(57)【要約】  液体に含まれる細胞を調製するユニット（１０）は、細胞を含む液体を貯蔵するとともに、所定の外力、特に遠心力が加わると、貯蔵した液体を出口開口部（２２）を通して放出するように構成された貯蔵室（２０）を含む。出口開口部（２２）に隣接して配された通路（３０）は、出口開口部（２２）よりも大きな断面を有する。出口開口部（２２）から通路（３０）に移行する部分の壁は、縁部（３２）を形成している。ユニットは、さらに、放出された液体を受ける観察部材（５０）と、通路（３０）と観察部材（５０）との間で、観察部材（５０）に隣接して配された吸収手段（４０）とを含む。吸収手段（４０）は、放出された液体が観察部材（５０）へと移動するのを許容する開口部（４２）を有し、観察のために観察部材（５０）上に細胞を残すように液体を取り除く。
2013515235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体に含まれる細胞および／または粒子を調製するユニット（１０）であって、
細胞および／または粒子を含む液体を貯蔵するとともに、所定の外力、特に遠心力が加わると、当該細胞および／または粒子を含む貯蔵した液体を、出口開口部（２２）を通して放出するように構成された貯蔵室（２０）と、
前記貯蔵室（２０）の出口開口部（２２）に隣接して配され、前記貯蔵室（２０）の出口開口部（２２）が通じる通路（３０）であり、前記出口開口部（２２）よりも大きな断面を有し、前記出口開口部（２２）から前記通路（３０）に移行する部分の壁が縁部（３２）を形成する通路（３０）と、
前記細胞および／または粒子を含む放出された液体を受ける観察部材（５０）と、
前記通路（３０）と前記観察部材（５０）との間で、前記観察部材（５０）に隣接して配された吸収手段（４０）であり、前記細胞および／または粒子を含む液体が前記観察部材（５０）へと移動するのを許容する開口部（４２）を有する吸収手段（４０）と、
を含み、
前記吸収手段（４０）は、観察のために前記観察部材（５０）上に前記細胞および／または粒子を残すように、前記観察部材（５０）上で前記細胞および／または粒子を含む液体からさらに液体を取り除くことを特徴とするユニット（１０）。
【請求項２】
前記出口開口部（２２）と前記通路（３０）との間の移行部分で、前記縁部（３２）の壁が９０度の角度（α）を含むことを特徴とする請求項１に記載のユニット（１０）。
【請求項３】
前記貯蔵室（２０）は、ドーム型または漏斗型部分（２５）と、当該ドーム型または漏斗型部分に隣接する円筒形状部分（２６）とを含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のユニット（１０）。
【請求項４】
前記貯蔵室（２０）は、前記細胞および／または粒子を含む液体を所定量収容するように構成され、前記所定量は、１μｌ〜１０００μｌ、特に１０μｌ〜１００μｌ、とりわけ５０μｌであることを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット（１０）。
【請求項５】
前記貯蔵室（２０）は、前記貯蔵室（２０）の前記出口開口部（２２）とは反対側の端部にベント開口部（２４）を含むことを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット（１０）。
【請求項６】
前記観察部材（５０）は、光学観察用のスライドガラスであることを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット（１０）。
【請求項７】
前記開口部（４２）を囲繞する前記吸収手段（４０）の部分は、前記液体を所定の速度で吸収するように、所定の厚さを有することを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載のユニット（１０）。
【請求項８】
前記開口部（４２）を囲繞する前記吸収手段（４０）の壁部は、前記観察部材（５０）側に予備曲げされており、ユニット（１０）を組み立てる際、この予備曲げ部分が前記観察部材（５０）に強固に取り付けられることを特徴とする請求項７に記載のユニット（１０）。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか一項に記載されたユニット（１０）を複数、個別に含む調製装置であって、当該個別のユニット（１０）が相互汚染しないように相互に分離されていることを特徴とする調製装置。
【請求項１０】
９６穴プレート（２００）または３８４穴プレートを含み、前記複数の個別のユニット（１０）の貯蔵室（２０）は、当該９６穴プレートまたは３８４穴プレートの穴によってそれぞれ形成されることを特徴とする請求項９に記載の調製装置。
【請求項１１】
前記個別のユニット（１０）の観察部材（５０）を形成する観察プレート（５００）をさらに含むことを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の調製装置。
【請求項１２】
前記個別のユニット（１０）の吸収手段（４０）を形成する第１（４００）および第２（４０２）吸収シートをさらに含み、当該第１吸収シート（４００）が、前記観察プレート（５００）に直接隣接し接触して配され、当該第２吸収シート（４０２）が、前記観察プレート（５００）から離れた面で、前記第１吸収シート（４００）に直接隣接し接触して配され、前記第２吸収シート（４０２）は、前記第１吸収シート（４００）の吸収能力に加えて吸収能力を有することを特徴とする請求項１１に記載の調製装置。
【請求項１３】
前記個別の吸収手段（４０）を前記個別の観察部材（５０）に強固に取り付けるため、前記個別のユニット（１０）にそれぞれ圧縮力を付与するバネプレート（６００）をさらに含むことを特徴とする請求項９から請求項１２のいずれか一項に記載の調製装置。
【請求項１４】
前記バネプレート（６００）は、前記個別のユニット（１０）の個数に応じて複数の螺旋状バネ（６０４）を含み、各螺旋状バネ（６０４）が各個別のユニット（１０）に作用することを特徴とする請求項１３に記載の調製装置。
【請求項１５】
液体に含まれる細胞を調製するための方法であって、
非接着性細胞を含む液体を貯蔵室（２０）に供給するステップと、
