(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒアルロン酸オリゴ糖を利用した、ＳＩＲＴ６誘導剤の提供。【解決手段】２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分として含有するＳＩＲＴ６誘導剤。上記ＳＩＲＴ６誘導剤は、寿命延長、老化抑制、ｉＰＳ細胞作製の際の元の細胞のリプログラミング、組織細胞増殖促進、癌、メタボリックシンドローム、肥満、脂質異常症、骨破壊、血管老化の治療及び／又は予防のために用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＳＩＲＴ６誘導剤。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、２糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種である請求項１記載のＳＩＲＴ６誘導剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、２糖以上５糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種である請求項１記載のＳＩＲＴ６誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸オリゴ糖を利用した、ＳＩＲＴ６誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、関節、皮膚、脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子として知られ、従来から、医薬品や化粧料に保湿成分として用いられている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位が連結した多糖類であり、その分子量によって、高分子量ヒアルロン酸、低分子量ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸オリゴ糖に分類される。高分子量ヒアルロン酸の分子量は一般的に１０万から１００万程度である。低分子量ヒアルロン酸の分子量は１万から１０万程度である。ヒアルロン酸オリゴ糖の分子量は、４００から１万程度である（非特許文献１）。そして、ヒアルロン酸は、生体内でも様々な生理活性を有しており、その生理活性は分子量によって大きく異なる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、  第２２８巻第１３２４〜１３２６頁（１９８５年）
【非特許文献２】Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ａｋｉｒａ  Ａｓａｒｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｅｄ：Ｇａｒｇ、ＨＧ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｓ  ＣＡ、４５７〜４７３頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特に、ヒアルロン酸オリゴ糖の生理活性は、高分子量のヒアルロン酸や低分子量のヒアルロン酸とは非常に異なると考えられている。しかしながら、その機能や効用などは未だ明らかではなかった。
【０００６】
本発明の目的は、ヒアルロン酸オリゴ糖を利用した、ＳＩＲＴ６誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＳＩＲＴ６誘導剤。
［２］前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、２糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種である上記［１］記載のＳＩＲＴ６誘導剤。
［３］前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、２糖以上５糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種である上記［１］記載のＳＩＲＴ６誘導剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＳＩＲＴ６誘導剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖の少なくとも１種を有効成分とするので、これにより細胞のＳＩＲＴ６蛋白質の発現を促進することができる。よって、例えば、寿命延長、老化抑制、ｉＰＳ細胞作製の際の元の細胞のリプログラミング、組織細胞増殖促進、癌、メタボリックシンドローム、肥満、脂質異常症、骨破壊、血管老化の治療及び／又は予防などに有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト表皮角化細胞の培養において３次元培養しＬｉｆｔ ｕｐして空気に暴露処理した直後の細胞を抗ＳＩＲＴ６抗体で染色した染色像を示す写真である。
【図２】ヒト表皮角化細胞の培養において３次元培養しＬｉｆｔ ｕｐして空気に暴露理後５日目の細胞を抗ＳＩＲＴ６抗体で染色した染色像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（ヒアルロン酸オリゴ糖）
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成単位である、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとがグリコシド結合してなる二糖単位を少なくとも含み、２糖以上２０糖以下のサイズのものを意味する。具体的には、下記式（１）、式（２）、式（３）又は式（４）で表わされる構造を有するヒアルロン酸オリゴ糖である。
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ−ＧｌｃＮＡｃ    …（１）
（式（１）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ    …（２）
（式（２）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ−ＧｌｃＡ    …（３）
（式（３）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ    …（４）
（式（４）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
なお、上記式中のＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃにおけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡにおけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
