(57)【要約】  本発明は、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ脂質などと組み合わせて使用してオリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成することのできる新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、従来のカチオン性脂質よりも効率的なカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、アミノアルコールを用いてｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率を促進する。【選択図】図１
2013531634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａのカチオン性脂質：
【化１】
2013531634.tif 000016
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ３は、Ｒ１と一緒に、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立に、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”およびＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’で置換されていてもよく；及び
Ｌ２は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’で置換されていてもよい）；
またはその任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、各々Ｈであり；
Ｒ３が、Ｈであり；
Ｌ１が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され；かつ
Ｌ２が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質、またはその任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項３】
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物１）；
２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物２）；
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（化合物３）；および
２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物４）
から選択されるカチオン性脂質、またはその任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項４】
脂質ナノ粒子の調製のための、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中の成分としての、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ脂質などと組み合わせて使用して、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成すること、細胞内取り込みおよびエンドソーム脱出を促進すること、ならびにインビトロおよびインビボの両方で標的ｍＲＮＡをノックダウンすることのできる新規なカチオン性脂質に関する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性脂質、および脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための使用は、これまでに開示されている。脂質ナノ粒子、および脂質ナノ粒子の、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための使用は、これまでに開示されている。オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む）およびオリゴヌクレオチドの合成は、これまでに開示されている。（米国特許出願：米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【０００３】
従来のカチオン性脂質、例えばＤＬｉｎＤＭＡなどは、肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に用いられているが、最適でない送達効率が難点である。本発明の目的は、効率の向上を示すカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、アミノアルコールを用いてｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率を向上させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書
【特許文献２】米国特許出願第２００６／０２４０５５４号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００８／００２００５８号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００９／０８６５５８号
【特許文献７】国際公開第２００９／１２７０６０号
【特許文献８】国際公開第２００９／１３２１３１号
【特許文献９】国際公開第２０１０／０４２８７７号
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０５４３８４号
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０５４４０１号
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０５４４０５号
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０５４４０６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ脂質などと組み合わせて使用して、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成することのできる新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、従来のカチオン性脂質よりも効果的なカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率を向上させるために、アミノアルコールを用いる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】マウスにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性を示す図である。
【図２】ラットにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の様々な態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを、任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子中で有用な新規なカチオン性脂質の有用性に関する。（米国特許出願：米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【０００９】
本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用な脂質ナノ粒子中の成分である。
