(57)【要約】  本発明は、蛋白質キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５の活性および/または発現を調節し、それによりインスリンの発現および/または放出を高めることが可能な化合物に関する。さらに本発明は、炭水化物代謝性疾患を治療するための前記化合物を特定する方法に関する。さらに本発明は、炭水化物代謝性疾患、特に２型真性糖尿病を治療する方法に関する。
2013536815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モジュレータであって、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種の蛋白質キナーゼの阻害、
または
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸およびＧＲＫ５をコードするた核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーション、
のための、
炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーター。
【請求項２】
前記疾患は糖尿病である、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項３】
前記疾患は２型真性糖尿病である、請求項１または請求項２に記載のモジュレーター。
【請求項４】
前記モジュレーターはインスリン産生の上方調節および/またはインスリン放出のために用いられる、請求項１、請求項２または請求項３に記載のモジュレーター。
【請求項５】
前記モジュレーターは、
ａ）小分子、
ｂ）ＲＮＡ分子、
ｃ）ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子の前駆体、
ｄ）アンチセンス  オリゴヌクレオチド、
ｅ）アプタマー、
ｆ）ポリペプチド、
ｇ）抗体、または、
ｈ）リボザイム、
である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のモジュレーター。
【請求項６】
炭水化物代謝性疾患を治療するための請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の前記モジュレーターを含む医薬用組成物。
【請求項７】
前記疾患は糖尿病である、請求項６に記載の医薬用組成物。
【請求項８】
前記疾患は２型真性糖尿病である、請求項６または請求項７に記載の医薬用組成物。
【請求項９】
インスリン産生の上方調節および/またはインスリン放出のために用いられる、請求項６、請求項７または請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーターをスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ）試験化合物をＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドからなる群から選ばれた少なくとも１種のポリペプチドと接触させること、
ｂ）前記試験化合物と前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１またはＧＲＫ５ポリペプチドとの結合を検出すること、および、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１またはＧＲＫ５ポリペプチドの活性を測定すること、
を含む方法。
【請求項１１】
ポリペプチドの代わりに前記ポリペプチドをコードする核酸を用いて、前記活性の代わりに発現率を測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験化合物は、ＲＮＡまたはペプチドまたは抗体またはキナーゼ阻害剤である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
キットであって、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸、
ｃ）インスリン産生細胞株、
ｄ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、または対応核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物  を含むキット。
【請求項１４】
代謝性疾患の治療のための方法であって、：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種のチロシンキナーゼの阻害または活性化、または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーションまたは活性化、
のための少なくとも１種のモジュレーターの医薬的に効果のある量を必要とする被検者に投与することを含む、
代謝性疾患の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、ある種の蛋白質キナーゼの活性および／または発現を調節し、それによりインスリンの発現および／または放出を促進させることができる化合物に関する。本発明はさらに代謝性疾患の治療のための前記化合物を特定する方法に関する。本発明はさらに代謝性疾患、特に２型真性糖尿病を治療する方法に関する。
【０００２】
先進国における主要な死亡原因としての糖尿病は、高血糖レベルによって特徴付けられる代謝の状態である。糖尿病には二つの主要な型がある：１型は、膵臓ベータ細胞の不十分なインスリンの産生によって生ずるものであり、患者はインスリンを注射する必要がある；及び２型は（骨格筋、肝臓、脂肪組織のような）末梢組織のインスリン放出変化に対する鈍感性および相対的なインスリン不足から生ずる。２型真性糖尿病はしばしば肥満によって起こるか、または肥満を伴う。２型真性糖尿病は、先ず、減量、食餌療法および運動によって治療されることができる。１型糖尿病は遺伝性もしくは自己免疫性の疾患であり、現在までの効果的な治療法は外部からのインスリンの供給のみである。この治療法は糖尿病を治癒しないので、患者は継続的なインスリンの供給を必要とする。
【０００３】
糖尿病の全てのケースの９０％を占める２型糖尿病における末梢組織のインスリン感受性の低下は、当初は膵臓のベータ細胞によるインスリンの放出の増加で補われる。糖尿病のある段階では、もはや膵臓はインスリン放出の増加を維持することはできない。疾病の進行に従って、現在利用可能でありインスリンの放出を高める薬剤が、ベータ細胞障害かつインスリン産生の損失につながっている。
【０００４】
癌、糖尿病、炎症を含む幾つかの疾患は、細胞のシグナル経路を介した蛋白質キナーゼの乱れに関連している。かねてから多数の新型のキナーゼ薬剤の臨床的試験が行われている。幾つかの薬剤が様々な適用のために認められており、その多くは癌治療のためである。イマニチブやスニチニブなどこれらら多くのキナーゼ阻害剤の目的は、二次メッセ―ジャー発生因子への細胞間シグナル伝達を開始する受容体チロシンキナーゼ及びシグナルカスケードに関与するキナーゼから、並びに細胞の運命を支配する細胞サイクルを調整するキナーゼに至るまでのシグナル伝達のあらゆる段階で相互作用することである。
【０００５】
幾つかの刊行物は、患者において１型または２型糖尿病の軽減につながる治療期間中に、糖尿病にス二チ二ブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））およびイマ二チブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））のようなキナーぜ阻害剤の効果を示している。しかしながら、ごく僅かのキナーゼだけが、特にさらなる具体的な治療戦略を発展させるために、インスリン放出又は感受性に影響を与えることが確認される可能性がある。
【０００６】
本発明の目的は、糖尿病のような代謝性疾患の治療のための標的、膵臓のベータ細胞のインスリン放出を高めることで血液インスリンのレベルを上昇させるのに有用な化合物、およびこのような化合物を特定することを提供する。本発明の目的は、請求項１による調節蛋白質キナーゼに結合する化合物、および請求項１による調節蛋白質キナーゼに結合する化合物のような化合物と開示される標的ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５とを特定するための方法によって達成される。さらに有利な実施の形態、様相および発明の詳細は、係属中の請求の範囲、明細書、実施例および図面により明らかとなる。
［発明の簡単な説明］
本発明は、特に蛋白質キナーゼの活性を阻害するモジュレーターに言及し、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５からなる群から選ばれたモル質量が６０ｋＤａより大きいキナーゼが阻害の標的として好ましく、また阻害の好ましい目的は代謝性疾患の治療、より好ましくは炭水化物代謝性疾患の治療、さらに好ましくは糖尿病の治療、さらに好ましくは２型真性糖尿病の治療、そして最も好ましいのはインスリンの産生および／またはインスリンの放出の上方調節である。さらに本発明は、代謝性疾患の治療、さらに好ましくは炭水化物代謝性疾患の治療、さらに好ましくは糖尿病の治療、さらに好ましくは２型真性糖尿病の治療、最も好ましくはインスリン産生および／またはインスリン放出の上方調節のために、ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸を不活性化、分解、下方調節、インターカレーションするためのモジュレーターに言及する。
【０００７】
前記モジュレーターは、小分子、ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子またはこれらの分子の先駆体、アンチセンスオレゴヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、抗体またはリボザイムを含む群から選択されることができ、その中でもＲＮＡ、ペプチド、小分子およびアプタマーは好ましいモジュレーターである。
【０００８】
本発明は、さらに代謝性疾患の、より好ましくは炭水化物代謝性疾患の、より好ましくは糖尿病の、より好ましくは２型真性糖尿病の治療のための、および最も好ましくはインスリン産生の上方調節のためのモジュレーターを含む医薬用組成物に言及する。
【０００９】
本発明は、さらに代謝性疾患の治療のためのモジュレーターをスクリーニングするための方法に言及し、代謝性疾患の治療のためのモジュレーターをスクリーニングするための方法は、少なくとも１種のポリペプチド、またはＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫからなる群から選ばれた６０ｋＤａより大きい質量の少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸に接触するための試験化合物を提供すること、前記試験化合物とＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、またはＧＲＫ５ポリぺプチドまたは少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸との結合を検出すること、前記試験化合物の存在下でＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、またはＧＲＫ５ポリぺプチドの活性を測定することを含む。
【００１０】
本発明の化合物を特定するために、本発明はさらに、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫポリペプチド、ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸、グルコース依存性インスリン産生を有する細胞株、およびＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５ポリペプチドに結合することでインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物を含むキットを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種のキナーゼの阻害または活性化のための、または、ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、劣化、下方調節、インターカレーションもしくは活性化のための少なくとも１種のモジュレーターの臨床的に有効な量を必要とする被験者に投与することを含む代謝性疾患の治療のための方法を提供する。
［説明］
意外なことに、スニチニブは投薬量依存的方法においてインスリン放出に効果があることがわかった。この効果はスニチニブによってある種のキナーゼの阻害に起因することが分かった。さらに意外なことに、他の化合物による６０ｋＤａより大きなモル質量の特定された蛋白質キナーゼの阻害は結果として上昇したインスリン放出になることがわかった。またさらに、ある種の蛋白質キナーゼ対の併用阻害は結果として付加的なインスリンの放出になることがわかった。さらに、ある種の蛋白質キナーゼ対の阻害は結果としてスニチニブ治療後の効果と同等のインスリン放出になることがわかった。
【００１２】
