(57)【要約】 【課題】  癌細胞内に抗癌剤を効率的に伝達する方法を提供する。【解決手段】  抗癌剤をｐＨ感受性金属ナノ粒子に結合させ、癌細胞から分離する。ｐＨ感受性金属ナノ粒子は、光熱治療により加熱することができるため、放出した抗癌剤と一体となって癌細胞を効率的に死滅させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を細胞に伝達する抗癌剤伝達方法であって、
ｐＨ感受性金属ナノ粒子に前記抗癌剤を結合し、
酸性ｐＨ条件で前記抗癌剤を放出することを特徴とする抗癌剤伝達方法。
【請求項２】
前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子の表面に化合物が結合されており、
前記化合物が下記化学式（１）の化合物である請求項１に記載の抗癌剤伝達方法。
【化１】
2013523877.tif 000007
【請求項３】
前記抗癌剤が１級アミン基またはＯＨ基を含む請求項１に記載の抗癌剤伝達方法。
【請求項４】
前記抗癌剤が、ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、シスプラチン、ブレオマイシン、またはこれらの組み合わせである請求項３に記載の抗癌剤伝達方法。
【請求項５】
ＥＤＣとスルホＮＨＳを用いて、前記抗癌剤を前記化学式（１）の化合物に結合する請求項２に記載の抗癌剤伝達方法。
【請求項６】
加水分解によって前記金属ナノ粒子から前記抗癌剤を放出する請求項１または２に記載の抗癌剤伝達方法。
【請求項７】
前記抗癌剤は１つのＮＨ２基を含んでおり、
前記抗癌剤が放出されると、前記ＮＨ２基が下記化学式（２）の化合物で置換される請求項１に記載の抗癌剤伝達方法。
【化２】
2013523877.tif 000008
【請求項８】
前記抗癌剤を持続的に放出する請求項１乃至６のいずれか１項に記載の抗癌剤伝達方法。
【請求項９】
癌を治療するためのｐＨ感受性金属ナノ粒子であって、
前記金属ナノ粒子には抗癌剤が結合されており、
酸性ｐＨ条件で前記抗癌剤を放出することを特徴とするｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項１０】
表面に化合物が結合されており、
前記化合物が下記化学式（１）の化合物である請求項９に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化３】
2013523877.tif 000009
【請求項１１】
サイズが５〜１５ｎｍの範囲である請求項９に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項１２】
加水分解によって前記抗癌剤を放出する請求項９に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項１３】
前記抗癌剤が、ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、シスプラチン、およびブレオマイシン、またはこれらの組み合わせである請求項９に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項１４】
前記抗癌剤は１つのＮＨ２基を含んでおり、
前記抗癌剤を放出すると、前記ＮＨ２基が下記化学式（２）の化合物で置換される請求項１０に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化４】
2013523877.tif 000010
【請求項１５】
下記化学式（３）の化合物が結合した金属ナノ粒子。
【化５】
2013523877.tif 000011
【請求項１６】
癌を治療するための化合物であって、
下記化学式（４）で表されることを特徴とする化合物。
【化６】
2013523877.tif 000012
【請求項１７】
表面に化合物が結合されているｐＨ感受性金属ナノ粒子であって、
前記化合物が下記化学式（１）の化合物であり、
１級アミン基またはＯＨ基を含む染料が結合されていることを特徴とするｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化７】
2013523877.tif 000013
【請求項１８】
前記染料がアレクサフルオール４８８ヒドラジドである請求項１７に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項１９】
癌を治療するための治療方法であって、
ｐＨ感受性金属ナノ粒子に抗癌剤を結合して、ｐＨ感受性金属ナノ粒子と抗癌剤との結合体を構成し、
ヒトを含む哺乳動物の被験体に、前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子と抗癌剤との結合体を投与し、
酸性条件下で前記抗癌剤を放出し、
