(57)【要約】本明細書は、がんに対するペプチドワクチンを記載する。特に、ＣＴＬを誘発するＣＬＵＡＰ１遺伝子に由来するエピトープペプチドを提供する。また、そのようなペプチドを標的とする抗原提示細胞および単離されたＣＴＬ、ならびに該抗原提示細胞またはCTLを誘導するための方法も、提供する。本発明はさらに、ＣＬＵＡＰ１に由来するペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、薬学的組成物を提供する。さらに本発明は、がん（腫瘍）の治療および／もしくは予防のための方法、ならびに／またはその術後再発の予防のための方法、ならびに、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ペプチドを提示する抗原提示細胞、または本発明の薬学的組成物を用いた、CTLを誘導するための方法、抗がん免疫を誘導するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬ誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＣＬＵＡＰ１のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２３および２５〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されている、請求項１および２のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２４との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項３記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸となるよう改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、またはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸となるよう改変されている。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ２との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項３記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
【請求項６】
ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
ＣＴＬを誘導するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項７記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項９】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項７記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項９記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
がんの治療のために製剤化される、請求項９または１０記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを、請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１３】
以下からなる群より選択される段階を含む方法によって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドと結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、Ｔ細胞に導入する段階。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法によって導入される、請求項１４記載のＡＰＣ。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１７】
請求項１３記載の方法によって誘導される、請求項１６記載のＣＴＬ。
【請求項１８】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドのいずれかに対する、抗体またはその断片。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、請求項７記載のヌクレオチド、または請求項１９記載の抗体を含む、診断キット。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん療法の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２０１０年４月８日に出願された米国仮出願第６１／３２２，０９９号の恩典を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されており（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80（非特許文献１）；Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9（非特許文献２））、これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる開発および臨床研究の前進が保証される（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55（非特許文献３）；Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42（非特許文献４）；Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9（非特許文献５）；van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14（非特許文献６）；Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8（非特許文献７）；Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72（非特許文献８）；Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66（非特許文献９）；Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94（非特許文献１０）。現在までに、これらのＴＡＡ由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながら、現在のがんワクチン治験の多くは低い客観的奏効率しか示していない（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80（非特許文献１１）；Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42（非特許文献１２）；Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15（非特許文献１３）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡが依然として必要である。
【０００５】
この目的のために、２３，０４０個の遺伝子を含むゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイを用いた結腸直腸癌の発現プロファイル解析により、ＣＬＵＡＰ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５０４１またはＮＭ＿０２４７９３）、クラステリン関連タンパク質１（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）が、結腸癌において頻繁にトランス活性化される遺伝子として同定された（Takahashi M et al., Oncogene. 2004 Dec 9;23(57): 9289-94（非特許文献１４））。ノーザンブロット解析により、ＣＬＵＡＰ１の発現は、細胞周期のＳ期後期〜Ｇ２／Ｍ期に徐々に増加し、Ｇ０／Ｇ１期には基底レベルまで戻ることが観察されている。さらに、ｓｉＲＮＡによるＣＬＵＡＰ１の抑制が、トランスフェクトした腫瘍細胞において増殖遅延をもたらすことが示されている。ＣＬＵＡＰ１の過剰発現も、骨肉腫、卵巣癌、および肺癌で観察されている（Ishikura H et al., Int J Oncol. 2007 Feb; 30(2):461-7（非特許文献１５））。総合すると、これらの事実から、ＣＬＵＡＰ１は複数のがんにおいてがん免疫療法のための有用な標的であり得ることが示唆される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Takahashi M et al., Oncogene. 2004 Dec 9;23(57): 9289-94
【非特許文献１５】Ishikura H et al., Int J Oncol. 2007 Feb; 30(2):461-7
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、免疫療法の標的として役立つ可能性のある新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般に免疫系により「自己」として認知され、そのため多くの場合は先天的免疫原性を有しないため、適切な標的の発見は極めて重要である。上述のとおり、ＣＬＵＡＰ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５０４１またはＮＭ＿０２４７９３の遺伝子（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）によりコードされる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）が、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を含むがこれらに限定されないがんにおいて上方制御されると同定されている。したがって本発明は、がん／腫瘍免疫療法の標的候補としてＣＬＵＡＰ１に着目する。
【０００８】
本発明はさらに、ＣＬＵＡＰ１に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＣＬＵＡＰ１の遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に関する。以下に詳述するように、健常ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＬＵＡＰ１由来のＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。これらの結果は、これらのペプチドが、ＣＬＵＡＰ１を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることを実証している。さらにこれらの結果は、ＣＬＵＡＰ１が強い免疫原性を有し、かつそのエピトープががん／腫瘍免疫療法の有効な標的であることを示している。
【０００９】
したがって、ＨＬＡ抗原と結合する単離されたペプチド、特にＣＬＵＡＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）またはその免疫学的活性断片を含むものを提供することが、本発明の１つの目的である。これらのペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予想され、したがってこれを用いて、エクスビボでＣＴＬを誘導することもでき、または、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌などのがんに対する免疫応答の誘導のために対象に投与されることもできる。好ましいペプチドはノナペプチドまたはデカペプチドであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２３および２５〜４３の中より選択されるアミノ酸配列を有するものである。中でも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に強力なＣＴＬ誘導能を示し、そのため、特に好ましい。
【００１０】
本発明のペプチドは、結果として得られる改変ペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持している限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたものを包含する。
本発明はまた、本発明の任意のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。これらのポリヌクレオチドを、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導もしくは調製するために用いることができ、または、本発明のペプチドと同様に、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１１】
対象に投与された場合、本発明のペプチドは好ましくは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、ＡＰＣの表面上に提示される。したがって、本発明の１つの目的は、ＣＴＬを誘導する組成物または物質を提供することであり、そのような組成物は、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、本発明の１種もしくは複数種のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を企図し、そのような組成物は、がんの治療および／または予防、ならびにその術後再発の予防のために製剤化され、そのようながんは、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を含むがこれらに限定されるわけではない。本発明の薬学的組成物または物質は、有効成分として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりにまたはそれに加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを含み得る。
【００１２】
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを該ペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示するＡＰＣを誘導することができる。そのようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、そのためがん免疫療法に有用である。したがって本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそのような方法によって得られるＡＰＣの両方を意図している。
【００１３】
本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための方法、すなわちＣＤ８陽性細胞を、１つまたは複数の本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドと結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む方法も提供する。そのような方法によって得られるＣＴＬは、例として乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を含むがこれらに限定されないがんの治療および予防において有用であり得る。したがって本発明は、本方法によって得られるＣＴＬを包含する。
