(57)【要約】【課題】植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を迅速、簡便かつ高精度で定量する方法を提供すること。【解決手段】植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を定量するための回帰式を、以下の工程（１）〜（３）を含む方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いて試料中の遊離脂肪酸を定量する方法。（１）試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物の近赤外光スペクトルを測定する工程（２）工程（１）に供した試料中の遊離脂肪酸を特異的に定量する工程（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、遊離脂肪酸の定量値を多変量解析法により解析し、遊離脂肪酸と関係する因子を決定する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を定量するための回帰式を得る方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする回帰式を得る方法。
（１）試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）工程（１）に供した試料中の遊離脂肪酸を特異的に定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、遊離脂肪酸の定量値を多変量解析法により解析し、遊離脂肪酸と関係する因子を決定する工程
【請求項２】
試料が米糠及び／または米油を含むことを特徴とする請求項１に記載の回帰式を得る方法。
【請求項３】
工程（２）において非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で遊離脂肪酸を特異的に定量することを特徴とする請求項１または２に記載の回帰式を得る方法。
【請求項４】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる移動相の組成が０〜０．０３％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むトルエンであることを特徴とする請求項３に記載の回帰式を得る方法。
【請求項５】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる試料溶媒がトルエンとアルコールとの混液であり、アルコール濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上であることを特徴とする請求項３または４に記載の回帰式を得る方法。
【請求項６】
工程（１）において試料または脂質濃縮物を、クロロホルム、アセトニトリル、ｔ−ブタノール及びジメチルスルホキシドから選択される溶媒に溶解し、得られた溶液の近赤外光スペクトルを測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項７】
工程（３）における波長領域が、１４３５±１０ｎｍ、１６６２±１０ｎｍ、１７６３±１０ｎｍ、２１６２±１０ｎｍおよび２２４５±１０ｎｍから選択される少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項８】
近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項９】
植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸の定量方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の回帰式を得る方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方法。
【請求項１０】
植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、ステロールエステル、ステロール、及びγ−オリザノールからなる群より選択される少なくとも２以上の成分を同時に分析する分析方法であって、非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法を用いることを特徴とする分析方法。
【請求項１１】
試料が米糠及び／または米油を含むことを特徴とする請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる移動相の組成が０〜０．０３％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むトルエンであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる試料溶媒がトルエンとアルコールとの混液であり、アルコール濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の遊離脂肪酸の定量方法を用いることを特徴とする植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度評価方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の分析方法を用いることを特徴とする植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の脂質成分の組成分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外分光法を用いた植物油脂またはその原料中の遊離脂肪酸の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米糠から抽出して得られる米油は、栄養・生理機能に富み、味質、食感にも優れた高付加価値の食用油として注目され、利用が拡大している。一方、米油の原料である米糠は、供給量が限られている上に劣化しやすい性質を持つため貯蔵が利かないこと、また抽出後の米原油に不純物が多く精製工程が複雑なことによって、米油は他の植物油脂と比較して製造コストが高く増産が困難という欠点がある。また、米油は機能性成分を豊富に含むが、その含量は原料によって変動する。よって米油の生産において原料米糠の品質管理が極めて重要である。
米糠は他の植物油脂原料と異なり、脂質分解酵素リパーゼを豊富に含んでいることが特徴であり、このリパーゼは玄米の状態では不活性であるが、精米によって米糠を分離すると活性化して急速に油分（トリアシルグリセロールやリン脂質など）を分解し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を生じさせる（下式１）ことが知られている（非特許文献１）。生じたＦＦＡ、特に二重結合を有するＦＦＡは酸化を受けやすく、人体に有害な過酸化脂質などの酸化生成物を生じ、脂質成分の劣化を促進する。劣化の進んだ米糠から抽出した米原油には酸化生成物が多く含まれ、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の含量も低下しているため、精製負荷の増大や収率の悪化につながる。よって、米糠から良質な米原油を効率よく得るためには、原料米糠だけでなく米原油の劣化度も評価し、その品質を評価・管理することが必要である。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
また昨今では食用油脂原料としての利用性に優れた稲品種（油糧米）の開発が進められており、米糠の急速な劣化を防ぐためにリパーゼやホスフォリパーゼなどのＦＦＡを生成する酵素の低減などの改良を施した品種の育種開発が一つのテーマとなっている。そこで米糠の劣化度を迅速に評価することが可能となれば、劣化度を経時的に評価することにより劣化しにくい米糠を選別することが出来るため、改良種の選定が容易となり、育種開発の効率を飛躍的に高めることができる。
以上の点から、米油の生産効率および品質の維持・向上のために、米糠や米原油の劣化度の迅速かつ正確な評価方法が求められている。
【０００５】
前述のように、米糠や米原油の劣化はＦＦＡの増加とともに起こるため、米糠や米原油の劣化度を評価する指標としてはＦＦＡ量をモニターすることが有効である。油脂中のＦＦＡは、一般的にはアルカリ滴定法を用いて測定される酸価（１ｇの油脂に含まれる酸を中和するのに必要な水酸化カリウム量）によって評価される。ただし脂質中にはＦＦＡ以外にも水酸化カリウムと反応する酸性物質が存在するため、酸価は正確なＦＦＡ量を表しているとは言えない。またアルカリ滴定法は夾雑物の影響によって測定値が変動するという欠点を有している。
ＦＦＡを正確に測定する手法としてはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法（特許文献１）、各種高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（非特許文献２）などが報告されている。しかし、ＧＣ法、ＨＰＬＣ法は脂肪酸を分子種毎に定量し、その定量値を合算する手法のため、煩雑さと測定精度に問題がある。一方、一度に脂肪酸含量の総量を測定できる手法として前述の滴定法以外に、酵素法（比色定量法）（特許文献２）やフーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）を利用した方法（非特許文献３）が報告されている。これらは分子種毎の計算が不要なため、ＧＣ法やＨＰＬＣ法よりも簡便な分析・評価が可能である。しかしこれらの方法についても、米糠中のＦＦＡを分析する場合には事前に油脂の抽出工程が必要となるため、迅速分析法としての運用は難しい。
【０００６】
一方、油脂類および食物中（米など）の油脂成分の劣化度を評価するため、近赤外分光（ＮＩＲ）法を用いて酸価を定量する分析法が報告されており（特許文献３、４）、実際に定量モデルが実用化されている。ＮＩＲ法は試料に近赤外光を照射して得られた散乱光や透過光のスペクトルから試料の物理的または化学的性質についての情報を得る手法であり、試料中の特定成分含量を、試料を破壊することなく、極めて短時間で予測することが可能である。ただしＮＩＲ法は化学分析値とＮＩＲスペクトルとの相関関係より検量モデルを作成するため、精度の高い検量モデルを得るためには高い分析精度を持った化学分析法の確立が必要である。
発明者らは過去にＮＩＲ法を用いた玄米・米糠中のＴＡＧ含量の予測法を確立している
（特許文献５）。ＮＩＲ法はその迅速性から米糠や米原油中のＦＦＡ量を定量し、劣化度を評価する上で非常に有望なツールであるが、ＮＩＲ法の適用には米糠や米原油に含まれるＦＦＡ量を正確に測定できる化学分析法の確立が必要である。これまでにもＮＩＲによるＦＦＡの検量モデルは作成されているが、その化学分析値はアルカリ滴定法（酸価）に基づくものであり、同法は先述のとおりＦＦＡを特異的に定量できる方法ではない。よって米糠や米原油の正確なＦＦＡ含量を予測できるＮＩＲ検量モデルの構築のために化学分析法の選定が課題となっている。
【０００７】
米油製品の原料としての観点から米糠および米原油の品質を評価する場合、油脂成分の劣化度だけでなくγ-オリザノール（ＯＺ）、ステロール（ＳＴ）、ステロールエステル（ＳＥ）などの米油に特徴的な機能性成分の含量も重要な指標である。また、最近油脂中のグリシドール脂肪酸エステルが発癌性を有することから問題となっている。本物質は精製工程において米原油中のジアシルグリセロールより生成すると考えられており、アシルグリセロール（トリ、ジ、モノ）のパターンも評価の指標となる。これらの成分の分析法については多数の報告があるが、いずれも分子種毎の評価法であるために手法として非常に煩雑である。品質管理・評価の上では分子種毎の評価は必ずしも必要でなく、これらの成分の量的なパターン（原油プロフィール）を簡便・迅速に分析・評価できる分析法が求められる。発明者は米油の主要な機能性成分であるγ-オリザノールについてＮＩＲを用いた迅速分析法を開発しているが、原油プロフィールを迅速に得ることができるような分析法については報告されていない。
