(57)【要約】  本発明は、マクロラクチンＡ、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ、及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡのようなマクロラクチン化合物を有効成分として含有する、抗血管新生組成物に関するものである。本発明が提供する前記マクロラクチン化合物はインビボ試験で血管新生を強力に抑制し、血管新生による疾患の予防または治療用医薬組成物として使用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロラクチンＡ（macrolactin A）、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ（7-O-malonyl macrolactin A）及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡ（7-O-succinyl macrolactin A）の少なくとも１つを有効成分として含む、抗血管新生組成物。
【請求項２】
マクロラクチンＡを有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡを有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡを有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
血管新生による疾患が、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎、乾癬、角膜潰瘍、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼科炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視眼腫瘍、角膜移植拒否、異常創傷こう着、骨疾患、タンパク尿症、腹部大動脈瘤、外傷性関節損傷による軟骨損失、神経性脱髄、肝硬変、糸球体疾患、胎膜の早期破裂、炎症性腸疾患、歯周病、動脈硬化症、再狭窄、中枢神経系の炎症疾患、アルツハイマー病、皮膚老化、及び癌の浸潤と転移よりなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生活性を有する、マクロラクチンＡ（以下、‘ＭＡ’という）、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ（以下、‘ＭＭＡ’という）、及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡ（以下、‘ＳＭＡ’という）のようなマクロラクチン化合物を有効成分として含有する抗血管新生組成物に関するものである。本発明による抗血管新生組成物を用いて、血管新生による疾患の予防または治療を目的とした医薬組成物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（angiogenesis）とは、既存の微細血管から新しい毛細血管が形成される過程である。胚発生（embryonic development）、組織再生及び創傷治療、並びに周期的な女性の生殖器系統の変化である黄体形成時に、正常な血管新生が生じ、これは厳格に調節されて進行する（非特許文献１）。
【０００３】
成人の場合、血管内皮細胞は極めてゆっくり成長し、他の種類の細胞に比べて殆ど分裂しない。血管新生の過程は、血管新生促進因子の刺激に起因するプロテアーゼによる血管基底膜の分解、血管内皮細胞の遊走及び増殖、並びに血管内皮細胞分化による管腔の形成を伴って進行し、その結果、血管が再構成され、新しい毛細血管が生成する。
【０００４】
幾つかの疾患は、血管新生の自己制御の欠如及び血管の異常な生育に起因している。病的な状態で発生する血管新生に関連した疾患は、血管腫、血管纎維腫、血管奇形、アテローム性動脈硬のような心血管疾患化、血管癒着、浮腫性硬化症並びに角膜移植性血管新生、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、新生血管による角膜疾患、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症及び顆粒性結膜炎のような眼科疾患などがある。関節炎のような慢性炎症性疾患、乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽種、脂漏性皮膚炎及びにきびのような皮膚科疾患、アルツハイマー及び肥満も血管新生と関連がある。さらに、癌の成長と転移は血管新生に必然的に依存している（非特許文献２、３、４、５）。
【０００５】
特に癌の場合、血管新生は、癌細胞の成長と転移に重要な役割を果たす。腫瘍は新生血管を通して栄養と酸素の供給を受けており、これは腫瘍に浸透し、そして癌細胞が血液循環系に入っていく機会を与え、癌が転移するようにする（非特許文献６、７）。現在臨床で、癌患者に使用する化学療法または免疫療法が、癌患者の生存率を高めるのに殆ど寄与していない主な要因は癌の転移である。
【０００６】
炎症性疾患の代表的な疾患である関節炎は、自己免疫異常が主要原因である。病状が進むと、関節間の活液嚢に生じた慢性炎症が血管新生を誘導して、軟骨を破壊する。即ち、炎症を誘導するサイトカインの助けで滑液細胞と血管内皮細胞が増殖して、血管新生が進行するのに伴い、軟骨部に発生する結合組織層である関節パンヌスが形成されて、クッションの役割をする軟骨を破壊する（非特許文献８、９、１０）。
