(57)【要約】  植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する化合物を同定するための方法は、第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの組み合わせた化合物の発現プロフィールを比較する工程であって、各々の植物細胞または組織は、これらの植物細胞または組織における少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む、工程と、組み合わせた化合物のプロフィールの遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する化合物を同定するための方法であって、
第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
追加の試験化合物と接触させた、同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに
第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた、同じ植物細胞または組織からの組み合わせた化合物の発現プロフィール
を比較する工程であって、
各々の植物細胞または組織は、前記植物細胞または組織における少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、前記植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む、工程と、
組み合わせた化合物のプロフィールの遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
同じ植物からの植物細胞または組織を、
ｉ．第１の試験化合物、
ｉｉ．追加の試験化合物、または
ｉｉｉ．第１の試験化合物と追加の試験化合物の組み合わせ
の１つと接触させる工程と、
ｉｖ．（ｉ）と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
ｖ．（ｉｉ）と接触させた植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、および
ｖｉ．（ｉｉｉ）の植物細胞または組織からの、組み合わせた化合物の発現プロフィール
を生じさせる工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の接触植物細胞の遺伝子または遺伝子産物からの、組み合わせた化合物のプロフィールにおける接触植物細胞の遺伝子または遺伝子産物の発現の変更が、組み合わせた化合物によって引き起こされる植物細胞における選択された効果と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の試験化合物または追加の試験化合物のいずれとも接触させられていない同じ植物の細胞または組織からの野生型遺伝子または遺伝子産物の発現プロフィールが、比較工程前に各々のプロフィールから差し引かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
発現プロフィールの変更が、平均（mean）もしくは平均（average）、数値平均または数値平均の範囲、数値パターン、図式パターン、または発現プロフィールとして表される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変更が、
第１のプロフィールおよび追加のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の追加発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の上方制御；ならびに
第１のプロフィールおよび追加のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の追加発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の下方制御；ならびに
組み合わせた化合物のプロフィールにおける１つ以上の選択された遺伝子または遺伝子産物のアイデンティティーまたは発現の変化であって、前記選択された遺伝子または遺伝子産物が、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更から生成されたプロフィールにおいて変更されていない、変化
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１の化合物が、植物への既知の効果を有し、追加の化合物が植物への未知の効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
各々の発現プロフィールが、植物の完全なゲノムによってコードされた遺伝子または遺伝子産物の小集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子産物が植物タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子産物の変更の結果である、植物代謝産物における対応する変化を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
化合物の組み合わせが相乗的効果を有し、相乗的効果は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける、植物の遺伝子または遺伝子産物の発現パターンまたはレベルの変更が、第１の発現プロフィールおよび追加の発現プロフィールのパターンまたはレベルの相加変更によって生じるものよりも大きいことである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化合物の組み合わせが拮抗作用を有し、拮抗作用は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける遺伝子または遺伝子産物の発現パターンもしくはレベルの変更の大きさが、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の発現のパターンまたはレベルによって生じるものよりも減少していることである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
組み合わせの発現プロフィールにおける発現のパターンまたはレベルの変更が、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更のパターンを形成する遺伝子または遺伝子産物の発現の少なくとも２倍の変更である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子または遺伝子産物発現プロフィールの選択された変更が、エチレン感受性の増加、エチレン感受性の減少、熟成の増大、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の増加、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の減少、病原体抵抗性の増加、病原体抵抗性の減少、開花の増加、窒素効率の増加、除草抵抗性の増加、光合成作用の増加、および収量の増加から選択される状態にある植物に典型的である遺伝子または遺伝子産物の発現パターンの変更である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
追加の化合物が、２つ以上の追加の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞が、米、トウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、キビ、スイッチグラス、ススキ、シバ、オートムギ、トマト、ポテト、バナナ、キウイフルーツ、アボカド、メロン、マンゴ、トウ、サトウダイコン、タバコ、パパイヤ、ピーチ、ストローベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、タマネギ、ブロッコリー、芽キャベツ、綿、キャノーラ、グレープ、大豆、菜種、アスパラガス、豆、ニンジン、キュウリ、ナス、メロン、オクラ、アメリカボウフウ、ピーナッツ、ペッパー、パインアップル、カボチャ、サツマイモ、ライ麦、カンタロープ、エンドウ、パンプキン、ヒマワリ、ホウレンソウ、リンゴ、チェリー、クランベリー、グレープフルーツ、レモン、ライム、ネクタリン、オレンジ、ピーチ、西洋ナシ、タンジェロ、タンジェリン、ユリ、カーネション、菊、ペチュニア、バラ、ゼラニウム、スミレ、グラジオリ、ラン、ライラック、クラブアップル、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、セイヨウトネリコ、ポプラ、リンデンツリーおよびシロイヌナズナからなる群から選択される植物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する相乗的化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ｉ．第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
ｉｉ．追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに
ｉｉｉ．第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの組み合わせの発現プロフィール
を比較する工程であって、
各々の植物細胞または組織は、前記植物細胞または組織において少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、前記植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む工程と、
（ｂ）組み合わせた化合物のプロフィール（ａ）（ｉｉｉ）の遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィール（ａ）（ｉ）および追加のプロフィール（ａ）（ｉｉ）の組み合わせの遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
前記比較が、数値データまたは図式データを生じさせるコンピュータプロセッサまたはコンピュータプログラムされた機器によって行われる、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
植物の物理的特徴を制御または調節するために、植物、種子、組織および器官を処理するのに望ましい組成物および方法の探索には、望ましい特徴に関与する標的遺伝子またはタンパク質を同定し、次に、標的遺伝子／タンパク質における効果について、種々の「試験」化合物をスクリーニングすることが行われてきている。一般的には、植物を各々の試験化合物と接触させ、次に、通常環境下で生育させ、野生型植物と比較して１つ以上の試験化合物の効果を決定する。このようなスクリーニング技術は、各々の試験化合物の効果を観察するために、関与する標的遺伝子を同定し、および植物を生育させることにおいてかなりの時間を必要とする。
【０００２】
より最近になって、標的植物遺伝子またはタンパク質を同定するための方法が、化合物スクリーニングを促進することが示唆された。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２２１２９０号および米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２６５１６４号を参照されたい。