【０００８】
油脂成分の分析法として最近開発されたものに、分子量分画（ＧＰＣ）と極性相互作用の２つの分離モードを組み合わせたＨＰＬＣ法（非特許文献４）がある。本法により植物油脂から合成したバイオディーゼル中の主成分であるＴＡＧ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）および脂肪酸メチルエステルをそれぞれ一つのピークとして分離することが可能となっている。本法はこれまでパーム油から合成したバイオディーゼル（非特許文献４）や、米糠由来のワックスの組成分析（非特許文献５）に用いられている。しかし、本法を米原油の分析に用いた報告はなく、米油に特徴的な機能性成分の分析についても報告はない。またＯＺやＳＴを含んだ油脂の分析例も報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２０４５９６号公報
【特許文献２】特開平２−１８４７５９号公報
【特許文献３】特開平４−７７６４８号公報
【特許文献４】特開平６−９１１８１号公報
【特許文献５】特開２０１３−７２７２６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】日本食品工業学会誌、36（6）、519（1989）
【非特許文献２】Journal of Chromatographic Science、 48、 663（2010）
【非特許文献３】分析化学、54（5）、381（2005）
【非特許文献４】Eur. J. Lipid Sci. Technol、 110、 422（2008）
【非特許文献５】Journal of the American Oil Chemists' Society、88（10）、 1497（2011）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を迅速、簡便かつ高精度で定量する方法を提供することを課題とする。また、同法を用いて植物油脂の原料となる植物体中の油脂成分の劣化度および劣化のしやすさ（安定性）を迅速かつ適切に評価する方法を提供することを課題とする。さらに、植物油脂の品質を評価するため、含有するγ-オリザノール、ステロール、ステロールエステルなどの量的なパターン(原油プロフィール)を得る方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を定量するための回帰式を得る方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする回帰式を得る方法。
（１）試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）工程（１）に供した試料中の遊離脂肪酸を特異的に定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、遊離脂肪酸の定量値を多変量解析法により解析し、遊離脂肪酸と関係する因子を決定する工程
［２］試料が米糠及び／または米油を含むことを特徴とする前記［１］に記載の回帰式を得る方法。
［３］工程（２）において非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で遊離脂肪酸を特異的に定量することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の回帰式を得る方法。
［４］非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる移動相の組成が０〜０．０３％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むトルエンであることを特徴とする前記［３］に記載の回帰式を得る方法。
［５］非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる試料溶媒がトルエンとアルコールとの混液であり、アルコール濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上であることを特徴とする前記［３］または［４］に記載の回帰式を得る方法。
［６］工程（１）において試料または脂質濃縮物を、クロロホルム、アセトニトリル、ｔ−ブタノール及びジメチルスルホキシドから選択される溶媒に溶解し、得られた溶液の近赤外光スペクトルを測定することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
［７］工程（３）における波長領域が、１４３５±１０ｎｍ、１６６２±１０ｎｍ、１７６３±１０ｎｍ、２１６２±１０ｎｍおよび２２４５±１０ｎｍから選択される少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
［８］近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
［９］植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸の定量方法であって、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の回帰式を得る方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方法。
［１０］植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、ステロールエステル、ステロール及びγ−オリザノールからなる群より選択される少なくとも２以上の成分を同時に分析する分析方法であって、非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法を用いることを特徴とする分析方法。
［１１］試料が米糠及び／または米油を含むことを特徴とする前記［１０］に記載の分析方法。
［１２］非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる移動相の組成が０〜０．０３％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むトルエンであることを特徴とする前記［１０］または［１１］に記載の分析方法。
［１３］非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる試料溶媒がトルエンとアルコールとの混液であり、アルコール濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上であることを特徴とする前記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の分析方法。
［１４］前記［９］に記載の遊離脂肪酸の定量方法を用いることを特徴とする植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度評価方法。
［１５］前記［１０］〜［１３］のいずれかに記載の分析方法を用いることを特徴とする植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の脂質成分の組成分析法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸を迅速、簡便かつ高精度で定量する方法を提供することができる。当該定量方法を用いることにより、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度及び安定性を迅速かつ適切に評価することができる。また、本発明によれば、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸量を従来の化学分析法より簡便かつ正確に分析できるとともに、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中に含まれる他の成分を同時に分析できる分析法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法における移動相（酢酸含有トルエン）中の酢酸濃度の影響を検討した結果を示す図であり、（ａ）は酢酸濃度が０．２５％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｂ）は酢酸濃度が０．０３％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｃ）は酢酸濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｄ）は酢酸濃度が０．００３％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示す。なお、ＴＡＧはトリアシルグリセロールを、ＤＡＧはジアシルグリセロールを、ＭＡＧはモノアシルグリセロールを、ＯＺはγ-オリザノールを、ＳＥはステロールエステルを、ＳＴはステロールを、ＦＦＡは遊離脂肪酸を指す。
【図２】ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法における試料溶媒（トルエン：２−プロパノール）中の２−プロパノール濃度の影響を検討した結果を示す図であり、（ａ）は２−プロパノール濃度が０％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｂ）は２−プロパノール濃度が２０％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｃ）は２−プロパノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｄ）は２−プロパノール濃度が８０％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示し、（ｅ）は濃度が２−プロパノール１００％（ｖ／ｖ）の場合の結果を示す。
【図３】ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法における試料溶媒（トルエン：２−プロパノール）中の２−プロパノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）の場合のＲＩクロマトグラムにおける各成分（ＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＳＴ、ＯＺ）のピークの分離状態を示す図である。
【図４】ＮＩＲ法による予測値と各分析値の相関を示す図であり、（ａ）は化学分析値がＨＰＬＣ−ＧＰＣ法による分析値である場合の結果を示し、（ｂ）は化学分析値がアルカリ滴定法による分析値である場合の結果を示す図である。
【図５】ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法及びアルカリ滴定法との分析値におけるγ−オリザノールの影響を検討した結果を示す図である。
【図６】米糠中の遊離脂肪酸含量について、近赤外光スペクトル予測値（定量値）とＨＰＬＣ−ＧＰＣ法分析値（実測値）の相関を示す図であり、（ａ）は脂質濃縮物当たりの遊離脂肪酸含量についての結果、（ｂ）は米糠当たりの遊離脂肪酸含量についての結果である。
【図７】米糠の脂質濃縮物中の遊離脂肪酸含量（脂質濃縮物当たり）について、近赤外光スペクトル予測値（定量値）とＨＰＬＣ−ＧＰＣ法分析値（実測値）の相関を示す図である。
【図８】米糠の保管時間と遊離脂肪酸含量（脂質濃縮物当たり）の関係を示す図である。
【図９】米糠の保管時間と遊離脂肪酸含量の化学分析値およびＮＩＲ法による予測値の関係を示す図であり、（ａ）は脂質濃縮物当たりの遊離脂肪酸含量についての結果、（ｂ）は米糠当たりの遊離脂肪酸含量についての結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において「植物油脂」は原料となる植物体から分離されたＴＡＧを主成分とする脂質を指し、その調製法は特に限定されず、未精製のものも精製後のものも含む。「原料」は植物油脂の主原料となる植物体を指し、加工剤は含まない。「試料の溶媒抽出液」は脂質の抽出に適した溶媒を用いて試料を抽出した液を指し、「脂質濃縮物」は該試料の溶媒抽出液から溶媒を留去して得られる未精製の脂質を指す。単に「脂質濃縮物」と記述した場合、その原料や組成については限定しない。
