(57)【要約】【課題】多成分を含む試料に対するMS2測定前に、同定される物質の数が最大になるようなプリカーサイオンの選択と積算回数の決定を実行し、測定の効率化を図る。【解決手段】所定の試料から得られた多数の分画試料をMS1、MS2測定し、同定結果と各MS1ピークのSN比とから、SN比が高い順にMS2測定及び同定を行った場合のピーク累積数と同定成功数との関係を示す同定確率推定モデルを作成しておく。目的試料中の物質同定に際し、MS1測定により得られた複数のMS1ピークについてSN比を求め、同定確率推定モデルを参照してSN比から同定確率推定値を求める（S24-S25）。プリカーサイオン選択と積算回数の最適化をMS2測定対象のMS1ピークの同定確率の和を最大化する問題として定義し、0-1変数を用いた目的関数を定める（S26）。目的関数を所定の制約条件の下で0-1整数計画問題として解き、その解の変数から最適なプリカーサイオンと積算回数とを求める（S27-S28）。【選択図】図３
2015049057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに同定に成功するピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、それらＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中でＭＳn測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳn-1ピークのＳＮ比から各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
c)同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の改善度合を想定した上で、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳn-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークと各ＭＳn-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴とする物質同定方法。
【請求項２】
各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに同定に成功するピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶するステップであって、同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算する回数を変えたときの物質同定の結果を利用して、積算回数毎の同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、それらＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中でＭＳn測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳn-1ピークのＳＮ比から各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を積算回数毎に算出する同定確率推定ステップと、
c)所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳn-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークと各ＭＳn-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴とする物質同定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の物質同定方法であって、
前記測定条件最適化ステップでは、積算回数をｍ倍にした際の同定確率をＳＮ比が√ｍ倍である同定確率と想定することを特徴とする物質同定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする物質同定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
前記測定条件最適化ステップは、線形計画問題として前記目的関数及び制約条件を定め、該目的関数を最大化する解を求めることを特徴とする物質同定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の物質同定方法であって、
前記測定条件最適化ステップは、0-1整数計画問題として前記目的関数及び制約条件を定め、変数が１となるＭＳ1ピーク及び積算回数を前記目的関数を最大化する解として求めることを特徴とする物質同定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
前記測定条件最適化ステップによりＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークが求まったあとに、その中でＳＮ比の小さいＭＳn-1ピークから優先的にＭＳn測定を実行することを特徴とする物質同定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質同定方法であって、
ＭＳn測定の実行に先立って、前記同定確率推定ステップ及び前記測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳn測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする物質同定方法。
【請求項９】
請求項８に記載の物質同定方法であって、
ＭＳn測定の実行に先立って、前記同定確率推定ステップ及び前記測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳn測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする物質同定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の物質同定方法を用いて物質同定を行うＭＳn測定可能な質量分析装置であって、
前記測定条件最適化ステップで得られた結果に基づくＭＳn測定の測定シーケンスに従って自動的にプリカーサイオン及び積算回数を自動的に設定したＭＳn測定を実施する制御部を備えることを特徴とする質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＳn測定（ただしｎは２以上の整数）を行うことが可能な質量分析装置を用いて試料に含まれる物質を同定する物質同定方法、及び、該方法を用いて試料中の物質を同定する質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象として、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖など様々な物質を網羅的に同定することがますます重要になってきている。特にタンパク質やペプチドを対象とするこうした網羅的な解析手法はショットガン・プロテオミクス（Shotgun Proteomics）と呼ばれている。こうした解析のためには、ＬＣ（液体クロマトグラフ）やＣＥ（キャピラリ電気泳動）などのクロマトグラフィと、ＭＳn型質量分析装置（タンデム型質量分析装置）とを組み合わせた分析手法が非常に威力を発揮している。
【０００３】
ＭＳn型質量分析装置を用いた生体試料中の各種物質の一般的な網羅的同定法の手順は次のとおりである。
