(57)【要約】  本発明は、疝痛に罹患した幼児から単離した大腸菌群に対して、糖、特にラクトースの発酵によりガスを産生する種に対して、抗酸化および／または抗菌および競合作用を発揮できる２つのプロバイオティック細菌株を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌群の阻害剤として、Lactobacillus delbruekii 種に属する細菌株を含む群から選択される、プロバイオティック細菌株。
【請求項２】
該大腸菌群が、糖、好ましくはラクトースの発酵によりガスを産生する大腸菌群を含む群から選択される、請求項1に記載のプロバイオティック細菌株。 
【請求項３】
該大腸菌群が、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacaeおよびEnterococcus faecalis種に属する細菌を含む群から選択される、請求項1または2に記載のプロバイオティック細菌株。
【請求項４】
該プロバイオティック株が、2008年12月10日にDSMZに寄託され、提出番号DSM 22106を有するLactobacillus delbruekii MB386である、請求項1〜3のいずれか一項記載のプロバイオティック細菌株。
【請求項５】
該L. delbruekii MB386 DSM 22106株が、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacaeおよびEnterococcus faecalis種に属する細菌に対して抗菌活性を有する、請求項4に記載のプロバイオティック細菌株。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項記載の少なくとも一つの細菌株を含む、食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項７】
抗酸化特性を有する少なくとも一つの他の細菌株もまた存在しており、好ましくは該株は2008年12月10日にDSMZに寄託され、提出番号DSM 22107を有するLactobacillus plantarum LP1である、請求項6に記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項８】
疝痛に罹患した対象の予防的および／または治療的処置において使用するための、請求項6または7に記載の組成物。
【請求項９】
該Lactobacillus delbruekii MB386, DSM 22106および該Lactobacillus plantarum LP1, DSM 22107が、少なくとも一つの脂質、好ましくは植物由来の脂質を含有する組成物により被覆されており、該脂質は、75℃以下の融点、好ましくは45〜65℃の融点を有する飽和脂肪を含む群から選択される、請求項6〜8いずれか一項記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１０】
該飽和脂肪が、飽和脂肪酸のモノおよびジグリセリド、飽和脂肪酸によりエステル化されたポリグリセロール、および遊離飽和脂肪酸の中から選択される、請求項9に記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１１】
該飽和脂肪が、ポリグリセリルジステアレート、グリセリルパルミトステアレート、飽和脂肪酸または非ラウリン酸由来の水素化された植物脂肪の中から選択される、請求項10に記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１２】
該プロバイオティック細菌株 Lactobacillus delbruekii MB386, DSM 22106およびLactobacillus plantarum LP1, DSM 22107が、第一および第二被覆により被覆されており、該第一被覆は、約60℃の融点を有する水素化されたパーム脂肪であって、該第二被覆は、57〜60℃の融点を有するグリセロールジパルミトステアレート脂肪である、請求項6〜11いずれか一項記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１３】
―オリーブ油、コーン油、大豆油、亜麻仁油、ピーナッツ油、ゴマ油、魚油および米油を含む群から選択される少なくとも一つの食用油、ここで該少なくとも一つの油が、懸濁液の全重量に対して、70重量%以上の量で存在している、ならびに
−L. delbrueckii およびL. plantarum種に属する細菌株を含む群から選択される少なくとも一つのプロバイオティック細菌株、ここで該株が、懸濁液の全重量に対して、30重量%以下の量で存在している、
を含む、油性懸濁液の形態における、請求項6〜12いずれか一項記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１４】
該懸濁液の油が、オリーブ油、好ましくはコーン油および／または大豆油および／または亜麻仁油と混合されたオリーブ油である、請求項13記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【請求項１５】
細菌株が、プロバイオティック株のLactobacillus delbruekii MB386, DSM 22106、およびLactobacillus plantarum LP1, DSM 22107であり、請求項9〜12いずれか一項に従って被覆されている、請求項13または14に記載の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疝痛に罹患した幼児から単離したガス産生大腸菌群を抑制できるプロバイオティック細菌株に関する。さらに、本発明は、腸管疾患の予防的および／または治療的処置における使用および幼児/乳児における疝痛のための該細菌株を含む食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幼児の疝痛は、幼児が生まれて最初の3ヶ月中で最も頻発する疾患の一つであることが良く知られている。この幼児の疝痛の病因は、依然として解明されておらず、多因子性ものものであることも知られている。
