(57)【要約】  生物サンプル中のハプトグロビン-マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9)複合体を検出するための方法。この方法は、固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートしてHp-MMP9を捕捉用試薬と結合させるステップを含む。捕捉用試薬は、MMP9と結合するモノクローナル抗体を含む。この方法は、結合したHp-MMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHp-MMP9を検出する。
2013536438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物サンプル中のハプトグロビン-マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9)複合体を検出するための方法であって、
固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートしてHp-MMP9を捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体を含むステップ、および
結合したHp-MMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHp-MMP9を検出するステップ
を含む方法。
【請求項２】
生物サンプル中のHp-MMP9の濃度を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
Hp-MMP9の濃度を決定するステップが、Hp-MMP9と結合する検出可能な抗体の量を一組の標準物質と比較するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
生物サンプル中のHp-MMP9の濃度が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを示す濃度の範囲内であるかどうか決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを診断するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
濃度の範囲が約900ng/ml〜約1,500ng/mlのHp-MMP9である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
生物サンプルが哺乳動物から得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物がヒトおよび畜牛から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
生物サンプルが畜牛から得られる、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
Hpと結合する検出可能な抗体が、発色検出剤、蛍光検出剤、酵素検出剤、および電気化学発光検出剤から選択される検出剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
検出剤がホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能な抗体がHRP結合ウサギ抗ウシHpである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
体液サンプル中のHp-MMP9の濃度を決定することにより急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を同定するための方法であって、
(a)MMP9またはHpの1つに特異的な第一のモノクローナル抗体を入手し、前記モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、
(b)患者から体液のサンプルを入手するステップであって、前記サンプルがHp-MMP9またはHp-MMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、
(c)前記サンプルをステップ(a)の前記モノクローナル抗体に加えるステップであって、前記サンプル中に含有される前記Hp-MMP9またはHp-MMP9の免疫原性断片を前記モノクローナル抗体によって捕捉するステップ、
(d)他のMMP9およびHpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、
(e)前記第二の抗体を検出物質で標識するステップ、
(f)ステップ(e)の前記第二の抗体をステップ(c)中で捕捉した前記Hp-MMP9またはHp-MMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップ(e)の前記第二の抗体がステップ(c)中で捕捉した前記Hp-MMP9またはHp-MMP9の免疫原性断片と結合するステップ、
(g)前記検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および
(h)前記反応産物を測定して前記サンプル中のHp-MMP9の濃度を決定するステップ、および
(i)前記サンプル中の前記Hp-MMP9の濃度がHp-MMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より高く上昇するかどうか決定するステップであって、前記上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを同定するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
前記カットオフ濃度が約900ng/mlである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
検出物質がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
レポーターが過酸化水素である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
生物サンプル中のHp-MMP9を検出するための方法であって、
(a)MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、
(b)抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、
(c)生物サンプルをマイクロタイタープレートに加えるステップ、
(d)Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、
(e)過酸化水素をマイクロタイタープレートに与えるステップ、および
(f)ステップ(a)〜(e)の結果として生じる反応を標準曲線と比較してHp-MMP9のレベルを決定するステップ
を含む方法。
【請求項１７】
生物サンプル中のHp-MMP9のレベルが急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを示す濃度の範囲内であるかどうか決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを診断するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
濃度の範囲が約900ng/ml〜約1,500ng/mlのHp-MMP9である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
生物サンプルが哺乳動物から得られる、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトおよび畜牛から選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
生物サンプルが畜牛から得られる、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2010年8月23日に出願された「ELISA for Haptoglobin-Matrix Metalloproteinase 9 Complex as a Diagnostic Test for Conditions Including Acute Inflammation」という表題の米国特許出願第12/861,395号、および2011年4月7日に出願された「ELISA for Haptoglobin-Matrix Metalloproteinase 9 Complex as a Diagnostic Test for Conditions Including Acute Inflammation」という表題の米国特許出願第61/472,815号の出願日の優先権および特典を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する陳述
米国政府は、国立食糧農業研究所により与えられた認可番号2008-35204-04473において提供される、特許権者が妥当な条件で他者にライセンスを与えるのに必要な、本発明のペイドアップライセンスおよび限定された状況における権利を有する。
【０００３】
本発明は、哺乳動物における急性炎症および急性炎症を含めた状態を診断または予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
このセクションは、以下に記載および/または特許請求する本発明の様々な態様と関係し得る分野の様々な態様を、読者に紹介することを目的とする。本論述は、読者に背景情報を提供し本発明の様々な態様の一層の理解を容易にする際に役立つと考えられる。したがって、これらの陳述は本開示に照らして読み取り、従来技術を承認するものではないと理解すべきである。
【０００５】
疾患状態の早期検出は、相応じてより好ましい臨床成果を伴う、より有効な療法治療を典型的に可能にする。しかしながら多くの場合、疾患症状の早期検出は問題が多い。したがって、診断が可能になる以前に、疾患が比較的進行した状態となる可能性がある。全身性炎症性状態は1つのこのようなクラスの疾患症状となる。これらの状態はヒトおよび他の哺乳動物において存在する。
【０００６】
全身性炎症性状態、例えば敗血症は、病原性微生物と宿主中の過剰で制御不能な炎症応答を誘発する宿主の防御システムの間の、相互作用に起因する可能性がある。全身性炎症応答中の宿主の応答の複雑さは、疾患の病因の理解に対する尽力を複雑にする可能性がある。且つ、疾患の病因のこの不完全な理解は、今度は、診断用バイオマーカーを発見する際の困難に寄与する。しかしながら、生命を脅かす状態への敗血症の著しく早い進行のため、早期の信頼できる診断が緊急に必要である。
【０００７】
全身性炎症性状態は十分記載されている経時変化をたどり、全身性炎症反応症候群(「SIRS」)陰性→SIRS陽性→敗血症に進行し、それは重度の敗血症、敗血症性ショック、多臓器不全(「MOF」)、および最終的には死に進行する可能性がある。個体が後にSIRSを発症するとき、敗血症が感染個体において生じる可能性もある。「SIRS」は2つ以上の以下のパラメーター、38℃を超える体温または36℃未満の体温、一分間当たり90拍を超える心拍数、一分間当たり20拍を超える呼吸数、32mmHg未満のPCo2、および4.0×109個の細胞/L未満の白血球数または12.0×109個の細胞/Lを超える白血球数のいずれか、または10%を超える未熟な帯状体を有する白血球細胞の存在によって定義されることが多い。「敗血症」は確認済みの感染プロセスと関係があるSIRSとして一般に定義される。「重度の敗血症」はMOF、低血圧、播種性血管内凝固症候群(「DIC」)、または乳酸アシドーシス、尿量減少を含めた低灌流異常、および精神状態の変化と関係がある。「敗血症性ショック」は、追加的な低灌流異常の存在を伴う輸液蘇生に耐性がある敗血症誘導型低血圧として一般に定義される。
【０００８】
ヒトにおけるこのような状態以外に、他の哺乳動物における全身性炎症性状態の表れは悪影響を有する可能性もある。例えば、ウシ呼吸器疾患(BRD)および他の急性疾患は、米国中で家畜の生産性に対して重大な影響を有し続けている。全国家畜健康モニタリングシステム(「NAHMS」)による近年の研究は、BRDが米国内の飼育場における疾患および死の主な原因であることを示唆している。野外条件下では、治療を必要とする動物および肺病変を発症する動物を検出するための急性期タンパク質(APP)の使用は、ある程度の有用性を実証している。例えば、畜牛中の炎症に対するハプトグロビン(Hp)応答は、急性気管支肺炎[Eckersall PD、Young FJ、McComb C、Hogarth CJ、Safi S、Weber A、McDonald T、Nolan AM、Fitzpatrick JL(2001)、Acute phase proteins in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis、Vet.Rec.148:35〜41頁;Humblet MF、Coghe J、Lekeux P、Godeau JM(2004)、Acute phase proteins assessment for an early selection of treatments in growing calves suffering from bronchopneumonia under field conditions、Res.Vet.Sci.77:41〜47頁;Katoh N、Miyamoto T、Nakagawa H、Watanabe A(1999)、Detection of annexin I and IV and haptoglobin in bronchoalveolar lavage fluid from calves experimentally inoculated with Pasteurella haemolytica、Am.J.Vet.Res.60:1390〜1395頁;Morimatsu M、Syuto B, Shimada N、Fujinaga T、Yamamoto S、Saito M、Naiki M(1991)、Isolation 
and characterization of bovine haptoglobin from acute phase sera、J.Biol.Chem.266:11833〜11837頁;Wittum TE、Young CR、Stanker LH、Griffin DD、Perino LJ、Littledike ET(1996)、Haptoglobin response to clinical respiratory tract disease in feedlot cattle、Am.J.Vet.Res.57:646〜649頁]、急性反芻類アシドーシス[Gozho GN、Plaizier JC、Krause DO、Kennedy AD、Wittenberg KM (2005)、Subacute ruminal acidosis induces ruminal lipopolysaccharide endotoxin release and triggers an inflammatory response、J.Dairy Sci.88:1399〜1403頁]、大腸菌型乳腺炎[Nielsen BH、Jacobsen S、Andersen PH、Niewold TA、Heegaard PM(2004)、Acute phase protein concentrations in serum and milk from healthy cows、cows with clinical mastitis and cows with extramammary inflammatory conditions、Vet.Rec.154:361〜365頁;Ohtsuka H、Kudo K、Mori K、Nagai F、Hatsugaya A、Tajima M、Tamura K、Hoshi F、Koiwa M、Kawamura S(2001)、Acute phase response in naturally occurring coliform mastitis、J.Vet.Med.Sci.63:675〜678頁]、肝リピドーシス[Katoh N、Nakagawa H(1999)、Detection of haptoglobin in the high -density lipoprotein and the very high -density lipoprotein fractions from sera of calves with experimental pneumonia and cows with naturally occurring fatty liver、J.Vet.Med.Sci.61:503 119〜124頁;Stengarde L、Traven M、Emanuelson U、Holtenius K、Hultgren J、Niskanen R(2008)、Metabolic profiles in five high -producing Swedish dairy herds with a history of abomasal displacement and ketosis、Acta Vet.Scand.50:31]、および輸送ストレス[Arthington JD、Eichert SD、Kunkle WE、Martin FG(2003)、Effect of transportation and commingling on the acute-phase protein response、growth、and feed intake of newly weaned beef calves、J.Anim Sci.81:1120〜1125頁;Murata H、Miyamoto T(1993)、Bovine haptoglobin as a possible immunomodulator in the sera of transported calves、Br.Vet.J.149:277〜283頁]において評価されている。
【０００９】
