(57)【要約】  真核細胞を培養するための方法及び組合せ、並びに真核細胞を調製するための方法が提供される。本方法は、培養される真核細胞のサンプルを提供し；細胞スキャフォールド材料に前記サンプルを適用し；細胞培養に適した条件下で、そこに適用される細胞を有する前記細胞スキャフォールド材料を維持することを含む。組合せは真核細胞と細胞スキャフォールド材料を含む。細胞スキャフォールド材料はスパイダーシルクのタンパク質のポリマーを含む。
2013523174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−培養される真核細胞のサンプルを提供し；
−前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し；及び
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む真核細胞の培養方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島由来の細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２】
−真核細胞のサンプルを提供し；
−前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し；
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し；及び
−前記細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む真核細胞の調製方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３】
−真核細胞；及び
−細胞スキャフォールド材
の組合せにおいて、
前記細胞スキャフォールド材が１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である
ことを特徴とする組合せ。
【請求項４】
前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項５】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項６】
前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項７】
前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項８】
前記細胞が、ランゲルハンス島由来の細胞、特にベータ細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項９】
前記真核細胞が単一細胞として提供される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、請求項８に記載の方法又は組合せ。
【請求項１２】
前記スパイダーシルクタンパク質が、式ＲＥＰ-ＣＴ及びＮＴ-ＲＥＰ-ＣＴにより定められるタンパク質の群から選択され、ここで、
ＮＴは１００〜１６０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＮ末端断片であり、
ＲＥＰは７０〜３００のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、Ｌ(ＡＧ)ｎＬ、Ｌ(ＡＧ)ｎＡＬ、Ｌ(ＧＡ)ｎＬ、及びＬ(ＧＡ)ｎＧＬからなる群から選択され、ここで、
ｎは２〜１０の整数であり、
各個々のＡセグメントは８〜１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０〜３のアミノ配列残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは１２〜３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基はＧｌｙであり；
各個々のＬセグメントは０〜２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴは７０〜１２０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＣ末端断片である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項１３】
前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【請求項１４】
前記細胞結合モチーフが、少なくとも１のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、請求項１３に記載の方法又は組合せ。
【請求項１５】
前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のＮ末端にカップリングしている、請求項１４に記載の方法又は組合せ。
【請求項１６】
前記オリゴペプチドが、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ(配列番号：２３)、ＹＩＧＳＲ(配列番号：２４)、ＥＰＤＩＭ(配列番号：２５)及びＮＫＤＩＬ(配列番号：２６)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４又は１５に記載の方法又は組合せ。
【請求項１７】
前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法又は組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞培養及び組織工学の分野に関し、真核細胞培養及び調製のための方法及び組合せを提供するものであり、ここで、スパイダーシルク（クモの糸）タンパク質のポリマーは、細胞スキャフォールド材料として使用される。
【背景技術】
【０００２】
スパイダーシルクは、強度と弾性の組み合わせにより桁外れの強靱性を有する天然の高性能ポリマーである。クモは、様々な機械的性質及び機能を持つ様々な糸タイプを生じせしめる最大７つの異なる分泌腺を有する。大瓶状(major ampullate)腺により生成される牽引糸は、最も強靱な繊維であり、重量基準では、例えば張力鋼のような人工の材料よりも高性能である。牽引糸の性質は、医療又は技術目的の新規材料の開発において魅力的なものである。
【０００３】
牽引糸は、大抵は大瓶状腺スピドロイン（major ampullate spidroin：ＭａＳｐ）１及び２と称されるが、例えばAraneus diadematusにおいてはＡＤＦ-３及びＡＤＦ-４と称される二つの主要ポリペプチドから構成される。Latrodectus hesperusの牽引糸をコードする遺伝子は、完全に特徴付けられている唯一のものであり、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２遺伝子はそれぞれ３１２９及び３７７９のアミノ酸をコードする(Ayoub NAら PLoS ONE 2(6): e514, 2007)。牽引糸ポリペプチドの性質はHuemmerich, Dら Curr. Biol. 14, 2070-2074 (2004)において検討されている。
【０００４】
クモの牽引糸のシルクタンパク質、又はＭａＳｐは、非反復Ｎ末端ドメイン、多くの繰り返しポリ-Ａｌａ／Ｇｌｙセグメントからなる中央反復領域、及び非反復Ｃ末端ドメインの３部構成を有している。一般的に、反復領域は、シルク繊維中における分子間接点を形成する一方、末端ドメインの厳密な機能はあまり明らかになっていないと考えられている。また、繊維形成に関連して、反復領域はランダムコイル及びα-ヘリックス立体構造からβ-シート構造への構造転換を被ると考えられている。スピドロインのＣ末端領域は、一般的にクモの種とシルクのタイプの間で保存されている。スパイダーシルクのＮ末端ドメインは最も保存されている領域である(Rising, Aら Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006))。
【０００５】
国際公開第０３／０５７７２７号は、哺乳動物細胞株及び動物中での可溶性組換えシルクポリペプチドの発現を開示している。得られたシルクポリペプチドは水性媒体中での溶解度が乏しく、及び／又は沈殿物する。得られたシルクポリペプチドは自発的には重合しないので、ポリマー又は繊維を得るためには紡糸が必要である。
【０００６】
国際公開第０７／０７８２３９号及びStark, Mら Biomacromolecules 8, 1695-1701, (2007)は、タンパク質の高含有量のＡｌａ及びＧｌｙを含む反復断片及びＣ末端断片からなるミニチュアのスパイダーシルクタンパク質を開示している。スパイダーシルクタンパク質の繊維は、その融合パートナーからのスパイダーシルクタンパク質の遊離時に自然に得られる。小さい融合単位が繊維形成に十分かつ必要である。
【０００７】
Hedhammar, M.ら Biochemistry 47, 3407-3417, (2008)は、組換えＣ末端及びＮ末端スピドロインドメイン及びポリ-Ａｌａ及びＧｌｙリッチの共ブロックを含む反復スピドロインドメインの構造及び凝集及び／又は重合に対する熱、ｐＨ及び塩の効果を研究している。
【０００８】
組換えスパイダーシルクの生体適合性についてのインビトロ研究は、今のところ少なく、研究された材料は、アミノ酸配列、生産態様及び形式において非常に変動している。
【発明の開示】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、
−培養される真核細胞のサンプルを提供し；
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し；及び
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む、真核細胞の培養方法を提供する。細胞スキャフォールド材はスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、
−真核細胞のサンプルを提供し；
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し；
−そこに適用された細胞を有する該細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し；及び
−前記細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む、真核細胞の調製方法を提供する。細胞スキャフォールド材はスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む。
【００１１】
スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む細胞スキャフォールド材が、様々な異なるセッティングにおいて真核細胞の培養のために有益な環境を提供することが本発明者によって見出された。さらに、この環境により、非常に困難で、非常にコスト高であり、又は実験室での培養が不可能でさえあった細胞の培養が確立でき、組織工学及び／又は移植に有用な細胞含有材料の樹立が可能になった。
【００１２】
そのいくつかの実施態様では、培養又は調製方法は、そこに適用された細胞を有する細胞スキャフォールド材を無血清培地中に維持することを含む条件で実施されうる。無血清培地中で細胞を培養する可能性により、無血清培地及び／又は特定の増殖因子又は細胞外マトリックス(ＥＣＭ)成分を含む培地の使用に対する、コスト効率が良くコントロールされた代替案が提供される。この種の培養培地は、多くの場合非常に高価であり、時には法外でさえあり、不均質である。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む細胞スキャフォールド材及び真核細胞の組合せを提供する。本発明のこのような組合せは、様々な異なる形式で提供され得、特定の状況の必要性に適合するようにあつらえられる。例えば、本発明の組合せは、損傷した又は疾患のある組織における細胞の置き換えのための細胞含有移植片として有用でありうる。
【００１４】
ここで提供される方法及び組合せのいくつかの実施態様では、真核細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。他の実施態様では、真核細胞は非哺乳動物細胞、例えば昆虫又は酵母細胞である。
【００１５】
本発明の方法により培養又は調製され、又は本発明の組合せに含まれる哺乳動物細胞の非限定的な例は、以下のマルチレベルのリストに列挙される：
外皮系の細胞
角質化上皮細胞
表皮角化細胞(分化表皮細胞)
表皮基底細胞(幹細胞)
手指爪及び足指爪の角化細胞
爪床基底細胞(幹細胞)
髄質毛幹細胞
皮質毛幹細胞
角質毛幹細胞
角質毛根鞘細胞
ハクスレー層の毛根鞘細胞
ヘレン層の毛根鞘細胞
外部毛根鞘細胞
毛母細胞(幹細胞)
ウエット重層上皮細胞
角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞
角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の基底細胞(幹細胞)
尿管上皮細胞(裏層膀胱及び尿管)
【００１６】
腺細胞
外分泌分泌上皮細胞
唾液腺粘膜細胞(多糖類リッチ分泌)
唾液腺漿液細胞(糖タンパク質酵素リッチ分泌)
舌のフォンエブネル腺細胞(味蕾を洗浄)
乳腺細胞(乳汁分泌)
涙腺細胞(涙分泌)
耳の耳道腺細胞(ロウ分泌)
エクリン汗腺暗細胞(糖タンパク質分泌)
エクリン汗腺明細胞(小分子分泌)
アポクリン汗腺細胞(臭分泌、性ホルモン感受性)
眼瞼のモル(Moll)細胞の腺(特化した汗腺)
皮脂腺細胞(脂質リッチの皮脂分泌)
鼻のボウマン腺細胞(嗅上皮を洗浄)
十二指腸のブルンネル腺細胞(酵素及びアルカリ粘液)
精嚢細胞(精子が泳ぐためのフルクトースを含有する、精液成分を分泌)
前立腺細胞(精液成分を分泌)
尿道球腺細胞(粘液分泌)
バルトリン腺細胞(膣液分泌)
リトレ細胞腺(粘液分泌)
子宮内膜細胞(炭水化物分泌)
呼吸及び消化管の単離された杯細胞(粘液分泌)
胃内壁粘液細胞(粘液分泌)
胃腺酵素源細胞(ペプシノーゲン細胞)
胃腺酸分泌細胞、壁細胞(塩酸分泌)
腸クロム親和性細胞様(ＥＣＬ)細胞(ヒスタミンを放出)
膵腺房細胞(重炭酸塩及び消化酵素分泌)
小腸のパネート細胞(リソザイム分泌)
肺のＩＩ型肺細胞(サーファクタント分泌)
肺のクララ細胞
ホルモン分泌細胞
下垂体前葉細胞
成長ホルモン産生細胞
乳腺刺激ホルモン分泌細胞
甲状腺刺激ホルモン産生細胞
性腺刺激ホルモン産生細胞
副腎皮質刺激因子
メラノサイト刺激ホルモンを分泌する脳下垂体中葉細胞
巨大細胞の神経分泌細胞
オキシトシン分泌
バソプレシン分泌
腸管及び気道細胞
ランゲルハンス島に含まれる細胞：
アルファ細胞(グルカゴンを生成)、ベータ細胞(インスリン生成細胞)、デルタ          細胞(ソマトスタチン生成細胞)、ｐｐ細胞(膵臓ポリペプチドを生成)、イプシ          ロン細胞(グレリンを生成)
セロトニンを分泌
エンドルフィンを分泌
ガストリンを分泌
セクレチンを分泌
コレシストキンを分泌
ボンベシンを分泌
甲状腺細胞
甲状腺上皮細胞
傍濾胞細胞
副甲状腺細胞
副甲状腺主細胞
好酸性細胞
副腎細胞
クロム親和性細胞
ステロイドホルモンを分泌(ミネラルコルチコイド類、アンドロゲン類及び糖コル      チコイド類)
テストステロンを分泌する精巣のライディッヒ細胞
エストロゲンを分泌する卵胞の内卵胞膜細胞
プロゲステロンを分泌する破裂した卵胞の黄体細胞
顆粒膜黄体細胞
内卵胞膜細胞
傍糸球体細胞(レニン分泌)
腎臓の密集斑細胞
腎臓の極周囲細胞
腎臓のメサンギウム細胞
【００１７】
代謝及び貯蔵細胞
肝細胞(肝臓細胞)
白色脂肪細胞(脂肪細胞／芽細胞)
褐色脂肪細胞
肝臓脂質細胞
【００１８】
バリア機能細胞(肺、腸、外分泌腺及び尿生殖路)
腎臓
腎糸球体壁細胞
腎糸球体上皮細胞
腎近位尿細管刷子縁細胞
腎集合管細胞
その他
Ｉ型肺細胞(肺の裏層エアスペース)
膵管細胞(房心細胞)
平滑筋導管細胞(汗腺、唾液腺、乳腺等のもの)
主細胞
間在細胞
導管細胞(精嚢、前立腺)
腸刷子縁細胞(微絨毛を有する)
外分泌腺線条導管細胞
胆嚢上皮細胞
精巣輸出管無線毛細胞
精巣上体主細胞
精巣上体基底細胞
【００１９】
閉じた内体腔を裏層する上皮細胞
微小血管内皮細胞
血管及びリンパ管の内皮有窓細胞
血管及びリンパ管の内皮連続細胞
血管及びリンパ管の内皮脾細胞
滑膜細胞(裏層関節腔、ヒアルロン酸分泌)
漿膜細胞(裏層の腹膜、胸膜及び心膜腔)
扁平細胞(耳の裏層外リンパ腔)
扁平細胞(耳の裏層内リンパ腔)
微絨毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞(耳の裏層内リンパ層)
微絨毛のない内リンパ嚢の円柱細胞(耳の裏層内リンパ層)
暗細胞(耳の裏層内リンパ腔)
前庭膜細胞(耳の裏層内リンパ腔)
血管条基底細胞(耳の裏層内リンパ腔)
血管条周辺細胞(耳の裏層内リンパ腔)
クラウディウス細胞(耳の裏層内リンパ腔)
ベトヒャー細胞(耳の裏層内リンパ腔)
脈絡膜叢細胞(脳脊髄液分泌)
軟膜くも膜扁平細胞
眼の色素性毛様体上皮細胞
眼の非色素性毛様体上皮細胞
角膜内皮細胞
ペッグ細胞(Peg cell)(卵管のもの)
【００２０】
推進機能を有する線毛細胞
軌道線毛細胞
輸卵管線毛細胞
子宮内膜線毛細胞(メス)
精巣網線毛細胞(オス)
精巣輸出管線毛細胞(オス)
中枢神経系の線毛上衣細胞(裏層脳腔)
【００２１】
細胞外マトリックス分泌細胞
エナメル芽上皮細胞(歯のエナメル分泌)
耳の前庭器の半月面上皮細胞(プロテオグリカン分泌)
コルチ器官の歯間上皮細胞(有毛細胞を覆う蓋膜を分泌)
疎性結合組織線維芽細胞
角膜線維芽細胞(角膜実質細胞)
腱線維芽細胞
骨髄細網組織線維芽細胞
他の非上皮性線維芽細胞
周皮細胞
椎間板の随核細胞
セメント芽細胞／セメント細胞(歯根の骨類似セメント分泌)
象牙芽細胞／象牙細胞(歯の象牙質の分泌)
硝子軟骨細胞
線維軟骨細胞
弾性軟骨細胞
骨芽細胞／骨細胞
骨前駆細胞(osteoprogenitor cell)(骨芽細胞の幹細胞)
眼の硝子体の硝子質細胞(hyalocyte)
耳の外リンパ腔の星状細胞
肝星細胞(伊東細胞)
膵星細胞
【００２２】
収縮細胞
骨格筋細胞
赤色骨格筋細胞(ゆっくり)
白色骨格筋細胞(早い)
中間骨格筋細胞(intermediate skeletal muscle cell)
筋紡錘の核嚢細胞
筋紡錘の核鎖細胞
衛星細胞(幹細胞)
心筋細胞
通常の心筋細胞
結節性心筋細胞
プルキンエ線維細胞
平滑筋細胞(様々なタイプ)
外分泌腺の筋上皮細胞
【００２３】
血液及び免疫系細胞
巨核球(血小板前駆体)
単球
結合組織マクロファージ(様々なタイプ)
上皮性ランゲルハンス細胞
破骨細胞(骨中)
樹状細胞(リンパ組織中)
ミクログリア細胞(中枢神経系中)
好中球顆粒球
好酸球顆粒球
好塩基球顆粒球
マスト細胞
ヘルパーＴ細胞
サプレッサーＴ細胞
細胞傷害性Ｔ細胞
ナチュラルキラーＴ細胞
Ｂ細胞
ナチュラルキラー細胞
網状赤血球
血液及び免疫系に関連した前駆体(様々なタイプ、例えば巨核球、骨髄芽球)
【００２４】
神経系の細胞
感覚変換器細胞
コルチ器官の聴覚内有毛細胞
コルチ器官の聴覚外有毛細胞
嗅上皮の基底細胞(嗅神経細胞の幹細胞)
低温変性一次感覚ニューロン
高温変性一次感覚ニューロン
表皮のメルケル細胞(タッチセンサー)
嗅覚受容神経
痛覚感受性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
眼の網膜の視細胞：
光受容杆体
眼の光受容青感性錐体細胞
眼の光受容緑感性錐体細胞
眼の光受容赤感性錐体細胞
自己受容性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
接触感応性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
Ｉ型頸動脈体細胞(血液ｐＨセンサー)
ＩＩ型頸動脈体細胞(血液ｐＨセンサー)
耳の前庭器のＩ型有毛細胞(加速及び重力)
耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞(加速及び重力)
Ｉ型味蕾細胞
自律神経細胞
コリン作動性神経細胞(様々なタイプ)
アドレナリン作動性神経細胞(様々なタイプ)
ペプチド作動性神経細胞(様々なタイプ)
感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞
コルチ器官の内柱細胞
コルチ器官の外柱細胞
コルチ器官の内支持細胞
コルチ器官の外支持細胞
コルチ器官の境界細胞
コルチ器官のヘンゼン細胞
前庭器支持細胞
味蕾支持細胞
嗅上皮支持細胞
シュワン細胞
衛星細胞(封緘末梢神経細胞体)
腸グリア細胞
中枢神経系ニューロン及びグリア細胞
アストロサイト(様々なタイプ)
ニューロン細胞(かなり多くの種類、未だ十分には分類分けされていない)
オリゴデンドロサイト
紡錘状ニューロン
松果体細胞(メラトニン生成)
レンズ細胞
前レンズ上皮細胞
クリスタリン含有レンズ
水晶体線維細胞
【００２５】
色素細胞
メラニン形成細胞
網膜色素上皮細胞
【００２６】
生殖細胞
卵原細胞／卵母細胞
精細胞
精母細胞
精祖細胞(精母細胞の幹細胞)
精子
【００２７】
ナース細胞
卵胞細胞
セルトリ細胞(精巣中)
胸腺上皮細胞
【００２８】
幹細胞及び前駆細胞
胚性幹細胞
成体幹細胞(例えば、造血幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細  胞)
前駆細胞(神経前駆細胞、リンパ球前駆細胞、衛星細胞、内皮前駆細胞、骨膜前駆体、  膵前駆細胞、筋肉の衛星細胞、造血前駆細胞)
羊水幹細胞(多能性であり、脂肪生成細胞、骨原性細胞、筋原細胞、内皮細胞、肝細胞、  及びニューロン線細胞への分化が可能)
人工多能性幹細胞
【００２９】
器官において、通常、主要組織及び散発性組織が存在する。主要組織は特定の器官に対して独特のものである。一実施態様では、ここで開示された方法又は組合せに使用される細胞は、主要組織の細胞、すなわち、それらの自然環境において、器官の機能に寄与する細胞であると考えられている。さらに、一実施態様では、結合組織の役割がこの実施態様におけるスパイダーシルクタンパク質により実行されると考えられているため、散発性組織、特に結合組織を形成する細胞は含まれない。
【００３０】
例えば、心臓の主要組織は心筋であり、一方、散発性であるのは、神経、血管、結合組織等である。以下、器官系の例の非限定的列挙であり、その主要組織細胞は、ここで開示の方法又は組合せに有用である。
【００３１】
循環器系：心臓、血液及び血管を用いた、体及び肺への血液のポンピング及びチャネリング。
消化器系：唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、直腸及び肛門を用いた、食物の消化及び処理。
内分泌系：視床下部、下垂体又は脳下垂体、松果体又は松果腺、膵臓、甲状腺、副甲状腺及び副腎(adrenals)、すなわち副腎(adrenal gland)等、内分泌腺により作成されるホルモンを使用する体内の情報交換。
排泄系：体液バランス、電解質バランス及び尿の排出に関連した、腎臓、尿管、膀胱及び尿道。
外皮系：皮膚、毛髪及び爪。
リンパ系：内皮を含む、リンパを移動させる血管及び結節及びリンパ、血流と組織との間のリンパの移動に関与する構造体。
免疫系：白血球、扁桃腺、咽頭扁桃腺、胸腺及び脾臓を用いた、病原体に対する防御。
筋系：筋肉を用いた運動
神経系：脳、脊髄、末梢神経及び神経を用いた、情報の収集、移動及び処理。
生殖器系：性器、例えば卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺及び陰茎。
呼吸器系：呼吸に使用される器官、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺及び横隔膜。
骨格系：骨、軟骨、靱帯及び腱を有する、構造体の支持及び保護。
【００３２】
ここで開示の方法及び組合せの様々な異なる実施態様は、細胞型及び気管及び組織系の上述の一般的列挙から、細胞の任意のサブグループ又はサブリスト、もしくは個々の細胞型を使用してよい。
【００３３】
より特定の実施態様では、前記哺乳動物細胞は、幹細胞及びランゲルハンス島からの細胞(例えば、ベータ細胞)からなる群から選択される。
【００３４】
さらに特定の実施態様では、前記細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、羊水幹細胞、及び前駆細胞から選択され、特に胚性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択されうる。
【００３５】
さらなる特定の実施態様では、前記細胞は胚性幹細胞である。
【００３６】
さらなる特定の実施態様では、前記細胞は、造血細胞、神経細胞、間葉系細胞、乳房細胞、内皮細胞、上皮細胞、及び嗅幹細胞から選択される、特に造血細胞、神経細胞、及び間葉系細胞から選択される成体幹細胞である。
【００３７】
さらに特定の実施態様では、前記細胞は、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞、及び造血前駆細胞からなる群から選択される。
