(57)【要約】  本発明は、用意した試料を、変性ユニット、次いで、変性ユニットから空間的に隔離された、マイクロアレイを有する反応領域を通して圧送し、反応ユニット内で、先に変性された反応性の試料成分のハイブリダイゼーションを行う、マイクロアレイにおける能動型のハイブリダイゼーション法に関する。
2013531243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ（５）の少なくとも１つのプローブにおける能動型のハイブリダイゼーション法において、
ａ．反応性の成分を含む試料液を用意する工程、
ｂ．少なくとも１つのポンプユニット（１）と、温度制御される少なくとも１つの変性ユニット（３）と、該変性ユニット（３）から空間的に隔離され温度制御される、少なくとも１つのマイクロアレイ（５）を有する少なくとも１つの反応領域（４）と、を有するポンプ区間に前記試料液を導入する工程、
ｃ．前記試料液を圧送する工程、
ｄ．前記変性ユニット（３）内で前記試料液の反応性の成分を変性させる工程、及び
ｅ．前記反応領域（４）内の前記マイクロアレイ（５）の少なくとも１つのプローブにおいて、前記変性された成分をハイブリダイゼーションする工程、
を備えることを特徴とする、能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項２】
前記ポンプユニット（１）と前記変性ユニット（３）とは、１つの構造的なユニットを形成する、請求項１記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項３】
前記変性ユニット（３）における変性と前記反応領域（４）におけるハイブリダイゼーションとの間で冷却工程を実施する、請求項１又は２記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項４】
前記工程ｄにおいて変性された成分のハイブリダイゼーションに、マイクロアレイ（５）の検出が続く、請求項１から３までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項５】
前記ポンプユニット（１）は、マイクロポンプ、好ましくはマイクロダイヤフラムポンプ又は蠕動マイクロポンプを有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項６】
前記ポンプユニット（１）は、前記ポンプ区間内に組み込まれているか、又はオフチップに配置されている、請求項５記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項７】
前記ポンプ区間を循環路として構成しておき、前記工程ｃにおける圧送によって、前記試料液の均質な管理された流動を起こす、請求項１から６までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項８】
前記変性ユニット（３）は、蛇行通路（１０）を有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項９】
前記変性ユニット（３）は、少なくとも１つの温度調整ユニットを有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項１０】
前記反応領域（４）は、該反応領域（４）にハイブリダイゼーションのために必要な反応液及び／又は洗浄液を供給する第２のポンプ区間に接続されている、請求項１から９までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法を実施する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
従来技術
本発明は、別個の変性機能を伴った能動型のハイブリダイゼーション法に関する。
【０００２】
マイクロアレイは、最新の分子生物学的な検査システムとして公知である。マイクロアレイは、少量の生物学的な試料材料で数千を超える個々の検出の並行した分析を可能にする。これに応じて、相互作用の種類に基づいて分類される多様な形態のマイクロアレイが確立されている。マイクロアレイの一形態には、核酸に基づくマイクロアレイがあり、この種のマイクロアレイは、例えば生物のある遺伝子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｒＲＮＡを検出するために役立つ。このために、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、又はｍＲＮＡに対して相補的なＰＣＲ産物の断片が、担体材料上にプリントされる（「スポッティドマイクロアレイ（Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」）。「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄ‐Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」の場合、人工的に合成されるオリゴヌクレオチドが、例えばガラス担体上に被着される。プローブあるいはゾンデ（Ｓｏｎｄｅ）として機能するオリゴヌクレオチドは、担体上に可及的大きな情報密度をコンピュータチップに類似した形式で最小のスペースに形成するので、マイクロアレイは、しばしば「遺伝子チップ（Ｇｅｎｃｈｉｐ）」又は「バイオチップ（Ｂｉｏｃｈｉｐ）」とも称呼される。
