(57)【要約】  本発明は、妊婦からのサンプルを分析することによる、染色体異数性を検出するための新規な非侵襲性の方法に関する。検出は、異数性に関連する染色体上にみられる胎児性メチル化マーカーの量と、参照染色体上にみられる胎児性遺伝マーカーの量の間の比率に基づくものであり、これにより正確度が改良される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、妊婦に担持されている胎児の染色体異数性を検出するための方法：
（ａ）妊婦から採取された生体サンプル中の胎児由来のメチル化マーカーの量を決定する工程。ここでメチル化マーカーは染色体異数性に関連する染色体上、または染色体異数性に関連する染色体の部位内に位置し、かつ胎児由来のメチル化マーカーは、差次的なＤＮＡメチル化によって、母体由来のその対応物から区別される；
（ｂ）サンプル中の胎児由来の遺伝マーカーの量を決定する工程。ここで遺伝マーカーは参照染色体上に位置し、かつ胎児由来の遺伝マーカーは、ポリヌクレオチド配列における相違、または遺伝マーカーが母体ゲノムに存在しないことによって、サンプル中の母体由来のその対応物から区別される；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から得られた量の比率を決定する工程；および
（ｄ）前記比率を標準コントロールと比較する工程。ここで前記比率が標準コントロールよりも高いかまたは低い場合に、胎児における染色体異数性の存在が示唆される。
【請求項２】
胎児由来のメチル化マーカーが胎盤に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
母体由来の対応物が妊婦の血液細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胎児由来のメチル化マーカーが母体由来のその対応物よりも高度にメチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
胎児由来のメチル化マーカーが母体由来のその対応物よりも低度にメチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが母体の全血、血清、血漿、尿、羊水、生殖器洗浄液、胎盤組織サンプル、絨毛膜絨毛サンプルであるか、または母体血から分離された胎児の細胞を含むサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが胎児の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
メチル化マーカーがホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）遺伝子の一部であるか、またはそれに近接する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
メチル化マーカーがＨＬＣＳ遺伝子の推定プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
メチル化マーカーがマーカー１８Ａまたはマーカー１３Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）が、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを差次的に修飾する試薬でサンプルを処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試薬が、亜硫酸水素塩、またはメチル化状態に基づいてＤＮＡに結合するタンパク質もしくは化学物質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試薬が、メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
試薬が、非メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝マーカーが母体ゲノムに存在しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝マーカーがＹ染色体上に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
胎児由来の遺伝マーカーが、遺伝的多型性によって母体由来の遺伝マーカーから区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
多型性が、一塩基多型（ＳＮＰ）、単純タンデムリピート多型、または挿入−欠失多型を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝マーカーが、Ｙ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝マーカーが、ＴＭＥＤ８遺伝子内のＳＮＰ  ｒｓ６６３６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数のメチル化マーカーまたは遺伝マーカーが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）または（ｂ）が、メチル化マーカーもしくは遺伝マーカーの増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲがメチル化特異的ＰＣＲである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
増幅が核酸配列に特異的な増幅である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）または（ｂ）が分子計数により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）または（ｂ）が、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、アレイキャプチャー、核酸配列に基づく検出、大量に平行して行うゲノムシークエンシング、単一分子のシークエンシング、またはカラーコードプローブ対によるポリヌクレオチドの多重検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）または（ｂ）が、マススペクトロメトリー、またはマイクロアレイ、蛍光プローブ、もしくは分子標識へのハイブリダイゼーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
染色体異数性に関連する染色体が、第１３、第１８、第２１、またはＸ染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記比率が、標準コントロールより少なくとも１標準偏差まで高いかまたは低いことが、胎児に染色体異数性のあることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記比率が、標準コントロールより少なくとも２標準偏差まで高いかまたは低いことが、胎児に染色体異数性のあることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記比率が標準コントロールより少なくとも３標準偏差まで高いかまたは低いことが、胎児に染色体異数性のあることを示す、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年８月１１日に出願された米国仮出願第６１／２３３，０４２号、および２０１０年２月２６日に出願された米国仮出願第６１／３０８，５７８号の優先権を主張するものであり、それぞれの内容はあらゆる目的のために全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
病院と医療従事者によって現在用いられている様々な方法により、染色体異数性のような様々な遺伝疾患が妊娠期間中に検出可能である。しかしながらこれらの方法はほとんどが侵襲性であり、胎児の意図されない喪失または流産の危険性を伴う。母体血漿中の胎児のＤＮＡを用いる、染色体異数性の非侵襲性出生前診断は活発に研究されている分野であり、早期検出のための新規な、より信頼性のある方法が明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、胎児に特異的なエピジェネティックマーカーと遺伝マーカーの組み合わせによる、２１トリソミーのような染色体異数性を検出するための新規方法を提供する。
【０００４】
特に本発明者らは、胎盤と母体血細胞において差次的にメチル化された、第２１、第１８、および第１３染色体上の胎児性ＤＮＡマーカーを、亜硫酸水素塩制限併用分析およびメチル化ＤＮＡの免疫沈降法に続くタイリングアレイハイブリダイゼーション（ＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ）を含む方法を用いて探索し、任意の標的遺伝子座を亜硫酸水素塩を用いるシークエンシングによって確認した。得られたマーカーを、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化と、それに続くリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはマイクロフルイディクスデジタルＰＣＲ分析を用いて分析した。染色体量分析は、これらのエピジェネティックマーカーの量を、胎児由来であり、その異なるポリヌクレオチド配列によって母体のＤＮＡ配列から区別され得るＤＮＡ配列である遺伝マーカーと比較することにより行った。このような遺伝マーカーの一例は、Ｙ染色体上に存在するＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子である。
【０００５】
例えば、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）遺伝子の推定プロモーターは胎盤では高度にメチル化されているが、母体血細胞では低メチル化されていることが見出された。高度にメチル化されたＨＬＣＳおよびＺＦＹ遺伝子座を用いた染色体量の比較により、２１トリソミーと正倍数体の胎盤ＤＮＡサンプルを区別することができる。本発明者らは、エピジェネティックな−遺伝的な染色体量によるアプローチが、２１トリソミー（Ｔ２１）、１８トリソミー（Ｔ１８）、または１３トリソミー（Ｔ１３）のような染色体異数性の、非侵襲性の出生前検出のための新規な方法であることを示した。このアプローチにより、染色体異数性に関わる任意の染色体上のエピジェネティックマーカーを用いた非侵襲性の出生前診断のための、一般に使用可能な技術が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、妊婦が担持している胎児の染色体異数性を検出するための方法を提供する。該方法は、（ａ）妊婦から採取された生体サンプル中の胎児由来のメチル化マーカーの量を決定する工程であって、ここでメチル化マーカーは染色体異数性に関連する染色体上、または染色体異数性に関連する染色体の部位内に位置し、かつ胎児由来のメチル化マーカーは、差次的なＤＮＡメチル化によって、母体由来のその対応物から区別される工程；（ｂ）サンプル中の胎児由来の遺伝マーカーの量を決定する工程であって、ここで遺伝マーカーは参照染色体上にみられ、かつ胎児由来の遺伝マーカーは、ポリヌクレオチド配列における相違、または遺伝マーカーが母体ゲノムに存在しないことによって、サンプル中の母体由来のその対応物から区別される工程；（ｃ）（ａ）および（ｂ）から得られた量の比率を決定する工程；および（ｄ）標準コントロールとの比率を比較する工程であって、ここで比率が標準コントロールよりも高いかまたは低い場合に、胎児における染色体異数性の存在が示される工程を含む。標準コントロール値は、検出方法に用いられる特定の方法論に依存してわずかな変動がみられ得るが、典型的には、ヒトゲノムにおいて予測される遺伝子、または染色体量、または比率に近い。例えば正倍数体の雄性ゲノムでは、第２１染色体は２コピー、Ｙ染色体は１コピーある。従って、第２１染色体上のエピジェネティックマーカーの、Ｙ染色体上の遺伝マーカーに対する量の比率はおおよそ２となるであろう。
【０００７】
場合によって、胎児由来のメチル化マーカーは胎盤に由来する。母体由来の対応物は妊婦の血液細胞に由来することもある。胎児由来のメチル化マーカーは、母体由来のその対応物よりも多くメチル化されていてもよいし、または母体由来のその対応物よりも少なくメチル化されていてもよい。
【０００８】
場合によって、サンプルは母体の全血、血清、血漿、尿、羊水、生殖器洗浄液、胎盤組織サンプル、絨毛膜絨毛サンプルであるか、または母体血から分離された胎児の細胞を含むサンプルである。サンプルは胎児の核酸を含む任意のサンプルであることもある。
【０００９】
場合によって、メチル化マーカーは、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）遺伝子の一部であるか、またはそれに近接する。例えば、表２に示すＨＬＣＳ遺伝子（推定プロモーター領域を含む）の幾つかの領域をメチル化マーカーとして使用してもよい。その他のメチル化マーカーは、マーカー１８Ａおよびマーカー１３Ａなどである。別のメチル化マーカーは以下のように定義される：約１５ないし４５０ヌクレオチドの領域であって、１シトシンを含み、（１）ＭＡＴ．１８．００９４、ＭＡＴ．１３．００２３、ＭＡＴ．１３．００２０、ＭＡＴ．１３．００３８、ＭＡＴ．１８．００７１、ＭＡＴ．１８．００９７、ＭＡＴ．２１．０１７８、およびＴＡＳ．２１．１１７５からなる群より選択されるゲノム遺伝子座；または（２）該遺伝子座から１０ｋｂを越えない上流および／または下流にある領域。第２１染色体上の幾つかの特定のマーカーは以下のように定義される：第２１染色体上の約１５ないし４５０ヌクレオチドの領域であって、１シトシンを含み、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ヒトプロテインホスファターゼ１、調節性（抑制性）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、およびＦｅｍ１Ａ（シノラブディス・エレガンス）に類似するもの、からなる群より選択されるゲノム遺伝子座、または（２）該遺伝子座から１０ｋｂを越えない上流および／または下流にある領域。これらのメチル化マーカーは、本明細書に記載される遺伝マーカーの任意の１以上と組み合わせて、本発明の検出方法に従って使用することが意図される。
【００１０】
場合によって、工程（ａ）は、メチル化DNAと非メチル化ＤＮＡとを差次的に修飾する試薬でサンプルを処理することを含む。このような試薬は、亜硫酸水素塩、またはメチル化状態に基づいてＤＮＡに結合するタンパク質もしくは化学物質を含んでいてもよく；または試薬は、メチル化ＤＮＡを優先的に切断するか、もしくは非メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素を含んでいてもよい。
【００１１】
場合によって、遺伝マーカーは母体ゲノムには存在しない。遺伝マーカーはＹ染色体上に位置することもある。しばしば、胎児由来の遺伝マーカーは、一塩基多型（ＳＮＰ）、単純タンデムリピート多型、および挿入−欠失多型などの遺伝的多型性に基づいて、母体由来の遺伝マーカーから区別される。一例では、遺伝マーカーは、Ｙ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子である。別の例では、遺伝マーカーは、ＴＭＥＤ８遺伝子内にＳＮＰ  ｒｓ６６３６を含むゲノム配列、例えば配列番号１または配列番号２である。
【００１２】
場合によって、複数のメチル化マーカーまたは複数の遺伝マーカーを用いてもよい。しばしば、工程（ａ）または工程（ｂ）は、メチル化マーカーおよび／または遺伝マーカー、特に胎児由来のメチル化マーカーおよび遺伝マーカーを増幅する過程を含み得る。一例として、増幅はメチル化特異的ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；または増幅は核酸配列に特異的な増幅によってもよい。
【００１３】
場合によって、工程（ａ）または（ｂ）は、分子計数により行われる。工程（ａ）または（ｂ）は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、アレイキャプチャー、核酸配列に基づく検出、大量に平行して行うゲノムのシークエンシング、単一分子のシークエンシング、またはカラーコードプローブ対によるポリヌクレオチドの多重検出を含むこともある。その他、工程（ａ）または（ｂ）は、マススペクトロメトリー、またはマイクロアレイ、蛍光プローブ、もしくは分子標識へのハイブリダイゼーションを含むこともある。
【００１４】
幾つかの場合には、染色体異数性に関連する染色体は、第１３、第１８、第２１、またはＸ染色体である。データ解釈の目的で、場合によって、比率が標準コントロールより少なくとも１標準偏差まで高いかまたは低い場合に、胎児に染色体異数性のあることが示されるが、比率が標準コントロールより少なくとも２または３標準偏差まで高いかまたは低い際であっても、胎児に染色体異数性のあることが示される場合もある。
【００１５】
広く応用すると、上記の方法は、その相対的な量がどのようにも変化しないと考えられる参照染色体である別の染色体との比較において、関心のある特定の染色体の何らかの潜在的な量の変化を評価するために、診断用ではない状況において使用できる。
【００１６】
本発明は、このような装置の１以上を含み、本明細書に記載される方法の全てもしくは幾つかを実行できる、装置またはシステムも具現できる。例えば、該装置またはシステムは、妊婦から採取された生体サンプルを受け取った後に以下の工程を行う場合もある：（ａ）サンプル中の染色体異数性に関連する胎児由来のメチル化マーカーの量を決定する工程；（ｂ）サンプル中の、参照染色体上の胎児由来の遺伝マーカーの量を決定する工程；（ｃ）（ａ）および（ｂ）から得られた量の比率を決定する工程；および（ｄ）標準コントロールとの比率を比較し、胎児に染色体異数性があるか否かを示す結果を提供する工程。本発明の装置またはシステムは、工程（ａ）および（ｂ）を行い、（ａ）および（ｂ）から得られた量を装置へ入力した後で、工程（ｃ）および（ｄ）のタスクを行う場合もある。好ましくは、該装置またはシステムは、部分的もしくは全体的に自動化される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＨＬＣＳ領域Ｂ２のクローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果を示した図である。個々のＣｐＧ部位は、転写開始点（位置０）に対して定義したヌクレオチドの位置により、最初から通し番号を付けた。最初のＣｐＧ部位（−２３２）は、ＵＣＳＣゲノムブラウザのHuman March 2006 (hg18)アセンブリのchr21: 37275031 (逆鎖)に相当する。続く各列は、クローニングによって調べられた単一ＤＮＡ分子内のＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を示す。黒丸および白丸は、それぞれメチル化および非メチル化ＣｐＧ部位を表す。２１トリソミー、正常第１期、および正常第３期の胎盤組織サンプルからのクローンを、それぞれ「Ｔ２１  ＰＬＮ」、「正常ＰＬＮ  第１」、および「正常ＰＬＮ  第３」の接頭辞により標識し、母体血細胞からのクローンを「ＭＢＣ」の接頭辞により標識した。異なる妊婦由来の胎盤および母体血細胞は、接頭辞に続くサンプル番号によって同定した。
【図２】遺伝子量実験のデジタルリードアウトを示した図である。ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａアッセイはモノプレックスで行い、ＺＦＸ／Ｙアッセイはデュプレックスの様式で行った。各チップを１２のパネルに分け、各パネルは７６５の反応ウェルに区分した。標的分子を有する反応ウェルを赤または青のカラードットで示し、増幅のみられない反応ウェルを灰色のカラードットで示す。ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＺＦＹを赤で示す。ＺＦＸを青で示す。（Ａ）酵素により消化した正倍数体の胎盤ＤＮＡサンプルに対するデジタルＰＣＲの結果の図示である。各サンプルについて４パネルを計算に入れると、各チップは３サンプルを収容することになる。（Ｂ）酵素により消化した正倍数体の母体血漿ＤＮＡサンプルに対するデジタルＰＣＲの結果の図示である。サンプルからのＤＮＡは、１２パネル全てに均等に分配した。母体血漿の分析については、ＺＦＹ（胎児ＤＮＡ）のコピー数が、ＺＦＸ（胎児プラス母体ＤＮＡ）のそれよりもかなり少ないことに留意されたい。
【図３】正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプルの遺伝子量の比較を示した図である。（Ａ）ＲＡＳＳＦ１Ａに対するＨＬＣＳの比率。（Ｂ）ＺＦＹに対するＨＬＣＳの比率。正常の参照範囲を点線で示す。
【図４】正倍数体および２１トリソミーの母体血漿ＤＮＡサンプルの遺伝子量の比較を示した図である。各サンプルについて、ＺＦＹに対するＨＬＣＳの比率をプロットした。正常の参照範囲を点線で示す。
