(57)【要約】  Ｔｈ１特性と細胞溶解活性の両方を有する新規の細胞型が生成された。これらのＴｈ１／キラー細胞は、末梢血液から精製され、例えば細胞傷害性Ｔ−細胞（ＣＴＬ）に類似する細胞溶解活性と合わせてＩＦＮ−ガンマの産生のようなＴｈ１特性を持つように操作されたＣＤ４＋細胞である。ＣＴＬ活性は正常細胞ではなく異常細胞を標的とする。Ｔｈ１／キラー細胞の細胞溶解活性は、グランザイムＢ−パーフォリン  メカニズムにより媒介され、異常細胞のアポトーシスをもたらす。これらのＴｈ１／キラー細胞の産生および使用の方法は、ＣＤ４＋を末梢血液から単離すること、Ｔｈ１／キラー細胞を形成するためにＣＤ４＋Ｔ−細胞を活性化すること、および細胞溶解活性を有するこれらのＴｈ１／キラー細胞を患者に投与することを含み、Ｔｈ１／キラー細胞は患者に同種異系である。
2013536232.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１／キラー細胞を含む組成物であって、
前記Ｔｈ１／キラー細胞はＴｈ１特性と細胞溶解活性を有する組成物。
【請求項２】
前記細胞溶解活性はＮＫ特性を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔｈ１／キラー細胞はグランザイムＢおよびパーフォリンを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＩＦＮ−ガンマを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＩＬ−４の発現を実質的に減少させるかあるいはＩＬ−４を全く発現しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＣＤ４＋細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＣＤ３およびＣＤ２８の架橋剤で調合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、正常なドナーの末梢血液から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、臨床的に意義のある数のＴｈ１／キラー細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、少なくとも約１ｘ１０7個の細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、少なくとも約１ｘ１０8個の細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｔｈ１／キラー細胞の前記細胞溶解活性は、正常細胞ではなく異常細胞を特に不活性にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記異常細胞は、癌細胞、感染細胞またはそれらの細胞の組合わせを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｔｈ１／キラー細胞を含む組成物であって、
前記Ｔｈ１細胞／キラー細胞は、腫瘍細胞株に対して細胞溶解活性を有するＣＤ４＋細胞である組成物。
【請求項１５】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、Ｔｈ１特性を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、グランザイムＢおよびパーフォリンを発現する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＩＦＮ−ガンマを発現する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞株は、ＡＲＨ７７である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、正常細胞を不活性化しない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
異常細胞を破壊するための方法であって、
前記異常細胞を同種異系のＴｈ１／キラー細胞を含む組成物と接触させるステップを含み、
前記異常細胞と前記Ｔｈ１／キラー細胞との相互作用により前記異常細胞が破壊される方法。
【請求項２１】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＣＤ４＋細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、Ｔｈ１特性および細胞溶解活性を発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔｈ１／キラー細胞の前記細胞溶解活性は、グランザイムＢ−パーフォリンの発現を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔｈ１特性は、ＩＦＮ−ガンマの発現を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＩＬ−４の発現を欠く、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、架橋抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とともにＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化により得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記異常細胞は、癌細胞、感染細胞、またはそれらの細胞の組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
患者を治療する方法であって、
臨床的に意義のある数のＴｈ１／キラー細胞を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、ＣＤ４＋細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、Ｔｈ１特性と細胞溶解活性を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に結合され架橋されるビーズにより活性化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、正常なドナーの末梢血液から得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔｈ１／キラー細胞は、患者にとって同種異系である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記臨床的に意義のある細胞数は、少なくとも１ｘ１０8個である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［背景技術］
