(57)【要約】本発明は、真珠貝の移植拒絶を抑止するため、１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）及び、殺菌性又は静菌性因子、瘢痕因子及び／又は抗炎症性因子などの任意で１つ以上の生理活性分子を含む膜で皮膜された核に関するものであり、並びに前記核を得るための方法に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成される１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を有する被膜核。
【請求項２】
１つ以上の生理活性分子を含む膜であることを特徴とする、請求項１に記載の核。
【請求項３】
１つ又は複数の生理活性分子が殺菌性又は静菌性因子、治癒因子及び／又は抗炎症性因子の中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核。
【請求項４】
ＥＰＳがＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６、好ましくはＭＯ２４５、ＨＥ８００、GG１、ＨＹＤ７２１及びＳＴ７１６の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核。
【請求項５】
１つ又は複数の殺菌性又は静菌性因子が抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の中から、好ましくはタキプレシン又は真珠貝デフェンシンＣｇ−Ｄｅｆｓから選択されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の核。
【請求項６】
溶液総量中のＥＰＳの重量で０．１〜１０％含む溶液への浸積によるＥＰＳで核を皮膜する工程を含む前記工程であって、請求項１に記載の核を得る工程。
【請求項７】
請求項６に記載の第一の工程、及び
１つ又は複数の前記殺菌性又は静菌性因子の１〜１０MICを含む溶液への浸積により予め形成されたＥＰＳ膜を有する１つ以上の殺菌性又は静菌性因子に関連する第二の工程、を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核を得る工程。
【請求項８】
溶液総量中のＥＰＳの重量で０．０５〜１０％及び１つ又は複数の前記殺菌性又は静菌性因子の１〜１０MICを含む溶液に浸積によりＥＰＳ及び殺菌性又は静菌性因子を用いて核を皮膜する工程を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核を得る工程。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核を含む真珠貝。
【請求項１０】
レシピエントの真珠貝の真珠袋への移植挿入を含むレシピエントの真珠貝を移植するための工程であって、移植片はドナーの真珠貝の外套上皮に対応し、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核、又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の工程により得られた核との組合せである工程。
【請求項１１】
請求項１０に記載の工程を含む、養殖真珠を生成する工程。
【請求項１２】
請求項１１によって得られる、又は請求項１〜５のいずれか１項に記載の核又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の工程によって得られる核を含む、又は１つ以上の真珠層の厚さの下でグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成された１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を含む、真珠。
【請求項１３】
真珠の質を改善するための及び／又は核を用いたレシピエントの真珠貝の移植失敗を低減させるための工程であって、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡又は核拒絶に対応するものであり、かつ前記工程は請求項１〜５のいずれか１項に記載の核を用いた又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の工程により得られた核を用いたレシピエントの真珠貝の移植を含むものである工程。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の工程を含む核の、又は核から生じるレシピエントの真珠貝の移植失敗を低減させるための請求項６〜８のいずれか１項に記載の工程の使用であって、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡又は核拒絶を含むものである使用、及び／又は得られた真珠の質を改善するための請求項６〜８のいずれか１項に記載の工程の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真珠の養殖（真珠貝による真珠生産）環境における核被膜の分野に関する。それ故、本発明は、治癒及び抗菌特性を有する膜を用いた核被膜に関し、前記核のレシピエントの真珠貝への挿入由来の死亡と核拒絶の現象とを低減させることができる。
【背景技術】
