(57)【要約】【課題】  電気浸透流を利用した電気泳動方法とそれを用いた抗原検出方法、及びその電気泳動に用いるための新規担体を提供することを目的とする。【解決手段】  電気泳動の新規担体をグラスファイバーシートとし、その担体中を、陽極側から陰極側へ物質を流す。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気浸透流を利用した電気泳動方法であって、
グラスファイバーシートを含んだ電気泳動担体中を、陽極側から陰極側へ物質を流す、電気泳動方法。
【請求項２】
請求項１に記載の電気泳動方法であって、
前記物質が全体として負に帯電していることを特徴とする電気泳動方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の電気泳動方法であって、
前記物質がタンパク質であることを特徴とする電気泳動方法
【請求項４】
電気泳動を利用した、抗原の検出方法であって、
グラスファイバーシートを含む電気泳動担体を備えた電気泳動装置において、
前記グラスファイバーシートは、
標識された、前記抗原に対する標識抗体を含む標識抗体部と、
前記標識抗体部より陰極側に、前記グラスファイバーシート内を移動できない大きさの担持体に結合した、前記抗原に対する担持体結合抗体を含む標識検出部と、を備え、
標識抗体部と前記標識検出部の間に、前記抗原を含み、
前記グラスファイバーシートに電圧を印加して、前記検出抗体部で、前記標識抗体と、前記抗原と、前記担持体結合抗体の複合体を作成する工程と、
前記標識を検出する工程と、
を含む検出方法。
【請求項５】
電気泳動を利用した、抗原の定量方法であって、
請求項４の方法によって、既知の濃度を有する前記抗原に対して前記標識を検出する工程と、
検出された前記標識の強度を用いて、標準曲線を作成する工程と、
請求項３の方法によって、未知の濃度を有する前記抗原に対して前記標識を検出する工程と、
前記標準曲線を用いて、前記未知の濃度を有する前記抗原に対して検出された前記標識の強度を濃度に変換する工程と、
を含む定量方法。
【請求項６】
電気浸透流を利用した電気泳動用の担体であって、
グラスファイバーシートを含む、担体。
【請求項７】
電気浸透流を利用した電気泳動装置であって、
電気泳動用担体としてグラスファイバーシートを含む、電気泳動装置。
【請求項８】
前記グラスファイバーシートの繊維間隙が０．１〜５０μｍであることを特徴とする請求項７記載の電気泳動装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動方法とそれを用いた抗原検出方法、及び電気泳動用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動に用いられる担体には、アクリルアミド、アガロースなどのゲルが最もよく用いられる。無担体電気泳動は、対流が起きやすく、物質の分離が不安定になる。そこで、毛細管を用いたキャピラリー電気泳動が開発された（例えば、特許文献１参照）。これは、石英でつくられた毛細管をバッファーで満たし、一方に試料を加えて両端に電圧をかける、というものである。すると、キャピラリー内壁は負に帯電し、壁表面は正に帯電するという電気二重層が発生し、それによって、陽極から陰極への電気浸透流と呼ばれる流れが生じる。それとともに、内部の物質も陰極へと流れるのであるが、その速度の差によって、物質が分離される。電気浸透流を利用した電気泳動には、他にも、マイクロ流路を加工したチップ、石英やシリカなどの多孔質材料を２つの電極で挟んだ電気浸透流ポンプ、電気浸透フローセルなどがある（例えば、特許文献２、非特許文献１参照）。しかし、キャピラリーの材料である石英が高価であり、使い捨てができないことや、マイクロ加工が煩雑で高価であること、などの欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特願平１−５００８６９号公報
【特許文献２】特願２００４−６４５２２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Stroock, A.D., et al., Physical Review Letters vol 84 p.3314, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、電気浸透流を利用した電気泳動方法とそれを用いた抗原検出方法、及びその電気泳動に用いるための新規担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、グラスファイバーシートを担体として蛍光標識抗体を電気泳動すると、蛍光標識抗体はアガロースゲル中では陰極から陽極に泳動するにもかかわらず、陽極から陰極に泳動することを見出した。通常の電気泳動では、正に荷電した成分はマイナス極側へ、負に荷電した成分はプラス極へと移動する (電気泳動流=Vep) が、本発明の場合、以下のように電気浸透流が発生し、それによって抗体が泳動したものと考えられた。