癌のワクチン接種治療は免疫療法の一種である。免疫療法は、癌治療のための治療薬の一種として化学療法、放射線治療および手術に加えて浮上している新しい治療方式である。免疫療法は病気を治療するために免疫システムの力を利用しようとする。治療用ワクチン接種は免疫療法の１つであり、存在する腫瘍、ウイルスおよびバクテリア病原体に対する治癒の可能性のある療法である。治療用ワクチンは、通常標的とする疾病から得られた抗原ソースと、所望の免疫反応を促進するように設計されたアジュバントとからなる。ある種の治療用ワクチンプロトコルにおいて、生体免疫細胞は宿主（自己）に由来するかまたはドナー（同種異系）に由来するかに拘わらず、治療用ワクチンの構成成分である。樹状細胞、ＮＫ細胞およびＴ−細胞のような自系または同種異系の生体免疫細胞もまた癌治療のための免疫療法プロトコルとして用いられる。
【０００２】
リンパ球は脊椎動物の免疫システムの一部であり、大顆粒状リンパ球と小リンパ球を含む。大顆粒状リンパ球はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。小リンパ球はＴ−細胞とＢ−細胞とからなる。ＮＫ細胞は自然免疫系の一部であり、動物を腫瘍やウイルス感染細胞から守るために主要な役割を果たしている。ＮＫ細胞は、多重組織適合複合体（ＭＨＣ）クラス１表面分子を介して、感染細胞および腫瘍細胞を未感染の細胞と識別することができる。ＮＫ細胞は、サイトカインに反応して活性化され、かつ活性化により感染細胞や腫瘍細胞を破壊するパーフォリンやグランザイムＢのような細胞傷害性顆粒を放出する。ＮＫ細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋によって特徴付けられるが、ＣＤ４は発現しない。
【０００３】
Ｔ−細胞およびＢ−細胞は適応性免疫反応の一部であり、非自己抗原を認識する。Ｂ−細胞は抗体産生により非自己抗原に対して応答する。異なるタイプのＴ−細胞は異なる方法で非自己抗原に対して応答する。細胞傷害性Ｔ−細胞（ＣＴＬ）は、マーカーＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＴＣＬαβにより特徴付けられるが、ＣＤ４は発現しない。腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＴＬｓは主に腫瘍除去の役割を果たす。さらにＣＴＬｓは特に腫瘍細胞を認識することができ、同一組織内の正常細胞を攻撃しない。ＣＴＬｓは、異常細胞や癌細胞の死を誘導するグランザイムＢとパーフォリンを含む強力な酵素を含有する中毒性顆粒を産出する。
【０００４】
ヘルパーＴ細胞は細胞表面マーカーＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＴＣＲαβにより特徴付けられる。ヘルパーＴ細胞は、他の細胞または分子を介して免疫反応を指示するサイトカインまたはその他の分子を産出する。ヘルパーＴ細胞は細胞致死に直接関与することは知られていないので、通常ではグランザイムＢまたはパーフォリンのような細胞傷害性顆粒は含有しない。ヘルパーＴ細胞は次の２つのタイプ、即ちヘルパーＴ１型（Ｔｈ１）およびヘルパーＴ２型（Ｔｈ２）に副分類される。Ｔｈ１細胞は細胞性免疫を媒介し免疫介在性腫瘍の根絶に対して重要であり、一方、Ｔｈ２は液性免疫または抗体免疫を媒介する。Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とは逆調節の関係にあり、Ｔｈ１細胞が増加するとＴｈ２細胞が減少し、またその逆も同様である。
【０００５】
患者の免疫反応を促進または低下させるために、数多くの免疫治療法や組成物が開発されている。細胞治療法はしばしば、細胞の増殖、分化および／または活性化のようなエキソビボでの操作、および治療として患者にこれらの細胞を移植することを含む。
【０００６】
養子免疫療法は、患者からリンパ球を除去すること、エキソビボでリンパ球の抗ガン活性を高めること、細胞を臨床的に有意な（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）数に増加させること、そしてそれらの細胞を患者に戻すことを含む。
【０００７】
養子免疫療法の最初の実験は、患者の血液からリンパ球を除去すること、免疫促進剤でリンホカイン・インターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下でリンパ球を成長させることを含んだ。次いで成長した細胞は患者に戻された。これらのリンパ球はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＥ）細胞と呼ばれた。
【０００８】
腫瘍そのものから単離されたリンパ球を用いることで腫瘍細胞に対してより強い反応が得られた。これら腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）は、ＩＬ−２の存在下で成長し腫瘍を攻撃するために患者の体内に戻される。
【０００９】
養子免疫療法は、エキソビボで処理した細胞を体内に導入する免疫療法の一形式である。臨床前の調査は、エキソビボで活性化されて増殖された自己リンパ球と共にインターロイキン−２を用いることにより、抗腫瘍活性が促進されることが可能であることを示唆した。また高用量ボーラスインターロイキン治療での第１の客観的反応は、患者においてリンパフェレーシスにより採取された自己末梢血液リンパ球のインビトロ活性化を通して調製されたＬＡＫ細胞とともにインターロイキン−２を受け取ること、そして先ずインターロイキン−２／ＬＡＫの組合せは、インターロイキン単独よりもより活性があったと思われることが知られている。ＩＬ−２はＴｈ１ヘルパー細胞によって産生されるサイトカインである。ＩＬ−２単独よりもＩＬ−２に活性化ＬＡＫまたはＴＩＬ細胞の添加がより効果的である、ということを実証できなかった臨床実験後には、養子免疫療法を利用することへの興味は減少した。
【００１０】
ＣＤ４＋Ｔ（Ｔｈ）細胞は、感染に対する宿主側の防御のほとんどの局面における活性化および調節に対して、また細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）の十分な機能に対して、極めて重要である。多くの腫瘍免疫学の研究は、自然発生による自己腫瘍特異的Ｔ細胞に関して焦点が当てられており、それらは主としてＣＤ８＋であり悪性黒色腫およびその他の腫瘍から分離することができるものである。自己腫瘍特異的Ｔ細胞のような細胞はインビトロで増殖して再注入されることが可能である。このタイプの養子免疫療法では結果として、客観的な腫瘍反応、および他の治療介入に対して難治である疾病を持つある種の患者において長期にわたる生存を得ることができる。養子免疫療法としてＣＤ８＋サイトカインＴ細胞を用いた広範な臨床治験がある一方で、臨床応答が良好でないので、より高い割合で患者が腫瘍拒絶を達成するように、ＣＤ８＋サイトカインＴ細胞を用いるような治療を改善する必要性が強調されている。
【００１１】
ＣＤ８＋リンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプがないと、インビトロで大部分の機能性を維持することができない。インビトロで、ＣＤ８＋細胞はＭＨＣ互換性細胞株に曝すことによって、大量のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を放出しかつ自己抗原陽性およびＭＨＣ１型陽性腫瘍を溶解する。しかしながら腫瘍細胞の遺伝的な不安定性はしばしば、ＣＤ８＋傷害性Ｔ細胞にとって腫瘍を本質的に信頼できない標的とする内因性抗原を処理して提示する能力を低下につながる。さらにＣＤ８＋Ｔ細胞は、ある種のＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットに本来備わっていると思われる幅広い抗腫瘍反応を統合するための固有の能力が欠如しているように思われる。
