(57)【要約】  本開示の実施形態は、特定の細胞及び/又は汚染物質の分離/捕捉並びに癌の決定、監視及び治療に関する。更に、一部の実施形態は、癌の増殖を予防又は妨げるために、インビボ又はインビトロにおいて体液から癌、幹及び/又は腫瘍細胞を除去するための方法、システム及びデバイスに関する。一部の実施形態は、例えば、分離プロセスの間に体液中に存在する細胞に対して定量的にも定性的にも最小の有害作用を生じるいくつもの開口部(好ましくは精密である)を備える膜を含む血液適合性フィルタを提供する。例えば、一部の実施形態において、循環腫瘍細胞の大部分はフィルタにより捕捉されるが、白血球の大部分は、例えば通過可能であり、通過した白血球はその生命力を保持する。【選択図】図１
2013523135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球も少なくとも含有する体液からCTCを捕捉するための分離デバイスであって、
体液中に含有されるCTCの大部分を捕捉し、白血球の大部分がフィルタを通過するように構成されているフィルタを含み、
実質的に全ての通過した白血球の生命力が保持される、デバイス。
【請求項２】
前記フィルタが、厚さと、膜全体に配置され膜を貫通する複数の開口部とを含む膜を含む、請求項1に記載のデバイス。
【請求項３】
前記膜の厚さ及び前記開口部の幅は、前記体液中の白血球の大部分を通過させ、前記体液中の白血球の大部分の生命力を保持するように構成されている、請求項2に記載のデバイス。
【請求項４】
捕捉した前記CTC及び通過した前記白血球の少なくとも一つの大部分は、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超、及び約99.9%超からなる群より選択される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項５】
前記開口部が約3μmから約5μmの間の幅を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項６】
前記開口部が約5μmから約8μmの間の幅を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項７】
前記膜の厚さが前記開口部の幅の約5%から約25%の間である、請求項2に記載のデバイス。
【請求項８】
前記フィルタが、前記体液中に存在する赤血球が約1%未満の溶血率で通過することを可能にする、請求項1に記載のデバイス。
【請求項９】
前記フィルタが、前記白血球の約99%超の通過を可能にし、実質的に全ての通過した白血球の生命力が保持される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記フィルタが、約99.99%超の前記白血球の通過を可能にし、実質的に全ての通過した白血球の生命力が保持される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記膜が血液適合性又は生体適合性コーティングを更に含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記コーティングの厚さが約500ナノメートル未満である、請求項11に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記コーティングが無機材料を含む、請求項11に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記無機材料が、チタン、窒化チタン、二酸化チタン、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項13に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記コーティングが有機材料を含む、請求項11に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記有機材料が、ポリシロキサン、PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)、pHEMA(ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項15に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記有機材料のコーティングが、前記膜表面に共有結合している、請求項15に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記コーティングが、両性イオン基を有する、又は有さない、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリスチレンポリ(ビニルピリジン)、ポリ(ビニルイミダゾール)からなる群より選択される、請求項11に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記両性イオン基が、ホスホリルコリン、スルホベタイン、カルボキシベタイン、アミン-N-オキシド部分基、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項18に記載のデバイス。
【請求項２０】
受容体分子が前記フィルタを備える、請求項1に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記膜が両性イオンコーティングを含み、他の種の非選択的吸着を回避するために前記コーティング上に受容体分子を備える、請求項2に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記フィルタの流動能が、約5mPa-sの粘度を有する体液について約100パスカルの圧力にてフィルタ面積1cm2当たり約1ml/min超である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記フィルタの流動能が、約5mPa-sの粘度を有する体液について約4torrの圧力にてフィルタ面積9mm2当たり約40ml/h超であり、前記フィルタの開口部が5ミクロン以下の幅を有する、請求項1に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記フィルタの流動能が、約5mPa-sの粘度を有する体液について約12torrの圧力にてフィルタ面積9mm2当たり約5ml/h超であり、前記フィルタの開口部が3.5ミクロン以下の幅を有する、請求項1に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記両性イオン基が、両性イオン前駆体官能基を有するモノマーを重合することにより生成される両性イオンポリマーを含む、請求項18に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記膜の総面積に対する前記開口部の合わせた面積が少なくとも約25%である、請求項2に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記膜の少なくとも一部における二つの開口部の間の最も近い距離が前記開口部の幅の約2倍未満である、請求項2に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記膜が、約10GPa超のヤング率及び制御された内部応力の少なくとも一つを有する無機材料を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項２９】
捕捉した前記CTCの実質的に全てが前記膜の開口部内に閉じ込められるわけではない、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３０】
実質的に全ての捕捉したCTCが前記膜の表面に保持される、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記膜がコーティング(受容体分子を有する???)を含み、CTCが前記コーティングの表面に保持される、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記膜が、制御された内部応力を有するケイ素が豊富な窒化ケイ素を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記膜がダイヤモンド状炭素材料(DLC)を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記膜が、約10GPa超のヤング率及び約1GPa超の降伏強さを有する材料を含む、請求項2に記載のデバイス。
【請求項３５】
体液中に含有される白血球を保持しながら、前記体液からCTCを分離する方法であって、
流動能を有するフィルタを提供する工程と、
少なくとも複数のCTC及び複数の白血球を含む体液を、前記フィルタに流す工程と、
前記体液中に含有されるCTCの大部分を前記フィルタによって捕捉する工程と、
前記白血球の大部分を、前記フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、実質的に全ての通過した前記白血球の生命力が保持される、工程と、
を含む方法。
【請求項３６】
捕捉した前記CTC及び通過した前記白血球の少なくとも一つの大部分が、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超、及び約99.9%超からなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2010年3月31日に出願された「Device and Method for Separation of Circulating Tumor Cells」という発明の名称のNL1037837及び2010年11月4日に出願された「Device and Method for Separation of Circulating Tumor Cells」という発明の名称のNL1038359号の利益及び優先権を主張する。それらの開示はいずれも、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
本開示の分野
本開示の実施形態は、血液から循環腫瘍細胞(CTC)を分離及び計数することのうちの少なくとも一つ、一部の実施形態においてはそれらの両方についての方法、システム及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
原発性癌の転移は、癌細胞(循環腫瘍細胞、即ちCTC)が原発性癌から末梢血及び/又はリンパ循環に移動した時に開始すると考えられる。従って、これらのCTCの除去は重要である。CTCは最終的に毛細血管又はリンパ節により閉じ込められ得るが、CTCはまた、循環系を通して何度も移動することも知られている。
【０００４】
CTCを除去する任意の診断上又は治療上の理由以外に、創薬研究開発などのための任意の実験を含む分析のためにCTCを捕捉することも重要である。このように、後者の使用のために体液からCTCを捕捉することも重要である。
【０００５】
血液からの循環腫瘍細胞の分離及び計数は、転移性癌を臨床的に評価し、さらには種々の治療法の治療効果を監視するために使用することもできる。血液からCTCを分離及び計数するための現在の技術は、電磁ビーズ分離、密度勾配遠心分離法、及び濾過法、又はそれらの組合せに基づいている。
【０００６】
