(57)【要約】細菌ｓｉｇＮ代替シグマ５４因子の結合部位の全て、もしくはその一部をコードする配列を含むデコイ核酸配列を説明する。抗菌性複合体での、および細菌感染の治療のためのデコイの使用も説明する。【選択図】図５
2013523111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌ｓｉｇＮ代替シグマ５４因子の結合部位、またはその変異体もしくは類似体の全てもしくはその一部をコードする配列を含むデコイ核酸配列であって、前記結合部位配列は、配列番号２、配列番号８、配列番号１４、および配列番号２０からなる群から選択される、デコイ核酸配列。
【請求項２】
前記結合部位配列は、配列番号１、配列番号３および４、配列番号７、配列番号９および１０、配列番号１３、配列番号１５および１６、ならびに配列番号２１および２２からなる群から選択される、請求項１に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のデコイ核酸配列、および１つ以上の送達部分を含む、抗菌性複合体。
【請求項４】
前記送達部分は、第四級アミン化合物、アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環の一部を形成するアミノ基である、ビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体、ならびに抗菌性ペプチドから選択される、請求項３に記載の抗菌性複合体。
【請求項５】
前記送達部分は、キノリンまたはアクリジンの第四級誘導体および抗菌性ペプチドから選択される、請求項４に記載の抗菌性複合体。
【請求項６】
前記送達部分は、ビスキノリニウムである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記送達部分は、デカリニウムまたはその類似体である、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
前記デカリニウム類似体のアルキル鎖は、８個〜１４個のメチル基を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記デカリニウム類似体のアルキル鎖は、１０個または１２個のメチル基を有する、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記デカリニウム類似体は、１０，１０’−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記抗菌性ペプチドは、天然ペプチドである、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記抗菌性ペプチドは、天然のペプチドのペプチド模倣物または合成変異体である、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記抗菌性ペプチドは、細菌の細胞膜を透過性にする、請求項１１または請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記抗菌性ペプチドは、デフェンシン、プロイロシジン（ｐｌｅｕｒｉｃｉｄｉｎ）、マガイニン、デルマセプチン、アピデシン、セクロピン、ミクロシン、およびペジオシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記抗菌性ペプチドは、グラミシジンおよびポリミキシンからなる群から選択される、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
送達を促進するためにポリエチレンイミンを含有する、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記抗菌性ペプチドは、細胞内標的を有する、請求項１１または請求項１２に記載の複合体。
【請求項１８】
前記抗菌性ペプチドは、抗生物質、グリコペプチド抗生物質、ポリリシンおよびポリアルギニン等のカチオン性ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記抗菌性ペプチドは、ブフォリンまたはその誘導体である、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
細菌感染の治療における、請求項１もしくは請求項２に記載されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載される抗菌性複合体の使用。
【請求項２１】
前記細菌感染の治療は、１つ以上の抗生物質および／または他の抗菌剤（複数可）の使用をさらに含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
任意に１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤を組み合わせた、請求項１もしくは請求項２に記載されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載される抗菌性複合体と、生理学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、薬学的組成物または薬剤。
【請求項２３】
細菌感染の治療で使用するための、請求項２２に記載の薬学的組成物または薬剤。
【請求項２４】
任意に１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤を組み合わせた、請求項１もしくは請求項２に定義されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載の抗菌性複合体を投与することを含む、細菌感染を治療する方法。
【請求項２５】
細菌感染の治療が、肺炎、菌血症、百日咳、ライム病、ブルセラ症、急性腸炎、敗血症、野兎病、インフルエンザ、消化性潰瘍、レジオネラ症、淋病、院内感染、敗血症、くる病、腸チフス、赤痢、コレラ、疫病、炭疽、偽膜性大腸炎、ジフテリア、リステリア病、結核、敗血症、Ｑ熱、および髄膜炎から選択される状態を治療することを含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の使用、薬学的組成物、または方法。
【請求項２６】
細菌感染の治療は、肺炎、菌血症、百日咳、ライム病、ブルセラ症、急性腸炎、敗血症、野兎病、インフルエンザ、消化性潰瘍、レジオネラ症、淋病、院内感染、敗血症、くる病、腸チフス、赤痢、コレラ、疫病、炭疽、偽膜性大腸炎、ジフテリア、リステリア病、結核、敗血症、Ｑ熱、および髄膜炎から選択される状態を治療することを含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の使用、薬学的組成物、または方法。
【請求項２７】
任意に１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて、請求項１もしくは請求項２に定義されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載の抗菌性複合体を適用することを含む、細菌を死滅させる、細菌増殖を阻害する、または細菌毒性を低減させるエクスビボ方法。
【請求項２８】
任意に１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせた、請求項１もしくは請求項２に記載されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載の抗菌性複合体を含む、洗浄組成物。
【請求項２９】
請求項１もしくは請求項２に記載されるデコイ核酸配列、または請求項３〜１９のいずれか１項に記載の抗菌性複合体と、１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤と、を含むキットであって、前記デコイならびに前記１つ以上の抗生物質および／または抗菌剤は、細菌の死滅、細菌増殖の阻害、または細菌毒性の低減において併用するためのものである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性組成物、特に、病原菌に対して有効である組成物に関し、本組成物は、デコイ核酸配列を含む。
【０００２】
病院環境および一般社会の両方における、広範な細菌病原体間のかつてないほど多くの、しばしば複数の薬剤に対する耐性の発生により、通常抗生物質と称される、新規抗菌剤の発見および開発が早急に必要となっている。販売予定および開発中の新規薬物の数の減少によって、問題の重大度は悪化している。これは、製薬業界が抗生物質の発見から実質的に撤退したためであり（Ｐｒｏｊａｎ［２００８］Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ１３：２７９−２８０）、２０年来の薬物様特性に欠く化合物の合成ライブラリと組み合わせた標的ベースのスクリーニングの不本意な結果を大きく反映している。問題は、慢性病および生活スタイル病ではなく、急病を治療するために使用される薬物に対する少ない投資利益によっても悪化している。この潜在的に悲惨な状況から、世界保健機構は、「現在、我々は、新しい抗菌剤の発見の減少とともに薬物耐性の出現を目の当たりにしている。結果として、我々は、効果的な抗生物質がない将来の可能性に直面することになる。これは、現代医学が実践している方式を根本的に変更するであろう。」と宣言した（ＷＨＯ（２００４）Ｐｒｉｏｒｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｕｒｏｐｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ）。
【０００３】
おそらく、最も懸念されるものは、病原菌種である大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ、および他のグラム陰性桿菌細菌により生じるもの等の、グラム陰性感染である。グラム陰性細菌は、その外細胞壁が治療に使用される抗生物質、洗剤、および化学物質の大半に対してそれらを保護するため、特に懸念される。この外細胞壁は、脂質二重層からなり、８００を超える分子量の化合物を排除する選択的透過性バリアである。しかしながら、多くの小分子は、多種多様な孔により外膜を通過する。
【０００４】
結果として、多くの通常使用される抗生物質は、グラム陰性菌に対して効果的ではない。幸い、それらに対して作用するいくつかの抗生物質が存在するが、この少数の治療、および付随する乱用の危険性を伴う治療を送達するための臨床的重圧は、耐性の上昇が起こる可能性を高め、それが起きた場合の対処をより困難にする（Ｒｉｃｅ［２００９］Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：４７６−４８１）。例えば、大腸菌株は、世界的に流行性である、広域スペクトルβラクタマーゼ大腸菌［ＥＳＢＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ］と称される、大半のβラクタマーゼに対する耐性を有して出現し始めた（Ｚａｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ１０：１７２−１８０）。ＥＳＢＬ−肺炎桿菌の株も蔓延しており（Ｊａｃｏｂｙ［１９９８］Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２７：８１−８３）、これらの細菌は、カルバペネムおよびチゲサイクリン等の他の他の抗生物質に対する耐性をさらに獲得し（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ［２００９］Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：１６１１−１６１２）、それらを治療するのがきわめて困難になった。アシネトバクター・バウマンニおよび緑膿菌感染は、治療が最も困難であり、通常、ＥＳＢＬ耐性を獲得しており、非常に多くの排出ポンプ（細胞から抗生物質を除去する）を有し、かつそれらが新規耐性機構をコードする遺伝子を迅速に獲得することができる機構を有する（Ｃｒｅｓｐｏ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：５０９４−５１０１、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２：ｅ７）。状況の重要性およびその蔓延の迅速性の表れは、グラム陰性株における薬物耐性の流行を定量化するための新しい用語が必要とされることである。多剤耐性［ＭＤＲ］が、極度薬剤耐性［ＸＤＲ］に取って代わられ、この用語は、最初に結核菌感染（Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．［２００６］５５：３０１−３０５）、そして最近ではアシネトバクター・バウマンニ（Ｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：９８０−９８２）に使用された。ＭＤＲという用語は、治療選択股が非常に少ない感染を説明するために使用され、一方、汎薬剤耐性［ＰＤＲ］という用語は、全ての治療に対する感受性が著しく低下した感染を説明するために使用される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ＆Ｄｏｉ［２００７］Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５：１１７９−１１８１）。
【０００５】
薬物耐性グラム陰性感染を治療するための治療の選択股不足の反映は、コリスチン等のポリミキシン系薬物の使用への復帰である（Ｆａｌａｇａｓ＆Ｋａｓｉａｋｏｕ［２００５］Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４０：１３３３−１３４１）。ポリミキシンは、公知の毒性問題を有する薬物にも関わらず使用される（Ｎａｔｉｏｎ＆Ｌｉ［２００９］Ｃｌｉｎ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２２：５３５−５４３）。チゲサイクリンへの依存もあり（Ｈｏｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００７］Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５７：４２３−４２８）、これは、それ自体耐性を受ける（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００３］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：９７２−９７３、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ［２００９］Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．６１：ｉ２９−ｉ３６）。よって、新しい抗菌性化合物の一般的な必要性、およびグラム陰性感染に対して活性を有する抗菌剤の緊急な必要性が存在する。理想的な候補は、薬物耐性感染に対して活性を示し、重要なことには、それら自体が耐性の上昇の影響をあまり受けない。複数の新しい標的を有する抗菌剤は、これらの基準を満たすが、従来の抗生物質の供給源は、そのような分子を送達する可能性は低い（Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．［２００７］Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．６：２９−４０）。製薬会社は、ますます、抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ［２０１０］９：１７７−１７８）および核酸に基づく治療薬（Ｇｅｌｌｅｒ［２００５］Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：１０９−１１３）等の生物学的治療の可能性を探索している。
【０００６】
ＤＮＡに基づく治療は、抗生物質耐性機構をコードする遺伝子の発現を防止することによって、または必須もしくは適応遺伝子もしくはオペロンの発現を修飾することによって、または同様に毒性または病原性の発生を防止することによって成長を阻止することにより、可能性としてあらゆる病原体を治療するように設計することができるため、既存の抗菌治療の制限を克服する可能性を有する。加えて、細菌は、転写因子およびその同族結合部位の両方に影響を及ぼす同時突然変異を必要とするので、これらの薬剤に対する耐性を生じる可能性は低い。これは、特に、複数の必須遺伝子を制御する薬剤に当てはまる。代替として、遺伝子が構成的に発現されるように、遺伝子は、突然変異によって転写因子デコイ媒介性制御を回避する可能性がある。しかしながら、多数の遺伝子に同時に作用する転写因子デコイの場合、そうした遺伝子のうちの多くは、それらを構成的発現である、可能性が低いと考えられる現象に切り替えるように、突然変異を獲得することが必要になる。
【０００７】
転写因子デコイ（ＴＦＤ）は、そのようなＤＮＡに基づく治療薬である。デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子の結合部位を模倣し、後者がそれらの同族ゲノム標的に結合するのを防止するように設計されており、必然的な遺伝子発現の修飾を伴う（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ（２０００）、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」１０６：１０７１−１０７５）。
