(57)【要約】【課題】小型かつ被検物質の濃度を高精度に検出することができる生体成分濃度計測装置を提供する。【解決手段】被検物質と特異的に結合する物質が修飾された複数の第１金属ナノロッド１０９ａが、長軸を同一方向にそろえ固定化されている第１の基板１０５ａと、ブロッキング物質が就職された複数の第２金属ナノロッド１０９ｂが、長軸を前記第１の基板１０５ａの前記第１金属ナノロッド１０９ａの長軸と垂直な方向にそろえ、固定化されている基板１０５ｂが存在する生体成分濃度測定用セルを用い、第１の基板１０５ａと第２の基板１０５ｂの光学特性を測定する光学測定装置とを備え、その光学特性から高精度に生体成分濃度を算出する。【選択図】図１
2013501917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体成分の濃度を測定する装置を用いて被検溶液に含まれる第１抗原の濃度を測定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｈ）を具備する、方法：
前記装置を準備する工程（ａ）、
ここで、前記装置は、
第１領域、第２領域、および前記被検溶液を保持する空間を内部に具備するセル、
光源、
前記光源から出射された光を偏光する偏光板、ならびに
前記第１領域、前記第２領域および前記被検溶液保持空間と交差する光軸に沿って前記セルを透過した光を受け取る受光器を備え、
前記第１領域には、表面に第１抗体を有する複数の第１金属ナノロッドが固定化されており、
前記第２領域には、表面にブロッキング物質を有する複数の第２金属ナノロッドが固定化されており、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記第１金属ナノロッドの長軸方向が、前記第２金属ナノロッドの長軸方向に直交しており、
前記偏光板および前記セルの少なくとも一方が、前記光軸を回転軸として回転可能であり、
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給し、前記第１抗原を前記第１抗体に結合させるが、前記第１抗原を前記ブロッキング物質には結合させない工程（ｂ）、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第１の光を前記受光器で受け取る工程（ｃ）、
前記第１の光に基づいて、前記第１抗原が前記抗体に結合したことによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλａを算出する工程（ｄ）、
前記偏光板および前記セルの少なくとも一方を回転させ、前記偏光板を透過した偏光を複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行に設定する工程（ｅ）、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第２の光を前記受光器で受け取る工程（ｆ）、
前記第２の光に基づいて、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλｂを算出する工程（ｇ）、
以下の等式によって表される差および検量線に基づいて、前記第１抗原の濃度を算出する工程（ｈ）、
前記差＝前記Δλａ−前記Δλｂ。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｉ）および（ｊ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第１金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第３の光を得る工程（ｉ）、および
前記第３の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記複数の第１金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λａ０を算出する工程（ｊ）、
ここで、工程（ｄ）において、前記第１抗原が前記抗体に結合したことによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λａ１を求め、そして前記Δλａを以下の等式により求める
前記Δλａ＝前記λａ１−前記λａ０。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｋ）および（ｌ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第４の光を得る工程（ｋ）、および
前記第４の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記第２金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ０を算出する工程（ｌ）、
工程（ｇ）において、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ１を求め、そして前記Δλｂを以下の等式により求める
前記Δλｂ＝前記λｂ１−前記λｂ０。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｋ）および（ｌ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第４の光を得る工程（ｋ）、および
前記第４の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記第２金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ０を算出する工程（ｌ）、
工程（ｇ）において、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ１を求め、そして前記Δλｂを以下の等式により求める
前記Δλｂ＝前記λｂ１−前記λｂ０  。
【請求項５】
前記セルが、第１基板および第２基板を具備し、
前記第１基板が、一方の面に前記第１領域を有し、
前記第２基板が、一方の面に前記第２領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１領域と、前記第２領域とが、同一方向を向いている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向するカバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第１基板の他方の面、前記第２領域および前記第２スペーサが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１領域が、前記第２領域に対向している、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１領域の周囲または前記第２領域の周囲に、スペーサが配され、
前記第１領域、前記第２領域および前記スペーサが、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向する第１カバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記第１カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第２スペーサを介して前記第２基板と対向する第２カバーが配され、
前記第２領域、前記第２スペーサおよび前記第２カバーが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記セルが、第１基板を具備し、
前記第１基板が、一方の面に前記第１領域を有し、他方の面に前記第２領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向する第１カバーが配され、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第２スペーサを介して前記第１基板と対向する第２カバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記第１カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域、前記第２スペーサおよび前記第２カバーが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体成分の濃度を測定する装置を用いて被検溶液に含まれる第１抗原の濃度を測定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｈ）を具備する、方法：
前記装置を準備する工程（ａ）、
ここで、前記装置は、
第１領域、第２領域、および前記被検溶液を保持する空間を内部に具備するセル、
偏光した光を前記セルに放射する光源、ならびに
前記第１領域、前記第２領域および前記被検溶液保持空間と交差する光軸に沿って前記セルを透過した光を受け取る受光器を備え、
前記第１領域には、表面に第１抗体を有する複数の第１金属ナノロッドが固定化されており、
前記第２領域には、表面にブロッキング物質を有する複数の第２金属ナノロッドが固定化されており、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記第１金属ナノロッドの長軸方向が、前記第２金属ナノロッドの長軸方向に直交しており、
前記光源および前記セルの少なくとも一方が、前記光軸を回転軸として回転可能であり、
