(57)【要約】【課題】本発明は、ポリグルタミン酸を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を提供することを第１の課題とする。また、前記した架橋体を製造する際に、ポットライフの長い原料（架橋剤組成物）を提供することを第２の課題とする。【解決手段】本発明の架橋体は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものであることを特徴とする。本発明の架橋剤組成物は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミド化合物とを含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、
当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものである
ことを特徴とする架橋体。
【請求項２】
請求項１に記載の架橋体において、
当該架橋体が繊維状である
ことを特徴とする架橋体。
【請求項３】
請求項２に記載の架橋体において、
当該架橋体の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする架橋体。
【請求項４】
ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミドとを含む
ことを特徴とする架橋剤組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の架橋剤組成物において、
前記カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸および前記ポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと前記カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなる
ことを特徴とする架橋剤組成物。
【請求項６】
縮合性の官能基を有する親水性高分子およびその塩のうち少なくともいずれかである繊維状架橋体であって、
当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されている
ことを特徴とする繊維状架橋体。
【請求項７】
請求項６に記載の繊維状架橋体において、
前記親水性高分子が生体高分子である
ことを特徴とする繊維状架橋体。
【請求項８】
請求項７に記載の繊維状架橋体において、
前記生体高分子がポリグルタミン酸である
ことを特徴とする繊維状架橋体。
【請求項９】
請求項６から請求項８までのいずれか１項に記載の繊維状架橋体において、
当該繊維状架橋体の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする繊維状架橋体。
【請求項１０】
繊維状架橋体の製造方法であって、
縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、
数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と
前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、
前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、
前記紡糸工程における温度が１０℃以上である
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の繊維状架橋体の製造方法において、
前記親水性化合物がポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかである
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の繊維状架橋体の製造方法において、
前記高分子架橋剤がカルボジイミドである
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０から請求項１２までのいずれか１項に記載の繊維状架橋体の製造方法において、
当該繊維状架橋体を構成する繊維の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０から請求項１３までのいずれか１項に記載の繊維状架橋体の製造方法において、
前記紡糸工程における紡糸が静電紡糸である
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
【請求項１５】
請求項６から請求項９までのいずれか１項に記載の繊維状架橋体を、細胞培養基材に被覆してなるものである
ことを特徴とする細胞培養床。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞培養床において、
前記被覆する手段が塗布または吹付である
ことを特徴とする細胞培養床。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の細胞培養床において、
前記細胞培養基材の表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製である
ことを特徴とする細胞培養床。
【請求項１８】
請求項１５から請求項１７までのいずれか１項に記載の細胞培養床を用いる
ことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の細胞の培養方法において、
前記細胞が正常細胞または幹細胞である
ことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２０】
請求項１５から請求項１７までのいずれか１項に記載の細胞培養床を用いる
ことを特徴とする移植用細胞シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン酸を原料とした架橋体、当該架橋体を製造するための架橋剤組成物、繊維状架橋体、繊維状架橋体の製造方法、細胞培養床、細胞培養床による細胞の培養方法、および細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリグルタミン酸は納豆の糸として古くから知られている。近年、工業的にポリグルタミン酸を製造することが可能となり、生分解性、生体適合性、および高吸水性を有する樹脂として注目されている。そして、これを架橋したゲルは化粧品などの保湿剤として使用されている。