生体機能化(bio-functionalized)表面(例えば、セレクチンCD62)はCTCを捕らえるか又はそれと接着することが示されているが、このような表面は、癌細胞の特定の画分のみを特定の時間しか得ることができないという不都合な点を有する。更に、免疫反応を誘発し得る生体機能化表面には、タンパク質及び他の機能細胞が接着する場合がある。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の実施形態の一部は、流体からCTCを分離すること、流体から汚染物質(例えば、細菌及びウイルス細胞を含む任意の細胞種類)を分離すること、体液からCTC/汚染物質を分離すること、血液からCTC/汚染物質を分離すること、並びに未処理及び未加工の血液の少なくとも一つからCTC/汚染物質を分離することを含む、あらゆる分離のための方法、システム及び/又はデバイスを提供する。上述のいずれかにおいて、本開示の一部の実施形態は、CTC/汚染物質を分離するだけでなく、成分、細胞(例えば、赤血球、白血球細胞(while blood cell)/白血球(leukocyte)、血小板、細菌、ウイルス)の少なくとも一つの生命力を保持しながらそれを分離するための方法、システム及びデバイスを提示する。一部の実施形態は、一つ又は複数の癌の評価、監視及び治療の少なくとも一つのための方法、システム及び/又はデバイスを提示する。更に、あらゆる実施形態において、プロセス(並びにこのようなプロセスを実施するためのシステム及び/又はデバイス)は、インビボ又はインビトロの一方又は両方においてあらゆる顕著な機能性を達成できる。一部の実施形態による、このような能力は、疾患、例えば癌(及び/又はその増殖)を妨げること、予防すること、及び治療することの少なくとも一つに役立ち得る。
【０００８】
従って、本開示の実施形態の少なくとも一部の目的は、体液、例えば血液試料中のCTCを閉じ込める及び/又は捕捉することである。一部の実施形態において、循環系を通して移動しているCTCを捕捉することにより、癌の増殖を予防又は少なくとも妨げることを目的とする。
【０００９】
捕捉は、所定の厚さと、膜上に所定のサイズ、形状及び配置の少なくとも一つを有する開口部とを有する膜の表面に対する標的粒子の保持及び結合の少なくとも一つにより粒子を分離するフィルタの使用による、流体からの標的粒子(例えば細胞)の分離と定義され得る。一部の実施形態によれば、捕捉は、例えば親和性物体(例えば抗体)を含み得る、膜表面のコーティングに対する標的粒子の保持及び結合を含んでもよい。
【００１０】
本開示の実施形態の少なくとも一部の目的は、体液中の任意の他の細胞の存在に対して定量的にも定性的にも最小の有害作用で、癌の増殖を予防する、妨げる(及び/又は癌を治療する)ために、体液(試料、又は患者から直接)からインビボ及びインビトロの少なくとも一つで癌細胞を除去することである。一部の実施形態において、濾過した体液は、その体液が由来する患者に戻してもよく、及び/又は実験、患者若しくは別の患者における使用、分析などのために保存してもよい。
【００１１】
本開示の実施形態の少なくとも一部の別の目的は、標的癌に対する臨床的評価、及び治療効果の監視の少なくとも一つのための方法、システム及び/又はデバイスを提供することである。
【００１２】
本開示の実施形態の少なくとも一部の別の目的は、統計的に有意な量の細胞(例えば105)を閉じ込め及び/又は捕捉するための、患者の血液の物質的損失を実質的に生じない(一部の実施形態においては、患者の血液の物質的損失を生じない)、リアルタイムで非侵襲性の体外液体生検を提供することであり、次いでその細胞は、治験検証、治療決定、遺伝学的研究、並びに/又は他の関連診断及び/又は治療法のために使用され得る。例えば、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3-キナーゼ又はPI3K)は、細胞成長、増殖、分化、運動性、生存及び細胞内移動などの細胞機能に関与し、次いでそれが癌細胞に関与する、酵素のファミリーである。このように、液体CTC生検は、(例えば)これらの酵素のうちの一つ又は複数における変異がCTCで発生したか否かを決定するために使用され得る。従って、このような決定は、患者にとって適切な治療を決定するための要素として使用され得る。
【００１３】
本開示の少なくとも一部の実施形態によれば、CTCを含有する体液は、体液からCTCを捕捉する、又はそうでなければ分離するために、濾過のための前処理を必要としない、例えば、本開示の実施形態は濃縮、希釈、固定(例えばホルムアルデヒドなどの固定剤)などを必要としないことが特定の特徴である。CTCを濾過するための既知の従来技術のシステムは全て、ある種の濃縮又は細胞固定、即ち、(例えば)患者の血液試料の希釈を必要とする。このような際立った特徴は、体外システムにおいて特に重要であり、なぜなら、(例えば)患者の血液を既知の従来技術のシステムに必要とされる程度(例えば10:1)まで連続して希釈又は固定することは実用的でないからである。当業者であれば理解されるように、このような程度の希釈は、このようなシステムの有用性を、一度に患者から採取することができる血液量(最大20ml)に対して本質的に制限している。従って、このようなシステムは、本開示の実施形態と比べて比較的少数のCTCしか捕捉できない。例えば、「3D microfilter device for viable circulating tumor cell(CTC) enrichment from blood」、Zheng et al., Springer Science+Business Media,LLC,2010年10月27日)、及び「Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip」、Stott et al., PNAS, 2010年10月26日(これらの両方の開示はその全体が本明細書に参照として組み込まれる)を参照されたい。
【００１４】
本開示全体を通して、さらには特許請求の範囲に列挙されているように、頭字語CTC(循環腫瘍細胞)は、以下の細胞種類及び/又は分類:癌細胞、腫瘍細胞(悪性又は良性)、及び幹細胞のいずれか一つを含んでもよい。一部の実施形態において、CTCはまた、保存、分析、実験、診断、治療及び処置の少なくとも一つのための、細菌及びウイルス、汚染物質、並びに/又は体液から捕捉されることが望まれる任意の標的粒子を含んでもよい。従って、癌細胞は任意の腫瘍、悪性及び/又は疾患細胞を含む。
【００１５】
更に、「体液」という語は、身体の任意の体液、例えば血液を含むことに加えて、一部の実施形態においては、捕捉するための癌細胞を含有する任意の試料流体をも意味する。
【００１６】
一部の実施形態において、重要な特徴は、体液中のCTCの全て又は実質的に全てを捕捉(又はそうでなければ濾過、保持、分離)しながら、体液(例えば血液)に含有される白血球(「白血球細胞」とも称され、この語は本開示全体を通して白血球と交換可能に使用される)の大部分、好ましくは全て、又は実質的に全てを通過させること、並びに通過した白血球の全て又は実質的に全ての生命力を保持することである。一部の治療的実施形態において、このような機能性により、患者の免疫系の保護及び/又は強化が可能となる。
【００１７】
更に、一部の実施形態において、捕捉されたCTCを樹状細胞(例えば細胞株由来)と融合させて、ハイブリッド細胞を生成し、次いでこの細胞を使用して患者の免疫系を活性化させる(即ち、融合したCTC/樹状細胞は患者に戻す)ことができる。ハイブリッド細胞を患者に与える場合、その細胞は患者の腫瘍特異性抗原のスペクトルを表すと考えられる。患者の免疫系が十分に健康な白血球細胞を有する場合、患者の免疫系が癌細胞を殺傷するのに適切な反応を生じるという、より多くの機会が存在する。そのため、少なくとも100,000個のハイブリッド細胞がこれを発生させるのに必要とされると考えられる。従って、本開示の一部の実施形態によるデバイスは、血液から比較的多数のCTC(例えば100,000個より多い)を獲得することができる。更に、一部の実施形態において、CTCは、膜表面に付着される腫瘍特異性抗原への保持、及び結合の少なくとも一つにより捕捉される。
【００１８】
一部の実施形態において、捕捉されたCTCからハイブリッド細胞を生成する融合方法が提供される。例えば、CTC(例えば約100,000個又はそれ以上)を有する膜は、膜表面(CTCを有する)を表向きにして細胞融合チャンバの底部に置かれる。好ましくは、等しい数の樹状細胞がチャンバ内に供給(導入?)される。樹状細胞は、(重力及び膜内の開口部を通る濾過の少なくとも一つにより)CTCの上部にゆっくりと堆積される。次に、(当該技術分野で知られている)適切なRFパルス列を、樹状細胞をCTCに融合するために適用し、その結果としてハイブリッド細胞が生成される。例えば、細胞を有する膜は、交番磁界、例えば、(例えば)1MHzにて約250〜300V/cmに供されて、細胞懸濁液を安定化させる。次に、十分な振幅の融合パルス(例えば約1500V/cm)及び持続時間(例えば約30〜50μs)が適用される。融合パルスの後、同じ周波数の交番磁界が再度適用されて、細胞質の混合及び二核ハイブリッド細胞周囲の膜の再構成の間、細胞間の接触を維持する。
【００１９】
一部の実施形態において、特に診断的実施形態に関して、患者の癌を評価し、治療を策定するのに、捕捉されたCTCのDNA分析が必須であるという点で、白血球の大多数(及び上記に示したように、好ましくは実質的に全ての白血球、及び最も好ましくは全ての白血球)を通過させるという特徴は重要な特徴となる。従って、フィルタ/膜上に白血球を有することは望ましくない。
【００２０】
一部の実施形態において、体液に含有される白血球を保持しながら、患者の体液からCTCを分離する方法が提供される。この方法は、流動能を有するフィルタを提供する工程と、少なくとも複数のCTC及び複数の白血球を含む体液を、フィルタに流す工程と、体液に含有されるCTCの大部分をフィルタによって捕捉する工程と、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、通過した白血球の実質的に全ての生命力は保持される、工程とを含む。
【００２１】
このような実施形態において、例えば、捕捉されたCTC及び通過した白血球の少なくとも一つの大部分は、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超、及び約99.9%超からなる群より選択される。
【００２２】
更に、このような実施形態において、フィルタが第1の種類のCTCを捕捉するために最初に最適化され、体液に存在する第1の種類のCTCの大部分が捕捉される。このような最適化は、所定の濾過面積及び濾過面積の1単位当たり所定量のフィルタ開口部及び所定の幅を有する第1のフィルタを用いて所定の濾過圧力にて所定量の体液の第1の試料を濾過すること、第1のフィルタにより所定量の体液に含有されるCTCを捕捉すること、捕捉されたCTCの量を測定し、その量を捕捉割合と関連付けること、捕捉割合が所定の捕捉割合未満である時に、所定量の体液の第2の試料からのCTCの濾過を反復することを含んでもよく、ここで、後の濾過の反復に関して、濾過圧力、濾過面積、濾過面積の1単位当たりのフィルタ開口部の量、及びフィルタ開口部の幅の少なくとも1つは、以前の濾過の反復から変更される。一部の実施形態において、固定したCTCは所与のフィルタの種類に対してより高い捕捉効果を示す。
【００２３】
同様に、一部の実施形態において、捕捉した固定していないCTCは、それらを、比較的狭い幅(例えば約3〜6マイクロメートル)の開口部を有する膜を通して十分に高い圧力(例えば50〜500mbar)で押圧することにより不活性化されてもよい。パルスが例えば約15分間隔で約毎秒印加されて、膜開口部を通してCTCを押圧してもよく、従って、血液から捕捉した望ましくないCTCを、(例えば)治療期間の間、膜から除去するために使用されてもよい。一部の実施形態において、他の血球に対してあらゆる起こり得る有害作用を最小化するために、(可能な限り)比較的短期間、パルスを維持することが好ましい。従って、このような特徴を用いて患者の血液からCTCを捕捉するための体外システムの一部の実施形態もまた、本開示により提示される。
【００２４】
一部の実施形態において、膜表面上に捕捉したCTCは、導電性ホウ素又はリンがドープされたダイヤモンド状炭素膜(DLC)を用いることにより不活性化/殺傷されてもよい。これらの導電性膜は、物質を分解しない比較的高い電圧パルスに供されて、導電性膜表面上に存在する全ての有機種を攻撃する強力なラジカル分子を作製してもよい。(例えば殺菌のために)膜の全体の洗浄が達成され得ても高電圧にて駆動している間、軽度の電圧パルスにて、膜表面に存在するCTCが(例えば治療期間の間)不活性化される。
