(57)【要約】  本発明はａ）ＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子１）またはＳＤＦ−１ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えた、その変異体またはフラグメントから選択された第一のポリペプチド、およびｂ）ＧＰＶＩ（糖タンパク質ＶＩ）、または前記ＧＰＶＩの細胞外領域、またはＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えた、前記ＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体から選択された第二のポリペプチド、を含む融合タンパク質に関する。本発明はさらに病気の治療のための融合タンパク質の使用に関する。【選択図】図１
2013523103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子１）、またはＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えた、その変異体またはフラグメントから選択された第一のポリペプチド、および
ｂ）ＧＰＶＩ（糖タンパク質ＶＩ）、または前記ＧＰＶＩの細胞外領域、またはＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えた、前記ＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体から選択された第二のポリペプチド、を含む融合タンパク質であって、
前記第一のポリペプチドおよび前記第二のペプチドが直接または第一のリンカー分子を介して互いにリンクしている、融合タンパク質。
【請求項２】
前記第一のポリペプチドがアミノ酸配列を備え、該第一のポリペプチドが配列番号１、２または３またはその変異体またはフラグメントから選択され、該変異体またはフラグメントがＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えていることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ペプチダーゼ／プロテアーゼ耐性のあるＳＤＦ−１変異体、特に基質−メタロプロテイナーゼおよび／またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性のある変異体が使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記第二のポリペプチドがアミノ酸配列を備え、該アミノ酸配列が配列番号４または５から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第二のポリペプチドが前記ＧＰＶＩの細胞外領域、または前記ＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えた、前記ＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体であり、および前記第二のポリペプチドが二量化するポリペプチドとリンクされることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記二量化するポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域またはそのフラグメントまたは変異体を備え、該フラグメントまたは変異体がＦｃ領域の二量化機能を備えていることを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域であることを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
二量化するペプチドが直接または第二のリンカー分子を介して前記第二のポリペプチドとリンクすることを特徴とする、請求項５〜７のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第一のリンカー分子が添付の配列表からの配列番号５の配列を備えていることを特徴とする、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が配列番号６または７を備えていることを特徴とする、請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質を備えたホモ二量体。
【請求項１２】
以下のグループから選択した配列：
ａ）融合タンパク質のために配列番号６または７でコードされた核酸配列、またはその変異体であり、該変異体は同じポリペプチドのために遺伝コードの縮重に従ってコードされる；
ｂ）ポリペプチドをコードする核酸配列であり、該ポリペプチドは少なくとも７０％の配列相同性を配列番号６でコードされたポリペプチドに対して備えており、その際核酸配列がポリペプチドをコードし、そのＮ末端からＣ末端ＳＤＦ−１まで、第一のリンカー分子のためにコードされる核酸配列、ＧＰＶＩの細胞外領域またはコラーゲンに結合できる状態であるその変異体、第二のリンカー分子をコードする核酸配列、および二量化するポリペプチドのためにコードする核酸配列を含み、この核酸配列はその趣意において、核酸によってコードされたタンパク質が、細胞がコラーゲンおよび／またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７と結合できる状態である形状に発現可能にするよう機能できる状態である；
ｃ）５'−３'−方向に第一のセクションを備え、このセクションがＳＤＦ−１のためにまたはペプチダーゼ−／プロテアーゼ耐性のあるその変異体またはフラグメントのためにコードされ、これらはＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えたポリペプチドのためにコードされる核酸、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのためにコードされる第二のセクション、ＧＰＶＩの細胞外領域またはＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えた、ＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体のためにコードされる第三のセクション、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを持つリンカー分子のためにコードされるセクション、およびＦｃ領域のためにコードされる第四のセクションまたは機能可能であるその保存的変異体で、これらは核酸によってコードされたタンパク質が、細胞がコラーゲンおよびＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７と結合できる状態である形状に発現可能にするよう機能できる状態である
