(57)【要約】本開示は、サイズまたは修飾に関係なく広範な活性を示す、任意のオリゴヌクレオチド（ＯＮ）による様々な二価２＋金属カチオンのキレート化について記載する。このキレート化の効果は、二価の（またはより価数の高い）カチオンに特異的であり、塩のようには挙動しないオリゴヌクレオチドキレート錯体の形成をもたらす。任意のＯＮおよび二価金属カチオンを使用して調製されたＯＮキレート錯体の新規組成物と、オリゴヌクレオチド投与においてＯＮキレート錯体を使用することによる、抗凝固および/もしくは皮下注射部位反応の抑制、ならびに/またはオリゴヌクレオチドに対する耐容性の改善のための方法とが、本明細書で記載される。2013536195.tif 000011
2013536195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価カチオンにより結合された２つ以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項２】
前記多価カチオンが二価金属カチオンである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項３】
前記多価カチオンが２＋荷電状態を有するアルカリ土類金属である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項４】
前記二価金属カチオンが２＋荷電状態を有する遷移金属である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項５】
前記二価金属カチオンが２＋荷電状態を有するランタニド金属である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項６】
前記二価金属カチオンが２＋荷電状態を有する後遷移金属である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項７】
前記二価金属カチオンが、カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項８】
前記キレート錯体が、２つ以上の異なる二価金属カチオンを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項９】
前記キレート錯体が、二本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１０】
前記キレート錯体が、ホスホロチオエート結合を１つ有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１１】
前記キレート錯体が、完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１２】
前記キレート錯体が、２'修飾リボースを１つ有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１３】
前記キレート錯体が、各リボースが２'Ｏ−メチル化されたオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１４】
皮下投与のために適合された、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１５】
少なくとも以下の投与経路のために適合された、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体：眼内、経口摂取、腸内、吸入、皮膚注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、くも膜下腔内注入、気管内、静脈内注射、静脈内注入および局所。
【請求項１６】
前記吸入投与がエアロゾルである、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：３〜１４からなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む、皮下投与のためのオリゴヌクレオチド製剤。
【請求項１９】
皮下投与のためにさらに適合された、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
少なくとも以下の投与経路のためにさらに適合された、請求項１８に記載の製剤：眼内、経口摂取、腸内、吸入、皮膚注射、皮下注射、筋肉注射、頭蓋内注射、頭蓋内注入、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、くも膜下腔内注入、気管内、静脈内注射、静脈内注入、および局所。
【請求項２１】
前記吸入投与がエアロゾルである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド製剤。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体または請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤と担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、任意のオリゴヌクレオチドナトリウム塩を薬学的に許容される水性賦形剤に溶解させる段階、および、オリゴヌクレオチドキレート錯体を可溶性のままとするように、該溶解させたオリゴヌクレオチドに二価金属塩溶液を徐々に添加する段階を含む、方法。
【請求項２４】
前記溶解させたオリゴヌクレオチドの濃度が、金属塩添加前において０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶解させたオリゴヌクレオチドに添加される金属塩の割合が、１００ｍｇのオリゴヌクレオチドにつき０．１〜４０ｍｇの二価塩である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
最終オリゴヌクレオチド濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記金属塩が、塩化物塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、エリソルビン酸塩およびプロピオン酸塩のうちの少なくとも１種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記金属塩溶液が、カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄（２＋）、マンガン、銅および亜鉛のうちの少なくとも１種を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
対象へのオリゴヌクレオチド投与の抗凝固効果を抑制または低減させるための方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３０】
対象へのオリゴヌクレオチド投与の皮下注射部位反応を抑制または低減させるための方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３１】
対象にＩＶ注射により投与された場合のオリゴヌクレオチドの耐容性を改善するための方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３２】
対象にＩＶ注射により投与された場合のオリゴヌクレオチドの血清タンパク質との相互作用を低減させる方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３３】
対象におけるオリゴヌクレオチドの血清半減期を減少させる方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３４】
対象へのオリゴヌクレオチド投与に関連する肝機能障害または腎機能障害を低減させる方法であって、該オリゴヌクレオチドを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３５】
水溶液中でオリゴヌクレオチドを安定化させる方法であって、該オリゴヌクレオチドを請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物として調製することを含む、方法。
【請求項３６】
前記キレート錯体がカルシウムキレート錯体である、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記キレート錯体がマグネシウムキレート錯体である、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記キレート錯体がマグネシウム／カルシウム混合キレート錯体である、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドキレート錯体の製造における多価カチオンの使用。
【請求項４０】
対象への前記オリゴヌクレオチド投与の抗凝固効果を抑制または低減させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４１】
前記皮下投与されたオリゴヌクレオチドについての対象における皮下注射部位反応を抑制または低減させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
ＩＶ注射により投与された場合の対象における前記オリゴヌクレオチドの耐容性を改善するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４３】
対象にＩＶ注射により投与された場合のオリゴヌクレオチドの血清タンパク質との相互作用を低減させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４４】
対象における前記オリゴヌクレオチドの血清半減期を減少させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４５】
対象における前記オリゴヌクレオチド投与に関連する肝機能障害または腎機能障害を低減させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４６】
水溶液中でオリゴヌクレオチドを安定化させるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドキレート錯体、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド製剤、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドカルシウム塩である、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドカルシウムキレート錯体を含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドマグネシウムキレート錯体を含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
カルシウム／マグネシウム混合オリゴヌクレオチドキレート錯体を含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドキレート錯体およびその組成物、ならびにオリゴヌクレオチド（ＯＮ）をキレート錯体として製剤化するための方法、ならびにＯＮ投与のためのこれらのＯＮキレート錯体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩は、酸と塩基の相互作用（中和）から得られるイオン化合物である。塩は、電気的に中性の状態が維持されるように相互作用するカチオンとアニオンから構成される。アニオンは無機（例えばＣｌ−）または有機（例えばアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−））とすることができる。溶解させた塩（電解質）を含む水溶液は、水性環境におけるアニオンおよびカチオン対の解離状態のために電気を通すことができる。オリゴヌクレオチドはポリアニオンであり、以前は、それらのカチオン対応物が解離状態で溶液中に存在する場合、塩としてのみ挙動すると考えられていた。
【０００３】
ヒト患者へのＯＮの投与は、典型的には、存在するヌクレオチド配列に関連しないいくつかの一般化された副作用を伴っている。これらには、血液の抗凝固（プロトロンビン時間またはＰＴＴ時間の上昇）(Kandmimlla et al., 1998, Bioorgan. Med. Chem. Let., 8: 2103（特許文献1）; Sheeban et al., Blood, 1998, 92: 1617（特許文献2）; Nicklin et al., 1197, Nucleosides & Nucleotides, 16: 1145（特許文献3）; Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2nd Ed., p374（特許文献4）)および皮下投与による注射部位反応、またはＩＳＲ（硬結、炎症、圧痛および疼痛）(Webb et al., 1997, Lancet, 349: 9059（特許文献5）; Schrieber et al., 2001, Gastroenterol., 120: 1339（特許文献6）; Seawell et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 303: 1334（特許文献7）; Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2nd Ed., p383（特許文献8）; Raal et al., 2010, Lancet, 375: 998（特許文献9）)が含まれる。抗凝固効果は、凝固カスケードのタンパク質との非配列特異的相互作用により媒介されると考えられている。ＯＮは、免疫賦活性（Ｔｏｌｌ様受容体またはＴＬＲ媒介サイトカイン誘導を介する）を有することが示されているので、ＩＳＲは典型的には皮下（ＳＣ）注射のための少量（典型的には１ｃｃ）での高濃度ＯＮ投与（これにより注射部位での局部炎症に至ると考えられている）の要求に起因するとされている。
【０００４】
