(57)【要約】本開示は、抗癌剤候補が、周知の癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力を評価する方法であって、周知の癌細胞株の単一細胞懸濁液をプレートのウェルに入れることと、少なくとも１つの薬物候補を、ウェルに、標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加することと、選択された時間間隔で選択された期間の間光学密度を測定することと、光学密度および時間測定値から動力学的単位値を決定することと、動力学的単位値が正である場合、動力学的単位値を、抗癌剤候補が癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と相関させることと、による方法を提供する。同様の方法は、癌型において、抗癌剤候補がアポトーシスを誘発する能力を評価するために使用されてもよい。【選択図】図３
2013523120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤候補が、周知の癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力を評価する方法であって、
周知の癌細胞株由来の生存癌細胞の単一細胞懸濁液を分光光度計により読み取ることができるプレートの少なくとも１つのウェルに入れることであって、前記癌細胞はウェルの底上に細胞の単層を形成するのに十分な濃度で存在する入れることと、
少なくとも１つの薬物候補を、ウェルに、標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加することと、
約６００ｎｍの波長で、分光光度計を使用し、選択された時間間隔で選択された期間の間ウェルの光学密度を測定することと、
前記光学密度および時間測定値から動力学的単位値を決定することと、
前記動力学的単位を、
ａ）前記動力学的単位値が正である場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と
ｂ）前記動力学的単位値が正でない場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることと、
を含む、方法。
【請求項２】
相関させることは、前記動力学的単位値を、
ａ）前記動力学的単位値が１．５より大きい場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と
ｂ）前記動力学的単位値が１．５未満である場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相関させることは、ほぼ直線領域の勾配を、
ａ）前記動力学的単位値が２より大きい場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と、
ｂ）前記動力学的単位値が２未満である場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相関させることは、ほぼ直線領域の勾配を、
ａ）前記動力学的単位値が３より大きい場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と、
ｂ）前記動力学的単位値が３未満である場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
相関させることは、前記期間にわたる前記光学密度のプロットの勾配が負である場合、前記動力学的単位値を、抗癌剤候補による前記癌細胞株における自然細胞死または壊死の誘発と相関させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞は２×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌細胞は、指数関数的増殖相にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌細胞はプレートの複数のウェルに入れられ、各ウェルは異なる標的薬物候補濃度を有
する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの追加の薬物候補を前記ウェルに追加の標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的薬物候補濃度は０．０１〜１０，０００μΜである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された時間間隔は５〜１０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記期間は１２時間〜１２０時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記周知の癌細胞株は癌型と相関し、前記薬物候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力または誘発することができないことは、前記薬物候補が前記癌細胞型においてアポトーシスを誘発する能力または誘発することができないことと相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