【０００３】
過去数年において、疝痛の病因における腸内細菌微生物叢の関与を指摘するデータが増加している。最近の実験から、疝痛に罹患した乳児の微生物環境の変化が、腸管運動機能の異常調節およびガス産生増加を引き起こし、これにより過剰な鼓腸、該疾患の典型的な症状の一つを提示する可能性があるというが示唆されている。最後に、疝痛に罹患した幼児は、健康な幼児に比べて、ガス産生微生物であるClostridium difficileの感染を合併することが非常によく起こることが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、シメチコンが、疝痛のための最も望ましい処置であると考えられる。疝痛を有する乳児において、プラセボに対してインビボでのその実際の効果を反証するという傾向を示す実験結果があるにも関わらず、シメチコンは疝痛の処置において推奨されている(Metcalf TJ, et al., Simethicone in the Treatment of Infant Colic: A Randomized, Placebo-Controlled, Multicenter Trial. 1994, Pediatrics. 94(1): 29-34; Sferra TJ, et al. Gastrointestinal gas formation and Infant Colic. 1996, Pediatr Clin North Am. 43(2): 489-510)。即ち、有効で、副作用のない、適用し易い幼児における胃腸管疾患および疝痛のための予防的および／または治療的処置を示す必要が依然として残っている。出願人は、幼児/乳児における胃腸管疾患の予防的および／または治療的処置に関する課題を解決するために行った。特に、出願人は、幼児/乳児における疝痛の予防的および／または治療的処置に関連した課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
熱心な研究活動の後に、本出願人は、Lactobacillus delbrueckii種に属している特定のプロバイオティック細菌株を選択した。本発明の目的は、Lactobacillus delbrueckii種に属している細菌株を含む群から選択されたプロバイオティック細菌株である。
【０００６】
本発明の好ましい実施態様を、下記詳細な説明において後記に示すが、本発明の範囲をいずれも制限するものではない。
【０００７】
表番号1は、疝痛を有する幼児から単離した大腸菌群に対して、Lactobacillus delb rueckii MB386 DSM 22106によりプレート上に示されたアンタゴニスト活性を示す。病原体の増殖阻害は、該選択されたlactobacillusの全細胞により含浸されたディスク周辺で発生する発育阻止帯(inhibition halo)の半径として表される。
【０００８】
表番号2は、該疾患顕在中の疝痛に罹患した20人の幼児の糞便サンプル中の全大腸菌群の定量を示す。
(*)マッコンキー寒天プレート上で増殖したコロニーを計測することにより大腸菌群の全数を決定したが、該種の濃度は種特異的PCR-フィンガープリント方法の使用およびリボタイピングにより決定した。
【０００９】
この選択されたプロバイオティック細菌株は、大腸菌群の増殖の阻害剤として作用する。
【００１０】
好ましくは、該大腸菌群が、糖の発酵、好ましくはラクトースの発酵によりガスを産生する大腸菌群を含む群から選択される。
【発明の効果】
【００１１】
この選択されたプロバイオティック細菌株は、疝痛に罹患した幼児から単離され、かつラクトースの発酵および腸内ガスの産生に関与する（後者は、幼児の疝痛の疾患において、主要な同時発生的病因と考えられる）大腸菌群に属しているEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae および最後にEnterococcus faecalisの種に対して、立証された抗菌および／または抗微生物活性(阻害活性)を有する。
【００１２】
特に、該大腸菌群は、Escherichia coli細菌を含む群から選択される。好ましい実施態様において、プロバイオティック細菌株は、提出番号DSM 22106にて2008年12月10日にSteve Jones Srl 社（Florence, Italy）によりDSMZに寄託されたLactobacillus delbrueckii MB386である。該株Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106は、疝痛に罹患した幼児から単離した大腸菌群に対して有効な抗菌および／または抗微生物活性を有する。
【００１３】
本発明の目的は、上記に特定したような、少なくとも一つのLactobacillus delbrueckii種に属しているプロバイオティック細菌株を含む食品組成物またはサプリメントである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、医薬として使用するための、上記に特定したような、少なくとも一つのLactobacillus delbrueckii種に属しているプロバイオティック細菌株を含む組成物である。
【００１５】
本発明の全ての上記組成物は、下痢、疝痛、消化不良および胃酸過多症、過敏性腸症候群、鼓腸、消化性潰瘍、胃あるいは十二指腸潰瘍、消化不良、クローン病、腹部の病変および胆道疾患に関連のある疾患または病状の予防的および／または治療的処置における適用である。
【００１６】
好ましい実施態様において、本発明の上記組成物の全ては、胃腸管疾患、疝痛および鼓腸に罹患した対象、特に幼児/乳児における、予防的および／または治療的処置において使用するための適用を有する。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の上記組成物の全ては、Lactobacillus plantarum種に属している細菌株を含む群から選択される抗酸化特性を有するさらに少なくとも一つの他の細菌株を含む；好ましくは、該株は、2008年12月10日にSteve Jones Srl 社（Florence, Italy）によりDSMZに寄託された提出番号DSM 22107を有するLactobacillus plantarum LP1である。