【００１０】
本発明の第一の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ａ：
【００１１】
【化１】
2013531634.tif 000003
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ３は、Ｒ１と一緒に、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立に、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”およびＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’で置換されていてもよく；かつ
Ｌ２は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’で置換されていてもよい）
あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体によって示される。
【００１２】
第二の実施形態では、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が、各々Ｈであり；
Ｒ３が、Ｈであり；
Ｌ１が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され；かつ
Ｌ２が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される；
式Ａを有する化合物、あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体を特徴とする。
【００１３】
具体的なカチオン性脂質は、
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物１）；
２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物２）；
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（化合物３）；および
２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物４）；
あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体である。
【００１４】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の調製に有用である。
【００１５】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１６】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１７】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１８】
本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸、およびキラル平面を有し（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐａｇｅｓ  １１１９−１１９０に記載される通り）、ラセミ化合物、ラセミ混合物、そして個々のジアステレオマーとして生じる可能性があり、光学異性体を含むすべての起こり得るその異性体および混合物が本発明に含まれる。その上、本明細書に開示されるカチオン性脂質は、互変異性体として存在する可能性があり、たとえ１つの互変異性体構造しか示されていないとしても、両方の互変異性型が本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００１９】
本発明のカチオン性脂質上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、当分野で公知の技法、ならびに下に示す方法によって、容易に入手可能な出発物質から容易に合成することのできるカチオン性脂質を提供するために、当業者によって選択され得ることは理解される。置換基自体が１超の基で置換されている場合、これらの複数の基は、安定した構造が生じる限り、同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことは理解される。
【００２０】
化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発物質から当分野で公知の技法によって容易に合成することのできるカチオン性脂質を提供するために、当業者によって１以上のＳｉ原子を本発明のカチオン性脂質に組み込むことができることは理解される。
【００２１】
式Ａの化合物において、原子は、その天然の同位体存在度を示してもよいし、あるいは１以上の原子は、同じ原子番号を有するが、天然に優勢に見出される原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する、特定の同位体が人工的に濃縮されていてもよい。本発明は、式Ａの化合物のすべての適した同位体変化を含むことを意図する。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形には、プロチウム（１Ｈ）および重水素（２Ｈ）が含まれる。プロチウムは、天然に見出される優勢な水素同位体である。重水素を濃縮することにより、ある種の治療上の利点、例えばインビボ半減期の増加または必要用量の低下などをもたらすことができるか、または、生体試料の特徴付けに標準物質として有用な化合物を得ることができる。式Ａの中の同位体濃縮化合物は、過度の実験を行うことなく、当業者に周知の従来技法によるか、または本明細書のスキームおよび実施例に記載されるものに類似するプロセスにより、適切な同位体濃縮試薬および／または中間体を用いて調製することができる。
【００２２】
本明細書において、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２３】
本明細書において、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する不飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２４】
本明細書において、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する４〜１０員の芳香族もしくは非芳香族複素環を意味し、それには二環式基が含まれる。したがって「ヘテロシクリル」には、以下：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドールアジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびに、そのすべてがＲ”から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、そのＮ−酸化物が含まれる。
【００２５】
本明細書において、「ポリアミン」は、２以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、「ハロゲン」は、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦおよびＩを意味する。
【００２７】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよいか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００２８】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよいか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００２９】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３０】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、各々Ｈである。