【図５】４種のデジタルＰＣＲアッセイ（ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＺＦＹ、およびＺＦＸ）のゲノム配列を示した図である。ＵＣＳＣゲノムブラウザのMarch 2006ヒト参照配列（NCBI Build 36.1）における染色体位置を示す。下線で示したヌクレオチドは酵素認識部位を表す。大文字による太字のヌクレオチドは、順方向および逆方向プライマーを表す。小文字による太字のヌクレオチドは、ＭＧＢ（minor groove binding）プローブ配列を表す。
【図６】（Ａ）ＨＬＣＳ領域Ｂ２、および（Ｂ）Ｃ２１またはｆ８１についての、ＣＯＢＲＡの結果のゲル電気泳動を示した図である。２サンプルの２１トリソミーの胎盤（Ｔ２１  ＰＬＮ）、２サンプルの第１期正常胎盤（正常ＰＬＮ  第１）、２サンプルの第３期正常胎盤（正常ＰＬＮ  第３）、および２サンプルの第１期母体血細胞（ＭＢＣ）を分析した。ＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ酵素と共に（＋）、または酵素なしで（−）インキュベートした。ＤＮＡのメチル化は、サイズがより小さい消化産物の出現によって検出した。ゲル電気泳動において、１ｋｂラダー（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）（Ｍ）を用いた。
【図７】４サンプルの胎盤組織および８サンプルの母体血細胞から得られたＨＬＣＳ  ＤＮＡの定量を示した図である。サンプルのメチル化指数は、酵素消化後のＨＬＣＳのコピー数を、モック消化により得られたコピー数で割ることによって算出した。「正常ＰＬＮ」は胎盤ＤＮＡを表し、「ＭＢＣ」は母体血細胞ＤＮＡを表す。
【図８】血漿における産後のクリアランスを示した図である。母体血漿サンプル中の（Ａ）制限酵素消化による（＋）、または（Ｂ）制限酵素消化なしの（−）、ＨＬＣＳの検出。「前」は出産前の血漿サンプルを表し、「後」は出産後の血漿サンプルを表す。同一被験者に由来する対のサンプルは、線で結ばれた同一のシンボルによって示す。
【図９】（Ａ）モック消化による、ＴＭＥＤ８−Ｃに対するＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化による、ＴＭＥＤ８−Ｃに対するＨＬＣＳの比率を決定することによる、正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１０】（Ａ）モック消化による、ＴＭＥＤ８−Ｇに対するＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化による、ＴＭＥＤ８−Ｇに対するＨＬＣＳの比率を決定することによる、正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１１】（Ａ）ＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する高度メチル化ＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する高度メチル化ＨＬＣＳの比率を決定することによる、ＢｓｔＵＩにより消化した正倍数体および２１トリソミーの母体血漿ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１２】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより決定した、６対の第１期正倍数体胎盤および母体血細胞におけるマーカー１８ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。各サンプルについて全８クローンをスコア化した。メチル化部位を黒丸で表し、非メチル化部位を白丸で表す。各ＣｐＧ部位におけるメチル化指数（ＭＩ）を、各ＣｐＧ部位のクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって得た。メチル化部位の頻度は、各サンプルについてクローン化されたＣｐＧ部位の総数に対するクローン化されたメチル化ＣｐＧ部位の数によって得た。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼによる認識部位の位置を、ＣｐＧ部位のゲノムの位置それぞれの隣に示した。ゲノムの位置は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（genome.ucsc.edu）のHuman Genome March 2006 (hg18)アセンブリに従って定義した。
【図１３】Epityperアッセイにより分析した、正倍数体（ｎ＝６）およびＴ１８（ｎ＝６）胎盤中のマーカー１８ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。Ｔ１８および正倍数体の胎盤は全て第１期に取得した。マンホイットニー順位和検定を用い、各ＣｐＧ単位において、正倍数体のケースのメチル化指数（ＭＩ）をＴ１８のケースと比較した。
【図１４】母体血漿中の、消化抵抗性マーカー１８Ａの配列の特性を示した図である。（Ａ）胎児の出産前および出産後の、母体血漿中の消化抵抗性マーカー１８ＡのＤＮＡ濃度。（Ｂ）雄性胎児を有する妊婦における、確立された胎児の遺伝マーカーであるＺＦＹの濃度に対する、消化抵抗性マーカー１８ＡのＤＮＡ濃度の相関。
【図１５】正倍数体（ｎ＝５）および１８トリソミー（Ｔ１８）（ｎ＝５）の胎盤ＤＮＡサンプルにおける、Ｙ染色体（ＺＦＹ）に対する第１８染色体（マーカー１８Ａ）の相対量を示した図である。正常参照範囲（平均±１．９６ＳＤ）を点線で表す。
【図１６】正倍数体（ｎ＝２７）および１８トリソミー（Ｔ１８）（ｎ＝９）の母体血漿サンプルにおける、Ｙ染色体（ＺＦＹ）に対する胎児の第１８染色体（マーカー１８Ａ）の相対量を示した図である。正常参照範囲（平均±１．９６ＳＤ）を点線で表す。
【図１７】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより決定した、３対の第１期正倍数体胎盤および母体血細胞におけるベータアクチン遺伝子の領域のＤＮＡメチル化レベルを示した図である。亜硫酸水素塩シークエンシングデータの説明については、図１２を参照されたい。この領域は、酵素消化の効率を調べるためのコントロールアッセイの開発に用いられた。
【図１８】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより分析した、正倍数体胎盤（ｎ＝６）および母体血細胞（ｎ＝６）におけるマーカー１３ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。全てのサンプルは第１期に取得した。各サンプルについて全８クローンをスコア化した。メチル化部位を黒丸で表し、非メチル化部位を白丸で表す。各ＣｐＧ部位におけるメチル化指数（ＭＩ）を、各ＣｐＧ部位のクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって得た。メチル化部位の頻度は、各サンプルについてクローン化されたＣｐＧ部位の総数に対するクローン化されたメチル化ＣｐＧ部位の数によって得た。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼによる認識部位の位置を、ＣｐＧ部位のゲノムの位置それぞれの次に標識した。ゲノムの位置は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（genome.ucsc.edu）のHuman Genome March 2006 (hg18)アセンブリに従って位置付けた。
【図１９】Epityperアッセイにより分析した、正倍数体（ｎ＝５）およびＴ１３（ｎ＝５）胎盤中のマーカー１３ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。４サンプルの１３トリソミー（Ｔ１３）胎盤は第１期に取得したが、１サンプルは第２期に取得した。正倍数体の胎盤は全て第１期に取得した。マンホイットニー順位和検定を用い、各ＣｐＧ単位において、正倍数体のケースのＭＩをＴ１３のケースと比較した。
【図２０】ＺＦＹに対する消化抵抗性マーカー１３Ａの比率を決定することにより、正倍数体（ｎ＝１０）および１３トリソミー（Ｔ１３）（ｎ＝５）胎盤ＤＮＡサンプルにおける染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本出願で用いられる「妊娠に付随する疾患」は、妊婦、妊婦が有する胎児、もしくは妊婦および胎児の両方に影響を及ぼし得るいずれの状態または疾病も指す。このような状態または疾病は、限定された時期、例えば妊娠もしくは出産の間にその症状を現すか、または胎児の誕生後に一生持続することもある。「妊娠に付随する疾患」は、妊娠に伴うことが必須であり、妊婦に偶然起こる単なる状態ではない。換言すれば、該疾患は妊婦でない者には起こり得ない。妊娠に付随する疾患の幾つかの例には、子宮外妊娠、子癇前症、早産、および１３、１８、または２１トリソミーなどの胎児の染色体異常が含まれる。
【００１９】
本明細書で用いられる「染色体異数性」の語は、いずれか一の染色体が正常な数よりも多いかもしくは少ないこと、およびいずれか一の染色体が正常な対に加えて余分な一部分を有するか、または正常な対においていずれか一の染色体の一部分が欠如していることなどの、染色体数の異常を示すいずれの遺伝的な異常も包含する。場合によって、異常は複数の染色体、または１以上の染色体の複数の部分に関係し得る。最も一般的な染色体異数性は、トリソミー、例えば罹患患者のゲノムが、正常な２（すなわち１対）ではなく３の第２１染色体を有する、２１トリソミーである。よりまれな場合には、患者は、正常な対に加えて第２１染色体の余分な断片（完全長よりも短い）を有し得る。さらに別の場合には、第２１染色体の一部分が別の染色体、例えば第１４染色体に転座し得る。この例では、第２１染色体は「染色体異数性に関連する染色体」であり、次に、関連しない染色体、すなわち患者のゲノム内に正常な対が存在する、例えば第１染色体は「参照染色体」である。また、関連する染色体の数が、正常な数である２よりも少ない場合もある。ターナー症候群は、女性患者のＸ染色体が２から１へ減少する、染色体異数性の一例である。
【００２０】
その相対的な量または濃度、すなわち比率を決定するために、「メチル化マーカー」との比較に関連して用いられる「遺伝マーカー」は、異なる対立遺伝子（例えば、胎児由来の対立遺伝子 v. 妊婦由来の対立遺伝子のような、二つの異なる個体に由来する対立遺伝子）を、ポリヌクレオチド配列における相違（例えば多型）、または完全に存在するか存在しない配列（例えば、雄性の胎児に由来するＹ染色体上に存在するが、妊婦のゲノムには存在しない配列）に基づいて互いに区別することを可能にする、参照染色体のゲノム配列内に存在するポリヌクレオチド配列を指す。これに関連して、染色体異数性に関連する染色体上に位置する「メチル化マーカー」は、異常な数を有する染色体上のゲノムポリヌクレオチド配列を指すか；または染色体の余分な断片が存在するか、もしくは染色体の一部が欠損する場合に、「メチル化マーカー」は関連する染色体の断片または部分内に位置する。メチル化マーカーのメチル化特性の相違により、二つの異なる個体、例えば胎児および妊婦由来に対応するメチル化マーカーの区別が可能になる。
【００２１】
本明細書で用いられる「エピジェネティックな状況」または「エピジェネティックな状態」の語は、一次ヌクレオチド配列以外の、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の分子レベルでのいずれの構造的特色も指す。例えば、ゲノムＤＮＡのエピジェネティックな状況には、例えばそのメチル化パターン、またはその細胞タンパク質、例えばヒストンとの会合、ならびにこのようなタンパク質の修飾、例えばアセチル化、脱アセチル化、およびメチル化によって決定されるかまたは影響される、その二次または三次構造が含まれ得る。
【００２２】
本出願においてゲノム配列のメチル化の状況を記載する際の、「メチル化特性」または「メチル化状態」の語は、メチル化に関連する特定の遺伝子座におけるＤＮＡ断片の特性を指す。このような特性には、このＤＮＡ配列内のいずれかのシトシン（Ｃ）残基がメチル化されているか否か、1または複数のメチル化Ｃ残基の位置、特定の残基区間におけるメチル化Ｃのパーセンテージ、および、例えば異なる対立遺伝子の由来の相違による、メチル化における対立遺伝子の相違が含まれるが、これらに限定されない。「メチル化特性」または「メチル化状態」の語はまた、生体サンプル中のいずれかの特定の残基区間における、メチル化Ｃまたは非メチル化Ｃの相対的もしくは絶対的な濃度も指してよい。
【００２３】
本明細書で用いられる「一塩基多型」または「ＳＮＰ」の語は、同じ個体に由来する同じ染色体の２コピー上に位置する同じ遺伝子（例えば、胎児に由来する二つの対立遺伝子）であってもよいし、または二つの異なる個体（例えば胎児と妊婦）に由来する同じ遺伝子であってもよい、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子の中の単一のヌクレオチド残基に存在する、ポリヌクレオチド配列のバリエーションを指す。このバリエーションは、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えばプロモーター領域もしくはその近傍、またはイントロン）内、または遺伝子間領域に起こり得る。１以上のＳＮＰの検出により、一つの遺伝子の異なる対立遺伝子の区別が可能になる。
【００２４】
本明細書で用いられる「単純タンデムリピート多型」の語は、同じ個体（例えば胎児）に由来する同じ染色体の２コピー上に位置する同じ遺伝子であってもよいし、または二つの異なる個体（例えば胎児と妊婦）に由来する同じ遺伝子であってもよい、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子の間の、ヌクレオチド配列のタンデムリピートの多様な数（例えば１以上のヌクレオチドのタンデムリピート）により示される、ポリヌクレオチド配列のバリエーションを指す。このバリエーションは、たいてい遺伝子の非コード領域（例えばプロモーター領域もしくはその近傍、またはイントロン）内、または遺伝子間領域に起こる。タンデムリピート数における相違の検出により、単一の遺伝子の異なる対立遺伝子の区別が可能になる。
【００２５】
本明細書で用いられる「挿入−欠失多型」の語は、同じ個体（例えば胎児）に由来する同じ染色体の２コピー上に位置する同じ遺伝子であってもよいし、または二つの異なる個体（例えば胎児と妊婦）に由来する同じ遺伝子であってもよい、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子の中の、短いヌクレオチド配列（例えば１〜３ヌクレオチド）の存在または非存在により示される、ポリヌクレオチド配列のバリエーションを指す。このバリエーションは、遺伝子のコード領域および非コード領域（例えばプロモーター領域もしくはその近傍、またはイントロン）両方の内に、または遺伝子間領域に起こり得る。短いヌクレオチド配列が存在するか否かの検出により、単一の遺伝子の異なる対立遺伝子の区別が可能になる。
【００２６】
本明細書で用いられる「血液」の語は、妊婦もしくは妊娠の可能性を試験中である女性から得られた血液サンプルまたは標本を指す。この語は、全血、または従来定義されている血清および血漿のような、血液のいずれの分画も包含する。
【００２７】
本明細書で用いられる「亜硫酸水素塩」の語は、メチル化シトシンを化学的に修飾することなくシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へ化学的に変換できることから、ＤＮＡのメチル化状態に基づいてＤＮＡ配列を差次的に修飾するために用いることができる亜硫酸水素ナトリウムなどの、全ての種類の亜硫酸水素塩を包含する。
【００２８】
本明細書で用いられる、メチル化または非メチル化ＤＮＡを「差次的に修飾する」試薬は、区別可能な産物または量的に区別可能な結果（例えば結合または沈殿の程度）がメチル化および非メチル化ＤＮＡから生成され、これによりＤＮＡのメチル化状態の同定が可能になる過程を通して、メチル化および非メチル化ＤＮＡと差次的に反応するいずれの試薬も包含する。このような過程には、化学反応（例えば亜硫酸水素塩による非メチル化Ｃ→Ｕ変換）、酵素処理（例えばメチル化依存性エンドヌクレアーゼによる切断）、結合、および沈殿が含まれてよいが、これらに限定されない。従って、メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素は、ＤＮＡがメチル化されている際に非常に高い効率でＤＮＡ分子を切断できるが、非メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素は、ＤＮＡがメチル化されていない際に著しく高い効率を示す。本発明において、メチル化および非メチル化ＤＮＡを「差次的に修飾する」試薬はまた、ＤＮＡ配列のメチル化状態に応じて、そのＤＮＡ配列への結合またはＤＮＡ配列の沈殿において差次的な能力を示すいずれの試薬も指す。このような試薬の一クラスは、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質からなる。
【００２９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」の語は、一本鎖または二本鎖いずれかの形である、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらの重合体を指す。特に限定しない限り、この語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に指示しない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、相同分子種、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補性配列、ならびに明示的に示される配列もまた、黙示的に包含する。特に縮重コドン置換は、選択された１以上（または全て）のコドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することにより達成されていてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸の語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換的に用いられる。
【００３０】
「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の産生に関わるＤＮＡの区域を意味し；これはコード領域（リーダーおよびトレーラー）の上流、および下流の、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関わる領域、ならびに個々のコード区域（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００３１】
「遺伝子座」の語は、参照ゲノムアセンブリ（例えば、ＵＣＳＣゲノムブラウザのHuman Genome March 2006アセンブリ(hg18)）の染色体上の開始ヌクレオチド位置から終止ヌクレオチド位置（すなわち、ゲノムの位置、または染色体の位置）により定義されるＤＮＡの区域を意味する。遺伝子座は、遺伝子、ＣｐＧアイランド、または転写／翻訳によるいずれかの産物のゲノムの位置と重複してもよいし重複しなくてもよい。本出願では、遺伝子座は通常、実験データ（例えば、ＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐデータセット）、および異なるＤＮＡメチル化レベルを含むためのそれに続くデータ解析（例えばＭＡＴ、ＴＡＳ）によって同定される、ＤＮＡの連続的な区域を指す。遺伝子座は、１以上のＣｐＧ部位を含んでいてもよい。遺伝子座は、分析（例えばEpityperアッセイ、亜硫酸水素塩シークエンシング、ポリヌクレオチド増幅および決定）が可能なより短い区域（例えばＣｐＧを含むゲノム配列、断片、または領域）に、さらに分割され得る。1遺伝子座は、１以上の胎児性エピジェネティックマーカーへ開発され得る。本出願のある状況では、遺伝子座は、特定のバイオインフォマティクス基準によって同定される、ＤＮＡの連続的な区域も指す。
【００３２】
本出願における「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の語は、アミノ酸残基の重合体を指すために、本明細書において互換的に用いられる。この語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工の化学模倣物であるアミノ酸重合体、ならびに天然アミノ酸の重合体および非天然アミノ酸の重合体に適用される。本明細書で用いられる際、この語は、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって連結される、完全長タンパク質（すなわち抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００３３】
「アミノ酸」の語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式において機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたこれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。