一方、ポリグルタミン酸を用いた繊維および繊維状架橋体についても種々の提案がなされている。例えば、ポリグルタミン酸を含む溶液を用いて静電紡糸を行い、得られた繊維に電子線架橋処理を行って繊維状架橋体を得る技術が開示されている（特許文献１参照）。前記した技術によれば、生分解性、生体適合性、吸水性および保水性に優れた繊維状架橋体を提供できる。また、ポリグルタミン酸からなる繊維に対し各種高分子架橋剤を用いて架橋する技術も開示されている（特許文献２参照）。前記した技術によれば、生分解性、生体適合性、および吸湿・吸水性に優れるとともに、吸湿・吸水した場合に水に溶解しない耐水性を備えた繊維状架橋体を提供できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−０１９０９３号公報
【特許文献２】特開２０１０−１９６１７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、水分吸収後の繊維状架橋体がゲル状となり、繊維形状を保つことは必ずしも容易ではない。また、遮蔽設備を有する電子線架橋装置が別途必要であり、コスト的にも問題がある。特許文献２に記載の技術では、架橋剤をポリグルタミン酸と混合して架橋剤組成物とした後、すぐに使用しなければならないほどポットライフが短い。
また、自家移植による再生医療の場においては、移植細胞の迅速な培養・調製が移植の成否の鍵となる。例えば、初代培養による移植片の製造に時間がかかると、熱傷等の皮膚移植の場合には生死にかかわることもある。
【０００５】
本発明の第１の目的は、ポリグルタミン酸を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を提供することにある。また、本発明の第２の目的は、前記した架橋体を製造する際に、ポットライフの長い原料（架橋剤組成物）を提供することにある。本発明の第３の目的は、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある繊維状架橋体を提供することにある。本発明の第４の目的は、紡糸工程において原料のポットライフが所定の範囲にある繊維状架橋体の製造方法を提供することにある。さらに、本発明の第５の目的は、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決すべく、本発明は、以下のような架橋体、架橋剤組成物、繊維状架橋体、繊維状架橋体の製造方法、細胞培養床、細胞培養床による細胞の培養方法、および細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供するものである。
（１）ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものであることを特徴とする架橋体。
（２）上述の（１）に記載の架橋体において、当該架橋体が繊維状であることを特徴とする架橋体。
（３）上述の（２）に記載の架橋体において、当該架橋体の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする架橋体。
（４）ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミドとを含むことを特徴とする架橋剤組成物。
（５）上述の（４）に記載の架橋剤組成物において、前記カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸および前記ポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと前記カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなることを特徴とする架橋剤組成物。
（６）縮合性の官能基を有する親水性高分子およびその塩のうち少なくともいずれかである繊維状架橋体であって、当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されていることを特徴とする繊維状架橋体。
（７）上述の（６）に記載の繊維状架橋体において、前記親水性高分子が生体高分子であることを特徴とする繊維状架橋体。
（８）上述の（７）に記載の繊維状架橋体において、
前記生体高分子がポリグルタミン酸である
ことを特徴とする繊維状架橋体。
（９）上述の（６）から（８）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体において、当該繊維状架橋体の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする繊維状架橋体。
（１０）繊維状架橋体の製造方法であって、縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、前記紡糸工程における温度が１０℃以上であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１１）上述の（１０）に記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記親水性化合物がポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかであることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１２）上述の（１０）または（１１）に記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記高分子架橋剤がカルボジイミドであることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１３）上述の（１０）から（１２）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体の製造方法において、当該繊維状架橋体を構成する繊維の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１４）上述の（１０）から（１３）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記紡糸工程における紡糸が静電紡糸であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１５）上述の（６）から（９）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体を、細胞培養基材に被覆してなるものであることを特徴とする細胞培養床。
