(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原と免疫特異的に結合し、ウサギ免疫グロブリン由来の結合ドメインを含むポリペプチドをスクリーニング及び産生するための方法。【解決手段】ウサギ抗体重鎖又は軽鎖スキャフォールドの使用により、特にげっ歯動物抗体由来のドメインと比べて、単離された免疫グロブリン可変ドメインに安定性及び／又は親和性の増強を付与する新規なＣＤＲループ及びフレームワーク領域の同定を可能にする。可変ドメインの安定性及び／又は親和性の増強により、単一ドメイン免疫特異的ポリペプチドを含む、つまりＶＨ又はＶＬドメインの一方を含む研究ツール又は治療用免疫特異的ポリペプチドの産生におけるそれらの使用が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ファージ発現ライブラリーから、前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ファージ発現ライブラリーが、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得された、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列から調製されるステップと；
ｂ）前記一組の配列又はそのサブセットをＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を取得するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、抗原と免疫特異的に結合し、ウサギ免疫グロブリン由来の結合ドメインを含むポリペプチドをスクリーニング及び作製するための方法に関する。本発明の方法は、ウサギ抗体重鎖又は軽鎖スキャフォールド（scaffold）の使用により、特にげっ歯動物抗体由来のドメインと比べて、単離された免疫グロブリン可変ドメインに安定性及び／又は親和性の増強を付与する新規なＣＤＲループ及びフレームワーク領域の同定を可能にする。本発明の可変ドメインの安定性及び／又は親和性の増強により、単一結合ドメインポリペプチド、つまりＶＨ又はＶＬドメインの一方を含む単一ドメイン抗体を含む、所望の抗原に免疫特異性を示す研究ツール及び治療用ポリペプチドの作製におけるそれらの使用が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
抗体は、軽鎖及び重鎖と名付けられた２つの鎖から構成される。軽鎖は、アミノ末端の可変ドメイン（ＶＬドメイン）及びカルボキシ末端の定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。重鎖は、アミノ末端の可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）から構成される。抗体結合部位は、ＶＬ及びＶＨドメインに位置し、相補性決定領域（ＣＤＲ，Complementarity-Determining Region）を表す６つの超可変ループにより作られている。ＶＬ及びＶＨ領域は両方とも、構造的に保存されたベータシートフレームワークに結合している３つのＣＤＲループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。
【０００３】
ハイブリドーマ技術の開発により、単一エピトープを特異的に標的とした単一集団の抗体、又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ，monoclonal antibody）の作製が可能になり、創薬分野における革命が導かれた。しかしながら、抗体作製に関する問題、並びに免疫原性及びサイトカイン関連副作用を含むインビボ応答に関する問題は、免疫特異的結合を依然として保持しつつ、抗体構造及び／又は機能を変更させる研究に繋がった。抗原認識及び親和性を著しく変化させずに、抗体をその最も小さな機能的形態に縮減させる試みが研究でなされている。抗原に結合可能な最も小さな抗体断片を同定することにより、完全な抗体分子又はＩｇＧから、Ｆａｂ及び組換え単鎖Ｆｖ断片へと進化した。
【０００４】
８０年代の遺伝子組換えの進歩により、組換え可変ドメインを迅速に容易に作製することは可能であった。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫された動物のゲノムＤＮＡからＶＨ及びＶＬドメインをコードする遺伝子の多様なレパートリーがクローニングされ、幾つかの抗原に対する多重結合活性及び機能性の特徴付けが可能になった。それにもかかわらず、初期に単離された可変ドメイン断片はほとんど可溶性がなく、作製が困難であった。
【０００５】
作製における問題は、重鎖のみを含む二量体分子であるラクダ抗体の特徴付けで取り上げられた。二量体分子の発見は、組換え抗体作製に関する多くの問題に対処しただけでなく、この分子は、免疫グロブリン分子の重鎖が軽鎖の非存在下で免疫特異的結合を導くことができる可能性も強調した。Ｉｇ重鎖が、軽鎖の非存在下で有意な抗原結合能を保持できることは、今や広く受け入れられている。免疫特異性に関するＣＤＲドメインの中で、ＶＨドメインのＣＤＲ３領域が最も重要であるという構造研究からの証拠も存在する。これは、ＨＣＤＲ３アミノ酸残基がほとんどの表面接触区域を提供し、抗原との分子的相互作用に重要であるという知見に基づく。したがって、免疫グロブリンＶＨドメインに基づいて、抗原結合タンパク質のサイズを単一ドメイン結合タンパク質にさらに縮減することが可能であり得る。
【０００６】
２．１  ウサギ抗体
ポリクローナル抗体の形態で数十年間利用されているウサギ抗体レパートリーは、強力な親和性及び高度な特異性を特徴とする抗体の優れた供給源である（Mage et al., 2006）。そのうえ、ウサギ目に属するウサギは、げっ歯目に属するマウス及びラットから進化的に遠く離れている。その結果として、げっ歯動物ｍＡｂ（さらには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから作製されたヒトｍＡｂ）が検知できない、げっ歯動物抗原とヒト抗原の間で保存されたエピトープは、ウサギポリクローナル抗体により認識されることが多い。
【０００７】
ファージディスプレーが産生するウサギｍＡｂは、表現型及び遺伝子型が同時に選択されるという事実により、さらなる利点を提供する。ウサギｍＡｂ配列についての知識は、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びＩｇＧを含む種々のｍＡｂ形態の容易な作製、並びに重要なことには、ヒト化及び親和性成熟を可能にする（Rader et al., 2000；Steinberger et al., 2000；Rader, 2001）。その結果として、ファージディスプレーが産生するウサギｍＡｂは、ヒトに対する治療的応用に有望な試薬となっている。
【０００８】
正常なウサギでは、ＶＤＪ遺伝子再編成でＤ近位ＶＨ遺伝子セグメント、ＶＨ１が使用されるため、７０〜９０％のＩｇ分子及びＢ細胞は、ＶＨａアロタイプを保持している。発現されたｃＤＮＡ配列中に種々の異なるＶＬ配列が見い出されているため、種々のＶｋ及びＶｌ遺伝子セグメントの再編成が、ウサギに生じると考えられる。
【０００９】
ウサギ骨髄中で発生するＢ細胞レパートリーは、ＶＤＪ遺伝子再編成で使用されるＶＨ遺伝子セグメントが少数であることにより制限されている。複数のＶｋ遺伝子セグメントが骨髄Ｂ系列細胞で再編成されるが、ほとんどのＢ系列細胞は、ＶＨａアロタイプ配列をコードする同一のＶＨ遺伝子、ＶＨ１を再編成する。レパートリーは、少数のＪＨ及びＤ遺伝子セグメントがＶＤＪ再編成に使用されることによっても制限される。ＪＨ４はＶＤＪ遺伝子再編成の８０％で、ＪＨ２は残りの２０％で見出され、他の３つの機能的ＪＨ遺伝子セグメントは稀にしか使用されない。また、ほとんどのＶＤＪ遺伝子再編成では、合計１２個のＤ遺伝子セグメントのうち、Ｄ２ａ（Ｄ９）、Ｄ２ｂ（Ｄｆ）、Ｄ３、又はＤ５が使用されており、Ｄ４及びＤ６は稀にしか使用されない。ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントの限定的使用は、限定的なＶＤＪレパートリーに帰着するであろうが、Ｎヌクレオチドは、細胞分化中の最初期の再編成からＶＤ及びＤＪ接合部の本質的に全てに見出される。ＶＤＪ遺伝子再編成中のＮ領域の高度な多様性は、限定的な数のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの再編成から期待されるより遥かに大きなレパートリーに帰着する。このレパートリーのサイズは推定されていない。しかしながら、Ｂ細胞が骨髄及びＢリンパ球産生の他の初期発生部位を離れた後、本質的に全てのＶＤＪ遺伝子が末梢で体細胞性に多様化するとすれば、Ｂ細胞発生の初期発生部位で発達するレパートリーは機能的に不十分であることが想定される。
【００１０】
Ｂ細胞Ｉｇ遺伝子再編成が若年ウサギの骨髄などの部位で生じた後、未熟ＩｇＭ  Ｂ細胞は、虫垂及び他の腸関連リンパ系組織において、さらなるＩｇレパートリー多様化を起こす。これらの部位は、一次的な免疫前レパートリーの発生を促すと考えられる。
【００１１】
再編成された重鎖及び軽鎖配列の遺伝子変換は、３〜４週齢までウサギ虫垂において見出される。体細胞性超変異は、公知の遺伝子変換供与体を欠如するＤ及びＪ領域で生じる。ＪＨ領域も体細胞性超変異により多様化され、したがって、体細胞性超変異は、再編成されたＶＨ遺伝子セグメントにも生じる可能性が高い。
【００１２】
遺伝子変換及び体細胞性超変異は、若年ウサギ虫垂の胚中心において生じるだけでなく、脾臓及びリンパ節などの二次的リンパ系組織における免疫応答中の多様化にも使用される。
【００１３】
発生中の虫垂に由来するクローン及び特異的免疫応答中の脾臓に由来するクローンの再編成された重鎖及び軽鎖遺伝子の配列を比較すると、虫垂に由来するクローンの多様化パターンは、脾臓に見出されたパターンとは著しく異なり、免疫抗原が、増殖及び選択過程を高親和性に向かって駆動させていた。クローン的に関連した虫垂Ｂ細胞は、ＣＤＲ３を含む各相補性決定領域（ＣＤＲ）に様々なアミノ酸配列を発生させた一方で、脾臓に由来する優性クローンは、ＣＤＲ３における変化をほとんど起こさなかった。
【００１４】
データによると、ウサギでは、脾臓の胚中心において免疫応答中の超変異の割合がより高いことも示されており、マウスと比較してウサギでは、超変異と選択との釣り合いがより多く変異に向かい、選択にはそれほど向かわないという傾向がある。
【００１５】
二次的リンパ器官の胚中心（ＧＣ，germinal center）は、再編成されたＶ遺伝子の体細胞性多様化がその中で生じ、Ｔ依存性抗原に対する免疫応答においてＡｂの親和性成熟を導く特殊構造体である。
【００１６】
マウス及びヒトと異なり、ウサギはほんの少数の重鎖Ｖ領域（ＶＨ）遺伝子を再編成し、そのためコンビナトリアル機序（combinatorial mechanism）により生み出される多様性は限定されている。全体的なパターンは、その生殖細胞系列又は近似的生殖細胞系列配列が、初期分裂中の遺伝子変換及び点突然変異の両方により、及び大部分は後期分裂中の点突然変異により変化する脾臓前駆細胞のパターンである。同一増殖クローンの集団内では、軽鎖配列の相当な多様化がＶＨ配列の変化と同時に生じた可能性があり、これらの事象は、ＧＣ内又は後には骨髄などの部位の移出細胞中のいずれかにおける選択により、さらなる親和性成熟のための基質として役立つ多様な配列を産生することができる。
【００１７】
ＶＨ１遺伝子セグメントの優先的使用による限定的な重鎖ＶＨＤＨＪＨレパートリーは、骨髄中で発生するＢ細胞の多様な軽鎖ＶｋＪｋレパートリーにより補われる。このレパートリーは、遺伝子変換及び体細胞性超変異によりＧＡＬＴで、及び後には免疫後の脾臓及びリンパ節の胚中心での両方において、著しく増殖する。
【００１８】
上記で考察したように、ウサギ抗体は、体細胞性超変異による進化成熟（evolving maturation）の影響下にあり、所与の抗原に対するその親和性及び結合性を増加させるために遺伝子変換に依存しない。認識性に加えて、単離された単一ドメイン抗体の別の重要な特性は、その本来的な構造的安定性である。ウサギ抗体は体細胞性超変異により進化するため、ウサギ抗体のＶＨ及びＶＬ安定性は、単一ＶＨ又はＶＬファミリーの本来的な特性に依存せず、進化が起きやすい特性に依存する。抗体安定性は、抗原を認識するためのＣＤＲの良好なコンフォメーションの促進だけでなく、産生及び血清半減期などの下流応用にとっても重要である。さらに、本発明はＶＨ及びＶＬタンパク質ドメインを単離するため、疎水性界面がタンパク質凝集を促進する場合があることが想定される。そのため、本来的に安定的な単離されたＶＨ及びＶＬドメインを選択するための本方法は、現存するものより独特な異なる特性を有する新規の小型ドメイン抗体を同定する可能性を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Mage et al., 2006
【非特許文献２】Rader et al., 2000
【非特許文献３】Steinberger et al., 2000
【非特許文献４】Rader, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本方法は、ヒト、マウス、及びラクダ抗体と比較して固有の特性を有し、高度な親和性、特異性、及び安定性を示す特有なウサギ単一ドメイン抗体の同定を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
３．発明の概要
本発明は、ウサギ免疫グロブリン可変ドメインに由来する配列を含む免疫特異的ポリペプチドの作製方法、そのような配列を含むポリペプチド、及びそのような方法により作製されるポリペプチドに関する。特に、本発明は、ウサギＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、並びに／又はそれらに由来する新規なＣＤＲ及びフレームワーク領域を単離及び使用するための方法を包含する。本発明は、組換え型免疫特異的ポリペプチドのＣＤＲループ及び／又はフレームワーク領域と関連した「スキャフォールド」又は構造的配列として使用するための、単離されたウサギＶＨ及びＶＬドメイン内の新規なアミノ酸配列（定義された位置の新規なアミノ酸残基を含む）の同定をさらに提供する。本発明のウサギスキャフォールド配列（スキャフォールド残基を含む）又は新規なＣＤＲ／フレームワーク配列は、特にげっ歯動物抗体と比べて、可変ドメイン（複数可）及び／又はそれらを含有する免疫特異的ポリペプチド（例えば、抗体）の安定性及び／又は親和性を増強し、高度に特異的な単一ドメイン免疫ペプチド、例えば単一ドメイン抗体の作製及び／又は使用を可能にする。
すなわち、本発明は、
１．抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ファージ発現ライブラリーから、前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ファージ発現ライブラリーが、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得された、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列から調製されるステップと；
ｂ）前記一組の配列又はそのサブセットをＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を取得するステップとを含む方法、
２．抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させるステップであって、前記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列が、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得されたステップと；
ｂ）ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組の配列を取得するステップと；
ｃ）前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードするファージ発現ライブラリーＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ライブラリーが前記一組の配列又はそのサブセットから調製されるステップとを含む方法、
３．ウサギ生体試料が、抗原で免疫されたウサギに由来する、上記１又は２に記載の方法、
４．ステップａ）が１回又は複数回繰り返される、上記１に記載の方法、
５．ステップｃ）が１回又は複数回繰り返される、上記２に記載の方法、
６．生体試料が形質細胞を含む、上記１〜３のいずれかに記載の方法、
７．生体試料が、リンパ系組織、骨髄組織、又は虫垂組織を含む、上記１〜３のいずれかに記載の方法、
８．試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織が脾臓組織である、上記７に記載の方法、
９．試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織がリンパ節組織である、上記７に記載の方法、
１０．上記１に従って作製されたＶＨ又はＶＬドメインを含む抗体又はその抗原結合性断片、
１１．抗体が単鎖抗体である、上記１０に記載の抗体又は断片、
１２．抗体が単一ドメイン抗体である、上記１０に記載の抗体又は断片、
１３．抗体が抗体断片である、上記１０に記載の抗体、
１４．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、上記１３に記載の断片、
１５．抗体がミニボディである、上記１０に記載の抗体又は断片、
１６．抗体がダイアボディである、上記１０に記載の抗体又は断片、
１７．抗体が二重特異性抗体である、上記１０に記載の抗体又は断片、
１８．抗体がナノボディである、上記１０に記載の抗体又は断片、
１９．抗体がＣＨ１ドメインを含まない、上記１０に記載の抗体又は断片、
２０．上記１０〜１９のいずれかに記載の抗体又は断片のキメラ型、
２１．上記９〜１１のいずれかに記載の抗体又は断片のヒト化型、
２２．抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、上記１０に記載の抗体又は断片、
２３．抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、上記１又は２に記載の方法、
２４．ステップ（ｂ）において選択が、少なくとも１．８ｍＭのクロラムフェニコール濃度での選択である、上記１又は２に記載の方法、
２５．組換えＶＨ又はＶＬドメインが少なくとも５４℃のＴｍを有する、上記１又は２に記載の方法、
２６．組換えＶＨ又はＶＬドメインが、抗原に対して２０ｎＭ以下のＫｄを示す、上記１又は２に記載の方法、
２７．抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＣＬドメインの１又は複数を有していない；又はＶＨ若しくはＶＬドメインの一方を有していないポリペプチド、
２８．ウサギＶＨドメインを含まない、上記２７に記載のポリペプチド、
２９．ウサギ以外の種のＶＨドメインを含まない、上記２８に記載のポリペプチド、
３０．ウサギＶＬドメインを含まない、上記２７に記載のポリペプチド、
３１．ウサギ以外の種のＶＬドメインを含まない、上記３０に記載のポリペプチド、
３２．ＣＨ１ドメインを含まない、上記２７に記載のポリペプチド、
３３．ＣＨ２ドメインを含まない、上記２７又は上記３２に記載のポリペプチド、
３４．ＣＨ３ドメインを含まない、上記２７、３２、又は３３に記載のポリペプチド、
３５．抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、上記２７に記載のポリペプチド、
３６．単鎖抗体である、上記２７に記載のポリペプチド、
３７．単一ドメイン抗体である、上記２７に記載のポリペプチド、
３８．抗体断片である、上記２７に記載のポリペプチド、
３９．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、上記３８に記載の断片、
４０．ミニボディである、上記２７に記載のポリペプチド、
４１．ダイアボディである、上記２７に記載のポリペプチド、
４２．二重特異性抗体又は多特異性抗体である、上記２７に記載のポリペプチド、
４３．ポリペプチドがナノボディである、上記２７に記載のポリペプチド又は断片、
４４．治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧをさらに含む上記２７に記載のポリペプチド、
４５．治療用作用剤が細胞毒素である、上記４４に記載のポリペプチド、
４６．治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、上記２７に記載のポリペプチド、
４７．治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、上記４６に記載のポリペプチド、
４８．治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、上記１０に記載の抗体又は断片、
４９．治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、上記４８に記載のポリペプチド、
５０．抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、かつ
（ａ）アミノ酸配列QEQLMETESGGGAEGGLVKPGASLTLTCTAS（配列番号５７）を有するＶＨ ＦＲ１ドメイン；
（ｂ）アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６９）を有するＶＨ ＦＲ２ドメイン；
（ｃ）アミノ酸配列YATWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTATYYCAR（配列番号９５）を有するＶＨ ＦＲ３ドメイン；
（ｄ）アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（配列番号１３９）を有するＶＨ ＦＲ４ドメイン；
（ｅ）アミノ酸配列ELVLTQTPPSLSASVGETVRIRC（配列番号１５０）又はELVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC（配列番号１５５）を有するＶＬ ＦＲ１ドメイン；
（ｆ）アミノ酸配列WYQQKPEKPPTLLIS（配列番号１７４）又はWYQQKPGQRPKLLIY（配列番号１８１）を有するＶＬ ＦＲ２ドメイン；
（ｇ）アミノ酸配列GVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDVATYYC（配列番号１８３）又はGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC（配列番号２０５）を有するＶＬ ＦＲ３ドメイン；又は
（ｈ）アミノ酸配列FGAGTNVEIK（配列番号２０６）又はFAFGGGTELEIL（配列番号２１０）を有するＶＬ ＦＲ４ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチド、
５１．抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又を含み、かつ、
（ａ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの４６位フェニルアラニン；
（ｂ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５３位グルタミン酸；
（ｃ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５４位アルギニン；
（ｄ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５６位グリシン；
（ｅ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５８位アラニン；
（ｆ）ＶＨ ＣＤＲ１ドメインの４４位システイン；
（ｇ）ＶＨ ＣＤＲ２ドメインの５９位システイン；
（ｈ）ＶＨ ＦＲ４ドメインの１２６位アルギニン；
（ｉ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの３９位フェニルアラニン又はチロシン；
（ｊ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの４５位リジン；又は
（ｋ）ＶＬ ＦＲ３ドメインの９１位システインの少なくとも１つを含み、
前記位置が、それぞれ図３及び４のＶＨドメイン配列アラインメント又はＶＬドメイン配列アラインメントの位置に一致するポリペプチド、
に関する。
【００２２】
本発明は、所与の抗原又はそのエピトープに対する特異性を有する新規なウサギＶＨ又はＶＬドメインの作製を包含する。特に、本発明は、ウサギＶＨ又はＶＬドメインを作製するための方法であって、（ａ）ファージ発現ライブラリーから、所望の抗原又はそのエピトープと免疫特異的に結合するウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択する（ファージ「パニング」としても知られている）ステップと、（ｂ）一組の配列又はそのサブセットを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」，chloramphenicol acetyltransferase）との融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択するステップとを含む方法を提供する。代替的な実施形態では、本発明は、ウサギＶＨ又はＶＬドメインを作製するための方法であって、（ａ）ウサギ免疫グロブリンのＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡの配列を、ＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させるステップと、（ｂ）ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を取得するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で取得された一組のＤＮＡ配列からファージ発現ライブラリーを準備し、所望の抗原又はそのエピトープと免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を選択する（つまり抗原又はエピトープに対する免疫特異的結合のライブラリーをパニングする）ステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ファージパニングステップが１回又は複数回繰り返される、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの作製方法を包含する。関連する実施形態では、ファージパニングステップは、連続して繰り返してもよく、又はしなくてもよい。本発明により使用するためのファージ発現ライブラリーは、商業的に取得してもよく、又は本明細書中に記述した任意の方法及び／又は当技術分野で公知な任意の方法により調製してもよい。ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を細菌中で融合タンパク質として発現させることは周知であり、本明細書中に記述した任意の方法又は当技術分野で公知な任意の方法、例えば、ＣＡＴをコードするヌクレオチド配列及び融合タンパク質発現を駆動するプロモーター配列を含む発現ベクターに、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をクローニングすることにより実施できる。
【００２３】