を含む核酸分子
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を備えたベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１１または１４のうちのいずれか一項に記載の、融合タンパク質を発現する細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質を、必要に応じて薬学的に許容可能なキャリア、希釈液または補助物質と共に、薬学的に有効な分量含む医薬組成物。
【請求項１７】
融合タンパク質を有効成分と組み合わせて含んでいる医薬組成物であって、該有効成分が以下：Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の少なくとも１つから選ばれていることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項１４に記載の融合タンパク質、または請求項１６または１７に記載の医薬組成物の、特に病気の治療のための、または特に血管または組織の再生のための、または造血および血管形成の改善のための、医薬品としての使用。
【請求項１９】
心臓血管の病気、動脈硬化症、心筋炎、心筋梗塞、拡張型心筋症から病気が選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
使用が、心筋、慢性進行性多発硬化症による血液脳関門、線維症肝切除、特にステント内挿後の血管内皮の再生、または内皮炎症、骨髄アブレーション後または糖尿病による組織創傷および血管創傷のために実施されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に血管、臓器または組織の損傷の治療または再生のための、または造血の改善のための治療ポテンシャルを備えた融合タンパク質に関する。さらに、本発明はこの融合タンパク質をコードする核酸分子、融合タンパク質を含む医薬組成物、血管または組織の損傷の治療、並びに急性のまたは慢性の血管疾患の手のための融合タンパク質または医薬組成物の使用、または同じく再生または新生のための、つまり血管形成のための、並びに造血の改善／補助のための融合タンパク質または医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の血管および組織の病的な変化には、物理的負傷の他に、さまざまな所見または疾病がその根底にある。これに関して、例えばステントのまたはステントグラフト内挿時に生じ得る負傷、ウイルス性のまたは細菌性の感染、糖尿病によって生じる損傷などが数えられる。また動脈硬化症の場合も、血管壁の変化として動脈の変性、つまり特に瘤および蓄積が生じ、その際その発生のためにやはり異なった要因が寄与し得る。例えば心筋の疾病の場合、血管の変化は梗塞または心筋炎を結果としてもたらし得る。
【０００３】
ごく一般的には、血管壁の傷は血管壁の完全性を損ない、ひいては周辺組織に出血することになりかねない。このことを阻止するため、血小板は可溶性の血漿成分と共に止血性血小板塞栓を形成し、この血小板塞栓は傷を塞いで止血する。血管に損傷が生じるやいなや直ちに、止血に必要なさまざまな細胞メカニズムおよび生化学メカニズムが活動を始める。動脈の止血の場合、血漿リポタンパク質の浸透性調整、白血球付着および血栓形成促進性因子および抗血栓因子並びに血管作用性物質の分泌により、内皮も中心的な役割を演じる。
【０００４】
内皮は単層の血管壁内膜であり、血流を内皮下層のトロンボゲン形成構造から隔離する。血管壁の内皮が傷つき、そのために血栓を形成する内皮下層の基質が露出すると、止血の目的で付着のために、休止している、血液内を循環している血小板が今や露出したコラーゲンのところに集まる。この最初の付着過程は、血小板の膜糖タンパク受容体（インテグリン）によってコントロールされ、形状変化、血小板活性化および貯蔵顆粒からの成分遊離が結果として生じる。その際、血小板糖タンパク質ＶＩ（以下では「ＧＰＶＩ」とも短縮される）が直接露出しているコラーゲンと相互作用し、形成を安定化させる。ＧＰＶＩは最も重要なコラーゲン受容体として、直接コラーゲンと固定的な結合を仲介するだけでなく、他の、付着に必要な受容体の活性化も仲介する。付着後、止血の次のステップとして凝集が行われ、これは血小板塞栓内での血小板の蓄積を結果としてもたらす。そのために血小板活性化の際にＧＰＶＩがコラーゲン受容体として血小板表面上で決定的な役割を果たし、心筋梗塞の危険因子とも見なされる。そのような血小板塞栓が生じることによって、組織への血液供給がもはや保証されず、その結果血小板塞栓より遠位にある組織が虚血状態になり得る。
【０００５】
こうして例えば狭心症または心筋梗塞のような心臓血管系疾患は、現在もなお、全世界の死因の約３分の１を占めている。これらの疾病においては、虚血に見舞われた冠動脈の迅速な再灌流は、心筋の損傷を阻止するために最も重要である。冠状動脈内の血流が減らされるとすぐに、筋細胞に非可逆性の傷が生じ、この傷は心筋中の機能代謝を停止させ、それによって壊死およびアポトーシスを経て最終的に細胞死に至る。
【０００６】
組織、血管または臓器の再生は、心筋も含め、該当する損傷ないし発病した箇所への幹細胞の小増殖の動員および蓄積に大きく左右される。一般に組織／臓器／血管の損傷上には刺激が与えられ、その刺激に基づいて、この幹細胞が増加し、末梢血内で循環し、損傷した範囲に付着する。骨髄からのＣＤ３４＋幹細胞が、血管内皮の完全性を促進することが知られている。なぜなら、これは該当する箇所に付着後、内皮細胞に分化しうるからである。
【０００７】
この前駆細胞の該当する箇所への、狙いを定めかつ制御された動員は、自然な再内皮化を促進するための好ましいツールであろう。
【０００８】