【０００３】
植物細胞における野生型遺伝子／タンパク質の発現に影響を及ぼす化合物を同定するためのより簡易かつより迅速な方法については、当該技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記載されている組成物および方法は、植物細胞における野生型遺伝子発現またはタンパク質発現を選択的に変更する試験化合物の組み合わせの迅速な同定を提供する。記載されている方法は、このような情報を得るために、完全な生理的成熟に植物を生育させなければならないということに先立って、化合物がどのように機能し相互作用するかを機械的に決定することを可能にする。これらの方法は、植物における試験化合物の効果の遺伝的評価を与える。
【０００５】
一態様では、植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する化合物の組み合わせを同定するための方法を記載する。このような１つの方法は、（ａ）第１の試験化合物と個別に接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、（ｂ）追加の試験化合物と個別に接触させた同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに（ｃ）第１の試験化合物および追加の試験化合物の組み合わせと接触させた同じ植物細胞または組織からの組み合わせの発現プロフィールを比較する工程を含む。本方法の他の実施形態では、追加の化合物は、２つ以上の追加の化合物を含む。第１のプロフィール（ａ）および追加のプロフィール（ｂ）の複数の遺伝子または遺伝子産物と比較して、組み合わせた化合物のプロフィール（ｃ）における複数の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルまたはパターンにおける任意のバックグラウンドを差し引いた有意な変更が、植物の生育特性への影響に有用な２つ以上の化合物の組み合わせを同定する。一実施形態では、発現プロフィールの変更は相乗的である。別の実施形態では、発現プロフィールの変更は拮抗的である。
【０００６】
上記した方法のいずれかにおいて、比較工程は、数値データまたは図式データを生じさせるコンピュータプロセッサまたはコンピュータプログラムされた機器によって任意に行われる。
【０００７】
別の実施形態では、植物生育特性に影響を及ぼす組成物は、植物への同時（simultaneous）もしくは同時（concurrent）に適用するための単一組成物またはキットにおいて、第１の試験化合物（ａ）と追加の試験化合物（ｂ）を比較することによって調製される。
【０００８】
これらの方法および組成物の他の態様および利点は、以下の詳細な説明においてさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】化合物である１−メチルシクロプロペン（ＭＣＰ）対コーン遺伝子（ＵＴ）、ストロビルリン（ＳＴＢ）対ＵＴ、またはＭＣＰとＳＴＢの組み合わせ対ＵＴの適用によって差異的に発現されるコーン遺伝子の数と分布を示すグラフである。交差している円は、コーン植物がＭＣＰで処理された場合、９３４個の遺伝子（実在物リスト１）の発現が未処理と比較して有意に（＞２倍）変化し、小集団の３６２個の遺伝子は、この条件に応答して固有的に変化したことを示す。同じ植物がストロビルリン系殺菌剤で処理された場合、ほんの１８５個の遺伝子（実在物リスト２）の発現は有意に変化し、７８個の遺伝子の変化がこの条件に固有である。しかしながら、これらの２つの化合物の組み合わせがコーン植物に適用された場合、全１１２８個の遺伝子は発現において変化し（実在物リスト３）、ほんの５６８個の遺伝子がこの組み合わせに特有に変化する。
【図２】１−メチルシクロプロペン（ＭＣＰ）対未処理のシロイヌナズナ遺伝子（ＵＴ）、ストロビルリン（ＳＴＢ）対ＵＴ、またはＭＣＰ／ＳＴＢの組み合わせ対ＵＴの適用によって差異的に発現されたシロイヌナズナ遺伝子の分布を示すグラフである。交差している円は、シロイヌナズナ植物がＭＣＰで処理された場合、４１１個の遺伝子の発現（実在物リスト１）は、未処理と比較して統計学的に変化し（＞５倍）、２０２個の特有の遺伝子発現が変化している。同じ植物がストロビルリン系殺菌剤で処理された場合、ほんの２７８個の遺伝子（実在物リスト２）の発現は統計学的に変化し、８０個の遺伝子はこの条件に特有である。しかしながら、これらの２つの化合物の組み合わせが植物に提供された場合、ほんの９３個の遺伝子（実在物リスト３）は、有意に発現において変化し、ほんの４４個の特有の遺伝子が変化している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に記載されている組成物および方法は、植物の生育特性に影響を及ぼす化合物の組み合わせの迅速かつ効率的な同定を提供する。本明細書に記載されている方法は、この方法を行う前に、特異的な標的遺伝子（単数または複数）を同定することを何ら必要とせずに特徴付けられる。同様に、これらの方法は、任意の特定された遺伝子の発現の増大を必要としないが、むしろ複数の遺伝子／タンパク質の発現の変更パターンを利用する。このパターンは、試験化合物の組み合わせに応答した複数の遺伝子の上方制御および／または下方制御を含み得る。
【００１１】
本明細書で使用するとき、用語「植物細胞または組織試料」とは、１つの植物細胞もしくは植物細胞の培養物または植物の全体もしくは一部を意味する。代表的な細胞もしくは細胞培養物または植物組織は、１つの特異的な細胞型、細胞型の組み合わせ；１つの特異的な組織型；組織型の組み合わせ；１つの特異的な植物器官；または植物器官の組み合わせから誘導されてもよい。このような細胞は、植物組織および器官から選択され、限定されないが、栄養組織、例えば根、幹、または葉、および繁殖組織、例えばフルーツ、胚珠、胚、内胚乳、外皮、種子、種皮、花粉、花弁、萼片、雌しべ、花、雄しべ、または任意の胚組織が挙げられる。
【００１２】
本明細書で使用するとき、用語「植物」とは、双子葉植物または単子葉植物から選択される。このような植物には、装飾花用植物、およびヒトまたは動物の消費のための植物または植物の一部が挙げられる。例えば、これらの方法において使用される細胞に寄与する適切な植物は、米、トウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、キビ、スイッチグラス、ススキ、シバ、オートムギ、トマト、ポテト、バナナ、キウイフルーツ、アボカド、メロン、マンゴ、トウ、サトウダイコン、タバコ、パパイヤ、ピーチ、ストローベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、タマネギ、ブロッコリー、芽キャベツ、綿、キャノーラ、グレープ、大豆、菜種、アスパラガス、豆、ニンジン、キュウリ、ナス、メロン、オクラ、アメリカボウフウ、ピーナッツ、ペッパー、パインアップル、カボチャ、サツマイモ、ライ麦、カンタロープ、エンドウ、パンプキン、ヒマワリ、ホウレンソウ、リンゴ、チェリー、クランベリー、グレープフルーツ、レモン、ライム、ネクタリン、オレンジ、ピーチ、西洋ナシ、タンジェロ、タンジェリン、ユリ、カーネション、菊、ペチュニア、バラ、ゼラニウム、スミレ、グラジオリ、ラン、ライラック、クラブアップル、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、セイヨウトネリコ、ポプラ、リンデンツリーおよびシロイヌナズナであってもよい。
【００１３】
このような植物細胞は、特徴的なセットの核酸分子の発現によって特徴付けられる。植物の任意の１つの物理的状態で、ある種のこれらの核酸分子、例えば、植物遺伝子、またはそれにコードされた産物は、多かれ少なかれ他のものよりも発現し、それによって、複数の遺伝子または遺伝子産物の発現パターンを与える。このパターンは、細胞の物理的状態を同定し得る表現「プロフィール」または「フィンガープリント」を意味することができる。このようにして、用語「発現プロフィール」とは、細胞または細胞培養物内の識別可能なセットの分子の発現パターンを意味する。発現プロフィールに特徴付けることができる代表的な分子タイプには、ｍＲＮＡ転写物またはそこから誘導されるｃＤＮＡ；タンパク質；リンタンパク質；炭水化物；脂質、代謝産物；またはｍＲＮＡ転写物、タンパク質、リンタンパク質、炭水化物、脂質および代謝産物の任意の組み合わせもしくは置換が含まれる。このような発現プロフィールは、任意の１つの生理学的状態での野生型またはバックグラウンドプロフィール、または植物が特定の物理的状態にある場合、例えば、化学薬品または環境条件に暴露された場合、細胞において観察される変更されたプロフィールを表すために得られてもよい。
【００１４】
一実施形態では、発現プロフィールは、植物細胞の完全なゲノムまたは完全なセットのコードされた遺伝子産物である。別の実施形態では、各発現プロフィールは、植物の完全なゲノムによってコードされた遺伝子または遺伝子産物の小集団を含む。ある種の実施形態では、遺伝子産物は植物タンパク質である。なお他の実施形態では、このプロフィールは、プロフィールにおける１つ以上の遺伝子産物の変更の結果である、植物代謝産物における対応する変化を追跡する。
【００１５】
本明細書に記載されている方法の一実施形態では、関連発現プロフィールを形成する遺伝子または遺伝子産物の小集団は、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、またはそれを超える遺伝子または遺伝子産物を含む。別の実施形態では、上記発現プロフィールを形成する遺伝子または遺伝子産物の小集団は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００またはそれを超える遺伝子または遺伝子産物を含む。本明細書に記載されている方法に有用なさらに他の発現プロフィールは、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０もしくは５００、またはそれを超える遺伝子または遺伝子産物によって形成される。本明細書に記載されている方法に有用なさらに他の発現プロフィールは、７５０、８５０、１０００、１５００、２０００またはそれを超える遺伝子または遺伝子産物によって形成され、最大では植物細胞の全ゲノムが含まれる。差異的発現を示す、得られた遺伝子の数に依存して、２倍を超える変化または５倍を超える変化のカットオフは、または、最も典型的には、最も意味のある小集団に関する分析に焦点を合わせるように選択される。本明細書に記載されている方法について有用な発現プロフィールを形成するために、評価された植物細胞の発現プロフィールは、同じ植物細胞試料のバックグラウンド発現プロフィールと、第１の試験化合物の発現プロフィールおよび追加の発現プロフィールとから有意に変更されなければならない。
【００１６】
本明細書で使用するとき、植物の「物理的状態」なる用語には、限定されないが、エチレン感受性の増加、エチレン感受性の減少、熟成の増大、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の増加、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の減少、病原体抵抗性の増加、病原体抵抗性の減少、開花の増加、窒素効率の増加、除草抵抗性の増加、光合成作用の増加、および収量の増加の状態が挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「試験化合物」または「追加の化合物」は、植物、植物細胞または細胞培養物に暴露されたとき、植物発現プロフィールへのその影響について試験されている化合物を意味する。このような化合物は、個別に使用されるとき、植物における既知または未知の効果を有する化合物を含むことができる。このような化合物は既知の植物病害物質もしくは制御剤を含むことができ、または当該技術分野において知られているコンビナトリアルライブラリー法における無数のアプローチのいずれかを用いることによって得られる未知の化合物であり得る。試験化合物は、適切な担体、希釈剤または溶液において示されてもよく、植物もしくは植物細胞を浸し、噴霧し、粉末にし、水浸し、滴らせ、または水をやることによって適用されてもよい。
