(57)【要約】  本発明は、擬陽性シグナルが排除される少なくとも３種のターゲット核酸配列のリアルタイムでの多重的な検出に関する。従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法とは異なり、本発明は、互いに別の反応容器における２つの異なる増幅反応、即ち、アンプリコンを取得する第１マルチプレックスＰＣＲ、及び前記アンプリコンを利用した第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを含む。本発明は、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナル、非特異的ハイブリダイゼーションによる擬陽性シグナル及び擬陰性シグナルが排除される。【選択図】  図１
2013515476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）から偽シグナルを排除し、試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列をリアルタイムで多重的に検出する方法であって、
（ａ）反応容器でターゲット核酸配列を増幅する第１マルチプレックスＰＣＲを行う工程であって、前記第１マルチプレックスＰＣＲは、前記試料中の前記ターゲット核酸配列のアンプリコンを得るために、少なくとも３種類のターゲット核酸配列を増幅できる条件下で少なくとも３種類のプライマー対及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼを利用して行われる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）に使用された反応容器とは別の反応容器に第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応用混合物として、
（ｉ）前記工程（ａ）で得たアンプリコンと、
（ｉｉ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための、対を形成する２つのうち少なくとも１つのプライマーは、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである、少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｉｉｉ）鋳型依存性核酸ポリメラーゼと、を含み、
前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対が、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含む、反応用混合物を用意する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記反応用混合物を利用してプライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２サイクル反復し、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行うことで、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じる工程であって、前記サイクルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じるが、偽シグナルは生じないサイクル数で行われる工程と、
（ｄ）ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記検出が、前記工程（ｃ）の前記反復の各サイクルにおいて、前記工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、又は前記工程（ｃ）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、これにより、前記ターゲット核酸配列を示すシグナルが、偽シグナルなしにリアルタイムで得られる工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、３０サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２５サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２０サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーが、標識を有し、アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも３種類のプライマー対の標識が、互いに異なっている、又は同一である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対の互いの標識が、異なっているか、又は同一である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識を有するプライマーが、１つの標識又は相互作用する２つの標識を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標識が、ターゲット核酸配列に対して相補的なプライマーの配列部分に位置する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標識が、化学標識、酵素標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
相互作用する２つの標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
第１マルチプレックスＰＣＲ又は第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための少なくとも３種類のプライマー対の少なくとも一つのプライマーが、下記一般式（Ｉ）の二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項１に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
［式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも３つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ，ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ，Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を前記３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。］
【請求項１３】
工程（ｂ）の鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は５’→３’ヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する核酸ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
擬陽性シグナルを排除しながら試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列のリアルタイムマルチマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）で検出するキットであって、
（ａ）試料中のターゲット核酸配列のアンプリコンを得るための、少なくとも３種類のターゲット核酸配列の第１マルチプレックスＰＣＲに使用する少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｂ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための少なくとも３種類のプライマー対であって、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対において、少なくとも一つのプライマーが、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーであり、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対として、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含み、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを、偽シグナルを生じず、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じるサイクル数で行うことができるプライマー対と、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１５】
キットが、鋳型依存性核酸ポリメラーゼをさらに含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、３０サイクル以下で行われる請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２５サイクル以下で行われる請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２０サイクル以下で行われる請求項１４に記載のキット。
【請求項１９】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーが、標識を有し、アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
少なくとも３種類のプライマー対の標識が、互いに異なっているか、又は同一である請求項１４に記載のキット。
【請求項２１】
少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対の標識が、互いに異なっているか、又は同一である請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
標識を有するプライマーが、１つの標識又は相互作用する２つの標識を含む請求項１４に記載のキット。
【請求項２３】
標識が、ターゲット核酸配列に対して相補的なプライマーの配列部分に位置する請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
相互作用する２つの標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を含む請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
第１マルチプレックスＰＣＲ又は第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための少なくとも３種類のプライマー対の少なくとも一つのプライマーは、下記一般式（Ｉ）の二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項１４に記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
［式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも３つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ，ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ，Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を前記３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。］
【請求項２７】
鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は５’→３’ヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する核酸ポリメラーゼである請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偽シグナル（ｆａｌｓｅ  ｓｉｇｎａｌｓ）が排除されるターゲット核酸配列の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲット核酸を検出するための大部分の技術は、ターゲット核酸増幅過程を含んでいる。核酸増幅は、分子生物学分野で利用される必須的な過程であって、多様な増幅方法が見出された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．ら（特許文献１）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にハイブリダイズさせた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知の、最もよく利用される核酸増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程を含む（特許文献２〜４及び非特許文献１）。
【０００４】
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野で科学的応用又は方法として広く利用されており、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ディファレンシャルディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、公知あるいは未知の遺伝子のＰＣＲを利用したクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、任意プライミングＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング及びＰＣＲ関与ゲノム分析（非特許文献２）がある。
【０００５】
一方、核酸増幅に基づいてターゲット核酸を検出するための方法として、多様なリアルタイムＰＣＲ法が開発されている。リアルタイムＰＣＲ法は、リアルタイムでターゲット増幅産物を検出することができるか、より正確な定量的分析を可能にして、汚染の問題がないという側面で大きく注目を浴びている。リアルタイムＰＣＲ法は、一般に増幅反応の間、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる、標識されたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ結合染料（ｄｙｅ）を使用する。
【０００６】
代表的なＤＮＡ結合染料としてのサイバーグリーン（ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ）はＤＮＡの二本鎖間に非特異的にインターカレートされる。そのため、サイバーグリーンは特異的なターゲットの検出に適していない。もっと大きい問題は、サイバーグリーン技術をリアルタイムマルチプレックス検出に応用する場合、メルティングカーブ分析（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて増幅産物を同定しなければならないため、時間的及び効率的な面で適していないと見なされる点である。
【０００７】
大部分のリアルタイムＰＣＲ法は、標識オリゴヌクレオチドを使用する。従来のリアルタイムＰＣＲ法は、（ｉ）標識オリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブ）の使用、（ｉｉ）標識オリゴヌクレオチドの特定形態若しくは構造の形成（例えば、ヘアピン−ループ構造）、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに結合された標識の数、（ｉｖ）シグナルの発生原理、又は（ｖ）利用される核酸ポリメラーゼの性質の側面で固有の特徴を有する。代表的な例としては、ＴａｑＭａｎＴＭ  ｐｒｏｂｅ法（特許文献５）、分子的ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）法（非特許文献３）、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）法（非特許文献４）、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ又はＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＴＭ）法（非特許文献５及び特許文献６）、Ｌｕｘ法（特許文献７）、ＣＰＴ（非特許文献６）、ＬＮＡ法（特許文献８）及びプレクサー（ＰｌｅｘｏｒＴＭ）法（非特許文献７）がある。
【０００８】
リアルタイムＰＣＲ法の開発と共に、複数のターゲット核酸配列を同時に検出できるリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法が見出されてきた。リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、下記のような観点で合理的な利点を有する：時間的効果、費用的効果、利便性及びハイスループットでの作動性（非特許文献８）。
