(57)【要約】  本出願は、妊娠の高血圧障害、特に妊娠高血圧腎症を予測、診断および予後予測するための新しいツール、上記の障害の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための方法、ならびに上記のバイオマーカーを測定し、および/または上記の方法を行うためのキットおよびデバイスを開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠の高血圧障害の診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのキエシンQ6の使用。
【請求項２】
方法の検査段階が、対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することを含む、対象者における妊娠の高血圧障害の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための方法。
【請求項３】
(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、
(ii) (i)において測定したキエシンQ6の量を、キエシンQ6の量の参照値であって、妊娠の高血圧障害の既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較することと、
(iii)参照値からの(i)において測定したキエシンQ6の量の逸脱または逸脱がないことを見出すことと、
(iv)逸脱または逸脱がないことの前記知見を、対象者における妊娠の高血圧障害の具体的な診断、予測および/または予後に帰属させることと
を含む、対象者における妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のための請求項２に記載の方法。
【請求項４】
(i) ２以上の逐次的な時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、
(ii) (i)において測定した試料間のキエシンQ6の量を比較することと、
(iii) (ii)において比較した試料間のキエシンQ6の量の逸脱または逸脱がないことを見出すことと、
(iv) 逸脱または逸脱がないことの前記知見を、２以上の逐次的な時点間の対象者における妊娠の高血圧障害における変化または妊娠の高血圧障害の発生の可能性における変化に帰属させることと
を含む、妊娠の高血圧障害をモニタリングするための請求項２に記載の方法。
【請求項５】
(i) 第１時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、
(ii) 逐次的な第２時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、
(iii) (i)および(ii)において測定したキエシンQ6の量の間の差を算出することと、
(iv) (iii)において算出した差を、上記の第１および第２の時点でのキエシンQ6の量の間の差の参照値であって、妊娠の高血圧障害の既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較することと、
(v) 参照値からの(iii)において算出した差の逸脱または逸脱がないことを見出すことと、
(iv)逸脱または逸脱がないことの前記知見を、対象者における妊娠の高血圧障害の具体的な診断、予測および/または予後に帰属させることと
を含む、対象者における妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のための請求項２に記載の方法。
【請求項６】
(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、
(ii) (i)で測定したキエシンQ6の量を、キエシンQ6の量の参照値であって、妊娠の高血圧障害の既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較することと、
(iii) 前記参照値からの(i)で測定したキエシンQ6の量の逸脱または逸脱がないことを見出すことと、
(iv) 前記知見から、妊娠の高血圧障害の治療的または予防的処置についての必要性の存在または非存在を推断することと
を含む、対象者が妊娠の高血圧障害の治療的または予防的処置を必要とするか否か(例えばまだ必要とするか、またはもはや必要としないか)を決定する方法。
【請求項７】
妊娠の高血圧障害のための治療が、降圧処置、中絶および分娩から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検査段階が、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1 (sFlt-1、sVEGFR-1)、エンドグリン、胎盤成長因子および血管内皮成長因子(VEGF)からなる群より選択される妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のために有用な１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量を測定することをさらに含む請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
母体の年齢、人種、15週目の訪問時の喫煙状態、１番目の三半期のアルコール消費、１番目の三半期のアルコール消費、対象者の出生時体重、15週目の訪問の５日(以上)前についての膣出血の出現(あり/なし)、患者の母がPEを有した(はい/いいえ)、患者のいずれかの姉妹がPEを有した(はい/いいえ)、対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)、母または姉妹がPEを有した(はい/いいえ)、母もしくは姉妹がPEを有した、および/または対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)、15週目でのBMI、15週目の訪問時の拡張期血圧-１回目の測定(mm Hg)、15週目の訪問時の収縮期血圧-１回目の測定(mm Hg)、15週目の訪問時の拡張期血圧-２回目の測定(mm Hg)、15週目の訪問時の収縮期血圧-２回目の測定(mm Hg)、１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧、１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧、妊娠中に測定される最高拡張期血圧、妊娠中に測定される最高収縮期血圧を含むかまたはそれらからなる群より選択されるもののような、対象者におけるHDPについての１以上の臨床パラメータまたはリスク因子の存在もしくは非存在および/またはレベルを決定することをさらに含む請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記臨床パラメータが、１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；15週目でのBMI、患者の出生時体重(g)；ならびに15週目の訪問の≧５日前についての膣出血の出現(あり/なし)を含む群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
臨床パラメータが、１回目もしくは２回目の測定の血圧から算出した平均動脈圧と、患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)との組み合わせである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
分析される臨床パラメータが、１回目もしくは２回目の測定の血圧から算出した平均動脈圧と、患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)と、15週目でのBMIと、患者の出生時体重(g)と、15週目の訪問の≧５日前についての膣出血の出現(あり/なし)との組み合わせである請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
キエシンQ6の量および/または１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量が、イムノアッセイ技術を用いて、質量分析法を用いて、クロマトグラフィー法を用いて、RNA分析法を用いてまたは前記方法の組み合わせを用いて測定される請求項２〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
試料が、全血、血漿、血清、赤血球、白血球、唾液、尿、便、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、乳管洗浄液、腫瘍浸出液、滑液、脳脊髄液、リンパ、穿刺吸引液、羊水、任意のその他の体液、細胞可溶化物、細胞分泌生成物、炎症液、膣分泌液または胎盤生検のような生検を含む群から選択される請求項２〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
キエシンQ6レベルが、妊娠約８〜20週目の間、より好ましくは妊娠約９〜約19、または約10〜約18、または約11〜約17、または約12〜約16、または約13〜約16、または約14〜約16週目の間、最も好ましくは妊娠約15 +/-1週目にて測定される、請求項２〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１時点が、妊娠約８〜20週目の間、より好ましくは妊娠約９〜約19、または約10〜約18、または約11〜約17、または約12〜約16、または約13〜約16、または約14〜約16週目の間、最も好ましくは妊娠約15 +/-1週目であり、前記第２時点が、妊娠約15〜約25週目の間、好ましくは妊娠約16〜約24、または約17〜約23、または約16〜22、または約18〜22、または約19〜21週目の間、最も好ましくは約20+/-１である請求項４、５および８〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するための手段と、場合によって、好ましくは、(ii) キエシンQ6の量の参照値または前記参照値を確立するための手段であって、前記参照値が、妊娠の高血圧障害の既知の診断、予測および/または予後を表す参照値または手段と、場合によって、好ましくは、(iii) １回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；15週目でのBMI、患者の出生時体重(g)；ならびに15週目の訪問の≧５日前についての膣出血の出現(あり/なし)を含む群から選択されるPEについての１以上の臨床パラメータを評価するための指示書とを含むキット。
【請求項１７】
対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するための前記手段が、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、アプタマー、小分子またはオリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー対などのような結合物質を含む群から選択される請求項16に記載のキット。
【請求項１９】
(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメント、好ましくは既知の量もしくは濃度のキエシンQ6および/またはそのフラグメントと、(b)場合によって、好ましくは、妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のために有用な１以上のその他のバイオマーカー、好ましくは既知の量もしくは濃度の１以上のその他のバイオマーカーとを含むタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドアレイまたはマイクロアレイ。
【請求項２０】
(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメントに特異的に結合できる１以上の結合物質、好ましくは既知の量または濃度の前記結合物質と、(b)場合によって、好ましくは、妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のために有用な１以上のその他のバイオマーカーに特異的に結合できる１以上の結合物質、好ましくは既知の量もしくは濃度の妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のための前記結合物質とを含む結合物質アレイまたはマイクロアレイ。
【請求項２１】
(i) 対象者から試料を得るための手段と、
(ii) 前記試料中のキエシンQ6および/またはフラグメントの量を測定するための手段と、
(iii) 試料中の測定されたキエシンQ6および/またはフラグメントの量を可視化するための手段と
を含む、対象者からの試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を測定できる妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のための試験デバイス。
【請求項２２】
請求項17もしくは18に記載のキット、請求項19に記載のマイクロアレイ、請求項20に記載の結合物質アレイまたは請求項21に記載の試験デバイスの、妊娠の高血圧障害の診断、予測および/または予後のための使用。
【請求項２３】
(a)１以上、好ましくは複数の試験結合物質を準備するステップと、(b) (a)の試験結合物質から、キエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質に結合するものを選択するステップと、(c) (b)で選択された試験結合物質から、いずれかの１以上のその他の、意図しないもしくは所望でない標的と結合するものを逆選択(すなわち除去)するステップとを含む、キエシンQ6のレベルまたは活性を増加できる物質を同定するための方法。
【請求項２４】
HDPの処置および/または防止において用いるためのキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項２５】
妊娠の高血圧障害が、妊娠高血圧腎症(PE)であり、好ましくは、対象者が、臨床的に顕れた妊娠の高血圧障害にまだ罹患しておらず、それにより、対象者が臨床的に顕れた妊娠の高血圧障害を発生する可能性、見込みまたは危険性が予測される、請求項１〜24のいずれか１項に記載の主題。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象者における疾患および状態、特に妊娠の高血圧障害、より具体的には妊娠高血圧腎症の診断、予測、予後および/またはモニタリングのために有用なバイオマーカー、特にタンパク質および/またはペプチドに基づくバイオマーカー、ならびに関連する方法、使用、キットおよびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患および状態において、予防的および/または治療的処置の好ましい転帰は、疾患または状態の早期のおよび/または正確な予測、診断、予後および/またはモニタリングと強く相関している。よって、処置の選択を手引きするために、疾患および状態の早期のおよび/または正確な予測、診断、予後および/またはモニタリングのためのさらなるかつ好ましくは改善された方法が継続的に必要とされている。
【０００３】
妊娠中に出現する高血圧障害は、世界的な妊産婦罹病率および死亡率の主な原因であり、周産期死亡率の増加とも関連する。
妊娠の高血圧障害のうちで妊娠高血圧腎症(PE)は突出しており、これは、妊娠女性の約５%〜10%で生じる(SolomonおよびSeely 2006, Endocrinol Metab Clin North Am 35(1): 157〜71, vii)。
PEは、以前は正常血圧の妊娠20週目を経過した妊娠女性における高血圧および蛋白尿の新しい発症として表すことができ、これは軽度または重度であり得る。軽度の疾患の患者は、妊娠20週目以降の24時間尿について＞140/90の血圧および＞300mgタンパク質の蛋白尿を示し、通常、著しい併存症なしで満期近くに分娩する。しかし、PEの約25%は、中枢神経系機能不全、肝細胞損傷、尿量の低減および血圧の著しい上昇(収縮期＞160 mmHgまたは拡張期＞110 mmHg)の症状および徴候を含んで重度になる傾向がある。重度のPEは、典型的に、２番目および３番目の三半期の後期に発生し、妊産婦および周産期の罹病率ならびに死亡率の増加と関連する。
【０００４】
PEの重度の合併症は、1)溶血、肝臓酵素の上昇および低血小板を特徴とするHELLP症候群ならびに2)てんかんの発生を特徴とする子癇を含む。これらの両方の状態はまれであるが、これらは、悪い予後と関連する(SolomonおよびSeely 2006, 既出)。
妊娠高血圧腎症は、子宮内胎児発育遅延 (IUGR)および胎内発育遅延(SGA)のような胎児合併症とも関連する。
【０００５】
PEの唯一の治癒は、乳児および胎盤の分娩である。妊娠37週目を越えると、分娩が是認される。34週未満の在胎期間にて、高血圧の処置および胎児の密接な監視は、根底にある疾患プロセスを治癒することなく脳血管事故を防ぎ、妊娠を延長できる。分娩は、重度のPEまたは子癇の発生についても是認される(SibaiおよびBarton 2007, Am J Obstet Gynecol 196(6):514.e1〜9)。
【０００６】
PEの病因および病態生理はほとんど解明されないままであり、その診断は、現在のところ、疾患が一旦進展してからの臨床基準に完全に基づく(Robertsら2003, Hypertension 41(3): 37〜45)。しかし、最近のデータは、PEに導くイベントが、１番目の三半期ほと早期に開始し、潜行的に進展し得ることを示唆している。
【０００７】
信頼できる早期の予測および/または診断は、よって、なかでもPEを含む妊娠の高血圧障害における処置介入の成功にとって重要である。つまり、妊娠の高血圧障害の診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのさらなる代替のそして好ましくは改善されたマーカーおよびツールを提供することは、最も重要なままである。
【０００８】
PEの発生を予測するための臨床的に有用なスクリーニング試験は、ほとんどない(Conde-Agudeloら 2004, Obstet Gynecol 104: 1367〜91)。リスク因子への依存も標準以下である。なぜなら(PEについてのリスク因子はいくつか同定されているが)、50%を超える症例は、若く、リスクが低い未産の女性で発生するからである。よって、妊娠の高血圧障害、特にPEは、その発症および疾患進行についてほとんど予測できないままである。
【０００９】
最近の報告は、血管作動性胎盤ペプチド、より具体的には可溶性fms様チロシンキナーゼ-1 (sFlt-1、sVEGFR-1) (Maynardら 2003, J Clin Invest 111(5): 649〜58)、エンドグリン(Levineら 2006, N Engl J Med 355: 992〜1005)、胎盤成長因子(PIGF)および血管内皮成長因子(VEGF) (Polliottiら 2003; Obstet Gynecol 101: 1266〜74)の不均衡が、妊娠高血圧腎症の早期の予測において有用であり得ることを示唆した。特に、sFlt-1およびエンドグリンは、PEの発生の約２〜３ヶ月前に過剰に生成される血管新生抑制ペプチドである。PIGFおよびVEGFは、後で重度のPEを発生する女性の２番目の三半期の妊産婦血清において低減することが示されている血管新生促進ペプチドである。
Proteogenix Inc.のWO2009/097584A1およびAuckland Uniservices Ltd のWO2009/108073A1も、PEバイオマーカーを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、妊娠の高血圧障害、特に妊娠高血圧腎症についてのバイオマーカーを同定し、そのための使用を提供することにより当該技術における上記の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
網羅的な実験および試験を行って、本発明者らは、そのレベルが妊娠の高血圧障害、より具体的には妊娠高血圧腎症の密接な予測および/または指標となるバイオマーカーを同定した。簡潔さのために、妊娠の高血圧障害および妊娠高血圧腎症は、以降、本明細書を通してHDPおよびPEとそれぞれ略記する。
【００１２】
具体的には、臨床試料を、妊娠のさらなる経過において妊娠高血圧腎症と診断されたか(症例)または妊娠高血圧腎症と診断されなかった(対照)いずれかの妊娠15+/-1および20 +/-1週目での単生児妊娠の妊婦から回収した。本発明者らは、上記の試料中のキエシンQ6 (Quiescin Q6)マーカーの量が、PEの予測および/または指標となる挙動を示したことを見出した。さらに、試料中のキエシンQ6レベルの予測力は、いくつかの特異的臨床パラメータと組み合わせた場合にさらに改善された。
【００１３】
よって、本発明は、キエシンQ6および/またはそのフラグメントならびにバイオマーカー、より具体的にはHDPについてのバイオマーカー、さらにより具体的には上記のHDPの診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのバイオマーカーとしてのその使用を提供する。好ましくは、上記のHDP障害は、PEである。
【００１４】
HDPの診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのキエシンQ6および/またはそのフラグメントの使用も提供される。好ましくは、上記のHDP障害は、PEである。
対象者からの試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントのレベルを測定することを含む、対象者におけるHDPの診断、予測、予後および/またはモニタリングのための方法も提供される。好ましくは、上記のHDP障害は、PEである。
【００１５】
本明細書を通して用いる場合、対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーのレベルを測定することは、特に、方法の検査段階が、対象者からの試料中の上記の１以上のバイオマーカーの量を測定することを含むことを表し得る。疾患および状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための方法が、一般的に、対象者からおよび/または対象者についてのデータを回収する検査段階を含むことが理解される。
【００１６】
ある実施形態において、対象者におけるHDP、例えば好ましくはPEの診断、予測および/または予後のための方法は、(i)対象者からの試料中のキエシンQ6からなる群より選択される任意の１以上のマーカーの量を測定するステップと、(ii) (i)で測定したマーカーの量を、上記のマーカーの量の参照値であって、HDPの既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較するステップと、(iii)参照値からの(i)で測定したマーカーの量の逸脱または逸脱がないことを見出すステップと、(iv)逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、対象者におけるHDPの具体的な診断、予測および/または予後に帰属させるステップとを含む。
【００１７】
HDP、例えば好ましくはPEの診断、予測および/または予後のための方法、特に前の段落に記載するステップ(i)〜(iv)を含む方法は、対象者について２以上の逐次的な時点で行うことができ、上記の逐次的な時点でのそれぞれの結果を比較して、そのことにより、上記の逐次的な時点間のHDPの診断、予測および/または予後の変化の存在または非存在を決定できる。上記の方法は、よって、対象者におけるHDPの診断、予測および/または予後の経時的な変化をモニタリングすることを可能にする。
【００１８】
本明細書で教示するキエシンQ6の量は、妊娠中および/または分娩後に変動し得る。よって、本明細書で教示する使用および方法の診断、予測および/または予後の信頼性を改善するために、検査される対象者における所定の妊娠期間または分娩後に測定される所定のマーカーの量は、実質的に同じ妊娠期間または分娩後(例えば+/-約３週間以内、好ましくは+/-約２週間以内、より好ましくは+/-約１週間以内、さらにより好ましくは+/-約0.5週間以内)にて確立された上記のマーカーの量の参照値と比較することが好ましい。
【００１９】
所定のマーカーが、妊娠中もしくは分娩後の１または１より多い時点で評価される場合に、その診断、予測および/または予後についての価値を示し得ることも認識される。例えば、マーカーは、実質的に妊娠中および/もしくは分娩後を通して評価されるか、または妊娠の一部分(例えば１番目、２番目および/または３番目の三半期内)もしくは分娩後内でだけ評価されるか、または妊娠もしくは分娩後の１以上の比較的短い期間内でだけ評価される(例えば約10、８、６、４または２週目の期間内)場合に、情報を与え得る。このようなマーカーは全て、本明細書において有用であり、適切である。
【００２０】
