(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１抗原を含んでなる免疫原性組成物ならびにＨＩＶ−１の予防および／または治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、異種ＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１感染症に関連する疾患の予防および／または治療における１種のクレードのＨＩＶ−１抗原の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、
ａ．Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇから選択される１種以上の抗原を含んでなる１種以上のポリペプチドであって、
該１種以上の抗原は１種以上のクレードの１種以上のＨＩＶ−１株から選択されるものと、
ｂ．Ｔｈ１免疫応答の優先的誘導物質であるアジュバント
とを含んでなる、
該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｎｅｆを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
Ｎｅｆが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｎｅｆが、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項２または請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
Ｐｏｌを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項１〜４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＰｏｌがＲＴ断片である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
Ｐｏｌが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である、請求項５または請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
Ｐｏｌが、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
Ｇａｇを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
Ｇａｇが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
Ｇａｇが、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項９または請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ｇａｇがｐ１７である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ｐ１７が、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ｐ１７が、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項１２または請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
Ｇａｇがｐ２４である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ｐ２４が、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ｐ２４が、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項１５または請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
Ｇａｇが、ｐ１７およびｐ２４の両方を、独立したタンパク質抗原成分としてまたは互いに融合された状態で含んでなる、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ｐ１７およびｐ２４が互いに融合され、異種アミノ酸配列によって隔てられる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
部分（ａ）の、２種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
アジュバントが、免疫学的活性サポニン画分および／またはリポ多糖類および／または免疫刺激性オリゴヌクレオチド：から選択される１種以上の成分を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
アジュバントが免疫学的活性サポニン画分およびリポ多糖類を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記免疫学的活性サポニン画分がＱＳ２１である、請求項２０または請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記リポ多糖類がリピドＡ誘導体である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記リピドＡ誘導体が３Ｄ−ＭＰＬである、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
アジュバントがステロールを含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記ステロールがコレステロールである、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
アジュバントがリポソーム担体を含んでなる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
アジュバントがサポニンおよびステロールを含んでなり、サポニン：ステロールの割合が１：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
サポニン：ステロールの割合が１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）である、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
サポニン：ステロールの割合が１：１〜１：５（ｗ／ｗ）である、請求項２８または請求項２９に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
アジュバントがサポニンおよびリポ多糖類を含んでなり、サポニン：リポ多糖類の割合が１：１である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
アジュバントがリポ多糖類を含んでなり、該リポ多糖類が投与量当たり１〜６０μｇの量で存在する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記リポ多糖類が投与量当たり５０μｇの量で存在する、請求項３３に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
前記リポ多糖類が投与量当たり２５μｇの量で存在する、請求項３３に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
アジュバントがサポニンを含んでなり、該サポニンが投与量当たり１〜６０μｇの量で存在する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記サポニンが投与量当たり５０μｇの量で存在する、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記サポニンが投与量当たり２５μｇの量で存在する、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．０２５〜２．５ｍｇ、０．０５〜１．５ｍｇ、０．０７５〜０．７５ｍｇ、０．１〜０．３ｍｇまたは０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３ｍｇ、０．１〜０．１５ｍｇ、０．２５ｍｇまたは０．１２５ｍｇ）のステロール（例えば、コレステロール）を含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
アジュバントが水中油型エマルションを含んでなる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
水中油型エマルションがスクアレンおよび／またはアルファトコフェロールを含んでなる、請求項４２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
水中油型エマルションが代謝性水中油型エマルションである、請求項４１または請求項４２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
水中油型エマルションがＴｗｅｅｎ８０などの乳化剤を含んでなる、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
アジュバントがサポニンおよびリポ多糖類を含んでなる、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
アジュバントが、サポニンおよびリポ多糖類を、１：１０〜１０：１（ｗ／ｗ）という範囲のサポニン：リポ多糖類の割合で含んでなる、請求項４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
アジュバントがサポニンおよびステロールを含んでなる、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
アジュバントが、サポニンおよびステロールを、１：１〜１：２０（ｗ／ｗ）の範囲のサポニン：ステロールの割合で含んでなる、請求項４８に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
アジュバントがサポニンおよび代謝性オイルを含んでなる、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
アジュバントが、サポニンおよび代謝性オイルを、１：１〜２５０：１（ｗ／ｗ）の範囲の代謝性オイル：サポニンの割合で含んでなる、請求項５０に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
アジュバントがアルファトコフェロールを含んでなる、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．５〜１５ｍｇ、１〜１３ｍｇ、２〜１１ｍｇ、４〜８ｍｇまたは５〜６ｍｇ（例えば、２〜３ｍｇ、５〜６ｍｇまたは１０〜１１ｍｇ）の代謝性オイル（スクアレンなど）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．１〜１０ｍｇ、０．３〜８ｍｇ、０．６〜６ｍｇ、０．９〜５ｍｇ、１〜４ｍｇまたは２〜３ｍｇ（例えば、０．９〜１．１ｍｇ、２〜３ｍｇまたは４〜５ｍｇ）の乳化剤（Ｔｗｅｅｎ８０など）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．５〜２０ｍｇ、１〜１５ｍｇ、２〜１２ｍｇ、４〜１０ｍｇ、５〜７ｍｇ（例えば、１１〜１３ｍｇ、５〜６ｍｇまたは２〜３ｍｇ）のトコール（アルファトコフェロールなど）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．０２５〜２．５ｍｇ、０．０５〜１．５ｍｇ、０．０７５〜０．７５ｍｇ、０．１〜０．３ｍｇまたは０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３ｍｇ、０．１〜０．１５ｍｇ、０．２５ｍｇまたは０．１２５ｍｇ）のステロール（例えば、コレステロール）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含んでなる、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
アジュバントが金属塩およびリピドＡ誘導体を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）１００〜７５０μｇ、２００〜５００μｇまたは３００〜４００μｇのＡｌを、例えば、リン酸アルミニウムとして含んでなる、請求項５９に記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
アジュバントが、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる、請求項５９または請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
アジュバントが、ＣｐＧモチーフを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
免疫原性組成物中に存在する１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）から選択される、請求項６３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
免疫原性組成物中のＨＩＶ−１クレードがクレードＢである、請求項６３または請求項６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）から選択される、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードが、クレードＡまたはＣから選択される、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードが、クレードＡおよびＣである、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するための、請求項６９に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体への長期未発症者状態の付与に使用するための、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体への長期未発症者状態の付与に使用するための、請求項７１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に使用するための、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に使用するための、請求項７３に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのうちの２種以上を産生する、請求項７３または請求項７４に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ２およびＩＦＮγを産生する、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ２およびＴＮＦαを産生する、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生する、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生する、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌを発現する、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における漸進的ＣＤ４＋Ｔ細胞減少の防止に使用するための、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における漸進的ＣＤ４＋Ｔ細胞減少の防止に使用するための、請求項８１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するための、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するための、請求項８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における、多数で長期間効果のある数のＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発に使用するための、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における、多数で長期間効果のある数のＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発に使用するための、請求項８５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するための、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するための、請求項８７に記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
抗原のうちの２種、３種、４種以上が、融合タンパク質を形成するように融合される、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
融合タンパク質が、Ｐｏｌと融合されたＧａｇまたはＧａｇと融合されたＰｏｌを含んでなる、請求項８９に記載の免疫原性組成物。
【請求項９１】
融合タンパク質が、Ｎｅｆと融合されたＰｏｌまたはＰｏｌと融合されたＮｅｆを含んでなる、請求項８９または請求項９０に記載の免疫原性組成物。
【請求項９２】
融合タンパク質が、Ｇａｇと融合されたＮｅｆまたはＮｅｆと融合されたＧａｇを含んでなる、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９３】
Ｇａｇがｐ１７および／またはｐ２４である、請求項９０または請求項９２に記載の免疫原性組成物。
【請求項９４】
ＰｏｌがＲＴである、請求項９０または請求項９１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９５】
抗原が、Ｎｅｆ、ＲＴ、ｐ１７およびｐ２４を任意の順序で含んでなる融合タンパク質を形成するように融合される、請求項１〜９４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９６】
抗原が、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７を含んでなる融合タンパク質を形成するように融合される、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９７】
融合タンパク質中の抗原が、２種、３種または４種の異なるＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１株由来である、請求項８９〜９６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９８】
融合タンパク質中の抗原の総てが、同じＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１株または株群由来である、請求項８９〜９６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９９】
抗原を含んでなる１種以上の非融合ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項８９〜９８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１００】
非融合ポリペプチド中の抗原が、融合タンパク質中の抗原の少なくとも１種と同じクレードのＨＩＶ−１株由来である、請求項９９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０１】
非融合ポリペプチド中の抗原が、融合タンパク質中の１種以上のクレードとは異なるＨＩＶ−１株由来である、請求項９９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０２】
非融合ポリペプチドがＥｎｖを含んでなる、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０３】
非融合ポリペプチドが、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０のうちの１種以上を含んでなる、請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０４】
免疫原性組成物中の１種以上の抗原のうちの１種が、クレードＢのＨＩＶ−１株由来である、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０５】
免疫原性組成物中に２種の抗原が存在する場合、両方の抗原がクレードＢのＨＩＶ−１株由来である、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０６】
免疫原性組成物中に３種の抗原が存在する場合、３種の抗原総てがクレードＢのＨＩＶ−１株由来である、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０７】
免疫原性組成物中に４種の抗原が存在する場合、４種の抗原総てがクレードＢのＨＩＶ−１株由来である、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０８】
免疫原性組成物の１回投与量における各抗原の総量が、０．５〜２５μｇ、２〜２０μｇ、５〜１５μｇまたはおよそ１０μｇである、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０９】
免疫原性組成物の１回投与量における融合タンパク質の総量が１０μｇである、請求項９５〜９８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１０】
免疫原性組成物の１回投与量における非融合ポリペプチドの総量が２０μｇである、請求項９９〜１０３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１１】
免疫原性組成物の１回投与量における全抗原の総量が、０．５〜５０μｇ、２〜４０μｇ、５〜３０μｇ、７〜２０μｇまたはおよそ３０μｇ、およそ２０μｇまたはおよそ１０μｇである、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１２】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する抗ウイルス免疫応答の長期記憶の誘導に使用するための、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１３】