接着力および／または表面張力のみにより、前記貯蔵室（２０）内の前記非接着性細胞を含む液体を重力に抗して保持するステップと、
前記液体を前記貯蔵室（２０）から観察部材（５０）上に放出するため、前記非接着性細胞を含む液体に対して、さらに所定の外力、特に遠心力を加えるステップと、
前記観察部材（５０）から前記液体を取り除き、観察のために前記非接着性細胞を前記観察部材（５０）上に残すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記細胞が堆積した前記観察部材（５０）上に、ヒドロゲルを含む被膜を塗布するステップをさらに含み、前記ヒドロゲルは、前記細胞に特有の成分に結合可能で、所定波長の光で励起する際に蛍光を放つ少なくとも一種類の染色剤を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載された方法を用いて前記細胞を調製するステップと、
当該調製された細胞を顕微鏡の下にセットするステップと、
顕微鏡画像を解析するステップと、
を含むことを特徴とする細胞の顕微分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中に含まれる、接着性または非接着性の細胞および／または粒子の調製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
液体中に含まれる生物学的細胞を観察するため、調製ユニットが製薬産業では周知である。例えば、このような調製ユニットは、米国・ウォルサム・ワイマンストリート８１のサーモフィッシャーサイエンティフィック社から"シャンドンＥＺシングルサイトファンネル（Shandon EZ Single Cytofunnel）"の商品名で入手可能である。このユニットは、貯蔵室と、フィルタカードと、光学スライドガラスとを含む。
【０００３】
対応するフィルタカードは、極めて吸収性の高い材料から構成され、中央に穴を有している。通常、フィルタカードはスライドガラスに隣接して配され、フィルタカードの穴がスライドガラス上に堆積領域を画定する。その結果、堆積領域はフィルタカードの極めて吸収性の高い材料によって包囲される。
【０００４】
最初に、細胞を含む液体がスライドガラスから離れた貯蔵室内に保持される。調製ユニットを専用の遠心分離機、例えば、シャンドンサイトスピン４サイトセントリフュージ（Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge）に載置した後、所定の速度で調製ユニットを回転させると、回転動作により調製ユニットが傾き、細胞を含む液体がフィルタカードの穴を通して、貯蔵室からスライドガラス上の堆積領域へと放出される。細胞を含む液体が堆積領域に達すると、フィルタカードの極めて吸収性の高い材料によって液体が除かれ、スライドガラスの堆積領域に細胞が残される。その後、プレートガラスを調製ユニットから分離して、プレートガラスを細胞の顕微鏡観察へと送ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した遠心分離機は、１２個の調製ユニットを同時に処理することができるが、より効果的且つ効率的な調製ユニットおよび／または調製装置が望ましい。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、液体に含まれる細胞および／または粒子を非常に効果的で確実且つ高品質に調製するための調製ユニット、調製装置および調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、この課題は、各独立請求項に記載された調製ユニット、調製装置、および方法によって解決される。本発明による調製ユニットおよび調製装置のさらなる実施形態は、従属請求項に詳述される。
【０００８】
特に、本発明は、細胞および／または粒子を含む液体を貯蔵するとともに、所定の外力、特に遠心力が加わると、当該細胞および／または粒子を含む貯蔵した液体を、出口開口部を通して放出するように構成された貯蔵室を含む、液体に含まれる細胞および／または粒子を調製するユニットを提案する。通路が貯蔵室の出口開口部に隣接して配されており、貯蔵室の出口開口部は通路に通じている。通路は出口開口部よりも大きな断面を有する。出口開口部から通路に移行する部分では、壁が縁部を形成している。ユニットは、さらに前記細胞および／または粒子を含む放出された液体を受ける観察部材と、通路と観察部材との間で、観察部材に隣接して配された吸収手段とを含む。吸収手段は、前記細胞および／または粒子を含む液体が観察部材へと移動するのを許容する開口部を有する。吸収手段は、観察のために観察部材上に細胞および／または粒子を残すように、観察部材上で前記細胞および／または粒子を含む液体からさらに液体を取り除く。本発明による調製ユニットは、細胞、特に非接着性細胞または液体にもともと含まれる他の粒子を、費用効率がよく、信頼性が高く、且つ高品質に調製するための小型で単純な構成のユニットである。
【０００９】
液体は、さらに外力を加えることなく、液体に作用する重力に抗して垂下した状態で貯蔵室内に貯蔵される。これは、貯蔵室またはその出口開口部の適切な形状によって好適に影響を受ける接着力および／または表面張力によって実現される。したがって、液体が貯蔵室内に確実に保持され、貯蔵室から液体を放出する前に、液体が吸収手段と自由に接触することが防止される。
【００１０】
加えて、細胞および／または粒子の注意深い処理が確実に行われる。調製の間に損傷することを減少または完全に防止することで、細胞の死亡率および／または粒子の変形を減少させることができる。さらに、細胞の閉塞を回避することで、多数の調製に対して高度に再現性のある結果を提供することができる。このようなことは、複数の調製ユニットがマルチウェルプレート（multi-well plate）によって提供され、細胞または粒子を含む様々な液体の処理を平行して行う場合には、特に有益である。
【００１１】
加えて、本発明による調製ユニットを使用すると、均一の条件下で貯蔵室内に保持された液体の中で、細胞および粒子を沈殿させることができる。この沈殿物は、細胞および粒子を有する液体を放出する間、乱されない状態に維持される。したがって、堆積領域上で得られた細胞分布は、非常に均質となる。均質な分布は、良好な観察条件を提供するので、特に自動画像解析には有益である。