癌細胞内で凝集した金属ナノ粒子を光熱処理して光熱治療を行うことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子の表面に、下記化学式（１）の化合物が結合されている請求項１９に記載の治療方法。
【化８】
2013523877.tif 000014
【請求項２１】
前記光熱処理が遠赤外線を用いて行われる請求項１９に記載の治療方法。
【請求項２２】
１級アミン基またはＯＨ基を含む薬剤が結合されており、
前記薬剤が、抗癌剤、感光剤、遺伝子治療剤、タンパク質治療剤、またはこれらの組み合わせであるｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項２３】
１つ以上のＮＨ２基を含む抗癌剤であって、
前記１つ以上のＮＨ２基のうちの少なくとも１つのＮＨ２基が下記化学式（２）の化合物で置換されていることを特徴とする抗癌剤。
【化９】
2013523877.tif 000015
【請求項２４】
ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、シスプラチン、ブレオマイシン、またはこれらの組み合わせである請求項２３に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ感受性ナノ粒子を用いた抗癌剤伝達方法及びこれを用いた抗癌剤伝達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
韓国特許出願第２００８−００６４２７０号にはｐＨ感受性金属ナノ粒子及びその製造方法が開示されている。ｐＨ感受性金属ナノ粒子は、中性及び塩基性では負電荷を帯び且つ良く分散した状態を維持するが、酸性条件に晒されると、加水分解によって表面が正電荷に変化する。この過程で、ナノ粒子は凝集体を形成し、吸光帯域が５００ｎｍ付近の波長から６００ｎｍ以上の赤色−近赤外線領域へ移動する。
【０００３】
したがって、このようなｐＨ感受性金属ナノ粒子を投与すると、中性及び塩基性を帯びる正常細胞では分散状態を維持し、酸性ｐＨを帯びる癌細胞内では選択的に凝集する。生体透過性の高い６００ｎｍ以上の近赤外線を照射すると、凝集した粒子が加熱されて癌細胞を死滅させることになる。
【０００４】
ところが、ｐＨ感受性金属ナノ粒子は、癌細胞に選択性を示して光熱治療が可能であるが、それ自体では癌細胞を治療することが可能な特性はない。よって、癌細胞内で選択的に凝集が可能であり且つ癌細胞を治療することができる新規な粒子が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌細胞治療用金属ナノ粒子を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、癌細胞に対する選択性を示しながら、それ自体で癌細胞を死滅させることが可能な新規のｐＨ感受性金属ナノ粒子を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、癌細胞内で凝集しながら抗癌剤を放出（release）して癌細胞を死滅させることが可能な新規のｐＨ感受性金属ナノ粒子及びその製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、抗癌剤を癌細胞へ選択的に伝達（delivering）することが可能な新規の伝達体を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、ｐＨ感受性金属ナノ粒子の抗癌剤伝達体としての用途を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、癌細胞に対する選択性及び抗癌性を示す粒子を用いて癌を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある観点によれば、ｐＨ感受性金属ナノ粒子（pH-sensitive metal nanoparticle）に抗癌剤（anticancer agent）が結合し、前記抗癌剤は酸性ｐＨ（acidic pH）で分離されて伝達されることを特徴とする、金属ナノ粒子を提供する。
【００１２】
本発明において、前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子は、中性又は塩基性で分散状態をなし、酸性ｐＨでは凝集する金属ナノ粒子である。
【００１３】
本発明において、「ｐＨ感受性（pH-sensitive）」とは、金属ナノ粒子が存在する領域のｐＨに応じて金属ナノ粒子が凝集することを意味する。
【００１４】
理論的に限定されるものではないが、本発明に係る金属ナノ粒子は、癌細胞などの異常な細胞の低い酸性ｐＨを感知して凝集しながら、結合した抗癌剤で治療し、かつ細胞外部からの光を受光して光熱作用によって細胞を死滅させる。