免疫原性組成物中の前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する抗ウイルス免疫応答の長期記憶の誘導に使用するための、請求項１１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１４】
持続性抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に使用するための、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が少なくとも６ヶ月間存続する、請求項１１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、６〜２４ヶ月間または９〜１８ヶ月間、例えば、１２ヶ月間存続する、請求項１１４〜１１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１７】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に２回または３回投与として最初に投与され、ここで、該投与は、２週間〜３ヶ月、好ましくは１ヶ月の期間の間隔がおかれる、免疫原性組成物。
【請求項１１８】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に（例えば、追加免疫として）６〜２４ヶ月または９〜１８ヶ月おきに、例えば、年１回投与される、免疫原性組成物。
【請求項１１９】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜１１７に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に（例えば、追加免疫として）６ヶ月または１年の間隔で投与される、免疫原性組成物。
【請求項１２０】
請求項１１８または請求項１１９に記載の免疫原性組成物であって、前記対象への該組成物の後の投与が同じ対象への該組成物の先行投与の免疫応答を高める、免疫原性組成物。
【請求項１２１】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜１２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物がプライムブースト治療計画の一環として使用される、免疫原性組成物。
【請求項１２２】
初回免疫量である、請求項１２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２３】
追加免疫量である、請求項１２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２４】
２回以上の初回免疫量および／または追加免疫量が投与される、請求項１２１〜１２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２５】
ワクチン組成物である、請求項１〜１２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２６】
請求項１〜１２５に記載のＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防のための医薬の製造における、請求項１〜１２４に記載の免疫原性組成物または請求項１２５に記載のワクチンの使用。
【請求項１２７】
請求項１〜１２５に記載のＨＩＶ−１疾患または感染症を治療または予防する方法であって、請求項１〜１２４に記載の免疫原性組成物または請求項１２５に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ＨＩＶ−１抗原を含んでなる免疫原性組成物ならびにＨＩＶ−１の予防および／または治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、異種ＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１感染症に関連する疾患の予防および／または治療における１種のクレードのＨＩＶ−１抗原の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、世界の重大な健康問題の１つと考えられている後天性免疫不全症候群（エイズ）の主要な原因である。世界中での感染者は３２００万人を超えており、ＨＩＶ−１に対する安全で有効なワクチンの開発が世界的な健康上の優先事項である。
【０００３】
ＨＩＶ−１は、レトロウイルス科(the family Retroviridiae)のＲＮＡウイルスである。ＨＩＶ−１ゲノムは少なくとも９個のタンパク質をコードし、これらのタンパク質は３つの種類に分けられる：主要な構造タンパク質であるＧａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ、調節タンパク質であるＴａｔおよびＲｅｖ、ならびにアクセサリータンパク質であるＶｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ。
【０００４】
ＨＩＶ−１は、いくつかの異なるクレード、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫに分けることができ、これらのクレードは世界を通じて有病率の点で異なる。例えば、ＨＩＶ−１クレードＢは北米および欧州全体で主に見られるが、一方、ＨＩＶ−１クレードＣは南アフリカ、インドおよび中国でのＨＩＶ−１流行に大きく関与している。組換え型流行株（ＣＲＦ）として知られている組換え型ＨＩＶ−１クレードは流布することも分かっている。これらの組換え型は、異なるクレードが感染者の細胞内で結合して新たなハイブリッドウイルスが生み出されることでもたらされる。大多数のハイブリッド型は短命であるが、２人以上へ感染し続けるものはＣＲＦとして知られている。例として、Ａ／Ｅが挙げられ、これはサブタイプＡと他のいくつかの「親」サブタイプＥとの間のハイブリダイゼーションによるものと考えられる。しかしながら、単一種のサブタイプＥはまだ見出されていない。
【０００５】
キプロスで単離されたウイルスは、当初、新サブタイプＩに入れられたが、後に組換え型Ａ／Ｇ／Ｉとして再分類された。現在、このウイルスは、サブタイプＡ、Ｇ、Ｈ、Ｋおよび未分類領域のもので構成されるさらに複雑なＣＲＦであると考えられている。
【０００６】
各クレードは、遺伝的類似性に基づいてグループ化された異なるＨＩＶ−１株を含んでなる。従って、異なるクレードのＨＩＶ−１株間の遺伝的差異は、同じクレードの異なるＨＩＶ−１株間の差異よりも大きい。
【０００７】
ＨＩＶ−１の遺伝的多様性によって、複数のＨＩＶ−１クレードの株に対しての、世界で安全で有効であるワクチンの開発が極めて困難になっている。これらのニーズに対処するワクチンは依然として必要である。
【０００８】
過去２０年に、予防ワクチンを開発する取り組みがなされてきた。これまで、フェーズＩＩｂ試験またはフェーズＩＩＩ試験において検証されたのは３つの候補ＨＩＶ−１ワクチンだけであり、総て、ＨＩＶ−１感染症を予防し得なかった[Flynn NM, Forthal DN, Harro CD, Judson FN, Mayer KH, et al. (2005) Placebo-controlled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection. J Infect Dis 191: 654-665, Pitisuttithum P, Gilbert P, Gurwith M, Heyward W, Martin M, et al. (2006) Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Efficacy Trial of a Bivalent Recombinant Glycoprotein 120 HIV-1 Vaccine among Injection Drug Users in Bangkok, Thailand. J Infect Dis 194: 1661-1671, Buchbinder SP, Mehrotra DV, Duerr A, Fitzgerald DW, Mogg R, et al. (2008) Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet 372: 1881-1893]。完全排除免疫(sterilizing immunity)をもたらす、感染症を予防する予防ワクチンの開発が優先事項であるが、強いＴ細胞性免疫応答の誘導に基づいた治療ワクチンまたは疾患修飾性ワクチンもまた望ましい。
【０００９】
持続性ウイルス感染症の制御におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の役割は十分に立証されてきた[Barouch DH, Letvin NL (2001) CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses to lentiviruses and herpesviruses. Curr Opin Immunol 13: 479-482]。ＨＩＶ−１感染症については、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現は、一次ＨＩＶ−１感染症の間に起こるウイルス血症の減少と密接に関連しており[Koup RA, Safrit JT, Cao Y, Andrews CA, McLeod G, et al. (1994) Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol 68: 4650-4655]、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のウイルス血症を劇的に増加させる[Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S, Sasseville VG, Simon MA, et al. (1999) Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science 283: 857-860, Jin X, Bauer DE, Tuttleton SE, Lewin S, Gettie A, et al. (1999) Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med 189: 991-998]。また、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を受けずにＨＩＶ−１感染症を制御する未発症者において多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞が優先的に維持されることも見出されてきた[Betts MR, Nason MC, Wes
t SM, De Rosa SC, Migueles SA, et al. (2006) HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+ T cells. Blood 107: 4781-4789]。
【００１０】
ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＩＶ−１をはじめとする、多くのウイルス感染症の免疫による制御において中心的な役割を果たすことが分かっている[Day CL, Walker BD (2003) Progress in defining CD4 helper cell responses in chronic viral infections. J Exp Med 198: 1773-1777, Klenerman P, Hill A (2005) T cells and viral persistence: lessons from diverse infections. Nat Immunol 6: 873-879]。さらに詳しくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および維持に必要である[Bourgeois C, Veiga-Fernandes H, Joret AM, Rocha B, Tanchot C (2002) CD8 lethargy in the absence of CD4 help. Eur J Immunol 32: 2199-2207, Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, et al. (2003) CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature 421: 852-856, Shedlock DJ, Shen H (2003) Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300: 337-339, Sun JC, Bevan MJ (2003) Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science 300: 339-342, Sun JC, Williams MA, Bevan MJ (2004) CD4+ T cells are required for the maint
enance, not programming, of memory CD8+ T cells after acute infection. Nat Immunol 5: 927-933, Yang TC, Millar J, Groves T, Zhou W, Grinshtein N, et al. (2007) On the role of CD4+ T cells in the CD8+ T-cell response elicited by recombinant adenovirus vaccines. Mol Ther 15: 997-1006]。ＨＩＶ−１感染患者における、増殖能を有する多機能性ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在は、長期未発症と関連している[Boaz MJ, Waters A, Murad S, Easterbrook PJ, Vyakarnam A (2002) Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. J Immunol 169: 6376-6385, Harari A, Petitpierre S, Vallelian F, Pantaleo G (2004) Skewed representation of functionally distinct populations of virus-specific CD4 T cells in HIV-1-infected subjects with progressive disease: changes after antiretroviral therapy. Blood 103: 966-972, Kannanganat S, Kapogiannis BG, Ibegbu C, Chennareddi L, Goepfert P, et al. (2007) Human immunodeficiency virus type 1 controllers but not noncontrollers maintain CD4 T cells coexpressing three cytokines. J Virol 81: 12071-12076, Potter SJ, Lacabaratz C, Lambotte O, Perez-Patrigeon S, Vingert B, et al. (2007) Preserved central memory and activated effector memory CD4+ T-cell subsets in human immunodeficiency virus controllers: an ANRS EP36 study. J Virol 81: 13904-13915]。さらに、急性ＨＩＶ−１感染症後のＨＩＶ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の低下は、in vitroおよびin vivoでＩＬ−２を産生するワクチン誘導ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によって回復され得る[Lichterfeld M, Kaufmann DE, Yu XG, Mui SK, Addo MM, et al. (2004) Loss of HIV-1-specific CD8+ T cell proliferation after acute HIV-1 infection and restoration by vaccine-induced HIV-1-specific CD4+ T cells. J Exp Med 200: 701-712]。これらの発見は、効果的なエイズワクチンは強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するものでなければならないということを示唆している。
【００１１】
ＨＩＶ−１の非常に大きな遺伝的多様性を考えると、効果的なワクチンは、広範囲の流行ＨＩＶ−１株に適用されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するものであることが有利であろう。そのようなワクチンが依然として必要である。
【００１２】
本発明は、これらのニーズに対処しようとするものである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＨＩＶの予防および／または治療のための免疫応答誘導用組成物を提供する。特に、本発明は、ＨＩＶ抗原含有組成物であって、ＨＩＶの２種以上のクレードおよび／または該組成物において使用されるＨＩＶ抗原とは異種のクレードに対する免疫応答誘導用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｆ４のヌクレオチド配列。
【図２】Ｆ４のアミノ酸配列。
【図３】Ｆ４ｃｏのヌクレオチド配列。
【図４】ｐ２４アミノ酸配列アラインメント。
【図５】ＲＴアミノ酸配列アラインメント。
【図６】Ｎｅｆアミノ酸配列アラインメント。
【図７】ｐ１７アミノ酸配列アラインメント。
【図８】クレード間の配列同一性およびエピトープ保存の解析。
【図９Ａ】Ｆ４のクーマシー染色およびウエスタンブロット。
【図９Ｂ】ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７溶解性アッセイ。
【図１０】Ｆ４ｃｏについてのクーマシー染色したゲルおよびウエスタンブロット。
【図１１】Ｆ４ｃｏ精製の追跡調査。
【図１２】ＣＢ染色したＳＤＳゲルおよび抗Ｆ４ウエスタンブロット。
【図１３】Ｆ４中の単独抗原に対するウエスタンブロット。
【図１４】３つの精製ロットのＳＥＣ分析。
【図１５】抗大腸菌(E. coli)ウエスタンブロット。
【図１６】ロット３の生産中に採取された全画分についてのＳＤＳゲルおよび抗Ｆ４ウエスタンブロット。
【図１７】Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群およびＦ４／ＷＦＩ群の反応原性。
【図１８】ＩＬ−２および少なくとももう１種のマーカーｐを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞。
【図１９】Ｆ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチン候補に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答：レスポンダー率。
【図２０】Ｆ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチン候補に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答：各抗原でのレスポンダーの割合。
【図２１】Ｆ４融合タンパク質に応答して、ＩＬ−２および少なくとも１種の他のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合。
【図２２】第２回目の投与後２週間目の１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群におけるＦ４特異的ＣＤ４＋ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞のサイトカイン共発現プロフィール。
【図２３】Ｆ４特異的ＣＤ４＋ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞のサイトカイン共発現プロフィール：１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群における全時点についての円グラフ。
【図２４】抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン共発現プロフィール。
【図２５】抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン共発現プロフィール。
【図２６】ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のクレード間交差反応性。
【図２７】ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の交差反応性。
【図２８】Ｆ４融合タンパク質に対する体液性免疫応答。
【図２９】Ｎｅｆ抗原、ＲＴ抗原、ｐ１７抗原、ｐ２４抗原に対する抗体応答。
【図３０】クレードＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。
【図３１】クレードＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。
【図３２】クレードＣ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。
【図３３】クレードＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図３４】クレードＢ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図３５】クレードＣ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図３６】クレード間交差Ｔ細胞応答概要。
【発明の具体的な説明】
【００１５】
本発明は、免疫原性組成物であって、
ａ．Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇから選択される１種以上の抗原を含んでなる１種以上のポリペプチドであって、
該１種以上の抗原は１種以上のクレードの１種以上のＨＩＶ−１株から選択されるものと、
ｂ．Ｔｈ１免疫応答の優先的誘導物質であるアジュバント
とを含んでなる、
該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、免疫原性組成物を提供する。
【００１６】