【０００２】
真珠養殖は養殖真珠を生産するためにアコヤガイ種の真珠貝を自然環境で養殖することを含む人間活動である。第一工程は真珠貝を集めかつ育てることを含み、これがドナーの真珠貝とレシピエントの真珠貝との両方で利用される。移植は外科的施術から成り、ここで移植片、ドナーの真珠貝（約４mm２）の外套上皮部は、真珠層ビーズ、核との組合せで、レシピエントの真珠貝の真珠袋に挿入される。レシピエントの真珠貝へ挿入されると、核を覆う真珠袋を生成するように移植片に並ぶ上皮は増殖しかつ真珠袋を覆う。前記真珠袋は核を覆う真珠層の層に蓄積し、結果として真珠を生成する（Ｍｏｎｔａｇｎａｎｉ等、２００９年）。
【０００３】
死亡及び核拒絶は移植後に、可変的割合で４５日周期で発生する。施術後３週間以内の真珠貝の４０〜５０％に影響するこれらの現象は、感染病理から又は不適当な移植片から生じる結果として現れる。核挿入後の炎症反応の進展及び病原細菌による汚染は、移植中の組織切片の迅速な治療を欠いたことと組合せて、十中八九、核拒絶の主原因である（Ｃｏｃｈｅｎｎｅｃ等、２０１０年）。
【０００４】
それ故移植施術の失敗率を低減する（特に死亡と核拒絶を低減させることによる）結果となる工程が求められている。
【０００５】
特開平０５−２１９８５６号公報は、移植工程時におけるレシピエントの真珠貝であって、核と結合して又は抗生剤と関連した高分子をその表面に含む固体材の核を用いて、挿入することについて記載する。
【０００６】
特開平０２−３０８８６９号公報及び特開昭６３−２１５６０９号公報は、特に得られた真珠の質を改善するために、核表面の同種均一性を増加させることにより、並びに、例えば様々な寄生による核のコロニー化を防ぐことにより拒絶及び死亡の現象を減少させるために、高分子を用いた核被膜の利用について主張する。
【０００７】
特開０２−１７４６２１号公報は移植時の汚染を制限するために抗菌剤に関連した核被膜用の自然な高分子の利用について記載する。
【０００８】
米国特許第６５１４６１４号明細書は、抗菌活性を有する物質と関連するのだが、前記核挿入に対する摩擦及び抵抗を効果的に低減させるように、水溶性の高分子、海水によって部分的に溶解した（２５％超の溶解率）前記高分子を用いた核被膜について記載する。
【０００９】
最後に、特開平０３−１８３４２４号公報は水溶性高分子を用いた（又は管理の遅延を可能にする任意の他の化合物により）核被膜の機構について記載し、前記高分子と関連した抗菌制御速度の管理を可能にしている。
【００１０】
しかし、上記引用公報は移植時に形成される切開の治癒の問題を解決していない。更には、抗菌剤の利用はそれらの不完全な生分解性を原因とする環境問題、及び耐性細菌の進化を原因とする公共福祉の問題を生じている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くべきことに、本出願はＥＰＳ（菌体外多糖）膜を用いた核被膜が移植施術の失敗率を減少させることについて記載する。いかなる理論による束縛も受けずに、ＥＰＳ膜による核被膜はレシピエントの真珠貝の治癒を促進することを可能にするだろう。更には、例えば抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）などの殺菌性又は静菌性の因子を用いた前記ＥＰＳ膜の関連は微生物汚染の発生を減少させる。ＥＰＳ単独で又は殺菌性若しくは静菌性の因子を組合せて実施することで、移植工程の失敗を低減させることが可能となり、特に前記真珠貝によるレシピエントの真珠貝の死亡及び核拒絶を低減させることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は１つ以上の菌体外多糖を含む膜を用いた核被膜に関する。
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成される。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、被膜は１つ以上の生理活性分子を更に含む。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、前記生理活性分子は１つ以上の殺菌又は静菌因子、１つ以上の治癒因子及び／又は１つ以上の抗炎症性因子の中から選択される。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳはＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６、及び好ましくはＭＯ２４５、ＨＥ８００、ＧＧ１、ＨＹＤ７２１及びＳＴ７１６の中から選択される。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、殺菌性又は静菌性因子は抗菌ペプチド（ＡＭＰ）から選択される。
【００１７】
本発明の実施形態によれば、前記ＡＭＰはタキプレシン又は真珠貝デフェンシン、Ｃｇ−Ｄｅｆｓの中から選択される。
【００１８】
本発明はまた上述の様に核を獲得する工程に関するものであり、前記工程は溶液体積に対するＥＰＳの重量で０．１〜１０％含む溶液中に浸漬することによるＥＰＳを用いた核被膜の工程を含む。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、本工程は、上述の様な第一の工程、及び前記殺菌性又は静菌性因子を１〜１０ＭＩＣ含む溶液に浸漬することにより、前もって形成されたＥＰＳ膜を用いた１つ以上の殺菌性又は静菌性の因子に関する第二の工程を含む。
