(57)【要約】  バイオ燃料を生成する方法を提供する。バイオ燃料を作製する方法は、実質的に無傷の藻細胞を脱水して、藻類バイオマスを作製すること、溶媒セットを藻類バイオマスに順次添加すること、および固体バイオマス画分を液体画分から順次分離して、中性脂質を含む液体画分に達することを含む。該方法はまた、中性脂質をエステル化すること、グリセリンを含む水混和性画分を、燃料エステル類、カロテノイド、およびω−３脂肪酸を含む水非混和性画分から分離することを含む。該方法はまた、炭素数１６以下の燃料エステル類画分、炭素数１６以上の燃料エステル画分、ならびにカロテノイドおよびω−３脂肪酸を含む残渣を得ることを含む。該方法は、（ｉ）ジェット燃料ブレンドストックを得るための炭素数１６以下の燃料エステル類および（ｉｉ）ディーゼルブレンドストックを得るための炭素数１６以上の燃料エステル類の少なくとも一方に水素添加し、およびこれを脱酸素化することを含む。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ燃料を作製する方法であって：
ａ．実質的に無傷の藻細胞を脱水して、藻類バイオマスを作製すること；
ｂ．約１部の溶媒セット対約１部の藻類バイオマスの重量比で、第１溶媒セット画分を藻類バイオマスに添加すること；
ｃ．第１の概ね固体のバイオマス画分を、タンパク質を含む第１の概ね液体の画分から分離すること；
ｄ．約１部の溶媒セット対約１部の固体バイオマスの重量比で、第１の概ね固体のバイオマス画分を第２溶媒セット画分と合わせること；
ｅ．第２の概ね固体のバイオマス画分を、極性脂質を含む第２の概ね液体の画分から分離すること；
ｆ．約１部の溶媒セット対約１部の固体バイオマスの重量比で、第２の概ね固体のバイオマス画分を第３溶媒セット溶媒画分と合わせること；
ｇ．第３の概ね固体のバイオマス画分は炭水化物を含み、該画分の藻細胞は実質的に無傷である第３の概ね固体のバイオマス画分を、中性脂質を含む第３の概ね液体の画分から分離すること；
ｈ．中性脂質をエステル化すること；
ｉ．グリセリンを含む水混和性画分を、燃料エステル類、カロテノイド、およびω−３脂肪酸を含む水非混和性画分から分離すること；
ｊ．炭素数１６以下の燃料エステル類画分、炭素数１６以上の燃料エステル画分ならびにカロテノイドおよびω−３脂肪酸を含む残渣を、真空蒸溜、吸着、および液体−液体抽出の少なくとも１つによって得ること；
ｋ．（ｉ）ジェット燃料ブレンドストックを得るための炭素数１６以下の燃料エステル類および（ｉｉ）ディーゼルブレンドストックを得るための炭素数１６以上の燃料エステル類の少なくとも一方に水素添加し、およびこれを脱酸素化すること
を含む方法。
【請求項２】
エステル化は、酸、塩基または酵素によって触媒される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カロテノイド、ω−３脂肪酸、グリセリン、炭水化物、および極性脂質の少なくとも１種を単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
極性脂質でない不純物成分から極性脂質を単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
極性脂質を加工処理して潤滑剤、洗浄剤、および食品添加物の少なくとも１つにすることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
カロテノイドを非カロテノイド成分から単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
水非混和性画分のカロテノイドおよび他の非レクチン成分中にあるレクチンを単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ω−３脂肪酸を非脂肪酸成分から単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第３の概ね液体の画分中にあるエイコサペンタエン酸を非脂肪酸成分から単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ドコサヘキサエン酸を非脂肪酸成分から単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
グリセリンを非グリセリン成分から単離することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１、第２、および第３溶媒セットの少なくとも１つは、アルコールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第１、第２、および第３溶媒セットの少なくとも１つは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルの少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
この出願は、「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ」のタイトルで２０１０年４月６日に提出された米国仮出願第６１／３２１，２９０号および「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｃｏ−Ｐｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ」のタイトルで２０１０年４月６日に提出された米国仮出願第６１／３２１，２８６号の利益を主張し、その全内容は、ここでの参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、限定されないが、油およびタンパク質を含めた藻類生成物を抽出および分画することに関する。より具体的には、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、湿潤藻類バイオマスを処理するための、僅かに非極性の溶媒による段階抽出および分画を利用する。
【背景技術】
【０００３】
石油は、主に炭化水素から構成される天然資源である。地球からの石油の抽出は、高価であり、危険であり、そして、しばしば環境を犠牲にしている。さらに、世界中の石油貯留層は、急速に減少している。また、石油をガソリンおよびジェット燃料などの有用な燃料に変換するのに必要な輸送ならびに処理に起因してコストも蓄積する。
【０００４】
藻類は、その脂質を生産する能力から近年かなり重要性を高めており、持続可能なバイオ燃料を生成するのに用いられ得る。この能力は、再生可能燃料を生成し、世界的な気候変化を低減し、廃水を処理することに活用され得る。バイオ燃料の原料としての藻類の優位性は、典型的な陸生の油性作物と比較して高い、１エーカーあたりの生産性、非食品系原料資源、さもなければ非生産性、非耕地性の耕地、広範な水源（未使用の汽水性の食塩水、および廃水）の利用、バイオ燃料ならびにカロテノイドおよびクロロフィルなどの有価副産物の両方を含めた種々の因子から生じる。
【０００５】
数千種の藻類が、世界中で過去数十年にわたって脂質生産について審査および研究されてきた。中でも、脂質生産に富む約３００種が確認されている。脂質の組成および含量は、ライフサイクルの種々の段階で変動し、環境および培養条件によって影響される。抽出のためのストラテジーおよびアプローチは、生化学的組成の大幅な変動および藻類細胞壁の物理的特性のために、使用される個々の藻類種／株に応じてずいぶん異なる。従来の物理的抽出プロセス、例えば押出は、藻細胞の細胞壁の厚さおよび小さなサイズ（約２〜約２０ｎｍ）を考えると、藻類とはうまく合わない。さらに、種子から回収される典型的な油と比較したときの藻油中の多量の極性脂質が、精製の問題をもたらす。
【０００６】
採取の際、培養物中の典型的な藻類濃度は、約０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲である。これは、藻類単位重量あたりの水の量の１０００倍もが、企図する油抽出の前に除去されなければならないことを意味している。現在、油性材料のための既存の油抽出法は、抽出される油の収率および量を改善するために、ほぼ完全に乾燥したフィードを厳密には必要とする。藻塊を加熱して十分に乾燥させるのに必要なエネルギー量に起因して、バイオ燃料プロセスへの藻類フィードは非経済的になる。典型的には、フィードは、高温で押出またはフレーク状にされて、抽出を高める。これらの工程は、藻類の単細胞のマイクロメータの性質に起因した既存の要件とは連動し得ない。さらに、藻油は、二重結合の長鎖脂肪酸の存在に起因して非常に不安定である。従来の抽出法で用いられた高温は、油の劣化を引き起こし、これにより、かかる方法のコストを増加させる。
【０００７】
溶媒としてヘキサンを用いることにより、乾燥した藻塊から油を抽出することが当該分野において公知である。このプロセスは、エネルギーを大量消費する。乾燥のための熱および抽出のためのヘキサンの使用は、このタイプの処理が脂質およびタンパク質の劣化を引き起こすに従って、より低量の生成物を生成する。
【０００８】
藻油の抽出は、２つのタイプ：破壊的または非破壊的方法に分類され得る。
【０００９】
破壊的方法は、機械的、熱的、酵素的または化学的方法により細胞株が関与する。大部分の破壊的方法はエマルションを生じ、高価なクリーンアッププロセスを必要とする。藻油は、高い百分率の、極性脂質と中性脂質の乳化を高めるタンパク質とを含有する。乳化は、溶液中に残る栄養および塩成分によってさらに安定化される。エマルションは、中性脂質、極性脂質、タンパク質、および他の藻類生成物を含有する複合混合物であり、大規模な精製プロセスは、バイオ燃料に変換されるフィードである中性脂質を単離する。
【００１０】
非破壊的方法は、低収率を与える。ミルキングとは、成長している藻類培養物から脂質を抽出するための、溶媒または化学物質の使用のことである。藻類生成物を抽出するのに用いられることがある一方で、ミルキングは、溶媒毒性および細胞壁破壊に起因してある種の藻類と連動し得ない。この複雑さは、全体的プロセスの開発を困難にする。さらに、必要とされる溶媒の体積は、培地中の達成可能な最大溶媒濃度に起因して桁外れに大きい。
【００１１】
多相抽出は、複合溶媒混合物を用い、溶媒の回収およびリサイクルのためのメカニズムが必要となる大規模な蒸留を必要とする。このことは、かかる抽出を藻油技術での使用に関して非実用的および非経済的なものにする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、これらの欠点を克服するために、藻類生成物、特に、藻油、藻類タンパク質、および藻類カロテノイドを抽出および分画するための改善された方法およびシステムが当該分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に記載されている実施形態は、例えば、藻類バイオマスを含めた油性材料から様々な極性の脂質を抽出するためのシステムおよび方法に一般に関する。特に、本明細書に記載されている実施形態は、種々な極性の溶媒および／または直列の膜フィルタを用いて藻類バイオマスから種々な極性の脂質を抽出することに関する。いくつかの実施形態において、フィルタは、マイクロフィルタである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、単一の溶媒および水が用いられて、油性材料中に存在する成分を抽出および分画する。他の実施形態において、これらの成分は、限定されないが、タンパク質、極性脂質、および中性脂質を含む。さらに他の実施形態において、１種を超える溶媒が用いられる。さらに他の実施形態において、溶媒の混合物が用いられる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法およびシステムは、油性材料から脂質の副産物を抽出するのに有用である。かかる副産物の例として、非限定的には、タンパク質性材料、クロロフィル、およびカロテノイドが挙げられる。本発明の実施形態は、燃料および栄養生成物の両方の生産を可能にするように藻類バイオマスからの藻類生成物の同時の抽出および分画を可能にする。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、バイオ燃料を生成する方法を提供する。
【００１７】
本発明の実施形態ではさらに、バイオ燃料を作製する方法は、実質的に無傷の藻細胞を脱水して、藻類バイオマスを作製すること、約１部の溶媒セット対約１部の藻類バイオマスの重量比で、第１溶媒セット画分を藻類バイオマスに添加すること、および第１の概ね固体のバイオマス画分を、タンパク質を含む第１の概ね液体の画分から分離することを含む。該方法はまた、約１部の溶媒セット対約１部の固体バイオマスの重量比で、第１の概ね固体のバイオマス画分を第２溶媒セット画分と合わせること、第２の概ね固体のバイオマス画分を、極性脂質を含む第２の概ね液体の画分から分離すること、および約１部の溶媒セット対約１部の固体バイオマスの重量比で、第２の概ね固体のバイオマス画分を第３溶媒セット溶媒画分と合わせることも含む。該方法は、第３の概ね固体のバイオマス画分を、中性脂質を含む第３略液体画分から分離し、第３の固体のバイオマス画分は炭水化物を含み、該画分の藻細胞は実質的に無傷であること、中性脂質をエステル化すること、およびグリセリンを含む水混和性画分を、燃料エステル類、カロテノイド、およびω−３脂肪酸を含む水非混和性画分から分離することをさらに含む。該方法はまた、炭素数１６以下の燃料エステル類画分、炭素数１６以上の燃料エステル画分ならびにカロテノイドおよびω−３脂肪酸を含む残渣を、真空蒸溜、吸着、および液体−液体抽出の少なくとも１つによって得ること、（ｉ）ジェット燃料ブレンドストックを得るための炭素数１６以下の燃料エステル類および（ｉｉ）ディーゼルブレンドストックを得るための炭素数１６以上の燃料エステル類の少なくとも一方に水素添加し、およびこれを脱酸素化することを含む。場合により、エステル化は、酸、塩基または酵素によって触媒される。
【００１８】
なお本発明の別の実施形態では、該方法はまた、カロテノイド、ω−３脂肪酸、グリセリン、炭水化物、および極性脂質の少なくとも１つを単離すること、極性脂質でない不純物成分から極性脂質を単離すること、ならびに／またはカロテノイドを非カロテノイド成分から単離することを含む。
【００１９】
本発明の実施形態ではさらに、該方法はまた、極性脂質を加工処理して潤滑剤、洗浄剤、および食品添加物の少なくとも１つにすることも含む。
【００２０】
本発明の実施形態では、該方法はまた、水非混和性画分のカロテノイドおよび他の非レクチン成分中にあるレクチンを単離すること、ω−３脂肪酸を非脂肪酸成分から単離すること、第３の概ね液体の画分中にあるエイコサペンタエン酸を非脂肪酸成分から単離すること、ドコサヘキサエン酸を非脂肪酸成分から単離すること、ならびに／またはグリセリンを非グリセリン成分から単離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の例示的な実施形態による方法に含まれる工程のフローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示による脱水プロセスの例示的な実施形態の概略図である。
【図２】図２は、本開示による抽出システムの例示的な実施形態の概略図である。
【図３】図３は、最大の非破壊的藻類油抽出効率を示す全極性範囲を包含した一連の溶媒を用いた、凍結乾燥された藻類バイオマスのＳｏｈｘｌｅｔ抽出、ならびに極性が極性および非極性脂質抽出に及ぼす効果を示す比較グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、メタノールおよび石油エーテルを３つの異なる温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスにおける中性脂質の純度を示すグラフ表示である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、メタノールおよび石油エーテルを３つの異なる温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスにおける中性脂質の回収を示すグラフ表示である。
