(57)【要約】本発明は、非小細胞肺ガンを含むガン等の過剰増殖性疾患を治療するための組み合わせ薬及び医薬組成物に関する。斯かる組み合わせ薬は、（１）式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素と、（２）少なくとも１の抗葉酸剤と、任意により（３）少なくとも１の白金錯体抗腫瘍性核酸結合剤とを含む。これらの成分はいずれも、医薬的に許容され得る塩又は他の誘導体の形態で存在していてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のガンの処置において治療的に有効な組み合わせ剤であって、
（１）式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素、又は、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体
【化１】
2013531067.tif 000035
及び、
（２）少なくとも１の抗葉酸剤
を含む組み合わせ剤。
【請求項２】
抗葉酸剤が、
・トリメトプリム（５−（３，４，５−トリメトキシベンジル）ピリミジン−２，４−ジアミン）；
・ピリメタミン（５−（４−クロロフェニル）−６−エチル−２，４−ピリミジンジアミン）；
・式Ｘのグルタミン酸誘導体、又は、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体；又は、
・式ＸＸのグルタミン酸誘導体、又は、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体：
【化２】
2013531067.tif 000036
（式中、
環Ａは、ピロール又はピロリン環であり、
Ｘは、アミノ基又はヒドロキシル基であり、
Ｙは、水素原子、アミノ基又はヒドロキシル基であり、
Ｒは、独立に、水素原子、フッ素原子、Ｃ１−６アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、水素原子又はＣ１−６アルキルであり、
Ｎは、２〜４の整数である。）；
【化３】
2013531067.tif 000037
（式中、
Ｒ１は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり、
Ｒ３は、無置換の、又はクロロ、フルオロ、メチル、メトキシ若しくはトリフルオロメチルで置換された、１，４−フェニレン又は１，３−フェニレン；各々無置換の、又はクロロ、フルオロ、メチル、メトキシ若しくはトリフルオロメチルで置換された、チエネジイル又はフラネジイル；シクロヘキサンジイル；又はアルカンジイルであり、
Ｒは、水素、メチル又はヒドロキシメチルであり、
Ｒ５は、水素又は１〜６の炭素原子を有するアルキルである。）
である、請求項１に記載の組み合わせ剤。
【請求項３】
抗葉酸剤が、ペメトレキセド、（Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−２−オキソ−３，５，７−トリアザビシクロ［４．３．０］ノナ−３，８，１０−トリエン−９−イル）エチル］ベンゾイル］アミノペンタン二酸、又は、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体である、請求項１又は２に記載の組み合わせ剤。
【請求項４】
（３）少なくとも１の白金錯体抗腫瘍核酸結合剤を更に含む、請求項１、２又は３に記載の組み合わせ剤。
【請求項５】
白金錯体抗腫瘍核酸結合剤が、
・シスプラチン、（シス−ジアミンジクロロ白金（II））；
・カルボプラチン、（シス−ジアミン（シクロブタン−１，１−ジカルボキシレート−Ｏ，Ｏ’）白金（II）；
・オキサリプラチン、（［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオエート−Ｏ，Ｏ’）白金（II））；
・テトラプラチン又はオルマプラチン（（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン白金（IV）テトラクロリド）
・サトラプラチン（（ＯＣ−６−４３）ビス（アセテート）アミンジクロロ（シクロヘキシルアミン）白金）、又は、
これらの多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体
である、請求項４に記載の組み合わせ剤。
【請求項６】
（１）式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素、その代謝物、又はその医薬的に許容され得る塩、
【化４】
2013531067.tif 000038
（２）ペメトレキセド、（Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−２−オキソ−３，５，７−トリアザビシクロ［４．３．０］ノナ−３，８，１０−トリエン−９−イル）エチル］ベンゾイル］アミノペンタン二酸、又はその医薬的に許容され得る塩、及び、
（３）シスプラチン、（シス−ジアミンジクロロ白金（II））
を含む、請求項１に記載の組み合わせ剤。
【請求項７】
成分（１）及び（２）を、それを必要とする患者に投与するべく、
（ａ）同一の製剤に、
（ｂ）同一の投与経路を用いた個別の製剤に、或いは、
（ｃ）異なる投与経路を用いた個別の製剤に
処方してなる、請求項１、２、３、４、５又は６に記載の組み合わせ剤。
【請求項８】
成分（１）、（２）及び（３）を、それを必要とする患者に投与するべく、
（ａ）同一の製剤に、
（ｂ）同一の投与経路を用いた個別の製剤に、或いは、
（ｃ）異なる投与経路を用いた個別の製剤に
処方してなる、請求項７に記載の組み合わせ剤。
【請求項９】
成分（１）及び（２）を、それを必要とする患者に、経口送達により、及び／又は、静脈注射、注入、筋肉内、皮下若しくは非経口経路での投与により投与するべく処方してなる、請求項７に記載の組み合わせ剤。
【請求項１０】
成分（１）、（２）及び（３）を、それを必要とする患者に、経口送達により、及び／又は、静脈注射、注入、筋肉内、皮下若しくは非経口経路での投与により投与するべく処方してなる、請求項８に記載の組み合わせ剤。
【請求項１１】
成分（１）及び（２）を、それを必要とする患者に、同時投与するべく処方してなる、請求項７又は９に記載の組み合わせ剤。
【請求項１２】
成分（１）、（２）及び（３）を、それを必要とする患者に、同時投与するべく処方してなる、請求項８又は１０に記載の組み合わせ剤。
【請求項１３】
成分（１）を、総体重１ｋｇ当たり約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で投与するべく処方してなる、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２に記載の組み合わせ剤。
【請求項１４】
成分（２）を溶液として、患者表面積１ｍ２当たり１０〜５００ｍｇとなるよう、注射で投与するべく処方してなる、請求項１３に記載の組み合わせ剤。
【請求項１５】
成分（３）の白金錯体を、５０〜１００ｍｇ／ｍ２（患者表面積）の単回投与で３〜４週に亘り、又は、１５〜２０ｍｇ／ｍ２の複数回投与で週５日以上３〜４週に亘り投与するべく処方してなる、請求項１３又は１４に記載の組み合わせ剤。
【請求項１６】
哺乳類のガンを治療するためのキットであって、
（１）式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素、又は、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、若しくは単離されたジアステレオ異性体
【化５】
2013531067.tif 000039
及び、
（２）少なくとも１の抗葉酸剤
を含むキット。
【請求項１７】
抗葉酸剤が、ペメトレキセド、（Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−２−オキソ−３，５，７−トリアザビシクロ［４．３．０］ノナ−３，８，１０−トリエン−９−イル）エチル］ベンゾイル］アミノペンタン二酸、又は、その医薬的に許容され得る塩である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
（３）少なくとも１の白金錯体抗腫瘍核酸結合剤を更に含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
白金錯体抗腫瘍核酸結合剤が、シスプラチン、（Platinol（登録商標））（シス−ジアミンジクロロ白金（II））である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
成分（１）及び（２）の個別の投与量を個別の容器に含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項２１】
成分（１）、（２）及び（３）の個別の投与量を個別の容器に含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
非小細胞肺ガンの処置のための、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
哺乳類のガンの処置のための医薬組成物であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２に記載の組み合わせ剤と、少なくとも１の医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
処置すべき哺乳類のガンが、非小細胞肺ガン、大腸、膵臓、前立腺、肝臓、腎臓、肺、頭部及び頸部、膵臓、甲状腺及び卵巣のガンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
処置すべき哺乳類のガンが、非小細胞肺ガン、大腸、膵臓、前立腺、肝臓、腎臓、肺、頭部及び頸部、膵臓、甲状腺及び卵巣のガンである、請求項１に記載の組み合わせ剤。
【請求項２６】
処置すべき哺乳類のガンが、
（ａ）小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、気管支腺腫、胸膜肺芽腫；
（ｂ）脳幹及び視床下部膠腫、小脳及び大脳星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、及び神経外胚葉性、松果体腫；
（ｃ）子宮内膜ガン、頸部ガン、卵巣ガン、膣ガン、外陰ガン、子宮骨肉腫；
（ｄ）肛門ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、食道ガン、胆嚢ガン、胃ガン、膵臓ガン、直腸ガン、小腸ガン、唾液腺ガン；
（ｅ）肝細胞ガン、胆管ガン、混合型肝細胞胆管ガン；
（ｆ）膀胱ガン、陰茎ガン、腎臓ガン、腎臓新生物、腎盂ガン、尿管ガン、尿道ガン；
（ｇ）扁平細胞ガン、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚ガン、非メラノーマ皮膚ガン；
（ｈ）眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫；
（ｉ）喉頭、下咽頭、鼻咽頭、中咽頭ガン、口唇及び口腔ガン；
（ｊ）精巣ガン、前立腺ガン；
（ｋ）ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、中枢神経系のリンパ腫；
（ｌ）神経膠芽腫、血液悪性疾患、レルミット・デュクロ病、悪性神経膠腫、多発性骨髄腫、骨髄化生、骨髄新生症候群；
（m）軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫；
（ｎ）急性骨髄性白血病、急性リンパ芽細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、及び毛様細胞白血病；
（ｏ）甲状腺ガン；又は、
（ｐ）消化管間葉性腫瘍（gastrointestinal stromal tumors：Ｇ．Ｉ．Ｓ．Ｔ）
である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
患者の過剰増殖性疾患を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１、２、３、４、５又は６に記載の組み合わせ剤を投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記過剰増殖性疾患が、脳腫瘍、乳ガン、骨肉腫、気管支前悪性、子宮内膜ガン、神経膠芽腫、血液悪性疾患、肝細胞ガン、ホジキン病、腎臓新生物、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ腫、レルミット・デュクロ病、悪性神経膠腫、メラノーマ、悪性メラノーマ、転移、多発性骨髄腫、骨髄化生、骨髄新生症候群、非小細胞肺ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、腎細胞ガン、横紋筋肉腫、軟組織の肉腫、甲状腺ガン、消化管間質腫瘍、皮膚の扁平上皮ガン、又はこれらの組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト及び／又は他の哺乳類における疾病を処置する方法であって、疾患がＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ｒａｆ、ｐ３８、及び／又はＶＥＧＦにより媒介されるとともに、前記方法が、ヒト又は他の哺乳類に対して、請求項１、２、３、４、５又は６に記載の組み合わせ剤を投与することを含む方法。
【請求項３０】
腫瘍増殖、網膜症、虚血性網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性； 関節リウマチ、乾癬、表皮下水疱形成を伴う水疱性疾患、例えば水疱性類天疱瘡、多形性紅斑、若しくは疱疹状皮膚炎、関節リウマチ、変形性関節炎、敗血症性関節炎、腫瘍転移、歯周病、角膜潰瘍、アテローム動脈硬化性プラークによるタンパク尿及び冠状動脈血栓、大動脈瘤、受胎調節、栄養障害型表皮水疱症、外傷性関節損傷に伴う変形性軟骨損失、ＭＭＰ活性媒介性骨減少症、顎関節症、又は神経系の脱髄性疾病から選択される、ヒト及び／又は他の哺乳類における１又は２以上の状態を処置又は予防する方法であって、
前記方法が、ヒト又は他の哺乳類に対して、請求項１、２、３、４、５又は６に記載の組み合わせ剤を投与することを含む方法。
【請求項３１】
アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルマスティン、クロラムブシル、コラスパーゼ（colaspase）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、アミノグルテチミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、５−アザシチジンクラドリビン、ブスルファン、ジエチルスチルベストロール、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ドセタキセル、エリスロヒドロキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシウリジン一リン酸、リン酸フルダラビン、フルオキシメステロン、フルタミド、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、イダルビシン、インターフェロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、ミトタン、パクリタキセル、ペントスタチン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（N-phosphonoacetyl-L-aspartate：ＰＡＬＡ）、プリカマイシン、セムスチン、テニポシド、プロピオン酸テストステロン、チオテパ、トリメチルメラミン、ウリジン、及びビノレルビン、ゲムシタビン、カペシタビン、エポチロン及びその天然又は合成誘導体、トシツモマブ、トラベクテジン（trabectedin）、及びテモゾロミド、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、ＺＤ−１８３９（イレッサ）、ＯＳＩ−７７４（タルセバ）、ＣＩ−１０３３、ＧＷ−２０１６、ＣＰ−７２４，７１４、ＨＫＩ−２７２、ＥＫＢ−５６９、ＳＴＩ−５７１（グリベック）、ＰＴＫ−７８７、ＳＵ−１１２４８、ＺＤ−６４７４、ＡＧ−１３７３６、ＫＲＮ−９５１、ＣＰ−５４７，６３２、ＣＰ−６７３，４５１、ＣＨＩＲ−２５８、ＭＬＮ−５１８、ＡＺＤ−２１７１、ＰＤ−３２５９０１、ＡＲＲＹ−１４２８８６、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（suberoylanilide hydroxamic acid：SAHA）、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ＭＳ−２７５、ＦＲ−９０１２２８、ボルテゾミブ、及びＣＣＩ−７７９から選択される更なる抗ガン剤を含む、請求項１、２、３、４、５又は６に記載の組み合わせ剤。
【請求項３２】
式（Ｉ）の化合物の代謝物が、
・４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸アミド、
・４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−１−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド、又は
・４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−１−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボン酸アミド
である、請求項１、２、３又は４に記載の組み合わせ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年７月１９日付で出願されたＵＳ仮出願第６１／３６５，５４７号に対して優先権を主張し、そして参照することでかかる仮出願の全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本願発明は、フルオロ置換オメガ−カルボキシアリールジフェニル尿素と、葉酸代謝拮抗化学療法薬との組み合わせ薬、並びにヒト及びその他の哺乳類におけるガンなどの過剰増殖性疾患を含む疾病及び状態の処置及び予防におけるその利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
置換ジアリール尿素は、当該技術分野で知られているセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、並びにチロシンキナーゼ阻害剤の区分にある（Smith et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2775-2778, Lowinger et al., Clin. Cancer Res. 2000, 6(suppl.), 335, Lyons et al., Endocr.-Relat. Cancer 2001, 8, 219-225, Lowinger et al., Curr. Pharm. Design 2002, 8, 99-110）。オメガ−カルボキシアリールジフェニル尿素は、ＷＯ００／４２０１２及びＷＯ００／４１６９８に開示されており、フルオロ置換オメガ−カルボキシアリールジフェニル尿素は、ＷＯ／２００５／００９９６１に開示されている。特に、式（Ｉ）のフルオロ置換ジフェニル尿素
【化１】
2013531067.tif 000002
別名「レゴラフェニブ」又は「４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド」又は「Ｎ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル−Ｎ’−（４−（２−（Ｎ−メチルカルバモイル）−４−ピリジルオキシ）−２−フルオロフェニル）尿素、及びその多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体が、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、ｐ３８、ＰＤＧＦＲ、及び／又はｆｌｔ−３シグナル伝達キナーゼの強力な阻害剤であることを開示している。これらの酵素はすべて、ガンを含めた過剰増殖性疾患の処置において対象となる分子標的である。
【０００４】
ＷＯ０３／０４７５７９は、ガンの処置のための細胞傷害性又は抗腫瘍性化合物との組み合わせ剤における置換ジアリール尿素の使用に関する。
【０００５】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素、及びその多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩又はジアステレオ異性体を調製する方法は、以下の出願に記載されている。
【０００６】
Ｗ０／２００５／００９９６１（出願日２００４年７月２２日）
Ｗ０／２００６／０２６５００（出願日２００５年８月２９日）
Ｗ０／２００８／０４３４４６（出願日２００７年９月２９日）
Ｗ０／２００８／０８９３８９（出願日２００８年１月１８日）
Ｗ０／２００８／０８９３８８（出願日２００８年１月１８日）
ＵＳ２００８−０２６２２３６（出願日２００８年５月２１日）
ＵＳ２００８−０２４２７６０７（出願日２００８年６月９日）
ＵＳ２００９−０３０６０２０（出願日２００９年４月２２日）
ＵＳ２０１０／００６３１１２（出願日２０１０年３月１１日）
ＵＳ２０１０／０１１３５３３（出願日２０１０年５月６日）
【０００７】
ＷＯ２００５／００９９６１に記載の様式で調製された式（Ｉ）の化合物は、１８６〜２０６℃の融点を有する多形体Ｉに相当する。多形体Ｉの固有のＸ線回折図、ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、ＦＩＲスペクトル、ＮＩＲスペクトル、及び１３Ｃ−固相ＮＭＲスペクトルは、米国特許出願公報第２０１０／０１１３５３３号及び同第２０１０／００６３１１２号の各々の図２〜７に示されている。本発明には、米国特許出願公報第２０１０／０１１３５３３号及び同第２０１０／００６３１１２号でそれぞれ開示されている４−［４−（｛［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイル｝アミノ）−３−フルオロフェノキシ］−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボキサミドの多形体II（１８１℃にて融解）及び多形体III（１４１℃にて融解）を含み、そしてそれらは、それぞれ米国特許出願公報第２０１０／０１１３５３３号及び同第２０１０／００６３１１２号の図２〜７に開示されている。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物の多形体Ｉとの比較では、多形体II及びIIIは、それぞれ米国特許出願公報第２０１０／０１１３５３３号及び同第２０１０／００６３１１２号の図２〜７に開示されているとおり、明確に識別可能なＸ線回折図、ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、ＦＩＲスペクトル、ＮＩＲスペクトル及び１３Ｃ−固相ＮＭＲスペクトルを有している。
【０００９】
葉酸代謝拮抗剤、葉酸拮抗剤、及び抗葉酸剤として知られている代謝拮抗化学療法薬の類は、葉酸の代謝を阻害することによって作用する。本明細書中では、これらを抗葉酸剤と呼ぶ。抗葉酸剤は、葉酸に依存し、且つ、細胞複製に必要とされる細胞代謝過程を妨げる。これらの物質が細胞代謝に組み入れられると、それらは、葉酸代謝経路の葉酸依存性酵素を阻害するために葉酸欠乏の細胞内状況を生じさせる。ＤＮＡ合成及び細胞分裂、すなわち、悪性腫瘍の増殖にかかわる過程が、この葉酸欠乏によって妨げられる。抗葉酸剤によって処置された患者は、抗葉酸剤の血液学的毒性及びＧＩ毒性を管理するためにビタミンＢ１２及び葉酸サプリメントを通常服用する。
【００１０】
現在、抗葉酸剤化学療法で処置されるガンの形態には：乳ガン、頭部及び頸部ガン、膀胱ガン、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、絨毛ガン、及び骨肉腫が含まれる。抗葉酸剤はまた、例えば、マラリア原虫、細菌感染、乾癬、及び関節リウマチなどの非ガン性疾患の処置にも使用される。
【００１１】
メトトレキサート（アメソプテリンとして以前知られていた）は抗葉酸剤であって、１９４０年代後半に開発された早期化学療法剤の１つである。それ以後、抗葉酸剤活性を有する、一連の以下の式Ｘの４−ヒドロキシピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−Ｌ−グルタミン酸誘導体
【化２】
2013531067.tif 000003
（式中、環Ａは、ピロール又はピロリン環であり、Ｘは、アミノ基又はヒドロキシル基であり、Ｙは、水素原子、アミノ基又はヒドロキシル基であり、Ｒは、水素原子、フッ素原子、Ｃ１−６アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、水素原子又はＣ１−６アルキルであり、及びｎは、２〜４の整数であり、そして、Ｒは、ｎ個の反復単位のそれぞれで異なっていてもよい。）
とその塩が開示され、そして特に有用な葉酸拮抗剤であることが示された。例えば、Akimoto, et al., U.S. Pat Nos. 4,997,838, 5,106,974及び5,539,113を参照のこと。
【００１２】