【００３１】
式Ａの一実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよいか、または、Ｒ３は、Ｒ１と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３２】
式Ａの一実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３３】
式Ａの一実施形態では、Ｒ３は、Ｈである。
【００３４】
式Ａの一実施形態では、Ｒ’は、Ｒ”である。
【００３５】
式Ａの一実施形態では、Ｒ”は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい。
【００３６】
式Ａの一実施形態では、Ｒ”は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３７】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００３８】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００３９】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００４０】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００４１】
式Ａの一実施形態では、「ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００４２】
式Ａの一実施形態では、「単環式複素環」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００４３】
式Ａの一実施形態では、「ポリアミン」は、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、またはスペルミンである。
【００４４】
本発明には、式Ａのカチオン性脂質の遊離形態、ならびにその製薬上許容される塩および立体異性体が含まれる。本明細書において例示される一部の単離された具体的なカチオン性脂質は、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩である。用語「遊離形態」とは、非塩形態のアミンカチオン性脂質をさす。包含される製薬上許容される塩には、本明細書に記載される具体的なカチオン性脂質について例示される単離された塩だけでなく、式Ａのカチオン性脂質の遊離形態のすべての典型的な製薬上許容される塩も含まれる。記載される具体的な塩カチオン性脂質の遊離形態は、当分野で公知の技法によって単離することができる。例えば、遊離形態は、該塩を適した希釈塩基水溶液、例えば希釈ＮａＯＨ水溶液、炭酸カリウム水溶液、アンモニア水および重炭酸ナトリウム水溶液などで処理することにより、再生することができる。遊離形態は、ある種の物理的特性、例えば極性溶媒中の溶解度などにおいてその各々の塩形態とは多少異なり得るが、酸塩および塩基塩は、その他の点で本発明の目的のその各々の遊離形態と製薬上等価である。
【００４５】
本発明のカチオン性脂質の製薬上許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する本発明のカチオン性脂質から従来の化学的手法によって合成することができる。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによるか、あるいは、適した溶媒または様々な組合せの溶媒中、遊離塩基と、化学量論量または過剰量の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸を反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応により形成される。
【００４６】
よって、本発明のカチオン性脂質の製薬上許容される塩には、塩基性の本発明のカチオン性脂質と無機酸または有機酸を反応させることにより形成されるような本発明のカチオン性脂質の従来型の非毒性塩が含まれる。例えば、従来型の非毒性塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸および同類のものなどから誘導される塩、ならびに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および同類のものなどから調製される塩が挙げられる。
【００４７】
本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、適した「製薬上許容される塩」とは、無機塩基および有機塩基を含む、製薬上許容される非毒性塩基から調製される塩をさす。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩（ｍａｎｇａｎｉｃ  ｓａｌｔｓ）、第一マンガン（ｍａｎｇａｎｏｕｓ）、カリウム、ナトリウム、亜鉛および同類のものが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。製薬上許容される有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンおよび同類のものなどの塩が挙げられる。
【００４８】
上記の製薬上許容される塩およびその他の典型的な製薬上許容される塩の調製は、Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９によってより詳細に記載されている。
【００４９】
また、本発明のカチオン性脂質は内部塩または双性イオンである可能性があることにも留意されたい。これは、生理的条件下では、化合物中の脱プロトン化酸性部分、例えばカルボキシル基などはアニオン性である場合があり、その結果、この電子電荷はプロトン化またはアルキル化塩基性部分、例えば第四級窒素原子などのカチオン電荷に対して内部的に平衡をとって離れ得るためである。
【実施例】
【００５０】
提供される実施例は、本発明のさらなる理解を助けることを目的とする。用いる特定の材料、種および条件は、本発明をさらに例示することを目的とし、その合理的な範囲を制限することを意図しない。カチオン性脂質を合成する際に利用される試薬は、市販のものであるか、または当業者によって容易に調製されるものである。
【００５１】
新規なカチオン性脂質の合成は、アミノトリオール（トリス、ｉ）で出発する線形プロセスである。アセトニドの後にＯ−アルキル化が続くような保護により、ｉｉｉが得られる。２回目のＯ−アルキル化が後に続くアセトニドの脱保護により、一般式ｖのアミノアルコール脂質が得られる。
【００５２】
一般的な反応スキーム１
【００５３】
【化２】
2013531634.tif 000004
アミノアルコールカチオン性脂質の代替経路は、オキサゾリン保護トリスｖｉで出発する。アルコールのアルキル化により、中間体ｖｉｉが得られ、それをエタノール性ＨＣｌ中で脱保護して一般式ｖｉｉｉの最終生成物が得られる。
【００５４】
一般的な反応スキーム２
【００５５】
【化３】
2013531634.tif 000005
一般的な反応スキーム３
【００５６】
【化４】
2013531634.tif 000006
スキーム１
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物１）
【００５７】
【化５】
2013531634.tif 000007