【００１２】
ＣＴＬの養子免疫伝達を伴う免疫療法は、多くの動物モデルにおいては見込みがあることを示しているが、多くの動物モデルの結果をヒトに移行することは困難でかつ理解しにくいことが判っている。ＣＤ４＋細胞、特にＴｈ１サブタイプのＣＤ４＋細胞は、養子免疫伝達されるＣＤ８＋キラー細胞に自然の「ヘルプ」を提供するための、利用可能な免疫療法治療装備にとって魅力的な付加物となるであろう。しかしながら、自然発生した腫瘍特異的ＣＤ４＋細胞とともに作用させるには大きな障害がある。特定の患者数においてＣＤ４＋ヘルパー細胞と関連する２型ＨＬＡの遺伝的多様性は、エピトープとＴＣＲｓの識別をより不確かにするので、ＣＤ８＋細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞内で見られる１型ＨＬＡの場合よりもさらに一層複雑である。さらにＣＤ４+Ｔ細胞のインビトロでの増殖はＣＤ８+細胞よりも少なく、培養条件は細胞の特性にかなりの影響を与える。結局、腫瘍特異的ＣＤ４+細胞に基づく現実の動物モデルが不足している。これらの要素は、ＣＤ４+Ｔ細胞を用いたトランスレーショナル・リサーチを限定しＣＤ４+Ｔ細胞の臨床使用を限定するものとなっている。
【００１３】
本発明は、臨床的に有意な数のＣＤ４＋細胞を産生する方法を開示するものであり、また細胞溶解性の顆粒状グランザイムＢおよびパーフォリンを含み、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮ−γを産生するがＩＬ−４は産生しない）としてグランザイムＢおよびパーフォリンがともに機能し、および治療用癌ワクチンと養子免疫細胞治療のプロトコルにおいて使用するためにＮＫ様活性（腫瘍細胞を認識し殺すが、正常細胞は殺さない）を有する。
［概要］
細胞を基礎とする治療用癌ワクチン（細胞免疫療法）は、癌治療のための新しい最小毒性アプローチとして期待されている。このアプローチへの期待は動物モデルによって立証されているが、この期待を臨床に移行させるのは困難である（ＢｏｄｅｙとＢｏｄｅｙら、２０００年）。最近ＦＤＡで認可された最初の細胞免疫療法薬であるプロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）(登録商標)（シプリューセル−Ｔ）（ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）は、無症候性または低症候性の転移性去勢抵抗前立腺癌を治療するための自己樹枝状細胞免疫治療用（ＫａｎｔｏｆｆとＨｉｇａｎｏら）であるが、臨床応用するための改良された細胞療法を開発する新たな熱意を有する。
【００１４】
動物で開発された細胞免疫療法戦略の免疫介在性抗腫瘍メカニズムを首尾良く移行させることが困難であることがわかったので、我々は代わりに、重要な臨床的抗腫瘍効果を引き出すために既に知られている抗腫瘍免疫メカニズムに移行することに集中した。恐らく人類において今までに開示された最も強力で最も効果的な免疫介在性抗腫瘍メカニズムは、骨髄非破壊的前処置とＨＬＡ適合幹細胞の移植後に発生する移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果である(ＢａｒｒｅｔｔとＣｈｉｌｄｓ、２０００年；Ｃｈｉｌｄｓ、２０００年；ＲｅｓｎｉｃｋとＳｈａｐｉｒａら、２００５年）。残念ながら、これらのＧＶＴ効果は慢性の移植対宿主疾患（ＧＶＨＤ）毒性を伴う。慢性的ＧＶＨＤは、著しい罹病率に関係し、また同種異系の造血幹細胞移植後に末期の死亡の主な原因となるので（ＬｅｅとＫｌｅｉｎら、２００２年）、ＧＶＴメカニズムの臨床応用は著しく制限されている。
【００１５】
有害なＧＶＨＤ効果から有益なＧＶＴ効果の分離は困難であるが、それはＧＶＨＤを阻害する操作が同時にＧＶＴ効果を減少させるという点で、有益なＧＶＴ効果が相関的でありまた比例的であるからである（ＬｉとＧｉｖｅｒら、２００９年）。相互に関係するＧＶＴとＧＶＨＤ効果の既知の免疫介在療法メカニズムを解析することで、分離する代わりに、ＧＶＴ／ＧＶＨＤ効果は移植片から宿主へ、宿主から移植片へと効果の方向を逆転させることにより免疫メカニズムの相互関係を維持するという同種異系の細胞免疫療法が開発可能であるだろうと仮定された（Ｈａｒ−ＮｏｙとＳｌａｖｉｎ、２００８年）。効果の方向の首尾よい反転は、結果的に非毒性宿主対移植（ＨＶＧ）拒絶効果に結びつく宿主対腫瘍（ＨＶＴ）効果をもたらすだろう。
【００１６】
ＣＤ４０Ｌを高密度で発現し、かつ大量のインターフェロン（ＩＦＮ）−γを産生する故意にミスマッチされ活性化された同種異系のＴｈ１細胞は、結合ＨＶＴ／ＨＶＧ効果を引き出すことができるだろうと仮定される。この仮定は化学療法での難治性Ｂ細胞白血病／リンパ腫の動物モデルにおいて試験された（Ｈａr−ＮｏｙとＺｅｉｒａら、２００８年）。これらの研究は、Ｔｈ１が活性化され抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆マイクロビーズに付着されて投与される場合にのみ、エキソビボで分化した同種異系Ｔｈ１細胞により著しいＨＶＴ／ＨＶＧ活性が引き出されることが可能であると実証した。さらなる研究では、これらの同種異系ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞は、全身性の優性Ｔｈ２免疫から優性Ｔｈ１免疫に切り替えることができる免疫調節効果と、Ｔｈ特異的免疫の展開の促進と腫瘍免疫回避メカニズムの調節不全を促進するためのアジュバント効果を有する（Ｈａｒ−ＮｏｙとＺｅｉｒａら、２００９年）。これらのデータを考慮して、この実験的アプローチの臨床への移行を可能にするために、Ｔｈ１同種移植片のヒトへの適用が調査された。
【００１７】