【０００７】
グラスファイバーシートが電気泳動用緩衝液で満たされると、グラスファイバー表面はマイナスに荷電する。すると緩衝液中の陽イオンがグラスファイバー表面にひきつけられる。この状態で電圧がかかると陽イオンは負電極側へ動き始め、これらは溶液中の水分子を引っ張りながら移動し、結果として負電極側への流れ(電気浸透流=Veo) が生ずるが、ほとんどの場合、Veo>Vepとなるため、全体として負に帯電している分子であっても、陽極から陰極に移動することになる。
【０００８】
本発明の一実施態様は、電気浸透流を利用した電気泳動方法であって、グラスファイバーシートを含んだ電気泳動担体中を、陽極側から陰極側へ物質を流す方法である。前記物質が全体として負に帯電していてもよい。
【０００９】
本発明の他の一実施態様は、電気泳動を利用した、抗原の検出方法であって、グラスファイバーシートを含む電気泳動担体を備えた電気泳動装置において、前記グラスファイバーシートは、標識された、前記抗原に対する標識抗体を含む標識抗体部と、前記標識抗体部より陰極側に、前記グラスファイバーシート内を移動できない大きさの担持体に結合した、前記抗原に対する担持体結合抗体を含む標識検出部と、を備え、標識抗体部と前記標識検出部の間に、前記抗原を含み、前記グラスファイバーシートに電圧を印加して、前記検出抗体部で、前記標識抗体と、前記抗原と、前記担持体結合抗体の複合体を作成する工程と、前記標識を検出する工程と、を含む検出方法である。前記抗原は、前記グラスファイバーシートの前記標識抗体部に添加されてもよく、その際、予め前記標識抗体と混合されて、前記標識抗体部に添加されてもよい。また、前記抗原は、前記グラスファイバーシートの前記標識検出部に添加されてもよく、その際、予め前記担持体結合抗体と混合されて、前記標識検出部に添加されてもよい。なお、前記標識は蛍光標識であって、前記標識は、前記蛍光を検出することにより検出されてもよい。
【００１０】
本発明のさらなる他の一実施態様は、電気泳動を利用した、抗原の定量方法であって、上記抗原の検出方法によって、既知の濃度を有する前記抗原に対して前記標識を検出する工程と、検出された前記標識の強度を用いて、標準曲線を作成する工程と、上記抗原の検出方法によって、未知の濃度を有する前記抗原に対して前記標識を検出する工程と、前記標準曲線を用いて、前記未知の濃度を有する前記抗原に対して検出された前記標識の強度を濃度に変換する工程と、を含む定量方法である。
【００１１】
本発明のさらなる他の一実施態様は、電気浸透流を利用した電気泳動用の担体であって、グラスファイバーシートを含む担体である。
【００１２】
本発明のさらなる他の一実施態様は、電気浸透流を利用した電気泳動装置であって、電気泳動用担体としてグラスファイバーシートを含む電気泳動装置である。物質を流す上流側に陽極、下流側に陰極があってもよい。また、前記物質が全体として負に帯電していてもよい。
【００１３】
本明細書で、グラスファイバーシートの前後という場合、電気浸透流の方向の軸に関して、グラスファイバーシートの上下という場合、重力方向の軸に関して、グラスファイバーシートの左右という場合、電気浸透流と垂直の方向の軸に関して言うものとする。なお、前後、上下、及び左右は、各軸に対する相対的な位置を表すものとし、絶対的な位置を表すものではない。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、電気浸透流を利用した電気泳動方法とそれを用いた抗原検出方法、及び電気泳動用の新規担体を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る電気泳動装置を利用した抗原抗体反応の一例を説明した図である。
【図２】発明の一実施例における、電気泳動装置の構造を示す斜視図である。（Ａ）は組み立て前、（Ｂ）は組み立て後を示す。
【図３】本発明の一実施例において、電気浸透流を利用した電気泳動装置で蛍光標識抗体を泳動させ、蛍光顕微鏡で蛍光を検出した写真を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、電気泳動装置を用いて抗原抗体反応を行い、検出対象のインスリン濃度と、抗原抗体反応によって得られた蛍光強度の間の相関関係を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾できることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝電気泳動装置の構成と製造＝＝
