(57)【要約】本発明は、定量リアルタイムＰＣＲを使用して、組換えタンパク質生物製剤における残留宿主細胞ゲノムＤＮＡを定量するための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物において前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法であって、前記方法は、
ａ）組換えタンパク質産物の試料からゲノムＤＮＡを精製し、そして場合により精製ゲノムＤＮＡを濃縮する工程；
ｂ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量リアルタイムＰＣＲ増幅法によって試料から精製されたゲノムＤＮＡを定量する工程；および
ｃ）組換えタンパク質産物における真核宿主細胞の残留ゲノムＤＮＡの量を決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列が、定量リアルタイムＰＣＲに適した非特異的ＤＮＡインターカレート色素を使用して検出される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡインターカレート色素が、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡインターカレート色素がＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列が、配列特異的蛍光発生プローブを使用して検出される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
配列特異的蛍光発生プローブが、ＴａｑＭａｎプローブまたは分子ビーコンである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
配列特異的蛍光発生プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号１の配列を含むまたはからなるフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列が、配列番号４の配列を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブを使用して検出される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
試料に、精製前に、その配列がどの公知の生物にも見られない合成コントロールＤＮＡの既知量を加え、そして定量リアルタイムＰＣＲ中に前記コントロールＤＮＡに特異的な追加の対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してゲノムＤＮＡと同時に前記コントロールＤＮＡを定量することによって、試料のゲノムＤＮＡの精製収率を決定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量を精製収率によって割ることによって、非精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量を決定することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
合成コントロールＤＮＡが、配列番号３の配列を含むまたはからなる、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
合成コントロールＤＮＡが、配列番号５の配列を含むまたはからなるフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を含むまたはからなるリバースプライマーを使用して増幅される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された合成コントロールＤＮＡの増幅配列が、配列特異的蛍光発生プローブを使用して検出される、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
配列特異的蛍光発生プローブが、配列番号７の配列を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、ヒト、マウス、サル、ウサギ、ハムスター、酵母、植物および昆虫の細胞からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質産物が薬学的組成物であるか、または薬学的使用のためのものである、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するためのキットであって、前記キットは、（ｉ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する少なくとも１対のプライマー；および（ｉｉ）その配列がどの公知の生物にも見られない少なくとも１つの合成コントロールＤＮＡ分子、および場合により、このようなキットを使用するためのガイドラインを提供するパンフレットを含む、前記キット。
【請求項１９】
ｑＰＣＲ反応を実施するためにおよび／またはＤＮＡ精製を実施するために必要とされる試薬をさらに含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
標準ＤＮＡの複数の希釈液をさらに含む、請求項１８または１９記載のキット。
【請求項２１】
前記キットがさらに、配列番号１の配列を含むまたはからなるフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のプライマーを含む、請求項１８〜２０のいずれか１項記載のキット。
【請求項２２】
前記キットがさらに、配列番号３の配列を含むまたはからなる合成コントロールＤＮＡ分子を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項記載のキット。
【請求項２３】
配列
【化３３】
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を含むまたはからなるフォワードプライマーおよび配列
【化３４】
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を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される合成コントロールＤＮＡを標的化する１対のプライマーをさらに含む、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するための請求項１８〜２３のいずれか１項記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分析分子生物学の分野、特にＤＮＡ定量の分野に関する。特に、本発明は、定量リアルタイムＰＣＲを使用した組換えタンパク質生物製剤における残留宿主細胞ＤＮＡの定量に関する。
【０００２】
発明の背景
組換えタンパク質薬物には必然的に、タンパク質を作製するために使用される細胞に由来するゲノムＤＮＡが混入し、そして世界保健機関および食品医薬品局（ＦＤＡ）の両方が、混入するＤＮＡの量は、１用量の生物学的薬物あたり１０ngの残留ＤＮＡを超えないことを推奨している。さらに、ＦＤＡは、残留ＤＮＡのために使用される検出法が、１用量あたり少なくとも１０pgに対する感度があることを推奨している。それ故、医薬品メーカーは、低いピコグラム範囲のゲノムＤＮＡを正確に定量することのできる高感度の方法を使用して、その生物製剤における残留ＤＮＡの量を定量することを余儀なくされている。
【０００３】