ヒトへの臨床研究に同種異系Ｔｈ１細胞を利用するために克服する必要がある同種異系Ｔｈ１の細胞のエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での分化と増殖に関する重要な規定と論理的関心があった。そのような問題の１つは、同種異系Ｔｈ１細胞のマウスへの応用では、マウスＴｈ１細胞のエキソビボでの分化を引き起こすために外因性のサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４ｍＡｂの使用が要求されたことであった。本発明は、ヒト用生物学的製剤として分類されるための不変のバッチごとの同一性と機能的特性が得られるように、外因的サイトカインを使用しないでヒトの同種異系Ｔｈ１細胞を産生するためのＧＭＰコンプライアント・プロセスの成功率の高い開発を開示する。得られた同種移植片細胞の特徴付けをしたところ、ヒト産生プロセスは予期せぬ発見をもたらした。本願に記載される方法で生成された同種異系Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ１特性を発展させるのみならずＮＫ様特性をも発展させた。Ｔｈ１とＮＫ様活性の組合せによる同種移植片は独自性のあるものであって正常血液循環においては記載されないものである。本発明の方法は、精製された、休止期の（ＣＤ２５−）、記憶表現型とナイーブ表現型の混合するＣＤ４＋Ｔ細胞（それぞれＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ）のエキソビボでの培養を含む。該細胞は、外因性サイトカインの非存在下で固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ｍＡｂｓで複数回活性化される。細胞は９日で２５乃至１００倍に増殖しＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２hi細胞に分化する。この中間細胞は液体窒素中で数年間保存されることができる。患者への投薬が必要な場合には、前駆細胞はマイクロビーズで被覆されたＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂで４時間培養される。この最終的な４時間培養の間に前駆細胞は、さらにＣＤ６２Ｌの発現を減少させ、かつＣＤ４０ＬおよびＣＤ２５の発現を増加させるように分化する。最終的なＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４０Ｌhi、ＣＤ６２Ｌlo、ＣＤ２５＋細胞は、ＩＦＮ−ガンマを＞１０００ｐｇ／１０5個の細胞産出し、かつＩＬ−４（Ｔｈ１表現型）を＜５０ｐｇ／１０6個の細胞産出し、かつグランザイムＢの細胞溶解性顆粒体とパーフォリンを発現し、かつ正常細胞は溶解しないが腫瘍細胞を溶解することができるＮＫ様活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａは、ＣＤ４＋選択前後それぞれの細胞表現型を示すＣＤ４表面抗原の免疫染色のフローサイトメトリープロットである。図１Ｂは、ＣＤ４＋選択前後各々の細胞表現型を示すＣＤ４表面抗体の免疫染色のフローサイトメトリープロットである。
【図２】図２Ａは、休止期ナイーブＣＤ４細胞(ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ)を有するソース細胞の表現型を示す連続したフローサイトメトリープロットである。図２Ｂは、活性化ＣＤ４記憶細胞（ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ２５）へ培養後に表現型の変化を示す連続したフローサイトメトリープロットである。
【図３】活性化前のＣＡＣと活性化後のＣＦＢにおいてＣＤ６２Ｌ発現が高発現から低発現にシフトするのを示すフローサイトメトリープロットである。
【図４】図４Ａ−図４Ｃは、ＣＦＢ中でＣＤ４０Ｌの増加した発現を示すＣＤ４＋細胞、ＣＡＣおよびＣＦＢ各々におけるＣＤ４０Ｌ発現パターンのプロットである。
【図５】直接致死アッセイのグラフで、ＣＦＢが腫瘍細胞株ＡＲＨ７７から細胞を殺すことが出来ることを示す。
【図６】図６Ａは、ＣＡＣによるグランザイムＢの発現のプロットである。図６Ｂは、ＣＦＢによるグランザイムＢの発現のプロットである。図６Ｃは、ＣＦＢ中のパーフォリンの検出を示すウエスタンブロット法による写真である。
【図７】ＥＧＴＡを含有する、あるいは、含有しないパーフォリンーグランザイムＢ活性のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
この開示は独特の特性を有する細胞を含む組成物に関する。本組成物は、Ｔｈ１ヘルパー細胞特性と細胞溶解性顆粒の両方およびＮＫ活性を有する細胞型の細胞を含む。Ｔｈ１特性とＮＫ特性を組み合わせたＣＤ４＋Ｔ−細胞は、様々な疾病を持った患者に対して高い治療能力を提供することができる。Ｔｈ１の特性には、例えば、ＩＬ−４を産生しないＩＦＮ−γの産生を含むことができる。ＮＫの特性には、グランザイムＢとパーフォリンの発現を利用して正常細胞を殺すことなく腫瘍細胞を殺すことを含むことができろ。
【００２０】
本発明は、養子免疫療法のために、この新規な細胞型を臨床的に意義のある数へと分化と増殖を引き起こす方法を含む。新規の細胞を得る方法は、末梢血液または他のＴ−細胞ソースからＴ−細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞を分離することを含むことができる。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、本願に記載される方法に従って臨床的に意義のある数まで分化と増殖が行われ、免疫療法に利用されることができる。意外なことに、本願に記載されるような方法で調製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、一般的にＮＫ／ＣＴＬ細胞において見られる細胞溶解活性に類似する細胞溶解活性を示し、かつまたＴｈ１特性とＴｈ１活性を示すことができる。
【００２１】
一般的にＴ−ヘルパー細胞は、直接的に細胞溶解活性を示さず、異常細胞を非活性化するか殺すためにサイトカインおよびＮＫ細胞やＣＴＬｓのような他の細胞を後に引き出す因子を産生する。本発明の組成物においてＣＤ４＋Ｔ細胞は、直接異常細胞を殺すことができ、また後に細胞溶解活性を実行するＮＫ細胞のような他の細胞を刺激するためのサイトカインを産生することができる。これらＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞溶解活性は、グランザイムＢおよびパーフォリンを介して調節され、その結果腫瘍または感染細胞の死につながる。
【００２２】
本願で述べるように細胞溶解活性は、エフェクター細胞が標的細胞と相互作用をした場合に、標的腫瘍細胞または細胞株のエフェクター細胞により直接殺すことに関する。直接的致死は、他の細胞型は存在せず、エフェクター細胞と標的細胞のみの存在によって発生することができる。
【００２３】
本発明に記載される新規の細胞は、本願ではＴｈ１／キラー細胞と呼称される。Ｔｈ１／キラー細胞は、Ｔｈ１の特性と、正常細胞ではなく腫瘍細胞を殺すことと、グランザイムＢおよびパーフォリンの発現メカニズムを介するＮＫ活性の発現とを組合せて示すことができる。
【００２４】
本願に記載される臨床的に意義のある細胞数とは、直接的であるか間接的であるかを問わず、抗腫瘍効果を引き出すために十分なＴｈ１／キラー細胞の数に関する。一般的に１回の投与で投与されるＴｈ１／キラー細胞の数は少なくとも１ｘ１０6個の細胞数、好ましくは少なくとも１ｘ１０7個の細胞数、より好ましくは少なくとも約１ｘ１０8個の細胞数である。より多くの細胞数での複数投与もこの発明の範囲である。複数の患者対して十分な投与量を生産するために１人の献血者から十分な量の細胞を生産することが好ましい。臨床的に意義のある数は、少なくとも１人、より好ましくは１０人まで、最も好ましくは１００人以上の患者ために十分な細胞数であることを含む。
【００２５】