よって、HDPがないこと、例えば好ましくはPEがないこと(すなわち健常な状況)の予測もしくは診断を表すかまたはHDP、例えば好ましくはPEについての良好な予後を表す参照値と比較した、対象者からの試料中のキエシンQ6の量の上昇または低減(すなわち逸脱)は、それぞれ、対象者が、HDPを有するかもしくはHDPを有する危険性にあることを示し得るか、または対象者におけるHDPについての悪い予後(例えば、PEが悪化するかまたはHELLP症候群もしくは子癇に進行するという予後)を示す。
【００２１】
例としてのみ、そして限定することなく、(a) HDPがないこと、例えば好ましくはPEがないこと(すなわち健常な状況)の予測もしくは診断を表すかまたはHDP、例えば好ましくはPEについての良好な予後を表す参照値と比較した、対象者からの試料中のキエシンQ6の量の低減(すなわち逸脱)は、それぞれ、対象者が、HDPを有するかもしくはHDPを有する危険性にあることを示し得るか、または対象者におけるHDPについての予後が悪い(例えば、PEが悪化するかまたはHELLP症候群もしくは子癇に進行するという予後)ことを示す。
【００２２】
実験により示され、例としてのみ、そして限定することなく以下の実施形態に反映されるように、好ましくは妊娠しているヒトの女性において：
- 参照値に対するキエシンQ6の量の低減は、妊娠約８〜約20週目の間、より好ましくは妊娠約9〜約19、約10〜約18、約11〜約17、約12〜約16、約13〜約16、さらにより好ましくは約14〜16週目の間、最も好ましくは妊娠約15 +/-1週目にて評価でき、および/または
HDP、好ましくはPEの診断、予測、予後および/またはモニタリングのための本発明の方法は、HDP障害、好ましくはPEを示し得るさらなるバイオマーカーまたは臨床パラメータも評価する。それぞれのこのようにして測定されるバイオマーカーまたはパラメータは、別々に独立して評価してよいか、または上記の２以上のバイオマーカーの量からバイオマーカープロフィールを作製してよいかもしくはPEについての組み合わせたパラメータ/バイオマーカーリスクプロフィールを作製してよい。
【００２３】
よって、(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を、１以上のその他の既知のHDPもしくはPEバイオマーカーまたは臨床パラメータと組み合わせて測定するステップと、(ii) (i)の測定を用いて、キエシンQ6および１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの量の対象者プロフィールを確立するステップと、(iii) (ii)の上記の対象者プロフィールを、キエシンQ6および１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの量の参照プロフィールであって、HDPの既知の診断、予測および/または予後を表す参照プロフィールと比較するステップと、(iv)参照プロフィールからの(ii)の対象者プロフィールの逸脱または逸脱がないことを見出すステップと、(v)逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、HDPの具体的な診断、予測および/または予後に帰属させるステップとを含む、対象者におけるHDP、例えば好ましくはPEの診断、予測および/または予後のための方法も開示される。
【００２４】
上記の方法を２以上の逐次的な時点にて用いることにより、HDPをモニタリングできる。
限定することなく、このような逐次的な時点は、約２週間以上離れ、好ましくは約４週間以上離れ、例えば約６もしくは８週間離れ、または好ましくは約10週間以上離れ、例えば約12週間もしくは15週間離れてよい。
【００２５】
よって、対象者からの試料中のHDPもしくはPEについての１以上のその他の既知のマーカーまたはPEについての臨床パラメータと場合によって組み合わせたキエシンQ6の測定した量を用いて確立し、HDPがないこと、例えば好ましくはPEがないこと(すなわち健常な状況)の予測もしくは診断を表すかまたはHDP、例えば好ましくはPEについての良好な予後を表す参照プロフィールと比較した場合にキエシンQ6の量の低減およびさらなるバイオマーカーもしくはパラメータの量または値の逸脱を含むバイオマーカープロフィールは、それぞれ、対象者が、HDPを有するかもしくはHDPを有する危険性にあることを示し得るか、または対象者におけるHDPについての予後が悪い(例えば、PEが悪化するかまたはHELLP症候群もしくは子癇に進行するという予後)ことを示す。
【００２６】
ある実施形態において、HDP、例えば好ましくはPEをモニタリングするため(またはHDP、例えば好ましくはPEの発生の可能性をモニタリングするため)の方法は、(i)２以上の逐次的な時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6および場合によって１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの量を測定するステップと、(ii) (i)において測定した試料間のキエシンQ6および場合によって１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの量を比較するステップと、(iii) (ii)において測定した試料間のキエシンQ6および場合によって１以上のその他のマーカーもしくは臨床パラメータの量の逸脱または逸脱がないことを見出すステップと、(iv)逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、２以上の逐次的な時点間の対象者におけるHDPの変化(またはHDPの発生の可能性における変化)に帰属させるステップとを含む。上記の方法は、よって、対象者におけるHDPまたはHDPを発生する危険性の経時的なモニタリングを可能にする。より具体的には、キエシンQ6レベルの経時的な上昇または正常化(例えば参照値に関して)は、対象者におけるPE状態の良好な予後または安定化を示すが、キエシンQ6レベルの経時的な低減は、悪い予後、すなわち対象者がPEの危険性にあり得ることを示す。
【００２７】
本開示を通して、本明細書で教示する任意の１つの疾患または状態をモニタリングするための方法は、なかでも、疾患もしくは状態の出現を予測すること、あるいは該疾患もしくは状態の進行、悪化、軽減または再発、あるいは処置もしくはその他の外的もしくは内的因子、状況またはストレス因子などに対する応答をモニタリングすることを可能にできる。有利には、本明細書で教示するモニタリング方法は、対象者の医療的処置、好ましくはこのようにしてモニタリングされる疾患または状態の軽減を目的とする医療処置の経過において用いることができる。このようなモニタリングは、例えば、患者を退院させるか、患者が処置の変更を必要とするかまたは患者がさらなる入院を必要とするかを決定することにおいて含まれ得る。本明細書で意図するように、疾患または状態のモニタリングについての言及は、具体的に、対象者が疾患または状態を発生する可能性、危険性または見込みをモニタリングすること、すなわち上記の可能性、危険性または見込みの経時的な変化をモニタリングすることを含む。
【００２８】
同様に、本開示を通して、本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の予測または予後のための方法は、なかでも、疾患もしくは状態の出現を予測または予後予測すること、あるいは該疾患もしくは状態の進行、悪化、軽減または再発、あるいは処置もしくはその他の外的もしくは内的因子、状況またはストレス因子などに対する応答を予測または予後予測することを可能にできる。
【００２９】
本発明者らは、妊娠中または分娩後の逐次的な時点での本明細書で教示するバイオマーカーの評価により、HDP、好ましくはPEの診断、予測および/または予後も可能になることにさらに気付いた。例えば、上記の逐次的な時点間のマーカーの量の差が、HDPまたはPEを発生しない女性における対応する時点で測定された上記のマーカーの量の間の差から逸脱する場合、このような逸脱は、対象者が、HDPもしくはPEを有するかまたはHDPもしくはPEを発生する危険性にあることを示し得る。
【００３０】
よって、(i)第１時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するステップと、(ii)逐次的な第２時点からの対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するステップと、(iii) (i)および(ii)において測定したキエシンQ6の量の間の差を算出するステップと、(iv) (iii)において算出した差を、上記の第１および第２の時点でのキエシンQ6の量の間の差の参照値であって、HDPの既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較するステップと、(v)参照値からの(iii)において算出した差の逸脱または逸脱がないことを見出すステップと、(iv)逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、対象者におけるHDP の具体的な診断、予測および/または予後に帰属させるステップとを含む、対象者におけるHDP、例えば好ましくはPEの診断、予測および/または予後のための方法も提供される。
【００３１】
例えば、上記の第１および第２の時点にて対象者において測定されたキエシンQ6の量の間の算出された差(DS)が、正常妊娠において観察される対応する差(DN)から逸脱する場合、逸脱は、対象者がHDP、例えばPEを有するかまたはそれを有する危険性にあることを示し得る。限定することなく、逸脱は、DS＞DN、またはDS＜DN、またはDN＜0である場合にDS＞0、またはDN＞0である場合にDS＜0の場合に明白である。差は、演算操作、例えば減算または除算(例えば勾配、比)として適切に表すことができる。この方法は、HDP、好ましくはPEについての１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの測定と場合によって組み合わせることができる。
【００３２】
限定することなく、このような逐次的な時点は、約２週間以上離れ、好ましくは約４週間以上離れ、例えば約６もしくは８週間離れ、または好ましくは約10週間以上離れ、例えば約12週間もしくは15週間離れていてよい。
【００３３】
これもまた限定することなく、第１時点は、妊娠約８〜約10週目の間、好ましくは妊娠約９〜約10 +/-２週目の間、より好ましくは妊娠約８+/-１〜約15 +/-１週目の間であり得る。非限定的な例は、妊娠約８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または20週目である。第２時点は、妊娠約15〜約25週目の間、好ましくは妊娠約16〜約24もしくは約17〜約23もしくは約16〜22もしくは約18〜22もしくは約19〜21週目の間、最も好ましくは約20+/-１であり得る。
【００３４】
(i)対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定することと、(ii) (i)で測定したキエシンQ6の量を、キエシンQ6の量の参照値であって、HDPの既知の診断、予測および/または予後を表す参照値と比較することと、(iii)上記の参照値からの(i)で測定したキエシンQ6の量の逸脱または逸脱がないことを見出すことと、(iv)上記の知見から、HDP、例えば好ましくはPEの治療的または予防的処置についての必要性の存在または非存在を推断する(infer)こととを含む、対象者がHDP、例えば好ましくはPEの治療的または予防的(防止)処置を必要とするか否か(例えばまだ必要とするか、またはもはや必要としないか)を決定する方法も開示される。
【００３５】
(i)対象者からの試料中のキエシンQ6および１以上のその他のHDPまたはPEバイオマーカーの量を測定することと、(ii) (i)の測定を用いて、キエシンQ6および上記の１以上のその他のマーカーの量の対象者プロフィールを確立することと、(iii) 上記の(ii)の対象者プロフィールを、キエシンQ6および上記の１以上のバイオマーカーの量の参照プロフィールであって、HDPの既知の診断、予測および/または予後を表す参照プロフィールと比較することと、(iv)参照プロフィールからの(ii)の対象者プロフィールの逸脱または逸脱がないことを見出すことと、(v)上記の知見から、HDP、例えば好ましくはPEの治療的または予防的処置についての必要性の存在または非存在を推断することとを含む、対象者がHDP、例えば好ましくはPEの治療的または予防的(防止)処置を必要とするか否か(例えばまだ必要とするか、またはもはや必要としないか)を決定する方法も開示される。
【００３６】
対象者がHDPを有するかもしくはHDPを有する危険性にあるかまたはHDPについての悪い予後を有するという結論を上記の方法が可能にする場合に、処置を特に指示できる。
【００３７】
限定することなく、医療介護センターに入院している際または滞在中にHDPを有する患者は、上記のHDPの処置の継続の必要性について本明細書で教示するようにして試験でき、そのような処置がもはや必要でないかまたは所定の限定された程度でのみ必要とされる場合に退院できる。HDP、例えばPEの例示的な治療的および予防的処置は、限定することなく、降圧処置(なかでもベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬および/またはDOPAデカルボキシラーゼ阻害剤、例えばメチルドパ、ラベタロール、アセブトロール、メトプロロール、ピンドロール、プロプラノロール、ニフェジピン、イスラジピンおよび/もしくはヒドララジンならびに/またはMgSO4処置)、中絶および分娩、例えば分娩誘導または帝王切開を包含する。
【００３８】
本明細書で教示するバイオマーカーの評価を含む使用および方法は、主に、妊娠しているまたは分娩後の胎生動物雌個体について行うことができる。このましくは、上記の対象者は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００３９】
本明細書で教示するバイオマーカーの評価を含む使用および方法は、好ましくは、任意の妊娠期間から分娩後約12週目まで、例えば限定することなく以下のような、妊娠しているまたは分娩後のヒト女性対象者について行うことができる：
- 妊娠ヒト女性対象者は、妊娠約５週目以上または妊娠約10週目以上、好ましくは妊娠約15週目以上、またはより好ましくは妊娠約20週目以上、例えば妊娠約21、22、23もしくは24週目、またはさらにより好ましくは妊娠約25週目以上、例えば妊娠約26、27、28もしくは29週目であり、および/または
- 妊娠ヒト女性対象者は、妊娠約40週目以下、例えば妊娠約39もしくは38週目、または妊娠約37週目以下、例えば妊娠約36もしくは35週目、または妊娠約34週目以下、例えば妊娠約33、32、31もしくは30週目であり、および/または
- 妊娠ヒト女性対象者は、妊娠約10週目〜約40週目の間、好ましくは妊娠約15週目〜約37週目の間、またはこれもまた好ましくは妊娠約20週目〜34週目の間であるか、もしくは
- 分娩後ヒト女性対象者は、分娩後約12週目以下、例えば分娩後約11もしくは10週目、または分娩後約９週目以下、例えば分娩後約８もしくは７週目、または分娩後約６週目以下、例えば分娩後約５もしくは４週目、または分娩後約３週目、例えば分娩後約２もしくは１週目である。
【００４０】
さらに、本実施例は、キエシンQ6のレベルが、キエシンQ6レベルが上昇しているが臨床的に顕れたHDPまたはPEにまだ罹患していない妊娠女性におけるHDP、好ましくはPEの見込みのある(すなわち将来のまたはこれから来る)出現を予測することを可能にすることを示す。さらに、この方法は、予測力を改善するために、HDP、好ましくはPEについての１以上のその他のマーカーまたは臨床パラメータの測定と場合によって組み合わせることができる。
【００４１】
よって、本明細書で教示するバイオマーカーの評価を含む使用および方法は、好ましくは、対象者、特に臨床的に顕れた(すなわち活動性)HDPまたはPEを有していない対象者におけるHDP、好ましくはPEの予測を意図し、そのために用いることができる。このような予測は、好ましくは、試験された対象者が、臨床的に顕れたHDPまたはPEを、例えばある期間内または妊娠中もしくは分娩後の所定の期間にて発生する可能性、見込みまたは危険性を示し得る。
例えば、本明細書で教示するキエシンQ6およびその他のバイオマーカーまたはパラメータの評価を含む使用および方法、特にHDP、好ましくはPEを予測することを意図する使用および方法は、以下の妊娠ヒト女性対象者について行うことができる：
- 妊娠約37週目以下、例えば妊娠約36もしくは35週目、または妊娠約34週目以下、例えば妊娠約33、32もしくは31週目、または妊娠約30週目以下、例えば妊娠約29、28もしくは27週目、または好ましくは妊娠約26週目以下、例えば約25、24もしくは23週目、またはより好ましくは妊娠約22週目以下、例えば妊娠約21週目、またはこれもまた好ましくは妊娠約20週目以下、例えば妊娠約19、18、17もしくは16週目、またはこれもまた好ましくは妊娠約15週目以下、例えば妊娠約14、13、12、11、10、９、８週目、および
妊娠ヒト女性対象者は、好ましくは、活動性HDPまたはPEを有さず、例えば、対象者は、HDPまたはPEの診断を可能にする臨床症状および徴候を顕さない。
【００４２】
それにより、HDP、例えば好ましくはPEの発症の妊娠期間もしくは分娩後期間および/または発症までに残された時間が予測される、本明細書で教示する使用および方法がさらに開示される。このような使用および方法は、バイオマーカーの量またはプロフィールを、HDPの発症の既知の妊娠期間または分娩後期間および/またはHDPの発症までに残された既知の時間を表す参照値または参照プロフィールと有利に比較できる。HGFL、PTPRS、ROBO4およびVGFR3から選択される任意の１以上のマーカーが、この点で特に有用である。
【００４３】
それにより、早期発症型妊娠高血圧腎症(すなわち臨床所見＜妊娠34週目)対早産型PE (すなわち臨床所見＞妊娠34および＜37週目)対満期産型PE (臨床所見≧妊娠37週目)を有するかまたは有する危険性にある対象者同士を区別することが可能になる、本明細書で教示する使用および方法がさらに開示される。
よって、HDPの診断、予測、予後および/またはモニタリングのために用いられる本発明の使用および方法であって、HDPが、早期発症型PEまたは早産型PEまたは満期産型PEである使用および方法も開示される。
【００４４】
本明細書で開示するHDP、好ましくはPEについてのマーカーを用いることは、HDPまたはPEを発生する危険性にあることがわかっているかまたは予期される対象者において特に有用であり得る。限定することなく、HDP、好ましくはPEと関連するリスク因子は、未産、多胎妊娠、長い妊娠間隔、以前の妊娠でのHDPもしくはPEの病歴またはHDPもしくはPEの家族歴、極端な年齢(＜20歳および＞40歳)、肥満、慢性高血圧、慢性腎臓疾患、偏頭痛、頭痛、(妊娠性)糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群、自己免疫疾患、例えばループス、関節リウマチ、サルコイドーシスもしくはMS、血管もしくは結合組織疾患、ビタミンＤ欠乏症、抗リン脂質抗体症候群または遺伝性栓友病、以前のパートナーがHDPもしくはPEを有していた男性パートナー、胎児水腫および原因不明の子宮内胎児発育遅延を含む。
【００４５】
よって、本発明の診断、予測、予後および/またはモニタリング方法は、好ましくは、１以上のこのようなリスク因子を有する対象者および対象者集団において用いることができる。ある実施形態において、本発明の診断、予測、予後および/またはモニタリング方法は、好ましくは、対象者におけるHDP、例えば好ましくはPEについての１以上のリスク因子の存在もしくは非存在および/またはレベルを決定することをさらに含み得る。
【００４６】
本明細書で教示する任意の１つの予測、診断、予後および/もしくはモニタリングの使用または方法は、好ましくは、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%、例えば≧85%もしくは≧90%もしくは≧95%、例えば約80%〜100%の間もしくは約85%〜95%の間の感度および/または特異性(好ましくは感度および特異性)を可能にできる。
【００４７】
「疾患および/または状態」への本明細書を通しての言及は、特定の詳述の文脈と矛盾しない限り、本明細書で開示するそのような任意の疾患および状態を包含し、より具体的には、しかし限定することなく、妊娠の高血圧障害(HDP)、好ましくは妊娠高血圧腎症(PE)を含む。
【００４８】
本明細書で教示する疾患および状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための使用ならびに方法は、そのようなものを有するとまだ診断されていないか(例えば防止スクリーニング)、またはそのようなものを有すると診断されているか、またはそのようなものを有することが疑われるか(例えば１以上の特徴的な徴候および/または症状を示す)、またはそのようなものを発生する危険性にある(例えば遺伝的素因、１以上の発育的、環境的もしくは挙動的リスク因子の存在)対象者において用いることができる。該使用および方法は、疾患および状態の進行の様々な段階または重症度を検出するために用いることもできる。該使用および方法は、予防的もしくは治療的処置またはその他の介入に対する疾患および状態の応答を検出するために用いることもできる。該使用および方法は、さらに、疾患および状態からの対象者の悪化、現状、部分的回復または完全回復を医療従事者が決定することを助けるために用いることができ、さらなる処置もしくは観察または医療介護センターからの患者の退院のいずれかをもたらすことができる。
【００４９】
また、本明細書で教示する疾患および状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための使用ならびに方法は、集団スクリーニング、例えば全般的な集団または１以上の基準、例えば年齢、家系、職業、各疾患および状態のリスク因子の存在もしくは非存在などに基づいて階層化された集団におけるスクリーニングのために用いることができる。
【００５０】
本明細書で教示する疾患および状態、特にHDP、好ましくはPEの予測、診断、予後および/またはモニタリングのための使用ならびに方法において、キエシンQ6の測定は、各疾患及および状態に関連する１以上のその他のバイオマーカーまたは臨床パラメータの評価と組み合わせることができる。
【００５１】
よって、対象者からの試料中の１以上のそのようなその他のマーカーの存在もしくは非存在および/またはレベルを測定することあるいは対象者における上記の臨床パラメータの任意の１つをモニタリングすることをさらに含む、上記で教示する対象者におけるHDP、例えば好ましくはPEの診断、予測、予後および/またはモニタリングのための方法も提供される。具体的には、方法の検査段階が、対象者からの試料中の１以上のそのようなその他のマーカーの存在もしくは非存在および/または量を測定することをさらに含む、そのような方法が提供される。任意の既知のまたはまだ知られていない適切なマーカーまたはパラメータを用いることができる。
好ましくは、本発明の方法は、対象者の試料中のキエシンQ6バイオマーカーの発現レベルを測定することを、以下の臨床パラメータの１以上と組み合わせる：母体の年齢；人種；15週目の訪問時の喫煙状態；１番目の三半期のアルコール消費；対象者の出生時体重；15週目の訪問の５日(以上)前についての膣出血の出現(あり/なし)；患者の母がPEを有した(はい/いいえ)；患者のいずれかの姉妹がPEを有した(はい/いいえ)；対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；母または姉妹がPEを有した(はい/いいえ)；母もしくは姉妹がPEを有した、および/または対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；15週目での対象者の肥満度指数(BMI)；15週目の訪問時の拡張期血圧-１回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の収縮期血圧-１回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の拡張期血圧-２回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の収縮期血圧-２回目の測定(mm Hg)；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；妊娠中に測定された最高拡張期血圧；または妊娠中に測定された最高収縮期血圧。本発明者らは、このことが、HDP、好ましくはPEについての予測ツールの特異性を著しく増加させることを示している。本明細書において用いる「臨床パラメータ」への言及は、よって、この段落に列挙するパラメータの任意の１つのことを言う。
【００５２】