【００１５】
本発明において、前記金属ナノ粒子は、非正常的な細胞へ浸透することが可能なサイズを有することが好ましい。発明の実施において、前記金属ナノ粒子の直径は２０ｎｍ以下、好ましくは約５〜１５ｎｍである。
【００１６】
本発明において、前記金属ナノ粒子は、非正常的な細胞に接近及び／又は浸透した後、酸性のｐＨ環境で凝集して、細胞外部への排出が抑制された状態で抗癌剤を放出（releasing）し、光熱治療（photothermal therapy）を行うことにより細胞を死滅させる。
【００１７】
本発明の実施において、前記金属ナノ粒子は、酸性のｐＨ環境で一部の表面電荷が別の電荷に変化して静電気的引力によって凝集し、かつ加水分解によって結合した抗癌剤が分離される。
【００１８】
本発明の一実施において、前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子と抗癌剤との結合は、水が除去される反応によって行われてもよい。一例として、カルボキシル基と１級アミン基との反応、又はカルボキシル基と水酸基との反応で行われてもよい。また、前記ｐＨ感受性金属ナノ粒子と抗癌剤の分離は、加水分解反応によって行われてもよく、好ましくは結合部位と別の部位とが分離されることで行われることが好ましい。
【００１９】
本発明の好適な一実施において、前記金属ナノ粒子は、金属ナノ粒子の表面に下記化学式（１）の化合物が結合し、他の末端カルボキシル基に抗癌剤のアミン基が反応して結合する。
【化１】
2013523877.tif 000002
【００２０】
この場合、このような金属ナノ粒子は、化学式（１）の化合物が酸性ｐＨで加水分解されて電荷が変化して凝集が起こり、抗癌剤が放出される。前記化学式（１）の化合物が酸性のｐＨで分離される過程は、本発明で参考文献として提示された韓国特許出願第２００８−００６４２７０号に開示されている。
【００２１】
本発明の一実施において、前記抗癌剤は、結合した抗癌剤の末端に形成されたＮＨ２基が化学式（２）で置換された形で放出される。
【化２】
2013523877.tif 000003
【００２２】
本発明の実施において、前記抗癌剤は、メトトレキサート(methotrexate)やパクリタキセル(paclitaxel)、シスプラチン(Cisplatin)、ブレオマイシン(bleomycin)などの公知の抗癌治療用薬物を用いることができる。
【００２３】
本発明の実施において、前記癌細胞治療用薬物は、直接的に癌細胞を死滅させる薬物だけでなく、癌細胞の治療に用いられるアミノレブリン酸(Aminolevulinic acid)やテモポルフィン(Temoporfin)などの光力学治療(photodynamic therapy)用感光剤（photosensitizers）、末端がアミン又は水酸基で改質されたｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)やリボザイム(ribozyme)などの遺伝子治療剤（gene therapeutic）、及びアプタマー(aptamer)や抗体(antibody)などのタンパク質ベース治療剤（protein-based therapeutics）を使用することができる。
【００２４】
本発明の他の観点によれば、金属ナノ粒子の表面に下記化学式（１）の表面分子篩が形成され、前記表面分子篩の末端に抗癌剤が結合した（conugated）治療剤を提供する。
【化３】
2013523877.tif 000004
【００２５】
理論的に限定されるものではないが、前記化学式（１）の表面分子篩の末端に結合した抗癌剤は、癌細胞内のｐＨ環境で前記表面分子篩が加水分解されながら、金属ナノ粒子から分離されて抗癌治療効果を発揮する。
【００２６】
本発明の別の観点によれば、癌細胞内で選択的に凝集する金属ナノ粒子に抗癌剤を結合させて癌細胞内へ抗癌剤を伝達する方法を提供する。ナノ粒子に結合した抗癌剤は、凝集の際に金属ナノ粒子から分離されて抗癌効果を示す。
【００２７】
本発明のさらに別の観点によれば、 表面に抗癌薬物が結合したｐＨ感受性金属ナノ粒子を投与する段階と、癌細胞内で凝集したｐＨ感受性金属ナノ粒子を光熱して治療する段階とを含んでなる、治療方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の観点によれば、ｐＨ感受性金属ナノ粒子の表面に蛍光体が結合したことを特徴とする、金属ナノ粒子を提供する。
【００２９】
本発明の一実施において、前記ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩の末端に有機染料（dye）のアレクサフルオール４８８ヒドラジド（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）を導入した。 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｈｙｄｒａｚｉｄｅは、蛍光染料であって、５２０ｎｍ付近の緑色蛍光を有する。