［ステップ１］分析対象である試料に含まれる各種物質をＬＣ、ＣＥ等により分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する（以下、分取・分画により得られた個々のサンプルを「分画試料」と呼ぶ）。なお、試料を分取・分画する際には、予め決めた一定の時間間隔で分画を行う又は一定量の試料液を採取するように分画を行うことにより、該試料中の物質ができるだけ漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする。
【０００４】
［ステップ２］各分画試料に対しＭＳ1測定をそれぞれ行ってＭＳ1スペクトルを取得し、該ＭＳ1スペクトル上で同定対象の物質群に由来すると推測し得るピークを選択する。
［ステップ３］上記ステップ２で選択されたピークをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対しＭＳ2測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケシングサーチを行い、その分画試料に含まれる物質を同定する。
【０００５】
［ステップ４］充分な確度で特定の物質が同定されなかった場合には、ＭＳ1スペクトル上で見つけた別のピークをプリカーサイオンに設定してＭＳ2測定を実行するか、或いは、ＭＳ2スペクトル上で観測される特定のイオンをプリカーサイオンとしたさらに高次（つまりｎが３以上）のＭＳn測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチなどにより、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ５］上記ステップ２〜４の処理を複数の分画試料に対してそれぞれ行い、元の試料に含まれている様々な物質を網羅的に同定する。
【０００６】
上記のような網羅的同定において、高い確度で以て物質を同定するには、同一の分画試料に含まれる物質の種数が少ない（できれば１種類のみである）ことが望ましい。しかしながら、そのためには１つの分画の時間を短くする必要があり、そうすると分画数自体が非常に多くなってしまう。そこで、限られた測定時間又は測定回数でできるだけ多くの物質を同定するためには、つまり、網羅的同定のスループットを向上させるためには、ＭＳ1スペクトル上で観測される複数のピークの中で、同定に成功する確率（以下「同定確率」という）が高いピークを優先的にプリカーサイオンとして選択し且つ適切な測定条件で以てＭＳn測定を行う必要がある。
【０００７】
或る試料に対して得られたＭＳ1スペクトル上で観測されるピークの中からＭＳ2測定のためのプリカーサイオンを選択する方法としては、ピーク強度が高いものから順に選択する方法が従来知られている（特許文献１参照）。或る１つの試料に対してＭＳ2測定を実行する時間や回数に制約がある場合には、ピーク強度の高い順に所定個数のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する等の制御が行われている。他方、測定時間又は測定回数が充分に確保できる場合には、プリカーサイオンの選択個数に制約を設けずに、信号強度が所定閾値以上であるピークを全て抽出してプリカーサイオンとする方法も知られている。
【０００８】
これらの方法はあくまでも、ピーク強度の高いイオンが同定確率が高いとの仮定に基づいていると考えられる。この仮定自体は定性的に誤りであるというわけではないが、ピーク強度の高さは必ずしも同定確率の高さを示すものではない。そのため、プリカーサイオン候補であるピークが複数存在するときに、いずれのピークでも同程度の高い確率で以て同定に至る場合と、一部のピークしか同定に至ることが期待できない場合とがあるが、ピーク強度からそうした状況の相違を充分に識別することはかなり困難である。
【０００９】
これに対し、本出願人は、ＭＳ2測定を実行する前にそのＭＳ2測定結果を利用した物質同定の確率を定量的に推定し、これを評価して同定される物質数の期待値を最大化するようにＭＳ2プリカーサイオンや測定条件を選択する新たな手法を特許文献２において提案している。これによれば、定量的な評価結果に基づいて、同定に至る確率が高い、より適切なピークをプリカーサイオンとして選択したり、より適切な順序で以て複数のピークをプリカーサイオンとして選択したりすることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３７６６３９１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１０１０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、ＬＣやＧＣで分離された成分を分取・分画する場合、一つの成分が連続する複数の分画に亘って含まれることがよくある。特に、一定の時間間隔でカラムからの溶出した試料液を分画する時間分画を行う場合、複数の分画試料に含まれる同成分の濃度が近いことがあり、その成分を同定するのにいずれの分画試料を用いるのが適切か判定する必要がある。
また、ＭＡＬＤＩ（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）イオン源を用いた質量分析装置では、レーザ光照射毎に生成される試料成分由来のイオンの量のばらつきが比較的多いため、同一試料に対する測定を複数回繰り返し、その複数回の測定結果を積算することで同定のためのスペクトルを算出する。その際、測定の繰り返し回数、つまりは積算回数を多くすれば、同定の精度は向上するもののそれだけ時間が掛かることになる。そこで、或る成分を同定しようとする際にＭＳ2プリカーサイオンの選択を最適化するだけでなく、積算回数も最適化することが好ましい。
特許文献２に記載された従来の手法では、こうした分画試料の最適な選択、或いは積算回数の最適化は考慮されておらず、それらについての最適な選択を行うことはできない。
【００１２】
本発明はこうした課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、単なるプリカーサイオンの選択だけでなく、積算回数の最適化や分画試料の選択の最適化も行いつつ、試料中に含まれる多数の物質を効率的に、つまりはできるだけ少ない測定回数で以て又はできるだけ短い測定時間で以て得られた質量分析データに基づき高い確度で同定することができる、物質同定方法、及び該方法を用いる質量分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様による物質同定方法は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに同定に成功するピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、それらＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中でＭＳn測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳn-1ピークのＳＮ比から各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
c)同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の改善度合を想定した上で、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳn-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークと各ＭＳn-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１４】