【００１４】
さらに、がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法であって、ＣＬＵＡＰ１ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片を含む組成物または物質、ＣＬＵＡＰ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＣＬＵＡＰ１ポリペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣを該対象に投与する段階を含むそのような方法を提供することは、本発明の別の目的である。
本発明の適用性は、ＣＬＵＡＰ１過剰発現に関連するかまたはＣＬＵＡＰ１過剰発現から生じる、がんなどのいくつかの疾患のいずれにも及び、がんの例としては、これらに限定されるわけではないが乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれる。
【００１５】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］ＣＴＬ誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＣＬＵＡＰ１のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド、
［２］ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２３および２５〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［１］の単離されたペプチド、
［３］１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されている、［１］および［２］のいずれか１つの単離されたペプチド、
［４］ＨＬＡ−Ａ２４との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、［３］の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸となるよう改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、またはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸となるよう改変されている、
［５］ＨＬＡ−Ａ２との関連において、以下の特徴の一方または両方を有する、［３］の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される、
［６］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］〜［５］のいずれか１つの単離されたペプチド、
［７］［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［８］ＣＴＬを誘導するための組成物であって、［１］〜［６］のいずれか１つの１種もしくは複数種のペプチド、または［７］の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物、
［９］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、［１］〜［６］のいずれか１つの１種もしくは複数種のペプチド、または［７］の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物、
［１０］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［９］の薬学的組成物、
［１１］がんの治療のために製剤化される、［９］または［１０］の薬学的組成物、
［１２］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを、［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１３］以下からなる群より選択される段階を含む方法によって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドと結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、Ｔ細胞に導入する段階、
［１４］ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１５］［１２］の方法によって導入される、［１４］のＡＰＣ、
［１６］［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ、
［１７］［１３］の方法によって誘導される、［１６］のＣＴＬ、
［１８］対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］〜［６］のいずれか１つのペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法、
［１９］［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドのいずれかに対する、抗体またはその断片、
［２０］［１］〜［６］のいずれか１つのペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
［２１］［２０］の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞、
［２２］［１］〜［６］のいずれか１つのペプチド、［７］のヌクレオチド、または［１９］の抗体を含む、診断キット、ならびに
［２３］ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれか１つの単離されたペプチド。
【００１６】
前述した本発明の概要および後述する詳細な説明は例示的な態様であり、本発明や本発明のその他の代替的な態様を制限するものではないことを理解されたい。
【００１７】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかし、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１ａ−ｆ】図１ａ〜ｆは、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している、一連の写真（ａ）〜（ｆ）からなる。以下のウェルにおけるＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したウェル＃６（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した＃２（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激した＃２（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した＃４（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で刺激した＃４（ｅ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）で刺激した＃１（ｆ）。長方形の枠で示したウェルにおける細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させた。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｋ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図１ｇ−ｋ】図１ｇ〜ｋは、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している、一連の写真（ｇ）〜（ｊ）からなる。以下のウェルにおけるＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激したウェル＃６（ｇ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）で刺激した＃２（ｈ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した＃４（ｉ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）で刺激した＃５（ｊ）。長方形の枠で示したウェルにおける細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させた。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｋ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２】図２は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）（ｄ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｅ）からなる。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）（ｂ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）（ｃ）で刺激したＣＴＬ株からの限界希釈によって樹立したＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）からなる。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、各ペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】図４は、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示している折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２または全長ＣＬＵＡＰ１遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角）またはＣＬＵＡＰ１（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【図５ａ−ｆ】図５ａ〜ｆは、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している、一連の写真（ａ）〜（ｆ）からなる。以下のウェルにおけるＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を用いたウェル番号＃３（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を用いた＃６（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を用いた＃２（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を用いた＃３（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を用いた＃２（ｅ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を用いた＃２（ｆ）。長方形の枠で示したウェルにおける細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させた。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）で刺激したＣＴＬからの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｈ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図５ｇ−ｈ】図５ｇ〜ｈは、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している、一連の写真（ｇ）からなる。以下のウェルにおけるＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を用いたウェル番号＃５（ｇ）。長方形の枠で示したウェルにおける細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させた。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）で刺激したＣＴＬからの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｈ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図６】図６は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）（ｅ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）からなる。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図７】図７は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｃ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株からの限界希釈によって樹立したＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）からなる。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図８】図８は、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）からなる。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＣＬＵＡＰ１遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｃ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）（ｄ）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（四角）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＣＬＵＡＰ１（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかし、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しないことも、また理解されるべきである。
本明細書において言及される全ての出版物、特許、または特許出願は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかし、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
【００２０】
Ｉ．定義
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含め本明細書が優先される。
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも１つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾されていてもよい残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２１】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、１つまたは複数の修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００２２】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