【００３４】
本明細書では、アミノ酸は、一般に知られている三文字シンボル、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される一文字シンボルのいずれかにより称され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に許容されているそれらの一文字コードにより称され得る。
【００３５】
本出願で用いられる「増大」または「減少」は、確立された標準コントロールからの、量における検出可能な正または負の変化を指す。増大は、標準コントロール値の少なくとも１０％もしくは２０％まで、または少なくとも５０％、８０％、もしくは１００％までの正の変化であり；幾つかの場合には、増大は、コントロール値の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍である。同様に減少は、コントロール値の少なくとも１／１０、１／６、１／５まで、または少なくとも１／３もしくは１／２までにもなる、負の変化である。「より多い」、「より少ない」、「より高い」、および「より低い」のような、比較に基づいた量的変化または相違を示すその他の語は、本出願において上記と同様の様式により用いられる。
【００３６】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」は、既知の配列のポリヌクレオチドプローブを用い、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ワトソン−クリックの塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力に基づき、ポリヌクレオチドの存在および／または量を検出するための方法を指す。このようなハイブリダイゼーション法の例には、サザンブロット法およびノーザンブロット法が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いられる「プライマー」は、関心のある遺伝子、例えば様々なメチル化状況のＨＬＣＳ遺伝子、に対応するポリヌクレオチド配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅法において使用できるオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列増幅のための少なくとも１のＰＣＲプライマーは、該配列に対して配列特異的である。
【００３８】
本明細書で用いられる「デジタルポリメラーゼ連鎖反応」の語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含む核酸を直接定量かつクローン性に増幅することで、標的核酸の量が直接定量的に測定される、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の改良されたバージョンを指す。デジタルＰＣＲは、増幅産物を検出可能なレベルまで集めて濃縮できる多数の分離反応チャンバー内で、サンプル中に存在する個別の核酸分子それぞれを捕捉または分離することによって、この直接定量法を達成する。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲの最終産物を含むチャンバーを数えることが、絶対的な核酸量の直接の測定となる。典型的には希釈による、個別の核酸分子の捕捉または分離は、キャピラリー、マイクロエマルション、小型化されたチャンバーのアレイ、または核酸結合表面において達成され得る。デジタルＰＣＲの基本的な方法論は、例えばSykes et al., Biotechniques 13 (3): 444-449, 1992; および Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:9236-41.に記載される。
【００３９】
本明細書で用いられる「分子計数」の語は、しばしば特性の異なるその他の共存分子または複合体に関連した相対数である、分子または分子複合体の数を定量的に測定することが可能ないずれの方法も指す。
分子計数の様々な方法は、例えばLeaner et al., Analytical Chemistry 69:2115-2121, 1997; Hirano and Fukami, Nucleic Acids Symposium Series No. 44:157-158, 2000; Chiu et al., Trends in Genetics 25:324-331, 2009；および米国特許第７，５３７，８９７号に記載される。
【００４０】
本明細書で用いられる「標準コントロール」は、参照染色体上に位置する胎児性遺伝マーカーの量または濃度に対する、特定の染色体異数性（例えば１３、１８、または２１トリソミー）に関連する染色体上に位置する胎児のゲノム配列の比率、または量もしくは濃度を反映する値であって、平均的な、染色体が正常である胎児を有する健常妊婦に由来する生体サンプル（例えば血液、血漿、または血清）中に見出される量または濃度としての値を指す。「標準コントロール」は別に決定されてよく、それが用いられる状況によって異なる値が示される。例えば、エピジェネティックマーカーが遺伝マーカーに対して測定される、エピジェネティック−遺伝的量の方法において用いられる際の「標準コントロール」は、参照染色体上に位置する胎児性遺伝マーカーの量または濃度に対する、特定の染色体異数性（例えば１３、１８、または２１トリソミー）に関連する染色体上に位置する胎児のゲノム配列の比率、または量もしくは濃度を反映する値であって、平均的な、染色体が正常である胎児を有する健常妊婦に由来する生体サンプル（例えば血液、血漿、または血清）中に見出される量または濃度としての値である。場合によって、標準コントロールは特定の妊娠期間にある平均的な健常妊婦に基づいて決定されるが、別の場合には妊娠期間に関して区別はされない。
【００４１】
妊婦についての記載に関連して用いられる「平均的な」の語は、染色体が正常である胎児を妊娠しており、かつサンプル収集の時点でいずれの妊娠に関連する疾病または状態も被っていない健常妊婦の無作為に選択された群を代表する妊婦の血液中に見出される、母体および胎児の両方に由来する特定の遺伝子またはゲノム配列のメチル化特性のような、特定の関連する特性を指す。この選択された群は、これらの妊婦の間での関心のある遺伝子の平均量またはメチル化特性が、妥当な正確さをもって、健常胎児を有する健常妊婦の一般的な集団における相当の特性を反映するように、十分な数の妊婦を含んでなる必用がある。加えて、選択された妊婦の群は一般に、その血液が潜在的に妊娠に付随する疾患の徴候について試験される妊婦の妊娠期間と同様の妊娠期間を有する。本発明の実施に好ましい妊娠期間は、スクリーニングされる疾患に応じて異なり得る。例えば、好ましくは胎児の染色体異数性がスクリーニングされ、できるだけ早期に診断される。さらに、試験に好ましい妊娠期間もまた、試験される関心のある遺伝子に依存し得る。
【００４２】
本出願で用いられる「量」の語は、関心のあるポリヌクレオチド配列、例えばサンプル中に存在する胎児由来の遺伝マーカーまたはエピジェネティック／メチル化マーカーの量を指す。このような量は、絶対的な語、すなわちサンプル中のポリヌクレオチド配列の総量（例えば質量による、または分子数による）、もしくは相対的な語（例えば比率、またはその他のマーカーへの相対性）により、またはサンプル中のポリヌクレオチド配列の濃度（例えば、単位容積あたりの質量、または単位容積あたりの分子数）として表され得る。
【００４３】
発明の詳細な説明
Ｉ．序文
２１トリソミー（Ｔ２１）のようなトリソミーについてのスクリーニングは、多くの国において現代の産科学的ケアの重要な要素を構成する。出生前外来で通常行われる一般的なスクリーニング法は、胎児の実際の染色体量を直接に標的とするよりも、むしろ染色体異数性に付随する付帯徴候を標的としている（Wapner et al., N Engl J Med 2003;349:1405-13; Malone et al., N Engl J Med 2005;353:2001-11）。確定試験のために、従来のスクリーニングプログラムでは、絨毛膜絨毛採取および羊水穿刺のような侵襲性の方法が必用とされている。しかしながらこれらの方法では、方法に関連した胎児の喪失が導かれ得る（Tabor et al., Lancet 1986;1:1287-93）。
【００４４】
１９９７年に母体血漿中に発見された無細胞性の胎児のＤＮＡにより、非侵襲性の出生前診断の新しい可能性が提示された（Lo et al., Lancet 1997;350:485-7;Lo and Chiu, Nat Rev Genet 2007;8:71-7）。母体血漿サンプル中の、胎児に由来する父性遺伝による遺伝物質の検出により、胎児のＲｈＤ血液型の出生前判定（Lo et al., N Engl J Med 1998;339:1734-8; Finning et al., BMJ 2008;336:816-8）および伴性疾患のための胎児の性別判定（Costa et al., N Engl J Med 2002;346:1502）が可能となった。しかしながら、胎児の染色体異数性のための、非侵襲性の出生前診断用試験の開発はさらに困難である。
【００４５】
アプローチの二つの主要なグループが、母体血漿の核酸分析によるＴ２１の直接検出のために開発されてきた。最初のグループは、胎児特異的な核酸マーカーに存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の対立遺伝子比の解析に関わる（Lo and Chiu, Nat Rev Genet 2007;8:71-7）。最近の例には、循環する胎盤ｍＲＮＡ（いわゆるＲＮＡ−ＳＮＰアプローチ）（Lo et al., Nat Med 2007;13:218-23）およびＤＮＡメチル化マーカー（いわゆるエピジェネティックな対立遺伝子比のアプローチ）（Tong et al., Clin Chem 2006;52:2194-202）が含まれる。このアプローチが不利である主な点は、これらの方法が、解析されたＳＮＰについてヘテロ接合性である胎児のみに適用可能なことである。さらに、特定の遺伝子座内に十分に高いヘテロ接合性率で存在するＳＮＰの数は限られているため、このアプローチでは集団のカバー率が主な課題である。アプローチの第２のグループは、デジタルＰＣＲのような単一分子計数アプローチの使用（Lo et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13116-21）および大量に平行して行うゲノムのシークエンシング（Chiu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:20458-63; Fan et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:16266-71）に関わる。これらのアプローチでは、個別の血漿ＤＮＡ分子が計数される。このような方法の精度により、Ｔ２１の胎児を有する妊婦の血漿中に存在する第２１染色体に由来するＤＮＡ分子の検出はわずかに増大する。これらのアプローチが不利である一点は、胎児に特異的ではないマーカー（例えば、第２１染色体由来のランダム配列）について使用した場合、極端に多数の分子を計数しなくてはならないことであり、このことは、一例あたり数百万の分子を計数しなくてはならなかった、大量に平行して行うゲノムのシークエンシングを用いた最近の実験により実証されている（Chiu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:20458-63; Fan et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:16266-71）。後者には、高価な機器および試薬の使用、ならびに比較的複雑なバイオインフォマティクスが必要とされる。
【００４６】
本出願は、潜在的に異数性に関わる染色体（例えば第２１染色体）上の胎児特異的なＤＮＡメチル化マーカーおよび参照染色体上の胎児特異的なＤＮＡマーカーの濃度の比率を決定することに基づく、母体血漿からの、染色体異数性（例えば２１トリソミー）の非侵襲性の出生前検出のための新規なアプローチについて記載する。これは、エピジェネティック−遺伝的（epigenetic-genetic: EGG）染色体量によるアプローチと称される。上記のエピジェネティックな対立遺伝子比に比較して、ＥＧＧによるアプローチはＤＮＡの短い伸展内に胎児特異的なＤＮＡメチル化マーカーおよびＳＮＰが存在することを必要としないために、集団カバー率を達成することがさらに容易となり得る。典型的には第２１染色体上の１つと参照染色体上の１つによって行われる、単にエピジェネティックマーカーに基づくアプローチよりも、ＥＧＧアプローチはさらに正確である。
【００４７】
ＥＧＧアプローチがトリソミー検出に役立つためには、第２１、第１８、または第１３染色体などの関連する染色体上に、良好な胎児特異的ＤＮＡメチル化マーカーが存在することが重要である。マーカーの好ましい一型は、消化によって母体の配列を除くためにメチル化感受性の制限酵素が使用できるように、胎児では過剰メチル化されているが母体血細胞では低メチル化されているものであろう。実際に以前の研究により、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子のプロモーターは、これが第３染色体上にあることを別にすれば、このようなマーカーの一つであることが示された（Chan et al., Clin Chem 2006;52:2211-8; Chiu et al., Am J Pathol 2007;170:941-50）。第２１染色体上にある胎児性ＤＮＡメチル化マーカーの数について報告されている（Chim et al., Clin Chem 2008;54:500-11; Old et al., Reprod Biomed Online 2007;15:227-35; Papageorgiou et al., Am J Pathol 2009;174:1609-18）。本発明者らは、第２１染色体上の３５の遺伝子プロモーター領域を標的とする亜硫酸水素塩制限併用分析（ＣＯＢＲＡ）（Xiong and Laird, Nucleic Acids Res 1997;25:2532-4）を用いて、さらなるマーカーを探索した。これにより、新規な過剰メチル化された胎児性ＤＮＡマーカーとして、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ビオチン−（プロピオニル−補酵素Ａ−カルボキシラーゼ（ＡＴＰ−加水分解性））リガーゼ）（ＨＬＣＳ）遺伝子の推定プロモーター領域の差次的なメチル化の発見が導かれた。その後、ＥＧＧの概念はＨＬＣＳを用いて実行された。第１８および第１３染色体上の胎児特異的なメチル化マーカーの発見により、１８および１３トリソミー検出のために同様の戦略を用いることがさらに可能になる。
【００４８】
ＩＩ．一般的方法論
本発明の実施には、分子生物学分野の日常的な技術が利用される。本発明で用いられる一般的方法を開示している基礎的な教科書には、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)が含まれる。
【００４９】
核酸の大きさは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで示される。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、シークエンシングされた核酸、または公開されているＤＮＡ配列に由来する推定である。タンパク質の大きさは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示される。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、シークエンシングされたタンパク質、由来するアミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から推定される。
【００５０】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981) によって最初に記述された固相ホスホラミダイトトリエステル法により、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984) によって記載される自動合成機を用いて、化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は、当該技術分野において認められる任意の戦略、例えばPearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983) に記載されるような、未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行われる。
【００５１】
本発明で用いられる遺伝マーカーの配列またはゲノム配列、例えばＨＬＣＳまたはＺＦＹ遺伝子のポリヌクレオチド配列、および合成オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）は、例えばWallace et al., Gene 16: 21-26 (1981) による二本鎖鋳型をシークエンシングするためのチェーンターミネーション法を用いて確認できる。
【００５２】
ＩＩＩ．血液サンプルの取得とＤＮＡの抽出
本発明は、妊娠に付随する状態または疾患の存在を検出するためおよび／または進行をモニターするための非侵襲性の手段として、母体血中に見出される適切な胎児性染色体ＤＮＡのエピジェネティック−遺伝的染色体量を分析することに関する。従って、本発明を実施するための第１工程は、妊婦から血液サンプルを取得し、該サンプルからＤＮＡを抽出することである。
【００５３】
Ａ．血液サンプルの取得
血液サンプルは、本発明の方法を用いる試験に適した妊娠期間の妊婦から取得される。以下に考察するように、適した妊娠期間は試験される疾患によって変動し得る。妊婦からの血液の採取は、病院または診療所が一般に従っている標準的なプロトコルによって行われる。末梢血の適切な量、例えば典型的には５〜５０ｍＬが採取され、さらなる調製の前に、標準的な手順に従って保管され得る。
【００５４】
Ｂ．血液サンプルの調製
本発明によって母体血中に見出された胎児ＤＮＡの分析は、例えば全血、血清、または血漿を用いて行われてよい。母体血から血清または血漿を調製する方法は、当業者の間で公知である。例えば妊婦の血液は、血液凝固を阻止するためにＥＤＴＡまたはVacutainer SST（Becton Dickinson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）のような専用の市販品を含むチューブ内に入れることができ、次に遠心分離を通して全血から血漿を得ることができる。ＥＤＴＡの代わりに、抗凝固剤としてヘパリンまたはクエン酸塩を用いることもできる。一方で血清は、血液凝固後に遠心分離により、または遠心分離なしで得てもよい。遠心分離を用いる場合、典型的には適切な速度、例えば１，５００〜３，０００ｘｇにおいて行われるが、限定されるものではない。血漿または血清は、ＤＮＡ抽出のための新しいチューブに移される前に、追加の遠心分離工程に供されてよい。このような追加の遠心分離工程の代わりに、またはそれに加えて、血漿または血清から粒状の物質を除去するため、１以上の濾過工程を用いることも可能である。
【００５５】
全血の無細胞部分に加えて、ＤＮＡはまた、妊婦からの全血サンプルを遠心分離後、血漿を除去して得られるバッフィーコート部分に濃縮された細胞画分からも回収され得る。細胞画分はまた、母体血中を循環する胎児の有核細胞から予め濃縮することもできる。このような濃縮手順には、胎児の細胞に対する１以上の抗体を含む選別もしくは選択手順、または胎児の細胞を母体細胞から区別できる物理的、化学的、生化学的、もしくはその他の特性を標的とした手順が含まれ得る。選別手順には、蛍光励起セルソーター、磁気活性化細胞選別、またはマイクロフルイディクスのような技術が含まれ得る。選択手順には、顕微操作、あるいはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション、光ピンセットによる操作、またはその他のいずれの単一細胞操作手順も含まれ得る。標的となり得る胎児の細胞の型には、有核赤血球、リンパ球、単核細胞、トロホブラスト、または細胞性残余物、例えばアポトーシス性の胎児細胞が含まれ得る。
【００５６】
Ｃ．ＤＮＡの抽出
血液を含む生体サンプルからDNAを抽出するための方法は、多数知られている。ＤＮＡ調製の一般的な方法（例えばSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001により記載される）に従って行うことができ；QIAamp ＤＮＡミニキットもしくはQIAamp ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen、ヒルデン、独国）、GenomicPrep（商標）血液ＤＮＡ分離キット（Promega、マディソン、ウィスコンシン州）、およびＧＦＸ（商標）ゲノム血液ＤＮＡ精製キット（Amersham、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のような様々な市販の試薬またはキットもまた、妊婦からの血液サンプル由来のＤＮＡを得るために用いられてよい。これらの方法の１を超える組み合わせもまた用いられてよい。