また上記課題を解決するために成された本発明の第２の態様による物質同定方法は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに同定に成功するピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶するステップであって、同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算する回数を変えたときの物質同定の結果を利用して、積算回数毎の同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた時間的に連続する２以上の分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、それらＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中でＭＳn測定のためのプリカーサイオンの候補である複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出し、前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記プリカーサイオン候補である複数のＭＳn-1ピークのＳＮ比から各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を積算回数毎に算出する同定確率推定ステップと、
c)所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳn-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定め、少なくとも、前記所定の複数の分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和を制約条件として前記目的関数を最大化する解を求めることにより、ＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークと各ＭＳn-1ピークに対する積算回数を求める測定条件最適化ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１５】
本発明において、試料に含まれる各種物質を分離する手段はＬＣ、ＣＥなどである。該手段がＬＣなどカラムを用いたものである場合には、上記分離用パラメータとは時間（保持時間）である。即ち、或る１つの分画試料は所定の時間範囲内にカラムから溶出してきた１乃至複数の物質を含む。また、試料に含まれる各種物質を分離する手段がＣＥである場合には、上記分離用パラメータとは移動度である。
【００１６】
また、ＭＳnスペクトルに基づいて物質を同定する同定方法は特に限定されず、例えばデノボシーケンスサーチ、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ、など任意のアルゴリズムを用いることができる。ただし、同定確率推定モデル構築ステップ（及び手段）において同定を実行するときと、目的試料から得られた同定試料に対して同定を実行するときとでは、同じアルゴリズムを使用する必要がある。
【００１７】
本発明の第１の態様による物質同定方法において、同定確率推定モデル構築ステップでは、ＭＳn-1測定、ＭＳn測定、及びその測定結果を利用した同定結果（同定の成否）が全て得られているデータを用いて、同定確率推定モデル情報を求める。同定確率推定モデルは、複数（通常はかなり多数）のＭＳn-1ピークのＳＮ比と、その複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに同定に成功するピークの累積数と、の関係を示す。したがって、この同定確率推定モデルは、全てのＭＳn-1ピークの中で、或るＳＮ比を示す１つのＭＳn-1ピークよりもＳＮ比が高い又は低いＭＳn-1ピークが同定成功となる割合を示している。なお、或るＭＳ1ピークのＳＮ比は、そのＭＳ1ピークの信号強度と、該ピークが存在するＭＳ1スペクトル（ノイズ除去などの加工がされていないプロファイル）から求めたノイズレベルとから求まるものとすることができる。
【００１８】
具体的には、複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に１つずつ選択した累積数と、その中で同定に成功したＭＳn-1ピークの総数との関係は、階段状に増加する形状になる。そこで、上記同定確率推定モデル構築ステップでは例えば、ＭＳnピークの累積数と同定成功数との連続的な関係を求めるべくフィッティングを行って滑らかなフィッティングカーブを求め、このカーブの形状を示す関数式又はその関数式に含まれる係数、定数を同定確率推定モデル情報とすればよい。
【００１９】
第１の態様による物質同定方法では、同定確率推定モデル構築ステップにおいて、ＭＳn-1ピークに対しＭＳn測定を１回のみ実施したときの、つまりは積算回数を考慮しない（或いは積算回数は１である）同定確率推定モデル情報を求める。これに対し、第２の態様による物質同定方法では、同一ＭＳn-1ピークに対しＭＳn測定を複数回実行してその結果を積算する積算回数を考慮した、即ち、積算回数が１だけではなく１から所定値までの各積算回数における同定確率推定モデル情報も求める。第１の態様では、積算回数が１でない場合の同定確率は積算回数が１である同定確率から推定する必要があるが、第２の態様では、そうした推定は必要なく、任意の積算回数の同定確率を同定確率推定モデル情報から直接的に求めることができる。
【００２０】
なお、適切な同定確率推定モデルは試料の種類、より厳密には試料に含まれる各種物質の種類に依存する。換言すれば、同定対象の物質の種類が同一又は類似していれば、同一の同定確率推定モデル情報を用いることができる。例えば生体試料中のタンパク質を同定するといった目的に対しては、同定済みのタンパク質を各種物質として含む試料について得られたＭＳn-1ピーク等に基づいて同定確率推定モデル情報を取得しておけばよい。
【００２１】
例えば、含有物質が未知である試料から得られた複数の分画試料に対してＭＳn-1測定が実行され、その結果から次にＭＳn測定を行うＭＳn-1ピークを決定する際には、同定確率推定ステップにおいてまず、各分画試料に対するＭＳn-1スペクトル上で観測される複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出する。ＳＮ比の算出方法は同定確率推定モデル作成時と同方法とする。そして、同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、各ＭＳn-1ピークのＳＮ比から同定確率推定値をそれぞれ算出する。これにより、実際に或るＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を行うことなく、そのＭＳn測定を実行した結果に基づく同定成否の推定確率が定量的に求まる。
【００２２】
そのあと測定条件最適化ステップにおいて、総合的に同定される物質の数が極力多くなるように、ＭＳn測定対象とするプリカーサイオンの選択を行うとともに積算回数を決定する。上述したように、同一成分由来のＭＳn-1ピークが連続する複数の分画試料に対するＭＳn-1スペクトルに現れる場合があるから、ここでいうプリカーサイオンの選択とは、単に１つの分画試料の中におけるＭＳn-1ピークの選択だけではなく、複数の分画試料に跨るＭＳn-1ピークについてその複数の分画試料におけるＭＳn-1ピークの中の選択も含む。