当該技術分野ではグルタミン酸誘導体の調製のために多数の方法が知られているが、そのうちの一部が米国特許第４，９９７，８３８号、同第５，１０６，９７４号、同第５，４１６，２１１号及び同第５，５３９，１１３号で開示されている。
【００１３】
特に着目のグルタミン酸誘導体は、米国特許第４，９９６，２０６号及び同第５，３４４，９３２号で開示されている、以下の式ＸＸ
【化３】
2013531067.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり、
Ｒ３は、無置換の、又はクロロ、フルオロ、メチル、メトキシ若しくはトリフルオロメチルで置換された、１，４−フェニレン又は１，３−フェニレン；各々無置換の、又はクロロ、フルオロ、メチル、メトキシ若しくはトリフルオロメチルで置換された、チエネジイル又はフラネジイル；シクロヘキサンジイル；又はアルカンジイルであり、
Ｒは、水素、メチル又はヒドロキシメチルであり、
Ｒ５’は、水素又は１〜６の炭素原子を有するアルキルである。）
のもの、並びに医薬として許容されるその塩である。
【００１４】
特に着目の葉酸拮抗薬は、グルタミン酸誘導体である、以下の式（Ａ）のペメトレキセド、（Ｓ）−２−［４［２−（４−アミノ−２−オキソ−３，５，７−トリアザビシクロ［４．３．０］ノナ−３，８，１０−トリエン−９−イル）エチル］ベンゾイル］アミノペンタン二酸
【化４】
2013531067.tif 000005
及び医薬として許容されるその塩である。
【００１５】
ペメトレキセドの調製に好適な方法は、米国特許第４，９９６，２０６号、同第５，３４４，９３２号、及び同第５，４１６，２１１号に記載されている。
【００１６】
ブランド名Alimta（登録商標）としても知られているペメトレキセドは、Indianapolisを拠点とする会社であるEli Lilly and Companyによって開発され、そして現在、そこで製造され、市販されている。ペメトレキセドは、プリン及びピリミジン合成に必要とされる多くの酵素を阻害するので、それがガンと正常細胞の両方の成長と生存に必要であるＤＮＡとＲＮＡの形成を妨げることが報告されている。これらの酵素には、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（ＧＡＲＦＴ）が含まれる。
【００１７】
ペメトレキセドは、白金含有化学療法薬であるシスプラチンと組み合わせた、肺の内壁の腫瘍の一種である悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の処置に関して米国食品医薬品局投与によって２００４年２月に承認された。２００４年７月には、この薬物は、進行性又は転移性の非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の処置のための第二選択薬としてＦＤＡによって承認された。２００８年９月には、ＦＤＡは、非扁平組織像を有する患者の局所進行性及び転移性ＮＳＣＬＣに対するシスプラチンと組み合わせた一次治療として承認した。ピロロピリミジン−Ｌ−グルタミン酸誘導体ではないその他の公知の抗葉酸剤は、トリメトプリム（５−（３，４，５−トリメトキシベンジル）ピリミジン−２，４−ジアミン）やピリメタミン（５−（４−クロロフェニル）−６−エチル−２，４−ピリミジンジアミン）である。
【００１８】
肉腫、いくつかのガン（例えば、小細胞肺ガンや卵巣ガン）、リンパ腫、及び胚細胞腫を含めた様々なタイプのガンを治療する化学治療法薬物としての白金配位錯体の使用が周知である。白金化合物の細胞毒性は、核酸に結合することによるガン細胞のＤＮＡ合成の阻害による結果と考えられており、最終的にアポトーシスを引き起こす。
【００１９】
一般的な白金配位錯体は、シスプラチン、（シス−ジアンミンジクロロ白金（II））；カルボプラチン、（シス−ジアンミン（シクロブタン−１，１−ジカルボキシレート−Ｏ，Ｏ’）白金（II）；オキサリプラチン、（［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオエート−Ｏ，Ｏ’）白金（II））；テトラプラチン又はオルマプラチン（（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン白金（IV）テトラクロリド）及びサトラプラチン、（ＯＣ−６−４３）ビス（アセテート）アミンジクロロ（シクロヘキシルアミン）白金）である。
【００２０】
シスプラチンを含む、及びカルボプラチンを含む併用化学療法レジメンによって、単剤化学療法よりも高い奏効率（数例の完全寛解を含む）が得られると報告されている。毒性の影響は様々であり得るが、結果はシスプラチンを含むほとんどのレジメンで類似しており；チスプラチンを含む５種類のレジメンを比較した無作為化試験では、その応答、応答の期間、又は生存率に有意の差が見られなかったとの報告がある［１］。全身状態が良好で遠隔転移部位の数が限定的である患者が化学療法を施された場合、他の患者と比較して、優れた応答と生存率を示したと報告されている［２］。
【００２１】
これらの結果は、転移性及び局所進行性非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の両方に対する化学療法的手段と現在のプログラムの有効性のさらなる検討を支持するものである。標準的な治療方法とみなされている特定のレジメンは存在しない。放射線療法は、気管、食道性、若しくは気管支の圧迫、骨若しくは脳への転移、痛み、声帯麻痺、喀血、又は上大静脈症候群などの、ＮＳＣＬＣの局所的な合併症の症状の軽減に効果的であり得る。
【００２２】
以下の化学療法レジメンは、同様の生存率をもたらした：
シスプラチンとビンブラスチンとマイトマイシン［１５］
シスプラチンとビノレルビン［３］
シスプラチンとパクリタキセル［８］
シスプラチンとゲムシタビン［１６］
カルボプラチンとパクリタキセル［６，７］。
【００２３】
参考文献
【表１】
2013531067.tif 000006
【００２４】
非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）は、類表皮ガン又は扁平上皮ガン、腺ガン、及び大細胞ガンを含む肺ガンの少なくとも３種類の異なる組織学的診断から成る異種凝集体（heterogeneous aggregate）である。これらは、局在的な状態ではすべて外科手術によって治癒する可能性があるため、同じ分類とされることが多い。診断時、ＮＳＣＬＣの患者は、疾患の程度と治療方法を反映する３つのグループに分けることができる。第一のグループは、腫瘍が外科手術によって切除可能であることが特徴であり、ステージI又はIIの段階に分けることができる。これは、腫瘍及びホストの種々の要因によるが、予後が最も良いグループである。第二のグループは、進行性肺ガンの患者であり、局所性（local）又は領域性（regional）というサブカテゴリーに分けることができる。好ましい治療方法は、化学療法を伴うか、若しくは伴わない放射線療法、又はその他の治療モダリティである。最後のグループは、遠隔転移の患者を含む。このグループは、原発腫瘍の症状を緩和するための放射線療法、又は化学療法によって治療することができる。シスプラチンに基づく化学療法では、症状の軽減が短期的であることと、生存率という恩恵が小さいことが示されている。
【００２５】
手術可能な患者の場合、肺の症状の存在、腫瘍のサイズが大きいこと（＞３センチメートル）、及びＥｒｂ−２腫瘍性タンパク質の存在により、予後が悪影響を受ける［１〜６］。切除可能な非小細胞肺ガンを持ついくつかのグループの患者で、有害な予後因子として識別されたその他の因子としては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異、 血管浸潤、及び腫瘍検体中の血管数の増加が挙げられる［３、７、８］。
【００２６】
参考文献
【表２】
2013531067.tif 000007
【００２７】
化学応答性である小細胞肺ガンと非小細胞ガンとを混同する場合があるため、どのような肺ガン患者に対しても、その治療を開始する前に熟練の病理学者による病理学的検体の再検査を行うことは重要であり得る［１］。非小細胞肺ガンは、組織学的には扁平上皮細胞（類表皮）ガン、腺ガン、大細胞ガン、腺扁平上皮ガン、及び未分化ガンに分類することができる。同様に、ステージ分類の手順は、対ガン米国合同委員会（ＡＪＣＣ）によって設定されたガイドラインを用いて行うことができる。この分類は、原発腫瘍の特徴付け（Ｔ）、リンパ節のサイズの測定（Ｎ）、及び遠隔転移の評価（Ｍ）に基づいているため、略して、ＮＳＣＬＣのＴＮＭ分類システムとして知られる。
【００２８】
進行ステージの疾患では、化学療法によって生存期間のメジアン値がやや改善されると報告されている［１、２］。化学療法は疾患関連の症状の短期的な改善をもたらすと報告されている一方で、併用化学療法では症状の軽減が見られるとの報告がある［３、４］。
【００２９】
参考文献
【表３】
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【００３０】
肺は原発性肺ガンを持つ患者の第二の原発性悪性腫瘍の部位となることも多い。その新しい病変部が新たな原発性ガンか又は転移ガンであるかを判断することは困難である場合がある。研究により大部分の患者において新しい病変部は第二の原発性腫瘍であり、切除によって患者の中には長期間の生存を達成する場合もあることが示唆されている。従って、第一の原発性腫瘍が制御された場合、第二の原発性腫瘍は可能であれば切除すべきである［８、９］。転移性疾患の患者に対する化学療法の使用により、客観的反応及び生存率のわずかな改善が見られたとの報告がある［１０］。
【００３１】
治療オプション：
１．緩和放射線療法。
２．化学療法単独。以前に化学療法を受けたことのない患者の場合、以下のレジメンが、同様の生存率をもたらした。
シスプラチンとビンブラスチンとマイトマイシン［１３］
シスプラチンとビノレルビン［１４］
シスプラチンとパクリタキセル［１５］
シスプラチンとゲムシタビン［１６］
カルボプラチンとパクリタキセル［１７、１８］。
３．孤立性脳転移の外科手術による切除（厳選された患者）［６］。
４．気管支内病変部位に対するレーザー療法又は組織内放射線療法［１９］。
５．定位放射線手術（厳選された患者）［３、５］。
【００３２】
参考文献
【表４】
2013531067.tif 000009
【００３３】
【表５】
2013531067.tif 000010
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本願発明は、組み合わせ薬、医薬組成物、並びに、結腸ガン、胃ガン、肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、膵臓ガン、甲状腺ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、白血病、メラノーマ、肝細胞ガン、腎臓ガン、頭部及び頸部のガン、神経膠腫、乳ガン、及び消化管間葉性腫瘍を含むがこれらに限定されないガンなど、これらに限定されない細胞増殖性疾患を含む疾患及び状態を治療する方法を提供する。
【００３５】
組み合わせ薬は、（１）少なくとも１種類の式Ｉ（上記で定める）のフルオロ置換ジアリール尿素、並びに（２）ペメトレキセド（Alimta（登録商標））などの少なくも１種類の抗葉酸剤、そして任意に（３）カルボプラチン（Paraplatin（登録商標））、オキサリプラチン（Eloxatin（登録商標））、シスプラチン（Platinol（登録商標））、及びテトラプラチン若しくはオルマプラチン、又はサトラプラチン（Spera（商標））などの少なくとも１種類の白金錯体抗腫瘍核酸結合剤を含み、ここで、これらの成分はいずれも、その薬理学的に許容される塩、又はその他のその公知の誘導体の形で存在することができる。本願発明の組み合わせ薬は、生体内、例えば、患者の体内で形成されることができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、組み合わせ薬は、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素、ペメトレキセド（Alimta（登録商標））、及びシスプラチンである。
【００３７】
本願発明は、１若しくは２種類以上の薬理学的に許容される担体分子、並びに式Ｉ（上記で定める）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド（Alimta（登録商標）））、及び任意に白金錯体（例えば、シスプラチン）を、合わせてガンの治療に有効となる量含む医薬組成物にも関し、ここで、これらの成分はいずれも、その薬理学的に許容される塩、又はその他の一般的な誘導体の形で存在することができる。
【００３８】
本願発明の方法は、例えば、（１）式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物（例えば、レゴラフェニブ）、（２）抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド（Alimta（登録商標）））、及び任意に（３）白金錯体（例えば、シスプラチン）、又はこれらの薬理学的に許容される塩若しくは誘導体などを投与する工程を含む。
【００３９】
本願発明の特定の実施形態では、組み合わせ薬の活性成分は、経口送達、及び／又は静脈内注射若しくは注入によって患者に投与される。
【００４０】
本願発明の特定の実施形態では、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物は、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド（Alimta（登録商標）））及び任意に白金錯体（例えば、シスプラチン）と同時に、同一の製剤として又は別々の製剤として、任意に異なる投与経路を用いて、ガン患者へ投与される。投与は、いずれの順序でも、逐次的に行うこともできる。
【００４１】
本願発明の特定の実施形態では、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物（例えば、レゴラフェニブ）は、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド（Alimta（登録商標）））及び任意に白金錯体（例えば、シスプラチン）とタンデム方式で投与され、ここで、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物は、一日に１若しくは２回以上、最大連続して２８日間まで患者に投与され、抗葉酸剤及び任意に白金錯体は、同じ全期間にわたって、同時に若しくは間欠的に投与される。
【００４２】
本願発明の特定の実施形態では、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物（例えば、レゴラフェニブ）は、総体重当たり約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる経口、静脈内、筋肉内、皮下、又は非経口投与量で患者に投与することができる。
【００４３】
本願発明の特定の実施形態では、抗葉酸剤は、従来の投与方法によって従来の投与量割合、従来の投与量レベルにて投与される。ペメトレキセドは、通常、静脈内への注射（１０分かけて注入）によって溶液（５００ｍｇ／ｍ２、患者表面積１平方メートル（ｍ２）当たり５００ｍｇ）として２１日に一度投与される。
【００４４】
本願発明の特定の実施形態では、任意の白金錯体は、従来の手法によって従来の投与量割合、従来の投与量レベルにて投与される。シスプラチンは、通常、無菌水溶液として静脈内に投与される。３〜４週間の期間向けの単回用量は、５０〜１００ｍｇ／ｍ２（患者表面積）の範囲とすることができる。３〜４週間毎の５日間の１５〜２０ｍｇ／ｍ２の日用量が、単回投与の代替手段である。
【００４５】
本願発明の特定の実施形態では、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物は、固体分散体で投与され、その合成は、２００５年８月２９日出願のＷＯ／２００６／０２６５００に開示されており、これは参照することで本明細書に援用される。
【００４６】
本願発明はまた、式（Ｉ）の置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤、及び白金錯体を、これらの作用物質の同時使用のために調整した量で含む組み合わせ剤、医薬合成方法にも関する。
【００４７】
本願発明はさらに、３種類の化学療法薬の投与量が少なくとも２つの個別のコンテナ内に存在するキットに関する。
【００４８】
本発明はまた、式（Ｉ）のフルオロ置換アリール尿素、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド）、及び白金錯体の有用な形態にも関する。これらには、式（Ｉ）のフルオロ置換アリール尿素、抗葉酸剤、及び白金錯体の多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩又はジアステレオ異性体が含まれている。
【００４９】
本願発明は、式（Ｉ）の化合物すべての薬理学的に許容される塩、代謝物、及びプロドラッグなど、本明細書で開示する化合物の有用な形態にも関する。「薬理学的に許容される塩」という用語は、比較的無毒性である本願発明の化合物の無機酸又は有機酸の付加塩を意味する。例えば、S. M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19を参照のこと。薬理学的に許容される塩としては、親化合物を塩基として機能させて無機酸又は有機酸と反応させ、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、及びクエン酸の塩などの塩を形成することによって得られる塩が含まれる。薬理学的に許容される塩としては、親化合物を酸として機能させ、適切な塩基と反応させて形成される、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、及び塩素の塩なども含まれる。当業者であれば、さらに、請求された化合物の酸付加塩を、数多くの公知の方法のいずれによっても、その化合物と適切な無機酸若しくは有機酸との反応によって作製可能であることが認識されるであろう。別の選択肢として、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が、種々の公知の方法により、本願発明の化合物を適切な塩基と反応させることによって作製される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本願発明の化合物の代表的な塩としては、従来の無毒性の塩及び四級アンモニウム塩が挙げられ、これらは、例えば、無機若しくは有機の酸又は塩基より当該技術分野で公知の手段によって形成される。例えば、そのような酸付加塩としては、アセテート、アジペート、アルギネート、アスコルベート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、硫酸水素塩、ブチレート、シトレート、カンファレート、カンファースルホネート、シナメート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルサルフェート、エタンスルホネート、フマレート、グルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミサルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホネート、イタコネート、ラクテート、マレエート、マンデレート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、硝酸塩、オキサレート、パモエート、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネ−ト、スクシネート、スルホネート、タルトレート、チオシアネート、トシレート、トリフルオロメタンスルホネート、及びウンデカノエートが挙げられる。
【００５１】
塩基塩としては、ジシクロヘキシルアミン及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基の、カリウム塩及びナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアンモニウム塩が挙げられる。さらに、塩基性窒素を有する基を、メチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの低級アルキルハロゲン化物、ジメチル、ジエチル、及びジブチルサルフェート、並びにジアミルサルフェートなどのジアルキルサルフェート、デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物、ベンジル及びフェネチルの臭化物などのアリール又はアラルキルハロゲン化物、並びに、その他の一置換アラルキルハロゲン化物又は多置換アラルキルハロゲン化物などの剤で四級化することもできる。
【００５２】
本願発明の目的のための、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド（Alimta（登録商標）））、及び任意の白金錯体（例えば、シスプラチン）の溶媒和物は、溶媒分子が、固相で複合体を形成し、且つ、それが、これらに限定されるものではないが、例えばエタノール及びメタノールであるような本化合物の形態のことである。
【００５３】
水和物は、溶媒和の特別な形態であり、ここで、溶媒分子が水である。
【００５４】
特定の薬理学的に活性な薬剤を、インビボでの投与後に開裂して主たる活性薬剤と薬理学的に不活性な誘導基とを提供する不安定性の官能基でさらに修飾することができる。このような誘導体は、一般にプロドラッグと称され、これを用いることにより、例えば、活性薬剤の物理化学的性質の変化、活性薬剤の特定の組織への標的化、活性薬剤の薬物動態学的及び薬力学的性質の変化、並びに望ましくない副作用の低減などが可能となる。本願発明で使用される式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤、及び任意の白金錯体のプロドラッグとしては、例えば、耐容性が良好であって薬理学的に許容されるエステルである本願発明の適切な化合物のエステルであり、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はペンチルのエステルを含むアルキルエステルなどが挙げられる。メチルエステルが好ましいが、フェニル−Ｃ１−Ｃ５アルキルなどのさらなるエステルも用いることができる。
【００５５】
その他のプロドラッグの合成に用いることができる方法は、この件に関する以下のレビューに記載されており、これらの合成法に関する記述は参照することで本明細書に組み入れられる。
【００５６】
【表６】
2013531067.tif 000011
【００５７】
式（Ｉ）のフルオロ置換アリール尿素と抗葉酸剤の活性代謝物は、本願発明に含まれる。式（Ｉ）のフルオロ置換アリール尿素の代謝物には、代謝部位が尿素窒素原子若しくはピリジン窒素原子の２つのうちのいずれかであるか、又はメチルアミド官能基であるか、又はそのいずれかの組み合わせである酸化誘導体が含まれる。酸化は、通常、ヒドロキシル基を持つ尿素の窒素原子、及び／又は酸素（当該技術分野では１−オキソ−ピリジンとも呼ばれる）若しくはヒドロキシ（当該技術分野では１−ヒドロキシ−ピリジンとも呼ばれる）によって置換されたピリジン窒素原子、及び／又は脱メチル化されたアミド官能基のいずれかをもたらす。例としては：
【００５８】
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸アミド、
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−１−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド、及び
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−１−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボン酸アミド、
が挙げられる。
【００５９】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素と抗葉酸剤の塩及びプロドラッグは、所望の種々の置換基の位置及び性質に応じて、１若しくは２箇所以上の不斉中心を有することができる。不斉炭素原子は、（Ｒ）、（Ｓ）、又は（Ｒ，Ｓ）の立体配置で存在することができる。ある場合では、不斉性は、例えば、特定の化合物の２個の置換芳香環を繋ぐ中心結合など、ある結合の周りの回転が制限されることによっても存在することができる。環上の置換基は、シス又はトランスの形で存在することもできる。そのような立体配置（エナンチオマー及びジアステレオマーを含む）はすべて、本願発明の範囲内に含まれることを意図している。好ましい化合物は、より望ましい生物活性を発生させる式（Ｉ）の化合物の絶対立体配置を有する化合物である。分離された、純粋な、若しくは部分的に精製された式（Ｉ）の化合物の誘導体の異性体、又はラセミ体の混合物も、本願発明の範囲内に含まれる。前記異性体の精製、及び前記異性体混合物の分離は、当該技術分野で公知の標準的な技術によって達成することができる。
【００６０】