【００３８】
さらに特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、少なくとも１つのニューロスフェアの形態、又は単一細胞として提供されうる、神経幹細胞(交換可能に神経皮質幹細胞と示される)である。
【００３９】
さらに特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、少なくとも１つのランゲルハンス島の形態、又は単一細胞として提供されうる、インスリン産生ベータ細胞である。
【００４０】
さらに特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、肝細胞、線維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞からなる群から選択される体細胞である。
【００４１】
本開示に使用される細胞スキャフォールド材は、「スピドロイン」とも称されるスパイダーシルクタンパク質又はポリペプチドのポリマーを含む。
【００４２】
細胞スキャフォールド材の一実施態様では、前記スピドロインは１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含む。
【００４３】
スピドロインは、１４０〜６００のアミノ酸残基、好ましくは２８０〜６００のアミノ酸残基、例えば３００〜４００のアミノ酸残基、より好ましくは３４０〜３８０のアミノ酸残基からなる。より長いシルクタンパク質は非晶質の凝集体を形成する傾向にあり、それには可溶化及び重合のための強力な溶媒の使用が必要となるため、小さなサイズが有利である。タンパク質断片は、典型的にはペプチド結合を介して、共有的にカップリングされる。
【００４４】
特定の好ましい実施態様では、細胞スキャフォールド材に使用されるスピドロインは、式ＮＴ-ＲＥＰ-ＣＴ及びＲＥＰ-ＣＴにより定まるタンパク質の群から選択される。
【００４５】
(任意成分の)ＮＴ断片は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端アミノ酸配列と高度の類似性を有する。図１に示されるように、このアミノ酸配列は、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含み、様々な種とスパイダーシルクタンパク質の間で良好に保存されている。また、以下の表１を参照のこと：
2013523174.tif 000003
【００４６】
あるとしても、どの特定のＮＴ断片が、ここに開示された細胞スキャフォールド材のスピドロインに存在しているかは重要ではない。よって、本発明のＮＴ断片は、図１に示されるアミノ酸配列のいずれか、又は高度な類似性を有する配列から選択することができる。多種多様なＮ末端配列を、ここに開示の細胞スキャフォールド材においてスピドロインとして使用することができる。図１の相同な配列に基づき、以下の配列がコンセンサスＮＴアミノ酸配列：
ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ(Ｍ／Ｌ)ＳＡ(Ａ／Ｉ)ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ(Ｄ／Ｎ／Ｑ)ＴＬＭＳＡＭＤ(Ｎ／Ｓ／Ｋ)ＭＧＲＳＧ(Ｋ／Ｒ)ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ(Ｇ／Ｑ)ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ(Ｎ／Ｓ)ＥＩＲＳＬＩ(Ｇ／Ｎ)Ｍ(Ｆ／Ｌ)(Ａ／Ｓ)ＱＡＳＡＮＥＶ(配列番号：８)
を構成する。
【００４７】
ＮＴ断片の配列は、図１のアミノ酸配列に基づき、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号：８に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性を有する。好ましい実施態様では、ＮＴ断片の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号：８に対して、少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性を有する。好ましい実施態様では、ＮＴ断片は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号：８に対して、７０％、好ましくは８０％類似性を有する。
【００４８】
ここで開示される細胞スキャフォールド材に使用されるタンパク質中の代表的なＮＴ断片は、配列番号６のEuprosthenops australis配列である。一実施態様では、ＮＴ断片は、配列番号６又は図１の任意の個々のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％同一性を有する。例えば、ＮＴ断片は、配列番号６又は図１の任意の個々のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一性を有する。ＮＴ断片は、配列番号６又は図１の任意の個々のアミノ酸配列、特にＥａ ＭａＳｐ１に対して同一でありうる。
【００４９】
ＮＴ断片は１００〜１６０のアミノ酸残基を含む。ＮＴ断片は、少なくとも１００、又は１１０を越え、好ましくは１２０を越えるアミノ酸残基を含むことが好ましい。また、ＮＴ断片は最大で１６０、又は１４０未満のアミノ酸残基を含む。典型的なＮＴ断片は、約１３０−１４０のアミノ酸残基を含む。
【００５０】
ＲＥＰ断片は、アラニンリッチ伸展部とグリシンリッチ伸展部が交互になっている反復特性を有する。以下に詳細に説明されるように、ＲＥＰ断片は、一般的に７０を超え、例えば１４０を超え、３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、以下により詳細に説明されるように、それ自体、数個のＬ(リンカー)セグメント、Ａ(アラニンリッチ)セグメント、及びＧ(グリシンリッチ)セグメントに分割されうる。典型的には、任意成分であってもよい前記リンカーセグメントは、ＲＥＰ断片末端に位置しているが、残りのセグメントは今度はアラニンリッチ及びグリシンリッチである。よって、ＲＥＰ断片は、一般的に以下の構造のいずれかを有し得、ここで、ｎは整数である：
Ｌ(ＡＧ)ｎＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ(ＡＧ)ｎＡＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ(ＧＡ)ｎＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は
Ｌ(ＧＡ)ｎＧＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ
【００５１】
アラニンリッチ又はグリシンリッチセグメントが、Ｎ末端又はＣ末端リンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要でないと理解される。ｎは２〜１０、好ましくは２〜８、また好ましくは４〜８、さらに好ましくは４〜６の整数である、すなわちｎ＝４、ｎ＝５又はｎ＝６であることが好ましい。
【００５２】
いくつかの実施態様では、ＲＥＰ断片のアラニン含有量は、２０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、５０％以下、好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３５％以下である。アラニンの含有量が多くなればなる程、伸長可能な繊維は堅くなる及び／又は強くなると考えられる。
【００５３】
いくつかの実施態様では、ＲＥＰ断片はプロリン残基を欠いており、つまり、ＲＥＰ断片にＰｒｏ残基は存在しない。
【００５４】
次に、ＲＥＰ断片を構成するセグメントに関しては、各セグメントは個別であり、すなわち特定のＲＥＰ断片の任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント、任意の２つのＬセグメントが同一であるか又は同一ではない場合があることが強調される。よって、セグメントの各タイプが特定のＲＥＰ断片内で同一であることは、スピドロインの一般的特徴ではない。むしろ、次の開示は、如何にして個々のセグメントを設計し、それらを集めて、細胞スキャフォールド材に有用な機能的なスパイダーシルクタンパク質の一部であるＲＥＰ断片にするかのガイドラインを当業者に提供する。
【００５５】
各個々のＡセグメントは、８〜１８のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。各個々のＡセグメントは１３〜１５のアミノ酸残基を有することが好ましい。また、Ａセグメントのほとんど、又は２以上が、１３〜１５のアミノ酸残基を有し、Ａセグメントの少数部分、例えば１又は２が、８〜１８のアミノ酸残基、例えば８−１２又は１６−１８のアミノ酸残基を有することもまた可能である。これらのアミノ酸残基の大部分はアラニン残基である。より詳細には、０〜３のアミノ酸残基はアラニン残基でなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。よって、各個々のＡセグメントにおける全てのアミノ酸残基は例外なく、又は１、２又は３のアミノ酸残基が任意のアミノ酸でありうる例外を除き、アラニン残基である。アラニン置換アミノ酸は天然のアミノ酸、好ましくはセリン、グルタミン酸、システイン及びグリシンから個々に選択されるもの、より好ましくはセリンである。もちろん、Ａセグメントの一又は複数は全てアラニンセグメントであり、残りのＡセグメントは１−３の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン又はグリシンを含むことが可能である。
【００５６】
ある実施態様では、各Ａセグメントは、上述したように、１０−１５のアラニン残基と０−３の非アラニン残基を含む１３−１５のアミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様では、各Ａセグメントは、上述したように、１２−１５のアラニン残基と０−１の非アラニン残基を含む、１３−１５のアミノ酸残基を含む。
【００５７】
各個々のＡセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基７−１９、４３−５６、７１−８３、１０７−１２０、１３５−１４７、１７１−１８３、１９８−２１１、２３５−２４８、２６６−２７９、２９４−３０６、３３０−３４２、３５７−３７０、３９４−４０６、４２１−４３４、４５８−４７０、４８９−５０２、５１７−５２９、５５３−５６６、５８１−５９４、６１８−６３０、６４８−６６１、６７６−６８８、７１２−７２５、７４０−７５２、７７６−７８９、８０４−８１６、８４０−８５３、８６８−８８０、９０４−９１７、９３２−９４５、９６９−９８１、９９９−１０１３、１０２８−１０４２及び１０６０−１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有するのが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定されるユープロステノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応している。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照のこと。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号：３のアミノ酸残基１４３−１５２、１７４−１８６、２０４−２１８、２３３−２４７及び２６５−２７８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、発現した非天然のスパイダーシルクタンパク質のセグメントに相当し、該タンパク質は適切な条件下でシルク繊維を形成する能力を有する。よって、スピドロインのある実施態様では、各個々のＡセグメントは、上述したアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸セグメントと同一である。何ら特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明のＡセグメントはヘリックス構造又はベータシートを形成すると考えられている。
【００５８】
さらに、各個々のＧセグメントは１２〜３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であるということは、実験データから結論付けられる。各個々のＧセグメントは１４〜２３のアミノ酸残基からなることが好ましい。各Ｇセグメントの少なくとも４０％のアミン酸残基がグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含有量は４０−６０％の範囲にある。
【００５９】
各個々のＧセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基２０−４２、５７−７０、８４−１０６、１２１−１３４、１４８−１７０、１８４−１９７、２１２−２３４、２４９−２６５、２８０−２９３、３０７−３２９、３４３−３５６、３７１−３９３、４０７−４２０、４３５−４５７、４７１−４８８、５０３−５１６、５３０−５５２、５６７−５８０、５９５−６１７、６３１−６４７、６６２−６７５、６８９−７１１、７２６−７３９、７５３−７７５、７９０−８０３、８１７−８３９、８５４−８６７、８８１−９０３、９１８−９３１、９４６−９６８、９８２−９９８、１０１４−１０２７、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定されるユープロステノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応している。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照のこと。また、各個々のＧセグメントは、配列番号：３のアミノ酸残基１５３−１７３、１８７−２０３、２１９−２３２、２４８−２６４及び２７９−２９６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。この群の各配列は、発現した非天然のスパイダーシルクタンパク質のセグメントに相当し、該タンパク質は適切な条件下でシルク繊維を形成する能力を有する。よって、細胞スキャフォールド材中のスピドロインのある実施態様では、各個々のＧセグメントは、上述したアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸セグメントと同一である。
【００６０】
ある実施態様では、各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-ではない。
【００６１】
Ｇセグメントには３つのサブタイプが存在する。この分類はユープロステノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質配列（国際公開第２００７／０７８２３９号）の注意深い解析に基づいており、その情報は、新規な非天然のスパイダーシルクタンパク質の構築において用いられ立証されている。
【００６２】
Ｇセグメントの第１のサブタイプは、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＧＱＧ(Ｇ／Ｓ)ＱＧＧ(Ｑ／Ｙ)ＧＧ(Ｌ／Ｑ)ＧＱＧＧＹＧＱＧＡＧＳＳ(配列番号：１１)により表される。この第１の、一般的には一番長いＧセグメントのサブタイプは、典型的には２３のアミノ酸残基を有するが、わずか１７のアミノ酸残基しか含まない場合があり、荷電残基を欠き、又は１つの荷電残基を含む。よって、この第１のＧセグメントのサブタイプは、１７−２３のアミノ酸残基を含むことが好ましいが、少なくて１２、又は多くて３０のアミノ酸残基を含むことも考えられる。如何なる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、このサブタイプはコイル構造又は３１-ヘリックス構造を形成すると予測される。この第１のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基２０−４２、８４−１０６、１４８−１７０、２１２−２３４、３０７−３２９、３７１−３９３、４３５−４５７、５３０−５５２、５９５−６１７、６８９−７１１、７５３−７７５、８１７−８３９、８８１−９０３、９４６−９６８、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２である。ある実施態様では、本発明のこの第１のサブタイプの各Ｇセグメントの第１の２つのアミノ酸残基は、-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-ではない。
【００６３】
Ｇセグメントの第２のサブタイプは、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ(Ｇ／Ｒ)ＹＧＱＧ(Ａ／Ｓ)Ｇ(Ｓ／Ｇ)Ｓ(配列番号：１２)により表される。この第２の、一般的には中サイズのＧセグメントのサブタイプは、典型的には１７のアミノ酸残基を有し、荷電残基を欠き、又は１つの荷電残基を有する。この第２のＧセグメントのサブタイプは、１４−２０のアミノ酸残基を有することが好ましいが、少なくて１２、又は多くて３０のアミノ酸残基を有することも考えられる。如何なる特定の理論に縛られることを望むものではないが、このサブタイプはコイル構造を形成すると予測される。この第２のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基２４９−２６５、４７１−４８８、６３１−６４７及び９８２−９９８；及び配列番号：３のアミノ酸残基１８７−２０３である。
【００６４】
Ｇセグメントの第３のサブタイプは、アミノ酸の１文字コンセンサス配列Ｇ(Ｒ／Ｑ)ＧＱＧ(Ｇ／Ｒ)ＹＧＱＧ(Ａ／Ｓ／Ｖ)ＧＧＮ(配列番号：１３)により表される。この第３のＧセグメントのサブタイプは、典型的には１４のアミノ酸残基を有し、一般的には最も短いＧセグメントのサブタイプである。この第３のＧセグメントのサブタイプは、１２−１７のアミノ酸残基を有することが好ましいが、多くて２３のアミノ酸残基を有することも考えられる。如何なる特定の理論に縛られることを望むものではないが、このサブタイプはターン構造を形成すると予測される。この第３のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基５７−７０、１２１−１３４、１８４−１９７、２８０−２９３、３４３−３５６、４０７−４２０、５０３−５１６、５６７−５８０、６６２−６７５、７２６−７３９、７９０−８０３、８５４−８６７、９１８−９３１、１０１４−１０２７；及び配列番号：３のアミノ酸残基２１９−２３２である。
【００６５】
よって、細胞スキャフォールド材中のスピドロインの好ましい実施態様では、各個々のＧセグメントは、配列番号：１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一性を有する。
【００６６】
ＲＥＰ断片のＡ及びＧセグメントの交互配列の一実施態様では、全ての第２のＧセグメントは第１のサブタイプのものであり、一方残ったＧセグメントは第３のタイプのもの、例えばＡ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｓｈｏｒｔＡ４ＧｌｏｎｇＡ５Ｇｓｈｏｒｔである。ＲＥＰ断片の他の実施態様では、第２のサブタイプの１つのＧセグメントは、挿入部を介し、Ｇセグメント規則性を中断する、例えばＡ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｍｉｄＡ４ＧｓｈｏｒｔＡ５Ｇｌｏｎｇである。
【００６７】
各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表し、０〜２０のアミノ酸残基、例えば０〜１０のアミノ酸残基を有してよい。このセグメントは任意であり、スパイダーシルクタンパク質の機能にとって重要ではないが、その存在により、十分に機能的なスパイダーシルクタンパク質又はそのポリマーが、繊維、フィルム、泡又は他の構造体を形成することができるようになる。また、ユープロステノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分(配列番号：１０)に存在するリンカーアミノ酸配列がある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されたＡ又はＧセグメントの任意のものと共通点があるが、通常、ここで記載のそれらの基準を十分に満足させるものではない。
【００６８】
国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、ＲＥＰ断片のＣ末端部分に配列されたリンカーセグメントは、アラニンリッチである、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳ及びＡＳＡＡＳＡＡＡによって表すことができる。実際には、第２の配列は、ここでの定義に従い、Ａセグメントとみなすことができるが、第１の配列は、この定義に従い、Ａセグメントに対する高度な類似性を有する。リンカーセグメントの他の例は、グリシンリッチである、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＧＳＡＭＧＱＧＳを有し、ここでの定義に従い、Ｇセグメントに対する高度な類似性を有する。リンカーセグメントの他の例はＳＡＳＡＧである。
【００６９】
代表的なＬセグメントは、配列番号：１０のアミノ酸残基１−６及び１０９３−１１１０、及び配列番号：３のアミノ酸残基１３８−１４２であるが、当業者であれば、これらのセグメントに対する、多くの適切な代替アミノ酸配列が存在していることを、容易に認識しているであろう。ＲＥＰ断片の一実施態様では、Ｌセグメントの一つはアミノ酸を含有しない、すなわちＬセグメントの一つを欠いている。ＲＥＰ断片の他の実施態様は、双方のＬセグメントがアミン酸を含まない、すなわち双方のＬセグメントを欠いている。よって、本発明のＲＥＰ断片のこれらの実施態様は、模式的に次のように表される：（ＡＧ)ｎＬ、(ＡＧ)ｎＡＬ、(ＧＡ)ｎＬ、(ＧＡ)ｎＧＬ；Ｌ(ＡＧ)ｎ、Ｌ(ＡＧ)ｎＡ、Ｌ(ＧＡ)ｎ、Ｌ(ＧＡ)ｎＧ；及び(ＡＧ)ｎ、(ＡＧ)ｎＡ、(ＧＡ)ｎ、(ＧＡ)ｎＧ。任意のこれらのＲＥＰ断片は、以下に定めるような任意のＣＴ断片と共に使用するのに適している。
【００７０】
細胞スキャフォールド材中のスピドロインのＣＴ断片は、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端アミノ酸配列に対する高度な類似性を有する。国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、このアミノ酸配列は、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、スパイダーシルクタンパク質と種々の種との間で良好に保存されている。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列は、配列番号：９として提供されている。図２において、以下のＭａＳｐタンパク質が配列されており、必要に応じてＧｅｎＢａｎｋ受託登録で示される：
2013523174.tif 000004
【００７１】
どの特定のＣＴ断片が、細胞スキャフォールド材中のスパイダーシルクタンパク質に存在しているかは重要ではない。よって、ＣＴ断片は、図２及び表２に示されるアミノ酸配列、又は高度な類似性を有する配列の任意のものから選択することができる。様々なＣ末端配列を、スパイダーシルクタンパク質に使用することができる。
【００７２】
ＣＴ断片の配列は、図２のアミノ酸配列に基づき、配列番号：９のコンセンサスアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％同一性、さらには少なくとも７０％同一性を有する。
【００７３】
代表的なＣＴ断片は、ユープロステノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列である配列番号：７のものである。よって、一実施態様では、ＣＴ断片は、配列番号：７、又は図２及び表２の任意の個々のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一性を有する。例えば、ＣＴ断片は、配列番号：７、又は図２及び表２の任意の個々のアミノ酸配列と同一でありうる。
【００７４】
ＣＴ断片は、典型的には７０〜１２０のアミノ酸残基からなる。ＣＴ断片は、少なくとも７０、又は８０以上、好ましくは９０以上のアミノ酸残基を含むことが好ましい。また、ＣＴ断片は、最大で１２０、又は１１０未満のアミノ酸残基を含むことが好ましい。典型的なＣＴ断片は、約１１０のアミノ酸残基を含む。
【００７５】
