(57)【要約】  本発明は、Ｋ−ｒａｓ突然変異の定量検出キットに関する。具体的に述べると、本発明は、分子標的抗癌薬の治療効果に関係するＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異の検出方法および検出キットに関する。特に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異ホットスポット領域における突然変異を検出する蛍光定量ＰＣＲ検出法、キットおよびその応用に関する。本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の特定部位の突然変異を検出し、分子標的抗腫瘍薬のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の治療効果を予測することができ、さらには腫瘍患者の臨床個別化投薬計画に対して指針を提供する。【選択図】図１
2013515493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切なＰＣＲ条件下において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異位置の上下流２００個以内のヌクレオチドと結合する、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマー。
【請求項２】
前記プライマーが上流プライマーおよび下流プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
適切なＰＣＲ条件下において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異位置の塩基配列と特異的に結合する、蛍光定量ＰＣＲのプローブ。
【請求項４】
前記プローブの５’末端に蛍光発光物質が結合され、３’末端に蛍光消光物質が結合される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
検出しようとするＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列を含む、プラスミド。
【請求項６】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列が配列番号２９である、請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
検出しようとするＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列を含む、プラスミド。
【請求項８】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４である、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
以下から選択される試薬、すなわち請求項１または２に記載のプライマー、請求項３または４に記載のプローブと、請求項５および／または７に記載のプラスミドを含む、Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異の定量検出キット。
【請求項１０】
プライマーおよびプローブの比率が２：１〜１０：１であり、順方向および逆方向プライマーの比率が１：３〜３：１である、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子はｒａｓ癌遺伝子ファミリーに属し、２１ｋＤのｒａｓタンパク質をコードするため、ｐ２１遺伝子とも呼ばれる。Ｋ−ｒａｓ遺伝子はＥＧＦＲシグナル伝達経路の重要分子の１つであり、ＥＧＦＲ経路の下流に位置する産物をコードし、腫瘍細胞の成長、増殖、血管生成などの過程において、重要な「スイッチ」の機能を果たす。突然変異が生じるとき、Ｋ−ｒａｓタンパク質は活性状態が持続した状態にあり、細胞成長に対する正常な制御ができず、細胞の持続的成長、アポトーシスの阻止が引き起こされる。異なる腫瘍組織におけるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異率は異なり、膵臓癌８２％、結腸癌４３％、肺癌３０％、甲状腺癌２９％、膀胱、肝、腎および子宮癌は１０％か、または１０％より低い（Ｂｏｓ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９８９，４９（１７）：４６８２〜４６８９）。突然変異したＫ−ｒａｓの持続的活性化は、ＥＧＦＲ活性が抑制されるかどうかと無関係であるため、患者への抗ＥＧＦＲ治療によって有効な効果を得ることはできない（Ａｍａｄｏ  Ｒ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００８，２６（１０）：１６２６〜１６３４、Ｌｉｅｖｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００８；２６（３）：３７４〜３７９）。したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異を検出することにより、抗ＥＧＦＲ薬物の治療効果に対して一定の予測的評価をすることができ、腫瘍患者の個別化治療を実現し、それにより良好な予後に達する。
【０００２】
現在、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異点は、主に１２、１３番目のアミノ酸コドンに集中しており（張健杰ら，西安交通大学学報，２００５，２６（４）：３４９〜３５１、何暁文ら，中華消化雑誌，２００２，２２（１）：２６〜２８）、このうちコドン１２のＧＧＴ塩基がＧＴＴまたはＧＡＴ塩基に突然変異するのが、最もよく見られる突然変異の型である。本発明は、リアルタイム定量ＰＣＲ法により、分子標的抗腫瘍薬の治療効果に関係する腫瘍関連遺伝子Ｋ−ｒａｓのコドン１２、１３における５種類の型の突然変異状態を検出し、アービタックスなど分子標的薬の治療効果を予測する。
【０００３】
