(57)【要約】【課題】皮膚の乾燥状態を迅速かつ精度よく評価する方法、及び乾燥肌を改善するための物質を効率よく探索する方法の提供。【解決手段】被験者から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定することを含む、皮膚の乾燥状態の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定することを含む、皮膚の乾燥状態の評価方法。
【請求項２】
皮膚の乾燥状態が皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
皮膚の乾燥により生じる荒れ肌が、乾燥肌、敏感肌、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬及び乾燥性湿疹からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）被験物質を被験者又は被験動物に投与すること；
（Ｂ）該被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した発現量を、該被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法。
【請求項５】
以下の（Ａ’）〜（Ｄ’）：
（Ａ’）ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させること；
（Ｂ’）該組織又は細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した発現量を、対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法。
【請求項６】
さらに以下：
（Ｅ）前記（Ｄ）にてＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を有すると評価された被験物質を乾燥肌改善剤として選択すること、
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
さらに以下：
（Ｅ’）前記（Ｄ’）にてＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を有すると評価された被験物質を乾燥肌改善剤として選択すること、
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
乾燥肌改善剤が皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の改善剤である、請求項４〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
皮膚の乾燥により生じる荒れ肌が、乾燥肌、敏感肌、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬及び乾燥性湿疹からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の乾燥状態を評価する方法、及び乾燥肌を改善するための物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な皮膚には水分を保つ機能（保湿機能）が備わっている。この保湿機能によって、皮膚は柔軟性を保ち、またバリア機能を維持して良好な状態を保つことができる。一方、皮膚保湿機能が低下して皮膚が乾燥すると、皮膚の状態が悪化し、肌荒れが発生する。
【０００３】
乾燥肌において、角層の水分量の低下（非特許文献１）、角層上層での角層細胞接着構造（コルネオデスモソーム）の残存（非特許文献２）、未成熟な周辺帯（コニファイドエンベロップ）を持つ角層細胞の増加（非特許文献３）が観察されることが報告されている。また近年、テープストリッピングから採取された角層のタンパク質網羅解析（２次元電気泳動法）によって、乾燥肌では、コルネオデスモシン、アネキシンＡ２、ホスファチジルエタノールアミン結合蛋白１が増加していることが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、これまでの乾燥肌に関する報告は、死んだ細胞（角層）の構造や成分に着目したものであり、生きた皮膚細胞（角層下の生細胞）に関する解析は行われていなかった。
【０００４】
ＡＧＲ２（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）及びＡＧＲ３（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３）は、ともにＰｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）ファミリーに属しているタンパク質である。ＡＧＲ２及びＡＧＲ３は、ともにチオレドキシン用ドメイン（ＣＸＸＳ）を１つ持っており、タンパク質のＳ−Ｓ結合部位に結合して、タンパク質のフォールディングや成熟に関与すると考えられている（非特許文献５、６）。実際、ＡＧＲ２が、腸においてムチンに結合してムチンの成熟に関与していること、乳癌細胞で発現していること、及びＡＧＲ３が卵巣癌細胞で発現していることが報告されている（非特許文献７〜９）。しかしこれまでに、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の皮膚における機能については報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bioengineering of the skin: Water & the stratum corneum. Elsner P, Berardesca E & Maibach HI (eds.), CRC Press Inc, 3-12, 1994
【非特許文献２】J Invest Dermatol, 116(1):23-30, 2001
【非特許文献３】Int J Cosmet Sci, 25(4):157-167, 2003
【非特許文献４】Exp Dermatol, 21(3):205-210, 2012
【非特許文献５】Mol Phylogenet Evol, 36(3):734-740, 2005
【非特許文献６】J Immunol Methods, 378(1-2):20-32, 2012
【非特許文献７】Proc Natl Acad Sci, 106(17):6950-6955, 2009
【非特許文献８】Dev Biol, 338(2):270-279, 2010
