(57)【要約】種々の遺伝子組換え事象およびヒトまたは動物由来のサンプル中に存在する抗体を表すPCR産物の産生量を増加させるプライマーを生成するための方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物由来のサンプルからの組換え免疫グロブリン配列の、プライマーによりもたらされる増幅による増幅産物の数を増加させるための方法であって、該プライマーによりもたらされる増幅に用いられる少なくとも1つのプライマーに対し、該プライマー配列の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方に、約2個〜約5個のランダムに生成されたヌクレオチドを組み入れる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ランダムに生成されたヌクレオチドを、前記プライマー配列の3'末端に組み入れる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記プライマー配列に対し、該プライマー配列の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方に、3個のランダムに生成されたヌクレオチドを組み入れる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
3個のランダムに生成されたヌクレオチドを、前記プライマー配列の3'末端に組み入れる、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2010年3月29日に出願された米国仮特許出願第61/318,417号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、B細胞免疫グロブリン遺伝子組換えを同定および定量化するための方法に関する。より具体的には、本発明は、免疫グロブリンcDNAおよび／またはRNAからのPCR増幅産物の数を増加させるためのプライマーを設計するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫学は、かつては科学研究における「沈滞している分野」と見なされていたが、身体およびその健康および疾患の両方における状態の研究における不可欠な部分となっている。科学者は、かつては免疫とは何の関係もないと考えられていた、身体の自然防御システムと疾患との間の関連性を、継続的に発見している。免疫系の細胞は炎症応答の最も重要な部分を提供し、炎症は、心血管疾患、腎疾患、糖尿病、関節炎、および癌といった多様な疾患と関連し得る。炎症応答は、慎重にバランスを保たれなければならず、そのバランスが維持されない場合には、免疫不全によって引き起こされる疾患、またはその対極にある全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、およびサルコイドーシス等の「自己免疫疾患」をもたらし得る。
【０００４】
米国国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Allergy and Infectious Disease）（NIAID）の所長であるDr. Anthony Fauci, M.D.は、「健康および疾患におけるヒト免疫系の状態を明らかにすることは、ヒト免疫学調査の主要な目標である」と述べたとされている（NIH ニュース，2010年3月8日，http://www.nih.gov.news/health/mar2010/niaid-08a.htm（非特許文献1））。NIAIDの科学者達は、「血中の免疫細胞の混合物における遺伝子発現の差異を調べる現在の方法は、健康な個体の間でさえ各細胞型の割合に広範な違いがあることを考慮に入れていない」と認めた（Dr. Mark Davis，NIHニュース，2010年3月8日（非特許文献2））。課題に対する彼らのチームのアプローチは、マイクロアレイ技術−細胞特異的マイクロアレイ有意性解析（csSAM）の使用を通して得られた分子データを解析する新しい数学的アプローチである。
【０００５】
B細胞によって提供される抗体応答は、抗原刺激に対する免疫系の応答に対し、相当な程度の多様性を生み出す。抗原によって刺激されると、B細胞はB細胞濾胞内に移動し、胚中心（GC）を構築する。それ自体が多様性の重要な供給源である再編成された免疫グロブリン遺伝子は、定常領域のクラススイッチ組換えおよび超可変領域の体細胞超変異によってさらに改変される。これらの領域における変異率は、自然発生的遺伝子変異よりも約106高いと推定されている。
【０００６】