【００５７】
ＩＶ．ＤＮＡのメチル化特異的な修飾
サンプル中に存在する胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの間で差次的にメチル化されるエピジェネティックマーカーまたはゲノム配列（例えばＨＬＣＳ遺伝子）の由来を正しく同定するために、最終工程で分離されたＤＮＡは、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡが区別されるように、それらのメチル化状態が分析されなければならない。妊婦の血液サンプルから抽出されたＤＮＡは、メチル化の差によってＤＮＡを化学的に修飾できる試薬によって処理される、つまり、異なっておりかつ区別可能な化学構造は、処理後のメチル化シトシン（Ｃ）残基および非メチル化Ｃ残基に起因する。典型的には、このような試薬はＤＮＡ分子内の単数または複数の非メチル化Ｃ残基と反応し、非メチル化Ｃ残基それぞれをウラシル（Ｕ）残基に変換するが、メチル化Ｃ残基には変化がない。このＣ→Ｕ変換により、核酸の一次配列における変化に基づくメチル化状態の検出および比較が可能となる。この目的に適した例示試薬は、亜硫酸水素ナトリウムのような亜硫酸水素塩である。ＤＮＡの化学修飾に亜硫酸水素塩を用いる方法は当該技術分野において周知であり（例えばHerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996を参照）、本明細書では詳述しない。
【００５８】
当業者が認識するであろうように、ここでは不特定であるが、メチル化および非メチル化ＤＮＡを差次的に化学（またはその他のいずれかの機序を通して）修飾する同じ性質を有するその他のいずれの試薬も、本発明を実施するために用いることができる。例えばＤＮＡのメチル化特異的な修飾は、メチル化感受性の制限酵素によって達成されてもよく、これらの酵素の幾つかは典型的に非メチル化ＤＮＡ断片を切断し、メチル化ＤＮＡ断片は切断しないが、その他（例えばメチル化依存性エンドヌクレアーゼ、ＭｃｒＢＣ）はメチル化シトシンを含むＤＮＡを切断し、非メチル化ＤＮＡは切断しない。加えて、化学修飾と制限酵素処理の組み合わせ、例えば亜硫酸水素塩制限併用分析（ＣＯＢＲＡ）を、本発明を実施するために用いてもよい。
【００５９】
Ｖ．ポリヌクレオチド配列の増幅及び決定
メチル化の差によるＤＮＡの修飾後、処理されたＤＮＡを次に配列に基づく解析に供し、ここで異数性に関連する染色体の胎児ＤＮＡに由来するエピジェネティックマーカー（例えばＨＬＣＳ遺伝子）として作用するゲノム配列は、母体ＤＮＡ由来の同遺伝子から区別され、サンプル中の胎児の遺伝子の量または濃度が定量的に決定され、胎児由来の参照染色体からの遺伝マーカーの量または濃度と比較され、次に二つの比率が標準コントロールと比較される。
【００６０】
Ａ．ヌクレオチド配列の増幅
増幅反応は、メチル化特異的な修飾後のエピジェネティックマーカーの配列解析に先立って任意に行われる。本発明の幾つかの実施形態では、増幅は、特定のメチル化パターンを有するマーカーの一部を優先的に増幅するために行われ、ここで例えば胎盤またはその他の胎児組織に由来する特定の一つの源からのマーカーのみが検出され、その量または濃度が分析される。所望により、マーカー配列の胎児性バージョンを選択的に増幅する既知の増幅法を用いて、ポリヌクレオチド配列の相違に基づいた胎児由来または母体由来の決定を可能にする、参照染色体上の遺伝マーカーの増幅が行われる。典型的には、優先的な増幅は入念なプライマー設計により達成される。
【００６１】
様々なポリヌクレオチド増幅法は十分に確立されており、研究においてしばしば用いられる。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的方法については当該技術分野において周知であることから、本明細書では詳述しない。ＰＣＲの方法、プロトコル、およびプライマー設計の原理についての総説は、例えば、Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990 を参照されたい。ＰＣＲ試薬およびプロトコルはまた、Roche Molecular Systems のような市販業者からも入手できる。
【００６２】
大抵の場合、ＰＣＲは耐熱性酵素を用いる自動化された方法によって行われる。この方法では、反応混合物の温度は、変性部分、プライマーのアニーリング部分、および伸長反応部分を通して自動的にサイクルする。この目的のために特に適応させた装置が市販されている。本発明のいくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲのような、改良された、さらに感受性の高いＰＣＲ法もまた有用である。
【００６３】
本発明の実施においては、標的ポリヌクレオチド配列（例えば胎児の配列と母体配列が差次的にメチル化される、エピジェネティックマーカーの部分）のＰＣＲ増幅が典型的に用いられるが、当業者は、母体血サンプル中に見出されるＨＬＣＳ遺伝子配列の増幅が、それぞれが十分な増幅を提供するリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性増幅、および自家持続配列複製法または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）のような既知のいずれの方法によっても達成され得ることを認識するであろう。分岐ＤＮＡ技術もまた、母体血中の、特定のマーカー配列（特定のメチル化パターンまたは特定のポリヌクレオチド配列を表す）の存在を定性的に実証するか、または特定のマーカー配列の量または濃度を定量的に決定するために用いられてよい。臨床サンプル中の核酸配列を直接定量するための分岐ＤＮＡシグナル増幅の総説については、Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998 を参照されたい。
【００６４】
Ｂ．ポリヌクレオチド配列の決定
ポリヌクレオチドシークエンシングのための技術もまた十分に確立されており、関連する研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドのシークエンシングの基本的原理および一般的技術については、上記のWallaceら；上記のSambrookおよびRussellら、ならびに上記のAusubelらのような、分子生物学および組み換え遺伝学についての様々な研究報告書ならびに論文に記載されている。本発明の実施には、通常研究室で用手または自動化のいずれかによって行われる、ＤＮＡシークエンス法を用いることができる。本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチド配列内の変化（例えばＣ→Ｕ）の検出に適したさらなる手段には、マススペクトロメトリー、プライマー伸長法、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高分解能融解分析、ヘテロ二本鎖分析、ピロシークエンス、および電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
ＶＩ．標準コントロールの確立
本発明の方法を実施するための標準コントロールを確立するため、最初に健常胎児を有する健常妊婦の群を選択する。これらの妊婦は、本発明の方法を用いて、胎児の染色体異数性などのような、妊娠に付随する状態をスクリーニングする目的に適した妊娠の時期内にある。任意に、妊婦は同様の妊娠期間、例えば、第１期または第２期のような同一の妊娠三半期にある。
【００６６】
選択された妊婦および該妊婦が妊娠している胎児の健康状態は、妊婦の一般的な健康診断、妊婦の遺伝子分析、ならびにＣＶＳおよび羊水穿刺を用いた胎児の遺伝子分析を含むがこれらに限定されない、十分に確立された通常用いられる方法によって確認される。
【００６７】
さらに、健常胎児を有する健常妊婦の選択数は、母体血中の胎児の遺伝マーカーおよびエピジェネティックマーカーの平均の量／濃度、その量／濃度の比率、およびこの群から得られた母体血中の１以上のエピジェネティックマーカーのメチル化特性が、健常胎児を有する健常妊婦の一般的な集団内でのメチル化特性の正常または平均レベルを代表すると正当にみなされ得るように、妥当な大きさでなければならない。好ましくは、選択された群は少なくとも１０人の妊婦を含む。
【００６８】
胎児のエピジェネティックマーカーのメチル化特性は、この遺伝子のメチル化状態についての複数の、異なっておりかつ分離可能な態様を反映し得る。例えばメチル化特性の一態様は、Ｃ残基がメチル化されているか否かであり；別の態様は、マーカーの特定の領域内のメチル化されたＣ塩基の数であり；特性のさらなる態様は、分析した幾つかのＤＮＡ分子の、任意の所定の位置におけるメチル化されたＣの単数または複数のパーセンテージである。メチル化特性のさらなる態様には、対立遺伝子のメチル化における相違、差次的にメチル化された対立遺伝子の比率などが含まれ得るが、これらに限定されない。胎児性エピジェネティックマーカーのメチル化特性もまた、組織型、例えば胎盤またはその他の胎児の組織によって変動し得る。従って、試験に用いられる様々な胎児の組織のための、別々の標準コントロールが確立されてよい。
【００６９】
選択された健常対照群の各妊婦に見出された個別の値に基づいて、母体サンプル中に存在する胎児性マーカーの特定のセットに対する、胎児性エピジェネティック−遺伝マーカーの比についての平均値が一旦確立されると、この平均値もしくは中央値もしくは代表値、または特性は標準コントロールとみなされる。これらの健常対照妊婦から採取されたサンプルは、理想的には侵襲性の手順に先立って採取されるべきである。同じ過程の間に、標準偏差もまた決定される。場合によっては、エピジェネティックマーカー配列の異なる領域に基づくような、エピジェネティックマーカーのメチル化特性の様々な態様に対して、別々の標準コントロールが確立されてもよい。
【００７０】
実施例
以下の実施例は例証の目的のみで提供されるものであり、限定が目的ではない。当業者は、本質的に同じであるかもしくは同様の結果を生み出すために変更または改変され得る、様々な決定的ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例１】
【００７１】
Ｉ．材料および方法
研究参加者
プリンスオブウェールズ病院（Prince of Wales Hospital）、香港、の産科および婦人科に通院する、正倍数体と２１トリソミーの妊婦を採用した。研究に参加した個人からインフォームドコンセントを得て、香港中文大学−新界東医院連合臨床研究倫理委員会（Joint Chinese University of Hong Kong−New Territories East Cluster Clinical Research Ethical Committee）から倫理的承認を得た。
【００７２】
ＣＯＢＲＡによる、第２１染色体上の差次的にメチル化された領域のスクリーニング
胎盤および母体血細胞からのＤＮＡサンプル中の、第２１染色体上のゲノム配列のメチル化状態を評価するため、ＣＯＢＲＡ（Xiong and Laird, Nucleic Acids Res 1997;25:2532-4）を用いた。
【００７３】
ＣＯＢＲＡにより同定された差次的にメチル化された遺伝子座の、クローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンス分析
クローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンシングのために、ＣＯＢＲＡ分析から得られたＰＣＲ産物を用いた。単一分子の分解能においてメチル化状態を分析するため、pGEM-T Easy Vector System （Promega、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、ＰＣＲ産物をプラスミドベクター内へＴＡクローニングした。組み換え陽性クローンからの挿入断片をベクタープライマーＴ７およびＳＰ６を用いてＰＣＲにより増幅し、次にBigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 キット（Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州）を製造者の指示に従って用いる、サイクルシーケンスによって分析した。エタノール沈殿後、サンプルを１０μＬのHi-Diホルムアミドに再懸濁し、3100 DNA Analyzer（Applied Biosystems）にかけた。シークエンスデータは、SeqScapeソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて分析した。スコア化に先立ち、亜硫酸水素塩による変換の完全性を確認した。メチル化部位の頻度は、メチル化ＣｐＧ部位の総数を、クローン化された全てのＣｐＧ部位で割ることにより算出した（Chiu et al., Am J Pathol 2007;170:941-50）。
【００７４】
ＨＬＣＳ遺伝子座の、従来のリアルタイム定量ＰＣＲによる分析
ＣＯＢＲＡスクリーニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果に基づき、本発明者らは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）による消化アッセイに続く、胎盤で過剰にメチル化されているが、母体血細胞ではメチル化されていないＨＬＣＳ遺伝子座領域Ｂ２を標的としたリアルタイム定量ＰＣＲ分析を開発した。酵素消化の使用により、様々なゲノムＤＮＡサンプル中の、ＨＬＣＳ遺伝子座におけるメチル化パターンの分析が可能になった。加えて、母体血漿サンプル中のバックグラウンドである母体ＤＮＡ分子を除去することができた。リアルタイムＰＣＲアッセイのためのプライマーおよびプローブの配列を表１に示す。
【００７５】
マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲプラットフォームによる遺伝子量の分析
第２１染色体と参照マーカーの遺伝子量の比較を、マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲプラットフォームにおけるポリメラーゼ連鎖反応によって分析した（Ottesen et al., Science 2006;314:1464-7; Warren et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:17807-12）。エピジェネティック−エピジェネティックの比較のための遺伝子座は、第２１染色体上のＨＬＣＳと第３染色体上のＲＡＳＳＦ１Ａであった（Chiu et al., Am J Pathol 2007;170:941-50）。両方とも、過剰メチル化された胎児性ＤＮＡマーカーであった。エピジェネティック−遺伝の比較のための遺伝子座は、雄性胎児の妊娠に由来する第２１染色体上のＨＬＣＳとＹ染色体上のＺＦＹであった。全てのアッセイのためのプライマーおよびプローブの配列を、ＰＣＲの熱サイクル条件と共に表１に示す。
【００７６】
統計解析
統計解析はSigmaStat 3.5ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて行った。
【００７７】
血液および組織サンプルの採取
絨毛膜絨毛サンプル（ＣＶＳ）を、妊娠第１期における従来の出生前診断において採取した。胎盤組織サンプルを、正倍数体の第３期妊娠の出産後に、および正倍数体および２１トリソミーの妊娠中絶後に採取した。胎児の染色体の状態を完全な核型分析によって確認した。全ての被験者から、母体末梢血サンプル（１２〜２０ｍＬ  ＥＤＴＡ）を採取した。第３期妊娠の出産後に、追加の１２ｍＬの血液をＥＤＴＡチューブ内に採取した。第１期、第２期、および第３期の妊娠期間のサンプルは、それぞれ１２〜１４週、１７〜２１週、および３８〜４０週であった。
【００７８】
血液および組織サンプルの処理
母体末梢血サンプルを、以前に記載したように二重遠心分離プロトコルによって処理した（Chiu et al., Clin Chem 2001;47:1607-13）。血液細胞部分を２，５００ｇで再遠心し、いずれの残余の血漿も除去した。末梢血液細胞からのＤＮＡと母体血漿からのＤＮＡを、QIAamp ＤＮＡ血液ミニキットおよびQIAamp DSP ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen、ヒルデン、独国）それぞれの血液および体液プロトコルにより抽出した。ＣＶＳおよび胎盤からのＤＮＡは、QIAampＤＮＡミニキット（Qiagen）を製造者の組織プロトコルに従って用いることにより抽出した。
【００７９】
ＣＯＢＲＡによる、第２１染色体上の差次的にメチル化された領域のスクリーニング
ＣＯＢＲＡの手順を以下に記載する。亜硫酸水素塩による変換は、１グラムの各ＤＮＡサンプルに対し、EZ DNA メチル化キット（Zymo Research、オレンジ、カリフォルニア州）を製造者の指示に従って用いることにより行った。亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡの４０ナノグラム（元のＤＮＡインプットに基づいた計算）を、次にHotStar Taq DNAポリメラーゼキット（Qiagen、ヒルデン、独国）に供給される試薬を用いたＰＣＲによる増幅に供した。各ＰＣＲのための試薬組成物を表２に示す。典型的には、ＰＣＲは、１ｘＰＣＲ緩衝液、ＭｇＣｌ２、５０μＭの各ｄＮＴＰ、順方向および逆方向プライマー、HotStar Taq ポリメラーゼ、および２Ｘ PCRx エンハンサー（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）が有または無の、２０μＬの反応にて行った。熱特性は、９５℃１５分に続き、９５℃２０秒の４５〜５５サイクル、適切なアニーリング温度で３０秒、７２℃１．５分、および７２℃３分の最終伸長であった。ＰＣＲ産物を次に制限酵素消化に供した。それぞれの遺伝子座に用いられる制限酵素は、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化および非メチル化配列を区別できる能力によって選択した。本質的に、制限酵素部位は、配列の一つが消化され得るがもう一つは未変化のままであるように、メチル化または非メチル化配列のいずれかのみに存在し、両方には存在しなかった。制限酵素消化は、５μＬのＰＣＲ産物、適切な１ｘ緩衝液、および１０Ｕの制限酵素（またはモック消化のために酵素なし）による２０μＬの反応において、製造者が推奨する温度下で２時間行った。全ての酵素は、New England Biolabs（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）から購入した。消化した産物は、次にアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００８０】
ＨＬＣＳ遺伝子座の、従来のリアルタイム定量ＰＣＲによる分析
ＭＳＲＥによる消化。各胎盤および母体血細胞ＤＮＡサンプルについて、１００ｎｇのＤＮＡをＭＳＲＥによる消化に供した。制限酵素消化は、適切な１ｘ緩衝液、２５ＵのＨｐａＩＩおよび５０ＵのＢｓｔＵＩ（またはモック消化のために酵素なし）（New England Biolabs）による５０μＬの反応において、製造者が推奨する温度下で少なくとも１６時間行った。各母体血漿サンプルについては、１．６ｍＬの血漿をＤＮＡ抽出に用い、５０μＬの脱イオン水中に溶出して、その２１μＬを制限酵素消化に供した。酵素消化は、適切な１ｘ緩衝液、２０ＵのＨｐａＩＩおよび３０ＵのＢｓｔＵＩ（またはモック消化のために酵素なし）による３０μＬの反応において、製造者が推奨する温度下で少なくとも１６時間行った。消化産物を次にリアルタイム定量ＰＣＲによって分析した。選択した制限酵素は非メチル化ＤＮＡのみを消化し、メチル化ＤＮＡは消化しない。ＣＯＢＲＡ分析のデータにより、ＨＬＣＳは胎盤組織で過剰メチル化されているが、母体血細胞ではメチル化されていないことが示されたから、制限酵素処理後に、胎盤組織由来のＤＮＡの割合は検出可能なままで、母体血細胞由来のほとんどのＤＮＡが消化され、検出されなくなることが予想された。
【００８１】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析。制限酵素消化が有または無によるＨＬＣＳゲノムＤＮＡの定量分析のために、リアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。制限酵素処理したＤＮＡまたはモック消化サンプルの４μｌを、リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。各反応には、１ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、各３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies、コーラルビル、アイオワ州）、および１００ｎＭのTaqManプローブ（Applied Biosystems）が含まれた。プライマーおよびプローブの配列を表１に示す。熱プロファイルは、５０℃２分、９５℃１０分に続き、９５℃１５秒の５０サイクル、および６０℃１分であった。全ての反応は二重に行い、平均量を採用した。最初に吸光度測定で定量して連続希釈したヒトゲノムＤＮＡをアッセイの定量標準物質として用い、アッセイの検出限界は反応あたり１コピーであった。メチル化画分を表す、制限酵素消化後に検出されるＨＬＣＳ分子として、リアルタイム定量ＰＣＲをメチル化の指数として表現した。サンプルのメチル化指数は、酵素消化後のＨＬＣＳのコピー数を、モック消化により得られたコピー数で割ることによって算出した。母体血漿ＤＮＡ分析は、過剰にメチル化されたＨＬＣＳ分子の産後クリアランスを示すために行った。