【００１１】
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、上記基本構造を有すればよく、その糖部分が修飾されていることに、特に制限はない。例えば、糖の水酸基の一部またはすべては、エステル化、エーテル化等を受けていてもよい。グルクロン酸のカルボキシル基の一部またはすべては、エステル化、アミド化等を受けていてもよい。非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。
【００１２】
上記ヒアルロン酸オリゴ糖は、そのサイズが２糖以上２０糖以下であるので、組織・細胞内に浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも適している。そのサイズは、２糖以上１０糖以下であることがより好ましい。これによれば、組織・細胞内に更により浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも更により適している。そのサイズは２糖以上５糖以下であることが最も好ましい。これによれば、前記効果とともに、組織・細胞に対する効果が、他のサイズのものに比べ顕著に優れている。
【００１３】
本発明においては、ヒアルロン酸オリゴ糖の薬学的に許容される塩を用いることもできる。その塩としては、アルカリ金属塩であるナトリウム塩やカリウム塩などが挙げられる。また、無水塩のみならず含水塩が含まれてもよい。その塩は、原料に由来するものであったり、また、ヒアルロン酸オリゴ糖の調製時に持ち込まれたりする場合もある。これらの塩は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸オリゴ糖と同様に機能する。
【００１４】
本発明においては、ヒアルロン酸オリゴ糖の薬学的に許容される溶媒和物を用いることもできる。溶媒和物としては、水和物が挙げられる。例えば、大気中に放置したり、再結晶することにより、水分を吸収したり、吸着水が付いたりして、水和物となる場合がある。また、ヒアルロン酸オリゴ糖の調製時に持ち込まれる場合もある。これらの溶媒和物は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸オリゴ糖と同様に機能する。
【００１５】
上記ヒアルロン酸オリゴ糖、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物は、その１種類のみを用いてもよく、その２種以上の複数を用いてもよい。すなわち、ヒアルロン酸オリゴ糖のサイズや分子構造が単一であってもよく、それらの異なるヒアルロン酸オリゴ糖を併用し、又はそれらの異なるヒアルロン酸オリゴ糖の複数を含有する複合物を用いてもよい。更に、塩や溶媒和物についても、単一種であってもよく、それらの異なる複数種を併用し、又はそれらの異なる複数種を含有する複合物を用いてもよい。
【００１６】
（ヒアルロン酸オリゴ糖の製造方法）
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたものであってよく、また、化学的もしくは酵素的に合成されたものを使用してもよい。好ましくは、例えば鶏冠、臍体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法によって得ることができるヒアルロン酸を酵素分解、酸分解、塩基分解、加熱処理、超音波処理などの分解処理した後、公知の精製法によってヒアルロン酸オリゴ糖を精製することにより製造することができる。また、乳酸菌やストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によって生成されるヒアルロン酸を出発原料として同様に製造することができる。更には、市販の高分子量のヒアルロン酸を出発原料としてもよい。
【００１７】
酵素分解の方法によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合、国際公開第２００２／４４７１号パンフレットや、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１２巻、第７号、第４２１−４２６頁に開示される方法に準じて製造することができる。高分子量ヒアルロン酸塩を、溶液のｐＨが５付近になるように緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液）に溶解し、ヒアルロニダーゼを添加して加水分解を行う。加水分解の温度は、３７℃付近が好ましく、１〜２４時間程度反応させる。反応後、１０、０００ｒｐｍ程度で遠心分離して上清を回収し、この上清をイオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。
【００１８】
酸加水分解によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合、高分子量ヒアルロン酸塩を、濃塩酸の５０％水溶液中において、４０℃〜還流温度で１〜５時間程度反応させる。反応後、イオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。また、ＤＭＳＯの溶媒中に０．０５〜１Ｍ程度の塩酸を用いて加熱することにより、より緩和な条件下で加水分解を行うこともできる。
【００１９】
一方、Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779には、固相合成法によって、下記のようなヒアルロン酸オリゴ糖を、その糖サイズごとに効率よく製造する方法が開示されているので、そのような方法によって製造することもできる。
【００２０】
【化１】
2015038046.tif 000002
【００２１】
なお、上記のうち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）の基本的糖構成を有するヒアルロン酸オリゴ糖は、ヒアルロン酸を出発原料にしてそれを分解処理することによっては、ほとんど得られないか、あるいは非常に収率の悪いヒアルロン酸オリゴ糖である。
【００２２】
（剤形等）
本発明に係るＳＩＲＴ６誘導剤は、上記に説明したヒアルロン酸オリゴ糖、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物（以下、単に「ヒアルロン酸オリゴ糖」という。）を、その有効成分として含有するものである。
【００２３】
ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量は、本発明の効果を発揮すれば特に限定されるものではないが、ＳＩＲＴ６誘導剤の総質量に対して、０．０００１質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。