【００１２】
例として、本発明によるユニットは、製薬産業で細胞および／または粒子の調製に使用することができる。
【００１３】
接着力および／または表面張力による貯蔵室内での液体保持力は、貯蔵室の出口開口部に配された縁部によって、強化される。その結果、貯蔵室がどのような向きであっても、さらに外力を加えることなく、液体を貯蔵室内で確実に保持することができる。
【００１４】
遠心分離処理は、接着剤化学薬品の使用を回避できるので、非接着性細胞を観察室に付着させるには特に有益である。接着剤化学薬品は、例えば、細胞間マトリックスタンパク質との相互作用により、潜在的に細胞の誘導状態を変更するリスクをはらんでいる。
【００１５】
本発明によるユニットの第１実施形態では、出口開口部と通路との間の移行部分で、縁部の壁が９０度の角度を含む。このような移行部分は製造が容易である。しかしながら、例えば、互い違いの形状や９０度以外の角度を含む縁部など、他の形状の移行部分も可能である。
【００１６】
液体の特性と縁部を形成する壁の材料特性が優れた相性を示すように、角度の大きさを決めてもよい。例えば、高いクリープ特性（high creeping capability）を有する液体では、縁部がピーク、すなわち９０度未満の角度を含む形状を有していてもよい。
【００１７】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、貯蔵室は、ドーム型または漏斗型部分と、当該ドーム型または漏斗型部分に隣接する円筒形状部分とを含む。本発明による調製ユニットの別の実施形態では、貯蔵室は、前記細胞および／または粒子を含む液体を所定量収容するように構成され、所定量は、１μｌ〜１０００μｌ、特に１０μｌ〜１００μｌ、とりわけ５０μｌである。これは、少量の液体製剤を処理する製薬産業において典型的に用いられる量である。
【００１８】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、貯蔵室は、貯蔵室の出口開口部とは反対側の端部にベント開口部を含む。これにより、遠心分離の間、貯蔵された液体を貯蔵室から注意深く均等に放出することができる。液体が放出されて残ったスペースは、ベント開口部を通して、例えば、空気などの気体で満たされる。したがって、不均一または不注意な液体の放出によって、液体に含まれる細胞または粒子に悪影響を及ぼすことを防止できる。
【００１９】
さらに、貯蔵室を充填するため、好適にはこのベント開口部を通して、細胞および／または粒子を含む液体を貯蔵室に供給することができる。これは、特に、細胞および／または粒子を有する液体が入ったピペットの開口端部を、ベント開口部を囲繞する壁の上に載せて、次に、液体がベント開口部を通して貯蔵室側へと移動するように、ピペットに入っている液体に圧力を加えることで実現される。貯蔵室の壁が液体によって湿るのにつれて、細胞および／または粒子を含む液体は、貯蔵室内に吸い込まれる。調製ユニットは、貯蔵室を吸収手段および／または観察部材と組み合わせることで事前に組み付けてもよく、分注ロボット（pipetting robot）により、貯蔵室に液体を充填してもよい。しかしながら、貯蔵室の充填はベント開口部を通して行うことが好適であるが、反対側の端部から貯蔵室を充填することも可能である。
【００２０】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、観察部材は光学観察用のスライドガラスである。特に、光学観察用の当該スライドガラスは、例えば、顕微鏡スライドガラス等の透明なスライドガラスであり、コーティングされているものでもコーティングされていないものでもよい。
【００２１】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、吸収手段が濾紙を含む。濾紙は高い吸収能力を備えて、比較的安価である。もちろん濾紙以外の吸収手段も使用することができる。
【００２２】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、開口部を囲繞する吸収手段の部分は、前記液体を所定の速度で吸収するように、所定の厚さを有する。吸収速度は、細胞および／または粒子が吸収手段に向かってその内部に移動する液体と共に引きずられて吸収されてしまうのではなく、観察部材上に堆積するように制御することができるパラメータである。
【００２３】
吸収手段は、開口部と直接隣接する内部領域と、内部領域の周囲の外部領域とを有する段差形状を有し、吸収速度を制御するように内部領域で吸収手段が圧縮され、外部領域では吸収手段は圧縮されずに高い吸収能力を有しているものでもよい。これにより、吸収速度を制御することと、多量の液体を取り除くことが可能になり、ユニットを隣接して配置する場合には、さらに相互汚染を防止することができる。
【００２４】
好適には、開口部に隣接する吸収手段の表面は、平坦、平面、均一または円滑であり、観察部材の開口部、すなわち細胞が堆積する領域内に繊維が漏出することがない。これにより、調製工程の高い再現性が得られる。
【００２５】
貯蔵室の出口開口部が通じる通路は別の縁部を形成し、ユニットを組み立てる際、当該縁部が観察部材に対して吸収手段を押圧して、吸収手段と観察部材との間の間隙を防止するように形作られてもよい。これにより、細胞および／または粒子が観察部材の堆積領域から漏れることを防止し、隣接して配置されたユニットの間での相互汚染も防止できる。
【００２６】
本発明による調製ユニットの別の実施形態では、開口部を囲繞する吸収手段の壁部は、観察部材側に予備曲げされており、ユニットを組み立てる際、この部分が観察部材に強固に取り付けられる。このような構成により、観察部材と吸収手段との間に間隙ができることを回避できる。
【００２７】
本発明は、さらに、上述した調製ユニットを複数、個別に含む調製装置を提案し、当該個別のユニットは、相互汚染しないように相互に分離されている。このような装置では、平行して多数の調製を行うことができ、細胞および／または粒子に対する自動化された高速の調製、観察および／または分析を行うことが可能となる。
【００２８】