抗癌剤候補がアポトーシスを誘発する能力を評価するための、周知の癌細胞株の細胞の使用であって、周知の癌細胞株由来の生存細胞の単一細胞懸濁液は、分光光度計により読み取ることができるプレートの少なくとも１つのウェルに入れられ、前記癌細胞はウェルの底上に細胞の単層を形成するのに十分な濃度で存在し、
少なくとも１つの薬物候補を、前記ウェルに、標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加し、
約６００ｎｍの波長で、分光光度計を使用し、選択された時間間隔で選択された期間の間前記ウェルの光学密度を測定し、
前記光学密度および時間測定値に対して動力学的単位値を決定し、
前記動力学的単位を、
（ａ）前記動力学的単位値が正である場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と、
（ｂ）前記動力学的単位値が正でない場合、前記抗癌剤候補が前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させる、使用。
【請求項１５】
前記周知の癌細胞株は癌型に相関し、前記薬物候補が、前記癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力、またはすることができないことは、前記薬物候補が、前記癌細胞型においてアポトーシスを誘発する能力またはことができないことと相関する、請求項１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤候補が癌細胞においてアポトーシスを誘発する能力を評価するための分光光度アッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は様々な様式で起こる場合があるが、成功した抗癌剤は、非常に特異的なアポトーシス過程により癌細胞死を引き起こす傾向がある。アポトーシスは、身体による整然とした処分のために、細胞が分解し、それ自体パッケージングするメカニズムである。アポトーシスは細胞がもはや必要なくなり、古くなりすぎ、または損傷もしくは罹患した場合に細胞を処分するために、身体により一般に使用される。実際、癌に至る可能性のある危険な変異を有するいくつかの細胞およびいくつかの初期の癌細胞であっても、自然過程の結果、アポトーシスを受ける可能性がある。
【０００３】
アポトーシス中、細胞はＤＮＡを切断し、保存し、核を縮合させ、過剰な水を廃棄し、ブレブ形成、細胞膜における不規則なバルジの形成などのような、細胞膜の様々な変化を受ける（図１を参照されたい）。アポトーシスは一般的に、いくつかのトリガーのうちの１つが、シグナルをアポトーシスを受けるべき細胞に送った後に起こる。多くの癌細胞では、このメッセージシステムが正確に働かない。なぜならば、細胞がトリガーを検出することができず、トリガーが受理された後シグナルを適正に送ることができず、またはシグナルに基づいて作用することができず、あるいは、細胞がこれらの問題の組み合わせを有する場合さえあるからである。全体的な効果は、いくつかの癌細胞における経験するアポトーシスへの抵抗である。
【０００４】
本明細書で使用される場合、癌は上皮性悪性腫瘍、白血病、リンパ腫および間葉悪性腫瘍を含む。多くの有効な制癌剤は、その過程への抵抗性にかかわらず、癌細胞がアポトーシスを受けるように誘発することができる。したがって、特定の薬物候補が様々な型の癌細胞においてアポトーシスを引き起こすことができるかを判断すること、および他の薬物または薬物候補に比べた場合の薬物候補の有効性を判定することの必要がある。
【０００５】
米国特許第６，０７７，６８４号および米国特許第６，２５８，５５３に記載されるＭｉＣＫアッセイは、現在、患者由来の癌細胞が、１つ以上の型の癌に対して有効であることが知られている特定の薬物に応答してアポトーシスを受けるかどうかを判断するために使用されている。ＭｉＣＫアッセイでは、患者由来の癌細胞が、所与の濃度の単一細胞または小細胞クラスタの懸濁液中に入れられ、マイクロタイタープレートの複数のウェル中の条件に調整することが可能になる。対照溶液または様々な濃度の周知の抗癌剤、一般的には患者の癌型に対し推奨されるそれらの薬物を有する溶液が、１ウェルにつき１つの試験試料を有するウェルに導入される。各ウェルの光学密度がその後定期的に、一般的には数分毎に、ある期間、典型的には数日間測定される。細胞はアポトーシス関連ブレブ形成を受けるので、その光学密度は直線的に増加する。細胞がアポトーシスを受けない、または他の理由で死ぬ場合、その光学密度はこのように変化しない。よって、ウェルに対する光学密度（ＯＤ）対時間のプロットがその時間間隔にわたって正の勾配を有する直線状の曲線となった場合（図２を参照されたい）、そのウェル内の抗癌剤は、患者の癌細胞のアポトーシスを誘発し、その患者に対し好適な療法である。ＯＤ対時間データはまた、動力学的単位を計算するために使用することができ、これは同様に患者に対する療法の適合性と相関する。