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給し、前記第１抗原を前記第１抗体に結合させるが、前記第１抗原を前記ブロッキング物質には結合させない工程（ｂ）、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第１の光を前記受光器で受け取る工程（ｃ）、
前記第１の光に基づいて、前記第１抗原が前記抗体に結合したことによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλａを算出する工程（ｄ）、
前記光源および前記セルの少なくとも一方を回転させ、前記偏光を複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行に設定する工程（ｅ）、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第２の光を前記受光器で受け取る工程（ｆ）、
前記第２の光に基づいて、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλｂを算出する工程（ｇ）、
以下の等式によって表される差および検量線に基づいて、前記第１抗原の濃度を算出する工程（ｈ）、
前記差＝前記Δλａ−前記Δλｂ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｉ）および（ｊ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第１金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第３の光を得る工程（ｉ）、および
前記第３の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記複数の第１金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λａ０を算出する工程（ｊ）、
ここで、工程（ｄ）において、前記第１抗原が前記抗体に結合したことによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λａ１を求め、そして前記Δλａを以下の等式により求める
前記Δλａ＝前記λａ１−前記λａ０。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｋ）および（ｌ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第４の光を得る工程（ｋ）、および
前記第４の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記第２金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ０を算出する工程（ｌ）、
工程（ｇ）において、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ１を求め、そして前記Δλｂを以下の等式により求める
前記Δλｂ＝前記λｂ１−前記λｂ０。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、さらに以下の工程（ｋ）および（ｌ）を具備する、方法：
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前に、前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、第４の光を得る工程（ｋ）、および
前記第４の光に基づいて、前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給する前の前記第２金属ナノロッドによる局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ０を算出する工程（ｌ）、
工程（ｇ）において、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長λｂ１を求め、そして前記Δλｂを以下の等式により求める
前記Δλｂ＝前記λｂ１−前記λｂ０。
【請求項１７】
前記セルが、第１基板および第２基板を具備し、
前記第１基板が、一方の面に前記第１領域を有し、
前記第２基板が、一方の面に前記第２領域を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１領域と、前記第２領域とが、同一方向を向いている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向するカバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第１基板の他方の面、前記第２領域および前記第２スペーサが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１領域が、前記第２領域に対向している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１領域の周囲または前記第２領域の周囲に、スペーサが配され、
前記第１領域、前記第２領域および前記スペーサが、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向する第１カバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記第１カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第２スペーサを介して前記第２基板と対向する第２カバーが配され、
前記第２領域、前記第２スペーサおよび前記第２カバーが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記セルが、第１基板を具備し、
前記第１基板が、一方の面に前記第１領域を有し、他方の面に前記第２領域を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１領域の周囲に、第１スペーサが配され、
前記第１スペーサを介して前記第１基板と対向する第１カバーが配され、
前記第２領域の周囲に、第２スペーサが配され、
前記第２スペーサを介して前記第１基板と対向する第２カバーが配され、
前記第１領域、前記第１スペーサおよび前記第１カバーが、第１空間を形成しており、
前記第２領域、前記第２スペーサおよび前記第２カバーが、第２空間を形成しており、
前記第１空間および前記第２空間が、前記被検溶液保持空間を形成している、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属に光を照射することで発生する表面プラズモン共鳴を利用して、被検溶液に含まれる抗原の濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療診断、遺伝子解析などは、迅速、高効率、かつ簡便に行うことが求められる。そこで、近年、微量な生体成分を高感度に検出する技術が重要になっている。
【０００３】
例えば、血液、汗、尿などの被検溶液に含まれる、タンパク質、ホルモン、低分子化合物などの生体成分を検出する方法では、表面プラズモン共鳴が利用されている。表面プラズモン共鳴は、金属中の自由電子と、電磁波（光）とが相互作用することによって起こる。表面プラズモン共鳴を用いた検出法は、蛍光検出法および電気化学法とは異なり、生体成分に標識することを必要とせず、簡便である。
【０００４】
表面プラズモン共鳴としては、伝搬型表面プラズモン共鳴および局在型表面プラズモン共鳴が挙げられる。
伝搬型表面プラズモン共鳴を用いたセンサは、例えば、三角プリズムを有する。三角プリズムの面の１つには、金属薄膜が形成されている。プリズムの別の面から、金属薄膜を有する面に光が照射される。金属薄膜に特定の角度から光が入射すると、伝搬型表面プラズモン共鳴が発生する。この特定の角度を、共鳴角度という。共鳴角度は、金属薄膜の近傍（約１００ｎｍ）に存在する物質の屈折率（誘電率）に依存する。そのため、伝搬型表面プラズモン共鳴センサは、周辺物質の物性変化を高感度に検出することができる。
【０００５】
伝搬型表面プラズモン共鳴をバイオセンサで利用する場合、金属薄膜の表面に抗体が固定化される。金属薄膜表面に、生体成分（抗原）を含む被検溶液を接触させることにより、抗原と抗体とが反応し、結合する。これにより、金属薄膜の近傍における屈折率が変化するため、共鳴角度が変化する。被検溶液に含まれる抗原の濃度と、共鳴角度との相関関係を予め求めておけば、共鳴角度の変化から抗原の濃度を算出することができる。
【０００６】
特許文献１は、局在型表面プラズモン共鳴を利用した方法を開示している。特許文献１によれば、貴金属により被覆された誘電体微粒子（以下、「微粒子」という）は、基板の表面の複数の領域に形成されている。１つの領域（以下、「信号領域」という）に形成された微粒子には、生体分子と結合する抗体が固定化されている。信号領域は生体分子の濃度を反映した共鳴波長を示す。他の領域（以下、「参照領域」という）に形成された微粒子には、生体分子との結合が起こらないように処理が施されている。光の照射により、各領域の局在型表面プラズモン共鳴が観測される。信号領域では、生体分子の結合が反射スペクトルを変化させる。一方、参照領域では、生体分子が結合しないために、反射スペクトルは変化しない。信号領域における反射スペクトルと参照領域の反射スペクトルとの間の差に基づき、生体分子の結合による反射スペクトルの変化量が求められる。当該反射スペクトルの変化量に基づいて、生体分子の濃度が算出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３５２８８００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