【００８２】
マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲプラットフォームによる遺伝子量の分析
ＭＳＲＥによる消化。ＭＳＲＥであるＢｓｔＵＩ（New England Biolabs）を、低メチル化ＤＮＡの消化に使用した。抽出したＤＮＡを、ＢｓｔＵＩ酵素により６０℃にて１６時間消化した。ＣＶＳ、胎盤組織、および母体血細胞に対しては、マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲアッセイのための２００ｎｇのＤＮＡを消化するために、４０ＵのＢｓｔＵＩ酵素を用いた。モック消化した一部の分量を、消化コントロールとして含めた。モック消化については、同量のＤＮＡを、酵素の添加なしで同じ消化条件に供した。血漿サンプルに対しては、第３期サンプルの３．４〜４．８ｍＬの血漿からのＤＮＡを消化するために２０ＵのＢｓｔＵＩ酵素を使用した。第１期および第２期の血漿サンプルに対しては、４．４〜９．１ｍＬの血漿から抽出したＤＮＡを消化するために４０Ｕまたは６０ＵのＢｓｔＵＩ酵素を使用した。下線で示したＢｓｔＵＩ制限酵素部位を有する標的配列を、図５に示す。
【００８３】
マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲ分析。それぞれが第２１染色体、第３染色体、およびＹ染色体の量を表す、ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＺＦＹ遺伝子座（図５）に対するマイクロフルイディクスデジタルＰＣＲアッセイを設計した。ＺＦＸ／Ｙアッセイ、およびデジタルＰＣＲ分析の基礎については以前に記載されている（Lun et al., Clin Chem 2008;54:1664-72）。プライマーおよびプローブの配列を表１に示す。デジタル実験は、１２．７６５デジタルアレイ（Fluidigm、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）を用いるBioMark System（Fluidigm）において実行した。デジタルアレイは１２パネルからなり、各パネルはさらに７６５の反応ウェルに分割される。各パネルに、最終濃度が１ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、１２５ｎＭのTaqManプローブ（Applied Biosystems）、ならびに９００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）になるように、製造者のプロトコルに従ってアッセイ添加液およびサンプル添加液によって希釈した１０μＬの混合物として反応を設定した。インプットＤＮＡの量は、１０μＬの各反応混合物に対して３．５μＬであった。熱プロファイルは、５０℃２分、９５℃１０分に続き、９５℃１５秒または３０秒の５０サイクル、および５７℃または６０℃１分であった。各アッセイの熱サイクル条件を表１に示す。ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａアッセイはモノプレックスアッセイとして行った。ＺＦＸ／Ｙアッセイはデュプレックスで行った。
【００８４】
ＢｓｔＵＩにより消化したゲノムＤＮＡサンプルにおけるアッセイ特異性。ＣＶＳ、胎盤、母体血細胞からのＤＮＡサンプルを、ＢｓｔＵＩ消化後、ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＺＦＸ／ＹデジタルＰＣＲ分析に供した。酵素消化後、デジタルＰＣＲ分析の反応混合物中に添加するため、ＤＮＡの濃度を１〜２ｎｇ／μＬに希釈した。ＣＶＳおよび胎盤からのＤＮＡサンプルは、酵素消化に抵抗性のＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａ分子により構成されるため、制限酵素消化後にシグナルが検出されるはずである。一方で本発明者らは、血液細胞がそれらの二つの遺伝子座において低メチル化されていることから、血液細胞における検出は無かまたは低レベルであると予想した。
【００８５】
ＺＦＸ／Ｙ遺伝子座はいずれのＢｓｔＵＩ酵素消化部位も含まなかったことから、制限酵素処理はＤＮＡ分子に対してどのような影響も与え得ない。ＺＦＹ分子は、比率を比較するための、雄性胎児からの胎児由来配列を構成した。
【００８６】
ＢｓｔＵＩにより消化した血漿ＤＮＡサンプルにおけるアッセイ特異性。母体血漿ＤＮＡサンプルをＢｓｔＵＩにより消化した後、脱イオン水で４倍に希釈した。次にサンプルを、分析用のマイクロフルイディクスチップ上に添加するため、反応混合物と混合した。
【００８７】
エピジェネティック−エピジェネティックアプローチおよびエピジェネティック−遺伝アプローチによる、遺伝子量の比較。ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＺＦＸ／Ｙ遺伝子座のデジタルＰＣＲ分析を、正倍数体およびＴ２１胎盤ＤＮＡサンプルについて、ＢｓｔＵＩによる制限酵素消化後に行った。母体血漿分析について、本発明者らは、正倍数体およびＴ２１の妊娠に由来するＢｓｔＵＩにより消化したＤＮＡサンプル中の、ＨＬＣＳのＺＦＹに対する比率を比較した。
【００８８】
ＩＩ．結果
ＣＯＢＲＡによる、第２１染色体上の差次的にメチル化された領域のスクリーニング
第２１染色体上の３５のプロモーター領域を、ＣＯＢＲＡ法を用いた差次的なメチル化のスクリーニングのために選択し、そのうちの３０はＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）と関連していなかったが、その他の５はＣＧＩに関連していた。ＣＧＩを決定する基準は以下の通りである：長さ＞４００ｂｐ、ＧＣ含量＞５０％、および観察された／予想されるＣｐＧ比＞０．６（Yamada et al., Genome Res 2004;14:247-66）。３５のプロモーターの、転写開始点に近接するＤＮＡ配列（−１ｋｂから＋５００ｂｐ；転写開始点は０となる）を、ＵＣＳＣゲノムバイオインフォマティクスデータベース（ウェブサイト：www.genome.ucsc.edu/）のMarch 2006ヒト参照配列（NCBI Build 36.1）から取得し、胎盤組織と母体血細胞の間でメチル化パターンを比較するために５１のＣＯＢＲＡアッセイを設計した（表２）。
【００８９】
５１のアッセイにおいて、第１期および第３期に採取した胎盤組織と母体血細胞の間で、プロモーター領域のメチル化特性を比較した。正常妊娠からの少なくとも１の胎盤組織および１の母体血細胞サンプルをＣＯＢＲＡスクリーニングに用いた（表２）。スクリーニングした領域のうち、ＨＬＣＳの推定プロモーター領域およびＣ２１またはｆ８１（GenBank 受入番号ＡＦ３２６２５７）は、胎盤組織と母体血細胞の間で差次的にメチル化されることが、ＣＯＢＲＡによって同定された。代表的なＣＯＢＲＡの結果を、胎盤が母体血細胞に比較して高度にメチル化されるＨＬＣＳ領域Ｂ２については図６Ａに；母体血細胞が胎盤組織に比較して低度にメチル化されるＣ２１またはｆ８１については図６Ｂに示す。
【００９０】
ＨＬＣＳ遺伝子座の、クローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンス分析
単一分子の分解能におけるメチル化状態のさらなる分析のため、ＨＬＣＳ領域においてクローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンシング実験を行った結果を図１に示す。ＨＬＣＳ領域のシークエンシング結果により、ＨＬＣＳの高度メチル化は胎盤特異的であり、メチル化部位の頻度は０．４３５ないし０．６９９であることが確認された。母体血細胞サンプル中の標的配列の３’末端（すなわち位置−５７から＋１１１、転写開始点は０となる）において低いメチル化レベルが検出されたが（メチル化部位頻度＜０．１００）、−２３２から−６７のＣｐＧ部位にはメチル化はほとんど観察されなかった。
【００９１】
ＭＳＲＥにより消化した胎盤、母体血細胞、および血漿ＤＮＡサンプルに対するリアルタイム定量ＰＣＲ
ＨＬＣＳ領域Ｂ２のＣＯＢＲＡおよび亜硫酸水素塩によるシークエンスのデータに基づいてＭＳＲＥ消化アッセイを行い、続いて胎盤および母体血細胞から抽出したゲノムＤＮＡの差次的なメチル化を分析するためのリアルタイム定量ＰＣＲ分析を行った。
【００９２】
８の母体血細胞サンプルに由来するＨＬＣＳの推定プロモーター領域のメチル化特性を、正倍数体の妊娠から採取した、２の第１期および２の第３期の胎盤組織サンプルに由来するものと比較した。制限酵素消化に続き、リアルタイム定量ＰＣＲ分析を行った結果を図７に示す。全ての母体血細胞サンプルからのＤＮＡは制限酵素によりほとんど消化され、メチル化指数は０に近づいた（中央値：０．０１７８、四分位範囲（ＩＱＲ）：０．０１２１〜０．０２８１）。胎盤組織ＤＮＡサンプルは部分的に消化され、メチル化指数は０．５６７ないし０．９６６の範囲であった。
【００９３】
以前のデータにより、胎盤は胎児ＤＮＡの主な源であるが（Bianchi, Placenta 2004;25 Suppl A:S93-S101）、母体血細胞は、母体血漿中で検出可能な、バックグラウンドである母体ＤＮＡに主に寄与することが示唆された（Lui et al., Clin Chem 2002;48:421-7）。従って、ＨＬＣＳのＤＮＡ分子の胎盤特異的な画分、つまりメチル化されているかまたは消化されない画分が、母体血漿中に検出され得ると仮定された。出産前および出産後の、第３期の母体血漿サンプルを２５組収集し、制限酵素で消化した後にリアルタイム定量ＰＣＲ分析を行った。結果を図８に示す。陽性のＨＬＣＳシグナルは、酵素消化した出産前の血漿サンプルの全てから得られた。酵素処理した出産前および出産後の血漿サンプルからのクリアランスパターンにより、消化抵抗性のＨＬＣＳ分子は妊娠特異的であったことが示唆された（Ｐ＝＜０．００１、ウィルコクソン符号順位検定）。出産後の血漿サンプル中のＨＬＣＳ濃度の中央値は、出産前のサンプル中のそれのわずかに８．１％であった（各２０．１対２４７．８コピー／ｍＬ）（図８Ａ）。モック消化を行ったサンプルについては、出産後の血漿サンプル中のＨＬＣＳ濃度の中央値は、出産前のサンプル中のそれの８３．８％であった（各１２０８．５対１４４２．４コピー／ｍＬ）（図８Ｂ）。モック消化により、出産前の血漿サンプルには胎児および母体ＤＮＡの両方が検出されたが、出産後のサンプルには母体ＤＮＡのみが測定された。モック消化による出産前と出産後のサンプル間でのＨＬＣＳ濃度の相違は、統計的に有意であることに留意されたい（Ｐ＝０．００３、ウィルコクソン符号順位検定）。
ＢｓｔＵＩで消化した一定分量のデータにより、比較的高レベルの胎児ＤＮＡを有する母体血漿サンプルが５サンプルあり、これらの５サンプルは、出産後のサンプル中で、酵素による消化なしでもＨＬＣＳ濃度が大きく減少しているサンプルと同一であったことが示された。このことは、酵素による消化なしであっても、明らかな「クリアランス」パターンの一因となり得る。出産後の血漿サンプル中に観察されるＨＬＣＳ濃度の減少は、異常に高レベルの胎児ＤＮＡを有する幾つかのサンプルによる可能性がある（Ｐ＝０．００３、ウィルコクソン符号順位検定）。極端に高濃度のＨＬＣＳを有する出産前の５サンプルは、酵素による消化の比較における上位の５サンプルと一致することに留意されたい。
【００９４】
マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲプラットフォームにおける遺伝子量の分析
第２１染色体と参照染色体のマーカーの遺伝子量の比較を、マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲプラットフォームにおいて行った。第２１染色体のマーカーは高度にメチル化されたＨＬＣＳであり、第３染色体およびＹ染色体上の参照マーカーは、それぞれ高度にメチル化されたＲＡＳＳＦ１Ａおよび雄性特異的なＺＦＹであった。
【００９５】
酵素による消化の有または無によってＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａアッセイの性能を点検するため、２組の胎盤組織および母体血細胞サンプルを用いた。ＺＦＸ／Ｙアッセイもまた行った（GenBank 受入番号、ＺＦＸ：ＮＭ＿００３４１０、およびＺＦＹ：ＮＭ＿００３４１１）。これらの遺伝子座には酵素消化部位が存在しなかったことから、コピー数は酵素消化によって影響され得ないことが予想された。消化抵抗性のＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａ分子の産後クリアランスを試験するため、出産後の母体血漿の２サンプルを用いた。
【００９６】
各ゲノムＤＮＡサンプルについて、各アッセイの１パネルを行った。出産後の母体血漿については、陽性シグナルを有するいずれのウェルもスコア化するために、酵素消化したＤＮＡを２パネルに分配した。ゲノムＤＮＡと血漿ＤＮＡサンプルの結果をそれぞれ表３Ａおよび３Ｂに要約する。各標的遺伝子座について、陽性であったウェル数を数えた。パネルに分配した分子の実際の数はポアソン分布に従っており、以下の方程式：
標的＝−ｌｎ［Ｅ／Ｎ］ｘＮ
（式中、標的はポアソン補正した標的分子の数、ｌｎは自然対数、Ｅは陰性（空）ウェルの数、およびＮは反応におけるデジタルＰＣＲウェルの総数である）
によって補正した。
【００９７】
ＢｓｔＵＩで消化した胎盤ＤＮＡサンプルの結果から、モック消化のサンプルと比較した際、ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａ分子の約６０％〜７０％がなお検出可能であることが示された。母体血ＤＮＡでは、低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ分子はＢｓｔＵＩ酵素処理によって完全に消化されたが、幾つかのＨＬＣＳ分子はなおサンプル中に検出可能であった。ＺＦＹおよびＺＦＸアッセイについては、モックまたはＢｓｔＵＩで消化したＤＮＡサンプルにおいてみられたコピー数に変化は見られなかった（表３Ａ）。
【００９８】
出産後の母体血漿分析により、ＢｓｔＵＩ酵素による消化後に、ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａ分子の両方が非常に低レベルで検出されたことが示された（表３Ｂ）。
【００９９】
ＭＳＲＥによる消化とそれに続くデジタルＰＣＲ分析による、胎盤ＤＮＡサンプルにおける遺伝子量の比較
１０の正倍数体および１２の２１トリソミーの胎盤ＤＮＡサンプルに対して、ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａアッセイを行った（表４Ａ）。各アッセイについて、４パネルを準備した（図２Ａ）。正倍数体およびＴ２１のサンプルにおいて、ＨＬＣＳとＲＡＳＳＦ１Ａの増幅が陽性であった数の比率は統計学的に有意に異なっていた（Ｐ＝０．００５、マンホイットニー順位和検定）。しかしながら、２群の間には大きな重複があった（図３Ａ）。ＨＬＣＳのＲＡＳＳＦ１Ａに対する比率の平均±１．９６ＳＤとして定義される正常参照範囲は、正倍数体サンプルから０．８６〜１．６３と算出した。参照範囲内であるＴ２１の事例は半数を超えていた。異なるサンプル間の、二つの遺伝子座のメチル化密度の不均一性が、ＨＬＣＳのＲＡＳＳＦ１Ａに対する比率が個体間で大きく変動する一因であると考えられる。この精密さの問題を解決するため、正倍数体とＴ２１のＤＮＡサンプル間での量の比較にはさらに安定なベースラインが要求され得る。
【０１００】
次に、そのメチル化状態に依存しない胎児特異的な遺伝子座、すなわちＺＦＹ遺伝子座を、雄性胎児の妊娠における遺伝子量比較のベースラインとするために調査した。これはエピジェネティックな−遺伝的な（ＥＧＧ）アプローチの重要な特色である。
【０１０１】
ＨＬＣＳとＲＡＳＳＦ１Ａの比較に使用した、同じ制限酵素で消化した胎盤ＤＮＡサンプルを、ＺＦＹデジタルＰＣＲ分析に供した（図２Ａ）。４パネルの総コピー数を、上で得たＨＬＣＳ分子の総コピー数に対する参照ベースラインとして用いた。ＨＬＣＳのＺＦＹに対する比率の平均±１．９６ＳＤとして定義される正常参照範囲は、正倍数体サンプルから１．０８〜１．６２と算出した。全てのＴ２１サンプルは、正常対象範囲よりも高い比率を示した（図３Ｂ）。
【０１０２】
ＭＳＲＥによる消化とそれに続くデジタルＰＣＲ分析による、母体血漿ＤＮＡサンプルにおける遺伝子量の比較
ＥＧＧアプローチが、胎児の２１トリソミーの非侵襲性の出生前検出に適用できるか否かを決定するために、次にＥＧＧ技術を正倍数体およびＴ２１の妊娠に由来する母体血漿ＤＮＡサンプルへ応用した。母体血漿中の母体ＨＬＣＳ分子はＢｓｔＵＩ酵素によって制限消化され、胎児由来の過剰メチル化ＨＬＣＳ分子は未変化のまま残って分析可能であったが、胎児由来のＺＦＹ遺伝子座は、ＰＣＲアンプリコン内に位置するＢｓｔＵＩ酵素認識部位が存在しないことから影響され得ず、このために遺伝子量比較のための安定なベースラインになると結論付けた。
【０１０３】
正倍数体胎児の妊娠第３期、第２期、および第１期それぞれから、８の母体血漿サンプルを得た。ＢｓｔＵＩによる消化後、各ＤＮＡサンプルを、ＨＬＣＳおよびＺＦＹアッセイのためのマイクロフルイディクスチップ上の少なくとも６パネルにおいて分析した（図２Ｂ）。陽性ウェルの総数を用いて、各サンプルごとにＨＬＣＳのＺＦＹに対する比率を算出した（表４Ｂ）。
【０１０４】
正常参照範囲の１．４９〜２．８８は、正倍数体の妊娠による２４の母体血漿サンプルから算出した。１サンプルの正倍数体ＤＮＡサンプルの比率は正常参照範囲外であった。このサンプルは、Speedvac濃縮の間に乾燥させ、サンプル調製の間に水で元に戻したことが不正確さの説明となるかもしれない。Ｔ２１の妊娠に由来する５の母体血漿サンプルは全て、ＨＬＣＳのＺＦＹに対する比率が参照範囲よりも高かった（図４）。このデータは、ＥＧＧアプローチによって、胎児の２１トリソミーが母体血漿サンプルにおいて非侵襲性に検出できることを示した。
【０１０５】
ＩＩＩ．考察
この研究の最初の部分で、本発明者らは、第２１染色体上の高度にメチル化された胎児性ＤＮＡマーカー、すなわちＨＬＣＳ遺伝子のプロモーター領域の検証に成功した（米国特許出願公開第２００７／０２７５４０２号）。このマーカーの高度にメチル化された性質により、メチル化感受性制限酵素による消化とＰＣＲによる増幅の使用を通して、母体血漿中にこれを比較的容易に検出することが可能になる。
【０１０６】
次にＨＬＣＳを用いて、新規なＥＧＧアプローチが胎児の染色体量分析のために実行可能な方法であることを示した。ＥＧＧ法が、これまでのエピジェネティックな対立遺伝子の比率分析（Tong et al., Clin Chem 2006;52:2194-202）よりも有利である主な点は、この方法を用いることで、エピジェネティックな標的および遺伝的な標的（すなわちＳＮＰ）が同じ遺伝子座に存在し、かつ互いの距離が近くなければならないという、後者の方法に対する要件を回避できることである。この研究では、Ｙ染色体上のＺＦＹ遺伝子を、胎児に特異的である遺伝的な標的のモデルとして用いた。しかしながら実際には、胎児に特異的であるいずれの遺伝的な標的、例えば胎児が父親から受け継いでいるが、妊婦には存在しないＳＮＰ対立遺伝子も用いることができる。このようなマーカーのパネルは、このアプローチが広い集団を網羅することを確実にするために、比較的容易に開発され得る。
【０１０７】
ＥＧＧアプローチがＴ２１を識別する威力は、例として高度メチル化ＨＬＣＳの高度メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａに対する比率を用いる、単なるエピジェネティックマーカーに基づいたアプローチより高いこともまた実証された。後者のアプローチの能力が最適以下であることの一つの可能な説明は、図１および以前に発表した亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果（Chiu et al., Am J Pathol 2007;170:941-50）にみられるように、個別の胎児に由来するＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａ分子のＤＮＡメチル化のレベルが様々であるという事実による。従って、これらの潜在的に可変的な二つのパラメータから決定された比率は、パラメータの一つが比較的安定な遺伝マーカー（ＥＧＧアプローチの場合のように）である場合よりも、広い基準範囲を有し得ることが予想されるであろう。
【０１０８】