【００１８】
本明細書に記載されている方法において使用するために発現プロフィールを生じさせるために、各々の植物もしくは植物細胞、または組織は、同じ植物由来であり、組成物、例えば、細胞の数および密度、細胞培養液、培養条件、植物生育条件などにおいて実質的に同一である。各々の植物、植物細胞または培養物は、第１の試験化合物；または追加の試験化合物、または第１の試験化合物と追加の試験化合物の組み合わせのうちの１つを用いて、植物細胞または組織において、少なくとも３つの遺伝子または遺伝子産物の発現における変化を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられる。「十分な時間」とは、一般に、少なくとも５、１０、１５、２５、３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも１、２、３、４、５、６時間、最大１２時間もしくは２４時間として定義される。組み合わせの化合物は、同時にまたは連続して、植物または植物細胞に適用されてもよい。さらに、ある種の実施形態では、追加の試験化合物は、１つの化合物よりも多く、それ自体が混合物であってもよい。ある種の実施形態では、第１の試験化合物は、植物細胞において既知の効果を有する化合物であり、追加の化合物は、細胞において未知の効果を有する化合物であり、あるいはその反対である。他の実施形態では、第１の試験化合物と追加の試験化合物は、細胞における未知の個別の効果を有する。同様に、この方法において用いるために必要とされる試験化合物の量は、野外、または実験室における植物生育において実験に必要とされる量よりも顕著に小さい。細胞または細胞培養物において使用するための組成物の適切な量は、当然に、化合物自体の同一性に依存するが、培養物中の細胞１ミリグラムあたり少なくとも０．２、０．５、０．８もしくは１．０またはそれを超えるマイクログラムを含んでもよく、あるいは植物または植物組織への適用については同量の希釈剤（ｍＬ）を含んでもよい。別の実施形態では、試験化合物の量は、培養物における細胞１ミリグラムあたり少なくとも２、５、８もしくは１０またはそれを超えるマイクログラムを含み、あるいは植物または植物組織への適用については同量の希釈剤（ｍＬ）を含む。別の実施形態では、試験化合物の量は、培養物における細胞１ミリグラムあたり少なくとも２、５、８もしくは１０またはそれを超えるミリグラムを含み、あるいは植物または植物組織への適用については同量の希釈剤（ｍＬ）を含む。
【００１９】
植物細胞、組織または植物を接触させた後、組織試料は、化合物との接触後の２、５、１０、２０、３０、４０、５０または６０分、または２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４時間以内に回収される。いくつかの実施形態では、組織は、化合物との接触後の２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日でサンプリングされてもよい。なお他の実施形態では、サンプリングは、化合物の長期間の下流効果にアクセスするために、植物細胞、組織または植物を化合物と接触させた後の最大６カ月間、月１回行われてもよい。
【００２０】
この方法は、個別に第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの発現プロフィール、個別に追加の化合物（単数または複数）と接触させた植物細胞または組織からの発現プロフィール；ならびに、試験化合物および追加の化合物の組み合わせと接触させた植物細胞または組織からの組み合わせた化合物の発現プロフィールを生じさせる工程をさらに含む。
【００２１】
発現プロフィールの作製および特徴付けは、通常、１つ以上の下記の方法によって得られてもよい：植物ゲノムまたはそれによってコードされている産物のポリ核酸マイクロアレイに適切に調製された試料の適用。このようなマイクロアレイの例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．または多数の他のマイクロアレイ製造業者によって記載されている。マイクロアレイの生成または使用は、ｍＲＮＡ発現パターン検出；タンパク質発現のパターンを誘導するために適切に調製された試料の２次元ゲル電気泳動；タンパク質発現のプロフィールを誘導するために抗体のアレイへの試料の適用；タンパク質発現のパターンを誘導するために、特異的なペプチドに差異的に結合するポリヌクレオチドのアレイへの試料の適用によって生じさせてもよい。同様に、質量分析法によって適切に調製された試料の分析は、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現パターンを誘導するために使用されてもよい。この分析は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現パターンを誘導するために、ビーズベースのｍＲＮＡおよびタンパク質発現の分析方法に適用するための手段、例えば、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．またはＬｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．によって記載されている手段によって、適切に調製された試料上で行われてもよい。また、下記の実施例に記載されている技術は、これらの目的のために使用されてもよい。本明細書に記載されている方法における使用について、試料の複数の分子成分の発現の特徴的なプロフィールを特徴付ける上記の方法以外の任意の方法を用いてもよい。例えば、米国出願公開第２００７／０２６５１６４号；米国出願公開第２００５／０２２１２９０号に記載され；または当該技術分野において現存して生じる発現プロフィールの他の既知の記載のうち、製薬特許である米国特許第７，３３２，２７２号に記載されている発現プロフィールの生成に関する技術を参照されたい。
【００２２】
ある種の実施形態では、発現プロフィールは、植物のｍＲＮＡを抽出し、酵素的に増幅させ、および検出可能なシグナル生成剤を用いて標識することによって生成される。次に、この標識された核酸分子は、植物細胞によって発現された可能なｍＲＮＡ種の多数または全てに相補的な離散的にスポットされたＤＮＡ配列であったマイクロアレイに暴露される。植物細胞によって発現される標識された核酸分子は、離散スポットに差異的にハイブリダイズし、これは、試料中の各分子の濃度に比例して、検出可能なシグナルを与える。各スポットのシグナル強度は、確立された技術、例えばマイクロアレイリーダーを用いて迅速に検出および定量される。種々の植物細胞（例えば、野生型植物細胞、第１の化合物で処理された植物細胞、第２の化合物で処理された植物細胞、および両試験化合物で処理された植物細胞）について、それらの同じｍＲＮＡ転写物または全ゲノムの発現レベルが決定される。各発現プロフィールが生成されるとき、および結果が適切なクラスターリングまたは他の技術によって分析される前に、発現プロフィールを形成する遺伝子／遺伝子産物のバックグラウンド発現プロフィールを差し引く。バックグラウンド発現レベルは、「試験」植物細胞または培養物と同じ培養条件および環境条件に暴露されたが、しかし、第１の化合物および任意の追加の化合物と接触させられていない、同タイプの植物、植物細胞／培養物から生成されたプロフィールから得られる。
【００２３】
その後、個別に処理されたプロフィールは、差異的に処理された植物細胞間で異なる発現レベルおよびパターンを有するｍＲＮＡ転写物を同定するために、組み合わせたプロフィールと比較される。いわゆる「追加の発現プロフィール」は、各々個別に処理された発現プロフィールの組み合わせの予期された計算結果である。
【００２４】
本明細書に記載されている方法は、全植物というよりはむしろ、植物細胞培養物を用いたハイスループット分析において行われ得る。例えば、植物細胞の数千もの別々の培養物は、９６ウェルまたはそれを超える培養プレートにおいて確立され、各ウェルは異なる試験化合物で処理される。ＲＮＡは上記されるように処理および抽出される。次に、各々の試料は、野生型植物細胞の別々のマイクロアレイに暴露される。各々のマイクロアレイは、植物細胞発現プロフィールにおける各々の試験化合物の効果を誘導するために、マイクロアレイリーダーまたは複数のマイクロアレイリーダーによって読まれる。期待される追加のプロフィールが計算され、期待される結果は、厳密な統計分析を用いて、実際に組み合わせた発現プロフィールと比較される。
【００２５】
また、発現プロファイリングは、多数の遺伝子の転写率の同時検出を利用してもよい。この比率は、いくつかの摂動を受けている細胞、組織または植物の迅速な連続アレイ測定によって得られる。比率のアレイ、および発現レベルの比率の変化率は、より有益な発現プロフィールを得るために、個別に、または絶対発現レベルを組み合わせて考慮されてもよい。このようにして、当業者は、本明細書に記載されている方法に、ｍＲＮＡ転写物などの多数の生体分子の発現率の同時検出を適用することができよう。
【００２６】
本明細書に記載されている方法は、組み合わせた化合物の発現プロフィールの遺伝子または遺伝子産物と、第１の試験化合物および追加の化合物と個別に接触させた細胞／培養物の発現プロフィールを形成する遺伝子または遺伝子産物との間における、発現レベルまたはパターンの有意な変更を、各々の発現プロフィールを比較することによって同定することをさらに含む。この比較工程は、プロフィールの目視検査によって行われてもよく、または望ましくは、数値データもしくは図式データを生じるコンピュータプロセッサもしくはコンピュータプログラムされた機器によって行われてもよい。各々の発現プロフィールを形成する遺伝子または遺伝子産物の発現の各変更は、平均（mean）または平均（average）、数値平均または数値平均の範囲、数値パターン、または図式パターンとして表される。
【００２７】
一実施形態では、この変更は、第１の試験化合物プロフィールおよび追加の試験化合物プロフィールにおける同じ選択された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の追加の発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の上方制御である。別の実施形態では、組み合わせプロフィールの変更は、第１の試験化合物プロフィールおよび追加の試験化合物プロフィールにおける同じ選択された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の追加の発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の下方制御である。
【００２８】