近年における核酸に基づく療法の出現で、臨床開発におけるＯＮに基づく化合物の数の増加が増している。歴史的にほとんどのＯＮ投与計画が、１週間に複数回投与または１週間に１回の投与を採用しており、これらはＯＮの経口バイオアベイラビリティが低いために非経口で投与されなければならない。ＯＮの静脈内注入は、典型的には反応性（発熱、震え、脱力）により用量および割合が制限され、慢性投与シナリオにおいてロジスティックに要求が高いので、より最近のＯＮの臨床応用は、皮下（ＳＣ）投与経路を使用している。これにより、全身の投与副作用が最小に抑えられるが、典型的には、様々な程度の重篤度の注射部位反応（上記）を伴い、これもまた、この投与経路により達成可能な用量を制限する。
【０００５】
よって、ＩＶまたはＳＣ投与経路のいずれかの際の反応性を緩和するＯＮ製剤を提供することが有用であり、望ましいであろう。さらに、ＯＮ投与の抗凝固効果は最小になると考えられるが、ＯＮのこの副作用を中和し、ヒトおよび非ヒト対象においてより広い安全域を提供するのも有用であろう。
【０００６】
よって、改善されたＯＮ製剤を提供することが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Kandmimlla et al., 1998, Bioorgan. Med. Chem. Let., 8: 2103
【特許文献２】Sheeban et al., Blood, 1998, 92: 1617
【特許文献３】Nicklin et al., 1197, Nucleosides & Nucleotides, 16: 1145
【特許文献４】Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2nd Ed., p374
【特許文献５】Webb et al., 1997, Lancet, 349: 9059
【特許文献６】Schrieber et al., 2001, Gastroenterol., 120: 1339
【特許文献７】Seawell et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 303: 1334
【特許文献８】Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2nd Ed., p383
【特許文献９】Raal et al., 2010, Lancet, 375: 998
【発明の概要】
【０００８】
概要
本記載によれば、ここでは、多価カチオンにより結合された２つ以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドキレート錯体が提供される。
【０００９】
さらに、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む、皮下投与のためのオリゴヌクレオチド製剤が提供される。
【００１０】
また、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体またはオリゴヌクレオチド製剤と担体とを含む医薬組成物も開示される。
【００１１】
さらに、オリゴヌクレオチドを、本明細書で記載されるキレート錯体、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で開示される医薬組成物として対象に投与する段階を含む、対象へのオリゴヌクレオチド投与に関連する肝機能障害または腎機能障害を低減させる方法が開示される。
【００１２】
本明細書では、ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として投与することにより、ＯＮによる血液抗凝固を抑制、阻止または低減させるための方法が開示される。
【００１３】
ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として調製することにより、ＩＶ注射により投与されるいずれかのＯＮの耐容性を改善するための方法もまた本明細書で開示される。
【００１４】
本明細書では、ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として投与することにより、注射部位反応を抑制または低減させるための方法が開示される。特に、ＯＮは皮下投与される。
【００１５】
本明細書では、ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として提供することにより、任意の経路により投与されるいずれかのＯＮとの金属キレート化を抑制するための方法が開示される。
【００１６】
本明細書では、ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として投与することにより、任意のＯＮの血清半減期を減少させるための方法が開示される。
【００１７】
本明細書では、ＯＮを、カルシウムキレート錯体もしくは他の適切な金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として投与することにより、任意のＯＮと血清タンパク質との相互作用を低減させるための方法が開示される。特に、オリゴヌクレオチドキレート錯体、製剤または組成物は、対象へのＩＶ注射により投与される。
【００１８】
また、以下のリストのいずれかに由来する二価金属カチオン源が、オリゴヌクレオチド使用時にオリゴヌクレオチドと共にＯＮキレート錯体として提供される、オリゴヌクレオチド製剤も本明細書で開示される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、および／または亜鉛。よって、カルシウムを含むオリゴヌクレオチド製剤；マグネシウムを含むオリゴヌクレオチド製剤；コバルトを含むオリゴヌクレオチド製剤；鉄（２＋）を含むオリゴヌクレオチド製剤；マンガンを含むオリゴヌクレオチド製剤；銅を含むオリゴヌクレオチド製剤；亜鉛を含むオリゴヌクレオチド製剤が本明細書で記載される。
【００１９】
本明細書では、下記金属カチオンのいずれかを、個々にまたは組み合わせて使用してＯＮ金属キレート錯体を製造するための方法が開示される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、および／または亜鉛。
【００２０】
本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物を調製するための方法であって、任意のオリゴヌクレオチドナトリウム塩を薬学的に許容される水性賦形剤に溶解させること、オリゴヌクレオチドキレート錯体を可溶なままとするように、溶解させたオリゴヌクレオチドに二価金属塩溶液を徐々に添加することを含む方法もまた開示される。
【００２１】
本明細書では、オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を使用して、対象内で下記二価金属カチオンをキレートするための方法が開示される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、鉛、ベリリウム、ストロンチウム、ラジウム、および／または任意の他の金属、遷移金属、後遷移金属、２＋または３＋荷電状態で存在することができるランタニドまたはアクチニド元素。
【００２２】
ＯＮをカルシウムキレート錯体もしくは他の適切なＯＮ金属キレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物として調製することにより、溶液中での任意のＯＮの安定性を改善する方法もまた本明細書で開示される。特に、水溶液中でオリゴヌクレオチドを安定化させる方法が開示される。
【００２３】
本明細書では多価カチオンが二価カチオンであることが含まれる。
【００２４】
本明細書では二価カチオンが２＋荷電状態を有するアルカリ土類金属であることが含まれる。
【００２５】
本明細書では二価カチオンが２＋荷電状態を有する遷移または後遷移金属であることが含まれる。
【００２６】
本明細書では二価カチオンが２＋荷電状態を有するランタニド金属であることが含まれる。
【００２７】
本明細書では二価カチオンが２＋荷電状態を有するアクチニド金属であることが含まれる。
【００２８】
二価カチオンは、個々にまたは組み合わせて下記とすることができる：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、および／または亜鉛。
【００２９】
特に、本明細書で記載されるキレート錯体は、２つ以上の異なる二価金属カチオンを含むことができる。
【００３０】
さらなる実施形態では、キレート錯体は二本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む。
【００３１】
別の実施形態では、キレート錯体は、ホスホロチオエート結合を１つ有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む。
【００３２】
キレート錯体はまた、完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むことができる。
【００３３】
キレート錯体はまた、２'修飾リボースを１つ有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むことができる。
【００３４】
キレート錯体はまた、各リボースが２'Ｏ−メチル化されたオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むことができる。
【００３５】
一実施形態では、キレート錯体または製剤は、皮下投与のために適合され；少なくとも以下の投与経路のために適合される：眼内、経口摂取、腸内、吸入、皮膚注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、くも膜下腔内注入、気管内、静脈内注射、静脈内注入および局所。特に、吸入投与はエアロゾルとすることができる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドが配列番号：３〜１４から構成されることがさらに含まれる。
【００３７】
溶解されたオリゴヌクレオチド濃度が金属塩添加前において０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌであることがさらに含まれる。
【００３８】
特に、溶解されたオリゴヌクレオチドに添加される金属塩の割合は、１００ｍｇのオリゴヌクレオチドにつき０．１〜４０ｍｇの二価塩とすることができる。
【００３９】
最終オリゴヌクレオチド濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであることがさらに含まれる。
【００４０】
さらなる実施形態では、金属塩は、塩化物塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、エリソルビン酸塩およびプロピオン酸塩のうちの少なくとも１種である。
【００４１】
別の実施形態では、金属塩溶液はカルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄（２＋）、マンガン、銅および／または亜鉛の少なくとも１種を含む。
【００４２】
キレート錯体がカルシウムキレート錯体；マグネシウムキレート錯体；またはマグネシウム／カルシウム混合キレート錯体であることもまた含まれる。
【００４３】
オリゴヌクレオチドキレート錯体の製造における、本明細書で記載される多価カチオンの使用もまた提供される。
【００４４】
さらに、対象へのオリゴヌクレオチド投与の抗凝固効果を抑制または低減させるための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用が提供される。
【００４５】
前記皮下投与されたオリゴヌクレオチドの対象における皮下注射部位反応を抑制または低減させるための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用が提供される。
【００４６】
ＩＶ注射により投与される場合の対象におけるオリゴヌクレオチドの耐容性を改善するための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、本明細書で記載される医薬組成物の使用もまた提供される。
【００４７】
対象にＩＶ注射により投与される場合のオリゴヌクレオチドの血清タンパク質との相互作用を低減させるための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用もまた提供される。
【００４８】
さらに、対象におけるオリゴヌクレオチドの血清半減期を減少させるための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用が提供される。
【００４９】
対象におけるオリゴヌクレオチド投与と関連する肝機能障害または腎機能障害を低減させるための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用もまた提供される。
【００５０】
水溶液中でのオリゴヌクレオチドの安定化のための、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチド製剤、または本明細書で記載される医薬組成物の使用もまた提供される。
【００５１】
「抗凝固」という表現は、通常の血液凝固または血餅形成の阻止を意味することが意図される。
【００５２】
「キレート化」という表現は、対イオンに結合してキレート錯体を形成することができる別の分子による、自由溶液反応からの対イオン（負または正）の隔離または除去を意味することが意図される。
【００５３】
「二価金属カチオン」という表現は、２＋荷電状態で自然に存在することができる任意の金属カチオンを意味することが意図され、アルカリ土類金属（ＩＵＰＡＣ命名法による２族元素）、遷移金属、後遷移金属、半金属またはランタノイドを含む。
【００５４】
「三価金属カチオン」という表現は、３＋荷電状態で自然に存在する任意の金属カチオンを意味することが意図され、遷移金属、後遷移金属、半金属、ランタノイドまたはアクチノイドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
以下、添付の図面を参照する。
【００５６】
【図１】ＯＮの一般的な生理化学的特徴を示す。Ａ）高速液体クロマトグラフィーによる、規定された配列を有するＲＥＰ  ２００６および２１マーホスホロチオエートＯＮの共分離。Ｂ）質量分析による２１マーＯＮにおける種の特定。Ｃ）質量分析によるＲＥＰ  ２００６  ＯＮにおける種の特定。