本明細書において「米糠」は玄米を精米した際に白米の副産物として得られる糠（赤糠、中糠、白糠）を指し、玄米表層部の果皮、種皮、胚芽、アリューロン層、サブアリューロン層、加工工程で混入した粉状の胚乳などが含まれる。「原油」は天然の原料から分離された未精製の油脂を指し、「米原油」は米糠を原料とする原油を指す。本明細書において「米油」とは米糠を原料とした米原油及び精製途中の米油、及び最終製品である精製米油のいずれかを指し、製法については特に限定しない。これは米油に限らず、「原料名＋油」と記述したもの全てについて同様である。
【００１６】
本明細書において遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、植物油に含まれるものであれば特に限定されないが、炭素数８〜２４で単鎖のモノカルボン酸が好ましい。好ましいＦＦＡとして、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ベヘン酸、エルシン酸、リグノセリン酸などが挙げられる。
【００１７】
本明細書においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）は特に限定されないが、上記のＦＦＡとグリセリンのエステル体であることが好ましい。本明細書においてステロール（ＳＴ）は一般的なステロール類の他に、トリテルペンアルコール類、およびステロール類、トリテルペンアルコール類の一部構造が変化（置換や異性化など）したステロール類似体も含まれる。ＳＴは植物油に含まれるものであれば特に限定されない。好ましいＳＴとして、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタール、スチグマスタノールコレステロール、デスモステロール、カンペステロール、ジヒドロブラシカステロールクリノステロール、ブラシカステロール、２４-メチレンコレステロール、コジステロール、β-シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、イソフコステロール、クレロステロール、２２-デヒドロクレロステロール、ラトステロール、フンギステロール、エピステロール、２２-ジヒドロスピナステロール、スピナステロール、コンドリラステロール、アベナステロールなどの４-デスメチルステロール類、ロフェノール、グラミステロール、シトロスタジエノール、２９-ノルラノステロール、オブツシホリオール、シクロオイカレノール、２９-ノルシクロラウデノールなどの４α-メチルステロール類、２４-ジヒドロラノステロール、パルケオール、シクロアルタノール、シクロアルテノール、シクロサドール、２４-メチレンシクロアルタノール、シクロブラノール、シクロラウデノール、ブチロスペルモール、Δ７−チルカノール、１０α-ククルビタジエノールなどの四環性トリテルペンアルコール類、ブラシノステロイドなどのステロール類似体などが挙げられる。本明細書においてγ−オリザノール（ＯＺ）は、上記のＳＴとフェルラ酸のエステル体が好ましい。本明細書においてステロールエステル（ＳＥ）は、上記のＳＴとＦＦＡのエステル体が好ましい。
【００１８】
〔植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中のＦＦＡを定量するための回帰式を得る方法〕
本発明は、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中のＦＦＡを定量するための回帰式を得る方法（以下「本発明の回帰式を得る方法」という。）を提供する。本発明の回帰式を得る方法は、以下の工程（１）〜（３）を含むものであればよい。
（１）試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）工程（１）に供した試料中の遊離脂肪酸を特異的に定量する工程
（３）ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、ＦＦＡの定量値を多変量解析法により解析し、ＦＦＡと関係する因子を決定する工程
本発明の回帰式を得る方法は、（１）〜（３）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は問わない。
【００１９】
工程（１）では、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物のＮＩＲスペクトルを測定する。ＮＩＲスペクトルの測定方法は特に限定されないが、拡散反射法または透過法が好ましく、これらを試料によって使い分けることがより好ましい。試料が固体であれば主に拡散反射法を用い、試料が液体であれば主に透過法を用いて測定することが好ましいが、液体の場合でも着色が強く、光を透過しにくい試料の場合は拡散反射光を測定することが好ましい。試料が溶液の場合は、適宜濃度を調整して透過光を測定することが好ましい。測定セルは特に限定されないが、測定試料、測定法に応じて使い分けることが好ましい。ＮＩＲスペクトルの測定は、オフライン（off line）分析だけではなく、アットライン（at line）、オンライン（on line）、インライン（in line）、無侵襲（non-invasive）分析などの形で実施してもよい。ＮＩＲスペクトルの測定は、試料を採取し分析室の近赤外分析計で測定することもできるが、生産現場や倉庫に近赤外分析計を持ち込みその場で測定することもできる。また製造ラインに近赤外分析計を組み込むことにより連続的に試料のＮＩＲスペクトルを測定することも可能である。
【００２０】
ＮＩＲスペクトルの測定には、市販の近赤外分光分析計を用いることができるが、透過光と拡散反射光を測定できるものが好ましい。また、試料に応じて固体測定モジュール、液体測定モジュール、光ファイバーモジュール、固体透過測定モジュールを備えたものが利用できる。また、測定セルの温度調節機能を備えたものがより好ましい。具体的にはＭＰＡ（ブルカー・オプティクス）、ＴＡＮＧＯシリーズ（ブルカー・オプティクス）、ＮＩＲＦｌｅｘ Ｎ−５００（ビュッヒ）、ＮＩＲＦｌｅｘ Ｎ−４００（ビュッヒ）、ＮＩＲＬａｂ Ｎ−２００（ビュッヒ）、ＮＩＲＭａｓｔｅｒ（ビュッヒ）、ＮＩＲＳ６５００（ニレコ）、ＸＤＳ・ＮＩＲシリーズ（ニレコ）、ＳｐｅｃｔｒａＳｔａｒ Ｓｅｒｉｅｓ（ＢＬＴＥＣ）、光品質チェッカーＨＯＳ−Ｆシリーズ（ＳＡＩＫＡ）、光品質チェッカーポータブルＨＱＣ−Ｆ３０（ＳＡＩＫＡ）、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ−１（島津製作所）、ＬＡＭＢＤＡ７５０／９５０／１０５０及びＦｒｏｎｔｉｅｒ ＮＩＲ（パーキンエルマー）、ＦＴ−ＩＲ４０００シリーズ及びＦＴ−ＩＲ６０００シリーズ（日本分光）、ＦＴ−ＮＩＲ ＭＢ３６００（ＡＢＢ ＢＯＭＥＭ）などが挙げられ、ＭＰＡとＴＡＮＧＯシリーズ（ブルカー・オプティクス）が特に好ましい。得られるスペクトルは、フーリエ変換スペクトルであることが好ましい。
【００２１】
工程（１）において、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物のいずれかをＮＩＲスペクトルの測定に供すればよく、その組成、植物油脂の原料となる植物体、植物油脂については限定されない。
植物油脂の原料となる植物体としては、稲、とうもろこし、ごま、ベニバナ、大豆、ナタネ、ひまわり、オリーブ、オオムギ、ブドウ、ヤシ、パーム、綿、アマ、トウゴマ（ヒマ）の種子、果実の一部、藻類などが挙げられる。このうち、稲の種子の一部であることが好ましく、玄米の一部であることがより好ましく、米糠であることがさらに好ましい。植物油脂としては米油、コーン油、ごま油、サフラワー油、大豆油、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、オオムギ油、グレープシードオイル、ヤシ油、パーム油、パーム核油、綿実油、ヤシ油、アマニ油、ひまし油、藻類油などが挙げられ、この内米油が好ましい。植物油脂は精製後であっても、精製前であっても、精製途中であってもかまわない。
【００２２】
好ましい米糠としては、例えば、玄米の精米により得られる米糠、加工糠、脱脂糠、米糠の搾油残渣、脱脂途中の米糠などが挙げられる。このうち、脱脂処理を行っていないものが好ましく、精米後未加工のものがより好ましい。試料となる米糠の原料となる稲の品種は特に限定されない。米糠は玄米を精米して得られる赤糠、中糠、白糠のいずれかを主成分とすることが好ましく、赤糠や中糠を主成分とすることが特に好ましい。またこれらの糠には白米が混ざっていてもかまわないが、その混入率は２０重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましい。
【００２３】
ＮＩＲスペクトルの測定に供する試料の油脂の純度は特に限定されない。試料として植物油脂を用いる場合、その製法については限定されないが、油脂の溶解性に優れた溶媒で抽出したもの、圧搾抽出したものなどが好ましく、精製途中の植物油脂や精製された植物油脂を用いる場合にも、このような原油から精製したものが好ましい。好ましい抽出溶媒としてはヘキサン、ジエチルエーテル、エタノール、２−プロパノール、アセトン、クロロホルムあるいはこれらの混液などが挙げられる。精製された植物油脂を用いる場合、使用前のものでもよく、使用後のもの（廃油）でもよい。また、精油過程で副産物として生じた脱臭スカム、ソープストック、ＦＦＡ、ワックス（ロウ）、ガム質などの副産物も試料として好適に用いることができる。
【００２４】
工程（１）において、異なる植物油脂の混合物をＮＩＲスペクトルの測定に供してもよい。また、異なる植物油脂の混合物は牛脂、ラード、鶏油（チー油）、魚油などの動物油を含んでいてもよいし、食品、飼料、化粧品、医薬品など用途に合わせて加工されたものであってもよい。
試料中の脂質の含有量は５重量％以上であることが好ましく、１０重量％以上であることがさらに好ましい。試料中の脂質の含有量が１０重量％を下回る場合、脂質の抽出処理を行って得られる溶媒抽出液または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物をＮＩＲスペクトル測定に供することが好ましい。脂質の抽出方法については後述する。
【００２５】
試料が植物油脂の原料の加工品の場合、試料は植物油脂の原料となる植物体を原料に用いた食品、飼料、化粧品、医薬品のいずれであってもよい。食品としては、例えば、菓子類（米菓、蒸菓子、ロックケーキ、クレープ、餅、ホットケーキ、マフィン、蒸しまんじゅう、カップケーキ、焼き菓子、鯛焼き、団子、クッキー、カステラ、マドレーヌ、ワッフルなど）、パン類（パン、スコーン、ナンなど）、麺類（うどん、ラーメン、そば、パスタ、マカロニなど）、練り製品（かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、ソーセージなど）、料理全般（白飯、おにぎり、おかゆ、豆腐、シリアル、ニョッキスープ、お好み焼き、カレー、シチュー、グラタン、天ぷら衣、パスタスープ、だんご汁、ピザ、ハンバーグ、チャーハン、スープの素など）、粉類（米粉、玄米粉、コーンスターチ、パン粉、片栗粉、天ぷら粉など）、ドリンク類（茶、コーヒー、ココア、清涼飲料、果実飲料、乳性飲料、酒類、栄養ドリンクなど）、調味料（醤油、ソース、料理酒、みりん、だし類、味噌など）、錠菓、サプリメント類などが挙げられる。飼料としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタなどの家畜用飼料、ニワトリなどの家禽用飼料、イヌ、ネコなどのペット用飼料、養殖魚用飼料などが挙げられる。化粧品としては、例えば、植物油脂の原料となる植物体を配合したクリーム、ローション、ジェル、ミスト、マスク、パック、シャンプー、リンス、入浴剤などが挙げられる。このような原料や素材を含む医薬品としては、例えば植物油脂の原料となる植物体を賦形剤として用いた錠剤、粉薬、カプセル剤などが挙げられる。