別の実施形態では、上記変更は、選択された遺伝子または遺伝子産物が、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更から生じたプロフィールにおいて、野生型レベルから変更されていない組み合わせた化合物のプロフィールにおける１つ以上の選択された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の発現の変化である。例えば、組み合わせた化合物の発現プロフィールにおける発現の野生型レベルから変更された遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）は、個別のプロフィールによって予測された第１の試験化合物プロフィール、追加の試験化合物プロフィール、または追加のプロフィールにおいて変更された異なる遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）である。あるいは、同じ遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）は比較された発現プロフィールを形成するが、この変更は、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの個別のまたは予測された追加の発現プロフィールにおいて影響されないかまたは下方制御された組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の上方制御を伴う。さらにあるいは、有意な変更は、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの個別のまたは予測された追加の発現プロフィールにおいて影響されないかまたは上方制御された組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の下方制御を伴う。組み合わせ発現プロフィールと個別の発現プロフィール（またはそこから予期された予測された追加のプロフィール）との間におけるさらに別の有意な変更は、組み合わせプロフィールを形成する個別の遺伝子産物または遺伝子産物対第１の試験化合物プロフィールおよび追加の試験化合物プロフィールによって形成された個別のまたは予測された追加のプロフィールを形成する遺伝子または遺伝子産物の識別における変化を伴う。例えば、第１のプロフィールと追加のプロフィールの相加変更から生じたプロフィールにおける野生型レベルから変更されていないいくつかの遺伝子／遺伝子産物は、組み合わせプロフィールにおいて上方制御または下方制御され、第１のプロフィールと追加のプロフィールの相加変更から生じたプロフィールにおける野生型レベルから上方制御または下方制御された他の遺伝子／遺伝子産物は、組み合わせプロフィールにおける発現の野生型レベルから変更しなかった。
【００２９】
一実施形態では、組み合わせた化合物の発現プロフィールにおける有意な変化の同定は、植物細胞における選択された効果、例えば、試験化合物単独もしくは追加の化合物単独のいずれかによって引き起こされる効果とは異なる効果、または２つの化合物の予測された追加の効果よりも異なった大きなもしくは小さな効果と相関する。一実施形態では、変更された効果は、試験化合物の１つによって引き起こされる効果の有意な増大もしくは減少、およびその他によって引き起こされる効果の減少である。一実施形態では、変更された効果は、試験化合物および追加の化合物の発現プロフィールに基づく、試験化合物および追加の化合物の追加の使用によって生じることが予期される効果の有意な増加である。さらに別の実施形態では、組み合わせ発現プロフィールは、試験化合物および追加の化合物の個別の効果単独、または試験化合物および追加の化合物の予期された追加の効果のいずれかによって引き起こされる効果とは異なる効果を引き起こす。
【００３０】
別の実施形態では、化合物の組み合わせは相乗的効果を有し、相乗的効果は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける、植物の遺伝子（単数もしくは複数）または遺伝子産物（単数もしくは複数）の発現パターンもしくはレベルの変更が、第１の発現プロフィールおよび追加の発現プロフィールのパターンまたはレベルの相加変更によって予測されるものよりも大きいことである。ある種の実施形態では、組み合わせ発現プロフィールにおける発現のパターンまたはレベルの変更は、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更のパターンを形成する遺伝子または遺伝子産物の上方制御もしくは下方制御された発現のいずれかにおける少なくとも２倍の変更である。他の実施形態では、この変更は、２つの化合物の発現プロフィールに基づいて、それらの化合物の追加の効果（上方制御または下方制御）を予測することによって期待されたものの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または２０倍を超える。
【００３１】
なおさらなる実施形態では、化合物の組み合わせは拮抗作用を有し、拮抗作用は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける遺伝子または遺伝子産物の発現パターンもしくはレベルの変更の大きさが、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の発現のパターンまたはレベルによって生じるものよりも減少していることである。この種の結果は、上記２つの化合物が植物細胞における拮抗作用を有することを指示する。
【００３２】
このようにして、２つ以上の化合物の個々の発現プロフィール、またはそれらの計算された追加の発現プロフィール結果に、本発明の方法を適用し、異なる化合物での植物細胞の組み合わせた処理により生じた発現プロフィールを比較することによって、本方法は、種々の植物病害または状態、例えば、ストレスの影響、熟成の遅延などの処理において、化合物における植物を生育させることを必要とせずに用いるための化合物の組み合わせの迅速かつ効率的なスクリーニングを提供する。
【００３３】
これらの方法およびそれにより得られる結果は、植物病害を処理し、または植物の物理的状態を操作するための組成物もしくはキットの処方をさらに可能にする。各々の組成物またはキットは、本明細書に記載されている方法によって同定される少なくとも２つの化合物の有効な相乗的な量を含む。それらの化合物は、植物に適用するために単一製剤に物理的に混合することができ、または野外において植物に同時もしくは連続適用のために別々の容器でキットに含めてもよい。
【００３４】
以下の実施例は、５０％ｗ／ｗの水分散性顆粒形成（Ｂａｙｅｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）において、第１の試験化合物、植物生育調節因子、１−メチルシクロプロペン（１−ＭＣＰ）、および追加の試験化合物として、ＣＯＭＰＡＳＳ（商標）トリフロキシストロビン系殺菌剤を用いることによって生じる、上記で検討された方法のある種の実施形態を例証する。ストロビルリンは、殺菌剤としてのその利益に加えて、植物健康におけるいくつかの効果を有することが観察されている。これらの化合物の両方は知られ、さらに相乗的であることが請求される一方で、それらは請求されている方法の性能を実証するために用いられる。これらの実施例は、特許請求の範囲および明細書の開示を限定するものではない。
[実施例]
【実施例１】
【００３５】
コーン植物の生育および処理
ハイブリッドコーン種子（１ポットあたり１植物）は、ＦＡＦＡＲＤ  ３Ｂ（商標）培養土ミックス（Ｃｏｎｒａｄ  Ｆａｆａｒｄ，Ｉｎｃ．、Ａｇａｗａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で満たされた１クオートポットに植え付けられた。コーンは、１２時間の光サイクルである温室中で生育され、２４時間ごとに、またはストレスツリー条件を維持するために必要に応じて水を与えられた。コーン植物がＶ１０生育段階に達したとき、ポットは、処理あたり３複製を有する４植物を含む無作為の完備ブロック計画に準備された。コーン植物は、２０ｇａｌ／エーカー担体体積で標準ＣＯ２噴霧器を用いて処理された。
処理は以下の通りであった：
対照：０．０３５％ｖ／ｖの有機ケイ素系界面活性剤であるＳＩＬＷＥＴ  Ｌ−７７（Ｈｅｌｅｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を用いた油分／アジュバントチェック
化合物１：Ａ１７４９２Ｆ（ＭＣＰ）２５ｇ有効成分／ヘクタール（ａｉ／ｈａ）＋０．０３５％ＳＩＬＷＥＴ界面活性剤
化合物２：ＣＯＭＰＡＳＳ抗菌剤（１×）＋０．０３５％ＳＩＬＷＥＴ界面活性剤
組み合わせ（１と２）：１ＭＣＰ  ２５ｇ／ｈａ＋ＣＯＭＰＡＳＳ抗菌剤（１×）
【００３６】
噴霧適用の２時間後、噴霧を受けた上位の葉をサンプリングした。各植物について、２インチ片の葉を５枚採取し、小片に切断し、５０ｍｌのポリプロピレン管に合わせた。試料をドライアイスで即座に凍結し、加工のため、一晩の間にドライアイス上にて研究所に送った。
【実施例２】
【００３７】
コーンＲＮＡ調製およびハイブリダイゼーション
Ａ．実験計画
単一色のＡｇｉｌｅｎｔのグローバル遺伝子発現プロファイリング設計を用いて、未処理のトウモロコシ葉組織と比較して、処理されたものについて差異的に発現された遺伝子を特定した。３つの技術的アレイ複製物（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）が、未処理の葉組織と比較して、ＣＯＭＰＡＳＳ抗菌剤および／または１−ＭＣＰで処理された葉組織間で異なる転写物量を比較するためにハイブリダイズされた。
【００３８】
６０マーの総合的なトランスクリプトーマワイドのトウモロコシ（Zea maize）オリゴヌクレオチドを生じさせたＤｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓカスタムを用いてマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。このアレイは、公開されているデータソースから得られた５８，０００個超の異なるトウモロコシ（maize）転写物（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を表す。Ａｇｉｌｅｎｔフォーマット２×１０５Ｋを用いてマイクロアレイチップをプリントし、これは、１０コピーの１００プローブ、２コピーの４４，１９６プローブ、１コピーの１４，３５５プローブ、さらに１，３２５のＡｇｉｌｅｎｔスパイクイン対照が含まれる。６０マーの固有かつ特定のオリゴヌクレオチドは、製造業者からのＳｕｒｅ−Ｐｒｉｎｔ技術を用いてインサイチューで合成された。
【００３９】
Ｂ．ＲＮＡ単離および精製
３０〜５０ｍｇの凍結葉組織の試料は、ＲＮＡ抽出用のＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）の４５０μＬの抽出緩衝液ＲＬＴに再懸濁された。次に、組織は、１個の３ｍｍ粉砕ビーズを各凍結試料に添加し、３００、１Ｘの比率でＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ機器を用いて、３分間粉砕することによって微粉末に細かくされた。総ＲＮＡは、製造業者の指示に従って精製された。続いて、精製された総ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計を用いて定量および品質管理され、標準の１％アガロースゲル電気泳動によって視覚化された。
【００４０】
Ｃ．ｃＲＮＡ標識