【図２】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−カルシウムキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−カルシウムキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化カルシウムをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図３】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−マグネシウムキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−マグネシウムキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化マグネシウムをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図４】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−コバルトキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−コバルトキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化コバルトをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図５】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−鉄キレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−鉄キレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化鉄をＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図６】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−マンガンキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−マンガンキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化マンガンをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図７】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−バリウムキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−バリウムキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化バリウムをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図８】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−ニッケルキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−ニッケルキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化ニッケルをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図９】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−銅キレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−銅キレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化銅をＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１０】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−亜鉛キレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−亜鉛キレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化亜鉛をＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１１】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−カドミウムキレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−カドミウムキレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化カドミウムをＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１２】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−水銀キレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−水銀キレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化水銀をＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１３】下記の、蛍光標識された縮重ホスホロチオエートＯＮによるＯＮ−鉛キレート錯体の形成を示す：Ａ）様々なサイズの６マー（ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ）、１０マー（ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ）、２０マー（ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ）、４０マー（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）およびＢ）ホスホロチオエート化（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ）、ホスホロチオエート化＋２'Ｏメチリボース（ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ）または２'Ｏメチルリボース（ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ）および異なる配列（ポリＣ−ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ；配列番号：４）を使用する蛍光標識された縮重ＯＮ。ＯＮキレート錯体形成の非配列依存性は、縮重オリゴヌクレオチドを使用することにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示される。ＯＮ−鉛キレート錯体の形成は、実施例１に記載されるように、増加させた濃度のＡＣＳグレード塩化鉛をＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと溶液中で組み合わせ、オリゴヌクレオチドキレート錯体形成を蛍光偏光の増加によりモニタすることにより証明した。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１４】図１４ＡはＯＮ配列に依存しないＯＮの一般的な化学的特徴を示す。配列に関係なく、いずれのＯＮも疎水性および親水性活性の両方を有するポリマとして存在する。ホスホロチオエート化（この図において化学構造で示される）はＯＮポリマの疎水性を増加させるように機能するが、親水性には影響しない。図１４Ｂは、二価および三価金属カチオンのオリゴヌクレオチドキレート化の性質を概念化する。金属カチオン（灰色の塗りつぶされた丸として表される）は、ホスホジエステル結合中の２つまたは３つの非架橋酸素または硫黄原子間の金属イオン架橋（楕円により表される）を介してＯＮポリマの親水性表面に結合する。
【図１５】様々なＯＮおよび二価金属カチオン濃度での二価金属カチオンの存在下でのＯＮの溶液挙動モデルを示す。Ａ）低二価／三価金属カチオン、低ＯＮ濃度では、ダイマーまたは低次ＯＮキレート錯体が得られる。Ｂ）二価／三価金属カチオン濃度を増加させると、溶液中でより完全なＯＮキレート錯体形成が得られる。Ｃ）さらに二価または三価金属存在下でのＯＮ濃度を増加させると、金属濃度の増加と共により高次のＯＮキレート錯体が得られる。（Ａ）〜（Ｃ）のキレート錯体は全て親水性表面が水性環境に依然として暴露されるため水溶液中で可溶性であり、よって溶解度が維持される。Ｄ）十分なＯＮおよび金属濃度では、ここで親水性表面は全てＯＮキレート錯体内に制限され、疎水性表面のみが水性環境に暴露される。この結果、ＯＮキレート錯体が沈殿する。
【図１６】蛍光偏光に対する蛍光ＯＮキレート錯体の溶液挙動の効果を示す。金属濃度の増加に伴い、ＯＮキレート錯体形成のサイズ（および質量）もまた増加し（図１５を参照されたい）、よって溶液中でよりゆっくり転がる。溶液中での錯体のこのより遅いタンブリングにより、蛍光偏光が増加し、ｍＰ値が増加する。
【図１７】蛍光偏光により測定される、塩化カルシウムまたは硫酸カルシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列番号：６）およびＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（配列番号：７）とのＯＮキレート錯体形成。Ｂ）ＲＥＰ  ２０３３−ＦＬ（配列番号：５）およびＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ（配列番号：２）とのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１８】蛍光偏光により測定される、塩化カルシウムまたは硫酸カルシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２０２８−ＦＬとのＯＮキレート錯体形成およびＲＥＰ  ２０５７−ＦＬ（配列番号：８）とのＯＮキレート錯体形成の非存在。Ｂ）ＲＥＰ  ２１２０−ＦＬおよびＲＥＰ  ２０３０−ＦＬとのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図１９】蛍光偏光により測定される、塩化カルシウムまたは硫酸カルシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２１２９−ＦＬ（配列番号：１２）およびＲＥＰ  ２１２６−ＦＬ（配列番号：９）とのＯＮキレート錯体形成。Ｂ）ＲＥＰ  ２１２８−ＦＬ（配列番号：１１）およびＲＥＰ  ２１２７−ＦＬ（配列番号：１０）とのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２０】蛍光偏光により測定される、塩化カルシウムまたは硫酸カルシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２１３９−ＦＬ（配列番号：１３）およびＲＥＰ  ２００６−ＦＬとのＯＮキレート。Ｂ）ＲＥＰ  ２０４５−ＦＬおよびＲＥＰ  ２００７−ＦＬとのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２１】蛍光偏光により測定される、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列番号：６）およびＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（配列番号：７）とのＯＮキレート錯体形成。Ｂ）ＲＥＰ  ２０３３−ＦＬ（配列番号：５）およびＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ（配列番号：１２）とのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２２】蛍光偏光により測定される、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２０２８−ＦＬ（配列番号：１１）とのＯＮキレート錯体形成およびＯＮキレート錯体形成ＲＥＰ  ２０５７−ＦＬ（配列番号：８）の非存在。Ｂ）ＲＥＰ  ２１２０−ＦＬおよびＲＥＰ  ２０３０−ＦＬ（配列番号：３）とのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２３】蛍光偏光により測定される、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２１２９−ＦＬ（配列番号：１２）およびＲＥＰ  ２１２６−ＦＬ（配列番号：９）とのＯＮキレート錯体形成。Ｂ）ＲＥＰ  ２１２８−ＦＬ（配列番号：１１）およびＲＥＰ  ２１２７−ＦＬ（配列番号：１０）とのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２４】蛍光偏光により測定される、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウムとのＯＮキレート錯体の形成を示す。Ａ）ＲＥＰ  ２１３９−ＦＬ（配列番号：１３）およびＲＥＰ  ２００６−ＦＬとのＯＮキレート。Ｂ）ＲＥＰ  ２０４５−ＦＬおよびＲＥＰ  ２００７−ＦＬとのＯＮキレート錯体形成。値は、２回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２５】蛍光偏光により測定される、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの存在下での２つの異なる二本鎖ＯＮキレート錯体の形成を示す。二本鎖ＯＮは、ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列番号：６）のＲＥＰ  ２０３３−ＦＬ（配列番号：５）との、およびＲＥＰ  ２０５７−ＦＬ（配列番号：８）のＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（配列番号：７）とのハイブリダイゼーションにより調製した。値は、３回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２６】二価金属カチオン（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋）のみの存在下、一価カチオン（Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋）の存在なしでの、様々なＯＮキレート錯体の形成を示す。値は、３回分の測定値による平均＋／−標準偏差を表す。