特許文献１から、二重特異性融合タンパク質が公知であり、この二重特異性融合タンパク質を介して一方で狙いを定めて前駆細胞を組織／血管に動員することができる。そのためにコラーゲン結合領域（ＧＰＶＩ）を介して融合タンパク質が損傷した組織／血管箇所と結合され、これを介して前駆細胞と結合する領域に前駆細胞を動員され得る。
【０００９】
しかし、依然として他の代替の生成物および物質への大きな需要があり、これらを介して該当する箇所への前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞の改良された動員が実行し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００８／１０１７００
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｅｇｅｒｓ他、（「Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ−  １  ｆｏｒ  Ｓｔｅｒｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００７年、１１６：１６８３〜１６９２ページ
【非特許文献２】Ｍａｓｓｂｅｒｇ他「Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｄｉｍｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００４年；１８号：３９７〜３９９
【非特許文献３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  および  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版
【非特許文献４】Ｋｉｂｂｅ  Ａ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明の課題は、組織疾患および血管疾患、特に心臓血管の治療、並びに損傷した組織または血管の再生のために使用され得る新しい手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明により、この課題は融合タンパク質によって解決され、この融合タンパク質は、ａ）第一のポリペプチドを備え、このポリペプチドはＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子１）またはその変異体またはフラグメントから選択されており、この変異体またはフラグメントはＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えており、およびｂ）第二のポリペプチドを備えており、このポリペプチドはＧＰＶＩ（糖タンパク質ＶＩ）、またはＧＰＶＩの細胞外領域、またはＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体から選択されており、この変異体またはフラグメントはＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えている。
【００１４】
本発明の根底にある課題はさらに、本発明による融合タンパク質が薬学的に有効な分量含んでいる医薬組成物により解決され、場合によっては薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、並びに本発明による融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物を、特に心臓血管の疾患の治療のために、組織、臓器および血管の内皮再生のために、並びに造血および血管形成の促進のために医薬品として使用することにより解決される。
【００１５】
本発明による融合タンパク質は、第二のポリペプチド、つまりコラーゲンに結合するＧＰＶＩを介して、あるいはＧＰＶＩの細胞外領域、またはＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体（これらはＧＰＶＩコラーゲン結合機能を有する）を介して、コラーゲンと結合し、および第一のポリペプチド、つまりＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子１）または変異体またはそのフラグメント（これらはＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４−／ＣＸＣＲ−７−結合機能を有する）を介して、ＣＤ３４＋細胞（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の受容体を有する）を備えており、結合しおよびそれによってコラーゲンが露出している場所に、すなわち特に損傷した血管、臓器または組織に動員される。本発明による融合タンパク質を介して損傷に動員された前駆細胞は、続いて内皮細胞に分化し、病気になった組織、臓器、または血管の再生のためにおよび最後には治療のために働く。
【００１６】
本願においては、「融合タンパク質」はハイブリッドタンパク質ないし人工タンパク質と理解され、この融合タンパク質はインビトロで、しかしインビボでも、従来技術によって公知の分子生物学的方法または化学的方法により、２つの（または複数の）（ポリ）−ペプチド（これらはそうでなければ、ないし自然には互いに結合またはリンクしない、またはさもなければ自然に発生しない）を結合またはリンクすることで、製造可能である。こうして融合タンパク質は例えば、２つの（または複数の）ポリペプチドを１つまたは複数の化学的試薬を使用してまたはＤＮＡ組み換え技術により共役させることで、つまりタンパク質のためにコードされる核酸を遺伝子的に「リンク」して、作り出される。その際融合タンパク質を一般的な発現ベクターの使用によって発生させ得る可能性があり、この発現ベクターは本発明による融合タンパク質をコードする。この発現ベクターは、適切な細胞内に挿入され、融合タンパク質を生成する。
【００１７】