本発明による調製装置の一実施形態は、９６穴プレートまたは３８４穴プレートを含み、複数の個別のユニットの貯蔵室は、当該９６穴プレートまたは３８４穴プレートの穴によってそれぞれ形成される。これは、個別のユニットの貯蔵室が、規格化された穴間距離と、規格化された設置面積を有するコンパクトで標準的なウェルプレート（well-plate）に組み合わされ、このようなマルチウェルプレート用の標準機器により非常に効率的に取り扱うことができるという点で有益である。例えば、このようなプレートの個別の穴のすべての貯蔵室を同時に充填することができる。
【００２９】
別の実施形態では、本発明による調製装置は、個別のユニットの観察部材を形成する観察プレートを含む。したがって、個別のユニットの観察部材は一緒に扱われ、自動画像解析を通して効率的な観察が行える。
【００３０】
別の実施形態では、本発明による調製装置は、個別のユニットの吸収手段を形成する第１および第２吸収シートを含み、当該第１吸収シートが、観察プレートに直接隣接し接触して配され、当該第２吸収シートが、観察プレートから離れた面で、第１吸収シートに隣接し接触して配されている。第２吸収シートは、第１吸収シートの吸収能力に加えて吸収能力を有する（例えば、第２吸収シートの吸収能力は、第１吸収シートの吸収能力よりも高くすることができる）。これにより、吸収する液体の全量を増加して、個別の調製細胞の相互分離を改善できるので、相互汚染のリスクを低減することができるという利点を有する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明による調製装置は、個別の吸収手段を個別の観察部材に強固に取り付けるため、個別のユニットにそれぞれ圧縮力を付与するバネプレートを含む。圧縮力により観察部材に対して吸収手段を強固に押圧し、間隙（上記参照）を防止する。また、圧縮することで、第１吸収シートの厚さのバラツキを補正することができる。
【００３２】
本発明による調製装置の別の実施形態では、バネプレートは、個別のユニットの個数に応じて複数の螺旋状バネを含む。各螺旋状バネは、各個別のユニットに作用する。この結果、個別の圧縮力が各個別の調製ユニットに加えられ、各吸収手段が介在した状態で、観察プレートの個別の部分を個別の貯蔵室側へと押圧する。螺旋状のバネは、例えば、円錐形でもよい。
【００３３】
本発明は、さらに、液体に含まれる細胞（それに限定されないが、特に非接着性細胞）を調製するための方法であって、細胞を含む液体を貯蔵室に供給するステップと、接着力および／または表面張力のみにより、貯蔵室内の細胞を含む液体を重力に抗して保持するステップと、液体を貯蔵室から観察部材上に放出するため、前記細胞を含む液体に対して、さらに所定の外力、特に遠心力を加えるステップと、観察部材から前記液体を取り除き、観察のために細胞を観察部材上に残すステップとを含む方法にも関する。
【００３４】
さらに所定の外力、特に遠心力を加えることで、細胞が観察部材の表面に付着する。加えて、前記力を加えることで細胞は平坦になり、細胞内の構造体は、多くの場合、相互に上下に隣接するよりも、相互に横方向に隣接する状態になる。顕微鏡画像は三次元細胞構造を実質的に二次元投影したものであるので、これにより細胞構造の顕微分析が改善される。これは、細胞がさらされた物質が、当該細胞の構造またはエンドソーム、ミトコンドリア、核または小核等の成分に及ぼすかもしれない遺伝毒性効果の測定に特に関連する重要性がある。
【００３５】
観察部材上に細胞が堆積した後、細胞を乾燥させ、顕微分析を行うことが可能であるが、本発明による調製方法の一実施形態は、さらに、細胞が堆積した観察部材上に、ヒドロゲルを含む被膜を塗布するステップを含む。ヒドロゲルは、前記細胞に特有の成分に結合可能な少なくとも一種類の染色剤を含む。前記細胞に特有の成分に結合する染色剤は、所定波長の光で励起させると蛍光を放つが、そのような特有の細胞成分と結合しない限り蛍光を放つことはない。
【００３６】
例として、ヒドロゲルは、観察部材上に堆積した細胞を湿潤状態に維持するアガロースヒドロゲルでもよい。ヒドロゲルは、観察部材（例えば、顕微鏡スライドガラス）または上述した観察プレート上に堆積した細胞の形態を維持することに関して有益である。上述したアガロースヒドロゲル等のヒドロゲルは、室温でゼラチンと同様の状態、つまり、実質的に固体である。ヒドロゲルは、細胞が乾燥することを防止するとともに、細胞が汚染されることを防止する。しかしながら、染色剤の分子のように小さな分子は、ヒドロゲル内を実質的に自由に移動可能であり、ヒドロゲルを介して細胞内に拡散し、そこで、例えば、核、小核、その細胞に特有の他の成分またはその細胞の境界等、特有の細胞成分と結合する。
【００３７】
この実施形態は、観察部材上に堆積した細胞に染色剤を塗布して、顕微分析のために顕微鏡の下に染色した細胞と共に観察部材をセットする前に、細胞内に拡散していない過剰の染色剤を観察部材から洗い流すこととは対照的に、染色剤は既にヒドロゲルに含有されており、過剰の染色剤を洗い流す必要なく細胞内に拡散するので、洗い流すステップを完全に省略することができる点で有益である。
【００３８】
したがって、本発明の別の態様は、本発明による上述した調製方法を用いて細胞を調製するステップと、所定の波長の光で細胞を照射するステップと、当該調製された細胞を顕微鏡の下にセットするステップと、顕微鏡画像を解析するステップとを含む細胞の顕微分析方法に関する。
【００３９】
細胞内に拡散し、細胞に特有の成分に結合している染色剤のみが、所定波長の光で照射後に蛍光性を示す。例えば、染色剤は、核に結合または潜在的に細胞の小核にも結合可能に構成されてもよい。したがって、顕微分析の前に細胞がさらされる特定の物質が遺伝毒性を有することを示す指標となるかもしれない小核の形成を判定することができる。
【００４０】
染色剤を追加し、追加した染色剤が細胞内に拡散し、細胞の境界に結合する場合、細胞をさらに所定波長の光で照射すると、当該追加した染色剤も蛍光性を示し、細胞の境界と細胞内の特有の構造が明確に視認できるので、顕微鏡画像のコントラストを強調させることができる。
【００４１】
以下、例示的な実施形態により、添付の図面を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明による個別の調製ユニットの実施形態を示す断面図。