【図５Ａ】図５Ａは、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの異なる温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスにおける中性脂質の純度を示すグラフ表示である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの異なる温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスにおける中性脂質の回収を示すグラフ表示である。
【図６】図６は、水性メタノールおよび石油エーテルを３つの異なる温度で用いる２段階溶媒抽出プロセスにおける脂質回収を示すグラフである。
【図７】図７は、溶媒対固体バイオマス比が脂質回収に及ぼす効果を示すグラフである。
【図８】図８は、乾燥バイオマスでの水性メタノールの一段階抽出回収における種々の抽出水溶液の有効性を示すグラフである。
【図９】図９は、全工程のメタノール抽出が累計脂質収率および中性脂質純度に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、湿潤バイオマスおよびエタノールを用いた脂質の累積回収を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マイクロ波アシスト抽出および従来の抽出システムの抽出時間の比較を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、タンパク質抽出工程を組み込んだ本開示の例示的な実施形態による方法に含まれる工程のフローチャートである。図１２Ａにおける全ての単位はポンドである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本開示による例示的な抽出プロセスに含まれる工程のフローチャートである。
【図１３】図１３は、中性脂質、極性脂質、およびタンパク質を藻類バイオマスから分離するために１０００ｌｂｓ．の藻類バイオマスが抽出および分画を経て処理される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートおよびマスバランス図である。
【図１４】図１４は、藻塊が処理されて種々の生成物を形成することができる本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１５】図１５は、藻類の中性脂質が処理されて種々の生成物を形成する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１６】図１６は、藻類の中性脂質が処理されて燃料生成物を形成する本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１７】図１７は、藻類タンパク質が淡水藻類バイオマスから選択的に抽出される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１８】図１８は、藻類タンパク質が塩水藻類バイオマスから選択的に抽出される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図１９】図１９は、選択された藻類タンパク質が塩水または淡水藻類バイオマスから抽出される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図２０】図２０は、選択された藻類タンパク質が塩水または淡水藻類バイオマスから抽出される本発明の実施形態の１つを記載するフローチャートである。
【図２１】図２１は、本明細書において記載されている方法を用いた抽出前後のイカダモ種の細胞を示す写真である。細胞は、抽出の前後両方において実質的に無傷である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
定義
用語「導管」またはその任意の変形体は、本明細書において用いられるとき、流体が搬送され得るあらゆる構造を含む。導管の非限定的な例として、管、管類、チャネル、または他の密閉構造が挙げられる。
【００２３】
用語「貯留層」またはその任意の変形体は、本明細書において用いられるとき、流体を保持することが可能であるあらゆる本体構造を含む。貯留層の非限定的な例として、池、タンク、湖、タブ、または他の同様の構造が挙げられる。
【００２４】
用語「約」または「およそ」は、本明細書において用いられるとき、当業者によって理解されているようにほぼ定義され、１つの非限定的な実施形態において、該用語は、１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、最も好ましくは０．５％以内にあると定義される。
【００２５】
用語「阻害する」または「低減する」あるいはこれらの用語の任意の変形例は、本明細書において用いられるとき、所望の結果を得るためのあらゆる測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００２６】
用語「効果的」は、本明細書において用いられるとき、所望の、予測される、または意図される結果を達成するのに適切であることを意味している。
【００２７】
語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、本明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて用いられているとき、「１つ（ｏｎｅ）」を意味する場合があるが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１を超える」の意味とも一致する。
【００２８】
用語「ｏｒ」は、本明細書において用いられるとき、別途明確に示さない限り「および／または」を意味して代替のみを称し、または代替が互いに排他的であるが、開示は、代替のみを称する定義ならびに「および／または」を支持する。
【００２９】
用語「湿潤」の使用は、本明細書において用いられるとき、約５０％〜約９９．９％の水分を含有することを意味するのに用いられる。水分は、細胞内にあっても細胞外にあってもよい。
【００３０】
用語「溶媒セット」の使用は、本明細書において用いられるとき、１種以上の溶媒を含む組成物を意味するのに用いられる。これらの溶媒は、両親媒性（両親媒性（両親媒性）または僅かに非極性としても知られている）、親水性、または疎水性であってよい。いくつかの実施形態において、これらの溶媒は、水混和性であり、他の場合には水に非混和性である。本発明の方法を実施するのに用いられ得る溶媒の非限定的な例として、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリル、アルカン類（ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル）、ケトン類（メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ））、芳香族類（トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン）、ハロアルカン類（クロロホルム、トリクロロエチレン）、エーテル類（ジエチルエーテル）、および混合物（ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）が挙げられる。
【００３１】
用語「油」は、本明細書において用いられるとき、中性脂質および極性脂質を含有する組成物を含む。用語「藻類油」および「藻油」は、本明細書において用いられるとき、互換的に用いられる。
【００３２】
用語「透析物」または「浸透物」は、本明細書において用いられるとき、限定されないがフィルタまたは膜を含めた分離装置を通過した材料を称し得る。
【００３３】
用語「残余分」は、本明細書において用いられるとき、透析物が分離装置を通過した後に残る材料を称し得る。
【００３４】
本明細書において用いられるとき、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的または無制限であり、付加的な、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。
【００３５】
用語「極性脂質」またはその任意の変形体は、本明細書において用いられるとき、限定されないが、リン脂質および糖脂質を含む。
【００３６】
用語「中性脂質」またはその任意の変形体は、本明細書において用いられるとき、限定されないが、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、カロテノイド、ワックス、ステロールを含む。
【００３７】
用語「固相」は、本明細書において用いられるとき、概ねどちらかと言えば固体である材料の集合を称し、相中の全ての材料が固体であることを意味することは意図されていない。したがって、いくぶん液体を保持するが相当量の固体を有する相は、該用語の意味の範囲内に包含される。一方で、用語「液相」は、本明細書において用いられるとき、概ねどちらかと言えば液体である材料の集合を称し、かかる集合は、固体材料を含んでいてよい。
【００３８】
用語「バイオディーゼル」は、本明細書において用いられるとき、藻類に由来する脂肪酸のメチルまたはエチルエステル類を称する。
【００３９】
用語「栄養価のあるもの」は、本明細書において用いられるとき、健康上および／または医学的利益を提供する食品を称する。非限定的な例として、カロテノイド、カロテン、キサントフィル、例えば、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびルテインが挙げられる。
【００４０】
用語「バイオ燃料」は、本明細書において用いられるとき、生物源に由来する燃料を称する。非限定的な例として、バイオディーゼル、ジェット燃料、ディーゼル、ジェット燃料ブレンドストックおよびディーゼルブレンドストックが挙げられる。
【００４１】
極性脂質と併せて用いられているときの用語「不純物」は、本明細書において用いられるとき、対象の生成物と同時抽出されるまたはこれと同じ特性を有する、対象の生成物以外の全ての成分を称する。
【００４２】
用語「潤滑剤」は、極性脂質と併せて用いられているとき、本明細書において用いられるとき、水素処理された藻類脂質、例えば、Ｃ１６〜Ｃ２０アルカン類を称する。
【００４３】
用語「洗浄剤」は、極性脂質と併せて用いられているとき、本明細書において用いられるとき、糖脂質、リン脂質およびこれらの誘導体を称する。
【００４４】
用語「食品添加物」は、極性脂質と併せて用いられているとき、本明細書において用いられるとき、藻類に由来する大豆レクチン代用物またはリン脂質を称する。
【００４５】
用語「非グリセリン物質」は、本明細書において用いられるとき、グリセリン画分と分離するあらゆる不純物を称する。さらなるクリーンアップ工程は、医薬品グレードのグリセリンを生成するために存在するものの大部分を除去する。
【００４６】
用語「不飽和脂肪酸」は、本明細書において用いられるとき、少なくとも１つの二重炭素結合を有する脂肪酸を称する。不飽和脂肪酸の非限定的な例として、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オクタデカン酸、リノレン酸、γ−リノレン酸、αリノレン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ホモγリノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサジエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸が挙げられる。骨格中に２０個以上の炭素原子を有する脂肪酸は一般に「長鎖脂肪酸」と称される。骨格中に１９個以下の炭素原子を有する脂肪酸は、一般に「短鎖脂肪酸」と称される。
【００４７】
不飽和長鎖脂肪酸として、限定されないが、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸、およびω−９脂肪酸が挙げられる。用語「ω−３脂肪酸」は、本明細書において用いられるとき、限定されないが、表１に列挙されている脂肪酸を称する。
【表１】
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【００４８】
用語「ジェット燃料ブレンドストック」は、本明細書において用いられるとき、ジェット燃料としての使用に適した炭素鎖長を有するアルカン類を称する。
【００４９】
用語「ディーゼルブレンドストック」は、本明細書において用いられるとき、ディーゼルとしての使用に適した炭素鎖長を有するアルカン類を称する。
【００５０】
用語「動物飼料」は、本明細書において用いられるとき、動物に栄養補給を提供するのに消費され用いられ得る藻類由来物質を称する。
【００５１】
用語「ヒト用食物」は、本明細書において用いられるとき、人々に栄養補給を提供するのに消費され得る藻類由来物質を称する。藻類由来のヒト用食品は、必須の栄養素、例えば、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、またはミネラルを含有し得る。
【００５２】
用語「バイオレメディエーション」は、本明細書において用いられるとき、汚染物質、例えば、限定されないが、硝酸塩、リン酸塩、および重金属を、産業廃水または一般廃水から除去するための藻類成長の使用を称する。
【００５３】
用語「廃水」は、本明細書において用いられるとき、限定されないが、硝酸塩、リン酸塩、および重金属を含めた種々の混入物質または汚染物質を含有する産業廃水または一般廃水を称する。
【００５４】
用語「富化された」は、本明細書において用いられるとき、約５０％以上の含量を意味する。
【００５５】
用語「実質的（略）」は、本明細書において用いられるとき、大部分を意味する。
【００５６】
用語「グロブリンタンパク質」は、本明細書において用いられるとき、塩可溶性タンパク質を称する。
【００５７】
用語「アルブミンタンパク質」は、本明細書において用いられるとき、水溶性タンパク質を称する。
【００５８】
用語「グルテリンタンパク質」は、本明細書において用いられるとき、アルカリ可溶性タンパク質を称する。
【００５９】
用語「プロラミンタンパク質」は、本明細書において用いられるとき、アルコール可溶性タンパク質を称する。プロラミンタンパク質の非限定的な例は、グリアジン、ゼイン、ホルデイン、アベニンである。
【００６０】
用語「藻類培養物」は、本明細書において用いられるとき、培養培地中の藻細胞を称する。
【００６１】
用語「藻類バイオマス」は、本明細書において用いられるとき、少なくとも部分的に脱水された藻類培養物を称する。
【００６２】
用語「脱水された」は、本明細書において用いられるとき、すくなくともいくぶんかの水の除去を称する。
【００６３】
用語「藻類ペースト」は、本明細書において用いられるとき、流れることを可能にする流体特性を有する部分的に脱水された藻類培養物を称する。一般に、藻類ペーストは、約９０％の水分を有する。
【００６４】
用語「藻類ケーキ」は、本明細書において用いられるとき、藻類ペーストの流体特性に欠き凝集する傾向にある部分的に脱水された藻類培養物を称する。一般に、藻類ケーキは、約６０％以下の水分を有する。
【００６５】
塩水藻細胞として、限定されないが、海洋および汽水性藻類種が挙げられる。塩水藻細胞は、限定されないが、海、大洋、および河口などの水辺において実際に見出される。塩水藻類種の非限定的な例として、ナンノクロロプシス属の種、ドナリエラ属の種が挙げられる。