「フラグメント」または「変異体」とは、各ポリペプチドの結合機能を備えており、本願ではアミノ酸配列と理解され、このアミノ酸配列は野生型配列ないし本願中に提示された配列とは１つまたは複数のアミノ酸置換で区別される。そのような修飾アミノ酸は「構造的」アミノ酸置換を備え、その際には置換されたアミノ酸は代替アミノ酸と同じまたは類似した性質を備えている。類似した小さな変更には、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入も含まれている。どの、およびいくつのアミノ酸残基が生物活性を失わずに、置換、挿入または欠失できるかを決めるための手引きは、例えば従来技術で公知のコンピュータープログラムを使用して見つけることができる。本願に含まれるタンパク質またはポリペプチドの変異体またはそのフラグメントは、ＧＰＶＩ−、またはＳＤＦ−１−タンパク質を含み、これらはそれぞれＧＰＶＩ−結合特性またはＳＤＦ−１−結合特性を備えており、すなわち同じまたはほぼ同等である。修飾ＧＰＶＩ−またはＳＤＦ−１ポリペプチドが非修飾ＧＰＶＩ−またはＳＤＦ−１−ポリペプチドの結合特性を備えているかどうかは、本願中以下に詳細に述べているように、例えばインビトロアッセイで検査可能である。したがって変異体はポリペプチドも含み、それぞれ、それぞれの野生型ポリペプチド／野生型タンパク質と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有している。２つのアミノ酸配列または核酸配列の配列同一性のパーセンテージを特定するため、従来技術に従って公知の方法、例えばアライメントおよび数学的アルゴリズムによる計算を使って、行うことができる。
【００１８】
「リンカー」または「スペーサー」または「リンカー分子」は、本願では同義語として使用され、本発明ではアミノ酸配列またはこのコードされた核酸配列の１つが、最大１００アミノ酸／基と理解され、これが２つの機能的ポリペプチドのリンクとして働き、および場合によっては機能的ポリペプチドの間に間隔が生成され、その際生物活性または他の分子への結合特性を有することがない。これは本願では「中立的」配列であり、それ以外は直前に記述した機能を他のどれもが満たさないかまたは満たすことができない。
【００１９】
特に好ましい一実施形態では、本発明による融合タンパク質により、ペプチダーゼ−／プロテアーゼ、特にジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性のあるＳＤＦ−１変異体が第一のポリペプチドとして挿入され、特に基質−メタロプロテイナーゼ耐性のある変異体も挿入される。
【００２０】
ＳＤＦ−１は、特に基質−メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２から分離され、それによってその化学走性の生物活性が失われる。これは修飾ＳＤＦ−１−変異体を挿入することで阻止することができ、この変異体はＭＭＰ−２に対して耐性があるがその化学走性の生物活性を保持している。このＳＤＦ−１−変異体の例は、例えば非特許文献１に記述されている。ＳＤＦ−１−変異体はこの文献ではＳ−ＳＤＦ−１と呼ばれており、それが例として明示的に参照される。
【００２１】
本願の発明者は、本発明による融合タンパク質が可溶性のコラーゲンに、および特定の細胞のＣＸＣＲ４受容体に結合可能であることを自験において示すことができた。さらに、融合タンパク質が造血幹細胞の化学走性を活発にすることができたことを示すことができた。このことは、融合タンパク質によってＣＸＣＲ４＋前駆細胞が動員され得ること、および融合タンパク質のＳＤＦ−１−部分がまだ正常に機能可能であることを示している。それに従い、本発明による融合タンパク質により、簡単で狙いを定めた方法で損傷した血管ないし各組織の再内皮化および修復が可能であり、これらは損傷またはその他の影響によってその表面にコラーゲンが露出したか露わになったもので、幹細胞の定着およびその成熟により治療できる。
【００２２】
さらに、本発明による融合タンパク質により造血を改善することも可能であり、そのことは特に骨髄アブレーションまたは骨髄移植の際に必要である。本発明による融合タンパク質は、上記の手術の際に化学療法または放射線療法後にＧＰＶＩのコラーゲン結合箇所で使用可能であり、結合し、骨髄内に蓄積し、および幹細胞の前駆細胞の動員によって、骨髄の再増殖および血液細胞形成がこの箇所で促進され支援される。
【００２３】
内皮前駆細胞は、大きな非白血球細胞の、循環する、脊髄から導き出される細胞増殖を示し、これは血管修復および止血に関与する。
【００２４】
受容体ＧＰＶＩは、最も重要なコラーゲンの血小板受容体である。ＧＰＶＩは血小板の凝集、分泌、形状変化および活性化を可能にする。ヒトのＧＰＶＩは、２０アミノ酸を含むシグナル配列、２４７アミノ酸の細胞外領域、並びに２１アミノ酸長の膜内外領域および５１アミノ酸長の細胞質性尾部を含んでいる。
【００２５】
コラーゲンへの結合は細胞外領域に仲介されるため、本発明による融合タンパク質の一実施形態においては、第一のポリペプチドがＧＰＶＩの細胞外部分、またはＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体を備えており、このフラグメントまたは変異体がＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を有しており、二量体化されたペプチドと結合することが好ましい。
【００２６】
その際例えばすでに可溶性であるＧＰＶＩを使用できると有利であり、以前従来技術で記述されている（非特許文献２）。その際可溶性のヒトＧＰＶＩの作製に関してこの出版物は明示的に参照される。
【００２７】
可溶性のＧＰＶＩは、二量体形としてのみ、例えば免疫グロブリン−Ｆｃ領域と結合して、コラーゲンに対する親和力を示す。この可溶性のＧＰＶＩを生成するため、ヒトＧＰＶＩの細胞外部分をクローン化し、ヒト免疫グロブリン−Ｆｃ領域と結合することができる。このＧＰＶＩ−Ｆｃタンパク質（以下では、可溶性のＧＰＶＩ−Ｆｃとも呼ばれる）は、例えばアデノウイルスを使用してヒトＨｅＬａ細胞株が発現可能である。そのような可溶性のＧＰＶＩ−Ｆｃは、インビトロでもインビボでもコラーゲンへの付着が証明されている。
【００２８】