信号領域および参照領域を表面に有する従来の局在型表面プラズモンセンサにより、高感度に被検物質の濃度が検出される。しかし、２つの検出領域、すなわち、信号領域および参照領域に光を照射させるために、光源または基板の少なくとも一方を移動させることが必要とされる。測定精度の維持または向上のためには、光源、検出領域、および光検出器の位置が高精度に制御されなければならない。従って、光源または基板の移動は、測定精度の低下をもたらし得る。
【０００９】
本発明の目的は、被検溶液に含まれる抗原の濃度を測定する方法であって、光源および基板の両方を移動させず、測定精度を向上させた方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
生体成分の濃度を測定する装置を用いて被検溶液に含まれる第１抗原の濃度を測定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｈ）を具備する、方法：
前記装置を準備する工程（ａ）、
ここで、前記装置は、
第１領域、第２領域、および前記被検溶液を保持する空間を内部に具備するセル、
光源、
前記光源から出射された光を偏光する偏光板、ならびに
前記第１領域、前記第２領域および前記被検溶液保持空間と交差する光軸に沿って前記セルを透過した光を受け取る受光器を備え、
前記第１領域には、表面に第１抗体を有する複数の第１金属ナノロッドが固定化されており、
前記第２領域には、表面にブロッキング物質を有する複数の第２金属ナノロッドが固定化されており、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸が同一方向に配向しており、
前記第１金属ナノロッドの長軸方向が、前記第２金属ナノロッドの長軸方向に直交しており、
前記偏光板および前記セルの少なくとも一方が、前記光軸を回転軸として回転可能であり、
前記被検溶液を前記被検溶液保持空間に供給し、前記第１抗原を前記第１抗体に結合させるが、前記第１抗原を前記ブロッキング物質には結合させない工程（ｂ）、
前記複数の第１金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第１の光を前記受光器で受け取る工程（ｃ）、
前記第１の光に基づいて、前記第１抗原が前記抗体に結合したことによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλａを算出する工程（ｄ）、
前記偏光板および前記セルの少なくとも一方を回転させ、前記偏光板を透過した偏光を複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行に設定する工程（ｅ）、
前記複数の第２金属ナノロッドの長軸方向と平行な偏光を、前記光軸に沿って前記セルに透過させ、得られた第２の光を前記受光器で受け取る工程（ｆ）、
前記第２の光に基づいて、前記被検溶液保持空間に前記被検溶液が供給されることによって生じた局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量Δλｂを算出する工程（ｇ）、
以下の等式によって表される差および検量線に基づいて、前記第１抗原の濃度を算出する工程（ｈ）、
前記差＝前記Δλａ−前記Δλｂ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、被検溶液に含まれる抗原の濃度を測定する方法を提供する。当該方法は、光源および基板の両方を移動することを必要とせず、測定精度の向上を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態１における生体成分濃度測定装置の構成を示す図
【図２】実施の形態１におけるセル１０５の断面を示す図
【図３】実施の形態１におけるセル１０５の一部の斜視図
【図４】Ａｕナノロッドの吸収スペクトルを示す図
【図５】（Ａ）ランダムに配向したＡｕナノロッドが形成された基板１０５ｈの構成図    （Ｂ）ランダムに配向したＡｕナノロッドが形成された基板１０５ｈの吸収スペクトルを示すグラフ
【図６】（Ａ）Ａｕナノロッドの長軸が同一方向に配向し形成された基板１０５ａの構成図    （Ｂ）Ａｕナノロッドの短軸方向の偏光の光を照射したときの基板１０５ａの吸収スペクトルを示すグラフ    （Ｃ）Ａｕナノロッドの長軸方向の偏光の光を照射したときの基板１０５ａの吸収スペクトルを示すグラフ
【図７】本発明の実施の形態２における生体成分濃度測定装置の構成を示す図
【図８】本発明の実施の形態２におけるセル２０５の断面を示す図
【図９】本発明の実施の形態２におけるセル２０５の一部の斜視図
【図１０】本発明の実施の形態３における生体成分濃度測定装置の構成を示す図
【図１１】本発明の実施の形態３における生体成分濃度測定用セル４０５の構成を示す図
【図１２】本発明の実施の形態４における生体成分濃度測定装置の構成を示す図
【図１３】本発明の実施の形態４におけるセル５０５の断面を示す図
【図１４】本発明の実施の形態４におけるセル５０５の一部の斜視図
【図１５】本発明の実施の形態５における生体成分濃度測定装置の構成を示す図
【図１６】本発明の実施の形態５におけるセル６０５の断面を示す図
【図１７】本発明の実施の形態５におけるセル６０５の一部の斜視図
【図１８】（Ａ）Ａｕナノロッドの長軸が同一方向に配向し形成された第１の基板１０５ａの構成図    （Ｂ）被検溶液供給前のＡｕナノロッドの長軸に平行な偏光の光を照射したときの第１の基板１０５ａの吸収スペクトルを示すグラフ    （Ｃ）被検溶液供給後のＡｕナノロッドの長軸に平行な偏光の光を照射したときの第１の基板１０５ａの吸収スペクトルを示すグラフ
【図１９】（Ａ）Ａｕナノロッドの長軸が同一方向に配向し形成された第２の基板１０５ｂの構成図    （Ｂ）被検溶液供給前のＡｕナノロッドの長軸に平行な偏光の光を照射したときの第２の基板１０５ｂの吸収スペクトルを示すグラフ    （Ｃ）被検溶液供給後のＡｕナノロッドの長軸に平行な偏光の光を照射したときの第２の基板１０５ｂの吸収スペクトルを示すグラフ
【図２０】（Ａ）セル１０５の分解図    （Ｂ）セル１０５にｙ方向の偏光光を照射したときの第１の基板１０５ａの吸収スペクトルを示すグラフ    （Ｃ）ｙ方向の偏光光を照射したときの第２の基板１０５ｂの吸収スペクトルを示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態が、図面を参照しながら説明される。
【００１４】
（実施の形態１）
実施の形態１が、図１〜図３を参照しながら説明される。
【００１５】
（装置１００の説明）
図１は、実施の形態１による生体成分の濃度を計測するための装置１００の構成を示す。装置１００は、セル１０５および光学測定装置２００を具備する。
【００１６】
光学測定装置２００は、光源１０１、レンズ１０２、偏光板１０３、レンズ１０４、スリット１０６、グレーティング素子１０７、受光器１０８、およびマイクロコンピュータ１１０を具備する。
【００１７】
光源１０１は、局在型表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射する。ハロゲン光源が好ましい。
【００１８】
レンズ１０２（第１レンズ１０２）は、ハロゲン光源１０１から放射された光を整形する。
【００１９】
偏光板１０３は、ハロゲン光源１０１から放射され、レンズ１０２により整形された光を偏光する。
【００２０】
レンズ１０４（第２レンズ１０４）は、セル１０５を透過した光を整形する。
【００２１】
スリット１０６は、グレーティング分光を行う際に光を略点光源状に整形する。
【００２２】
グレーティング素子１０７は、スリット１０６を透過した光を波長に応じて分散させながら反射する。
【００２３】
受光器１０８は、複数の受光領域を有し、分散した光を検出する。
【００２４】
マイクロコンピュータ１１０（すなわち、演算部）は、受光器１０８によって受光された光の強度を算出する。マイクロコンピュータ１１０は、算出された強度から局在型表面プラズモン共鳴波長を算出する。マイクロコンピュータ１１０は、算出された局在型表面プラズモン共鳴波長に基づき被検物質の濃度を算出する。
【００２５】
セル１０５は、被検溶液を保持する。セル１０５は、第１の基板１０５ａおよび第２の基板１０５ｂを具備する。第１の基板１０５ａは、同一方向に配向した長軸を有する複数の第１金属ナノロッドを具備する。各金属ナノロッドは、およそ２ｎｍ〜１００ｎｍの短軸およびおよそ５０〜５００ｎｍの長軸を有する。第２の基板１０５ｂは、第１の基板１０５ａと同様に複数の第２金属ナノロッドを具備する。
【００２６】
第１の基板１０５ａおよび第２の基板１０５ｂは、それぞれ第１領域および第２領域に相当する。金属ナノロッドは、基板の全面または一部に形成され得る。
【００２７】
受光器１０８の例は、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ、および１次元フォトディテクターアレイである。受光器１０８は、複数の受光領域を具備することが好ましい。
【００２８】
偏光板１０３の例は、有機分子から形成された偏光フィルムである。
【００２９】
偏光板１０３および前記セル１０５の少なくとも一方が、光軸を回転軸として回転する。言うまでもないが、当該光軸は第１の基板１０５ａの法線方向に平行である。
【００３０】
光学測定装置２００は、メモリ１１１を備えていることが好ましい。メモリ１１１は、受光器１０８の各受光領域に対応する波長のデータ、および局在型表面プラズモン共鳴波長の共鳴波長シフト量と生体成分濃度との間の相関関係（すなわち、検量線）に関するデータを保持している。
【００３１】
図２は、第１の実施の形態におけるセル１０５を示す。
【００３２】