ここで使用される「％同一性」なる用語は、以下のようにして算出される。クエリ配列を、CLUSTAL Wアルゴリズム(Thompsonら, Nucleic Acids Research,22:4673-4680 (1994))を使用し、標的配列に対して整列させる。整列させた配列の最も短いものに対して対応するウインドウ上で比較をする。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一対応を有するクエリ配列の位置の割合を、％同一性として報告する。
【００７６】
ここで使用される「％類似性」なる用語は、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓが類似しており；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓが類似しており；酸性残基Ｇｌｕ及びＡｓｐが類似しており；親水性の無電荷残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒが類似していることを除き、「％同一性」として上述したようにして算出される。残った天然のアミノ酸Ｇｌｙは、この文脈ではいずれの他のアミノ酸とも類似していない。
【００７７】
この明細書において、本発明の別の実施態様は、同一性の特定の割合の代わりに、類似性の対応する割合を満たす。他の実施態様は、他と同様、同一性の特定の割合を満たし、類似性のより高い割合が、各配列に対して、同一性の好ましい割合の群から選択される。例えば、配列は、他の配列に対して７０％類似していてよく；又は他の配列に対して７０％同一であってよく；又は他の配列に対して、７０％同一であり、９０％類似していてもよい。
【００７８】
ここで開示された方法又は組合せのいくつかのより特定の実施態様では、細胞スキャフォールド材のスパイダーシルクタンパク質は、４ＲｅｐＣＴ、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ、ＲＧＥ-４ＲｅｐＣＴ、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ、ＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ、５ＲｅｐＣＴ、８ＲｅｐＣＴ、４ＲｅｐＣＴＭａ２、ＮＴ８ＲｅｐＣＴ及びＮＴＮＴ８ＲｅｐＣＴ(以下、添付の配列リストを参照)からなる群から選択されるスピドロインを含む。さらなる特定の実施態様では、スピドロインは４ＲｅｐＣＴ(配列番号：２)である。
2013523174.tif 000005
【００７９】
ここで開示された方法又は組合せの一実施態様では、前記スパイダーシルクタンパク質は、細胞結合モチーフを含む。所定の状況におけるある種の細胞の培養に関連して、細胞結合モチーフの存在により、細胞生存率が改善又は維持されることが観察されており、スパイダーシルクタンパク質の一部として、細胞スキャフォールド材にこのようなモチーフが含まれることにより、付加的な有益性がもたらされると考えられる。
【００８０】
いくつかの実施態様では、細胞結合モチーフは、少なくとも１のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである。例えば、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のＮ末端又はＣ末端、又はスパイダーシルクタンパク質の残りの部分のアミノ酸配列の任意の位置にカップリングしうる。オリゴペプチド細胞結合モチーフの選択に関し、当業者はいくつかの代替案に気づく。前記オリゴペプチドは、例えばＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ(配列番号：２３)、ＹＩＧＳＲ(配列番号：２４)、ＥＰＤＩＭ(配列番号：２５)及びＮＫＤＩＬ(配列番号：２６)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲは、一般的な細胞結合モチーフであるが、ＥＰＤＩＭ及びＮＫＤＩＬは、角化細胞の培養において特に有用でありうる角化細胞特異的モチーフとして知られている。スパイダーシルクタンパク質の残りの部分への、オリゴペプチド細胞結合モチーフのカップリングは、当業者により、標準的な遺伝的操作又は化学的カップリング技術を使用して容易に達成される。よって、いくつかの実施態様では、細胞結合モチーフは、遺伝的操作を介して導入される、すなわち、細胞結合モチーフ及び「野生型」スパイダーシルクタンパク質をコードする核酸の間に、遺伝的融合を形成させる。このような実施態様の付加的で有益な特徴として、細胞結合モチーフは、細胞スキャフォールド材を形成するポリマーにおいて、スパイダーシルクタンパク質のモノマーに対して、１：１の比率で存在するであろう。
【００８１】
ここで開示される方法又は組合せに使用される細胞スキャフォールド材中のポリマーは、様々な物理的形態を採り得、特定の物理的形態の使用により、種々の特定の状況における付加的な利点がもたらされる。例えば、本方法又は組合せの実施態様では、前記細胞スキャフォールド材は、フィルム、発泡体、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である。
【００８２】
本発明において、細胞の「培養」、「細胞培養」等の用語は、それらが、例えば細胞が分裂し及び／又は増殖する状況、細胞が自然環境に存在している場合、細胞型により示される少なくとも１の機能的特徴を保持して分化状態に維持される状況、及び幹細胞が未分化状態に維持される状況を包含するように、広義に解釈されなければならない。
【００８３】
さらに、上の開示から明白なように、細胞は、単一細胞の形態で、又は細胞構造体又は「微小器官」の一部として提供されうると考えられる。細胞構造体又は「微小器官」の形態での細胞培養は、細胞スキャフォールド材との組合せでの全構造の維持を伴いうる。
【００８４】
実施態様の項目別リスト
１．−培養される真核細胞のサンプルを提供し；
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し；及び
−そこに適用された細胞を有する該細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む真核細胞の培養方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする方法。
【００８５】
２．−真核細胞のサンプルを提供し；
−細胞スキャフォールド材に、該サンプルを適用し；
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し；及び
−該細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む真核細胞の調製方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする方法。
【００８６】
３．前記条件が、そこに適用された細胞を有する細胞スキャフォールド材を無血清培地中に維持することを含む、項目１又は２に記載の方法。
【００８７】
４．前記真核細胞が哺乳動物細胞である、上述したいずれかの項目に記載の方法。
５．前記哺乳動物細胞が器官の主要組織から誘導される、項目４に記載の方法。
６．前記哺乳動物細胞が、幹細胞及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される、項目４又は５に記載の方法。
７．前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、羊水幹細胞及び前駆細胞から選択され、さらに胚性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される、項目６に記載の方法。
８．前記細胞が胚性幹細胞である、項目７に記載の方法。
９．前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、項目７に記載の方法。
１０．前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択され、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、項目７に記載の方法。
１１．前記細胞が、ランゲルハンス島由来の細胞、例えばベータ細胞である、項目６に記載の方法。
【００８８】
１２．前記真核細胞が単一細胞として提供される、上述した項目のいずれかに記載の方法。
１３．前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、項目１０に記載の方法。
１４．前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、項目１１に記載の方法。
１５．前記哺乳動物細胞が、例えば肝細胞、線維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、項目１−５のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記細胞がヒト細胞である、任意の上述した項目に記載の方法。
【００８９】
１７．前記スパイダーシルクタンパク質が、式ＲＥＰ-ＣＴ及びＮＴ-ＲＥＰ-ＣＴにより定まるタンパク質の群から選択され、ここで、
ＮＴは１００〜１６０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＮ末端断片であり、
ＲＥＰは７０〜３００のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、Ｌ(ＡＧ)ｎＬ、Ｌ(ＡＧ)ｎＡＬ、Ｌ(ＧＡ)ｎＬ、及びＬ(ＧＡ)ｎＧＬからなる群から選択され、ここで、
ｎは２〜１０の整数であり、
各個々のＡセグメントは８〜１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０〜３のアミノ配列残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは１２〜３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基はＧｌｙであり；
各個々のＬセグメントは０〜２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴは７０〜１２０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＣ末端断片である、上述した項目のいずれかに記載の方法。
【００９０】
１８．前記スパイダーシルクタンパク質が、４ＲｅｐＣＴ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ、５ＲｅｐＣＴ、８ＲｅｐＣＴ、４ＲｅｐＣＴＭａ２、ＮＴ８ＲｅｐＣＴ及びＮＴＮＴ８ＲｅｐＣＴからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
１９．前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを有する、上述した項目のいずれかに記載の方法。
２０．前記細胞結合モチーフが、少なくとも１のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、項目１９に記載の方法。
２１．前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のＮ末端にカップリングしている、項目２０に記載の方法。
２２．前記オリゴペプチドが、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＥＰＤＩＭ及びＮＫＤＩＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２０−２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、泡、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、上述した項目のいずれかに記載の方法。
【００９１】
２４．−真核細胞；及び
−細胞スキャフォールド材；
の組合せにおいて、
前記細胞スキャフォールド材が１４０〜６００のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される７０〜３００のアミノ酸残基の反復断片；
スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から誘導される７０〜１２０のアミノ酸残基のＣ末端断片；及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から誘導される１００〜１６０のアミノ酸残基のＮ末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする組合せ。
【００９２】
２５．前記真核生物が哺乳動物細胞である、項目２４に記載の組合せ。
２６．前記哺乳動物細胞が器官の主要組織から誘導される、項目２５に記載の組合せ。
２７．前記哺乳動物細胞が、幹細胞及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される、項目２５又は２６に記載の組合せ。
２８．前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、特に人工多能性幹細胞、羊水幹細胞及び前駆細胞から選択され、さらに胚性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される、項目２７に記載の組合せ。
２９．前記細胞が胚性幹細胞である、項目２８に記載の組合せ。
３０．前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、項目２８に記載の組合せ。
３１．前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、項目２８に記載の組合せ。
３２．前記細胞が、ランゲルハンス島からの細胞、例えばベータ細胞である、項目２７に記載の組合せ。
【００９３】
３３．前記真核細胞が単一細胞として提供される、上述した項目のいずれかに記載の組合せ。
３４．前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、項目３１に記載の組合せ。
３５．前記哺乳動物細胞が、少なくとも１のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、項目３０に記載の組合せ。
３６．前記哺乳動物細胞が、例えば肝細胞、線維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、項目２４−２６のいずれか１項に記載の組合せ。
３７．前記細胞がヒト細胞である、項目２４−３６のいずれか１項に記載の組合せ。
【００９４】
３８．前記スパイダーシルクタンパク質が、式ＲＥＰ-ＣＴ及びＮＴ-ＲＥＰ-ＣＴにより定められるタンパク質の群から選択され、ここで、
ＮＴは１００〜１６０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＮ末端断片であり、
ＲＥＰは７０〜３００のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、Ｌ(ＡＧ)ｎＬ、Ｌ(ＡＧ)ｎＡＬ、Ｌ(ＧＡ)ｎＬ、及びＬ(ＧＡ)ｎＧＬからなる群から選択され、ここで、
ｎは２〜１０の整数であり、
各個々のＡセグメントは８〜１８のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０〜３のアミノ配列残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは１２〜３０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基はＧｌｙであり；
各個々のＬセグメントは０〜２０のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；
ＣＴは７０〜１２０のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるＣ末端断片である、項目２４−３７のいずれか１項に記載の組合せ。
【００９５】
３９．前記スパイダーシルクタンパク質が、４ＲｅｐＣＴ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ、５ＲｅｐＣＴ、８ＲｅｐＣＴ、４ＲｅｐＣＴＭａ２、ＮＴ８ＲｅｐＣＴ及びＮＴＮＴ８ＲｅｐＣＴからなる群から選択される、項目３８に記載の組合せ。
４０．前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを有する、項目２４−３９のいずれか１項に記載の組合せ。
４１．前記細胞結合モチーフが、少なくとも１のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、項目４０に記載の組合せ。
４２．前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のＮ末端にカップリングしている、項目４１に記載の組合せ。
４３．前記オリゴペプチドが、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＥＰＤＩＭ及びＮＫＤＩＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４１−４２のいずれか１項に記載の組合せ。
４４．前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、泡、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、項目２４−４３のいずれか１項に記載の組合せ。
【００９６】
４５．前記スパイダーシルクタンパク質が、４ＲｅｐＣＴ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ、ＲＧＥ-４ＲｅｐＣＴ、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ及びＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴからなる群から選択される、いずれかの上述した項目に記載の方法又は組合せ。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１はスピドロインＮ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図２】図２はスピドロインＣ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図３】図３は４ＲｅｐＣＴ繊維で培養されたマウス間葉系幹細胞を示す一連の写真である。
【図４】図４は、４ＲｅｐＣＴ繊維上で培養されたヒト間葉系幹細胞を示す一連の写真である。
【図５】図５は、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養されたヒト間葉系幹細胞の培養を示す一連の写真である。
【図６】図６は、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養されたヒト間葉系幹細胞の脂質生成分化に対する実験結果を示す一連の写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養されたヒト間葉系幹細胞の骨原性分化についての実験結果を示す一連の写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養されたヒト間葉系幹細胞の骨原性分化についての実験結果を示す一連の写真である。
【図８】図８は、実施例２に記載の実験前のＲＣＭ-１ ｈＥＳＣのＡ）４×及びＢ）１０×倍率の１対の写真である。
【図９】図９は、Ａ）ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭ ＣＴＳＴＭ及びＢ）ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴでの１４４時間の培養後のＲＣＭ-１ ｈＥＳＣ培養物を示す１０×倍率の１対の写真である。
【図１０】図１０は、Ａ）ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭ ＣＴＳＴＭ及びＢ）ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴでの１４４時間の培養後のＲＣＭ-１ ｈＥＳＣ培養物を示す１０×倍率の１対の写真である。
【図１１】図１１は、実施例２に記載されたＡ）ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭ ＣＴＳＴＭ及びＢ）ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴに対するＲＣＭ-１ ｈＥＳＣ培養物のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す１０×倍率の１対の写真である。
【図１２】図１２は、Ａ）ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴでの２４０時間の培養後のＲＣＭ-１ ｈＥＳＣ、Ｂ）ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴでの２４０時間の培養後のＲＣＭ-１ ｈＥＳＣのアルカリホスファターゼ染色を示す１０×倍率の１対の写真である。
【図１３】図１３は、示されたように４ＲｅｐＣＴ(ＷＴ)の発泡体及び繊維メッシュ、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(ＲＧＤ)の発泡体及び繊維メッシュ、ＭＥＦ(コントロール)又はゼラチンでの３継代について培養されたＲ１ ｍＥＳＣを示す一連のペアワイズ写真である。
【図１４】図１４は、示されたように４ＲｅｐＣＴフィルム及びコントロール(ＰＯＲＮ)で培養され、未分化で維持され(上列)、神経細胞分化(下列)を受けたＮＳＣを示す。細胞はネスチン(上列)及びＴｕＪ１(下列)で染色されている。
【図１５】図１５は、示されたように４ＲｅｐＣＴフィルム及びコントロール(ＰＯＲＮ)で培養され、未分化で維持され(上列)、オリゴデンドロサイト(上列)及び星状細胞(下列)分化を受けたＮＳＣを示す。また、４ＲｅｐＣＴの発泡体で未分化に維持され、星状細胞分化を受けたＮＳＣの外観を示す。
【図１６】図１６は、実施例４に記載された、４ＲｅｐＣＴフィルムで増殖するＮＳＣのＥｄＵ-アッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は、左側(播種の７２時間後)の４ＲｅｐＣＴフィルムで、及び右側(播種の４８時間後)のＰＯＲＮで増殖したＮＳＣの生存／死亡染色を示す。写真の各カラムは同じ領域を表し、それぞれ生存及び脂肪細胞を示す。
【図１８】図１８は、培養の５−７日後、ヒト(Ａ)及びマウス(Ｂ)のランゲルハンス島が、４ＲｅｐＣＴの繊維、発泡体及びフィルムのそれぞれに付着したことを示す一連の写真である。
【図１９】図１９は、マウスの島が、対応する繊維及びフィルム及びコントロールと比較して、全ての時点で、４ＲｅｐＣＴ発泡体構造体へかなり高い接着性（付着性）を示すことを表す図である(ｎ＝１６、＊＊＊Ｐ＝０．００１)。
【図２０】図２０は、１−５日培養した後に示される種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴの発泡体に付着したヒトの島の数を示す図である(ｎ＝３±ＳＥＭ；ＲＧＥ±標準偏差に対してｎ＝２)。
【図２１】図２１は、種々のスキャフォールドに対する島の接着性を示す１対の図である。Ａ：１−５日の培養後に示された種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴの発泡体に対するマウスの島の接着性(ｎ＝４、±ＳＥＭ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１)；Ｂ：２日の培養後の、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ及びコントロールと比較した、ＮＴ４ＲｅｐＣＴの発泡体に対するマウスの島の接着性(ｎ＝１、２回実験を実施、±ＳＥＭ)。
【図２２Ａ−Ｄ】図２２Ａ−Ｄは、示されるように、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いた、ウェルにおいて５日間培養した島をグルコース刺激した際の、インスリン放出性を示す一連の図である；Ａ：示されるように、５日間、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、全てのマウスの島からのインスリン放出性；Ｂ：５日間、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、マウスの島の刺激指数；Ｃ：５日間、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、付着したマウスの島からのインスリン放出性(ｎ＝２、２回実験を実施)：Ｄ：２日間、ＮＴ４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(ＮＴ)を用いて培養された、付着したマウスの島からのインスリン放出性。