【非特許文献９】J Immunol Methods, 378(1-2):20-32, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、迅速かつ精度よく、皮膚の乾燥状態、又は皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態を評価する方法の提供、及び乾燥肌、又は皮膚の乾燥により生じる荒れ肌を改善するための物質を効率よく探索する方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまで皮膚水分量と関連付けて研究されていなかった皮膚の生きた細胞（角層下の生細胞）に着目し、これらの細胞の活動と皮膚水分量とを関連付ける指標を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、従来皮膚における機能について報告されていなかったＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現が、皮膚の乾燥の状態を表すよい指標であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、被験者から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定することを含む、皮膚の乾燥状態の評価方法を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）被験物質を被験者又は被験動物に投与すること；
（Ｂ）該被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した発現量を、該被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、以下の（Ａ’）〜（Ｄ’）：
（Ａ’）ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させること；
（Ｂ’）該組織又は細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した発現量を、対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、被験者における皮膚の乾燥状態、又は皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態を迅速かつ精度よく評価することができる。また本発明によれば、乾燥肌、又は皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態を改善するための物質を効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】皮膚組織におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現パターン。各図の矢印はＡＧＲ２又はＡＧＲ３発現領域を示す。Ｎｏｎ−Ｄｒｙ：健常者、Ｄｒｙ：ドライスキン保有者。
【図２】皮膚組織におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３  ｍＲＮＡの発現量。Ｎｏｎ−Ｄｒｙ：健常者、Ｄｒｙ：ドライスキン保有者。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（Ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図３】保湿剤がＡＧＲ２発現に与える影響。各データについてｎ＝２。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「皮膚の乾燥状態」とは、皮膚の保湿状態ともいいかえることができる。皮膚の乾燥がより強いほど、皮膚はより保湿されておらず、被験者はより高度の乾燥肌である。逆に、皮膚の乾燥がより弱いほど、皮膚はより保湿されており、被験者はより軽度の乾燥肌であるか、又は乾燥肌ではない。
【００１４】
本明細書において、「皮膚の乾燥により生じる荒れ肌」（本明細書においては、単に「荒れ肌」ということもある）とは、皮膚の保湿機能が低下することによって、皮膚の柔軟性やバリア機能が失われることにより、状態が悪化した皮膚をいう。乾燥により生じる荒れ肌の例としては、乾燥肌、敏感肌、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬、乾燥性湿疹などが挙げられる。
【００１５】
本明細書において、「被験者（又は被験動物）から採取された皮膚細胞」としては、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現し得る皮膚組織の生細胞が挙げられ、好ましくは、表皮生細胞である。表皮生細胞は、表皮組織の角層より深層にある細胞群である。被験者（又は被験動物）の表皮生細胞は、パンチバイオプシーなどの通常の手段によって皮膚組織を採取した後、ディスパーゼ処理などにより表皮と真皮を分離することによって採取することができる。
【００１６】
本明細書において、「ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現」とは、ＡＧＲ２遺伝子及びＡＧＲ３遺伝子の少なくとも一方若しくは両方の発現、又はＡＧＲ２蛋白質及びＡＧＲ３蛋白質の少なくとも一方若しくは両方の発現をいう。ＡＧＲ２遺伝子又はＡＧＲ３遺伝子の発現量の測定は、ｍＲＮＡレベルで検出する場合は、例えば細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、あるいはノーザンブロット解析法等を利用して、ＡＧＲ２遺伝子又はＡＧＲ３遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出定量することにより行うことができる。ＡＧＲ２蛋白質又はＡＧＲ３蛋白質の発現量の測定は、通常の免疫測定法、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、プロテオーム、ウェスタンブロットなどにより行うことができる。このうち、ウェスタンブロットが安価かつ簡便である。
【００１７】
後述の実施例に示すとおり、乾燥肌の被験者では、乾燥肌でない被験者と比較して、皮膚細胞中のＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量はともに低下する。また、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量は、皮膚の乾燥状態の指標として知られる皮膚のドライスコア及び角層コンダクタンスと相関する。したがって、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量は、被験者の皮膚の乾燥状態を反映する指標となり得る。
【００１８】
したがって、本発明の一態様は、被験者から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定することを含む、皮膚の乾燥状態の評価方法である。当該方法の一実施形態において、皮膚の乾燥状態の評価とは、皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態の評価である。当該方法が適用される被験者としては、美容目的等の非治療的目的で、乾燥肌や敏感肌の予防や改善を所望するか又は乾燥肌や敏感肌になるリスクを知りたい者、及び、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬、乾燥性湿疹等の乾燥により生じる皮膚の症状又は状態の予防や改善を所望する者、などが挙げられる。当該方法におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定手順は、上述したとおりである。
【００１９】