【図２７】異なるサイズ（ＲＥＰ  ２００４、ＲＥＰ  ２００６）および異なる化学（ＲＥＰ  ２００６、ＲＥＰ  ２１０７）の様々な濃度のＯＮのヒト血液への添加の抗凝固効果を示す。この相互作用の非配列依存様式は、縮重オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２００４、ＲＥＰ  ２００６、ＲＥＰ  ２１０７）を用いることにより示されたが、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＲＥＰ  ２０３１；配列番号：４）を用いても示された。これらの化合物の存在下での血液抗凝固は、承認された臨床検査方法を用いて、プロトロンビン時間（ＰＴＴ）を測定し、これを血液中の生理食塩水の存在下のＰＴＴと比較することによりモニタした。薬物の存在および非存在下のＰＴＴの比から正規化比（ＮＲ）が得られる。ＮＲ＝１は正常な血液凝固活性を示し、ＮＲ＞１は血液凝固活性が損なわれた（抗凝固）ことを示す。
【図２８】ＣａＣｌ２の添加によるオリゴヌクレオチドの抗凝固効果の抑制を示す。ＲＥＰ  ２０５５（配列（ＡＣ）２０を有する４０マーホスホロチオエート：配列番号：６）を血液に２．５ｍＭで添加した。これは、著しい血液抗凝固を誘導する濃度である。ＲＥＰ  ２０５５を、様々な組み合わせのＣａＣｌ２と組み合わせ、添加した各濃度のＣａＣｌ２の効果を承認された臨床検査方法を用いて決定した。これらの化合物の存在下での血液抗凝固は、承認された試験方法を用いて、プロトロンビン時間（ＰＴＴ）を測定し、これを血液中の生理食塩水の存在下のＰＴＴと比較することによりモニタした。薬物の存在および非存在下のＰＴＴの比から正規化比（ＮＲ）が得られる。ＮＲ＝１は正常な血液凝固活性を示し、ＮＲ＞１は血液凝固活性が損なわれた（抗凝固）ことを示す。
【図２９】慢性肝疾患を有する患者における総血清カルシウムに対する慢性ＯＮ治療のカルシウムキレート化効果を示す。ミネラル補給を受けていない患者を（Ａ）で示し、ＯＮ治療を受けながら補給を受けている患者を（Ｂ）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
ＯＮが様々な二価金属カチオン、例えばカルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、亜鉛、カドミウム、水銀および鉛をキレート化することを本明細書において示す。さらに、これらの二価カチオンのキレート化により、金属カチオンを介して結合された２つ以上のＯＮからなるＯＮキレート錯体の形成が得られ、例えば、限定はされないが、長さが６〜８０ヌクレオチドのＯＮが、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの存在下で起こることが示される。キレート化はまた、リボースでの２'修飾を含むかまたは含まないオリゴヌクレオチドにより起こる。さらに、金属カチオンのキレート化は、存在するヌクレオチドの配列に依存しないが、その代わりに、全てのオリゴヌクレオチドに共通の生理化学的特徴に依存する（図１４Ａを参照されたい）。
【００５８】
本明細書では、二価である任意の単純な金属カチオン（例えば、例として、限定はされないが、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋）を含む水溶液中のオリゴヌクレオチドは、塩として存在せず、むしろ、ＯＮのキレート錯体として存在するという発見が示される。これらの錯体は、オリゴヌクレオチドダイマーまたはより高次の分子組織から構成され、そこでは、ＯＮがそれらのホスホジエステルバックボーンで二価金属イオン架橋を介して結合される（図１４Ｂを参照されたい）。特定のＯＮおよび金属カチオン濃度では、これらのキレート錯体は水溶液中で安定であり、可溶であり、ＯＮキレート錯体中の任意の二価カチオンを溶液相互作用から効果的に隔離する。このキレート錯体形成はまた、３＋以上の電荷を有する単純な金属カチオンと共に起こる可能性も高い（図１４Ｂに図示）。よって、ＯＮは二価カチオンキレーターとして機能し、二価カチオンと塩を形成しない。
【００５９】
重要なことに、オリゴヌクレオチドキレート錯体の形成は、一価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋とでは起こらず、よって、いずれの一価カチオンとも起こる可能性は低い。よって、「オリゴヌクレオチド塩」という用語は、特定的に、一価カチオンまたはオリゴヌクレオチドとキレート錯体を形成するカチオンとのオリゴヌクレオチド塩にのみ限定され、二価金属カチオン（または三価金属カチオンさえ）との溶液または粉末形態で存在するオリゴヌクレオチドを記載するのに使用するのは間違ってる。
【００６０】
当技術分野における標準は、ナトリウム塩としてのみのＯＮの投与を明確に教示する。これは、多くのオリゴヌクレオチドの臨床治験におけるナトリウム塩としての投与により例示され、ホミビルセン（ＩＳＩＳ  ２９２２）、ミポメルセン（ＩＳＩＳ  ３０１０１２）、トレコビルセン（ＧＥＭ  ９１）、クスチルセン（ＯＧＸ−０１１／ＩＳＩＳ  １１２９８９）、ゲナセンス（Ｇ３１３９）およびアプリノカルセン（ＩＳＩＳ  ３５３１／ＬＹ  ９００００３）が挙げられる(Geary et al., 2002, Clin. Pharmacokinetics, 41: 255-260; Yu et al., 2009, Clin. Pharmacokinetics, 48: 39-50; Sereni et al., 1999, J. Clin. Pharmacol., 39: 47-54; Chi et al., 2005, J. Nat. Canc. Inst., 97: 1287-1296; Marshall et al., 2004, Ann. Oncol., 15: 1274-1283; Grossman et al., 2004, Neuro-Oncol, 6: 32-40)。
【００６１】
本明細書では、オリゴヌクレオチドによる血液の抗凝固は、塩化カルシウムの添加による血液中の正常な遊離カルシウムの回復によるオリゴヌクレオチド誘導抗凝固の逆転により示されるように、オリゴヌクレオチドによるカルシウムのキレート化により引き起こされるということを示すことも提供される。
【００６２】
本明細書では、カルシウムキレート錯体として調製されたＯＮの注射による注射部位反応（ＩＳＲ）の阻止により示されるように、オリゴヌクレオチドの皮下注射により観察される注射部位反応（硬結、炎症、圧痛および疼痛）は、少なくとも一部は、オリゴヌクレオチドによるカルシウム、およびおそらく他の二価カチオン、例えばマグネシウムの注射部位での局所キレート化に起因するということを示すこともまた提供される。
【００６３】
蛍光偏光は、分子間相互作用を調べるために使用される一般的な方法である。この技術では、ベイト（すなわち、任意のＯＮ）は蛍光タグ（例えばＦＩＴＣ）で標識される。溶液中、ベイト分子は、ブラウン運動により溶液中を自由に転がり、ベイトが正しい波長の光による励起に供せされた場合不十分な偏光蛍光放射となる。十分な分子量（少なくともベイトと同じサイズ）のリガンドを用いると、ベイトとリガンド間の相互作用により、溶液中での錯体のタンブリングのかなりの阻止が導入される。この溶液中でのタンブリングの阻止の結果、蛍光放射は、励起で著しく偏光される。よって、この技術を用いると、いずれの結合パートナーに対しても物理的制約条件なしで、溶液中にて相互作用を測定することができる。蛍光偏光は無次元ｍＰとして報告され、これは反応における結合ベイト分子の割合に正比例する。例えば、ほんのわずかの割合のベイト分子が特定のリガンドにより結合された場合、蛍光偏光はほとんどなく、結果として、小さなｍＰ値となる。その対極で、大部分のベイト分子が特定のリガンドにより（または、より高濃度のリガンドで）結合された場合、かなりの蛍光偏光があり、その結果、大きなｍＰ値となる。このように、特定のベイト−リガンド相互作用に対する結合等温線が、固定された量の蛍光タグベイトの存在下でリガンドの濃度を変動させることにより作成され得る。
【００６４】
本明細書では、様々な蛍光標識されたＯＮが、一価および二価カチオンの存在下でのそれらの錯体形成を調べるために使用される。蛍光偏光による錯体形成のモニタリングでは、これらのＯＮが蛍光標識されることが要求されるが、この標識はＯＮの３'端に付着され、問題のＯＮの窒素塩基またはホスホジエステルバックボーンのいずれも妨害しない。さらに、蛍光タグは、強固な３炭素リンカーによりＯＮから離されて保持され、さらに溶液中での正常なＯＮ挙動のいずれの摂動も排除しない。よって、蛍光標識されたＯＮによる蛍光偏光を使用して、本明細書で観察されるいずれのＯＮ錯体形成も、非標識ＯＮ（錯体形成されたかどうかに関係なく）の溶液挙動の正確な表示となる。
【００６５】
オリゴヌクレオチド（ＯＮ）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマまたはポリマおよび／またはそれらの類似体を示す。この用語は、天然起源の核酸塩基、糖およびヌクレオシド間（バックボーン）共有結合からなるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する非天然起源の部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドはしばしば、望ましい特性、例えば例として、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のために、自然形態よりも好ましい。
【００６６】
本出願では、「縮重オリゴヌクレオチド」という用語は、任意の位置にゆらぎ（Ｎ）、例えばＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味することが意図される。各塩基は、ゆらぎとして合成され、そのため、このＯＮは実際には、同じ長さおよび生理化学特性の異なる無作為に生成された配列の集団として存在する。例えば、長さが４０塩基のＯＮ縮重では、集団中の任意の特定の配列が、理論的には総画分のわずか１／４４０または８．３×１０−２５に相当する。１モル＝６．０２２×１０２３分子とすると、縮重の合成は、今まで２ミリモルを超えないという事実から、事実上存在する特定の配列を有するいずれのオリゴヌクレオチドも、いずれの調製においても２回以上存在することがない。よって、そのような調製において観察される任意の錯体形成は、オリゴヌクレオチドの非配列依存的（または配列とは無関係の）生理化学特性によるものでなければならず、というのも、規定された配列のいかなる特定のオリゴヌクレオチドも、調製において固有のものであり、その特定のヌクレオチド配列に由来する任意の活性の一因となると予測することができないからである。
【００６７】
この概念のさらなる説明として、実施例Ｉは、高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析により、ＲＥＰ  ２００６（縮重ホスホロチオエート化配列を有する４０マーＯＮ）の特性を規定された配列の２１マーと比較し、同様のサイズおよび化学修飾（すなわちホスホロチオエート化）を有するいずれのＯＮも存在するヌクレオチドの配列により影響されない類似性の高い（全く同じではないにしても）生理化学的特徴を有することを明確に示す。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは様々な修飾、例えば、安定化修飾を含むことができ、よって、ホスホジエステル結合中および／または糖上、および／または塩基上に少なくとも１つの修飾を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、限定はされないが、１つ以上のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、および／またはメチルホスホネート結合を含むことができる。異なる化学的に適合可能な修飾結合は組み合わせることができ、例えば、合成条件が化学的に適合可能である修飾である。修飾結合は有用であるが、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドポリマの一般的な生理化学特性が大幅に影響されないホスホジエステル結合を含むことができる。追加の有用な修飾としては、限定はされないが、糖の２'位での修飾、例えば２'−Ｏ−アルキル修飾、例として２'−Ｏ−メチル修飾、２'−アミノ修飾、２'−ハロ修飾、例えば２'−フルオロ；非環式ヌクレオチド類似体が挙げられる。他の修飾もまた、当技術分野では知られており、使用することができ、例えば、ロックド核酸である。特に、オリゴヌクレオチドは至るところに修飾結合、例えば、ホスホロチオエートを有し；３'−および／または５'−キャップを有し；末端３'−５'結合を含み；オリゴヌクレオチドはリンカーにより連結された２つ以上のオリゴヌクレオチド配列からなるコンカテマーであるか、またはこれを含む。