【図２２Ｅ−Ｆ】図２２Ｅ−Ｆは、示されるように、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いた、ウェルにおいて５日間培養した島をグルコース刺激した際の、インスリン放出性を示す一連の図である。Ｅ：５日間、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、全てのヒトの島からのインスリン放出性：Ｆ：５日間、種々のペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、付着したヒトの島からのインスリン放出性(ｎ＝１、３回実験を実施)。
【図２３】図２３は、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴで１日間培養された１つの島の、高グルコース及びＫＣｌ刺激後の、[Ｃａ２＋]ｉ反応を例証する図である。
【図２４】図２４は、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体での、より無傷の付着した島(Ｂ)と比較した、コントロール群におけるより分散した島(Ａ)を示す、ヒトの島生存率の形態学的分析の１対の写真である。
【図２５】図２５は、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴでの長期間(３０日)の培養後の、ヒトの島の形態学的分析を可能にした写真である。
【図２６】図２６は、示されるように、ペプチドモチーフを持たない(ＷＴ)及び持つ、４ＲｅｐＣＴを用いて培養された、ヒトの島の長期間にわたる培養後の、島当たりのインスイン放出性を示す、１対の図である。５日目(Ａ)と４週間後(Ｂ)でのインスリン放出性。低グルコース(３ｍＭ)刺激により、基底レベルのインスリン放出性(白)が得られ、高グルコース(１６．７ｍＭ)により、刺激されたインスリン放出性(黒)が得られた(ｎ＝１；３回実験を実施)。
【図２７】図２７は、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体(ライトグレー)での長期間(７８日)の培養後の、ヒトの島及び島様クラスターでの、インスリン生成細胞(白、矢印で指す)のポジティブ染色を表す、標記倍率の１対の写真である。
【図２８Ａ】図２８は、コントロール組織の培養プレート(Ａ)での単一の島細胞(マウス)の培養後のクラスター形成を示す一連の写真である。
【図２８Ｂ】ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(Ｂ)での単一の島細胞(マウス)の培養後のクラスター形成を示す一連の写真である。
【図２８Ｃ】Ｃ：スキャフォールドと密着して、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ(右)、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(中央)及び４ＲｅｐＣＴ(左)の発泡体での、インスリン陽性クラスター(明部分；矢印で指す)の拡大(６３×)。
【図２９】図２９は、示されるように、発泡体状スキャフォールド４ＲｅｐＣＴ(ＷＴ)及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(ＲＧＤ)での、間葉系幹細胞(ＭＳＣ)の接着性及び増殖を表す、標示倍率の１対の写真である。ＭＳＣ(グレー)は発泡体構造(ライトグレー、矢印により例示)に素早く付着し、そこで経時的に増殖し続けることができた。
【図３０】図３０は、細胞追跡染色により可視化された、島のベータ細胞、内皮細胞及び間葉系幹細胞(「ＢＥＭ」)の同時培養を示す、１対の写真である(ベータ細胞：ブライトホワイト；内皮細胞：ライトグレー；間葉系細胞：グレー)。同時培養されたＢＥＭは、４ＲｅｐＣＴの発泡体においてクラスターを形成する。ＢＥＭのクラスターは４ＲｅｐＣＴの発泡体(左)及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体(右、ｎ＝２、２回実験を実施)に接着することが見いだされた。
【図３１】図３１Ａ−Ｅは、種々の細胞結合モチーフを有するフィルム又は発泡体の形態及びコントロールプレート(細胞培養ガラス)における異なった４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養された内皮細胞を示す写真である；Ａ：フィルム、左側パネル４ＲｅｐＣＴ(野生型)、右側パネルＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ；Ｂ：フィルム、左側パネルＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ、右側パネルＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴ；Ｃ：発泡体、左側パネル４ＲｅｐＣＴ(野生型)、右側パネルＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ；Ｄ：発泡体、左側パネルＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ、右側パネルＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴ；Ｅ：コントロール。
【図３２】図３２は、示された種々の細胞結合モチーフを有する、種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで被覆された９６ウェル培養プレート内で分析された全領域の内皮細胞の密度比を示す図である。
【図３３】図３３は、４ＲｅｐＣＴから調製された細胞スキャフォールド材の一連の写真である。上部パネルは、約２５×倍率の９６ウェルプレート内のウェルを示す。下部パネルは、２００×倍率の反転光学顕微鏡で視察されたスキャフォールドを示す。
【図３４】図３４は、アラマーブルー可視化アッセイで測定された、標示された４ＲｅｐＣＴスキャフォールド及びコントロールでの線維芽細胞の増殖の図を示す。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図３５】図３５は、アラマーブルー可視化アッセイで測定された、標示された４ＲｅｐＣＴスキャフォールド及びコントロールでの線維芽細胞の増殖の図を示す。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図３６】図３６は、１５０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、示された４ＲｅｐＣＴスキャフォールド及びコントロールで４日培養され、生存／死亡細胞の検出のために生存／死亡染色されたＨＤＦの一連の写真である。
【図３７】図３７は、無血清条件下での４ＲｅｐＣＴフィルムでのＳＦ-ＨＤＦ増殖の図を示す。播種密度(細胞／ｃｍ２)は標記の通りである。６日後、細胞数は増加し続け、よって、最も高い標準体を超え、プロットのためのデータの再計算を妨げた。生細胞の数をアラマーブルーで測定した。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図３８】図３８は、(写真のグレーのストランドのように見える)AlexaFlour488-ファロジンを用いたフィラメントアクチングリーン染色により可視化された、４ＲｅｐＣＴ繊維(左側パネル)及びフィルム(右側パネル)に付着したＨＤＦｎの写真を示す。核は、ＥｔｈＤ-１で赤に染色した(ブライトホワイトとして見える)。
【図３９Ａ】図３９Ａ−Ｄは、示された種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで増殖する細胞によるＩ型コラーゲンの産生を示す。Ａは、最初の５日間の培養中に分泌された細胞培養培地中のＣペプチドの濃度を示す図である。
【図３９Ｂ】図３９Ａ−Ｄは、示された種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで増殖する細胞によるＩ型コラーゲンの産生を示す。Ｂは、同じ培養期間中における種々のスキャフォールドで増殖する細胞／分泌されたＣ-ペプチドの量を示す図である。Ｃ-ペプチド濃度はＥＩＡにより測定した。エラーバーは２回の標準偏差を示す。
【図３９Ｃ−Ｄ】図３９Ａ−Ｄは、示された種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで増殖する細胞によるＩ型コラーゲンの産生を示す。Ｃ及びＤは、免疫蛍光法で染色されたフィルム(Ｃ)及び繊維-メッシュ(Ｄ)で増殖する細胞中に存在する細胞内Ｉ型コラーゲン(白色の点として見える)を示す写真である。
【図４０】図４０は、１４日間、示された種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養され、ついでＩ型プロコラーゲンのＣペプチド(上部パネル)及び細胞内Ｉ型コラーゲン産生(下部パネル)それぞれの分析のために、組織培養処理(ＴＣＴ)プレート又はチャンバースライドに再播種された線維芽細胞上へのコラーゲンの産生及び分泌を示す。
【図４１Ａ】図４１Ａは、示されたインテグリン結合モチーフＲＧＤを持つか又は持たない繊維-メッシュ(Ａ)で増殖する生存ＨＤＦｎの数を示す図である。アラマーブルーを用いてアッセイした。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図４１Ｂ−Ｃ】図４１Ｂ−Ｃは、フィルム(Ｂ−Ｃ)の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで増殖する生存ＨＤＦｎの数を示す図である。アラマーブルーを用いてアッセイした。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図４２】図４２は、３日目の野生型４ＲｅｐＣＴ(ｗｔ、オープンバー)又はＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(フィルドバー)で増殖するＳＦ-ＨＤＦの数を示す図である。播種密度は細胞／ｃｍ２で与えられる。生細胞の数はアラマーブルーで測定する。エラーバーは６回の標準偏差を示す。
【図４３】図４３は、示された種々の細胞結合モチーフを持つ４ＲｅｐＣＴフィルムで増殖した線維芽細胞を示す一連の写真である。線維芽細胞は、わずか３時間後に全てのフィルム変形体で接着斑を示し、材料に対するインテグリン媒介性接着を示す。接着斑は、明るく細長い点として見える。細胞は何ら血清を添加することなく培養される。ＷＴ：４ＲｅｐＣＴ；ＮＲＣ：ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ。
【図４４】図４４は、示された種々の細胞結合モチーフを持つか又は持たない４ＲｅｐＣＴ、及びＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ(ＮＲＣ)でのヒト一次角化細胞の増殖を示す図である。使用されるコントロールは未処理のセルプラスチック(ＨＰ)及びプルロニック被覆セルプラスチック(付着防止のため)である。生細胞は播種の１日後及び４日後にアラマーブルーで検出された。
【図４５】図４５は、示された種々の細胞結合モチーフを持つ４ＲｅｐＣＴフィルムで培養した３日後の、継代４のヒト一次角化細胞を示す一連の写真である。ＷＴ：４ＲｅｐＣＴ；ＮＲＣ：ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ；ＣＴＲＬ：細胞培養ガラス。
【図４６】図４６は、示された材料上に播種した４日後の角化細胞を示す一連の写真である。細胞は、細胞膜に近い、明るく細長い点のように見え、白色矢印により示される、接着斑を可視化するためにビンクリンで染色された。ＷＴ：４ＲｅｐＣＴ、ＲＧＤ：ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ、ＩＫＶＡＶ：ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ、ＣＴＲＬ：細胞培養ガラス。
【図４７】図４７は、４ＲｅｐＣＴフィルム及び繊維(それぞれパネルＡ及びＢ)に対する肝細胞の接着性を示す１組の写真である。肝細胞と繊維のスキャフォールドとの間の密接した相互作用が、ＣとＤにおいて見ることができる(ｎ＝１、６回実験を実施)。
【図４８】図４８は、１６日間、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルム(ＲＧＤ)で増殖させたｈＥＳＣ(左)、及び１９２時間、コントロール被覆で増殖させたｈＥＳＣ(Cellstart)(右)の外観を示す１対の写真である。細胞は、実施例１２に記載する実験の第１の継代にある。
【図４９】図４９は、それぞれの被覆においての実施例１２に記載する実験の第２の継代に播種した２４時間後のｈＥＳＣの外観を示す１対の写真である。左：Cellstartコーティング(コントロール)；右：ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルム(ＲＧＤ)。
【図５０】図５０は、それぞれの被覆においての実施例１２に記載する実験の第３の継代に播種した２４時間後のＡＰ-染色ｈＥＳＣの外観を示す１対の写真である。左：Cellstartコーティング(コントロール)；右：ＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴフィルム(Ｙ)。ポジティブＡＰ染色は茶色で現れる(写真ではダークグレー)。
【図５１】図５１は、それぞれの被覆においての実施例１２に記載する実験の第３の継代に播種した２４時間後のＡＰ染色ｈＥＳＣの外観を示す１対の写真である。左：ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルム(ＲＧＤ)で増殖させた細胞；右：ＲＧＥ-４ＲｅｐＣＴフィルム(ＲＧＥ)で増殖させた細胞。ポジティブＡＰ染色は茶色に見える(写真ではダークグレー)。
【図５２】図５２は、それぞれの被覆においての実施例１２に記載する実験の第３の継代に播種した２４時間後のＡＰ染色されたｈＥＳＣの外観を示す１対の写真である。左：ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴフィルム(ＩＫＶＡＶ)で増殖させた細胞；右：ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓフィルム(ＮＲＣ)で増殖させた細胞。ポジティブＡＰ染色は茶色に見える(写真ではダークグレー)。
【実施例】
【００９８】
実施例１
組換えスパイダーシルクにおける造血及び間葉系幹細胞
その直接の微小環境からの好ましくない影響に対して極めて敏感であることが知られている造血幹細胞(ＨＳＣ)と、種々の生物分解性の天然又は合成スキャフォールドに接着し、そこで増殖することが示されている間葉系幹細胞(ＭＳＣ)を、上述のように、４ＲｅｐＣＴを含む組換えスパイダーシルクマトリックスで培養した。ＨＳＣを４ＲｅｐＣＴの発泡体で培養し、Ｆａｌｃｏｎ １００８プラスチック及びレトロネクチン被覆プレートで培養されたＨＳＣ：ｓと比較して、それらの分化能力及びそれらの表現型は維持されていた。ＭＳＣは、４ＲｅｐＣＴで増殖させた場合のコントロールと比較して、類似した細胞数及び分化を示し、４ＲｅｐＣＴのフィルム及び発泡体において増殖させた場合、中胚葉系列、例えば骨、軟骨及び脂肪細胞の細胞において分化能力を維持していた。
【００９９】
材料と方法
組換えスパイダーシルクタンパク質の発現
組換えスパイダーシルクタンパク質４ＲｅｐＣＴ(配列番号：２)を、先に記載したようにして産生させた(Hedhammarら (2008), 上掲)。簡潔に述べると、４ＲｅｐＣＴ発現のために、ベクターと共に、大腸菌.ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞(Merck Biosciences)を、カナマイシンを含むＬＢ培地中において、３０℃で、０．８−１のＯＤ６００になるまで増殖させ、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドで誘導させ、さらに室温で３時間、インキュベートした。その後、細胞を収集し、リゾチームとＤＮアーゼＩが補填された２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)に再懸濁させた。完全に溶解させた後、１５０００ｇで遠心分離した上清を、Ｎｉセファロース(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)が充填されたカラムに充填した。３００ｍＭのイミダゾールを用い、結合したタンパク質を溶出させる前に、カラムを広範囲に洗浄した。標的タンパク質を含む画分をプールし、２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)で透析した。室温で１−２時間、１：１０００(ｗ／ｗ)のトロンビン：融合タンパク質の比率を用いたタンパク質切断により、４ＲｅｐＣＴをタグから放出させた。放出されたＨｉｓ ＴｒｘＨｉｓタグを除去するために、切断混合物を第２のＮｉセファロースカラムに充填し、フロースルーを収集した。タンパク質含有量を２８０ｎｍでの吸光度で測定した。
【０１００】
スキャフォールド調製
精製した４ＲｅｐＣＴタンパク質を、上掲のStarkら(2007)に記載されたようにして、繊維中に自己組織化させた。ついで、非組織培養処理されたファルコン皿(Falcon 1008)での培養に使用する前に、繊維をより小さな小片に切断した。０．２−２．０ｍｌのタンパク質溶液で、ファルコン１００８皿を被覆し、空気乾燥させ、皿の底部に薄層の形成を可能にすることにより、フィルムを調製した。さらに、いくつかのファルコン１００８皿を、タンパク質溶液を激しく攪拌した後に得られた発泡体で被覆し、２４時間空気乾燥させ、皿の底部に３Ｄマトリックスを形成させた。１３７Ｃｓ源(Gammacell, Atomic Energy of Canada, Ottawa, Canada)により送達される２８０Ｇｙのγ線に暴露することにより、繊維、フィルムまたは発泡体を有する皿を滅菌した。
【０１０１】
造血幹細胞の単離及び培養
健康なＢａｌｂ／ｃマウスを殺し、大腿を取り除いた。骨髄(ＢＭ)細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー(HH; GIBCO)で緩衝されたハンクス平衡塩溶液を用い、大腿部から流した。ＢＭ細胞を、製造者の使用説明書に従い、系列細胞枯渇キット(Miltenyi Biotec)を用いた系列枯渇の後、又は直接使用し、３×１０５及び５×１０４細胞／皿にて、それぞれ、マウス幹細胞因子(ｍＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ；Immunex, Seattle, WA)及びｍＩＬ-３  (３０ｎｇ／ｍｌ；Genentech, San Francisco, CA)が補填された無血清ＤＭＥＭ(Wognumら (2000), Hum Gene Ther 11:2129-2141)において培養した。
【０１０２】
表面抗原の測定
４ＲｅｐＣＴの存在下での培養の前後に、マウス骨髄細胞を、表現型分析のために収集した。簡潔に述べると、細胞を、０．５％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ；Sigma, St Louis, MO)、０．０５％(ｗｔ／ｖｏｌ)のアジ化ナトリウム、及び０．４５％(ｗｔ／ｖｏｌ)のグルコース(Merck, Darmstadt, Germany)(ＨＢＮ)を含むハンクス緩衝ＨＥＰＥＳ溶液(ＨＨＢＳ)で２回洗浄し、モノクローナル抗体(ＭｏＡｂｓ)の非特異的結合を防止するために、２％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)の通常の熱失活マウス血清を含有する５０μｌのＨＢＮに再懸濁させ、続いて、次の表面マーカー：ｃ-ｋｉｔ、ｓｃａ-１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ及びＢ２２０(BD Biosciences, San Jose, CA)に対して生じたＭｏＡｂｓと共に、３０分インキュベートした。細胞をＨＢＮで２回洗浄し、死亡細胞をヨウ化プロピジウム(ＰＩ、Sigma)に基づく分析から除去した。細胞サンプルをFACSCalibur フローサイトメーターを使用して測定し、１００００のリストのモードイベントを収集し、Cellquestソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用して分析した。
【０１０３】
インビトロクローン原性前駆体アッセイ
５×１０４のマウスＢＭ細胞又は１×１０３の系列枯渇したＢＭ細胞(ｌｉｎ−／−)を、濃縮ＤＭＥＭに入った０．８％(ｗｔ／ｖｏｌ)のメチルセルロース(Methocel A4M Premium grade, Dow Chemical Co, Barendrecht, The Netherlands)、１％(ｗｔ／ｖｏｌ)のＢＳＡ、０．３ｍｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、０．１μｍｏｌ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｌのヌクレオシド(シチジン、アデノシン、ウリジン、グアノシン、２'-デオキシシチジン、２'-デオキシアデノシン、チミジン、及び２'-デオキシグアノシン；Sigma)、０．１ｍｍｏｌ／ｌのβ-メルカプトエタノール、１５μｍｏｌ／ｌのリノール酸、１５μｍｏｌ／ｌのコレステロール、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する、１ｍｌの無血清半固体状メチルセルロース培養培地にて、ファルコン１００８(直径３５ｍｍ)のペトリ皿に配した。顆粒球／マクロファージコロニー形成(ＣＦＵ-ＧＭ)を、１０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ-３、１００ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ-ＣＳＦを添加することにより刺激し、培養の８-１０日目にスコア化した。赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＵ-Ｅ)の成長は、１００ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ及び４Ｕ／ｍｌのヒトエリスロポエチン(ｈＥＰＯ；Behringwerke, Marburg, Germany)により誘発させ、８-１０日後に計測したが、赤芽球コロニー形成単位(ＣＦＵ-Ｅ)の成長はｈＥＰＯ単独で刺激し、２日後に計測した。巨核球前記細胞(ＣＦＵ−-Ｍｅｇ)を、１００ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ-３ｍ、及び１０ｎｇ／ｍｌのｍＴＰＯ(Genentech, San Francisco, CA)が補填された０．２７５の％寒天培地にて刺激した。１０日後にコロニーを乾燥させ、アセチルコリンエステラーゼポジティブ細胞に対して染色し、数え上げた。
【０１０４】
間葉系幹細胞の単離及び培養
ヒトの間葉系幹細胞(ｈＭＳＣ)をLonza (Verviers, Belgium)から購入した。細胞を、５４％のＤＭＥＭ-ＬＧ、３６％のＭＣＤＢ-２０１、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのＬ-グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン(Reyesら(2001), Blood 98:2615-2625)からなる完全培地-１(ＣＭ-１)において培養した。細胞をトリプシン処理し、コンフルエンスが８０-９０％に達した時に継代培養し、培地を３-４日毎にリフレッシュした。
【０１０５】
マウスの間葉系幹細胞(ｍＭＳＣ)を、ＨＨを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿をフラッシングすることにより得た。完全なＢＭ細胞を、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのＬ-グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン(ＣＭ-２)が補填されたＤＭＥＭ-ＬＧの存在下で培養した。付着細胞を継代培養し、１週間に１度継代した。培地を３-４日毎に変えた。
【０１０６】
分化アッセイ