【０００８】
ＤＮＡに基づく他の治療薬としては、遺伝子治療のための導入遺伝子、アンチセンスおよびアンチジーン適用のためのオリゴヌクレオチド（Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  核酸  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：１１５−１２２）、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマー、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｓｔｕｌｌ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１２：４６５−４８３；Ｐａｔｉｌ  Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｄ．Ｊ．（２００３）ＡＡＰＳ  Ｎｅｗｓｍａｇａｚｉｎｅ  ６：２７）を含有するプラスミドがある。ＤＮＡに基づく薬物の大部分は、前臨床開発または臨床試験の初期段階にあるが、近年、化合物のクラスとしてのＴＦＤが浮上し、癌、エイズ、パーキンソン病およびアルツハイマー病等の神経疾患、ならびに心血管疾患を含む、広範囲にわたる病気の薬物治療のための極めて有望な候補をもたらしている。
【０００９】
ＴＦＤは、ＤＮＡに基づく他の治療薬を超える明白な利点を有する。それらの作用機構は単純で、かつ予測可能である。それらは、転写因子を封鎖することによって遺伝子発現を制御し、細胞を特異的結合配列の十分なコピーであふれさせることによって、後者が促進因子に結合することを防止する（したがって、「デコイ」と称される）。これは、ｍＲＮＡの複雑な二次構造のため標的を画定することが困難である、アンチセンス戦略とは対照的である。アンチセンス手法と比較すると、ＴＦＤは、アンチセンス手法が発現の結果に対処するのに対して、迅速に作用して遺伝子の発現を防止するという、さらなる利点を有する。結果として、ＴＦＤは、非常に低い濃度で効果がある。ＴＦＤと転写因子との単一の相互作用は、別の場合であればアンチセンス手法のための標的を構成する何千ものｍＲＮＡのコピーを生じさせ得る、単一の遺伝子の転写を阻止することができるからである。
【００１０】
ＴＦＤは、複数の新規標的に作用するため、抗体およびアンチセンス分子を含む、従来の抗菌剤および他の種類の生物製剤の両方を超える利点も有する。標的の新規性は、治療が現存耐性機構の影響を受けず、かつ水平方向の遺伝子導入より、耐性が病原体によって容易に獲得されないことを確実にする。それらが複数の標的（協調的調節遺伝子の組）に作用することは、標的のそれぞれで、または標的の大部分で複数の突然変異の獲得を必要とするため、耐性が上昇する可能性を大幅に低減する。
【００１１】
ＴＦＤは、転写因子の結合部位を含有する核酸である。細胞に導入されるとき、それらは、転写因子のそのゲノム標的への結合に対して競合的阻害剤として作用し、そのため、標的遺伝子の調節を修飾する。治療状況において、標的遺伝子は、病原菌で生じ、成長、環境適応、または病原性の開始に必須である。
【００１２】
細菌が成長し、動物宿主内に病気を生じさせるために必要な適応応答を制御する種類の細菌特異的転写因子の例は、代替シグマ因子である（Ｋａｚｍｉｅｃｒｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．［２００５］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｒｅｖ．６９：５２７−５４３、Ｇｒｕｂｅｒ＆Ｇｒｏｓｓ［２００３］Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４４１−４６０、Ｈｅｌｍａｎ［２００２］Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４６：４７−１００）。シグマ因子は、原核生物のＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始する。細胞は、１つの主要なハウスキーピングシグマ因子と、異なる促進因子認識特性を保有する様々な数の代替シグマ因子とを有する。細胞は、そのシグマ因子の種類から選択して、例えば応力に反応して、その転写プログラムを変更することができる。細菌において、シグマ因子は、主要なハウスキーピングシグマ因子またはハウスキーピングシグマ因子を含む大腸菌シグマ７０［σ７０］のいずれかに対する相同性に基づく２つの種類と、大腸菌シグマ５４因子（σ５４）に対する相同性を持つはるかに小さい種類とに分けることができる（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）［１９９２］Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ１２９−１７６）。いくつかのσ５４様タンパク質も、その発見が最初に窒素飢餓と関連しているため、σＮ（ｓｉｇＮ）またはＲｐｏＮとして知られる（Ｍｅｒｒｉｃｋ（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：９０３−９０９）。σ５４様タンパク質は、転写開始のための別個の機構を有する、最も系統学的に異なるシグマ因子であり（Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．［２０００］Ｊ．Ｂａｃ．１８２：４１２９−４１３６）、それらは全てのグラム陰性細菌を通して広範に分布するが、数個から数十のσ７０タンパク質の相同分子種が存在する一方で、それらは、通常、単一の相同分子種に限定される（Ｇｒｕｂｅｒ＆Ｇｒｏｓｓ［２００３］Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４４１−４６０）。σ７０様シグマ因子は、−３５／−１０配列と称される、転写開始部位から３５および１０ヌクレオチド上流に集中する保存要素を伴う促進因子配列を認識する（Ｔｈｏｎｙ＆Ｈｅｎｎｅｃｋｅ［１９８９］ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４１−３５８）。σ５４様タンパク質は、−２４／−１２配列と称される、転写開始部位から約２４および１２ヌクレオチド上流に位置する保存要素を認識する（Ｂａｒｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．［１９９９］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４３０５−４３１５）。細菌遺伝子の大部分は、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子の全てを含む、−３５／−１０コンセンサスの制御下にある。これらの遺伝子は、したがって、誘発され、かつ成長に必須である、または病原性に必要である遺伝子に最適に作用するＴＦＤによる調節の理想的な候補ではない。したがって、−２４／−１２調節配列を認識するシグマ因子によって制御されるような遺伝子が好ましい。病原菌におけるこれらのσ５４様タンパク質の例は、Ｍｅｒｒｉｃｋ［１９９３］Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：９０３−９０９に示される。
【００１３】
選択された病原菌における応力反応の媒介に関係する代替シグマ因子の遺伝的欠失は、動物モデルにおいて、成長低下、生存能低下、および低感染率をもたらすことが示され、緑膿菌からのｒｐｏＮの欠失は、マウスモデルにおいて毒性の減少をもたらし（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ［２００１］Ｊ．Ｂａｃ．１８３：７１２６−７１３４）、ＲｐｏＮコレラ菌突然変異体は、マウス幼仔競合モデルにおいて毒性が低く（Ｋｌｏｓｅ＆Ｍｅｋａｌａｎｏｓ［１９９８］Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：５０１−５２０）、鞭毛形成に必要な毒性遺伝子は、ヘリコバクター・ピロリのＲｐｏＮによって調節され（Ｎｉｅｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．５２：９４７−９６１）、遺伝子研究は、大腸菌において、ＲｐｏＮが応力および毒性に対する重要な調節因子であることを明らかにしている（Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２０１０］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６：５０１−５２０）。
【００１４】
この背景に対して、本発明が考案された。特に、本発明は、細菌代替シグマ５４因子またはその変異体もしくは類似体の結合部位の全てまたは一部をコードする配列を含むデコイ核酸配列に属する。本発明のデコイ配列は、一般に、転写因子デコイ（ＴＦＤ）と称される。細菌代替シグマ５４因子という用語は、σＮ（ｓｉｇＮ）またはＲｐｏＮとしても知られるシグマ因子を指す。３つの用語は、同じ実体を意味するように本明細書全体を通して互換的に使用される。
【００１５】
理想的には、デコイ配列は、細菌の１つ以上の株、好ましくは、大腸菌、緑膿菌、および肺炎桿菌等のグラム陰性細菌の１つ以上の株に由来する。
【００１６】
適切なデコイコンセンサス配列の例は、配列番号２（大腸菌）、配列番号８（緑膿菌）、配列番号１４（肺炎桿菌）、および配列番号２０に提供されている。
【００１７】
特異的な細菌代替シグマ５４因子の結合部位配列を含むＴＦＤは、配列番号１ならびに配列番号３および４（大腸菌）、配列番号７ならびに配列番号９および１０（緑膿菌）、配列番号１３ならびに配列番号１５および１６  １４（肺炎桿菌）、ならびに配列番号２１および２２に提示される配列を含む。
【００１８】
理論に拘束されるものではないが、トランスフェクションのプロセス、すなわち、ＴＦＤの膜を通した細菌細胞中への送達は、それ自体が、ＴＦＤによって遮断されると細胞死をもたらすσ５４媒介応力反応を刺激すると考えられている。グラム陰性病原体の場合において、σ５４結合のコンセンサス配列は高度に保存され、発明者は、単一配列が大腸菌および緑膿菌の両方を効果的に死滅させることを発見し、広域スペクトルグラム陰性の抗菌剤としてのＴＦＤ治療の開発の見通しを提起した。
【００１９】
細菌は応力が加えられると、従来の抗生物質および抗菌性化合物の活性の影響をはるかに多く受けやすくなる。実際、抗生物質を用いた病原体の治療は、応力反応を引き起こし（Ｋｏｈａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［２００７］Ｃｅｌｌ１３０：７９７−８１０）、応力反応を阻害するＴＦＤが抗生物質の作用を増強し、以前の耐性株に対するこれらの従来の化合物の有効性を回復させるように組み合わせて使用することができる可能性を提起する（Ｄｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：４８２−４８９）。よって、本発明は、抗生物質および／または抗微生物性化合物と組み合わせた上述のＴＦＤの使用を包含する。
【００２０】
応力反応遺伝子は、細胞適応遺伝子の種類を形成する。これらは、遺伝子の組の数を制限し、その全てまたはいくつかは、広範囲の応力に応えて誘発される。応力は、物理的因子（温度変化、酸性度、低酸素）、生物的因子（宿主または他の細菌に応えて）、および化学的因子（抗生物質を用いた治療等）を含み得る。
【００２１】
別の態様において、本発明のＴＦＤは、一般に、抗生物質の有効性を増加するのに適している。これは、静菌性および殺菌性抗生物質の両方を含む。
【００２２】
殺菌性抗生物質の例としては、以下が挙げられる。
β−ラクタム
（ａ）ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリン等）
（ｂ）カルバペネム（メロペネム等）
（ｃ）モノバクタム
（ｄ）セファロスポリン（セフェピム等）
第一世代：セファセトリル（Ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（Ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ）、Ｄｕｒｉｃｅｆ）。セファレキシン（Ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）（セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）、Ｋｅｆｌｅｘ）、セファログリシン（Ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（Ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（セファロラジン）、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）、Ｋｅｆｌｉｎ）、セファピリン（Ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ）、Ｃｅｆａｄｒｙｌ）、セファトリジン、セファザフルル、セファゼドン、セファゾリン（Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、Ａｎｃｅｆ、Ｋｅｆｚｏｌ）、セフラジン（Ｃｅｆｒａｄｉｎｅ）（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）、Ｖｅｌｏｓｅｆ）、セフロキサジン、セフテゾール、
第二世代：セファクロル（Ｃｅｃｌｏｒ、Ｄｉｓｔａｃｌｏｒ、Ｋｅｆｌｏｒ、Ｒａｎｉｃｌｏｒ）、セフォニシド（Ｍｏｎｏｃｉｄ）、セフプロジル（セフプロキシル、Ｃｅｆｚｉｌ）、セフロキシム（Ｚｉｎｎａｔ、Ｚｉｎａｃｅｆ、Ｃｅｆｔｉｎ、Ｂｉｏｆｕｒｏｋｓｙｍ）、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタン、セフォキシチン、カルバセフェム：ロラカルベフ（ロラビド）、セファマイシン：セフブペラゾン、セフメタゾール（ゼファゾン）、セフミノックス、セフォテタン（セフォタン）、セフォキシチン（メフォキシン）、
第三世代：セフカペン、セフダロキシム、セフジニル（Ｏｍｎｉｃｅｆ）、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム（Ｓｕｐｒａｘ）、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム（Ｃｌａｆｏｒａｎ）、セフピミゾール、セフポドキシム（Ｖａｎｔｉｎ、ＰＥＣＥＦ）、セフテラム、セフチブテン（Ｃｅｄａｘ）、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム（Ｃｅｆｉｚｏｘ）、セフトリアキソン（Ｒｏｃｅｐｈｉｎ）、セフォペラゾン（Ｃｅｆｏｂｉｄ）、セフタジディム（Ｆｏｒｔｕｍ、Ｆｏｒｔａｚ）、オキサセフェム：ラタモキセフ（モキサラクタム）、
第４世代：セフクリジン、セフェピム（Ｍａｘｉｐｉｍｅ）、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、オキサセフェム：フロモキセフ
まだ分類されていないもの：セフトビプロール、セファクロメジン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォベシン、セフォキサゾール、セフロチル、セフスマイド、セフタロリン、セフチオキシド、セフラセチム
【００２３】
アミノグリコシド系：
（ａ）アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、
（ｂ）アントラサイクリン、例えばドキソルビシン
【００２４】
キノロン系：
（ａ）第一世代：シノキサシン、フルメキン、ナリジクス酸、オキソリニン酸、ピペミド酸、ピロミド酸、ロソクサシン
（ｂ）フルオロキノロン系：
１）第二世代：シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン
２）第三世代：バロフロキサシン（Ｂａｌｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン
３）第四世代：ベシフロキサシン、クリナフロキサシン、ガレノキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン／アラトロフロキサシン、プルリフロキサシン
４）獣医学：ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エンロフロキサシン、イバフロキサシン、マルボフロキサシン、オルビフロキサシン、プラドフロキサシン、サラフロキサシン
【００２５】
グリコペプチド抗生物質：
バンコマイシン、テイコプラニン、テラバンシン、ブレオマイシン、ラモプラニン、ダプトマイシン、デカプラニン、およびダルババンシン。
【００２６】
ペプチド抗生物質：
（ａ）ランチビオティック系；
ズラマイシン（Ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）、ナイシン、エピデルミン、アクタガルジン、ミクロビスポリシン、およびメルサシジン、
（ｂ）リポペプチド系；
キュビシン、ポリミキシンＢ、および変異体
ストレプトグラミン系：
キヌプリスチン＋ダルホプリスチン（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ（登録商標））。
【００２７】