【００６９】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用して調製される薬理学的に許容される、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドキレート錯体を使用して、オリゴヌクレオチド誘導抗凝固を防止する医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７０】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用して調製される薬理学的に許容される、本明細書で記載されるＯＮキレート錯体を含む、皮下投与による注射部位反応を防止する医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上記で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７１】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用して調製される薬理学的に許容されるＯＮキレート錯体を含む、ＩＶ注射耐容性を改善した医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上記で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７２】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用する薬理学的に許容されるＯＮキレート錯体を使用して、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、銅または亜鉛のオリゴヌクレオチド誘導欠乏を防止する医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上記で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７３】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用する薬理学的に許容されるＯＮキレート錯体を含む、貯蔵安定性を改善した医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上記で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７４】
治療的有効量の、下記金属カチオンのいずれかを使用する薬理学的に許容されるＯＮキレート錯体を含む、血清半減期が減少され、または血清タンパク質との相互作用が低減された医薬ＯＮ組成物もまた提供される：カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、鉄、銅、および／または亜鉛。ＯＮキレート錯体はまた、上記で記載される２つ以上の異なるカチオンを使用して調製され得る。特に、医薬組成物は、ヒト、または非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類への投与に承認される。
【００７５】
さらに、上記組成物は生理学的におよび／または薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤を含み得る。担体の特徴は、投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤」という用語は、本発明の組成物に組み込まれて対象に投与することができ、その薬理学的活性を破壊しない担体、アジュバント、ビヒクルまたは賦形剤を示す。本明細書で記載される医薬組成物中で使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクルおよび賦形剤としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達システム（「ＳＥＤＤＳ」）、医薬剤形において使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎまたは他の同様のポリマ送達マトリクス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマ、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂。シクロデキストリン、例えばα、βおよびγ−シクロデキストリン、または化学修飾誘導体、例えばヒドロキシアルキルシクロデキストリン（２−および３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む）、または他の可溶化誘導体もまた、本発明の組成物の送達を増強させるために使用され得る。
【００７６】
本明細書で記載される組成物は、下で記載される他の治療薬を含むことができ、および、例えば、医薬製剤の技術分野ではよく知られているものなどの技術に従い、従来の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与方法に適切な型の医薬添加物（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料、など）を使用することにより製剤化することができる。
【００７７】
本明細書で記載される組成物は、任意の好適な手段により、例えば、経口で、例として、錠剤、カプセル、顆粒または粉末の形態で；舌下に；頬側に；非経口で、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または基質内注射または注入技術（例えば、滅菌注射水溶液または非水溶液あるいは懸濁液として）により；経鼻で、例えば吸入噴霧により；局所で、例えばクリームまたは軟膏の形態で；または経直腸的に、例えば坐薬の形態で；非毒性の、薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤を含む用量単位剤形で投与され得る。本組成物は、例えば、即時放出または持続放出に好適な形態で投与され得る。即時放出または持続放出は、好適な医薬組成物の使用により、または、特に持続放出の場合、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置の使用により、達成され得る。よって、上記組成物は、下記経路の任意の１つによる投与に適合され得る：眼内、経口摂取、腸内、吸入、皮膚注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射または注入、気管内、静脈内注射または注入、あるいは局所。
【００７８】
経口投与のための例示的な組成物としては、例えば、バルクを与えるための結晶セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース、および甘味剤または香味剤、例えば当技術分野では知られているものを含み得る懸濁液；および、例えば、結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤、例えば当技術分野では知られているものを含み得る即時放出錠剤が挙げられる。本組成物はまた、口腔を通じて舌下および／または頬側投与により送達され得る。湿製錠剤、圧縮錠剤または凍結乾燥錠剤は、使用され得る例示的な形態である。例示的な組成物は、本組成物を速溶性希釈剤、例えばマンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンと共に製剤化するものを含む。そのような製剤中には、高分子量賦形剤、例えばセルロース（アビセル）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もまた、含まれ得る。そのような製剤はまた、粘膜接着を助ける賦形剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマ（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）、および放出を制御する作用物質、例えばポリアクリルコポリマ（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９３４）を含み得る。滑沢剤、流動促進剤、香料、着色剤および安定剤もまた、製作および使用を容易にするために使用され得る。
【００７９】
本明細書で記載される化合物の有効量は、当業者により決定され得、成人ヒトに対し、１日につき約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物の例示的な投与量を含み、これは、１回投与でまたは個々の分割投与形態で、例えば１日につき１〜５回で投与され得る。任意の特定の対象に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は変動する可能性があり、様々な因子、例えば、使用される特定の化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用の長さ、対象の種、年齢、体重、全体的な健康および食餌、投与様式および時間、排泄速度およびクリアランス、合剤、および特定の病状の重篤度に依存することは理解されるであろう。治療に好ましい対象としては、血管新生依存性または血管新生関連障害にかかりやすい動物、最も好ましくは哺乳類種、例えばヒト、および飼育動物、例えばイヌ、ネコなどが挙げられる。
【００８０】
医薬組成物はまた他の活性因子および／または活性を増強させる作用物質を含み得る。投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、噴霧、液体、粉末およびエアロゾルが挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性ベース、増粘剤などが必要であり、または望ましい場合がある。他の製剤としては、ＯＮが局所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、負（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）および他の送達作用物質または分子が挙げられる。ＯＮは、リポソーム内に封入されてもよく、またはそれら、特にカチオンリポソームと錯体を形成してもよい。または、ＯＮは脂質、特にカチオン脂質に複合体化されてもよい。好ましい脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本開示は、下記実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００８２】
実施例Ｉ
縮重ＯＮの特徴付け
図１Ａは、カラムに一緒に同時注入された２つのオリゴヌクレオチド調製物のＨＰＬＣ（疎水性カラムを使用）による分離を詳述する。これらのうちの最初のものは内部標準と呼ばれ、特定の規定された配列を有する２１マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、第２はＲＥＰ  ２００６（４０マー縮重ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）である。これらの種のどちらも、それらの生理化学的特性（すなわち、サイズおよび疎水性）にのみに基づいて明確な規定されたピークに分離され；これらのＯＮの各々中に存在するヌクレオチドの配列は、それらの生理化学的特性に対し重要な影響を有さず、よって、それらの分離に影響を有さない。したがって、内部標準は、ＲＥＰ  ２００６に比べ、これら２つのＯＮポリマのサイズの違いによってのみ、より少ない保持時間で明確に規定されたピークとしてカラムから溶離する。ＲＥＰ  ２００６ピークの両側の肩は、より長いオリゴヌクレオチドの生成において典型的な失敗配列によることに注意されたい。ＲＥＰ  ２００６の不均一な配列の性質にもかかわらず、非常に多くの異なる配列が存在するが、ＨＰＬＣにより、ＲＥＰ  ２００６調製における全ての種の共通の生理化学的特性を示す２１マー特定配列と同様に明確に規定されたピークに分離される。ＲＥＰ  ２００６および２１マーピークのＨＰＬＣ分離後、これらは質量分析（ＭＳ）に供することができ、これらの規定されたピーク内に存在する種が特定される（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【００８３】
図１Ｂでは、２１マーは、７４０２．６ＤａのＭＷを有する単一種に分解され、規定された配列を有するこのＰＳ−ＯＮと一致する。しかしながら、ＲＥＰ  ２００６（図１Ｃ）のＭＳ分析は、質量範囲がほとんど完全な正規分布を有する非常に多くの種が存在することを明らかにし、その完全な縮重特性と一致する。この質量範囲はＣ４０（最小種）〜Ａ４０（最大種）であり、これらの種の出現率は非常に小さく、それらの質量が質量範囲の中心に到達するにつれ、種の数が増加する（ピーク強度）。これは、次第に多くの異なる配列が、同様の質量となるからである。ＲＥＰ  ２００６中に存在する異なるＯＮ種の全てが、ＨＰＬＣ分離中疎水性カラム上で同じ保持時間を有するという事実は、同じサイズの、同じ化学修飾（すなわちホスホロチオエート化）を有するＯＮはすべて、類似性の高い（全く同じではないにしても）生理化学的特性を有し、したがって、特定のＯＮ分子中に存在するヌクレオチドの配列に依存しない任意の適用または特性において機能的に類似すると考えることができることを明確に証明する。よって、いかなる特定の縮重ＯＮ（例えばＲＥＰ  ２００３、ＲＥＰ  ２００４）を用いて観察された任意のＯＮキレート錯体形成も、存在するオリゴヌクレオチド上の配列に依存することはあり得ず、任意のＯＮの保存された生理化学的特性に依存するはずである。
【００８４】
実施例ＩＩ
ＯＮは様々な二価金属カチオンとキレート錯体を形成する
オリゴヌクレオチドアンモニウム塩の様々な二価金属カチオンとの相互作用を、上で記載されるように蛍光偏光（ＦＰ）により調べた。オリゴヌクレオチド合成中、各オリゴヌクレオチドを、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に３'端で、強固な３炭素リンカーにより、確立された試薬および合成プロトコルを用いて結合させた。これらのオリゴヌクレオチドを合成から切断し、アンモニウム塩のままとした。この実施例で使用したオリゴヌクレオチドを表１で記載する。
【００８５】
（表１）実施例１で使用したＯＮ
2013536195.tif 000003
Ｎ＝縮重配列（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの無作為組み込み）
ＰＳ＝各結合でのホスホロチオエート化
２'ＯＭｅ＝各リボースでの２'Ｏメチル化
【００８６】