【００２３】
第１の態様の測定条件最適化ステップでまず、同一のＭＳn-1ピークにおける積算回数の増加に対する同定確率の改善度合を想定する。一例としては、積算回数をｍ倍にした際の同定確率をＳＮ比が√ｍ倍である同定確率であると想定すればよい。一方、上述したように第２の態様では、積算回数毎に同定確率推定モデル情報が用意されているので、第１の態様のような想定は不要である。
【００２４】
いずれにしても測定条件最適化ステップでは、所定の複数の分画試料に対する全てのプリカーサイオン候補であるＭＳn-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、ＭＳn-1ピークの選択の組み合わせを変えるとともに積算回数を１から所定回数まで変化させたときの同定確率の総和を最大化する目的関数を定める。また、少なくとも、所定の複数の分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和、及び、１つの分画試料に対するＭＳn測定の実行回数の総和を、制約条件として設定する。これ以外に、例えば同一成分由来のＭＳn-1ピークは１つの分画試料からのみ選択する、といった別の制約条件を加えてもよい。そして、そうした制約条件の下で、上記目的関数を最大化する解を求めることによって、ＭＳn測定すべきプリカーサイオンとしてのＭＳn-1ピークを選択するとともに、選択した各ＭＳn-1ピークに対する最適な積算回数を求める。
【００２５】
こうして本発明に係る第１及び第２の態様による物質同定方法では、同定確率モデルに基づいて算出される同定確率の定量値を利用して、極力多くの物質が同定されるように適切なプリカーサイオンの選択及びＭＳn測定の実行回数の決定を事前に、つまり実際のＭＳn測定の実行前に行うことができる。
【００２６】
なお、測定対象である試料の量が限られているような場合、測定毎の試料の消費による試料量の減少を考慮する必要がある。一般的には、ＳＮ比の低いピークほど試料の枯渇の影響を受け易いから、上述したようにＭＳn測定すべきＭＳn-1ピークが求まったならば、例えば、その中でＳＮ比の小さいＭＳn-1ピークから優先的にＭＳn測定を実行するとよい。これによって、試料の枯渇の影響を最小限に抑えて多くの物質を同定することができる。
【００２７】
また本発明に係る物質同定方法において好ましくは、上記測定条件最適化ステップは、線形計画問題として目的関数及び制約条件を定め、該目的関数を最大化する解を求めるようにするとよい。より具体的には、線形計画問題の一つである0-1整数計画問題として目的関数及び制約条件を定め、その0-1変数が１となるＭＳ1ピーク及び積算回数を目的関数を最大化する解として求めるようにするとよい。なお、線形計画問題の解法自体は従来提案されている各種の方法を用いることができ、特にその解法は問わない。
【００２８】
また本発明に係る物質同定方法では、目的試料に対する測定に先立って所定の試料に対する測定を実行し、上記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することが好ましい。同定確率モデル構築用の所定試料に対する測定を目的試料に対する測定の直前に実行することにより、例えばノイズ環境が殆ど同一である等、測定条件がほぼ揃う。それにより、所定試料について求めた同定確率推定モデルの適用精度が向上し、同定確率推定値自体の精度も向上して、より的確な優先順位を求めることが可能となる。
【００２９】
また本発明に係る物質同定方法では、ＭＳn測定の実行に先立って、同定確率推定ステップ及び測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとよい。この場合、最初に決められた測定シーケンスに従って複数のＭＳn-1ピークのそれぞれをプリカーサイオンとしたＭＳn測定を実行すればよいので、ＭＳn測定の制御は簡単で済む。
【００３０】
また本発明に係る物質同定方法では、ＭＳn測定の実行に先立って、同定確率推定ステップ及び測定条件最適化ステップにおける一連の処理の結果に基づいてＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳn測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更するようにしてもよい。
【００３１】
例えば、測定シーケンスに従って順次異なる又は同一のＭＳn-1ピークについてＭＳn測定を実行する途中で、ＭＳn測定結果に基づく同定ができない状態が続いたならば、その時点でその測定シーケンスに従ったＭＳn測定を中止し、次の分画試料に対するＭＳn測定及び同定処理に移行してもよい。これにより、同定確率推定モデルと実際の同定結果との乖離がある程度存在する場合に、無駄なＭＳn測定の実行をできるだけ少なくし、同定効率が下がることを回避することができる。
【００３２】
また本発明に係る質量分析装置は、上記本発明に係る物質同定方法を用いて物質同定を行うＭＳn測定可能な質量分析装置であって、上記測定条件最適化ステップで得られた結果に基づくＭＳn測定の測定シーケンスに従って自動的にプリカーサイオン及び積算回数を自動的に設定したＭＳn測定を実施する制御部を備えることを特徴としている。この質量分析装置は、特定の質量電荷比を有するイオンの選択と該イオンに対する解離操作とが可能な質量分析装置であれば、特にその構成は問わない。
【００３３】
本発明に係る質量分析装置によれば、上記物質同定方法によってＭＳn測定の実行前に決定されたプリカーサイオンや積算回数に従って自動的にＭＳn測定が実施されるので、分析者自身がＭＳn測定の条件等を入力する必要がなく、分析者の手間を省いて効率的に目的試料の同定作業を行うことができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る物質同定方法によれば、目的試料中に含まれる多数の未知物質を同定するためにＭＳn測定を行う前に、できるだけ多くの物質が同定されるように１つの分画試料中のＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして選択したり、同一物質由来で複数の分画試料に跨るＭＳn-1ピークの１つをプリカーサイオンとして選択したり、さらには、それぞれのＭＳn-1ピークに対する最適なＭＳn測定回数を求めたりすることができる。それにより、例えば、従来と同程度の数の物質の同定を成功させるのに要する測定時間を短縮する又は測定回数を減らすことができる。また、従来と同じ測定時間や測定回数であれば、それだけ多くの物質を同定することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に係る物質同定方法を実施する質量分析装置の概略ブロック構成図。
【図２】本発明に係る物質同定方法における同定確率推定モデル構築の際の処理フローチャート。
【図３】本発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデルに基づくＭＳ2測定シーケンス最適化処理のフローチャート。
【図４】ノイズレベル評価処理を説明するためのＭＳ1プロファイル（マススペクトル）の一例を示す図。
【図５】２つのＭＳ1プロファイルに対するノイズレベル算出結果例を示す図。
【図６】質量電荷比m/zとＳＮ比とに対するＭＳ1ピークの分布状況の一例を示す図。
【図７】ＭＳ1ピークをＳＮ比で順位付けしたときの、同定に成功したＭＳ1ピークの経験累積分布関数の概念を示す模式図。
【図８】同定に成功したＭＳ1ピークの経験累積分布関数、該分布関数に対するフィッティング関数、及び該フィッティング関数に基づく同定確率推定値の変化を示す図。
