量（２．５ｇのトキソイド）および陽性対照（トキシンのみ）からなる４つの群（ｎ＝６頭の動物／群）に分けた。０．５ｍＭ  ＰＧを含有するｐＨ８．３重炭酸塩緩衝液中で、３７℃にて７日間にわたってＣ．ディフィシールトキシンＡをトキソイド化した。０日目および４２日目に、５０μｌのトキソイド溶液をマウスに筋内注射した。６３日目に、３ＬＤ５０（３０ｎｇ）のＣ．ディフィシールトキシンＡをすべての動物に腹腔経路で注射して暴露させた。動物を抗原投与の１４日後に選別し、血液を心臓穿刺によって採取して、特異抗体レベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【０１２０】
トキソイドを免疫されなかった対照動物は３ＬＤ５０のトキシンを抗原として投与されてから４８時間に死亡したことが、結果から判る。低用量群は２４時間後に毒作用による徴候を示し、毛を逆立てうずくまった姿勢を呈したが、いずれも４８時間で完全に回復した。高用量群は毒作用による徴候をまったく示さず、いずれもトキシンを抗原として投与された後も生き残った。Ｃ．ディフィシールトキシンに対する特異的抗体についてＥＬＩＳＡを実施した結果は、図１５に示すとおりである。高用量を投与された動物においては、未投与（ｎａｉｖｅ）対照動物と比較して抗体が高度なレベルで存在している（図１５Ａ）ことが確認できる。低用量群において存在する抗体の量ははるかに少量で、個体動物間での差異が大きい（図１５Ｂ）。これらのデータは、ＰＧトキソイドが免疫原性であることと、致死トキシンを抗原として投与に対して産生された抗体によって完全な防御が行われることを立証している。
【０１２１】
次いで、動物ＨＤ１から採取された血清を使用してインビトロ中和アッセイを実施したところ、ＥＬＩＳＡで確認されたように、Ｃ．ディフィシールトキシンに対する特異的抗体が最高レベルで産生された。最初に血清を媒質で１／５に希釈し、次いで順次１：１に希釈し、漸増的に血清を希釈する。続いて、この希釈液を作業台上で１時間インキュベートした。Ｃ．ディフィシールトキシンの最終濃度は、組織培養液中で約３×ＬＣ５０（２５ｐＭ）と同等になった。ここで、この混合物１００μＬをベロ細胞に添加し、３７℃にて５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、前と同様に、ＷＳＴ−１試薬を用い細胞生存率を評価した。結果は図１６に示すとおりである。
【０１２２】
血清濃度が高いときは推定上、血清中に存在する抗体が中和され、Ｃ．ディフィシールトキシンの細胞毒性が完全に阻害されることを確認できる。血清濃度が減少するにつれて中和活性が低下し、細胞生存率が逓減する。インビボデータによって実証されるように、ＰＧトキソイドが産生する抗体は防御力を備えていることが以上の結果から確認される。
【０１２３】
［実施例１３］
トキソイドの円偏光二色性分光法
ホルムアルデヒド（３７％ｖ／ｖ）をリシン（１ｍｇ／ｍｌ）に添加した後、ホルムアルデヒドトキソイドを調製して、最終濃度２．５％ｖ／ｖを得た。この混合物を３７℃にて３週間インキュベートしてから、最終濃度が０．１Ｍになるまでリシンを添加した。この後、ＰＤ１０クロマトグラフィカラムを使用して溶液を脱塩して生理食塩水にした。等量のトキシン（２ｍｇ／ｍｌ）およびＰＧ（ｐＨ８の重炭酸塩緩衝液中０ｍＭから４０ｍＭ）を添加してフェニルグリオキサール（ＰＧ）トキソイドを調製すると、０ｍＭから２０ｍＭ  ＰＧ中で最終濃度１ｍｇ／ｍｌのトキシンが得られる。この後、溶液を室温にて２４時間および９６時間、または３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後に、ＰＤ１０クロマトグラフィカラムを使用して溶液ＰＧトキソイドを脱塩して生理食塩水にした。前掲の方法（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，上記）を使用してトキソイドの濃度を測定し、必要になるまで−８０℃で凍結貯蔵した。ＰＧトキソイドのＰＧ濃度は０ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭおよび２０ｍＭであった。ホルミル化された単一のリシンサンプル（３００ｍＭ）を調べた。