【００２３】
本明細書で用いる「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。「薬学的組成物」に関するそのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的組成物」という用語は、本発明の化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の組成物を指す。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、ポリファーマコフォアにスキャフォールドされた対象をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００２４】
別段の定めのない限り、「がん」という用語は、ＣＬＵＡＰ１遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
別段の定めのない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指す。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプを指す。
【００２５】
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「キット」という用語は、試薬と他の物質との組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００２６】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【００２７】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００２８】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
【００２９】
ＩＩ．ペプチド
ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＣＬＵＡＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）由来のペプチドを解析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
【００３０】
ＣＬＵＡＰ１由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドを候補とみなす：
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−２８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−２５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、および
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−６３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。
【００３１】
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５１−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５２−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５３−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５６−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５７−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５８−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６３−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１６６−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１６７−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、および
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１６９−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）。
【００３２】
ＣＬＵＡＰ１由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドを候補ペプチドとみなす：
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−９５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−２６５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−２９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−１８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−９６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−２３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、および
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−２２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）。
【００３３】
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、および
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）。
【００３４】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果は、ＣＬＵＡＰ１がＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験されたペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＬＵＡＰ１のエピトープペプチドであることを実証している。
【００３５】
ＣＬＵＡＰ１遺伝子は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を含むがこれらに限定されないがんの細胞および組織では過剰発現されるが、ほとんどの正常器官では発現されないため、これはがん免疫療法の優れた標的となる。したがって、本発明は、ＣＴＬによって認識されるＣＬＵＡＰ１由来のエピトープに相当するノナペプチド（９個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）を提供する。あるいは本発明は、ＨＬＡ抗原に結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のアミノ酸配列を有するかまたはその免疫学的活性断片である、ペプチドを提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００３６】
一般に、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17に記載されているソフトウェアプログラムなど、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラムを用いて、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えば、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81、Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424、Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003、Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されているように測定することができ、これらは例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220において要約されている。結合親和性を測定するための方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを用いて、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＣＬＵＡＰ１由来の断片を選択することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムによる、ＨＬＡ抗原と結合するＣＬＵＡＰ１由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらにそのようなペプチドは、ＣＬＵＡＰ１の全長ペプチドを含み得る。
【００３７】
本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持している限り、付加的なアミノ酸残基に隣接させることができる。該付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって、本発明は、ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドを含む、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合は約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００３８】
一般に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、欠失、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し得、かつ１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３９】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識するであろう。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により、元のタンパク質と類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存的であることが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族基含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４を参照されたい）。
【００４０】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかし、本発明のペプチドはこれらに限定されず、結果として生じた改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＣＬＵＡＰ１の多型変異体、種間相同体、およびアリルのＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、好ましくは少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変（挿入、付加、欠失、および／または置換）することができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個または３個またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００４１】
がん免疫療法との関連で用いられる場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するだけでなくＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性も包含するペプチドを選択することが好ましい。この目的のために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変し、結合親和性が向上した改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００４２】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２４との結合親和性を高めるために、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されており、かつ／または前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されているペプチドが、本発明に包含される。
【００４３】
あるいは、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を高めるために、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２５〜４３の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、かつ／または前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンもしくはメチオニンで置換されているペプチドが、本発明に包含される。
【００４４】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れた機能を有し得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
本発明はまた、１個、２個、または数個のアミノ酸の付加もまた本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加され得ることも企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００４５】
しかし、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変してもよい。
【００４６】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Tリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００４７】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識してもよく、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出してもよい。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００４８】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８によって示されるアミノ酸配列の中より選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡに対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい例示的態様である。