【０００６】
ＭｉＣＫアッセイは、周知の抗癌剤の特定の患者の癌細胞への効果を検出するために使
用されているが、他の型のアポトーシス関連細胞／化学的相互作用を研究および評価することができるアッセイのバリエーションを開発する必要が残されている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、抗癌剤候補が、周知の癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力を評価する方法を提供する。方法は、周知の癌細胞株由来の生存癌細胞の単一細胞懸濁液を分光光度計により読み取ることができるプレートの少なくとも１つのウェルに入れること（癌細胞はウェルの底上に細胞の単層を形成するのに十分な濃度で存在する）と、少なくとも１つの薬物候補を、ウェルに、標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加することと、約６００ｎｍの波長で、分光光度計を使用し、選択された時間間隔で選択された期間の間ウェルの光学密度を測定することと、光学密度および時間測定値から動力学的単位値を決定することと、動力学的単位値を、動力学的単位値が正である場合、抗癌剤候補が癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と、または、動力学的単位値が正でない場合、抗癌剤候補が癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることと、を含んでもよい。
【０００８】
さらなる実施形態によれば、同様の方法が、ある癌型において、抗癌剤候補がアポトーシスを誘発する能力を評価するために使用されてもよく、アッセイにおいて使用される周知の癌細胞株はその癌細胞型である。
【０００９】
より特異的な実施形態によれば、相関させることは、動力学的単位値を、動力学的単位値が１．５、２、または３より大きい場合、抗癌剤候補が癌細胞型においてアポトーシスを誘発する能力と、動力学的単位値が１．５、２、または３未満である場合、抗癌剤候補が癌細胞型においてアポトーシスを誘発することができないことと、それぞれ相関させることを含んでもよい。相関させることはまた、動力学的単位値を、動力学的単位値が負である場合、抗癌剤候補による自然細胞死または壊死の誘発と相関させることを含んでもよい。
【００１０】
さらに特異的な実施形態によれば、癌細胞は、２ｘ１０５〜１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で存在する場合がある。癌細胞は、指数関数的または非指数関数的増殖相にある場合がある。特定の実施形態では、特に癌細胞が癌細胞株に由来する場合、指数関数的増殖相にある場合がある。
【００１１】
他の特定の実施形態によれば、少なくとも１つの追加の薬物候補が、追加の標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量でウェルに添加されてもよい。
【００１２】
さらなる実施形態によれば、癌細胞は、プレートの複数のウェルに入れられてもよく、各ウェルは、異なる標的薬物候補濃度を有してもよい。例えば、標的薬物候補濃度は０．０１〜１０，０００μＭであってもよい。
【００１３】
追加の実施形態によれば、選択された時間間隔は、５〜１０であってもよい。期間は１２時間〜１２０時間であってもよい。
【００１４】
追加の実施形態によれば、開示は、抗癌剤候補がアポトーシスを誘発する能力を評価するための、周知の癌細胞株の細胞の使用に関し、周知の癌細胞株由来の生存細胞の単一細胞懸濁液は、分光光度計により読み取ることができるプレートの少なくとも１つのウェルに入れられ、癌細胞はウェルの底上に細胞の単層を形成するのに十分な濃度で存在する。使用は、少なくとも１つの薬物候補を、ウェルに、標的薬物候補濃度を達成するのに十分な量で添加することと、約６００ｎｍの波長で、分光光度計を使用し、選択された時間間隔で選択された期間の間ウェルの光学密度を測定することと、光学密度および時間測定値
に対する動力学的単位値を決定することと、動力学的単位を、（ａ）動力学的単位値が正である場合抗癌剤候補が癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力と、または、（ｂ）動力学的単位値が正でない場合抗癌剤候補が癌細胞株においてアポトーシスを誘発することができないことと相関させることと、を含む。