標識について、処理および未処理の組織からの全１．０μｇの精製されたＲＮＡを逆転写し、増幅し、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の単一色マイクロアレイベースの遺伝子発現ＱｕｉｃＡｍｐ（商標）標識プロトコールに従って、Ｃｙ３−ＣＴＰを用いて標識した。遺伝子発現用のＤｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓで生成されたトウモロコシ（Zea maize）のＡＧＩＬＥＮＴ（商標）マイクロアレイ（Ｐ／Ｎ  Ｇ４５０３Ａ，デザインＩＤ０２２２３２）は内部スパイクインコントロールを含むため、単一色のＲＮＡスパイクインキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）もまた製造業者の指示に従って標識された。試料は、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写され、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅された。増幅後、ｃＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを用いて精製され、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量された。Ｃｙ３の比活性度は、以下の式：（Ｃｙ３濃度）／（ｃＲＮＡ濃度）＊１０００＝１μｇのｃＲＮＡあたりのＣｙ３のｐｍｏｌによって決定された。ハイブリダイゼーション用の試料を８２５ｎｇに正規化し、１μｇのｃＲＮＡあたりのＣｙ３の比活性度は８．０ｐｍｏｌを超えた。
【００４１】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
オリゴ遺伝子発現アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット、洗浄緩衝液キット、安定化および乾燥溶液を用いて、製造業者の指示に従ってハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたＴＥＣＡＮ  ＨＳ４８００  ＰＲＯ（商標）（ＴＥＣＡＮ  Ｕ．Ｓ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）で行われた。ハイブリダイゼーション混合物を６５℃で注入し、撹拌しながら１７時間インキュベートし、その後、スライドのプレハイブリダイゼーション工程を６５℃にて３０秒間行った。次に、スライドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＥ  Ｗａｓｈ  ＃１を用いて３７℃にて１分間洗浄し、続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＥ  Ｗａｓｈ  ＃２を用いて３０℃にて１分間、第２の洗浄を行い、窒素ガスを用いて２分３０秒間、３０℃にて最終の乾燥工程を行った。シグナル強度における環境中のオキシダントの影響を最少にするために、スライドを即座にスキャンした。
【００４２】
Ｅ．スキャニング、特徴抽出およびＱＣ測定基準
アレイは、ＳｕｒｅＳｃａｎ（商標）高解像能技術を有するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＣＡマイクロアレイレーザースキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてスキャンされた。各々のアレイをスキャンするためのプロトコールは、色素チャネル、スキャン領域および解像度、ＴＩＦＦファイルダイナミックレンジ、ＰＭＴゲイン、ならびに最終画像出力の設定のパラメータを画定する。一度、アレイがスキャンされると、特徴抽出プロトコールは、グリッドフィットを設置および最適化し、スポットを検出し、異常値をフラグで示し、バックグラウンドバイアス、誤差および割合を算出し、ならびに品質管理測定基準を計算するために画定されたパラメータを用いて行われる。
【００４３】
スキャニングおよび特徴抽出プロトコールが完了後、Ｃｙ３画像を含むＴＩＦＦファイルは、品質管理測定基準レポートおよび全ての生データを含む最終ファイル（ＴＸＴ）とともに作成される。画像ファイル（ＴＩＦＦ）を用いて、スライドの一般的な品質、右位（四隅）におけるスパイクインコントロールの存在、ならびに強度を調べ、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニングおよび特徴抽出プロセスが成功したことを確認した。品質管理（ＱＣ）レポートは変動係数の値を与え、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって提供され、設計された陽性および陰性（原核生物遺伝子および人工配列）のスパイクインコントロールに基づいて、データの分散を測定するために使用された。このレポートを用いて、データ分布、均一性、バックグラウンド、再現性、感受性および一般的なデータの品質を決定した。全ての生データを含むＴＸＴファイルを分析のためにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）プログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にアップロードした。
【００４４】
Ｆ．データアップロード、正規化、フィルタリングおよび統計学的分析
スキャニングおよび特徴抽出後、生データファイルをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）ＧＸバージョン１０．０．２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にアップロードし、各アレイデータファイルを一試料と定義し、適切なパラメータ値を割り当てるプロジェクトを作成した。同じパラメータ値を有する試料は複製物として処理された。試料がどのようにして実験条件に分類されたかを特定する解釈を作成し、データを視覚化および分析するのに用いた。スパイクインコントロールに基づく試料に関する品質管理は、分析を開始する前にデータの品質を確実するために行われた。レポートを作成した。
【００４５】
系統的な非生物学的差異を最少にし、相互比較についてアレイを標準化するために、全パーセンタイルシフト正規化法を用いて、データを正規化した。次に、データは、正規化データにおいて２０パーセンタイルと１００パーセンタイルとの間の発現レベルに基づいてフィルターにかけられ、研究中の全ての試料においてカットオフ内にある有意な値を有するように限定された。研究中の全ての単一試料において存在するものとしてフラグされた実在物を選択し、境界または不存在としてフラグされた実在物を排除することによって、別のセットのフィルタリングが行われた。
【００４６】
インプットとして実在物（アレイに示された遺伝子）のこの最終リストを用いて、統計学的分析がワンウェイＡＮＯＶＡを用いて行われ、補正されたＰ値は０．０５以下であり、Ｂｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇマルチプルテスティング補正のＦＤＲは０．０５であった。次に、有意な実在物の最終リストは特定の倍数変化によってフィルターにかけられ、データ解釈のために用いられた。図１は、実施例３、４および５の結果を図式的に示す。
【実施例３】
【００４７】
１−メチルシクロプロペンによって誘導されたコーン遺伝子発現
１−メチルシクロプロペン（１−ＭＣＰ）を用いたコーンの処理は、マイクロアレイ上で９３４個の遺伝子の差異的発現（＞２倍の変化）をもたらした。これらの結果から、１−ＭＣＰ処理に固有の一部の３６２個の遺伝子をさらに分析した。この分析について、本発明者らは、注釈付きの遺伝子に焦点を合わせ、遺伝子の関連した機能的グループ内で変化／傾向を探索した。これらの遺伝子の発現および推定機能を表１に示す。
【００４８】
表１における具体的な遺伝子の分析は、１０個の遺伝子のうちの９個の遺伝子の発現が、この特定の実験において変化した発現を誘導する翻訳に関与し、たった１つが抑制されていたことを示唆する。全翻訳は、典型的には、非生物ストレスおよび生物ストレスに応答して抑制される第１プロセスの１つであるため、一般的な翻訳機構の構成要素の発現は、植物におけるストレスの一般的レベルの指標として機能する可能性がある。これらのデータは、植物がストレスを受けておらず、減少したストレスレベルを経験していた場合があることを示唆する。グルタチオントランスフェラーゼまたはチオレドキシン関連タンパク質などの遺伝子は、多くの場合、ストレス状態中に誘導され、観察されたこれらの遺伝子発現の減少は、減少したストレスレベルと一致している。第３の分類では、特定のストレス（例えば、普遍的ストレスタンパク質）によって発現が誘導されるタンパク質をコードする遺伝子の発現が減少し、これはストレスの減少を指示する一方、細胞増殖に関与するベータ−エクスパンシンの発現が増加し、これはストレスの減少と一致していた。ＡＢＡ産生に関与する胎生１４の発現が増加し、エチレンとＡＢＡはしばしば互いに対抗するため、これは１−ＭＣＰ処理によるエチレンシグナル伝達の減少を指示している可能性があった。全体から見ると、１−ＭＣＰ処理は、ストレス関連遺伝子発現の減少をもたらし、より活性な代謝を反映する一連の遺伝子の発現の増加をもたらしたようである。最後の実施例１０の後に記載される表１は、１−ＭＣＰ単独に反応して差異的に発現された有益なコーン遺伝子を列挙する。
【実施例４】
【００４９】
Ｃｏｍｐａｓｓ殺菌剤によって誘導されたコーン遺伝子発現
ＣＯＭＰＡＳＳストロビルリン系殺菌剤を用いたコーンの処理により、マイクロアレイ上で１８５個の遺伝子の差異的発現（＞２倍の変化）をもたらした。これらのうち、ＣＯＭＰＡＳＳ処理に固有である７８個の遺伝子の小集団があった。差異的に発現した低数の遺伝子は、１−ＭＣＰによる処理と比較して、この処理において観察された。これは、処理後の遺伝子発現レベルで有意な変化を生じさせるのに２時間超を要するＣＯＭＰＡＳＳストロビルリン系殺菌剤に起因している可能性がある。
【実施例５】
【００５０】
１−ＭＣＰおよびＣｏｍｐａｓｓ殺菌剤の組み合わせによって誘導されたコーン遺伝子発現
１−メチルシクロプロパンとストロビルリン系殺菌剤であるＣｏｍｐａｓｓの組み合わせによるコーンの処理は、マイクロアレイ上で１１２８個の遺伝子の差異的発現（＞２倍の変化）をもたらした。これらから、組み合わせ処理に固有の５６８個の遺伝子の小集団をさらに分析した。この分析について、本発明者らは、注釈付きの遺伝子に焦点を合わせ、遺伝子の関連した機能的グループ内で変化／傾向を探索した。図１は、条件の比較の図式結果を示す。
【００５１】
これらの遺伝子の発現および推定機能を表２に示す。これらの遺伝子の分析は、この特定の実験において発現が変化した翻訳に関与する７個の遺伝子のうち３個の遺伝子の発現が誘導され、４個の遺伝子は抑制されたことを示唆する。１−ＭＣＰ単独での処理について観察されたものとは異なり、組み合わせ処理は、全翻訳の状態に関して何ら一致した傾向を示さない。しかしながら、グルタチオントランスフェラーゼまたはアスコルビン酸ペルオキシダーゼなどの遺伝子発現の減少は、減少したストレスレベルと一致して観察された。この特定の実験で発現が変化したこれらの遺伝子の５個のうち４個は減少し、１個だけが増加した。第３の分類では、特定のストレス（例えば、温度誘導）によって発現が誘導されるタンパク質をコードする７個の遺伝子のうち５個の遺伝子の発現は減少し、これはストレスの減少を指示し、２個だけが増加した。また、防御反応に関与する２個の遺伝子は減少し、ストレスの減少を示唆した。除草剤解毒結合タンパク質の発現が増加した。この発現は、いくつかの除草剤（例えば、クロロアセトアニドおよびチオカルバメート）からの損傷に対してトウモロコシを保護し、保護機構としてグルタチオンの産生を誘導し、またはグルタチオントランスフェラーゼの発現を増加させる結合性解毒剤に関与する。この同じタンパク質は、ストロビルリン単独の処理において増加し、これは、ストロビルリンに対する応答を特異的に誘導する遺伝子である可能性を示唆する。それは、ストロビルリン処理／応答に関する潜在的なマーカー遺伝子として機能する。別の分類では、炭酸脱水酵素の発現が増加した。この発現は、光合成のための葉緑体においてＣＯ２濃度の上昇を支援する、ＣＯ２の重炭酸塩への変換に関与する。しかしながら、この同じ遺伝子の発現は、１−ＭＣＰ処理において減少した。また、カルビンサイクルに関与する他の３個の遺伝子の発現は、組み合わせ処理からの５６８個の固有遺伝子の小集団において減少し、これは光合成の減少の可能性を示唆した。