より具体的には、本発明は、HDP、好ましくはPEを予測、診断するかまたはその予後のための方法であって、以下の臨床パラメータの１以上の評価と組み合わせた、本明細書で規定する実施形態のいずれかに示すようなキエシンQ6のレベルを測定する方法を提供する：母体の年齢；人種；15週目の訪問時の喫煙状態；１番目の三半期のアルコール消費；対象者の出生時体重；15週目の訪問の５日(以上)前についての膣出血の出現(あり/なし)；患者の母がPEを有した(はい/いいえ)；患者のいずれかの姉妹がPEを有した(はい/いいえ)；対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；母または姉妹がPEを有した(はい/いいえ)；母もしくは姉妹がPEを有した、および/または対象者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；15週目での対象者の肥満度指数(BMI)；15週目の訪問時の拡張期血圧-１回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の収縮期血圧-１回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の拡張期血圧-２回目の測定(mm Hg)；15週目の訪問時の収縮期血圧-２回目の測定(mm Hg)；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；妊娠中に測定される最高拡張期血圧；または妊娠中に測定される最高収縮期血圧。
【００５３】
より好ましくは、パラメータの群は、１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；１回目の測定血圧から算出した平均動脈圧；患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)；15週目でのBMI、患者の出生時体重(g)；ならびに15週目の訪問の≧５日前についての膣出血の出現(あり/なし)である。
さらにより好ましくは、用いるパラメータの上記の群は、１回目もしくは２回目の測定血圧から算出した平均動脈圧と、患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)との組み合わせである。
最も好ましくは、分析されるパラメータは、１回目もしくは２回目の測定血圧から算出した平均動脈圧と、患者の母もしくは姉妹が妊娠高血圧腎症を有した、および/または患者の父が虚血性心臓疾患を有する(はい/いいえ)と、15週目でのBMIと、患者の出生時体重(g)と、15週目の訪問の≧５日前についての膣出血の出現(あり/なし)との組み合わせである。
【００５４】
本明細書を通して「その他の(バイオ)マーカー」への言及は、全般的に、本明細書で開示する疾患および状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのために有用なこのようなその他のマーカーを包含する。例としてそして限定することなく、HDP、好ましくはPEの評価において有用なバイオマーカーは、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1 (sFlt-1、sVEGFR-1) (Maynardら2003, 既出)、エンドグリン(Levineら2006, 既出)、胎盤成長因子(PIGF)および血管内皮成長因子(VEGF) (Polliottiら2003, 既出)を含む。さらなるバイオマーカーは、Proteogenix Inc.のWO2009/097584A1およびAuckland Uniservices Ltd.のWO2009/108073A1 (参照により本明細書に組み込む)に開示されるものを含み得る。
【００５５】
このようなその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量は、それぞれ別々に独立して評価してよいか、あるいはこのようなその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量は、本明細書で開示する方法において確立される対象者プロフィールまたは参照プロフィールに含めてよいことが認識される。
【００５６】
本明細書で用いる参照値は、その他のバイオマーカーについて以前に用いた既知の手順に従って確立できる。このような参照値は、本明細書で教示する方法内(すなわちステップを構成する)または方法外(すなわちステップを構成しない)のいずれかで確立できる。したがって、本明細書で教示する方法の任意の１つは、本明細書で教示する１以上のマーカーの量についての参照値を確立するステップであって、該参照値が、(a)本明細書で教示する疾患もしくは状態の非存在の予測または診断あるいはその良好な予後、あるいは(b)本明細書で教示する疾患もしくは状態の予測または診断あるいはその悪い予後のいずれかを表すステップを含み得る。
【００５７】
さらなる態様は、キエシンQ6の量についての参照値を確立するための方法であって、該参照値が、
(a)本明細書で教示する疾患もしくは状態の非存在の予測または診断あるいはその良好な予後、あるいは
(b)本明細書で教示する疾患もしくは状態の予測または診断あるいはその悪い予後
を表し、
(i) キエシンQ6の量を、
(i a) 各疾患もしくは状態を有さないかまたはそのようなものを有する危険性にないかまたはそのようなものについての良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上の試料、あるいは
(i b) 各疾患もしくは状態を有するかまたはそのようなものを有する危険性にあるかまたはそのようなものについての悪い予後を有する１以上の対象者からの１以上の試料
において測定することと、
(ii) キエシンQ6の量を、
(ii a) (i a)において測定されたように、各疾患もしくは状態の非存在の予測または診断を表すかあるいはそれについての良好な予後を表す参照値として、あるいは
(ii b) (i b)において測定されたように、各疾患もしくは状態の予測または診断を表すかあるいはそれについての悪い予後を表す参照値として
保存することとを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の方法は、そうでなければ、キエシンQ6の量および場合によって１以上のその他のバイオマーカーもしくはパラメータの存在もしくは非存在および/または量もしくは値についての参照プロフィールを用いることができ、これは、このようなその他のバイオマーカーおよびパラメータについて以前に用いた既知の手順に従って確立できる。このような参照プロフィールは、本明細書で教示する方法内(すなわちステップを構成する)または方法外(すなわちステップを構成しない)のいずれかで確立できる。したがって、本明細書で教示する方法は、キエシンQ6の量および場合によって１以上のその他のバイオマーカーもしくはパラメータの存在もしくは非存在および/または量もしくは値についての参照プロフィールを確立するステップであって、該参照プロフィールが、(a)本明細書で教示する疾患もしくは状態の非存在の予測または診断あるいはその良好な予後、あるいは(b)本明細書で教示する疾患もしくは状態の予測または診断あるいはその悪い予後のいずれかを表すステップを含み得る。
【００５９】
さらなる態様は、キエシンQ6の量および場合によって本明細書で教示する疾患もしくは状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのために有用な１以上のその他のバイオマーカーもしくはパラメータの存在もしくは非存在および/または量もしくは値についての参照プロフィールを確立するための方法であって、
該参照値が、
(a)各疾患もしくは状態の非存在の予測または診断あるいはその良好な予後、あるいは
(b)各疾患もしくは状態の予測または診断あるいはその悪い予後
を表し、
(i) キエシンQ6の量ならびに上記の１以上のその他のバイオマーカーもしくはパラメータの存在もしくは非存在および/または量もしくは値を、
(i a) 各疾患もしくは状態を有さないかまたはそのようなものを有する危険性にないかまたはそのようなものについての良好な予後を有する１以上の対象者からの１以上の試料、あるいは
(i b) 各疾患もしくは状態を有するかまたはそのようなものを有する危険性にあるかまたはそのようなものについての悪い予後を有する１以上の対象者からの１以上の試料
において測定することと、
(ii)
(ii a) (i a)の測定を用いて、本明細書で教示する上記の１、２以上のマーカーの量および上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量のプロフィールを創出するか、あるいは
(ii b) (i b)の測定を用いて、本明細書で教示する上記の１、２以上のマーカーの量および上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量のプロフィールを創出する
ことと、
(iii)
(iii a) (ii a)のプロフィールを、各疾患もしくは状態の非存在の予測または診断を表すかあるいはそれについての良好な予後を表す参照プロフィールとして、あるいは
(iii b) (ii b)のプロフィールを、各疾患もしくは状態の予測または診断を表すかあるいはそれについての悪い予後を表す参照プロフィールとして
保存することとを含む方法を提供する。
【００６０】
(i)本明細書で教示する疾患または状態に罹患していない対象者からの試料中のキエシンQ6の量を異なる時点で測定することと、(ii)上記の対象者のベースラインまたは参照値である対象者の範囲または平均値を算出することとを含む、対象者におけるベースラインまたは参照値を確立するための方法がさらに提供される。キエシンQ6の量ならびに/あるいは１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量は、当該技術において知られるような任意の適切な技術により測定できる。
【００６１】
例えば、各バイオマーカーおよび/またはそのフラグメントに特異的に結合できる結合物質を用いることができる。結合物質は、なかでも、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子であり得る。例えば、イムノアッセイ技術または質量分析法またはクロマトグラフィー法または上記の方法の組み合わせを用いることができる。
【００６２】
(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するための手段と、場合によって、好ましくは、(ii) キエシンQ6の量の参照値または上記の参照値を確立するための手段であって、上記の参照値が、各疾患または状態の既知の診断、予測および/または予後を表す手段とを含む、対象者における本明細書で教示する疾患もしくは状態を診断、予測、予後および/またはモニタリングするためのキットがさらに開示される。キットは、手段(i)により、対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定すること、手段(i)により測定されたキエシンQ6の量を、(ii)の参照値もしくは手段(ii)により確立された参照値と比較すること、(ii)の参照値からの手段(i)により測定されたキエシンQ6の量の逸脱または逸脱がないことを見出すこと、ならびにその結果、逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、対象者における各疾患または状態の具体的な診断、予測および/または予後に帰属させることを可能にする。
【００６３】
さらなる実施形態は、(i) 対象者からの試料中のキエシンQ6の量を測定するための手段と、(ii)場合によって、対象者からの試料中の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量を測定するための手段と、場合によって、好ましくは、(iii) キエシンQ6の量および場合によって上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量の対象者プロフィールを確立するための手段と、場合によって、好ましくは、(iv) キエシンQ6の量および場合によって上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量の参照プロフィール、あるいは上記の参照プロフィールを確立するための手段であって、該参照プロフィールが、各疾患もしくは状態の既知の診断、予測および/または予後を表す参照プロフィールあるいは手段とを含む、対象者における本明細書で教示する疾患もしくは状態を診断、予測、予後および/またはモニタリングするためのキットを提供する。このようなキットは、よって、それぞれ手段(i)および(ii)により、対象者からの試料中のキエシンQ6の量および場合によってキエシンQ6の存在もしくは非存在および/または量を測定すること、上記の測定に基づいて、キエシンQ6の量および上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量の対象者プロフィールを(例えばキットに含まれる手段を用いてまたは適切な外的手段を用いて)確立すること、対象者プロフィールを、(iv)の参照プロフィールまたは手段(iv)により確立された参照プロフィールと比較すること、上記の参照プロフィールからの上記の対象者プロフィールの逸脱または逸脱がないことを見出すこと、ならびにその結果、逸脱または逸脱がないことの上記の知見を、対象者における各疾患または状態の具体的な診断、予測および/または予後に帰属させることを可能にする。
【００６４】
本発明のキットにおけるキエシンQ6の量ならびに/あるいは１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量を測定するための手段は、それぞれ、キエシンQ6および/もしくはそのフラグメントに特異的に結合できる１以上の結合物質、ならびに上記の１以上のその他のバイオマーカーに特異的に結合できる１以上の結合物質を含み得る。結合物質は、なかでも、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子であり得る。結合物質は、有利には、固相または支持体に固定化され得る。本発明のキットは、イムノアッセイ技術または質量分析技術またはクロマトグラフィー技術または上記の技術の組み合わせを用いることができる。
【００６５】
よって、(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメントに特異的に結合できる１以上の結合物質と、(b)好ましくは、既知の量もしくは濃度のキエシンQ6および/またはそのフラグメント(例えば対照、標準物質および/または校正物質として用いるため)と、(c)好ましくは、キエシンQ6の量の参照値、または上記の参照値を確立するための手段とを含む、本明細書で教示する疾患または状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのキットも開示される。(a)および/または(c)の下での上記の成分は、本明細書の他の場所で教示するように、適切に標識され得る。
【００６６】
(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメントに特異的に結合できる１以上の結合物質と、(b)場合によって、１以上のその他のバイオマーカーに特異的に結合できる１以上の結合物質と、(c)好ましくは、既知の量もしくは濃度のキエシンQ6および/またはそのフラグメントならびに場合によって、既知の量もしくは濃度の上記の１以上のその他のバイオマーカー(例えば対照、標準物質および/または校正物質として用いるため)と、(d)好ましくは、キエシンQ6の量および場合によって上記の１以上のその他のバイオマーカーの存在もしくは非存在および/または量の参照プロフィール、あるいは上記の参照プロフィールを確立するための手段とを含む、本明細書で教示する疾患または状態の診断、予測および/または予後のためのキットも開示される。(a)、(b)および/または(c)の下での上記の成分は、本明細書の他の場所で教示するように、適切に標識され得る。
【００６７】
本明細書で教示する疾患または状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのための本明細書に記載するキットの使用がさらに開示される。
【００６８】
本明細書に関するキエシンQ6および場合によって１以上のその他のバイオマーカーを測定するために有用な試薬およびツールも開示される。
よって、(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメント、好ましくは既知の量もしくは濃度のキエシンQ6および/またはそのフラグメントと、(b)場合によって、好ましくは、１以上のその他のバイオマーカー、好ましくは既知の量もしくは濃度の上記の１以上のその他のバイオマーカーとを含む、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドアレイまたはマイクロアレイが開示される。
(a) キエシンQ6および/またはそのフラグメントに特異的に結合できる１以上の結合物質、好ましくは既知の量もしくは濃度の上記の結合物質と、(b)場合によって、好ましくは、１以上のその他のバイオマーカーに特異的に結合できる１以上の結合物質、好ましくは既知の量もしくは濃度の上記の結合物質とを含む結合物質アレイまたはマイクロアレイも開示される。
【００６９】
ポータブルデバイス、例えばベッドサイドデバイスとして構成された、家庭または臨床的状況で用いるための本明細書で教示するキットも開示される。
【００７０】
関連する態様は、よって、(i)対象者から試料を得るための手段と、(ii)上記の試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を測定するための手段と、(iii)試料中の測定されたキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を可視化するための手段とを含む、対象者からの試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を測定できるポータブル試験デバイスを提供する。
ある実施形態において、(ii)および(iii)の部分の手段は、同じであってよく、よって、(i)対象者から試料を得るための手段と、(ii)上記の試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を測定し、試料中で測定されたキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を可視化するための手段とを含む、対象者からの試料中のキエシンQ6および/またはそのフラグメントの量を測定できるポータブル試験デバイスを提供する。
【００７１】
ある実施形態において、上記の可視化する手段は、試料中のキエシンQ6および/もしくはフラグメントの量が、ある閾値レベル未満であるか、ならびに/または試料中のキエシンQ6および/またはフラグメントの量が、キエシンQ6および/またはフラグメントの量の参照値から逸脱するか否か(該参照値は、本明細書で教示する疾患もしくは状態の既知の診断、予測および/または予後を表す)を示すことができる。よって、ポータブル試験デバイスは、上記の参照値または参照値を確立するための手段も適切に含むことができる。
【００７２】
ある実施形態において、閾値レベルは、上記の閾値レベル未満の試料中のキエシンQ6および/またはフラグメントの量が、対象者が各疾患もしくは状態を有するかまたは有する危険性にあることを示すかあるいは対象者におけるそのようなものの悪い予後を示し、上記の閾値レベルを超える試料中のキエシンQ6および/またはフラグメントの量が、対象者が本明細書で教示する疾患もしくは状態を有さないかまたは有する危険性にないことを示すかあるいは対象者におけるそのようなものの良好な予後を示すように選択される。
【００７３】
本明細書で規定する任意の１つの実施形態において、用語「マーカーのレベルを測定する」とは、タンパク質およびRNAレベルの両方についての存在および/またはレベルを測定することを包含する。
【００７４】
本発明のその他の態様は、本明細書で開示するマーカーが、特に、限定されないが、HDP、好ましくはPEを含む本明細書で教示する疾患および状態における治療的および/または予防的介入について価値のある標的であり得ることを実現することに関する。
非PE対象者に対してPE対象者においてキエシンQ6のレベルが低減していることが明らかであるので、本発明は、キエシンQ6タンパク質、遺伝子、mRNAもしくはcDNAおよび/またはそのフラグメントの治療的使用、ならびに/あるいはPEの処置、すなわち危険性がある対象者におけるPEイベントの出現の防止において用いるための上記のキエシンQ6の豊富さ、安定性もしくは発現を増加する物質も企図する。
【００７５】
本発明は、医薬品として用いるため、好ましくは本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置および/または防止において用いるための、キエシンQ6のレベルおよび/または活性もしくは安定性を増加できる物質であって、特に、上記の状態または疾患が、HDP、好ましくはPEから選択され得る物質をさらに提供する。
本発明は、医薬品として用いるため、好ましくは本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置および/または防止において用いるための、核酸、例えばキエシンQ6をコードする遺伝子、またはキエシンQ6ポリペプチドもしくはタンパク質であって、特に、上記の状態または疾患が、HDP、好ましくはPEから選択され得るものをさらに提供する。
【００７６】
本発明は、本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置および/または防止のための医薬品の製造のための、上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の使用であって、特に、上記の状態または疾患が、HDP、好ましくはPEから選択され得る使用をさらに提供する。
本発明は、本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置および/または防止のための、上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の使用であって、特に、上記の状態または疾患が、HDP、好ましくはPEから選択され得る使用をさらに提供する。
【００７７】
本発明は、対象者に、治療的または予防的有効量の上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質を投与することを含む、処置を必要とする対象者において本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態を処置および/または防止するための方法であって、特に、上記の状態または疾患が、HDP、好ましくはPEから選択され得る方法をさらに提供する。
本発明は、本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置および/または防止のための医薬品の製造のための、上記で規定されるキエシンQ6のレベルおよび/または活性もしくは安定性を増加できる物質の使用、あるいは本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の処置において用いるための上記で規定されるキエシンQ6のレベルおよび/または活性もしくは安定性を増加できる物質をさらに提供する。
【００７８】
本発明は、対象者に、治療的または予防的有効量の上記で規定されるキエシンQ6のレベルおよび/または活性もしくは安定性を増加できる物質を投与することを含む、処置を必要とする対象者において本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態を処置する方法をさらに提供する。
【００７９】
本発明は、試験物質の群から、本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態を処置および/または防止することにおいて潜在的に有用な候補物質を選択するアッセイであって、試験物質が、キエシンQ6のレベル、活性および/または安定性を増加できるかを決定することを含むアッセイをさらに提供する。上記のアッセイは、選択された候補物質の、非ヒト動物モデル、好ましくは非ヒト哺乳類モデルに投与するための組成物の調製のため、および該モデルにおいて本明細書で教示する任意の１つの疾患もしくは状態の、その予防的および/または治療的効果をモニタリングするための使用をさらに場合によって含み得る。
【００８０】
本発明は、上記のアッセイにより単離される物質をさらに提供する。
【００８１】
本発明は、予防的および/または治療的有効量の上記で規定されるキエシンQ6のレベルおよび/または活性もしくは安定性を増加できる１以上の物質またはその医薬的に許容されるＮオキサイド形、付加塩、プロドラッグもしくは溶媒和物と、１以上の医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物または製剤をさらに提供する。
【００８２】
本発明は、上記の１以上の物質を、上記の１以上の医薬的に許容される担体と混和することを含む、上記の医薬組成物または製剤を製造する方法をさらに提供する。
本明細書で規定する実施形態の任意の１つにおいて示す状態または疾患は、特に、HDP、好ましくはPEから選択できる。
【００８３】
よって、(a)１以上、好ましくは複数の試験結合物質を準備することと、(b) (a)の試験結合物質から、キエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質に結合するものを選択することと、(c) (b)で選択された試験結合物質から、いずれかの１以上のその他の、意図しないもしくは所望しない標的と結合するものを逆選択(すなわち除去)することとを含む、キエシンQ6核酸、例えば遺伝子またはポリペプチドもしくはタンパク質に特異的に結合できる物質を選択するための方法(スクリーニングアッセイ)も意図される。