細菌中で不溶性ペプチドとの融合タンパク質としてＣＡＴが発現すると、可溶性ペプチド（例えば、細菌中で発現した際に、少なくとも部分的折り畳まれて、凝集しないペプチド）との融合タンパク質として発現するより、著しく低いクロラムフェニコール耐性が付与される。したがって、ＶＨ又はＶＬドメイン及びＣＡＴを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換された細菌のクロラムフェニコール耐性を選択することにより、正しく折り畳まれて及び／又は非凝集形態で組換えによって発現することが可能な配列が選択されよう。ある実施形態では、本発明は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．４ｍＭ、少なくとも０．６ｍＭ、少なくとも０．８ｍＭ、少なくとも１．０ｍＭ、少なくとも１．２ｍＭ、少なくとも１．４ｍＭ、少なくとも１．６ｍＭ、少なくとも１．８ｍＭ、少なくとも２．０ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３．０ｍＭ、少なくとも５．０ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、又は少なくとも２０ｍＭのクロラムフェニコールを含む選択培地で上記形質転換された細菌を培養することを含む方法を包含する。本明細書中に記述されたＣＡＴ融合アッセイにより、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を選択することにより、タンパク質安定性が選択される。本発明は、熱安定性及び／又は動力学的安定性のアッセイ（例えば、タンパク質融解温度（「Ｔｍ」）又は折り畳みのギブス自由エネルギー（ΔＧＮ−Ｕ）の決定）を含む、本発明のＶＨ又はＶＬドメインを評価するための、当技術分野で公知な任意の他の方法又は本明細書中に記述した任意の他の方法の使用をさらに包含する。ある実施形態では、本発明のＶＨ又はＶＬドメインは、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５４℃、又は約５５℃以上の融解温度を有する。
【００２４】
本発明は、ウサギ免疫グロブリンに由来する及び／又はそこで同定されたＶＨ若しくはＶＬドメイン又はアミノ酸配列若しくは残基を含むポリペプチドであり、抗原／結合タンパク質特異性を評価するための当技術分野で公知な任意の標準的方法により決定されるように、所望の抗原又はそのエピトープと免疫特異的に結合するポリペプチドに関する。免疫特異的ポリペプチド、例えば抗原又はエピトープに対する抗体又はその抗原結合性断片の結合特異性を決定するアッセイには、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、BIAcore）、及びラジオイムノアッセイが含まれる。結合ポリペプチドの特異性を評価するための当技術分野で公知な任意の方法を使用すると、０．００１ｎＭを越えるが、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下のｋｄを示す本発明のポリペプチドを同定することができる。ある実施形態では、本発明の単離されたＶＨ又はＶＬドメインは、BIAcoreアッセイにより決定されるような、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下のｋｄを示す。
【００２５】
免疫グロブリンＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、未処置ウサギ、又は以前に抗原で免疫されたウサギから取得することができる。ウサギの免疫、及びウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）の単離は、当技術分野で公知な任意の方法又は本明細書中に記述した任意の方法により行うことができる。ある実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、未処置ウサギ又は免疫されたウサギの任意の組織から取得できるが、好ましくは、形質細胞、例えばＢ細胞が豊富な組織供給源から取得される。ある実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むウサギ組織は、骨髄である。他の実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むウサギ組織は、虫垂組織である。さらに他の実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むウサギ組織はリンパ系組織であり、この実施形態による特定の例では、リンパ系組織は脾臓又はリンパ節組織である。
【００２６】
本発明は、本明細書中に記述した方法により単離、同定、又は構築されたＶＨ又はＶＬドメインを含む免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその抗原結合性断片をさらに包含する。代替的な実施形態では、本発明は、新規な（ウサギ以外の種の免疫グロブリンのアミノ酸配列と比べて）スキャフォールドアミノ酸配列、ＶＨ又はＶＬドメインの特定の位置（例えば、それぞれ図３Ａ及び図４に示されているウサギＶＨ及びＶＬアラインメント配列における位置に従って決定されるような）における新規なアミノ酸残基、又は本発明の方法により同定されたＣＤＲループの新規な配列を含む免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体を包含する。ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ダイアボディ（diabody）、ミニボディ（minibody）、ナノボディ（nanobody）、又はこれらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及び細胞内抗体（intrabody）を含む上記のいずれかの抗原結合性断片である。ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、二重特異的又は多特異的である。本発明の二重特異的又は多特異的分子は、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば本発明の１又は複数の分子を、互いに及び／又は異なるエピトープ結合ポリペプチドと化学的にコンジュゲートさせることにより形成でき、二重特異的又は多特異的分子の結合ドメインは、少なくとも２つの異なる抗原に対する親和性を示す。例えば、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、第１及び第２のＶＬドメイン、又は第１及び第２のＶＨドメインを含むことができ、上記第１及び第２のドメインは、異なる結合特異性を有する（つまり、異なる抗原に結合する）。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、１つのＶＬドメイン、又は１つのＶＨドメイン、及び１つの抗原結合ポリペプチドを含み、このＶＬドメイン、又はＶＨドメイン、及び上記ポリペプチドは異なる結合特異性を示す。本発明のある実施形態では、本発明の二重特異的又は多特異的分子の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、アルブミンと免疫特異的に結合する。本発明の他の実施形態では、本発明の二重特異的又は多特異的分子の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、フィブロネクチンと免疫特異的に結合する。
【００２７】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその抗原結合性断片は、ＣＨ１ドメインを含まない。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はそのエピトープ結合性断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＨドメインの１又は複数を含まないか、又はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＨドメインのいずれも含まない。さらに別の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はそのエピトープ結合性断片は、ＣＨ１ドメイン、Ｈドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、又はＣＨ３ドメインの１つを含み、免疫グロブリンに由来する他の定常ドメイン又はヒンジ領域をいずれも含まない（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、ＣＨ１ドメインを含むが、Ｈドメイン、ＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメインのいずれも含まないか；又はＣＨ２ドメインを含むが、ＣＨ１ドメイン、Ｈドメイン、又はＣＨ３ドメインのいずれも含まない等）。
【００２８】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインの１又は複数を含む。ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインの各々を含む。
【００２９】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインの１つを含むが、他のＣＤＲドメインをいずれも含まず、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されており、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されている（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まない）。
【００３０】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのいずれか２つを含むが、他のＣＤＲドメインをいずれも含まず、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されており、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されている（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＨ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインは含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ
ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まず；又は２つのＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又は２つのＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まないなど）。
【００３１】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのいずれか３つを含むが、他のＣＤＲドメインをいずれも含まず、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されており、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されている（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又は２つのＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まないなど）。
【００３２】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのいずれか４つを含むが、他のＣＤＲドメインをいずれも含まず、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されており、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されている（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含むが、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン又はＶＬ  ＣＤＲ３２ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメインを含まず；又は２つのＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン及び２つのＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含まないなど）。
【００３３】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのいずれか５つを含むが、他のＣＤＲドメインをいずれも含まず、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されており、上記ＣＤＲドメインは本発明の方法により単離及び／又は同定されている（例えば、ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、及びＶＬ  ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＶＬ  ＣＤＲ３ドメインを含まず；又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含むが、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインを含まないなど）。
【００３４】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、本発明の方法により単離及び／又は同定されたフレームワークドメインの１又は複数を含む。特定の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、そこに移植された異種性ＣＤＲ配列を有する、本明細書中で同定されたフレームワークドメインを含む。
【００３５】
本発明のポリペプチドには、任意の種（例えば、ウサギ、マウス、ラット）に由来してよい免疫グロブリン分子が含まれるが、好ましくは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、又は任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は任意のサブクラスであってよいヒト免疫グロブリン分子である。本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその抗原結合性断片は、当技術分野で周知な任意の方法、例えば化学合成又は組換え技術により作製することができる。
【００３６】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨドメイン、例えばウサギＶＨドメインを含まず、及び／又はウサギ以外の任意の種に由来するＶＨドメインを含まない。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＬドメインを含まず、及び／又はウサギ以外の任意の種に由来するＶＬドメインを含まない。好ましい実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドはＶＨドメインを含み、ＶＬドメインを含まない。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドはＶＬドメインを含み、ＶＨドメインを含まない。特定の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体は、アミノ酸配列QEQLMETESGGGAEGGLVKPGASLTLTCTAS（配列番号５７）を有するＶＨ  ＦＲ１ドメイン；アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６９）を有するＶＨ  ＦＲ２ドメイン；アミノ酸配列YATWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTATYYCAR（配列番号９５）を有するＶＨ  ＦＲ３ドメイン；アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（配列番号１３９）を有するＶＨ  ＦＲ４ドメイン；アミノ酸配列ELVLTQTPPSLSASVGETVRIRC（配列番号１５０）又はELVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC（配列番号１５５）を有するＶＬ  ＦＲ１ドメイン；アミノ酸配列WYQQKPEKPPTLLIS（配列番号１７４）又はWYQQKPGQRPKLLIY（配列番号１８１）を有するＶＬ  ＦＲ２ドメイン；アミノ酸配列GVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDVATYYC（配列番号１８３）又はGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC（配列番号２０５）を有するＶＬ  ＦＲ３ドメイン；又はアミノ酸配列FGAGTNVEIK（配列番号２０６）若しくはFAFGGGTELEIL（配列番号２１０）を有するＶＬ  ＦＲ４ドメインの１又は複数を含む。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその抗原結合性断片（例えば、単一可変ドメイン）は、６．１．２節における表３のＶＨ  ＦＲ１ドメイン、表４のＶＨ  ＦＲ２ドメイン、表５のＶＨ  ＦＲ３ドメイン、表６のＶＨ  ＦＲ４ドメイン、表７のＶＬ  ＦＲ１ドメイン、表８のＶＬ  ＦＲ２ドメイン、表９のＶＬ  ＦＲ３ドメイン、又は表１０のＶＬ  ＦＲ４ドメインの１又は複数を含む。
【００３７】
さらに特定の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体は、ペプチドの安定性及び／又は抗原結合親和性を向上させる１又は複数のスキャフォールド残基を含む。ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位のフェニルアラニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５３位のグルタミン酸；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５４位のアルギニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５６位のグリシン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５８位のアラニン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの４４位のシステイン；ＶＨ  ＣＤＲ２ドメインの５９位のシステイン；ＶＨ  ＦＲ４ドメインの１２６位のアルギニン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの３９位のフェニルアラニン又はチロシン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの４５位のリジン；又はＶＬ  ＦＲ３ドメインの９１位のシステインの１又は複数を含み、上記位置は、それぞれ図３及び４に示されているＶＨ又はＶＬドメインアミノ酸配列アラインメントによる。
【００３８】
本発明は、可変ドメイン、ＣＤＲ、アミノ酸スキャフォールド配列（例えば、６．１．２節の表３〜１０に列挙されているものなどのフレームワークドメイン）、又は上記のいずれかに突然変異（例えば、１又は複数のアミノ酸置換）を有する本発明のアミノ酸スキャフォールド残基のいずれかのアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチド又はその断片の使用も包含する。この実施形態による特定の例では、本発明は、１又は複数のアミノ酸置換を含む免疫特異的ポリペプチドを包含し、上記置換は、ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位では、フェニルアラニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５３位では、グルタミン酸；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５４位では、アルギニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５６位では、グリシン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５８位では、アラニン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの４４位では、システイン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの５９位では、システイン；ＶＨ  ＦＲ４ドメインの１２６位では、システイン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの３９位では、フェニルアラニン又はチロシン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの４５位では、リジン；又はＶＬ  ＦＲ３ドメインの９１位では、システインの１又は複数に帰着する。好ましくは、これらの領域、ドメイン、又は残基における突然変異は、それらが免疫特異的に結合する抗原、つまりエピトープに対する免疫特異的ポリペプチドの結合活性及び／又は親和性を維持又は増強する。列挙した位置は、それぞれ図３及び４に示されているＶＨ又はＶＬドメインアミノ酸配列アラインメントによる。
【００３９】
ある実施形態では、本発明のポリペプチド又はその抗原結合性断片は、マウス及び／又はラットにおいて免疫的に中性（immuno-neutral）又は非免疫原性である抗原のエピトープと免疫特異的に結合する。
【００４０】
本発明は、治療用ポリペプチドの血清半減期を増加又は向上させることが知られている当技術分野で公知な任意の方法及び／又は本明細書中に記述されている任意の方法により修飾された本発明の免疫特異的ポリペプチドも包含する。そのような修飾の非限定的な例には、ペグ化、アセチル化、及び非天然アミノ酸の使用が含まれる。ある実施形態では、免疫特異的ポリペプチドの血清半減期は、アルブミン又はフィブロネクチンと免疫特異的に結合する付加的な抗原結合ドメインをポリペプチドに含めることにより増加又は向上させることができる。
【００４１】
本発明の方法は、本発明の免疫特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記述した方法により同定又は構築されたＶＨ又はＶＬドメインをコードする単離された核酸配列を提供する。本発明は、新規の（ウサギ以外の種の免疫グロブリンのアミノ酸配列と比べて）スキャフォールドアミノ酸配列、ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列の特定の位置における新規のアミノ酸残基、又は本明細書中に記述した方法により同定されたＣＤＲループの新規なアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。本発明は、さらに、上記核酸を含むベクターに関する。本発明の免疫特異的ポリペプチドが、本発明の方法により同定、単離、又は構築されたＶＨ及びＶＬドメインの両方を含む特定の実施形態では、本発明は、上記ＶＨドメインをコードする第１の核酸分子及び上記ＶＬドメインをコードする第２の核酸分子を含むベクターを提供し、上記ＶＨ及びＶＬドメインは、同一の抗原及び／又はエピトープに対する免疫特異的結合について独立して又は同時に選択される。１つの特定の実施形態では、上記ベクターは発現ベクターである。本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのベクターを含有する宿主細胞をさらに提供する。
【００４２】
本発明は、治療用作用剤又は追加的な抗原結合ドメイン、例えば異種性ポリペプチド（つまり、無関係なポリペプチド；又はその一部、好ましくは少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）に組換えによって融合されるか、又は化学的にコンジュゲートされて（共有結合及び非共有結合によるコンジュゲーションの両方を含む）融合タンパク質を産生する免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して又は化学的コンジュゲーションを介して生じてもよい。本発明の免疫特異的ポリペプチドは、例えば、特定の細胞表面受容体に特異的な本発明の免疫特異的ポリペプチドに作用剤を融合又はコンジュゲートさせることにより、治療用作用剤を特定の細胞タイプにターゲティングするために、インビトロ又はインビボのいずれでも使用できる。他の実施形態では、追加的な抗原結合ドメインを使用して、本発明の免疫特異的ポリペプチドをアルブミン又はフィブロネクチンに結合させて、それにより血清半減期を向上させることができる（例えば、Holt et al., 2008, Protein Eng Des Sel 21:283-288及びStork et al., 2007, Protein Eng Des Sci 20:569-576を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。本発明の治療用作用剤／免疫特異的ポリペプチド融合体は、当技術分野で公知な方法を使用してインビトロイムノアッセイ及び精製方法にも使用することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Naramura et al., Immunol. Lett., 39:91-99, 1994；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Gillies et al., PNAS, 89:1428-1432, 1992；及びFell et al., J. Immunol., 146:2446-2452, 1991を参照されたい。これらは参照により本明細書中にこれらの全体が組み込まれる。本発明の方法により使用するための治療用作用剤は、古典的な化学的治療用作用剤（例えば、化学療法剤）に限定されるとは解釈されるべきではないが、生体応答を改変又は変更してもよく又はしなくてもよいペプチド、薬物部分、放射性物質、大環状キレート剤、及びｓｉＲＮＡを含むことができる。非限定的な例では、治療用作用剤としてのそのようなポリペプチドには、アルブミン、プロタミン、アルブミン相互作用タンパク質（例えば、ｇｐ６０、ｇｐ３０、ｇｐ１８）、プロテインＡ、Ｇタンパク質、タンパク質形質導入ドメイン（Bogoyevitch et al., 2002, DNA Cell Biol 12:879-894を参照されたい。これは参照によりその全体が組み込まれる）、毒素、細胞毒素、又は抗体分子の一部分（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインなど）が含まれていてよく；そのような放射性核種には、標識用（つまり、インビボ又はインビトロで検出可能なシグナルを生成する）及び／又は治療効果生成用（例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃなど）に当技術分野で公知な放射性核種（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ放射体など）が含まれていてよく；そのような大環状キレート剤には、放射性金属イオン（例えば、ＤＯＴＡ）をコン���ュゲートさせるために当技術分野で公知なものが含まれる。
