(57)【要約】  本発明は、ウイルス、特に医療(たとえば、ワクチン接種又は遺伝子治療)において使用するためのウイルスの生産のための改良された方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させることを含み、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性である、対象のウイルスを細胞培養において生産するための方法であって、対象のウイルスを含む溶液と感受性の細胞間の接触時間が120分未満である又は120分に等しいことを特徴とする方法。
【請求項２】
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、及び
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ
を含む、対象のウイルスを生産するための方法。
【請求項３】
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、及び任意選択で
d)前記生産されたウイルスを適切な医薬担体と一緒に製剤化するステップ
を含む、医療において使用するための対象のウイルスを生産するための方法。
【請求項４】
対象のウイルスを含む溶液が一つ又は複数の外来性媒介体を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が一つ又は複数の外来性媒介体の感染に感受性である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
a)対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ
を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90％減少している、対象のウイルスを生産するための方法。
【請求項７】
a)対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞の集団から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、
を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体が、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に比べて、複製された対象のウイルスの集団から取り除かれる又は実質的に取り除かれる、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法。
【請求項８】
接触期間が120分未満である又は120分に等しい、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、
を含む、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法。
【請求項１０】
ステップa)における接触時間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを吸着させるのに十分である、請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90％減少している、請求項7又は請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が一つ又は複数の外来性媒介体の感染に感受性である、請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
追加のステップa)において細胞の集団を接触させるための対象のウイルスを含む溶液としてステップc)で得られた複製された対象のウイルスの集団を使用して、a)からc)の一連のステップが少なくとも一回繰り返される、請求項2〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
接触期間が、10秒から120分まで、1分から30分まで、5分から15分までの範囲であり、10分である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、哺乳動物、トリ又は昆虫細胞である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が群:MRC-5、Vero、CHO、FRHL-2、MDCK、PER.C6、EBx(登録商標)細胞及びニワトリ胚線維芽細胞[CEF]から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞がVero細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
対象のウイルスが、弱毒化されたウイルスである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象のウイルスが群:麻疹、ムンプス、風疹、ヒトパピローマウイルス(HPV)、バキュロウイルス、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、E型肝炎(HBV)、デングウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、狂犬病ウイルス、ヒトロタウイルス(HRV)、アデノウイルス又はA型肝炎(HAV)から選択される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象のウイルスがヒトロタウイルス(HRV)、HRVである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
対象のウイルスに、約1、約0.5、約0.1、約0.01、約0.001、約0.0001又は約0.00001の感染多重度(MOI)で細胞を接触させる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
外来性媒介体が、ウイルス、PCV、PCV-1及び/又はPCV-2である、請求項4〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップc)における細胞が、約1から30日間、約2から20日間、約3から9日間、約4から8日間、約5から7日間、又は約5から6日間インキュベートされる、請求項2〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップc)における細胞が、約25℃から約41℃まで、約34℃から40℃まで、35℃から39℃まで、36℃から38℃まで、たとえば、約37℃±1℃の温度でインキュベートされる、請求項2〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
複製された対象のウイルスの集団を収集するステップをさらに含む、請求項2〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
複製された対象のウイルスの集団を清澄化して、細胞片を取り除くステップをさらに含む、請求項2〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
複製された対象のウイルスの集団において対象のウイルスを不活化するステップをさらに含む、請求項2〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
複製された対象のウイルスの集団を、滅菌等級フィルター膜を通して滅菌濾過するステップをさらに含む、請求項2〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法により入手可能なウイルス。
【請求項３０】
請求項29に従って得られるウイルスから生産される免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３１】
医療において使用するための、請求項30に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３２】
疾患又は状態に対するヒトの予防及び/又は処置において使用するための、請求項31に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３３】
ワクチン組成物に外来性媒介体がない又は実質的にない、ウイルスを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【請求項３４】
ウイルスがHRVである、請求項33に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３５】
PCV-1及び/又はPCV-2が実質的にない、請求項33又は34に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３６】
医療において使用するための、請求項33〜35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【請求項３７】
疾患の処置又は予防において使用するための、請求項33〜36のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特に医療(たとえば、ワクチン接種又は遺伝子治療)において使用するためのウイルスの生産のための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスを含む医薬(たとえば、免疫原性組成物又はワクチン)を生産するために最近開発された方法の一つは、細胞培養系、特に哺乳動物細胞培養物に基づく。典型的には、それらの系は、対象のウイルスの細胞への感染並びに細胞内でのウイルスの複製及び生産に十分な時間の後の細胞からの前記ウイルスの精製を含む。細胞上でウイルスを生産する間、他の原料(たとえば、組織培養試薬、安定化剤)は様々な生産段階でウイルスに添加し得る。したがって、外来性媒介体は、潜在的にこれらの成分のいずれかを通してウイルス産物に入り、前記産物を汚染する可能性がある。細胞基質上で生産されるウイルスは特にこの種の汚染を生じやすい。外来性媒介体は、その主成分がウイルスであるが、細胞株などの生体材料を汚染することが知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
第一の態様では、本発明は、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させることを含み、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性である、対象のウイルスを細胞培養において生産するための方法であって、対象のウイルスを含む溶液と感受性の細胞間の接触時間が120分未満である又は120分に等しいことを特徴とする方法を提供する。
【０００４】
第二の態様では、本発明は、
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、及び
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ
を含む、対象のウイルスを生産するための方法を提供する。
【０００５】
第三の態様では、本発明は、
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、及び任意選択で
d)前記生産されたウイルスを適切な医薬担体と一緒に製剤化するステップ
を含む、医療において使用するための対象のウイルスを生産するための方法を提供する。
【０００６】
第四の態様では、本発明は、
a)対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ
を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90％減少している、対象のウイルスを生産するための方法を提供する。
【０００７】
第五の態様では、本発明は、
i)対象のウイルス及び一つ又は複数の外来性媒介体を含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種するステップ、
ii)前記接種された細胞をインキュベートするステップ、並びに
iii)接種後120分未満の後に前記接種された細胞培養物を洗浄するステップ、