【０００７】
毎年、数百万人を失明させる眼科疾患は血管新生が原因になっている（非特許文献１１）。例えば、老人に起こる黄斑変性（macular degeneration）、糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy）、早熟児の網膜症、血管新生緑内障及び新生血管による角膜疾患は、血管新生が原因である（非特許文献１２）。その中で、糖尿病性網膜症は、網膜にある毛細血管が硝子体に浸潤して失明をもたらす糖尿病の合併症である。
【０００８】
赤色斑と鱗屑の皮膚が特徴の乾癬も、皮膚に生ずる慢性の増殖性疾患であり、治癒が難しく、苦痛と奇形を伴う。正常状態の角質細胞が１カ月に一度増殖するのに比べて、乾癬患者では一週間に一度増殖する。このような速い増殖のためには、大量の血液を供給しなければならず、これが活発な血管新生を押し進める（非特許文献１３）。
【０００９】
血管新生抑制剤を各種血管新生疾患の治療に適用できる。血管新生抑制剤は、普通、患者に長期的に投与しなければならないので、毒性が少なく、経口投与されるものが理想的である。従って、毒性が低い新規な血管新生抑制剤の開発が求められている。
【００１０】
本発明者らは、長い間、２４員のラクトン環を有するマクロライド系抗生物質である、マクロラクチンＡを含むマクロラクチン誘導体及びそれらの活性の薬理学的メカニズムを研究してきた。マクロラクチン化合物は分類されていない海洋バクテリア、放線菌及びバチルス菌株から生産されており（非特許文献１４、１５、１６）、２３のマクロラクチン化合物が確認されている。マクロラクチン化合物の薬理活性に対する従来の研究は下記通りである。
【００１１】
１９８９年に、初めて単離されたＭＡは、マウスメラノーマ癌細胞 （Murine Melanoma Cancer Cell）と単純ヘルペスウイルスの増殖を抑制し、ＨＩＶにより損傷されたＴ−リンパ芽球細胞を保護する（非特許文献１４）。また、これはスクアレン合成酵素を抑制し（非特許文献１７）、グルタメートによって損傷した脳細胞を保護し（非特許文献１５）、そしてスーパーバクテリアをはじめとする種々病原性菌に対しても抗菌活性を示す（非特許文献１６）。この他にも、本研究者らは、ＭＡ及びその誘導体がリポ多糖体（ＬＰＳ）によって誘発される炎症性メディエーターの生成を阻害することを確認し、特許出願した（特許文献１）。
【００１２】
本発明者らは、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ、以下、‘ＢＰ２’という）の発酵液または培養液からＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡが生産されることを確認し、それらの構造を明らかにした。前記３種類のマクロラクチン化合物の他にも、マクロラクチンＢ、マクロラクチンＣ、マクロラクチンＤ、マクロラクチンＥ、マクロラクチンＦ、マクロラクチンＧ、マクロラクチンＨ、マクロラクチンＩ、マクロラクチンＪ、マクロラクチンＫ、マクロラクチンエルＬ、マクロラクチンＭ、マクロラクチンＮ、イソマクロラクチン酸、及びマクロラクチン酸がＢＰ２発酵液または培養液粗抽出物から生産されることもＬＣ／Ｍａｓｓで確認した（特許文献２）。しかし、本発明者らは、ＢＰ２からマクロラクチンＯ、マクロラクチンＰ、マクロラクチンＱ、マクロラクチンＲ、マクロラクチンＳの生産は確認できなかった。
【００１３】
マクロラクチン化合物は、様々な構造のために様々な薬理活性を有している。しかし、マクロラクチン化合物の血管新生抑制に対する研究は、現在まで全く報告されていない。そこで、本発明者らは、多様な種類のマクロラクチン化合物を含むＢＰ２の発酵液または培養液から生成された粗抽出物を中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を用いて分画し、各画分の血管新生抑制活性を調べ、マクロラクチン化合物を含む画分が血管新生を抑制し、特にＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡを含む画分が新生血管形成を強力に抑制することを見出した。それに基づき、本発明者らは、前記３種類のマクロラクチン化合物を含むＭＰＬＣ画分から各化合物を高純度で精製し（特許文献１）、精製された各マクロラクチン化合物の血管新生抑制活性を調べた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３２３９
【特許文献２】韓国特許第１０−０８９５９０８号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Folkman J. et al., Int. Rev. Exp. Pathol., 16, pp. 207-248, 1976
【非特許文献２】D'Amato R.J. et al., Ophthalmology, 102(9), pp. 1261-1262, 1995
【非特許文献３】Arbiser J.L., J. Am. Acad. Dermatol., 34(3), pp. 486-497, 1996
【非特許文献４】O'Brien K.D. et al. Circulation, 93(4), pp. 672-682, 1996