本発明の組成物は様々な異常細胞を有する患者に対して投与されることができる。患者は動物、ヒトまたは他の哺乳類であることができる。異常細胞は癌細胞もしくは感染組織からの細胞であることができる。異常細胞はウイルスおよび／または細菌性病原体で感染されてもよい。本発明の組成物は、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌などの固形癌を有する患者に投与され得る。また本発明の組成物は血液性悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ性白血病、多重骨髄炎、非ホジキン性リンパ腫）またはウイルス性感染症（例えば、肝炎Ｂまたは肝炎Ｃ、ヘルペス、ＨＩＶ）、およびその他の障害を有する患者に投与され得る。
【００２６】
本願に記載される組成物は生細胞である。生細胞とは、トリパンブルー押出法、ＭＴＴ法、または、適切な条件下で増殖、分化および／または活性などのエキソビボでの細胞操作が可能であるようなＡＴＰレベルの生体発光検出法、などの適切なアッセイ法を用いた測定により、７０％より多くの細胞が生存可能であることを意味する。しかしながら組成物はいくらかの、不活性細胞、放射性細胞および／または生育不能細胞、および非生存成分を含み得る。
【００２７】
一般的に組成物は、例えば、まずドナーの血液に由来するＣＤ４＋細胞を含む。ドナーは疾患のない正常者であることができる。ＣＤ４＋細胞は、本願に記載される方法で処理され、次に同じドナーに、または血縁関係者あるいは非血縁関係者の受容者に輸液として処方され得る。
【００２８】
ＣＤ４＋の細胞ソースは末梢血液から精製されるものが好ましい。ＣＤ４細胞は種々の方法で精製されることができる。一般的に、ＣＤ４＋細胞は正の選択により末梢血液のバフィーコート（軟膜）から精製される。バフィーコートからのＣＤ４＋の正の選択は、例えば磁気ビーズおよびカラム（ミルテニーバイオテク社製（オーバン、カリフォルニア州））を用いて行われることができる。これにより、細胞組成物は約９０％より多く、好ましくは９５％より多く、さらに好ましくは９８％より多くの純粋ＣＤ４＋細胞を得ることができる。
【００２９】
バフィーコートから分離されＴｈ１細胞／キラー細胞の産生のための原料物質として用いられるＣＤ４＋細胞は、幾つかの細胞表面マーカーの発現により特徴付けられることができる。末梢血液のバフィーコートから精製されたＣＤ４＋細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯマーカーの混合集団を有することができる。通常ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分はＣＤ２５−である。好ましくはＣＤ４＋細胞ソースは、ほとんどがナイーブ（ＣＤ４５ＲＯでなくＣＤ４５ＲＡを発現）である。またソースＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ６２Ｌ発現およびＣＤ４０発現により評価される。一般的にソースＣＤ４＋Ｔ細胞は極めて少量のＣＤ４０Ｌを発現する。ＣＤ６２Ｌの発現は二峰性の（高および低）平均蛍光強度（ＭＦＩ）ピークであることができる。ソースＣＤ４＋.細胞は高ＣＤ６２Ｌ発現を有することが好ましい。
【００３０】
ソースＣＤ４＋Ｔ細胞は複数の活性化ステップにより、Ｔｈ１／キラー細胞に分化するように処理されることができる。ＣＤ４＋細胞は３日ごとに９日間活性化することが好ましい。これらのＣＤ４＋細胞は、ＣＤ３およびＣＤ２８細胞の表面分子を架橋することで活性化されることが好ましい。ＣＤ３およびＣＤ２８の架橋は、固定化抗ＣＤ３およびＣＤ２８のモノクローナル抗体を添加することで達成できる。通常Ｔｈ１／キラー細胞は細胞培養で分化と増殖により得られる。多重活性化されたＣＤ４＋細胞は細胞培養液から採取されて液体窒素中に凍結保存される。患者に投与する前に細胞は最終活性化される。活性剤は細胞と共に残される。活性剤が添付された細胞は、例えば、注射器のような注入または注射に適した器具内で調合される。本願で用いられる「活性化」は、モノクローナル抗体のような作用体による細胞表面分子の結合およびを架橋剤によるこれらの作用体の架橋の両方を指す。このタイプの活性化は例えば米国特許第７，４３５，５９２号および米国特許第７，４０２，４３１号に記載されており、両明細書は参照のために本願に援用される。
【００３１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ−細胞表面分子に特異的な固定化モノクローナル抗体を用いることを含む様々な方法で活性化され得る。好適な活性化Ｔ−細胞は、例えば、米国特許第７，４３５，５９２号に記載されている。細胞は、後に架橋されるモノクローナル抗体もしくは他の結合剤によって結合された細胞表面部分を有することが好ましい。これらのモノクローナル抗体および／または結合剤は、例えばＴ−細胞を活性化するために固体表面上に固定するような結合剤により架橋することが好ましい。これらは、培養液活性化細胞（ＣＡＣ）として本願に称される。これらエキソビボで調合されたＣＡＣは、将来使用するためにあるいは輸液を処方するために凍結されることができる。ＣＡＣは、例えば分注されて液体窒素タンクのガス相で凍結され得る。ＣＡＣは後述するように予め定義されている同一性と機能的放出の基準を一貫して満たすことができる。工程および最終品質管理において、無菌と非毒性の状態を確認するためのテストが定められている。
【００３２】
一実施の形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、インビトロジェン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入したＣＤ３／ＣＤ２８  クリネックス  ビボ  ダイナル  ビーズ  ＣｌｉｎＥｘ  Ｖｉｖｏ  Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓで９日間培養される。細胞は、３７℃、５％ＣＯ2のライフ  セル  フラスク（バクスター  サイエンティフィック社製（ディアフィールド、イリノイ州））中で成育され、培養の３日目および６日目にビーズで再刺激される。９日間の培養の後、ビーズは取り除かれて得られた細胞はＣＡＣと称されることができる。活性化のための他の細胞培養方法もまた本発明の範囲内である。
【００３３】
好ましい実施の形態において、エキソビボで調製されたＣＡＣは、患者への投与または他の用途に必要とされるまで冷凍保存される。患者への投与をする前に、必要があればＣＡＣは解凍されて洗浄され、例えば米国特許第７，４０２，４３１号に記載されたようにＣＤ３およびＣＤ２８のような細胞表面結合部分の架橋により栄養培地で再活性化される。ＣＡＣは、次に活性剤および架橋剤とともに洗浄されかつ調合用緩衝液のような非栄養緩衝液に移される。調合用緩衝液中の再活性化細胞は、本願では調合用緩衝液内細胞（ＣＦＢ）と呼ばれる。また本願ではＣＦＢはＴｈ１／キラー細胞とも呼ばれ得る。ＣＦＢとＴｈ１／キラー細胞とは本願において置き換え可能に用いられる。
【００３４】