本発明者らは、１種の特定クレードのＨＩＶ−１株由来のタンパク質性ＨＩＶ−１抗原を含んでなる免疫原性組成物が、他の、異なるＨＩＶ−１クレード由来のＨＩＶ−１株に対する強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することができるということを見出した。例えば、ＨＩＶ−１クレードＢ株由来のＨＩＶ−１抗原は、ＨＩＶ非クレードＢ株由来のＨＩＶ−１抗原、例えば、クレードＡ、クレードＣ、または、とりわけ、クレードＣＲＦ−０１（クレードＡおよびクレードＥの組換え型流行株）などの組換えクレード由来のＨＩＶ−１抗原、ならびに他の、異なるＨＩＶ−１クレードＢ株由来のＨＩＶ−１抗原に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
【００１７】
この交差反応性は、同じＨＩＶ−１株由来のＨＩＶ−１抗原に対して見られる「同種」免疫応答に追加される。従って、クレードＢのＨＩＶ−１株由来のＨＩＶ−１抗原を含んでなる免疫原性組成物は、例えば、同じＨＩＶ−１株、クレードＢの異なるＨＩＶ−１株または他の、ＨＩＶ非クレードＢ株、例えば、クレードＡおよび／またはクレードＣおよび／またはクレードＣＲＦ−０１由来の株によって起こるＨＩＶ−１感染症および疾患を治療または予防するために使用することができる。
【００１８】
免疫応答は、抗原に対して、抗原と免疫系の細胞との相互作用を通じて引き起こされる。結果として起こる免疫応答は２つの主要な流れ、すなわち、自然免疫応答（多様性は低いが作用は独立している）および適応免疫応答（非常に大きな多様性を有するが自然免疫に強く依存し、それゆえ自律性は乏しい）に大きく分けられる。
【００１９】
侵入病原体に対する有効な宿主防御は、自然免疫系と適応免疫系をつなぐ複雑な情報伝達ネットワークの協調を通じて成し遂げられる。ウイルス感染症からの保護は、適応免疫によって、そして体液性免疫および細胞性免疫の両方によって主に媒介される。体液性免疫の抗ウイルス作用は、標的細胞のウイルス侵入／感染を阻止する能力を有する中和抗体の生成を通じて媒介される。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞性免疫のエフェクター成分であり、それらの抗ウイルス作用は、サイトカインの分泌およびウイルス感染標的細胞の死滅を通じて媒介される。
【００２０】
ウイルス複製制御およびＨＩＶ−１関連疾患予防におけるＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答の保護的役割については、複数の研究によって強く裏付けられている。
【００２１】
樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞によって提示される抗原との相互作用を受けて、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、典型的なＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞ならびに誘導性の調節性Ｔ（ｉＴｒｅｇ）細胞を含む、様々なエフェクターサブセットへと分化することができる。分化決定は、サイトカインの存在によって主に決定され、ある程度は、抗原とＴ細胞抗原受容体との間の相互作用の強さによって決定される。
【００２２】
Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γの産生を特徴とし、細胞内微生物に対する細胞性免疫に関与する。自然免疫細胞によって産生されるＩＬ−１２は、細胞をＴｈ１細胞分化プログラムに向け、ＮＫ細胞およびＴ細胞の双方によって産生されるＩＦＮ−γも同様である。
【００２３】
Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生し、寄生虫および他の細胞外病原体を制御する体液性免疫に必要である。Ｔｈ２細胞分化には、ＩＬ−４およびＳｔａｔ６による下流でのＧＡＴＡ３の作用が必要である。
【００２４】
Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２を産生し、とりわけ、粘膜表面での、細胞外細菌および真菌のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。Ｔｈ１７細胞分化にはレチノイド関連オーファン受容体（ＲＯＲ）ｇｔ、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３とともにＴＧＦ−βによって誘導される転写因子が必要であり、これらは総てＳｔａｔ３リン酸化を活性化する。
【００２５】
Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞応答の成熟を調節するヘルパーＴ細胞のサブセットである。これらの細胞の分化は、サイトカインＩＬ−２１を必要とし、転写因子Ｂｃｌ−６に依存し得る。
【００２６】
エフェクターＴ細胞応答の厳密な調節は、効果的な感染症制御ならびに自己免疫疾患および免疫病理学的疾患の回避に必要である。
【００２７】
ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、多くのウイルス感染症の免疫制御において中心的な役割を果たすことが分かっている上、上に論じたように、ＨＩＶ−１による感染症をはじめとする持続性ウイルス感染症の制御に関与することが分かっている機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および維持に必要である。
【００２８】
ＨＩＶ−１ゲノムは複数の異なるタンパク質をコードする。エンベロープタンパク質としては、例えば、ｇｐ１２０およびその前駆体であるｇｐ１６０が挙げられる。ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質としては、例えば、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質、ならびにＲｅｖ、Ｎｅｆ、ＶｉｆおよびＴａｔなどの他の非構造タンパク質が挙げられる。
【００２９】
そのようなＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、可能な限り広範囲の流行ＨＩＶ−１株に対する応答であることが有利であるため、ＨＩＶ−１ワクチンは、様々なウイルスタンパク質由来の、可能な限り多くの異なるＣＤ４エピトープを含むことが望ましい。保存されたＴ細胞エピトープを最大数含有するウイルス抗原はＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆである。
【００３０】
本発明の免疫原性組成物は、これらの抗原のうちの１種以上を含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる。
【００３１】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、Ｎｅｆを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる。
【００３２】
ＨＩＶ−１  Ｎｅｆは初期タンパク質であり、すなわち、ＨＩＶ−１  Ｎｅｆは感染初期に構造タンパク質の不在下で発現される。Ｎｅｆ遺伝子は、いくつかの活性を有することが示されている初期アクセサリーＨＩＶ−１タンパク質をコードする。例えば、Ｎｅｆタンパク質は、細胞表面のＨＩＶ−１受容体であるＣＤ４、およびＭＨＣクラスＩ分子のダウンレギュレーションを引き起こすことが知られているが、これらの機能の生物学的重要性は議論されている。加えて、Ｎｅｆは、Ｔ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘導し、この活性状態によって、次いで、より効率的な遺伝子発現が促進され得る。一部のＨＩＶ−１分離株はこの領域に突然変異を有し、これらの突然変異によって機能性タンパク質はコードされなくなり、in vivoでのそれらの複製および病因において重い障害が生じる。
【００３３】
Ｎｅｆに関する記載は、全長Ｎｅｆ、ならびに全長Ｎｅｆの断片、変異体および誘導体に関するものである。その用語はまた、Ｎｅｆを含んでなるポリペプチドも含み、それらにはＮｅｆの断片、変異体および誘導体を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【００３４】
ある実施形態では、Ｎｅｆは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である。
【００３５】
便宜には、Ｎｅｆは、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である。
【００３６】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、Ｐｏｌを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる。
【００３７】
Ｐｏｌ遺伝子は、初期感染においてウイルスにより必要とされる２つの活性を含む２種のタンパク質、ＲＴおよびウイルスＤＮＡの細胞ＤＮＡへの組込みに必要なインテグラーゼタンパク質をコードする。Ｐｏｌの一次産物は、ビリオンプロテアーゼによって切断され、ＤＮＡ合成に必要な活性（ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ならびにＲＮアーゼＨ機能）を含むアミノ末端ＲＴペプチドおよびカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質を生じる。よって、ＲＴはＰｏｌの断片の一例である。ＨＩＶ−１  ＲＴは、全長ＲＴ（ｐ６６）と、カルボキシ末端ＲＮアーゼＨドメインを欠失している切断産物（ｐ５１）と（これらの各々もまたＰｏｌの断片の例である）のヘテロ二量体である。
【００３８】
Ｐｏｌに関する記載は、全長Ｐｏｌ、ならびに全長Ｐｏｌの断片、変異体および誘導体に関するものである。その用語はまた、Ｐｏｌを含んでなるポリペプチドも含み、それらにはＰｏｌの断片、変異体および誘導体を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【００３９】
ある実施形態では、ＰｏｌはＲＴ断片を含んでなる。ＲＴ断片はＰｏｌの断片の一例である。ＲＴに関する記載もまた、全長ＲＴ、ならびに全長ＲＴの断片、変異体および誘導体に関するものである。その用語はまた、ＲＴを含んでなるポリペプチドも含み、それらにはＲＴの断片、変異体および誘導体を含んでなるポリペプチドが含まれる。このように、ＲＴは、ｐ６６断片、ｐ５１断片、ならびに／またはｐ６６および／またはｐ５１の断片、変異体および誘導体を含んでなり得る。
【００４０】
ある実施形態では、Ｐｏｌは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である。
【００４１】
便宜には、Ｐｏｌは、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である。
【００４２】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、Ｇａｇを含んでなる１種以上のポリペプチドを含んでなる。
【００４３】
Ｇａｇ遺伝子は、前駆体ポリタンパク質として翻訳され、この前駆体ポリタンパク質はプロテアーゼによって切断され、基質タンパク質（ｐ１７）、キャプシド（ｐ２４）、ヌクレオキャプシド（ｐ９）、ｐ６ならびに２つのスペースペプチド、ｐ２およびｐ１（それらは総てＧａｇの断片の例である）を含む産物を生じる。
【００４４】
Ｇａｇ遺伝子は、ｐ５５とも呼ばれる５５キロダルトン（ｋＤ）のＧａｇ前駆体タンパク質を生じさせ、それはスプライシングを受けていないウイルスｍＲＮＡから発現される。翻訳中に、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、細胞膜の細胞質側とのその結合を誘発する。膜に結合したＧａｇポリタンパク質は、２コピーのウイルスゲノムＲＮＡを、感染細胞表面からのウイルス粒子の出芽を誘発する他のウイルスタンパク質および細胞タンパク質とともに補充する。出芽後、ｐ５５は、ウイルス成熟プロセス中に、ウイルスによりコードされるプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって、ＭＡ（基質［ｐ１７］）、ＣＡ（キャプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド［ｐ９］）およびｐ６と呼ばれる４種のより小さなタンパク質（それらは総てＧａｇの断片の例である）へと切断される。
【００４５】
ｐ１７（ＭＡ）ポリペプチドは、ｐ５５のＮ末端のミリストイル化された端部からのものである。大多数のＭＡ分子はビリオン脂質二重層の内表面に結合した状態のままであり、その粒子は安定化する。ＭＡのサブセットは、ビリオンのより深い層の内部に補充され、そこで、ウイルスＤＮＡを核へと送り届ける複合体の一部となる。これらのＭＡ分子はウイルスゲノムの核輸送を容易にするが、これは、ＭＡ上の核親和性シグナルが細胞核内輸送機構によって認識されるためである。この現象によって、非分裂細胞へのＨＩＶ−１感染が可能になる。
【００４６】
ｐ２４（ＣＡ）タンパク質はウイルス粒子の円錐状コアを形成する。シクロフィリンＡは、ｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、ＨＩＶ−１粒子へのその取り込みを導くことが示されている。ＧａｇとシクロフィリンＡとの間の相互作用は必須であるが、これは、シクロスポリンＡによるこの相互作用の破壊がウイルス複製を阻害するためである。
【００４７】
ＧａｇのＮＣ領域は、いわゆるＨＩＶ−１のパッケージングシグナルの特異的認識に関与する。このパッケージングシグナルは、ウイルスＲＮＡの５’末端近くに位置する４つのステムループ構造からなり、ＨＩＶ−１ビリオンへの異種ＲＮＡの取り込みを媒介するのに十分である。ＮＣは、２つの亜鉛フィンガーモチーフによって媒介される相互作用を通じてパッケージングシグナルと結合する。ＮＣはまた、逆転写を促進する。
【００４８】
ｐ６ポリペプチド領域は、ｐ５５  Ｇａｇとアクセサリータンパク質Ｖｐｒとの間の相互作用を媒介して、構築中のビリオンへのＶｐｒの取り込みを導く。ｐ６領域はまた、感染細胞からの出芽ビリオンの効率的な放出に必要ないわゆる後期ドメインも含む。
【００４９】
ある実施形態では、Ｇａｇは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である。
【００５０】
便宜には、Ｇａｇは、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である。
【００５１】
ある実施形態では、Ｇａｇはｐ１７である。そのような実施形態では、ｐ１７は、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来である。便宜には、ｐ１７は、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である。
【００５２】
ある実施形態では、Ｇａｇはｐ２４である。そのような実施形態では、ｐ２４は、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え流行株（ＣＲＦ）由来である。便宜には、ｐ２４は、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である。
【００５３】
ある実施形態では、Ｇａｇは、ｐ１７およびｐ２４の両方を、独立したタンパク質抗原成分としてまたは互いに融合された状態で含んでなる。
【００５４】
便宜には、ｐ１７およびｐ２４は、互いに融合され、異種アミノ酸配列によって隔てられる。
【００５５】
本発明において、記載される抗原は全長抗原、例えば、全長Ｎｅｆ、全長Ｐｏｌ、全長Ｇａｇである。本発明はまた、全長ではない抗原も包含し、それらには抗原の断片または変異体が含まれ、それらは全長と対応していても対応していなくてもよい。好適には、断片は免疫原性断片であり、変異体は免疫原性変異体である。
【００５６】
典型的には、「断片」は、免疫原性であるかそうでないかにかかわらず、それらを断片とするＨＩＶ−１抗原を含んでなるポリペプチド由来の連続したアミノ酸配列を含む。便宜には、断片は、それらを断片とするポリペプチド由来の、少なくとも５〜８個のアミノ酸、少なくとも９〜１５個のアミノ酸、少なくとも２０個、少なくとも５０個または少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００５７】
本明細書において用いられる「免疫原性断片」は、抗原の少なくとも１つのエピトープを含んでなり、ＨＩＶ−１抗原性を表示するものである。そのような断片は、単独でまたは好適な構築物中に存在する場合、例えば、他のＨＩＶ−１エピトープまたは抗原と融合される場合、タンパク質性および／または免疫原性のものであり得る融合パートナーと融合される場合、あるいは担体上または中に存在する場合など、天然抗原に対する免疫応答を誘導することが可能である。
【００５８】
本明細書において用いられる「変異体」という用語は、それらの非変異体対照物と比べて限定的に改変されているポリペプチドを含む。これには、例えば、発現系における発現の改善または望ましくない活性（望ましくない酵素活性を含む）の除去によって、ポリペプチドの特性を変更し得る点突然変異が含まれる。しかしながら、ＨＩＶ−１抗原を含んでなるポリペプチド変異体は、それらが免疫原性組成物またはワクチンにおいて望ましい抗原特性を保持して、天然抗原に対する免疫応答を惹起する能力を依然として有するように、天然ポリペプチドと十分に類似したままでなければならない。特定の変異体がそのような免疫応答を惹起するかどうかは、ＥＬＩＳＡ（抗体応答の場合）または細胞マーカーおよびサイトカインについての適当な染色を用いたフローサイトメトリー（細胞応答の場合）などの適当な免疫学的アッセイによって評価することができる。
【００５９】
便宜には、本発明による「変異体」は、１個以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含んでなる。「変異体」は末端切断型抗原を包含し、その場合、その抗原のＣ末端および／またはＮ末端は１個以上のアミノ酸が切断されている。便宜には、「変異体」は、１〜５個のアミノ酸、６〜１０個のアミノ酸、１１〜１５個のアミノ酸、１６〜２０個のアミノ酸、２１〜２５個のアミノ酸または２５個以上のアミノ酸が抗原のＣ末端および／またはＮ末端から切断されている末端切断型または断片を含む。
【００６０】
本発明の変異体は、１個以上のアミノ酸の１以上の欠失、付加または置換を組み込むことができる。従って、抗原の末端切断型は、そのペプチドの異なる部分に１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換をさらに含んでなることができる。
【００６１】
本発明の変異体はまた、Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇのポリペプチド配列と７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一性を有するポリペプチド配列も含んでなる。
【００６２】
本発明のある実施形態では、前記免疫原性組成物は、１種以上の抗原を含んでなる２種のポリペプチド、１種以上の抗原を含んでなる３種のポリペプチド、１種以上の抗原を含んでなる４種のポリペプチド、または１種以上の抗原を含んでなる５種以上のポリペプチドを含んでなる。
【００６３】
Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇの各々は、免疫原性組成物中に２回以上存在し得る。例えば、本発明の免疫原性組成物は、Ｎｅｆを含んでなる２種以上のポリペプチド、Ｐｏｌを含んでなる２種以上のポリペプチドおよび／またはＧａｇを含んでなる２種以上のポリペプチドを含んでなり得る。
【００６４】
さらなる実施形態では、前記１種以上のポリペプチドの各々は、Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇのうちの１種、Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇのうちの２種、Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇのうちの３種、Ｎｅｆ、Ｐｏｌおよび／またはＧａｇなならびにその他のうちの４種などを含んでなり得る。前記組成物中に２種以上のポリペプチドが存在するならば、各ポリペプチドは同じ数および／または組成の抗原を含んでなり得るか、または各ポリペプチドは異なる数および／または組成の抗原を含んでなり得る。前記組成物中に３種以上のポリペプチドが存在するならば、２種以上のポリペプチドは同じ数および／または組成の抗原を含んでなり得、一方、残りのポリペプチド（群）は異なる数および／または組成の抗原を含んでなり得る。
【００６５】
これらの抗原についてのポリペプチド配列は異なる株全体にわたって（ＨＩＶ−１の異なるクレード由来の株全体にわたることを含む）よく保存されていることは十分に裏付けられている。
【００６６】
しかしながら、異なるクレード全体にわたるＨＩＶ−１抗原についてのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ保存の解析により、これらの抗原の配列は異なるクレード全体にわたって比較的よく保存され得るが、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは驚くべきことにあまり保存されていないと思われることが示される（解析については図８を参照のこと）。
【００６７】
この解析では、「既知」ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと「予測」ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとを考察した。エピトープは、３つのソフトウェア：ＳＶＭＨＣ(www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC)、ＰｒｏＰｒｅｄ(www.imtech.res.in/raghava/propred/)およびGSKbio社製プログラム（Ｔｅｐｉｔｏｐｅ）を用いて「予測した」。潜在的「エピトープ」として選ばれるには、３つのプログラムによって、９−ｍｅｒペプチドが、白人人口において最も典型的なものである１７種の対立遺伝子のうちの特定のＨＬＡ対立遺伝子のエピトープと予測される必要があった。その後、配列間で保存された予測ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの数を算出した。
【００６８】
調査したクレードの間で観察されたエピトープ保存の程度が比較的低いことにもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、交差反応性の程度が予測されるよりもずっと高いことを見出した。
【００６９】
交差反応性とは、本明細書において、本発明の免疫原性組成物によって誘導される免疫応答についての、該免疫原性組成物において表されていないクレードのＨＩＶ−１株を認識する能力を意味すると理解される。例えば、クレードＢのＨＩＶ−１株由来の抗原を含んでなるポリペプチドを含んでなる本発明の免疫原性組成物は、該組成物によって誘導される、ＨＩＶ特異的免疫応答、例えば、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答などが、該組成物中に存在しない異なるＨＩＶ−１株、例えば、クレードＢ以外のクレードのＨＩＶ−１株と反応するならば、交差反応性であると考えられる。