使用した３'ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドはＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ（６マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ（１０マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ（２０マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ（４０マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ（４０マーポリシトシンホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド；配列番号：４）、ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ（各リボースが２'Ｏメチル化により修飾された４０マーホスホロチオエート化縮重オリゴヌクレオチド）およびＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ（各リボースが２'Ｏメチル化により修飾された４０マー縮重ホスホジエステルオリゴヌクレオチド）であった。これらのＯＮの各々を、１ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．２）中の０．５ｍＭストックとして調製した。これらのストックを使用して、ＦＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中３ｎＭ蛍光ＯＮ溶液を調製した。ＥＤＴＡが、ＦＰ測定前に溶液中に存在する全ての二価金属を除去するために存在した。これらの緩衝溶液の各々はまた、モル過剰の一価カチオンの存在下でのＯＮ錯体形成を評価するために８０ｍＭのＮａＣｌを含んだ（図１〜１２の各グラフにおいて、これは０ｍＭ金属塩化物濃度として報告されている）。溶液中の各蛍光ＯＮに様々な量の二価（２＋）金属のＡＣＳグレード塩化物塩を添加した。これらの塩は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化バリウム、塩化ニッケル、塩化銅、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化水銀よび塩化鉛を含んだ。ダイマーまたはより高次のＯＮキレート錯体の形成を、蛍光偏光の増加によりモニタし（無次元単位「ｍＰ」により定量化）、よってＯＮキレート錯体の形成が増加すると、質量のより大きな変化がもたらされるようにした。得られた、溶液中でのこれらのＯＮキレート錯体のより遅いタンブリングは、放射される蛍光の偏光の増加につながる（図１６を参照されたい）。これらの実験の結果を図２〜１３に示す。いずれの場合も、全てのＯＮで、すべての二価カチオンの存在下で蛍光偏光の著しい増加が見られたが、高モル過剰のＮａ＋（ＮａＣｌとして補給）の存在下では見られず、、これは二価金属カチオンのみとＯＮキレート錯体が形成されることを示す。これらの結果は以下を証明する:
・８０ｍＭのＮａＣｌの存在下でのＯＮは、ダイマーまたは他のより高次のＯＮ錯体のいかなる検出可能な形成をも示さない。
・ＯＮは、下記二価金属カチオンの存在下で、それらが２＋荷電状態で存在する場合、ダイマーおよびより高次の錯体を形成する：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、亜鉛、カドミウム、水銀および鉛。これらのＯＮ錯体の形成は、ＯＮのこれらの二価金属カチオンとの相互作用を含む。
・ＯＮ錯体の形成は、試験したＯＮの縮重特性のために、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用を介する窒素塩基間のハイブリダイゼーションによるものではあり得ない。さらに、ＲＥＰ  ２０３１（配列番号：４）は、使用した実験条件下でセルフハイブリダイズすることができない。
・ＯＮ錯体の形成は水溶液中で安定であり、可溶であり、これらの錯体は、問題の二価金属を形成された錯体の一部として組み込むと考えられるので、これらのＯＮ錯体は、ＯＮ錯体が形成された溶液から問題の二価金属をキレートする効果を有する。
・これらの金属のキレート化およびＯＮキレート錯体の形成は縮重オリゴヌクレオチドで観察されるキレート化により証明されるように、特定のヌクレオチド配列に依存せず、また、ホスホジエステル結合または２'リボース部分の修飾を含むヌクレオチド修飾に依存しない。
・これらの金属のキレート化は、６〜４０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドにより起こる。
・これらの金属のキレート化は、ホスホロチオエート化または２'リボース修飾の有無にかかわらず起こる。
【００８７】
この実施例における多くの二価金属カチオンの全てのＯＮとのＯＮキレート錯体の拡張形成はまた、以下を強く示唆する：
・二価カチオンは、ＯＮ錯体形成を触媒するが、一価カチオンは触媒しないので、またＯＮ錯体形成は、上記で記載されるように塩基ハイブリダイゼーションを介して起こらないので、ＯＮキレート錯体形成は、２つのＯＮ間の、カチオン中の空の電子軌道を満たすことができる電子を容易に共有する位置でのいくつかの形態の「金属イオン架橋」が関与するはずである。この「電子共有」を最も受けやすい位置は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素（またはホスホロチオエート化の場合硫黄）原子である（図１４Ｂを参照されたい）。
・二本鎖ＯＮは、ＤＮＡまたはＲＮＡに関係なく、同じキレート錯体形成を示すことが予期され、よって、溶液から金属カチオンをキレートする同じ傾向を有する。
・これらの金属架橋は、分子内相互作用は蛍光偏光の有意の増加を引き起こさないので分子間相互作用が関与するはずである(図１５Ａ〜Ｃおよび１６を参照されたい）。
・可溶性ＯＮキレート錯体は、キレート錯体沈殿を形成しないＯＮおよび二価カチオンの任意の濃度で存在する（図１４Ｄを参照されたい）。
・ＯＮは、二価金属カチオンと塩を形成することはできず、水溶液中で塩として挙動しない。これは、ＯＮと塩を形成し、溶液中塩（電解質）として挙動する一価カチオンとは対照的である（この実施例ではナトリウムにより例示されるが、他の一価カチオン、例えばカリウム、リチウムまたはアンモニウムにも当てはまる）。さらに、この実施例で使用した全てのＯＮは水溶液でアンモニウム塩であったが、アンモニウムイオンはＯＮから解離する可能性があり（塩で予測されるように）、二価カチオンによるＯＮキレート錯体の形成を阻止しない。これは、追加の一価塩（この場合８０ｍＭのＮａＣｌ）は二価カチオンとのＯＮキレート錯体の形成を妨害しないと考えられるという観察によりさらに強化される。
・ＯＮキレート錯体の形成は２＋荷電状態を有する任意の金属、遷移金属、ランタニドまたはアクチニド元素と共に起きることが予測でき、また、３＋またはそれ以上の荷電状態で存在することができる金属イオン（例えば、クロム）と共に起こる可能性も高い。
・長さが４０マーよりも大きい、または他の修飾を有する、または任意の特定の規定されたヌクレオチド配列を有するＯＮもまた、従来のホスホジエステル結合中の非架橋酸素（硫黄）原子と同じ様に電子を共有することができる結合を含む限り、二価金属カチオンとのＯＮキレート錯体を形成すると予測することができる。
・ＯＮ塩（例えば、ナトリウム塩）は、ヒトまたは非ヒト患者内で、例えば限定はされないが以下の二価金属をキレートするのに有用であり得る：カドミウム、水銀、鉛。さらに、ナトリウム塩オリゴヌクレオチドによるいずれの特定の二価金属カチオン（例えば、鉄）のキレート化も、ＯＮナトリウム塩を別の二価金属カチオン（例えば、カルシウム）とのＯＮキレート錯体として調製することにより抑制され得る。
・塩化物塩以外の金属塩もまた、ＯＮキレート錯体の形成を可能にし得る。カルシウム塩を例にとると、ＯＮキレート錯体形成と適合する他のカルシウム塩としては、限定はされないが、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、アスパラギン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、安息香酸カルシウム、エリソルビン酸カルシウム、および／またはプロピオン酸カルシウムが挙げられる。
【００８８】
実施例ＩＩＩ
ＯＮは、カルシウムおよびマグネシウムの異なる塩とキレート錯体を形成する
ＯＮキレート錯体形成の普遍的な性質をさらに証明するために、および、ＯＮキレート錯体の形成における二価金属カチオンの異なる塩の有用性をも証明するために、２つの異なる形態のカルシウムおよびマグネシウム塩を使用して、異なる特定配列のＯＮとの様々なＯＮキレート錯体を調製した。使用した塩は、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムであった。使用したＯＮを以下の表２に列挙する。ＦＰ反応条件は、ＥＤＴＡ媒介効果なしでのＯＮキレート錯体の形成を証明するためにＥＤＴＡを省略したことを除き、実施例１のものと同一であった。
【００８９】
（表２）実施例２で使用したＯＮ
2013536195.tif 000004
Ｎ＝縮重配列（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの無作為組み込み）
ＰＳ＝各結合でのホスホロチオエート化
２'ＯＭｅ＝各リボースでの２'Ｏメチル化
ＮＡ＝不適用（配列は縮重）
【００９０】
これらの実験の結果を図１７〜２４に示し、試験したＯＮは全て、カルシウムおよびマグネシウムの異なる塩とＯＮ錯体を形成することができることが証明される。一般的な所見に対する２つの例外はＲＥＰ  ２０２８−ＦＬ（４０マーポリＧ、配列番号：１；図１８Ａおよび２２Ａ）およびＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ（４０マーポリＡ、配列番号：２；図１７Ｂおよび２１Ｂ）である。これらのＯＮはどちらもポリプリンであり、とりわけポリＧの場合、熱力学的に安定な分子内相互作用（ポリＧトラクトの場合「Ｇ−カルテット」と呼ばれる）を形成することが知られており、これによって、これらのＯＮはタイトな分子内錯体を形成し、この場合、ホスホジエステルバックボーンはこの錯体内で部分的に折りたたまれる可能性が高く、あるいはもはや、溶液相互作用に参加することができない（同様のキレート錯体形成）。ＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ（配列番号：２）は、キレート錯体を形成することができることが弱く、これは、おそらく、このＯＮで生じる弱い「Ａ−カルテット」相互作用のためである。よって、ポリＡおよびポリＧのみを含むＯＮおよび熱力学的に安定な分子内相互作用を形成するアプタマーは本明細書では含まれない。本明細書で含まれるＯＮは完全ポリＡまたはポリＧ  ＯＮおよび／またはハプタマーではない。
【００９１】
実施例ＩＩの結果はマグネシウムおよびカルシウムの異なる塩形態を使用して、ＯＮキレート錯体を調製することができることを示し、さらに、下記を説明する：
・実施例ＩＩのＯＮは全て（ＲＥＰ  ２００６−ＦＬを除く）は特定の配列を含み、これらはヘアピンを形成することができる回文構造配列を含まず、これらの配列のいずれも自己相補的ではない。よって、観察されるＯＮキレート錯体形成はいずれも、ハイブリダイゼーションイベントに起因しない。
・ＲＥＰ  ２０２８−ＦＬ  （配列番号：１）およびＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ  （配列番号：２）のＯＮキレート錯体を形成する能力の悪さから、ほどけたホスホジエステルバックボーンが、キレート錯体を形成するための２つ以上のＯＮの結合に必要とされるＯＮ上の化学的特徴としてホスホジエステルバックボーンを再び示すＯＮキレート錯体形成のためには必要とされることが示唆される。
・ホスホジエステルバックボーンを含むいかなるＯＮも、他の存在する修飾、例えばホスホロチオエート化、２'リボース修飾またはロックド核酸修飾に関係なく、キレート錯体を形成することができると予測される。
・ＯＮキレート錯体は８０マー長もの大きさのＯＮおよび８０マー長を超えるＯＮと形成させることができ、また、二価金属カチオンの存在下、同じ挙動を示す。
【００９２】
実施例ＩＶ
二本鎖ＯＮとのＯＮキレート錯体の形成
二本鎖オリゴヌクレオチドは２つの一本鎖相補オリゴヌクレオチドから形成され、これらは水溶液中で、互いにＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用を介してハイブリダイズする。二本鎖ＯＮは依然として形成されるＤＮＡへリックスの外側で暴露されたホスホジエステルバックボーンを有するので、二価カチオンの存在下でキレート錯体を形成することができるはずである。この仮説を試験するために、２つの異なる二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（４０マーポリＡＣ；配列番号：６）をＲＥＰ  ２０３３−ＦＬ（４０マーポリＴＧ；  配列番号：５）と、ＲＥＰ  ２０５７−ＦＬ（４０マーポリＡＧ；配列番号：８）をＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（４０マーポリＴＣ；配列番号：７）とハイブリダイズさせることにより調製した。ＯＮハイブリダイゼーションにより、二本鎖が得られるので、得られた質量の増加は、錯体を調製するために使用した一本鎖ＯＮに対する蛍光偏光の増加により検出することができる。一本鎖ＯＮ（ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列番号：６）、Ｒｅｐ  ２０３３−ＦＬ（配列番号：５）、Ｒｅｐ  ２０５７−ＦＬ（配列番号：８）およびＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（配列番号：７））をそれぞれ、１ＸＦＰ緩衝液中で２０ｎＭまで希釈した。上で特定された２つの相補対のハイブリダイゼーションもまた、１Ｘ  ＦＰ緩衝液（１０ｎＭの各ＯＮ）中で実施し、ハイブリダイゼーションは、蛍光偏光の増加により確認した。二本鎖コンストラクトを次いで、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２または１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２に暴露させた。Ｏｎキレート錯体形成を蛍光偏光のさらなる増加によりモニタした（図２５を参照されたい）。この実験結果により、蛍光偏光の増加により証明されるように、ＯＮの両方の相補対の二本鎖ＯＮへのハイブリダイゼーションの成功が確認された。さらに、ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２のいずれかをこれらの二本鎖ＯＮに添加すると、蛍光偏光のさらなる増加が得られ、これらの二本鎖ＯＮはまた、二価金属カチオンの存在下でキレート錯体を形成することができることが示される。これらの結果から、二本鎖ＯＮは任意の二価カチオンとＯＮキレート錯体を形成することができ、前記二価カチオンを溶液から隔離する効果を有することも予測されることが強く示唆される。