当業者にとっては本発明による機能の実現、すなわちＧＰＶＩに関して、コラーゲンへの結合は、融合タンパク質を非強制的に完全ないし同一の可溶性のＧＰＶＩのアミノ酸配列に投入しなければならないことは明かである。むしろ、本発明による融合タンパク質の機能は、第二のポリペプチドが可溶性のＧＰＶＩの１つのセクションまたは１つの配列変異体を備えていることによっても実現され、しかしこれらがＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を場合によって軽減した形で実行される。周知のようにタンパク新生のアミノ酸は４つのグループ、すなわち極性、非極性、酸性、塩基性のアミノ酸に区分される。極性アミノ酸と他の極性アミノ酸との置換、例えばグリシンとセリンとの置換は、一般に、対応するタンパク質の生物活性だけに、小さなまたはわずかな変化がもたらされ、その結果そのようなアミノ酸置換は、本発明による融合タンパク質にその機能においてさらなる影響をもたらさない。このような背景から、本発明はまたそのような融合タンパク質を、第一のポリペプチドとして可溶性のＧＰＶＩの変異体として、１つまたは複数のアミノ酸が上記のアミノ酸クラスの１つで同じクラスの他のアミノ酸と置換される。そのような配列変異体は、その際好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％および最も好ましくは約９０〜９５％、可溶性のＧＰＶＩのアミノ酸配列に対して相同である。
【００２９】
「Ｆｃ」は「ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、結晶化可能フラグメント」の略である。このフラグメントは２つのＦａｂ−フラグメントと並んでＩｇＧ分子のパパイン分解によって生じる。Ｆｃ領域は、対になったＣＨ２およびＣＨ３領域からなり、ヒンジ領域（英語「ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ」）を含み、二量化機能を担う免疫グロブリンの一部を含有する。有利には、ここで商用ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によって分離することができるか、またはやはり市販の購入可能なすでに核外遺伝子内でクローン化されてある、市販のヒトまたはマウス−ＦｃＤＮＡを用いることができる（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディアゴ、米国から入手可能）。
【００３０】
フラグメントないし変異体がさらに場合によって抗体の弱められた二量化機能を備えている限りにおいて、第二のポリペプチドの本発明による機能を損なうことなくＦｃ領域のフラグメントまたは変異体も使用し得ることは明らかである。フラグメントまたは変異体と同程度と見なされる、ＧＰＶＩのフラグメントまたは変異体に関する上記の実施形態を参照のこと。
【００３１】
その他の点に関しては、二量化機能を備えた他のいずれの分子も、それによってＧＰＶＩの二量化が保証される限りにおいて、本願の融合タンパク質も組み込まれることが可能である。他の二量化分子の相応する配列が、Ｆｃ部分の代わりに融合タンパク質内に組み込まれ得ることは当業者には明確であろう。
【００３２】
二量化分子はそのアミノ酸配列に関して、タンパク質のセクションを備え、このセクションは２つの別個のタンパク質またはサブユニットタンパク質の二量化の仲介に関係するように形成されている。この処置も、当業者にとっては簡単なことである。なぜならペプチド二量体複合体のアミノ酸配列を含む微細構造は、さまざまな複数のタンパク質について、従来技術において詳細に記述されているからである。公知の二量体を形成する、その配列および構造が公知のタンパク質、Ｇ−タンパク質、ヒストン、インターフェロンγ、インターロイキン−２受容体、Ｈｓｐ９０、チロシンキナーゼ、ＩｇＧ分子などを含んでいる。それぞれの、挙げられたタンパク質の二量化を仲介する領域は、本発明による融合タンパク質を生成するために直接継承され得る。この領域を、標的突然変異によってまたはＣおよび／またはＮ末端を個々のアミノ酸を付加することによって、修飾し、その結果例えば融合タンパク質の免疫活性が低減され、そのことが融合タンパク質の生成の改善を可能にするが二量化機能は引き続き保持されることは、ぜひとも望まれてよい。
【００３３】
一実施例において、好ましくは、Ｆｃ領域の変異体または合成Ｆｃフラグメントが使用される場合に、これらが補体−およびＦｃ受容体の結合領域で、免疫系の活性化がさらに低減され、および場合によって消失するように突然変異する。こうして例えば１個のＦｃフラグメントが挿入され得、そのフラグメントにおいて、位置３３１での標的突然変異によりプロリンがセリンと、およびアミノ酸位置２３４から２３７までテトラペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙがＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａと置換される。
【００３４】
第一の実施形態において、好ましくは、第一のポリペプチドが、添付の配列表配列番号１、２または３のアミノ酸配列を備えている。
【００３５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ヒトＳＤＦ−１の配列を示し、配列番号２で表されるアミノ酸配列はアイソフォームＳＤＦ−１アルファ（リーダー配列なし）を示し、配列番号３で表されるアミノ酸配列はアイソフォームＳＤＦ−１ベータ（リーダー配列なし）を示す。ＳＤＦ−１は翻訳後に、特にリーダー配列が修飾され、配列番号８に示され、切断される。ＳＤＦ−１は、ＣＸＣモチーフケモカイングループの内因性ケモカインであり、ＣＸＣＬ１２とも表される。ＳＤＦ−１はケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ７を結合し、これらはＧ−タンパク質に連結された受容体に属し、およびＳＤＦ−１の結合によって活性化される。
【００３６】
別の一実施形態において、好ましくは、第二のポリペプチドが、添付の配列表配列番号４のアミノ酸配列を備えている。
【００３７】
アミノ酸配列配列番号４はヒトＧＰＶＩの細胞外領域を表し、膜貫通領域の２つの別のアミノ酸を含んでいる。その変異体またはフラグメントも、ＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えており、本発明の目的に適していることは明かである。当業者はその際例えば、従来技術ですでに公知の変異体を用いる（これは例えばＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅｓ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）で見つけることができる）か、またはしかし自己の容易に思いつく試行によって、例えばアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入によって、そのようなフラグメント／変異体を生成させる。
