(57)【要約】【課題】細胞毒性が低く、生物活性物質と遺伝子治療および薬物送達において有用な複合体を形成する生分解性陽イオンポリマを提供する。【解決手段】生分解性陽イオンポリマが開示される。この生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意で末端保護基を含む。第１の繰り返し単位は、第４級アミン基を含む側鎖部分を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導され、その０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有する、第１の繰り返し単位、
前記開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および
任意選択の末端保護基
を含む生分解性陽イオンポリマ。
【請求項２】
前記第１の繰り返し単位の０％超は、第４級アミン基および第３級アミン基を含む側鎖部分を有する、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項３】
前記第１の繰り返し単位の前記側鎖部分は、側鎖カルボン酸基をさらに含む、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４】
前記陽イオンポリマは第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位をさらに含み、前記第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項５】
前記陽イオンポリマはポリカーボネートである、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項６】
前記陽イオンポリマは、ブロックコポリマである、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項７】
前記陽イオンポリマは両親媒性であり、水中で自己集合して５．０から８．０のｐＨにおいて１０ｎｍから５００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子を形成する、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項８】
生分解性陽イオンポリマの形成方法であって、
第１の環状カルボニルモノマ、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意で溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、
前記第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成するステップ、
任意選択として、前記第１のポリマを末端保護して前駆体ポリマを形成するステップ、および
前記前駆体ポリマを前記第３級アミンで処理して前記陽イオンポリマを形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップ
を含む、方法。
【請求項９】
前記第３級アミンはビス第３級アミンであり、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンおよび第３級アミンを含む前記側鎖部分を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビス第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第３級アミンはカルボキシ基を含み、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンおよびカルボン酸を含む前記側鎖部分を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の混合物は疎水性の第２の環状カルボニルモノマを含み、前記陽イオンポリマは前記第２の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第２の繰り返し単位を含むランダムコポリマであり、前記第２の環状カルボニルモノマは前記第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む側鎖部分を形成することができる１価の脱離基を含まない、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の繰り返し単位は、側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生分解性陽イオンブロックコポリマの形成方法であって
触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む反応混合物を形成するステップ、
前記反応混合物に第１の環状カルボニルモノマ、およびそれに続いて第２の環状カルボニルモノマを順次加え、開環重合によって反応させ、それによって第１のブロックコポリマを形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含み、前記第２の環状カルボニルモノマは、前記第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを形成することができないステップ、
任意選択として、前記第１のブロックコポリマを末端保護し、それによって前駆体ブロックコポリマを形成するステップ、および
前記前駆体ブロックコポリマを第３級アミンで処理して前記陽イオンポリマを形成するステップであって、前記陽イオンポリマは前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含み、前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記順次の反応を、逆の順序で実行して前記第１のブロックコポリマを形成させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のブロックコポリマをカルボン酸無水物を用いて末端保護し、それによって末端エステル基を形成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（１）で表され、
【化１】
2013515816.tif 000048
式中、
ｔは、０から６の整数であり、
各Ｙは、
【化２】
2013515816.tif 000049
からなる群から独立に選ばれた２価のラジカルであり、
各Ｑ１は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
【化３】
2013515816.tif 000050
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、および−ＳＲ１からなる群から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ１基の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（２）で表され、
【化４】
2013515816.tif 000051
式中、
各Ｑ２は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
【化５】
2013515816.tif 000052
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１からなる群から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
Ｒ２は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
Ｑ３は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から選ばれた１価のラジカルであり、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｒ２基は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（３）で表され、
【化６】
2013515816.tif 000053
式中、
ｕは、１から８の整数であり、
各Ｑ４は、水素、ハロゲン化物、カルボキシル基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
【化７】
2013515816.tif 000054
ここで、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
任意選択として、前記式（３）の
【化８】
2013515816.tif 000055
は、独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＲ１、または−ＮＲ１Ｒ１を表し、
任意選択として、前記式（３）の
【化９】
2013515816.tif 000056
は、独立に、
【化１０】
2013515816.tif 000057
基を表し、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ４基の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（４）で表され、
【化１１】
2013515816.tif 000058
式中、
各Ｑ５は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
【化１２】
2013515816.tif 000059
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、
各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる前記群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
各Ｑ６は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から独立に選ばれた１価の基であり、
各ｖは、独立に１から６の整数を表し、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ５基もしくはＱ６基またはその両方の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記陽イオンブロックコポリマは前記第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位を含み、前記第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記開始剤は、ＢｎＭＰＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれたビス第３級アミンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
負電荷を有する生物活性物質、並びに、生分解性陽イオンポリマを含むポリマ複合体であって、
前記生分解性陽イオンポリマは、
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位であって、前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有する繰り返し単位、
前記開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および
任意選択の末端保護基
を含む、
ポリマ複合体。
【請求項２５】
前記第１の繰り返し単位の前記０％超は側鎖第３級アミン基をさらに含む、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項２６】
前記第１の繰り返し単位の前記０％超が側鎖カルボン酸基をさらに含む、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項２７】
前記陽イオンポリマは、ポリカーボネートである、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項２８】
前記陽イオンポリマは疎水性の第２の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第２の繰り返し単位をさらに含み、前記第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項２９】
前記負電荷を有する生物活性物質は、遺伝子、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、薬物、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項３０】
前記陽イオンポリマは、ブロックコポリマである、請求項２４に記載のポリマ複合体。
【請求項３１】
ポリマ複合体を形成する方法であって、
生分解性陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させて、前記ポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成するステップであって、前記生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、前記開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、前記第１の繰り返し単位の０％超は、第４級アミン基を含む側鎖部分を有するステップ
を含む方法。
【請求項３２】
細胞を処理する方法であって、
前記細胞を生分解性陽イオンポリマおよび負電荷を有する生物活性物質を含むポリマ複合体のナノ粒子と接触させるステップであって、前記生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、前記開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、前記第１の繰り返し単位の０％超は、第４級アミン基を含む側鎖部分を有するステップ
を含む方法。
【請求項３３】
前記接触させるステップは、０％から１５％の溶血を誘発する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ粒子は、０％から２０％の細胞毒性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物活性物質は遺伝子であり、前記細胞は前記遺伝子を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
それぞれの第１の末端、それぞれの第２の末端、およびそれぞれの第１の繰り返し単位を含む２つのポリマ鎖、
酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選ばれた２つの主鎖ヘテロ原子を含むモノマ結合基
を含み、
ｉ）前記２つのポリマ鎖の前記それぞれの第１の末端は、前記２つの主鎖ヘテロ原子の１つとそれぞれ結合し、ｉｉ）任意選択として、前記それぞれの第２の末端は、それぞれの末端保護基を含み、ｉｉｉ）前記それぞれの第１の繰り返し単位は、エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第１の主鎖官能基を含み、前記それぞれの第１の繰り返し単位の０％超は、それぞれの側鎖第４級アミン基を含む
生分解性両親媒性陽イオンポリマ。
【請求項３７】
前記２つの主鎖ヘテロ原子は、酸素原子である、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項３８】
前記陽イオンポリマは、水溶液中５．０から８．０のｐＨにおいて自己集合し、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビームおよび９０°の散乱角を用いる動的光散乱法によって測定したとき、１０ｎｍから５００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子になる、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項３９】
前記陽イオンポリマは、ＡＳＴＭ  Ｄ６４００に則って生分解性である、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４０】
前記第１の側鎖は、それぞれの第３級アミン基をさらに含む、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４１】
前記２つのポリマ鎖は、ｉ）エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第２の主鎖官能基、およびｉｉ）エンドソーム環境においてカルボン酸基を形成することができるそれぞれの潜在的なカルボン酸基を含むそれぞれの第２の側鎖を含む、それぞれの第２の繰り返し単位を含む、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４２】
前記２つのポリマ鎖は、ブロックコポリマ鎖である、請求項３６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４３】
負電荷を有する生物活性物質、および
請求項３６に記載の生分解性両親媒性陽イオンポリマ
を含むポリマ複合体。
【請求項４４】
ポリマ複合体を形成する方法であって、
請求項３６に記載の生分解性両親媒性陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を、負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させて、前記ポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成するステップ
を含む方法。
【請求項４５】
細胞を処理する方法であって、
前記細胞を請求項４３に記載のポリマ複合体のナノ粒子と接触させるステップ
を含む方法。
【請求項４６】
生分解性陽イオンポリマを形成する方法であって、
ｉ）第１の環状カルボニルモノマ、ｉｉ）有機触媒、ｉｉｉ）促進剤、ｉｖ）２つの求核開始基を含むモノマ開始剤であって、前記２つの求核開始基はアルコール、アミン、およびチオールからなる群から独立に選ばれたモノマ開始剤、およびｖ）任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、
前記第１の混合物を撹拌し、それによって、前記第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成するステップ、
任意選択として、前記第１のポリマを末端保護するステップ、および
前記第１のポリマまたは前記末端保護された第１のポリマを前記第３級アミンで処理し、それによって前記陽イオンポリマを形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性ポリマに関する。より詳しくは、本発明は、遺伝子治療および薬物送達に用いるための生分解性ポリマと生物活性分子との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子治療の進歩によって、より安価な細胞毒性のない遺伝子移入用キャリア物質のより広い選択肢が切に求められるようになった。キャリア物質は、遺伝子の荷物を細胞外環境において包装および保護し、細胞膜を通して荷物を輸送し、細胞内の適当な点において荷物を放出する必要がある。通常、キャリア物質は、ウイルスベクタおよび非ウイルスベクタに分類される。ウイルスベクタは、遺伝子の送達および発現の効率が優れている。しかし、ウイルスベクタは、多くの場合に免疫的に有害な反応を引き起こし、製造するのに費用がかさみ、遺伝子カプセル化の点で限界がある。
【０００３】
非ウイルスベクタは、陽イオンポリマおよび陽イオン脂質（リポプレックス）を含む。これらの物質は生産コストが低くなる可能性があり、分子設計の点で柔軟性があるので、ウイルスベクタの代替として次第に関心を集めるようになった。陽イオンポリマおよび陽イオン脂質は、負電荷を有する遺伝物質と静電結合して正味電荷の減少したキャリア−遺伝子複合体を形成することができる。これらの複合体には、細胞への遺伝物質の効果的な移入を容易にすることができる可能性がある。
【０００４】
理想としては、高分子−遺伝子複合体はエンドサイトーシスによって細胞の細胞質に入るべきである。複合体は、酵素が遺伝子を分解することができるリソソームに入る前に酸性のエンドソーム環境から細胞質ゾルに逃げ込まなければならない。そのように振る舞うための設計上の要点がポリマキャリアのアミン残基を調整して緩衝能力を提供することである。これによってエンドソームは浸透圧によって膨潤および破裂し、生物活性荷物もしくは生物活性荷物−キャリア複合体（すなわちポリプレックス）またはその両方が細胞質中に放出され（プロトンスポンジ仮説）、従って遺伝子移入が可能になる。たとえば、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの陽イオンポリマの遊離アミン残基は、エンドソーム中のプロトンを効果的に緩衝し、エンドソームの浸透圧膨潤および破裂を引き起こすことができる。ＰＥＩは、優れた移入効率を有する良好な非ウイルスベクタとして認識されている。これは、圧縮された複合体の形成を容易にするその高い電荷密度と、緩衝能力を提供するその中性に近い第２級アミン部位の高い密度とによると考えられる。しかし、ＰＥＩは生分解性ではなく、細胞毒性も高いと考えられている。従って、陽イオンポリマにもとづく合成移入ベクタの設計における難問は、低い細胞毒性と高い移入効率とを達成することである。安全な遺伝子送達のための効率的な非ウイルスベクタとしてポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、修飾ＰＥＩ、ポリ（アミノ酸）、ポリ（β−アミノスルホンアミド）（ＰＢＡＳ）、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）にもとづくデンドリマ、およびポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマが報告された。しかし、これらの高分子には、特に合成プロセスにおいて、解決されるべきいくつかの課題がある。重縮合によって調製されたＰＢＡＥおよびＰＢＡＳは分子量分布が比較的広く、ＰＥＩおよびその誘導体は、通常、制御するのが難しい分岐構造体を一部含み、デンドリマは望ましい分子量を生成させるのに多数のステップが必要であり、アミノ酸にもとづくポリマは高価な出発物質のために製造コストが高い。
【０００５】