【００２０】
別の実施形態によれば、１つ以上の殺菌性又は静菌性因子との組合せにおける１つ以上のＥＰＳを含む膜で被膜された核を取得するための工程は、溶液体積におけるＥＰＳの重量で０．０５〜１０％、及び前記殺菌性又は静菌性因子を１〜１０ＭＩＣ含む溶液中に浸漬することにより、ＥＰＳ及び殺菌性又は静菌性因子を用いる核被膜の工程を含む。
【００２１】
本発明はまた上述のように核を含む真珠貝に関する。
【００２２】
また、本発明は、上述の核又は核を用いたレシピエントの真珠貝の移植の失敗、レシピエントの真珠貝による死亡又は核拒絶を含む前記失敗を減少させるための上述の工程を利用することに関する。
【００２３】
また、本発明は、レシピエントの真珠貝の真珠袋に移植挿入することを含むレシピエントの真珠貝に移植する工程に関するものであり、かつ移植は上述の核と、又は上述の工程によって取得する核との組合せで、ドナーの真珠貝の外套上皮に対応する。
【００２４】
また、本発明は、上述する移植工程を含む、養殖真珠を生成する工程に関する。
【００２５】
また、本発明は、真珠を得るための工程であって、本発明による核移植、又はレシピエントの真珠貝の真珠袋にドナーの真珠貝の外套上皮の一部を組合せた、本発明による工程によって得られる核を含むものである。
【００２６】
また、本発明は、上述の様に真珠を得る工程によって得られる真珠に関するものであり、又は本発明による核若しくは本発明による工程によって得られる核を含み、又は１つ以上の真珠層の厚みの下、グラム陽性若しくはグラム陰性細菌、古細菌若しくは藻類によって生成された１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を含むものである。
【００２７】
また、本発明は、真珠の質を改善し、及び／又は核を用いてレシピエントの真珠貝の移植失敗を減少させる工程に関するものであって、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡及び核拒絶に対応するものであって、前記工程は本発明による核を用いた又は本発明による核取得工程によって得られる核を用いたレシピエントの真珠貝移植を含むものである。
【００２８】
また、本発明は、本発明による核の利用、若しくは核を用いたレシピエントの真珠貝の移植失敗を減少させるための発明により核を得る工程によって得られた核の利用に関するものであり、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡又は核拒絶から成り、及び／又は得られた真珠の質を改善するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】顕微鏡撮影により得られた写真の一式であり、被膜されていない核（ａ）及び被膜された核（ｂ、ｃ及びｄ）である。印は膜の存在を確認するための意図的な破断に対応する。
【図２】核を培養した微生物の溶液を用いて実施された養殖後のペトリ皿の写真一式である。（ａ）被膜されていない又はＥＰＳ単独で被膜されている核である。（ｂ）核がそそぎなしのＥＰＳ／ＡＭＰの組合せで被膜された核である。（ｃ）ＥＰＳ／ＡＭＰの組合せで被膜されかつ海水又はＭｉｌｌＱ水で洗浄した核である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明において、以下の言葉は以下の意味を有する。
核：要素、一般的には球状で、移植時にレシピエントの真珠貝に挿入させる自然化合物（例えばミシシッピのムラサキガイの真珠層、Ａｍｂｌｅｍａ  ｐｌｉｃａｔａ）又は合成化合物（例えばビロナイト）であって、レシピエントの真珠貝による真珠層の剥奪を支持し仕えるものをいう。前記複数の核は得られる真珠の質を改善するように特殊な物質によって被膜されていることがある。
【００３１】
真珠養殖：一般的にアコヤガイ種の系統に属する真珠貝によって養殖された真珠を生成する目的での人間活動をいう。
【００３２】
殺菌性因子：殺菌、例えば細菌死を引き起こす作用を有する物質。
【００３３】
静菌性因子：静菌、例えば発展、成長及び／又は細菌の分裂を防ぐ作用を有する物質。
【００３４】
ＭＩＣ：最少抑制濃度。これは一昼夜培養後に因子が微生物の可視可能な成長を防げる最少濃度に対応する。因子のＭＩＣ決定方法は技術状態としてよく知られている。
【００３５】
治癒：例えば切開などの傷、より詳細には開放創の回復又は治癒の促進可能因子として記載する。
【００３６】
約：数値的要素の前に置く、この数値的要素の大小１０％を意味する。
【００３７】
真珠層：（真珠層の約９０％を形成する）霰石の結晶及びコンキオリンによって形成されたバイオ鉱物化した構造。霰石は式ＣａＣＯ３＋少量のストロンチウム；鉛；亜鉛の化学合成物である。
【００３８】
真珠養殖では、真珠生成は移植工程時にレシピエントの真珠貝の中に挿入する複数の核上で真珠層が剥奪することで生じる。移植時に生じた切開で又は細菌の汚染でレシピエントの真珠貝の不十分な治癒が原因となって、核移植工程は一般的に高い失敗率を有する。それ故に、真珠養殖で使用される複数の核は移植工程の失敗率を減少させることができるように、ますます被膜を用いて覆われている。
【００３９】