【０００３】
他の形態としては、プロテインアレイが公知である。プロテインアレイは、例えば抗原‐抗体‐相互作用、酵素‐基質‐相互作用、受容体‐タンパク質‐相互作用又は別のタンパク質‐タンパク質‐相互作用を検出する。タンパク質への核酸の結合も検出・定量可能である。
【０００４】
微生物学においてマイクロアレイを使用する場合、一般に調製され前処理された試料から生体分子がマイクロアレイに供給される。マイクロアレイにおいて、個々の箇所（「スポット」）で、特有の結合反応が起こる。結合反応は、試料内における特定の分子、例えばＤＮＡ片の存在に関する情報を提供する。この結合反応の前提は、一本鎖としてのＤＮＡ又はＲＮＡの存在である。その結果、先の変性工程は、不可避である。一般に進展する自動化に際し、時間及びコストを節約するため、１つの装置ユニット内で分析の可及的多数の個別工程を実施する多数の試みが存在する。この場合、特にマイクロポンプが使用される。マイクロポンプにより、極小の試料体積が、装置ユニット内で搬送される。これについては、米国特許出願公開第２００４／０１４１８５６号明細書を参照されたい。
【０００５】
他方、マイクロアレイのプローブにおける本来の結合プロセスあるいはハイブリダイゼーションは、数時間を要する場合がある。これは、粒子の運動がブラウンの分子運動にしたがい、ひいてはゆっくりとしか進行しないからである。さらに、これにより、試料中に存在する目的分子の一部のみが、それぞれの捕捉構造、すなわちプローブに到達するにすぎない。
【０００６】
発明の概要
本発明の課題は、生体分子の変性、例えば二本鎖として存在する核酸の一本鎖への分離、及び変性された生体分子とマイクロアレイのプローブとの結合を含み、本来のハイブリダイゼーションを、分析の感度にネガティブな影響を及ぼすことなく加速する方法を提供することである。
【０００７】
これにより、本発明の対象は、マイクロアレイの少なくとも１つのプローブにおける能動型のハイブリダイゼーション法において、
ａ．反応性の成分を含む試料液を用意する工程、
ｂ．少なくとも１つのポンプユニットと、温度制御される少なくとも１つの変性ユニットと、変性ユニットから空間的に隔離され温度制御される、少なくとも１つのマイクロアレイを有する少なくとも１つの反応領域と、を有するポンプ区間に試料液を導入する工程、
ｃ．試料液を圧送する工程、
ｄ．変性ユニット内で試料液の反応性の成分を変性させる工程、及び
ｅ．反応領域内のマイクロアレイの少なくとも１つのプローブにおいて、変性された成分をハイブリダイゼーションする工程、
を備える、能動型のハイブリダイゼーション法である。
【０００８】
マイクロアレイにおけるハイブリダイゼーションは、一般には、試料液中の生体分子の拡散運動により行われる。この拡散運動は、試料液の振動又は揺動によって助成可能である。これについては、種々異なるシステム、例えばＢｉｏＭｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．のＭａｕｉＲ  Ｍｉｘｅｒが公知である。これに対して、本発明に係る方法は、拡散プロセスが試料液の圧送運動により助成されるという決定的な利点を有している。圧送により、試料液の均質な管理された流動が形成可能である。試料液の均質な管理された流動は、プローブ上に常に十分な数の結合する粒子を維持する。このことは、拡散により制御されたプロセスにおいては常に生じていた、結合する粒子の欠乏に対抗する。マイクロアレイを有する反応領域に直接試料液が流れ着くようになっていてもよいし、反応領域が反応チャンバの内部に配置されるようになっていてもよい。しかしながら、いずれにしても、マイクロアレイの単数又は複数のプローブを介した均質な管理された流動が保証されねばならない。加えて、反応領域に、複数のマイクロアレイが装備されていてもよい。マイクロアレイ上には、それぞれ単数又は複数のプローブが配置されている。
【０００９】
一態様では、ポンプ区間が循環路あるいは回路として配置されている。このことは、マイクロアレイのプローブを介した試料液の均質な管理された流動を付加的に助成する。圧送速度は、試料が数ｍｍ／ｍｉｎで反応領域内を流動するように設計されている。このことは、さもなければ拡散による制限を受けるハイブリダイゼーション反応を助成する。例えば、核酸のハイブリダイゼーション反応は、約５４℃で進行する。
【００１０】
別のポジティブな効果は、変性ユニットが反応領域から空間的に隔離されており、その結果、まず一本鎖の変性が実施可能であることにより生じる。核酸の場合、試料液は、二本鎖を一本鎖に分離するために、比較的高い温度（例えば９４℃）の領域を介して案内される。一本鎖としての、試料中にある核酸の存在は、下流に配置される反応領域での、マイクロアレイのプローブへの引き続いての結合（ハイブリダイゼーション）の前提である。マイクロアレイのスポットにおける結合反応の速度及び感度は、使用可能な一本鎖分子の増大により改善される。このことは、特に、ポンプ区間が環状に形成されており、既に再び又は未だ二本鎖分子として存在する核酸が、周期的に再度の変性及び後続のハイブリダイゼーションに供給される場合に該当する。これにより、未結合の分子は、後続のラウンドでマイクロアレイのプローブに結合可能である。
【００１１】
いずれにしても、本発明に係る方法により、生体分子の結合の平衡反応（Ｂｉｎｄｕｎｇｓｇｌｅｉｃｈｇｅｗｉｃｈｔ）はシフトされ、分析の感度は向上される。その結果、試料体積中の少数の生体分子の検出も可能となる。
【００１２】