急性疾患状態の畜牛におけるHpの血清中濃度は(100倍を超えて)増大し、48〜96時間の間に最大濃度に達する[Eckersall PD、Young FJ、McComb C、Hogarth CJ、Safi S、Weber A、McDonald T、Nolan AM、Fitzpatrick JL(2001)、Acute phase proteins in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis、Vet.Rec.148:35〜41頁;Hiss S、Mielenz M、Bruckmaier RM、Sauerwein H(2004)、Haptoglobin concentrations in blood and milk after endotoxin challenge and quantification of mammary Hp mRNA expression、J.Dairy Sci.87:3778〜3784頁;Katoh N、Miyamoto T、Nakagawa H、Watanabe A(1999)、Detection of annexin I and IV and haptoglobin in bronchoalveolar lavage fluid from calves experimentally inoculated with Pasteurella haemolytica、Am.J.Vet.Res.60: 1390〜1395頁;Larsen K、Macleod D、Nihlberg K、Gurcan E、Bjermer L、Marko-Varga G、Westergren-Thorsson G(2006)、Specific haptoglobin expression in bronchoalveolar lavage during differentiation of circulating fibroblast progenitor cells in mild asthma、J.Proteome.Res.5:1479〜1483頁;Morimatsu M、Syuto B、Shimada N、Fujinaga T、Yamamoto S、Saito M、Naiki M(1991)、Isolation and characterization of bovine haptoglobin from acute phase sera、J.Biol.Chem.266:11833〜11837頁;Tseng CF、Lin CC、Huang HY、556 Liu HC、Mao SJ(2004)、Antioxidant role of human haptoglobin、Proteomics.4:2221〜2228頁]。しかしながら、罹患の指標としての血清中Hp応答の信頼度は、BRDを有する子牛における適切な治療によるその低下と疾患の臨床的消炎の関係ほど有用ではない[Berry BA、Confer AW、Krehbiel CR、Gill DR、Smith RA、Montelongo M(2004)、Effects of dietary energy and starch concentrations for newly received feedlot calves: II. Acute phase protein response、J.Anim Sci.82:845〜850頁; Humblet MF、Coghe J、Lekeux P、Godeau JM(2004)、Acute phase proteins assessment for an early selection of treatments in growing calves suffering from bronchopneumonia under field conditions、Res.Vet.Sci.77:41〜47頁]。血清中Hpの観察される適度な増大は、炎症の明らかな兆候を必ずしも有していない、いくつかの慢性疾患を有するウシに関して記載されており[Gronlund U、Hallen SC、Persson 489WK(2005)、Haptoglobin and serum amyloid A in milk from dairy cows with chronic sub-clinical mastitis、Vet.Res.36:191〜198頁;Nakagawa H、Yamamoto O、Oikawa S、Higuchi H、Watanabe A、Katoh N(1997)、Detection of serum haptoglobin by enzyme-linked immunosorbent assay in cows with fatty liver、Res.Vet.Sci.62:137〜141頁]、このことが炎症指標としてのこの試験の値を低下させる。
【００１０】
且つ、前に記載したように、ヒトにおける急性炎症、全身感染、好中球活性化および敗血症の現在の診断法は、多数の制約をさらに有し、したがって新たな、迅速な、そして信頼できる試験が治療および結果を改善し得る[Mancini N、Carletti S、Ghidoli N、Cichero 522P、Burioni R、Clementi M(2010)、The era of molecular and other non-culture-based methods in diagnosis of sepsis、Clin.Microbiol.Rev.23:235〜251頁]。
【００１１】
したがって、有効な介入および予防を可能にするほど十分早期の、ヒトおよび他の哺乳動物における敗血症(および急性炎症を含めた他の状態)の診断法に関する必要性が存在する。大部分の既存の敗血症記録システムまたは予測モデルは、既に敗血症であると考えられる患者における、死を含めた末期の合併症のリスクのみを予測する。しかしながら、このようなシステムおよびモデルは敗血症自体の発症は予測しない。さらに必要とされるのは、症状を示していないヒトおよび兆候を示していない他の哺乳動物において、急性炎症を予測する方法である。一般に研究者は、敗血症患者群と正常(すなわち、非敗血症)対照群の患者において、異なるレベルで発現される1つまたは複数のバイオマーカーを定義する。米国特許第7,465,555号は、様々なバイオマーカーの発現レベルの時間依存的変化を分析することにより、初期敗血症を示す方法を開示する。したがって、初期敗血症を診断するのに最適な方法は、複数のバイオマーカーの測定と、一定期間のこれらのバイオマーカーの発現のモニタリングの両方を現在必要とする。
【００１２】
経時的に対象のモニタリングを必要としない、特異性および感受性を用いた敗血症の診断が、当技術分野で絶えず緊急に必要である。経時的に一地点において1つのバイオマーカーを正確且つ迅速に測定する技法により診断を施し、それによって早期診断および診断に必要な時間中の疾患進行の最小化を可能にすることが理想的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第7,465,555号
【特許文献２】米国特許第4,816,567号
【特許文献３】米国特許第3,720,760号
【特許文献４】米国特許第3,645,852号
【特許文献５】米国特許第3,969,287号
【特許文献６】米国特許第3,691,016号
【特許文献７】米国特許第4,195,128号
【特許文献８】米国特許第4,247,642号
【特許文献９】米国特許第4,229,537号
【特許文献１０】米国特許第4,330,440号
【特許文献１１】米国特許第4,376,110号
【特許文献１２】米国特許第4,737,456号
【特許文献１３】米国特許第3,940,475号
【特許文献１４】米国特許第3,645,090号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Eckersall PD、Young FJ、McComb C、Hogarth CJ、Safi S、Weber A、McDonald T、Nolan AM、Fitzpatrick JL(2001)、Acute phase proteins in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis、Vet.Rec.148:35〜41頁
【非特許文献２】Humblet MF、Coghe J、Lekeux P、Godeau JM(2004)、Acute phase proteins assessment for an early selection of treatments in growing calves suffering from bronchopneumonia under field conditions、Res.Vet.Sci.77:41〜47頁
【非特許文献３】Katoh N、Miyamoto T、Nakagawa H、Watanabe A(1999)、Detection of annexin I and IV and haptoglobin in bronchoalveolar lavage fluid from calves experimentally inoculated with Pasteurella haemolytica、Am.J.Vet.Res.60:1390〜1395頁
【非特許文献４】Morimatsu M、Syuto B, Shimada N、Fujinaga T、Yamamoto S、Saito M、Naiki M(1991)、Isolation and characterization of bovine haptoglobin from acute phase sera、J.Biol.Chem.266:11833〜11837頁
【非特許文献５】Wittum TE、Young CR、Stanker LH、Griffin DD、Perino LJ、Littledike ET(1996)、Haptoglobin response to clinical respiratory tract disease in feedlot cattle、Am.J.Vet.Res.57:646〜649頁
【非特許文献６】Gozho GN、Plaizier JC、Krause DO、Kennedy AD、Wittenberg KM (2005)、Subacute ruminal acidosis induces ruminal lipopolysaccharide endotoxin release and triggers an inflammatory response、J.Dairy Sci.88:1399〜1403頁
【非特許文献７】Nielsen BH、Jacobsen S、Andersen PH、Niewold TA、Heegaard PM(2004)、Acute phase protein concentrations in serum and milk from healthy cows、cows with clinical mastitis and cows with extramammary inflammatory conditions、Vet.Rec.154:361〜365頁
【非特許文献８】Ohtsuka H、Kudo K、Mori K、Nagai F、Hatsugaya A、Tajima M、Tamura K、Hoshi F、Koiwa M、Kawamura S(2001)、Acute phase response in naturally occurring coliform mastitis、J.Vet.Med.Sci.63:675〜678頁
【非特許文献９】Katoh N、Nakagawa H(1999)、Detection of haptoglobin in the high -density lipoprotein and the very high -density lipoprotein fractions from sera of calves with experimental pneumonia and cows with naturally occurring fatty liver、J.Vet.Med.Sci.61:503 119〜124頁
【非特許文献１０】Stengarde L、Traven M、Emanuelson U、Holtenius K、Hultgren J、Niskanen R(2008)、Metabolic profiles in five high -producing Swedish dairy herds with a history of abomasal displacement and ketosis、Acta Vet.Scand.50:31
【非特許文献１１】Arthington JD、Eichert SD、Kunkle WE、Martin FG(2003)、Effect of transportation and commingling on the acute-phase protein response、growth、and feed intake of newly weaned beef calves、J.Anim Sci.81:1120〜1125頁
【非特許文献１２】Murata H、Miyamoto T(1993)、Bovine haptoglobin as a possible immunomodulator in the sera of transported calves、Br.Vet.J.149:277〜283頁
【非特許文献１３】Hiss S、Mielenz M、Bruckmaier RM、Sauerwein H(2004)、Haptoglobin concentrations in blood and milk after endotoxin challenge and quantification of mammary Hp mRNA expression、J.Dairy Sci.87:3778〜3784頁
【非特許文献１４】Larsen K、Macleod D、Nihlberg K、Gurcan E、Bjermer L、Marko-Varga G、Westergren-Thorsson G(2006)、Specific haptoglobin expression in bronchoalveolar lavage during differentiation of circulating fibroblast progenitor cells in mild asthma、J.Proteome.Res.5:1479〜1483頁
【非特許文献１５】Tseng CF、Lin CC、Huang HY、556 Liu HC、Mao SJ(2004)、Antioxidant role of human haptoglobin、Proteomics.4:2221〜2228頁
【非特許文献１６】Berry BA、Confer AW、Krehbiel CR、Gill DR、Smith RA、Montelongo M(2004)、Effects of dietary energy and starch concentrations for newly received feedlot calves: II.Acute phase protein response、J.Anim Sci.82:845〜850頁
【非特許文献１７】Gronlund U、Hallen SC、Persson 489WK(2005)、Haptoglobin and serum amyloid A in milk from dairy cows with chronic sub-clinical mastitis、Vet.Res.36:191〜198頁
【非特許文献１８】Nakagawa H、Yamamoto O、Oikawa S、Higuchi H、Watanabe A、Katoh N(1997)、Detection of serum haptoglobin by enzyme-linked immunosorbent assay in cows with fatty liver、Res.Vet.Sci.62:137〜141頁
【非特許文献１９】Mancini N、Carletti S、Ghidoli N、Cichero 522P、Burioni R、Clementi M(2010)、The era of molecular and other non-culture-based methods in diagnosis of sepsis、Clin.Microbiol.Rev.23:235〜251頁
【非特許文献２０】Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁
【非特許文献２１】Kohler G、Milstein C(1975)、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature256:495〜497頁
【非特許文献２２】Clackson et al.Nature352:624〜628頁(1991)
【非特許文献２３】Marks et al. J.Mol.Biol.222:581〜597頁(1991)
【非特許文献２４】Rotmans et al.J.Immunol.Methods 57:87〜98頁(1983)
【非特許文献２５】Hunter et al.Nature144:945(1962)
【非特許文献２６】David et al.Biochemistry 13:1014〜1021頁(1974)
【非特許文献２７】Pain et al.J.Immunol.Methods 40:219〜230頁(1981)
【非特許文献２８】Nygren J.Histochem.and Cytochem.30:407〜412頁(1982)
【非特許文献２９】O'Sullivan et al.「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」、in Methods in Enzymology、ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis、Vol.73(Academic Press、New York、N.Y.、1981)、147〜166頁
【非特許文献３０】Klimiuk PA、Sierakowski S、Latosiewicz R、Cylwik B、Skowronski J、Chwiecko J(2002)、Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in different histological variants of rheumatoid synovitis、Rheumatology.(Oxford)41:78〜87頁
