(57)【要約】  本発明は、大動脈瘤の予防及び／又は治療において使用される、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−２９）の発現及び／又は機能のアンタゴニストに関する。ｍｉＲＮＡ−２９アンタゴニストを特定する方法と、上記ｍｉＲＮＡ−２９アンタゴニストを含む医薬組成物と、かかる治療を必要とする被験体における年齢に関連する大動脈瘤形成を予防及び治療する方法とが更に開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における大動脈瘤形成の予防及び／又は治療に使用される、ｍｉＲＮＡ−２９の発現及び／又は機能のアンタゴニスト。
【請求項２】
前記大動脈瘤が腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）である、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記大動脈瘤形成が、動脈血管の脆弱化及び／又は大動脈破裂を更に伴う、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記大動脈瘤が、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ１Ａ３、ＥＬＮ及び／又はＦＢＮ１等の動脈組織における細胞外マトリクスタンパク質、例えばコラーゲン、フィブリリン又はエラスチン等に関する遺伝子の下方調節を更に伴う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ−２９がｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃから選択され、又はｍｉＲＮＡ−２９ｂである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸ＬＮＡ（商標）塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、アンタゴｍｉｒ、並びにそれらの混合物から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記アンタゴニストを薬物溶出ステントにより又はバルーンにより該動脈組織に投与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを特定する方法であって、
（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの内の少なくとも１つの活性又は発現を評価することと、
（ｃ）工程（ｂ）における活性又は発現を、該候補化合物の非存在下でのｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの活性又は発現と比較することと、
を含み、工程（ｃ）におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの測定された活性又は発現と比較した場合の工程（ｂ）におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの測定された活性又は発現の低減が、該候補化合物がｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストであることを示す、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを特定する方法。
【請求項９】
細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで該候補化合物に接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
候補化合物がタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は小分子である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現を評価することが、ノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの活性を評価することが、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ１Ａ３、ＥＬＮ及び／又はＦＢＮ１等のｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃにより調節される遺伝子、例えばコラーゲン、フィブリリン又はエラスチン等に関する遺伝子の発現又は活性を評価することを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡ−２９、又はｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡ−２９の該アンタゴニストが、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸ＬＮＡ（商標）塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴ、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、アンタゴｍｉｒ、並びにそれらの混合物から選択され、又はｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴｍｉｒである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの該アンタゴニストが、ｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ、ｍｉＲＮＡ−２９ｃ、又はそれらの組合せの成熟配列に相補的な配列を含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大動脈瘤の予防及び／又は治療において使用される、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−２９）の発現及び／又は機能のアンタゴニストに関する。ｍｉＲＮＡ−２９アンタゴニストを特定する方法と、上記ｍｉＲＮＡ−２９アンタゴニストを含む医薬組成物と、かかる治療を必要とする被験体における年齢に関連する大動脈瘤形成を予防及び治療する方法とが更に開示される。