【００２６】
試料が植物油脂の加工品の場合、その原料となる植物体、組成、製法などについては特に限定されない。加工品としては、例えば、天ぷら、天かす、唐揚げ、フライ、マーガリン、バター、チーズ、フライドポテト、油揚げ、厚揚げ、生クリーム、コーヒーミルク（粉）、ホイップクリーム、ドレッシング、マヨネーズ、タルタルソース、オイスターソース、ホワイトソース、ポテトチップス、チョコレート、ビスケット、コーンスナック、ポップコーン、クラッカー、揚げせんべい、米菓、ショートケーキ、エクレア、シュークリーム、ウエハース、ババロア、ドーナッツ、かりんとう、アイスクリームなどの食品が挙げられる。また、例えば、石鹸、洗剤、ファンデーション、クレンジングオイル、アロマオイル、リップクリーム、マニキュアなどの油脂を主体とする化粧品などが挙げられる。
【００２７】
試料が植物油脂の原料となる植物体を含み、固体の場合、そのまま工程（１）のＮＩＲ分析に供してもよいが、均質化のために粉砕処理を行うことが好ましく、さらに乾燥処理を行って水分を除去することが好ましい。この場合の乾燥処理法は特に限定されず、加熱乾燥法、凍結乾燥法、真空乾燥法などが使用できるが、試料の変性を避けられる方法が好ましい。粉砕処理法は特に限定されないが、例えば試料が固体の場合で試料が大きすぎてそのまま破砕できない場合は、適切な大きさに切断、破断してから粉砕処理を施すのがよく、試料が軟質の場合はまず凍結乾燥処理や真空乾燥処理を行ってから破砕するのがよい。試料が液体の場合で油脂を主成分とするものは、後述の油脂試料と同様に扱う。油脂を主成分としないものは乾燥処理を行って水分を除去し、得られた残渣を固体試料と同様に扱うか、残渣から溶媒抽出し、得られた抽出物を後述の試料の溶媒抽出液と同様に扱う。
【００２８】
試料が植物油脂を含む油脂の場合、異物が除去されており、均質な状態であることが好ましい。試料が液体の場合、そのまま透過法により工程（１）のＮＩＲスペクトル測定に供してもよい。固体の油脂の場合、固体のまま拡散反射法によりＮＩＲスペクトルを測定してもかまわないが、加温による溶解が可能であれば加温して液体状態とし、透過法によりＮＩＲスペクトルを測定することが好ましい。試料が液体の油脂で沈殿（不溶物）がある場合、加温によってその沈殿が溶解する場合には、測定セルを加温し沈殿を溶解させた後、透過法によって測定することが好ましい。沈殿を加温しても溶解しない場合には試料に均質化処理を行い、拡散反射法によってＮＩＲスペクトルを測定するか、溶媒抽出処理や溶解処理を行って得られた溶媒抽出液を試料とすることが好ましい。試料の粘度が高い場合には試料を入れた測定セルを加温して試料粘度を下げることが好ましい。試料が不透明な場合であって加温により透明化できる場合には測定セルを加温して透明化した状態で測定することが好ましい。
【００２９】
試料が植物油脂の加工品の場合、試料が油脂を主成分とする場合は油脂試料と同様に扱う。油脂が主成分でない場合、試料が均質ないし容易に均質化できるものであれば、均質化処理を行った後ＮＩＲスペクトルを測定してもよいが、均質化が困難な試料であれば測定精度を向上させるために後述の溶媒抽出処理や溶解処理を行って得られた溶媒抽出液を試料とすることが好ましい。均質化した試料のＮＩＲスペクトルの測定法については油脂原料を含む試料と同様に扱い、溶媒抽出を行って得られた溶媒抽出液を分析する場合は後述の試料の溶媒抽出液と同様に扱う。
【００３０】
試料が固体、液体に関わらずタンパク質を含む場合は、タンパク質の除去処理を行うことが好ましい。除タンパク処理の方法は特に限定されず、酸や有機溶媒の添加や加熱処理などによる変性沈殿法、限外濾過法、透析法、カラム法、などが挙げられる。試料が固体の場合は試料を破断・粉砕した上で適当な溶媒に懸濁し、除タンパク処理を行うことが好ましい。
【００３１】
試料が固体の場合または油脂を主成分としない液体の場合、試料中のＦＦＡ濃度（脂質濃縮物当たり）は、１．５重量％以上が好ましく、３．０重量％以上がさらに好ましい。試料が油脂を主成分とする液体試料、油脂試料または油脂加工試料の場合、試料中のＦＦＡ濃度（脂質濃縮物当たり）は０．５重量％以上が好ましく、１．０重量％以上がより好ましい。
【００３２】
工程（１）において、試料の溶媒抽出液、または該抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物を好適にＮＩＲスペクトルの測定に供することができる。抽出に用いる溶媒は、ＦＦＡを溶解可能な溶媒であることが好ましい。ＦＦＡを溶解可能な溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、２−メトキシエタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（２−プロパノール）、ブタノール、ｔ−ブタノール、グリセリン、エチレングリコールなどの炭素数３〜１１のアルコール類、ペンタン、ヘキサンなどの炭素数５〜１７のアルカン類、ペンテン、ヘキセンなどの炭素数５〜２０のアルケン類、シクロペンタン、シクロヘキサンなどのシクロアルカン類、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、酢酸エチル、ジオキサン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ベンゼン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、石油エーテル、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、四塩化炭素、ｔ−ブチルアセトアセタートなどが挙げられる。これらの溶媒は単独で用いてもよいし、均質に混合できるならば任意の割合で混合したものを用いてもよい。抽出法は特に限定されず、公知の脂質抽出法を用いることができる。例えば、ソックスレー抽出法、クロロホルム−メタノール抽出法、酸分解法などが挙げられ、中でもソックスレー抽出法が抽出効率の点で好ましい。溶媒抽出液を用いる場合、溶媒が後述するＮＩＲ測定に好ましい溶媒であれば、そのままＮＩＲスペクトルを測定すればよい。溶媒がＮＩＲ測定に好ましい溶媒でない場合、いったん溶媒を除去して得られた脂質濃縮物をＮＩＲ測定に好ましい溶媒に再溶解するか、脂質濃縮物を直接分析することが好ましい。ＮＩＲ測定に好ましい溶媒は、特に限定されないが、クロロホルム、アセトニトリル、ｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシドなどが挙げられ、この内、クロロホルム、アセトニトリルがより好ましい。試料が溶媒抽出液または脂質濃縮物をＮＩＲ測定に好ましい溶媒に再溶解した溶液の場合はそのまま透過法にてＮＩＲ分析に供することが可能で、脂質濃縮物の場合は油脂の場合と同様に扱う。試料が溶媒抽出液の場合、そのＦＦＡ濃度（溶媒抽出液当たり）は０．０３％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、０．０６％（ｗ／ｖ）以上がより好ましい。
【００３３】
本発明により得られる回帰式は、臨床試験などを目的とした生体由来の試料中のＦＦＡの定量にも利用することができる。生体由来の試料は特に限定されないが、例えば、動物の生体構成成分が好適である。動物由来の試料としては、例えばヒト、実験動物、家畜、養殖魚などの血液、血清、血漿、組織液、リンパ液、脳脊髄液、母乳、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水、精液などの体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨などの組織、毛髪、体毛などを挙げることができる。
【００３４】
試料が生体由来の試料であって、非破壊分析を目的とする場合は、試料をそのまま工程（１）のＮＩＲスペクトル測定に供してもよいが、測定精度を向上させるために試料の調製を行うことが好ましい。試料が固体の場合、異物を取り除くことが好ましく、試料が液体の場合、異物や沈殿を除き攪拌処理を行って均質化することが好ましい。
非破壊分析を目的としない場合は、粉砕や攪拌による均一化や除タンパク処理を行うことが好ましい。しかし試料中に含まれるＦＦＡは非常に低濃度であることが予測されるため、直接分析では十分な測定感度が得られない可能性もある。よって、安定した回収率が得られることが条件であるが、試料を直接分析するよりも溶媒を用いて抽出した脂質濃縮物を測定試料として調製するのがより好ましい。抽出法については特に限定されないが、抽出効率の向上のため、除タンパク処理を先に行うことが好ましい。除タンパク処理の方法は特に限定されず、酸や有機溶媒の添加による沈殿法、限外濾過法、透析法、カラム法などが挙げられる。試料を直接分析する場合、測定試料中のＦＦＡ濃度（脂質濃縮物当たり）は、１．５重量％以上が好ましく、３．０重量％以上がさらに好ましい。
【００３５】
工程（１）に供する試料として、ＦＦＡ含量の異なる複数の試料を用いることが好ましい。例えば米糠を試料とする場合、精米直後の新鮮な米糠及び当該米糠をある程度大量に保存し、劣化の進行に応じて経時的に測定に必要な量をサンプリングして測定することや、測定に適した量を最初からサンプリングして保存し、その同じ試料を経時的に測定することができる。また、例えば米油を試料とする場合、ＦＦＡ含量の低い米油とＦＦＡ含量の高い米油を混合することによりＦＦＡ含量の異なる複数の米油を調製して用いることができる。工程（１）に供する複数の試料は、試料に含まれるＦＦＡの最小値と最大値の範囲内に、得られる回帰式を用いて定量する被験試料中のＦＦＡ含量が含まれるように調製することが好ましい。工程（１）に供する試料数は多いほどよく、十分な予測精度を得るためには３０試料以上が好ましく、５０試料以上であることがより好ましい。
【００３６】
工程（２）では、工程（１）に供した試料中のＦＦＡを特異的に定量する。工程（２）においてＦＦＡを特異的に定量する方法は、特に限定されないが、例えば、酵素法、ＬＣ／ＭＳ法、非水系ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムを用いたＨＰＬＣ分析法（以下「ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法」という。）などが挙げられる、このうちＨＰＬＣ−ＧＰＣ法が好ましい。なお、アルカリ滴定法は試料中のＦＦＡを特異的に定量することができないので、ＦＦＡを特異的に定量する方法に含まれない。
【００３７】
ＦＦＡを特異的に定量する方法がＨＰＬＣ−ＧＰＣ法である場合、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に用いる分離カラムとしては、特に限定されないが、移動相としてトルエンなどの低極性溶媒の使用が可能なものが好ましい。カラムの形状は必要な分離が得られるものであれば特に限定されない。カラム充填剤の材質は特に限定されないが、ポリマーベースのものが好ましく、ポリスチレンベースのものがより好ましく、スチレンジビニル共重合体をベースとするものがさらに好ましい。また、ＧＰＣカラムの排除限界分子量は３００以上である必要があり、１０００以上が好ましく、１０００〜５０００がより好ましい。浸透限界分子量は２００以下である必要があり、１００以下が好ましく、５０以下がより好ましい。カラム温度はカラムの性能上問題ない範囲であれば特に限定されない。本発明に適するＧＰＣカラムとして具体例を挙げれば、Ｐｈｅｎｏｇｅｌシリーズ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、ＧＰＣ ＵＴ−８００、ＧＰＣ  ＨＴ−８００、ＧＰＣ  ＡＴ−８００シリーズ（昭和電工）、ＨＳＰｇｅｌシリーズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＴＳＫｇｅｌシリーズ（東ソー）、ＰＬｇｅｌシリーズ（ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＳＤＶシリーズ（ＰＳＳ）などが挙げられるが、中でもＰｈｅｎｏｇｅｌシリーズ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が好ましい。なお一本のＧＰＣカラムで必要な分離を得ることが好ましいが、必要に応じて同種または異種のＧＰＣカラムを複数本接続して用いてもかまわない。また、ＧＰＣカラムとそれ以外のＨＰＬＣ用カラムを接続して用いてもかまわない。ＧＰＣカラム以外のＨＰＬＣ用カラムとしては順相カラム、逆相カラム、アミノカラム、フェニルカラム、銀カラムなどが挙げられる。