静電相互作用によるポリマ−遺伝子複合体生成は、遺伝物質のための効果的な輸送および保護戦略であるが、この緊密な充填は遺伝子を取り出す上で問題にもなる。生物活性名荷物の放出を容易にするために、分解性システム、可逆的な架橋、適度に帯電した陽イオンポリマ、階層的に自己集合したｐＨ応答性の３元ポリマおよび複数の電荷シフト戦略を含む多数の戦略が探索された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子移入および薬物送達のためのより安価な、より細胞毒性の低い、より生分解性の高い合成キャリアが依然として求められている。そのようなキャリアは、予測可能な分子量および低い多分散性を有するべきであり、生物活性分子、特にヌクレオチドと可逆的な細胞外複合体を形成するべきである。従って、本発明の目的は、細胞毒性が低く、生物活性物質と遺伝子治療および薬物送達において有用な複合体を形成する生分解性陽イオンポリマを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、実施態様において、
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導され、その０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有する第１の繰り返し単位、
開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および
任意選択の末端保護基
を含む生分解性陽イオンポリマが開示される。
【０００８】
別の実施態様において、
第１の環状カルボニルモノマ、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成するステップ、
任意選択として、第１のポリマを末端保護して前駆体ポリマを形成するステップ、および、
前駆体ポリマを第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成するステップであって、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップ
を含む、生分解性陽イオンポリマを形成する方法が開示される。
【０００９】
別の実施態様において、
触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む反応混合物を形成するステップ、
第１の環状カルボニルモノマ、および続いて第２の環状カルボニルモノマを反応混合物に順次加え、開環重合によって反応させ、それによって第１のブロックコポリマを形成するステップであって、第１の環状カルボニルモノマは第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含み、第２の環状カルボニルモノマは該第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを形成することができないステップ、
任意選択として、第１のブロックコポリマを末端保護し、それによって前駆体ブロックコポリマを形成するステップ、および
前駆体ブロックコポリマを第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成するステップであって、陽イオンポリマは第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップ
を含む、生分解性陽イオンブロックコポリマを形成する方法が開示される。
【００１０】
別の実施態様において、
負電荷を有する生物活性物質、および
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導され、その０％超が第４級アミン基を含む側鎖部分を有する第１の繰り返し単位、
開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および
任意選択の末端保護基
を含む生分解性陽イオンポリマ
を含む、ポリマ複合体が開示される。
【００１１】
別の実施態様において、
生分解性陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を、負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させてポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成するステップであって、生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有するステップ
を含む、細胞を処理するためのポリマ複合体を形成する方法が開示される。
【００１２】
別の実施態様において、
細胞を、生分解性陽イオンポリマおよび負電荷を有する生物活性物質を含むポリマ複合体のナノ粒子と接触させるステップであって、生分解性陽イオンポリマは第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有するステップ
を含む、細胞を処理する方法が開示される。
【００１３】
上記に記載の本発明の特徴および効果ならびにその他の本発明の特徴および効果は以下の詳細な記載、図面、および添付の請求項から当業者に明らかとなり、理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１５の陽イオンポリマおよびＤＮＡを用いて調製したポリプレックスの種々のｐＨおよびさまざまなＮ／Ｐ比におけるアガロースゲル電気泳動実験を示す写真画像である。
【図２】ｐＨ７．０、６．０および５．０において調製したポリプレックスのＮ／Ｐ比と粒子サイズとの間の関係を示す棒グラフである。
【図３】ｐＨ７．０、６．０および５．０において調製したポリプレックスのＮ／Ｐ比とζ電位との間の関係を示す棒グラフである。
【図４】種々のｐＨおよびＮ／Ｐ比において作製したポリプレックスについてＨｅｐＧ２ヒト肝癌腫細胞系統におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較する棒グラフである。ＤＮＡおよびＰＥＩ／ＤＮＡ対照物も示されている。
【図５】種々のｐＨおよびＮ／Ｐ比における細胞生存率を比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
生物活性分子とナノサイズの複合体を形成し、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの他のキャリアより細胞毒性の低い生分解性陽イオンポリマが開示される。陽イオンポリマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができるハロゲン化アルキルまたはスルホン酸エステルなどの１価の脱離基を有する第１の環状カルボニルモノマの開環重合（ＲＯＰ）によって誘導される。このための希釈剤として他の環状カルボニルモノマが選ばれてポリマに疎水性もしくは電荷シフト能力またはその両方を提供する。陽イオンポリマは高密度の電荷を有することができ、従って水に自由に溶解することができるか、または両親媒特性を備え、水溶液中でナノ粒子を形成することができる。開環方法により、ポリマの分子量の正確な制御が可能になり、低い多分散性（polydispersity）が達成され、さまざまな官能基と適合する。第４級アミンを含む部分を形成する第３級アミンとの反応は、開環重合の前か後に、特に重合の後に実行することができる。この４級化には、あったとしても最小限の陽イオンポリマの架橋しか伴わない。環状カルボニルモノマの例は、開環してカーボネートおよびエステルの繰り返し単位をそれぞれ含むポリマを形成する環状カーボネートモノマ、およびラクチドを含むラクトンを含む。第４級アミンは、ポリマの側鎖に位置し、望むならポリマ主鎖に直接結合してもよい。正電荷を有する第４級アミン基は、負電荷を有する生物活性物質との結合強度を提供する。実施態様において、第３級アミンはビス第３級アミンであり、陽イオンポリマは第４級アミンおよび第３級アミンを含む側鎖部分を有する。側鎖第３級アミン基は、緩衝能力を提供してポリマ複合体からの生物活性物質の放出を容易にする。他の官能基、例えば第２級アミン基、シトラコンアミド基、エステル基、およびイミン基を用いてポリマ複合体からの生物活性物質の放出を容易にすることができる。生物活性物質の放出は、電荷シフトが可能な陽イオンポリマによっても容易にすることができる。電荷シフトにおいては、ポリマ複合体が細胞に入った後に陽イオンポリマ側鎖の電荷のない基が負電荷を有する基に変換されることによって、陽イオンポリマの正味の正電荷が減少する。電荷シフトが可能な陽イオンポリマは、第４級アミンに加えて、たとえばアセタールエステルなどの潜在的なカルボン酸基を含むことができる。アセタールエステルは、エンドソーム環境の弱酸性条件下で加水分解されてカルボン酸基を形成することができる。細胞質ゾルのより塩基性の環境において、カルボン酸基はイオン化され、それによって陽イオンポリマの正味の正電荷を低下させ、負電荷を有する生物活性物質の放出を可能にする。環状カルボニルモノマの開環重合によって、陽イオンポリマの電荷シフト能力を特定の生物活性物質のために調整することが可能になる。陽イオンポリマは直鎖であっても分岐であってもよく、電荷および緩衝作用の強さを調整するために容易に修飾することができる。遺伝子とともに、陽イオンポリマは約１０ｎｍから約２５０ｎｍの平均粒子サイズを有する複合体（すなわちポリプレックス）を形成する。
【００１６】
用語「生分解性」は、米国材料試験協会によって、材料の化学構造の顕著な変化に至る生物活性、特に酵素作用によって引き起こされる分解として定義されている。本明細書において、材料は、ＡＳＴＭ  Ｄ６４００に則って１８０日以内に６０％生分解するなら「生分解性である」。
【００１７】
本明細書において、「荷物（cargo）」は、開示される陽イオンポリマと可逆的なナノサイズの複合体を形成する任意の生物活性物質であってよいが、複合体はエンドサイトーシスによって細胞に入ること、および複合体は細胞内において所望の段階で生物活性物質を放出することが前提条件である。生物活性物質は、生体分子（たとえばＤＮＡ、遺伝子、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、リン脂質、およびヌクレオチド）、天然または合成の有機化合物（たとえば、薬物、染料、合成ポリマ、オリゴマ、およびアミノ酸）、無機物質（たとえば金属および金属酸化物）、前述のものの放射性変化形、および前述のものの組み合せを含む。「生物活性」は、物質が細胞の化学構造もしくは活性またはその両方を望ましいように変化させることができること、あるいは細胞型の化学構造もしくは活性またはその両方を別の細胞型に対して選択的に望ましいように変化させることができることを意味する。一例として、１つの望ましい化学構造の変化は、細胞のＤＮＡへの遺伝子の組み込みであってよい。望ましい活性の変化は、移入された遺伝子の発現であってよい。細胞活性の別の変化は、所望のホルモンまたは酵素の誘起された産生であってよい。あるいは、望ましい活性の変化は、別の細胞型を上回る１つの細胞型の選択的な死であってよい。生物活性物質によって引き起こされる細胞活性の相対的な変化には、変化が望ましくかつ有用であれば限定はない。さらに、いわゆる「荷物」には、荷物が複合体から放出されると有用な細胞応答を誘発するのであれば限定はない。
【００１８】
環状カルボニルモノマに関する以下の一般式の記載において、「第１の環状カルボニルモノマ」は、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含む第１の範疇の環状カルボニルモノマを指す。用語「第２の環状カルボニルモノマ」は、第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含まない第２の範疇の環状カルボニルモノマを指す。それ以外は、第１および第２の環状カルボニルモノマは、以下に記載されている式のいずれから選ばれた構造も有することができる。
【００１９】
環状カルボニルモノマは、一般式（１）の化合物から独立に選ぶことができる。
【００２０】
【化１】
2013515816.tif 000002
【００２１】
式中、ｔは０から６の整数であり、ｔが０のとき４の炭素と６の炭素とは単結合によって結合している。各Ｙは、
【００２２】
【化２】
2013515816.tif 000003
【００２３】
から独立に選ばれた２価のラジカルである。ここでダッシュ「−」は結合点を示す。後の２つの基は、本明細書において−Ｎ（Ｑ１）−および−Ｃ（Ｑ１）２−とも表される。各Ｑ１は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、または下段の構造を有する基から独立に選ばれた１価のラジカルである。
【００２４】
【化３】
2013515816.tif 000004
【００２５】
ここで、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、ここでダッシュは結合点を表し、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、または６から３０の炭素を含むアリール基から独立に選ばれた１価のラジカルである。１つ以上のＱ１基は、第３級アミンと反応して第４級アミン（すなわち４つの炭素に結合した正の電荷を有する第四級アンモニウムイオン）を含む部分を形成することができる１価の脱離基をさらに含むことができる。１価の脱離基の非限定的な例は、ハロゲン化アルキル（たとえば塩化アルキル、臭化アルキルまたはヨウ化アルキル）の形のハロゲン化物、スルホン酸エステル（たとえばトシル酸エステルまたはメシル酸エステル）、およびエポキシドを含む。各Ｑ１基は、独立に、分岐形または非分岐形であってよい。各Ｑ１基は、独立に、ケトン基、アルデヒド基、アルケン基、アルキン基、３から１０の炭素を含む脂環式の環、２から１０の炭素を含む複素環、エーテル基、アミド基、エステル基を含む追加の官能基、および前述の追加の官能基の組み合わせも含むことができる。複素環は、酸素、硫黄もしくは窒素またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。２つ以上のＱ１基が一緒に環を形成することができる。式（１）の第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含む１つ以上のＱ１基を含む。式（１）の第２の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む部分を形成することができる官能基を含まない。
【００２６】
開環重合することができる別の特定の環状カルボニルモノマは、一般式（２）を有する。
【００２７】
【化４】
2013515816.tif 000005
【００２８】
式中、Ｑ２は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記の構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである。
【００２９】
【化５】
2013515816.tif 000006
【００３０】
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、Ｒ２は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、Ｑ３は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである。実施態様において、各Ｑ２は、水素であり、Ｑ３は、メチルまたはエチル基である、Ｒ２は、１から３０の炭素を含むアルキル基である。式（２）の第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含むＲ２基を含む。式（２）の第２の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む部分を形成することができる官能基を含まない。
【００３１】
さらに別の特定の環状カルボニルモノマは、一般式（３）を有する。
【００３２】
【化６】
2013515816.tif 000007
【００３３】
式中、各Ｑ４は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記の構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである。
【００３４】
【化７】
2013515816.tif 000008
【００３５】
ここで、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、式中、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、ｕは、１から８の整数である。任意選択として、ラクトン環は、炭素−炭素二重結合を含むことができる。すなわち、任意選択として、式（３）の
【００３６】
【化８】
2013515816.tif 000009
【００３７】
は、独立に、
【００３８】
【化９】
2013515816.tif 000010
【００３９】
を表すことができる。ラクトン環は、ヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、またはそれらの組み合わせも含むことができる。すなわち、任意選択として式（３）の
【００４０】
【化１０】
2013515816.tif 000011
【００４１】
は、独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＲ１、または−ＮＲ１Ｒ１基を表すことができる。式中、Ｒ１は、上記と同じ定義を有する。式（３）の第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含む１つ以上のＱ４基を含む。式（３）の第２の環状カルボニルモノマは、この第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む部分を形成することができる官能基を含まない。実施態様において、ｕは、１から６の整数であり、各Ｑ４は、水素である。
【００４２】
さらに別の特定の環状カルボニルモノマは、一般式（４）のジオキサンジカルボニルである。
【００４３】
【化１１】
2013515816.tif 000012
【００４４】
式中、各Ｑ５は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記の構造を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである。
【００４５】
【化１２】
2013515816.tif 000013
【００４６】
ここで、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、式中、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、各Ｑ６は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から独立に選ばれた一価の基である。各ｖは、独立に、１から６の整数である。式（４）の第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含む１つ以上のＱ５基および／またはＱ６基を含む。式（４）の第２の環状カルボニルモノマは、この第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む部分を形成することができる官能基を含まない。実施態様において各ｖは１であり、各Ｑ５は水素であり、各Ｑ６は１から６の炭素を含むアルキル基である。
【００４７】
環状カルボニル化合物は、Ｒ−異性体またはＳ−異性体のどちらかとして異性体が濃縮された形で存在することができる１つ以上の不斉炭素中心を有することができる。さらに、各不斉炭素中心は、独立に、８０％以上、より詳しくは９０％のエナンチオマ過剰率で存在することができる。
【００４８】
ハロゲン化アルキルの形の１価の脱離基を有する式（１）または（２）の環状カルボニルモノマの例は、表１の環状モノマを含む。
【００４９】
【表１】
2013515816.tif 000014
【００５０】
式（２）の環状カルボニルモノマの追加の例は、表２の化合物を含む。これらは、たとえば、表１のハロゲン化物モノマの開環重合におけるコモノマとして用いてランダムコポリマまたはブロックコポリマを形成することができる。
【００５１】
【表２】
2013515816.tif 000015
【００５２】
式（３）の環状カルボニルモノマの例は、表３の化合物を含む。
【００５３】
【表３】
2013515816.tif 000016
【００５４】
式（４）の環状カルボニルモノマの例は、表４の化合物を含む。
【００５５】
【表４】
2013515816.tif 000017
【００５６】
上記に述べたように、静電相互作用による複合体生成は、遺伝物質のための効果的な包装（packaging）戦略である。しかし、多くの場合に、移入後放出は難しく、したがって移入速度は低くなることがある。この問題を回避するために、環状カルボニルモノマが潜在的なカルボン酸基を含む電荷シフト戦略を利用することができる。これは、陽イオンポリマがエンドソーム環境のｐＨに対応する約ｐＨ５においてカルボン酸に変換することができる保護された側鎖カルボン酸を含むことを意味する。潜在的なカルボン酸基の例は、本明細書においてアセタールエステル基とも呼ばれるアセタール保護されたカルボン酸基である。アセタールエステル基は、一般式（５）を有する。
【００５７】
【化１３】
2013515816.tif 000018
【００５８】
式中、＊−は、環状カルボニル部分との結合を表し、ＲｃおよびＲｄは、独立に、１から２０の炭素を含む１価のラジカルである。実施態様において、Ｒｃはメチルであり、Ｒｄはエチルである。別の実施態様において、第２の環状カルボニルモノマは、ＭＴＣＯＥＥである。
【００５９】
【化１４】
2013515816.tif 000019
【００６０】
ＭＴＣＯＥＥから誘導された繰り返し単位は、共重合されて陽イオンポリマに入ったとき、酸性のエンドソーム環境において容易に脱保護される側鎖アセタールエステルを含む。細胞質中に放出されると、結果として生じた陽イオンポリマのカルボン酸基は脱プロトンし、従ってキャリアの正味電荷を中和し、生物活性物質の放出の促進を可能にする。ＭＴＣＯＥＥから誘導された陽イオンポリマは、ＤＮＡと結合して９０ｎｍから１１０ｎｍの平均直径を有する自己集合ナノ粒子を形成することができる。
【００６１】
エンドソーム内放出を容易にするための別の戦略は、たとえばフッ素化第３級アルコール基を含む環状カルボニルモノマを用いて生物活性な荷物を安定化させる非共有結合相互作用を含む。フッ素化第３級アルコール基は、リン酸および関連構造物と結合するが、相互作用エネルギーが静電相互作用より低く、したがってより容易に放出されることが知られている。
【００６２】
上記のモノマは、酢酸エチルなどの溶媒からの再結晶または他の公知の精製方法によって精製することができ、モノマからできるだけ多くの水を取り除くことに特に注意が払われる。モノマ水分含有率は、モノマの重量を基準として１から１０，０００ｐｐｍ、１から１，０００ｐｐｍ、１から５００ｐｐｍ、最も詳しくは１から１００ｐｐｍであってよい。
【００６３】