Ｔｈ１／キラー細胞は、注射器または他の適切な容器内に充填され、必要に応じて治療現場に移されることができる。次いでＴｈ１／キラー細胞は、治療目的のために患者に投与されることができる。Ｔｈ１／キラー細胞は、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与または他の適切な方法によって投与され得る。Ｔｈ１／キラー細胞は、一旦非栄養緩衝液に移されると保存期間が制限される。細胞は、少なくとも１ｍｌ当たり約１０6個の細胞密度、好ましくは約１０7個の細胞密度またはそれ以上の密度に調合されることができる。ある実施の形態では、細胞は１ｍｌ当たり約１０8個の細胞密度、あるいはそれ以上の細胞密度に調合される。細胞の固有濃度は、細胞の特定の使用または治療プロトコルにより決定され得る。
【００３５】
組成物には、Ｔｈ１／キラー細胞に加えて、幾つかの他の構成成分を含み得る。これらの成分には、例えば、細胞を望ましい活性化状態で維持する薬剤を含むことができる。１つの例示的な実施の形態では、構成成分には、以下の実施例において記載されるダイナビーズ  クリネックスビボ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ）（登録商標）のようにＴ−細胞を活性化状態に維持する薬剤を含むことができる。
【００３６】
一般的に、細胞は患者への輸液に適した非栄養緩衝液に移される。細胞は種々の非栄養緩衝液中に入れることができる。本願で述べられる非栄養緩衝液は、細胞増殖および／または細胞拡大を支持するために適切な構成成分に欠ける任意のタイプの媒体、緩衝液あるいは他の液体である。非栄養緩衝液は一般的に、等張性で、ＵＳＰステライル（ＵＳＰ  ｓｔｅｒｉｌｅ）で、発熱物質がなく、無傷の生細胞を維持するために適切な構成成分および／または緩衝システムを含み、かつヒトの非経口使用が許可されているものである。１つの例示的な実施の形態では、非栄養緩衝液は１％のヒト血清アルブミン（マッケソン社製（サンフランシスコ、カリフォルニア州））を添加したプラズマライト  Ａ（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ）（バクスター  サイエンティフィック社製（ディアフィールド、イリノイ州））である調合用緩衝液である。
【００３７】
Ｔｈ１／キラー細胞の幾つかの実施の形態では、細胞に対する活性化信号は、細胞が非栄養緩衝液に移される場合でも維持される。例えば、細胞表面の結合部分を架橋することで細胞が活性化される幾つかの実施の形態では、架橋は非栄養緩衝液中で維持されることが好ましい。保存期間中の架橋のメンテナンスは、保存場所から移動させた後に組成物の機能的特性を回復させるために重要であり得る。
【００３８】
組成物中のＴｈ１／キラー細胞は機能特性の新規な組合せを示すことができる。これらの機能は、Ｔｈ１特性およびＮＫ機能に類似した細胞溶解機能を含む。Ｔｈ１／キラー細胞は、通常ＩＦＮ−ガンマを産生し、また実質的にＩＬ−４の産生は減少または無産生である。ＩＬ−４の産生は５０ｐｇ／１０6個の細胞より少なくＩＦＮ−ガンマの産生は１０００ｐｇ／１０6個の細胞よりも多いことが好ましい。
【００３９】
Ｔｈ１／キラー細胞の付加的な機能特性は、例えばＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、パーフォリンおよびグランザイムＢのような機能性分子、４−ＩＢＢＬ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＴＷＥＡＫ、ＰＤ−１、Ｂ７ファミリーなどのＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）などの共刺激分子、インテグリン、カドへリンおよび種々のサイトカインとケモカインのセレクチンと分泌物などの粘着分子を発現することと、およびこれらサイトカインとケモカインの受容体を発現すること含むことができる。Ｔｈ１／キラー細胞は、大量のサイトカインを産生し分泌することができる。産生されたサイトカインは、例えば、残留するＩＬ４分泌物のみを伴ったＩＮＦα、ＧＭ-ＣＳＦおよびＴＮＦ−αである。
【００４０】
また本願に記載されるＴｈ１／キラー細胞は、細胞溶解活性も示すことができる。細胞溶解活性はＣＴＬ細胞／ＮＫ細胞の特徴に類似する。一般的に、ＣＴＬ細胞／ＮＫ細胞の細胞溶解活性は、Ｔｈ１／キラー細胞と同様に、腫瘍細胞または異常細胞に対して特異性があるが正常細胞に対して特異性はない。すなわち、Ｔｈ１／キラー細胞は異常細胞を殺すことはできるが、正常細胞を殺すことはできない。細胞溶解活性は様々なメカニズムを介して生じることができる。例えば細胞溶解活性は、グランザイムＢ−パーフォリン  メカニズムを介して生じることができる。細胞溶解活性は細胞溶解やアポトーシスにより細胞の破壊につながり得る。Ｔｈ１／キラー細胞の細胞溶解活性をＥＧＴＡにより阻止することができる。例えば、ＥＧＴＡ濃度約１ｍＭで活性Ｔｈ１細胞の細胞溶解活性を減少させることができる。
【００４１】
本発明のＴｈ１／キラー細胞は、グランザイムＢ分子とパーフォリン分子を発現することができる。グランザイムＢとパーフォリンは、通常ナイーブまたは分化や活性などによる成熟後であってもＣＤ４＋細胞には発現されない。活性Ｔｈ１細胞のグランザイムＢとパーフォリンの用量は変えることができる。通常、発現されるグランザイムＢとパーフォリンの用量は、異常細胞を破壊するのに十分な量である。
【００４２】
好ましい実施の形態では、本発明はＴｈ１／キラー細胞を含む組成物を含む。本発明に含まれる組成物のＴｈ１／キラー細胞は、ＡＲＨ７７などの骨髄腫瘍細胞株を含む様々な腫瘍細胞を不活性化することができる。異常細胞の不活性化は、ＥＧＴＡに対して感受性があるメカニズムを介してできる。エフェクター細胞（Ｔｈ１／キラー細胞）と標的細胞（異常細胞）の比率は変化させることができる。エフェクター細胞と標的細胞の比率は、少なくとも１：９、好ましくは少なくとも１：５、より好ましくは少なくとも１：１、とすることができる。
【００４３】
本発明は異常細胞を破壊する方法を含む。異常細胞は患者の体内に存在することができる。例えば、患者は悪性腫瘍を有してもよく、またはウイルス感染により感染した細胞組織を含んでもよい。患者は充実性腫瘍または血液の悪性腫瘍を有してもよい。本発明の方法は、患者に本願に記載されるＴｈ１／キラー細胞を含む組成物を投与することを含むことができる。Ｔｈ１／キラー細胞は患者にとって同種異系であることが好ましい。同種異系細胞は１人の正常な同種異系のドナーから得られてもよい。あるいは、同種異系細胞は複数のドナーから得られて治療用組成物に結合されてもよい。患者と同種異型細胞間の組織適合性の不一致を最大化することが好ましい。患者と同種異系細胞間の組織適合性は許容されることができ、依然として所望の結果を得ることができる。
【００４４】
Ｔｈ１／キラー細胞は、皮内、静脈内、腹腔内などの様々な経路で患者に投与されることができる。患者は１投与量または複数投与量を投与され得る。患者に投与される細胞数は様々であることができるが、特異的疾患、患者、活性化の方法および他の要因によって決まり得る。通常、患者は少なくとも１０7個の、好ましくは少なくとも１０8個の、より好ましくは１０9個の活性Ｔｈ１細胞が投与される。
【００４５】
また本発明はＴｈ１／キラー細胞を含む組成物を投与することにより患者を治療する方法を含む。患者はＴｈ１／キラー細胞の１以上の投与量を受けてよい。投与量および投与の頻度は変わることができ、特異的疾患により決定することができる。好ましい実施の形態では、Ｔｈ１／キラー細胞は患者に対して同種異系であり、Ｔｈ１／キラー細胞の患者への投与は、移植片対宿主病を起こさずに宿主対移植片効果に加えて宿主対腫瘍効果をもたらす。