さらに、相同性解析の結果から、これらのペプチドが他のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を有していないことが示された。よって、免疫療法に用いた場合に未知のまたは望ましくない免疫応答が生じる可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＣＬＵＡＰ１に対する免疫を誘発するのに有用である。したがって、本発明のペプチドは、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４９】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドを、結果として得られる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持している限り、他のペプチドに連結させることもできる。他の適切なペプチドの例には、本発明のペプチドまたは他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。適切なペプチド間リンカーは当技術分野で周知であり、例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）である。
【００５０】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、ＣＬＵＡＰ１ではない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が２種類以上の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは、十分に確立されている。したがって、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するかどうかを判定すること、ならびに続いて本発明によるＣＬＵＡＰ１組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含めることは、当業者の慣例的な実験法の範囲内である。
【００５１】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照されたい）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明において用いることができる。したがって当業者は、１種もしくは複数種のＣＬＵＡＰ１ペプチドおよび１種もしくは複数種のＣＬＵＡＰ１ではないペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的手法を用いて容易に調製することができる。
【００５２】
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用により連結して、ポリトープを形成することができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
【００５３】
本発明のペプチドは、結果として得られる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持している限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。本ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれないという条件で、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含んでもよい。このような種類の修飾は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与するため、またはペプチドを安定化するために行うことができる。
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念は本発明のポリペプチドにも適合し得る。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００５４】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：ペプチドの活性を測定する段階、および
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、アッセイされる活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＣＬＵＡＰ１ペプチド」または「ＣＬＵＡＰ１ポリペプチド」と記載することもできる。
【００５５】
ＩＩＩ．ＣＬＵＡＰ１ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
【００５６】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００５７】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞もまた、本発明によって提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を取り入れて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００５８】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＣＬＵＡＰ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５０４１またはＮＭ＿０２４７９３（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体から構成され得る。当技術分野で周知の通り、ＤＮＡ分子は天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを認識する。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってもよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００６０】
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００６１】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報  特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００６２】
複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２４型またはＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを得るために、天然のＣＬＵＡＰ１部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を行うことができる。
【００６３】
本発明のエキソソームに対してＡ２４型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の中より選択される配列を有するペプチドが使用される。
あるいは、本発明のエキソソームに対してＡ２型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２５〜４３の中より選択される配列を有するペプチドが使用される。
【００６４】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとで形成された複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００６５】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「APCを誘導する」という語句には、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、HLA抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を細胞表面上に提示させることが含まれる。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
【００６６】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、該対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００６７】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または課程を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｂによって得られるＡＰＣは、がん、例えば乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を治療および／または予防するためのワクチンであり得る。
本発明の一局面によると、ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導しない可能性のあるペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。当分野において従来より実施されている様々な方法、例えば、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法を含む、導入の方法の例を、使用することができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明の部分ペプチドが提示される。
【００６８】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と該ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって、得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法の詳細は後述の「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に記載される。
【００６９】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＣＬＵＡＰ１を内因的に発現する細胞、またはＣＬＵＡＰ１遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００７０】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＣＬＵＡＰ１を提示している腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを解析するためにはＰＣＲ法が好ましい。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）であってよいが、これらに限定されるわけではない。ＴＣＲ誘導体は、ＣＬＵＡＰ１ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＣＬＵＡＰ１ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００７１】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込んでもよい。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入してもよい。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
【００７２】
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に提示されている場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与し得る受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、その好ましい例には、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡマルチマー染色解析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現するＴ細胞がそのＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。上述した複合体が、その複合体がＴ細胞表面上に存在する場合にＴ細胞に細胞傷害活性を付与することができることの確認を、公知の方法によって行うこともできる。好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定、例えばクロム放出アッセイなどが含まれる。
【００７３】
また、本発明は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４との関連においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、および１８のＣＬＵＡＰ１ペプチド、かつまたＨＬＡ−Ａ２との関連においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８のＣＬＵＡＰ１ペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸の形質導入によって調製されるＣＴＬも提供する。
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要としている患者におけるがんの療法または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために用いることができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００７４】
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減する任意の行為を含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）が疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を軽減することによって、既存の疾患の悪影響を軽減することを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管新生を軽減することを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
【００７５】
がん予防のためおよび／またはその術後再発の予防のための治療とは、以下の、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療を構成し、および／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の、軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００７６】
ＩＸ．薬学的な物質または組成物
ＣＬＵＡＰ１の発現は、正常組織と比較して、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌を例として含むがそれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって、本発明は、その術後再発の治療および／または予防のための薬学的な物質または組成物を提供し、そのような組成物は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１種または複数種を有効成分として含む。あるいは、薬学的な物質または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な物質または組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の薬学的な物質および組成物はまた、ワクチンとしても有用であり得る。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００７７】