必要とされているのは、健康および疾患における免疫系の状態についてのよりよい理解を提供するための、B細胞多様性を検出するためのより感度の高い方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dr. Anthony Fauci, M.D., NIH ニュース，2010年3月8日，http://www.nih.gov.news/health/mar2010/niaid-08a.htm
【非特許文献２】Dr. Mark Davis，NIHニュース，2010年3月8日
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、免疫グロブリン組換え領域のPCR増幅を改善し、検出可能な組換え分子の数を増加させるための方法であって、1つまたは複数の免疫グロブリン可変領域のPCR増幅のための少なくとも1つのプライマーの3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方に、約3個〜約5個のランダムに生成されたヌクレオチドを付加する工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト患者由来のB細胞集団からの免疫グロブリン可変領域のPCR増幅の結果を図示している。レーン1〜3は、対照プライマー（ランダムに生成されたヌクレオチド配列を3'末端に有しない）を用いることによるPCRの産物の相対的な産生量を図示しており、レーン4〜6は、試験プライマー（ランダムに生成されたヌクレオチド配列を3'末端に有する）を用いることにより増幅された配列の相対的な数を図示している。レーン1は正常個体のRNAからの増幅産物を表し、レーン2はCLL患者からのものを表し、レーン3は陰性対照としてのブランクである。レーン4は正常個体から単離されたRNAからの増幅産物を表し、レーン5はCLL患者からのものを表し、レーン6は陰性対照である。増幅条件は同じであった。レーン1、2、4、および5におけるバンド間の強度の差によって示されるように、プライマーに対し、ランダムに生成されたヌクレオチドを3'に付加することによって、有意により多くの増幅産物が産生された。
【図２】異なる個体における再編成の検出のための、複数の標的のシークエンシングの結果を図示している。これらの再編成およびその相対的頻度、ある配列の欠如などの検出によって、健康および疾患における免疫系の状態およびその役割についての貴重な情報が提供され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
本発明者は、ヒトおよび／または動物のB細胞集団のサンプルから、免疫グロブリン組換え領域のPCR増幅を改善し、かつ検出可能な組換え分子の数を増加させるための新しい方法を開発した。本発明は、1つまたは複数の免疫グロブリン可変領域のPCR増幅のための少なくとも1つのプライマーの3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方に、約3個〜約5個のランダムに生成されたヌクレオチドを付加する工程を含む。該方法は、一方または両方の末端にランダムに生成されたヌクレオチドを有しないプライマーを利用する増幅反応と比較して、増幅産物の数の増加を提供する。
【００１１】
胚中心において、B細胞は、再編成された免疫グロブリン遺伝子を体細胞超変異によって改変する。この超変異は、さらなる多様性および抗原結合特異性を提供する。それはまた、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子のV領域の中および周辺に変異を導入する。近年、これらの配列に対してより容易に結合する縮重プライマーの設計を手助けするコンピュータープログラムが開発されているため、プライマーの設計は改善されている。しかしながら、抗体分子の実際の組換え集団を表す組換えを検出するために、超可変領域の接合部で結合し、かつこの領域における配列の非常に変化しやすい性質を考慮に入れたプライマーを使用することによって、検出可能な分子の数が増加し得ることを、本発明者は発見した。
【００１２】
本発明は、ヒトまたは動物の血液サンプルからRNAおよび／またはcDNAを増幅するための方法を提供する。しかしながら、サンプルはヒトまたは動物の身体における骨髄または他のB細胞供給源から採取されたものであってもよい。「組換え免疫グロブリン配列」とは、抗体の様々な多様性をもたらす、身体内で起こっている種々の遺伝子再編成を表す。
【００１３】
増幅は当業者に公知の様々な方法によって行われてもよく、これは市販のキットの使用によって、より容易になされてもよい。1つのサンプルから複数の標的を増幅するための方法は、例えばTEM-PCRとして知られる方法を記載している米国特許出願公開第20070141575号、およびARM-PCRとして知られる方法を記載している米国特許出願公開第20090253183号に記載されている。