【０１２４】
ＰＧトキソイドを常温常圧（ＲＴＰ）にて２４時間および９６時間（０ｍＭから２０ｍＭで）インキュベートし、３７℃にて２４時間（０ｍＭから２０ｍＭで）インキュベートしてから、実験に先だって室温で自然に解凍させた。すべてのサンプルをｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液で１：１の比率に希釈し、１０ｍｍおよび０．５ｍｍの細胞経路長で測定した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｔｄ  Ｃｈｉｒａｓｃａｎスペクトロメータを使用して、４００ｎｍから２３０ｎｍおよび２６０ｎｍから１９０ｎｍの領域内でＵＶおよびＣＤスペクトルを測定した。適用したパラメータは、１ｎｍのスペクトル帯域幅、０．５ｎｍの刻み幅、１．５ｓ（４００ｎｍから２３０ｎｍ）および３．０ｓ（２６０ｎｍから１９０ｎｍ）の１点当たり時間である。すべてのスペクトルをベースライン補正し、ここで適切な温度を記録した。濃度および経路長に対する遠紫外ＣＤスペクトルを補正してから、平均残基モル楕円率［θ］または平均残基モル吸光係数、Δε（Ｍ−１ｃｍ−１）に換算して表す（平均残基分子量１１３を使用した。）。
【０１２５】
各溶液のＣＤスペクトルを室温（２０℃）にて記録し、高温（９０℃）になるまで加熱し、加熱後に２０℃になるまで再び冷却した。融解プロフィールもまたλ＝２３３ｎｍでモニターした。Ｍｅｌｃｏｒ  Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｅｌｔｉｅｒユニット装備の機器は、１℃／分の速度、１℃の刻み幅および０．２℃の公差にて温度を２０℃から９６℃に変化させるように設定された。１０ｓ点当たりの時間ＣＤ測定時間を使用した。蛋白質溶液中で熱電対プローブを用い、温度を直接測定した。すべての測定が矩形０．５ｍｍ細胞経路長で行われた。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、ＣＤ対温度プロットを１成分のファントホフ（Ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆ）式に適合させた。
【０１２６】
ｐＨ滴定は、ＴｈｅｒｍｏＲｕｓｓｅｌ  Ｋシリーズ電極搭載のＣｏｒｎｉｎｇ  ｐＨ１０５ｐＨ  ｍｅｔｅｒを使用して測定した。ｐＨ２から８までの範囲でｐＨを変えるために、ＮａＯＨおよびＨＣｌのアリコートを使用した。理論的ｐＨ曲線は、Ｏｒｉｇｉｎ  ｖ７．５ソフトウェアで生成された。
【０１２７】
無傷の（ｗｈｏｌｅ）天然型リシンの遠紫外ＣＤスペクトルのオーバレイ、１ｍＭ  ＰＧリシントキソイドおよびホルミル化されたリシントキソイドは、図１７に示すとおりである。１ｍＭ  ＰＧがＣＤスペクトルに対して及ぼす影響は明らかに最小限である。重要なことに、リシンの立体配座の変化をほとんどまたは一切推論することなく２２３ｎｍ陽性機能のほとんどが保持される。他方、ホルミル化は２３３ｎｍ陽性機能を失うため、ＣＤスペクトルの全体的な縮小につながる。このことにより、秩序正しい立体配座における縮小（アンフォールディング）を示される。
【０１２８】