残留ＤＮＡを定量するために製薬産業によって現在使用されている最も一般的な方法は、閾値法（Molecular Devices社, Menlo Park, California, USA）である。閾値法は、一本鎖ＤＮＡを認識して低いピコグラム範囲で任意の起源に由来するＤＮＡを定量する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および抗体を有する、サンドイッチＥｌｉｓａ反応を使用する。このアッセイの非特異性は、あらゆる宿主細胞に由来する混入ＤＮＡを検出するために使用することができるので有利であるが、前記方法は、コスト、複雑性および再現性の点から欠点を有する。それ故、痕跡量のＤＮＡを定量するための代替的な方法が開発された。
【０００４】
定量ＰＣＲ（すなわちｑＰＣＲ）は、痕跡量のＤＮＡを測定するための別の方法である。ｑＰＣＲは、ＰＣＲ反応において反応の各サイクルにおいて発生した蛍光シグナルを測定する方法である。ｑＰＣＲ反応に導入された試験配列の量は、サイクリング中に発生するシグナルの強度を決定し、このシグナルを、既知の標準物質から得られたシグナルと比較することによって、ＤＮＡを幅広い濃度範囲におよび正確に定量することができる。
【０００５】
ゲノムＤＮＡを測定する場合のアッセイの感度は、宿主種のゲノムにおける標的配列のコピー数に直接的に依存し、従って、高い感度が要求される場合には高度に反復した配列が最善の標的である。感度はまたゲノムサイズに反比例し、よって小さなゲノムを有する生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ（ゲノムサイズは４．６メガベース）に由来する宿主ＤＮＡは、コピー数の多い標的に頼ることなく、低いピコグラム範囲で定量され得る。しかしながら、バイオ医薬品における現在の傾向は、高等真核生物、例えばハムスター、サルおよびヒト（全て２ギガベースを超えるゲノムサイズを有する）などに由来する細胞においてタンパク質産物を産生することである。それ故、残留ＤＮＡのためのあらゆるｑＰＣＲアッセイは、大きなゲノムサイズを有する細胞に由来する低いピコグラムの量のゲノムＤＮＡを検出することができなければならない。
【０００６】
真核宿主細胞のＤＮＡの検出に必要とされる感度を得るための一般的なアプローチは、高度に反復した配列標的を使用することである。LetwinおよびJezuit (US patent 5,393,657)は、ＰＣＲアッセイにおける標的として高度に反復したハムスターＡｌｕ等価共通配列を使用してハムスターＤＮＡを定量する方法を開示する。このアッセイの解読は、ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション技術またはシークエンスなどの標準的な分子生物学的技術に依拠した。Anderson et al (US patent application 2009/0325175)もまた、残留ＤＮＡを検出するためにハムスターＡｌｕ様配列を使用し、解読としてｑＰＣＲに依拠した。ｑＰＣＲのための標的配列としてヒトＡｌｕエレメントを使用してヒトＤＮＡを定量するために類似したアプローチが使用された（Walker et al. Analytical Biochemistry 315 (2003) 122-128）。
【０００７】
しかしながら、Ａｌｕ様配列、および他の明らかに非機能的な高度に反復した配列は、種間で保存されておらず、そして別々のＰＣＲプライマーを使用した別々のアッセイが、試験されなければならない各々の種のＤＮＡに対して必要とされる。
【０００８】
結果として、ｑＰＣＲが真核生物ＤＮＡ定量にもたらす利点、例えば低コストおよび高い再現性、およびｑＰＣＲに基づかない閾値法の普遍性を有する方法が依然として非常に必要とされる。
【０００９】
発明の要約
本発明者らは本明細書において、組換えタンパク質を産生するために使用された真核宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを、低いピコグラムから高いフェムトグラムまでの範囲で、検出および定量するために、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を、定量ＰＣＲのための標的配列として使用することができることを実証する。
【００１０】
従って、第１の局面において、本発明は、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法に関し、前記方法は、
ａ）組換えタンパク質産物の試料からゲノムＤＮＡを精製し、そして場合により精製ゲノムＤＮＡを濃縮する工程；
ｂ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量リアルタイムＰＣＲ増幅法によって試料から精製されたゲノムＤＮＡを定量する工程；および
ｃ）組換えタンパク質産物における真核宿主細胞の残留ゲノムＤＮＡの量を決定する工程
を含む。
【００１１】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、定量リアルタイムＰＣＲに適した非特異的ＤＮＡインターカレート色素を使用して検出され得る。１つの態様において、ＤＮＡインターカレート色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅからなる群より選択される。好ましくは、ＤＮＡインターカレート色素はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩである。
【００１２】
あるいは、工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、配列特異的蛍光発生プローブを使用して検出され得る。１つの態様において、配列特異的蛍光発生プローブはＴａｑＭａｎプローブまたは分子ビーコンである。好ましくは、配列特異的蛍光発生プローブはＴａｑＭａｎプローブである。
【００１３】
１つの態様において、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドプライマーの対は、配列番号１を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列番号２を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される。
【００１４】
別の態様において、工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、配列番号４を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブを使用して検出される。
【００１５】
本発明の方法は、試料に、精製前に、その配列がどの公知の生物にも見られない合成コントロールＤＮＡの既知量を加え、そして定量リアルタイムＰＣＲ中に前記コントロールＤＮＡに特異的な追加の対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してゲノムＤＮＡと同時に前記コントロールＤＮＡを定量することによって、試料のゲノムＤＮＡの精製収率を決定することをさらに含み得る。非精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量はさらに、精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量を精製収率によって割ることによって決定され得る。
【００１６】
１つの態様において、合成コントロールＤＮＡは、配列番号３の配列を含むまたはからなる。合成コントロールＤＮＡは、配列番号５の配列を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列番号６の配列を含むまたはからなるリバースプライマーを使用して増幅され得る。
【００１７】