【００３０】
理論的に限定されるものではないが、金属ナノ粒子の表面分子篩に染料が導入されて金属ナノ粒子と染料との距離が１０ｎｍ以下と非常に近くなると、染料の蛍光エネルギーが金属ナノ粒子の表面へ伝達できる。この際、伝達された蛍光エネルギーが金属ナノ粒子の表面から光を発しない他の経路で放出されて染料の蛍光が消滅するＮＳＥＴ(Nanoparticle Surface Energy Transfer)現象が生じうる(Yun, C. S., Javier, A., Jennings, T., Fisher, M., Hira, S., Peterson, S., Hopkins, B., Reich, N. O., and Strouse, G. F., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3115-3119)。このような特異的な光学性質を利用すると、金属ナノ粒子の表面に染料が導入されることを容易に確認することができる。
【００３１】
本発明のさらに別の観点によれば、下記化学式（３）で表される化合物が結合した抗癌治療用金属ナノ粒子を提供する。
【化４】
2013523877.tif 000005
【００３２】
本発明のさらに別の観点によれば、下記化学式（４）で表される治療用化合物を提供する。
【化５】
2013523877.tif 000006
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、癌細胞に対する選択性を有する新規の金属ナノ粒子を提供するとともに、これを用いた治療方法を提供する。さらに、本発明に係る癌治療方法は、抗癌剤（anticancer drug）を用いた治療と共に、金属ナノ粒子の光熱のための治療を併行することが可能な新規の抗癌治療方法を提供する。
【００３４】
また、本発明は、金属ナノ粒子の表面に治療用又は診断用試薬を結合させて癌細胞へ移動させた後、これを伝達することが可能な新規の診断及び治療方法を提供する。
【００３５】
また、ｐＨ感受性金ナノ粒子自体が癌細胞に対する選択性を持っているので、抗癌薬物による正常細胞の損傷を最小化する選択的な癌治療が可能であり、向後、抗体やアプタマーなどの標的用分子篩を導入する場合、抗癌治療効率をさらに増加させることができるものと期待される。
【００３６】
また、ｐＨ感受性金ナノ粒子の優れた光熱治療効果に基づいて、抗癌薬物による化学治療と光を用いた光熱治療とを併行すると、より選択的且つ完全な癌細胞の死滅を誘導することができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｐＨ感受性金属ナノ粒子が表面分子篩の加水分解によって凝集しながら吸収波長が変化することを示す概念図である。
【図２】癌細胞と正常細胞に濃度と時間を変化させながらｐＨ感受性金属ナノ粒子を培養した後に観察した暗視野顕微鏡写真である。
【図３】ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩にアレクサフルオール４８８ヒドラジドを導入した結合体溶液（黒色）と、ここにＫＣＮを添加して金ナノ粒子のみを選択的に溶かした溶液（赤色）の吸光（左）及び蛍光スペクトル（右）を示す図である。
【図４】ｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体をｐＨ７．６（黒色）、ｐＨ１．０（赤色）の水溶液に分散させた後に測定した吸光（左）及び蛍光（右）スペクトルを示す図である。
【図５】ｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体を共に培養した後に測定したマウス黒色腫細胞の蛍光顕微鏡写真であり、左が１時間、右が３時間経過後に測定した写真である。
【図６】ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシン(doxorubicine)の結合体を共に培養した乳癌細胞実験群（中間パネル）、ｐＨ感受性金ナノ粒子（左パネル）、及びドキソルビシン（右パネル）を共に培養した対照群の時間による蛍光顕微鏡写真である。ドキソルビシンが細胞内に伝達されると、ドキソルビシンの蛍光によって細胞の核がオレンジ色に見える。培養時間は２４時間である。
【図７】ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩との結合体の形成模式図である。
【図８】ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩との結合体の形成模式図である。