【非特許文献５】Hanahan D. et al., Cell, 86, pp. 353-364, 1996
【非特許文献６】Folkman and Tyler, Cancer Invasion and Metastasis, Biological Mechanism and Therapy (S.B. Day, ed.) Raven Press, New York, pp. 94-103, 1977
【非特許文献７】Polverini P.J., Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 6(3), pp. 230-247, 1995
【非特許文献８】Koch A.E. et al., Arthritis. Rheum., 29, pp. 471-479, 1986
【非特許文献９】Stupack D.G. et al., Braz, J. Med. Biol. Res., 32(5), pp. 578-581, 1999
【非特許文献１０】Koch A.E., Arthritis Rheum., 41(6), pp. 951-962, 1998
【非特許文献１１】Jeffrey M.I. et al., J. Clin. Invest., 103, pp. 1231-1236, 1999
【非特許文献１２】Adamis A.P. et al., Angiogenesis, 3, pp. 9-14, 1999
【非特許文献１３】Folkman J., J. Invest. Dermatol., 59, pp. 40-48, 1972
【非特許文献１４】Willam Fenical et al., J. Am. Chem. Soc., 111, pp. 7519-7524, 1989
【非特許文献１５】Ik Dong Yoo et al., J. Microbiol. Biotechnol., 7, pp. 429-434, 1997
【非特許文献１６】Gabriella Molinari et al., Antimicrob. Agents Chemother., 50, pp. 1701-1709, 2006
【非特許文献１７】Sung Won Choi et al., Can. J. Microbiol., 49, pp. 663-668, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡが血管新生を強力に抑制することを確認し、本発明を完成した。従って、本発明の目的は、血管新生による疾患を予防または治療するためにマクロラクチン化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本発明は、式１、式２及び式３の化合物のうち少なくとも一つを有効成分として含有する血管新生抑制用組成物を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、式１、式２及び式３の化合物のうちの少なくとも一つを有効成分として含有する、血管新生関連疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【００１９】
【化１】
2013531032.tif 000003
【００２０】
【化２】
2013531032.tif 000004
【００２１】
【化３】
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【００２２】
前記血管新生に関連する疾患としては、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎、乾癬、角膜潰瘍、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼科炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視眼腫瘍、角膜移植拒否、異常創傷こう着、骨疾患、タンパク尿症、腹部大動脈瘤、外傷性関節損傷による軟骨損失、神経性脱髄、肝硬変、糸球体疾患、胎膜の早期破裂、炎症性腸疾患、歯周病、動脈硬化症、再狭窄、中枢神経系の炎症疾患、アルツハイマー病、皮膚老化及び癌の浸潤と転移などが知られている。
【００２３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明に係る化合物は、本発明者らが所有している特許出願（特許文献１）に記載された方法で製造して得ることができる。
【００２４】
即ち、それぞれ式１、式２及び式３の化合物に該当する、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは、本発明者らによって単離されたバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）菌株を使用する発酵、抽出、分離及び精製の工程を経て得られる。
【００２５】
前記のような方法で得られた本発明の化合物は、ニワトリの絨毛尿膜モデルを用いるインビボ試験で、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）のような血管新生誘導因子の処理によって誘導された血管新生に起因する新生血管形成と癌転移を強力に抑制した；従って、血管新生に関連する疾患を予防及び治療するための医薬組成物として、本発明の化合物を使用できるということが確認された。
【発明の効果】
【００２６】