【００２５】
一部の実施形態によれば、フィルタは、厚さと、膜に配置され膜を通過する複数の開口部とを含む膜を含む。一部の実施形態において、膜の厚さ及び開口部の幅は好ましくは、CTC及び/又は他の汚染物質の大部分を捕捉し、白血球及び/又は体液中の他の「良好な」成分の大部分を通過させ、それらの生命力を保持するように構成されている。
【００２６】
一部の実施形態において、癌患者の免疫系を保持及び/又は増強する方法が提供され、癌患者の所定量の血液の流れをフィルタに方向付けること、血液に含有されるCTCの大部分をフィルタによって捕捉すること、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させることを含み、ここで、通過した白血球の実質的に全ての生命力は保持され、濾過した血液に含有される通過した白血球は患者に戻されるように方向付けられる。以前の実施形態と同様に、捕捉したCTC及び通過した白血球の少なくとも一つの大部分は、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超、及び約99.9%超からなる群より選択される。
【００２７】
一部の実施形態において、少なくとも白血球を含有する体液からCTCを捕捉するためのシステムも提供され、該システムは、ポンプと、注入口及び排出口を有するフィルタと、体液源とフィルタとの間の流体連通を確立する第1の導管と、フィルタとポンプとの間の流体連通を確立する第2の導管とを含む。フィルタは、体液に含有されるCTCの大部分を捕捉し、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させるように構成されており、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される。
【００２８】
このような実施形態において、以下のあらゆるものが更に含まれてもよい:第1の導管における圧力を測定するための第1の圧力センサ、及び第2の導管における圧力を測定するための第2の圧力センサ。ポンプは、蠕動ポンプ、ギアポンプ、進行性空洞ポンプ、ルーツ式、ベンチュリポンプ、ピストン/往復ポンプ、圧縮ガス/空気ポンプ、及び上述のいずれかの組合せからなる群より選択される。
【００２９】
いずれかのシステムにおいて、本対象の開示により提示される実施形態(及び更にデバイスコンポーネント)はまた、作動を制御するため及び/又はデバイス/システムの流れ及び圧力の少なくとも一つを監視するための制御装置を含んでもよい。
【００３０】
一部の実施形態において、患者の血液からCTCを捕捉するための体外システムが提供され、必要に応じて、ポンプループ応答タイマーと、ポンプと、フィルタと、患者からの血液の供給とポンプとの間の流体連通を確立するための第1の導管と、ポンプとフィルタとの間の流体連通を確立するための第2の導管と、フィルタから外部への流体連通を提供するための第3の導管と、を備える制御装置を含む。フィルタは、血液に含有されるCTCの大部分を捕捉し、白血球の大部分をフィルタを通り抜けて通過させるように構成されており、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される。
【００３１】
このような実施形態において、第3の導管が、フィルタと患者又は容器との間の流体連通を確立し、また、バルブを備えてもよく、その場合、第3の導管がフィルタとバルブとの間に流体連通を提供する。なおさらなる実施形態において、第4の導管が、バルブと患者との間の流体連通を確立するためのこのようなシステムのために提供されてもよく、その場合、濾過した血液は患者に戻されるように送達される。
【００３２】
このような実施形態は更に、フィルタアセンブリ内への流体連通の圧力を監視するための少なくとも一つの圧力センサ、又は患者とポンプとの間の流体連通の圧力を監視するための第1の圧力センサと、ポンプとフィルタとの間の流体連通の圧力を監視するための第2の圧力センサとの少なくとも二つの圧力センサを備えてもよい。なお更に、このようなシステムは、第3及び第4の圧力センサであって、フィルタとバルブとの間の圧力を監視するための第3の圧力センサ、及びバルブと患者との間の圧力を監視するための第4の圧力センサを更に備えてもよい。
【００３３】
バブルセンサもまた、例えば第3の導管において体液中の泡を検知するために更に提供されてもよい。
【００３４】
本開示のあらゆる実施形態は更に、捕捉した汚染物質、CTCなどを計数するため、又はそうでなければ特徴付けるための一つ又は複数の計数装置を備えてもよい。このような計数デバイス/システムには、例えば:CASYセルカウンター、及びCoulterカウンターが含まれてもよい(例えば米国特許第7,738,094号、7,136,152号、6,974,692号、6,350,619号、5,962,238号、5,556,764号、4,296,373号、及び3,977,995号もまた参照のこと;上述の参考文献はその全体が本明細書に参照として援用される)。
【００３５】
一部の実施形態において、分離システムを用いて体液から癌細胞を分離する方法であって、該分離システムが、制御装置と、第1の方向付けられた流量を提供するためのポンプと、フィルタと、体液源とフィルタとの間の流体連通を確立する第1の導管と、フィルタアセンブリとポンプとの間の流体連通を確立する第2の導管と、第1の導管における流体連通の第1の圧力P1を監視するための第1の圧力センサと、第2の導管における流体連通の圧力P2を監視するための第2の圧力センサと、少なくともポンプの作動を制御するための制御装置とを備える、方法が提供される。該方法は、所定の時間間隔で圧力P1及びP2を測定する工程を含み、ここで、各時間間隔に関して、該方法は更に、P1とP2との間の差圧値を決定する工程と、該差圧値と所定の標的圧力範囲とを比較する工程を含む。標的圧力範囲は標的圧力値±圧力ヒステリシス値を含む。このような実施形態において、入力差圧値が標的圧力範囲内である時、第1の方向付けられたポンプの流量は解放され、プロセスは、後の時間間隔についての圧力P1及びP2の測定に戻り、入力差圧値が標的圧力範囲外である時、新たなポンプ流量が決定され、第1の方向付けられたポンプ流量は新たなポンプ流量に変更され、プロセスは、後の時間間隔についての圧力P1及びP2の測定に戻る。
【００３６】
このような実施形態において、システムは更に、ポンプループ応答タイマーを備え、ここで、該ポンプループ応答タイマーはカウントダウン形式で作動し、新たなポンプ流量の計算は以下を含む:入力差圧値の検出が標的圧力値と圧力ヒステリシス値の合計より大きい時、新たなポンプ流量は流量ステップサイズによる第1の方向付けられたポンプ流量の減少を含む。更に、入力差圧値の検出が標的圧力値と圧力ヒステリシス値との間の差未満である時、新たなポンプ流量は流量ステップサイズによる第1の方向付けられたポンプ流量の増加を含む。このような実施形態において、流量ステップサイズはオーバーシュートを除去するように選択される。
【００３７】
一部の実施形態において、癌及び/又は癌の種類を診断する方法が提供され、この方法は、流動能を有するフィルタを提供する工程と、少なくとも複数のCTC及び複数の白血球を含む体液を、フィルタに流す工程と、体液に含有されるCTCの大部分をフィルタによって捕捉する工程と、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される、工程と、捕捉したCTCの分析を実施する工程と、癌及び/又はCTCの癌の種類を決定する工程とを含む。
【００３８】
一部の実施形態において、癌を治療する方法が提供され、この方法は、流動能を有するフィルタを提供する工程と、少なくとも複数のCTC及び複数の白血球を含む体液を、フィルタに流す工程と、体液に含有されるCTCの大部分をフィルタによって捕捉する工程と、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される、工程と、捕捉したCTCの分析を実施する工程と、癌及び/又はCTCの癌の種類を決定する工程と、決定した癌についての治療を決定する工程とを含む。
【００３９】
一部の実施形態において、患者の免疫系を保持及び/又は増強する方法が提供され、この方法は、流動能を有するフィルタを提供する工程と、少なくとも複数の汚染物質及び複数の白血球を含む体液を、フィルタに流す工程と、体液に含有される汚染物質の大部分をフィルタによって捕捉する工程と、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される、工程と、通過した白血球を含有する濾過した体液を患者に戻すように方向付ける工程とを含む。
【００４０】
一部の実施形態において、体液に含有される白血球を保持しながら患者の体液から汚染物質を分離する方法が提供され、この方法は、流動能を有するフィルタを提供する工程と、少なくとも複数の汚染物質及び複数の白血球を含む体液を、フィルタに流す工程と、体液に含有される汚染物質の大部分をフィルタによって捕捉する工程と、白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程であって、通過した白血球の実質的に全ての生命力が保持される、工程とを含む。
【００４１】
一部の実施形態において、CTC/樹状細胞を融合する方法が提供され、この方法は、一定量のCTCを有する膜を提供する工程と、CTCを有する膜を、CTCを有する膜表面を表向きにして細胞融合チャンバの底部に配置する工程と、少なくとも対応する量の樹状細胞をチャンバに供給する工程であって、樹状細胞はCTCに堆積する、工程と、RFパルスシーケンス(例えば上記を参照のこと)を印加する工程であって、樹枝細胞はCTCと融合してハイブリッド細胞を形成する、工程とを含む。
【００４２】
一部の実施形態において、膜を含むCTCフィルタをコーティングする方法が提供され、この方法は、窒化ケイ素の第1の表面を有する膜を提供する工程であって、窒化ケイ素はSi-H及びNH2官能基の少なくとも一つを含有し、酸化ケイ素の層が第1の表面に存在する、工程を含む。この方法はまた、膜の第1の表面上の酸化ケイ素層を除去する工程と、窒化ケイ素表面を、Si-C結合を介した表面への直接共有結合のための末端アルケン又はアルキン部分の少なくとも一つを含有する化合物と反応させる工程とを含む。
【００４３】
従って、複数の治療及び診断的実施形態を含む、多くの他の実施形態が可能である。例えば、本開示の一部の実施形態は、体液からのCTCの捕捉、捕捉したCTCを遺伝的に分析する工程、癌の種類を決定する工程及び/又は治療を決定する工程を含む。治療を決定する工程は決定した癌に利用可能な任意の治療であってもよい。このように、本開示の実施形態は、例えば本開示の実施形態の一部の濾過/分離特徴を用いて、癌(及び/又は癌の種類)を決定する方法、癌の治療を決定する方法、及び癌を治療する方法を含む。
【００４４】
一部の実施形態に係る膜の開口部は、約3μmから約5μmの間であってもよく、一部の実施形態において、約5μmから約8μmの間の幅を含んでもよい。
【００４５】
本明細書に開示される方法、システム、及びデバイスのあらゆるものに関する上記の実施形態の一つ又は複数、並びに本開示により支持される任意の他の実施形態は、以下の特徴のうちの一つ又は複数を含んでもよい:
-第1の種類のCTCを捕捉するためのフィルタの最適化、及び体液に存在する第1の種類のCTCの大部分が捕捉される;
-(上記に示したような)このような最適化は、所定の濾過面積及び濾過面積の1単位当たり所定量のフィルタ開口部及び所定の幅を有する第1のフィルタを用いて所定の濾過圧力にて所定量の体液の第1の試料を濾過する工程と、第1のフィルタにより所定量の体液に含有されるCTCを捕捉する工程と、捕捉したCTCの量、捕捉割合に関連する量を測定する工程と、捕捉割合が所定の捕捉割合未満である時、所定量の体液の第2の試料からのCTCの濾過を反復する工程の一つ又は複数(及び好ましくはいくつか又は全て)を含んでもよい。後の濾過の反復に関して、濾過圧力、濾過面積、濾過面積の1単位当たりのフィルタ開口部の量、及びフィルタ開口部の幅は、以前の濾過の反復から変更される。