【００６６】
淡水藻細胞は、限定されないが、湖および池などの水辺において実際に見出される。淡水藻類種の非限定的な例として、イカダモ種、ハエマトコッカス属の種が挙げられる。
【００６７】
本発明の方法によって用いられ得る微細藻類の非限定的な例は、以下の区分：緑色植物門、藍色植物門（シアノバクテリア）、および不等毛植物門のうちの１つのメンバーである。ある一定の実施形態において、本発明の方法によって用いられる微細藻類は、以下のクラス：珪藻網、真正眼点藻網、および黄金色藻網のうちの１つのメンバーである。ある一定の実施形態において、本発明の方法による微細藻類は、以下の属：ナンノクロロプシス、クロレラ、ドナリエラ、イカダモ、セレナストラム、オシラトリア、フォルミジウム、スピルリナ、アンフォラ、およびオクロモナスのうちの１つのメンバーである。
【００６８】
本発明の方法によって用いられ得る微細藻類種の非限定的な例として：アクナンセス・オリエンタリス、アグメヌルム種、アンフィプロラ・ヒアリン、アンフォラ・コフェイフォルミス、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・リネア、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・プンクタタ、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・タヨロリ、アンフォラ・コフェイフォルミス・バー・テヌイス、アンフォラ・デリカティッシマ、アンフォラ・デリカティッシマ・バー・キャピタタ、アンフォラ属の種、アナバエナ、アンキストロデスムス、アンキストロデスムス・ファルカタス、ボエケロヴィア・ホオグランディ、ボロディネラ属の種、ボツリョコッキス・ブラウニイ、ボツリョコッカス・スデティクス、バクテリオコッカス・マイナー、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス、カルテリア、キートケロス・グラシリス、キートケロス・ムエレリ、キートケロス・ムエレリ・バー・スブサルスム、キートケロス属の種、クラミドモナス・ペリグラヌラタ、クロレラ・アニトラタ、クロレラ・アンタルクティカ、クロレラ・アウレオビリディス、クロレラ・カンジダ、クロレラ・カプスレイト、クロレラ・デシカート、クロレラ・エリプソイデア、クロレラ・エメルソニイ、クロレラ・フスカ、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ、クロレラ・グルコトロファ、クロレラ・インフシオナム、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ、クロレラ・インフシオナム・バー・アウゼノフィラ、クロレラ・ケッセレリ、クロレラ・ロボフォラ、クロレラ・ルテオビリディス、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス、クロレラ・ルテオビリディス・バー・ルテスセンス、クロレラ・ミニアタ、クロレラ・ミヌティッシマ、クロレラ・ムタビリス、クロレラ・ノクツルナ、クロレラ・オヴァリス、クロレラ・パルバ、クロレラ・ファトフィリア、クロレラ・プリングシェイミィ、クロレラ・プロトセコイデス、クロレラ・プロトセコイデス・バー・アシジコラ、クロレラ・レグラリス、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ、クロレラ・レイシグリィ、クロレラ・サッカロフィア、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア、クロレラ・サリナ、クロレラ・シンプレックス、クロレラ・ソロキニアナ、クロレラ属の種、クロレラ・スファエリカ、クロレラ・スティグマトフォラ、クロレラ・バニエリィ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルティア、クロレラ・ブルガリス・バー・アウトトロフィカ、クロレラ・ブルガリス・バー・ヴィリディス、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルティア、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ヴィリディス、クロレラ・キサンテラ、クロレラ・ゾフィンジエンシス、クロレラ・ツレボウシオイデス、クロレラ・ブルガリス、クロロコッカム・インフシオナム、クロロコッカム属の種、クロロゴニウム属、クロオモナス属の種、クリソスファエラ属の種、クリコスファエラ属の種、クリプテコディニウム・コーニィ、クリプトモナス属の種、サイクロテラ・クリプティカ、サイクロテラ・メネグヒニアナ、サイクロテラ属の種、ドナリエラ属の種、ドナリエラ・バルダウィル、ドナリエラ・バイオクラタ、ドナリエラ・グラヌラテ、ドナリエラ・マリタイム、ドナリエラ・ミヌタ、ドナリエラ・パルバ、ドナリエラ・ペイルセイ、ドナリエラ・プリモレクタ、ドナリエラ・サリナ、ドナリエラ・テリコラ、ドナリエラ・テルチオレクタ、ドナリエラ・ヴィリディス、ドナリエラ・テルチオレクタ、エレモスファエラ・ヴィリディス、エレモスファエラ属の種、エリプソイデン属の種、エウグレナ種、フランセイア属の種、フラギラリア・クロトネンシス、フラギラリア属の種、グレオカプサ属の種、グロエオサムニオン属の種、ヘマトコッカス・プルビアリス、ヒメノモナス属の種、イソクリシス・エーエフエフ・ガルバナ、イソクリシス・ガルバナ、レポシンクリス、ミクルアクチニウム、ミクルアクチニウム、モノラフィディウム・ミヌツム、モノラフィディウム属の種、ナンノクロリス属の種、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス属の種、ナビクラ・アクセプタタ、ナビクラ・ビスカンテラエ、ナビクラ・シュードテネロイデス、ナビクラ・ペリクロサ、ナビクラ・サプロフィラ、ナビクラ属の種、ネフロクロリス属の種、ネフロセルミス属の種、ニツスチア・コムニス、ニツスチア・アレクサンドリア、ニツスチア・クロステリウム、ニツスチア・コムニス、ニツスチア・デイシパタ、ニツスチア・フルスツルム、ニツスチア・ハンツスチアナ、ニツスチア・インコンスピクア、ニツスチア・インテルメディア、ニツスチア・マイクロセファラ、ニツスチア・プシラ、ニツスチア・プシラ・エリプティカ、ニツスチア・プシラ・モノエンシス、ニツスチア・クアヅラングラー、ニツスチア属の種、オクロモナス属の種、オオサイスティス・パルバ、オオサイスティス・プシラ、オオサイスティス属の種、オシラトリア・リムネティカ、オシラトリア属の種、オシラトリア・スブレヴィス、パラクロレラ・ケッセレリ、パスケリア・アシドフィラ、パブロバ属の種、フェオダクチラム・トリコヌタム、ファグス、フォルミジウム属、プラティモナス属の種、プレウロクリシス・カルテレ、プレウロクリシス・デンタテ、プレウロクリシス属の種、プロトテカ・ウィクケルハミイ、プロトテカ・スタグノラ、プロトテカ・ポルトリセンシス、プロトテカ・モリフォルミス、プロトテカ・ゾフィ、シュードクロレラ・アクアティカ、ピラミモナス属の種、ピロボツリス、ロドコッカス・オパクス、サルシノイド・クリソフィテ、セネデスムス・アルマツス、シゾシツリウム、スピロギラ、スピルリナ・プラテンシス、スチココッカス属の種、シネココッカス属の種、シネコシスティス、タゲテス・エレクタ、タゲテス・パツラ、テツラエヅロン、テツラセルミス属の種、テツラセルミス・スエシカ、タラッシオシラ・ウェイッスフロギィ、およびヴィリデイエラ・フリデリシアナが挙げられる。
【００６９】
他の実施形態において、バイオマスは、限定されないが、ダイズ、トウモロコシ、ヤシ、カメリナ、ヤトロファ、ナタネ、ココナツ、ピーナツ、ベニバナ、綿実、アマニ、ヒマワリ、ヌカ、およびオリーブを含めた植物材料であってよい。
【００７０】
種々の極性の脂質および副産物（例えば、タンパク質）を例えば、藻類バイオマスを含めた湿潤油性材料から抽出するためのシステムおよび方法が開示されている。特に、本明細書に記載されている方法およびシステムは、次第に極性が低くなる（すなわち、一抽出工程から次に進行するに従い、溶媒中の水／水比が次第に低減する）親水性溶媒／水混合物によって順次抽出を行うことによる藻類成分の抽出および分画の両方を行う能力に関する。換言すると、藻類中の介在溶媒（その重量の７５％）は、最初は水であり、僅かに非極性の溶媒によって徐々に有機溶媒の共沸混合物に置き換えられる。これは、各工程で生じた極性で可溶性である成分を結果として抽出し、これにより、抽出された成分の同時分画をもたらす。酸浸出および／またはアルカリ抽出によるタンパク質性副生成物の抽出も開示されている。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態において、単一の溶媒および水が用いられて、油性材料中に存在する成分を抽出および分画する。他の実施形態において、油性材料中に存在する成分を抽出および分画するのに溶媒セットおよび水が用いられる。いくつかの実施形態において、油性材料は湿潤正である。他の実施形態において、油性材料は、藻類である。
【００７２】
極性脂質回収は、そのイオン電荷、水溶解度、および場所（細胞内、細胞外または膜結合性）に主に依存する。極性脂質の例として、限定されないが、リン脂質および糖脂質が挙げられる。極性脂質を分離および精製するのに用いられ得るストラテジーは、バッチまたは連続モードに大まかに分割され得る。バッチモードの例として、沈澱（ｐＨ、有機溶媒）、溶媒抽出および結晶化が挙げられる。連続モードの例として、遠心分離、吸着、泡沫分離および沈澱、ならびに膜技術（タンジェント流濾過、透析濾過および沈澱、限外濾過）が挙げられる。
【００７３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および実施例は、本発明の具体的な実施形態を示すが、例示のみによって付与されることが理解されるべきである。したがって、本発明の精神および範囲内での変形および修飾は、この詳細な説明から当業者に明らかになることが意図される。
【００７４】
驚くべきことに、提案されている非破壊的抽出プロセスは、９０％の回収をもたらす。残存するバイオマスは、フィードに用いられるとき、その中の少量の極性物質がその価値を高める。これは、少なくとも部分的に、バイオマスの高い長鎖不飽和脂肪酸含量に起因する。加えて、エタノール抽出物は、さらに直接エステル交換され得る。さらに、既存の従来の方法とは違って、本明細書に記載されている方法およびシステムは、あらゆる藻類に関して一般的なものであり、水混和性有機溶媒勾配の使用によって藻類中の極性脂質を含めた相当部の有価成分の回収を可能にする。
【００７５】
本発明の使用によって得られる中性脂質は、低い金属含量を有し、これにより、脂質画分の安定性を高め、その後の処理工程を低減する。金属は、酸化を触媒するその能力に起因して、中性脂質を不安定にする。さらに、金属は、水素処理触媒を阻害し、中性脂質混合物が精製され得る前にその除去を必要にする。本明細書に開示されているシステムおよび方法は、タンパク質および／または極性脂質画分における金属の抽出を可能にする。このことは、タンパク質および極性脂質が金属暴露によってあまり影響されず、いくつかの場合においては金属によって実際に安定化されるため、有利である。
【００７６】
本明細書に開示されているシステムおよび方法は、湿潤バイオマスによって開始することができ、乾燥および脱水コストを低減する。従来の抽出プロセスと比較して、開示されている抽出および分画プロセスは、溶媒リサイクルと併せて、穏やかな温度および圧力条件に起因して操作コストが比較的低いはずである。さらに、従来の抽出プロセスは、非常に高いコストがかかり、市場の要求を満たすことができない。
【００７７】
本明細書に記載されているシステムおよび方法の別の態様は、抽出プロセスの間の中性脂質からの極性脂質の分離である予備精製を達成する能力である例示的な実施形態において用いた藻油と先の実施形態において用いた植物油との間の差異は、個々のクラスの脂質の百分率を含む。例示的な藻類粗油の組成を、以下の表２に示す植物油と比較する。
【表２】
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【００７８】
植物油の脱ガム（物理的および／または化学的）は、極性脂質（例えば、糖脂質およびリン脂質）を除去するためになされる。化学的に脱ガムされた植物油は、相当量の中性脂質を保持する。この中性脂質画分は、溶媒抽出もしくは超臨界／亜臨界流体抽出または膜技術を用いて、脱ガムされた材料からさらに除去される。対照的に、油性藻類バイオマスからの中性脂質の分離は、藻油中に典型的に見出される多量の極性物質に起因する植物油原料（表２参照）からよりもはるかに困難である。これは、藻油に存在するより高い百分率の極性脂質が、中性脂質の乳化を増進するためである。乳化は、溶液中に残る栄養および塩成分によってさらに安定化される。極性脂質の存在は、金属と併せて、中性脂質の分離および利用に処理困難性をもたらす。しかし、極性脂質は既存の市場を有するため、その回収は、燃料を生成する藻油の使用に相当な価値を加える。
【００７９】
極性脂質は、その分子構造に起因して本質的に界面活性剤であり、巨大な既存の市場を有する。極性脂質を生産する既存の技術の多くは、原材料またはコストが非常に高い。糖脂質およびリン脂質の代替の原料は、主に、藻類油、オーツ麦油、小麦胚珠油および植物油である。藻類油は、種、細胞の生理学的状態、培養条件、採取時期、および抽出に利用した溶媒に応じて典型的には約３０〜８５％（ｗ／ｗ）の極性脂質を含有する。さらに、各極性脂質のグリセロール骨格は、中性脂質であるトリアシルグリセロール中の３個の代わりに付着した２個の脂肪酸基を有する。極性脂質のエステル交換では、質量基準あたりで、中性脂質のものと比較して、３分の２の最終生成物、すなわち、エステル化脂肪酸しか得られないことがある。したがって、極性脂質の除去および回収は、多量のバイオ燃料またはトリグリセリドを藻類から生産するのに高度に有利であるだけでなく、付加価値のある副産物である糖脂質およびリン脂質も生成し、このことは、藻類ベースのバイオ燃料の生産に関連するコストをひいては相殺し得る。藻類によって生産される種々の油および副産物を容易に回収および分画する能力は、藻類油プロセスの経済的成功に有利である。
【００８０】
本明細書に記載されている方法およびシステムのさらなる態様は、藻類バイオマスなどの油性材料からタンパク質を抽出する能力である。本明細書に開示されている、藻類バイオマスからタンパク質性材料を抽出する方法は、柔軟かつカスタマイズ可能な抽出および分画プロセスを含む。例えば、いくつかの実施形態において、抽出および分画は、単１工程で行われ、これにより、高効率なプロセスを提供する。かかるバイオマスから調達されるタンパク質は、動物飼料、食品成分および工業製品に有用である。例えば、かかるタンパク質は、例えば、繊維、接着剤、塗料、セラミック、インク、化粧品、布地、チューイングガム、および生分解性プラスチックの適用において有用である。
【００８１】
本明細書に記載されている方法およびシステム別の態様は、抽出される成分を基準にした藻類バイオマス対溶媒の比を変動させることを含む。一実施形態において、藻類バイオマスは、等重量の溶媒と混合される。別の実施形態において、藻類バイオマスは、より少ない重量の溶媒と混合される。なお別の実施形態において、藻類バイオマスは、より多い重量の溶媒と混合される。いくつかの実施形態において、藻類バイオマスと混合される溶媒の量は、用いられる溶媒、および藻類バイオマス／溶媒混合物の望ましい極性を基準にして計算される。さらに他の実施形態において、藻塊は、数工程で抽出される。例示的な実施形態において、藻類バイオマスが、第１に、約５０〜６０％の重量で、僅かに非極性の水混和性溶媒によって順次抽出される。第２に、残存する藻類固体が、溶媒中約７０％の固体の重量を用いて抽出される。次いで、溶媒中約９０％の固体の重量を用いて第３の抽出が実施される。本発明のこれらの態様を報告したが、当業者は、藻類生成物を選択的に抽出するために、藻類バイオマスおよび／または固体の比を所望の極性に調整することによって、異なる極性の異なる溶媒を用いることができる。