１６０ｍｌのＤＭＦに、ＴＲＩＳ（登録商標）ＨＣｌ（ｉ）（２０ｇ、１２７ｍｍｏｌ）およびｐＴｓＯＨ（１．８ｇ、９．４６ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（１８ｍｌ、１４５ｍｍｏｌ）を滴下した。アルゴン下で４８時間攪拌した後、ＤＭＦを真空除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）によりさらに精製した。最終生成物（白色固体）は１３グラムであった。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １６２．１。
【００５８】
【化６】
2013531634.tif 000008
ＮａＨ（０．４７２ｇ、１９．６５ｍｍｏｌ）を、２５０ｍｌ  ＲＢＦ（丸底フラスコ）の中に添加し、それに続いてトルエン（９０ｍｌ）を添加した。氷／水浴中で、化合物ｉｉ（２．６４ｇ、１６．３８ｍｍｏｌ）を反応系に添加し、アルゴン下で１時間攪拌した。１０ｍｌのトルエン中のリノレイルメシラート（１６．３８ｍｍｏｌ）を、氷／水浴中の反応系に滴下した。反応系をゆっくりと室温まで温めた後、アルゴン下で還流した。５時間後、ＬＣ／ＭＳで、反応は完了した。氷／水浴中で冷却した後、１０ｍｌの氷冷水を反応系に滴下して塩基を中和した。溶媒を真空除去し、粗生成物を３００ｍｌのエーテルに溶解し、ブラインで洗浄した（１００ｍｌ×３）。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、粗生成物を濃縮し、カラムに乾燥充填し、精製して（ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）、ｉｉｉを無色の油状物質として得た。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１０．４。
【００５９】
【化７】
2013531634.tif 000009
化合物ｉｉｉ（８．０ｇ、１９．５３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解した。２０ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌ（４．９３ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）を、０℃の反応系に滴下した。５時間後、反応は完了した。反応溶液を、飽和重炭酸ナトリウムの添加により中和し、水／ＣＨ２Ｃｌ２に分液した。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）によりさらに精製して、ｉｖを無色の油状物質として得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ３）：δ５．３２−５．４２（ｍ，４Ｈ）、３．５２（ｓ，４Ｈ）、３．４３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．４１（ｓ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）、１．５５−１．５８（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．３７（ｍ，１８Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８，３Ｈ）；ｍ／ｚ  ３７０．３。
【００６０】
【化８】
2013531634.tif 000010
ＮａＨ（０．１８６ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  ＲＢＦに添加し、それに続いてトルエン（１００ｍｌ）を添加した。氷／水浴中で、化合物ｉｖ（２．２ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）を反応系に添加し、アルゴン下で１時間攪拌した。１０ｍｌのトルエン中のリノレイルメシラート（６．５５ｍｍｏｌ）を、氷／水浴中の反応系に滴下した。反応系をゆっくりと室温まで温めた後、アルゴン下で還流した。４時間後、反応物を０℃に冷却し、１０ｍｌの氷冷水を反応系に滴下して塩基を中和した。溶媒を真空除去し、粗生成物をエーテル／水に分液した後、ブラインで洗浄した（１００ｍｌ×３）。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、粗生成物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール）により精製して１を無色の油状物質として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣｌ３）：５．４１−５．２７（ｍ，８Ｈ）、３．５０（ｓ，４Ｈ）、３．３８（ｔ，４Ｈ）、３．３６（ｄ，２Ｈ）、３．３１（ｄ，２Ｈ）、２．７４（ｔ，４Ｈ）、２．０２（ｑ，４Ｈ）、１．５２（ｍ，４Ｈ）、１．２９（ｍ，３６Ｈ）、０．８５（ｔ，６Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ６１８．６。
【００６１】
スキーム２（代替合成）
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物１）
【００６２】
【化９】
2013531634.tif 000011
トルエン（１４０ｍＬ）中、水素化ナトリウム（４３．３ｍｍｏｌ、１．７ｇ）の攪拌溶液に、オキサゾリンジオールｖｉ（１４．５ｍｍｏｌ、２．３ｇ）を０℃で添加した。得られる混合物を３０分間８０℃に加熱した。塩酸トリエチルアミン（２．９ｍｍｏｌ、０．４ｇ）を添加し、溶液を１０分間攪拌した。次に、リノレイルメシラート（３０．３ｍｍｏｌ、１０．３ｇ）を添加し、反応物を８０℃で１６時間攪拌した。反応物を周囲温度まで冷却し、水でクエンチし、水と酢酸エチルに分液した。有機物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。粗油状物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、０〜１０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、３．５ｇのｖｉｉを無色の油状物質として得た。ＨＲＭＳ：計算値  ｍ／ｚ＝６５６．５９７６、測定値  ｍ／ｚ＝６５６．５９９４。
【００６３】
【化１０】
2013531634.tif 000012
オキサゾリンｖｉｉ（２．２ｍｍｏｌ、１．４ｇ）のエタノール（２０ｍＬ）溶液に、６Ｍエタノール性ＨＣｌ（３．６ｍＬ、２１．６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は乳白色に変化した。反応混合物を４８時間７０℃に加熱した。反応物を周囲温度まで冷却し、水酸化アンモニウム水溶液で中和し、水／ジクロロメタンに分液した。水相を３部のジクロロメタンで抽出した。合した有機物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空蒸発させて１．５ｇの化合物１を得た。分析データは、以前に報告した上のデータと一致した。
【００６４】
化合物２および３は、新規なカチオン性脂質であり、上のスキームに従って調製した。
【００６５】
【化１１】
2013531634.tif 000013
化合物２