【００３８】
上述したように、特に好ましくは、第二のポリペプチドがＧＰＶＩの細胞外領域、またはＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体であり、ＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えており、および第二のポリペプチドが二量化するポリペプチドと、特に免疫グロブリンのＦｃ領域またはそのフラグメントまたは変異体とリンクし、このフラグメントまたは変異体はＦｃ領域の二量化機能を備えている。
【００３９】
その際好ましい一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域である。
【００４０】
別の実施形態では、好ましくは、二量化するペプチドが直接または第二のリンカー分子／スペーサーを介して第二のポリペプチドとリンクされる。その際一実施形態では、好ましくは、第二のリンカー分子が配列グリシン−グリシン−アルギニンを備えている。他の配列も使用され得ることは明かであり、好ましくはその極性に関して上述に類似した配列である。その際、二量化するペプチドを第二のポリペプチドとリンクするために、当業者の能力と知識に適した配列を同定しおよびそれに対応して融合タンパク質内に組み込む。
【００４１】
別の一実施形態に従い、これを介して第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと好ましい一実施形態で互いにリンクされるリンカー分子は、添付の配列表からの配列番号５の配列を備えている。特に提示したリンカー分子と比較して、対応する融合タンパク質の生物活性をまったく変えないかまたはわずかしか変えないような他のリンカー分子を２つのポリペプチドをリンクするために使用でき、その結果そのようなアミノ酸置換が本発明による融合タンパク質の機能を引き続き保持させることも明かである。
【００４２】
本発明による融合タンパク質の一実施形態に従い、好ましくは、アミノ酸配列が配列番号６または７を備えている。２つの配列は、配列番号６で表される配列が分泌シグナル用配列を備えており、他方配列番号７を備えた配列がこの配列を含んでいないことによって区別される。
【００４３】
本発明はさらに核酸分子に関し、この核酸分子は以下のグループから選択された配列を含んでいる：
ａ）融合タンパク質のために配列番号６または７でコードされた核酸配列、またはその変異体であり、この変異体は同じポリペプチドのために遺伝コードの縮重に従ってコードされる；
ｂ）ポリペプチドをコードする核酸配列であり、このポリペプチドは少なくとも７０％の配列相同性を配列番号６でコードされたポリペプチドに対して備えており、その際核酸配列がポリペプチドをコードし、そのＮ末端からＣ末端ＳＤＦ−１まで、第一のリンカー分子のためにコードされる核酸配列、ＧＰＶＩの細胞外領域またはコラーゲンに結合できる状態であるその変異体、第二のリンカー分子をコードする核酸配列、および二量化するポリペプチドのためにコードする核酸配列を含み、この核酸配列はその趣意において、核酸によってコードされたタンパク質が、細胞がコラーゲンおよび／またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７と結合できる状態である形状に発現可能にするよう機能できる状態である。
ｃ）５'−３'−方向に第一のセクションを備え、このセクションがＳＤＦ−１のためにまたはペプチダーゼ−／プロテアーゼ耐性のあるその変異体またはフラグメントのためにコードされ、これらはＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７−結合機能を備えたポリペプチドのためにコードされる核酸、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのためにコードされる第二のセクション、ＧＰＶＩの細胞外領域またはＧＰＶＩのコラーゲン結合機能を備えた、ＧＰＶＩの細胞外領域のフラグメントまたは変異体のためにコードされる第三のセクション、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを持つリンカー分子のためにコードされるセクション、およびＦｃ領域のためにコードされる第四のセクションまたは機能可能であるその保存的変異体で、これらは核酸によってコードされたタンパク質が、細胞がコラーゲンおよび／またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７と結合できる状態である形状に発現可能にするよう機能できる状態である。
【００４４】
本発明はさらに、本発明による核酸を含むベクターに関する。加えて、本発明は本発明による核酸によってコードされる融合タンパク質、ならびに本発明による融合タンパク質が発現する細胞に関する。
【００４５】
本発明による融合タンパク質は、専門分野で公知の組み換え型発現ベクターを使用して生成されることができる。本願では、「ベクター」／「発現ベクター」は複製可能ＤＮＡ構築物と理解され、本発明による融合タンパク質の発現のためにコードするＤＮＡが使用される。これは遺伝子発現の際の制御作用を持つ１つまたは複数の遺伝因子の配置、例えばプロモーター、オペレーターまたはエンハンサーを含む転写ユニットを含み、これは本発明による融合タンパク質のためにコードするＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列はｍＲＮＡ内に転写されおよびタンパク質に翻訳される）および適切な転写配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列と機能的に結合する。プロモーターの選択および他の制御因子は、一般に挿入された（宿主）細胞によって少しずつ異なる。好ましい一実施形態では、本発明による融合タンパク質のためにコードする核酸は、組み換えＤＮＡ技術を使用して宿主細胞にトランスフェクションする。適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞または真核細胞を含み、当業者はその専門知識に基づいて本明細書と関連させて簡単に入手できる。
【００４６】