本発明の薬学的な物質または組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含むがそれらに限定されない対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【００７８】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００７９】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８０】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または課程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体とともに製剤化する段階を含む方法または課程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８１】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または課程であって、以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む方法または課程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８２】
本発明により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２２の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが見出され、またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２５〜４３の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが見出された。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８および２３、３０、３３、３４、３５、３６、３８のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な物質または組成物は、それぞれ、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な物質または組成物にも当てはまる。
【００８３】
本発明の薬学的な物質または組成物によって治療されるがんは、限定的でなく、ＣＬＵＡＰ１が関与する（例えば、過剰発現する）任意のがんを含み、これには、例えば、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８４】
本発明の薬学的な物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されるわけではない。
必要に応じて、本発明の薬学的な物質または組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症物質または抗炎症組成物、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体におけるその他の治療物質に加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的な物質または組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な物質または組成物の量は、例えば、使用する薬理学的な物質または組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に左右される。
【００８５】
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な物質または組成物は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の物質または組成物も含み得ることが理解されるべきである。
本発明の一態様において、本発明の薬学的な物質または組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器表面のラベルには、該物質または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【００８６】
本発明の薬学的な物質または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【００８７】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な物質または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な物質または組成物として直接投与してもよく、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してもよい。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００８８】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上で構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、ペプチドを化学的に結合させてもよく、または、リンカー（例えば、リジンリンカー：K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715）として１つもしくは複数のアミノ酸を有し得る単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出した後、本発明のペプチドで刺激して、本発明のペプチドのいずれかをその細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのAPCを対象に再投与して該対象内でＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
【００８９】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な物質または組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な組成物は、他の有効成分と共に投与してもよく、または顆粒内へ製剤化することによって投与してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する任意の化合物、物質、または組成物を指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、これらに限定されるわけではないが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれる。
【００９０】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られる塩を指す。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な物質または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質または組成物として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【００９２】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００９３】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な物質または組成物
本発明の薬学的な物質または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい。同じく例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい）。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００９４】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００９５】
患者へのポリヌクレオチドの送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【００９６】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００９７】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導するために、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、そのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、後述のようにＡＰＣを誘導することもできる。
【００９８】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【００９９】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有することから、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明の任意のペプチドを、単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
【０１００】
一方、本発明のペプチドを対象に投与すると、ＡＰＣは該ペプチドとインビボで接触し、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明は、本発明のペプチドを対象に投与する段階を含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与すると、本発明のペプチドはインビボで発現してＡＰＣと接触し、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する段階も含み得る。「発現可能な形態」とは、上記の「ＩＸ．薬学的な物質または組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な物質または組成物」の章で説明されている。
【０１０１】
本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階を含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
あるいは本発明は、以下の段階のうちの１つを含み得る、ＣＬＵＡＰ１に対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１０２】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含み得る：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
【０１０４】
あるいは、それらをエクスビボで用いることによってＣＴＬを誘導することもでき、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すこともできる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階（ｂ）のＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
【０１０５】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階も含むことができる。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章で上述した方法によって調製することができる。
【０１０６】
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することができる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または過程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【０１０７】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＣＬＵＡＰ１に関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０８】
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む物質または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与も企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な物質または組成物」の項、特に本発明の薬学的な物質または組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、上記「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述している。
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または過程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
【０１０９】
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１０】
本発明との関連において、ＣＬＵＡＰ１を過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。このようながんの例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべき細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者においてＣＬＵＡＰ１を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られた細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＣＬＵＡＰ１の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＣＬＵＡＰ１を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１１１】
あるいは本発明は、ＣＬＵＡＰ１を過剰発現するがんを有する対象に投与される、上記の（ａ）〜（ｄ）の中より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＣＬＵＡＰ１ポリペプチドで治療すべき対象を同定するための方法であって、対象由来の細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルを決定する段階を含み、該レベルが、該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象が本発明のＣＬＵＡＰ１ポリペプチドで治療され得るがんを有し得ることが示される方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下、より詳細に説明する。
【０１１２】
目的とするＣＬＵＡＰ１の転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＣＬＵＡＰ１発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。