本発明で採用された検出方法は、以下のいくつかの利点を有する。操作が簡単で標準化しやすい。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション法のようなその他の方法は、ハイブリダイゼーションに対する条件が非常に敏感で、実験条件を厳格にコントロール必要があり、また、制限酵素断片長多型実験はかなりの人的操作を必要とし、さらに定量することができない。実験周期が短く、２時間以内で完成することができる。シークエンシングにより結果を検証する必要はないが、ダイレクトシークエンシング法および高解像度融解曲線解析は、４日〜２週間が必要である。感度が高く、実験条件の最適化を行うことにより、突然変異の検出感度は１％に達することができるが、ダイレクトシークエンシング法の感度は２０〜５０％である。特異性が高いが、免疫組織化学法では偽陽性および偽陰性率が高く、さらに点突然変異の位置および型を確定することができない。定量が正確であることは本発明の実験方法で最も独特な利点であり、絶対定量法でデータを処理し、それにより標準曲線を作成することにより、検体中の野生型および突然変異型遺伝子の含量を正確に測定する。さらには突然変異型遺伝子が占める比率が得られ、臨床診断および投薬の助けとなる。ほかに、本発明は安全無毒性であるが、ミスマッチ塩基の化学的開裂法のようなその他の方法は、アイソトープおよび毒劇物試薬を使用する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｏｓ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９８９，４９（１７）：４６８２〜４６８９
【非特許文献２】Ａｍａｄｏ  Ｒ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００８，２６（１０）：１６２６〜１６３４
【非特許文献３】Ｌｉｅｖｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００８；２６（３）：３７４〜３７９
【非特許文献４】張健杰ら，西安交通大学学報，２００５，２６（４）：３４９〜３５１
【非特許文献５】何暁文ら，中華消化雑誌，２００２，２２（１）：２６〜２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする問題は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異の定量検出キットを提供することである。Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２（配列番号１、配列番号２）、２１５５位のＧＧＴ塩基がＧＴＴ、ＡＧＴ、ＧＡＴまたはＴＧＴ塩基に突然変異した状態、コドン１３（配列番号１、配列番号２）のＧＧＣ塩基がＧＡＣ塩基に突然変異した状態を定量的に検出する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の問題を解決するために、本発明は、Ｔａｑ酵素、１０×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異部位の配列を特異的に増幅することができるＰＣＲプライマーと、野生型および突然変異型の配列を特異的に識別することができるプローブを含む定量検出キット、ならびに以下に示す検出方法を提供する。
【０００７】
（１）Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３の突然変異部位付近に、それぞれ上下流プライマーを設計し、各突然変異部位の突然変異状態に基づき、特異的なプローブを設計する。このプローブはＫ−ｒａｓの特定部位の野生型または検出しようとする突然変異型の配列と特異的に結合することができ、それによりこの部位に検出される遺伝子の突然変異が生じているかどうかを確定する。
【０００８】
（２）検出されるＫ−ｒａｓ突然変異の比率を正確に定量するために、本発明は標準品を設計した。
【０００９】
（３）被験検体および標準品に対し、蛍光定量ＰＣＲを行って検出する。
【００１０】
（４）標準品の検出結果から、定量に用いる標準曲線が得られ、標準曲線から、被験検体の核酸のＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子全体に占める比率を算出する。
【００１１】
前記ステップ（１）の前に、被験検体中の核酸の抽出、精製、および濃度の測定が行われることをさらに含む。
【００１２】
蛍光定量ＰＣＲは、適切なＰＣＲ条件下において、使用したプローブと、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異位置の塩基配列との特異的な結合を検出する。前記プローブは、好ましくは５’末端に蛍光発光物質が結合され、３’末端に蛍光消光物質が結合される。前述した蛍光発光物質はＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸから選択され、前述した蛍光消光物質はＢＨＱ、ＴＡＭＡＲＡから選択される。好ましくは、前記蛍光発光物質はＦＡＭであり、前述した蛍光消光物質はＢＨＱである。前記プローブの配列は、好ましくは配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８である。
【００１３】
前記標準品は、少なくともプラスミド、ゲノムＤＮＡまたは化学的に合成された配列のうちの１種を含む。好ましくは、前記標準品は、野生型プラスミドおよび／または突然変異型プラスミドを含み、このうち野生型プラスミドはＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列を含み、突然変異型プラスミドはＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列を含む。さらに好ましくは、前記標準品は野生型プラスミドおよび／または突然変異型プラスミドからなる。
【００１４】
前記被験検体には、新鮮組織、パラフィン包埋組織、細胞株、血液、胸膜滲出液、腹膜滲出液、唾液、消化液、尿、唾液、糞便が含まれる。
