(57)【要約】作用因子複合体及び少なくとも１つの標的探索リガンドの結合体であって、作用因子複合体は、封入材料によって封入された作用因子を含み、標的探索リガンドはプロスタサイクリン類似体であることを特徴とする結合体及び該結合体の使用。【選択図】なし
2013515023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用因子複合体及び少なくとも１つの標的探索リガンドの結合体であって、前記作用因子複合体は、封入材料によって封入された作用因子を含み、前記標的探索リガンドはプロスタサイクリン類似体であることを特徴とする、結合体。
【請求項２】
前記プロスタサイクリン類似体は、イロプロスト又はトレプロスチニルであることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記作用因子は、核酸若しくはその誘導体、ペプチド、ポリペプチド、若しくはそれらの誘導体、作用物質、又はトレーサーであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項４】
前記核酸は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすか、若しくは免疫調節活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記作用因子は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすか、又は免疫調節活性を有するペプチド又はポリペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載の結合体。
【請求項６】
前記作用因子は、タンパク質欠乏又はタンパク質欠損を補償する生成物であって、肺内で活性を有する、核酸、タンパク質、タンパク質誘導体、若しくはタンパク質フラグメント、薬剤、又はこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の結合体。
【請求項７】
前記作用物質は抗炎症作用物質又はステロイドであることを特徴とする、請求項３に記載の結合体。
【請求項８】
前記作用因子はレポーター分子であり、特に、放射性又は蛍光トレーサーであることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の結合体。
【請求項９】
前記封入材料は、天然物質、合成物質、又は天然物質の誘導体であり、例えば、脂質、ポリマー、又はオリゴマーであることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１０】
前記封入材料は、好ましくはプロトン化することができる生物分解性窒素性ポリマー、特に、ポリエチレンイミン又は生物分解性ポリエチレンイミンのようなカチオンポリマー、スペルミン又はカチオン性脂質のようなカチオン性オリゴマーであることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１１】
前記封入材料及び前記核酸の前記作用因子複合体は、付加的にペグ化されることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１２】
タンパク質欠損又は遺伝子欠損に起因する肺疾患、特に嚢胞性線維症の、遺伝子治療又は肺疾患治療に使用するための請求項１〜１１の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１３】
ポリマーの窒素含量のＤＮＡリン酸塩含量に対するモル比として測定されるカチオン性ポリマーの核酸に対する比率は、１０：１〜１：２０の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１２の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１４】
前記封入材料によって封入される前記作用因子は、ナノカプセル、ナノ粒子、又はリポソームとして存在することを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の結合体。
【請求項１５】
気管支及び／又は肺胞上皮細胞に輸送される作用因子用の標的探索構造である、肺疾患治療用のプロスタサイクリン類似体。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の結合体及び在来の薬剤アジュバントを含み、吸入に適した状態の、肺疾患治療用の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的探索構造としてプロスタサイクリン類似体を含む作用因子を含む結合体と、そのような結合体を、気管支上皮細胞及び肺胞上皮細胞における遺伝子治療及び／又は遺伝子導入に使用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第１に、肺は、その機能が非常に重要な臓器であり、第２に、肺は、表面積が大きくアクセスが良好なため、作用物質又は作用因子を体内に導入するには非常に魅力的な臓器である。
【０００３】
局所作用及び全身作用の両方のために、エアロゾル、ネブライザー、吸入器、又は、ポンプスプレーによって肺に作用因子を導入することが知られている。ウィルス性遺伝子導入剤又は非ウィルス性遺伝子導入剤を、肺を介して投与して遺伝子治療することも知られている。ウィルス性賦形剤（viral excipients）を使用しても非ウィルス性賦形剤を使用しても、副作用が生じる。これは、特に、遺伝子導入（細胞に所望の遺伝子を導入すること）は、往々にして効果が十分ではないため、投与量が比較的高くならざるを得ないからである。そこで、研究者らは、遺伝子導入の有効性を改善することができる薬剤を長い間捜し求めてきた。これに関連して、カチオン性粒子は比較的容易に摂取（phagocyte）されるため、カチオン性脂質で遺伝子を封入することが提案されてきた。これに関連して提案されてきた薬剤であって、既に臨床試験（非特許文献１）の対象とされているものは、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｐｉｄ ６７である。ポリエチレンイミンポリマー（ＰＥＩ）を使用して核酸を封入することが知られている（非特許文献２）。ＰＥＩはＤＮＡを保護することができるが、遺伝子導入効率が悪いというデメリットがあり、さらに、導入効率が悪いために、ＰＥＩを大量投与すると、炎症を引き起こしてしまうということも明らかにされてきた。
【０００４】
従って、研究者らは、カチオンポリマー封入粒子を細胞内に導入することが予測されるリガンドを有するカチオンポリマー封入粒子を提供することに長い間試みてきた。これらの試みにおいて、トランスフェリン（非特許文献３）、葉酸（非特許文献４）、ラクトフェリン（非特許文献５）、クレンブテロール（非特許文献６）、及びＥＧＦのような成長因子（非特許文献７）が用いられてきた。これらのリガンドを用いてＰＥＩを介した遺伝子導入法を改善することは可能であったが、高効率かつ標的を絞った方法で作用因子を肺に到達させることが、依然として必要とされていた。
【０００５】
更に、遺伝子導入が確実な方法である慢性肺疾患の治療方法のための新たな手段を見出す試みが目下継続中である。先天性又は後天性のタンパク質異常及び／又は遺伝子異常に起因する肺疾患は、欠損又は損傷したタンパク質又は遺伝子産物を供給することで、改善、緩和又は完治することができた。しかし、そのような目的の投薬は定期的に行わなければならない。従って、望ましくない副作用と所望の治療効果とのバランスを見出す必要がある。他の重要な観点は、長期的な治療に必要とされる投薬回数である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、標的を絞った方法で、肺細胞、特に気管支上皮細胞及び肺胞上皮細胞に取り込ませることが可能な状態で、肺疾患の治療又は緩和に適した作用物質又は作用因子を供給することが可能な結合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、請求項１に記載した結合体によって解決することができる。
【０００８】
驚くべきことに、肺上皮細胞、即ち、気管支上皮細胞及び肺胞上皮細胞は、ＩＰ１受容体を有しており、これらの受容体は、作用物質を有する粒子の効率的な移送のための標的となりうる。本発明による結合体を用いて、標的探索構造として少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体を用いて、これらのＩＰ１受容体を介して気管支及び肺胞内の上皮細胞をうまく標的とすることができる。
【０００９】
以下において、本発明の主題を詳述し、特徴及び有利な効果をより詳細に説明する。本発明を、添付の図面を参照して更に詳細に説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Alton EW, Stern M, Farley R, Jaffe A, Chadwick SL, Phillips J, et al. Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis: a double-blind placebo-controlled trial. Lancet. 1999 Mar 20;353(9157):947-54.
【非特許文献２】Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1995 Aug 1;92(16):7297-301.
【非特許文献３】Kircheis R, Kichler A, Wallner G, Kursa M, Ogris M, Felzmann T, et al. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery. Gene Ther. 1997 May;4(5):409-18.
【非特許文献４】Chul Cho K, Hoon Jeong J, Jung Chung H, Joe CO, Wan Kim S, Gwan Park T. Folate receptor-mediated intracellular delivery of recombinant caspase-3 for inducing apoptosis. J. Control. Release. 2005 Nov 2;108(1):121-31.
【非特許文献５】Elfinger M, Maucksch C, Rudolph C. Characterization of lactoferrin as a targeting ligand for nonviral gene delivery to airway epithelial cells. Biomaterials. 2007 Aug;28(23):3448-55.
【非特許文献６】Elfinger M, Geiger J, Hasenpusch G, Uzgun S, Sieverling N, Aneja MK, et al. Targeting of the beta(2)-adrenoceptor increases nonviral gene delivery to pulmonary epithelial cells in vitro and lungs in vivo. J. Control. Release. 2009 May 5;135(3):234-41.
【非特許文献７】Blessing T, Kursa M, Holzhauser R, Kircheis R, Wagner E. Different strategies for formation of pegylated EGF-conjugated PEI/DNA complexes for targeted gene delivery. Bioconjug. Chem. 2001 Jul-Aug;12(4):529-37.