光学異性体は、例えば、光学活性な酸若しくは塩基を用いたジアステレオマーの塩を形成、又は共有結合性ジアステレオマーの形成など、従来のプロセスに従ったラセミ体混合物の分割によって得ることができる。適切な酸の例としては、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、及びカンファースルホン酸である。ジアステレオマーの混合物は、その物理的及び／又は化学的な違いに基づき、例えば、クロマトグラフィー若しくは分別再結晶などの当該技術分野で公知の方法により、個々のジアステレオマーに分離することができる。そして、分離されたジアステレオマーの塩から光学活性な塩基又は酸を遊離させる。光学異性体の分離のための別のプロセスでは、従来の誘導体化を伴うか若しくは伴わない、エナンチオマーの分離が最大となるように最適に選択されたキラルクロマトグラフィー（例えば、キラルＨＰＬＣカラム）の使用を含む。適切なキラルＨＰＬＣカラムは、Diacel製の、数ある中で、例えば、Chiracel OD、及びChiracel OJがあり、すべて通常通りに選択可能である。誘導体化を伴うか若しくは伴わない酵素分離も有用である。光学活性な化合物は、同様に、光学活性である出発物質を用いたキラル合成によって得ることができる。
【００６１】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素の一般的な調製方法
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は、以下に示す特許公開公報、ＷＯ２０００／４２０１２、ＷＯ２００３／０４７５７９、ＷＯ２００４／０７８７４７、ＷＯ２００５／０００２８４、ＷＯ２００５／００９９６１、ＷＯ／２００６／０２６５００、ＷＯ／２００８／０４３４４６、ＷＯ／２００８／０８９３８９、ＷＯ／２００８／０８９３８８、ＵＳ２００８−０２６２２３６、ＵＳ２００８−０２４２７６０７、ＵＳ２００９−０１９２１２７、及びＵＳ２００９−０３０６０２０に記載の公知の化学反応及び手順を用いることによって調製することができる。
【００６２】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は、従来の化学的な方法に従い、及び／又は、以下に開示するように、市販されている出発物質、若しくは通常の従来の化学的な方法に従って調製可能である出発物質から調製することができる。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素を調製するための一般的な方法を以下に示し、その調製については、実施例の中で具体的に例示する。
【００６３】
上記の特許公開公報の１若しくは複数に記載のように、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素の調製は、ホスゲン、ジ−ホスゲン、トリ−ホスゲン、カルボニルジイミダゾール、又はその同等物の存在下、いずれの出発物質とも反応しない溶媒中での２種類のアリールアミン成分の縮合によって行うことができるか、あるいは、別の選択肢として、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は、アミノ化合物をイソシアネート化合物と反応させることによって合成することができる。
【００６４】
イソシアネートは、市販されており、又は、当業者に公知の方法に従ってヘテロ環アミンから合成することができる（例えば、アミンを、ホスゲン、又はトリクロロメチルクロロホルメート（ジホスゲン）、ビス（トリクロロメチル）カーボネート（トリホスゲン）、若しくはＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などのホスゲン同等物で処理することにより；又は、別の選択肢として、アミド、若しくはエステル、酸ハライド、若しくは無水物などのカルボン酸誘導体のＣｕｒｔｉｕｓ転位により）。
【００６５】
アリールアミンは、一般に、Ｎｉ、Ｐｄ、若しくはＰｔなどの金属触媒、及びＨ2、又はホルメート、シクロヘキサジエン、若しくはボロヒドリドなどのヒドリド転位剤を用いたニトロアリールの還元によって合成される（Rylander. Hydrogenation Methods; Academic Press: London, UK (1985)）。ニトロアリールは、ＬｉＡｌＨ４などの強力なヒドリド源を用いることで（Seyden-Penne. Reductions by the Alumino- and borohydrides in Organic Synthesis; VCH Publishers: New York (1991)）、又は、Ｆｅ、Ｓｎ、若しくはＣａなどのゼロ価金属を、多くの場合酸性媒体中で用いることで、直接還元することもできる。ニトロアリールの合成には多くの方法が存在する（March. Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed.; John Wiley: New York (1985). Larock. Comprehensive Organic Transformations; VCH Publishers: New York (1989)）。ニトロアリールは、一般に、ＨＮＯ３、又は別のＮＯ２＋源を用いた求電子芳香族ニトロ化反応によって形成される。
【００６６】
ピリジン環がその窒素原子上にヒドロキシ置換基を有し、Ａ、Ｂ、Ｌが上記で広く定められる式（Ｉ）のピリジン−１−オキシドは、当該技術分野で公知の酸化条件を用い、対応するピリジンから調製することができる。いくつかの例を以下に示す：
・ジクロロメタン、ジクロロエタン、又はクロロホルムなどの塩素化溶媒中のメタクロロ過安息香酸などの過酸（Markgraf et al., Tetrahedron 1991, 47, 183）；
・ジクロロメタンなどの塩素化溶媒中、触媒量の過レニウム酸の存在下での（Coperet et al., Terahedron Lett. 1998, 39, 761）；
・ハロゲン化溶媒のいくつかの組み合わせの中でのパーフルオロ−シス−２−ブチル−３−プロピルオキサジリジン（Amone et al., Tetrahedron 1998, 54, 7831）；
・クロロホルム中の次亜フッ素酸（hypofluoric acid）−アセトニトリル複合体（Dayan et al., Synthesis 1999, 1427）；
・ＫＯＨなどの塩基の存在下、水中のオキソン（Robker et al., J. Chem. Res., Synop. 1993, 10, 412）；
・氷酢酸の存在下でのモノパーオキシフタル酸マグネシウム（Klemm et al., J. Heterocylic Chem. 1990, 6, 1537）；
・水及び酢酸の存在下での過酸化水素（Lin A.J., Org. Prep. Proced. Int. 1991, 23(1), 114）；
・アセトン中のジメチルジオキシラン（Boyd et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1991, 9, 2189）。
【００６７】
さらに、ジアリール尿素及び中間化合物を調製する具体的な方法が、別の特許文献に既に記載されており、本願発明の化合物に適応することができる。例えば、Miller S. et al, "Inhibition of p38 Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Diphenyl Ureas" PCT Int. Appl. WO 99 32463, Miller, S et al. "Inhibition of raf Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Substituted Diphenyl Ureas" PCT Int. Appl., WO 99 32436, Dumas, J. et al., "Inhibition of p38 Kinase Activity using Substituted Heterocyclic Ureas" PCT Int. Appl., WO 99 32111, Dumas, J. et al., "Method for the Treatment of Neoplasm by Inhibition of raf Kinase using N-Heteroaryl-N'-(hetero)arylureas" PCT Int. Appl., WO 99 32106, Dumas, J. et al., "Inhibition of p38 Kinase Activity using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" PCT Int. Appl., WO 99 32110, Dumas, J., et al., "Inhibition of raf Kinase using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" PCT Int. Appl., WO 99 32455, Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as raf Kinase Inhibitors" PCT Int. Appl., WO 00 42012, Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as p38 Kinase Inhibitors" PCT Int. Appl., WO 00 41698, Dumas, J. et al. "Heteroaryl ureas containing nitrogen hetero-atoms as p38 kinase inhibitors" U.S. Pat. Appl. Publ., US 20020065296, Dumas, J. et al. "Preparation of N-aryl-N'-[(acylphenoxy) phenyl]ureas as raf kinase inhibitors" PCT Int. Appl., WO 02 62763, Dumas, J. et al. "Inhibition of raf kinase using quinolyl, isoquinolyl or pyridyl ureas" PCT Int. Appl., WO 02 85857, Dumas, J. et al. "Preparation of quinolyl, isoquinolyl or pyridyl-ureas as inhibitors of raf kinase for the treatment of tumors and/or cancerous cell growth" U.S. Pat. Appl. Publ., US 20020165394である。前述の特許出願はすべて、参照することで本明細書に援用される。
【００６８】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素の合成で用いることができる合成変換法は、当業者に公知であるか、又は当業者が利用可能である。様々な合成変換法を、以下の編集物中に見ることができ、例えば以下が挙げられる。
【００６９】
【表７】
2013531067.tif 000012
【００７０】
さらに、合成方法、及び関連事項に関するレビューは頻繁に行われており、例えば、Organic Reactions; John Wiley: New York；Organic Syntheses; John Wiley: New York；Reagents for Organic Synthesis: John Wiley: New York；The Total Synthesis of Natural Products; John Wiley: New York；The Organic Chemistry of Drug Synthesis; John Wiley: New York；Annual Reports in Organic Synthesis; Academic Press: San Diego CA；及びMethoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl); Thieme: Stuttgart, Germany、が挙げられる。さらに、合成変換法に関するデータベースとしては、CAS OnLine又はSciFinderを用いて検索可能であるChemical Abstracts、SpotFireを用いて検索可能であるHandbuch der Organischen Chemie (Beilstein)、及びREACCSが挙げられる。
【００７１】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｒａｆ、ｐ３８及び／又はｆｌｔ−３キナーゼのシグナル伝達経路の阻害を含む種々の活性を有するという特性がすでに確認されている。これらの活性、並びに種々の疾患及び状態の治療へのその利用については、例えば、ＷＯ／２００５／００９９６１、ＷＯ／２００６／０２６５００、ＷＯ／２００８／０４３４４６、ＷＯ／２００８／０８９３８９、ＷＯ／２００８／０８９３８８、ＵＳ２００８−０２６２２３６、ＵＳ２００８−０２４２７６０７、ＵＳ２００９−０１９２１２７、及びＵＳ２００９−０３０６０２０に開示されており、これらはその全文が参照することで本明細書に援用される。
【００７２】
経口投与を意図した医薬組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で公知の適切ないかなる方法によっても調製することができる。医薬組成物は、本願発明の組み合わせ薬の化合物を速やかに送達させる適切な投与形態を含み、例えば、錠剤（コーティングなし、又はコーティングありの錠剤）、口腔内で速やかに崩壊する錠剤若しくは任意に顆粒剤を充填してもよいカプセル剤（例えば、硬質若しくは軟質ゼラチンカプセル剤）、シュガーコートした錠剤、粉末剤、袋剤（sachet）、顆粒剤、ペレット、糖衣錠、チュアブル錠、分散錠、トローチ、及びロゼンジである。このような組成物は、飲みやすい製剤を提供するために、希釈剤、甘味料、香味料、着色剤、及び保存剤から成る群より選択される１若しくは２種類以上の剤を含むことができる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適する無毒性の薬理学的に許容される賦形剤との混合物として含有する。このような賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、若しくはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；例えば、コーンスターチ、若しくはアルギン酸などの造粒剤及び崩壊剤；並びに、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、若しくはタルクなどの結合剤であってよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、又は、胃腸管内での崩壊及び吸着を遅らせ、それによって長期間にわたる持続作用をもたらすために、公知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル、又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延剤を使用することができる。このような化合物は、固体の速放性の形態で調製することもできる。
【００７３】
経口投与のための医薬組成物は、硬質ゼラチンカプセル錠として提供することもでき、この場合、活性成分は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、若しくはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合され、又は、軟質ゼラチンカプセル錠として提供することもでき、この場合、活性成分は、水、又は例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、若しくはオリーブ油などの油媒体と混合される。
【００７４】
水性懸濁液の製造に適する賦形剤との混合物として活性成分の少なくとも１種類を含有する水性懸濁液を用いることもできる。そのような賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、及びアラビアゴムなどの懸濁剤であり；分散剤若しくは湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然のホスファチド、又は、例えば、ポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、又は、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、又は、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物、又は、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートなどのエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物であってよい。水性懸濁液は、さらに、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエチル又はｎ−プロピルエステルなどの１若しくは２種類以上の保存剤、１若しくは２種類以上の着色剤、１若しくは２種類以上の香味料、及びショ糖又はサッカリンなどの１若しくは２種類以上の甘味料を含有することもできる。
【００７５】
薬理学的に許容される担体は、その担体に起因するいかなる副作用も活性成分の有益な効果を損なうことのないように、活性成分の有効作用に適合する濃度において、比較的無毒性であり、患者に無害であるいずれかの担体である。
【００７６】
本化合物の薬理学的効果量とは、治療される特定の状態に対して効果をもたらすか、又は影響を及ぼす量である。本願発明の組み合わせ薬の化合物は、当該技術分野で公知の薬理学的に許容される担体と共に、速放性、徐放性、及び時限放出性製剤を含む効果的である従来のいずれの単位剤形を用いても投与することができる。
【００７７】
薬理学的に許容される賦形剤は、その賦形剤に起因するいかなる副作用も活性成分の有益な効果を損なうことのないように、活性成分の有効作用に適合する濃度において、比較的無毒性であり、患者に無害であるいずれかの賦形剤である。
【００７８】
本願発明にかかる薬理学的に許容される賦形剤は、例えば、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、充填剤、可塑剤、界面活性剤及び湿潤剤、膜形成剤及びコーティング剤、並びに、例えば顔料などの着色剤である。
【００７９】
崩壊剤としては、これらに限定されないが、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ポラクリリンカルシウム、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、ナトリウムスターチグリコレート、部分加水分解デンプン、カルボキシメチルスターチナトリウム、及びデンプンが挙げられる。クロスカルメロースナトリウム、及び／又は架橋ポリビニルピロリドンが好ましく、クロスカルメロースナトリウムがより好ましい。
【００８０】
医薬組成物に含まれる崩壊剤の量は、組成物の総重量に対して、０〜１５％とすることができ、好ましくは５〜１２％である。
【００８１】
結合剤としては、これらに限定されないが、ヒドロキシプロピルセルロース、ハイプロメロース（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ＨＰＭＣ）、微結晶セルロース、アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮糖（compressible sugar）、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、及びアルファ化デンプンが挙げられる。顆粒化液（granulation liquid）中に溶解する水性結合剤が好ましく、ハイプロメロース（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ＨＰＭＣ）及び／又はポリビニルピロリドンがより好ましく、ハイプロメロースが最も好ましい。
【００８２】
医薬組成物に含まれる結合剤の量は、組成物の総重量に対して、０〜１５％とすることができ、好ましくは０．５〜８％である。
【００８３】
滑沢剤としては、これらに限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸、フマル酸、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、及びポリエチレングリコールが挙げられる。好ましくはステアリン酸マグネシウムである。
【００８４】
医薬組成物に含まれる滑沢剤の量は、組成物の総重量に対して、０〜２％とすることができ、好ましくは０．２〜０．８％である。
【００８５】
充填剤としては、これらに限定されないが、リン酸水素カルシウム、カオリン、ラクトース、マンニトール、微結晶セルロース、珪化微結晶セルロース（silicated microcrystalline cellulose）、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、三珪酸マグネシウム、マンニトール、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、例えば無水物若しくは一水和物などの水和物の形のラクトース、デキストロース、マルトース、ショ糖、グルコース、フルクトース若しくはマルトデキストリン、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びデンプンが挙げられる。微結晶セルロース、マンニトール、ラクトース、及び／又はリン酸二カルシウムが好ましく、微結晶セルロースがより好ましい。
【００８６】
医薬組成物に含まれる充填剤の量は、組成物の総重量に対して、０〜６０％とすることができ、好ましくは３〜２０％である。
【００８７】
界面活性剤及び湿潤剤としては、これらに限定されないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール１０、オクストキシノール（oxtoxynol）９、ポリソルベートの例えば２０、４０、６０、若しくは８０、ソルビタンモノパルミテート、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、などの脂肪アルコール硫酸ナトリウム塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどのスルホコハク酸ナトリウム塩、グリセリンモノステアレートなどのアルコールによる脂肪酸の部分エステル、ソルビタンモノラウレートなどのソルビタンによる脂肪酸の部分エステル、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、モノステアレート、若しくはモノオレエートなどのポリヒドロキシエチレンソルビタンによる脂肪酸の部分エステル、脂肪アルコールのポリヒドロキシエチレンによるエーテル、脂肪酸のポリヒドロキシエチレンによるエステル、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体（Pluronic（登録商標））、並びにエチレンオキシド付加トリグリセリドが挙げられる。好ましくは、ラウリル硫酸ナトリウムである。
【００８８】
医薬組成物に含まれる界面活性剤の量は、組成物の総重量に対して、０〜５％とすることができ、好ましくは０．１〜２％である。
【００８９】
膜形成剤及びコーティング剤としては、これらに限定されないが、液体グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ハイプロメロース、ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、シェラック、ポリビニルピロリドン、Kollidon（登録商標）ＶＡ６４ ＢＡＳＦなどのビニルピロリドンと酢酸ビニルとの共重合体、アクリル酸及び／又はメタクリル酸のエステルとトリメチルアンモニウムメチルアクリレートとの共重合体、ジメチルアミノメタクリル酸と中性メタクリル酸エステルとの共重合体、メタクリル酸又はメタクリル酸エステルの重合体、アクリル酸エチルエステルとメタクリル酸メチルエステルとの共重合体、並びにアクリル酸とアクリル酸メチルエステルとの共重合体が挙げられる。膜形成剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ハイプロメロース、ＨＰＭＣ）が好ましい。
【００９０】
可塑剤としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、フタル酸ジエチル、及びグリセロールが挙げられる。好ましくはポリエチレングリコールである。
【００９１】
着色剤としては、これらに限定されないが、顔料、無機顔料、ＦＤ＆ＣレッドＮｏ．３、ＦＤ＆ＣレッドＮｏ．２０、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．６、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．２、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．５、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．５、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．８、カラメル、赤酸化第二鉄、黄酸化第二鉄、及び二酸化チタンが挙げられる。好ましくは、赤酸化第二鉄、黄酸化第二鉄、及び二酸化チタンである。