【００９３】
実施例Ｖ
様々な一価カチオンはＯＮとキレート錯体を形成しない
ＯＮキレート錯体の形成は、一価カチオンの存在下で起こり得ず、それらの形成には二価カチオンを明確に必要とすることをより具体的に証明するために、多くのＯＮ（実施例２を参照されたい）を用いたＯＮ錯体形成を、１つのカチオン源のみを含むＦＰ緩衝液中で観察した。下記塩のうちの１つのみを含み、ＦＰ緩衝液中のカチオン濃度は同等であるように、１ＸＦＰ緩衝液を調製した：塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウム（全て８０ｍＭ濃度）。実施例２で記載される蛍光標識されたＯＮを、異なるＦＰ緩衝液中１０ｎＭまで希釈し、ＯＮキレート錯体形成を蛍光偏光によりモニタした（図２６を参照されたい）。試験した各ＯＮの場合、キレート錯体形成は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋カチオンのみで観察され、試験した一価カチオン（Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋）のいずれでも観察されなかった。実施例ＩＩＩで観察されるように、ＲＥＰ  ２０２９−ＦＬ（配列番号：２）およびＲＥＰ  ２０２８−ＦＬ（配列番号：１）は、それぞれ、カルシウムまたはマグネシウムの存在下でわずかな錯体形成を示し、または錯体形成を示さなかった。これにより、さらに、ＯＮは二価カチオンとのみキレート錯体を形成することができ、ＯＮは一価塩と、塩としてのみ存在することができることが確認される。
【００９４】
実施例ＶＩ
ＷＦＩにおいて調製したＯＮキレート錯体中の金属量の評価
ＯＮキレート錯体調製の全てのＯＮへの広い適用性を証明するために、いくつかの異なるＯＮキレート錯体を、表３に示されるようにＯＮおよび２＋金属塩化物塩を用いて調製した。これらの調製において使用した全てのＯＮは、ナトリウム塩であり、これらは、脱塩されてＮａＣｌ由来のナトリウムが除去され、最終の凍結乾燥ＯＮ中でのＯＮ塩形成に不可欠なナトリウムのみが残されていた。ＯＮキレート錯体を注射用水（ＷＦＩ）中、最初に、処方量のＯＮナトリウム塩を溶解して５０ｍｇ／ｍｌ濃度とし、処方量の二価金属塩化物塩をＯＮ溶液に添加することにより調製した。二価金属塩化物添加／ＯＮキレート形成前のＯＮ溶液を、ナトリウムおよび関連金属に対し、誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）により分析した。ＯＮキレート錯体形成後、試料を限外濾過により５０００ＭＷＣＯ再生セルロースフィルタを通して脱塩した。このフィルタは前に遊離塩を透過させるが、ＯＮまたはＯＮに付着されたカチオンは透過しないことが確認されている。残余分溶液（ＯＮキレート錯体を含む）を、ナトリウムおよび金属量に対してＩＣＰ−ＯＥＳにより、塩化物量に対しイオンクロマトグラフィーにより分析し、存在する二価金属はＯＮ上でキレートされ、残余分溶液中に存在する二価金属塩に由来しないことを確認した（表４）。
【００９５】
（表３）
様々なＯＮキレート錯体の調製
2013536195.tif 000005
Ｎ＝縮重塩基（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの無作為分布である）
ＰＳ＝ホスホロチオエート
２'ＯＭｅ＝２'Ｏメチル化リボース
５ＭｅＣ＝５'メチルシチジン
【００９６】
（表４）
様々なＯＮキレート錯体溶液中の金属量の確認
2013536195.tif 000006
【００９７】
これらの結果から、２０〜６０マーの様々な長さ、完全縮重ＯＮから３つの特定配列（ポリＣ、ポリＡＣおよびポリＡＧ）の配列の変動を有するＯＮにおいて、ホスホロチオエート修飾を有するまたは有さない、２'リボース修飾を有するまたは有さない、およびホスホロチオエートおよび２'リボース修飾を含むＯＮにおいてナトリウムのカルシウム、マグネシウムまたは鉄（２＋）による部分置換が確認される。２'Ｏメチルリボース修飾ＯＮをキレート錯体として製剤化する能力は、任意の他の２'リボース修飾、例えば限定はされないが２'フルオロおよび２'Ｏメトキシエチルを含むＯＮに拡張することが予測される。さらに、それらは二価金属量の最小増加により、著しいナトリウム置換が達成されることを証明し、図１５で記載されるＯＮキレート錯体構造と一致する。これらの結果はまた、ＯＮキレート錯体を調製するために使用することができる、カルシウム、マグネシウム、鉄（２＋）およびカルシウム／マグネシウム混合の塩溶液の様々な組み合わせを証明し、任意の二価金属塩溶液または二価金属塩溶液の混合物を、ＯＮキレート錯体を調製するために同様に使用でき得ることを示す。
【００９８】
よって、ＯＮキレート錯体は、完全にホスホロチオエート化されており、またはされておらず、任意の数のホスホロチオエート化結合を含み、少なくとも１つの２'リボース修飾を含むかまたは完全に２'リボース修飾され、あるいは２'リボース修飾を含まないＯＮから調製することができる。ＯＮは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡを含むハイブリッドとすることができる。ＯＮキレート錯体の調製において使用される金属塩としては、限定はされないが、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、任意の他の二価金属塩が挙げられる。
【００９９】
実施例ＶＩＩ
生理食塩水中で安定なＯＮキレート錯体の調製
実施例ＩＩおよびＩＩＩにおいて異なる二価金属とのＯＮキレート錯体形成および調製の広く保存される性質について証明してきたが、安定な、可溶性ＯＮカルシウムキレート錯体の調製を、対象にＯＮキレート錯体を投与するためのより適切な賦形剤である生理食塩水中で調べた。この実験のために、生理食塩水に溶解した２００ｍｇ／ｍｌのＲＥＰ  ２００６のナトリウム塩の溶液をＯＮ源として使用した。カルシウム源は、ＷＦＩに溶解したＣａＣｌ２の１０％溶液であった（１００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２）。異なるカルシウムおよびＲＥＰ  ２００６濃度を使用した様々なＲＥＰ  ２００６カルシウムキレート錯体を下記プロトコルに従い、１ｍｌ溶液中、室温で調製した（表５を参照されたい）：（１）ＲＥＰ  ２００６をバイアルに添加する、（２）生理食塩水を添加し、混合する、および（３）ＣａＣｌ２を添加し、混合する。これらのＲＥＰ  ２００６カルシウムキレート溶液を、３６日にわたり、沈殿の出現について観察した（表６を参照されたい）。
【０１００】
（表５）
様々なＲＥＰ  ２００６カルシウムキレート錯体の調製のための条件
2013536195.tif 000007
【０１０１】
（表６）
様々なＯＮおよびカルシウム濃度でのＲＥＰ  ２００６カルシウムキレート錯体における沈殿の形成
2013536195.tif 000008
-        澄んだ、透明溶液
+        バイアルの底に非常に少量の白色沈殿
++       微細なコロイド沈殿、半透明
+++      微細なコロイド沈殿、不透明
++++     主に管の底に沈殿、しかし、残留コロイドが存在
+++++    管の底に沈殿、残りの溶液は澄んでおり、透明である
【０１０２】
全ての場合において、ＲＥＰ  ２００６  カルシウムキレートの溶液は、バイアルを静かにひっくり返した場合のバイアルおよび粘性溶液挙動におけるより顕著なメニスカスにより証明されるように、カルシウムが存在しないＲＥＰ  ２００６溶液に比べ（試験した全ての濃度）、表面張力の減少および粘度の増加を示した。この溶液挙動は、図１５Ａ〜Ｃにおいて示される大きな可溶性多量体錯体（キレート錯体）の形成と一致する。沈殿が形成されるそれらのバイアルにおいてさえ、残りの溶液は依然としてこの特徴的な表面張力および粘度増加を示した。これらの溶液中で形成した沈殿は、図１５Ｄで示されるように、飽和（不溶）ＯＮキレート構造をとり、残りの沈殿していないＯＮおよびカルシウムは溶液中で依然として可溶性キレートを形成することが可能である。これらの挙動は、ＯＮ長、化学、構造（一本鎖もしくは二本鎖）または存在する二価金属に関係なく、任意のＯＮキレート錯体の挙動を一般に表すことが予測される。さらに、これらの実験はまた、ＯＮおよびカルシウムの濃度が高くなると、最初に、完全な可溶性錯体を形成することができるが、これらは動的に不安定であり、徐々に可溶性キレート錯体（図１５Ａ〜Ｃ）から不溶性キレート錯体（図１５Ｄ）に移行する可能性があることを示す。よって、溶液中で安定な可溶性ＯＮキレート錯体を有する表５で示されるものなどのＯＮおよび金属濃度でＯＮキレート錯体を調製することが望ましい。異なるＯＮおよび金属の組み合わせに対し、時間と共に溶液中で可溶なままである可溶性ＯＮキレート錯体が得られる最適ＯＮおよび金属濃度は、表５でＲＥＰ  ２００６およびカルシウムに対して示されるそれらの濃度から変動する可能性がある。
【０１０３】
実施例ＶＩおよびＶＩＩはＯＮキレート錯体の調製において有用であり得る異なる賦形剤中のＯＮおよび二価金属塩濃度の様々な組み合わせを記載し、生理食塩水中で、すぐに沈殿する、徐々に沈殿する、または長期間にわたり完全に可溶性のままであるＯＮキレート錯体溶液が得られる、ＯＮおよび二価金属塩または二価金属塩混合物の組み合わせを記載する。これらの安定性特徴のいずれかを有するＯＮキレート溶液を使用することが有利であり得る。
【０１０４】
よって、ＯＮキレート錯体は任意のＯＮ塩、例えば、限定はされないがＯＮナトリウム塩またはＯＮアンモニウム塩またはナトリウム／アンモニウム混合ＯＮ塩を使用して調製することができる。理想的には、ＯＮ塩は水性賦形剤、例えば、限定はされないが注射用水または生理食塩水に溶解される。ＯＮキレート形成のために使用される二価金属源は、塩化物塩、硫酸塩または任意の他の薬学的に許容される塩、例えば、限定はされないがグルコン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、エリソルビン酸塩、および／またはプロピオン酸塩とすることができる。塩は下記二価金属カチオンのいずれかを含むことができる：カルシウム、マグネシウム、鉄（２＋）、マンガン、銅および／または亜鉛。さらに２以上の金属塩の混合物を使用することができる。前記金属塩は粉末形態で直接使用することができるが、好ましくは、ＯＮが溶解されるものと同じ賦形剤中の水溶液として調製される。金属塩は、前記賦形剤中での前記金属塩に対する溶解度の限界までの任意の濃度で調製することができる。ＯＮキレート錯体は好ましくは、塩溶液の添加中にＯＮキレート沈殿物が蓄積するのを防止するために常に混合しながら、金属塩溶液をＯＮ溶液に徐々に添加することにより調製される。使用されるＯＮおよび金属塩の濃度に依存して、ＯＮキレート溶液は時間と共に徐々にＯＮキレート沈殿を形成し、または完全に可溶性のままとすることができる（実施例ＶＩＩを参照されたい）。
【０１０５】
実施例ＶＩＩＩ
ＯＮによる血清カルシウムのキレート化は血液の抗凝固を引き起こす
特定のＯＮの抗凝固効果については前に記載されているが、本開示におけるＯＮキレート錯体の抗凝固効果を証明するために、非ＦＩＴＣ標識ＯＮを、生物学的に適合可能なものとするために高純度ナトリウム塩として調製した。これらのＯＮはＲＥＰ  ２００４、ＲＥＰ  ２００６、ＲＥＰ  ２１０７およびＲＥＰ  ２０３１（配列番号：４）であり、これらは、実施例１で記載されるそれらのＯＮの非標識バージョンである。様々な濃度のこれらのＯＮ（５００μｌの生理食塩水中）を、クエン酸管中に収集した新５ｍｌの鮮ヒト全血に添加した。これらのＯＮの存在下でのプロトロンビン時間（血液の凝固状態に対して一般に認められている測定値）を一般に認められている臨床検査方法を用いて評価し、等量の生理食塩水の存在下のプロトロンビン時間と比較した。凝固に対する相対効果を比（ＰＴＴオリゴ：ＰＴＴ生理食塩水）として表し、正規化比（ＮＲ）として報告した。ＮＲ＝１は通常の凝固状態を示し、ＮＲ＞１は抗凝固処理された血液を示す。これらの実験の結果を図２７に示す。評価した全てのＯＮに対し、抗凝固の用量依存増加が存在した。
【０１０６】
ＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）は配列（ＡＣ）２０を有する４０マーホスホロチオエート化ＯＮである。２．５ｍＭのＲＥＰ  ２０５５のナトリウム塩の添加の血液凝固状態に対する効果を、上記のように評価した。抗凝固効果が血液からのカルシウムのキレート化によるものであるかを決定するために、ＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）誘導抗凝固に対する様々な量のカルシウム補給（塩化カルシウムの形態）の効果を観察した。この実験の結果を図２８に示す。図２７の結果から予測されるように、２．５ｍＭのＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）は、血液の顕著な抗凝固を誘導した。この抗凝固は、カルシウムの補給により効果的に抑制され、２．２５ｍＭを超える塩化カルシウム濃度では完全に逆転させることができた。これらの結果から、オリゴヌクレオチドの抗凝固効果は、ＯＮ投与後血液中でＯＮキレート錯体が形成し、上記実施例で記載されるカルシウムキレート化が得られることにより媒介されることが強く示唆される。さらに、これらの結果は、ＯＮをカルシウムキレート錯体として調製することにより投与されるＯＮのキレート効果を無効にする、ＯＮによる血液の抗凝固を防止するための方法を特定する。カルシウムキレート化の無効化はまた、下記を含むがこれらに限定されない別の二価金属の塩を用いて調製されるＯＮキレート錯体によっても達成され得る：マグネシウム、マンガン、鉄（２＋）、銅、および／または亜鉛。オリゴヌクレオチド媒介抗凝固を抑制するこれらの方法は、ＩＶまたは他の投与経路によりヒトまたは非ヒト対象に投与されるオリゴヌクレオチドで有効であると予測することができる。
【０１０７】
この実験の結果はまた、ＯＮの血清タンパク質との相互作用の性質に関して疑問を投げかける。ＯＮ抗凝固の性質の前の仮定は、ＯＮは、凝固カスケードのタンパク質と直接相互作用するというものであったが、我々はこれらのタンパク質の大部分がカルシウム結合タンパク質またはカルシウム依存凝固カスケード(Sheerhan and Lan, 1998, Blood 92: 1617)に関係するタンパク質であることに注目した。ＯＮの血液の抗凝固が、カルシウムを添加することにより無効化することができるという事実、およびＯＮはカルシウムキレート剤として作用するという事実は、以下を示唆する：