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト肺胞上皮細胞及びヒト気管支上皮細胞におけるＩＰ1受容体の発現をウェスタンブロット分析した結果を示す図である。
【図２】ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰと共にそれぞれ培養したＡ５４９及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞の蛍光強度を示す図である。
【図３ａ】様々な細胞株におけるＦＬＵＯ−ＢＳＡ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの蛍光強度の比較結果を示す図である。
【図３ｂ】ＣＡＹ１０４４９濃度を上昇させつつ測定した平均蛍光強度を示す図である。
【図３ｃ】ＩＬＯ濃度を上昇させつつ測定した平均蛍光強度を示す図である。
【図３ｄ】ＣＡＹ１０４４９の投入後のＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの平均蛍光強度を示す図である。
【図３ｅ】表面結合の共焦点レーザー走査顕微鏡像である。
【図４】様々なＮ／Ｐ比におけるＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ構造体のＤＮＡ遊離を示す図である。
【図５ａ】図５Ａは、ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターでトランスフェクションした細胞についての発現度を未処理ＰＥＩと比較して示す図である。
【図５ｂ】ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯについての遺伝子発現度をＰＥＩと比較して示す図である。
【図５ｃ】Ａ５４９及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯの発現度をＰＥＩと比較して示す図である。
【図６ａ】ルシフェラーゼの遺伝子発現のインビボ実験結果を示す図である。
【図６ｂ】ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターを投与したマウスから採取したホモジナイズ肺細胞におけるルシフェラーゼ発現を、ＰＥＩ遺伝子ベクターを投与した場合と比較して示す図である。
【図７ａ】ＰＥＩ又は本発明による構造体で処理した細胞と、未処理細胞の代謝活性を比較して示す図である。
【図７ｂ】ＰＥＩ又は本発明による構造体を投与した後のサイトカインレベルを、未処理細胞と比較して示す図である。
【図８】投与量に依存した、遺伝子ベクターの肺細胞への到達を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
驚くべきことに、標的探索構造としてプロスタサイクリン類似体を含む結合体は、肺の中の上皮細胞、特に気管支細胞及び肺胞細胞を標的とすることに適しており、高効率で細胞内に作用因子を導入することができる。本発明により提供される作用因子は、作用成分を肺上皮細胞に導入するものである。この作用因子は、広範な肺疾患の治療法に新たな可能性をもたらすものである。
【００１３】
プロスタサイクリンは、プロスタグランジン類に属し、プロスタグランジンＩ２又はＰＧＩ２として知られており、プロスタサイクリン（ＩＰ１）受容体を標的とし、結合する。ＩＰ１受容体は、７回膜貫通型Ｇタンパク共役型受容体であり、主に内皮細胞上、特に、筋肉細胞上、例えば、血管の筋肉細胞上に存在する［１５−１７］。ＩＰ１受容体アゴニストへのプロスタサイクリンの結合は、クラスリン依存性プロセスによる受容体／リガンド複合体のエンドソーム内在化（endosomal internalization）を導く［１８，１９］。本発明者らは、活性薬剤を肺胞上皮細胞及び気管支上皮細胞への活性薬剤の標的輸送（targeted transfer）を改善し、肺に有用な、又は肺疾患状態を治療する活性薬剤の摂取を可能にするために、上述のような作用を利用できることを見出した。
【００１４】
従って、本発明によれば、気管支上皮細胞及び肺胞上皮細胞の標的構造として少なくとも一種のプロスタサイクリン類似体を含む結合体が提供される。プロスタサイクリン自体は非常に不安定であり、意図した目的で使用するには分解が早すぎる。しかし、プロスタサイクリンと同様にＩＰ１受容体に結合して、アゴニストとして作用するプロスタサイクリン類似体が知られている。本明細書においては、プロスタサイクリン類似体はプロスタン酸から誘導される化合物であって、ＩＰ１受容体への結合能がプロスタサイクリンと同等又はそれ以上であり、天然のプロスタサイクリンよりも安定している化合物を意味する。このようなタイプの化合物は既知である。既知のプロスタサイクリン類似体は、本発明による結合体に適している。
【００１５】
好適に使用されるリガンドは、イロプロスト及び／又はトレプロスチニルといった、２種のプロスタサイクリン類似体であり、薬剤として承認されている。他のプロスタサイクリン類似体も同様に使用することができる。
【００１６】
本発明に適したプロスタサイクリン類似体は、生理環境及び／又は保存時において天然のプロスタサイクリンよりも安定しているプロスタサイクリン類似体である。上述したように、プロスタサイクリンは非常に迅速に分解してしまう。生理環境（例えば、血液中）におけるプロスタサイクリンの半減期は数分間であり、長期の保存ができない。従って、本発明に適したプロスタサイクリン類似体は、生理環境中で分解又は不活性化することなく、少なくとも２０分間、好ましくは少なくとも３０分間、更に好ましくは少なくとも４５分間にわたって特性を維持できるものか、あるいは、生理環境中における半減期が、少なくとも１５分、好ましくは少なくとも２０分、更に好ましくは少なくとも２５分であるものである。本明細書では、概して、半減期とは、生理環境中で開始材料（この場合はプロスタサイクリン類似体）の半分が分解されるか、不活性化されるか、又は変質されるかする時間であると解するものとする。半減期は、例えば、測定対象のプロスタサイクリン類似体を３５〜３７℃の生理溶液中に入れ、未分解のプロスタサイクリンの量を開始時と所定時間後に測定することにより、慣例的な方法でシンプルに測定することができる。
【００１７】
本発明に適したプロスタサイクリン類似体は、さらに、ＩＰ１受容体への結合能がプロスタサイクリンと同等又はそれ以上であるものである。プロスタサイクリン類似体の結合能の測定方法は、プロスタサイクリン又は、イロプロスト及び／又はトレプロスチニルのような既知のプロスタサイクリン類似体、並びに候補のプロスタサイクリン類似体をフルオレセイン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合し、様々な肺細胞株（pulmonary cell line）に添加して、フローサイトメトリーや共焦点レーザー走査顕微鏡によって結合及び細胞内取り込みを調べる、競合的な方法である。プロスタサイクリン、イロプロスト、又はトレプロスチニルと同等又はそれ以上の結合能を有する候補は、同様に本発明による結合体の一部として好ましい。同等の結合能とは、フルオレセイン標識された候補がフルオレセイン標識されたプロスタサイクリン、フルオレセイン標識されたイロプロスト、又はフルオレセイン標識されたトレプロスチニルと少なくとも同程度結合するということを意味する。フルオレセイン標識された候補の割合が低い場合、プロスタサイクリン、イロプロスト、又はトレプロスチニルでその候補の結合を置換してしまい、候補の結合能を下げてしまう。
【００１８】
既知のプロスタサイクリン類似体は、肺高血圧症（ＰＡＨ）の治療に用いられており、通常、静脈内投与又はエアロゾルとして投与される［２０］。これらは、分割量ずつ投与する必要があり、肺高血圧症の治療のために終日にわたり頻繁に投与しなければならない。しかし、本発明では、プロスタサイクリン類似体を標的探索構造として採用し、肺高血圧症の治療のためには使用しない。カチオン性封入材料及び作用因子を含む本発明による組み合わせにおけるプロスタサイクリン類似体類は、抗炎症活性を有し、これによって、本発明による結合体の活性を更に向上させる。
【００１９】
本発明による結合体の第２の部分は、作用因子複合体であり、例えば、封入材料によって封入された作用因子である。封入材料は、作用因子を保護するとともに、細胞内取り込みを阻害しないように、適切な場合には、実際に細胞内取り込みを促進するように作用する。
【００２０】
本発明による結合体の成分は、有効成分又は作用物質として活性である、本発明による標的探索構造によって標的とされる細胞内で有利な作用、治癒作用、緩和作用、及び調整作用を奏する、プロスタサイクリン以外のあらゆる作用因子でありうる。本発明において使用される作用因子は、具体的には、核酸、ペプチド又はポリペプチド、作用物質、又はトレーサー、及び／又は、これらの物質の誘導体、及び／又は、これらの混合物である。本発明において使用される作用因子は、肺疾患状態を緩和又は治癒することができる作用因子であることが好ましい。これに関連して、本発明においては、プロスタサイクリン類似体は作用物質としてではなく、標的探索リガンドとして使用する。
【００２１】
本発明の１つの観点によれば、作用因子は、その欠陥又は欠如により肺疾患を生じさせる遺伝子又は遺伝子フラグメントを含む核酸、又は免疫調節活性タンパク質（特に、抗原）をコードする核酸である。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、１種又は複数種の遺伝子又は遺伝子フラグメントを含みうる。核酸は自己複製配列又は一体化配列であり、プラスミド、ベクター、又はその他の当業者によく知られた形式でありうる。核酸は、直鎖状又は環状、一本鎖又は二本鎖でありうる。細胞内で活性を有するあらゆる核酸がこのような目的に適している。更に、核酸は、遺伝子を発現するために不可欠又は有効な更なる要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び信号配列等としてそれ自体知られている要素を含みうる。
【００２２】
更なる実施形態において、本発明による結合体の活性成分は、肺疾患を引き起こすおそれがあるタンパク質欠乏又はタンパク質欠損（protein defect）を修復するために適している、あるいは、免疫調節活性を有するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質フラグメントでありうる。
【００２３】
更に、本発明による結合体の活性成分は、気管支上皮細胞及び／又は肺胞上皮細胞中に存在する場合に肺の疾患状態を治癒又は緩和する作用物質でありうる。例として、喘息の治療に用いられるステロイドのような抗炎症剤が挙げられる。リガンドは抗炎症作用も有するため、この組み合わせは非常に有効な組成物となる。
【００２４】
更なる実施形態において、作用因子は、細胞内に取り込まれることにより診断上重要な情報を提供することができるレポーター分子でありうる。診断に適したレポーター分子は当業者に既知であり、適したレポーター分子は、例えば、当業者に既知の放射性分子又は蛍光トレーサー分子である。レポーター分子は、例えば、治療プロセス又は肺の状態をモニタリングするために使用されうる。
【００２５】
本発明による結合体の更なる必須成分は、作用因子を封入して、分解又は変性から作用因子を保護し、細胞内への導入を妨げず、むしろ実質的に促進する封入材料である。封入材料はカチオン性又は中性材料であり、例えば、ポリマー又はあらゆる他の層形成材料である。封入材料は、生物学的及び生理学的に許容可能であり、輸送中に作用因子を保護し、細胞内で分解されて生理学的に許容可能な分子を与え、作用因子に対して不活性である（作用因子と反応しない）ことが重要である。適切な封入材料は既知であり、あらゆる形態で入手可能である。カチオン性封入材料は核酸を封入するために好ましく、他の作用因子、例えば、タンパク質、作用物質、又はトレーサーは、カチオン性又は中性封入材料を用いてカプセル化することができる。
【００２６】
本発明の一実施形態において、特に、作用因子が核酸である場合に使用される封入材料はカチオン性ポリマーである。正に荷電した粒子は中性又は負に荷電した粒子よりも迅速に細胞に取り込まれる。しかし、これらは比較的非特定的な付着も促進する。カチオン性封入材料は、作用因子として核酸を封入するために好ましい。これは、カチオン性物質によって、核酸を非常に迅速に封入及び保護することができるからである。適切な方法は当業者には既知である。
【００２７】