【背景技術】
【０００２】
今日における人間の長寿化には、加齢に伴う心臓血管疾患の有病率の増大という代償が伴う（非特許文献１）。死亡率の高い特定の病態の１つが、大動脈瘤形成、及びそれに続く大動脈血管の破裂である。大動脈瘤（ＡＡ）は、高齢の男性のおよそ９％が罹患し、かなりの数の死をもたらす典型的な年齢に伴う疾患である（非特許文献２）。
【０００３】
ＡＡの発生率は依然として増大しており、このことは例えば血圧を標的とすることによる現在の一次予防的な健康管理戦略はＡＡを低減する効果が十分ではないことを示している。手術が現在のところ、現行の技術水準の治療であるが、この外科的介入は、かなりの罹患率及び死亡率を伴い、例えば術前死亡率及び術後死亡率が大きいために、患者の１０％〜２５％しか破裂から生存しない。機構的レベルでの人間の病理切片の解析により、ＡＡの形成及び破裂は血管壁の薄層化を特徴とすることが明らかになった。細胞外マトリクスの形成の低減又は破壊が、血管壁の薄層化に至る重要な病態生理学的プロセスであると考えられる（非特許文献３）。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一部の（病態）生理学的プロセスの重要な調節因子として近年明らかになっている。ｍｉＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡの分解を誘導することにより、又はタンパク質の翻訳を阻止することにより転写後にタンパク質発現を調節する短い非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡはステム−ループ構造へと折り畳まれる転写産物前駆体として発現される。続いてｍｉＲＮＡ前駆体はＤｒｏｓｈａヌクレアーゼ及びＤｉｃｅｒヌクレアーゼにより消化され、成熟ｍｉＲＮＡ二本鎖を生じ、それからこれがｍｉＲＮＡ関連のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入される。しかしながら、成熟ｍｉＲＮＡの一方の鎖だけが複合体中に保持され、標的となるｍＲＮＡとの結合をもたらす。サイレンシングした（silenced）遺伝子転写産物内の標的配列領域は多くの場合、各ｍＲＮＡの非翻訳領域に見られ、ｍｉＲＮＡは好ましくはそれらの標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域で結合し、翻訳阻害又はｍＲＮＡ分解を促進する。
【０００５】
様々な研究により、特定のｍｉＲＮＡが血管成長及び心臓機能を制御することが示されたが（非特許文献４）、ＡＡ形成及びアテローム性動脈硬化粥腫の破裂におけるｍｉＲＮＡの関与、並びに血管ｍｉＲＮＡの発現に対する年齢の影響は未だに知られていない。
【０００６】
ｍｉＲＮＡ−２９周辺のマイクロＲＮＡファミリーが、心組織における線維化の重要な調節因子として知られている。特許文献１は、ｍｉＲＮＡ−２９ファミリーの成員であるｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃがストレスに応じて心臓組織で下方調節され、ストレス及び線維化の両方に耐性があるマウスの心臓組織で上方調節されることを示している。しかしながら、大動脈瘤形成は特許文献１には開示されていない。
【０００７】
同様に、特許文献２は、心臓の疾患におけるｍｉＲＮＡ発現の治療的影響を開示している。心筋細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の変化が心不全における様々な遺伝子の転写に対して広範な効果を誘発することが見出された。例えば、ｍｉＲ−１はカルモジュリン発現レベルを調節する。予測されるｍｉＲ−１標的には、心不全発病に寄与し得る幾つかのものが含まれ、それらの中でも、心臓における主要なカルモジュリンアイソフォームはＣａｌｍ  １及びＣａｌｍ  ２である。この出願は、治療標的として罹患した心臓組織で特異的に発現するｍｉＲＮＡを使用することを示唆している。
【０００８】
特許文献１は、血管系において軟性粥腫を線維性組織へと変形させ、心筋梗塞症を予防する線維化促進剤（profibrotic agents）としてのｍｉＲ−２９ａアンタゴニスト〜ｍｉＲ−２９ｃアンタゴニストの使用を開示している。
【０００９】
幾つかの他のマイクロＲＮＡは心臓病の発症における重要な調節因子である。Silvestri et al.は、ＭｉＲ−２９が心筋梗塞症後の線維化反応に関与し、ｍｉＲ−２１が血管形成術後の再狭窄において基本的な役割を果たし得ると述べている。ＭｉＲ−２０８は心不全における収縮性タンパク質での胎児性遺伝子の発現パターンへの移行に関与する。ＭｉＲ−１は、心筋梗塞症後の心不整脈に対する感受性に影響を与える（非特許文献５）。
【００１０】