を含む、対象のウイルスの複製中に外来性媒介体の発生を取り除く及び/又は減少させるための方法を提供する。
【０００８】
追加の態様では、本発明は、
a)約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスによる感染に感受性であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、
を含む、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法を提供する。
【０００９】
さらに追加の態様では、本発明は、
a)対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、
b)対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞の集団から取り除くステップ、
c)前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、
を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体が、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に比べて、複製された対象のウイルスの集団から取り除かれる又は実質的に取り除かれる、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、本発明の方法によって入手可能なリサーチウイルス種子(research viral seed)、マスターウイルス種子(master viral seed)及び/又はワーキングウイルス種子(working viral seed)並びに本発明のウイルス種子から生産される免疫原性組成物又はワクチンも提供する。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載される方法のいずれによっても入手可能なウイルス懸濁液又はウイルス調製物、前記懸濁液又は調製物を含むワクチン/免疫原性組成物、並びに医療、特に疾患の予防及び/又は処置におけるその使用も提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ウイルスは様々な物理化学的な特性を示し、したがって、物理的又は化学的処置に対するその感受性は異なる。典型的には、エンベロープウイルス(enveloped viruses)は非エンベロープウイルスほど抵抗力がなく、溶剤がオルトミクソウイルス科(orthomyxoviridae)又はパラミクソウイルス科(paramyxoviridae)などのエンベロープウイルスを破壊することができることは周知である。
【００１３】
医療において使用するのに適切なウイルス培養物から、汚染する外来性媒介体、特に外来性ウイルスを除去する方法は、特に外来性ウイルスが対象のウイルスよりも物理化学的処置に対して抵抗力が大きい場合には、明確にするのが困難であることが多くあり得る。対象のウイルス及び外来性ウイルスが同一細胞培養で複製することができる場合は、外来性ウイルスの発生を取り除く及び/又は減少させるための方法はさらに限定される。どんな外来性媒介体でも取り除く古典的方法は、エンドポイント希釈により対象のウイルス(たとえば、ワクチンウイルス)をクローン化することである。外来性ウイルスのアンチウイルス又は阻害剤は、既知である場合には使用することが可能であるが、対象のウイルスへの影響は一般的に未知である。対象のウイルスの複製へのいかなる干渉をも回避する及び/若しくは減少させるために、対象のウイルスを生産するのに使用される細胞から、存在する場合には、外来性媒介体を取り除くこと、又は対象のウイルスの増殖及び生産から生じるウイルス懸濁液から外来性媒介体を取り除くことが極めて望ましい。
【００１４】
ワクチンなどの免疫原性組成物及び/又は遺伝子治療における使用に適しているウイルスは、ウイルスを複製させる、すなわち、細胞がウイルスに感受性である細胞培養物において増殖される。外来性媒介体は、細胞培養物、前記細胞に接種するのに使用される対象のウイルス接種材料並びにウイルス複製及び生産の間に使用される試薬(たとえば、培地)のいずれをも汚染することが可能である。一部の汚染物質は無害なこともあるが、外来性媒介体は、ワクチン及び/又は遺伝子治療において使用される対象のウイルスの増殖を妨げることがあるために、その発生又は存在を取り除く又は実質的に減少させることが特に望ましい。同様に、安全上の理由及び健康規制事項のために、ウイルスを含むワクチンなどの最終産物をどんな外来性媒介体汚染もない、又は実質的にないようにすることが好ましい。したがって、細胞培養でウイルスを生産する際に外来性媒介体を取り除くための方法を提供することが本発明の目的である。
【００１５】
本発明者(ら)は、感受性細胞培養物における対象のウイルスの複製/増幅及び生産中に外来性媒介体の発生又は存在を取り除く及び/又は減少させるための手段を実証した。驚くべきことに、本発明者らは、感受性細胞と、対象のウイルスを含む溶液との間の接触時間を減らすと、外来性媒介体がない又は実質的にない対象のウイルスが生産されることを観察した。
【００１６】
用語「接触時間」は当技術分野では周知であり、本明細書で使用されるように、接種後にウイルス接種材料を細胞に接触したままにしておく期間、すなわち、洗浄する(すなわち、細胞に接触している培地をウイルス無しの培地で必要に応じて一、二、三、四、五又はそれよりも多い回数取り換える)ことによりウイルス接種材料が取り除かれる又は実質的に取り除かれる前の期間を意味する。接触時間の減少は、生産される対象のウイルスの種類に応じて変化することがある。たとえば、接触の持続時間は、感受性細胞の少なくとも部分集団にウイルスを吸着させる又は付着させるのに必要な時間と同じ程度に短くてもよい。当業者であれば、所与のウイルスの所与の細胞への付着動態をモニターし、したがって、最適なウイルス接触時間を決定することができる。ウイルス接触時間の最大持続時間は、外来性媒介体の量を、対象のウイルス接種材料中で検出可能な場合には、本発明の方法に従って得られる対象のウイルス調製物において少なくとも50％、適切には90％、さらに適切には95％及び99％又は99.9％さえも減少させるように決定してもよい。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法において、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に感受性細胞を接触させ、接触期間は、細胞の集団の少なくとも部分集団に対象のウイルスを感染させる、特に少なくとも吸着させるのに十分であり、前記外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルスを含む溶液中に最初に存在するレベルに比べて、生産された対象のウイルスの調製物において少なくとも90％、適切には少なくとも99％、さらに適切には99.9％減少している。
【００１７】
本発明の方法における適切な接触時間は、120分未満である又は120分に等しく、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分、約1分未満、又は45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までである。本発明の特定の実施形態では、接触時間は少なくとも10秒である。追加の実施形態では、接触時間は約45分未満、特に約35分未満、たとえば、約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までである。したがって、本発明の特定の実施形態では、ウイルス接触材料又はウイルス溶液は、本明細書に記載される方法において、10秒から120分まで、1分から30分まで、5分から15分までの範囲、特に10分間の期間感受性細胞に接触させる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「発生を減少させる」は、生産されるウイルス懸濁液、ウイルス種子及び/又は調製物が、(i)接種材料が取り除かれ洗い流されることがない若しくは接触時間が本発明の方法の接触時間よりも多い、特に120分よりも長い方法を用いて調製される場合よりも少ない外来性媒介体、すなわち、DNA、RNA及び/若しくは感染性外来性粒子、又は(ii)細胞に接種する及び感染するのに使用されるウイルス種子若しくはウイルス調製物に最初に存在するよりも少ない外来性媒介体、すなわち、DNA、RNA及び/若しくは感染性外来性粒子を含むことを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される用語「外来性媒介体を取り除く」は、本発明の方法に従って生産されるウイルス懸濁液、ウイルス種子及び/又は調製物に、ウイルス接種材料に存在していた一つ又は複数の外来性媒介体がない、又は実質的にないことを意味する。本明細書で使用される用語「実質的にない」は、ミリリットル(ml)あたり検出可能な外来性媒介体(すなわち、DNA、RNA及び/又は感染性外来性粒子)が106、105、104、103、102、101未満である又はまったくないことを意味する。特に、本発明の方法に従って入手可能である対象のウイルス、たとえば、ロタウイルスの調製物は、104未満、適切には103未満、さらに適切には102未満、又は101未満のPCV-1などの外来性媒介体のDNAコピー/mlを含む。用語「外来性媒介体を取り除く」は、本発明の方法に従って生産されるウイルス懸濁液が、細胞に接種する及び感染するのに使用される対象のウイルス種子又はウイルスの調製物に最初に存在する量よりも少なくとも90％少ない、適切には少なくとも95％少ない、さらに適切には少なくとも99％少ない、及び少なくとも99.9％さえ少ない外来性媒介体を含むことを意味してもよい。
【００２０】
本明細書で使用される用語「洗浄する」は、たとえば、細胞に感染する前などの培養培地であれ、細胞に感染するのに使用される対象のウイルス接種材料などのウイルス含有溶液であれ、溶液又はその溶液の実質的にすべてを取り除き、前記溶液を培養培地などのウイルスがない培地で置き換えることを意味し、ウイルスのない培地は実質的に取り除かれ、必要に応じて、一、二、三、四、五又はそれよりも多い回数新鮮なウイルスのない培地で置き換えられてもよい。したがって、本発明の一部の実施形態では、ウイルス溶液を取り除いた後、細胞はさらにインキュベートして複製された対象のウイルスの集団を生産する前に、少なくとも一回、適切には二回洗浄される。
【００２１】
そのもっとも広い意味での「ウイルス種子」は、細胞上でウイルスを複製させ増殖させるために、接種することにより細胞に感染させるのに使用される任意のウイルス溶液又はウイルス懸濁液又はウイルス調製物として理解されるべきである。ウイルス種子は、その接種材料が細胞に接種するために使用されるウイルス接種材料と呼ぶことも可能である。たとえば、ワクチン製造を考慮する場合、用語「ウイルス種子」は、そこからワクチン及び/又は遺伝子治療において使用するためのそれに続くすべてのウイルスが生産されるウイルス調製物として理解し得る。ウイルス種子の起源は公知であり、ウイルスが受けた継代数は明確にされている。本発明の目的のために、用語「ウイルス種子」は、リサーチ種子、マスター種子及びワーキング種子を包含し、したがって本発明はいかなるウイルス種子でも生産するのに適している。マスター種子は、起源種子に由来する既知の継代数の同種ウイルス調製物である。リサーチ種子は、起源種子由来であって、マスター種子の一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数継代が少ない任意のウイルス調製物である。ワーキング種子は、マスター種子に由来し、典型的には一継代差であるが、マスター種子よりも二、三、四、五又はそれよりも多い回数継代されていてもよいウイルス調製物である。ウイルス種子は一般的には、使用されるまで滅菌ポリエチレンバイアル中に、たとえば、約-40℃から約-70℃及び-196℃までで凍結保存される。本発明に従った方法は、いかなる種類のウイルス種子をも含むいかなる種類のウイルス調製物の生産にも適用可能である。
【００２２】
用語「感染」は当技術分野では周知である。しかし、明確にするために、「感染」は、少なくとも、細胞上へのウイルスの吸着又は付着、細胞内へのウイルスの侵入若しくは浸透、及びおそらくウイルスの複製、及びさらに細胞に感染することができる新たに形成されたウイルス粒子の放出のステップを包含する。