キナーゼはドナーから受容者へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。リン酸化されるのは、ヒドロキシ基、カルボキシ基、グア二ジノ基、チオール基、またはイミダゾール基のような求核官能基である。蛋白質をリン酸化するキナーゼは蛋白質キナーゼと呼ばれる。蛋白質キナーゼは細胞内シグナル伝達に特別な役割を果たす。蛋白質キナーゼは通常では蛋白質キナーゼの基質により類別される。従って蛋白質キナーゼは、おおよそ２つのグループに分けられ得る：チロシンのヒドロキシル基をリン酸化する蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、およびセリンまたはスレオニンのヒドロキシル基をリン酸化するセリン／スレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）である。ＰＴＫの例は、ＥｐｈＡファミリー、Ｌｃｋ、Ｓｃｙｌ、ＨＣＫ、ＢＬＫ、ＩＴＫ、ＴＥＣ、ＥＸＫ、ＢＴＫ、ＣＴＫ、Ｆｙｎ、Ｆｇｒ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｔｙｋ、ＪＡＫファミリー、ＣＳＫ、Ａｒｇ、Ａｂｌ、Ｆｅｓ、Ｆｅｒ、Ｓｒｍ、Ｂｒｋ、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、ＦＡＫ、ＰＹＫ２、ＤＤＲ、ＴＲＫ、ＨＥＲファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＦＬＴ、Ｍｅｒ、Ｒｅｇ、Ａｘｉ、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、ＲＹＫ、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｌｍｒファミリーなどのキナーゼである。ＳＴＫは、主としてｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＤＡＧ、Ｃａ2+またはカルモジュリン、１，２−ジアシルグリセリン、ＰＩＰ３およびその他のリン脂質誘導体によって調節される。ＳＴＫの例は、蛋白質キナーゼＡ、ＢおよびＣのファミリー、ＧＲＫファミリー、ＭＡＳＴファミリー、ＣＳＮＫ、ＰＲＫ、ＮＤＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＭＳＫ、ＭＲＣＫ、ＲＯＣＫ、ＣＲＩＫ、ＤＭＰＫ、ＰＫＮ、Ｎｅｋ、Ｐｉｍ、Ａｕｒ、ＳＳＴＫ、ＴＳＳＫ、Ｏｂｓｃｎ、ｓｋＭＬＣＫ、ＤＡＲＫ、ＦＡＰＫ、ＢＲＳＫ、ＭＮＫ、ＰＫＤ、ＭＡＰ、ＰＩＫ３、ＣＨＢＫ、ＰＩＰ、ＣＥＲＫ、ＴＬＫ、ＣＡＳＫ、ＡＫＴ、ＫＣＮＨ２、ＧＳＫ、ＦＵＫなどの酵素を含む。
【００１３】
他の類別化は、キナーゼの活性化化合物、または活性化メカニズム、またはある種の触媒ドメイン、またはキナーゼの特定のアミノ酸配列に基づかれる。１つの細胞内のキナーゼの全体をキノームという。
【００１４】
蛋白質キナーゼは、蛋白質キナーゼの機能に基づきシグナル伝達に非常に重要な調節メカニズを示し、種々な同化経路と代謝経路を調節している。蛋白質キナーゼの重要性に基づき、細胞経路における蛋白質キナーゼ機能障害は、癌、代謝性疾患、心臓血管障害、動脈硬化症、甲状腺障害、内分泌疾患、消化器疾患、炎症、免疫障害、成長障害、血液学的疾患、呼吸器疾患、筋肉骨格疾患、神経学的疾患、および泌尿器疾患のような多くの疾患の原因となる。このことは蛋白質キナーゼのような酵素を、治療のための魅力的な分子標的とさせる。
【００１５】
驚くべきことにキナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５は、重要な方法でインスリンの放出を調節することが確認された（図１および図４）。ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５のようなキナーゼは、好ましくは代謝性疾患、糖尿病、より好ましくは２型糖尿病の治療のための標的物、および最も好ましくはインスリンの血中濃度を上昇させるのための標的物である。ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５のようなキナーゼは少なくとも６０ｋＤａの分子量を有するという特徴を共有する。明らかにある大きさのキナーゼは、特に容易に阻害されインスリン放出の調節をもたらすことになる。代謝性疾患の治療の標的であるキナーゼは基本的に代謝経路に影響する全てのキナーゼである。本発明によれば、インスリンの放出や感受性に影響または調節することが見いだされ、およびそれ故に糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療に好ましい標的となるキナーゼは、キナーゼ、即ちＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１及びＧＲＫ５であり、キナーゼの阻害がインスリンの放出を著しく増加させることと相関がある。
【００１６】
本発明は、炭水化物代謝疾患の治療のための、
ａ）ＳCＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくと  も１種の蛋白質キナーゼの阻害、または
ｂ）ＳCＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーション
のためのモジュレーターに特に言及する。
【００１７】
従って、好ましい実施の形態によれば、蛋白質キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５の作用は、モジュレーターまたはより好ましくは阻害剤によって阻止される。
【００１８】
それ故に、本発明は炭水化物代謝疾患の治療のための、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種の蛋白質キナーゼ、または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節またはインターカレーション
のための好ましい阻害剤に言及する。
【００１９】
キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、またはＧＲＫ５の１種を阻止すれば十分である。しかしながら、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、ＧＲＫ５のうちの２種のキナーゼの阻害はさらに治療効果を増大させ得る。従って、本発明のさらに好ましい実施の形態では、インスリン放出の増加により２種のキナーゼが組み合わされて阻害される。可能な組み合わせは、ＳＣＹＬ１／ＡＤＣＫ１、ＳＣＹＬ１／ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１／ＧＲＫ５である。さらに本発明の好ましい実施の形態においては、インスリン放出の増加により３種すべての酵素ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５を一度に阻害し得る。２種のキナーゼの阻害を達成するためには、１種類のモジュレーターもしくは阻害剤または２種類のモジュレーターもしくは阻害剤の組み合わせを使用することができる。３種類のキナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５の阻害を達成するためには、単一のモジュレーターもしくは阻害剤、または２種のモジュレーターもしくは阻害剤の組み合わせ、または３種の阻害剤の組み合わせを使用することができる。酵素阻害剤は一般的に酵素に結合し酵素の活性を低下させる分子である。阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入ることを防ぎ、酵素の結合部位で基質と競合するか、酵素が当該酵素反応を触媒するのを妨げる。阻害剤の結合は、可逆的又は不可逆的であることができる。蛋白質キナーゼ阻害剤は、特に１種以上の蛋白質キナーゼの作用を阻止する酵素阻害剤の１種である。蛋白質キナーゼの阻害は、蛋白質キナーゼの活性部位へ結合し、対応するキナーゼの標的配列を模倣するが、しかしセリン又はトレオニンを持たない偽基質を用いて達成されることが可能である。
【００２０】
別の好ましい実施の形態では、蛋白質キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および/またはＧＲＫ５の作用は、不活性化、分解、下方調節、またはインターカレーションにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者であることができる蛋白質キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および/またはＧＲＫ５をコードする核酸の干渉により妨げられる。核酸の不活性化は、例えばヌクレオチドのメチル化、挿入、欠失、ヌクレオチドの交換、架橋、鎖の切断／破損によって生じることができる。核酸は温度、化学物質、酵素、および特にＲＮＡによって、脱アデニル化または５'分解または３'分解によって単一ヌクレオチドに分解されることが可能である。ＤＮＡまたはＲＮＡの下方調節は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸の発現の減少と言及され、通常ポリペプチドであるレプレッサーの結合により生じることができるが、しかしまた核酸の化学的また構造的変化または修飾によっても生じることができる。インターカレーションは分子が他の２つの分子間に可逆的に入り込むことである。核酸では、インターカレーションは適切な大きさと化学的性質を有するリガンドが塩基対間に適合する場合に生じる。
【００２１】
本願に現われるモジュレーターという用語は、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５ポリペプチドの活性を変化させることが可能な分子を称する。ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５ポリペプチドの活性の変化は、酵素活性、結合特性、または機能性、免疫性またはその他のペプチドの生物学的特性を増加させたり減少させたりし得る。インスリンの放出を高めるためには酵素活性の減少は有利である。
【００２２】
本発明によれば、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５の阻害のためのモジュレーターは、小分子のような分子、ＲＮＡまたはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの前駆体、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの前駆体、リボザイム、ＤＮＡまたはＲＮＡ  アンチセンス・オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体または抗体の断片、ペプチド、ポリペプチド、シクロペプチド、またはイマ二チブ、ダサ二チブおよびソラフェニブのような薬剤である。
【００２３】
本発明のモジュレーターは、化合物または試験化合物とも言及される。化合物または試験化合物は本発明のポリペプチドの発現および／または活性を調節し、また１つ以上のアッセイ（検査方法）を単独または組み合わせて使用することによって特定されることができる。スクリーニングで用いられる試験化合物は特に限定されない。化合物または試験化合物は人工的なものであっても自然物であってもよい。
【００２４】
小分子なる用語は定義上は重合体でない低分子量の有機化合物を称する。薬理学の分野では、小分子はまた通常蛋白質、核酸、または多糖類のような生物重合体に高い親和性で結合する分子に限定される。小分子の最大分子量の上限は、細胞膜を介して迅速に拡散する可能性がある約２００Ｄａである。小分子は酵素阻害剤として広く用いられているので、小分子は本発明の好ましいキナーゼを阻害する好ましいモジュレーターである。
【００２５】
低分子干渉ＲＮＡ(短鎖干渉ＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は二本鎖ＲＮＡ分子類であって、１９−３０ヌクレオチド、好ましくは２０−２５ヌクレオチドの長さを有する。ＳｉＲＮＡは特定の遺伝子発現のＲＮＡ干渉に関与する。ＳｉＲＮＡは長い二本鎖ＲＮＡからリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）ＩＩＩダイサーによってカットされる。ＳｉＲＮＡを化学合成によっても得ることができる。またｓｉＲＮＡは抗ウイルスメカニズムまたはゲノムのクロマチン構造の形成に役割を果たす。分子研究においては、合成ｓｉＲＮＡはまたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において特定の標的遺伝子の発現を下方に調節するために使用されることもできる。本質的に興味のある任意の遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡの能力で、ｓｉＲＮＡは、インスリン産生におけるｓｉＲＮＡの役割を研究するために蛋白質キナーゼをノックダウンするのに使用されている（図１−図４）。本発明では、ＳｉＲＮＡは、好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。
【００２６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）は、転写後レギュレーターであって、ｍＲＡＮ転写物の３’ＵＴＲにおいて相補的配列に結合し、通常は結果として遺伝子サイレンシングをもたらす。マイクロＲＮＡは  約２２ヌクレオチド長さのショートＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、転写分解、隔離、および転写抑制において多くの役割を果たすことが示されているので、ｍｉＲＮＡはまた本発明における好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターでもある。
【００２７】