それ故、本発明は１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を用いて覆われ又は被膜された複数の核と関連する。
【００４０】
ＥＰＳ膜は治癒特性を有し、移植工程によって誘発された傷の治癒促進を可能とし、かつそれ故に移植失敗をもたらすレシピエントの真珠貝の死亡を減少させることを可能とする。
【００４１】
ある細菌は制御条件下において、栄養学上不均衡な状況に応答して、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含むエキソ高分子を合成する潜在性を有する。菌体外多糖は類似する炭化水素（一般に糖又は単糖と呼ばれる）によって形成された高分子として定義される可能性がある。これらの菌体外多糖は産業規模で生成され、かつ他の特性の中では、（自然界においてこれらの分子の機能と関連して）粘着性及び膜形成特性を有する。
【００４２】
ＥＰＳは、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌、菌、かつある藻類などの多数の微生物によって生成されている。好都合にも、ＥＰＳはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成されている。
【００４３】
ＥＰＳは、例えば超音波処理、遠心分離、アルカリ処理、エタノール抽出、酵素抽出などの周知の物理的又は化学的抽出方法によって微生物培養から抽出できる。
【００４４】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳは、例えばＳａｔｐｕｔｅ等が記述している（バイオテクノロジー  アドバンス、２０１０年２８巻４３６頁〜４５０頁）ように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，  Ｈａｌｏｍｏｎａｓ，  Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，  Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ，  Ｐｓｕｅｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ，  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｚｏｏｇｌｏｅａ，  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｖｉｂｒｉｏ等の海洋微生物によって生成されるこれらの中から選択される。分類学が修正される必要があるならば、本発明で使用可能なこのＥＰＳを推論するために、当業者は分類学上の修正を適用するだろう。
【００４５】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳは深海水熱生態系由来の細菌発酵によって得られる。より具体的には、これらのＥＰＳは、深海水熱生態系由来の細菌発酵時に制限条件下（炭化水素飽和の栄養環境が原因の高い炭素／窒素比率により生じた栄養の偏り）であれらが生成される（例えば、Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ（２００２年）深海水熱口：生物工学的に重要な革新的細菌の菌体外多糖の新資源？ジャーナル  オブ  インダストリアル  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー２９巻：２０４頁〜２０８頁参照）。
【００４６】
実施形態によれば、ＥＰＳは例えばＧＧ１などの、非帯電（すなわち中性）ＥＰＳから成る群より選択される。
【００４７】
実施形態によれば、ＥＰＳは例えばＨＥ８００及びＭＯ２４５などの、帯電ＥＰＳから成る群から選択される。
【００４８】
実施形態によれば、ＥＰＳはＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６、好ましくはＭＯ２４５、ＨＥ８００、ＧＧ１、ＨＹＤ７２１及びＳＴ７１６から選択されることがある。
【００４９】
実施形態によれば、ＥＰＳは本来のものである。別の実施形態によれば、ＥＰＳは（例えば、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩、コハク酸塩又はピルビン酸塩を加えることにより）化学的又は物理的に修正され得る。
【００５０】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ膜は核の周囲に連続している。
【００５１】
また、本発明は、１つ以上のＥＰＳ及び１つ以上の生理活性物質から成る膜による核皮膜に関する。
【００５２】
実施形態によれば、これらの生理活性物質は殺菌性又は静菌性の因子である。真珠養殖では、核上に殺菌性又は静菌性因子を追加すると、レシピエントの真珠貝での細菌汚染の発生が前記真珠貝の核拒絶や死の結果となる可能性を制限すること可能となる。
【００５３】
別の実施形態によれば、これらの生理活性物質は例えばコラーゲン、フィブリノーゲン、ラミニン又は成長因子などの治癒性又は抗炎症性の因子である。
本発明の実施形態によれば、殺菌性又は静菌性の因子は例えば、テトラサイクリン、カナマイシン、スルホモノメトキシン、及びアンピシリンなどの化学抗体の中から選択される。
【００５４】