本発明の電気泳動装置は、電気浸透流を利用した電気泳動装置であって、電気泳動用担体としてグラスファイバーシートを含む。そして、さらに、グラスファイバーシートを載せるためのシート台と、電気泳動用バッファーを入れるための２つの槽と、を備えてもよい。槽は電気浸透流の方向に対し、シート台の前後に設けられ、シート台に載せられたグラスファイバーシートの前後端が、槽の中に入るように構成されてもよい。
【００１８】
グラスファイバーシートは、特に限定されないが、例えば、坪量１０〜１００ｇｓｍ、より好ましくは、６５〜８５ｇｓｍ、厚さ１００〜１０００μｍ、より好ましくは、２００〜５００μｍ、繊維間隙０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜３０μｍ、より好ましくは５〜１５μｍのガラス繊維からなる不織布である。グラスファイバーシートの中に、穴（ウエル）を配置した場合には、繊維間隙よりも大きい粒子等の担持体を保持することができるので、電気浸透流を利用して免疫測定におけるＢ/Ｆ（bound/free）分離などに利用することもできる。例えば、繊維間隙が１０μｍの場合、ウエルにφ５０μｍの担持体を設置すると、グラスファイバー中に電気浸透流が発生しても、担持体はウエルから流れ出ることはない。このように、繊維間隙の大きさは、担持体との相対的な大きさを考慮して決めることもできる。材料となるガラス繊維は、特に限定されず、Ｅガラス繊維、Ｄガラス繊維、Ｓガラス繊維、ＮＥガラス繊維、Ｃガラス繊維、石英ガラス繊維、高珪酸ガラス繊維等を挙げることができ、２種類以上のガラス繊維から成っていても良い。また、ガラス繊維の間に結合剤として、ポリビニルアクリルアミド、ポリビニルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ゼラチンが含まれていてもよい。例えば、グラスファイバーシートの繊維間隙が１０μｍ程度の場合、すきまが網目状に無数に存在しているため、毛細管現象が生じやすく、キャピラリーのように一方向の筒状ではないので、キャピラリーより逆流は生じにくく、φ１０μｍのマイクロ流路チップよりもかなり大きな電気浸透流を得ることができること、グラスファイバーは加工容易なので、グラスファイバーのサイズや密度を調整することで、添加できるサンプル量や泳動時間をコントロールすること、などの利点を有する。
【００１９】
このようなガラス繊維から成るグラスファイバーシートをシート台に載せ、両端にバッファーを貯蔵できる槽のついた電気泳動用装置の両側の槽に渡すことによって、電気泳動装置を製造することができる。電気泳動用装置の材料は、合成樹脂、例えば、アクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ＰＤＭＳ、などからなっていても良いが、アクリルであることが好ましい。
【００２０】
このように、本電気泳動装置は、安価で容易に製造可能であり、使い捨てのチップとすることも可能である。
【００２１】
なお、グラスファイバーシートは、平らになるように、電気泳動用装置の両端の槽の間のシート台に熱接着することが好ましい。また、グラスファイバーシートは、熱接着した部位に、穴（ウエル）を有することが好ましく、熱接着されていることにより、電気泳動するためのサンプルや担持体等がウエルから外に漏れなくなるとともに、透明なため、光学的な検出用ウエルとして用いることができる。
【００２２】
＝＝電気泳動装置の使用＝＝
こうして製造された電気泳動装置において、ＴＡＥまたはＴＢＥなどの電気泳動用バッファーを槽に満たし、サンプル添加用のウエルにサンプルを滴下し、サンプルを流す方向に対し、上流を陽極、下流を陰極として、電圧を印加する。印加する電圧は、装置の大きさや泳動時間によって、適当に調節すればよいが、例えば、１〜５００Ｖが好ましく、１０〜２００Ｖがより好ましい。上記電気泳動用バッファーとしては、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン、リン酸、ホウ酸、酢酸、炭酸、アミノ酸、クエン酸等を含むバッファーあるいはグッドバッファーに、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤を添加したものを含む。
【００２３】