【００１５】
より特定的な実施形態では、周知の癌細胞株は癌型と相関し、薬物候補が、癌細胞株においてアポトーシスを誘発する能力、またはすることができないことは、薬物候補が、癌細胞型においてアポトーシスを誘発する能力またはことができないことと相関する。
【００１６】
下記略称および用語が、この明細書を通して一般に使用される：
ＯＤ−光学密度
ＭｉＣＫ−ミクロ培養動力学
【００１７】
本実施形態およびその利点のより完全な理解は、添付の図面と併せてなされている下記説明を参照することにより得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】細胞の先行技術の顕微鏡写真を示す。図１Ａは、アポトーシス前の細胞を示す。図１Ｂは、アポトーシス中の、ブレブ形成が起きている時の細胞を示す。図１Ｃは、アポトーシスが完了した、またはほぼ完了した時の細胞を示す。
【図２】抗癌剤が試験される癌細胞においてアポトーシスを誘発するＭｉＣＫアッセイ中の時間対光学密度（ＯＤ）のプロット例を示す先行技術のグラフである。
【図３】ＭｉＣＫアッセイにおけるアポトーシスの誘発、薬物抵抗性、および薬物なしの対照細胞に対する代表的な曲線を示すグラフである。「Ｂ１２」と表示された曲線は、薬物がアポトーシスを誘発する細胞を表すデータを示す。「Ｆ３」と表示された曲線は、薬物に抵抗性である細胞を表すデータを示す。「Ｇ５」と表示された曲線は、いずれの薬物も受けていない対照細胞を表すデータを示す。
【図４】ＭｉＣＫアッセイにおけるアポトーシスまたは壊死の誘発に対する代表的なデータを示すグラフである。「Ｄ２」と表示された曲線は、薬物がアポトーシスを誘発する細胞を表すデータを示す。「Ｄ７」と表示された曲線は薬物が壊死を誘発する、または別法によりアッセイの過程中に壊死を受ける細胞を表すデータを示す。
【図５】ＭｉＣＫアッセイにおける一般的な非薬物誘発細胞死に対する代表的なデータを示すグラフである。「Ｃ４」と表示された曲線はアッセイ過程中における自然細胞死を表すデータを示す。
【図６】異なる癌型に対応する周知の細胞株のイダルビシンに対する応答の評価のための代表的なデータを示すグラフである。
【図７】周知のＣＡＯＶ−３卵巣癌細胞株の異なる化学療法薬に対する応答の評価のための代表的なデータを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、ある期間にわたる光学密度（ＯＤ）を測定する分光光度アッセイを用いて癌細胞においてアポトーシスを引き起こす場合の抗癌剤候補の有効性の評価に関する。１つの実施形態では、開示は、米国特許第６，０７７，６８４号および米国特許第６，２５８，５５３号（どちらも、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されるミクロ培養動力学（ＭｉＣＫ）アッセイに類似するアッセイにおいて薬物候補を癌細胞に適用することにより、そのような抗癌剤候補を評価する方法を含む。
【００２０】
アッセイ
１つの特定の実施形態によれば、アッセイは、抗癌剤候補を選択することと、薬物がそれにより試験される少なくとも１つの周知の癌細胞型を選択することと、により開始して
もよい。実施形態はこれらの周知の癌細胞型を使用して薬物候補を試験する方法、または本明細書でさらに詳細に記載される薬物候補試験におけるこれらの周知の癌細胞型の使用に関してもよい。
【００２１】
癌細胞は、ＲＰＭＩなどのような培地中の単一細胞懸濁液として懸濁されてもよい。本明細書で使用される場合、「単一細胞懸濁液」は、細胞が個々に、または１０細胞以下の凝集塊で分離された液体中の１つ以上の細胞懸濁液である。培地は、他の成分、例えばウシ胎児血清または癌細胞により特異的に要求される成分を含んでもよい。これらの成分は、アッセイの期間、典型的には少なくとも２４時間かつ１２０時間以下、細胞を保持するのに必要なものに限定されてもよい。
【００２２】
懸濁された細胞は、分光光度プレートのウェル中に試料を入れることにより試験されてもよい。細胞は、ＯＤの分光光度測定中、プレートリーダーのビームが通常、一度に１つの細胞層しか通過しないように任意の濃度で懸濁されてもよい。ほとんどの細胞では、２×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬの濃度が使用されてもよい。濃度は、小細胞では増加、大細胞では減少されてもよい。適切な細胞濃度をより正確に決定するために、薬物候補試験試料において使用される細胞懸濁液の体積をプレートの少なくとも１つの濃度試験ウェルに添加してもよい。ウェルが薬物候補の試験中に追加の培地で予め充填される場合、濃度試験ウェルは同様に、追加の培地で予め充填されてもよい。濃度試験ウェルが充填された後、プレートは、細胞がウェルの底に沈殿するように遠心分離されてもよい（例えば、５００ＲＰＭで２分）。細胞濃度がアッセイに適切である場合、細胞は、重なることなく単層を形成するはずである。細胞濃度は、この結果が達成されるまで適切に調節されてもよい。複数の濃度の細胞が、異なる濃度試験ウェルを用いて一度に試験されてもよい。