（１６）上述の（１５）に記載の細胞培養床において、前記被覆する手段が塗布または吹付であることを特徴とする細胞培養床。
（１７）上述の（１５）または（１６）に記載の細胞培養床において、前記細胞培養基材の表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製であることを特徴とする細胞培養床。
（１８）上述の（１５）から（１７）までのいずれか１つに記載の細胞培養床を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
（１９）上述の（１８）に記載の細胞の培養方法において、前記細胞が正常細胞または幹細胞であることを特徴とする細胞の培養方法。
（２０）上述の（１５）から（１７）までのいずれか１つに記載の細胞培養床を用いることを特徴とする移植用細胞シートの製造方法
【発明の効果】
【０００７】
第１の発明によれば、ポリグルタミン酸（塩）を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を提供することができる。また、第２の発明によれば、前記した架橋体を製造する際に、原料のポットライフが長い架橋剤組成物を提供することができる。第３の発明によれば、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある繊維状架橋体を提供することができる。第４の発明によれば、紡糸工程において原料のポットライフが所定の範囲にある繊維状架橋体の製造方法を提供することができる。さらに、第５の発明によれば、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図２】実施例２により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図３】実施例３により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図４】実施例４により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図５】実施例５により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図６】実施例６により製造された繊維状架橋体の電子顕微鏡写真。
【図７】正常ヒト角膜上皮細胞を７日間培養した後の光学顕微鏡写真（実施例５により製造された繊維状架橋体を塗布したガラスシャーレを使用）。
【図８】正常ヒト角膜上皮細胞を７日間培養した後の光学顕微鏡写真（未処理のガラスシャーレを使用）。
【図９】正常ヒト皮膚繊維芽細胞を７日間培養した後の光学顕微鏡写真（実施例５により製造された繊維状架橋体を塗布したガラスシャーレを使用）。
【図１０】正常ヒト皮膚繊維芽細胞を７日間培養した後の光学顕微鏡写真（未処理のガラスシャーレを使用）。
【図１１】正常ヒト角膜上皮細胞を７日間培養した際の細胞数の変化を示すグラフ。
【図１２】正常ヒト皮膚繊維芽細胞を７日間培養した際の細胞数の変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本願の第１の発明における架橋体（以下、単に「本架橋体」ともいう。）は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものであることを特徴とする。本願の第２の発明における架橋剤組成物は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミド化合物とを含むことを特徴とする。なお、以下の説明において、第１の発明と第２の発明を特に区別する必要がない場合は、単に「本発明」と記載する。
【００１０】
［ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩］
本発明におけるポリグルタミン酸あるいはポリグルタミン酸塩は、公知の製法で得られたもの、あるいは天然物由来のものを使用することができる。
ポリグルタミン酸は、アミノ酸の一種であるグルタミン酸が直鎖状に連結した高分子で、生分解性や生体適合性などの特性を備えている。また、ポリグルタミン酸塩は吸湿性、吸水性および保水性に優れている。ポリグルタミン酸塩としては、アルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
【００１１】
紡糸性の観点より、ポリグルタミン酸（塩）は、質量平均分子量が２０万以上のものが好ましく、５０万以上のものがより好ましい。なお、後述する静電紡糸の場合は、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量が２０万未満であると、ポリグルタミン酸（塩）の濃度を上げても粒子しか生成されず、繊維状に紡糸することが困難となるおそれがある。
また、水溶液の取扱い性の観点からは、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量は１０００万以下のものが好ましい。なお、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量は、ＧＰＣ法により測定すれば求められる。
【００１２】
［架橋体および架橋剤組成物］
ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量を２０万以上とすることにより、紡糸による繊維化が容易となるが、得られた繊維はそのままでは吸湿、吸水して溶解してしまう。本発明では、ポリグルタミン酸（塩）を、高分子架橋剤である数平均分子量１０００以上のカルボジイミド（以下、「本カルボジイミド」ともいう。）と混合して架橋剤組成物を調製し、紡糸を行った後に熱架橋することで耐水性の繊維状架橋体とすることができる。
【００１３】