脂質生成分化について、ＭＳＣ：ｓを、ＤＭＥＭ-ＬＧ、１０％のＦＣＳ、１μＭのデキサメタゾン、６０μＭのインドメタシン、５００μＭのイソブチルメチルキサンチン(ＩＢＭＸ)及び５μｇ／ｍｌのインスリン(Sigma, St. Louis, USA)からなる脂質生成培地の存在下、２１日間培養し、オイルレッドＯ(Sigma, St Louis, USA)で染色した。骨原性分化について、ＭＳＣ：ｓを、ＤＭＥＭ-ＬＧ、１０％のＦＣＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ-グリセロホスファート及び０．２ｍＭのアスコルビン酸(Sigma, St. Louis, USA)からなる骨原性培地において、２１日間維持した。リン酸カルシウム沈着物の存在を確認するために、細胞をアリザリンレッドＳ(Sigma, St. Louis, USA)で染色した。軟骨形成分化について、２．５×１０５の細胞を１５ｍｌのポリプロピレンチューブに沈降させ、自発的に形成された３次元ペレットを、ＤＭＥＭ-ＨＧ(Gibco)、１００ｎＭのデキサメタゾン、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３(Peprotech, USA)、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、５０ｍｇ／ｍｌのＩＴＳ＋プレミックス(Becton Dickinson, USA)からなる軟骨形成培地において、２１日間培養した。ペレット切片を組織学的研究のために調製し、軟骨形成系列の確認のためにアルシアンブルーで染色した。
【０１０７】
結果
４ＲｅｐＣＴ繊維の存在下における幹細胞の増殖及び分化
２回実施される３つの別々の実験において、４ＲｅｐＣＴの小片の有無での、マウス骨髄細胞の増殖を研究した。結果を、１００ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ及び３０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ-３が補填された無血清培地での、マウス骨髄(ＢＭ)細胞の増殖における、４ＲｅｐＣＴの存在下で４日間培養した影響を示す、表３に提示する。計測された細胞は赤芽球コロニー形成単位(ＣＦＵ-Ｅ)；赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＵ-Ｅ)；コロニー形成単位-顆粒球／マクロファージ(ＣＦＵ-ＧＭ)；及びコロニー形成単位-巨核球(ＣＦＵ-Ｍｅｇ)である。コントロールウェルと比較して、４ＲｅｐＣＴ繊維の存在下で４日間の培養した後、細胞数と形成されたコロニーの量との間には、有意な差異は見いだされなかった。
結果を、３回の別々の実験の平均±標準偏差として表す。全ての実験は２回実施した。
１１×１０５ＢＭ細胞当たりのコロニー
２細胞×１０５
Ｓ.Ｉ.：０日に対して比較される刺激指数値
2013523174.tif 000006
【０１０８】
マウスＭＳＣ：ｓを、サブコンフルエンスになるまで培養培地で維持し、ついでトリプシン処理した。１×１０５のｍＭＳＣを、７日間、４ＲｅｐＣＴ繊維の１ｃｍ小片の有無において、６-ウェルプレートにて培養し、ついでトリプシン処理し、計測した。コントロールウェルは７日後に、５．７倍の増殖を示したが、４ＲｅｐＣＴの存在下で培養された細胞は、４．０倍増殖した。しかしながら、培養さらに維持された細胞だけをトリプシン処理し、繊維上で増殖させた細胞を全細胞計測に含めないと、各ウェルに存在する細胞の実際数の過小評価に至った。高密度コンフルエンス近傍での培養における接触阻害による、阻害シグナルの排出を防止するために、７日、１４日及び２１日後、繊維を培養皿から注意深く取り出し、ＰＢＳで洗浄し、培養培地のみを含有する新たなウェルに移動させた。よって、これらの培養皿で生じた細胞は全て単一源、すなわち組換えスパイダーシルク糸から誘導された(図３)。
【０１０９】
ヒトＭＳＣ：ｓを、ｍＭＳＣ：ｓと類似した条件下で、培養培地に維持した。繊維を１週間に１度、新たな培養皿に移した(図４)。培養の２１日後、４ＲｅｐＣＴ繊維を取り出した。培養ウェルの表面を覆い、組換えスパイダーシルク糸から誘導された、残存するｈＭＳＣ：ｓをトリプシン処理し、脂質生成、骨原性及び軟骨形成系列における、それらの分化能力についてテストした(図５)。全てのテストを３回実施した。４ＲｅｐＣＴ繊維から誘導された細胞は、４ＲｅｐＣＴの不在下で培養された、同様の継代からのｈＭＳＣ：ｓと比較して、それに匹敵する分化能力を示した。
【０１１０】
４ＲｅｐＣＴ-コーティングされた組織培養皿における増殖及び分化
マウス骨髄細胞を系列枯渇させ(ｌｉｎ−／−)、ｍＳＣＦ及びｍｌＬ-３を含有する無血清培地において、４ＲｅｐＣＴの発泡体でコーティングされた培養皿にて培養した。培養の４日後、ｌｉｎ−／−ＢＭ細胞の増殖及びコロニー形成単位の数を、１０μｇ／ｃｍ２の濃度で、組換えフィブロネクチン断片ＣＨ-２９６(レトロネクチン: RN; Takara Shuzo, Otzu, Japan)でコーティングされたファルコン１００８皿及び非組織培養処理された皿(３５ｍｍ、ファルコン１００８)において培養された陰性細胞株列の培養物と比較した。インビトロ赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＵ-Ｅ)；コロニー形成単位-顆粒球／マクロファージ(ＣＦＵ-ＧＭ)；及びコロニー形成単位-巨核球(ＣＦＵ-Ｍｅｇ)の数について、結果を表４に示す。
2013523174.tif 000007
２回実施した実験の１つの結果を示す。
１１×１０５ＢＭ細胞当たりのコロニー
２細胞×１０５
Ｓ.Ｉ.：０日に対して比較される刺激指数値
【０１１１】
さらに、細胞表面マーカーの発現を、異なってコーティングされた皿における培養の前後で測定した(表５)。
2013523174.tif 000008
３回実施した実験の１つの結果を示す。データは絶対細胞数×１０５として表す。
Ｓ.Ｉ.：０日に対して比較される刺激指数値
【０１１２】
１×１０５の老化したｈＭＳＣ：ｓを、非組織培養処理された皿(３５ｍｍ、ファルコン１００８)、組織培養処理された皿(３５ｍｍ、ファルコン３００１)、組織培養処理された６-ウェルプレート(Falcon)、及び４ＲｅｐＣＴのフィルム又は発泡体でコーティングされた皿(３５ｍｍ、ファルコン１００８)に配し、ほぼコンフルエントになるまで培養した。ついで、細胞を、コントロール培地、脂質生成分化培地又は骨原性分化培地において、２１日間維持した。それぞれ脂質生成分化及び骨原性分化についての結果を、図６及び図７に提示する。皿のコーティングとは独立して、脂質生成培地の存在下で培養された細胞は、類似した程度の脂質生成分化性を示し、皿の表面上で等しく分割された複数の脂質小胞体を含む丸形細胞を有する。これに対し、老化したｈＭＳＣ：ｓは、任意のコントロール条件下で培養した場合、骨原性分化培地で、通常の培地交換を行ったにもかかわらず、もはや骨原性系列に分化することができなかったが(図７)、興味深いことに、フィルム又は発泡体でコーティングされたプレートにおいては、ある程度のパッチ状アリザリンレッドＳ染色を示した(それぞれ、図７Ｂの上部左及び右)。細胞を含有しない、４ＲｅｐＣＴのフィルム又は発泡体でコーティングされたプレートは、何のポジティブアリザリンレッドＳ領域を示さなかったため、この染色は、４ＲｅｐＣＴそれ自体の染色に原因するものではない(それぞれ、図７Ｂの上部左及び右)。
【０１１３】
実施例２
組換えスパイダーシルクにおけるヒト胚性幹細胞
本実験は、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性を示す。
【０１１４】
材料及び方法
標準的な６-ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、３つのウェルはＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルムを含有し、残りの３つのウェルは空であった。細胞結合モチーフＲＧＤを有する４ＲｅｐＣＴフィルムを、本質的に実施例１に記載したようにして調製した。組織培養プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。
【０１１５】
実験の準備において、組織培養プレートを、クラスＩＩの微生物学的安全キャビネットにおいて、３０分間、ＵＶ照射をした。ついで、各プレートにおける３つの空のウェルを、製造者のプロトコルのようにして、ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭＣＴＳＴＭ(Invitrogen; カタログ番号A10142-01)で被覆した。
【０１１６】
ヒト胚性幹細胞(ＲＣＭ-１、De Sousaら, Stem Cell Res 2:188-197; Roslin Cells, Edinburgh, UK)を、製造者のプロトコルのようにして、血清及びフィーダーフリーの培地ＳＴＥＭＰＲＯ(登録商標)ｈＥＳＣ ＳＦＭ−ヒト胚性幹細胞培養培地(Invitrogen; カタログ番号A1000701)を用い、ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭにおいて培養した。細胞を、製造者のプロトコルのようにして、STEMPRO(登録商標)ＥＺＰａｓｓａｇｅＴＭ−使い捨て幹細胞継代ツール(Invitrogen; カタログ番号23181-010)を使用し、９０％コンフルエントなウェルから、１：６の比率で継代した。
【０１１７】
ウェルをＰＢＳで洗浄し、培地を全てのウェルに配し、細胞を播種する前に、プレインキュベートした。継代６４での細胞を、推奨する密度で全てのプレートの全てのウェルに播種し、播種後の細胞妨害がないようにケアした。全てのウェルを、製造者のプロトコルのようにして、ＳＴＥＭＰＲＯ(登録商標)ｈＥＳＣ ＳＦＭを用いて培養した。３７℃、空気中に５％のＣＯ２、湿度９５％にて、標準的な培養インキュベーターでインキュベートを行った。細胞を毎日観察し、４８時間毎に、１００％の培地を交換した。全ての培地は、摂食交換の２時間前に、インキュベーター条件に対して前平衡した。
【０１１８】
研究の終わりに、製造者のプロトコルのようにして、ウェルをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ：アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、白血球(Sigma-Aldrich; Ref 86R-1KT, Lot 019K4349)で染色した。
【０１１９】
結果
細胞培養実験から選択された画像を、図８−１２に提示する。
【０１２０】
全てのコントロールウェルは、使用したコントロール培養条件下でこのｈＥＳＣ系で予期されるであろう、特徴及び形態を示した。
【０１２１】
ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルムは、細胞の付着及び増殖に成功した。成長はコントロールウェルで見られるものよりも遅かったが、これは、新たなマトリックスに細胞が適応した結果であると考えられる。最初の細胞配置において、細胞は、マトリックスに対するある程度の付着性を示したが、非付着細胞は胚様体(ＥＢ)構造の外観をとり、このことは、ｈＥＳＣ：ｓを、系列及び分化分析用にＥＢ構造体を特異的に誘導するため、低付着性又は低クラスター性のプレートに配した場合に見られた。しかしながら、これらの細胞のＥＢ様凝集体は、結局はマトリックスに付着し、これらの「凝集塊」から、細胞は成長し、拡大すると見られ、新規のマトリックスへの適合が示唆される。
【０１２２】
この研究の細胞は、常に成長し、摂食しており、拡大し続けることが予期される。さらに、細胞は継代及び増殖可能で、それらの多能性及び分化状態について評価可能であることも予期される。ポジティブアルカリホスファターゼ染色により、細胞が未だに未分化幹細胞の特徴を示すことが提示された。
【０１２３】
実施例３
組換えスパイダーシルクにおけるマウス胚性幹細胞
背景
マウス胚性幹細胞(ｍＥＳＣｓ)は、フィーダー依存性(すなわち、マウス胚性線維芽細胞、ＭＥＦの層において培養する必要がある)、又はフィーダー独立性(通常、ゼラチンで培養)のいずれかとすることができる。ｍＥＳＣは、未分化を維持するために、培養培地に存在するＬＩＦ(白血病抑制因子)と共に培養する必要がある。それらの分化状態(又は幹細胞性の維持)は、多能性細胞がＡＰを発現し、ポジティブ染色されるため、アルカリホスファターゼ活性(ＡＰ)染色により、又は１セットの分化マーカー(遺伝子)の転写を測定することにより、決定することができる。
【０１２４】
手順
継代１７におけるフィーダー-依存性ｍＥＳＣ(Ｒ１)を解凍し、２０％の熱失活したＥＳ細胞認定ＦＢＳ(Invitrogen, カタログ番号16141-079)及び５×１０５単位／ｍｌのＬＩＦ(Chemicon, ESG 1107)が補填されたグルタマックス(Invitrogen, カタログ番号31966-021)を含有するＤＭＥＭにて、６０ｍｍのペトリ皿中のＭＥＦの層(照射、１日培養)に配した。２日後、細胞を収集し、ここの実施例に記載されたようにして調製した種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(４ＲｅｐＣＴの発泡体及び繊維-メッシュ、及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体及び繊維-メッシュ)、並びに１２-ウェルプレートのコントロール(ＭＥＦ又はゼラチン)に播種した。分割比は１：７であった。培地を毎日交換し、細胞を２日毎(ＭＥＦ又はゼラチン)、又は４日毎(４ＲｅｐＣＴスキャフォールド)に分割させた。ゆっくりと増殖するため、スキャフォールドにおいて成長する細胞については、より長い分割期間を使用した。細胞が多能性を維持しているかどうかを評価するために、細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて１分固定し、ついで、各継代(ｐ１９、ｐ２０及びｐ２１)の終わり、又は継代２１のスキャフォールド上の細胞については３日後(ゼラチン又はＭＥＦ上の細胞については２日後)に、アルカリホスファターゼ活性ついて染色した(VECTOR Laboratoriesのキット)。つまり、スキャフォールド上に維持されている細胞は、ｐ２１の終わりに、全体で４＋４＋３＝１１日培養されたが、ゼラチン又はＭＥＦ上で維持された細胞は、ｐ２１の終わりに、２＋２＋２＝６日培養された。顕微鏡写真を反転顕微鏡にて撮った。
【０１２５】
結果
ゼラチン上で成長したｍＥＳＣは分化し始め、形態を失ったが、ＭＥＦ上で成長した細胞は、３継代後でも、丸いコロニー形態及び幹細胞性を維持していた。ｍＥＳＣは、ＭＥＦと比較して、全てのスキャフォールドタイプにおけるコロニー数が少なかったことが示されていることから、ＭＥＦに対する結合性と比較して、発泡体及び繊維-メッシュの双方への結合度合いの低さが提示された。スキャフォールド上で成長したコロニー数は、ゼラチン上で成長したコロニー数とほぼ同じであった。
【０１２６】
スキャフォールド材と結合すると、細胞は成長し、発泡体及び繊維-メッシュにコロニーを形成するが、いくつかのコロニーは、ＭＥＦと比較してあまり滑らかでない形状を示す傾向にある。コロニーは、ゼラチン上のものと同じようにみえる。発泡体及び繊維-メッシュを分割することなく、４日後、コロニーは非常に大きくなっており、部分的に分化し始めていた(すなわち、それらのＡＰポジティブ性の喪失)。第３の継代(ｐ２１)において、細胞を、３日間、それぞれのスキャフォールドにおいて増殖させた。コロニーは発泡体においてはＡＰポジティブ性を維持していたが、繊維-メッシュでは分化の兆候を示した。４ＲｅｐＣＴの発泡体において、コロニーは、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体と比較して、より多く、より大きくなっていた(図１３)。
【０１２７】
図１３を参照し、それぞれの基質上の第３継代(細胞継代２１)の３日目(発泡体及びメッシュ)及び２日目(コントロール及びゼラチン)に、ＡＰ活性について染色した。ＡＰ染色(ダークグレーのコロニー)により、ＭＥＦ(コントロール)におけるｍＥＳＣで見られたものと類似していることが示されたため、４ＲｅｐＣＴ(ＷＴ)の発泡体において成長する細胞は幹細胞性を維持していることが提示された。これに対し、繊維-メッシュにおいて成長するｍＥＳＣは、分化の兆候である弱い染色を示した。ＲＧＤ４ＲｅｐＣＴの発泡体におけるコロニーは小さいがＡＰポジティブであり、あまり増殖しないが、幹細胞性を維持していることが示された。
【０１２８】
継代なしに４日の培養後、発泡体及び繊維-メッシュ上のコロニーに見られる分化は、コロニーが異常増殖し、あまりに大きくなった結果であるとすることができるが、細胞がそれらの多分化能を維持するために依存しているＭＥＦにより分泌される因子を欠いているためでもあるとできる。このことは、ＭＥＦを含まないゼラチンに維持されている細胞も分化し始める(２日後に既に)といった観察により裏付けられる。繊維-メッシュにおいて、コロニーがまだ２日後のＭＥＦ上のコロニーに匹敵するサイズである時点で、細胞は３日後に分化し始めた。
【０１２９】
結論
ｍＥＳＣは、４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体及び繊維-メッシュに結合し、増殖することが示されている。４日後、４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ４ＲｅｐＣＴの発泡体及び繊維-メッシュにおけるｍＥＳＣは、大きなコロニーである可能性のため、分化し始めた。しかしながら、これらの細胞が、新規に調製されたスキャフォールドに播種され、３日間培養された場合は、４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体において、それらの幹細胞性を維持しており、コロニーの大きさは、２日後にＭＥＦにおいて見られたものと類似していた。４ＲｅｐＣＴの発泡体と比較して、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴの発泡体においては、ゆっくりとした成長が観察された。ゼラチンで２日間維持された細胞は分化し始め、ＭＥＦ上のｍＥＳＣも、大きなコロニー(過剰成長)であるために、４日後に分化し始めるであろう。４ＲｅｐＣＴの発泡体において、付着性、成長性及び幹細胞性の維持は、ゼラチンと比較して改善していた。
ｍＥＳＣは通常、それらの幹細胞性を維持するために、ＭＥＦにより提供される因子に依存しているため、本結果は驚くべきことである。
【０１３０】
実施例４
組換えスパイダーシルクにおける神経幹細胞(ＮＳＣ)
材料及び方法
スキャフォールドを含有するウェル及びポジティブコントロールウェルの調製
４ＲｅｐＣＴ、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴを組換え的に生成させ、Hedhammarら(2008)，上掲の記載に類似させて精製した。得られたタンパク質溶液の一画分を、Hedhammarら(2010), Biomacromolecules 11:953-959に記載されたようにして、リポ多糖類(ｌｐｓ)から精製した。実施例１に記載したように、スキャフォールド(フィルム、発泡体又は繊維)の調製に使用する前に、タンパク質溶液を滅菌濾過した(０．２２μｍ)。半分のスキャフォールドを、リポ多糖類が枯渇したタンパク質溶液から作製した。細胞培養プレートに配する前に、２．８バール、蒸留水において、１２１℃で１５分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の６-ウェル細胞培養プレート(Sarstedt)において調製した。ポジティブコントロールとして、ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチン(ＰＯＲＮ)でコーティングされたウェルを使用した。「野生型」４ＲｅｐＣＴを有する６-ウェルプレートの概略を、以下に付与する。
2013523174.tif 000009
2013523174.tif 000010
2013523174.tif 000011
【０１３１】
さらに、類似のプレートを、「野生型」ＲｅｐＣＴスキャフォールドを、それぞれＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴから作製されるスキャフォールドと交換し、全体で９の実験用プレートを作製することにより調製した。
【０１３２】
コントロールプレートとして提供される第１０番目の６-ウェルプレートの２つのウェルを、以下のプロトコルを使用して調製した：
−各ウェルに２ｍｌのポリ-Ｌ-オルニチン溶液を添加
−３７℃で、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベート
−吸入によりポリ-Ｌ-オルニチン溶液を除去
−細胞培養インキュベーターにおいて２-４時間インキュベート
−ＰＢＳ１ｘで２回洗浄
【０１３３】
プレートの残った４つのウェルは被覆しない、すなわち細胞を、ポリスチレンプラスチックの表面に直接播種した。例えば、コントロールプレートは概略的に以下のように表すことができる：
2013523174.tif 000012
【０１３４】
上述した物質を、４８時間未分化状態のＮＳＣの培養に使用し、ここで細胞は星状細胞に分化した。
【０１３５】
さらに、神経幹細胞(ＮＳＣ)の特徴の詳細な研究のために、４ＲｅｐＣＴフィルムを用いた一連の細胞培養プレートを、以下のようにして調製した：
−各プレートの６つのウェルの５つに、４ＲｅｐＣＴフィルムを持つ３つの６-ウェルポリスチレンプレート(Sarstedt)。空のウェルと１つの付加的なウェルを、上述に従い、フィブロネクチン及びポリ-Ｌ-オルニチンで被覆した。これらのプレートを、４８-９６時間、未分化状態のＮＳＣ細胞を増殖させるのに使用され、その後、該細胞は星状細胞、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化する(以下参照)。
−コントロールプレート：１つの６-ウェルポリスチレンプレート(Sarstedt)。第１列を上述に従い、フィブロネクチン及びポリ-Ｌ-オルニチンで被覆し、第２列をＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)で被覆し、第３列は被覆しないままにした。
−４ＲｅｐＣＴフィルムを有する７つの３５ｍｍポリスチレンプレート(Sarstedt)を、細胞死の率及び割合を特異的にかつ性格に分析するために調製した。
【０１３６】
溶液
培地：
Ｎ２培地(５００ｍｌ)
ＤＭＥＭ：Ｆ１２(１：１)＋Ｌ-グルタミン(５００ｍｌボトル；Gibco 11320-074)
１ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン(Sigma T-1147；ＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈)
１００μｌの１００μＭプロゲステロン
５０μｌの１Ｍプトレシン溶液
３０μｌの５００μＭ亜セレン酸ナトリウム
１ｍｌの１２．５ｍｇ／ｍｌインスリン
５ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ(１００×)溶液
Ｎ２培地は、一次(組織誘導された、非細胞株)細胞の培養のための標準培地である。
【０１３７】
バッファー：
ハンクス(５００ｍｌ)
５０ｍｌの１０×ＨＢＳＳ(Gibco 14170)、１．８５ｇのＮａＨＣＯ３及び１．９５ｇのｄｄＨ２Ｏに溶解させたＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２に調節。フィルター滅菌。
【０１３８】
使用液：
ｄｄＨ２Ｏにポリ-Ｌ-オルニチン(１５μｇ／ｍｌ)が入ったもの。フィルター滅菌(Sigma P-3655)
ｄｄＨ２Ｏにフィブロネクチン(１μｇ／ｍｌ)が入ったもの。フィルター滅菌(Sigma F-1141) 
ＮａＯＨ(１０ｍＭ)
【０１３９】
保管溶液：
ｄｄＨ２Ｏにプトレシン(１Ｍ)が入ったもの(Sigma P-5780)
ＥｔＯＨにプロゲステロン(１００μＭ)が入ったもの(Sigma S-5261)
ｄｄＨ２Ｏに亜セレン酸ナトリウム(５００μＭ)が入ったもの(Sigma P-8783)
ＰＢＳにＦＧＦ(１０μｇ／ｍｌ)が入ったもの(R&D Systems, rhFGF-basic)
０．０２ＭのＨＣｌにインスリン(１２．５ｍｇ／ｍｌ)が入ったもの。滅菌濾過(Sigma I-6634)
ＤＭＥＭ：Ｆ１２にトランスフェリン(５０ｍｇ／ｍｌ)が入ったもの。滅菌濾過(Sigma T-1147)
【０１４０】
皮質神経幹細胞
神経幹細胞(ＮＳＣ)を、妊娠したスプラーグドーリーＥ１５．５ラットの胚の解離大脳皮質から得た。ＮＳＣ：ｓを、Ｎ２サプリメントに富む、１ｍｌ／９６２ｍＭ２の無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地において培養し、ポリ-Ｌ-オルニチン／フィブロネクチンどコーティングされた細胞培養皿において増殖させた。８０％コンフルエンスに達するまで、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２細胞を使用し、細胞を増殖状態で維持し、実験に使用する前に、２回継代した。第２継代後に、細胞を１５００００細胞／ｃｍ２で播種し、４８時間培養した。細胞が未分化のままであるかを決定するために、ネスチンで染色した。