【非特許文献３１】Godson DL、Campos M、Attah-Poku SK、Redmond MJ、Cordeiro DM、Sethi MS、Harland RJ、Babiuk LA(1996)、Serum haptoglobin as an indicator of the acute phase response in bovine respiratory disease、Vet. Immunol.Immunopathol.51:277〜292頁
【非特許文献３２】Peake NJ、Foster HE、Khawaja K、Cawston TE、Rowan AD(2006)、Assessment of the clinical significance of gelatinase activity in patients with juvenile idiopathic arthritis using quantitative protein substrate zymography、Ann.Rheum.Dis.65:501〜507頁
【非特許文献３３】Cohn.L.A.(2003)、The influence of corticosteroids on host defense mechanisms、J.Vet.Intern.Med..5:95〜104頁
【非特許文献３４】D'Armiento J、Dalai SS、Chada K(1997)、Tissue、temporal and inducible expression pattern of haptoglobin in mice、Gene 195:19〜27頁
【非特許文献３５】Sharpe-Timms KL、Zimmer RL、Ricke EA、Piva M、Horowitz GM(2002)、Endometriotic haptoglobin binds to peritoneal macrophages and alters their function in women with endometriosis、Fertil.Steril.78:810〜819頁
【非特許文献３６】Bannikov、GA et al、2011;Vet.Immunol.Immunopath 139:41〜49頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明のいくつかの例示的な態様を以下に述べる。これらの態様は本発明のいくつかの形がとり得る簡単な要約を読者に提供するためのみに表すこと、およびこれらの態様は本発明の範囲を制限することは意図しないことは理解されるはずである。実際本発明は、以下で明確には述べることができない様々な態様を包含することができる。
【００１６】
前に記載したように、対象(例えば、ヒトまたは他の哺乳動物)が急性炎症状態またはそのリスクに罹患しているかどうか検出するための、信頼できる有効な方法は現在存在しない。経時的に一地点において1つのバイオマーカーを正確且つ迅速に測定する技法により診断を施し、それによって早期診断および診断に必要な時間中の疾患進行の最小化を可能にすることが理想的である。
【００１７】
以前に、Hpとマトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP9)の共有結合した、ヘテロマー複合体が、腹部または胸部の急性敗血症性炎症を有する畜牛の好中球顆粒および血清において確認されている[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁]。大部分のこれらの例では、混合型の細菌性敗血症が明らかであった[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁]。炎症中に主に肝臓によって産生される遊離Hpとは対照的に、Hp-MMP9複合体は脱顆粒時に好中球から放出される[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁]。これは、血清中に存在するHp-MMP9複合体は、好中球活性化および脱顆粒の症状発現であることを示唆する。
【００１８】
本発明の様々な態様は、in vitroで好中球により産生され急性期血清において見られる、ハプトグロビン(Hp)とマトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP9)の複合体、すなわちHp-MMP9複合体は、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独とは異なる特異的機能有意性を有するという概念を対象とする。したがって、Hp-MMP9の血清中濃度は、急性炎症中に生じる臨床上重要な事象の独立指標として働き得る。このように、ヒト、畜牛、および他の哺乳動物における全身性好中球活性化を具体的に確認する方法を提供することにより、哺乳動物における急性敗血症性炎症疾患の指標としての非複合体HpまたはMMP9単独に関するELISAと比較した、Hp-MMP9複合体ELISAの有用性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明の一態様は、対象由来のサンプル中のバイオマーカー、または特定濃度のバイオマーカーの存在を検出することにより、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出する方法を提供する。サンプルは、血清分画などの血液サンプルであってよい。一実施形態では、バイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質を含むことができる。バイオマーカーは、血清タンパク質ハプトグロビン、または血清タンパク質ハプトグロビンのアイソフォームを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素と複合体形成した血清タンパク質などのタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9複合体)などを含むことができる。バイオマーカーは、様々なアイソフォームのHp-MMP9複合体を含むことができる。一実施形態では方法は、対象から回収したサンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するステップを含むことができる。この実施形態の方法は、その濃度と一定範囲の標準濃度を比較するステップも含むことができる。別の実施形態では、方法は、異なるときに対象から回収したサンプル中のバイオマーカーのレベルを比較するステップを含むことができる。さらに別の実施形態では、方法は、同じ対象または異なる対象由来の参照バイオマーカーとバイオマーカーを比較するステップを含むことができる。
【００２０】
本発明の別の態様は、前に記載した方法を実施するための試験を提供する。一実施形態では、試験は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)であってよい。
【００２１】
1つのこのようなELISA試験の実施形態は、生物サンプル中のHp-MMP9複合体の1つまたは複数のアイソフォームを検出するための方法を対象とする。この方法は、(1)固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートして複数のHp-MMP9のアイソフォームを捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体などの抗体を含むステップ、および(2)結合したHp-MMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHp-MMP9を検出するステップを含む。
【００２２】
別のELISA試験の実施形態は、体液サンプル中のHp-MMP9の濃度を決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を確認するための方法を対象とする。この方法は、(a)MMP9に特異的なモノクローナル抗体を入手し、モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、(b)患者から体液のサンプルを入手するステップであって、サンプルがHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、(c)サンプルをステップ(a)のモノクローナル抗体に加えるステップであって、サンプル中に含有されるHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片を前記モノクローナル抗体によって捕捉するステップ、(d)Hpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、(e)第二の抗体を検出物質で標識するステップ、(f)ステップ(e)の第二の抗体をステップ(c)中で捕捉したHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップ(e)の第二の抗体がステップ(c)中で捕捉したHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片と結合するステップ、(g)検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および(h)反応産物を測定してサンプル中のHp-MMP9の濃度を決定するステップ、および(i)サンプル中のHp-MMP9の濃度がHp-MMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より上昇するかどうか決定するステップであって、上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを確認するステップを含む。
【００２３】
別のELISA試験の実施形態は、血漿または血清中のHp-MMP9を検出して急性炎症状態またはそのリスクをスクリーニングするための方法を対象とする。この試験は、(a)MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、(b)抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、(c)血清または血漿をマイクロタイタープレートに加えるステップ、(d)Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、(e)過酸化水素を反応物質としてマイクロタイタープレートに与えるステップ、および(f)ステップ(a)〜(e)の結果として生じる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したHp-MMP9のレベルを決定するステップを含む。
【００２４】
本特許または出願は色を施した少なくとも1つの図面を含有する。(1つまたは複数の)色付き図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要求に応じて必要な料金を支払うことにより特許事務所により提供される。
【００２５】
本出願中に組み込まれ、本出願の一部を構成する添付の図面は、本発明の原理を説明するのに役立つ、前に示した本発明の一般的記載および以下に示す実施形態の詳細な説明と一緒に、本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】遊離MMP9とHp-MMP9の複合体に関するMMP9とHp-MMP9のELISAアッセイの特異性を実証する、ELISAデータのグラフ図である。このグラフは3つの独立した実験の結果を表す。線および中実黒丸(-●-)は、MMP9モノクローナル抗体で捕捉し抗HpHRP結合体で検出した高濃度のHp-MMP9に関する吸光度を表す(Hp-MMP9標準曲線)。線および白丸(-○-)は、アフィニティー精製したHp、次に抗HpHRP結合体を抗MMP9コーティングウエルに加えた、ウエルを表す。白い下向き三角形を有する線は、アフィニティー精製したMMP9、次に抗HpHRP結合体を加えたウエルを表す。線および白い上向き三角形(-△-)は、Hp-MMP9複合体をウエルに加え、HRP結合抗MMP9(クローン10.1)をウエルに加えた、ウエルを表す(MMP9ELISAのシミュレーション)。
【図２Ａ】疾病分類による畜牛における血清中ハプトグロビンに関するデータのプロットおよびボックスプロットオーバーレイの図である(この場合疾病分類「1」=急性敗血症疾患、「2」=慢性または代謝性疾患、および「3」=正常)。白い上向き三角形(△)は急性敗血症の動物を表し、下向き三角形は慢性/代謝性疾患を表し、且つ菱形(◇)は正常な動物を表す。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(破線)、5パーセンタイル値、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値および95パーセンタイル値を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図２Ｂ】疾病分類による畜牛における血清中Hp-MMP9に関するデータのプロットおよびボックスプロットオーバーレイの図である(この場合疾病分類「1」=急性敗血症疾患、「2」=慢性または代謝性疾患、および「3」=正常)。白い上向き三角形(△)は急性敗血症の動物を表し、下向き三角形は慢性/代謝性疾患を表し、且つ菱形(◇)は正常な動物を表す。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(緑色の破線)、5パーセンタイル値、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値および95パーセンタイル値を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図２Ｃ】疾病分類による畜牛における血清中MMP9に関するデータのプロットおよびボックスプロットオーバーレイの図である(この場合疾病分類「1」=急性敗血症疾患、「2」=慢性または代謝性疾患、および「3」=正常)。白い上向き三角形(△)は急性敗血症の動物を表し、下向き三角形は慢性/代謝性疾患を表し、且つ菱形(◇)は正常な動物を表す。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(緑色の破線)、5パーセンタイル値、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値および95パーセンタイル値を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図２Ｄ】図2Aからのボックスプロットのデータを示す図である。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(破線)、5パーセンタイル値(下端/キャップバー)、25パーセンタイル値(ボックス底部)、75パーセンタイル値(ボックス先端)および95パーセンタイル値(上端/キャップバー)を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図２Ｅ】図2Bからのボックスプロットのデータを示す図である。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(破線)、5パーセンタイル値(下端/キャップバー)、25パーセンタイル値(ボックス底部)、75パーセンタイル値(ボックス先端)および95パーセンタイル値(上端/キャップバー)を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図２Ｆ】図2Cからのボックスプロットのデータを示す図である。ボックスプロットは、メディアン(実線)、平均(破線)、5パーセンタイル値(下端/キャップバー)、25パーセンタイル値(ボックス底部)、75パーセンタイル値(ボックス先端)および95パーセンタイル値(上端/キャップバー)を示す。黒い三角形または菱形はアウトライヤーを示す。
【図３】畜牛におけるHp-MMP9および全白血球細胞(WBC)数に対するリポ多糖(LPS)注入の影響を示すグラフである。
【図４】畜牛におけるHp-MMP9および血清中コルチゾールに対するLPS注入の影響を示すグラフである。
【図５】畜牛におけるHp-MMP9およびバンドPMN(多形核)に対するLPS注入の影響を示すグラフである。
【図６】畜牛における血清中Hp-MMP9およびHpに対するLPS注入の影響を示すグラフである。
【図７】畜牛におけるHp-MMP9および血清中α1-酸性糖タンパク質(AGP)に対するLPS注入の影響を示すグラフである。
【図８】実験的マイコプラズマボビス(Mycoplasma bovis)感染における血清中Hp-MMP9を示すグラフである。
【図９】全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、または骨関節炎を有するヒト患者における血清中Hp-MMP9の存在を示すグラフである。
【図１０】第一の子牛(子牛101)に関するLPS注射後の様々な白血球数を示すグラフである。
【図１１】第二の子牛(子牛102)に関するLPS注射後の様々な白血球数を示すグラフである。
【図１２】第三の子牛(子牛104)に関するLPS注射後の様々な白血球数を示すグラフである。
【図１３】LPS注射後の図10の子牛(子牛101)における好中球およびHp-MMP9の濃度を示すグラフである。
【図１４】LPS注射後の図11の子牛(子牛102)における好中球およびHp-MMP9の濃度を示すグラフである。
【図１５】LPS注射後の図12の子牛(子牛104)における好中球およびHp-MMP9の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の1つまたは複数の具体的な実施形態を以下に記載する。これらの実施形態の簡潔な説明を提供するための尽力において、実装の全ての特徴を本明細書中に記載できるわけではない。任意の工学または設計プロジェクトなどの、任意のこのような実装の開発において、多数の実装固有の決定を施して、一実装から他の実装で変わり得るシステム関連およびビジネス関連制約に関するコンプライアンスなどの、開発者の具体的な目標を達成するに違いないことは理解されるはずである。さらに、このような開発尽力は複雑で時間を浪費する可能性があるが、それにもかかわらず、当業者にはこの開示の利点を有する設計、製作、および製造の通常の作業であることは理解されるはずである。