【００１８】
Lactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107株は、抗酸化特性を有する。該株 Lactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107は、インビトロで胃液および胆汁中で試験された卓越した生存能に関連のある抗酸化活性を示すため、腸内通過に対する耐性を暗示するプロバイオティック株である。
【００１９】
上記した全ての組成物は、細菌感染の防止ならびに胃腸消化管の症状および疾患、疝痛および鼓腸の抑止に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
原文に記載なし。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施態様において、食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物は、マイクロカプセル化形態、即ち少なくとも一つの脂質(脂質組成物)、好ましくは植物由来の脂質を含有する組成物により被覆された形態において、本発明の上記細菌株を含有しうる。
【００２２】
あるいは、食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物は、マイクロカプセル化された細菌およびマイクロカプセル化されていない細菌として、本発明の上記細菌株を含み得る。
【００２３】
該脂質組成物は、少なくとも一つの脂質を含み、該少なくとも一つの脂質は、植物由来の脂質である。
【００２４】
有利には、植物由来の脂質は、飽和脂肪を含む群から選択される。
【００２５】
有利には、75℃より低い、好ましくは45℃〜65℃の融点を有する飽和脂肪が使用される。
【００２６】
好ましい実施態様において、該飽和脂肪は、飽和脂肪酸のモノおよびジグリセリド、飽和脂肪酸によりエステル化されたポリグリセロールおよび遊離飽和脂肪酸を含む群から選択される。好ましい飽和脂肪は、ポリグリセリルジステアレート、グリセリルパルミトステアレートおよび非ラウリン酸由来の水素化植物脂肪を含む群から選択される。
【００２７】
第一の実施態様において、本発明の上記細菌株は、単被覆される。
【００２８】
事実上、一つの脂質による単一被覆が実現される。有利には、この単一被覆は、ポリグリセリルジステアレート(販売名Plurol Stearique WL 1009)を基にしている。
【００２９】
本発明の上記単一被覆細菌株は、本発明の食品組成物またはサプリメントまたは医薬組成物に含まれる。
【００３０】
第二の実施態様において、本発明の上記細菌株は、二重被覆される。
【００３１】
事実上、二重被覆は、連続した互いに異なる2つの脂質を用いて実現される。
【００３２】
有利には、選択されるこの2つの脂質は、水素化されたパーム脂肪(Tm=60℃)およびグリセロールジパルミトステアレート(Tm=57-60℃)である;それらは、連続してこの凍結乾燥物上に噴霧される、即ち二重被覆がこの凍結乾燥物に適用される：水素化されたパーム脂肪(例えば、Revel C)を用いる第一の被覆、およびグリセリンジパルミトステアレート(例えば、 Precirol Ato 5) を用いる第二の被覆を、それぞれ3:1の重量比にて、有利には2:1、例えば第一の被覆が2/3重量および第二の被覆が1/3重量にて適用される。上記細菌種は、0.1%〜75重量%の量で、好ましくは0.5%〜15重量%で存在する；さらにより好ましくは、組成物またはサプリメントの全重量に対して1%〜10重量%である。しかし、組成物の全重量に対するこの％は、組成物またはサプリメントの製品タイプに依存する。
【００３３】
好ましい実施態様において、該組成物またはサプリメントは、被覆および／または非被覆細菌を、1x106〜1x1011 CFU/g、好ましくは1x108〜1x1010 CFU/gの濃度にて含有する。
【００３４】
好ましい実施態様において、該組成物またはサプリメントは、1x106〜1x1011 CFU/用量、好ましくは1x108〜1x1010 CFU/用量を含む濃度にて細菌を含む。該用量は、0.2 g〜10 gを含んでもよく；例えば、0.25 g、1 g、3 g、5 gまたは7 gであってもよい。
【００３５】
本発明で使用したプロバイオティック細菌は、固体形態、特に粉体形態、脱水和物、スプレーまたは凍結乾燥化粉末の形態で存在していてもよい。該細菌は、被覆されていてもおよび／または被覆されていなくてもよい。該細菌、好ましくはマイクロカプセル化された形態にある(被覆された)細菌は、当業者には十分知られた通常の技術および医薬業界では良く知られた利用可能な機器を用いてマイクロカプセル化され得る。例えば、流動層式技術を使用してもよく(例えば、上部スプレーまたは下部スプレー)、ここでは脂質特性の被覆材が使用される。ミクロカプセル化において、製造過程の熱制御は重要である。特に、使用される株の死滅を回避するためには、使用される脂質の温度を制御することが重要である。
【００３６】
好ましい実施態様において、組成物またはサプリメントは、下記のもの：
−オリーブ油、コーン油、大豆油、亜麻仁油、ピーナッツ油、ゴマ油、魚油および米油を含む群から選択される少なくとも一つの食用油であって、該少なくとも一つの油は、70重量%以上の量で存在している、および
−L.delbrueckiiおよびL.plantarum種に属する細菌株を含む群から選択される少なくとも一つのプロバイオティック細菌株であって、該株は、懸濁液の全重量に対して、30重量%以下の量にて存在する、
を含む油性懸濁液の形態において存在する。
【００３７】
好ましい実施態様において、懸濁液の油は、オリーブ油単独である；好ましくは、それは、コーン油および／または大豆油および／または亜麻仁油と混合されたオリーブ油である。
【００３８】