前駆体分子、例えばｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの前駆体分子は、標的細胞のｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ生合成装置（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｐｐａｒａｔｕｓ）のための基質であり得る。基質は、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などのＲＮＡ前駆体分子を含み、ｓｉＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子のそれぞれに対しドローシャ（Ｄｏｒｓｈａ）および／またはパーシャ(Ｐａｓｈａ)のようなエンドヌクレアーゼにより処理される。したがって、例えば、２７ヌクレオチドよりも長い、好ましくは３０から１００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを有するｄｓＲＮＡ分子またはショートヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、および最も好ましくは３０−５０ヌクレオチドの長さをを有するｄｓＲＮＡ分子を用いることができる。
【００２８】
さらに本発明による前駆体分子はｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構造体であり得り、それ故コードする要素は標的細胞でｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの発現を許す調節要素により制御される。このような調節要素の例として、例えばＵ６またはＨ１のようなポリメラーゼＩＩプロモータまたはポリメラーゼＩＩＩプロモータがある。
【００２９】
リボザイムは、化学反応を触媒することができる明確に定義された構造を有する触媒ＲＮＡｓである。自然発生リボザイム以外にリボザイムは人工的に作られることができ、核酸および蛋白質と相互作用するように調整されることができる。リボザイムもまた本発明における好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。
【００３０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、選択した配列を補完する一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。これらは１０〜３５７ヌクレオチド長さ、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長さである。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドは、特定の相補的ＲＮＡを標的にすることができ、結合によってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ鎖に結合することでｍＲＮＡと結合することができる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドもまた本発明における好ましいキナーゼを阻害するための好ましいモジュレーターである。
【００３１】
アプタマーはオリゴ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）または特定の標的分子と結合するペプチド分子(ペプチドアプタマー)である。アプタマーは、高分子薬剤として治療目的に使用されることができる。アプタマーは大規模ランダム配列群からオリゴ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）または特定の標的分子と結合するペプチド分子(ペプチドアプタマー)を選択することによって創出される。アプタマーもまた本発明の好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。
【００３２】
抗体は抗原に非常に特異的に結合する蛋白質である。抗体は抗原の存在に応じて体内の免疫系により形成される。抗体は実質的に任意の構造で形成されることができるので、ある種の分子と直接的な相互作用するための貴重なツールである。組み換え技術は、抗体および一本鎖抗体のような基本的には抗体の結合部分からなる抗体フラグメントを生成するために使用される。組み換え技術は、細胞外適用および細胞内適用においてインビボで利用されることができる。抗体もまた本発明における好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。キナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５に結合する種々の抗体は商業的に入手可能である。あるいは、キナーゼに対する特定の阻害抗体は周知の技術によって産生されることができるので、抗体の産生は本発明の使用のために過度の実験的負担を示さない。、
ペプチドは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の連鎖である。ペプチドは僅かな蛋白質と見られることができる。ペプチドは通常１００アミノ酸までの長さであり化合物ではそれ以降は蛋白質と言われる。ポリペプチドは少なくとも１０アミノ酸のペプチドである。シクロペプチドは環状構造を形成する２個、３個またはそれ以上のアミノ酸により形成され、従ってＣ−末端およびＮ−末端アミノ酸は存在しない。ペプチドは本発明の好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーター、ポリペプチドさらに好ましいモジュレーターである。
【００３３】
薬剤のス二チニブ、イマチ二ブ、ダサチ二ブおよびソラフェ二ブは蛋白質キナーゼを阻害する小分子であり、主として癌治療のために使用される。しかしながら、本発明では、ス二チ二ブ治療は１つの主要な副作用として高血圧を伴うので、薬剤のス二チ二ブは好ましいキナーゼの阻害のためのモジュレーターではない。糖尿病である人々は糖尿病でない人々に比べてより高血圧の問題を有する傾向にある。糖尿病と高血圧の両者を有することは、胸部疾患、脳卒中、眼、腎臓、および神経混乱のリスクが増加する限り損傷を与えるワンツーパンチを与えることができる。高血圧と関連する特に一般的な糖尿病の合併症がある。高血圧と関連する特に一般的な糖尿病の合併症は糖尿病網膜症および糖尿病腎症を含む。英国プロスぺクティブ糖尿病研究（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ）によって行われた研究で確立されたように、糖尿病を有する人々の血圧を管理することは将来の合併症のリスクを低下させる。
【００３４】
代謝性疾患は代謝の病理学的障害によって特徴付けられる疾病及び状態と言われる。代謝性疾患は、主として基質の病理学的な濃縮、代謝産生物の不足、エネルギー産生の低下、細胞成分再生の低下、代謝産生物排除の低下、ホメオスタシス維持の低下を導く調節システムにおける酵素の欠失及び異常によって特徴付けられる。代謝性疾患は後天性または遺伝性疾患であることができる。代謝性障害は、以下に限定されるものではないが、肥満症、糖尿病(例えば１型糖尿病、２型糖尿病、ＭＯＤＹ、妊娠性糖尿病)、低血糖症、アニロイド症、側鎖疾患、高アミノ酸血症、高アミノ酸尿症、尿素代謝の障害、高アンモニア血症、マロトー・ラミ―症候群などのムコ多糖症、糖原病、脂質蓄積症、コーリ症、腸性炭水化物吸収不全症、マルターゼ機能不全症、ラクターゼ機能不全症、サッカラ−ゼ機能不全症、フルクトースの代謝障害、ガラクトースの代謝障害、ガラクトース血症、ピルビン酸代謝障害、低脂血症、低リボ蛋白血症、高脂質血症、高リポ蛋白血症、カルニチンまたはカルニチンアシルトランスフェラーゼ欠乏症、ポルフィリン症、プリン代謝障害、リソソーム症、ガングリオシドーシスのような神経及び神経系の代謝疾患、スフィンゴリピド―シス、スルファチドーシス、白質ジストロフィー、レスチ−ナイハン症候群、副甲状腺機能障害、膵臓島細胞機能障害、炭水化物および脂肪の貯蔵ミオパシー、糖原病、ミオグロビン尿症、アルカプトン尿症、副腎性器症候群、ケトーシス、ケトアシドーシス、メチルマロン酸血症、アジソン病、コン病、クッシング病、ファブリ病、ゴーシェ病、ハンター症候群、膿胞性線維症、フェニルケトン尿症、蓄積症、ペーソス病（ｕｒｉｃｏｐａｔｈｉａ）などを含む。炭水化物の代謝は生体内における炭水化物の形成、破壊、および相互交換をもたらす種々の生化学的プロセスを示し、最も重要な炭水化物はグルコースである。ホルモンインスリンは動物にとって第１次の調節シグナルであり、ホルモンインスリンがあると、多くの組織細胞で血液循環からグルコースを取り出しを引き起こし、幾つかの細胞ではグリコーゲンの形で内部にグルコースを貯蔵を引き起こし、幾つかの細胞では脂質を取り込み貯蔵しを引き起こし、及び多くの場合には細胞の電解質バランスとアミノ酸取り込みも制御する。炭水化物の代謝疾患は、１個以上の炭水化物の代謝における病理生理学的変質に特徴付けられる疾病及び状態を言う。もし炭水化物の代謝性疾患が、真性糖尿病、ラクトース不耐性、フルクトース不耐性、ガラクトース血症、糖原病、糖尿病ケトアシドーシス  高浸透圧性昏睡および低血糖症からなるまたは含む群の１つの疾病から選ばれる場合には好ましい。
【００３５】
本発明はまた効果的な量の少なくとも１種の本発明の化合物、および少なくとも１種の薬学的に容認できる担体、賦形剤、結合剤、分解剤、滑剤、希釈液、潤滑剤、着色剤、甘味剤、人工香味料、保存料、溶剤などを含むかまたはそれらからなる医薬用組成物に関する。本発明の医薬用組成物は、従来の固体もしくは液体担体または希釈剤および周知の方法により適切な投薬量レベルで医薬的に作られたアジュバントで調合されることができる。
【００３６】
本発明によれば、本発明の化合物または医薬用組成物は、炭水化物代謝性疾病の治療、好ましくは真性糖尿病の治療、さらに好ましくは２型真性糖尿病の治療、および最も好ましくは膵臓細胞からのインスリン放出のレベルを増加させるために使用されることができる。
【００３７】
本発明の医薬用組成物は、投薬のために意図された経路に適合するように配合される。投薬の形式は、例えば、丸薬、錠剤，フィルム状錠剤、コート錠、カプセル、リポソーム配合剤、ミクロおよびナノ配合剤、粉末および沈着剤などを含む。さらに本発明は、また非経口利用のための医薬用製剤を含み、皮膚、皮膚内、胃内、皮内、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻膣内、膣内、口内、経皮、直腸、皮下、舌下、局部的、または経皮的な使用を含み、医薬用製剤は典型的な賦形剤および／または希釈剤に加えて本発明による化合物を含む。静脈内および経口利用は本発明における投与の好ましい形態であり、経口利用は特に好ましい。
【００３８】
また本発明は、医薬用製剤および／またはダイエタリーフードサプリメント（栄養補助食品）のいずれかとして、新生児、トドラー（ｔｏｄｄｌｅｒｓ）、幼児に本発明の化合物を経口投与するための調合剤として哺乳動物乳、人工哺乳動物乳ならびに代用哺乳動物乳も含む。
【００３９】
また本発明の組成物は、当該医薬用活性塩の形態で投与されることができる。適切な医薬用活性塩は酸付加塩、およびアルカリまたは土類アルカリ塩を含む。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩を得ることができる。
【００４０】
本発明による医薬用組成物は、意図される投与形態、すなわち、錠剤の形では経口投与、カプセル（固形物充填、セミ固形物充填または液体充填の何れかのもの）、構成成分の粉末、通常の薬務と一致するエアゾル製剤の形態で選ばれた適切な担体材料とともに典型的には投薬される。その他の適切な調合剤は、ゲル、エリキシル、拡散性顆粒、シロップ、懸濁液、クリーム、ローション、溶液剤、エマルジョン、懸濁液、分散系などである。持効性のための適切な剤形は、異なる分解速度の層を有する錠剤または活性成分で含浸された放出制御重合体マトリックスを含み、そのような含浸またはカプセル化された多孔性の重合体マトリックスを含む錠剤またはカプセルの形態に形成される。医薬用組成物は本発明の組成物の５〜９５重量％含まれ得る。
【００４１】
医薬的に受容できる担体として、賦形剤および／または希釈剤は、乳糖、澱粉、シヨ糖、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ジカルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール（液体充填カプセル）が使用されることができる。
【００４２】
適切な結合剤には、澱粉、ゼラチン、自然糖、コーン甘味料、アカシアのような天然または合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチル―セルロース、ポリエチレングリコールおよびワックスを含む。このような投薬形態での使用のために言及され得る潤滑剤としては、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩酸ナトリウムなどがある。錠剤分解物質は、澱粉、メチルセルロース、グアールガムなどを含む。また甘味剤および芳香剤および保存剤は適当なものでよい。上記の幾つかの用語、すなわち錠剤分解物質、希釈剤、潤滑剤、結合剤などについては以下により詳細に述べられる。
【００４３】
さらに、本発明の組成物またはモジュレーターは、治療効果を最適化するために、任意の１種以上の成分または活性成分が制御された放出速度を与える持効性のある形態で調合される。持効性のための適切な投薬形態は、異なる分解率の層または活性成分で含浸され放出が制御された重合体マトリックスを含んだ層状の錠剤を含み、このような含浸またはカプセル化された多孔性の重合体マトリックスを含む錠剤形態またはカプセルに形成される。
【００４４】
吸入に適するエアゾル製剤は、例えば窒素のような圧縮された不活性ガスなどの薬剤として許容される担体と組み合わせ得り、溶液または粉末状の固体を含み得る。
座薬を調製するためには、脂肪酸グリセリド混合物のような低融点ワックス、例えばココアバターを先ず溶かし、その中に活性成分を撹拌または撹拌と同様に混合することによって均一に分散させる。次に溶融した均一混合物は適当な大きさの鋳型に注入され、冷却してそれによって固体化される。
【００４５】