【図２】本発明による調製装置の実施形態を示す分解斜視図。
【図３】図２に示す調製装置の側面図。
【図４】図３のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図。
【図５】図４の細部Ｖの拡大図。
【図６】図４の細部ＶＩの拡大図。
【図７】図２の細部ＶＩＩの拡大図。
【図８】図２に示す調製装置を組み立てた状態を示す側面図。
【図９】図８のＩＸ−ＩＸ線に沿った断面図。
【図１０】図９の細部Ｘの拡大図。
【図１１】図２に示す調製装置を組み立てた状態を示す斜視図。
【図１２】細胞が堆積し、染色剤を含有するヒドロゲルによって被覆された、図２に示す装置の観察プレートの詳細図。
【図１３】本発明による装置および方法を用いて調製された非接着性細胞の実例画像。
【図１４】本発明による装置および方法を用いて行った小核試験の分析結果の実例。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
図１は、本発明による、液体に含まれる細胞および／または粒子を調製する個別のユニットの実施形態の断面図を示す。
【００４４】
調製ユニット１０は、細胞懸濁液を貯蔵するための貯蔵室２０を含む。貯蔵室２０は、ドーム型または漏斗型部分２５と、当該ドーム型部分２５に隣接する円筒形状部分２６を含む。貯蔵室２０は、所定量の細胞懸濁液を収容するように構成されてもよく、所定量は、通常、１μｌ〜１０００μｌ、特に１０μｌ〜１００μｌ、とりわけ５０μｌである。ドーム型部分２５から遠い方の端部で、貯蔵室２０は出口開口部２２を含む。貯蔵室２０は、さらにドーム型部分２５に通じるベント開口部２４を含む。
【００４５】
円筒形状通路３０は、貯蔵室２０の出口開口部２２に隣接して配されている。通路３０は、出口開口部２２の断面よりも大きい断面を有する。特に、通路３０は、貯蔵室２０の出口開口部２２と同軸に整列している。出口開口部２２から通路３０に移行する部分では、壁が縁部３２を形成する。この実施形態では、縁部３２は、９０度の角度αを含む。
【００４６】
濾紙４０として例示する吸収手段４０は、貯蔵室２０の出口開口部２２から離間した側で、通路３０に隣接して配される。濾紙４０は、方眼紙またはクロマトグラフィー用ペーパー、特に、英国・ロンドン・ブレントフォードにあるワットマン社（Whatman Ltd）から市販されているグレード１７Ｃｈｒペーパーを使用できる。濾紙４０は開口部４２を有する。開口部４２は円筒形状通路３０と同軸に配されている。
【００４７】
スライドガラス５０として例示する観察部材５０は、濾紙４０が通路３０とスライドガラス５０の間に配置されるように、濾紙４０に隣接して配される。さらに、調製ユニット１０の通路は、濾紙４０に隣接して配される別の縁部３４を形成するように形作られる。縁部３４は濾紙４０をスライドガラス５０側に押圧し、濾紙４０とスライドガラス５０との間に間隙が形成されることを防止する。
【００４８】
部分２５および２６は、重力以外の外力が加わらない限り、液体と液体に含まれる細胞を含む細胞懸濁液を貯蔵する貯蔵室２０の内部中空スペースを形成する。この点について、縁部３２は、接着力および／または表面張力に関連して、重力に抗して貯蔵室２０内に細胞懸濁液を保持することを助長する。しかしながら、所定の遠心力を加えると、細胞懸濁液は出口開口部２２を通して貯蔵室から放出される。その後、ベント開口部２４を通して貯蔵室２０内に空気を流し、細胞懸濁液が放出されて残った空きスペースを空気が満たしてもよい。ベント開口部２４を囲繞する壁の上にピペットの端部を載せ、（例えば、ピペットを絞ることで）ピペット内の細胞懸濁液に所定の圧力を加えることで、ベント開口部２４を用いて貯蔵室２０内に細胞懸濁液を充填することもできる。その結果、細胞懸濁液がベント開口部２４を通って、貯蔵室２０の拡径するドーム型部分へ、さらには円筒部分２６内へと引き込まれることになる。
【００４９】
通路３０と開口部４２により、貯蔵室２０から放出された細胞懸濁液は、貯蔵室２０からスライドガラス５０へと移動する。スライドガラス５０は、開口部４２を介して、放出された細胞懸濁液を受ける役割を果たす。濾紙４０の開口部４２は、細胞懸濁液から液体を取り除き、スライドガラス５０上に細胞を堆積したままにするため、受け取った細胞懸濁液と接触するように構成される。液体の吸収速度は、開口部４２を囲繞する濾紙４０の部分の高さによって制御することができる。液体が吸収され、細胞がスライドガラス５０上に堆積すると、例えば、顕微鏡またはプレートリーダなどの画像装置にスライドガラス５０を移動することができる。
【００５０】
図２は、本発明による調製装置の実施形態の分解斜視図を示す。この調製装置は、異なるプレートおよびシートのスタック、すなわち下から上に並ぶ順番で、ベースプレート７００、バネプレート６００、中間プレート６０２、観察プレート５００（例えば、プレートガラス）、第１吸収シート４００（例えば、第１フィルタシート）、第２吸収シート４０２（例えば、第２フィルタシート）、ウェルプレート２００（例えば、ファンネルプレート）およびカバープレート７０２を含む。
【００５１】
調製装置は、９６個の個別のユニット１０（図１参照）を含む。ウェルプレート２００は貯蔵室２０と通路３０とを含み、第１吸収シート４００は吸収手段４０を含み、観察プレート５００は観察部材５０を含む。
【００５２】
中間プレート６０２は、バネプレート６００の個別のバネによって個別の調製ユニット１０に作用する異なる圧力を調整する役割を果たす。さらに、中間プレート６０２は、バネプレート６００のバネ６０４（図７の細部ＶＩＩも参照）による観察プレート５００の引掻き傷を防止する。
【００５３】
ベースプレート７００は、組立て時にプレートのスタックを正しく整列させることを補助する複数のペグ７０６を含む。これらのペグ７０６は、バネプレート６００およびウェルプレート２００の対応する穴と係合する。さらに、組み立てられ、圧縮されたスタックをコンパクトな調製装置として纏めて保持するのに好適な留め具７０４が図示されている。この目的のため、留め具７０４はＵ字形状であり、２つの折り曲げられた縁部は、ベースプレート７００およびカバープレート７０２の側壁に設けられた溝に係合するように構成されている。