【００５２】
さらなる分類では、転写誘導にしばしば関与する酵素である１つのヒストン脱アセチル化酵素の発現が増加した一方で、別のヒストン脱アセチル化酵素は減少した。異なるファミリーメンバーが同条件下で差異的に作用し得るという説明が可能である。ストレス関連ホルモンであると一般的に考えられる、ジャスモン酸生合成に関与するアレンオキシドシンターゼの発現は減少し、これはストレスレベルの減少の可能性を示唆した。したがって、いくつかの変化は可能なストレスの減少を指示する一方で、他はそうでない可能性がある。全体から見ると、これらの結果は、上記２つの化合物が拮抗的に作用することを示唆する。
【実施例６】
【００５３】
シロイヌナズナ植物の生育および処理
１３個のシロイヌナズナ種子（コロンビア亜種）は、砂質粘土培養土で満たされた６インチポットに植え付けられた。発芽後、ポットを１ポットあたり１０個の植物になるように間引かれた。植物は、１２時間の光サイクルである温室中で生育され、２４時間ごとに、またはストレスフリー条件を維持するために必要に応じて水を与えられた。シロイヌナズナ植物が生長（＞ＢＢＣＨ  １１＜ＢＢＣＨ  ３０）期（植え付けから約２〜３週）に達したとき、ポットは、処理あたり３複製を有する１０個の植物を含む無作為の完備ブロック計画に準備された。植物は、２０ｇａｌ／エーカーのキャリア体積で標準ＣＯ２噴霧器を用いて処理された。
処理は以下の通りであった：
対照：油分／アジュバントチェック（０．０３５％ｖ／ｖのＳＩＬＷＥＴアジュバントＬ−７７）
化合物１：Ａ１７４９２Ｆ（ＭＣＰ）２５ｇ  ａｉ／ｈａ＋０．０３５％ＳＩＬＷＥＴアジュバント
化合物２：ＣＯＭＰＡＳＳ抗菌剤（１×）＋０．０３５％ＳＩＬＷＥＴアジュバント
組み合わせ：１ＭＣＰ  ２５ｇ／ｈａ＋ＣＯＭＰＡＳＳ抗菌剤（１×）
【００５４】
噴霧適用の２時間後、噴霧を受けた葉をサンプリングした。各々の処理について、１０個の植物の各々から２枚の葉を採取し、５０ｍｌのポリプロピレン管に合わせた。試料をドライアイスで即座に凍結し、加工のため、一晩の間にドライアイス上にて研究所に送った。
【実施例７】
【００５５】
シロイヌナズナＲＮＡの調製およびハイブリダイゼーション
Ａ．実験設計
単一色のＡｇｉｌｅｎｔ全遺伝子発現プロファイリング設計を用いて、未処理のシロイヌナズナ葉組織と比較して、処理されたものについて差異的に発現された遺伝子を画定した。３つの技術的アレイ複製物（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）が、未処理の葉組織と比較して、ストロビルリンおよび／または１−ＭＣＰで処理された葉組織間で異なる転写物量を比較するためにハイブリダイズされた。シロイヌナズナスライド、製造番号Ｇ２５１９Ｆ、デザインＩＤ０２１１６９をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。
【００５６】
Ｂ．ＲＮＡ単離および精製
３０〜５０ｍｇの凍結葉組織の試料は、ＲＮＡ抽出用のＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）の４５０μＬの抽出緩衝液ＲＬＴに再懸濁された。次に、組織は、１個の３ｍｍ粉砕ビーズを各凍結試料に添加し、３００、１Ｘの比率でＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ機器を用いて、３分間粉砕することによって微粉末に細かくされた。総ＲＮＡは、製造業者の指示に従って精製された。続いて、精製された総ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量および品質管理され、標準の１％アガロースゲル電気泳動によって視覚化された。
【００５７】
Ｃ．ｃＲＮＡ標識
標識について、処理および未処理の組織からの全１．０μｇの精製されたＲＮＡを逆転写し、増幅し、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の単一色マイクロアレイベースの遺伝子発現ＱｕｉｃＡｍｐ標識プロトコールに従って、Ｃｙ３−ＣＴＰを用いて標識した。遺伝子発現用のＡｇｉｌｅｎｔシロイヌナズナマイクロアレイ（製造番号Ｇ２５１９Ｆ、デザインＩＤ０２１１６９）は内部スパイクインコントロールを含むため、単一色のＲＮＡスパイクインキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）もまた製造業者の指示に従って標識された。試料は、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写され、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅された。増幅後、ｃＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを用いて精製され、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量された。Ｃｙ３の比活性度は、以下の式：（Ｃｙ３濃度）／（ｃＲＮＡ濃度）＊１０００＝１μｇのｃＲＮＡあたりのＣｙ３のｐｍｏｌによって決定された。ハイブリダイゼーション用の試料を８２５ｎｇに正規化し、１μｇのｃＲＮＡあたりのＣｙ３の比活性度は８．０ｐｍｏｌを超えた。
【００５８】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
オリゴ遺伝子発現アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット、洗浄緩衝液キット、安定化および乾燥溶液を用いて、製造業者の指示に従ってハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたＴＥＣＡＮ  ＨＳ４８００  ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ  Ｕ．Ｓ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）ハイブリダイゼーション機器で行われた。ハイブリダイゼーション混合物を６５℃で注入し、撹拌しながら１７時間インキュベートし、その後、スライドのプレハイブリダイゼーション工程を６５℃にて３０秒間行った。次に、スライドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＥ  Ｗａｓｈ  ＃１を用いて３７℃にて１分間洗浄し、続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＥ  Ｗａｓｈ  ＃２を用いて３０℃にて１分間、第２の洗浄を行い、窒素ガスを用いて２分３０秒間、３０℃にて最終の乾燥工程を行った。シグナル強度における環境中のオキシダントの影響を最少にするために、スライドを即座にスキャンした。
【００５９】
Ｅ．スキャニング、特徴抽出およびＱＣ測定基準
アレイは、ＳｕｒｅＳｃａｎ（商標）高解像能技術を有するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＣＡマイクロアレイレーザースキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてスキャンされた。各々のアレイをスキャンするためのプロトコールは、色素チャネル、スキャン領域および解像度、ＴＩＦＦファイルダイナミックレンジ、ＰＭＴゲイン、ならびに最終画像出力の設定のパラメータを画定する。一度、アレイがスキャンされると、特徴抽出プロトコールは、グリッドフィットを設置および最適化し、スポットを検出し、異常値をフラグで示し、バックグラウンドバイアス、誤差および割合を算出し、ならびに品質管理測定基準を計算するために画定されたパラメータを用いて行われる。スキャニングおよび特徴抽出プロトコールが完了後、Ｃｙ３画像を含むＴＩＦＦファイルは、品質管理測定基準レポートおよび全ての生データを含む最終ファイル（ＴＸＴ）とともに作成される。画像ファイル（ＴＩＦＦ）を用いて、スライドの一般的な品質、右位（四隅）におけるスパイクインコントロールの存在、ならびに強度を調べ、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニングおよび特徴抽出プロセスが成功したことを確認した。品質管理（ＱＣ）レポートは変動係数の値を与え、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって提供され、設計された陽性および陰性（原核生物遺伝子および人工配列）のスパイクインコントロールに基づいて、データの分散を測定するために使用された。このレポートを用いて、データ分布、均一性、バックグラウンド、再現性、感受性および一般的なデータの品質を決定した。全ての生データを含むＴＸＴファイルを分析のためにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にアップロードした。
【００６０】
Ｆ．データアップロード、正規化、フィルタリングおよび統計学的分析
スキャニングおよび特徴抽出後、生データファイルをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸバージョン１０．０．２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にアップロードし、各アレイデータファイルを一試料と定義し、適切なパラメータ値を割り当てるプロジェクトを作成した。同じパラメータ値を有する試料は複製物として処理された。試料がどのようにして実験条件に分類されたかを特定する解釈を作成し、データを視覚化および分析するのに用いた。スパイクインコントロールに基づく試料に関する品質管理は、分析を開始する前にデータの品質を確実するために行われた。レポートを作成した。
【００６１】
系統的な非生物学的差異を最少にし、相互比較についてアレイを標準化するために、全パーセンタイルシフト正規化法を用いて、データを正規化した。次に、データは、正規化データにおいて２０パーセンタイルと１００パーセンタイルとの間の発現レベルに基づいてフィルターにかけられ、研究中の全ての試料においてカットオフ内にある有意な値を有するように限定された。研究中の全ての単一試料において存在するものとしてフラグされた実在物を選択し、境界または不存在としてフラグされた実在物を排除することによって、別のセットのフィルタリングが行われた。
【００６２】
インプットとして実在物（アレイに示された遺伝子）のこの最終リストを用いて、統計学的分析がワンウェイＡＮＯＶＡを用いて行われ、補正されたＰ値は０．０５以下であり、Ｂｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇマルチプルテスティング補正のＦＤＲは０．０５であった。次に、有意な実在物の最終リストは特定の倍数変化によってフィルターにかけられ、データ解釈のために用いられた。図２は、実施例８〜１０の各条件によって有意に発現した遺伝子の比較、およびこれらの条件のいずれかによって発現した固有遺伝子の数を図式的に示す。
【実施例８】
【００６３】
シロイヌナズナにおける１−メチルシクロプロペンによって誘導された遺伝子発現