その少なくとも１つは第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、上記に記載されている環状カルボニルモノマは、開環重合して第１のポリマを形成する。第１のポリマは、同じ環状カルボニルモノマまたは別の環状カルボニルモノマ、または環状カルボニルモノマの混合物と連鎖成長を開始してブロックコポリマを形成することができるリビングポリマである。任意選択として、第１のポリマは、さらなる連鎖成長を防ぎ、反応性末端基を安定させるために末端保護剤で処理される。その結果得られた前駆体ポリマは、次に、第３級アミンで処理されて陽イオンポリマを形成する。第１のポリマ、前駆体ポリマ、および陽イオンポリマは、アタクチック形、ジンジオタクチック形またはアイソタクチック形で作り出すことができる。特定のタクティシティーは、環状モノマ（単数または複数）、異性体純度、および反応条件によって決まる。
【００６４】
あるいは、陽イオンポリマは、第４級アミン基および第３級アミン基を含む環状カルボニルモノマの開環重合によって得ることができる。しかし、これらのモノマは、調製するのがより難しく、安定性がより低く、対応するポリマの多分散性が大きくなる傾向がある。従って、４級化反応は、開環重合の後に実行する。
【００６５】
最も簡単な例において、第１のポリマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを含む部分を形成することができる１価の脱離基を含む第１の環状カルボニルモノマ、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む反応混合物から調製されたホモポリマである。実施態様において、触媒および促進剤は、同じ物質である。たとえば、一部の開環重合は、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）だけを用いて別の触媒を用いないで行なうことができる。一般に、開環重合は、窒素またはアルゴンなどの不活性雰囲気下の反応器中で行なう。重合は、ベンゼン、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ジオキサン、クロロホルムおよびジクロロエタンなどの不活性溶媒中の溶液重合によって、またはバルク重合によって実行することができる。ＲＯＰの反応温度は、常温付近から２５０℃であってよい。一般に、反応混合物を大気圧において０．５から７２時間加熱して重合を行い、第１のポリマを含む第２の混合物を形成させる。開環して成長した各ポリマ鎖の出発点となった末端に、モノマジオール開始剤から誘導されたサブユニットが結合している。次に、任意選択として、第１のポリマを末端保護して前駆体ポリマを形成させる。次に、前駆体ポリマを第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成させる。ここで、第１のカルボニルモノマから誘導された繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有する。
【００６６】
第１のポリマは、たとえば、第１の環状カルボニルモノマおよび疎水性の第２の環状カルボニルモノマを含む混合物の開環重合によって形成されたランダムコポリマでもあってよい。ランダムな第１のポリマを末端保護してランダムな前駆体コポリマを形成することができる。この場合、開始剤から誘導されたサブユニット、および末端保護基を含む末端繰り返し単位を、どちらのモノマから誘導された繰り返し単位とも結合させることができる。次に、ランダムな前駆体コポリマを第３級アミンで処理してランダムな陽イオンコポリマを形成させる。ここで、第１の環状カルボニルモノマから誘導された繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む部分を含む。第２の環状カルボニルモノマから誘導された繰り返し単位は、第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含まない。望むなら、反応混合物は第１の範疇もしくは第２の範疇またはその両方の追加の環状カルボニルモノマを含むことができると理解される。
【００６７】
より詳しくは、第１のポリマは、たとえば第１の環状カルボニルモノマおよび疎水性の第２の環状カルボニルモノマを順次に開環重合させて第１のブロックコポリマを形成させることによって形成されたブロックコポリマである。次に、任意選択として、第１のブロックコポリマを末端保護して前駆体ブロックポリマを形成させる。次に、前駆体ブロックポリマを第３級アミンで処理して陽イオンブロックコポリマを形成させる。ここで、第１の環状カルボニルモノマから誘導された繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有する。前と同じように、第２の環状カルボニルモノマから誘導された繰り返し単位は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含まない。開環重合の順序に応じて、モノマジオール開始剤から誘導されたサブユニットを第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位または第２のカルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位と結合させることができる。１例において、最初に第１の環状カルボニルモノマを重合させてブロックコポリマの第１のブロックを形成させ、２番目に第２の環状カルボニルモノマを重合させてブロックコポリマの第２のブロックを形成させる。この例において、陽イオンブロックコポリマは、モノマジオール開始剤から誘導されたサブユニットと結合した、第１の環状カルボニルモノマから誘導された親水性のコアブロック、および任意選択として末端保護された、第２のカルボニルモノマから誘導された疎水性の外側のブロックを含む。別の例において、最初に第２の環状カルボニルモノマを重合させ、２番目に第１の環状カルボニルモノマを重合させる。この例において、陽イオンブロックコポリマは、ジオール開始剤から誘導されたサブユニットと結合した第２の繰り返し単位を含む疎水性コアブロック、および任意選択として末端保護された親水性の外側のブロックを含む。望むなら、第１の環状カルボニルモノマ、第２の環状カルボニルモノマ、別の環状カルボニルモノマ、またはそれらの組み合わせを用いて、保護されていない鎖のリビング末端から追加のブロックを成長させることができる。ブロックコポリマは、両親媒性であり、水溶液中で自己集合ナノサイズ粒子を形成する。
【００６８】
ＲＯＰ重合のための触媒の例は、金属酸化物、たとえば、テトラメトキシジルコニウム、テトラ−イソ−プロポキシジルコニウム、テトラ−イソ−ブトキシジルコニウム、テトラ−ｎ−ブトキシジルコニウム、テトラ−ｔ−ブトキシジルコニウム、トリエトキシアルミニウム、トリ−ｎ−プロポキシアルミニウム、トリ−イソ−プロポキシアルミニウム、トリ−ｎ−ブトキシアルミニウム、トリ−イソ−ブトキシアルミニウム、トリ−ｓｅｃ−ブトキシアルミニウム、モノ−ｓｅｃ−ブトキシ−ジーイソ−プロポキシアルミニウム、エチルアセトアセテートアルミニウムジイソプロピレート、アルミニウムトリス（エチルアセトアセテート）、テトラエトキシチタン、テトラ−イソ−プロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラ−ｎ−ブトキシチタン、テトラ−ｓｅｃ−ブトキシチタン、テトラ−ｔ−ブトキシチタン、トリ−イソ−プロポキシガリウム、トリ−イソ−ブトキシアンチモン、トリメトキシホウ素、トリエトキシホウ素、トリ−イソ−プロポキシホウ素、トリ−ｎ−プロポキシホウ素、トリ−イソ−ブトキシホウ素、トリ−ｎ−ブトキシホウ素、トリ−ｓｅｃ−ブトキシホウ素、トリ−ｔ−ブトキシホウ素、トリ−イソ−プロポキシガリウム、テトラメトキシゲルマニウム、テトラエトキシゲルマニウム、テトラ−イソ−プロポキシゲルマニウム、テトラ−ｎ−プロポキシゲルマニウム、テトラ−イソ−ブトキシゲルマニウム、テトラ−ｎ−ブトキシゲルマニウム、テトラ−ｓｅｃ−ブトキシゲルマニウムおよびテトラ−ｔ−ブトキシゲルマニウム；ハロゲン化化合物、たとえば、五塩化アンチモン、塩化亜鉛、臭化リチウム、塩化スズ（ＩＶ）、塩化カドミウムおよび三フッ化ホウ素ジエチルエーテル；アルキルアルミニウム、たとえば、トリメチルアルミニウム、トリエチルアルミニウム、ジエチルアルミニウムクロリド、エチルアルミニウムジクロリドおよびトリ−イソ−ブチルアルミニウム；アルキル亜鉛、たとえばジメチル亜鉛、ジエチル亜鉛およびジイソプロピル亜鉛；第３級アミン、たとえば、トリアリルアミン、トリエチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミンおよびベンジルジメチルアミン；ヘテロポリ酸、たとえば、リンタングステン酸、リンモリブデン酸、シリコタングステン酸およびそれらのアルカリ金属塩；ジルコニウム化合物、たとえば、ジルコニウム酸塩化物、オクタン酸ジルコニウム、ステアリン酸ジルコニウムおよび硝酸ジルコニウムを含む。さらに詳しくは、触媒は、オクタン酸ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム化合物またはトリアルコキシアルミニウム化合物である。
【００６９】
他のＲＯＰ触媒は、制御された、予測可能な分子量および狭い多分散性を有するポリマへの共通基盤を提供することができる無金属の有機触媒を含む。環状エステル、カーボネートおよびシロキサンのＲＯＰのための有機触媒の例は、４−ジメチルアミノピリジン、ホスフィン、Ｎ−複素環カルベン（ＮＨＣ）、二官能アミノチオ尿素、ホスファゼン、アミジン、およびグアニジンである。実施態様において、触媒は、Ｎ−（３，５−トリフルオロメチル）フェニル−Ｎ’−シクロヘキシル−チオ尿素（ＴＵ）である。
【００７０】
【化１５】
2013515816.tif 000020
【００７１】
別の無金属ＲＯＰ触媒は、少なくとも１つの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン−２−オール−２−イル（ＨＦＰ）基を含む。単独供与型水素結合触媒は、式（６）を有する。
Ｒ２−Ｃ（ＣＦ３）２ＯＨ      （６）
Ｒ２は、水素または１から２０の炭素を有する１価のラジカル、たとえばアルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、置換ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、またはそれらの組み合わせを表す。表５に単独供与型水素結合触媒の例を挙げる。
【００７２】
【表５】
2013515816.tif 000021
【００７３】
二重供与型水素結合触媒は、２つのＨＦＰ基を有し、一般式（７）によって表される。
【００７４】
【化１６】
2013515816.tif 000022
【００７５】
式中、Ｒ３は、１から２０の炭素を含有する２価のラジカルの橋架け基、たとえばアルキレン基、置換アルキレン基、シクロアルキレン基、置換シクロアルキレン基、ヘテロシクロアルキレン基、置換ヘテロシクロアルキレン基、アリーレン基、置換アリーレン基、およびそれらの組み合わせである。代表的な式（７）の二重水素結合型触媒は、表６に列挙されているものを含む。特定の実施態様において、Ｒ２はアリーレン基または置換アリーレン基であり、ＨＦＰ基は芳香環の互いにメタの位置を占める。
【００７６】
【表６】
2013515816.tif 000023
【００７７】
一実施態様において、触媒は、４−ＨＦＡ−Ｓｔ、４−ＨＦＡ−Ｔｏｌ、ＨＦＴＢ、ＮＦＴＢ、ＨＰＩＰ、３，５−ＨＦＡ−ＭＡ、３，５−ＨＦＡ−Ｓｔ、１，３−ＨＦＡＢ、１，４−ＨＦＡＢ、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００７８】
担体に結合されたＨＦＰ含有基を含む触媒も意図される。一実施態様において、担体は、ポリマ、架橋ポリマビーズ、無機粒子、または金属粒子を含む。ＨＦＰ含有ポリマは、ＨＦＰ含有モノマ（たとえばメタクリレートモノマ３、５−ＨＦＡ−ＭＡまたはスチリルモノマ３，５−ＨＦＡ−Ｓｔ）の直接重合を含む公知の方法によって形成させることができる。直接重合（またはコモノマとの重合）することができるＨＦＰ含有モノマの官能基は、アクリレート、メタクリレート、α，α，α−トリフルオロメタクリレート、α−ハロメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ノルボルネン、ビニル、ビニルエーテル、および当分野において公知の他の基を含む。Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ａｄｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，１７（２），１０４−１１５、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，２００５，１７２，３７−２４５、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００６０２９２４８５号、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００５０９８５４１号、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００７０２５４２３５号、およびＭｉｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００５００５３７０号に、そのような重合性ＨＦＰ含有モノマの典型的な例を見いだすことができる。あるいは、結合基を介してポリマまたは担体にＨＦＰ含有基を化学的に結合することによって予め形成されたポリマおよび他の固体担体表面を修飾することができる。Ｍ．Ｒ．Ｂｕｃｈｍｅｉｓｅｒ，ｅｄ．“Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，”Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００３、Ｍ．Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ  “Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６（１２），１０３１−１０４３、Ａ．Ｒ．Ｖａｉｎｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ  “Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｉｎ”，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２０００，２（６），５７９−５９６、Ｄ．Ｃ．Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ”Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，ａｎｄ  Ｓｏｒｂｅｎｔｓ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｖｉｅｗ，”Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ａ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２００１，３９（１４），２３６４−２３７７、およびＴ．Ｊ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｖｅｒａｂｌｅ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００２，１０２（１０），３３２５−３３４３にそのようなポリマまたは担体の例が参照される。結合基の例は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２ヘテロアルキル、エーテル基、チオエーテル基、アミノ基、エステル基、アミド基、またはそれらの組み合わせを含む。ポリマまたは担体表面の反対電荷を有する部位にイオン会合によって結合された、電��を有するＨＦＰ含有基を含む触媒も意図される。
【００７９】
ＲＯＰ反応混合物は、少なくとも１つの触媒、適切であればいくつかの触媒を一緒に含む。ＲＯＰ触媒は、環状カルボニルモノマに対して１／２０モルから１／４０，０００モル、好ましくは１／１，０００モルから１／２０，０００モルの割合で加える。
【００８０】
開環重合は、促進剤、詳しくは窒素塩基の存在下で行う。窒素塩基促進剤の例は下に列挙され、表７に示されているピリジン（Ｐｙ）、Ν，Ν−ジメチルアミノシクロヘキサン（Ｍｅ２ＮＣｙ）、４−Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン（ＴＭＣＨＤ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、（−）−スパルテイン（Ｓｐ）、１，３−ビス（２−プロピル）−４，５−ジメチルイミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−１）、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）イミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−２）、１，３−ビス（２，６−ジ−ｉ−プロピルフェニル（イミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−３）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−４）、１，３−ジ−ｉ−プロピルイミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−５）、１，３−ジ−ｔ−ブチルイミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−６）、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−７）、１，３−ビス（２，６−ジ−ｉ−プロピルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾール−２−イリデン、１，３−ビス（２，６−ジ−ｉ−プロピルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾール−２−イリデン（Ｉｍ−８）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００８１】
【表７】
2013515816.tif 000024
【００８２】
一実施態様において、促進剤は、２つまたは３つの窒素を有し、そのそれぞれがたとえば構造（−）−スパルテインにおけるようにルイス塩基として参加することができる。一般に、強い塩基ほど重合速度を向上させる。
【００８３】
ＲＯＰ反応混合物は、開始剤も含む。一般に、開始剤は、アルコール、アミンおよびチオールなどの求核剤を含む。開始剤は、単官能、二官能、またはデンドライト、ポリマもしくは関連体などの多官能の構造であってよい。単官能開始剤は保護された官能基を有する求核基を含んでよく、チオール、アミン、酸およびアルコールを含む。アルコール開始剤は、アルコールの選択が重合収率、ポリマ分子量、生物活性物質との複合体生成もしくは生成物ポリマの望ましい機械特性および物理特性またはそれらの任意の組合せに悪影響を及ぼさないことを前提として、モノアルコール、ジオール、トリオール、または他のポリオールを含む任意の適当なアルコールであってよい。アルコールは、１つ以上のヒドロキシル基に加えて、ハロゲン化物、エーテル基、エステル基、アミド基、または他の官能基を含む多官能であってもよい。アルコールの例は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、アミルアルコール、カプリルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、ノナデシルアルコールおよび他の脂肪族飽和アルコール、シクロペンタノール、シクロヘキサノール、シクロヘプタノール、シクロオクタノールおよび他の脂肪族環状アルコール；フェノール、置換フェノール、ベンジルアルコール、置換ベンジルアルコール、ベンゼンジメタノール、トリメチロールプロパン、糖、ポリ（エチレングリコール）、プロピレングリコール、オリゴマアルコールから誘導されたアルコール官能化ブロックコポリマ、または分岐アルコールから誘導されたアルコール官能化分岐ポリマ、またはそれらの組み合わせを含む。実施態様において、ＲＯＰ開始剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ハイドロキノン、およびレゾルシノールからなる群から選ばれたモノマジオールである。さらに詳しくは、開始剤は、環状カーボネートモノマの調製において用いられる前駆体ＢｎＭＰＡである。
【００８４】
【化１７】
2013515816.tif 000025
【００８５】
開環重合反応は、溶媒を用いて実行しても溶媒を用いないで実行してもよい。任意選択の溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ベンゾトリフルオリド、石油エーテル、アセトニトリル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２，２，４−トリメチルペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ｔ‐ブチルジメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、または前述の溶媒の１つを含む組み合わせを含む。溶媒が存在するとき、適当なモノマ濃度は、１リットルあたり約０．１から約５モル、より詳しくは１リットルあたり約０．２から約４モルである。特定の実施態様において、開環重合のための反応混合物は溶媒を含まない。
【００８６】
開環重合は、大体室温以上の温度、より詳しくは１５℃から２００℃、より詳しくは２０℃から２００℃の温度で実行することができる。反応をバルクで行うとき、重合は、５０℃以上、より詳しくは１００℃から２００℃の温度で実行する。反応時間は、溶媒、温度、撹拌速度、圧力、および装置によって変るが、一般に重合は１から１００時間の範囲内で完了する。
【００８７】
溶液中で実行しようとバルクで実行しようと、重合は不活性（すなわち無水）雰囲気中および１００Ｍｐａから５００ＭＰａ（１気圧から５気圧）の圧力で、より典型的には１００ＭＰａから２００ＭＰａ（１気圧から２気圧）の圧力で行う。反応が完了したら、溶媒は、減圧を用いて除去することができる。
【００８８】
触媒は、環状カルボニルモノマの全モル数を基準として約０．２モル％から２０モル％、０．５モル％から１０モル％、１モル％から５モル％、または１モル％から２．５モル％の量で存在する。
【００８９】
窒素塩基促進剤は、環状カルボニルモノマの全モル数を基準として０．１モル％から５．０モル％、０．１モル％から２．５モル％、０．１モル％から１．０モル％、または０．２モル％から０．５モル％の量で存在する。上記に述べたように、場合によっては、触媒および窒素塩基促進剤は、特定の環状カルボニルモノマに応じて同じ化合物であってよい。
【００９０】