【０００９】
それにも係わらず、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法のプライマー又はプローブは、非特異的ハイブリダイゼーションを発生させる可能性が高い（非特許文献８）。標識プライマーベースのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの場合、標識プライマーのダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成は、擬陽性シグナルを発生させるため、主要な問題点と考えられる。
【００１０】
リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ過程で生じる擬陽性シグナルが実質的に除去又は完全に除去されることで、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、複数のターゲット核酸配列を同時に検出する最も有望な技術になるであろう。
【００１１】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第８９／０６７００号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献３】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１１７，６３５号明細書
【特許文献７】米国特許第７，５３７，８８６号明細書
【特許文献８】米国特許第６，９７７，２９５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）
【非特許文献２】ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ，  ＰＣＲ．  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ（２０００）
【非特許文献３】Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４  ＭＡＲＣＨ，３０３−３０８（１９９６）
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７  ＡＵＧＵＳＴ，８０４−８０７（１９９９）
【非特許文献５】Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５  ｎｏ．１２，２５１６−２５２１（１９９７）
【非特許文献６】Ｄｕｃｋ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９，１４２−１４８（１９９０）
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｒｒｉｌｌ  Ｃ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２６，４５５０−４５５６（２００４）
【非特許文献８】Ｇｕｎｓｏｎ  Ｒ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４３，３７２−３７５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、従来の標識プライマーベースのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法を行う際の、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルを完璧に排除して、複数のターゲット核酸配列をリアルタイムマルチプレックス検出できる新たな方法の開発に努めてきた。その結果、本発明者らは、最初に多数が増幅したアンプリコンを取得し、続いて、標識ネステッドプライマーを利用したネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにより前記アンプリコンを増幅させ、少なくとも３種類のターゲット核酸配列を検出する優れた方法を見出した。本発明者らは、前記新規な方法が標識プライマーのダイマー形成により引き起こされた擬陽性シグナルを完璧に排除して、また、より改善された感度及び特異性で複数のターゲット核酸配列をリアルタイムマルチプレックス方式で検出できることを確認した。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲで偽シグナル（Ｆａｌｓｅ  ｓｉｇｎａｌｓ）が排除される少なくとも３種類のターゲット核酸配列に対するリアルタイムマルチプレックス検出方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおいて、偽シグナルが排除される少なくとも３種類のターゲット核酸配列のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ検出のためのキットを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】第１マルチプレックスＰＣＲ及び第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに係わる本発明を模式的に示す。パネルＡは、第１マルチプレックスＰＣＲを示す。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ターゲット核酸配列とハイブリダイズして伸長される。変性、アニーリング及び伸長を含むＰＣＲサイクルを繰り返すことにより、複数のターゲット核酸配列が増幅される。第１マルチプレックスＰＣＲ用プライマーは、当業者に知られたどのような形態又は構造、例えば、ＤＰＯ（Ｄｕａｌ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）構造や従来の構造を有することができる。パネルＢは、標識ネステッドプライマーを利用した第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを示す。少なくとも一つの標識を有するフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一つは、第１マルチプレックスＰＣＲから得られたアンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである。第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに利用できる代表的なプライマーとしては、単一の標識又は二重の標識システムを有するＴＳＧプライマー、ＴＨＤプライマー、スコーピオン、サンライズ、Ｌｕｘ、プレクサー（商標）及びアンチプライマーが含まれる。標識ネステッドプライマーを利用する第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、ターゲットシグナルは生じるが擬陽性シグナルは生じない範囲で反応サイクルを実施することにより、標識プライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルが排除され、且つ、ターゲット核酸配列の存在を示す、満足するシグナルを提供することができる。また、本発明の方法は、ＰＣＲターゲット特異性及び感度が向上される。
【図２】Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＴ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ検出用の３種類のプライマー対を使用して実施した従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の結果を示す。従来の方法は、標識プライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルを生じた。
【図３】Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＴ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ検出用の３種類のプライマー対を使用して実施した本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の結果を示す。結果は、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを３０サイクル実施することにより、擬陽性シグナルが排除され、且つ、ターゲット核酸の存在を示す陽性シグナルが得られることを示す。
【図４】Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２検出用の３種類のプライマー対を使用して実施した従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の結果を示す。従来の方法は、標識プライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルを生じた。
【図５】Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２検出用の３種類のプライマー対を使用して実施したネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の結果を示す。結果は、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを３０サイクル実施することにより、擬陽性シグナルが排除され、且つ、ターゲット核酸の存在を示す陽性シグナルが得られることを示す。
【図６】本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の感度及び特異性を示す結果である。３０サイクルで実施した第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２検出用の３種類のプライマー対を使用して実施した。１０倍ずつ順に希釈したＨ． ｄｕｃｒｅｙｉのゲノムＤＮＡ（１０００ｆｇから  １ｆｇまで）を鋳型として用いた。
【図７】本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の感度及び特異性を示す結果である。３０サイクルで実施した第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２検出用の３種類のプライマー対を利用して実施した。１０倍ずつ順に希釈させたＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のゲノムＤＮＡ（１０００ｆｇから  １ｆｇまで）を鋳型として用いた。
【図８】Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２の検出のために実施した本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の結果を示す。Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一様態によると、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）から偽シグナルを排除し、試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列をリアルタイムで多重的に検出する方法であって、
（ａ）反応容器でターゲット核酸配列を増幅する第１マルチプレックスＰＣＲを行う工程であって、前記第１マルチプレックスＰＣＲは、前記試料中の前記ターゲット核酸配列のアンプリコンを得るために、少なくとも３種類のターゲット核酸配列を増幅できる条件下で少なくとも３種類のプライマー対及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼを利用して行われる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）に使用された反応容器とは別の反応容器に第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応用混合物として、
（ｉ）前記工程（ａ）で得たアンプリコンと、
（ｉｉ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための、対を形成する２つのうち少なくとも１つのプライマーは、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである、少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｉｉｉ）鋳型依存性核酸ポリメラーゼと、を含み、
前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対が、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含む、反応用混合物を用意する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記反応用混合物を利用してプライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２サイクル反復し、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行うことで、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じる工程であって、前記サイクルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じるが、偽シグナルは生じないサイクル数で行われる工程と、
（ｄ）ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記検出が、前記工程（ｃ）の前記反復の各サイクルにおいて、前記工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、又は前記工程（ｃ）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、これにより、前記ターゲット核酸配列を示すシグナルが、偽シグナルなしにリアルタイムで得られる工程とを含む方法を提供する。
【００２０】
一般に、複数のターゲット配列を同時的に検出するために、標識プローブ又はプライマーを利用する従来のリアルタイムＰＣＲ技術を実施する場合、深刻な問題が引き起こされる。例えば、標識プローブ（Ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅ）を利用する方法は、増幅及び検出のために、それぞれプライマー及びプローブのようなたくさんのオリゴヌクレオチドを必要とする。したがって、プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドの適する配列を決定することが非常に難しく、また、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲの反応条件を最適化することも難しい。しかも、このような方法は、オリゴヌクレオチドのダイマー形成又は非特異的ハイブリダイゼーションにより発生される擬陽性シグナルが発生する可能性が高い。したがって、プローブベースのリアルタイムＰＣＲ法は、複数のターゲット配列を同時的に検出するに不適であると考えられる。
【００２１】
また、標識プライマーを利用する従来のリアルタイムＰＣＲによるアプローチは、ターゲット配列のリアルタイム検出において、擬陽性シグナルの発生を引き起こす標識プライアーのダイマー形成に係わる不可避な欠点がある。特に、このような問題点は、複数のターゲット配列を同時的に検出するためのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲでより深刻になる。リアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、複数の標識プライマーを必要とするため、このような標識プライマーのダイマー形成により擬陽性シグナルが発生する可能性が高い。
【００２２】
さらに、ターゲット核酸配列が非常に少ない量で存在するか、あるいは存在しない場合、標識プライマーベースのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲから得たシグナルが、ターゲット核酸配列の存在による陽性シグナルであるか、あるいは標識プライマーのダイマー形成による偽シグナルであるかを区別又は決定することが非常に難しい。
【００２３】
一方、標識プライマーの配列選択は、一般にダイマー形成問題を避けるための戦略として利用される。しかし、このような戦略は、ダイマー問題を完璧に排除する点で依然として限界を有している。
【００２４】