組み換え型融合タンパク質を生成するために、発現ベクターを持つ宿主細胞が、本発明による融合タンパク質をコードする核酸を抱え、トランスフェクションないしトランスフォームされており、本発明による融合タンパク質の発現を促進する条件下で培養される。融合タンパク質は、培地または宿主細胞から従来技術で公知の方法で浄化および分離できる（これに関して例えば非特許文献３を参照。
【００４７】
別の一実施形態に従い、本発明はまた、本発明による融合タンパク質を薬学的に有効な分量、場合によって薬学的に許容可能なキャリア、希釈液または補助物質および／または必要に応じてその他の薬学的に有効な物質を含んだ医薬組成物に関する。
【００４８】
必要に応じてその他の添加物を含む薬学的に許容可能なキャリアは、従来技術では一般に公知であり、例えば論文（非特許文献４）に記述されている。添加物には本発明により任意の化合物または組成物を含み、これらは組成物の治療上の使用のために有利であり、それには塩、結合材、溶剤、分散剤およびその他の、医薬品の製剤と関連する通常使用される物質が該当する。
【００４９】
本発明による融合タンパク質は、その際それぞれの治療法に適切な投与に統合されてよい。投与の例には、非経口投与、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与がある。本発明により生成された組成物は、本発明による融合タンパク質を含み、および治療するべき患者に例えば注射によって投与され、融合タンパク質がＧＰＶＩ−領域を経由して内皮損傷の範囲に蓄積し、それによってＳＤＦ−１勾配が生じ、および幹細胞が動員される。それによって極めて効果的なツールが、その原因が血管、臓器ないし組織の損傷である疾病の治療のために提供され、そこではその損傷の結果として血栓形成性内皮が露出している。
【００５０】
一実施形態では、その際好ましくは、本発明による医薬組成物がステントまたはバルーンカテーテルを介した投与のために生成される。
【００５１】
別法として好ましくは、本発明によつ組成物または融合タンパク質が幹細胞溶液を使用してコインキュベートされ（およびこうして幹細胞が融合タンパク質に結合され得る）、およびこうして得られた融合タンパク質−前駆細胞−抱合体が投与される。
【００５２】
特に本発明はまた、本発明による融合タンパク質を有効成分と組み合わせて含んでいる医薬組成物に関し、この有効成分は少なくとも１つのＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤から選択される。
【００５３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶがＳＤＦ−１を非活性化し、その結果融合タンパク質およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤から成る配合剤がＳＤＦ−１の半減期を延長することが公知である。他方で、Ｇ−ＣＳＦが幹細胞の可動化を引き起こすことが公知である。そのために、融合タンパク質とＧ−ＣＳＦの組み合わせが前駆細胞の融合タンパク質への結合比率を高め得る。
【００５４】
本発明はさらに、本発明による融合タンパク質または本発明による医薬組成物の、疾病の治療または特に血管または組織の再生または造血および血管形成の改善のための使用に関する。
【００５５】
すでに詳述したように、本発明による融合タンパク質ないし、その１つを含んでいる医薬組成物を使用して組織、血管または臓器を治療することができ、これらにおいては例えば損傷または疾病によって内皮下層が露出され、その結果一方で融合タンパク質がそのＧＰＶＩ部分を介して、それによって露出したコラーゲンと結合することができ、および他方でＳＤＦ−１部分を介してＣＸＣＲ４＋細胞、つまり特に幹細胞の前駆細胞が損傷した箇所で動員され得る。ここで前駆細胞が内皮細胞に分化し、こうして再内皮化ないし病んだ組織／臓器／血管の治癒に寄与する。
【００５６】
特にその際、心臓血管の病気、動脈硬化症、心筋炎、心筋梗塞から選択された病気を治療することができる。さらに、本発明による融合タンパク質は、心筋の再生、慢性進行性多発硬化症における血液脳関門の再生、線維症肝切除の治療、特にステント内挿後の血管上皮または内皮炎症、骨髄アブレーション後または糖尿病による組織創傷および血管創傷の治療に使用される。それによって特に血管の、例えば冠状血管、脳へ血液を供給する血管、四肢に血液を供給する血管、結合組織、骨、およびコラーゲンを有している各血管または組織の損傷が治療される。
【００５７】
上に挙げて述べられ、以下に説明される特徴は、それぞれ提示された組み合わせだけでなく、他のバリエーションでも、または単独でも、本発明の枠を離れることなく使用可能であることは明かである。
【００５８】
本発明は以下の例において、および図において、詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】本発明によるＳＤＦ−１−ＧＰＶＩ−融合タンパク質の実施形態の模式的構造図である。
【図１Ｂ】本実施形態のタンパク質の発現を示す図であり、その際融合タンパク質の本実施形態３つの領域がイムノブロット解析により、対応する抗体（抗ＳＤＦ−１；抗ＧＰＶＩ；抗ＩｇＧ）が証明され得る。
【図１Ｃ】図１Ａに模式的に示された実施形態のアミノ酸配列であり、分泌シグナル配列を含んでいる。
【図２Ａ】ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によるコラーゲン結合の証明である。
【図２Ｂ】図２Ａの結合は可溶性のコラーゲンのインキュベートにより競合可能であった。
【図３】融合タンパク質の実施形態がＣＸＣＲ４でＣＤ１４+単球へ結合することを示す図であり、ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）競合分析を使用した図である。
【図４】本発明による融合タンパク質による、トランスウェルシステム内でのヒト造血幹細胞の化学走性の濃度依存性刺激を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
図１では１Ａに本発明による融合タンパク質の実施形態の模式図を示しており、その際Ｎ末端からＣ末端まで、順にヒトＳＤＦ−１にリンカー分子が続き、これを介してＳＤＦ−１がＧＰＶＩとリンクされている。リンカー分子は、本実施形態ではアミノ酸鎖（Ｇｌｙｃｉｎ４Ｓｅｒｉｎ）３から成る。ＧＰＶＩ部分にはヒトＩｇＧ２−Ｆｃ部分がリンクされ、この部分は二量化を引き起こす。
【００６１】