封入材料は天然物質、合成物質、又は、カチオン誘導（cationically derivatized）した天然物質であり、例えば、脂質、ポリマー、又はオリゴマーでありうる。天然オリゴマーの一例は、スペルミンである。合成ポリゴマーは、例えば、窒素性生分解性ポリマー、具体的には、プロトン化することができる窒素原子を有するポリマーである。特に適しているものは、ポリエチレンイミンであり、具体的には、分岐ポリエチレンイミンであり、市販されている。適切な材料は、例えば、平均分子量が２５ｋＤａである分岐ポリエチレンイミンであり、市販されている。標的探索リガンドを結合したこの高分子は、非常に良好に許容されることが明らかとなっている。天然の、任意には誘導された層形成封入材料として使用可能な物質も、脂質、具体的にはカチオン性及び中性脂質である。脂質は多くの変体として入手可能であり、例えば、リポソームを形成するために用いることができる。Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｐｉｄ ６７という名称で入手可能であるカチオン誘導脂質が特に適している。スターチ又はスターチ誘導体のような糖分子をベースとするポリマーはあまり適当ではないので、本発明による封入材料として使用されない。
【００２８】
タンパク質、作用物質、又はトレーサーのような他の作用因子について、適切なポリマーが当業者に知られている。適切なポリマーは、生物的適合性を有し、少なくとも本発明によるプロスタサイクリン類似体と組み合わせて使用され、炎症を引き起こさず、他のいかなる方法においても細胞に損傷を与えず、そして、標的（すなわち、細胞）に到達すると作用因子を放出するポリマーである。
【００２９】
作用因子結合体は、コーティング材料と、例えば、それ自体既知であり調製方法も良く知られている、ナノ粒子又はナノカプセル、及びリポソーム等から成る。適切な方法は、放出制御可能な、ポリラクチド及び／又はポリグリコライドのような、生分解性ポリマーである。よって、予め定めた方法で作用因子が放出されるようにコーティング材料を選択することができる。そのようなコーティング材料は、文献中に種々の実例を挙げて説明されており、当業者は非常に多数の材料の中から目的に最適の材料を選択することができる。
【００３０】
既知の方法によって、活性薬剤を封入材料で封入又はコーティングする。作用因子及び封入材料の複合体は、以下、「作用因子複合体」と称する。本発明において、「封入する」とは、ポリマーによって作用因子を生理環境から保護して、標的に到達するまで変性又は分解されないようにすることをいう。封入は作用因子を取り囲む単一層のみでもよいが、作用因子を埋め込み又は封入したリポソームか、ナノ粒子、又はマイクロ粒子であってもよい。錯形成（complexing）によって作用因子を封入することもできる。本発明による結合体について使用可能な種々の形式による作用因子の封入又はコーティングが当業者に既知であり、それらは、標的探索リガンドの受容体への結合を阻害することがなく、細胞内への結合体の導入及び作用因子の細胞中への放出を阻害することがない限りにおいて、使用可能である。封入材料及び／又は適切な粒子の調製による作用因子の封入は、慣習的な方法によって実施可能である。最もシンプルな実施形態においては、例えば、核酸のような活性薬剤を、例えば、溶解状態が適切な場合に、ポリエチレンイミンのようなカチオン性ポリマーである封入材料と混合する。
【００３１】
本発明において標的探索構造として使用される少なくとも一種のプロスタサイクリン類似体を、封入前又は封入後に封入物質に対して結合する。封入材料に対してリガンドを結合しても、作用因子の活性に悪影響を及ぼすことはない。リガンドの結合又は固定化によって、受容体への結合能は損なわれない。当業者に既知のリガンドの固定化方法を本発明においても使用することができる。当業者は、ある封入物質及びリガンドの適合性について、これらから所望の作用因子複合体を調整して、遊離リガンドの結合能と調整した複合体の結合能とを比較することにより、その封入物質及びリガンドの適合性を調査することができる。更に、封入前のフリーの作用因子の活性と、放出後の作用因子の活性とを測定することにより、作用因子に関する封入物質の適合性を調査することができる。
【００３２】
封入材料を作用因子の封入に使用する前に、リガンドを封入材料に直接結合させることができる。このような実施形態は、封入材料がカチオン性ポリマーであり、作用因子が核酸である場合に適している。また、作用因子複合体を最初に形成してから、リガンドを結合させることも可能である。このような実施形態は、作用因子複合体をナノ粒子、ナノスフィア、又はリポソームとして形成する場合に適している。適切な場合には、スペーサーによって封入材料に対してリガンドを結合させ、結合活性を有するリガンドの部位が結合可能となるようにする。これにより、結合によって活性薬剤が影響を受けず、さらに、表面の少なくとも一種のプロスタサイクリン類似体をＩＰ１受容体に対して自由に結合可能とすることができる。例えば、プロスタサイクリン類似体のようなリガンドは、封入材料に対して、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、のようなあらゆるタイプの結合を形成することで結合することができ、これらの結合は、リガンドを固定化させるために十分であり、さらに、受容体に対する結合能が悪影響を受けない限りにおいて、採用可能である。従って、プロスタサイクリン類似体を封入材料に対して、例えば、共有又はイオン結合によって、直接又はスペーサーを介して結合させることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がスペーサーの一例として当業者に知られている。
【００３３】
カップリングの程度、即ち、結合体又は封入された粒子がリガンドをどの程度引き付けるかは、結合体粒子あたりのリガンド数で表され、作用因子の放出に影響するため、細胞内における作用因子の活性に影響する。封入された粒子に結合するリガンド量は極度に多くない方が好ましい。これは、リガンド量が極度に多いと、受容体を標的とした結合が阻害されて、結果的に、立体障害となってしまうからである。当業者は、日常的な実験により理想的な結合の程度を見出すことができる。リガンド量は、封入材料の性質及び粒子の大きさに依存する。
【００３４】
カップリングの程度が高いと、作用因子の放出が不完全となるおそれがあることが見出された。カチオン性ポリマーを封入にしようした場合、カップリングはポリマーあたり１５リガンド以下であるべきである。他方、標的結合を実現するために、少なくとも１種のプロスタサイクリン類似体を各封入粒子に結合する必要がある。
【００３５】
各場合において、一種類のプロスタサイクリン類似体を結合体又は粒子に対して結合させることができる。適切な場合に、二種以上のプロスタサイクリン類似体の混合物を結合させて、結合能及び／又は細胞内取り込みを強化することも可能である。
【００３６】
封入材料の活性薬剤に対する割合は、活性に影響することが見出された。十分な封入材料が存在しない場合、活性薬剤は十分に保護されない。封入材料の割合が高すぎると、第１に、適合性の問題が生じ、第２に、封入材料の割合が過度に高いことにより活性薬剤の放出が不可能になるという問題が生じる。いずれの場合においても、運搬効率が悪影響を受ける。当業者は幾つかの日常的な実験により、最適な割合を決定することができる。封入材料の活性薬剤に対する割合は、重量ベースで１０：１から１：４の範囲であることが特に適していることが証明された。封入材料の作用因子に対する割合は、４：１から１：４であることが特に好ましい。結合体が作用因子として核酸を含み、ポリマーとしてポリエチレンイミンを含む場合、ポリマーの割合は、ポリマーの窒素含量のＤＮＡリン酸塩含量に対するモル比によっても表すことができ、その割合は、好ましくは２〜１０、特に好ましくは、４〜８である。ポリマーの窒素含量のＤＮＡリン酸塩含量に対するモル比が４対８である場合、取り込み特性に最適な結合体粒子の流体力学直径は、５０〜１００ｎｍの範囲であることが明らかになった。
【００３７】
さらに、リガンド密度を封入の程度に適合させた場合に、最適な結合体を得ることができるということが明らかになった。封入材料の割合が比較的高い場合、作用因子が過剰に保護されてしまうため、リガンド密度を過剰に高くすべきではない。封入材料の割合を比較的低い範囲とすると、それに応じてリガンド密度を比較的高い範囲とすることができる。
【００３８】
本発明による結合体は、作用物質を気管支上皮細胞及び／又は肺胞上皮細胞に導入するために理想的な物質である。従来技術に記載の標的リガンド（ターゲッティングリガンド）を有する粒子の５％以下のみが標的（即ち、細胞）に到達し、従来技術に記載のリガンド含有結合体の５０％以下のみが標的に到達してその機能を発揮することができるに過ぎない。一方、本発明による結合体の５０％超、しばしば、６０％以上、時には、最大８０％が細胞によって取り込まれて、作用因子を放出する。
【００３９】
従って、本発明により、活性成分を高効率で標的細胞に導入することができる方法を提供する。該方法によれば、細胞内への輸送中に活性薬剤が良好に保護され、細胞に到達する活性薬剤の割合が非常に高く、本発明による結合体の構造に起因して摂取効率が非常に高い。
【００４０】
更なる実施形態において、本発明による結合体は、例えば、ポリエチレングリコール鎖を有して肺の中における生存時間を延長できる、カチオン性ポリマー封入材料により封入された粒子を更に提供することにより、本発明による結合体を更に改良することができる。核酸のような活性分子を、ペグ化によって保護することは既知であり、通常の方法を用いて保護することもできる。
【００４１】
本発明による結合体を用いて様々な肺疾患を治療することができる。特に、本発明による結合体は、遺伝子欠損又はタンパク質欠損に起因する肺疾患を治療又は緩和するのに適している。その一例は、嚢胞性線維症である。上述のように、欠如又は欠損遺伝子を細胞内に導入するだけではなく、欠如又は欠損遺伝子によりコードされているタンパクシツを細胞内に導入することが可能である。
【００４２】
本発明による結合体の更なる応用技術分野は、ワクチンとしての使用である。このような実施形態では、結合体の活性成分は、免疫調節活性又は免疫活性ペプチド、若しくはタンパク質、又は免疫調節活性又は免疫活性ペプチド、若しくはタンパク質をコードする遺伝子の何れかである［１，２］。この実施形態の利点は、例えば、噴霧器又はエアロゾルを用いて、非侵襲的に肺からワクチンを投与することができる点である。このような技術は複雑ではなく、衛生環境に起因して、又は、適切に訓練された人員が不足していることにより、注射による投与に問題がある状況でさえ投与を可能にし、さらに、複数用量を容易に実現して、免疫応答を強化することができる。さらに、肺は表面積が大きく、免疫活性細胞を有するため、ワクチン接種目的に非常に適している。
【００４３】
本発明による結合体は、肺への投与のために提供される。このため、吸入又は噴霧により肺に導入される医薬組成物として既知のものと同様に処方することができる。適切な処方は当業者に既知である。従って、結合体を懸濁液又はエマルジョンとして調製して、噴霧器又はエアロゾルによって、運搬体として不活性ガスを伴って投与することができる。また、結合体は粉末として提供することも可能である。
【００４４】
本発明は以下の実施例によってより詳細に説明するが、本発明は実施例によって制約されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
封入材料でコーティングされ、標的探索構造としてイロプロスト又はトレプロスチニルを有する粒子の結合体を調製及び検証した。
【００４６】
［材料及び方法］
化学物質及びプラスミドの供給元、並びに使用濃度は以下の通りである。
イロプロスト、トレプロスチニル、ＣＲＹ１０４４９：ケイマンケミカル社（米国ミシガン州)
分岐ポリエチレンイミン（平均分子量２５ｋＤａ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リン酸ナトリウム、ピクリルスルホン酸溶液、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びヘパラン硫酸：シグマアルドリッチ社（独国、シュネルドルフ）
ＰＥＩを再蒸留水（注射用の水、Ｂブラウンメルズンゲンアーゲー社（独国メルズンゲン））に希釈し、塩酸水溶液を用いてｐＨを７に調節した。
リン酸ナトリウムを再蒸留水に溶解して、濃度を０．５ｍＭとし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．５に調節した。
ＨＥＰＥＳを蒸留水に溶解して、濃度を０．１Ｍとし、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．４に調節した。
ヘパラン硫酸を再蒸留水に溶解して濃度を５ｍｇ／ｍｌとした。
エタノール（分析グレード）及び３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）：メルク社（独国ダルムシュタット）
ＭＯＰＳを再蒸留水に溶解して、濃度を０．１Ｍとし、塩酸水溶液を用いてｐＨを６に調節した。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及び５−（及び６−）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＮＨＳ）：ピアース社（米国ロックフォート）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：アマシャムバイオサイエンス社（米国南サンフランシスコ）