開始剤の量は、アルコール開始剤中のヒドロキシル基あたりの当量分子量にもとづいて計算される。ヒドロキシル基は、環状カルボニルモノマの全モル数を基準として０．００１モル％から１０．０モル％、０．１モル％から２．５モル％、０．１モル％から１．０モル％、および０．２モル％から０．５モル％の量で存在する。たとえば、開始剤の分子量が１００ｇ／モルであり、開始剤に２つのヒドロキシル基があるなら、ヒドロキシル基あたりの当量分子量は５０ｇ／モルである。重合がモノマのモルあたり５モル％のヒドロキシル基を必要とするなら、開始剤の量はモノマのモルあたり０．０５×５０＝２．５ｇである。
【００９１】
特定の実施態様において、触媒は約０．２モル％から２０モル％の量で存在し、窒素塩基促進剤は０．１モル％から５．０モル％の量で存在し、開始剤のヒドロキシル基は開始剤中のヒドロキシル基あたりの当量分子量を基準として０．１モル％から５．０モル％の量で存在する。
【００９２】
上記に述べたように、第１のポリマは、リビングポリマである。第１のポリマは、それぞれがＲＯＰ連鎖成長を開始することができる末端ヒドロキシル基、末端チオール基、または末端アミン基を含む。本明細書において、第１のポリマは、さらなる連鎖成長を防ぐためもしくは他の方法で主鎖を安定化させるためまたはその両方のために末端保護する。末端保護物質および技法は、高分子化学において十分に確立されている。これらは、たとえば末端ヒドロキシル基をエステルに変換するための物質、例えばカルボン酸無水物、カルボン酸塩化物、または反応性エステル（たとえばｐ−ニトロフェニルエステル）を含む。実施態様において、第１のポリマを無水酢酸で処理して分子鎖をアセチル基で末端保護し、前駆体ポリマを形成させる。
【００９３】
第１のポリマもしくは前駆体ポリマまたはその両方は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定したとき、少なくとも２５００ｇ／モル、より詳しくは４０００ｇ／モルから１５００００ｇ／モル、さらに詳しくは１００００ｇ／モルから５００００ｇ／モルの数平均分子量Ｍｎを有することができる。実施態様において、第１のポリマもしくは前駆体ポリマまたはその両方は、１００００ｇ／モルから２００００ｇ／モルの数平均分子量Ｍｎを有する。第１のポリマもしくは前駆体ポリマまたはその両方は、一般に１．０１から１．３５、より詳しくは１．１０から１．３０、さらに詳しくは１．１０から１．２５の狭い多分散性指数（ＰＤＩ）を有する。第１のポリマもしくは前駆体ポリマまたはその両方は、ホモポリマ、ランダムコポリマ、またはブロックコポリマであってよい。実施態様において、陽イオンポリマは、ポリエステルホモポリマ、ランダムポリエステルコポリマ、ポリカーボネートホモポリマ、ランダムポリカーボネートコポリマ、またはランダムポリエステルカーボネートコポリマである。
【００９４】
触媒は、選択沈殿によって、または固体担持触媒の場合には単にろ過によって、除去することができる。第１のポリマは、第１のポリマと残留触媒との全重量を基準として０ｗｔ．％（重量パーセント）より大きな量の残留触媒を含んでもよい。残留触媒の量は、第１のポリマと残留触媒との全重量を基準として２０ｗｔ．％未満、１５ｗｔ．％未満、１０ｗｔ．％未満、５ｗｔ．％未満、１ｗｔ．％未満、最も詳しくは０．５ｗｔ．％未満でもあってもよい。同様に、前駆体ポリマは、前駆体ポリマと残留触媒との全重量を基準として０ｗｔ．％より大きな量の残留触媒を含んでもよい。残留触媒の量は、前駆体ポリマと残留触媒との全重量を基準として２０ｗｔ．％未満、１５ｗｔ．％未満、１０ｗｔ．％未満、５ｗｔ．％未満、１ｗｔ．％未満、最も詳しくは０．５ｗｔ．％未満でもあってもよい。
【００９５】
前駆体ポリマは、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含む。第１の繰り返し単位は、第３級アミンで処理されると第４級アミンを含む部分を含む陽イオンポリマを生成させる反応性の１価の脱離基を含む側鎖部分を有する。第３級アミンは、第３級アミンが第１の繰り返し単位の１価の脱離基の０％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、またはより詳しくは８０％以上と反応して第４級アミンを含む側鎖部分を形成させることができることを前提として、構造を限定されない。
【００９６】
第３級アミンは、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、および類似物を含むがこれに限定されるものではないトリアルキルアミンなど１個の窒素を含むことができる。第３級アミンは、別の官能基、詳しくはカルボン酸基、たとえば３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピオン酸をさらに含んでよい。そのような事例において、陽イオンポリマは、第４級アミンおよびカルボン酸基を含む側鎖部分を有する第１の繰り返し単位を含む。
【００９７】
第３級アミンは、同位体元素を濃縮した形の第３級アミン、例えばトリメチルアミン−１３Ｃ、トリメチルアミン−１５Ｎ、トリメチルアミン−１５Ｎ、トリメチル−１３Ｃ３−アミン、トリメチル−ｄ９−アミン、およびトリメチル−ｄ９−アミン−１５Ｎを含んでよい。第３級アミンは、特定の細胞型、例えば癌細胞を標的とするのに適している放射性部分も含んでよい。放射性部分は、重金属放射性同位元素を含んでもよい。
【００９８】
より詳しくは、第３級アミンは、一般式（８）のビス−第３級アミンである。
【００９９】
【化１８】
2013515816.tif 000026
【０１００】
ここで、Ｌ”は、２から３０の炭素を含む２価の結合基であり、それぞれの１価のＲｂ基は、１から３０の炭素を含むアルキル基または６から３０の炭素を含むアリール基から独立に選ばれる。各Ｒｂ基は、独立に、分岐形または非分岐形であってよい。各Ｒｂ基は、独立に、別の官能基、たとえばケトン基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、アルケン基、アルキン基、３から１０の炭素を含む脂環式の環、２から１０の炭素を含む複素環、エーテル基、アミド基、エステル基、および前述の別の官能基の組み合わせを含んでよい。複素環は、酸素、硫黄もしくは窒素またはそれらの任意の組み合わせを含んでよい。２つ以上のＲｂ基が一緒になって環を形成してもよい。代表的なＬ”基は、−（ＣＨ２）Ｚ’−（ｚ’は２から３０の整数）、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）Ｚ”ＣＨ２ＣＨ２−（ｚ”は１から１０の整数）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−を含む。Ｌ”は、３から２０の炭素を含む１価または２価の脂環式の環、６から２０の炭素を含む１価または２価の芳香環、ケトン基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、アルケン基、アルキン基、２から１０の炭素を含む複素環、エーテル基、アミド基、エステル基、および前述の官能基の組み合わせをさらに含んでもよい。複素環は、酸素、硫黄もしくは窒素またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ビス−第３級アミンは、同位元素を濃縮した形、例えば重水素、炭素−１３、もしくは窒素−１５またはそれらの任意の組み合わせを濃縮した形のビス−第３級アミンも含んでよい。
【０１０１】
より具体的なビス第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせを含む。実施態様において、ビス第３級アミンはＴＭＥＤＡである。
【０１０２】
前駆体ポリマは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの適当な有機溶媒中で第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成させる。この反応は、１価の脱離基に対して過剰の第３級アミンを用いて室温または高温において無水条件下で行う。一般に、第３級アミンは、前駆体ポリマ中の１価の脱離基の１モルあたり２モルから１０モル、より詳しくは前駆体ポリマ中の１価の脱離基の１モルあたり３モルから８モル、より詳しくは前駆体ポリマ中の１価の脱離基の１モルあたり３モルから５モルの量で用いる。正電荷を有する第４級アミンは、負の電荷を有する対イオンになる置換された脱離基と塩を形成する。あるいは、望むなら、負電荷を有する対イオンは、公知の方法を用いて別のより適当な負電荷を有する対イオンとイオン交換させることができる。
【０１０３】
陽イオンポリマは、テトラヒドロフランなどの有機溶媒中の１回以上の沈殿と、それに続くろ過および真空中の乾燥とによって単離される。第１の繰り返しの０％超が、第４級アミン基を含む側鎖部分を有する。前駆体ポリマをビス第３級アミンで処理すると、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基および第３級アミン基を含む側鎖部分を有する。カルボキシ基を含む第３級アミンで前駆体ポリマを処理すると、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンおよびカルボン酸を含む側鎖部分を有する。第４級アミン基は、第１の環状カルボニルモノマから誘導された側鎖１価の脱離基の０％超からの量で陽イオンポリマ中に存在する。より詳しくは、第４級アミン基は、第１の環状カルボニルモノマから誘導された側鎖の１価の脱離基の１０％から１００％、２０％から１００％、３０％から１００％、４０％から１００％、５０％から１００％、６０％から１００％、７０％から１００％、または８０％から１００％の量で陽イオンポリマ中に存在する。前駆体ポリマをビス−第３級アミンで処理すると、第３級アミン基は、前駆体ポリマの第１の繰り返し単位中の１価の脱離基の０％超から、より詳しくは前駆体ポリマの第１の繰り返し単位中の１価の脱離基の１０％から１００％、２０％から１００％、３０％から１００％、４０％から１００％、５０％から１００％、６０％から１００％、７０％から１００％、または８０％から１００％の量で陽イオンポリマ中に存在させることができる。
【０１０４】
陽イオンポリマは、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定したとき、少なくとも２５００ｇ／モル、より詳しくは４０００ｇ／モルから１５００００ｇ／モル、さらに詳しくは１００００ｇ／モルから５００００ｇ／モルの数平均分子量Ｍｎを有してよい。実施態様において、陽イオンポリマは、１００００ｇ／モルから２００００ｇ／モルの数平均分子量Ｍｎを有する。陽イオンポリマは、一般に１．０１から１．３５、より詳しくは１．１０から１．３０、さらに詳しくは１．１０から１．２５の狭い多分散性指数（ＰＤＩ）も有する。
【０１０５】
より詳しくは、陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマと第２の環状カルボニルモノマとの順次の開環重合によって誘導された両親媒性ブロックコポリマである。陽イオンポリマは、ポリオール開始剤から誘導されたサブユニットと結合した２つ以上のブロックコポリマ鎖を含むことができる。これらの２つ以上のブロックコポリマ鎖のそれぞれは、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含み、これらの２つ以上のブロックコポリマ鎖のそれぞれは、任意選択として末端保護することができる。実施態様において、陽イオンブロックコポリマは、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含む親水性のコアブロックであって、第１の繰り返し単位がポリオール開始剤から誘導されたサブユニットと結合している親水性のコアブロック、および第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位を含む疎水性の外側のブロックを含む。別の実施態様において、環状カルボニルモノマの順次の重合を逆にする。すなわち、陽イオンブロックコポリマは、第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位を含む疎水性のコアブロックであって、第２の繰り返し単位がポリオール開始剤から誘導されたサブユニットと結合している疎水性のコアブロック、および疎水性コアブロックと結合した第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含む親水性の外側のブロックを含む。実施態様において、ポリオール開始剤は、モノマジオールである。
【０１０６】
水溶液中で陽イオンポリマは自己集合し、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビーム（散乱角９０°）を備えた動的光散乱式粒度分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって測定したとき、たとえば１０ｎｍから５００ｎｍ、１０ｎｍから２５０ｎｍ、５０ｎｍから２００ｎｍ、５０ｎｍから１５０ｎｍ、５０ｎｍから１２０ｎｍ、さらに詳しくは５０ｎｍから１００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子になる。粒子サイズ測定は、各試料について５回繰り返し、粒子サイズは、５回の読み値の平均として報告する。上述の粒子サイズの場合、水溶液のｐＨは５．０から８．０であってよい。
【０１０７】
生分解性陽イオンポリマを形成させる方法は、第１の環状カルボニルモノマ、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを開環重合によって形成させるステップ、任意選択として、第１のポリマを末端保護して前駆体ポリマを形成させるステップ、および前駆体ポリマを第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成させるステップであって、第１の環状モノマから誘導された繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップを含む。実施態様において、第３級アミンはビス−第３級アミンであり、側鎖部分は第４級アミンおよび第３級アミンを含む。別の実施態様において、ビス−第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。別の実施態様において、第３級アミンはカルボキシ基を含み、第１の繰り返し単位は第４級アミンおよびカルボン酸を含む側鎖部分を有する。別の実施態様において、第１の混合物は疎水性の第２の環状カルボニルモノマを含み、陽イオンポリマは第２の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第２の繰り返し単位を含むランダムコポリマであり、第２の環状カルボニルモノマは第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含まない。別の実施態様において、第２の繰り返し単位は、側鎖アセタールエステル基を含む。
【０１０８】
生分解性陽イオンブロックコポリマを形成させる別の方法は、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む反応混合物を形成させるステップ、反応混合物に第１の環状カルボニルモノマ、続いて第２の環状カルボニルモノマを順次加え、開環重合によって反応させ、それによって第１のブロックコポリマを形成させるステップであって、第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含み、第２の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができないステップ、任意選択として、第１のブロックコポリマを末端保護し、それによって前駆体ブロックコポリマを形成させるステップ、および前駆体ブロックコポリマを第３級アミンで処理して陽イオンポリマを形成させるステップであって、陽イオンポリマは第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップを含む。実施態様において、順次の反応を逆の順序に実行して第１のブロックコポリマを形成させる。別の実施態様において、カルボン酸無水塩を用いて第１のブロックコポリマを末端保護し、それによって末端エステル基を形成させる。別の実施態様において、陽イオンブロックコポリマは、第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位を含み、第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む。別の実施態様において、開始剤はエチレングリコール、プロピレングリコール、ハイドロキノン、およびレゾルシノールからなる群から選ばれたモノマジオールである。別の実施態様において、開始剤はＢｎＭＰＡである。別の実施態様において、１価の脱離基は、ハロゲン化物、スルホン酸エステル、およびエポキシドからなる群から選ばれる。別の実施態様において、第３級アミンはビス−第３級アミンであり、側鎖部分は、第４級アミンおよび第３級アミンを含む。別の実施態様において、ビス−第３級アミンは、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１０９】
一般に、開環重合によって得られる陽イオンポリマは、開始剤の開始部位の数と同じ数の枝を含む。さらに、陽イオンポリマは、異なる環状カルボニルモノマ組成物を用いて順次の開環重合を実行するとの理解を前提として、末端保護の前の順次の開環重合の数と同じ数のブロックを含む。
【０１１０】
陽イオンポリマは、負電荷を有する生物活性物質、たとえば遺伝子、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、薬物、またはそれらの組み合わせと複合体（ポリプレックス）を形成する。水溶液中５．０から８．０のｐＨにおいて、これらの複合体は自己集合し、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビーム（散乱角９０°）を備えた動的光散乱式粒度分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって測定したとき、たとえば１０ｎｍから５００ｎｍ、１０ｎｍから２５０ｎｍ、５０ｎｍから２００ｎｍ、５０ｎｍから１５０ｎｍ、５０ｎｍから１２０ｎｍ、さらに詳しくは５０ｎｍから１００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子になる。穏やかに混合することによってさまざまなＮ／Ｐ比のポリマ／ＤＮＡ複合体を調製する。粒子サイズ分析の前に、複合体溶液を３０分間安定化させる。粒子サイズ測定は、各試料について５回繰り返し、粒子サイズは５つの読み値の平均として報告する。実施態様において、生物活性物質は負電荷を有する遺伝物質であり、ポリプレックスは、陽イオンポリマと負電荷を有する遺伝物質との反対電荷を有する基の間の強い相互作用によって緊密に充填される。ナノサイズの複合体は、０から１５％の溶血を誘発し、より詳しくは溶血を誘発せず、０から２０％の細胞毒性を有し、またはより詳しくは細胞毒性がない。別の実施態様において、生物活性物質は薬物である。
【０１１１】
細胞を処理するためのポリマ複合体を調製する方法も開示される。この方法は、生分解性陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を、負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させて、ポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成させることを含み、生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有する。ポリマ複合体の粒子サイズは、５．０から８．０のｐＨにおいて５０ｎｍから５００ｎｍである。
【０１１２】
さらに、細胞を処理する方法が開示される。この方法は、細胞を、生分解性陽イオンポリマおよび負電荷を有する生物活性物質を含むポリマ複合体のナノ粒子と接触させることを含み、生分解性陽イオンポリマは、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位、開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および任意選択の末端保護基を含み、第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミン基を含む側鎖部分を有する。実施態様において、生分解性ポリマは、両親和性ブロックコポリマである。ナノ粒子の粒子サイズは、５．０から８．０のｐＨにおいて５０ｎｍから５００ｎｍであってよい。実施態様において、負電荷を有する生物活性物質は、遺伝子である。細胞は、インビトロ、エキソビボでポリマ複合体に曝露したから順番として動物に入れるか、またはインビボ（たとえば動物またはヒト）で曝露する。別の実施態様において、負電荷を有する生物活性物質は分子薬物またはタンパク質である。別の実施態様において、ポリマ複合体は溶血を誘発しない。別の実施態様において、ナノ粒子には細胞毒性がない。
【０１１３】