【０１４１】
ＮＳＣの分化を誘発させるために、ＦＧＦ２を培養物から引き出し、新鮮な培地を、特定の組換え成長因子又は小分子と共に添加し、特異的な分化を誘発させた。
【０１４２】
星状細胞分化について、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＣＮＴＦ(毛様体神経栄養因子)を添加した。ＣＮＴＦ及びインターロイキン-６ファミリーの他の因子(例えば、ＣＴ-１、ＬＩＦ)が、星状細胞の形態を有し、原型的星状細胞マーカーＧＦＡＰ(Hermansonら(2002), Nature 419:934-939)に対してポジティブな細胞において、急速(４８時間以内)で効率的な(＞＞５０％)皮質ＮＳＣの分化を誘発し、これらの細胞が機能的星状細胞であることが、カルシウムイメージング技術により、近年示されている(Anderssonら (2011), Mol Cell Neurosci, Epub 14 January 2011)。
【０１４３】
神経細胞分化について、０．５-１．０ｍＭのバルプロ酸(ＶＰＡ)又は１０ｎｇ／ｍｌの組換えＢＭＰ４(骨形成タンパク質４)及び１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを、ＦＧＦ２の引き出し後に投与した。ＶＰＡは、神経細胞マーカー抗体ＴｕＪ１に対してポジティブであり、神経細胞形態を有する、１０-３０％早期の、電気生理学的に無反応の細胞に、ＮＳＣの急速な(７２時間以内)分化を誘発する。ＶＰＡ-誘発性の分化した細胞の遺伝子発現分析により、それらが、阻害(GABAergic)ニューロンへ分化プログラムを開始させることが示唆された。ＢＭＰ４＋Ｗｎｔ３ａは、ＴｕＪ１を含む全てのパン-神経細胞マーカーに対してポジティブであり、神経細胞形態を有する、１０-３０％成熟した、電気生理学的に活性な細胞に、ＮＳＣのゆっくりとした(５-１４日；ここでは７日)分化を誘発する(Leaoら(2010), PLoS One 5:e13833)。ＢＭＰ４＋Ｗｎｔ３ａ-誘発された分化細胞の遺伝子発現及び生理学的分析により、それらが、興奮性(グルタミン酸作動性)ニューロンへの分化プログラムを開始させることが示唆された。また、ＢＭＰ４＋Ｗｎｔ３ａ処理により、ＶＰＡを使用して分化した細胞と比較して、神経細胞の成熟した表現型の一因である星状細胞分化の増加にも帰する。
【０１４４】
オリゴデンドロサイト分化について、５０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン(Ｔ３)を添加した。Ｔ３は、４-７日以内に、最も原型的オリゴデンドロサイト特徴的タンパク質(例えばＭＢＰ)に対してポジティブであり、オリゴデンドロサイト形態を有する細胞に、高められた分化(１-２０％)を誘発する。分化は他のプロトコルから得られたものより効果的ではないが、コントロール培養におけるオリゴデンドロサイトの数は非常に少ない、例えば＜＜１％であることを記しておくべきである。
【０１４５】
免疫細胞化学
免疫細胞化学について、培養物をＰＢＳで１回洗浄し、２０分間、１０％ホルマリン(Sigma)で固定した。次に、細胞を、ＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ１００で、３×５分洗浄した。一次抗体を４℃で一晩インキュベートした(ＰＢＳで抗体希釈１：５００＋０．１％のトリトンＸ１００＋０．１％のＢＳＡ)。
【０１４６】
次に、プレートをＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ１００で、６×５分洗浄し、二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。
【０１４７】
次の抗体：Sigmaのマウスモノクローナル抗-平滑筋アクチン(ＳＭＡ)(１：１０００)；DAKOのウサギポリクローナル抗-グリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)(１：５００)；CoVanceのマウスＴｕＪ１(ニューロン検出のため)(１：５００)、及びChemiconのラット抗-ＭＢＰ(ＭＡＢ３８６)(１：２５０)、続いて適切な種特異性アレキサ(Alexa)-４８８及びアレキサ-５９４コンジュゲート二次細胞(分子プローブ；１：５００)を使用した。ＤＡＰＩ(Vector Laboratories, Inc.)を含有するVectashieを使用し、核を可視化した。蛍光及び明視野画像を Axiovisionソフトウェアを具備する、Zeiss Axioskop 2 mot plus/Axiocam MRmカメラを使用して獲得した。
【０１４８】
増殖アッセイ
５０μＭの５-エチニル-２'-デオキシウリジン(ＥｄＵ；Invitrogen)を添加した１５分後に、１０％ホルマリンを使用して細胞を固定し、続いて、供給者の推奨に従い、免疫細胞化学を行った。
【０１４９】
細胞死アッセイ
スキャフォールドに付着した生存細胞と死亡細胞を区別するために、生存／死亡キット(Invitrogen)を使用した。製造者の推奨に従い、アッセイを始める前に、予め暖めておいたＰＢＳ(３７℃)で、プレートを２回すすいだ。アッセイにより、生細胞(緑色)及び死亡細胞(赤色)を同定することができた。
【０１５０】
結果
繊維-メッシュ、発泡体又はフィルムにおいて成長及び拡大した場合の、神経幹細胞の増殖性及び生存率、及び星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトへの分化の可能性における実験。特に示さないならば、全ての実験は３回実施した(ｎ＝３)。
４８−７２時間後、ＮＳＣは、発泡体及びフィルムにおいて、正常に増殖した。ウェルにおいて、プラスチックの一部をフィルム及び発泡体の隣に暴露させ、細胞はフィルム及び発泡体においてのみ成長した。形態はコントロール培養(ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチン)とは区別できなかった。ネスチンで染色した時(播種の４８時間後)、４ＲｅｐＣＴにおけるＮＳＣの外観は、ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチンにおいて成長した細胞のものとは区別できなかった(図１４)。
【０１５１】
フィブロネクチン及びポリ-Ｌ-オルニチンでコーティングされた、シルクスキャフォールドを有するウェルにおいて、細胞は全てのプレートウェル上で成長しており、ウェルのプラスチック表面がコーティングされているので、このことは予期される。コントロールに対し、４ＲｅｐＣＴフィルム上で成長したＮＳＣ間の細胞死亡及び増殖においては、４８時間を超える任意の段階で、何の明らかで有意な差異は見られなかった。また、コントロール(ｎ＝１)と比較して、４ＲｅｐＣＴの発泡体状構造体上で成長したＮＳＣ間にも、何ら明らかな差異は見られなかった。ＢＳＡコーティングされたウェルにおいて、細胞は付着せず、予期したように、５日以内に死亡した。
【０１５２】
４ＲｅｐＣＴのフィルム及び発泡体構造体上で増殖させた場合、ＮＳＣは、ＦＧＦ２の存在下で、コントロール培養の幹細胞と、形態学的に区別できないままであった。それらは、生存可能であり(生存／死亡染色により測定して８５％)、増殖し(ＥｄＵアッセイにより測定して２８％、コントロール２０-３０％)、及び未分化状態を維持しており、コントロールと比較して、何の有意な差異も検出されなかった(図１４、１６及び１７)。
【０１５３】
ＮＳＣが分化能力に関して多能性を維持しているかどうかをテストするために、種々の神経系列(例えば、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト)への分化をテストするための一連のプロトコルを、上述した方法の項に詳細に記載されたようにして適用した。
【０１５４】
４ＲｅｐＣＴフィルム上で増殖させたＮＳＣを、方法に記載したようにして、ＣＮＴＦで処理した場合、それらは、原型型マーカータンパク質ＧＦＡＰを発現する星状細胞の形態を有する細胞に、急速に効率的に分化し、コントロール培養(ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチン)と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった(図１５)。
【０１５５】
４ＲｅｐＣＴフィルム上で増殖させたＮＳＣを、方法に記載したようにして、ＢＭＰ４＋Ｗｎｔ３ａで処理した場合、それらは、原型型抗体ＴｕＪ１でポジティブ染色された神経細胞の形態を有する細胞に分化し、コントロール培養(ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチン)と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった(図１４)。
【０１５６】
４ＲｅｐＣＴフィルム上で増殖させたＮＳＣを、方法に記載したようにして、ＶＰＡで処理した場合、それらは、原型型抗体ＴｕＪ１でポジティブ染色された神経細胞の形態を有する細胞に分化した。コントロール培養(ポリ-Ｌ-オルニチン及びフィブロネクチン)と比較して、増殖又は細胞死には、何の有意の差異はなかったが、分化においてわずかに効率性の低下が観察された(コントロール数と比較して約１０-５０％の分化細胞)。組換え成長因子が細胞内的に作用するのに対し、小分子ＶＰＡは基質に付着し分解するという事実のために、ＶＰＡ-媒介性分化が基質により影響を受けることは、以前から観察されている。それにもかかわらず、ＮＳＣのＶＰＡ-媒介性神経細胞分化が、実際に４ＲｅｐＣＴフィルムにおいて観察された。
【０１５７】
４ＲｅｐＣＴフィルム上で増殖させたＮＳＣを、方法に記載したようにして、Ｔ３で処理した場合、それらは、原型型マーカータンパク質ＭＢＰを発現するオリゴデンドロサイトの形態を有する細胞に効率的に分化し、コントロール培養(ｎ＝２)と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった。ＭＢＰ染色は、コントロール条件下で分化した細胞よりも、おそらくあまり成熟していない形態であることを示唆していると観察された。しかしながら、オリゴデンドロサイト成熟は複雑であり、このような観察には、決定的になる前に、注意深く拡張分析する必要があることを記しておくべきである(図１５)。
【０１５８】
ｌｐｓ枯渇した又はしていない４ＲｅｐＣＴタンパク質から作製されたスキャフォールド間での比較において、いずれの実験においても、形態、増殖、生存率、又は分化能力において、何の有意の差異も観察されなかった。さらに、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ又はＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ(ｎ＝１)上で成長したＮＳＣにおいて、形態、増殖、又は生存率に、明らかな負の差異は見られなかった。
【０１５９】
実施例５
スパイダーシルクスキャフォールドにおける、ランゲルハンス島(Ａ)と単一ベータ細胞、単独(Ｂ)又は他の細胞(Ｃ)との組合せ
背景
ランゲルハンス島の移植は、重度のＩ型糖尿病の、広範囲に適用可能な処置を見いだすための、最も前途有望なアプローチの一つである。残念ながら、現在利用可能な手順は、膵臓細胞の機能及び生存性が失われるための、低い効率性に悩んでいる(Alejandroら(2008), Transplantation 86:1783-1788)。成功率の低さは不完全に理解されているが、移植前、島の単離中、細胞を包囲する環境は破壊され、血管新生及び神経支配の喪失、細胞外マトリックスとの相互作用の変化に至る。このことは、制限された生存性及び機能の主要原因であることに暗示されている(van der Windtら (2007), Xenotransplantation 14:288-297; Kilkenny and Rocheleau (2008), Mol Endocrinol 22:196-205)。外分泌部分とは異なり、膵臓の内分泌部分は、それらが所有する基底膜を生成しないが、むしろその周囲の環境に依存し、正しいニッチが重要であるかもしれないことを、再度示唆している(Otonkoskiら (2008), Diabetes Obes Metab 10 Suppl 4:119-127)。
【０１６０】
島移植に対する他の主要な障害物は、ドナー不足によるベータ細胞の利用可能性が制限されることである。多くの他の細胞型と異なり、ベータ細胞は、それらを拡大させる試みにより脱分化に至るため、インビトロでの増殖は不可能である(Beckら (2007), Tissue Eng 13:589-599)。島及びベータ細胞にとって最適な環境の確立は、膵島及び島細胞(ベータ細胞)の研究及び増殖、及び移植用の人工島／ベータ細胞キャリアの設計の双方にとって必要である。このことを実施するために、高度に多用途の生体材料が、スキャフォールドとして必要とされている。
【０１６１】
近年、生理学的条件下における組換えスパイダーシルクタンパク質生成の成功が、本発明の研究グループにより報告されている。タンパク質ポリマーは、３次元繊維-メッシュ、発泡体又はフィルム等の、種々の物理的形態を採択可能な、強くて高度に多目的な物質を作成可能である。このような「スキャフォールド」の安定性により、後続する移植のための、細胞の検索が可能になる。さらに、スキャフォールドは、例えばベータ細胞等、付着に適した特異的細胞結合モチーフで機能化させることができる。これらの特性により、天然の細胞環境を模倣したスキャフォールドを生成するための、優れた候補であるタンパク質が作製され、よってランゲルハンス島及び単離後の個々のベータ細胞に対する支持体が提供される。
【０１６２】
移植後、例えば適切な血管新生を用い、島を宿主環境において採択することが重要である。同時に、ネガティブな宿主免疫応答、例えば即時炎症反応は回避されるべきである。新規の毛細管の形成には内皮細胞が必要であり、もちろん、これらの細胞は血液との接触に対して容易に耐える。間葉系幹細胞は、内皮細胞における重要な成長因子の発現をアップレギュレートし、プロテアーゼを生成可能であり、よって新規の毛細管のための経路を作製することができる(Zacharek, A.ら Neurosci Lett 404, 28-32 (2006))。ここに記載の実験により、機能化されたシルクのスキャフォールドを使用することで、個別化された島環境を組み立て可能であり、島細胞、内皮細胞(例えば実施例６)及び間葉系幹細胞(実施例１)の付着性及び組合せ成長が可能になることが示される。
【０１６３】
実験材料
組換えスパイダーシルクタンパク質、４ＲｅｐＣＴ(配列番号：２)を、実施例１に記載したようにして調製されたスキャフォールド構造体の形成において、本質的にHedhammarら (2008), 上掲に記載したように調製した。ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、及びＹＩＧＳＲ等、細胞外マトリックスに関連した種々の細胞結合モチーフの導入により、又はトリペプチドＲＧＥの導入により修飾された変異体の形態、又は元来の形態４ＲｅｐＣＴに、材料を使用した。他の変異体には、スピドロインＮ末端ドメイン(ＮＴ)及びＣ末端Ｈｉｓ-タグが含まれ、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ(配列番号：５)と命名されたタンパク質が生じる
ランゲルハンス島(ヒト及び齧歯動物)
ヒト及びマウスの島からの細胞、例えばベータ細胞
内皮細胞
間葉系幹細胞
【０１６４】
実験方法
細胞単離
ヒトランゲルハンス島を、修正半自動消化-濾過法を使用することにより、スエーデンのウプサラ大学の臨床免疫学部会にて単離し、その後、栄養補助剤及び１０％のヒト血清を含有する、ＣＭＲＬ-１０６６培地で培養した(Johanssonら (2008), Diabetes 57:2393-2401)。
【０１６５】
齧歯動物ランゲルハンス島を、コラゲナーゼ処理された膵臓から単離し、連続した機械的振揺により消化させ、外分泌組織から分離し、その後、栄養補助剤及び１０％のＦＢＳを含有する、ＲＰＭＩ-１６４０培地で培養した(Nyqvistら (2005), Diabetes 54:2287-2293)。
【０１６６】
単一細胞を、１０ヶ月の肥満マウスの島、又はヒトドナーの島から調製した。アキュターゼ(accutase)消化プロトコルに従い、単一細胞を単離した。簡潔に述べると、２００の島をプールし、１×ＰＢＳで２回洗浄した。その後、１ｍｌのアキュターゼを島に添加した。島-アキュターゼ懸濁液を、ゆっくりと振揺させる２工程を伴い、３７℃で１０-１５分インキュベートし、その後、島の単一細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、ついで蒔き、種々の物理的形態であり、種々のペプチドモチーフを有する又は有さない、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドの種々の変異体において培養した。
【０１６７】
細胞培養
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドと組合せたヒト島(２０島／ウェル)を、栄養補助剤と共に、ＣＭＲＬ-１０６６において培養した (Johanssonら, 上掲)。
４ＲｅｐＣＴ  スキャフォールドと組合せた単一の島細胞及び齧歯動物島(１０島／ウェル)を、補填されたＲＰＭＩ-１６４０培地において培養した(Nyqvistら, 上掲)。
【０１６８】
商業的に入手可能な、ヒト微小血管内皮細胞を得、よく知られている方式で、供給者の使用説明書に従い、培養物に維持した。
商業的に入手可能な、骨髄から誘導されたヒト間葉系幹細胞を得、よく知られている方式で、供給者の使用説明書に従い、培養物に維持した。
【０１６９】
細胞培養プレート(疎水性プラスチック)を、島用のコントロールとして使用した(島は、通常、これらのプレートに自由に浮かんで培養される)。組織-培養処理されたプラスチックを、単一細胞の成長をコントロールするために使用した。
【０１７０】
付着アッセイ
多数(１０-２５)の島を、コントロールとして通常の培養プラスチック、及び４ＲｅｐＣＴスキャフォールドの種々の変異体及び細胞結合モチーフに配した。特定の島培地を使用し、４ＲｅｐＣＴ及び島を５日間培養した。この期間、付着した島を毎日計測した。２日毎に培地交換を実施し、インスリン放出性を５日目に研究した。その後、４ＲｅｐＣＴスキャフォールド内の島を、２週間まで培養し、その際に島の生存性を分析した。ヒトドナーからの島を使用する一実施態様においては、島を１２週間培養した。
【０１７１】
島及び島細胞の機能及び生存性の評価
個々の島及び島細胞の双方、ヒト及び齧歯動物の双方におけるシグナル伝達を、種々の４ＲｅｐＣＴ-ベースのスキャフォールドにおいて、種々の期間、種々の成長、機能及び生存促進条件下で、無傷の島又は島細胞を培養した後に研究した。島細胞の成長、機能及び生存性を、種々のシグナル伝達経路における特定の行程に対するバイオセンサー、及び種々の蛍光染料を用いてモニターした。いくつかの重要な事象をテストした：グルコース代謝、遊離のＣａ２＋([Ｃａ２＋]ｉ)の細胞質濃度、増殖、及びアポトーシス／壊死。例えば、ＡＴＰ生成、エキソサイトーシス、及び刺激誘発性インスリン遺伝子転写についてテストすることもできる。
【０１７２】
インビボ移植
島及び４ＲｅｐＣＴの移植(例えば眼の前房への移植)を、P. O. Berggren's laboratory (Speierら(2008), Nat Protoc 3:1278-1286; Speierら(2008), Nat Med 14:574-578)において開発された方法に従い実施した。この方法では、生理学的及び糖尿病状態の双方にある生存生物体における、細胞の生存性、機能及び組込みを研究するための方法として、角膜を使用した。
【０１７３】
結果
Ａ）島の培養
野生型、又は種々の細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフ(例えば、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲ等)の導入により修飾された変異体の双方の４ＲｅｐＣＴの使用は、単離後の膵島の機能及び生存性を維持するための最適な環境を定める可能性がある。
【０１７４】
島を、ヒト膵臓(Ｎ＝７)及びマウス膵臓(Ｎ＝１０)から単離した。
【０１７５】
島を、それらに特異的な媒体及び血清において、３時間〜３日培養した。その後、４ＲｅｐＣＴの種々の変異体上に配した(導入されたペプチドモチーフを有する繊維、発泡体及びフィルム；なし(野生型；ＷＴ)、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲ)。また、島をＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ上にも配した。
【０１７６】
図１８Ａ(ヒト)及び図１８Ｂ(マウス)に示すように、島は、４ＲｅｐＣＴ変異体に自発的に付着した。空の培養プレート(疎水性プラスチック)をコントロールとして使用した。これらの結果から、フィルム及び繊維と比較して、発泡体状のスキャフォールド構造体への優先的付着が観察された(図１９)。よって、付着性及び機能の全てのテストを、発泡体状構造体において続けた。
【０１７７】
付着した島を５日目まで、播種後毎日計測した。島は、図２０(ヒト島、ｎ＝２であるＲＧＥを除きｎ＝３；全ての実験を３回実施)、図２１Ａ-Ｂ(マウス島、ｎ＝４(Ａ)及びｎ＝１(Ｂ)；実験を３回実施)に示すように、島は種々の数で付着していた。また、種々のモチーフ間での比較を実施し、２、４及び５日目に、モチーフＲＧＤを有する４ＲｅｐＣＴについては、付着性にかなりの増加が見られた(図２１Ａ)。さらに、コントロールと比較して、増加した方式で、島はＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓに付着した(図２１Ｂ)。
【０１７８】
４ＲｅｐＣＴと接触した島をグルコースに暴露し、５日目にインスリン放出性を測定した。結果を図２２Ａ-Ｆに示す。インスリンは、４ＲｅｐＣＴにおいて培養されたマウス島から放出された(図２２Ａ-Ｂ：ｎ＝６；実験を２回実施)。また、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓで培養された場合も、マウス島はインスリンを放出した(図２２Ｄ；ｎ＝１；実験を３回実施)。４ＲｅｐＣＴで培養された場合、ヒト島は、グルコース刺激の後にインスリンを放出した(図２２Ｅ；ｎ＝３；実験を３回実施)。全ての島が発泡体状スキャフォールドに付着したわけではなく、よって２日目及び５日目における付着した島のインスリン放出機能を、別の実験でテストした(図２２Ｃ(マウス)、図２２Ｆ(ヒト))。
【０１７９】
島によるグルコース刺激されたインスリン放出性は、ペプチドモチーフを有する又は有さない、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでコーティングされたウェル、及びコントロールウェルにおける培養後と類似していた。これにより、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで培養された島はそれらの機能を維持していることが示された。また、ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓで培養された島も機能を維持していた(図２２Ｄ)。
【０１８０】
最初の基底グルコース(黒棒)で測定されたインスリン放出性は、ペプチドモチーフを有する又は有さない４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでのいくつかのマウス実験においては高く、これは、これらの実験用島に間に高い変異性があり、スキャフォールドから洗い流すことが困難な、最初の培養培地に暴露された結果であると考えられる。刺激指数(刺激インスリン／基底インスリン)を各ウェルにおいて別々に測定したところ、スキャフォールド上のすべての島が、コントロールと等しく良好にインスリンを放出することにより、グルコースに対して応答することが示された。
【０１８１】
４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(ペプチドモチーフを有する又は有さない)で培養されたヒト島は、細胞-結合モチーフにかかわらず、低い基底インスリンレベルを示し、高度にグルコースに暴露した後に、満足のいく、刺激されたインスリン放出性を示した。
【０１８２】
遊離のＣａ２＋([Ｃａ２＋]ｉ)の細胞質濃度を、種々のモチーフを担持するスキャフォールドにおいて培養された島ついて測定した。島はグルコースに応答し、レシオメトリック画像分析により証明されるように、Ｃａ２＋における増加が示された(図２３)。コントロール島とスキャフォールドで培養された島の間には、何の差異も観察されなかった。
【０１８３】