工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された合成コントロールＤＮＡの増幅配列は、配列特異的蛍光発生プローブ、好ましくはＴａｑＭａｎプローブを使用して検出され得る。１つの態様において、配列特異的蛍光発生プローブは、配列番号７の配列を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブである。
【００１８】
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、ハムスター、酵母、植物および昆虫の細胞からなる群より選択され得る。
【００１９】
組換えタンパク質産物は薬学的組成物であり得るか、または薬学的使用のためのものであり得る。
【００２０】
別の局面において、本発明は、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するためのキットに関し、前記キットは、（ｉ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する少なくとも１対のプライマー；および（ｉｉ）その配列がどの公知の生物にも見られない少なくとも１つの合成コントロールＤＮＡ分子、および場合により、このようなキットを使用するためのガイドラインを提供するパンフレットを含む。
【００２１】
キットは、ｑＰＣＲ反応を実施するためにおよび／またはＤＮＡ精製を実施するために必要とされる試薬をさらに含み得る。それはまた、標準ＤＮＡの複数の希釈液も含み得る。
【００２２】
１つの態様において、キットはさらに、配列番号１の配列を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列番号２の配列を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のプライマーを含む。
【００２３】
別の態様において、キットはさらに、配列番号３の配列を含むまたはからなる合成コントロールＤＮＡ分子を含む。キットはまたさらに、配列
【化１】
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を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列
【化２】
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を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、合成コントロールＤＮＡを標的化する１対のプライマーを含み得る。
【００２４】
さらなる局面において、本発明はまた、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するための本発明によるキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】７つの真核生物種からのＤＮＡを使用したＳｙｂｒＧｒｅｅｎによる解読を伴う増幅。
【図２】７つの真核生物種からのＤＮＡを使用したＴａｑＭａｎプローブによる解読を伴う増幅。
【００２６】
発明の詳細な説明
１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、真核生物の細胞質リボソームの小さい方の成分に対する構造ＲＮＡである。１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子からの配列データは、そのゆっくりとした進化の速度、および遺伝子配列を入手するためのユニバーサルプライマーの使用を可能とする高度に保存されたフランキング領域の存在に因り、生物の進化の歴史を再構築するための分子分析において幅広く使用されている。さらに、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、比較的一定したレベルで全ての細胞に発現されているハウスキーピング遺伝子と考えられており、そして主に、ＲＮＡ発現アッセイのための内部標準として使用されている。
【００２７】
本発明者らは本明細書において驚くべきことに、組換えタンパク質を産生するために使用された真核宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを、低いピコグラムから高いフェムトグラムまでの範囲で定量するために、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的化するプライマーをｑＰＣＲアッセイにおいて使用することができることを見出した。
【００２８】
実際に、１８Ｓ遺伝子のコピー数は、Ａｌｕ様配列のコピー数よりはるかに少ないが（数百のコピー数、対、数十万のコピー数、すなわち１０００倍の差）、本発明者らは、１８Ｓ遺伝子のコピー数は、組換えタンパク質薬物の残留ゲノムＤＮＡ検出アッセイのために当局によって必要とされる、ピコグラム以下の感度を与えるには十分であることを実証する。
【００２９】
１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、哺乳動物などの高等真核生物においては１ゲノムあたり１００〜２００コピーで、および酵母においては７コピーで存在しており、そして真核生物間で高度に保存されているので、例えば、酵母、マウス、ヒト、ハムスター、ラットおよびサル細胞株、並びに、ウサギにおいて増殖された腫瘍において産生されたタンパク質における残留ＤＮＡの検出のために同じアッセイを使用することが可能である。真核生物ゲノムＤＮＡの２０００万個の塩基ごとに約１コピーの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が存在し、そしてこれにより、哺乳動物においては２００フェムトグラムという少なさのおよび酵母においてはそれよりはるかに少ないＤＮＡを検出することができる非常に高感度なアッセイを可能とする。
【００３０】
結果として、本発明の方法は、低コスト、高い再現性および使用し易さなどのｑＰＣＲが提供する利点を有し、また、１８Ｓ遺伝子は種間で高度に保存されているという事実に因り真核生物に対して普遍的である。
【００３１】
従って、本発明は、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物において前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法に関し、前記方法は、
ａ）組換えタンパク質産物の試料からゲノムＤＮＡを精製し、そして場合により精製ゲノムＤＮＡを濃縮する工程；
ｂ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量リアルタイムＰＣＲ増幅法によって試料から精製されたゲノムＤＮＡを定量する工程；
ｃ）組換えタンパク質産物における真核宿主細胞の残留ゲノムＤＮＡの量を決定する工程
を含む。
【００３２】
本明細書において使用する「組換えタンパク質産物」という用語は、宿主細胞によって、好ましくは真核宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を含む組成物を指す。組換えタンパク質は、宿主細胞によって、好ましくは真核宿主細胞によって産生された任意のタンパク質であり得る。前記タンパク質は、例えば酵素、抗体またはそのフラグメント、レセプター、サイトカイン、ホルモン、凝固因子または増殖因子であり得る。好ましくは、前記タンパク質は治療用または診断用である。特定の態様において、組換えタンパク質産物は薬学的組成物であるか、または薬学的使用のためのものである。
【００３３】
残留ゲノムＤＮＡについて試験される組換えタンパク質産物の試料は、組換えタンパク質を含む任意の試料、例えば、組換えタンパク質の精製画分の試料、タンパク質精製過程の中間画分の試料、精製組換えタンパク質を含む組成物の試料であり得、そしてこれを使用して、最終薬物製剤、すなわち組換えタンパク質を含む最終薬物製剤が調製され得る。