また、使用直前に経口または非経口の投与のために液体形態の製剤に変換するように意図した固体形態の製剤も含まれる。そのような液体形態の製剤は、溶液、懸濁液および乳状液を含む。
【００４６】
また本発明の化合物は経皮的にも送達し得る。経皮的組成物はクリーム、ローション、エアゾル、および/またはエマルジョンの形態をとってもよく、またこの目的のための従来技術で、マトリックスまたはリザーバ型の経皮パッチに含まれることができる。
【００４７】
カプセルという用語は、有効成分を含む組成物を保持または含むメチルセルローズ、ポリビニールアルコールまたは変性ゼラチンまたは澱粉で作られた特別な容器または封入器を言う。硬殻カプセルは典型的には比較的高いゲル強度の骨と豚皮ゼラチンの混合物から作られる。カプセルそれ自体は少量の染料、不透明化剤，塑性剤および保存剤を含み得る。
【００４８】
錠剤は、適当な希釈剤とともに有効成分を含む圧縮または鋳込みによる固体の投薬形態を意味する。錠剤は、当業者にとって周知の湿式粒状化、乾式粒状化または圧縮固化によって得られた粒状または混合物を圧縮することによって製剤されることができる。
【００４９】
経口ゲルは親水性の半固体マトリックス内に分散または固化させた有効成分を言う。
構成成分の粉末は、有効成分および水またはジュースに懸濁されることができる適切な希釈剤を含む粉末混合物を言う。新生児、トドラー（ｔｏｄｄｌｅｒｓ）および／または幼児のための経口投薬形態の一例としては、粉ミルクおよび粉ミルクホエイから作られる母乳代替物、及び任意でまた部分的に乳糖で代用されるヒトの母乳代替物がある。
【００５０】
母乳は栄養物と非栄養生体活性成分が豊富である複合流体である。母乳は新生児に必要とされるすべての栄養物を含む。母乳は代謝性成分（脂肪、蛋白質、および炭水化物）、水、および脂肪酸、アミノ酸、ミネラル、ビタミン、微量元素のような組織の成長と発達のために必要な物質を含む。
【００５１】
脂肪の９８％以上がトリグリセリドの形態で存在する。オレイン酸およびパルミチン酸は、比較的含有率の高い必須脂肪酸とリノレン酸を持ち、後ににアラキドン酸およびドコサへキサン酸のような長鎖ポリ不飽和脂肪酸になる母乳トリグリセリドにおいて最も豊富な脂肪酸である。アラキドン酸およびドコサへキサン酸のような長鎖脂肪酸は、脳組織および神経組織の構成成分であり、幼児の知能および視覚の発達に必要とされる。母乳の脂質成分は、プロスタグランジンおよびビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫのような脂肪可溶性微小栄養素のための輸送機関である。
【００５２】
蛋白質は、母乳の窒素含有化合物の約７５％を占める。非蛋白質窒素物質は、尿素、ヌクレオチド、酵素、遊離アミノ酸、およびＤＮＡを含む。母乳の蛋白質は、２つの分類に分けられることができる。ミセル構造のカゼインおよび水溶性のホエイ蛋白質は、約４０:６０の比率で存在する。カゼインは比較的小容量のミセルを形成し、幼児の胃中で柔らかい養毛状の凝結物を産生する。大部分のホエイ蛋白質はラクトアルブミン、ラクトフェリン、分泌型ＩｇＡ、および血清アルブミンであり、多くの他の蛋白質とペプチドを少量伴っている。
【００５３】
主要な炭水化物は乳糖であり、ラクトアルブミンが関与する反応により哺乳類の上皮細胞中でグルコースから産生される二糖類である。
栄養上の成分に加えて、母乳は有効な非栄養機能を有する豊富な生体活性成分を含む。生体活性成分はサイトカインおよび抗炎症性物質などの広範囲の特定または非特定の抗菌因子、ホルモン、成長調節剤および消化性酵素を含み、これらの多くは多様な活性を有する。幼いときは宿主側防御および消化器官の未熟のため、生体活性成分は特に小さい幼児にとって重要であり得る。
【００５４】
本発明の人工母乳配合物または母乳代替物は、本発明の化合物を粉末形態で、商業的に入手可能な母乳配合物を含む母乳配合物に添加することで調製されることが好ましい。本発明の化合物は、３−１００μｇ／１００ｍｌ（商業的に入手可能なもの）で母乳配合物に添加されることが好ましく、より好ましくは５−７０μｇ／１００ｍｌ、最も好ましくは１０−４０μｇ／１００ｍｌで添加される。
【００５５】
好適な希釈剤は、一般的に組成物または投薬形態物の主要部分を構成する物質である。好適な希釈剤は、ラクトース、ショ糖、マンニトールおよびソルビトール、小麦、コーン、米、芋から得られる澱粉及び、及び微結晶性セルロードなどのセルの―ルなどの砂糖類を含む。組成物中の希釈剤の量は組成物総量の約５〜約９５重量％で、好ましくは約２５〜約７５重量％、より好ましくは約３０〜約６０重量％、そして最も好ましくは約４０〜５０重量％の範囲であることができる。
【００５６】
分解剤なる用語は、粉々にして（分解して）薬剤を放出するのを助けるために組成物に添加される物質を言う。好適な分解剤は、澱粉、カルボキシメチルナトリウム澱粉のような「冷水溶性の」修飾澱粉、イナマメ、カラヤ、グアール、トラガカントおよびアガールのような合成ゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリムのような架橋結晶セルロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムのようなアルギネート、ベントナイトのような粘土類、および発泡性混合物などを含む。組成物中の分解剤の量は、組成物の約１〜約４０％重量％、好ましくは約２〜約３０重量％、より好ましくは約３〜２０重量％、そして最も好ましくは約５〜約１０重量％の範囲であることができる。
【００５７】
結合剤は、粉末を相互に結合または「接着」させる物質で、顆粒を形成することで粉末を密着させ配合物中で「接着」するものとして使用する物質の特性を示す。結合剤は希釈剤または充填剤で既に得られている密着力を付加する。好適な結合剤には、ショ糖のような砂糖類、麦、コーン  米および芋から得られる澱粉、アカシア、ゼラチンおよびトラガカントのような天然ゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリム、アルギン酸アンモニウムカルシウムのような海藻誘導体、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムおよびヒドロキシプロピル―メチルセルロースのようなセルロース材料、ポリビニルピロリドン、ケイ酸マグネシウムアルミニウムのような無機材料などが含まれる。組成物中の結合剤の量は、組成物の約１〜３０重量％、好ましくは約２〜約２０重量％、さらに好ましくは約３〜約１０重量％、そしてよりさらに好ましくは、約３〜約６重量％の範囲であることができる。
【００５８】
潤滑剤とは、錠剤や顆粒などが圧縮後、鋳型または金型から解放される際に、摩損または擦損を減少させるために投薬形態に加えられる物質を言う。好適な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、またはステアリン酸カリウムなどの金属ステアリン酸、ステアリン酸、高融点ワックス、及び塩酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、およびｄ’ｌ−ロイシンのような水溶性潤滑剤などを含む。また潤滑剤は、顆粒表面および顆粒間、及び錠剤プレスの一部に存在する必要があるので、圧縮前の最後の段階で加えられる。組成物中の潤滑剤の量は、組成物の約０．０５〜約１５重量％の範囲、好ましくは約０．２〜約５重量％、さらに好ましくは約０．３〜約３重量％、そして最も好ましくは、約０．３〜約１．５重量％の範囲であることができる。
【００５９】
滑剤は、顆粒の凝結を防ぎ、流動が円滑及び均一になるように顆粒相互の流動特性を改善する材料である。好適な滑剤として二酸化ケイ素およびタルクを含む。組成物中の滑剤の量は、組成物の約０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜約７重量％、さらに好ましくは約０．２〜５重量％、そして最も好ましくは、約０．５〜約２重量％の範囲であることができる。
【００６０】
着色剤は組成物または投薬形態に色彩を施す賦形剤である。このような賦形剤には、食品用染料および粘土または酸化アルミニウムのような適切な吸着剤上に吸着させた食品用染料を含むことができる。組成物中の着色剤の量は、組成物の約０．０１〜１０重量％、好ましくは約０．０５〜６重量％、さらに好ましくは約０．１〜約４重量％、そして最も好ましくは、約０．１〜約１重量％でさまざまである。
【００６１】
液体形態の製剤は溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。一例としては、注射液のための水―プロピレングリコール溶液、または経口液のための甘味剤または乳白剤の添加、懸濁液及びエマルジョンに言及され得る。また液体形態の製剤には鼻腔内投薬用溶液をも含み得る。
【００６２】
その他の好ましい医薬用組成物は緩衝液である。緩衝、緩衝系、緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および緩衝液（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）なる用語は、水素イオン濃度またはｐＨに関して使用される場合に、酸またはアルカリの添加または溶剤での希釈に際してのｐＨの変化を阻害するために、システム、特に水溶液系の能力を言う。好適な緩衝系は、以下の緩衝液：蟻酸塩（ｐＫａ＝３．７５）、乳酸塩（ｐＫａ＝３．８６）、安息香酸（ｐＫａ＝４．２）、シュウ酸塩（ｐＫａ＝４．２９）、フマル酸塩（ｐＫａ＝４．３８）、アニリン（ｐＫａ＝４．６３）、酢酸緩衝液（ｐＫａ＝４．７６）、クエン酸塩緩衝液（ｐＫａ２＝４．７６、ｐＫａ３＝６．４）、グルタミン酸塩緩衝液（ｐＫａ＝４．３）、リン酸塩緩衝液、（ｐＫａ＝７．２０）、コハク酸塩（ｐＫａ１＝４．９３、ｐＫａ２＝５．６２）、ピリジン（ｐＫａ＝５．２３）、フタル酸塩（ｐＫａ＝５．４１）、ヒスチジン（ｐＫａ＝６．０４）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ｐＫａ＝６．１５）、マレイン酸（ｐＫａ＝６．２６）、カコジル酸塩（ジメチルアルシネ―ト、ｐＫａ＝６．２７）、炭酸（ｐＫａ＝６．３５）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ−ジアセチック酸、（ｐＫａ＝６．６２）、ＰＩＰＥＳ（４−ピぺラジンビス−（エタンスルホン酸、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ−プロパン(１，３−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン)（ｐＫａ＝６．８０）、エチレンジアミン（ｐＫａ＝６．８５）、ＡＣＥＳ  ２−[（２-アミノ−２−オキソエチル）アミノ]  エタンスルホン酸（ｐＫａ＝６．９）、イミダゾール（ｐＫａ＝６．９５）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフイン）−プロパンスルホン酸（ｐＫａ＝７．２０）、ジエチルマロン酸（ｐＫａ＝７．２）、ＴＥＳ（２−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５０）およびＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシルエチルピぺラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５５）または他のｐＫａが３．８〜７．７の範囲を有する緩衝液からなる群から選ばれることができる。
【００６３】
酢酸塩のようなカルボン酸緩衝液、フマル酸塩、酒石酸塩およびフタル塩のようなカルボキシリック二酸緩衝液（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｄｉａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒｓ）、クエン酸塩のようなカルボキシリック三酸緩衝液（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｔｒｉａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒｓ）の群が好ましい。好ましい緩衝液の別の群は、硫酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、シュウ酸塩、水酸化カルシウムおよびリン酸塩緩衝液のような無機緩衝液が挙げられる。また好ましい緩衝液の別の群は、イミダゾール、ジエチレンジアミン、およびピぺラジンのような窒素含有緩衝液である。
【００６４】
またＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピぺラジン−１−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）およびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）のようなスルホン酸緩衝液も好ましい。
【００６５】
別の好ましい緩衝液の群は、グリシン、グリシル−グリシン、グリシル−グリシル−グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンおよびＮ−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシ−メチル）エチル］グリシン（トリシン）のようなグリシン緩衝液である。
【００６６】
またさらに、グリシン、アラ二ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオ二ン、フェ二ルアラ二ン、チロシン、トリプトファン、リシン、アルギ二ン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、プロリン、４−ヒドロキシピロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｏ−ホスホセリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ−アセチルリシン、ω−Ｎ−メチルアルギ二ン、シトルリン、オルニチンおよびこれらの誘導体のようなアミノ酸緩衝液が好ましい。