本発明が提供するＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは、ニワトリの絨毛尿膜モデルを用いるインビボ試験で新生血管形成を強力に抑制するので、これらを有効成分として含有する医薬組成物は、血管新生による疾患を治療及び予防するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１（ａ）は、ＶＥＧＦにより誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示す実施例における絨毛尿膜の立体顕微鏡の写真である。  図１（ｂ）は、ＶＥＧＦにより誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示したグラフである。
【図２】図２（ａ）は、ＴＮＦ−αにより誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示す実施例における絨毛尿膜の立体顕微鏡の写真である。  図２（ｂ）は、ＴＮＦ−αにより誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は、ＩＬ−８により誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示す実施例における絨毛尿膜の立体顕微鏡の写真である。  図３（ｂ）は、ＩＬ−８により誘導された新生血管形成に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示すグラフである。
【図４】図４（ａ）は、５％ＦＢＳにより誘導された繊維肉腫細胞の転移に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示す写真である。  図４（ｂ）は、５％ＦＢＳにより誘導された繊維肉腫細胞の転移に対する、本発明に係る化合物の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、有効成分としてＭＡ、ＭＭＡ又はＳＭＡ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する、血管新生による疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【００２９】
本明細書で、血管新生による疾患は、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎、乾癬、角膜潰瘍、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼科炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視眼腫瘍、角膜移植拒否、異常創傷こう着、骨疾患、タンパク尿症、腹部大動脈瘤、外傷性関節損傷による軟骨損失、神経性脱髄、肝硬変、糸球体疾患、胎膜の早期破裂、炎症性腸疾患、歯周病、動脈硬化症、再狭窄、中枢神経系の炎症疾患、アルツハイマー病、皮膚老化及び癌の浸潤と転移よりなる群から選択された少なくとも一つである。
【００３０】
以下、本発明に係る、血管新生による疾患の予防または治療用医薬組成物を説明する。
【００３１】
上記医薬組成物は、ＢＰ２を含むバチルスポリファーメンチカス菌の培養液または発酵液から生成されたマクロラクチン化合物である、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの少なくとも一つを有効成分として、そして薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する。
【００３２】
また、本発明の血管新生による疾患を予防または治療する医薬組成物は、医薬組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤または希釈剤を更に含むことができる。
【００３３】
本発明の血管新生による疾患を予防または治療する医薬組成物に含まれ得る担体、賦形剤または希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カリウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。
【００３４】
本発明に係るＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの少なくとも一つを含む医薬組成物は、通常の製剤方法を用いて、散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ及びエアゾールなどの経口剤、外用剤、坐剤、点眼剤、点耳剤及び滅菌注射剤として製剤化できる。
【００３５】