セル１０５は、第１の基板１０５ａ、第２の基板１０５ｂ、第１のスペーサ１０５ｃ、第２のスペーサ１０５ｄ、およびカバーガラス１０５ｅを具備する。第１の基板１０５ａは、複数の第１金属ナノロッド１０９ａを具備する。第２の基板１０５ｂは、複数の第２金属ナノロッド１０９ｂを具備する。
【００３３】
図２に示されるように、第１の被検溶液保持空間１０５ｆは、第１の基板１０５ａ、第１のスペーサ１０５ｃ、およびカバーガラス１０５ｅによって囲まれている。同様に、第２の被検溶液保持空間１０５ｇは、第１の基板１０５ａ、第２のスペーサ１０５ｄ、および第２の基板１０５ｂによって囲まれている。第１の被検溶液保持空間１０５ｆおよび第２の被検溶液保持空間１０５ｇは、被検溶液の供給口および排出口（図示せず）を具備する。
【００３４】
第１の基板１０５ａ、第２の基板１０５ｂ、およびカバーガラス１０５ｅの材料は、光源１０１からの光が透過する限り、特に限定されない。ＳｉＯ2が好ましい。
【００３５】
図３は、第１の基板１０５ａおよび第２の基板１０５ｂを示す。
【００３６】
第１の基板１０５ａは、同一方向に配向した長軸を有する複数の第１金属ナノロッド１０９ａを具備する。複数の第１金属ナノロッド１０９ａを一括して「第１金属ナノロッド群」と呼ぶことがある。
【００３７】
第２の基板１０５ｂは、同一方向に配向した長軸を有する複数の第２金属ナノロッド１０９ｂを具備する。複数の第２金属ナノロッド１０９ｂを一括して「第２金属ナノロッド群」と呼ぶことがある。複数の第１金属ナノロッド１０９ａの長軸は、複数の第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に直交する。
【００３８】
複数の第１金属ナノロッド１０９ａに第１の抗体１１２ａが修飾され、計測領域が形成される。一方、複数の第２金属ナノロッド１０９ｂにブロッキング物質１１２ｃが修飾され、参照領域が形成される。ブロッキング物質１１２ｃには、抗原、タンパク質、およびペプチドのいずれもが結合しない。当該抗原は、被検溶液に含有される被検物質を包含する。当該タンパク質は、アルブミンおよびグロブリンを包含する。
【００３９】
ブロッキング物質１１２ｃの例は、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質極性基を側鎖に有するＭＰＣ（２-メタクリロイルオキシエチル
ホスホリルコリン）ポリマー、ＭＰＣポリマー含有重合体、およびＭＰＣポリマー含有共重合体である。
【００４０】
複数の第１金属ナノロッド１０９ａおよび第２金属ナノロッド１０９ｂがそれぞれ形成された第１の基板１０５ａの面および第２の基板１０５ｂの面は、同一方向を向いている。
【００４１】
（基板の製法）
第１の基板１０５ａおよび第２の基板１０５ｂを作製する方法は、特に限定されない。例えば、Ｘ線リソグラフィーまたは電子線リソグラフィーにより微細構造が描画される。次いで金属がスパッタリングされ、基板１０５を作製し得る。
【００４２】
Ｓｉ基板に、Ｘ線リソグラフィーまたは電子線リソグラフィーにより金型が作製される。ナノインプリンティング技術により、樹脂上にナノロッドが作製される。金属がスパッタリングされて金属ナノロッドが作製され、基板１０５を作製し得る。
【００４３】
化学反応を用いる合成法、光反応を用いる合成法により合成された金属ナノロッドが用いられ、基板１０５を作製し得る。
【００４４】
金属ナノロッドを含有する組成物に一定方向の剪断応力を加え、複数の金属ナノロッドの長軸を同一方向に配向させ得る。具体的には、分散剤、溶媒、樹脂、および金属ナノロッド含有する組成物が基板に塗布される。マイクログラビアコーターにより、基材の進行方向とは反対方向に一定の剪断応力が印加されながら、当該組成物が塗布され得る。これに代えて、当該組成物を塗布している間または塗布した後に、一定方向の電気的又は磁気的な力が基板に印加され、当該長軸を同一方向に配向させ得る。
【００４５】
金属ナノロッド１０９の材料は、銀、金、銅、アルミニウム、または白金である。複数の材料が用いられ得る。金属ナノロッドは、二つの局在型表面プラズモン共鳴バンドを示す。一方の局在型表面プラズモン共鳴バンドは、短軸方向に由来する。Ａｕナノロッドが用いられる場合、当該一方の局在型表面プラズモン共鳴バンドは５２０ｎｍ付近の波長において現れる。他方の局在型表面プラズモン共鳴バンドは、長軸に由来する。Ａｕナノロッドが用いられる場合、当該他方の局在型表面プラズモン共鳴バンドは、６００〜１５００ｎｍの波長において現れる。
【００４６】
（吸収スペクトルの説明）
図４は、１０ｎｍの平均短軸長および３７ｎｍの平均長軸長３７ｎｍを有するＡｕナノロッドの吸収スペクトルを示す。５１０ｎｍの波長の付近のピークは、短軸由来の局在型表面プラズモン共鳴バンドである。７８０ｎｍの波長の付近のピークは、長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴バンドである。局在型表面プラズモン共鳴バンドにおける吸収ピーク波長は、局在型表面プラズモン共鳴波長と呼ばれる。
【００４７】
実施の形態１においては、長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長が７００〜１０００ｎｍであることが好ましい。
【００４８】
同一方向に配向した長軸を有する複数の第１金属ナノロッド１０９ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂを具備する基板は、強い偏光特性を有する。図５（Ａ）は、ランダムに配向した金属ナノロッド１０９ｃを具備する基板１０５ｈを示す。図５（Ｂ）は、その吸収スペクトルを示す。基板１０５ｈは、どのような偏光の入射光に対しても、図５（Ｂ）に示されるように、短軸および長軸の両方に由来する局在型表面プラズモン共鳴バンドにおける吸収ピークを有する。
【００４９】
図６（Ａ）は、同一方向ｙに配向した長軸を有する第１金属ナノロッド１０９ａを具備する基板１０５ａを示す。図６（Ｂ）は、当該長軸に直交する方向（すなわち、図６（Ａ）におけるｘ方向）に沿った偏光を照射することによって生じる吸収スペクトルを示す。図６（Ｃ）は長軸に平行な方向（図６（Ａ）におけるｙ方向）に沿った偏光を照射することによって生じる吸収スペクトルを示す。
【００５０】
図６（Ｂ）および図６（Ｃ）から理解されるように、基板１０５ａは、ｘ方向に沿った偏光に対しては、短軸由来の局在型表面プラズモン共鳴バンドによる吸収スペクトルのみを示す。ｙ方向に沿った偏光に対しては、基板１０５ａは、長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴バンドによる吸収スペクトルのみを示す。
【００５１】
第１金属ナノロッド１０９ａの長軸または第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸のどちらかに平行に偏光光が設定されることにより、第１の基板１０５ａまたは第２の基板１０５ｂのどちらか一方に特有な吸収スペクトルを得ることができる。偏光板１０３またはセル１０５のどちらかが光軸を回転軸として回転され、偏光を第１金属ナノロッド１０９ａの長軸または第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸のどちらかと平行にする。偏光板１０３およびセル１０５の両方が回転され得る。
【００５２】
複数の第１金属ナノロッドの長軸は、複数の第２金属ナノロッドの長軸に直交する必要がある。その理由について、図２０を用いて、以下に説明する。
【００５３】
図２０（Ａ）には、セル１０５の分解図を示す。セル１０５の第１の基板１０５ａには、長軸が同一方向に配向した第１金属ナノロッド１０９ａが形成されている。第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な軸をｙ方向、短軸に平行な軸をｘ方向とする。セル１０５の第２の基板１０５ｂには、長軸が同一方向に配向した第２金属ナノロッド１０９ｂが形成されている。図２０（Ａ）に示すように、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸は、ｙ方向に対して４５度の角度で傾いて形成されている。すなわち、セル１０５においては、複数の第１金属ナノロッド１０９ａの長軸は、複数の第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸は直交していない。
【００５４】
セル１０５において、第１の基板１０５ａ上の第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収のみを得るためには、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な偏光光、つまり、ｙ方向の偏光光を入射する必要がある。セル１０５にｙ方向の偏光光を照射したときの第１の基板１０５ａの吸収スペクトルを図２０（Ｂ）に示す。図２０（Ｂ）より、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収ピークのみ観測できる。
【００５５】