心筋梗塞症におけるｍｉＲＮＡ−２９の発現は、心筋虚血−再潅流傷害に対するピオグリタゾン（ＰＰＡＲ−γアゴニスト）の予防効果に関する研究の出発点である。ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現はラットへのピオグリタゾン投与後にかなり弱くなった。興味深いことに、ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴｍｉｒは、ＩＲ傷害に罹った心臓において心筋梗塞のサイズ及びアポトーシスを大幅に低減した。これは、心臓における抗アポトーシス因子（Ｍｃｌ−２）の発現の増大によるものであると考えられた（非特許文献６）。さらに、非特許文献７は、オステオポンチンがヒトの腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）に関連すること、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究により、このサイトカインがペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）のライゲーションにより下方調節されることが示唆されることを開示している。同様に、非特許文献８は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γアゴニストであるロシグリタゾンが動脈瘤の拡大又は破裂を低減することを開示している。ロシグリタゾンによる前処理又は後処理はマウスモデルにおける大動脈瘤の拡大及び破裂を低減した。ロシグリタゾンで前処理した動物における病変の低減は炎症性メディエータの発現の低減と同時に起こる。正確な機構を解明するために必要とされる更なる研究が述べられている。それにもかかわらず、これらの刊行物では、リガンド又はロシグリタゾン又はピオグリタゾンの効果は本発明に関わる機構とは完全に独立している。
【００１１】
大動脈瘤形成の治療のための薬物治療は全く認可されておらず、また利用することができないが、危険因子の変更、並びにスタチン及びＡＣＥ阻害剤を用いた予防的治療法により、ここ１５年間のアテローム性動脈硬化症による死亡率が低減している。しかしながら最も重要なことに、平均余命の増大及び集団全体の年齢の増大により、動脈瘤の形成のような年齢に伴う疾患が、時間が経つにつれて更に増大することが予測される。そのため、有効な治療が強く必要とされている。異常な血管リモデリングを治療により妨げようとする現在の試みは、血管壁構造の変化に関連する炎症反応を抑えることだけに焦点を絞っている。しかしながら、血管壁の構造的脆弱性を変更するための治療選択肢は１つも存在していない。コラーゲンを分解するプロテイナーゼを阻止する特定の治療介入、又は炎症細胞の動員の抗体介在性の阻害は失敗に終わってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００９／０１８４９３号
【特許文献２】国際公開第２００８／０４２２３１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Lakatta EC. Age-associated cardiovascular changes in health: impacton cardiovascular disease in older persons. Heart Fail Rev. 2002;7:29-49
【非特許文献２】Singh K, Bonaa KH, Jacobsen BK, Bjork L, Solberg S. Prevalence ofand Risk Factors for Abdominal Aortic Aneurysms in a Population-based Study:The Tromso Study. Am J Epidemiol. 2001; 154:236-244
【非特許文献３】Guo DC, Papke CL, Hc R, Milewicz DM. Pathogenesis of thoracic and abdominalaortic aneurysms. Ann N Y Acad Sci. 2006;1085:339-352
【非特許文献４】Urbich C, Kuehbacher A, Dimmeler S. Role of microRNAs in vasculardiseases; inflammation, and angiogenesis. Cardiovasc Res. 2008;79:581-588
【非特許文献５】Silvestri P et al., MicroRNAs and ischemic heart disease: towards abetter comprehension of pathogenesis, new diagnostic tools and new therapeutictargets. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009 Jun;4(2):109-18
【非特許文献６】Ye Y, et al., Down-regulation of microRNA-29 by antisense inhibitorsand a PPAR-{gamma} agonist protects against myocardial ischemia-reperfusioninjury, Cardiovasc Res. 2010 Feb 17
【非特許文献７】Golledge et al.（in Golledge J, et al.Peroxisome proliferator-activated receptor ligands reduce aortic dilatation ina mouse model of aortic aneurysm. Atherosclerosis. 2010 May;210(1):51-6. Epub2009 Oct 29.）
【非特許文献８】Jones et al.（in Jones A, et al.Rosiglitazone reduces the development and rupture of experimental aorticaneurysms. Circulation. 2009 Jun 23;119(24):3125-32. Epub 2009 Jun 8.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の従来技術、及び大動脈瘤に現在利用可能な予防的又は治癒的な戦略の制限を鑑みると、本発明の目的は、高齢者で診断されることの多い大動脈瘤形成の予防及び／又は治療のための新規な診断戦略及び治療戦略を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様では、上記の課題は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける大動脈瘤形成の予防及び／又は治療に使用される、ｍｉＲＮＡ−２９の発現及び／又は機能のアンタゴニストにより解決される。生物情報学的なアプローチを用いることにより、本発明者らは驚くべきことに、ｍｉｒ−２９ファミリー（ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−２９ｂ及びｍｉｒ−２９ｃ）が、本発明に関して研究されるような２０個の調節されるｍｉＲＮＡの中で、若齢マウスと比較して老齢マウスの大動脈におけるｍＲＮＡレベルに機能的に影響を与える唯一のものであることを見出した。