試験結合物質と上記の１以上の核酸またはタンパク質との間の結合は、有利には、上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質を、試験結合物質と、そのような結合を一般的に行うことができる条件下で接触させる(すなわち組み合わせる、曝露するまたはインキュベートする)ことにより試験できる。例えば、そして限定することなく、試験結合物質とキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質との間の結合は、インビトロで適切に試験できるか、あるいは上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質を含む宿主細胞または宿主生物において試験でき、試験結合物質に曝露するかまたは試験結合物質を発現するように構成される。
【００８４】
限定することなく、結合物質または調節物質は、キエシンQ6核酸、ポリペプチドもしくはタンパク質と結合できるかまたは上記の核酸、ポリペプチドもしくはタンパク質の活性および/またはレベルをインビトロ、細胞、器官および/または生物において調節できる。
【００８５】
上記のスクリーニングアッセイにおいて、試験調節物質によるキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の活性および/またはレベルの調節は、有利には、上記の核酸、ポリペプチドまたはタンパク質(例えば遺伝子またはタンパク質)を、試験調節物質と、そのような調節を一般的に行うことができる条件下で接触させる(すなわち組み合わせる、曝露するまたはインキュベートする)ことにより試験できる。例えば、そして限定することなく、上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドもしくはタンパク質の活性および/またはレベルの調節が、上記の１以上の核酸またはタンパク質への試験調節物質の結合に起因する場合、上記の条件は、そのような結合のために一般的に用いることができる(conductive)。例えば、そして限定することなく、試験調節物質による上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドもしくはタンパク質の活性および/またはレベルの調節は、インビトロで適切に試験できるか、あるいは上記のキエシンQ6核酸、ポリペプチドまたはタンパク質を含む宿主細胞または宿主生物において試験でき、試験結合物質に曝露するかまたは試験結合物質を発現するように構成される。
【００８６】
本発明の上記のおよびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下の部分および添付の特許請求の範囲に記載される。
添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】キエシンQ6アイソフォーム１の核酸(Ａ) (配列番号１)およびアミノ酸(Ｂ) (配列番号２)の配列を示す。
【図２】キエシンQ6アイソフォーム２の核酸(Ａ) (配列番号３)およびアミノ酸(Ｂ) (配列番号４)の配列を示す。
【図３】キエシンQ6のアイソフォーム１(配列番号２)および２(配列番号４)のアミノ酸配列間の差を示す。アイソフォーム２において欠けているＣ末端部分を、小文字で示す。選択されたMASSterclass(登録商標)定量ペプチド(pept110 -太字、二重下線、配列番号５)も示す。MASSterclass(登録商標)ペプチドは、キエシンQ6の両方のアイソフォームを定量できる。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
本明細書で用いる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、単数形および複数形の両方の言及を含む。
用語「含む(comprising)」、「含み(comprises)」および「含む(comprised of)」は、本明細書で用いる場合、「含む(including)」、「含み(includes)」または「含有する(containing)」、「含有し(contains)」と同義であり、包括的または開放的であり、追加の言及していないメンバー、要素または方法ステップを排除しない。この用語は、「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」も包含する。
【００８９】
終点による数値範囲の言及は、それぞれの範囲内に包摂される全ての数値および画分ならびに言及される終点を含む。
【００９０】
「約」との用語は、パラメータ、量、時間的な期間などのような測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる場合、特定の値のおよび特定の値から、特に特定の値のおよび特定の値から+/-10%以下、好ましくは+/-５%以下、より好ましくは+/-１%以下、さらにより好ましくは+/-0.1%以下の変動(そのような変動を開示する発明において行うことが適当である限り)を包含することを意味する。修飾語「約」が言及する値は、それ自体、具体的および好ましく開示されることが理解される。
用語「１以上」、例えばメンバーの群の１以上のメンバーが、さらなる例示によりそれ自体明確である場合、この用語は、なかでも、上記のメンバーの任意の１つ、または上記のメンバーの２以上、例えば上記のメンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６もしくは≧７および上記のメンバーの全てまでについての言及を包含する。
【００９１】
本明細書で引用する全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
そうでないと記載しない限り、技術的および科学的用語を含む本発明を開示するために用いる全ての用語は、本発明が属する当該技術の当業者により一般的に理解される意味を有する。さらなる手引きにより、本発明の教示をよりよく認識するために用語の定義を含め得る。
【００９２】
本発明者らは、キエシンQ6を、特に妊娠の高血圧障害(HDP)、例えば好ましくは妊娠高血圧腎症(PE)についての価値のあるバイオマーカーとして同定した。
【００９３】
用語「バイオマーカー」は、当該技術において広く用いられており、対象者におけるその定性的および/または定量的評価が、例えば所定の疾患または状態についての対象者の現状に関する対象者の表現型および/または遺伝子型の１以上の側面を予測させるまたは情報を与える(例えば予測的、診断的および/または予後的)である生体分子および/またはその検出可能部分のことを広く示す。好ましくは、本明細書で意図するバイオマーカーは、ペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質に基づく。用語「バイオマーカー」および「マーカー」は、本明細書において交換可能に用いることができる。
【００９４】
「本明細書で教示する疾患および/または状態」についての本明細書における言及または同様の言及は、そのような詳述の文脈に矛盾しない限り、特に、限定されないが、妊娠の高血圧障害、好ましくは妊娠高血圧腎症を含む本明細書で開示する任意のそのような疾患および状態を包含する。
【００９５】
妊娠の高血圧障害(HDP)は、妊娠中および分娩後(例えば分娩後12週目まで)の高血圧と関連する疾患および状態の不均質な集まりを含む。
HDPは、簡便には以下のように分類できる：
I. 妊娠誘導性高血圧
a. 蛋白尿または(全身性)浮腫なし
b. 蛋白尿または(全身性)浮腫あり(すなわち妊娠高血圧腎症)
i. 軽度
ii. 重度
c. 子癇
II. 同時発生高血圧(慢性高血圧)
III. 妊娠により悪化する高血圧(妊娠悪化型高血圧)
a. 混合型妊娠高血圧腎症
b. 混合型子癇
【００９６】
最近の研究は、PEを軽度または重度とはもはや分類しないことがあるが、代わりに、妊娠期間、好ましくは：a.早期発症型(すなわち臨床所見＜妊娠34週目); b.早産型(すなわち臨床所見＞妊娠34および＜37週目); c.満期産型(すなわち臨床所見≧妊娠37週目)に基づいてPE群を同定することがある。
【００９７】
HPDは、そうでなければ、既存型または妊娠性として分類されることがあり、妊産婦または胎児の症状、徴候または試験結果がそれを必要とするならば、いずれのカテゴリーにも「妊娠高血圧腎症を伴う」を場合によって加える。
【００９８】
妊娠の非蛋白尿性高血圧は、簡便に、４時間を超える間隔、例えば約４時間〜約168時間の間隔での２回の別々の機会に測定される収縮期BP≧140 mmHgおよび/または拡張期BP≧90 mmHgの血圧として定義できる。妊娠前に高血圧が測定されたかまたは妊娠20週目前に測定される場合、これを慢性高血圧と一般的にいうことができる。以前は正常血圧の妊娠20週目以降の女性において高血圧が測定される場合、これを妊娠誘導性高血圧ということができる。典型的には、妊娠誘導性高血圧は、分娩後12週目までに消散する。少なくとも140/90 mmHgの血圧が測定されるが、６時間より長く持続しない場合、これを一過性高血圧ということができる。
【００９９】
妊娠の蛋白尿性高血圧は、前の段落において定義されるように、24時間尿採集における≧300 mgの総タンパク質をさらに伴うことがある。
HDPは、当該技術において妊娠性高血圧、軽度妊娠高血圧腎症、妊娠誘導性高血圧、妊娠特異的高血圧、妊娠中毒症などと一般的に言われる疾患および状態も包含する。
【０１００】
用語「妊娠期間」、「妊娠の期間」および同様の用語は、当該技術において普及しており、女性の最後の月経期間の第１日目からの週で測定される時間のことを一般的にいう。正常妊娠のヒトの妊娠は、約38〜42週の間、好ましくは約40週である。
【０１０１】
「妊娠高血圧腎症」(PEまたは妊娠高血圧腎症)は、一般的に、蛋白尿もしくは浮腫またはその両方を伴う高血圧を特徴とする妊娠に関連した疾患または状態のことをいう。PEは、糸球体機能不全、脳浮腫、肝浮腫、凝固異常および/またはその他の合併症も伴うことがある。
PEは、以下の徴候および症状のある組み合わせとして簡便に定義されることがある：
(1) 妊娠20週目後に収縮期血圧(BP)≧140 mmHgおよび/または拡張期BP≧90 mmHg (一般的に、４時間を超える間隔、例えば約４〜約168時間間隔の２回の機会に測定される)、
(2) 妊娠20週目後に新しく発症した蛋白尿(検尿ディップスティックの１+、24時間尿採取において≧300 mgのタンパク質、またはタンパク質/クレアチニン比≧0.3を有する１回の無作為の尿試料)、および
(3)分娩後12週目までの高血圧および蛋白尿の消散、
例えば特に高血圧と蛋白尿との組み合わせ。
【０１０２】
重度PEは、簡便に、以下のように定義されることがある：
(1) 収縮期BP≧160 mmHgまたは拡張期BP≧110 mmHg (一般的に、４時間を超える間隔、例えば約４〜約168時間間隔の２回の機会に測定される)、あるいは
(2) 24時間尿採取において≧3.5 gの測定またはディップスティックにより少なくとも３+タンパク質を有する２回の無作為の尿検体を特徴とする蛋白尿。
【０１０３】
PEでは、高血圧および蛋白尿は、一般的に、互いに７日間以内で出現する。重度PEでは、重度高血圧、重度蛋白尿またはHELLP症候群(溶血、肝臓酵素の上昇、低血小板)または子癇が、同時にまたは一度に１つの症状のみが出現し得る。
時折、重度PEは、てんかんの発生、すなわち子癇を導き得る。子癇は、肝臓(例えば肝細胞損傷、門脈周囲壊死)および中枢神経系(例えば大脳浮腫および脳出血)のようないくつかの器官または組織への機能不全または損傷も含み得る。
よって、HDPは、なかでも軽度PE、重度PEならびにさらなる合併症、子癇およびHELLP症候群を伴うPEを含む、当該技術においてPEと一般的にいわれる疾患および状態も包含する。
【０１０４】
用語「予測する」または「予測」、「診断する」または「診断」および「予後予測する」または「予後」は、医療および臨床のプラクティスにおいてありふれておりよく理解されている。所定の疾患または状態の「診断、予測および/または予後のための方法」との句は、上記の疾患もしくは状態を「診断、予測および/または予後予測するための方法」または上記の疾患もしくは状態の「診断、予測および/または予後を行う(または決定するもしくは確立する)方法」などと交換可能に用いることもできることが理解される。
【０１０５】
さらなる説明によりそして限定することなく、「予測する」または「予測」は、一般的に、疾患もしくは状態を(まだ)有していない対象者における該疾患もしくは状態の事前の宣言、表示または予告のことをいう。例えば、対象者における疾患または状態の予測は、例えばある期間以内またはある年齢までに上記の疾患または状態を対象者が発生する可能性、見込みまたは危険性を示し得る。上記の可能性、見込みまたは危険性は、なかでも、絶対値、範囲もしくは統計値として示すことができるか、または適切な対照対象者もしくは対象者集団に対して(例えば一般的、正常もしくは健常対象者または対象者集団に対して)示すことができる。よって、対象者が疾患または状態を発生する可能性、見込みまたは危険性は、適切な対照対象者もしくは対象者集団に対する増加もしくは減少または倍数増加もしくは倍数減少として有利に示すことができる。本明細書で用いる場合、対象者における本明細書で教示する状態または疾患の「予測」との用語は、対象者がそのようなものの「陽性」の予測を有する、すなわち対象者がそのようなものを有する危険性にある(例えば危険性が対照対象者または対象者集団に対して著しく増加している)ことも特に意味し得る。対象者における本明細書で記載する本明細書で教示する疾患または状態が「ないことの予測」との用語は、対象者がそのようなものの「陰性」の予測を有する、すなわちそのようなものを有する対象者の危険性が、対照対象者または対象者集団に対して著しく増加していないことを特に意味し得る。
【０１０６】
用語「診断する」または「診断」は、一般的に、症状および徴候ならびに/または様々な診断手順の結果(例えば診断される疾患または状態に特徴的な１以上のバイオマーカーの存在、非存在および/または量を知ることから)に基づいて対象者における疾患または状態について認識、決定または結論付けるプロセスまたは動作のことをいう。本明細書で用いる場合、対象者における本明細書で教示する疾患または状態の「診断」は、対象者がそのようなものを有すること、すなわち対象者がそのようなものを有すると診断することを特に意味し得る。対象者における本明細書で教示する疾患または状態が「ないことの診断」は、対象者がそのようなものを有さないこと、すなわち対象者がそのようなものを有さないと診断することを特に意味し得る。対象者は、そのようなものを思い起こさせる１以上の通常の症状または徴候を示すにもかかわらず、そのようなものを有さないと診断されることがある。
【０１０７】
用語「予後予測する」または「予後」は、一般的に、疾患または状態の進行および回復の見通し(例えば可能性、持続期間および/または程度)についての予想のことをいう。本明細書で教示する疾患または状態の良好な予後は、一般的に、好ましくは許容可能な期間内での疾患または状態からの満足のいく部分的または完全な回復の予想を包含し得る。そのようなものの良好な予後は、より一般的には、好ましくは所定の期間内でのそのようなもののさらなる悪化(worsening)または悪化(aggravating)がないとの予想を包含し得る。本明細書で教示する疾患または状態の悪い予後は、一般的に、標準以下の回復および/または満足でない遅い回復あるいは実質的に回復がないことまたはそのようなものがさらに悪化することの予想を包含し得る。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、用語「対象者」または「患者」は、典型的にヒトのことをいうが、非ヒト動物、好ましくは温血動物、より好ましくは胎生動物、さらにより好ましくは哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどについての言及も包含し得る。女性対象者、より具体的には妊娠しているまたは分娩後の女性対象者を特に意図する。
【０１０９】
用語「試料」または「生体試料」は、本明細書で用いる場合、対象者から得られた任意の生物学的検体を含む。試料は、限定することなく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球(例えば末梢血単核球)、唾液、尿、便(すなわち糞便)、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、乳管洗浄液、腫瘍浸出液、滑液、脳脊髄液、リンパ、穿刺吸引液、羊水、任意のその他の体液、細胞可溶化物、細胞分泌生成物、炎症液、膣分泌液または好ましくは胎盤生検のような生検を含み得る。好ましい試料は、本明細書で教示するタンパク質のような任意の１以上のマーカーを検出可能な量で含むものを含み得る。好ましい実施形態において、試料は、全血またはその分画成分、例えば血漿、血清または細胞ペレットであってよい。好ましくは、試料は、対象者から上記の試料を回収または単離することを可能にする最小限に侵襲性の方法により容易に得ることができる。試料は、組織試料および生検、組織ホモジネートなども含み得る。好ましくは、本明細書で教示するいずれかの１以上のマーカーのレベルを検出するために用いる試料は、血漿である。用語「血漿」は、一般的に、細胞を含有しないが、血液細胞(赤血球、白血球、血小板など)は通常懸濁されており、栄養分、糖類、タンパク質、ミネラル、酵素などを含有する血液の実質的に無色の水のような流体のことをいう。上記の試料は、尿であることも好ましい。
【０１１０】
本発明の方法の好ましい実施形態において、キエシンQ6タンパク質レベルは、血液試料、好ましくは血清試料中で、好ましくはELISAまたは質量分析法を用いて分析される。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、キエシンQ6のタンパク質レベルは、胎盤生検組織において、標準的な免疫組織化学的技術を用いて測定される。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、キエシンQ6タンパク質をコードするmRNAのレベルは、胎盤生検組織において、定量逆転写PCRなどのような高度に特異的な定量法を用いて測定される。
【０１１１】
別の好ましい実施形態において、試料は、胎盤生検であることができ、これは、妊娠に対して危険性を伴わないかもしくはほとんど伴わない既知の技術を用いて妊娠中に採取できるか、あるいは中絶もしくは分娩の場合に、妊娠が中絶もしくは完了した後に、例えば病理的もしくは診断的な目的のためまたは該対象者の将来の妊娠におけるHDP、例えばPEの出現の危険性に関する情報を得るために採取できる。
【０１１２】
分子または分析物、例えば核酸、RNA、DNAもしくはcDNA、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドは、上記の分子もしくは分析物または分子もしくは分析物の群の存在もしくは非存在および/または量が試料中で、好ましくはその他の分子および分析物を実質的に排除して検出または決定される場合に、試料中で「測定」される。
【０１１３】
用語「量(quantity)」、「量(amount)」および「レベル」は同義であり、一般的に当該技術においてよく理解されている。これらの用語は、本明細書で用いる場合、特に、試料中の分子もしくは分析物の絶対量または試料中の分子もしくは分析物の相対量、すなわち別の値に対する量、例えば本明細書で教示する参照値もしくはバイオマーカーのベースライン発現を示す値の範囲に対する量のことをいうことがある。これらの値または範囲は、単一の患者または患者の群から得ることができる。
試料中の分子または分析物の絶対量は、有利には、重量もしくはモル量、またはより一般的には濃度、例えば容量あたりの重量もしくは容量あたりのモルで表すことができる。
試料中の分子または分析物の相対量は、有利には、上記の別の値に対する、例えば本明細書で教示する参照値に対する増加もしくは減少または倍数増加もしくは倍数減少として表すことができる。第１パラメータと第２パラメータ(例えば第１の量と第２の量)との間の相対比較を行うことは、まず、上記の第１および第２パラメータの絶対値を決定することを必要とすることがあるが、必ずしも必要でない。例えば、測定方法は、上記の第１および第２パラメータについての定量可能な読み出し(例えばシグナル強度)を生成でき、上記の読み出しは、上記のパラメータの値の関数であり、上記の読み出しは、該読出しを各パラメータの絶対値にまず変換することを実際に必要とせずに、第１パラメータ対第２パラメータについての相対的な値を生成するように直接比較できる。
【０１１４】
本明細書で用いる場合、任意の１つのマーカー(バイオマーカー)、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質についての言及は、当該技術におけるそれぞれの明示の下で一般的に知られるマーカー、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に相当する。これらの用語は、見出される任意の生物、特に動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトのそのようなマーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチドを包含する。これらの用語は、天然の配列を有するそのようなマーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチド、すなわち１次配列が天然で見出されるかまたは天然に由来するマーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチドのものと同じであるものを包含する。当業者は、天然配列が、異なる種の間でこのような種の間の遺伝子分岐により異なることがあることを理解している。さらに、天然配列は、同じ種の異なる個体の間または個体のうちで、所定の種内の通常の遺伝子多様性(変動性)により異なることがある。また、天然配列は、同じ種の異なる個体の間または個体のうちでさえ、転写後または翻訳後修飾により異なることがある。マーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチドのこのようなバリアントまたはアイソフォームはいずれも、本明細書において意図する。よって、天然で見出されるかまたは由来するマーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチドの全ての配列は、「天然」であるとみなされる。これらの用語は、生体、器官、組織もしくは細胞の一部分を形成する場合、生体試料の一部分を形成する場合、およびそのような起源から少なくとも部分的に単離されている場合のマーカー、核酸、タンパク質およびポリペプチドを包含する。これらの用語は、組換えまたは合成の手段により生成されるタンパク質およびポリペプチドも包含する。
【０１１５】
本明細書で用いる場合、用語「キエシンQ6」、「QSOX1」および「スルフヒドリルオキシダーゼ１」は同義であり、当該技術においてこれらの名称のもとで一般的に知られているタンパク質およびポリペプチドのことをいう。これらの用語は、見出される任意の生物、特に動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトのこのようなタンパク質およびポリペプチドを包含する。これらの用語は、特に、天然配列を有するこのようなタンパク質およびポリペプチド、すなわち１次配列が天然で見出されるかまたは由来するキエシンQ6のものと同じであるものを包含する。当業者は、キエシンQ6の天然配列が、異なる種の間で、そのような種の間の遺伝子分岐により異なることがあることを理解している。さらに、キエシンQ6の天然配列は、同じ種の異なる個体の間または個体のうちで、所定の種内の通常の遺伝子多様性(変動性)により異なることがある。また、キエシンQ6の天然配列は、同じ種の異なる個体の間または個体のうちでさえ、転写後または翻訳後修飾により異なることがある。よって、天然で見出されるかまたは由来する全てのキエシンQ6配列は、「天然」であるとみなされる。これらの用語は、生体、器官、組織もしくは細胞の一部分を形成する場合、生体試料の一部分を形成する場合、およびそのような起源から少なくとも部分的に単離されている場合のキエシンQ6タンパク質およびポリペプチドを包含する。これらの用語は、組換えまたは合成の手段により生成される場合のタンパク質およびポリペプチドも包含する。
【０１１６】
例示的なキエシンQ6は、限定することなく、アイソフォーム１(acc. no. O00391-1)およびアイソフォーム２(O00391-2) (選択的スプライシングにより生じる)を含む、Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/)アクセッション番号O00391 (2009年１月20日に改訂されたエントリーバージョン69; 2001年６月１日に創出された配列バージョン３)の下でアノテートされる１次アミノ酸配列を有するヒトキエシンQ6を含む。キエシンQ6の上記のアイソフォーム１および２の配列は、それぞれ図1A (配列番号１)および図1B (配列番号２)に示す。図２は、上記のアイソフォーム１と２との間のＣ末端領域における違いを示す。当業者は、上記の配列がキエシンQ6の前駆体のものであり、成熟キエシンQ6からプロセシングされて除かれる部分を含み得ることも認識できる。例えば、アイソフォーム１配列を参照して、Uniprot/Swissprotエントリーは、アミノ酸１〜29で構成されるシグナルペプチドを明記している。例示的なヒトキエシンQ6は、なかでも、Coppockら1998 (Genomics 54: 460〜468)によっても記載されている。