１−メチルシクロプロペン（１−ＭＣＰ）を用いたシロイヌナズナの処理は、マイクロアレイ上で４１１個の遺伝子の差異的発現（＞５倍の変化）をもたらした。これらから、１−ＭＣＰ処理に固有の２０２個の遺伝子の小集団をさらに分析した。この分析について、本発明者らは、注釈付きの遺伝子に焦点を合わせ、遺伝子の関連した機能的グループ内で変化／傾向を探索した。これらの遺伝子の発現および推定機能を表３に示す。固有のＭＣＰ遺伝子セットにおいて反映される１−ＭＣＰ処理は、ストレス関連遺伝子発現の減少をもたらし、エチレン誘導性であることが知られている一連の遺伝子、例えば、ＰＤＦ１．２；キチナーゼ、ＡＣＳ２；ＳＡＧ１３の発現が減少したようである。使用されるマイクロアレイチップに示されたα−キチナーゼ遺伝子は同様に調節されるかどうかが未知であるが、α−キチナーゼはエチレン誘導性であることが留意された。また、エチレン制御がしばしば関与されるＡＢＡによって制御される一連の遺伝子の発現の減少は、実際に発現の真の減少を示す可能性を示唆する。グルタチオントランスフェラーゼまたはチオレドキシン関連タンパク質などの遺伝子は、多くの場合、ストレス状態中に誘導され、観察されたこれらの遺伝子の発現の減少は、ストレスの減少レベルと一致している。さらに、特定のストレス（例えば、普遍的ストレスタンパク質）によって発現が誘導されるタンパク質をコードする遺伝子の発現が減少し、ストレスの減少を指示する。また、これは、コーンマイクロアレイ実験でも観察された。創傷によって阻害されるＡＣＳ５の発現の増加はまた、ストレスの減少と一致している。ジャスモン酸の生合成の第１工程を触媒するアレンオキシドシクラーゼ（ＡＯＣ３）の発現が減少した。これは、ストレスレベルの減少の可能性を示唆する。同様に、アレンオキシドシンターゼの発現は、ストレス関連ホルモンであると一般に考えられるジャスモン酸生合成に関与し、コーンマイクロアレイ実験において減少した。これは、ストレスレベルの減少の可能性を示唆した。エチレンは、アレンオキシドシンターゼの発現を誘導する。Ｆ−ｂｏｘファミリータンパク質の発現が減少し、いくつかのＦ−ｂｏｘタンパク質は、ＥＩＮ３を制御するものなどのエチレンによって下方制御される。いくつかのＷＲＫＹ転写因子の発現は減少し、いくつかのＷＲＫＹ転写因子は誘導されることで知られ、他はエチレンによって抑制された。２つのＡＰ２ドメイン含有転写因子ファミリータンパク質の発現は減少した。エチレン応答因子（ＥＲＦ）は、そのいくつかがエチレンによって誘導され、エチレン応答因子／アペタラ２ファミリーのメンバーである。他の遺伝子、即ち、メチオニンスルホキシド還元酵素ドメイン含有タンパク質、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼ／メチルトランスフェラーゼ、ＭＡＰＫＫＫ１９；ＡＴＰ結合／キナーゼ／タンパク質キナーゼ／タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質キナーゼファミリータンパク質；代替オキシダーゼ；ペルオキシダーゼ；およびＭＹＢタンパク質の発現はパターンを示すが、それらがエチレンによって制御されるかどうかは知られていない。最後の実施例１０の後に記載される表３は��１−ＭＣＰ単独に応答して差異的に発現された有益なシロイヌナズナ遺伝子を列挙する。データは、全体から見ると、１−ＭＣＰ処理がストレス関連遺伝子発現の減少をもたらしたことを実証する。
【実施例９】
【００６４】
シロイヌナズナにおけるＣＯＭＰＡＳＳ殺菌剤によって誘導される遺伝子発現
ＣＯＭＰＡＳＳストロビルリン殺菌剤を用いたシロイヌナズナの処理は、マイクロアレイ上で２７８個の遺伝子の差異的発現（＞５倍の変化）をもたらした。これらのうち、ＣＯＭＰＡＳＳ処理に固有であった８０個の遺伝子の小集団があった。ＣＯＭＰＡＳＳ処理の影響に洞察を与えるように分類され得る注釈付きの遺伝子を表４に示す。８０個の固有のＣＯＭＰＡＳＳ単独処理遺伝子の分析は、遺伝子発現のいくつかのパターンを示し、例えば、栄養貯蔵タンパク質；ジャスモン酸−Ｚｉｍ−ドメインタンパク質；ニトリル指定タンパク質；α−アミラーゼ；Ｏ−メチルトランスフェラーゼファミリー２タンパク質；トランスフェラーゼファミリータンパク質；ＪＡによって誘導される創傷応答性遺伝子であるＪＲ１；ヌクレオシドホスファターゼファミリータンパク質；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼファミリータンパク質；システインプロテイナーゼ；ＮＡＩ２の減少が挙げられる。しかしながら、それらがエチレンによって制御されるかどうかは知られていない。残りの注釈付きの遺伝子のうち、共通の経路に影響を及ぼす遺伝子のグループは観察されておらず、したがって、傾向を決定することができず、結果として、これらに基づいた結果は非常に思索的であった。本発明者らは、この処理において差異的に発現した低数の遺伝子を観察した。ＣＯＭＰＡＳＳストロビルリン殺菌剤は、処理後の遺伝子発現のレベルで有意な変化を生じさせるのに２時間超を要する場合がある。
【００６５】
１−ＭＣＰ単独またはＣＯＭＰＡＳＳ単独のいずれかを用いた処理後に１６５個の共通遺伝子が存在するという事実は、ストロビルリン処理単独に固有であるものよりも、２つの処理間で共通したより多くの遺伝子が存在することを示唆し、ストロビルリン処理が１−ＭＣＰ処理がするのと同じ遺伝子の小集団を変更し得る。各処理に共通している有益な遺伝子は、最後の実施例１０の後に記載される表５に示される。ペルオキシダーゼをコードする複数の遺伝子発現の減少は、細胞レドックス状態を調節するストレス応答の減少を示唆する。ＧＳＴ発現の減少はこれと一致している。ＷＲＫＹ転写因子の発現の減少は、１−ＭＣＰ処理を用いて観察されたものと類似している。遺伝子セットの追加の分析は、遺伝子発現においていくつかのパターンを表し、例えば、後期胚発生豊富タンパク質；β−グリコシダーゼ／銅イオン結合／フコシダーゼ／加水分解酵素、加水分解Ｏ−グリコシル化合物；栄養貯蔵タンパク質；ヒドロキシプロリン富化糖タンパク質ファミリータンパク質；ジャカリンレクチンファミリータンパク質；脂肪酸還元酵素の減少が挙げられる。しかしながら、それらがエチレンによって制御されるかどうかは知られていない。
【００６６】
表４は、最後の実施例１０の後に記載され、ＣＯＭＰＡＳＳ単独に応答して差異的に発現される有益なシロイヌナズナ遺伝子を列挙する。以下の表５は、１−ＭＣＰ単独またはＣＯＭＰＡＳＳ単独のいずれかに共通した有益なシロイヌナズナ遺伝子を列挙する。
【実施例１０】
【００６７】
シロイヌナズナにおける１−ＭＣＰおよびＣＯＭＰＡＳＳ殺菌剤の組み合わせによって誘導された遺伝子発現
１−メチルシクロプロペンおよびＣＯＭＰＡＳＳストロビルリン殺菌剤の組み合わせを用いたシロイヌナズナの処理は、マイクロアレイ上で９３個の遺伝子の差異的発現（＞５倍の変化）をもたらした。これらから、組み合わせ処理に固有の４４個の遺伝子の小集団をさらに分析した。この分析について、本発明者らは、注釈付きの遺伝子に焦点を合わせ、遺伝子の関連した機能的グループ内で変化／傾向を探索した。図２は、状態の比較の図式的な結果を示す。
【００６８】
これらの注釈付きの遺伝子の発現および推定機能を表６に示す。１−ＭＣＰおよびストロビルリンの組み合わせを用いた処理によって変更された固有の遺伝子を表す遺伝子セットは４４個の遺伝子であって少ないが、遺伝子発現におけるいくつかのパターンが観察され、これには、エチレン応答性エレメント結合ファミリータンパク質（ＥＲＦ）、および転写因子のＥＲＦ／ＡＰ２スーパーファミリーに属するＡＰ２ドメイン含有転写因子の増加が挙げられる。このデータは、ストレスシグナル伝達の増加が生じた可能性があることを示唆する。疾患耐性タンパク質、およびＤＮＡ結合転写因子であるＣリピート結合因子（ＣＢＦ２はストレスホルモンエチレンによって誘導される葉の老化を抑制したことを気付かれたい）の発現の増加は、ストレスシグナル伝達の変更を示唆する。別のエチレン応答性因子；病原性関連遺伝子；ＡＧＤ２様防御応答性タンパク質１；およびいくつかの熱ショックタンパク質の発現の減少は、ストレス応答の減少の可能性を示唆する。このようにして、シロイヌナズナにおいて、上記２つの化合物は、コーンの結果におけるように、拮抗的に作用しない。このデータは、これらの実施例において試験された２つの化合物について、種および／または単子葉植物／双子葉植物に特異的な応答に関して証拠を与える。以下の表６は、組み合わせの１−ＭＣＰとＣＯＭＰＡＳＳに応答して差異的に発現された有益なシロイヌナズナ遺伝子を列挙する。
【００６９】
【表１】
2013531484.tif 000002
2013531484.tif 000003
2013531484.tif 000004
【表２】
2013531484.tif 000005
2013531484.tif 000006
2013531484.tif 000007
【表３】
2013531484.tif 000008
2013531484.tif 000009
2013531484.tif 000010
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【表４】
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2013531484.tif 000014
2013531484.tif 000015
【表５】
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2013531484.tif 000017
2013531484.tif 000018
【表６】
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2013531484.tif 000020
2013531484.tif 000021
【００７０】
上記で列挙され、または参照される特許、特許出願および刊行物、および非特許刊行物を含む全ての文献、ならびに添付の図面は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲まで、それら全体が参照により本明細書に援用される。しかしながら、本明細書におけるいずれの参考文献の引用は、このような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【００７１】
本明細書または特許請求の範囲における種々の実施形態は「含む」という用語を用いて示されているが、種々の条件下で、関連する実施形態もまた「からなる」または「から本質的になる」という用語を用いて記載されてもよい。用語「１つの（a）」または「１つの（an）」は、１つ以上のことを意味し、例えば、「化合物（a compound）」は１つ以上の化合物を表すと理解されることに留意されたい。このようにして、用語「１つの（a）」（または「１つの（an）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明は、特定の実施形態および実施例を参照して説明されている。しかしながら、修飾が本発明の精神から逸脱せずになし得ることは承認される。このような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2013531484.tif 000022
【図２】
2013531484.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する化合物を同定するための方法であって、
（a）(i) 第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
(ii) 追加の試験化合物と接触させた、同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに
(iii) 第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた、同じ植物細胞または組織からの組み合わせた化合物の発現プロフィール