Ｄ−ルシフェリン：シンケムＯＨＧ社（独国フレンスベルク／アルテンブルク）
初期サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御によりフォティナス・ピラリス（Fotinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子を含有させたｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミド、及びｐＣｐＧ−ｌｕｃプラスミドは、大腸菌中で増殖され、高度に精製された状態（ＬＰＳ含量≦０．１Ｅ．Ｕ．／μｇＤＮＡ）で、プラスミドファクトリー社（独国ビーレフェルト）により得た。スーパーコイルｐＤＮＡの量は、ｐＣＭＶ−ｌｕｃでは９０％ｃｃｃ（共有結合閉環）以上であり、ｐＣｐＧ−ｌｕｃでは、９８％ｃｃｃ以上であった。
【００４７】
［使用した細胞株］
Ａ５４９細胞（ヒト肺胞上皮細胞）：ＤＳＭＺ（deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen［ドイツ国微生物及び細胞培養物コレクション］、独国ブラウンスヴァイク）
ＢＥＡＳ−２Ｂ（ヒト気管支上皮細胞）、Ｈ４４１（ヒト細気管支上皮細胞）：ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）
１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞：ヒト気管支上皮細胞
Ａ５４９、ＢＥＡＳ−２Ｂ、及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞株を３７℃、空気中のＣＯ２が５％の湿気環境で、基礎培地（ＭＥＭ、ジブコ−ＢＲＬ社製（独国カールスルーエ））中で培養し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ジブコ−ＢＲＬ社製（独国カールスルーエ））を追加した。Ｈ４４１細胞株を３７℃、空気中のＣＯ２が５％の湿気環境で、基礎培地（ＭＥＭ、ジブコ−ＢＲＬ社製（独国カールスルーエ））中で培養し、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、ジブコ−ＢＲＬ社製（独国カールスルーエ））中で培養し、１０％ＦＣＳを追加した。
【００４８】
［動物］
１４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバーラボラトリー社、独国スールツフェルト）を特定病原体未感染条件下で飼育した。実験に先立って、マウスを少なくとも７日間順応させた。すべての動物取り扱い手順は動物実験倫理委員会によって承認及び検査され、Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｃｈｔ ｚｕｍ Ｓｃｈｕｔｚ ｖｏｎ Ｔｉｅｒｌｅｂｅｎ［独国動物生命保護法］によるガイドラインに従って実施した。
【００４９】
［ウェスタンブロット分析］
Ａ５４９−，ＢＥＡＳ−２Ｂ、及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をＰＢＳで洗浄して、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムを含む溶解（lysis）バッファー中で氷冷溶解した。１ｍＭのＤＴＴ及びプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム）を、使用前に直接新たに添加した。バイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド社、独国ミュンヘン）によりタンパク質濃度を測定した。各細胞株について、５０μｇのタンパク質をＳＤＳサンプルローディングバッファー（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２％ＤＴＴ、０．００１％ブロモフェノールブルー）で希釈し、５分間沸騰させ、７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（バイオラッド社、独国ミュンヘン）上で分離させ、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社、独国シュヴァルバハ）に転写した。５％スキムミルク粉末（シグマアルドリッチ社、独国デイセンホッヘン）ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  (ｐＨ７．６)、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１%のＴｗｅｅｎ−２０）で、室温で１時間、膜をブロックした。ＩＰ１受容体用の１次ポリクローナル抗体（希釈１：５００）（ケイマンケミカル社、米国ミシガン州）を０．５％スキムミルク中で１晩培養した。膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、２次ＨＲＰ結合抗ラビット抗体（希釈１：１５０００、バイオラッド社、独国ミュンヘン）と共に０．５％スキムミルク中で、室温で１．５時間培養した。ＴＢＳ−Ｔによる数回の洗浄ステップの後に、製造元の説明書に従って、ＥＣＬ測定キット（ピアース社、米国ロックフォート）を用いた化学発光の測定を実施した。
【００５０】
［フルオレセインＢＳＡ−イロプロスト（ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ）及びフルオレセインＢＳＡ−トレプロスチニル（ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰ）の合成］
ＢＳＡの２０ｍｇ（０．３μｍｏｌ）を２．５ｍｌのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）で希釈し、１０倍モル過剰のフルオレセインＮＨＳと混合した。室温で１時間攪拌した後、混合物をＰＢＳ平衡セファデックスＧ２５ＭＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ）で精製した。０．７ｍｇ（１．８μｍｏｌ）のＩＬＯ又は０．８ｍｇ（１．８μｍｏｌ）のＴＲＰを１３０μｌの分析グレードエタノールに溶解し、３７０μｌのＭＯＰＳバッファー、０．１Ｍ、ｐＨ６、０．５ｍｇ（５ｍＭ）のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ＭＯＰＳバッファー中）、及び０．２ｍｇ（２ｍＭ）のＥＤＣ（ＭＯＰＳバッファ中）に添加して、混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、５μｌ（２０ｍＭ）のＤＴＴ（蒸留水中）を添加し、１９０μｌ中３ｍｇ（４５．２ｎｍｏｌ）のＦＬＵＯ−ＢＳＡ、及び２１０μｌの０．５Ｍリン酸バッファーを、ピペットによって迅速に反応溶液に注入した。混合物を室温で２時間混合して、ＰＢＳ平衡セファデックスＧ２５ＭＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ）で精製した。ＢＳＡ標準曲線を用いたバイオラッドプロテインアッセイにおいて、ＢＳＡの量を定量的に評価した。最終産物及び中間産物のカップリング効率をＴＮＢＳアッセイによって測定し［２１］、吸光度を４９５ｎｍで測定した。ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＢＳＡ−ＴＲＰのカップリング度は、ＢＳＡ１ｍｏｌあたり、ＩＬＯ又はＴＲＰが１０ｍｏｌであることが明らかとなった。
【００５１】
［イロプロストをグラフトしたＰＥＩポリマー（ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ）の合成］
様々な程度のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯのカップリングを、反応混合物に添加するＥＤＣ量を変化させて合成した。ＩＬＯ１ｍｇ（２．８μｍｏｌ）を分析グレードエタノール１００μｌに希釈し、９００ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の６８ｎｍｏｌのＰＥＩ及び１ｍｇ（５ｍＭ）のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳと混合した。様々な量のＥＤＣを添加して最終濃度をそれぞれ２５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、又は１００ｍＭとし、混合物を室温で４時間攪拌しながら培養した。再蒸留水で平衡化したセファデックスＧ２５ＭＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ）で反応混合物を精製した。ＰＥＩ濃度を、ウンガロらによる文献［２２］に記載のようなＣｕＳＯ４テストで測定した。ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯの１Ｈ−１Ｄ ＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏ中で、ブルーカー社（Bruker）ＡＶ２５０ＭＨｚスペクトロメーターで測定した。ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯのカップリング度は、δ（１Ｈ）＝２．５〜３．１ｐｐｍにおけるＰＥＩ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−）の幅広多重線（broad multiplet）と、δ（１Ｈ）＝１．７３ｐｐｍにおけるＩＬＯ（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）の末端メチル基の一重線とを統合することによって算出した。ＩＬＯのＰＥＩに対する共有結合は、４つの異なるカップリング度（ＦＩＬＯ（ｍｏｌ ＩＬＯ／ｍｏｌ ＰＥＩ）＝２,５,８,１６）に反映される。ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯは、少量の等分量に分割し、液体窒素中で凍結保存し、この後使用するまで−８０℃に維持した。
【００５２】
［ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰを用いた培養実験］
Ａ５４９，Ｈ４４１，１６ＨＢＥ１４ｏ−及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞について、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの受容体結合／取り込みを調査した。ＦＡＣＳ測定実験のために、２４−ウェルプレート（ＴＰＰ社、スイス国トラサディンゲン）に、結合体を添加する２４時間前に１０００００細胞／ウェルを播種した。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ，ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰ、及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ結合体をＭＥＭに希釈して濃度を０．５μＭとし、細胞を３７度で５時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって細胞をウェルから除去し、ベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳスキャン（米国サンノゼ）を用いてＦＡＣＳ測定を実施した。共焦点レーザー走査顕微鏡のために、ＢＤＦａｌｃｏｎカルチャー（ＢＤバイオサイエンス社、米国サンノゼ）の４つのチャンバーを有するスライドであって、１つのチャンバーあたり２５０００個の細胞を有するスライドについて実験を実施した。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡの培養は上述のようにして実施した。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、標準的な手順で、核を０．３３μＭのＤＡＰＩ（４‘，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色し、Ｆ−アクチンをＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ファロイジン（インビトロゲン社、独国カールスルーエ）で染色した。スライドに溶媒（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、ベクターラボラトリー社、米国ベーリンガム）を広げ、共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ社、独国ゾルムス）を用いて撮像した。
【００５３】
［ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯのＣＡＹ１０４４９に対する結合の阻害実験］
１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞について、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの受容体結合／取り込みの阻害を調査した。上述のようにして２４−ウェルプレートを準備した。ＣＡＹ１０４４９をＭＥＭに希釈して濃度を１５μＭ、３０μＭ、及び１５０μＭとし、混合物を３７℃で１５分間培養した。その後、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡを添加して最終濃度を２５ｎＭとし、細胞と共に３７℃で４時間培養した。結合／取り込みはＦＡＣＳを用いて測定した。
【００５４】
［遺伝子ベクター粒子の調製］
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）及びＰＥＩ又はＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯをそれぞれ２５μｌの再蒸留水に希釈した。様々なＮ／Ｐ比（ＰＥＩ窒素のＤＮＡリン酸塩に対するモル比）を試験した。ｐＣＭＶ−ｌｕｃ溶液を同一量のポリマー溶液に添加し、ピペッティングにより８回上下させて穏やかに混合し、２０μｇｐＣＭＶ−ｌｕｃ／ｍｌの濃度の粒子とした。遺伝子導入粒子を室温で２０分間培養した。
【００５５】
［粒子サイズの測定］
粒子サイズ（動的光散乱によって測定する）をゼータパルス／ゼータ電位分析装置（ブルックヘブンインスツルメント社、オーストリア国ウィーン）を用いて測定した。遺伝子ベクター粒子は上述のようにして生成した。以下のような設定、即ち、１つの試料あたり１分間の測定を５回、水の粘度０．８９ｃＰ、参照インデックス１．３３０、温度２５℃、で測定を実施した。
【００５６】
［ＤＮＡリターデーションアッセイ］
Ｎ／Ｐ＝４で、様々なカップリング度のＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ及びＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ遺伝子ベクター粒子を、上述のようにして再蒸留水中で調製した。各粒子溶液５μｌを再蒸留水２μｌ又はヘパラン硫酸溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２μｌと混合した。４５分間培養した後、試料を１μｌのローディングバッファー（水に対して、ブロモフェノールブルー０．２５％、キシレンシアノールＦＦ０．２５％、グリセロール３０％）と混合し、０．８％アガロースゲルのウェルにそれぞれ充填し、１２５Ｖでアガロースゲル電気泳動を１時間実施して分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色して、ＵＶ光でＤＮＡバンドを可視化した。
【００５７】
［インビトロトランスフェクションの調査］
トランスフェクションの２４時間前に、Ａ５４９，１６ＨＢＥ１４ｏ−、及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を２４ウェルプレート（ＴＰＰ社、スイス国トラサディンゲン）に、１０００００細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＣＳを含み、０．１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションの前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、４５０μｌの未使用の血清非含有培地を各ウェルに添加した。その後、１μｇのｐＣＭＶ−ｌｕｃに相当する５０μｌの遺伝子ベクター粒子を細胞上にピペットで滴下した。阻害実験のために、遺伝子ベクター粒子を添加する１５分前に、濃度１５０μＭでＣＡＹ１０４４９を未使用の培地に添加した。４時間培養下の地、トランスフェクション培地を、１０％ＦＣＳを含み、０．１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＭＥＭによって除去した。トランスフェクションの２４時間後に、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０マルチラベルカウンター（パーキンエルマー社、米国ボストン）を用いて、フス等により記載されたようにして［２３］、ルシフェラーゼ活性を測定した。バイオラッドプロテインアッセイを使用し、ＢＳＡをタンパク質の標準として、結果を全細胞タンパク質含量に正規化した。
【００５８】
［インビボ遺伝子導入調査］
マウスへのエアロゾル供給用のベクター粒子を準備するために、ｐＣｐＧ−ｌｕｃ及びＰＥＩ又はＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯを、注射用にそれぞれ４．０ｍｌの水で希釈した（Ｂブラウンメルズンゲンアーゲー社、独国メルズンゲン）。これにより、濃度は、それぞれ、ｐＣｐＧ−ｌｕｃが２５０μｇ／ｍｌ、ＰＥＩが１３０．４μｇ／ｍｌとなった（Ｎ／Ｐ比４に相当）。ｐＣｐＧ−ｌｕｃ溶液をＰＥＩ溶液にピペット注入して、８回上下させて混合し、最終的なＤＮＡ濃度を１２５μｇ／ｍｌとした。使用前に粒子を室温で２０分間培養した。ルドルフらによる文献［２４］に記載された縦方向全身エアロゾル装置に接続されたパリＬＣ＋噴霧器を有するパリ・ターボボーイ（登録商標）Ｎ吸入器（パリ社、独国シュタルンベルク）を用いて、粒子を噴霧した。２４時間後、マウスを麻酔し、Ｄ−ルシフェリン基質（マウス１匹あたり１．５ｍｇ／５０μｌＰＢＳ）を経鼻投与（sniffing）により肺内投与した［２５］。１０分後、（ＩＶＩＳ１００イメージングシステム、キセノジェン社、米国アラメダ）により生物発光を測定した。カメラ設定は、視野１０、Ｆ１  ｆ−ストップ、高解像度ビニング、露出時間１０分とした。肺内のレポーター遺伝子の発現度を確認するために、インビボ生物発光イメージングした後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死（sacrifice）させた。正中線に沿って切開して腹膜を開き、マウスの肺を切除してＰＢＳでかん流した。肺を液体窒素で凍結保存して、凍結状態でホモジナイズした。４００μｌの溶解バッファー（ｐＨ７．８の２５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ロシュコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠）を添加し、氷上で２０分培養した後、上澄みのルシフェラーゼ活性をＬｕｍａｔＬｂ９５０７チューブルミノメーター（ＥＧ＆Ｇベルトールド社、独国ミュンヘン）を用いて測定した。組み換え型ルシフェラーゼ（ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム）を肺細胞中で発現したルシフェラーゼ量を算出するための基準として使用した。
【００５９】
［ＭＴＴベースアッセイ］
Ｎ／Ｐ比４で、１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞について、ＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ又はＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子の毒性を評価した。実験の２４時間前に、８００００細胞／ウェルの密度で細胞を２４−ウェルプレートに播種した。上述のようにしてトランスフェクションを実施した。４時間後、トランスフェクション混合物を４００μｌの培地と置き換えて、製造元の説明書に従って、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット１（ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム）を用いてＭＴＴベース試験を実施した。未処理の細胞の吸光度を１００％生存細胞として設定して、未処理の細胞を参照として使用した。
【００６０】
［血清の回収及びサイトカイン濃度の分析］
エアロゾル供給の２４時間後に、血液試料をマウスから採取し、４℃で一晩保存した。血液を遠心分離にかけて、血清を回収した。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を、製造元の説明書に従って、マウスＩＬ−１２（Ｐ４０／Ｐ７０）及びマウスＩＮＦ−γ−ＥＬＩＳＡキット（レイバイオテック社、米国ノークロス）を用いて定量的に測定した。未処置のマウスの濃度を１と設定して、未処置のマウスを参照として使用した。
【００６１】
［統計分析］
結果を平均値±標準偏差で示す。統計的に有意な差を、独立スチューデントＴ検定によって評価した。ｐ＜０．０１である場合に有意であるとした。
【００６２】
［結果］
［ウェスタンブロットによる肺細胞内におけるＩＰ１受容体の発現の確認］
ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９）及び気管支上皮細胞（ＢＥＡＳ−２Ｂ，１６ＨＢＥ１４ｏ−）内におけるＩＰ１受容体の発現をウェスタンブロット分析により確認した。４７ｋＤａにタンパク質バンドが検出された（図１）、このバンドは、細胞膜上で発現したＩＰ１受容体タンパク質のグリコシル化型に対応する［２６］。よって、タンパク質又は遺伝子を輸送するためにＩＰ１受容体を標的としてアドレスすることが可能か否かを確認した。
【００６３】
［様々なＩＰ１受容体リガンドによる肺細胞へのアドレス］
受容体媒介遺伝子導入のためにＩＰ１受容体を標的とすることを調査するために、ＴＲＰ及びＩＬＯを、モデル物質として作用するフルオレセイン標識ウシ血清アルブミン（ＦＬＵＯ−ＢＳＡ）に化学的にカップリングした。Ａ５４９及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をＦＬＵＯ−ＢＳＡと共に培養すると、非特異的バックグラウンド結合を生成し、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯと共に培養すると、５．５±０．５％ 及び３９．３±０．６％の陽性Ａ５４９細胞と、５１±１．８％及び７６．１±１．４％陽性１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をそれぞれ生じる（図２）。Ａ５４９及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯで培養した方がＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰで培養したものよりも有意に高かった。これらの結果は、ＴＲＰ及びＩＬＯはモデル物質ＦＬＵＯ−ＢＳＡの肺細胞に対して結合することを媒介することができるが、ＩＬＯはより効率的な標的リガンドであることを示す。
【００６４】
［様々な肺細胞株に結合するＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの特異性］
ＴＲＰと比較して良好な細胞結合／取り込みを解明するために、追加の肺細胞株について、標的リガンドであるＩＬＯを更に調査した。Ａ５４９及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞に加えて、Ｈ４４１及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞もＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯと共に培養すると、それぞれ、対照ＦＬＵＯ−ＢＳＡよりも陽性細胞が有意に多く（ｐ＜０．０１）、ＭＳＩが有意に高かった。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯを用いた場合、陽性細胞率はそれぞれ、３８．０±１．８％及び８２．７±１．６％であり、対照ＦＬＵＯ−ＢＳＡでは、それぞれ、９．１±１．９％及び１３．７±１．２％であった（図３Ａ）。このような効果は、ヒト気管支上皮細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ−,ＢＥＡＳ−２Ｂ）の方が、クララ細胞（Ｈ４４１）上皮細胞又は肺胞（Ａ５４９）上皮細胞よりも顕著であった。このような結果は、ヒト肺細胞の種類によって、細胞表面におけるＩＰ１受容体の発現が異なることを証明した。
【００６５】