【００３４】
本明細書において使用する「残留ゲノムＤＮＡ」という用語は、組換えタンパク質を産生するために使用された宿主細胞に由来し、そして産物試料に含まれる、任意のゲノムＤＮＡ分子を指す。
【００３５】
真核宿主細胞は、組換えタンパク質を産生するために使用された任意の真核宿主細胞であり得る。１つの態様において、宿主細胞は、ヒト、マウス、ウサギ、サル、ハムスター、酵母、植物および昆虫の細胞からなる群より選択される。好ましい態様において、宿主細胞は、ヒト、マウス、ハムスター、ウサギ、酵母、植物および昆虫の細胞からなる群より選択される。
【００３６】
ヒト細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）が挙げられるがこれに限定されない。マウス細胞の例としては、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞株（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３）が挙げられるがこれに限定されない。ハムスター細胞の例としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）が挙げられるがこれに限定されない。酵母細胞の例としては、Pichiacells（ＡＴＣＣ５８０）およびSaccharomyces cerevisiae（ＡＴＣＣ２０６２６）が挙げられるがそれらに限定されない。植物細胞の例としては、Nicotiana tabacum（ＡＴＣＣ４０９０４）が挙げられるがこれに限定されない。昆虫細胞の例としては、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１）が挙げられるがこれに限定されない。サル細胞の例としては、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）が挙げられるがこれに限定されない。宿主細胞はまた、例えば、モノクローナル抗体を産生し、そしてウサギの皮下に配置された腫瘍に由来するウサギ細胞であり得る。
【００３７】
ｑＰＣＲ分析の前に、高濃度のタンパク質、緩衝剤および安定化剤から通常なる組換えタンパク質産物の試料から、残留ゲノムＤＮＡが精製される。これらの非ＤＮＡ成分の大半はＰＣＲ阻害物質であり、そしてこれは除去されるべきである。
【００３８】
当業者には公知の種々の方法を使用して、ゲノムＤＮＡを試料から精製することができる。特に、ゲノムＤＮＡは、抽出−沈降プロトコール、シリカメンブレンに基づいた核酸精製、磁気粒子に基づいた精製システム、またはアニオン交換樹脂を使用したＤＮＡ精製プロトコールを使用して精製され得る。好ましくは、ゲノムＤＮＡは、シリカメンブレンに基づいた核酸精製を使用して試料から精製される。好ましくは、二価カチオンおよびタンパク質などのＰＣＲ阻害物質を除去するための方法が選択される。シリカメンブレン技術を使用し、ＰＣＲ適用に適した種々のゲノムＤＮＡ精製キットが、例えばQIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)のように市販されている。
【００３９】
１つの態様において、プロテイナーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫを、精製前に試料に加えて、前記試料中に含まれるタンパク質を消化する。別の態様において、ＲＮａｓｅ、好ましくはＲＮａｓｅＡを、精製前に試料に加えて、前記試料中に含まれるＲＮＡを消化する。特定の態様において、プロテイナーゼおよびＲＮａｓｅを、精製前に試料に加えて、前記試料中に含まれるタンパク質およびＲＮＡを消化する。最適な消化を得るために使用される条件は当業者には周知である。
【００４０】
精製されたゲノムＤＮＡは、使用する精製技術に依存して、ＰＣＲ適用に適した水または低塩または低ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁または溶出される。
【００４１】
ｑＰＣＲ分析に使用することのできるＤＮＡの容量は最大でも数マイクロリットルである。結果として、必要であれば、精製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅前に濃縮してもよい。Millipore社(Billerica, Ma, USA)のMicrocon YM100フィルターを使用したろ過による、またはエタノール沈降によるなどの任意の公知の方法を使用してＤＮＡを濃縮し得る。
【００４２】
試料から精製され、そして場合により濃縮された残留ゲノムＤＮＡを、その後、定量リアルタイムＰＣＲ増幅法を使用して定量する。定量リアルタイムＰＣＲ（すなわちｑＰＣＲ）は、標的化ＤＮＡ分子を増幅および同時に定量するために使用される周知の技術である。
【００４３】
ｑＰＣＲでは、ＤＮＡ増幅を、蛍光シグナルを測定することによってＰＣＲの各サイクルにおいてモニタリングする。ｑＰＣＲ反応に導入された標的化配列の量は、サイクリング中に発生するシグナルの強度を決定し、そしてこのシグナルを、既知の標準物質から得られたシグナルと比較することによって、ＤＮＡを幅広い濃度におよび正確に定量することができる。反応の対数期中に存在するＤＮＡの相対濃度は、サイクル数に対して蛍光をｌｏｇ尺度でプロットすることによって決定される。バックグラウンドを上回る蛍光の検出のための閾値が決定される。試料からの蛍光が閾値と交差するサイクルは、サイクル閾値Ｃｔと呼ばれる。既知量の標準ＤＮＡの複数の希釈液を使用することによって、Ｃｔに対するｌｏｇ濃度の標準曲線を作成することができる。その後、未知の試料中のＤＮＡの量を、そのＣｔ値から計算することができる。
【００４４】
本発明の方法において、試料から精製されたゲノムＤＮＡを、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してｑＰＣＲによって定量する。
【００４５】
本明細書において使用する「プライマー」という用語は、約８から約３５塩基長、好ましくは約１５から約３０塩基長、より好ましくは約１５から約２５塩基長、さらにより好ましくは約２０塩基長を含むオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において使用する「約」という用語は、特定の数値の数値±１０％の範囲を指す。例えば、「約２０」は、２０の±１０％、すなわち１８から２２を含む。好ましくは、「約」という用語は、特定の数値の数値±５％の範囲を指す。
【００４６】
１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するプライマーとして使用するのに適したオリゴヌクレオチドは、真核生物ゲノムＤＮＡ全体を通して反復され、そして真核生物種間で高度に保存されている、この遺伝子の配列に向けられる。系統発生解析における１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の広範な使用に因り、これらの必要条件を満たした種々のプライマーは当業者によってよく知られている。例えば、Torczynski et al (Nucleic Acid Research, vol 11, number 14, p 4879, 1983)は、ラット、カエルおよび酵母の１８Ｓ遺伝子の配列を比較し、そして高度の類似性を見出した。遺伝子の多くの領域が完全に保存され、そしてこれを使用してユニバーサルプライマーを設計することができる。保存領域に対して設計された多くのプライマー対が現在市販されている。例えばEurogentec (Liege, Belgium)は、１８Ｓ遺伝子に対するプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅することによってＲＮＡを定量するための製品を販売している（カタログ番号RT-CKFT-18S）。これらの市販されているプライマーの配列の比較は、それらがカエル、酵母およびラット間で１００％保存されている１８Ｓ遺伝子の領域を認識することを示す。SABiosciences社(Frederick, MD, USA)もまた、ユニバーサル１８Ｓプライマーを含む製品を販売している（製品番号PA-112）。さらに、１８Ｓ遺伝子に対するプライマー配列はまた、http://www.its.caltech.edu/~mirsky/qpcrprimer.htmのCalTech QPCR表などの公共データベースにおいても入手可能である。