【００２３】
本明細書で使用される用語「外来性媒介体」は、たとえば、ワクチンに封入するためのウイルスなどの目的の産物にとって外来性である任意の病原体を意味する。本明細書に記載される外来性媒介体は当業者には公知のいかなる手段によっても検出することが可能である。当業者に利用できる方法には、免疫学的アッセイ(たとえば、酵素結合免疫吸着測定法[ELISA]及びウェスタンブロット)、核酸法(たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、定量的PCR[Q-PCR]サザンブロット、逆転写酵素PCR[RT-PCR]、RT-Q-PCR等)並びに/又は力価測定(titration)及び/若しくは感染性アッセイが含まれるが、これらに限定されない。多くの外来性媒介体を検出する方法は、WO2006/027698(米国特許出願公開第2009081252A1号)に開示されている。ブタサーコウイルス(porcine circovirus、PCV)、サルレトロウイルス(simian retrovirus、SRV)、トリ白血病ウイルス(avian leukosisvirus、ALV)及び内在性トリウイルス(endogenous avian virus、AEV)を含むワクチンに見出される外来性ウイルスを検出する方法は、Victoria JG et al.、2010 (Journal of Virology 84(12): 6033〜6040)に開示されている。PCVを検出するための方法はOuardani M et al., 2000 (Journal of Clinical Microbiology 38(4):1707)にも開示されている。
【００２４】
外来性媒介体の発生を取り除く及び/又は減少させるための方法は、ウイルス/ウイルス種子の生産に特に有用である。さらに、本発明の方法（the processes and methods of the invention）は、任意の未知の外来性媒介体によるいかなる汚染に対しても防御手段として日常的に用い得る。したがって、本発明の方法は、検出可能な外来性媒介体がない又は既知の外来性媒介体がない場合でも用い得ることが想定されている。したがって、感受性細胞をウイルス懸濁液に接触させることにより感受性細胞に接種することを含み、ウイルス懸濁液と感受性細胞間の接触時間が120分未満である、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分未満、又は約5分、約1分未満、又は45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までであることを特徴とする、ウイルス(特に、ウイルス種子)を生産するための方法が提供される。
【００２５】
本発明の追加の実施形態では、
i)ウイルスを含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種し、前記接種された細胞をインキュベートするステップ、
ii)接種後120分未満、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分、約1分未満、又は接種後45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までの前記接種された細胞を洗浄するステップ
を含む、ウイルス種子を生産するための方法が提供される。
【００２６】
本発明は、たとえば、ワクチン/免疫原性組成物及び/又は遺伝子治療において使用するためのウイルスの生産において、一つ又は複数の外来性媒介体を減少させる及び/又は取り除くことが望ましい場合に、ウイルスの生産においても有用である。
【００２７】
したがって、本発明の追加の実施形態では、ウイルス接種材料又はウイルス調製物に感受性細胞を接触させることにより感受性細胞に接種することを含み、ウイルス接種材料又はウイルス調製物と感受性細胞間の接触時間が120分未満である、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分未満、又は約1分未満、たとえば、約1から約120分まで、約1分から90分まで、約1から約90分まで、約1から約60分まで、約1から約45分まで、約1から約30分まで、約1から約25分まで、約1から約20分まで、約1から約15分まで、約1から約10分まで、約1から約5分まで、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20分であることを特徴とする、医療において(特に、ワクチン及び/又は遺伝子治療において)使用するためのウイルスを生産するための方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、
(i)ウイルスを含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種し、前記接種された細胞をインキュベートするステップ、
(ii)接種後120分未満、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分未満、又は約5分、約1分未満、又は接種後45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までの前記接種された細胞を洗浄するステップ
を含む、医療(特に、ワクチン及び/又は遺伝子治療)において使用するためのウイルスを複製するための方法が提供される。
【００２９】
外来性媒介体汚染は、種々の源から、たとえば、ウイルスが複製し生産される細胞から、細胞に感染させるのに使用されるウイルス接種材料から(すなわち、前記ウイルスの源は汚染された又はその後に汚染されてしまった)又は細胞培養及び/若しくはウイルス複製中に使用される培地/試薬から生じ得る。一実施形態では、ウイルス接種材料又は対象のウイルス溶液が一つ又は複数の外来性媒介体を含む本発明の方法が提供される。
【００３０】
本発明の方法の一目的は、外来性媒介体の発生/存在を減少させる及び/又は取り除くことである。用語「外来性媒介体」は当技術分野では周知であり、本明細書で使用されるように、たとえば、ワクチン及び/又は遺伝子治療において使用するために生産されることを意図している対象のウイルス以外のウイルスなどの任意の外来性の汚染する感染性作用物質を意味する。したがって、本発明の目的のために、その中に開示されている方法により生産されることを意図しているウイルスは「対象のウイルス」と呼ばれ、本発明の方法により取り除かれる又は減少されることを意図している望ましくない汚染する外来性ウイルスは「外来性ウイルス」と呼ばれる。たとえば、一実施形態では、インフルエンザウイルスは複製されることを意図している対象のウイルスであるが、別の実施形態ではインフルエンザウイルスは、生産されることを意図している対象のウイルスが異なるウイルス、たとえば、麻疹ウイルス(measles virus)である場合には外来性ウイルスとなり得る。したがって、本発明は、外来性媒介体が外来性ウイルスである、本明細書に定義される方法を提供する。外来性ウイルスは本明細書に記載されるいかなるウイルスでもあり得る。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、外来性ウイルスは、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、レオウイルス科(Reoviridae)、ビルナウイルス科(Birnaviridae)(たとえば、ガンボロウイルス(gumboro virus))、パルボウイルス科(Parvoviridae)、サーコウイルス科(Circoviridiae)、アデノウイルス科(Adenoviridae)(たとえば、ヒト又はサルアデノウイルス(adenovirus)などのアデノウイルス)又はポリオーマウイルス科(Polyomaviridae)などの非エンベロープウイルスである。
【００３２】
他の外来性ウイルスには、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)(たとえば、単純ヘルペス1(Herpes simplex 1)及び単純ヘルペス2(Herpes simplex 2))、パラインフルエンザウイルス(Parainfluenza viruses、PIV)たとえば、PIV-1、PIV-2及びPIV-3、SARSコロナウイルスなどのコロナウイルス科(Coronaviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae family)のエンテロウイルス(たとえば、コクサッキーウイルス(Coxsackie viruses)又はエコーウイルス(echoviruses))、ライノウイルス(Rhinoviruses)、ニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)、モルビリウイルス(Morbilliviruses)又はパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)が含まれる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、外来性ウイルスは、霊長類、たとえばヒトにおいて複製し及び/又は疾患を引き起こすことがないウイルスである。本発明の特定の実施形態では、外来性媒介体は、ブタサーコウイルス(PCV)であり、本発明の追加の実施形態では、外来性媒介体はブタサーコウイルス1型(PCV-1)及び/又はPCV2型(PCV-2)である。ブタサーコウイルス(PCV)は、非分割型環状ゲノムを有する非エンベロープの一本鎖DNAウイルス(クラスII)であり、ウイルス科サーコウイルス科(Circoviridae)のメンバーである。PCV-2は若い子ブタに、下痢及び体重が増えないことを特徴とする離乳後多臓器発育不良症候群(post-weaning multisystemic wasting syndrome)を引き起こすと考えられている。PCV-1はPCV-2と関係しているが、ブタで疾患を引き起こすとは思われない。PCV-1はヒトでは増殖せず、ヒトで疾病を引き起こすことは知られていない。
【００３４】
PCV-1及び/又はPCV-2はHRV(ヒトロタウイルス)ワクチンにおける外来性媒介体として知られている。したがって、特定の実施形態では、特にワクチンにおける使用のために本発明の方法により生産される対象のウイルスはHRVであり、その外来性媒介体はPCV、特にPCV-1及び/又はPCV-2である。
【００３５】
外来性媒介体は細胞中で又は培養培地において複製することができる場合がある。本発明の特定の実施形態では、対象のウイルスを感染させる細胞は、外来性媒介体が前記細胞由来であれ、ウイルス懸濁液由来であれ、試薬由来であれ、一つ又は複数の外来性媒介体に感受性である。本発明は、細胞が外来性媒介体に感受性である、すなわち前記外来性媒介体(複数可)が細胞内で複製することができる場合には特に有用である。したがって、細胞が一つ又は複数の前記外来性媒介体の感染に感受性である方法(process or method)が提供される。
【００３６】
本明細書で使用される用語「細胞」は、ワクチン及び/又は遺伝子治療において使用するための対象のウイルスの生産のために使用される任意の細胞、すなわち人工的条件下、特にインビトロで維持される細胞を意味する。使用される細胞の種類は生産される対象のウイルスに依存することになる。なぜならば、前記細胞は、生産されるウイルスに感受性でなければならない、すなわち対象のウイルスは前記細胞内で複製することができなければならないからである。当業者であればどの細胞型が特定のウイルスに感受性であるかを知っている。いくつかの細胞型がワクチンに使用するのに適切なウイルスを生産するために使用されており、これらの細胞には、MRC-5、Vero、CHO、FRHL-2、MDCK、PER.C6などの哺乳動物細胞、又はニワトリ胚線維芽細胞[CEF]若しくはEBx(登録商標)細胞などのトリ細胞が含まれる。本発明の一実施形態では、細胞がウイルスワクチンを生産するのに使用される任意の細胞型から選択される本発明の方法が提供される。追加の実施形態では、本発明の方法は、群:MRC-5、Vero、CHO、FRHL-2、MDCK、PER.C6、EBx(登録商標)細胞及びニワトリ胚線維芽細胞[CEF]から選択される細胞を使用する。本発明の特定の実施形態では、細胞はVero細胞である。Vero細胞は、特にHRV及びポリオウイルス(Poliomyelitis virus)に感受性である。一実施形態では、本発明の方法はVero細胞を使用してHRVを生産する。代わりに、Vero細胞を使用してポリオウイルスを生産する。本発明の別の特定の実施形態では、細胞は、WO2008129058又はWO2003076601において製造される又は他の方法で開示される、ニワトリ細胞若しくは細胞株EB14(商標)又はアヒル細胞若しくは細胞株EB24(商標)若しくはEB66(商標)である(Vivalis社により生産される:www.vivalis.comも参照)。MDCK細胞、PER.C6及びEB66(商標)は、特にインフルエンザウイルスの感染に感受性であることが知られている。CEF細胞は、特に麻疹及びムンプス(Mumps)ウイルスの感染に感受性である。