【００２３】
細胞のプレート内への配置〜薬物候補アッセイの開始の間、一晩中または別の期間、細胞が著しく増殖する場合がある実施形態によれば、細胞濃度は、最初、増殖を可能にするように単層未満を達成するように調節されてもよく、そのために、単層のための十分な細胞が、薬物候補アッセイが開始するときに存在するであろう。
【００２４】
癌細胞は、指数関数的または非指数関数的増殖相である場合がある。特定の実施形態では、特に癌細胞が癌細胞株に由来する場合、それらは指数関数的増殖相である場合がある。
【００２５】
適切な細胞濃度が決定された後、薬物候補アッセイは、プレート内の試験および対照ウェルを適切な体積の培地および適切な数の細胞で充填することにより開始してもよい。他の実施形態では、ウェルは、培地のみで部分的に予め充填され得る。
【００２６】
充填後、細胞は一定期間、例えば少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または１２〜１６時間、１２〜２４時間、もしくは１６〜２４時間プレート条件に対して調整することができてもよい。調整期間は、ある細胞型、例えば白血病／リンパ腫細胞株または通常個々の細胞として存在する他の細胞型では省略されてもよい。調整期間は、一般的には、細胞がその時間中、著しい増殖を経験しないよう十分短い。調整期間は、薬物候補アッセイにおいて使用される癌細胞の型によって変動してもよい。調整は細胞が生きているままで、かつ健康的なままに保つのに好適な条件下で行われてもよい。例えば、プレートは、３７℃で５％Ｃ０２雰囲気下の、加湿インキュベーター中に配置されてもよい。いくつかの細胞型、特に調整期間を受けない細胞型、例えば白血病またはリンパ腫細胞株では、細胞がウェルの底に沈殿するようにプレートは遠心分離されてもよい（例えば、５００ＲＰＭで２分）。
【００２７】
薬物候補および任意の対照薬物または他の対照試料は、調整期間後にウェルに添加され
てもよい。一般的には、薬物候補は、ウェル中の液体の総体積と比べて小体積の培地または他の液体に添加される。例えば、添加される薬物の体積は、ウェル中の液体の総体積の１０％未満であってもよい。薬物候補は、任意の濃度効果の決定が可能になるように、複数希釈で添加されてもよい。多くの薬物候補は、水溶性である場合があるが、水に容易に溶けない薬物候補もまた試験することができる。そのような候補は、任意の適切な担体と混合されてもよい。そのような候補は、好ましくは、実際の臨床用途のために予想される担体と混合されてもよい。粘性のある薬物候補は、試験されるために実質的な希釈を必要とする場合がある。強烈な色を有する薬物候補は、この薬物候補のみを含む試験ウェル中のＯＤのモニタリングおよび試験試料ウェルに対する測定からのこのＯＤの減算から恩恵を受ける場合がある。
【００２８】
薬物候補の添加後、細胞は、もう１つの短い調整期間、例えば１５分または３０分が与えられてもよい。細胞は、細胞が生きたままで、かつ健康的に保たれるのに好適な条件下に配置されてもよい。例えば、プレートは、３７℃、５％Ｃ０２雰囲気下の加湿インキュベーター中に配置されてもよい。この短い調整期間後、培地中のＣ０２が維持されるように、鉱物油層が各ウェルの上面に配置されてもよい。
【００２９】
その後、プレートは各ウェルに対し、所与の時間間隔で、所与の総期間の間６００ｎｍの波長でＯＤを測定するように構成された分光光度計内に配置されてもよい。例えば、各ウェルに対するＯＤは、秒、分、または時間のタイムフレームにわたり、２４〜１２０時間の間、定期的に測定されてもよい。ある特定の細胞では、１２時間という短い期間での測定で十分であるかもしれない。特定の実施形態では、測定は５〜１０分毎に実施されてもよい。分光光度計は、細胞の自然死を避けるためにインキュベートされたチャンバを有してもよい。
【００３０】
分光光度データは、動力学的単位に変換されてもよい。動力学的単位は、細胞ブレブ形成により引き起こされた６００ｎｍでのＯＤ変化が、時間の関数としてプロットされた場合に作成された曲線の勾配により決定される。動力学的単位の計算に関する具体的情報は、Kravtsov, Vladimir D. et al, Use of the Microculture Kinetic Assay of Apoptosis to Determine Chemosensitivities of Leukemias, Blood 92:968-980 (1998)（参照により本明細書に組み込まれる）において提供される。所与濃度の所与薬物候補に対する光学密度は時間に対してプロットされてもよい。このプロットは、細胞がアポトーシスを受けている場合、特徴的な増加曲線を与える。細胞がアポトーシスを受ける場合に得られる曲線の例は、図３および図４で示される。比較すると、薬物候補が細胞に効果を有さない（例えば、それらが抵抗性である）場合、曲線は薬物または薬物候補を有しない対照試料に対して得られるものと類似する（図３）。アポトーシス以外の理由による細胞死はまた、現アッセイにより決定することができ、薬物候補スクリーニングから偽陽性を排除するのに有用である。例えば、細胞壊死は、図４で示されるように、アポトーシス関連曲線から容易に区別できる特徴的な右下がり曲線を生成させる。さらに、一般的な細胞死はまた、図５に示されるように下降曲線を引き起こす。