市販の薬物の例は、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、５‐フルオロウラシル、５−ＦＵ、６−メルカプトプリン、６−ＭＰ、６−ＴＧ、６−チオグアニン、アブラキサン、アキュタン（商標）、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン（商標）、アドルシル（商標）、アフィニトル（商標）、アグリリン（商標）、アラ−コート（商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＡＬＩＭＴＡ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（商標）、アルケラン（商標）、オールｔｒａｎｓレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラ−Ｃ、アラネスプ（商標）、アレディア（商標）、アリミデクス（商標）、アロマシン（商標）、アラノン（商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン（商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ＢＥＸＸＡＲ（商標）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン（商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（商標）、Ｃ２２５、カルシウムロイコボリン、カンパス（商標）、カンプトサー（商標）、カンプトテシン−１１、カペシタビン、カラック（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチンウエハ、カソデクス（商標）、ＣＣ−５０１３、ＣＣＩ−７７９、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン（商標）、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（商標）、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン（商標）、シタラビン、シタラビンリポソーマル、シトサー−Ｕ（商標）、シトキサン（商標）、ダカルバジン、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノキソーム（商標）、デカドロン、デシタビン、δ−コルテフ（商標）、デルタソン（商標）、デニロイキンジフィトックス、デポシト（商標）、デキサメタソン、酢酸デキサメタソン、デキサメサソンリン酸ナトリウム、デキサソン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ジオデクス、ドセタキセル、ドキシル（商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマル、ドロキシア（商標）、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−ドーム（商標）、ヅラロン（商標）、エフデクス（商標）、エリガード（商標）、エレンス（商標）、エロキサチン（商標）、エルスパー（商標）、エムシト（商標）、エピルビシン、エポエチンα、エルビツクス、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポホス（商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、オイレキシン（商標）、エベロリムス、エビスタ（商標）、エクセメスタン、ファレストン（商標）、ファスロデクス（商標）、フェマラ（商標）、フィルグラスチム、フロキシウリジン、フルダラ（商標）、フルダラビン、フルオロプレクス（商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタ���ド、フォリン酸、ＦＵＤＲ（商標）、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲムザー、グリベック（商標）、グリアデル（商標）ウエハ、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハロテスチン（商標）、ヘルセプチン（商標）、ヘキサドロール、ヘキサレン（商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（商標）、ハイドリー（商標）、酢酸ハイドロコート（商標）、ハイドロコルチゾン、リン酸ナトリウムハイドロコルチゾン、コハク酸ナトリウムハイドロコルチゾン、リン酸ハイドロコルトン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタンイダマイシン（商標）、イダルビシン、イフェックス（商標）、ＩＦＮ−αイホスファミド、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、イマチニブメシレート、イミダゾールカルボキサミドインターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ共役体）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（商標）（インターフェロンα−２ｂ）、イレッサ（商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イキセンプラ（商標）、Ｋキドロラーゼ（ｔ）、ラナコート（商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイキン（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン、ロイスタチン（商標）、リポソームＡｒａ−Ｃ、リキッドプレップ（商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、ルプロン（商標）、ルプロンデポ（商標）、マツラン（商標）、マキシデクス、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドラロン（商標）、メドロール（商標）、メガセ（商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネクス（商標）、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニソール（商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスタルゲン（商標）、ムスチンムタマイシン（商標）、マイルラン（商標）、マイロセル（Ｍ）、マイロターグ（商標）、ナベルビン（商標）、ネララビン、ネオサー（商標）、ノイラスタ（商標）、ノイメガ（商標）、ノイポゲン（商標）、ナクサバー（商標）、ニランドロン（商標）、ニルタミド、ニペント（商標）、ナイトロジェンマスタード、ノバルデクス（商標）、ノバントロン（商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー（商標）、オンコビン（商標）、オンタク（商標）、オンキサル（商標）、オプレベルキン、オラプレッド（商標）、オラソン（商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルプロテインバウンド、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（商標）、パラプラチン（商標）、ペディアプレッド（商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール（商標）、プラチノール−ＡＱ（商標）、プレドニソロン、プレ��ニソン、プレロン（商標）、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標）、プロロイキン（商標）、カルマスチンインプラント併用プロリフェプロスパン２０、プリネトール（商標）、ラロキシフェン、レブリミド（商標）、リューマトレクス（商標）、リツキサン（商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（商標）（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス（商標）、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン（商標）、サンドスタチンＬＡＲ（商標）、サルグラモスチム、ソリュ−コルテフ（商標）、ソリュ−メドロール（商標）、ソラフェニブ、ＳＰＲＹＣＥＬ（商標）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、スーテント（商標）、タモキシフェン、タルセバ（商標）、タルグレチン（商標）、タキソール（商標）、タキソテール（商標）、テモダール（商標）、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド（商標）、セラシス（商標）、チオグアニン、チオグアニンタブロイド（商標）、チオリン酸アミド、チオプレックス（商標）、チオテパ、ＴＩＣＥ（商標）、トポサー（商標）、トポテカン、トレミフェン、トリセル（商標）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ（商標）、トレチノイン、トレキソール（商標）、トリセノクス（商標）、ＴＳＰＡ、ＴＹＫＥＲＢ（商標）、ＶＣＲ、ベクチビクス（商標）、ベルバン（商標）、ベルケイド（商標）、ベペシド（商標）、ベサノイド（商標）、ビアズール（商標）、ビダーザ（商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサーＰｆｓ（商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット、ＶＰ−１６、ブモン（商標）、キセローダ（商標）、ザノサー（商標）、ゼバリン（商標）、ジネカード（商標）、ゾラデクス（商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、およびゾメタを含む。
【０１１４】
非ウイルスベクタによって形質移入することができるいずれの細胞も上記に記載の複合体で処理することができる。詳しくは、細胞は、真核細胞、哺乳類細胞、より詳しくは齧歯類細胞またはヒト細胞である。細胞は、全能性または多能性、分裂性または非分裂性、柔組織または上皮、不死化または変換された胚外または胚幹細胞、または類似物を含むさまざまな組織から誘導することができる。細胞は、幹細胞であっても分化細胞であってもよい。分化した細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、樹状細胞、神経細胞、神経膠、肥満細胞、血液細胞および白血球（たとえば、赤血球、巨核球、Ｂ、Ｔおよびナチュラルキラー細胞などのリンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、顆粒球）、上皮細胞、角質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌腺または外分泌腺の細胞、ならびに感覚細胞を含む。
【０１１５】
上記に記載の複合体は、非ウイルス移入ベクタとして用いることができる。標的遺伝子は、いずれの特定の種類の標的遺伝子またはヌクレオチド配列にも限定されない。たとえば、標的遺伝子は、細胞遺伝子、内在遺伝子、腫瘍遺伝子、移入遺伝子、ウイルス遺伝子、または翻訳ＲＮＡもしくは非翻訳ＲＮＡであってよい。可能な標的遺伝子の例は、転写因子および発生遺伝子（たとえば接着分子、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼型ヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、成長／分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）、腫瘍遺伝子（たとえばＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭＩ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＫＰ２、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、およびＹＥＳ）、癌抑制遺伝子（たとえばＡＰＣ、ＢＲＡＩ、ＢＲＣＡ２、ＣＴＭＰ、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢＩ、ＴＰ５３、およびＷＴＩ）、ならびに酵素（たとえばＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミルグルコシダーゼ、カタラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、インスリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡ成分もしくはタンパク質成分またはその両方を含むテロメラーゼ、およびトポイソメラーゼ）を含む。
【０１１６】
以下の実施例は、有機触媒開環重合によって作り出される生分解性ポリカーボネートおよびポリ（エステルカーボネート）コポリマは、効果的な非ウイルス遺伝子キャリアであることを示す。生分解性ハロゲン含有カーボネートと、アミンとの簡単な４級化反応とを組み合わせると、多様な機能を有する遺伝子キャリアのための陽イオンポリマの形成のための利用価値の高い経路が開ける。前駆体ポリマにあるハロゲン化物は、標的構造および利用の種類に応じて変えることができる。前駆体ポリマ、特に塩化物残基を有する前駆体ポリマは、遺伝子と緊密な複合体を形成し、このポリプレックスは低い細胞毒性を示す。陽イオンポリカーボネートは、自己集合して疎水性コアと正電荷を有する表面とを有するミセルナノ粒子になることができる。従って、陽イオンポリカーボネートは、小分子薬物およびタンパク質の送達のために、ならびに薬物および遺伝子、または薬物およびタンパク質の同時送達のためにも用いることができる。
【実施例】
【０１１７】
ポリマ合成のための物質
反応に用いられるＴＨＦ、ＤＭＦ、および塩化メチレンは、溶媒乾燥システム（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ）によって得た。Ｎ−（３，５−トリフルオロメチル）フェニル−Ｎ’−シクロヘキシル−チオ尿素（ＴＵ）は、Ｒ．Ｃ．Ｐｒａｔｔ、Ｂ．Ｇ．Ｇ．Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ、Ｄ．Ａ．Ｌｏｎｇ、Ｐ．Ｎ．Ｐ．Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ａ．Ｄｏｖｅ、Ｈ．Ｌｉ、Ｃ．Ｇ．Ｗａｄｅ、Ｒ．Ｍ．Ｗａｙｍｏｕｔｈ，ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６，３９（２３），７８６３−７８７１によって報告されているように調製し、無水ＴＨＦ中ＣａＨ２上で撹拌し、ろ過し、真空下で溶媒を除くことによって脱水した。ＢｉｓＭＰＡベンジルエステル（ＢｎＭＰＡ）は、下記に記載されているように調製し、無水ＴＨＦに溶解させ、ＣａＨ２とともに撹拌し、ろ過し、真空下で溶媒を除くことによってさらに脱水した。無水酢酸、ＤＭＳＯ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、および（−）−スパルテインは、ＣａＨ２上で撹拌し、真空蒸留し、次にモレキュラーシーブ（３Ａ）上で保存した。Ｌ−ラクチドおよびＤ−ラクチド（Ｐｕｒａｃ、９９％）は、使用の前に乾燥トルエンから３回再結晶した。炭酸トリメチレン（ＴＭＣ）は、使用の前にトルエンから共沸脱水した。他の試薬は、受け取った状態で用いた。
【０１１８】
ポリマの物理化学的および生物的キャラクタリゼーションのための物質
酢酸、酢酸ナトリウム、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分岐形、重量平均分子量Ｍｗ、２５ｋＤａ）、アガロース、臭化エチジウムおよび３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は、すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取った状態で用いた。ＨＰＬＣグレードの超純水はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）から得た。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、およびトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液は１ｓｔ  ＢＡＳＥ（Ｍａｌａｙｓｉａ）から購入し、使用前に意図した濃度に希釈した。レポータ溶菌緩衝液およびルシフェリン基質はＰｒｏｍｅｇａ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。ＤＭＥＭ成長培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンはすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータによって駆動される６．４ｋｂホタルルシフェラーゼ（ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼＶＲ１２５５Ｃ）をコードするプラスミドＤＮＡは、Ｖｉｃａｌ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＣａｒ  Ｗｈｅｅｌｅｒの厚意によって提供され、大腸菌ＤΗ５α中で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ（オランダ）によって供給されるＥｎｄｏｆｒｅｅ  Ｇｉｇａプラスミド精製キットを用いて精製した。ＨｅｐＧ２細胞系統はＡＴＣＣ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手し、供給元による推薦条件下で成長させた。
【０１１９】
モノマ合成
官能基生分解性モノマの特に有用なシントンは、２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸（ビス−ＭＰＡ）から誘導されたいわゆるＭＴＣファミリーの環状カーボネートモノマである。ビス−ＭＰＡは、スキーム１に示されているように、５−メチル−５−カルボキシル−１，３−ジオキサ−２−オン（ＭＴＣＯＨ）およびその誘導体への簡単な経路を提供する。
【０１２０】
【化１９】
2013515816.tif 000027
【０１２１】
この手法は、（メタ）アクリレート誘導体化の手法と対応し、開環重合することができる官能性モノマの広い選択を生み出すことが示された。最初に２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸（ビスＭＰＡ）が（ｉ）ベンジルエステルＢｎＭＰＡ（本明細書においては重合のための開始剤としても用いられる）に変換され、続いて（ｉｉ）ＢｎＭＰＡとトリホスゲンとを反応させて環状カルボニルモノマＭＴＣＯＢｎを形成させる。ＭＴＣＯＢｎを脱ベンジルさせて（ｉｉｉ）環状カルボニルカルボン酸ＭＴＣＯＨを作り出す。ＭＴＣＯＨからエステルを形成させるための２つの経路が示されている。第１の経路（ｉｖ）において、ＭＴＣＯＨは適当なカルボキシ活性化剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で処理され、ＲＯＨと反応して１段階でＭＴＣＯＲを形成する。あるいは、最初にＭＴＣＯＨを（ｖ）酸塩化物ＭＴＣＣｌに変換し、続いて（ｖｉ）塩基の存在下でＭＴＣＣｌをＲＯＨで処理してＭＴＣＯＲを形成することができる。どちらの経路も例示であり、限定するものではない。以下の条件は、スキーム１に示されている反応に典型的である。（ｉ）臭化ベンジル（ＢｎＢｒ）、ＫＯＨ、ＤＭＦ、１００℃、１５時間、ビス−ＭＰＡのベンジルエステルの収率６２％、（ｉｉ）トリホスゲン、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃から０℃、ＭＴＣＯＢｎの収率９５％、（ｉｉｉ）Ｐｄ／Ｃ（１０％）、Ｈ２（３気圧）、ＥｔＯＡｃ、室温、２４時間、ＭＴＣＯＨの収率９９％、（ｉｖ）ＲＯＨ、ＤＣＣ、ＴＨＦ、室温、１から２４時間、（ｖ）（ＣＯＣｌ）２、ＴＨＦ、室温、１時間、ＭＴＣＣ１の収率９９％、（ｖｉ）ＲＯＨ、ＮＥｔ３、ＲＴ、３時間、ＭＴＣＯＲが得られる。
【０１２２】
上記のスキームを用いて、ＭＴＣＣｌを３−ブロモプロパノール、３−クロロプロパノ、２−ヨードエタノール、およびエタノールと反応させて対応するＭＴＣＯＰｒＢｒ、ＭＴＣＯＰｒＣｌ、ＭＴＣＯＥｔＩ、およびＭＴＣＯＥｔを形成させた。これらのハロエステルを再結晶またはフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）のどちらかによって高収率（＞８５％）で精製した。ＭＴＣＯＥｔは、非官能性対応物として希釈効果のため、およびポリマに自己集合のための疎水性ブロックを導入するために用いた。
【０１２３】
実施例１  ５−メチル−５−（３−クロロプロピル）オキシカルボキシル−１，３−ジオキサ−２−オン（ＭＴＣＯＰｒＣｌ）、ｍｗ  ２３６．６５の調製
【０１２４】
【化２０】
2013515816.tif 000028
【０１２５】
ＭＴＣＯＨ（１１．１ｇ、６９ミリモル）のＴＨＦ溶液（２００ｍＬ）に触媒量のＤＭＦ（３滴）を加え、続いてＴＨＦ（１００ｍＬ）中の塩化オキサリル（７．３ｍＬ、８７ミリモル）の溶液をＮ２雰囲気下で２０分間かけて穏やかに加えた。この溶液を１時間撹拌し、Ｎ２気流を吹き込んで揮発性物質を除去し、真空下で蒸発させて中間体を得た。
【０１２６】
中間体の無水ＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、氷／塩浴を用いて溶液温度を０℃より低温に保ちながら、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の３−クロロ−１−プロパノール（５．４ｍＬ、７６ミリモル）とピリジン（６．２ｍＬ、６５ミリモル）との混合物を３０分間かけて滴下して加えた。反応混合物を室温でさらに３時間を撹拌し続けた後にろ過し、ろ液を蒸発させた。残留物を塩化メチレンに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、食塩水および水で洗浄し、ＭｇＳＯ４とともに一夜撹拌し、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、酢酸エチルとヘキサンと（５０／５０から８０／２０）のグラジエント溶離によってシリカゲルカラムを通過させて生成物を無色の油として得た。この油は、ゆっくり固化して白色の固体（９．８ｇ、６０％）となった。
【０１２７】
実施例２  ５−メチル−５−（３−ブロモプロピル）オキシカルボキシル−１，３−ジオキサ−２−オン（ＭＴＣＯＰｒＢｒ）、ｍｗ２８１．１０の調製
【０１２８】
【化２１】
2013515816.tif 000029
【０１２９】
ＭＴＣＯＰｒＢｒは、実施例１の手順によって３−ブロモ−１−プロパノールをアルコールとして用いて４５ミリモルスケールで調製した。生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、続いて再結晶して白色の結晶（６．３ｇ、４９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）：δ  ４．６９（ｄ，２Ｈ；ＣＨ２ＯＣＯＯ）、４．３７（ｔ、２Η；ＯＣＨ２）、４．２１（ｄ、２Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ）、３．４５（ｔ、２Η；ＣＨ２Ｂｒ）、２．２３（ｍ、２Η；ＣＨ２）、１．３３（ｓ、３Η；ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １７１．０、１４７．３、７２．９、６３．９、４０．２、３１．０、２８．９、１７．３。
【０１３０】
実施例３  ５−メチル−５−（２−ヨードエチル）オキシカルボキシル−１，３−ジオキサ−２−オン（ＭＴＣＯＥｔＩ）、ｍｗ３１４．０８の調製
【０１３１】
【化２２】
2013515816.tif 000030
【０１３２】
ＭＴＣＯＥｔＩは、実施例１の手順によって２−ヨードエタノールをアルコールとして用いて４５ミリモルスケールで調製し、カラムクロマトグラフィーおよびそれに続く再結晶によって精製して黄色がかった結晶（７．７ｇ、５４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ４．７３（ｄ、２Ｈ；ＣＨ２ＯＣＯＯ）、４．４５（ｔ、２Ｈ；ＯＣＨ２）、４．２２（ｄ、２Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ）、３．３４（ｔ、２Η；ＣＨ２Ｉ）、１．３８（ｓ、３Η；ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １７０．５、１４７．３、７２．８、６５．６、４０．３、１７．５、−０．３。