この研究では、これまでの結果により高度に正確な分析法であることが示されたていため（Lun et al., Clin Chem 2008;54:1664-72; Lun et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:19920-5）、マイクロフルイディクスデジタルＰＣＲを検出および測定のプラットフォームとして用いた。ＥＧＧアプローチは、この分子計数をテーマとするその他の変形、例えば「次世代」シークエンサーを用いる標的化されたシークエンシングによっても実行できる。
【０１０９】
出生前のスクリーニングに重要なその他の染色体、例えば第１８および第１３染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーの開発も、ＥＧＧアプローチの有用性をさらに広げるであろう。胎児性エピジェネティックマーカーの一例は、マスピンをコードする第１８染色体上のＳＥＲＰＩＮＢ５遺伝子である（Chim et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:14753-8）。第１８および第１３染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーのその他の例については、Papageorgiouらにより記載される（Papageorgiou et al., Am J Pathol 2009;174:1609-18）。
【実施例２】
【０１１０】
胎児のエピジェネティックマーカーとして第２１染色体上のホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）の推定プロモーター、および胎児の遺伝マーカーとしてＹ染色体上に存在するＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子を用いる、胎児の２１トリソミーを検出するための新規のエピジェネティック−遺伝的染色体量アプローチが最近開発された（Tong et al., Clin Chem 2010;56:90-8）。この方法が雄性および雌性胎児の両方における検出に使用できることを実証するため、本発明者らは、Ｙ染色体マーカーの代わりにエピジェネティック−遺伝的第２１染色体の量の決定のベースラインとして役立つように、参照染色体上にある父親から受け継いだ胎児の一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子の使用について探索した。
【０１１１】
Ｉ．材料および方法
研究参加者
プリンスオブウェールズ病院（Prince of Wales Hospital）の産科および婦人科に通院する正倍数体と２１トリソミー（Ｔ２１）の妊婦を、２００９年１０月から２０１０年３月の間に採用した。研究に参加した個人からインフォームドコンセントを得て、香港中文大学−新界東医院連合臨床研究倫理委員会（Joint Chinese University of Hong Kong−New Territories East Cluster Clinical Research Ethical Committee）から倫理的承認を得た。
【０１１２】
絨毛膜絨毛サンプル（ＣＶＳ）を、妊娠第１期における通常の出生前診断において採取した。胎盤組織サンプルを、正倍数体の第３期妊娠の出産後に、およびＴ２１の妊娠中絶（ＴＯＰ）後に採取した。Ｔ２１の各例の染色体の状態を完全な核型分析によって確認した。全ての被験者から、母体末梢血サンプル（ＥＤＴＡチューブ内に１２ｍＬ）を採取した。
【０１１３】
血液および組織サンプルの処理
末梢血サンプルを、以前に記載したように二重遠心分離プロトコルによって処理した（Chiu et al., Clin Chem 2001;47:1607-13）。血液細胞部分を２，５００ｇで再遠心し、いずれの残余の血漿も除去した。末梢血液細胞からのＤＮＡと母体血漿からのＤＮＡを、QIAamp ＤＮＡ血液ミニキットおよびQIAamp DSP ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen）それぞれの血液および体液プロトコルにより抽出した。
【０１１４】
ＣＶＳおよび胎盤からのＤＮＡは、QIAampＤＮＡミニキット（Qiagen）を製造者の組織プロトコルに従って用いることにより抽出した。
【０１１５】
染色体量分析
胎盤組織および母体血漿ＤＮＡサンプル中の第２１染色体と参照マーカーの染色体量の比較を、それぞれリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）およびデジタルＰＣＲ（Vogelstein and Kinzler Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:9236-41）により分析した。染色体量分析は、高度にメチル化されたＨＬＣＳの量を、胎児が父親から受け継いだが、妊娠中の母親には存在しないＳＮＰ対立遺伝子（Ｃ／ＧＳＮＰであるｒｓ６６３６）の量と比較することにより行った。ＳＮＰｒｓ６６３６は、第１４染色体上の輸送ドメイン含有膜貫通型ｅｍｐ２４タンパク質８（transmembrane emp24 protein transport domain containing 8: TMED8）遺伝子内に位置し、平均ヘテロ接合性は０．４５１＋／−０．１４９（dbSNP build 130）である。ｒｓ６６３６は、既報のＳＮＰの一つである（Chow et al. Clin Chem 2007;53:141-2）。ｒｓ６６３６  ＳＮＰアッセイは、この文書ではＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイとして表される。
【０１１６】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）による消化
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであるＢｓｔＵＩ（New England Biolabs）を、低メチル化ＤＮＡの消化に使用した。抽出したＤＮＡを、ＢｓｔＵＩ酵素により６０℃にて１６時間消化した。ＣＶＳ、胎盤組織、ならびに母体および正常コントロール血液細胞に対しては、ＰＣＲアッセイのための１００ｎｇのＤＮＡを消化するために、４０ＵのＢｓｔＵＩ酵素を用いた。モック消化した一定分量を、消化コントロールとして含めた。モック消化については、同量のＤＮＡを、酵素の添加なしで同じ消化条件に供した。血漿サンプルに対しては、１．６〜５．２ｍＬの血漿からのＤＮＡを消化するために２０Ｕないし４０ＵのＢｓｔＵＩ酵素を使用した。
【０１１７】
従来のリアルタイムｑＰＣＲ分析のアッセイ設計および反応条件
リアルタイムＰＣＲ分析をＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８遺伝子座について行った。プライマーおよびプローブの配列を表５に示す。ＨＬＣＳ、ＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子、およびＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子アッセイは全てモノプレックス反応として行った。ＨＬＣＳ遺伝子座のＰＣＲアンプリコン内には、二つのＢｓｔＵＩ酵素認識部位が存在した。対照的に、ＴＭＥＤ８  ＳＮＰアッセイはいずれのＢｓｔＵＩ酵素認識部位も含まなかった。
【０１１８】
最終濃度が１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、１００ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）、ならびに各３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）であり、２５ｎｇのＤＮＡインプットを含む、２５μＬの混合物として、各反応を設定した。反応は５０℃２分で開始し、次に９５℃１０分、９５℃１５秒の４０サイクル、および６０℃１分で続けた。実験は7300 Real-time PCR System（Applied Biosystems）で行い、蛍光データを収集してSDS v1.3.0 ソフトウェア（Applied Biosystems）により解析した。全ての反応は二重に実行し、平均量を採用した。検量線は、成人男性の血液細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、反応あたり１００００ゲノム当量（ＧＥ）ないし３ＧＥの範囲の濃度に段階希釈することによって作成した。
【０１１９】
デジタルＰＣＲ分析のアッセイ設計および反応条件
ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰのデジタルＰＣＲ分析には、リアルタイムＰＣＲ分析に対するものと同じオリゴヌクレオチド配列を用いた（表５）。ここでＨＬＣＳアッセイはデュプレックス反応として、各ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイと共に行った。蛍光プローブは、ＨＬＣＳ（ＶＩＣ）とＴＭＥＤ８−Ｃ（ＦＡＭ）をデュプレックスで、およびＨＬＣＳ（ＦＡＭ）とＴＭＥＤ８−Ｇ（ＶＩＣ）をデュプレックスとして標識した。
【０１２０】
デジタルＰＣＲ分析の基礎については既報である（Lo et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13116-21; Lun et al. Clin Chem 2008;54:1664-72）。３８４ウェルプレートのウェルあたりの反応総量は５μＬであり、最終濃度は１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、１００ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）、ならびに各３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）であった。反応は５０℃２分で開始し、次に９５℃１０分、９５℃１５秒の５０サイクル、および６０℃１分で続けた。実験は7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）において３８４ウェルフォーマットにより行い、蛍光データをSDS 2.3 ソフトウェアの「Absolute Quantification」アプリケーション（Applied Biosystems）により収集した。
【０１２１】
ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイの特異性
既知のＴＭＥＤ８遺伝子型を有するゲノムＤＮＡを胎盤組織から抽出し、ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８のデュプレックスアッセイに供した。一対立遺伝子がホモ接合性であったサンプルは、もう一方の対立遺伝子のＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイによって試験した。Ｃ対立遺伝子がホモ接合性であるサンプルは、Ｇ対立遺伝子を検出するＴＭＥＤ８アッセイに対してどのようなシグナルも示さないはずであり、この逆もまた同じである。
【０１２２】
消化コントロールとしてのベータアクチンアッセイ
胎盤および母体血細胞の両方においてメチル化されていない、既報のベータアクチン領域を、ＢｓｔＵＩによる消化の効率を判定するために用いた（Chan et al. Clin Chem 2006;52:2211-8）。ベータアクチンアッセイは、現行のＨＬＣＳアッセイにおけるＢｓｔＵＩ酵素認識部位の数に一致させるため、二つのＢｓｔＵＩ酵素認識部位を含むように改変した。プライマーおよびプローブの配列を表５に示す。リアルタイムｑＰＣＲとデジタルＰＣＲ分析の両方に同じ配列を使用した。
【０１２３】
統計解析
統計解析はSigmaStat 3.5ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて行った。
【０１２４】
ＩＩ．結果と考察
従来のリアルタイムｑＰＣＲによる染色体量分析
ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイを、ヘテロ接合性のＣ／Ｇ遺伝子型を有する、総数２０の正倍数体と９のＴ２１胎盤組織サンプルに適用した。６の正倍数体と４のＴ２１サンプルは、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率を用いて分析し、残りの１４の正倍数体と５のＴ２１サンプルは、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率を用いて分析した。成人男性の血液細胞から抽出したゲノムＤＮＡを段階希釈することによって作成した、反応あたり１００００ＧＥないし３ＧＥの範囲の濃度を有する検量線を、試験サンプル中の二つの遺伝子座の絶対的なコピー数を判定するために用いた。
【０１２５】
検量線の勾配およびｙ切片によって示すように、三つのアッセイは全て効率が同じになるように最適化した。ＨＬＣＳ、ＴＭＥＤ８−Ｃ、およびＴＭＥＤ８−Ｇアッセイの検量線の勾配は、それぞれ−３．７１、−３．７０、および−３．６２であり、一方でｙ切片は、それぞれ３９．６２、３９．７９、および４２．０４の閾値サイクル値を示した。
【０１２６】
胎盤ＤＮＡサンプルにおけるＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率
最初に、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率をモック消化した胎盤ＤＮＡサンプルにおいて決定した。ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率の平均±１．９６ＳＤとして定義される正常参照範囲は、６の正倍数体サンプルから１．７８〜２．６６と算出された。４のＴ２１サンプルは全て、正常対象範囲よりも高い比率を示した（図６Ａ）（図９Ａ）。
【０１２７】
次に同じサンプルを、リアルタイムＰＣＲ分析に先立ち、ＢｓｔＵＩ制限酵素による消化に供した。ＰＣＲにより検出される消化抵抗性の過剰メチル化ＨＬＣＳ分子のみを残して、非メチル化ＨＬＣＳ分子はＢｓｔＵＩ酵素処理により消化され得たが、ＴＭＥＤ８のＰＣＲアンプリコン内にＢｓｔＵＩ酵素認識部位が存在しなかったことから、ＴＭＥＤ８分子は未変化のまま残ったであろう。正常参照範囲は１．２４〜２．２６と算出した。全てのサンプルは、正確に判定された（表６Ｂ）（図９Ｂ）。
【０１２８】
アッセイの特異性を試験するために、モックとＢｓｔＵＩによる消化実験の両方に、ＴＭＥＤ８  ＳＮＰについてホモ接合性のＧＧ遺伝子型を有する胎盤ＤＮＡサンプルを含めた。Ｃ対立遺伝子を検出するＴＭＥＤ８アッセイでは、シグナルは見られなかった（表６Ａおよび６Ｂ）。
【０１２９】
胎盤ＤＮＡサンプルにおけるＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率
最初に、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率をモック消化した胎盤ＤＮＡサンプルにおいて決定した。正常参照範囲は、１４の正倍数体サンプルから１．３６〜３．０３と算出した。正倍数体およびＴ２１群それぞれからの１サンプルについては判定を誤った（図７Ａ）（図１０Ａ）。
【０１３０】
次に同じサンプルを、リアルタイムＰＣＲ分析の前に、ＢｓｔＵＩ制限酵素による消化に供した。正常参照範囲は、０．９０〜１．９９と算出した。正倍数体およびＴ２１群それぞれからの１サンプルについては判定を誤った（図７Ｂ）（図１０Ｂ）。これらはモック消化実験において判定を誤ったサンプルと同じものではない。
【０１３１】
アッセイの特異性を試験するために、モックとＢｓｔＵＩによる消化実験の両方に、ＴＭＥＤ８  ＳＮＰについてホモ接合性のＣＣ遺伝子型を有する胎盤ＤＮＡサンプルを含めた。Ｇ対立遺伝子を検出するＴＭＥＤ８アッセイでは、シグナルは見られなかった（表７Ａおよび７Ｂ）。
【０１３２】
消化コントロールとしてのベータアクチン
ベータアクチンアッセイを、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８に対する染色体量分析で用いたものと同じであるモックおよびＢｓｔＵＩにより消化した胎盤ＤＮＡサンプルに適用することにより、ＢｓｔＵＩ酵素による消化の効率を評価した。サンプル中のベータアクチン配列量を定量するために、同じ標準検量線を用いた。検量線の勾配は−３．４１であり、一方でｙ切片は３７．９７の閾値サイクル値を示した。結果により、試験したサンプル全てにおいて９６％を超えるＤＮＡが消化されたことが示された（表８Ａおよび８Ｂ）。
【０１３３】
デジタルＰＣＲによる染色体量分析
ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイの特異性
ＳＮＰ対立遺伝子のいずれか１の検出に対する特異性を確認するため、ヘテロ接合性のＣ／Ｇ、ホモ接合性のＣ／Ｃ、およびホモ接合性のＧ／Ｇ遺伝子型の胎盤ＤＮＡサンプルを、ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８のデュプレックスアッセイにより試験した。３グループそれぞれに２サンプルを用いた。Ｃ対立遺伝子がホモ接合性であるサンプルは、Ｇ対立遺伝子を検出するＴＭＥＤ８アッセイに対してどのようなシグナルも示さないはずであり、この逆もまた同じである。
【０１３４】
各標的遺伝子座について、陽性であったウェル数を数えた。３８４ウェルプレートに分配した分子の総数はポアソン分布に従っており、以前に記載したように補正した（Tong et al. Clin Chem 2010;56:90-8）。
【０１３５】
ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｃのデュプレックスアッセイの適用により、ヘテロ接合性のＣ／Ｇおよびホモ接合性のＣ／Ｃ遺伝子型である胎盤ＤＮＡサンプルは、両遺伝子座に対して陽性のウェルを示したが、ホモ接合性のＧ／Ｇ遺伝子型のサンプルは、ＨＬＣＳ遺伝子座に対してのみ陽性であり、ＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する検出可能なシグナルは見られなかった（図９Ａ）。
【０１３６】
ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｇのデュプレックスアッセイの適用により、ヘテロ接合性のＣ／Ｇおよびホモ接合性のＧ／Ｇ遺伝子型である胎盤ＤＮＡサンプルは、両遺伝子座に対して陽性のウェルを示したが、ホモ接合性のＣ／Ｃのサンプルは、ＨＬＣＳ遺伝子座に対してのみ陽性であり、ＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する検出可能なシグナルは見られなかった（図９Ｂ）。
【０１３７】
この結果により、ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイは、個々のＳＮＰ対立遺伝子の検出に特異的であったことが示された。特異性は、異なる蛍光色素によって標識された対立遺伝子特異的なプローブによって与えられた。
【０１３８】
母体血漿ＤＮＡサンプルにおける、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率
情報価値のあるなサンプルにおいて、消化抵抗性ＨＬＣＳの胎児特異的なＴＭＥＤ８  ＳＮＰ対立遺伝子に対する比率を比較することにより、母体血漿ＤＮＡ分析を行った。情報価値のあるサンプルは、ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰが胎児がヘテロ接合性であり、かつ母親がホモ接合性であるものとして定義される。胎児が父親から受け継いだ余分の対立遺伝子は、第２１染色体の量を決定するための参照ベースラインとして用いた。
【０１３９】
ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｃのデュプレックスアッセイを、総数１６の正倍数体および２のＴ２１の妊娠に対して適用した。これらのサンプルにおいて、胎児および母体のＴＭＥＤ８  ＳＮＰの遺伝子型は、それぞれＣ／ＧおよびＧ／Ｇであった。胎児特異的なＳＮＰ対立遺伝子はＣ対立遺伝子であった。母体血漿ＤＮＡサンプルをＢｓｔＵＩ酵素で消化した後、デジタルＰＣＲにより分析した。各サンプルは、少なくとも１の３８４ウェルプレートにて分析した。陽性ウェルの総数を用いて、各サンプルにおけるＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する比率を算出した。
【０１４０】
正倍数体の母体血漿サンプルから正常参照範囲の２．１２〜３．６５を算出した。妊娠第３期から８サンプルを採取し、第２期および第１期からそれぞれ４サンプルを採取した。これらの１６の正倍数体サンプルのうち、１０は雌性胎児の妊娠由来であり、６は雄性胎児の妊娠由来であった。正倍数体サンプルの全てにおいて、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する比率は参照範囲内であった。妊娠第２期および第１期から採取したＴ２１サンプルは、参照範囲よりも高い比率を示した（図７Ａ）。Ｔ２１の例は両方とも雌性胎児を妊娠していた。
【０１４１】
母体血漿ＤＮＡサンプルにおける、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率