【００３１】
薬物候補の有効性は、改良ＭｉＣＫアッセイにおいて周知の細胞株を用いて生成される動力学的単位の値によって決定されてもよい。動力学的単位は下記のように決定されてもよい。
ＫＵ＝（Ｖｍａｘ薬物処理−Ｖｍａｘ対照）×６０×ｙ／（ＯＤ細胞−ＯＤブランク）。Ｖｍａｘは、最大動的速度であり、これは細胞がアポトーシスを受けている時のＯＤ対時間プロットにおける急増の勾配である。この式におけるＶｍａｘは、ミリ光学密度単位／時間（ｍＯＤ／ｈ）で与えられる。ＯＤ細胞は細胞を含む対照の初期ＯＤであり、ＯＤブランクは培地のみまたは培地および薬物を含むブランクウェルの初期ＯＤであり（その薬物はいくつかの薬物では省略されてもよいが、特に着色薬物では、ブランクに含められて
もよい）、ｙはアッセイされる細胞型に依存する係数であり、実験的に細胞株の観察を通して決定されてもよい。この式に関するさらなる情報は、Kravtsov et alにおいて見いだされる場合がある。
【００３２】
薬物候補がアポトーシスを引き起こすかどうかの決定を可能にする他に、現アッセイを用いて作成される動力学的単位値は、特定の薬物候補が現在の薬物より良好に、または同様に機能するかどうかを決定するために、比較されてもよい。異なる濃度の薬物候補の比較もまた、実施されてもよく、適切な用量の一般的な指示を提供することができる。時には、いくつかの薬物は、いくつかの癌において、より低い濃度よりもより高い濃度で機能が悪くなる場合がある。異なる濃度の薬物候補に対する動力学的単位値の比較は、同様のプロファイルを有する薬物候補を同定する場合がある。
【００３３】
全体に、抗癌剤候補の評価は、その薬物候補の癌細胞のアポトーシスに対する効果の何等かの決定を含む場合がある。効果としては、アポトーシスの誘発、周知の制癌剤に比べた場合のアポトーシスの誘発の程度、異なる薬物候補濃度でのアポトーシスの誘発の程度およびアポトーシスを誘発できなかったことを挙げてもよいが、それらに限定されない。抗癌剤評価アッセイはまた、癌細胞における非薬物関連または非アポトーシス事象、例えばアッセイ中の癌細胞増殖または細胞壊死を検出する場合がある。
【００３４】
いずれかの統計学的に有意な正の動力学的単位値は、薬物候補が癌細胞のアポトーシスを誘発することの、何等かの傾向を示す場合がある。しかしながら、多くの臨床目的のためには、非常に低いレベルのアポトーシスしか誘発することができない薬物候補または薬物濃度は、対象とはならない。したがって、本開示の一定の実施形態では、しきい動力学的単位値は、癌細胞において臨床的に意義のあるレベルのアポトーシスを誘発することができる薬物候補を識別するように設定されてもよい。例えば、しきい値は、１．５、２または３動力学的単位であってもよい。特定の薬物候補または薬物候補濃度に対して選択された実際のしきい値は、多くの因子に依存する場合がある。例えば、より低いしきい値、例えば１．５または２は、他の薬物に応答しない、または著しい負の副作用をともなう薬物のみに応答する癌型においてアポトーシスを誘発することができる薬物候補に対し許容される場合がある。より低いしきい値はまた、より高い濃度で減少した有効性を示し、またはそれ自体著しい負の副作用を有する可能性がある薬物候補に対し許容される場合がある。３のような、より高いしきい値は、すでに好適な治療が存在する癌型においてアポトーシスを誘発することができる薬物候補に対し許容されてもよい。
【００３５】
薬物候補
特定の実施形態によれば、抗癌剤候補は、癌細胞においてアポトーシスを誘発する能力に対して評価される任意の化学物質とすることができる。これらの候補としては、化学療法薬、他の小分子、タンパク質またはペプチド系薬物候補などのような、様々な化学的または生物学的実体を含んでもよく、化学療法薬分子に結合された抗体または抗体フラグメント、核酸系療法薬、他の生物、ナノ粒子系候補、などが挙げられる。薬物候補は、既存の薬物と同じ化学物質ファミリーであってもよく、または新規化学物質または生物学的実体であってもよい。
【００３６】
薬物候補は、単一の化学的、生物学的または他の実体に限定されない。それらは、異なる化学的または生物学的実体の組み合わせ、例えば提案された併用療法薬を含んでもよい。さらに、本明細書における多くの例が単一の薬物候補が適用されるアッセイに関連するが、アッセイはまた、組み合わされた複数の薬物候補に対し実施され得る。