【００３８】
移動相の流速はカラムの性能上問題ない範囲であれば特に限定されない。検出器はＦＦＡを検出できるものであれば特に限定されないが、ＦＦＡと同時にＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ステロールエステル（ＳＥ）、ＳＴ、ＯＺなどの成分を検出できるものが好ましい。具体的には、蛍光（ＦＬ）検出器、紫外可視分光（ＵＶ-Ｖｉｓ）検出器、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）検出器、質量（ＭＳ）検出器、電気化学（ＥＣ）検出器、示差屈折率（ＲＩ）検出器、電気電導度（ＣＤ）検出器、コロナＣＡＤ検出器などが挙げられる。中でも、ＲＩ検出器、ＭＳ検出器、ＥＬＳＤ検出器、ＵＶ-Ｖｉｓ検出器、ＰＤＡ検出器、コロナＣＡＤ検出器を用いることが好ましく、ＲＩ検出器、ＥＬＳＤ検出器、コロナＣＡＤ検出器がより好ましい。なお必要に応じてこれらの異なる検出器を複数接続して用いてもかまわない。
【００３９】
ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に用いる移動相は、ＦＦＡを溶解でき、かつＧＰＣに適した溶媒が好ましく、さらにＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺなどの成分を溶解できる溶媒がより好ましい。移動相はＧＰＣカラムで用いることができる溶媒が好ましく、具体的にはＴＨＦ、クロロホルム、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）、ジクロロメタン（塩化メチレン）、トルエン及びこれらの混合溶媒などが挙げられる。この内、低極性溶媒を主成分とすることが好ましく、少量の酸を添加することが好ましい。低極性溶媒としては、トルエン、ベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素のほか、ペンタン、ヘキサンなどの炭素数５〜１７のアルカン類、シクロペンタン、シクロヘキサンなどのシクロアルカン類、ペンテン、ヘキセンなどの炭素数５〜２０のアルケン類、石油エーテルなどを単独または混合（均質に混合できる場合）して用いることができるが、トルエンを用いることが好ましい。添加する酸としては、例えば、酢酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、ホウ酸、ギ酸、ＴＦＡなどを好ましく用いることができ、中でも酢酸が好ましい。例としてＰｈｅｎｏｇｅｌを分離カラムとして用いる場合にはトルエンと酸の混液が好ましい。酢酸とトルエンとの混液を移動相に用いる場合、酢酸を０．００３〜０．０３％（ｖ／ｖ）含むことが好ましく、０．００５〜０．０３％（ｖ／ｖ）含むことがより好ましく、０．０１〜０．０３％（ｖ／ｖ）含むことがさらに好ましい。
【００４０】
均質に混合できるならば、移動相にＴＨＦ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＨＦＩＰ、ジエチルエーテル、トリクロロベンゼン、ピリジン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、ジクロロメタン、キノリン、ｍ−クレゾール、炭素数３〜１１のアルコール類、エーテル類、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジクロロメタン、四塩化炭素、ｔ−ブチルアセトアセタートなどの極性溶媒を必要に応じて加えてもよい。この中でも好ましいものはＴＨＦ、ＤＭＦ、ＨＦＩＰ、ジクロロメタンである。
【００４１】
工程（２）において、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法により試料中のＦＦＡを定量する場合は、公知の脂質抽出法（例えば、ジエチルエーテル抽出法など）により試料から脂質濃縮物を抽出し、これを試料溶媒に溶解してＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に供することが好ましい。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法により試料中のＦＦＡを定量する場合は、試料を直接試料溶媒に溶解してＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に供してもよく、試料と同様に、公知の脂質抽出法により脂質濃縮物を抽出し、これを試料溶媒に溶解してＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に供してもよい。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に供する試料濃度は脂質成分が完全に溶解していれば特に限定されず、試料液中のＦＦＡ濃度は検出器で定量的に測定できる範囲であれば特に限定されない。
【００４２】
試料から抽出した脂質濃縮物はそのまま試料溶媒に溶解し、ＨＰＬＣ法に供して構わないが、必要に応じてＦＦＡ以外の成分を低減するための前処理を行ってもよい。前処理の手法としては遠心分離による沈殿・不溶物の除去、脱水処理、脱ガム処理、ウインタリングによるロウ分の除去処理、複数の溶媒を用いた液液抽出処理、固相抽出処理などが挙げられる。
固相抽出処理にはあらかじめ固定相が充てんされたカラムを用いるカラム法と試料に固定相を添加するバッチ法の２通りがあるが、これらのいずれであっても構わない。カラム法で用いる好適なカラムとしては順相カラム、逆相カラム、アミノカラム、フェニルカラム、イオン交換カラム等が挙げられ、これらは単独で用いても、組み合わせて用いても構わない。固相抽出処理に適するカラムとしてはＳｅｐ-ｐａｋシリーズ、Ｏａｓｉｓシリーズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｉｎｅｒｔｓｅｐシリーズ（ジーエルサイエンス）、ＢｏｎｄＥｌｕｔｅシリーズ（アジレントテクノロジー）、Ｐｒｅｓｅｐシリーズ（和光純薬）などが挙げられる。一方バッチ法ではカラム法で用いられるカラムに充てんされている固定相と同様のものが使用できる。バッチ法での固定相は単独で用いてもよいが、複数の固定相を組み合わせてもよく、脱水剤を組み合わせて用いてもよい。固定相や脱水剤を組み合わせた処理法の一例としてはＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法などが挙げられる。
これらの前処理を行う際には試料の酸化を避けるために抗酸化剤を添加してもよい。添加する酸化防止剤としては、例えばピロガロール（ピロガロール酸）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔ−ブチルハイドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキンなどが挙げられる。
【００４３】
試料溶媒は、ＦＦＡを溶解できる溶媒であればよく、さらにＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺなどの成分を溶解できる溶媒が好ましい。工程（２）において用いる試料溶媒としては、トルエン、ベンゼンのほか、ペンタン、ヘキサンなどの炭素数５〜１７のアルカン類、ペンテン、ヘキセンなどの炭素数５〜２０のアルケン類、石油エーテルなどの低極性溶媒を単独あるいは混合して用いるか、これにＴＨＦ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＨＦＩＰ、ｔ−ブチルアセトアセタートなどの極性溶媒を必要に合わせて添加・混合した液が好ましい。なお、検出器としてＲＩ検出器を用いる場合は試料溶媒の主成分は移動相に用いたものと同じものを用いることが好ましい。
一例として、Ｐｈｅｎｏｇｅｌ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた場合にはトルエンとアルコールの混液が好ましい。アルコールは特に限定されないが、炭素数４以下の低級アルコールが好ましく、具体的にはエタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどが挙げられ、中でも２−プロパノールが好ましい。試料溶媒としてトルエンとアルコールの混液を用いる場合、アルコール濃度は２０〜１００％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、４０〜１００％（ｖ／ｖ）であることがより好ましく、４０〜８０％（ｖ／ｖ）であることがさらに好ましい。
【００４４】
ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法は、例えばアルカリ滴定法などの従来の化学分析法と比較して、高精度にＦＦＡを定量することができる点で優れている。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法は、分析試料を溶媒に溶解する以外の前処理を必要とせず、種々の分子種を含むＦＦＡのピークを１本のピークとして分離できるため、脂肪酸を分子種毎に定量し、その定量値を合算する従来の分析法に比べて定量が非常に容易であり、測定値の再現性も高い。
上記ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法では分子量の近いＭＡＧとＦＦＡの分離を実現し、ＦＦＡの分析だけでなく、同時にＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺなどの成分の量的なパターンを明らかにすることが可能である。工程（２）での分析条件はこれらの成分のピークが分離・検出できる条件で設定することが好ましい。
【００４５】
工程（２）のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法は単独でＦＦＡの分析法として用いることが可能である。この場合の分析試料は特に限定されないが、油脂原料及び／または油脂を含むことが好ましい。この場合の油脂原料は植物体であることが好ましく、米糠であることがより好ましい。その他の条件については上記ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法と同様である。
【００４６】
工程（３）ではＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、ＦＦＡの定量値を多変量解析法により解析し、ＦＦＡと関係する因子を決定する。ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の一部とはＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲に含まれる任意の部分領域である。ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の一部は特に限定されないが、８００〜２５００ｎｍまたはその一部であることが好ましく、１０６３〜２３５５ｎｍまたはその一部であることがより好ましい。また、ＦＦＡに関連する群（１４３５±１０、１６６２±１０、１７６３±１０、２１６２±１０および２２４５±１０ｎｍ）の好ましくは１つ以上、より好ましくは２つ以上の領域を含むことがさらに好ましい。また、この１つの波長領域は最大波長と最小波長の差が２０ｎｍ以上の連続した領域であることが好ましく、１００ｎｍ以上の連続した領域である事がより好ましく、１５０ｎｍ以上であればさらに好ましい。この波長領域は１つのみを設定してもよく、複数設定してもよい。
【００４７】