肺細胞におけるＩＰ１受容体の結合の受容体特異性を確認するために、ＣＡＹ１０４４９量を上昇させつつ、１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯと共に培養した。ＣＡＹ１０４４９は、ヒトＩＰ１受容体の強力なアンタゴニストとして以前から報告されていた［２７，２８］。１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞を、ＣＡＹ１０４４９量を上昇させつつ、２５ｎＭのＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯと共に培養した。ＣＡＹ１０４４９を添加することで、蛍光陽性細胞数のみならず、ＭＦＩが、ＣＡＹ１０４４９の投与量に依存した減少（ｐ＜０．０１）傾向を示した（図３Ｂ）。使用するＣＡＹ１０４４９の濃度が最も高い場合、蛍光陽性細胞数は９５．７±０．７％から７．４±０．９％に減少した。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ結合体と共に培養した細胞を対照として使用したが、これらの細胞は、ＣＡＹ１０４４９を追加しても活性を示さなかった。過剰の未結合ＩＬＯを用いて比較実験を実施しても、同様の結果を得た。
【００６６】
阻害実験と共にＦＡＣＳ測定を実施したことにより、肺上皮細胞上におけるＩＰ１受容体の細胞型依存細胞表面発現の可能性が示唆された。ＩＬＯによってＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの細胞内取り込みが媒介されるかを更に試験するために、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて追加の実験を行った。０．５μＭのＦＬＵＯ−ＢＳＡ又はＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの何れかと共に、１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞を培養した。共焦点顕微鏡によって細胞を可視化すると、明確な細胞表面結合に続いて、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ結合体の細胞内取り込みが生じ（図３Ｃ）、ＦＬＵＯ−ＢＳＡは取り込まれないことが観察された。
【００６７】
［ＰＥＩ及びＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクター粒子のキャラクタリゼーション］
カルボイミジドの化学的性質によってＩＬＯをＰＥＩに結合し、ＦＩＬＯ＝２，５，８及び１６とし、得られた遺伝子ベクター粒子のサイズを動的光散乱で測定した（表１）。カップリング度がＦＩＬＯ＝２及び５で、Ｎ／Ｐ比４〜８の粒子は、ＰＥＩ遺伝子ベクターに相当する流体力学直径５０〜１００ｎｍを有した。Ｎ／Ｐが２のＰＥＩ、ＦＩＬＯ＝２でＮ／Ｐが２〜３のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ、及びＦＩＬＯ＝１６でＮ／Ｐが４のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯによって調製した粒子は、不安定であり沈殿した。１５０ｎｍ未満の粒子は、多分岐性が＜２であった。
【００６８】
【表１】
2013515023.tif 000003
【００６９】
次のステップにおいて、ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ構造体のＤＮＡ結合親和性を測定した。Ｎ／Ｐが４の粒子を調製し、ＤＮＡ遊離アッセイ（DNA release assay）を実施した（図４）。ＰＥＩ、ＦＩＬＯ＝２のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯについて、ヘパラン硫酸を添加するとＤＮＡが完全に遊離した。カップリング度が１６と高ければ、ＤＮＡは部分的にしか遊離しなかったので、プラスミドに対するポリマーの結合が比較的強いことが示唆された。１６以上のカップリング度は、好ましくない。
【００７０】
［インビトロトランスフェクション効率］
様々な肺細胞における、ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの結合及び取り込みの増大や、ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子を形成する可能性は、インビトロ遺伝子導入を改善するために、リガンドとしてＩＬＯを更に研究する理由である。ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターによって１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をトランスフェクションし、対照である未改変ＰＥＩと比較した。遺伝子導入効率はＮ／Ｐ比に従って上昇した。Ｎ／Ｐが４、ＦＩＬＯ＝５の場合に、遺伝子発現度は最高であった。このような最適条件下では、遺伝子発現度はＰＥＩよりも４６倍有意に高かった（図５Ａ）。比較的高いＮ／Ｐ比（＞４）での粒子形成では、遺伝子発現度が更に上昇することは無かった。その他のカップリング度のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ結合体では、ＰＥＩと比較してトランスフェクショングレードが同等かそれ以下であった。
【００７１】
ＣＡＹ１０４４９について競合的な阻害実験を実施して、ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターの受容体媒介遺伝子導入を確認した。１５０μＭのＣＡＹ１０４４９のある状態又は無い状態で、１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞を、Ｎ／Ｐを４として、ＰＥＩ、又はＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターの何れかでトランスフェクションした。ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターの遺伝子発現度は、ＰＥＩに対して３３倍有意に少なかった（図５Ｂ）。ＰＥＩによってトランスフェクションした細胞に関しては、ＣＡＹ１０４４９の影響は観察されなかった。
【００７２】
さらに、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯを、Ａ５４９細胞及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞について試験した。最適条件の下、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯによって媒介された発現度は、Ａ５４９細胞及びＢＥＡＳ−２Ｂ細胞について、それぞれＰＥＩよりも４５倍及び１４倍高かった（図５Ｃ）。
【００７３】
［インビボ遺伝子遊離実験］
ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ及びＰＥＩ遺伝子ベクター粒子をエアロゾルによってＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺に投与し、遺伝子投与の２４時間後に遺伝子発現を分析した。ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定と対比して、インビボ生物発光画像は、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターで処理したマウス肺において強い信号を呈したが、ＰＥＩ遺伝子ベクターの場合は検出限界に達した（図６Ａ）。肺細胞１ｍｇ当たりのルシフェラーゼの定量評価のために、マウスを安楽死させて肺を摘出した。ホモジナイズした肺細胞についてルシフェラーゼ発現を測定した結果、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクターの方がＰＥＩ遺伝子ベクターよりも１６倍有意に高かった（図６Ｂ）。
【００７４】
［インビトロ及びインビボ毒性］
遺伝子ベクター粒子（ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ又はＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）を適用した後のインビトロ生存率を、ＭＴＴアッセイにより測定した。ＰＥＩと比較して、細胞毒性に上昇は見られなかった（生存率は、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯで８６．０±１０．１％であり、ＰＥＩで８９．２±３．２％であった）。インビトロ毒性及び炎症を測定するために、処置マウスから血清を採取し、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を含む炎症サイトカインを測定した。インビトロＭＴＴの結果と同様に、遺伝子投与後２４時間後のＥＬＩＳＡによる測定では、サイトカインの有意な上昇は見られなかった。
【００７５】
上述の実験により、プロスタグランジン−Ｉ２類似体ＩＬＯ、ＩＰ１受容体アゴニストを標的リガンドとして用いて、インビトロ及びインビボの肺細胞における、ＰＥＩのようなカチオンポリマーを用いた遺伝子導入を改善することができることが明らかになった。標的リガンドとしてプロスタグランジン−Ｉ２類似体を有し、作用物質の封入剤としてカチオンポリマーを有する、本発明による結合体は、遺伝子発現を有意に改善することが明らかとなった。従って、実験により、ヒト肺胞（Ａ５４９）及び気管支上皮細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ−，ＢＥＡＳ−２Ｂ）におけるレポーター遺伝子発現を有意に（４６倍）増加させることが証明された。更に、マウス肺のルシフェラーゼ活性も、エアロゾル処理した場合に、ＰＥＩと比較して有意に（１４倍）高くなった。
【００７６】
ＩＬＯ及びＴＲＰはヒトＩＰ１受容体のアゴニストである［２９］。これらは両方とも、エアロゾル吸入による肺高血圧症の治療又は静脈内投与に承認されている［２０、３０、３１］。ＩＰ１受容体はヒト及びマウスの肺で発現され［１５、３２−３４］、ＩＰ１受容体／リガンド複合体は細胞内に内在化される［３５、３６］。これらの特性は本発明により実現され、肺細胞内に作用因子を導入するための改善されたシステムを実現する。
【００７７】
ＩＰ１受容体は、様々な種類の肺細胞で発現することがウェスタンブロットにより確認された。肺細胞表面におけるＩＰ１受容体の発現をより詳細に特徴づけるために、フルオレセイン標識ＢＳＡ結合体であって、ＩＬＯ又はＴＲＰの何れかにカップリングされた結合体を合成した。両構造体を肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）及び気管支上皮細胞株（１６ＨＢＥ１４ｏ−）と共に培養し、フローサイトメトリーによって細胞への結合を分析した。分析結果により、試験された各細胞株上にＩＰ１受容体が存在することが示された。しかし、ＩＬＯはＴＲＰよりも細胞表面結合がより明瞭であった。したがって、以後の実験において標的リガンドとしてＩＬＯを使用した。ＩＰ１受容体の結合の特異性は、特定のＩＰ１受容体アンタゴニストＣＡＹ１０４４９を用いた阻害実験［２７，２８，３２］及び過剰の遊離ＩＬＯにより証明された。
【００７８】
観察結果を確認するために、共焦点レーザー走査顕微鏡観察を実施し、細胞表面へのＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯの結合及び１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞内への細胞内取り込みを確認した。従って、これらの結果により、本発明において、結合及び結合物質の細胞内取り込みを媒介する標的リガンドとしてＩＬＯを使用することが確認できた。結合物質は、例えば、遺伝子ベクターナノ粒子の受容体媒介取り込みの前提物質（prerequisite）であるＦＬＵＯ−ＢＳＡである。
【００７９】