【００２４】
本発明に係るＳＩＲＴ６誘導剤は、例えば、医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いることができる。
【００２５】
医薬品の形態としては、例えば、錠剤、液剤、乾燥粉末剤、注射剤、点滴剤、外用剤、貼付剤、気化投与用の液剤、挿入剤などが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の薬学的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料などを加えることができる。また、外用の形態で用いる場合には、例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧ、セラミドといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
【００２６】
機能性食品の形態としては、例えば、液状食品、錠剤食品、粉末状食品、顆粒状食品などが挙げられる。この場合、食用として許容される１種又は２種以上の成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ナイアシン、ビタミンＥといったビタミン類、油脂類、増粘剤、防腐剤、着色料、並びに酸化防止剤、調味料、酸味料、甘味料などを加えることができる。
【００２７】
化粧料の形態としては、例えば、点眼剤、ゲル、クリーム、スプレー液剤、噴霧液剤、泡状エアゾール製剤、ゲル状やシート状のフェイスマスクなどが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の化粧料製剤的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧ、セラミドといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
【００２８】
本発明に係るＳＩＲＴ６誘導剤の投与形態としては、経口的に摂取したり、注射剤や点滴剤の形態にて静脈注射や灌流することにより投与したりすることができる。あるいは皮膚に塗布したり、呼吸器系から吸引したりして吸収させてもよく、それらの局所に適用してもよい。点眼投与であってもよい。いずれにしてもこれらの投与形態に特に制限されるものではない。また、ヒトだけでなく動物にも適用できる。
【００２９】
ヒアルロン酸オリゴ糖の１回あたりの投与量、投与間隔等は、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、経口摂取する場合には、成人１人１回当り１ｍｇ〜７５００ｍｇが例示される。また、皮膚に塗布する場合には、単位面積あたり一回およそ０．０１μｇ〜１０００μｇ／ｃｍ２の量が例示される。また、点眼投与する場合には、１回当り０．０１μｇ〜１０００μｇの適用量が例示される。
【００３０】
なお、ヒアルロン酸オリゴ糖は毒性や抗原性がほとんどないことから、副作用のおそれが極めて少ない。
【００３１】
（ＳＩＲＴ６誘導剤）
ＳＩＲＴ６蛋白質は、ＳＩＲＴ６遺伝子の翻訳産物であり、ＳＩＲＴ６蛋白質は、老化の早期指標マーカーとしとも有用であることが報告されている（A service of the U.S. National Institutes of Health、http://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT01567176）。その生理機能としては、テロメア安定化作用（細胞分裂の限界を延長することによって細胞老化を防ぐ）、ＤＮＡを様々なダメージから防御する作用、ＤＮＡ修復作用、肝臓における糖新生（Gluconeogenesis）の抑制による糖尿病抑制作用や肥満抑制作用、癌遺伝子ＭＹＣを強力に抑制することによる癌抑制作用などが知られている。
【００３２】
ＳＩＲＴ６蛋白質は、また、ｉＰＳ細胞作製の場合の元の細胞（例えば皮膚線維芽細胞）のリプログラミングを促進するので、ＳＩＲＴ６蛋白質を増加させればｉＰＳ細胞を効率的に作製することができる。このようにさまざまな細胞機能の調節作用を担うことで細胞、組織又は生物個体の寿命の決定に関与している。
【００３３】
具体的には、ＳＩＲＴ６蛋白質は、以下の文献に示すように、寿命延長、老化抑制、ｉＰＳ細胞作製の際の元の細胞のリプログラミング、癌抑制、メタボリックシンドローム、組織細胞増殖促進、肥満防止、脂質異常症、骨破壊、血管老化などに関与していることが知られている。よって、それら種々の疾患の治療・予防に応用できる。
【００３４】
・寿命延長
Kanfi Y, Naiman S, Amir G, Peshti V, Zinman G, Nahum L, Bar-Joseph Z, Cohen HY「The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice.」Nature. 2012 Feb 22;483(7388):218-21.
【００３５】
・老化抑制、ｉＰＳ細胞のリプログラミング
1. Sharma A, Diecke S, Zhang WY, Lan F, He C, Mordwinkin NM, Chua KF, Wu JC「The Role of SIRT6 Protein in Aging and Reprogramming of Human Induced Pluripotent Stem Cells.」J Biol Chem. 2013 Jun 21;288(25):18439-47.
2. Mao Z, Tian X, Van Meter M, Ke Z, Gorbunova V, Seluanov A「Sirtuin 6 (SIRT6) rescues the decline of homologous recombination repair during replicative senescence.」Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jul 17;109(29):11800-5.
【００３６】
・癌抑制
1. Khongkow M, Olmos Y, Gong C, Gomes AR, Monteiro LJ, Yague E, Cavaco TB, Khongkow P, Man EP, Laohasinnarong S, Koo CY, Harada-Shoji N, Tsang JW, Coombes RC, Schwer B, Khoo US, Lam EW「SIRT6 modulates paclitaxel and epirubicin resistance and survival in breast cancer.」Carcinogenesis. 2013 Jul;34(7):1476-86.