上記方法においては、測定されたＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量に基づいて、被験者の皮膚の乾燥状態、又は荒れ肌の状態を評価する。好ましくは、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の両方の発現量を指標とする。
【００２０】
上記評価の一実施形態においては、被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が低い場合、被験者の皮膚は乾燥した状態又は荒れ肌であると評価され、一方、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が高い場合、被験者の皮膚は乾燥した状態でない又は荒れ肌でないと評価される。発現量の高さの判断は、予め設定した参照値との比較により行うことができる。参照値としては、乾燥肌又は荒れ肌の集団から取得したＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の指標（以下、参照値１）、又は非乾燥肌又は非荒れ肌の集団から取得したＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の指標（以下、参照値２）を採用することができる。参照値１の具体的な例としては、乾燥肌又は荒れ肌の集団から採取した皮膚細胞（例えば表皮生細胞）におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の平均値が挙げられる。参照値２の具体的な例としては、非乾燥肌又は非荒れ肌の集団から採取した皮膚細胞（例えば表皮生細胞）におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の平均値が挙げられる。非乾燥肌又は非荒れ肌の集団の例としては、皮膚のドライスコアが１．５以下のヒトの集団、好ましくは皮膚のドライスコアが１以下のヒトの集団が挙げられる。乾燥肌又は荒れ肌の集団の例としては、皮膚のドライスコアが２．５より大きいヒトの集団、好ましくは皮膚のドライスコアが３より大きいヒトの集団が挙げられる。本明細書において、皮膚の「ドライスコア」は、対象部位の乾燥状態を、５段階（０：乾燥無し、１：わずかにかさつきが認められる、２：かさつき、落屑が認められる、３：顕著な落屑、わずかな亀裂が認められる、４：著しい落屑、亀裂が認められる）で目視評価を行った値である。ただし、本実施形態において、参照値は上記の値に限定されず、現実の皮膚乾燥状態を反映できる適切な値を適宜設定することができる。
【００２１】
例えば、被験者からのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値１以下の場合、当該被験者の皮膚は乾燥した状態又は荒れ肌であるであると評価される。また例えば、被験者からのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値２以上の場合、当該被験者の皮膚は乾燥した状態でない又は荒れ肌でないと評価される。また例えば、被験者からのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値１よりも高いが参照値２よりも低い場合、当該被験者の皮膚は、やや乾燥した状態、又は乾燥肌や荒れ肌になるリスクの高い状態であると評価される。
【００２２】
また例えば、被験者からのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値２の５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２５％以下である場合に、当該被験者の皮膚は乾燥した状態又は荒れ肌であるであると評価される。
【００２３】
あるいは、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が参照値１以下の場合、該皮膚細胞は、皮膚が乾燥した状態又は荒れ肌である被験者由来の皮膚細胞であると評価され、一方、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が参照値２以上の場合、該皮膚細胞は、皮膚が乾燥した状態でない又は荒れ肌でない被験者由来の皮膚細胞であると評価される。またあるいは、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値１よりも高いが参照値２よりも低い場合、該皮膚細胞は、皮膚がやや乾燥した状態であるか、又は乾燥肌や荒れ肌になるリスクの高い被験者由来の皮膚細胞であると評価される。
【００２４】
あるいは、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定値が参照値２の５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２５％以下である場合、該皮膚細胞は、皮膚が乾燥した状態又は荒れ肌である被験者由来の皮膚細胞であると評価される。
【００２５】
上記評価の別の実施形態においては、被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量は経時的に測定される。経時的測定の頻度は、一週間毎、二週間毎、一ヶ月毎などが挙げられるが、これらに限定されず、またその回数は２回以上であればよいが、好ましくは３回以上である。例えば、前回測定時に比べてＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が低下していた場合、被験者の皮膚は乾燥が進行している、又は荒れ肌が進行していると評価され、一方、前回測定時に比べて、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が上昇している場合、被験者の皮膚は乾燥が改善している、又は荒れ肌が改善していると評価される。また例えば、３回以上経時的測定したときに、最初の測定から継続的にＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が低下していた場合、被験者の皮膚は乾燥が進行している、又は荒れ肌が進行していると評価され、一方、最初の測定から継続的にＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が上昇している場合、被験者の皮膚は乾燥が改善している、又は荒れ肌が改善していると評価される。
【００２６】
あるいは、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が、前回測定時に比べて低下していた場合、該皮膚細胞は、皮膚の乾燥が進行している又は荒れ肌が進行している被験者由来の皮膚細胞であると評価され、一方、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が前回測定時に比べて上昇している場合、該皮膚細胞は、皮膚の乾燥が改善している又は荒れ肌が改善している被験者由来の皮膚細胞であると評価される。またあるいは、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が最初の測定から継続的に低下していた場合、該皮膚細胞は、皮膚の乾燥が進行している又は荒れ肌が進行している被験者由来の皮膚細胞であると評価され、一方、皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が最初の測定から継続的に上昇している場合、該皮膚細胞は、皮膚の乾燥が改善している又は荒れ肌が改善している被験者由来の皮膚細胞であると評価される。