【００１５】
前記プライマーは、上流プライマーおよび下流プライマーからなる。前記プライマーは、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７である。
【００１６】
前述したＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異の定量検出キットは以下から選択される試薬、すなわち上述したようなプライマー、プローブおよび標準品を含む。前記キットは、好ましくはさらにＴａｑ酵素、１０×Ｔａｐ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックスを含む。好ましいプライマーおよびプローブの比率は２：１〜１０：１であり、好ましい順方向プライマーおよび逆方向プライマーの比率は１：３〜３：１である。標準品は、上述したプラスミドが一定の比率に応じて混合されたものが含まれ、野生型プラスミドおよび突然変異型プラスミドの含量の比率は、それぞれ０〜１００％である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下に図および実施例を組み合わせて、本発明についてさらに詳細な説明を行う。
【００１８】
【図１】図１は、実施例２で用いるプラスミド標準品の構築方法の概要図である。
【図２】図２は、実施例２の野生型プラスミドのマップであり、矢印は、ベクターに野生型ＰＣＲ産物の配列を挿入する位置を示す。
【図３】図３は、実施例２のＫ−ｒａｓ野生型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２の突然変異型プラスミド標準品のシークエンシング結果であり、矢印は塩基の突然変異部位を示す。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２の突然変異型プラスミド標準品のシークエンシング結果であり、矢印は塩基の突然変異部位を示す。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例２の突然変異型プラスミド標準品のシークエンシング結果であり、矢印は塩基の突然変異部位を示す。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＡＴ突然変異型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例２の突然変異型プラスミド標準品のシークエンシング結果であり、矢印は塩基の突然変異部位を示す。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施例２の突然変異型プラスミド標準品のシークエンシング結果であり、矢印は塩基の突然変異部位を示す。Ｋ−ｒａｓコドン１３のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異型プラスミドのシークエンシング結果である。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓ野生型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＡＴ突然変異型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、実施例３の標準品の増幅曲線図である。Ｋ−ｒａｓコドン１３のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異型プラスミド標準品の増幅曲線である。
【図６Ａ】図６Ａは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＡはＫ−ｒａｓ野生型プラスミドの標準曲線である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＢはＫ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異型プラスミドの標準曲線である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＣはＫ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異型プラスミドの標準曲線である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＤはＫ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＧＡＴ突然変異型プラスミドの標準曲線である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＥはＫ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型プラスミドの標準曲線である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、図４に基づいて作成された標準曲線図である。このうち、図ＦはＫ−ｒａｓコドン１３のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異型プラスミドの標準曲線である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の実施例３で検出されたパラフィン包埋組織検体のＫ−ｒａｓコドン１２の野生型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の実施例３で検出されたパラフィン包埋組織検体のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、本発明の実施例３で検出された新鮮組織検体のＫ−ｒａｓコドン１２の野生型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、本発明の実施例３で検出された新鮮組織検体のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、本発明の実施例３で検出された全血検体のコドン１３の野生型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図でありである。