【００９２】
必要に応じて意図する投与経路のための組成物の製剤に使用することができる、通常使用されるさらなる医薬賦形剤としては、これらに限定されないが；例えば、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、及び硝酸などの酸性化剤；例えば、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、及びトロラミンなどのアルカリ化剤；例えば、粉末セルロース及び活性炭などの吸着剤；例えば、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの安定化剤及び抗酸化剤；例えば、ブロック重合体、天然及び合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーン、ポリシロキサン、並びにスチレン−ブタジエン共重合体などのその他の結合剤；例えば、メタリン酸カリウム、リン酸二カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム無水物、及びクエン酸ナトリウム水和物などの緩衝剤；例えば、ゼラチン、デンプン、及びセルロース誘導体などのカプセル化剤；例えば、アニス油、シナモン油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油、及びバニリンなどの香味料、マスク剤、及び香料；例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びソルビトールなどの湿潤剤；例えば、アスパルテーム、デキストロース、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトール、及びショ糖などの甘味料；例えば、ステアリン酸マグネシウム及びタルクなどの粘着防止剤（anti−adherent）、例えば、リン酸水素カルシウム、ラクトース、及び微結晶セルロースなどの直打用賦形剤（direct compression excipient）；例えばカルナウバロウ及び白ロウなどの錠剤研磨剤、が挙げられる。
【００９３】
必要に応じて意図する投与経路のための組成物の製剤に使用することができる、通常使用される医薬成分としては、以下が挙げられる。
【００９４】
酸性化剤（例としては、これらに限定されないが、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸が挙げられる）；
【００９５】
アルカリ化剤（例としては、これらに限定されないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロラミンが挙げられる）；
【００９６】
吸着剤（例としては、これらに限定されないが、粉末セルロース及び活性炭が挙げられる）；
【００９７】
エアロゾル噴霧剤（例としては、これらに限定されないが、二酸化炭素、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｆ２ＣｌＣ−ＣＣｌＦ２、及びＣＣｌＦ３が挙げられる）；
【００９８】
空気置換剤（air displacement agent）（例としては、これらに限定されないが、窒素およびアルゴンが挙げられる）；
【００９９】
抗真菌保存剤（例としては、これらに限定されないが、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウムが挙げられる）；
【０１００】
抗菌保存剤（例としては、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、及びチメロサールが挙げられる）；
【０１０１】
抗酸化剤（例としては、これらに限定されないが、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられる）；
【０１０２】
結合剤（例としては、これらに限定されないが、ブロック重合体、天然及び合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーン、ポリシロキサン、並びにスチレン−ブタジエン共重合体が挙げられる）；
【０１０３】
緩衝剤（例としては、これらに限定されないが、メタリン酸カリウム、リン酸二カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム無水物、及びクエン酸ナトリウム二水和物が挙げられる）；
【０１０４】
担体（carrying agent）（例としては、これらに限定されないが、アラビアゴムシロップ、芳香族シロップ、芳香族エリキシル剤、チェリーシロップ、ココアシロップ、オレンジシロップ、シロップ、コーン油、鉱油、ピーナッツ油、ゴマ油、静菌性塩化ナトリウム注射液、及び注射用の静菌水が挙げられる）；
【０１０５】
キレート化剤（例としては、これらに限定されないが、エデト酸二ナトリウム及びエデト酸が挙げられる）；
【０１０６】
着色剤（例としては、これらに限定されないが、ＦＤ＆ＣレッドＮｏ．３、ＦＤ＆ＣレッドＮｏ．２０、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．６、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．２、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．５、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．５、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．８、カラメル、及び赤酸化第二鉄が挙げられる）；
【０１０７】
透明化剤（clarifying agent）（例としては、これに限定されないが、ベントナイトが挙げられる）；
【０１０８】
乳化剤（例としては、これらに限定されないが、アラビアゴム、セトマクロゴール、セチルアルコール、グリセリルモノステアレート、レシチン、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン５０モノステアレートが挙げられる）；
【０１０９】
カプセル化剤（例としては、これらに限定されないが、ゼラチン及びセルロースアセテートフタレートが挙げられる）；
【０１１０】
香味料（例としては、これらに限定されないが、アニス油、シナモン油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油、及びバニリンが挙げられる）；
湿潤剤（例としては、これらに限定されないが、グリセロール、プロピレングリコール、及びソルビトールが挙げられる）；
【０１１１】
研和剤（levigating agent）（例としては、これらに限定されないが、鉱油及びグリセリンが挙げられる）；
【０１１２】
油類（例としては、これらに限定されないが、アラキス油、鉱油、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、及び植物油が挙げられる）；
【０１１３】
軟膏基剤（例としては、これらに限定されないが、ラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ワセリン、親水性ワセリン、白色軟膏、黄色軟膏、及びバラ水軟膏が挙げられる）；
【０１１４】
浸透促進剤（経皮送達）（例としては、これらに限定されないが、モノヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルコール、１価若しくは多価アルコール、飽和若しくは不飽和脂肪アルコール、飽和若しくは不飽和脂肪エステル、飽和若しくは不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトン、及び尿素が挙げられる）；
【０１１５】
可塑剤（例としては、これらに限定されないが、フタル酸ジエチル及びグリセロールが挙げられる）；
【０１１６】
溶媒（例としては、これらに限定されないが、エタノール、コーン油、綿実油、グリセロール、イソプロパノール、鉱油、オレイン酸、ピーナッツ油、純水、注射用水、注射用殺菌水、及び灌注用殺菌水が挙げられる）；
【０１１７】
硬化剤（例としては、これらに限定されないが、セチルアルコール、セチルエステルワックス、微結晶ワックス、パラフィン、ステアリルアルコール、白ロウ、及び黄ロウが挙げられる）；
【０１１８】
坐薬基剤（例としては、これらに限定されないが、ココアバター及びポリエチレングリコール（混合物）が挙げられる）；
【０１１９】
界面活性剤（例としては、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール１０、オクストキシノール９、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、及びソルビタンモノパルミテートが挙げられる）；
【０１２０】
懸濁剤（例としては、これらに限定されないが、寒天、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカントガム、及びビーゴム（veegum）が挙げられる）；
【０１２１】
甘味料（例としては、これらに限定されないが、アスパルテーム、デキストロース、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトール、及びショ糖が挙げられる）；
【０１２２】
錠剤用抗粘着剤（例としては、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム及びタルクが挙げられる）；
【０１２３】
錠剤用結合剤（例としては、これらに限定されないが、アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮糖、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、メチルセルロース、非架橋ポリビニルピロリドン、及びアルファ化デンプンが挙げられる）；
【０１２４】
錠剤及びカプセル剤用希釈剤（例としては、これらに限定されないが、リン酸水素カルシウム、カオリン、ラクトース、マンニトール、微結晶セルロース、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール、及びデンプンが挙げられる）；
【０１２５】
錠剤用コーティング剤（例としては、これらに限定されないが、液体グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、及びシェラックが挙げられる）；
【０１２６】
錠剤直打用賦形剤（例としては、これに限定されないが、リン酸水素カルシウムが挙げられる）；
【０１２７】
錠剤用崩壊剤：（例としては、これらに限定されないが、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ポラクリリンカリウム、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、ナトリウムスターチグリコレート、及びデンプンが挙げられる）；
【０１２８】
錠剤用流動化剤（tablet glidant）（例としては、これらに限定されないが、コロイダルシリカ、コーンスターチ、及びタルクが挙げられる）；
【０１２９】
錠剤用滑沢剤（例としては、これらに限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸、及びステアリン酸亜鉛が挙げられる）；
【０１３０】
錠剤／カプセル剤用不透明化剤（例としては、これに限定されないが、二酸化チタンが挙げられる）；
【０１３１】
錠剤用研磨剤（例としては、これらに限定されないが、カルナウバロウ及び白ロウが挙げられる）；
【０１３２】
粘稠化剤（例としては、これらに限定されないが、蜜ロウ、セチルアルコール、及びパラフィンが挙げられる）；
【０１３３】
等張化剤（tonicity agent）（例としては、これらに限定されないが、デキストロース及び塩化ナトリウムが挙げられる）；
【０１３４】
増粘剤（例としては、これらに限定されないが、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、及びトラガカントガムが挙げられる）；並びに
【０１３５】
湿潤剤（例としては、これらに限定されないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンステアレートが挙げられる）。
【０１３６】
式Ｉの化合物を含む組み合わせ薬の成分は、医薬的に許容され得るマトリックスによる固体分散体の形態で存在できる。固体分散体は、固溶体、ガラス状固溶体、ガラス状懸濁体、結晶性担体中の無定形析出物、共晶若しくは偏晶混合物、化合物若しくは複合体形成物、又はその組み合わせなどのＷＯ２００６／２６５００で規定される様々なタイプのうちの１つであり得る。
【０１３７】
医薬的に許容され得るマトリックスは、好ましくは、例えば、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、ポロキサマー、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、ヒドロキシアルキルメチルセルロース（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースサクシネート（例えば、セルロースアセテートサクシネート及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート）、セルロースフタレート（例えば、セルロースアセテートフタレート及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、ポリメタクリレート（例えば、Eudragit（登録商標）タイプのもの）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ビニルアルコール／ビニルアセテートコポリマー、キサンタンガム、ガラクトマンナン、カラゲナン、キトサン、キチン、アルギン酸及びその塩、ポリラクチド、デキストリン、デンプン及びデンプン誘導体、タンパク質及びこれらの組み合わせなどのような、医薬的に許容され得る重合体を含むものである。
【０１３８】
水を添加することによる水性懸濁液の調製に適する分散性粉末及び顆粒により、活性成分が、分散剤又は湿潤剤と、懸濁剤と、１若しくは２種類以上の保存剤との混合物として提供される。適切な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤は、上記ですでに述べられているもので例示される。例えば、甘味料、香味料、及び着色剤などのさらなる賦形剤も存在していてよい。
【０１３９】
微粒子化は、当業者に公知の標準的な粉砕方法によって達成することができ、エアーチャットミリング（air chat milling）が好ましい。微粒子形態は、０．５〜１０μｍの平均粒子径を有することができ、好ましくは１〜６μｍであり、より好ましくは１〜３μｍである。記載の粒子径は、当業者に公知のレーザー回折によって測定した粒子径分布の平均値である（測定機器：ＨＥＬＯＳ、Sympatec）。
【０１４０】
組み合わせ薬の成分は、例えば、ポリエチレングリコール、例えばアラキス油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはピーナッツ油などの植物油、又は液状パラフィンなどの鉱油の中に活性成分を懸濁させて製剤することができる油状懸濁液などの、非水液体製剤の形であってもよい。油状懸濁液は、例えば、密ロウ、硬質パラフィン、又はセチルアルコールなどの粘稠化剤を含むことができる。上述のような甘味料、及び香味料を添加して飲みやすい経口製剤を提供することができる。このような組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。
【０１４１】
本願発明の組み合わせ薬の成分は、水中油型エマルジョンの形であってもよい。油相は、例えば、オリーブ油若しくはアラキス油などの植物油、又は、例えば、液体パラフィンなどの鉱油、又はこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、例えば、アラビアゴム若しくはトラガカントガムなどの天然ガム、例えば、大豆レシチンなどの天然ホスファチド、例えばソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸と無水ヘキシトールとから誘導されるエステル若しくは部分エステル、並びに、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物であってよい。エマルジョンは、甘味料及び香味料をさらに含んでいてもよい。
【０１４２】
シロップ及びエリキシル剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、又はショ糖などの甘味料を用いて製剤することができる。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤、並びに香味料及び着色剤をさらに含んでもよい。
【０１４３】
本願発明の組み合わせ薬の活性成分は、当業者に公知の方法を用いて、経皮投与することもできる（例えば、Chien; "Transdermal Controlled Systemic Medications"; Marcel Dekker, Inc.; 1987、１９９４年３月３日公開のLippらによるＷＯ９４／０４１５７を参照のこと）。例えば、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素の、任意に浸透促進剤を含有してもよい適切な揮発性溶媒中の溶液又は懸濁液は、マトリックス剤及び殺菌剤など、当業者に公知のさらなる添加剤と組み合わせることができる。殺菌の後、得られた混合物は、公知の手順に従って剤形へ製剤することができる。さらに、懸濁剤及び水で処理することにより、アリール尿素化合物の溶液又は懸濁液は、ローション又は軟膏へ製剤することができる。
【０１４４】
経皮送達システムを行うための適切な溶媒は、当業者に公知であり、ジメチルスルホキシド、エタノール若しくはイソプロピルアルコールなどの低級アルコール、アセトンなどの低級ケトン、酢酸エチルなどの低級カルボン酸エステル、テトラヒドロフランなどの極性エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、若しくはベンゼンなどの低級炭化水素、又はジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロトリフルオロエタン、若しくはトリクロロフルオロエタンなどのハロゲン化炭化水素が含まれる。適切な溶媒としては、低級アルコール、低級ケトン、低級カルボン酸エステル、極性エーテル、低級炭化水素、ハロゲン化炭化水素から選択される１若しくは２種類以上の物質の混合物も含むことができる。
【０１４５】
経皮送達システムに適切な浸透促進剤は、当業者に公知であり、例えば、エタノール、プロピレングリコール、又はベンジルアルコールなどのモノヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルコール、ラウリルアルコール又はセチルアルコールなどの飽和若しくは不飽和Ｃ８−Ｃ１８脂肪アルコール、ステアリン酸などの飽和若しくは不飽和Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸、酢酸、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、又はパルミチン酸のメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、又はモノグリセリンエステルなどの炭素数が最大２４個までの飽和若しくは不飽和脂肪エステル、又は、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソブチル、セバシン酸ジイソプロピル、マレイン酸ジイソプロピル、又はフマル酸ジイソプロピルなどの炭素数の総数が最大２４個までの飽和若しくは不飽和脂肪ジカルボン酸のジエステルなどが含まれる。さらなる浸透促進剤としては、レシチン若しくはセファリンなどのホスファチジル誘導体、テルペン、アミド、ケトン、尿素及びその誘導体、並びにジメチルイソソルビド及びジエチレングリコールモノエチルエーテルなどのエーテルが含まれる。適切な浸透促進製剤は、さらに、モノヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルコール、飽和若しくは不飽和Ｃ８−Ｃ１８脂肪アルコール、飽和若しくは不飽和Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸、炭素数が最大２４個までの飽和若しくは不飽和脂肪エステル、炭素数の総数が最大２４個までの飽和若しくは不飽和脂肪ジカルボン酸のジエステル、ホスファチジル誘導体、テルペン、アミド、ケトン、尿素及びその誘導体、並びにエーテルから選択される１若しくは２種類以上の物質の混合物も含むことができる。
【０１４６】
経皮送達システムに適切な結合剤は、当業者に公知であり、ポリアクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ブロック重合体、スチレンブタジエン共重合体、並びに天然及び合成ゴムが含まれる。セルロースエーテル、誘導体化ポリエチレン、及びシリケートも、マトリックス成分として使用することができる。粘稠性樹脂又は油類などのさらなる添加剤を加えてマトリックスの粘度を上昇させることができる。
【０１４７】
本願発明の組み合わせ薬の範囲内である化合物の具体的な製剤は、当該技術分野で公知のその他のものから適合させることができる。例えば、Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as raf Kinase Inhibitors" PCT Int. Appl., WO 00 42012, Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as p38 Kinase Inhibitors" PCT Int. Appl., WO 00 41698であり、これらは参照することで本明細書に援用される。
本願発明にかかる医薬組成物は、以下のように例示することができる。
【０１４８】
殺菌ＩＶ溶液：本願発明の組み合わせ薬の所望の化合物の溶液５ｍｇ／ｍｌを、殺菌注射用水で調製し、必要に応じてｐＨを調節する。この溶液を、投与用に、５％の殺菌デキストロースで１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＩＶ注入液として６０分かけて投与する。
【０１４９】
ＩＶ投与のための凍結乾燥粉末：殺菌製剤は、（ｉ）本願発明の組み合わせ薬の所望の化合物を凍結乾燥粉末として１００〜１０００ｍｇ、（II）クエン酸ナトリウムを３２〜３２７ｍｇ／ｍｇ、及び（III）デキストラン４０を３００〜３０００ｍｇ使用して調製することができる。この製剤は、注射用殺菌食塩水又は５％の殺菌デキストロースにより１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度へ再構築し、これをさらに、食塩水又は５％デキストロースにより０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌへ希釈し、ＩＶボーラス又はＩＶ注入により、１５〜６０分かけて投与する。
【０１５０】
筋肉内投与用懸濁液：筋肉注射用には、以下の溶液又は懸濁液を準備することがある：
本願発明の組み合わせ薬の所望の水溶性化合物を５０ｍｇ／ｍｌ
カルボキシメチルセルロースナトリウムを５ｍｇ／ｍｌ
ＴＷＥＥＮ８０を４ｍｇ／ｍｌ
塩化ナトリウムを９ｍｇ／ｍｌ
ベンジルアルコールを９ｍｇ／ｍｌ
【０１５１】
ハードシェルカプセル剤：標準的なツーピース硬質ゼラチンカプセルの各々に、粉末活性成分１００ｍｇ、ラクトース１５０ｍｇ、セルロース５０ｍｇ、及びステアリン酸マグネシウム６ｍｇを充填することにより、大量の単位カプセル剤が調製される。
【０１５２】
軟質ゼラチンカプセル剤：大豆油、綿実油、又はオリーブ油などの消化可能な油類中の活性成分の混合物を調製し、容積式ポンプを用いた手段によって溶融ゼラチン中へ注入して、１００ｍｇの活性成分を含有する軟質ゼラチンカプセル剤を形成する。このカプセル剤を洗浄し、乾燥させる。活性成分は、ポリエチレングリコール、グリセリン、及びソルビトールの混合物へ溶解させて、水混和性の薬剤混合物を調製してもよい。
【０１５３】
錠剤：単位投与量が活性成分１００ｍｇ、コロイダル二酸化ケイ素０．２ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇ、微結晶セルロース２７５ｍｇ、デンプン１１ｍｇ、及びラクトース９８．８ｍｇとなるように、従来の手順により、大量の錠剤が作製される。適切な水性及び非水性コーティングを施すことにより、飲みやすさを向上させたり、高級感及び安定性を改善したり、又は吸収を遅らせたりすることができる。
【０１５４】
速放性錠剤／カプセル剤：これは、従来の、及び新規なプロセスによって調製される固体経口剤形である。これらの単位剤形は、水なしで経口摂取され、直ちに溶解して薬物を送達する。活性成分は、糖分、ゼラチン、ペクチン、及び甘味料などの成分を含有する液体中で混合される。このような液体を凍結乾燥及び固体抽出法によって固化し、固形錠剤又はカプセル剤とする。この薬物化合物は、粘弾性及び熱弾性である糖分、並びに重合体、又は発泡成分と共に圧縮し、水を必要としない速放性を意図した多孔性マトリックスを形成することができる。