本発明者らは、従来標識プライマーベースのリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法を行う際、標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルを完璧に排除し、複数のターゲット核酸配列をリアルタイムマルチプレックス検出できる新規なアプローチを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、少なくとも３種類の核酸配列を第１マルチプレックス増幅してアンプリコンを取得し、標識ネステッドプライマーを利用したネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにより前記アンプリコンを増幅させる方式を実施して、少なくとも３種類のターゲット核酸配列を検出する卓越な方法を見出した。本発明者らは、新規な方法が標識プライマーのダイマー形成により引き起こされた擬陽性シグナルを完璧に排除しながら、複数のターゲット核酸配列をリアルタイムマルチプレックス方式で検出できることを確認した。
【００２５】
本発明者らが知る限りでは、標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルを排除あるいは区別するネステッドリアルタイム方式で、少なくとも３種類の標識ネステッドプライマーを利用して少なくとも３種類のターゲット核酸配列を同時に検出することができるということは、本発明者らにより最初に提示された。
【００２６】
標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルの排除（又は除去）は、下記の三つの戦略の絶妙な組み合わせによるものである。第一の戦略は、複数のターゲット核酸配列の事前の増幅であって、これは、リアルタイムシグナルが発生される過程と分離して行わなければならない。第二の戦略は、事前の増幅により生成された該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされる標識ネステッドプライマーを利用することである。第三の戦略は、ターゲットシグナルは発生されるが、ダイマー形成による擬陽性シグナルは発生されない範囲までリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応のサイクル数を制限することである。
【００２７】
本発明において、ターゲット核酸配列は、まず、第１マルチプレックスＰＣＲにより事前に増幅されて、その後、アンプリコンが第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲで鋳型として利用される。前−増幅は、ターゲット核酸配列の量を増加させるため、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間のターゲット核酸配列に対するシグナルの閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ，Ｃｔ）値は、事前の増幅無しに得たＣｔ値よりさらに低くなる。その反面、標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルのＣｔ値は、事前の増幅を行うこととは関係なく、変わらない。したがって、このような現象は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが擬陽性シグナルが生じる以前に生じ、これにより結局、陽性ターゲットシグナルと擬陽性シグナルが区別される。
【００２８】
第１マルチプレックスＰＣＲ用プライマーが第２リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ用標識プライマーとして利用される場合、第１マルチプレックスＰＣＲの際発生された非特異産物又はダイマー産物と標識プライマーとの相互作用により擬陽性シグナルが発生される可能性が高い。その反面、第２リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ用標識プライマーが第１マルチプレックスＰＣＲから生成された該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーである場合、第１マルチプレックスＰＣＲの非特異産物又はダイマー産物と標識ネステッドプライマーとの相互作用を避けることにより、このような擬陽性シグナルが根本的に防止される。
【００２９】
最終的に、本発明の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのサイクル数は、複数のターゲットシグナルは発生されるが、ダイマー形成による擬陽性シグナルは発生されないように制限される。したがって、サイクル数の制限は、ダイマー形成により発生された擬陽性シグナルは排除されるようにして、結局、ターゲット核酸配列の存在を示す陽性シグナルが検出されるようにする。
【００３０】
また、本発明者らは、擬陽性シグナル、例えば、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおいて、標識プライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルが３０サイクル以後に発生される可能性が高いということを見出した。したがって、本発明者らは、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを最大３０サイクル実施することにより、ダイマー形成により発生された擬陽性シグナルが防止されることを確認した。本発明の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、事前に増幅されたターゲット核酸配列を利用して行われるため、本発明者らは、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが３０サイクル以内で得られるということを見出した。
【００３１】
本発明によると、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、少なくとも３種類のプライマー対を利用して実施されて、少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対において、少なくとも一つのプライマーが第１マルチプレックス増幅から得た該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーであり、これは、特異性及び感度の向上のようなネステッドＰＣＲ効果の発生をもたらす。第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、従来ネステッドＰＣＲの第２ラウンドＰＣＲと類似した効果を発生させる。即ち、本発明の第１マルチプレックスＰＣＲは、従来ネステッドＰＣＲの第１ラウンドＰＣＲに該当し、本発明の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、従来ネステッドＰＣＲの第２ラウンドＰＣＲに該当する。
【００３２】
特に、本発明の特徴の一つは、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおいて、ネステッドプライマーを標識プライマーとして指定することである。したがって、本発明は、リアルタイムＰＣＲにおいて、ネステッド増幅効果により複数のターゲット核酸配列を検出時、ターゲット特異性が著しく向上されるようにして、これは、試料の非−ターゲット配列との非−特異ハイブリダイゼーションによる擬陽性シグナルを排除又は減少される。
【００３３】
また、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法に比べ、本発明の方法のネステッド効果は、感度を顕著に向上させる。即ち、複数のターゲット配列鋳型がごく少ない量で存在する場合、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、検出に限界があるため、ターゲットシグナルを検出できない可能性もある。その反面、本発明の方法は、ネステッド増幅効果により、著しく向上された感度で、非常に少ない量で存在するターゲット配列も正確に検出することができる。
【００３４】
したがって、本発明は、‘第１マルチプレックスＰＣＲ及び第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの連続的組み合わせによるネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法（Ｎｅｓｔｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｂｙ  ａ  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）’と命名される。
【００３５】
本発明の特徴を表現するために使用される用語‘第１マルチプレックスＰＣＲ（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）’は、試料からターゲット核酸配列のアンプリコンを取得するために、少なくとも３種類のプライマー対を利用して実施されるマルチプレックスＰＣＲ反応を意味する。
【００３６】
本発明の特徴を表現するために使用される用語‘第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）’は、鋳型として第１マルチプレックスＰＣＲから取得したアンプリコン及びそれぞれの対における少なくとも一つのプライマーは、該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能な標識ネステッドプライマーである少なくとも３種類のプライマー対を利用して行って、リアルタイム方式でターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生するリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される用語‘擬陽性シグナルの排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（又は除去（ｒｅｍｏｖａｌ））’又は‘擬陽性データの排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（又は除去（ｒｅｍｏｖａｌ））’は、ターゲット核酸配列が事前に増幅されない従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応に比べ、擬陽性シグナルが減少されることを意味する。好ましくは、前記用語は、擬陽性シグナルの実質的な排除（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を意味し、より好ましくは、擬陽性シグナルの完璧な排除（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）である。
【００３８】
本発明で使用される試料は、あらゆる試料を含む。好ましくは、本発明の方法を利用して生物試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）を分析する。植物、動物、人間、菌類、バクテリア及びウイルス起源の生物試料が分析され得る。哺乳類又は人間起源の試料を分析する場合、前記試料は、特定組織又は器官由来のものでありえる。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉又は神経組織が含まれる。器官の代表的な例としては、眼、脳、肺、肝、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。分析される生物試料は、生物学的ソースからから出たある細胞、組織、体液（ｆｌｕｉｄ）、又は本発明により分析できるあらゆる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）を含み、これは、人間、動物、人間又は動物の消費のために製造された飲食物から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は、体液試料を含み、これは、血液、血清、血漿、リンパ、母乳、小便、糞便、涙、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，  ｄＧＭＰ，  ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチド、ユニバーサルヌクレオチド、又は非天然ヌクレオチドが含まれる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
【００４０】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。本明細書で使用された用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００４１】
本明細書で使用された用語‘ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、二つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こりうる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリダイゼーション’には差がなく、本明細書で混用される。
【００４２】
本明細書で使用される用語‘マルチプレックス検出又はマルチプレッキシング検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）’は、反応容器（例えば、反応チューブ）で複数のターゲット核酸配列を同時的に検出することを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下でプライマー又はプローブとアニーリング又はハイブリダイズされる。
【００４４】
本明細書で使用される用語‘マルチプレックスＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）’は、反応容器でポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により複数のターゲットが同時的に増幅されることを意味する。
【００４５】
本発明によると、マルチプレックスＰＣＲは、反応容器で少なくとも３種類のターゲット核酸配列を増幅できる少なくとも３種類のプライマー対を利用して行われて、これにより試料からターゲット核酸配列のアンプリコンを得る。
【００４６】
ターゲット核酸配列のマルチプレックスＰＣＲは、当業者に公知のＰＣＲ法によって行うことができる。好ましくは、マルチプレックスＰＣＲ反応は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号に開示された過程によって行われる。
【００４７】
本発明の好ましい具体例によると、本発明の第１マルチプレックスＰＣＲは、最大５０サイクルで実施されて、より好ましくは最大４０サイクル、さらに好ましくは、最大３０サイクル、最も好ましくは、最大２０サイクルである。
【００４８】
本発明の好ましい具体例によると、本発明の第１マルチプレックスＰＣＲは、少なくとも２サイクルで実施されて、より好ましくは少なくとも５サイクル、さらに好ましくは、少なくとも１０サイクル、最も好ましくは、少なくとも１５サイクルである。
【００４９】
本発明の好ましい具体例によると、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの際に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの発生に必要な量のアンプリコンが提供されるように第１マルチプレックスＰＣＲのサイクル数が決定される。
【００５０】
試料のターゲット核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。前記分子は、二本鎖又は一本鎖形態であり得る。初期物質としての核酸が二本鎖である場合、二つの鎖を一本鎖又は部分一本鎖形態にすることが好ましい。鎖を分離する公知の方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、鎖の分離は、８０℃乃至１０５℃の温度で熱処理して達成できる。上述の処理の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）に開示されている。
【００５１】
ｍＲＮＡが初期物質として利用される場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；  及びＮｏｏｎａｎ，  Ｋ．  Ｆ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０３６６  （１９８８）に開示されている。逆転写反応のために、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓから構成されて、ｄＴプライマーがプライマーとしての役割ができる範囲内でこれのｄＴＭＰｓの一つ又はそれ以上は、他のｄＮＭＰで代替できる。逆転写は、ＲＮａｓｅＨ活性を有する逆転写酵素で実施できる。ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を利用する場合、慎重に反応条件を選択することにより、ＲＮａｓｅＨ切断過程を省くことができる。