【００１６】
大動脈瘤形成は、コラーゲン、フィブリリンの破壊、血管平滑筋細胞のアポトーシス、及び炎症細胞の動員により引き起こされる。
【００１７】
本明細書に記載される本発明のアンタゴニストは、急性心筋梗塞症、不安定狭心症、末梢動脈閉塞性疾患、虚血性脳卒中、大動脈瘤形成及び大動脈破裂等の動脈血管の脆弱化を伴う疾患及び事象の予防に特に有用である。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ｉ）アテローム性動脈硬化症による大動脈における動脈瘤の形成、ｉｉ）遺伝的要因による、例えばマルファン症候群での大動脈における動脈瘤の形成、ｉｉｉ）大動脈二尖弁が形成した患者における動脈瘤の形成、及びｉｖ）年齢依存性の大動脈瘤形成を含む病態の予防及び／又は治療に用いられる。このため、１つの実施の形態では、上記の大動脈瘤形成が高齢の哺乳動物で起こり、そのため年齢に関連する場合がある。別の実施の形態では、上記の大動脈瘤形成が遺伝的状態が原因で起こる場合があり、かつ／又は疾患に関連する。両方の実施の形態が同時に起こる場合もある。
【００１８】
本発明との関連では、「大動脈破裂」という用語は、身体における最も大きい動脈である大動脈が、拡張の結果として、特に大動脈瘤形成の影響で、又はアテローム性動脈硬化粥腫の形成の結果として引き裂かれた又は破裂した状態に関する。
【００１９】
本発明との関連では「予防」という用語は、多くの場合で、疾患を有する患者の病態の悪化、又は健常な及び／若しくは病気の被験体の傷害若しくは死に至る負の事象の発生を避けることを目的とする医学的介入と理解される。
【００２０】
１つの実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９の発現及び／又は機能のアンタゴニストは、血管壁の薄層化による大動脈の局所的拡張を特徴とする大動脈瘤（ＡＡ）に使用される。
【００２１】
そのため、別の実施の形態では、本発明によるアンタゴニストは、年齢に関連する大動脈瘤の予防及び／又は治療に使用され、上記大動脈瘤、好ましくは年齢に関連する大動脈瘤は、ＣＯＬ１  Ａ１、ＣＯＬ１  Ａ２、ＣＯＬ１  Ａ３、ＥＬＮ及び／又はＦＢＮ１等の大動脈組織における細胞外マトリクスタンパク質、例えばコラーゲン、フィブリリン又はエラスチン等に関する遺伝子の下方調節を更に伴う。
【００２２】
また本発明の更なる実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９の発現及び／又は機能のアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現及び／又は機能のアンタゴニストから選択され、特にｍｉＲＮＡ−２９ｂの発現及び／又は機能のアンタゴニストである。
【００２３】
更なる実施の形態では、本発明によるアンタゴニストは、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸ＬＮＡ（商標）塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴ、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、アンタゴｍｉｒ、並びにそれらの混合物から選択されるアンタゴニストである。
【００２４】
ｍｉＲＮＡがワトソン・クリック塩基対合によりそれらのｍＲＮＡを標的としているため、ｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストが、内因性ｍＲＮＡ標的と競合する、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを有する塩基対に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲＮＡ−２９（ａ〜ｃ）及び／又はその種配列の相補体に対して５０％同一であり、好ましくはｍｉＲＮＡ−２９（ａ〜ｃ）及び／又はその種配列の相補体に対して６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％、最も好ましくは１００％同一である。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡとの二本鎖の熱安定性を改善するように化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。好ましい化学修飾体は例えば、糖−リン酸骨格におけるフラノース環が、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋の導入によりＲＮＡを模倣するＮ型立体配座に化学的に固定された二環式の高親和性のＲＮＡ類似体（ＬＮＡ（商標）−ａｎｔｉｍｉＲ）を含む。他の好ましい化学修飾したオリゴヌクレオチドには、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチド、及びコレステロール抱合型の２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチド（アンタゴｍｉｒ）が含まれる。
【００２５】