【図９】ＭＳ1スペクトルのヒートマップ表示の一例を示す図。
【図１０】通常の積算回数におけるＳＮ比と同定確率推定値との関係の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明に係る物質同定方法の一実施例、及び該方法による物質同定を実施する質量分析装置の一実施例について、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００３７】
本発明に係る物質同定方法は、目的試料からＬＣ等により分離・分画されることで得られた時間的に連続した多数の分画試料に対し、それぞれＭＳn-1測定を実行して得られるＭＳn-1スペクトル上に現れる１又は複数のＭＳn-1ピークをプリカーサイオンに選出して該プリカーサイオンに対するＭＳn測定を行い、それにより得られるＭＳnスペクトルを利用して目的試料に含まれる各種物質を同定する質量分析装置（又は化合物同定システム）において、実際にＭＳn測定を実施する前に、ＭＳn-1スペクトル上のＭＳ1ピークについて物質の同定が成功する確率を定量的に推定し、それに基づいて、ＭＳn測定のプリカーサイオン選択の最適化、同一成分由来のプリカーサイオンに対するＭＳn測定回数（積算回数）の最適化、及び、同一成分由来で複数の分画試料に跨るＭＳ1ピークのうちの１つの選択の最適化、を含むＭＳn測定シーケンスの最適化を行うための処理に特徴を有する。
【００３８】
本発明におけるＭＳn測定シーケンス最適化方法を具体例を挙げて説明する。
この例による方法では、予備的に、つまり同定対象である目的試料の測定及び同定処理に先立って、多くの物質を含む同定確率推定モデル構築用試料（以下、単に「モデル構築用試料」という）に対する測定及び同定処理の結果を利用して、同定確率推定モデルを作成しておく。この同定確率推定モデルは、ＭＳ2測定及び同定実行前のＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしてＭＳ2測定及び同定処理を実行したと仮定したときに同定が成功する確率を推測するための参照データである。モデル構築用試料は目的試料と同種、例えば目的試料がペプチド混合物である場合にはモデル構築用試料もペプチド混合物であることが好ましい。
【００３９】
図２は同定確率推定モデル構築処理の手順を示すフローチャートである。図２を参照して同定確率推定モデルを作成する手順を詳細に説明する。
【００４０】
［ステップＳ１１］同定確率推定モデル構築用データの収集
まず、モデル構築用試料をＬＣで分離して、所定の分画時間毎に分取された多数の分画試料を調製する。そして、各分画試料に対しＭＳ1測定が実施され、ＭＳ1スペクトルデータが収集される。さらに、このＭＳ1スペクトルデータに基づいて抽出される各ＭＳ1ピークに対して、１回の解離操作を加えたＭＳ2測定が実施されてＭＳ2スペクトルデータが収集され、そのＭＳ2スペクトルデータを用いた同定処理が試みられる。
【００４１】
上述したように保持時間に応じて分画された各分画試料に含まれる物質を同定する場合には、各分画試料のＭＳ1スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ1スペクトルを求める。そして、該３次元ＭＳ1スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ1ピーク（後述する２Ｄピーク）を抽出し、該ＭＳ1ピークの質量電荷比をプリカーサイオンとしてＭＳ2測定を行いＭＳ2スペクトルを取得する。そして、そのＭＳ2スペクトルに基づいて所定の同定アルゴリズム（例えばデノボシーケンスサーチやＭＳ／ＭＳイオンサーチなど）により物質の同定を試みる。この同定はＭＳ1ピーク毎に行われるから、３次元ＭＳ1スペクトルから抽出されるＭＳ1ピーク毎に同定の成功又は失敗（同定不可）が決まる。
【００４２】
［ステップＳ１２］ＭＳ1スペクトルのノイズレベルの評価
後述する同定確率はＭＳ1スペクトルのノイズレベルの影響を受ける。そこで、モデル構築用試料に対するＭＳ1スペクトルのノイズレベルを評価する。本例では、次のステップＳ１２１〜Ｓ１２３の手順により、 ＭＳ1測定により得られた生データ（加工されていないデータ）であるＭＳ1ロー（raw）プロファイル（以下、単に「ロープロファイル」という）からノイズレベルを分画試料毎に、つまりＭＳ1スペクトル毎に評価する。以下の説明では、離散化されたロープロファイルの信号強度をＲmとおく。ただし、ｍ＝０、１、…は、評価対象である試料のロープロファイルの、サンプリング点における質量電荷比の順序を示す番号である。ロープロファイルに含まれるサンプリング点全体の集合はＭで表すものとする。
【００４３】
［ステップＳ１２１］ピーク部分及びピーク近傍の情報の除外
ロープロファイルの最大ピーク強度をＰ(max)とおく。つまり、次の(1)式のようにおく。
Ｐ(max)＝ max Ｒm      …(1)
（ただしｍ∈Ｍ）
ここで、ピーク近傍の判定用閾値μ（０＜μ＜１）を適宜に選び、信号強度が最大ピーク強度Ｐ(max)のμ倍以上であるサンプリング点をピーク部分であるとみなす。そして、ピーク部分に含まれるサンプリング点、つまり信号強度がμ・Ｐ(max)以上であるサンプリング点からの距離がＷ以内であるサンプリング点、を除いたサンプリング点の集合Ｍ’(Ｗ，μ)を求める。図４（ａ）はm/z 1060-m/z 1080の範囲についてＭＳ1スペクトルのロープロファイルに対しサンプリング点集合Ｍ’(Ｗ，μ)を求めた例であり、図４（ｂ）は（ａ）のm/z 1070-m/z 1075の範囲の拡大図である。
【００４４】
［ステップＳ１２２］局所的な信号変動量の算定
次に、上記ピーク部分とピーク近傍とを除外したサンプリング点集合Ｍ’(Ｗ，μ)において、通過帯域が半値幅Ｗであるフィルタによりロープロファイルを平滑化した、平滑化プロファイル*Ｒm(ｗ，μ)を求める。つまり、*Ｒm(ｗ，μ)は次の(2)式で求まる。
*Ｒm(ｗ，μ)＝｛１／（２Ｗ＋１）｝ΣＲm'      …(2)
（ただしｍ∈Ｍ’(Ｗ，μ)）
ここで、Σはｍ’＝−ＷからＷまでの総和である。この平滑化プロファイル*Ｒm(Ｗ，μ)と元のロープロファイルとの差を局所的な信号変動量と定義し、ΔＲm(Ｗ，μ)で表す。つまり、ΔＲm(Ｗ，μ)は次の(3)式で求まる。
ΔＲm(Ｗ，μ)＝Ｒm−*Ｒm(Ｗ，μ)      …(3)
【００４５】
［ステップＳ１１３］局所的な信号変動量に基づくノイズレベルの算定
ここでは、上記局所的な信号変動量ΔＲm(Ｗ，μ)の２乗平均のｃ倍をノイズレベルＮ(Ｒm；Ｗ，μ)と定義する。ｃはノイズレベルを定義するための適当な定数である。つまり、Ｎ(Ｒm；Ｗ，μ)の定義式は次の(4)式である。
Ｎ(Ｒm；Ｗ，μ)＝ｃ・√｛ΣΔＲm(Ｗ，μ)2｝      …(4)
なお、ノイズレベルの定義は上記説明のものに限定されるわけではなく、ＭＳ1スペクトルのノイズレベルを適切に定義できる方法でありさえすればよい。
実際の２つのＭＳ1ロープロファイルに基づいて、上記方法によりノイズレベルＮ(Ｒm；Ｗ，μ)を算定した結果の例を図５に示す。
【００４６】
［ステップＳ１３］同定成功ＭＳ1ピークの抽出
図６は、モデル構築用試料由来の全てのＭＳ1ピークの質量電荷比m/zとＳＮ比とをプロットした結果の例である。ここで、ＳＮ比はピーク強度とステップＳ１２で求めたノイズレベルとの比である。図６に□印で示したプロット点はＭＳ1ピークを示している。また、●印で示したプロット点は、そのＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2測定によって物質同定が可能であった、即ち、同定に成功したＭＳ1ピークを示している。図６を見ると、この例では、ＳＮ比が大きいほど同定に成功するＭＳ1ピークの割合が大きくなる傾向にあることが分かる。これは本例に限らず、一般的な傾向である。