【図７Ｆ】図７Ｆは、本発明の実施例３で検出された全血検体のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異型の蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｇ】図７Ｇは、本発明の実施例３で検出された細胞系検体のＫ−ｒａｓコドン１２の野生型蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図７Ｈ】図７Ｈは、本発明の実施例３で検出された細胞系検体のＫ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異型蛍光定量ＰＣＲの増幅曲線図である。
【図８】図８は、本発明の定量方法の概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の実施例は、関連するいかなる実施も当業者に提供し、さらに本発明の完全な開示および記載に使用される。なおかつこれらの例は、出願人が考える発明の範囲を制限するものではなく、下文の実験もまた、実施されたすべての実験を指すものではなく、ただ実施することができる実験であるのみである。実施例において、具体的条件を明記していない実験方法は、通常、通例の条件、例えば分子クローニング実験マニュアル第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）に基づくか、またはメーカー推奨の条件に基づく。
【実施例１】
【００２０】
ヒトの新鮮腫瘍組織、パラフィン包埋組織、末梢血、胸水、ヒト細胞系のゲノムＤＮＡの抽出
我々が検査を行ったヒト癌細胞系には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ８３８およびＨ１７０３）、乳癌（ＭＣＦ−７、ＢＴ４７４およびＨｕＬ１００）、悪性中皮腫細胞系（Ｈ５１３、Ｈ２０５２、Ｈ２９０、ＭＳ−１およびＨ２８）、結腸癌細胞系（ＳＷ４８０）、頭頸部癌細胞系（Ｕ８７）、子宮頸癌（Ｈｅｌａ）、肉腫細胞系（Ｍｅｓ−ＳＡ、Ｓａｏｓ−２およびＡ２０４）が含まれる。
【００２１】
検査を行ったヒトの新鮮な腫瘍組織、末梢血、パラフィン包埋組織には、ＮＳＣＬＣ、中皮腫、結腸癌、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、甲状腺癌、悪性癌および卵巣癌が含まれる。
【００２２】
標本のＤＮＡ抽出
Ｑｉａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ社のＤＮＡ抽出キットを使用して検体のゲノムＤＮＡを抽出することができ、Ｇｅｎｅ社のＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ１０００型核酸微量測定器を使用して抽出したＤＮＡの濃度および純度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０は約１．８、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０は２．０より大きい）を測定した。以下に、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤＮＡ抽出キットを例とし、検体ＤＮＡの抽出手順を紹介する。
【００２３】
１．新鮮組織のＤＮＡ抽出
（１）はさみで大豆ほどの大きさに組織を切り取り、乳鉢に入れた。組織をせん断し、液体窒素を加えてすりつぶし、粉末にした。
【００２４】
（２）あらかじめ冷却したライシス溶液６００μｌを乳鉢に入れ、１ｍｌのピペットチップで６回ピペッティングを行い組織粉末およびライシス溶液を十分に混合させた。混合物を１．５ｍｌＥＰチューブに移し、転倒混和を６回行って混合した後、６５℃で２０分間水浴に入れた。
【００２５】
（３）ＲＮａｓｅを３μｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、３７℃で２０分間水浴に入れた。
【００２６】
（４）室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を２００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した。氷上に５分間放置した後、１３，０００×ｇ、室温で４分間遠心分離を行った。
【００２７】
（５）事前に６００μｌのイソプロパノール（室温）を入れた新しいＥＰチューブに上清を移し、６回穏やかに混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００２８】
（６）上清を捨て、沈殿に７０％エタノール（室温）を６００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００２９】
（７）エタノールを除去し、１５分間空気乾燥させた。
【００３０】
（８）沈殿に４０μｌのＤＮＡ溶解液を加え、６５℃で１時間または４℃でオーバーナイトでインキュベートした。
【００３１】
２．パラフィン包埋組織のＤＮＡ抽出
（１）１ｍｇまたは１ｍｇより小さい組織を１．５ｍｌの遠心分離チューブに入れた。
【００３２】
（２）新鮮なインキュベーション緩衝液／プロテイナーゼＫ溶液１００μｌを調製して加えた。検体の種類に基づき、５６℃、オーバーナイトでインキュベートした。
【００３３】
（３）インキュベートした検体チューブを取り出し、２倍容量のライシス緩衝液を加えた。
【００３４】
（４）樹脂が完全に懸濁するまで、ボルテックスミキサーで１０秒間樹脂を撹拌し、完全に懸濁した樹脂を７μｌ加えた。ボルテックスミキサーで３秒間撹拌後、室温で５分間インキュベートした。
【００３５】