【００５２】
本発明で使用されるプライマーは、ターゲット核酸配列（鋳型）の一位置（ｓｉｔｅ）にハイブリダイズ又はアニーリングされて、二本鎖構造を形成する。このような二本鎖構造を形成するに適した核酸アニーリングの条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  （１９８５）に開示されている。
【００５３】
多様なＤＮＡポリメラーゼが本発明の第１マルチプレックスＰＣＲ段階に利用できて、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの‘Ｋｌｅｎｏｗ’断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得ることができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｔｔｈ），  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  （Ｐｆｕ）を含む。
【００５４】
重合反応が実施される場合、反応容器に、このような反応に必要な構成成分を過量提供することが好ましい。伸長反応に必要な構成成分の過量は、所望の程度の伸長が、構成成分の濃度によって実質的に制限されない程度の各構成成分の量を意味する。Ｍｇ２＋のような必要な助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、反応混合物に十分な量を提供し、伸長が所望の程度になされるようにすることが好ましい。
【００５５】
第１マルチプレックスＰＣＲ又は第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに利用される全ての酵素は、同一な反応条件下で活性状態であり得る。実際に、バッファーは、全ての酵素が最適の反応条件に近接するようになっている。したがって、本発明のマルチプレックスＰＣＲ過程は、反応物の添加のような条件の変化無しに、単一反応物で実施され得る。
【００５６】
本発明の方法において、マルチプレックスＰＣＲのためのアニーリング又はハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列とプライマー間に特異的結合を可能にするストリンジェントな条件下で実施される。アニーリングのためのストリンジェントな条件は、配列依存的であり、周囲の環境によって様々である。好ましくは、アニーリング温度は、４０℃乃至７５℃であり、より好ましくは、４５℃乃至６８℃であって、最も好ましくは、５０℃乃至６５℃である。
【００５７】
本発明の好ましい具体例によると、前記第１マルチプレックスＰＣＲ又は第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための前記少なくとも３種類のプライマー対の少なくとも一つのプライマーは、下記一般式（Ｉ）の二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも３つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ，ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ，Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を前記３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。
【００５８】
ＤＰＯ構造は、ＤＳＯ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のプライマー形態であって、本発明者らにより最初に見出された（参照国際公開第２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。ＤＰＯは、ハイブリダイゼーション又はアニーリングが分割区域により互いに分離された５’−高Ｔｍ  特異性部位（又は５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ  特異性部位（又は３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具体化したもので、非常に向上されたハイブリダイゼーション特異性を示す（参照：国際公開第２００６／０９５９８１；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９：７６−８４（２００８）；  Ｋｉｍ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）；  Ｈｏｒｉｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、ＤＰＯは、互いに異なるハイブリダイゼーション特性を有する二つのプライマーの部位、即ち、初期の安定したハイブリダイゼーションを招来する５’−第１プライミング部位及びターゲット特異性を決定する３’−第２プライミング部位を結局のところ有する。
【００５９】
擬陽性シグナルが排除されたマルチプレックス増幅反応が成功するのに、ＤＰＯ構造を有するプライマーが部分的に寄与する。
【００６０】
本発明の好ましい具体例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【００６１】
好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３ユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも４ユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５ユニバーサル塩基である。択一的に、前記分割部位は、３〜１０、３〜７又は５〜７個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６２】
好ましくは、ＤＰＯ構造の５’−第１プライミング部位の長さは、３’−第２プライミング部位より長い。前記５’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記３’−第２プライミング部位は、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。前記分割部位は、好ましくは、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明の好ましい具体例によると、前記５’−第１プライミング部位は、４０〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５〜６５℃のＴｍを有する。３’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３〜１５℃のＴｍを有する。
【００６３】
第１マルチプレックスＰＣＲのための工程（ａ）には、少なくとも３種類のプライマー対が利用されて、好ましくは、少なくとも４種のプライマー対、より好ましくは、少なくとも５種のプライマー対が利用される。
【００６４】
ターゲット核酸配列の第１マルチプレックスＰＣＲに続けて、第１マルチプレックスＰＣＲの工程（ａ）の反応容器とは別の反応容器で第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行う。それぞれの対の少なくとも一つのプライマーは、工程（ａ）から得た該当アンプリコンのそれぞれの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーである少なくとも３種類のプライマー対を利用して、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行う。第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲによって、少なくとも３種類のターゲット核酸配列がリアルタイム方式で検出できる。
【００６５】
本発明の好ましい具体例によると、第２ネステッドマルチプレックスＰＣＲ用正方向及び逆方向プライマーの少なくとも一つは、工程（ａ）から得た該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーである。
【００６６】
本明細書で使用される用語‘ネステッドプライマー（Ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）’は、工程（ａ）から得た該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるプライマーを意味する。即ち、ネステッドプライマーは、一番目にターゲッティングされたヌクレオチド配列内ヌクレオチド配列由来であり、前記一番目にターゲッティングされたヌクレオチド配列内に含まれている、より狭い二番目にターゲッティングされたヌクレオチド配列の側面に位置（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する。
【００６７】
本明細書で使用される用語‘アンプリコンの内部配列’は、アンプリコンの配列として、少なくとも一つのヌクレオチドだけでも内部に位置する配列を意味する。
【００６８】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための工程（ｃ）が行われる場合、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生する標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含む。
【００６９】
本発明の好ましい具体例によると、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーがターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生する標識を有する場合、前記プライマーは、該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーである。
【００７０】
本発明において、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、事前に増幅された産物を利用するため、標識ネステッドプライマーのダイマー形成により発生された擬陽性シグナル無しに、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが生じる。
【００７１】
本発明の好ましい具体例によると、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲでターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、３０サイクル以内に発生されて、より好ましくは、２５サイクル以内、最も好ましくは２０サイクル以内である。
【００７２】
本発明において、工程（ｃ）の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、偽シグナルは発生させず、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは発生させるサイクル数で実施される。
【００７３】
本発明の好ましい具体例によると、工程（ｃ）の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、最大３０サイクルで実施されて、より好ましくは、最大２５サイクル、最も好ましくは、最大２０サイクルである。第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、一般に少なくとも２サイクルで実施されて、好ましくは、少なくとも３サイクル、最も好ましくは、少なくとも５サイクルである。
【００７４】
本発明によると、標識ネステッドプライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルが発生するサイクル数（又はＣｔ値）は、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに、鋳型無しに標識ネステッドプライマーを利用して決定することができる。
【００７５】
本発明の好ましい具体例によると、第１マルチプレックス増幅ＰＣＲの産物は、少なくとも一つの個別容器に分株できて、それぞれの容器は、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおいて少なくとも３種類の異なるターゲット核酸の検出に利用する。例えば、１０プライマー対で１０種の異なるターゲット核酸を増幅させるために、第一１０−プレックス（ｐｌｅｘ）ＰＣＲを実施して、増幅産物を三つの異なる容器に分株した後、それぞれの容器は、リアルタイム方式で少なくとも３種類のターゲット核酸配列のサブタイピング（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）、グルーピング（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）又は同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に利用される。
【００７６】
本発明の好ましい具体例によると、少なくとも３種類のプライマー対の標識は、互いに異なっているか、あるいは同一である。
【００７７】
本発明の好ましい具体例によると、少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対の標識は、互いに異なっているか、あるいは同一である。
【００７８】
本明細書で使用される表現‘プライマーの標識は、互いに異なっている’は、（ｉ）プライマーに連結された標識の数、種類、吸収波長又は放出波長側面における差異；又は（ｉｉ）プライマーに連結された標識のシグナル発生メカニズムの差異（例えば、酵素的切断、標識を有するプライマーの３次元的構造変化又は二本鎖ＰＣＲ産物への標識プライマーの挿入によるシグナル発生）を意味する。
【００７９】
本明細書で使用される表現‘プライマーの標識は、互いに同一である’は、（ｉ）プライマーに連結された標識の数、種類、吸収波長又は放出波長側面における同一性；及び（ｉｉ）プライマーに連結された標識のシグナル発生メカニズムの同一性（例えば、酵素的切断、標識を有するプライマーの３次元的構造変化又は二本鎖ＰＣＲ産物への標識プライマーの挿入によるシグナル発生）を意味する。
【００８０】
本発明の好ましい具体例によると、用語‘標識’は、少なくとも一つの標識を意味するに使用される。
【００８１】
本発明の好ましい具体例によると、標識を有するプライマーは、単一標識又は相互作用的二重標識を含む。
【００８２】
好ましくは、標識は、ターゲット核酸配列に相補的な位置（ｓｉｔｅ）に位置する。
【００８３】
本発明の好ましい具体例によると、標識を有するプライマーは、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以前に線形（ｌｉｎｅａｒ）構造又は分子間（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）構造を有する。分子間構造の例としては、ヘアピン−ループ又はＧ−ｑｕａｒｔｅｔ構造である。
【００８４】
本発明に有用な標識は、当業界に知られた如何なる標識でも含む。標識の大部分は、単一分子又は単一原子（ａｔｏｍ）標識を含み；しかし、一部標識（例えば、相互作用的標識システム）は、少なくとも二つ又はそれ以上の標識分子又は原子を含む。本発明の好ましい具体例によると、プライマーに連結された標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識（例えば、金）である。
【００８５】
本発明の好ましい具体例によると、標識は、蛍光標識であり、好ましくは、モノ（ｍｏｎｏ）蛍光標識、より好ましくは、相互作用的標識システム、最も好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
【００８６】
相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子間にエネルギーが非−放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性又は非蛍光性である。  
【００８７】
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
【００８８】
より好ましくは、ターゲット核酸配列を示すシグナルは、相互作用的標識システムにより発生されて、さらに好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
【００８９】
ＦＲＥＴ標識が利用される場合、レポーター分子の蛍光をクエンチャー分子がクエンチングされる範囲で、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の位置は、多様である。例えば、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、５〜５０ヌクレオチド離隔され得て、好ましくは、５〜４０ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜３０ヌクレオチド離隔され得る。