【００８２】
例えば、好ましい実施形態において、用いられる溶媒はエタノールである。成分は、溶媒の比を変動させることによって選択的に単離され得る。タンパク質は、約５０％エタノールによって藻類バイオマスから、約８０％エタノールによって極性脂質から、および約９５％以上のエタノールによって中性脂質から抽出され得る。メタノールが用いられるならば、藻類バイオマスからタンパク質を抽出する溶媒濃度は、約７０％である。極性脂質は約９０％メタノールを必要とし、中性脂質は約１００％メタノールを必要とする。
【００８３】
本明細書に記載されているシステムおよび方法の実施形態は、驚くべき予測されない結果を示す。まず、回収／抽出プロセスは、湿潤バイオマスにおいて行われ得る。これは、例示的な実施形態が、細胞を乾燥および破壊するのに必要とされる多量のエネルギーの使用を回避するとする、主に経済的な利点である。乾燥藻類バイオマスからの中性脂質の抽出は、本発明のシステムおよび方法を用いるとはるかにより効果的である。開示されているプロセスから得られる収率は、従来の抽出によって得られるものよりも有意に高く純粋である。これは、従来の抽出がエマルションを頻繁にもたらして成分の分離を極めて困難にするためである。
【００８４】
例示的な実施形態は、いずれの藻類または非藻油性材料に適用されてもよい。例示的な実施形態は、限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルを含めたいずれの水−混和性の僅かに非極性の溶媒を用いてもよい。具体的な実施形態は、グリーンな再生可能溶媒、例えば、エタノールを用いてよい。試験されたアルコール溶媒は、単離された中性脂質の収率および純度をさらに高くする。エタノールは、本明細書に開示されている他の溶媒と比較して購入するのが比較的経済的である。いくつかの例示的な実施形態において、抽出および分画は、１工程で、続いて、必要に応じて、膜ベースの精製により実施され得る。得られるバイオマスは、ほとんど水を含まず、水性藻類スラリーよりも少ないエネルギーで完全に乾燥され得る。
【００８５】
いくつかの例示的な実施形態において、抽出するのにいられる溶媒は、エタノールである。他の実施形態として、限定されないが、シクロヘキサン、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、イソプロパノール、およびメタノールが挙げられる。いくつかの実施形態において、同じ溶媒が順次抽出工程で用いられる。他の実施形態において、異なる溶媒が各抽出工程で用いられる。さらに他の実施形態において、２種以上の溶媒が混合されて１以上の抽出工程で用いられる。
【００８６】
本明細書において記載されている方法のいくつかの実施形態において、抽出工程のいずれかにおいて用いられる２種以上の溶媒の混合物は、少なくとも１種の親水性溶媒および少なくとも１種の疎水性溶媒を含む。かかる混合物を用いる場合、親水性溶媒は、拡散を介してバイオマスから材料を抽出する。一方で、比較的少量の疎水性溶媒が組み合わせて用いられ、対象の材料が少量の疎水性溶媒で濃縮されるような液−液分離が関与する。次いで、２種の異なる溶媒は、当該分野において公知の技術を用いて分離され得る２層系を形成する。かかる実施においては、疎水性溶媒は、アルカン、エステル、ケトン、芳香族、ハロアルカン、エーテル、または市販の混合物（例えば、ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）のうちのいずれか１種以上であってよい。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されている抽出プロセスは、ｐＨ偏位を１種以上の工程に組み込む。かかるｐＨ偏位は、タンパク質性材料を単離するのに有用である。いくつかの実施形態において、抽出プロセスのｐＨは、酸（例えば、約５未満）である。いくつかの実施形態において、抽出プロセスのｐＨは、アルカリ（例えば、約１０超）である。
【００８８】
従来の抽出手順におけるヘキサンの使用は、副産物を食品において用いることができないように藻類バイオマスを汚染する。本発明の実施形態は、はるかに少ないエネルギーを必要とし、生成物を燃料ならびに食料品および栄養補給剤としての使用に好適にするため、当該分野において公知のものよりも優れている。
【００８９】
この明細書において議論されているいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法またはシステムによっても実施され得、またその逆も然りであることが意図される。さらに、本発明のシステムは、本発明の方法を達成するのに用いられ得る。
例示的な実施形態の説明
【００９０】
藻類からの油の溶媒抽出に関して、最も良好な場合のシナリオでは、溶媒がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を選択的に抽出し、高い回収で藻細胞内の全ての極性脂質および非ＴＡＧ中性脂質、例えばワックス、ステロールを残す。第２オプションは、極性脂質を選択的に抽出し、次いで、極性脂質を含まないより純粋な中性脂質を抽出して、結果として高い回収を得る。最後のオプションは、抽出物全ての脂質を抽出して、１または２工程で非常に高い回収を達成する。
【００９１】
図１Ａを参照すると、フローチャート１００は、藻類含有バイオマスからの脂質の分画および精製において用いられる方法の例示的な実施形態に含まれる工程の概要を提供する。第１工程１１０において、藻細胞が採取される。その後の工程１２０において、藻細胞から水が除去されて、１０〜２５％の固体バイオマスを得る。工程１３０において、溶媒ベースの抽出がバイオマスにおいて実施されて、画分が収集される。いくつかの実施形態において、工程１３０はまた、ｐＨベースの抽出および画分収集も組み込む。最後に、より小さな脂質成分を分離するために、限定されないが、例えば、濾過、デカント、および遠心分離の技術を含めた固／液相分離が、工程１４０において実施され得る。
【００９２】
藻類バイオマスは、工程１１０において採取されるとき、典型的には約１〜５ｇ／Ｌの全固体からなる。バイオマスは、限定されないが、気泡浮上分離、膜濾過、軟凝集、沈降、フィルタ押圧、デカンテーションまたは遠心分離を含めた技術を用いて工程１２０において部分的に脱水され得る。脱水は、固体または半固体物質からの水のいくらか、大部分または全ての除去である。本発明の実施形態は、採取された藻類バイオマスから水を除去する脱水技術を利用する。脱水は、本明細書において記載されている方法のいずれか１つまたは組み合わせを用いて、および当業者に公知のいずれかの他の方法によって行われ得る。
【００９３】
工程１２０から得られた脱水された藻類バイオマスは、典型的には約１０〜３０％の固体からなる。このバイオマスは、次いで、水混和性の僅かに非極性の溶媒（例えば、アルコール）によって、各段階で画分を隔離する多段階向流溶媒抽出プロセスで抽出され得る。このタイプのプロセスは、資本および運転経費の両方を低減することができる。いくつかの実施形態において、バイオマスはまた、酸および／またはアルカリ抽出を経て、タンパク質材料を分画する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、藻類バイオマスの脱水は、採取された藻類バイオマスを溶媒、例えば、エタノールで処理することによって行われ得る。藻類バイオマスは、次いで、溶液を沈降させ、次いで、液体は、方法、例えば、限定されないが、吸収によって除去され得る。この新規の脱水方法は、公知の方法よりも資本および運転コストが低く、溶媒リサイクルを可能にし、バイオマスの乾燥コストを低減し、藻類成分の抽出および／または分離の前に藻類バイオマスの極性を減少させるという追加の利益を有する。実際、本明細書において記載されている溶媒ベースの沈降プロセスは、藻類表面上の負電荷を低減または中和させるという事実に起因して、部分的に効果的であるということが理論化されている。本発明のいくつかの実施形態において、脱水方法は、さらに多くの水を除去するように組み合わされる。いくつかの実施形態において、脱水プロセスの間の溶媒の添加は、抽出プロセスを開始させる。
【００９５】
図１Ｂは、脱水プロセス３００の例示的な実施を示す。約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ（すなわち、０．１〜１％ｗ／ｗ）の最終乾燥重量を有する藻類培養物３１０は、水分離プロセス３２０に付される。プロセス３２０は、遠心分離、デカント、沈降または濾過を含み得る。一実施形態において、焼結金属槽フィルタは、培養物の水から藻類バイオマスを分離するのに用いられる。かかるフィルタを用いると、回収された水３３０は、他の藻類培養物を対象としてリサイクルされる。一方で、回収された藻類バイオマスは、約２００ｇ／Ｌ（すなわち、１０〜２０％ｗ／ｗ）と高い藻類密度を有する「藻類ペースト」にまで濃縮されている。この濃縮された藻類ペーストは、次いで、溶媒ベースの沈降プロセス３５０において溶媒３４０で処理される。
【００９６】
沈降プロセス３５０は、溶媒３４０を藻類ペーストに添加して、約１：１〜約１：１０の間の溶媒対バイオマスの重量／重量比を有する混合物を得ることを含む。藻類は沈降ベッセルにおいて沈降して、溶媒／水混合物３６０は、例えば、吸収および／またはデカントによって除去される。溶媒は、周知の技術、例えば、蒸留および／またはパーベーパレイションによって回収および再使用され得る。残存する湿潤バイオマス３７０は、アルコールおよび水溶液中約３０％〜約６０％ｗ／ｗの固体含量を有すると予測される。
【００９７】
脱水に理想的な溶媒は、１．１ｇ／ｍＬ超または０．９ｇ／ｍＬ未満の密度を有する工業上一般的な水溶性溶媒である。例として、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、エタノール、メタノール、１−プロパノール、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、および／またはグリセリンが挙げられる。溶媒密度が１．１ｇ／ｍＬを超えるとき、藻類バイオマスは、沈降ベッセルの底部において堆積物を作り出すよりもむしろ浮く。
【００９８】
図２は、抽出システム２００の例示的な実施形態の概略図である。湿潤または乾燥藻類バイオマスは、限定されないが、移動ベルト、スクリューコンベヤ、または直通抽出チャンバを含めた当該分野において公知の方法を用いて輸送される。抽出用溶媒は、各バイオマスのスロット位置に割り当てられた貯蔵タンクから再循環される。抽出混合物は濾過され、バイオマス固体をスロットに戻し、抽出物を貯蔵タンクに戻す。ベルト上の固体は、抽出のための滞留時間に基づいて周期的に移動する。各貯蔵タンクにおける抽出物は、飽和時に補給されても、未使用の溶媒によって連続的に置き換えられてもよい。これにより、下流の処理時間およびコストも劇的に低減される。この実施形態は、一次貯留層２１０、輸送機構２２０、複数の分離装置２４１〜２４８（例えば、膜濾過装置）、複数の抽出貯留層２６１〜２６８、および複数のリサイクルポンプ２８１〜２８７を含む。この実施形態において、一次貯留層２１０は、複数の入口貯留層２１１〜２１８に分割される。
【００９９】
操作の間、藻類バイオマス２０１は、輸送機構２２０の第１端２２１の付近の第１入口貯留層２１１に置かれる。加えて、溶媒２０５は、輸送機構２２０の第２端２２２の付近の入口貯留層２１８内に置かれる。輸送機構２２０は、輸送機構２２０に沿って、第１端２２１から第２端２２２に藻類バイオマスを向かわせる。藻類バイオマスは、輸送されるに従い、複数の分離装置２４１〜２４８を通過して、種々の極性の画分に分離される。分離装置２４１〜２４８を通過する透析物部分は、貯留層２６１〜２６８に向かう。
【０１００】
例えば、第１分離装置２４１を通過する、藻類バイオマスの透析物部分（例えば、分離装置２４１を通過するのに十分に小さな液体および粒子を含有する部分）は、第１貯留層２６１に向かう。第１貯留層２６１から、透析物部分がリサイクルされて第１入口貯留層２０１に戻り得る。第１分離装置２４１を通過しない藻類バイオマスの残余部分は、次いで、輸送機構２２０によって、第２入口貯留層２１２、および第１分離装置２４１よりも微細な分離または濾過媒体を含み得る第２分離装置２４２に向かってよい。
【０１０１】
第２分離装置２４２を通過する透析物部分のセグメントは、第２貯留層２６２に向かって、次いでリサイクルされてリサイクルポンプ２８２を介して第２入口貯留層２１２に戻されてよい。第２分離装置２４２を通過しない藻類バイオマスの残余または抽出部分は、輸送機構２２０によって第３入口貯留層２１３に向かってよい。このプロセスは、各段階での残余部分がその後の入口貯留層に向かうように入口貯留層２１３〜２１８および分離装置２４３〜２４８について繰り返されてよいが、透析物部分は、リサイクル貯留層に向かって、リサイクルされて現在の入口貯留層に戻る。
【０１０２】
例示的な実施形態において、第１画分は、最も高い、水対僅かに非極性の溶媒比、すなわち、最も極性の混合物で抽出されるが、最後の画分は、最も純粋な、僅かに非極性の溶媒、すなわち最も極性の低い混合物で抽出される。プロセスは、画分によって、極性を減少させる順序で成分を抽出する。第１画分の機能は、残りの水を除去して溶媒抽出プロセスを促進することである。続いての画分は、極性脂質リッチであるが、最後の画分は中性脂質リッチである。
【０１０３】
油画分は、エステル化されて、長鎖不飽和脂肪酸を遊離することができる。カロテノイドおよび長鎖不飽和脂肪酸は、プロセス、例えば、非分子蒸留と併せた分子蒸留を用いて油から分離され得る。全ての脂肪酸は、分子蒸留を用いてカロテノイドから分離され得る。蒸留物は、単一の蒸留カラムを用いて分画されて、精製のために、より短鎖の脂肪酸を分離することができる。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム中に高沸点残渣として残存する。
【０１０４】
いくつかの非限定的な実施形態において、本明細書において記載されている抽出システムおよび方法は、タンパク質材料を油性材料（例えば、藻類バイオマス）から単離するための１つ以上の工程を組み込む。かかるタンパク質抽出工程は、ｐＨ調整を使用して、タンパク質の単離および抽出を達成する。例えば、１つの非限定的な実施形態において、第１分離装置中の溶媒のｐＨが、タンパク質抽出のために最適化され、タンパク質材料リッチな第１画分を生じる。タンパク質抽出工程のｐＨは、対象のタンパク質のｐＫａに応じて調整される。対象のタンパク質のｐＫａは、限定されないが、Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ式、経験的方法、分子動力学をベースとする方法を用いること、または滴定曲線の使用を含めた、当業者に公知の方法を用いて確かめられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、溶媒ｐＨはアルカリである。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒ｐＨは、約１０超である。他の実施形態において、溶媒ｐＨは、約１０〜約１２の範囲である。さらなる実施形態において、溶媒ｐＨは、約１０、約１１、または約１２である。他の実施形態において、溶媒ｐＨは、酸である。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒ｐＨは、約５未満である。他の実施形態において、溶媒ｐＨは、約２〜約５の範囲である。さらなる実施形態において、溶媒ｐＨは、約２、約３、約４、約４．５、または約５である。第１分離装置の抽出部分は、次いで、その後の入口貯留層に向かい、極性ベースの抽出および分画を達成する。別の非限定的な実施形態において、タンパク質材料は、同様の手段（すなわち、溶媒のｐＨ調整）によって最終の分離装置において分離される。