本発明との関連ではアンタゴニストはまた、マイクロＲＮＡの発現を阻害することにより、又はマイクロＲＮＡのサイレンシング機能を阻害することによりｍｉＲＮＡ−２９を阻害することが可能な任意の物質も含む。このため、例えばＰａｓｈａタンパク質、Ｄｒｏｓｈａタンパク質、Ｄｉｃｅｒタンパク質、又はＡｒｇｏｎａｕｔファミリータンパク質の機能を阻害することによりマイクロＲＮＡ経路を妨げる任意の化合物が、本発明によるアンタゴニストであり得る。さらに、ｍｉＲＮＡ−２９のマイクロＲＮＡ前駆体の発現を阻害する任意の化合物、例えばポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩの阻害剤等が、ｍｉＲＮＡ−２９発現の候補アンタゴニストである。成熟ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ−２９機能の阻害剤の設計のための標的としても働く。マイクロＲＮＡとの完全な又はミスマッチした相補性（complementarity）を有する核酸を、内因性ｍｉＲＮＡ−２９とその標的ｍＲＮＡとの結合を阻害する、又はその結合と競合させるのに使用することができる。このようなｍｉＲＮＡ阻害剤の設計法は当該技術分野で既知である。
【００２６】
更なる実施の形態では、本発明のアンタゴニストを薬物溶出ステントにより又はバルーンにより動脈組織へと投与する。好ましくは薬物溶出ステント又はバルーンは生体吸収性材料でできている。薬物の血管内部への局所送達に好適な任意のデバイスを本発明との関連で使用することができることが理解される。
【００２７】
別の態様では、本発明の目的は、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを特定する方法であって、
（ａ）細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの活性又は発現を評価することと、
（ｃ）工程（ｂ）における活性又は発現を、候補化合物の非存在下でのｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの活性又は発現と比較することと、
を含み、工程（ｃ）におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの測定された活性又は発現と比較した場合の工程（ｂ）におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの測定された活性又は発現の低減が、候補化合物がｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストであることを示す、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを特定する方法により解決される。
【００２８】
好適な細胞は、血管壁細胞、大動脈起源の細胞、又は哺乳動物の血管由来の他の細胞、例えば好ましくは内皮細胞（ＥＣ）及び／又は平滑筋細胞（ＳＭＣ）等から選択することができ、これらは更なる好ましい実施の形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ１Ａ３、ＥＬＮ及び／又はＦＢＮ１等のマトリクス遺伝子、例えばコラーゲン、フィブリリン又はエラスチンに関する遺伝子等を組換えにより若しくは本質的に発現する、又は好ましくは過剰発現する。
【００２９】
更なる実施の形態では、本発明の方法は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで候補化合物に接触させることを含む。
【００３０】
それから、また別の実施の形態は、候補化合物がタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は小分子である、本発明の方法に関する。
【００３１】
更なる実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現を評価することは、ノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲを含む。しかしながら、現行の技術水準で知られる、マイクロＲＮＡの同定及び定量のための技法が複数存在する。ノーザンブロット法及びＲＴ−ＰＣＲの他に、マイクロＲＮＡ発現の評価を、マイクロＲＮＡ発現アレイ、蛍光核酸プローブ、例えば膜又はビーズに連結した蛍光核酸プローブ、及び抗体ベースの検出システムにより行うことができる。間接的なアプローチでは、マイクロＲＮＡの活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのレポータアッセイにより更に測定する。例えば、当業者は、本発明の技術を利用することなく、ｍｉＲＮＡ−２９ファミリーの種配列に基づいたレポータアッセイを設計することができ、これにより候補ｍｉＲＮＡ−２９アンタゴニストの容易なスクリーニングが可能になる。このようなアプローチでは、ｍｉＲＮＡの標的配列を最適なレポータ遺伝子の３’非翻訳領域又は５’非翻訳領域に導入することができる。それから、このｍｉＲ感受性構築物を好適な細胞発現系へと形質転換し、続いてこれを候補化合物に接触させる。対照試料におけるレポータ遺伝子の活性と比較した、化合物に接触させた試料におけるレポータ遺伝子の活性により、試験化合物の阻害効果についての情報が与えられる。
【００３２】
更に別の実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを特定する本発明の方法は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ１Ａ３、ＥＬＮ及び／又はＦＢＮ１等のｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃにより調節される遺伝子、例えばコラーゲン、フィブリリン又はエラスチンに関する遺伝子等の発現又は活性を評価することを含む。
【００３３】