情報価値のあるサンプルの他の群において、胎児および母体のＴＭＥＤ８  ＳＮＰの遺伝子型は、それぞれＣ／ＧおよびＣ／Ｃであった。胎児特異的なＳＮＰ対立遺伝子はＧ対立遺伝子であった。ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−ＧのデュプレックスデジタルＰＣＲアッセイを、ＢｓｔＵＩにより消化した９の正倍数体妊娠および１のＴ２１妊娠に由来する母体血漿ＤＮＡサンプルに適用した。各サンプルは、少なくとも１の３８４ウェルプレートにて分析した。陽性ウェルの総数を用いて、各サンプルにおけるＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する比率を算出した。
【０１４２】
正倍数体の母体血漿サンプルから正常参照範囲の２．０６〜３．６８を算出した。９の正倍数体サンプルのうち、５，３、および１例は、それぞれ妊娠第３期、第２期、および第１期から採取した。これらには、雌性胎児の妊娠４例、および雄性胎児の妊娠５例が含まれた。正倍数体サンプルの全てにおいて、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する比率は参照範囲内であった。雌性胎児を有するＴ２１の妊娠第１期は、参照範囲よりも高い、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率を示した（図７Ｂ）。
【０１４３】
消化コントロールとしてのベータアクチン
ベータアクチンデジタルＰＣＲアッセイを、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８に対する染色体量分析で用いたものと同じであるＢｓｔＵＩにより消化した母体血漿ＤＮＡサンプルに適用することにより、ＢｓｔＵＩ酵素による消化の効率を評価した。染色体量分析に供する前に、消化したＤＮＡサンプルの一定分量（消化混合物の総量の１／５０）について、ベータアクチンアッセイでは１を超える陽性ウェルを示さないことを確認した。
【０１４４】
ＩＩＩ．結論
前の実施例で本発明者らは、ＥＧＧアプローチが原理的には母体血漿ＤＮＡサンプル中の胎児の染色体量分析のために実行可能な方法であることを実証した。高度にメチル化されたＨＬＣＳ遺伝子座を、胎児特異的な分子のクラスを表すエピジェネティックな成分として用い、ＺＦＹ遺伝子座は、雄性胎児に特異的な遺伝マーカーであった。第２１染色体上の胎児特異的なエピジェネティックマーカーと参照染色体上の胎児特異的な遺伝マーカーとの間の比率を比較することにより、第２１染色体の量が推定できた。
【０１４５】
この実施例で本発明者らはさらに、エピジェネティック−遺伝的染色体量アプローチが、雄性胎児由来のＹ染色体マーカーの代わりに胎児特異的なＳＮＰ対立遺伝子を遺伝的な参照ベースラインとして用いる、２１トリソミーの出生前診断に応用できることを実証した。
【０１４６】
ここでは、第１４染色体上のＴＭＥＤ８遺伝子座内に位置するＳＮＰ  ｒｓ６６３６を例として用いた。高度にメチル化されたＨＬＣＳと胎児特異的なＴＭＥＤ８  ＳＮＰ対立遺伝子との間の比率を比較することにより、第２１染色体の量が推定できた。両ＳＮＰ対立遺伝子とも、このような遺伝的な参照ベースラインとして役立ち得ることが実証された。
【０１４７】
情報価値のあるＳＮＰ対立遺伝子を遺伝的な参照ベースラインとして用いることにより、ＥＧＧによる染色体量へのアプローチを２１トリソミーの出生前診断に、雄性および雌性胎児の両方に対して適用できる。さらに、このようなマーカーのパネルの開発により、このアプローチが広い集団を網羅することを確実にするであろう。既報のように（Chow et al. Clin Chem 2007;53:141-2）、ＳＮＰのパネルについて母体の遺伝子型を確認するためには、ほとんどが母体ＤＮＡを含む母体バッフィーコートサンプルが最初に試験できる。母親のＳＮＰがホモ接合性を示すと、次に母体血漿中の母体遺伝子型には表れない対立遺伝子の検出が目標となる。血漿サンプルが母体のものではない対立遺伝子について陽性である場合、胎児は父親から対立遺伝子を受け継いだことが示唆される。母体血漿中の、この父親から受け継がれた胎児特異的な対立遺伝子の定量化は、次にエピジェネティック−遺伝的アプローチを用いる遺伝子量評価のための参照として用いることができる。最後に、出生前試験に重要なその他の異数性に関わるその他の染色体、例えば第１８および第１３染色体に対するエピジェネティックマーカーの使用により、ＥＧＧアプローチの臨床的な有用性はさらに拡大するであろう。
【実施例３】
【０１４８】
胎児の１８トリソミー検出に対するエピジェネティック−遺伝的染色体量によるアプローチ
この実施例は、胎児の１８トリソミー（Ｔ１８）検出に対するエピジェネティック−遺伝的（ＥＧＧ）染色体量によるアプローチの適用を示すものである。ＥＧＧアプローチについてのこの実施例は、母体血漿中の、第１８染色体上に位置する胎児性エピジェネティックマーカーおよび参照染色体上に位置する胎児性遺伝マーカーそれぞれに関する。胎児性エピジェネティックマーカーは、好ましくはマーカー１８Ａ［ゲノム位置chr18:10022533-10022724、Human Genome March 2006アセンブリ(hg18)により定義される］であり、これは、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法およびタイリングアレイ分析によって同定された通り（米国特許出願第６１／３０８，５７８号に記載される）、ＶＡＰＡ（小胞結合膜タンパク質）結合プロテインＡ）遺伝子の７５ｋｂ下流およびＡＰＣＤＤ１（発現低下大腸腺腫症１：adenomatosis polyposis coli down-regulated 1）遺伝子の４２１ｋｂ上流に位置する、１４６ｂｐの遺伝子間領域である。しかしながらこの胎児性エピジェネティックマーカーは、上記の遺伝子座、すなわちchr18:10022533-10022724の１００ｋｂ上流または下流の範囲に位置する、シトシン含有ＤＮＡゲノム領域のいずれかであってもよい。さらにこの胎児性エピジェネティックマーカーは、母体血漿中で胎児の第１８染色体を母体の第１８染色体から区別する、異なったエピジェネティック特性（ＤＮＡのメチル化レベル）を有するシトシン含有ＤＮＡゲノム領域のいずれかであってもよい。
【０１４９】
母体血漿中の胎児性遺伝マーカーは、好ましくはＹ染色体上のＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子内に位置する領域である。しかしながらこの胎児性遺伝マーカーは、一塩基多型（ＳＮＰ）および挿入／欠失（indel）多型を含む、胎児とその母親との間のいずれかの遺伝的な相違であってもよい。
【０１５０】
この実施例で本発明者らは、Ｔ１８の出生前の非侵襲性検出のために、ＥＧＧアプローチを導入して、第１８染色体上のマーカー１８Ａの濃度とＹ染色体上の胎児性遺伝マーカーであるＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子の濃度を比較した。
【０１５１】
Ｉ．材料および方法
サンプルの採取
サンプルは、プリンスオブウェールズ病院（Prince of Wales Hospital）、香港、の産科および婦人科、または賛育医院（Tsan Yuk Hospital）、香港、の出生前診断とカウンセリング部門、またはKing's College Hospital、ロンドン、英国、のHarris Birthright Research Centre for Fetal Medicineに通院する妊婦から採取した。全ての妊婦はインフォームドコンセントを得て採用された。本研究はそれぞれの機関の審査委員により承認された。
【０１５２】
絨毛膜絨毛サンプル（ＣＶＳ）を、妊娠第１期および第２期における通常の出生前診断において採取した。正倍数体およびＴ１８の各例の染色体の状態を完全な核型分析によって確認した。全ての被験者から、母体末梢血サンプル（ＥＤＴＡチューブ内に１２ｍＬ）を採取した。英国からの血漿は採取後に凍結し、ドライアイスによりバッチで香港へ送った。
【０１５３】
サンプル処理
末梢血サンプルを、既報の通り二重遠心分離プロトコルによって処理した（Chiu et al., Clin Chem 2001;47:1607-13）。血液細胞部分を２，５００ｇで再遠心し、いずれの残余の血漿も除去した。
【０１５４】
末梢血液細胞からのＤＮＡと母体血漿からのＤＮＡを、QIAamp ＤＮＡ血液ミニキットおよびQIAamp DSP ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen）それぞれの血液および体液プロトコルにより抽出した。ＣＶＳおよび胎盤からのＤＮＡは、QIAampＤＮＡミニキット（Qiagen）を製造者の組織プロトコルに従って用いることにより抽出した。
【０１５５】
胎盤および母体血細胞におけるマーカー１８Ａのメチル化状態の分析
クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングによるＤＮＡメチル化の分析
マーカー１８Ａのメチル化状態を、クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングにより、６組の胎盤組織および母体血細胞において分析した。簡単に述べると、EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を製造者の指示に従って用いることにより、抽出したＤＮＡの亜硫酸水素塩による変換を行った。亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１８Ａ領域を標的としたプライマーによるＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲのためのプライマー配列を表１０に示す。ＰＣＲ条件については、表１１Ａに要約する。続いて、pGEM-T Easy クローニングキット（Promega）を製造者の指示に従って用い、ＰＣＲ産物をプラスミドベクター内へＴＡクローニングした。クローニングは、大腸菌株JM109（Promega）により行った。次にクローンからの挿入断片を、Ｔ７およびＳＰ６プロモータープライマー（Promega）を製造者の指示に従って用いることによって増幅した（反応条件を、表１１ＡのコロニーＰＣＲアッセイの副題の下に要約する）。ＰＣＲ産物を次に、BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 キット（Applied Biosystems）を製造者の指示に従って用いるシークエンシング反応に供した（反応条件を、表１１Ａのシークエンシング反応の副題の下に要約する）。次にＤＮＡをエタノール沈殿し、１０μＬのＨｉ−Ｄｉホルムアミドに再懸濁して、3100 DNA Analyzer（Applied Biosystems）によりシークエンシングした。シークエンスデータは、SeqScape v2.5ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて分析した。本発明者らは、非ＣｐＧシトシン残基における変換率を調べることにより、各クローンの亜硫酸水素塩による変換が＞９９％であることを確保した。
【０１５６】
各ＣｐＧ部位におけるＭＩは、各サンプルについてメチル化クローンの数を総クローン数で割ることにより算出した。各ＣｐＧ部位について、２つの生物学的複製の平均ＭＩを算出した。メチル化部位の頻度は、各サンプルを通して、スコア化したクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって示した。
【０１５７】
Ｔ１８および正倍数体の胎盤におけるマーカー１８Ａのメチル化状態の分析
EpityperアッセイによるＤＮＡメチル化の分析
標準的なMassCLEAVEプロトコル（Sequenom）（Ehrich et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:15785-90）によって、Epityperアッセイを行った（プロトコルに含まれる個別の反応に対する条件の詳細を図１１Ｂに要約する）。簡単に述べると、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１８Ａを標的とするEpityperアッセイによるＰＣＲ増幅に供した。プライマー配列を表１０に示す。Ｔ７プロモータータグを逆方向プライマーの３’末端に付加し、１０ベースタグを該プライマーの５’末端に付加して、順方向と逆方向プライマーの間で融解温度が同等になるようにした。抽出したＤＮＡを、EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を用いる亜硫酸水素塩による変換に製造者の指示に従って供し、ＰＣＲによって増幅した。次にＰＣＲ産物を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡにin vitro転写し、リボヌクレアーゼＡにより、ＡまたはＧ残基を有する塩基を特異的に切断した。切断反応によってＣｐＧを含む断片、またはＣｐＧ単位が生成し、これらの大きさはＣｐＧ部位のメチル化状態（すなわち亜硫酸水素塩による変換後の、メチル化および非メチル化ＣｐＧそれぞれに対するＣｐＧまたはＴｐＧ）に依存するであろう。次に産物を精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光光度計（MassARRAY Analyzer Compact）によって分離した。各ＣｐＧ単位のメチル化指数（ＭＩ）は、メチル化産物のピーク高さをメチル化および非メチル化産物のピーク高さの和で割ることによって算出した。
【０１５８】
出産前および出産後の母体血漿におけるメチル化されたマーカー１８Ａの配列の検出
マーカー１８Ａを標的とした、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを設計した。関連する制限エンドヌクレアーゼにより、母体ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ部位が特異的に切断され得るが、胎児ＤＮＡのメチル化ＣｐＧ部位は切断され得ないように、プライマーおよびプローブを戦略的に配置した。
【０１５９】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）による消化
血漿ＤＮＡを消化するため、二つの型のＭＳＲＥ、すなわちＨｐａＩＩおよびＨｉｎＰ１Ｉ（New England Biolabs）を使用した。各血漿サンプルについて、０．８ｍＬ〜３．２ｍＬの血漿からＤＮＡを抽出し、５０μＬの水に溶出した。次に溶出したＤＮＡ３５μＬを、各２０ＵのＨｐａＩＩおよびＨｉｎＰ１Ｉ（New England Biolabs）と、１Ｘ NEBuffer 1中で３７℃２時間インキュベートした。
【０１６０】
従来のリアルタイム定量ＰＣＲ分析
１）胎児出産前および出産後の、消化抵抗性マーカー１８Ａの濃度
ＭＳＲＥによる消化後、マーカー１８Ａの高度メチル化ＤＮＡ配列を従来のｑＰＣＲによりABI 7300 HT sequence detection system（Applied Biosystems）において増幅した。各ｑＰＣＲアッセイの反応量は５０μＬであり、これには１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、各１５００ｎｍｏｌ／Ｌの順方向および逆方向ＰＣＲプライマー（Integrated DNA Technologies）、および２５０ｎｍｏｌ／ＬのTaqMan（登録商標）プローブ（Integrated DNA Technologies）が含まれた。プローブは、レポーターとしてその５’末端をＦＡＭにより標識した。熱プロファイルは、５０℃２分、９５℃１０分、９５℃１５秒の４０サイクル、および６０℃１分であった。プライマーおよびプローブの配列を表１２に示す。
【０１６１】
２）雄性胎児の妊娠から得た出産前の母体血漿における、消化抵抗性のマーカー１８Ａの濃度とＺＦＹの濃度との関連性
ＺＦＹの濃度は、ｑＰＣＲによりABI 7300 HT sequence detection system（Applied Biosystems）において、これまでに確立されたアッセイ（Lun et al. Clin Chem 2008; 54:1664-72）を用いて決定した。各ｑＰＣＲアッセイの反応量は５０μＬであり、これには１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、各３００ｎｍｏｌ／Ｌの順方向および逆方向ＰＣＲプライマー、および１００ｎｍｏｌ／ＬのTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）が含まれた。プローブは、レポーターとしてその５’末端をＶＩＣにより標識した。熱プロファイルは、５０℃２分、９５℃１０分、９５℃１５秒の４０サイクル、および６０℃１分であった。プライマーおよびプローブの配列を表１２に示す。
【０１６２】
ｑＰＣＲ分析による定量化のため、NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific Waltham）によりDNA-50の設定を用いて定量した、雄性の末梢血液細胞サンプルから抽出した既知の濃度のゲノムＤＮＡを段階希釈して検量線を作成した。次にこれを、反応あたり３コピーないし反応あたり１０，０００コピーの直線ダイナミックレンジを有する定量標準物質を構築するために用いた。検出限界（ＬＯＤ）は反応あたり３コピーであった。ＬＯＤ濃度にて反応を二重に２０回行うと（４０回反復）、定量化サイクルの中央値３９．１（範囲：３８．２〜４０．８）で１００％のウェルが陽性であった。この限界を超えて検出されたいずれのシグナルも、検出不能とみなした。全ての反応を二重に行い、平均量を採用した。ＰＣＲ実施の全てに、水ブランク（鋳型を含まないコントロール）を複数含めた。
【０１６３】
ＥＧＧによる染色体量の分析
本発明者らは、正倍数体ならびにＴ１８の妊娠から得た胎盤組織（ＣＶＳ）および母体血漿サンプル中の、第１８染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーであるマーカー１８Ａの相対量と、Ｙ染色体上の胎児性遺伝マーカーであるＺＦＹの相対量を比較するために、ＥＧＧアプローチを導入した。
【０１６４】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）による消化
マーカー１８Ａに関するＥＧＧ分析のための消化プロトコルは、ｑＰＣＲ分析のために用いたものと同じとした。胎盤サンプル分析のため、５０ｎｇのＤＮＡを消化に供した。胎盤組織は全て妊娠第１期から得た。血漿サンプル分析のため、正倍数体ならびにＴ１８の妊娠第１期、第２期、および第３期から得た１．６ｍＬ〜３．２ｍＬの血漿よりＤＮＡを抽出した。各例から抽出したＤＮＡを５０μＬの水に溶出し、その３５μＬを消化に供した。
【０１６５】
デジタルＰＣＲ分析のアッセイ設計および反応条件
消化抵抗性のマーカー１８ＡおよびＺＦＹ配列を増幅するために、デュプレックスデジタルＰＣＲアッセイを開発した。デジタルＰＣＲ分析の基礎については既報である（Lo et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104:13116-21; Tong et al. Clin Chem 2010; 56: 90-8）。
【０１６６】
ウェルあたりの反応量は５μＬで、最終濃度は、各標的に対するそれぞれのプライマーおよびプローブについて１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）であった。マーカー１８Ａについての反応は、２５０ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Integrated DNA Technologies）ならびに各１５００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）を含んだ。ＺＦＹについての反応は、１００ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）ならびに各３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）を含んだ。マーカー１８Ａに対するプローブはレポーターＦＡＭで標識したが、ＺＦＹに対するプローブはレポーターＶＩＣで標識した（表１２）。各標的に対するデジタルＰＣＲ反応の総数は３８４とした。プライマーおよびプローブの配列はｑＰＣＲに対するものと同じとした。
【０１６７】
