(57)【要約】  本発明は、植物原料、すなわちココア抽出物からの生物学的に活性な生成物の生産に関する。この生成物は、インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する１つ以上の生物学的ペプチドを有し、栄養学、食品および製薬の産業にて使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物であって、
（ａ）５〜２０アミノ酸の鎖より形成される１つ以上のペプチドを含み、
（ｂ）インビトロでＰＥＰ酵素阻害活性を発揮し、
（ｃ）インビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有し、
ＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号２９）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号３０）；ＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３１）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３２）；ＲＲＳＤＬＤＮＧＴＰＶＩＦ（配列番号３３）；ＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴ（配列番号３４）；ＴＳＴＶＷＲＬＤＮＹＤＮＳＡ（配列番号３５）およびＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴＴＤ（配列番号３６）からなる群より選択される１つ以上のペプチドを含む生物学的に活性な生成物を除く、生成物。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群からの１つ以上のペプチドを含む、請求項１に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項３】
バークといわれる殻を有するココア生成物から酵素的加水分解によって得られる、請求項１または２に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項４】
酵素的加水分解の前に前記バークが物理的加圧によって脱脂されて５〜１５％、好ましくは１０％の脂質を有している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項５】
脱脂された前記生成物が水中に５〜２０％溶解されており、酵素的加水分解の工程に供され、
上記工程において、１つ以上の酵素が得られた水溶液に添加され、４０〜６０℃の温度が連続する１〜２４時間にわたって、適切なｐＨにて維持される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項６】
酵素的加水分解が、Ｔｅｒｍａｍｙｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、ＵｌｔｒａｆｌｏまたはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅの群に属する１つ以上の酵素によって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項７】
前記生物学的に活性なペプチドが、加水分解が完了した後に加水分解抽出物の遠心分離によって上清から得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群からの１つ以上のペプチドを含み、これが、抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性をもたらすに要求される量にて機能性食品に添加されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、使用。
【請求項９】
インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する１つ以上の生物学的に活性なペプチドを含む、請求項８に記載の機能性食品。
【請求項１０】
神経変性状態を処置する医薬を製造するための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群からの１つ以上のペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群からの１つ以上のペプチドを含み、抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性を有する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、植物原料、すなわちココア抽出物からの生物学的に活性な生成物の生産に関する。この生成物は、インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する１つ以上の生物学的ペプチドを有し、栄養学、食品および製薬の産業にて使用され得る。
【０００２】
〔背景技術〕
本願は、本願と同一発明者による特許出願ＰＣＴ／ＥＳＳ２００８／０００５４０の継続出願であることが認識され得る。上記特許出願には、単離されかつ配列によって特徴付けられた一連の８ペプチドの１つ以上を含む、酵素的加水分解によって得られた生物学的に活性な生成物が記載されている。この８つのペプチドの配列は、以下のとおりである：ＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号２９）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号３０）；ＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３１）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３２）；ＲＲＳＤＬＤＮＧＴＰＶＩＦ（配列番号３３）；ＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴ（配列番号３４）；ＴＳＴＶＷＲＬＤＮＹＤＮＳＡ（配列番号３５）およびＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴＴＤ（配列番号３６）。
【０００３】
食品中のタンパク質は、特定の生物学的な活性を有する多数のペプチドの前駆体であり、種々の身体的なプロセスに影響を及ぼす有用な特性を有している。天然製品を開発することに対する非常に多くの興味を集めている。この天然製品は、それを消費するヒトに、健康面で「特別な」有利なある種の効果を提供する。このような興味によって、種々の植物原料供給源を使用して新たな製品および機能的な成分を開発するためのよい機会が訪れる。これらのペプチドを生成することは、栄養学の産業での最新の研究によって可能となり、同様に、新たな機能性食品の生成を可能にする。これにより、食品成分および副生成物の付加価値（慣用的な食品の栄養面での特性を含む。）が向上し、新たなダイエット用サプリメントまたは新たな医薬品が開発される。
【０００４】
農業−食品の産業におけるいくつかの副生成物が、高含量のタンパク質および生物学的に活性なペプチドを有しており、付加価値を与える。マトリクスを相当量冨化することによってペプチド含量の増加を増強するための種々のメカニズムが存在し、特定の特徴（例えば、抗高血圧、抗高脂血症、抗神経変性、抗う蝕および抗高リポ蛋白血症の特徴）を与える。
【０００５】
蛋白質分解酵素を使用して、特定の位置でタンパク質を加水分解し、複数の生理学的効果を有する広範なペプチドを加水分解生成物中に生成し得る。
【０００６】
当該分野における技術常識は、とりわけ以下の文献に見出され得る：特許出願ＷＯ９１／１９８００ Ａ１（これは、ココア由来のタンパク質および核酸に関する。特に、請求の範囲は、ココアアロマの前駆体としての、ココア種からのタンパク質アルブミン（２１ｋＤａ）のフラグメントに関する。）。この特許出願は、２０５アミノ酸のペプチド、またはそのフラグメントに関し、その機能はココアの香りの前駆体である。
【０００７】
欧州特許ＥＰ１２９８２１０ Ａ１は、チョコレートの香りの前駆体としての、ココア豆からのアルブミンタンパク質およびビシリン（ｖｉｃｉｌｉｎ）タンパク質に由来するペプチドを記載する。この文献には、２〜３０アミノ酸、好ましくは２〜５アミノ酸の、その機能がチョコレートの香りの前駆体であるペプチドが記載されている。同様に、この文献の請求の範囲には、アイスクリーム、飲料、乳製品、化粧品、動物の餌、および医薬品を製造するための、これらのペプチドの使用が記載されている。
【０００８】
特許出願ＷＯ９６／３８４７２ Ａ１は、ココアの香りの前駆体であるペプチドとしてアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌを有するペプチドおよび上記配列中に２〜１１アミノ酸が含まれているフラグメントを権利請求している。権利請求された配列およびそのフラグメントは、ココアの香りの前駆体としての機能に寄与している。
【０００９】
特許出願ＷＯ ０２／４２３２７ Ａ２は、ココアの香りの前駆体タンパク質といての、２Ｓアルブミンタンパク質の単離、精製および同定のプロセスに関する。特に、この特許出願は、ココア／チョコレートの香りを生成するための、上記ポリペプチドまたはそのフラグメントの使用を記載する。
【００１０】
特許文献ＪＰ         ２００８０１９２２８は、ポリフェノール抽出に供される前のココア抽出物に由来する、アンギオテンシン−１変換酵素（ＡＣＥ）阻害特性を有するアミノ酸組成物、ならびにこの組成物を含有する食品を記載する。この文献は、上記抽出物に含まれるペプチド／アミノ酸配列を特定しておらず、使用される同定および／または精製のプロセスについて言及されていない。