【０１０６】
溶媒ｐＨの調整は、当業者に公知の方法によって達成される。例えば、酸ｐＨは、適切な酸の溶媒ストリーム中への混合によって得られる。タンパク質抽出に有用な例示的な酸として、限定されず、リン酸、硫酸、および塩化水素酸が挙げられる。同様に、アルカリｐＨは、適切な塩基の溶媒ストリーム中への添加および混合によって得られる。タンパク質抽出に有用な例示的な塩として、限定されず、水酸化カリウム、および水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、タンパク質抽出は、本明細書において記載されている抽出および分画システムとは別個のシステムにおいて実施される。例えば、いくつかの実施形態において、藻類バイオマスは、ｐＨ調整された溶媒混合物中に浸漬され、続いて、適切な分離技術（例えば、遠心分離、または濾過）を介して単離される。残存する固体は、次いで、本明細書において記載されているように、極性ベースの抽出および分画システムに導入される。同様に、いくつかの実施形態において、極性ベースの抽出および分画プロセスからの残存抽出物は、ｐＨ調整された溶媒混合物に暴露されて、抽出プロセスの最後にタンパク質材料を単離する。
【０１０８】
図３に示すように、溶媒選択および極性ベースの分画の理論は、溶媒およびＳｏｈｘｌｅｔ抽出プロセスを用いる抽出への影響の詳しい分析によって発展され、固体材料からの脂質の分離を可能とする。Ｓｏｈｘｌｅｔ抽出システムは、脂質クラス選択性および回収のための溶媒を迅速にスクリーニングするために利用される。広範な極性、例えば、アルカン類、シクロアルカン、ハロゲン化アルキル、エステル類、ケトン類を包含する種々の化学物質のクラスからの溶媒が試験された。抽出の前に、抽出されるバイオマスの脂質含量および組成が、藻類油の概算のための標準的な方法、例えば、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ脂質抽出法を用いて３回試験された。バイオマスに含有される合計脂質は、２２．１６％であり、その４９．５２％が中性脂質であった。
【０１０９】
図３は、種々の極性および非極性溶媒をＳｏｈｘｌｅｔ抽出プロセスと併用した乾燥藻塊の抽出によって集められたデータを提示する。アルカン溶媒の鎖長に応じて、６０〜７０％の純度の中性脂質および１５〜４５％の合計脂質回収が、破壊および溶媒抽出なしに得られ得る。試験した最長鎖のアルカン溶媒、ヘプタンにより、６０％の中性脂質および４２％の合計脂質が回収された。図３が示すように、溶媒および従来の抽出法、例えば、ヘキサンを用いた乾燥藻塊の抽出結果は非効率的で高価であり、低い収率をもたらす。本明細書に開示されているシステムおよび方法は、成分の損失を最小にしながら種々の極性の成分を分離するために僅かに非極性の溶媒の水に対する割合を制御することによって、これらの非効率性に対処する。
【０１１０】
より低炭素のアルコール溶媒は、極性脂質に対してより選択性であった。中性脂質の純度はメタノールで２２％、エタノールで４５％であった。イソプロピルアルコールは、極性と非極性脂質との間でいずれの選択性も示さず、５２％の純粋な中性脂質生成物を生じた。メタノールにより、６７％の合計脂質および９０％を超える極性脂質が回収された。したがって、メタノールは、ヘプタンまたはヘキサンを用いて中性脂質を抽出する前に油性材料から極性脂質を選択的に抽出するのにメタノールが用いられ得る本発明の実施形態の優れた候補である。試験した他の溶媒のクラスは、脂質のクラスに対していずれの選択性も示さなかった、なぜなら、元のバイオマスに存在する脂質の組成と同様に、中性脂質純度が４９％に近かった。さらに、合計脂質回収は、約１５〜３５％のこれら溶媒によって得られ、これらの溶媒を特定の脂質のクラスの選択的抽出または合計脂質抽出に好適でないものにした。
【０１１１】
Ｓｏｈｘｌｅｔ分析から得られる結果は、標準的なベンチスケールのバッチ溶媒抽出装置を用いて、実施例１において以下に示されるように確認された。選択された溶媒は、極性脂質を回収する第１工程ではメタノール、中性脂質回収のための第２工程では石油エーテルであった。全ての抽出は、１：１０の固体：溶媒比で実施された。この実験における各抽出工程は、１時間の長さである。なされた他の実験（データ示さず）により、約４５分以上は、抽出が成功するには十分に長いことを示している．
【０１１２】
メタノール抽出は、いずれが最適であるかを決定するために、異なる温度、４０℃、５０℃、および６５℃で実施された。石油エーテル抽出は、溶媒の沸点に近い３５℃で実施される。石油エーテルは、中性脂質の高い選択性があるため、低い沸点および抽出後に観測され、抽出後に観察された生成物量を測定した
【０１１３】
図４Ａは、６５℃でのメタノール抽出工程に行われた石油エーテル抽出における中性脂質純度が、８０％を超え、この２つの抽出工程では、最終の粗油生成物の中性脂質含量が高められる。図４Ｂは、合計中性脂質回収が低く、第１工程において相当量の中性脂質が存在した。
【０１１４】
メタノール抽出工程における中性脂質の損失を最小にするために、水を溶媒に添加することによって溶媒の極性を増加させてよい。図５Ａおよび５Ｂは上記バイオマスの、７０％ｖ／ｖの水性メタノールによる抽出、続いて石油エーテルによる抽出の結果を示す。図５Ａは、中性脂質純度が、純粋なメタノールの使用によって得られたものよりも、石油エーテル抽出においてかなり高かったことを示す。さらに、中性脂質の損失は、第１抽出工程における水性メタノールの使用によって大きく低減された。図５Ｂに見られるように、より高温でのメタノール抽出により、中性脂質純度が改善されたが、その後の工程において合計脂質回収が僅かに減少した。
【０１１５】
いくつかの例示的な実施形態において、抽出プロセスの温度は、藻類バイオマスに存在する藻類成分の最適な安定性を確保するように制御される。藻類タンパク質、カロテノイド、およびクロロフィルは、温度感受性を示す藻類成分の例である。他の実施形態において、温度は、温度感受性の藻類成分が藻類バイオマスから抽出された後に増加させる。
【０１１６】
さらに他の例示的な実施形態において、抽出プロセスの温度は、所望の生成物の収率を最適化するように調整される。抽出は、周囲温度から抽出混合物の沸点まで、しかしこれ未満で実行され得る。さらに他の実施形態において、抽出プロセスの温度は、所望の生成物の溶解度に応じて変化する。さらに他の実施形態において、抽出は、温度は、抽出されるバイオマスの藻類株に応じて最適化される。抽出温度が上昇することで、所望の化合物の溶解度を増加させ、抽出混合物の粘度を低減して、抽出回収を高める。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、抽出は、抽出混合物の沸点を上昇させるために加圧下に実行される。これらの実施において、圧力を、所望の生成物のいずれかが崩壊し、変性し、分解し、または破壊され始める温度未満に抽出混合物の温度を維持しながら、沸騰を防止するのに必要な程度まで増加させる。
【０１１８】
いくつかの例示的な実施形態において、抽出は、用いられる溶媒の沸点付近で、抽出が実施される条件（例えば、周囲圧力または高圧）において実施される。他の実施形態において、抽出は、他の抽出条件を同様に構成する、抽出混合物の沸点付近で実施される。かかる温度において、藻細胞内への溶媒の気相浸透は、より低い物質移動抵抗に起因して、より速い。抽出温度が、溶媒の沸点を有意に超えるようにするとき、溶媒−水システムは共沸混合物を形成し得る。このように、溶媒の沸点またはその付近にシステムを維持することで、費用を低減しながら、抽出を高めるのに十分な蒸気を生成する。加えて、油の溶解度は、より高い温度で増加し、このことは、溶媒沸点に近い温度での抽出の高価をさらに増加させ得る。図６は、水性メタノール−石油エーテル抽出スキームにおける合計脂質回収を示す。メタノール抽出を沸騰温度付近で実施することで中性脂質回収を僅かに減少させるが、図５Ｂにおいて観察されるように、合計脂質回収を高める。
【０１１９】
他の実施形態において、抽出は、周囲照明条件下に行われる。他の実施形態において、抽出は、光感受性の藻類成分を劣化から保護するために、限定されないが、スチール管またはケースなどの不透明な容器において行われる。カロテノイドは、光感受性の藻類成分である。
【０１２０】
他の例示的な実施形態において、抽出は、標準大気条件下に行われる。さらに他の実施形態において、抽出は、酸化しやすい藻類成分を保護するために、窒素雰囲気下で行われる。さらに他の実施形態において、抽出は、酸化しやすい藻類成分を保護するために、不活性ガス雰囲気下で行われる。酸化しやすい藻類成分として、カロテノイド、クロロフィル、および脂質が挙げられる。
【０１２１】
例示的な実施形態において、抽出のための溶媒対固体比は、バイオマス中の固体の乾燥重量を基準として３〜５の間である。残りの藻類バイオマスは、炭水化物（例えば、デンプン）リッチであり、フィードストックとして用いられて、抽出に用いられる溶媒を生成することができる。
【０１２２】
図７は、溶媒対固体比の合計脂質回収への影響を示す。溶媒対固体比が増加するに従い、合計脂質回収が対応して劇的に増加した。これは、他の一般的に用いられている油抽出溶媒、例えば、ヘキサンと比較して、メタノール中への脂質の溶解度が低いためであると考えられる。
【０１２３】
成分の溶解度は、抽出プロセスにおいて用いられる溶媒の極性によって影響される。溶媒度特性は、湿潤バイオマス対溶媒の比を決定するのに用いられ得る。例えば、４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスは、１００ｇの湿潤バイオマスにつき４０ｇのバイオマスおよび６０ｇの水を有する。１００ｇのエタノールがこの混合物に添加されると、エタノール対湿潤バイオマスの比は、１部の湿潤バイオマス対１部のエタノールであり、混合物中のエタノールの濃度は、１００／（１００＋６０）＝約６２％ｗ／ｗのエタノール（液相中）である。エタノール水混合物中６２％ｗ／ｗのエタノールは、６．６の極性指数に相当し、重量および成分の極性を平均したものによって計算される。６２％のエタノールおよび３８％の水を含有する混合物中では、エタノールの極性指数は５．２であり、水の極性指数は９であり、結果として、（０．６２＊５．２＋．３８＊９）約６．６の極性指数をもたらす。極性脂質および中性脂質の、抽出のための混合物の極性指数は、それぞれ約５．８および５．４であると計算される。本開示に照らして、当業者は、これらの成分を選択的に抽出することができる溶媒セットを調合することができる。
【０１２４】
別の例において、抽出溶媒がイソプロピルアルコールおよびエタノールの１：１混合物であるとき、この溶媒の極性は、（（３．９＋５．４）／２）、約４．６５である。溶媒対湿潤バイオマスの比は、極性を適合させるように計算される。６．６の極性指数を得るには、本発明者らは、以下の代数方程式を解くことによって計算される５５％ｗ／ｗのＩＰＡ−水混合物を作製する必要がある：
【数１】
2013523161.tif 000005
【０１２５】
４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスについて、これは、１００部の湿潤バイオマス対７５部の溶媒混合物の比に相当する。４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスは、１００ｇの湿潤バイオマスにつき４０ｇのバイオマスおよび６０ｇの水を有する。７５ｇの溶媒混合物がこの混合物に添加されると、混合物中の溶媒の濃度は（７５／（７５＋６０））であり、これは溶媒混合物−水溶液中約５５％ｗ／ｗの溶媒混合物である。この計算は、各抽出段階において各生成物について溶媒バイオマス比を得るのに用いられ得る。溶媒セットのいくつかの非限定例を表３に表す。
【表３】
2013523161.tif 000006
【０１２６】
全ての例において記載されている抽出混合物は、略固相および略液相から作製される。これらの相は、次いで、抽出後に分離される。次いで、これに続いて、液体溶媒を液相から除去することができ、抽出生成物を生じさせる。いくつかの実施形態において、溶媒は蒸発される。かかる実施においては、液体−液体抽出技術は、蒸発される必要がある溶媒の量を低減するのに用いられ得る。用いられるいずれの溶媒も、条件が許すならばリサイクルされ得る。
【０１２７】
抽出前の藻類バイオマスの処理が、脂質抽出の生産性および効率を高めることが理論化された。この方向では、塩基または別の有機溶媒を藻類バイオマスに添加して表面特性を変更し抽出を高める効果を比較しながら実験を行った。水性メタノール、水性水酸化ナトリウム、および水性ＤＭＳＯを含めた種々の処理を試みた。図８が実証するように、５％のＤＭＳＯの添加は、脂質回収を３倍に増加させる。これらの抽出工程は、メタノール抽出工程を劇的に低減するのに活用されてよい。しかし、上記実験で用いた溶液は、高いコスト、粘度、ならびにＤＭＳＯを回収およびリサイクルする能力により、より大規模での使用には理想的でないことがある。
【０１２８】
図９は、８工程メタノール抽出が、抽出された中性脂質の累計脂質収率および純度に及ぼす効果を示すチャートである。この実施形態において、１１２ｇの湿潤バイオマス（２５．６％乾燥重量）を、３５０ｍＬの純粋なメタノールで抽出し、各工程において１６０Ｗの照射電力で１０分間加熱した。これにより、抽出混合物の沸点付近である約７５℃の抽出温度をもたらした。このプロセスを用いて、大部分の極性脂質が抽出されたら、高度に純粋な中性脂質が藻油から得られることが可能であることが判明した。図９は、極性脂質が全て抽出されると、高純度の中性脂質を単離することか可能であることを示す。この場合には、メタノール抽出工程５〜８において、９０％の中性脂質純度で、全バイオマスの５％の収率が得られた。さらに、抽出混合物の沸点に起因して、バイオマス中の大部分の水が、炭水化物、タンパク質および金属と併せて、第１抽出工程において完全に抽出される。
【０１２９】
図１０は、脂質回収が、脂質およびタンパク質を湿潤バイオマスから抽出するためのエタノールの使用によってより効果的になり得ることを示す。エタノールを用いることによって、８０％の合計脂質回収が、メタノールを用いることによって一般に必要とされる９よりもむしろ約４工程で得られ得る。この回収の増加は、メタノールと比較してエタノール中の脂質の溶解度が高いことに起因し得る。さらに、水性エタノールの沸点は、水性メタノールよりも高く、脂質のさらなる回収を促進する。これは、より高い温度が油の粘性を低くし、これにより分散性を改善するためである。このプロセスの別の明確な利点は、油画分中の残りのエタノールをエステル交換に用いること、およびバイオマス乾燥操作への熱負荷を低くすることである。
【０１３０】
さらに、図１０は、初期画分が、タンパク質および他の高度極性分子を含有する非脂質リッチであり、続いて極性脂質リッチな画分、最終的に中性脂質画分であることを実証する。そのため、抽出装置の適正な設計により、単一抽出および分画プロセスにおける３種の全ての生成物を回収することができる。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、抽出を補助するためのマイクロ波を利用する。本出願において開示されている先に集められたデータに基づいて、メタノールが、全ての脂質を藻類から抽出するための最良の単一溶媒であることが示される。そのため、単一溶媒の多工程の抽出は、本出願の実施例１に記載されているように、一溶媒のマイクロ波抽出システムの有効性に関するデータを集めるのに実施した
【０１３２】