【０１５５】
本願発明は、さらに、哺乳類のガンを治療するためのキットも包含する。そのようなキットを用いて、ｒａｆキナーゼに刺激されたガン、並びにｒａｆキナーゼによって刺激されないガンを有する患者を治療することができる。このキットは、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物（例えば、レゴラフェニブ）、及び抗葉酸剤（例えば、ペメトレキセド）、及び任意に白金錯体（例えば、シスプラチン）を含有する単一の医薬製剤を含むことができる。別の選択肢として、このキットは、別々の製剤として、式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤、及び白金錯体を含むことができる。このキットは、さらに、治療を必要とするガン患者への化合物の投与方法を示した説明書も含むことができる。このキットを用いて、ＮＳＣＬＣ、結腸ガン、前立腺ガン、白血病、メラノーマ、肝細胞ガン、腎臓ガン、頭部及び頸部のガン、神経膠腫、肺ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、及び乳ガンを含むがこれらに限定されない種々のガンを治療することができる。
【０１５６】
当業者であれば、特定の投与方法が様々な要因に依存し、それらは全て治療薬の投与の際に通常の手順として考慮されるということは、正しく認識されるであろう。しかしながら、ある患者に対する具体的な投与レベルが、使用する具体的な化合物の活性、患者の年齢、患者の体重、患者の一般的健康状態、患者の性別、患者の食事習慣、投与時間、投与経路、排出速度、組み合わせ薬、及び治療を行う状態の重症度を含む種々の要因に依存することも理解されるであろう。さらに、当業者であれば、最適な治療方針、すなわち、治療方法、及び定められた日数の間投与される組み合わせの範囲内の１若しくは２種類以上の薬物（又は、その薬理学的に許容される塩）の一日あたりの投与回数は、従来の治療試験を用いることで、当業者によって確認可能であることは、正しく認識されるであろう。
【０１５７】
標準的な毒性試験、上記で識別された哺乳類の状態の治療方法を決定するための標準的な薬理学的アッセイ、及びこれらの状態の治療に用いられる公知の薬物による結果とこれらの結果との比較によって、過剰増殖性疾患の治療に有用である化合物を評価することで知られる標準的な実験方法に基づき、各所望の適応症の治療に対する本願発明の化合物の効果投与量を容易に決定することができる。これらの状態の一つを治療する際に投与される活性成分の量は、使用される特定の化合物及び投与単位、投与方法、治療期間、治療を受ける患者の年齢及び性別、並びに治療する状態の性質及び程度、などの考慮事項に応じて、大きく変わり得る。
【０１５８】
一般的に、本願発明の組み合わせ薬の使用によって、（１）単一の化学療法薬の投与と比較して、より優れた腫瘍の増殖を低減する効力、又は腫瘍の根絶さえも得られ、（２）投与される化学療法薬の量が低減し、（３）単一の化学療法薬のより多い投与量、及び特定のその他の併用治療に起因する薬理学的な合併症による有害な影響が低減される結果として、患者の耐容性が高い化学療法治療が提供され、（４）哺乳類、特にヒトにおける広範囲にわたる様々な種類のガンの治療が提供され、（５）治療を行った患者の中で、高い応答率が得られ、（６）通常の化学療法治療と比較して、長い生存期間が得られ、（７）腫瘍の進行時間が引き伸ばされ、及び／又は（８）その他のガン治療薬の組み合わせが拮抗効果を生み出す公知のケースと比較して、薬剤を単独で用いた結果と少なくとも同程度に優れた効力と耐容性が得られる。
【０１５９】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、又はその多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩若しくはジアステレオ異性体は、総体重当たり約０．００１〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲、通常、総体重当たり約１６０ｍｇ／ｋｇとすることができる用量で患者に投与することができる。単位用量は、約０．５ｍｇ〜約２０００ｍｇの活性成分を含有することができ、一日あたり１若しくは２回以上投与することができる。医薬組成物中の式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（又はその多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩若しくはジアステレオ異性体）の量としては、２０〜２０００ｍｇが好ましく、４０〜８００ｍｇが好ましく、５０〜６００ｍｇがさらに好ましい。特に好ましいのは、医薬組成物中の４−｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドのｐ−トルエンスルホン酸塩の量が２７〜２７４０ｍｇであり、５４〜１０９６ｍｇが好ましく、６８〜８２２ｍｇがさらに好ましい。
【０１６０】
経口投与の毎日の用量は、総体重当たり０．１〜３００ｍｇ／ｋｇが好ましく、通常は、体重に対して一日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。静脈内、筋肉内、皮下、及び非経口の注射、並びに注入法を含む注射投与の場合の一日の用量としては、総体重当たり０．１〜３００ｍｇ／ｋｇが好ましい。一日の膣内投与計画としては、総体重当たり０．１〜３００ｍｇ／ｋｇが好ましい。一日の局所投与レジメンンとしては、一日１〜４回の投与で、０．１〜３００ｍｇが好ましい。経皮投与の濃度としては、一日の用量を１〜３００ｍｇ／ｋｇに維持するのに必要な濃度が好ましい。上述のすべての投与経路について、好ましい用量は０．１〜３００ｍｇ／ｋｇである。一日の吸入投与レジメンとしては、総体重当たり０．１〜３００ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【０１６１】
ペメトレキセドなどの抗葉酸剤、及びシスプラチンなどの白金錯体は、各々、非経口投与されることが好ましく、静脈内注入がより好ましく、ガンの単剤療法で従来から通常用いられる量、又は活性薬剤との組み合わせに基づいて減少させた量で投与される。
【０１６２】
体表面積及び投薬の頻度に基づき、ペメトレキセドなどの抗葉酸剤の注入用量は、単回投与に関しては約１０〜５００ｍｇ／ｍ２の範囲とすることができ、好ましくは約５００ｍｇ／ｍ２である。抗葉酸剤の注入に先立って、当業者に公知の適切な前投薬を行うべきである。白金錯体の用量は、好ましくは静脈内注入により、少なくとも約３時間、好ましくは約３又は２４時間かけて投与され、そして５日間に及ぶ分離間隔で投与されてもよい。
【０１６３】
３〜４週に亘る単回投与は、５０〜１００ｍｇ／ｍ２（患者表面積）の範囲とすることができる。３〜４週毎に５日に亘る１５〜２０ｍｇ／ｍ２の日用量が、単回投与に対する代替手段である。
【０１６４】
式Ｉのフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤、及び白金錯体の各々について、その化合物の用量は、定期的な測定によって、本願発明により得られる優れた又は予期しない結果に応じて変更することができる。標準的な毒性試験、上記で識別された哺乳類の状態の治療方法を決定するための標準的な薬理学的アッセイ、及びこれらの状態の治療に用いられる公知の薬物による結果とこれらの結果との比較によって、過剰増殖性疾患の治療に有用である化合物を評価することで知られる標準的な実験方法に基づき、当業者であれば本願発明の医薬組成物の効果用量を容易に決定することができる。活性成分の用量は、使用される特定の化合物及び投与単位、投与の方法及び時間、治療期間、治療を受ける患者の年齢、性別、及び一般的健康状態、治療する状態の性質及び程度、薬物の代謝及び排出の速度、考えられる組み合わせ薬、並びに薬物同士の相互作用などの考慮事項に応じて、大きく変わり得る。
【０１６５】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体は、経口、局所、非経口、直腸、吸入、及び注射投与することができる。注射投与としては、静脈内、筋肉内、皮下、及び非経口投与、並びに注入法による投与が挙げられる。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体は、１若しくは２種類以上の無毒性の薬理学的に許容される担体、及び所望する場合はその他の活性成分と共に存在することができる。アリール尿素化合物の好ましい投与経路は、経口投与である。
【０１６６】
抗葉酸剤及び白金錯体は、これらの化合物に対する従来のいずれの投与経路によっても、患者へ投与することができる。これには、経口、局所、非経口、直腸、及び吸入投与、並びに注射投与を挙げることができる。注射投与としては、静脈内、筋肉内、皮下、及び非経口投与、並びに注入法による投与が挙げられる。本願発明で用いられる抗葉酸剤及び白金錯体に対する好ましい投与経路としては、通常、注射投与であり、これはこの薬剤単独に対して用いられる投与経路と同じである。いずれの抗葉酸剤及び白金錯体も、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）と組み合わせて、既述のいずれの投与経路によっても投与することができる。
【０１６７】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、並びに抗葉酸剤及び白金錯体の両方を、本明細書で議論するいずれの投与経路によって投与する場合でも、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）は、抗葉酸剤及び白金錯体と同時に投与することができる。これは、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）と、抗葉酸剤及び白金錯体との両方を含有する単一の製剤を投与することによって、又は、独立した製剤中の式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物、抗葉酸剤、及び白金錯体を同時に患者へ投与することによって実施することができる。
【０１６８】
別の選択肢として、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）は、抗葉酸剤及び任意に白金錯体と共にタンデム方式で投与することができる。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）は、抗葉酸剤と（任意に）白金錯体のいずれか、又は両方に先立って投与することができる。例えば、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）は、一日に１若しくは２回以上、最大連続して２８日間まで投与し、これに続いて抗葉酸剤及び任意の白金錯体を投与することができる。さらに、抗葉酸剤、白金錯体のいずれか、又は両方をまず投与し、これに続いて式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物を投与することもできる。抗葉酸剤及び任意の白金錯体に対する式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）の投与順序の選択は、薬剤に応じて変わり得る。さらに、抗葉酸剤及び任意の白金錯体は、これらの薬剤に対して従来から用いられるいかなるレジメンを用いても、投与することができる。
【０１６９】
別の投与レジメンでは、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素化合物（その多形体、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、医薬的に許容され得る塩、又はジアステレオ異性体）並びに抗葉酸剤及び任意の白金錯体は、投与日に、一日あたり１〜２回以上投与することができる。
【０１７０】
使用方法
本発明は、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｐ３８、及び／又はｆｌｔ−３キナーゼが含まれる一以上のシグナル伝達経路を変調することができる組み合わせ薬を提供する。
【０１７１】
ｒａｆは、細胞生育、細胞生存及び侵入を含む、多数のキー細胞プロセスの調節に関与する重要なシグナル分子である。それはＲａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の一員である。この経路は大多数の腫瘍細胞内に存在する。ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及びｆｌｔ−３は膜横断レセプター分子であり、それは適切なリガンドによって刺激される時、Ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ細胞シグナル経路を引き起こし、細胞的事象のカスケードへ導く。これらレセプター分子の各々はチロシンキナーゼ活性を持っている。
【０１７２】
ＶＥＧＦＲレセプターは脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）によって刺激され、そして内皮細胞発達及び機能の調節において重要なコントロールポイントである。ＶＥＧＦ−βレセプターは、間葉細胞を含む多数の細胞タイプにおける細胞増殖及び生存を規制する。ｆｌｔ−３はＦＬリガンドのためのレセプターである。これはｃ−ｋｉｔに構造的に似ており、そして多能性造血細胞の成長を変調し、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞及び樹状細胞の発達に影響する。
【０１７３】
野生型及び変異型を含む、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、ｐ３８、ＰＤＧＦ、及び／又はｆｌｔ−３の任意の遺伝子又はイソフォームが本発明に従って変調されることができる。ｒａｆ又はｒａｆ−１キナーゼは少なくとも３種のファミリーメンバー、すなわちａ−ｒａｆ、ｂ−ｒａｆ及びｃ−ｒａｆ又はｒａｆ−１よりなるセリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。例えば、Dillon and Kolch, Arch. Biochem. Biophys. 2002, 404, 3-9を参照のこと。ｃ−ｒａｆ及びｂ−ｒａｆが本発明の化合物のための好ましい標的である。活性化するｂ−ｒａｆ突然変異（例えばＶ５９９Ｅ変異株）は、メラノーマを含む各種のガンにおいて同定されており、ここに記載する化合物はそれらの活性を阻害するために使用することができる。
【０１７４】
用語「変調」とは、経路（又はその成分）の機能的活性が該化合物の不存在下での正常な活性に比較して変化することを意味する。この効果は、増強、アゴナイジング、増大、促進、容易化、刺激、減少、ブロッキング、阻害、消失、拮抗化などを含む。変調のどのような品質又は程度をも含む。
【０１７５】
本発明の組み合わせ薬はまた、これらに限定されないが、以下のプロセスの一以上を変調することができる。細胞成長（例えば分化、細胞生存、及び／又は増殖）、腫瘍細胞成長（例えば分化、細胞生存、及び／又は増殖）、腫瘍退行、内皮細胞成長（例えば分化、細胞生存、及び／又は増殖）、血管形成（血管成長）、リンパ管形成（リンパ管成長）、及び／又は造血（例えばＴ−及びＢ−細胞発達、樹状細胞発達など）。
【０１７６】
特定の作用の理論又はメカニズムに拘束されることを欲するものではないが、本発明の化合物はキナーゼ活性を変調する能力を有していることが発見された。しかしながら本発明の方法は特定のメカニズム又は如何に本発明の化合物がそれぞれの効果を達成するかに制限されない。用語「キナーゼ活性」とは、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）からのγ−リン酸エステルがアミノ酸残基（例えばセリン、スレオニン又はチロシン）に変換される触媒活性を意味する。ある化合物は、例えばキナーゼのＡＴＰ結合ポケットに対してＡＴＰと直接競合することにより、活性に影響する酵素のコンフォメーション変化を生じさせることにより（例えば生物学的に活性な三次元構造の破壊により）などによってキナーゼ活性を阻害することができる。
【０１７７】
キナーゼ活性は、従来のアッセイの方法を用いた通常の手順により測定することができる。キナーゼアッセイは、通常、キナーゼ酵素、基質、バッファー、及び検出システムの成分を含む。典型的なキナーゼアッセイは、タンパク質キナーゼと、ペプチド基質及び３２Ｐ−ＡＴＰなどのＡＴＰとの反応によるリン酸化最終産物（例えば、ペプチド基質を用いた場合は、リン酸化タンパク質）の生成を含む。得られた最終産物は、適切ないずれかの方法によって検出することができる。放射性ＡＴＰを使用した場合は、親和性膜又はゲル電気泳動を用いて、放射標識されたリン酸化タンパク質を未反応のガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰから分離し、その後、オートジオグラフィーを用いてゲル上に可視化するか、又はシンチレーションカウンターで検出することができる。非放射性の方法も使用することができる。例えば抗ホスホチロシン抗体など、リン酸化基質を認識する抗体を使用することができる方法がある。例えば、キナーゼ酵素を、基質と共に、ＡＴＰ及びキナーゼバッファーの存在下、酵素が基質をリン酸化するのに効果的な条件下でインキュベートすることができる。この反応混合物を、例えば電気泳動などによって分離し、その後、基質のリン酸化を、例えば抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロッティング法などによって測定することができる。抗体は、例えば、ＨＲＰなどの酵素、アビジン若しくはビオチン、化学発光試薬など、検出可能な標識によって標識することができる。その他の方法では、ＥＬＩＳＡ方式、親和性膜分離、蛍光偏光アッセイ、発光アッセイなどを用いることができる。
【０１７８】
放射性方式に代わる方法としては、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）がある。この方法は、標準的なキナーゼ反応に従うが、ここで、例えば、ビオチン化ポリ（ＧｌｕＴｙｒ）などの基質が、ＡＴＰの存在下でタンパク質キナーゼによりリン酸化される。そして、最終産物は、ユーロピウムキレートリン酸化型特異的抗体（抗ホスホチロシン、又は抗ホスホセリン／スレオニン）、及びビオチン化基質と結合するストレプトアビジン−ＡＰＣによって検出することができる。この２つの成分は、結合によって空間的に接近し、リン酸化型特異的抗体から受容体（ＳＡ−ＡＰＣ）へのエネルギー転移によって、読み取ることができる均一な形での蛍光を発生させる。
【０１７９】
本発明の組み合わせ薬は、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、ｐ３８、ＰＤＧＦＲ、及び／又はｆｌｔ−３が含まれる細胞シグナル伝達経路の一以上によって仲介されるどれかの病気又は状態を処置／又は防止するために使用することができる。用語「処置」は慣用的に、例えば病気又は障害状態の撲滅、緩和、軽減、寛解、改善を目的として対象の管理又はケアを意味する。組み合わせ薬はまた、シグナル分子によって仲介される病気及び／又は状態を防止及び／又は処置するために使用されるとしても記載することができる。用語「仲介」は、例えばシグナル分子が病気及び／又は状態において異常又は乱れている経路の一部であることを指示する。
【０１８０】
処置し得る疾病及び状態には、上記及び下記に記載したもの、並びに以下のもののすべてを含む：
【０１８１】
ｒａｆ関連病は、例えば細胞増殖障害、ガン、腫瘍などを含む。
【０１８２】
ＶＥＧＦＲ−２関連病は、例えばガン、腫瘍成長、炎症病、関節リウマチ、網膜症、乾癬、糸球体腎炎、喘息、慢性気管支炎、アテローム性動脈硬化症、移植拒絶、血管形成が関与する状態などを含む。
【０１８３】
ＶＥＧＦＲ−３関連病は、例えばガン、角膜病、炎症角膜（例えば、Hamrah, Am. J. Path. 2003, 163, 57-68）、角膜移植（Cursiefen et al., Cornea 2003, 22, 273-81）、リンパ管過形成、リンパ管形成が関与する状態などを含む。
【０１８４】
ＰＤＧＦＲ−β関連病は、例えば細胞増殖、細胞マトリッス生産、細胞運動、及び／又は細胞外マトリッス生産によって特徴付けられる病気又は状態である。特定の例は、例えば腫瘍、悪性腫瘍、ガン、転移、慢性骨髄白血病、炎症、腎臓病、糖尿性ネフロパシー、糸状体増殖性糸状体腎炎、線維症状態、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、高血圧関連動脈硬化、静脈パイパス移植動脈硬化、硬皮症、間隙性呼吸器病、滑液障害、関節炎、白血病、リンパ腫などを含む。
【０１８５】
ｆｌｔ−３関連病は、例えば免疫関連障害、血球障害、造血細胞発達が関与する状態（例えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、樹状細胞）、ガン、貧血、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ症候群などを含む。
【０１８６】
ｐ３８関連病は、例えば免疫関連障害、血球障害、及び異常なサイトカイン生産、特にＴＮＦ−α又は異常なＭＭＰ活性にリンクした他の障害を含む。これら障害は、これらに限定されないが、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、骨粗しょう症、クローン病及び乾癬を含む。
【０１８７】
加えて本発明の組み合わせ薬は、米国特許第６，３１６，４７９号に開示されている状態又は障害、例えば糸状体硬化症、間隙性腎炎、間隙性呼吸器病、アテローム性動脈硬化症、創傷瘢痕及び硬皮症を処置するために使用することができる。
【０１８８】
以下の公開公報はＶＥＧＦＲ−３変調に関し、そしてＶＥＧＦＲ−３によって仲介される病状及びそのような活性を測定するためアッセイについての記載が本明細書に援用される。
【０１８９】
【表８】
2013531067.tif 000013
【０１９０】
以下の公開公報はＶＥＧＦＲ−２変調に関し、そしてＶＥＧＦＲ−２によって仲介される病状及びそのような活性を測定するためアッセイについての記載が本明細書に援用される。
【０１９１】
【表９】
2013531067.tif 000014
【０１９２】
以下の公開公報はｆｌｔ−３変調に関し、そしてｆｌｔ−３によって仲介される病状及びそのような活性を測定するためアッセイについての記載が本明細書に援用される。
【０１９３】
【表１０】
2013531067.tif 000015
【０１９４】
以下の特許及び公開公報はＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲ変調に関し、そしてＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲによって仲介される病状及びそのような活性を測定するためアッセイについての記載が本明細書に援用される。
【０１９５】
【表１１】
2013531067.tif 000016
【０１９６】
【表１２】
2013531067.tif 000017
【０１９７】
【表１３】
2013531067.tif 000018
【０１９８】
【表１４】
2013531067.tif 000019
【０１９９】
本発明の組み合わせ薬は、炎症状態、冠再狭窄、腫瘍関連血管形成、アテローム性硬化症、自家免疫病、炎症、糸状体又は糸状体細胞の増殖に関連した腎臓病、網膜脈管増殖に関連した眼病、乾癬、肝硬変、糖尿病、アテローム性硬化症、再狭窄、血管移植再狭窄、ステント内再狭窄、血管形成、眼病、呼吸器線維症、閉塞性気管支炎、糸状体腎炎、関節リウマチのような広い範囲の病気の進行を処置又は予防する広い治療活性を有する。
【０２００】