好ましい実施態様において、油性懸濁液は、懸濁液の全重量に対して、0.1〜15重量%の量にて、シリカ、シリコンジオキシド、シリカゲル、コロイド状シリカ、沈殿シリカ、タルク、マグネシウムシリケート、酸化マグネシウム、マグネシウムカーボネート、カルシウムシリケート、レシチン、モノまたはジグリセリド、例えばグリセリルモノステアレート、グリセリルモノオレエート、プルロール・オレイク（Plurol Oleique）酸、スターチ、修飾スターチ、コンニャクガム、キサンタンガム、ゲランガムおよびカラゲーナンを含む群から選択される、少なくとも一つの細かく細分された食品化合物を含む。
【００３９】
好ましい実施態様において、油性懸濁液を、懸濁液の全重量に対して、イヌリン、フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトおよびトランスガラクトオリゴサッカリド(GOSおよびTOS)、グルコ-オリゴサッカリド(GOSα)、キシロオリゴサッカリド(XOS)、キトサンオリゴサッカリド (COS)、大豆オリゴサッカリド(SOS)、イソマルト-オリゴサッカリド(IMOS)、マルトデキストリン、耐性スターチ、ペクチン、オオバコ、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、ラクトサッカロース、ラクチュロース、ラクチトール、アカシアファイバー、カルバファイバー、オーツ麦ファイバー、竹ファイバーおよびシトラスファイバーから選択される少なくとも一つのプレバイオティックスファイバーおよび／またはビフィズス菌生成の炭化水素を0.5〜25重量%の量にて含有できる。
【００４０】
好ましい実施態様において、油性懸濁液は、グルコオリゴサッカリド(GOSα)、フルクト-オリゴサッカリド(FOS)、イヌリンおよび／またはマルトデキストリンの中から選択される少なくとも一つのファイバーおよび少なくとも一つの炭化水素を含む。
【００４１】
好ましい実施態様において、油性懸濁液は、上記のとおり、75℃以下、好ましくは45〜65℃の融点を有する少なくとも一つの脂質を用いて、単一被覆(または2つの被覆)にて被覆された(マイクロカプセル化された)Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106およびLactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107を含む。
【００４２】
本発明の油性懸濁液を、当業者には十分知られた技術および周知の機器を用いて調製した。
【００４３】
事実上、所定量の油を、攪拌および加熱手段を備えた容器に導入する。その後、固体形態のプロバイオティック細菌を、塊や凝集物の形成を避けるために攪拌しながら、徐々に添加した。細菌の添加が完了してから、この油状物質を、攪拌下で1〜30分間維持し、必要であれば、24〜40℃、好ましくは30〜35℃の温度に若干加熱する。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、プロバイオティック細菌を、マイクロカプセル化された形態、即ち少なくとも一つの脂質、好ましくは植物由来の脂質を含有する組成物により被覆された形態にて使用できる。このマイクロカプセル化された細菌を、上記と同じ操作方法を用いて油に添加した。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、油に添加した細菌は、マイクロカプセル化された細菌およびマイクロカプセル化されていない「そのままの(naked)」細菌の形態にて存在していてもよい。
【００４６】
この細菌、好ましくはマイクロカプセル化された形態の細菌を、当業者には周知技術によりマイクロカプセル化できる。例えば、流動層式技術を使用してもよい(例えば、上部スプレーまたは下部スプレー)、ここでは脂質特性の被覆材が使用される。
【００４７】
好ましい実施態様において、75℃以下、好ましくは45〜65℃の融点を有する飽和植物脂肪を使用した。
【００４８】
好ましい実施態様において、特定の親水性度を有する飽和植物脂肪を使用できる；これらを、飽和脂肪酸のモノおよびジグリセリド、飽和脂肪酸でエステル化されたポリグリセロール、および遊離飽和脂肪酸の中から選択できる。
【００４９】
例えば、ポリグリセリルジステアレート(商品名Plurol Stearique WL 1009)、グリセリルパルミトステアレート(商品名Precirol Ato 5)、飽和脂肪酸(商品名Revel C)または非ラウリン酸由来の水素化植物脂肪を使用できる。
【００５０】
好ましい実施態様において、凍結乾燥された微生物とそれを被覆する脂質被覆材の重量比は、50:50または40:60である。
【００５１】
第一の態様において、2つの脂質、即ち水素化されたパーム脂肪(Tm=60℃)およびグリセリンジパルミトステアレート(Tm=57-60℃)を、凍結乾燥物に連続して噴霧する、即ち二重被覆が凍結乾燥物に適用される：それぞれ3:1の重量比にて、水素化されたパーム脂肪による第一の被覆およびグリセリンジパルミトステアレートによる第二の被覆。細胞の二重被覆は、外界と通じる孔がない連続フィルムを作成して、環境からの該細菌の良好な遮断を確実にする。しかし、この被覆体は、腸内段階にて開封されて、細菌を放出し、細菌を定着させる。選択された脂質は、実際、被覆は、腸通過中に被覆に穴を形成できるようにわずかな塩基性pHに感受性であるが、胃内で無傷にて維持できるために、酸性pHに耐性がある。
【００５２】
該油性懸濁液は、懸濁液の全重量に対して、0.5〜20重量%を含む30重量%以下の量にて細菌を含有できる；懸濁液の全重量に対して、好ましくは0.5〜10%の量にて;さらにより好ましくは、1.5〜5重量%の量にて含有できる。
【００５３】
該油性懸濁液は、腸管疾患、例えば小児対象における疝痛の処置のための医薬として使用するための価値のある適用を有する。
【００５４】
試験を、幼児の疝痛の病因においてガス産生大腸菌群の役割を評価するために行った。 
【００５５】