トランスフェクション実験を実施するために、アミド結合によりＩＬＯを２５ｋＤａの分岐ＰＥＩに結合した。合成により、カップリング度ＦＩＬＯ＝２、５、８及び１６の結合が得られた。ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子を１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞にスクリーンしたところ、Ｎ／Ｐが４でＦＩＬＯ＝５のときにトランスフェクション効率が最高であり、８〜１６という比較的高いカップリング度ではトランスフェクション率がより低かった。このことは、ＤＮＡ遊離アッセイにより確認されたように、カップリング度が高いとｐＣＭＶ−ｌｕｃの遊離が不完全となることに起因すると考えられる。ＰＥＩ／ｐ−ＤＮＡ粒子からのｐＤＮＡの遊離は、遺伝子導入が成功したことのクリティカルパラメーターとなることが見出されていた［３７］。ｐＤＮＡとＩＬＯとの追加の疏水的相互作用によってｐＤＮＡ結合が強化されることが推測される。様々な粒子のサイズを測定した結果、リガンド量が増加すると、ＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子の流体力学直径が最大１μｍまで大きくなることが証明された。Ｅｌｆｉｎｇｅｒらにより、クレンブテロールをＰＥＩにカップリングした場合に同様の結果が得られている［１３］。ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯを有する粒子は、直径１００ｎｍ未満である。比較的サイズの小さい粒子は比較的大きい粒子よりも効率的に内在化させることができるということは既に証明されてきた［３８］。Ｎ／Ｐが４でＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子による肺胞（Ａ５４９）及び気管支（１６ＨＢＥ１４ｏ−，ＢＥＡＳ−２Ｂ）上皮細胞のトランスフェクションは、Ｎ／Ｐ比が同じＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子と比較して、すべての実験対象とした細胞株においてレポーター遺伝子発現が４６倍増加した。ＭＴＴアッセイで測定したように、このような遺伝子発現の向上により、代謝毒性が大きく上昇することは無かった。更に、受容体媒介遺伝子導入の仮説は、特定のアンタゴニストによって媒介された１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞における阻害剤を用いた実験により更にサポートされた。ＣＡＹ１０４４９を添加したことで、ＰＥＩに匹敵する程度まで遺伝子発現が減少した。
【００８０】
ＣｐＧを含まないルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＣｐＧ−ｌｕｃ）を用いて、動物実験を行った。ＣｐＧを含まないプラスミドは、ＣｐＧを含むプラスミドよりも炎症作用が少ないということが明らかとされてきた。ＣｐＧを含まないプラスミドは、肺における比較的高く持続的な遺伝子発現につながることが証明されてきた［３９］。動物実験前に、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣｐＧ−ｌｕｃ及びＰＥＩ／ｐＣｐＧ-ｌｕｃ遺伝子ベクターを霧化して様々なフラクション（霧状、非霧状）を収集し、粒子の安定性を試験した。ゲルリターデーションアッセイ及び粒子サイズ測定の両方により、非霧化粒子と比較して霧化後の粒子に変化が無いことを確認した。これにより、エアロゾルの形成は粒子に悪影響を及ぼさないということが確認された。同様の結果はこれまでに報告されている［４０］。マウス肺へのエアロゾル投与後、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣｐＧ−ｌｕｃの遺伝子発現は、ＰＥＩ／ｐＣｐＧ-ｌｕｃ遺伝子ベクターよりも有意に、１４倍高かった。大量の血清中のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を測定した結果、これらのサイトカインは有意に増加しないことが明らかとなった。この結果は、ＰＥＩ−ＤＮＡ粒子のエアロゾル投与は、より高いサイトカイン応答を誘発しないことを証明した、Ｇａｕｔｈａｍらによる報告に一致する［４１］。
【００８１】
要するに、本発明により、肺に物質を投与するための新規な標的探索構造が提供されたということができる。プロスタサイクリン類似体、特にＩＬＯの標的探索目的のためのリガンドとしての可能性は、本発明者らによって認識され、肺細胞に対して物質を投与する「フェリー」として利用された。特に、ＩＬＯプロスタサイクリン類体は、エアロゾル状の非ウィルスベクター用の有用な標的探索リガンドである。フルオレセインベースの分子結合体を用いて、ＩＰ１受容体は、肺細胞における受容体媒介遺伝子導入の適切な候補であることが証明された。分子結合体の受容体特異的結合及び細胞内摂取は、肺胞細胞だけでなく、気管支上皮細胞及びクララ細胞についても証明された。本発明による結合体は、インビトロ及びインビボでの遺伝子発現に実質的に有意な増加をもたらした。遺伝子発現を１０倍超増加させることで、ｐＤＮＡ量及び遺伝子キャリア量を低減し、ＤＮＡ又はキャリアによって媒介される毒性及び炎症を抑えることができる。
【００８２】
これらの例の結果を図１〜７及び表１に示す。
【００８３】
表１：様々なＮ／Ｐ比で様々なカップリング度のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯを用いた、ＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ及びＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ遺伝子ベクターの物理的特性
【００８４】
粒子サイズ及び多分散性（括弧内）の測定結果を示す。測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）として示す。
【００８５】
［図１］
ウェスタンブロットは、ヒト肺胞（Ａ５４９）及び気管支（ＢＥＡＳ−２Ｂ，１６ＨＢＥ１４ｏ−）上皮細胞内の６７ｋＤａのＩＰ１受容体タンパク質の発現を示す。各レーンには４０μｇの抽出タンパク質を投入した。
【００８６】
［図２］
ＴＲＰ及びＩＬＯをＩＰ１受容体に標的投与して、肺胞（Ａ５４９）及び気管支（１６ＨＢＥ１４ｏ−）上皮細胞株に標的投与した結果を示す。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ，ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＴＲＰ、及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯを０．５μＭ（Ｎ＝４）の濃度で培養してＦＡＣＳ測定した。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１における統計的有意性を意味する。
【００８７】
［図３］
肺胞（Ａ５４９）、気管支肺胞（Ｈ４４１）及び気管支 (１６ＨＢＥ１４ｏ−、ＢＥＡＳ−２Ｂ)上皮細胞における、ＩＰ１受容体の分散及び受容体結合を示す。ＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡを０．５μＭ（Ｎ＝４）の濃度で培養し、ＦＡＣＳ測定を実施した（ａ）。１６ＨＢＥ１４ｏ−（ｂ，ｃ）及びＡ５４９（ｄ）細胞は、２５ｎＭのＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡ及び濃度を段階的に上昇させたＣＡＹ１０４４９（ｎ＝４）とともに培養し、ＦＡＣＳ測定を実施した（ｂ，ｃ，ｄ）。共焦点レーザー走査顕微鏡観察のために、０．５μＭのＦＬＵＯ−ＢＳＡ−ＩＬＯ及びＦＬＵＯ−ＢＳＡと共に１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞を培養した（ｅ）。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１における統計的有意性を意味する。
【００８８】
［図４］
ＰＥＩ、及び、Ｎ／Ｐ＝４の様々なＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ構造体のためのＤＮＡリターデーションアッセイを実施した。ｐＣＭＶ−ｌｕｃと結合したポリマーをヘパラン硫酸のある状態（＋）及び無い状態（−）で培養し、アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロマイドで染色した後にＵＶ光で可視化した。
【００８９】
［図５］
インビトロでのトランスフェクション効率を示す。様々なＮ／Ｐ比（ｎ＝４）の様々なＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ構造体と結合したｐＣＭＶ−ｌｕｃを有する１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞のトランスフェクションであり、ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定（ａ）、Ｎ／Ｐ比を４として、ＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ、及びＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子のＣＡＹ１０４４９（ｎ＝３）の阻害実験を実施し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した（ｂ）。Ｎ／Ｐ比４（ｎ＝６）で、Ａ５４９、１６ＨＢＥ１４ｏ−、及びＢＥＡＳ−２Ｂを、ＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ及びＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃでトランスフェクションし、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した（ｃ）。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、細胞内タンパク質１ｍｇあたり１０秒間、相対発光ユニット（ＲＬＵ）における発光として測定した。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１における統計的有意性を意味する。
【００９０】
［図６］
Ｎ／Ｐ比＝４で、ＰＥＩ／ｐＣｐＧ−ｌｕｃ及びＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣｐＧ−ｌｕｃ粒子によって得られた、エアロゾル投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボルシフェラーゼ遺伝子発現（ｎ＝５）を示す。２４時間後、露光時間１０分で生物発光画像を取得した（ａ）。トランスフェクションの２４時間後に、露光時間３０秒で、マウス肺ホモジネートにおけるルシフェラーゼ発現を測定した（ｂ）。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１における統計的有意性を意味する。
【００９１】
［図７］
ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ／ｐＣｐＧ−ｌｕｃ粒子、及び未処理の細胞と比較して、Ｎ／Ｐ＝４でＰＥＩ／ｐＣＭＶ−ｌｕｃ粒子でトランスフェクションした、肺胞 （Ａ５４９）及び気管支（１６ＨＢＥ１４ｏ−、ＢＥＡＳ−２Ｂ）上皮細胞は、ＭＴＴアッセイによる測定の結果、代謝毒性の増加は見られなかった（ａ）。更に、マウス肺にＦＩＬＯ＝１０のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯを投与した後のマウス血清において、インターロイキン−１２及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を測定し、ＰＥＩを投与したマウス及び未処置のマウスと結果を比較した。サイトカインに有意な増加は見られなかった。
【実施例２】
【００９２】
［肺細胞における投与量依存の遺伝子ベクター標的投与］
ｐＣＭＶ−ｌｕｃの量を１μｇから０．２５μｇへ減らしつつ、ＰＥＩ及びＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクター粒子で１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞をトランスフェクションした（図８）。トランスフェクション後２４時間で、遺伝子導入効率は投与量に依存して低下した。ｐＣＭＶ−ｌｕｃが１μｇである場合に、遺伝子発現度が最高であった。しかし、ＦＩＬＯ＝５のと結合したＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯが０．５μｇである場合に、未改変のＰＥＩに結合したｐＣＭＶ−ｌｕｃが１μｇの場合と同一の遺伝子発現度となった（３．３×１０５対３．２×１０５ＲＬＵ／１０秒／ｍｇタンパク質）。
【００９３】
遺伝子導入効率が投与量に依存して低下することを証明するために、遺伝子ベクター粒子量を減少させながら、トランスフェクション実験を実施した。この実験により、ＦＩＬＯ＝５のＰＥＩ−ｇ−ＩＬＯ遺伝子ベクター粒子は５０％に減少したが、発現は１００％のＰＥＩ遺伝子ベクター粒子と比較して同じであることが証明された。これらのデータは、発現度を同一に維持しながら、ｐＤＮＡ及び遺伝子キャリアの量を低減することができることを明確に示している。更に、ｐＤＮＡ及びキャリアにより媒介される毒性及び炎症を抑制することも可能である。
【００９４】
本例の結果を図８に示す。
【００９５】
本明細書において参照した文献を以下に示す。
【００９６】
1.  Gill DR, Davies LA, Pringle IA, Hyde SC. The development of gene therapy for diseases of the lung. Cell Mol. Life Sci. 2004 Feb;61(3):355-68.