セル１０５に照射されたｙ方向の偏光光は第１の基板１０５ａを透過した後、第２の基板１０５ｂに照射される。図２０（Ｃ）に、ｙ方向の偏光光を照射したときの第２の基板１０５ｂの吸収スペクトルを示す。図２０（Ｃ）より、２つの吸収ピークが表れることがわかる。長波長側の吸収ピークは、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収ピークであり、短波長側の吸収ピークは、第２金属ナノロッド１０９ｂの短軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収ピークである。２つの吸収ピークが表れる理由は、ｙ方向の偏光光が、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸と短軸に平行な２つの偏光成分から成っているからである。よって、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収のみを得るために照射されたｙ方向の偏光光では、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収も得てしまうため、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収のみを得ることができない。したがって、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収のみを得るためにｙ方向の偏光光を照射した場合には、第２金属ナノロッド１０９ｂによる長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴による吸収が発生しないようにする必要がある。そのためには、ｙ方向の偏光光に対して、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸を垂直にする必要がある。
【００５６】
（抗原の濃度を測定する方法）
実施の形態１による装置１００を用いて、被検溶液に含まれる抗原の濃度を測定する方法が、図面を参照しながら、以下、説明される。
【００５７】
（前測定）
まず、装置１００が準備される。そして、セル１０５が光学測定装置２００に挿入される。前測定においては、当該セル１０５は、被検溶液を保持していない。すなわち、一般的には、セル１０５は真空であるか、または空気が満たされている。
【００５８】
光源１０１の電源が入れられる。光源１０１から放射された光は、レンズ１０２により整形され、そして偏光板１０３を通過する。
【００５９】
偏光板１０３を通過した偏光光は、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な偏光成分のみを有する。偏光光がセル１０５を通過すると、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長における光の消衰が極大となる。複数の第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長においては、光は消衰しない。セル１０５を透過した偏光光は、レンズ１０４により集光され、スリット１０６を透過し、グレーティング素子１０７により分散され、そして受光器１０８に到達する。当該偏光光は、請求の範囲における「第３の光」に対応する。
【００６０】
マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８の各受光領域において検出された光強度に基づいて、光の消衰が極大となる波長を決定する。当該波長は、被検溶液を供給する前の波長λａ０として、メモリ１１１に格納される。
【００６１】
波長λａ０が決定された後、マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を９０°回転させる。このことは、偏光板１０３を通過した偏光光が、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行な偏光成分のみを有することをもたらす。
【００６２】
当該偏光光がセル１０５を通過すると、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長における光の消衰が極大となる。当該偏光光は、請求の範囲における「第４の光」に対応する。第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長においては、光は消衰しない。上記と同様に、被検溶液を供給する前の波長λｂ０として、メモリ１１１に格納される。
【００６３】
波長λａ０：第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な偏光成分のみを有する偏光光が被検溶液を供給する前のセル１０５を通過したことによって生じた光の消衰が極大化される波長。
【００６４】
波長λｂ０：第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行な偏光成分のみを有する偏光光が被検溶液を供給する前のセル１０５を通過したことによって生じた光の消衰が極大化される波長。
【００６５】
本実施の形態では、被検溶液を供給する前に、セル１０５および装置１００により波長λａ０および波長λｂ０が決定された。これに代えて、予め決定された波長λａ０および波長λｂ０がメモリ１１１に格納されてもよい。
【００６６】
（工程（ａ）および工程（ｂ））
装置１００が準備される。セル１０５に被検溶液が満たされる。被検溶液に含有される抗原が、第１金属ナノロッド１０９ａ上の抗体１１２ａと特異的に結合する。一方、当該抗原は、ブロッキング物質１１２ｃには結合しない。
【００６７】
（工程（ｃ））
抗体１１２ａに抗原が充分に結合した後、光源１０１の電源を入れる。波長λａ０の測定と同様に、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な偏光成分のみを有する偏光光がセル１０５に透過され、第１の光を得る。受光器１０８は、当該第１の光を受光する。
【００６８】
（工程（ｄ））
マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８における光強度に基づいて、光の消衰が極大となる波長を決定する。当該波長は、被検溶液を供給した後の波長λａ１として、メモリ１１１に格納される。そして、マイクロコンピュータ１１０は、抗原の抗体への結合による共鳴波長シフト量Δλａを、以下の等式から算出する：
Δλａ＝λａ１−λａ０。
【００６９】
（工程（ｅ））
その後、マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を９０°回転させる。このことは、偏光板１０３を通過した偏光光が、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行な偏光成分のみを有することをもたらす。
【００７０】
（工程（ｆ））
波長λｂ０の測定と同様に、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行な偏光成分のみを有する偏光光がセル１０５に透過され、第２の光を得る。受光器１０８は、当該第２の光を受光する。
【００７１】
（工程（ｇ））
マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８における光強度に基づいて、光の消衰が極大となる波長を決定する。当該波長は、被検溶液を供給した後の波長λｂ１として、メモリ１１１に格納される。そして、マイクロコンピュータ１１０は、被検溶液が複数の第２金属ナノロッド１０９ｂに接触することにより生じる共鳴波長シフト量Δλｂを、以下の等式から算出する：
Δλｂ＝λｂ１−λｂ０。
【００７２】
（工程（ｈ））
マイクロコンピュータ１１０は、ΔλａとΔλｂとの差を算出し、抗原の抗体１１２ａへの結合による正確な共鳴波長シフト量Δλを算出する。
【００７３】
その後、マイクロコンピュータ１１０は、正確な共鳴波長シフト量Δλと抗原の濃度との間の相関関係（以下、「検量線」という）を参照しながら、抗原の濃度を算出する。言うまでもないが、マイクロコンピュータ１１０はメモリ１１１に当該検量線を予め保持している。
【００７４】
算出された抗原の濃度は、例えば、スピーカー（図示せず）またはディスプレイによりユーザに通知される。
【００７５】
上記検量線は、例えば、以下の手順によって取得され得る。
【００７６】
様々な抗原濃度を持つ被検溶液を作製する。この被検溶液の溶媒は純水であり、溶質は抗原である。被検溶液を供給する前のセル１０５の局在型表面プラズモン共鳴波長λａ０とλｂ０を測定する。その後、既知のある抗原濃度を持った被検溶液をセル１０５に供給し、波長λａ１とλｂ１を測定する。その後、以下の３つの等式からある抗原濃度に対する共鳴波長シフト量Δλを算出する。
Δλａ＝λａ１−λａ０
Δλｂ＝λｂ１−λｂ０
Δλ＝Δλａ−Δλｂ
様々な抗原濃度の被検溶液に対し、Δλを求め、縦軸を共鳴波長シフト量Δλ、横軸を抗原濃度としてプロットすることにより、検量線を得ることができる。
【００７７】
（本発明の課題および効果の詳細）
長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長は、金属ナノロッドの周辺の屈折率に対して非常に敏感である。
【００７８】
１０ｎｍの平均短軸長および３７ｎｍの平均長軸長を有するＡｕナノロッドが用いられた場合、１．０×１０0の屈折率の変化は、長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長を、およそ２２０ｎｍ、長波長側へシフトすることをもたらす。
【００７９】
Ａｕナノロッド上に修飾された抗体に抗原が吸着し、Ａｕナノロッドの周辺の屈折率の変化のため、局在型表面プラズモン共鳴波長がシフトする。
【００８０】
当該抗原が当該抗体と結合する前の局在型表面プラズモン共鳴波長と、当該抗原が当該抗体と結合した後の局在型表面プラズモン共鳴波長との差、すなわち共鳴波長シフト量が測定される。当該共鳴波長シフト量に基づいて、抗原の抗体への結合による屈折率変化量が算出される。このようにして、抗原の濃度が算出される。
【００８１】
しかし、金属ナノロッドの周辺の屈折率は、抗原の抗体への結合だけでなく、金属ナノロッドの周辺の媒質が真空または空気から被検溶液に置換されることによっても変化する。