【００６７】
緩衝液は、有効なｐＨの範囲が２．７〜８．５、より好ましくは３．８〜７．７であることが好ましい。各緩衝液の有効なｐＨの範囲はは、ｐＫａ−１〜ｐＫａ＋１で定義されることができ、Ｋａは緩衝液中の弱酸のイオン化定数であり、ｐＫａ＝−ｌｏｇＫである。
【００６８】
薬剤使用のために最も好ましい緩衝液は、例えば、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、およびコハク酸塩のような患者への投薬に適した緩衝液である。特に通常使用される医薬用緩衝液は、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、グルタミン酸塩緩衝液、およびリン酸塩緩衝液である。また最も好ましい緩衝液はカルボン酸緩衝液の群である。本願で使用される「カルボン酸緩衝液」なる用語は、カルボキシリックモノ酸緩衝液、カルボキシリック二酸緩衝液、およびカルボキシル三酸緩衝液に言及すべきである。また言うまでもなく、緩衝液の組み合わせ、特に本願で述べた緩衝液の組み合わせは本発明にとって有用である。
【００６９】
好適な医薬剤用緩衝液のいくつかは、クエン酸緩衝液（最終製剤濃度が約２０〜２００ｍＭであることが好ましく、最終製剤濃度が約３０〜１２０ｍＭであることがより好ましい）または酢酸緩衝液（最終製剤濃度が約２０〜２００ｍＭであることが好ましい）またはリン酸緩衝液（最終製剤濃度が約２０〜２００ｍＭであることが好ましい）である。
【００７０】
本発明の化合物の製剤および投与についての技術は、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」  （マックパブリシング株式会社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．)、イーストン、ペンシルバニア州）で分かり得る。本願で述べる化合物を含む好適な組成物は、適切な液体医薬用担体中での化合物溶液、または錠剤、ピル、フィルム状錠剤、被覆錠剤、ドラジェー糖衣錠、カプセル、粉末または沈着剤、ゲル、スラリー、懸濁物、エマルジョン等のような任意の製剤であり得る。
【００７１】
吸入による投与または静脈内投与のために特に好ましい医薬用組成物は、凍結乾燥製剤である。好ましい凍結乾燥製剤を調製するためには本発明の化合物を４〜５％（ｗ／ｖ）のマンニトール溶液内で溶解し、得られた溶液を凍結乾燥する。またマンニトール溶液は上記のような好ましい緩衝液中で調製することもできる。
【００７２】
さらに好適な低温／分散保護剤（充填剤もしくは安定剤ともいう）は、チオール無含有アルブミン、免疫グロブリン、ポリアルキレン酸化物（例えば、ＰＥＧ、ポリプロピレングリコール）、トレハロース、グルコース、ショ糖、ソルビト―ル、デキストリン、麦芽糖、ラフィノース、スタキオース、その他の糖類（例えばＷＯ９７／２９７８２を参照）を含み、一方マンニトールの使用も好ましい。これらは従来の凍結乾燥技術で従来の用量を使用されることができる。凍結乾燥法は、従来の医薬用製剤の調製技術において周知の方法である。
【００７３】
吸入による投薬のために、凍結乾燥された製剤の粒径は２〜５μｍの範囲であることが好ましく、３〜４μｍの範囲であることがより好ましい。凍結乾燥製剤は、特に、例えば、ＯＰＴＩＮＥＢ（登録商標）またはＶＥＮＴＡ−ＮＥＢ（登録商標）吸入器（ＮＥＢＵテック社製、エルゼンフェルト、ドイツ）のような吸入器を用いる投薬に適している。凍結乾燥製品は、吸入投薬のために無菌蒸留水または他の好適な液体中で再水和されることができる。
【００７４】
あるいは静脈内投与のために凍結乾燥製品は、蒸留水または他の適切な液体中で再水和されることができる。
投薬のために蒸留水または他の適切な液体中で再水和した後、凍結乾燥製剤はほぼ再水和された化合物製剤に対する標的組織、例えば静脈内投与のための血液、または吸入投与のための肺組織のおおよその生理的浸透圧を有するべきである。従って再水和された配合物は実質的に等張であることが好ましい。
【００７５】
静脈内、経口、または吸入投与のための好ましい投薬濃度は、１００〜２０００μｍｏｌ／ｍｌであり、より好ましくは２００〜８００μｍｏｌ／ｍｌである。これらはまた母乳代替物、人工母乳配合物または本願に記載される医薬用組成物において好ましい範囲でもある。
【００７６】
本発明のさらに別の態様では、本発明の化合物をダイエタリーサプリメント(栄養補助食品)として使用することに関する。そのようなダイエタリーサプリメントは経口投与が好ましく、以下に限定するものではないが特に新生児、トドラー（ｔｏｄｄｌｅｒｓ）、および／または幼児への経口投与が好ましい。ダイエタリーサプリメントは、栄養を補給することを目的とする。これらの製品の「ダイエットの成分」はさらに、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、およびアミノ酸、および酵素、臓器組織、顆粒状物質および代謝物質などの物質を含み得る。ダイエタリーサプリメントは、錠剤、カプセル、ソフトジェル、ジェルカップ、液体または粉末などの形態で製造され得る。
【００７７】
さらに本発明は代謝性疾患の治療のためのモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、該方法は：
ａ）試験化合物をＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドからなる群から選ばれた少なくとも１種のポリペプチドと接触させること、
ｂ）前記試験化合物の前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドとの結合を検出すること、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドの活性を測定すること
を含む。
【００７８】
本発明のスクリーニング法は、明らかに３段階からなる。試験化合物なる用語は、任意の上記潜在的モジュレーターであり得る。試験化合物が少なくとも１種のポリペプチドと接触することは、例えば化合物ライブラリーの形態で、生理溶液または非生理溶液中でまたは固相系で起こり得るが、液体環境であることが好ましい。試験化合物がポリペプチド結合することが出来る十分な条件と時間が必要である。通常スクリーニングの方法は室温の溶液中で通常ｐＨ５〜ｐＨ９の範囲の適切なｐＨ値で実行されるが、全てのパラメータは当業者ならば容易に選択される。
【００７９】
ポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＫ１、および／またはＧＲＫ５は、初代ヒト細胞、細胞株からの、またはポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および／またはＧＲＫ５の１種以上をコードする核酸配列を含む発現構築体によって形質転換された細胞からの純化により、または直接化学合成によって得られることができる。
【００８０】
ポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＫ１、および／またはＧＲＫ５をコードする核酸配列は、関連する遺伝子のクローン化、ｃＤＮＡｓの増殖または核酸配列の化学合成により得られることができる。対応するポリペプチドの発現のために、核酸配列は組換えバクテリオファ―ジ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターのような発現ベクターに挿入されることができる。
【００８１】
結合なる用語は試験化合物および１種以上のポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＫ１、および／またはＧＲＫ５または１種以上のポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＫ１、および／またはＧＲＫ５をコードする核酸との間の相互作用を言う。蛋白質に結合するためには、結合相互作用は例えば結合分子によって認識される抗原決定基またはエピトープのようなキナーゼの特定の構造の存在によるものである。化合物が核酸に結合するためには、試験化合物は核酸に対して相補的配列を有するかまたは核酸の特定の二次または三次構造に適合することが必要である。
【００８２】
試験化合物のポリペプチドまたは核酸との結合は、この分野で周知の任意の適切な方法でチェックされることができる。分離工程には非結合成分から結合成分を分離することを含まれ得る。試験化合物がポリペプチドまたは核酸と結合しているかどうかをチェックするために、試験化合物が直接検出（放射能、発光、蛍光、光学、電子密度など）または間接検出（例えば、ＦＬＡＧ、Ｖ５またはｍｙｃエピトープなどのエピトープ標識、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼなどの酵素標識、転写産物など）のために標識されていれば有利である。標識は基質、アッセイで用いられる蛋白質または候補薬物に結合され得る。また試験化合物の結合は、固体基質上で成分の１つが固定されていれば都合よくチェックされることもできる。基質は例えばチューブ、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、深棒などの広範な材料で種々の形状に作られることができる。また成分の１つがビオチン化により修飾されているなら、ビオチン化により修飾された成分はストレプトアビジンカバーされた表面上に固定されることができるので有利である。
【００８３】
蛋白質―ＤＮＡ相互作用は、例えばゲルシフトまたはバンドシフト・アッセイすなわち電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）によりチェックすることができ、このアッセイでは蛋白質とＤＮＡの複合体は非変性ポリアクリルアミド・ゲル中を遊離ＤＮＡ断片よりゆっくりと移動することが観察される。
【００８４】
蛋白質―ＲＮＡ相互作用はＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイにより調査されることができ、ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイはゲル電気泳動中の移動スピードの変化により蛋白質―ＲＮＡ相互作用を検出するのに用いられるインビトロ技術である。インキュベーションの後に、結合反応は非変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を介して分離される。蛋白質―ＤＮＡ複合体のように、蛋白質―ＲＮＡ複合体はゲルマトリックス中を遊離ＤＮＡ断片よりもゆっくりと移動する。これは非結合ＲＮＡプローブに関連する移動シフトを引き起こす。特異性は競合反応により決定され、過剰な非標識ＲＮＡは結合反応でインキュベートされて、結果として標識ＲＮＡおよび非標識ＲＮＡ配列が同一の蛋白質に結合するように競合する場合にシフトシグナルは減少する。あるいは、蛋白質―ＲＮＡ複合体は架橋されてもよく、反応は変性ゲルで実行する。特異性は単一シフトバンドの可視化により決定される。蛍光および化学発光検出も可能であるが、従来ではＲＮＡプローブは検出のために放射性標識される。非放射性ＲＮＡ末端標識技術には限界があるが、今日ではさらなる汎用性ビオチンや蛍光標識方法が利用可能である。あるいはサンプルから蛋白質―ＲＮＡ複合体を選択的に抽出するＲＮＡプルダウンアッセイを実行することができる。この方法は幾つかのＲＮＡが標的蛋白質とともに使われることができるという有利な点を有し、選択的に結合するＲＮＡを特定することが可能である。典型的には、ＲＮＡプルダウンアッセイは、ビオチンまたはアジドフォスフィン化学など高親和性タグを利用する。ＲＮＡプローブは、ビオチン化され細胞溶解物からの蛋白質と複合化され、次にアガロースまたは磁気ビーズを用いてで精製されることが可能である。あるいは、蛋白質を標識し得ること、またはＲＮＡ−蛋白質複合体を目的の蛋白質に対する抗体を用いて分離し得る。ＲＮＡは次にノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ分析により検出され、蛋白質はウエスタンブロット法または質量分析法で検出される。また蛋白質―ＲＮＡ相互作用はオリゴヌクレオチド標的リボヌクレアーゼＨ保護アッセイ（ＲＰＡ）により特定されることもでき、オリゴヌクレオチド標的リボヌクレアーゼＨ保護アッセイは細胞抽出物中のＲＮＡおよびＲＮＡ断片を検出するための強力な方法である。ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ分析とは異なり、ＲＰＡアッセイは、ハイブリダイゼーション及び検出に非常に短いセグメントを必要とし、標的ＲＮＡの整合性においてより柔軟性が大きくなる。またＲＰＡアッセイは蛋白質―ＲＮＡ相互作用をマッピングするために用いられることもできる。ＲＰＡの適応において、リボヌクレアーゼＨはＤＮＡプローブとハイブリダイズされた特異的部位で標的ＲＮＡ分子を切断するために用いられる。蛋白質が標的配列でＲＮＡと結合する場合には、プローブハイブリダイぜーションを防ぎ、リボヌクレアーゼＨによる切断を防ぎ、そして蛋白質とＲＮＡの相互作用の部位を示すであろう。リボヌクレアーゼＨは、目的のＲＮＡ分子を切断するためにＤＮＡプローブと４つの塩基対ハイブリッドのみを必要とする。多くの小プローブを使うことでＲＮＡの全体配列を相互作用の部位のためにマッピングされることができる。
【００８５】
ペプチドと蛋白質の相互作用は様々な方法でそれぞれ調査されることが可能であり、それらの方法には以下に限定されるものではないが、蛋白質結合マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、蛋白質チップおよび様々なアッセイ、ＵＶ架橋実験などを含む。