（５）ボルテックスミキサーで２秒間撹拌し、チューブをＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）磁気分離スタンドに置いた。磁気分離をすぐに行った。
【００３６】
（６）チューブの壁の樹脂には触れないように、すべての溶液を注意深く除去した。
【００３７】
（７）ライシス緩衝液を１００μｌ加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、ボルテックスミキサーで２秒間撹拌した。
【００３８】
（８）チューブを磁気分離スタンドに戻し、全てのライシス溶液を除去した。
【００３９】
（９）調製した１×洗浄液を１００μｌ加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、ボルテックスミキサーで２秒間撹拌した。
【００４０】
（１０）チューブを磁気分離スタンドに戻し、全ての洗浄液を除去した。
【００４１】
（１１）ステップ（９）および（１０）を２回繰り返し、全部で３回洗浄を行い、最後の１回の洗浄を確実に行った後、全ての液体を除去した。
【００４２】
（１２）蓋を開けてチューブを磁気分離スタンドに置き、空気中で５分間乾燥させた。
【００４３】
（１３）溶出液を２５μｌ加えた。
【００４４】
（１４）チューブの蓋を閉め、ボルテックスミキサーで２秒間撹拌した。６５℃で５分間インキュベートした。
【００４５】
（１５）インキュベートしたチューブを取り出し、ボルテックスミキサーで２秒間撹拌した。すぐに磁気分離スタンドに置いた。
【００４６】
（１６）ＤＮＡ溶液を選択した容器に注意深く移した。
【００４７】
３．全血のＤＮＡ抽出
（１）抗凝固全血を３００μｌ採取し、細胞ライシス溶液を９００μｌ加え、１ｍｌのピペットチップでピペッティングを６回行って混合し、できる限り全血および細胞ライシス溶液を混合させた。室温に１０分間放置し、その間に１ｍｌピペットチップでピペッティングを３回行って混合した。
【００４８】
（２）１３，０００×ｇ、室温で２０秒間遠心分離を行った後、上清を捨て、激しく振盪させた。あらかじめ冷却したライシス溶液を３００μｌ加え、沈殿が完全に溶解するまで１ｍｌのピペットチップでピペッティングを行い混合した。
【００４９】
（３）ＲＮａｓｅを１．５μｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、３７℃で２０分間水浴に入れた。
【００５０】
（４）室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を１００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した。氷上で５分間放置した後、１３，０００×ｇ、室温で４分間遠心分離を行った。
【００５１】
（５）事前に３００μｌのイソプロパノール（室温）を入れた新しいＥＰチューブに上清を移し、６回穏やかに混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００５２】
（６）上清を捨て、沈殿に７０％エタノール（室温）を１ｍｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００５３】
（７）エタノールを除去し、１５分間空気乾燥させた。
【００５４】
（８）沈殿にＤＮＡ溶解液を４０μｌ加え、６５℃１時間または４℃オーバーナイトでインキュベートした。
【００５５】
４．胸水のＤＮＡ抽出
（１）胸水５ｍｌを採取し、２０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離を行った。上清を回収し、細胞ライシス溶液を１ｍｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、室温に１０分間放置した。
【００５６】
（２）１３，０００×ｇ、室温で２０秒間遠心分離を行った後、上清を捨て、激しく振盪し、あらかじめ冷却したライシス溶液を１ｍｌ加え、沈殿が完全に溶解するまで混合した。
【００５７】
（３）ＲＮａｓｅを３μｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、３７℃で２０分間水浴に入れた。
【００５８】
（４）室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を２００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した。氷上で５分間放置した後、１３，０００×ｇ、室温で４分間遠心分離を行った。
【００５９】
（５）事前にイソプロパノール（室温）を５ｍｌ入れた新しいＥＰチューブに上清を移し、６回穏やかに混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００６０】
（６）上清を捨て、沈殿に７０％エタノール（室温）を１ｍｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００６１】
（７）エタノールを除去し、１５分間空気乾燥させた。
【００６２】
（８）沈殿にＤＮＡ溶解液を４０μｌ加え、６５℃１時間または４℃オーバーナイトでインキュベートした。
【００６３】
５．細胞系のＤＮＡ抽出
（１）少なくとも約１×１０６個の細胞を採取し、１．５ｍｌのＥＰチューブに移して、１３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０秒間行った。接着細胞である場合、細胞を採取する前にトリプシンで消化する必要がある。
【００６４】
（２）上清を捨て、ＰＢＳ２００μｌを加えて細胞を洗浄し、１３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０秒間行った後、上清を捨て、沈殿が混濁するまで激しく振盪した。
【００６５】
（３）あらかじめ冷却したライシス溶液を６００μｌ加え、細胞の塊が肉眼で見えなくなるまで、１ｍｌのピペットチップでピペッティングを行って混合した。
【００６６】
（４）ＲＮａｓｅを３μｌ加え、転倒混和を６回行って混合し、３７℃で２０分間水浴に入れた。