【００２８】
前に記載したように、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出するための、信頼できる有効な方法は現在存在しない。
【００２９】
定義
本明細書で使用する用語「Hp-MMP9」は、ハプトグロビンとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の複合体を指す。複合体は2つ以上の結合ポリペプチド鎖の一群であり、本明細書においてHp-MMP9複合体は、2つの結合ポリペプチド鎖、ハプトグロビンに関する鎖およびマトリックスメタロプロテイナーゼ9に関する鎖の一群である。当業者には知られているように、ハプトグロビンはヒトにおいてHp遺伝子によってコードされるタンパク質である。血漿中で、ハプトグロビンは赤血球から放出された遊離ヘモグロビン(Hb)と高い親和性で結合し、これによってその酸化活性を阻害する。次いでハプトグロビン-ヘモグロビン複合体は細網内皮系により除去される(大部分は脾臓)。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。それらは全ての種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解することができるだけでなく、いくつかの生物活性分子を処理することもできる。それらは、細胞表面受容体の切断、アポトーシスリガンド(FASリガンドなど)の放出、およびケモカイン/サイトカイン活性化に関与することが知られている。MMPは、細胞増殖、移動(接着/分散)、分化、血管新生、アポトーシスおよび宿主防御などの細胞挙動に関して主要な役割を果たすとも考えられる。MMPは共通のドメイン構造を共有する。3つの共通ドメインは、プロペプチド、触媒ドメイン、および柔軟なヒンジ領域により触媒ドメインと連結したヘモペキシン様C末端ドメインである。MMPの中で、2つ、MMP2とMMP9はゼラチナーゼである。ゼラチナーゼの主要基質はIV型コラーゲンとゼラチンであり、これらの酵素は触媒ドメイン中に挿入された追加的ゼラチン結合ドメインの存在によって区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフの直前に位置し、触媒ドメインの構造を妨害しない別個のフォールディングユニットを形成する。
【００３０】
用語「検出」は、標的分子の定性測定と定量測定の両方を含むように広い意味で使用される。一態様では、本明細書に記載する検出法は、生物サンプル中の単なるHp-MMP9の存在を確認するために使用する。別の態様では、この方法を使用して、サンプル中のHp-MMP9が特定レベルであるかどうか試験する。さらに別の態様では、この方法を使用して、サンプル中のHp-MMP9の量を定量化することができ、さらに異なるサンプル由来のHp-MMP9レベルを比較することができ、またはサンプル中のHp-MMP9の量を参照標準物質と比較することができる。
【００３１】
用語「生物サンプル」は、任意の哺乳動物など、例えばヒトなどの、任意の動物由来の身体のサンプルを指す。このようなサンプルには、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、濾胞液、精液、羊水、乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、肺洗浄液、涙、汗、粘液などの生体液、および組織培養培地、および均質組織などの組織抽出物、ならびに細胞抽出物がある。
【００３２】
用語「捕捉用試薬」は、捕捉用試薬-標的分子複合体をサンプルの残りから切り離すことができるような適切な条件下で、サンプル中の標的分子と結合し捕捉することができる試薬を指す。典型的には、捕捉用試薬は固定化されるかまたは固定化可能である。サンドイッチイムノアッセイでは、捕捉用試薬は、標的抗原に対する抗体または異なる抗体の混合物であってよい。
【００３３】
用語「検出可能な抗体」は、検出剤により増幅した標識を介して直接的、または例えば標識した別の抗体を介して間接的のいずれかで、検出することができる抗体を指す。直接標識に関して、典型的には、いくつかの手段により検出可能な成分と抗体を結合させる。1つのこのような抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した抗体である。
【００３４】
用語「検出剤」は、検出可能な抗体の存在を検出するために使用する成分または技法を指し、マイクロタイタープレート上に捕捉された標識などの、固定化標識を増幅する検出剤を含む。1つのこのような検出剤は過酸化水素である。
【００３５】
用語「抗体」は広義で使用し、それらが望ましい結合特異性を示す限り、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、および抗体断片を含む。
【００３６】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る考えられる天然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、1つの抗原エピトープに対して作られている。さらに、異なる抗原決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の1つの抗原決定基に対して作られる。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要とされると解釈すべきではない。例えば、本発明に従い使用するモノクローナル抗体は[Kohler et al.Nature256:495(1975)により記載されている]ハイブリドーマ法により作製することができ、または組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)により作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al.Nature352:624〜628頁(1991)およびMarks et al. J.Mol.Biol.222:581〜597頁(1991)中に記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３７】
治療目的の「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物、および家畜、および動物園用、スポーツ、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含めた哺乳動物として分類される任意の動物を指す。本発明の様々な態様では、哺乳動物はヒトまたは畜牛であってよい。
【００３８】
「全身性炎症反応症候群」または「SIRS」は、ヒトにおいて24時間の間に2つ以上の以下の条件、38℃(100.4°F.)を超える体温または36℃(96.8°F.)未満の体温、一分間当たり90拍を超える心拍数(HR)、一分間当たり20拍を超える呼吸数(RR)、または32mmHg未満のPCo2、または必要な機械的換気、および12.0×109個の細胞/Lを超える白血球数(WBC)または4.0×109個の細胞/L未満の白血球数(WBC)のいずれか、または10%を超える未熟な帯状体(バンド)を有する白血球細胞によって現れる、様々な重度の臨床的傷害に対する臨床応答を指す。
【００３９】
SIRSのこれらの症状は、将来改善される定義によって改変または変更される可能性があるSIRSの一般的な定義を表す。現在の臨床診療を明らかにするためにこの定義を使用し、本発明の重要な態様を表すものではない。
【００４０】
SIRSがある対象には、前に定義したSIRSとして分類されるが、臨床上は敗血症とみなされない臨床症状がある。
【００４１】
「敗血症」は、確認済みの感染プロセスと関係があるSIRS陽性状態を指す。敗血症の臨床的な疑いは、SIRS患者のSIRS陽性状態は感染プロセスの結果であるという疑いから生じる。本明細書で使用する「敗血症」は、敗血症の発症、重度の敗血症および末期段階の敗血症と関係があるMOFを含めた全段階の敗血症を含むが、これらだけには限定されない。
【００４２】
「敗血症の発症」は、敗血症の初期段階、すなわち臨床症状発現が敗血症の臨床的疑いを支持するのに十分であるときの段階以前を指す。本発明の方法は、従来技法を使用して敗血症が疑われるときより前の敗血症を検出するために使用されるので、敗血症の症状発現が臨床上より明らかであるとき、初期敗血症における患者の病状は回顧的にのみ確認することができる。それによって患者が敗血症になる正確なメカニズムは、本発明の重要な態様ではない。本発明の方法は、感染プロセスの源とは無関係にバイオマーカープロファイルの変化を検出することができる。どのように敗血症が生じるかとは無関係に、本発明の方法は、以前に使用された基準によって分類される敗血症またはSIRSを有する、または有する疑いが有る患者の状態を決定することができる。
【００４３】
「重度の敗血症」は、臓器不全、低灌流異常、または敗血症誘導型低血圧と関係がある敗血症を指す。低灌流異常には、乳酸アシドーシス、尿量減少、または精神状態の急性変化があるが、これらだけには限定されない。「敗血症性ショック」は、適切な静脈内液注入に反応せず末梢低灌流の症状発現を伴う敗血症誘導型低血圧を指す。
【００４４】
「バイオマーカー」は、生物サンプル中に存在し、生物サンプルから単離可能またはそこで測定することができる、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機または無機化合物、天然ポリマー、および小分子などの、ほぼ任意の生物学的化合物である。さらに、バイオマーカーは完全で無傷の分子であってよく、またはバイオマーカーは、一部分が機能的であり得るか、または例えば抗体もしくは他の特異的結合タンパク質によって認識され得る、分子の一部であってよい。バイオマーカーは、そのバイオマーカーの測定可能な態様が、敗血症の特定段階などの対象の所与の状態と関係があるかどうか示すと考えられる。このような測定可能な態様は、例えば、対象由来の生物サンプル中の、バイオマーカーの存在、不在、または個々の濃度を含み得る。
【００４５】
「表現型変化」は、対象の所与の状態と関係があるパラメーターの検出可能な変化である。例えば、表現型変化は体液中のバイオマーカーの増大または減少を含む可能性があり、この場合変化は敗血症または敗血症の発症と関係がある。表現型変化は、バイオマーカーの測定可能な態様の変化ではない、患者の所与の状態の検出可能な態様の変化をさらに含む可能性がある。例えば、表現型の変化は、体温、呼吸数、拍数、血圧、または他の生理学的パラメーターの検出可能な変化を含む可能性がある。このような変化は、当業者によく知られている従来技法を使用して、臨床的観察結果および測定により決定することができる。本明細書で使用する「従来技法」は、本発明によりバイオマーカープロファイルを得ることなく、表現型の変化に基づいて個体を分類する技法である。
【００４６】
「アイソフォーム」は、可変スプライシングまたは翻訳後修飾を経たタンパク質を意味すると理解されよう。例えば、細胞は一般に、一遺伝子を多くの関連タンパク質に転写および翻訳する。アイソフォームと呼ばれるタンパク質間の違いは、本来翻訳されるタンパク質の変化の結果である。800を超える周知の翻訳後修飾が存在し、タンパク質切断断片、リン酸化、グリコシル化、脂質化、架橋、タンパク質フォールディング、他の分子との水素結合相互作用、他の分子とのファンデルワールス力による相互作用、および他の分子との共有結合相互作用などを含むが、これだけには限定されない。
【００４７】
本発明の様々な態様は、in vitroで好中球により産生され急性期血清において見られるHp-MMP9複合体は、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独とは異なる特異的機能有意性を有するという概念を対象とする。さらに、Hp-MMP9の血清中濃度は、急性炎症中に生じる臨床上重要な事象の独立指標として働き得る。畜牛における急性敗血症性炎症疾患の指標としての非複合体HpまたはMMP9単独に関するELISAと比較した、Hp-MMP9複合体ELISAの有用性を本明細書において評価する。血清中Hp-MMP9複合体は急性敗血症性炎症を有する動物中に存在し、したがってヒト、畜牛、および他の哺乳動物における全身性好中球活性化を具体的に確認するための手段をもたらし得る。
【００４８】
したがって、本発明の一態様は、対象由来のサンプル中のバイオマーカー、または特定濃度のバイオマーカーの存在を検出することにより、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出する方法を提供する。サンプルは、血清分画などの血液サンプルであってよい。一実施形態では、バイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質を含むことができる。バイオマーカーは、血清タンパク質ハプトグロビン、または血清タンパク質ハプトグロビンのアイソフォームを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素と複合体形成した血清タンパク質などのタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9複合体)などを含むことができる。バイオマーカーは、いくつかのHp-MMP9複合体のアイソフォームを含むことができる。一実施形態では方法は、対象から回収したサンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するステップを含むことができる。この実施形態の方法は、その濃度と一定範囲の標準濃度を比較するステップも含むことができる。別の実施形態では、方法は、異なるときに対象から回収したサンプル中のバイオマーカーのレベルを比較するステップを含むことができる。さらに別の実施形態では、方法は、同じ対象または異なる対象由来の参照バイオマーカーとバイオマーカーを比較するステップを含むことができる。
【００４９】
具体的な実施形態がバイオマーカーとしてのHp-MMP9を対象としているが、当業者は、他のマーカーを使用する他の試験を、本明細書に記載する指針および技法を使用して開発することができることを理解している。例示的なバイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質、核酸またはヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖タンパク質、糖脂質、タンパク質断片、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、免疫調節物質、細胞、血液学的パラメーター、サンプル中の細胞からのゲノム発現、およびこれらの組合せを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、ハプトグロビン、トランスフェリン、ヘモペキシン、アルブミンなどの血清タンパク質のアイソフォーム、およびこれらの組合せである。一実施形態では、バイオマーカーはハプトグロビンを含む。別の実施形態では、バイオマーカーはマトリックスメタロプロテイナーゼを含むことができる。バイオマーカーは、前に記載したようにタンパク質の複合体を含むことができる。特定の一実施形態では、バイオマーカーは、ハプトグロビンとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の複合体(Hp-MMP9複合体)を含むことができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーはタンパク質のアイソフォームである。
【００５０】
バイオマーカーを検出するために使用するサンプルの例には、全血、血清分画、血漿分画などの血液の分画、または白血球細胞または赤血球細胞などの細胞分画、他の液体(すなわち唾液、尿、脳脊髄液、胆汁、細胞外液、サイトゾル液など)、細胞、組織(例えば皮膚、骨、筋肉、髪の毛など)、およびこれらの組合せがある。
【００５１】
バイオマーカーおよびバイオマーカーのレベルは、そのバイオマーカーと選択的に結合する化合物を用いて検出することができる。選択化合物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、受容体、ファージディスプレイ、ペプチド、タンパク質断片、核酸、核酸の配列、リボ核酸、デオキシリボ核酸、小分子、およびこれらの組合せを含むことができる。選択化合物は検出系と連結または結合させて、検出バイオマーカーのレベルを示すことが可能である。例示的な検出系は、試験片、チップ、スライド、マイクロアレイ、タイタープレート、膜、電極、プローブ、ビーズ、カラム、マトリックス、ゲル、および液体を含むが、これだけには限定されない、エレメントを有し得る。しかしながら、バイオマーカーの結合以外により検出を行うことができることは、当業者によって理解される。例えば、バイオマーカーの大きさ、電荷、構造、および/または配列などの化学的パラメーターを分析することにより、バイオマーカーレベルを代替的に検出することができる。
【００５２】
バイオマーカーまたはバイオマーカーのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ゲル電気泳動、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ブロッティング、試験片、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、結合アッセイ、質量分析法、マイクロアレイ、ゲノムマイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応(PC)、逆転写PCR(RT-PCR)、リアルタイムRT-PCR、およびこれらの組合せを使用して検出することができる。一実施形態では、ELISAでバイオマーカーを検出する。
【００５３】
一実施形態では、バイオマーカーのレベルの比較は、対象から回収した少なくとも2つのサンプル中の、バイオマーカーのレベルを比較することにより検出することができる。2つのサンプルは異なるときに、または異なる源から回収することができる。第二の入手サンプル中の量が第一の入手サンプル中の量より多いとき、第一サンプルからのバイオマーカーのレベルを第二サンプル中のバイオマーカーのレベルと比較して、対象中で増大したHp-MMP9の存在を判定する。
【００５４】