【０１１７】
本明細書におけるキエシンQ6への言及は、キエシンQ6のフラグメントも包含し得る。よって、本明細書におけるキエシンQ6の測定またはキエシンQ6の量の測定への言及は、キエシンQ6タンパク質もしくはポリペプチドの測定(例えばキエシンQ6の成熟アイソフォーム１および/またはアイソフォーム２の測定)および/またはキエシンQ6の１以上のフラグメントの測定を包含し得る。例えば、キエシンQ6および/またはその１以上のフラグメントは、集合的に測定でき、測定された量は、集合的に測定した種の合計量に相当する。別の例では、キエシンQ6および/またはその１以上のフラグメントは、それぞれ個別に測定できる。
【０１１８】
本明細書における任意の生体分子、例えばマーカー(バイオマーカー)、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質への言及は、そのフラグメントも包含し得る。よって、本明細書における任意の１つのマーカーまたは生体分子の測定(または量の測定)は、マーカーまたは生体分子の測定、例えばマーカーもしくは生体分子の成熟および/またはプロセシングされた可溶化された/分泌された形(例えば血漿循環形)の測定ならびに/あるいはその１以上のフラグメントの測定を包含し得る。
例えば、任意のマーカーもしくは生体分子および/またはその１以上のフラグメントは、集合的に測定でき、測定された量は、集合的に測定した種の合計量に相当する。別の例では、任意のマーカーもしくは生体分子および/またはその１以上のフラグメントは、それぞれ個別に測定できる。好ましくは、上記のフラグメントは、血漿循環(すなわち細胞結合型または膜結合型でない)形であり得る。いずれの理論に結び付けられることなく、このような循環形は、天然プロセシングにより全長マーカーもしくは生体分子から導くことができるか、または試料中において生じる既知の分解プロセスに起因し得る。あるいくつかの状況では、循環形は、血漿中に循環していることが見出される全長マーカーまたは生体分子でもあり得る。上記の「循環形」は、よって、試料中に循環している、すなわち該試料の細胞画分または膜画分に結合していない任意のマーカーもしくは生体分子またはその任意のプロセシングされた可溶化形あるいはいずれかのフラグメントであり得る。
【０１１９】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書における任意の生体分子、例えばマーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質への言及は、見出される任意の生物、特に好ましくは動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトからのそのようなものを包含する。
【０１２０】
さらに、文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書における任意のマーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントへの言及は、例えばリン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへのメチオニンの酸化などを含む発現後修飾を有するような上記のマーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾形も包含する。
【０１２１】
ある実施形態において、任意のマーカー、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質およびそのフラグメントまたは本明細書で用いるその他のバイオマーカーもしくはそのフラグメントは、ヒトであり得、すなわち、それらの１次配列が、天然に生じるヒトマーカー、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の対応する１次配列または天然に生じるヒトマーカー、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に存在する対応する１次配列と同じであり得る。よって、この関係における「ヒト」との修飾語は、それらの起源または供給源よりもむしろ各マーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはフラグメントの１次配列に関する。例えば、このようなマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはフラグメントは、ヒト対象者の試料に存在するかもしくはそこから単離されてよいか、またはその他の手段により得ることができる(例えば組換え発現、無細胞翻訳または非生物学的ペプチド合成により)。
【０１２２】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「フラグメント」との用語は、一般的に、上記のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＮ末端および/もしくはＣ末端欠失または短縮形のことをいう。この用語は、任意の機構、例えば、限定されないが、上記のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の選択的翻訳、エキソおよび/またはエンドタンパク質分解および/あるいは分解、例えばインビボまたはインビトロでの、例えば物理的、化学的および/または酵素的タンパク質分解により生じるフラグメントを包含する。限定することなく、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのフラグメントは、該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５%または少なくとも約10%、例えば≧20%、≧30%もしくは≧40%、例えば≧50%、例えば≧60%、≧70%もしくは≧80%、または≧90%もしくは≧95%さえ表し得る。
例えば、フラグメントは、対応する全長タンパク質の≧５連続アミノ酸の配列、または≧10連続アミノ酸、または≧20連続アミノ酸、または≧30連続アミノ酸、例えば≧40連続アミノ酸、例えば≧50連続アミノ酸、例えば≧60、≧70、≧80、≧90、≧100、≧200、≧300、≧400、≧500もしくは≧600連続アミノ酸を含み得る。
【０１２３】
ある実施形態において、フラグメントは、対応する成熟全長タンパク質またはその可溶化もしくは血漿循環形と比較して、１〜約20の間のアミノ酸、例えば１〜約15の間のアミノ酸、または１〜約10の間のアミノ酸、または１〜約５の間のアミノ酸がＮ末端および/またはＣ末端で短縮され得る。
ある実施形態において、所定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのフラグメントは、上記のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのインビトロタンパク質分解により達成して、有利に検出可能なペプチドを試料から得ることができる。例えば、このようなタンパク質分解は、適切な物理的、化学的および/または酵素的な物質、例えばプロテイナーゼ、好ましくはエンドプロテイナーゼ、すなわちタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド鎖の内部を切断するプロテアーゼにより行うことができる。適切なエンドプロテイナーゼの非限定的なリストは、セリンプロテイナーゼ(EC 3.4.21)、トレオニンプロテイナーゼ(EC 3.4.25)、システインプロテイナーゼ(EC 3.4.22)、アスパラギン酸プロテイナーゼ(EC 3.4.23)、メタロプロテイナーゼ(EC 3.4.24)およびグルタミン酸プロテイナーゼを含む。例示的な非限定的なエンドプロテイナーゼは、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、リソバクター・エンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes)エンドプロテイナーゼLys-C、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)エンドプロテイナーゼGlu-C (エンドペプチダーゼV8)またはクロストリジウム・ヒストリティカム(Clostridium histolyticum)エンドプロテイナーゼArg-C (クロストリパイン)を含む。さらなる既知のまたはまだ同定されていない酵素を用いることができる。当業者は、それらの切断特異性および頻度に基づいて適切なプロテアーゼを選択して、所望のペプチド形を達成できる。好ましくは、タンパク質分解は、トリプシン型のエンドペプチダーゼ(EC 3.4.21.4)、好ましくはトリプシン、例えば、限定されないが、ウシ膵臓、ヒト膵臓、ブタ膵臓からのトリプシン、組換えトリプシン、Lys-アセチル化トリプシン、可溶化トリプシン、固体支持体に固定化されたトリプシンなどのトリプシンの調製物により行うことができる。トリプシンは、なかでも、高い特異性および切断の効率から特に有用である。本発明は、任意のトリプシン様プロテアーゼ、すなわちトリプシンのものと同様の特異性を有するプロテアーゼの使用も包含する。そうでなければ、化学試薬をタンパク質分解のために用いることができる。例えば、CNBrは、Metにて切断でき、BNPS-スカトールは、Trpにて切断できる。処理についての条件、例えばタンパク質濃度、酵素または化学試薬の濃度、pH、バッファー、温度、時間は、用いる酵素または化学試薬に依存して当業者が決定できる。
【０１２４】
特定の成分(例えば核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはそのフラグメント)に関する「単離」との用語は、一般的に、そのような成分がその天然の環境の１以上のその他の成分から分離されて存在する(例えばそれらから分離されたまたは分離されて調製された)ことをいう。例えば、単離ヒトまたは動物核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントは、それが天然に生じるヒトまたは動物の体から分離されて存在する。
用語「単離」は、本明細書で用いる場合、好ましくは、修飾語「精製」も包含できる。本明細書で用いる場合、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/またはそのフラグメントに関する「精製」との用語は、絶対的な純粋性を必要としない。代わりに、これは、そのような核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/またはフラグメントが、その他のタンパク質に対するそれらの豊富さ(簡便には、質量または重量または濃度の点で表される)が生体試料中よりも大きい孤立環境にあることをいう。孤立環境とは、単一媒体、例えば単一溶液、ゲル、沈殿物、凍結乾燥物などのことをいう。精製核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントは、例えば実験室または組換え合成、クロマトグラフィー、調製電気泳動、遠心分離、沈殿、親和性精製などを含む既知の方法により得ることができる。
【０１２５】
精製タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/またはフラグメントは、好ましくは、重量で、孤立環境のタンパク質含量の≧10%、より好ましくは≧50%、例えば≧60%、さらにより好ましくは≧70%、例えば≧80%、さらにより好ましくは≧90%、例えば≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%または100%さえを構成できる。タンパク質含量は、例えばLowry法(Lowryら1951. J Biol Chem 193: 265)、場合によってHartree 1972 (Anal Biochem 48: 422〜427)により記載されるようにして決定できる。また、ペプチドまたはポリペプチドの純度は、クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる還元または非還元条件下でのSDS-PAGEにより決定できる。
【０１２６】
検出可能な標識を含む本明細書で教示するキエシンQ6または任意のその他の単離マーカー、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質およびそのフラグメントがさらに開示される。このことにより、そのようなフラグメントの容易な検出が容易になる。用語「標識」は、本明細書を通して用いる場合、検出可能で好ましくは定量可能な読み出しまたは特性を提供するために用いることができ、興味対象の実体に結合できるかもしくはその一部分を形成できる任意の原子、分子、部分または生体分子、例えばペプチドもしくはポリペプチドまたは特異的結合物質のことをいう。標識は、質量分析、分光光学、光学、比色、磁気、光化学、生化学、免疫化学または化学的手段により適切に検出可能であり得る。標識は、限定されないが、色素；放射性標識、例えば32P、33P、35S、125I、131I；高電子密度試薬；酵素(例えばイムノアッセイにおいて通常用いられるようなセイヨウワサビホスファターゼ(phosphatise)またはアルカリホスファターゼ(phosphatise))；結合部分、例えばビオチン-ストレプトアビジン；ハプテン、例えばジゴキシゲニン；発光性、リン光性もしくは発蛍光性部分；マスタグ；および単独または蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)により発光スペクトルを抑制もしくはシフトできる部分と組み合わせた蛍光色素を含む。
【０１２７】
例えば、標識は、質量変更標識(mass-altering label)であり得る。好ましくは、質量変更標識は、対応する非標識ペプチドに対して、ペプチドの１以上のアミノ酸における別個の安定同位体の存在を含み得る。質量標識ペプチドは、質量分析の用途において陽性対照、標準物質および校正物質として特に有用である。特に、１以上の別個の同位体を含むペプチドは、化学的に同様であり、クロマトグラフィーおよび電気泳動により同じ方法で分離され、同じ方法でイオン化およびフラグメント化される。しかし、適切な質量分析計において、このようなペプチドおよび場合によってその選択フラグメンテーションイオンは、区別可能なm/z比を示し、よって、識別できる。区別可能な安定同位体の対の例は、HとD、12Cと13C、14Nと15Nまたは16Oと18Oを含む。通常、本発明において分析する生体試料のペプチドおよびタンパク質は、天然において高く普及している一般的な同位体、例えばH、12C、14Nおよび16Oだけを実質的に含有し得る。そのような場合、質量標識ペプチドを、天然において普及が低い１以上の一般的でない同位体、例えばD、13C、15Nおよび/または18Oで標識できる。生体試料のペプチドまたはタンパク質が１以上の一般的でない同位体を含む場合に、質量標識ペプチドが、それぞれの一般的な同位体を含み得ることも考えられる。
【０１２８】
同位体標識合成ペプチドは、なかでも、１以上の同位体標識アミノ酸基質を用いてそのようなペプチドを合成もしくは組換え生成することにより、または未標識のペプチドを化学的もしくは酵素的に改変することにより１以上の別個の同位体を導入して得ることができる。例えば、そして限定することなく、D標識ペプチドは、市販で入手可能な重水素化L-メチオニンCH3-S-CD2CD2-CH(NH2)-COOHまたは重水素化アルギニンH2NC(=NH)-NH-(CD2)3-CD(NH2)-COOHの存在下で合成または組換え生成できる。その重水素化または15N-もしくは13C-含有形が存在する任意のアミノ酸を、標識ペプチドの合成または組換え生成のために考慮できることが認識される。別の非限定的な例において、ペプチドを、H216OまたはH218O中でトリプシンで処理して、該ペプチドのCOOH末端に２つの酸素(それぞれ16Oまたは18O)の組み込みを導くことができる(例えばUS 2006/105415)。
【０１２９】
よって、場合によって検出可能な標識を含むキエシンQ6または本明細書で教示する任意のその他の(単離)マーカー、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質およびそのフラグメントの、上記のマーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントの定性的または定量的検出アッセイ(測定方法)における、特に対象者における本明細書で教示する疾患もしくは状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのそのような方法における(陽性)対照、標準物質または校正物質としての使用も意図する。マーカー、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、任意の形、なかでも沈殿物、真空乾燥物、凍結乾燥物、液体もしくは凍結した溶液、あるいは固相、例えば固体クロマトグラフィーマトリクスもしくはガラスもしくはプラスチックもしくはその他の適切な表面(例えばペプチドアレイおよびマイクロアレイの一部分として)に共有的または非共有的に固定化されて供給できる。ペプチドは、容易に調製でき、例えば天然供給源から単離できるかまたは組換えもしくは合成により調製できる。
【０１３０】
キエシンQ6または本明細書で教示する任意の１以上のその他の(単離)マーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントに特異的に結合できる結合物質がさらに開示される。本明細書で教示する(単離)マーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントの１つだけと特異的に結合できる結合物質も開示される。本明細書を通して意図する結合物質は、なかでも、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子を含み得る。
【０１３１】
用語「特異的に結合する」は、本明細書を通して用いる場合、物質(本明細書において「特異的結合物質」ともいう)が、１以上の所望の分子または分析物、例えば１以上の興味対象のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそのフラグメントに、無作為または無関係のその他の分子を実質的に排除して、かつ場合によって構造的に関連するその他の分子を実質的に排除して結合することを意味する。用語「特異的に結合する」は、物質がその意図する標的のみに結合することを必ずしも要求しない。例えば、物質は、結合の条件下での意図する標的についてのその親和性が、非標的分子についてのその親和性よりも少なくとも約２倍大きい、好ましくは少なくとも約５倍大きい、より好ましくは少なくとも約10倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約25倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約50倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約100倍以上大きいならば、興味対象のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/またはそのフラグメントと特異的に結合するということができる。
【０１３２】
好ましくは、物質は、その意図する標的と、KA≧１×106 M-1、より好ましくはKA≧１×107 M-1、さらにより好ましくはKA≧１×108 M-1、さらにより好ましくはKA≧１×109 M-1、さらにより好ましくはKA≧１×1010 M-1またはKA≧１×1011 M-1 (ここで、KA = [SBA_T]/[SBA][T]であり、SBAは、特異的結合物質を示し、Tは、意図する標的を示す)のそのような結合の親和性定数(KA)で結合できる。KAの決定は、当該技術において知られる方法、例えば平衡透析およびScatchardプロット解析により行うことができる。
本明細書を通して用いる特異的結合物質は、なかでも、抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子を含み得る。
【０１３３】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、その最も広い意味で用い、一般的に、任意の免疫学的結合物質のことをいう。この用語は、具体的に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価(例えば２、３またはそれより多い価数)および/または少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば２重またはそれより多い特異性の抗体)、ならびに所望の生物活性(特に、興味対象の抗原に特異的に結合する能力)を示す限り抗体フラグメント、ならびにそのようなフラグメントの多価および/または多重特異性複合体を包含する。用語「抗体」は、免疫化を含む方法により作製される抗体だけでなく、興味対象の抗原上のエピトープに特異的に結合できる少なくとも１つの相補性決定領域(CDR)を包含するように作製された任意のポリペプチド、例えば組換え発現ポリペプチドも含む。よって、この用語は、それらがインビトロまたはインビボで生成されたかにかかわらず、そのような分子に対して用いられる。
【０１３４】
抗体は、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMクラスのいずれであってもよく、好ましくはIgGクラス抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、例えば抗血清またはそれから精製される(例えば親和性精製)免疫グロブリンであってよい。抗体は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物であってよい。モノクローナル抗体は、特定の抗原または抗原内の特定のエピトープを、より大きい選択性および再現性で標的にできる。例えば、そして限定することなく、モノクローナル抗体は、Kohlerら1975 (Nature 256: 495)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製できるか、または組換えDNA法(例えばUS 4,816,567におけるような)により作製できる。モノクローナル抗体は、例えばClacksonら1991 (Nature 352: 624〜628)およびMarksら1991 (J Mol Biol 222: 581〜597)により記載される技術を用いるファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１３５】
抗体結合物質は、抗体フラグメントであってよい。「抗体フラグメント」は、その抗原結合領域または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分を含む。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab'、F(ab')2、FvおよびscFvフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多価および/または多重特異性抗体、例えばダイアボディ、トリボディおよびマルチボディを含む。上記の記載Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFvなどは、当該技術において確立されたそれらの意味を有することを意図する。
【０１３６】
抗体との用語は、任意の動物の種、例えば鳥類および哺乳動物を含む好ましくは脊椎動物の種に由来する１以上の部分を起源とするかまたは含む抗体を含む。限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラまたはキジであり得る。これもまた限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ科(例えばマウス、ラットなど)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ(例えばカメルス・バクトリアヌス(Camelus bactrianus)およびカメルス・ドロマデリウス(Camelus dromaderius))、ラマ(例えばラマ・パッコス(Lama paccos)、ラマ・グラマ(Lama glama)またはラマ・ビクナ(Lama vicugna))またはウマであり得る。
【０１３７】
当業者は、抗体が、１以上のアミノ酸の欠失、付加および/または置換(例えば保存置換)を、そのような変更が各抗原へのその結合を保存する限り含むことができることを理解している。抗体は、その構成アミノ酸残基の１以上の天然または人工的な改変(例えばグリコシル化)なども含み得る。