図１１は、従来の抽出およびマイクロ波補助抽出の抽出時間および合計脂質回収を比較した対数プロットである。曲線のスロープに基づいて、マイクロ波システムが抽出時間を約５倍以上低減することが計算された。従来の方法は、より高い正味の脂質回収を有するが、これは、極性脂質回収がより高いことに起因するものである。これらの結果に基づいて、マイクロ波の補助を用いてまたは用いずに溶媒を用いて乾燥藻類バイオマスを抽出するための条件が最適化された。本発明のいくつかの実施形態は、水分子を励起する波長を放出する常套的なマイクロ波装置を用いる。本発明のさらに実施形態は、種々の溶媒を励起することが可能である特別注文されたマイクロ波装置を利用する。本発明のさらなる他の実施形態は、藻類バイオマスに存在する脂質を励起することが可能である特別注文のマイクロ波装置を利用する。いくつかの実施形態において、藻類バイオマスに存在する脂質は、マイクロ波を用いて励起され、これにより、脂質成分の藻類バイオマスからの分離および抽出を高める。
【０１３３】
水分含量は、油抽出の効率に影響する、バイオマスの別のパラメータである。本発明のいくつかの実施形態において、乾燥藻塊は抽出および分画される。他の実施形態において、藻塊は湿潤である。藻類質量含有率が１０％、２５％、および３３％であるバイオマスサンプルを、抽出性能に及ぼす影響を調査するのに用いた。
【０１３４】
図１２Ａは、藻類バイオマスからの生成物の段階的抽出の例示的プロセス４００を示す。図１２Ａにおける単位は全てポンドである。図１２Ａは、プロセス４００のマスバランスを示すが、を実施するための設備および／またはシステムの詳細は、本明細書のいずれかの箇所に記載されている。５ポンドの藻類を含有するバイオマスは、約０．６３ポンドの極性脂質、１．８７ポンドの中性脂質、１ポンドのタンパク質、および１．５ポンドの炭水化物を有する。バイオマスおよび１０００ポンドの水が脱水工程４０５で処理され、これは、９５０ポンドの水を混合物から分離して、４５ポンドの水中の５ポンドの藻類を第１抽出工程４１０に通す。本明細書に開示されている脱水技術は、脱水工程４０５において用いられ得る。第１抽出工程４１０において、２３８ポンドのエタノールおよび１２ポンドの水が、前の工程からの藻類および水と合わされる。第１抽出工程４１０は、約８０．９％ｗ／ｗのエタノールの液相を有する。２３１ポンドのエタノール、５３ポンドの水、および０．５ポンドの藻類タンパク質の第１液相が回収され、これから、水およびエタノールが、例えば、蒸発によって除去されて、タンパク質リッチな生成物４１５を残す。蒸発から回収された溶媒は、第１抽出工程４１０にリサイクルされ得る。
【０１３５】
第１抽出工程４１０からの第１固相は、第２抽出工程４２０に通される；この第１固相は、４．５ポンドの藻類、２．６ポンドの水、および１０．９ポンドのエタノールを含む。８６ポンドのエタノールおよび４ポンドの水は、前の工程からの第１固相に添加される。第２抽出工程４２０は、約９３．６％ｗ／ｗのエタノールの液相を有する。８５．９ポンドのエタノール、５．９ポンドの水、および０．６ポンドの極性脂質の第２液相は、回収され、これから、水およびエタノールが、例えば、蒸発によって除去されて、極性脂質リッチな生成物４２５を残す。蒸発から回収された溶媒は、第２抽出工程４２０にリサイクルされ得る。
【０１３６】
第２抽出工程４２０からの第２固相は、第３抽出工程４３０に通される；この第１固相は、３．９ポンドの藻類、０．７ポンドの水、および１１ポンドのエタノールを含む。７４．５ポンドのエタノールおよび３．５ポンドの水は、前の工程からの第２固相に添加される。第３抽出工程４３０は、約９５．４％ｗ／ｗのエタノールの液相を有する。７８．９ポンドのエタノール、３．９ポンドの水、および１．６ポンドの中性脂質の第３液相は、回収され、これから、水およびエタノールが、例えば、蒸発によって除去されて、中性脂質リッチな生成物４３５を残す。蒸発から回収された溶媒は、第２抽出工程４３０にリサイクルされ得る。２．３ポンドの藻類、０．３ポンドの水、および６．６ポンドのエタノールの固相が残存する。
【０１３７】
図１２Ａにおいて実証されているように、逐次的な各エタノール抽出工程によって得られる脂質プロファイルは、出発藻類中の水分含量によって大きく影響された。プロセス４００のモデルを、異なる初期含水量を各々有する３種の異なるバイオマス収集物において実行した。初期含水量が減少するに従い、最大の脂質回収工程は第３抽出工程から第４（示さず）に変化した。しかし、これらの３種のバイオマスサンプルからの全体の脂質回収は、かなり似ており、全てが藻類バイオマスの合計脂質含量の９５％を超えた。
【０１３８】
より高い水分含量を有する藻塊が用いられたときには、水性エタノール混合物中のエタノール濃度はかなり低くなり、結果として、粗抽出物中の中性脂質百分率も低くなった。９０％の水を含む藻類ペーストの脱水は、エネルギーを非常に大量消費するプロセスであることが報告されている。本明細書において記載されている方法は、予想外にも、ほとんど水を含有する藻塊を成功裏に抽出および分画するのに用いられ得る。全体の脂質回収は、９０％の水（１０％の藻類固体）を含有する藻類ペーストから出発することによっては有意には影響されなかったため、従来の抽出法とは違って、本明細書に開示されている方法は、エネルギーを大量消費する乾燥工程の使用を必要としない。
【０１３９】
図１２Ｂは、プロセス４００の抽出工程の１つの例示的実施５００を示す。藻類バイオマスおよび溶媒混合物５０５は、抽出ベッセル５１０に提供される。藻類が抽出された後（本明細書のいずれかの箇所に記載されている）、混合物は、粗濾過システム５１５、例えば、焼結金属管フィルタに提供され、これは、混合物を液相および固相に分離する。固相は、下流の抽出工程に通される。液相は、溶媒除去システム５２０、例えば、エバポレータに通されて、液相中の溶媒（例えば、エタノール）含量を低減する。溶媒除去後に残存する液相は、遠心分離機５２５に場合により通される。溶媒除去システムに残存するあらゆる固体は、リサイクルまたは廃棄される。遠心分離機５２５は、所望の藻類生成物（例えば、タンパク質または脂質）を液相中のあらゆる残存する水および／または固体から分離することを助ける。
【０１４０】
図１４は、藻塊が処理されて１種以上の藻類生成物を形成または回収することができるプロセス６００の例を示す。この例において、藻類バイオマスは、本明細書に開示されている方法を用いて前部プロセス６０５において段階的に抽出される。抽出および分離工程に、エステル化プロセス６１０、加水分解プロセス６１５、水素処理プロセス６２０、および／または蒸留プロセス６２５が続き、成分および生成物をさらに単離する。成分および生成物は、藻類脂質、藻類タンパク質、グリセリン、カロテノイド、栄養価のあるもの（例えば、長鎖不飽和油および／またはエステル類）、燃料エステル類（一般に、Ｃ２０以下の鎖長を有するエステル類）、燃料、燃料添加剤、ナフサ、および／または液体石油代用物を含む。好ましい実施形態において、燃料エステル類は、Ｃ１６の鎖長である。他には、燃料エステル類は、Ｃ１８の鎖長である。さらに他の実施形態において、燃料エステル類は、鎖長がＣ２０以下の混合物である。
【０１４１】
エステル化プロセス６１０、加水分解プロセス６１５、水素処理プロセス６２０、および蒸留プロセス６２５は、場合によるものであり、種々の順序で用いられてよい。破線の矢印および点線の矢印は、加水分解、水素処理、および／または蒸留プロセスが脂質画分の処理において実施されてよいときの選択肢の、全てではなくいくつかを示す。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、抽出および／または分離が行われた後、中性脂質画分は、燃料生成物および／または添加剤を作製するために直接水素処理され得る。代替的には、他の実施形態において、中性脂質画分は、エステル化プロセス６１０に通されてよい。
【０１４２】
エステル化プロセス６１０は、当該分野において公知の技術、例えば、酸／塩基触媒作用を含み得、エステル交換を含み得る。塩基触媒作用は、いくつかの生成物を生成するには排除されないが、これらの技術が塩基触媒作用の間に形成される石鹸を回避するときには酸触媒作用が好ましく、下流の処理を複雑にし得る。酵素的エステル化技術が用いられてもよい。エステル化は、実質的に純粋な脂質材料（７５％を超える脂質、本明細書において用いられるとき）を処理し得る。エステル化後、副生成物のグリセリンが除去され得る。次いで、エステル化脂質は、種々の鎖長のエステル化脂質および脂質画分中に存在するカロテノイドを分離するために、分子および／または非分子蒸留（プロセス６２５）を経てよい。次いで、エステル化脂質は、水素処理プロセス６２０に通されて、ジェット燃料、バイオディーゼル、および他の燃料生成物を生成することができる。当該分野において公知のいずれの水素処理プロセスが用いられてもよく；かかるプロセスは、水素を脂質分子に添加し、酸素分子を除去する。水素処理のための例示的な条件は、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル類を、６００ｐｓｉの範囲の高圧下および６００°Ｆの範囲の温度下に水素と反応させることを含む。一般的に用いられている触媒はＮｉＭｏまたはＣｏＭｏである。
【０１４３】
原料の脂質よりもむしろ燃料エステル類を水素処理することは、いくつかの利点を有する。まず、エステル化プロセス６１０は、藻油に存在するある一定のリンおよび金属化合物のレベルを低減する。これらの材料は、水素処理プロセスにおいて典型的に用いられる触媒には毒である。このように、水素処理の前のエステル化は、水素処理触媒の寿命を長くする。また、エステル化は、水素処理される化合物の分子重量を低減し、これにより、水素処理プロセス６２０の性能を改善する。さらに依然として、水素処理に必要とされるエネルギーを低減することから、蒸気形態で水素処理されるよう、蒸留プロセス６２５からの燃料エステル類を保持することが有利である。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態において、中性の藻類脂質は、該脂質が燃料生成物および添加剤に変換されるためには、直接水素処理される。他の実施においては、中性脂質はエステル化され、蒸留プロセス６２５を介してカロテノイド、長鎖不飽和エステル類、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）エステル類、および／または燃料エステル類に分離される。蒸留プロセス６２５は、分子蒸留および当該分野において公知の蒸留技術を含み得る。例えば、蒸留物は、簡単な蒸留カラムを用いて分画されて、精製のために、より短鎖の脂肪酸を分離することができる。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム中に高沸点残渣として残存する。いくつかの実施形態において、残存する蒸気は、次いで、水素処理プロセスに送られてよい。本発明の利点の２つは、純粋なフィードおよび蒸気生成物を生じさせることであり、上記のように、エネルギーを大量消費する水素処理反応が好ましい。
【０１４５】
本発明のいくつかの実施形態において、極性脂質（および場合により中性脂質）は、エステル化プロセスに通される前に加水分解プロセス６１５において加水分解される。そうすることで、藻類脂質を開放し、より多量の藻類脂質が有用な生成物とされ得る。
【０１４６】
図１５は、栄養価のある生成物を中性脂質から生成するプロセス７００を示すフローチャートである。プロセス７００の一実施において、中性脂質は、ＥＰＡリッチな油からカロテノイドを分離する吸着プロセス７０５に供給される。中性脂質は、本明細書に開示されている選択的抽出技術のいずれかによって生成された藻類源からのものであり得る。しかし、中性脂質は、他の源、例えば、植物源からであってもよい。
【０１４７】
吸着プロセス７０５は、中性脂質を、カロテノイド、例えば、ベータカロテンおよびキサントフィルを吸着する吸着剤と接触させることを含む。一実施において、吸着剤は、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ２０ＳＳ（ＩＴＯＣＨＵ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．から市販されている）である。中性脂質は、バッチタイプのプロセスにおいて吸着剤に接触し得、ここで、中性脂質および吸着剤は、選択された時間量でベッセルに保持される。接触時間の後、吸収剤および液体が、当該分野において公知の技術を用いて分離される。他の実施において、吸着剤は、吸着剤床に保持され、中性脂質は、吸着剤床を通過する。吸着剤床を通過する際、中性脂質のカロテノイド含量は低減され、これにより、ＥＰＡリッチな油を生成する。
【０１４８】
カロテノイドは、限定されないが、アルコール、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、エステル、例えば、酢酸エチルまたは酢酸ブチル、アルカン、例えば、ヘキサン、およびペンタンを含めた適切な溶媒で吸着剤を処理することによって吸着剤材料から回収され得る。
【０１４９】
図１６は、燃料生成物８３０を中性脂質８０５から生成するためのプロセス８００を示すフローチャートである。中性脂質は、本明細書に開示されている選択的抽出技術のいずれかによって生成された藻類源からのものであり得る。しかし、中性脂質は、他の源、例えば、植物源からであってもよい。中性脂質は、脱ガムプロセス８１０において処理され、ここで、脂質は、酸洗浄されて、中性脂質中の金属およびリン脂質のレベルを低減する。いくつかの実施において、リン酸の相対的希釈溶液が中性脂質に添加され、混合物が加熱および振とうされる。沈殿したリン脂質および金属は、次いで、例えば、遠心分離機によって残存する油から分離される。
【０１５０】
次いで、処理された油は、漂白プロセス８１５に通されて、クロロフィルおよび他の着色化合物を除去する。いくつかの実施において、漂白プロセス８１５は、油をクレイおよび／または他の吸着剤材料、例えば、漂白クレイ（すなわちベントナイトまたはフーラー土）と接触させることを含み、油中のクロロフィルおよび他の着色化合物を低減する。処理された油は、次いで、油の成分に水素添加し、およびこれを脱酸素化して燃料生成物、例えば、ジェット燃料混合物、ディーゼル燃料添加剤、およびプロパンを形成する水素処理プロセス８２０に通される。加えて、水素処理プロセス８２０もまた、より短鎖の化合物、例えば、ＬＰＧおよびナフサのいくらかのクラッキングおよび作製を引き起こす。本明細書において記載されている水素処理プロセスのいずれが、水素処理プロセス８２０に用いられてもよい。
【０１５１】
水素処理プロセス８２０において作り出された化合物の混合物は、蒸留プロセス８２５に通されて、種々の燃料生成物８３０に分離される。蒸留プロセス８２５は、燃料化合物の分離のための、本明細書において記載されているまたは当該分野において公知である分子および非分子蒸留技術のいずれかを含んでよい。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、藻類バイオマスから選択的に抽出され得る。開示されている方法を用いたタンパク質抽出は、多くの利点を付与する。特に、藻細胞は、所望のタンパク質を抽出する前に溶解される必要がない。これは、抽出を簡素化し、その費用を低減する。本発明の方法は、種々のクラスのタンパク質の溶解度プロファイルを、藻類培養物、バイオマス、ペースト、またはケーキから選択的に抽出および分画するために利用する。
【０１５３】
例えば、藻類バイオマスは、水および塩可溶性タンパク質（アルブミンおよびグロブリンと呼ばれる）を抽出するための加熱および混合に付されてよい。この混合物は、次いで、グルテリンと呼ばれるアルカリ可溶性タンパク質を回収するためにｐＨ変化に付され得る。この工程には、次いで、プロラミンと呼ばれるアルコール可溶性タンパク質の溶媒ベースの分離が続き得る。残存するバイオマスは、炭水化物および脂質リッチである。
【０１５４】