泳動する物質は、グラスファイバーシート内を移動できる大きさであれば構わない。前記対象物質としては特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、生体試料、食品等に含まれるタンパク質、ペプチド、遺伝子等が挙げられ、具体的には、例えば、インスリン、カゼイン、β―ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、グルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子；コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン；ジゴキシン、テオフィリン等の薬物；細菌、ウイルス等の感染性物質；肝炎抗体、ＩｇＥ、ソバの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２等の可溶性タンパク質等が挙げられる。また、泳動する物質は、物質全体として、正に帯電していても、負に帯電していてもかまわない。
【００２４】
＝＝電気泳動装置を利用した抗原抗体反応＝＝
上述したような電気泳動装置における抗原抗体反応を利用して、サンプル溶液中に目的の抗原があるかどうか、調べることができる。ここでは、その一例を記載する（図１）。
【００２５】
すなわち、電気泳動装置が電気泳動担体として備えるグラスファイバーシートは、標識された、検出対象の抗原に対する標識抗体を含む標識抗体部と、標識抗体部より陰極側に、グラスファイバーシート内を移動できない大きさの担持体に結合した、抗原に対する担持体結合抗体を含む標識検出部とを備え、標識抗体部と標識検出部の間に抗原を含み、グラスファイバーシートに電圧を印加して、検出抗体部で、標識抗体と、抗原と、担持体結合抗体の複合体を作成し、標識を検出することによって、その抗原を検出できる。
【００２６】
具体的には、まず、グラスファイバーシートを電気泳動担体として備える電気泳動装置において、標識検出部として検出用ウエルを設けておく。このウエルには、グラスファイバーシートの中を移動できない大きさの担持体に、検出対象とする抗原に対する抗体を結合させた担持体結合抗体、及び検出対象の抗原の入ったサンプル溶液を入れる。この担持体結合抗体及びサンプル溶液は、予め混合してから添加してもよく、別々に添加してもよい。一方、検出用ウエルの上流側（陽極側）に、抗原に対する標識抗体を添加し、抗原をグラスファイバーシートに浸み込ませる。その後、電圧を印加する（step1）と、標識抗体は、下流に移動し、検出用ウエル中の抗原に結合した標識抗体は、その検出用ウエルに捕捉され（step2）、抗原に結合しなかった標識抗体は、下流に流れる（step3）ので、検出用ウエルの中の標識を検出することにより、サンプル中に、対象の物質が存在したかどうかが判明する。
【００２７】
ここで、担持体は特に限定されないが、ポリスチレン、セファロース、ラテックスなどからなる樹脂ビーズ、金コロイドなどの金属コロイド、酸化チタン粒子などの無機酸化物粒子などが例示でき、その粒径は、１〜１０００μｍ、より好ましくは５〜５００μｍ、さらに好ましくは１０〜２００μｍである。担持体に結合させるための抗体と標識抗体のための抗体は、検出対象とする抗原に対する抗体であれば、同じであっても違っていてもよいが、異なるエピトープを認識する抗体が好ましく、例えば、少なくとも一方がポリクローナル抗体であったり、または両方が異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体であったりすることが好ましい。標識抗体の標識は、特に限定されないが、基質との反応がなくても容易に検出できるという点で、蛍光物質が好ましい。前記標識としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、ルシファーイエロー、カスケードブルー、フィコエリスリン、エオシン、ビオチン、ＧＦＰ等の蛍光物質；ルシフェラーゼなどの発光タンパク質；１２５Ｉ等の放射性同位元素；ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素等が挙げられる。
【００２８】
なお、抗原を添加する場所は、標識抗体部と標識検出部の間であれば制限されず、別の実施態様として、サンプル溶液を標識抗体と混合し、検出用ウエルの上流側（陽極側）の標識抗体部に、標識抗体とともに添加してもよい。この場合、抗原は、標識抗体と結合し、電圧の印加により、標識抗体に結合した状態で下流に流され、検出用ウエルで抗体結合担持体に捕捉されることになる。なお、サンプル溶液は、ウエル添加前に標識抗体と混合してもよいが、標識抗体と別々にウエルに添加し、ウエル内で混合させてもよい。
【００２９】