本発明は、ヒト及び／又は他の哺乳類における以下の状態の一つ以上を処置、予防、変調などを提供する：糖尿病性網膜症を含む網膜症、虚血性網膜静脈閉塞、未熟児網膜症および加齢性黄斑変性；関節リウマチ、乾癬、または水疱性類天疱瘡、多形性紅もしくはヘルペス状皮膚炎を含む、表皮下水疱形成を伴う水疱性疾患、リウマチ熱、骨吸収、閉経後骨粗鬆症、敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、毒素性ショック症候群、全身性炎症反応症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、ヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応、喘息、成人呼吸促迫症候群、急性肺線維性疾患、肺サルコイドーシス、アレルギー性呼吸器疾患、ケイ肺症、炭坑夫塵肺、肺胞傷害、肝不全、急性炎症における肝臓疾患、重篤なアルコール性肝炎、マラリア（熱帯熱マラリアおよび脳性マラリア）、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、うっ血性心不全、心臓病後の損傷、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、急性脳炎、脳傷害、多発性硬化症（多発性硬化症における脱髄（demyelation）および乏突起膠細胞の損失）、進行ガン、リンパ性腫瘍、膵炎、感染、炎症およびガンにおける創傷治癒の悪化、骨髄異形成症候群、全身性エリテマトーデス、胆汁性肝硬変、腸壊死、放射線損傷／モノクローナル抗体投与後の毒性、宿主対移植片反応（虚血性再灌流傷害、並びに、腎臓、肝臓、心臓および皮膚の同種移植片拒絶）、肺同種移植片拒絶（閉塞性気管支炎）または人工股関節全置換に起因する合併症、および、結核、消化性潰瘍疾患におけるヘリコバクターピロリ感染、クルーズ・トリパノソーマ感染に起因するシャーガス病、大腸菌感染に起因する志賀様毒素の効果、ブドウ球菌感染に起因するエンテロトキシンＡの効果、髄膜炎菌感染、並びに、ライム病菌、梅毒トレポネーマ、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの感染、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、メラノーマ、肺ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮ガン、星状細胞腫、頭部のガン、頸部のガン、膀胱ガン、乳ガン、結腸直腸ガン、甲状腺ガン、膵ガン、胃ガン、肝細胞ガン、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、血管新生、再狭窄、ステント内再狭窄、血管移植後再狭窄、肺線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、血栓性微小血管障害症候群、移植片拒絶、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症、および、神経変性疾患、過免疫障害、血管腫、心筋血管新生、冠血管および脳の側副血管新生、虚血、角膜疾患、虹彩炎、血管新生緑内障、早産児の黄斑変性網膜症、創傷治癒、潰瘍性ヘリコバクター関連疾患、骨折、子宮内膜症、糖尿病性症状、猫ひっかき熱、甲状腺過形成、火傷後の喘息または浮腫、外傷、慢性肺疾患、卒中、ポリープ、嚢胞、滑膜炎、慢性およびアレルギー性炎症、卵巣過刺激症候群、肺および脳浮腫、ケロイド、線維症、硬変、手根管症候群、成人呼吸促迫症候群、腹水症、眼の症状、心血管症状、クロウ・フカセ（ＰＯＥＭＳ）病、クローン病、糸球体腎炎、骨関節炎、多発性硬化症、移植片拒絶、ライム病、敗血症、フォン���ッペル・リンダウ病、類天疱瘡、パジェット病、多発性嚢胞腎、サルコイドーシス、甲状腺炎、過粘稠度症候群、オスラー・ウェーバー・ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、照射、低酸素症、子癇前症、機能性子宮出血、子宮内膜症、単純ヘルペスによる感染、虚血性網膜症、角膜の血管新生、帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス、パラポックスウイルス、原生動物、トキソプラズマ症、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、ベヒテレフ病、例えば血清型Ｈ５Ｎ１を含む鳥インフルエンザ、並びに腫瘍関連滲出および浮腫。
【０２０１】
組み合わせ薬は、前述の活性の２以上を持つことができ、それ故複数のシグナル伝達経路を標的とすることができる。このためこれら化合物は異なる化合物の組合わせを使用する時のみ通常得られる治療及び予防効果を達成することができる。例えば、単一の化合物を使用する新しい脈管形成（例えばＶＥＧＦＲ−２及び３の機能に関連した）（例えば血管及び／又はリンパ管）及び細胞増殖（例えばｒａｆ及びＰＤＧＦＲ−β機能に関連した）の両方を阻害する能力は、ガン及び新しい脈管形成で容易になる他の細胞増殖障害の処置において特に有益である。脈管成長及び細胞増殖から利益を受けるの障害又は状態も本発明に従って処置することができる。
【０２０２】
先に示したとおり、本発明はｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及び／又はｆｌｔ−３に関連した病気及び状態を処置及び／又は予防するための、及び／又は一以上の経路、ポリペプチド、遺伝子、病気、状態などを変調するための方法に関する。これらの方法は一般に本発明の組み合わせ薬の化合物の有効量を投与することを含み、ここで有効量とは所望の結果を達成するのに有用な該化合物の量である。組み合わせ薬の化合物は、後で詳しく論ずるように、どのような有効なルートによってもどのような形においても投与することができる。
【０２０３】
該方法は、細胞増殖の阻害を含む、腫瘍細胞増殖の変調を含む。細胞増殖の変調は腫瘍細胞の成長及び／又は分化が減少、消失、遅延化されることなどを意味する。用語「増殖」は、細胞成長及び分裂に関するいかなるプロセスを含み、そして分化及びアポプトシスを含む。上で論じたように、ｒａｆキナーゼは細胞増殖、分化及びアポトシスに含まれる細胞形質シグナルカスケードの活性化においてキーとなる役目を果す。例えば、研究はアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃ−ｒａｆ−１の阻害は細胞増殖をブロックできることを発見した（上を参照）。阻害のどのような量も治療的であると考えられる。
【０２０４】
本発明の方法には、哺乳類の過剰増殖性疾患を処置するために上記組み合わせ薬を使用する方法が含まれる。この方法はヒトを含むそれを必要する哺乳類へ、該障害を処置するのに有効量の本発明の組み合わせ薬を投与することよりなる。過剰増殖性疾患は、これらに限定されないが、乳房、呼吸器、脳、生殖器、消化器、泌尿器、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺、及びそれらの遠隔転移のガンのような固形腫瘍を含む。これらの障害はリンパ腫、内腫及び白血病をも含む。
【０２０５】
これらに限定されないが、ｒａｆ及び／又はｆｌｔ−３、及び／又はｒａｓ、それにそれらが一部であるシグナル経路のどれかの上流又は下流メンバーの一以上の突然変異を有するガンを含む、いかなる腫瘍又はガンも処置することができる。以前に論じたように、ガンはその原因となるメカニズムに関係なく本発明の化合物で処置することができる。これらに限定されないが、例えば結腸、膵臓、乳房、前立腺、骨、肝臓、腎臓、肺、睾丸、皮膚、胃のガン、結腸直腸ガン、腎細胞ガン、肝細胞ガン、メラノーマなどを含むどの器官のガンも処置することができる。
【０２０６】
ガンなどの過剰増殖性疾患を処置する方法
本発明の組み合わせ薬はそこで化合物によって変調される細胞経路に関連する、又はそれに媒介されるあらゆる疾患又は状態を治療するのに利用されることができるが、特に興味深いことは、本発明に従ってガンを含む哺乳類の過剰増殖性疾患を処置するための組み合わせ薬の使用方法である。本願発明には、作用のメカニズム又はその達成される方法に関係なく、いかなる寛解効果、又は治療効果も含まれる。
【０２０７】
過剰増殖性疾患を処置する際に、組み合わせ薬は、以下に示すものを含む活性、抗増殖；抗腫瘍；抗血管新生；内皮細胞又は腫瘍細胞の増殖の阻害；抗悪性腫瘍；免疫抑制；免疫調節；アポトーシス促進など、の１若しくは２個以上を有することができる。
【０２０８】
本願発明に従って治療可能なガンとしては、これらに限定されないが、特に、脳腫瘍、乳ガン、骨肉腫（例えば、骨肉腫、及びユーイング肉腫）、気管支前ガン状態、子宮内膜ガン、神経膠芽腫、血液悪性疾患、肝細胞ガン、ホジキン病、消化管間葉性腫瘍（Ｇ．Ｉ．Ｓ．Ｔ．）、腎臓腫瘍、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ腫、レルミット・デュクロ病、悪性神経膠腫、メラノーマ、悪性メラノーマ、転移、多発性骨髄腫、骨髄化生、骨髄異形成症候群、非小細胞肺ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、腎細胞ガン（例えば、進行性ガン、治療抵抗性進行性ガン）、横紋筋肉腫、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮ガン、甲状腺ガン、ＰＴＥＮの機能の欠損；Ａｋｔの活性化に伴うガン（例えば、ＰＴＥＮ欠損腫瘍、及びｒａｓ変異を有する腫瘍）が挙げられる。
【０２０９】
乳ガンの例としては、これらに限定されないが、浸潤性乳管ガン、浸潤性小葉ガン、非浸潤性乳管ガン、及び非浸潤性小葉ガンが挙げられる。
【０２１０】
気道ガンの例としては、これらに限定されないが、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、気管支腺腫、及び胸膜肺芽腫が挙げられる。
【０２１１】
脳ガンの例としては、これらに限定されないが、脳幹及び視床下部の神経膠腫、小脳及び大脳の星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、並びに神経外胚葉及び松果体の腫瘍が挙げられる。
【０２１２】
雄性生殖器官の腫瘍としては、これらに限定されないが、前立腺ガン及び精巣ガンが挙げられる。雌性生殖器官の腫瘍としては、これらに限定されないが、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、及び外陰部のガン、並びに子宮肉腫が挙げられる。
【０２１３】
消化管の腫瘍としては、これらに限定されないが、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸、唾液腺のガン、及び消化管間葉性腫瘍（Ｇ．Ｉ．Ｓ．Ｔ．）が挙げられる。
【０２１４】
尿路の腫瘍としては、これらに限定されないが、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、及び尿道のガンが挙げられる。
【０２１５】
眼ガンとしては、これらに限定されないが、眼内メラノーマ及び網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０２１６】
肝臓ガンの例としては、これらに限定されないが、肝細胞ガン（線維層板の変異を伴うか、または伴わない肝細胞のガン）、胆管ガン（肝内胆管ガン）、及び混合型肝細胞胆管ガンが挙げられる。
【０２１７】
皮膚ガンとしては、これらに限定されないが、扁平上皮ガン、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚ガン、及び非メラノーマ皮膚ガンが挙げられる。
【０２１８】
甲状腺ガンとしては、これらに限定されないが、乳頭及び／又は混合乳頭、濾胞及び／又はヒュルトレ細胞、髄様及び未分化のものが挙げられる。
【０２１９】
頭部及び頸部のガンとしては、これらに限定されないが、喉頭、下咽頭、鼻咽頭、及び／又は口咽頭のガン、並びに口唇及び口腔のガンが挙げられる。
【０２２０】
リンパ腫としては、これらに限定されないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、及び中枢神経系のリンパ腫が挙げられる。
【０２２１】
肉腫としては、これらに限定されないが、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、及び横紋筋肉腫が挙げられる。
【０２２２】
白血病としては、これらに限定されないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及びヘアリーセル白血病が挙げられる。
【０２２３】
腫瘍細胞の増殖の阻害に加えて、本願発明の医薬組成物（組み合わせ薬）は、例えば、腫瘍の大きさの減少、又は体内のガンの程度の低下などの腫瘍退縮も引き起こすことができる。
【０２２４】
組み合わせ薬の成分は、異なる時間に、順番に投与することもできる。薬剤は、従来の方法で製剤し、例えば、１２時間、２４時間などの長い時間にわたって放出される所望の放出速度を達成することができる。これは、適切な代謝半減期を有する薬剤及び／若しくは誘導体を用いることにより、並びに／又は、徐放性製剤を用いることによって達成することができる。
【０２２５】
組み合わせ薬は、相乗作用的であってよもよく、例えば、その場合、薬物の作用が組み合わされることにより、組み合わせられた効果が、個々の効果の代数的な合計よりも大きくなる。従って、薬物の用量を少なくすることができ、例えば、毒性又はその他の有害若しくは望ましくない影響を低減したり、並びに／又は、薬剤を単独で投与した場合と同じ量を用いながらも、例えば、より強力な抗増殖作用及びアポトーシス促進作用を有するなど、より高い効力を達成したりすることが可能である。
【０２２６】
本願発明の組み合わせ薬は、さらにその他の適切ないかなる添加剤又は薬理学的に許容される担体とも組み合わせることができる。そのような添加剤には、既述の物質のいずれも、並びに、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000)；Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, 1986)；Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2nd edition, Marcel Dekker, 2002)、に記載のものなどの従来から用いられるいずれもが含まれる。これらは、本明細書では「薬理学的に許容される担体」と称する場合があり、これらが活性薬物と組み合わせられて、治療目的で対象に安全に投与することができることを示している。
【０２２７】
さらに、本願発明の医薬組成物（組み合わせ薬）は、上述の疾患及び／若しくは状態の治療に用いられるその他の活性薬剤、又は治療法（例えば、放射線）と合わせて投与することができる。
【０２２８】
本発明は、細胞を含むシステムにおいて血管形成及び／又はリンパ管形成を変調する方法に関し、該方法はここに記載した組み合わせ薬の有効量をシステムへ投与することを含む。細胞を含む系は、患者の腫瘍、単離した器官、細胞又は細胞のようなインビボシステム、インビトロアッセイシステム（ＣＡＭ、ＢＣＥなど）、動物モデル（例えばインビボ、皮下、ガンモデル）、処置を必要とする宿主（例えばガンのような血管形成及び／又はリンパ管形成成分を有する病気にかかっている宿主）などであることができる。本発明の好ましい化合物は血管形成及び／又はリンパ形成、例えば新しい血管の形成を阻害する。
【０２２９】
血管形成の不適切なそして異所性の発現は生物にとって有害であり得る。多数の病現学的状態は余分の血管形成に関連する。これらは、これらに限定されないが、糖尿性網膜症、新生脈管緑内障、乾癬、退行性線維増殖、血管線維腫、炎症などを含む。加えてガン及び新生組織に関連した増加した血液供給は成長を促進し、急速な腫瘍拡大及び転移へ導く。さらに腫瘍内の新しい血管及びリンパ管の成長は変節した細胞の逃げ道を提供し、転移及びその結果のガンのひろがりを促進する。
【０２３０】
血管形成及び／又はリンパ管形の測定及びその阻害のための有用なシステムは、例えば腫瘍外科植片の新生脈管化（例えば米国特許第５，１９２，７４４号；同第６，０２４，６８８号）、ニワトリ奨尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えばTaylor and Folkman, Nature 1982, 297, 307-312; Eliceiri et al., J. Cell Biol. 1998, 140, 1255-1263），ウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば米国特許第６，０２４，６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol. 1991, 198, 440-450），ミグレーションアッセイ，及びＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯脈管内皮）成長阻害アッセイ（例えば米国特許第６，０６０，４４９号）を含む。加えて、リンパ管形成変調のための有用なシステムは、例えばウサギ耳モデル（例えばSzuba et al., FASEB J. 2002, 6(14), 1985-7）を含む。
【０２３１】
血管形成の変調は任意の適当な方法によって決定することができる。例えば、組織脈管化の程度は典型的には与えられたサンプル中に存在する脈管の数及び密度を評価することによって決定される。例えば微小脈管密度（ＭＶＤ）は他出力顕微鏡フィールドにおいて皮内細胞クラスターの数を計数することにより、又は微小脈管皮内細胞に対して特異的なマーカーもしくはＣＤ３１（血小板皮内細胞接着分子もしくはＰＥＣＡＭとしても知られる）のような確立された脈管の成長の他のマーカーを検出することによって決定することができる。ＣＤ３１抗体は、例えば米国特許第６，０１７，９４９号；Delias et al., Gyn. Oncol. 1997, 67, 27-33などに記載されているような、免疫ステイン組織片に対する慣用の免疫細胞学的方法に使用することができる。血管形成に対する他のマーカーは、例えばＶｅｚｆｌ（例えばXiang et al., Dev. Bio. 1999, 206, 123-141），アンギオポイエチンＴｉｅ−１及びＴｉｅ−２（例えばSato et al., Nature 1995, 376, 70-74）を含む。
【０２３２】
アッセイ
本願発明の組み合わせ薬の活性は、効果的ないかなるインビトロ又はインビボの方法によっても測定することができる。
【０２３３】
Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性
ｃ−Ｒａｆキナーゼアッセイは、Ｌｃｋキナーゼによって活性化（リン酸化）されたｃ−Ｒａｆ酵素を用いて実施することができる。Ｌｃｋで活性化されたｃ−Ｒａｆ（Ｌｃｋ／ｃ−Ｒａｆ）は、ポリヘドリンプロモーターの支配下でＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ（アミノ酸３０２からアミノ酸６４８）、及びＬｃｋ（全長）を発現するバキュロウイルスで細胞を共感染させることにより、Ｓｆ９昆虫細胞内で産生される。両バキュロウイルスは、感染効率２．５で用い、細胞は、感染後４８時間で回収する。
【０２３４】
ＭＥＫ−１タンパク質は、Ｓｆ９昆虫細胞内で産生され、ＧＳＴ−ＭＥＫ−１（全長）融合タンパク質を発現するバキュロウイルスにより感染効率５で細胞を感染させ、細胞を感染後４８時間で回収する。ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ３０２−６４８及びＧＳＴ−ＭＥＫ−１に対しては、類似の精製手順を用いる。
【０２３５】
トランスフェクトされた細胞を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７.３、０.５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びプロテアーゼ阻害薬カクテルを含有するバッファー中に、１ｍＬあたり湿潤状態の細胞の生物体量１００ｍｇで懸濁させる。細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで破砕し、３００００ｇを３０分間遠心分離にかける。この３００００ｇの上清をＧＳＨ−セファロースにかける。この樹脂を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０.０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するバッファーで洗浄する。ＧＳＴタグタンパク質を、１００ｍＭのグルタチオン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０.０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液で溶出させる。精製したタンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２０％のグリセロールを含有するバッファー中へ透析する。
【０２３６】
試験化合物を、三倍希釈によってＤＭＳＯ中へ段階希釈し、通常は、５０μＭ〜２０ｎＭの範囲のストック液濃度とした（例えば、アッセイでの最終濃度は、１μＭ〜０．４ｎＭの範囲とすることができる）。ｃ−Ｒａｆ生化学アッセイは、放射性フィルターマットアッセイとして、９６ウェルのＣｏｓｔａｒポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３３６５）中で実施する。プレートに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、７０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｎｇのＬｃｋ／ｃ−Ｒａｆ、及び１μｇのＭＥＫ−１を含有する溶液７５μＬを充填する。続いて、段階希釈した個々の化合物２μＬを、ＡＴＰを添加する前に、この反応液に添加する。５μＭのＡＴＰ及び０.３μＣｉの［３３Ｐ］−ＡＴＰを含有するＡＴＰ溶液２５μＬで反応を開始させる。プレートを密封し、３２℃で１時間インキュベートした。４％のリン酸５０μｌを添加することで反応を停止し、Wallac Tomtec Harvesterを使用してＰ３０フィルターマット（PerkinElmer）上で回収を行う。フィルターマットをまず１％のリン酸で、次に脱イオン水で洗浄する。フィルターをマイクロ波中で乾燥し、シンチレーション液に浸漬し、Wallac 1205 Betaplate Counter（Wallac Inc., Atlanta, GA, U.S.A.）で読み取りを行う。結果をパーセント阻害として表す。
％阻害＝［１００−（Ｔｉｂ／Ｔｉ）］ｘ１００
ここで、
Ｔｉｂ＝（阻害薬ありのカウント毎分）−（バックグラウンド）
Ｔｉ＝（阻害薬なしのカウント毎分）−（バックグラウンド）
【０２３７】
Ｒａｆ活性は、ＥＲＫリン酸化（すなわち、ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）を誘発するカスケードを開始させてリン酸化−ＥＲＫを産生する能力によってモニタリングすることも可能である。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２免疫アッセイは、以下のように実施することができる：
【０２３８】
細胞株中の基底ｐＥＲＫの阻害を測定するために、レーザーフローサイトメトリーのプラットフォームを用いる９６ウェルのリン酸化−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）免疫アッセイを確立した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、細胞数５００００個／ウェルで、９６ウェルマイクロタイタープレート上の完全増殖培地中へ播種する。基底ｐＥＲＫ１／２の阻害に対する試験化合物の効果を調べるために、播種の翌日、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに移し、最終濃度３ｍＭ〜１２ｎＭとなるように０.１％ＤＭＳＯ中に１：３で希釈した試験化合物と共にインキュベートする。細胞を試験化合物と共に２時間インキュベートし、洗浄し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ全細胞溶解バッファーＡの中に溶解する。サンプルをバッファーＢで１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、直接アッセイプレートに移すか、又は、処理を行うまで−８０℃で冷凍しておく。希釈したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解液５０ｍＬを、抗−ＥＲＫ１／２抗体を結合させた５ミクロンのＢｉｏ−Ｐｌｅｘビーズ約２０００個と共に、シェーカー上、室温で一晩インキュベートする。翌日、ビオチン化リン酸化−ＥＲＫ１／２サンドイッチ免疫アッセイを実施し、各インキュベーションの間にビーズを３回洗浄し、次にＰＥ−ストレプトアビジン５０ｍＬを現像剤として使用する。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘフローセル（プローブ）を用いて高感度で２５個のビーズを計数することにより、ｐＥＲＫ１／２の相対蛍光単位を検出する。未処理細胞を最大値とし、細胞無し（ビーズのみ）をバックグラウンドとして、ＩＣ５０を算出する。
【０２３９】
細胞増殖
細胞増殖アッセイの例は、下記の例の中で述べる。しかし、増殖アッセイは、適切ないかなる方法によっても実施することができる。例えば、乳ガン細胞増殖アッセイは、以下のように実施することができる。他の種類の細胞を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株と置き換えることができる。
【０２４０】
ヒト乳ガン細胞（ＭＤＡ ＭＢ−２３１、ＮＣＩ）を、１０％熱失活ＦＢＳを添加した標準的な増殖培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ）下、３７℃で、加湿インキュベーター内で培養する。細胞を、細胞３０００個／ウェルの密度で、増殖培地９０μＬ中、９６ウェル培養ディッシュ上に播種する。Ｔ０ｈＣＴＧ値を決定するために、播種の２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光試薬（Promega）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ II装置で発光を記録する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬により、細胞が溶解し、そしてＡＴＰ存在量に比例する発光シグナルが発生し、それはさらに、存在する細胞数に直接比例する。
【０２４１】
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭのストック液を調製する。ストック液を増殖培地中でさらに１：４００に希釈し、０.２５％ＤＭＳＯ中２５μＭの試験化合物の作業用ストック液を得る。試験化合物を、０.２５％ＤＭＳＯを含有する増殖培地により、全ウェルで一定のＤＭＳＯ濃度が維持されるように段階希釈する。希釈した試験化合物６０μＬを各培養ウェルに添加し、最終体積を１８０μＬとする。細胞を、個々の試験化合物と共に、及び試験化合物なしで、７２時間インキュベートし、前述のように、そこでＡＴＰによる発光を測定することでＴ７２ｈ値を得る。任意に、化合物濃度対パーセント阻害を用いた最小二乗解析プログラムにより、ＩＣ５０値を決定することができる。