本カルボジイミドとしては、例えば市販品として、日清紡ケミカル製のカルボジライトが挙げられる。本カルボジイミドをポリグルタミン酸（塩）と混合した後に加熱するとポリグルタミン酸（塩）が容易に架橋される。
また、架橋を行う際は、必要に応じて電子線架橋、紫外線架橋、放射線架橋、グルタルアルデヒド架橋剤に浸漬するなどの従来公知の架橋処理を併用してもよい。
【００１４】
本発明の架橋剤組成物は、本カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸（塩）と本カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなることが好ましく、より好ましい配合量は０．５質量％以上３０質量％以下であり、さらに好ましい配合量は１質量％以上２０質量％以下である。本カルボジイミドの配合量が０．１質量％以上であれば架橋反応が十分進行し、架橋しても水に溶解しなくなる。また、本カルボジイミドの配合量が５０質量％以下であると、ポリグルタミン酸（塩）の特性を十分に発揮できる。
【００１５】
［助剤］
上述の架橋においては、助剤として、硫酸、硝酸、リン酸、塩酸、酢酸、シュウ酸、りんご酸、およびクエン酸などの酸により溶液を酸性にすることで、カルボジイミド基との反応が促進され、架橋体の耐水性が増す。また、上述の酸を用いることでポリグルタミン酸塩（ナトリウム塩など）を用いた場合は、遊離のポリグルタミン酸となり、架橋剤の官能基と反応しやすくなる。この架橋は、溶媒を必要とせず加熱することで生じるため、架橋する前に繊維が溶媒に溶けてしまう問題が無く、処理工程としても加熱設備を設けるだけなので、溶液による架橋方法よりも経済的である。
【００１６】
また、架橋剤組成物には、必要に応じてバインダーを配合することもできる。このようなバインダーとしては公知のものが使用可能であり、例えば、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンイミド、ポリアニリン、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、シリコーン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレンサルファイド、ポリスチレン、ポリブタジエン、およびポリエチレンテレフタレートなど溶媒に溶解可能な合成高分子が挙げられる。また、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、セリシン、フィブロイン、核酸、ヒアルロン酸、エラスチン、ヘパリン、およびカテキンなどの天然高分子もバインダーとして挙げられる。さらに、オルガノシリカやオルガノチタンなどのゾル溶液もバインダーとして挙げられる。
【００１７】
また、ポリグルタミン酸（塩）を溶解する溶媒には、水と水溶性有機溶媒が好ましく用いられる。例えばポリグルタミン酸塩（ナトリウム塩など）は水に可溶であるが、後述する静電紡糸の際には、水溶性有機溶媒を併用することが好ましい。水溶性有機溶媒としてはポリグルタミン酸（塩）水溶液と混合しうるものが適宜選択される。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールなどのアルコール類以外にも、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、およびジメチルスルホキシドなどを用いることができる。これらは１種を単独で用いてもよいし、任意の２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１８】
［他の添加剤］
架橋剤組成物には、必要に応じて、界面活性剤、金属塩、および増粘剤等を適宜混合してもよい。
界面活性剤としては、特に制限はなく、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、および両性界面活性剤のような公知の界面活性剤を使用することができる。具体的には、ｐ−ノニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルオキシスルホン酸ナトリウム、およびラウリルオキシリン酸二ナトリウム等のアニオン界面活性剤、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、およびセチルピリジニウムクロリド等のカチオン界面活性剤、ステアリン酸ポリエチレングリコール、およびペンタエリスリットステアリン酸モノエステル等のノニオン界面活性剤、さらにラウリルジメチルペタイン等の両性界面活性剤が挙げられ、これらの１種を単独で、または、２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。
金属塩としては、金属ハロゲン化物が好ましく、具体的には塩化物、臭化物、およびヨウ化物などが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、メチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、各種ガム類、ペクチン、アルギン酸ソーダ、デキストリン、寒天、およびゼラチン等の天然高分子増粘剤が挙げられる。
【００１９】
［繊維状架橋体］
本願における第３の発明は、繊維状架橋体である。具体的には、縮合性の官能基を有する親水性高分子およびその塩のうち少なくともいずれかである繊維状架橋体であって、当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されていることを特徴とする。
ここで、縮合性の官能基とは、縮合反応により高分子架橋剤が有する官能基と反応しうる官能基をいう。例えば、アミノ基、水酸基、カルボニル基、カルボキシル基、シラノール基、エステル基、アミド基などが挙げられる。
縮合性の官能基を有する親水性高分子としては、生体高分子、合成高分子、および天然高分子などが挙げられるが、特に生体高分子が好ましい。
生体高分子としては、アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸）、タンパク質、糖類（例えば、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸）が挙げられる。これらの中では、本発明の効果の観点より、ポリグルタミン酸が特に好ましい。