【００４６】
-膜の厚さ及び開口部の幅は、CTCの大部分を捕捉し、体液中の白血球の大部分を通過させ、それらの生命力を保持するように構成されている;
-体液はフィルタに流す前に処理されない;
-体液はフィルタに流す前に固定剤で処理されない;
-捕捉したCTC及び通過した白血球の少なくとも一つの大部分が、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超、及び約99.9%超からなる群より選択される方法;
-あらゆる流体導管に沿って圧力を決定する圧力センサ(複数も含む);
-蠕動ポンプ、ギアポンプ、進行性空洞ポンプ、ルーツ式、ベンチュリポンプ、ピストン/往復ポンプ、圧縮ガス/空気ポンプ、及び上述のいずれかの組合せからなる群より選択されるポンプ;
-一つ又は複数の制御装置、プロセッサ、モニタ、センサ、メモリ、通信手段、並びに作動、報告、通信、及び/又は本明細書に開示される任意の方法、システム及び/又は装置の監視をアナログ、デジタル若しくはそれらの組合せのいずれかを介して制御する回路;
-いずれかの開示される要素(例えばフィルタ、ポンプ、センサ、容器、患者、バルブなど)間の流体連通を確立するための一つ又は複数の流体導管;
-一つ又は複数のバルブ;
-システムのいずれかの場所(例えばポンプ、フィルタ、導管、バルブ)に提供される圧力及び/又はバブルセンサ;
-一部の実施形態に係るシステム/デバイスのいずれかの場所に提供される、捕捉したCTC、汚染物質及び通過した細胞(例えば白血球)の少なくとも一つを計数又はそうでなければ特徴付けるための一つ又は複数の計数デバイス;
-一つ又は複数のCTCの少なくとも一部に接着するように構成されている機能性抗体及び/又は受容体分子を含む濾過膜であって、このような受容体分子は、他の種の非選択的吸着を回避するために両性イオンコーティング上に構成されていてもよい、濾過膜;
-時間がカウントダウン形式で作動するタイマー、例えばポンプループ応答タイマー;
-標的圧力値と圧力ヒステリシス値の合計より多い入力差圧値の検出時に、新たなポンプ流量は、流量ステップサイズにより第1の方向付けられたポンプ流量の減少を含み、標的圧力値と圧力ヒステリシス値との間の差未満の入力差圧値の検出時に、新たなポンプ流量は、流量ステップサイズにより第1の方向付けられたポンプ流量の増加を含む、の一つ又は複数(及び好ましくはいくつか又は全て)を含んでもよい新たなポンプ流量を計算するための方法、システム及びデバイス;
並びに
-流量ステップサイズ(上記を参照のこと)はオーバーシュートを除去するように選択されてもよい。
【００４７】
これら及び他の実施形態、本出願に開示される方法、システム及びデバイスの目的及び利点は、以下の図面及び以下の詳細な説明を参照することにより更に十分に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本開示の一部の実施形態に係る癌細胞を捕捉するための膜の断面図を示す。
【図２Ａ】図2A及び2Bは、対象の開示の一部の実施形態に係る、流体の流れからの癌細胞の分離後、癌細胞の存在について20倍の倍率で見た膜を示し、図2Aは、両性イオンコーティングを有さない膜の実施形態を示し、図2Bは、両性イオンコーティングを有する膜の実施形態を示す。
【図２Ｂ】図2A及び2Bは、対象の開示の一部の実施形態に係る、流体の流れからの癌細胞の分離後、癌細胞の存在について20倍の倍率で見た膜を示し、図2Aは、両性イオンコーティングを有さない膜の実施形態を示し、図2Bは、両性イオンコーティングを有する膜の実施形態を示す。
【図３Ａ】図3Aは、対象の開示の一部の実施形態に係る、制限された流体試料からCTC(及び/又は他の細胞、汚染物質など)を分離するためのシステムの概略図を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、対象の開示の一部の実施形態に係る、制限された流体試料からCTCを分離するための図3Aに示した概略図の例示的なシステムの斜視図を示す。
【図４Ａ】図4Aは、対象の開示の一部の実施形態に係る、大きな流体試料(例えば患者由来の直接的/間接的な有意な量の血液)からCTC(及び/又は他の細胞、汚染物質など)を分離するための体外システムの概略図を示す。
【図４Ｂ】図4Bは、対象の開示の一部の実施形態に係る、大きな流体試料からCTCを分離するための図4Aに示す概略図の外部システムの斜視図を示す。
【図５】対象の開示の一部の実施形態に係る、図3A-Bに提供される例示的なシステムを介して流体試料(例えば体液)の流れを制御するための例示的なプロセスの流れを示す。
【図６】正常なヒト成体組織に見出される上皮細胞接着分子(Ep-CAM)の分布を示す表である(例えば、Balzar, M, et al.,「The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)」, J. Mol. Med., 77:699-712(1999)を参照のこと)。
【図７】ヒトの悪性腫瘍形成のEp-CAM発現を示す表である(例えば、Balzar,M.et al.,「The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)」,J.Mol.Med.,77:699-712(1999)を参照のこと)。
【図８Ａ】図8A及び8Bは、本開示の一部の実施形態に係る、フィルタ膜の表面全体に配置された開口部を有するフィルタ膜の(異なる倍率の)拡大写真である。
【図８Ｂ】図8A及び8Bは、本開示の一部の実施形態に係る、フィルタ膜の表面全体に配置された開口部を有するフィルタ膜の(異なる倍率の)拡大写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示の少なくとも一部の実施形態は、体液(例えば血液)に含有されるCTCの大部分を分離(捕捉又は濾過とも呼ばれる場合があり、分離、捕捉及び濾過は本開示全体を通して交換可能に使用される)するための方法、システム、及びデバイスを提供し、このような実施形態は血液適合性フィルタを含む。このようなフィルタは、いくつもの開口部を備える膜又は同様の構造(例えばマイクロシーブ/フィルタ;開口部は孔(複数)又は単数の孔とも呼ばれる)を含んでもよく、一部の実施形態において、開口部は精密である。即ち、一部の実施形態に係る開口部の許容差は、約0.5μm未満、約0.25μm未満、約0.1μm未満、約0.05μm未満、約0.025未満、及び約0.01μm未満の範囲内である。注目すべきことは、一部の実施形態において、膜は、任意の全体的に薄く平坦で、厚さを有するプレート状の構造であってもよく、例えば、中空繊維、エッチング飛跡膜、微細機械加工膜、PDMS膜などが含まれ、このような膜は単層又は高性能化/複雑な構造(例えば3次元)のいずれであってもよい。
【００５０】
一部の実施形態によれば、大部分には、(CTC及び/又は他の所定の特異的細胞及び/又は汚染物質の捕捉、白血球及び/又は濾過媒体の他の生体成分(即ち体液)の通過の少なくとも一つに関して、限定されないが、約:50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.9%、及び99.99%を超える値、並びにこのような百分率の間の値が含まれる。
【００５１】
一部の実施形態において、膜上に設けられる開口部は最小作用、一部の実施形態において、分離/濾過プロセス(本開示の実施形態に関して、分離及び濾過は同意語として使用される)の間の体液に存在する正常細胞及び/又は成分に対して、並びに特に体液に存在する白血球に対して、定量的及び定性的の両方で、最小有害作用を有する。更に、少なくとも開示される実施形態の一部において、以下のうちの少なくとも一つは体液の濾過の結果である:実質的に溶血が生じず、実質的に血小板損傷及び/又は活性化が生じず、実質的に白血球損傷、活性化及び/又は保持が生じない。一部の実施形態において、以下のうちの少なくとも一つは体液の濾過の結果である:溶血が生じず、血小板損傷及び/又は活性化が生じず、白血球損傷、活性化及び/又は保持が生じず、さらには補体系活性化、凝固系活性化、血栓形成など(例えば、体外血管系を試験するためのISO要件)が生じない。
【００５２】
例えば一部の実施形態において、定量的及び定性的とは、赤血球が(実施形態に依存して)約1%未満、約0.8%未満、約0.5%未満、又は約0.1%未満の溶血率で膜を通過することを意味する。例えば一部の実施形態によれば、定量的及び定性的とは、膜が、例えば、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.9%及び99.99%を含む大部分のCTCを保持でき、顕著な血小板活性化を起こすことなく血小板の約90%超、一部の実施形態において、好ましくは、約95%、約99%、約99.9%、及び約99.99%超並びにこのような百分率の間の値である、血小板の大部分を通過させることができることを意味する。更に、一部の実施形態において、定量的及び定性的とは、例えば、膜がCTCを保持でき、白血球細胞に対する損傷が最小から実質的にない状態で、及び/又は白血球細胞活性化が最小から実質的にない状態で白血球細胞の95%超を通過させることができることを意味する。更に、一部の実施形態によれば、このような割合は、(実施形態に依存して)約99%、約99.9%、及び約99.99%であってもよい。このような実施形態に関して、定性的はまた、フィルタを通過する白血球の大部分の生命力が(例えば、健康に機能して)保持されることを暗示する場合がある。一部の実施形態によれば、通過した白血球の大部分には、限定されないが、約:95%、99%、99.9%、99.99%、99.9999%及び99.999999%及びこのような割合の間の値が含まれる(通常、通過した白血球の実際の数は多くのオーダー又はより多くの量であるため、保持される白血球の最大数は膜の開口部の数より少ない)。従って、細胞(例えば通過した白血球)の生命力は、例えばヒト又は動物の身体内でそれらの意図される機能を発揮し得る健康で適切及び/又は十分な細胞と定義されてもよい。
【表１】
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【００５３】
窒化ケイ素上に有機コーティングを塗布するのに利用可能な方法の実施形態の一部のいくつかの特徴を表1にまとめる。理想的には、この技術により、表面独立性及び拡張性プロセス全体にわたって制御された厚さ及び少ない粗さを有する共形コーティングが生じることが好ましい。例えば、自己組織化単分子層(複数も含む)(SAM)が、共形有機層を有する表面を機能化するために使用されてもよい。このような方法は一般的に、意図される表面と適合する単分子層を形成する有機化合物(複数も含む)の特異的反応性を必要とする。例えば、オキシ窒化ケイ素は、単分子層堆積のためにオルガノシランを用いて、又はアルケン若しくはアルキンを有する水素終端窒化ケイ素を用いて機能化されてもよい。このようなプロセスの欠点には拡張性及び厚さ制御が含まれる。しかしながら、厚さ制御は、ポリマー層を成長させるための原子移動ラジカル重合(ATRP)を用いることにより改良され得るが、これは依然として、表面上に特異的反応基、即ちATRP重合開始剤及び溶剤ベースのプロセスを必要とする。
【００５４】
一部の実施形態に係る膜にコーティングを塗布するための代替的プロセスは、表面がモノマー材料又はポリマー材料を有する溶液に浸漬される、浸漬コーティングである。除去後、溶液の薄いフィルムが表面上に残り、乾燥し、結果として、後で硬化される有機材料の薄層を生じる。このプロセスは基板独立性及び拡張性であるが、共形コーティング及び最終的なフィルムの厚さに制御をほとんど与えない。化学蒸着(CVD)が、一部の実施形態に係る膜にコーティングを塗布するために利用されてもよい。CVDは、基板にフィルムを塗布するための気相プロセスであり、多くの場合、無機材料に使用される。より最近の方法は、プラズマ助長CVD、パルスプラズマCVD、熱線CVD及び開始CVDなどの有機フィルムのCVDのために開発された。これらの方法により、制御された厚さを有する共形方法で有機ポリマーフィルムの堆積が可能となる。これらのプロセスの利点は、それらが表面独立性、無溶媒及び拡張性であることである。
