(57)【要約】ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導し、それ故にがん免疫療法、より詳細にはがんワクチンとの関連において用いるのに適している、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に由来する単離されたペプチドおよびその断片を本明細書で説明する。本発明のペプチドは、前述のアミノ酸配列、および１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたその改変版の両方を範囲に含むが、ただしそのような改変版は元の配列の必要なＨＬＡ結合性および／またはＣＴＬ誘導能を保持することを条件とする。さらに、前述のペプチドのいずれかをコードする核酸、ならびに前述のペプチドまたは核酸のいずれかを含むかまたは組み入れている薬学的な剤、物質、および／または組成物も提供する。本発明のペプチド、核酸、薬学的な剤、物質、および組成物は、例えば、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣを含むがんおよび腫瘍の治療において特に有用性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる単離されたペプチドであって、ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する、ペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項１記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
（ａ）ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド、
（ｂ）ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、（ａ）の単離されたペプチド、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド、および
（ｄ）改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持することを条件として、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド
からなる群より選択される、単離されたペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項４記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される；および
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
【請求項６】
ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項７記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導するための組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項７記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および／または予防および／または術後再発の予防のための薬学的組成物。
【請求項１０】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項９記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
がんの治療のために製剤化される、請求項９または１０記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
（ａ）インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、ＡＰＣを請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法。
【請求項１３】
（ａ）ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣと、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を共培養する段階；
（ｂ）ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するエキソソームと、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドと結合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、Ｔ細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む方法によって、ＣＴＬを誘導するための方法。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法によって導入される、請求項１４記載のＡＰＣ。
【請求項１６】
請求項１〜６記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１７】
請求項１３記載の方法によって誘導される、請求項１６記載のＣＴＬ。
【請求項１８】
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
【請求項２０】
請求項１〜６記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２１】
請求項１〜６記載のペプチド、請求項７記載のヌクレオチド、または請求項１９記載の抗体のいずれかを含む、診断キット。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、および２１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか一項記載の単離されたペプチドまたは請求項７記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん療法の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２０１０年４月２日に出願された米国仮出願第６１／３２０，５７７号の恩典を主張し、それらの内容はその全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１、Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２、Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
有望なＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡである。そのようなＴＡＡを免疫療法の標的として用いることにより、療法によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳述されているリスクが最小限に抑えられ得る。したがって、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる開発および臨床研究の前進が保証される（非特許文献３、Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４、Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５、Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６、van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７、Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８、Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９、Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０、Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながら、現在のがんワクチン治験の多くは低い客観的奏効率しか示していない（非特許文献１１、Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２、Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３、Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的として新規ＴＡＡが依然として必要とされている。
【０００５】
上皮細胞トランスフォーミング配列２（ＥＣＴ２）がん遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３７６４３９；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）が、がんにおいて上方制御されることが同定された転写物から発見されている。ＥＣＴ２遺伝子は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸がん、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含むがこれに限定されないさまざまながんの腫瘍細胞において特異的に上方制御され、それ故に本発明にとって特別なものである（特許文献１、ＷＯ２００７／０１３６７１号；特許文献２、ＷＯ２００８／１０２５５７号；特許文献３、ＷＯ２０１０／００７７９１号）。特に、ＥＣＴ２に由来する免疫原性ペプチドは、そのような抗原を発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させるために有用である可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2007/013671
【特許文献２】WO2008/102557
【特許文献３】WO2010/007791
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、免疫療法の適した標的の発見に、少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般に免疫系によって「自己」と認識され、そのため多くの場合は免疫原性を有しないことから、適切な標的の発見は極めて重要である。ＥＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３７６４３９の遺伝子（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）によってコードされるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）が、例として膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣを含むがこれらに限定されないがんにおいて上方制御されるものとして同定されていることの認識に立ち、本発明は、がん／腫瘍免疫療法の標的の候補として、ＥＣＴ２、より詳細には、適した免疫療法標的として役立つ可能性のある新規ＥＣＴ２エピトープペプチドに着目する。
【０００９】
そのため、本発明は、ＥＣＴ２に対して特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＥＣＴ２の遺伝子産物の中の特定のエピトープペプチドの同定を、少なくとも一つの目標とする。以下に詳細に考察するように、健常ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＥＣＴ２に由来するＨＬＡ−Ａ*０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。次いで、各候補ペプチドでパルス刺激したＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的な細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。本明細書における結果は、これらのペプチドが、ＥＣＴ２を発現する細胞に対する強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることを実証している。これらの結果はさらに、ＥＣＴ２の免疫原性が強いこと、およびそのエピトープががん／腫瘍免疫療法の有効な標的であることを実証している。
【００１０】
したがって、ＥＣＴ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）およびその免疫学的活性断片を含む、ＨＬＡ抗原と結合する単離されたペプチドを提供することは、本発明の１つの目的である。そのようなペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予想され、そのため、そのようなペプチドを用いて、エクスビボでＣＴＬを誘導するか、または例として膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるがこれらに限定されないがんに対する免疫応答を誘導することを目的として対象に投与することができる。好ましいペプチドはノナペプチドおよびデカペプチドであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドおよびデカペプチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３および２１の中から選択されるアミノ配列を有するペプチドは、強いＣＴＬ誘導能を示しており、そのため特に好ましい。
【００１１】
本発明はまた、１個、２個またはそれ以上のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有する改変ペプチドも、その改変ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、想定している。
本発明はさらに、本発明のいずれかのペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを範囲に含む。これらのポリヌクレオチドは、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導もしくは調製するために用いることができ、または本発明の上記のペプチドと同じように、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１２】
対象に投与されると、本ペプチドは、各々のペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、ＡＰＣの表面上に提示される。したがって、ＣＴＬを誘導するための本発明のいずれかのペプチドまたはポリヌクレオチドを含むかまたは組み入れている剤、組成物、および／または物質を提供することは、本発明の１つの目的である。そのような剤、組成物、および物質は、がん、特に膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣの治療および／または予防および／または術後再発のために用いることができる。したがって、本発明の１つまたは複数のペプチドまたはポリヌクレオチドを含むかまたは組み入れている、がんの治療および／または予防および／または術後再発の予防のための薬学的な剤、組成物、および／または物質を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本ペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、本発明の薬学的な剤、組成物、および物質が、本ペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを有効成分として含んでもよい。
【００１３】
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、例えば、対象由来のＡＰＣを本ペプチドと接触させるかまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって、ＨＬＡ抗原と本ペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣを誘導することもできる。そのようなＡＰＣは標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法において有用である。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそのような方法によって得られるＡＰＣを範囲に含む。
【００１４】
本発明の１つのさらなる目的は、ＣＴＬを誘導するための方法を提供することであり、そのような方法は、本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとＣＤ８陽性細胞を共培養する段階、または本ペプチドと結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む。そのような方法によって得られるＣＴＬは、例として膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるがこれらに限定されないがんの治療および／または予防に利用される。したがって、本方法によって得られるＣＴＬを提供することは、本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、がんに対する免疫反応を、それを必要とする対象において誘導するための方法を提供することであり、そのような方法は、ＥＣＴ２ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片、ＥＣＴ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＥＣＴ２ポリペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを含む組成物または物質を投与する段階を含む。
本発明の適用範囲は、例として膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるがこれらに限定されないがんのような、ＥＣＴ２過剰発現と関係があるかまたはそれに起因する数多くの疾患の任意のものにも拡張される。