合成高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸、およびポリアクリル酸などが挙げられる。
天然高分子としては、セルロースやカルボキシメチルセルロールなどが挙げられる。
【００２０】
［繊維状架橋体の製造方法］
本願における第４の発明は、繊維状架橋体の製造方法である。具体的には、縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、前記紡糸工程における温度が１０℃以上であることを特徴とする。なお、この第４の発明を上述の第１〜第３の発明と特に区別する必要がない場合は、単に「本発明」とも記載する。
【００２１】
前記した紡糸工程では、静電紡糸法を用いることが好ましい。例えば、特許第５１２３８７３号公報や特許第５４５１８３７号公報に記載された静電紡糸法を好ましく適用することができる。
静電紡糸法により紡糸すると、電荷の高まりが糸の細化を促進し、細化に伴い溶媒の揮散が進むため、極細繊維（ナノファイバー）を得ることができる。それ故、表面積が大きく、吸湿、吸水性および保水性に優れた繊維状架橋体を提供することができる。また、静電紡糸法においては、ノズル式とロール式のどちらを用いてもよい。ノズル式では他成分との芯／鞘構造であってもよい。なお、紡糸により得られた繊維状プレ架橋体を所定の温度で加熱することにより高分子架橋剤の機能が発揮され、繊維状架橋体とすることができる。
【００２２】
上述の親水性化合物としては、生分解性、生体適合性、および吸湿・吸水性の観点より、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかを用いることが好ましい。ポリグルタミン酸（塩）としては、上述した第１の発明や第２の発明で用いたものを好ましく適用できる。
ポリグルタミン酸塩（特にナトリウム（Ｎａ）塩）と、高分子架橋剤とを混合したポリグルタミン酸溶液から静電紡糸法により紡糸すると、水、水溶性有機溶媒を溶媒として用いることができるので、取り扱いが容易であり、製造を容易に行うことができるので経済的である。
【００２３】
ここで、前記した高分子架橋剤としては、架橋効率およびポットライフの観点より、数平均分子量が１０００以上のカルボジイミドを用いることが好ましい。このカルボジイミドは上述した第１〜第３の発明で用いるものを好適に使用できる。
ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を用いた架橋体の製造において、ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を混合すると徐々に反応が進んでゲル化が起こり、さらには硬化することがある。そこで、ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を含む架橋剤組成物を調製してから、架橋が実質的に進行せず、紡糸可能な期間をポットライフ（可使時間）と言う。
【００２４】
静電紡糸法の特徴として常温にて紡糸工程が可能であることも挙げられるが、事前に原料液（架橋剤組成物）を調製して装置に仕込むため、原料液には長時間の安定性が必要とされる。これまで架橋性能とポットライフとを両立させる製造法は確立されておらず、その製造法の確立が望まれていた。上記したカルボジイミドを高分子架橋剤として用いると、上記目的を容易に達成できるようになる。
ポットライフは、基本的に長い方が好ましく、具体的には５時間以上であることが好ましく、１０時間以上あることが好ましい。一方、ポリグルタミン酸（塩）を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を製造するため、架橋剤組成物のポットライフは、５００時間以下であり、好ましくは２００時間以下であり、より好ましくは７２時間以下である。
【００２５】
本発明により得られる繊維状架橋体において、繊維は、繊維集合体を構成していることが好ましく、この繊維集合体が架橋されて繊維状架橋体を形成する。この繊維状架橋体は吸湿、吸水しても架橋しているため元の形態を十分に保持している。
本発明により得られる繊維状架橋体において、前記繊維の平均径は３μｍ以下であることが好ましく、０．０１μｍ以上３μｍ以下であることがより好ましく、０．０５μｍ以上１．８μｍ以下であることがさらに好ましい。
上述の繊維の平均径が３μｍを超えると、超極細繊維としての特徴であるフィルター性能や、表面積による吸水性が繊維集合体の単位重量あたりで必ずしも優位ではなくなってしまい、風合い的にもいわゆるゴアゴア感が生じてくるおそれがある。繊維の平均径は基本的に細い方が好ましいが、０．０１μｍ未満になると、生産性、強度、取り扱いの面で問題が生じるおそれもある。なお、繊維の平均径は、電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）により任意の１０本を選定しその算術平均値を取れば求められる。
【００２６】
本願における第５の発明は、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法である。
上述の繊維状架橋体に細胞接着因子を配合すると、当該繊維状架橋体に付着させた細胞の増殖速度を飛躍的に高めることができる。細胞接着因子としては、ラミニン、ポリエルリジン（ＰＬＬ）、およびコラーゲンなどを好ましく用いることができる。増殖の対象となる細胞としては、特に制限はなく正常細胞でも幹細胞でもよい。
細胞培養床は、上記した繊維状架橋体を、細胞培養基材に被覆するだけで容易に製造することができる。被覆する手段は特に問わないが、塗布でも吹付でもよい。
細胞培養基材としては、表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製であることが好ましい。
また、上記した細胞培養床を用いると、移植用細胞シートを効率的かつ迅速に製造することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例や比較例によって何ら限定されるものではない。
〔紡糸方法および架橋方法〕
（１）原料液（架橋剤組成物）の調製