【０１３８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそのフラグメントを生成する方法は、当該技術において公知であり、例えば組換え抗体またはそのフラグメントを生成する方法である(例えばHarlowおよびLane, 「Antibodies: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; HarlowおよびLane, 「Using Antibodies: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; 「Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques」, Zola編, CRC Press 1987, ISBN 0849364760; 「Monoclonal Antibodies: A Practical Approach」, DeanおよびShepherd編, Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: 「Antibody Engineering: Methods and Protocols」, Lo編, Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照)。
【０１３９】
用語「アプタマー」は、ペプチドのような標的分子に特異的に結合できる１本鎖もしくは２本鎖のオリゴDNA、オリゴRNAまたはオリゴDNA/RNAあるいはその任意の類似体のことをいう。有利には、アプタマーは、それらの標的に対して相当に高い特異性および親和性を示すことができる(例えば１×109 M-1程度のKA)。アプタマー生成は、なかでもUS 5,270,163; EllingtonおよびSzostak 1990 (Nature 346: 818〜822); TuerkおよびGold 1990 (Science 249: 505〜510);または「The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications」, Klussmann編, Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592 (本明細書に参照により組み込まれる)に記載されている。用語「フォトアプタマー」は、標的分子と共有結合または架橋できる１以上の光反応性官能基を含有するアプタマーのことをいう。用語「ペプチド模倣物」は、対応するペプチドの位相幾何学的類似体である非ペプチド物質のことをいう。ペプチドのペプチド模倣物を合理的に設計する方法は、当該技術において既知である。例えば、硫酸化８マーペプチドCCK26-33に基づく３つのペプチド模倣物および11マーペプチド、サブスタンスＰに基づく２つのペプチド模倣物の合理的設計、ならびに関連するペプチド模倣物設計原理が、Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13: 132〜134)に記載されている。
【０１４０】
用語「小分子」は、製薬分野において通常用いられる有機分子のサイズに匹敵するサイズを有する化合物、好ましくは有機化合物のことをいう。この用語は、生物学的巨大分子(例えばタンパク質、核酸など)を除外する。好ましい有機小分子のサイズは、約5000 Daまで、例えば約4000まで、好ましくは3000 Daまで、より好ましくは2000 Daまで、さらにより好ましくは約1000 Daまで、例えば約900、800、700、600までまたは約500 Daまでの範囲である。
【０１４１】
よって、場合によって提示担体に結合した、本明細書で教示する任意の１以上の(単離)マーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントを用いて(すなわち免疫化抗原として用いて)、動物、例えば非ヒト動物、例えば実験動物または家畜を免疫化するための方法も開示される。免疫化および免疫血清からの抗体試剤の調製は、それ自体公知であり、本明細書の他の場所で言及する文献に記載されている。免疫化される動物は、任意の動物の種、好ましくは温血種、より好ましくは例えば鳥類、魚類および哺乳動物を含む脊椎動物種を含み得る。限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、サメ、ウズラまたはキジであり得る。これもまた限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ科(例えばマウス、ラットなど)、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ブタ、サメ、ラクダ、ラマまたはウマであり得る。用語「提示担体」または「担体」は、一般的に、第２分子に結合している場合に、該第２分子に対する免疫応答を、通常、さらなるＴ細胞エピトープを提供することにより増強する免疫原性分子のことをいう。提示担体は、(ポリ)ペプチド構造または非ペプチド構造、例えばなかでもグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣物、合成ポリマーなどであり得る。非限定的な担体の例は、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、多重C3dドメイン、破傷風毒素フラグメントＣまたは酵母Ty粒子を含む。
【０１４２】
本明細書で教示する免疫化により得られるまたは得ることができる免疫血清は、本明細書で開示する任意の１以上の(単離)マーカー、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそのフラグメントに特異的に結合する抗体試剤を作製するために特に有用であり得る。
【０１４３】
試料中のマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および/もしくはそのフラグメントならびに場合によって１以上のその他のバイオマーカーもしくはそのフラグメントの存在または非存在(例えば存在する読出し対存在しない読出し；または検出可能な量対検出不可能な量)および/または量(例えば絶対的または相対的な量である読出し、例えば絶対的または相対的な濃度)を測定するために、任意の現存する、利用可能なまたは従来の分離、検出および定量方法を本明細書において用いることができる(本明細書で教示する任意の１以上のマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびそのフラグメントを含む試料中のそのようにして測定される興味対象の任意の分子または分析物は、以下、集合的にバイオマーカーという)。
例えば、そのような方法は、イムノアッセイ法、質量分析法もしくはクロマトグラフィー法またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１４４】
用語「イムノアッセイ」は、一般的に、試料中の興味対象の１以上の分子または分析物を検出するためのそれ自体で既知の方法のことをいい、ここで、興味対象の分子または分析物についてのイムノアッセイの特異性は、特異的結合物質、一般的には抗体と、興味対象の分子または分析物との間の特異的結合による。イムノアッセイ技術は、限定することなく、直接ELISA (酵素結合免疫吸着アッセイ)、間接ELISA、サンドイッチELISA、競合ELISA、多重ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISPOT技術および当該技術において既知のその他の同様の技術を含む。これらのイムノアッセイ法の原理は、当該技術、例えばJohn R. Crowther, 「The ELISA Guidebook」, 第１版, Humana Press 2000, ISBN 0896037282において既知である。
【０１４５】
さらなる説明のため、そして限定することなく、直接ELISAは、固体支持体、例えばマイクロウェルプレートに固定化された、試料中の標的抗原に結合し、それによりそれを定量する標識１次抗体を用いる。間接ELISAは、標的抗原に結合する非標識１次抗体と、抗原に結合した１次抗体を認識しそれを定量することを可能にする２次標識抗体とを用いる。サンドイッチELISAでは、標的抗原は、抗原内の１つの抗原部位に結合する固定化「捕捉」抗体を用いて試料から捕捉され、非結合分析物の除去の後に、そのようにして捕捉された抗原を、該抗原内の別の抗原部位に結合する「検出」抗体(検出抗体は、直接標識され得るか、または上記のように間接的に検出できる)を用いて検出する。競合ELISAは、１次抗体または標的抗原のいずれかであり得る標識「競合物質」を用いる。例えば、非標識固定化１次抗体を試料とインキュベートし、この反応を平衡に到達させ、次いで、標識標的抗原を加える。標識標的抗原は、１次抗体に、その結合部位が試料からの非標識標的抗原により占められていない場合に結合する。よって、結合した標識抗原の検出された量は、試料中の非標識抗原の量に逆比例する。多重ELISAは、２以上の分析物の同時の検出を、単一区画(例えばマイクロプレートウェル)内で、通常、複数のアレイアドレスにて可能にする(例えばNielsenおよびGeierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107〜20ならびにLingら2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87〜98をさらなる手引きのために参照されたい)。認識されるように、ELISA技術における標識は、通常、酵素(例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ)コンジュゲーションにより、終点は、典型的に、比色、化学発光もしくは蛍光、磁気、圧電、焦電などである。
【０１４６】
ラジオイムノアッセイ(RIA)は、競合に基づく技術であり、既知の量の放射活性標識(例えば125Iまたは131I標識)標的抗原を、該抗原に対する抗体と混合し、次いで、試料からの非標識または「非放射性」抗原を加え、置き換えられた標識抗原の量を測定することを含む(例えば「An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques」, Chard T編, Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198をさらなる手引きのために参照されたい)。
【０１４７】
一般的に、ペプチドの質量、好ましくはさらにフラグメンテーションおよび/または選択されたペプチドの(部分的)アミノ酸配列についての正確な情報を得ることができる任意の質量分析(MS)技術も(例えばタンデム質量分析、MS/MS;またはポストソース分解で、TOF MS)本明細書において有用である。適切なペプチドMSおよびMS/MS技術およびシステムは、それ自体公知であり(例えばMethods in Molecular Biology, vol. 146: 「Mass Spectrometry of Proteins and Peptides」, Chapman編, Humana Press 2000, ISBN 089603609x; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455〜79;またはMethods in Enzymology, vol. 402: 「Biological Mass Spectrometry」, Burlingame編, Academic Press 2005, ISBN 9780121828073を参照)、本明細書で用いることができる。バイオマーカーペプチド分析に適切なMSの構成、装置およびシステムは、限定することなく、マトリクス支援レーザ脱離/イオン化時間飛行型(MALDI-TOF) MS; MALDI-TOFポストソース分解(PSD); MALDI-TOF/TOF; 表面増強レーザ脱離/イオン化時間飛行型質量分析(SELDI-TOF) MS; エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n (nは、ゼロより大きい整数である); ESI 3Dまたは線形(2D)イオントラップMS; ESI三連四重極MS; ESI四重極直交型TOF (Q-TOF); ESIフーリエ変換MSシステム; シリコン上での脱離/イオン化(DIOS); ２次イオン質量分析(SIMS); 大気圧化学イオン化質量分析(APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI- (MS)n; 大気圧光イオン化質量分析(APPI-MS); APPI-MS/MS;およびAPPI- (MS)nを含み得る。タンデムMS (MS/MS)の構成におけるペプチドイオンフラグメンテーションは、当該技術において確立された方法、例えば衝突誘起解離(CID)を用いて達成できる。質量分析によるバイオマーカーの検出および定量は、例えばなかでもKuhnら2004 (Proteomics 4: 1175〜86)により記載される多重反応モニタリング(MRM)を含み得る。MSペプチド分析法は、有利には、上流のペプチドもしくはタンパク質分離または分画法、例えば本明細書の以下に記載するクロマトグラフィーおよびその他の方法と組み合わせることができる。
【０１４８】
クロマトグラフィーも、バイオマーカーを測定するために用いることができる。本明細書で用いる場合、用語「クロマトグラフィー」は、それ自体のことをいい、当該技術において広大に利用可能な化学物質を分離するための方法を包含する。好ましいアプローチにおいて、クロマトグラフィーは、液体または気体の移動流(「移動相」)により運ばれる化学物質の混合物(分析物)が、それらが定常の液体または固体相(「固定相」)の周囲または上を流れながら、分析物の異なる分布の結果として成分に分離されるプロセスのことをいう。固定相は、通常、微細に分けられた固体、フィルタ材料のシート、または固体の表面上の液体の薄層などであり得る。クロマトグラフィーは、生体起源の化学的化合物、例えばアミノ酸、タンパク質、タンパク質のフラグメントまたはペプチドなどの分離のためにも広く用いることができる。
【０１４９】
本明細書で用いる場合、クロマトグラフィーは、好ましくは円柱状(すなわち固定相がカラム内に堆積または充填されている)、好ましくは液体クロマトグラフィー、さらにより好ましくはHPLCであり得る。クロマトグラフィーの詳細は当該技術において公知であるが、さらなる手引きのために、Meyer M., 1998, ISBN: 047198373Xおよび「Practical HPLC Methodology and Applications」, Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993を参照されたい。クロマトグラフィーの型の例は、限定することなく、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、順相HPLC (NP-HPLC)、逆相HPLC (RP-HPLC)、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)、例えばカチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはゲル透過クロマトグラフィーを含むサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、クロマトフォーカシング、親和性クロマトグラフィー、例えば免疫親和性、固定化金属親和性クロマトグラフィーなどを含む。
【０１５０】
１次元、２次元または多次元クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを、さらなるペプチド分析法、例えば本明細書の他の場所で記載する下流の質量分析と組み合わせてペプチド分画法として用いることができる。
【０１５１】
さらなるペプチドまたはポリペプチドの分離、同定または定量法は、場合によって上記の分析法のいずれかと組み合わせて、本開示におけるバイオマーカーを測定するために用いることができる。このような方法は、限定することなく、化学抽出分画、キャピラリー等電点電気泳動(CIEF)、キャピラリー等速電気泳動(CITP)、キャピラリー電気クロマトグラフィー(CEC)などを含む等電点電気泳動(IEF)、１次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)、ミセル導電クロマトグラフィー(MEKC)、フリーフロー電気泳動(FFE)などを含む。
【０１５２】
タンパク質検出が血漿試料であることに加えて、キエシンQ6バイオマーカーのレベルは、例えば妊娠早期の間の経子宮頸部(transcervical)胎盤生検または妊娠に対して危険性がない同様の方法を用いて得られた胎盤組織のRNA分析を用いて確立できる。この試験は、妊娠10週目〜12週目の間に少量の胎盤組織を回収することを含む。膣を通して超音波の手引きの元に、細い管を胎盤に挿入し、少量の生検を採取する。妊娠の同じ期間に採取された健常胎盤組織(例えば合法的中絶を受ける対象者から採集された)を、次いで、その段階でのキエシンQ6の健常RNAレベルを測定するための参照試料として用いることができる。代わりに、胎盤生検は、中絶の原因を確立するために、妊娠を自然中絶する対象者から得ることができる。この情報は、将来の妊娠の観点で重要な予測ツールである。
【０１５３】
RNAレベルは、当該技術において既知の標準的な定量的RNA測定を用いて検出できる。キエシンQ6の発現レベルを検出するためのこのようなツールまたは手段の非限定的な例は、ハイブリダイゼーションに基づく分析、マイクロアレイ、デジタル遺伝子発現(DGE)、RNA-in-situハイブリダイゼーション(RISH)、ノザンブロット分析などにおいて用いるためのキエシンQ6に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含む。代わりに、キエシンQ6の発現レベルを検出するための上記のツールまたは手段は、PCR、RT-PCR、RT-qPCR、エンドポイントPCR、デジタルPCRなどにおいて用いるためのキエシンQ6遺伝子および/またはそのフラグメントに特異的なプライマー対であり得る。さらに代わりの実施形態において、キエシンQ6の発現レベルを検出するための上記の手段またはツールは、支援オリゴヌクレオチド検出、ピロシーケンシング、合成によるポロニーサイクルシーケンシング(Polony Cyclic Sequencing by Synthesis)、同時両方向シーケンシング、単分子シーケンシング、単分子リアルタイムシーケンシング、真の単分子シーケンシング(True Single Molecule Sequencing)、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシングおよび合成によるシーケンシングからなる群より選択されるキエシンQ6および/またはそのフラグメントに特異的な配列解析に基づく発現解析に適切である。
【０１５４】
キエシンQ6の存在は、上記のようにして得られた胎盤生検について、標準的な免疫組織化学的技術を用いて検出することもでき、ここでは、キエシンQ6タンパク質の存在、非存在または量は、胎盤組織において直接検出される。生検組織は、当該技術において公知の以下のルーチンの手順に従って固定できる。
【０１５５】
本明細書で教示する様々な態様および実施形態は、試料中で測定される任意の１以上のバイオマーカーの量を、上記の１以上のバイオマーカーの量の参照値と比較することにさらに依拠し、ここで、上記の参照値は、本明細書で教示する疾患もしくは状態の既知の予測、診断および/または予後を表す。
例えば、独特の参照値は、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態を有する危険性(例えば異常に上昇した危険性)の予測対上記の疾患もしくは状態を有さない予測または通常の危険性を表し得る。別の例では、独特の参照値は、このような疾患または状態を有する危険性の程度が異なる予測を表し得る。
【０１５６】
さらなる例において、独特の参照値は、本明細書で教示する所定の疾患または状態の診断対そのような疾患または状態がないことの診断(例えば健常、または上記の疾患もしくは状態からの回復などの診断)を表し得る。別の例では、独特の参照値は、様々な重度のそのような疾患または状態の診断を表し得る。
【０１５７】
さらに別の例では、独特の参照値は、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態についての良好な予後対上記の疾患もしくは状態の悪い予後を表し得る。さらなる例において、独特の参照値は、そのような疾患または状態についての様々に好ましいまたは好ましくない予後を表し得る。
【０１５８】
このような比較は、一般的に、少なくとも１つの差の存在もしくは非存在、および場合によってそのような差のサイズを、比較される値またはプロフィールの間で決定するための任意の手段を含み得る。比較は、視覚的比較、測定の算術的または統計学的比較を含み得る。このような統計学的比較は、それらに限定されないが、法則を当てはめることを含む。値またはバイオマーカーのプロフィールが少なくとも１つの標準物質を含むならば、該値またはバイオマーカーのプロフィールにおける差を決定するための比較は、これらの標準物質の測定も含むことができ、これにより、バイオマーカーの測定は、内部標準物質の測定と相関する。
任意の１以上のバイオマーカーの量についての参照値は、他のバイオマーカーについて以前に用いられた既知の手順に従って確立できる。
例えば、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後予測のための任意の１以上のバイオマーカーの量の参照値は、上記の疾患もしくは状態の具体的な診断、予防および/または予後を特徴とする個体または個体の集団からの試料中の上記の１以上のバイオマーカーの量を決定することにより確立できる(すなわち、上記の疾患もしくは状態の診断、予防および/または予後が真である者について)。このような集団は、限定することなく、≧２、≧10、≧100または数百以上の個体さえ含み得る。
【０１５９】
よって、例示的な例により、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の診断対そのような疾患もしくは状態がないことの診断のための任意の１以上のバイオマーカーの量の参照値は、それぞれ疾患もしくは状態を有するかまたは有さないと診断される１の個体または個体集団(例えばその他の適切に決定的な手段、例えば臨床徴候および症状、イメージング、ECGなど)からの試料中の１以上のバイオマーカーの量を決定することにより確立できる。
【０１６０】
ある実施形態において、本明細書で意図する参照値は、任意の１以上のバイオマーカーの絶対量を伝え得る。別の実施形態では、試験される対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの量は、参照値に対して直接的に決定できる(例えば増加もしくは減少または倍数増加もしくは倍数減少の点で)。有利には、このことにより、対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの量を、上記の１以上のバイオマーカーのそれぞれの絶対量をまず決定する必要なく、参照値と比較する(言いかえると、参照値に対する対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの相対量を測定する)ことができる。
【０１６１】
患者の試料中のバイオマーカーの発現レベルまたは存在は、時折変動し、すなわち症状が変化する(症状の見かけ、悪化または改善)ことなく著しく増加または減少し得る。このような場合には、マーカーの変化が症状の変化に先行し、症状の変化よりも感度が高い尺度になる。治療的介入は、より早期に開始でき、悪化させる症状を待つよりも効果的であり得る。より良性の状態での早期の介入は、家庭で安全に行うことができ、これは、重度に悪化した患者を緊急室で処置することからの主要な改善である。
【０１６２】
同じ患者の任意の１以上のバイオマーカーのレベルを異なる時点で測定することは、よって、そのような場合に、患者の状態の継続的なモニタリングを可能にし、本明細書で教示する所定の疾患または状態に関する患者の状態の悪化または改善の予測を導くことができる。本明細書で示す家庭もしくは臨床的な試験キットまたはデバイスは、この継続的モニタリングのために用いることができる。そのような試験についてのある疾患状態に関連する任意の１以上のバイオマーカーのレベルの１以上の参照値または範囲は、例えば、予め、または該対象者におけるある期間にわたるモニタリングプロセス中に決定できる。代わりに、これらの参照値または範囲は、非常に類似する疾患表現型を有するいくらかの患者のデータセットにより、例えば健常対象者または興味対象の疾患もしくは状態を有さない対象者から確立できる。上記の参照値または範囲からの任意の１以上のバイオマーカーのレベルの突然の逸脱により、実際に(しばしば重度の)症状を感じるかまたは症状が観察できる前に患者の状態の悪化を(例えば家庭でまたは医療機関で)予測できる。
【０１６３】
よって、臨床状態の変化(悪化または改善)を示す、ある患者における本明細書で教示する任意の１以上のバイオマーカーのレベルの著しい変化を決定するための方法またはアルゴリズムも開示される。さらに、本発明は、対象者が、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態から回復しているかまたは回復したとの診断を確立することを可能にする。
【０１６４】
ある実施形態において、本方法は、そのような参照値を確立するステップを含み得る。ある実施形態において、本キットおよびデバイスは、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後のための、本明細書で教示する任意の１以上のバイオマーカーの量の参照値を確立するための手段を含み得る。このような手段は、例えば、上記の疾患もしくは状態の上記の具体的な診断、予測および/または予後を特徴とする１以上の個体からの１以上の試料(例えば別々またはプールされた試料)を含み得る。