実際に、前向き無作為化試験を、49人の疝痛に罹患した幼児および35人の健康な幼児を動員して行った；彼らは、独占的に母乳で育ち、胃腸系疾患がない、在胎齢に対応している20および90日齢である。糞便サンプルを、予め決定された時間時に双方の幼児群から採取して、その後48時間内に試験した。この試験は、2群の幼児において、ガス産生大腸菌群の存在に関して、定性/定量的な有意差が存在するかどうかを確立することを目的とする。
【００５６】
大腸菌群に含まれる一般的な属は次のとおりである：Citrobacter、Enterobacter、Escherichia coli、Klebsiellaおよびその他の下位群。糞便サンプルから単離した最も代表的な各種の同定を、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)および自動化リボタイピング技術を用いて分子レベルで行った。最後に、微生物コロニーが、ラクトースおよび他の糖の発酵によりガスを産生する能力を試験した。
【００５７】
様々な種の大腸菌群の分子および表現型の同定から、疝痛の有無による2群の異なるコロニー化のパターンが示された、特にEscherichia coli種の濃度が、疝痛を有する幼児の群において有意に高いことを示した[糞便の(6.04 Log10 対 4.47 Log10)CFUg-1]。まさにEscherichia coliのこの種の異常な濃度が疾患の発症に関与し得ると考えられる。
【００５８】
病的状態にある幼児における我々の試験で観察された大量の大腸菌種が、宿主にとって価値のあるまだ同定されていない細菌の他のある菌種の低下と関連しており、宿主の健康状態に影響をもたらすことは否定できない。
【実施例】
【００５９】
実験の部
1. 導入部
出願人は、疝痛に罹患した幼児から単離した大腸菌群に対するその抗酸化効果、抗菌作用および抗微生物作用に関して、選択かつ評価されるLactobacillus種に属するプロバイオティック細菌株の選抜を目的として試験を行った。
【００６０】
糖、特にラクトースの発酵によるガス産生体である大腸菌群の10株を、疝痛に罹患した幼児の糞便から単離して、検討されるLactobacillus種に属するプロバイオティック細菌株によるその増殖阻害をインビトロで評価した。
【００６１】
2. 株の単離および培養条件
大腸菌群の定量および該存在を試験する目的のために、糞便サンプルを、登録前の6±1日に疝痛を呈した独占的に母乳で育てられた49人の疝痛罹患幼児から採取した。腸内細菌(いわゆる「大腸菌群」)を単離および定量するために広く使用される培地であるマッコンキー寒天(DIFCO n. 0075.17.1)の選択プレート上で、それらを増殖にとって理想的な条件下：制御された大気中37℃に置いた後に、株の単離を行った。
【００６２】
12時間のインキュベーション後、プレート上に出現したコロニーを計測して、コロニー自体の間の全ての形態学的差異を注意深く観察した。この数値結果を、コロニー形成単位(CFU)/糞便gのLog10として示した。次いで、単離した各コロニーを個々に採取して、LB(Luria-Bertani)液体培地の管内でインキュベートして、純粋培養物を得た。
【００６３】
3.大腸菌群コロニーの同定
疝痛に罹患した幼児の糞便から得た20人全ての糞便培養物を、大腸菌群に関する最も代表的な属を単離することを目的として分析した。 
【００６４】
該コロニーの種特異的識別を、2つの異なる分子識別法を用いて達成した：プライマー特異的PCRおよび自動化リボタイピング。両方の方法により得た結果を組合せることにより、単離株を高精度にて同定すること、およびどの種が疝痛に罹患した幼児の腸に定着する最も代表的な大腸菌群であるかを規定すること双方が可能である。
【００６５】
最終的に、各細菌種を、％にて計算することにより定量し、それは全ての単離した大腸菌群を表す。
【００６６】
a. 自動化リボタイピング
自動化株特異的リボタイピングは、非常に高機能の機器の使用を含む:RiboPrinter Microbial Characterization System (Qualicon Inc., Wilmington, DE, USA)。プレート上で単離した細菌コロニーを個々に採取した；熱工程後、分解酵素使用により、制限エンドヌクレアーゼEcoR1により解裂されたDNA分離物を得た。最後に、ゲル電気泳動により分離されたDNAフラグメントを、改変したサザンブロッティング技術を用いて分析した。ハイブリダイゼーション分析を、別々の化学蛍光バンドの画像に変換し、機器が電気データまたはリボプリンターパターンへと変換し、記録媒体中に捕捉および保存する。最終的な同定は、得られたリボプリンターパターンを、機器中のDupontデータベースにある蓄積データと比較することにより達成される。好適なアルゴリズムにより計算された場合、少なくとも93%に等しい類似性を有するプロファイルを組み合わせて、単離したコロニー間の関係性または遺伝的同一性を反映する動力学的リボグループ(dynamic Ribogroup)を形成する。
【００６７】
b. プライマー特異的PCR
大腸菌群の分子同定の目的のために、16S-23Sの内部転写されたスペーサー領域のリボソーマルDNAフラグメントを増幅した。プレート上で単離した純粋なコロニーを、個々に取り出し、滅菌蒸留水に再懸濁して、次いでDNAを分離できるように95℃で5分間溶菌した。増幅反応を、ユニバーサルプライマー：16S-for (5’-GCTGGATCACCTCCTTTC-3’)および23S-rev (5’-AGTGCCAAGGCATCCACC-3’)を用いて得た。
【００６８】
増幅反応を、特定の熱サイクルプログラムを設定して、Biometra TGradient Thermal Cycler(Biometra, Gottingen, Germany)で行った。この増幅部物を電気泳動により分離した；約400 bpのフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて精製した；最後に、16Sおよび23Sプライマーを用いて増幅したDNAフラグメントを、自動化配列分析に供した。
【００６９】
4. 大腸菌群によるガス産生