本発明の別の態様では、上記課題は、ｍｉＲＮＡ−２９、特にｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストを含む医薬組成物により解決される。好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物は、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸ＬＮＡ（商標）塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴ、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、アンタゴｍｉｒ、並びにそれらの混合物から選択され、特にｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴｍｉｒである、ｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストを含む。特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ、ｍｉＲＮＡ−２９ｃ、又はそれらの組合せの成熟配列に相補的な配列を含む。
【００３４】
治療法における使用のために、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現及び／又は機能のアンタゴニストを未処理の化学物質として投与することができると考えられるが、医薬組成物として活性成分を与えることが好ましい。したがって更なる態様では、本発明は、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と結び付いた、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃの発現及び／若しくは機能のアンタゴニストを含む医薬組成物、又はその薬学的に許容可能な誘導体を提供する。担体及び／又は賦形剤は、配合物の他の成分と相溶性であり、そのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければいけない。
【００３５】
更に別の態様では、本発明の目的は、
（ａ）大動脈瘤形成を有する被験体を特定する工程と、
（ｂ）上記被験体に、ｍｉＲＮＡ−２９の発現又は機能のアンタゴニストを投与する工程と、
を含む、それを必要とする被験体において大動脈瘤形成を予防及び／又は治療する方法により解決される。
【００３６】
大動脈瘤形成の予防及び／又は治療を必要とする被験体は、本発明との関連では大動脈において動脈瘤を有すると診断された被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。大動脈瘤を発生する危険性が増大した被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトが更に含まれる。
【００３７】
１つの実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストが、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックド核酸ＬＮＡ（商標）塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴ、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、アンタゴｍｉｒ、並びにそれらの混合物から選択され、特にｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴｍｉｒである、本明細書の上記で開示された方法が好ましい。特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ〜ｍｉＲＮＡ−２９ｃのアンタゴニストが、ｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ、ｍｉＲＮＡ−２９ｃ、又はそれらの組合せの成熟配列に相補的な配列を含む。
【００３８】
次の実施の形態では、ｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストが非経口投与又は動脈組織への直接注射により投与される、それを必要とする被験体において大動脈瘤形成を予防及び／又は治療する方法が好ましい。アンタゴニストのこのような投与は好ましくは、経口投与、経皮投与、持続放出性投与、制御放出性投与、遅延放出性投与、坐剤投与、カテーテル投与、薬物溶出ステント投与、バルーン投与、又は舌下投与を含む。
【００３９】
更なる実施の形態では、本発明による大動脈瘤形成を予防及び／又は治療する方法は、上記被験体に二次療法を施すことを含む。好ましくは上記二次療法は、ステント又はバルーンの導入からなる群から選択される。上記二次療法がｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストと同時に施されるか、又は上記二次療法がｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストの前又は後のいずれかで施されるのが最も好ましい。
【００４０】
血管壁の薄層化、及び／又は細胞外マトリクスタンパク質の形成の低減若しくは破壊の内の１つ又は複数の症状が、ｍｉＲＮＡ−２９のアンタゴニストの投与後に被験体で改善される、本発明による年齢に関連する大動脈瘤形成を予防及び／又は治療する方法の更なる実施の形態が好ましい。
【００４１】
以下の図面及び実施例は、本発明を単に説明するものにすぎず、本発明の範囲を実施例に記載の本発明の特定の実施形態に限定するものとは解釈されないものとする。本発明のために、引用される全ての参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【００４２】
本発明の実施例は添付の図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】ｍＲＮＡ発現を標的とするｍｉＲＮＡを同定するためのｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現の生物情報学的解析を示す図である。６ヌクレオチド長のワードを用いたＳｙｌａｍｅｒランドスケープ。最大のピークを有する「ワード」はｍｉＲＮＡ−２９種配列に対応する。