【００４７】
［ステップＳ１４］ＭＳ1ピークのＳＮ比と同定成功ＭＳ1ピーク累積数との関係付け
ＳＮ比の大きい順にＭＳ1ピークを抽出して「１」から順位付けし（つまりＭＳ1ピークをＳＮ比が大きい順にソートして順位を付け）、その順位毎にそれまでに同定に成功したＭＳ1ピークの数（累積数）を求めると、図７に示すように、累積数が右上がりの階段状に増加するグラフが描ける。例えば、図７中の実線で示す階段状の折れ線は、順位１のＳＮ比を示すＭＳ1ピークは同定に成功し、順位１よりも低いＳＮ比である順位３のＳＮ比を示すＭＳ1ピークは同定に失敗したことを意味している。この折れ線は、或るＳＮ比以上を示すＭＳ1ピークのうち幾つのＭＳ1ピークが同定に成功したのかを示す経験累積分布関数であるといえる。
【００４８】
ただし、図６から分かるように、この例では、同一の質量電荷比に対する複数のＭＳ1ピーク（ＳＮ比は同一とは限らない）に対してそれぞれ個別に同定が行われている。そのため、質量電荷比の重複が多いと、同定の成否に対する特定の質量電荷比の影響が相対的に強くなり過ぎるおそれがある。そこで、これを避けるために、同一の質量電荷比であるＭＳ1ピークＮ個（Ｎは２以上の整数）に対してそれぞれ同定がなされた場合には、個々の同定は１／Ｎ回であるとみなして経験累積分布関数を求めるほうが好ましい。図７に示した例では、順位１、２、４、５、及び８において同定に成功した場合を表しているが、図７中の実線は質量電荷比の重複を考慮しない経験累積分布関数である。ここで、順位２及び８に含まれる同定に成功した複数のＭＳ1ピークが同一質量電荷比を有していた場合には、重複を考慮してその順位２、８のＭＳ1ピークをそれぞれ１／２とカウントして、経験累積分布関数を図７中に一点鎖線で示すように修正する。
【００４９】
図６に示したＭＳ1ピークの同定成否分布の例について、上述したように質量電荷比の重複を考慮した経験累積分布関数を求めると、図８中に示すような階段状のプロファイルが得られる。順位が大きくなるほど、つまりはＭＳ1ピークのＳＮ比が下がるほど、同定に成功するＭＳ1ピークの数は減るため、同定成功累積数は頭打ちになる（飽和する）ことが分かる。
【００５０】
［ステップＳ１５］同定確率推定モデルとパラメータの算出
ステップＳ１４で得られた階段状のプロファイルに対し解析的な関数を用いてフィッティングを行うことにより、ＳＮ比に従ったＭＳ1ピークの累積数と同定成功累積数との滑らかなカーブ状の関係を求める。ここでは、フィッティング関数の形状として、次の(5)式の双曲線関数を用いた。
Ｎ(ident)tanh（ｍ／Ｎ(all)σ）      …(5)
ただし、ここでｍは或る順位よりも上位順位であるＭＳ1ピークの総数であり、Ｎ(all)及びＮ(ident)はそれぞれＭＳ1ピークの総数及び同定に成功したＭＳ1ピークの総数である。また、σはフィッティング関数の立ち上がりの速さを定めるパラメータであり、先に求めた階段状のプロファイルにフィットするように算出する。図８中に階段状のプロファイルにフィットさせたフィッティング関数を一点鎖線で示している。このフィッティング関数のカーブが同定確率推定モデルであり、σはこのモデルを規定するパラメータである。
【００５１】
以上のような手順で、同定確率推定モデルを定めるパラメータσを算出することができるから、同定確率を推定するために、このパラメータσを記憶しておく（ステップＳ１６）。
【００５２】
次に、上記のような同定確率推定モデルのパラメータが予め用意されている状況の下で、目的試料をＬＣで分離し分取することで得られた複数の分画試料をＭＳ1測定して求まるＭＳ1スペクトルに基づいて、プリカーサイオンとして適切なＭＳ1ピークを選択するとともに最適なＭＳ2測定シーケンスを決定する際の処理手順を、図３に示すフローチャートに従って説明する。
【００５３】
［ステップＳ２１］目的試料由来のＭＳ1測定データの収集
まず、目的試料から調製された多数の分画試料に対してそれぞれＭＳ1測定が実行され、ＭＳ1スペクトルデータが収集される。そして、各分画試料のＭＳ1スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ1スペクトルを求める。
【００５４】
［ステップＳ２２］２Ｄピークの検出及びプリカーサイオン候補の抽出
各分画試料に対して得られたＭＳ1スペクトルを分画の時間順に並べて表示すると、図９（ａ）に示すように、質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上において信号強度を濃淡（又はカラー）で表したヒートマップが得られる。このヒートマップにおいて２次元的にピーク検出を行ってＭＳ1ピークを抽出する。これによって検出されたピークを２Ｄピークと呼ぶ。図９（ａ）では１個の点が１個の２Ｄピークに相当する。
【００５５】
いま、検出された２ＤピークをＰk(2D)（ｋ＝１，２，…，Ｋ）とする。各２Ｄピークは試料に含まれていた一つの成分（物質）に対応するが、一つの成分は２Ｄピークの頂点が位置する分画試料だけでなく、前後の連続する複数の分画試料に跨って観測されることがよくある。図９（ｂ）は図９（ａ）の拡大図であり、図９（ｂ）において水平に延伸する点線は分画の区切りを示している。この図から、図９（ａ）では１個の点に相当する縦長形状の２Ｄピークが複数の分画に跨っていることが分かる。この場合、同一成分由来の同じ質量電荷比を持つＭＳ1ピークが連続する分画試料において観測されることになる。したがって、２ＤピークＰk(2D)は、同じ質量電荷比を持つ一つ又は複数のＭＳ1ピークの集合であるとみなすことができる。
【００５６】
いま、各分画試料に時間順に付された番号がｗである分画試料において検出された複数のＭＳ1ピークのうち、いずれかの２Ｄピークに含まれるものに（ただし、いずれの２Ｄピークに含まれるのかについては問わずに）連番を付し、Ｐwj（ｊ＝１，２，…，Ｋ）と表すものとする。例えば、Ｐ11はｗ＝１である分画試料において検出された複数のＭＳ1ピークの中でｊ＝１である、つまり１番目のＭＳ1ピークである。ここでｊの値は特に意味はなく、例えば質量電荷比の小さい順に連番とすればよい。
【００５７】
Ｐwjの和集合はいずれかの２Ｄピークに含まれるＭＳ1ピークの全体に相当するので、次の(6)式が成り立つ。
∪w｛Ｐwj｜∃kＰj ∈ Ｐk(2D)｝＝∪wＰk(2D)      …(6)
なお、∪w、∪kはそれぞれｗ、ｋに関する和集合を意味する。
以下、こうして抽出されたＭＳ1ピークであるＰwjをＭＳ2測定のプリカーサイオン候補として、適切なプリカーサイオン選択と積算回数の最適化を行う。
【００５８】
［ステップＳ２３］ＭＳ1スペクトルのノイズレベルの評価
次に、上記ステップＳ１２（Ｓ１２１〜Ｓ１２３）と同様の処理を行うことで、各分画試料におけるＭＳ1スペクトル毎にそれぞれノイズレベルを評価する。
【００５９】
［ステップＳ２４］各ＭＳ1ピークのＳＮ比の算出
ステップＳ２２で抽出されたＭＳ1ピークＰwj毎に、そのピーク強度、及び該ピークが存在する分画試料についてステップＳ２３で算出されたノイズレベルからＳＮ比を算出する。
【００６０】
［ステップＳ２５］同定確率推定モデルに基づくＳＮ比からの同定確率の推定
上記(5)式に示したフィッティング関数の傾きが１であるということは１００％、その傾きが０．５であるということは５０％の確率で以て同定に成功することを示している。したがって、フィッティング関数の微分である次の(7)式により、或る１つのＭＳ1ピークに対して、その順位値ｍから、同定に成功する確率を推定することができる。