【００４７】
特定の態様において、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドプライマー対は、配列
【化３】
2013536678.tif 000005
を含むフォワードプライマー、および
【化４】
2013536678.tif 000006
の配列を含むリバースプライマーによって構成される。より特定した態様において、フォワードプライマーは配列
【化５】
2013536678.tif 000007
からなり、そしてリバースプライマーは、
【化６】
2013536678.tif 000008
の配列からなる。これらのプライマーは前記したように市販されている（Eurogentec、カタログ番号RT-CKFT-18S）。これらのプライマーを使用して、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１５５ｂｐ領域を増幅する。
【００４８】
定量リアルタイムＰＣＲにおいて、ＤＮＡ増幅を、蛍光シグナルを測定することによってＰＣＲの各サイクルにおいてモニタリングする。一般的に、２つの方法を使用して増幅配列を検出し得る：あらゆる二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光色素、およびプローブとその相補的ＤＮＡ標的のハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能とする蛍光リポーターを用いて標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブ。
【００４９】
１つの態様において、本発明の方法の工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、非特異的ＤＮＡインターカレート色素を使用して検出される。定量リアルタイムＰＣＲに適した数多くのインターカレート色素が開発されており（例えばGudnason et al., Nucleic Acids Res. 2007 October; 35(19): e127参照）、そしてこれらの周知の色素のいずれかを本発明に使用することができる。特定の態様において、ＤＮＡインターカレート色素は、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅからなる群より選択される。好ましくは、ＤＮＡインターカレート色素はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩである。
【００５０】
別の態様において、本発明の方法の工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、配列特異的蛍光発生プローブを使用して検出される。この態様において、増幅配列は、プローブの一方の末端においてはリポーター蛍光色素およびプローブの逆の末端においては蛍光のクエンチャーの両方を用いて標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出される。リポーターとクエンチャーの近接は、その蛍光の検出を妨げる。リポーター−クエンチャーの近接さの破壊は、蛍光の放出を可能とし、これをレーザーを用いて励起した後に検出することができる。
【００５１】
リアルタイム検出のための種々の化学に基づいた配列特異的プローブが入手可能である。好ましくは、配列特異的蛍光発生プローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブまたは分子ビーコンである。
【００５２】
分子ビーコンは、一本鎖のヘアピン形状のオリゴヌクレオチドプローブである。相補的標的配列の非存在下においてはビーコンは閉じたままであり、そして認識可能な蛍光は全くない。相補的標的配列の存在下において、ビーコンの「ステム」部分は分離し、プローブは標的にハイブリダイズする。ビーコンがアンフォールドされると、フルオロフォアはもはやクエンチされず、そして分子ビーコンは蛍光を発する。
【００５３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Roche Molecular Systems, Inc.）は、５’末端においてリポーターフルオロフォアおよび３’末端においてクエンチャーフルオロフォアを用いて標識された１８〜２２ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブからなる、二重標識された加水分解プローブである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲ反応において標的配列の量を測定するために、酵素Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。プローブが加水分解されない時までは、クエンチャーおよびフルオロフォアは互いに近接して留まり、プローブの長さだけ離れている。ＰＣＲ中に、プローブは、フォワードプライマーとリバースプライマーの間の増幅配列の内部領域に特異的にアニーリングする。その後、ポリメラーゼはプライマーの伸長を行ない、そしてＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合した鋳型を複製する。ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性はプローブを切断し、クエンチャーの近位からリポーター分子を離して放出させ、その結果、蛍光強度は増加する。ＴａｑＭａｎプローブを設計するための種々のフルオロフォアおよびクエンチャーが入手可能である。フルオロフォアの例としては、ＮＥＤ（Life Technologies）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡＳＥ）およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）が挙げられるがそれらに限定されない。クエンチャーの例としては、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４−（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン−４−カルボン酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＢＨＱ（Black Hole Quencher（登録商標））ファミリーのクエンチャー、ＮＦＱ−ＭＧＢ（非蛍光クエンチャーおよび副溝結合剤）、ＱＳＹ２１カルボン酸、スクシンイミジルエステル、およびＱＳＹ（登録商標）７カルボン酸、スクシンイミジルエステルが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５４】
配列特異的蛍光発生プローブ、特にＴａｑＭａｎプローブを、種々のフルオロフォアを使用してマルチプレックスアッセイ（同じｑＰＣＲ反応におけるいくつかの標的化配列の検出のための）において使用することができる。