【００７０】
異なるクレードのＨＩＶ−１株に対して、前記組成物により誘導される免疫応答による反応は、誘導される免疫応答の種類に応じて異なるであろう。ＣＤ４特異的免疫応答の場合、これには、関連サイトカインの分泌が含まれ得る。ＣＤ８特異的免疫応答には、細胞溶解活性の誘導および／または関連サイトカインの分泌が含まれ得る。抗体特異的応答には、例えば、中和抗体の誘導が含まれ得る。
【００７１】
本発明において、本発明の免疫原性組成物において表されていないクレードのＨＩＶ−１株によって誘導される免疫応答はＣＤ４特異的免疫応答であることが好ましい。
【００７２】
交差反応性免疫応答は、異なるＨＩＶ−１クレードの異なるウイルス株全体にわたって配列において保存されている、ポリペプチドにおける免疫原性領域、すなわちエピトープに対して向けられ得、または免疫認識を無効にすることなくある程度の配列変異を許容するエピトープに対して向けられ得る。
【００７３】
交差反応性は、特定の免疫応答の大きさによっておよび／またはレスポンダーの割合によって測定することができる。
【００７４】
免疫応答の大きさを検討する際には、これは、免疫原性組成物中のクレードと同じクレードまたはクレード群のポリペプチドによって誘導される特定の免疫応答と、前記免疫原性組成物において表されていないクレードのポリペプチドによって誘導される免疫応答との大きさによって表すことができる。
【００７５】
免疫応答の大きさを解析するために、免疫原性組成物中の、抗原を含んでなるポリペプチドは、免疫学的アッセイにおいて、例えば、抗体応答の解析ではタンパク質の形でまたはＴ細胞応答の解析では重複合成ペプチドのセットの形で使用することができる。好適な免疫学的アッセイの例は、当業者には周知であり、下の実施例において記載される。
【００７６】
免疫応答の大きさはまた、適切な血清学的試験によって決定される、免疫原性組成物によって誘導される抗原特異的抗体の力価（または濃度）としても表すことができる。Ｔ細胞応答の大きさは、Ｔ細胞集団全体の間で前記免疫原性組成物によって誘導される抗原特異的細胞の頻度（または数）として表すことができ、サイトカイン産生によってモニタリングすることができる。
【００７７】
免疫応答、例えば、交差反応性免疫応答の大きさは、全体的にまたは部分的に保存されているエピトープの数ならびに認識されるエピトープの優性によって影響を受け得る。
【００７８】
例えば、大きさの大きい免疫応答は、多数の比較的弱い保存エピトープの認識または少数の優性エピトープの認識によって起こり得る。
【００７９】
便宜には、観察される交差反応性のレベルは、Ｔ細胞集団全体の間で免疫原性組成物によって誘導される抗原特異的細胞、または前記免疫原性組成物によって誘導される抗原特異的抗体の力価（または濃度）の、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、３５％まで、４０％まで、４５％まで、５０％まで、５５％まで、６０％まで、６５％まで、７０％まで、８０％まで、９０％または１００％までである。
【００８０】
異なるクレードのＨＩＶ−１株に対するレスポンダーの割合によって交差反応性を測定する際には、後の抗原投与後に免疫学的アッセイにおいて陽性反応を示すワクチン接種個体の数または割合を測定することができる。レスポンダーは抗原の１以上のエピトープに対して応答することができる。レスポンダーはまた、本発明の免疫原性組成物中の１種以上のポリペプチドに対しておよび／または本発明の免疫原性組成物中の１種以上の抗原に対しても応答することができる。
【００８１】
レスポンダーの割合または免疫応答の大きさを解析するために使用することができる免疫学的アッセイおよび血清学的試験は当技術分野で公知である。そのようなアッセイの例は、当業者には公知であり、下に実施例セクションにおいて記載される。
【００８２】
好ましくは、観察される交差反応性のレベルは、サンプル中の対象の、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、３５％まで、４０％まで、４５％まで、５０％まで、５５％まで、６０％まで、６５％まで、７０％まで、８０％まで、９０％または１００％までがレスポンダーであることである。
【００８３】
どのような測定方法を用いても、免疫原性組成物において表されていないクレードのＨＩＶ−１株に対する完全な交差反応性、例えば、１００％交差反応性は、本発明では必要でない。
【００８４】
本発明の免疫原性組成物は、Ｔｈ１免疫応答の優先的誘導物質であるアジュバントを含んでなる。
【００８５】
アジュバントは、Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach (Powell and Newman編, Plenum Press, New York, 1995)において一般的に記載されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００８６】
アジュバントとは、免疫刺激薬の一例であり、抗原に対する特異的免疫応答（抗体応答および／または細胞性応答）を増強または強化する免疫原性組成物中の成分を指す。
【００８７】
アジュバントはＴｈ１型免疫応答およびＴｈ−２型応答を誘導することができる。Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導に有利に働く傾向があるが、一方、Ｔｈ−２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉｌ−６、ＩＬ−１０）は、抗原に対する体液性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。
【００８８】
本発明において、アジュバントはＴｈ１免疫応答の優先的誘導物質である。
【００８９】
Ｔｈ１型免疫応答とＴｈ２型免疫応答との区別は絶対的なものではない。実際には、個体は、Ｔｈ１主体またはＴｈ２主体であるといわれる免疫応答を支持するであろう。しかしながら、Mosmann and CoffmanによってネズミＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおいて記載されている点からサイトカインのファミリーを考慮に入れることが便宜である場合が多い（Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。従来、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連づけられる。Ｔｈ１型免疫応答の誘導と直接関連づけられることが多い他のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２などは、Ｔ細胞によって産生されない。これに対して、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連づけられる。主にＴｈ１応答を促進する好適なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドＡまたはその誘導体（または一般的には、解毒リピドＡ−例えば、ＷＯ２００５１０７７９８を参照のこと）、特に３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製についてはＧＢ２２２０２１１Ａを参照のこと）；ならびにモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）または水中油型エマルションのいずれかとの組合せが挙げられる。そのような組合せでは、抗原および３Ｄ−ＭＰＬは同じ粒子構造中に含まれ、抗原シグナルおよび免疫刺激シグナルのより効率的な送達が可能となる。３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに向上することが可能であることが研究により示されている［Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; ＥＰ６８９４５４−Ｂ１、各々の文献は引用することにより本明細書の一部とされる］。
【００９０】
増強された系は、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）において開示されている、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）において開示されている、ＱＳ２１がコレステロールによってクエンチングされている低反応原性組成物を含む。水中油型エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０において記載されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。一実施形態では、前記免疫原性組成物はサポニンをさらに含んでなり、このサポニンはＱＳ２１であり得る。前記処方物はまた、水中油型エマルションおよびトコフェロールも含んでなり得る（ＷＯ９５／１７２１０、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００９１】
本発明のある実施形態では、前記アジュバントは、免疫学的活性サポニン画分および／またはリポ多糖類および／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドから選択される１種以上の成分を含んでなる。
【００９２】
ある実施形態では、前記アジュバントは、免疫学的活性サポニン画分およびリポ多糖類を含んでなる。
【００９３】
便宜には、前記免疫学的活性サポニン画分はＱＳ２１であり、かつ／または前記リポ多糖類はリピドＡ誘導体である。好適には、前記リピドＡ誘導体は３Ｄ−ＭＰＬである。
【００９４】
好適なアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せ（ＥＰ０６７１９４８Ｂ１、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含んでなる水中油型エマルション（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４、各々の文献は引用することにより本明細書の一部とされる）または他の担体とともに処方された３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ０６８９４５４Ｂ１、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）である。
【００９５】
３Ｄ−ＭＰＬは、GlaxoSmithKline Biologicals North Americaから入手可能であり、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を主として促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａにおいて開示されている方法に従って生産することができる。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと、３本、４本、５本または６本のアシル化鎖との混合物である。本発明の組成物では小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用することが好ましい。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターで濾過除菌し得るような粒径を有する。そのような調製物はＷＯ９４／２１２９２において記載されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００９６】
本発明において使用するためのもう１つの好適なアジュバントはＱｕｉｌ  Ａおよびその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南米の樹木バラ科キラヤ(Quilaja Saponaria Molina)から単離されたサポニン調製物であり、１９７４年にDalsgaard et al.によってアジュバント活性を有すると初めて記載された（“Saponin adjuvants”, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。Ｑｕｉｌ  Ａに関連した毒性がなくアジュバント活性を有する、Ｑｕｉｌ  Ａの精製断片、例えば、ＱＳ７およびＱＳ２１（ＱＡ７およびＱＡ２１としても知られている）は、ＨＰＬＣによって単離された（ＥＰ０３６２２７８、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。ＱＳ２１はバラ科キラヤの樹皮より得られた天然サポニンであり、ＱＳ２１はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞および主たるＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導し、本発明に関連して好ましいサポニンである。
【００９７】
特に好適である特定のＱＳ２１処方物は記載されており、これらの処方物はステロールをさらに含んでなる（ＷＯ９６／３３７３９、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。本発明の一部をなすサポニンは、ミセル、すなわち、混合ミセル（優先的には、限定されるものではないが、胆汁酸塩を含む）の形で分散し得るし、あるいはコレステロールおよび脂質とともに処方される場合には、ＩＳＣＯＭマトリックス（ＥＰ０  １０９９４２Ｂ１、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）、リポソームまたは関連コロイド構造（例えば、ミミズ状もしくはリング状の多量体または脂質／層状構造およびラメラなど）の形で、または水中油型エマルションの形で（例えば、ＷＯ９５／１７２１０の場合など、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）であり得る。前記サポニンは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの金属塩と結合され得る（ＷＯ９８／１５２８７、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００９８】
増強された系は、モノホスホリルリピドＡ（または解毒リピドＡ）およびサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）において開示されている、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）において開示されているＱＳ２１がコレステロールによってクエンチングされている低反応原性組成物を含む。水中油型エマルション中にトコフェロールを含みＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬを含むまたは含まない特に強力なアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０において記載されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００９９】
ある実施形態では、前記アジュバントはステロールを含んでなり、このステロールは、好適には、コレステロールであり得る。好適なステロール、例えば、コレステロールは、前記サポニンのアジュバント効果を維持しながら、前記組成物の反応原性を低下させるように作用する。
【０１００】
本発明のある実施形態では、前記アジュバントはリポソーム担体を含んでなる。
【０１０１】
ある実施形態では、前記アジュバントはサポニンおよびステロールを含んでなり、サポニン：ステロールの割合は１：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である。便宜には、サポニン：ステロールの割合は１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）であり、またはサポニン：ステロールの割合は１：１〜１：５（ｗ／ｗ）である。
【０１０２】
ある実施形態では、前記アジュバントはサポニンおよびリポ多糖類を含んでなり、サポニン：リポ多糖類の割合は１：１である。
【０１０３】
便宜には、前記アジュバントはリポ多糖類を含んでなり、該リポ多糖類は投与量当たり１〜６０μｇの量で存在する。好適には、該リポ多糖類は、投与量当たり５０μｇ、投与量当たり２５μｇ、投与量当たり１０μｇまたは投与量当たり５μｇの量で存在する。
【０１０４】
便宜には、前記アジュバントはサポニンを含んでなり、該サポニンは投与量当たり１〜６０μｇの量で存在する。好適には、該サポニンは、投与量当たり５０μｇ、投与量当たり２５μｇ、投与量当たり１０μｇまたは投与量当たり５μｇの量で存在する。
【０１０５】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．０２５〜２．５ｍｇ、０．０５〜１．５ｍｇ、０．０７５〜０．７５ｍｇ、０．１〜０．３ｍｇまたは０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３ｍｇ、０．１〜０．１５ｍｇ、０．２５ｍｇまたは０．１２５ｍｇ）のステロール（例えば、コレステロール）を含んでなる。
【０１０６】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる。
【０１０７】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含んでなる。
【０１０８】
本発明のある実施形態では、前記アジュバントは水中油型エマルションを含んでなる。
【０１０９】
便宜には、前記水中油型エマルションはスクアレンおよび／またはアルファトコフェロールを含んでなる。好適には、前記水中油型エマルションは代謝性水中油型エマルションである。特に、前記水中油型エマルションは、Ｔｗｅｅｎ８０などの乳化剤を含んでなることが好適である。
【０１１０】
前記アジュバントは、便宜には、サポニンおよびリポ多糖類を含んでなり得る。特に、前記アジュバントは、サポニンおよびリポ多糖類を、１：１０〜１０：１（ｗ／ｗ）という範囲のサポニン：リポ多糖類の割合で含んでなり得る。
【０１１１】
前記アジュバントは、便宜には、サポニンおよびステロールを含んでなり得る。特に、前記アジュバントは、サポニンおよびステロールを、１：１〜１：２０（ｗ／ｗ）の範囲のサポニン：ステロールの割合で含んでなり得る。
【０１１２】
前記アジュバントは、便宜には、サポニンおよび代謝性オイルを含んでなり得る。特に、前記アジュバントは、サポニンおよび代謝性オイルを、１：１〜２５０：１（ｗ／ｗ）の範囲の代謝性オイル：サポニンの割合で含んでなり得る。
【０１１３】
前記アジュバントは、便宜には、アルファトコフェロールを含んでなり得る。
【０１１４】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．５〜１５ｍｇ、１〜１３ｍｇ、２〜１１ｍｇ、４〜８ｍｇまたは５〜６ｍｇ（例えば、２〜３ｍｇ、５〜６ｍｇまたは１０〜１１ｍｇ）の代謝性オイル（スクアレンなど）を含んでなる。
【０１１５】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．１〜１０ｍｇ、０．３〜８ｍｇ、０．６〜６ｍｇ、０．９〜５ｍｇ、１〜４ｍｇまたは２〜３ｍｇ（例えば、０．９〜１．１ｍｇ、２〜３ｍｇまたは４〜５ｍｇ）の乳化剤（Ｔｗｅｅｎ８０など）を含んでなる。
【０１１６】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．５〜２０ｍｇ、１〜１５ｍｇ、２〜１２ｍｇ、４〜１０ｍｇ、５〜７ｍｇ（例えば、１１〜１３ｍｇ、５〜６ｍｇまたは２〜３ｍｇ）のトコール（アルファトコフェロールなど）を含んでなる。
【０１１７】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる。
【０１１８】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）０．０２５〜２．５ｍｇ、０．０５〜１．５ｍｇ、０．０７５〜０．７５ｍｇ、０．１〜０．３ｍｇまたは０．１２５〜０．２５ｍｇ（例えば、０．２〜０．３ｍｇ、０．１〜０．１５ｍｇ、０．２５ｍｇまたは０．１２５ｍｇ）のステロール（例えば、コレステロール）を含んでなる。
【０１１９】
ある実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含んでなる。
【０１２０】
別の実施形態では、前記アジュバントは金属塩およびリピドＡ誘導体を含んでなる。
【０１２１】
そのような対象アジュバント系としては、アルミニウム塩と、リポ多糖類である３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとに基づいたものが挙げられる。抗原と３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡは、同じ金属塩粒子に共吸着され得、または異なる金属塩粒子にも吸着され得る。
【０１２２】
好適には、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）１００〜７５０μｇ、２００〜５００μｇまたは３００〜４００μｇのＡｌを、例えば、リン酸アルミニウムとして含んでなる。そのような実施形態では、前記アジュバントは、（０．５ｍＬ投与量当たり）５〜６０μｇ、１０〜５０μｇまたは２０〜３０μｇ（例えば、５〜１５μｇ、４０〜５０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇまたは５０μｇ）のリピドＡ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）を含んでなる。
【０１２３】
本発明のある実施形態では、前記アジュバントは、ＣｐＧモチーフを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１２４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは本発明の免疫原性組成物において使用することができる。本発明のアジュバントまたは免疫原性組成物に使用するための好ましいオリゴヌクレオチドはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも６個以上のヌクレオチドによって隔てられた２個以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。ＣｐＧモチーフは、シトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続く。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエートであり、またはより好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートの生産方法は、ＵＳ５，６６６，１５３、ＵＳ５，２７８，３０２およびＷＯ９５／２６２０４において記載されており、各々の文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１２５】