【００２７】
上記評価のさらに別の実施形態においては、上記参照値との比較と、経時的比較とを組み合わせることができる。本実施形態においては、被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量は経時的に測定される。経時的測定の頻度や回数は上記と同様である。各回の測定値の各々は上述の手順で参照値と比較され、さらに２回目以降の測定値は、上述の手順で以前の測定値とも比較される。本実施形態においては、参照値との比較結果及び以前の測定値との比較結果を総合的に検討することにより、被験者の皮膚の乾燥状態や荒れ肌の状態をより詳細に評価することができる。
【００２８】
以上のとおり、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の低下は皮膚の乾燥と関連している。したがって、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる物質は、皮膚の保湿機能を高めて、乾燥肌又は荒れ肌を改善することができる。
【００２９】
したがって、本発明の別の態様は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）被験物質を被験者又は被験動物に投与すること；
（Ｂ）該被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した発現量を、該被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤又は荒れ肌改善剤の評価又は選択方法である。
【００３０】
上記被験動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル等の霊長類などの非ヒト動物を挙げることができるが、入手や取扱いが容易な点からラットやマウスなどのげっ歯類が好ましい。
【００３１】
上記被験者又は被験動物に投与される被験物質は、乾燥肌改善剤又は荒れ肌改善剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。該被験物質の投与方法は特に限定されないが、簡便さや低侵襲性の点からは経皮投与、経口投与、照射、吸入などが好ましい。投与期間は１日〜数ヶ月の範囲で設定することができ、また投与回数も１日１回〜数回の範囲で設定することができる。
【００３２】
次いで、上記被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞（試験群）におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定する。発現量の測定手順は上述したとおりである。
【００３３】
さらに、上記被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞（対照群）におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定する。対照群としては、被験物質投与前の同じ被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞、同じ被験者又は被験動物の被験物質を投与されていない皮膚領域又は対照物質を投与された皮膚領域から採取された皮膚細胞、被験物質を投与されていない別の被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞、などが挙げられる。発現量の測定手順は上述したとおりである。
【００３４】
次いで、試験群と対照群の間で、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を比較する。好ましくは、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の両方の発現量を比較する。対照群と比べて、試験群でのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が増加していれば、上記被験物質は、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果があると評価される。このＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果を有すると評価された被験物質は、乾燥肌又は荒れ肌改善剤として選択される。
【００３５】
例えば、試験群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が、対照群における発現量に対して統計学的に有意に増加していた場合に、被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価される。また例えば、対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量を１００％としたときに、試験群における発現量が１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上である場合に、被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価される。このＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果を有する被験物質は、乾燥肌又は荒れ肌改善剤として選択される。
【００３６】
本発明による乾燥肌改善剤又は荒れ肌改善剤の評価又は選択方法は、上述したｉｎ  ｖｉｖｏで行う方法以外に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行うこともできる。すなわち、本発明のさらに別の態様は、以下の（Ａ’）〜（Ｄ’）：
（Ａ’）ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させること；
（Ｂ’）該組織又は細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した発現量を、対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤又は荒れ肌改善剤の評価又は選択方法である。
【００３７】
上記方法において、使用できる被験物質の種類は、上述したｉｎ  ｖｉｖｏでの方法の場合と同じである。
【００３８】
上記（Ａ’）に用いられる、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞の例としては、ＡＧＲ２遺伝子若しくはＡＧＲ３遺伝子、又はＡＧＲ２蛋白質若しくはＡＧＲ３蛋白質を発現している、哺乳動物から単離された組織若しくは細胞、又はその培養物が挙げられる。当該単離された組織若しくは細胞、又はその培養物としては、単離された皮膚組織又は細胞、好ましくは表皮生細胞、及びそれらの培養物；腸細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株などが挙げられる。