（Ｎ(ident)／Ｎ(all)σ）sech2（ｎ／Ｎ(all)σ）      …(7)
図８には上記(7)式による微分関数で示される推定同定確率（図８中右側の目盛り）も重ねて示してある。
【００６１】
図８の横軸（順位）を各順位に対応するＳＮ比に変換すると、与えられたＳＮ比に対応する同定確率の推定値ｐ1(ｒ)が得られる。ここでｒはＭＳ1ピークのＳＮ比である。したがって、ＭＳ1ピークＰwjのＳＮ比をｒwjとすると、ＭＳ1ピークＰwjの同定確率の推定値はｐ1(ｒwj)となる。この推定値ｐ1(ｒwj)は、通常の、つまり同定確率推定モデル作成に用いたデータと同条件の積算回数でＭＳ2測定を行った場合において推定される同定確率である。これに対し、同一ＭＳ1ピークに対するＭＳ2測定の回数、つまりは積算回数をｎ倍にしたとすると、ＭＳ2スペクトルのＳＮ比は理想的には√ｎ倍になるから、ＳＮ比の改善に伴って同定確率も向上することが期待される。そこで、ここでは、積算回数がｎ倍であるときの同定確率はＭＳ1ピークのＳＮ比が√ｎ倍になった場合の同定確率に等しいと想定する。即ち、同じＭＳ1ピークに対して積算回数をｎ倍にしたときの同定確率の推定値ｐn(ｒwj)は、次の(8)式で求められるものとする。
ｐn(ｒwj)＝ｐ1(√(ｎ)ｒwj)      …(8)
【００６２】
説明を簡略化するために、同定確率推定モデル作成に用いたデータと同条件である通常の積算回数を１回積算（積算なし）であるとし、ｎ倍の積算をｎ回積算であるとする。この場合、ＭＳ1ピークＰwjをｎ回ＭＳ2測定して積算したときの同定確率ｐwj(n)は次の(9)式で求められる。
ｐwj(n)＝ｐn(ｒwj)＝ｐ1(√(ｎ)ｒwj)      …(9)
なお、実際の積算回数に戻すには、通常の積算回数を乗じればよい。
【００６３】
［ステップＳ２６］プリカーサイオン選択及び積算回数の最適化問題に関する目的関数の設定
ここでは、多数の物質の同定確率の期待値を最大化するためのプリカーサイオン選択及び積算回数の最適化問題を、ＭＳ2測定対象となるＭＳ1ピークＰwjに対する同定確率ｐwj(n)の和の最大化であると定義する。この問題を線形計画問題の１つである0-1整数計画問題に帰着させ、以下の手順で定式化する。
即ち、ＭＳ1ピークＰwjに対するＭＳ2測定の回数について、以下の二値をとる0-1変数ｘwj(n)を定義する。
ｘwj(n)＝１    ：ＭＳ1ピークＰwjに対してｎ回積算のＭＳ2測定を実施する
ｘwj(n)＝０    ：それ以外
上記定義は全てのｎに対してｘwj(n)＝０であるときは、ＭＳ1ピークＰwjに対してＭＳ2測定を全く行わないことを意味する。また、ｘwj(1)＝１且つｎ＝１以外の全てのｎに対してｘwj(1)＝０であるときは、ＭＳ1ピークＰwjに対して１回のみＭＳ2測定を行う、つまり積算を実行しないことを意味する。なお、後述する制約(10)式により、ｗ、ｊの組毎にｘwj(n)＝１となるｎはたかだか一つであり、その他のｎに対してはｘwj(n)＝０であることを保証される。
【００６４】
上記0-1変数ｘwj(n)を用いると、最大化すべき同定確率の和は次の(10)式で表される。
f(ｘwj(n))＝Σｐwj(n)ｘwj(n)      …(10)
ここで、Σはｗ、ｊ、ｎについての総和である。つまり、(10)式は、対象としている全ての分画試料について各分画試料で抽出された全てのプリカーサイオン候補であるＭＳ1ピークの組み合わせにおいて、積算回数を１から所定値までの範囲で変化させたときの、それぞれの総和である。この(10)式のｆを最大化すべき目的関数とする。このとき、同定確率ｐwj(n)は同定確率推定モデルとＭＳ1ピークＰwjのＳＮ比とから求めることができる既知の値である。
【００６５】
［ステップＳ２７］目的関数を最大化するに際しての制約条件の設定
上記目的関数ｆの最大化に際して、以下の制約条件を設定する。
（Ａ）ＭＡＬＤＩイオン化質量分析装置の利用を想定した場合、測定を実行する毎に少しずつ試料は消費されていく。そのため、測定の繰り返しによって試料は枯渇していくため、１つの分画試料に対して実施できる測定回数、つまり積算回数の総和には上限がある。そこで、或る１つの分画試料ｗに対する積算回数の上限をＵwとおく。
（Ｂ）測定時間等の制約から、対象としている全ての分画試料に亘る積算回数の総和にも上限がある。そこで、この総積算回数の上限をＵ(Total)とおく。
（Ｃ）上記条件のほかに、下記２つの条件を課すものとする。
・ＭＳ1ピークＰwj毎に積算回数は一意的に選択される（複数の値をとらない）。
・同一質量電荷比を持つＭＳ1ピークが連続する複数の分画試料において存在する場合であっても、いずれか１つの分画試料におけるＭＳ1ピークのみをＭＳ2測定の対象とする。
【００６６】
上記制約条件（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ次の(11)〜(13)式の不等式により表される。
Σｎｘwj(n)≦Ｕw      …(11)
(11)式は任意のｗについて成り立ち、Σはｊ、ｎについての総和である。
Σｎｘwj(n)≦Ｕ(Total)      …(12)
(12)式においてΣはｗ、ｊ、ｎについての総和である。
Σｘwj(n)≦１      …(13)
(13)式は任意のｋについて成り立ち、Σはｗ、ｊ、ｎについての総和である。
ただし、(13)式の左辺に含まれるｗ、ｊに関する総和はＭＳ1ピークＰwjが存在する特定の２ＤピークＰk(2D)に含まれる範囲で和をとるものとする。
【００６７】
［ステップＳ２８］制約条件の下で目的関数を最大化する最適変数の算出及び該変数からプリカーサイオン選択と積算回数への変換
(11)式〜(13)式の制約条件の下で、(10)式に示した目的関数を最大化する0-1変数ｘwj(n)を求める問題は一般に0-1整数計画問題と呼ばれる。0-1整数計画問題の解法については様々な手法があるが、いずれも一般によく知られているので、ここではその解法については説明を略す。いずれにしても、(10)式を最大化する0-1変数を調べると、最適な0-1変数ｘwj(n)の組が得られる。そこで、その最適変数の組からｘwj(n)＝１であるｗ、ｊ、ｎの組を全て抽出する。抽出されたｗ、ｊの組で表されるＭＳ1ピークＰwjが選択すべきプリカーサイオンであり、それらｗ、ｊと組をなすｎが、そのプリカーサイオンに対する最適な積算回数である。こうして、多くの物質の同定確率が全体として高くなるような、最適なプリカーサイオンの選択と積算回数の最適化が実現できる。
【００６８】
ＭＳ2測定のプリカーサイオンとすべきＭＳ1ピークが決まったならば、そのＭＳ1ピークが得られる分画試料に対し、該ＭＳ1ピークを対象とするＭＳ2測定を規定の回数だけ実行するように測定を実施すればよい。
【００６９】
なお、一般にＳＮ比が低いＭＳ1ピークはＳＮ比が高いＭＳ1ピークよりも試料枯渇の影響を受け易い。そこで、同一分画試料において複数のＭＳ1ピークがプリカーサイオンとして選択されている場合には、ＳＮ比が低いＭＳ1ピークをＳＮ比が高いＭＳ1ピークよりも優先的にＭＳ2測定することが望ましい。これにより、より多くの物質を同定できる可能性が高くなる。
【００７０】
また、上述した最適なＭＳ2プリカーサイオン選択及び積算回数の最適化は、ＭＳ2測定を実行する前に求められるものであり、あくまでも既知の同定確率推定モデルを参照して求められたものである。したがって、同定確率の推定の確度は高いとはいえ、それに基づくプリカーサイオンの選択及び積算回数の最適化が絶対的に正しいとは限らない。そこで、ＭＳ2測定が途中まで進んだ段階で、それまでの実際のＭＳ2測定結果を用いた同定結果を踏まえて、以降の測定を最適化する処理を行うようにしてもよい。
【００７１】