好ましいオリゴヌクレオチドの例は以下の配列を有する。それらの配列は、好ましくは、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含む。
オリゴ１（配列番号１）：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
オリゴ２（配列番号２）：TCT CCC AGC GTG CGC CAT
オリゴ３（配列番号３）：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ４（配列番号４）：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT
オリゴ５（配列番号５）：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT
オリゴ６（配列番号６）：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G
【０１２６】
代替ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、上記の好ましい配列を含んでなり得るが、それは、それらの配列における欠失または付加が重要ではないものであるためである。
【０１２７】
本発明において使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法によって合成することができる（例えば、ＥＰ４６８５２０参照、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。便宜には、そのようなオリゴヌクレオチドは自動合成装置を利用して合成することができる。
【０１２８】
本発明のある態様によれば、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するためのものである。
【０１２９】
加えて、本発明のある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中に存在する１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するためのものである。
【０１３０】
従って、前記免疫原性組成物は、前記免疫原性組成物において表されているクレードに対する同種免疫応答の誘導だけでなく、前記組成物中に存在する抗原株には含まれないクレードに対する交差反応性免疫応答の誘導も可能である。よって、前記免疫原性組成物は、複数のクレードの複数のＨＩＶ−１株による疾患または感染症を幅広く治療または予防することができる。
【０１３１】
便宜には、本発明の総ての実施形態において、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）から選択される。特に、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードは、クレードＢである。
【０１３２】
同様に便宜には、本発明の総ての実施形態において、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）から選択される。特に、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードは、クレードＡまたはＣから選択される。好適には、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードは、クレードＡおよびＣである。
【０１３３】
これらのＨＩＶ−１クレードは世界中で有病率の点で異なる。従って、本発明の免疫原性組成物は、その好適な使用地域が限定される必要はなく、世界中でＨＩＶ−１感染症および疾患を治療および予防するために使用することができる。
【０１３４】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対しても体液性免疫応答は誘導され得る。
【０１３５】
本発明において、体液性免疫応答は、強い抗原特異的抗体力価によって特徴付けられた。免疫応答は、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイによって検出された。強い体液性応答の誘導は、本発明の免疫原性組成物の幅広い免疫原性を示す。
【０１３６】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体への長期未発症者状態の付与に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体へも長期未発症者状態は付与され得る。
【０１３７】
長期未発症者（ＬＴＮＰ）は、ＨＩＶ−１感染症を制御する能力があることから、疾患の進行を予防することが可能なＨＩＶ−１感染患者である。そのような状態は、多くの場合、増殖能を有する多機能性ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在と関連している。
【０１３８】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対しても多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞は誘導され得る。
【０１３９】
便宜には、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのうちの２種以上を産生する。そのような細胞は多機能性であると考えることができる。この点に関して、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ２およびＩＦＮγを産生し、または前記ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ２およびＴＮＦαを産生し、または前記ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生する。好適には、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生する。ある実施形態では、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４０Ｌを発現する。
【０１４０】
多機能性表現型を示すＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導は、本発明の免疫原性組成物の幅広い免疫原性を示す。そのような多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在は、ＨＩＶ−１感染症およびウイルス血症の制御、例えば、長期未発症者における感染症および／または疾患の未発症と関連している。
【０１４１】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における漸進的ＣＤ４＋Ｔ細胞減少の防止に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体においても漸進的ＣＤ４＋Ｔ細胞減少は防止される。
【０１４２】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体においてもウイルス保有者は減少または消滅させ得る。
【０１４３】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における、多数で長期間効果のある数のＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体においても多数で長期間効果のある数のＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞は誘発され得る。
【０１４４】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するためのものである。便宜には、そのような実施形態では、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体においてもウイルス血症は制御または減少され得る。
【０１４５】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する抗ウイルス免疫応答の長期記憶の誘導に使用するためのものである。便宜には、該免疫原性組成物中の１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対しても抗ウイルス免疫応答の長期記憶は誘導され得る。
【０１４６】
好適には、前記抗ウイルス免疫応答は持続性抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を含んでなる。そのようなＴ細胞は、前記免疫原性組成物において表されているクレードだけでなく、前記免疫原性組成物において表されていないクレードの抗原にも応答して誘導されることから、それらは本発明による交差反応性免疫応答である。
【０１４７】
便宜には、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は少なくとも６ヶ月間存続する。「存続する」とは、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が初期誘導時と同等の表現型状態で長期間存在することができるということを意味する。例えば、最初の誘導時に前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が２種以上の特異的サイトカインを放出するならば、存続するＣＤ４＋Ｔ細胞は、長期間経過後、例えば、少なくとも６ヶ月後に同じサイトカインプロフィールを依然として示すであろう。
【０１４８】
好適には、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、６〜２４ヶ月間または９〜１８ヶ月間、例えば、１２ヶ月間存続する。
【０１４９】
従って、本発明はまた、ＨＩＶ感染症の治療または予防のための方法も提供し、その方法は、前記免疫原性組成物を対象に投与することおよび該対象において、前記免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対して、免疫応答を誘導することを含む。他の実施形態では、本発明は、本明細書において記載される組成物の使用のための方法を提供する。
【０１５０】
本発明の免疫原性組成物中に存在し得る抗原のうちの１種以上を含んでなる融合タンパク質は、ＷＯ２００６／０１３１０６において開示されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。抗原Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｇａｇおよびそれらの変異体および断片は、異なるＨＩＶ株全体にわたって比較的よく保存されていると考えられることから、免疫原性組成物において使用する融合タンパク質に含めるためにこれまでにも選択されており、あまり保存されていない抗原よりも異なるＨＩＶ株由来の抗原と交差反応する可能性が高い。しかしながら、融合タンパク質へのこれらの抗原の取り込みは、それらの抗原が天然タンパク質に該当しないため予測できない複雑な状況をもたらし得る。従って、融合タンパク質の生産は簡単ではなく、天然タンパク質と同様に機能するとは考えられない。
【０１５１】
本発明のある実施形態では、前記免疫原性組成物中の抗原のうちの２種、３種、４種以上は、融合タンパク質を形成するように融合される。
【０１５２】
便宜には、ＧａｇはＰｏｌと融合されまたはＰｏｌはＧａｇと融合され、ＰｏｌはＮｅｆと融合されまたはＮｅｆはＰｏｌと融合され、および／またはＮｅｆはＧａｇと融合されまたはＧａｇはＮｅｆと融合される。
【０１５３】
好適には、本発明の融合タンパク質において、Ｇａｇはｐ１７および／またはｐ２４であり、および／またはＰｏｌはＲＴである。
【０１５４】
特に、前記免疫原性組成物中の抗原は、Ｎｅｆ、ＲＴ、ｐ１７およびｐ２４を任意の順序で含んでなる融合タンパク質を形成するように融合されることが便宜である。好適には、前記抗原は、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７を含んでなる融合タンパク質を形成するように融合される。そのような融合タンパク質はＦ４として知られており、実施例において記載されている。
【０１５５】
融合タンパク質中の抗原は、相互に直接融合することができ、またはリンカー用いて融合することもできる。そのようなリンカーは、１個以上のアミノ酸を含んでなる異種アミノ酸配列を含んでなり得る。
【０１５６】
前記融合物中の抗原は、同じＨＩＶ株由来であってよく、同じＨＩＶ−１クレード内の異なる株由来であってよく、または異なるＨＩＶ−１クレードの異なる株由来であってもよい。
【０１５７】
一実施形態では、前記融合タンパク質中の抗原は、２種、３種または４種の異なるＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１株由来である。あるいは、前記融合タンパク質中の抗原の総ては、同じＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１株または株群由来である。
【０１５８】
本発明によるペプチドは他の抗原と組み合わせることができる。特に、これには、ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質またはそれらの断片または変異体が含まれ得る。ｅｎｖの好ましい形態はｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０である。このｅｎｖは、例えば、Ｒ２として知られているＨＩＶ−１クレードＢエンベロープクローンに由来する、ＷＯ００／０７６３１において記載されているエンベロープタンパク質、またはその断片または変異体であってよい。ｅｎｖはまた、Ｗ６１．Ｄとして知られているｇｐ１２０クローン、またはその断片または変異体であってもよい。
【０１５９】
よって、本発明はさらに、ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質またはその断片または変異体をさらに含んでなる、本発明による免疫原性組成物を提供する。明確にするために、本明細書において用いられる「断片」および「変異体」という用語の意味は上に定義されたとおりである。
【０１６０】
ある実施形態では、融合タンパク質を含んでなる、本発明の免疫原性組成物は、抗原を含んでなる１種以上の非融合ポリペプチドをさらに含んでなる。
【０１６１】
一実施形態では、前記非融合ポリペプチド中の抗原は、前記融合タンパク質中の抗原の少なくとも１種と同じクレードのＨＩＶ−１株由来である。
【０１６２】
あるいは、前記非融合ポリペプチド中の抗原は、前記融合タンパク質中の１種以上のクレードとは異なるＨＩＶ−１株由来である。
【０１６３】
一実施形態では、前記非融合ポリペプチドはＥｎｖを含んでなる。例えば、前記非融合ポリペプチドは、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０のうちの１種以上を含んでなる。
【０１６４】
ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は、宿主細胞への付着に用いられるウイルスタンパク質である。ｇｐ１２０タンパク質は中和抗体の主要な標的であるが、残念ながら、該タンパク質の最も免疫原性の高い領域（Ｖ３ループ）は該タンパク質の最も可変性の高い部分でもある。ｇｐ１２０タンパク質はまた、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるエピトープも含む。これらのエフェクター細胞は、ウイルス感染細胞を消滅させることができるため、第２の主要な抗ウイルス免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域とは対照的に、いくつかのＣＴＬエピトープは異なるＨＩＶ−１株の間で比較的保存されていると思われる。このような理由で、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０は、細胞性免疫応答（特にＣＴＬ）の誘発を目的とするワクチンにおける有用な抗原成分であり得る。
【０１６５】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物において、該免疫原性組成物中の１種以上の抗原のうちの１種は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋから選択されるクレード、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）のいずれか１種のＨＩＶ−１由来である。該免疫原性組成物中に２種以上の抗原が存在する場合には、全抗原は同じクレードのものであってよい。
【０１６６】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物において、前記免疫原性組成物中の１種以上の抗原のうちの１種はクレードＢのＨＩＶ−１株由来である。
【０１６７】
例えば、ある特定の実施形態では、前記免疫原性組成物中に２種の抗原が存在する場合、両方の抗原はクレードＢのＨＩＶ−１株由来であり、または前記免疫原性組成物中に３種の抗原が存在する場合、３種の抗原総てはクレードＢのＨＩＶ−１株由来であり、または前記免疫原性組成物中に４種の抗原が存在する場合、４種の抗原総てはクレードＢのＨＩＶ−１株由来である、などである。
【０１６８】
あるいは、本発明の免疫原性組成物において、該免疫原性組成物中の１種以上の抗原のうちの１種はクレードＣのＨＩＶ−１株由来である。
【０１６９】
例えば、ある特定の実施形態では、前記免疫原性組成物中に２種の抗原が存在する場合、両方の抗原はクレードＣのＨＩＶ−１株由来であり、または前記免疫原性組成物中に３種の抗原が存在する場合、３種の抗原総てはクレードＣのＨＩＶ−１株由来であり、または前記免疫原性組成物中に４種の抗原が存在する場合、４種の抗原総てはクレードＣのＨＩＶ−１株由来である、などである。
【０１７０】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、免疫保護量または免疫治療量のポリペプチドを含有し、それらは従来技術によって調製することができる。
【０１７１】
一実施形態では、前記免疫原性組成物の１回投与量における各抗原の総量は、０．５〜２５μｇ、２〜２０μｇ、５〜１５μｇまたはおよそ１０μｇである。
【０１７２】
好適には、前記免疫原性組成物の１回投与量における融合タンパク質の総量は１０μｇであり、および／または前記免疫原性組成物の１回投与量における非融合ポリペプチドの総量は２０μｇである。
【０１７３】
一実施形態では、前記免疫原性組成物の１回投与量における全抗原の総量は、０．５〜５０μｇ、２〜４０μｇ、５〜３０μｇ、７〜２０μｇまたはおよそ３０μｇ、およそ２０μｇまたはおよそ１０μｇである。
【０１７４】
前記免疫原性組成物の投与量におけるタンパク質の量は、典型的な受容者において重大な有害副作用を起こさずに免疫応答を誘導する量として選択される。そのような量は、採用される具体的な免疫原や選択される投与計画またはワクチン接種計画に応じて変動するであろう。特定の免疫原性組成物に最適な量は、対象における関連免疫応答の観察を含む標準的な調査によって確認することができる。
【０１７５】
医薬組成物の投与は、例えば、同じポリペプチドを含有する組成物の反復投与として、または異種「プライムブースト」ワクチン接種計画において、単回投与または複数回投与の形をとることができる。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、対象に２回または３回投与として最初に投与され、ここで、該投与は、２週間〜３ヶ月、好ましくは１ヶ月の期間の間隔がおかれる。
【０１７７】
便宜には、前記組成物は、対象に（例えば、追加免疫として）６〜２４ヶ月または９〜１８ヶ月おきに、例えば、年１回投与される。例えば、前記組成物は、対象に（例えば、追加免疫として）６ヶ月または１年の間隔で投与される。
【０１７８】
好適には、この点に関して、前記対象への前記組成物の後の投与は、同じ対象への前記組成物の先行投与の免疫応答を高める。
【０１７９】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防における使用のために、プライムブースト治療計画の一環として使用される。
【０１８０】
便宜には、前記組成物は初回免疫量である。あるいは、前記組成物は追加免疫量である。
【０１８１】
好適には、２回以上の初回免疫量および／または追加免疫量が投与される。
【０１８２】
異種プライムブースト治療計画は、プライムおよびブーストにおいて異なる形態の免疫原性組成物またはワクチンの投与を用い、プライムおよびブーストの各々は、それ自体、２回以上の投与を含んでよい。初回免疫用組成物および追加免疫用組成物はともに少なくとも１種の抗原を含むが、それは同一形態の抗原である必要はなく、同じ抗原の異なる形態であってよい。
【０１８３】
本発明によるプライムブースト免疫は、同種プライムブースト治療計画または異種プライムブースト治療計画であってよい。同種プライムブースト治療計画は、プライムおよびブーストに同じ組成物、例えば、本発明の免疫原性組成物を用いる。
【０１８４】
異種プライムブースト治療計画は、タンパク質およびＤＮＡに基づく処方物の組合せを用いて実施することができる。そのような戦略は、幅広い免疫応答の誘導に効果的であると考えられる。アジュバント添加タンパク質ワクチンは、主に抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を誘導するが、一方、プラスミドまたは組換えベクターとしてのＤＮＡの送達では強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導される。このように、タンパク質およびＤＮＡワクチン接種の組合せによって様々な免疫応答を提供することができる。中和抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＩＶ−１に対する免疫防御に重要であると考えられるため、これはＨＩＶに関して特に重要性がある。
【０１８５】
一実施形態では、ＤＮＡはウイルスベクターで送達される。例えば、該ウイルスベクターはアデノウイルスから得られ得る。さらなる実施形態では、該ウイルスベクターはＵＳ２０１０００５５１６６に記載されているとおりであってよく、この文献はウイルスベクターおよびプライムブースト法の開示内容について引用することにより本明細書の一部とされる。別の実施形態では、該ウイルスベクターは麻疹ウイルスから得られ得る。さらなる実施形態では、該ウイルスベクターは、ＷＯ２０１０／０２３２６０に記載されている組換え麻疹ベクターであってよく、この文献はウイルスベクターおよびプライムブースト法の開示内容について引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１８６】