【０１６５】
本明細書で教示する様々な態様および実施形態は、対象者からの試料中で測定した任意の１以上のバイオマーカーの量と、所定の参照値との間の逸脱または逸脱がないことを見出すことを必然的にさらに伴うことがある。
第２の値からの第１の値の「逸脱」は、一般的に任意の方向(例えば増加：第１の値＞第２の値または減少：第１の値＜第２の値)および任意の程度の変更を包含し得る。
例えば、逸脱は、限定することなく、比較を行う第２の値に対して、少なくとも約10% (約0.9倍以下)または少なくとも約20% (約0.8倍以下)または少なくとも約30% (約0.7倍以下)または少なくとも約40% (約0.6倍以下)または少なくとも約50% (約0.5倍以下)または少なくとも約60% (約0.4倍以下)または少なくとも約70% (約0.3倍以下)または少なくとも約80% (約0.2倍以下)または少なくとも約90% (約0.1倍以下)第１の値が減少することを包含し得る。
【０１６６】
例えば、逸脱は、限定することなく、比較を行う第２の値に対して、少なくとも約10% (約1.1倍以上)または少なくとも約20% (約1.2倍以上)または少なくとも約30% (約1.3倍以上)または少なくとも約40% (約1.4倍以上)または少なくとも約50% (約1.5倍以上)または少なくとも約60% (約1.6倍以上)または少なくとも約70% (約1.7倍以上)または少なくとも約80% (約1.8倍以上)または少なくとも約90% (約1.9倍以上)または少なくとも約100% (約２倍以上)または少なくとも約150% (約2.5倍以上)または少なくとも約200% (約３倍以上)または少なくとも約500% (約６倍以上)または少なくとも約700% (約８倍以上)第１の値が増加することを包含し得る。
好ましくは、逸脱は、統計学的に有意な観察される変更のことをいうことがある。例えば、逸脱は、所定の集団における参照値の誤差範囲外(例えば標準偏差もしくは標準誤差で表されるかまたは予め決定されたその倍数、例えば±１×SDもしくは±２×SDまたは±１×SEもしくは±２×SE)の観察される変更のことをいうことがある。逸脱は、所定の集団における値により定義される参照範囲外(例えば該集団における値の≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧75%もしくは≧80%もしくは≧85%もしくは≧90%もしくは≧95%または≧100%さえを含む範囲外)の値のことをいうこともある。
【０１６７】
さらなる実施形態において、観察される変更が所定の閾値またはカットオフを超えるならば、逸脱を結論付けることができる。このような閾値またはカットオフは、当該技術において一般的に知られるようにして選択して、診断、予測および/または予後方法の選択された感度および/または特異性、例えば少なくとも50%もしくは少なくとも60%もしくは少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも85%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%の感度および/または特異性を提供できる。
例えば、ある実施形態において、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態がないとの予測または診断を表すかあるいは上記の疾患または状態についての良好な予後を表す参照値と比較して、対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの量の上昇(好ましくは少なくとも約1.1倍の上昇もしくは少なくとも約1.2倍の上昇、より好ましくは少なくとも約1.3倍の上昇、さらにより好ましくは少なくとも約1.4倍の上昇、さらにより好ましくは少なくとも約1.5倍の上昇、例えば約1.1倍〜３倍の間の上昇もしくは約1.5倍〜２倍の間の上昇)は、対象者が、上記の疾患もしくは状態を有するかまたは有する危険性にあることを示すか、あるいは対象者における疾患もしくは状態についての悪い予後を示すか、あるいは対象者が上記の疾患もしくは状態を有さないかまたは有する危険性にないことを示すか、あるいは対象者における疾患もしくは状態についての良好な予後を示す。
【０１６８】
対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの量と、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態のある診断、予測および/または予後を表す参照値との間に逸脱が見出される場合、該逸脱は、該対象者における上記の疾患もしくは状態の診断、予測および/または予後が、参照値により表されるものとは異なるとの結論を示すかあるいはそのような結論に帰することができる。
対象者からの試料中の任意の１以上のバイオマーカーの量と、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態のある診断、予測および/または予後を表す参照値との間に逸脱が見出されない場合、そのような逸脱がないことは、該対象者における上記の疾患もしくは状態の診断、予測および/または予後が、参照値により表されるものと実質的に同じであるとの結論を示すかあるいはそのような結論に帰することができる。
【０１６９】
上記の考察は、バイオマーカープロフィールについても同様に当てはめられる。
【０１７０】
２以上の異なるバイオマーカーを対象者において決定する場合、それらのそれぞれの存在、非存在および/または量は、バイオマーカープロフィール、すなわち該プロフィールの一部分を構成する各測定されたバイオマーカーについての値を一緒に表し得る。本明細書で用いる場合、用語「プロフィール」は、興味対象の状態、例えば本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後に関連する独特の特性または特徴を表す任意のデータセットを含む。この用語は、一般的に、なかでも核酸プロフィール、例えば遺伝子型プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上の遺伝子の遺伝子型を表す遺伝子型データセット)、遺伝子コピー数プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上の遺伝子の増幅または欠失を表す遺伝子コピー数のデータセット)、遺伝子発現プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上の遺伝子のmRNAレベルを表す遺伝子発現データセット)、DNAメチル化プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上の遺伝子のDNAメチル化レベルを表すメチル化データセット)、ならびにタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドプロフィール、例えばタンパク質発現プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上のタンパク質のレベルを表すタンパク質発現データセット)、タンパク質活性化プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上のタンパク質の活性化または不活性化を表すデータセット)、タンパク質改変プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上のタンパク質の改変を表すデータセット)、タンパク質切断プロフィール(興味対象の状態に関連する１以上のタンパク質のタンパク質分解切断を表すデータセット)ならびにそれらの任意の組み合わせを包含する。
【０１７１】
バイオマーカープロフィールは、いくつかの方法で創出でき、比率のような方法またはその他のより複雑な連係法もしくはアルゴリズム(例えば法則に基づく方法)を用いて測定可能なバイオマーカーまたはバイオマーカーの態様の組み合わせであり得る。バイオマーカープロフィールは、少なくとも２の測定を含み、該測定は、同じまたは異なるバイオマーカーに相関できる。バイオマーカープロフィールは、少なくとも３、４、５、10、20、30以上の測定を含むこともできる。一実施形態において、バイオマーカープロフィールは、数百または数千の測定さえ含む。
【０１７２】
よって、例えば、独特の参照プロフィールは、所定の疾患もしくは状態を有する危険性の予測(例えば異常に上昇した危険性)対該疾患もしくは状態がないかまたはそれを有する通常の危険性の予測を表し得る。別の例では、独特の参照プロフィールは、上記の疾患または状態を有する危険性の異なる程度の予測を表し得る。
さらなる例において、独特の参照プロフィールは、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の診断対そのような疾患もしくは状態がないことの診断(例えば健常、該疾患もしくは状態からの回復などの診断)を表すことができる。別の例では、独特の参照プロフィールは、様々な重度の上記の疾患または状態の診断を表し得る。
【０１７３】
さらに別の例では、独特の参照プロフィールは、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の良好な予後対該疾患もしくは状態の悪い予後を表し得る。さらなる例では、独特の参照プロフィールは、そのような疾患または状態についての様々に好ましいまたは好ましくない予後を表し得る。
【０１７４】
本明細書で用いる参照プロフィールは、その他のバイオマーカーについて以前に用いた既知の手順に従って確立できる。
例えば、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後についての任意の２以上のバイオマーカーの量の参照プロフィールは、上記の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後を特徴とする(すなわち、該疾患もしくは状態の診断、予測および/または予後が真である)１の個体または個体の集団からの試料中のプロフィールを決定することにより確立できる。このような集団は、限定することなく、≧２、≧10、≧100または数百以上の個体さえ含み得る。
【０１７５】
よって、例示的な例により、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態対そのような疾患もしくは状態がないことの診断についての参照プロフィールは、それぞれ該疾患もしくは状態を有するかまたは有さないと診断された１の個体または個体の集団からの試料におけるバイオマーカープロフィールを決定することにより確立できる。
【０１７６】
ある実施形態において、本方法は、このような参照プロフィールを確立するステップを含み得る。ある実施形態において、本キットおよびデバイスは、本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後についての参照プロフィールを確立するための手段を含み得る。このような手段は、例えば、上記の疾患もしくは状態の具体的な診断、予測および/または予後を特徴とする１以上の個体からの１以上の試料(例えば別々またはプールされた試料)を含み得る。
さらに、当該技術において既知の多重パラメータ分析を、必要な変更を加えて用いて、値およびそれから得られるプロフィールの群との間の逸脱を決定できる(例えば試料プロフィールと参照バイオマーカープロフィールとの間)。
【０１７７】
試料プロフィールと本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態のある診断、予測および/または予後を表す参照プロフィールとの間に逸脱が見出された場合、該逸脱は、該対象者における上記の疾患もしくは状態の診断、予測および/または予後が、参照プロフィールにより表されるものとは異なるとの結論を示すかあるいはそのような結論に帰することができる。
試料プロフィールと本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態のある診断、予測および/または予後を表す参照プロフィールとの間に逸脱が見出されない場合、そのような逸脱がないことは、該対象者における上記の疾患もしくは状態の診断、予測および/または予後が、参照プロフィールにより表されるものと実質的に同じであるとの結論を示すかあるいはそのような結論に帰することができる。
【０１７８】
本発明は、患者の試料中の任意の１以上のバイオマーカーのレベルを検出するための手段を含む、本明細書で教示する任意の１の疾患もしくは状態の診断、予測、予後および/またはモニタリングのためのキットあるいはデバイスをさらに提供する。より好ましい実施形態において、本発明のこのようなキットは、臨床的背景または家庭で用いることができる。本発明によるキットは、該疾患もしくは状態を診断するため、該疾患もしくは状態に罹患している対象者を薬剤で処置する有効性をモニタリングするため、または該対象者における該疾患もしくは状態の出現について対象者を防止的にスクリーニングするために用いることができる。
【０１７９】
臨床的背景において、キットまたはデバイスは、ベッドサイドデバイスの形、または緊急チームの背景において、例えば救急車もしくはその他の移動式緊急車両の備品の一部またはチーム備品または応急手当キットの一部であり得る。診断キットまたはデバイスは、医療従事者、応急手当ヘルパーまたは看護士が、観察下にある患者が本明細書で教示する疾患または状態を発生しているかを決定することを支援でき、その後、適当な行動または処置を行うことができる。
家庭での試験キットは、患者に読出しを提供し、患者は、これを医療従事者、応急手当ヘルパーまたは病院の救急部門に伝えることができ、その後、適当な行動をとることができる。このような家庭での試験キットは、本明細書で教示する任意の１の疾患もしくは状態の病歴を有するかまたはそれに罹患する危険性にある人々にとって特に興味がある。
【０１８０】
本発明による典型的なキットまたはデバイスは、以下の要素を含む：
a) 対象者から試料を得るための手段
b) 上記の試料中の本明細書で教示する任意の１以上のマーカーの量を測定し、該試料中の１以上のマーカーの量が、ある閾値レベルもしくは値未満またはそれを超えるかを可視化し、対象者が本明細書で教示する所定の疾患もしくは状態に罹患しているか否かを示すための手段またはデバイス。
【０１８１】
本発明のいずれの実施形態においても、キットまたはデバイスは、c) 医療従事者、病院の救急部門または応急手当ポストと直接交流して、ある人が上記の疾患もしくは状態に罹患しているか否かを示すための手段をさらに含むことができる。
【０１８２】
用語「閾値レベルまたは値」または「参照値」は、同義語として交換可能に用いられ、本明細書で定義されるとおりである。これは、妊娠のほぼ同時期に採取された、非常によく似た疾患状態を有する個別の患者または患者の群において決定されたベースライン(例えば「乾燥重量」)の値でもあり得る。
【０１８３】
いずれの理論とも結び付けられることを望まないが、本発明者らは、正常妊娠中に、妊娠の１番目の四半期中に、タンパク質およびmRNAレベルの両方でキエシンQ6レベルが増加することを観察した。試験したPE妊娠患者において、キエシンQ6レベルは、同じ妊娠段階の健常妊娠女性のものよりも低い。これは、PE妊娠におけるキエシンQ6レベルが、上昇していないか、または健常妊娠対象者と比較して上昇が(かなり)低いかのいずれかによると考えられる。
本発明において示す閾値の値は、よって、妊娠のほぼ同じ段階で採取された参照、すなわち非PE妊娠対象者における値であるとよりみなされ、妊娠前または後のPE対象者の値であるとはあまり見られない。
【０１８４】
本明細書で定義するキットはいずれも、対象者自体または臨床従事者が用いるためのベッドサイドデバイスとして用いることができる。
非限定的な例は、固相に結合した上記の１以上のマーカーについての特異的結合分子を含むシステム、例えば当該技術において公知のラテラルフローストリップまたはディップスティックデバイスなどである。生化学的アッセイを行うためのある非限定的な例は、テストストリップとその組み合わせがメンブレンのいずれの洗浄も必要としない標識抗体とを用いることである。テストストリップは、例えば抗hCG 抗体が支持体上に存在し、hCGと複合して、尿の流れにより、可視化を許容する固定化２次抗体へと運ばれる妊娠検査キットの分野において公知である。このような家庭での試験デバイス、システムまたはキットのその他の非限定的な例は、例えば以下において見出すことができる；米国特許第6,107,045、6,974,706、5,108,889、6,027,944、6,482,156、6,511,814、5,824,268、5,726,010、6,001,658号または米国特許出願第2008/0090305もしくは2003/0109067号。好ましい実施形態では、本発明は、ラテラルフローデバイスまたはディップスティックを提供する。このようなディップスティックは、試料が塗布されるストリップの一端から試料中の分析物の存在が測定されるそのようなストリップの他端へのキャピラリーフローによる試料の移動を可能にするテストストリップを含む。別の実施形態では、本発明は、試剤ストリップを含むデバイスを提供する。このような試剤ストリップは、１以上の試験パッドを含み、これは、試料で湿らせた場合に、分析物の存在下で色の変化を示し、および/または試料中のタンパク質の濃度を示す。
【０１８５】
試料中の任意の１以上のマーカーのレベルがある予め決定された閾値レベルまたは値より高い場合にだけシグナルが形成される半定量的テストストリップを得るために、予め決定された量のキエシンQ6の固定捕捉抗体が、テストストリップ上に存在できる。このことにより、予め決定された閾値レベルまたは値に対応する試料中に存在するある量のキエシンQ6の捕捉が可能になる。例えばコンジュゲートされたかまたは標識された結合分子が結合する残りの量のキエシンQ6 (もしあれば)は、次いで、検出ゾーンに移動することができ、これは、その後、試料中の該１以上のバイオマーカーのレベルが予め決定された閾値レベルまたは値よりも高い場合にのみ、実質的にシグナルを生成する。
【０１８６】
試料中の任意の１以上のマーカーの量がある閾値レベルまたは値未満またはそれを超えるかを決定する別の可能性は、試料中に存在する全ての上記の１以上のマーカーを捕捉する１次抗体を、固相に結合した場合にあるシグナルまたは色を発生する標識２次抗体と組み合わせて用いることである。色またはシグナルの強度を、次いで、参照の色またはシグナルチャートと比較して、シグナルの強度がある閾値シグナルを超える場合に、試験が陽性であることを示すことができる。代わりに、色またはシグナルの量または強度を、例えば光吸収センサまたは光放射計を含み、形成されるシグナル強度または色吸収の数値をもたらす電子デバイスを用いて測定でき、これは、次いで、該数値が閾値の値未満であるならば陰性の結果または数値が閾値の値を超えるならば陽性の結果の形で対象者に示すことができる。この実施形態は、患者における１以上のマーカーのレベルを経時的にモニタリングする場合に特に関連する。
【０１８７】
参照値または範囲は、例えば、対象者が所定の疾患または状態を有さない期間に家庭でのデバイスを用いて決定でき、患者に、任意の１以上のマーカーの患者のベースラインレベルを示すことができる。家庭での試験デバイスを定期的に用いることにより、よって、ベースラインレベルと比較した１以上のマーカーのレベルの突然の変化を対象者に知らせることができ、このことは、対象者が医療従事者に接触することを可能にする。
代わりに、参照値は、本明細書で教示する所定の疾患または状態に罹患している対象者において決定して、これは、次いで、任意の１以上のマーカーの対象者個人の「リスクレベル」、すなわち対象者が上記の疾患もしくは状態にあるかまたはそれにすぐに曝露されることを示す上記の１以上のマーカーのレベルを示すことができる。このリスクレベルは、疾患の進行をモニタリングするためまたは処置の効果を評価するために興味深い。
【０１８８】
さらに、参照値またはレベルは、非常によく似た疾患状態または表現型を有する対象者(例えば全員が本明細書で教示する疾患もしくは状態を有さないまたは該疾患もしくは状態を有する)における測定結果の組み合わせにより確立できる。
【０１８９】
その原理を本発明による家庭での試験デバイスに用いることができる当該技術において既知の半定量的試験の非限定的な例は、Sanitoetsにより販売されるHIV/AIDS試験または前立腺がん試験である。家庭での前立腺試験は、全血中での４ng/mlより高いPSA血液レベルを検出するための最初の半定量的試験を意図する迅速試験である。典型的な家庭での自己試験キットは、以下の成分を含む：血液試料を塗布し、タンパク質レベルがある閾値レベルを超える場合にシグナルをもたらす試験デバイス、例えば滴下ピペット中のある量の希釈剤(分析物(すなわち興味対象のタンパク質)が試料塗布ゾーンからシグナル検出ゾーンに移動することを助けるため)、場合によって血液検体回収のための空のピペット、指プリックデバイス、場合によって滅菌スワブ(プリックした領域を清浄するため)およびキットの使用説明書。
【０１９０】
類似の試験は、例えば乳がん検出および心臓リスクの家庭での試験の観点でのCRP-タンパク質レベル検出についても知られている。後者の試験は、試験結果を実験室に送ることを包含し、ここで、結果が技術または医療専門家により解釈される。このような患者の状態の電話またはインターネットに基づく診断は、もちろん、ほとんどのキットにおいて可能であり、推奨される。なぜなら、試験結果の解釈は、試験を行うことよりも頻繁により重要であるからである。試料中に存在するタンパク質のレベルの数値を与える上記の電子デバイスを用いる場合、この値は、もちろん、電話、携帯電話、衛星電話、電子メール、インターネットまたはその他の通信手段により容易に伝えることができ、ある人が、本明細書で教示する疾患もしくは状態に罹患しているかまたは罹患する危険性にあることを病院、医療従事者または応急手当チームに警告できる。このようなシステムの非限定的な例は、米国特許第6,482,156号に開示されている。
【０１９１】
試料中の任意の１以上のマーカーの存在および/または濃度は、固定化された該１以上のマーカーについての結合分子を有するチップを用いる表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)、蛍光消光、蛍光分極測定または当該技術において既知のその他の手段により測定できる。本明細書に記載する結合アッセイのいずれも、試料中の任意の１以上のマーカーの存在および/または濃度を決定するために用いることができる。そのようにするために、任意の１以上のマーカーについての結合分子を試料と反応させ、該１以上のマーカーの濃度を、用いる結合アッセイについて適切なようにして測定する。アッセイを有効にして校正するために、異なる濃度の標準の１以上のマーカーおよび/または該１以上のマーカーについての結合分子を用いる対照反応を行うことができる。固相アッセイを用いる場合、インキュベーションの後に、洗浄ステップを行って未結合のマーカーを除去する。結合したマーカーを、所定の標識について適当なようにして測定する(例えばシンチレーションカウント、蛍光、抗体-色素など)。定性的結果が所望される場合、対照および異なる濃度は必要でないことがある。もちろん、上記の１以上のマーカーおよび結合分子の役割は、交換できる。当業者は、結合分子が、様々な濃度の試料にて試料に提供されるように方法を適合させることができる。
【０１９２】
本明細書で意図する結合分子は、任意の１以上のマーカーに特異的に結合する任意の物質である。本発明により有用な結合分子の例は、それらに限定されないが、抗体、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、ペプチド-核酸、小分子、有機小分子、またはその他の薬物候補を含む。結合分子は、例えば合成小分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物に含まれる化合物、およびそのような細胞からの馴化培地を含む天然または合成の化合物であり得る。代わりに、結合分子は、上記の１以上のマーカーについての結合部位を有する工学的なタンパク質であり得る。本発明の態様によると、結合分子は、上記の１以上のマーカーに、10-6 Mよりよい親和性で特異的に結合する。適切な結合分子は、上記の１以上のマーカーの標準試料とのその結合から決定できる。結合分子と上記の任意の１以上のマーカーとの間の結合を決定する方法は、当該技術において既知である。本明細書で用いる場合、抗体との用語は、それらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化もしくはキメラ抗体、工学的な抗体およびタンパク質との抗体フラグメントの結合にとって十分な生物学的に機能的な抗体フラグメント(例えばscFv、ナノボディ、Fvなど)を含む。このような抗体は、上記の１以上のマーカーに対する市販で入手可能な抗体、例えばマウス、ラット、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であり得る。
【０１９３】
本キットにおける特異的結合物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、バイオマーカーなどは、例えば凍結乾燥された、溶液中に遊離または固相に固定化された様々な形であり得る。これらは、例えば、マルチウェルプレートで、またはアレイもしくはマイクロアレイとして提供できるか、あるいはこれらは別々および/または個別に包装され得る。これらは、本明細書で教示するようにして適切に標識され得る。上記のキットは、本発明のアッセイ法、例えばイムノアッセイ、ELISAアッセイ、質量分析アッセイなどを行うために特に適切である。