２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物２）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ５．３３−５．３６（ｍ，４Ｈ）、３．５１（ｓ，２Ｈ）、３．４１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）、３．３９（ＡＢｑのＡ、Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．３３（ＡＢｑのＢ、Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．０２（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，８Ｈ）、１．５３−１．５５（ｍ，１０Ｈ）、１．２７−１．２９（ｍ，４０Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ６２２．６。
【００６６】
【化１２】
2013531634.tif 000014
化合物３
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（化合物３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ５．３２−５．４１（ｍ，４Ｈ）、３．５１（ｓ，２Ｈ）、３．４２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）、３．３９（ＡＢｑのＡ、Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．３４（ＡＢｑのＢ、Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．７７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）、１．５２−１．５７（ｍ，８Ｈ）、１．２４−１．３９（ｍ，２４Ｈ）、０．８６−０．９１（ｍ，６Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２．５。
【００６７】
【化１３】
2013531634.tif 000015
化合物４
２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（化合物４）
２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（２．２９ｇ、３．７ｍｍｏｌ）およびホルムアルデヒド（３．０１ｇ、３７．１ｍｍｏｌ）の、ＴＨＦ（２５ｍＬ）および酢酸（６．２５ｍＬ）中の溶液を、２−ピコリンボラン複合体（０．７９ｇ、７．４ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を周囲温度で１時間攪拌した後、クエン酸水溶液（１０％）と酢酸エチルに分液した。水層を酢酸エチルで洗浄し（３回）、合した有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、０〜４％  メタノール／ＤＣＭ）による精製により、化合物４を淡黄色の油状物質として生成した。
【００６８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ５．３−５．４２（ｍ，８Ｈ）、３．５６（ｓ，２Ｈ）、３．４８（ｄｄ，Ｊ＝２４．８Ｈｚ，４Ｈ）、３．３９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ）、２．７８（ｔ，４Ｈ）、２．３９（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｑ，８Ｈ）、１．５５（ｍ，４Ｈ）、１．２９（ｍ，３６Ｈ）、０．８９（ｔ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ＋Ｈ）計算値：６４６．６０６０、観察値：６４６．６１４０。
【００６９】
ＬＮＰ組成
以下の本発明の脂質ナノ粒子組成（ＬＮＰｓ）は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０。
【００７０】
ＬＮＰｓの合成および使用は、公知である。（米国特許出願：米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【００７１】
ＬＮＰプロセスの説明：
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、衝突噴流法により調製される。この粒子は、アルコールに溶解した脂質とクエン酸塩緩衝液に溶解したｓｉＲＮＡを混合することにより形成される。脂質のｓｉＲＮＡに対する混合比は、脂質４５〜５５％およびｓｉＲＮＡ６５〜４５％を目標とする。この脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質、および５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＳＰＣを、アルコール（例えばエタノール）中９〜１２ｍｇ／ｍＬの目標で含有する。これらの脂質の比は、カチオン性脂質について２５〜９８モルパーセントの範囲（目標は３５〜６５）であり、ヘルパー脂質は、０〜７５モルパーセントの範囲（目標は３０〜５０）であり、ＰＥＧ脂質は、１〜１５モルパーセントの範囲（目標は１〜６）であり、ＤＳＰＣは、０〜１５モルパーセントの範囲（目標は０〜１２）である。ｓｉＲＮＡ溶液は、１以上のｓｉＲＮＡ配列を０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含有し、目標は、３．５〜５の範囲のｐＨのクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬである。これら２つの液体を、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲の温度に加熱した後、衝突噴流ミキサーで混合し、直ちにＬＮＰを形成した。ティー内径（ｔｅｅＩＤ）は、０．２５〜１．０ｍｍの範囲であり、全流速は１０〜６００ｍＬ／分の範囲である。流速とチューブ内径（ｔｕｂｉｎｇ  ＩＤ）の組合せは、ＬＮＰｓの粒径を３０〜２００ｎｍの間に制御する効果がある。次に、溶液を、より高いｐＨの緩衝液と、１：１〜１：３  容積：容積の範囲であるが１：２  容積：容積を目標とする範囲の混合比で混合する。この緩衝液は、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲の温度である。混合したＬＮＰｓを、アニオン交換濾過段階の前に３０分〜２時間保持した。インキュベーション中の温度は、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲である。インキュベートした後、溶液を、アニオン交換分離段階を含む０．８ｕｍフィルターに通して濾過する。この方法は、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤまでのチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流速を使用する。ＬＮＰｓを濃縮し、限外濾過法によって透析濾過し、アルコールを除去し、クエン酸塩緩衝液を最終の緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水などに交換する。限外濾過法は、タンジェンシャルフロー濾過方式（ＴＦＦ）を使用する。この方法は、公称分子量カットオフが３０〜５００ＫＤの範囲の膜を使用する。膜形式は、中空糸であってもフラットシートカセットであってもよい。適切な分子量カットオフを用いるＴＦＦ法は、ＬＮＰを保持液中に保持し、濾液または透過液は、アルコール；クエン酸緩衝液；最終の緩衝液廃棄物を含有する。ＴＦＦ法は、ｓｉＲＮＡ濃度に対する初期濃度が１〜３ｍｇ／ｍＬの多段階法である。濃縮した後、アルコールを除去して緩衝液交換を実施するために、ＬＮＰｓ溶液を、１０〜２０容積の最終緩衝液に対して透析濾過する。次に、材料をさらに１〜３倍に濃縮する。ＬＮＰ法の最終段階は、濃縮したＬＮＰ溶液を滅菌濾過し、生成物をバイアルに入れることである。
【００７２】