【００５５】
好ましい態様において、配列特異的蛍光発生プローブはＴａｑＭａｎプローブである。
【００５６】
特定の態様において、本発明の方法の工程ｂ）の定量リアルタイムＰＣＲ中に合成された増幅配列は、配列
【化７】
2013536678.tif 000009
を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブを使用して検出される。より特定の態様において、このプローブの５’末端におけるリポーターフルオロフォアはＮＥＤ色素であり、そして３’末端におけるクエンチャーはＮＦＱ−ＭＧＢである。好ましくは、配列
【化８】
2013536678.tif 000010
を含むＴａｑＭａｎプローブを使用して、配列
【化９】
2013536678.tif 000011
を含むまたはからなるフォワードプライマーおよび
【化１０】
2013536678.tif 000012
の配列を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドプライマー対を使用することによって増幅して配列を検出する。
【００５７】
当業者は、定量リアルタイムＰＣＲ反応を実施する方法および得られたデータを分析する方法、すなわち、ｑＰＣＲの結果に基づいて標的ＤＮＡを定量する方法を知っている。
【００５８】
当業者は、増幅する標的配列の長さ、またはプライマーの配列および長さを含む種々の要因に依存して、温度および各ｑＰＣＲサイクルの長さなどのｑＰＣＲ反応のパラメーターを容易に調整することができる。典型的なｑＰＣＲ反応は、約２０サイクルから約５０サイクル、好ましくは約２５サイクルから約４５サイクル、より好ましくは約３０サイクルから約４５サイクルのＰＣＲを含む。典型的には、各サイクルは、変性工程（例えば９５℃で１５秒間）、その後のアニーリング工程（例えば６０℃で１分間）を含む。ｑＰＣＲ反応はまた２回の追加の初期の工程、すなわち、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いてのキャリーオーバーＰＣＲ産物の分解を可能とする５０℃での２分間、および増幅前の鋳型の完全な変性を可能とする９５℃での１分間を含み得る。通常、ｑＰＣＲ反応は、自動システム、例えばApplied Biosystems 7500装置を使用して実施される。データ分析もまたコンピューターソフトウェア、例えばABI Prism 7500ソフトウェアを使用して実施することができる。
【００５９】
本発明の方法の定量リアルタイムＰＣＲ（工程ｂ）による試料から精製されたゲノムＤＮＡの定量に基づいて、組換えタンパク質産物における真核宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡの量を、試験試料に由来するシグナルを、同じ種に由来するゲノムＤＮＡを使用して作成された標準曲線と比較することによって容易に決定（工程ｃ）することができる。標準曲線のためのＤＮＡは濃縮溶液中にあり得、そしてＵＶ吸収またはピコグリーン染色などの非ｑＰＣＲ法によって定量され得る。
【００６０】
ゲノムＤＮＡ精製過程中に、アッセイの正確度を減少させるいくらかの試料ごとのばらつきが存在し得る。なぜなら、試料について得られた最終結果は、最初の試料中に存在するゲノムＤＮＡの量および精製収率の両方に依存するからである。試料基準で試料の精製収率を制御するための１つのアプローチは、精製前に、各試料に既知量の不活性コントロールＤＮＡ配列を添加し、そして精製産物におけるこのコントロール配列の量を決定することである。コントロール配列の量および宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡの量を、その後、デュプレックスｑＰＣＲを使用することによって同じ反応において同時に決定する。
【００６１】
従って、１つの態様において、本発明の方法はさらに、試料に、精製前に、その配列がどの公知の生物にも見られない合成コントロールＤＮＡの既知量を加え、そして定量リアルタイムＰＣＲ中に前記コントロールＤＮＡに特異的な追加の対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してゲノムＤＮＡと同時に前記コントロールＤＮＡを定量することによって、試料のゲノムＤＮＡの精製収率を決定することを含む。その後、非精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量は、精製試料中の残留ゲノムＤＮＡの量を精製収率によって割ることによって決定され得る。
【００６２】
あらゆる公知の生物に存在しないＤＮＡ配列は試験試料に由来するＤＮＡと交差反応せず、そして有用な可能性のある配列を周知のデータベースと比較することによって独特であり天然には存在しないことが確認され得る。例えば、あらゆる配列を、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiのBasic Local Alignment Search (BLAST)を実施することによって全ての公知の配列と比較することができる。このような配列は、例えば、Swango et al, Forensic Science International 158 (2006) 14-26に記載されている。当業者はこのような配列を容易に選択することができ、そしてそれを増幅するための特異的なプライマーを設計することができる。
【００６３】
特定の態様において、合成コントロールＤＮＡは、配列
【化１１】
2013536678.tif 000013
を含むまたはからなる。
【００６４】
この態様において、合成コントロールＤＮＡは、配列
【化１２】
2013536678.tif 000014
を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列
【化１３】
2013536678.tif 000015
を含むまたはからなるリバースプライマーを使用して増幅され得る。
【００６５】
ゲノムＤＮＡ増幅からもたらされる蛍光シグナルと、合成コントロールＤＮＡ増幅からもたらされる蛍光シグナルとを識別するために、増幅配列は、好ましくは、明確に異なるフルオロフォアを有する、配列特異的蛍光発生プローブ、特にＴａｑＭａｎプローブを使用して検出される。特定の態様において、ｑＰＣＲ反応中に合成される合成コントロールＤＮＡの増幅配列を検出するために使用された配列特異的蛍光発生プローブは、配列
【化１４】
2013536678.tif 000016
を含むまたはからなるＴａｑＭａｎプローブを使用して検出される。より特定の態様において、このプローブの５’末端におけるリポーターフルオロフォアはＦＡＭであり、そして３’末端におけるクエンチャーはＭＧＢである。
【００６６】
代替的な態様において、ゲノムＤＮＡの精製収率を決定するために使用されたコントロールＤＮＡは、その配列がどの真核生物にも見られない原核生物ＤＮＡである。
【００６７】
第２の局面において、本発明は、原核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物において前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法に関し、前記方法は、
ａ）組換えタンパク質産物の試料からゲノムＤＮＡを精製し、そして場合により精製ゲノムＤＮＡを濃縮する工程；
ｂ）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量リアルタイムＰＣＲ増幅法によって試料から精製されたゲノムＤＮＡを定量する工程；
ｃ）組換えタンパク質産物における原核宿主細胞の残留ゲノムＤＮＡの量を決定する工程
を含む。
【００６８】