【００１１】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素活性は、記憶／学習のプロセスの喪失に関する。なぜなら、この酵素は、プロリンリッチなニューロペプチド（例えば、上記プロセスに関連するバゾプレッシンおよびサブスタンスＰ）を分解するからである。いくつかの研究がまた、上記酵素がアルツハイマー病に関連し得ることを示している。細菌では、数名の研究者が、特定の植物のポリフェノール抽出物がプロリルエンドペプチダーゼ阻害を引き起こしていることを主張している（例えば、Kim et al., (“Prolyl Endopeptidase Inhibitors from Green Tea”,  Arch Pharm Res, 24 (4) :292-296 2001)、およびTezuka et al. (“Screening of crude drug extracts for prolylendopeptidase inhibitory activity”, Phytomedicine, 6(3) :197-203 1999)）。特許文献ＵＳ ２００７／０１１６７７９もまた、ポリフェノール供給源として、薬学的組成物の構成要素の１つとして、そして神経変性疾患（例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病）に関連する特定の酵素のインヒビタとしての、ココア豆の使用を記載している。
【００１２】
他の研究者は、いくつかのペプチドフラグメントがＰＥＰ活性を阻害することを述べている（例えば、Maruyama et al., (“Prolyl Endopeptidase Inhibitory Activity of Peptides in the Repeated Sequence of various Proline-Rich proteins”, Journal of Fermentation and Bioengineering, 74:145-148 1992)、およびAsano et al., (“Inhibition of prolyl endopeptidase by synthetic peptide fragments of human beta-casein”; Agric.Biol.Chem, 55(3):825-828 1991)）。しかし、最近では、上記酵素の阻害性の代謝物としてのココアペプチドに関する参考文献はない。
【００１３】
従って、この種の阻害活性を有する新たな成分および化合物に対する要求が増加しているので、体によいココアの特性を提供するために、ＰＥＰ阻害活性を示す、ココア抽出物からの生物学的に活性なペプチドを見出すことの可能性が検討されている。８つのペプチドが単離された。これらは、インビトロでのＰＥＰ阻害活性を有しているだけでなく、特許出願ＰＣＴ／ＥＳ／０００５４０に記載された線虫モデルＣ．ｅｌｅｇａｎｓを用いたアッセイに従ってインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能もまた示す。
【００１４】
驚くことに、継続中の研究において、新たな２８個のペプチドを含む、新たな生物学的に活性な生成物が見出されている。
【００１５】
〔発明の目的〕
本発明は、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する、生物学的に活性な新たなペプチドが冨化された、ココア抽出物からの生物学的に活性な生成物の生産に関する。
【００１６】
特に、本発明は、機能性食品に含まれるべき成分として潜在的に使用するためのＰＥＰ酵素阻害活性および／または抗酸化能および／または抗神経変性能を有する、精製されたペプチド画分をココアから得ることに関する。
【００１７】
生物学的に活性なペプチドは、得られたココア抽出物中に存在する１つ以上のタンパク質またはペプチドの加水分解によって生産され得る。この目的のために、酵素および加水分解条件が、所望のバイオペプチドを得るために設定される。
【００１８】
種々の方法論を使用して、これらの阻害活性が研究され得る。インビトロでの試験は、問題のインヒビタの存在下でのＰＥＰ酵素活性の測定に基づく。すなわち、本発明において、これはペプチドリッチなココア画分に関する。
【００１９】
生物学的に活性なペプチドまたはこれらを含む加水分解物は、機能性食品中に含められ得る。一旦濃縮されると、画分は、食品産業および食品、ならびに医薬品の製造のための製薬産業において使用され得る。好適な量の上記ペプチドを含む生物学的に活性な生成物は、疾患（例えば、血圧コントロール（すなわち高血圧）、変性性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病など））の処置および予防に使用され得る。これらはまた抗酸化剤として使用され得る。よって、本発明は、ココアに関する新たな適用を見出し、健康の観点からのポジティブな再評価に寄与する。
【００２０】
本発明の目的である２８個のペプチドは、生物学的に活性な生成物に含まれ得、配列決定および同定がなされており、これらを含む任意の原材料または基質より取得され得る。さらに、加水分解物中にて同定されたこれらの生物学的に活性な新たなペプチドは、化学的および／または酵素的なペプチド合成、ならびに組換え法によって取得され得る。
【００２１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、疎水性相互作用のクロマトグラフ（ＨＩＣ）を示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分３および４に含まれると結論付けられる．
図２は、ＨＩＣ（疎水性相互作用のクロマトグラフ）の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる．
図３は、ＨＩＣ画分４の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる．
図４は、画分Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）を用いた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６中のアミロイドβペプチドの集積に対する保護能力のアッセイを示す図である。ポジティブコントロールは、ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）である。この図から、画分Ｆ８、Ｆ９およびＦ１０がβアミロイドペプチドの集積に対する保護を提供すると結論付けられ、Ｆ９およびＦ１０が最大保護を付与する．
図５は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。バーは標準偏差を示す。この図は、酸化ストレス条件に供された場合に、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫の生存率がどのように増加するのかを示す．
図６は、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。この図は、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫に対応する、漸増する生存曲線を示す。
【００２２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、生物学的に活性な生成物を、特に新たなペプチドが富化されたココア画分から得る方法に関し、これらのペプチドは、インビトロでのＰＥＰ阻害活性、ならびに／あるいはインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する。特に、本発明は、生物学的に活性なペプチドを得るために、ココア副生産物（バーク）の酵素的な加水分解によって種々のペプチド画分を得ることに基づいており、機能性食品に含ませるための成分として潜在的に使用する目的を有している。
【００２３】
本発明の別の局面は、得られたココア抽出物からのペプチドの精製に関する。種々の戦略（例えば、イオン交換または疎水性相互作用による濃縮、および分離（例えばＲＰＣ（逆相クロマトグラフィ）またはゲル濾過クロマトグラフィ）を、抽出物中に存在するペプチドに応じて使用する。
【００２４】
本発明は、ココア抽出物からの、新たな２８個の生物学的に活性なペプチドに関する。このペプチドは、以下に規定されたアミノ酸配列を用いて同定される：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８。これらは、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する。
【００２５】
さらに、本発明は、上記生物学的に活性なペプチドの、種々の食品についての機能性成分としての使用に関する。食品は、消費が意図される任意の組成物であることを考慮すると、液体であっても固体であってもよい。
【００２６】
本発明の原材料の供給源は、本明細書中に記載された生物学的に活性なペプチドの１つ以上を含む任意の好適な基質であり得る。特定の実施形態において、上記原材料は植物であり、すなわち原材料の供給源はココアである。Theobroma cacaoはココアツリーの特定の名称である。用語ココアはマヤの言語（Ka'kaw）からきており、Theobromaは「神の食べ物」をいうギリシャ語である。より特定には、ココア副産物（いわゆるバーク）が使用され、これは殻付きのココアであり、物理的な加圧によって部分的に脱脂されており、脂質の割合は、重量パーセントで５〜１５％の範囲内、好ましくは１０％であり得る。