【００８６】
核酸間の相互作用は、例えば相補ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ−配列のアニーリングに基づくハイブリダイゼーションによりチェックすされることができる。ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で試験化合物として利用される核酸のサンプルに添加されてもよい。適切なインキュベーション期間の後、サンプルは洗浄されシグナルは定量化されて基準値と比較される。患者サンプル中のシグナル量が比較可能なコントロールサンプルのシグナル量とは著しく変化している場合には、ヌクレオチド配列はサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしているので、サンプル中でＧＲＫ５をコードするヌクレオチド配列に一定レベルの変化の存在は、関連する障害の存在を示す。またそのようなアッセイは、動物研究、臨床試験または個々の患者の治療をモニタリングする際の特定の治療的処置計画(レジメン)の有効性を評価するためにも使用され得る。また核酸の相互作用はマイクロアレイで調査されることができる。核酸間の結合を試験するさらなる方法はゲルシフト法の利用があり、ゲルシフト方法ではハイブリッド分子は電気泳動により変性ゲル中でより遅く流れる。
【００８７】
本発明のポリペプチドの発現およびキナーゼ活性を調節（刺激または阻害)する化合物を特定する全ての方法において、本発明のポリペプチドの発現レベルとキナーゼ活性は試験化合物の非存在で検出された発現レベルとキナーゼ活性と比較される。本発明は、特に本発明のポリペプチドのキナーゼ活性に阻害活性を持つ化合物の特定に関する。従って特に発現と活性の測定される阻害に関する。
【００８８】
ポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルの核酸の阻害は、ウエスタンブロット法または酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの定量的方法によってポリペプチドの発現を調査することでチェックされることができる。さらに蛋白質発現を定量化する方法は融合蛋白質を測定することで、本発明のポリペプチドは蛍光蛋白質のように定量化することが容易な蛋白質または蛋白質断片（フラグメント）と融合される。ＤＮＡの阻害およびそれによるｍＲＮＡの産生の阻害は、ｍＲＮＡ定量化によってチェックされることができる。ｍＲＮＡのレベルはノーザンブロッティングにより定量的に測定されることができる。別の方法は、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応  (ＲＴ−ＰＣＲ、続いて起こるｑＰＣＲ）である。ｍＲＮＡの定量化の別の方法はマイクロアレイを用いる方法であり、しかしながらマイクロアレイを用いる方法はｍＲＮＡの大規模なセットが調査される場合により実用的である。
【００８９】
蛋白質レベルでのポリペプチドの阻害は、ポリペプチドの活性を測定することで調査されることができる。ポリペプチド/蛋白質/酵素の活性の決定は当該特異性に依存する。従って、キナーゼの活性はリン酸化反応アッセイで測定され、基質はキナーゼによりリン酸化される。ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５のキナーゼ活性は、例えば放射性標識されたリン酸塩を有するＡＴＰをポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５を含む系および基質に添加し、基質に付着したリン酸塩の放射性を測定することで検出されることができる。
【００９０】
本発明によれば、本発明のポリペプチドのキナーゼ活性への試験化合物の効果は、膵臓細胞のあるいは膵臓細胞から得られたインスリン産生細胞株またはプライマリ細胞を用いた系中で評価されることができる。その点でインスリン放出レベルの変化は試験化合物を用いない放出レベルと比較される。インスリン放出レベルはｍＲＮＡおよび上記で特定された蛋白質定量化レベルで評価されることができる。
【００９１】
ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５のポリペプチドは、キナーゼ活性の調節能力のための試験化合物でアッセイするために高生産性スクリーニングで用いられることができる。これらの試験化合物は、キナーゼ活性に対する試験化合物の効果を決定するために機能性キナーゼに対してさらにスクリーニングされることができる。さらにこれらの化合物は、活性/有効性を決定するために動物または無脊椎系で試験されることができる。化合物は所望の度合いでキナーゼを活性(作用薬)または不活性(拮抗薬)することが特定されることができる。さらに、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５は、キナーゼ蛋白質と通常キナーゼ蛋白質と相互作用する分子、例えば基質またはキナーゼ蛋白質が通常相互作用するシグナル経路の成分(例えば、別のキナーゼ)）の相互作用を刺激または阻害する能力のために化合物をスクリーニングするために用いられることができる。そのようなアッセイは典型的には、キナーゼ蛋白質またはフラグメント（断片）を標的分子と相互作用させることができる条件下でキナーゼ蛋白質を候補化合物と結合するステップと、蛋白質と標的との複合体の形成を検出すること、または、例えば、蛋白質のリン酸化、ｃＡＭＰ代謝回転およびアデニル酸シクラーゼの活性化などのシグナル伝達の任意の関連効果などのような、キナーゼ蛋白質と標的との相互作用の生化学的結果を検出することを含む。
【００９２】
またＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５のポリペプチドは、キナーゼと相互作用する化合物(例えば、結合相手および/またはリガンド)を発見するようにデザインされた方法において競合結合アッセイにも有用である。従って化合物は、化合物が結合あるいはポリペプチドと相互作用することができる条件下で、キナーゼポリペプチドに曝される。また可溶性キナーゼポリペプチドも混合物に添加される。試験化合物が可溶性キナーゼポリペプチドと相互作用する場合には、形成された複合体の量または標的とするキナーゼの活性は減少する。このアッセイの形式は、キナーゼの特定領域と相互作用する化合物を探求する場合に特に有用である。
【００９３】
本発明のペプチドの発現と活性化のためのモジュレーターの特定を容易にするために、さらに発明は好ましい実施の形態では：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、
および/または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、および/またはＧＲＫ５をコードする核酸、
および
ｃ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物。
【００９４】
を含むキットを提供する
さらに好ましい実施の形態では、本発明は：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、
および/または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、および／またはＧＲＫ５をコードする核酸、
および
ｃ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１および/またはＧＲＫ５ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物、
さらに、
ｄ）インスリン産生細胞株。
【００９５】
を含むキットを提供する。
さらに好ましい実施の形態では、本発明は：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５ポリペプチド、
および/または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸、
および
ｃ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているキナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５それぞれのコントロール化合物
を含むキットを提供する
さらに好ましい実施の形態では、本発明は：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５ポリペプチド、
および/または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸、
および
ｃ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているキナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５それぞれのコントロール化合物、
さらに、
ｄ）インスリン産生細胞株。
【００９６】
を含むキットを提供する。
キットを用いた全ての実施の形態において、コントロール化合物は上記で特徴付けされた任意の試験化合物であることができる。コントロール化合物は、試験化合物の結合/阻害の有効性を参照するために用いられ、それは選択されたポリペプチドまたは選択されたポリペプチドをコードする対応核酸に結合しそれによりポリペプチドの活性または発現を阻害することが知られているからである。選択されたコントロール化合物は、阻害化合物が試験されるための同一のポリペプチドを参照し、例えば、ＳＣＹＬ１の阻害のための複数の化合物がテストされる場合には、コントロール化合物は、ＳＣＹＬ１を阻害する化合物である。
【００９７】
さらに好ましい実施の形態では、キットはポリペプチドＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、ＧＲＫ５および/またはＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、ＧＲＫ５の対応核酸を含むなら特に好ましい。
【００９８】
ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、ＧＲＫ５ポリペプチに結合することでインスリン放出に影響を与えるコントロール化合物は、例えば、スニチニブおよび本発明のｓｉＲＮＡまたはインスリン産生を調節することが立証されている任意の他の化合物である。
【００９９】
さらに本発明は、炭水化物代謝性疾患の、好ましくは真性糖尿病の、より好ましくは２型真性糖尿病の治療のための、最も好ましくは膵臓細胞からのインスリン放出のレベルを増加させるための方法に関し、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種のチロシンキナーゼの阻害または活性化、
または
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーションまたは活性化
のための少なくとも１種のモジュレーターの医薬的に効果のある量を必要とする被検者に投与することを含む。
【０１００】
ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５ポリペプチドの発現および/または活性に影響を与えることが知られている本発明の化合物は、代謝性疾患の、好ましくは真性糖尿病の、より好ましくは２型真性糖尿病の治療のため、最も好ましくは膵臓細胞からのインスリン放出のレベルを増加させるために、上記概略のように薬剤の範囲内で本発明の化合物を投与することで使用されることができる。本発明の好ましい実施の形態では、ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５の少なくとも２つが１つ以上の本発明の化合物により調節される。
【０１０１】
本発明の化合物または本発明の組成物は、本発明によると、代謝性疾患、好ましくは炭水化物代謝性疾患からなる疾患群の疾患ごとに有用である。
インスリン放出に対するキナーゼＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５の影響は、限定されるものではないが、特に炭水化物代謝性疾患、好ましくは真性糖尿病、より好ましくは２型真性糖尿病の診断のためにポリペプチドの利用を示唆する。
【０１０２】
明細書に記載される実施の形態および以下の実施例は、本発明を例示する目的で提示されるものであって本発明を限定する目的は含まれない。当業者にとって明白な本発明の変形や変更および本願に記載される実施の形態と同等の解法は、本発明の特許請求の範囲が保護する範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】キノ―ムスクリーニングにおける正または負の調節キナーゼの類別を示す図。候補キナーゼは階層的クラスタリングおよびプロポージングを用いることで限定されインスリン放出を１５％著しく増加させた。さらに、データはポシティブおよびネガティブコントロールとしてスニチニブ治療（５μＭ）および非標的ｓｉＲＮＡと相関させた。結果は、ｎ≧４生物学非依存性実験として示される。
【図２】キナーゼＳＣＹＬ１（図２Ａ）、ＧＲＫ５（図２Ｂ）およびＡＤＣＫ１（図２Ｃ）にｓｉＲＮＡ配列をそれそれ用いて標的破壊に対するインスリン放出の増加の相関性を示す図。キナーゼのインスリン放出は（棒グラフ、上方パネル）ｓｉＲＮＡのノックダウン効果に相関し、ＲＴ−ＰＣＲおよびデンシトメトリーをスキャンすることでモニターされた（アガロースゲル；中間パネル；△破壊；下部パネル）。インスリン増加およびノックダウン効果は、インスリン放出または非標的ｓｉＲＮＡの遺伝子破壊と比較される。
【図３】キナーゼＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１のインスリン放出の増加の有効性を示す図。ＳＣＹＬ１は約４６．３８±５．５１％で遺伝子破壊後にインスリン放出の最も確実な増加を示し、次にＧＲＫ５（４１．２３±１．５３％）およびＡＤＣＫ１（３３．９５±９．２０％）である。コントロールのスニチニブは７６．５２±１３％であった。