【０１３３】
実施例４  有機触媒開環重合
塩化メチレン中室温において、有機触媒Ｎ−（３，５−トリフルオロメチル）フェニル−Ｎ’−シクロヘキシル−チオ尿素（ＴＵ）および１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下、２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸ベンジル（ＢｎＭＰＡ）を開始剤として用いて開環重合（１〜２時間）を行なって仕込み比（［Ｍ］０／［Ｉ］０）と矛盾しない分子量、狭い多分散性（１．１〜１．２）、および末端基の忠実性を有する側鎖３−ハロプロピルエステルを含む陽イオンプレポリマを得た。反応時のアミン存在下の末端ヒドロキシル基に由来する逆開裂によるポリマ鎖の切断を回避するために、前駆体を無水酢酸で２４時間から４８時間アセチル化した。
【０１３４】
下記で調製されるＲＯＰポリマは、一般式（９）を有する。
【０１３５】
【化２３】
2013515816.tif 000031
【０１３６】
式中、Ｌ’は、開始剤から誘導されたサブユニットであり、ｗは、Ｌ’の開始基の数であり、Ｍ１は、環状カルボニルモノマであり、Ｍ２は、別の環状カルボニルモノマであり、Ｅ’は、末端保護基であり、ａ：ｂはＭ１：Ｍ２モル比である。初期ＲＯＰポリマは、前駆体ポリマとも呼ばれる。ブロックコポリマの調製において、最初にＭ１、続いてＭ２が加えられる。ランダムコポリマの場合には、モノマＭ１またはＭ２のどちらも開始剤Ｌ’に結合することができると理解される。各重合は、ジオールであるＢｎＭＰＡによって開始され、従って、ｗ＝２であり、２つのポリマ鎖が形成され、開始剤から誘導されたサブユニットによって結合している。各ポリマ鎖は、無水酢酸を用いてアセチル基で末端保護した。
【０１３７】
ポリカーボネート。
実施例５  ＭＴＣＯＰｒＣｌの重合
【０１３８】
【化２４】
2013515816.tif 000032
【０１３９】
ＭＴＣＯＰｒＣｌ（５０１ｍｇ、２．１ミリモル）、ＢｎＭＰＡ（４．７ｍｇ、０．０２ミリモル、開始剤）、およびＴＵ（３７．２ｍｇ、０．１ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（１５．２ｍｇ、０．１ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移して室温で重合を開始させた（［Ｍ］０／［Ｉ］０＝１００）。２時間後、この混合物に無水酢酸（７２．４ｍｇ、０．７１ミリモル）を加え、混合物を４８時間撹拌した（反応率約９５％）。次に溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥させた。収量：４６６ｍｇ（９３％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １２２００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１７、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３９〜７．２９（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１６（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．３８〜４．１９（ｂｒ、〜３５０Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６４〜３．５５（ｍ、〜１１７Η；ＣＨ２Ｃｌポリマ）、２．１５〜２．０７（ｍ、〜１１４Η；ＣＨ２ポリマ）、２．０６（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．２７（ｂｒ、〜１６９Η；ＣＨ３ポリマ）。
【０１４０】
実施例６  ＭＴＣＯＰｒＢｒの重合
【０１４１】
【化２５】
2013515816.tif 000033
【０１４２】
ＭＴＣＯＰｒＢｒ（２８８ｍｇ、１．０ミリモル）、ＢｎＭＰＡ（４．４ｍｇ、０．０１ミリモル、開始剤）、およびＴＵ（９．８ｍｇ、０．０３ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（３．３ｍｇ、０．０２ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移して室温で重合を開始させた（［Ｍ］０／［Ｉ］０＝５２）。２時間後、この混合物に無水酢酸（９６．９ｍｇ、０．９５ミリモル）を加え、２夜の間撹拌した（反応率９４％）。次に、溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：２６５ｍｇ（９２％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １１７００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１１、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３８〜７．２８（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１７（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４０〜４．１７（ｍ、〜３４８Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．５３〜３．３６（ｍ、〜１１１Η；ＣＨ２Ｂｒポリマ）、２．２３〜２．１５（ｍ、〜１１１Ｈ；ＣＨ２ポリマ）、２．０６（ｓ、６Ｈ；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３０〜１．２４（ｂｒ、〜１６９Η；ＣＨ３ポリマ）。
【０１４３】
実施例７  ＭＴＣＯＥｔＩの重合
【０１４４】
【化２６】
2013515816.tif 000034
【０１４５】
ＭＴＣＯＥｔＩ（３１２ｍｇ、１．０ミリモル）、ＢｎＭＰＡ（４．４ｍｇ、０．０２ミリモル、開始剤）、およびＴＵ（９．４ｍｇ、０．０３ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（３．３ｍｇ、０．０２ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移して室温で重合を開始させた（［Ｍ］０／［Ｉ］０＝５１）。２時間後、この混合物に無水酢酸（１０７．２ｍｇ、１．０５ミリモル）を加え、２夜の間撹拌した（反応率９４％）。次に、この溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：２６８ｍｇ（８６％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １０５００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．２２、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３７〜７．３１（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１７（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４４〜４．３６（ｍ、〜９２Η；ＯＣＨ２ポリマ）、４．３６〜４．２４（ｍ、〜１７８Η；ＣＨ２ＯＣＯＯポリマ）、３．３５〜３．２７（ｍ、〜８９Η；ＣＨ２Ｉポリマ）、２．０７（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３４〜１．２４（ｂｒ、〜１４４Η；ＣＨ３ポリマ）。
【０１４６】
実施例８  ＴＭＣとＭＴＣＯＰｒＣｌとのブロック重合
【０１４７】
【化２７】
2013515816.tif 000035
【０１４８】
ＴＭＣ（１０８ｍｇ、１．０ミリモル、Ｍ１とする）、ＢｎＭＰＡ（１１ｍｇ、０．０５ミリモル）、およびＴＵ（１７．５ｍｇ、０．０５ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（７．３ｍｇ、０．０５ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移して室温で重合を開始させた（［Ｍ１］０／［Ｉ］０＝２０。ＮＭＲによって第１のモノマ（Ｍ１）が完全に消費されたことを確かめた後（３時間、反応率９７％）、この反応混合物を第２の重合のために第２のモノマＭ２であるＭＴＣＯＰｒＣｌ（６０３ｍｇ、２．５５ミリモル）を含むバイアルに移し、さらに１８時間撹拌した（反応率９６％）（［Ｍ２］０／［Ｉ］０＝５０）。次に、この混合物に無水酢酸（１７１ｍｇ、１．１５ミリモル）を加え、２夜の間撹拌した。次に、この溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：６４０ｍｇ（９０％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １２０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１９、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３８〜７．３０（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１７（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．３３〜４．２６（ｍ、〜２０８Ｈ；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２  Ｐ（ＭＴＣｐｒＣｌ））、４．２６〜４．２０（ｍ、〜７０Η、ＣＨ２ＯＣＯＯ  ＰＴＭＣ）、３．６３〜３．５６（ｍ、〜７３Η；ＣＨ２Ｃｌ  ｐ（ＭＴＣｐｒＣｌ））、２．１５〜２．００（ｍ、〜１１１Η；ＣＨ２  Ｐ（ＭＴＣｐｒＣｌ）、ＣＨ２  ＰＴＭＣ、ＯＣＨ３アセチル末端）、１．２７（ｂｒ、〜１０７Η、ＣＨ３  ｐ（ＭＴＣｐｒＣｌ））。
【０１４９】
ポリエステル−ポリカーボネートブロックコポリマ
実施例９  ＬＬＡとＭＴＣＯＰｒＢｒとのブロック重合。
以下の調製において、Ｌ−ラクチド（ＬＬＡ）の立体化学は示されていない。
【０１５０】
【化２８】
2013515816.tif 000036
【０１５１】
Ｌ−ラクチド（１４６ｍｇ、１．０ミリモル）（ＬＬＡ）、ＢｎＭＰＡ（１２ｍｇ、０．０５ミリモル）、およびＴＵ（９．０ｍｇ、０．０２４ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、（−）−スパルテイン（３．０ｍｇ、０．０１３ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移して室温で重合を開始させた（［Ｍ１］０／［Ｉ］０＝２０）。第１のモノマが完全に消費されたことをＮＭＲで確かめた後に（１．５時間、反応率９６％）、第２の重合のためにＭＴＣＯＰｒＢｒ（４２７ｍｇ、１．５２ミリモル）を含むバイアルにこのポリエステルを含む反応混合物を移し、さらにＴＵ（９，７ｍｇ、０．０２６ミリモル）およびＤＢＵ（４．１ｍｇ、０．０２７ミリモル）を含むバイアルに移した（［Ｍ２］０／［Ｉ］０＝２９）。第２の反応混合物をさらに１時間撹拌した（反応率９７％）。次にこの混合物に無水酢酸（２０５ｍｇ、２．０１ミリモル）を加え、２夜の間撹拌した。次に、この溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥してポリエステル−ポリカーボネートブロックコポリマを得た。収量：５２４ｍｇ（９０％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １２２００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１４、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３８〜７．２８（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．２２〜５．０９（ｍ、〜３５Ｈ；ＰｈＣＨ２、ＣＨＰＬＡ）、４．３８〜４．１９（ｍ、〜１５８Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ Ρ（ΜΤＣｐｒＢｒ））、３．４８〜３．４１（ｍ、〜５６Η、ＣＨ２Ｂｒ）、２．２３〜２．１４（ｍ、〜５５Η；ＣＨ２）、２．０６（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．６１〜１．５２（ｍ、〜１０６Η；ＣＨ３ ＰＬＡ）、１．３２〜１．２７（ｂｒ、〜８６Η、ＣＨ３ Ｐ（ＭＴＣｐｒＢｒ））。
【０１５２】
実施例１０  ＤＬＡとＭＴＣＯＰｒＢｒとのブロック重合。
このポリマは、第１のモノマとしてＬ−ラクチド（ＬＬＡ）の代りにＤ−ラクチド（ＤＬＡ）を加え、実施例９と同じ手順によって調製された。収量：５０３ｍｇ（８７％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １２４００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１３。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３８〜７．２８（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．２２〜５．０９（ｍ、〜３９Ｈ；ＰｈＣＨ２、ＣＨ  ＰＬＡ）、４．３８〜４．１９（ｍ、〜１９５Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ Ｐ（ＭＴＣｐｒＢｒ））、３．４８〜３．４１（ｍ、〜６３Η、ＣＨ２Ｂｒ）、２．２３〜２．１４（ｍ、〜６２Η；ＣＨ２）、２．０６（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．６１〜１．５２（ｍ、〜１１９Η；ＣＨ３ ＰＬＡ）、１．３２〜１．２７（ｂｒ、〜９７Η、ＣＨ３ Ｐ（ＭＴＣｐｒＢｒ））。
【０１５３】
ランダムポリカーボネートコポリマ。
実施例１１  ＭＴＣＯＥｔとＭＴＣＯＰｒＢｒとのランダム重合
【０１５４】
【化２９】
2013515816.tif 000037
【０１５５】
上記の構造式の角括弧は、ＭＴＣＯＰｒＢｒまたはＭＴＣＯＥｔのどちらから誘導された繰り返し単位も、開始剤から誘導されたサブユニットならびにアセチル基と結合してよいことを示している。
【０１５６】
ＭＴＣＯＰｒＢｒ（２８２ｍｇ、１．０ミリモル）、ＭＴＣＯＥｔ（１８８ｍｇ、１．０ミリモル）、ＢｎＭＰＡ（９．０ｍｇ、０．０４ミリモル）、およびＴＵ（１８．７ｍｇ、０．０５ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（７．８ｍｇ、０．０５ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移し、室温で重合を開始させた（［Ｍ］０／［Ｉ］０＝５０）。２時間後、この混合物に無水酢酸（１９４ｍｇ、１．９０ミリモル）を加え、２夜の間撹拌した（反応率９３％）。次に、この溶液を低温メタノール中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：３７０ｍｇ（７７％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １１４００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．２０、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３７〜７．３１（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１６（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．３５〜４．２４（ｍ、〜２４７Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ ＰＭＴＣ（ｐｒＢｒ））、４．２３〜４．１４（ｍ、〜５６Η；ＯＣＨ２ ＰＭＴＣ（Ｅｔ））、３．４８〜３．４１（ｍ、〜４７Η；ＣＨ２Ｂｒ）、２．２３〜２．１４（ｍ、〜４７Η；ＣＨ２ ＰＭＴＣ（ｐｒＢｒ））、２．０６（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３０〜１．２０（ｍ、〜２２７Η；ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３ ＰＭＴＣ（Ｅｔ））。
【０１５７】
陽イオンポリマの調製
陽イオンハロ官能化プレポリマ（すなわち初期ＲＯＰポリマ）をＤＭＳＯ中でΝ，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）と反応させて対応する陽イオンポリマを得た。いくつかのビス−アミンを調べたが、第１および第２アミンではポリカーボネート主鎖が顕著に減少したので、第３級アミンだけを実現可能性のある試薬として選んだ。
【０１５８】
実施例１２
【０１５９】
【化３０】
2013515816.tif 000038
【０１６０】
実施例５のホモポリマ（４２７ｍｇ、［Ｃｌ］＝１．７７ミリモル）をＤＭＳＯ（８ｍＬ）に溶解し、ＴＭＥＤＡ（１．１ｍＬ、７．２２ミリモル）と混合し、９０℃で６時間撹拌した。次に、この混合物をＴＨＦ中で２回沈殿させ、遠心分離によって沈殿物を集め、真空中で乾燥した。収量：５４６ｍｇ（８６％）、ＧＰＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ  １１３００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．２７、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４２〜７．３２（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１９（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４５〜４．１７（ｍ、〜２５２Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６３〜３．４４（ｂｒ、〜１４９Η；ＣＨ２Ｎ＋ポリマ）、３．２７〜３．１８（ｂｒ、〜２１０Η；Ｎ＋ＣＨ３ポリマ）、２．８５〜２．７６（ｂｒ、〜７３Η；ＣＨ２Ｎポリマ）、２．３６〜２．３０（ｂｒ、〜２１３Η；ＮＣＨ３ポリマ）、２．２８〜２．１７（ｂｒ、〜７０Η；ＣＨ２ポリマ）、２．０６（ｓ、３Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３４〜１．２５（ｂｒ、〜１１９Η；ＣＨ３ポリマ）、１．２２（ｓ、３Η；ＣＨ３末端基）。
【０１６１】
実施例１３
【０１６２】
【化３１】
2013515816.tif 000039
【０１６３】
実施例６において形成させたポリマ（１７７ｍｇ、［Ｂｒ］＝０．６２ミリモル）のＤＭＳＯ溶液（３ｍＬ）にＴＭＥＤＡ（０．３８ｍＬ、２．５ミリモル）を加えた。この溶液を室温で一夜撹拌し、ＴＨＦ中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：２２０ｍｇ（８８％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４２〜７．３０（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．２０（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４６〜４．１３（ｍ、〜２６６Η、ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６６〜３．４２（ｂｒ、〜１６８Η；ＣＨ２Ｎ＋ポリマ）、３．２８〜３．１７（ｂｒ、〜２４３Η；Ｎ＋ＣＨ３ポリマ）、２．８７〜２．７５（ｂｒ、〜８４Η；ＮＣＨ２ポリマ）、２．３７〜２．２９（ｂｒ、〜２５１Η；ＮＣＨ３ポリマ）、２．３０〜２．１６（ｂｒ、〜８５Η；ＣＨ２ポリマ）、２．０７（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３７〜１．２３（ｂｒ、〜１３３Η；ＣＨ３ポリマ）。
【０１６４】
実施例１４
【０１６５】
【化３２】
2013515816.tif 000040
【０１６６】
この陽イオンポリマは、実施例７において調製したポリマを用いたことを除いて実施例１３に記載されていると同じ手順を用いて２０１ｍｇスケールで調製した。収量：２１１ｍｇ（７７％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ  ７．４９〜７．３１（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．２２（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．６９〜４．５６（ｂｒ、〜６８Η；ＯＣＨ２）、４．４７〜４．２３（ｍ、〜１７６Η；ＯＣＯＣＨ２）、３．９０〜３．７６（ｂｒ、〜７４Η；Ｎ＋ＣＨ２）、３．６６〜３．５１（ｂｒ、〜７８Η；ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋）、３．２９〜３．１５（ｂｒ、〜２２０Ｈ；Ｎ＋ＣＨ３）、２．９３〜２．８２（ｂｒ、〜７６Η；ＮＣＨ２）、２．３３〜２．２３（ｂｒ、〜２２２Η；ＮＣＨ３）、２．０７（ｓ、６Η；ＣＨ３アセチル）、１．３８〜１．２０（ｂｒ、〜１２４Ｈ；ＣＨ３）。
【０１６７】
実施例１５
【０１６８】
【化３３】
2013515816.tif 000041
【０１６９】
実施例８において形成させたポリマ（５７８ｍｇ、［Ｃｌ］＝１．９３ミリモル）のＤＭＳＯ溶液（１０ｍＬ）にＴＭＥＤＡ（１．２７ｍＬ、８．５ミリモル）を加えた。この反応混合物を９０℃で６時間撹拌し、ＴＨＦ中で２回沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：７３５ｍｇ（９２％）、ＧＰＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ  １５７００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．２７、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４１〜７．３２（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１９（ｂｒ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４８〜４．１３（ｂｒ、〜３８８Ｈ；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６５〜３．４５（ｂｒ、〜１７９Ｈ；ＣＨ２Ｎ＋ポリマ）、３．２８〜３．１８（ｂｒ、〜２７０Η；Ｎ＋ＣＨ３ポリマ）、２．８７〜２．７７（ｂｒ、〜８８Η；ＮＣＨ２ポリマ）、２．３８〜２．３０（ｂｒ、〜２７２Η；ＮＣＨ３ポリマ）、２．２８〜２．１６（ｂｒ、〜８８Η；ＣＨ２ポリマ）、２．０８〜１．９８（ｍ、〜４４Η；ＣＨ２ポリマ、ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３５〜１．２５（ｂｒ、〜１４９Η、ＣＨ３ポリマ）。