【００４３】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドのＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域は、本明細書中に記述した方法により同定又は単離されたウサギＶＨ又はＶＬ領域に由来する。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドのＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域は、本明細書中に記述した方法により同定又は単離されたウサギＶＨ又はＶＬ領域に由来しないが、新規なスキャフォールドアミノ酸配列及び／又は本発明の方法により同定されたＶＨ又はＶＬドメインのアミノ酸配列のある位置における新規なアミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記述された本発明の免疫特異的ポリペプチドは、これらに限定されないが、本明細書中で単離及び同定されたＶＨ及び／又はＶＬ配列のアミノ酸欠失、挿入、及び改変を含む追加的な変更を含む。
【００４４】
好ましくは、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその抗原結合性断片は、モノクローナル（つまり、抗原の同一エピトープに結合する）であり、ある実施形態ではヒト化されていてもよい。
【００４５】
本発明は、（ｉ）、及び（ii）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００４６】
本発明のある実施形態では、医薬組成物は、本発明方法による使用のために提供され、上記医薬組成物は、治療有効量の本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容される担体を含む。
【００４７】
３．１  定義
本明細書で使用される場合、タンパク質性作用剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、及び抗体）の文脈における「類似体」という用語は、第２のタンパク質性作用剤と類似した又は同一の機能を所有するが、第２のタンパク質性作用剤と類似した又は同一のアミノ酸配列を必ずしも含まないか、又は第２のタンパク質性作用剤と類似した又は同一の構造を必ずしも所有しないタンパク質性作用剤を指す。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質性作用剤とは、下記の少なくとも１つを満たす第２のタンパク質性作用剤を指す：（ａ）少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が第２のタンパク質性作用剤のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性作用剤；（ｂ）少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接するアミノ残基、少なくとも７０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接するアミノ酸残基、又は少なくとも１５０個の隣接するアミノ酸残基の第２のタンパク質性作用剤をコードするヌクレオチド配列に厳密性の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質性作用剤；及び（ｃ）少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が第２のタンパク質性作用剤をコードするヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質性作用剤。第２のタンパク質性作用剤と類似した構造を有するタンパク質性作用剤とは、第２のタンパク質性作用剤と類似した二次、三次、又は四次構造を有するタンパク質性作用剤を指す。ポリペプチドの構造は、これらに限定されないが、ペプチド配列決定法、Ｘ線結晶法、核磁気共鳴法、円偏光二色性法、及び結晶電子顕微鏡法を含む、当業者に公知な方法により決定できる。
【００４８】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するためには、配列を最適に比較するためにアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列と最適にアラインメントさせるために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入することができる；例えば図３〜４を参照）。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一位置の数の関数である（つまり、％同一性＝同一重複位置の数／位置の総数×１００％）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【００４９】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用しても達成できる。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877で改変された、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えばスコア＝１００、ワード長＝１２で、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施すると、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を取得できる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えばスコア−５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施すると、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を取得できる。比較目的のためにギャップを考慮したアラインメント（gapped alignment）を取得するためには、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用できる。代替的には、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用すると、分子間の距離関係を検出する反復探索を実施することができる（Ｉｄ）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）初期パラメータを使用できる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照）。配列比較用に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（PAM120 weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４が使用できる。
【００５０】
２つの配列間のパーセント同一性は、上述されたものに類似する技術を使用して、ギャップを考慮して又は考慮せずに決定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には完全な一致だけが計数される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、非タンパク質性作用剤の文脈における「類似体」という用語は、第１の有機又は無機分子と類似した又は同一の機能を所有し、第１の有機又は無機分子と構造的に類似する第２の有機又は無機分子を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、免疫特異的ポリペプチド（例えば、抗体）を含むポリペプチド又はタンパク質の文脈における「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加の導入により変更されたアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、つまりポリペプチド又はタンパク質に任意のタイプの分子を共有結合させることにより修飾されたポリペプチド又はタンパク質も指す。例えば、限定目的ではないが、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などにより修飾できる。誘導体ポリペプチド又はタンパク質は、これらに限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、当業者に公知の技術を使用した化学的修飾により作製できる。さらに、誘導体ポリペプチド又はタンパク質誘導体は、それが由来していたポリペプチド又はタンパク質と類似した又は同一の機能を所有する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体が特異的に結合する抗原分子上の領域を指す。抗原分子は、単一の又は複数のエピトープを含む場合がある。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の、少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接するアミノ残基、少なくとも７０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも隣接する８０個のアミノ酸残基、少なくとも隣接する９０個のアミノ酸残基、少なくとも隣接する１００個のアミノ酸残基、少なくとも隣接する１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも隣接する１７５個のアミノ酸残基、少なくとも隣接する２００個のアミノ酸残基、又は少なくとも隣接する２５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。好ましくは、本発明の免疫特異的ポリペプチドの断片は、抗原結合性断片（特に、エピトープ結合性断片）である。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などの用語は、免疫学分野におけるそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロブリンのドメイン、及び合成（例えば、組換え型）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。天然の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本的構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される２つの軽鎖及び２つの重鎖を有する四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、抗原認識の主因である約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は、単一の定常ドメインを有する軽鎖と、通常は３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する重鎖とを有する定常領域を定義する。したがって、免疫グロブリン分子、例えばＩｇＧの軽鎖の構造は、ｎ−ＶＬ−−ＣＬ−ｃであり、免疫グロブリン分子、例えばＩｇＧの重鎖の構造は、ｎ−ＶＨ−−ＣＨ１−−Ｈ−−ＣＨ２−−ＣＨ３−ｃ（ここで、Ｈはヒンジ領域である）である。本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体の可変領域は、抗原に接触する残基を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、一般的に構造を維持しＣＤＲループの位置決めを決定するフレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントとで構成される（あるフレームワーク残基は抗原と接触してもよいが）。したがって、ＶＬ及びＶＨドメインは、ｎ−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４−ｃ構造を有する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」又は「ヒト化免疫特異的ポリペプチド」という用語は、ヒトフレームワーク領域及び本発明の方法により同定された１又は複数のＣＤＲを含む少なくとも１つの免疫グロブリン可変を含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、免疫グロブリン全体は含まず、又は単一の免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＬドメイン）を含んでいてよいが、任意の他の免疫グロブリンドメイン又は領域（例えば、Ｆｃ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬなど）を含むことができない。ＣＤＲを提供する免疫特異的ポリペプチド（例えば、抗体又は可変ドメイン）は、「供与体」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリン又はその断片（例えば、可変ドメイン）は「受容体」と呼ばれる。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、つまり少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、本発明の免疫特異的ポリペプチドがヒト化免疫グロブリンを含む実施形態によると、上記免疫グロブリンの恐らくはＣＤＲ以外の部分は全て、自然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。本明細書で使用される免疫特異的ポリペプチド、つまり少なくとも可変ドメイン（又はそのエピトープ結合性断片）を含むポリペプチドの状況では、例えば本発明のキメラ分子の可変領域全体がヒトではないので、本発明のヒト化分子、例えば抗体は、本発明のキメラ分子を包含しない。その結果生じるヒト化分子がＣＤＲを提供する供与体抗体と同一の抗原に結合すると予想されるため、供与体分子は「ヒト化」工程により「ヒト化された」と言われる。一般的に、ヒト化免疫特異的分子は、受容体の超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（供与体抗体；例えば、ウサギＶＨ又はＶＬドメインに由来する供与体ＣＤＲ）に由来する超可変領域残基に置換されているヒト免疫グロブリン（又はその可変ドメイン及び／若しくは断片）、受容体分子である。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリン又はその断片のフレームワーク領域（ＦＲ、Framework Region）残基は、対応する非ヒト残基に置換される。さらに、ヒト化分子は、受容体抗体又は供与体抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、機能性、例えば免疫特異性をさらに洗練するためになされる。一般的に、ヒト化分子、例えば抗体は、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン又は可変ドメインの超可変領域に対応するか、又はＦＲの全て若しくは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化分子は、ＣＬ及び／又はＣＨ１ドメイン及び／又は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、本発明のヒト化分子は誘導体である。そのようなヒト化分子は、非ヒト、例えばウサギＣＤＲの１又は複数におけるアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加を含む。本発明のヒト化分子の誘導体は、本発明の非誘導体ヒト化分子と比較して、実質的に同一の結��性、良好な結合性、又は悪化した結合性を示す場合がある。特定の実施形態では、本発明の方法により同定及び／又は構築されたＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸残基が、置換、欠失、又は付加される（つまり、突然変異される）。抗体のヒト化に関するさらなる詳細については、以下を参照されたい；欧州特許第２３９，４００号明細書、欧州特許第５９２，１０６号明細書、及び欧州特許第５１９，５９６号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット及び国際公開第９３／１７１０５号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書、第５，５３０，１０１号明細書、第５，５６５，３３２号明細書、第５，５８５，０８９号明細書、第５，７６６，８８６号明細書、及び第６，４０７，２１３号明細書；並びにPadlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25；Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60；Morea et al., 2000, Methods 20:267-79；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84；Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904；Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s；Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22；Sandhu, 1994, Gene 150:409-10；Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73；Jones et al., 1986, Nature 321:522-525；Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329；及びPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596（それぞれ参照により本明細書中にその全体が組み込まれる）。「ヒト化」という用語は、各々Studnickaらによる米国特許第５，７７０，１９６号明細書；第５，７７６，８６６号明細書；第５，８２１，１２３号明細書；及び第５，８９６，６１９号明細書（それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されたものなどの、タンパク質及び／又は抗体の再表面化（resurfacing）の方法も含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」という用語、及び類似の用語は、抗原（例えば、エピトープ又は免疫複合体）と特異的に結合し、別の分子には特異的に結合しない分子を指す。抗原と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、又は当技術分野で公知な他のアッセイにより決定されるような低親和性を有する他のペプチド又はポリペプチドと結合してもよい。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。抗原と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、又は当業者に公知な他の技術により同定することができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「免疫特異的ポリペプチド」及び「免疫特異的ポリペプチド」という用語は、ＶＨ又はＶＬドメインの少なくとも一方を含み、抗原／抗体特異性を評価するための、当技術分野で公知な任意の方法（例えば、BIAcore）により決定されるような免疫特異的結合性を示すポリペプチド、ペプチド、及び／又はタンパク質を指す。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ダイアボディ（例えば、米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号明細書及び第２００６／０２１０５６４号明細書を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）、ミニボディ（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号明細書及び米国特許出願公開第２００７／０００３５５６号明細書を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）、ナノボディ（例えば、Revets et al., 2005, Expert Opin Biol Ther 5:111-124を参照されたい。これはその全体が参照により組み込まれる）、又はこれらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及び細胞内抗体を含む上記のいずれかの抗原結合性断片を指す。この用語には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、つまり抗原結合部位を含有し、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は任意のサブクラスであってよい分子も含まれる。この用語は、その少なくとも１つが、本発明の方法により決定されたＶＨ又はＶＬドメインであるか、又はその少なくとも１つが本発明の方法により決定された可変ドメインフレームワーク領域を含む複数の抗原結合分子を含む二重特異的又は多特異的分子も意味することができる。
【００５９】
本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体（本明細書中で幅広く定義されたような）を参照する場合、各ドメインへのアミノ酸の帰属は、例えば、ヒトの可変ドメイン、マウス及びウサギ可変ドメインを含む抗体可変ドメインの特徴付けのために当技術分野で周知の方法による。本発明の方法により単離及び同定されたような成熟した重鎖及び軽鎖のウサギ可変ドメインに由来するアミノ酸は、ＶＨドメインについては図３、及びＶＬドメインについては図４に示されているアラインメント配列におけるそれらの位置により指定される。例えば、本発明の方法により単離及び／又は同定されたウサギＶＨドメインのＦＲ１ドメインは、典型的には２４個から３１個までのアミノ酸残基から構成され、それらの残基の各々は、各ドメインの最長アミノ酸配列に基づくアラインメント配列におけるそれらの位置により指定される（例えば、図４を参照されたい）。したがって、特定の可変ドメインは、アラインメント配列の特定の位置の残基を含んでいてもよく、又は含まなくともよい。図３〜４に示されているアラインメント及び本発明のポリペプチドの特異的ドメイン決定は、免疫グロブリン分子に基づいて配列を特徴付け及びアラインメントするための、当技術分野で公知の方法により決定された（例えば、参照により明示的に本明細書に組み込まれたKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, NH1, MD (1991)によりアラインメントされた）。したがって、図３に示されているように、ＶＨドメインのアラインメント配列では、ＦＲ１は、１位〜３１位から構成され、ＣＤＲ１は３２位〜４４位、ＦＲ２は４５位〜５８位、ＣＤＲ２は５９位〜６９位、ＦＲ３は７０位〜１１０位、ＣＤＲ３は１１１位〜１２５位、及びＦＲ４は１２６位〜１３６位から構成され、並びに図４に示されているように、ＶＬドメインのアラインメント配列では、ＦＲ１は１位〜２３位から構成され、ＣＤＲ１は２４位〜３７位、ＦＲ２は３８位〜５２位、ＣＤＲ２は５３位〜５９位、ＦＲ３は６０位〜９１位、ＦＲ４は９２位〜１０５位、及びＦＲ４は１０６位〜１１６Ｂ位から構成される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組合せ又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ又はＲＮＡ分子の類似体が含まれる。そのような類似体は、例えば、これらに限定されないが、イノシン又はトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を使用して作製することができる。そのような類似体は、例えばヌクレアーゼ耐性又は細胞膜を通過する能力の増加などの、分子に有益な属性を与える修飾された骨格を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子も含むことができる。核酸又はヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であってよく、一本鎖及び二本鎖部分の両方を含有していてもよく、三本鎖部分を含有していてもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「予防用作用剤（prophylactic agent）」及び「予防用作用剤（prophylactic agents）」という用語は、障害の予防、又は障害の再発若しくは蔓延の予防に使用できる任意の作用剤（複数可）を指す。予防上有効な量は、疾患の再発若しくは蔓延、疾患徴候の再発若しくは増悪、又は対象におけるそのようなものの出現を予防するのに十分な予防用作用剤の量を指すことができる。予防上有効な量は、疾患の予防に予防上の利益を提供する予防用作用剤の量を指すこともできる。さらに、本発明の予防用作用剤に関する予防上有効な量とは、予防用作用剤単独の量、又は疾患の予防に予防上の利益を提供する他の作用剤と組み合わせた量を意味する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖に存在する抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を指す。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが所望の抗原結合用構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖに関する総説は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。特定の実施形態では、ｓｃＦｖには、二重特異的ｓｃＦｖ及びヒト化ｓｃＦｖが含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、本発明の免疫特異的ポリペプチドを含む製剤の文脈における「安定的」という用語は、タンパク質が、その物理的及び化学的安定性並びに保管時の完全性をその中で本質的に保持する製剤を指す。タンパク質安定性を測定するための種々の分析的技術は、当技術分野において利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に総説されている（それぞれ参照によりその全体が組み込まれる）。安定性は、選択された温度で選択された期間、測定することができる。迅速スクリーニングの場合、製剤を２週間から１か月間４０℃で保持し、その間安定性を測定する。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃又は４０℃で少なくとも１か月間安定的であるべきであり、及び／又は２〜８℃では少なくとも２年間安定的であるべきである。製剤が３０℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃で少なくとも２年間安定的であるべきであり、及び／又は４０℃では少なくとも６か月間安定的であるべきである。例えば、凍結乾燥及び保管後の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用することができる。例えば、「安定的」製剤は、約１０％未満及び好ましくは約５％未満のタンパク質しか、製剤中に凝集体として存在しない製剤であり得る。他の実施形態では、凍結乾燥製剤の凍結乾燥及び保管後の凝集体形成は、そのいかなる増加も決定することができる。例えば、「安定的」な凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤における凝集体の増加が、少なくとも１年間２〜８℃で凍結乾燥製剤が保管される場合、約５％未満及び好ましくは約３％未満である製剤であり得る。他の実施形態では、タンパク質製剤の安定性は、生物活性アッセイを使用して測定することができる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、本発明の免疫特異的ポリペプチドの文脈における「安定的」という用語は、タンパク質の動力学的安定性、又は変性に対するタンパク質の耐性を指すことができる。動力学的安定性は、通常はより高次のエネルギー遷移状態（ＴＳ）により隔てられている２つのタンパク質コンフォメーション、天然折り畳み状態（Ｎ）及び変性状態（Ｕ）間の単純な平衡反応として、変性過程を例示することにより最適に説明できる。ＴＳ障壁の高さが折り畳み及び変性の速度を決定するため、動力学的に安定的なタンパク質は著しく高エネルギーのＴＳを所有し、そのため非常に遅い変性速度に帰着し、事実上タンパク質をその天然状態に閉じ込める。たとえ高濃度の変性剤などの極端な溶媒条件下で、ギブス自由エネルギー（ΔＧ）の全体的な変化が変性に好ましい場合でも、ＴＳの高い活性化エネルギーにより、動力学的に安定的なタンパク質の変性速度は著しく遅くなる。ポリペプチドの安定性を評価する方法は当技術分野で周知であり、例えば、単一分子力分光法、例えば動的光散乱（「ＤＬＳ」）によりモニターされる熱変性の評価、及びＳＤＳ変性に対する耐性の評価を含む（例えば、米国特許出願公開第２００６／００９９６４７号明細書を参照されたい。これはその全体が参照により組み込まれる）。安定性は、組換え発現系におけるタンパク質発現の特徴により評価することもできる。直ちに折り畳まれて変性に耐性のあるポリペプチドは、そのような系において可溶性タンパク質として発現されることになるが、不適切に又は部分的にのみ折り畳まれたタンパク質は、それらの疎水性領域を介して相互作用し、封入体を形成する。本発明者らは、組換えタンパク質の溶解度に基づき、上記タンパク質がＣＡＴとの融合体として発現され、融合体のＣＡＴ活性が評価される安定性アッセイをさらに実行した（以下を参照）。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、同義的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」とは、疾患又は障害の治療又は管理に十分な、本発明の治療用作用剤の量を指す。治療有効量は、疾患の発症を遅延又は最小限にするために十分な、治療用作用剤の量を指す場合がある。治療有効量は、疾患の治療又は管理における治療上の利益を提供する治療用作用剤の量も指すことができる。さらに、本発明の治療用作用剤に関する治療有効量は、治療用作用剤単独の量、又は例えば疾患を治療又は管理するのに十分な量の本発明の治療用作用剤の治療効能を増強するのに十分な、疾患の治療又は管理における治療上の利益を提供する他の治療法と組み合わせた量を意味する。