％阻害＝［１−（Ｔ７２ｈ ｔｅｓｔ−Ｔ０ｈ）／（Ｔ７２ｈ ｃｔｒｌ−Ｔ０ｈ）］ｘ１００
ここで、
Ｔ７２ｈ ｔｅｓｔ＝試験化合物存在下、７２時間でのＡＴＰによる発光
Ｔ７２ｈ ｃｔｒｌ＝試験化合物非存在下、７２時間でのＡＴＰによる発光
Ｔ０ｈ＝ゼロ時間でのＡＴＰによる発光
【０２４２】
血管新生
血管新生を研究するための１つの有用なモデルは、増殖因子（例えば、ＦＧＦ−１）を添加したＭａｔｒｉｇｅｌなどの再構築された基底膜マトリックスをホスト動物に皮下注射すると、内皮細胞がマトリックスに取り込まれ、数日間かけて新しい血管が形成されるという観察に基づいている。例えば、Passaniti et al., Lab. Invest., 67:519-528, 1992、を参照のこと。抽出物を様々な時間でサンプリングすることにより、血管新生を時間的に分析することができ、例えば、内皮細胞のマトリックス中への遊走、内皮細胞の血管新生経路への関与、細胞伸長及び嚢状の空間（sac−like space）の形成、並びに赤血球を含有する連結した線状構造を有する機能的毛細血管の確立などを含む、血管新生の全段階に関与する遺伝子の同定が可能となる。増殖因子の安定化、及び／又はマトリックスからのその放出の遅延化のために、増殖因子をヘパリン、又はその他の安定化剤に結合させることができる。マトリックスに定期的に増殖因子を再注入して、血管新生プロセスを促進及び延長することもできる。
【０２４３】
血管新生を研究するためのその他の有用なシステムとしては、例えば、腫瘍外植片の新血管新生（例えば、米国特許第５,１９２,７４４号；第６,０２４,６８８号）、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えば、Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982；Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998）、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば、米国特許第６,０２４,６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991）、遊走アッセイ、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）増殖阻害アッセイ（例えば、米国特許第６,０６０,４４９号）、などが挙げられる。
【０２４４】
本発明の組み合わせ薬に含まれる追加化合物
本発明の組み合わせ薬は、任意に、許容できない副作用を発生させない場合、１以上の追加医薬品との合剤として投与することができる。これはガンのような過剰増殖性疾患の処置のために特に適切であり得る。この場合、本発明の組み合わせ薬はその他の既知の細胞毒剤、シグナル導入阻害剤、又は他の抗ガン剤、それにそれらの混合物又は合剤と組合せることができる。
【０２４５】
１つの実施形態において、本発明の化合物は細胞毒抗ガン剤と組合せることができる。そのような剤の例は、Merck Index第１１版（１９９６）に見られる。これらの剤は、これらに限定されないが、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、イリノテカン、リュウコボリン、ロムスチン、メクロレサミド、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、トキサントロン、プレドニソロン、プレドニソン、プロカルバジン、ラノキシフェン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン及びビンデシンを含む。
【０２４６】
本発明の組み合わせ薬と共に使用するのに適した他の細胞毒薬物は、これらに限定されないが、Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Ninth Edition, 1996, McGraw-Hill)において新生物病の処置に使用が知られた化合物である。これらの剤は、これらに限定されないが、アミノグルテチミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、５−アザシチジン、クラドリビン、ブスルファン、ジエチルスチルベストロール、２’−２’−ジフルオロデオキシシチジン、ドセタクセル、エリスロヒドロキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、５−フルオロデオキシウリジン、５−クロロデオキシウリジンモノリン酸、フルダラビンホスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、イダルビシン、インターフェロン、メドロキシプロゲステロンアセテート、メゲステロールアセテート、メルファラン、ミトタン、パクリタクセル、ペントスタチン、Ｎ−ホスフォノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、プリカマイシン、セムスチン、テニポシド、テストステロンプロピオネート、チオテパ、トリメチルメラミン、ウリジン、及びビノレルビン腫瘍性病に使用するために認知された化合物を含む。
【０２４７】
本発明の組み合わせ薬との合剤において使用に適した他の細胞毒抗ガン剤は、オキサシプラチン、ゲムシタビン、カペシタビン、エポチロン及びその天然又は合成誘導体、テモゾロミド（Quinn et al., J. Clin. Oncology 2003, 21(4), 646-651），トシツモマブ（Baxxar）、トラベテクシン（Vidal et al., Proceedings of the American Society or Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3181），及びカイネシンスピンドルタンパクＥｇ５の阻害剤（Wood et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2001, 1, 370-377）のような新しく発見された細胞毒剤をも含む。
【０２４８】
本発明の他の実施形態においては、本発明の組み合わせ薬は他のシグナル導入阻害剤と組合せることができる。特に関心あるものは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２及びＨＥＲ−４のようなＥＧＦＲファミリを標的とするシグナル導入阻害剤（Raymond et al., Drugs 2000, 60 (Suppl. l), 15-23; Harari et al., Oncogene 2000, 19 (53), 6102-6114）、及びそれらのリガンドである。そのような剤の例は、これらに限定されないが、ヘルセプチン（トラスツズマブ）、エルビタックス（セツキシマブ）、及びペルツズマブのような抗体治療剤を含む。そのような治療剤の例は、これらに限定されないが、ＺＤ−１８３９／イレッサ（Baselga et al., Drugs 2000, 60 (Suppl. 1), 33-40）、ＯＳＩ−７７４／タルセバ（Pollack et al. J. Pharm. Exp. Ther. 1999, 291(2), 739-748）、ＣＩ−１０３３（Bridges, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 825-843）、ＧＷ−２０１６（Lackey et al., 92nd AACR Meeting, New Orleans, March 24-28, 2001, abstract 4582）、ＣＰ−７２４，７１４（Jani et al., Proceedings of the American Society or Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3122）、ＨＫＩ−２７２（Rabindran et al., Cancer Res. 2004, 64, 3958-3965）、及びＥＫＢ−５６９（Greenberger et al., 11th NCI-EORTC- AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Amsterdam, November 7-10, 2000, abstract 388）のような、小分子キナーゼ阻害剤をも含む。
【０２４９】
他の実施形態においても、本発明の組み合わせ薬はスプリットキナーゼドメイン（ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｆｌｔ−３、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｆｍｓなど）及びそれらのリガンドを標的とする他のシグナル導入阻害剤と組合せることができる。これらの剤は、これらに限定されないが、アバスチン（ベバシズマブ）のような抗体を含む。又はこれらの剤は、これらに限定されないが、ＳＴＩ−５７１／グリーベック（Zvelebil, Curr. Opin. Oncol., Endocr. Metab. Invest. Drugs 2000, 2(1), 74-82）、ＰＴＫ−７８７（Wood et al., Cancer Res. 2000, 60(8), 2178-2189）、ＳＵ−１１２４８（Demetri et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3001）、ＺＤ−６４７４（Hennequin et al., 92nd AACR Meeting, New Orleans, March 24-28, 2001, abstract 3152）、ＡＧ−１３７３６（Herbst et al., Clin. Cancer Res. 2003, 9, 16 (suppl 1), abstract C253）、ＫＲＮ−９５１（Taguchi et al., 95th AACR Meeting, Orlando, FL, 2004, abstract 2575）、ＣＰ−５４７，６３２（Beebe et al., Cancer Res. 2003, 63, 7301-7309），ＣＰ−６７３，４５１(Roberts et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 3989)、ＣＨＩＲ−２５８（Lee et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 2130）、ＭＬＭ−５１８（Shen et al., Blood 2003, 102, 11, abstract 476）、及びＡＺＤ−２１７１（Hennequin et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 4539）のような小分子阻害剤を含む。
【０２５０】
他の実施形態において、本発明の組み合わせ薬はｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ形質伝達経路の阻害剤（Avruch et al., Recent Prog. Horm. Res. 2001, 56, 127-155）、又はＰＫＢ（ａｋｔ）経路阻害剤（ＬLawlor et al., J. Cell Sci. 2001, 114, 2903-2910）と共に使用することができる。これらは、これらに限定されないが、ＰＤ−３２５９０１（Sebolt-Leopold et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 4003）、及びＡＲＲＹ−１４２８８６（Wallace et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 3891）を含む。
【０２５１】
他の実施形態において、本発明の組み合わせ薬はヒストンデアセチラーゼの阻害剤と共に使用することができる。このような剤は、これらに限定されないが、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＬＡＱ−８２４（Ottmann et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3024）、ＬＢＨ−５８９(Beck et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3025)、ＭＳ−２７５（Ryan et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 2452）、及びＦＲ−９０１２２８（Piekarz et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004, 23, abstract 3028）を含む。
【０２５２】
他の実施形態において、本発明の組み合わせ薬はプロテアソーム阻害剤及びｍ−ＴＯＲ阻害剤のような他の抗ガン剤と共に使用することができる。これらは、これらに限定されないが、ボルテゾミブ（Mackay et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004, 23, Abstract 3109）、及びＣＣＩ−７７９（Wu et al., Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004, 45, abstract 3849）を含む。
【実施例】
【０２５３】
本明細書において使用した略号は以下のとおりである：
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ 質量スペクトル分析
ＥＳ エレクトロスプレー
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＮＭＲ 核磁気共鳴スペクトル分析
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ｒｔ 室温
【０２５４】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素の中間体／出発物質の調製
１）  ４−アミノ−３−フルオロフェノールの調製
【化５】
2013531067.tif 000020
【０２５５】
アルゴンでパージした乾燥フラスコへ、１０％Ｐｄ／Ｃ（８０ｍｇ）と、次いで酢酸エチル（４０ｍｌ）中に溶液として３−フルオロ−２−ニトロフェノール（１．２ｇ、７．６４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をＨ２雰囲気下４時間かきまぜた。混合物をセライトのパッドを通して濾過し、溶剤を減圧下蒸発し、黄褐色固体として所望の生成物を得た（９４０ｍｇ、７．３９ｍｍｏｌ、収率９７％）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）４．３８（ｓ，２Ｈ），６．２９−６．３５（ｍ，１Ｈ），６．４１（ｄｄ，Ｊ＝２．５，１２．７，１Ｈ），６．５２−６．６２（ｍ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ）
【０２５６】
２）  ４−（４−アミノ−３−フルオロフェノキシ）ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドの調製
【化６】
2013531067.tif 000021
【０２５７】
０℃へ冷却したＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド（６ｍｌ）中の４−アミノ−３−フルオロフェノール（５００ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）の溶液をカリウムｔ−ブトキサイド（４４１ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）と加熱し、褐色溶液を０℃で２５分かきまぜた。この混合物へジメチルアセタミド（４ｍｌ）中の溶液として４−クロロ−Ｎ−メチル−２−ピリジンカルボキサマイド（５１６ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１００℃で１６時間加熱した。混合物を室温に冷やし、水で反応停止し、そして酢酸エチル（４×４０ｍｌ）で抽出した。合併した有機層を水（２×３０ｍｌ）で洗い、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発して赤褐色オイルを得た。１Ｈ−ＮＭＲが残ったジメチルアセタミドの存在を示したので、このオイルをジエチルエーテル（５０ｍｌ）に取り、食塩水（５×３０ｍｌ）でさらに洗った。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮して赤褐色固体として所望の生成物９５０ｍｇを得た。このものは精製することなく次の工程に使用された。
【０２５８】
４−クロロ−Ｎ−メチル−２−ピリジンカルボキサマイドの調製法は、Bankston et al., Org. Proc. Res. Dev. 2002, 6(6), 777-781に記載されている。
【０２５９】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素である、４−{４−〔３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド〕−３−フルオロフェノキシ}ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドの調製
【化７】
2013531067.tif 000022
【０２６０】
トルエン（３ｍｌ）中の４−（４−アミノ−３−フルオロフェノキシ）ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド（１７７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）の溶液を４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルイソシアネート（１５０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）へ加えた。混合物を室温で７２時間かきまぜた。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をジエチルエーテルとこねた。生成した固体を濾過により集め、４時間減圧下乾燥して題記化合物（１５５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、収率４７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）２．７６（ｄ，Ｊ＝４．９，３Ｈ），７．０３−７．０８（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．６，５．６，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１１．６，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝２．５，１Ｈ），７．６０（ｓ，２Ｈ），８．０７−８．１８（ｍ，２Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝５．７，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．７４−８．８０（ｍ，１Ｈ），９．５０（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＨＰＬＣ／ＥＳ）４８３．０６ｍ／ｚ＝（Ｍ＋１）
【０２６１】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素である、 ４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドとポリビニルピロリドンとの固形分散体の製造
【０２６２】
キャップを外したバイアル中で、遊離塩基としての、式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素である、４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド１部を、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−２５／Kollidon 25）の４部と混合し、全ての粉末が溶液となるまで、アセトンとエタノールとの１：１混合物の十分量に溶解させた。キャップを外したそれらバイアルを、４０℃に設定した真空オーブンに入れ、少なくとも２４〜４８時間乾燥させた。
【０２６３】
あるいは、塩基としての、式（Ｉ）の４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド１部とポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−２５／Kollidon 25）の３部とを、８０：２０のアセトン／エタノール混液（ｗ／ｗ）の３０部に溶解させた。ロータリー真空エバポレーターを用いて７０℃にて溶媒を除去した。乾燥した残渣をエバポレーションフラスコから取り出し、篩にかけた（６３０μｍ）。
【０２６４】
更なる代替の実施形態において、塩基としての、式（Ｉ）の４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド１部とＰＶＰ ２５の７部とを、８０：２０のアセトン／エタノール混液（ｗ／ｗ）の３０部に溶解させた。ロータリー真空エバポレーターを用いて７０℃にて溶媒を除去した。乾燥した残渣をエバポレーションフラスコから取り出し、篩にかけた（６３０μｍ）。
【０２６５】
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドとＰＶＰ及びクロスカルメロースナトリウムとの固形分散体
【０２６６】
アセトン６．４ｋｇとエタノール１．６ｋｇの混液中の、塩基としての、式（Ｉ）の４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド０．４ｋｇとＰＶＰ ２５の１．２ｋｇとの溶液を製造した。流動床真空造粒機を用いて、この溶液をクロスカルメロースナトリウム１．６ｋｇよりなる粉末床に６０〜７０℃にて噴霧した。乾燥後、生成物を篩にかけた（１ｍｍ）。顆粒はそのままで使用でき、又は更に、例えばサシェ剤、カプセル剤、又は錠剤の処方へと処方化することができる。例えば、その顆粒をローラーで固め３及び１ｍｍの篩にかけた。次いでこの固めた顆粒を０．５４ｋｇのクロスカルメロースナトリウム、２４ｇのコロイド状無水シリカ及び３６ｇのステアリン酸マグネシウムと混合した。この圧縮準備のできた混合物を回転式打錠機で圧縮して、式Ｉの化合物２０、５０及び１００ｍｇを含有する錠剤とした。これらの錠剤は、光から保護するためフィルムコーティングしてもよい。
【０２６７】
４−{４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ}ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド塩酸塩の調製
遊離塩基として実施例１の化合物（２．０ｇ）を無水テトラヒドロフラン（１５ｍｌ）に溶かし、そして４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン（過剰）を加えた。次に溶液を真空濃縮し、灰白色固体２．３２ｇを得た。この粗製塩を熱エタノール（１２５ｍｌ）に溶かし、活性炭を加えて１５分間還流加熱した。熱い懸濁液をセライトパッドを通して濾過し、室温へ冷却した。フラスコを一夜フリーザー中に入れた。結晶性固体を吸引濾過し、エタノール、次にヘキサンで洗い風乾した。母液は濃縮し、一夜結晶化（フリーザー中）を許容した。固体の２回目のクロップを集め、１回目のクロップと合併した。無色の塩を２日間６０℃で真空オーブン中で乾燥した。得られた塩酸塩の収量は１．７２ｇ（７９％）であった。融点：２１５℃
【０２６８】
【表１５】
2013531067.tif 000023
【０２６９】
４−{４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロ}ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドメシレートの調製
【０２７０】
遊離塩基として実施例１の化合物（２．２５ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶かし、メタンスルホン酸のストック溶液（過剰）を加えた。溶液を次に減圧濃縮し、黄色オイルを得た。エタノールを加え、濃縮を繰り返した灰白色固体２．４１ｇを得た。粗製塩を熱エタノール（〜１２５ｍｌ）に溶かし、徐々に冷却化して結晶化させた。室温へ達した後、フラスコを一夜フリーザー中へ置いた。無色結晶性物質を吸引濾過により集め、フィルターケーキをエタノール、次にヘキサンで洗い風乾して物質２．０５ｇを得た。これを一夜６０℃で真空オーブン中で乾燥した。融点：２３１℃
【０２７１】
【表１６】
2013531067.tif 000024
【０２７２】