【０１７０】
実施例１６
【０１７１】
【化３４】
2013515816.tif 000042
【０１７２】
実施例９において形成させたポリマ（４０６ｍｇ、［Ｂｒ］＝１．０７ミリモル）およびＴＭＥＤＡ（０．６５ｍＬ、４．３ミリモル）をＤＭＳＯ（４．０ｍＬ）中で混合し、室温で一夜撹拌し、ＴＨＦ中で２回沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：５１５ｍｇ（９７％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４２〜７．３０（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ開始剤）、５．２９〜５．１１（ｍ、〜４２Ｈ；ＰｈＣＨ２開始剤、ＣＨ  ＰＬＡ）、４．４９〜４．１５（ｂｒ、〜２０４Η、ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６７〜３．４３（ｂｒ、〜１２３Η、ＣＨ２Ｎ＋ポリマ）、３．２９〜３．１５（ｂｒ、〜１７７Η、Ｎ＋ＣＨ３ポリマ）、２．８５〜２．７４（ｂｒ、〜６１Η、ＮＣＨ２ポリマ）、２．３７〜２．２８（ｂｒ、〜１８９Η、ＮＣＨ３ポリマ）、２．２９〜２．１５（ｂｒ、〜６２Η、ＣＨ２ポリマ）、２．０６（ｓ、６Η、ＯＣＨ３アセチル末端）、１．６０〜１．５０（ｍ、〜１２８Η；ＣＨ３  ＰＬＡ）、１．３５〜１．２４（ｂｒ、〜１０３Η、ＣＨ３）。
【０１７３】
実施例１７
実施例１０からのこのポリマを、実施例１６において用いられた手順にしたがってＴＭＥＤＡで処理して陽イオンポリマを得た。違いはＬＬＡではなくＤＬＡから誘導したサブユニットであった。収量：４９７ｍｇ（９６％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４２〜７．３１（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ開始剤）、５．２４〜５．１３（ｍ、〜４１Ｈ；ＰｈＣＨ２開始剤、ＣＨ  ＰＬＡ）、４．４６〜４．１８（ｍ、〜２０６Η、ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２ポリマ）、３．６６〜３．４５（ｂｒ、〜１２４Η、ＣＨ２Ｎ＋ポリマ）、３．２８〜３．１８（ｂｒ、〜１７３Η、Ｎ＋ＣＨ３ポリマ）、２．８４〜２．７５（ｂｒ、〜５７Η、ＮＣＨ２ポリマ）、２．３５〜２．２８（ｂｒ、〜１７５Η、ＮＣＨ３ポリマ）、２．２８〜２．１６（ｂｒ、〜５９Η、ＣＨ２ポリマ）、２．０６（ｓ、６Η、ＯＣＨ３アセチル末端）、１．５９〜１．５２（ｍ、〜１２１Η；ＣＨ３  ＰＬＡ）、１．３５〜１．２５（ｂｒ、〜１１０Η、ＣＨ３）。
【０１７４】
実施例１８
【０１７５】
【化３５】
2013515816.tif 000043
【０１７６】
実施例１１からのポリマ（３４２ｍｇ、［Ｂｒ］＝０．６７ミリモル）のＤＭＳＯ溶液（３ｍＬ）にＴＭＥＤＡ（０．４０ｍＬ、２．６９ミリモル）を加えた。この溶液を室温で一夜撹拌し、ＴＨＦ／ヘキサン（３：１）の混合物中で２回沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：３７７ｍｇ（９０％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４１〜７．３５（ｂｒ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．１９（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４２〜４．２３（ｍ、〜２５３Η、ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２  ＰＭＴＣ（ｐｒＢｒ−Ｎ））、４．２８〜４．１３（ｍ、〜５６Η；ＯＣＨ２  ＰＭＴＣ（Ｅｔ））、３．６４〜３．４９（ｂｒ、〜９６Η；ＣＨ２Ｎ＋）、３．２８〜３．１９（ｂｒ、〜１４２Η；Ｎ＋ＣＨ３）、２．８４−２．７５（ｂｒ、〜５２Η；ＮＣＨ２）、２．３５〜２．２８（ｂｒ、〜１４５Η；ＮＣＨ３）、２．２９〜２．１７（ｂｒ、〜４９Η；ＣＨ２  ＰＭＴＣ（ｐｒＢｒ−Ｎ））、２．０６（ｓ、６Η；ＯＣＨ３アセチル末端）、１．３５〜１．１９（ｍ、〜２３４Η；ＣＨ３ポリマ）。
【０１７７】
電荷シフトポリマ
実施例１９
【０１７８】
【化３６】
2013515816.tif 000044
【０１７９】
５−メチル−５−（１−エトキシエチル）オキシカルボキシル−１，３−ジオキサン−２−オン（ＭＴＣＯＥＥ；６２ｍｇ、０．２７ミリモル）、ＭＴＣＯＰｒＢｒ（２１２ｍｇ、０．７５ミリモル）、ＢｎＭＰＡ（４．６ｍｇ、０．０２ミリモル）、およびＴＵ（１９．４ｍｇ、０．０５ミリモル）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（７．４ｍｇ、０．０５ミリモル）を含むバイアルにこの溶液を移し、室温で重合を開始させた（［Ｍ］０／［Ｉ］０＝５０）。２．５時間後、この溶液を低温メタノール中で沈殿させ、沈殿物を遠心分離し、真空中で乾燥した。収量：２４１ｍｇ（８７％）、ＧＰＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ  １１８００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ  １．１９、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）：δ  ７．４５〜７．３２（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、５．９６（ｑ、〜１２Ｈ；ＣＨ（ＯＥＥ））、５．２０（ｓ、２Η；ＰｈＣＨ２）、４．４２〜４．２２（ｍ、〜３３３Η；ＣＨ２ＯＣＯＯ、ＯＣＨ２  ポリマ）、３．７５〜３．４８（ｍ、〜１２８Η；ＯＣＨ２（ＯＥＥ）、ＣＨ２Ｂｒ）、２．２７〜２．１６（ｍ、〜８７Η；ＣＨ２  （ＯΡｒΒｒ））、１．３５（ｄ、〜４４Η；ＣＨＣＨ３（ＯＥＥ））、１．３３〜１．２３（ｍ、〜１８２Η；ＣＨ３ポリマ）、１．２２〜１．０８（ｍ、〜６９Η；ＣＨ３（ＯＥＥ））。ａ：ｂ＝１．０：３．１。
【０１８０】
実施例２０  実施例１９の四級化
【０１８１】
【化３７】
2013515816.tif 000045
【０１８２】
ドライアイス／アセトン浴中に浸漬した実施例１９のポリマ（２０２ｍｇ、［Ｂｒ］＝０．５６ミリモル）のアセトニトリル溶液（４ｍＬ）にトリメチルアミンガス（３９４ｍｇ、６．７ミリモル）を注入した。次に、この溶液を室温に戻らせ、１８時間撹拌した後に真空下でアセトニトリルおよび過剰のガスを除去した。濃縮した残留物を真空中で乾燥した（アミノ化率約９０％）。収量：２００ｍｇ（８５％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．４３〜７．３２（ｍ、５Ｈ；Ｐｈ）、６．０２〜５．９３（ｍ、〜６Ｈ；ＣＨ（ＯＥＥ））、５．２１（ｓ、２Ｈ；ＰｈＣＨ２）、４．４８〜４．１１（ｍ、〜２６７Η；ＣＨ２ＯＣＯＯおよびＣＨ２Ｏ  ポリマ）、３．７５〜３．６４（ｍ、〜１５Η；ＯＣＨ２ＣＨ３（ＯＥＥ））、３．６３〜３．４５（ｍ、〜７８Ｈ；Ｎ＋ＣＨ２（ＰＡＢ））、２．２９〜２．１５（ｂ、〜２９８Η；Ｎ＋ＣＨ３（ＰＡＢ））、２．３２〜２．１５（ｂ、〜６８Η；ＣＨ２（ＰＡＢ））、１．４１〜１．３５（ｄ、〜１９Η；ＣＨＣＨ３（ＯＥＥ））、１．３５〜１．２３（ｍ、〜１２２Η；ＣＨ３ポリマ）、１．２４〜１．１０（ｍ、〜４６Η；ＣＨ２ＣＨ３（ＯＥＥ））。Ｍｎ（ＮＭＲ）＝１４７００ｇ／ｍｏｌ。
【０１８３】
表８に、前駆体ポリマ（実施例５から１１、および１９）、ならびにそれらの対応する陽イオンポリマ（実施例１２から１８、および２０）についてポリマ調製を要約している。
【０１８４】
【表８】
2013515816.tif 000046
【０１８５】
表９は、前駆体ポリマ（実施例５から１１、および１９）、ならびにそれらの対応する陽イオンポリマ（実施例１２から１８、および２０）について得た分析データ（数平均分子量Ｍｎ、多分散性指数（ＰＤＩ）、％収率、ハロゲン化物Ｘから第４級アミンへの％反応率）を要約している。
【０１８６】
【表９】
2013515816.tif 000047
【０１８７】
予測可能な分子量を有する分散性の狭いホモポリマ、ランダムポリマ、およびブロックコポリマの合成によって、この有機触媒系（ＴＵ／ＤＢＵ）の有用性を示した。多分散性は、１．１１から１．２２の範囲であった。前駆体ポリマの数平均分子量Ｍｎは１０５００から１２４００であった。陽イオンポリマの数平均分子量Ｍｎは１３１００から１９４３３であった。ハロゲン化物から第４級アミンへの反応率は約８４％から１００％であった。
【０１８８】
前駆体ポリマとアミンとの反応性は、側鎖のハロゲン化物によって決まる。実施例５のポリマ（Ｘ＝Ｃｌ）はアセトニトリル中室温でトリメチルアミンと容易に第４級アミンを形成することができるが、ＴＭＥＤＡ（［Ｃｌの当量あたり４当量のＴＭＥＤＡ］）と実施例１２の陽イオンポリマを製造するには、ＤＭＳＯなどの極性のより高い溶媒および加熱（９０℃）が必要であった。比較すると、実施例６（Ｘ＝Ｂｒ）および実施例７（Ｘ＝Ｉ）の前駆体ポリマはＤＭＳＯまたはアセトニトリル中のＴＭＥＤＡを用いて室温で実施例１３および１４の対応する陽イオンポリマにそれぞれ変換された。ＴＭＥＤＡとの反応速度において臭化物とヨウ化物との反応性の間に差はほとんど見いだされなかった。
【０１８９】
塩素、臭素およびヨウ素の間の反応性の差は、ブロックコポリマ、特に陽イオンポリカーボネートセグメントを含むミセルを形成する両親媒性ブロックコポリマの設計において役立てることができる。上記に示したように、両端の陽イオン親水性セグメント（実施例１５から１７）と疎水性コアとを含む陽イオンブロックコポリマを形成させることができる。疎水性コアは、炭酸トリメチレン（ＴＭＣ）またはラクチド（ＬＬＡもしくはＤＬＡ）から誘導された繰り返し単位を含む。しかし、ＬＬＡおよびＤＬＡから誘導された疎水性コアは、特に塩化物脱離基を有するポリカーボネートサブユニットの場合、熱を必要とするＴＭＥＤＡ四級化反応時に熱的に不安定であることが見いだされた。従って、これらのモノマを使用して、室温においてＴＭＥＤＡと反応することができるであろう、臭化物またはヨウ化物脱離基を有する前駆体ポリマを形成させた。塩化物脱離基を含む前駆体ポリマの場合、ＴＭＥＤＡ四級化反応において用いられる高温において、ＴＭＣから誘導されたポリ（トリメチレンカーボネート）を含む疎水性ブロックが比較的安定であった。
【０１９０】
ハロゲンの反応性は、電荷を有するポリマの安定性にも影響を及ぼすことがある。ハロゲン残基の９０％前後が変換されるが、反応平衡、立体障害、および電荷反発のために、過剰のＴＭＥＤＡを用いてもすべての側鎖ハロゲン化物基を第４級アミンに変換するのは難しい。未反応ハロゲン化アルキル基は、側鎖の最末端における第３級アミンとの反応のための潜在的な架橋部位である。それらの低い反応性のために、塩化物含有前駆体ポリマから誘導された陽イオンポリマは極めて安定である。一方、臭化物またはヨウ化物含有前駆体ポリマから誘導された陽イオンポリマは少量の不溶性物質を含んでいた。しかし、実施例１１のランダム前駆体ポリマから誘導された実施例１８の陽イオンポリマを生成させる反応において架橋は観測されなかった。実施例１８の陽イオンポリマは、コモノマモル比ＭＴＣＯＥｔ：ＭＴＣＯＰｒＢｒが１：１のとき良好な水への溶解性を示した。
【０１９１】
物理化学試験および生物試験
ポリマ／ＤＮＡおよびＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の調製のための一般的な手順
超純水（ＨＰＬＣグレード、ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０または６．０）にポリマを溶解し、超純水にＰＥＩを溶解した。等しい体積のポリマまたはＰＥＩ溶液とＤＮＡ溶液とを混合して意図したＮ／Ｐ比（ＤＮＡのリン酸基のモル数に対する陽イオンポリマのアミン基のモル数の比）を達成することによって、複合体を直接形成させた。ポリマまたはＰＥＩ分子とＤＮＡ分子との間の完全な静電相互作用を可能にするために、混合したらこの溶液を室温で３０分間平衡化させてからその後の測定に用いた。
【０１９２】
ゲル遅延度アッセイ
種々のＮ／Ｐ比を有するポリマ／ＤＮＡ複合体のさまざまな調合物を調製した。平衡後、複合体を１％アガロースゲル（５０ｍＬのアガロース溶液あたり０．５マイクログラム／ｍＬの臭化エチジウムを４マイクロリットル用いて染色した）上、０．５×ＴＢＥ緩衝液中、８０ｍＶで６０分間電気泳動に付した。ＴＢＥ緩衝液の原液は、５３ｇのＴＲＩＳ塩基（ＨＯＣＨ２）３ＣＮＨ２、２７．５ｇのホウ酸、および２０ｍｌの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）を含む。使用の前にＴＢＥ原液を０．５×に希釈した。次に、ゲルを紫外線照射器（ＣｈｅｍｉＧｅｎｉｕｓ，Ｅｖｏｌｖｅ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）で分析して裸のＤＮＡの位置と比べた複合体化ＤＮＡの位置を示させた。
【０１９３】
粒子サイズおよびζ電位分析
Ｎ／Ｐ  １、５、１０、２０、３０、４０および５０にしたがってポリマ／ＤＮＡ複合体を調製した。３０分間インキュベーションした後、１００マイクロリットルの複合体溶液を１ｍＬの超純水または２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０またはｐＨ６．０）で１１倍に希釈した。超純水または酢酸ナトリウム緩衝液で同じ濃度に希釈した裸のＤＮＡを対照として使用した。分析の前に、希釈した複合体溶液を３０分間安定化させた。ポリマ／ＤＮＡ複合体の粒子サイズおよびζ電位を６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビーム（散乱角：９０°）を備えた動的光散乱式粒度分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）をそれぞれ用いて測定した。粒子サイズおよびζ電位測定は、各試料について５回繰り返し、データは５つの読み値の平均として報告した。
【０１９４】
細胞毒性試験
ＨｅｐＧ２細胞を、５％ＣＯ２の雰囲気下で１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１００マイクログラム／ｍＬペニシリンおよび１００単位／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ成長培地中に３７℃で維持した。ＨｅｐＧ２細胞におけるポリマ／ＤＮＡ複合体の細胞毒性を評価するために、標準ＭＴＴ（ジメチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウム塩）アッセイプロトコルを使用した。９６−ウェルプレート上で、１×１０４細胞／ウェルの密度で細胞を接種し、２４時間成長させて６０％から７０％密生に到達させた。上記に記載のプロトコルにしたがってＤＮＡ複合体を調製した。裸のＤＮＡ溶液も複合体溶液の濃度と同じ濃度に調製した。各ウェルに１００マイクロリットルの新しい成長培地を追加し、１０マイクロリットルの複合体溶液で処理した。細胞毒性試験は、１つのＮ／Ｐ比あたり８つのウェルの繰り返しで実行した。４時間インキュベーションした後、ウェルを新しい培地で置き換え、さらに６８時間インキュベーショントした。ウェルを１００マイクロリットルの新しい培地および２０マイクロリットルのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ緩衝液中５ｍｇ／ｍＬ）で置き換えた後、細胞をさらに４時間インキュベーションした。最後に、用いた培地を除去し、各ウェルの中の取り込まれた紫色のホルマザン結晶を１５０マイクロリットルのＤＭＳＯで溶解した。各ウェルから１００マイクロリットル量のホルマザン／ＤＭＳＯ溶液を新しい９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて５５０ｎｍおよび６９０ｎｍの波長で吸光度（Ａ）を測定した。種々のＮ／Ｐ比における相対細胞生存率を測定するために、処理された細胞中のホルマザン溶液の吸光度を対照細胞のものと比較した。
細胞生存率＝［（Α５５０−Ａ６９０）試料／（Ａ５５０−Ａ６９０）対照］×１００％
データは、ｐ＜０．０５のスチューデントｔ検定によって有意差を統計学的に分析した。
【０１９５】
インビトロ遺伝子発現
ポリマ／ＤＮＡ複合体のインビトロ遺伝子移入をＨｅｐＧ２細胞において調べた。細胞は２４−ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、０．５ｍＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地）成長培地を用いて２４時間６０％から７０％密生に培養した。各ウェルの細胞を新しい成長培地で置き換え、続いて５０マイクロリットルの複合体溶液（２．５マイクログラムのＤＮＡを含む）を用いて移入した。４時間移入した後、用いた培地を新しい培地で置き換え、細胞をさらにインキューベートした。培養培地を６８時間後に取り除き、細胞をＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ二塩基リン酸ナトリウム、２ｍＭ一塩基リン酸カリウムを含むリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で洗浄した後に０．２ｍＬの１×レポータ溶菌緩衝液を加えた。凍結（−８０℃で３０分間）および解凍のサイクルを２回行った後に、細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して細胞残屑を除去した。上清（２０マイクロリットル）を１００マイクロリットルのルシフェリン基質緩衝液と混合し、直ちに照度計（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７，Ｍａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いてその蛍光強度（相対光単位ＲＬＵで）を測定した。ＲＬＵ読み値をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した上清のタンパク質濃度に対して規格化して全体的な発現効率を得た。
【０１９６】
すべてのインビトロ遺伝子発現実験において、裸のＤＮＡをネガティブコントロールとして用いた。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体をポジティブコントロールとして用い、最適Ｎ／Ｐ比（すなわち１０）で調製した。このＮ／Ｐ比において、ＰＥＩは高い遺伝子発現を誘発したが、５０％より高い細胞生存率が得られた。各Ｎ／Ｐ比におけるルシフェラーゼ発現効率を６つの繰り返しウェルの平均として表した。スチューデントｔ検定を用いて統計解析を実行した。差は、ｐ＜０．０５において統計的に有意であると考えた。
【０１９７】
上記で調製した両親媒性ポリマ（実施例１２から１８）は、水溶液中でミセルナノ粒子を形成することができる。典型的な例として、実施例１５の陽イオンポリマは、このポリマを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に直接溶解すると３７０ｎｍのサイズおよび３４ｍＶのζ電位を有するナノ粒子を形成した。実施例１５の陽イオンポリマにもとづくポリプレックスは、強いＤＮＡとの結合能力を示した。図１は、実施例１５の陽イオンポリマを用いて種々のｐＨおよびさまざまなＮ／Ｐ比において調製したポリプレックスのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。ｐＨ７において調製したポリプレックスでは、Ｎ／Ｐ＝４においてＤＮＡ移動度の完全な遅滞が観測された。ｐＨ６またはｐＨ５において調製したポリプレックスでは、Ｎ／Ｐ＝３においてＤＮＡ移動度の完全な遅滞が観測された。ｐＨが低くなるほど多くの第３級アミンがプロトン化され、陽イオンポリマのＤＮＡ結合能力を増強する。さらに、ポリプレックスは、高いＮ／Ｐ比において１５０ｎｍ未満の粒子サイズおよび正のζ電位を有し、これらは細胞取り込みに有利である。
【０１９８】
図２は、ｐＨ７．０、６．０および５．０において調製したポリプレックスのＮ／Ｐ比と粒子サイズとの間の関係を示す棒グラフである。粒子サイズは、Ｎ／Ｐ比の増加（５から５０）とともにｐＨ５．０（１１０から約８０ｎｍ）およびｐＨ６．０（約２５０ｎｍから約１００ｎｍ）で減少した。ｐＨ７．０では、粒子サイズはＮ／Ｐ比が１から５０について比較的一定にとどまるかまたはわずかに増加した（約１２０ｎｍから１５０ｎｍ）。
【０１９９】
図３は、ｐＨ７．０、６．０および５．０において調製したポリプレックスのＮ／Ｐ比とζ電位との間の関係を示す棒グラフである。ζ電位は、高いＮ／Ｐ比および低いｐＨ値で最も高く、ポリプレックスが低いｐＨほど高い正の電荷密度、したがって大きなＤＮＡ結合能力を有することを示した。
【０２００】
図４は、種々のｐＨおよびＮ／Ｐ比において作製したポリプレックスについて、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌腫細胞系統におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較する棒グラフである。ＤＮＡ対照およびＰＥＩ／ＤＮＡ対照も示している。３つのｐＨ条件の中でｐＨ６．０が最も高い遺伝子発現レベルを与え、Ｎ／Ｐ３０において１．１×１０７ＲＬＵ／ｍｇタンパク質であった。図２および３に示すように、ｐＨ７．０およびｐＨ６．０において調製したときポリプレックスの粒子サイズは高いＮ／Ｐ比（たとえば３０から５０）において同様であったが、ｐＨ６．０において作製したポリプレックスの方が高いζ電位を有した。理論にはとらわれないが、ζ電位が高い方がポリプレックスと負電荷を有する細胞膜との相互作用を増強し、ポリプレックスの細胞取り込みを促進し、従って遺伝子発現効率を増加させるかもしれない。第３級アミンはポリプレックスのエンドソームエスケープのためのプロトンスポンジ効果を提供するように設計した。ｐＨ６．０と比較すると、ｐＨ５．０における方が多くの第３級アミンがプロトン化され、そのことがプロトンスポンジ効果を弱め、観測されたより低い遺伝子発現レベルの原因となったのかもしれない。
【０２０１】
図５の棒グラフに、細胞生存率データを示す。ポリプレックスによって誘発された最も高い遺伝子発現レベル（ｐＨ６．０およびＮ／Ｐ  ３０）はＰＥＩによってその最適Ｎ／Ｐ比（すなわちＮ／Ｐ  １０）において媒介されたものより低かったが、ポリプレックスの細胞毒性はＰＥＩ／ＤＮＡ複合体よりはるかに低かった。たとえば、細胞生存率は、開示したポリプレックスでは９６％であったが、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体では６４％しかなかった。向上した生存率は、開示したポリマのより大きな生分解性によると考えられる。