【図９】ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩との結合体の形成模式図である。
【図１０】ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩との結合体の形成模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施例
ｐＨ感受性リガンドの合成
リポ酸(Lipoic acid)を無水クロロホルム(anhydrous chloroform)に溶かした後、常温、真空環境で１．３当量のカルボニルジイミダゾール(carbonyldiimidazole)に添加して５分間攪拌し、残っているカルボニルジイミダゾールを除いた反応溶液層を分離する。リポ酸の５当量に相当するエチレンジアミン(ethylenediamine)を窒素環境で無水クロロホルムに溶かした後、氷浴(ice bath)で温度を下げた状態で上記の溶液を添加して１時間攪拌した。
【００３９】
反応溶液を１０％のＮａＣｌ水溶液で３回、イオン交換水で１回抽出して精製し、無水シトラコン酸(citraconic anhydride)を添加して常温で２４時間攪拌した後、生成された固体を濾過した。この固体を、２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ９に調整した水溶液に溶かした後、１当量のＮａＢＨ４を添加して常温で４時間攪拌し、ｐＨ感受性リガンドを合成した。
【００４０】
クエン酸塩(citrate)で安定化された金ナノ粒子の合成
金の前駆体であるＨＡｕＣｌ４を蒸留水に溶かし、１２０℃で３０分間加熱、攪拌した後、クエン酸三ナトリウム(trisodium citrate)を添加してさらに１２０℃で２時間加熱、攪拌する。この際、クエン酸三ナトリウムが還元剤及び表面リガンドとして作用するが、数分内に溶液の色が黄色から赤色に変化することにより、金ナノ粒子が作られたことが分かる。その後、常温で攪拌して冷やす(Ind. Chem. Res. 2007, 46, 3128-3136)。
【００４１】
ｐＨ感受性金ナノ粒子の合成
合成したｐＨ感受性リガンドが過量で溶解されている水溶液に、クエン酸塩で安定化された金ナノ粒子を入れ、８時間常温で攪拌した。ｐＨ感受性リガンドの一方の作用基がジチオール(dithiol)であって、カルボン酸(carboxylic acid)を作用基とするクエン酸塩(citrate)に比べて金ナノ粒子との強い表面結合力を持っているので、クエン酸塩がｐＨ感受性リガンドでリガンド交換(ligand exchange)される。その後、透析して余分なリガンドを除去する。
【００４２】
ｐＨ感受性金ナノ粒子と薬物の結合
１）ｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドとの結合体（conjugate）の合成
ｐＨ感受性金ナノ粒子をｐＨ７．０のリン酸緩衝液(phosphate buffer)に分散させた後、過量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide、ＥＤＣ）とスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド［sulfo-N-hydroxy succinimide、スルホＮＨＳ（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）］を添加し、常温で１０分間攪拌してｐＨ感受性金ナノ粒子を活性化させた。反応溶液をｐＨ７．０のリン酸緩衝液で３回透析して余分なＥＤＣとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを除去し、蒸留水に分散しているアレクサフルオール４８８ヒドラジドを添加した。その後、常温で３時間攪拌してｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体を形成した後、蒸留水で３回透析して余分なアレクサフルオール４８８ヒドラジドを除去した。
【００４３】
結合体の形成のために使用したＥＤＣとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳは、ｐＨ感受性金ナノ粒子の末端のカルボン酸(carboxylic acid)とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの１級アミン(primary amine)基がアミド結合によって結合させる分子篩であって、これによりｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体を図７のように形成した。
【００４４】
形成された結合体が細胞内エンドソームなどの弱酸性条件に晒されると、図８に示すように、ｐＨ感受性金ナノ粒子表面分子篩の加水分解が起こって金ナノ粒子からアレクサフルオール４８８ヒドラジドを放出する。