さらに別の実施態様としては、上流の標識抗体部に標識抗体を添加し、標識抗体部より下流で標識検出部より上流にある中流においてサンプル溶液を添加し、さらに下流の標識検出部に抗体結合担持体を準備し、電圧を印加すると、標識抗体は中流で抗原に結合し、さらに、標識検出部で抗体結合担持体に結合するため、標識検出部で抗原を捕捉し、検出することができる。
【００３０】
＝＝抗原抗体反応を利用した抗原の定量＝＝
さらに、このような抗原検出系を用いて、未知の濃度のサンプル溶液中の抗原を定量することができるので、以下、その方法を説明する。
【００３１】
まず、既知の濃度を有する抗原に対して、同様に標識を検出し、検出された標識の強度を用いて、標準曲線を作成する。一方、サンプル溶液中の抗原に対して、同様に標識を検出し、作成した標準曲線を用いて、その標識の強度を濃度に変換することによって、サンプル溶液中の抗原の濃度を算出できる。
【００３２】
ここで、標識の強度の定量方法は特に限定されないが、例えば、蛍光標識の場合、蛍光強度測定装置を用いてもよいが、手軽さという点で、蛍光顕微鏡で顕微鏡写真をとり、Image Jなどのソフトウエアを用いて、 色の平均の濃さや平均シグナル強度などを解析することによって蛍光強度を測定してもよい。
【００３３】
[実施例１] 電気泳動装置の作製
図２Ａのように、ガラス繊維等からなるFusion5（ＧＥヘルスケア製）を2×70×0.37mmの短冊状グラスファイバーシート１とし、ウエルとして生検トレパンでφ1.5mmの穴（組み立て後のウエル４に当たる）を開けた。一方、両端にくり抜いた部分２のあるアクリル板24×70×30mmと平らなアクリル板24×70×5mmを熱圧着して貼り合わせ、アクリル製電気泳動用装置３を作製した。２枚のガラス板の間に短冊状グラスファイバーシート１とアクリル製電気泳動用装置３をはさんで、１４０℃５分間、熱圧着することにより、短冊状グラスファイバーシート１とアクリル製電気泳動用装置３の両槽２の間の面であるシート台１０とを熱接着し、図２Ｂのような電気泳動装置を作製した。
【００３４】
[実施例２] 電気泳動
実施例１で製造した電気泳動装置（図２Ｂ）において、グラスファイバーシートをＴＢＥで濡らし、槽２もＴＢＥ５で満たした。ウエル４に０．１ｍｇ/ｍＬのDyLight488（Thermo scientific製）を標識した抗インスリン抗体（森永生科学研究所製）１μＬを入れ、１００Ｖの電圧をかけ、５分ごとに、蛍光顕微鏡で蛍光写真を撮影した。
【００３５】
その結果、図３に示すように、通常のアガロースゲル（左図）では、陰極から陽極に流れるため、蛍光標識抗体は、負に帯電していると考えられるが、それにも関わらず、グラスファイバーシートを電気泳動担体として用いた場合（右図）、蛍光標識抗体は、陽極から陰極に流れた。このように、蛍光標識抗体は、グラスファイバーシートの場合、電気浸透流を利用して流れていることがわかる。
【００３６】
[実施例３] 抗原抗体反応を用いた抗原の定量
実施例１で製造した電気泳動装置を用いて、抗原抗体反応を用いた抗原の定量をおこなった。抗インスリン抗体（森永生科学研究所製）を固定化したNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（ＧＥヘルスケア製）、及びインスリン標準品（０，１０，５０, １００ｎｇ／ｍＬ（ＰＢＳで希釈））（森永生科学研究所製）を等量ずつ混合し、５分室温で静置後、混合物１０μＬをウエル４に添加した。一方、DyLight488（Thermo scientific製）を標識した抗インスリン抗体（森永生科学研究所製）０．１ｍｇ/ｍＬ、１μＬをウエル４の上流側（陽極側）に添加した。電極をセットし、１００Ｖの電圧を印加し、２５分後にｃｃｄカメラ付蛍光顕微鏡で、下流側のウエルにおける蛍光写真を撮像した。各インスリン標準品に対し、そのデジタルイメージをImage Jの一機能である"mean grey value"を利用して、平均シグナル強度を測定し、抗原濃度と蛍光強度の相関を調べるためにグラフにプロットした。
【００３７】
図４に示すように、インスリン濃度と蛍光強度の間に相関関係があって、測定した範囲では、インスリン濃度と蛍光強度がほぼ比例関係にあった。従って、このようにして得られる標準曲線を用いれば、抗原濃度が未知のサンプルであっても、濃度を推定することが可能になる。
【符号の説明】
【００３８】
１    短冊状グラスファイバーシート
２    バッファー用槽
３    アクリル製電気泳動用装置
４    ウエル
５    ＴＢＥ
１０    シート台
【図１】
2015135237.tif 000003
【図２】
2015135237.tif 000004
【図３】
2015135237.tif 000005
【図４】
2015135237.tif 000006