タンパク質は、図１７および１８に示されるように、塩水および炭水藻細胞の両方から抽出され得る。塩水藻類培養物またはバイオマス中の塩の存在は、種々のクラスのタンパク質の抽出に影響するが、本明細書に開示されている方法は、淡水または塩水藻類のいずれかからタンパク質を抽出することを可能にする。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、淡水藻細胞からのタンパク質抽出は、図１７に示される新規プロセスによって達成される。淡水藻細胞または淡水藻類バイオマスは加熱および混合される。混合は、当該分野において公知の種々の方法、例えば、限定されないが、撹拌、振とう、および揺動によって達成され得る。このプロセスは、第１略液相および第１略固相から構成される、第１の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相は、次いで分離される。分離は、限定されないが、遠心分離、デカンテーション、浮遊、沈降、および濾過を含めた、当該分野において公知の種々の方法によって達成され得る。この第１略液相は、アルブミンタンパク質が富化されている。
【０１５６】
第１略固相は、次いで、塩水と混合され、加熱されて、第２略液相および第２略固相から構成される、第２の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。塩水は天然の海水であっても水性塩溶液であってもよい。かかる溶液の一例は、主にＮａＣｌを含み、典型的には約３５ｇ／Ｌを含む。固体および液相は、次いで分離される。この第２略液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。
【０１５７】
第２略固相は、次いで、水と混合され、加熱されて、第３略液相および第３略固相から構成される、第３の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。この第３抽出混合物またはスラリーのｐＨは、次いで、約９以上まで上げられて、第３略液相をグルテリンタンパク質が富化されているようにする。固体および液相は、次いで分離され、第３略液相は、グルテリンタンパク質が富化されている。
【０１５８】
第３略固相は、次いで、溶媒セットと混合され、加熱されて、第４略液相および第４略固相から構成される、第４の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。好ましい一実施形態において、溶媒セットはエタノールを含む。他の非限定的な実施形態において、溶媒セットは、以下の溶媒：メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリル；のうちの１種以上を含む。固体および液相は、次いで分離される。この第４略液相は、プロラミンタンパク質が富化されている。残存する第４略固相は、出発藻類バイオマスの組成に応じて脂質で富化されていてよい。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、塩水藻細胞からのタンパク質抽出は、図１８に示される新規プロセスによって達成される。塩水藻細胞または塩水藻類バイオマスは加熱および混合される。混合は、当該分野において公知の種々の方法、例えば、限定されないが、撹拌、振とう、および揺動によって達成され得る。このプロセスは、第１略液相および第１略固相から構成される、第１の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相は、次いで分離される。分離は、限定されないが、遠心分離、デカンテーション、浮遊、沈降、および濾過を含めた、当該分野において公知の種々の方法によって達成され得る。この第１略液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。
【０１６０】
第１略固相は、次いで、水と混合され、加熱されて、第２略液相および第２略固相から構成される、第２の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。固体および液相は、次いで分離される。この第２略液相は、アルブミンタンパク質が富化されている。
【０１６１】
第２略固相は、次いで、水と混合され、加熱されて、第３略液相および第３略固相から構成される、第３の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。この第３抽出混合物またはスラリーのｐＨは、次いで、約９以上まで上げられて、第３略液相をグルテリンタンパク質が富化されているようにする。固体および液相は、次いで分離され、第３略液相は、グルテリンタンパク質が富化されている。
【０１６２】
第３略固相は、次いで、溶媒セットと混合され、加熱されて、第４略液相および第４略固相から構成される、第４の加熱された抽出混合物またはスラリーを生成する。好ましい一実施形態において、溶媒セットはエタノールを含む。他の非限定的な実施形態において、溶媒セットは、以下の溶媒：メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリル；のうちの１種以上を含む。固体および液相は、次いで分離される。この第４略液相は、プロラミンタンパク質が富化されている。残存する第４略固相は、出発藻類バイオマスの組成に応じて脂質で富化されていてよい。
【０１６３】
開示されている方法は、図１７〜２０において示されるように種々のタイプのタンパク質の選択的抽出も提供する。上記抽出プロセスの工程のいずれもが、単一のタンパク質生成物を選択的に抽出するために、残りの工程と別個に実施されてもよい。これの２つの例は、抽出工程１ａの周囲の破線のボックスによって示されているように、図１７および１８において見られる。
【０１６４】
非限定的な例において、グロブリンタンパク質は、バイオマスを塩水と混合して加熱し、略液相および略固相から構成される、加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって、淡水藻類バイオマスから選択的に抽出され得る。固体および液相は、次いで分離され得る。液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。図１７の抽出工程１ａを参照されたい。
【０１６５】
別の非限定的な例において、アルブミンタンパク質は、バイオマスを水と混合して加熱し、略液相および略固相から構成される、加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって、塩水藻類バイオマスから選択的に抽出され得る。固体および液相は、次いで分離され得る。液相は、グロブリンタンパク質が富化されている。図１８の抽出工程１ａを参照されたい。
【０１６６】
さらなる非限定的な例において、プロラミンタンパク質は、図１９に示されるように、淡水または塩水藻類バイオマスのいずれかから選択的に抽出され得る。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒セットと混合加熱し、略液相および略固相から構成される、加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって達成される。固体および液相は、次いで分離され得る。液相はプロラミンタンパク質が富化されている。
【０１６７】
なお別の非限定的な例において、タンパク質画分は、図２０に示されるように、淡水または塩水藻類バイオマスのいずれかから選択的に抽出され得る。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒セットと混合加熱し、略液相および略固相から構成される、加熱された抽出混合物またはスラリーを生成することによって達成される。固体および液相は、次いで分離され得る。液相はタンパク質が富化されている。
【０１６８】
本発明のこれらの態様について情報を付与したが、当業者は、一工程の抽出プロセス、または多工程の抽出プロセスのいずれかによって、淡水または塩水藻類バイオマスのいずれかから、所望のタンパク質を選択的に抽出することができる。本開示に照らして、当業者は、藻塊のタンパク質含量および対象のタンパク質の溶媒度特性が考慮されるということを前提に、上記の開示の多工程の抽出スキームの順序を置き換えることが可能である。開示されている方法の他の実施形態は、各抽出工程間に洗浄工程を組み込んでよい。
【０１６９】
開示されているタンパク質抽出法のいずれについても、抽出混合物／スラリーは、一定時間の間、加熱温度で維持されてよい。いくつかの実施形態において、抽出混合物は、約２０分〜約９０分の間、加熱温度で維持される。いくつかの態様において、抽出混合物は、約２０分と約６０分の間、加熱温度で維持される。他の態様において、抽出混合物は、約４５分〜約９０分の間、加熱温度で維持される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、抽出混合物／スラリーは、約５０℃未満の温度で加熱されてよい。いくつかの態様において、アルブミン、グロブリン、およびグルテリンタンパク質は、約５０℃未満の温度で抽出される。他の実施形態において、抽出混合物／スラリーは、抽出混合物／スラリーの沸点近くの温度で加熱される。いくつかの態様において、プロラミンタンパク質は、抽出混合物／スラリーの沸点近くの温度で加熱される。他の実施形態において、圧力は、抽出を高める加熱および混合工程の間、大気圧を超えて最大で５０ｐｓｉ（これを含む）まで増加される。
【実施例】
【０１７１】
実施例１
グリーンな微細藻類スセネデスムス・ジモルファス（ＳＤ）を、パネル光バイオリアクタの外側で培養した。種々の脂質含量のＳＤサンプルを採取した。遠心分離によってバルク水を除去した後、藻類サンプルを３〜５ｃｍの藻類ケーキとして−８０℃で使用まで貯蔵した。予備計算された量の湿潤藻類バイオマス（１５ｇ、乾燥藻類の重量等価）および９０ｍＬのエタノール溶媒を、冷却器、機械的撹拌および熱電対を備えた３つ口フラスコに添加した。一実験において、混合物をマイクロ波照射下に１０分間還流した。第２に、混合物を電子加熱によって１時間還流した。その後、混合物を室温に冷却し、濾過によって透析物と残余分とに分離した。
【０１７２】
藻類サンプルの合計脂質を、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒの脂質抽出法に従ってクロロホルム-メタノール-水システムを用いて分析した。この合計脂質の値を脂質回収計算の参照として用いた。合計脂質を、６０〜２００メッシュのシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、標準的なカラムクロマトグラフィ方法によって、中性脂質および極性脂質にさらに分離した。各脂質画分を予備秤量したバイアルに移し、回転エバポレータ（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて初めに３０℃で蒸発させ、次いで高真空下に乾燥した。乾燥した残余分を窒素下に置き、秤量した。各サンプルの脂肪酸プロファイルを、内部標準としてヘプタデカン酸（Ｃ１７：０）を用いて脂肪酸メチルエステル類に誘導体化した後にＧＣ−ＭＳによって定量した。
【０１７３】
結果（データ示さず）は、マイクロ波アシスト抽出が、中性脂質の分離にはいくぶん効果的でないが、第１抽出工程における極性脂質の除去については最も良好であることが示された。電子加熱は、抽出効果がより一貫している。最終的な収率は、マイクロ波アシスト抽出と電子加熱補助抽出との間に匹敵するが、マイクロ波アシスト抽出が有意にもより速い。
実施例２
藻類バイオマスからのタンパク質抽出
【０１７４】
（１）酸浸出：藻類バイオマスをｐＨ４．５で１時間、水に浸漬した。次いで、サンプルを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを除去した。残存する固体を希酸（ｐＨ４．５）で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１７５】
（２）アルカリ抽出：藻類バイオマスをｐＨ１１で１時間、水に浸漬し、続いてｐＨ調整された水を添加した。次いで、サンプルを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを除去した。上澄みを希酸（ｐＨ４．５）で中和し、続いて遠心分離した。残存する固体を希酸（ｐＨ４．５）で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１７６】
酸浸出およびアルカリ抽出の結果を表４において以下に示す。
【表４】
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【０１７７】
タンパク質収率を重量基準で計算し、凍結乾燥された固体の重量を、ｐＨ調整された水に浸漬する前の藻類バイオマスの重量と比較した。タンパク質純度をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｂａ−２ａ−３８）の公式な方法によって決定し、各プロセスの凍結乾燥された固体中の窒素の量を測定した。タンパク質は、藻類生成物抽出の値を増大させる重要な生成物であるため、この情報は、本明細書に開示されているシステムおよび方法において、種々のタンパク質レベルを有する原料の使用を可能にする。
実施例３
塩水藻類バイオマスからのタンパク質抽出
【０１７８】
初めに塩水中約１〜１０％ｗ／ｗの固体とされた塩水藻類培養物を５０℃に加熱し、この温度で１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液体抽出物はグロブリンタンパク質リッチであることが判明した（元の藻類バイオマスに約１０％の合計タンパク質が存在）。
【０１７９】
固体を次いで淡水に懸濁させ、約５０℃まで加熱し、約１時間維持した。得られたスラリーを再び遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、アルブミンタンパク質リッチであることが判明した（元の藻類バイオマスに約１０％の合計タンパク質が存在）．
【０１８０】
固体を次いでエタノールに懸濁させ、７０％ｗ／ｗの混合物を得た。この混合物を約７５℃に加熱し、この温度で約１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、アルブミンタンパク質リッチであることが判明した（元の藻類バイオマスに約３０％の合計タンパク質が存在）。
【０１８１】
固体を次いでアルカリ溶液（水性ＮａＯＨ、ｐＨ９）に懸濁させ、約５０℃に加熱し、この温度で約１時間維持した。得られたスラリーを遠心分離して液相を固相から分離した。液相は、グルテリンタンパク質リッチであることが判明した（元の藻類バイオマスに約５０％の合計タンパク質が存在）。
実施例４
エタノールによる藻類バイオマスの工程分画および抽出
【０１８２】
１０００ポンドのナンノクロロプシス属のバイオマス（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｇａｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た株２０２．０から培養、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０４８）を採取し、藻類が約３５％ｗ／ｗ含まれ、次いで最終的に凍結されるまで脱水した。
【０１８３】
抽出工程を、ヒンジ付蓋を有する４００ガロンのジャケット付ケトルにおいて実施した。蓋をストラップで固定し、シリコーンでシールした。システムは、２個の翼軸を有する２馬力の防爆モーターを有するミキサーも含有した。凍結した藻類材料をタンク内で空にして、等重量のエタノールを空気圧ドラムポンプを用いてポンピングした。材料を１５分間撹拌し、ジャケットによって水蒸気を加熱して、各抽出工程における所望の温度を得た。所望の温度は、沸点近く、混合物の沸点の３℃以内を意味するが、沸騰しない。この所望の温度は、エタノールの割合が変化するに従って混合物の沸点が変化するため、各抽出工程において異なる。所望の温度に達したら、システムは、ケトルの内容物が均一に加熱されることを各日にするために６０分間所望の温度で保持され、これを連続的に撹拌した。