本発明の別の実施形態によれば、殺菌性又は静菌性因子は抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の中から選択される。
【００５５】
抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は生来の免疫作動体分子であり、進化上保存されかつ活性領域全体に広く普及している。APMの広域な多様性は近年、構造条件上で多くの多様性、大きさ及び活動形態を表すことを示している。ＡＭＰは陽イオン性及び疎水性アミノ酸の高表示により一般的に特徴付けられている。これらの分子は通常細菌膜との相互作用のため両親媒性の特徴的要素を有する（Ｂｕｌｅｔ等、２００４年）。洗浄型効果を用いるか又は気孔を形成することによりそれらの膜を透過性にすることで、又は細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンの合成を阻害することで、又は細菌の代謝経路を阻害することで、ＡＭＰは微生物を殺す（Ｂｒｏｄｇｅｎ等、２００５年）。
【００５６】
一般的に使用される化学抗生物質の観点から、ＡＭＰは全く生分解可能な利点を有する。それらの生物的特性故に、それらは型にはまった化学抗生剤の代用の良い候補者として現れる。実際にそれらは抗菌活性の薬効範囲の広域性、低い特異性、異なった行動形態を有しかつ環境への害が無い。
【００５７】
ＡＭＰは化学合成によって又は微生物若しくは酵母の組み換え機構の発現（クローニング、発現、精製）によって生成され得る。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰはアルファヘリックスを有する直線状のＡＭＰのファミリーに属することがあり、ＡＭＰファミリーは１つ以上のアミノ酸の過剰出現又は１又は２のジスルフィド結合を有するヘアピンＡＭＰファミリー（ベータヘアピン）又はベータシートを有するサイクリックＡＭＰ及び３つ以上のジスルフィド結合を有するアルファヘリックスを有する（Ｂｕｌｅｔ等、イムノロジカル  リヴュー、２００４年、１９８巻、１６９頁〜１８４頁；Ｂｒｏｇｄｅｎ、ネイチャーリヴュー  マイクロバイオロジー、２００５年、３巻：２３８頁〜２５０頁）。
【００５９】
アルファヘリックスを有する直線状のＡＭＰの例は、制限するものではないが、セクロピン、ストモキシン、ポネリシン、スピニゲリン、オキシオピニン、カピエンニン、カラバニン、スチエリン、パルダキシン、ミスグリン、プレウロシジン、パラシン、オンコルハインシン、モロネシジン、マガイニン、テンポリン、カテリシジン及びインドリシジンを含む。
【００６０】
１つ以上のアミノ酸、プロリン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンの飽和なＡＭＰの例は、制限するものではないが、バクテネシン、PR-３９、アバエシン、アピダエシン、ドロソシン、ピルルホコリシン、Cg-Prp、プロフェニン及びインドリシンを含む。
【００６１】
２〜４のシステインを含むヘアピンＡＭＰの例は、制限するものではないが、タキプレシン、プロテグリン、タナチン、アンドロクトニン、ゴメシン、ポリフェムシン、ヘプシジン、ブレビニン、エスカレンチン、チゲリニン及びバクテネシンを含む。
【００６２】
６つ以上のシステイン残渣又は開放周期を含むサイクリックＡＭＰの例は、制限するものではないが、デフェンシン（脊椎動物、無脊椎動物又は植物）、ターミシン、ヘリオマイシン、ヘリオマイシン、ドロソマイシン、ＡＳＡＢＦ、ｐＢＤ、ペナエイジン、ＡＬＦ及びビッグ‐デフェンシンを含む。無脊椎動物のデフェンシンの例はＣｇ−Ｄｅｆ真珠貝デフェンシン又はＭＧＤアコヤガイデフェンシンである。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰはタキプレシン及びＣｇ−Ｄｅｆｓ真珠貝デフェンシンの中から選択される。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰは化学合成により合成される。本発明の別の実施形態によれば、ＡＭＰは細菌又は菌類の遺伝子組換え機構及び好ましくは酵母の機構において生物学的合成によって合成される。
【００６５】
レシピエントの真珠貝の移植に由来する死亡や核拒絶は施術後４５日で発生し、及び一般的には施術後最初の３週間で生じる。
【００６６】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰは前記ＥＰＳ膜に安定的に関連している。
【００６７】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ及び任意に殺菌性又は静菌性因子を含む膜は海水を用いた洗浄に抵抗し、かつ３週間超、好ましくは４℃から３０℃の範囲で１ヶ月超安定であった。それから、ＥＰＳ及び任意に殺菌性又は静菌性因子を含む膜は海水（例１）との接触の間、少なくとも３週間溶解しない。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ及び任意に殺菌性又は静菌性因子を含む膜は細菌成長抑制活性を３週間超、好ましくは３７℃の温度で１ヶ月超維持する。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、例えばＡＭＰなどの、ＥＰＳ膜と殺菌性又は静菌性因子との間の関連はＥＰＳと前記因子との間の吸着現象又は化学反応に由来する。