【０１１３】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生物学的試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１４】
本発明によれば、対象から得られた細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルを決定してもよい。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＣＬＵＡＰ１のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイなどにおいて行うことができる。アレイの使用は、ＣＬＵＡＰ１の発現レベルを検出するのに好ましい可能性がある。当業者は、ＣＬＵＡＰ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＬＵＡＰ１のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いてＣＬＵＡＰ１の転写産物（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を定量してもよい。そのようなプライマーを、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
【０１１５】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＣＬＵＡＰ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によって達成してもよい。
【０１１６】
プローブまたはプライマーは特定のサイズのものであってよい。サイズは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの範囲であってよく、プローブおよびプライマーのサイズは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドの範囲にわたってよい。
【０１１７】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＣＬＵＡＰ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）またはその免疫学的断片の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＣＬＵＡＰ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。本発明のペプチドに対するこのような抗体またはその断片もまた、本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１１８】
ＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＣＬＵＡＰ１タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＣＬＵＡＰ１遺伝子の高発現レベルが示される。
標的遺伝子、例えばＣＬＵＡＰ１遺伝子のがん細胞における発現レベルは、そのレベルが、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
【０１１９】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＣＬＵＡＰ１遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料中のＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
ＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１２０】
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有すると疑われるかどうかを診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＣＬＵＡＰ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＬＵＡＰ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１２１】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＣＬＵＡＰ１の発現レベルを決定する段階；
ｂ）ＣＬＵＡＰ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＬＵＡＰ１の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１２２】
本発明はまた、本発明のＣＬＵＡＰ１ポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているかまたは罹患していることが疑われる対象を診断または判定するための診断キットを提供し、該診断キットはまた、がんの予後を評価する、および／またはがん療法、特にがん免疫療法の有効性もしくは適用性をモニターするのにも有用であり得る。適切ながんの具体例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。より詳細には、本キットは、対象由来の細胞中のＣＬＵＡＰ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み得ることが好ましく、そのような試薬は以下の群より選択される：
（ａ）ＣＬＵＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＬＵＡＰ１タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＬＵＡＰ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１２３】
ＣＬＵＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１２４】
一方、ＣＬＵＡＰ１タンパク質またはその免疫学的断片を検出するのに適した試薬の例には、ＣＬＵＡＰ１タンパク質またはその免疫学的断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＣＬＵＡＰ１タンパク質またはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＣＬＵＡＰ１タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１２５】
本キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。本キットはさらに、ＣＬＵＡＰ１遺伝子に対するプローブまたはＣＬＵＡＰ１ペプチドに対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＣＬＵＡＰ１ペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象またはがんに罹患している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれ得る。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１２６】
本発明の一態様において、試薬がＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＣＬＵＡＰ１  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１２７】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＣＬＵＡＰ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＣＬＵＡＰ１陽性試料を回収し、次にそれらのＣＬＵＡＰ１レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＣＬＵＡＰ１タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＣＬＵＡＰ１を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＣＬＵＡＰ１標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＣＬＵＡＰ１は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＣＬＵＡＰ１レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１２８】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその免疫原性断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本明細書において企図される本発明のタンパク質の部分ペプチドおよび免疫原性断片の例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のペプチドまたはタンパク質を調製するための方法は、上記の通りである。
【０１２９】
抗ＣＬＵＡＰ１抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＣＬＵＡＰ１抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＣＬＵＡＰ１）に対する抗体を含み、この抗ＣＬＵＡＰ１抗体の量が正常対照中の抗ＣＬＵＡＰ１抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１３０】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するのに適した方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。この複合体を用いて、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することができる。
【０１３１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫学的応答を評価するための方法または診断試薬を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の中で選択し得る。そのような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は当技術分野において周知である。特定の態様においては、試薬として用いられる物質または組成物は、ペプチドエピトープを認識して結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る組成物であってよい。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１３２】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174: 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１３３】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手法によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１３４】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について解析することができる。ＰＢＭＣを培養し、該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について解析することができる。
【０１３５】
本ペプチドを、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いてもよい。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて解析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１３６】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＣＬＵＡＰ１免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。そのような方法は、生物学的試料中でのＣＬＵＡＰ１  ＨＬＡ結合ペプチド、またはＣＬＵＡＰ１  ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検材料などの生物学的試料中のＣＬＵＡＰ１の発現は、ＣＬＵＡＰ１プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＣＬＵＡＰ１増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１３７】
好ましい診断法は、対象から単離された生物学的試料をＣＬＵＡＰ１  ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生物学的試料中のＣＬＵＡＰ１  ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生物学的試料中に存在するＣＬＵＡＰ１  ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生物学的試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般に、剤と生物学的試料を接触させるための条件は、分子と生物学的試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Ｌｏｗらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１３８】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生物学的試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生物学的試料はインビボの組織であってよく、かつＣＬＵＡＰ１免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生物学的試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生物学的試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から採取された腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１３９】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することにより抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法を用いて、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべて、より慣例的なアッセイより少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
【０１４０】
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＣＬＵＡＰ１ペプチドの少なくとも１つを投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）免疫原を、該免疫原に対して特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）で誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または決定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答をＣＴＬ誘導レベルと相関させる段階。