【０１８４】
次いで、ケトルの内容物を、空気圧のＶｉｋｉｎｇのベーンポンプを１分あたり約１ガロンで用いて、抽出ベッセルの外であってＳｈａｒｐｌｅｓデカンタ遠心分離機の中にポンピングした。デカンタ遠心分離機のロータ速度を約６０００ｒｐｍに設定した。固体を密閉したプラスチックドラムに収集し、該固体は、液体に対して約５０％ｗ／ｗの固体からなった。これらの固体をケトルに戻し、ここで、上記抽出工程を繰り返した。デカンタからの液体ストリームをフィードタンク内に収集し、次いで膜濾過システムに供給した。用いた膜は、Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の０．３７５ｆｔ２ＳＳの膜であった。操作条件は６０℃±５℃であり、４０ｐｓｉの平均圧力勾配であった。膜システムを圧縮空気で約１５分ごとに逆洗浄し、流束を維持した。膜システムから収集した浸透物は、いずれの粒子状物も含まなかった。残余分を収集し、デカンタにリサイクルした。
【０１８５】
この抽出および分画は、各抽出におけるプロセスを通した、溶媒の極性の変化に起因するものである。図１３に示される抽出において、プロセスを、約６５％の純粋な水（３５％ｗ／ｗの藻類固体）を含有する約１０００ｌｂｓ．の湿潤藻類バイオマスによって開始した。これを８６０ｌｂｓ．の変性エタノール（９５％のエタノールおよび５％のメタノール）と混合し、約５５％の水性エタノールを含有する混合物を生じた。固体および液体を上記のようにデカンタを用いて分離した。湿潤固体部分は、５２５ｌｂｓの重量であり、４０％の乾燥質量であった。合計５２５ｌｂｓ．の９５％変性エタノールを固体に添加し、約８５％を水性エタノールが占める混合物を生じた。固体および液体を上記のようにデカンタを用いて分離した。固体部分は、３５４．５ｌｂｓの重量であり、４０％の乾燥質量であった。この塊に、別の７００ｌｂｓ．の変性エタノールを添加し、約９５％の水性エタノールの混合物を生じた。固体および液体を上記のようにデカンタを用いて分離した。得られた固体は、約４０％の乾燥質量であった。このバイオマスは、水およびエタノールの潜在熱を基準に計算されるとき、乾燥に６０％未満のエネルギーを必要とする。
【０１８６】
いくつかの実験において（データ示さず）、他のタイプの変性エタノールを試した。９５％のエタノールおよび５％のイソプロピルアルコールを含有する変性エタノールを抽出に用いたが、９５％のエタノールおよび５％メタノールのものほど効果的でないことが分かった。１００％のエタノールの使用が本発明の好ましい実施形態であるが、コスト制約によって一般に利用可能でない。
【０１８７】
膜システムからの浸透物ストリームを、社内で製作したバッチ式蒸留室を用いて蒸発させた。操作条件は、真空蒸留の間、約８０℃であった。浸透物中の全てのエタノールを蒸発させた。これらの抽出工程を３回繰り返し、図１３に示すように、４つの生成物プールを生じた。これは、各抽出工程について、混合物への水の添加により極性が変化し、各工程について異なる成分の抽出を可能にするためである。生成物１は、藻類タンパク質を含有し、結果として、操作条件下に蒸気化され得ない、システム内の過剰の水を保持することとなった。生成物２は極性脂質を含有した。生成物３は中性脂質を含有した。最終的に、生成物４は残りのバイオマスであり、潜在的な副産物、例えば、カロテノイドを含有した。
実施例５
エタノールによる藻類バイオマスの脱水および抽出
【０１８８】
採取の際、藻類バイオマスは、典型的には約０．１〜０．５％（ｗ／ｗ）の間の固体を含有する。これは、限定されないが膜濾過、遠心分離、加熱、沈降または浮遊を含めた藻類産業において公知の方法のいずれかによって脱水され得る。軟凝集は、浮遊または沈降のいずれかを補助してよい。かかる方法の典型的な結果は、約１０％ｗ／ｗの固体を含有する藻類スラリーである。さらに脱水するために、残存する遊離水のいくらかを除去して４０％ｗ／ｗに近い固体濃度を得る別の脱水方法が用いられてよい。しかし、脱水のコストは、第１脱水が行われた後に指数関数的に増加する。本明細書に開示されているシステムおよび方法の利点は、たった１ラウンドの脱水を経た藻塊の抽出および分画を可能にすることである。
【０１８９】
かかるプロセスの例は、第１抽出ラウンドにおいて、実施例３に記載のプロトコルに従い、９０％の純粋な水を含有する１０００ｌｂｓ．の湿潤バイオマスを１０００ｌｂｓ．の変性エタノール（９５％のＥｔＯＨおよび５％のＭｅＯＨ）と混合して、約５０％の水性エタノールの溶媒混合物を生じることである。得られたバイオマス（３５０ｌｂｓ．）は、４０％乾燥である。これらの湿潤固体の組成は、５０％が水性エタノールである。別の３５０ｌｂｓ．の変性エタノールでは、混合物の組成は約８１％が水性エタノールである。得られたバイオマス（２３５ｌｂｓ．）は、４０％乾燥である。これらの湿潤固体の溶媒組成は、８１％が水性エタノールである。別の４７０ｌｂｓ．の変性エタノールでは、混合物の組成は、約９５％が水性エタノールである。得られた固体は、約９５％がエタノールで、４０％乾燥である。この湿潤バイオマスは、水およびエタノールの潜在熱を基準にして、乾燥に６０％未満のエネルギーを必要とする。この場合、１００ｌｂｓ．の藻類は、１８２０ｌｂｓ．のエタノールを用いて抽出された。出発物質が４０％の藻類固体である実施例３と比較すると、３５０ｌｂｓ．の乾燥藻類等価物が、のエタノールで抽出された。
参照文献
以下の参照文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる：
米国特許第７，１４８，３６６号
Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，  ９２（１）：３９-９０，  ２００９．  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌＣｈｉｓｔｉ，  Ｙ．  （２００７）．  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２５，  ２９４−３０６．  −  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
Ａｍｉｎ，  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｎｖｅｒｓ．  Ｍａｎａｇｅ．，  ５０：１８３４-１８４０，  ２００９．  Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇａｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ａｎｄ  ｇａｓ
Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄｓ，  ４７：５９１-５９７，  ２００９．  ＳＣＦ  ＣＯ２  ｂａｓｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｌｉｐｉｄｓ
Ｂｌｉｇｈ  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｄｙｅｒ  Ｗ  Ｊ．  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９．
Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，  Ｗ．  Ｗ．，  Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＵＫ，  ２００３，  ４１６．
Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＣ，  ９ｔｈ  ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ，  １９９５  ＡＡＣＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ５８−１９．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月13日(2012.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ燃料を作製する方法であって：
ａ．無傷の藻細胞を脱水して、無傷の藻細胞を含む湿潤藻類バイオマスを作製すること；
ｂ．両親媒性溶媒セットの重量は湿潤した藻類バイオマスの重量とほとんど差がなく、湿潤した藻類バイオマスを、１種類以上の両親媒性溶媒を含む両親媒性溶媒セットと合わせて、第１抽出混合物を作製すること；
ｃ．第１抽出混合物を、タンパク質および第１バイオマス画分を含む第１液体画分に分離すること；
ｄ．第２両親媒性溶媒セットの重量は、第１バイオマス画分の重量とほとんど差がなく、第１バイオマス画分を、１種類以上の両親媒性溶媒を含む両親媒性溶媒セットと合わせて、第２抽出混合物を作製すること；
ｅ．第２抽出混合物を、極性脂質および第２バイオマス画分を含む第２液体画分に分離すること；
ｆ．両親媒性溶媒セットの重量は、第２バイオマス画分の重量とほとんど差がなく、第２バイオマス画分を両親媒性溶媒セットと合わせて、第３抽出混合物を作製すること；
ｇ．第３抽出混合物を中性脂質および第３バイオマス画分を含む第３液体画分に分離することを含み、第１液体画分はタンパク質濃度が第２および第３液体画分より高く、第２液体画分は極性脂質濃度が第１および第３液体画分より高く、第３液体画分は中性脂質濃度が第１および第２液体画分より高いこと；
ｈ．中性脂質をエステル交換して、グリセリンおよび燃料エステル類を含む混合物を生成すること；
ｉ．グリセリンを含む水混和性画分を、燃料エステル類を含む水混和性画分、およびエステル化できない材料から分離すること；
ｊ．燃料エステル類を回収することと
を含む方法。
【請求項２】
ａ．蒸留、吸着、または液体−液体抽出からなる群から選択される分離技術によって、燃料エステル類を、炭素数１６以下の燃料エステル画分、および炭素数１６以上の燃料エステル画分に分離すること；
ｂ．炭素数１６以下の燃料エステル類に水素添加し、およびこれを脱酸素化して、ジェット燃料ブレンドストックを得ること；および
ｃ．ジェット燃料ブレンドストックを異性化して、ジェット燃料を得ること
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．蒸留、吸着、または液体−液体抽出からなる群から選択される分離技術によって、燃料エステル類を、炭素数１６以下の燃料エステル画分および炭素数１６以上の燃料エステル画分に分離すること；
ｂ．炭素数１６以下の燃料エステル類に水素添加し、およびこれを脱酸素化して、ディーゼルブレンドストックを得ること；および
ｃ．ディーゼルブレンドストックを異性化して、ジェット燃料を得ること
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バイオ燃料を作製する方法であって：
ａ．無傷の藻細胞を脱水して、無傷の藻細胞を含む湿潤藻類バイオマスを作製すること；
ｂ．両親媒性溶媒セットの重量は、湿潤した藻類バイオマスの重量とほとんど差がなく、湿潤藻類バイオマスを、１種類以上の両親媒性溶媒を含む両親媒性溶媒セットと合わせて、第１抽出混合物を作製すること；
ｃ．第１抽出混合物を、タンパク質および第１バイオマス画分を含む第１液体画分に分離すること；
ｄ．第２両親媒性溶媒セットの重量は、第１バイオマス画分の重量とほとんど差がなく、第１バイオマス画分を、１種類以上の両親媒性溶媒を含む両親媒性溶媒セットと合わせて、第２抽出混合物を作製すること；
ｅ．第２抽出混合物を、極性脂質および第２バイオマス画分を含む第２液体画分に分離すること；
ｆ．両親媒性溶媒セットの重量が、第２バイオマス画分の重量とほとんど差がなく、第２バイオマス画分を両親媒性溶媒セットと合わせて、第３抽出混合物を作製すること；
ｇ．第３抽出混合物を中性脂質および第３バイオマス画分を含む第３液体画分中に分離することを含み、第１液体画分はタンパク質濃度が第２および第３液体画分より高く、第２液体画分は極性脂質濃度が第１および第３液体画分より高く、第３液体画分は中性脂質濃度が第１および第２液体画分より高いこと；
ｈ．中性脂質を触媒によってエステル化して、脂肪酸エステル類およびグリセリンを作製すること；
ｉ．グリセリンを含む水溶性画分を、脂肪酸エステル類を含む水不溶性画分から分離すること；
ｊ．炭素数１６以下の脂肪酸エステル類画分および炭素数１６以上の脂肪酸エステル画分を脂肪エステル類から得ることと；および
ｋ．（ｉ）ジェット燃料ブレンドストックを得るための炭素数１６以下の脂肪酸エステル類および（ｉｉ）ディーゼルブレンドストックを得るための炭素数１６以上の脂肪酸エステル類の少なくとも一方に水素添加し、およびこれを脱酸素化すること
を含む方法。
【請求項５】
エステル化は、酸、塩基または酵素によって触媒される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
溶媒セットの少なくとも１つはアルコールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
溶媒セットの少なくとも１つは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、およびアセトニトリルの少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バイオ燃料を作製する方法であって：
ａ．無傷の藻細胞を脱水して、無傷の藻細胞を含む湿潤藻類バイオマスを作製すること；
ｂ．湿潤藻類バイオマスを、その重量が湿潤藻類バイオマスの重量とほとんど差がなく、１種類以上の両親媒性溶媒を含む両親媒性溶媒セットと合わせて、第１抽出混合物を作製すること；
ｃ．第１抽出混合物を、タンパク質を含む第１液体画分と、第１バイオマス画分と、に分離すること；
ｄ．第１バイオマス画分を、その重量が第１バイオマス画分の重量とほとんど差がなく、１種類以上の両親媒性溶媒を含む第２両親媒性溶媒セットと合わせて、第２抽出混合物を作製すること；
ｅ．第２抽出混合物を、カロテノイド並びにリン脂質および糖脂質を含む極性脂質を含む第２液体画分と、第２バイオマス画分と、に分離すること；
ｆ．第２液体画分を、カロテノイドと、リン脂質と、糖脂質とに分離すること；
ｇ．第２バイオマス画分を、その重量が第２バイオマス画分の重量とほとんど差がない両親媒性溶媒セットと合わせて、第３抽出混合物を作製すること；
ｈ．第３抽出混合物を、カロテノイドとω−３脂肪酸を豊富に含む油を含む中性脂質とを含む第３液体画分と、第３バイオマス画分と、に分離することを含み、ここで第１液体画分はタンパク質濃度が第２および第３液体画分より高く、第２液体画分は極性脂質濃度が第１および第３液体画分より高く、第３液体画分は中性脂質濃度が第１および第２液体画分より高いこと；
ｉ．中性脂質を、カロテノイドと、ω−３脂肪酸を豊富に含む油とに分離すること；
ｊ．ω−３脂肪酸を豊富に含む油をエステル交換して、グリセリンを含む水混和性画分と、脂肪酸エステル類を含む水非混和性画分と、を含有する混合物を生成すること；
ｋ．グリセリンを含む水混和性画分を、脂肪酸エステル類を含む水非混和性画分から分離すること；
ｌ．ここで、脂肪酸エステル類は長鎖ω−３脂肪酸エステル類と短鎖脂肪酸燃料エステル類とを含み；
ｍ．水非混和性画分を真空蒸留して、長鎖ω−３脂肪酸エステル類を、短鎖脂肪酸燃料エステル類から分離すること；および
ｎ．燃料エステル類を回収すること
を含む方法。
【国際調査報告】
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2013523161.tif 000034
2013523161.tif 000035