2. Sebastian C, Zwaans BM, Silberman DM, Gymrek M, Goren A, Zhong L, Ram O, Truelove J, Guimaraes AR, Toiber D, Cosentino C, Greenson JK, MacDonald AI, McGlynn L, Maxwell F, Edwards J, Giacosa S, Guccione E, Weissleder R, Bernstein BE, Regev A, Shiels PG, Lombard DB, Mostoslavsky R「The histone deacetylase SIRT6 is a tumor suppressor that controls cancer metabolism.」Cell. 2012 Dec 7;151(6):1185-99.
【００３７】
・メタボリックシンドローム
Lerrer B, Cohen HY「The guardian: metabolic and tumour-suppressive effects of SIRT6.」EMBO J. 2013 Jan 9;32(1):7-8.
【００３８】
・組織細胞増殖促進・肥満防止
Schwer B, Schumacher B, Lombard DB, Xiao C, Kurtev MV, Gao J, Schneider JI, Chai H, Bronson RT, Tsai LH, Deng CX, Alt FW「Neural sirtuin 6 (Sirt6) ablation attenuates somatic growth and causes obesity.」Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21790-4.
【００３９】
・脂質異常症
Naiman S, Cohen HY. 「The contentious history of sirtuin debates.」Rambam Maimonides Med J. 2012 Oct 31;3(4):e0022. doi: 10.5041/RMMJ.10093. Print 2012 Oct.
【００４０】
・骨破壊
Lee HS, Ka SO, Lee SM, Lee SI, Park JW, Park BH.「Overexpression of sirtuin 6 suppresses inflammatory responses and bone destruction in mice with collagen-induced arthritis.」Arthritis Rheum. 2013 Jul;65(7):1776-85.
【００４１】
・血管老化
Shen J, Ma W, Liu Y.「Deacetylase SIRT6 deaccelerates endothelial senescence.」Cardiovasc Res. 2013 Mar 1;97(3):391-2.
【実施例】
【００４２】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
＜試験例＞  
被検物質として、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）１−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、４糖サイズのヒアルロン酸オリゴ糖（商品名「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ４ＥＦ−５」、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）（以下、「ＨＡ４」という。）を用いた。
【００４４】
ヒト表皮角化細胞（正常ヒト角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、アジア人女性（２７歳）由来））を１２wellプレート（Trans well、基底膜のあるもの）に播種した後、上記ＨＡ４を濃度１０ｎｇ／ｍｌで含むＤＭＥＭ培地、又は含まない同培地で培養した。なお、培養３日目には、ｗｅｌｌトップの培地を抜き取り、ｗｅｌｌボトムに新たな培地を添加して、細胞を空気にさらし３次元培養とした（Ｌｉｆｔ ｕｐ処理）。そのＬｉｆｔ ｕｐ処理直後、又はＬｉｆｔ ｕｐ処理後５日目に、細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィン切片を作製した。１次抗体として抗ＳＩＲＴ６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、２次抗体として蛍光色素標識抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）を用いて、免疫染色を行ない、その染色像を、共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）で観察した。
【００４５】
図１に示されるように、Ｌｉｆｔ ｕｐ処理直後の角化細胞において、無処置群では、ＳＩＲＴ６蛋白質の発現がほとんど認められないのに比べ、ＨＡ４添加により、顕著な発現促進が認められた。なお、Ｌｉｆｔ ｕｐ処理直後の細胞には、組織幹細胞のような未成熟な細胞が多く含まれており、そのような未成熟な細胞においてＳＩＲＴ６蛋白質の発現が促進されたものと考えられた。
【００４６】
図２に示されるように、Ｌｉｆｔ ｕｐ処理後５日目の角化細胞においても、無処置群では、ＳＩＲＴ６蛋白質の発現がほとんど認められなかった。それに対して、ＨＡ４添加した細胞では、顕著な発現促進が認められた。なお、Ｌｉｆｔ ｕｐ処理後５日目の細胞には、組織幹細胞のような未成熟な細胞と分化成熟した細胞が混在しており、そのような未成熟な細胞と分化した細胞の両方でＳＩＲＴ６蛋白質の発現が促進されたものと考えられた。
【図１】
2015038046.tif 000003
【図２】
2015038046.tif 000004