【００３９】
あるいは、上記（Ａ’）に用いられる、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞の例としては、ＡＧＲ２遺伝子若しくはＡＧＲ３遺伝子、又はＡＧＲ２蛋白質若しくはＡＧＲ３蛋白質を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織若しくは細胞、又はその培養物が挙げられる。当該遺伝的に改変された哺乳動物の組織又は細胞、及びその培養物は、例えば、哺乳動物の任意の組織又は細胞にＡＧＲ２蛋白質及び／又はＡＧＲ３蛋白質をコードする遺伝子を導入して、該組織又は細胞がＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現するように、あるいはＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現が強化されるように形質転換することによって作製することができる。遺伝子を細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーションやリポフェクションなどによるベクター導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の方法で使用されるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な組織又は細胞が由来する哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な組織又は細胞と被験物質との接触は、例えば、被験物質を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、当該組織又は細胞を培養液に載置すること、あるいは、当該組織又は細胞が載置された培養液に、被験物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。接触後の組織又は細胞は、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常３〜４８時間程度培養するのが好ましい。上記組織又は細胞を培養する培地には、常用の培地を用いることができる。
【００４２】
上記（Ｂ’）においては、上記の被験物質と接触させた組織又は細胞（試験群）におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定する。ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定手順は上述したとおりである。
【００４３】
上記（Ｃ’）における対照群としては、試験群と同じＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞であって、被験物質に接触させなかったものが挙げられる。あるいは、対照群としては、生来的にＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現能がない又はほとんどない哺乳動物由来の組織又は細胞；試験群と同じ組織又は細胞を、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３が発現しないように改変したもの；さらにこれら組織又は細胞を被験物質に接触させたもの、などが挙げられる。ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３が発現しないように改変した組織又は細胞としては、ｓｉＲＮＡによるノックダウン細胞、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３ノックアウトマウス由来の組織又は細胞などが挙げられる。対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定手順は上述したとおりである。
【００４４】
次いで、試験群と対照群の間で、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を比較する。好ましくは、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の両方の発現量を比較する。対照群と比べて、試験群でのＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が増加していれば、上記被験物質は、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果があると評価され、乾燥肌又は荒れ肌改善剤として選択される。試験群と対照群との比較、及び被験物質の評価と選択の手順は、上述したｉｎ  ｖｉｖｏでの方法の場合と同じである。
【００４５】
上記ｉｎ  ｖｉｖｏ方法、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法のいずれにおいても、必要に応じて、選択された物質をさらなるスクリーニングにかけてもよい。例えば、上記方法で乾燥肌又は荒れ肌改善剤として評価又は選択された試験物質を、被験者や被験動物、それらに由来する培養皮膚などに投与し、皮膚の保湿能への影響を直接調べることによって、より強力な乾燥肌又は荒れ肌の改善作用を有する物質をさらに選別することができる。皮膚の保湿能は、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）や、皮膚ドライスコア、角層コンダクタンス、角層の保湿成分（ＮＭＦ、セラミド等）量などに基づいて測定することができる。
【００４６】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４７】
＜１＞被験者から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定することを含む、皮膚の乾燥状態の評価方法。
【００４８】
＜２＞好ましくは、上記皮膚の乾燥状態が皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の状態である、＜１＞記載の方法。
【００４９】
＜３＞好ましくは、上記皮膚の乾燥により生じる荒れ肌が、乾燥肌、敏感肌、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬及び乾燥性湿疹からなる群より選択される、＜２＞記載の方法。
【００５０】
＜４＞好ましくは、上記被験者が、非治療的目的で乾燥肌や敏感肌の予防や改善を所望する者、非治療的目的で乾燥肌や敏感肌になるリスクを知りたい者、あるいは乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬及び乾燥性湿疹からなる群より選択される症状又は状態の予防や改善を所望する者である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の方法。
【００５１】