島を２週間培養した(２日毎に培地を交換)。その後、島を計測し、生存率(例えば壊死)についてスキャンした。スキャフォールドにおける島の島形態は、２週間後も保存されていたが、コントロール島は、より不規則な形状により可視化されるような糖分解を示し、単一細胞に懸濁していた(図２４)。壊死体を光学顕微鏡で分析した。さらなる壊死体がコントロール島に見られたが、４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(ペプチドモチーフを有する又は有さない)で培養された、マウス及びヒトの双方の島は、無傷であり、生存していた。
【０１８４】
若いヒトドナーからの島を長期間培養し、５日後、４週間後及び１２週間後のインスリン放出性、及び島様クラスターの形成についてテストした。ＲＧＤモチーフを有する発泡体状スキャフォールドにおける島は、４週間後、島様クラスターの形成の増加を示した(表６)。
2013523174.tif 000013
【０１８５】
これらのクラスターは細胞に付着し、島と島様クラスターの間の細胞は、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴスキャフォールド構造体に沿って成長した(図２５)。島と発泡体状構造体との間のこのような細胞成長は、ＹＩＧＳＲモチーフを有するスキャフォールドにおいても見られた。ＲＧＤを有するスキャフォールドに対する、インスリン放出性は経時的に増加し、ＹＩＧＳＲモチーフを有するスキャフォールドにおいて維持されており、これらの結果は、このような長期間の培養後、コントロール島と比較して、満足のいく機能を示す(図２６)。染色により、島と島様クラスターに、インスリンポジティブ細胞が示された(図２７)。
【０１８６】
Ｂ）ベータ細胞単独の培養
単一細胞(主としてベータ細胞)を、肥満マウスの膵臓のランゲルハンス島(ｎ＝３)、及びヒト島(ｎ＝１)から単離した。単一細胞を配し、種々の４ＲｅｐＣＴ(導入されたモチーフを有する繊維、発泡体及びフィルム：なし(野生型；ＷＴ)、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲ)において、３-７日間培養した。
【０１８７】
形態分析には、単一細胞が４ＲｅｐＣＴの種々の変異体に、種々の方式で付着していることが示された。
【０１８８】
単一細胞の長期間培養(２週間以上)を分析した。組織-培養処理されたプラスチックをコントロールとして提供し(図２８Ａ)、ＲＧＤ等、導入された細胞結合モチーフを有する４ＲｅｐＣＴの発泡体又はフィルムでコーティングされたウェルと比較した。全ての異なるウェルにおいて、図２８に示すように、単一細胞は細胞クラスターを形成した。これらの細胞クラスターは形態が異なり、例えばコントロールにおいては散乱クラスター(図２８Ａ)、例えばＲＧＤモチーフを有する４ＲｅｐＣＴにおいては丸型クラスター(図２８Ｂ)を示した。これらのクラスターを２週間後に計測し、ついでインスリン染色などの組織学的分析用に保存した。結果には、見いだされたこれら丸形クラスターの量は、ＲＧＤを有する４ＲｅｐＣＴの発泡体において増加しており、これらの丸形クラスターは、図２８Ｃに示すように、インスリンポジティブであることが示されている。これらの結果には、通常の細胞培養プラスチックにおいて培養された単一細胞と比較して、４ＲｅｐＣＴが島のベータ細胞の機能を維持可能で、インスリンポジティブである丸形細胞クラスターの成長を高めることを示している。
【０１８９】
Ｃ）他の細胞と組合せたベータ細胞の培養
単一マウスベータ細胞、ヒト内皮細胞、及びヒト間葉系幹細胞を、導入されるモチーフ：なし(野生型；ＷＴ)、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲを有する、４ＲｅｐＣＴの発泡体状スキャフォールドに、 単独又は組合せて配し、培養した。間葉系幹細胞は、単独で培養された場合、スキャフォールド構造体に付着し、それに沿って成長した(図２９)。
【０１９０】
単一ベータ細胞、内皮細胞、及び間葉系幹細胞は、発泡体状のスキャフォールドにおいて成長し、４ＲｅｐＣＴ及びＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴにおいて、クラスター形成の増加を示した(図３０)。
【０１９１】
ランゲルハンス島又は島細胞と組合せた、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドの移植は、生着支持を示すことが予期される。
【０１９２】
結論
種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(種々の型式及びペプチドモチーフを有するもの)を用いた島の培養により、細胞レベルでの糖尿病の潜在的処置方法の開発に関する、基本的研究が可能になる。
【０１９３】
種々の変異体を有する４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでの、島及び島単一細胞、例えばベータ細胞の培養は、インビトロにおけるそれらの機能の維持及び増加に役立つ。
【０１９４】
レシピエント自身の内皮細胞及び間葉系幹細胞を使用し、レシピエントに移植するならば、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでのインスリン複合細胞集合体の培養は、インスリン生成装置としての可能性を有する。
【０１９５】
Prof Berggren研究所で近年開発された技術を使用し、マウスの目から前房に島と４ＲｅｐＣＴとを一緒に移植することで、島の生着及び生存性が改善されることが予期される。ランゲルハンス島又は島細胞と組合せて、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドを移植することで、生着支持性を示すことが予期される。
【０１９６】
この実施例に記載された研究では、４ＲｅｐＣＴスキャフォールド(ペプチドモチーフを有する又は有さない)に基づき、移植可能な人工的インスリン生成装置の開発にとっての事前必要事項を実施した。
【０１９７】
実施例６
組換えスパイダーシルクにおける内皮細胞
血管の成長は、再生医療における組織工学に必須である。内皮細胞は血管成長の原因であり、このプロセスにより、ある種の状況において、例えば創傷治癒が誘発される。体内では、器官及び組織に応じて、多くの異なる種類の内皮細胞が存在する。組織に密接に接触して存在する内皮細胞は、微小血管内皮細胞として知られてる。
【０１９８】
実験材料
商業的に入手可能な微小血管内皮細胞は、よく知られている方法で、供給者の使用説明書に従い、培養物から得られ、維持される。
【０１９９】
４ＲｅｐＣＴタンパク質の種々の変異体ポリマーを含有する細胞スキャフォールド材を、実施例１に記載されたように、種々の物理的形態に調製した。４ＲｅｐＣＴタンパク質を、任意の付加的な細胞結合モチーフを有さない未修飾の「野生型」形態、並びにペプチド細胞結合モチーフＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ又はＹＩＧＳＲで修飾された形態で使用した。
【０２００】
実験方法
細胞を、種々のスキャフォールド材に添加し、研究した。細胞において、増殖アッセイ及びＢＤ経路アッセイ(BD Biosciences)を含む、様々なアッセイを実施した。例えば、細胞機能アッセイ、アポトーシス及び壊死の生存／死亡アッセイ、及び組織学的アッセイを実施することも可能である。組織培養処理されたプラスチックプレートをコントロールとして使用した。
【０２０１】
結果
結果を図３１及び３２に提示する。種々の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドと共に、培養物において、内皮細胞は付着し、成長した。培養の３日後、それらの形態を分析し、細胞量を計測した。形態分析には、細胞結合モチーフを有する又は有さない、種々の物理的形態の４ＲｅｐＣＴスキャフォールド上の細胞は付着し、生存していることが示された(図３１及び３２)。
【０２０２】
結論
内皮細胞は生存可能であり、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドで成長可能で、そこで増殖能力を示した。
【０２０３】
実施例７
組換えスパイダーシルクにおける線維芽細胞
４ＲｅｐＣＴから調製されたスキャフォールドが、一次線維芽細胞に依存して足場の成長を支持し、細胞が生存しており、物質に付着し、それらの主要機能の一つを維持しており、すなわちＩ型コラーゲンを分泌することを示す実験を実施した。４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでは、組織培養処理されたプラスチックと比較して、細胞成長を支持する能力の増加が示された。インテグリン結合モチーフＲＧＤの導入により、この細胞の支持能力がさらに改善された。野生型４ＲｅｐＣＴとＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴにおける成長は、双方とも、血清タンパク質に無関係であることが示された。
【０２０４】
材料及び方法
細胞培養
新生児由来の一次ヒト皮膚線維芽細胞、ＨＤＦｎ(ＥＣＡＣＣ／ＨＰＡ)を、５％のウシ胎児血清(Gibco)、ペニシリン及びストレプトマイシン(National Veterinary Institute, SVA, Sweden)が補填された、ダルベッコの改変イーグル培地栄養混合物Ｆ１２ＨＡＭ(Sigma)において培養した(図３４-３６及び３８-４１)。平行実験において、(図３７及び４２)、一次ヒト線維芽細胞(ＳＦ-ＨＤＦ、PromoCell)を、２５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸(Sigma)、及び５ｍＭのＬ-グルタミン(ＳＶＡ)が補填された無血清細胞培養培地ＰＣ-１(Lonza, Belgium)において培養した。３０００細胞／ｃｍ２又は１５０００細胞／ｃｍ２の密度で、細胞を４ＲｅｐＣＴスキャフォールドに播種した。全ての実験を、３７℃、５％のＣＯ２、湿度９５％にて、継代８(継代４で実施された、図３６及び４１の例外を有する)において実施した。
【０２０５】
細胞培養スキャフォールド
精製後、付加的なＮ末端細胞結合モチーフＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲ、又はトリペプチドＲＧＥを有する又は有さない、組換え的に発現した４ＲｅｐＣＴ(Hedhammarら(2008), 上掲)を、遠心濾過(Amicon Ultra, Millipore)により濃縮し、実施例１の記載に従い、スキャフォールドを調製する前に滅菌濾過した(０．２２μｍ)。同様に、組換えＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓを調製した。２．８バール、蒸留水において、１２１℃で１５分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の９６-ウェル細胞培養プレート(Sarstedt)、又は細胞培養チャンバーガラススライド(LabTek)において調製した。ネガティブコントロール(ＨＰ)としてスキャフォールドを有さないウェル、ポジティブコントロール(ＴＣＴ)として組織培養処理されたプレートを使用した。
【０２０６】
プレート及びチャンバースライドを、全速力のファンを用いた滅菌条件下、室温で一晩乾燥させた。スキャフォールドを滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、細胞播種の前に、３７℃、５％のＣＯ２で１時間、完全細胞培養培地でプレインキュベートした。
【０２０７】
アラマーブルーを用いた細胞列挙
９６-ウェルプレートスキャフォールドにおいて成長した細胞を、アラマーブルー細胞生存率アッセイ(Molecular Probes)を用い、培養期間中、２日毎にモニターした。細胞培養培地で１：１０に希釈されたアラマーブルーと共にインキュベートして４時間後、励起５４４／発光５９５での蛍光強度を、蛍光プレートリーダー(FarCyte, TECAN)を用い、培養物からの上清１００μｌにおいて測定した。５０-６４０００細胞／ウェルの範囲内の標準曲線を確立し、これにより、細胞数(生存細胞)に対する蛍光強度の再計算が可能になった。各スキャフォールドタイプを６回分析した。
【０２０８】
細胞染色
チャンバースライドにおけるスキャフォールド上で培養された細胞を、培養期間中、３日毎に、生存／死亡細胞、フィラメントアクチン又はＩ型コラーゲンについて染色した。共焦点顕微鏡(Leica)、緑の蛍光：４８８ｎＭで励起／５００−５３０ｎＭで検出、赤の蛍光：５４３ｎＭで励起／６２０−６６０で検出)の条件下で染色を視察し、Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェア(ＬＣＳ)で写真を撮った。
【０２０９】
生存／死亡染色：生存／死亡生存率アッセイ(Molecular Probes)を使用し、スキャフォールド上で成長する生存及び死亡細胞を可視化した。培養物を予め暖めておいたリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄し、カルセリン-ＡＭ及びエチジウムホモダイマー-１(ＥｔｈＤ-１)を用い、室温で３０分染色した。
【０２１０】
フィラメントアクチン：スキャフォールドを２回洗浄し、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳに０．１％のトリトンＸ-１００が入ったもので透過処理し、ＰＢＳに１％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、AppliChem)が入ったものでブロックし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８-ファロインジン (Invitrogen)、ＰＢＳに１％のＢＳＡが１：４０で入ったもので染色した。核染色用にＥｔｈＤ-１を使用した。スライドを蛍光搭載培地(Dako, Copenhagen)に搭載した。
【０２１１】
ビンクリン：ス カフォールドを２回洗浄し、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳに０．１％のトリトンＸ-１００が入ったもので透過処理し、ＰＢＳに１％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、AppliChem)が入ったものでブロックし、その後、１％のＢＳＡに９．５μｇ／ｍｌでマウス抗ヒトビンクリン(Sigma V9131)が入ったもの、続いてＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８-ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)で、交差吸着したもの(Invitrogen)及びＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ５９４-ファロインジン (Invitrogen)、ＰＢＳに１％のＢＳＡが１：４０で入ったもので染色した。核染色用にＤＡＰＩを使用した。スライドを蛍光搭載培地(Dako, Copenhagen)に搭載した。
【０２１２】
Ｉ型コラーゲン：スキャフォールドを２回洗浄し、細胞を−２０℃でアセトンを用いて固定し、ＰＢＳに１％のＢＳＡが入ったものでブロックし、その後、１％のＢＳＡに３．５μｇ／ｍｌでマウス抗Ｉ型コラーゲン(クローンＣＯＬ-１、Sigma-Aldrich)が入ったもの、続いてＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８-ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)で、交差吸着したもの(Invitrogen)で染色した。核染色用にＥｔｈＤ-１を使用した。スライドを蛍光搭載培地に搭載した。アイソタイプのコントロールとして、マウスＩｇＧ１(クローンＢ-Ｚ１、BioSite)を使用した。
【０２１３】
分泌されたＩ型コラーゲンの定量的測定
上清を、２日毎に培養物から収集し、１：１０に希釈し、製造者の使用説明書に従い、Ｉ型プロコラーゲンＣ-ペプチドＥＩＡキット(TAKARA)を使用し、細胞培養培地への分泌中、Ｉ型プロコラーゲン分子から切断されたＣ-ペプチドについて分析した。Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダー(TECAN)を用いてＯＤ４５０を測定し、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウエアを用いたデータ管理を使用して、オリジナルサンプルにおけるＣ-ペプチドの濃縮を達成した。ｐｇＣ-ペプチド分泌／細胞に対して、データを再計算した。
【０２１４】
結果
４ＲｅｐＣＴから調製された細胞培養スキャフォールド
フィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュスキャフォールドを、４ＲｅｐＣＴタンパク質溶液から、成功裏に調製した(図３３)。
【０２１５】
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおける線維芽細胞の成長
培養の初位相後に、スキャフォールドウェルに存在する生存細胞の数が多いことによって示されるように、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドは、ＴＣＴと比較して、一次線維芽細胞の成長及び増殖を支持する能力が増加していることが提示された(すなわち、７日目からは低播種密度、５日目からは高播種密度、図３４)。しかしながら、初位相において、細胞は、ＴＣＴと比較して、スキャフォールド上で、幾分ゆっくりと成長しているように見えた。発泡体状スキャフォールドにおける生存細胞の数は、フィルム及び繊維-ベースのスキャフォールドよりも一貫して少ない。しかしながら、発泡体状スキャフォールドの利用しやすいスキャフォールド領域は推定が困難であり、他のスキャフォールド型式に対する直接比較は不可能である。繊維又は繊維-メッシュスキャフォールド下で４ＲｅｐＣＴを添加することにより、支持能力はさらに増加した(図３５)。
【０２１６】
また、我々は、線維芽細胞が、スキャフォールドにおいて高度な生存／死亡率を示すことを提示しており、ここでフィルムスキャフォールドはほとんど同一の成長パターン、細胞密度、及び細胞培養処理されたガラススライドに対する生存／死亡比率を示した(図３６、右側パネル)。発泡体及び繊維ベースのスキャフォールドは、このアッセイで赤に染色されたため、生存細胞の形状は物質の形態に追随することを見せることができた。
【０２１７】
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおけるヒト線維芽細胞の無血清培養
また、我々は、ＳＦ-ＨＤＦ(無血清条件下で増殖した一次ヒト線維芽細胞)が、培養物に血清が存在しなくても、４ＲｅｐＣＴのフィルム状スキャフォールド上で成長可能であることを示した(図３７)。これにより、材料と細胞の相互作用が、表面に非特異的に結合しする血清タンパク質に依存しないが、スキャフォールドそれ自体が、そこでの成長のために、細胞に適した表面を提供することを証明した。
【０２１８】
スキャフォールドに対する細胞の付着性
周囲のマトリックスへ細胞が付着している間、フィラメントアクチンは、結合により媒介される、膜結合レセプターに結合している。細胞内フィラメントアクチンを染色することにより、細胞と基底物質との間の結合タンパク質を、間接的に可視化することができる。この方法を用いて、我々は、ＨＤＦｎが、実際に繊維(図３８、左側パネル)、繊維-メッシュ、フィルム(図３８、右側パネル)及び発泡体のスキャフォールドに、初期及び後期培養(１、４、７、１０日)の双方で結合することを示すことができた。さらに、フィラメントアクチンと組合せてビンクリンを染色することで、無血清条件下、野生型(ＷＴ)フィルム、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ及びＮＲＣ(ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ)においてＳＦ-ＨＤＦを３時間培養した後に、限局的付着を検出することができた(図４３)。これらの結果には種々の基質に対するインテグリン-媒介性付着が示されている。
【０２１９】
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおいて成長する細胞によるＩ型コラーゲンの分泌
全て異なる型式の４ＲｅｐＣＴ、すなわちフィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュのスキャフォールドにおいて増殖させる場合、細胞はＩ型コラーゲンを生成した。よって、細胞は、４ＲｅｐＣＴスキャフォールド材におけるインビトロでの培養中、それらの重要な機能の一つを維持している。分泌されたコラーゲンのレベル(分泌中に切断されたＣ-ペプチドにより測定)は、培養の最初の５日間で、培養培地中で増加していた(図３９、左側上部パネル)。しかしながら、細胞当たりに生成されたコラーゲンの量は、播種の２４-７２時間後に最大に達し、ＴＣＴと比較して、任意の４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおいて成長する細胞に対し、この時点では高くなっていた(図３９、右側上部パネル)。コラーゲンの細胞内生成は、播種の１、４、７及び１０日後、全てのスキャフォールド型で同じような程度であることが示された(図３９に示す実施例、下部パネル)。
【０２２０】
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおける培養後の維持された線維芽細胞表現型
４ＲｅｐＣＴスキャフォールドでの培養後、線維芽細胞がそれらの表現型を維持していることを検証するために、培養の１４日後に、スキャフォールドから細胞を収集し、Ｉ型コラーゲンの分泌を評価するためのＴＣＴ、又はＩ型コラーゲンの細胞内染色のためのガラスのいずれかに再播種した。このことを実施することで、線維芽細胞がＩ型コラーゲンを生成し(図４０、下部パネル)、分泌しており(図４０、上部パネル)、よって、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおける比較的長時間の培養後でさえ、それらの最も重要な機能の一つを失っていないことが示された。
【０２２１】
機能化された４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにおいて成長する線維芽細胞
アラマーブルー生存率実験からの予備データには、４ＲｅｐＣＴへのＲＧＤの導入により、それぞれ３及び１日目から、フィルム及び繊維-メッシュのスキャフォールドにおいて成長する、生存細胞の全数が増加していることが示されている。経時的に、すなわち７日目から、細胞数はＴＣＴウェルに存在する細胞計測も超える。平行セットアップにおいては、無血清細胞培養システムを使用すると、血清の不在下でさえ、一次線維芽細胞の成長向上が、ＲＧＤを有さない４ＲｅｐＣＴＴと比較して、ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴフィルムで達成されることが示された。よって、ＲＧＤの導入により、足場依存性細胞の成長を支持する、スキャフォールドの能力を、極めて改善することができ、その効果は、細胞培養培地に存在する血清成分に依存しない。また、結果には、ＲＧＤモチーフがスキャフォールド表面に、適切に暴露されることが示されている。
【０２２２】
実施例８
組換えスパイダーシルクにおける角化細胞
４ＲｅｐＣＴから調製されたフィルム状スキャフォールドが、一次角化細胞の成長を支持し、細胞が物質に付着し、それらの特徴的形態を維持していることを示すために、実験を実施した。野生型４ＲｅｐＣＴ及び機能化された４ＲｅｐＣＴの双方においる成長が、血清タンパク質に依存しないことが示された。
【０２２３】
材料と方法
ヒトの皮膚から単離された角化細胞を、角化細胞の成長用に設計された無血清セットアップである、栄養補助剤を含有する角化細胞ＳＦＭ(Gibco)において培養した。伝統的には、細胞の収集後に、１０％のウシ胎児を不活性トリプシンに添加し、再播種時での結合を確実にした。現在のセットアップにおいて、この血清付加を伴う又は伴わない平行実験を実施した。先の実施例に記載されたように、４ＲｅｐＣＴの野生型又は機能化されたフィルム状スキャフォールドにおいて、角化細胞を継代４(１００００細胞／ｃｍ２)で播種した。テストされる機能化には、一般的な細胞結合モチーフＲＧＤ及びＩＫＶＡＶが含まれるが、一般的な細胞結合モチーフＹＩＧＳＲ、及び／又は角化細胞-特異的モチーフＥＰＤＩＭ及びＮＫＤＩＬを含めることもできる。角化細胞-特異的マーカーをさらに使用し、培養の終わりに表現型を確実に維持させ、分化状態、例えばケラチン(Ｋ１、Ｋ５、Ｋ１０、Ｋ６／Ｋ１６／Ｋ１７)、フィラグリン、Ｔｏｂ、Ｇ６Ｋ１２、ｇｐ８０及びＭＲＰ-８を測定した。
【０２２４】