【００４５】
２）ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンとの結合体の合成
ｐＨ感受性金ナノ粒子をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に分散させた後、過量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を添加し、常温で１０分間攪拌してｐＨ感受性金ナノ粒子を活性化させる。反応溶液をｐＨ７．０のリン酸緩衝液で３回透析して余分なＥＤＣ及びｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを除去し、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液に分散しているドキソルビシン(doxorubicin)を添加する。その後、常温で３時間攪拌してｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体を形成した。
【００４６】
合成したｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体は、精製せず、直ちに細胞と共に培養した。結合体の形成のために使用するＥＤＣとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳは、ｐＨ感受性金ナノ粒子の末端のカルボン酸とドキソルビシンの１級アミン基(primary amine)とをアミド結合によって結合させる分子篩であって、これによりｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体を図９のように形成することができる。
【００４７】
結合体が細胞内エンドソームなどの弱酸性条件に晒されると、図１０のようにｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩の加水分解が起こって金ナノ粒子からドキソルビシンを放出する。
【００４８】
この際、ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面電荷が（−）から（＋）に変化するが、この過程で静電気的引力によって粒子間の凝集体を形成して長波長の光を吸収することができるので、抗癌薬物による化学治療と共に、長波長の光を用いた光熱治療を同時に行うことができる。
【００４９】
蛍光試験
ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩にアレクサフルオール４８８ヒドラジドを導入した結合体溶液と、結合体にＫＣＮを添加して金ナノ粒子を溶かした溶液の吸光及び蛍光スペクトルを図３に示した。
【００５０】
結合体が、よく分散した金ナノ粒子の吸光特性である５００ｎｍ付近の吸光帯域を有することにより、染料が結合した後にも金ナノ粒子が安定的によく分散していることが分かる（図３、左の黒色）。
【００５１】
同じ溶液にＫＣＮを添加して金ナノ粒子を溶かした後には金ナノ粒子による吸光特性が無くなることにより、金ナノ粒子が完全に除去されたことが分かる（図３、左の赤色）。
【００５２】
それぞれの蛍光スペクトルの場合、本来の結合体溶液ではアレクサフルオール４８８ヒドラジドの蛍光強度が非常に小さいが、ここにＫＣＮを添加して金ナノ粒子を除去した後には蛍光強度が約５０倍以上大きく増加した（図３、右）。
【００５３】
これにより、金ナノ粒子による染料の蛍光消滅作用が存在することが分かる。よって、ｐＨ感受性金ナノ粒子に染料が都合よく導入されて安定な結合体を形成していることを確認することができる。
【００５４】
ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩の末端に特定の分子が導入された結合体が酸性条件に晒されると、加水分解によって末端の作用基が解離するので、導入された分子を放出する。その後、ナノ粒子は隣接した粒子間の静電気的引力によって凝集体を形成する。
【００５５】
これを確認するために、先立って合成したｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体をそれぞれｐＨ７．６及びｐＨ１．０の条件に分散させた後、吸光及び蛍光スペクトルを測定した。測定されたスペクトルを図４に示した。
【００５６】
左の吸光スペクトルにおいて、結合体が中性条件のｐＨ７．６ではよく分散して５００ｎｍ付近の吸光帯域を有するが、酸性条件のｐＨ１．０では速く凝集体を形成して吸光帯域が６００ｎｍ以上の長波長へ移動することが分かる。
【００５７】