【００９０】
本発明の好ましい具体例によると、標識プライマーの蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、標識プライマーの５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置に位置する。例えば、蛍光レポーター分子は、標識プライマーの５’−末端に位置し、クエンチャー分子は、レポーター分子から５〜５０ヌクレオチド離隔された位置に位置する。
【００９１】
本発明の好ましい具体例によると、標識プライマーの蛍光レポーター分子は、標識プライマーの５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置に位置し、最も好ましくは、標識プライマーの５’−末端である。
【００９２】
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られた如何なるものでも利用できる。その例は、下記のようである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６），ＹＯＰＲＯＴＭ−１  ５０９），ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９），Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７），ＦＩＴＣ（５１８），ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９），ＡｌｅｘａＴＭ（５２０），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０（５２０），５−ＦＡＭ（５２２），Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ５００（５２２），Ｏｒｅｇｏｎ  ２５  ＧｒｅｅｎＴＭ  ４８８（５２４），ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９），Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１），Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３），ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３），ＴＯＴＯ１（５３３），ＪＯＥ（５４８），ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０），Ｄｉｌ（５６５），ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８），ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８），ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０），Ｃｙ３ＴＭ（５７０），ＡｌｅｘａＴＭ  ５４６（５７０），ＴＲＩＴＣ（５７２），Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５），Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５），Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ  （５７６），Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０），  ＴＡＭＲＡ（５８２），Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０），Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６），ＲＯＸ（６０８），Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５），ＡｌｅｘａＴＭ  ５９４（６１５），Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５），Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８），ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１），ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１），Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２），Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８），ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０），ＴＯＴＯ３（６６０），ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５），Ｃｙ５ＴＭ（６７０），Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）及びＣｙ５．５（６９４）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
【００９３】
本発明において、広範囲波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非−蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。
【００９４】
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようにたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７０）；  Ｂｅｒｌｍａｎ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，  ２ｎｄ  ＥＤＩＴＩＯＮ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７６）；  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄｉｔｏｒ，  ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９７２）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  １９９２）；  Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４９）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｐ．，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．，  １９９６；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ３，９９６，３４５及び４，３５１，７６０。
【００９５】
標識プライマーに適用されるＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーターとして利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
【００９６】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ用の少なくとも３種類のプライマー対は、ターゲット核酸配列に相補的な配列を含んでさえいれば、如何なる形態（ｆｏｒｍ）又は構造でも有することができる。
【００９７】
一具体例によると、上述のように第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ用の少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対において、少なくとも一つのプライマーは、ＤＰＯ構造を有する。
【００９８】
本発明で有用な標識プライマーは、従来のリアルタイムＰＣＲ過程でシグナルを発生させるために当業界に知られた如何なる標識プライマーでも含む。それらは、標識プライマーの種類によって追加的な構造的特徴を含むか、又は特異的ポリメリゼーション条件を必要とする。
【００９９】
標識プライマーの例は、以下を含むが、これらに限定されない：ＰｌｅｘｏｒＴＭ  （Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  ＣＢら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６：４５５０−４５５６（２００４）），  Ａｎｔｉｐｒｉｍｅｒ  （Ｊｉｎ  Ｌｉら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２：４  ６２４−６３３  （２００６）），  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  （米国特許第６，５９３，０９１号），  ＬＵＸＴＭ  （Ｉ．  Ａ．  Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０：２０８９−２０９５（２００２）；米国特許第７，５３７，８８６号），  ＴＳＧ  ｐｒｉｍｅｒ  （大韓民国特許第１０−２００９−０１２７８８０号），  ＴＨＤ  ｐｒｉｍｅｒ  （国際出願／ＫＲ２００９／００７０６４号），  Ｌｉｏｎ  （米国特許第６，２４８，５２６号），  Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  （米国特許第５，８４６，７２６号及び第６，０５４，２７９号），  Ｓｕｎｒｉｓｅ  （Ｉ．Ａ．Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）；  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｍ  ｅｔ，  ａｌ．  Ｊ．  ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ３９：９９−１０７（２００４），  米国特許第５，８６６，３３６号，  第６，０９０，５５２号及び第６，１１７，６３５号）及びＳｃｏｒｐｉｏｎｓ  （Ｄａｖｉｄ  Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １７：８０４−８０７（１９９９）及びヨーロッパ特許第１，０８８，１０２号）。
【０１００】
標識プライマーとしてＰｌｅｘｏｒＴＭ（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  ＣＢら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６：４５５０−４５５６（２００４））を利用する場合、クエンチングのためにＤａｂｃｙｌ−ｉｓｏ−ｄＧＴＰを使用することが好ましい。
【０１０１】
標識プライマーとしてアンチプライマー（ａｎｔｉｐｒｉｍｅｒ）（Ｊｉｎ  Ｌｉら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２：４  ６２４−６３３  （２００６））を利用する場合、フリー（ｆｒｅｅ）プライマーをクエンチングできるアンチプライマーを追加的に使用することが好ましい。
【０１０２】
標識プライマーとしてＩｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（米国特許第６，５９３，０９１号）を利用する場合、それぞれ単一標識を有する二つのプライマーを使用することが好ましい。
【０１０３】
例示された標識プライマーのうち、ＴＨＤプライマー及びＴＳＧプライマーは、本発明者が発明したものである。前記プライマーと関連し、本発明者らが見出したことによると、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ増幅において、ＴＨＤプライマー又はＴＳＧプライマーは、少なくとも３種類のターゲット核酸配列が検出されるシグナルを成功的に発生させる。また、本発明者らは、ＴＨＤプライマー又はＴＳＧプライマーから出るシグナルがプライマーの構造的変化又は５’−末端の切断により発生されるという驚くべき事実も見出した。
【０１０４】
本発明の好ましい具体例によると、工程（ｃ）に使用される鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は、これらの組み合わせである。好ましくは、鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は、これらの組み合わせである。
【０１０５】
プライマーシグナリング過程において、最終的に検出されるシグナルは、好ましくは、二本鎖ＰＣＲ産物への標識プライマーの挿入、標識プライマーの形態変化又は標識プライマーの５’−末端の切断により発せられる。
【０１０６】
例えば、標識プライマーが単一標識を有する場合、それが二本鎖ＰＣＲ産物に挿入される時、標識は、蛍光強度増加によりシグナルを提供する。
【０１０７】
標識プライマーがレポーター分子及びクエンチャー分子から構成された相互作用的二重標識システムを有してターゲット核酸配列にハイブリダイズされない場合、クエンチャー分子は、レポーター分子と３次元的に隣接して、レポーター分子から出るシグナルをクエンチングする。相互作用的二重標識プライマーがターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、クエンチャー分子は、レポーター分子から３次元的に離隔されて、レポーター分子から出るシグナルをそれ以上クエンチングできない。相互作用的二重標識プライマーの形態変化により、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを得ることができる。
【０１０８】
このようなシグナル発生過程において、標識プライマーシステムは、ターゲット増幅だけではなく、シグナル発生も引き起こして、これは、標識プローブシステムとは異なっている。
【０１０９】
二本鎖ＰＣＲ産物への標識プライマーの挿入又は標識プライマーの形態変化により発生されたシグナルでターゲット核酸配列を検出する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼを利用することができる。
【０１１０】
５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１１１】
択一的に、本発明者らの以前の発見によると、標識プライマーがレポーター分子及びクエンチャー分子から構成された相互作用的二重標識システムを有する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触することにより、その３’−末端は、伸長されて、その５’−末端は、切断されて、以後、レポーター分子又はクエンチャー分子が放出されつつ、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生する。このような標識プライマーは、‘ＴＨＤ（Ｔａｒｇｅｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ’プライマーと命名される。前記シグナル発生戦略において、ＴＨＤプライマーは、ターゲット増幅及びシグナル発生を伴う二重機能を有する。
【０１１２】
標識プライマー（例えば、ＴＨＤプライマー）の５’−末端の切断により発生されたシグナルでターゲット核酸配列の存在を検出する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを必要とする。
【０１１３】
本発明の好ましい具体例によると、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、多様なバクテリア種から得ることができて、例えば、  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓを含む。最も好ましくは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１４】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用する場合、標識プライマーは、その３’−末端部位に人為的ミスマッチヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
ミスマッチヌクレオチドは、３’−末端部位の多様な位置に位置できる。本発明の好ましい具体例によると、ミスマッチヌクレオチドは、プライマーの３’−末端又はプライマーの３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置に位置して、より好ましくは、プライマーの３’−末端又はプライマーの３’−末端から１〜２ヌクレオチド離隔された位置、さらに好ましくは、プライマーの３’−末端又はプライマーの３’−末端から１ヌクレオチド離隔された位置、最も好ましくは、プライマーの３’−末端である。