【００１４】
例えば、ARM-PCR法の第一のステップでは、高濃度の標的特異的ネステッド（nested）プライマーを用いて標的特異的な第一の増幅手順を行う。公知の免疫グロブリン重鎖可変領域配列（IgHV）に結合する可能性に基づいて、プライマーを選択する。先に言及しているように、多数のコンピュータープログラムがプライマーの選択を助けるのに利用可能であり、当業者にとって、プライマー選択は、当技術分野において公知である一定の原則によってより容易になされる。標的特異的プライマーを用いて、1種または複数種の（好ましくは複数種の）標的核酸を増幅してもよい。ネステッドプライマーの濃度は、概ね5〜50pmolの間であってもよい。選択されたプライマーは、標的核酸に対して特異的でない追加の配列が与えられるように追加のヌクレオチドで「タグ付け」され、その結果、そのようなプライマーによる標的核酸の増幅は、標的特異的プライマーの場合とは異なり、無関係な標的核酸アンプリコンをさらに増幅するために用いることのできる共通プライマーの結合部位をも、得られるアンプリコンの中に組み入れる。増幅をおよそ10〜15サイクルにわたって行って反応を終了させ、得られたアンプリコンを反応混合物からレスキューし、これらを、標的特異的反応からレスキューされた種々のアンプリコンに相当する無関係なヌクレオチド配列の増幅を比較的無差別な様式でもたらす共通プライマーによってプライミングされるポリメラーゼ連鎖反応を含む、第2の標的非依存的な増幅手順に用いる。
【００１５】
アンプリコンレスキューを行って、第1の反応のプライマーをできるだけ減らすかまたは排除すると同時に、共通プライマーを用いる第2の増幅に用いるためのアンプリコンを提供する。アンプリコンレスキューは種々の様式で行うことができる。例えば、完了した第1の増幅反応物からの少量試料採取を行って、第2の増幅のためのアンプリコンを用意することができる。少量の試料を採取する場合、それによって第2の増幅のために十分な数のアンプリコンが提供され、同時に第1の増幅のプライマーの残存数が大幅に減少する（すなわち、希釈される）。アンプリコンのレスキューは、第一の増幅の反応系の含有物の大部分を除去し、残存する含有物に、レスキューされたアンプリコンを第二の反応系で増幅するために共通プライマーを利用する第二の増幅を行うのに必要な酵素、ヌクレオチド、バッファー、および／または他の試薬とともに共通プライマーを添加することによって行われてもよい。分離技術を利用してアンプリコンをレスキューしてもよい。そのような技術は、プライマーとアンプリコンとの間のサイズの差、アンプリコン、プライマー、もしくは両方に接着しているタグ、または当業者に公知の他の方法に依存し得る。いったん分離したら、レスキューされたアンプリコンのすべてまたはレスキューされたアンプリコンの一部を第二の増幅に使用してもよい。
【００１６】
ARM-PCRでは、新しいバッファー、ヌクレオチド、および共通プライマーを用いて第二の増幅を行う。レスキューされたアンプリコンの効率的な増幅を提供し、それらのアンプリコンの相当数のコピーを第二の増幅の最後に提供するように、共通プライマーを選択する。
【００１７】
標的特異的プライマーによって推進される第一の増幅、および標的とは無関係な共通プライマーによって推進される第二の増幅に反応を分離することによって、当該方法は、特定の標的に存在する核酸の種類および数のみを増幅する標的特異的プライマーの使用によって特異性を提供し、また、ネステッドプライマーおよび高濃度の標的特異的プライマーの使用、ならびに非特異的な（標的とは無関係な）増幅をより高いコピー数で提供する共通プライマーの使用によって達成される感度を提供する。さらに、第一の増幅における高濃度のプライマーの使用、それに続くアンプリコンのレスキュー（特に、第一の増幅物の一部を除去し、それを新しい反応系に入れることによるか、または第一の増幅物の大部分を除去し、それに標的とは無関係な第二の増幅のための第二の反応系を形成するのに必要な試薬を添加することのいずれかにより、第一の増幅の一部を単離することによってアンプリコンのレスキューを行う場合）は、自動化に適している。これらのステップを、コンタミネーションの可能性を制限する比較的閉じた反応系で行うことができるだけでなく、該方法によって提供される、第一の増幅、アンプリコンのレスキュー、および第二の増幅の組み合わせにより、複数のサンプル由来の複数の標的に対する、特異的かつ高感度で2時間未満の時間内での検出方法がもたらされる。
【００１８】