【００３７】
２つ以上の薬物候補、薬物候補濃度、または薬物もしくは薬物候補の組み合わせが、単一アッセイにおいて単一プレートを用いて評価されてもよい。異なる試験試料は、異なる
ウェルに入れられてもよい。試験される薬物候補の濃度は、特定の実施形態では、０．０１μΜ〜１０，０００μΜであってもよい。試験される濃度は薬物型によって変動してもよい。
【００３８】
プレートおよび分光光度計システム
特定の実施形態では、プレートおよび分光光度計は、分光光度計がプレートを読み取ってもよいように選択されてもよい。例えば、より古い分光光度計を使用する場合、より大きなウェルを有するプレートを使用してもよい。というのは、機器はより小さなウェルプレートを読み取ることができないからである。より新しい分光光度計は、より小さなウェルを有するプレートを読み取ることができる場合がある。しかしながら、非常に小さなウェルを有するプレートは、ウェルを充填すること、小体積を正確に測定することの困難、および上を覆っている鉱物油の毒性（小体積ウェルでは増加する場合がある）のため回避される場合がある。１つの実施形態では、各ウェルの底の直径は、分光光度計の光線の直径以上である。より特定的な実施形態では、各ウェルの底の直径は、分光光度計の光線の直径の２倍以下である。これは、各ウェル内の細胞の代表的な部分の６００ｎｍでのＯＤが、確実に正確に読み取られることを助ける。分光光度計は、６００以外の波長で測定する場合がある。例えば、波長は＋／−５または＋／−１０であってもよい。しかしながら、他の波長はが、ブレブ形成を識別することができるように選択されてもよい。
【００３９】
分光光度計は、機器を動作させるため、または結果を読み取るために１つ以上のコンピュータまたはプログラムを含んでもよい。１つの実施形態では、分光光度計は、測定過程を制御し、その結果を記録し、各ウェルに対し、時間の関数として光学密度をプロットするグラフを表示または送信することができる１つ以上のコンピュータに機能的に接続されていてもよい。
【００４０】
組織培養のために設計されたプレートを使用してもよく、または他のプレートを、組織培養に適合するように滅菌し、処理してもよい。分光光度計にアクセスできない領域、例えば角に細胞が集まることを許してしまうプレートは、そのような集合を回避するプレートよりも、うまく働かない場合がある。代替的に、より多くの癌細胞がこれらのプレートに添加されると、アッセイ中に分光光度計にアクセスできる単層の存在が確保される場合がある。狭い底を有するプレート、例えばＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）ハーフエリア９６ウェルプレートはまた、不都合に低い試料体積を要求することなく、ウェルの底での単層の形成を促進するのを助ける場合がある。他のプレート、例えば他の９６−ウェルプレートまたはより小さなウェルプレート、例えば３８４−ウェルプレートもまた使用されてもよい。
【００４１】
癌細胞
現アッセイにおいて使用される癌細胞は、任意のよく特徴付けられた樹立癌細胞株であってもよい。樹立細胞株の使用は、検出するのが困難であり、不正確な試験結果を引き起こす場合がある複雑な事態、例えば細胞の一部の変異を回避するのを助ける。特定の実施形態では、癌細胞は、特定の癌を治療する薬物のＦＤＡまたは等価の政府認可を得るために、制癌剤スクリーニングのために一般に使用される任意の系列に由来する場合がある。
【００４２】
一般に、正確な結果のためには、癌細胞株は周知の癌細胞株であってもよく、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは同様のリポジトリから入手可能な細胞株などのような、一般的に経時的に同じである単一培養物またはほぼ単一培養物であってもよい。周知の癌細胞株は、悪性として、または細胞株を同定するために当技術分野において使用されるマーカーを有するものとして証明できるものであってもよい。例えば、ＨｅＬａ細胞株は周知の子宮頸癌細胞株である。必須ではないが、場合によっては、周知の癌細胞株は不死化される。
【００４３】
複数の癌細胞株が現アッセイでは同じプレート上で試験されてもよい。しかしながら、非常に異なる増殖速度または対照薬物に対する非常に異なる感受性を有する細胞株は、調整および試験時間の違いのために、異なるプレート上で試験されてもよい。
【００４４】
アッセイ中、癌細胞は必ずしも単一細胞懸濁液のままではない場合がある。例えば、固形腫瘍株は、ウェル表面に付着し、互いに結合された細胞層を形成し得る。この付着および結合は一般的には、特に、分光光度計測定が、ブレブ形成を受ける総細胞のパーセンテージを実質的に表すのを阻止するように、細胞が重ならない、または凝集塊を形成しない場合、アッセイを妨害しない。
【００４５】
実施例