従って、本発明はまた、ＨＩＶ感染症の治療または予防のための方法も提供し、その方法は、第１の組成物を対象に投与することおよび第２の組成物を該対象に後に投与することを含み、ここで、投与後に、該対象は、該対象において、該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対して、検出可能な免疫応答を示す。代替実施形態では、該方法は同種プライムブースト治療計画または異種プライムブースト治療計画であってよい。
【０１８７】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物はワクチン組成物である。
【０１８８】
ワクチン調製は、New Trends and Developments in Vaccines(Voller et al.編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978)において一般的に記載されており、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１８９】
本発明のさらなる態様において、上の総ての例に記載されているＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用が提供される。
【０１９０】
本発明のさらなる態様において、上記の総ての例による、ＨＩＶ−１疾患または感染症を治療または予防する方法が提供され、その方法は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与する工程を含んでなる。
【０１９１】
本明細書における「含んでなる(comprising)」、「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprises)」という用語は、あらゆる場合において、それぞれ、「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」および「からなる(consists of)」という用語と場合によって置換可能であることが本発明者らによって意図される。
【０１９２】
本発明の「免疫原性組成物」に関する本明細書における実施形態はまた、本発明の「ワクチン」に関する実施形態にも適用可能であり、逆の場合も同じである。
【０１９３】
本発明がよりよく理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、単に例示を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されてはならない。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例およびデータによって本発明を説明するが、それらは本発明を限定するものではない。
【０１９５】
１．アジュバント調製物
有機溶媒中の脂質（卵黄由来または合成のホスファチジルコリンなど）およびコレステロールおよび３Ｄ−ＭＰＬの混合物を真空下（あるいは不活性ガス流下）で乾燥させた。次いで、水溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）を加え、脂質が総て懸濁状態になるまで容器を攪拌した。次いで、この懸濁液を、リポソームサイズが約１００ｎｍに減少するまでマイクロ流動化し、その後、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。この工程の代わりに押し出しまたは超音波処理を行ってもよい。
【０１９６】
典型的には、コレステロール：ホスファチジルコリン比は１：４（ｗ／ｗ）であり、水溶液を加え、１０ｍｇ／ｍｌの最終コレステロール濃度を得た。
【０１９７】
リポソームはおよそ１００ｎｍのサイズを有し、ＳＵＶ（小さな一枚膜リポソーム(small unilamelar vesicles)）と呼ぶ。リポソームはそれら自体が長期にわたって安定しており、融合能力を有していない。
【０１９８】
滅菌した多量のＳＵＶをＰＢＳに加えた。ＰＢＳ組成は、Ｎａ２ＨＰＯ４：９ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４：４８ｍＭ；ＮａＣｌ：１００ｍＭ  ｐＨ６．１であった。ＱＳ２１水溶液をＳＵＶに加えた。３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１の終濃度は、それぞれ、１００μｇ／ｍｌであった。成分の各添加の間に、中間生成物を５分間攪拌した。ｐＨを確認し、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて６．１＋／−０．１に調整した。
【０１９９】
２．ＨＩＶ−１抗原の調製
２．１  ＨＩＶ−１  ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合物（「Ｆ４」）およびＦ４のコドン最適化型（ｃｏ）（「Ｆ４ｃｏ」）の構築および発現。
２．１．１  Ｆ４の非コドン最適化型
ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４（キャプシドタンパク質）およびｐ１７（基質タンパク質）、逆転写酵素およびＮｅｆタンパク質を、バクテリオファージＴ７プロモーター（ｐＥＴ発現系）の制御下で、大腸菌(E. coli)Ｂ８３４株（Ｂ８３４（ＤＥ３）は、ＢＬ２１（ＤＥ３）のメチオニン要求性親株である）において発現させた。
【０２００】
それらを、４種のタンパク質の完全配列を含有する単一融合タンパク質として発現させた。成熟ｐ２４コード配列はＨＩＶ−１  ＢＨ１０分子クローンに由来し、成熟ｐ１７配列およびＲＴ遺伝子はＨＸＢ２に由来し、Ｎｅｆ遺伝子はＢＲＵ分離株に由来する。
【０２０１】
誘導後、組換え細胞は、総タンパク質の１０％になる著しいレベルのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合物を発現した。
【０２０２】
細胞を２２℃で増殖させ誘導した場合、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質は主として細菌溶解物の可溶性画分（凍結／融解後でも）に限定され。３０℃で増殖させた場合、およそ３０％の組換えタンパク質が不溶性画分に存在した。
【０２０３】
融合タンパク質ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７は、１１３６個のアミノ酸で構成されており、およそ１２９ｋＤａの分子量を有する。全長タンパク質はＳＤＳゲル上で約１３０ｋＤａに移動する。このタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づいて理論等電点（ｐＩ）７．９６を有し、これは２Ｄ−ゲル電気泳動によって確認される。
【０２０４】
組換えプラスミドの詳細：
名称：        ｐＲＩＴ１５４３６（または研究室における名称  ｐＥＴ２８ｂ／ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７）
宿主ベクター：ｐＥＴ２８ｂ
レプリコン：  ｃｏｌＥ１
選択：        カナマイシン
プロモーター：Ｔ７
インサート：  ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合遺伝子。
【０２０５】
組換えタンパク質の詳細：
ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質：１１３６個のアミノ酸。
Ｎ末端−ｐ２４：２３２ａ．ａ．−ヒンジ：２ａ．ａ．−ＲＴ：５６２ａ．ａ．−ヒンジ：２ａ．ａ．−Ｎｅｆ：２０６ａ．ａ．−Ｐ１７：１３２ａ．ａ．−Ｃ末端
【０２０６】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列：
ヌクレオチド配列
【化１】
2013523617.tif 000002
2013523617.tif 000003
［配列番号７］
ｐ２４配列を太字で示している
Ｎｅｆ配列には下線を施している
囲み：遺伝子構築によって導入されたヌクレオチド
【０２０７】
アミノ酸配列
【化２】
2013523617.tif 000004
［配列番号８］
Ｐ２４配列：アミノ酸１−２３２（太字）
ＲＴ配列：アミノ酸２３５−７９５
Ｎｅｆ配列：アミノ酸７９８−１００２
Ｐ１７配列：アミノ酸１００５−１１３６
囲み：遺伝子構築によって導入されたアミノ酸
Ｋ（リジン）：トリプトファン（Ｗ）の代わり。酵素活性をなくすために導入された突然変異。
【０２０８】
組換えタンパク質の発現：
ｐＥＴプラスミドにおいて、標的遺伝子（ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７）は強いバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にある。このプロモーターは、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識されず、宿主細胞におけるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの起源に依存する。Ｂ８３４（ＤＥ３）宿主細胞はｌａｃＵＶ５の制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含み、その発現は細菌培養物へのＩＰＴＧの添加によって誘導される。
【０２０９】
前培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で対数増殖期中期（Ａ６２０：０．６）まで増殖させ、その後４℃で一晩保存した（定常期培養物を避けるため）。培養物を、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補給したＬＢＴ培地で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基礎組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する（ｃＡＭＰ媒介性ｌａｃＵＶ５プロモーター抑制を回避する）。
【０２１０】
４℃で一晩保存した培養物１０ｍｌを用いて、カナマイシン含有ＬＢＴ培地（グルコース不含）２００ｍｌに接種した。培養物を３０℃および２２℃で増殖させ、Ｏ．Ｄ．６２０が０．６に達したときに、ＩＰＴＧを添加した（最終濃度１ｍＭ）。培養物をさらに３時間、５時間および１８時間（一晩）インキュベートした。誘導前および誘導から３時間後、５時間後および１８時間後にサンプルを採取した。
【０２１１】
抽出物の調製は以下の通りであった：
細胞ペレットを破砕バッファー＊中に（理論Ｏ．Ｄ．１０に）懸濁し、フレンチプレスに（２０．０００ｐｓｉまたは１２５０バール（bars）で）４回通すことによって破壊した。粗抽出物（Ｔ）を２０．０００ｇで３０分間遠心分離機にかけ、可溶性（Ｓ）画分と不溶性（Ｐ）画分を分離した。
＊破砕バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（一式／Boerhinger）。
【０２１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析：
不溶性ペレット（Ｐ）、上清（Ｓ）および粗抽出物（Ｔ）に対応する画分を１０％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動した。ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７組換えタンパク質をクーマシーブルー染色およびウエスタンブロット（ＷＢ）により検出した。
【０２１３】
クーマシー染色：ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質は以下のように現れる：
±１３０ｋＤａ付近に１つのバンド（算出ＭＷと一致している）
ＭＷ理論値：  １２８．９７０ダルトン
ＭＷ見かけ値：１３０ｋＤａ
【０２１４】
ウエスタンブロット解析：
試薬＝    −ＲＴ（ｐ６６／ｐ５１）に対するモノクローナル抗体
ABI(Advanced Biotechnologies)から購入
希釈度：１／５０００
−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体
希釈度：１／７５００
【０２１５】
発現レベル：    ２２℃で２０時間誘導後に総タンパク質の最大１０％を示す（図９Ａを参照のこと）非常に強いｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７特異的バンド。
【０２１６】
組換えタンパク質「溶解性」：
「新鮮な」細胞抽出物（Ｔ画分、Ｓ画分、Ｐ画分）：２２℃／２０時間の増殖／誘導を行った場合、ほぼ総てのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質が細胞抽出物の可溶性画分において回収される（図９Ａ）。３０℃／２０時間の増殖／誘導を行った場合、およそ３０％のｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質が不溶性画分に存在する（図９Ａ）。
【０２１７】
「凍結／融解」（Ｓ２画分、Ｐ２画分）：
可溶性（Ｓ１）画分（２２℃で２０時間の誘導）を−２０℃で保存した。融解し、２０．０００ｇ／３０分間で遠心分離機にかけた：Ｓ２およびＰ２（１／１０容量に再懸濁した）
【０２１８】
ＤＴＴを含む破砕バッファー：ほぼ総てのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質は依然として可溶性であった（１〜５％のみ沈降した）（図９Ｂを参照のこと）
【０２１９】
ＤＴＴを含まない破砕バッファー：８５〜９０％のｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７は依然として可溶性であった（図９Ｂ）
【０２２０】
Ｆ４タンパク質を、下記で確認される精製方法を用いて精製した。
【０２２１】
２．１．２  Ｆ４のコドン最適化型
以下のポリヌクレオチド配列は、そのコドン使用頻度が、大腸菌において高度に発現される遺伝子におけるコドン使用頻度と類似するようにコドン最適化されている。そのアミノ酸配列は、Ｆ４の非コドン最適化型について上に示したものと同一である。
【０２２２】
Ｆ４ｃｏのヌクレオチド配列：
【化３】
2013523617.tif 000005
2013523617.tif 000006
［配列番号９］
ｐ２４配列を太字で示している
Ｎｅｆ配列には下線を施している
囲み：遺伝子構築によって導入されたヌクレオチド
【０２２３】
Ｆ４の非コドン最適化型に関して用いた手法をコドン最適化配列に適用した。
【０２２４】
組換えプラスミドの詳細：
名称：        ｐＲＩＴ１５５１３（研究室における名称：ｐＥＴ２８ｂ／ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７）
宿主ベクター：ｐＥＴ２８ｂ
レプリコン：  ｃｏｌＥ１
選択：        カナマイシン
プロモーター：Ｔ７
インサート：  ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合遺伝子、コドン最適化型
【０２２５】
Ｆ４のコドン最適化型遺伝子を、Ｂ８３４（ＤＥ３）株のｒｅｃＡ−誘導体である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞において発現させた。ＲｅｃＡ突然変異は推定されるλファージ生産を防止する。
【０２２６】
前培養物を、振盪フラスコ中、３７℃で対数増殖期中期（Ａ６２０：０．６）まで増殖させ、その後４℃で一晩保存した（定常期培養物を避けるため）。
【０２２７】
培養物を、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補給したＬＢＴ培地で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基礎組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する（ｃＡＭＰ媒介性ｌａｃＵＶ５プロモーター抑制を回避する）。
【０２２８】
４℃で一晩保存した培養物１０ｍｌを用いて、カナマイシン含有ＬＢＴ培地（グルコース不含）２００ｍｌに接種した。培養物を３７℃で増殖させ、Ｏ．Ｄ．６２０が０．６に達したときに、ＩＰＴＧを添加した（最終濃度１ｍＭ）。培養物をさらに１９時間（一晩）、２２℃でインキュベートした。誘導前および誘導から１９時間後にサンプルを採取した。
【０２２９】
抽出物の調製は以下の通りであった：
細胞ペレットを、サンプルバッファー中に（理論Ｏ．Ｄ．１０に）再懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに直接ロードした。
【０２３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析：
粗抽出物サンプルを１０％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動した。
ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７組換えタンパク質をクーマシーブルー染色（図１０）およびウエスタンブロットにより検出する。
【０２３１】
クーマシー染色：ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質は以下のように現れる：
±１３０ｋＤａ付近に１つのバンド（算出ＭＷと一致している）
ＭＷ理論値：  １２８．９６７ダルトン
ＭＷ見かけ値：１３０ｋＤａ
【０２３２】
ウエスタンブロット解析：
試薬＝    −ウサギポリクローナル抗ＲＴ（ウサギＰＯ３Ｌ１６）
希釈度：１／１０．０００
−ウサギポリクローナル抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ（ウサギ３８８）
希釈度  １／１０．０００
−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体
希釈度：１／７５００
【０２３３】
２２℃で１９時間かけての誘導後に、組換えＢＬＲ（ＤＥ３）細胞は、総タンパク質の１０〜１５％に及ぶ非常に高いレベルでＦ４融合物を発現した。
【０２３４】
天然遺伝子由来のＦ４と比較して、コドン最適化遺伝子のＦ４組換え産物プロフィールは少し単純化されている。６０ｋＤａの主要なＦ４関連バンドだけでなく、それより小さい弱いバンドも消失した（図１０を参照のこと）。
【０２３５】
２．２  Ｆ４ｃｏ  ＧＭＰロットの調製
前培養物を、大腸菌(Escherichia coli)株Ｂ１９７７の凍結種培養物を用いて調製した。この株は、Ｆ４をコードするコドン最適化配列（Ｆ４ｃｏ）を含有するｐＥＴ２８ｂ誘導体で形質転換したＢＬＲ（ＤＥ３）株である。種培養能はおよそ１Ｅ＋１０コロニー形成単位／ｍｌと決定された。
【０２３６】
種培養物を室温に融解し、５００μｌを用いて、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補給した前培養培地４００ｍｌが入った２リットルエルレンマイヤーフラスコ（バッフルなし）に接種した（出典、Zabriskie et al.(J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))から、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０２３７】
次いで、接種したフラスコを３７℃（±１℃）および２００ｒｐｍでインキュベートした（New Brunswick Scientific社製Ｉｎｎｏｖａ  ４４３０、ストローク１インチを使用）。６５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６５０ｎｍ）が２に達したとき（これはおよそ５時間３０分のインキュベーションに相当する）に前培養を停止させた。停止直後に前培養物を接種に用いた。
【０２３８】
大型発酵槽への接種が必要である場合、複数のバッチの前培養物を合わせてもよい。
【０２３９】
２．３  Ｆ４ｃｏ（ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７）の精製−大腸菌株Ｂ１９７７
２．３．１  概要
融合構築物Ｆ４ｃｏを精製するために、２つのクロマトグラフィー工程ならびに最終バッファー交換およびタンパク質リフォールディングのためのダイアフィルトレーションを含む精製プロセスを使用することができる。そのような方法は以下の主要工程を含む：
・ＯＤ９０での細胞ペーストホモジナイゼーションおよび８Ｍ尿素の添加
・ＣＭ  ｈｙｐｅｒＺでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ポジティブモード）
・ＱＡＥ  ５５０Ｃでの陰イオン交換クロマトグラフィー（ポジティブモード）
・タンジェンシャルフローフィルトレーション
・滅菌濾過
【０２４０】
１．５ｌホモジネートＯＤ９０の最終開発規模で３つの再現性バッチを生産することに成功した。３つの異なる細胞培養収穫物から得られた一貫した結果によって精製プロセスのロバスト性（robustness）が立証された。
【０２４１】
３つのロットによって１．３〜１．６ｇの間のＦ４ｃｏが生産された。全長産物の純度は、産物の不均一性から約９３〜９４％であった（クーマシーブルー染色したＳＤＳゲルの密度スキャン）。
【０２４２】
下に、３つの再現性バッチを用いて得られた結果を示す。
【０２４３】
３．３．２  解析方法
ローリー法を用いて総タンパク質濃度を決定した。
【０２４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、還元または非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（＋／−β‐メルカプトエタノール）でサンプルを調製し、９５℃で５分間加熱した。
１ｍｍ厚の、プレキャストＮｕＰａｇｅゲルまたはＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴゲル(Bio-Rad)のいずれかを用い、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で１５０Ｖで９０分間、タンパク質を分離した。
クーマシーブルーＲ２５０を用いてタンパク質を可視化した。
【０２４５】
抗Ｆ４ウエスタンブロットについては、染色していないＳＤＳゲルからタンパク質をニトロセルロース膜(Bio-Rad)に４℃で７０Ｖで２時間または３０Ｖで一晩、転写した。抗Ｆ４抗体を用いてＦ４を検出した。アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体(Promega)を一次抗体に結合させ、タンパク質バンドを、基質としてＢＣＩＰおよびＮＢＴを用いて可視化した。
【０２４６】
抗大腸菌ウエスタンブロットについては、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写した。残りの宿主細胞タンパク質を、ポリクローナル抗大腸菌抗体を用いて検出した。上記のように、アルカリ性ホスファターゼ反応を用いてタンパク質バンドを可視化した。
【０２４７】
サンプルを、無菌状態のエッペンドルフカップ中で異なる温度（通常、−２０℃、４℃、ＲＴ、３０℃）において安定性試験に付した。サンプルを指定時間インキュベートし、その後、Ｆ４分解を検出するために還元性条件においてまたは凝集体を検出するために非還元性条件において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０２４８】