【００８２】
すなわち、共鳴波長シフト量Δλａは、抗原が抗体に結合することによる局在型表面プラズモン共鳴波長のシフト量（以下、「シフト量Ａ１」という。これはΔλに等しい）、および周辺の媒質が空気から被検溶液に置換されることによって生じた共鳴波長シフト量（以下、「シフト量Ａ２」という）を含む。
【００８３】
被検溶液は、アルブミンおよびグロブリンを含有し得る。各個体は、異なるアルブミン濃度を有する。各個体は、異なるグロブリン濃度を有する。シフト量Δλａは、アルブミンの濃度およびグロブリンの濃度を、シフト量Ａ２として含む。そのため、抗原の濃度をシフト量Δλａのみから正確に求めることは困難である。
【００８４】
この理由について、図１８〜２３を用いて詳細に説明する。
【００８５】
図１８（Ａ）は、第１の抗体１１２ａにより修飾された第１金属ナノロッド１０９ａを有する第１の基板１０５ａを示す。
【００８６】
図１８（Ｂ）は、被検溶液が供給される前の第１の基板１０５ａに、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行な光が照射されることによって発生した吸収スペクトルを示す。λａ０は、得られた局在型表面プラズモン共鳴波長である。
【００８７】
図１８（Ｃ）は、被検溶液が供給され、第１の抗体１１２ａに抗原が十分に結合した後の吸収スペクトルを示す。λａ１は、図１８（Ｃ）における実線のスペクトルにおける局在型表面プラズモン共鳴波長である。図１８（Ｃ）中の点線は、図１８（Ｂ）の吸収スペクトルである。
【００８８】
抗体１１２ａへの抗原の結合による共鳴波長シフト量Δλａは以下の式で表される：
Δλａ＝λａ１−λａ０。
【００８９】
Δλａは、シフト量Ａ１だけでなく、シフト量Ａ２をも含む。
【００９０】
抗原の濃度が０Ｍである場合、Δλａは、周辺の媒質が空気から被検溶液に置換されることによって生じた屈折率変化による共鳴波長シフト（シフト量Ａ２）のみを表す。
【００９１】
被検溶液の屈折率は、抗原以外の物質（例えば、アルブミンおよびグロブリン）の濃度に依存して変化する。アルブミンおよびグロブリンの濃度は、各個体に依存して変化し得る。従って、抗原の濃度が０Ｍであっても、Δλａは各個体に依存して変化し得る。そのため、Δλａのみから抗原の濃度は正確に算出され得ない。特に、抗原の濃度が１０-10Ｍ以下である場合、この傾向が顕著に見られる。なぜなら、アルブミンおよびグロブリンの血中濃度は１０-3程度であるからである。
【００９２】
被検物質が、血液、尿、唾液、汗のような体液に含有される疾患マーカーまたはホルモンである場合、本発明は特に有効である。この理由が以下に記述される。
【００９３】
体液に含有される抗原の濃度は極めて低い。具体的には、当該濃度は１０-15〜１０-8Ｍである。一方、血液に含有されるアルブミンまたはグロブリンの濃度はおよそ１０-3Ｍである。各個体は、アルブミンまたはグロブリンの異なる濃度を有する。当該最大濃度は、最低濃度のおよそ２倍である。例えば、アルブミンの最大濃度と最低濃度との間の差は、およそ２０００ｍｇ／ｄｌである。
【００９４】
当該濃度差が、個体間での血液の屈折率の違いをもたらす。１ｍｇ／ｄｌのたんぱく質の濃度の変化は、およそ１．９×１０-6の屈折率の変化をもたらす。従って、各個体間でのアルブミンによる屈折率の最大差は、およそ３．８×１０-3である。
【００９５】
Ａｕナノロッドが用いられる場合、１．０×１０0（＝１）の屈折率の変化は、およそ２５０ｎｍの共鳴波長のシフトをもたらす。従って、３．８×１０-3の屈折率の変化は、およそ０．９５ｎｍの共鳴波長のシフトをもたらす。一方、およそ１０-12Ｍの濃度を有する抗原を抗体に結合させることによって生じる共鳴波長のシフト量はおよそ１０-2nmである。従って、抗原を抗体に結合させることによって生じる共鳴波長のシフト量は、各個体に依存するアルブミン濃度の差によって生じるシフト量よりもずっと小さい。さらに、血液中では、糖分、塩分等が屈折率に影響を及ぼす。
【００９６】
よって、共鳴波長のシフト量が、個体に依存して生じるシフト量なのか、抗原を抗体に結合させることによって生じるシフト量なのかを区別することができないため、抗原濃度を正確に求めることができない。
【００９７】
本発明では、図１９（Ａ）に示されるように、第２の基板１０５ｂが、ブロッキング物質１１２ｃにより修飾された複数の第２金属ナノロッド１０９ｂを参照領域として具備している。
【００９８】
図１９（Ｂ）は、被検溶液が供給される前の第２の基板１０５ｂに、第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行な光が照射されることによって生じた吸収スペクトルを示す。λｂ０は、得られた局在型表面プラズモン共鳴波長である。
【００９９】
図１９（Ｃ）は、被検溶液が供給された後の吸収スペクトルを示す。λｂ１は、図１９（Ｃ）における実線のスペクトルにおける局在型表面プラズモン共鳴波長である。図１９（Ｃ）中の点線は、図１９（Ｂ）の吸収スペクトルである。
【０１００】
共鳴波長シフト量Δλｂは、複数の第２金属ナノロッド１０９ｂの周辺の媒質が真空または空気から被検溶液に置換されたことによって生じた共鳴波長シフト量Ａ２に等しく、以下の式により表される：
Δλｂ＝λｂ１−λｂ０。
【０１０１】
ΔλａとΔλｂの差を求めることにより、共鳴波長シフト量Ａ１（＝Δλ）が算出される。
【０１０２】
（その他）
本実施の形態においては、光源として、ハロゲン光源１０１を用いたが、局在型表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射する光源であれば、特に限定することなく利用することができる。本実施の形態では、無偏光のハロゲン光源１０１を用いたが、特定の偏光を持つ光源を用いることもできる。特定の偏光を持つ光源としては、レーザー光源などが挙げられる。特定の偏光を持つ光源を用いた場合、偏光制御手段としては、波長板を用いることができる。
【０１０３】
モーターなどを用い、特定の偏光を持つ光源自体を回転させることにより偏光方向を回転させる手段も、偏光制御手段として用いることができる。
【０１０４】
この時、被検溶液が満たされているかどうかを判定するためのセンサを備えていることが好ましい。例えば、カバーガラス１０５ｅと第１の基板１０５ａに電極を設け、さらに、第１の基板１０５ａと第２の基板１０５ｂに別の電極を設けておき、セル１０５を光学測定装置２００に挿入した後、電極に弱い電圧がかかるようにしておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液が第１の被検溶液保持空間１０５ｆ、第２の被検溶液保持空間１０５ｇに満たされているかどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用してハロゲン光源１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。
【０１０５】
（実施の形態２）
本発明の別の実施の形態について、図７〜図９を用いて説明する。
【０１０６】
図７〜図９において、図１〜図３と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。
【０１０７】
図７は、本発明の実施の形態２に係る生体成分濃度測定装置の構成を示す図である。図７において、実施の形態１と異なる構成は、セル２０５が、生体成分濃度測定用セルとして第１の基板１０５ａの第１金属ナノロッド１０９ａが形成されている面と第２の基板１０５ｂの第２金属ナノロッド１０９ｂが形成されている面が対面するように構成されている点である。その他の構成は同じであるので、説明を省略する。
【０１０８】
図８は、本発明の実施の形態２におけるセル２０５の断面図である。セル２０５は、第１金属ナノロッド１０９ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂが設けられている第１の基板１０５ａ、第２の基板１０５ｂ、スペーサ２０５ｃから構成されている。また、第１の基板１０５ａ、スペーサ２０５ｃ、第２の基板１０５ｂで形成される被検溶液保持空間２０５ｆと、被検溶液の供給口、排出口（図示せず）から構成されている。
【０１０９】
図９は、セル２０５の第１の基板１０５ａ、第２の基板１０５ｂの金属ナノロッドが形成された部分の斜視図である。第１の基板１０５ａには、長軸が同一方向に配向した金属ナノロッド１０９ａが形成されている。第２の基板１０５ｂには、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａと長軸が垂直に配向した第２金属ナノロッド１０９ｂが形成されている。第１金属ナノロッド１０９ａには抗体１１２ａが修飾されている。第２金属ナノロッド１０９ｂにはブロッキング物質１１２ｃが修飾されている。
【０１１０】
第１金属ナノロッド１０９ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂが形成された面が対面するようにセル２０５が形成されている。このような構成にすることにより、被検溶液保持空間２０５ｆを１つのみ設ければよいので、被検溶液を供給することが容易になる。
【０１１１】
被検溶液が満たされているかどうかを判定するためのセンサは、簡便な構成を有する。例えば、第１の基板１０５ａと第２の基板１０５ｂに電極を設けておき、セル２０５を光学測定装置２００に挿入した後、電極に弱い電圧がかかるようにしておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液が被検物質保持空間２０５ｆに満たされているかどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用してハロゲン光源１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。