【００６７】
（５）室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を２００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した。氷上で５分間放置した後、１３，０００×ｇ、室温で４分間遠心分離を行った。
【００６８】
（６）事前に６００μｌのイソプロパノール（室温）を入れた新しいＥＰチューブに上清を移し、６回穏やかに混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００６９】
（７）上清を捨て、沈殿に７０％エタノール（室温）を６００μｌ加え、転倒混和を６回行って混合した後、１３，０００×ｇ、室温で１分間遠心分離を行った。
【００７０】
（８）エタノールを除去し、１５分間空気乾燥させた。
【００７１】
（９）沈殿にＤＮＡ溶解液４０μｌを加え、６５℃１時間または４℃オーバーナイトでインキュベートした。
【実施例２】
【００７２】
突然変異型および野生型の検出配列を含むプラスミド標準品の準備
１．野生型プラスミドの構築（図１、図２）
１．１  ベクターの準備
ＴＡクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔは、ＴＡＫＡＲＡ社から購入した。
【００７３】
１．２  インサートの準備
ＰＣＲ法を使用してインサートを調製した。ＰＣＲのテンプレートはステップ１で抽出した検体のゲノムＤＮＡであり、反応系および増幅条件は下表のとおりである（表１、表２、表３）。
表１：ＰＣＲ反応系（５０μｌ）
【００７４】
【表１】
2013515493.tif 000003
表２：ＰＣＲプライマー
【００７５】
【表２】
2013515493.tif 000004
表３：ＰＣＲ増幅条件
【００７６】
【表３】
2013515493.tif 000005
【００７７】
１．３  ＱＩＡｇｅｎゲル回収キットを使用して目的断片を回収した後、ＴＡクローニングにより、ｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ社より購入）に挿入した。
【００７８】
１．４  新しく構築したプラスミドは、大腸菌ＤＨ５α株で大量に増幅させ、抽出精製することにより得られた（具体的な方法は《分子クローニング実験マニュアル》第３版、９６〜９９、１０３頁を参照のこと）。
【００７９】
１．５  ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを利用して、ダブルダイジェストを行って確認した。
【００８０】
１．６  制限酵素消化の結果、陽性を呈した菌種のシーケンシングを行い、シーケンシングを正確に行った後、野生型の配列を含む標準品とした（図３）。
【００８１】
２．突然変異型プラスミドの構築：突然変異部位の突然変異プライマーを設計し、ＤＰＮ１法を利用して突然変異型配列を含む標準品が得られた。
【００８２】
２．１  必要な突然変異配列に基づき、突然変異部位の突然変異プライマーを設計した（表４）。
表４：突然変異プライマー
【００８３】
【表４】
2013515493.tif 000006
【００８４】
２．２  ５ｎｇの野生型プラスミドをテンプレートとし、突然変異プライマーおよびＰｆｕ酵素を使用して目的部位を突然変異させた。増幅系および条件は、表１、表４、表３に示す通りである。
【００８５】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異配列を含むプラスミドの調製過程において、増幅系にＫ−ｒａｓ−１−Ｆ（配列番号７）およびＫ−ｒａｓ−１−Ｒ（配列番号８）プライマーを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異配列を含むプラスミドの調製過程において、増幅系にＫ−ｒａｓ−２−Ｆ（配列番号９）およびＫ−ｒａｓ−２−Ｒ（配列番号１０）プライマーを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＧＡＴ突然変異配列を含むプラスミドの調製過程において、増幅系にＫ−ｒａｓ−３−Ｆ（配列番号１１）およびＫ−ｒａｓ−３−Ｒ（配列番号１２）プライマーを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異配列を含むプラスミドを調製する過程において、増幅系にＫ−ｒａｓ−４−Ｆ（配列番号１３）およびＫ−ｒａｓ−４−Ｒ（配列番号１４）プライマーを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１３のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異配列を含むプラスミドの調製過程において、増幅系にＫ−ｒａｓ−５−Ｆ（配列番号１５）およびＫ−ｒａｓ−５−Ｒ（配列番号１６）プライマーを添加する必要がある。
【００８６】
２．３  ＤＰＮ１酵素を使用してステップ２．２で得られた産物を処理し、３７℃で１時間インキュベートした後、産物を回収した。大腸菌ＤＨ５α株で大量に増幅させ、抽出、精製することにより得られた。
【００８７】
２．４  ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを利用して、ダブル酵素消化を行いプラスミドを同定し  た。
【００８８】
２．５  制限酵素消化の結果、陽性を呈した菌種のシークエンシングを行い、シークエンシングを正確に行った後、突然変異型配列を含む標準品とした（図４）。
【実施例３】
【００８９】
肺癌および子宮頸癌検体を例とした、ヒト細胞系、ヒトの新鮮な腫瘍組織、末梢血、パラフィン包埋組織のゲノムＤＮＡにおけるＫ−ｒａｓ突然変異の検出
１．蛍光定量ＰＣＲ反応のテンプレートは、実施例１で抽出した肺癌および子宮頸癌検体のゲノムＤＮＡと、実施例２で調製した標準品であり、再蒸留水をネガティブコントロールとした。標準曲線を作成するため、標準品を１ｎｇ／μｌ、０．５ｎｇ／μｌ、０．２５ｎｇ／μｌ、０．１２５ｎｇ／μｌ、０．０６２５ｎｇ／μｌ、０．０３１２５ｎｇ／μｌに２倍希釈した。