製剤は、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤等の希釈剤または賦形剤の手段で製剤化される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらは少なくとも一つの賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース及びゼラチンなどを混合して製剤化される。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム及びタルクのような潤滑剤等も使用できる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、ゲル溶液、乳剤、シロップ剤などが挙げられる。水及び流動パラフィンのような通常用いられる単純希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味剤、芳香剤及び保存剤のような各種賦形剤を液体製剤中に含有させることができる。非経口投与のための製剤は、滅菌したゲル溶液、非水性溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤、点眼剤及び点耳剤が含まれる。非水性溶液と懸濁液用に、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂（laurinum）、グリセロゼラチンなどを用いることができる。点眼剤または点耳剤を調製するために、リン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸のような緩衝剤、及び塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなｐＨ調整剤も使用することができる。
【００３６】
ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの少なくとも一つの用量は、患者の年齢、性別、体重によって異なるが、典型的には、１日当り０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を１度に又は単位用量に分割して投与できる。ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの少なくとも一つの用量は投与経路、症状の程度、性別、体重、年齢などに応じて変化できる。従って、前記用量は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、ラット、マウス、ウシ、ヒトなどを含む哺乳動物に投与することができる。あらゆる投与経路が予想でき、例えば、経口、直腸または静脈内、筋肉、皮下、子宮内または脳室内注射を用いることができる。
【００３８】
本発明を下記実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を説明しようとしているだけで、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
【００３９】
−実験材料及び試薬
受精卵は、Baekja Korean native chicken（青松（Cheongsong）、韓国）から得た。２−ピリジンカルボキサルデヒド、２−アセチルフラン及び酢酸コルチゾンはAldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)から、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)とインターロイキン−８(ＩＬ−８）はR&D Systems (Minneapolis, MN, USA)から、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）はInvitrogen Life Tech.から、ワットマンフィルタディスクはWhatman (UK)から、そしてバチマスタット（batimastat）はTocris Bioscience (Ballwin, MO, USA)から購入した。
【００４０】
＜製造例１＞試料の生産、分離及び精製
ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは、本発明者らの特許出願（特許文献１）に開示記載された製造方法に従って得た。
【００４１】
＜実施例１＞血管新生抑制効果のＣＡＭ分析
インビボ試験で、マクロラクチン化合物の抗血管新生効果を確認するために、絨毛尿膜（ＣＡＭ）分析を実施した（Nguyen M. et al., Microvascular Res., 47, pp. 31-40, 1994）。各群当たり６±１個の受精卵を使用した。
【００４２】
ニワトリの受精卵を温度３７℃及び相対湿度５５％を保持しながら培養した。培養の１０日目に気嚢（air sac)部位に皮下注射針（Green Cross Medical Corporation, Korea）を用いて、第１の孔をあけ、受精卵の平坦な部位に第２の孔をあけて、窓（window）を作った。
【００４３】
第１の孔を通して気嚢内に空気を射出することによって、絨毛尿膜（ＣＡＭ）を卵殻から分離し、次いでこの部位を回転研摩機（griding wheel,  Multipro 395JA, Dremel, Mexico）で切断して窓を作った。
【００４４】
ワットマンフィルタディスク♯１(Whatman, USA)を酢酸コルチゾン３ｍｇ／ｍＬで処理し、乾燥した。フィルタディスクを１０μｌの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン−８(ＩＬ−８）で処理した（２０ｎｇ／ＣＡＭ）。
【００４５】
予め作っておいた窓を通して、フィルタディスクを血管上に載置し、ＤＭＳＯに溶解してＰＢＳで希釈した各種濃度のＭＡ、ＭＭＡまたはＳＭＡで処理した。
【００４６】