他の例としては、キノリン系（レバキン（ｌｅｖａｑｕｉｎ）等）、スルホンアミド系（バクトリム等）、テトラサイクリン系（テトラサイクリン等）、ならびに様々なクロラムフェニコール、リファンピシン、およびＺｙｖｏｘとして知られる種類の抗生物質が挙げられる。
【００２８】
しかしながら、デコイすなわち本発明は、マクロライド、ケトライド、テトラサイクリン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン）、オキサゾリジノン（リネゾリド）等の静菌性抗生物質の効果を増加させるために使用されてもよい。
【００２９】
一態様において、細胞における応力反応の抑制を生じる、または細胞に応力を生じさせるデコイ配列は、殺菌性抗生物質の効果を増強するのに特に適している。
【００３０】
本発明のデコイ核酸配列は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列であり得る。オリゴヌクレオチド配列は、概して、リン酸ジエステル結合によって接合された最高２０個のヌクレオチドの線状配列として認識されている一方で、ポリヌクレオチド配列は、典型的に、２０個を超えるヌクレオチドを有し、様々な量の内部折り畳みを伴う１本鎖または２本鎖であってもよい。また、主鎖は、分子の電荷を低減するか、または生体液中でのその安定性を増加させることが既知の合成化学を組み込むように修飾されてもよい。これらの例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、連結核酸（ＬＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
本明細書で提供される配列は、１本鎖の結合部位を例証する。しかしながら、自然の、および本発明のＴＦＤでは、配列は、２本鎖であることが理解されるであろう。本明細書に列挙される配列に対する相補鎖は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），２００１から明確かつ容易に導き出すことが可能である。
【００３２】
本発明のデコイは、同時係属出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３号に記載されるような方法等の、あらゆる適切な方法によって調製され得る。
【００３３】
例えば、亜鈴型は、線状オリゴヌクレオチドとして調製され、次いでＴ４リガーゼで結紮され得る。代替として、亜鈴型デコイは、適切なプライマーを使用して、ＰＣＲによって調製され得る。各プライマーは、一般に、亜鈴型構造のステムループを形成する一部分を含有する。プライマーを使用するＰＣＲ増幅に続いて、典型的には、増幅生成物の制限消化および結紮を行い、閉環亜鈴型を形成する。
【００３４】
代替として、亜鈴型は、プラスミドの制限消化によって調製され得る。消化に続いて結紮を行い、閉環亜鈴型構造を形成する。
【００３５】
デコイ配列は、デコイ機能を保持する天然もしくはコンセンサス結合配列の変異体または類似体を含んでもよい。変異体または類似体は、例えば親配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドを変更することによって調製され得る。例えば、フットプリント実験は、特定のヌクレオチドが転写因子結合にあまり重要ではなく、変更される場合があることを示してもよい。
【００３６】
推定上のデコイ配列は、デコイ配列を含むデコイポリヌクレオチドを適切な宿主細胞の中に導入することによって、所与の転写因子結合部位と競合する能力が試験され得る。宿主細胞は、発現が例えば表現型の変化についてのスクリーニングによって直接的または間接的に判定され得る単一の遺伝子または複数の遺伝子に操作可能に連結される、標的転写因子結合部位を含む。試験配列のデコイ機能は、遺伝子（複数可）の発現の変化、または表現型の変化についてスクリーニングすることによって判定され得る。適切なデコイ配列を試験および調査するための方法は、同時係属出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３号に記載されている。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、デコイ核酸配列および１つ以上の送達部分を含む抗菌性複合体に属し、デコイ核酸配列は、細菌代替シグマ５４因子結合部位、またはその変異体もしくは類似体の全てもしくは一部をコードする配列を含む。
【００３８】
前記のように、デコイは、細菌の１つ以上の株、好ましくは、大腸菌、緑膿菌、および肺炎桿菌等のグラム陰性細菌の１つ以上の株に由来する配列を含むことができる。
【００３９】
適切なデコイコンセンサス配列の例は、配列番号２（大腸菌）、配列番号８（緑膿菌）、配列番号１４（肺炎桿菌）、および配列番号２０に提供される。
【００４０】
特定の細菌代替シグマ５４因子配列の結合部位配列を含むＴＦＤは、配列番号１ならびに配列番号３および４（大腸菌）、配列番号７ならびに配列番号９および１０（緑膿菌）、配列番号１３ならびに配列番号１５および１６（肺炎桿菌）、ならびに配列番号２１および２２に記述される配列を含む。
【００４１】
発明者らは、自らの能力で何らかの抗菌性活性を有する送達部分が理想的であることを見出した。具体的には、単一または複数の送達部分は、核酸配列と組み合わせた時に、相乗効果的な抗菌効果を示すはずである。換言すれば、送達部分および核酸配列の組み合わせは、核酸配列または送達部分単独の効果と比較した時に、強化された抗菌効果を示すはずである。
【００４２】
好ましい実施形態では、送達部分は第四級アミン化合物ならびにビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体から選択されてもよく、「アミノアルカン」という用語は、本明細書で使用される場合、複素環式環の一部を形成するアミノ基（好ましくは、第三級アミノ基）を指す。
【００４３】
例示的なそのような化合物は、式（Ｉ）の化合物であり、
【００４４】
【化１】
2013523111.tif 000003
式中、Ｑは、
（ａ）式
【００４５】
【化２】
2013523111.tif 000004
を有する、Ｑ１基、および
（ｂ）Ｑ２、Ｑ２−ＮＨ−、Ｑ２−Ｏ−、またはＱ２−Ｓ−基から選択され、式中、Ｑ２は、５個〜１４個の環員の単環式、二環式、および三環式複素環芳香族基から選択され、そのうちの１個、２個、または３個は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であるが、少なくとも１つの窒素環員が存在することを条件とし、複素芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ａによって随意に置換され、１個の窒素環員は、Ｎ−オキシドを形成してもよく、またはＣ１−４アルキル、フェニル−Ｃ１−４アルキル、またはジ−フェニル−Ｃ１−４アルキルで置換されて第四級基を形成してもよく、フェニル部分は、いずれの場合においても、１個または２個のハロゲン、メチル、またはメトキシ基で随意に置換され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０または１であり、
ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
ｎが１である時、Ｒ０、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれＣ１−４アルキルから選択され、ｎが０である時、Ｎ、Ｒ１、およびＲ２は、共に５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成し、そのうちの１個は、窒素原子Ｎであり、０、１、または２個はさらに、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であり、複素環芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ｂによって随意に置換され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、それぞれが１個または２個の置換基Ｒ４ｃによって随意に置換された３個〜７個の環員の単環式炭素環式基、Ｑ基、−ＮＨ−Ｑ２基、−Ｏ−Ｑ２基、および−Ｓ−Ｑ２基から選択され、
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｃは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシル基；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択される。
【００４６】
好ましい一実施形態では、Ｑは、Ｑ１基である。
【００４７】
【化３】
2013523111.tif 000005
【００４８】
したがって、式（Ｉ）内の１つの好ましい下位化合物群は、式（ＩＩ）によって表され、
【００４９】
【化４】
2013523111.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｐ、Ａ、ｑ、およびＲ３は、式（Ｉ）に記載の通りである。
【００５０】
式（ＩＩ）内の１つの好ましい下位化合物群（Ｒ３は、Ｑ１であり、ｎは、いずれの場合でも０である）は、式（ＩＩＩ）によって表すことができ、
【００５１】
【化５】
2013523111.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｐ、Ａ、およびｑは、式（Ｉ）に記載の通りである。
【００５２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物では、ｍが１である時、窒素原子Ｎは第四級窒素でなければならない。故に、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物（式中、ｍは、１である）は、対イオンとして、例えば、鉱酸、スルホン酸、およびカルボン酸から誘導されるアニオンといった、１つ以上のアニオンを含むことになる。
【００５３】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２は、ともに５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成する時、典型的に、該基は通常、唯一のヘテロ原子環員としての窒素原子Ｎを含有するか、またはＮ、Ｏ、およびＳから選択される第２のヘテロ原子環員を含有する。
【００５４】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２が、共に単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成する時、窒素原子Ｎは、芳香族環の一部を形成する。好ましい複素環芳香族基は、単環式芳香族環；どちらの環も芳香族である二環式複素環式環；１つの窒素含有環が芳香族であり、かつ他の環が非芳香族である二環式複素環式環；および窒素含有環を含む２つの環が芳香族であり、かつ他の環が非芳香族である三環式環である。
【００５５】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２が、共に５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環基を形成する時、複素環基は、好ましくは、キノリン；イソキノリン；アクリジン；テトラヒドロアクリジンおよびその環同族体；ピリジン；ベンゾイミダゾール；ベンゾキサゾール；およびベンゾチアゾールから選択される。テトラヒドロアクリジンの環同族体は、化合物が以下のコア構造を含有していることを意味し、
【００５６】
【化６】
2013523111.tif 000008
式中、ｙは、１または３である。テトラヒドロアクリジンは、化合物が、上記のコア構造を有し、式中、ｙが２である化合物を意味する。
【００５７】
好ましい実施形態では、送達部分は、キノリンまたはアクリジン、具体的には、１，２，３，４−テトラ−ヒドロ−９−アミノ−アクリジンの第四級誘導体である。１，２，３，４−テトラ−ヒドロ−９−アミノ−アクリジンの好適な誘導体は、米国特許第ＵＳ３５１９６３１号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。特に興味深いのは、米国特許第３５１９６３１号の実施例１７〜２５に例示される化合物ならびに式およびその類似体、ならびに同時係属出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０５０２６３号である。好適なキノリン誘導体は、デカリニウムおよびその類似体等のビスキノリニウム化合物である。
【００５８】
デカリニウム（図１）は、ビスキノリニウム化合物であり、穏やかな抗微生物性を有し、３０年にわたって、市販のうがい薬、局所軟膏、経口および膣ペイント、ならびに咽喉炎錠剤中の抗微生物剤として使用されてきた。さらに、局所静菌剤であり、カルシウムチャネルの阻害因子、抗真菌薬剤（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１５：３４２２−３４２９）、結核の阻害因子（Ｇｕｉｔｅｒｒｅｚ−Ｌｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：６４３−６５２）、およびプロテインキナーゼＣの阻害因子（ＰＫＣ；Ａｂｅｙｗｉｃｋｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１４：７７９６−７８０３）としても試験が行われてきた。
【００５９】
また、ＤＮＡに基づく治療薬およびｐａｘｃｉｔｏｌ等の従来の薬物をインビトロの実験でミトコンドリアに送達するために、デカリニウムが使用されてきた。これらの実験では、デカリニウムは、乾燥膜法によってボラソームとして調製された。すなわち、デカリニウムは、メタノール等の有機溶媒中に溶解し、真空中で完全に乾燥し、そして、水性溶液中に再懸濁し、その後、超音波振動処理してボラソームを形成し、続いて、ＤＮＡと混合して複合体を形成する。これらの複合体は、ミトコンドリアの外膜を伴う複合体の融合を含むと考えられる機構によって、ＤＮＡをミトコンドリアに送達することが可能であることが示されている（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ２００１  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４９：１２７−１４９；Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ７５：４０１−４０８）。ミトコンドリアの膜構造は、細菌の中に起こるものと同一ではないが、類似している。これは、インビボ設定で細菌に治療薬を送達するのにデカリニウムが好適であり得るという可能性を高める。しかしながら、デカリニウムとともに形成した複合体は、生理学的バッファおよび生体液の存在下で、希釈に対して経時的に不安定である。
【００６０】
したがって、特に好ましい一実施態様では、複合体は、デカリニウム類似体を含む。このようにして、（希釈および塩の存在の双方に対して）強化された安定性を有しながら、さらにデカリニウムに類似したまたは改善された毒性プロファイルを有する、デカリニウム化合物を設計することが可能である。そのような類似体は、蛍光染料ＳＹＢＲグリーンを除外してＤＮＡを結合する能力、動的光散乱法で測定し電子顕微鏡法で視覚化した時の、形成された粒子のサイズ、ならびに高濃度の塩、希釈、および長期間にわたる貯蔵におけるそれらの安定性等の（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１：９１−９６）、種々の生理化学的パラメータによって試験を行った時に、より安定した複合体を形成することが説明されている（化合物７、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３５：３５３６−３５４６］）。
【００６１】
デカリニウムおよびその類似体の例は、式（ＩＶ）の化合物であり、
【００６２】
【化７】
2013523111.tif 000009
式中、
ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ハロゲン、フェニル部分が１個または２個のメトキシ、メチル、もしくはハロゲン置換基で随意に置換されたフェニル−Ｃ１−２アルキル、ウレイドおよびグアニジニルから選択されるか、またはＲ９およびＲ１０は、一緒に連結して、ｗが３〜５であるアルキレン鎖（ＣＨ２）ｗを形成し、かつＲ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ハロゲン、フェニル部分が１個または２個のメトキシ、メチル、もしくはハロゲン置換基で随意に置換されたフェニル−Ｃ１−２アルキル、ウレイドおよびグアニジニルから選択されるか、またはＲ９ａおよびＲ１０ａは、一緒に連結して、ｗが３〜５であるアルキレン鎖（ＣＨ２）ｗを形成する。
【００６３】
式（ＩＶ）内では、化合物の１つのサブセットは、Ａが、結合であるか、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基であるか、またはＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基である、サブセットである。このサブセット内で、好ましくは、Ａは、結合である。すなわち、２つのキノリン環の窒素原子間に延在する、飽和アルキレン鎖がある。
【００６４】
Ａが結合である時に、典型的に、ｐおよびｑの合計は、３〜２２の範囲であり、好ましくは６〜２０の範囲であり、より好ましくは、８〜１８の範囲である。特定の例は、ｐ＋ｑ＝８、ｐ＋ｑ＝９、ｐ＋ｑ＝１０、ｐ＋ｑ＝１１、ｐ＋ｑ＝１２、ｐ＋ｑ＝１３、ｐ＋ｑ＝１４、ｐ＋ｑ＝１５、ｐ＋ｑ＝１６、ｐ＋ｑ＝１７、またはｐ＋ｑ＝１８である。