【００９０】
２．反応系および反応条件は表２、表５、表６、表７に示され、このうち標識プローブの蛍光発光物質は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸから選択され、蛍光消光物質はＢＨＱ、ＴＡＭＡＲＡから選択された。
表５：蛍光定量ＰＣＲ反応系（２０μｌ／チューブ）
【００９１】
【表５】
2013515493.tif 000007
【００９２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２、１３の突然変異状態の検出には、６つの系を構成する必要があるが、プローブが異なる以外、系に用いるその他の試薬は同じである。Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２、１３の野生型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−ｗ１（配列番号１７）またはＫ−ｒａｓ−ｗ２（配列番号１８）プローブを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＧＴＴ突然変異型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−１１（配列番号１９）またはＫ−ｒａｓ−１２（配列番号２０）プローブを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＡＧＴ突然変異型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−２１（配列番号２１）またはＫ−ｒａｓ−２２（配列番号２２）プローブを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＧＡＴ突然変異型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−３１（配列番号２３）またはＫ−ｒａｓ−３２（配列番号２４）プローブを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−４１（配列番号２５）またはＫ−ｒａｓ−４２（配列番号２６）プローブを添加する必要があり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１３のＧＧＣ→ＧＡＣ突然変異型遺伝子を検出する場合、系にＫ−ｒａｓ−５１（配列番号２７）またはＫ−ｒａｓ−５２（配列番号２８）プローブを添加する必要がある。
表６：プローブ
【００９３】
【表６】
2013515493.tif 000008
表７：増幅条件
【００９４】
【表７】
2013515493.tif 000009
【００９５】
３．標準曲線の作成
ステップ３の標準品から得られたＣＴ値の結果に基づき、標準曲線を作成した。図５はプラスミド標準品の増幅曲線であり、図中、上昇した５本の曲線は、左から右に順次それぞれ０．５ｎｇ／μｌ、０．２５ｎｇ／μｌ、０．１２５ｎｇ／μｌ、０．０６２５ｎｇ／μｌ、０．０３１２５ｎｇ／μｌに希釈したプラスミド標準品の増幅曲線を表す。横軸はサイクル数を示し、縦軸は蛍光検出値を示す。ここから、さらに計算に用いる標準曲線を作成することができる（図６）。図６中、横軸はテンプレートのコピー数の対数値であり、縦軸はＣＴ値である。このうちテンプレートのコピー数＝質量／分子量×６．０２×１０２３である。本実験において、プラスミドはｐＭＤ１８−Ｔベクターおよびインサートからなり、インサートの塩基長は略一致し、違っていても最大でわずか２０数塩基の長さであり、ＰＭＤ１８−Ｔベクター２６９２ｂｐの長さに相対して、影響は大きくないため、野生型および突然変異型プラスミドの標準品のコピー数の比≒質量の比である。
【００９６】
４．標本Ｋ−ｒａｓ遺伝子の特定の突然変異型の比率の計算
標準曲線に基づき、検体のＣＴ値から反応した野生型および突然変異型のゲノムＤＮＡのコピー数を求め、それにより突然変異型Ｋ−ｒａｓＤＮＡおよびＫ−ｒａｓＤＮＡの総量（この部位の野生型にあらゆる突然変異型を加えたもの）の割合が得られる。図７に示すように、ある肺癌パラフィン包埋組織検体から検出された、Ｋ−ｒａｓコドン１２の野生型のＣＴ値は１９．１５であり（図７Ａ）、ＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異型の値は２０．７４であった（図７Ｂ）。それぞれ対応する標準曲線の公式（図６）から各々のコピー数を求めることができ、ここから突然変異型および野生型の含量の比が３０：７０であることがわかり、組織中の約３０％のＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２にＧＧＴ→ＴＧＴ突然変異が生じていることが推測された。
【００９７】
５．検出結果
本実施例は、４８例の肺癌および膵臓癌の組織、全血と、細胞系の標本に対してＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異の検出を行った。全部で１０例に突然変異が生じていることが検出された。具体的な突然変異例数を表８に示す。突然変異比率、すなわちその検体中の突然変異遺伝子および非突然変異遺伝子の比率を表９に示す。
表８：Ｋ−ｒａｓ突然変異例数
【００９８】
【表８】
2013515493.tif 000010
表９：Ｋ−ｒａｓ突然変異の比率  
【００９９】
【表９】
2013515493.tif 000011
【図３】
2013515493.tif 000012
【図４Ａ】
2013515493.tif 000013
【図４Ｂ】
2013515493.tif 000014
【図４Ｃ】
2013515493.tif 000015
【図４Ｄ】
2013515493.tif 000016
【図４Ｅ】
2013515493.tif 000017
2013515493.tif 000018
【図１】
2013515493.tif 000019
【図２】
2013515493.tif 000020
【図５Ａ】