【００１６】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる単離されたペプチドであって、ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する、単離されペプチド。
［２］  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、［１］記載の単離されたペプチド。
［３］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載の単離されたペプチド。
［４］（ａ）ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド、
（ｂ）ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、（ａ）の単離されたペプチド、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド、および
（ｄ）改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持することを条件として、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、（ａ）または（ｂ）の単離されたペプチド
からなる群より選択される、単離されたペプチド。
［５］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、以下の特徴の一方または両方を有する、［４］記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される；および
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
［６］  ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］〜［５］のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
［７］  ［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
［８］  ［１］〜［６］のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチドまたは［７］記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導するための組成物。
［９］  ［１］〜［６］のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチドまたは［７］記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および／または予防および／または術後再発の予防のための薬学的組成物。
［１０］  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［９］記載の薬学的組成物。
［１１］  がんの治療のために製剤化される、［９］または［１０］記載の薬学的組成物。
［１２］（ａ）インビトロ、エクスビボまたはインビボで、ＡＰＣを［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法。
［１３］（ａ）ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣと、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を共培養する段階；
（ｂ）ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するエキソソームと、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドと結合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、Ｔ細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む方法によって、ＣＴＬを誘導するための方法。
［１４］  ＨＬＡ抗原と［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
［１５］  ［１２］記載の方法によって導入される、［１４］記載のＡＰＣ。
［１６］  ［１］〜［６］記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたＣＴＬ。
［１７］  ［１３］記載の方法によって誘導される、［１６］記載のＣＴＬ。
［１８］  がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、［１］〜［６］のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、またはそのペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
［１９］  ［１］〜［６］記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
［２０］  ［１］〜［６］記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
［２１］  ［１］〜［６］記載のペプチド、［７］記載のヌクレオチド、または［１９］記載の抗体のいずれかを含む、診断キット。
【００１７】
前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００１８】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかし、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＥＣＴ２由来のペプチドによって誘導されたＣＴＬに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している一連の写真（ａ）〜（ｃ）で構成される。ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）により刺激したウェル番号＃６（ａ）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）により刺激したウェル番号＃５（ｂ）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）により刺激したウェル番号＃１（ｃ）におけるＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの画像のウェル上の四角印は、対応するウェル由来の細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示している。図面中で、「＋」は適切なペプチドでパルス刺激した標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示しており、「−」はいずれのペプチドでもパルス刺激していない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示している。
【図２】図２は、（ａ）ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、（ｂ）ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、および（ｃ）ＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示すＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）で構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強いＩＦＮ−γ産生を示すことを実証している。図面中で、「＋」は適切なペプチドでパルス刺激した標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示しており、「−」はいずれのペプチドでもパルス刺激していない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示している。
【図３】図３は、（ａ）ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および（ｂ）ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示している一対の折れ線グラフ（ａ）および（ｂ）を示している。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強いＩＦＮ−γ産生を示したことを実証している。図面中で、「＋」は適切なペプチドでパルス刺激した標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示しており、「−」はいずれのペプチドでもパルス刺激していない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示している。
【図４】図４は、ＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１を外因性に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示している一対の折れ線グラフ（ａ）および（ｂ）を示している。ＨＬＡ−Ａ*０２０１または完全長ＥＣＴ２遺伝子がトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞を、対照として調製した。ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）によって樹立されたＣＴＬクローン（ａ）およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）によって樹立されたＣＴＬ株（ｂ）は、ＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１の両方がトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示した（●）。一方、ＨＬＡ−Ａ*０２０１（△）またはＥＣＴ２（○）のいずれかを発現する標的細胞に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった
【発明を実施するための形態】
【００２０】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい材料、方法、および装置をここに記載する。しかし、本発明の材料および方法について記載する前に、これらの記載が説明のためだけのものであり、限定することを意図していないことが理解されるべきである。同様に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および／または最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。さらに、本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００２１】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかし、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証するためのものであり、限定することは意図しない。
【００２２】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも１つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が、修飾された残基、すなわち対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であってよいアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で時として用いる「オリゴペプチド」という用語は、長さが２０残基またはそれ未満、典型的には１５残基またはそれ未満の本発明のペプチド、および典型的には約８〜約１１残基、しばしば９または１０残基から構成される本発明のペプチドを指すのに用いられる。
【００２３】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、１つまたは複数の修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００２４】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
「剤」、「物質」、および「組成物」という用語は本明細書で互換的に用いられ、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。「薬学的」という修飾語句に関して用いる場合のそのような用語は（例えば「薬学的な剤」および「薬学的組成物」）、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的な剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の産物を指す。
【００２５】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、ポリファーマコフォアにスキャフォールドされた対象をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００２６】
本発明の薬学的な剤または組成物は、特にワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」という語句（「免疫原性組成物」とも称される）は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物の文脈において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に用いるための薬学的な剤または組成物の場合、剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／または組織に対して直接的または間接的に、少なくとも１つの生物学的作用または生理的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低下または阻害、がん細胞および／または組織の損傷または殺傷などが含まれ得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識または殺傷するＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク（bulk）」、「原薬（drug substance）」、または「原体 (technical product)」とも称される場合がある。
【００２７】
別段の定めのない限り、「がん」という用語は、ＥＣＴ２遺伝子を過剰発現するがんを指し、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
【００２８】
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２」という用語が代表的に指すサブタイプの例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２２８、およびＨＬＡ−Ａ＊０２５０が含まれるがこれらに限定されない。
【００２９】
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「キット」という用語は、試薬と他の物質との組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
対象または患者との関連において、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２陽性」という語句は、その対象または患者がＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、ＨＬＡ−Ａ２抗原が対象または患者の細胞においてＨＬＡ抗原として発現していることを指す。
【００３０】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＥＣＴ２遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００３１】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【００３２】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００３３】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通に理解しているのと同じ意味を有する。
【００３４】
ＩＩ．ペプチド
ＥＣＴ２由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＥＣＴ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）由来のペプチドを解析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
【００３５】
ＥＣＴ２由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下の候補ペプチドを同定した：