【図１Ｂ】ｍＲＮＡ発現を標的とするｍｉＲＮＡを同定するためのｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現の生物情報学的解析を示す図である。ｍｉＲＮＡスコアのヒストグラム。スコアは以下のとおりであった：
【表Ａ】
2013523696.tif 000002
【図２】大動脈における年齢により調節されたｍｉＲＮＡの確認を示す図である。ｍｉＲＮＡを若齢（６週齢）マウス（ｎ＝４）及び高齢（１８ヶ月齢）マウス（ｎ＝４）においてＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。（＊＊）は若齢マウスと老齢マウスとの間の有意差を示す。
【図３】老齢マウスの大動脈対若齢マウスの大動脈におけるｍｉＲＮＡ−２９標的遺伝子の発現（増加倍数又は減少倍数単位で）を示す図である。
【図４】ｓｎｏ２０２に対して正規化した、Ａｎｇ  ＩＩが注入されたマウスの大動脈におけるｍｉＲＮＡ−２９ファミリー成員の発現を示す図である。（ａ）ｍｉＲＮＡ−２９ｂ、（ｂ）ｍｉＲＮＡ−２９ａ、（ｃ）ｍｉＲＮＡ−２９ｃ。１群当たりｎ＝６。（＊＊）は、対照試料とアンギオテンシン処理試料との間の有意差を示す。
【図５】Ａｎｇ  ＩＩ処理ＳＭＣにおける相対的なＭｉＲ−２９発現（変化倍数）を示す図である。（Ａ）ｍｉＲＮＡ−２９ｂ、（ｂ）ｍｉＲＮＡ−２９ａ。
【図６】対照大動脈と比較した、正常な大動脈三尖弁を有する患者、又は異常な大動脈二尖弁を有する患者のいずれかのヒト大動脈瘤の組織切片におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃの相対的な発現（変化倍数単位で）を示す図である。（＊＊）は発現の有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４４】
実施例１：大動脈におけるｍｉＲＮＡの年齢に関連する調節
ｍｉＲＮＡ発現に対する年齢の影響を決定するために、本発明者らは、老齢の雄マウス（１８ヶ月齢）と、若齢の雄マウス（６週齢）とを比較する、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡのマイクロアレイ発現プロファイルを作製した。大動脈において年齢により調節される２０個のｍｉＲＮＡ（増加／減少の倍数＞１．５及びｐ＜０．０１）をこのアプローチにより同定した（表１）。
【００４５】
またこれらのｍｉＲＮＡの中でどのｍｉＲＮＡが加齢における生物学的影響を示すかを確定するために、ｍｉＲＮＡによる推定調節を特定するためにｍＲＮＡ発現データを使用する、２つの異なる不偏バイオインフォマティクスツールを適用した。これらのツール、Ｓｙｌａｍｅｒ（van Dongen S et al., Detecting microRNA binding and siRNA off-targeteffects from expression data. Nat Meth. 2008;5:1023-1025）及びＭｉｒＥｘＴｒａ（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/hexamers）の両方によって、２０個の調節されるｍｉＲＮＡの中で、ｍＲＮＡレベルに機能的に影響を与える唯一のものであるとしてｍｉｒ−２９ファミリー（ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−２９ｂ及びｍｉｒ−２９ｃ）が特定された（図１）。年齢によるｍｉｒ−２９ファミリー（ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｍｉＲＮＡ−２９ｂ）の上方調節をリアルタイムＰＣＲにより確認した（図２）。心臓では、ｍｉＲＮＡ−２９ファミリー（ｍｉＲＮＡ−２９ａ、ｍｉＲＮＡ−２９ｂ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃを含む）が、細胞外マトリクスタンパク質、例えばコラーゲン、フィブリリン及びエラスチンを標的とすることにより、急性心筋梗塞症後の組織線維化を制御することが分かっている（van Rooij E et al., Dysregulation of microRNAs after myocardialinfarction reveals a role of miRNA-29 in cardiac fibrosis. PNAS.2008;105:13027-13032）。実際、ｍｉｒ−２９のこれらの既知の標的は全て、大動脈において年齢により下方調節された（図３）。
【００４６】
表１：上方調節及び下方調節されたｍｉＲＮＡ
【表Ｂ】
2013523696.tif 000003
【００４７】
表１−２２：下方調節されたｍｉＲＮＡ
【表Ｃ】
2013523696.tif 000004
【００４８】
実施例２：アンギオテンシンＩＩはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｍｉＲＮＡ−２９発現を誘導する
ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるアンギオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩ注入は、マウスにおけるＡＡ形成の確立されたモデルとして用いられる。そのため、Ａｎｇ  ＩＩを４週間マウスに連続適用した。Ａｎｇ  ＩＩ処理マウスの大動脈では、ｍｉＲＮＡ−２９ｂが有意に上方調節された（図４ａ）。しかしながら、ｍｉＲＮＡ−２９ファミリーの他の成員、ｍｉＲＮＡ−２９ａは調節されなかった（図４ｂ）。これらのｉｎ  ｖｉｖｏデータは、平滑筋細胞のＡｎｇ  ＩＩ処理がｍｉＲＮＡ−２９ｂ発現を刺激したが、ｍｉＲＮＡ−２９ａに影響を与えなかったことを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により確認された（図５）。これらのデータにより、マウスにおけるＡＡ形成の原型的な誘導因子としてＡｎｇ  ＩＩがｍｉＲＮＡ−２９ｂ発現を誘導することが実証される。