＜５＞好ましくは、参照値１として、乾燥肌又は荒れ肌の集団から採取した皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の平均値を取得することをさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の方法。
【００５２】
＜６＞好ましくは、参照値２として、非乾燥肌又は非荒れ肌の集団から採取した皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の平均値を取得することをさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の方法。
【００５３】
＜７＞上記乾燥肌又は荒れ肌の集団が、好ましくは皮膚のドライスコアが２．５より大きいヒトの集団であり、より好ましくは皮膚のドライスコアが３より大きいヒトの集団である、＜５＞記載の方法。
【００５４】
＜８＞上記非乾燥肌又は非荒れ肌の集団が、好ましくは皮膚のドライスコアが１．５以下のヒトの集団であり、より好ましくは皮膚のドライスコアが１以下のヒトの集団である、＜６＞記載の方法。
【００５５】
＜９＞好ましくは、上記被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と、上記参照値１又は参照値２とを比較することをさらに含む、＜５＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法。
【００５６】
＜１０＞好ましくは、上記被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が参照値１以下の場合に、該被験者の皮膚は乾燥した状態又は荒れ肌であると評価することをさらに含む、＜９＞記載の方法。
【００５７】
＜１１＞好ましくは、上記被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が参照値２以上の場合に、該被験者の皮膚は乾燥した状態でない又は荒れ肌でないと評価することをさらに含む、＜９＞記載の方法。
【００５８】
＜１２＞好ましくは、上記被験者の皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が参照値２の５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２５％以下である場合に、該被験者の皮膚は乾燥した状態又は荒れ肌であると評価することをさらに含む、＜９＞記載の方法。
【００５９】
＜１３＞好ましくは、上記皮膚細胞が表皮生細胞である、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の方法。
【００６０】
＜１４＞好ましくは、上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定が、
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、又はノーザンブロット解析法によるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３のｍＲＮＡ定量であるか、
あるいは、
ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、プロテオーム、又はウェスタンブロットによるＡＧＲ２蛋白質及び／又はＡＧＲ３蛋白質の発現量の測定である、
＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法。
【００６１】
＜１５＞以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）被験物質を被験者又は被験動物に投与すること；
（Ｂ）該被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した発現量を、該被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法。
【００６２】
＜１６＞好ましくは、上記皮膚細胞が表皮生細胞である、＜１５＞記載の方法。
【００６３】
＜１７＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ）上記（Ｄ）にてＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を有すると評価された被験物質を乾燥肌改善剤として選択すること、
を含む、＜１５＞又は＜１６＞記載の方法。
【００６４】
＜１８＞好ましくは、上記被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞が、以下：
（１）被験物質投与前の同じ被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞；
（２）同じ被験者又は被験動物の被験物質を投与されていない皮膚領域又は対照物質を投与された皮膚領域から採取された皮膚細胞；及び
（３）被験物質を投与されていない別の被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞、
からなる群より選択される、＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。
【００６５】
＜１９＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した発現量が、上記被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞における発現量に対して統計学的に有意に増加していた場合に、該被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価する、＜１５＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の方法。
【００６６】
＜２０＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した発現量が、上記被験物質を投与されていない被験者又は被験動物から採取された皮膚細胞における発現量を１００％としたときに、１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上である場合に、該被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価する、＜１５＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の方法。
【００６７】
＜２１＞以下の（Ａ’）〜（Ｄ’）：
（Ａ’）ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させること；
（Ｂ’）該組織又は細胞におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した発現量を、対照群におけるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量と比較すること；