別の実施形態では、参照バイオマーカーのレベルとバイオマーカーのレベルを比較することにより、バイオマーカーのレベルを検出することができる。これは、急性炎症状態などの状態、またはそのリスクの有無を示し得る。
【００５５】
一実施形態では、参照バイオマーカーは別の対象に由来する。この文脈での別の対象は、1つまたは複数の他の対象を意味すると理解され、急性炎症状態またはそのリスクのいずれかの有無を示すことがわかっている対象集団において見られる参照バイオマーカーのレベルを表し得る。
【００５６】
本発明は、対象中のHp-MMP9の存在を検出するために、前に記載した方法中で使用するためのキットも含む。キットの例示的な用途には、試験対象における炎症状態またはそのリスクの存在の判定がある。キットは、対象由来のサンプル中のバイオマーカー(例えばHp-MMP9)の存在およびレベルの検出に適合させたデバイスおよび試薬を含む。
【００５７】
本発明の別の態様は、前に記載した方法を実施するための試験を提供する。一実施形態では、試験はELISAであってよい。
【００５８】
1つのELISA試験の実施形態は、生物サンプル中のハプトグロビン-マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9)複合体の複数のアイソフォームを検出するための方法を対象とする。この方法は、(1)固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートして複数のHp-MMP9のアイソフォームを捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体などの抗体を含むステップ、および(2)結合したHp-MMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHp-MMP9を検出するステップを含む。
【００５９】
別のELISA試験の実施形態は、体液サンプル中のHp-MMP9の濃度を決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を確認するための方法を対象とする。この方法は、(a)MMP9に特異的なモノクローナル抗体を入手し、モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、(b)患者から体液のサンプルを入手するステップであって、サンプルがHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、(c)サンプルをステップ(a)のモノクローナル抗体に加えるステップであって、サンプル中に含有されるHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片をモノクローナル抗体によって捕捉するステップ、(d)Hpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、(e)第二の抗体を検出物質で標識するステップ、(f)ステップ(e)の第二の抗体をステップ(c)中で捕捉したHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップ(e)の第二の抗体がステップ(c)中で捕捉したHp-MMP9および/またはHp-MMP9の免疫原性断片と結合するステップ、(g)検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および(h)反応産物を測定してサンプル中のHp-MMP9の濃度を決定するステップ、および(i)サンプル中のHp-MMP9の濃度がHp-MMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より上昇するかどうか決定するステップであって、上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを確認するステップを含む。
【００６０】
別のELISA試験の実施形態は、血漿または血清中のHp-MMP9を検出するための方法を対象とする。この試験は、(a)MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、(b)抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、(c)血清または血漿をマイクロタイタープレートに加えるステップ、(d)Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、(e)過酸化水素を反応物質としてマイクロタイタープレートに与えるステップ、および(f)ステップ(a)〜(e)の結果として生じる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したHp-MMP9のレベルを決定するステップを含む。
【００６１】
一実施形態では、本明細書に記載するアッセイはマルチサイトイムノアッセイである。このアッセイの一実施形態の第一ステップでは、生物サンプルを接触させ、抗MMP9モノクローナル抗体であってよい1つまたは複数の固定化捕捉(またはコーティング)試薬とインキュベートする。これらの抗体は任意の種に由来してよいが、モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体であることが多い。モノクローナル抗体は、当業者によく知られている方法によって調製することができる。例えば、ウシ好中球により産生されたアフィニティー精製MMP9モノマーとダイマーの混合物を、BALB/Cマウスの免疫感作に使用した。マウスは7日間隔で、100μgの精製MMP9で二回免疫感作した。4週間後、マウスを4日間毎日100μgのMMP9で追加抗原刺激し、4日後、脾細胞はB細胞ミエローマSP2/0と融合させ、96ウエルプレート中に平板培養した。ハイブリドーマは、[参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Kohler G、Milstein C(1975)、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature256:495〜497頁中に記載されているように]、当業者によく知られている確立した方法に従い、100μΜのヒポキサンチン、0.4μΜのアミノプテリン、および16μΜのチミジンの存在下で選択した。[参照により本明細書に組み込まれている、Kohler G、Milstein C (1975)、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature256:495〜497頁中に記載されているように]ELISAにより試験してMMP9に対する特異性を有する抗体を分泌したクローンを、二回の限界希釈によりさらにクローニングして、クローン性を確実にした。クローン10.1を、バイオリアクター中での陽性反応性および細胞増幅用に選択し[Celline、CL1000、Sartorius Stedim、North America、Inc.Bohemia NY 11716]、それは以下のように実施した。
【００６２】
ハイブリドーマ細胞はCL1000の細胞コンパートメント中に維持し、約7日間隔で採取した。採取中、細胞および上清を細胞コンパートメントから回収し、採取分画は細胞コンパートメントに新鮮な培地とともに再接種した。栄養培地は除去し、採取の日に新鮮な培地と交換した。
【００６３】
方法
マウスハイブリドーマ細胞系を凍結ストックから解凍し、静置培養培地(RPMI-1640、10〜15%のFBS、2×L-グルタミン、Pen-Strep)で増殖させた。静置培養培地中での一貫した細胞倍加を実証した後、CL1000デバイス中に細胞を接種した。
【００６４】
細胞コンパートメント培地
RPMI-1640;2×L-グルタミン(5mM)、ペニシリンG(66mg/L)、硫酸ストレプトマイシン(144mg/l)。基本培地に(Hyclone、Logan Utahから市販されている)10%FBSを補充した。ハイブリドーマ増殖サプリメント(0.1%のVitacyte、J.Brooks Irvine、CA)の培地への追加補充を行い、従来型フラスコ中での同じ細胞系の事前のバッチ産生実験と一貫した状態を保った。
【００６５】
栄養培地
RPMI-1640;2×L-グルタミン(5mM)、ペニシリンG(66mg/L)、硫酸ストレプトマイシン(144mg/l)および0.8%のFBS、0.1%のVitacyte。
【００６６】
接種
第0日に静置培養培地からCL1000デバイスの細胞コンパートメントに、20ml体積で細胞を接種した。3.0×106個細胞/mlを超える接種密度を維持した。細胞は凍結ストック初代培養物から除去し、接種前に新鮮な細胞コンパートメント培地に再縣濁した。栄養培地(1000ml)を栄養培地コンパートメントに供給し、デバイスは5%C02、37℃で湿度調節機能付き組織培養インキュベーター中に置いた。
【００６７】
採取
採取時に、全細胞コンパートメント体積をピペットによりCL1000ユニットから除去した。サンプルを希釈し標準的な血球計を使用して計数することにより、細胞数を測定した。生命力のある細胞は、トリパンブルー染色および位相差顕微鏡により非生存細胞と区別した。細胞コンパートメント含有物は、採取時に細胞コンパートメント中の細胞数により測定し3〜5倍に戻し分けた。新鮮な細胞コンパートメント培地(17〜15ml)を細胞分画(3〜5ml)に加え20ml体積を得て、細胞縣濁液は細胞コンパートメントに戻した。採取した細胞を含有する上清分画は滅菌状態に保ち、アフィニティークロマトグラフィーによる精製まで4℃に保存した。細胞コンパートメント採取時に、栄養培地(1000ml)を除去し、新鮮な培地と交換した。デバイスは次の採取までインキュベーターに戻した。デバイスはインキュベーター内で互いに積み重ねた。
【００６８】
抗体精製
製造者のプロトコールに従い、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから抗体を溶出することにより培養上清を処理した。溶出抗体分画を回収し、プールし、分光光度計およびELISAにより抗体を定量化した。ポリクローナルヤギ抗マウスIgGまたはIgM捕捉用抗体およびペルオキシダーゼで標識したポリクローナル抗マウスIgGまたはIgM抗体を用いて、サンドイッチELISAを実施した。ABTSで発色させた。SDSPAGEおよびクーマシーブルー染色により抗体純度を評価した。
【００６９】
従来、固定化は、(米国特許第3,720,760号中に記載されているような)非水溶性マトリックスまたは表面への吸着、または[例えば、米国特許第3,645,852号中またはRotmans et al.J.Immunol.Methods 57:87〜98頁(1983)中に記載されているような、硝酸および還元剤を例えば用いた担体の事前の活性化有りまたは無しで、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミド系架橋剤を使用する]非共有結合もしくは共有結合により、アッセイ手順前、または例えば後の免疫沈降のいずれかで、捕捉用試薬の不溶化により実施されている。
【００７０】
固定化に使用する固相は、例えば表面、粒子、多孔性マトリックスなどの型の支持体を含めた、ほぼ非水溶性であり免疫測定アッセイにおいて有用である、任意の不活性支持体または担体であってよい。一般に使用される支持体の例には、小片、Sephadex(登録商標)、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、および96ウエルマイクロタイタープレートを含めた、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造されたアッセイプレートまたは試験管、ならびに濾過紙、アガロース、架橋デキストラン、および他の多糖などの微粒子材料がある。あるいは、米国特許第3,969,287号、米国特許第3,691,016号、米国特許第4,195,128号、米国特許第4,247,642号、米国特許第4,229,537号および米国特許第4,330,440号中に記載されている臭化シアン活性化炭水化物および反応性基質などの反応性非水溶性マトリックスを、捕捉用試薬の固定化に利用するのが適している。一実施形態では、固定化された捕捉用試薬をマイクロタイタープレート上にコーティングし、特に使用する一つの例示的な固相は、一度に数個のサンプルを分析するために使用することができるマルチウエルマイクロタイタープレートである。一つのこのようなELISAプレートは、Dynatech Immobilon IIとして販売されているプレートである(Dynatech Laboratories、Chantily、VAから市販されている)。
【００７１】
固相は、非共有結合または共有結合相互作用または必要に応じて物理的連結により連結することができる、前に記載した試薬などの捕捉用試薬でコーティングする。結合に関する技法には、米国特許第4,376,110号およびその中に引用された参照文献中に記載されている技法がある。共有結合の場合、プレートまたは他の固相は、当技術分野でよく知られている条件下(室温で1時間など)で、捕捉用試薬と一緒に架橋剤と共にインキュベートする。
【００７２】
固相基質に予め混合させた捕捉用試薬を結合させるのに、一般に使用される架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、およびビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミドがある。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生成する。
【００７３】
96ウエルプレートを利用する場合、それらは一般に捕捉用試薬の混合物でコーティングする(典型的には、約3℃〜4℃の温度、および約7.5のpHで、少なくとも約12時間のインキュベーションによりトリス緩衝生理食塩水などのバッファー中で希釈)。
【００７４】
プレートはアッセイ前に積み重ねそれ自体を長時間コーティングすることができ、次いでアッセイを、手動、ロボットの使用などにより半自動、または自動式に、いくつかのサンプルに同時に実施することができる。
【００７５】
コーティングしたプレートは、次いで、典型的には、結合部位に非特異的に結合し飽和状態にしてプレートのウエル上の過剰部位と遊離リガンドの望ましくない結合を防止する、ブロッキング剤を用いて処理する。この目的に適したブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン、カゼイン、およびノンファットミルクがある。特定の一実施形態では、BSA、20mg/ml、TBS中またはSuperBlockブロッキングバッファーをブロッキング剤として使用する。典型的にはブロッキング処理は、周囲温度の条件下で約1〜4時間行う。
【００７６】
コーティングおよびブロッキング後、適切に希釈した分析する生物サンプルを固定化相に加える。特定の実施形態では、希釈率は約2.5体積%(1:40)〜20体積%(1:5希釈)、約10体積%などである。この目的で希釈に使用することができるバッファーにはTBS+1mg/mLBSAがある。
【００７７】
使用する捕捉用試薬の量は、Hp-MMP9標準と比較して良い兆候をもたらすほど十分多い。十分な感度のため、一般に加える生物サンプルの量は、サンプルの適切な希釈後、固定化捕捉用試薬が生物サンプル中で予想される遊離Hp-MMP9の最大モル濃度のモル過剰であるような量である。この予想レベルは、分析する特定の生物サンプル中の遊離Hp-MMP9の濃度レベルと患者の臨床状態の間の、任意の知られている相関関係に主に依存する。一般に、全試薬の濃度を滴定してELISAの最適な結果を得なければならない。
【００７８】
したがって、これらの実施形態では、捕捉用試薬の濃度は、生物サンプルの任意の必要な希釈を考慮してHp-MMP9の対象の濃度範囲により一般に決定するが、捕捉用試薬の最終濃度は実験により決定して、対象の範囲にわたるアッセイの感度を最大にする。
【００７９】
サンプルのインキュベーションおよび固定化捕捉用試薬に関する条件を選択して、アッセイの感度を最大にし解離を最小にする。一般にインキュベーションは、約3℃〜約5℃の範囲のほぼ一定温度で実施して、例えば室温より変動が少ない、低い変動係数(CV)を得る。インキュベーション時間は主に温度に依存し、一般にアッセイ感度の低下を避けるため約2時間を超えない。一般にインキュベーション時間は、捕捉用試薬と遊離Hp-MMP9の結合を最大にするため3℃〜5℃で約2時間である。
【００８０】
この段階で、インキュベーション混合物のpHは通常約7.2〜7.5の範囲内である。インキュベーションバッファーのpHを選択して、捕捉するHp-MMP9と捕捉用試薬の有意なレベルの特異的結合を維持する。ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス-HClまたはトリス-リン酸、酢酸、バルビトールなどを含めた様々なバッファーを利用して、このステップ中に望ましいpHを獲得および維持することができる。利用する個々のバッファーは本発明には重要ではない。
【００８１】
本明細書のアッセイ法の第二のステップでは、生物サンプルを固定化捕捉用試薬から(洗浄により)分離して非捕捉Hp-MMP9を除去する。洗浄に使用する溶液は一般に、インキュベーションステップ用の前に記載した考慮事項およびバッファーを使用して決定したpH、約7.2〜7.5のpH範囲を有するバッファー(「洗浄バッファー」)である。洗浄は三回以上行うことができる。洗浄の温度は一般に冷蔵温度から適温であり、アッセイ期間中は一定温度、典型的には約22℃〜25℃を保つ。
【００８２】
次のステップでは、任意の固定化複合体を、約22℃〜25℃などの温度で検出可能な抗体と接触させ、2つの接触に関する温度および時間は利用する検出物質に主に依存する。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)および過酸化水素を検出手段として使用し、接触は一般に1時間〜2時間実施してシグナルを最大に増幅する。検出可能な抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。さらに、検出可能な抗体は直接検出可能であってよく、蛍光または比色定量標識を有してよい。
【００８３】