【００６５】
前述の実施形態および化合物のサブセットのそれぞれにおいて、Ｒ８およびＲ８ａは、好ましくは、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、およびグアニジニルから選択される。
【００６６】
より好ましくは、Ｒ８およびＲ８ａは、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、およびグアニジニルから選択される。
【００６７】
さらに好ましくは、Ｒ８およびＲ８ａは、それぞれメトキシおよびアミノから選択される。
【００６８】
一実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもアミノである。
【００６９】
別の実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもメトキシである。
【００７０】
別の実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもグアニジニルである。
【００７１】
前述の実施形態および化合物のサブセットのそれぞれにおいて、好ましくは、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、
または、Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００７２】
より好ましくは、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、
または、Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００７３】
式（ＩＶ）内の１つの特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、およびグアニジニルから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００７４】
式（ＩＶ）内の別の特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、グアニジニルであり、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００７５】
式（ＩＶ）内の別の特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、およびアミノから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００７６】
この群内のより好ましい化合物は、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、メトキシ、およびアミノから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、または
Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する、化合物である。
【００７７】
式（ＩＶ）内では、１つの好ましい化合物群は、式（Ｖ）によって表されてもよく、
【００７８】
【化８】
2013523111.tif 000010
式中、
ｒは、２〜２４の整数であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ハロゲン、フェニル部分が１個または２個のメトキシ、メチル、もしくはハロゲン置換基で随意に置換されたフェニル−Ｃ１−２アルキル、ウレイドおよびグアニジニルから選択されるか、またはＲ９およびＲ１０は、一緒に連結して、ｗが３〜５であるアルキレン鎖（ＣＨ２）ｗを形成し、かつＲ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、ハロゲン、フェニル部分が１個または２個のメトキシ、メチル、もしくはハロゲン置換基で随意に置換されたフェニル−Ｃ１−２アルキル、ウレイドおよびグアニジニルから選択されるか、またはＲ９ａおよびＲ１０ａは、一緒に連結して、ｗが３〜５であるアルキレン鎖（ＣＨ２）ｗを形成するが、
但し、
（ｉ）Ｒ１０およびＲ１０ａがどちらもハロゲンであるか、もしくはどちらもメチルであり、かつＲ９およびＲ９ａがどちらも水素である時に、Ｒ８およびＲ８ａのうちの少なくとも１つが水素、アミノ、もしくはジメチルアミノ以外であること、または
（ｉｉ）Ｒ９およびＲ１０が共に連結し、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（ｗは、４である）を形成し、かつＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結し、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（ｗは、４である）を形成する時に、Ｒ８およびＲ８ａの少なくとも１つはアミノ以外であることを条件とする。
【００７９】
好ましくは、ｒは、８〜２０の整数、より好ましくは、１０〜１８の整数であり、例えば、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８のいずれか１つの整数である。
【００８０】
式（Ｖ）内の１つの化合物群では、Ｒ８およびＲ８ａは、メトキシおよびグアニジニルから選択される。この化合物群内で、Ｒ９およびＲ９ａは、典型的に、どちらも水素であり、Ｒ１０およびＲ１０ａは、典型的に、水素、メチル、トリフルオロメチル、およびアミノから選択される。
【００８１】
式（Ｖ）内の別の化合物群では、Ｒ８およびＲ８ａは、水素、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、メトキシ、ならびにグアニジニルから選択され、Ｒ９およびＲ９ａは、どちらも水素であり、Ｒ１０およびＲ１０ａは、どちらもトリフルオロメチルである。
【００８２】
例えば、類似体は、１０，１０´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライド（図２）であってもよい。この化合物は、Ｇａｌａｎａｋｉｓ他ではカルシウムチャネルの潜在的阻害因子として調査されていたが、そこでの元の表記（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３５：３５３６−３５４６）から、本明細書では化合物７を指す。化合物は、その後、ＤＮＡ治療薬のミトコンドリアへの送達のための薬剤として試験が行われ（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１１：９１−９６）、その刊行物では、化合物７の類似体によって形成される複合体の有利な安定性が報告されている。さらなる論文（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）は、化合物７の類似体が、デカリニウムと比較して、インビトロでより低い毒性を有することを報告している。
【００８３】
より長いアルキル鎖を伴うデカリニウムの類似体が、さらに低い毒性を示したので、異なる鎖長さを伴う類似体が検討された（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）。したがって、好ましくは、デカリニウム類似体のアルキル鎖は、８個〜１４個のメチル基を有するが、アルキル鎖の中に、３個のメチル基しか含有しない鎖（Ｇａｌａｎｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３５９２−３５９５）、および３６個ものメチル基を含有する他の脂溶性カチオン（Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９：４０６３−４０６７）の例がある。より好ましくは、アルキル鎖は、１０個または１２個のメチル基を有する。結果として、化合物７の類似体は、化合物７＿１２（１０，１０’−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライド（図３））と称されるアルキル鎖の中に１２個のメチル基を用いて設計された。
【００８４】
デカリニウムの他の好適な類似体には、以下が挙げられる：
１−デカニル−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１−ブチル−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１，１，１−トリエチル−１−（１０−ヨードデカン−１−イル）アンモニウムヨージド
１−［１−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム−１−イル）−２−メチル−４−アミノキノリニウムジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノピリジニウム）ジヨージド
１−（４−ペンチン−１−イル）−４−アミノピリジニウムクロライド
１，１´−（デカ−４，６−ジイン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノピリジニウム）ジクロライドデハイドレート
２，２´−Ｎ，Ｎ−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２，４−ジアミノピリジン）［化合物８］
２，２´−Ｎ，Ｎ−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−アミノピリジン）
２，２´−Ｎ，Ｎ´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチル−２−アミノピリジニウム）ジヨージド
１−（４−ペンチン−１−イル）−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１，１´−（デカ−４，６−ジイン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノ−２−メチルキノリニウム）ジヨージドハイドレート
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（キノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジブロマイドハイドレート
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（キノリン）
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチルキノリニウム）ジヨージドハイドレート
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−メトキシキノリン）
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチル−４−メトキシキノリニウム）ジヨージド
２，２´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（１−メチルキノリニウム）ジヨージド
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（イソキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−ブロモイソキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１Ｈ−ベンゾイミダゾール）
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（３−メチルベンゾイミダゾリウム）ジヨージドヘミハイドレート
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−メチルベンゾイミダゾール）
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２，３−ジメチルベンゾイミダゾリウム）ジヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（アクリジン−９−イル）アミノ］デカンジヒドロクロリドジハイドレート
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−アミノキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−Ｎ，Ｎ，ジメチルアミノキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［キノリニウム］ジヨージド
１，６−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−２−メチル）アミノ］ヘキサンジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［１−アミノイソキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルベンゾオキサゾリウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルベンゾチアゾリウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−アミノ−１−メチルベンゾイミダゾリウム］ジヨージド
１，１´−［（Ｅ）−５−デセン−１，１０−ジイル］ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−［（Ｚ）−５−デセン−１，１０−ジイル］ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１２−ドデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１４−テトラデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１６−ヘキサデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
Ｎ−デシル−４−アミノキナルジニウムヨージド
１，１´−［ビフェニル−３，３´−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）
ジブロマイドハイドレート（４）、１，１´−［ビフェニル−４，４´−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジトリフルオロアセテート
１，１´−（フェナントレン−３，６−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレートエタノエート
１，１´−［フルオレン−２，７−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジトリフルオロアセテート
１，１´−［メチレンビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［エチレンビス−（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
（Ｚ）−１，１´−［スチルベン−４，４´−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドセスキハイドレート
（Ｅ）−１，１´−［スチルベン−４，４´−ジイルビス（メチレン）］ビス−（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドジハイドレート
１，１´−［エチン−１，２−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドセスキハイドレート
１，１´−［プロパン−１，３−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレートエタノエート
１，１´−［ピリジン−２，６−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［ブタン−１，４−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス−（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［１，１：４´，１´´−テルフェニル−４，４´´−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドトリハイドレート
１，１´−［ナフタレン−２，６−ジイル（ビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［ベンゼン−１，４−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドジハイドレート
１，１´−［ベンゼン−１，３−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレート
１，１´−（プロパン−１，３−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ブタン−１，４−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ペンタン−１，５−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ヘキサン−１，６−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（オクタン−１，８−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレート
１，１０−ビス［Ｎ−（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］デカン
１，１２−ビス［Ｎ−（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］ドデカン
１，１０−ビス［（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］デカン
１，１２−ビス［（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］ドデカン
１，１０−ビス（Ｎ−キノリン−４−イルアミノ）デカン
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（オキシ）］ビス［キノリン］
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（チオ）］ビス［キノリン］
４，４´−ドデカン−１，１２−ジイルビス［キノリン］
１，８−ビス（Ｎ−キノリン−４−イルジアミノ）オクタン
１，８−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］オクタンジヨージドハイドレート
１，１０−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンジヨージド
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（オキシ）］ビス［１−メチルキノリニウム］ジヨージド
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（チオ）］ビス［１−メチルキノリニウム］ジヨージドハイドレート（１０）。
１，１´−ジメチル−４，４´−ドデカン−１，１２−ジイルビス［キノリニウム］ジヨージド
４，４´−デカン−１，１０−ジイルビス［キノリン］
１，１´−ジメチル−４，４´−デカン−１，１０−ジイルビス［キノリニウム］ジヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（１−ベンジルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンジブロマイド
１，１０−ビス［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−デカンビス（トリフルオロアセテート）
１，１２−ビス［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−ドデカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−１０−［Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−１２−（Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］ドデカンビス（トリフルオロアセテート）−３，５−ジメトキシベンジルヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−［１−（３，５−ジメトキシベンジル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−［１−（３，５−ジメトキシベンジル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］−１０−［Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカン
ビス（トリフルオロアセテート）
１，１´−（３−ヨードプロピリデン）ビス［ベンゼン］
１，１０−ビス［Ｎ−［１−（３，３−ジフェニルプロプ−１−イル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］デカン
ビス（トリフルオロアセテート）
４，７−ジクロロ−１−メチルキノリニウムヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（７−クロロ−１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−デカンジヨージドジハイドレート
１０，１０´−（オクタン−１，８−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド
１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド
１０，１０´−（テトラデカン−１，１４−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド
１０，１０´−（オクタデカン−１，１８−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド
５，５´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（１１−アミノ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロヘプタ［ｂ］キノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−メトキシキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−アミノキノリニウム）ジヨージド。
【００８５】
デカリニウムおよびその塩は、例えば（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販されている。好適な類似体を作製する方法は、ＷＯ  ９７／４８７０５、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：５９５−６０６、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：３５３６−３５４６、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３５９２−３５９５、Ａｂｅｙｗｉｃｋｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１４：７７９６−７８０３、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１４１３−１４１７、およびＣａｍｐｏｓ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４２４７−４２５４に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。特に、化合物７の合成は、上記Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）に記載されており、化合物７＿１２の合成は、そこから誘導されてもよい。
【００８６】
式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物は、上記に記載および参照されるようなデカリニウムを調製するための既知の方法に類似した方法によって調製されてもよい。
【００８７】
例えば、式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物は、式（ＶＩ）
【００８８】
【化９】
2013523111.tif 000011
のキノリン化合物を式Ｉ−（ＣＨ２）ｒ−Ｉの化合物と反応させることによって調製され得る。反応は、典型的に、例えば、１２０℃〜１６０℃の範囲、例えば約１５０℃の高温で実行される。
【００８９】
式（ＶＩ）のキノリン化合物は、商業的に入手可能であるか、または当業者に周知の標準方法またはその類似する方法によって作製され得、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１−８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｅｒｅｍｉａｈ  Ｐ．Ｆｒｅｅｍａｎ  （ＩＳＢＮ：０−４７１−３１１９２−８），１９９５、Ｆｉｅｓｅｒｓ’Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１−１７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｙ  Ｆｉｅｓｅｒ（ＩＳＢＮ：０−４７１−５８２８３−２）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１０を参照のこと。
【００９０】
式（ＶＩ）の化合物（式中、Ｒ８は、アミノであり、Ｒ９およびＲ１０は、ともに連結してアルキレン鎖（ＣＨ２）Ｗを形成する）は、以下の反応順序によって調製することができる。
【００９１】
アミノ基は、次いで、標準的な方法、例えば、ジアゾ化とその後のザントマイヤー反応とによって、他の官能基に変換されてもよい。
【００９２】
ＴＦＤは、ナノモル濃度で効果的であり、１ｎＭという低濃度においてインビトロおよびインビボで細菌の成長を防止するのに有効であったが、特定の細菌に対して、および患者等のより複雑な設定では、より高い濃度が必要になり得ると予想される。よって、好ましい範囲は、したがって、約１０〜１００ｎＭの間、および最高で約１μΜである。該範囲は、２０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、およびその中間（例えば、２７．２ｎＭ）等の、約１０ｎＭ〜１μΜの間の濃度を含むことが理解されるであろう。
【００９３】
送達部分が、デカリニウムまたはその類似体等の式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１つの化合物である場合、複合体は、どちらも異なる比率を使用して、核酸と化合物（例えば、デカリニウムまたはその類似体）との間に形成される。該比率は、一般的に、Ｎ／Ｐ比と称され（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ８：３４９３−３５０２を参照されたい）、核酸の中の負に帯電したリン酸塩原子１個あたりの、またはいかなるリン酸塩原子も存在しない時はヌクレオチド１個あたりの、送達分子の中の正に帯電した窒素原子の数を画定する。典型的に、複合体は、０．１〜１の間のＮ／Ｐ比（電荷中和を達成するのに十分である）で、化合物とＴＦＤとの間に形成される。本発明は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、およびその中間（例えば、０．２３）等の、０．１〜１の間の比率を含むことが理解されるであろう。
【００９４】
細菌をインビトロでトランスフェクションさせることが可能な複合体は、動物実験では良好な耐容性を示す。さらに、そのような複合体の成分は、既知の最大耐量（ＭＴＤ）を下回る濃度で使用されてもよい。最大耐量（ＭＴＤ）は、明白な毒性を生じない最高１日用量である。ＭＩＣは、一群の試験動物に投与された時に、長期生存性に関していかなる測定可能な影響も有しない化合物の量として、動物実験によって推定することができる。例えば、Ｎ／Ｐ比が１である１μΜの１００のヌクレオチドＴＦＤを含有する複合体を投与することは、約３ｍｇ／ｋｇのデカリニウム類似体の用量を与える。このデカリニウム類似体の用量は、実質的に、デカリニウムのＭＴＤを下回ることが理解されるであろう。化合物７等のデカリニウムの類似体は、デカリニウムより少ないインビトロでの毒性を示す（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）。デカリニウムは、マウスでは、１５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを有するので（Ｇａｍｂｏａ−Ｖｕｊｉｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８２：２３１−２３５）、複合体が、良好な耐容性を示すことが予測される。好適な濃度を算出して、調製することは、当業者の相応な技術および知識の範囲内である。
【００９５】
代替の実施形態では、抗菌性複合体は、核酸配列と、抗菌性ペプチドとを含む。抗菌性ペプチドという用語は、抗微生物性ペプチド、細胞浸透性ペプチド、非リボソーム的に合成されたペプチド、およびグリコペプチドを含み、包含する。
【００９６】
抗微生物性ペプチド（ＡＭＰ；宿主防御ペプチドとも呼ばれる）は、多様かつ広く普及した古代および自然の抗菌物質である。それらは、生来の免疫反応の進化的に保存された成分で、あらゆる種類の生命の中で見られる。抗微生物性ペプチドに対する標的を表し得る、原核生物細胞と真核生物細胞との間には、根本的な差が存在する。これらのペプチドは、新しい治療薬としての可能性を示す、有力な広域抗生物質である。抗微生物性ペプチドは、グラム陰性およびグラム陽性細菌（従来の抗生物質に対して耐性を示す株を含む）、マイコバクテリウム（ヒト型結核菌を含む）、エンベロープウイルスおよび菌類を死滅させることが実証された。大多数の従来の抗生物質とは異なり、抗微生物性ペプチドはまた、免疫調節物質として機能することによって耐量を強化する能力を有し得ると思われる。
【００９７】
抗微生物性ペプチドは、概して、１２個〜５０個のアミノ酸である。これらのペプチドは、アルギニン、リシン、または酸性環境ではヒスチジン、および疎水性残基の大部分（概して、＞５０％）によって提供される、２つ以上の正に帯電した残基を含む。これらの分子の二次構造は、次の４つのテーマに従う。ｉ）α−螺旋構造、ｉｉ）２つ以上のジスルフィド結合の存在によるβ−鎖化構造、ｉｉｉ）ペプチド鎖の単一のジスルフィド結合および／または環化の存在によるβ−ヘアピンまたはループ構造、ｉｖ）拡張構造。これらのペプチドのうちの多くは、自由溶液中で構造化されず、生物学的膜に区切った時にそれらの最終的な構成に折り重なる。ペプチドは、螺旋分子の片側に沿って整列した親水性アミノ酸残基と、反対側に沿って整列した疎水性アミノ酸残基とを含有する。抗微生物性ペプチドのこの両親媒性は、ペプチドを、膜脂質二分子層に区切ることを可能にする。
【００９８】
これらのペプチドは、膜透過性化から細胞質標的の範囲に及ぼす作用まで、種々の抗微生物活性を有する。
【００９９】
抗微生物性ペプチドが細菌を死滅させる作用のモードは、様々であり、膜の破壊、代謝の干渉、および細胞質成分の標的化を含む。ペプチドと標的微生物との間の初期接触は、大部分の細菌表面がアニオンであるので、静電的である。それらのアミノ酸組成物、両親媒性、カチオン性電荷、およびサイズは、それらが、膜二分子層に付着してその中に挿入されて、「バレルステーブ」、「カーペット」、または「トロイダル孔」機構の細孔を形成することを可能にする。細胞に浸透すると、ペプチドは、細胞が生きるために必須である細胞内分子に結合し、それによって、細胞壁合成を阻害し、細胞質膜を改変し、オートリシンを活性化し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を阻害し、特定の酵素を阻害する。しかしながら、多くの場合、死滅の正確な機構は、知られていない。多数の従来の抗生物質とは対照的に、これらのペプチドは、静菌性（細菌成長阻害因子）ではなく殺菌性（細菌キラー）であると思われる。
【０１００】
細菌細胞および宿主細胞の抗微生物性ペプチドとの競合において、抗微生物性ペプチドは、哺乳動物細胞に対して細菌細胞と優先的に相互作用し、これは、それらが、哺乳動物細胞に対する重大な毒性を伴わずに、微生物を死滅させることを可能にする。細菌膜の表面は、哺乳動物細胞よりも負に帯電するので、抗微生物性ペプチドは、細菌膜および哺乳類の細胞膜に対して異なる親和性を示す。
【０１０１】
コレステロールは、通常、膜安定化物質として哺乳類の細胞膜の中に広く分布しているが、細菌細胞膜の中には存在しないことがよく知られている。これらのコレステロールの存在はまた、概して、脂質二分子層の安定化のため、またはコレステロールとペプチドとの間の相互作用のため、抗微生物性ペプチドの活性も低減する。したがって、哺乳動物細胞のコレステロールは、抗微生物性ペプチドによる攻撃から細胞を保護する。
【０１０２】
加えて、膜電位は、ペプチドと脂質との相互作用に影響を及ぼすことがよく知られている。細胞膜の外葉と内葉との間には、負の膜電位が存在する。この内部の負膜電位は、おそらくは、正に帯電したペプチドの膜の中への挿入を促進することによって、膜透過性化を促進する。比較すると、細菌細胞の膜電位は、通常の哺乳動物細胞の膜電位よりも負であり、よって、細菌膜は、正に帯電した抗微生物性ペプチドによって攻撃され易い。
【０１０３】
前述のように、ＡＭＰは、一意的かつ多様な分子群であり、それらのアミノ酸組成および構造に基づいて下位群に分けられる。既知の多数のＡＭＰのデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｂｃｍ．ｕｎｉｔｓ．ｉｔ／〜ｔｏｓｓｉ／ｐａｑ１．ｈｔｍで見つけることができる。抗感染性を伴うペプチドの他の群としては、非リボソームペプチドが挙げられ、その例には、グラミシジンが挙げられ、その下位群として、ペプチド（一般的に、環式である）がグリコシル化された、グリコペプチド抗生物質を伴うものが挙げられる。これらの例には、ポリミキシンが挙げられる。
【０１０４】