処理３日後、ＣＡＭ部分をフィルタディスクとともにはがして、リン酸緩衝溶液で洗浄した。立体顕微鏡(Leica, Wetzlar, Germany）とImage-Pro Plus software（Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA）を使用して写真を撮影し、血管枝の個数を測定して、データを分析した。
【００４７】
全データは、平均±平均標準誤差で表され、統計分析をGraphPad Prism 4 Software （San Diego, CA, USA）を使用して、一元配置分散分析（one-way ANOVA）で実施した。ＮＫ（Newman-Keuls）の方法を用いて、各群間の差に対する多重比較を行った。Ｐ値が０.０５未満のとき、そのデータを統計的に有意と評価した。
【００４８】
上記試験の結果は図１、図２及び図３に示した。
図１、図２及び図３は、各実験群で観察された新生血管の写真及び各実験群の血管枝個数測定結果を示すグラフである。
【００４９】
ＰＢＳ、ＶＥＧＦのみ、またはＶＥＧＦと各種濃度のマクロラクチン化合物で処理した各実験群の結果を表わしている図１（ａ）及び（ｂ）が示すように、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡはＶＥＧＦによる新生血管の形成を強力に抑制した。特に、ＳＭＡは濃度依存的に新生血管形成を抑制した。
【００５０】
ＰＢＳ、ＴＮ−αのみ、またはＴＮ−αと各種濃度のマクロラクチン化合物で処理した各実験群の結果を表わしている図２（ａ）及び（ｂ）が示すように、ＭＡとＳＭＡはＴＮＦ−αによる新生血管の形成を強力に抑制した。特に、ＳＭＡは２０μｇ／ＣＡＭで処理した群の血管枝の個数が対照群と同様であったように、新生血管形成を強力に抑制した。
【００５１】
ＰＢＳ、ＩＬ−８のみ、またはＩＬ−８と各種濃度のマクロラクチン化合物で処理した各実験群の結果を表わしている図３（ａ）及び（ｂ）が示すように、ＭＡとＳＭＡはＩＬ−８による新生血管の形成を強力に抑制した。特に、ＳＭＡは２０μｇ／ＣＡＭで処理した群の血管枝の個数が対照群と同様であったように、新生血管形成を強力に抑制した。
【００５２】
このように、本願発明に係るマクロラクチン化合物の処理によって、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−８のような新生血管形成誘導物質による新生血管形成が有意に減少した。
【００５３】
＜実施例２＞癌転移抑制効果の試験
−細胞培養
ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含有するＤＭＥＭ培地で、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞が培養フラスコの８０％またはそれ以上に成長したときに、これらを１：３の割合で継代して、本実験に用いた。
【００５４】
−癌転移抑制効果の試験
インビトロ試験で、マクロラクチン化合物の癌転移抑制効果を確認するために、８ｍｍの細孔径を有するポリカーボネートフィルタを取り付けた２４−ウェルのトランスウェル（transwell）を利用して繊維肉腫細胞の浸潤性実験を遂行した。まず、フィルタの底部をＩ型コラーゲン（０．５ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、次いで、フィルタの上部をマトリゲル（Matrigel、１．５ｍｇ／ｍＬ）でコーティングした。コーティング終了後、挿入部分の下部に５％ＦＢＳ含有培地を充填し、上部に細胞培養器で１８時間培養したヒト繊維肉腫細胞ＨＴ−１０８０を含有している無血清培地を充填した。フィルタの底部に浸潤したヒト繊維肉腫細胞をメタノールで固定した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。浸潤した細胞を顕微鏡で観察し、各フィルタから無作為に三つの部分を選択して写真を撮影した後、細胞数を測定した（Kim, M.S. et al., Cancer Res., 63, pp. 5454-5461, 2003; Park, B.C. et al., Eur. J. Pharm., 567, pp. 193-197, 2007）。
【００５５】
上記の試験結果を図４に示した。
図４（ａ）及び（ｂ）に示されるように、マクロラクチン化合物の癌転移抑制効果を比較するための対照群として、癌転移に必須のマトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、‘ＭＭＰ’という）の抑制剤である、バチマスタット(batimastat)を使用した。５％ＦＢＳによって誘導された繊維肉腫細胞の浸潤は増加したが、ＭＭＰ抑制剤であるバチマスタット５μｍで処理した対照群では浸潤は有意に抑制された。ＭＡとＳＭＡは、５％ＦＢＳで誘導された浸潤を伴う繊維肉腫細胞の転移を濃度依存的に抑制した。特に、ＳＭＡ  １μｍは転移に対する有意な抑制効果を示し、ＳＭＡ  ５μｍはバチマスタットに匹敵する優れた転移抑制効果を示した。
【００５６】
本発明は、限られた実施例と図面により説明されたが、本発明の範囲は、これにより限定されるものではない。本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術及び着想、並びに下記に記載される特許請求の範囲の均等物の範囲内で様々な修正及び改変を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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