原核生物のリボソーム遺伝子は、真核生物のそれとは配列が異なり、そして前記したような１８Ｓ ｒＲＮＡに特異的な同じプライマーを使用することはできない。しかしながら、原核生物は１６Ｓリボソーム遺伝子の複数のコピーを有し、これは株間で配列が高度に保存されている。例えば、E.coliゲノムＤＮＡはこの遺伝子の７つのコピーを含む。
【００６９】
真核宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法のために開示された全ての態様がまた、この方法において考えられる。
【００７０】
特定の態様において、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドプライマーの対は、配列
【化１５】
2013536678.tif 000017
を含むフォワードプライマー、および
【化１６】
2013536678.tif 000018
の配列を含むリバースプライマーによって構成される。
【００７１】
より特定の態様において、前記に列挙したプライマー（配列番号８および９）を使用して、好ましくはE.coliなどの原核宿主細胞の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のアンプリコンを、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどの非特異的ＤＮＡインターカレート色素、またはＴａｑＭａｎプローブなどの配列特異的蛍光発生プローブの存在下で増幅することにより、残留原核生物ゲノムＤＮＡ、特に残留E.coliゲノムＤＮＡを検出するための高感度かつ正確なアッセイが得られる。
【００７２】
原核生物に由来する残留ＤＮＡはまたプラスミドＤＮＡを含み得、これは細菌染色体の配列に指向されるプライマーを用いて検出されない。プラスミドＤＮＡを検出するために、親プラスミドＰＢＲ３２２の複製起点（E.coliにおける発現に使用される大半のプラスミドがこの複製起点を有する）などのプラスミドにおいて保存されていることが多い配列に対する追加のプライマーが設計され得る。プラスミドＤＮＡのためのアッセイは、非特異的ＤＮＡインターカレート色素による解読、好ましくはＳｙｂｒＧｒｅｅｎによる解読を用いて非標識プライマーを使用して別々のｑＰＣＲ反応において実施され得るか、または、配列特異的プローブ、好ましくはＴａｑＭａｎプローブを使用してゲノムＤＮＡのためのプライマーと一緒にデュプレックスｑＰＣＲ反応において実施され得る。
【００７３】
いくつかの環境においては組換えタンパク質には、原核および真核宿主細胞の両方に由来するゲノムＤＮＡが混入し得る。前記したアッセイを、例えばＳｙｂｒＧｒｅｅｎによる解読を用いる２つの別々の反応として組み合わせるか、またはＴａｑＭａｎプローブなどの配列特異的蛍光発生プローブを用いる二重反応とすることにより、両方の起源の混入ＤＮＡを検出することができる。両方のタイプのＤＮＡを検出できることはまた、ＤＮＡがｑＰＣＲを実施する前に試料から精製される場合に収量を定量するための手段として有用である。例えば、真核生物ＤＮＡを含む試料に、既知量の原核生物ＤＮＡを添加し得、そしてその後、精製された試料を原核生物ＤＮＡおよび真核生物ＤＮＡの両方について試験する。回収された原核生物ＤＮＡの量は収率を決定し、そしてこれを使用して真核生物ＤＮＡについて得られた解読値を調整することにより、元来の試料中の真核生物ＤＮＡの正確な測定を得ることができる。
【００７４】
従って、別の局面において、本発明は、真核および／または原核宿主細胞（群）から得られた組換えタンパク質産物において前記宿主細胞（群）に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法に関し、前記方法は、
ａ）組換えタンパク質産物の試料からゲノムＤＮＡを精製し、そして場合により精製ゲノムＤＮＡを濃縮する工程；
ｂ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーおよび１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量リアルタイムＰＣＲ増幅法によって試料から精製されたゲノムＤＮＡを定量する工程（増幅配列は配列特異的蛍光発生プローブを使用して検出される）；
ｃ）組換えタンパク質産物における真核宿主細胞および／または原核宿主細胞の残留ゲノムＤＮＡの量を決定する工程
を含む。
【００７５】
真核宿主細胞に由来するおよび原核宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量する方法のために開示された全ての態様がまた、この方法において考えられる。
【００７６】
別の局面において、本発明は、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するためのキットに関し、前記キットは、（ｉ）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する少なくとも１対のプライマー；および（ｉｉ）その配列がどの公知の生物にも見られない少なくとも１つの合成コントロールＤＮＡ分子、および場合により、このようなキットを使用するためのガイドラインを提供するパンフレットを含む。
【００７７】
キットはまた、ｑＰＣＲ反応を実施するために（例えばＤＮＡポリメラーゼ）および／またはＤＮＡ精製を実施するために必要とされる試薬を含み得る。
【００７８】
キットはさらに、Ｃｔに対するｌｏｇ濃度の標準曲線を作成するための標準ＤＮＡの複数の希釈液を含み得る。
【００７９】
１つの態様において、キットは、配列
【化１７】
2013536678.tif 000019
を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列
【化１８】
2013536678.tif 000020
を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のプライマーを含む。
【００８０】
１つの態様において、キットは、配列
【化１９】
2013536678.tif 000021
を含むまたはからなる合成コントロールＤＮＡ分子を含む。キットはさらに、配列
【化２０】
2013536678.tif 000022
を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列
【化２１】
2013536678.tif 000023
を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、合成コントロールＤＮＡを標的化する１対のプライマーを含み得る。
【００８１】
キットはさらに、ゲノムＤＮＡの増幅配列およびコントロールＤＮＡの増幅配列を検出するために設計された、配列特異的蛍光発生プローブ、特にＴａｑＭａｎプローブを含み得る。
【００８２】
本発明はさらに、真核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するための前記したようなキットの使用に関する。
【００８３】
さらなる局面において、本発明は、原核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するためのキットに関し、前記キットは、（ｉ）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する少なくとも１対のプライマー；および（ｉｉ）その配列がどの公知の生物にも見られない少なくとも１つの合成コントロールＤＮＡ分子、および場合により、このようなキットを使用するためのガイドラインを提供するパンフレットを含む。
【００８４】
キットはまた、ｑＰＣＲ反応を実施するために（例えばＤＮＡポリメラーゼ）および／またはＤＮＡ精製を実施するために必要とされる試薬を含み得る。