【００６７】
［図面の簡単な説明］
４．図面の簡単な説明
［図１］重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列におけるプライマー位置の模式図である。
［図２Ａ−２Ｂ］軽鎖可変ドメインのヌクレオチド配列におけるプライマー位置の模式図である；（Ａ）κ鎖；（Ｂ）λ鎖。
［図３］本発明の方法により選択された重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）のアミノ酸配列の典型的なアラインメントを示す図である。
［図４］本発明の方法により選択された軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）のアミノ酸配列の典型的なアラインメントを示す図である。
［図５］ＳＤＶＬ及び／又はＳＤＶＨドメインをＣＡＴとの融合タンパク質として発現することを可能にする発現ベクターの模式図である。
［図６Ａ−６Ｂ］本発明の代表的なＳＤＶＬドメインの変性遷移曲線の内部蛍光を示す図である。（Ａ）熱誘導変性；（Ｂ）ＧｄｍＣｌ誘導変性。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
５．詳細な説明
５．１  免疫特異的ポリペプチド
本発明は、ウサギに由来するＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン又はその一部（例えば、ＣＤＲドメイン、フレームワークドメインなど）を有する、修飾され遺伝子操作された免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ウサギ免疫グロブリン可変ドメインに由来する単一ドメイン抗体及び／又はそのエピトープ結合性断片を包含する。本発明者らは、ウサギ可変ドメインが、単一ドメインとして組換えによって発現された際に、固有の安定性を維持し、高い結合親和性を保持することを発見した。
【００６９】
本発明は、ウサギＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、並びに／又はそれらに由来する新規なＣＤＲ及びフレームワーク領域を単離及び使用するための方法を包含する。本発明は、組換え型免疫特異的ポリペプチドのＣＤＲループ及び／又はフレームワーク領域と関連した「スキャフォールド」又は構造的配列として使用するための、単離されたウサギＶＨ及びＶＬドメイン内の新規なアミノ酸配列（定義された位置の新規なアミノ酸残基を含む）の同定をさらに提供する。本発明のウサギスキャフォールド配列（スキャフォールド残基を含む）又は新規なＣＤＲ／フレームワーク配列は、特にげっ歯動物抗体と比べて、可変ドメイン（複数可）及び／又はそれらを含有する免疫特異的ポリペプチド（例えば、抗体）の安定性及び／又は親和性を増強し、高度に特異的な単一ドメイン免疫ペプチド、例えば単一ドメイン抗体の作製及び／又は使用を可能にする。
【００７０】
本発明は、所与の抗原又はそのエピトープに対する特異性を有する新規なウサギＶＨ又はＶＬドメインの作製を包含する。特に、本発明は、ウサギＶＨ又はＶＬドメインを作製するための方法であって、（ａ）ファージ発現ライブラリーから、所望の抗原又はそのエピトープと免疫特異的に結合するウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択する（ファージ「パニング」としても知られている）ステップと、（ｂ）一組の配列又はそのサブセットを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）との融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択するステップとを含む方法を提供する。代替的な実施形態では、本発明は、ウサギＶＨ又はＶＬドメインを作製するための方法であって、（ａ）ウサギ免疫グロブリンのＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡの配列を、ＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させるステップと、（ｂ）ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を取得するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で取得された一組のＤＮＡ配列からファージ発現ライブラリーを準備し、所望の抗原又はそのエピトープと免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を選択する（つまり抗原又はエピトープに対する免疫特異的結合のライブラリーをパニングする）ステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ファージパニングステップが１回又は複数回繰り返される、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの作製方法を包含する。関連する実施形態では、ファージパニングステップは、連続して繰り返してもよく、又はしなくてもよい。本発明により使用するためのファージ発現ライブラリーは、商業的に取得してもよく、又は本明細書中に記述した任意の方法及び／又は当技術分野で公知な任意の方法により調製してもよい。ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を細菌中で融合タンパク質として発現させることは周知であり、本明細書中に記述した任意の方法又は当技術分野で公知な任意の方法、例えばＣＡＴをコードするヌクレオチド配列及び融合タンパク質発現を駆動するプロモーター配列を含む発現ベクターに、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をクローニングすることにより実施できる。本発明は、本明細書中に記述した方法により作製されたＶＨ及び／又はＶＬドメイン、又はその断片をさらに包含する。本発明は、これらの方法により単離及び／又は同定された新規のスキャフォールドアミノ酸配列又はスキャフォールドアミノ酸残基（本発明の可変ドメインの定義された位置における）も包含する。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明は、２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、１つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体の断片を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、単一のＶＨ又はＶＬドメインを含み、他の免疫グロブリン由来のドメイン（例えば、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、Ｆｃドメインなど）を含まない免疫特異的ポリペプチドを提供する。本発明以前は、単一ドメイン抗体は、主としてラクダ属の抗体に基づいており、つまりラクダ化単一ドメイン抗体であった（例えば、Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230；Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253；Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開第９４／０４６７８号パンフレット及び国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；米国特許第６，００５，０７９号明細書を参照されたい；これらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）。ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、二重特異的又は多特異的である。本発明の二重特異的又は多特異的分子は、当技術分野で公知な任意の方法及び／又は本明細書中に記述された任意の方法を使用して形成でき、例えば、融合又はコンジュゲートペプチドの生成により形成できる。本発明の二重特異的又は多特異的分子は、本発明の方法により同定、単離、又は構築された少なくとも１つのＶＨ又はＶＬドメイン、又は可変ドメインの少なくとも１つのフレームワーク領域を含む。ある実施形態、ある実施形態では、本発明の二重特異的又は多特異的分子は、複数のＶＬ及び／又は複数のＶＬドメインを含み、これらのドメインは、本発明の方法により単離、同定、及び／又は構築された。
【００７２】
本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体には、これらに限定されないが、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、又はこれらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及び細胞内抗体を含む上記のいずれかの抗原結合性断片、並びにそれらのエピトープ結合性断片が含まれる。特に、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体には、単一ドメイン抗体又は免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分が含まれる。
【００７３】
本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体のＣＤＲ、スキャフォールドアミノ酸配列及び／又はスキャフォールドアミノ酸残基は、ウサギ科（例えば、ウサギ及びノウサギ）の任意のメンバーに由来してよく、好ましくはウサギ（例えば、ニュージーランド白ウサギ）に由来する。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００７４】
本発明は、本発明のフレームワークドメインのアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるフレームワークドメインのアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチド又はその断片も包含する。ある実施形態では、本発明は、本発明のフレームワークドメインと比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失など）を含むフレームワークドメインを包含する。本発明は、本発明の１又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である１又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチド又はその断片をさらに包含する。ある実施形態では、本発明は、本発明のＣＤＲと比べて、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失など）を含むＣＤＲを包含する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性の決定は、当業者に公知な任意の方法により決定することができる。
【００７５】
本発明は、本発明の可変ドメイン、ＣＤＲ、アミノ酸スキャフォールド配列、又はアミノ酸スキャフォールド残基（例えば、重鎖可変ドメインＦＲ２では４６、５３、５４、５６、及び５８位、重鎖ドメインＣＤＲ１では４４及び５９位、重鎖可変ドメインＦＲ４では１２６位、軽鎖可変ドメインＦＲ２では３９及び４５位、並びに軽鎖可変ドメインＦＲ３では９１位）のいずれかのアミノ酸配列を含み、上記のいずれかにおける突然変異（例えば、１又は複数のアミノ酸置換）を有する免疫特異的ポリペプチド又はその断片の使用も包含する。この実施形態による特定の例では、本発明は、１又は複数のアミノ酸置換を含む免疫特異的ポリペプチドを包含し、上記置換は、ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位では、フェニルアラニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５３位では、グルタミン酸；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５４位では、アルギニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位では、グリシン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５８位では、アラニン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの４４位では、システイン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの５９位では、システイン；ＶＨ  ＦＲ４ドメインの１２６位では、システイン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの３９位では、フェニルアラニン又はチロシン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの４５位では、リジン；又はＶＬ  ＦＲ３ドメインの９１位では、システインの１又は複数に帰着する。好ましくは、これらの領域、ドメイン、又は残基における突然変異は、それらが免疫特異的に結合する抗原、つまりエピトープに対する免疫特異的ポリペプチドの結合活性及び／又は親和性を維持又は増強する。特定の抗原に対する免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体の親和性をアッセイするためには、当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）が使用できる。
【００７６】
他の実施形態では、本発明は、本明細書中で同定された可変ドメイン、ＣＤＲ、アミノ酸スキャフォールド配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、又はアミノ酸スキャフォールド残基（例えば、重鎖可変ドメインＦＲ２では４６、５３、５４、５６、及び５８位、重鎖ドメインＣＤＲ１では４４及び５９位、重鎖可変ドメインＦＲ４では１２６位、軽鎖可変ドメインＦＲ２では３９及び４５位、並びに軽鎖可変ドメインＦＲ３では９１位）を含む免疫特異的ポリペプチド又はその断片の使用を包含する。ある実施形態では、本発明は、ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位では、フェニルアラニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５３位では、グルタミン酸；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５４位では、アルギニン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの４６位では、グリシン；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの５８位では、アラニン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの４４位では、システイン；ＶＨ  ＣＤＲ１ドメインの５９位では、システイン；ＶＨ  ＦＲ４ドメインの１２６位では、システイン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの３９位では、フェニルアラニン又はチロシン；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの４５位では、リジン；又はＶＬ  ＦＲ３ドメインの９１位では、システインの１又は複数を有する免疫特異的ポリペプチドを包含する。本明細書中で同定されたスキャフォールド残基は、特に、単一ドメイン結合タンパク質、つまり単一のＶＬ又はＶＨドメインのみを含み、他のいずれの免疫グロブリン可変ドメインも含まないポリペプチドを含む本発明の実施形態の場合、それらが免疫特異的に結合する抗原、つまりエピトープに対する免疫特異的ポリペプチドの結合活性及び／又は親和性を維持又は増強することができる。特定の抗原に対する免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体の親和性をアッセイするためには、当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）が使用できる。
【００７７】
本発明の方法で使用されるポリペプチドには、つまり本発明の免疫特異的ポリペプチドに任意のタイプの分子を共有結合させることにより修飾される誘導体が含まれる。例えば、限定目的ではないが、誘導体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などにより修飾された免疫特異的ポリペプチドが含まれる。任意の数の化学的修飾は、これらに限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術により実施できる。そのうえ、誘導体は、１又は複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【００７８】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的分子を修飾して、インビボでの血清半減期を増加させる。血清半減期を増加させるための当技術分野で周知の方法には、これらに限定されないが、Ｆｃ及び／又はヒンジ領域を含む抗体定常領域（例えば、米国特許第５，５６５，３３５号明細書及び第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。それぞれ本明細書中に引用された全ての参考文献を含み、その全体が参照により組み込まれる）、並びに／又はインターフェロン及び／若しくはサイモシン標的ペプチドなどの他の公知なエレメント、並びに透過性増強タンパク質（例えば、それぞれ米国特許第６，３１９，６９１号明細書及び第５，６４３，５７０号明細書を参照されたい。それぞれ、各特許内で引用された全参考文献を含み、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を含む抗体ドメインへのコンジュゲーション又は融合が含まれる。本発明の免疫特異的分子がＩｇＧ定常ドメインを含む場合、そのような修飾は、上記定常ドメイン又は好ましくはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくは、Ｆｃ又はヒンジ−Ｆｃドメイン断片）への、１又は複数のアミノ酸修飾（つまり、置換、挿入、又は欠失）の導入も含むことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット；国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；及び米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。本発明の分子の寿命を延ばすための当技術分野で公知な他の修飾には、例えばＤ型の非天然アミノ酸の使用、又は代替的若しくは追加的には、硫黄含有型アミノ酸などのアミノ酸類似体の使用が含まれる。代替的には、本発明のポリヌクレオチド及び遺伝子は、ワクチン製剤用の免疫原性構築体の調製に有用なエレメント、又は準備したポリペプチドの単離に有用なエレメントに組換えによって融合することができる。
【００７９】
本発明の分子は、これらに限定されないが、アミド化又はアセチル化を含む、Ｃ末端及び／又はＮ末端に対する修飾を含有することができる。ある実施形態では、アミノ酸残基は、当技術分野で公知のキャッピング基によりキャッピングできる反応性側鎖、例えばグルタミン酸のカルボキシ側鎖を含有する。アセチル化とは、ペプチド（複数可）又はペプチド断片（複数可）のアミノ末端、又は少なくとも１つのリジンの側鎖（複数可）のいずれかに、ＣＯＣＨ３基を導入することを指す。重要なことには、アセチル化はタンパク質安定性を調節することができる。例えば、インビボでアセチル化されたＥ２Ｆ１を分析すると、アセチル化型がより長い半減期を有することが示される（Martinez-Balbas et al., (2000) EMBO J. 19(4):662-71；Takemura et al. (1992) J Cell Sci. 103 ( Pt 4):953-64も参照されたい；それぞれ参照によりその全体が組み込まれる）。したがって、ある実施形態では、本発明の免疫特異的分子のアミノ末端は、アセチル化により修飾されている。ある実施形態では、免疫特異的分子のリジン側鎖は修飾されている。さらに他の実施形態では、本発明の免疫特異的分子は、アミノ末端及びリジン側鎖の両方がアセチル化されている。
【００８０】
本発明は、フレームワーク又は可変領域に突然変異（例えば、１又は複数のアミノ酸置換）を有する本発明の免疫特異的ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチドの使用も包含する。好ましくは、これらの領域における突然変異は、それらが免疫特異的に結合する特定の抗原（複数可）及び／又はエピトープに対する抗体の結合活性及び／又は親和性を維持又は増強する。特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイするためには、当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）が使用できる。
【００８１】
本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入するためには、例えば、アミノ酸置換に帰着する部位特異的変異誘発、ＰＣＲを媒介とした突然変異誘発を含む当業者に公知の標準的技術が使用できる。ある実施形態では、誘導体は、必須ではないと予測された１又は複数のアミノ酸残基においてなされる保存的なアミノ酸置換を有する。
【００８２】
本発明は、フレームワーク又は可変領域に突然変異（例えば、１又は複数のアミノ酸置換）を有する本発明の免疫特異的ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含む免疫特異的ポリペプチドの使用も包含する。好ましくは、これらの領域における突然変異は、それらが免疫特異的に結合する特定の抗原（複数可）及び／又はエピトープに対する抗体の結合活性及び／又は親和性を維持又は増強する。特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイするためには、当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）が使用できる。
【００８３】
インビボでの半減期が増加された本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、上記ポリペプチド又は断片に、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ，polyethyleneglycol）などのポリマー分子を結合させることにより生成できる。ＰＥＧは、上記ポリペプチド又は断片のＮ末端又はＣ末端に対するＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを介して、又はリジン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介してのいずれかで、多官能性リンカーと共に又は伴わずに、上記ポリペプチド又は断片に結合することができる。生物活性の最小限の喪失に帰着する直鎖状又は分岐状ポリマー誘導体化が使用できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によりコンジュゲーションの度合いを詳細にモニターして、本発明の免疫特異的ポリペプチド又は断片に対するＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを保証することができる。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチド−ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。