反応領域からの変性ユニットの空間的な隔離は、その都度の反応のための最適化された条件の設定を可能にする。この場合、特に、それぞれの生体分子のための最適な温度の設定が、決定的な意味を有している。例えば核酸の変性のためには、少なくとも９０℃、好ましくは９４℃〜９８℃の温度範囲が選択される。核酸のハイブリダイゼーション反応のために、反応領域内の温度は、例えば５４℃に維持される。いずれにしても、変性ユニット及び反応領域の個別の温度管理が重要である。
【００１３】
別の態様では、変性ユニットにおける生体分子の変性と反応領域におけるハイブリダイゼーションとの間に冷却工程が設けられている。その結果、変性された生体分子が最適な温度で反応領域に進入することが保証可能である。冷却は、適当に設計された冷却区間により実施可能である。
【００１４】
変性ユニット及び／又はハイブリダイゼーションユニットの温度調整のために、種々異なる方法が使用可能である（例えば抵抗ヒータ、赤外線ヒータ、温風ブロア及び／又はペルチェ素子）。反応領域内でのハイブリダイゼーションは、一般に比較的低い温度で進行するので、ポンプ区間からの試料体積が、反応領域に開口する際、所望の目標温度を有していることが保証されねばならない。それゆえ、反応領域は、高信頼性の温度管理をし、場合によっては変性ユニットと同様に温度調整されてもよい。
【００１５】
ハイブリダイゼーション反応は、一般に、変性反応より低温で進行するので、試料の、所定のハイブリダイゼーション温度への冷却が重要である。第１の温度範囲において、生体分子は、変性され、解離あるいは分離される。第１の温度範囲と比較して低温の第２の温度範囲により、マイクロアレイのプローブにおけるハイブリダイゼーションが保証され、最適化された温度管理により監視される。
【００１６】
多成分システムとしての構造の他、本発明に係る方法は、特に好ましくはラボオンチップシステム（Ｌａｂ‐ｏｎ‐ａ‐Ｃｈｉｐ‐Ｓｙｓｔｅｍ）として実現される。ラボオンチップシステムは、例えばあるポリマーから担体基板として成形される。この場合、ポンプ機能は、種々異なるポンプにより実現可能である。本発明に係る方法での使用のために、特にチップに組み込まれるマイクロポンプ、例えばマイクロダイヤフラムポンプ又は蠕動マイクロポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｓｃｈｅ  Ｍｉｋｒｏｐｕｍｐｅ）が適している。外的に運転されるポンプとしては、例えばシリンジポンプ若しくは注射ポンプ（Ｓｐｒｉｔｚｅｎｐｕｍｐｅ）又は蠕動ポンプが使用可能である。この種のポンプは、例えばドイツ連邦共和国特許出願公開第１０２００８００２３３６号明細書に記載されており、従来技術に属するものである。
【００１７】
別の態様では、変性ユニットとポンプユニットとが１つの構造的なユニットとして形成されている。この場合、温度制御は１つの加熱可能なポンプを介して実施される。
【００１８】
これに対して択一的には、変性ユニットが、変性のために必要な温度に加熱可能な蛇行通路として存在する。このような構造では、特に循環路内での試料の混合が有利である。これに由来する試料の均質性の改善により、本来のハイブリダイゼーション反応も改善される。蛇行通路は、好ましくはマイクロ構造を有している。その結果、これらのコンポーネントも、ラボオンチップシステム内に実現可能である。
【００１９】
別の態様では、反応領域が第２のポンプ区間に接続されており、第２のポンプ区間を介して反応領域にハイブリダイゼーションために必要な反応液及び／又は洗浄液若しくはすすぎ液が供給可能である。特別な態様では、付加的なポンプ区間が、ハイブリダイゼーションユニットから変性ユニットを遮断する弁を有している。択一的には、反応のために必要な物質は、中央のポンプ区間を介してプロセスに供給されてもよい。しかし、いずれにしても、少なくとも１つの適当な供給部又は入口及び少なくとも１つの適当な出口が設けられている。供給部又は入口及び出口を介して、試料液並びに反応液及び／又は洗浄液が供給あるいは排出可能である。
【００２０】
マイクロアレイの検出は、別の態様では、直接ハイブリダイゼーション工程に接続可能である。その結果、ハイブリダイゼーション及びマイクロアレイの検出は、１つのユニット内で進行可能であり、場合によっては構造的に統合可能である。しかし、特に有利であるのは、ラボオンチップシステムである。
【００２１】
本発明に係る方法のその他の利点及び好ましい態様を図示し、以下に説明する。ただし、図面は、説明の用に供するだけで、本発明を何らかの形態に限定することを意図するものではない点に留意されたい。図中、以下の符号を使用する：
１：ポンプユニット
２：流動接続ライン
３：変性ユニット
４：反応領域
５：マイクロアレイ
６：入口
７：出口
８：担体基板。
【００２２】
図１及び図２は、本発明に係る方法を示している。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】蛇行通路としての変性ユニットと、マイクロアレイを有する反応領域とを有する、循環路として配置されたポンプ区間を備える、本発明に係る方法を実施する装置の概略図である。
【図２】構造がラボオンチップシステムとして形成され、循環路として配置されたポンプ区間がポンプユニット、変性ユニット及び反応領域を有する、本発明に係る方法を実施する装置の概略図である。
【００２４】