【００２７】
原材料の供給源は水に溶解されて、その割合は５〜２０％の間を変動し得、好ましくは１０％であり得る。一旦バークが水に溶解されると、これは、種々の温度（例えば、４０〜６０℃、好ましくは５０℃で、種々の時間（例えば１〜２４時間、好ましくは、１時間、６時間、１８時間または２４時間）にわたって、種々の濃度の１または複数の加水分解酵素で処理される。目的のペプチドを提供し得る任意の酵素が用いられ得る。特に、使用される酵素は、酵素Ｔｅｒｍａｍｙｌの場合、セルロース活性を有する酵素と同等であり、プロテアーゼ活性を有する酵素（例えば、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、ＵｌｔｒａｆｌｏまたはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）と同等である。所望の特性を有するバイオペプチドの１つ以上を生産するという条件で、単一の酵素または２つ以上の酵素の組合せが使用される。使用される酵素の濃度は、原材料１ｇあたり、酵素０．１０〜１０μＬの範囲であり、０．５〜２μＬの範囲である。加水分解の条件（ｐＨ、温度、圧力、酵素の濃度、反応時間など）は、使用される酵素に応じて最適化される。
【００２８】
抽出物を得るために、加水分解反応が一旦完了し、酵素が不活性化される。４０００ｒｐｍでの遠心分離が１５分間行われ、本発明の目的物である、生物学的に活性なペプチドを含む上清が回収され、次いで、単離および精製のために画分および亜画分に分けられる。
【００２９】
従って、本発明の別の局面は、ココア抽出物から得られた生物学的に活性なペプチドの精製および同定である。もしも、抽出物中に存在するペプチドが種々のアミノ酸長であり、目的のペプチドが５〜２０アミノ酸を有することを考慮すると、所望されないペプチドを除去するために、そして本発明の目的のペプチドを単離および濃縮するために、種々の精製戦略が行われる。例えば、種々の分子量の画分が、加水分解された生成物から限外濾過によって取得され得、イオン交換クロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィまたは高速逆相クロマトグラフィまたはゲル濾過クロマトグラフィによって活性な亜画分が単離される。
【００３０】
本発明の利点は、新たなペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８として示されることだけでなく、上記ペプチドが得られる原材料が、最初のココアから得られた加水分解産物および画分の全てに元々存在し、ＰＥＰ酵素阻害活性、および／または抗酸化活性および／または抗神経変性活性を同時に示すという、生物学的に活性な特性を有することである。ペプチドおよびこれらのペプチドを含む抽出物の両方が、機能性食品に含まれ得、そして薬学的または栄養学的な化合物の一部を形成し得、種々の疾患（特に心臓血管疾患および中枢の変性）の処置および予防を補助するために使用され得る。
【００３１】
〔実施例〕
〔実施例１：生物学的に活性なペプチドが富化されたココア抽出物の調製〕
Ivory Coast からのForastero cocoa種を使用して本プロセスを行った。
【００３２】
バークを得るプロセスを、本願と同一発明者による特許文献ＥＳ ２２８６９４７ Ａ１およびＰＣＴ／ＥＳ２００８／０００５４０に従うプロセスによって、ココアポッドから得られた新鮮なココア種を用いて行った。加圧による脱脂の後に得られた生成物を、本発明の場合、殻付きの豆からのバークと称する。最終的に、連続的な機械的抽出機での加圧によって脱脂して得られた１００ｇのバークを、各々１μＬ／ｇの濃度のＴｅｒｍａｍｙｌ酵素およびＡｌｃａｌａｓｅ酵素の組合せとともに１Ｌの蒸留水中に、１：１０（ｗ／ｖ）で溶解し、５０℃で１時間撹拌し続けた。撹拌時間が完了した後、１００℃で酵素を不活性化し、４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、約８５０ｍＬのペプチドリッチな上清を回収した。この上清を用いて、生物学的に活性なペプチドの精製、およびＰＥＰ酵素阻害アッセイを行った。
【００３３】
〔実施例２：ココア抽出物からのペプチドの精製〕
遠心分離の後に得られた、ペプチドを含む上清を、以下の２ステップに供した。
【００３４】
本プロセスの第１ステップは、上記サンプルを、AKTA Explorer chromatographer（GE Healthcare, Amersham Biosciences AB）での疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）による濃縮に供することである。最終的に、HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub)カラムを用い、引き続く溶出のために、平衡化緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ７））を、（ＮＨ４）２ＳＯ４の１．５〜０Ｍのグラジエントで用いた。溶出を２１４ｎｍにてモニタリングし、得られた１０ｍＬ画分の各々にて、ＰＥＰ阻害活性をインビトロで評価した。
【００３５】
活性を有する画分を、先ず１０ｋＤａフィルタ（Amicon Ultra, Millipore）を用いる限外濾過ステップ、次いで、１０ｋＤａより下の画分の逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）による精製ステップに供した。AKTA Explorer chromatographer（Amersham Biosciences）での３ｍＬカラム（Amersham Biosciences）、そして、ミリＱ水中に０．１％ＴＦＡ（Ａ）およびアセトニトリル中に０．１％ＴＦＡ（Ｂ）を用いる広範な溶出グラジエントを用いた。プロセス中で用いた溶媒を除去した後に、サンプルを２１４ｎｍでモニタリングした。得られた画分の各々（今回の場合は２ｍＬ）にて、ＰＥＰ阻害活性をインビトロで再評価した。
【００３６】
〔実施例３：インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性の評価〕
〔Ａ．ＰＥＰ阻害活性の評価〕
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素活性を、Yoshimotoによって記載された方法（Yoshimoto, T. and Tsuru, D. 1978. Agr. Biol. Chem., 42, 2417; Yoshimoto, T., Walter, R. and Tsuru, D. 1980. J. Biol. Chem., 255, 4786)） に従い、基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリンの使用に基づいて測定した。ＰＥＰ酵素の作用によってこの基質からｐ−ニトロアニリンが放出される。これは、分光光度計で４１０ｎｍでの吸収を読み取ることによって定量化され得る。
【００３７】
ＰＥＰ阻害活性を、反応混合物に試験サンプルを添加することによって測定した。最初のバーク阻害を、酵素処理ナシのコントロールとして測定し、市販の酵素を用いたタンパク質加水分解の後に精製したＨＩＣ画分を測定した。（図１）。
【００３８】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって種々の画分を分離した。表１は、バークサンプルおよび種々の画分のＰＥＰ阻害パーセントを示す。
【００３９】
表１は、精製の第１段階を通してのサンプル全てのＰＥＰ酵素阻害の結果を含んでいる。
【００４０】
〔表１：バークサンプルおよび疎水性相互作用画分のＰＥＰ阻害パーセント〕
【００４１】
【表１】
2013515703.tif 000002
【００４２】
疎水性相互作用クロマトグラフィによる精製によって得られた画分３および４を、最大のＰＥＰ酵素阻害能を有しているものとして選択した。よって、これらを逆相クロマトグラフィに供した（図２および３）。表２および３は、疎水性相互作用画分３および４に由来する、逆相クロマトグラフィによって得られた画分のＰＥＰ酵素阻害値、ならびに各々のタンパク質含量を含んでいる。
【００４３】
〔表２：疎水性相互作用の画分３より得られたＲＰＣ画分の、ＰＥＰ阻害のパーセントおよびタンパク質定量〕
【００４４】
【表２】
2013515703.tif 000003
【００４５】
〔表３：疎水性相互作用の画分４より得られたＲＰＣ画分の、ＰＥＰ阻害のパーセントおよびタンパク質定量〕
【００４６】
【表３】
2013515703.tif 000004
【００４７】
ＨＩＣ画分４からの、ＲＰＣ画分８，９および１０は、最大のＰＥＰ酵素阻害値を示したので、これらを、タンパク質含量の評価のために選択した。これらの画分を、質量分析ＭＳ／ＭＳによって分析し、２８個の新たなペプチドを同定し、これらの配列を表４に挙げた。
【００４８】
〔表４：ＨＩＣ画分４からの、ＲＰＣ画分８，９および１０において同定された２８個のペプチドの配列（ペプチド８および１２が画分９および１０の両方にて同定された）〕
【００４９】
【表４】
2013515703.tif 000005
【００５０】
〔実施例３：ＲＰＣ（逆相クロマトグラフィ）画分のインビボでの評価〕
〔Ａ．  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでの画分の抗神経変性能の評価〕