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、該被験物質のＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を評価すること、
を含む、乾燥肌改善剤の評価又は選択方法。
【００６８】
＜２２＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ’）上記（Ｄ’）にてＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量を増加させる効果を有すると評価された被験物質を乾燥肌改善剤として選択すること、
を含む、＜２１＞記載の方法。
【００６９】
＜２３＞好ましくは、上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞が、以下：
（１）単離された皮膚組織若しくは細胞、又はそれらの培養物；
（２）単離された表皮生細胞、又はそれらの培養物；
（３）腸細胞株、乳癌細胞株、又は卵巣癌細胞株；及び
（４）ＡＧＲ２遺伝子若しくはＡＧＲ３遺伝子、又はＡＧＲ２蛋白質若しくはＡＧＲ３蛋白質を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織若しくは細胞、あるいはその培養物、
からなる群より選択される、＜２１＞又は＜２２＞記載の方法。
【００７０】
＜２４＞好ましくは、上記対照群が、以下：
（１）上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞であって、被験物質に接触させなかったもの；
（２）生来的にＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現能がない又はほとんどない哺乳動物由来の組織又は細胞；
（３）上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞を、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３が発現しないように改変したもの；及び
（４）該（２）又は（３）の組織又は細胞を被験物質に接触させたもの、
からなる群より選択される、＜２１＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の方法。
【００７１】
＜２５＞好ましくは、上記（Ｂ’）で測定した発現量が、上記対照群における発現量に対して統計学的に有意に増加していた場合に、該被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価する、＜２１＞〜＜２４＞のいずれか１に記載の方法。
【００７２】
＜２６＞好ましくは、上記（Ｂ’）で測定した発現量が、上記対照群における発現量を１００％としたときに、１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上である場合に、該被験物質はＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３発現量の増加効果があると評価する、＜２１＞〜＜２４＞のいずれか１に記載の方法。
【００７３】
＜２７＞好ましくは、上記ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量の測定が、
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、又はノーザンブロット解析法によるＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３のｍＲＮＡ定量であるか、
あるいは、
ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、プロテオーム、又はウェスタンブロットによるＡＧＲ２蛋白質及び／又はＡＧＲ３蛋白質の発現量の測定である、
＜１５＞〜＜２６＞のいずれか１に記載の方法。
【００７４】
＜２８＞上記乾燥肌改善剤が、皮膚の乾燥により生じる荒れ肌の改善剤である、＜１５＞〜＜２７＞のいずれか１に記載の方法。
【００７５】
＜２９＞皮膚の乾燥により生じる荒れ肌が、乾燥肌、敏感肌、乾皮症、老人性乾皮症、魚鱗癬及び乾燥性湿疹からなる群より選択される、＜２８＞記載の方法。
【００７６】
＜３０＞被験者の皮膚の乾燥状態の指標としての、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の使用。
【００７７】
＜３１＞好ましくは、ＡＧＲ２とＡＧＲ３を組み合わせて使用する、＜３０＞記載の使用。
【００７８】
＜３２＞好ましくは、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が該指標として使用され、より好ましくは、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３のｍＲＮＡ量、あるいはＡＧＲ２蛋白質及び／又はＡＧＲ３蛋白質の発現量が該指標として使用される、＜３０＞又は＜３１＞記載の使用。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００８０】
（サンプル）
米国在住のコーカシアン健常女性（２０〜４０代）のうちドライスキンの症状を示す者７名及び健常者６名のすね部位から、パンチバイオプシーを用いて皮膚組織を採取し、サンプルとして用いた。
【００８１】
（実施例１）
皮膚組織におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３発現パターンの比較
サンプルとして採取された皮膚組織をＯＣＴ  コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）に包埋し凍結した。その後、クライオトームで厚さ７μｍの切片を作成し、冷却したアセトンで組織切片を固定した。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｕｓｅ（Ｄａｋｏ）で非特異的な結合を阻害した。１次抗体：Ａｎｔｉ−ＡＧＲ２（ａｂｃａｍ）又はＡｎｔｉ−ＡＧＲ３（ａｂｃａｍ）をＣａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＯＹＯＢＯ）に希釈し、１時間インキュベートした。その後、２次抗体：Ａｌｅｘａ５５５  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＡｌｅｘａ５５５  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＤＡＰＩ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＣａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに希釈し、３０分間インキュベートして可視化した。
【００８２】
結果を図１に示す。ＡＧＲ２及びＡＧＲ３は、皮膚の表皮生細胞領域の上部に局在して発現していた（図中矢印）。ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の局在領域は、健常者及びドライスキン保有者のいずれでも違いがなかったが、発現強度はドライスキン保有者において明らかに弱かった。