右の蛍光スペクトルの場合、ｐＨ７．６に比べてｐＨ１．０でアレクサフルオール４８８ヒドラジドの蛍光強度が増加することを確認することができる。これは結合体が酸性条件に晒されたときに金ナノ粒子によるアレクサフルオール４８８ヒドラジドの蛍光消滅作用が抑制されることを意味する。よって、ｐＨ感受性金ナノ粒子の表面に導入されたアレクサフルオール４８８ヒドラジドが解離して金ナノ粒子との距離が遠くなっていることが分かる。
【００５８】
上記の結果より、ｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体が酸性条件でアレクサフルオール４８８ヒドラジドの放出を開始すると同時に、金ナノ粒子間の凝集体が形成されて吸光帯域が長波長へ移動することが分かる。
【００５９】
図５は癌細胞であるマウス黒色腫細胞にｐＨ感受性金ナノ粒子とアレクサフルオール４８８ヒドラジドの結合体を共に培養した後、培養時間に伴ってアレクサフルオール４８８ヒドラジドの細胞内蛍光強度の増加を観察した顕微鏡写真である。
【００６０】
結合体が細胞内に取り込まれると、細胞内の酸性ｐＨを有しうるエンドソームなどの部分で加水分解が起こってアレクサフルオール４８８ヒドラジドの解離が誘導される。この際、金ナノ粒子へのエネルギー伝達現象により、消滅していたアレクサフルオール４８８ヒドラジドの蛍光が回復して、細胞内部で緑色の蛍光を観察することができる。
【００６１】
図５より、結合体を細胞と共に培養して１０分、３０分が経過したときには非常に弱い蛍光のみが観察されるが、培養１時間後から細胞内部で強い蛍光が見え始め、３時間が経過すると、蛍光強度がさらに増加することが分かる。
【００６２】
これにより、細胞内に取り込まれたｐＨ感受性金ナノ粒子の結合体からアレクサフルオール４８８ヒドラジドが徐々に放出されることを確認することができる。
【００６３】
このようにｐＨ感受性金ナノ粒子の結合体が細胞内に取り込まれた後、時間経過に伴って徐々に加水分解が起こり、結合していた分子が解離する現象を利用すると、抗癌薬物をｐＨ感受性金ナノ粒子の表面に結合させて薬物伝達体として使用することができる。
【００６４】
薬物試験
本実施例では抗癌薬物としてドキソルビシン(doxorubicin)を使用した。ドキソルビシンは、細胞核内のＤＮＡに挿入されて細胞の死滅を誘導する抗癌剤であって、６００ｎｍ付近のオレンジ色の蛍光を放出する。よって、結合体が癌細胞に浸透した後、酸性条件による加水分解によってドキソルビシンが金ナノ粒子から解離すると、癌細胞の核内にドキソルビシンが伝達されて核がオレンジ色の蛍光を放出する。試験結果を図６に示した。
【００６５】
実験群はｐＨ感受性金ナノ粒子の表面分子篩に抗癌剤のドキソルビシンを導入した後、乳癌細胞と共に培養して結合体の細胞内捕獲を誘導した（図６の中間パネル）。
【００６６】
比較群として、ドキソルビシンが結合していないｐＨ感受性金ナノ粒子（図６の左パネル）及びｐＨ感受性金ナノ粒子が結合していないドキソルビシン（図６の右パネル）を同じ条件で細胞と共に培養した。
【００６７】
培養後、蛍光顕微鏡で細胞を観察したとき、ドキソルビシンによって細胞内核がオレンジ色に染色される程度から、核へ伝達されるドキソルビシンの量を定性的に確認することができる。
【００６８】
まず、対照群として使用したドキソルビシンが結合していないｐＨ感受性金ナノ粒子の場合には、ドキソルビシンが存在しないので、２４時間が経過しても細胞核から蛍光が観察されない。
【００６９】
これに対し、ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体を培養した場合は、時間経過に伴って徐々にドキソルビシンの蛍光が現れ始め、１２時間（図６の中間パネル、４番目の項）が経過したときには鮮明にオレンジ色に染色された核を観察することができ、２４時間後（図６の中間パネル、５番目の項）には非常に鮮明な蛍光を観察することができる。
【００７０】
別の対照群であるｐＨ感受性金ナノ粒子が結合していないドキソルビシンのみを培養したときは、１時間（図６の右パネル、１番目の項）のみ培養しても蛍光が観察され始め、３時間後（図６の右パネル、３番目の項）には比較的強い蛍光が観察され、それ以降は時間経過に伴って少しずつ蛍光強度が増加するもののその変化が相対的に少ないことが分かる。
【００７１】
このように短い培養時間の条件でも強く蛍光が観察されるドキソルビシンのみを培養した場合に比べて、ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体は、蛍光の強度増加が相対的に遅い。
【００７２】
しかし、２つの場合とも、２４時間後には同様の蛍光強度を有するが、これは十分な時間が経過した後には細胞核へ伝達されるドキソルビシンの量が同一であることを示唆する。ｐＨ感受性金ナノ粒子に結合しているドキソルビシンが大部分放出されることが分かる。
【００７３】
ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体を培養した細胞からドキソルビシンの蛍光が観察されるためには、結合体が細胞内に取り込まれた後、加水分解によってドキソルビシンが解離しなければならない。
【００７４】
したがって、ｐＨ感受性金ナノ粒子とドキソルビシンの結合体が細胞内に取り込まれ、酸性のエンドソームで加水分解が起こってドキソルビシンを放出する一連の過程が比較的遅く起こるため、細胞核へのドキソルビシンの蓄積に長時間がかかることを確認することができる。
【００７５】
上記の結果より、ｐＨ感受性金属ナノ粒子の表面分子篩に抗癌薬物を導入して抗癌剤伝達システムとして使用する場合、ｐＨ感受性金属ナノ粒子を使用しない場合に比べて薬物放出の制御がより容易になることが期待できる。
【００７６】
すなわち、抗癌薬物のみを投与したときは、非常に速い時間内に細胞核への蓄積が起こって、短期間で過量の薬物を服用したような効果を示すが、ｐＨ感受性金属ナノ粒子との結合体システムを使用すると、薬物が比較的長い時間持続的に放出されるので、長時間制御された濃度の薬物を使用する効果を得ることができる。
【００７７】
このようにｐＨ感受性金属ナノ粒子との結合体システムを介して薬物放出を制御することができれば、薬物用量の過不足に関連した毒性を減らすことができ、投薬回数を減らすことにより、患者の不便さを減少させることができる。また、ｐＨ感受性金ナノ粒子の溶解度が高いので、抗癌薬物の低い溶解度を改善することができ、様々な種類の抗癌薬物を結合させて使用することができるという利点を持つことができる。
【００７８】
この際、抗癌薬物は、ドキソルビシンなどの既存の各種抗癌剤、或いはｓｉＲＮＡなどの遺伝子治療剤といった様々な種類の抗癌剤を使用することができる。
【００７９】
ｐＨ感受性金属ナノ粒子は、このような抗癌薬物伝達体としての機能の他にも、抗癌薬物の放出後に金属ナノ粒子が凝集体を形成して優れた光熱治療効果を有するので、光熱治療を併行することにより、より完全な癌細胞の死滅を誘導することができるという長所を持っている。
【００８０】
このような長所を利用すると、ｐＨ感受性金属ナノ粒子と抗癌薬物の結合体システムを効果的な抗癌薬物伝達体及び抗癌治療剤として用いることができるものと期待される。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月18日(2013.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するためのｐＨ感受性金属ナノ粒子であって、
前記金属ナノ粒子には抗癌剤が結合されており、
酸性ｐＨ条件で前記抗癌剤を放出することを特徴とするｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項２】
表面に化合物が結合されており、
前記化合物が下記化学式（１）の化合物である請求項１に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化１】
2013523877.tif 000026
【請求項３】
サイズが５〜１５ｎｍの範囲である請求項１に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項４】
加水分解によって前記抗癌剤を放出する請求項１に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項５】
前記抗癌剤が、ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、シスプラチン、およびブレオマイシン、またはこれらの組み合わせである請求項１に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【請求項６】
前記抗癌剤は１つのＮＨ２基を含んでおり、
前記抗癌剤を放出すると、前記ＮＨ２基が下記化学式（２）の化合物で置換される請求項２に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化２】
2013523877.tif 000027
【請求項７】
下記化学式（３）の化合物が結合した金属ナノ粒子。
【化３】
2013523877.tif 000028
【請求項８】
表面に化合物が結合されているｐＨ感受性金属ナノ粒子であって、
前記化合物が下記化学式（１）の化合物であり、
１級アミン基またはＯＨ基を含む染料が結合されていることを特徴とするｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【化４】
2013523877.tif 000029
【請求項９】
前記染料がアレクサフルオール４８８ヒドラジドである請求項８に記載のｐＨ感受性金属ナノ粒子。
【国際調査報告】
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