ＥＣＴ２−Ａ２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−６１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−６６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−６３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−１４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−５６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−５７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−２９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−８２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−２２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−７５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−３５７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−４３８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−８７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−５６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−１６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−４４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−６３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−１４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−７０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−７５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−５５７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−７７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−４２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−６１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−５７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−４６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−５７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−４３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−４７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、および
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）。
【００３６】
さらに、これらのペプチドをパルス（負荷）した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドでＤＣを刺激することによりＣＴＬの樹立に成功した：
ＥＣＴ２−Ａ２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
ＥＣＴ２−Ａ２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、および
ＥＣＴ２−Ａ２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＥＣＴ２がＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験したそれらのペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＣＴ２のエピトープペプチドであることを実証している。
【００３７】
ＥＣＴ２遺伝子は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣなどのがん細胞では過剰発現されるが、ほとんどの正常臓器では発現されないため、これはがん免疫療法の優れた標的となる。したがって、本発明は、ＣＴＬにより認識されるＥＣＴ２由来のエピトープのノナペプチド（９個のアミノ酸残基で構成されるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基で構成されるペプチド）を提供する。あるいは、本発明は、ＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する、単離されたペプチドを提供し、このペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列を有するかまたはその免疫学的活性断片である。より具体的には、いくつかの態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【００３８】
一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えば、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al.,  Protein Sci., 2003; 12: 1007-17に記載されたものなどを用いて、さまざまなペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで計算することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えば、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されたようにして測定することができ、それらは例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220に概括されている。結合親和性を決定するための方法は、例えば、Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190)およびProtein Science (2000, 9: 1838-1846)に記載されている。このため、そのようなソフトウェアプログラムを用いて、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＥＣＴ２由来の断片を選択することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムによって、ＨＬＡ抗原と結合すると判定されるであろう、ＥＣＴ２由来の任意の断片で構成されるペプチドを範囲に含む。さらに、そのようなペプチドには、完全長のＥＣＴ２で構成されるペプチドを含んでもよい。
【００３９】
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、そのペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基が隣接してもよい。具体的な付加的アミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、あらゆる種類のアミノ酸で構成され得る。したがって、本発明は、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを範囲に含み、これにはＥＣＴ２由来のペプチドが含まれる。そのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合は約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００４０】
一般に、ペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸の改変は、そのペプチドの機能に影響を及ぼさず、または場合によっては元のタンパク質の所望の機能を強化しさえすることが知られている。事実、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列に対して１個、２個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を行うことによって改変されたアミノ酸配列で構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持していることが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、本発明の１つの態様によれば、本発明のＣＴＬ誘導能を有するペプチドは、１個、２個またはさらにはそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドで構成されてよい。
【００４１】
当業者は、単一のアミノ酸もしくは低いパーセンテージのアミノ酸を変更するアミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、および／または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすことを認識しているであろう；これはそのため、「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合にはタンパク質の変更によって類似の機能を有するタンパク質がもたらされる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表は当技術分野で周知である。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；イオウ原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換物であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。
【００４２】
そのような保存的に改変されたペプチドも、本発明のペプチドであると判断される。しかし、本発明のペプチドはそれらには限定されず、結果として生じる改変ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的改変物も含んでよい。さらに、改変ペプチドから、ＥＣＴ２の多型変異体、種間相同体、およびアレルのＣＴＬ誘導可能ペプチドを除外すべきではない。
【００４３】
より高い結合親和性を実現するために、アミノ酸残基を本発明のペプチドに挿入、置換、もしくは付加してもよく、または代替としてそこからアミノ酸残基を欠失させてもよい。必要なＣＴＬ誘導能を保持するためには、少数（例えば、１個、２個または数個）または低いパーセンテージのアミノ酸のみを改変する（挿入、欠失、付加、および／または置換する）ことが好ましい。本明細書において、「数個の」という用語は、５個またはそれ未満、例えば、４個または３個またはそれ未満のアミノ酸を意味する。改変するアミノ酸の割合は、例えば、２０％またはそれ未満、好ましくは１５％またはそれ未満、より好ましくは１０％またはそれ未満、さらにより好ましくは１〜５％であってよい。
【００４４】
がん免疫療法との関連において用いる場合、本ペプチドを、ＨＬＡ抗原との複合体として細胞またはエキソソームの表面上に提示させることができる。このため、ＣＴＬを誘導するだけでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性をも有するペプチドを選択することが好ましい。この目的に向けて、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、改良された結合親和性を有する改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原との結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づく改変を、本発明の免疫原性ペプチドに導入してもよい。
【００４５】
例えば、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を示すペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンで置換されている傾向がある。同様に、Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンで置換されているペプチドを用いることが有利なこともある。したがって本発明で想定されるのは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、ここで前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸はロイシンまたはメチオニンで置換されている、および／または前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端はバリンまたはロイシンで置換されている。
【００４６】
置換は、ペプチドの末端アミノ酸の箇所だけでなく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）認識位置である可能性のある位置に導入してもよい。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドは、元のものと機能が同等であるかまたはより優れている場合があることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００４７】
本発明はまた、本ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１個、２個または数個のアミノ酸の付加も想定している。高いＨＬＡ抗原結合親和性を示し、かつＣＴＬ誘導能を保持する、そのような改変ペプチドも、本発明に含まれる。例えば、本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、長さが１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸未満の単離されたペプチドを提供する：
（ｉ）１個、２個または数個のアミノ酸が置換されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２０からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、そのペプチドがＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する、アミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）以下の特徴のうち一方または両方を有する、（ｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される；および
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
【００４８】
さらに、本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、長さが１５、１４、１３、１２または１１アミノ酸未満の単離されたペプチドも提供する：
（ｉ）１個、２個または数個のアミノ酸が置換されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、そのペプチドがＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する、アミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）以下の特徴のうち一方または両方を有する、（ｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される；および
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのＣ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
これらのペプチドがＡＰＣと接触するかまたはその中に導入されると、これらのペプチドはＡＰＣにおいてプロセシングを受けて（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉ'）および（ｉｉ'）のペプチドがその表面に提示される。
【００４９】
しかし、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことができる。相同性検索から、対象ペプチドとは１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変してもよい。
【００５０】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００５１】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識してもよく、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出してもよい。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、それを検討してもよい。
【００５２】
上記のペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの中から選択されるノナペプチドおよびデカペプチドが、特に高いＣＴＬ誘導能、ならびにＨＬＡに対する高い結合親和性を示すことが発見された。したがって、これらのペプチドが本発明の好ましい態様として例示される。
【００５３】
その上、相同性解析の結果により、そのようなペプチドが、他のいずれの公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を有しないことが示された。このことから、免疫療法のために用いた場合に未知のまたは望ましくない免疫応答が生じる可能性は低くなる。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＥＣＴ２に対する免疫を誘発させるために有用である。したがって、本発明のペプチド、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって想定される。