【０１１６】
ミスマッチヌクレオチドの数は、１〜５、好ましくは、１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、最も好ましくは、１である。プライマーに少なくとも二つのミスマッチヌクレオチドがある場合、ミスマッチヌクレオチドは、連続的又は不連続的に位置することができる。
【０１１７】
本発明の好ましい具体例によると、プライマーの蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プライマーの３’−末端又はプライマーの３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置に位置して、最も好ましくは、プライマーの３’−末端である。プライマーがターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子を有するプライマーの３’−末端は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼにより切断され、蛍光分子又はクエンチャー分子を放出して、これにより、レポーター分子から出る蛍光シグナルがアンクエンチングされてターゲット核酸配列を示す蛍光シグナルを得る。
【０１１８】
本発明の好ましい具体例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、多様なバクテリア種から得ることができ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  （Ｐｆｕ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓのＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、３’→５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１９】
最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが検出される。シグナルの検出は、反復の各サイクルで、反復の終了時点で、又は、反復の間、指定時間間隔のそれぞれで実施できる。好ましくは、検出の正確性を向上させるために、反復の各サイクルでシグナル検出が実施される。
【０１２０】
各標識に対するシグナルは、従来の方法により検出されるか又は測定することができる。例えば、蛍光シグナルは、従来の方法、例えば、蛍光強度測定器を利用して検出するか測定することができる。
【０１２１】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、擬陽性シグナルを排除しながら試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列のリアルタイムマルチマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）で検出するキットであって、
（ａ）試料中のターゲット核酸配列のアンプリコンを得るための、少なくとも３種類のターゲット核酸配列の第１マルチプレックスＰＣＲに使用する少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｂ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための少なくとも３種類のプライマー対であって、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対において、少なくとも一つのプライマーが、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーであり、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対として、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含み、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを、偽シグナルを生じず、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じるサイクル数で行うことができるプライマー対と、を含むキットを提供する。
【０１２２】
本発明のキットは、上述の本発明のネステッドマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ法を実施できるように構成されたものであるため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０１２３】
本発明の好ましい具体例によると、キットは、鋳型依存性核酸ポリメラーゼをさらに含む。
【０１２４】
好ましくは、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、最大３０サイクルで行われて、より好ましくは、２５サイクル、最も好ましくは、２０サイクルである。
【０１２５】
本発明の好ましい具体例によると、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーがターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生する標識を有する場合、プライマーは、該当アンプリコンの内部配列にハイブリダイズされるネステッドプライマーである。
【０１２６】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
【０１２７】
また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須の試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される。
【０１２８】
本発明の特徴及び利点を要約すると、下記のようである：
（ａ）標識プライマー（Ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）のダイマー形成により発生される擬陽性シグナルの排除
従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、複数の標識プライマーを必要とし、擬陽性シグナルの発生を引き起こすダイマーを形成する可能性が高く、これは、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の深刻な短所及び限界と考えられる。一方、本発明の方法は、事前に増幅された産物、標識ネステッドプライマー（Ｌａｂｅｌｅｄ  ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及びサイクル数の調整を利用して、標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルを抜本的に排除する。
（ｂ）陰性対照群における擬陽性シグナルの排除
従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、複数の標識プライマーのダイマー形成のため、鋳型のない陰性対照群からも擬陽性シグナルが生じる問題を有する。一方、本発明は、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルを完璧に排除することにより、鋳型のない陰性対照群におけるこのような擬陽性シグナル問題を防止する。
（ｃ）非ターゲット配列と標識プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションにより発生された擬陽性シグナルの排除
当業者の技術常識によると、多重的なターゲット検出において、標識プライマーは、非−ターゲット核酸配列と非特異的にハイブリダイズされる可能性が高く、擬陽性シグナルが生じる。本発明の方法では、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにネステッドプライマーとして標識プライマーを利用するため、従来のネステッドＰＣＲと類似した効果が生じ、その結果、本発明のターゲット特異性が非常に増加し、非特異的ハイブリダイゼーションによる擬陽性シグナルの発生を防止する。
（ｄ）ごく少量のターゲット配列検出における擬陽性シグナルの排除
ターゲット配列が非常に少量の場合、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法では、陰性と分析される可能性がある。しかし、本発明の第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、事前に増幅された産物を利用して行われるため、ごく少量のターゲット配列を検出することができ、擬陰性シグナルも防止する。
（ｅ）上述のように、本発明で使用されるＤＰＯ構造を有するプライマーは、結合特異性を向上し、これにより、マルチプレックスＰＣＲにおいて、プライマーの非ターゲット結合に因る擬陽性シグナルを排除する。
【０１２９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓに対するリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおける、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルの排除のためのネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の効果
標識されたプライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルを排除する効果を確認するために、本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法と従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法とを比較して実験した。
【０１３１】
本実験では、Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＴ． ｖａｇｉｎａｌｉｓの３種類の異なるターゲット核酸の検出のために、第１マルチプレックスＰＣＲ用プライマー対及び第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ用の標識されたネステッドプライマーをデザインした。
【０１３２】
第１マルチプレックスＰＣＲ用プライマー対は、ターゲット特異性を向上させるために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するようにデザインした。
【０１３３】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのために、本実施例では、ターゲットシグナル発生用標識プライマーとして二重標識プライマーを使用した。二重標識プライマーは、その５’−末端にＦＡＭ、Ａｌｅｘａ  ５３２又はＡｌｅｘａ  ６４７のような蛍光レポーター分子と、ＢＨＱＩ（Ｂｌｏｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）又はＢＨＱ２（Ｂｌｏｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２）のようなクエンチャー分子を有する。蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、１８又は１９ヌクレオチド隔離されている。二重標識プライマーは、第１マルチプレックスＰＣＲにより生成されたアンプリコンの内部配列とハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである。二重標識ネステッドプライマーのターゲット核酸配列とのアニーリング及び伸長は、蛍光シグナルを生じる。第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのために、第１マルチプレックスＰＣＲに利用されたプライマー対の１つのプライマーを二重標識ネステッドプライマーと共に用いた。
【０１３４】
標識ネステッドプライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルを、本発明の方法が排除できるかどうか実験するために、従来の構造又はＤＰＯ構造を有する標識されたネステッドプライマーの組み合わせを利用した。
【０１３５】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法及び従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法に、同一のプライマー対を使用した。
【０１３６】
擬陽性シグナルの排除を達成する本発明の特徴を説明するために、１種類の鋳型（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ）のみを使用した。
【０１３７】
本実施例で利用されるプライマー配列は、下記のようである：
Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対するプライマーセット
ＣＴ＿Ｆ：  ５’−ＴＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＩＩＩＩＩＣＡＴＴＧＡＡＡＣＴ−３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
ＣＴ＿Ｒ：  ５’−ＡＣＣＣＡＴＡＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＴＴＣＴＩＩＩＩＩＧＣＣＴＡＣＡＣＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）
ＣＴ＿ＤＬＰ（１８）：  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６＋Ａｌｅｘａ５３２］  ＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＡＡＡＧＣ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＡＧＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）
Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対するプライマーセット
ＮＧ＿Ｆ：  ５’−ＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＩＩＩＩＩＡＡＧＣＧＴＧＧＧＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
ＮＧ＿Ｒ：  ５’−ＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＩＩＩＩＩＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
ＮＧ＿ＤＬＰ（１８）：  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＣＣＣＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＩＩＩＩＩＴＴＧＣＧＧＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
Ｔ． ｖａｇｉｎａｌｉｓに対するプライマーセット
ＴＶ＿Ｆ：  ５’−ＣＣＣＡＡＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＡＧＡＩＩＩＩＩＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
ＴＶ＿Ｒ：  ５’−ＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＩＩＩＩＩＣＡＣＧＣＴＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
ＴＶ＿ＤＬＰ（１９）：  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６＋Ａｌｅｘａ６４７］ＴＧＡＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧ［ＢＨＱ２−ｄＴ］ＣＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）
（Ｉ：  デオキシイノシン）
【０１３８】
従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法