【００５５】
一部の実施形態において、開口部を有する膜を含む、方法、システム及び/又はデバイスが提供され、その膜はまた、好ましくは約500ナノメートル未満の厚さを有する膜表面上の血液適合性コーティングを含む。例えば一部の実施形態に係る、このような血液適合性コーティングは、コーティング材料と血液との間の最小相互作用を含み、好ましくは、(例えばタンパク質吸着による)細胞又は血漿タンパク質カスケードの制御されていない活性化を誘発しないので、血液凝固及び血小板凝集が防がれる。前述の血液凝固及び血小板凝集が濾過を妨げ、デバイスの性能に悪影響を与える場合があるため、血液凝固及びタンパク質凝集の形成の予防は利点がある。
【００５６】
一部の実施形態において、コーティングは、チタン、窒化チタン、二酸化チタンなどの無機材料及び/又は有機材料であってもよい。有機材料は、ポリシロキサン及びPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)などの天然の疎水性であってもよいか、又はpHEMA(ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)及び両性イオンポリマー材料(逆帯電した基を含有するポリマー)などの親水性であってもよい。また、親水性及び疎水性領域が交互にあるナノメートルサイズの領域を有するポリマーフィルムが得られる親水性及び疎水性モノマーの両方を含有する共重合体も、有効な血液接触材料であり得る。一部の実施形態において、周知のPEO(ポリエチレンオキシド)又はPEG(ポリエチレングリコール)コーティングは比較的不安定であることが見出されており、このような分子は数日内で炭素鎖の更なる酸化により分解することが見出されているので、コーティングは耐久性があり、再利用可能であることが好ましい。従って、一部の実施形態において、PEO及びPEGコーティングは避けるべきである。
【００５７】
一部の実施形態に係るコーティングは、ホスホリルコリン、スルホベタイン、カルボキシベタイン、又はアミン-N-オキシド部分基などの分子を含む両性イオン基を含む。ホスホリルコリン、スルホベタイン又はカルボキシベタイン基を有する両性イオンポリマーで修飾された一部の実施形態に係る膜は、溶血及び血小板活性化に対して優れた血液適合性を示しており、また、膜開口部の閉塞も防止する。周知の(安定化)オスモライトを有する両性イオン基と酷似しているため、トリメチルアミン-N-オキシド(即ち例えばN-オキシド基を含有する)由来のポリマーもまた、血液適合性コーティングとして有効であるだろう。
【００５８】
一部の実施形態において、耐性のある適用を考慮して、血液適合性分子は膜表面に共有結合される。共有結合は、原子間の電子対の共有により特徴付けられる化学結合の形態である。例えば、窒化ケイ素の天然酸化物に対する共有結合はシラン又はシロキサン化学を用いて可能になる。しかしながら、これらの結合は加水分解する傾向があるので、本開示の一部の実施形態に係る膜上の耐久性のある表面コーティングに関して、直接的なシリコン-炭素又は窒素-炭素結合による結合が好ましく、及び/又は最適である。これは、例えば膜上部の酸化ケイ素層を除去し、Si-H及びNH2官能基を含有する、裸の窒化ケイ素表面を、Si-C結合を介しての表面への直接共有結合のための末端アルケン又はアルキン部分を含有する化合物と反応させることにより達成され得る。この反応は、表面の熱又は光化学活性化の少なくとも一つを用いて、該表面を、気相又は液相、即ち純液体化合物及び/又は溶解した溶媒の少なくとも一つ由来の反応物と接触させて行われ得る。同様に、裸の窒化ケイ素のNH2基が、例えばハロゲン化アルキル、アルデヒド、無水物を用いて有機基の共有結合に使用されてもよく、酸ハロゲン化物基が、表面を機能化するために使用されてもよい。化合物は、表面の更なる機能化のために好適な表面にする、アルケン、カルボン酸、エステル、アミド、N-ヒドロキシスクシンイミド又はエポキシドなどの別の官能基(複数も含む)を含有してもよい。
【００５９】
一部の実施形態によれば、窒化ケイ素と同様の様式で、水素終端化ダイヤモンド状炭素膜が、C-C結合を介しての表面への直接共有結合のための末端アルケン又はアルキン部分を含有する化合物を用いてコーティングされてもよい。ダイヤモンド状炭素はまた、アルデヒド及びカルボキシル官能基を有する表面を得るために、例えば酸素プラズマを用いて表面を処理することにより機能化されてもよい。このような表面は、例えばカルボン酸基を、例えば抗体を有する表面の更なる機能化に好適なN-ヒドロキシスクシンイミドエステル又はペンタフルオロフェニルエステルに変換することによって更に修飾されてもよい。代替として、アミンベースのプラズマが、アミン終端化ダイヤモンド状炭素フィルムを得るために使用されてもよい。これらのアミン終端化表面は、例えばハロゲン化アルキル、アルデヒド、無水物及び酸ハロゲン化物と反応できる。
【００６０】
表面に対して共有結合を有するポリマーコーティングは、重合開始剤、例えばビニルベンジルクロリド若しくはα-ブロモイソブチレートを用いて単分子層により、又はポリマー、例えばビニル、アクリレート若しくはマレイン酸基を移植するために表面上に重合可能な基を提供することにより得られ得る。これらの修飾された表面は、親水性ポリマー層を生成するために、両性イオン又はPEO基などの親水性を有する、例えばアクリレート、アクリルアミド、メタクリレート、メタクリルアミド、スチレン、ビニルピリジン、ビニルイミダゾール又は他のビニルモノマーに基づいたモノマーの重合によりポリマー層を生成するために使用されてもよい。重合は、例えばモノマーのフリーラジカル重合及び又は原子移動ラジカル重合(ATRP)などの制御されたリビング重合技術又は開始化学蒸着により行われてもよい。重合の間に、架橋モノマー、例えばジビニルベンゼン又はエチレングリコールメタクリレートを添加することもまた、高い化学的及び機械的安定性を有する架橋されたヒドロゲル層を得るのに有益であり得る。
【００６１】
両性イオンポリマーは、両性イオン前駆体官能基、例えば、化学反応により後で両性イオン基に変換され得る、第三級アミン、ピリジン、イミダゾール基を有するモノマーを最初に重合することにより生成されてもよい。これらの前駆体ポリマー、例えば、ポリ(ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(ビニルピリジン)又はポリ(ビニルイミダゾール)は、溶液からの重合、例えばATRP、又は気相重合プロセス、例えば(パルス状)プラズマ重合又は自然酸化物で被覆された窒化ケイ素表面上への、若しくはフッ化水素エッチングによる酸化物の除去により得られた自然窒化ケイ素層上への直接的な開始化学蒸着を介してポリマーの堆積により得られ得る。代替として、ポリマーは、表面上に重合可能な基、例えばビニル、アクリレート又はマレイン酸基を提供する単分子層上に移植されてもよい。続いて、これらのポリマーは、例えばプロピオラクトン、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、1,3-プロパンスルホン、過酸化水素及び/又は3-クロロ過安息香酸とのポリマー中の第三級窒素原子の化学反応により両性イオンポリマーに変換されてもよい。
【００６２】
当業者は、本開示の一部の実施形態に係る、上記の実施例に示される膜と組み合わせたこのような耐久性のある生体又は血液適合性コーティングはまた、例えば血漿抽出、白血球除去輸血、水、食物、飲料及び健康状態に存在する微生物学的汚染物質(例えばレジオネラ菌(legionella)、サルモネラ菌(salmonella)、大腸菌(E-Coli)、リステリア菌(listeria))並びに血液に存在する細菌及びウイルス感染の数え上げ技術を含む、血液からのCTC/汚染物質の捕捉以外の同様に適用できる用途であることを理解するだろう。一部の実施形態において、穿孔した窒化ケイ素又はダイヤモンド状炭素膜上の両性イオンコーティングもまた、乳化、吸入、スポッティング、インクジェット及び他の噴霧用途のためのノズル板上の親水性防汚コーティングとしての使用などの用途のために塗布されてもよい。
【００６３】
有益には、一部の実施形態において、試料流体からの汚染物質の選択的捕捉に関して、膜表面(又はコーティングが膜表面上に提供される場合、コーティング表面)は、生体適合性コーティングと組み合わせて、抗体、又はより一般的に記載すると、親和性物質又は受容体分子を備える。コーティングは非標的物質の非特異的結合を減少させ、及び/又は検出の選択性を高める。
【００６４】
例えば、(コーティングを有する又は有さない)膜表面の一部又は十分な面積は、CTCの少なくとも一部に接着できる抗体(例えばCD326)で被覆されてもよい。この場合、その目的は、官能基(複数も含む)、例えばアルデヒド、アミン、エステル、アミド、N-ヒドロキシスクシンイミド又はエポキシドを有する表面に結合したわずかなプライマーへの結合を介して表面に対するCTCの共有結合を生成することである。これはまた、例えば上記の血液適合性コーティングと組み合わせて行われてもよい。
【００６５】
本開示の一部の実施形態において、CTC(又は捕捉するための他の汚染物質)を有する流体の流れを受容できる膜(本明細書以下でフィルタ、CTCフィルタ、分離膜及び/又は分離デバイスとも称される場合がある)が提供される。このような体液は、膜が100Pa圧力にて膜面積1cm2当たり約1ml/min2で濾過できる、約5mPa.s(例えば血液)の粘度を含んでもよい。このように、約1cm2の膜面積は、水より5倍高い粘度を有する流体に関して100Pa(約1mbar)の圧力にて少なくとも3ml/minを濾過できる。一部の実施形態において、約10ml/min/cm2以上までの流量で血液からCTC(又は他の同様の汚染物質)を除去できる膜が提供される。一部の実施形態において、膜の流動能は、約5mPa-secの粘度を有する体液について約4torrの圧力にて約9mm2の膜面積を介して、約40ml/hより高くてもよく、これは1cm2当たり約1ml/minの流量を生じる。12torr、9mm2では5ml/hである。従って、このような実施形態は、インビボ及びインビトロでの用途の少なくとも一つについてハイスループットを有する小型分離デバイスを可能にする。
【００６６】
一部の実施形態において、膜における開口部は、円形、スリットの形状並びにCTC(及び/又は他の有害な要素/細胞)の捕捉及び必要及び/又は健康な成分の経路のいずれか又は両方に有益な他の形状であってもよい。一部の実施形態においては、スリットは、他の形状の開口部より多くの流量(即ち、単位時間において所与の表面の単位面積を通過する流体の量)を得るという利点がある。一部の実施形態において、膜の開口部が約8マイクロメートル未満の直径(即ち幅)を含む場合にCTCの改良された分離が生じてもよく、一部の実施形態において、開口部が約5マイクロメートル未満である場合に更により改良された分離が得られる。一部の実施形態において、スリットは全体的に長さ及び幅を有する形状を含み、ここで、その長さは幅より長く、例えば約10:1(長さ対幅)のアスペクト比を含んでもよく、このような実施形態で円形又はとがって画定される角が実現されてもよい。一部の実施形態において、このようなスリットは、全体的に長方形を含んでもよく、ここで、このような長方形の角は半径範囲を含んでもよい。更に本開示の他の実施形態は、楕円形であってもよいスリットを含む。
【００６７】
一部の実施形態において、膜の多孔率(開口部の合わせた表面積対開口部を含む膜の全表面積の比)が少なくとも約25%である場合、溶血、白血球細胞(即ち白血球)活性化及び/又は保持並びに血小板活性化の十分な最小化が達成され得る。また、一部の実施形態において、膜上の二つの開口部間の最も近い中心間の距離が開口部の直径(幅)の約2倍より短い場合、高動作流量が得られ得るので、これは小型分離デバイスのための高流量膜の使用を可能にする。