【００３７】
本発明の細胞は典型的にはインビトロで増殖される。細胞は単層の形態で、すなわち容器の表面に付着している又はマイクロキャリアに付着しているなどの培養培地における懸濁液中の支持体に付着しているなどの接着細胞でもよい。好ましいマイクロキャリアは、好ましいCytodex(登録商標)Iなどの架橋されたデキストランを含む合成材料から製造されている。別の実施形態では、細胞は培養培地における懸濁液中に存在していてもよい。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法において使用される細胞は哺乳動物、トリ又は昆虫細胞である。特定の実施形態では、本発明の方法において使用される細胞は哺乳動物由来である(すなわち、細胞は哺乳動物である)。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、アフリカミドリザル(African Green monkey)などの霊長類由来である。
【００３９】
本発明の方法は、特にワクチンの製造において使用されるウイルスを生産するのに使用される。したがって、一実施形態では、対象のウイルスが霊長類、特にヒトに感染する及び/又は霊長類、特にヒトにおいて疾患を引き起こすウイルスである本発明の方法が提供される。本発明の方法により生産され、したがって本発明の方法において使用されるウイルスは弱毒化され得る、すなわちウイルスは生存可能である(すなわち、生きている)が、野生型株と比べて毒性が弱い又は無毒性である。一実施形態では、対象のウイルスが、弱毒化されたウイルスである本発明の方法が提供される。
【００４０】
別の実施形態では、ウイルスは弱毒化されていない。これらの状況では、感染された細胞のインキュベーション(すなわち、ウイルスの複製及び増幅)に続いて、非弱毒化ウイルスは、ワクチンが投与される宿主に前記ウイルスが疾患を引き起こす、たとえば、ポリオウイルスの場合にはその後不活化される(すなわち、死滅される)。いくつかの状況では、生きたウイルスはヒトに疾患を引き起こさず、別の生物に対して免疫応答を誘発するので不活化される必要はない。たとえば、前記免疫応答は関連するウイルス及び病原体に対して防御を生じたか、又は別の実施形態では、前記ウイルスは、前記病原体に対して防御的免疫応答を誘発する異なる病原体由来の一つ又は複数の抗原をコードし得る。
【００４１】
一実施形態では、対象のウイルスが群:麻疹、ムンプス、風疹(rubella)、ヒトパピローマウイルス(human papilloma virus、HPV)、バキュロウイルス(Baculovirus)、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus、VZV)、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス(Epstein bar virus、EBV)、ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency virus、HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、B型肝炎(Hepatitis B、HBV)、C型肝炎(Hepatitis C、HCV)、E型肝炎ウイルス(Hepatitis E、HBV)、デングウイルス(Dengue virus)、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus、CMV)、呼吸器多核体ウイルス(respiratory syncytial virus、RSV)、狂犬病ウイルス(rabies virus)、ヒトロタウイルス(human rotavirus、HRV)、アデノウイルス又はA型肝炎(Hepatitis A、HAV)から選択される、本発明の方法が提供される。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、ウイルスはヒトロタウイルス(HRV)である。ヒトロタウイルスは幼児及び小児に重度の下痢を引き起こし、レオウイルス科由来の二本鎖RNAウイルスである。5種類のロタウイルス、A、B、C、D及びEがあり、そのうちのAがもっとも一般的にヒトに感染する。
【００４３】
HRV種Aは血清型により特徴付けることが可能である。糖タンパク質VP7はG型を定義し、プロテアーゼ感受性タンパク質VP4はP型を定義する。株は一般にそのG血清型特異性(たとえば、血清型G1からG4及びG9)によって示され、P型はP血清型を表す数と文字により及び対応するP遺伝子型を表す角括弧内の数字により示される。本発明の特定の実施形態では、選択されるロタウイルスはHRV Aである。追加の実施形態では、HRVは血清型G1、G2、G3、G4、G9、P1又はP8を含む群から選択される。追加の実施形態では、本発明の方法により生産される対象のウイルスはG1P[8]型のヒトロタウイルスである。本発明の方法は、たとえば、ヒト、ウシ、及びヒト/ウシリアソータントを含むリアソータントロタウイルスの生産にも適用可能である。したがって、本発明は、その中に開示されている方法に従って細胞に感染するいかなる種類のリアソータントロタウイルスも含む溶液を使用することを企図している。
【００４４】
感染多重度(MOI)は対象のウイルス、並びにウイルス接種材料又はウイルス溶液中のいずれの外来性媒介体にも依存することになる。当業者であれば用語「MOI」を完全に理解しているが、明確にするために、MOIは感染時の細胞に対するウイルスの比である。感受性細胞に感染する際に対象のウイルスのMOIの数を増やすと、対象のウイルスの収率が改善される場合がある。しかし、この数を増やすと汚染する外来性媒介体の生産が同時に増加する場合もある。汚染する外来性媒介体のレベルを許容可能なレベルに維持しながら、MOIの数を変化させ、どれだけの数(複数可)が適切な収率の対象のウイルスを与えるのかを決定するのは当業者の能力の範囲内である。本発明の方法に従って生産される対象のウイルスを目的とする適用に応じて、汚染する外来性媒介体の最小及び最大閾値は変化し得る。したがって、MOI数は対象のウイルスの目的の収率に及び汚染する外来性媒介体の望ましいレベルに適応されることになる。一実施形態では、対象のウイルスに約1.0、約0.5、約0.1、約0.01、約0.001、約0.0001又は約0.00001の感染多重度(MOI)で細胞を接触させることにより細胞が適切に感染される本発明の方法が提供される。特定の実施形態では、細胞、特にVero細胞には、おそらくPCV-1で汚染されている、たとえばHRVなどのウイルスを0.1のMOIで接触させる。
【００４５】
ウイルス感染のための温度条件は変化し得る。温度はウイルス型に応じて32℃から39℃まで及び得る。インフルエンザウイルス生産では、細胞培養感染は、生産される株に応じて変化し得る。インフルエンザウイルス感染は適切には、32℃から35℃までの範囲の温度で、適切には33℃で実施される。代わりに、ロタウイルス感染は適切には、37℃で実施される。プロテアーゼ、典型的にはトリプシンを、ウイルス株に応じて細胞培養物に添加し、ウイルス複製及び増殖を最適化してもよい。たとえば、インフルエンザウイルス及びロタウイルス生産は、細胞培養においてトリプシンを使用することにより改善することが可能である。プロテアーゼは培養中の適切であればどの段階でも添加することが可能である。プロテアーゼは、感受性細胞に接触させる対象のウイルスを含む溶液中に及び/又はウイルスに接触させた後に細胞をインキュベートするのに使用される培養培地に添加することが可能である。トリプシンは非動物起源である、すなわち、プロテアーゼが動物源から精製されていないことが適切である。トリプシンは、細菌などの微生物、酵母又は植物において組換え的に生産されるのが適切である。組換えトリプシンの適切な例は、トウモロコシにおいて生産される組換えトリプシンであるTrypzean(Prodigen、101 Gateway Blvd、Suite 100 College Station、Texas 77845. Manufacturer code :TRY)、又は真菌において発現されるトリプシン様酵素であるTrpLE(Invitrogen)(WO2004/020612)である。代わりに、トリプシンは動物起源である、適切にはブタ起源であることが可能である。非限定的例として、上記に従って添加されるトリプシンの適切な濃度は5μg/mlから25μg/mlまでの範囲であり、適切には7.5μg/ml又は15μg/mlである。
【００４６】
本発明の追加の実施形態では、ウイルスに接触させた細胞をインキュベートして複製された対象のウイルスの集団を生産させるステップをさらに含む、本明細書で定義される方法が提供される。接触させた細胞は、ウイルス複製及び生産に適している条件下でインキュベートされる。温度は生産されるウイルスに従って変化し得る。したがって、本発明の一実施形態では、対象のウイルスを含む溶液に接触させた細胞が、たとえば、25℃から41℃までなどの25℃よりは高く、適切には41℃よりも低い、たとえば、34℃から40℃までの、35℃から39℃までの、36℃から38℃までの、たとえば、約37℃±1℃の温度でインキュベートされる、本発明の方法が提供される。
【００４７】
本発明のさらに追加の実施形態では、複製された対象のウイルスの集団を収集するステップをさらに含む、本明細書で定義される方法が提供される。細胞は、感染されると、受動的溶解とも呼ばれる宿主細胞の自然溶解のせいで、又は出芽現象のせいで、新たに複製し形成されるウイルス粒子を培養培地中に放出し得る。したがって、生産された対象のウイルスを収集する考えうる一つの方法は、ウイルス含有培養培地を収集することである。代わりに、ウイルス感染後、生産された対象のウイルスは、能動的溶解とも呼ばれる、細胞を溶解する外部因子を用いることにより収穫し得る。能動的細胞溶解のために使用することができる方法は公知である。この点に関して有用な方法は、たとえば、凍結融解、固体剪断、高張性及び/若しくは低張性溶解、液体剪断、高圧押出し、界面活性剤溶解、又はその任意の組合せである。ウイルス含有培養培地の収集と細胞の溶解を組み合わせて、本発明の方法に従って生産される対象のウイルスを収穫してもよい。
【００４８】
ウイルスを収集する前のインキュベーションの持続時間は、生産される対象のウイルスに依存する。たとえば、インキュベーションの持続時間は約1日から約30日まででもよい。特定の実施形態では、対象のウイルスに接触させた細胞が約2日から10日、たとえば、3日から9日、4日から8日、5日から7日、又は5日から6日間インキュベートされる本発明の方法が提供される。生産されたウイルスを収穫する最適時間は通常、感染ピークの決定に基づいている。たとえば、対象のウイルスが細胞変性である、すなわち感染後に細胞の自然溶解を誘発する場合、CPE(細胞変性効果)は、細胞円形化(cell rounding)、方向性の喪失(disorientation)、膨化若しくは収縮、死、表面からの脱離を含む、ウイルス接種後の細胞において起きる形態学的変化をモニターすることにより測定することが可能である。特定のウイルス抗原の検出は、ウェスタンブロット解析などのタンパク質検出の標準技法によってもモニターし得る。次に、収穫物は目的の検出レベルに到達した時に収集することが可能である。抗原の含有量も、当業者にはよく知られている技法であるSRDアッセイ(Wood, JM、et al. (1977). J. Biol. Standard. 5、237〜247)により、ウイルスによる細胞接種後いつでもモニターし得る。この技法は、インフルエンザウイルスのHA含有量を決定するのに特に適している。代わりに、対象のウイルスの生産又は収率は、細胞の50％に感染することができるウイルスの量を表す細胞培養感染量(CCID50/ml)を測定することにより解析することが可能である。試験される感染性ウイルス試料の一連の連続希釈を実施し、各希釈物の一部が感受性細胞に接種するのに使用される。ウイルスが複製することができるように数日間細胞をインキュベートした後、ウイルスの存在は、当業者には公知である二つの読取り方法、すなわち、細胞における細胞変性効果(CPE)の解析及び/又は培養液上清で実施されるニワトリ赤血球を用いた血液凝集アッセイにより検出し得る。次に、ウイルス力価はリードミュンヒ法に従って計算される(Reed, L.J. and Muench, H.、1938、The American Journal of Hygiene 27: 493〜497