【００５４】
上記に考察したような本ペプチドの改変に加えて、結果として生じる連結したペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持し、かつ、より好ましくはその必要なＨＬＡ結合性をも保持する限り、本発明のペプチドを他のペプチドと連結させてもよい。例示的な「他の」ペプチドには、本発明のペプチド、または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。ペプチド間のリンカーは当技術分野において周知であり、例えば、ＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）である。
【００５５】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、ＥＣＴ２以外の腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に用いることもできる。がん細胞が複数の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは十分に立証されている。したがって、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するか否かを判定して、続いて、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを、本発明のＥＣＴ２組成物またはワクチンの中に含めることは、当業者の慣例的な実験の範囲内にある。
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明に関連して用いることができる。当業者は、１つもしくは複数のＥＣＴ２ペプチドおよび１つもしくは複数の非ＥＣＴ２ペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、従来の分子生物学の手順を用いて調製することができる。
【００５６】
上記の連結ペプチドを、本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、さまざまな配置（例えば、連鎖状、一部重複）で１つに結びつけることのできる、免疫原性または免疫応答刺激性を持つ可能性のある２つまたはそれ以上のペプチドの群のことである。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫処置プロトコールに従って例えば動物に投与して、免疫応答を刺激、強化、および／または誘発させる上でのポリトープの有効性を試験することができる。
直接的にまたはポリトープを形成する隣接配列の使用を介して、このようなペプチドを１つに結びつけることができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照）。さまざまな数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製して、ＣＴＬによる認識、および免疫応答を増大させる効力に関して試験することができる。
【００５７】
本発明のペプチドを、それらが必要なＣＴＬ誘導性を保持する限り、他の物質とさらに連結させてもよい。そのような「他の」物質の実例には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成性のポリマーなどが含まれるが、これに限定されない。ペプチドは、修飾によって本明細書に記載のペプチドの生物活性が損なわれない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化などの修飾を含んでもよい。これらの種類の修飾は、追加的な機能（例えば、ターゲティング機能および送達機能）を付与するため、またはポリペプチドを安定化するために行う場合がある。
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣物、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野では公知である；この考え方を本ポリペプチドに取り入れてもよい。ポリペプチドの安定性は、さまざまな方法でアッセイしてもよい。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒト血漿および血清などのさまざまな生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照）。
【００５８】
その上、上述したように、１個、２個または数個のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失、または付加された改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じまたはより高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。本発明はしたがって、元のものと比較して同じまたはより高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法も提供する。例えば、本方法は以下の段階を含んでもよい：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失、または付加を行う段階；
ｂ：前記ペプチドの活性を決定する段階；および
ｃ：元のものと比較して同じまたはより高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、このような活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬの誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドが「ＥＣＴ２ペプチド」または「ＥＣＴ２ポリペプチド」と記載される場合もある。
【００５９】
ＩＩＩ．ＥＣＴ２ペプチドの調製
本発明のペプチドは、周知の手法を用いて調製することができる。例えば、本ペプチドを、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって合成的に調製してもよい。本発明のペプチドは、個別にまたは２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いペプチドとして合成してもよい。本ペプチドを単離してもよく、すなわち、天然に存在する他の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片も、いかなる他の化学物質も実質的に含まないように精製または単離してもよい。
【００６０】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含んでもよい。他の例示的な修飾には、例えば、ペプチドの血清中半減期を延長させるために用いることのできる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣物の組み入れが含まれる。
【００６１】
選択したアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、本発明のペプチドを得ることもできる。例えば、この合成のために採用され得る従来のペプチド合成法には、以下のものが含まれる：
（i）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ii）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（iii）「ペプチド合成」(日本語), 丸善., 1975；
（iv）「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語), 丸善, 1985；
（v）医薬品の開発（第2版）(日本語), 丸善, 第14巻 (ペプチド合成), 広川書店, 1991；
（vi）ＷＯ９９／６７２８８号；および
（vii）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００６２】
あるいは、ペプチドを生産するための任意の公知の遺伝子工学的方法を採用して、本ペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に対応する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドの保有に適したベクターを調製し、適した宿主細胞への形質転換導入を行う。そのようなベクターおよび宿主細胞も本発明によって提供される。続いて宿主細胞を培養し、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を採用して、本ペプチドをインビトロで生成させてもよい。
【００６３】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のＥＣＴ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３７６４３９（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１））に由来するポリヌクレオチド、およびそれらの保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するものが含まれる。本明細書において、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。このため、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、当技術分野において「サイレント変異」と称され、保存的に改変された変異の一種を表すものである。ペプチドをコードすると本明細書中に記載されたあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製し得ることを容易に理解するであろう。したがって、開示されたペプチドをコードする各ヌクレオチド配列は、それに付随するサイレント変異の非明示的な開示でもある。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体で構成され得る。当技術分野において周知であるように、ＤＮＡ分子は天然の塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基で適切に構成され、ＲＮＡではＴがＵに置き換えられる。当業者は非天然塩基も同様にポリヌクレオチドの中に含まれることを認識しているであろう。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の複数のペプチドを、介在アミノ酸配列を伴うかまたは伴わずにコードすることができる。例えば、介在アミノ酸配列が、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を与えてもよい。その上、ポリヌクレオチドが、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の追加的な配列を含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現のために必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってもよく、またはマーカー遺伝子などを有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、そのような組換えポリヌクレオチドは、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる、従来の組換え手法によってポリヌクレオチドを操作することによって調製してもよい。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドの作製には、組換え手法および化学合成手法の両方を用いてもよい。例えば、適切なベクター中への挿入によってポリヌクレオチドを作製することができ、それをコンピテント細胞にトランスフェクトして発現させてもよい。あるいは、ＰＣＲ法または適した宿主における発現を用いてポリヌクレオチドを増幅させてもよい（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相法を用いて、ポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００６６】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９号に詳述された方法を用いることによって調製してもよく、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製してもよい。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
【００６７】
複合体に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば、日本人の場合は、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ*０２０１、ＨＬＡ−Ａ*０２０２、ＨＬＡ−Ａ*０２０３、ＨＬＡ−Ａ*０２０４、ＨＬＡ−Ａ*０２０５、ＨＬＡ−Ａ*０２０６、ＨＬＡ−Ａ*０２０７、ＨＬＡ−Ａ*０２１０、ＨＬＡ−Ａ*０２１１、ＨＬＡ−Ａ*０２１３、ＨＬＡ−Ａ*０２１６、ＨＬＡ−Ａ*０２１８、ＨＬＡ−Ａ*０２１９、ＨＬＡ−Ａ*０２２８、およびＨＬＡ−Ａ*０２５０が適切であることが多い。日本人および白人で高発現されるＡ２４型またはＡ２型を用いることが有効な結果を得るためには有利であり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１、ＨＬＡ−Ａ*０２０２、ＨＬＡ−Ａ*０２０３、ＨＬＡ−Ａ*０２０４、ＨＬＡ−Ａ*０２０５、ＨＬＡ−Ａ*０２０６、ＨＬＡ−Ａ*０２０７、ＨＬＡ−Ａ*０２１０、ＨＬＡ−Ａ*０２１１、ＨＬＡ−Ａ*０２１３、ＨＬＡ−Ａ*０２１６、ＨＬＡ−Ａ*０２１８、ＨＬＡ−Ａ*０２１９、ＨＬＡ−Ａ*０２２８、およびＨＬＡ−Ａ*０２５０などのサブタイプも使用される。典型的には、診療施設で、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を前もって調べることにより、この抗原に対して高レベルの結合親和性を有するか、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能になる。その上、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能を示すペプチドを得る目的で、天然のＥＣＴ２部分ペプチドのアミノ酸配列を基に、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失、または付加を行うこともできる。
Ａ２型のＨＬＡ抗原を本発明のエキソソーム用に用いる場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０のいずれか１つの配列を有するペプチドが特に有用である。
【００６８】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとによって形成された複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣも提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者由来のものであってよく、単独で、または本発明のペプチド、エキソソームもしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与してもよい。
これらのＡＰＣは特定の種類の細胞には限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして利用される。
【００６９】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、続いてそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（本発明のペプチドで刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得てもよい。本発明のペプチドを対象に投与すると、本発明のペプチドを提示するＡＰＣがその対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後に、対象からＡＰＣを収集することによって得てもよい。あるいは、対象から収集したＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって、本発明のＡＰＣを得てもよい。
【００７０】
本発明のＡＰＣは、対象におけるがんに対する免疫応答を誘導するために、単独でまたは本発明のペプチド、エキソソームまたはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与してもよい。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含んでもよい：
ａ：第１の対象からＡＰＣを収集する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを本ペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００７１】
第１の対象および第２の対象は同じ個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られたＡＰＣは、がんを治療および／または予防するためのワクチンとして投与することができ、がんの例には膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これに限定されない。
本発明はまた、ＡＰＣを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程も提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
【００７２】