【０１４１】
本発明において、免疫原は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２３および２５〜４３のアミノ酸配列の中より選択されるＣＬＵＡＰ１ペプチド、そのようなアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにそのようなアミノ酸配列が１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸置換によって改変されたペプチド、のうち少なくとも１つである。一方、免疫原特異的ＣＴＬの誘導に適した条件は当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞を、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために免疫原の存在下でインビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導する目的で、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してもよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
【０１４２】
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および／または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを３〜１０週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってもよい。
本発明によれば、免疫原特異的ＣＴＬの誘導が対照と比較して強化されていることにより、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するのに適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合の、またはいかなるＣＬＵＡＰ１ペプチドとも異なるアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドと接触させている場合の、ＣＴＬ誘導レベルが含まれる。
【０１４３】
１つの好ましい態様においては、対象に投与された各免疫原間で免疫学的応答を比較することにより、対象の免疫学的応答を配列特異的な様式で評価する。特に、いくつかの種類のＣＬＵＡＰ１ペプチドについての混合物を対象に投与する場合であっても、免疫学的応答はペプチドに応じて異なる可能性がある。その場合には、各ペプチド間で免疫学的応答を比較することにより、対象がより強い応答を示すペプチドを同定することができる。
【０１４４】
ＸＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＣＬＵＡＰ１ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＣＬＵＡＰ１の発現が関与するがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４５】
本発明はまた、ＣＬＵＡＰ１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、必要に応じて、ＣＬＵＡＰ１タンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１種または複数種の抗ＣＬＵＡＰ１抗体を含み得る。本発明との関連において、ＣＬＵＡＰ１ポリペプチドに結合する抗ＣＬＵＡＰ１抗体は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、解析される抗体と全長ＣＬＵＡＰ１ポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイは、様々な種類の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されるわけではない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０１４６】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイもまた含まれ得る。加えて本発明は、ＣＬＵＡＰ１を発現するがんを検出できる免疫学的画像化法を企図し、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されるわけではない。そのようなアッセイは、ＣＬＵＡＰ１を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４７】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、任意の形態で、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として用いることができ、かつさらに、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体を含み得る。
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
【０１４８】
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
本明細書では、抗体を、ＣＬＵＡＰ１ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、８、９、１０、１４、１５、１６、１８、２３、３０、３３、３４、３５、３６、および３８の中より選択されるアミノ酸配列を有するＣＬＵＡＰ１の断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１４９】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
【０１５０】
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１５１】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０１５２】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１５３】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１５４】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０１５５】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１５６】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０１５７】
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１５８】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１種または複数種に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１５９】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１６０】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１６１】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０１６２】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手法は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１６３】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
【０１６４】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０１６５】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
【０１６６】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点（ori）」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。
【０１６７】
例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１６８】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１６９】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１７０】
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴＩＳＩは、ＩＨＷＧ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴ２、およびアフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０１７１】
ＣＬＵＡＰ１由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と結合するＣＬＵＡＰ１由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合予測ソフトウエア「ＢＩＭＡＳ」（www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）（Parker et al.（J Immunol 1994, 152(1): 163-75）、Kuzushima et al.（Blood 2001, 98(6): 1872-81））および「ＮｅｔＭＨＣ  ３．０」（www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）（Buus et al.（Tissue Antigens., 62:378-84, 2003）、Nielsen et al.（Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004））を用いて予測した。これらのペプチドは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘａｓ）により、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１７２】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１，０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１，０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。
【０１７３】
作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。
【０１７４】
ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴＩＳＩ細胞（Ａ２４）またはＴ２細胞（Ａ２）に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７５】
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７６】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７７】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴＩＳＩ（Ａ２４）またはＴ２（Ａ２）（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０１７８】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子、ＨＬＡ−Ａ２４、またはＨＬＡ−Ａ２のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２−ヌル細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０１７９】
結果１
がんにおけるＣＬＵＡＰ１発現の増強
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた広範な遺伝子発現プロファイルデータにより、ＣＬＵＡＰ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５０４１またはＮＭ＿０２４７９３；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）の発現が上昇していることが明らかになった。ＣＬＵＡＰ１発現は、７７例の乳癌のうち１７例、１９例の子宮頸癌のうち１５例、１９例の結腸直腸癌のうち１２例、１９例の食道癌のうち１２例、２５例の胃癌のうち７例、５例の浸潤型胃癌のうち５例、１８例のリンパ腫のうち５例、１６例の神経芽細胞腫のうち２例、９例の膵癌のうち４例において、対応する正常組織と比較して確かに上昇していた（表１）。
【０１８０】
（表１）対応する正常組織と比較してがん性組織においてＣＬＵＡＰ１の上方制御が観察された症例の比
2013523083.tif 000002
【０１８１】
結果２
ＣＬＵＡＰ１由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表２ａおよび２ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＣＬＵＡＰ１の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜２２のペプチドはＢＩＭＡＳによって予測し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜１４のペプチドはＮｅｔＭＨＣ  ３．０によって予測した。エピトープペプチドを決定するために、ＨＬＡ−Ａ２４結合能を潜在的に有する合計２２種のペプチドを選択して調べた。
【０１８２】
（表２ａ）ＣＬＵＡＰ１に由来するＨＬＡ−Ａ２４結合９ｍｅｒペプチド
2013523083.tif 000003
【０１８３】
（表２ｂ）ＣＬＵＡＰ１に由来するＨＬＡ−Ａ２４結合１０ｍｅｒペプチド
2013523083.tif 000004
開始位置は、ＣＬＵＡＰ１のＮ末端からのアミノ酸残基の番号を示す。
結合スコアおよび解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は「ＢＩＭＡＳ」および「ＮｅｔＭＨＣ３．０」に由来する。