【０２０２】
追加の特定の実施態様
一つの特定の実施態様において、生分解性両親媒性陽イオンポリマは、ａ）それぞれの第１の末端、それぞれの第２の末端、およびそれぞれの第１の繰り返し単位を含む２つのポリマ鎖、およびｂ）酸素、窒素および硫黄からなる群から独立に選ばれた２つの主鎖ヘテロ原子を含むモノマ結合基を含み、ｉ）２つのポリマ鎖のそれぞれの第１の末端は、２つの主鎖ヘテロ原子の１つとそれぞれ結合し、ｉｉ）任意選択として、それぞれの第２の末端は、それぞれの末端保護基を含み、ｉｉｉ）それぞれの第１の繰り返し単位は、エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第１の主鎖官能基を含み、それぞれの第１の繰り返し単位の０％超は、それぞれの側鎖第４級アミン基を含む。追加の実施態様において、２つの主鎖ヘテロ原子は酸素原子である。別の追加の実施態様において、陽イオンポリマは水溶液中５．０から８．０のｐＨにおいて自己集合し、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビームおよび９０°の散乱角を用いて動的光散乱法によって測定したとき、１０ｎｍから５００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子になる。別の追加の実施態様において、陽イオンポリマは、ＡＳＴＭ  Ｄ６４００に則って生分解性である。別の追加の実施態様において、第１の側鎖は、それぞれの第３級アミン基をさらに含む。別の追加の実施態様において、２つのポリマ鎖は、ｉ）エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第２の主鎖官能基、およびｉｉ）エンドソーム環境内でカルボン酸基を形成することができるそれぞれの潜在的なカルボン酸基を含むそれぞれの第２の側鎖を含む、それぞれの第２の繰り返し単位を含む。別の追加の実施態様において、２つのポリマ鎖は、ブロックコポリマ鎖である。
【０２０３】
別の特定の実施態様において、ポリマ複合体は、負電荷を有する生物活性物質および上記に記載の生分解性両親媒性陽イオンポリマを含む。
【０２０４】
別の特定の実施態様において、ポリマ複合体を形成させる方法は、上記に記載の生分解性両親媒性陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させてポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成させるステップを含む。
【０２０５】
別の特定の実施態様において、細胞を処理する方法は、細胞を上記に記載のポリマ複合体のナノ粒子と接触させるステップを含む。
【０２０６】
別の特定の実施態様において、生分解性陽イオンポリマを形成させる方法は、ｉ）第１の環状カルボニルモノマ、ｉｉ）有機触媒、ｉｉｉ）促進剤、ｉｖ）２つの求核開始基を含むモノマ開始剤であって、２つの求核開始基はアルコール、アミン、およびチオールからなる群から独立に選ばれたモノマ開始剤、およびｖ）任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、第１の混合物を撹拌し、それによって、第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成させるステップ、任意選択として、第１のポリマを末端保護するステップ、および第１のポリマまたは末端保護された第１のポリマを第３級アミンで処理し、それによって陽イオンポリマを形成させるステップであって、第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位の０％超は第４級アミンを含む側鎖部分を有するステップを含む。
【０２０７】
本明細書において用いられている用語法は、特定の実施態様を記載することだけを目的とし、本発明を限定するものではない。本明細書に用いられている単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に断らない限り複数形も含むものとする。用語「含む」もしくは「含んでいる」またはその両方は、本明細書において用いられるとき、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、要素もしくは成分またはそれらの任意の組み合わせの存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分もしくはそれらの群またはそれらの任意の組み合わせの存在または追加を排除しないとさらに理解される。
【０２０８】
添付の請求項にあるすべての手段またはステップおよび機能要素についての対応する構造、物質、行為、および均等物は、具体的に請求されている他の請求要素と組み合わされて機能を実施するためのいずれの構造、物質、または行為も含むものとする。本発明の記載は、例示および記載を目的として提示したが、包括的であることも開示されている形の発明に限定されることも意図しない。本発明の範囲および思想から逸脱しない多くの変更形および変化形が当業者に明らかとなる。実施態様は、本発明の原理および原理の実際的な適用を最も良好に説明し、他の当業者が本発明を理解することを可能にするために選び、記載した。
【図１】
2013515816.tif 000060
【図２】
2013515816.tif 000061
【図３】
2013515816.tif 000062
【図４】
2013515816.tif 000063
【図５】
2013515816.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月5日(2012.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位であって、前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は第４級アミン基を含む側鎖部分を含む第１の繰り返し単位、
前記開環重合のためのモノマジオール開始剤から誘導されたサブユニット、および
任意選択の末端保護基
を含む生分解性陽イオンポリマ。
【請求項２】
前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は、第４級アミン基および第３級アミン基を含む側鎖部分を含む、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項３】
前記第１の繰り返し単位の前記側鎖部分は、側鎖カルボン酸基をさらに含む、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項４】
前記陽イオンポリマは第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位をさらに含み、前記第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項５】
前記陽イオンポリマはポリカーボネートである、請求項１に記載の陽イオンポリマ。
【請求項６】
それぞれの第１の末端、それぞれの第２の末端、およびそれぞれの第１の繰り返し単位を含む２つのポリマ鎖、
酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選ばれた２つの主鎖ヘテロ原子を含むモノマ結合基
を含み、
ｉ）前記２つのポリマ鎖の前記それぞれの第１の末端は、前記２つの主鎖ヘテロ原子の１つとそれぞれ結合し、ｉｉ）任意選択として、前記それぞれの第２の末端は、それぞれの末端保護基を含み、ｉｉｉ）前記それぞれの第１の繰り返し単位は、エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第１の主鎖官能基を含み、前記それぞれの第１の繰り返し単位の少なくとも一部は、それぞれの側鎖第４級アミン基を含む
生分解性両親媒性陽イオンポリマ。
【請求項７】
前記２つの主鎖ヘテロ原子は、酸素原子である、請求項６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項８】
前記第１の側鎖は、それぞれの第３級アミン基をさらに含む、請求項６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項９】
前記２つのポリマ鎖は、ｉ）エステル、カーボネート、カーバメート、尿素、チオカーバメート、チオカーボネート、またはジチオカーボネートからなる群から独立に選ばれたそれぞれの第２の主鎖官能基、およびｉｉ）エンドソーム環境においてカルボン酸基を形成することができるそれぞれの潜在的なカルボン酸基を含むそれぞれの第２の側鎖、を含むそれぞれの第２の繰り返し単位を含む、請求項６に記載の陽イオンポリマ。
【請求項１０】
前記２つのポリマ鎖は、ブロックコポリマ鎖である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の陽イオンポリマ。
【請求項１１】
前記陽イオンポリマは、水溶液中５．０から８．０のｐＨにおいて自己集合し、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザビームおよび９０°の散乱角を用いる動的光散乱法によって測定したとき、１０ｎｍから５００ｎｍの平均粒子サイズを有するナノ粒子になる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の陽イオンポリマ。
【請求項１２】
前記陽イオンポリマは、ＡＳＴＭ  Ｄ６４００に則って生分解性である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の陽イオンポリマ。
【請求項１３】
第１の環状カルボニルモノマ、触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成するステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、
前記第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成させるステップ、
任意選択として、前記第１のポリマを末端保護して前駆体ポリマを形成させるステップ、および
前記前駆体ポリマを前記第３級アミンで処理して前記陽イオンポリマを形成させるステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は第４級アミンを含む側鎖部分を含むステップ
を含む、生分解性陽イオンポリマを形成させる方法。
【請求項１４】
前記第３級アミンはビス第３級アミンであり、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は前記第４級アミンおよび第３級アミンを含む前記側鎖部分を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビス第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３級アミンはカルボキシ基を含み、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は前記第４級アミンおよびカルボン酸を含む前記側鎖部分を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の混合物は疎水性の第２の環状カルボニルモノマを含み、前記陽イオンポリマは前記第２の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第２の繰り返し単位を含むランダムコポリマであり、前記第２の環状カルボニルモノマは前記第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを含む側鎖部分を形成することができる１価の脱離基を含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の繰り返し単位は、側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
触媒、促進剤、モノマジオール開始剤、および任意選択の溶媒を含む反応混合物を形成させるステップ、
前記反応混合物に第１の環状カルボニルモノマ、およびそれに続いて第２の環状カルボニルモノマを順次加え、開環重合によって反応させ、それによって第１のブロックコポリマを形成させるステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含み、前記第２の環状カルボニルモノマは、前記第３級アミンと反応していずれかの第４級アミンを形成することができないステップ、
任意選択として、前記第１のブロックコポリマを末端保護し、それによって前駆体ブロックコポリマを形成させるステップ、および
前記前駆体ブロックコポリマを第３級アミンで処理して前記陽イオンポリマを形成させるステップであって、前記陽イオンポリマは前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された第１の繰り返し単位を含み、前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部前記第４級アミンを含む側鎖部分を含むステップ
を含む、生分解性陽イオンブロックコポリマを形成させる方法。
【請求項２０】
前記順次の反応を、逆の順序で実行して前記第１のブロックコポリマを形成させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のブロックコポリマをカルボン酸無水物を用いて末端保護し、それによって末端エステル基を形成させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（１）
【化１】
2013515816.tif 000065
式中、
ｔは、０から６の整数であり、
各Ｙは、
【化２】
2013515816.tif 000066
からなる群から独立に選ばれた２価のラジカルであり、
各Ｑ１は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造
【化３】
2013515816.tif 000067
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、および−ＳＲ１からなる群から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである
を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである
の化合物であり、前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ１基の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（２）
【化４】
2013515816.tif 000068
式中、
各Ｑ２は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造
【化５】
2013515816.tif 000069
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１からなる群から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである
を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
Ｒ２は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
Ｑ３は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から選ばれた１価のラジカルである
の化合物であり、前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｒ２基は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（３）
【化６】
2013515816.tif 000070
式中、
ｕは、１から８の整数であり、
各Ｑ４は、水素、ハロゲン化物、カルボキシル基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造
【化７】
2013515816.tif 000071
ここで、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルであり、各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである
を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルである
の化合物であり、
任意選択として、式（３）の
【化８】
2013515816.tif 000072
は、独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＲ１、または−ＮＲ１Ｒ１を表し、
任意選択として、式（３）の
【化９】
2013515816.tif 000073
は、独立に、
【化１０】
2013515816.tif 000074
基を表し、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ４基の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の環状カルボニルモノマは、式（４）
【化１１】
2013515816.tif 000075
式中、
各Ｑ５は、水素、ハロゲン化物、カルボキシ基、１から３０の炭素を含むアルキル基、６から３０の炭素原子を含むアリール基、および下記構造
【化１２】
2013515816.tif 000076
式中、Ｍ１は、−Ｒ１、−ＯＲ１、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、または−ＳＲ１から選ばれた１価のラジカルである
を有する基からなる群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
各Ｒ１は、１から３０の炭素を含むアルキル基、および６から３０の炭素を含むアリール基からなる前記群から独立に選ばれた１価のラジカルであり、
各Ｑ６は、水素、１から３０の炭素を有するアルキル基、および６から３０の炭素を有するアリール基からなる群から独立に選ばれた１価の基であり、
各ｖは、独立に１から６の整数を表す
の化合物であり、
前記第１の環状カルボニルモノマの前記Ｑ５基もしくはＱ６基またはその両方の１つ以上は、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記陽イオンブロックコポリマは前記第２の環状カルボニルモノマから誘導された第２の繰り返し単位を含み、前記第２の繰り返し単位は側鎖アセタールエステル基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記開始剤は、ＢｎＭＰＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記第３級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＭＰＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＭＢＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，２−エタンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，３−プロパンジアミン（ＴＥＰＤＡ）、１，４−ビス（ジメチルアミノ）シクロヘキサン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチル−１，４−ブタンジアミン（ＴＥＢＤＡ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４，４−ジピリジル−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、４−ピロリジノピリジン、１−メチルベンゾイミダール、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれたビス第３級アミンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
負電荷を有する生物活性物質、および
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の陽イオンポリマ
を含むポリマ複合体。
【請求項３０】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の陽イオンポリマを含む第１の水性混合物を、負電荷を有する生物活性物質を含む第２の水性混合物と接触させて、ポリマ複合体を含む第３の水性混合物を形成させるステップを含む、ポリマ複合体の形成方法。
【請求項３１】
細胞を処理する方法であって、
前記細胞を請求項１ないし１０のいずれかに記載の陽イオンポリマおよび負電荷を有する生物活性物質を含むポリマ複合体のナノ粒子と接触させるステップを含むステップ
を含む方法。
【請求項３２】
前記接触させるステップは、０％から１５％の溶血を誘発する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ粒子は、０％から２０％の細胞毒性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物活性物質は遺伝子であり、前記細胞は前記遺伝子を発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
生分解性陽イオンポリマを形成させる方法であって、
ｉ）第１の環状カルボニルモノマ、ｉｉ）有機触媒、ｉｉｉ）促進剤、ｉｖ）２つの求核開始基を含むモノマ開始剤であって、前記２つの求核開始基はアルコール、アミン、およびチオールからなる群から独立に選ばれたモノマ開始剤、およびｖ）任意選択の溶媒を含む第１の混合物を形成させるステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマは、第３級アミンと反応して第４級アミンを形成することができる１価の脱離基を含むステップ、
前記第１の混合物を撹拌し、それによって、前記第１の環状カルボニルモノマから開環重合によって誘導された第１の繰り返し単位を含む第１のポリマを形成させるステップ、
任意選択として、前記第１のポリマを末端保護するステップ、および
前記第１のポリマまたは前記末端保護された第１のポリマを前記第３級アミンで処理し、それによって前記陽イオンポリマを形成させるステップであって、前記第１の環状カルボニルモノマから誘導された前記第１の繰り返し単位の少なくとも一部は第４級アミンを含む側鎖部分を含むステップ
を含む方法。
【国際調査報告】
2013515816.tif 000077
2013515816.tif 000078