【図４】キナーゼ対ＳＣＹＬ１およびＡＤＣＫ１のダブルノックダウンによるンスリン放出のさらなる増加を示す図。破壊は結果として最も多くのインスリンを放出（９０．６４±１７．３２％）なり、これはスニチニブ治療の後のインスリンに匹敵した。数字はシングルノックダウンの値（淡い灰色および灰色）、理論数値（濃い灰色から灰色に転換）、実際のインスリンはダブルノックダウンの後に増加する（濃い灰色）。
【図５】ＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の遺伝子発現の減少によるＡＫＴ１のリン酸化を示す図。
【図６】２４時間のスニチニブ治療によるＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１のｍＲＮＡレベルの測定を示す図。
【図７】ベータＣ２Ｃ１２および３Ｔ３−Ｌ１細胞において候補キナーゼ遺伝子ノックダウンによる蛍光グルコース類似体２-ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【図８】ベータＣ２Ｃ１２および３Ｔ３−Ｌ１細胞の候補標的ノックダウンによるＡＫＴ１のリン酸化を示す図。
【図９】ベータＴＣ６細胞により放出されたインスリンの潜在的グルコース介在効果の分析を示す図。
【図１０】低グルコース培地での遺伝子発現の減少後にベータＴＣ６細胞より放出されたインスリンを示す図。
【図１１】ＧＲＫ５の一次ヒット化合物のＩＣ50のグラフを示す図。
【図１２】ベータＴＣ６細胞系で化合物１−５によりＧＲＫ５の阻害後のインスリンの放出を示す図。
【図１３】シクロヘキシミドおよびＧＲＫ阻害剤治療で蛋白質生合成の阻止後に放出されたインスリンを示す図。
【図１４】ＧＲＫ５阻害剤によるベータ−ＴＣ６細胞のＡＫＴのリン酸化を示す図。
【図１５】化合物５μＭを用いて低グルコース環境（１．２５ｍＭ）でＧＲＫ５の阻害後のベータＴＣ６細胞により放出されたインスリンを示す図。
【図１６】化合物１０μＭを用いて低グルコース環境（１．２５ｍＭ）でＧＲＫ５の阻害後のベータＴＣ６細胞により放出されたインスリンを示す図。
【０１０４】
図１７-２１の解説：
１＝ｗｏ２-ＮＢＤＧ＋化合物（グルコースのない培地+化合物）。
２＝ｗｏ２-ＮＢＤＧ（グルコースのない培地）。
【０１０５】
３＝１００μＭ の２−ＮＢＤＧ。
４＝１００μＭ の２−ＮＢＤＧ＋化合物。
上部パネルは左から右に常に化合物１-３を示す。下部パネルは左から右に常に化合物４−５およびスニチニブを示す。(図２０および２１：スニチニブは用いない。)
【図１７】Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のＧＲＫ５阻害後のグルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【図１８】ベータＴＣ６細胞のＧＲＫ５阻害後のグルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【図１９】ベータ３Ｔ３−Ｌ１細胞のＧＲＫ５阻害後のグルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【図２０】成熟Ｃ２Ｃ１２管状筋細胞のＧＲＫ５阻害後のグルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【図２１】３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞のＧＲＫ５阻害後のグルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
【表１】
2013536815.tif 000003
【０１０７】
［実施例］
実施例１：膵臓ベータ細胞株ベーターＴＣ６のｓｉＲＮＡスクリーニング
スニチニブ治療後の高インスリン放出の原因であろうキナーゼを特定するために、我々はキノームーワイド（ｋｉｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）ｓｉＲＮＡノックダウンスクリーニングを実行した。各キナーゼ激減のインスリン放出の効果は、ラット/マウス  インスリン  ＥＬＩＳＡを用いてモニターされた。得られたデータは、ポジティブコントロールとしてスニチニブ治療（５μＭ）と比較され、非標的ｓｉＲＮＡと相関させた。候補遺伝子は、階層的に集積して用いることによって、及び１５％インスリン放出を著しく増加/減少を提示することによって限定された。ＳＣＹ１様１(ＳＣＹＬ１)、ａａｒＦ含有キナーゼ１（ＡＤＣＫ１）およびＧ蛋白質結合受容体キナーゼ５（ＧＲＦ５）の激減は、コントロールｓｉＲＮＡと比べて、ベータ−ＴＣ６細胞にインスリン放出を高めることになり、それらのキナーゼをインスリン放出の潜在的ネガティブモジュレーターとする（図１）。
実施例２：ネガティブモジュレーターの有効性
ネガティブモジュレーターキナーゼＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の有効性確認のために、標的遺伝子は、４つの異なるｓｉＲＮＡ配列それぞれを用いて激減させた（図２Ａ−Ｄ）。遺伝子激減は７２時間後にｍＲＮＡレベルで測定され、一方インスリン放出は２時間インキュベーション後ラット/マウス  インスリン  ＥＬＩＳＡを用いて測定された。残留キナーゼＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の激減は異なる効率で増加したインスリン放出につながった。さらに、５０からほぼ１００％の範囲でＲＴ−ＰＣＲおよびデンシトメトリーをスキャンすることによって評価され、キナーゼのインスリン放出はＳＣＹＬ１およびＡＤＣＫ１のそれぞれのノックダウン効率と逆相関した。全ての配列が等しいノックダウン効率となるＧＲＫ５の場合には、この相関関係は観察されなかった。増加はＳＣＹＬ１（４６．３８±５．５１％）の激減で最高となり、次にＧＲＫ５（４１．２３±１．５３％）、そしてＡＤＣＫ１（３３．９５±９．０２％）である。スニチニブは、コントロールとして含められた（図３）。これはインスリン放出を誘発してこれらのキナーゼの役割を高めるものである。
【０１０８】
【表２】
2013536815.tif 000004
【０１０９】
実施例３：有効性キナーゼのダブルノックダウンの結果
スニチニブ治療と比較すると、シングルノックダウンの効果は、インスリン放出の誘発に複数のキナーゼの関与を示唆しているとははっきりとは断言されなかった。候補キナーゼは様々なシグナル経路で広範囲に広がる。キナーゼがインスリン放出に関して冗長効果あるいは相加効果のどちらを持つのかを調べるために、実施可能なキナーゼ対それぞれについて我々はダブルノックダウンを実施した。ダブルノックダウンによるインスリン増加はシングルノックダウンおよび非標的ｓｉＲＮＡと相関した。１６のキナーゼ対の内、ＳＣＹＬ１とＡＤＣＫ１激減は結果として最大のインスリン放出となり（９０．６４±１７．３２％）、スニチニブが誘発するインスリン放出に匹敵した(図４)。他のキナーゼ対は、シングルノックダウンと比べてインスリン放出の増加は見られなかった（データは示さず)。
実施例４：ベーターＴＣ６のキナーゼＣ候補遺伝子発現の減少によるＡＫＴ１のリン酸化
ＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の遺伝子発現はｓｉＲＮＡにより阻害された。ＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の下方調節は許容標準偏差で（ＳＣＹＬ１：４３．７３±３．３７％；ＧＲＫ５：９６．５３±２８．８７％；ＡＤＣＫ１：）ＡＫＴのリン酸化を高めた (図５)。遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介による減少がＡＫＴのリン酸化を結果として増大させたことが結論づけられることができる。前述の通りこの増大はレイビガー、Ｂおよびその同僚らによる文献によればインスリン放出に関係すると思われる。（レイビガーら（Ｌｅｉｂｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）  ２０１０年、２４；ｐ１８２４−１８３７）。
実施例５：２４時間のスニチニブ治療におけるＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１のｍＲＮＡレベル測定
ベータＴＣ６細胞は、１μＭ，５μＭでそれぞれスニチニブを２４時間処置された。ｍＲＮＡレベルを測定することで遺伝子発現の阻害が証明された。スニチニブ治療は候補キナーゼのｍＲＮＡレベルに負の影響を与える（図６）。この見解はスニチニブがより長期間使用される臨床現場において糖尿病患者に対してスニチニブの正の効果のさらなる説明を示すだろう。
実施例６：ベータＣ２Ｃ１２および３Ｔ３−Ｌ１細胞における候補キナーゼノックダウンによる蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込み
候補遺伝子発現の減少と呼応して細胞のグルコース取り込みが調査された。ＡＤＣＫ１は９．７２±３．８１％増加を示した一方、ＧＲＫ５の下方調節はＣ２Ｃ１２における２−ＮＢＤＢの取り込みに著しく影響する（ＧＲＫ５：２１．２４±３．９６％）。３Ｔ３−Ｌ１細胞では、ＳＣＹＬ１の遺伝子減少による遺伝子発現の減少は、グルコースの取り込みに対し影響することを示す(９．４５±３．４５％）(図７)。全てのデータは平均値として提示される（±ＳＥＭ）。Ｇ蛋白質結合受容体キナーゼ５（ＧＲＫ５）およびＡＤＣＫ１の発現の減少は、インスリン刺激を必要とせずにマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）でグルコース類似体２−ＮＢＤＧ（２１．２４±３．９６％）の取り込みを高めて、それによりＧＲＫ５はインスリン感受性および/またはインスリン非依存性グルコースの取り込みを引き起こすと思われると結論付けられることができる。
実施例７：Ｃ２Ｃ１２および３Ｔ３−Ｌ１細胞の候補標的ノックダウンにおけるＡＫＴ１のリン酸化
ＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の遺伝子発現の減少におけるＡＫＴ１リン酸化が研究された。図解するように、ＳＣＹＬ１およびＧＲＫ５の下方調節はＣ２Ｃ１２細胞でＡＫＴ1のリン酸化を増大させる。３Ｔ３−Ｌ１モデルシステムでは、我々は全ての候補キナーゼのＡＫＴ１リン酸化の減少を検出した（図８)。末梢組織では、ＡＫＴ１リン酸化は、ＧＬＵＴ４転座と関係があり、そのためグルコースの取り込みと関係があることが結論付けられることができる。ベーターＴＣ６細胞株において、ＳＣＹＬ１およびＧＲＫ５のノックうダウンはＡＫＴ１のリン酸化を増大させる。さらに、Ｃ２Ｃ１２細胞における２-ＮＢＤＧ取り込みアッセイの結果、および候補遺伝子発現の減少によるベータ−ＴＣ６でのＡＫＴ１リン酸化の観察される増大は、高インスリン放出に関してＧＲＫ５の機能的役割を説明するだろう。
実施例８：ベータＴＣ６細胞により放出されたインスリンへの潜在的グルコース介在効果の分析
外部グルコースの影響は、グルコースを含まないコントロールと比較して１．１２５から４．５ｍＭの範囲のグルコース濃度で調査された(図９)。生理的濃度から病理生理学的濃度の範囲(１ｇ/Ｌ(５．５ｍＭ)から４．５ｇ/Ｌ(２５．５ｍＭ)までの範囲)の異なるグルコース濃度のベータＴＣ６細胞培地への添加は、結果的にインスリン放出は濃度依存的に増加しない。しかしながら、０．８ｇ/Ｌ（４．５ｍＭ）を下回る濃度で使用すると、グルコースはインスリンのグルコース依存的放出を示した（Ｐｏｉｔｏｕｔら、「糖尿病  （Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、１９９５年、４；ｐ３０６−３１３）。従って低グルコース環境での今後の実験では０．２ｇ/Ｌ（１．１２５ｍＭ）のグルコース濃度が選択された。
実施例９：低グルコース培地における遺伝子発現の減少後のベータＴ６細胞によるインスリン放出
インスリン放出は０．２ｇ/Ｌ（１．１２５ｍＭ）低グルコース環境下で遺伝子発現の減少により媒介された（図１０）。ＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１のノックダウンは低グルコース環境下でインスリン放出を減少させると思われることを結論付けられることができる。実施されたＭＴＴアッセイは細胞生存率を損なわないことを示した。
実施例１０：医薬品開発のための抗糖尿病標的としてのＧＲＫ５
８８００カスタマー（ｃｏｓｔｏｍｅｒ）化合物は、ＧＲＫ５の酵素力を阻害するための８８００カスタマー（ｃｏｓｔｏｍｅｒ）化合物の能力をスクリーニングされた。スクリーニングはＡＤＰ  Ｇｌｏ（登録商標）キナーゼアッセイ技術（プロメガ株式会社製）を用いて実施された。小分子量化合物は原液濃度１０ｍＭで送達され、１００μＭの最終アッセイ濃度で試験された。平均阻害率が３．２％で標準偏差が１１％の狭いヒット分布が観察された。その結果、３６．１％（＝ｉｎｈａｖ＋（３Ｘｉｎｈｓｔｄｅｖ））より大きい阻害値を持つ化合物は、ヒットとして考慮されるものとして推奨される。最上の候補化合物を表３に要約する。スクリーニングにより特定された５つ全ての化合物は、２００から４５０ｇ/ｍｏｌの範囲の分子量を有する。
【０１１０】
【表３】
2013536815.tif 000005
【０１１１】