2013515493.tif 000021
【図５Ｂ】
2013515493.tif 000022
【図５Ｃ】
2013515493.tif 000023
【図５Ｄ】
2013515493.tif 000024
【図５Ｅ】
2013515493.tif 000025
【図５Ｆ】
2013515493.tif 000026
【図６Ａ】
2013515493.tif 000027
【図６Ｂ】
2013515493.tif 000028
【図６Ｃ】
2013515493.tif 000029
【図６Ｄ】
2013515493.tif 000030
【図６Ｅ】
2013515493.tif 000031
【図６Ｆ】
2013515493.tif 000032
【図７Ａ】
2013515493.tif 000033
【図７Ｂ】
2013515493.tif 000034
【図７Ｃ】
2013515493.tif 000035
【図７Ｄ】
2013515493.tif 000036
【図７Ｅ】
2013515493.tif 000037
【図７Ｆ】
2013515493.tif 000038
【図７Ｇ】
2013515493.tif 000039
【図７Ｈ】
2013515493.tif 000040
【図８】
2013515493.tif 000041
【配列表】
2013515493000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月26日(2011.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異の定量検出キットであって、前記キットが、
（１）適切なＰＣＲ条件下において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異位置の上下流２００個以内のヌクレオチドと結合する、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと、
（２）適切なＰＣＲ条件下において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異位置の塩基配列と特異的に結合する、蛍光定量ＰＣＲのプローブと、
（３）野生型プラスミドおよび／または突然変異型プラスミドを含み、このうち野生型プラスミドがＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列を含み、突然変異型プラスミドがＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列を含む標準品と、
を含むキット。
【請求項２】
前記プライマーが上流プライマーおよび下流プライマーからなる、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記プライマーが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記プローブが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記プローブの５’末端に蛍光発光物質が結合され、３’末端に蛍光消光物質が結合される、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記プローブの蛍光発光物質がＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸを含むが、これに限定されず、前記蛍光消光物質がＢＨＱ、ＴＡＭＡＲＡを含むが、これに限定されない、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
プライマーおよびプローブの比率が２：１〜１０：１であり、順方向および逆方向プライマーの比率が１：３〜３：１である、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列が配列番号２９である、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記プラスミドに含まれる突然変異型配列が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２、２１５５位のＧＧＴ塩基がＧＴＴ、ＡＧＴ、ＧＡＴまたはＴＧＴ塩基に突然変異したものか、またはコドン１３のＧＧＣ塩基がＧＡＣ塩基に突然変異したものを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
野生型プラスミドおよび／または突然変異型プラスミドを含む標準品であって、このうち野生型プラスミドがＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列を含み、突然変異型プラスミドがＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異型配列を含む標準品。
【請求項１２】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型配列が配列番号２９である、請求項１１に記載の標準品。
【請求項１３】
前記プラスミドに含まれる突然変異型配列が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２、２１５５位のＧＧＴ塩基がＧＴＴ、ＡＧＴ、ＧＡＴまたはＴＧＴ塩基に突然変異したものか、またはコドン１３のＧＧＣ塩基がＧＡＣ塩基に突然変異したものを含む、請求項１１に記載の標準品。
【請求項１４】
前記プラスミドに含まれるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４である、請求項１１に記載の標準品。
【国際調査報告】
2013515493.tif 000042
2013515493.tif 000043
2013515493.tif 000044
2013515493.tif 000045
2013515493.tif 000046
2013515493.tif 000047
2013515493.tif 000048