図１は、本発明に係る方法を実現する１つの可能な構造を示している。反応領域４は、反応領域４中に含まれるマイクロアレイ５とともに、流動接続ライン２を介してポンプ区間に接続されている。ポンプ区間内では試料液が、ポンプユニット１によって回路中を圧送される。流動方向は、図中央に矢印で示してある。変性ユニット３として蛇行通路が用いられる。変性ユニット３において試料液は、それぞれの生体分子にとって最適化された温度範囲に加熱され、生体分子の変性が行われる。次に、第２の温度範囲で、本来のハイブリダイゼーション反応が、反応領域４内のマイクロアレイ５のプローブにおいて行われる。ポンプユニット１において試料液は、場合によっては第３の温度範囲に調節可能である。
【００２５】
図２は、ラボオンチップシステムとしての本発明に係る方法を実施する装置の概略図である。システムは担体基板８を有している。担体基板８上には、試料液並びに必要な試薬及び洗浄液のための入口６及び出口７が配置されている。流動接続ライン２を介して、試料が、ポンプユニット１を備えるポンプ区間に供給される。変性ユニット３は、マイクロ寸法の蛇行通路として形成されている。変性ユニット３には、変性された生体分子をハイブリダイゼーションする本来のマイクロアレイ５を備える反応領域４が接続している。ラボオンチップシステムにおいても、ポンプユニット１、変性ユニット３及び反応領域４は、それぞれの温度管理下及び／又は温度制御下にある。
【図１】
2013531243.tif 000003
【図２】
2013531243.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月26日(2012.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ（５）の少なくとも１つのプローブにおける能動型のハイブリダイゼーション法において、
ａ．反応性の成分を含む試料液を用意する工程、
ｂ．少なくとも１つのポンプユニット（１）と、温度制御される少なくとも１つの変性ユニット（３）と、該変性ユニット（３）から空間的に隔離され温度制御される、少なくとも１つのマイクロアレイ（５）を有する少なくとも１つの反応領域（４）と、を有するポンプ区間に前記試料液を導入する工程、
ｃ．前記試料液を圧送する工程、
ｄ．前記変性ユニット（３）内で前記試料液の反応性の成分を変性させる工程、及び
ｅ．前記反応領域（４）内の前記マイクロアレイ（５）の少なくとも１つのプローブにおいて、前記変性された成分をハイブリダイゼーションする工程、
を備えることを特徴とする、能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項２】
前記ポンプユニット（１）と前記変性ユニット（３）とは、１つの構造的なユニットを形成する、請求項１記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項３】
前記変性ユニット（３）における変性と前記反応領域（４）におけるハイブリダイゼーションとの間で冷却工程を実施する、請求項１又は２記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項４】
前記工程ｄにおいて変性された成分のハイブリダイゼーションに、マイクロアレイ（５）の検出が続く、請求項１から３までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項５】
前記ポンプユニット（１）は、マイクロポンプを有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項６】
前記マイクロポンプは、マイクロダイヤフラムポンプ又は蠕動マイクロポンプである、請求項５記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項７】
前記ポンプユニット（１）は、前記ポンプ区間内に組み込まれているか、又はオフチップに配置されている、請求項５又は６記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項８】
前記ポンプ区間を循環路として構成しておき、前記工程ｃにおける圧送によって、前記試料液の均質な管理された流動を起こす、請求項１から７までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項９】
前記変性ユニット（３）は、蛇行通路（１０）を有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項１０】
前記変性ユニット（３）は、少なくとも１つの温度調整ユニットを有する、請求項１から９までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項１１】
前記反応領域（４）は、該反応領域（４）にハイブリダイゼーションのために必要な反応液及び／又は洗浄液を供給する第２のポンプ区間に接続されている、請求項１から１０までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の能動型のハイブリダイゼーション法を実施する装置。
【国際調査報告】
2013531243.tif 000005
2013531243.tif 000006
2013531243.tif 000007
2013531243.tif 000008
2013531243.tif 000009
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