本研究の目的は、インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ阻害についてのポジティブな結果を与えたＲＰＣ画分の機能をインビボで評価することである。この目的のためにモデル生物としてCaenorhabditis elegansを用いた。上記機能は、神経変性疾患であるアルツハイマー病の発達に対して、上記抽出物によって提供される潜在的な保護に関する。この能力を評価するために、ＨＩＣ画分４からのＲＰＣ画分８、９および１０を選択し、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６トランスジェニック系統を用いて無力化（ｐａｒａｌｉｓｉｓ）を決定するための試験を行った。この系統は、温度での誘導の後にヒトアミロイドβペプチド（Ａｂ１−４２）を発現することが特徴付けられている。
【００５１】
以前公開された文献中のデータは、アミロイドβペプチドプラークの形成は酸化ストレスに続いて起こることを示す（Drake et al., “Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer´s disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model” Neurobiol Aging 2003, 24(3):415-20）。よって、分子または化合物の作用によって発揮される効果が、ニューロンにおける線維性Ａβペプチド沈着の集積により強い体制を提供するか否かを評価することは興味深い。これらのトランスジェニック線虫において、上記ペプチドの発現は、目的の分子または化合物の添加後に評価され得る無力化を引き起こす。
【００５２】
実験を行うために、ＮＧＭ（線虫増殖培地）上にて１６℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ４１７６系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭ，およびＮＧＭ−非誘導（実験を通じて線虫を１６℃でインキュベート）である。条件あたり１００匹の線虫を分析した。インキュベートの１日後（線虫は約２０時間齢）に温度を１６℃から２５℃に上げてＡｂペプチド発現を誘導した。次いでインキュベートの２４時間後に温度を２０℃に下げ、試験期間の残りにわたって維持した。インキュベートの後に、無力化した線虫の割合が１００％に達するまで、試験した各条件について、無力化した線虫の数を分析した。
【００５３】
図４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６系統を用いた無力化試験の完了に際して得られた結果を示す。これは、試験した画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）が、ＮＧＭ誘導コントロールと比較してアミロイドβペプチド集積に対する保護を提供する証拠であり、画分Ｆ９およびＦ１０が同様のレベルで最大保護を示している。アミロイドβペプチドを誘導していない線虫は、無力化を患わない。
【００５４】
〔Ｂ：  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでのペプチド画分の抗酸化能の評価〕
実験を行うために、ＮＧＭ上にて２０℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ２０７０系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭである。条件あたり１００匹の線虫を分析した。上記条件下でのインキュベートの７日後に、線虫を酸化ストレスに供した。最終的に、線虫を、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ）を含むＳ基本培地を含むプレートに移した。プレートを２０℃でインキュベートし、５時間後に処置後に生存する線虫の総数を記録した。
【００５５】
図５は、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ）を５時間用いた酸化ストレスに供した後にペプチド抽出物（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）で処理した線虫の生存の増加を、ＮＧＭネガティブコントロールと比較して示す。
【００５６】
〔Ｃ：  培養培地へのペプチド画分の添加後のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生存の評価〕
実験を行うために、ＮＧＭ上にて２０℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ２０７０系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭである。条件あたり１００匹の線虫を分析した。各条件下での線虫生存の数を、生存する線虫が残らなくなるまで２日毎に係数した。
【００５７】
図６は、２１日間にわたる種々の条件下にて増殖する線虫についての生存曲線を示す。ＮＧＭネガティブコントロールと比較した場合に、ポジティブコントロールおよびペプチド画分の両方が線虫の寿命を延長したことは注目に値する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】疎水性相互作用のクロマトグラフ（ＨＩＣ）を示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分３および４に含まれると結論付けられる。
【図２】ＨＩＣ（疎水性相互作用のクロマトグラフ）の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる。
【図３】ＨＩＣ画分４の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる。
【図４】画分Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）を用いた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６中のアミロイドβペプチドの集積に対する保護能力のアッセイを示す図である。ポジティブコントロールは、ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）である。この図から、画分Ｆ８、Ｆ９およびＦ１０がβアミロイドペプチドの集積に対する保護を提供すると結論付けられ、Ｆ９およびＦ１０が最大保護を付与する。
【図５】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。バーは標準偏差を示す。この図は、酸化ストレス条件に供された場合に、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫の生存率がどのように増加するのかを示す。
【図６】線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。この図は、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫に対応する、漸増する生存曲線を示す。
【図１】
2013515703.tif 000006
【図２】
2013515703.tif 000007
【図３】
2013515703.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2013515703000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月21日(2012.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、植物原料、すなわちココア抽出物からの生物学的に活性な生成物の生産に関する。この生成物は、インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する１つ以上の生物学的ペプチドを有し、栄養学、食品および製薬の産業にて使用され得る。
【０００２】
〔背景技術〕
本願は、本願と同一発明者による特許出願ＰＣＴ／ＥＳＳ２００８／０００５４０の継続出願であることが認識され得る。上記特許出願には、単離されかつ配列によって特徴付けられた一連の８ペプチドの１つ以上を含む、酵素的加水分解によって得られた生物学的に活性な生成物が記載されている。この８つのペプチドの配列は、以下のとおりである：ＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号２９）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号３０）；ＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３１）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３２）；ＲＲＳＤＬＤＮＧＴＰＶＩＦ（配列番号３３）；ＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴ（配列番号３４）；ＴＳＴＶＷＲＬＤＮＹＤＮＳＡ（配列番号３５）およびＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴＴＤ（配列番号３６）。
【０００３】