ポリグルタミン酸として、味丹社製ＨＭ−ＮａＦＯＲＭ（Ｍｗ＝１．３×１０６）を用いた。カルボジイミド基含有高分子架橋剤として、日清紡ケミカル株式会社製カルボジライトＳＶ−０２（固形分４０質量％の水溶液）およびＳＷ−１２Ｂ（固形分１００質量％）を用いた。オキサゾリン基含有高分子架橋剤として、日本触媒社製ＷＳ−７００（固形分２５質量％の水溶液）を用いた。エポキシ基含有高分子架橋剤として、日本油脂社製エピオールＥ−４００を用いた。上記した各成分を所定の配合で混合し、それぞれの高分子架橋剤を含むポリグルタミン酸溶液（架橋剤組成物）を作製した。
【００２８】
（２）紡糸装置および繊維状プレ架橋体の紡糸条件
（１）で調製した各架橋剤組成物を、エルマルコ社製ＮＳ−ＬＡＢ２００Ｓを用いて、電極間距離１００〜１６０ｍｍ、電圧４０〜８０ｋＶ、電極回転速度４ｒ／ｍｉｎ、ライン速度０．０８ｍ／ｍｉｎで、目付け３０ｇ／ｍ２のポリプロピレン製不織布（出光ユニテック社製、ＲＣ２０３０）またはガラスシャーレに対し繊維状プレ架橋体をシート状に堆積させた。
（３）架橋方法
（２）で得られた繊維状プレ架橋体が堆積したシートを、真空オーブンにより１２０℃〜１４０℃で３０分〜１時間加熱し、ポリグルタミン酸の繊維状架橋体を製造した。具体的な加熱温度と加熱時間は以下の通りである。
実施例１〜４：１２０℃で１時間
実施例５、６：１４０℃で３０分
比較例１、２：１２０℃で１時間
【００２９】
〔実施例１〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液５４．０ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＶ−０２）１０．１ｇ、エタノール３０．０ｇ、および１Ｎ塩酸２２．５ｇを混合して、原料液（架橋剤組成物）を調製した。ここでポリグルタミン酸ナトリウムの割合は６６．７質量％とした。そして、原料液調製直後に上述した製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）を図１に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３０】
〔実施例２〕
実施例１と同様にして原料液を調製後、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件にて繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図２に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３１】
〔実施例３〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液５４．０ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＶ−０２）２．０ｇ、エタノール３０．０ｇ、および１Ｎ塩酸１６．９ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は９１．０質量％とした。原料液の調製直後に製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図３に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３２】
〔実施例４〕
実施例３と同様にして原料液を調製し、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図４に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３３】
〔実施例５〕
３０質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液３８．６ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＷ−１２Ｂ）４０質量％水溶液５．１ｇ、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液２１．０ｇ、５３質量％エタノール水溶液４０．６ｇを混合した。その後、溶液粘度を調整するためにエタノールを１３．６ｇ加え、原料液（架橋剤組成物）を調製した。ここで、ポリグルタミン酸ナトリウムの割合は８５質量％とした。そして、原料液調製直後に上述した製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）を図５に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３４】
〔実施例６〕
実施例５と同様にして原料液を調製後、５℃にて１２０時間放置した。その後、製造例の条件にて繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図６に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
【００３５】
〔比較例１〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液３６．０ｇ、オキサゾリン基含有高分子架橋剤（ＷＳ−７００）１４．４ｇ、エタノール３０．０ｇ、１Ｎ塩酸２２．５ｇ、および水９．６ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は５４．０質量％とした。
原料液を調製後、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行おうとしたが、ポットライフが短すぎて、紡糸が不可能であった。
【００３６】
〔比較例２〕
１６．７質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液６０．０ｇ、エポキシ基含有高分子架橋剤（エピオールＥ−４００）６．６６ｇ、メタノール１００．０ｇ、クエン酸０．６６ｇ、および塩化カルシウム０．６６ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は５５．６質量％とした。原料液の調製直後に製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。この繊維状架橋体を水に浸漬すると水中で溶解してしまい繊維の形状を保つことができなかった。
【００３７】
〔評価結果１〕
実施例１〜６の原料液（架橋剤組成物）は、高分子量のカルボジイミドを架橋剤としているので、いずれもポットライフおよび紡糸性に優れ、得られた繊維状架橋体も耐水性に優れている。