工程（３）で用いられる多変量解析法には、ＰＬＳ（ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）回帰分析法、多重線形回帰分析（ＭＬＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）法、主成分回帰分析（ＰＣＲ、ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｒｅｇｒｅｅｓｉｏｎ）法、ＣＬＳ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）回帰分析法などがあるが、この内ＰＬＳ回帰分析法を用いるのが好ましい。ＰＬＳ回帰分析は市販のソフトウェアを使用して行うことができる。使用するソフトウェアは、例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ（株式会社カモソフトウェアジャパン）、ＯＰＵＳ（ブルカー・オプティクス社）、ＮＩＲＣａｌ（日本ビュッヒ社）、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ（ジーエルサイエンス社）などが例示できる。これらのソフトウェアを利用して、ＮＩＲ拡散反射光スペクトルを解析し、その結果を本発明で用いる。使用するスペクトルデータまたはフーリエ変換スペクトルデータは、原スペクトルデータでもよいが、原スペクトルデータを加工したものを使用することが好ましい。データ加工の方法としては、例えば、一次微分、二次微分、三次微分などの多次微分（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、平滑化（Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）、スペクトルの減算（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）、ＭＳＣ補正（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、ＳＮＶ補正（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｖａｒｉａｔｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）などが挙げられる。これらの加工方法は単独で用いても組み合わせて用いてもよい。中でも好ましい加工方法としてはＳＮＶ単独、二次微分単独、一次微分とＳＮＶ補正の組み合わせ、一次微分とＭＳＣ補正の組み合わせなどがある。
【００４８】
解析に用いる波長領域のスペクトルデータと定量したＦＦＡ含量（ＦＦＡの実測値）とを多変量解析法に供することにより、ＦＦＡ含量と関係する因子を決定して回帰式を得ることができる。ＦＦＡ含量と関係する因子とは、スペクトルデータの中に内在するＦＦＡ含量の変化と相関の高い仮想的な変量を指す。この因子の回帰係数を用いてスペクトルデータからＦＦＡ含量を予測する回帰式を作成する。近赤外分光法では、通常回帰式作成後、回帰式を得るための試料以外の試料（評価用試料）を用いて、作成された回帰式の測定精度を評価する。回帰式の測定精度は評価用試料の実測値と作成した回帰式によって算出された予測値による分析値との残差（測定誤差）の標準偏差や平均値によって評価する。この予測値（定量値）と実測値の散布図が図６、７である。検量線回帰式はこの実測値と予測値（定量値）の相関が最大となるように導出された回帰式である。
【００４９】
なお本発明においては、被験試料に水分が多く含まれる場合が想定され、その場合には乾物量あたりで定量することが考えられる。そうしたケースでは測定試料に水分除去処理を行ってからＮＩＲスペクトルデータを取得し定量するか、何らかの方法で水分含量を定量し、予測値（定量値）を補正する必要がある。水分含量の定量法としては試料の一部を採取して乾燥減量法、カールフィッシャー法にて計測する方法が挙げられる。また、非破壊分析を目的とする場合には、ＮＩＲスペクトルデータを用いて水分含量を予測する方法を好適に用いることができる。
【００５０】
〔ＮＩＲ分光法を利用したＦＦＡの定量方法〕
本発明は、上記本発明の回帰式を得る方法により得られた検量線回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料のＮＩＲスペクトルデータとを用いるＦＦＡの定量方法（以下「本発明のＦＦＡ定量法」という。）を提供する。具体的には、まず、被験試料のＮＩＲスペクトルを測定する。被験試料の形態は、ＦＦＡの定量に用いる検量線回帰式を得るためにＮＩＲスペクトル測定に供した試料と同じ形態であることが好ましい。換言すれば、本発明のＦＦＡ定量法においては、被験試料の形態と同じ形態の試料のＮＩＲスペクトル測定値に基づいて得られた検量線回帰式を用いることが好ましい。ＮＩＲスペクトルを測定する波長範囲は、検量線回帰式の作成に使用した波長領域を含むものであればよく、８００〜２５００ｎｍであることが好ましい。
【００５１】
被験試料のＮＩＲスペクトルデータは、上記本発明の検量線回帰式を得る方法においてＮＩＲスペクトルデータを取得する場合と同様にして取得することができる。すなわち、市販の近赤外分光分析計を用いてＮＩＲスペクトルを測定しスペクトルデータ、好ましくはフーリエ変換スペクトルデータを取得する。スペクトルデータまたはフーリエ変換スペクトルデータは、原スペクトルデータでもよいが、原スペクトルデータを加工したものを使用することが好ましい。データ加工の方法としては、例えば、一次微分、二次微分、三次微分などの多次微分（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、平滑化（Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）、スペクトルの減算（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）、ＭＳＣ補正（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、ＳＮＶ補正（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｎｏｒｍａｌ  Ｖａｒｉａｔｅ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）などが挙げられる。これらの加工方法は単独で用いても組み合わせて用いてもよい。中でも好ましい加工方法としてはＳＮＶ単独、二次微分単独、一次微分とＳＮＶ補正の組み合わせ、一次微分とＭＳＣ補正の組み合わせなどがある。
【００５２】
被験試料のＮＩＲスペクトルデータ（好ましくは前項の加工を施されたもの）を解析して、先に得られた検量線回帰式を適用することにより、ＦＦＡ含量の予測値を算出する。ここでのスペクトルデータの解析と予測値（定量値）の算出は市販のソフトウェアを使用して行うことができる。使用するソフトウェアは例えばＴｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ（株式会社カモソフトウェアジャパン）、ＯＰＵＳ（ブルカー・オプティクス社）、ＮＩＲＣａｌ（日本ビュッヒ社）、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ（ジーエルサイエンス社）などが例示できる。
【００５３】
〔ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いる植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の各種成分含量の分析方法〕
本発明者らは、本発明の検量線回帰式を得る方法および本発明のＮＩＲ定量方法を完成させる過程において、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の各種成分（ＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴなど、米糠及び米油の場合はＯＺも含む）含量をＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いて同時に分析する方法を完成させた。すなわち、本発明は、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料のＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺからなる群より選択される少なくとも２以上の成分を同時に分析する分析方法であって、ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法を用いることを特徴とする分析方法（以下「本発明の一斉分析法」という。）を提供する。
【００５４】
本発明の一斉分析法を用いれば、植物油脂及び／またはその原料となる植物体の成分であるＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺを、それぞれ別々のピークとして検出することができるので、従来の分析方法では困難であった、これらの成分のうちの２以上の成分を同時に分析することが可能となる。
本発明の一斉分析法は、上記本発明の回帰式を得る方法の工程（２）において説明したＨＰＬＣ−ＧＰＣ法により、実施することができる。本発明の一斉分析法においても上記本発明の回帰式を得る方法の工程（２）と同様に、試料を直接試料溶媒に溶解するか、または公知の脂質抽出法により脂質濃縮物を抽出し、試料溶媒に溶解してＨＰＬＣ−ＧＰＣ法に供してもよい。測定しようとする成分の濃度は検出器で定量的に測定できる範囲であれば特に限定されない。
【００５５】
本発明の一斉分析法において分析対象となる成分が限定されている場合には、必要に応じて分析対象外の成分を低減するための前処理を行ってもよい。前処理法としては遠心分離による沈殿・不溶物の除去、脱水処理、脱ガム処理、ウインタリングによるロウ分の除去処理、複数の溶媒を用いた液液抽出処理、ケン化処理、アルカリ処理、蒸留処理、脱色処理、固相抽出処理などが挙げられる。
固相抽出処理および抗酸化剤の使用については本発明の回帰式を得る方法の工程（２）においてＦＦＡの分析のためにＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いる場合と同様である。
【００５６】
本発明の一斉分析法で用いる標品は特に限定されないが、測定しようとする成分の内、試料中に主成分として含まれる分子種を一つ以上含むものが好ましい。標品は市販の単一組成の標品でもよいし、複数の分子種の標品を混合して用いてもかまわない。また、試料から定量目的の成分だけを精製したものを標品として用いてもよい。
例えば米油を試料としてＦＦＡを分析する場合、標品として、米油中に含まれるＦＦＡの主成分であるオレイン酸、リノール酸、パルミチン酸を単独で用いてもよく、混合して用いてもよく、または米油から別途精製したＦＦＡ（分子種混合物）を標品として用いてもよい。同様に米油のＴＡＧを定量する場合には、トリオレインなどの単一組成の標品を単独で用いてもよく、混合して用いてもよく、または精製米油をＴＡＧの標品として用いてもよい。
【００５７】
〔植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度の評価方法〕
本発明は、上記本発明のＦＦＡ定量法を用いた植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度の評価方法を提供する。評価の基準は特に限定されないが、例えば米糠の場合、精米直後の米糠中のＦＦＡ濃度と比較して、保存後の米糠中のＦＦＡ濃度の増加の程度により劣化度を評価することができる。例えば米油の場合、精製直後の米油中のＦＦＡ濃度と比較して、保存後の米油中のＦＦＡ濃度の増加の程度により劣化度を評価することができる。本発明は、米糠中のＦＦＡを迅速かつ簡便かつ非破壊的に定量することができるため、その米糠の劣化度を迅速に評価することができる点で非常に優れている。
【００５８】
〔米糠の安定性の評価方法〕