食品中のタンパク質は、特定の生物学的な活性を有する多数のペプチドの前駆体であり、種々の身体的なプロセスに影響を及ぼす有用な特性を有している。天然製品を開発することに対する非常に多くの興味を集めている。この天然製品は、それを消費するヒトに、健康面で「特別な」有利なある種の効果を提供する。このような興味によって、種々の植物原料供給源を使用して新たな製品および機能的な成分を開発するためのよい機会が訪れる。これらのペプチドを生成することは、栄養学の産業での最新の研究によって可能となり、同様に、新たな機能性食品の生成を可能にする。これにより、食品成分および副生成物の付加価値（慣用的な食品の栄養面での特性を含む。）が向上し、新たなダイエット用サプリメントまたは新たな医薬品が開発される。
【０００４】
農業−食品の産業におけるいくつかの副生成物が、高含量のタンパク質および生物学的に活性なペプチドを有しており、付加価値を与える。マトリクスを相当量冨化することによってペプチド含量の増加を増強するための種々のメカニズムが存在し、特定の特徴（例えば、抗高血圧、抗高脂血症、抗神経変性、抗う蝕および抗高リポ蛋白血症の特徴）を与える。
【０００５】
蛋白質分解酵素を使用して、特定の位置でタンパク質を加水分解し、複数の生理学的効果を有する広範なペプチドを加水分解生成物中に生成し得る。
【０００６】
当該分野における技術常識は、とりわけ以下の文献に見出され得る：特許出願ＷＯ９１／１９８００ Ａ１（これは、ココア由来のタンパク質および核酸に関する。特に、請求の範囲は、ココアアロマの前駆体としての、ココア種からのタンパク質アルブミン（２１ｋＤａ）のフラグメントに関する。）。この特許出願は、２０５アミノ酸のペプチド、またはそのフラグメントに関し、その機能はココアの香りの前駆体である。
【０００７】
欧州特許ＥＰ１２９８２１０ Ａ１は、チョコレートの香りの前駆体としての、ココア豆からのアルブミンタンパク質およびビシリン（ｖｉｃｉｌｉｎ）タンパク質に由来するペプチドを記載する。この文献には、２〜３０アミノ酸、好ましくは２〜５アミノ酸の、その機能がチョコレートの香りの前駆体であるペプチドが記載されている。同様に、この文献の請求の範囲には、アイスクリーム、飲料、乳製品、化粧品、動物の餌、および医薬品を製造するための、これらのペプチドの使用が記載されている。
【０００８】
特許出願ＷＯ９６／３８４７２ Ａ１は、ココアの香りの前駆体であるペプチドとしてアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌを有するペプチドおよび上記配列中に２〜１１アミノ酸が含まれているフラグメントを権利請求している。権利請求された配列およびそのフラグメントは、ココアの香りの前駆体としての機能に寄与している。
【０００９】
特許出願ＷＯ ０２／４２３２７ Ａ２は、ココアの香りの前駆体タンパク質といての、２Ｓアルブミンタンパク質の単離、精製および同定のプロセスに関する。特に、この特許出願は、ココア／チョコレートの香りを生成するための、上記ポリペプチドまたはそのフラグメントの使用を記載する。
【００１０】
特許文献ＪＰ         ２００８０１９２２８は、ポリフェノール抽出に供される前のココア抽出物に由来する、アンギオテンシン−１変換酵素（ＡＣＥ）阻害特性を有するアミノ酸組成物、ならびにこの組成物を含有する食品を記載する。この文献は、上記抽出物に含まれるペプチド／アミノ酸配列を特定しておらず、使用される同定および／または精製のプロセスについて言及されていない。
【００１１】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素活性は、記憶／学習のプロセスの喪失に関する。なぜなら、この酵素は、プロリンリッチなニューロペプチド（例えば、上記プロセスに関連するバゾプレッシンおよびサブスタンスＰ）を分解するからである。いくつかの研究がまた、上記酵素がアルツハイマー病に関連し得ることを示している。細菌では、数名の研究者が、特定の植物のポリフェノール抽出物がプロリルエンドペプチダーゼ阻害を引き起こしていることを主張している（例えば、Kim et al., (“Prolyl Endopeptidase Inhibitors from Green Tea”,  Arch Pharm Res, 24 (4) :292-296 2001)、およびTezuka et al. (“Screening of crude drug extracts for prolylendopeptidase inhibitory activity”, Phytomedicine, 6(3) :197-203 1999)）。特許文献ＵＳ ２００７／０１１６７７９もまた、ポリフェノール供給源として、薬学的組成物の構成要素の１つとして、そして神経変性疾患（例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病）に関連する特定の酵素のインヒビタとしての、ココア豆の使用を記載している。
【００１２】
他の研究者は、いくつかのペプチドフラグメントがＰＥＰ活性を阻害することを述べている（例えば、Maruyama et al., (“Prolyl Endopeptidase Inhibitory Activity of Peptides in the Repeated Sequence of various Proline-Rich proteins”, Journal of Fermentation and Bioengineering, 74:145-148 1992)、およびAsano et al., (“Inhibition of prolyl endopeptidase by synthetic peptide fragments of human beta-casein”; Agric.Biol.Chem, 55(3):825-828 1991)）。しかし、最近では、上記酵素の阻害性の代謝物としてのココアペプチドに関する参考文献はない。
【００１３】
従って、この種の阻害活性を有する新たな成分および化合物に対する要求が増加しているので、体によいココアの特性を提供するために、ＰＥＰ阻害活性を示す、ココア抽出物からの生物学的に活性なペプチドを見出すことの可能性が検討されている。８つのペプチドが単離された。これらは、インビトロでのＰＥＰ阻害活性を有しているだけでなく、特許出願ＰＣＴ／ＥＳ／０００５４０に記載された線虫モデルＣ．ｅｌｅｇａｎｓを用いたアッセイに従ってインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能もまた示す。
【００１４】
驚くことに、継続中の研究において、新たな２４個のペプチドを含む、新たな生物学的に活性な生成物が見出されている。
【００１５】
〔発明の目的〕
本発明は、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する、生物学的に活性な新たなペプチドが冨化された、ココア抽出物からの生物学的に活性な生成物の生産に関する。
【００１６】
特に、本発明は、機能性食品に含まれるべき成分として潜在的に使用するためのＰＥＰ酵素阻害活性および／または抗酸化能および／または抗神経変性能を有する、精製されたペプチド画分をココアから得ることに関する。
【００１７】
生物学的に活性なペプチドは、得られたココア抽出物中に存在する１つ以上のタンパク質またはペプチドの加水分解によって生産され得る。この目的のために、酵素および加水分解条件が、所望のバイオペプチドを得るために設定される。
【００１８】
種々の方法論を使用して、これらの阻害活性が研究され得る。インビトロでの試験は、問題のインヒビタの存在下でのＰＥＰ酵素活性の測定に基づく。すなわち、本発明において、これはペプチドリッチなココア画分に関する。
【００１９】
生物学的に活性なペプチドまたはこれらを含む加水分解物は、機能性食品中に含められ得る。一旦濃縮されると、画分は、食品産業および食品、ならびに医薬品の製造のための製薬産業において使用され得る。好適な量の上記ペプチドを含む生物学的に活性な生成物は、疾患（例えば、血圧コントロール（すなわち高血圧）、変性性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病など））の処置および予防に使用され得る。これらはまた抗酸化剤として使用され得る。よって、本発明は、ココアに関する新たな適用を見出し、健康の観点からのポジティブな再評価に寄与する。
【００２０】
本発明の目的である２４個のペプチドは、生物学的に活性な生成物に含まれ得、配列決定および同定がなされており、これらを含む任意の原材料または基質より取得され得る。さらに、加水分解物中にて同定されたこれらの生物学的に活性な新たなペプチドは、化学的および／または酵素的なペプチド合成、ならびに組換え法によって取得され得る。
【００２１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、疎水性相互作用のクロマトグラフ（ＨＩＣ）を示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分３および４に含まれると結論付けられる．
図２は、ＨＩＣ（疎水性相互作用のクロマトグラフ）の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる．
図３は、ＨＩＣ画分４の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる．
図４は、画分Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）を用いた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６中のアミロイドβペプチドの集積に対する保護能力のアッセイを示す図である。ポジティブコントロールは、ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）である。この図から、画分Ｆ８、Ｆ９およびＦ１０がβアミロイドペプチドの集積に対する保護を提供すると結論付けられ、Ｆ９およびＦ１０が最大保護を付与する．