フィラメントアクチンと組合せてビンクリン(クローンＶ９１３１、Sigma-Aldrich)の検出のための免疫蛍光染色を使用し、限局的付着性、すなわち、上述した実施例７に記載されたような、細胞と物質との間の実際の接触点を同定した。アポトーシスにおける影響を、EnzChekカスパーセ３アッセイ(Molecular Probes)を用いて評価する。上述した実施例７に記載されたようにして、生存細胞をアラマーブルー(Molecular Probes)を用いて検出した。
【０２２５】
結果
一次ヒト角化細胞を、細胞結合モチーフを有する又は有さない、４ＲｅｐＣＴフィルムにおいて、４日間培養した。細胞は生存しており、１〜４日間、細胞の数は増加した(図４４)。それらは、全培養期間中、全ての物質において、角化細胞の特徴的形態を示した(図４５)。野生型、ＲＧＤ及びＩＫＶＡＶフィルムにおいて、限局的付着が検出され(４日目に分析)、テストされた物質に対する、インテグリン-媒介性付着が示された(図４６)。結果は、播種前の血清付加とは無関係であり、よって、細胞は、厳密には無血清状態下で物質に結合した。
【０２２６】
実施例９
組換えスパイダーシルクにおける一次肝細胞
肝臓は固有の機能を有する必須器官である。現在、急性肝不全、例えば肝臓ベースの代謝疾患、及び慢性肝疾患のケースは、肝移植又は肝細胞治療により救済されている。残念なことに、現在の有用な肝細胞治療は、例えば多くの細胞が失われ、肝細胞移植中に生着しないため、最適ではない。肝細胞の宿主として提供され、それらを適所に維持するスキャフォールドにより、移植前に、これらの細胞を全生着させることができる。これにより、肝移植の新規な方法が開けた。
【０２２７】
実験材料
齧歯動物の肝細胞を、連続した機械的振揺により、コラゲナーゼ処理された肝臓を消化して単離し、分離し、１０％のＦＢＳが補填されたＲＰＭＩ-１６４０培地で培養した。
【０２２８】
先の実施例に記載された、組換えスパイダーシルクタンパク質４ＲｅｐＣＴを、野生型、及び種々の細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフ(例えば、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ及びＲＧＥ)の導入により修飾された変異体の形態で使用し、実施例１に記載されたようにして調製された、スキャフォールド構造体の形態で、本質的に、Hedhammarら(2008), 上掲に記載されたように調製した。
【０２２９】
細胞培養：４ＲｅｐＣＴスキャフォールドと組合せた齧歯動物肝細胞を、補填されたＲＰＭＩ-１６４０培地において培養した。
【０２３０】
肝細胞の生存性の評価：細胞を、細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフ(例えば、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ及びＲＧＥ)が導入された、繊維状及びフィルム状スキャフォールドに配した。細胞の形態及び生存性を、培養において、経時的に評価した。
【０２３１】
結果
肝細胞は繊維状及びフィルム状スキャフォールドに付着した(図４７)。
また、肝細胞は、４ＲｅｐＣＴを用いた培養において生存可能であった。
【０２３２】
実施例１０
組織工学用の組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールド
実験では、４ＲｅｐＣＴにより、インビボの脊髄損傷のアノックスを再生可能であることが予期される。播種された細胞を有さない４ＲｅｐＣＴスキャフォールド、及びヒト神経細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた４ＲｅｐＣＴスキャフォールドの双方を使用した。組織学的及び行動学的分析を使用し、結果を記載した。
【０２３３】
材料及び方法
動物手術
ラットの体重は、手術時、１７０-２００ｇであった。手術の３０分前に、動物にアトロピン(０．０５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、NM Pharma AB)を注射した。Ｈｙｐｎｏｒｍ(クエン酸フェンタニル、０．２２ｍｇ／ｋｇ、及びフルアニゾン、６．８ｍｇ／ｋｇ、Janssen Pharmaceutical)とドルミカム(ミダゾラム、３．４ｍｇ／ｋｇ、Hoffman-La Roche)の混合物を用いて、ラットに麻酔をかけた。ラットの体温をモニターし、手術手順を通して３８℃に維持した。
【０２３４】
腰髄を部分的椎弓切除により外科的に暴露させ、脊髄損傷の前に、暴露した脊髄表面を数滴のキシロカイン(塩酸リドカイン、２０ｍｇ／ｍｌ、AstraZeneca Sweden AB)で処理した。
【０２３５】
コードの離断を、メスを用いて脊髄を切断することにより実施した。丁寧な視診により、外科医は、吻側及び尾側末端が完全に分離され、わずかに退縮したことを断言した。コードを病変させた後、リオプラント(Lyoplant)層(B/Braun Aesculap AG)を、傷を縫合する前に、硬膜置換として脊髄に配した。手術の前後に、３ｍｌのリンガー／グルコース(２．５％)を、皮下的に２回注射した。手術後、４日間、１日２回、ラットにＴｅｍｇｅｓｉｃ(ブプレノルシン、７μｇ／ｋｇ、Reckitt & Colman)を筋肉内注射した。膀胱を１日に２回、手動で空にし、尿路感染症の兆候が現れたら、Ｂｏｒｇａｌ(トリメトプリムスルファ、１５ｍｇ／ｋｇ皮下、 Intervet International B.V.)を付与した。
【０２３６】
例えば、先の実施例に記載されたようにして調製された４ＲｅｐＣＴ繊維の２-３ｍｍの長束(付加的なペプチドモチーフ、例えばＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲを有する又は有さない、もしくはＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ等、スピドロインの他の変異体を使用)を、損傷時又は損傷の１週間後に脊髄の間隙に配した。急性移植パラダイムにおいて、４ＲｅｐＣＴ繊維の束を、切断した脊髄の間隙に適合するように切断し、脊髄と同様の軸において、４ＲｅｐＣＴ繊維と共に、移植片に、脊髄の断端吻側及び尾側と接触するようにゆっくりと配した。その後、リオプラント硬膜置換を、４ＲｅｐＣＴ上に配した。
【０２３７】
４ＲｅｐＣＴ繊維のケースにおいて、束を損傷の１週間後に移植し、動物に麻酔をかけ、再び傷を開き、脊髄を暴露させた。コードの吻側及び尾側断端をトリミングした後、繊維の束を、間隙に適合するように切断し、脊髄と同じ軸に配し、繊維と移植片の吻側及び尾側の脊髄組織との間の接触を確認した。上述したようにして傷を閉じた。
【０２３８】
ヒトの未熟細胞の同時移植
同様の実験において、上述したような４ＲｅｐＣＴ繊維の移植を、ヒト神経幹細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた。地方倫理委員会に承認されている手順に従い、中絶を依頼した女性に同意書を記入してもらった後、ヒトの所定の中絶から細胞を得た。
【０２３９】
所有権のある手順に従い、適切な細胞をインビトロ培養した後、成長因子を含有しない、最小量のＤＭＥＭ-Ｆ１２に、１０００００-５０００００細胞を懸濁させたものを、４ＲｅｐＣＴ繊維の束に注射し、ついで、先の項に記載されたようにして使用した。
【０２４０】
行動評価
後肢の運動機能を研究するため、ラットをオープンフィールド(１５０×６４ｃｍ)で運動させ、少なくとも４分間観察した。後肢の機能、関節の動き、足の位置、荷重負荷、協調運動性、及びトウクリアランスを評価し、Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) Locomotor Rating Scale (Bassoら(1995), J Neurotrauma 12:1-21, Basso (2004), J Neurotrauma 21:395-404を参照)に従い、評価した。テストをビデオ記録し、処置に対する予備知識のない、少なくとも２人の独立した観察者は、各ラットを評価した。手術前、及び手術の１、２、６、１２及び１８週後に、動物を評価した。
【０２４１】
神経細胞成長の追跡
順行的追跡を、製造者の記載に従い、１週間、頭頂葉皮質の複数の部位に、ビオチニル化デキストランアミン(ＢＤＡ、Neurotrace)を注射することにより実施した。逆行性追跡を、病変の脊髄の３−５ｍｍ尾側に、フルオロゴールドを注射することにより実施した。ＢＤＡを損傷の脊髄尾側で可視化させることで、脊髄病変を通過するコルチコ-脊髄下行アクソンが可視化され、フルオロゴールド標識されたニューロンを、下行赤核脊髄ニューロンの再成長の証拠として、脳幹の赤核についてスクリーニングした。
【０２４２】
形態分析
病変の１８週後、最後の行動評価をした後、ラットに致死量の静脈鎮静剤を付与し、１００ｍｌの無Ｃａ２＋タイロード液、続いて４００ｍｌのリン酸で緩衝された４％パラホルムアルデヒド(PFA, Merck)を、上行大動脈を通してかん流させた。全脳幹と病変を含む４−５ｃｍの脊柱を解剖し、同じ固定液において２時間、後固定させ、４℃で少なくとも２４時間、１０％のスクロース中に凍結保存した。ついで、脊髄を脊柱から丁寧に切断し、コード及び脳幹をＴｉｓｓｕｅ-Ｔｅｋに包埋し、凍結し、クリオスタットにおいて１０μｍに薄片化し、ゼラチンコーティングされたスライドに搭載した。
【０２４３】
免疫組織化学分析について、次の一次抗体：ヒト-特異的ウサギ抗-熱ショックタンパク質２７、ウサギ抗-ネスチン、ウサギ抗-β-ＩＩ型チューブリン、マウスモノクローナルヒト-特異的抗-グリア線維酸性タンパク質、ウサギ抗微小管結合タンパク質２を使用した。一次抗体を、０．３％のトリトンＸ-１００(ＴＰＢＳ)を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液で希釈した。使用する二次抗体をＣｙ３(Jackson ImmunoResearch Laboratories Lab. Inc)又はＡｌｅｘａ４８８(Molecular Probes)にコンジュゲートさせた。室温で３０分、１．５％の通常のヤギ血清(Sigma)を用いて、切片を処理し、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートし、すすぎ、室温で、二次抗体と共に２時間インキュベートした。全ての切片を核マーカーHoechst 33342 (３０μｇ／ｍｌ、Molecular Probes)を用いて対比染色し、ＤＡＢＣＯ(１,４-ジアザビシクロ[２.２.２]オクタン、０．０３ｍｇ／ｍｌ、Sigma)にポリビニルアルコール(０．１ｍｇ／ｍｌ、Sigma)が入ったものと共に搭載した。免疫標識された組織切片を、定量分析のために蛍光顕微鏡(Zeiss Axiophot)で研究し、マッキントッシュ用のＯｐｅｎｌａｂソフトウェア(Improvision)及びＣＣＤカメラ(Hamamatsu ORCA-ER)を使用して、画像を保存した。
【０２４４】
実施例１１
器官型培養におけるアクソンの再生を支持する組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールド
この実験では、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドが、アクソンの再生を支持し、先導可能であることが示されるであろう。脊髄と脳幹の小片を、エクスビボ培養物に維持した。２つのこのような組織片に結合する４ＲｅｐＣＴのスキャフォールドを適用することにより、再生アクソンにより、間隙に架橋する十分な支持体が提供されるであろう。実験には、インビボでの脊髄損傷において、ダメージを受けた組織のアクソン成長及び修復を支持する、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドの有用性が示されるであろう。
【０２４５】
脳幹及びコードの頸部の器官型培養物を調製した。脳と脊髄を、初期の出生前及び出生後のスプラーグドーリー(ＳＤ)ラットから収集した。脳幹、及び脊髄の頸部を通過した矢状面における切片を、ビブラトームを使用して作製した。切断された組織を、３７℃、５％のＣＯ２、加湿雰囲気にある、６-ウェル組織培養プレートにおいて、１ｍｌの血清ベース培地(アール液(ＢＭＥ；Sigma, St. Louis, MD, USA)、２５％の熱失活ウマ血清(Gibco, Grand Island, NY, USA)、及び２５％のアール平衡塩溶液(ＥＢＳＳ；Sigma)、１ｍＭのＬ-グルタミン及び０．５％のｄ-グルコースを含有する、５０％の基底イーグル培地)中の膜(Millicell-CM; Millipore, Billerica, MA, USA)上に配した。組織切片を７-１４日間インキュベートし、培地を３日毎に取り替えた。損傷時、上頸髄の切片を剃刀刃で作製した。組織を反転顕微鏡で視察し、外殖片の２つの部分を完全に分離させた。
【０２４６】
先の実施例に記載されたようにして調製された４ＲｅｐＣＴ繊維の束(付加的なペプチドモチーフ、例えばＲＧＤ、ＲＧＥ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲを有する又は有さない、もしくはＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ等、スピドロインの他の変異体を使用)を、組織片の間の間隙に配した。培養物をさらに１４日間インキュベートし、リン酸で緩衝された４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ、Merck)に２時間浸漬して固定化し、４℃で２４時間、１０％のスクロース中に凍結保存した。
【０２４７】
免疫組織化学分析について、次の一次抗体：ヒト-特異的ウサギ抗-熱ショックタンパク質２７、ウサギ抗-ネスチン、ウサギ抗-β-ＩＩ型チューブリン、マウスモノクローナルヒト-特異的抗-グリア線維酸性タンパク質、ウサギ抗微小管結合タンパク質２を使用した。一次抗体を、０．３％のトリトンＸ-１００(ＴＰＢＳ)を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液で希釈した。使用する二次抗体をＣｙ３(Jackson ImmunoResearch Laboratories Lab. Inc)又はＡｌｅｘａ４８８(Molecular Probes)にコンジュゲートさせた。固定化された培地を、１．５％の通常のヤギ血清(Sigma)を用いて、室温で３０分処理し、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートし、すすぎ、室温で、二次抗体と共に２時間インキュベートした。全ての組織を核マーカーHoechst 33342 (３０μｇ／ｍｌ、Molecular Probes)を用いて対比染色し、ＤＡＢＣＯ(１,４-ジアザビシクロ[２.２.２]オクタン、０．０３ｍｇ／ｍｌ、Sigma)にポリビニルアルコール(０．１ｍｇ／ｍｌ、Sigma)が入ったものと共に搭載した。免疫標識された組織切片を、定量分析のために蛍光顕微鏡(Zeiss Axiophot)で研究し、マッキントッシュ用のOpenlabソフトウェア(Improvision)及びＣＣＤカメラ(Hamamatsu ORCA-ER)を使用して、画像を保存した。
【０２４８】
結果では、４ＲｅｐＣＴスキャフォールドにより、損傷を受けたアクソンの再生を先導可能であることが予期される。
【０２４９】
実施例１２
組換えスパイダーシルクに対するヒト胚性幹細胞
本実験は、上述の実施例２として報告された研究で組み立てられた、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性をさらに探究する。
【０２５０】
材料及び方法
標準的な６ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、３つのウェルは、次の４ＲｅｐＣＴ変異体：ＲＧＤ-４ＲｅｐＣＴ、ＲＧＥ-４ＲｅｐＣＴ、ＩＫＶＡＶ-４ＲｅｐＣＴ、ＹＩＧＳＲ-４ＲｅｐＣＴ及びＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓの一つを含んでおり、各プレートの残りの３つのウェルは空であった。ＮＴ４ＲｅｐＣＴＨｉｓ、及びペプチドモチーフを有する４ＲｅｐＣＴの全てのフィルムを、本質的に実施例１に記載したようにして調製した。全体で１５のプレートを実験に含めた(各４ＲｅｐＣＴ変異体では３回を表す)。プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。
【０２５１】
実験の準備において、組織培養プレートを、クラスＩＩの微生物学的安全キャビネットにおいて、３０分間、ＵＶ照射をした。ついで、各プレートにおける３つの空のウェルを、製造者のプロトコルに従って、CELLstartＴＭCTSＴＭ(Invitrogen; カタログ番号A10142-01)で被覆した。
【０２５２】
ヒト胚性幹細胞(ＲＣＭ-１、De Sousaら, Stem Cell Res 2:188-197; Roslin Cells, Edinburgh, UK)を、製造者のプロトコルに従って、血清及びフィーダーフリーの培地STEMPRO(登録商標)hESC SFM−ヒト胚性幹細胞培養培地(Invitrogen; カタログ番号A1000701)を用い、ＣＥＬＬｓｔａｒｔＴＭで培養した。細胞を、製造者のプロトコルに従って、ＳＴＥＭＰＲＯ(登録商標)ＥＺＰａｓｓａｇｅＴＭ−使い捨て幹細胞継代ツール(Invitrogen; カタログ番号23181-010)を使用し、９０％コンフルエントなウェルから１：６の比率で継代した。
【０２５３】
ウェルをＰＢＳで洗浄し、培地を全てのウェルに配し、細胞を播種する前に、プレインキュベートした。継代６０での細胞を、推奨する密度で５つの６ウェルプレートの全てのウェル(５つの異なる変異体を表す)に播種し、播種後の細胞妨害がないようにケアした。全てのウェルを、製造者のプロトコルに従って、STEMPRO(登録商標)hESC SFMを用いて培養した。３７℃、空気中に５％のＣＯ２、湿度９５％において、標準的な培養インキュベーターでインキュベートを行った。細胞を毎日観察し、４８時間毎に１００％の培地を交換した。全ての培地は、摂食交換の２時間前に、インキュベーター条件に対して前平衡化した。
【０２５４】
細胞を１６日後、さらに６日後に、それぞれの変異体の残った２つの６-ウェルプレートに継代した。これら２時点についての継代計画は、ヒト胚性幹細胞の単一細胞解離についてのRoslin Cellabsにより確立された方法を含む。単位細胞解離は、製造者の使用説明書に従って(Watanabeら (2007),Nat Biotechnol 25, 681-686)、ＲＯＣＫインヒビター(ＲＯＣＫインヒビター／Ｙ２７６３２；FluoroChem カタログ番号047265)を使用して１時間前処理したTrypLE Select (Invitrogen カタログ番号 A12177 (１００ｍｌ １０×))を、製造者の使用説明書に従って使用して達成される。これにより、酵素的継代後の胚性幹細胞の成功裏の増殖に必須であることが示された。コントロール及び試行細胞を同じく処理し、全てを等価に播種した。
【０２５５】
本研究の第３継代の２４時間後、製造者のプロトコルに従って、ウェルをＳｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ：アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、白血球(Sigma-Aldrich; Ref 86R-1KT, Lot 019K4349)で染色した。
【０２５６】
結果
細胞培養実験から選択された画像を図４８−５２に提示する。
【０２５７】
種々の４ＲｅｐＣＴ間には、何の差異も観察されなかった。最初、細胞は、小さい程度の接着性を持つ非接着性の「凝集塊（クランプ）」であった。増殖はコントロールウェルで見られるものよりもかなり遅かったが、これは、実施例２で見られるように、４ＲｅｐＣＴ変異体に細胞株が適応した結果であろう。しばしば、新規のマトリックス、又は実際には新規の培地組成物において再度樹立される前に、胚性幹細胞株が、移行又は遅延の相を通過する場合である。これらの胚様体(ＥＢ)構造は、最終的にはマトリックスに付着し、ＥＢ塊を形成し、細胞は増殖し、拡大することが見られ、実験の第１、第２及び第３継代の写真に示されるように、新規のマトリックスへの適合が示唆される。
後続する継代も、改善された形態及び増殖を生じた。
【０２５８】
アルカリホスファターゼ染色により示されるように、驚くべきことに、細胞は、それぞれの４ＲｅｐＣＴ変異体での培養２３日後も、未だに未分化幹細胞の特徴を示している。
【０２５９】
結論
全てのコントロールウェルは、使用されたコントロール培養条件下でこのｈＥＳＣ系で予期されるであろう特徴及び形態を示した。細胞株は、全ての４ＲｅｐＣＴ変異体に対し、適合の兆候を示した。４ＲｅｐＣＴ変異体における第１継代では、最初の接着性、増殖性及び培養形態は乏しかった。しかしながら、後続する増殖及び継代では、全ての変異体のためのポジティブアルカリホスファターゼ染色を用い、コロニーが未分化細胞の形態的特徴を示す結果となった。
【０２６０】
４ＲｅｐＣＴ変異体でのｈＥＳＣ培養のこの研究には、驚くべきことに、変異体がｈＥＳＣの培養を可能にし、それらが、例えば、形態、増殖特性、及びアルカリホスファターゼ染色に関し、細胞の幹細胞性の維持に適していることが示された。
【図１】
2013523174.tif 000014
【図２】
2013523174.tif 000015
【図１９】
2013523174.tif 000016
【図２０】
2013523174.tif 000017
【図２１】
2013523174.tif 000018
【図２２Ａ−Ｄ】
2013523174.tif 000019
【図２２Ｅ−Ｆ】
2013523174.tif 000020
【図２３】
2013523174.tif 000021
【図２６】
2013523174.tif 000022
【図３２】
2013523174.tif 000023
【図３４】
2013523174.tif 000024
【図３５】
2013523174.tif 000025
【図３７】
2013523174.tif 000026
【図３９Ａ】
2013523174.tif 000027
【図３９Ｂ】
2013523174.tif 000028
【図４１Ａ】
2013523174.tif 000029
【図４１Ｂ−Ｃ】
2013523174.tif 000030
【図４２】
2013523174.tif 000031
【図４４】
2013523174.tif 000032
【図３】
2013523174.tif 000033
【図４】
2013523174.tif 000034
【図５】
2013523174.tif 000035
【図６】
2013523174.tif 000036
【図７Ａ】
2013523174.tif 000037
【図７Ｂ】
2013523174.tif 000038
【図８】
2013523174.tif 000039
【図９】
2013523174.tif 000040
【図１０】
2013523174.tif 000041
【図１１】
2013523174.tif 000042
【図１２】
2013523174.tif 000043
【図１３】
2013523174.tif 000044
【図１４】
2013523174.tif 000045
【図１５】
2013523174.tif 000046
【図１６】
2013523174.tif 000047
【図１７】
2013523174.tif 000048
【図１８】
2013523174.tif 000049
【図２４】
2013523174.tif 000050
【図２５】
2013523174.tif 000051
【図２７】
2013523174.tif 000052
【図２８Ａ】
2013523174.tif 000053
【図２８Ｂ】
2013523174.tif 000054
【図２８Ｃ】
2013523174.tif 000055
【図２９】
2013523174.tif 000056
【図３０】
2013523174.tif 000057
【図３１】
2013523174.tif 000058
【図３３】
2013523174.tif 000059
【図３６】
2013523174.tif 000060
【図３８】
2013523174.tif 000061
【図３９Ｃ−Ｄ】
2013523174.tif 000062
【図４０】
2013523174.tif 000063
【図４３】
2013523174.tif 000064
【図４５】
2013523174.tif 000065
【図４６】
2013523174.tif 000066
【図４７】
2013523174.tif 000067
【図４８】
2013523174.tif 000068
【図４９】
2013523174.tif 000069
【図５０】
2013523174.tif 000070
【図５１】
2013523174.tif 000071
【図５２】
2013523174.tif 000072
【配列表】
2013523174000001.app
【国際調査報告】
2013523174.tif 000073
2013523174.tif 000074
2013523174.tif 000075
2013523174.tif 000076