・抗凝固に関与するＯＮタンパク質結合は抗凝固にとって必要であるが、十分ではない可能性がある。カルシウム依存タンパク質からのＯＮによるそのキレート化を介するカルシウムの除去が、ＯＮが抗凝固活性を発揮するメカニズムであり得る。
・凝固カスケードの成分とのＯＮタンパク質の相互作用はそれ自体、カルシウム依存性であり得る。
【０１０８】
主要な血液タンパク質であるアルブミンはまた、カルシウムに結合し、血清カルシウム調節機序の一部である。アルブミンはまた、ＯＮと相互作用することが知られており、血液中でのＯＮの循環半減期において大きな役割を果たす可能性がある。上記抗凝固実験の結果から、血液中でのタンパク質との相互作用のほとんどは、主にＯＮのカルシウムキレート機能により触媒され得ると考えられる。よって、血清タンパク質との相互作用を減少させるために（これはまた、ＯＮの循環半減期を減少させる、およびそれらの非経口投与との耐容性を改善する効果を有する可能性がある）、ＯＮは対象にＯＮキレート錯体として投与することができ得る。これらの錯体は、カルシウム塩から調製することができ得るが、投与された時にカルシウムをキレートするＯＮの傾向を無効にするために他の適切な金属塩からも調製することができる。そのような錯体は、すでにそれらのキレート化活性が無効化されており、よって、血清タンパク質との相互作用が著しく減少されていることが予測される。この血清タンパク質との相互作用の減少の利点は、投与されたＯＮ（キレート錯体として）の耐容性の改善、および血液中での遊離ＯＮの半減期の短縮であろう。
【０１０９】
実施例ＩＸ
慢性ＯＮ治療による対象における低カルシウム血症の発症および防止
上記実施例で記載されるＯＮによる二価金属カチオンのキレート化がヒト対象において生物学的関連性を有するかをさらに調べるために、慢性ＯＮ投与の血清カルシウムに対する効果を、慢性肝疾患を有する患者において調べた。これらの対象は特に、ＯＮキレート化の生物学的効果（もしあれば）を調べるのによく適しており、それは、ビタミンＤ欠乏を患っていることが示されているからであり、これは典型的には無機質代謝障害および骨密度低下を伴う(Arteh et al., 2010, Dig. Dis. Sci., 55: 2624-2628 and George et al., 2009 World J Gasteroenterol., 15: 3516-3522)。よって、慢性投与されるＯＮのキレート化がヒト対象において二価金属恒常性（例えばカルシウム）を変化させるならば、この変化の効果はこれらの患者において最も容易に観察されるであろう。それは、もし起きた場合、そのような患者はいかなる血清金属の不均衡にも対抗することがあまりできないからである。慢性Ｂ型肝炎感染を有する患者（診断された慢性肝疾患を有する）を、１週間に１度ＯＮ  ＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）（ＧＭＰグレードナトリウム塩として）を用いて生理食塩水中の遅いＩＶ注射により処置した。総血清カルシウムレベルを、一般に認められている臨床検査方法により、対象においてモニタした。ＯＮ治療を受けた最初の２人の対象は、治療１２週以内で著しい低カルシウム血症を発症した（図２９Ａ）。この低カルシウム血症はその重篤度が変化したが、治療後の１３週中持続した。ＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）による慢性ＯＮ治療を受けた後の対象に、ミネラルサプリメントを与え（カルシウム、マグネシウムおよび亜鉛を与える）、ＯＮ治療のキレート化効果に対抗させた。ミネラルサプリメントを摂取した対象はいずれも低カルシウム血症をＯＮ治療中に発症しなかった（図２９Ｂ）。これらの結果から、ＯＮのキレート化活動がヒト対象において起こることが証明される。これは、血清カルシウムにより直接観察されたが、他の生物学的に関連する二価金属カチオン、例えばマグネシウム、亜鉛および銅でも起こりえる。さらに、ＯＮキレート化効果により引き起こされる金属欠乏は、ミネラル補給により修正することができ、また、ＯＮをキレート錯体として投与することにより低減させることができる。
【０１１０】
ＯＮは、ヒト対象中で二価金属カチオンをキレートすることが示されているので、キレートされていないＯＮの投与は、対象における有害重金属、例えば水銀、カドミウム、鉛またはクロム（６＋）キレート化に有用であり得る。そのような方法は薬学的に許容されるＯＮ塩の適切な賦形剤中での投与を含むこととなり、ＯＮは、配列依存的機能性を有さないように設計され（例えば、限定はされないが、実施例ＩＩＩで記載される特定配列ＯＮ）好ましくはＩＶ投与によるが、他の非経口経路にもよるであろう。正常な肝機能を有する患者は、起こるであろうカルシウムキレート化に対抗することができると予測されるであろうが、生物学的に重要な二価カチオンの血清欠乏が確実に防止されるようにミネラル補給が提供され得る（実施例ＩＸのように）。そのようなキレートされていないＯＮは、血液中に存在する重金属を隔離し、これらの金属の有害効果を直ちに低減または排除し、また、問題の対象からの排除を加速する可能性もあるであろう。
【０１１１】
二本鎖ＯＮはまた、ＯＮキレート錯体を形成する（よって、また、二価金属を隔離する）ことも証明されているので、任意の二本鎖核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投与はまた、上記実施例において一本鎖ＯＮに対し記載されるキレート化効果の少なくともいくらかを有するであろうと予測される。よって、二本鎖ＯＮを投与前にキレート錯体として調製することが有利であり得る。
【０１１２】
実施例Ｘ
ＯＮキレート錯体は皮下投与されるオリゴヌクレオチドの注射部位反応を抑制することができる
ヒト患者における皮下投与されたオリゴヌクレオチドによる注射部位反応（ＩＳＲ）は一般的であり、それらの免疫賦活性を最小に抑えるにように高度に修飾されたオリゴヌクレオチドによってさえもそうである。皮下投与は高濃度オリゴヌクレオチド（典型的には１００ｍｇ／ｍｌ超）の注射を含み、注射部位の周囲に局在するキレート化効果（たいがい、カルシウムであるが、他の二価金属、例えばマグネシウムも可能性がある）はかなりのものであるに違いなく、通常観察されるＩＳＲの一因となるであろう。この仮説を試験するために、ＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）またはＲＥＰ  ２１３９（配列番号：１３、全てのリボースが２'Ｏ−メチル化され、すべてのシトシン塩基が５'メチル化されているＲＥＰ  ２０５５類似体）を、皮下投与によりヒト患者に投与した。両方の溶液を無菌的に生理食塩水中で、ナトリウム塩またはカルシウムキレート錯体のいずれかとして調製した（表７および８を参照されたい、実施例ＶＩＩＩの手順に従う）。患者間の変動を制御するために、各ＯＮの両方の製剤を、同じヒト対象において注射反応性について評価した。対象を、ＩＳＲに対し、各注射部位でＲＥＰ  ２０５５  （配列番号：６）投与後１２時間およびＲＥＰ  ２１３９（配列番号：１３）投与後７２時間の間モニタした。この実験の結果を表７および８において示す。
【０１１３】
（表７）
カルシウムキレート錯体としての調製によるＲＥＰ  ２０５５（配列番号：６）の注射部位反応性の抑制（１ｃｃボーラス注射、２０ｍｇＣａＣｌ２／１００ｍｇ  ＯＮ）
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【０１１４】
（表８）
カルシウムキレート錯体としての調製によるＲＥＰ  ２１３９（配列番号：１３）の注射部位反応性の抑制（２ｃｃボーラス注射、３０ｍｇＣａＣｌ２／１００ｍｇ  ＯＮ）
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【０１１５】
これらの結果から、ＯＮをカルシウムキレート錯体として投与すると、２つの異なる皮下投与されたＯＮによるＩＳＲが実質的に低減または排除されることが示される。これらの結果から、カルシウム（および潜在的に他の二価金属）のＯＮによるキレート化は、典型的にはＯＮの皮下投与に伴うＩＳＲの徴候に影響することがさらに示される。さらに、これらの結果は、任意の皮下投与されたＯＮによるＩＳＲを、前記ＯＮをキレート錯体として投与することにより防止するための方法を特定する。これらの実施例において、カルシウムをキレート錯体形成のためのビヒクルとして使用したが、ＩＳＲの緩和は、カルシウム以外の別の適切な二価金属を用いて調製されたＯＮキレート錯体でも起こることが予測される。いかなるＯＮ金属キレート錯体も、中和されたカルシウムをキレートする傾向を有すると予測され、これは、キレート錯体として投与された場合のＯＮのＳＣ耐容性の改善のための基本的なメカニズムであろう。ＯＮキレート錯体が、オリゴヌクレオチド誘導ＩＳＲを抑制する能力は、本明細書における実施例で開示されるＯＮキレート錯体形成の広く保存される性質を考慮すると、任意の特定の配列および／または修飾の任意のＯＮあるいは一本鎖または二本鎖ＯＮに対し有効であると予測される。この実施例では、カルシウムを例示的な二価金属として使用しているが、ＯＮキレート錯体の調製において他のカルシウム塩を使用することができ、皮下投与によるオリゴヌクレオチド媒介ＩＳＲに対し同じ抑制効果を有するＯＮキレート錯体が得られることが予測され、例えば、限定はされないがグルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、アスパラギン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、安息香酸カルシウム、エリソルビン酸カルシウム、および／またはプロピオン酸カルシウムが挙げられる。ＯＮキレート錯体は、他の二価金属カチオン、例えば限定はされないが、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛の塩を用いて調製することができる。
【０１１６】
ＯＮキレート錯体の調製では、二価原子ではないが、同様にオリゴヌクレオチドのキレート化効果を防止することができる他のカチオンを使用することが望ましい可能性がある。これらのカチオンを使用して調製したＯＮキレート錯体はまた、ＯＮによる抗凝固を抑制するため、または皮下投与した場合のＯＮによる注射部位反応を抑制するため、またはＯＮ投与後の生物学的に重要な二価金属の隔離を防止するために製剤中で使用することができ得る。そのような対イオンとしては、限定はされないが以下が挙げられる：３＋以上の荷電状態の原子または有機カチオン。
【０１１７】
ＯＮキレート錯体の調製では、二価カチオンの混合物を用いて（すなわち、カルシウムおよびマグネシウム塩を用いて）ＯＮキレートを調製することが好ましい可能性がある。そのような混合ＯＮキレートは、単一の二価カチオンを用いて調製されるキレートよりも製造がより容易であり、より大きな溶解度を有し得、よって、高濃度用途に対しより良好に適合されるであろう。
【０１１８】
様々なＯＮ配列を使用する、様々な修飾を有する、および一本鎖または二本鎖状態にある、および様々な二価金属を使用する上記実施例を考慮すると、ＯＮキレート錯体の形成は、他の修飾に関係なく、ホスホジエステルバックボーン（ホスホロチオエート化されているかどうかに関係なく）を有する任意のおよび全てのＯＮの普遍的な特徴であると考えることができる。したがって、血液または皮下空間中でのＯＮキレート錯体の形成は、ＯＮが塩（典型的にはナトリウム塩）として投与された場合の任意のＯＮ投与の通常の特徴であり、このキレート化の二次効果は、問題のＯＮを摂取する特定の対象集団において無症候性であり得るが、二価金属カチオンの隔離が得られるが。重要なことに、ＯＮについて、（ナトリウム塩としての）皮下投与によるＩＳＲ反応を明確に示すいくつかの例が存在し(PRO-051 / GSK2402968 - Goemans et al., 2011 New England J. Med., 364: 1513-1522 and ISIS 301012 (mipomersen) - Viser et al., 2010, Curr. Opin. Lipidol. 21: 319-323)、これらは実施例ＩＸで観察されるＩＳＲに類似し、よって、投与後のＯＮキレート錯体形成の診断となる。これらのＯＮはどちらも異なる配列および２'リボース修飾を有するが、それらはどちらもホスホジエステルバックボーン（どちらもの場合もホスホロチオエート化）を有し、そのため、ＯＮキレート錯体を形成することができ、局所環境から二価金属を隔離することができる（この場合、皮下空間）。さらに、これらのＯＮはどちらも、ＯＮキレート化が起きているが、生物学的効果を行使することができることが示されおり、よって、生物系におけるＯＮキレート錯体は、ＯＮの生物活性を妨害しない。
【０１１９】
全てのホスホロチオエート化ＯＮ（ヌクレオチド配列に関係なく）は、典型的には腎臓および肝臓内で最高薬物濃度を達成することが当技術分野において、広く認められ、よく証明されている。歴史的に、多くの異なるホスホロチオエート化ＯＮの慢性投与は、軽度の肝または腎機能障害を伴っている。これらの機能障害の原因は明確には解明されていないが、一般的にＯＮのキレート化効果が保存されていることを考慮すると、肝臓および腎臓における二価金属のキレート化は、慢性ＯＮ投与で顕著となる可能性があり、というのも、キレート化活性は、存在する高濃度のＯＮのためにこれらの器官で最も顕著となり得るからである。ＯＮのキレート錯体としての投与は、器官体内分布を変化させない（または、上記で示されるように生物活性に影響しない）が、肝臓および腎臓における、これらの器官の正常機能に影響する金属欠乏を防止するように作用し得る。
【０１２０】
ＯＮキレート錯体が溶液中で多量体ＯＮ錯体を形成することを考慮すると、これらの錯体はヌクレアーゼ分解に対し、おそらく加水分解に対しずっと大きな抵抗性を有する可能性が高く、ホスホロチオエートＯＮはまた、酸化に対しより抵抗性であり得る。よって、任意のＯＮのキレート錯体としての貯蔵は、水溶液中でのその安定性を著しく増加させ、対象に投与された場合にその生物活性を著しく変化させることがない可能性がある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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