鋳型としてＮ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ  １０００ｆｇが含まれているか、又は含まれていない２Ｘ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲバッファー、ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックス］１０μｌ及びそれぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ：１，３，４，６，８及び９）  ５ｐｍｏｌｅを含有した２０μｌの最終容量の反応用混合物で従来のリアルタイムＰＣＲ反応を行った。前記反応用混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し、前記反応用混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒の過程を４０サイクル行った。各サイクルのアニーリング段階（５５℃）で生じたシグナルを検出した。
【０１３９】
図２のパネルＡに示されたように、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡのみを鋳型として利用したにも係わらず、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のシグナル（Ｃｔ値：３３．３１）だけではなく、Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のシグナル（Ｃｔ値：３２．８９）が生じた。これは、ＣＴのシグナルが擬陽性であることを示す。
【０１４０】
図２のパネルＢに示されたように、鋳型無しに実施した従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法において、ＮＧ（Ｃｔ値：３３．４３）及びＣＴ（Ｃｔ値：３２．９４）の両方からシグナルが生じた。このような結果は、標識プライマーのダイマー形成により擬陽性シグナルが生じることを示す。したがって、パネルＡの擬陽性シグナル（ＣＴ）は、標識プライマーのダイマー形成により発生されたものであることを確認した。
【０１４１】
また、パネルＡ及びＢにおいて、シグナルが類似したパターンで生成されたことが観察されたが、パネルＡにおけるＮＧシグナルは陽性であると思われるが、パネルＢにおけるＮＧシグナルは擬陽性である。このような結果は、陽性シグナル及び偽シグナルが、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法では区別できない可能性を示す。
【０１４２】
ターゲット配列を検出するための従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、標識プライマーのダイマー形成による擬陽性シグナルを伴う可能性が非常に高く、これは、ターゲット配列に対するエラー問題のない検出結果を得難くする。
【０１４３】
本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法
−第１マルチプレックスＰＣＲ−
鋳型としてＮ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ  １０００ｆｇが含まれている、又は含まれていない２Ｘマルチプレックスマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ  ＰＣＲバッファー、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックス］１０μｌ及びそれぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ：１，２，４，５，７及び８）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μｌの最終容量の反応用混合物を用いて第１マルチプレックスＰＣＲを行った。前記反応用混合物を含有しているチューブをサーマルサイクラー（ＡＢＩ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に設置し、前記反応用混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で６０秒過程を３５サイクル行った。
【０１４４】
−第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ−
第１マルチプレックスＰＣＲ産物１μｌ、２Ｘ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲバッファー、ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックス］１０μｌ及びそれぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ：１，３，４，６，８及び９）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μｌの最終容量の反応用混合物を用いて第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行った；前記反応用混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し、前記反応用混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を３０サイクル行った。各サイクルのアニーリング段階（５５℃）で生じるシグナルを検出した。
【０１４５】
図３のパネルＡに示されたように、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）を鋳型として利用した場合、本発明の方法は、如何なる擬陽性シグナル無しに、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のターゲットシグナル（Ｃｔ値：９．１４）のみを生じた。また、鋳型のない陰性対照群では、本発明の方法は、図３のパネルＢに示されたように、如何なる擬陽性シグナルも生じなかった。
【０１４６】
このような結果は、本発明の方法が、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ方式において、標識プライマーのダイマー形成により発生される擬陽性シグナルを排除し、且つ、ターゲット核酸配列を正確に検出することを立証する。
【０１４７】
実施例２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２に対するリアルタイムマルチプレックスＰＣＲにおける、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルの排除のためのネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の効果
本発明の再現性を確認するための実験として、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２の３種類のターゲット核酸配列を使用した。プライマー配列及びラベリングを除いて、プライマーのデザイン及び実験条件は、実施例１と同様である。二重標識プライマーは、その５’−末端にＡｌｅｘａ  ５３２，  Ａｌｅｘａ  ５９４又はＡｌｅｘａ  ６４７のような蛍光レポーター分子と、ＢＨＱＩ（Ｂｌｏｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）又はＢＨＱ２（Ｂｌｏｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２）のようなクエンチャー分子を有する。蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子は、１８、２０又は２１ヌクレオチド隔離されている。Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のゲノムＤＮＡ  １０００ｆｇを鋳型として用いた。
【０１４８】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ及び従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに、両方とも同一なプライマー対を利用した。
【０１４９】
本実施例で利用されるプライマー配列は、下記のようである：
Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉに対するプライマーセット
ＨＤ＿Ｆ：  ５’−ＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＡＣＣＩＩＩＩＩＡＡＡＡＴＴＡＣＴＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）
ＨＤ＿Ｒ：  ５’−ＡＴＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＡＧＣＡＡＴＩＩＩＩＩＧＡＣＡＡＴＣＡＡＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）
ＨＤ＿ＤＬＰ（２０）：５’−［ＡｍｉｎｏＣ６＋Ａｌｅｘａ５３２］ＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＴＡ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＣＩＩＩＩＩＡＧＣＣＴＡＧＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）
Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １に対するプライマーセット
ＨＳＶ１＿Ｆ：  ５’−ＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＩＩＩＩＩＡＧＴＴＣＣＧＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）
ＨＳＶ１＿Ｒ：  ５’−ＡＴＡＣＧＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＣＩＩＩＩＩＴＧＴＧＡＧＡＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）
ＨＳＶ１＿ＤＬＰ（１８）：５’−［ＡｍｉｎｏＣ６＋Ａｌｅｘａ５９４］ＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡ［ＢＨＱ２−ｄＴ］ＩＩＩＩＩＴＧＡＣＧＡＧＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）
Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２に対するプライマーセット
ＨＳＶ２＿Ｆ：  ５’−ＧＴＣＧＴＣＴＧＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＩＩＩＩＩＧＣＡＧＡＣＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）
ＨＳＶ２＿Ｒ：  ５’−ＣＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＴＩＩＩＩＩＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）
ＨＳＶ２＿ＤＬＰ（２１）：５’−［ＡｍｉｎｏＣ６＋Ａｌｅｘａ６４７］ＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧ［ＢＨＱ２−ｄＴ］ＩＩＩＩＩＡＡＣＧＴＧＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）
（Ｉ：  デオキシイノシン）
【０１５０】
従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法
プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０，１２，１４，１５，１７及び１８）及び鋳型（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）を除いて、実施例１と同様に従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法を行った。
【０１５１】
図４のパネルＡに示されたように、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １（ＨＳＶ１）のゲノムＤＮＡのみを鋳型として利用したにも係わらず、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １（ＨＳＶ１）のシグナル（Ｃｔ値：３３．５０）だけではなく、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ（ＨＤ）（Ｃｔ値：３８．２４）及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２（ＨＳＶ２）のシグナル（Ｃｔ値：３２．７９）を生じた。これは、ＨＤ及びＨＳＶ２のシグナルが擬陽性であることを示す。
【０１５２】
図４のパネルＢに示されたように、鋳型も無しに実施した従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法は、ＨＳＶ１（Ｃｔ値：３４．５２）及びＨＳＶ２（Ｃｔ値：３４．５２）の両方からシグナルを生じた。このような結果は、標識プライマーのダイマー形成により、擬陽性シグナル（ＨＳＶ１及びＨＳＶ２）が発生するということを示す。
【０１５３】
したがって、パネルＡのＨＳＶ２擬陽性シグナルは、標識プライマーのダイマー形成により発生したものであることを示し、パネルＡのＨＤ擬陽性シグナルは、標識プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションにより発生したものであることを示す。
【０１５４】
また、パネルＡ及びＢのＨＳＶ１及びＨＳＶ２シグナルは、ターゲット鋳型の存在有無に関係なく発生した。このような結果は、陽性シグナル及び偽シグナルが、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法では区別できない可能性を示す。
【０１５５】
本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法
−第１マルチプレックスＰＣＲ−
プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０，１１，１３，１４，１６及び１７）及び鋳型（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）を除いては、実施例１と同様に第１マルチプレックスＰＣＲを行った。
【０１５６】
−第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ−
プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０，１２，１４，１５，１７及び１８）を除いては、実施例１と同様に第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行った。
【０１５７】
図５のパネルＡに示されたように、ＨＳＶ１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）を鋳型として利用した場合、本発明の方法は、擬陽性シグナル無しに、ＨＳＶ１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）のターゲットシグナル（Ｃｔ値：７．９９）のみを生じた。また、鋳型のない陰性対照群では、本発明の方法は、図５のパネルＢに示されたように、如何なる擬陽性シグナルも生じなかった。
【０１５８】
このような結果は、本発明の方法が、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ方式において、標識プライマーのダイマー形成により生じる擬陽性シグナルを排除し、且つ、ターゲット核酸配列を正確に検出することを立証する。
【０１５９】
実施例３：本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法の感度及び特異性
Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２を検出するための３種類のプライマー対の存在下で、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ又はＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のゲノムＤＮＡを検出することにより、本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法における感度及び特異性を確認した。
【０１６０】
実施例２に述べたものと同じプライマー対を使用し、順に希釈したＨ． ｄｕｃｒｅｙｉ又はＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。