)。一実施形態では、対象のウイルスに接触させた細胞は6日間又は7日間インキュベートされ、その後ウイルスは細胞培養培地を収集することによりおそらく収穫される本発明の方法が提供される。
【００４９】
方法に応じて、インキュベーションに続いて、ウイルス懸濁液はウイルス種子(リサーチ、マスター種子又はワーキング種子)として使用してもよいし、又はワクチンを生産するのに直接使用してもよい。ウイルス懸濁液をもっと後の日付で使用するつもりであれば、ウイルスは、ウイルスの生存率を維持するいかなる条件下でも凍結してよい。特に、ウイルスは約-(マイナス)40℃から約-70℃までの温度、たとえば約-45℃、約-60℃、約-70℃で又は約-196℃で保存し得る。したがって、一実施形態では、ウイルス懸濁液を凍結するステップをさらに含む本発明の方法が提供される。
【００５０】
細胞培養でのその生産に加えて、対象のウイルスは任意選択で精製することが可能である。一つ又は複数の精製ステップは、当技術分野で公知であるが、本発明の方法中に実行することが可能である。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、そこに記載される方法は、清澄化、限外濾過/ダイアフィルトレーション、密度、特にショ糖密度勾配超遠心分離などの超遠心分離及びクロマトグラフィー、又はその任意の組合せから選択される少なくとも一つのステップを含む。望まれる純度レベルに応じて、上記ステップはいかなる形でも組合せ得る。特定の実施形態では、複製された対象のウイルスの集団又は細胞培養で生産されるウイルス懸濁液を清澄化して細胞片を取り除くステップをさらに含む本発明の方法が提供される。本明細書で使用される用語「清澄化する」は、無傷の浮遊する細胞及び/又は細胞片などの細胞性物質からウイルスを分離することを意味する。ウイルス懸濁液は、濾過(たとえば、0.5μmフィルター膜を用いて)又はマイクロフィルター法を含むがこれらに限定されない当業者には公知のいかなる手段によっても清澄化することができる。適切な代わりの清澄化手段は遠心分離である。特に、本発明の方法に従って得られるウイルス懸濁液は、約1000rpmで、たとえば10分間などの数分間遠心分離される。
【００５１】
本発明のウイルス懸濁液は、清澄化する前に凍結してもよく、したがって、一実施形態では、ウイルス懸濁液が凍結される本明細書で定義される方法が提供される。ウイルスは、ウイルスの生存率を維持するいかなる条件下でも凍結し得る。特に、ウイルスは約-(マイナス)40℃から約-70℃までの温度で、たとえば約-45℃、約-60℃又は約-70℃で保存し得る。
【００５２】
ウイルスが清澄化に先立って凍結される場合、ウイルス懸濁液は清澄化に先立って解凍/除霜する必要がある。一実施形態では、凍結されたウイルス懸濁液を解凍し次にウイルス懸濁液を清澄化して細胞片を取り除くステップをさらに含む本発明の方法が提供される。
【００５３】
細胞に由来するDNAを取り除くためには、ウイルス懸濁液は、Benzonase(商標)を含むが、これに限定されない当業者には公知のヌクレアーゼで処理し得る。したがって、たとえばBenzonase(商標)を使用して、ウイルス懸濁液を処理し細胞由来のDNAを取り除く本発明の方法が提供される。
【００５４】
本発明の方法により生産されるウイルス懸濁液又は複製された対象のウイルスの集団は、たとえば、ワクチン接種に適した容量に製剤化するために又は細胞を接種に適した容量に再懸濁することができるように、濃縮を必要とする場合がある、すなわち、ウイルスを懸濁させる液体の容量を減らす必要がある場合がある。したがって、追加の実施形態では、本発明の方法により生産されるウイルス懸濁液は、限外濾過を含むがこれに限定されない当業者には公知の手段により濃縮し得る。
【００５５】
ウイルスが弱毒化されず宿主において疾患を引き起こす本発明の実施形態では、ウイルスが防御的免疫応答を誘発するが、前記ウイルスが投与された宿主において疾患を引き起こさないように、ウイルスを不活化する必要がある。したがって、本発明は、ウイルスを不活化するステップを含む本発明の方法を提供する。不活化の方法は当業者には公知である。本発明の特定の実施形態では、ウイルス(たとえば、インフルエンザウイルス)は、「スプリッティング(splitting)」、すなわち、界面活性剤を使用してウイルスを破壊しウイルス断片を作り出すことにより不活化される。代わりに、又はさらに、本発明の方法に従って得られる対象のウイルスは、ベータプロピオラクトン(BPL)若しくはホルムアルデヒドを使用するなどの化学的処理、及び紫外線照射などの物理的処理、又はその両方の組合せにより不活化することが可能である。
【００５６】
細菌などのより大きな外来性媒介体を本明細書で定義されるウイルス懸濁液から取り除くために、ウイルス懸濁液は滅菌濾過され得る。したがって、追加の実施形態では、滅菌等級フィルター膜を通してウイルス懸濁液を滅菌濾過するステップをさらに含む本明細書で定義される方法が提供される。滅菌濾過するのに適切な手段は当業者には周知である。滅菌濾過は滅菌等級フィルター膜を使用して実施される。滅菌等級フィルター膜は、有効濾過面積の1×107/cm2よりも大きな又は1×107/cm2に等しいチャレンジレベルで微生物により攻撃された後に滅菌流出液を作り出すフィルター膜である。滅菌等級フィルターは当業者には周知であり、約0.2μmの孔径を有し、したがって約0.22μmの孔径のフィルターを含む。
【００５７】
本発明の追加の実施形態では、本明細書で定義される方法により生産されるウイルス懸濁液は、一つ又は複数のフィルター(たとえば、滅菌等級フィルター)を通してウイルス懸濁液を濾過するステップをさらに含む。本発明の特定の実施形態では、ウイルス懸濁液が約0.5μm(たとえば、0.4μmから0.6μm)の孔径のフィルターを通して、続いて滅菌等級フィルター(たとえば、約0.2μm又は0.22μm)を通して濾過される本明細書で定義される方法が提供される。
【００５８】
本発明の方法のステップのいずれも、たとえば一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数繰り返してよい。本発明の意味で、本発明の方法のa)からc)の一連の連続するステップは、「ウイルス継代」とも呼ばれる。たとえば、特定の実施形態では、ウイルスが一、二、三、四、五又はそれよりも多い回数継代される本発明の方法が提供される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスは、a)からc)の最初の一連のステップに加えて一回又は二回さらに継代される。したがって、特定の実施形態では、a)からc)の一連のステップが、追加のステップa)において細胞の集団を接触させるための対象のウイルスを含む溶液として、ステップc)で得られる複製された対象のウイルスの集団を使用して、少なくとも一回繰り返される本発明の方法が提供される。適切には、a)からc)の一連のステップは一回よりも多い、たとえば、一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数繰り返される。本発明の方法のa)からc)のステップを繰り返すことによって、ウイルスを二回又は三回などの一回よりも多く継代すると、特に汚染する外来性媒介体の存在をさらに減少させることが可能である。
【００５９】
本発明の方法により生産される又は一回継代された複製された対象のウイルスの集団は、追加のウイルス継代を受ける前に、任意選択で保存する(たとえば、-70℃で凍結する)ことが可能である。特定の実施形態では、第一の継代に続いて生産されるウイルス懸濁液が新たな細胞に感染させるのに使用される前に任意選択で保存される(たとえば、-70℃で凍結される)、二回目の継代をウイルスは受ける。
【００６０】
本発明の方法により、一つ又は複数の外来性媒介体の発生が減少している又は、存在が減少している及び/若しくは非存在である、ウイルス種子などのウイルス懸濁液又はウイルス調製物が得られる。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明に従ってウイルスを生産するための方法のいずれによっても入手可能なウイルス種子などのウイルス調製物が提供される。追加の実施形態では、本発明の方法のいずれによっても入手可能なウイルス種子などのウイルス調製物から生産される及び/又は由来するワクチンなどの免疫原性組成物が提供される。
【００６１】
本発明の方法により生産されるウイルス種子などのウイルス調製物により作られる又は由来するワクチン又は免疫原性組成物は、一つ又は複数のウイルスを含み得る。本発明の特定の実施形態では、ウイルスがHRVである、ウイルスを生産するための方法のいずれによっても入手可能なウイルス懸濁液から生産される及び/又は由来するワクチンが提供される。
【００６２】
本発明の特定の実施形態では、組成物又はワクチンに外来性媒介体が実質的にない、ウイルスを含むワクチンなどの免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、外来性媒介体が実質的にない組成物又はワクチンはHRVを含む。さらに具体的な実施形態では、組成物又はワクチンにPCV-1及び/又はPCV-2が実質的にない、HRVを含む免疫原性組成物又はワクチンが提供される。
【００６３】
同様に、本発明の方法は、ワクチン接種及び/又は遺伝子治療において使用するためのウイルスを生産するために使用することができ、したがってそれにより、本発明は、本明細書で定義される方法のいずれによっても入手可能なウイルス及び/又はウイルス懸濁液も提供する。
【００６４】
ワクチン又は免疫原性組成物は、本発明の方法によって生産されるワクチンにおいて使用するための一つ又は複数のウイルスを含み得る。本発明の特定の実施形態では、ウイルスがHRVである本発明の方法により生産される対象のウイルスを含むワクチンが提供される。
【００６５】
本発明のHRVワクチンはHRVの一つよりも多い血清型を含み得、本発明の特定の実施形態では、HRVワクチンは五つ又はそれよりも多いHRV血清型(特に、G1、G2、G3、G4、G9、P1又はP8)を含む。ロタウイルス又はその抗原は、ヒト、ウシ又はヒト/ウシリアソータントなどのリアソータントであることが可能である。代わりに、本発明のロタウイルスワクチンは、任意選択で弱毒化されているG1P[8]株を含む。
【００６６】
本発明の追加の実施形態では、外来性媒介体がない又は実質的にないウイルスを含む免疫原性組成物又はワクチンが提供される。別の実施形態では、外来性媒介体がない又は実質的にない本明細書で定義されるHRVワクチンが提供される。本発明の特定の実施形態では、PCV-1及び/又はPCV-2が実質的にない本明細書で定義されるHRVワクチンが提供される。
【００６７】
本発明の追加の実施形態では、本明細書で定義される一つ又は複数のウイルスを含むワクチンが提供される。本発明の特定の実施形態では、ワクチンは麻疹、ムンプス、風疹、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)又はその任意の組合せを含む。別の特定の実施形態では、ワクチンはインフルエンザウイルスを含む。
【００６８】
一つ又は複数のウイルスを含む本発明の免疫原性組成物又はワクチンでは、前記ウイルスのうちの一つ、いくつか(たとえば、二、三又は四)又はすべては本発明の方法により生産され得、一部のウイルスは他の方法により生産され得る。各ウイルスは別々に生産され最終ワクチン製剤に組み合わされることが想定されている。
【００６９】