【００８３】
（実施例２）
皮膚組織におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量の比較
サンプルとして採取された皮膚組織（ドライスキン保有者７名及び健常者６名）を、Ｄｉｓｐａｓｅ溶液に浸漬し、表皮と真皮に分離した。得られた表皮組織はＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）に浸漬し、使用するまで−８０℃に保存した。その後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＨｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。得られたｃＤＮＡから、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３のｍＲＮＡ発現の定量を行った。定量は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ（ＡＧＲ２：Ｈｓ００１８０７０２＿ｍ１、ＡＧＲ３：Ｈｓ００４１１２８６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＰＲＩＳＭ  ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出定量した。ＰＣＲは、２０μＬの反応系にて、増幅条件は９５℃で１５秒の変性反応、６０℃で１分のアニーリング、伸長反応にて行った。それぞれの遺伝子発現量は、ＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）発現量により補正し、健常者におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３それぞれの平均発現量を１とした場合の相対値として示した。
【００８４】
結果を図２に示す。ドライスキン保有者の皮膚におけるＡＧＲ２及びＡＧＲ３発現量は、健常者と比べて顕著に低下していた。
【００８５】
（実施例３）
ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量と皮膚乾燥レベルとの相関
被験者（１３名）において、皮膚のドライスコア及び角層コンダクタンスを調べた。皮膚のドライスコアは、２名の評価者が、対象部位の乾燥状態を、５段階（０：乾燥無し、１：わずかにかさつきが認められる、２：かさつき、落屑が認められる、３：顕著な落屑、わずかな亀裂が認められる、４：著しい落屑、亀裂が認められる）で目視評価し、その平均値を取得した。角層コンダクタンスは、Ｓｋｉｃｏｎ２００ＥＸ（アイ・ビィ・エス社）により測定した。各被験者から、パンチバイオプシーを用いてすね部位の皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織から、実施例２と同様の手順で、表皮組織を分離してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現量を定量し、測定値をＲＰＬＰ０発現量で補正することにより、ＡＧＲ２及びＡＧＲ３それぞれの発現量を測定した。スピアマン順位相関係数検定により、各被験者から測定したＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量の各々について、皮膚のドライスコア及び角層コンダクタンスとの相関係数をそれぞれ求めた。結果を表１に示す。ＡＧＲ２及びＡＧＲ３の発現量はいずれも、皮膚の乾燥状態の指標であるドライスコア及び角層コンダクタンスのいずれとも有意に相関していたことから、ＡＧＲ２及び／又はＡＧＲ３の発現量が皮膚の乾燥状態を表す指標となることが示された。
【００８６】
【表１】
2015227865.tif 000002
【００８７】
（実施例４）
保湿剤におけるＡＧＲ２遺伝子発現量促進作用の解析
ヒト正常表皮細胞（ＮＨＥＫ）はＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）（Ｋｕｒａｂｏより購入）を用い、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。細胞を１２穴プレートに１×１０5個で播種し、４８時間培養後、培地を血清無添加培地に交換するとともに、公知の乾燥肌改善剤であるＶｉｔａｍｉｎ  Ｄ3（９９．５％エタノール溶液、最終濃度１ｎＭ又は１０ｎＭ）（Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，４（９）：１２１３−８，２０１２）、ユーカリエキス（５０％エタノール溶液、最終濃度０．００１％）（Ｊ Ｃｏｓｍｅｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ， １２（１）：３−１１，２０１３）、ユーカリエキスの主な生理活性物質であるマクロカルパール（５０％エタノール溶液、最終濃度１０ｎＭ）（Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｓｍｅｔ Ｓｃｉ， ３４（１）：１７−２２，２０１２）を、又はコントロールとして９９．５％エタノールもしくは５０％エタノールを、培地に添加した。７２時間培養後、細胞からＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＨｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。得られたｃＤＮＡから、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより、ＡＧＲ２のｍＲＮＡ発現の定量を行った。定量は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ（ＡＧＲ２：Ｈｓ００１８０７０２＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＰＲＩＳＭ  ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出定量した。ＰＣＲは、２０μＬの反応系にて、増幅条件は９５℃で１５秒の変性反応、６０℃で１分のアニーリング、伸長反応にて行った。ｍＲＮＡ発現量は、ＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）発現量により補正し、コントロール（９９．５％ＥｔＯＨ溶媒のみ）におけるＡＧＲ２の平均発現量を１とした場合の相対値として示した。
【００８８】
結果を図３及び表２に示す。Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ3、ユーカリエキス、マクロカルパールは、コントロールに対してＡＧＲ２発現を増加させた。
【００８９】
【表２】
2015227865.tif 000003
【図１】
2015227865.tif 000004
【図２】
2015227865.tif 000005
【図３】
2015227865.tif 000006