【００８４】
ヒトにおけるインビボでの使用及びインビトロでの検出アッセイを含む幾つかの使用については、キメラ分子又はヒト化分子を使用することが望ましい場合がある。
【００８５】
抗原及び／又はエピトープと免疫特異的に結合するウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする核酸配列は、各特徴に関する連続スクリーニング法を使用して親和性及び安定性の両方について選択される。本発明の方法を使用すると、ウサギ可変ドメインをコードする初期貯留は、高い安定性（例えば、組換え系で適切に発現及び折り畳まれる能力、これらの系で分解又は凝集に抵抗し、免疫特異的結合に関するその機能的な特徴を保持する能力）と同様に、所望の抗原に対する高親和性を示す免疫特異的ポリペプチド、例えばウサギ可変ドメインをコードする配列を多く含むことになろう。ある実施形態では、上記配列によりコードされるポリペプチドは、安定性について選択される前に、抗原に対する免疫特異的結合について選択される。他の実施形態では、上記配列によりコードされるポリペプチドは、抗原に対する免疫特異的結合について選択される前に、安定性について選択される。本発明は、結合選択及び／又は安定性選択ステップ（複数可）のいずれか又は両方が、１回又は複数回繰り返される方法を包含する。本発明は、結合選択及び安定性選択ステップ並びに／又はその繰り返しが、任意の順番で１回又は複数回実施される方法をさらに包含する。
【００８６】
５．１．１  ファージディスプレーを使用した親和性選択
抗原及び／又はエピトープと免疫特異的に結合するウサギＶＨ又はＶＬドメインは、当技術分野で公知な種々のファージディスプレー及びパンニング法を使用して選択される。ファージディスプレー法を使用すると、機能的なウサギ可変ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示される。その後、ファージ粒子を、所望の抗原及び／又はエピトープと接触させ、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば標識抗原、又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉された抗原を使用して、上記記抗原及び／又はエピトープに対する免疫特異的結合を示す粒子を選択又は同定する。本発明の方法により使用できるファージディスプレー法の例には、Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995；Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994；Persic et al., Gene, 187:9-18, 1997；Burton et al., Advances in Immunology, 57:191-280, 1994；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；並びに米国特許第５，６９８，４２６号明細書；第５，２２３，４０９号明細書；第５，４０３，４８４号明細書；第５，５８０，７１７号明細書；第５，４２７，９０８号明細書；第５，７５０，７５３号明細書；第５，８２１，０４７号明細書；第５，５７１，６９８号明細書；第５，４２７，９０８号明細書；第５，５１６，６３７号明細書；第５，７８０，２２５号明細書；第５，６５８，７２７号明細書；第５，７３３，７４３号明細書、及び第５，９６９，１０８号明細書に開示されるものが含まれ、それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【００８７】
本発明の方法で使用されるファージディスプレーライブラリーは、商業的に取得してもよく、又は本明細書中に記述されているような及び／又は当技術分野で公知の未処理又は免疫ウサギの抗体レパートリーに由来してもよい。当技術分野で公知のように、ファージミドベクター中の核酸によりコードされ、したがってファージ表面に発現されるポリペプチドは、単一のウサギＶＨ又はＶＬドメインであってもよく、単鎖抗体であってもよく、ｓｃＦｖであってもよく、又はウサギ重鎖若しくは軽鎖の任意の断片であってもよい。ある実施形態では、各ファージ粒子は、その表面に単一可変ドメインを発現する。代替的な実施形態では、ファージ粒子は、ＶＨ及びＶＬドメインが相互作用して結合対を形成するように、その表面にＶＨ及びＶＬドメインを発現する。
【００８８】
ファージディスプレー及びパンニング法に使用されるファージ粒子は、繊維状ファージであり、クラスＩファージ（例えば、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆなど）若しくはクラスIIファージ（例えば、Ｘｆ、Ｐｆ１、Ｐｆ３など）又はそれらの誘導体から選択することができる。ウサギ重鎖及び／又は軽鎖、例えばウサギＶＨ又はＶＬドメインの一部をコードするヌクレオチド配列は、ファージｆｄの遺伝子IIIカプシドタンパク質（ｐIII）又は別の繊維状ファージのその対応物との融合体として宿主細胞（つまり細菌）内で上記配列の発現を駆動するファージミドベクターから発現される。ファージディスプレー技術は、ファージミドゲノムのパッケージングを支援するための、ヘルパーファージ又は相補的ファージ遺伝子をコードするプラスミドの使用を包含し、ｐIII融合タンパク質は、そのためのカプシドタンパク質である。
【００８９】
ウサギ重鎖又は軽鎖の一部分を発現し、したがって上記一部分をコードするヌクレオチド配列を含み、所望の抗原に対する特異性を示す個々のファージ粒子は、当技術分野で公知のスクリーニング法を使用してライブラリーから単離することができる（例えば、Gherardi et al., 1990, J Immunol Meth 126:61-68を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。選択は、所望の抗原及び／又はエピトープを固体表面（例えば、培養皿、マイクロタイタープレート、クロマトグラフィービーズ、磁気ビーズなど）に係留し、結合されている抗原及び／又はエピトープ上にファージ粒子のライブラリーを通過させることにより達成できる。結合するこれらの個々のファージは洗浄後も保持され、当技術分野で公知の任意の検出系（例えば、抗ｆｄ抗体酵素コンジュゲート）により検出することができる。特定の実施形態では、ｐIII融合タンパク質は、抗標的抗体酵素コンジュゲートによる検出を容易にするために標的アミノ酸配列をさらに含む。結合したファージ粒子は、結合親和性の増加を選択するために、徐々に厳密性の洗浄条件下で除去することができる。洗浄条件の厳密性は、当技術分野で公知な任意の方法、例えば、洗浄ｐＨの変更、洗浄時間の増加、洗浄溶液への表面活性剤の添加などにより、増加させることができる。特定の実施形態では、一組の結合したファージ粒子を回収し、標的抗原及び／又はエピトープに対する免疫特異的結合を１回又は複数回再選択する。ファージディスプレー選択は、安定性分析による本発明のポリペプチドの選択前若しくは選択後、又は選択前及び選択後の両方で実施できる。
【００９０】
ファージディスプレー技術は、標的抗原及び／又はエピトープに対する本発明の免疫特異的ポリペプチドの親和性を増加させるために使用することができる。親和性成熟と呼ばれるこの技術では、選択された配列の初期貯留と比較してより高い親和性で抗原に結合する本発明のアミノ酸配列を同定するために、突然変異誘発又はＣＤＲウォーキング（CDR walking）、並びに標的抗原及び／又はそのエピトープを使用する再選択が使用される。単一ヌクレオチドではなくコドン全体を突然変異させることは、アミノ酸突然変異の半無作為化レパートリーに帰着する。各々が単一ＣＤＲにおける単一アミノ酸の変更により異なる変異体クローンの貯留で構成され、各ＣＤＲ残基の各可能なアミノ酸置換を表す変異体を含有するライブラリーを構築することができる。抗原に対する結合親和性が増加した突然変異体は、固定化された突然変異体を標識抗原と接触させることによりスクリーニングすることができる。抗原に対する結合活性が増加した突然変異抗体を同定するためには、当技術分野で公知の任意のスクリーニング法が使用できる（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:6037；Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
【００９１】
本発明のポリペプチドの結合特異性は、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、BIAcore）、及びラジオイムノアッセイを含む、結合対相互作用を決定するための、当技術分野で公知な任意の方法により評価することができる。結合ポリペプチド特異性を評価するための当技術分野で公知な任意の方法を使用すると、０．００１ｎＭを越えるが、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下のＫｄを示す本発明のポリペプチドを同定することができる。ある実施形態では、本発明の単離されたＶＨ又はＶＬドメインは、BIAcoreアッセイにより決定されるような、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下のＫｄを示す。
【００９２】
本発明は、所望の抗原に対して高い結合親和性を有する本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片も提供する。特定の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数又はｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）Ａｂ−Ａｇ）を有する。好ましい実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７ＭＭ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有する。
【００９３】
別の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、又は１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）Ａｂ−Ａｇ）を有する。好ましい実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、又は１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆを有する。
【００９４】
さらに別の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、又は少なくとも５×１０１５Ｍ−１の親和定数又はｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。さらに別の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、又は５×１０−１５Ｍ未満の解離定数又はＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する。
【００９５】
５．１．２  免疫特異的ポリペプチドの溶解度／安定性選択
高い安定性を示すウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、改変されたクロラムフェニコール耐性アッセイを使用して選択する。このアッセイでは、可溶性のままであることを示し、適切に折り畳まれ、組換え発現中の凝集に耐性を有するポリペプチドが選択される。
【００９６】
安定性選択の方法は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、抗生物質クロラムフェニコールに対する菌耐性付与の原因である酵素との融合体として大腸菌（E. coli）内で発現されるような組換えタンパク質の溶解度の評価に基づく。ＣＡＴは、種々の他のタンパク質と融合されても活性を維持することが示されている２５ｋＤａ分子量の高度に可溶性のホモ三量体タンパク質である（Robben et al., 1993, Gene 126:109-113）。しかしながら、融合タンパク質のＣＡＴ活性レベル（したがってクロラムフェニコールに対する耐性）は、遺伝子が可溶性タンパク質との構築体として発現される場合より、不溶性タンパク質との融合タンパク質で発現される場合に著しくより低い。したがって、可溶性形態の本発明のポリペプチド（例えばウサギＶＨ及びＶＬドメイン）は、クロラムフェニコールを用いる選択により、潜在的なタンパク質の大きな貯留から選択することができる。本発明のヌクレオチド配列を含む細菌は、液体培地又は細菌プレートを使用して選択することができる。本発明は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．４ｍＭ、少なくとも０．６ｍＭ、少なくとも０．８ｍＭ、少なくとも１．０ｍＭ、少なくとも１．２ｍＭ、少なくとも１．４ｍＭ、少なくとも１．６ｍＭ、少なくとも１．８ｍＭ、少なくとも２．０ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３．０ｍＭ、少なくとも５．０ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、又は少なくとも２０ｍＭのクロラムフェニコールを含む選択培地で上記形質転換された細菌を培養することを含む方法を包含する。当技術分野で公知の任意の方法により、細菌を形質転換し、選択された細菌からＤＮＡを抽出することができる。
【００９７】
本発明は、タンパク質安定性を評価するための、当技術分野で公知な他のアッセイも包含する。そのようなアッセイの非限定的な例は、単一分子力分光法、内部蛍光の変化の評価、例えば動的光散乱（「ＤＬＳ」）によりモニターされる熱変性の評価、及びＳＤＳ変性に対する耐性の評価である（例えば、米国特許出願公開第２００６／００９９６４７号明細書を参照されたい。これはその全体が参照により組み込まれる）。本発明の方法は、安定性を決定する方法として、折り畳みのギブス自由エネルギー（ΔＧＮ−Ｕ）の決定をさらに包含する。ある実施形態では、本発明の分子のΔＧＮ−Ｕは、約１ｋＪ／ｍｏｌ、約２ｋＪ／ｍｏｌ、約４ｋＪ／ｍｏｌ、約６ｋＪ／ｍｏｌ、約８ｋＪ／ｍｏｌ、約１０ｋＪ／ｍｏｌ、約１２ｋＪ／ｍｏｌ、約１４ｋＪ／ｍｏｌ、約１６ｋＪ／ｍｏｌ、約１８ｋＪ／ｍｏｌ、約２０ｋＪ／ｍｏｌ、約２１ｋＪ／ｍｏｌ、約２２ｋＪ／ｍｏｌ、約２３ｋＪ／ｍｏｌ、約２４ｋＪ／ｍｏｌ、約２５ｋＪ／ｍｏｌ、約２６ｋＪ／ｍｏｌ、約２７ｋＪ／ｍｏｌ、約２８ｋＪ／ｍｏｌ、約２９ｋＪ／ｍｏｌ、約３０ｋＪ／ｍｏｌ、約３２ｋＪ／ｍｏｌ、約３４ｋＪ／ｍｏｌ、約３６ｋＪ／ｍｏｌ、約３８ｋＪ／ｍｏｌ、約４０ｋＪ／ｍｏｌ、約４５ｋＪ／ｍｏｌ、又は約５０ｋＪ／ｍｏｌである。
【００９８】
タンパク質折り畳み／変性をモニターするための、当技術分野で公知な任意の他の方法も、本発明の方法により使用することができる。
【００９９】
５．２  ヒト化分子
好ましい実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド及び／又はその断片は、ヒト化される。本発明のヒト化分子は、所定の抗原と免疫特異的に結合が可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、本明細書中に記述した方法により単離及び／又は同定されたウサギ免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲとを含む少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン（又はその変異体若しくは断片）を含むポリペプチドである。本発明のヒト化免疫特異的ポリペプチドは、全ての又は実質的に全てのＣＤＲ領域が、本発明の方法により単離／同定されたウサギ可変ドメインの領域（つまり、供与体ドメイン／領域）に対応し、全ての又は実質的に全てのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリン共通配列の領域である、少なくとも１つの、又はある実施形態では２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができる。ある実施形態では、本発明のヒト化分子は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む。本発明のヒト化分子の定常ドメインは、免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体の提唱されている機能、特に必要とされる場合があるエフェクター機能に関して選択することができる。幾つかの実施形態では、本発明のヒト化分子の定常ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインである。特定の実施形態では、本発明のヒト化分子が治療的使用のためであり、抗体エフェクター機能が望ましい場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソタイプのヒトＩｇＧ定常ドメイン定常が使用される。代替的な実施例では、本発明のヒト化分子が治療目的のためであり、抗体エフェクター機能が必要でない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４イソタイプが使用される。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、重鎖のみ、軽鎖のみ、ＶＨドメインのみ、ＶＬドメインのみ、又は上記断片及び／又はドメインの任意の組合せを含む。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又は断片は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を１つも含まなくてもよく、それらの１つ、又はそれらの１つ若しくは複数をさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又は断片は、ＣＬドメインを含まない。本発明の免疫特異的ポリペプチド又は断片は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のイソタイプから選択されるレセプター抗体を含むことができる。幾つかの実施形態では、定常ドメインは、ヒト化分子、例えば抗体が細胞毒性活性を示し、クラスが典型的にはＩｇＧ１であることが望ましい補体結合定常ドメインである。そのような細胞毒性活性が望ましくない他の実施形態では、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスであり得る。本発明のヒト化分子は、１つを越えるクラス又はイソタイプに由来する配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野の通常技術内にある。
【０１０１】
本発明のヒト化分子のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、供与体ウサギＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、その部位でのＣＤＲ又はフレームワーク残基がコンセンサス又は供与体分子のいずれにも対応しないように、少なくとも１つの残基の置換、挿入、又は欠失により突然変異していてもよい。しかしながら、そのような突然変異は広範でないことが好ましい。通常、ヒト化残基の少なくとも７５％は、親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲの配列に対応し、より多くの場合９０％であり、及び最も好ましくは９５％を越えることになる。ヒト化分子、特に抗体は、これらに限定されないが、ＣＤＲ移植（CDR-grafting）（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；及び米国特許第５，２２５，５３９号明細書、第５，５３０，１０１号明細書、及び第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（veneering）又は再表面化（resurfacing）（欧州特許第５９２，１０６号明細書及び欧州特許第５１９，５９６号明細書；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；及びRoguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973）、鎖シャフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）、並びに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、第５，７６６，８８６号明細書、第５，５８５，０８９号明細書、国際公開第９３１７１０５号パンフレット、Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25、Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60、Morea et al., 2000, Methods 20:267-79、Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904、Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu, 1994, Gene 150:409-10、Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323、及びPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596で開示された技術を含む当技術分野で公知な種々の技術を使用して作製することができる。多くの場合、フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、好ましくは向上させるためにＣＤＲ又は供与体ウサギ可変ドメイン由来の対応する残基と置換される（つまり、本発明の方法により同定されたスキャフォールドアミノ酸配列及び／又は残基の置換）。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデリングすること、及び特定の位置で稀であるフレームワーク残基を同定するために配列を比較することにより同定される。（例えば、Queen et al.、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許公開第２００４／００４９０１４号明細書、及び第２００３／０２２９２０８号明細書；米国特許第６，３５０，８６１号明細書；第６，１８０，３７０号明細書；第５，６９３，７６２号明細書；第５，６９３，７６１号明細書；第５，５８５，０８９号明細書；及び第５，５３０，１０１号明細書、並びにRiechmann et al., 1988, Nature 332:323を参照されたい。これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）。「ヒト化」という用語は、各々Studnickaらによる米国特許第５，��７０，１９６号明細書；第５，７７６，８６６号明細書；第５，８２１，１２３号明細書；及び第５，８９６，６１９号明細書（それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されたものなどのタンパク質及び／又は抗体の新表面化の方法も含む。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、供与体ウサギ可変ドメインに由来する少なくとも１つのＣＤＲが受容体フレームワーク領域に移植されているヒト化分子を含む。他の実施形態では、供与体ウサギＶＨ及び／又はＶＬドメインの少なくとも２つ及び好ましくは３つ全てのＣＤＲが、受容体フレームワーク領域に移植されている。
【０１０３】
５．３  キメラ分子
本発明のキメラ分子は、免疫特異的ポリペプチドの異なる部分が、ウサギ重鎖又は軽鎖に由来する可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などの異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第６，３１１，４１５号明細書、第５，８０７，７１５号明細書、第４，８１６，５６７号明細書、及び第４，８１６，３９７号明細書を参照されたい。これらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。本発明のウサギ供与体分子に由来する１又は複数のＣＤＲと、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを含む本発明のキメラ分子は、例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；並びに米国特許第５，２２５，５３９号明細書、第５，５３０，１０１号明細書、及び第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング又は新表面化（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805；及びRoguska et al., 1994, PNAS 91:969）、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）を含む、当技術分野で公知な種々の技術を使用して作製することができる。上記で特定された参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１０４】
多くの場合、フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、好ましくは向上させるために、ＣＤＲウサギ供与体可変ドメイン由来の対応する残基と置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するために、ＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデリングすること、及び特定の位置で稀であるフレームワーク残基を同定するために配列を比較することにより同定される。（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；及びRiechmann et al., 1988, Nature 332:323を参照されたい。これらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。）
【０１０５】
５．４  コンジュゲート分子