ＩＣ50値は、希釈係数を３として１２の濃度で三重で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）決定された。三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）は３つの異なるアッセイプレートで測定された。最大化合物アッセイ濃度は、一次スクリーニングで使用された化合物アッセイ濃度である１００μＭに設定された。化合物プレートでの最大化合物濃度は１０ｍＭ（アッセイ中、＞１％ＤＭＳＯ濃度）なので、より大きな最大化合物アッセイ濃度は達成できなかった。全てのアッセイプレートで、Ｚ素数値はデータの統計的有意性を示す０．５よりもかなり大きいことがわかった（表４を参照）。大部分の一次スクリーニングヒットは、１００μＭ一次スクリーニング濃度でＧＲＫ５阻害率が５０％よりも少ないことを示したので、最大化合物濃度１００μＭで全てのＩＣ50のグラフの大部分も阻害率５０％に達しなかった。最大化合物濃度１００μＭで少なくとも３０％のＧＲＫ５の阻害率が観察された場合には、最大化合物濃度１００μＭで少なくとも３０％のＧＲＫ５の阻害率が観察されたような化合物ではＩＣ50値が挿入された。実験した化合物の６２％で、有効なＩＣ50値が決定されることができた。残り３８％の化合物は、最も高い化合物濃度１００μＭで阻害率３０％よりも少なかった（図１１、表４）。
【０１１２】
【表４】
2013536815.tif 000006
【０１１３】
実施例１１：ベータＴＣ６―細胞系における化合物１−５によるＧＲＫ５阻害後のインスリンの放出
ＧＲＫ５阻害剤治療によりベータ−ＴＣ６細胞におけるインスリン放出は増加した。化合物２（Ｃ２）、化合物３（Ｃ３）、化合物５（Ｃ５）による阻害は、我々のシステムにおいてス二チニブ（ＳＵＴ）の効果を２倍にすることでインスリン放出を高める最も著しい効果をもたらした（Ｃ２：５μＭで２．５８±０．９４、１０μＭで２．０１±０．１９；Ｃ３：５μＭで３．５２±１．３５、１０μＭで２．１５±０．５９； Ｃ５：５μＭで１．９３±０．５、１０μＭで１．６９±０．１９）(図１２)。これらの値は表５にも示した。
【０１１４】
【表５】
2013536815.tif 000007
【０１１５】
全てのＧＲＫ５スクリーニングを基礎とする阻害剤は、ベータＴＣ６細胞系でインスリン放出を刺激することが示された。従って、標的ＧＲＫ５は、インスリン分泌の重要な調節因子として実証されている。さらに、我々の系では、化合物２、３および５による阻害は、ス二チニブの効果を２倍にすることでインスリン放出を高める最も著しい効果につながった（Ｃ２：５μＭで２．５８±０．９４、１０μＭで２．０１±０．１９；Ｃ３：５μＭで３．５２±１．３５、１０μＭで２．１５±０．５９；Ｃ５：５μＭで１．９３±０．５、１０μＭで１．６９±０．１９）。
実施例１２：シクロへキシミドとＧＲＫ５阻害剤治療で蛋白質の生合成の阻止後に放出されたインスリン
インスリン放出においてＧＲＫ５阻害剤の効果は増強されたインスリン合成に基づくものではないことがわかった。インスリン放出はシクロヘキシミド(ＣＨＸ)とＤＭＳＯの平均値（±ＳＥＭ）で処理したコントロールと比較したシクロヘキシミドと適切な５μＭ化合物治療により測定された（図１３）。蛋白質転写が阻止されてそれにより蛋白質生合成によりインスリンが再生することは、ＧＲＫ５阻害剤化合物に曝すことでインスリン放出に影響しないことが結論づけられることができる。
実施例１３：ＧＲＫ５阻害剤によるベータＴＣ６細胞におけるＡＫＴ１リン酸化
ＡＫＴ１のリン酸化は、ＧＲＫ５阻害剤治療で測定された。ベータＴＣ６細胞は適切な化合物５μＭと１０μＭ各々で治療され、ＤＭＳＯコントロールおよびＡＫＴ蛋白質レベルと比較された。ＡＫＴ１は、１μｇ/ｍＬインスリン処理によりリン酸化され、それに関してＡＫＴ１のリン酸化はＧＲＫ５阻害剤と処理することで高められることが特徴づけられることができる(図１４)。これとは対照的に、コントロールとしてのス二チニブは、インスリンを媒介したＡＫＴ１リン酸化の増加を減少させる。前記のＡＫＴリン酸化および２−ＮＢＤＧ取り込みのためのノックダウン研究とともに、ＧＲＫ５はグルコースの取り込みに影響を与えるのでそれによりインスリンの放出を増加させることになることを我々は示唆する。
実施例１４：低グルコース環境下（１．２５ｍＭ）でＧＲＫ５阻害後にベータＴＣ６細胞により放出されたインスリン
低グルコース環境下でのＧＲＫ５の阻害は、５μＭ処理（図１５）と１０μＭ処理（図１６）後インスリン分泌を減少させることになった。明らかにした化合物の５μＭと１０μＭそれぞれによるＧＲＫ５の阻害は結果として低グルコース培地（１．１２５ｍＭ）でのインスリン放出の減少につながったと結論づけられることができる。実施されたＭＴＴアッセイは細胞生存率を損なわないことを示した。
実施例１５：Ｃ２Ｃ１２、ＴＣ６、３Ｔ３−Ｌ１および細胞にＧＲＫ５化合物を処理した後の２−ＮＢＤＧを介したグルコースの取り込み
５つ全ての化合物のＣ２Ｃ１２（図１７）およびＴＣ６（図１８）細胞において、ＧＲＫ５の阻害は蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤの増加した取り込みをにつながった。我々は、ＧＲＫ５の阻害はインスリンを必要とすることなくグルコースの感受性を増加させることにつながることを示唆する。従ってＧＲＫ５のリン酸化の阻止はインスリンの代用となることができた。
【０１１６】
グルコースのベータＴＣ６細胞内への取り込みの増加は、以前に観察されたＡＫＴリン酸化及びインスリンを放出させる傾向がある。どういう訳か、グルコースの３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞（図１８）への取り込みは化合物２のみにより刺激されることができたが、これは細胞モデルが恐らく適切ではないかまたは分化されるべきであるということを示唆している。
【０１１７】
データは表６に要約する。
【０１１８】
【表６】
2013536815.tif 000008
【０１１９】
実施例１６：成熟Ｃ２Ｃ１２管状筋細胞および３Ｔ３−Ｌ１においてＧＲＫ５化合物処理後の２−ＮＢＤＧを介したグルコースの取り込み
５つ全ての化合物で成熟Ｃ２Ｃ１２管状筋細胞（図２０）および３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（図２１）において、ＧＲＫ５の阻害は蛍光グルコース類似体２-ＮＢＤＧの増加した取り込みにつながった（表４に要約される）。Ｃ２Ｃ１２細胞の系列では、化合物１−５によるＧＲＫ５阻害後に成熟管状筋細胞は増加する２-ＮＢＤＧの取り込みをを示す。さらに、成熟脂肪細胞も５つ全ての化合物に応答し、それは脂肪細胞のグルコース代謝は基本的により高いので容易に検出されることができたことを示唆している。
【０１２０】
【表７】
2013536815.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月19日(2013.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モジュレーターであって、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種の蛋白質キナーゼの阻害、
または
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーション、
のための、
炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーター。
【請求項２】
前記疾患は糖尿病である、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項３】
前記疾患は２型真性糖尿病である、請求項１または請求項２に記載のモジュレーター。
【請求項４】
前記モジュレーターはインスリン産生の上方調節およびインスリン放出の少なくともいずれかに有用な、請求項１、請求項２または請求項３に記載のモジュレーター。
【請求項５】
前記モジュレーターは、
ａ）小分子、
ｂ）ＲＮＡ分子、
ｃ）ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子の前駆体、ｄ）アンチセンス  オリゴヌクレオチド、
ｅ）アプタマー、
ｆ）ポリペプチド、
ｇ）抗体、または、
ｈ）リボザイム、
である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のモジュレーター。
【請求項６】
炭水化物代謝性疾患を治療するための請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の前記モジュレーターを含む医薬用組成物。
【請求項７】
前記疾患は糖尿病である、請求項６に記載の医薬用組成物。
【請求項８】
前記疾患は２型真性糖尿病である、請求項６または請求項７に記載の医薬用組成物。
【請求項９】
インスリン産生の上方調節およびインスリン放出の少なくともいずれかのために用いられる、請求項６、請求項７または請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーターをスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ）試験化合物をＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドからなる群から選ばれた少なくとも１種のポリペプチドと接触させること、
ｂ）前記試験化合物と前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１またはＧＲＫ５ポリペプチドとの結合を検出すること、および、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１またはＧＲＫ５ポリペプチドの活性を測定すること、
を含む方法。
【請求項１１】
ポリペプチドの代わりに前記ポリペプチドをコードする核酸を用いて、前記活性の代わりに発現率を測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験化合物は、ＲＮＡまたはペプチドまたは抗体またはキナーゼ阻害剤である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
キットであって、
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１、およびＧＲＫ５ポリペプチドの少なくともいずれか
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸、およびＧＲＫ５をコードする核酸、
ｃ）インスリン産生細胞株、
ｄ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５ポリペプチドの少なくともいずれか、または対応核酸の結
合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物  を含むキット。
【請求項１４】
代謝性疾患の治療のための方法であって、：
ａ）ＳＣＹＬ１、ＡＤＣＫ１およびＧＲＫ５からなる群から選ばれた少なくとも１種のチロシンキナーゼの阻害または活性化、または、
ｂ）ＳＣＹＬ１をコードする核酸、ＡＤＣＫ１をコードする核酸およびＧＲＫ５をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーションまたは活性化、
のための少なくとも１種のモジュレーターの医薬的に効果のある量を必要とする被検者に投与することを含む、
代謝性疾患の治療のための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
［実施例］
実施例１：膵臓ベータ細胞株ベータ−ＴＣ６のｓｉＲＮＡスクリーニング
スニチニブ治療後の高インスリン放出の原因であろうキナーゼを特定するために、我々はキノームーワイド（ｋｉｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）ｓｉＲＮＡノックダウンスクリーニングを実行した。各キナーゼ激減のインスリン放出の効果は、ラット/マウス  インスリン  ＥＬＩＳＡを用いてモニターされた。得られたデータは、ポジティブコントロールとしてスニチニブ治療（５μＭ）と比較され、非標的ｓｉＲＮＡと相関させた。候補遺伝子は、階層的に集積して用いることによって、及び１５％インスリン放出を著しく増加/減少を提示することによって限定された。ＳＣＹ１様１(ＳＣＹＬ１)、ａａｒＦ含有キナーゼ１（ＡＤＣＫ１）およびＧ蛋白質結合受容体キナーゼ５（ＧＲＦ５）の激減は、コントロールｓｉＲＮＡと比べて、ベータ−ＴＣ６細胞にインスリン放出を高めることになり、それらのキナーゼをインスリン放出の潜在的ネガティブモジュレーターとする（図１）。
実施例２：ネガティブモジュレーターの有効性
ネガティブモジュレーターキナーゼＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の有効性確認のために、標的遺伝子は、４つの異なるｓｉＲＮＡ配列それぞれを用いて激減させた（図２Ａ−Ｃ）。遺伝子激減は７２時間後にｍＲＮＡレベルで測定され、一方インスリン放出は２時間インキュベーション後ラット/マウス  インスリン  ＥＬＩＳＡを用いて測定された。残留キナーゼＳＣＹＬ１、ＧＲＫ５およびＡＤＣＫ１の激減は異なる効率で増加したインスリン放出につながった。さらに、５０からほぼ１００％の範囲でＲＴ−ＰＣＲおよびデンシトメトリーをスキャンすることによって評価され、キナーゼのインスリン放出はＳＣＹＬ１およびＡＤＣＫ１のそれぞれのノックダウン効率と逆相関した。全ての配列が等しいノックダウン効率となるＧＲＫ５の場合には、この相関関係は観察されなかった。増加はＳＣＹＬ１（４６．３８±５．５１％）の激減で最高となり、次にＧＲＫ５（４１．２３±１．５３％）、そしてＡＤＣＫ１（３３．９５±９．０２％）である。スニチニブは、コントロールとして含められた（図３）。これはインスリン放出を誘発してこれらのキナーゼの役割を高めるものである。
【国際調査報告】
2013536815.tif 000031
2013536815.tif 000032
2013536815.tif 000033
2013536815.tif 000034
2013536815.tif 000035
2013536815.tif 000036