本発明者らは、これらの全てのペプチドの機能分類を行った。該ペプチドは、殺菌の機構に基づいてＡＭＰと区別するために、本明細書では抗菌性ペプチド（ＡＢＰ）と称され、細胞浸透性ペプチド、非リボソーム的に合成されたペプチド、およびグリコペプチド等の他の分類の抗菌剤から誘導されるペプチドを含む。本発明は、天然および非天然の合成ペプチドを包含することが理解されるであろう。
【０１０５】
分類Ｉ。ＡＢＰであり、これは、膜活性（ポリミキシン、グラミシジン）であり、外膜に穴を開けるのに十分な損傷を引き起こすことによって侵入に影響を及ぼして、そこを通って大分子が通過することができる、細菌内膜の突出（または「気泡」）を形成することを可能にする。これらのペプチドのうちいくつかは、病院で使用されているが、それらが真核生物膜にも損傷を与えるので、毒性に対する懸念がある。
【０１０６】
抗菌性ペプチドに対する耐性の割合は著しく低く、これらのペプチドは、本質的に広く普及している。この分類は、大部分がカチオン性であるので、耐性機構は、細菌の外膜に関する電荷密度の変化という形態をとり、実験室では、そのような変化が見られた。したがって、耐性の相対的に低い発生率は、ＡＢＰが、抵抗することが困難であるのではなく、それほど有効ではないという事実を反映し得る。
【０１０７】
分類ＩＩ。これは、非常に小さい分類である。これらのＡＢＰは、膜に損傷を与えないが、代わりに細胞内標的を有する。したがって、ペプチドは、それらの標的に到達するように、細菌膜を通して転座させなければならない。結果として、それらは、溶血等を引き起こす真核生物膜への損傷を与えないので、分類ＩのＡＢＰよりも著しく毒性が低い。それらは、カチオン性であるが、膜を横断する能力は、それらの電荷だけではなく、ほとんど未定儀のままである他の広範な構造的性質にも基づくと予想される。結果として、耐性機構は、そのような機構が細菌膜自体の疎水性を変えることを必要とするので、起こる可能性は低いと考えられる。
【０１０８】
転座が可能であるＡＢＰの例は、ブフォリンおよび先端を切断した形のブフォリンＩＩ（ＢＦ２）である。このペプチドは、病原菌に対して（弱い）広域スペクトル活性を示す（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８２４５−８２５０）。これは、エンドサイトーシスを介したものであり、またおそらくペプチドのカチオン性の性質によるものだが、それは、真核生物膜を転座し、２８ｋＤａペプチド（ＧＦＰ）をヒト細胞系に送達さえするように使用されてきた（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３１０−１３１５）。
【０１０９】
ＡＢＰは、グラミシジン等の天然のペプチド、またはブフォリンであってもよい。代替として、ＡＢＰは、ペプチド模倣物、またはブフォリンＩＩもしくはポリミキシンノナペプチド等の天然のペプチドの合成変異体であってもよい。
【０１１０】
生体膜を透過性化する能力を有する抗微生物性ペプチドの例は、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ（（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：４６５−４９９）で提供されており、デフェンシン、ｐｌｅｕｒｉｃｉｄｉｎ、マガイニン、デルマセプチン、アピデシン、セクロピン、ミクロシン、およびペジオシンが挙げられる。
【０１１１】
生体膜を透過性化する能力を有する抗菌性ペプチドの例は、Ｖａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：３９５−４１１）で提供されており、ランチビオティック、グリコペプチド抗生物質、ポリリシンおよびポリアルギニン等のカチオン性ポリペプチドが挙げられる。
【０１１２】
ＡＢＰの種類および特性を表１に要約する。
【０１１３】
【表１】
2013523111.tif 000012
【０１１４】
ＡＢＰは、静電または共有結合連結によって、核酸に連結されてもよい。具体的には、ＡＢＰの死滅の機構が、膜を透過性にするのではなく細胞内標的を介したものである場合、複合体は、核酸配列とＡＢＰとの間に、好適なリンカーまたは架橋剤等の、共有結合連結を含む場合がある。好適なリンカーの例は、カルボキシル基を第一級アミンに連結するものである。例えば、好適なリンカーは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）であってもよい。
【０１１５】
ＥＤＣは、アミド結合を得るために第一級アミンの連結のためのカルボキシル活性化剤としての使用が知られており、このカルボジイミドの一般的な使用は、タンパク質の核酸への架橋である。
【０１１６】
ＡＢＰは、それ自体が抗微生物活性を有するが、そのようなペプチドは、ＴＦＤと組み合わせた時に、細菌増殖を防止するように相乗的に作用することが分かっている。ＡＢＰは、静菌効果を有するものもあれば、接触時に死滅させるものもある。ペプチドの亜致死濃度がＴＦＤの侵入を可能にすることが分かっている。ペプチドは、ＴＦＤに対してより弱くする応力を細菌に加え、次いで、成長停滞または細胞死を引き起こす応力を阻止する。
【０１１７】
複合体は、ＡＢＰが典型的にそれらの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の５〜１０倍低い濃度であるように調製される。化合物のＭＩＣは、細菌の目に見える成長を防止するその化合物の最小濃度である。典型的に、ＭＩＣは、細菌の摂取培養液を一連の濃度の化合物で一晩インキュベートする、希釈法によって判定され、成長を防止するものがＭＩＣとみなされる。好適な濃度を算出して、調製することは、当業者の相応な技術および知識の範囲内である。
【０１１８】
またさらなる実施形態では、本発明の抗菌性複合体は、ａ）デコイ核酸配列と、ｂ）アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環の一部を形成するアミノ基である、第四級アミン化合物もしくはビスアミノアルカン、またはその不飽和誘導体と、ｃ）抗菌性ペプチドと、を含む。デコイ核酸配列は、細菌代替シグマ５４因子の結合部位またはその変異体もしくは類似体の全てまたは一部をコードする配列を含む。
【０１１９】
別の表現では、本発明の抗菌性複合体は、ａ）核酸配列と、ｂ）キノリンまたはアクリジンの第四級誘導体と、ｃ）抗菌性ペプチドと、を含む。
【０１２０】
特に好ましい実施形態では、抗菌性複合体は、ａ）上述の転写因子デコイと、ｂ）デカリニウム類似体と、随意にｃ）抗微生物性ペプチドと、を含む。
【０１２１】
またさらなる態様では、本発明は、１つ以上の細菌性感染症の治療のための好適な製剤中の本発明のデコイ核酸配列および複合体の使用に属する。
【０１２２】
具体的には、本発明は、本明細書に記載されるように製剤化されるデコイ核酸配列または抗菌性複合体を投与することを含む、被検体の細菌感染を治療するための方法を提供する。被検体は、ヒトまたは動物であってもよい。本発明はまた、医療で使用するための、例えば被検体の細菌感染を治療または防止する際に使用するための、本明細書に記載されるように製剤化されるデコイ核酸配列または抗菌性複合体、および細菌感染を治療するための薬剤の製造のために本明細書に記載されるように製剤化されるデコイ核酸配列または抗菌性複合体の使用も提供する。
【０１２３】
本発明はさらに、デコイ核酸配列もしくは抗菌性複合体と、少なくとも１つの送達部分と、生理学的に許容される担体もしくは賦形剤と、を含む、薬学的組成物もしくは薬剤に関する。デコイ核酸配列は、細菌代替シグマ５４因子結合部位またはその変異体もしくは類似体の全てまたは一部をコードする配列を含む。送達部分は、第四級アミン化合物、ビス−アミノアルカン、およびその不飽和誘導体から選択され、アミノアルカンのアミノ成分は、複素環式環の一部を形成するアミノ基および抗菌性ペプチドである。本組成物は、１つ以上の抗生物質、もしくは他の抗菌性化合物、または上記に列挙されるもの等の組成物をさらに含んでもよい。
【０１２４】
標的遺伝子の発現に対して予測可能な効果を示し、かつ静菌または殺菌効果を有するために必要なデコイ配列の数は、細胞１個あたりわずか約５０００個とすることができる。１００万個もの細菌細胞が、わずか１ｎＭのＴＦＤで効率的に死滅させられることが分かっており（ＰＣＴ／ＧＢ／２００９／０５１３０１）、０．００１％未満のトランスフェクション効率が死滅を達成するのに十分であることを示唆している。アンチセンス等の細菌性感染症に取り組む他の核酸に基づく戦略と比較すると、細胞を死滅させるために必要なこの分子の数は、１００〜１０００倍少ない。これは、アンチセンス手法およびＴＦＤは、どちらも遺伝子を阻害するように作用するが、ＴＦＤが初期の段階で転写を阻止するのに対し、アンチセンスは、最も一般的な反復法で、転写の生成物（数千個ものｍＲＮＡ分子）を立体配置的に阻止することを、一部反映するものである。第２に、ＴＦＤは、正に誘発されるので生存のためにスイッチを入れる必要がある、必須遺伝子を標的にするように設計され、正に調節される（転写因子は、それ自体の生成を推進する）。インビトロで、この後者の特徴は、遺伝子が誘導されない時に比較的に少数の転写因子のコピーが存在する可能性があり、よって、少数のＴＦＤが誘発を阻止することができる。
【０１２５】
治療状況では、細菌集団の自然な多様性のため、または遺伝子がすでに誘発されているため、細胞１個あたりにより多くの転写因子があってもよい。この状況では、治療効果を見て、有益な効果を得るには用量を１００倍に（１００ｎＭに）増加させ、またはトランスフェクション効率を改善すれば（２桁）十分であると推定するためには、さらに多くのＴＦＤが必要となることが予想される。トランスフェクションは、蛍光顕微鏡を使用して定量化されてもよい（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１３−２８）。
【０１２６】
本発明による、および本発明に従って使用するための薬学的組成物は、活性成分として、またはそれに加えて、薬剤として許容される賦形剤もしくは希釈剤、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤、または当業者によく知られている他の材料を含んでもよい。そのような材料は、無毒であるべきで、活性成分の有効性に干渉するべきでない。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、薬剤の技術分野でよく知られており、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）で説明されている。担体または他の材料の正確な性質は、経口であるか、または例えば皮膚、皮下、もしくは静脈の注射によるものであり得る投与経路に依存する。
【０１２７】
活性成分は、単独で、または送達部分と複合される（もしくは製剤化される）かのいずれかのデコイ核酸配列として画定され、送達部分は、キノリンまたはアクリジンの第四級誘導体および抗菌性ペプチドから選択される送達部分である。複合体／または製剤において、デカリニウムもしくはその類似体等のキノリンまたはアクリジンの第四級誘導体は、ボラソームの形態である。「ボラソーム」という用語は、本明細書において、化合物が超音波処理を受けた後の誘導体の小胞を説明するために使用される（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４９：１２７−１４９を参照）。
【０１２８】
本発明のデコイまたは抗菌性複合体を細菌感染の部位に送達するために、種々の方法が使用されてもよい。インビボおよび／またはインビトロ送達のための方法には、頬もしくは経口送達、静脈送達、感染症への直接注射、または間接注射（例えば、皮下、腹膜内、筋肉内、または他の注射方法）、局所塗布、水性もしくは媒体溶液中の直接露出、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストランに基づくもの、および脂質で媒介されたもの）、トランスジェニック発現（例えば、マイクロインジェクションによって送達されるデコイ発現システム、胚性幹細胞発生、またはレトロウイルス導入）、または当技術分野で知られている他の一般に使用される核酸送達システムのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。投与は、適切な投与量の抗生物質と組み合わされてもよく、抗生物質（複数可）は、核酸配列として同時にまたは個別に投与される。
【０１２９】
経口投与のための薬学的組成物は、タブレット、カプセル、粉末、または液状であってもよい。タブレットは、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含んでもよい。液体薬学的組成物は、概して、水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油、または合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、ブドウ糖もしくは他の単糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれてもよい。
【０１３０】
静脈、皮膚、もしくは皮下注射、または疾患部位での注射の場合、活性成分は、ピロゲンを含まず、好適なｐＨ、張度、および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態となる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム等の等張ビヒクル、リンゲル液、ラクトリンゲル液、防腐剤、安定剤、バッファ、抗酸化剤を使用して好適な溶液を調製することが可能であり、および／または必要に応じて他の添加剤を含んでもよい。
【０１３１】
いくつかの応用では、薬学的製剤が必要とされない場合がある。例えば、本発明の抗菌性複合体は、賦形剤および／または担体を必要とせずに、それ自体で医薬として耐容性を示し得る。
【０１３２】
代替として、抗菌性複合体は、抗菌性消毒剤として使用するのに好適であり得、よって、好適な水性の形態で必要とされ得る。その場合、複合体は、水性および有機溶媒、ならびにそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【０１３３】
本発明のデコイまたは抗菌性複合体は、種々の細菌性感染症が起こるヒトの体内のどこでも、それらを治療するために使用されてもよい。細菌感染の５つの一般的な領域を説明することができる。
【０１３４】
気道感染症は、最も一般的なものであり、上気道感染症は、熱帯適用またはエアロゾル調製で治療することができる、耳、咽喉、および鼻腔を含む。下気道感染症は、一連の細菌病原体によって引き起こされる肺炎、気管支炎、嚢胞性線維症の感染性合併症を含む。
【０１３５】
地域社会および医療活動双方における共通の問題は、尿路感染症であり、尿が感染した状態になり、抗菌剤が、膀胱、平伏、尿管、および腎臓に進入することが必要である。
【０１３６】
消化器官は、感染症にかかり易く、そこでは、細菌は、粘膜侵襲または毒素生成のいずれかによって病気を引き起こし、その例には、コレラの流行が挙げられ、抗生物質は、使用する時に、摂取されるか、または静注で投与される。
【０１３７】
局所塗布によって治療することができる皮膚および軟部組織感染症は、外傷または火傷の後にありがちで、微生物の定着および移入を可能にし、どちらも局所化された、または組織を通して迅速に拡散する感染症をもたらす。皮膚感染症の原因となる微生物は、しばしば、表皮感染症（膿痂疹）、蜂巣炎（血液に拡散する可能性があるより深在性の感染症）、および壊死性筋膜炎（しばしば生命に危険のある急速進行性感染症）を引き起こす、化膿連鎖球菌等の、通常の皮膚フローラから生じる。
【０１３８】
最後に、細菌性髄膜炎等の中央神経系の感染症は、治療が血液脳障壁に浸透しなければならず、また病原菌も有するので、おそらくは治療が最も困難である。
【０１３９】
本発明のデコイまたは抗菌性複合体は、核酸配列が細菌細胞をより敏感にする１つ以上の抗生物質、および／または別の抗菌剤と組み合わせて使用されてもよい。適切な抗生物質は、上記ならびに同時係属出願第ＷＯ２００９／０４４１５４号および第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１３０１号に記載される。その中で提供されるリストが包括的でなくてもよいことが理解されるであろう。本発明は、任意の好適な抗生物質、抗菌性化合物、または組成物を含む。
【０１４０】
抗生物質または抗菌性化合物は、本発明の抗菌性複合体と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。抗生物質／抗菌性化合物、およびデコイまたは抗菌性複合体は、同じまたは別個の組成物で投与されてもよい。したがって、本発明は、本明細書で識別および／または説明されるデコイもしくは抗菌性複合体が、１つ以上の抗生物質または他の抗菌性治療と組み合わせて被検体に投与される、併用療法を含む。本組成物は、付加的に、１つ以上の抗生物質または他の抗菌性化合物もしくは組成物を含んでもよい。
【０１４１】
本発明のデコイは、一般に原核生物で使用するのに適している。具体的には、デコイは、病原体、特に病原菌、例えばヒトに影響を及ぼす病原菌に使用され得る。これらは、以下の属の細菌を含む（グラム株試験の結果に従い列挙する）：
【０１４２】
グラム陰性：アシネトバクター、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、レジオネラ、レプトスピラ、ナイセリア、プロテオバクテリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、シゲラ、トレポネーマ、ビブリオ、エルシニア。
【０１４３】
グラム陽性：バチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、リステリア、マイコバクテリウム、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス。