【００４９】
実施例３：ｍｉＲＮＡ−２９ｂはヒトの動脈瘤の病理切片において特異的に増大する
ヒトにおけるこれらの実験による発見の妥当性を検証するために、大動脈二尖弁疾患の患者の病理切片におけるｍｉＲＮＡ−２９ファミリー成員の発現を測定した。この実験設計では、対照の大動脈（ｎ＝３０）と比較して患者の切片（ｎ＝７７）においてｍｉＲ−２９ｂが有意に増大したが、ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃは有意に増大しなかった（図６）。それにもかかわらず、理論に束縛されることを望むものではないが、各マウスモデルで見出されたように、より高齢の被験体／患者では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｍｉＲＮＡ−２９ｃの調節も変化することが推測される。
【００５０】
本研究のデータにより、年齢が大動脈におけるｍｉＲＮＡ−２９ファミリーの発現の増大に関連することが示される。ｍｉＲＮＡ−２９ファミリー成員の発現の増大と一致して、ｍｉＲＮＡ−２９が標的とする細胞外マトリクスタンパク質のレベルが顕著に低減する。年齢がＡＡの発生の主要な危険因子を含むため、続いて本発明者らは、Ａｎｇ  ＩＩ注入マウスの大動脈におけるｍｉＲＮＡ−２９の調節を決定した。Ａｎｇ  ＩＩはマウスにおいてＡＡの発生率を増大させる因子の１つである。加齢と同様に、Ａｎｇ  ＩＩ注入はｍｉＲＮＡ−２９ｂの発現を高める。しかしながら、加齢とは異なり、ｍｉＲＮＡ−２９ファミリーの他の成員はＡｎｇ  ＩＩ注入では調節されなかった。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＭＣのＡｎｇ  ＩＩ処理もｍｉＲＮＡ−２９ｂ発現を優先的に増大させた。ヒトにおける推測による妥当性を決定するために、本発明者らは更に、ヒトの病理切片におけるｍｉＲＮＡ−２９ファミリー成員の発現を測定した。刺激因子としてＡｎｇ  ＩＩを用いた実験による発見と一致して、ｍｉＲＮＡ−２９ｂはヒト大動脈の対照切片に対して病変切片で選択的に及び有意に上方調節された。まとめると、これらのデータにより、ｍｉＲＮＡ−２９ｂが実験モデル及びヒトにおいて年齢により及びＡＡを刺激する因子により増大することが実証される。ｍｉＲＮＡ−２９ｂが細胞外マトリクスタンパク質を標的とするため、ｍｉＲＮＡ−２９ｂの発現の増大が細胞外マトリクスの破壊及び血管壁の薄層化に寄与し得るという仮説を立てることができる。
【００５１】
ＭｉＲ−２９は更に、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ファミリー成員であるＭｃｌ−１を標的とすることにより（Mott JL et al., mir-29 regulates Mcl-1 protein expression and apotosis.Oncogene. 2007; 26:6133-6140）、及びｐ５３レベルを高めることにより（Park SYet al., miRNA-29 miRNAs activate p53 by targeting p85[alpha] and CDC42. NatStruct Mol Biol. 2009; 16:23-29）、がん細胞においてアポトーシスを誘導することが示された。平滑筋細胞のアポトーシスが、粥腫破裂に寄与すると考えられ、またＡＡにも関与し得る（Clarke MCH et al., Chronic Apoptosis of Vascular Smooth Muscle CellsAccelerates Atherosclerosis and Promotes Calcification and Medial Degeneration,Circ Res. 2008;102:1529-1538）。またｍｉＲＮＡ−２９のこれらのアポトーシス促進効果が平滑筋細胞で起こることは依然として実証されていないが、ｍｉＲＮＡ−２９による平滑筋細胞のアポトーシスの誘導は更に粥腫の不安定化を引き起こし得る。このため、ｍｉＲＮＡ−２９ｂは、アテローム性動脈硬化粥腫の薄層化及び不安定化を妨げるのに非常に魅力的な標的であり得る。
【００５２】
手術がＡＡに現在利用可能な唯一の治療であることから、新規な薬理学的介入はＡＡの治療法における大きな進歩を与えるであろう。ｍｉＲＮＡ阻害剤、いわゆるアンタゴｍｉｒ又はａｎｔｉｍｉＲを用いて、マウスモデル及び非ヒト霊長類においてｍｉＲＮＡ発現を低減することに成功している（Bonauer A et al., MicroRNA-92a Controls Angiogenesis and FunctionalRecovery of ischemic Tissues in Mice. Science. 2009;324:1710-1713、Lanford RE et al., Therapeutic Silencing of MicroRNA-122 in Primateswith Chronic Hepatitis C Virus Infection. Science. 2010;327:198-201）。薬物溶出ステントによる又はバルーンを介したアンタゴｍｉｒの局所送達は、標的組織におけるｍｉＲＮＡの効率的な局所抑制を与え、他の器官に対して推測される副作用を制限するのに有用であり得る。
【図１Ａ】
2013523696.tif 000005
【図１Ｂ】
2013523696.tif 000006
【図２】
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【図３】
2013523696.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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