【０１１２】
本実施の形態における生体成分濃度計測装置の動作については、実施の形態１と同様であるので説明を省略する。本実施の形態によれば、被検溶液の供給が容易かつ、セルの作製が簡単な生体成分濃度測定用セルを提供することができる。
【０１１３】
（実施の形態３）
本発明の別の実施の形態について、図１０〜図１１を用いて説明する。
【０１１４】
本実施の形態において、実施の形態１と異なる構成は、生体成分濃度測定用セル４０５が第２の基板１０５ｂの底面に歯車３１３を備え、光学測定装置４００が、生体成分濃度測定用セル４０５の歯車３１３と連結する歯車１１３、歯車１１３と連結するシャフト１１４、シャフト１１４と連結し歯車１１３を回転させるモーター１１５とを備えている点である。その他の構成は同じであるので、説明は省略する。
【０１１５】
図１１は、本発明の実施の形態３における生体成分濃度測定用セル４０５の構成を示す図である。図１１（Ａ）は、生体成分濃度測定用セル４０５の断面を示す図であり、図１１（Ｂ）は生体成分濃度測定用セル４０５の分解斜視図である。
【０１１６】
第２の基板１０５ｂの底面に歯車３１３が備えられている。歯車３１３は、第１の基板１０５ａ、第２の基板１０５ｂを通過してきた光を遮ることがないように、貫通孔３０６を備えている。
【０１１７】
本実施の形態における歯車１１３、シャフト１１４、モーター１１５、歯車３１３は本発明におけるセル回転手段に相当する。本実施の形態では、ハロゲン光源１０１の偏光を選択するために偏光板１０３を用いているが、特定の偏光を持つ光源を用いることもできる。特定の偏光を持つ光源としては、レーザー光源などが挙げられる。特定の偏光を持つ光源を用いた場合、偏光板１０３を用いなくてもよい。
【０１１８】
次に、本実施の形態における生体成分濃度計測装置の動作について、図面を参照しながら説明する。まず、セル４０５を光学測定装置４００に挿入する。光学測定装置４００にセル４０５が挿入されるとハロゲン光源１０１の電源が入れられる。ハロゲン光源１０１から放射された光は、レンズ１０２により整形され、偏光板１０３を通過する。
【０１１９】
マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を通過した光の偏光方向と、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸方向が平行になるように、モーター１１５により歯車１１３を回転させ、セル４０５を回転させる。
【０１２０】
偏光板１０３を通過した光の偏光方向と、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸方向が平行であることを検知する手段としては、あらかじめ、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸方向が分かるように、セル４０５に凹部（図示せず）を設け、フォトセンサにより検出する方法を用いてもよい。
【０１２１】
偏光板１０３を通過した光は、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行になるように回転させたセル４０５を通過する。その際、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が極大となる。第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長においては、光は消衰しない。セル１０５を透過した光は、レンズ１０４により集光され、スリット１０６を透過し、グレーティング素子１０７により分散され、受光器１０８における各受光領域に到達する。
【０１２２】
マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８の各受光領域が検出した光強度に基づいて光の消衰が極大となる波長を決定し、被検溶液供給前の第１の波長λａ０としてメモリ１１１に格納する。
【０１２３】
被検溶液供給前の第１の波長λａ０を決定した後、マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を通過した光の偏光方向と第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸方向が平行になるようにモーター１１５により歯車１１３を回転させ、セル４０５を回転させる。
【０１２４】
偏光板１０３を通過した光は、第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行になるように回転させたセル４０５を通過する。その際、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長では、光は消衰しない。一方、同時に第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が極大となる。
【０１２５】
セル１０５を透過した光はレンズ１０４により集光され、スリット１０６を透過し、グレーティング素子１０７により分散され、受光器１０８における各受光領域に到達する。マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８の各受光領域が検出した光強度に基づいて光の消衰が極大となる波長を決定し、被検溶液供給前の第２の波長λｂ０としてメモリ１１１に格納し、ハロゲン光源１０１の電源を切る。λａ０とλｂ０の計測が完了し、被検溶液を供給可能な状態であることは、例えば、スピーカー（図示せず）を通じて音声での通知や、ディスプレイ等（図示せず）に表示させることにより、ユーザに通知される。その後、被検物質が含まれる被検溶液を供給する。
【０１２６】
セル１０５に被検溶液が満たされると、被検溶液中の被検物質である抗原が、第１金属ナノロッド１０９ａ上の抗体１１２ａと特異的に結合する。
【０１２７】
一定時間が経過し、抗体１１２ａと抗原が結合した後、ハロゲン光源１０１の電源を入れる。ハロゲン光源１０１から放射された光は、レンズ１０２により整形され、偏光板１０３を通過する。
【０１２８】
マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を通過した光の偏光方向と、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸方向が平行になるように、モーター１１５により歯車１１３を回転させ、セル４０５を回転させる。
【０１２９】
偏光板１０３を通過した光は、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸に平行になるように回転させたセル４０５を通過する。その際、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が極大となる。第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長においては、光は消衰しない。
【０１３０】
セル１０５を透過した光は、レンズ１０４により集光され、スリット１０６を透過し、グレーティング素子１０７により分散され、受光器１０８における各受光領域に到達する。
【０１３１】
マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８の各受光領域が検出した光強度に基づいて光の消衰が極大となる波長を決定し、被検溶液が供給された後の第１の波長λａ１としてメモリ１１１に格納する。
【０１３２】
この時、被検溶液が満たされているかどうかを判定するためのセンサを備えていることが好ましい。例えば、カバーガラス１０５ｅと第１の基板１０５ａに電極を設け、さらに、第１の基板１０５ａと第２の基板１０５ｂに別の電極を設けておき、セル４０５を光学測定装置４００に挿入した後、電極に弱い電圧がかかるようにしておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液が第１の被検溶液保持空間１０５ｆ、第２の被検溶液保持空間１０５ｇに満たされているかどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用してハロゲン光源１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。
【０１３３】
被検溶液が供給された後の第１の波長λａ１を決定した後、マイクロコンピュータ１１０は、偏光板１０３を通過した光の偏光方向と第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸方向が平行になるようにモーター１１５により歯車１１３を回転させ、セル４０５を回転させる。
【０１３４】
偏光板１０３を通過した光は、第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸に平行になるように回転させたセル４０５を通過する。その際、第１の基板１０５ａに形成された第１金属ナノロッド１０９ａの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長では、光は消衰しない。一方、同時に第２の基板１０５ｂに形成された第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸由来の局在型表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が極大となる。
【０１３５】