単離された全大腸菌群により媒介されるガス産生能を、単一炭素源として10 g/Lのラクトースを含有する液体LB培地および／またはラウリルスルフェートトリプトース(LST)培地に各々個別の株を植菌することにより評価した。植菌および35℃でのインキュベーションの24-48時間後に、細菌培養物を、Jiang T らの方法に従って、液体培地中のガス泡の存在について試験した。ガスの存在は、試験に対する陽性反応を示す。
【００７０】
5.乳酸菌の無作為選択および培養条件
幼児の大腸菌群に対する抗微生物活性を試験した乳酸菌株は、乳酸菌の様々な種の代表的な30の無作為に選択した株であった。この試験に使用したlactobacilliは、ATCCおよびDSMZコレクション(American Type Culture Collection, Rockville, Md., および Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen, Braunschweig, Germany, respectively)から取得した。
【００７１】
Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107株の分類を、自動化リボタイピングにより種レベルにて確認した。スクリーニングにより選択された株、Lactobacillusi delbrueckii MB386は、the German DSMZ コレクション(DSM 20074またはATCC 9649)から得た。
【００７２】
この試験で使用した全てのlactobacilliを、還元剤として0.5 g/Lシステインを含むLactobacilli MRS培地-Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA-(MRS)において37℃で24時間培養した。
【００７３】
6.抗微生物特性を評価するためのアッセイ
抗微生物特性を2つの方法を用いて評価した：プレート上での細菌増殖の阻害またはKirby-Bauerディスク拡散方法(1940)、および選択された乳酸菌と疝痛に罹患した幼児から得た1以上の大腸菌群との共培養物の調製。
【００７４】
a)プレート上での抗微生物活性
本方法の目的は、幼児から単離した大腸菌群のインビトロでの増殖に対して、検討されるlactobacilli株の阻害効果を試験することである。lactobacilli株を、MRS液体培地中において37℃で48時間、嫌気培養にて増殖させた。培養物から遠心分離により回収したこの細胞を、600nmで光学密度を測定することにより決定した場合に104および106細胞/mlの濃度となるまで生理食塩水に再懸濁させた。バイオマスから分離した上清を、pH7.0に中和した。検討される大腸菌群を103から106細胞/mlの濃度にて含有する細胞懸濁液を、LB(Luria Bertani)寒天(0.7%)の固体培地に分配した；その後、2枚のディスク(直径6mm)、即ち検討されるlactobacillusの細胞懸濁液により含浸された一枚および関連上清にて含浸したもう一枚を、培地上に置いた。コントロールは、2枚の非含浸滅菌ディスクを培地に置く事を除いて同じ方法にて調製された。
【００７５】
37℃で18時間インキュベーションした後に、ディスク周辺に出現した偽病原体(pseudopathogen)の阻害領域を測定した。
【００７６】
b)液体共培養物中の抗微生物活性
大腸菌群の増殖に対して本試験において検討されるlactobacilliにより発揮される拮抗作用を、液体培地中で各々有望なプロバイオティック阻害剤と幼児から単離した最も代表的な大腸菌群との共インキュベーションにより確認した。共インキュベーションの接種材料を、プロバイオティックと大腸菌群を別々に至適条件において培養することにより得た。各々2つの培養物からの細菌細胞を、遠心分離により回収して、望ましくないpHの変化または栄養源の低減を理由とする共培養中で起こり得る増殖に関する任意の調節を回避するために、当量の新規培地に再懸濁した。改変LB培地(3% 酵母抽出物を添加したLuria Bertani、pH7)の液体培地に、全量105CFU/mlのlactobacilliおよび同濃度の既知の大腸菌群細菌懸濁液を植菌した。コントロールは、プロバイオティック接種材料をいずれの細胞をも含まない新規培地単独に置き換える事を除いて同じ方法にて調製された。
【００７７】
このように調製した共培養物およびコントロールを、制御された微好気性条件下に37℃でインキュベートして、8-10時間後に、プロバイオティックにより発揮されるアンタゴニスト活性を、大腸菌群の増殖阻害を決定することにより評価した。これを、共培養管中に見出された大腸菌群の数を、大腸菌群のみを用いて植菌したコントロールの管からの大腸菌群の数から控除して計算した。lactobacilli(Lactobacilli MRS 寒天)および大腸菌群(マッコンキー寒天)(Annuk 2003)の双方に対する選択培地に、共培養物およびコントロールの既知のアリコートを分配して、増殖した生存細菌群のCFU/mlを測定した；最後に、共培養24時間後のpH変化を決定した。lactobacilliおよび大腸菌群の大腸菌濃度に関する結果を、Log10 CFU/mlで表した。
【００７８】
後記実施例は説明の目的として提供するものであり、本発明の範囲を制限することを決して意図するものではない。
【００７９】
実施例1
選択した株Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106を、37℃で48時間、液体培地中で嫌気培養した。臨床学的に診断された幼児疝痛に関する症候を呈した15人の幼児から単離した大腸菌群のEscherichia coli 種 a 株の終夜培養物(表番号2を参照されたい)を、先に記述したプレート上で、抗微生物活性を分析するためのアッセイのとおりに処理した。大腸菌群の103-106 細胞/mlの濃度を有する懸濁液を、LB固形培地に分配した；続いて、2枚のディスク、即ちLactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106の収集細胞の懸濁液を用いて含浸した一枚(ディスクB、図番号1)および各々中和された(neutralized)上清(ディスクA、図番号1)を用いて含浸したもう一枚を、培地に置いた。
【００８０】