分析的ＳＥＣについては、分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０カラム(Amersham Biosciences)において１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ８．５−０．４Ｍアルギニン−１０ｍＭ亜硫酸ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡにより流速０．５ｍｌ／分でタンパク質を分離した。タンパク質の溶出を２８０ｎｍにおいてオンラインでモニタリングした。
【０２４９】
ＬＡＬ試験を採用し、Bio Whittaker社製のキットを用いて精製バルク中のエンドトキシンを測定した。大腸菌０５５：Ｂ５エンドトキシンを標準として用いた。９６ウェル分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ２５０、Molecular Devices）により３７℃で反応曲線を記録し、それらのデータを、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏを使用して解析した。
【０２５０】
Roche社製の尿素／アンモニア試験キットを用いて残留尿素を測定した。分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＩＩ、Pharmacia）を使用して、ＮＡＤＨの吸光度を３４０ｎｍにおいてモニタリングした。
【０２５１】
３．３．３  精製プロセス
【化４】
2013523617.tif 000007
【０２５２】
２．３．４  再現性ロットの結果
追跡調査
典型的な例としてロット１の精製追跡調査を図１１に示す。Ｆ４ｃｏ陽性画分だけをこのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに対応する抗Ｆ４ウエスタンブロットにおいて解析した。
【０２５３】
図３Ａのゲルでは、タンパク質の純度が高まるにつれて約１３０ｋＤａに位置する全長Ｆ４ｃｏバンドの増加が見られる。レーン２はホモジネートにおけるＦ４ｃｏの割合を示している。Ｆ４ｃｏはＣＭ溶出液中に回収され、多くのＨＣＰは消滅した（レーン３）。最終産物純度は第２の精製工程後にＱＡＥ溶出液においてすでに得られた（レーン４）。Ｆ４ｃｏは限外濾過後に保持液において変化しておらず（レーン５）、レーン６は精製産物を表している。産物の不均一性からＳＤＳゲルにおいていくつかの低分子量バンドが目に見える；これらのバンドは図３Ｂの抗Ｆ４ｃｏウエスタンブロットにおいても検出された。
【０２５４】
純度
産物の一貫性を確認するために、３つの精製バルクを、ＣＢ染色したＳＤＳゲルおよび抗Ｆ４ウエスタンブロットにおいて比較し、それらを図１２Ａおよび図１２Ｂに示している。加えて、各タンパク質に対して向けられる抗体を用いてウエスタンブロットを行った（図１３Ａ〜図１３Ｄの抗ｐ２４、抗ＲＴ、抗Ｎｅｆ−Ｔａｔおよび抗ｐ１７−Ｈｉｓ）。
【０２５５】
ＳＥＣ分析
分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーＳＥＣ分析により３つの精製バルクをさらに比較した。３つのクロマトグラムは下記図１４において比較している。
【０２５６】
図１２ＡのＳＤＳゲルならびに図１２Ｂおよび図１３Ａ〜図１３Ｄのウエスタンブロットにおいて明らかなＦ４ｃｏのタンパク質パターンの類似性だけでなく、図１４のＳＥＣカラムからのほぼ同一の溶出プロフィールからも、非常に良好なロット間一貫性が示される。
【０２５７】
全長Ｆ４ｃｏバンドおよび低分子量（ＬＭＷ）バンドはＳＤＳゲルおよびウエスタンブロットにおいて同じような強度で現れる。ゲルにおいて目に見えるＬＭＷバンドは明らかに産物に関連するものである：それらは、抗Ｆ４抗体および／または各タンパク質に対して向けられる抗体によって認識されるが、下記図１５の抗大腸菌ウエスタンブロットでは検出されなかった。
【０２５８】
抗大腸菌ウエスタンブロットは、各精製バルクのレーンにつき１０μｇのタンパク質を用いて行った。可視バンドの不在は産物の純粋性のさらなる指標であり、それによってＳＤＳゲルにおける可視バンドは産物に関連するものであることが示される。標準（０．１〜１μｇホモジネート）との比較によって、３つの精製バルク総てにおいて残留ＨＣＰ混入は一貫して１％未満であったことが示される。
【０２５９】
まとめると、これらの総てのデータによって、産物の純粋性および不純物の不在だけでなく、Ｆ４ｃｏの不均一性もまた示される。重要なことは、それらのデータが異なる発酵バッチからの精製材料の優れたロット間一貫性を示しているということである。
【０２６０】
回収および収率
各精製工程後のＦ４ｃｏの回収率は、ＣＢ染色したＳＤＳゲルおよび総タンパク質の回収（ローリー試験によって測定されたタンパク質濃度）に基づいて評価した。
【０２６１】
図１６では、例としてロット３の生産中に採取された全画分を示している。ゲル上に置くサンプル容量は、各採取画分の容量と同じにし、図１６のレーン２ホモジネート容量と直接関係する。従って、全長Ｆ４ｃｏバンドの密度の目視検査によって回収率の評価が可能である。
【０２６２】
ＳＤＳゲルでは、レーン２のホモジネートおよび初期Ｆ４ｃｏ含量を示す。ＣＭカラムは、非清澄化ホモジネートから総てのＦ４ｃｏを捕捉したが、一方、膨大な量のＨＣＰは、ｐＨ７．０ではその樹脂と相互作用せず、ＦＴでは消滅した（レーン３）。前溶出液ではわずかな損失が観察され、それによって産物パターンは単純化され、ＨＣＰの除去は向上した。全長Ｆ４ｃｏは、３５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＣＭ溶出液においてほとんど定量的に回収された（レーン５）。
【０２６３】
Ｆ４ｃｏについての損失がほとんどないことが以下の工程で検出された。ＱＡＥカラムのＦＴおよび前溶出液ではさらなるＨＣＰバンドおよびＬＭＷ  Ｆ４ｃｏバンドの除去が見られる（レーン７およびレーン８）。ＱＡＥ溶出液では高いＦ４ｃｏ回収率および最終産物純度が得られた（レーン９）。
【０２６４】
限外濾過工程後に多少の産物損失があることに気づく。この損失は約１０〜１５％と評価され、濾液（レーン１１およびレーン１２）では著しい量のタンパク質が認められなかったことからこれはＵＦ膜上へのタンパク質吸着によって説明することができた。
【０２６５】
これらのＳＤＳゲルに基づいて、全体的なＦ４ｃｏ回収率は３つのロット総てにおいて５０％より高いようであった。
【０２６６】
３．ヒト被験者におけるＦ４の免疫原性
３．１  方法論
本実施例では、ＨＩＶ−１ワクチン候補は、投与量当たり１０μｇ、３０μｇまたは９０μｇのＦ４組換えタンパク質を有効成分として含み、それにＡＳ０１Ｂをアジュバントとして添加するかまたは注射水（ＷＦＩ）を用いて再構成した。
【０２６７】
ワクチン抗原は、スクロース、ＥＤＴＡ、アルギニン、ポリソルベート８０および亜硫酸ナトリウムを含むリン酸バッファー中にＦ４抗原を含有する凍結乾燥させたペレット(a lyophylized pellet)として調製した。ＡＳ０１Ｂリポソームに基づくアジュバント系は５０μｇＭＰＬおよび５０μｇＱＳ２１を含み、上記実施例１に従って調製した。
【０２６８】
Ｆ４抗原を含有する凍結乾燥画分ならびにＡＳ０１Ｂアジュバント系またはＷＦＩを含有する液体画分は、いずれも単回投与用３ｍｌガラスバイアルで与え、注射直前にワクチン投与者が再構成した。バイアル内容物の溶解後に、再構成されたワクチン溶液０．５ｍｌを筋肉内投与用シリンジに吸引した。
【０２６９】
参加者は、別のＨＩＶ−１ワクチン研究にこれまでに参加したことがなく、またはＭＰＬを受けたことがない、ＨＩＶ−１感染症のリスクが低い１８〜４０歳の健常な成人男女であった。被験者は、初回ワクチン接種前８週間以内の血清スクリーニング（総ての検査はＡｂｂｏｔｔ  ＡｘＳＹＭで）においてＨＢＶ（ＨＢｃ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のコア抗原に対する抗体に対して血清反応陰性であり、かつＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓ  Ａｇ）およびＨＩＶ−１  ｐ２４抗原に対して陰性であることが必要であった。ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖの登録事項に詳述されているとおり、本研究への登録には標準的な適格基準を用いた。
【０２７０】
１８０名の被験者をアジュバント添加群とアジュバント非添加群との間で５：１に無作為に割り付けた。各群５０名の被験者からなる３つの群は、ＡＳ０１Ｂ中１０μｇ、３０μｇまたは９０μｇのＦ４からなる漸増用量を受け、各群１０名の被験者からなる３つの群は、注射水（ＷＦＩ）中Ｆ４の漸増用量を受けた。本研究はアジュバンテーション(adjuvantation)については観察者盲検としたが、抗原含量についてはオープンとした。各被験者は、利き腕でない方の腕の三角筋内への注射によって、０ヶ月時に初回ワクチン投与を受け、第１ヶ月目に第２回目の投与を受けた。安全性および免疫応答の評価のために、ワクチン投与前（第０日目）、第２回目のワクチン投与から２週間後（第４４日目）および１ヶ月後（第６０日目）、ならびに第６ヶ月目（第１８０日目）および第１２ヶ月目（第３６０日目）に血液サンプルを得た。
【０２７１】
研究参加者の平均（±ＳＤ）年齢は２２．３（±４．６２）歳（範囲：１８〜４０歳）であり、６３．３％は女性であり、その割合は大部分が白人（９６．７％）であった。６つの研究群間ではベースライン統計に差異はなかった。被験者は総て、研究ワクチンの２回投与を受け、１８０名の被験者のうちの１７６名は本研究を完遂した。第１２ヶ月目のプロトコール免疫原性コホートには１５０名の被験者（８３．３％）が含まれた。解析からの除外理由を下に要約する。
【０２７２】
【化５】
2013523617.tif 000008
【０２７３】
【化６】
2013523617.tif 000009
【０２７４】
３．２  安全性
各ワクチン投与後７日間、予測される局所症状（注射部位の痛み、発赤、腫脹）、全身症状（発熱、疲労、頭痛、発汗、筋肉痛）および消化管症状（悪心、嘔吐、下痢、腹痛）をダイアリーカードに記録した。症状の重篤度を１〜３の段階で格付けし、段階３の症状は、発赤または腫脹が直径５０ｍｍを超えている場合、または発熱が３９．０℃より高い場合、その他の症状については通常の日常生活に支障をきたす場合と定義される。予測されない症状は各ワクチン投与後３０日間記録し、一方、重篤な有害事象（ＳＡＥ）は本研究を通して記録した。
【０２７５】
全ワクチン接種コホートにおいて反応原性および安全性の解析を行った。予測される局所症状および全身症状ならびに／または予測されない局所症状および全身症状を報告している被験者の数および割合を、厳密な９５％信頼区間（ＣＩ）を用いて算出した。安全性データについての正式な統計比較は行わなかった。
【０２７６】
各ワクチン投与後、ワクチン接種後の７日の間にＦ４／ＡＳ０１Ｂ群において、Ｆ４／ＷＦＩ群と比べて著しく高い反応原性が観察された（図１７）。ワクチン接種後の７日の間での予測される症状および予測されない症状の全発生率は、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群での投与の９９．０〜１００．０％であるのに対し、Ｆ４／ＷＦＩ群では４５．０〜７５．０％であった。さらに、全身症状の発生率は、第２回目のワクチン投与後にＦ４／ＡＳ０１Ｂ群においてより高かった。Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群では、投与全体のおよそ３分の１に段階３の症状が結果として生じた。これに対して、Ｆ４／ＷＦＩ群では、ワクチン接種に関連して、予測されるまたは予測されない段階３の症状は報告されなかった。
【０２７７】
Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群では抗原用量レベルの間で反応原性に差異は観察されなかった。最も多く見られる予測される局所症状は注射部位における痛みであった。それは、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群での投与の９６．０〜９８．０％で起こったのに対し、Ｆ４／ＷＦＩ群での投与の１０．０〜３０．０％であった。段階３の重篤度の注射部位における痛みは、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群での投与の≦１０．１％で起こった。発赤および腫脹はＦ４／ＡＳ０１Ｂ群でのみ報告され、それぞれ、投与の１９．０〜３５．０％および２０．０〜２５．０％で起こった。最も多く見られる予測される全身症状は、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群およびＦ４／ＷＦＩ群において、それぞれ、疲労（投与の６６〜７７％、３０〜４５％）および頭痛（投与の５８〜６２％、２０〜２５％）であった。段階３の予測される全身症状の投与当たり発生率全体は、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群では≦１２．１％であった。
【０２７８】
ワクチン接種後の３０日の間に、Ｆ４／ＷＦＩ群の被験者の５０．０〜７０．０％が予測されない症状を報告したのに対し、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群では被験者の６０．０〜８４．０％であった。Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群の被験者の３０．０〜４４．０％では症状は原因としてワクチン接種が関係していると考えられ（最も頻繁には、悪寒および注射部位の反応）、段階３の重篤度のものは少数であった。症状は、全体的に見て、一過性であり、一般的には２日または３日以内に後遺症なく消えた。本研究期間を通して、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群において６種のＳＡＥが報告された。総ては、ワクチン接種と無関係であると考えられ、後遺症なく消えた。本研究期間中に死亡は認められず、有害事象を理由に本研究から離脱した被験者はいなかった。
【０２７９】
３．３  Ｔ細胞応答
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、ｐ１７、ｐ２４、ＲＴおよびＮｅｆペプチドプールを用いた刺激後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により評価し、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびＣＤ４０−リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の発現を評価した。実施したＩＣＳは、これまでに記載されている方法論［Maecker HT, Maino VC, Picker LJ (2000) Immunofluorescence analysis of T-cell responses in health and disease. J Clin Immunol 20: 391-399およびMaecker HT, Dunn HS, Suni MA, Khatamzas E, Pitcher CJ, et al. (2001) Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokine flow cytometry. J Immunol Methods 255: 27-40を参照のこと、各々の文献は引用することにより本明細書の一部とされる］を適合させたものであり、採血後６時間以内での標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって全血細胞から単離されさらなる解析まで液体窒素中で低温保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた。
【０２８０】
簡潔には、融解したＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ４９ｄ抗体(BD Biosciences, Belgium)の存在下で、クレードＢのｐ１７、ｐ２４、ＲＴまたはＮｅｆ適合抗原の配列を包含する、１１個のアミノ酸の重複を有する１５ｍｅｒペプチドのプール(Eurogentec, Belgium)を用いてin vitroで刺激した。３７℃での２時間のインキュベーション後に、細胞内遮断薬であるブレフェルジンＡ(BD Biosciences, Belgium)を添加して、さらなる一晩のインキュベーション中のサイトカイン分泌を阻害した。その後、細胞を収穫し、表面マーカーであるＣＤ４＋およびＣＤ８＋(BD Biosciences)について染色し、次いで固定した（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット、BD Biosciences）。次いで、固定した細胞を細胞膜浸透化処理し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＣＤ４０Ｌに対する標識抗体(BD Biosciences)を用いて染色し、洗浄し、胎児仔ウシ血清含有リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア(BD Biosciences)またはＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Tree Star)を用いたフローサイトメトリーによって解析した。
【０２８１】
ワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞のクレード間交差反応性を評価するために、第０日目および第４４日目に採取したＰＢＭＣを、クレードＡおよびクレードＣ  ＨＩＶ−１株のコンセンサス配列のペプチドプールを用いてＣＤ４０Ｌの発現ならびにＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生についてＩＣＳにより解析した。ｐ２４およびｐ１７に用いたクレードＡ配列は、天然分離株ＴＺＡ１７３（タンザニア）に由来し、ＲＴおよびＮｅｆに用いたクレードＡ配列は、天然分離株ＫＥ  ＭＳＡ４０７０（ケニア）に由来する。全抗原のクレードＣ配列はＺＭ６５１株由来のものであった。この予備調査は上記のように行い、Ｆ４  １０μｇ／ＡＳ０１Ｂ群の被験者由来のサンプルでのみ行った。
【０２８２】
ＩＣＳの結果は、ｐ１７抗原、ｐ２４抗原、ＲＴ抗原またはＮｅｆ抗原を用いた刺激に応答して免疫マーカーであるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＣＤ４０Ｌをそれぞれ発現する、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞全体の頻度（単位パーセント）として表した。抗原特異的ＣＤ４＋応答がカットオフ値以上であるならば、被験者はレスポンダーと考えられた。０．０３％二重陽性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわち、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＣＤ４０Ｌから少なくとも２種のマーカーを発現する細胞）のカットオフ値は、異なる抗原に対して、９５パーセンタイルの二重陽性抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞全体の中での最大値（百未満切り上げ）に基づいて選択した。
【０２８３】
免疫原性の解析は、プロトコール遵守した免疫原性（ＡＴＰ）コホートにおいて行った。各単独抗原によるin vitro刺激後および少なくとも１種、２種、３種および４種総ての抗原によるin vitro刺激後のＩＬ−２および少なくとも１種の他のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度ならびにレスポンダーの割合を各時点において決定した。Ｆ４特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、各単独抗原に応答した特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度の合計として定義した。
【０２８４】
第２回目のワクチン投与の２週間後にアジュバントを添加したまたは添加しないＦ４の３回投与を比較するために、ＩＬ−２および少なくとも１種の他のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度について二元配置ＡＮＯＶＡ統計検定を行った。ＡＮＯＶＡモデルには固定効果として用量（１０μｇ、３０μｇおよび９０μｇ）およびアジュバント（ＡＳ０１ＢおよびＷＦＩ）を含めた。正規分布した応答を得るために、ＣＤ４＋Ｔ細胞のｌｏｇ１０頻度で解析を行った。分散の一様性の基準は、アジュバント添加群およびアジュバント非添加群の間では満たされなかった。
【０２８５】
用量とアジュバントとの間の相互作用は大部分の抗原（ｐ１７を除く）によるin vitro刺激について有意であり（ｐ≦０．０５）、ＡＳ０１ＢとＷＦＩとの間の差異は明らかに大きかったことから、第２回目の投与の２週間後（第４４日目）にＡＳ０１Ｂを添加したＦ４の３回投与を比較するために、ＩＬ−２および少なくとも１種の他のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のｌｏｇ１０頻度について一元配置ＡＮＯＶＡを行った。一元配置ＡＮＯＶＡモデルには固定効果として用量（１０μｇ、３０μｇおよび９０μｇ）を含めた。分散の一様性の基準は３つのＡＳ０１Ｂ群の間で満たされた。Ｆ４抗原およびその成分各々に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答についてＡＮＯＶＡ解析を実施した。
【０２８６】
多重比較（テューキー・クレーマー法(Tukey-Kramer adjustment)）を行い、用量とＣＤ４＋Ｔ細胞応答との関係も評価した。幾何平均（ＧＭ）比およびそれらのＣＩを表にした。解析は、Ｆ４抗原およびその成分各々に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答について行った。
【０２８７】
３．４  同種抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答
総てのアジュバント非添加ワクチン群において、ＩＬ−２をはじめとする少なくとも２種の免疫マーカーを発現する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、ほとんどの場合、カットオフ値より低いかまたはその値に近かった（図１８を参照のこと）。これに対して、総てのＦ４／ＡＳ０１Ｂ群において非常に高いレスポンダー率が観察された（図１９）。第２回目のワクチン投与の２週間後（第４４日目）に１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群において最大の割合のレスポンダーが見られた、総てのワクチン接種被験者が少なくとも３種の抗原に対して応答し、４種の抗原総てに対しては８０．４％が応答した。各抗原でのＣＤ４＋Ｔ細胞レスポンダー率を調査したときに（図２０）、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群における応答は非常に幅広く、４種のワクチン抗原総てに対して向けられるが、ＲＴ抗原を用いた刺激後に頻度がより高いことが明らかになった。