また、上記説明では、ｎ回積算によってＳＮ比が√ｎ倍になると仮定して同定確率を求めたが、モデル作成用サンプルをｎ回積算でＭＳ2測定した場合の同定結果から、図２のステップＳ１１〜Ｓ１５の手順に沿ってフィッティングを行い、ｎ回積算時の同定確率モデルを作成することも可能である。この場合には、(7)、(8)式で示したようなｎ回積算の際の同定確率の推定は不要になり、ｎ回積算に対応した同定確率モデルに基づいて直接的にｎ回積算の際の同定確率を求めることができる。
【００７２】
以上のように、本発明に係る物質同定方法によれば、同定確率推定モデルのパラメータを目的試料の測定に先立って求めておくことにより、該同定確率推定モデルを利用した簡易な演算及び処理によって、同定される物質数が最大又はそれに近い状態となるように、同一のＭＳ1ピークに対する積算回数を、実際のＭＳ2測定実行前に定めることができる。したがって、定められたＭＳ2測定シーケンスに従ってプリカーサイオンを選択しながらＭＳ2測定を実行し、その測定結果を利用して物質同定を実施することにより、きわめて効率的に物質同定を行うことができる。
【００７３】
次に、上記物質同定方法による物質同定を実施するための質量分析装置の一実施例を図１により説明する。図１は本実施例による質量分析装置の概略構成図である。
【００７４】
図１において、分析部１は、液体試料中の各種物質を保持時間に応じて分離するＬＣ部１１と、ＬＣ部１１で分離された物質を含む試料を分取・分画してそれぞれ異なる分画試料を調製する分取分画部１２と、複数の分画試料のうちの１つを選択して該分画試料に対する質量分析を実行するＭＳ部１３と、を含む。図示しないが、ＭＳ部１３は、ＭＡＬＤＩイオン源、イオントラップ、及び飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を含むＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳであり、ＭＳ1測定だけでなく、イオントラップにおいてプリカーサイオン選択と衝突誘起解離操作とを１乃至複数回繰り返した後にＴＯＦＭＳで質量分析を行うＭＳn測定が可能となっている。ただし、ＭＳ1測定及びＭＳ2測定のみを実行すればよい場合（ｎが３以上のＭＳn測定が不要である場合）には、イオントラップとＴＯＦＭＳとの組み合わせに代えて、三連四重極型質量分析計のような、より簡単な構成の質量分析装置を利用することができる。
【００７５】
制御部２は上記分析部１中の各部の動作をそれぞれ制御する。分析部１のＭＳ部１３で得られたデータはデータ処理部３に入力され、データ処理部３で処理されて例えばその結果が表示部４に出力される。データ処理部３は機能ブロックとして、ＭＳ1スペクトルデータやＭＳnスペクトルデータなどの測定データを収集するスペクトルデータ収集部３１、上記ステップＳ１２〜Ｓ１６に対応した処理を実行する同定確率推定モデル構築部３２、同定確率推定モデル構築部３２により得られたパラメータを記憶しておく同定確率推定パラメータ記憶部３３、上記ステップＳ２２〜Ｓ２５に対応した処理を実行する同定確率推定値算出部３４、ＭＳ2測定条件最適化部３５に含まれ、上記ステップＳ２６に対応した処理を実行する目的関数設定部３５１、上記ステップＳ２７に対応した処理を実行する制約条件設定部３５２、上記ステップＳ２８に対応した処理を実行するプリカーサイオン選択・積算回数算出処理部３５３、及び所定のアルゴリズムに従って同定処理を実行する同定処理部３８、を含む。なお、データ処理部３や制御部２は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。
【００７６】
目的試料に対する網羅的同定を実行するに先立って、制御部２の制御の下に分析部１は同定確率推定モデル構築用試料から得られる各分画試料に対するＭＳ1測定、ＭＳ2測定を実行する。同定処理部３８は、収集されたＭＳ1、ＭＳ2スペクトルデータに基づいて同定処理を実行し、同定確率推定モデル構築部３２はそれらスペクトルデータ及び同定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成する。そして、この同定確率推定モデルを再現するパラメータが同定確率推定パラメータ記憶部３３に格納される。
【００７７】
目的試料に対する網羅的同定時には、制御部２の制御の下に分析部１は、まず、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ1測定を実行し、スペクトルデータ収集部３１はＭＳ1スペクトルデータを収集する。同定確率推定値算出部３４は、各分画試料に対するＭＳ1スペクトルデータ毎に、同定確率推定パラメータ記憶部３３から読み出したパラメータに基づき再現した同定確率推定モデルを利用して、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ1ピークの同定確率推定値を算出する。目的関数設定部３５１は、同定確率推定値を利用して、ＭＳ2測定の際のプリカーサイオン選択及び積算回数を最適化するために(10)式に示した目的関数を定める。また、制約条件設定部３５２は、(11)〜(13)式に示した制約条件を示す不等式を定める。そして、プリカーサイオン選択・積算回数算出処理部３５３は、目的関数を最大化する最適変数を求め、該最適変数に基づいて、同定のために適したプリカーサイオンを選択するとともにプリカーサイオン毎に積算回数を決定する。そして、こうして求まったプリカーサイオンや積算回数を基づいて、最適なＭＳ2測定シーケンスを作成する。
【００７８】
上述したように求まった最適なＭＳ2測定シーケンスは制御部２に送出され、制御部２はこのＭＳ2測定シーケンスに従って分析部１を自動的に制御することにより、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ2測定を実行する。同定処理部３８は、先に収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ1スペクトルデータと、新たに収集された各ＭＳ1ピークに対するＭＳ2スペクトルデータとに基づいて同定処理を実行し、目的試料中の物質の同定を実行する。その同定結果は表示部４の画面上に表示される。以上のようにして、本実施例の質量分析装置では、限られた測定時間又は測定回数で、より多数の物質の同定に至ることができる。
【００７９】
以上説明した実施例の動作は、最適なＭＳ2測定シーケンスが求まったあとに該シーケンスに従って自動的にＭＳ2測定が実行されるようにしたものであるが、最適なＭＳn測定シーケンスを表示部４の画面上に一旦表示し、ユーザ（分析担当者）によるＭＳ2測定実行指示を受けて初めて目的試料に対するＭＳ2測定及び同定処理を実行するようにしてもよい。こうした構成とすれば、ユーザが自らの判断や経験に従ってＭＳ2測定シーケンスを適宜に手直ししてＭＳ2測定を実行させるようにすることができる。
【００８０】
なお、上記実施例は本発明の一実施例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００８１】
１…分析部
１１…ＬＣ部
１２…分取分画部
１３…ＭＳ部
２…制御部
３…データ処理部
３１…スペクトルデータ収集部
３２…同定確率推定モデル構築部
３３…同定確率推定パラメータ記憶部
３４…同定確率推定値算出部
３５…ＭＳ2測定条件最適化部
３５１…目的関数設定部
３５２…制約条件設定部
３５３…プリカーサイオン選択・積算回数算出処理部
３８…同定処理部
４…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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