セル１０５を透過した光はレンズ１０４により集光され、スリット１０６を透過し、グレーティング素子１０７により分散され、受光器１０８における各受光領域に到達する。マイクロコンピュータ１１０は、受光器１０８の各受光領域が検出した光強度に基づいて光の消衰が極大となる波長を決定し、被検溶液が供給された後の第２の波長λｂ１としてメモリ１１１に格納する。
【０１３６】
次に、マイクロコンピュータ１１０は、λａ１とλａ０の差を算出し、第１の基板における共鳴波長シフト量Δλａを算出する。
【０１３７】
同様に、マイクロコンピュータ１１０は、λｂ１とλｂ０の差を算出し、第２の基板における共鳴波長シフト量Δλｂを算出する。
【０１３８】
さらに、マイクロコンピュータ１１０は、ΔλａとΔλｂの差を算出し、被検物質である抗原が抗体１１２ａに結合することによる共鳴波長シフト量Δλを算出する。
【０１３９】
その後、マイクロコンピュータ１１０は、メモリ１１１にあらかじめ格納されている共鳴波長シフト量Δλと被検物質濃度の相関関係を参照し、被検物質の濃度を算出する。算出された被検物質の濃度は、例えば、スピーカー（図示せず）を通じて音声での通知や、ディスプレイ等（図示せず）に表示させることにより、ユーザに通知される。
【０１４０】
本実施の形態では、実施の形態１の生体成分濃度計測装置にセル回転手段を設けたが、実施の形態２の生体成分濃度計測装置に同様にセル回転手段を設けてもよい。本実施の形態では、修飾されている物質を抗体としたが、他の物質を抗体とすることも可能である。本実施の形態において、光源として、ハロゲン光源１０１を用いたが、局在型表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射する光源であれば、特に限定することなく利用することができる。
【０１４１】
本実施の形態によれば、単にセルを回転させるだけで、光源、検出領域、光検出器の位置関係を変化させたり、測定領域を移動したりする必要がない。光照射のための複数の光軸を設けたり、照射領域を大きくしたりする必要もないので装置構成が簡便となり、かつ、高精度に生体成分濃度を測定することができる。
【０１４２】
（実施の形態４）
本発明の別の実施の形態について、図１２〜図１４を用いて説明する。
【０１４３】
図１２において、実施の形態１と異なる構成は、生体成分濃度測定用セルであるセル５０５が平面基板５０５ａの第１金属ナノロッド１０９ａが形成されている面の裏面に第２金属ナノロッド１０９ｂが構成されている点である。セル５０５以外の構成は同じであるので、説明を省略する。
【０１４４】
図１３は、本実施の形態４におけるセル５０５の断面図である。セル５０５は第１金属ナノロッド１０９ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂが設けられている平面基板５０５ａ、第１のカバーガラス５０５ｂ、第２のカバーガラス５０５ｅ、第１のスペーサ５０５ｃ、第２のスペーサ５０５ｄ、被検溶液の供給口（図示せず）、排出口（図示せず）から構成されている。また、第１のカバーガラス５０５ｂ、平面基板５０５ａ、第１のスペーサ５０５ｃから構成される第１の被検溶液保持空間５０５ｆと第２のカバーガラス５０５ｅ、平面基板５０５ａ、第２のスペーサ５０５ｄから構成される第２の被検溶液保持空間５０５ｇを備える。
【０１４５】
図１４は、セル５０５の平面基板５０５ａの金属ナノロッドが形成された部分の斜視図である。平面基板５０５ａの一方の面には、長軸が同一方向に配向した第１金属ナノロッド１０９ａが形成されており、平面基板５０５ａの他方の面には、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸方向と垂直な方向に長軸が配向した第２金属ナノロッド１０９ｂ（一部のみ図示）が形成されている。第１金属ナノロッド１０９ａには、第１の抗体１１２ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂには、ブロッキング物質１１２ｃが修飾されている。
【０１４６】
このような構成にすることにより、金属ナノロッドが形成された基板を張り合わせる必要がないので、張り合わせにより、第１金属ナノロッド１０９ａと第２金属ナノロッド１０９ｂの長軸の方向は、垂直方向から変わらない。よって、測定精度向上につながる。本実施の形態における生体成分濃度計測装置の動作については、実施の形態１と同様であるので説明を省略する。また、実施の形態３のように計測領域と参照領域を設けてもよい。
【０１４７】
本実施の形態によれば、セルの作製精度が高く、計測精度が高い生体成分濃度測定用セルを提供できる。
【０１４８】
（実施の形態５）
本発明の別の実施の形態について、図１５〜図１７を用いて説明する。
【０１４９】
図１５において、実施の形態１と異なる構成は、生体成分濃度測定用セルであるセル６０５が、第１の基板６０５ａの第１金属ナノロッド１０９ａが形成されている面と、第２の基板６０５ｂの第２金属ナノロッド１０９ｂが形成されている面が逆方向を向いて構成されている点である。セル６０５以外の構成は同じであるので、説明を省略する。
【０１５０】
図１６は、本実施の形態５におけるセル６０５の断面図である。セル６０５は第１金属ナノロッド１０９ａが設けられている第１の基板６０５ａ、第２金属ナノロッド１０９ｂが設けられている第２の基板６０５ｂ、第１のカバーガラス６０５ｅ、第２のカバーガラス６０５ｈ、第１のスペーサ６０５ｃ、第２のスペーサ６０５ｄ、第３のスペーサ６０５ｉ、被検溶液の供給口（図示せず）、排出口（図示せず）から構成されている。また、第１のカバーガラス６０５ｅ、第１の基板６０５ａ、第１のスペーサ６０５ｃから構成される第１の被検溶液保持空間６０５ｆと第２のカバーガラス６０５ｈ、第２の基板６０５ｂ、第３のスペーサ６０５ｉから構成される第２の被検溶液保持空間６０５ｇを備える。
【０１５１】
図１７は、セル６０５の第１の基板６０５ａの金属ナノロッドが形成された部分と第２の基板６０５ｂの金属ナノロッドが形成された部分の斜視図である。第１の基板６０５ａには、長軸が同一方向に配向した第１金属ナノロッド１０９ａが形成されており、第２の基板６０５ｂには、第１金属ナノロッド１０９ａの長軸と垂直な方向に長軸が配向した第２金属ナノロッド１０９ｂが形成されている。第１の基板６０５ａの第１金属ナノロッド１０９ａが形成された面と第２の基板６０５ｂの第２金属ナノロッド１０９ｂが形成された面は、互いに逆方向を向いている。第１金属ナノロッド１０９ａには、第１の抗体１１２ａが修飾されており、第２金属ナノロッド１０９ｂには、ブロッキング物質１１２ｃが修飾されている。
【０１５２】
本実施の形態における生体成分濃度計測装置の動作については、実施の形態１と同様であるので説明を省略する。本実施の形態によれば、計測精度が高い生体成分濃度測定用セルを提供できる。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明にかかる生体成分濃度測定装置は、小型でかつ高精度に生体成分濃度を測定することができるので、被検物質の濃度が低く、複数の被検物質濃度を測定する際に有用である。
【符号の説明】
【０１５４】
１００、３００    生体成分濃度計測装置
１０１    ハロゲン光源
１０２    レンズ
１０３    偏光板
１０４    レンズ
１０５、２０５、３０５、４０５、５０５、６０５    セル
１０５ａ、６０５ａ    第１の基板
１０５ｂ、６０５ｂ    第２の基板
１０５ｃ、５０５ｃ、６０５ｃ    第１のスペーサ
１０５ｄ、５０５ｄ、６０５ｄ    第２のスペーサ
１０５ｅ    カバーガラス
１０５ｆ、５０５ｆ、６０５ｆ    第１の被検溶液保持空間
１０５ｇ、５０５ｇ、６０５ｇ    第２の被検溶液保持空間
１０５ｈ    基板
１０６    スリット
１０７    グレーティング素子
１０８    複数の受光領域を持つ光検出器
１０９ａ、１０９ｂ、１０９ｃ  金属ナノロッド
１１０    マイクロコンピュータ
１１１    メモリ
１１２ａ    第１の抗体
１１２ｂ    第２の抗体
１１２ｃ    ブロッキング物質
１１３    歯車
１１４    シャフト
１１５    モーター
２００、４００    光学計測装置
２０５ｃ    スペーサ
２０５ｆ    被検溶液保持空間
３０６    貫通孔
３１３    歯車
５０５ａ    平面基板
５０５ｂ、６０５ｅ    第１のカバーガラス
５０５ｅ、６０５ｈ    第２のカバーガラス
６０５ｉ    第３のスペーサ
【図１】
2013501917.tif 000003
【図２】
2013501917.tif 000004
【図３】
2013501917.tif 000005
【図４】
2013501917.tif 000006
【図５】
2013501917.tif 000007
【図６】
2013501917.tif 000008
【図７】
2013501917.tif 000009
【図８】
2013501917.tif 000010
【図９】
2013501917.tif 000011
【図１０】
2013501917.tif 000012
【図１１】
2013501917.tif 000013
【図１２】
2013501917.tif 000014
【図１３】
2013501917.tif 000015
【図１４】
2013501917.tif 000016
【図１５】
2013501917.tif 000017
【図１６】
2013501917.tif 000018
【図１７】
2013501917.tif 000019
【図１８】
2013501917.tif 000020
【図１９】
2013501917.tif 000021
【図２０】
2013501917.tif 000022
【国際調査報告】
2013501917.tif 000023
2013501917.tif 000024
2013501917.tif 000025