【０１９４】
結合分子は、別の物質(例えばプローブ結合パートナー)を用いる検出を可能にするタグで標識できる。このようなタグは、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、hisタグ、mycタグ、マルトース、マルトース結合タンパク質または結合パートナーを有する当該技術において既知の任意のその他の種類のタグであり得る。プローブ：結合パートナーの構成において利用できる相互作用の例は、例えば、ビオチン：ストレプトアビジン、hisタグ：金属イオン(例えばNi2+)、マルトース：マルトース結合タンパク質であり得、これらを含む。
【０１９５】
結合分子コンジュゲートは、検出を容易にするために検出物質に相互作用させるかまたはそれに結合させることができる。実験室検出物質の例は、それらに限定されないが、発光標識；比色標識、例えば色素；蛍光標識；または化学標識、例えば電気活性物質(例えばフェロシアン化物)；酵素；放射活性標識；または無線周波標識を含む。より一般的に、検出物質は、粒子である。本発明を行うために有用な粒子の例は、それらに限定されないが、コロイド金粒子；コロイド硫黄粒子；コロイドセレン粒子；コロイド硫酸バリウム粒子；コロイド硫酸鉄粒子；金属ヨウ素酸塩粒子；ハロゲン化銀粒子；シリカ粒子；コロイド金属(水和)酸化物粒子；コロイド金属硫化物粒子；コロイドセレン化鉛粒子；コロイドセレン化カドミウム粒子；コロイド金属リン酸化物粒子；コロイド金属フェライト粒子；有機もしくは無機の層で被覆された上記の任意のコロイド粒子；タンパク質もしくはペプチド分子；リポソーム；あるいは有機ポリマーラテックス粒子、例えばポリスチレンラテックスビーズを含む。好ましい粒子は、コロイド金粒子である。金コロイドは、任意の従来の手段、例えばG. Frens, 1973 Nature Physical Science, 241:20 (1973)に概説される方法により作製できる。代替の方法は、米国特許第5,578,577、5,141,850; 4,775,636; 4,853,335; 4,859,612; 5,079,172; 5,202,267; 5,514,602; 5,616,467; 5,681,775号に記載され得る。
【０１９６】
用語「調節する」は、一般的に、調節されるものの増加(例えば活性化)または減少(例えば阻害)の両方を具体的に包含する定性的もしくは定量的な変更、変化または変動のことをいう。この用語は、任意の程度のそのような調節を包含する。本発明の好ましい実施形態において、調節するとの用語は、増加を包含する。例えば、調節が決定可能または測定可能な変数に影響する場合、調節は、該調節がない参照状況と比較して、該変数の値の少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約50%、例えば少なくとも約75%、さらにより好ましくは少なくとも約100%、例えば少なくとも約150%、200%、250%、300%、400%または少なくとも約500%の増加を包含し得る。
【０１９７】
好ましくは、キエシンQ6の活性および/またはレベルの増加は、特異的または選択的であり得、すなわち意図する標的の活性および/またはレベルは、無作為で無関係(意図しない、所望しない)標的の活性および/またはレベルを実質的に変更することなく調節できる。
標的の「活性」への言及は、一般的に、標的の生物活性の任意の１以上の態様、例えば、限定することなく、例えば細胞、組織、器官もしくは生物内でのその生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性および/または構造活性の任意の１以上の態様を包含し得る。
【０１９８】
標的の治療的または予防的ターゲティングの文脈において、標的の「レベル」への言及は、好ましくは、例えば細胞、組織、器官もしくは生物内での標的の量および/または利用可能性(例えばその生物活性を行うための利用可能性)を包含し得る。
例えば、標的のレベルは、標的の発現を調節し、および/または発現される標的を増加することにより増加できる。標的の発現の増加は、例えば、ヘテロ核RNA (hnRNA)、前駆mRNA (プレmRNA)、標的をコードするmRNAまたはcDNAのレベルにて達成または観察できる。例えば、そして限定することなく、標的の発現の増加は、当該技術において既知の方法、例えば細胞、組織、器官または生物に上記の標的をコードする組換え核酸を、該細胞、組織、器官または生物における適切な発現レベルをもたらす調節配列の制御下で(例えばエレクトロポレーション、リポフェクションなどにより)トランスフェクトまたは(例えばウイルスベクターを用いて)形質移入することにより達成できる。
【０１９９】
代わりに、キエシンQ6の発現、活性または安定性を増加する物質を、本明細書で言及する障害または疾患を処置するために用いることができる。
【０２００】
用語「医薬的に許容される」は、本明細書で用いる場合、当該技術に矛盾せず、医薬組成物のその他の成分と適合し、その受容者にとって有害でないことを意味する。
【０２０１】
本明細書で用いる場合、「担体」または「賦形剤」は、任意のおよび全ての溶剤、希釈剤、バッファー(例えば中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水)、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート化剤(例えばEDTAまたはグルタチオン)、アミノ酸(例えばグリシン)、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香料、芳香付加剤(aromatisers)、増粘剤、デポー効果を達成するための物質、コーティング、抗真菌剤、防腐剤、抗酸化剤、等張性調節物質、吸収遅延剤などを含む。医薬的活性物質にこのような媒体および物質を用いることは、当該技術において公知である。任意の従来の媒体または物質が活性物質と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるそれらの使用が企図できる。
【０２０２】
本活性物質(作用剤)は、単独で、または本明細書で教示する疾患および状態について当該技術において既知の任意の療法と組み合わせて(「併用療法」)用いることができる。本明細書で企図する併用療法は、本発明の少なくとも１つの活性物質と、少なくとも１つのその他の医薬的または生物学的活性成分との投与を含み得る。上記の本活性物質および医薬的または生物学的活性成分は、同じもしくは異なる医薬製剤中で、同時または任意の順序で逐次的に投与できる。
【０２０３】
場合によって投与される１以上のその他の活性化合物と組み合わせて用いられる本活性物質(作用剤)の投与量または量は、個別の事例に依存し、慣例と同様に、最適な効果を達成するための個別の状況に適合される。つまり、これは、処置される障害の重症度、ならびに性別、年齢、体重、全身の健康、食餌、投与の形態および時間、処置されるヒトもしくは動物の個別の応答性、投与経路、用いる化合物の効力、代謝安定性、作用持続期間、療法が急性もしくは慢性または予防的であるか、あるいはその他の活性化合物が本発明の作用剤に加えて投与されるかにも依存する。
【０２０４】
限定することなく、疾患の型および重症度に依存して、典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して約１μg/kg〜100 mg/kg体重以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与について、条件に依存して、処置は、疾患症状の所望の抑制が出現するまで持続される。本発明の活性物質の好ましい投与量は、約0.05 mg/kg〜約10 mg/kg体重の範囲であり得る。つまり、約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kgまたは10 mg/kg (または任意のそれらの組み合わせ)の１以上の用量を、患者に投与できる。このような用量は、間欠的、例えば毎週、２週間または３週間ごとに投与できる。
【０２０５】
本明細書で用いる場合、「処置を必要とする対象者」のような句は、本明細書で教示する所定の疾患または条件の処置から利益を受け得る対象者を含む。このような対象者は、限定することなく、上記の状態を有すると診断された対象者、上記の状態にかかるかもしくは発生しやすい対象者および/または上記の状態を防止しようとする対象者を含み得る。
【０２０６】
用語「処置する」または「処置」は、既に発生した疾患または状態の治療的処置および予防的または防止措置の両方を包含し、その狙いは、望ましくない病気の発生の見込みを妨げるかもしくは少なくし、例えば本明細書で教示する疾患または状態にかかることおよびその進行の見込みを妨げることである。利益のあるまたは所望の臨床結果は、限定することなく、１以上の症状もしくは１以上の生物学的マーカーの軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定した(すなわち悪化しない)状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善もしくは寛解などを含み得る。「処置」は、処置を受けない場合に予期される生存と比較した生存の延長を意味することもできる。
【０２０７】
用語「予防的有効量」は、対象者において、研究者、獣医学者、医者またはその他の臨床者が求める障害の開始を阻害または遅延する活性化合物または医薬剤の量のことをいう。用語「治療的有効量」は、本明細書で用いる場合、対象者において、研究者、獣医学者、医者またはその他の臨床者が求める生物学的または医学的応答を誘発する活性化合物または医薬剤の量のことをいい、これは、なかでも処置される疾患または状態の症状の軽減を含み得る。本化合物についての治療的および予防的有効量を決定するための方法は、当該技術において既知である。
【０２０８】
上記の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によりさらに支持される。
【実施例】
【０２０９】
実施例１：キエシンQ6は、PEについての予想マーカーである
材料および方法：
研究試料
前向き研究臨床試料を、単生児妊娠の女性から妊娠15+/-1週目および20 +/-1週目に回収し、これを、妊娠のさらなる経過において妊娠高血圧腎症であると診断したか(症例)または妊娠高血圧腎症であると診断しなかった(対照)。全ての試料は、SCOPE研究(Screening fOr Pregnancy Endpoints(妊娠終点についてのスクリーニング))、オーストラリア臨床研究登録番号ACTRN12607000551493、未産女性の前向きスクリーニング研究の参加者から得た。書面での同意を各参加者から得た。研究のために用いた組み入れ基準は、未産、単生児妊娠、14週０日〜16週６日の間の妊娠期間および参加のための告知に基づく同意であった。排除基準は、最後の月経期間(LMP)が不確実であることおよび≦20週目での超音波スキャンの不承諾、≧３回の流産、≧３回の中絶、主要な胎児の異例/異常核型、妊娠前に処置された本質的な高血圧、予約時に≧160/100 mmHgの中度-重度の高血圧、糖尿病、腎臓疾患、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、鎌状赤血球症、HIV陽性、主要な子宮異常、子宮頸部縫合、ナイフ錐体生検、現在の胎膜破裂(ruptured membranes now)、長期間のステロイド、低用量のアスピリン処置、カルシウム処置(＞１g/24h)、エイコサペンタエン酸処置(魚油)、ビタミンＣ≧1000mgおよびビタミンＥ≧400iuでの処置、ヘパリン/低分子量ヘパリンでの処置であった。
【０２１０】
妊娠高血圧腎症は、妊娠性高血圧(妊娠20週目以降であるが分娩前の４時間の間隔をあけた少なくとも２回の機会に収縮期血圧(BP)≧140 mmHgおよび/または拡張期BP≧90mmHg (Korotkoff V))あるいは分娩後の４時間の間隔をあけた少なくとも２回の機会に分娩後収縮期BP≧140 mmHgおよび/または拡張期BP≧90mmHgと蛋白尿≧300 mg/24hまたはスポット尿タンパク質：クレアチニン比率≧30 mg/mmol クレアチニンまたは尿ディップスティックタンパク質≧２または妊娠高血圧腎症のいずれかの多系統合併症と定義した。多系統合併症は、以下のいずれかを含む：１.血清クレアチニンの新しい増加≧100 umol/L分娩前または＞130 umol/L分娩後と定義される急性腎臓不全症、２.アスパラギン酸アミノ基転移酵素および/またはアラニンアミノ基転移酵素の上昇＞45 IU/Lならびに/あるいは重度の右上腹部もしくは上腹部痛または肝破裂と定義される肝臓疾患、３.子癇もしくは切迫子癇(反射亢進および持続的な視覚障害を伴う重度の頭痛)または脳出血と定義される神経の問題、４.血小板減少症(血小板＜100×109/L)、播種性血管内凝固または血液塗抹標本上の特徴により診断される(例えば断片化細胞、ヘルメット形細胞)溶血およびハプトグロビンの低減を含む血液学的問題。妊娠高血圧腎症は、採用後分娩までまたは分娩後の最初の２週間までの妊娠中の任意の段階で診断できた。
【０２１１】
自発的早産は、＜37.0週目での早産をもたらす自発的早期出産または早産型早期破水(PPROM)と定義する。
早産型妊娠高血圧腎症は、＜37.0週目での分娩をもたらす妊娠高血圧腎症と定義する。
早期発症型妊娠高血圧腎症は、＜34.0週目での分娩をもたらす妊娠高血圧腎症と定義する。
胎内発育遅延は、母体重、身長、経産回数、人種および幼児の性別について調整した、個別化した百分位数を用いて出生時体重＜第10%と定義する。体重は、乳児の出生後24時間以内に測定する。
【０２１２】
妊娠高血圧腎症についての既知のリスク因子(ZhongらPrenatal Diagnosis, 30, p. 293〜308, 2010; Sibaiら, 365, p.785〜799, 2005)についての臨床データは、妊娠15+/-1および20+/-1週目に、女性の面会および検査により収集した。超音波データを、20週目に、胎児測定、解剖学、子宮および臍帯動脈ドップラーならびに子宮頚部長測定について得た。胎児の成長、子宮および臍帯ドップラーは、24週目に測定する。妊娠の転帰を追跡し、女性を分娩の48時間以内に診察した。乳児の測定は、出産の48時間以内に得る。
【０２１３】
表１において、症例(n= 50)および対照(n=50)のベースライン特徴のまとめを、15週目の面会および検査にて得たいくつかの臨床パラメータと一緒に示す。血圧測定は２回行った。平均動脈圧は、以下のようにして計算する：(1/3 * 収縮期血圧 + 2/3 * 拡張期血圧)。
【０２１４】
【表１−１】
2013531799.tif 000002
【０２１５】
【表１−２】
2013531799.tif 000003
【０２１６】
表１の説明：疾患の家族歴についての情報を含む母体の特徴、妊娠15週目での訪問中に得た臨床パラメータ、妊娠転帰にて収集したいくつかの母体および胎児の特徴。結果は、N、患者の数または平均(標準偏差)である。
【０２１７】
キエシンQ6についてのMASSterclass(登録商標)実験設定
MASSterclass(登録商標)アッセイは、最終段階ペプチド定量システムとして安定同位体希釈法を用いる標的タンデム質量分析を用いる(多重反応モニタリング(MRM)および単一反応モニタリング(SRM)ともよばれる)。標的ペプチドは、興味対象の特異的タンパク質について特異的(すなわちプロテオタイプ的)であり、すなわち測定されるペプチドの量が、元の試料中のタンパク質の量に正比例する。
【０２１８】
複合試料中のバイオマーカー定量に必要な特異性および感度に達するために、ペプチド分画を、最終段階定量ステップの前に行う。
適切なMASSterclass(登録商標)アッセイは、以下のステップを含み得る：
- 血漿または血清試料の調製
- ProteoPrepスピンカラム(Sigma Aldrich)を用い、抗アルブミンおよび抗IgG抗体を用いる親和性捕捉を用いるヒトアルブミンおよびIgGの枯渇(タンパク質レベルについての複雑さの低減)
- 既知量の同位体標識ペプチドの添加。このペプチドは、質量の差を生じるために組み込まれた１つの同位体標識アミノ酸を典型的に有する興味対象のプロテオタイプペプチドと同じアミノ酸配列を有する。プロセス全体の間に、標識ペプチドは、分子質量に基づく最終段階定量ステップ中以外は、内因性ペプチドと同一の化学的およびクロマトグラフィーにおける挙動を有する。
- トリプシン消化。枯渇血清/血漿試料中のタンパク質を、トリプシンを用いてペプチドに消化する。この酵素は、リシンまたはアルギニンのＣ末端にプロリンが存在する場合を除いて、タンパク質をＣ末端でリシンおよびアルギニンから切断する。消化の前に、タンパク質を煮沸により変性させ、これによりタンパク質分子は37℃にて16時間のインキュベーションの間にトリプシン活性がより近づきやすくなる。
- 第１のペプチドに基づく分画: フリーフロー電気泳動(FFE; BD Diagnostic)は、ゲルフリーの流体分離技術であり、連続層流で移動する荷電分子が流れに対して垂直の電場により分離される。電場により、荷電分子はその等電点(pI)に従ってpH勾配中で分離される。モニタリングしたペプチドを含有する画分だけを、さらなる分画およびLC-MS/MS分析のために選択する。興味対象の各ペプチドをFFEチャンバから特定の画分番号(これは、合成タンパク質ホモログを用いるタンパク質アッセイ開発中に決定する)にて溶出する。特定の画分または画分プール(多重化(multiplexing))は、次のレベルの分画に進んだ。
- 第２のペプチドに基づく分画：フェニルHPLC (XBridge Phenyl; Waters)は、ペプチドを、ペプチド配列中に存在するアミノ酸の疎水性および芳香族の性質に従って分離する。バックエンドC18分離を用いる直交性は、カラムを増加したpH値(pH 10)で操作することにより達成する。Gilarら2005, J Sep Sci 28(14): 1694〜1703により証明されるように、pHは、RP-HPLCにおけるペプチド選択性を変更するための各段に最も劇的なパラメータである。興味対象の各ペプチドは、フェニルカラムから特定の保持時間にて溶出され、これは、合成ペプチドホモログを用いるタンパク質アッセイ開発中に決定される。９つの標準ペプチドの混合物を試料分離のバッチの前に分離する外的対照システムを用いることにより、保持時間シフトを修正するために画分回収を調整することが可能になる。分画の程度は、試料中のタンパク質の濃度および試料の複雑さに依存する。
-逆相(C18)ナノLC (PepMap C18; Dionex)およびMS/MS：MRM (4000 QTRAP; ABI)/SRM (Vantage TSQ; Thermo Scientific)モードを用いるタンデム質量分析でのさらなる分離を含むLC-MS/MSに基づく定量。LCカラムは、質量分析計のソースヘッドに連結されたエレクトロスプレーの針に連結する。物質がカラムから溶出されるにつれ、分子はイオン化され、気相の質量分析計に入る。モニタリングされるペプチドは、第１四重極(Q1)を通過するように、その質量電荷比(m/z)に基づいて特異的に選択される。選択されたペプチドは、次いで、衝突セルとして用いられる第２四重極(Q2)においてフラグメンテーションされる。得られたフラグメントは、次いで、第３四重極(Q3)に入る。装置の設定により(アッセイ開発段階中に決定される)、１または複数の特異的ペプチドフラグメント(またはいわゆるトランジション)のみが検出のために選択される。
- モニタリングされるペプチドのm/zとこのペプチドのモニタリングされるフラグメントのm/zとの組み合わせは、トランジションとよばれる。このプロセスは、１つの実験中の複数のトランジションについて行うことができる。内因性ペプチド(分析物)およびその対応する同位体標識合成ペプチド(内部標準物質)はともに、同じ保持時間にて溶出され、同じLC-MS/MS実験において測定される。
- MASSterclass(登録商標)の読出しは、分析物に特異的なピーク下面積と、合成同位体標識類似体(内部標準物質)に特異的なピーク下面積との比により定義される。MASSterclass(登録商標)読出しは、試料中のタンパク質の元の濃度に正比例する。MASSterclass(登録商標)読出しは、よって、異なる試料および試料の群の間で比較できる。
【０２１９】
本研究において従った適切なMASSterclass(登録商標)プロトコールを以下に示す：
- 25μLの血漿を、20mM NH4HCO3を結合/平衡化バッファーとして用いた以外は、製造業者のプロトコールに従って(ProteoPrepスピンカラム; Sigma Aldrich)、ヒトアルブミンおよびIgGの枯渇に供する。
- 枯渇試料(225μL)を、95℃にて15分間変性させ、直ちに氷上で冷却する。
- 500 fmolの同位体標識ペプチド(カスタム調製「Heavy AQUA」ペプチド; Thermo Scientific)を試料に添加する。
- 20μgのトリプシンを試料に加え、37℃にて16時間消化を行う。
- 消化した試料を、まず、溶剤Ａ(0.1%ギ酸)中で1/8、次いで250 amol/μLの全て同位体標識した興味対象ペプチド(カスタム調製「Heavy AQUA」 ペプチド; Thermo Scientific)を含有する同じ溶剤中で1/20に希釈した。
- 20μLの最終希釈物を、オンラインMS/MSを有する逆相NanoLCをMRM/SRMモードで用いて分離した：
- カラム:  PepMap C18、75μm I.D.×25cm L、100Å孔径、５μm粒子サイズ
- 溶剤Ａ: 0.1%ギ酸
- 溶剤Ｂ: 80%アセトニトリル、0.1%ギ酸
- 勾配: 30分; ２%〜55% 溶剤Ｂ
- MRMモードでのMS/MS: 方法は、分析物および合成標識ペプチドについてのトランジションを含む。
- 用いたトランジションは、タンパク質アッセイ開発中に実験的に決定して選択した。
- 興味対象のトランジションのそれぞれは、興味対象のペプチドの決定された保持時間の３分前に開始して３分後に終了する期間にわたって測定して、各ピークが少なくとも15のデータ点を有することを確実にした。
- 未処理データを、LCQuanソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて分析して定量した：同じC18保持時間での分析物(=キエシンQ6ペプチド)ピーク下面積および内部標準物質(標識合成キエシンQ6ペプチド)ピーク下面積を、自動ピーク検出により決定した。これらは、手動で確認した。
- MASSterclass(登録商標)読出しは、分析物ピーク面積と内部標準物質ピーク面積の比により定義した。
【０２２０】
統計解析
受信者動作特性(ROC)解析は、0.53〜0.75の95% CIでの0.64のROC曲線(AUC)下面積により示されるように、キエシンQ6が15週目の患者における妊娠高血圧腎症(症例)を予測するために中程度の感度および特異性を有することを証明した。
ロジスティック回帰解析を用いて、キエシンQ6と組み合わせた場合にPEを予測するためにどの母体臨床パラメータを用いることができるかを決定した。分析物濃度(すなわちMASSterclass(登録商標)を用いて測定されるキエシンQ6相対濃度)を、log変換した。２元変数を「いいえ」について１、「はい」について２とコード化した。その他の全ての変数は連続的であり、そのまま用いた。ロジスティック回帰から得られた予測確率を用いてROC曲線解析を行い、これから、いくつかの変数を組み合わせたモデルの予測力を評価した。
【０２２１】
結果
ロジスティック回帰解析は、有意な独立した寄与がキエシンQ6、fh_petXcardioおよび1st_vst_mapによりもたらされることを証明した。モデルは、MasterClassを用いて測定した相対キエシンQ6濃度のlog変換を用いて計算した。fh_petXcardio、キエシンQ6および15週目訪問時の血圧測定を組み合わせることにより得られたAUCは、１回目の平均動脈圧を用いた場合に0.83であった。２回目の平均動脈圧を用いた場合、AUCは0.84であった。より高いAUCは、BMI、繰り返しの膣出血および母体出生時体重のようなその他の既知のリスク因子を用いて得ることができた(表２を参照)。「変数」欄のパラメータは、表１で定義されるとおりである。
【０２２２】
線形モデルにおけるキエシンQ6についての係数は負であり、15週目でのキエシンQ6の血中濃度が低いほど、より後の段階でのPEの顕れの見込みがより高いことが確認された。
【０２２３】
【表２】
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【０２２４】
上記の表２から、キエシンQ6単独は、約0.68のAUCを有してPEについての予測マーカーであることが明確である。しかし、１以上の臨床パラメータと組み合わせた場合に、AUCは、0.78以上のレベルまで著しく増加する。キエシンQ6レベルをここで試験した臨床パラメータと組み合わせることは、よって、試験の予測力にとって非常に有利である。達成された最高のAUCは0.858であり、これにより、この組み合わせは、現在利用可能なPEについての断然最良の予測試験になる。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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