一般に、(前に記載した)予想される最大濃度の捕捉Hp-MMP9に対してモル過剰の抗体を、洗浄した後のプレートに加える。(直接的または間接的に検出可能な)この抗体はポリクローナル抗体であってよいが、任意の抗体を利用することができる。抗体の親和性は一般に、少量の遊離Hp-MMP9を検出できるほど十分高いが、それが検出可能な抗体の非特異的バックグラウンド結合を引き起こすほど高くはない。
【００８４】
アッセイ法の最後のステップでは、捕捉用試薬とその時点で結合しているHp-MMP9の量を、検出可能な抗体用の検出物質を使用して測定する。したがって、固定化捕捉用試薬に加える抗体は直接標識されているか、または過剰な第一の非標識の検出可能な抗体を洗浄除去した後の、第一の抗体に対するモル過剰の第二の標識抗体の添加により、間接的に検出されるかのいずれかである。
【００８５】
第一の抗体または第二の抗体のいずれかに使用する標識は、抗体と遊離Hp-MMP9の結合に干渉しない、任意の検出可能な機能性のあるものであってよい。適切な標識の例は、フルオロクロム、化学発光、発色、および放射性標識などの直接検出することができる成分、ならびに反応または誘導体化させ検出することが可能である酵素などの成分を含む、イムノアッセイにおける使用が知られている多数の標識である。このような標識の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、過酸化水素を利用する酵素と結合して色素前駆体を酸化するウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼおよびMUG、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、レアアース擬似体またはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオンなどがある。
【００８６】
従来の方法を利用して、これらの標識をタンパク質またはポリペプチドと共有結合させることが可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジンなどのカップリング剤を使用して、前に記載した蛍光、化学発光、および酵素標識で抗体をタグ化することができる。例えば、米国特許第3,940,475号(蛍光)および米国特許第3,645,090号(酵素);Hunter et al.Nature144:945頁(1962);David et al.Biochemistry 13:1014〜1021頁(1974);Pain et al.J.Immunol.Methods 40:219〜230頁(1981);およびNygren J.Histochem.and Cytochem.30:407〜412頁(1982)を参照。
【００８７】
抗体とこのような標識の結合は、イムノアッセイ技法分野の当業者には標準的な操作手順である。例えば、O'Sullivan et al.「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」、in Methods in Enzymology、ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis、Vol.73(Academic Press、New York、N.Y.、1981)、147〜166頁を参照。
【００８８】
最後の標識抗体の添加後、結合抗体の量を、洗浄により過剰な非結合標識抗体を除去し、次いでその標識に適した検出法を使用して結合標識の量を測定し、測定した量と生物サンプル中の遊離Hp-MMP9の量を関連付けることによって決定する。例えば酵素の場合、発色量および測定量は、存在するHp-MMP9の量の直接的測定値である。
【００８９】
キット
便宜上、本発明のアッセイ法はキットの形で提供することができる。このようなキットは、(1)ヒトHp-MMP9分子に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体からなる捕捉用試薬、および(2)Hp-MMP9と結合する検出可能な(標識または非標識)抗体からなる検出用試薬の基本構成要素を含むパッケージ化された組合せである。
【００９０】
一般にキットは、別の構成要素として提供することができる捕捉用試薬用の固体担体をさらに含み、または固体担体上に捕捉用試薬が既に固定化されている。したがって、キット中の捕捉用抗体は固体担体上に固定化することができ、またはそれらは、キットに含まれるかまたはキットと別に提供される担体上に固定化することができる。例えば、捕捉用試薬はマイクロタイタープレート上にコーティングすることができる。検出用試薬は直接検出される標識抗体、または異なる種で産生した非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体であってよい。標識が酵素である場合、キットは酵素に必要とされる基質およびコファクターを通常含み、標識がフルオロフォアである場合、検出可能なクロモフォアをもたらす色素前駆体である。検出用試薬が非標識である場合、キットはさらに、蛍光検出形式などで、非標識抗体に対する標識抗体などの検出可能な抗体用の、検出物質を含むことができる。
【００９１】
キットはまた、アッセイを実施するための説明書、および/または抗原標準物質としてHp-MMP9(例えば、精製Hp-MMP9)、ならびに例えば安定剤、洗浄およびインキュベーションバッファーなどの他の添加剤を典型的に含有する。
【００９２】
キットの構成要素は所定の割合で提供することができ、様々な試薬の相対量を適切に変えて、アッセイの感度をほぼ最大にする試薬の溶液中濃度をもたらす。特に、溶解時に試験対象のサンプルと組合せるのに適した濃度を有する試薬溶液をもたらす、賦形剤を含めた、通常は凍結乾燥状態の乾燥粉末として試薬を提供することができる。
【００９３】
本発明の様々な態様を、以下の非制限的な実施例に関してさらに詳細に記載する。
【００９４】
(実施例)
(実施例1)
この実施例は、Hp-MMP9複合体が、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独と異なる特異的診断有意性を有することを実証する。且つ、本実施例は、Hp-MMP9複合体用の試験として使用することができるELISA、および急性炎症状態、またはそのリスクの指標として使用することができるHp-MMP9複合体濃度の範囲を記載する。
【００９５】
材料および方法
動物
35匹の畜牛をこの実施例において試験した。これらの動物は、様々な障害を評価するためにThe Ohio State University VTHに与えられた動物(22匹の動物)、またはOhio State University Waterman Dairyからサンプル採取した動物(13匹の動物)であった。動物は、通常の臨床病理学的後処理用、またはウシ群感染疾患調査の一部のためとして出血させた。凝固後に遠心分離により通常の形式で血清を採取し、分析まで-20℃に凍結させた。動物の年齢(3.5±1.7年;範囲0.4〜8年)、品種(ホルスタイン=20、ジャージー=8、ヘレフォード=2、グエルンセイ=1、アンガス=3;ブラウンスイス=1)、性別(オス=3、メス=32)を、患者および/またはウシ群の記録から記録した(そして以下のTable1A(表1)、Table1B(表2)、およびTable1C(表3)において開示する)。畜牛は、死亡したかまたは安楽死させた動物における臨床兆候、病歴、ならびに臨床病理学的および病的評価の結果に基づいて、(1)急性敗血症疾患(15匹の畜牛)、(2)慢性疾患(10匹の畜牛)および(3)正常な動物(10匹の畜牛)に分類した。これらの動物は院内で獣医師により調べられたので、それらは、ELISAによる血清中タンパク質の分析前に、それらの疾患カテゴリーに関して分類された。ELISAによりサンプルを分析した個体は個々の動物のアイデンティティーまたは分類が分からず、動物研究室の指定で唯一与えられた凍結血清サンプルであった。基準に含めるための動物の選択は、The Ohio State University VTH Hospital Executive Committeeの臨床試験調査による承認の指針(2006年1月1日〜2008年1月1日)、およびThe Ohio State University Institutional Animal Care and Use committeeから得た研究試験結果の承認の下でそのように実施した。
【００９６】
MMP9分子種の精製
ウシMMP9モノマー、ダイマーおよびHp-MMP9複合体の精製を、[参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁中に]以前に記載されているように実施した。簡単に言うと、新鮮なウシの血液由来の好中球をPMAで刺激し、馴化培地を、反応性Red120アガロース(Sigma)クロマトグラフィー、ゼラチンアガロースアフィニティークロマトグラフィー、およびUltragel AcA34ゲル濾過にかけた。分画をSDSPAGEにより分析し、プールし、濃縮し-20℃で保存した。
【００９７】
モノクローナル抗体の産生
ウシ好中球により産生されたアフィニティー精製MMP9モノマーとダイマーの混合物を、BALB/Cマウスの免疫感作に使用した。マウスは7日間隔で、100μgの精製MMP9で二回免疫感作した。4週間後、マウスを100μgのMMP9で追加抗原刺激し、4日後に屠殺し、脾細胞はB細胞ミエローマSP2/0と融合させ、96ウエルプレート中に平板培養した。ハイブリドーマは、[参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Kohler G、Milstein C(1975)、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature256:495〜497頁中に記載されているように]、当業者によく知られている確立した方法に従い、100μΜのヒポキサンチン、0.4μΜのアミノプテリン、および16μΜのチミジンの存在下で選択した。[Kohler G、Milstein C (1975)、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature256:495〜497頁中に記載されているように]ELISAにより試験してMMP9に対する特異性を有する抗体を分泌したクローンを、二回の限界希釈によりさらにクローニングして、クローン性を確実にした。クローン10.1を、以前に記載されているように実施して[Celline、CL1000、Sartorius Stedim、North America、Inc.Bohemia NY 11716]、バイオリアクター中での陽性反応性および細胞増幅用に選択した。ハイブリドーマ上清の反応性は、酵素により活性化したMMP9モノマーおよびダイマーを用いて還元および非還元条件下で、精製モノマーおよびダイマーのウエスタンイムノブロットを使用して試験した。さらに、ウシ好中球由来、および末梢血白血球由来の全細胞溶解物を、モノクローナル抗体を用いてイムノブロット処理した。モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス(lgG1)は、市販のモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット[Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL61105から市販されているPierce Rapid ELISAマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット]を使用して決定した。ハイブリドーマ培地由来のIgGは[Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL61105から市販されている]プロテインGアガロースで精製し、4℃において1mg/mlの濃度で保存した。
【００９８】
抗ウシMMP9モノクローナル抗体(クローン10.1)は、酵素活性化後に還元または非還元とは無関係に、ウエスタンブロットにおいてウシMMP9モノマーおよびダイマーと陽性反応を示した。クローン10.1抗体は、ウエスタンブロットにおいてヒト起源の組換えMMP9とも陽性反応を示した。
【００９９】
10.1抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合体
約1mgの精製モノクローナル抗体10.1を、製造者の説明書に従いRocheのHRPタンパク質標識キットを用いてHRPと結合させた[ペルオキシダーゼ標識キット、Roche Diagnostics Corporation、Indianapolis、IN46250から市販されている]。得られた抗体-HRP結合体は[Sigma-Aldrich Co.、St.Louis、MO63178から市販されている]Ultragel AcA34(Sigma、U8878)でのゲル濾過により精製し、4℃において60μg/mlの濃度で保存した。
【０１００】
ELISAアッセイ
血清中HpのELISA-血清中Hpの濃度を、製造者の説明書に従い、市販のウシハプトグロビンELISA試験キット[ウシハプトグロビン96ウエルELISA、Life Diagnostics、West Chester PA19380から市販されている]を使用して決定した。標準曲線は、7.8〜500ng/mLの濃度範囲で、キットを含め精製ウシハプトグロビン標準物質(2.5μg/mL)を使用して作製した。血清サンプルはキットの説明書に従い希釈し(1:2,000希釈)、または低濃度のHpを含有するサンプルに関して低希釈で使用し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、5%BSA、TBS中、および対照ウエルであった。
【０１０１】
血清中MMP9のELISA-捕捉用抗体として非結合ウシMMP9モノクローナル抗体10.1(100μl、ウエル当たりに1μg含有)、および結合MMP9の検出用にHRP結合10.1抗体(TBS中0.3μg/ml、1mg/mlのBSA)を利用する、ウシMMP9用のELISAが研究室で開発された。これらの濃度は予備実験に基づいて選択した。捕捉用抗体の結合後、プレートはTBSで3×5分間洗浄し、TBS中に20mg/mlの濃度においてウシ血清アルブミン[Fisher Scientific、Thermo Fisher Scientific、Pittsburg PA 15275から市販されているウシ血清アルブミン、分画V]で、またはSuper Blockブロッキングバッファー[Tharmo Fisher Scientific、Rockford IL 61105から市販されているPierce Super Blockブロッキングバッファー]で、ウエルをブロッキングした。ブロッキングウエルの洗浄、および連続希釈した血清サンプルまたは既知濃度の精製ウシMMP9モノマーの添加後(22℃で60分間)、プレートは再度TBSで5×5分間洗浄し、HRP結合モノクローナル抗体(10.1)をそれぞれのウエルに1:200の最終濃度で加えた。過剰なHRP結合体は洗浄によって除去し、その後100μLのTMBを、HRP活性を測定するためにそれぞれのウエルに加えた。ウエルをインキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーを使用し経時的に比色分析を続けた(λ=630nm)。最高濃度の標準物質において発色が最大になったとき、1Nの塩酸を加えることにより反応を停止させた。次いでλ=450nmを使用して発色を測定した。MMP9タンパク質の量は、39〜2500ng/mlの濃度範囲を含む較正曲線として精製ウシMMP9タンパク質を使用して測定した。39ng/mL未満で登録したサンプルはゼロであると考えた。
【０１０２】
疾患状態および健常動物由来の血清サンプルを、二連で1mg/mlのBSAを含有するTBSを用いて各サンプルを連続希釈することにより分析した。各サンプルのセットを分析した後、標準曲線の直線範囲内に存在した希釈からの吸光度値を使用しMMP9濃度を定量化した。分析用に、血清は1mg/mlのBSAを含有するPBSで連続希釈し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、TBS中5%BSA、および対照ウエルであった。
【０１０３】
血清中Hp-MMP9複合体のELISA-精製モノクローナル抗体10.1を、前に記載したように捕捉用抗体として使用した(100μl、ウエル当たりに1μg含有)。しかしながら、選択した検出抗体は[Immunology Consultants Laboratory、RHPT-10P、Newberg、OR97132から入手した]アフィニティー精製したHRP結合ウサギ抗ウシハプトグロビンであり、、TBS中0.033μg/ml、1mg/mlのBSAの最終濃度で使用した。捕捉用抗体と検出抗体の両方のこれらの濃度は、予備実験に基づいて選択した。ウシ血清アルブミン、TBS中20mg/ml、またはSuper Blockブロッキングバッファーを、ブロッキング剤として使用した。精製ウシHp-MMP9複合体を使用して、40〜5000ng/mlの濃度を使用し標準曲線を作製した。40ng/mL未満で登録したサンプルはゼロng/mLであると考えた。各サンプルのセットを分析した後、標準曲線の直線範囲内に存在した希釈からの吸光度値を使用しHp-MMP9濃度を定量化した。分析用に、血清は1mg/mlのBSAを含有するPBSで連続希釈し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、、TBS中5%BSA、および対照ウエルであった。
【０１０４】
血清中Hp-MMP9ELISAの特異性-前に記載したように得たアフィニティー精製ウシHp、MMP9モノマーおよびHp-MMP9複合体を使用した。捕捉用抗体が抗ウシMMP9モノクローナル抗体(クローン10.1)であったプレート中、(4.8〜5,000ng/mLの範囲を超える)高濃度のHp、MMP9およびHp-MMP9複合体を別個のウエルに加え結合させた。洗浄後、HRP結合二次抗体を、以下のように加えた。:1)Hpを加えたウエルに、抗ウシHpHRP結合体または抗ウシMMP9HRP結合体を加えた。2)アフィニティー精製MMP9を加えたウエルに、、抗ウシHpHRP結合体または抗MMP9モノクローナル抗体HRP結合体を加えた。3)最後に、Hp-MMP9複合体を加えたウエルに、、抗ウシHpHRP結合体または抗ウシMMP9HRP結合体を加えた。TMB基質の添加後、450nmでプレートリーダーにより測定した各ウエルの吸光度の測定により、抗体結合の定量化(図1)。