【００４６】
［実施例］
材料
ＰＥ結合  ＣＤ４０Ｌは、ベックマン  コールター社（ブレア、カリフォルニア州）から購入し、７−アミノーアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（１０００ｘ）は、ケイマン  ケミカル社（アナーバー、ミシガン州）から購入し、プラズマライト  Ａ（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ）は、バクスター  サイエンティフィック社（ディアフィールド、イリノイ州）から購入し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、マッケソン社（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から購入し、ＦｃＲ結合阻害剤は、ｅバイオサイエンス社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入し、ダイナビーズ  クリネックスビボ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ）（商標）は、インビトロジェン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入した。
【００４７】
培養で活性化される細胞の調製（ＣＡＣ）
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、インビトロジェン社から購入したＣＤ３／ＣＤ２８  クリネックスビボ  ダイナル  ビーズ）（ＣｌｉｎＥＸＶｉｖｏ  Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄｓ）の存在下で９日間培養された（ロケーション）。細胞は、３７℃で５％のＣＯ2のライフ  セル  フラスク（バクスター社）中で培養され、培養の３日目と６日目にビーズで再び刺激された。培養から９日目にビーズを取り除くことができ、これらの細胞はＣＡＣと呼ばれる。
【００４８】
調合用緩衝液中の細胞の調製（ＣＦＢ）
ＣＡＣは、洗浄のためｃＲＰＭＩ培地に置かれた。調合プロトコルの始まりを指示するために時間が記録された。ｃＲＰＭＩ培地中の細胞は遠心分離されて上澄み液は除去されて、細胞はｃＲＰＭＩ緩衝液中に再懸濁された。細胞生存率はトリパンブルー法を用いて測定された。生細胞の総数と濃度を用いて生細胞の割合（％）を決定した。生細胞が８０％より大きいサンプルの場合には、処置は細胞の再活性化および調合のために続けられた。
【００４９】
ＣＡＣ細胞は、１ｍｌあたり１ｘ１０7個の細胞濃度中に再懸濁された。１ｘ１０7個の生細胞濃度で再活性化が行われた。再活性化は容積によるが２４ウエルプレート、６ウエルプレートまたは７５ｃｍ3のフラスコで行われた。ダイナビーズ  クリネックスビボ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ）（登録商標）ＣＤ３/ＣＤ２８は、細胞を再活性化するために添加され、３６−３８℃で５%のＣＯ2で４時間培養された。
【００５０】
４時間培養した後、次に細胞は取り除かれて最終調合用緩衝液（ＦＦＢ）の入った５０ｍｌのチューブに移された。ＦＦＢは、１％のＨＳＡを添加したプラズマライト  Ａ（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ）である。再活性化細胞は、遠心分離され、上澄み液は取り除かれてＦＦＢ中で再懸濁された。これらは、調合用緩衝液内細胞（ＣＦＢ）と呼ばれる。
【００５１】
ＣＦＢは、１ｍｌあたり１０7個の細胞濃度のＦＦＢ中で再懸濁された。ＣＦＢは、皮内（ＩＤ）投与、脊椎内（ＩＴ）投与または静脈内（ＩＶ）投与のために懸濁された。細胞懸濁液の１ｍｌは、皮内（ＩＤ）投与調合剤として３ｍｌ、脊椎腔内（ＩＴ）投与配合剤として３ｍｌ、静脈内（ＩＶ）投与配合剤として５ｍｌ、それぞれの注射器に加えられた。適切な調合剤の入ったこれらの注射器は平均温度約４℃で冷蔵保存された。
【００５２】
保存後のサンプルの採取
細胞および上澄み液は異なる時点で回収された。回収された時点は以下の通りであった：０(起点)、室温（ＲＴ）で２時間、４℃で４８時間、および４℃で４８時間保存後室温で２時間。
【００５３】
各時点で、１００ｕｌ（μｌ）の細胞懸濁液が採集されて、細胞は４００ｇで５分間４℃で回転された。次に、上澄み液は後にＥＬＩＳＡ法でＩＦＮ−γを検出するために別のチューブに移し変えられた。細胞はフローサイトメトリーのために染色バッファ１５０ｕｌ中に再懸濁された。いくつかの実験では、細胞は１００ｕｌのｃＲＰＭＩ培地に再懸濁され、３７℃で２４時間５％ＣＯ2でインキュベータ中で培養された。２４時間培養した後上澄み液は取り除かれＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ−γを検出した。
【００５４】
フローサイトメトリー（ＣＤ４０Ｌおよび７−ＡＤＤ）
５０ｕｌの細胞懸濁液は上記１５０ｕｌから３つのエッペンドルフチューブに移されて、それぞれ染色なし、ＣＤ４０Ｌ、および７−ＡＤＤと標識された。染色なしのチューブは、氷上で２０分間培養された。ＣＤ４０Ｌチューブは、製造者の指示によれば氷上で２０分間ＦｃＲ結合阻害剤とともにプレインキュベートされた。次に、染色バッファ４０ｕｌ（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ)とＰＥ−ＣＤ４０Ｌ抗体１０ｕｌは、細胞懸濁液に添加されて、さらに２０分間暗闇の氷上で培養された。
【００５５】
細胞の生存は、７−ＡＡＤを用いたフローサイトメトリーにより試験された。７−ＡＡＤは死細胞または損傷を受けた細胞のＤＮＡ中にインターカレートし、７−ＡＡＤ陽性細胞の決定は細胞生存性の指標となる。７−ＡＡＤのチューブは４００ｇで５分間、６℃で遠心分離された。上澄み液を取り除いた後、細胞ペレットは１００ｕｌの１ｘ７−ＡＡＤ液中に再懸濁された。チューブは、氷上において１５分間暗闇中で培養された。染色バッファ１ｍｌがＣＤ４０Ｌチューブに添加され、次に３つのチューブが一緒に遠心分離された。上澄み液を捨てた後で、細胞ペレットは０．４ｍｌの染色バッファで再懸濁されてＦＡＣＳ機器が操作された。
【００５６】
実施例１  ＣＤ４＋細胞の精製および細胞表現型
正常なドナーの抹消血液を得てミルテニーバイオテク社（オーバーン、カリフォルニア州)から入手したミルテニー磁気ビーズとカラムを用いてバフィーコートからＣＤ４＋細胞を精製した。図１は、ＣＤ４に対する測方散乱（細胞の大きさと密度を測定）のフローサイトメトリープロットである。図１は、ＣＤ４＋細胞は総数（Ｎ＝２２）の約４６％を示す。ＣＤ４＋細胞の正の選択の結果として、９８．６９％の純粋ＣＤ４＋細胞（Ｎ＝２２)が得られた。図１Ｂに見ることができるように、カラム後のＣＤ４＋の集団はリンパ球と単球の両方を含む。
【００５７】