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種性ポリペプチド（つまり、無関係なポリペプチド；又はその一部、ポリペプチドの好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個のアミノ酸）に組換えによって融合、又は化学的にコンジュゲートされた（共有結合及び非共有結合によるコンジュゲーションの両方を含む）、免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。本発明の免疫特異的ポリペプチドは、例えば、特定の細胞表面受容体に対して免疫特異的性を示す本発明の分子に異種性ポリペプチドを融合又はコンジュゲートさせることにより、異種性ポリペプチドを特定の細胞タイプにターゲティングするために、インビトロ又はインビボのいずれでも使用できる。代替的には又は追加的には、異種性ポリペプチド、特に抗原結合異種性ポリペプチドは、例えば、特定のＣ血清タンパク質又は標的タンパク質に対して免疫特異性を示す異種性ポリペプチドに本発明の分子を融合又はコンジュゲートさせることにより、本発明の免疫特異的ポリペプチドを特定の血清タンパク質又はタンパク質標的にターゲティングするために、インビトロ又はインビボのいずれでも使用できる。そのような融合又はコンジュゲーションは、本発明の二重特異的又は多特異的ポリペプチドに帰着する。異種性ポリペプチドに融合又はコンジュゲートされた本発明の免疫特異的ポリペプチドは、当技術分野で公知な方法を使用してインビトロのイムノアッセイ及び精製法にも使用することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett., 39:91-99；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Gillies et al., 1992, Proc Natl Acad Sci, 89:1428-1432；及びFell et al., 1991, J. Immunol., 146:2446-2452を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１０６】
さらに、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、所与の生体応答を改変する治療用作用剤又は薬物部分とコンジュゲートさせてもよい。治療用作用剤又は薬物部分は、古典的な化学的治療用作用剤に制限されるとは解釈するべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を所有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素（つまりＰＥ−４０）又はジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、及びアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などの毒素、腫瘍壊死因子などのタンパク質、これらに限定されないが、アルファ−インターフェロン（ＩＦＮ（interferon）−アルファ）、ベータ−インターフェロン（ＩＦＮ（interferon）−ベータ）、神経成長因子（ＮＧＦ，nerve growth factor）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ，platelet derived growth factor）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ，tissue plasminogen activator）を含むインターフェロン；アポトーシス作用剤（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＰＣＴ国際公開第９７／３３８９９号パンフレットで開示されているようなＡＩＭ  Ｉ）、ＡＩＭ  II（例えば、ＰＣＴ国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照）、Ｆａｓリガンド（Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574）、及びＶＥＧＩ（ＰＣＴ国際公開第９９／２３１０５号パンフレット）、血栓剤又は抗血管新生剤（例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン）、又は例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン１（「ＩＬ−１」，interleukin-1）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」，interleukin-2）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」，interleukin-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」，granulocyte macrophage colony stimulating factor）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」，granulocyte colony stimulating factor））などの生体応答調節剤、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」，macrophage colony stimulating factor）、又は増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」，growth hormone）；プロテアーゼ、又はリボヌクレアーゼが含まれる。
【０１０７】
本発明の免疫特異的ポリペプチドは、精製を容易にするためにペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、数ある中で、pQEベクター（QIAGEN Inc社製、９２５９  イートンアベニュー、チャッツワース、米国カリフォルニア州、９１３１１）に備えられているタグなどの、ヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは商業的に入手可能である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824に記述されているように。精製に有用な他のペプチドタグには、これらに限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（その全体が参照により組み込まれるWilson et al., 1984,Cell, 37:767）及び「Ｆｌａｇ」タグ（その全体が参照により組み込まれるKnappik et al., 1994, Biotechniques, 17(4):754-761）が含まれる。
【０１０８】
本発明は、本発明の分子の断片に融合又はコンジュゲートされた異種性ポリペプチドを含む組成物の使用をさらに含む。例えば、異種性ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ナノボディ、又はその一部分に融合又はコンジュゲートすることができる。抗体部分にポリペプチドを融合又はコンジュゲートするための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、第５，６２２，９２９号明細書、第５，３５９，０４６号明細書、第５，３４９，０５３号明細書、第５，４４７，８５１号明細書、及び第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；及びVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341（上記参考文献は参照によりそれらの全体が組み込まれる）を参照されたい。
【０１０９】
追加的な融合タンパク質は、遺伝子シャフリング（gene-shuffling）、モチーフシャフリング（motif-shuffling）、エクソンシャフリング（exon-shuffling）、及び／又はコドンシャフリング（codon-shuffling）（「ＤＮＡシャフリング」と総称される）の技術により作製することができる。ＤＮＡシャフリングは、本発明の免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体、又はその断片の活性を変更するために使用できる（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号明細書；第５，８１１，２３８号明細書；第５，８３０，７２１号明細書；第５，８３４，２５２号明細書；及び第５，８３７，４５８号明細書、並びにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265；及びLorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照されたい（これらの特許及び出版物はそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる）。本発明の核酸若しくはその断片、又はコードされたポリペプチド若しくはその断片は、組換えに先立って、誤りを起こし易いＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入、又は他の方法により無作為突然変異誘発にかけることにより変更することができる。
【０１１０】
本発明は、診断薬又は治療用作用剤にコンジュゲートされた免疫特異的ポリペプチドも包含する。例えば、そのような分子は、例えば所与の治療計画の効能を決定するための臨床試験手順の一部として疾患、障害、又は感染の発生又は進行をモニターするために、診断的に使用することができる。検出は、本発明のポリペプチドを検出可能な物質に結合することにより容易になり得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、及び非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、直接的に、又は当技術分野で公知の技術を使用して、媒介体（例えば、当技術分野で公知のリンカーなど）を介して間接的にのいずれかで、本発明の免疫特異的ポリペプチドと結合又はコンジュゲートさせることができる。本発明により診断法として使用するために抗体とコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号明細書（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。そのような診断及び検出は、種々の酵素、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む酵素；これらに限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなどの補欠分子団複合体；これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンなどの蛍光物質；これに限定されないが、ルミノールなどの発光物質；これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンなどの生物発光物質；これらに限定されないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）などの放射性物質；種々の陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、及び非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質に本発明のポリペプチドを結合することにより達成できる。そのうえ、上記トレーサー放射性金属はいずれも、本発明の方法による免疫特異的ポリペプチドにコンジュゲートされた場合、治療効果を示す場合がある。
【０１１１】
本発明の免疫特異的ポリペプチドは、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制性又は細胞破壊性作用剤）、治療用作用剤、又は放射性元素（例えば、アルファ放射体、ガンマ放射体など）などの治療用部分とコンジュゲートさせることができる。細胞毒素又は細胞毒性作用剤には、細胞に有害なあらゆる作用剤が含まれる。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が含まれる。治療用作用剤には、これらに限定されないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルボアジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシスジクロロジアミン白金（II）（ＤＤＰ、cisdichlorodiamine platinum (II)）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有系分裂作用剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。
【０１１２】
ある実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、遺伝子の過剰発現又は誤発現により引き起こされる疾患、及び突然変異を含有する遺伝子の発現によりもたらされる疾患の治療又は予防に有用なｓｉＲＮＡなどの治療用部分とコンジュゲートさせることができる。ｓｉＲＮＡ活性の機序及びその使用様式は当技術分野で周知であり、例えば、Provost et al., 2002, EMBO J., 21: 5864-5874；Tabara et al., 2002, Cell 109:861-71；Ketting et al., 2002, Cell 110:563；及びHutvagner & Zamore, 2002, Science 297:2056を参照されたい。それぞれその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１１３】
さらに、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、放射性物質又は放射性金属イオンの結合に有用な大環状キレート剤などの治療用部分とコンジュゲートさせることができる（放射性物質の例に関しては上記を参照）。ある実施形態では、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’、Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これはリンカー分子を介して抗体とコンジュゲートさせることができる。そのようなリンカー分子は、当技術分野で一般的に公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；及びZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50に記述されており、それぞれ参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１１４】
本発明の免疫特異的ポリペプチドは、生体応答を変更又は改変しないが、その代わりに免疫特異的ポリペプチド又はその断片の標的機能及び／又は輸送機能を変更又は改変する治療用部分とコンジュゲートさせることができる。そのような部分の非限定的な例には、プロテインＡ、Ｇタンパク質、アルブミン、アルブミン相互作用性ペプチド（例えば、ｇｐ６０、ｇｐ３０、ｇｐ１８；例えば、Schnitzer et al., 1992, J Biol Chem 34:24544-24553を参照）；及びタンパク質形質導入ドメイン（例えば、Bogoyevitch et al, 2002, DNA Cell Biol 12:879-894を参照）が含まれる（上記で引用した参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。そのような部分には、本発明の免疫特異的ポリペプチドの血清半減期を向上又は増加させる部分も含まれる。ポリペプチドの血清半減期を増加又は向上させる部分の非限定的な例には、アルブミン及びフィブロネンクチン、又はその活性断片、並びにアルブミン及び／又はフィブロネクチン結合タンパク質、例えば、アルブミン及び／又はフィブロネクチン結合性抗体、又はその抗原結合性断片が含まれる（例えば、Holt et al., 2008, Protein Eng Des Sel 21:238-288；Weimer et al., 2008, Thromb Haemost 99:659-667；Yazaki et al., 2008, Nucl Med Biol 35:151-158；Huang et al., 2007, J Pept Sci 12:588-595；及びStork et al., 2007, Protein Eng Des Sel 20:569-576を参照されたい。それぞれ参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１１５】
そのような治療用部分をポリペプチドとコンジュゲートさせるための技術は、周知であり、例えば、Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press；及びThorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を参照されたい（それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
【０１１６】
単独で投与されるか、又は細胞毒性因子（複数可）及び／若しくはサイトカイン（複数可）と組み合わせて投与され、それとコンジュゲートしている治療用部分を有する又は有しない本発明の免疫特異的ポリペプチド又はそのエピトープ結合性断片は、予防薬又は治療薬として使用することができる。
【０１１７】
代替的には、本発明の免疫特異的なポリペプチドは、第２の抗体とコンジュゲートさせ、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第４，６７６，９８０号明細書中でSegalにより記述されているような抗体ヘテロコンジュゲートを形成することができる。
【０１１８】
本発明の分子は、固体支持体に結合させることもでき、イムノアッセイ又は標的抗原の精製に特に有用である。そのような固体支持体には、これらに限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンが含まれる。
【０１１９】
本発明は、本発明の分子の血清半減期を延長又は増加させるためのリポソームの使用も包含する。ある実施形態では、本発明が意図する免疫特異的分子、例えば、ＶＬ又はＶＨドメインは、過去に記述されている方法を使用してリポソームとコンジュゲートさせることができ、例えば、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれるMartin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288を参照されたい。したがって、本発明は、米国特許第５，０１３，５５６号明細書で開示された方法などの、血清半減期が延長された、つまり循環時間が増強されたリポソーム調製法を包含する。本発明の方法に使用される好ましいリポソームは、血行から迅速に除去されない、つまり、単核食細胞系（ＭＰＳ）に摂取されない。本発明は、当業者に公知な一般的方法を使用して調製される、立体的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、立体的に安定化されたリポソームは、かさ高く高度に可動性の親水性部分を有する脂質成分を含有し、これにより血清タンパク質とリポソームとの望ましくない反応が低減され、血清成分とのオプソニン化が低減され、ＭＰＳによる認識が低減される。立体的に安定化されたリポソームは、好ましくはポリエチレングリコールを使用して調製される。リポソーム及び立体的に安定化されたリポソームの調製には、例えば、Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224；Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6；Klibanov et al., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7；Blum et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7；Torchilin .et al., 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116；Litzinger et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107；Maruyama et al., 1991, Chem. Pharm. Bull., 39: 1620-2；Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8；Allen et al., 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309を参照されたい。これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。本発明は、特異的器官ターゲティングに適したリポソームを包含し、例えば米国特許第４，５４４，５４５号明細書を参照、又は特異的細胞ターゲティングに適したリポソームを包含し、例えば米国特許出願公開第２００５／００７４４０３号明細書を参照されたい。本発明の組成物及び方法に使用される特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ，PEG derivatized phosphatidylethanolamine）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法（reverse phase evaporation method）により作製することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを産出するために、定義された細孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【０１２０】
５．５  本発明のポリペプチドの調製及び特徴付け
本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、結合対の相互作用を特徴付けるための、当技術分野で公知な任意の免疫学又は生化学に基づく方法を使用して、抗原及び／又はエピトープへの特異的結合を特徴付けることができる。本発明の免疫特異的ポリペプチドの、抗原及び／又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、親和性クロマトグラフィー、及び平衡透析法を含む免疫学又は生化学に基づく方法を使用して決定することができる。本発明の分子の免疫特異的結合及び交差反応を分析するために使用できるイムノアッセイには、ほんの数例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法、enzyme linked immunosorbent assay）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合及び非競合アッセイ系が含まれるが、それらに限定されない。そのようなアッセイは、当技術分野において定常的であり、周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
【０１２１】
本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片は、免疫特異的タンパク質と所望の抗原及び／又はエピトープとの相互作用の動力学的パラメータを特徴付けるための、当技術分野で公知な任意の表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを使用して、アッセイすることもできる。本発明では、これらに限定されないが、Biacore AB社（ウプサラ、スウェーデン）から入手可能なBIAcore機器；Affinity Sensors社（フランクリン、米国マサチューセッツ州）から入手可能なIAsys機器；Windsor Scientific Limited社（バークス、英国）から入手可能なIBISシステム、Nippon Laser and Electronics Lab社（北海道、日本）から入手可能なSPR-CELLIAシステム、及びTexas Instruments社（ダラス、米国テキサス州）から入手可能なＳＰＲ検出装置Spreetaを含む、市販されている任意のＳＰＲ機器が使用できる。ＳＰＲに基づく技術に関する総説は、これら全てが参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれるMullet et al., 2000, Methods 22: 77-91；Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23；Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101；Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい。そのうえ、米国特許第６，３７３，５７７号明細書；第６，２８９，２８６号明細書；第５，３２２，７９８号明細書；第５，３４１，２１５号明細書；第６，２６８，１２５号明細書に記述されているタンパク質間相互作用を測定するためのＳＰＲ機器及びＳＰＲに基づく方法は、本発明の方法において企図されており、それらの全ては参照により本明細書中にそれらの全体が組み込まれる。
【０１２２】
簡潔に言えば、ＳＰＲに基づくアッセイは、結合対のメンバーを表面に固定し、結合対の他方のメンバーとの相互作用を溶液中でリアルタイムにモニターすることを伴う。ＳＰＲは、複合体の形成又は解離の際に生じる表面付近の溶媒屈折率の変化を測定することに基づく。固定化が起こる表面は、ＳＰＲ技術の核心であるセンサーチップであり、センサーチップは、金の薄層で被覆されたガラス表面で構成され、分子の表面への結合を最適化するように設計された一連の特殊表面の基底を形成する。種々のセンサーチップが、特に上記で列挙された企業から商業的に入手可能であり、それらの全ては本発明の方法に使用することができる。センサーチップの非限定的な例には、BIAcore AB, Inc.社から入手可能なチップ、例えば、センサーチップＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡ、及びＨＰＡが含まれる。本発明の分子は、これらに限定されないが、アミン基を介する直接的共有結合、スルフヒドリル基を介する直接的共有結合、アビジン被覆表面へのビオチン結合、炭化水素基へのアルデヒド結合、及びヒスチジンタグを介したＮＴＡチップとの結合を含む、当技術分野で公知の固定化法及び化学的作用のいずれかを使用して、センサーチップの表面上に固定できる。
【０１２３】
５．５．１  本発明の免疫特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の免疫特異的ポリペプチド（例えば、アミノ酸スキャフォールド配列又はアミノ酸スキャフォールド残基などを含む、本発明の方法により同定された１又は複数のＣＤＲを含むウサギＶＨ又はＶＬドメインを含むポリペプチド）、又は本発明の方法により作製される他の免疫特異的ポリペプチド若しくはその断片、及びそれらのヒト化型をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを作製する方法も含む。
【０１２４】