様々なＰＧレベルの作用をモニターする遠紫外ＣＤスペクトルおよびそれぞれのインキュベーション条件は、図１８に示すとおりである。インキュベーション条件に関係なく、ＰＧレベルが高いと、ＣＤスペクトルが変化しやすくなり、結果として蛋白質立体配座も変わる。ＰＧ濃度の関数として、２４時間および９６時間の両方の常温常圧（ＲＴＰ）で室温にてインキュベートすると、ＣＤシグナルが累進的減少し、Ｂ鎖に関連付けられている２３３ｎｍ陽性ＣＤ機能が顕著に失われるのが確認される。２２５ｎｍ以下（約２２５ｎｍ）にて、Ｂ鎖の２つの成分変性を表す見かけ上の「等濃度点」が観測される。ＰＧレベルを高くして常温常圧（ＲＴＰ）で３７℃にてインキュベートションした場合（５ｍＭおよび２０ｍＭ  ＰＧ）、更なる変性を呈する。ＣＤ２３３ｎｍ（Ｂ鎖完全性）とフェニルグリオキサール含有量を対照的に示したプロットは、変性過程をグラフで図解した図１８Ｄに示すとおりである。
【０１２９】
現在の作業の一環として測定を行っている間、それぞれのトキソイド中のＰＧ「濃度」に関連してＰＧトキソイド溶液の２５０ｎｍでの吸光度が顕著になることが注目された（データは非公開）。これにより、蛋白質濃度尺度となるＡ２８０の使用が阻止されている。
【０１３０】
ホルミル化は、リシン残基で起こることが知られている。リシンＡ鎖に含まれるリシン残基は２つだけであるのに対し、リシンＢ鎖には７つ含まれている。従って、リシンＢ鎖の方がホルミル化に対する感度が大きい。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰＤＢビューアを使用してアミノ酸配列およびＸ線構造を見ると、リシンＢ鎖のリシン残基のうちの５つ（Ｋ４０、Ｋ６２、Ｋ１６８およびＫ２０３）が空間的にジスルフィド結合に近接していることが認められた。従って、リシンＢ鎖のホルミル化が２３３ｎｍ陽性ＣＤ機能を司るジスルフィド立体配座を混乱させたことは、驚くべきことではない。
【０１３１】
フェニルグリオキサール化は、アルギニン残基で起こることが知られている。アルギニン残基はリシンＡ鎖に２１個、リシンＢ鎖には１３個存在し、両方の領域にわたって均一に分布している。ここに提示されているＣＤ結果は、二次構造に対する影響が考慮されるのは、フェニルグリオキサール化が高度な場合のみ（＞１ｍＭ）であることを示している。毒性結果と連関させると、低レベルのフェニルグリオキサールによる抑制（アルギニンの修飾）は、二次構造変化と関係していないことが、ＣＤデータから判る。他方、ホルミル化によって二次構造の変化が誘発された。
【０１３２】
上の例から、本発明のα−ジカルボニルトキソイド化試薬（例えば、ＰＧ）は特に有効なトキソイド化試薬であり、この点で本発明が特に有利であると結論づけることができる。本発明のα−ジカルボニルトキソイド化試薬は、ホルムアルデヒドと同等なトキソイド化能力を提供しながらも、より低い温度、短い期間および低い濃度で使用して安定なトキソイドを生成することが可能で、しかもこの際にトキソイド化剤を更に添加して処方する必要がない。例えば、ＰＧは０．５ｍＭの濃度でリシン、ジフテリア、コレラおよびＣ．ディフィシールトキシンをトキソイド化する。トキソイド化は３７℃にて７日間以下で達成される。２０℃にてＰＧはリシンを７日間以下で不活化する。他の関係のあるグリオキサールも、トキシン活性を抑制させるが、この適用可能性はＰＧほどは広範でないと思われる。リシントキシンのＰＧトキソイドは、調製に過剰なＰＧを必要とすることなしにｐＨ５、７および８にて少なくとも６か月間安定している。Ｃ．ディフィシールトキシンのＰＧトキソイドは、３ＬＤ５０のＣ．ディフィシールトキシンを抗原として投与から、マウスを防御する能力のある応答を誘発する。このトキソイドは、Ｃ．ディフィシールに対する抗体の生成を誘発し、これらの抗体によってトキシンがインビトロで中和される。このことは、ベロ細胞における細胞毒性の阻止によって実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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