【００６８】
一部の実施形態に係る膜は、未処理の血液(例えば未希釈、未加工、未固定など)を濾過する場合でさえ、約85%超のCTCを保持できる。当業者は、一部の実施形態において、膜の厚さが、膜における開口部の幅の約1%〜約30%の間、好ましくは約5%〜約25%の間、例えば一部の実施形態において、約0.5μm〜約2.5μm(例えば約5μm〜10μmの間の開口部に関して)、及び一部の実施形態において、約0.1μm〜約0.5μmの間である場合、予期しない利点が観察されることを理解するだろう。従って、このような実施形態において、膜がこのような厚さを含む場合、赤血球及び白血球細胞の両方の通過はより速くなる。このような厚さはまた、溶血、白血球細胞活性化及び/又は保持並びに血小板活性化の少なくとも一つの最小化を補助することが示されている。このような利点は、例えば開口部を通る細胞通過に対する最小のマイナスの影響のために、上記の厚さ範囲の膜の開口部を通る長い細胞の通過時間から生じると理解される。
【００６９】
従って、一部の実施形態において、白血球細胞の通過は孔又は開口部のサイズ、形状及び/若しくは量(例えば膜の単位面積当たりの量)に依存しているだけでなく、膜の厚さにも依存し得る。上記のように、膜の厚さが例えば開口部の幅の約5%〜約25%の間である場合、比較的低い膜貫通圧力にて白血球細胞の開口部を通る(及び従って膜を通る)短い通過時間が観察される。このような実施形態において、実質的に全ての白血球細胞(及び一部の実施形態において全ての白血球細胞)は、約3〜8マイクロメートルの幅を有する孔又はスリット(即ち開口部)について約1〜10mbar程の低い膜貫通圧力でさえ膜における開口部を通過でき、一方で十分な保持(及び一部の実施形態によれば完全な保持)がCTC(例えば上皮癌細胞)について見出されている。更に、通過した白血球細胞の生命力が保持されていることが見出されている。
【００７０】
一部の実施形態において、制御された内部応力を有する膜が提供される。このような膜は、(例えば)材料の最大降伏応力の約10%未満である室温での(膜の)内部応力を導く薄いフィルム堆積法により製造される。
【００７１】
膜により分離するためにCTCを含有する流体(体液又は他のもの)を流すと、CTCは、膜の開口部/孔内で捕捉されるのではなく、最終的に膜の表面全体(又は膜のコーティングが存在する場合、コーティング上)に捕捉されることは、本開示の一部の実施形態に係る方法、システム及びデバイスの特定の特徴である。このような特徴により、流体からCTCの容易な除去が可能となる。一部の実施形態において、この効果は、CTCが開口部の入口に近接するのを防ぐのに有用な低い粘性(即ち滑りやすい)の白血球の結果(このような結果は、開口部が約5マイクロメートル未満、より具体的には約3〜約5マイクロメートルの間である実験において少なくとも観察される)であると理解される。このような透過及び保持の結果は典型的には、例えばポリエステル、ポリカーボネート、ポリイミド、ナイロン及びパリレンなどの公知のポリマーから作製された比較的厚い膜の使用では得られない。より厚い膜に関して、特に白血球細胞による開口部の実質的な閉塞が観察される。従って、一部の実施形態において、このようなポリマー材料は、比較的低い値のヤング率、即ち10GPa未満のヤング率及び/又は1GPa未満の降伏強さにより特徴付けられ、一般的に、本開示の一部の実施形態に係る、機械的に安定且つ薄い膜を製造するのに適していない。従って、一部の実施形態において、膜は約10GPa超のヤング率及び約1GPa超の降伏強さを有する材料から製造される。このように、高圧力強度を有する機械的に安定且つ比較的薄い膜は、数百ナノメートルのみ、より具体的には約50から約500ナノメートルの間の厚さを有する膜からでも作製され得る。一部の実施形態によれば、CTCを除去するためのシステム及び/又はデバイスは、少なくとも一つの膜(フィルタアセンブリ及び/又はハウジング内に含まれてもよい)、患者からの体液を受容する注入口、及びこのような「濾過された」体液を患者に戻すことを可能にする排出口を備える。
【００７２】
CTCの一例として、参照がEp-CAMに対してなされる。図6及び7は、正常(図6)及び癌組織(図7)の両方におけるEp-CAM分布を例示する。「The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)」, Balzar, M., et al.(Balzar, M., et al.,「The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)」, J. Mol. Med., 77:699-712(1999)。この参考文献はその全体が参照として本明細書に組み込まれる)の論文に示されているように、Ep-CAMは厳密に言えば成人のヒトにおける上皮分子であり、全ての簡単な、多列上皮及び移行上皮の基底外側細胞膜において検出される。Balzarの702にて。多くの癌は高レベルのEp-CAMを発現する(図7を参照のこと)。Balzarの704にて。
【００７３】
図8A及び8Bは本開示の一部の実施形態に係る膜の拡大写真である。従って、(例えば)規則正しいスリット形状の(例えば)開口部802a、802b(その角が半径範囲を含み得る)を有する膜800a、800bが(異なる倍率で、図8Bはより高い倍率である)示される。
【実施例１】
【００７４】
図1を参照すると、単結晶シリコンウエハ1を用いて、ケイ素が豊富な窒化ケイ素膜が、5マイクロメートルの孔径を有する開口部を有して作製される(図1を参照のこと)。窒化ケイ素膜は400ナノメートルの厚さを有する層2を含み、例えば、(例えば堆積の間に制御された方法でケイ素と窒化物の比を選択することにより)比較的低い内部引張応力を導く低圧化学蒸着プロセス(LPCVD)によって750μm厚の研磨されたシリコンウエハ1上に堆積される。一部の実施形態において、得られたケイ素が豊富な窒化ケイ素層は、約290GPaの弾性率及び約4GPaの降伏応力を有する。次に、光抵抗性(photo-resistive)層3がスピンコーティングにより形成される。この層は約5マイクロメートルの直径を有する孔4を有してパターン形成され、(例えば)フォトマスクを介してUV光に膜を露出することにより製造される。光抵抗性層3、4のこのパターンは、例えば反応性イオンエッチング(RIE)によって窒化ケイ素膜5上/内に移され、それによって、開口部5が膜に形成される。最終的に、単結晶100シリコン本体が、(一部の実施形態に係る)深い反応性イオンエッチングを用いて大きな貫通穴6を有して異方的にエッチングされる。代替として、ホウ素ドープダイヤモンド状炭素膜(DLC)が、ホットフィラメント化学蒸着法及びホウ素ドープしたエチルアルコール前駆体を用いて得られてもよい。DLCフィルム内の孔のエッチングは二酸化ケイ素マスクを用いて実施されてもよい。得られたDLCフィルムの典型的な値は、約100GPa超の弾性率及び約2GPa超の降伏応力を含む。
【００７５】
次いで加工されたシリコンウエハに、例えば公知の化学的方法で得て、窒化ケイ素に共有結合されるスルホベタイン基を有する、約30ナノメートル厚の両性イオンコーティングが提供される。次いで加工されたウエハを酸素プラズマで処理し、その後、約2時間、エタノール中約2.5%の(3-トリメトキシシリル)プロピル2-ブロモ-2-メチルピロピオネートのアルコキシシラン溶液で反応する。次いでそのウエハを溶液から取り出し、エタノールでリンスし、アルゴン流下で乾燥させる。次いでポリマーを、例えば原子移動ラジカル重合を用いて表面から移植する。イソプロパノール/水(3/1)中のスルホベタインメタクリルアミドモノマー及びビピリジンリガンドの溶液は20分間アルゴンでパージされ、アルゴン雰囲気下でCuBrに加えられる。モノマー及びリガンドを有するCuBr溶液を開始剤でコーティングしたウエハに(アルゴン雰囲気下で)加え、重合反応を3時間進行させる。そのウエハを溶液から取り出し、きれいな温水/イソプロパノール混合物でリンスし、アルゴン流下で乾燥させる。代替として、加工したシリコンウエハに、約10〜50ナノメートルの厚さを有する二酸化チタンコーティングを提供する。完了したウエハを、各々が(例えば)約10×25mmのサイズを有するチップに切断する。各々のチップは約5マイクロメートルの直径を有する約125万個の孔を含有する。
【００７６】
従って、流体からCTCを除去する方法において、1,500個の前立腺上皮癌細胞(腫瘍細胞)を、健常ボランティアからの500mlの血液に意図的に加え、濾過モジュールを使用して約15分間、デッドエンドモードにおいて、低圧で上記のフィルタ(例えば膜(例えば本明細書に開示される一部の実施形態に係る200a、200b)を含むアセンブリ又はモジュール;このような膜はパッケージであってもよく、並びに/又はフィルタ、膜及び/若しくは膜チップと称される場合もある)の一つを通して押圧する。測定した通過した血液の溶血率は0.1%未満であり、白血球細胞の通過は99.9%超であり、血小板の回収は99.999%超だった。次いで膜チップをモジュールから除去し、膜において/膜上で収集した細胞を、UV励起核酸染料DAPI(Molecular Probes)及び蛍光色素Cy3で標識したサイトケラチンモノクローナル抗体(上皮細胞を識別する)を含有する400μlの緩衝液中に再懸濁した。洗浄工程後、腫瘍細胞204a、204bの存在について、膜チップを20倍の倍率で見た(例えば図2Aを参照のこと)。蛍光分光法を用いて少なくとも1,450+/-50個の細胞を識別した。窒化ケイ素膜は自己蛍光を有さず、膜は平らであり、顕微鏡の焦点面に容易にもたらされることを観察した。この実施例1に利用した実施形態において、膜開口部内の白血球202a、202b(図2Aを参照のこと)の非存在は、両性イオンコーティングの使用に起因し得る(例えばこのコーティングを有さないと、白血球202bは多くの膜開口部内に存在し得る。
【００７７】
従って、上記の実施例により例示したように、本開示の一部の実施形態はまた、CTCを分離及び計数する方法、システム及びデバイスを提供し、特にまた、例えば薄く機械的に平らで安定な膜を用いて、診断又は治療的処置の間に使用されてもよい。細胞計数は、CTCに接着できる抗体(例えばCD326)で機能化されている膜を用いることにより更に最適化されてもよい。
【実施例２】
【００７８】
CTC計数。約10個の前立腺上皮細胞を健常なボランティアからの8mlの血液に意図的に加え、濾過モジュールを使用して約15分間、デッドエンドモードにおいて、20,000個のスリット形状の孔(5×10マイクロメートル)を有する3mm×3mm膜チップに4torrの低圧で流した。濾過後、デッドエンドモードにおいて膜チップを10mlのPBSで洗浄した。次に、PBS中の2%ホルムアルデヒドを5分間使用して捕捉した細胞を固定した。以下の洗浄を行った。
【００７９】
-10mlのPBSでの洗浄;
-PBS中の1mlの0.2%トリトンX-100で洗浄して細胞透過性を誘導する;
-BSA遮断剤で洗浄して抗体の非特異的吸着を防ぐ);
-1mlの抗CD45溶液(1mlのPBS中の50μlのCD45-APCストック)での洗浄;
-10mlのPBSでの洗浄工程。
【００８０】
-1mlの抗サイトケラチン(1mlのPBS中の50μlの抗CK-PEストック)
-10mlのPBSでの洗浄;
-1mlのDAPI溶液での洗浄;及び
-10mlのPBSでの洗浄。
【００８１】
次いで膜を画像化まで約4℃に保存した。蛍光顕微鏡検査法を用いて、血液試料に加えた全ての前立腺癌細胞を回収したことを見出した。
【実施例３】
【００８２】
遺伝子治療のためのCTC濃縮。患者からの血液(8ml)を、濾過モジュールを使用して約15分間、デッドエンドモードにおいて、40,000個のスリット形状の孔(約3×10マイクロメートルの直径を有する)を有する膜チップに通過させて、約10個のCTCを回収する。健常な血球の他のDNAを分配せずに回収したCTCに関するDNA分析を実施するために、膜フィルタ上及び中の細胞を以下の工程のうちの一つ又は複数により制御した:
-膜フィルタをデッドエンドモードにおいて10mlのPBSで洗浄した;
-捕捉した細胞を低張液に入れて細胞を膨潤させた。孔の内側にある細胞(典型的に白血球細胞)は閉じ込めたが、一方、膜の上部にあるCTCは更なる分析のためにかなり簡単に洗い流してもよい;
-細胞を収縮させる高張液を用いて孔に位置する全ての白血球細胞を押し出すために、膜フィルタに固着防止コーティング(PTFE、TiO2、両性イオン、PEO、HEMA)を提供する;及び
-電磁ビーズで標識したABを有する選択的標識により白血球細胞を固定する。
【００８３】
- CTCに結合するEPCAM(CD326)を有する電磁ビーズを膜フィルタに提供する。次に、磁石を使用して、CTCを更なる調査のために膜表面から引き離す。
【実施例４】
【００８４】
患者の血液のCTCクリアランス。患者からの血液を、体外濾過モジュールを使用して約60分間、デッドエンドモードにおいて、スリット形状の孔を有する(例えばこの場合、3×10マイクロメートルのスリット形状の孔を有する)、約10cm2の累積表面積を有する、膜チップ、又は膜チップのアレイに通過させて、実質的に全ての患者のCTCを回収する。12torrの膜貫通圧力にて、患者の血液の平均流量は2.0リットル/時/10cm2である。従って、患者のCTCの全血液量を除去できる長時間(例えば1〜2時間)、臨床又は外来環境のいずれかにおいて実施できる。当該技術分野において公知の抗凝固剤(プラズマフェレーシスを参照のこと)を特定の要件に応じてその時間の間に加えてもよいが、本開示の最初に示したように、それは一部の実施形態においては必要ではない。長時間の後、有意な量のCTCが遺伝子治療及び他の治療法のためにこの方法で得られ得る。
【００８５】
一般に、本開示の一部の実施形態に係る膜を利用する細胞分離は、開口部の直径/サイズ、膜の厚さ、及び(いくつかある特徴の中で特に)膜に配置された開口部/孔の密度の少なくとも一つ(及び一部の実施形態においてそれらのいくつか、及び一部の実施形態においてそれらの全て)により、並びに例えば膜表面に対する細胞接着能及び/又はコーティングを用いるこのような能力を含む、細胞と材料表面との間の生化学的相互作用により決定されてもよい。
【００８６】
本開示の一部の実施形態において、CTCを捕捉及び/又は回収するための上記で説明したCTC回収チップの一つ又は別のものを用いる自動化システムが提供される。このようなシステムは、所定の入力、出力、及び制御パラメータを有する制御プロセス(制御アルゴリズムとも称される場合もある)を含む。図5は本開示の一部の実施形態に係る高レベルの制御プロセスの略図を例示する。
【００８７】
図3A-B及び4A-Bは、本開示のこのようなCTCフィルタの実施形態の一つ又は別のものに係るCTCフィルタを含む、CTCを捕捉するための、本開示の一部の実施形態に係る、例示的なシステムの概略図及び斜視モックアップである。図3A-Bは、試料からCTCを分離するためのCTCフィルタ(例えば図1を参照のこと)を含むフィルタアセンブリ330と、流体導管312を介して流体連通する試料容器(例えば図3Bに示すように注射器本体)内に提供され得る、制限された流体試料310(例えば血液)と、流体導管312の一部に沿って提供される流体流動の方向においてCTCフィルタ330(例えば一部の実施形態に係る膜を含む)の前に配置される、CTCフィルタへの入力圧力を監視するための第1の圧力センサ320と、流体導管342の一部に沿った流体流動の方向においてCTCフィルタの後に配置される、CTCフィルタからの出力圧力を監視するための第2の流体センサ340と、注射器ポンプ350とを含むシステム300を例示する。注射器ポンプは、CTCフィルタ、及び種々の流体導管及び圧力センサを通った、CTCを含有する流体試料を試料容器から引き抜くように負圧を流体導管342の端部に付与し、次いで注射器ポンプの容器(例えば注射器本体)内で濾過された流体として回収される。(限定されないが)制御装置、プロセッサ、レギュレータ、電気回路、センサ、通信手段(例えば、wifi、Bluetooth(登録商標)、携帯電話及び/又は結線-例えばEthernet(登録商標))、メモリ、及び電源(例えば、バッテリー、AC及び/又はDC電源)を含む、種々の電子機器360(図3Aには示さず)も提供されてもよく、それらは本明細書以下で「種々の電子機器」(このような記載される構成要素に限定されないが、記載される構成要素の一つ又は複数であってもよい)と称され、このようなものは、例えばある区画において図3Bに示されるように配置されてもよい。種々の電子機器は、モニタ、制御、(システムへの及び/又はシステムからの)通信手段及びシステムへの電源の少なくとも一つに提供されてもよい。当業者は、流体試料を引き抜き、濾過するために、限定されないが、蠕動ポンプ、ギアポンプ、進行性空洞ポンプ、ルーツ式、ベンチュリポンプ、ピストン/往復ポンプ、圧縮ガス/空気ポンプなどを含む、他の種類のポンプが使用されてもよいことを理解するだろう。
【００８８】
図4A-Bは、患者の血液からCTCを患者から直接除去するための、一部の実施形態に係る体外システム400を例示する。一部の実施形態において、このようなシステムは実質的に全ての患者の血液(及び好ましくは全ての患者の血液)からCTCを除去するために使用されてもよい。従って、患者からの体液402(例えば血液)は、流体連通経路404に沿ってポンプ408(例えば蠕動ポンプ、ギアポンプ、進行性空洞ポンプ、ルーツ式、ベンチュリポンプ、ピストン/往復ポンプ、圧縮ガス/空気ポンプなど)に方向付けられる。圧力P1(CTCフィルタの入力圧力)を監視するための圧力センサ406は、流動方向においてポンプの前の流体導管に沿って提供され、圧力P2(CTCフィルタの出力圧力)を監視するための圧力センサ410は、流動方向においてポンプの後の流体導管411に沿って提供される。次いで体液402は、CTCが流動から除去されるCTCフィルタ412に方向付けられる。その後、血液は導管414を介して患者に戻される。少なくとも一つのバブルセンサ413が、導管の一部に沿って(例えば導管414に沿って)提供されてもよく、一部の実施形態において、二つのこのようなバブルセンサが提供されてもよい。圧力P3の表示を提供する圧力センサ420、及び圧力P4の表示を提供する圧力センサ424。一部の実施形態において、圧力センサ420と424との間にバルブ426(例えばピンチシャットオフバルブ)が提供されてもよい。その点から、濾過された体液が次いで患者内(例えば患者の血流内)へ導入するために患者に戻るように方向付けられる。バイパス428もまた、フィルタ周囲の流れの全て又は一部を方向付けるために提供されてもよい。図3A-Bに示した実施形態に記載されているように、種々の電子機器がモニタ、制御、(システムへの及び/又はシステムからの)通信手段及びシステムへの電源の少なくとも一つに提供されてもよい。
【００８９】
例えばこのような実施形態によれば、例えば図3A-Bにおいて以下が示されている:
-入力圧力はCTCフィルタ(例えばフィルタチップ)の入力側においてmmHgで測定され得る;
-出力圧力はCTCフィルタ/チップの出力側(例えば制限された試料システムにおいてポンプの前にあり得る;例えば図3A-Bを参照のこと)においてmmHgで測定され得る;
-差圧値は、フィルタ(例えば320、324)に対する入力及び出力圧力センサにより測定した圧力の計算した差である。
【００９０】
-標的圧力値は、分離プロセスの間、CTCフィルタ/チップにわたって達成され、好ましくは維持される差圧である;
-圧力ヒステリシス値は、ポンプ流量調節の前にCTCフィルタ/チップにわたって許容される絶対圧力偏差である;
-ループ応答タイマー値は連続自動化制御プロセス実行の間の最小時間を表し、本質的に、そのタイマーは開始自動化制御プロセスの完了時に開始し、プロセスのいずれかの更なる実行の前に終了する;
-流量ステップサイズは、ポンプ流量値が自動化制御プロセス実行の連続実行の間に変更される値である;及び
-ポンプ流量値はシステムポンプ流量を設定するために使用される自動化制御プロセス出力である。
【００９１】
従って、一部の実施形態において、CTCを外部に分離(即ち濾過)するための自動化制御プロセスの重要な機能は、CTCフィルタにわたって一定の差圧を維持することである。そのため、一部の実施形態に係るCTC制御プロセスは、以下の工程のうちの少なくとも複数、及び一部の実施形態において以下の工程の全てを実施することによりこのような機能を可能にする。制御プロセスの実施形態は図5に例示する。
【００９２】
CTCを含有する体液はシステムにより処理される。フィルタ入力及びフィルタ出力圧力(例えば入力圧力センサ320により、及び出力圧力センサ340により)を所定の時間間隔にてmmHgで測定する。これらの値を利用して、差圧値を計算する。次いで入力差圧値を、計算した(所定の)標的圧力範囲と比較する。標的圧力範囲は標的圧力値±圧力ヒステリシス値からなり得る。入力差圧値が標的圧力範囲内である場合、CTC制御プロセスはポンプ流量値を変更せずに終了し、工程1に戻り飛ぶ;そうでなければ新たなポンプ流量値が以下に定義するように計算される。
【００９３】
以前に示したように、CTC制御プロセスの目標の一つを決定し、必要な場合、システムがオーバーシュートせずに(即ち、特定の割合(又はヒステリシス)より多く標的差圧を超えずに)CTCフィルタにわたって実質的に一定の圧力値を維持するように新たなポンプ流量値を更新する。これを達成するために、ポンプ流量値は好ましくは周期的に更新されて圧力オーバーシュートを最小化する。この目標を達成するために、CTC制御プロセス実行はポンプループ応答タイマーにおいて構成される値に従って制限され得る。ゼロに下がるまでカウントするタイマーは、(一部の実施形態によれば)制御プロセスの実行を制限及び/又は阻止することを意図する。一旦タイマーが終了すると、制御プロセスが開始し、圧力誤差の範囲及びその対応する方向(例えば正又は負)の少なくとも一つ(及び好ましくは両方)を最初に決定する。一旦圧力誤差及び/又は方向が計算されると、次いでCTC制御プロセスは以下の数式の一つに従って新たなポンプ流量値を決定する:
式(1):差圧値>(標的圧力値+圧力ヒステリシス値)。式(1)の場合、本圧力ポンプ流量値は流量ステップサイズにより減少する。
【００９４】
式(2):差圧力<(標的圧力値-圧力ヒステリシス値)。式(2)の場合、本ポンプ流量値は流量ステップサイズにより増加する。
【００９５】
一部の実施形態において、流量ステップサイズはオーバーシュートを排除するように選択されるが、これは圧力振動を生じてもよい。完了時に、ポンプの制御装置は、実際のポンプ速度を更新する更新されたポンプ流量値を用いて更新される。次いでこのプロセスが反復される。
【００９６】
一部の実施形態において、示したCTC制御プロセスは、血液の溶血及び白血球による膜の開口部/孔の閉塞を実質的に回避する(及び好ましくは完全に回避する)。また注目すべきことに、一部の実施形態において、血液からCTCを濾過するための方法、システム及びデバイスは、抗凝固剤(例えばヘパリン、クエン酸塩)を用いても又は用いなくても作動できる。
【００９７】
本開示の一部の実施形態は、所与の量の血液のために所定数の孔を有する膜を提供する。このような実施形態において、次いで最終的にCTCが開口部上に偶然に存在し、わずかな数の開口部のみが(CTCで)遮断されるべきであることが保証され得る。例えば、10,000個のCTCを捕捉することは100万個より多くの孔を必要とし得る。
【００９８】
種々の実施形態に従って列挙された任意の百分率(例えば捕捉したCTC、通過した白血球などの大部分)はまた、列挙した百分率の間の百分率も含む。
【００９９】
一部の実施形態は単一の流れシステムとして記載しているが、提示した種々の実施形態の並行及び連続配置もまた本開示の範囲内である。従って、(例えば)体液からCTCを捕捉するためのプロセス時間は、並行流れ配置を利用して短くすることができる。更に、連続配置もまた、CTC(及び/又は汚染物質、細胞など)の少なくとも一つの種類を捕捉するために提供されてもよく、続いてCTCの少なくとも一つ、並びに/又は他の種類のCTC及び/若しくは汚染物質を捕捉するためにフィルタ設定される。このように、このような特徴は開示される実施形態のいずれかの一部であってもよい。