【００５４】
図３は図２の調製装置の側面図を示し、図４は同一の参照番号を参照して、図３のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図を示す。ウェルプレート２００の一部を示す細部Ｖを図５に拡大して示し、第１吸収シート４００の一部を示す細部ＶＩを図６に拡大して示す。これらの部分については、以下でより詳細に説明する。
【００５５】
図５は、図３に示すウェルプレート２００の細部Ｖの拡大図を示す。細部Ｖは、ウェルプレート２００における９６個の個別の調製ユニットのうち２つの部分を示す。個別のユニットの各部分は、個別の細胞懸濁液を個別に貯蔵および放出するため、貯蔵室２０と、通路３０とを含む。
【００５６】
図６は、図３に示す第１吸収シート４００の細部ＶＩの拡大図を示す。この詳細は、吸収シート４００の９６個の個別のユニットのうち、吸収シート４００により囲繞される開口部４２を含む１つの完全なユニットを示す。吸収シート４００は、開口部４２を囲繞する領域に段差形状の断面を有し、段差形状の内部領域４４は、開口部４２を囲繞して薄い厚さを有し、段差形状の外部領域４５は、内部領域４４を囲繞して、内部領域４４よりも厚い厚さを有している。内部領域４４の薄い厚さは、吸収シート４００を圧縮することで得ることができる。このように圧縮することで、液体の吸収速度を所望の速度に調節することができる。外部領域４５は、取り除く液体に対して高い吸収能力を有するように圧縮しないままにする。
【００５７】
図７は、図２に示すバネプレート６００の細部の拡大図で、２つの螺旋状バネ６０４を示す。螺旋状バネ６０４は、バネプレート６００と中間プレート６０２の間に配される。各螺旋状バネ６０４は、個別のユニット１０（図１参照）に作用する。したがって、各バネ６０４の力により、中間プレート６０２の対応する領域に個別の圧力を付与し、その圧力によって観察プレート５００の対応する領域に圧力を付与して、観察プレート５００が個別の貯蔵室２０を含むウェルプレート２００側に押圧される。
【００５８】
螺旋状バネ６０４は、大径のバネ巻部がバネプレート６００に隣接して配され、当該巻部の直径が中間プレート６０２側に向かって減少するような円錐形でもよい。
【００５９】
図８は、図２の調製装置を組み立てた状態の側面図を示し、図９は、図８のＩＸ−ＩＸ線に沿った断面図を示す。２つの留め具７０４（一方のみを図示する）は、組み立てられ、圧縮されたプレートおよびシートのスタックをコンパクトな調製装置として纏めて保持している。これは、ベースプレート７００およびカバープレート７０２の側壁に設けられた溝に係合する、各留め具７０４の２つの折り曲げられた縁部によって実現される。調製装置の細部Ｘを図１０に示し、さらなる詳細を以下に説明する。
【００６０】
図１０は、図９に示す調製装置の細部Ｘの拡大図を示し、特に、この細部は、２つの完全に組み立てられた調製ユニット１０を示す。第２吸収シート４０２は、第１吸収シート４００の観察プレート５００からは遠い方の面に隣接および接触して配される。第２吸収シート４０２は、第１吸収シート４００の吸収能力よりも高い吸収能力を有する。これにより、吸収シートによって吸収できる液体の総量が増加し、個別の調製細胞の相互分離を改善して、相互汚染のリスクを減少することができる。
【００６１】
図１１は、図２の調製装置を組み立てた状態の斜視図を示し、スタックは、２つの留め具７０４（一方のみを図示する）により纏めて固定されたベースプレート７００とカバープレート７０２を含む。組み立てた状態では、調製装置は非常にコンパクトで堅牢であり、容易に遠心分離機に載置できる。この実施形態では、調製装置は標準的な設置面積を有している。したがって、従来の遠心分離機、例えば、「シャンドンサイトスピン４サイトセントリフュージ（Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge）」に何ら変更を加えることなく、調製装置をセットすることができる。
【００６２】
図２から図１１に示す調製装置は、相互汚染を防止するため相互に分離された複数の個別のユニット１０を含み、そのため、平行して多数の調製作業を行うのに適している。ウェルプレート２００は、規格化された穴間距離と、規格化された設置面積を有しコンパクトに、個別のユニット１０の貯蔵室２０および通路３０を提供する。観察プレート５００は、観察部材５０を一緒に扱うことで、自動画像解析を通して効率的な観察が行えるように、個別のユニット１０の観察部材５０を提供する。第１吸収シート４００は、観察プレート５００から液体を取り除くものの、吸収の間に細胞が液体と共に引きずられて失われるのを防止するように、制御された吸収速度で液体を取り除く一次手段としての役割を果たす。第２吸収シート４０２は、液体を取り除く際に第１吸収シート４００を補助し、個別の調製ユニットの相互分離を改善する役割を果たす。
【００６３】
中間プレート６０２は、バネプレート６００のバネ６０４により付与される個別の圧縮力を均一に分配し、バネ６０４による観察プレート５００の引掻き傷を防止する役割を果たす。バネプレート６００は、ベースプレート７００、カバープレート７０２および留め具７０４によって、コンパクトで堅牢に纏めて保持されたプレートおよびシートのスタックに圧縮力を付与する役割を果たす。ペグ７０６は、組立て時にプレートのスタックを正しく整列させる役割を果たす。圧縮力を増加することが望ましい場合には、残りのスタックを変更せずに追加のスペーサプレートを挿入（したがって、バネプレート６００のバネの圧縮を増加）してもよい。組み立てられた調製装置全体を、標準的な遠心分離機内に設置することで、複数の細胞調製を同時に行うことができる。
【００６４】
上述したように、観察部材または観察プレート上にそれぞれ堆積した細胞に、一つまたはそれ以上の染色剤を含むヒドロゲルを塗布することは有益である。ヒドルゲルは、細胞に特有の成分と結合することが可能な、少なくとも１つの染色剤を含んでもよい。例えば、ヒドロゲルはアガロースヒドロゲルで、２つの染色剤を含み、一方が細胞に特有の成分または細胞の構造、例えば、核または小核と結合し、他方の染色剤は細胞の境界と結合するように構成される。特有の成分または構造或いは細胞の境界とそれぞれ結合する際、各染色剤は、それぞれ所定波長の光で励起されると蛍光を放つが、そのような特有の細胞成分、構造または境界と結合しない限り蛍光を放つことはない。