【０１４４】
未染色：クラミジア属、マイコプラズマ属。
【０１４５】
グラム陰性病原性種およびそれらが原因の疾患の例としては、Ａ．バウマンニ（肺炎、菌血症）、ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳）、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、ブルセラ・アボルタス（ブルセラ症）、カンピロバクター・ジェジュニ（急性腸炎）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｑ熱）、エシェリキア・コリ（敗血症、髄膜炎、および肺炎）、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ヘモフィリス・インフルエンザ（インフルエンザおよび髄膜炎）、ヘリコバクター・ピロリ（消化性潰瘍）、クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎）、レジオネラ・ニューモフィラ（レジオネラ症）、ナイセリア・ゴノレア（淋病）、ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎）、アシネトバクターｓｐｐ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）（院内、感染）、シュードモナス・エルギノーサ（敗血症）、リッケチア・リケッティ（くる病）、サルモネラ・チフィリウム（腸チフス）、シゲラ・ディセンテリエ（赤痢）、ビブリオ・コレラ（コレラ）、エルシニア・ペスティス（疫病）が挙げられる。
【０１４６】
グラム陽性病原性種およびそれらが原因の疾患の例としては、バチルス・アンスラシス（炭疽）、クロストリジウム・ディフィシレ（偽膜性大腸炎）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（ジフテリア）、エンテロコッカス・フェカリス（院内感染）、リステリア・モノサイトゲネス（リステリア病および髄膜炎）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、Ｓ．ニューモニエ（肺炎）が挙げられる。
【０１４７】
以下の属（上記の種を含む）の細菌には、本方法が特に適している：アシネトバクター、エシェリキア、ヘリコバクター、クレブシエラ、ナイセリア、プロテオバクター、シュードモナス、サルモネラ、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、スタヒロコッカス、シゲラ。
【０１４８】
例えば、医療または獣医学の治療使用と同様に、本発明のデコイまたは抗菌性複合体は、例えば殺菌剤および洗浄製品における他のエクスビボ、例えば非治療用途を有する。基本的に、デコイまたは抗菌性複合体は、原核生物細胞の生存能を低下させる、細胞を死滅させる、成長を阻害する、または毒性を低下させる必要がある場合の方法に用途を見出す。よって、デコイは、殺菌または静菌組成物に用途を見出してもよい。
【０１４９】
本発明のデコイ核酸配列は、微生物の成長を低下させるもしくは防止し、かつ／または微生物を死滅させ、それによって微生物の成長を低下させるもしくは防止する、または微生物を死滅させるのに十分な時間および条件下で、作業体または手等の表面に塗布される製品にさらに使用されてもよい。例えば、１つ以上のデコイが表面上に噴霧されてもよい。そのような噴霧塗布は、例えば食料を準備するための表面を準備する、または患者の中に挿入される物体を殺菌するのに有用である。これは、デコイ製剤の噴霧が表面または物体の取り扱いを低減し、それによって汚染のリスクをさらに低減するためである。手および口の洗浄用途も、本発明の範囲内であるものとする。
【０１５０】
上記の状況において、デコイは、適切な水性形式に製剤化され得る。その場合、製剤は水を含み水性組成物を形成することができる。水性組成物は、水性および有機溶媒ならびにその組み合わせをさらに含んでもよい。
【０１５１】
本発明は、本明細書に説明されるデコイ核酸配列もしくは抗菌性複合体と、細菌の死滅またはその成長もしくは毒性の阻害において併用するための１つ以上の抗生物質もしくは他の抗菌剤（複数可）とを含む、抗菌使用のためのキットにも関する。典型的に、キットは、使用説明書を含む。同様に、キットは、例えば細菌感染に対する治療的使用、または例えば洗浄もしくは消毒のための非治療的使用のためであってもよい。
【０１５２】
本明細書で参照される全ての資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本発明は、ここで、以下の図を参照しながら、非制限的な実施例によってより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】デカリニウムの化学構造である。
【図２】１０，１０´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドの化学構造である。
【図３】１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドの化学構造である。
【図４】インビトロバイオアッセイで判定された、化合物７を用いて形成されたＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体による大腸菌の成長遅延を示すグラフである。
【図５】インビトロバイオアッセイで判定された、ブフォリンＩＩの存在下、化合物７を用いて形成されたＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体による緑膿菌の成長遅延を示すグラフである。
【図６】インビトロバイオアッセイで判定された、抗微生物性ペプチドの存在下、化合物７を用いて形成されたＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体による肺炎桿菌の成長遅延を示すグラフである。
【図７】ブフォリンＩＩの存在下、化合物７を用いて形成されたＧＮ＿ＳｉｇＴＦＤ複合体による大腸菌および緑膿菌の成長遅延を示すインビトロバイオアッセイ。
【図８】ＰＥＩの存在下、化合物７を用いて形成されたＧＮ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体による大腸菌の成長遅延を示すインビトロバイオアッセイ。
【０１５５】
（配列の簡単な説明）
配列番号１−ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ配列
配列番号２−ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号３＆４−ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ亜鈴型配列
配列番号５＆６−スクランブルされた大腸菌Ｓｉｇ結合部位の順向および逆向リン酸化プライマー配列
配列番号７−ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ配列
配列番号８−ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号９＆１０−ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ亜鈴型配列
配列番号１１＆１２−スクランブルされた緑膿菌Ｓｉｇ結合部位の順向および逆向リン酸化プライマー配列
配列番号１３  ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ配列
配列番号１４−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号１５＆１６−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ亜鈴型配列
配列番号１７＆１８−スクランブルされた肺炎桿菌Ｓｉｇ結合部位の順向および逆向リン酸化プライマー配列
配列番号１９−抗微生物性ペプチド配列
配列番号２０−グラム陰性Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号２１＆２２−グラム陰性Ｓｉｇ  ＴＦＤ亜鈴型配列
【０１５６】
［実施例］
一般に本明細書に記述される技法の多くは、当業者に周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０１５７】
（実施例１．）
（ＥＣ  ＳｉｇＴＦＤはインビトロで大腸菌を死滅させる）
ｓｉｇＮ代替シグマ因子（σ５４様）の結合部位を含有するＴＦＤは、配列番号１に記述される配列を有した。配列は、Ｂａｒｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．［１９９９］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４３０５−４３１３に記載される大腸菌ｇｌｎＡ遺伝子の促進因子領域に基づいた。
ＥＣ＿Ｓｉｇ：ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  Ｔ（配列番号１）
【０１５８】
Ｂａｒｒｉｏｓらに列挙される他の大腸菌遺伝子（ｆｄｈＦ、ｈｙｃＡ、ｈｙｐＡ、ｎａｃ、ｇｌｎＨ、およびｐｓｐＡ）で発見された類似する結合部位は、大腸菌の結合部位にＩＵＰＡＣ変質ＤＮＡアルファベットを使用してコンセンサス配列を生成するために使用された。
ＥＣ＿Ｓｉｇコンセンサス：ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＮＮＷ  ＷＮＴ  ＴＧＣ  Ｗ（配列番号２）
【０１５９】
ＩＵＰＡＣ一文字コードが使用され、その場合、ＷはＡまたはＴである。
【０１６０】
配列番号１の配列は、ＴＦＤに組み込まれ、大腸菌培養物に送達された場合、成長を防止するかどうかをみるために試験された。
【０１６１】
材料および方法
（結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製）
それぞれ、大腸菌ｓｉｇＮタンパク質の一本鎖の認識部位を含有する、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを合成した。分子のいずれかの末端では、小さいヘアピンループが、分子を分解から保護するように作用した。各オリゴヌクレオチドは、２５０ｐｍｏｌ／μＬの濃度で、ｄＨ２Ｏ中で再懸濁した。
【０１６２】
大腸菌Ｓｉｇ亜鈴型ＴＦＤ（ＥＣ＿ＳｉｇＴＦＤと称する）を形成するために、以下のリン酸化したオリゴヌクレオチドを合成した。
ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  Ｔ（配列番号３）
ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  Ａ（配列番号４）
【０１６３】
典型的に、３０μＬの各オリゴヌクレオチドを、２７μＬのｄＨ２Ｏと混合し、以下のＰＣＲプログラムを使用してアニールした：９５℃で３分間、−０．１℃／ｓで８℃まで冷却して終了。続いて、１０μＬの１０×ＮＥＢリガーゼバッファ、および３μＬのＨＣ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を添加した。混合物は、１６℃で一晩インキュベートした。次いで、材料をＴ７エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で十分に消化して、未結紮オリゴヌクレオチドを全て除去し、エタノール沈殿を２回行うことによって回収した。
【０１６４】
ＥＣ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤと称する、スクランブルされたバージョンのＥＣ＿Ｓｉｇ結合部位を含有する、ＤＢ＿ＴＦＤも調製した。この場合、使用するリン酸化プライマーは、以下の通りとした。
ＥＣ＿Ｓｃｒ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  Ｃ（配列番号５）
ＥＣ＿Ｓｃｒ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  Ｔ（配列番号６）
【０１６５】
（脂溶性カチオンの調製）
１５ｍｇの化合物７（Ｓｙｇｎａｔｕｒｅ  Ｌｔｄ．、Ｃ７と称する）を１０ｍＬのメタノール中に溶解し、回転式蒸発器を使用して完全に乾燥させ、そして、１０ｍＭの最終濃度まで、５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４に再懸濁した。化合物７は直ちに溶解して、澄んだ淡黄色の溶液を生じ、これは、次いで、ＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０を使用して、氷上でプローブ音波処理を受けた。使用条件：６０サイクルの３０秒オン（振幅１０ミクロン）および６０秒オフ。この処理後、試料は完全に透明になった。続いて、試料を遠心分離して細片を取り除き、ｓＣ７（音波処理された化合物７）と称する。このステップで、小胞または「ボラソーム」を形成した。
【０１６６】
（ＴＦＤ複合体の形成）
送達のために、ＴＦＤ複合体はｓＣ７を用いて形成された。２μｇのいずれかのＴＦＤを結合するために必要なＣ７ボラソームの最小量は、経験的に確立され、適切な量のボラソームを、５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４中でＴＦＤと混合して、複合体を形成した。ＴＦＤ複合体の希釈物は、以降のバイオアッセイで使用した。
【０１６７】
（９６ウェルプレートにおける成長研究の実行）
ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＥＣ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤのいずれかからなるＴＦＤ複合体を使用して、大腸菌の成長への影響を判定するために成長アッセイを行った。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためのアッセイを行い、各ウェルは、ＬＢ媒体からなる２００μＬのブロスを含有する（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  ＬＢ媒体（１％［ｗ／ｖ］  Ｂａｃｔｏ−トリプトン、０．５％［ｗ／ｖ］酵母抽出物、１％［ｗ／ｖ］ＮａＣｌ））。１μＬの種々の濃度のＴＦＤ複合体を各ウェルに加え、大腸菌の細菌増殖への影響は、インキュベーション中に周期的にブロスの吸光度を測定することによって観察した。プレートは、振盪しながら３７℃でインキュベートし、（４５０ｎＭでの）吸光度読み取り値は、プレートリーダーを使用して取り込んだ。
【０１６８】
結果
（ＴＦＤ複合体は、インビトロで大腸菌を効率的に死滅させることができる）
ＬＢブロスを播種するために大腸菌細胞を使用して、５×１０５／ｍＬの細胞の最終濃度を得た。２００μＬアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに分配した。ウェルは、様々な濃度のＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体、ＥＣ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤ複合体（ＴＦＤ対照）で補足されるか、またはウェルは未処理であった。どちらのＴＦＤ複合体も、５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＣ７と、５μｇ／ｍＬのＴＦＤとを含有した。
【０１６９】
図１に示されるように、細胞成長は、基本的に未処理試料およびＴＦＤ対照試料において同じであった。しかしながら、ＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体は、細菌増殖を防止した。したがって、Ｃ７ボラソームの特にＥＣ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤとの組み合わせは、大腸菌株を死滅させ、一方、対照ＴＦＤ複合体は大腸菌株を死滅させなかった。この効果は、複合体が細菌に効果的にＴＦＤ治療を送達していることに起因した。随従性膜損傷を伴う送達単独の作用は、ＴＦＤ対照試料が細胞成長に影響を及ぼさなかったため、細胞を死滅させなかった。
【０１７０】
（実施例２．）
（ＰＡ＿ＳＩＧ  ＴＦＤはインビトロで緑膿菌を死滅させる）
ｓｉｇＮ代替シグマ因子（σ５４様）の結合部位を含有するＴＦＤは、配列番号７に記述される配列を有した。配列は、Ｂａｒｒｉｏｓら（上記）に記載される緑膿菌ａｌｇＣ遺伝子の促進因子領域に基づいた。
ＰＡ＿Ｓｉｇ：ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  Ｃ（配列番号７）
【０１７１】
Ｂａｒｒｉｏｓらに列挙される他の緑膿菌遺伝子（ｏｐｒＥ、ｃｐｇ２、ｒｈｌＡＢ、ａｌｇＤ、および  ｆｌｅＳＲ）で発見された類似する結合部位は、緑膿菌の結合部位にＩＵＰＡＣ変質ＤＮＡアルファベットを使用してコンセンサス配列を画定するために使用された。
ＰＡ＿Ｓｉｇコンセンサス：  ＧＧＮ  ＡＮＷ  ＣＳＣ  ＮＴＮ  ＳＣＮ（配列番号８）
【０１７２】
配列番号７の配列は、ＴＦＤに組み込まれ、緑膿菌培養物に送達された場合、細菌増殖を防止するかどうかをみるために試験された。
【０１７３】