【０１００】
本明細書に開示される種々の実施形態の実施(例えば体外システム)は、制御装置及び例えばデジタル電子回路、集積回路、特別に設計されたASIC(特定用途向け集積回路)、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、及び/又はそれらの組合せを含む、他の電子手段/プロセッサを利用して実現されてもよい。このような実施形態は、ストレージシステム、少なくとも一つの入力デバイス、及び少なくとも一つの出力デバイスからデータ及び命令を受信、並びにそれらにデータ及び命令を送信するように連結される、特定又は汎用目的であってもよい、少なくとも一つのプログラム可能なプロセッサを含むプログラム可能なシステム上で実行可能及び/又は解釈可能である一つ又は複数のコンピュータプログラムにおける実施を含んでもよい。
【０１０１】
これらのコンピュータプログラム(プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション又はコードとしても知られている)は、例えばプログラム可能なプロセッサのための機械命令を含み、高レベルの手続き型及び/若しくはオブジェクト指向のプログラミング言語、並びに/又はアセンブリ/機械語において実施されてもよい。本明細書に使用される場合、「機械可読媒体」という用語は、機械可読信号として機械命令を受信する機械可読媒体を含む、プログラム可能なプロセッサに機械命令及び/又はデータを提供するために使用される任意のコンピュータプログラム製品、装置及び/又はデバイス(例えば磁気ディスク、光ディスク、メモリ、プログラム可能論理回路(PLD))を指す。「機械可読信号」という用語は、プログラム可能なプロセッサに機械命令及び/又はデータを提供するために使用される任意の信号を指す。
【０１０２】
使用者(例えば患者、医療従事者)との相互作用を提供するために、一部の実施形態は、使用者に情報を表示するためのディスプレイデバイス(例えばCRT(ブラウン管)又はLCD(液晶ディスプレイ)モニタなど)並びに使用者がコンピュータに入力を提供できるキーボード及び/又はポインティングデバイス(例えばマウス又はトラックボール)を有するコンピュータによる実施を含んでもよい。例えば、このようなプログラムは、分配ユニット、リモートコントロール、PC、ラップトップ、スマートフォン、メディアプレーヤー又は携帯情報端末(「PDA」)により保存、実行及び作動できる。同様に使用者との相互作用を提供するために他の種類のデバイスが使用されてもよく、例えば、使用者に提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック(例えば視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバック)であってもよく、使用者からの入力は、音響、音声又は触覚入力を含む、任意の形態で受信されてもよい。
【０１０３】
本開示の一部の実施形態は、バックエンドコンポーネント(例えばデータサーバ)を含む、或いはミドルウェアコンポーネント(例えばアプリケーションサーバ)を含む、或いはフロントエンドコンポーネント(例えば使用者が本明細書に開示される対象の実施と相互作用できるグラフィカルユーザインターフェース若しくはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータ)、又はこのようなバックエンド、ミドルウェア、若しくはフロントエンドコンポーネントを含む、コンピュータシステム及び/又はデバイスにおいて実施されてもよい。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信手段(例えば通信ネットワーク)の任意の形態又は媒体により相互接続されてもよい。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク(「LAN」)、広域ネットワーク(「WAN」)、及びインターネットが含まれる。
【０１０４】
従って、上記の一部のこのような実施形態に係るコンピュータシステムはクライアント及びサーバを含んでもよい。クライアント及びサーバは一般に互いから離れており、典型的には通信ネットワークを介して相互作用する。クライアント及びサーバの関係は、それぞれのコンピュータで作動し、互いにクライアント-サーバ関係を有するコンピュータプログラムのおかげで生じる。例えば、「少し距離を置いて」制御装置を有さない患者は、インターネットを介して本明細書に記載される種々の方法、システム及びデバイスの実施形態の特定の機能を管理及び制御してもよい。他の実施形態は、患者(及びシステム/デバイス)から離れた位置にいるが、それでもインターネット又はデータサーバを介して監視でき、作動でき及びデバイスからデータを受信できる医師又は医療従事者を含む、方法、システム及びデバイスを含み、例えば米国に在住している医師は海外に存在しているデバイス及び患者と通信できる。
【０１０５】
限定されないが、本出願に提示されている、特許、特許出願、論文、ウェブページ、本などを含む、刊行物又は他の文書に対するあらゆる参照は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０１０６】
多くの実施形態が上記に詳細に記載されているが、他の実施形態及び開示された実施形態に対する修飾が可能である。例えば、添付の図面に示し、本明細書に記載している論理の流れは、望ましい結果を達成するために、示されている特定の順序、又は順次的な順序を必要としない。
【０１０７】
注目すべきことに、種々の開示された実施形態の中のあらゆる特徴及びあらゆる機能は、添付の特許請求の範囲の一つ又は別の範囲内であり、並びに/又は関連出願においてこの及び/若しくは後の分野に後で提示される特許請求の範囲内のいずれかであり得る、他の実施形態を提示するために種々の実施形態の中のものと混合され、合わされてもよい。従って、本明細書に記載される実施形態及び実施例は例示の目的のみであり、種々及び多くの修飾が当業者に示唆され、本出願の開示の範囲内に含まれることは理解される。開示される実施形態の少なくとも一部は添付の特許請求の範囲内に含まれるが、出願人はまた、対象出願の利益を主張する本出願及び後の出願のいずれか又は両方の対象の開示について他の特許請求の範囲を追求する権利を有する。このような特許請求の範囲は、現在特許請求されているこのような実施形態の広範囲の態様、並びに本開示により開示、教示及び/又はそうでなければ支持されている他のあらゆる態様、実施形態及び発明を含む、添付の特許請求の範囲と同様の特許請求の範囲を含んでもよい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月29日(2012.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CTCを含み、白血球も含む体液からCTCを分離するための方法であって：
体液を、約2.5μm未満の厚さと、約3μmから8μmの間の幅又は直径を有する複数の開口部と、血液適合性又は生体適合性コーティングとを有する膜を含むフィルタに流す工程；
体液からCTCを除去し、且つ白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させるのに十分な圧力をかける工程；
を含む、方法。
【請求項２】
血液適合性又は生体適合性コーティングが、一つ又は複数の両性イオンポリマー材料を含み、場合により前記両性イオンポリマー材料がホスホリルコリン、スルホベタイン、カルボキシベタイン、アミン-N-オキシド部分基、及びそれらの組合せから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
膜における開口部が細長である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも約4torrの圧力をかけ、体液を少なくとも約0.1〜0.4 l/h/cm2(膜表面積)の速度で濾過する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
除去したCTCを不活性化又は殺傷する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
除去したCTCを、癌の診断若しくは治療、治療決定、遺伝学的カウンセリング、遺伝学的研究において、又は薬物送達及び検証において使用する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
請求項1に記載の方法によって体液から採取された単離CTC。
【請求項８】
CTCを含み、白血球も含む体液から、生存能力のあるCTCを捕捉することを含む、薬物送達の方法であって：
体液を、約2.5μm未満の厚さと、約3μmから8μmの間の幅又は直径を有する複数の開口部と、一つ又は複数の両性イオンポリマー材料を含む血液適合性又は生体適合性コーティングとを有する膜を含むフィルタに流す工程；
体液中の統計的に有意な数のCTCを捕捉する工程；
白血球の大部分を、フィルタを通り抜けて通過させる工程；及び
捕捉したCTCを、薬物又は他の治療剤の有効性を試験又は検証するために使用する工程；
を含む、方法。
【請求項９】
体液中のCTCを捕捉するためのフィルタであって：
約2.5μm未満の厚さと、約3μmから8μmの間の幅又は直径を有する複数の開口部と、血液適合性又は生体適合性コーティングとを有する膜を含み、
体液をフィルタに通しながら、体液中に含有される生存能力のあるCTCを捕捉するように構成されている、フィルタ。
【請求項１０】
血液適合性又は生体適合性コーティングが、一つ又は複数の両性イオンポリマー材料を含み、場合により前記両性イオンポリマー材料がホスホリルコリン、スルホベタイン、カルボキシベタイン、アミン-N-オキシド部分基、及びそれらの組合せから選択される、請求項9に記載のフィルタ。
【請求項１１】
膜における開口部が細長である、請求項9に記載のフィルタ。
【請求項１２】
膜における開口部が、膜の全表面積の少なくとも約25%を占める、請求項9に記載のフィルタ。
【請求項１３】
膜が、窒化ケイ素、DLC、ホウ素、又はリンがドープされたDLC膜を含む、請求項9に記載のフィルタ。
【請求項１４】
CTCを含み、白血球も含む体液中のCTCを捕捉するための体外デバイスであって：
第1の流体導管、第2の流体導管、圧力差を有するフィルタ、及びポンプを含み、
体液が、第1の流体導管によってフィルタに流体連通され、第2の流体導管によってポンプに流体連通され、フィルタをはさんで圧力差を生じ、
フィルタが、約2.5μm未満の厚さと、約3μmから8μmの間の幅又は直径を有する複数の開口部と、血液適合性又は生体適合性コーティングとを有する膜を含み、
フィルタが、体液中に含有される生存能力のあるCTCを捕捉し、且つ生存能力のある白血球をフィルタを通り抜けて通過させるように構成されている、デバイス。
【請求項１５】
血液適合性又は生体適合性コーティングが、一つ又は複数の両性イオンポリマー材料を含み、場合により前記両性イオンポリマー材料がホスホリルコリン、スルホベタイン、カルボキシベタイン、アミン-N-オキシド部分基、及びそれらの組合せから選択される、請求項14に記載のデバイス。
【請求項１６】
膜における開口部が細長である、請求項14に記載のデバイス。
【請求項１７】
圧力差が少なくとも約4torrであり、デバイスが少なくとも約0.1〜0.4 l/h/cm2(膜表面積)の速度で体液を濾過することができる、請求項14に記載のデバイス。
【請求項１８】
濾過した体液を患者に戻す第3の流体導管を更に含む、請求項14に記載のデバイス。
【国際調査報告】
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