本発明の１つの局面によれば、ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないか、またはＣＴＬを誘導しないと考えられるペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比べたものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上述した方法のほかに、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに移入する段階を含む方法によっても調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であってもよい。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム法といった、当分野において従来より実施されているさまざまな方法が含まれ、使用され得る。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13；J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載された通りに、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに移入することによって、その遺伝子は細胞内で転写、翻訳などを受け、その後、得られたタンパク質がＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによるプロセシングを受けて、提示経路を経て部分ペプチドが提示される。
【００７３】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させ、それ故にペプチドと同様にワクチンとして用いることができる。したがって、本発明はまた、本ペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬも提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（本発明のペプチドで刺激する）こと、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）本発明のペプチドと結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入すること、によって得てもよい。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製してもよく、（４）の方法の詳細は、以下の「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の項で説明する。
【００７４】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者由来のものであってよく、単独で投与してもよく、または作用を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与してもよい。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導のために用いたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＥＣＴ２を内因性に発現する細胞、例えばがん細胞などであってもよく、またはＥＣＴ２遺伝子がトランスフェクトされた細胞であってもよい；本発明のペプチドによる刺激が原因でそのペプチドを細胞表面上に提示する細胞も、活性化ＣＴＬの攻撃の標的として役立ち得る。
【００７５】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法も提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＥＣＴ２を提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明の１つまたは複数のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５号、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとして、５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、および３'側プライマーとして、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に対して特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に対して特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に対して特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）であってよいが、これらには限定されない。派生ＴＣＲは、ＥＣＴ２ペプチドをディスプレイする標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＥＣＴ２ペプチドを提示する標的細胞の効率的な死滅をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
【００７６】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適したベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは当技術分野において周知である。核酸またはそれらを有効な形で含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に移入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のもの）の迅速な改変により、優れたがん細胞死滅特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする汎用的な組成物を提供する。
【００７７】
特異的ＴＣＲとは、そのＴＣＲがＴ細胞の表面上に提示された場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与することのできる受容体のことである。上記の複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡマルチマー染色分析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現するＴ細胞がそのＴＣＲによって細胞を認識すること、およびそのシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。上述した複合体がＴ細胞表面上に存在する場合に、その複合体がＴ細胞に細胞傷害活性を与えることができることを、公知の方法によって確認してもよい。好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の判定、例えばクロム放出アッセイなどが含まれる。
また、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２との関連においてＥＣＴ２ペプチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０などと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸による形質導入によって調製されるＣＴＬも提供する。
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または防御を必要とする患者において、がんを治療または予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために用いてもよい（ＷＯ２００６／０３１２２１号）。
【００７８】
ＩＸ．薬学的物質または組成物
ＥＣＴ２の発現は、正常組織と比較して、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣなどのがんで特異的に増大しているため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の予防のために用いることができる。したがって、本発明は、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の予防のための薬学的物質または組成物を提供し、そのような剤、物質、または組成物は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１つまたは複数を有効成分として含む。あるいは、薬学的物質または組成物として用いるために、前記のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に、本ペプチドを発現させることもできる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬを、本薬学的物質または組成物の有効成分として用いることもできる。
【００７９】
本発明の薬学的な剤、物質、または組成物はまた、ワクチンとして使用される。本発明において、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
本発明の薬学的な剤、物質、または組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含むがこれに限定されない対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【００８０】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のために製剤化された薬学的な剤、物質、または組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８１】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８２】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤、組成物、または物質を製造するための方法または工程を提供し、本方法または工程は、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体とともに製剤化する段階を含む：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８３】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤、組成物、または物質を製造するための方法または工程を提供し、本方法または工程は、以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００８４】
本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが見いだされている。このため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本薬学的物質または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために特に適している。これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的物質または組成物に対しても同じことが成り立つ。
【００８５】
本発明の薬学的物質または組成物によって治療されるがんは限定的でなく、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣを含むがこれに限定されない、ＥＣＴ２が関与する（例えば、過剰発現される）あらゆるがんが含まれる。
本薬学的物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、そのような他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、そのような他のペプチドを提示する他の細胞なども含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、それらには限定されない。
【００８６】
必要に応じて、本発明の薬学的物質または組成物は、任意で、他の治療的物質を、その物質が有効成分、例えば本ペプチドのいずれかの抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として含んでもよい。例えば、製剤は、抗炎症性物質または抗炎症性組成物、鎮痛剤、化学療法薬などを含んでもよい。医薬自体におけるその他の治療的物質に加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な物質または組成物と逐次的または同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な物質または組成物の量は、例えば、用いる薬理学的な物質または組成物の種類、治療される疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
本明細書において特に言及した成分に加えて、本発明の薬学的物質または組成物は、当該の製剤の種類を考慮した上で、当技術分野において慣例的な他の物質または組成物も含み得ることが理解されるべきである。
【００８７】
本発明の１つの態様において、本薬学的物質または組成物を、治療しようとする疾患、例えばがんなどの病態を治療するために有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。本薬学的物質または組成物のいずれかの容器をラベルと共に、製品に含めてもよい。適した容器には、瓶、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器上のラベルには、この物質または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。また、ラベルが投与などに関する指示を示してもよい。
【００８８】
上記の容器に加えて、本発明の薬学的物質または組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容する第２の容器をさらに含んでもよい。それはさらに、使用に関する指示書とともに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および使用者の立場から見て望ましい他の材料も含み得る。
薬学的組成物を、必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置の中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書を添付することができる。
【００８９】
（１）ペプチドを有効成分として含む薬学的物質または組成物
本発明のペプチドは、薬学的物質もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してもよい。後者の場合には、本発明のペプチドに加えて、薬物用に通常用いられる担体、添加剤などを特に限定せずに適宜含めることができる。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などがある。その上、薬学的物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存料、界面活性剤などを含み得る。本発明の薬学的物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００９０】
本発明のペプチドは、インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドの２種またはそれ以上を含む組み合わせとして調製することができる。ペプチドはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な手法を用いて互いにコンジュゲートさせてもよい。例えば、ペプチドを化学的に連結させてもよく、または１個もしくは数個のアミノ酸をリンカー（例えば、リジンリンカー：K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715）として有し得る単一の融合ポリペプチド配列として発現させることもできる。組み合わせにおけるペプチドは同じでも異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することにより、これらのペプチドがＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、続いて、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出し、続いて本発明のペプチドで刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再び投与し、対象においてＣＴＬを誘導させ、その結果として、腫瘍を伴う内皮に対する攻撃性を高めることもできる。
【００９１】
本発明のペプチドのいずれかを有効成分として含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な剤、物質、または組成物は、細胞性免疫が効率的に成立するようにするアジュバントを含むこともできる。あるいは、薬学的な剤、物質、または組成物を他の有効成分とともに投与することもでき、またはそれらを顆粒に製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と一緒に（または続けて）投与された時に、そのタンパク質に対する免疫応答を強化する任意の化合物、物質、または組成物のことを指す。適用できるアジュバントには、文献中に記載されたものが含まれる（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）。例示的なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、水中油型エマルションなどが含まれるが、これらには限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００９２】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な物質または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質または組成物として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【００９４】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００９５】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な物質または組成物