図５は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。バーは標準偏差を示す。この図は、酸化ストレス条件に供された場合に、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫の生存率がどのように増加するのかを示す．
図６は、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。この図は、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫に対応する、漸増する生存曲線を示す。
【００２２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、生物学的に活性な生成物を、特に新たなペプチドが富化されたココア画分から得る方法に関し、これらのペプチドは、インビトロでのＰＥＰ阻害活性、ならびに／あるいはインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する。特に、本発明は、生物学的に活性なペプチドを得るために、ココア副生産物（バーク）の酵素的な加水分解によって種々のペプチド画分を得ることに基づいており、機能性食品に含ませるための成分として潜在的に使用する目的を有している。
【００２３】
本発明の別の局面は、得られたココア抽出物からのペプチドの精製に関する。種々の戦略（例えば、イオン交換または疎水性相互作用による濃縮、および分離（例えばＲＰＣ（逆相クロマトグラフィ）またはゲル濾過クロマトグラフィ）を、抽出物中に存在するペプチドに応じて使用する。
【００２４】
本発明は、ココア抽出物からの、新たな２４個の生物学的に活性なペプチドに関する。このペプチドは、以下に規定されたアミノ酸配列を用いて同定される：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８。これらは、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性、ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する。
【００２５】
さらに、本発明は、上記生物学的に活性なペプチドの、種々の食品についての機能性成分としての使用に関する。食品は、消費が意図される任意の組成物であることを考慮すると、液体であっても固体であってもよい。
【００２６】
本発明の原材料の供給源は、本明細書中に記載された生物学的に活性なペプチドの１つ以上を含む任意の好適な基質であり得る。特定の実施形態において、上記原材料は植物であり、すなわち原材料の供給源はココアである。Theobroma cacaoはココアツリーの特定の名称である。用語ココアはマヤの言語（Ka'kaw）からきており、Theobromaは「神の食べ物」をいうギリシャ語である。より特定には、ココア副産物（いわゆるバーク）が使用され、これは殻付きのココアであり、物理的な加圧によって部分的に脱脂されており、脂質の割合は、重量パーセントで５〜１５％の範囲内、好ましくは１０％であり得る。
【００２７】
原材料の供給源は水に溶解されて、その割合は５〜２０％の間を変動し得、好ましくは１０％であり得る。一旦バークが水に溶解されると、これは、種々の温度（例えば、４０〜６０℃、好ましくは５０℃で、種々の時間（例えば１〜２４時間、好ましくは、１時間、６時間、１８時間または２４時間）にわたって、種々の濃度の１または複数の加水分解酵素で処理される。目的のペプチドを提供し得る任意の酵素が用いられ得る。特に、使用される酵素は、酵素Ｔｅｒｍａｍｙｌの場合、セルロース活性を有する酵素と同等であり、プロテアーゼ活性を有する酵素（例えば、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、ＵｌｔｒａｆｌｏまたはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）と同等である。所望の特性を有するバイオペプチドの１つ以上を生産するという条件で、単一の酵素または２つ以上の酵素の組合せが使用される。使用される酵素の濃度は、原材料１ｇあたり、酵素０．１０〜１０μＬの範囲であり、０．５〜２μＬの範囲である。加水分解の条件（ｐＨ、温度、圧力、酵素の濃度、反応時間など）は、使用される酵素に応じて最適化される。
【００２８】
抽出物を得るために、加水分解反応が一旦完了し、酵素が不活性化される。４０００ｒｐｍでの遠心分離が１５分間行われ、本発明の目的物である、生物学的に活性なペプチドを含む上清が回収され、次いで、単離および精製のために画分および亜画分に分けられる。
【００２９】
従って、本発明の別の局面は、ココア抽出物から得られた生物学的に活性なペプチドの精製および同定である。もしも、抽出物中に存在するペプチドが種々のアミノ酸長であり、目的のペプチドが５〜２０アミノ酸を有することを考慮すると、所望されないペプチドを除去するために、そして本発明の目的のペプチドを単離および濃縮するために、種々の精製戦略が行われる。例えば、種々の分子量の画分が、加水分解された生成物から限外濾過によって取得され得、イオン交換クロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィまたは高速逆相クロマトグラフィまたはゲル濾過クロマトグラフィによって活性な亜画分が単離される。
【００３０】
本発明の利点は、新たなペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８として示されることだけでなく、上記ペプチドが得られる原材料が、最初のココアから得られた加水分解産物および画分の全てに元々存在し、ＰＥＰ酵素阻害活性、および／または抗酸化活性および／または抗神経変性活性を同時に示すという、生物学的に活性な特性を有することである。ペプチドおよびこれらのペプチドを含む抽出物の両方が、機能性食品に含まれ得、そして薬学的または栄養学的な化合物の一部を形成し得、種々の疾患（特に心臓血管疾患および中枢の変性）の処置および予防を補助するために使用され得る。
【００３１】
〔実施例〕
〔実施例１：生物学的に活性なペプチドが富化されたココア抽出物の調製〕
Ivory Coast からのForastero cocoa種を使用して本プロセスを行った。
【００３２】
バークを得るプロセスを、本願と同一発明者による特許文献ＥＳ ２２８６９４７ Ａ１およびＰＣＴ／ＥＳ２００８／０００５４０に従うプロセスによって、ココアポッドから得られた新鮮なココア種を用いて行った。加圧による脱脂の後に得られた生成物を、本発明の場合、殻付きの豆からのバークと称する。最終的に、連続的な機械的抽出機での加圧によって脱脂して得られた１００ｇのバークを、各々１μＬ／ｇの濃度のＴｅｒｍａｍｙｌ酵素およびＡｌｃａｌａｓｅ酵素の組合せとともに１Ｌの蒸留水中に、１：１０（ｗ／ｖ）で溶解し、５０℃で１時間撹拌し続けた。撹拌時間が完了した後、１００℃で酵素を不活性化し、４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、約８５０ｍＬのペプチドリッチな上清を回収した。この上清を用いて、生物学的に活性なペプチドの精製、およびＰＥＰ酵素阻害アッセイを行った。
【００３３】
〔実施例２：ココア抽出物からのペプチドの精製〕
遠心分離の後に得られた、ペプチドを含む上清を、以下の２ステップに供した。
【００３４】
本プロセスの第１ステップは、上記サンプルを、AKTA Explorer chromatographer（GE Healthcare, Amersham Biosciences AB）での疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）による濃縮に供することである。最終的に、HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub)カラムを用い、引き続く溶出のために、平衡化緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ７））を、（ＮＨ４）２ＳＯ４の１．５〜０Ｍのグラジエントで用いた。溶出を２１４ｎｍにてモニタリングし、得られた１０ｍＬ画分の各々にて、ＰＥＰ阻害活性をインビトロで評価した。
【００３５】
活性を有する画分を、先ず１０ｋＤａフィルタ（Amicon Ultra, Millipore）を用いる限外濾過ステップ、次いで、１０ｋＤａより下の画分の逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）による精製ステップに供した。AKTA Explorer chromatographer（Amersham Biosciences）での３ｍＬカラム（Amersham Biosciences）、そして、ミリＱ水中に０．１％ＴＦＡ（Ａ）およびアセトニトリル中に０．１％ＴＦＡ（Ｂ）を用いる広範な溶出グラジエントを用いた。プロセス中で用いた溶媒を除去した後に、サンプルを２１４ｎｍでモニタリングした。得られた画分の各々（今回の場合は２ｍＬ）にて、ＰＥＰ阻害活性をインビトロで再評価した。
【００３６】
〔実施例３：インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性の評価〕
〔Ａ．ＰＥＰ阻害活性の評価〕