【００７０】
また、本発明は、細菌起源の１つ以上の菌体外多糖を含むフィルムを有する真珠培養核を被膜する工程に関する。
【００７１】
本発明の実施形態によれば、前記工程は水成のＥＰＳ溶液、好ましくは逆浸透水中のＥＰＳ溶液で核を浸漬する第一工程を含む。本発明の好ましい実施形態によれば、前記水成ＥＰＳ溶液は０．１〜１０％重量／体積のＥＰＳ濃度、より好ましくは０．５〜５％、さらにより好ましくは水成溶液体積当たりＥＰＳが１重量％のＥＰＳ濃度を含む溶液に核を浸漬する第一工程を有する。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液に核を浸漬する前記第一工程は一定の温度で、好ましくは周囲温度で（例えば１５℃〜２５℃）、より好ましくは約２０℃で実施される。本発明の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液中へ核を浸漬する前記第一工程は好ましくは１分間〜６０分間、より好ましくは５分間〜２０分間、さらにより好ましくは１０分間実施される。
【００７３】
本発明の別の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液へ核を浸漬する前記第一工程は一定の温度で、好ましくは１℃〜１０℃、より好ましくは約４℃で実施される。本発明のこの実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液へ核を浸漬する前記第一工程は好ましくは１時間〜３時間、より好ましくは約２時間実施される。
【００７４】
本発明の実施形態によれば、被膜された核はその後真空下で乾燥される。
【００７５】
核被膜が１つ以上の殺菌性又は静菌性因子を更に含む場合、上述した第一工程は、１ＭＩＣ〜１０ＭＩＣ、好ましくは１０ＭＩＣの濃度で１つ以上の殺菌性又は静菌性因子を含む溶液中の核浸漬を含む第二工程に続く。
【００７６】
本発明によれば、殺菌性又は静菌性因子は、例えば水（例えば逆浸透水）、エタノール、トリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ、ＴＦＥ）又はこれらの混合液で例えば、水／ＴＥＦ、好ましくはトリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ）又は逆浸透水などの、生物学的に許容可能な極性溶媒中の溶液内にある。
【００７７】
本発明の第一の実施形態によれば、核浸漬の第二工程は一定温度で、好ましくは１℃〜１０℃、より好ましくは約４℃で実施される。本発明のある実施形態によれば、核を浸漬する前記第二工程は好ましくは２４時間から１２０時間、より好ましくは４８時間から９６時間、さらにより好ましくは７２時間で実施される。別の実施形態によれば、核を浸漬する第二工程は１２時間から４８時間、好ましくは１２時間から２４時間及び更により好ましくは２４時間で実施される。
【００７８】
本発明の第二の実施形態によれば、核を浸漬する第二工程は一定の温度で、好ましくは周囲温度（２０℃〜３０℃）で、より好ましくは約２５℃で実施される。本発明の実施形態によれば、核を浸漬する前記第二工程は好ましくは３分間から３時間の間、好ましくは１時間から２時間、及び更により好ましくは約１時間３０分で実施される。
【００７９】
本発明の実施形態によれば、被膜核はその後真空下で乾燥される。
【００８０】
本発明の実施形態によれば、前記工程は任意で第一浸漬工程と第二浸漬工程との間に洗浄の工程を含む。この実施形態によれば、核は１０ｍＬ〜１０００ｍＬの体積の蒸留水、より好ましくは約２００ｍＬの蒸留水で洗浄される。
【００８１】
また、本発明は、１つ以上のＥＰＳ及び１つ以上の殺菌性又は静菌性因子を含むフィルムで覆われた核を得る工程に関するものであり、前記工程はＥＰＳ及び殺菌性又は静菌性因子を含む溶液中で核を浸漬する単一工程を含む。
【００８２】
実施形態によれば、ＥＰＳは溶液の全体積に占める重量で０．０５〜１０％、好ましくは０．１〜５％の濃度、より好ましくは１％の濃度で溶液に存在する。
実施形態によれば、殺菌性又は静菌性因子は１ＭＩＣ〜１０ＭＩＣの濃度で溶液に存在する。
【００８３】
実施形態によれば、この浸漬工程は一定の温度、１℃〜１０℃、好ましくは４℃、及び１２時間〜１２８時間、好ましくは４８時間〜９６時間、及びより好ましくは７２時間で実施される。
【００８４】
本発明の実施形態によれば、本発明による、又は本発明の工程により得られた被膜核は４℃に保たれる。本発明の別の実施形態によれば、本発明による、又は本発明の工程により得られた被膜核は周囲温度に保たれる。
【００８５】
本発明の実施形態によれば、核は自然由来のもので、より好ましくは前記核はＡｍｂｌｅｍａ種起源、好ましくはＡｍｂｌｅｍａ  ｐｌｉｃａｔａに属するミシシッピ  ムラサキガイの真珠層により形成されたものである。核の例はＡｍｉｎｇ（Ａｍｉｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）又はＰｏｅ  Ｉｍｐｏｒｔにより販売されている。
【００８６】
本発明の実施形態によれば、前記核は１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは２ｍｍ〜１５ｍｍ、より好ましくは２ｍｍ〜４ｍｍ、及び更により好ましくは２．１ｍｍ〜３．５ｍｍの直径を有する。