本発明の薬学的な剤、物質、または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０も参照されたい）。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００９６】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００９７】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【００９８】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも適用可能な組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、AusubelらによってCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993に、かつKriegerによってGene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【００９９】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１００】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、ＣＴＬ誘導能を他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができる。それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に説明するように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【０１０１】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【０１０２】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている、ＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。好ましくは、ＡＰＣの中で最も強いＣＴＬ誘導能を有するため、ＤＣを用いることができる。本発明の任意のペプチドは、単独でまたは本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
【０１０３】
一方、本発明のペプチドを対象に投与する場合には、ＡＰＣがインビボでペプチドと接触し、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明は、本発明のペプチドを対象に投与することを含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与する場合には、本発明のペプチドがインビボで発現されてＡＰＣと接触し、その結果、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与することを含んでもよい。「発現可能な形態」という語句は、「ＩＸ．薬学的物質および組成物、（２）ポリヌクレオチドを有効成分として含む薬学的物質または組成物」の項に上述されている。
【０１０４】
さらに、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することも含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含むことができる：
ａ：対象からＡＰＣを収集する段階：および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の項に上述した通りに行うことができる。
【０１０５】
あるいは、本発明は、ＥＣＴ２に対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法を提供し、本方法は、以下の段階の一方を含むことができる：
（ａ）インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１０６】
（２）ＣＴＬの誘導方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導するための方法も提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてＣＴＬを誘導するための方法も提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中から選択される少なくとも１つの段階を含んでもよい：
（ａ）ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を接触させる段階、ならびに
（ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
【０１０７】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエキソソームを対象に投与すると、対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が強化される。したがって、本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
【０１０８】
あるいは、それらをエクスビボで用いてＣＴＬを誘導することもでき、ＣＴＬを誘導した後に、活性化されたＣＴＬを対象に戻すことができる。例えば、本方法は以下の段階を含むことができる：
ａ：対象からＡＰＣを収集する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣを、上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の項に記載されているように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに移入することによって調製することもできるが、本発明はそれらには限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に有効に提示するあらゆるＡＰＣを範囲に含む。
【０１０９】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含んでもよい。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
【０１１０】
その上、本発明のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的物質または組成物を製造するための方法または工程を提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
【０１１１】
（３）免疫応答の誘導方法
さらに、本発明は、ＥＣＴ２と関係のある疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適した疾患にはがんが含まれてよく、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これに限定されない。
【０１１２】
本発明の方法は、本発明のペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む物質または組成物を投与する段階を含んでもよい。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与も想定し得る。詳細については、「ＩＸ．薬学的物質または組成物」の項目、特に本発明の薬学的物質または組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に用いることができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣおよびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項目にも詳述されている。
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的物質または組成物を製造するための方法または工程も提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る。
【０１１３】
あるいは、本発明の方法は、以下のものを含む、本発明のワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含んでもよい：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１４】
本発明との関連において、ＥＣＴ２を過剰発現するがんをこれらの有効成分によって治療することができる。そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これに限定されない。このため、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物の投与の前に、治療しようとするこれらの細胞または組織におけるＥＣＴ２の発現レベルが同じ臓器の正常細胞と比較して増強されているか否かを確かめることが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＥＣＴ２を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供し、本方法は、以下の段階を含み得る：
ｉ）治療しようとするがんを有する対象から得られた細胞または組織におけるＥＣＴ２の発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＥＣＴ２の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの構成成分を、正常対照と比較してＥＣＴ２を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１１５】
あるいは、本発明は、ＥＣＴ２を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、上記の（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの構成成分を含むワクチンまたは薬学的組成物も提供する。言い換えれば、本発明はさらに、本発明のＥＣＴ２ポリペプチドによって治療すべき対象を同定するための方法を提供し、そのような方法は、対象由来の細胞または組織におけるＥＣＴ２の発現レベルを決定する段階を含み、そのレベルが遺伝子の正常対照レベルと比較して高いことにより、その対象が本発明のＥＣＴ２ポリペプチドによって治療され得るがんを有する可能性があることが示される。本発明について、以下により詳細に説明する。
【０１１６】
対象由来の任意の細胞または組織を、それが目的とするＥＣＴ２の転写産物または翻訳産物を含む限り、ＥＣＴ２発現の決定のために使用することができる。適した試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織の試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがん性である疑いのある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要であれば、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、続いてそれを対象由来試料として用いてもよい。
【０１１７】
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物は、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むが、これに限定されない。
本発明によれば、対象から得られた細胞または組織におけるＥＣＴ２の発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＥＣＴ２のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によって、プローブを用いて定量することができる。検出は、チップ、アレイなどの上で行うことができる。アレイの使用は、ＥＣＴ２の発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ＥＣＴ２の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＥＣＴ２のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要であれば、プローブを、色素、蛍光物質および同位体といった適した標識で標識してもよく、遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いて、ＥＣＴ２の転写産物（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を定量してもよい。そのようなプライマーは、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【０１１８】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＥＣＴ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によって達成してもよい。
【０１１９】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０もしくは２５の連続した、ＥＣＴ２配列を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＥＣＴ２配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはこれらの配列の天然の変異体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、１つの好ましい態様において、５〜５０の長さを有するオリゴヌクレオチドを、検出しようとする遺伝子を増幅するためのプライマーとして用いることができる。より好ましくは、ＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、特定のサイズ、一般に長さが１５〜３０ｂのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて検出することができる。
【０１２０】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは１５〜２５から選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いることによる遺伝子の検出のためのアッセイの手順、装置または試薬は周知である（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはタグまたはリンカー配列を含んでもよい。さらに、プローブまたはプライマーを、捕捉しようとする検出可能な標識または親和性リガンドによって修飾することもできる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく検出手順では、数百（例えば、約１００〜２００）塩基から数キロ（例えば、約１０００〜２０００）塩基までの長さを有するポリヌクレオチドを、プローブ用に用いることもできる（例えば、ノーザンブロットアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ分析）。
【０１２１】
あるいは、翻訳産物を、本発明の診断のために検出することもできる。例えば、ＥＣＴ２タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）またはその免疫学的断片の数量を決定することができる。翻訳産物としてのタンパク質の数量を決定するための方法には、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いるイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよくまたはポリクローナルであってもよい。その上、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）も、その断片または改変抗体がＥＣＴ２タンパク質に対する結合能を保持している限り、検出に用いてもよい。本発明のペプチドおよびそれらの断片に対するそのような抗体も、本発明によって提供される。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製するための方法は当技術分野において周知であり、任意の方法を本発明において使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１２２】
ＥＣＴ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＥＣＴ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的分析を介して、染色の強度を測定することもできる。すなわち、この測定では、強力な染色により、タンパク質の存在／レベルの増大が示され、それと同時に、ＥＣＴ２遺伝子の発現レベルが高いことが示される。
がん細胞における標的遺伝子、例えばＥＣＴ２遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）から、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大しているか；または１.１倍を上回って、１.５倍を上回って、２.０倍を上回って、５.０倍を上回って、１０.０倍を上回って、もしくはそれ以上に増大している場合に、増大していると判定することができる。