【００８５】
キットはさらに、Ｃｔに対するｌｏｇ濃度の標準曲線を作成するための標準ＤＮＡの複数の希釈液を含み得る。
【００８６】
１つの態様において、キットは、配列
【化２２】
2013536678.tif 000024
を含むまたはからなるフォワードプライマー、および
【化２３】
2013536678.tif 000025
の配列を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的化する１対のプライマーを含む。
【００８７】
１つの態様において、キットは、配列
【化２４】
2013536678.tif 000026
を含むまたはからなる合成コントロールＤＮＡ分子を含む。キットはさらに、配列
【化２５】
2013536678.tif 000027
を含むまたはからなるフォワードプライマー、および配列
【化２６】
2013536678.tif 000028
を含むまたはからなるリバースプライマーによって構成される、合成コントロールＤＮＡを標的化する１対のプライマーを含み得る。
【００８８】
キットはさらに、ゲノムＤＮＡの増幅配列およびコントロールＤＮＡの増幅配列を検出するために設計された、配列特異的蛍光発生プローブ、特にＴａｑＭａｎプローブを含み得る。
【００８９】
本発明はさらに、原核宿主細胞から得られた組換えタンパク質産物における前記宿主細胞に由来する残留ゲノムＤＮＡを定量するための前記したようなキットの使用に関する。
【００９０】
以下の実施例は説明のために示され、制限するためではない。
【００９１】
実施例
実施例１：残留ＤＮＡのアッセイ
種々の真核生物種に由来するゲノムＤＮＡを、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的化するプライマーを使用してｑＰＣＲによって定量した。
【００９２】
以下のプライマーを使用して、１８Ｓリボソーム遺伝子の１５５ｂｐ領域を増幅した：フォワードプライマー：
【化２７】
2013536678.tif 000029
およびリバースプライマー
【化２８】
2013536678.tif 000030
【００９３】
フォワードおよびリバースプライマーを１００nMの濃度で使用した。
【００９４】
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎによる解読を使用したｑＰＣＲ反応を、供給業者の指示に従ってApplied Biosystems (Foster City, California, USA)のＳｙｂｒＧｒｅｅｎマスターミックスを使用して実施した。
【００９５】
ｐＰＣＲ反応を、２５μlの反応容量を用いてApplied Biosystems 7500装置で実施した。以下のサイクリングパラメーターを使用した：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒間の変性および６０℃で１分間のアニーリングを４０サイクル。
【００９６】
各実験を３回実施した。
【００９７】
ヒトＤＮＡの定量
２０ngから２００fgまでのヒトＤＮＡの１０倍希釈液（Promega社のヒトDNA, Madison Wisconsin, USA, カタログ番号1471）が、ｑＰＣＲ反応のための鋳型として提供された。混合反応液に加える直前に蒸留水で希釈を行なった。
【００９８】
最初の実験において、１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを、蛍光としてＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いてシングルプレックスな反応において単独で使用した。この実験について得られたＣｔ値を表１に示す。
【００９９】
【表１】
2013536678.tif 000031
【０１００】
標準曲線の勾配は−３．５５であり、これはｑＰＣＲについて予期された範囲である。
【０１０１】
第２の実験において、１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを、増幅配列内に結合して蛍光シグナルを発生するＴａｑＭａｎプローブと共に使用した。ＴａｑＭａｎプローブは５０nMの濃度で使用され、そして以下の配列を有していた：
【化２９】
2013536678.tif 000032
【０１０２】
このアッセイ中に得られたＣｔ値を表２に示す。
【０１０３】
【表２】
2013536678.tif 000033
【０１０４】
種々の真核生物種に由来するゲノムＤＮＡの定量
１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は種間で保存されており、そして本発明者らは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎアッセイおよびＴａｑＭａｎアッセイの両方が、多くの真核生物源に由来するゲノムＤＮＡを増幅することを実証した。
【０１０５】
最初に試料中のタンパク質をプロテイナーゼＫを用いて消化し、その後、標準的なグアニジニウム／シリカによる精製によって（Applied BiosystemsのPrep Seq Residual DNA調製キット）、ゲノムＤＮＡを種々の真核生物源から精製した。ゲノムＤＮＡを、低塩／低ＥＤＴＡ緩衝液（５０μl）の最小容量を使用してシリカから溶出した。
【０１０６】
ゲノムＤＮＡを、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１）、酵母細胞（Pichia細胞、ＡＴＣＣ５８０）およびヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）から精製した。
【０１０７】
他のゲノムＤＮＡは業者からPCR ready genomic DNAとして（マウス、ウサギ、ハムスター、植物（Arabidopsis thaliana）ゲノムＤＮＡ）購入された。
【０１０８】
ｑＰＣＲ反応の条件は、前記したようなヒトＤＮＡアッセイと同じであった。
【０１０９】
７つの真核生物種に由来するＤＮＡを使用してＳｙｂｒＧｒｅｅｎによる解読を用いてのｑＰＣＲ反応の結果を図１に示す。各アッセイの感度は、低いピコグラムレベルまで及んだ。類似の結果が、図２に示したように、ＴａｑＭａｎに基づいたアッセイを用いて得られた。
【０１１０】
実施例２：コントロールＤＮＡの添加
コントロールＤＮＡを使用して非精製試料に添加することにより、精製収率を決定する。コントロールＤＮＡは、その配列がどの公知の生物にも見られず、以下の配列：
【化３０】
2013536678.tif 000034
を有する合成オリゴヌクレオチドである。
【０１１１】
このＤＮＡ配列は、以下のプライマー：
【化３１】
2013536678.tif 000035
および以下の配列
【化３２】
2013536678.tif 000036
を有するＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＰＣＲによって定量される。
【０１１２】
ｑＰＣＲ反応は、実施例１と同じ条件およびパラメーターで実施される。
【０１１３】
本発明は、種々の特定のおよび例示的な態様および技術に関して記載されている。しかしながら、多くの変法および改変が、前記の本発明の詳細な説明から当業者には明らかであり、そして本発明の精神および範囲内において行なわれ得ることを理解すべきである。
【図１】
2013536678.tif 000039
【図２】
2013536678.tif 000040
【配列表】
2013536678000001.app
【国際調査報告】
2013536678.tif 000041
2013536678.tif 000042
2013536678.tif 000043
2013536678.tif 000044