【０１０５】
ウエスタンブロットによるELISA結果の確認
ELISAにより検出した個々の血清サンプル中のHp-MMP9複合体の存在を確認するため、独立した方法を使用した。選択血清のゼラチン結合断片はウエスタンブロッティングにより分析した。SDS-PAGE分析前に、3mlの各血清を0.5MのNaClに調節し、0.5MのNaCl、2mMのCaCl2、20mMのトリス-HCl pH7.5で事前に平衡化した300μlのゼラチンアガロースとインキュベートした。徹底的な洗浄後、20mMのトリス-HCl pH7.5、10mMのNaCl、2mMのCaCl2、0.015%のBrij35および10%のDMSOを含有する3mlのバッファーで、結合タンパク質をゼラチンアガロースから溶出した。溶出液はDMSOを含まない同じバッファーで6mlに希釈し、iCon濃縮器[Thermo Fisher Scientific. Rockford、IL61105から市販されているPierce濃縮器、9KMWCO、7ml]中で300μlに濃縮した。2mlに希釈した後、サンプルはiCon濃縮器中で200μlに再度濃縮した。サンプルは4×LDSサンプルバッファーで希釈し、4〜20%トリス-グリシンゲルを介した電気泳動にかけた[Invitrogen Corp、Carlsbad、CA92008から市販されているMuPAGE LDSサンプルバッファー(4×)、Invitrogen Corp、Carlsbad、CA92008から市販されているNovexの4〜20%トリス-グリシンゲル1.0mm、12ウエル]。分子量マーカーを1つのウエル中に置き、ゼラチンアフィニティーマトリックスから溶出したタンパク質のおよその分子量を決定した[Invitrogen Corp、Carlsbad、CA92008から市販されているMagicMark XPウエスタンタンパク質標準物質(20〜220kDa)]。HpおよびMMP9バンドは、ウサギ抗ウシハプトグロビン[ICL、Inc、Newburg、OR97132から市販されているウサギ抗ウシハプトグロビンポリクローナル抗体]、およびヤギ抗ヒトMMP9[R & D Systems Inc、Minneapolis、MN55413から市販されているヤギ抗ヒトMMP9アフィニティー精製ポリクローナルAB]を用いた標識により可視化にした。HRP結合抗ウサギおよび抗ヤギ抗体は二次抗体として使用し、次いでECLで可視化した[Cell Signaling Technology、Danvers、MA01923から市販されている20×Lumiglo試薬および20×ペルオキシド]。
【０１０６】
統計解析
動物を、(1)臨床試験、研究室、または他の診断の所見に基づく臨床診断結果、または(2)検死に基づく死後診断のいずれかにより分類した。これらの診断の結果に基づき、急性敗血症疾患、慢性または代謝性疾患、または正常として動物を表した。急性敗血症疾患動物は数字「1」で表し、慢性または代謝性疾患動物は数字「2」で表し、正常動物は数字「3」で表した。疾病分類の予備知識なしで個々によりELISAアッセイを実施した。3ELISAアッセイのそれぞれに関する各動物からのデータを、次いで動物IDによりスプレッドシートに配置した(番号1〜35)。
【０１０７】
各分類中の、3ELISAアッセイのそれぞれに関する動物からのデータを、次いで統計的に記載した(平均、標準偏差、最小、最大、メディアン)。データは正規分布ではなかったので(ハプトグロビンおよびハプトグロビン-MMP9複合体に関して正常および慢性疾患動物においてゼロ)、ノンパラメトリック法(クラスカル-ワリス検定、一元配置分散分析法)を使用して、3ELISAのそれぞれおよび3群のそれぞれに関する結果を比較した。データのさらなる試験は、ウィルコクスン順位和検定を使用する3ELISAアッセイのペアワイズ比較を含んでいた。複数(n=3)のペアワイズ比較を考慮するため、ボンフェローニの調整を行い、P値<0.0167(=0.05/3)は統計上有意であると考えた。
【０１０８】
結果
抗ウシMMP9モノクローナル抗体(クローン10.1)は、酵素活性化後に還元または非還元とは無関係に、ウエスタンブロットにおいてウシMMP9モノマーおよびダイマーと陽性反応を示した。クローン10.1抗体は、ウエスタンブロットにおいてヒト起源の組換えMMP9とも陽性反応を示した。この試験中で使用したMMP9ELISAとHp-MMP9複合体ELISAの両方の分析感度は39ng/mlであった。これらのアッセイの分析特異性は、無関係な分子(Hp-MMP9複合体ELISAに関してMMP9およびHpならびにMMP9ELISAに関してHp-MMP9複合体)が、濃度5000ng/mlまで検出不能であった事実(図1)により確認される。この試験中で使用した動物の病歴ならびに臨床病理学的および病的評価の結果は、それらの血清中のHp、MMP9およびHp-MMP9複合体の対応する値と一緒に(以下の)Table1A(表1)、Table1B(表2)、およびTable1C(表3)中に表し、3つの健康状態分類における各動物に関するELISAデータの分布のグラフ図は図2A、2B、および2C中に描く。
【０１０９】
論じるように、図2A中、測定可能な血清中Hp濃度を有していた正常な動物はほとんど存在せず(10匹中8匹が「0」であった)、一方、急性敗血症および慢性炎症/代謝性疾患の疾病分類において血清中Hpは高かった。この検体に関する急性敗血症および慢性炎症/代謝性疾患の疾病分類の、血清中のHp濃度間には相当な重複があった。急性敗血症動物、慢性または代謝性疾患を有する動物、および健常動物の血清中ハプトグロビン濃度のメディアン、および25パーセンタイル値、および75パーセンタイル値をTable2(表4)中に表す。急性炎症(メディアン415μg/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、302、680)および慢性炎症/代謝性疾患(メディアン178μg/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、131、567)を有する動物中の血清中ハプトグロビン濃度が互いに有意に異なることはなかった(p=0.1655)。しかしながら、急性敗血症疾患および慢性炎症/代謝性疾患における血清中Hp濃度は、健常なウシにおいて観察した濃度より有意に高かった(それぞれ0μg/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、0、0、p<0.0001、p=0.005)。
【０１１０】
さらに論じるように、図2B中、正常全ておよび疾病分類2の動物10匹中8匹が、測定可能な血清中Hp-MMP9濃度を有していなかった。疾病分類1に分類した動物は、疾病分類2および3の動物より有意に高い測定可能な濃度を有していた。2匹の疾病分類2の動物が高い血清中Hp-MMP9濃度を有していた(図2B)。1匹の動物が胸腺リンパ腫を有すると診断し、他の動物は、臨床上検出不能であった急性疾患をおそらくを有していた。急性敗血症の動物では、15匹中14匹の動物が高い血清中濃度のHp-MMP9複合体を有していた(図2B)。且つ論じるように、図1C中、疾病分類1および2の動物は、疾病分類3の動物より有意に多い血清中MMP9を有していた。疾病分類1および2の動物におけるMMP9の血清中濃度が、有意に異なることはなかった。
【０１１１】
各疾病分類の統計的比較は、各検体(ハプトグロビン、MMP9およびHp-MMP9複合体)に関して、正常動物と急性疾患動物の間に有意な差が見られたことを実証した。疾患カテゴリー2(慢性疾患)および3(正常なウシ)において動物を比較すると、ハプトグロビンとMMP9の血清中濃度は統計学的に異なった。しかしながら、Hp-MMP9複合体の血清中濃度は、正常または慢性疾患動物において統計学的に有意ではなかった。
【０１１２】
正常全ておよび慢性炎症/代謝性疾患を有する動物10匹中8匹が、測定可能な血清中Hp-MMP9複合体をいずれも有していなかった。急性敗血症の動物では、15匹中14匹の動物が高い血清中濃度のHp-MMP9複合体を有していた(Table1A(表1)、図2B)。
【０１１３】
急性敗血症疾患を有する動物における血清中Hp-MMP9複合体に関するメディアン、および25パーセンタイル値、および75パーセンタイル値(メディアン1014ng/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、477ng/mL、1392ng/mL)は、慢性炎症を有する動物/代謝性疾患を有する動物において観察された値(メディアン0ng/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、0ng/mL、0ng/mL、p<0.0031)、および正常動物において観察された値(メディアン0ng/mL、0,0、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、0ng/mL、0ng/mL、p<0.0001)より統計学的に高かった(Table2(表4))。正常または慢性疾患動物間のHp-MMP9複合体の血清中濃度の差は、統計学的に有意ではなかった(p=0.1468)。
【０１１４】
血清中MMP9濃度の範囲は、健常動物および慢性炎症/代謝性疾患を有する動物間より、急性敗血症性炎症を有する動物間ではるかに広範囲であった(Table2(表4))。しかしながら、疾患動物間には相当な重複があった(Table1C(表3)、図2C)。急性敗血症を有する動物における血清、遊離MMP9に関するメディアン、および25パーセンタイル値、および75パーセンタイル値(メディアン2745ng/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、1115ng/mL、3871ng/mL)、ならびに慢性/代謝性疾患を有する動物における血清、遊離MMP9に関するメディアン、および25パーセンタイル値、および75パーセンタイル値(メディアン2233ng/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、1625ng/mL、2910ng/mL)は、健常畜牛において測定した値(メディアン330ng/mL、25パーセンタイル値、75パーセンタイル値、153ng/mL、573ng/mL)より有意に高かった(それぞれp=0.0011およびP=0.0019)(Table2(表4))。しかしながら、急性疾患および慢性/代謝性疾患カテゴリーに含めた動物におけるMMP9の血清中濃度は、互いに有意に異ならなかった(p=0.5417)(Table2(表4))。
【０１１５】
【表１】
2013536438.tif 000003
【０１１６】
【表２】
2013536438.tif 000004
【０１１７】
【表３】
2013536438.tif 000005
【０１１８】
【表４】
2013536438.tif 000006
【０１１９】
急性敗血症疾患(疾患カテゴリー1)と慢性疾患(疾患カテゴリー2)の間の比較において、ハプトグロビンとハプトグロビン-MMP9複合体の濃度は有意に異なった。疾病分類1と2において畜牛間でMMP9濃度の差はなかった。
【０１２０】
考察
この試験は、正常な動物と比較して、急性敗血症疾患および慢性炎症、または代謝性疾患を有する畜牛における、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP9)、ハプトグロビン(Hp)およびハプトグロビン-マトリックスメタロプロテイナーゼ9(Hp-MMP9)複合体の血清中濃度の診断用途を比較する。この分析は、in vitroでのホルボールエステル刺激ウシ好中球由来の条件付き培地におけるHp-MMP9、および慢性炎症または健常ウシの血清中ではなく敗血症畜牛の血清中での、Hp-MMP9の存在の観察の以前の所見によって助長された[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁]。この試験の設計は、Hp-MMP9複合体の2つの別個成分、畜牛における主な急性期タンパク質であるHp、および炎症を経た畜牛の血清中に濃縮するMMP9の血清中濃度の測定も含んでいた。
【０１２１】
本試験を実施するために、MMP9またはHp-MMP9複合体のいずれかを特異的に認識するウシMMP9およびELISAアッセイに対するモノクローナル抗体を開発した。実験によって測定したように、Hp-MMP9のELISAは、別個の分子として遊離血清MMP9または遊離血清Hpを認識しない(図1)。さらに、MMP9のELISAは血清中のHp-MMP9複合体を認識しないことも確認した(図1)。最後に、急性敗血症疾患を有する畜牛における血清中Hp-MMP9複合体がHp-ELISAに関するデータをゆがめることはない。Hp-MMP9複合体の血清中濃度は、Hpの濃度より3桁低い濃度で存在するからである。
【０１２２】
いくつかの試験は、MMP9は末梢血好中球中の顆粒内に予め形成された状態で保存されることを示している[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet. Res.68:995〜1004頁;Klimiuk PA、Sierakowski S、Latosiewicz R、Cylwik B、Skowronski J、Chwiecko J(2002)、Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in different histological variants of rheumatoid synovitis、Rheumatology.(Oxford)41:78〜87頁;Ohtsuka H、Kudo K、Mori K、Nagai F、Hatsugaya A、Tajima M、Tamura K、Hoshi F、Koiwa M、Kawamura S(2001)、Acute phase response in naturally occurring coliform mastitis、J.Vet.Med.Sci.63:675〜678頁]。本実施例では、臨床上正常なウシと比較して急性または慢性疾患動物において、MMP9は明らかに上昇した(Table1A〜C(表1〜3)、図2A〜C)。他方で、データは慢性炎症/代謝性疾患および急性敗血症疾患の畜牛におけるMMP9の血清中濃度はほぼ同一であることを実証し、血清中MMP9は急性および慢性炎症または代謝性疾患の区別に適していないことを示唆した。この点で、急性期タンパク質としてのMMP9の血清中濃度の使用は勧めることができない。このタンパク質の検出が、健常な畜牛においてさえ
血清中MMP9濃度の相当な変動が原因で、偽陽性の診断結果につながり得るからである。[Klimiuk PA、Sierakowski S、Latosiewicz R、Cylwik B、Skowronski J、Chwiecko J(2002)、Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in different histological variants of rheumatoid synovitis、Rheumatology.(Oxford)41:78〜87頁;Larsen K、Macleod D、Nihlberg K、Gurcan E、Bjermer L、Marko-Varga G、Westergren-Thorsson G(2006)、Specific haptoglobin expression in bronchoalveolar lavage during differentiation of circulating fibroblast progenitor cells in mild asthma、J.Proteome.Res.5:1479〜1483頁;Ohtsuka H、Kudo K、Mori K、Nagai F、Hatsugaya A、Tajima M、Tamura K、Hoshi F、Koiwa M、Kawamura S(2001)、Acute phase response in naturally occurring coliform mastitis、J.Vet.Med.Sci.63:675〜678頁中で示唆されたように]、試験した全3群の動物におけるMMP9濃度間の明らかな区分領域の欠如は、炎症促進または抗炎症活性の一方を助長する、炎症におけるMMP9の二重の役割と関係がある可能性がある。
【０１２３】
Hpは畜牛において急性炎症の指標として認識されるが、血清中Hpの適度な増大が、臨床上明らかな炎症の兆候がないにもかかわらず、肝リピドーシスを有するウシに関して記載されている[Godson DL、Campos M、Attah-Poku SK、Redmond MJ、Cordeiro DM、Sethi MS、Harland RJ、Babiuk LA(1996)、Serum haptoglobin as an indicator of the acute phase response in bovine respiratory disease、Vet. Immunol.Immunopathol.51:277〜292頁;Katoh N、Miyamoto T、Nakagawa H、Watanabe A(1999)、Detection of annexin I and IV and haptoglobin in bronchoalveolar lavage fluid from calves experimentally inoculated with Pasteurella haemolytica、Am.J.Vet.Res.60:1390〜1395頁;Morimatsu M、Syuto B、Shimada N、Fujinaga T、Yamamoto S、Saito M、Naiki M(1991)、Isolation and characterization of bovine haptoglobin from acute phase sera、J.Biol.Chem.266:11833〜11837頁;Peake NJ、Foster HE、Khawaja K、Cawston TE、Rowan AD(2006)、Assessment of the clinical significance of gelatinase activity in patients with juvenile idiopathic arthritis using quantitative protein substrate zymography、Ann.Rheum.Dis.65:501〜507頁]。さらに、乳中のHp濃度の相当な変動が慢性、潜在性乳腺炎を有するウシにおいて観察されている[Gronlund U、Hallen SC、Persson 489 WK(2005)、Haptoglobin and serum amyloid A in milk from dairy cows with chronic sub-clinical mastitis、Vet.Res.36:191〜198頁]。以前の試験は、健常なウシの血清中のHp濃度は無視できる程度(約20ng/mL以下)であるが、急性炎症では950μg/mLもの高い値に増大し得ることを実証する。