【０１２３】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いて、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する臓器の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＥＣＴ２遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料中のＥＣＴ２遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＥＣＴ２遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値  ＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値  ＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１２４】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
ＥＣＴ２遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１２５】
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有する疑いがあるかどうかを診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は以下の段階を含んでもよい：
（ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＥＣＴ２の発現レベルを決定する段階；
（ｂ）ＥＣＴ２の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
（ｃ）ＥＣＴ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１２６】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含んでもよい：
（ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のＥＣＴ２の発現レベルを決定する段階；
（ｂ）ＥＣＴ２の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
（ｃ）ＥＣＴ２の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１２７】
本発明はまた、本発明のＥＣＴ２ポリペプチドによって治療し得るがんに罹患しているか、または罹患している疑いのある対象を診断または判定するための診断キットも提供し、それはがん免疫療法の有効性または適用可能性を評価および／またはモニターするのにも使用され得る。好ましくは、がんには、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるがこれに限定されない。より詳細には、キットは、好ましくは、対象由来細胞におけるＥＣＴ２遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含むことができ、そのような試薬は以下の群から選択され得る：
（ａ）ＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＥＣＴ２タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＥＣＴ２タンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１２８】
ＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＥＣＴ２  ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなど、ＥＣＴ２  ｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはＥＣＴ２  ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＥＣＴ２  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＥＣＴ２  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＥＣＴ２  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１２９】
一方、ＥＣＴ２タンパク質またはその免疫学的断片を検出するのに適した試薬の例には、ＥＣＴ２タンパク質またはその免疫学的断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＥＣＴ２タンパク質またはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識と、抗体を標識しかつ標的に対するその抗体の結合を検出する方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＥＣＴ２タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１３０】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、ＥＣＴ２遺伝子に対するプローブまたはＥＣＴ２ペプチドに対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＥＣＴ２ペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象またはがんに罹患している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれてよい。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１３１】
本発明の一態様において、試薬がＥＣＴ２  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＥＣＴ２  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１３２】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＥＣＴ２標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＥＣＴ２陽性試料を回収し、次にそれらのＥＣＴ２レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＥＣＴ２タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＥＣＴ２を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＥＣＴ２標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＥＣＴ２は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＥＣＴ２レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１３３】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本発明の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記の通りである。
【０１３４】
抗ＥＣＴ２抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＥＣＴ２抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＥＣＴ２）に対する抗体を含み、この抗ＥＣＴ２抗体の量が正常対照中の抗ＥＣＴ２抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１３５】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するための方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。この複合体を用いて、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することにより、診断を行うことができる。
【０１３６】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫学的応答を評価するための方法または診断用の剤を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ−Ａ０２拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。いくつかの態様においては、ペプチドエピトープを認識して結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の物質または組成物を、試薬として用いてもよい。ペプチド試薬を免疫原として使用しなくてもよい。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択し得る。そのような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は当技術分野において周知である。代替の好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞を含む。
【０１３７】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174: 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１３８】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１３９】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について解析することができる。ＰＢＭＣを培養し、該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について解析することができる。
【０１４０】
本発明のペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて解析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１４１】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＥＣＴ２免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。これらの方法は、生物学的試料中でのＥＣＴ２  ＨＬＡ結合ペプチド、またはＥＣＴ２  ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検材料などの生物学的試料中のＥＣＴ２の発現は、ＥＣＴ２プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＥＣＴ２増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
好ましくは診断法は、対象から単離された生物学的試料をＥＣＴ２  ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生物学的試料中のＥＣＴ２  ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生物学的試料中に存在するＥＣＴ２  ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生物学的試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般に、剤と生物学的試料を接触させるための条件は、分子と生物学的試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Ｌｏｗらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生物学的試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生物学的試料はインビボの組織であってよく、かつＥＣＴ２免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生物学的試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生物学的試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から採取された腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１４４】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法により、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべて、より慣例的なアッセイより少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
【０１４５】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＥＣＴ２ペプチドの少なくとも１つを投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）免疫原を、該免疫原に対して特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）で誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または決定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答をＣＴＬ誘導レベルと相関させる段階。
【０１４６】
本発明との関連において、免疫原は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中より選択されるＥＣＴ２ペプチド、および（ｂ）１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸置換によって改変されたそのようなアミノ酸配列を有するペプチド、のうち少なくとも１つである。一方、免疫原特異的ＣＴＬの誘導に適した条件は当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞を、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために免疫原の存在下でインビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導する目的で、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してもよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および／または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを３〜１０週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってもよい。
【０１４７】
本発明によれば、免疫原特異的ＣＴＬの誘導が対照と比較して強化されていることにより、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するのに適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合の、またはいかなるＥＣＴ２ペプチドとも異なるアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドと接触させている場合の、ＣＴＬ誘導レベルが含まれる。１つの好ましい態様においては、対象に投与された各免疫原間で免疫学的応答を比較することにより、対象の免疫学的応答を配列特異的な様式で評価する。特に、いくつかの種類のＥＣＴ２ペプチドについての混合物を対象に投与する場合であっても、免疫学的応答はペプチドに依存して異なる可能性がある。その場合には、各ペプチド間で免疫学的応答を比較することにより、対象がより強い応答を示すペプチドを同定することができる。
【０１４８】
ＸＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＥＣＴ２ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＥＣＴ２の発現が関与するがんの治療において治療上の使用を見出すことができ、そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明はまた、ＥＣＴ２タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、必要に応じて、ＥＣＴ２タンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１種または複数種の抗ＥＣＴ２抗体を含み得る。本発明において、ＥＣＴ２ポリペプチドに結合する抗ＥＣＴ２抗体は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、解析される抗体と全長ＥＣＴ２ポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中より選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合する。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイは、様々な種類の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０１５０】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイもまた含まれ得る。加えて、ＥＣＴ２を発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法も、本発明によって提供され、これには、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイは、ＥＣＴ２を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床上の使用を見出すことができ、そのようながんには、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体が含まれる。