各バッチは異なるドナーから生産されるので、抗原マーカーは生産の始めと終わりにテストされた。培養で活性化される細胞（ＣＡＣ)（図２Ｂ）に対するＣＤ４＋細胞の細胞表現型（図２Ａ)がテストされた。結果はナイーブＣＤ４＋表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋）から記憶表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋)へと非常に一貫性のあるシフトを示す。図２Ａは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ２５に対してＣＤ４＋細胞の表現型をそれぞれ示す。図２Ｂは、培養９日後のＣＡＣの表現型と、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ２５のそれぞれの表面発現の分析を示す。ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯの混合集団から、ＣＲ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性集団が得られる。ＣＤ２５＋細胞は発現工程の開始時には約１０％である。９日目にはＣＤ２５＋細胞は約８５％であった。これは細胞の活性化状態によるものである。図２Ａは、カラム後のＣＤ４＋細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（平均４４．７６％、ｎ＝２９）、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（平均５３．４４％、ｎ＝２９)およびＣＤ２５＋細胞（平均１０．８３％、ｎ＝２９）のナイーブ表現型であることを示す。図２Ｂは、継続して刺激を与えた培養で９日後を示すが、表現型はＴｈメモリ様細胞に変化する。ＣＤ４５ＲＡは急激に減少し（平均４．２２％、ｎ＝２９）、ＣＤ４５ＲＯ＋は平均９７．８（ｎ＝２９）に増加し、またＣＤ２５＋も平均９０．０３％（ｎ＝２９）に増加する。
【００５８】
ＣＤ６２Ｌ発現パターン
図３は第０日目（デイ０)を示し、ＣＤ４＋シード細胞は最大ピーク約１０3（算術平均は５４１、ｎ＝１７）の二峰性ＣＤ６２Ｌ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を発現する。ＭＦＩは、培養９日後に算術平均は１５４１まで増加し（ＣＡＣ）、次いで最後の４時間の活性化の後、極端に減少する（算術平均の平均は１９０．３）（ＣＦＢ)。
【００５９】
ＣＤ４０Ｌ発現パターン
ＣＤ４０ＬのＣＡＣ上の発現密度は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４時間刺激した後にＣＡＣの表面上で一貫して上昇する。図４は、代表的なバッチにおけるＣＤ４０Ｌ発現の算術平均と割合の変化を示し、第０日目（図４Ａ)、最終活性前にＣＡＣを採取した第９日目（図４Ｂ）、および４時間活性化させた後のＣＦＢ（図４Ｃ)と比較する。見られるように、不活性細胞と活性細胞の違いは、ＣＤ４０Ｌ＋細胞の割合においてはさほど大きくはないが、むしろ算術平均において大きい（ＣＦＢの算術平均は１１２であるが（ｎ＝２９）、ＣＡＣの算術平均は２０（ｎ＝２９）である）。
【００６０】
最終活性化中のサイトカイン分泌物
第９日目の各生産物バッチからＣＡＣ細胞を採取したサンプルはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４時間活性化され、上澄み液は収集され、ＥＬＩＳＡ分析法を用いてサイトカイン生産物（ＩＦＮ−γ，ＩＬ−４，ＩＬ−８，ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ）を試験した。表１は、これらの実験の結果を示す。
【００６１】
【表１】
2013536232.tif 000003
ＩＦＮ（著作権）とＩＬ−４の数値のみが機能的な放出基準に使用された。１９の連続したバッチの結果を表１に示す（数値はｐｇ／１０6個の細胞／４時間として示される）。報告される平均はパッシング  バッチ（ｐａｓｓｉｎｇ  ｂａｔｃｈｅｓ）のみを含む。
【００６２】
実施例２
活性化Ｔｈ１／キラー細胞による直接致死
ＣＦＢが腫瘍細胞に直接影響があり得るかどうかをテストするために、ＡＲＨ７７細胞株を殺す細胞能力が試験された。ＡＲＨ７７の細胞株は樹立骨髄腫細胞株である。ＡＲＨ７７細胞は、ＡＲＨ７７細胞をＣＦＢと区別するためにＣＦＳＥで染色された。ＣＦＢは、標的（ＡＲＨ７７）に対して異なるエフェクター（ＣＦＢ）で１８時間染色されたＡＲＨ７７と混合された。その後、７ＡＡＤが添加されて、細胞はＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメトリーを用いて得られた。この実験は異なるＣＡＣバッチを用いて、新鮮で解凍されたＣＦＢを用いて繰り返し行われる。ＡＲＨ７７単独、ダイナビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ）、ＣＤ４＋細胞と供に、またはＣＡＣと供にでは、示されてはいないが、著しい致死（１０％以下)データは見られない。図５に示される結果は、ＣＡＣ、ＣＤ４＋細胞またはビーズではなく、ＣＦＢがＡＲＨ７７細胞株に対して直接致死効果があることを示す。
【００６３】
直接致死効果の性質は、その効果がパーフォリン−グランザイム経路によるものであるかどうかを見るために試験された。パーフォリンとグランザイムＢを染色するために内部染色とウエスタンブロット法の両方を用いた。見られるように、図６ＡはＣＡＣがグランザイムＢをほとんど発現しないことを示す。図６ＢはＣＦＢがかなり多量のグランザイムＢを発現することを示す。図６Ｃは、ウエスタンブロット法の使用によってのみパーフォリンが検出可能であることを示す。レーン１は、ポジティブコントロールとして活性ＰＢＭＣｓの抽出物である。レーン２及び４は、異なるバッチからのＣＡＣである。レーン３およびび５は、同一バッチからのＣＦＢである。
【００６４】
阻害アッセイはまた、直接致死メカニズムの性質を明らかにするために行われた。下の表２に示すように、ＣＦＢは上記のようにＡＲＨ７７細胞と混合されて異なる阻害剤が添加された。ＣＤ４０Ｌおよび/またはＦＡＳ−Ｌに対する抗体が、ＣＦＢ・ＡＲＨ７７混合物に添加された。表２は、最も高い濃度でも致死プロファイルを妨げなかったことを示す。
【００６５】
【表２】
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直接致死メカニズムにおけるＥＧＴＡの効果が試験された。ＥＧＴＡは、パーフォリンの重合を妨げ、パーフォリン／グランザイムＢメカニズムの阻害剤として作用する。１ｍＭのＥＧＴＡが上記の直接致死アッセイに添加された。図７に示すように、１ｍＭのＥＧＴＡは平均５０％致死を減少させた（ｎ＝７）。ペアｔ検定のＰ値は０．０００２である。ＣＦＢが示す直接致死効果は、パーフォリン−グランザイム経路に由来する。
【００６６】
本発明は、好ましい実施の形態に関して記載されているが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく当業者は形式上のおよび詳細において変更がされ得ることは認識されるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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