追加の実施形態では、一つ又は複数の対象のウイルス(たとえば、不活化されたポリオウイルス)及び一つ若しくは複数の細菌由来の一つ若しくは複数の抗原、たとえば、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)、破傷風トキソイド(tetanus toxoid)、百日咳トキソイド(pertussis toxoid)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)多糖類、又はナイセリア(Neisseria)(たとえば、髄膜炎菌(N. meningitidis))由来の抗原又はそれらの組合せを含むワクチンが提供される。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は水銀物質(たとえば、チオメルサール)及び/又は動物由来産物(たとえば、血清、特にウシ由来血清)を含まない。
【００７１】
本明細書に記載される本発明のワクチン及び/又は免疫原性組成物は、ミョウバン(たとえば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又はその組合せ)などの一つ又は複数のアジュバント、Toll様受容体リガンド(たとえば、3D-MPLなどのTLR4リガンド又はCpGオリゴヌクレオチドなどのTLR9リガンド)、サポニン(たとえば、QS21)、リポソーム、水中油型乳剤(たとえば、AS03又はMF59)、又はそれらの組合せをさらに含み得る。
【００７２】
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、医療において使用するのに、特に哺乳動物(特に、ヒト)における疾患の予防及び/又は処置で使用するのに適している。したがって、一実施形態では、医療において使用するための本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物が提供される。追加の実施形態では、疾患又は状態に対する予防及び/又は処置において使用するための本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物が提供される。特に、ワクチンがロタウイルスを含む場合には、前記ワクチンはロタウイルス関連胃腸炎を予防する及び/又は処置するために使用される。
【００７３】
追加の実施形態では、疾患又は状態に対する予防及び/又は処置のための医薬の製造における本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物の使用が提供される。別の実施形態では、本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物を投与するステップを含む処置方法が提供される。
【００７４】
本発明の「ワクチン組成物」又は「ワクチン」に関する本明細書の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、逆もまた同じである。
【００７５】
本明細書の用語「含む(「comprising」、「comprise」及び「comprises」)」は、いかなる場合も、任意選択でそれぞれ用語「からなる(「consisting of」、「consist of」及び「consists of」)」と代用可能であることが発明者らにより意図されている。
【００７６】
数値xに関係する用語「約」はx±5％又は10％を意味する。
【００７７】
用語「実質的に」は「完全に」を排除せず、本発明の定義から省いてもよい。
【００７８】
本発明は、この時点で以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明される。
【実施例１】
【００７９】
プロトコールの要旨
ロタウイルスの大量生産は、さまざまな前培養段階を通じてVero細胞バンクを増殖させることにより実施された。外来性媒介体PCV-1は、DNA、RNA、及び感染性粒子を含むウイルス粒子として、細胞に感染するのに使用されるロタウイルス種子中に存在していた。必要な細胞培養支持体の調製後、細胞をロタウイルス懸濁液に接触させることによりウイルスは増殖及び生産のために接種され、細胞は5日から7日間ウイルスと一緒にインキュベートさせておいた。生産されたウイルスは、上清を収集することにより望ましいインキュベーション時間後に収穫された。収穫されたウイルスは凍結され-70℃で保存された。
【００８０】
1.1  細胞培養物調製
Vero細胞培養物は、増殖培地としてVP-SFM培養培地(Invitrogen、No.11681420)を使用して無血清条件下で調製された。T-175フラスコ(175cm2)又はT-25フラスコ(25cm2)に50,000から100,000細胞/cm2を播種し3日から7日間増殖させた。
【００８１】
1.2  ウイルス調製
必要量のロタウイルス接種材料(ヒトG1P[8]株に由来する)は、攪拌下水浴中37℃で解凍された。次に、ウイルスは、室温で30分間、ブタトリプシン(Sigma)を最終濃度7.5から20μg/mlで補充されたDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)の溶液中で活性化された。活性化後、ウイルス溶液は、10-1、10-3、10-4又は10-5のMOIを目標とするのに必要なウイルス濃度を得るために、最終濃度7.5μg/mlでトリプシンを補充された新鮮なDMEMを添加することにより希釈された。
【００８２】
1.3  ウイルス感染
増殖培地はTフラスコから廃棄され、細胞層は50mlのDMEMで洗浄された。次に、細胞に以下の通りにロタウイルスを感染させた:細胞は、洗浄培地を45mlの上記希釈され活性化されたウイルス溶液で置き換えることにより目的のMOI数のウイルスと接触させた。次に、細胞は、1分未満若しくは1分に等しい時間又は30分間37℃でウイルス溶液に接触したままにされた。
【００８３】
1.4  ウイルス生産
指示された接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二回洗浄された。次に、Tフラスコは、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中で5から7日間37℃でさらにインキュベートされた。対照として、いくつかのフラスコは、細胞をウイルス溶液に接触させた後洗浄されず(すなわち、ウイルス溶液は取り除かれずに)、5から7日間37℃でウイルス溶液と一緒にインキュベートされたままにした。ウイルス含有上清は感染後の5から7日目に収集された。前記物質は-70℃で保存された。
【００８４】
1.5  ロタウイルス力価を測定するための方法-ffu/mlでのウイルス力価測定(virus titration)
MA-104細胞は、10％ウシ胎児血清を補充されたDMEM中で培養された。96ウェルプレートにウェルあたり20,000細胞を播種した。細胞は37℃で4日間インキュベートされたままであった。力価測定されるウイルス含有上清の試料を細胞に添加する前に、細胞はDMEMで三回穏やかに洗浄された。次に、120μlの力価測定培地、すなわち8μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加された。ウイルス含有上清の最初の二倍希釈試料が調製され、希釈されたウイルスは室温で30分間活性化された。活性化された希釈ウイルスを使用して、上で調製されたMA-104細胞を含む96ウェルプレートに直接実施される追加の連続二倍希釈を調製した。120μlの活性化された希釈ウイルスは最初の一連のウェルに添加され、それぞれのウェルは120μlの力価測定培地を含有していた。次に、120μlのそのさらに希釈されたウイルスは次の一連のウェルに添加され、それぞれのウェルは120μlの力価測定培地を含有していた、等。プレートは、2000rpm、30℃で1時間30分間遠心分離された。次に、96ウェルプレートはウイルス含有試料の希釈物と一緒に16時間インキュベートされた。次に、細胞はDMEMで一回洗浄され、-20℃で15分から25分間冷アセトン80％(-20℃)中で前記細胞をインキュベートすることにより固定された。次に、アセトン溶液は取り除かれ、プレートは乾燥させた。次に、試料中のロタウイルスの存在を検出し定量化するために、VP6タンパク質に対するモノクローナル抗体を含む溶液が細胞に添加され、37℃で1時間インキュベートされた。前記存在は、37℃で1時間、細胞上でインキュベートされたFITCに結合された二次抗マウス抗体を使用する免疫蛍光によって明らかにされた。蛍光に陽性の一細胞(フォーカスと呼ばれる)は、前記細胞が感染されていることを示している。ウイルスの集団と一緒の細胞の16時間インキュベーションにより、細胞には一つのウイルスのみが感染することが可能であると推定される。したがって、ffu/mlで示されるウイルス溶液の力価は、希釈係数により補正されるウェル中で検出されるフォーカスの数に一致する。ffuとはフォーカス形成単位を表す。
【００８５】
1.6  ロタウイルス力価を測定するための方法-log CCID50/mlでのウイルス力価測定
ウイルス不活化は、TCID50アッセイ(組織培養感染量)を通じてウイルス力価(viral titration)を測定することにより評価された。一晩のインキュベーションの終了時に、各実験内のすべてのBPL条件由来の試料が収集されて、BPL不活化の有効性を評価するために、その感染性を試験した。試験される試料の一連の連続希釈が実施される。50μlの各希釈物は、MDCK細胞を含有する96ウェルマイクロプレーに10複製物(replicates)で接種され、8希釈物が試験される試料ごとに接種される。次に、プレートは、ウイルスが感染性の場合には細胞内で複製することができるように、35℃で5〜7日間インキュベートされる。細胞中の感染性ウイルスの存在は、顕微鏡によって細胞に対する細胞変性効果(CPE)をモニターすることにより検出される。感染性ウイルスの懸濁液は、細胞感受性を実証するために陽性対照として使用され、非接種培養物は陰性対照として使用される。CPEが検出されるウェルの数は感染した細胞として希釈物ごとに点数化され、ウイルス力価はリードミュンヒ法に従って計算される(Reed, L.J. and Muench, H.、1938、The American Journal of Hygiene 27: 493〜497)。
【００８６】
1.7  PCV-1 DNA含有量を測定するための方法-Q-PCRアッセイ(定量的PCR)
リアルタイム増幅アッセイとしても知られている定量的PCR(Q-PCR)は、各PCRサイクル後に増幅された産物の蓄積を検出する蛍光プローブの使用に基づいている。PCR産物増幅は、増幅された産物に特異的に結合する蛍光発生プローブを介してリアルタイムでモニターされる。プローブが結合しない限り、蛍光を発することはない。Q-PCRアッセイは、以下の通りに実施された。試験試料一本鎖DNAは、市販のシステム(QIAamp Viral RNA)を製造業者の使用説明書に従って使用して抽出された。抽出されたPCV-1 DNAは、特定のプライマー及びプローブを使用するQ-PCRにより増幅された(表1参照)。Q-PCRアッセイに使用されるサイクリング条件は表2に詳述されている。前記アッセイは、Applied Biosystem社製のABI PRISM 7900 HT装置を使用して96ウェルマイクロプレートにおいて実行された。試料の汚染を回避するために、専用の部屋及び材料が各ステップ(PCR前混合調製、DNA抽出、PCRアセンブリー、PCR増幅)に割り当てられた。
【００８７】
多数の陽性及び陰性対照を使用してアッセイを検証した。
【００８８】
・DNAが存在していない抽出
・DNAが存在していないPCR反応
・PCR反応の陽性対照として使用される、及び試験される試料の定量化を可能にする標準曲線を描くために使用される既知の濃度のPCV-1 DNA(10から107コピーまで)
各試料は二通りに実行された。
【表１】
2013531503.tif 000002
【表２】
2013531503.tif 000003
【００８９】
1.8  PCV-1感染力アッセイ