【０１８４】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性のＣＬＵＡＰ１由来の予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜j）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃６（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した＃２（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激した＃２（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した＃４（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で刺激した＃４（ｅ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）で刺激した＃１（ｆ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃６（ｇ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）で刺激した＃２（ｈ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した＃４（ｉ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）で刺激した＃５（ｊ）。一方、表２aおよび２ｂに示されるその他のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激では特異的なCTL活性は測定されなかった。陰性データの典型的な例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからは特異的ＩＦＮ−γ産生が観察されなかった（図１ｋ）。結果として、ＣＬＵＡＰ１に由来する１０種のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導することができるペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
【０１８５】
ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
上記「材料および方法」の章に記載した通りに、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いたウェル番号＃６（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いた＃４（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を用いた＃４（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いた＃６（ｄ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いた＃２（ｅ）において、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、限界希釈によってＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｅ）。すべてのＣＴＬ株は、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、「材料および方法」に記載したとおりＣＴＬ株から限界希釈によってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図３において、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。
【０１８６】
ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を内因的に発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子の遺伝子両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株を用いて試験した。全長ＣＬＵＡＰ１遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬは、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）がＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子とともに標的細胞上で天然に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果は、ＣＬＵＡＰ１に由来するこのペプチドが、ＣＬＵＡＰ１を発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンとして適している可能性を示している。
【０１８７】
抗原ペプチドの相同性解析
ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）で刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。この相同性解析の結果は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−９−１５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ２４−１０−１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の配列が固有のものであること、およびしたがって、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
結論として、ＣＬＵＡＰ１に由来する新規ＨＬＡ−Ａ２４エピトープペプチドが同定されている。さらに、本明細書における結果は、ＣＬＵＡＰ１のエピトープペプチドががん免疫療法における使用に適し得ることを実証している。
【０１８８】
結果３
ＣＬＵＡＰ１由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表３ａおよび３ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＣＬＵＡＰ１の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。エピトープペプチドを決定するために、ＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する可能性がある合計２１種のペプチドを選択して調べた。
【０１８９】
（表３ａ）ＣＬＵＡＰ１に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合９ｍｅｒペプチド
2013523083.tif 000005
【０１９０】
（表３ｂ）ＣＬＵＡＰ１に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合１０ｍｅｒペプチド
2013523083.tif 000006
開始位置は、ＣＬＵＡＰ１のＮ末端からのアミノ酸残基の番号を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【０１９１】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＬＵＡＰ１由来の予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
ＣＬＵＡＰ１由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図５ａ〜ｇ）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を用いたウェル番号＃３（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を用いた＃６（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を用いた＃２（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を用いた＃３（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を用いた＃２（ｅ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を用いた＃２（ｆ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を用いた＃５（ｇ）。一方、表３ａおよび３ｂに示されるその他のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激では、特異的なＣＴＬ活性を測定することができなかった。陰性データの典型例として、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）で刺激したＣＴＬからは特異的ＩＦＮ−γ産生が観察されなかった（ｈ）。結果として、ＣＬＵＡＰ１に由来する７種のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導することができるペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
【０１９２】
ＣＬＵＡＰ１由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
上記「材料および方法」の章に記載した通りに、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を用いたウェル番号＃３（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を用いた＃６（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を用いた＃２（ｃ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を用いた＃３（ｄ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を用いた＃２（ｅ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を用いた＃２（ｆ）において、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、限界希釈によってＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図６ａ〜ｆ）。これらのＣＴＬ株は、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、「材料および方法」に記載した通りに、ＣＴＬ株から限界希釈によってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｃ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｄ）で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図７ａ〜ｄ）。
【０１９３】
ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
各ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株およびクローンを、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を内因的に発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株およびクローンを用いて試験した。全長ＣＬＵＡＰ１またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。
【０１９４】
図８において、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｃ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株は、ＣＬＵＡＰ１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ａ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｂ）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）（ｃ）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）（ｄ）のペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子とともに標的細胞上で発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果は、ＣＬＵＡＰ１を発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンに適用するために、ＣＬＵＡＰ１由来のこれらのペプチドが利用可能であり得ることを示した。
【０１９５】
抗原ペプチドの相同性解析
ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）で刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。
【０１９６】
この可能性を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。この相同性解析の結果は、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−９−９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、およびＣＬＵＡＰ１−Ａ０２−１０−８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）の配列が固有であること、およびしたがって、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
【０１９７】
結論として、本発明者らは、ＣＬＵＡＰ１に由来する新規ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドを同定した。さらに、ＣＬＵＡＰ１のエピトープペプチドががん免疫療法に適用可能であり得ることが実証された。
【０１９８】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得、かつ広範ながんの種類に対する適用性を有する、ＣＬＵＡＰ１由来の新規ＴＡＡを提供する。このようなＴＡＡは、ＣＬＵＡＰ１に関連した疾患、例えばがん、より詳細には乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、浸潤型胃癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵癌に対するペプチドワクチンとして有用であり得る。
【０１９９】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明しているが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識すると考えられ、その境界は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【図１ａ−ｆ】
2013523083.tif 000007
【図１ｇ−ｋ】
2013523083.tif 000008
【図２】
2013523083.tif 000009
【図３】
2013523083.tif 000010
【図４】
2013523083.tif 000011
【図５ａ−ｆ】
2013523083.tif 000012
【図５ｇ−ｈ】
2013523083.tif 000013
【図６】
2013523083.tif 000014
【図７】
2013523083.tif 000015
【図８】
2013523083.tif 000016
【配列表】
2013523083000001.app
【国際調査報告】
2013523083.tif 000017
2013523083.tif 000018
2013523083.tif 000019