分析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖濃度は、２９９６  ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて、強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）により決定される。ＬＮＰｓ（そうでなければＲＮＡｉ送達ビヒクル（ＲＤＶｓ）と呼ばれる）を、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離し、２５４ｎｍでＵＶ検出するＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いるＳＡＸ分離により分析する。移動相は、０〜１５分の線形勾配および１ｍｌ／分の流速を用いる、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  トリス、２０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０およびＢ；２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  トリス、２０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０で構成される。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
【００７３】
２）カプセル封入率
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量化に用いて、ＲＤＶｓのカプセル封入率をモニターする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むまたは含まないＲＤＶｓを使用して、遊離ｓｉＲＮＡおよび全ｓｉＲＮＡ量を決定する。このアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光光度計を用いて実施される。サンプルは４８５ｎｍで励起し、蛍光発光は５３０ｎｍで測定された。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
カプセル封入率＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
【００７４】
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶｓを、１×ＰＢＳで希釈して最終容積３ｍｌとする。サンプルの粒径および多分散性を、ＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｉｌｅ，ＮＹ）を用いる動的光散乱法により測定する。散乱強度を、散乱角９０°で２５℃のＨｅ−Ｎｅレーザーによって測定する。
【００７５】
４）ゼータ電位分析
１μｇのｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶｓを、１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して最終容積２ｍｌとする。サンプルの電気泳動移動度を、電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを備えたＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｉｌｅ，ＮＹ）を用いて決定する。Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの極限を、ゼータ電位の計算において仮定する。
【００７６】
５）脂質分析
個々の脂質濃度は、コロナ荷電化粒子検出器（Ｃｏｒｏｎａ  ｃｈａｒｇｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により決定する。ＲＤＶｓ中の個々の脂質は、ＣＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、粒径１．８μｍ）カラムを６０℃で用いて分析する。移動相は、Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＴＦＡおよびＢ：ＩＰＡ中０．１％ＴＦＡで構成される。勾配は、１ｍｌ／分の流速で、０時の移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％から、１．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％；１．００〜５．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％；５．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％から、１０．００分の移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％；１０．００分の移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％から、１５．００分の移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％；そして１５．００分の移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％から、２０．００分の移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％に変化する。個々の脂質濃度は、二次曲線の当てはめによって、ＲＤＶｓ中のすべての脂質成分を含む標準曲線と比較することにより決定される。各々の脂質の分子百分率は、その分子量に基づいて計算される。
【００７７】
上記のＬＮＰプロセスを利用して、以下の比をもつ具体的なＬＮＰｓを特定した：
公称組成：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７。
Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ
５’−ｉＢ−ＡＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＴＴ−ｉＢ  ３’（配列番号：１）
３’−ＵＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＡＣＵＵＣＵＣＵＡＵ−５’（配列番号：２）
ＡＵＧＣ−リボース
ｉＢ−逆位デオキシ脱塩基
ＵＣ−２’フルオロ
ＡＧＴ−２’デオキシ
ＡＧＵ−２’ＯＣＨ３
公称組成
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０
ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ
５’−ｉＢ−ＣＵＵＵＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＴＴ−ｉＢ（配列番号：３）
３’−ＵＵＧＡＡＡＵＵＧＵＵＡＡＧＧＡＣＵＵＵＡ−５’（配列番号：４）
ＡＵＧＣ−リボース
ｉＢ−逆位デオキシ脱塩基
ＵＣ−２’フルオロ
ＡＧＴ−２’デオキシ
ＡＧＵ−２’ＯＣＨ３
【００７８】
オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの合成および使用は公知である。（米国特許出願：米国特許出願第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【実施例１】
【００７９】
有効性のマウスインビボ評価