このように調製したプレートを、4℃で少なくとも一時間静置した。37℃で18時間インキュベーションした後に、この2枚のディスク周辺で発生したEscherichia coli sp. 株 a の増殖阻害領域について測定を行った。
【００８１】
結果：疝痛に罹患した幼児15人から単離した試験されるEscherichia coli 株の発育阻止帯は、Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106の細胞懸濁液による含浸ディスク周辺のみで確認できるが、しかし阻害領域は、lactobacillusの対応する上清による含浸ディスク周辺には出現しなかった。大腸菌群の発育阻止帯を測定すると、13 mmの半径を有することがわかった(図番号1)。
【００８２】
実施例2
12人の疝痛に罹患した幼児から単離したKlebsiella pneumoniae 株 b (表番号2)に対して、プロバイオティックであるlactobacillus Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106により示される抗微生物活性の評価を行った。この試験の目的のために、2つの細菌株を実施例1に記載したとおりに処理した。
【００８３】
結果：Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106の細胞懸濁液により含浸されたディスク周辺に出現した12人の疝痛罹患幼児から単離したKlebsiella pneumoniae 株 b の増殖阻害領域の測定を行った。この場合においても、lactobacillusの培養物から得た細胞を含まない上清のみで含浸されたディスクからアンタゴニスト活性は得られない。この発育阻止帯を測定すると、図番号2より理解されるとおり12.5 mmの半径を有した。 
【００８４】
実施例3
疝痛に罹患した幼児および健康なコントロールから単離された全てのEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、およびEnterococcus faecalis株に対して、プロバイオティックであるlactobacillus Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106により示される抗微生物活性について評価を行った。
【００８５】
この試験の目的のために、乳酸菌のプロバイオティック株および幼児から単離した大腸菌群を、実施例1に記載したとおりに処理した。
結果：一般的に、Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106の試験株は、試験した全ての大腸菌群に対して阻害活性を常に示した。LB寒天培地上に、細胞懸濁液または培養基単独のいずれも含浸されていない2枚の滅菌ディスクを静置することにより、コントロールプレートを調製した。該コントロールは、試験した大腸菌株の増殖に対していずれの阻害効果も示さなかった。阻害領域の平均半径として表されるプレート上に示された検討されるlactobacillusによるアンタゴニスト活性を評価するために行った試験から得た全ての結果を、表番号1に報告する。
【００８６】
実施例4
また、疝痛に罹患した幼児および健康なコントロールから単離されたEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae およびEnterococcus faecalisの全ての株に対して、選択されたプロバイオティックであるlactobacillus Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107により示される抗微生物活性により、評価を行った。この試験の目的のために、乳酸菌のプロバイオティック株および幼児から単離した大腸菌群を、実施例1に記載したとおりに処理した。
【００８７】
結果：一般的に、Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107の試験株は、試験した大腸菌群に対していずれの阻害効果をも示さなかった。
【００８８】
実施例5
疝痛に罹患した幼児から単離されたEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae およびEnterococcus faecalisの大腸菌群の全ての単離株に対する、本発明の乳酸菌の2つのプロバイオティック株、Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 および Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107の組合せにて示される抗微生物活性の評価を行った。この試験の目的のために、乳酸菌の2つのプロバイオティック株を、実施例1に記載したとおりに別々に培養して、各大腸菌を実施例1に記載したとおりに処理した。103-106 細胞/mlの大腸菌濃度を有する懸濁液を、LB固形培地に分配した。その後、2枚のディスク、即ち既知濃度のLactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106の回収した細胞の懸濁液＋L. plantarum DSM 22107の培養物から回収した同じ濃度の細胞懸濁液を用いて含浸した1枚および2つの乳酸菌の培養物から得た細胞を含まない2つの中和された上清から形成される混合液により含浸したもう1枚を培地においた。こうして調製したプレートを、4℃で少なくとも一時間静置した。37℃で18時間インキュベーションした後に、存在している2枚のディスク周辺に発生した検討される大腸菌の増殖阻害領域の測定を行った。
【００８９】
結果：相乗的に行った抗菌活性に対する試験から、疝痛を有する幼児から単離した各大腸菌株の増殖阻害領域は、L. delbruekii DSM 22106およびL. plantarum DSM 22107の2つの細胞懸濁液により含浸されたディスク周辺にのみ常に出現したが、一方で、発育阻止帯は、2つの乳酸菌の培養物から得た各上清により含浸されたディスク周辺には出現しないことが明らかになった。最後に、全細胞から生じる発育阻止帯を測定すると、L. delbruekii DSM 22106(表番号1)により示された単独のアンタゴニスト活性による平均半径に相当する平均半径を有することが判った。