【００６５】
アガロースヒドロゲルは、観察部材上に堆積する細胞を湿潤状態に保つので、それぞれ観察部材または観察プレート上に堆積した細胞の形態を維持することに関して有益である。上述したアガロースヒドロゲル等のヒドルゲルは、室温でゼラチンと同様の状態、つまり、実質的に固体である。これにより、細胞が乾燥することを防止するとともに、細胞が汚染されることが防止される。しかしながら、染色剤の分子のように小さな分子は、ヒドロゲル内を実質的に自由に移動可能であり、ヒドロゲルを介して細胞内に拡散し、そこで、例えば、核、小核、他の細胞に特有の成分または細胞の境界等、特有の細胞成分と結合する。
【００６６】
細胞５０１が堆積し、染色剤を含有するヒドロゲル５０２によって被覆された観察プレート５００の詳細を図１２に概略的に示す。このように準備された観察プレート５００は、染色剤が細胞５０１内に拡散して、核および潜在的な小核および細胞の境界にそれぞれ結合するように、所定時間貯蔵することができる。その後、細胞を顕微分析して、細胞および細胞構造の高コントラストの顕微鏡画像を得ることもできる。
【実施例】
【００６７】
この方法のより詳細な実施例を以下に説明する。
【００６８】
細胞培養
「Ｌ５１７８Ｙｔｋ+/-」タイプのマウスリンパ腫細胞（Mouse lymphoma cells）を、Ｔ−１７５フラスコ内で、１０％の馬不活性血清（horse inactivated serum）、２ｍＭのＬ-グルタミン酸、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（pen/strep antibiotics）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（すべての培地は、米国・カリフォルニア州・カールスバッドのライフテクノロジーズコーポレーションより市販されている）の懸濁液中で、７５％のコンフルエンシー（密集度）および９５％の生存率まで成長させる。
【００６９】
混合物のインキュベーション
混合物は、米国・ニュージャージー州のベクトン・ディッキンソン社から市販されている「ファルコン３５３０７７（Falcon 353077）」タイプの９６穴プレートで、６０μｌの生育培地で８０００個の細胞を用いて、３７℃で２４時間、５％のＣＯ２の条件でインキュベーションを行う。混合物は、ジメチルスルホキシドＤＭＳＯ中（場合によっては水中）に溶解され、最終的なＤＭＳＯ濃度は１％となる。陽性対照として、１５μｇ／ｍｌのメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）を使用した。
【００７０】
細胞の遠心分離と固定
ドイツ・イエナのサイバイオ株式会社（CyBio AG）から市販されている「サイビーウェル（CyBi-well）」タイプの自動分注器の９６個のヘッドを用いて、２５０μｌのピペット先端部で５回攪拌した後、細胞懸濁液のうち５０μｌをインキュベーションプレートから反転したファンネルプレートの室部（図４および図５に示すウェルプレート２００の室部２０を参照）に移動させる。
【００７１】
細胞調製装置は、実質的に図２に示すように組み立てられる。同じ強さの９６個の螺旋状バネを含むバネプレート６００を、フレームのベースプレート７００の上に載置し、保護目的のため、薄くて柔軟な金属製の中間プレート６０２で被覆する。次に、積層した組立体のうち、専用のプレートガラス５００が、細胞を受ける観察プレートとしての役割を果たす。このプレートガラスは、ドイツ・イエナのショット・テクニカル・ガラス・ソリューションズ・ゲーエムベーハー（Schott Technical Glass Solutions GmbH）社から市販されている「ネクステリオン（Nexterion）」プレートガラスでもよい。それぞれＳＢＳ規格間隔（SBS-standard spacing (SBS = Society for Biomolecular Science)）で９６穴を有する、２つの有孔濾紙プレート４００および４０２を用いる。プレートガラス５００と接触する第１フィルタプレート４００は、９６個の各試料スポット（３．５ｍｍ直径の穴）の境界を形成し、遠心分離の間、懸濁液から培地を取り除く。所定の速度で均質かつ等方性の液体の除去を実現するため、フィルター材料を各穴の周囲でリング形状で０．５ｍｍの厚さに押圧した。第１フィルタプレート４００上で緩く接触して位置する第２フィルタプレート４０２は、第１フィルタプレート４００の保持能力を増加させ、反転したファンネルプレート２００の縁部３２にぴったり合うように、大きな穴（直径７．０ｍｍ）を含む。細胞懸濁液で満たされたファンネルプレート２００は、第１フィルタプレート４００の上に注意深く載置され、第２フィルタプレート４０２の穴に篏合する。この組立体は、調製装置のカバープレートを被せることで完成する。手動てこプレスによって予圧して、実質的にスペースを取らない側面から２つの金属ブラケット７０４を用いて調製装置を固定することで、装置全体が、例えば、ドイツのヘレウス社から市販されている「マルチフュージ（Multifuge）１Ｓ」等の市販の遠心分離機のマイクロタイタープレートバケットに篏合する。この特定の遠心分離機は、すぐに１０００ＲＰＭの設定遠心分離速度まで加速して、この速度を５分間維持する。調製装置を分解した後は、大気中で１分間プレートを乾燥させ、次に、固定するために一晩中、そして貯蔵するために１週間まで、７０％のエタノール／水にプレートを浸す。
【００７２】
染色および装着
固定後、過剰な水分を振り払った状態でプレートガラスを１分間乾燥させ、前準備として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５分間浸した。細胞が堆積した表面と反対側のプレート底面が、再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で素早く洗い流され、プレートは装着の準備が整っている。