米糠を保存し、その劣化度を先述の評価方法を用いて評価し、その経時的な変化を記録することで、劣化速度を求めることができる。この劣化速度は米糠の安定性の指標であり、より米糠の劣化速度の低い品種を選定することで、酸化に強く、精製米油への加工性に優れた稲品種を選抜することができる。
なお、ＦＦＡの増加速度はＴＡＧの濃度に影響されるため、米糠の劣化度が低く、ＴＡＧ濃度が十分に高いうちは一定の速度（初速度）で進行するが、劣化が進みＴＡＧの濃度が減少するに従ってＦＦＡの増加速度は徐々に低下する。米糠の劣化速度は米糠の劣化度が低い段階のＦＦＡの初期増加速度で評価することが好ましく、保存試験開始時の米糠は劣化の進んでいないものであることが好ましい。保存試験開始時のＦＦＡ濃度（脂質濃縮物当たり）は１０重量％以下が好ましく、５重量％以下が好ましい。米糠の劣化速度には水分含量、酸素濃度も影響することから、水分含量、酸素濃度が同程度になるように試料調製することが好ましい。
米糠の保存条件は特に限定されないが、暗所で保存することが好ましく、インキュベーターなどを使用し、湿度と温度が一定な環境で保存することが好ましい。
【００５９】
〔植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の脂質成分の量的なパターンの測定〕
本発明は、上記本発明の一斉分析法を用いた植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の組成分析法を提供する。本発明を用いれば、１回のＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析により、植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の各種成分（ＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＥ、ＳＴ、ＯＺなど）の量的なパターンが簡単に取得可能となる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６１】
〔実施例１：ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の移動相中の酢酸濃度の検討〕
まず、米原油に含まれる主要な脂質成分であるＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＳＴ、ＳＥ、ＯＺについて分析するＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の移動相中の酢酸濃度の条件を検討した。以下の標品を試料とし、後述のＨＰＬＣ-ＧＰＣ法にて分析した。
＜標品の一覧＞
ＦＦＡとしてオレイン酸、ＴＡＧとしてトリオレイン、ＤＡＧとしてジオレイン酸グリセリル、ＭＡＧとしてモノオレイン酸グリセリル、ＳＴとしてβ-シトステロール、ＳＥとしてオレイン酸β-シトステリル、ＯＺとしてγ-オリザノール分子種混合物を標品として用いた。
＜ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法＞
（１）試料を試料溶媒（トルエン）に加えて２５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。
（２）ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の検出器には示差屈折率検出器（ＲＩ検出器）を、カラムには、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製「Ｐｈｅｎｏｇｅｌ」（７．８×３００ｍｍ、粒子径５μｍ）を用いた。カラム温度６０℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、酢酸濃度が０．２５％（ｖ／ｖ）のトルエンを移動相として（１）の標品を個別に分析した。
（３）移動相の酢酸濃度を０．００３、０．０１、０．０３％（ｖ／ｖ）に代えて同様の分析を行った。
得られたＲＩクロマトグラム（各標品のクロマトグラムを重ねて表示）を図１（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）は酢酸濃度が０．２５％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｂ）は酢酸濃度が０．０３％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｃ）は酢酸濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｄ）は酢酸濃度が０．００３％（ｖ／ｖ）の場合の結果である。なお、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡは本条件では負のピークとして現れるが、便宜上クロマトグラムを正負反転して示した。
図１（ａ）〜（ｄ）に示すように、酢酸濃度０．２５％（ｖ／ｖ）ではＦＦＡとＳＴのピークが分離できないが、酢酸濃度０．０３％（ｖ／ｖ）以下でＦＦＡとＳＴの良好な分離が得られることが判明した。ただし酢酸濃度が０．００３％（ｖ／ｖ）未満になるとＦＦＡの溶出が非常に遅くなって試料溶媒のピークと重なってしまうため、酢酸の適正濃度は０．００３〜０．０３％（ｖ／ｖ）であった。なお検出器として蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）検出器など、溶媒のピークが検出されない検出器を用いた場合には、酢酸濃度が０．００３％（ｖ／ｖ）以下であってもピークはブロードになるが分析可能であった。
【００６２】
〔実施例２：ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の試料溶媒に用いる溶媒の検討〕
実施例１において試料を米原油とし、試料溶媒を２−プロパノールが各濃度（０、２０、５０、８０、１００％（ｖ／ｖ））のトルエン及び２−プロパノールの混液とし、移動相の酢酸濃度を０．０１％（ｖ／ｖ）とし、その他の条件は実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を行った。得られたＲＩクロマトグラムから米原油中のＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＳＴ、ＳＥ、ＯＺのピークを同定するために、実施例１で用いた標品を同条件で分析した。
各濃度の２−プロパノールの米原油のＲＩクロマトグラムを図２（ａ）〜（ｅ）に示す。（ａ）は２−プロパノール濃度が０％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｂ）は２−プロパノール濃度が２０％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｃ）は２−プロパノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｄ）は２−プロパノール濃度が８０％（ｖ／ｖ）の場合の結果、（ｅ）は濃度が２−プロパノール１００％（ｖ／ｖ）の場合の結果である。なお、主たる分析対象であるＦＦＡのピークを正にするため、便宜上、ＲＩクロマトグラムを正負反転して示す。
図２（ａ）〜（ｅ）に示すように、２−プロパノール濃度が０％（ｖ／ｖ）の場合はＦＦＡのピークは未同定のピークと分離できず正確な定量ができないが、２０〜１００％（ｖ／ｖ）ではＦＦＡと未同定のピークは分離し、単一のピークとして得られた。なお、ＭＡＧとＳＥは米原油にほとんど含まれていないため、ピークとして検出されなかった。
一例として２−プロパノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）の場合のＲＩクロマトグラムにおける各成分（ＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＳＴ、ＯＺ）のピークの分離状態を図３に示す。  図３から明らかなように、米原油に含まれる５つの各成分のピークについて良好な分離が得られた。
【００６３】
〔実施例３：ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法による米原油の組成分析〕
図３のデータから米原油中のＦＦＡ、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＳＴ、ＯＺの含量を算出した。各成分の定量値（重量％）について表１に示す。以下、図３のデータが得られたＨＰＬＣ−ＧＰＣ条件、すなわち実施例１のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法において試料溶媒として２−プロパノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）のトルエン／２−プロパノール混液を用い、移動相の酢酸濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）である条件を「実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法」という。
【００６４】
【表１】
2015135323.tif 000003
【００６５】
表１から明らかなように、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の条件を最適化することで米原油のＴＡＧおよびその分解物（ＤＡＧ、ＦＦＡ）と代表的な機能性成分の含量を一度の分析で定量することが可能となった。
【００６６】
〔実施例４：遊離脂肪酸の測定法による化学分析値の比較〕
後述のＬＣ／ＭＳ法にてＦＦＡ濃度を精密分析した種々の米原油について、実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法、公知のアルカリ滴定法によりＦＦＡを定量し、それぞれの測定値と精密分析値との相関を求めた。
＜ＬＣ/ＭＳ法によるＦＦＡ精密測定＞
（１）米原油を２−プロパノールに溶解して分析試料とした。
（２）下記の条件でＬＣ／ＭＳ法にて分析を行った。分離カラムとしてＯＤＳカラムを、移動相としてメタノール／酢酸＝９９／１（ｖ／ｖ）を用いた。カラム温度は４０℃、流速は０．４５ｍＬ／ｍｉｎとした。ＬＣ/ＭＳ検出器を用いて、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ステアリン酸の４種について分子種毎にモニターイオンを設定して分析し、モニターイオンのクロマトグラムを得た。
（３）（２）と同様の条件でそれぞれの標品を分析し、モニターイオンによる定量を行った。
（４）４種の脂肪酸の定量値の合計値を脂肪酸含量の精密分析値として算出した。
【００６７】
結果を図４（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）はＨＰＬＣ−ＧＰＣ法による分析値と精密分析値との相関であり、（ｂ）はアルカリ滴定法による分析値と精密分析値との相関である。図４（ａ）および（ｂ）からわかるように、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の方がアルカリ滴定法よりも精密分析値と高い相関を示しており、ＦＦＡの簡易測定法としての精度が優れていることが明らかとなった。
【００６８】
〔実施例５：ＯＺ濃度の化学分析値への影響の検討〕
脱酸米原油（米原油に常法に従って蒸留脱酸処理とアルカリ脱酸処理を行い、ＦＦＡ濃度０．１重量％以下としたもの）と、ＦＦＡを含まずＯＺ含量が約３０重量％の米油（「胚芽油ガンマ３０」（商品名）、築野食品工業株式会社製）とをＯＺの終濃度１０〜２０重量％となるように混合し、ＯＺを高濃度で含みＦＦＡを少量含むモデル試料を調製した。このモデル試料について実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法およびアルカリ滴定法にてＦＦＡ含量を測定した。