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素活性を、Yoshimotoによって記載された方法（Yoshimoto, T. and Tsuru, D. 1978. Agr. Biol. Chem., 42, 2417; Yoshimoto, T., Walter, R. and Tsuru, D. 1980. J. Biol. Chem., 255, 4786)） に従い、基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリンの使用に基づいて測定した。ＰＥＰ酵素の作用によってこの基質からｐ−ニトロアニリンが放出される。これは、分光光度計で４１０ｎｍでの吸収を読み取ることによって定量化され得る。
【００３７】
ＰＥＰ阻害活性を、反応混合物に試験サンプルを添加することによって測定した。最初のバーク阻害を、酵素処理ナシのコントロールとして測定し、市販の酵素を用いたタンパク質加水分解の後に精製したＨＩＣ画分を測定した。（図１）。
【００３８】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって種々の画分を分離した。表１は、バークサンプルおよび種々の画分のＰＥＰ阻害パーセントを示す。
【００３９】
表１は、精製の第１段階を通してのサンプル全てのＰＥＰ酵素阻害の結果を含んでいる。
【００４０】
〔表１：バークサンプルおよび疎水性相互作用画分のＰＥＰ阻害パーセント〕
【００４１】
【表１】
2013515703.tif 000012
【００４２】
疎水性相互作用クロマトグラフィによる精製によって得られた画分３および４を、最大のＰＥＰ酵素阻害能を有しているものとして選択した。よって、これらを逆相クロマトグラフィに供した（図２および３）。表２および３は、疎水性相互作用画分３および４に由来する、逆相クロマトグラフィによって得られた画分のＰＥＰ酵素阻害値、ならびに各々のタンパク質含量を含んでいる。
【００４３】
〔表２：疎水性相互作用の画分３より得られたＲＰＣ画分の、ＰＥＰ阻害のパーセントおよびタンパク質定量〕
【００４４】
【表２】
2013515703.tif 000013
【００４５】
〔表３：疎水性相互作用の画分４より得られたＲＰＣ画分の、ＰＥＰ阻害のパーセントおよびタンパク質定量〕
【００４６】
【表３】
2013515703.tif 000014
【００４７】
ＨＩＣ画分４からの、ＲＰＣ画分８，９および１０は、最大のＰＥＰ酵素阻害値を示したので、これらを、タンパク質含量の評価のために選択した。これらの画分を、質量分析ＭＳ／ＭＳによって分析し、２４個の新たなペプチドを同定し、これらの配列を表４に挙げた。
【００４８】
〔表４：ＨＩＣ画分４からの、ＲＰＣ画分８，９および１０において同定された２８個のペプチドの配列（ペプチド８および１２が画分９および１０の両方にて同定された）〕
【００４９】
【表４】
2013515703.tif 000015
【００５０】
〔実施例４：ＲＰＣ（逆相クロマトグラフィ）画分のインビボでの評価〕
〔Ａ．  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでの画分の抗神経変性能の評価〕
本研究の目的は、インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ阻害についてのポジティブな結果を与えたＲＰＣ画分の機能をインビボで評価することである。この目的のためにモデル生物としてCaenorhabditis elegansを用いた。上記機能は、神経変性疾患であるアルツハイマー病の発達に対して、上記抽出物によって提供される潜在的な保護に関する。この能力を評価するために、ＨＩＣ画分４からのＲＰＣ画分８、９および１０を選択し、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６トランスジェニック系統を用いて無力化（ｐａｒａｌｉｓｉｓ）を決定するための試験を行った。この系統は、温度での誘導の後にヒトアミロイドβペプチド（Ａｂ１−４２）を発現することが特徴付けられている。
【００５１】
以前公開された文献中のデータは、アミロイドβペプチドプラークの形成は酸化ストレスに続いて起こることを示す（Drake et al., “Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer´s disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model” Neurobiol Aging 2003, 24(3):415-20）。よって、分子または化合物の作用によって発揮される効果が、ニューロンにおける線維性Ａβペプチド沈着の集積により強い体制を提供するか否かを評価することは興味深い。これらのトランスジェニック線虫において、上記ペプチドの発現は、目的の分子または化合物の添加後に評価され得る無力化を引き起こす。
【００５２】
実験を行うために、ＮＧＭ（線虫増殖培地）上にて１６℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ４１７６系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭ，およびＮＧＭ−非誘導（実験を通じて線虫を１６℃でインキュベート）である。条件あたり１００匹の線虫を分析した。インキュベートの１日後（線虫は約２０時間齢）に温度を１６℃から２５℃に上げてＡｂペプチド発現を誘導した。次いでインキュベートの２４時間後に温度を２０℃に下げ、試験期間の残りにわたって維持した。インキュベートの後に、無力化した線虫の割合が１００％に達するまで、試験した各条件について、無力化した線虫の数を分析した。
【００５３】
図４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６系統を用いた無力化試験の完了に際して得られた結果を示す。これは、試験した画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）が、ＮＧＭ誘導コントロールと比較してアミロイドβペプチド集積に対する保護を提供する証拠であり、画分Ｆ９およびＦ１０が同様のレベルで最大保護を示している。アミロイドβペプチドを誘導していない線虫は、無力化を患わない。
【００５４】
〔Ｂ：  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでのペプチド画分の抗酸化能の評価〕
実験を行うために、ＮＧＭ上にて２０℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ２０７０系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭである。条件あたり１００匹の線虫を分析した。上記条件下でのインキュベートの７日後に、線虫を酸化ストレスに供した。最終的に、線虫を、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ）を含むＳ基本培地を含むプレートに移した。プレートを２０℃でインキュベートし、５時間後に処置後に生存する線虫の総数を記録した。
【００５５】
図５は、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ）を５時間用いた酸化ストレスに供した後にペプチド抽出物（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）で処理した線虫の生存の増加を、ＮＧＭネガティブコントロールと比較して示す。
【００５６】
〔Ｃ：  培養培地へのペプチド画分の添加後のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生存の評価〕
実験を行うために、ＮＧＭ上にて２０℃でプレート培養するによって、年齢を同調させたＣＬ２０７０系統線虫を得た。１００μＬの各ペプチド画分（Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０）を含むＮＧＭプレート上で卵を回収した。ポジティブコントロールは、最終濃度０．１ｍＭ（プレート表面に１０ｍＭストックを１００μＬ）のＺ−プロリルプロリナル、および最終濃度０．１μｇ／ｍＬ（０．０４ｍｇ／ｍＬストックを２５μＬ）のビタミンＣである。ネガティブコントロールは、ＮＧＭである。条件あたり１００匹の線虫を分析した。各条件下での線虫生存の数を、生存する線虫が残らなくなるまで２日毎に係数した。
【００５７】
図６は、２１日間にわたる種々の条件下にて増殖する線虫についての生存曲線を示す。ＮＧＭネガティブコントロールと比較した場合に、ポジティブコントロールおよびペプチド画分の両方が線虫の寿命を延長したことは注目に値する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】疎水性相互作用のクロマトグラフ（ＨＩＣ）を示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分３および４に含まれると結論付けられる。
【図２】ＨＩＣ（疎水性相互作用のクロマトグラフ）の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる。
【図３】ＨＩＣ画分４の逆相クロマトグラフを示す図であり、２１４ｎｍでの曲線を観察することで、全てのタンパク質が画分７および１１に含まれると結論付けられる。
【図４】画分Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）を用いた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ４１７６中のアミロイドβペプチドの集積に対する保護能力のアッセイを示す図である。ポジティブコントロールは、ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）である。この図から、画分Ｆ８、Ｆ９およびＦ１０がβアミロイドペプチドの集積に対する保護を提供すると結論付けられ、Ｆ９およびＦ１０が最大保護を付与する。