ARM-PCRおよびTEM-PCR法の両方が、複数の標的配列を増幅するために本発明者に用いられており、そして免疫グロブリンRNAおよび／またはcDNA配列のサンプルにおける検出可能な標的の数を増加させるプライマーを生成するために、本発明の方法と組み合わされている。例として、プライマー配列の3'末端に3個のランダムに生成されたヌクレオチドを付加することによって、ARM-PCRおよびTEM-PCR法の両方が、B細胞サンプルから複数の標的を増幅するためにより効率的になった。このことは、プライマーのミスマッチは結合の低下およびそのようなミスマッチを有する標的の増幅の欠如をもたらすと考えられるため、ランダムに生成された末端を有しないプライマーを用いた場合には検出され得ないと考えられる超変異を有し得るさらなる標的の検出に、少なくとも64の異なる可能性を提供する。
【００１９】
複数の標的の増幅のためのさらなる方法を本発明の方法とともに用いてもよく、複数の標的を増幅する望ましい方法を達成するために本発明者によって上手く用いられている方法の例として、ARM-PCRおよびTEM-PCR法が提供される。
【００２０】
ハイスループットシークエンシングに関して存在する1つの主要な課題は、プライマーダイマーが増幅を妨害し、かつ除去するのが非常に困難なことである。40塩基対長である正方向（forward-in）および逆方向（reverse-in）プライマーを用いることにより、ダイマーは80塩基対程度の長さであり得る。従来の方法によって産生される産物は、150〜250塩基対程度の短さであり得る。本発明の方法によって提供される新しいプライマー設計を、プライマーを外に移し、より長いインサートを増幅およびシークエンシングするステップと組み合わせることによって、PCR産物が350bpを上回り、産物をダイマーから分離することがはるかに容易になる。
【００２１】
本発明の方法は、以前は検出するのが困難であった抗体配列をより効率的に増幅するプライマーを産生するのに有用である。これにより、任意の1個体から採取されたサンプル中に存在する多様な配列を増幅するのがより容易になり、その結果、再編成がより高頻度で存在し得ること、全く存在し得ないことなどを確認するのがより容易になる。このことは、以前は、あるクローンはそれらのクローンの産生につながる超変異によるプライマーのミスマッチ対合のために検出するのが困難であるという事実によって、より困難になっていた。
【００２２】
ランダムに生成されたヌクレオチドは、Ig分子およびARM-PCR／TEM-PCRに関する本発明者の経験では、それらは3'末端に付加された場合に最も有用であるが、5'末端、3'末端、または両方の末端においてプライマー配列に付加されてもよい。ランダムに生成されたヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプライマーの3'または5'末端のいずれかに約2個〜約5個のヌクレオチドを含んでもよい。3'末端に3個のランダムに生成されたヌクレオチドを用いた結果は、特にPCR反応に用いられるより高い範囲のアニーリング温度を用いた場合に、ヒト血液からの組換え免疫グロブリン配列の増幅および検出において目覚ましい結果を提供している。
【００２３】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され得る。
【実施例】
【００２４】
図1に示されている増幅のために、Conversant Healthcare Systems, Inc., Huntsville, Alabamaから血液サンプルを入手した。Qiagen OneStep RT-PCRキット（Qiagen, Carlsbad, California）を用いた第一の増幅反応のために、Qiagenキットを用いてmRNAを抽出した。サンプルに逆転写酵素を添加した：50℃40分間（最低30分間のRT）、最初のPCR活性化のために95℃15分間。濃縮サイクルを、94℃30秒間→63℃2分間→72℃30秒間の15サイクルで行った。94℃30秒間→72℃2分間の2ステップサイクルを15サイクル行い、72℃10分間での最後の伸長を行った。Qiagen Multiplex PCRキットを用いた第二の増幅反応では、最初のPCR活性化を95℃15分間で行い、続いて、94℃30秒間→55℃30秒間→72℃30秒間の3ステップサイクルを40サイクル行い、72℃5分間での最後の伸長と続いた。Promega製のRecombinant RNasin（登録商標）Ribonuclease Inhibitorも添加した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
2013523129.tif 000004