本発明は、下記実施例を参照することにより、よりよく理解されるかもしれない。これらの実施例は例示的な実施形態を説明するためだけに含められ、本発明の全範囲を含むと解釈されるべきではない。
【００４６】
実施例１−複数の細胞株を使用する薬物候補スクリーニング
一般的には急性骨髄性白血病を治療するために使用される薬物候補イダルビシン（４−デメトキシダウノルビシン）は、４つのヒト白血病およびリンパ腫由来細胞株に対する抗悪性腫瘍、アポトーシス誘発活性について、現開示の実施形態による薬物スクリーニングアッセイを使用して試験された。試験した細胞株は、ＨＬ６０、急性前骨髄球性白血病細胞株、ＪＵＲＬ−ＭＫ２、急性転化における慢性骨髄性白血病、ＭＯＬＴ−３、急性Ｔ−細胞リンパ芽球性白血病、およびＲＡＭＯＳ、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫由来のＢ細胞株であった。
【００４７】
癌細胞は、フェノールレッドなしで、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）において５％Ｃ０２を有する加湿空気中、３７℃で指数関数的に増殖する培養物から入手した。細胞を収集し、予め温めた培地で洗浄し、完全培地中に再懸濁させた。適切な細胞数および生存率を試験した。
【００４８】
完全培地中の各細胞株由来の細胞を９６−ウェルプレートのウェルに、２〜５×１０５細胞／ｍｌの濃度で入れた。様々な希釈の薬物候補、イダルビシンをウェルに５μＬアリコートで添加した。薬物候補に対する最終濃度は０．０１、０．１、０．５、１、５、１０および２０μＭであった。プレートを３７℃で３０分間、加湿５％Ｃ０２雰囲気中でインキュベートした。この調整期間後、３０μｌの滅菌鉱物油を、各ウェルの上面に積層させた。マイクロタイタープレートをインキュベートさせた分光光度計チャンバ（３７℃）に入れ、６００ｎｍでのＯＤを５分毎に、４８時間測定した。リーダーを完全培地のみを含み、細胞を含まないウェルを使用して０吸光度に較正した。全ての試験を３通り実施した。
【００４９】
データ収集および計算を、適切なソフトウェアを用いて実施した。ＯＤ読み取り値を、時間に対してプロットし、薬物および薬物候補に対する細胞応答の動力学的表示を提供した。動力学的単位を各試験ウェルに対して計算した。３未満の動力学的単位は負の応答であると考え、３より大きいものは正の応答であると考えた。１．５〜３の動力学的単位は境界応答であると考えた。
【００５０】
イダルビシンは、ＭＯＬＴ−３、ＪＵＲＬ−ＭＫ２、およびＲＡＭＯＳ細胞株において、３動力学的単位を超えるアポトーシス応答を誘発した。ＨＬ−６０細胞は、２．３動力学的単位のどちらの対照薬物に対しても最大応答を有し、よって、薬物感度に対するしき
い値にわずかに及ばず、境界感度を示すにすぎなかった。したがって、試験は、イダルビシンは、急性前骨髄球性白血病に対して有用でないかもしれないことを示す。
【００５１】
さらに、正の応答がＲａｍｏｓ細胞株では高濃度でのみ見られ、イダルビシンは、より高い薬物濃度での副作用の可能性の増加のために、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫を治療する際に限界使用のみを有し得ることが示される。
【００５２】
最後に、ＭＯＬＴ−３細胞に対するより低い濃度のイダルビシンでのより高い動力学的単位読み取り値は、急性Ｔ−細胞リンパ芽球性白血病を治療するためにより低いイダルビシン濃度が好ましい場合があることを示す場合がある。
【００５３】
実施例２−単一細胞株に対する複数の薬物候補または化学療法薬を用いたスクリーニング
様々な抗癌剤を、単一卵巣癌細胞株、ＣＡＯＶ−３に対して試験し、卵巣癌への使用に対する適合性を決定した。実施例１における試験と同様であるが、より高い薬物濃度を使用して試験が実施された。結果は、ビノレルビンおよびオキサリプラチンは、卵巣癌を治療するのに好適な薬物ではないことを示す。結果はまた、イリノテカンは、正の応答を達成するには高濃度の薬物の使用が要求されるため、卵巣癌の治療においては限界使用のみを有するかもしれないことも示す。マイトマイシン、イダルビシン、ダウノルビシン、およびミトキサントロンは全て、妥当な濃度で正の応答を示し、よって、卵巣癌の治療のための好適な薬物候補である。
【００５４】
本発明の例示的な実施形態のみを上記で特定的に記載してきたが、本発明の精神および対象範囲から逸脱せずにこれらの実施例の改変および変更が可能であることが理解されるであろう。例えば、明細書では、特定の測定値が与えられる。当業者であれば、多くの場合、与えられた測定値に類似するが、全く同じではない値は等価であり、これらもまた本発明により包含されてもよいことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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