【図５】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。バーは標準偏差を示す。この図は、酸化ストレス条件に供された場合に、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫の生存率がどのように増加するのかを示す。
【図６】線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＬ２０７０系統の生存に対する、ペプチド抽出物Ｆ８（３１．３μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｆ９（１８．１μｇタンパク質／ｍＬ）およびＦ１０（９．９μｇタンパク質／ｍＬ）の効果を示す図である。ＺＰＰ（０．１ｍＭ）およびビタミンＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。この図は、画分Ｆ８，Ｆ９およびＦ１０からのペプチド抽出物で処置された線虫に対応する、漸増する生存曲線を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する生物学的に活性な生成物であって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群より選択される５〜２０アミノ酸の鎖より形成される１つ以上のペプチドを含み、
ＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号２９）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号３０）；ＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３１）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３２）；ＲＲＳＤＬＤＮＧＴＰＶＩＦ（配列番号３３）；ＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴ（配列番号３４）；ＴＳＴＶＷＲＬＤＮＹＤＮＳＡ（配列番号３５）およびＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴＴＤ（配列番号３６）からなる群より選択される１つ以上のペプチドを含む生物学的に活性な生成物を除く、生成物。
【請求項２】
ココア抽出物より得られる、請求項１に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項３】
バークといわれる殻を有するココア生成物から酵素的加水分解によって得られる、請求項２に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項４】
酵素的加水分解の前に前記バークが物理的加圧によって脱脂されて５〜１５％、好ましくは１０％の脂質を有している、請求項２または３に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項５】
脱脂された前記生成物が水中に５〜２０％溶解されており、酵素的加水分解の工程に供され、
上記工程において、１つ以上の酵素が得られた水溶液に添加され、４０〜６０℃の温度が連続する１〜２４時間にわたって、適切なｐＨにて維持される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項６】
酵素的加水分解が、Ｔｅｒｍａｍｙｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、ＵｌｔｒａｆｌｏまたはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅの群に属する１つ以上の酵素によって行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項７】
前記生物学的に活性なペプチドが、加水分解が完了した後に加水分解抽出物の遠心分離によって上清から得られる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項８】
抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性を有する食品または機能性成分を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性なペプチドを含む、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する機能性食品。
【請求項１０】
神経変性状態を処置する医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物を含み、抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性を有する、薬学的組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月26日(2012.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでのプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）酵素阻害活性ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する生物学的に活性な生成物であって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の群より選択される１つ以上のペプチドを含み、
ＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号２９）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦ（配列番号３０）；ＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３１）；ＬＳＤＮＥＷＡＷＭＦＫ（配列番号３２）；ＲＲＳＤＬＤＮＧＴＰＶＩＦ（配列番号３３）；ＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴ（配列番号３４）；ＴＳＴＶＷＲＬＤＮＹＤＮＳＡ（配列番号３５）およびＤＮＹＤＮＳＡＧＫＷＷＶＴＴＤ（配列番号３６）からなる群より選択される１つ以上のペプチドを含む生物学的に活性な生成物を除く、生成物。
【請求項２】
ココア抽出物より得られる、請求項１に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項３】
バークといわれる殻を有するココア生成物から酵素的加水分解によって得られる、請求項２に記載のココア抽出物より得られる生物学的に活性な生成物。
【請求項４】
酵素的加水分解の前に前記バークが物理的加圧によって脱脂されて５〜１５％、好ましくは１０％の脂質を有している、請求項２または３に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項５】
脱脂された前記生成物が水中に５〜２０％の割合で溶解されており、酵素的加水分解の工程に供され、
上記工程において、１つ以上の酵素が得られた水溶液に添加され、４０〜６０℃の温度が連続する１〜２４時間にわたって、適切なｐＨにて維持される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項６】
酵素的加水分解が、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）の群に属するセルロース活性を有する１つ以上の酵素、あるいはＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）またはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）の群に属するプロテアーゼ活性を有する１つ以上の酵素によって行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項７】
前記生物学的に活性なペプチドが、加水分解が完了した後に加水分解抽出物の遠心分離によって上清から得られる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物。
【請求項８】
抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性を有する食品または機能性成分を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、非治療的な使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性なペプチドを含む、インビトロでのＰＥＰ酵素阻害活性ならびにインビボでの抗酸化能および／または抗神経変性能を有する機能性食品。
【請求項１０】
神経変性状態を処置する医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物の、使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物学的に活性な生成物を含み、抗高血圧活性および／または抗神経変性活性および／または抗酸化活性を有する、薬学的組成物。
【国際調査報告】
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