【００８７】
本発明の実施形態によれば、前記核は２ＢＵ〜２．５ＢＵ、好ましくは約２．４ＢＵの直径を有する。ＢＵは計量単位で、１ＢＵは３．０３ｍｍに対応する。
【００８８】
また、本発明は、上述の様な又は上述の工程によって得られた核を含む真珠貝に関する。
【００８９】
好ましくは、真珠貝はアコヤガイ種起源、より好ましくはアコヤガイ  Ｆｕｃａｔａ、アコヤガイ  ｍａｘｉｍａ又はアコヤガイ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ種に属する。
【００９０】
また、本発明は、上述の様な核の組合せにおいて、又は上述の工程によって得られたドナーの真珠貝の外套上皮と対応する移植の、レシピエントの真珠貝の真珠袋への挿入を含むレシピエントの真珠貝への移植工程に関する。
【００９１】
本発明の実施形態によれば、移植工程は（ｉ）レシピエントの真珠貝の手動での開口、（ｉｉ）真珠袋を入手しかつ第三工程で可能とするためにレシピエントとなる真珠貝の組織切開を生成、（ｉｉｉ）上述の様なＥＰＳ膜で覆われた核との組合せで、レシピエントの真珠貝（約４mm２）の外套上皮部に対応する移植の、レシピエントの真珠貝の真珠袋への挿入を含む。
【００９２】
また、本発明は、上述の様な移植工程を含む、養殖真珠を生成する工程に関する。
【００９３】
また、本発明は、上述の様な皮膜核の利用を含む、又は上述の様な皮膜工程によって得られる真珠を得る工程に関する。
【００９４】
本発明の実施形態によれば、真珠を得るための工程は、ドナーの真珠貝の外套上皮部と組合せて、レシピエントの真珠貝の真珠袋に本発明による核を移植することを含む。
【００９５】
本発明の実施形態によれば、提供者の真珠貝及びレシピエントの真珠貝を得る為に、真珠を生産又は獲得する前記工程は、好ましくは上記の属及び種に属する真珠貝の収集及び育成を含む第一工程を含む。
【００９６】
本発明の実施形態によれば、提供者とレシピエントの真珠貝はその後寄生生物をも除去する為洗浄される。
【００９７】
本発明の実施形態によれば、前記生成工程は、移植後、レシピエントの真珠貝の、好ましくは１０ヶ月〜２４ヶ月、より好ましくは１２ヶ月〜２０ヶ月、更により好ましくは１６ヶ月〜１８ヶ月の期間の養殖工程を更に含む。養殖期間の間は、核の周りの真珠袋を生成する為に移植片上皮の裏側は増殖しかつ真珠袋を覆い、核の周りの真珠層の層を堆積させ、その後、結果として真珠が生成する。
【００９８】
本発明はまた上述の様な真珠獲得工程により得られた真珠に関する。
【００９９】
本発明はまた本発明により被膜された核、又は本発明による工程によって得た核を含む真珠に関する。
【０１００】
また、本発明は、任意で１つ以上の生理活性分子に関連したＥＰＳ膜、好ましくはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類により生成されたＥＰＳ膜で被膜された核の真珠に関する。
【０１０１】
また、本発明は、１つ以上の真珠層の厚みの下で、任意で１つ以上の生理活性分子に関連したＥＰＳ膜、好ましくはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類により生成されたＥＰＳ膜からなる真珠に関する。
【０１０２】
本発明の実施形態によれば、真珠は大きさ、好ましくは２ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜１５ｍｍ、さらにより好ましくは６．８ｍｍ〜１０ｍｍの直径を有する。
【０１０３】
本発明によれば、本発明に記載の様な核周囲の膜の存在は幾つかの利点を有する。
‐核表面の同質性の改善、及び／又は
‐（表面の欠陥出現に制限のある）得られた真珠の質の改善及び／又は
‐移植時に形成された切開の治癒促進、及び／又は
‐真珠発達を改善する移植及び真珠袋の細胞上の活動、及び／又は
‐微生物汚染現象の抑止、及び／又は
‐切開の影響によるレシピエントの真珠貝の死亡の現象
また、本発明は、核の同質性を改善する工程に関するものであり、本発明に記載の様な膜を用いた前記核の被膜を含む。
【０１０４】
また、本発明は、レシピエントの真珠貝の移植で得られた真珠の質を改善する工程に関するものであり、本発明に関する核利用を含む。本発明の実施形態によれば、移植工程間の本発明による核の利用は、真珠の表面欠陥の出現を制限する。
【０１０５】
また、本発明は、核を有するレシピエントの真珠貝の移植失敗を低減させる工程に関するものであり、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡と核拒絶に対応するものであり、かつ前記工程は本発明による又は本発明により核を得る工程によって得られる核を用いたレシピエントの真珠貝の移植を含む。
【０１０６】
本発明はまた移植時に核拒絶を抑止する工程に関するものであり、前記工程は移植で本発明により被膜された核の利用を含む。
【０１０７】
本発明は移植工程由来のレシピエントの真珠貝の死亡を減少させる工程に関するものであり、移植で本発明により被膜された核の利用を含む。本発明のある実施形態によれば、本発明の工程によって抑止された死亡は移植時生成された切開の影響に依る。
【０１０８】
また、本発明は、核を有するレシピエントの真珠貝の移植失敗を減少させる為本発明により又は本発明により核を得る工程により得られた核の利用に関するものであり、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死又は核拒絶を含むものであり及び／又は得られる真珠の質を改善するためのものである。