これに対して、比較例１の原料液では、ポットライフが短すぎ紡糸そのものが不可能であった。また比較例２の原料液では、耐水性に優れた繊維状架橋体を得ることができなかった。
【００３８】
〔実施例７〕
本発明の細胞培養床が、ヒト角膜上皮細胞、およびヒト皮膚繊維芽細胞の増殖速度に対して与える効果を確認した。
（１）細胞および培地
クラボウ社より購入して使用した。具体的には、初代細胞２種類（ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ−２：クラボウ社製品番号ＫＣ−４００９）、およびヒト皮膚繊維芽細胞（成人）（ＮＨＤＦ（ＡＤ）)：クラボウ社製品番号ＫＦ−４１０９）をクラボウ社より購入し、クラボウ社の推奨する培地（正常ヒト角膜上皮細胞用培地：FibroLifeR Comp kit、正常ヒト皮膚繊維芽細胞：OcuLifeR Comp kit）にて前培養し、７５ｃｍ２ Ｔ−Ｆｌａｓｋ×１枚がセミコンフルエントになるまで培養した細胞を使用した。
【００３９】
（２）細胞培養床
実施例５と同様にして原料液を調製し、静電紡糸した繊維状架橋体（ＰＧＡナノファイバー）を内面に塗布したガラスシャーレ（φ９ｃｍ）（細胞培養基材）と未処理のガラスシャーレ（φ９ｃｍ  滅菌処理済）を用いた。
（３）細胞密度
７５ｃｍ２ Ｔ−Ｆｌａｓｋでセミコンフルエントとなった正常細胞を、下記の細胞密度となるよう、ＰＧＡナノファイバーを内面に塗布したφ９ｃｍガラスシャーレ、および未処理のφ９ｃｍガラスシャーレに播種した。ｎ数はいずれも２である。
ＨＣＥＣ−２：正常ヒト角膜上皮細胞：５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
ＮＨＤＦ：正常ヒト皮膚繊維芽細胞：２５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
【００４０】
（４）細胞の播種方法
両細胞とも手順は共通である（播種細胞数のみ異なる。）。具体的な手順は以下の通りである。
１）培養上清をアスピレータで除去した。
２）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を６ｍＬ添加し、細胞表面を洗浄した。
３）トリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ、ＨＫ−３１２０）を６ｍＬ添加し、細胞表面の全体に行き渡らせた。
４）室温で１分間静置した。
５）トリプシン／ＥＤＴＡを４．５ｍＬ除去した。
６）室温で５分間静置した。
７）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を３．５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
８）トリプシン中和液（クラボウ、ＨＫ−３２２０）を５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
９）細胞懸濁液を１５ｍＬ ｔｕｂｅに移した。
１０）遠心分離（２００Ｇ、５分、２５℃）を行った。
１１）上清をアスピレータで除去した。
１２）各細胞用の培地を１ｍＬ、ピペットマンで取り、細胞塊をよく懸濁させた。
１３）各細胞用の培地を９ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
１４）細胞懸濁液を１０μＬ取り、細胞数を計測した。
１５）１ｗｅｌｌあたり上記細胞数になるように細胞を播種した。
【００４１】
（５）播種後の細胞増殖および増殖後の細胞の形態観察
炭酸ガスインキュベーター（サーモ社製）にて３７℃、５ｖｏｌ％炭酸ガス条件下で７日間培養したのち、光学顕微鏡にて細胞の形態を観察した。光学顕微鏡写真を図７〜図１０に示す。
なお、ガラスシャーレならびにプラスチックシャーレ（ナノファイバー吹付細胞培養基材）からシート状の細胞隗を剥離すれば、移植用細胞シートとして用いることもできる。その際は、上記（４）の３）、４）において処理時間を短くし、シート状で剥離する。
【００４２】
（６）細胞増殖性（増殖速度）の評価
光学顕鏡鏡による観察後、下記手順にて細胞数をカウントし、増殖性を評価した。両細胞とも手順は共通である。
１）培養上清をアスピレータで除去した。
２）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を２ｍＬ添加し、細胞表面を洗浄した。
３）トリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ、ＨＫ−３１２０）を１ｍＬ添加し、細胞表面の全体に行き渡らせた。
４）室温で１分間静置した。
５）トリプシン／ＥＤＴＡを０．７５ｍＬ除去した。
６）室温で５分間静置した。
７）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を０．２５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
８）トリプシン中和液（クラボウ、ＨＫ−３２２０）を０．５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
９）細胞懸濁液を１０μＬ取り、細胞数を計測した。初日から７日後までの細胞数の変化を図１１、図１２に示す。いずれも、ＰＧＡナノファイバーを塗布したガラスシャーレ（ＰＧＡＮＦ（＋））を用いたものと、未処理のガラスシャーレを用いたものとを比較して示したものである。
【００４３】
〔評価結果２〕
図１１、図１２より、両細胞とも、ＰＧＡナノファイバーが塗布されたガラスシャーレを用いることにより増殖性（増殖速度）が向上していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、パックやフェイスマスクなどの化粧用品、創傷被覆剤や止血シートや癒着防止シートなどの医療用品、また、細胞培養床や発芽シートなどのバイオ、農業用品、さらには、水系インクの受理体としての日用品や電気電子材料に利用できる。
【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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