細胞を湿潤状態に維持して、細胞形態および人工染色の望ましくない変化を防ぐため、細胞をアガロースヒドロゲルで被覆することが有益であることが判明した。このため、米国・ミズーリ州にあるシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich Corporation）から市販されている「低融点低ゲル化温度アガロースタイプＶＩＩ（low-melting point low gelling temperature agarose type VII）」を、８５０Ｗの電子レンジでＰＢＳ内に溶解して、最終的に２％（ｗ/ｖ）の溶液（final 2% weight/volume solution）とする。粉体を完全に溶解させるには、数分間にわたり、数回の沸騰および攪拌を繰り返す必要がある。米国・ミズーリ州のシグマアルドリッチ社から市販されている「ヘキスト（Hoechst）」タイプの染色剤（１μＭ（Ｈ２Ｏ））を用いた細胞の核の染色と、米国・カリフォルニア州・カールスバッドのライフテクノロジーズコーポレーションより市販されている「セルマスクレッド（cell mask red）」タイプの染色剤（１μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ））を用いた細胞の細胞質の染色は、さらに洗浄工程を必要とすることなく、アガロースゲル内で行うことができる。これは、染色剤ヘキストが、溶液中で実質的に非蛍光性であり、ＤＮＡと結合する際にのみ蛍光性となることや、共焦点励起と検出によって画像の取得が行われることで、飛躍的に背景のピンぼけを減少することができることによるものである。染色剤を含む液体アガロース溶液は５０℃に維持され、２５ｍｌの使い捨てピペットを用いてプレートの上に注がれる。溶液は、表面張力によりプレート上に留まり、縁部から溢れ出ることはない。２０〜３０分後、ゲルが硬化し、プレートガラスと同じ会社から市販されている、プレートガラス「ネクステリオン（Nexterion）」用の専用蓋付きフレーム内にプレートを装着することができる。
【００７３】
画像化
９６個のフィーチャーを備えるプレートガラスの回転ディスク型共焦点蛍光顕微鏡法（spinning-disc confocal fluorescence microscopy）を、ドイツ・ハンブルグのパーキンエルマー・セルラー・テクノロジーズ社（PerkinElmer Cellular Technologies）から市販されているハイスループットの自動画像システム「オペラ  ＱＥＨＳ（Opera QEHS）」で行った。核染色剤（ヘキスト）および細胞質染色剤（セルマスクレッド）は、それぞれ４０５ｎｍと６３５ｎｍで固体レーザによって励起された。
照明光源の励起強度と継続時間は、各実験ごとに調節され、標識効率に違いを生じさせ、明るさおよびコントラストを最適化して、色あせを最小限にする（典型的には、５０ｍＷのレーザ出力、２００〜２０００ｍｓの積算時間）。
各スポットでは、典型的には２５組の走査画像が、ＬＣＰＬＦ  ２０ｘ  ＮＡ  ０．４  エア対物レンズ（LCPLF 20x NA 0.4 air objective lens）（日本のオリンパス株式会社から入手可能）および最適化されたフィルタセットを通して、２つの独立した高量子効率１２ビットＣＣＤカメラ（１．３メガピクセルモノクローム）によって記録された。未処理の照射不均一性、画像シフトまたは歪みはすべて、校正試料から別々に得られた画像を用いて補正された。
【００７４】
画像解析
共焦点顕微鏡写真は、パーキンエルマー社の「オペラ」画像システムの所有ソフトウェア環境「アカペラ（Acapella）２．０」を用いて分析した。これらは、共にドイツ・ハンブルグのパーキンエルマー・セルラー・テクノロジーズ社から市販されている。最初に、核染色画像のセグメンテーションによって、各細胞の位置を特定した。核の位置が特定され、核の輪郭と領域が測定されると、細胞質染色剤のセグメンテーションにより細胞の輪郭が決定される。
さらに、ドイツ・ミュンヘンのデフィニエンス・アーゲー社（Definiens AG）から市販されている画像分析ソフト「イーコグニション（eCognition）」により、小核を含む試料の画像を分析した。
【００７５】
図１３は、上述した装置および方法を用いて調製した非接着性細胞の実例画像を示す。上段の列の画像では、上述した染色剤「ヘキスト」を用いて細胞を染色した。一方、下段の列では、同様に上述した染色剤「セルマスクレッド」を用いて染色した。左列では細胞が処理されておらず、右列では遺伝毒性化合物を用いて細胞が処理されている。図示するように、上述した装置および方法によって調製された細胞は、未処理のガラス表面にしっかりと付着し、細胞内構造が十分に分離するように、平らに広がる。
【００７６】
図１４は、上述した装置および方法を用いて行った小核試験の分析結果の実例を示す。グラフの上の凡例に示すように、実験は４回に分けて異なる日に繰り返して行った。すべての細胞に対する小核含有細胞の比率は、グラフに示すように、物質濃度と対比してグラフに表される。上段の列は非遺伝毒性として知られる物質を含み、下段の列は遺伝毒性として知られる物質を含む。すべての３つの物質が正しく分類されていることがグラフよりわかる。プレート＃１３および＃１４は、陰性対照として、如何なる毒性物質も加えることなくＤＭＳＯ（ジメチル・スルホキシド）のみで処理されたものであり、特に、下段の列に示すグラフに見ることができる。細胞を希釈して、グラフに示す物質の１２個の希釈物を得た。濃度領域は、最大濃度（ニトロキノリンオキシドおよびマイトマイシンＣに対しては１０μＭ、その他の物質に対しては１００μＭ）、希釈係数１．５、希釈回数によって定まる。特注の画像処理アルゴリズムを用いて、小核を含まない細胞と、１から３個の小核を含む細胞を計数した。グラフでは、単に表示目的のため、ニトロキノリンオキシドとマイトマイシンＣのデータを１０倍して右側にシフトさせている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
2013515235.tif 000015
【図１３】
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【国際調査報告】
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