直前に記載される公称組成の化合物１〜４を利用するＬＮＰｓを、ルシフェラーゼマウスモデルにおけるインビボ有効性および炎症性サイトカインの誘導について評価した。ｓｉＲＮＡは、ホタル（フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼ遺伝子（受託番号Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写物を標的にする。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンを上に表示する。インビボルシフェラーゼモデルは、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞に存在しているトランスジェニックマウスを用いる。ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から認可されたＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウスを、最初にＬＳＬ配列を組換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。ウイルスの臓器親和性に起因して、尾静脈注射により送達される場合には、発現は肝臓に制限される。肝臓におけるルシフェラーゼ発現レベルを、ルシフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与の後に、ＩＶＩＳ撮像装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて発光を測定することにより定量化する。投薬前（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）発光レベルをＲＤＶｓの投与の前に測定する。ＰＢＳ中のルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を、１５０ｕＬの量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分のインキュベーション期間の後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ撮像装置に入れる。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶｓ（ｓｉＲＮＡを含有）を、０．２ｍＬの量で尾静脈注射した。最終投与量レベルは、０．３〜３ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの範囲であった。ＰＢＳビヒクル単独は、対照として投与した。投薬の３時間後、マウスを後眼窩から出血させてサイトカイン分析のための血漿を得た。マウスを、投薬の４８時間後に上記の方法を用いて撮像した。ルシフェリン光出力の変化は、直接にルシフェラーゼｍＲＮＡレベルに相関し、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ活性の間接的な尺度を示す。インビボ有効性の結果は、投薬前発光レベルに対する発光の阻害％として表される。血漿中サイトカイン濃度は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重サイトカイン化学発光アレイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて決定した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ  ＲＤＶｓの全身投与は、ルシフェラーゼ発現を用量依存的に低下させた。オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質を含有するＲＤＶを投与したマウスよりも、ＲＤＶｓを含有する化合物１を投与したマウスにおいて、より高い有効性が観察された（図１）。ＯＣＤは公知であり、国際公開第２０１０／０２１８６５号に記載されている。
【００８０】
有効性および毒性のラットインビボ評価
上記の公称組成において化合物１を利用するＬＮＰｓを、スプラーグ・ドーリー（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雌ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）において、インビボ有効性およびアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加について評価した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（受託番号ＮＭ  ０１９２８７）のｍＲＮＡ転写物を標的にする。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶｓ（ｓｉＲＮＡを含有）を、１〜１．５ｍＬの量で尾静脈注射した。注入速度は、約３ｍｌ／分である。各々の投薬群に５匹のラットを使用した。ＬＮＰの投与後、ラットを標準的な食餌および水のあるケージに入れる。投薬の６時間後、食物をケージから取り出す。動物の解剖をＬＮＰ投薬の２４時間後に実施する。ラットを５分間のイソフルランで麻酔した後、イソフルランの送達を継続しながら全採血が終了するまでラットをノーズ・コーンに入れることにより麻酔下で維持する。血液は、２３ゲージバタフライ型静脈穿刺セットを用いて大静脈から採取し、血清化学分析のために血清分離器バキュテイナに等分する。切除した肝尾状葉のパンチを採取し、ｍＲＮＡ分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に入れる。保存肝組織をホモジナイズし、ＱｉａｇｅｎビーズミルおよびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを製造業者の説明書に従って用いて全ＲＮＡを単離した。肝臓ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ラットＡｐｏＢの市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＲＮ０１４９９０５４＿ｍｌ）を利用して精製ＲＮＡからメッセージを増幅させた。ＰＣＲ反応を、９６ウェルＦａｓｔ  Ｂｌｏｃｋを備えたＡＢＩ  ７５００機器で実施した。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ０１１１４９）ｍＲＮＡに正規化する。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ００４７８２９５＿ｍｌ）を用いて測定した。結果を、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡの比として表す。すべてのｍＲＮＡデータは、ＰＢＳ対照投薬量と比較して表される。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ分析を、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）試薬を利用して、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  １８００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで実施した。オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質を含有するＲＤＶを投与したラットよりも、ＲＤＶを含有する化合物１を投与したラットにおいて、より高い有効性が観察された（図２）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2013531634000001.app
【国際調査報告】
2013531634.tif 000019