細胞培養物ベースのアッセイは、ロタウイルスバルクにおけるPCV-1複製能力のある粒子、すなわち、PCV-1感染性粒子の存在を評価するために実施された。前記アッセイはPCV-1無しVero細胞上で実行された。下の実施例に記載される通りに、クリアランス試験から生じるロタウイルス含有上清試料由来のロタウイルスは、ロタウイルス特異的モノクローナル抗体を添加することにより中和された。前日にフラスコに播種されたサブコンフルエントVero細胞に上記中和された試料を接触させた。37℃で2時間の接触時間後、培養上清は取り除かれ、細胞は洗浄されて新鮮な培養培地が添加された。陰性対照として、Vero細胞にはロタウイルス含有試料を接触させず培養培地で満たされた。陽性対照は、ロタウイルス特異的モノクローナル抗体有り又は無しの培養培地中でPCV-1ウイルスストックから1×103 CCID50でVero細胞に感染させることにより作製された。フラスコは通常の細胞継代(週二回)で、37℃でインキュベートされた。ウイルス試料での接種14日後、細胞は収集され、PCV-1転写物の存在は、下に記載される通りに逆転写酵素rep'RT-Q-PCRアッセイにより試験され、この転写物は、存在すれば、PCV-1の複製能力、したがって感染性PCV-1粒子の存在を反映する。
【００９０】
2×106Vero細胞はPBSで洗浄され、細胞ペレットは製造業者の使用説明書に従ってDNAse処理と共にHigh pure RNAキット(Roche)を使用してRNA抽出を受けた。RNAは50μlの溶出バッファーに溶出されTurboDNAseで処理された。RT反応はQスクリプトcDNA合成(Quanta)を使用することにより試料ごとに実施された。手短に言えば、5μlのRNAは20μlの容積中で逆転写され22℃で5分間、続いて42℃で30分間さらに85℃で5分間インキュベートされた。Rep'転写物に対して向けられるTaqman Q-PCRが使用され、111bpの断片を増幅させた。使用されたプライマー及びプローブは、Mankertz & Hillenbrand、2001 (Virology 279: 429〜438)に開示されているものであった。Q-PCRは、2.5μlのcDNAを含有する最終容積25μlで、Gene expression master mix (ABI)を使用することにより実施された。50℃で2分及び95℃で10分間後、95℃で15秒及び60℃で1分間からなる40サイクルが実施された。
【実施例２】
【００９１】
細胞とのウイルス接触時間を減らす効果
2.1  三つの独立した実験(実行1、実行2及び実行3)は、ウイルス溶液が取り除かれずウイルス収穫時まで維持される対照に比べた、減少させた接触時間後にウイルス溶液を取り除く効果を評価するために開始された。ウイルスMOIは10-1であり、細胞培養及びウイルス感染の条件は同一であり実施例1に記載される通りであった。ウイルス含有上清は6又は7日後に収穫された。
【００９２】
実行1では、PCV-1無しVero細胞培養物は、セクション1.1に記載される通りに、T-175フラスコ内のVP-SFMにおいて増殖された。前記細胞培養物はDMEMで洗浄され、次に前記細胞培養物をMOI 10-1のロタウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMに希釈される)に接触させることにより感染させた。37℃で10から30秒後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37℃で6日又は7日間さらにインキュベートされた。接触に先立って、ウイルスは15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション1.2に記載される通りに特異的に活性化された。対照として、ウイルス溶液はいくつかのフラスコからは取り除かれず、ウイルス溶液との接触はインキュベーション期間(6又は7日)中ずっと維持された。ウイルス含有上清は感染の6日又は7日後に収穫され、-70℃で凍結された。
【００９３】
同一方法に基づいて、第二のウイルス継代(VP2)は、実行1に類似する形で調製されるVero細胞において行われた。実行1の上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション1.2に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、10-1のMOIの活性化されたウイルス溶液(7.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEMに希釈される)に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37℃で6日間7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収集され、-70℃で保存された。
【００９４】
第三のウイルス継代(VP3)は同一方法でT-25フラスコにおいて実施された。実行1の第二のウイルス継代の上記収集された上清由来のウイルス試料は解凍され、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション1.2に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、10-1のMOIの活性化されたウイルス溶液(7.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEMに希釈される)に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37℃で7日間7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、-70℃で保存された。
【００９５】
実行2では、ウイルス継代は上記方法に従ってT-175フラスコ(VP1)又はT-25フラスコ(VP2)のいずれかで行われた。PCV-1無しVero細胞培養物は、セクション1.1に記載される通りに、VP-SFMにおいて増殖させた。細胞はDMEMで洗浄され、次に10-1のロタウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM培地に希釈される)に接触させることにより感染させた。37℃で10から30秒の接触(実行2b)又は30分の接触(実行2a)後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37℃で6日間さらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、-70℃で保存された。第二のウイルス継代(VP2)は、上記に類似する形で調製されるVero細胞において行われた。実行2bの上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、上に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、10-1のMOIの活性化されたウイルス溶液(7.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEMに希釈される)に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37℃で7日間7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収集され、-70℃で保存された。
【００９６】
実行3では、一ウイルス継代(VP1)は上記方法に従って細胞ファクトリー(Cell Factory)において実施された。細胞をロタウイルス溶液に接触させることに先立って、ウイルスは20μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション1.2に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、10-1のMOIの活性化されたウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM培地に希釈される)に接触させることにより感染させた。接触時間は1分近くであった。その後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞はDMEMで二度洗浄され、37℃で6日間7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清が収穫された。
【００９７】
上記のロタウイルス含有上清はすべて、それぞれ上記のセクション1.5及び1.7に記載される通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV-1 DNA含有量の決定を可能にするQ-PCRアッセイを受けた。結果は表3に示されている。結果は、それぞれlog ffu/ml及びDNAコピー/mlで表されている。
【表３】
2013531503.tif 000004
【００９８】
結果
10-1のMOIで10から30秒のウイルス接触時間が使用された実行1では、ウイルス溶液は取り除かれずロタウイルスを収穫する前に6又は7日間維持される対照に比べて、一ウイルス継代(VP1参照)後のPCV-1 DNA含有量の2から3logの減少が観察された。さらに、第一のウイルス継代後に収集されたウイルス収穫物を使用する第二のウイルス継代(VP2参照)で検出可能なPCV-1の非存在が観察された。注目に値することであるが、ウイルス溶液は取り除かれずロタウイルスを収穫する前に6又は7日間維持される対照に比べて、ロタウイルス力価はほとんど同一のままであった(最後の列-ロタウイルス力価参照)。実行1の第二のウイルス継代後に収集されたウイルス収穫物を使用する第三のウイルス継代(VP3参照)後PCV-1 DNAレベルは検出不可能なままであったが、ロタウイルス力価は、第二のウイルス継代後に得られた力価に比べてさらに増加していた。
【００９９】
実行2では、10から30秒のウイルス接触時間を使用すると、ロタウイルス種子中に存在するPCV-1 DNAのレベルに比べて、PCV-1 DNA含有量が7log減少することが観察された。30分のウイルス接触時間を使用すると、ロタウイルス種子中に存在するPCV-1 DNAのレベルに比べて、6log減少が観察されるので、それでも良好な減少結果が得られた。さらに、30分などのより長いウイルス接触時間は、ロタウイルスにさらに高い力価を与えると思われる(VP1行における8.2対7.7値を比較されたい、実行2実験)。
【０１００】
2.2  1分、10分及び30分などの短いウイルス接触時間を使用する効果を評価するために二つの追加の独立した実験が行われた(実行4及び実行5)。実行4実験には、(i)所与の30分ウイルス接触時間について、10-1のMOI対0.5のMOIを比較する;(ii)所与の30分接触時間及び所与の10-1のMOIについて、ウイルス生産培地中に7.5μg/mlのトリプシン(セクション1.4参照)対15μg/mlのトリプシンの使用を比較するという二つの追加の一連の条件(下のセクション3.2参照)の評価も含まれる。
【０１０１】
Vero細胞は50,000細胞/cm2の密度で播種され、ウイルス感染前に6日間(実行4)又は7日間(実行5)増殖させた。ロタウイルス溶液は室温で30分間20μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中で特異的に活性化された。感染前、細胞はDMEMで洗浄された。次に、細胞は1分間、10分間又は30分間、15μg/mlのトリプシンを補充したDMEMに希釈された10-1の上記の活性化されたロタウイルス溶液に細胞を接触させることにより感染させた。指示された接触時間後、ロタウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、7.5μg/mlのトリプシン(実行4)を又は15μg/mlのトリプシン(実行5)を補充したDMEM中で7日間さらにインキュベートされ、この時点でウイルス含有上清は収穫された。その後、ウイルス含有上清は、室温で10分間、180gの遠心分離により清澄化した。ウイルス含有上清の試料(清澄化の前及び後)は、それぞれセクション1.6及び1.7に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV-1 DNA含有量の決定を可能にするQ-PCRアッセイを受けた。結果は表4に示されている。結果は、それぞれlog CCID50/ml及びDNAコピー/mlで表されている。
【０１０２】