【０１５１】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
【０１５２】
本明細書では、抗体を、ＥＣＴ２ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４０の中より選択されるアミノ酸配列を有するＥＣＴ２の断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１５３】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）科の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１５４】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０１５５】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでもよく、同様にポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１５６】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１５７】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０１５８】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１５９】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０１６０】
あるいは、免疫したリンパ球など、抗体を産生する免疫細胞を、がん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１６１】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１種または複数種に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１６２】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１６３】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１６４】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０１６５】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１６６】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識する二次抗体をアルカリホスファターゼなどの酵素で標識して添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
【０１６７】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０１６８】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用することができる。
【０１６９】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点(ori)」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1992)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１７０】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１７１】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を保有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１７２】
材料および方法
細胞株
ヒトＢリンパ芽球様細胞株であるＴ２（ＨＬＡ−Ａ２）およびアフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０１７３】
ＥＣＴ２由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と結合するＥＣＴ２由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合予測ソフトウエア「ＢＩＭＡＳ」（ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ）（Parker et al.（J Immunol 1994, 152(1): 163-75）、Kuzushima et al.（Blood 2001, 98(6): 1872-81）を用いて予測した。これらのペプチドを、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，  Ｔｅｘａｓ）により、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１７４】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と、１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。
ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７５】
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７６】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１７７】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０１７８】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１ヌル細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０１７９】
結果
がんにおけるＥＣＴ２発現の増強
ｃＤＮＡ−マイクロアレイを用いてさまざまながんから得られた包括的な遺伝子発現プロファイルデータにより、ＥＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３７６４３９；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）の発現が増大していることが明らかになった。ＥＣＴ２発現は、膀胱がん１９例中１７例、乳がん１２例中５例、子宮頸がん１４例中１４例、胆管細胞がん１３例中１３例、ＣＭＬ ５例中５例、結腸直腸がん８例中７例、食道がん１６例中１２例、ＮＳＣＬＣ １６例中６例、リンパ腫１０例中８例、膵がん１例中１例、前立腺がん１３例中１０例、腎がん６例中３例、およびＳＣＬＣがん１３例中１２例において、対応する正常組織と比較して、確かに増大していた（表１）。
【０１８０】
（表１）対応する正常組織と比較して、がん性組織においてＥＣＴ２の上方制御が観察された症例の割合
2013523082.tif 000002
【０１８１】
ＥＣＴ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合性ペプチドの予測
表２ａおよび２ｂは、ＥＣＴ２のＨＬＡ−Ａ０２結合性９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示している。エピトープペプチドを判定するために、ＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する可能性のある合計４０種のペプチドを選択して検討した。
【０１８２】
（表２ａ）ＥＣＴ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合性９ｍｅｒペプチド
2013523082.tif 000003
開始位置はＥＣＴ２のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示している。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【０１８３】
（表２ｂ）ＥＣＴ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合性１０ｍｅｒペプチド
2013523082.tif 000004
開始位置はＥＣＴ２のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示している。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【０１８４】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１で拘束されるＥＣＴ２由来の予測されたペプチドによるＣＴＬ誘導
ＥＣＴ２に由来するペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載されたプロトコールに従って作製した。ペプチド特異的ＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した（図１ａ〜ｃ）。ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃６（ａ）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したウェル＃５（ｂ）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激したウェル＃１（ｃ）は、対照ウェルと比較して強いＩＦＮ−γ産生を明らかに示した。その結果として、ＥＣＴ２に由来するＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ａ）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ｂ）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）（ｃ）が、強力なＣＴＬを誘導する可能性のあるペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
【０１８５】
ＥＣＴ２由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃６（ａ）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃５（ｂ）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激した＃１（ｃ）においてＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出されたペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を、上記の「材料および方法」の項に記載された通りに増殖させ、限界希釈によってＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した（図２ａ〜ｃ）。これらのＣＴＬ株は、ペプチドパルス刺激を受けていない標的細胞と比較して、対応するペプチドでパルス刺激された標的細胞に対する強いＩＦＮ−γ産生を明らかに示した。さらに、「材料および方法」の項に記載された通りに、ＣＴＬ株から限界希釈によってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドでパルス刺激された標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。図３では、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ａ）およびＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ｂ）で刺激されたＣＴＬクローンから強いＩＦＮ−γ産生が明らかにされた。
【０１８６】
ＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１を外因性に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して生じた、樹立されたＣＴＬ株およびクローンを、ＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を外因性に発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。完全長のＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１分子の遺伝子の両方がトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞（ＥＣＴ２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１遺伝子を外因性に発現する標的細胞の具体的モデルの１つ）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって生じたＣＴＬ株およびクローンをエフェクター細胞として用いて検査した。完全長のＥＣＴ２またはＨＬＡ−Ａ* ０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、対照として調製した。図４において、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で刺激されたＣＴＬクローン（ａ）およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激されたＣＴＬ株（ｂ）は、ＥＣＴ２およびＨＬＡ− Ａ* ０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ａ）、ＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）（ｂ）が、標的細胞上にＨＬＡ−Ａ*０２０１分子とともに自然下で発現され、ＣＴＬによって認識されたことが明らかに実証された。これらの結果は、ＥＣＴ２に由来するＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ａ）およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）（ｂ）が、ＥＣＴ２を発現する腫瘍を有する患者を治療するためのがんワクチンとして適している可能性を示している。
【０１８７】
抗原ペプチドの相同性解析
ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激されたＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の配列が、ヒト免疫系を感作させることが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を否定するために、これらのペプチド配列に関する相同性解析を、それをクエリーとしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ /ｂｌａｓｔ/ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ）を用いて行ったところ、有意な相同性を有する配列は認められなかった。この相同性解析の結果は、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＥＣＴ２−Ａ０２−９−６６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、およびＥＣＴ２−Ａ０２−１０−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の配列が固有のものであること、およびしたがって、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が何らかの非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
【０１８８】
結論として、ＥＣＴ２に由来する新規ＨＬＡ−Ａ２エピトープペプチドが同定された。さらに、本明細書における結果は、ＥＣＴ２のエピトープペプチドががん免疫療法に用いるのに適している可能性を実証している。
【０１８９】
産業上の利用可能性
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、かつ幅広いがんの種類に対する適用可能性を有し得る、新たなＴＡＡ、特にＥＣＴ２に由来するものを提供する。そのようなＴＡＡは、ＥＣＴ２と関連のある疾患、例えばがん、より詳細には膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、結腸直腸がん、食道がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびＳＣＬＣに対するペプチドワクチンとして使用することができる。
【０１９０】
本発明を、その具体的な態様を参照しながら、本明細書において詳細に説明してきたが、前述の説明は例示的かつ説明的な性質のものであって、本発明およびその好ましい態様を実例で説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通じて、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変をそれに加えてもよいことを容易に認識すると考えられ、本発明の範囲および境界は添付の特許請求の範囲によって定められる。
【図１】
2013523082.tif 000005
【図２】
2013523082.tif 000006
【図３】
2013523082.tif 000007
【図４】
2013523082.tif 000008
【配列表】
2013523082000001.app
【国際調査報告】
2013523082.tif 000009
2013523082.tif 000010
2013523082.tif 000011