４−{４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロ}ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドフェニルスルホン酸塩の調製
【０２７３】
遊離塩基として実施例１の化合物（２．２５ｇ）をエタノール（５０ｍｌ）に懸濁し、エタノール（５０ｍｌ）中のベンゼンスルホン酸（０．７３７ｇ）を加えた。混合物を激しくかきまぜながら加熱した。すべての固体が溶解し、赤色溶液を与えた。この溶液を室温へ冷やし、フラスコを引掻いた。結晶生成を達成するのは困難で、いくらかの種晶が発見され、これを溶液へ加え、一夜フリーザー中へ置いた。フラスコ中に灰褐色の固体が生成し、この物質を砕き、そして吸引濾過により集めた。固体をエタノール、次にヘキサンで洗い、風乾した。秤量した生成物は２．０６ｇであり、収率は６９％であった。融点：２１３℃
【０２７４】
【表１７】
2013531067.tif 000025
【０２７５】
ｃ−ｒａｆ（ｒａｆ−１）生化学アッセイ
ｃ−ｒａｆ生化学アッセイは、Ｌｃｋキナーゼによって活性化（ホスホリル化）したｃ−ｒａｆ酵素で実施された。Ｌｃｋ−活性化ｃ−ｒａｆ（Ｌｃｋ−ｒａｆ）は、Ｓｆ９昆虫細胞中にポリヘドリンプロモーターのコントロール下にＧＳＴ−ｃ−ｒａｆ（アミノ酸３０２からアミノ酸６８４まで）とＬｃｋ（全長）を発現するバキュロウイルスで同時感染させることによって生産した。両方のバキュロウイルスは２．５の感染倍数で使用し、そして細胞は感染後４８時間で収穫した。
【０２７６】
ＭＥＫ−１タンパクは、Ｓｆ９昆虫細胞中に感染倍数５においてＧＳＴ−ＭＥＫ−１（全長）融合タンパクを発現するバキュロウイルスで細胞を感染させ、そして細胞を感染４８時間後に収穫することによって生産した。ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆ３０２−６４８及びＧＳＴ−ＭＥＫ−１のために同様な精製操作が使用された。
【０２７７】
形質転換した細胞は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．３、０．５％トリトンＸ−１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含んでいるバッファー中ｍＬあたり湿った細胞バイオマス１００ｍｇ懸濁した。細胞をポリトロンホモナイザーで破壊し、３０，０００ｇで３０分遠心した。３０，０００ｇ上清をＧＳＨ−セファローズへ適用した。樹脂を５０ｍｇトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％トリトンＸ−１００を含んでいるバッファーで洗った。ＧＳＴ−標識タンパクをグルタチオン１００ｍＭ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％トリトンＸ−１００を含む溶液で溶出した。精製したタンパクは、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０％グリセロールを含むバッファー中へ透析した。
【０２７８】
試験化合物は３倍希釈液を用いて典型的には５０μＭないし２０ｎＭの範囲ストック濃度へ（１μＭないし０．４ｎＭのアッセイ範囲の最終濃度）ＤＭＳＯ中に段階希釈した。ｃ−ｒａｆ生化学アッセイは９６ウエルコスターポリプロピレンプレート（コスタ３３６）中で放射活性フィルターマットアッセイとして行われた。プレートへ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７０ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｎｇのＬｃｋ／ｃ−ｒａｆ及び１μｇ ＭＥＫ−１を含む溶液７５μＬを負荷した。次に段階希釈した個々の化合物の２μＬをＡＴＰ添加の前に反応へ加えた。反応は５μＭ ＡＴＰ及び０．３ｕＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰを含む２５μＬ ＡＴＰ溶液によって開始された。プレートはシールされ、３２℃で１時間インキュベートされた。反応は４％リン酸５０μＬの添加により停止され、そしてＷａｌｌａｃ Ｔｏｍｔｅｃハーベスターを用いてＰ３０フィルターマット（PerkinElmer）上に収穫された。フィルターマットは最初１％リン酸で、２番目に脱イオン水で洗った。フィルターをマイクロウェーブで乾燥し、シンチレーション液に浸し、そしてＷａｌｌａｃ１２０５ベータープレートカウンター（Wallac Inc., Atlanta, GA, U.S.A.）中で読取られた。結果はパーセント阻害として表される。
【０２７９】
％阻害＝［１００−（Ｔｉｂ／Ｔｉ）］×１００
ここで、
Ｔｉｂ＝（阻害剤ありのカウント／分）−（バックグラント）
Ｔｉ＝（阻害剤なしのカウント／分）−（バックグラント）
【０２８０】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は、このアッセイにおいてｒａｆキナーゼの強力な阻害を示した。
【０２８１】
ｐ３８キナーゼインビトロアッセイ
精製し、Ｈｉｓ−標識したｐ３８α２（Ｅ．コリ（E.coli）中に発現）をＭＭＫ−６により高比活性へインビトロで活性化した。マイクロタイターフォーマットを使用し、すべての反応はアッセイパッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ７．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に活性化ｐ３８α２の０．０５μｇ／ウエルとミエリン塩基性タンパク１０μｇ／ウエルを得るように希釈された試薬で１００μＬ体積において実施された。試験化合物（水中１０％ＤＭＳＯ溶液５μＬ）が調製され、そして５ｎＭから２．５μＭまでの最終濃度をカバーするように希釈された。キナーゼアッセイはウエルあたりコールドＡＴＰ １０μＭ及び［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ０．２μＣｉ（２００−４００ｄｐｍ／ｐｍｏｌＡＴＰ）最終濃度を与えるようにＡＴＰカクテル２５μＬの添加によって開始された。プレートを３２℃において３５分間インキュベートし、反応を１Ｎ ＨＣｌ水溶液の７μＬで停止した。サンプルはＴｏｍＴｅｃ１２９５ハーベスター（Wallac, Inc.）を用いてＰ３０フィルターマット（Wallac, Inc.）上に収穫され、そしてＬＫＢ １２０５ベータプレート液体シンチレーションカウンター（Wallac, Inc.）中でカウントされた。陰性対照は基質プラスＡＴＰ単独を含んでいた。
【０２８２】
ＳＷ１３５３細胞アッセイ：細胞（ヒトコンドロ肉腫）が９６ウエルプレート中に接種（１０００細胞／１００μＬ ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ／ウエル）され、そして一夜インキュベートされた。培地置換後、細胞は試験化合物へ３７℃において１時間曝露され、その時ヒトＩＬ−１（１ｎｇ／ｍｌ、Endogen, Woburn, WA）と、組換えヒトＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）が添加された。培養物は３７℃で４８時間インキュベートされ、次に上清ＩＬ−６値がＥＬＩＳＡによって決定される。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素はｐ３８キナーゼの有意な阻害を示す。
【０２８３】
Ｂｉｏ−ＰＬｅｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２イムノアッセイ
レーザーフローサイトメトリープラットフォームを使用する９６−ウエルホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）イムノアッセイは、細胞ライン中のベーサルｐＥＲＫの阻害を測定するために確立された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を完全成育培地中、９６−ウエルマイクロタイタープレート中で５０，０００細胞／ウエルにおいてプレートした。ベーサルｐＥＲＫ１／２阻害に対する試験化合物の効果のため、プレート翌日にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を０．１％ＢＳＡを有するＤＭＥＭへ移し、０．１％ＤＭＳＯ中３μＭないし１２ｎＭの最終濃度へ１：３希釈した。細胞を試験化合物と２時間インキュベートし、洗浄し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ全細胞溶解バッファーＡに溶解した。サンプルはバッファーＢ１：１（ｖ／ｖ）で希釈し、アッセイプレートへ直接移すか、又は処理するまで−８０℃で凍結した。希釈したＭＤＡ−ＭＢ−２３１溶解物の５０μＬを抗ＥＲＫ１／２抗体を接合した５ミクロンＢｉｏ−Ｐｌｅｘビーズ約２０００と一夜シエカー上で室温でインキュベートした。翌日、ビオチニル化ホスホＥＲＫ１／２サンドイッチイノムアッセイを実施し、ビーズを各インキュベーションの間３回洗い、次に現像剤としてＰＥ−ストレプトアビジン５０μＬを使用した。ｐＥＲＫ１／２の相対的蛍光単位が高感度において２５ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘフローセル（プローブ）でカウントすることによって検出された。ＩＣ５０が最大として未処理細胞をそしてバックグランドとして細胞なし（ビーズのみ）を用いて計算された。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素はこのアッセイにおいて有意な阻害を示す。
【０２８４】
Ｆｌｋ−１（ネズミＶＥＧＦＲ−２）生化学アッセイ
このアッセイは、ＴＲ−ＦＲＥＴフォーマット中の９６ウエルオパックプレート（Ｃｏｓｔａｒ３９１５）中で実施された。反応条件は以下のとおり。１０μＭ ＡＴＰ、２５ｎＭポリＧＴ−ビオチン、２ｎＭ Ｅｎ標識ホスホ−Ｔｒｙ Ａｂ、１０ｎＭ ＡＰＣ、７ｎＭ Ｆｌｋ−１（キナーゼドメイン）、１％ＤＭＳＯ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１５％ＢＲＵ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％メルカプトエタノール。反応は酵素の添加により開始される。各ウエル中の最終容積は１００μＬである。プレートは、反応開始後約１．５ないし２．０時間においてパーキンエルマービクターＶマルチラベルカウンター上で６１５及び６６５ｎｍの両方において読まれる。シグナルは各ウエルあたり比：（６６５ｎｍ／６１５ｎｍ）＊１００００として計算される。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素は有意なＶＥＧＦＲ−２キナーゼ阻害を示す。
【０２８５】
ネズミＰＤＧＦＲ ＦＲＥＴ生化学アッセイ
このアッセイは９６ウエルブラックプレート（Ｃｏｓｔａｒ３９１５）中にフォーマット化された。以下の試薬（及びそれらのソース）が使用された。ユーロピウム標識抗ホスフォチロシン抗体ｐＹ２０及びストレプトアビジン−ＡＰＣ；ポリＧＴ−ビオチン、及びＤＲＴ中のマウスＰＤＧＦＲ。反応条件は以下のとおり。１ｎＭマウスＰＤＧＦＲがアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１５％ ＢＲＩＪ ３５、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％メルカプトエタノール）中、２０μＭ ＡＴＰ、７ｎＭポリＧＴ−ビオチン、１ｎＭ ｐＹ２０抗体、５ｎＭストレプトアビジン−ＡＰＣ及び１％ ＤＭＳＯと混合される。各ウエル中の最終反応容積は１００μＬである。９０分後１０μＬ／ウエルの５μＭスタウロスポリンを添加して反応を停止する。反応停止約１時間後、プレートはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒＶマルチラベルカウンター上６１５及び６６５ｎｍにおいて読取られる。シグナルは各ウエルについて比：（６６５ｎｍ／６１５ｎｍ）×１０００として計算される。式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素はＰＤＧＦＲキナーゼの有意な阻害を示す。
【０２８６】
ＰＤＧＦＲとＦｌｋ−１の両方についてＩＣ５０の発生のため、酵素開始前に化合物が加えられた。５０倍ストックプレートは５０％ＤＭＳＯ／５０％ｄＨ２Ｏ溶液中段階的に１：３希釈した化合物でつくられた。ストックの２μＬ添加は１％ＤＭＳＯ中１０μＭないし４．５６ｎＭの範囲の化合物最終濃度を与えた。データは％阻害として表わされた。％阻害＝１００−（阻害剤ありシグナル−バックグランド）／（阻害なしのシグナル−パックグランド）×１００
【０２８７】
ＭＤＡ−ＭＥ２３１増殖アッセイ
ヒト乳ガン細胞（ＭＤＡ ＭＢ−２３１、ＮＣＩ）を、１０％熱失活ＦＢＳを添加した標準的な増殖培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ）下、３７℃で、加湿インキュベーター内で培養する。細胞を、細胞３０００個／ウェルの密度で、増殖培地９０μＬ中、９６ウェル培養ディッシュ上に播種する。Ｔ０ｈＣＴＧ値を決定するために、播種の２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光試薬（Promega）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ II装置で発光を記録する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬により、細胞が溶解し、そしてＡＴＰ存在量に比例する発光シグナルが発生し、それはさらに、存在する細胞数に直接比例する。
【０２８８】
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭのストック液を調製する。ストック液を増殖培地中でさらに１：４００に希釈し、０.２５％ＤＭＳＯ中２５μＭの試験化合物の作業用ストック液を得る。試験化合物を、０.２５％ＤＭＳＯを含有する増殖培地により、全ウェルで一定のＤＭＳＯ濃度が維持されるように段階希釈する。希釈した試験化合物６０μＬを各培養ウェルに添加し、最終体積を１８０μＬとする。細胞を、個々の試験化合物と共に、及び試験化合物なしで、７２時間インキュベートし、前述のように、そこでＡＴＰによる発光を測定することでＴ７２ｈ値を得る。任意に、化合物濃度対パーセント阻害を用いた最小二乗解析プログラムにより、ＩＣ５０値を決定することができる。
【０２８９】
％阻害＝［１−（Ｔ７２ｈ ｔｅｓｔ−Ｔ０ｈ）／（Ｔ７２ｈ ｃｔｒｌ−Ｔ０ｈ）］×１００
ここで、
Ｔ７２ｈ ｔｅｓｔ＝試験化合物の存在下７２時間におけるＡＴＰ依存ルミネセンス
Ｔ７２ｈ ｃｔｒｌ＝試験化合物なしの７２時間におけるＡＴＰ依存ルミネセンス
Ｔ０ｈ＝ゼロ時間におけるＡＴＰによる発光
【０２９０】
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素はこのアッセイを用いて増殖の有意な阻害を示す。
【０２９１】
ＡｏＳＭＣ細胞中のｐＰＤＧＦＲサンドイッチＥＬＩＳＡ
１００Ｋ Ｐ３−Ｐ６大動脈ＳＭＣが標準的細胞技術を用いて１２ウエルクラスターの各ウエルへＳＧＭ−２の１００μＬ／ウエルにおいてプレートされた。翌日細胞を１００μＬ Ｄ−ＰＢＳ（Gibco）で１回リンスし、０．１％ＢＳＡを含む５００μＬ ＳＢＭ（平滑筋細胞基本培地）中で一晩、血清飢餓状態にした。化合物はＤＭＳＯ中に１０μＭないし１ｎＭまで１０倍希釈ステップにおいて希釈された。流し中で急速に反転することによって古い培地を除去し、次に各希釈液の１００μＬを細胞の対応するウエルへ３７℃において１時間加えた。次に細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ ＢＢリガンドで３７℃において７分間刺激した。培地を傾斜し、プロテアーゼ阻害剤錠（完全、ＥＤＴＡなし）と０．２ｍＭ Ｎａバナデートを含む等張溶解バッファーを加えた。細胞は冷室内で−４℃において１５分間溶解される。溶解物をエッペンドルフ管へ入れ、それへアガロース接合抗ＰＤＧＦＲ−β抗体１５μＬを加え（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３３９）、４℃で一夜インキュベートする。翌日ビーズをＰＢＳの５０ボリュームで３回リンスし、１×ＬＤＳサンプルバッファー中５分間沸騰する。サンプルを３−８％勾配トリス−アセテートゲルを通し、ニトロセルロース上へ移した。膜は、ブロッキングバッファー（１：１０００希釈）中抗ホスホＰＤＧＦＲ−β中１時間インキュベートする前に、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１時間ブロックした。ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗った後、膜をヤギ抗ウサギＨＲＰ ＩｇＧ（１：２５０００希釈）中で１時間インキュベートした。ＥＣＬ基質の添加前にもう３回の洗浄が続いた。膜をハイパーフィルムＥＣＬへ露出した。その後膜を剥がし、全ＰＤＧＦＲ−βについて抗ＰＤＧＦＲ−βで再プローブした。
【０２９２】
表１は、ｐ３８キナーゼ：ＰＤＧＦＲキナーゼ、及びＶＥＧＦＲ２キナーゼに対するインビトロキナーゼ生化学アッセイの結果を示す。これら３キナーゼ標的は、血管形成へ導き、そして腫瘍組織へ血液供給を提供する、ストローマ活性化及び内皮細胞増殖にすべて含まれる。
【０２９３】
【表１８】
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【０２９４】
表２は、（ｉ）ｒａｆキナーゼ活性の機械的読取りである、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中のｐＥＲＫの阻害、及び（ｉｉ）ｒａｆキナーゼ活性の機能的アッセイである、ＭＡＤ−ＭＢ２３１細胞中の増殖アッセイの、ｒａｆキナーゼ活性のための二つの細胞アッセイの結果を示す。加えて、表２は、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害の機械的読取りである、大動脈平滑筋細胞中のＰＤＧＦＲ−βのＰＤＧＦＲ誘導ホスフォリル化の結果を示す。
【０２９５】
【表１９】
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【０２９６】
動物体内の代謝特性
式（Ｉ）のフルオロ置換ジアリール尿素のＮ−オキシド（Ｍ−２）、ヒドロキシメチル（Ｍ−３）、脱メチル化（Ｍ−４）及びＮ−オキシド脱メチル化（Ｍ−５）代謝物が、以下に示されている。それらは、様々な哺乳類（ヒト、イヌ、ラット、マウス）の肝臓酵素とのインキュベーションによりレゴラフェニブの代謝物としてインビトロにおいて同定された。研究により、ヒト及び動物種において、その代謝物がで結合する高度なタンパク質結合を示すことが明らかになった（データ未掲載）。
【０２９７】
【化８】
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【０２９８】
【化９】
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【０２９９】
【化１０】
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【０３００】
【化１１】
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【０３０１】
代謝特性を以下の表１に示す。
表１．［１４Ｃ］レゴラフェニブ（２０μＭ）と、異なる種の肝ミクロソームとのインキュベーション（タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、６０分）による代謝特性。
【表２０】
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【０３０２】
薬理学的特性
５日間のマウスへの１０ｍｇ／ｋｇのレゴラフェニブの経口投与後に、Ｎ−オキシド（Ｍ−２）露光量は総ＡＵＣ（Ｒ＋Ｍ−２＋Ｍ−５）の〜１６％を占めたのに対し、Ｍ−５の寄与は総ＡＵＣに対して〜２％であった。データを以下の表２に示す。マウスへの１０ｍｇ／ｋｇのＭ−２の経口投与に続いて、レゴラフェニブは総露光量の〜１７％に達したことで、Ｎ−オキシドの低減が生体内における関連代謝経路を示唆したのに対して、Ｍ−５は総露光量の５％を占めた。
【０３０３】
表２．レゴラフェニブ、並びにその代謝物であるＭ−２及びＭ−５に関する、雌ＮＭＲＩ−Ｆｏｘｎ−１マウスへのそれらの経口投与後の定常状態における薬物動力学パラメーター。
【表２１】
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【０３０４】
経口的に投薬した合成代謝物は、発症前マウスＨＴ−２９結腸直腸ガン及びＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガン異種移植において、１０ｍｇ／ｋｇにて、溶媒対照と比較して、それぞれ６２／５８％と５４／５０％の有意なＴＧＩを達成する強力な用量依存的腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示した。
【０３０５】
生体内薬理試験
２１日間、毎日１６０ｍｇの共沈錠剤で処置した大腸ガン患者では、Ｍ−２及びＭ−５はレゴラフェニブと非常に似た全身曝露を示した。結果を表４に示す。表４に示されているように、結腸直腸ガンを患っている患者のレゴラフェニブの生体内変換が、脱メチル化及び酸化Ｍ−２及びＭ−５合成代謝物レベルの有意な上昇につながっている。合成代謝物は、１６０ｍｇ共沈錠剤の単回又は複数回のｑｄ投薬後に観察された。
【０３０６】
１９日間の結腸直腸ガンを患っている患者への連続したｑｄ投薬は、それぞれ、Ｍ−５及びＭ−２合成代謝物に関してＡＵＣの２５倍及び２倍の増大をもたらした。Ｃｍａｘ値も同様に、それぞれ、４２倍及び５倍に増大した。値は、初回投与に対する比較を反映している。
【０３０７】
代謝物をさらに特徴づけるために、レゴラフェニブ、Ｍ−２及びＭ−５の血漿中濃度を、結腸直腸ガンを患っている患者への１６０ｍｇのレゴラフェニブ共沈錠剤の投与後の１日目と２１日目にその日ごとに観察した（ｎ＝９、予備データ）。親化合物及びＭ２／Ｍ５代謝物の総Ｃｍａｘレベルは、２１日目に１１ｍｇ／Ｌであった。総薬理学的関連血漿中濃度は、〜２．５ｍｇ／Ｌと評価され、そして最後の投薬の３日後まで残っていた。
【０３０８】
表４．結腸直腸ガンを患っている患者への１６０ｍｇのレゴラフェニブ共沈錠剤の投与後の１日目と２１日目のレゴラフェニブ、Ｍ−２、及びＭ−５に関する薬物動力学パラメーター（幾何平均（％ＣＶ）、予備データ）。
【０３０９】
【表２２】
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【０３１０】
先見的な例
手順Ａ
このトライアルでは、レゴラフェニブを、ペメトレキセドとシスプラチンの次の注入前に７日間のウォッシュアウト期間を設ける連続投薬により、スクリーニングにかけた患者に投与する。レゴラフェニブを、７日間の中断に続いて、２日目から１４日目まで毎日１６０ｍｇの用量にて投与する。レゴラフェニブの薬物動態を、１サイクル目の１４日目と２サイクル目の１日目に評価する。
【０３１１】
手順Ｂ
このトライアルでは、レゴラフェニブを、２日目から２１日目まで連続して（１６０ｍｇ、毎日）スクリーニングにかけた患者に投与する。１サイクル目では、併用レゴラフェニブ投薬なしにペメトレキセドとシスプラチンの薬物動態を評価するために、レゴラフェニブ投薬を２日目に始める。レゴラフェニブの薬物動力学を、１サイクル目の２１日目と２サイクル目の１日目に評価する。
【０３１２】
当業者は、以上の情報及び当分野で利用可能な情報を使用して本発明をその全範囲において利用とできるものと考えられる。当業者には、ここに述べた本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく変更及び修飾をなすことができることを認識すべきである。
【０３１３】
以上及び以下に述べたトピックの標題は、本出願に或種の情報が見られる場合のガイダンスを意味し、そのようなトピックについての情報が見られる場合本出願中の唯一の情報源であることを意図するものではない。
【０３１４】
さらなる詳述がなくても、当業者は先の記載を使用することで、本発明をその最大限まで利用できると考えられる。従って、先の好ましい特定の実施形態は、単なる例示説明と解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を何ら限定するものでは決してない。
【０３１５】
上記及び実施例において、別段の指示がない限り、すべての温度が校正不要の摂氏温度で記載されており、そしてすべての要素及びパーセンテージが重量による。
【０３１６】
前述の実施例は、前述の実施例で使用されているものに関して、本願発明に関する一般的又は具体的に記載された反応条件及び／又は運転条件を置換しても同様にうまく再現できる。
【０３１７】
先の記載から、当業者は、本願発明の本質的特徴を容易に認識し、且つ、本願発明の要旨及び範囲から逸脱することなく様々な用法及び条件に適合するように本発明の様々な変更及び修飾をおこなうことができる。
【０３１８】
以上及び以下に引用したすべての出願、特許、及び公開公報の全ての開示は、参照することで本願に援用される。
【国際調査報告】
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