【０１６１】
−第１マルチプレックスＰＣＲ−
順に希釈したＨ． ｄｕｃｒｅｙｉ又はＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のゲノムＤＮＡ（１０００ｆｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ又は１ｆｇ）、２ＸマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ  ＰＣＲバッファー，  ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックス］１０μｌ及びそれぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ：１０，１１，１３，１４，１６及び１７）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μｌの最終容量の反応用混合物を用いて第１マルチプレックスＰＣＲを行った。前記反応用混合物を含有しているチューブをサーマルサイクラー（ＡＢＩ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に設置し、前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で６０秒過程を３５サイクル行った。
【０１６２】
−第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ−
第１マルチプレックスＰＣＲ産物１μｌ、２Ｘ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲバッファー、ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックス］１０μｌ及びそれぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ：１０，１２，１４，１５，１７及び１８）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μｌの最終容量の反応用混合物を用いて第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行った。前記反応用混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し、前記反応用混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を３０サイクル行った。各サイクルのアニーリング段階（５５℃）で生じるシグナルを検出した。
【０１６３】
図６に示されたように、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉのターゲット核酸配列を成功裏に検出しすることで、本発明の特異性及び感度を確認した。
【０１６４】
Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ（ＨＤ）、ＨＳＶ１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）及びＨＳＶ２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２）の同時的検出のために、第２リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応混合物に三つの異なる標識プライマーを利用したにも係わらず、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２の如何なるシグナル無しにＨＤのターゲットシグナルのみが検出された。これは、本発明のターゲット特異性を示す。
【０１６５】
また、図６に示されたように、本発明の方法は、１０ｆｇのＨ． ｄｕｃｒｅｙｉゲノムＤＮＡまで検出することができる。
【０１６６】
図７は、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １のターゲット核酸配列を検出することにより、本発明の特異性及び感度を確認した他の実施例を示す。
【０１６７】
Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ（ＨＤ）、ＨＳＶ１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）及びＨＳＶ２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２）の同時的検出のために、第２リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応用混合物に３つの異なる標識プライマーを利用したにも係わらず、ＨＤ及びＨＳＶ２のシグナルを生じること無しにＨＳＶ１のターゲットシグナルのみが検出された。これは、本発明のターゲット特異性を示す。
【０１６８】
また、図７に示されたように、本実施例は、本発明の方法が１０ｆｇのＨＳＶ１ゲノムＤＮＡまで検出することを示す。
【０１６９】
要するに、本発明の方法は、リアルタイムマルチプレックス方式において、向上された感度及び特異性でターゲット配列を検出することができる。
【０１７０】
実施例４：本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法を用いた複数のターゲット検出
少なくとも３種類の異なるターゲット核酸配列が、本発明の方法により、リアルタイム方式で同時に検出できるかどうかを実験するために、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２の混合ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。実施例２に使用されたものと同じプライマー対を用いた。
【０１７１】
−第１マルチプレックスＰＣＲ−
鋳型（Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２のゲノムＤＮＡをそれぞれ１０００ｆｇ）を除いては、実施例２と同様に第１マルチプレックスＰＣＲを行った。
【０１７２】
−第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ−
実施例２と同様に、第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行った。
【０１７３】
図８に示されたように、本発明のネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、Ｈ． ｄｕｃｒｅｙｉ（ＨＤ）（Ｃｔ；４．６１）、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １（ＨＳＶ１）（Ｃｔ；２．８０）及びＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２（ＨＳＶ２）（Ｃｔ；７．３９）に対する３種類の異なるターゲットシグナルを同時的に検出した。鋳型のない陰性対照群では、如何なる擬陽性シグナルも表れなかった。
【０１７４】
したがって、本発明は、リアルタイムマルチプレックス方法として、擬陽性シグナルを排除し、少なくとも３種類の異なるターゲット核酸配列を同時に検出されるということを立証した。
【０１７５】
以上、本発明の望ましい具体例を詳細に記述したが、当業者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具体例に過ぎず、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその均等物により定義されると言える。
【図１】
2013515476.tif 000003
【図２】
2013515476.tif 000004
【図３】
2013515476.tif 000005
【図４】
2013515476.tif 000006
【図５】
2013515476.tif 000007
【図６】
2013515476.tif 000008
【図７】
2013515476.tif 000009
【図８】
2013515476.tif 000010
【配列表】
2013515476000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月20日(2012.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイムマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）から偽シグナルを排除し、試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列をリアルタイムで多重的に検出する方法であって、
（ａ）反応容器でターゲット核酸配列を増幅する第１マルチプレックスＰＣＲを行う工程であって、前記第１マルチプレックスＰＣＲは、前記試料中の前記ターゲット核酸配列のアンプリコンを得るために、少なくとも３種類のターゲット核酸配列を増幅できる条件下で少なくとも３種類のプライマー対及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼを利用して行われる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）に使用された反応容器とは別の反応容器に第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ反応用混合物として、
（ｉ）前記工程（ａ）で得たアンプリコンと、
（ｉｉ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための、対を形成する２つのうち少なくとも１つのプライマーは、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである、少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｉｉｉ）鋳型依存性核酸ポリメラーゼと、を含み、
前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対が、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含む、反応用混合物を用意する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記反応用混合物を利用してプライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２サイクル反復し、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行うことで、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じる工程であって、前記サイクルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、前記標識を有するプライマーのそれぞれから生じるが、偽シグナルは生じないサイクル数で行われる工程と、
（ｄ）ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記検出が、前記工程（ｃ）の前記反復の各サイクルにおいて、前記工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、又は前記工程（ｃ）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、これにより、前記ターゲット核酸配列を示すシグナルが、偽シグナルなしにリアルタイムで得られる工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、３０サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２５サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２０サイクル以下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーが、標識を有し、アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも３種類のプライマー対の標識が、互いに異なっている、又は同一である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対の互いの標識が、異なっているか、又は同一である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識を有するプライマーが、１つの標識又は相互作用する２つの標識を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標識が、ターゲット核酸配列に対して相補的なプライマーの配列部分に位置する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）の鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は５’→３’ヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する核酸ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
擬陽性シグナルを排除しながら試料中の少なくとも３種類のターゲット核酸配列のリアルタイムマルチマルチプレックスＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）で検出するキットであって、
（ａ）試料中のターゲット核酸配列のアンプリコンを得るための、少なくとも３種類のターゲット核酸配列の第１マルチプレックスＰＣＲに使用する少なくとも３種類のプライマー対と、
（ｂ）前記アンプリコンの第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのための少なくとも３種類のプライマー対であって、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対において、少なくとも一つのプライマーが、前記アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーであり、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲの間、前記少なくとも３種類のプライマー対のそれぞれの対として、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じる標識を有する少なくとも一つのネステッドプライマーを含み、前記第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを、偽シグナルを生じず、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生じるサイクル数で行うことができるプライマー対と、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
キットが、鋳型依存性核酸ポリメラーゼをさらに含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、３０サイクル以下で行われる請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２５サイクル以下で行われる請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲが、２０サイクル以下で行われる請求項１１に記載のキット。
【請求項１６】
第２ネステッドリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用されるプライマーが、標識を有し、アンプリコンの内部配列にハイブリダイズ可能なネステッドプライマーである請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
標識を有するプライマーが、１つの標識又は相互作用する２つの標識を含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１８】
標識が、ターゲット核酸配列に対して相補的なプライマーの配列部分に位置する請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、又は５’→３’ヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する核酸ポリメラーゼである請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】
2013515476.tif 000011
2013515476.tif 000012
2013515476.tif 000013
2013515476.tif 000014