【０１０９】
また、本発明は、移植時に生成される切開の治癒を促進する工程に関するものであり、本発明による被膜核の利用を含む。
【０１１０】
また、本発明は、移植時に生じる微生物汚染現象を抑止する工程に関する者であり、前記工程は移植で本発明による被膜核の利用を含む。
【０１１１】
加えて、殺菌性又は静菌性因子としてのＡＭＰの利用は従来通りの化学抗体の利用よりも環境に良く、真珠貝の筋肉が生で消費することができる程に、より健康的である。
破断ＭｉｌｌＱ洗浄した  
【実施例】
【０１１２】
本発明は、以下の実施例により、簡単に理解かつ解釈できるであろう。
【０１１３】
実施例１：ＥＰＳ膜の存在
核はＥＰＳ  ＭＯ２４５及び任意でタキプレシンを含む膜で被膜されていた。これらの核は２の工程によって得られた。
１）      
１％ＭＯ２４５を含む溶液中に４℃にて２時間浸し、
２）      
タキプレシン（例えば１０ＭＩＣ）７０ｍｇ／ｌを含むＴＦＥ溶液に４℃にて７２時間浸す。
【０１１４】
顕微鏡撮影により得られた図１は明確に膜の存在を示す。図ｂ及び図ｃは破断後に膜の存在を示しかつ図ｄは水及び／又はＴＦＥを用いた洗浄後膜が安定的に残ることを示す。
【０１１５】
実施例２：抗菌活性
実験：
標準直径の核は微生物発酵から得られた生体高分子で表面を前処理した影響に関する研究のため利用された。
【０１１６】
核はＥＰＳ  ＭＯ２４５単独又はタキプレシンとの組合せを含む膜で被膜される。
【０１１７】
これらの核は単一の工程過程により得られる。０．１％ＭＯ２４５及び任意で７０ｍｇ／ｌ（例えば１０ＭＩＣ）のタキプレシンを含む溶液中で４℃にて４８時間核を浸す。
【０１１８】
特定の核は乾燥前に海水又はＭｉｌｌＱ水２００ｍｌを用いて洗浄した。全ての核はその後真空下で乾燥された。
【０１１９】
従来通りの微生物成長抑制試験がこれらの核で実施された。
核はアコヤガイ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａから単離されたＶｉｂｒｉｏ菌株（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｐｍａｒ０２‐１４９）の対数増殖期の細菌溶液と、タヒチでの移植において３０℃にて１８時間接触することで置かれた。細菌増殖はその後６３０ｎｍの光学密度で分光光度計にて測定した。細菌溶液はその後ペトリ皿（ゾベル寒天媒体）上に広げられかつ展開されたコロニーはその後計測される。
【０１２０】
図２ａは被膜していない核の存在が細菌増殖を阻害しないことを示す。似た結果がＥＰＳを含む膜のみで被膜された核で得られた。
図２ｂはＥＰＳとＡＭＰの組合せを含む膜により被膜された核の存在が細菌の増殖を阻害することを示す。
【０１２１】
図２ｃはＥＰＳとＡＭＰの組合せを含む膜で被膜された核の抗菌活性が核洗浄後保存されることを示す。
【０１２２】
加えて、抗菌活性の安定性は超過時間でかつ海水処理（真珠貝の真珠空洞に必要な要素）に対して研究された。その結果、ＥＰＳとＡＭＰの組合せを含む膜で被膜された核の抗菌活性は周囲温度（１８℃〜２１℃）で少なくとも２週間は安定であることを示した。
【０１２３】
同じ実験がその後タキプレシンとＥＰＳ  ＭＯ２４５又はＥＰＳ  ＧＧ１とを組み合せて被膜された核において実施された。
核の抗菌活性は対照群（核の無い細菌培養）に対し１８時間接触後に細菌増殖の阻害の百分率により測定された。測定された百分率の阻害は、以下の表に示される。
【表１】
2013536681.tif 000002
ＥＰＳとＡＭＰ（タキプレシン）との組合せで被膜された核は細菌増殖を強く阻害した（ＥＰＳ  ＭＯ２４５及びＧＧ１、それぞれに対して９７％及び９５％）。
【０１２４】
実施例３：移植実験中本発明の核の影響
１‐死亡
被膜されていない核、又はＥＰＳ  ＧＧ１、単独で又はＡＭＰ（タキプレシン）との組合せで被膜された核はレシピエントの真珠貝でレシピエントの真珠貝（移植）の外套上皮部との組合せで移植された。６７個の提供者の真珠貝がこの実験に使用された。８の移植実験が核の種類毎及び提供者毎に実施された。
【０１２５】
レシピエントの真珠貝の死亡は移植後４０日で評価された。死亡は被膜されていない核を受け取ることを有する真珠貝の観点から百分率で評価された。結果は以下の表に示す。
【表２】
2013536681.tif 000003
核上のＥＰＳ膜又はＥＰＳとＡＭＰ膜の存在は、真珠貝の死亡をほぼ２５％阻害する。
２‐移植拒絶
被膜されていない核、又はＥＰＳ  ＭＯ２４５及びＡＭＰ（タキプレシン）で被膜された核は上述の様な移植実験で使用された。
移植後４０日の核拒絶が計測された。結果は以下の表に示され、かつ被膜されていない核を有する真珠貝に対して表現される。
【表３】
2013536681.tif 000004
ＥＰＳ及びＡＭＰを含む本発明による膜の存在は、核拒絶を２０％超減少させることができる。
【図１】
2013536681.tif 000005
【図２】
2013536681.tif 000006
【国際調査報告】
2013536681.tif 000007
2013536681.tif 000008
2013536681.tif 000009
2013536681.tif 000010