を比較する工程であって、
各々の植物細胞または組織は、前記植物細胞または組織における少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、前記植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む、工程と、
(b) 組み合わせた化合物のプロフィールの遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
(c) 同じ植物からの植物細胞または組織を、
(i) 第１の試験化合物、
(ii) 追加の試験化合物、または
(iii) 第１の試験化合物と追加の試験化合物の組み合わせ
の１つと接触させる工程と、
(d)(i) (c)（i）と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
(ii) (c)（ii）と接触させた植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、および
(iii) (c)（iii）の植物細胞または組織からの、組み合わせた化合物の発現プロフィール
を生じさせる工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の接触植物細胞の遺伝子または遺伝子産物からの、組み合わせた化合物のプロフィールにおける接触植物細胞の遺伝子または遺伝子産物の発現の変更が、組み合わせた化合物によって引き起こされる植物細胞における選択された効果と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の試験化合物または追加の試験化合物のいずれとも接触させられていない同じ植物の細胞または組織からの野生型遺伝子または遺伝子産物の発現プロフィールが、比較工程前に各々のプロフィールから差し引かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
発現プロフィールの変更が、平均（mean）もしくは平均（average）、数値平均または数値平均の範囲、数値パターン、図式パターン、または発現プロフィールとして表される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変更が、
(i) 第１のプロフィールおよび追加のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の追加発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の上方制御；ならびに
(ii) 第１のプロフィールおよび追加のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の追加発現と比較した、組み合わせた化合物のプロフィールにおける同じ選択された遺伝子または遺伝子産物の下方制御；ならびに
(iii) 組み合わせた化合物のプロフィールにおける１つ以上の選択された遺伝子または遺伝子産物のアイデンティティーまたは発現の変化であって、前記選択された遺伝子または遺伝子産物が、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更から生成されたプロフィールにおいて変更されていない、変化
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の化合物が、植物に対して既知の効果を有し、追加の化合物が植物に対して未知の効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の化合物が１−メチルシクロプロペンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
各々の発現プロフィールが、植物の完全なゲノムによってコードされた遺伝子または遺伝子産物の小集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子産物が植物タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子産物の変更の結果である、植物代謝産物における対応する変化を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化合物の組み合わせが相乗的効果を有し、相乗的効果は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける、植物の遺伝子または遺伝子産物の発現パターンまたはレベルの変更が、第１の発現プロフィールおよび追加の発現プロフィールのパターンまたはレベルの相加変更によって生じるものよりも大きいことである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物の組み合わせが拮抗作用を有し、拮抗作用は、組み合わせた化合物のプロフィールにおける遺伝子または遺伝子産物の発現パターンもしくはレベルの変更の大きさが、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更の発現のパターンまたはレベルによって生じるものよりも減少していることである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組み合わせの発現プロフィールにおける発現のパターンまたはレベルの変更が、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの相加変更のパターンを形成する遺伝子または遺伝子産物の発現の少なくとも２倍の変更である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子または遺伝子産物発現プロフィールの選択された変更が、エチレン感受性の増加、エチレン感受性の減少、熟成の増大、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の増加、ストレス、熱、集団密度または塩分に対する抵抗性の減少、病原体抵抗性の増加、病原体抵抗性の減少、開花の増加、窒素効率の増加、除草抵抗性の増加、光合成作用の増加、および収量の増加から選択される状態にある植物に典型的である遺伝子または遺伝子産物の発現パターンの変更である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
追加の化合物が、２つ以上の追加の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物細胞が、米、トウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、キビ、スイッチグラス、ススキ、シバ、オートムギ、トマト、ポテト、バナナ、キウイフルーツ、アボカド、メロン、マンゴ、トウ、サトウダイコン、タバコ、パパイヤ、ピーチ、ストローベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、タマネギ、ブロッコリー、芽キャベツ、綿、キャノーラ、グレープ、大豆、菜種、アスパラガス、豆、ニンジン、キュウリ、ナス、メロン、オクラ、アメリカボウフウ、ピーナッツ、ペッパー、パインアップル、カボチャ、サツマイモ、ライ麦、カンタロープ、エンドウ、パンプキン、ヒマワリ、ホウレンソウ、リンゴ、チェリー、クランベリー、グレープフルーツ、レモン、ライム、ネクタリン、オレンジ、ピーチ、西洋ナシ、タンジェロ、タンジェリン、ユリ、カーネション、菊、ペチュニア、バラ、ゼラニウム、スミレ、グラジオリ、ラン、ライラック、クラブアップル、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、セイヨウトネリコ、ポプラ、リンデンツリーおよびシロイヌナズナからなる群から選択される植物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞の野生型遺伝子発現を選択的に変更する相乗的化合物を同定するための方法であって、
（a）(i) 第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
(ii) 追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに
(iii)第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの組み合わせの発現プロフィール
を比較する工程であって、
各々の植物細胞または組織は、前記植物細胞または組織において少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、前記植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む工程と、
（b）組み合わせた化合物のプロフィール（a）（iii）の遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィール（a）（i）および追加のプロフィール（a）（ii）の組み合わせの遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
前記比較が、数値データまたは図式データを生じさせるコンピュータプロセッサまたはコンピュータプログラムされた機器によって行われる、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１および第２の化合物の各々が前記植物に対して未知の効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の試験化合物が１−メチルシクロプロペンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
植物細胞の野生型遺伝子の発現を選択的に変更する化合物を同定するための方法であって、
（a）(i) 前記植物細胞に対して未知の効果を有する第１の試験化合物と接触させた植物細胞または組織からの第１の発現プロフィール、
(ii）前記植物細胞に対して未知の効果を有する追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの追加の発現プロフィール、ならびに
(iii) 第１の試験化合物および追加の試験化合物と接触させた同じ植物細胞または組織からの組み合わせた化合物の発現プロフィール
を比較する工程であって、
各々の植物細胞または組織は、前記植物細胞または組織において少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現の変更を生じさせるのに十分な時間にわたって接触させられており、各々の発現プロフィールは、前記植物細胞または組織の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物の発現レベルまたはパターンを含む工程と、
（b）組み合わせた化合物のプロフィールの遺伝子または遺伝子産物と、第１のプロフィールおよび追加のプロフィールの組み合わせの遺伝子または遺伝子産物との間における、発現のレベルまたはパターンの有意な予測外の変更を同定する工程と
を含む方法。
【請求項２３】
前記植物細胞が、トウモロコシ、大豆、小麦、菜種、米、サトウダイコン、綿、オートムギ、大麦、ソルガム、タバコ、および、シロイヌナズナから成る群から選択される植物に由来する、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2013531484.tif 000024
2013531484.tif 000025
2013531484.tif 000026