【０２８８】
１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群の被験者の９７．７％は、第３６０日目でも２種の抗原に対して応答し続けており、３種および４種の抗原に対してはそれぞれ、８４．１％および５９．１％が応答し続けていた（図１９）ことから、ワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は長く続いた。Ｆ４融合タンパク質に対する全体応答は、Ｆ４  １０μｇ／ＡＳ０１Ｂ群においてより大きくかつより持続的であった（第４４日目においてｐ＜０．０００１）（図２１）。この群では、ＩＬ−２および少なくとも１種の他のマーカーを産生するＦ４特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の幾何平均頻度は、第４４日目に１．２％近くでピークに達した。
【０２８９】
Ｆ４／ＡＳ０１Ｂワクチンは、１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群におけるそれらのサイトカイン共発現プロフィールによって示されるとおり、多機能性Ｆ４特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した（図２２）。特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ４０Ｌを発現し、ＩＬ−２を単独でまたはＴＮＦ−αおよび／もしくはＩＦＮ−γとともに産生した。Ｆ４特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のおよそ５０％は少なくとも２種のサイトカインを分泌し、このサイトカイン共発現プロフィールは第１２ヶ月目まで維持された（図２３）。単独抗原の総てで類似のプロフィールが観察された（図２４および図２５を参照のこと）。
【０２９０】
３．５  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答
ＩＣＳ方法に基づいて、ワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞はまだ検出されていない。
【０２９１】
３．６  異種抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答（クレード間交差反応性）
第４４日目の１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１Ｂ群におけるワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞応答についてのＨＩＶ−１非クレードＢ抗原との交差反応性を評価するために、クレードＡおよびクレードＣの抗原、ならびにクレードＢ抗原（対照として含めた）を用いたin vitro刺激後に応答を解析した。ｐ１７、ｐ２４、ＲＴおよびＮｅｆペプチドプールを用いたＩＣＳおよびフローサイトメトリー解析によって、クレードＡおよびクレードＣに属する４種の抗原総てに対して幅広い交差反応性を示すＣＤ４＋Ｔ細胞応答が明らかになった（図２６）。興味深いことに、１０μｇ  Ｆ４ｃｏ投与を受けたどのボランティアも同種クレードＢのＲＴおよびｐ２４に対する応答を起こし、クレードＡおよびクレードＣの対応抗原両方に対する応答も示した（図２７）。
【０２９２】
異なるクレード全体にわたるこれらの抗原でのエピトープ保存レベルが比較的低いことと比べると、そのような高いレベルの交差反応性が観察されることは驚くべきである。
【０２９３】
３．７  体液性免疫応答
ｐ１７、ｐ２４、ＲＴ、ＮｅｆおよびＦ４に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体応答についての血清における有無を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて解析した。各試験サンプルの相対濃度を評価するために、陽性対照およびキャリブレータを各プレートで実施し、特異性を確認するために陰性対照も実施した。ＶｅｒｓａＭａｘプレートリーダー(Molecular Devices, Berkshire, United Kingdom)において４５０ｎｍでプレート読み取り、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ３．１．１．ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて解析した。血清反応陽性は、アッセイカットオフ値以上（ｐ１７については≧１８７ｍＥＵ／ｍｌ、ｐ２４については≧１１９ｍＥＵ／ｍｌ、ＲＴについては≧１２５ｍＥＵ／ｍｌ、Ｎｅｆについては≧２３２ｍＥＵ／ｍｌ、Ｆ４については≧４２ｍＥＵ／ｍｌ）の抗体濃度として定義した。カットオフ値は、総ての被験者のワクチン接種前の応答に基づいて選択した。Ｎｅｆについてはワクチン接種前の時点での９５％パーセンタイルに基づいて、Ｆ４ｃｏ、ｐ１７、ｐ２４およびＲＴについてはワクチン接種前の時点での９９％パーセンタイルに基づいて選択を行った。
【０２９４】
各単独抗原および融合タンパク質についての血清反応陽性率および幾何平均抗体濃度（ＧＭＣ）を９５％ＣＩで算出した。血清反応陽性率については、二項変数の厳密法を用いて９５％ＣＩをコンピュータ計算した。ＧＭＣについての９５％ＣＩは、平均ｌｏｇ１０変換抗体濃度の９５％ＣＩの真数を求めることによって算出した。アッセイのカットオフより低い抗体濃度については、ＧＭＣ算出のためにカットオフの半分の任意の値を与えた。
【０２９５】
体液性免疫応答では、ＡＳ０１Ｂ群においてＦ４融合タンパク質に対する抗体濃度が強かった（図２８）。アジュバント添加群総てにおいてＦ４に対する１００％血清変換率が認められ、用量レベル総てについて類似のＩｇＧ力価を有し、これは第１２ヶ月目まで存続した。さらに、各単独Ｆ４抗原成分に対してもＩｇＧ抗体が誘発された。アジュバント非添加群では、非常に低い応答が誘導された（図２９を参照のこと）。
【０２９６】
３．８  結論
これらの結果は、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチンの反応原性プロフィールは、安全性への懸念なく、許容できたことを示している。加えて、免疫原性結果によって、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチン候補が多数で長期間効果のある数のＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することも分かった。特に重要なのは、アジュバント添加ワクチン群におけるレスポンダー率が全体的に高かったことであり、ワクチン抗原総てに対して応答が誘発された。興味深いことに、最高レスポンダー率は最低抗原用量群（１０μｇ  Ｆ４／ＡＳ０１）において観察され、３種のＨＩＶ−１抗原に対しては参加者の１００％が応答し、４種のＨＩＶ−１抗原総てに対しては８０％が応答した。アジュバント添加ワクチン群は、Ｆ４特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が非常に高いことが特徴であり、これは第１２ヶ月目まで存続した。
【０２９７】
多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞は単一サイトカイン産生細胞よりも機能的に優れていると考えられることから、ワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌを発現し、ＩＬ−２を単独でまたはＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γとともに産生したという発見は重要で有望な報告である。
【０２９８】
さらに、この研究の結果は、クレードＢ抗原単独で構成されるＦ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチンによって、クレードＡおよびクレードＣの４種の抗原総てに対しても幅広い交差反応性を示すＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することができたことを示している。世界でのＨＩＶ−１ウイルスの多様性を考えれば、幅広い交差反応性を示し長期間効果のある免疫応答の誘導は、ＨＩＶ−１ワクチンの開発における考慮すべき重要な事柄である。
【０２９９】
結論として、この研究の結果は、Ｆ４／ＡＳ０１Ｂアジュバント添加ＨＩＶ−１ワクチン候補の安全性および免疫原性を立証している。ＡＳ０１アジュバントを添加した、１０μｇのＦ４タンパク質を含有するワクチン２回投与により、幅広い反応性を示し持続する強い多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘導された。この免疫応答の特性によって、このワクチンは、予防状況においてだけでなく疾患修飾性治療ワクチンとしても有望なエイズワクチン候補となる。
【０３００】
４．異なるクレード由来のＦ４ｃｏの免疫原性
本実施例では、クレードＢおよびクレードＣ由来のコドン最適化Ｆ４によって誘発されるＴ細胞応答を、クレードＡ、クレードＢおよびクレードＣ由来のペプチドに対する交差反応性について試験した。
【０３０１】
４．１  方法論
免疫処置に用いるクレードＢ  Ｆ４ｃｏタンパク質は、実施例２に記載のとおり調製し、同じ配列を有する。
【０３０２】
免疫処置に用いるクレードＣ  Ｆ４ｃｏは、以下の配列を有するコンセンサスクレードＣ配列を用いて調製した：
【０３０３】
Ｆ４ｃｏクレードＣコンセンサス抗原のアミノ酸配列
【化７】
2013523617.tif 000010
［配列番号１０］
【０３０４】
クレードＣ  Ｆ４ｃｏをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列：
【化８】
2013523617.tif 000011
2013523617.tif 000012
（配列番号１１）
【０３０５】
各免疫処置では、Ｆ４ｃｏタンパク質に、ＡＳ０１Ｂを用いてアジュバント添加した。
【０３０６】
６〜８週齢の雌ＣＢ６Ｆ１（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスとＢａｌｂ／Ｃマウスのハイブリッド）に、ＡＳ０１Ｂアジュバント系において処方した５０μｌのＦ４ｃｏクレードＢまたはＦ４ｃｏクレードＣ（３μｇまたは９μｇ）を用いて、第０日目、第１４日目および第２８日目に３回筋肉内に免疫した。
【０３０７】
マウスを４群に割り当てた（各群動物４０匹）：
第１群：９μｇ  Ｆ４ｃｏクレードＢ／ＡＳ０１Ｂ
第２群：３μｇ  Ｆ４ｃｏクレードＢ／ＡＳ０１Ｂ
第３群：９μｇ  Ｆ４ｃｏクレードＣ／ＡＳ０１Ｂ
第４群：３μｇ  Ｆ４ｃｏクレードＣ／ＡＳ０１Ｂ
【０３０８】
第２回目および第３回目の免疫処置の７日後（それぞれ、７ｄ  ｐＩＩおよび７ｄ  ｐＩＩＩ）に、試験実施のために血液サンプルを採取した。第２回目および第３回目の投与の７日後に、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦαを分泌するＦ４ｃｏ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を決定した。
【０３０９】
簡潔には、４０匹のマウス／群の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を採取し、プールした（１０匹のマウス／群のもの４プール）。赤血球溶解を行った後、それらの細胞を丸型９６−ウェルプレートに１ウェル当たり１００万細胞でプレーティングした。次いで、それらの細胞を、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄの存在下で、Ｆ４ｃｏクレードＢ配列、Ｆ４ｃｏクレードＣ配列またはＦ４ｃｏクレードＡ配列を包含する重複１５ｍｅｒｓペプチド（１μｇ／ｍｌ／ペプチド）のプールを用いてin vitroで、３７℃で６時間再刺激した。ｐ２４およびｐ１７に関するクレードＡペプチド配列は、天然分離株ＴＺＡ１７３（タンザニア）由来のものであり、ＲＴおよびＮｅｆに関するクレードＡペプチド配列は、天然分離株ＫＥ  ＭＳＡ４０７０（ケニア）に由来する。クレードＣペプチド配列は、ＺＭ６５１株由来のものである（ｐ２４、ｐ１７、ＮｅｆおよびＲＴに関する）。クレードＢペプチドは、Ｆ４ｃｏクレードＢ抗原の配列（ｐ２４およびｐ１７はＢＨ１０株由来のもの、ＲＴはＨＸＢ２株由来のもの）およびＮｅｆはＢｒｕ−Ｌａｉ株由来のもの）を包含する。
【０３１０】
バックグラウンド応答のため、培地（ペプチド刺激を行わない）中に残っている細胞を陰性対照として用いた。ペプチドプールとの共培養から２時間後に、ブレフェルジンＡをウェルに添加し（サイトカイン分泌を阻害するため）、それらの細胞を４時間さらにインキュベートし、一晩  ℃で移動させた。その後、それらの細胞を以下のマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αについて染色し、ＬＳＲＩＩ(BD Biosciences, USA)およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Three Star)を用いたフローサイトメトリーによって解析した。
【０３１１】
４．２  ＣＤ４＋Ｔ細胞応答
Ｆ４ｃｏクレードＢ抗原またはＦ４ｃｏクレードＣ抗原によって誘導される特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の交差反応性を、マウスにおいて、クレードＡペプチド、クレードＢペプチドおよびクレードＣペプチドに対するＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の大きさを測定することによって評価した。
【０３１２】
全体として、Ｆ４ｃｏ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、Ｆ４ｃｏクレードＢ抗原およびＦ４ｃｏクレードＣ抗原の双方によって誘導され、総てのクレードのペプチドに対して変動する強度で観察された。ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、クレードＢ  Ｆ４ｃｏ抗原およびクレードＣ  Ｆ４ｃｏ抗原の双方で第３回目の投与後に増加した。
【０３１３】
Ｆ４ｃｏクレードＢ抗原が、クレードＢペプチドに対する最大レベルのＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導したことは、恐らく、該ペプチドが、免疫処置に用いたＦ４ｃｏクレードＢ抗原と全く同じ配列を有するという事実に起因すると思われる。Ｆ４ｃｏクレードＢ誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の交差反応性は、クレードＡペプチドおよびクレードＣペプチドに対して観察された。クレードＡペプチドおよびクレードＣペプチドに対する特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度は、クレードＢペプチドで観察された強度のおよそ半分であった（図３０〜図３２および図３６）。
【０３１４】
Ｆ４ｃｏクレードＣ抗原およびＦ４ｃｏクレードＢ抗原の双方によって誘発されたクレードＣ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の大きさは同等であった（図３２）。興味深いことに、交差反応性ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、Ｆ４ｃｏクレードＣ抗原によって誘導されたが、クレードＡペプチドおよびクレードＢペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強度は、クレードＣペプチドで得られた強度の半分を超えていた（図３０〜図３２および図３６）。
【０３１５】
予想どおり、応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、免疫処置に用いた抗原に関係なく、クレードＡペプチドに対して最も低く（図３０および図３６）、これは、Ｆ４ｃｏタンパク質に用いたクレードＢ配列およびクレードＣ配列とのこれらのペプチドの同一性パーセントが最も低いためである（図８）。
【０３１６】
加えて、第２回目および第３回目の免疫処置後に単離されたＦ４ｃｏ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は多機能性であることが見出され、各集団の半分を超えるものがＩＬ２ならびにＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαを発現した（データは示していない）。
【０３１７】
４．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答
クレードＢ抗原およびクレードＣ抗原双方によって誘導されたＦ４ｃｏ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答で観察されたレベルよりも全体的に低くかったが、動物のいくつかのプールではそれでも検出できた。ＣＤ４＋Ｔ細胞データと同様に、最大のＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＦ４ｃｏクレードＢ抗原によって誘導され、クレードＢペプチドに対して特異的であった。クレードＣペプチドおよびクレードＡペプチドに対する交差反応性は非常に低かった（図３３〜図３５および図３６）。Ｆ４ｃｏクレードＣ抗原は、クレードＣに対して特異的な、非常に低いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発したが、クレードＢペプチドおよびクレードＡペプチドに対する交差反応性も低い強度ではあるが検出できた。
【０３１８】
多機能性については、レスポンダーＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が低いことから、確実に解析できなかった。
【０３１９】
４．４  結論
この前臨床研究からのクレード間交差結果を図３６に要約している。クレードＡ、クレードＢおよびクレードＣに対する強い交差反応性Ｆ４ｃｏ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、Ｆ４ｃｏクレードＢ抗原およびＦ４ｃｏクレードＣ抗原の双方によって誘導され、それらの応答は多機能性であった。Ｆ４ｃｏ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は強くなかったが、クレード間交差応答は試験した３種のクレード総てにわたって検出できた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２４】
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【図２７】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月28日(2012.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、
ａ．ＨＩＶ−１抗原  Ｎｅｆ、ＰｏｌおよびＧａｇを含んでなる１種以上のポリペプチドであって、
Ｎｅｆ、ＰｏｌおよびＧａｇが、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋに属するＨＩＶ−１株、またはＨＩＶ−１組換え型流行株（ＣＲＦ）由来であるものと、
ｂ．Ｔｈ１免疫応答の優先的誘導物質であるアジュバント
とを含んでなる、
該免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｎｅｆ、ＰｏｌよびＧａｇが、クレードＢに属するＨＩＶ−１株由来である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
抗原が、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７を含んでなる融合タンパク質を形成する、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｅｎｖをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
アジュバントが、免疫学的活性サポニン画分、リポ多糖類、および必要に応じて免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記免疫学的活性サポニン画分がＱＳ２１であり、前記リポ多糖類がリピドＡ誘導体、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬであり、かつ、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＣｐＧモチーフを含んでなる、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
アジュバントが、リポソーム担体または水中油型エマルションを含んでなる、請求項５または６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、
サイトカインがＩＬ２、ＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαから選択される、組成物。
【請求項１０】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における漸進的ＣＤ４＋Ｔ細胞減少の防止に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体における、ＨＩＶ−１特異的多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株に対する長期免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に２回または３回投与として投与され、ここで、該投与は、２週間〜３ヶ月、好ましくは１ヶ月の期間の間隔がおかれる、免疫原性組成物。
【請求項１６】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に６〜２４ヶ月もしくは好ましくは９〜１８ヶ月おきに、または好ましくは年１回投与される、免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物がプライムブースト治療計画の一環として使用される、免疫原性組成物。
【請求項１８】
免疫原性組成物中の１種以上のＨＩＶ−１クレードとは異なる前記１種以上のクレードのＨＩＶ−１株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【国際調査報告】
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