ＴＦＤの緑膿菌細胞への送達を可能にするために、ＴＦＤ複合体を抗微生物性ペプチドと混合した。この実施例において、ブフォリンＩＩを使用し（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．［２０００］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８２４５−８２５０）、典型的に、２００μＬのブロスを１μｇのペプチドで補足した。
【０１７４】
材料および方法
（結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製）
それぞれ、緑膿菌代替シグマタンパク質の一本鎖の認識部位を含有する、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、一緒に結紮して、実施例１に記載されるように亜鈴型ＴＦＤを形成した。使用した配列は、
ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  Ｃ（配列番号９）
ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  Ｇ（配列番号１０）であった。
【０１７５】
同様に、スクランブルされたバージョンのＴＦＤをリン酸化したプライマーを使用して作製した。
ＰＡ＿Ｓｃｒ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ（配列番号１１）
ＰＡ＿Ｓｃｒ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ（配列番号１２）
【０１７６】
（成長アッセイ）
実施例１に記載されるようにＴＦＤ複合体を形成した。成長アッセイは、緑膿菌の成長への影響を判定するために、ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＰＡ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤのいずれかからなる複合体を使用して実行した。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためのアッセイを行い、各ウェルは、１μｇ／ｍＬのブフォリンＩＩで補足されたＬＢ媒体からなる２００μＬのブロスを含有する。
【０１７７】
１μＬの種々の濃度のＴＦＤ複合体を各ウェルに加え、緑膿菌の細菌増殖への影響は、インキュベーション中に周期的にブロスの吸光度を測定することによって観察した。プレートは、振盪しながら３７℃でインキュベートし、（４５０ｎＭでの）吸光度読み取り値は、プレートリーダーを使用して取り込んだ。
【０１７８】
結果
（ＴＦＤ複合体はインビトロで効果的に緑膿菌を死滅させる）
ＬＢブロスを播種するために緑膿菌細胞を使用して、５×１０５／ｍＬの細胞の最終濃度を得た。２００μＬアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに分配した。ウェルは、様々な濃度のＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体、ＰＡ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤ複合体（ＴＦＤ対照）、ブフォリンに添加された化合物７からなる送達対照（相乗効果を試験するため）で捕捉されるか、またはウェルは未処理であった。どちらのＴＦＤ複合体も、５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＣ７と、５μｇ／ｍＬのＴＦＤとを含有した。
【０１７９】
図２に示されるように、細胞成長は、基本的に未処理試料、送達対照、およびＴＦＤ対照試料において同じであった。しかしながら、ＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体は、細菌増殖を防止した。したがって、送達ビヒクルの特にＰＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤとの組み合わせは、緑膿菌株を死滅させ、一方、対照ＴＦＤ複合体は、緑膿菌株を死滅させなかった。この効果は、複合体が細菌に効果的にＴＦＤ治療を送達していることに起因した。随従性膜損傷を伴う送達単独の作用は、ＴＦＤ対照試料が細胞成長に影響を及ぼさなかったため、細胞を死滅させなかった。
【０１８０】
（実施例３．）
（ＫＰ＿ＳＩＧ  ＴＦＤはインビトロで肺炎桿菌を死滅させる）
ｓｉｇＮ代替シグマ因子（σ５４様）の結合部位を含有するＴＦＤ  は、配列番号１３に記述される配列を有した。配列は、Ｂａｒｒｉｏｓら（上記）に記載される肺炎桿菌ｇｌｎＡ遺伝子の促進因子領域に基づく。
ＫＰ＿Ｓｉｇ：ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  Ｔ（配列番号１３）
【０１８１】
Ｂａｒｒｉｏｓらに列挙される他の肺炎桿菌遺伝子（ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＭ、およびｎｉｆＵ）で発見された類似する結合部位は、肺炎桿菌の結合部位にＩＵＰＡＣ変質ＤＮＡアルファベットを使用してコンセンサス配列を生成するために使用された。
ＫＰ＿Ｓｉｇコンセンサス：ＴＧＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＷＴＴ  ＴＧＣ  Ｗ  配列番号１４）
【０１８２】
配列番号１３の配列は、ＴＦＤに組み込まれ、肺炎桿菌培養物に送達された場合、成長を防止するかどうかをみるために試験された。
【０１８３】
（結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製）
それぞれ、肺炎桿菌代替シグマタンパク質の一本鎖の認識部位を含有する、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、一緒に結紮して、実施例１に記載されるように亜鈴型ＴＦＤを形成した。使用した配列は、
ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  Ｔ（配列番号１５）
ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  Ａ（配列番号１６）であった。
【０１８４】
同様に、スクランブルされたバージョンのＴＦＤをリン酸化したプライマーを使用して作製した。
ＫＰ＿Ｓｃｒ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  Ｃ（配列番号１７）
ＫＰ＿Ｓｃｒ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  Ｇ（配列番号１８）
【０１８５】
肺炎桿菌細胞への送達を可能にするために、ＴＦＤ複合体を抗微生物性ペプチドと混合した。ＴＦＤを細胞浸透性ペプチドと複合することによって、トランスフェクションを達成した。ペプチドは、前述されており、肺炎桿菌の膜を浸透することが可能であることが分かっている（Ｖａａｒａ［１９９６］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：１８０１）。使用されたペプチドの配列は、
ＫＰトランスフェクションペプチド：ＩＫＦＬＫＦＬＫＦＬ（配列番号１９）であった。
【０１８６】
（成長アッセイ）
実施例１に記載されるようにＴＦＤ複合体を形成した。成長アッセイは、肺炎桿菌の成長へのそれらの影響を判定するために、ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＫＰ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤのいずれかからなる複合体を使用して行った。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためにアッセイを行った。各ウェルは、５μｇ／ｍＬのＩＫＦＬＫＦＬＫＦＬペプチドで補足されたＭ９媒体からなる２００μＬのブロスを含有する。１μＬの種々の濃度のＴＦＤ複合体を各ウェルに加え、肺炎桿菌の細菌増殖への影響は、インキュベーション中に周期的にブロスの吸光度を測定することによって観察した。プレートは、振盪しながら３７℃でインキュベートし、（４５０ｎＭでの）吸光度読み取り値は、プレートリーダーを使用して取り込んだ。
【０１８７】
結果
（ＴＦＤ複合体はインビトロで肺炎桿菌を効果的に死滅させる）
１μｇ／ｍＬのＩＫＦＬＫＦＬＫＦＬペプチドで補足されたＭ９ブロスを播種するために、肺炎桿菌細胞を使用して、５×１０５／ｍＬの細胞の最終濃度を得た。２００μＬアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに分配した。ウェルは、様々な濃度のＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体、ＥＣ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤ複合体（ＴＦＤ対照）で補足されるか、またはウェルは、未処理であった。どちらのＴＦＤ複合体も、５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＣ７と、５μｇ／ｍＬのＴＦＤとを含有した。
【０１８８】
図３に示されるように、細胞成長は、基本的に、未処理試料およびＴＦＤ対照試料において同じであった。しかしながら、ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体は、細菌増殖を防止した。したがって、Ｃ７ボラソームの特にＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤとの組み合わせは、肺炎桿菌株を死滅させ、一方、対照ＴＦＤ複合体は、肺炎桿菌株を死滅させなかった。この効果は、複合体が細菌に効果的にＴＦＤ治療を送達していることに起因した。随従性膜損傷を伴う送達単独の作用は、ＴＦＤ対照試料が細胞成長に影響を及ぼさなかったため、細胞を死滅させなかった。
【０１８９】
（実施例４．）
（コンセンサスＳＩＧ  ＴＦＤはインビトロで大腸菌および緑膿菌の両方を死滅させる）
上記のコンセンサス配列（配列番号２、配列番号８、および配列番号１４）の目視検査により、グラム陰性コンセンサス配列を導き出した。
ＧＮｅｇコンセンサス：ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号２０）
【０１９０】
このコンセンサス配列を有するＴＦＤが大腸菌、緑膿菌、および肺炎桿菌、ならびに他のグラム陰性感染においてＳｉｇ  ＴＦＤとして機能するという予測を検査するために、実験を行った。
【０１９１】
材料および方法
（結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製）
それぞれ、グラム陰性代替シグマタンパク質の一本鎖の認識部位を含有する、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、一緒に結紮して、実施例１に記載されるように亜鈴型ＴＦＤを形成した。使用した配列は、
ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号２１）
ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  Ａ（配列番号２２）であった。
【０１９２】
（成長アッセイ）
実施例２に記載されるようにＴＦＤ複合体を形成した。成長アッセイは、大腸菌と緑膿菌の混合培養物の成長への影響を判定するために、ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＰＡ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤ（実施例２：配列番号１１および１２）のいずれかからなる複合体を使用して行った。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためにアッセイを行い、各ウェルは、１μｇ／ｍＬのブフォリンＩＩで補足されたＬＢ媒体からなる２００μＬのブロスを含有する。１μＬのＴＦＤ複合体または対照を１→２および１→１０希釈で、各ウェルに添加した。両種の細菌増殖への影響は、振盪しながら３７℃で一晩プレートをインキュベートすることによって評価された。
【０１９３】
結果
ＧＮ  ＴＦＤ複合体はインビトロで大腸菌および緑膿菌の両方を効果的に死滅させる
全てのＧＮ  ＴＦＤ複合体およびブフォリンＩＩの希釈物で処理された細胞だけが本アッセイで成長しなかった（図５）。他の全ての条件下の細菌は成長した：未処理細胞、ブフォリンＩＩを含む類似する濃度の対照ＴＦＤ複合体で処理された細胞、ならびに類似する濃度の送達化合物を含む対照、ブフォリンＩＩおよび化合物７を含む対照。したがって、コンセンサスＴＦＤの送達は、同時に２つのグラム陰性病原体を死滅させることができる。
【０１９４】
（実施例５．）
（コンセンサスＳＩＧ  ＴＦＤはインビトロでどちらの大腸菌も死滅させる）
上記のコンセンサス配列（配列番号２、配列番号８、および配列番号１４）の目視検査により、グラム陰性コンセンサス配列を導き出した。
ＧＮｅｇコンセンサス：ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号：２０）
【０１９５】
このコンセンサス配列を有するＴＦＤが大腸菌、緑膿菌、および肺炎桿菌、ならびに他のグラム陰性感染においてＳｉｇ  ＴＦＤとして機能するという予測を検査するために、実験を行った。
【０１９６】
材料および方法
（結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製）
それぞれ、グラム陰性代替シグマタンパク質の一本鎖の認識部位を含有する、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、一緒に結紮して、実施例１に記載されるように亜鈴型ＴＦＤを形成した。使用した配列は、
ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号２１）
ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＤＢ２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  Ａ（配列番号２２）であった。
【０１９７】
（成長アッセイ）
実施例２に記載されるようにＴＦＤ複合体を形成した。成長アッセイは、緑膿菌の培養物の成長への影響を判定するために、ＧＮ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＰＡ＿Ｓｃｒ  ＴＦＤ（実施例２；配列番号１１および１２）のいずれかからなる複合体を使用して行った。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためにアッセイを行い、各ウェルは、８μｇ／ｍＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で補足されたＬＢ媒体からなる２００μＬのブロスを含有する。このポリカチオン性ポリマーは、以前に、これらの細菌の外膜を破壊することによって、グラム陰性菌を透過性にし、それらを抗生物質により敏感にさせることを示している（Ｈｅｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［１９９７］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４３：３１９３−３１９９）。１μＬのＴＦＤ複合体または対照を１→２および１→１０希釈で、各ウェルに添加した。両種の細菌増殖への影響は、振盪しながら３７℃で一晩プレートをインキュベートすることによって評価された。
【０１９８】
結果
（ＧＮ  ＴＦＤ複合体は、インビトロで大腸菌を効果的に死滅させることができる）
全てのＧＮ  ＴＦＤ複合体およびＰＥＩの希釈物で処理された細胞だけが本アッセイで成長しなかった（図８）。他の全ての条件下の細菌は成長した：未処理細胞、ＰＥＩを含む類似する濃度の対照ＴＦＤ複合体で処理された細胞、ならびに類似する濃度の送達化合物、ＰＥＩ、および化合物７を含む対照。したがって、ＰＥＩによって媒介されるコンセンサスＴＦＤの送達は、大腸菌種を死滅させることができる。ＰＥＩは、ブフォリンＩＩまたは他の抗微生物性ペプチドの使用に対していくつかの利点を有する：低コストの商品製品であり、非毒性であると考えられ（Ｈｅｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［１９９８］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４４：３８５−３９０）、したがって、ＴＦＤの製剤化において適切な賦形剤であると考えられてもよい。
【図１】
2013523111.tif 000013
【図２】
2013523111.tif 000014
【図３】
2013523111.tif 000015
【図４】
2013523111.tif 000016
【図５】
2013523111.tif 000017
【図６】
2013523111.tif 000018
【図７】
2013523111.tif 000019
【図８】
2013523111.tif 000020
【配列表】
2013523111000001.app
【国際調査報告】
2013523111.tif 000021
2013523111.tif 000022
2013523111.tif 000023
2013523111.tif 000024
2013523111.tif 000025
2013523111.tif 000026