図１Ｂは、免疫ブロットを示しており、これを介して融合タンパク質内の個々の成分の発現が、図１Ａで模式的に示したように証明された。左は融合タンパク質内のＳＤＦ−１−部分を検出するために抗ＳＤＦ−１−抗体（単一クローンの抗ヒト／抗マウスＣＸＣＬ１２／ＳＤＦｌアルファ抗体；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社；ミネアポリスＵＳＡ）を使用して、中央は抗ＧＰＶＩ部分を検出するために抗ＧＰＶＩ−抗体を使用して、および右は融合タンパク質内のＩｇＧ２−Ｆｃ部分を検出するために抗ＩｇＧ−抗体を使用して（それぞれ第一の痕跡）証明された。融合タンパク質が約８５ｋＤａの大きさであることが見て取れる。陽性対照として、ＳＤＦ−１の証明のために非可溶性のポリペプチドｈＳＤＦ−１（第三の痕跡）、またはＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ２−構造（ＧＰＶＩ用；第三の痕跡）またはＦｃＩｇＧ２単独（ＦｃＩｇＧ２用：第三の痕跡）が使用された。
【００６２】
図１Ｃでは、上に融合タンパク質の配列が示され、この配列はさらにその５'−末端にさらに２０−アミノ酸の長い分泌シグナル配列（ＩｇＫリーダー配列）を備えている（配列番号６）；配列番号７は図１Ｃの下に示されており、この分泌シグナル配列なしで融合タンパク質が示されている。この分泌シグナル配列は、融合タンパク質の細胞培養上清中へのエクスポートを担っている。この分泌シグナル配列の後に、アミノ酸位置２１から８８までＳＤＦ−１配列（リーダーなし）が続き、これは６８アミノ酸長である。ＳＤＦ−１のリーダー配列（ＭＮＡＫＶＶＶＶＬＶＬＶＬＴＡＬＣＬＳＤＧ;配列番号８）はその際、上述のように含まれていない。それに続いて（位置８９から１０３、配列番号６中）１５アミノ酸長のリンカー／リンカー配列が続き、これを介して細胞外ＧＰＶＩ−領域（位置１０４から３５２）が融合タンパク質とリンクされる。これに関して、やはり短い（３アミノ酸）リンカー（位置３５３から３５５）が続き、これを介して融合タンパク質がまだＩｇＧ２−Ｆｃ部分（位置３５６から５７８）とリンクしている。
【００６３】
図１に示された実施形態は、ＰＣＲ法およびそれぞれ個々のセクションに適したプライマーを使用して生成される。次にこの合成遺伝子はベクターｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ（インビトロゲン）にクローン化された。続いてＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（インビトロゲン）が構造に安定してトランスフェクションされた。細胞は融合タンパク質を上澄み中で発現させ、この上澄みが浄化された。
【００６４】
図２に示されたデータを得るために、コラーゲン−ＧＰＶＩ−ＥＬＩＳＡが実施された。これに関して、１０μｇ／ｍｌのコラーゲンが入れられた９６ウェルプレートがコートされ、ブロッキング溶液でブロックされ、その後で融合タンパク質または対応する対照タンパク質とインキュベートされた。続いて、ペルオキシダーゼ共役抗ヒトＩｇＧ抗体が検知された。以下では、結合カーブの値が４５０ｎｍでの波長測定により検出された。図２Ａでは、融合タンパク質ＳＤＦ１−ＧＰＶＩも対照構造ＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ２も濃度に依存してコラーゲンに結合し、他方でＦｃＩｇＧ２は結合を備えていないことが見て取れる。
【００６５】
図２Ｂには、融合タンパク質を競合阻害剤としての可溶性のコラーゲンとプレインキュベーションすることによって結合がほぼ完全にブロックされたことを示すことができた。
【００６６】
図３には、ＳＤＦ１−ＧＰＶＩのＣＸＣＲ４への結合が、ＦＡＣＳ−競合アッセイを使用して示されている。ここで単球が分離された。なぜなら単球はその表面上にＣＸＣＲ４を発現するからである。この単球は、融合タンパク質とまたは対応する対照タンパク質とインキュベートされ、続いてａＣＸＣＲ４−ＰＥによる標識抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カタログ番号５５５９７４；米国）で染色された。融合タンパク質ＳＤＦ１−ＧＰＶＩのＣＸＣＲ４への結合により、抗体が競合され、それによって後続するＦＡＣＳ分析において抗ａＣＸＣＲ４−ＰＥポジティブに染色された細胞が減少した。これによって分析された細胞数は右下の角で増加する。これにより、融合タンパク質ＳＤＦ１−ＧＰＶＩがＣＸＣＲ４に結合したことを示すことができた。
【００６７】
図４では、融合タンパク質はその化学走性機能について検査された。ここで、トランスウェルプレートの株チャンバ内に融合タンパク質ＳＤＦ１−ＧＰＶＩが異なった濃度で（２μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ）、ｈＳＤＦｌをポジティブ対照としておよび媒体をネガティブ対照として入れられた。ＣＤ３４+造血幹細胞は分離され、それぞれ１５０，０００の細胞が上部チャンバに入れられた。インキュベーター内でインキュベーションが３７℃で６時間行われた後、上部チャンバは捨てられた。下部チャンバ内に移動した細胞は写真撮影され、続いて下部チャンバ内の細胞数が特定された。ここで、下部チャンバの細胞がそれぞれ１分間、ＦＡＣＳを使用して数えられた。この実験により、融合タンパク質ＳＤＦ１−ＧＰＶＩが化学走性の効果があることを示すことができた。
【図１Ｃ】
2013523103.tif 000003
【図１Ａ】
2013523103.tif 000004
【図１Ｂ】
2013523103.tif 000005
【図２Ａ】
2013523103.tif 000006
【図２Ｂ】
2013523103.tif 000007
【図３】
2013523103.tif 000008
【図４】
2013523103.tif 000009
【配列表】
2013523103000001.xml
【国際調査報告】
2013523103.tif 000019
2013523103.tif 000020
2013523103.tif 000021
2013523103.tif 000022
2013523103.tif 000023
2013523103.tif 000024
2013523103.tif 000025
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