2.  Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization*. Annu. Rev. Immunol. 2000;18:927-74.
3.  Davies L, Hyde, SC and Gill, DR Plasmid inhalation: delivery to the airways; 2005.
4.  Rudolph C, Schillinger U, Ortiz A, Plank C, Golas MM, Sander B, et al. Aerosolized nanogram quantities of plasmid DNA mediate highly efficient gene delivery to mouse airway epithelium. Mol. Ther. 2005 Sep;12(3):493-501.
5.  Canonico AE, Conary JT, Meyrick BO, Brigham KL. Aerosol and intravenous transfection of human alpha 1-antitrypsin gene to lungs of rabbits. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1994 Jan;10(1):24-9.
6.  McLachlan G, Baker A, Tennant P, Gordon C, Vrettou C, Renwick L, et al. Optimizing aerosol gene delivery and expression in the ovine lung. Mol. Ther. 2007 Feb;15(2):348-54.
7.  Alton EW, Stern M, Farley R, Jaffe A, Chadwick SL, Phillips J, et al. Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis: a double-blind placebo-controlled trial. Lancet. 1999 Mar 20;353(9157):947-54.
8.  Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1995 Aug 1;92(16):7297-301.
9.  Dunlap DD, Maggi A, Soria MR, Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery. Nucleic Acids Res. 1997 Aug 1;25(15):3095-101.
10.  Kircheis R, Kichler A, Wallner G, Kursa M, Ogris M, Felzmann T, et al. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery. Gene Ther. 1997 May;4(5):409-18.
11.  Chul Cho K, Hoon Jeong J, Jung Chung H, Joe CO, Wan Kim S, Gwan Park T. Folate receptor-mediated intracellular delivery of recombinant caspase-3 for inducing apoptosis. J. Control. Release. 2005 Nov 2;108(1):121-31.
12.  Elfinger M, Maucksch C, Rudolph C. Characterization of lactoferrin as a targeting ligand for nonviral gene delivery to airway epithelial cells. Biomaterials. 2007 Aug;28(23):3448-55.
13.  Elfinger M, Geiger J, Hasenpusch G, Uzgun S, Sieverling N, Aneja MK, et al. Targeting of the beta(2)-adrenoceptor increases nonviral gene delivery to pulmonary epithelial cells in vitro and lungs in vivo. J. Control. Release. 2009 May 5;135(3):234-41.
14.  Blessing T, Kursa M, Holzhauser R, Kircheis R, Wagner E. Different strategies for formation of pegylated EGF-conjugated PEI/DNA complexes for targeted gene delivery. Bioconjug. Chem. 2001 Jul-Aug;12(4):529-37.
15.  Coleman RA, Smith WL, Narumiya S. International Union of Pharmacology classification of prostanoid receptors: properties, distribution, and structure of the receptors and their subtypes. Pharmacol. Rev. 1994 Jun;46(2):205-29.
16.  Narumiya S, Sugimoto Y, Ushikubi F. Prostanoid receptors: structures, properties, and functions. Physiol. Rev. 1999 Oct;79(4):1193-226.
17.  Stitham J, Arehart EJ, Gleim SR, Douville KL, Hwa J. Human prostacyclin receptor structure and function from naturally-occurring and synthetic mutations. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007 Jan;82(1-4):95-108.
18.  Clark RB, Knoll BJ, Barber R. Partial agonists and G protein-coupled receptor desensitization. Trends Pharmacol. Sci. 1999 Jul;20(7):279-86.
19.  Ferguson SS. Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling. Pharmacol. Rev. 2001 Mar;53(1):1-24.
20.  Strauss WL, Edelman JD. Prostanoid therapy for pulmonary arterial hypertension. Clin. Chest. Med. 2007 Mar;28(1):127-42; ix.
21.  Snyder SL, Sobocinski PZ. An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines. Anal. Biochem. 1975 Mar;64(1):284-8.
22.  Ungaro F, De Rosa G, Miro A, Quaglia F. Spectrophotometric determination of polyethylenimine in the presence of an oligonucleotide for the characterization of controlled release formulations. J. Pharm. Biomed. Anal. 2003 Feb 5;31(1):143-9.
23.  Huth S, Lausier J, Gersting SW, Rudolph C, Plank C, Welsch U, et al. Insights into the mechanism of magnetofection using PEI-based magnetofectins for gene transfer. J. Gene Med. 2004 Aug;6(8):923-36.
24.  Rudolph C, Ortiz A, Schillinger U, Jauernig J, Plank C, Rosenecker J. Methodological optimization of polyethylenimine (PEI)-based gene delivery to the lungs of mice via aerosol application. J. Gene Med. 2005 Jan;7(1):59-66.
25.  Buckley SM, Howe SJ, Rahim AA, Buning H, McIntosh J, Wong SP, et al. Luciferin detection after intranasal vector delivery is improved by intranasal rather than intraperitoneal luciferin administration. Hum. Gene Ther. 2008 Oct;19(10):1050-6.
26.  Zhang Z, Austin SC, Smyth EM. Glycosylation of the human prostacyclin receptor: role in ligand binding and signal transduction. Mol. Pharmacol. 2001 Sep;60(3):480-7.
27.  Bley KR, Bhattacharya A, Daniels DV, Gever J, Jahangir A, O'Yang C, et al. RO1138452 and RO3244794: characterization of structurally distinct, potent and selective IP (prostacyclin) receptor antagonists. Br. J. Pharmacol. 2006 Feb;147(3):335-45.
28.  Clark RD, Jahangir A, Severance D, Salazar R, Chang T, Chang D, et al. Discovery and SAR development of 2-(phenylamino) imidazolines as prostacyclin receptor antagonists [corrected]. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004 Feb 23;14(4):1053-6.
29.  Olschewski H, Rose F, Schermuly R, Ghofrani HA, Enke B, Olschewski A, et al. prostacyclin and its analogues in the treatment of pulmonary hypertension. Pharmacol. Ther. 2004 May;102(2):139-53.
30.  Skoro-Sajer N, Lang I. Treprostinil for the treatment of pulmonary hypertension. Expert Opin. Pharmacother. 2008 Jun;9(8):1415-20.
31.  Krug S, Sablotzki A, Hammerschmidt S, Wirtz H, Seyfarth HJ. Inhaled iloprost for the control of pulmonary hypertension. Vasc. Health Risk Manag. 2009;5(1):465-74.
32.  Ayer LM, Wilson SM, Traves SL, Proud D, Giembycz MA. 4,5-Dihydro-1H-imidazol-2-yl)-[4-(4-isopropoxy-benzyl)-phenyl]-amine (RO1138452) is a selective, pseudo-irreversible orthosteric antagonist at the prostacyclin (IP)-receptor expressed by human airway epithelial cells: IP-receptor-mediated inhibition of CXCL9 and CXCL10 release. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008 Feb;324(2):815-26.
33.  Boie Y, Rushmore TH, Darmon-Goodwin A, Grygorczyk R, Slipetz DM, Metters KM, et al. Cloning and expression of a cDNA for the human prostanoid IP receptor. J. Biol. Chem. 1994 Apr 22;269(16):12173-8.
34.  Namba T, Oida H, Sugimoto Y, Kakizuka A, Negishi M, Ichikawa A, et al. cDNA cloning of a mouse prostacyclin receptor. Multiple signaling pathways and expression in thymic medulla. J. Biol. Chem. 1994 Apr 1;269(13):9986-92.
35.  Giovanazzi S, Accomazzo MR, Letari O, Oliva D, Nicosia S. Internalization and down-regulation of the prostacyclin receptor in human platelets. Biochem. J. 1997 Jul 1;325 ( Pt 1):71-7.
36.  Smyth EM, Austin SC, Reilly MP, FitzGerald GA. Internalization and sequestration of the human prostacyclin receptor. J. Biol. Chem. 2000 Oct 13;275(41):32037-45.
37.  Huth S, Hoffmann F, von Gersdorff K, Laner A, Reinhardt D, Rosenecker J, et al. Interaction of polyamine gene vectors with RNA leads to the dissociation of plasmid DNA-carrier complexes. J. Gene Med. 2006 Dec;8(12):1416-24.
38.  Rejman J, Oberle V, Zuhorn IS, Hoekstra D. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. Biochem. J. 2004 Jan 1;377(Pt 1):159-69.
39.  Hyde SC, Pringle IA, Abdullah S, Lawton AE, Davies LA, Varathalingam A, et al. CpG-free plasmids confer reduced inflammation and sustained pulmonary gene expression. Nat. Biotechnol. 2008 May;26(5):549-51.
40.  Rudolph C, Muller RH, Rosenecker J. Jet nebulization of PEI/DNA polyplexes: physical stability and in vitro gene delivery efficiency. J. Gene Med. 2002 Jan-Feb;4(1):66-74.
41.  Gautam A, Densmore CL, Waldrep JC. Pulmonary cytokine responses associated with PEI-DNA aerosol gene therapy. Gene Ther. 2001 Feb;8(3):254-7.
【図２】
2013515023.tif 000004
【図３ａ】
2013515023.tif 000005
【図３ｂ】
2013515023.tif 000006
【図３ｃ】
2013515023.tif 000007
【図３ｄ】
2013515023.tif 000008
【図３ｅ】
2013515023.tif 000009
【図４】
2013515023.tif 000010
【図５ａ】
2013515023.tif 000011
【図５ｂ】
2013515023.tif 000012
【図５ｃ】
2013515023.tif 000013
【図６ａ】
2013515023.tif 000014
【図６ｂ】
2013515023.tif 000015
【図７ａ】
2013515023.tif 000016
【図７ｂ】
2013515023.tif 000017
【図８】
2013515023.tif 000018
【図１】
2013515023.tif 000019
【国際調査報告】
2013515023.tif 000020
2013515023.tif 000021
2013515023.tif 000022
2013515023.tif 000023
2013515023.tif 000024
2013515023.tif 000025