本発明の方法は、種々の厳密性条件下で、例えば高度な厳密性、中程度の又はより低い厳密性条件下で、本発明の免疫特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。ハイブリダイゼーションは、種々の厳密性条件下で実施することができる。限定ではなく一例として、低厳密性条件を使用する手順は以下の通りである（Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792も参照）。ＤＮＡを含有しているろ紙を、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、６時間４０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションは、以下のように改変された同じ溶液中で実行する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／体積）硫酸デキストラン、及び５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを使用する。ハイブリダイゼーション混合物中でろ紙を１８〜２０時間４０℃でインキュベートし、その後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で１．５時間５５℃で洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と取り替え、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。ろ紙をブロット乾燥（blotted dry）し、オートラジオグラフィーで露光させる。ろ紙は、必要に応じて６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに再度露光させる。使用できる低厳密性の他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに使用されるような）。限定ではなく一例として、高厳密性条件を使用する手順は以下の通りである。ＤＮＡを含有しているろ紙のプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で、８時間から終夜６５℃で実行する。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中で、ろ紙を４８時間６５℃でハイブリダイズさせる。ろ紙の洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール、及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中で、１時間３７℃で行う。この後、オートラジオグラフィー前に０．１×ＳＳＣ中で４５分間５０℃で洗浄する。使用できる他の高厳密性条件は、当技術分野で周知である。そのような厳密性に適切な条件を選択することは、当技術分野で周知である（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；さらにはAusubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, .COPYRGT. 1987-1997, Current Protocols, .COPYRGT. 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.；特にDyson, 1991, "Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis," In: Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Vol. 2, T. A. Brown, ed., pp. 111-156, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UKを参照されたい）（それぞれ参照によりその全体が���明細書中に組み込まれる）。
【０１２５】
当技術分野で公知な任意の方法により、ポリヌクレオチドを取得し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。
【０１２６】
本発明の免疫特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより、及び／又は可変ドメイン配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅、又は同定する特定の遺伝子配列、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡクローンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、好適な供給源（例えば、ウサギ抗体、特にウサギ可変ドメインを発現する任意の組織又は形質細胞などの細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリー、又は単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）由来の核酸から生成することができる。その後、ＰＣＲにより生成された増幅核酸は、当技術分野で周知な任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０１２７】
本発明の免疫特異的ポリペプチドのヌクレオチド配列が決定されると、ヌクレオチド配列を操作するための当技術分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを使用して（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記述されている技術を参照されたい。これらはいずれも参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）、このヌクレオチド配列を、異なるアミノ酸配列を有する本発明の分子を作製するため、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生成するために、操作することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明の方法により同定されたウサギＣＤＲの１又は複数を、定常的な組換えＤＮＡ技術を使用して異種性フレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、天然又はコンセンサスフレームワーク領域であってよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストは、Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照）。好ましくは、フレームワーク領域及びＣＤＲの組合せにより生成されたポリヌクレオチドは、所望の抗原及び／又はエピトープと特異的に結合する免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体をコードする。好ましくは、上記で考察されたように、フレームワーク領域内に１又は複数のアミノ酸置換を行うことができ、好ましくは、アミノ酸置換は、上記抗原及び／又はエピトープに対する本発明の抗体の結合を向上させる。
【０１２９】
別の実施形態では、ウサギ免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン可変ドメインのライブラリー又は当技術分野で利用可能な任意の他のウサギライブラリーを、当技術分野で公知の標準的技術によりスクリーニングし、本発明の免疫特異的ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることができる。
【０１３０】
５．５．２  本発明の免疫特異的ポリペプチドの組換え発現。
本発明の分子をコードする核酸配列が取得されると、免疫特異的ポリペプチドを作製するためのベクターは、当技術分野で周知の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により作製することができる。当業者に周知である方法を使用して、本発明のポリペプチドのコード配列、並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記述されている技術を参照）。
【０１３１】
本発明の免疫特異的ポリペプチドのヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソーム形質移入、及びリン酸カルシウム沈殿）により宿主細胞に導入することができ、その後、形質移入された細胞を従来技術により培養し、本発明のポリペプチドが作製される。特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、構成的な特異的プロモーター、誘導可能な特異的プロモーター、又は組織性特異的プロモーターにより調節される。
【０１３２】
本発明の組換え型免疫特異的ポリペプチド発現に使用される宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であるか、又は特に組換え免疫グロブリン分子全体を発現する場合は、好ましくは真核細胞であるかのいずれかである。特に、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターを併用したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，Chinese hamster ovary cell）などの哺乳動物細胞は、免疫グロブリンの効率的な発現系である（Foecking et al., 1998, Gene 45:101；Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。
【０１３３】
本発明の免疫特異的ポリペプチドを発現するためには、種々の宿主発現ベクター系を使用することができる。そのような宿主発現系は、それによりポリペプチドのコード配列が作製され、その後精製することができる媒介体を意味するだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換又は形質移入した際に、本発明のポリペプチドをインサイツで発現することができる細胞も意味する。これらには、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌（B. subtilis））などの微生物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス・ピキア（Saccharomyces Pichia））；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ，cauliflower mosaic virus）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ，tobacco mosaic virus）に感染したか、又はポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築体を内包する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ球細胞（米国特許第５，８０７，７１５号明細書を参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Crucell社により開発されたラット網膜細胞））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
細菌系では、発現させる免疫特異的ポリペプチドを対象とした使用に依存して、多数の発現ベクターを都合よく選択することができる。例えば、本発明の免疫特異的ポリペプチドの医薬組成物を製造するために、大量のそのようなタンパク質を作製する場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、これらに限定されないが、融合タンパク質が産生されるように、免疫特異的ポリペプチドコード配列を個々にｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターにライゲーションすることができる大腸菌発現ベクターpUR278（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791）；及びpINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが含まれる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ，glutathione S-transferase）との融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現するためには、pGEXベクターを使用することもできる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合した後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離できるように、トロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１３５】
昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ，Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）が、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する。免疫特異的ポリペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。
【０１３６】
哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づく多数の発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、所望の免疫特異的ポリペプチドコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三重リーダー配列（tripartite leader sequence）にライゲーションすることができる。その後、このキメラ遺伝子を、インビトロ又はインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）における挿入は、生存可能で、感染した宿主内で免疫特異的ポリペプチド分子の発現が可能な組換えウイルスをもたらすことになる。（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照）。挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が含まれる。さらに、インサート全体の翻訳を保証するためには、開始コドンが、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、由来が種々であってよく、天然及び合成の両方であってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含させることにより増強できる（Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照）。
【０１３７】
さらに、挿入した配列の発現を調節するか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物を翻訳後にプロセシング及び修飾するための特徴的で特異的な機序を有する。適切な細胞系又は宿主系を選択すると、発現される外来性タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証することができる。そのためには、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化の細胞機構を所有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０、並びにＨｓ５７８Ｂｓｔが含まれる。
【０１３８】
組換えタンパク質を長期にわたり高収量で作製するためには、安定的発現が好ましい。例えば、本発明の免疫特異的ポリペプチドを安定的に発現する細胞系を遺伝子操作することができる。宿主細胞は、ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡ及び選択可能なマーカーを用いて形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入後、強化培地中で１〜２日間、遺伝子操作された細胞の増殖を可能にし、その後選択培地に切り替える。組換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、自身の染色体にプラスミドを安定的に組み込み、その後クローニングして細胞系統へと増殖することができるフォーカスを形成するように増殖を可能にする。この方法は、本発明の免疫特異的ポリペプチドを発現する細胞系統を遺伝子操作するために都合よく使用できる。そのような遺伝子操作された細胞系統は、本発明の免疫特異的ポリペプチドと直接的に又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。
【０１３９】
これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:817）遺伝子を含む多数の選択系を使用することができ、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、又はａｐｒｔ細胞で使用することができる。また、以下の遺伝子の場合は、選択基準として代謝拮抗剤耐性を使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及びMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215）。使用できる組換えＤＮＡ技術の、当技術分野で一般的に公知な方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；及びDracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NYの１２及び１３章;Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1に記述されており、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏである（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）（上記参考文献はそれぞれ、これによりそれらの全体が組み込まれる）。
【０１４０】
本発明の免疫特異的ポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（総説は、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照）。免疫特異的ポリペプチドを発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤レベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域が、本発明の免疫特異的ポリペプチドのヌクレオチド配列に結合しているため、免疫特異的ポリペプチドの産生も増加することになる（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）（上記参考文献の各々は、これによりそれらの全体が組み込まれる）。
【０１４１】
宿主細胞は、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする本発明の２つの発現ベクターを用いて同時形質移入することができる。２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含有することができる。代替的には、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを使用することができる。そのような状況では、軽鎖は、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために重鎖の前に配置されるべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322:52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１４２】
本発明の免疫特異的ポリペプチドは、組換えによって発現されると、免疫特異的ポリペプチドを精製するための当技術分野で公知な任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡ後の、特異的抗原に対する親和性による親和性クロマトグラフィー、及びサイズで分離するカラムクロマトグラフイー（sizing column chromatography））、遠心分離、溶解度の違い（differential solubility）、又はタンパク質精製用の任意の他の標準的技術により精製することができる。
【０１４３】
５．６  予防方法及び治療方法
疾患、障害、又は感染に対する予防用及び／又は治療用作用剤として機能する本発明の免疫特異的ポリペプチドは、疾患、障害、又は感染に伴う１又は複数の徴候を治療、予防、又は寛解するために、動物に、好ましくは哺乳動物に、及び最も好ましくはヒトに投与することができる。本発明の免疫特異的ポリペプチドは、疾患、障害、又は感染の治療、予防、又は管理に有用な１又は複数の他の予防用及び／又は治療用作用剤と組み合わせて投与することができる。ある実施形態では、１又は複数の本発明の免疫特異的ポリペプチドは、疾患の治療に有用な１又は複数の他の治療用作用剤と同時に、哺乳動物に、好ましくはヒトに投与される。「同時に」という用語は、予防用又は治療用作用剤の厳密な同時投与に制限されず、むしろ、本発明の免疫特異的ポリペプチドが他の作用剤と共に作用して、それ以外の方法で投与された場合より利益の増加が提供されるように、本発明の免疫特異的ポリペプチド及び他の作用剤を、ある時間間隔内で順次対象に投与することを意味する。例えば、各予防用又は治療用作用剤は、同時に又は異なる時点において任意の順番で順次投与することができる；しかしながら、同時に投与しない場合、所望の治療的又は予防的効果を提供するように、時間的に十分近接して投与すべきである。各治療用作用剤は、任意の適切な形態で、任意の好適な経路により、別々に投与することができる。
【０１４４】
種々の実施形態では、予防用又は治療用作用剤は、１時間未満ずらして、約１時間ずらして、約１時間〜約２時間ずらして、約２時間〜約３時間ずらして、約３時間〜約４時間ずらして、約４時間〜約５時間ずらして、約５時間〜約６時間ずらして、約６時間〜約７時間ずらして、約７時間〜約８時間ずらして、約８時間〜約９時間ずらして、約９時間〜約１０時間ずらして、約１０時間〜約１１時間ずらして、約１１時間〜約１２時間ずらして、長くとも２４時間ずらして、又は長くとも４８時間ずらして、投与する。好ましい実施形態では、１回の患者来診で複数の成分を投与する。
【０１４５】
本明細書中で提供される投与用量及び投与頻度は、治療上有効な及び予防上有効なという用語により包含される。用量及び頻度はさらに、典型的には、投与された特定の治療用又は予防用作用剤、疾患の重症度及び種類、投与経路、並びに患者の年齢、体重、応答性、及び既往症に依存して、各患者に特定的な要因により変動しよう。当業者であれば、そのような要因を考慮することにより、例えば文献に報告されており、Physician's Desk Reference (56th ed., 2002)により推奨される用量に従うことにより、好適な治療計画を選択することができる。
【０１４６】
５．７  組成物及び投与方法
本発明は、本発明の免疫特異的ポリペプチドを含む方法及び医薬組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子、又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を対象に投与することにより、疾患、障害、又は感染に伴う１又は複数の徴候を治療、予防、及び寛解する方法も提供する。好ましい態様では、免疫特異的ポリペプチド又は融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている（つまり、その効果を制限するか、又は望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイザル及びヒト）などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【０１４７】
種々の送達システムが公知であり、例えば、リポソーム内封入、微粒子、マイクロカプセル、免疫特異的ポリペプチド又は融合タンパク質を発現可能な組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、レトロウイルス又は他のベクターなどの一部としての核酸構築が、本発明の免疫特異的ポリペプチドを含む組成物を投与するために使用することができる。
【０１４８】
本発明の免疫特異的ポリペプチドを投与する方法には、これらに限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外、粘膜（例えば、鼻腔内及び経口経路）が含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫特異的ポリペプチドは、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。組成物は、任意の便利な手段により、例えば点滴又はボーラス注射により、上皮内層又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）による吸収により投与することができ、他の生理活性物質と共に投与することができる。投与は、全身性であってもよく又は局所的であってもよい。そのうえ、例えば、吸入器又は噴霧器の使用及びアエロゾル化剤での製剤により、経肺投与も使用することができる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書；第５，９８５，２０号明細書；第５，９８５，３０９号明細書；第５，９３４，２７２号明細書；第５，８７４，０６４号明細書；第５，８５５，９１３号明細書；第５，２９０，５４０号明細書；及び第４，８８０，０７８号明細書；並びにＰＣＴ国際公開第９２／１９２４４号パンフレット；国際公開第９７／３２５７２号パンフレット；国際公開第９７／４４０１３号パンフレット；国際公開第９８／３１３４６号パンフレット、及び国際公開第９９／６６９０３号パンフレットを参照されたい。それぞれその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４９】
本発明の免疫特異的分子は、徐放性製剤で送達することができる。この製剤は、投与された治療用ポリペプチドの放出延長、及び半減期の延長を提供する。使用に好適な放出制御系には、限定ではないが、拡散制御系、溶媒制御系、及び化学的制御系が含まれる。拡散制御系には、例えば、分子の放出が拡散障壁を介する透過によって制御されるように、本発明の免疫特異的分子がデバイス内に封入されている貯蔵デバイス（reservoir device）が含まれる。一般的な貯留デバイスには、例えば、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム、及び中空繊維が含まれる。第２のタイプの拡散制御系は、免疫特異的分子が、速度制御マトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）に分散又は溶解されているモノリシック（マトリックス）デバイスである。本発明の免疫特異的分子は、速度制御マトリックスにわたって均一に分散されており、放出速度はマトリックスを介した拡散により制御される。モノシックマトリックスデバイスで使用するのに好適なポリマーには、天然ポリマー、合成ポリマー、及び合成的に修飾された天然ポリマー、並びにポリマー誘導体が含まれる。
【０１５０】