【０１２４】
他方で、この試験において慢性炎症/代謝性疾患を有した大部分のウシは、それらの血清中に相当濃度のHpも有する。慢性炎症/代謝性障害および急性敗血症疾患におけるHp濃度間の統計差がないため、血清中Hp濃度自体は、畜牛において急性炎症と慢性炎症の間の不確かな識別子であると考えられる。
【０１２５】
この試験からのデータは、HpおよびMMP9ELISAアッセイに優るHp-MMP9ELISAの有意な診断利点を実証した。慢性炎症/代謝性疾患を有する動物または健常動物と比較して、急性敗血症疾患を有する畜牛において観察した血清中Hp-MMP9濃度の有意な差が存在する。このデータは、Hp-MMP9アッセイは急性、敗血症疾患に特異的であることを示唆する。急性炎症を有することを臨床的に確認した15匹の動物の中で、14匹の動物が高い血清中濃度のHp-MMP9を有していた。15匹の動物中わずか1匹の動物が、39ng/mL未満の血清中濃度のHp-MMP9複合体を有していた(0として解釈)。このウシ(番号8、Table1A(表1))は近年出産しクレブシエラ亜種(Klebsiella spp.)乳腺炎を発症していた。HpおよびMMP9の血清中濃度は、疾患カテゴリー2と3両方の動物の血清において観察した濃度の範囲内にあった。しかしながら、この動物はPredef 2X(商標)(酢酸イソフルプレドン)で3日間治療した。血清中Hp-MMP9複合体の欠如は事前のコルチコステロイド治療と関連し得る。in vitroおよびin vivoで、コルチコステロイドは炎症に対して顕著な影響があるからである[Cohn.L.A.(2003)、The influence of corticosteroids on host defense mechanisms、J.Vet.Intern.Med..5:95〜104頁]。
【０１２６】
急性敗血症状態に対するHp-MMP9複合体ELISAの特異性は、12匹の慢性疾患動物のわずか2匹における、その存在によってさらに確認される。この2症例の1匹(Table 1B(表2)、番号16)は、病的と記載されるいかなる壊死または細菌感染もない、胸腺リンパを有すると診断した。新生物形成がある畜牛におけるHp-MMP9複合体の存在を調べなければならない。第二のHp-MMP9陽性動物は臨床的所見に基づき疾病分類2に置いた(Table 1B(表2)、番号19)。それは血清中Hp-MMP9複合体を有していたが、解放前のこの特定動物に対する診断試験の不実施は、これらの血清中Hp-MMP9複合体の存在の説明を妨げる。
【０１２７】
Hp-MMP9ELISAの別の好ましい特徴は、急性敗血症動物の血清の狭い濃度範囲であった。急性敗血症として臨床分類した動物中のHp-MMP9のメディアン濃度は1,014ng/mL(および586〜1373ng/mLの範囲の25パーセンタイル値、75パーセンタイル値)であった。慢性炎症/代謝性疾患の症例に関するメディアン値は0ng/mLであった。急性敗血症動物における血清中Hp-MMP9複合体の比較的狭い濃度範囲は、その診断有用性を高める。
【０１２８】
血清中Hp-MMP9複合体に対するELISAベースアッセイの特異性に関する生物学的根拠は、おそらくその細胞起源の独自性からなる(現在、唯一の知られている源は脱顆粒好中球である)[Bannikov GA、Mattoon JS、Abrahamsen EJ、Premanandan C、Green-Church KB、Marsh AE、Lakritz J(2007)、Biochemical and enzymatic characterization of purified covalent complexes of matrix metalloproteinase-9 and haptoglobin released by bovine granulocytes in vitro、Am.J.Vet.Res.68:995〜1004頁]。対照的に、遊離血清中Hpおよび遊離MMP9は、様々な攻撃に応じていくつかの細胞源により産生され分泌される[D'Armiento J、Dalai SS、Chada K(1997)、Tissue、temporal and inducible expression pattern of haptoglobin in mice、Gene 195:19〜27頁;Sharpe-Timms KL、Zimmer RL、Ricke EA、Piva M、Horowitz GM(2002)、Endometriotic haptoglobin binds to peritoneal macrophages and alters their function in women with endometriosis、Fertil.Steril.78:810〜819頁]。これは、慢性炎症/代謝性疾患を有する10匹の動物中8匹において、測定可能量のHp-MMP9複合体が存在せず、遊離Hpおよび遊離MMP9が上昇したことを示すデータにより支持される。
【０１２９】
結論として、遊離HpまたはMMP9と比較すると、Hp-MMP9の血清中濃度は、畜牛において急性敗血症性炎症のより信頼できる指標であるようである。したがって、Hp-MMP9ELISAの施用は、ウシにおける急性敗血症状態の初期事象の診断に有用であり得る。
【０１３０】
(実施例2)
この実施例中の試験は、in vivoでは、LPS誘導型の血液学的および生化学的変化は血清中Hp-MMP9複合体の存在と関係があり、したがってこれらの複合体は、妊娠中毒症など、畜牛における様々な状態のバイオマーカーとして働くことができることを実証する。
【０１３１】
材料および方法
9匹のオスの子牛、約6週齢をOSU Waterman Dairyから得た。一回用量の細菌LPS、具体的には大腸菌(E.coli)O111:B4エンドトキシンを、2.5ug/体重1Kgの割合で9匹の子牛のそれぞれに静脈内投与した。次いで血清サンプルを、当業者に知られている標準的な技法により、エンドトキシン投与後96時間連続的にそれぞれの子牛から得た(例えば、凝固後遠心分離により通常の形式で血清を採取し、分析するまで-20℃に凍結した)。
【０１３２】
血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更(および確認)することができることを、当業者は理解している。
【０１３３】
結果
静脈内LPS注入は、血清中コルチゾール、白血球細胞活性化およびHp-MMP9の変化を誘導する。
【０１３４】
静脈内LPS注入は、いくつかの重要な血液学的および生化学的所見と関係があった。図3を参照すると、LPS注入は末梢血白血球細胞数の急速で統計上有意な低下を引き起こした(t=0と比較してP<0.01、混合型手順、SAS)。これは、血管内皮内膜への好中球の移動、および0.5時間までの血液内のリンパ球数の急速な低下によるものであった(t=0と比較してP<0.001、混合型手順、SAS)。さらに、ここで図4を参照すると、LPS注入は1時間までに<1ug/mL〜>4.7ug/mLの血清中コルチゾールの急速な上昇と関係があり、これらの9匹の子牛中でLPS注入後3時間までに6.3ug/dLのピークに達した(t=0と比較してP<0.001、混合型手順、SAS)。コルチゾールの急速な増加は、リンパ球数の劇的な減少がおそらく原因であると考えられる。末梢血白血球数はLPS注入後約4時間は少ない状態であり、細胞数は次の20時間は徐々に増大し正常に戻った。
【０１３５】
ここで図5を参照すると、未成熟バンドPMNはLPS注入後約8時間で0/uLから600/uLの平均値まで増大した(t=0と比較してP<0.001、混合型手順、SAS)。LPS注入後約6時間で、血清中コルチゾールの減少(図4)および末梢血におけるWBCリバウンドの開始(図3)に付随して、血清中Hp-MMP9複合体が検出可能であり、LPS注入後36時間でピークまで増大した(図3〜5、t=0と比較してP<0.01、混合型手順、SAS)。LPS注入後36〜96時間から、血清内のHp-MMP9の濃度は徐々に減少した。
【０１３６】
同様に、ここで図6を参照すると、(Hp-MMP9に特異的なELISAに基づいて)血清中Hp-MMP9を検出したとき、血清中の全ハプトグロビン(Hp)がカットオフポイント未満に存在し、約20時間でのみこの閾値を超える。血清中の全ハプトグロビンの濃度対経時変化は、Hp-MMP9出現後6〜10時間遅れていたにもかかわらず、血清中Hp-MMP9のそれと形状が非常に類似していた(図6)。さらに、得られた血清中の全ハプトグロビンの程度は、前のLPS誘導型血清中Hpの試験で観察したそれの約半分であった。以前に報告されたように、これらのLPS誘導型Hp-MMP9複合体および血清中Hpは、8日ではなく96時間以内に正常に戻ることを観察した。いかなる理論によっても束縛されないが、これは、血清中の全ハプトグロビンのELISAを使用して検出され得る好中球Hp-MMP9複合体の初期放出に、原因がある可能性があると考えられる。
【０１３７】
対照的に、ここで図7を参照すると、別の血清中急性期タンパク質(α1酸性糖タンパク質-「AGP」)が、この実施例中に記載する試験の行程にわたり有意に変わることはなかった。血清中Hpのアッセイと同様に、この一元放射免疫拡散法(SRID)形式イムノアッセイは全AGPを測定する。以前に報告された試験と同様に、血清中AGPが、血清中Hp-MMP9複合体に関する情報と類似した情報を与えるわけではないようである。これらのデータは、血清中Hp-MMP9の放出は好中球活性化の初期指標であり、静脈内LPSに関する末梢血白血球の急速な減少および増大に付随して起こることを示唆する。
【０１３８】
(実施例3)
この実施例は、実験的マイコプラズマボビスによる肺感染は、血清中Hp-MMP9複合体と関係があることを示す。
【０１３９】
血清サンプルをDr.David Anderson(Kansas State University College of Veterinary Medicine、Manhattan、Kansas)の研究室から得て、ウシ呼吸器疾患の血清マーカーをアッセイした。実験的マイコプラズマボビス接種に関するHp-MMP9複合体アッセイ用の血清が提供された。動物(n=28)を109cfuの生命力があるマイコプラズマボビスを気管内注入する直前(t=0)に出血させ(n=24)、滅菌生理食塩水を擬似注入した(n=4)。次いで全ての子牛を第7日と第14日に出血させた。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更(および確認)することができることを、当業者は理解している。血清中Hp-MMP9複合体は、試験開始前に28匹中26匹の動物において存在しなかった。検出可能な血清中Hp-MMP9を有する1匹の動物は、試験開始時に多量の血中心筋トロポニンIも有しており、胸部炎症を示唆した。他の動物は第14日に多量の血清中ハプトグロビンを有しており、慢性の、非特異的な炎症異常を示唆した。血清中Hp-MMP9複合体は、第7日に28匹中4匹の動物において、および第14日に28匹中18匹の動物において検出された(図8参照)。
【０１４０】
(実施例4)
この実施例は、骨関節炎と比較して、自己免疫疾患を有するヒト患者における血清中Hp-MMP9複合体を調べる。
【０１４１】
血清中Hp-MMP9複合体の分析用に、29対象由来の血清サンプルをDr.Michael Wiseman(Cedar Sinai Medical Center in Southern California)の研究室から得た。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更(および確認)することができることを、当業者は理解している。これらのサンプル(n=29)は、そのアイデンティティー、疾患および疾患期間がこれらのサンプルに関するELISA試験を実施する個体に適用できない3つの異なる患者群由来であった。患者群番号1由来のサンプル(n=9)は慢性骨関節炎を有する患者に由来し(「OA」)、患者群番号2由来のサンプル(n=10)は全身性エリテマトーデスを有する患者に由来し(「SLE」)、且つ患者群番号3由来のサンプル(n=10)は関節リウマチを有する患者に由来した(「RA」)。血清中Hp-MMP9のELISAアッセイはこれらの盲検サンプルに実施し、データはCedar Sinai Medical Centerに返却した。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更(および確認)することができることを、当業者は理解している。データの返却後、次いでDr.Wisemanは試験管数と関係がある疾患プロセスを与え、したがってそれらの疾患プロセスは血清中Hp-MMP9濃度と一致した。
【０１４２】
SLE患者とOA患者の間(p=0.068)、およびRA患者とOA患者の間(p=0.068)の血清中Hp-MMP9濃度の差は有意な傾向に向かい、OA患者と比較してHp-MMP9SLEおよびRA患者において活性好中球仲介の炎症を示唆した。したがって血清中Hp-MMP9は、好中球活性化を特徴とする疾患に罹患したヒト中に存在するようである(図9)。さらに、これらの患者の病歴臨床データ(初期診断、治療経験、臨床的寛解)を入手して、このデータの有意性をさらに解明することができる。
【０１４３】
(実施例5)
この実施例は、本明細書に記載するHp-MMP9ELISAを変更および確認するための、さらなる方法を対象とする。
【０１４４】
前に記載した実施例は、実施例1中に記載したように、アフィニティー精製した捕捉用物質(モノクローナル抗体10.1、抗ウシMMP9)、アフィニティー精製した検出用物質(ウサギ、抗ウシHp-HRP結合体)および精製Hp-MMP9複合体で確認するELISAを利用して実施した。これらの試験は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Bannikov、GA et al、2011;Vet.Immunol.Immunopath 139:41〜49頁中に記載されているように確認した。このとき以来、敗血症のウシ由来の血清サンプルの使用に焦点が当てられており、標準に関する以前の試験の一部として分析されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Bannikov、et al、2011)。周知のHp-MMP9濃度を有する血清が、ELISA条件を最適化するために現在使用されている。較正曲線として使用する血清サンプルを調製し(連続希釈)、チェッカーボード滴定を実施しコーティング抗体濃度(2ug/ウエル〜64ug/ウエル)および検出用抗体(1:5,000〜1:160,000倍希釈)を評価した。これは、コーティング抗体濃度>2ug/ウエルは十分であること、および標準曲線は1:5K(0.2ng/mL)から1:160K(0.0063ng/mL)検出用抗体まで直線的であることを実証した。しかしながら、第二抗体の濃度が低下すると、較正曲線の直線勾配およびダイナミックレンジは1:5Kから1:160Kまで減少する。さらに、コーティング、洗浄およびブロッキングバッファーおよび洗浄剤濃度の評価により、最大5%のtween-20を取り込んだBSAは非特異的バックグラウンドを減少させ、較正曲線の底部から上部までアッセイのダイナミックレンジを>1吸光度単位増大させることを測定した。陽性対照カリブレーターに関する相対標準偏差は0.6%(114ng/mL)〜4.7%(14ng/mL)であった。
【０１４５】
前に記載した実施例は、周知の感染因子および炎症刺激に対する本明細書で開示するアッセイの適性を実証する。刺激試験の使用は、感染/刺激に関するサンプリング時間地点の知識をもたらす。これらの応答を使用して、実地試験で使用するのに最適なサンプリング時間を定義することができる。LPS試験から、到着第0日と第4日の間で得たサンプルが有用である可能性があると思われる。本発明者らは、これらの時間地点はマンヘミア・ヘモリチカ(M.hemolytica)の試験においても有用であると予想する。マイコプラズマボビスの試験から、0〜7日の間のサンプリング時間が有用である可能性がある。この情報は、本明細書で示すようなBRDの実地調査におけるHp-MMP9試験の有用性を定義する際に有用である。さらに、方法特徴付け試験は、アッセイは確かなものであり、実地用途に適合し得ることを実証している。Hp-MMP9の合成源の産生により、畜牛における潜在性BRDに関して市販の患者側検定を首尾よく実施する能力が改善するはずである。
【０１４６】
本明細書中に列挙する本発明の実施形態は単なる例示的なものであることを意図し、当業者は、本発明の精神から逸脱せずに、それに対する多数の変形および変更形態を作製することができる。例えば、前に記載した実施例は、畜牛における急性炎症状態を試験するのに有用なELISAおよび複合濃度範囲を開示するが、このようなELISAは、ヒトなどの他の哺乳動物におけるHp-MMP9複合体の試験に適用することができ、本明細書中に記載する方法は、過度の実験無しにこのような他の哺乳動物における急性炎症状態を示す有用な複合濃度範囲を決定することができることは、当業者によって理解される。さらに、Hp-MMP9複合体ELISAは、急性敗血症とは異なるが好中球脱顆粒と関係がある、他の状態の診断においておそらく有用である。これらの状態は、様々な型の関節炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈プラーク形成などを含み得る。前述の事項にもかかわらず、特定の変形および変更形態は、最適未満の結果をもたらす一方で、満足のいく結果を依然もたらすことができる。全てのこのような変形および変更形態は、本発明の範囲内に存在するものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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