ＯＺ添加量とＦＦＡ含量の定量値の関係を図５に示す。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法では試料中のＯＺ濃度が増加してもＦＦＡの定量値に変化はなかったが、アルカリ滴定法では試料中のＯＺ濃度の増加に応じて滴定量が増加し、ＦＦＡの定量値が増大した。この結果から、米油に特徴的な成分であるＯＺを含む油脂試料のＦＦＡ含量を測定する場合、ＦＦＡを誤検出する恐れのあるアルカリ滴定法よりも、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法の方が適していることが明らかとなった。
【００６９】
〔実施例６：米糠のＦＦＡ含量検量線回帰式の作成〕
（１）検量線回帰式を取得するための試料として、玄米を精米して得た米糠を３０℃で保存し、経時的にサンプリングすることで劣化度の異なる米糠を得た。
（２）ＮＩＲスペクトル分析装置としてＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて、（１）の米糠のＮＩＲ拡散反射光を８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。
（３）スペクトルを取得した米糠についてジエチルエーテルを用いたソックスレー抽出法で脂質濃縮物を抽出し、実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いてＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり、または、米糠当たり）を定量した。
（４）（２）で得られた原スペクトルの前処理（ＳＮＶ補正）を行い、前処理スペクトル（１３３３〜１６４０、２１７３〜２３５５ｎｍ）の波長データを説明変数とし、測定したＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり、または、米糠当たり）を目的変数とするＰＬＳ回帰分析により、米糠のＦＦＡ検量モデルを作成した。ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を図６（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は脂質濃縮物当たりのＦＦＡ含量についての結果、（ｂ）は米糠当たりのＦＦＡ含量についての結果である。ここでのＮＩＲ予測値（重量％、定量値）はＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり、または、米糠当たり）の検量線回帰式とＮＩＲスペクトルのデータから測定装置によって導出される計算値である。定量値と実測値は高い相関（それぞれＲ２＝０．９５５およびＲ２＝０．９６２）を示し、本検量線回帰式が高い予測精度を持つことが明らかとなった。また、ＰＬＳ回帰分析結果から、ＦＦＡ含量に関連する重要な波長データとして１４３５ｎｍ±１０ｎｍ、１６６２±１０ｎｍ、１７６３±１０ｎｍ、２１６２±１０ｎｍ、２２４５±１０ｎｍの５つの領域がリストアップされた。
【００７０】
〔実施例７：米糠の脂質濃縮物のＦＦＡ含量検量線回帰式の作成〕
（１）実施例６の（３）で得た米糠の脂質濃縮物を測定試料とした。
（２）試料のＮＩＲ透過光を、ＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて８００ｎｍ〜２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。なお、油脂試料を均質化させるため、測定セルを７５℃に加熱して温度の安定を確認してからＮＩＲスペクトルを取得した。
（３）スペクトルを取得した脂質濃縮物について実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いてＦＦＡ含量を定量した。
（４）（２）で得られた原スペクトルの前処理（ＳＮＶ補正）を行い、前処理スペクトル（１６３９〜２１７５ｎｍ）の波長データを説明変数とし、ＦＦＡ含量を目的変数とするＰＬＳ回帰分析により、脂質濃縮物のＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）の検量モデルを作成した。ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を図７に示した。ここでのＮＩＲ予測値（重量％、定量値）はＦＦＡ含量の検量線回帰式とＮＩＲスペクトルのデータから測定装置によって導出される計算値である。定量値と実測値は非常に高い相関（Ｒ２＝０．９９）を示し、本検量線回帰式が高い予測精度を持つことが明らかとなった。
【００７１】
〔実施例８：至適波長範囲の検討〕
実施例６の米糠試料について、前処理スペクトルの波長データの波長範囲を様々に変えてＦＦＡ検量モデルを作成した。得られた検量モデルの全条件の決定係数Ｒ２を表２に示した。波長は用いた波長範囲を示しており、最小波長と最大波長で区切られた１区間（条件Ｎｏ．４、６〜８、１０、１６〜２１）ないし２区間（条件Ｎｏ．１〜３、５、９、１１〜１５）のデータを用いて解析を行った。表２からわかるように条件Ｎｏ．１〜１６でＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）には高い相関関係（Ｒ２＞０．９０）が見られた。これらの相関の高い条件には実施例６で示されたＦＦＡに関連する波長領域である１４３５ｎｍ±１０ｎｍ、１６６２±１０ｎｍ、１７６３±１０ｎｍ、２１６２±１０ｎｍ、２２４５±１０ｎｍの領域を２つ以上含むという共通点があった。
【００７２】
【表２】
2015135323.tif 000004
【００７３】
〔実施例９：米原油の溶媒抽出液のＦＦＡ含量の化学分析値とＮＩＲ予測値の相関〕
ＦＦＡ含量の異なる米原油を種々の溶媒（クロロホルム、アセトニトリル、ｔ−ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド）にて抽出し、１％（ｗ／ｖ）溶液としてＮＩＲ透過光スペクトルを測定し、実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法によるＦＦＡ含量（抽出液当たり）の化学分析値とＮＩＲによる予測値の相関を調べた。表３に溶媒と相関係数Ｒ２の関係を示した。使用した溶媒の種類によって相関係数に大きな差が見られ、クロロホルム、アセトニトリルで高い相関が得られることから、米原油を希釈して測定する場合には溶媒としてクロロホルム、アセトニトリルが適することが確認された。
【００７４】
【表３】
2015135323.tif 000005
【００７５】
〔実施例１０：米糠の劣化評価試験〕
精米直後でＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）が５重量％程度の米糠を３０℃のインキュベーターで保存した。経時的に米糠をサンプリングし、実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いてＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）を測定した。米糠中のＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）の経時的変化を図８に示す。ＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）５〜１０重量％程度では保管時間に対して直線的に増加するが、その後は緩やかなカーブを描いて増加した。なお、劣化速度を直線性のある０〜９６時間までのＦＦＡ含量の増加度で評価すると脂質濃縮物当たりで０．０５６重量％／ｈとなった。
【００７６】
〔実施例１１：米糠の劣化評価試験における化学分析値とＮＩＲ予測値の比較〕
精米直後でＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり）が５重量％程度の米糠を４０℃のインキュベーターで保存した。経時的に米糠をサンプリングし、ＮＩＲスペクトル分析装置としてＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて、米糠のＮＩＲ拡散反射光を８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。測定したＮＩＲスペクトルを、実施例６で作成した米糠のＦＦＡ含量（脂質濃縮物当たり、または、米糠当たり）の検量モデルに当てはめて、ＦＦＡ含量を予測した。また、実施例３のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いて、ＦＦＡ含量（脂質濃縮物ないし米糠当たり）を測定した。米糠のＦＦＡ含量の経時的変化を図９（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は米糠の脂質濃縮物当たり、（ｂ）は米糠当たりのＦＦＡ含量（重量％）である。劣化速度を直線性のある０〜９６時間までのＦＦＡ含量の増加度で評価すると、脂質濃縮物当たりではＮＩＲ予測値が０．０５４重量％／ｈ、化学分析値が０．０５５重量％／ｈ、米糠当たりではＮＩＲ予測値が０．０１１重量％／ｈ、化学分析値が０．０１２重量％／ｈとなり、共に有意差は見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月16日(2015.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠及び／または米油を含む試料中の遊離脂肪酸を定量するための回帰式を得る方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする回帰式を得る方法。
（１）試料、試料の溶媒抽出液、または該溶媒抽出液から溶媒を除いた脂質濃縮物の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）工程（１）に供した試料中の遊離脂肪酸を、非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で特異的に定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、遊離脂肪酸の定量値を多変量解析法により解析し、遊離脂肪酸と関係する因子を決定する工程
【請求項２】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる移動相の組成が０〜０．０３％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むトルエンであることを特徴とする請求項１に記載の回帰式を得る方法。
【請求項３】
非水系ＧＰＣカラムを用いたＨＰＬＣ分析法で用いる試料溶媒がトルエンとアルコールとの混液であり、アルコール濃度が２０％（ｖ／ｖ）以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の回帰式を得る方法。
【請求項４】
工程（１）において試料または脂質濃縮物を、クロロホルム、アセトニトリル、ｔ−ブタノール及びジメチルスルホキシドから選択される溶媒に溶解し、得られた溶液の近赤外光スペクトルを測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項５】
工程（３）における波長領域が、１４３５±１０ｎｍ、１６６２±１０ｎｍ、１７６３±１０ｎｍ、２１６２±１０ｎｍおよび２２４５±１０ｎｍから選択される少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項６】
近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の回帰式を得る方法。
【請求項７】
植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料中の遊離脂肪酸の定量方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の回帰式を得る方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方法。
【請求項８】
請求項７に記載の遊離脂肪酸の定量方法を用いることを特徴とする植物油脂及び／またはその原料となる植物体を含む試料の劣化度評価方法。