障害に伴う１又は複数の徴候の治療、予防、又は寛解に有効であろう本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤に使用されるべき正確な用量は、投与経路及び状態の重症度にも依存し、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量反応曲線から推定することができる。
【０１５１】
一般的には、ヒト化免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体は、免疫特異的ポリペプチド、例えば外来性ポリペプチドに対する免疫応答による他種由来の抗体より長い人体内半減期を有する。したがって、ヒト化免疫特異的ポリペプチド、例えば抗体の用量が低ければ低いほど、より低頻度での投与が可能であることが多い。さらに、本発明の免疫特異的ポリペプチド又はその断片の投与用量及び投与頻度は、例えばＧタンパク質とのコンジュゲーションなどの修飾により、抗体の取り込み及び組織透過性を増強することにより低減することができる。
【０１５２】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療が必要性な区域に局所投与することが望ましい場合があり、局所投与は、例えば、限定目的ではないが、局所注入により、注射により、又は移植体により達成することができ、上記移植体は、シラスティック膜などの膜又は繊維を含む多孔性物質、非多孔性物質、又はゲル状物質である。好ましくは、本発明の免疫特異的ポリペプチドを投与する場合、免疫特異的ポリペプチド又は融合タンパク質が吸収されない物質を使用するように注意しなければならない。
【０１５３】
治療上及び予防上有効な量の本発明の免疫特異的ポリペプチドを用いた対象の治療には、単回の治療、又は好ましくは一連の治療が含まれ得る。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回、又は１日３回投与することができる。他の実施形態では、医薬組成物は、週１回、週２回、２週間に１回、１か月に１回、６週間に１回、２か月に１回、１年に２回、又は毎年１回投与することができる。治療に使用される抗体の有効量は、特定の治療の経過中に増加又は減少させことができることも理解されよう。
【０１５４】
５．７．１  医薬組成物
本発明の組成物には、医薬組成物の製造に有用なバルク薬剤組成物（例えば、不純物の混じった組成物又は滅菌されていない組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（つまり、対象又は患者への投与に好適な組成物）が含まれる。そのような組成物は、予防上又は治療有効量の本明細書中で開示された予防用及び／又は治療用作用剤、又はそれらの作用剤と薬学的に許容される担体との組合せを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防上又は治療有効量の本発明の免疫特異的ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。
【０１５５】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物及びより好ましくはヒトにおける使用について、連邦政府又は州政府の規制当局により承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、賦形剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、水、並びに石油、動物、植物、又は合成由来のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、及び胡麻油を含む油類などの滅菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内に投与される場合、好ましい担体は水である。特に注射剤用の液体担体としては、生理食塩水、並びにデキストロース水溶液及びグリセリン水溶液も使用することができる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなどが含まれる。所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、及び徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０１５６】
一般的には、本発明の組成物の成分は、別々に又は単位剤形中に混合されてのいずれかで、例えば、活性作用剤の量を表示したアンプル又はサシェなどの密封容器中の乾燥凍結乾燥散剤又は無水濃縮物として供給される。点滴により投与される場合、組成物は、滅菌した医薬等級の水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、成分を投与前に混合できるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１５７】
本発明の組成物は、中性形態又は塩形態として製剤することができる。薬学的に許容される塩には、これらに限定されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するイオンなどの陰イオンと形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するイオンなどの陽イオンと形成された塩が含まれる。
【０１５８】
５．７．２  キット
本発明は、本発明の免疫特異的ポリペプチドの１又は複数を充填した１又は複数の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。そのうえ、医薬パック又はキットには、疾患の治療に有用な１又は複数の他の予防用又は治療用作用剤も含むことができる。本発明は、本発明の医薬組成物の成分の１又は複数を充填した１又は複数の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。自由選択的に、そのような容器（複数可）には、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府当局により規定された形態の注意書きを付随させることができ、注意書きはヒト投与用の製造、使用、又は販売の当局による承認を反映する。
【０１５９】
本発明は、上記の方法で使用できるキットを提供する。１つの実施形態では、キットは、１又は複数の本発明の免疫特異的ポリペプチドを含む。別の実施形態では、キットは、１又は複数の容器に、疾患の治療に有用な１又は複数の他の予防用又は治療用作用剤をさらに含む。他の実施形態では、予防用又は治療用作用剤は、生物学的治療薬又はホルモン治療薬である。
【０１６０】
５．８  治療的有用性の特徴付け及び例証
予防用及び／又は治療用作用剤の組合せは、ヒトに使用する前に、好適な動物モデル系で試験することができる。そのような動物モデル系には、これらに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれる。当技術分野で周知な任意の動物系が使用できる。本発明の特定の実施形態では、予防用及び／又は治療用作用剤の組合せは、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は、広く使用されており、当業者に周知されている。予防用及び／又は治療用作用剤は、繰り返し投与することができる。予防用及び／又は治療用作用剤投与の時間的投与計画、及びそのような作用剤が別々に投与されるか又は混合剤として投与されるかなどの手順の幾つかの態様は、様々であり得る。
【０１６１】
本発明の予防用及び／又は治療用作用剤は、動物モデルで試験されると、それらの効能を確立するために臨床試験で試験することができる。臨床試験の確立は、当業者に公知の一般的方法論に従って行われ、本発明の組成物の最適な投与量及び投与経路並びに毒性特性は、定常的な実験法を使用して確立することができる。
【０１６２】
本発明の予防用及び／又は治療用プロトコールの毒性及び効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬手順により決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。大きな治療指数を示す予防用及び／又は治療用作用剤が好ましい。毒性副作用を示す予防用及び／又は治療用作用剤を使用してもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限にし、それにより副作用を低減するために、そのような作用剤を患部組織の部位にターゲティングする送達系を設計するように注意するべきである。
【０１６３】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、一連の用量の予防用及び／又は治療用作用剤をヒト使用に製剤する際に使用することができる。そのような作用剤の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか又は全くないＥＤ５０を含む一連の血中濃度内に収まる。用量は、使用される剤形及び使用される投与経路に依存して、この範囲内で変動してよい。本発明の方法で使用される任意の作用剤の場合、治療上有効な用量は、最初は細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（つまり、徴候の最大半阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、ある用量を動物モデルに処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【実施例】
【０１６４】
６．実施例
下記方法は、未処理又は免疫されたウサギに使用することができる。
【０１６５】
６．１  免疫特異的で安定的なＶＨ及びＶＬドメインの単離及び特徴付け
下記方法は、ヒト、マウス、又はラクダ抗体と比較して固有の特性を示し、高い親和性、特異性、及び安定性を表す独特なウサギ可変ドメインの同定及び単離を提供する。
【０１６６】
６．１．１  材料及び方法
ウサギ免疫（自由選択的）
ニュージーランド白ウサギを、１２週間の経過にわたって、精製されたＶｉｆ、ＨＩＶ  ＧＰ４１、ＨＩＶインテグラーゼ、ＴＮＦアルファ、ｖＷＦ、又はＤｅｌｔａ４で免疫した。製造業者（Ribi Immunochem Research社製、ハミルトン、米国モンタナ州）の使用説明に従って１ｍｌのアジュバント中に調製した５０μｇの精製タンパク質を、２〜３週間間隔で４回皮下注射でウサギに投与した。最終追加免疫の５日後に、脾臓及び骨髄を回収し、全ＲＮＡ調製用に使用した。
【０１６７】
ＲＮＡ単離及びライブラリー構築
組織試料を回収し、製造業者のプロトコールに従ってＴＲＩ試薬（Molecular Research Centre社製）を使用して、全ＲＮＡ単離用に調製した。単離された全ＲＮＡを、５００μｌの無ＲＮａｓｅ水に溶解し、濃度及び純度を分光測光法により決定した。製造業者のプロトコールを使用してオリゴ（ｄＴ）プライマー及び逆転写酵素（上述；Invitrogen社製）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡ（first strand cDNA）を全ＲＮＡから合成した。
【０１６８】
重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子の初期増幅は、表１（可変領域の５’部分；図１）に示されているセンスプライマー、及び表２（重鎖及び軽鎖の定常領域の３’部分；図２Ａ〜Ｂ）に示されているアンチセンスプライマーを使用して実施した。
【０１６９】
【表１】
2015012869.tif 000002
【０１７０】
【表２】
2015012869.tif 000003
【０１７１】
初期ＰＣＲは、２５ｐｍｏｌの各プライマーを使用して、５０μｌ反応体積中で実施した。２．５μｌのランダムプライム又はオリゴ−ｄＴ  ｃＤＮＡを、鋳型（５μｇ  ｍＲＮＡ当量）として使用した。初期ＰＣＲ用の反応条件は、９４℃で１１分間、その後５４／５５／７２℃で３０／６０／１２０秒を３０サイクル、及び７２℃で５分間であった。反応は全て、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ（Roche Diagnostics社製、ブリュッセル、ベルギー）、及び１．２５ＵのAmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Roche社製）を用いて実施した。
【０１７２】
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルで分離し、ＤＮＡは、QIAquickゲル抽出キット又はQIAEXII（Qiagen社製）を使用して溶出した。
【０１７３】
プライマーは全てSfiI部位を有する。ＤＮＡ断片を、Sfiで切断し、精製し、ファージミドベクターにクローニングした。ファージミドは、サプレッサー終止コドン（suppressor stop codon）及び、精製用（Ｈｉｓ６）及び検出用（ＨＡ）ペプチドタグをコードする配列を含有していた。
【０１７４】
ライブラリーライゲーション及び形質転換
およそ５０ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ（ゲル電気泳動法により既知量に対して決定されるような）を、付着末端ライゲーションのライゲーション用の、１×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオエリトリトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ７．５）及び１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Roche社製）を含有する２０μｌ反応液中で、およそ１〜３倍過剰量のインサートを用いてライゲーションした。ライゲーションは、１２〜１４℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０１７５】
ライゲーションの結果物及び対応する数のキュベットを、１０分間氷上でインキュベートした。同時に、エレクトロコンピテントな大腸菌を氷上で融解した。２μｌの各ライゲーション反応物をエレクトロコンピテントな細菌に添加し、キュベットに移し、１分間氷上で保管した。エレクトロポレーションは、２．５ｋＶ、２５μＦ、及び２００Ωで実施した。１ｍｌのＳＯＣ培地を用いて室温で直ちにキュベットを洗い流し、３７℃又は３０℃で１時間、２５０ｒｐｍで培養物を振とうした。その後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、及び１７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートに培養物を播き、３７℃又は３０℃で終夜インキュベートした。
【０１７６】
ファージミドベクターを単離し、製造業者のプロトコールに従って宿主細胞へエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、５ｍｌのＳＯＣを添加し、培養物を３７℃で１時間振とうした。その後、１０ｍｌのＳＢ培地／ｃａｒｂを、３７℃で１時間添加した。次に４．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを添加し、各１５ｍｌの培養物に１ｍｌのＶＳＣＭ１３（ヘルパーファージ；１０１３ｐｆｕ／ｍｌ）を添加する前に、培養物をさらに１時間３７℃で振とうした。合計１７０ｍｌのＳＢ培地／ｃａｒｂを培養物に添加し、それを３７℃で２時間振とうした。２８０μｌの５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加し、培養物を３７℃で終夜振とうし続けた。翌朝、培養物を遠心分離にかけ、２５ｍｌのＰＥＧ−８０００（ポリエチレングリコール）／ＮａＣｌを添加して３０分間氷上でインキュベーションすることにより、ファージ上澄みを沈殿させた。ファージを上澄みから遠心分離し、沈殿物を２ｍｌのＴＢＳ／ＢＳＡ１％に再懸濁し、遠心沈降させ、０．２μｍフィルターで滅菌チューブへとろ過した。
【０１７７】
ライブラリーパニング
固定化された抗原（Ｖｉｆ、Ｇｐ４１、インテグラーゼ、ＴＮＦアルファ、ｖＷＦ、Ｄｅｌｔａ４）を使用して、免疫特異的結合についてファージ発現ライブラリーをパニングした。４℃で終夜インキュベーションすることにより、抗原をマイクロタイタープレートに結合させた。その後、３７℃で１時間ＴＢＳ／ＢＳＡ３％を用いてプレートを洗浄及びブロッキングした。５０μｌの新しく調製したファージライブラリーを各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。パニングは、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定化された抗原に対するファージ結合、洗浄、トリプシン処理による溶出（ファージ表面から抗体断片を切り離す）、及び再増幅の数回のラウンドから構成されていた。各ラウンド中に、特異的結合クローンが選択及び増幅された。これらのクローンは、３又は４ラウンド後に圧倒的に多くなった。
【０１７８】
１５０μｌのＴＢＳ／０．５％Tween20でウェルを洗浄した。洗浄ステップは、第１ラウンドの５回から、第２ラウンドでは１０回、第３及び第４ラウンドでは１５回に増加させた。
【０１７９】
さらなるラウンドのパニングが望ましい場合は、２μｌのＥＲ２５３７を用いた接種により調製し、Ｏ．Ｄ＝１まで３７℃で２時間振とうさせてインキュベートした２ｍｌの大腸菌培養液にファージ溶出物を移した。溶出物に曝された培養液を、室温で１５分間インキュベートした。事前に暖めておいた６ｍｌのＳＢ培地／ｃａｒｂを添加し、３７℃で１時間振とうさせ、その後１ｍｌのＶＣＳＭ１３（ヘルパーファージ）及び事前に暖めておいた９１ｍｌのＳＢ培地／ｃａｒｂを添加した。培養液を３７℃で２時間振とうし、その後１４０μｌの５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加し、その後３７℃で終夜振とうした。次のラウンドのパニングを行うために、抗原被覆プレートを記載の通り準備した。その後、第２ラウンドのパニングを、同じプロトコールに従って繰り返した。
【０１８０】
パニング後、抗原被覆プレート（記載の通り準備された）に結合させることにより貯留ファージを試験し、ＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡ（１：２０００）により検出して、単一クローン分析の継続に値するかどうかを評価した。
【０１８１】
ＣＡＴ融合単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
ＣＡＴ遺伝子は、ＰＣＲによりpCAT（Stratagene社製）から増幅し、EcoRI及びSphI制限部位を使用してpET由来のプラスミドに挿入して、pE-CATを生成した。本来は可変ドメインをクローニングするために使用される５’ＰＣＲプライマーも、２つの連続した異なるSfiIクローニング部位、及びＣＡＴ遺伝子の始まりの直前にあるアンバーコドン（ＴＡＧ）を含有するように設計した。ＣＡＴ遺伝子に融合された本発明者らの単一ドメイン抗体ライブラリーをクローニングするためには、ＳＤＶＨ及びＳＤＶＬ断片を、各p-SDVH（ＶＨドメインを発現するプラスミド）及びpSDVL（ＶＬドメインを発現するプラスミド）
ライブラリーベクターから、又はパニングにより選択されたファージミドベクターからＰＣＲにより作製した。その結果生じたＳＤＶＨ及びＳＤＶＬのＰＣＲ断片をゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼSfiIで消化し、SfiIで適切に切断したベクターpE-CATに個別にクローニングした。pSDVH-CAT及びpSDVL-CAT構築体は、Ｎ末端Ｈｉｓｔ６親和性タグ及びアンピシリン耐性遺伝子も含む、強力なＬａｃプロモーターの制御下にある。代替的には、ＳＤＶＨ又はＳＤＶＬ断片は、クローニングされた配列をＣＡＴとの融合タンパク質として発現するように設計されている容易に入手可能なベクター（例えばPCFN1ベクター）に
クローニングすることができる（Maxwell, et al., 1999, J Prot Sci 8:1908-1911を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる；図５）。
【０１８２】
クロラムフェニコール耐性分析
クロラムフェニコール耐性アッセイは、各単一ドメインＣＡＴ融合ライブラリーを用いてＥＲ２７３８細胞（New England Biolabs, Inc社製）を形質転換することにより実施した。形質転換混合物を５ｍＬのＳＯＣに接種し、１時間３７℃でインキュベートした。次に、３μｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを有する１０ｍｌのＳＢ培地を、各ライブラリーに添加した。合計１５ｍｌの各培養物を３７℃で１時間振とうした。続いて、４．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、培養物を３７℃で１時間振とうした。その後、８５μｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを有する８５ｍｌのＳＢ培地を添加し、培養物を３７℃で終夜増殖させた。翌日、６００μｌの各培養物を使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２０ｍｌのＳＢ培地に接種した。ＣＡＴ融合単一ドメインタンパク質の発現は、培養物の光学密度が０．９（６００ｎＭで）に達した時に０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより誘導した。３７℃で２時間のインキュベーション後、１００μｌ等量の各ライブラリーを、ＩＰＴＧ（２００μｇ／ｍｌ）及び種々の濃度のクロラムフェニコールを有する寒天プレートにプレーティングした。プレートを３７Ｃで１６〜２０時間培養した。耐性のレベルは、３７℃でのインキュベーション期間後にコロニーが出現したクロラムフェニコールの最高レベルとして定量化した。
【０１８３】
安定性分析
パニング及び／又はクロラムフェニコール耐性アッセイ（又は両方の組合せ）により選択されたクローンの安定性確認は、加熱又は塩化グアニジウム（ＧｄｍＣｌ）の濃度増加に応答した変性遷移を内部蛍光によりモニターすることにより実施した。発現及び単離されたクローンを、６μＭの濃度に希釈した。内部蛍光は、２８０又は２９５ｎｍの波長で３１０〜４４０ｎｍまで記録された発光スペクトルを用いて決定した。蛍光スペクトルは、溶液の背景蛍光を補正した。図６Ａは、加熱の増加に応答した本発明のＶＬドメインの代表的な変性遷移曲線を描写している。図６Ｂは、ＧｄｍＣｌ濃度の増加に応答した本発明のＶＬドメインの代表的な変性遷移曲線を描写しており、蛍光測定前に、６μＭのタンパク質試料を、各ＧｄｍＣｌ濃度につき２５℃で終夜インキュベートしておいた。
【０１８４】
配列分析
パニング及び／若しくはクロラムフェニコール耐性、又はその両方の組合せにより選択されたベクタークローンを培養物に接種し、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）で培養物を誘導し、結合を試験した。ＤＮＡフィンガープリント法（ＰＣＲによる増幅後の様々なサイズの断片の分析）、及びＰＣＲ産物をコードする抗体断片のAluI分析（幾つかの配列でＤＮＡを消化する酵素）を、クローン中の多様性に対する試験と同時に実施した。その後、選択されたクローンをＤＮＡ配列分析にかけ、さらなる分析のために遺伝子III産物無しで発現させた。
【０１８５】
６．１．２  結果
重鎖可変ドメイン
表３〜６は、安定性アッセイ及び／又はファージパニングを用いた安定性アッセイにより選択されたウサギ重鎖可変ドメインの代表的なフレームワーク配列を表す。選択されたクローンを初期貯留と比べて配列分析することにより、以下の配列が安定性及び／又は親和性の増強を提供することが示された：ＶＨ  ＦＲ１ドメインの場合、QEQLMETESGGGAEGGLVKPGASLTLTCTAS（配列番号５７）；ＶＨ  ＦＲ２ドメインの場合、WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６９）；ＶＨ  ＦＲ３ドメインの場合、YATWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTATYYCAR（配列番号９５）；及びＶＨ  ＦＲ４ドメインの場合、WGQGTLVTVSS（配列番号１３９）。
【０１８６】
さらなる点突然変異研究により、以下のアミノ酸残基の１又は複数の存在が、ＶＨドメインに安定性及び／又は親和性の増強を付与したことが示された：４６位のフェニルアラニン（ＦＲ２ドメイン内）、５３位のグルタミン酸（ＦＲ２ドメイン内）、５４位のアルギニン（ＦＲ２ドメイン内）、５６位のグリシン（ＦＲ２ドメイン内）、５８位のアラニン（ＦＲ２ドメイン内）、及び１２６位のアルギニン（ＦＲ４ドメイン内）。ＣＤＲドメイン内の分析及び点突然変異研究により、４４位のシステイン（最後のＣＤＲ１残基）及び／又は、５９位のシステイン（ＣＤＲ２の最初の残基）の存在が、安定性及び／又は親和性の増強を付与したことも示された。これらのシステインは、ドメインの三次元構造を安定させるように作用すると考えられている。アミノ酸位置は、図３に示されている配列アラインメント内の位置による。
【０１８７】
【表３】
2015012869.tif 000004
2015012869.tif 000005
【０１８８】
【表４】
2015012869.tif 000006
【０１８９】
【表５】
2015012869.tif 000007
2015012869.tif 000008
【０１９０】
【表６】
2015012869.tif 000009
【０１９１】
軽鎖可変ドメイン
表７〜１０は、安定性アッセイ及びファージパニングにより選択されたウサギ軽鎖可変フレームワークドメインの代表的な配列を表す。選択されたクローンを初期貯留と比べて配列分析することにより、以下の配列が安定性及び／又は親和性の増強を提供することが示された：ＶＬ  ＦＲ１ドメインの場合、ELVLTQTPPSLSASVGETVRIRC（配列番号１５０）又はELVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC（配列番号１５５）；ＶＬ  ＦＲ２ドメインの場合、WYQQKPEKPPTLLIS（配列番号１７４）又はWYQQKPGQRPKLLIY（配列番号１８１）；ＶＬ  ＦＲ３ドメインの場合、GVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDVATYYC（配列番号１８３）又はGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC（配列番号２０５）；及びＶＬ  ＦＲ４ドメインの場合、FGAGTNVEIK（配列番号２０６）又はFAFGGGTELEIL（配列番号２１０）。
【０１９２】
さらなる点突然変異研究により、３９位のフェニルアラニン（ＦＲ２ドメイン内）の存在及び／又は４２位のリジン（ＦＲ２ドメイン内）の存在及び／又は９１位のシステイン（最後のＦＲ３残基）の存在は、ＶＬドメインに安定性及び／又は親和性の増強を付与したことが示された。アミノ酸位置は、図４に示された配列アラインメント内の位置による。
【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
【表９】
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【０１９６】
【表１０】
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【配列表】
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