【００９０】
実施例6
インビトロでのLactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106のアンタゴニスト活性を、液体共培養中で抗微生物活性を評価する方法に関する段落に既に記載したとおり、全量105 CFU/mlのlactobacilliおよび疝痛に罹患した15人の幼児から単離した同じ細胞濃度のEscherichia coli 株 a を改変LB培地に植菌することにより評価した(表番号3)。改変LBを含有する第二の管に、大腸菌群の細胞のみを用いて植菌した。共培養物およびコントロールを、37℃で微好気にて培養して、8-10時間後に、Escherichia coli 株に対する乳酸菌により示されたアンタゴニスト活性を評価した。
【００９１】
共培養試験およびコントロール試験双方から得たLactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 および Escherichia coli 株の増殖を測定するために、この2つの細菌株のCFU/mlを、0.2% バンコマイシン(乳酸菌に対して選択的)を含有するMRS寒天培地およびマッコンキー寒天培地(Escherichia coliに対して選択的)双方の上に、共培養物およびコントロールから得た培養基のアリコートを分配して、接種0時点および24時間時双方を評価した；最後に、24時間の後の共培養した管およびコントロールの管内のpH変化を決定した。
【００９２】
結果：t0)時(接種時の、2.7x105 細胞の Lactobacillus delbruekii DSM 22106を、5.0*105 細胞のEscherichia coliと共に同時に植菌した。開始pHは6.8であった。24時間後(t24)に、選択プレート上での計測により、7.0x109 CFU/mlのLactobacillus delbruekii DSM 22106 および 5.0*105 CFU/mlのEscherichia coliが明らかとなり、一方でpHは4.3に低下した。コントロールの管には、4.5x105 CFU/mlのEscherichia coliのみをt0で植菌した；乳酸菌の植菌材料を、任意の細胞を含まない等量の新規培地のみを添加することにより置き換えた。24時間のインキュベーション後に、この計測により、接種したEcherichia coliが1.0x109 CFU/mlであることが明らかとなった。培地のpHは、6.8に等しく、24時間後に変化しなかった。
【００９３】
実施例7
実施例5と同様ではあるが、幼児から単離された各々同定された最も代表的な大腸菌株と共に共培養した場合に、Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 および Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107の2つの株の組合せにより示される抗微生物活性の評価を行った。
【００９４】
2つの乳酸菌により「相乗作用」にて発揮されるアンタゴニスト活性を、改変LB培地に、全数102 CFU/mlのL. delbruekii DSMZ 22106 および102 細胞のL. plantarum DSMZ 22107、および最後に等濃度(104)の細胞の検討される大腸菌群を植菌することにより評価した。改変LBを含有する第二の管に、双方の乳酸菌の細胞のみを用いて植菌した。このように調製した共培養物およびコントロールを、37℃で微好気にてインキュベートして、8-10時間の後に、得られるアンタゴニスト活性を必要に応じて評価した。
【００９５】
共培養試験およびコントロール試験双方から得られる乳酸菌および大腸菌群の増殖を測定するために、各細菌のCFU/mlを、実施例5に説明したとおりに、接種0時および24時間後の双方で評価した。
【００９６】
全ての乳酸菌のCFU/mlを、検討される大腸菌のCFU/mlと共に計測した；最後に、24時間後の共培養管およびコントロール管中のpH変化を決定した。
【００９７】
結果：単離した種や幼児に関係なく、2つのプロバイオティックのlactobacilliによる共培養中の大腸菌群の濃度は、コントロールの管と比較して、少なくとも4位数対数単位(E109からE105に)まで低下した。インキュベーション24時間の前後に常に測定されたpHは、該管が乳酸菌および大腸菌株と共に共培養された場合に少なくとも3.3±0.4の値まで変化したが、コントロール管中のpHは変化せず常に維持された。
【００９８】
前記より、幼児の疝痛の疾患において主な同時発生的病因と見なされるラクトース発酵および腸内ガスの産生に関与する大腸菌群の属に属しており、疝痛に罹患した幼児から単離されたEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae種および、最後にEnterococcus faecalis種に対して、L. delbruekii MB386 DSM 22106株は、明確な抗菌活性を有することが判った。
【００９９】
腸の大腸菌群の濃度の低下は、ヒトの腸微生物叢中の安定な平衡を維持するために重要であると考えられるため、ヒトの健康状態に有益である。
【０１００】
表番号1 
【表１】
2013531506.tif 000002
【０１０１】
表番号2
【表２−１】
2013531506.tif 000003
【表２−２】
2013531506.tif 000004
(*)マッコンキー寒天プレート上で増殖したコロニーを計測することにより大腸菌群の全数を決定したが、種の濃度は種特異的PCRフィンガープリント方法およびリボタイピング法を用いて決定した。
【図１】
2013531506.tif 000005
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【国際調査報告】
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