同じロタウイルス種子を使用して、実行4及び実行5では細胞に感染させたが、この種子はlog CCID50/mlで測定された場合、7.5の力価を有する。その上、このロタウイルス種子の試料で実施されたPCV-1 DNA含有量を測定するためのQ-PCRアッセイによれば、PCV-1 DNAはこの種子内に4×107DNAコピー/mlのレベルで存在していることが示された。この値は、本セクションにおいて例示される本発明の方法を使用した場合、DNA PCV-1減少を評価するための対照値としての役割を果たす。
【表４】
2013531503.tif 000005
【０１０３】
結果
実行4で得られるデータを検討すると、達成されたPCV-1 DNA減少は、1分、10分又は30分のウイルス接触時間を使おうとも、約5log以上であり、それらの短い接触時間のいずれでも良好なPCV-1 DNA減少を与えることを示している。実行5において得られたデータを検討すると、1分及び10分のウイルス接触時間を使用した場合は類似の5log減少が観察され、30分のウイルス接触時間ではより低い減少が得られた。なぜならば、この接触時間では4log減少が観察されたからであった(清澄化前に得られたデータ参照)。実行4でも実行5でもロタウイルス力価測定では、ウイルス接触時間を増加させるとロタウイルス力価が増加する傾向にあることが示された。
【実施例３】
【０１０４】
変化するロタウイルスMOIの効果
3.1  別々の実験で、PCV-1 DNA含有量に対する減少したMOI、すなわち、10-3、10-4及び10-5などの10-1未満の影響を評価した。
【０１０５】
PCV-1無しのVero細胞培養物は、T-175フラスコ又はT-25フラスコのいずれかにおいてVP-SFMで増殖させた。細胞はDMEMで洗浄され、10から30秒間又は30分間、10-1又は10-3のMOIでロタウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを含有するDMEMに希釈される)に接触させた。別々の実験で、10-4又は10-5のMOIのロタウイルス溶液を10から30秒間又は30分間、洗浄された細胞に接触させた。MOI 10-1及び10-3を用いた感染はそれぞれ、一つのT-175フラスコにおいて試験され、MOI 10-4及び10-5はT-25フラスコにおいて五つの培養複製物で試験された。細胞をウイルスに接触させることに先立って、ウイルスはセクション1.2に記載される通りに、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMにおいて特異的に活性化された。
【０１０６】
37℃での10から30秒又は30分のウイルス接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。次に、7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMが添加され、細胞は37℃で5又は6日間さらにインキュベートされた。したがって、ウイルス含有上清は5又は6日後に収穫され(表5に示されている)、-70℃で保存された。
【０１０７】
同一方法に基づいて、第二のウイルス継代(VP2)は、上記の第一の継代に類似する形で調製されたVero細胞上で行われた。上記の第一のウイルス継代(ウイルス感染は10-3のMOIで実施された)から生じる上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、セクション1.2に記載される通りに、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMにおいて特異的に活性化された。細胞をDMEMで洗浄後、細胞は、10-1のMOIの活性化されたウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM培地で希釈される)に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37℃で7日間、7.5μg/mlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、-70℃で保存された。
【０１０８】
上記のウイルス含有上清はすべて、それぞれセクション1.5に及びセクション1.7に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV-1 DNA含有量の決定を可能にするQ-PCRアッセイを受けた。結果は表5に示されている。結果は、それぞれlog ffu/ml及びDNAコピー/mlで表されている。10-1及び10-3のMOIのウイルスが試験される実験においてVero細胞に感染させるのに使用されるロタウイルス種子は、6.2×1010 DNAコピーのPCV-1/mlを含んでいた。この値は、本セクションにおいて例示される本発明の方法を使用した場合、DNA PCV-1減少を評価するための対照値としての役割を果たす。
【表５】
2013531503.tif 000006
【０１０９】
結果
ウイルス接触時間30分で、10-3などの10-1未満のMOIを使用すると、一ウイルス継代(VP1)後PCV-1 DNA含有量に関する限りネガティブ結果及び5.8logのロタウイルス力価が得られる。30分の又は10〜30秒のウイルス接触時間で、より低いMOI、すなわち10-4及び10-5が試験される実験では、得られたロタウイルス力価は著しく低く、10-4のMOIでは≦4log及び10-5のMOIでは≦3.3であった。その低いMOIでの第一のウイルス継代に続くQ-PCRによりPCV-1 DNAは検出されなかった(又は検出限界に極めて近い値が検出された)。PCV-1ネガティブデータは、第一ウイルス継代(10-3のMOIを有する)中に生産されたMOI 10-1のウイルス及び10から30秒の接触時間を使用する第二のウイルス継代後に確認され(VP2行参照)、ロタウイルス力価は6.7logまで増加していた(第一ウイルス継代後に得られた5.8logと比べて)。それらの結果は、10-3、10-4及び10-5などのより低いウイルスMOIを使用すれば、10-1 MOIを使用した場合に得られる結果に比べて、PCV-1 DNA含有量を大いに減少させることも可能であったことを示している。ロタウイルス力価に関する限り、それらのより低いウイルスMOIにより、10-1 MOIを使用した場合に得られる力価よりも著しく低い力価が得られた。しかし、得られたウイルスをさらに継代すれば、PCV-1 DNA含有量をネガティブに維持したままロタウイルス力価をさらに増加させることが可能であった。
【０１１０】
3.2  セクション2.2に示されるように、実行4実験は、評価される条件に基づいて三つの部分に分けられ、第一の部分はセクション2.2にすでに記載されている。
【０１１１】
第二の部分は、PCV-1 DNA含有量に対するMOI数を増加させる影響を試験することを目標とした:10-1対0.5。
【０１１２】
第三の部分は、以前の実験のように、ウイルス生産培地において15μg/mlのトリプシンを使用すること(セクション1.4参照)対7.5μg/mlのトリプシンを使用することの影響を試験することを目標とした。
【０１１３】
PCV-1無しVero細胞培養物は、セクション1.1に記載される通りに細胞ファクトリー中のVP-SFMにおいて増殖させた。実験条件はセクション2.2に記載される条件と同じであった。すべてのウイルス含有上清の試料は、それぞれセクション1.6に及び1.7に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV-1 DNA含有量の決定を可能にするQ-PCRアッセイを受けた。結果は表6に示されている。結果は、それぞれlog CCID/ml及びDNAコピー/mlで表されている。細胞に感染させるのに使用されるロタウイルス種子は、log CCID50/mlで測定された場合、7.5の力価を有している。このロタウイルス種子の試料で実施されたPCV-1 DNA含有量を測定するためのQ-PCRアッセイにより、PCV-1 DNAは4×107 DNAコピー/mlのレベルでこの種子内に存在していることが示された。
【表６】
2013531503.tif 000007
【０１１４】
結果
ウイルス生産培地において15μg/mlのトリプシン濃度を用いる30分のウイルス接触時間を使用すれば、MOI 10-1でもMOI 0.5でもPCV-1 DNA含有量の良好な減少が得られた(行2と3を比較されたい)。しかし、MOI 10-1を使用すると、MOI 0.5(3log減少)と比べて、より良好な減少(5log減少)が得られた。ロタウイルス収率に関しては、力価測定データは、より大きなMOI(0.5対10-1)を使用するとより高いロタウイルス力価を与える傾向があることを示している(行1及び2と行3を比較されたい)。ウイルス生産培地におけるトリプシン濃度に関しては、表6に示されているデータ(行1及び2)によれば、生産中トリプシンが多いほど(15μg/ml)、力価はほぼ1log増加することが可能であることが示された。
【実施例４】
【０１１５】
条件の最適化-ロタウイルスプレマスター種子の調製
4.1  PCV-1無しVero細胞培養物は、250,000細胞/cm2の細胞密度に到達するように細胞ファクトリーのVP-SFMにおいて増殖させた。次に、細胞はDMEMで洗浄された。ロタウイルス溶液は、トリプシンを20μg/mlの濃度で補充されたDMEMにおいて室温で30分間特異的に活性化された。次に、細胞はDMEMで洗浄した後、10-1 MOIの活性化されたロタウイルス溶液(15μg/mlのトリプシンを含有するDMEMに希釈される)に37℃で10分間接触させることにより感染させた。10分の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、15μg/mlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37℃で7日間さらにインキュベートされ、その時点でウイルス含有上清は収穫された。次に、ウイルス収穫物は、室温で1000rpmでの遠心分離により清澄化した。ウイルス上清は収集され、-70℃で保存された。
【０１１６】
上記のウイルス含有上清は、それぞれセクション1.6に及び1.7に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV-1 DNA含有量の決定を可能にするQ-PCRアッセイを受けた。結果は表7に示されている。結果は、それぞれlog ffu/ml及びDNAコピー/mlで表されている。
【表７】
2013531503.tif 000008
【０１１７】
結果
6×107 PCV-1 DNAコピー/mlで汚染されたロタウイルス種子から開始して(対照行とPCV-1列参照)、本実施例4において例示される本発明の方法、すなわち、10-1のウイルスMOIと、10分の細胞とのウイルスの減少された接触時間とを組み合わせる本発明の方法により、5logよりも大きなPCV-1 DNA含有量の減少を達成することが可能になり、ウイルス損失はわずか0.6logであるためにロタウイルス力価は著しい影響を受けない。本発明の方法に従った一ウイルス継代後、本実施例4において例示されるように、PCV-1のDNA含有量は、ロタウイルス種子に存在する最初のレベルに比べて、99.99％よりも多く減少した。
【０１１８】
4.2  上記に従って得られるロタウイルスプレマスター種子も、PCV-1感染力アッセイにかけられた。上記プレマスター種子の試料は、セクション1.8に記載される通りに、先ず抗ロタウイルス抗体で中和され、次にVero細胞上に接種された。接種の14日後(表8のD14参照)、接種されたVero細胞は収集され、PCV-1から特定のmRNAを増幅させることを目的とするRT-Q-PCRをセクション1.8に記載される通りに実施できるように、セクション1.8に記載される通りにRNAが抽出された。このRT-Q-PCRの結果は表8に示されている。陰性対照として、特にこのアッセイにおいて使用されたVero細胞がPCV-1無しであることを確認するために、Vero細胞にプレマスター種子を接種する前にRT-Q-PCRはVero細胞でも実施された(表8でのRT-Q-PCR D0参照)。
【表８】
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【０１１９】
結果
D14で得られた表8のネガティブ結果は、本実施例において例示される本発明の方法に従って得られるロタウイルスプレマスター種子がいかなる感染性PCV-1粒子も含有していなかったことを示している。
【国際調査報告】
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