消化の完全性を評価するため、（ｉ）妊娠第１期の胎盤および母体血細胞の両方において全くメチル化されておらず（図１７）；かつ（ｉｉ）マーカー１８Ａと同様のＭＳＲＥ認識部位の数および型を含む、ベータアクチン遺伝子の一領域を標的とした別のデジタルＰＣＲアッセイを開発した。この特定領域のメチル化状態を、クローン化した亜硫酸水素塩によるシークエンシングによって確認した（図１７）。亜硫酸水素塩によるシークエンス分析についてのＰＣＲ増幅のためのプライマーの配列を表１０に示した。反応条件は、マーカー１８Ａについて記載したものと同じとした。完全な消化後に、ベータアクチン配列は検出されないことが予想された。ウェルあたりの反応量は５μＬで、最終濃度は、２５０ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）ならびに各９００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）を含む１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）であった。プローブは、その５’末端をレポーターＶＩＣにより標識した（表１０）。アッセイは、7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）において行った。反応は５０℃２分で開始し、次に９５℃１０分、９５℃１５秒の５５サイクル、および６０℃１分で続けた。各標的に対するデジタルＰＣＲ反応の総数は９６とした。
【０１６８】
全てのデジタルＰＣＲアッセイの蛍光データは、SDS 2.3 ソフトウェアの「Absolute Quantification」アプリケーション（Applied Biosystems）により収集した。
【０１６９】
統計解析
統計解析はSigmaStat 3.0ソフトウェア（ＳＰＳＳ）により行った。
【０１７０】
ＩＩ．結果
マーカー１８Ａは有望な胎児性エピジェネティックマーカーである
以前の研究により、胎盤と母体血細胞の間で差次的にメチル化されるゲノム領域は、母体血漿中の胎児性エピジェネティックマーカーへと開発できる可能性のあることが示された（Chim et al. Clin Chem 2008; 54:500-11; Tong et al. Clin Chem 2010; 56:90-8）。クローニングと亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果から、マーカー１８Ａは正倍数体の胎盤では主にメチル化されているが（ｎ＝６）、母体血細胞では基本的にメチル化されていない（ｎ＝６）ことが明らかになった（図１２）。胎盤および母体血細胞における平均メチル化指数は、それぞれ０．６８および０．０１である。
【０１７１】
本発明者らはまた、Epityperにより、正倍数体（ｎ＝６）およびＴ１８（ｎ＝６）胎盤におけるマーカー１８Ａのメチル化レベルについても研究した。正倍数体胎盤のＭＩとＴ１８胎盤のＭＩをそれぞれのＣｐＧ単位において比較するため、マンホイットニー順位和検定を行った（図１３）。マーカー１８Ａのメチル化レベルが正倍数体とＴ１８の胎盤の間で大きく変化しない場合には、正倍数体とＴ１８の母体血漿中における胎児の第１８染色体の量を比較するためにこれを使用できると結論付けた。マーカー１８Ａの標的領域内では、全てのＣｐＧ単位が、正倍数体とＴ１８の胎盤の間で著しく差次的にメチル化されないことが見出された（図１３）。
【０１７２】
酵素消化後の母体血漿中におけるマーカー１８Ａの検出
本発明者らは、出産前および出産後２４時間に得た母体血漿ＤＮＡ中の消化抵抗性のマーカー１８Ａの濃度を分析し、比較した。消化後のサンプル全てにおいて非メチル化ベータアクチン配列が検出されなかったことから、消化は完全であったと示唆される。妊娠第３期において、胎児を出産する前、消化抵抗性マーカー１８Ａ配列の濃度の中央値は８０６コピー／ｍＬであった（ｎ＝１０）。出産後、血漿濃度は、反応あたり３コピーと見積もられるアッセイの検出限界未満に低下した。消化抵抗性マーカー１８Ａ配列の血漿濃度は、胎児を出産する前と後で統計学的に有意に異なっていた（ウィルコクソン符号順位検定、Ｐ値＝０．００２）（図１４Ａ）。
【０１７３】
さらに、出産前の消化抵抗性マーカー１８Ａ配列の血漿濃度は、確立された胎児性遺伝マーカーであるＺＦＹの血漿濃度と有意に相関することが示された（ｎ＝１３、ｒ＝０．９１；Ｐ値＜０．００００１；スピアマン相関）（図１４Ｂ）。これらの結果により、母体血漿中の消化抵抗性マーカー１８Ａ配列は胎児由来であることが示唆された。
【０１７４】
ＥＧＧによる染色体量の分析
胎盤ＤＮＡサンプルにおけるマーカー１８ＡのＺＦＹに対する比率
雄性胎児の妊娠に由来する、妊娠第１期の胎盤ＤＮＡサンプル（５サンプルのＴ１８および５サンプルの正倍数体）を、マーカー１８ＡおよびＺＦＹに対するデュプレックスデジタルＰＣＲアッセイによって分析した。正倍数体およびＴ１８のサンプルにおけるマーカー１８ＡのＺＦＹに対する比率は有意に異なっていた（マンホイットニー順位和検定、Ｐ値＝０．０２３）。正倍数体サンプルについて、マーカー１８ＡのＺＦＹに対する比率の平均±１．９６ＳＤとして定義される正常参照範囲は１．２０〜１．６６であった。Ｔ１８の全ての例で、比率は参照範囲の上限を超えていた（図１５）。
【０１７５】
母体血漿サンプルにおけるマーカー１８ＡのＺＦＹに対する比率
このアプローチにより、母体血漿において非侵襲性にＴ１８を検出することが可能であることを実証するために、本発明者らは、正倍数体の雄性胎児の妊娠から得た２７の母体血漿サンプル、およびＴ１８の雄性胎児の妊娠から得た９サンプルについて分析した。正倍数体の２７例のうち、１８、４、および９例は、それぞれ妊娠第１期、第２期、および第３期から得た。Ｔ１８の例は全て妊娠第１期から得た。正倍数体およびＴ１８群の妊娠期間の中央値は、それぞれ１４．１および１３．３であった。正常参照範囲は０．３４〜３．０４であった（図１６）。この参照範囲に基づいて、正倍数体の２７例のうちの２６例、およびＴ１８の９例のうちの８例は正確に判定され、感度は８８．９％で特異性は９６．３％であった。
【０１７６】
消化コントロールとしてのベータアクチン
酵素により消化した母体血漿サンプルを、胎盤および母体血細胞において全くメチル化されていないが、マーカー１８Ａアンプリコンと同様のＭＳＲＥ制限酵素部位を含む領域を標的とするベータアクチンアッセイを用いて分析することにより、酵素消化の効率を評価した（図１７）。消化した血漿サンプル全てにおいて、ベータアクチン配列は検出されなかった。
【０１７７】
ＩＩＩ．結論
この実施例では、第１８染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーとしての高度にメチル化されたマーカー１８ＡおよびＹ染色体上の胎児性遺伝マーカーとしてのＺＦＹを用いて、母体血漿から胎児の第１８染色体の相対量を推測するためにＥＧＧアプローチが適用可能であることを示した。正倍数体とＴ１８の母体血漿サンプル中のこのような相対的な染色体量をＥＧＧアプローチによって比較することにより、１８トリソミーの非侵襲性の出生前検出が実行可能であることもまた示された。ＥＧＧアプローチを用いる１８トリソミーの非侵襲性の出生前検出は、母体血漿中の胎児の参照染色体の量を特異的に測定するために、具体例としてこの実施例で用いたＹ特異的な胎児性遺伝マーカーを、参照染色体上にある父親より受け継いだＳＮＰなどのその他の胎児性遺伝マーカーに置き換えることにより、一般的集団においてより多くの胎児を網羅するように拡大することができる。
【実施例４】
【０１７８】
胎児の１３トリソミー検出に対するエピジェネティック−遺伝的染色体量によるアプローチ
この実施例は、胎児の１３トリソミー（Ｔ１３）検出に対するエピジェネティック−遺伝的（ＥＧＧ）染色体量によるアプローチの適用を示すものである。このＥＧＧアプローチは、第１３染色体上に位置する胎児性エピジェネティックマーカーおよび参照染色体上に位置する胎児性遺伝マーカーそれぞれに関わる。胎児性エピジェネティックマーカーは、好ましくはマーカー１３Ａ［ゲノム位置chr13:105941431-105941818、Human Genome March 2006アセンブリ(hg18)により定義される］である。これは、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法およびタイリングアレイ分析によって同定された通り（米国特許出願第６１／３０８，５７８号に記載される）、ＥＦＮＢ２（エフリンＢ２）遺伝子の３’末端に位置する１８８ｂｐの領域である。しかしながらこの胎児性エピジェネティックマーカーは、上記の遺伝子座、すなわちchr13:105941431-105941818の１００ｋｂ上流または下流の範囲に位置する、シトシン含有ＤＮＡゲノム領域のいずれかであってもよい。さらにこの胎児性エピジェネティックマーカーは、母体血漿中において母体の第１３染色体から胎児のものを区別する、異なったエピジェネティック特性（ＤＮＡのメチル化レベル）を有するシトシン含有ＤＮＡゲノム領域のいずれかであってもよい。
【０１７９】
母体血漿中の胎児性遺伝マーカーは、好ましくはＹ染色体上のＹ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子内に位置する領域である。しかしながらこの胎児性遺伝マーカーは、一塩基多型（ＳＮＰ）および挿入／欠失（indel）多型を含む、胎児とその母親との間のいずれの遺伝的な相違であってもよい。
【０１８０】
材料および方法
サンプルの採取
サンプルは、プリンスオブウェールズ病院（Prince of Wales Hospital）、香港、の産科および婦人科、またはKing's College Hospital、ロンドン、英国、のHarris Birthright Research Centre for Fetal Medicineに通院する妊婦から採取した。全ての妊婦はインフォームドコンセントを得て採用された。本研究はそれぞれの機関の審査委員により承認された。
【０１８１】
絨毛膜絨毛サンプル（ＣＶＳ）を、妊娠第１期および第２期における通常の出生前診断において採取した。正倍数体およびＴ１３の各例の染色体の状態を完全な核型分析によって確認した。全ての被験者から、母体末梢血サンプル（ＥＤＴＡチューブ内に１２ｍＬ）を採取した。英国からのＣＶＳは採取後に凍結し、ドライアイスによりバッチで香港へ送った。
【０１８２】
この研究では、５例のＴ１３（妊娠第１期から４例、および第２期から１例）および１０例の正倍数体（全て妊娠第１期から）を採用した。
【０１８３】
サンプル処理
末梢血サンプルを、既報の二重遠心分離プロトコルによって処理した（Chiu et al., Clin Chem 2001;47:1607-13）。血液細胞部分を２，５００ｇで再遠心し、いずれの残余の血漿も除去した。末梢血液細胞からのＤＮＡを、QIAamp ＤＮＡ血液ミニキットの血液および体液プロトコルにより抽出した。
【０１８４】
ＣＶＳおよび胎盤からのＤＮＡは、QIAampＤＮＡミニキット（Qiagen）を製造者の組織プロトコルに従って用いることにより抽出した。
【０１８５】
胎盤および母体血細胞におけるマーカー１３Ａのメチル化状態の分析
クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングによるＤＮＡメチル化の分析
マーカー１３Ａのメチル化状態を、クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングにより、６組の胎盤組織および母体血細胞において分析した。EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を製造者の指示に従って用いることにより、抽出したＤＮＡの亜硫酸水素塩による変換を行った。亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１３Ａ領域を標的とした順方向プライマー５’−ａｇｇａａｇａｇａｇＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’および逆方向プライマー５’−ｃａｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｇｇｃｔＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴ−３’によるＰＣＲ増幅に供した。このプライマーセットはEpityperアッセイによる分析のために設計したが、亜硫酸水素塩によるシークエンス分析のために、亜硫酸水素塩によって変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅にも適用した。ＰＣＲ条件については、表１３Ａに要約する。続いて、pGEM-T Easy クローニングキット（Promega）を製造者の指示に従って用い、ＰＣＲ産物をプラスミドベクター内へＴＡクローニングした。クローニングは、大腸菌株JM109（Promega）により行った。次にクローンからの挿入断片を、Ｔ７およびＳＰ６プロモータープライマー（Promega）を製造者の指示に従って用いることによって増幅した（反応条件を、表１３ＡのコロニーＰＣＲアッセイの副題の下に要約する）。ＰＣＲ産物を次に、BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 キット（Applied Biosystems）を製造者の指示に従って用いるシークエンシング反応に供した（反応条件を、表１３Ａのシークエンシング反応の副題の下に要約する）。次にＤＮＡをエタノール沈殿し、１０μＬのＨｉ−Ｄｉホルムアミドに再懸濁して、3100 DNA Analyzer（Applied Biosystems）によりシークエンシングした。シークエンスデータは、SeqScape v2.5ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて分析した。本発明者らは、非ＣｐＧシトシン残基における変換率を調べることにより、各クローンの亜硫酸水素塩による変換が＞９９％であることを確保した。
【０１８６】
各ＣｐＧ部位におけるＭＩは、各サンプルについてメチル化クローンの数を総クローン数で割ることにより算出し、本発明者らの実験では８であった。各ＣｐＧ部位について、２つの生物学的複製の平均ＭＩを算出した。メチル化部位の頻度は、各サンプルにわたり、スコア化したクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって示した。
【０１８７】
Ｔ１３および正倍数体の胎盤におけるマーカー１３Ａのメチル化状態の分析
EpityperアッセイによるＤＮＡメチル化の分析
標準的なMassCLEAVEプロトコル（Sequenom）（Ehrich et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:15785-90）に従って、Epityperアッセイを行った（プロトコルに含まれる個別の反応に対する条件の詳細を図１３Ｂに要約する）。簡単に述べると、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１３Ａ領域を標的とした順方向プライマー５’−ａｇｇａａｇａｇａｇＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’および逆方向プライマー５’−ｃａｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｇｇｃｔＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴ−３’によるＰＣＲ増幅に供した。このプライマーセットにおいて、Ｔ７プロモータータグを逆方向プライマーの３’末端に付加し、１０ベースタグを該プライマーの５’末端に付加して、順方向と逆方向プライマーの間で融解温度が同等になるようにした。抽出したＤＮＡを、EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を用いる亜硫酸水素塩による変換に製造者の指示に従って供し、ＰＣＲによって増幅した。次にＰＣＲ産物を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡにin vitro転写し、リボヌクレアーゼＡにより、ＡまたはＧ残基を有する塩基を特異的に切断した。切断反応によってＣｐＧを含む断片、またはＣｐＧ単位が生成し、これらの大きさはＣｐＧ部位のメチル化状態（すなわち亜硫酸水素塩による変換後の、メチル化および非メチル化ＣｐＧそれぞれに対するＣｐＧまたはＴｐＧ）に依存するであろう。次に産物を精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光光度計（MassARRAY Analyzer Compact）によって分離した。各ＣｐＧ単位のメチル化指数（ＭＩ）は、メチル化産物のピーク高さをメチル化および非メチル化産物のピーク高さの和で割ることによって算出した。
【０１８８】
ＥＧＧによる染色体量の分析
本発明者らは、正倍数体ならびにＴ１３の妊娠から得た胎盤組織（ＣＶＳ）における、第１３染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーであるマーカー１３Ａの相対量と、Ｙ染色体上の胎児性遺伝マーカーであるＺＦＹの相対量を比較するために、ＥＧＧアプローチを導入した。
【０１８９】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＲＥ）による消化
胎盤ＤＮＡを消化するために、３タイプのＭＳＲＥ、すなわちＡｃｃＩ、ＮｌａＩＶ、およびＨｐａＩＩ（FastDigest（登録商標）酵素、Fermentas Life Sciences）を用いた。各サンプルにつき、５０ｎｇの胎盤ＤＮＡを各２ＦＤＵの上記酵素と共に１ＸFastDigest（登録商標）緩衝液中で３７℃２時間インキュベートし、続いて６５℃２０分で酵素の不活性化を行った。
【０１９０】
デジタルＰＣＲ分析のアッセイ設計および反応条件
消化抵抗性のマーカー１３ＡおよびＺＦＹをそれぞれ増幅するために、２つのモノプレックスデジタルＰＣＲアッセイを開発した。デジタルＰＣＲ分析の基礎については既報である（Lo et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104:13116-21; Tong et al. Clin Chem 2010; 56: 90-8）。
【０１９１】
ウェルあたりの反応量は５μＬで、最終濃度は、各標的に対するそれぞれのプライマーおよびプローブ濃度について１ｘ TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）とした。マーカー１３Ａについての反応は、２５０ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブ（Integrated DNA Technologies）ならびに各９００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）を含んだ。ＺＦＹについての反応は、１００ｎＭのTaqMan（登録商標）プローブならびに各３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（Integrated DNA Technologies）を含んだ。マーカー１３Ａに対するプローブはレポーターＦＡＭで標識したが、ＺＦＹに対するプローブはレポーターＶＩＣで標識した（表１４）。各標的に対するデジタルＰＣＲ反応の総数は１９２とした。
【０１９２】
実験は、7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）において行った。反応は５０℃２分で開始し、次に９５℃１０分、９５℃１５秒をマーカー１３ＡおよびＺＦＹそれぞれについて５５および４５サイクル、および６０℃１分で続けた。蛍光データは、SDS 2.3 ソフトウェアの「Absolute Quantification」アプリケーション（Applied Biosystems）により収集した。
【０１９３】
統計解析
統計解析はSigmaStat 3.0ソフトウェア（ＳＰＳＳ）により行った。
【０１９４】
ＩＩ．結果
マーカー１３Ａは有望な胎児性エピジェネティックマーカーである
以前の研究により、胎盤と母体血細胞の間で差次的にメチル化されるゲノム領域は、母体血漿中の胎児性エピジェネティックマーカーへと開発できる可能性のあることが示された（Chim et al. Clin Chem 2008; 54:500-11; Tong et al. Clin Chem 2010; 56:90-8）。クローニングと亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果から、マーカー１３Ａは正倍数体の胎盤で主にメチル化されているが（ｎ＝６）、母体血細胞では基本的にメチル化されていない（ｎ＝６）ことが明らかになった（図１８）。胎盤および母体血細胞における平均メチル化指数は、それぞれ０．７８および０．００である。
【０１９５】
本発明者らはまた、Epityperにより、正倍数体（ｎ＝５）およびＴ１３（ｎ＝５）胎盤におけるマーカー１３Ａのメチル化レベルについても研究した。５サンプルの正倍数体胎盤のＭＩと５サンプルのＴ１３胎盤のＭＩをそれぞれのＣｐＧ単位において比較するため、マンホイットニー順位和検定を行った（図１９）。マーカー１３Ａのメチル化レベルが正倍数体とＴ１８の胎盤の間で大きく変化しない場合には、正倍数体とＴ１８の胎児の組織または母体血漿における胎児の第１３染色体の量を比較するためにこれを使用できると結論付けた。マーカー１３Ａの標的領域内では、３つのＣｐＧ単位が、正倍数体とＴ１３の胎盤の間で著しく差次的にメチル化されないことが見出された（図１９）。従って本発明者らは、これら３個のＣｐＧ単位を標的とすることにより、次に行うこれらのデジタルＰＣＲアッセイを設計した。
【０１９６】
胎盤ＤＮＡサンプルを用いた、ＥＧＧによる染色体量の分析
雄性胎児の妊娠に由来する胎盤ＤＮＡサンプル（５サンプルのＴ１３および１０サンプルの正倍数体）を、マーカー１３ＡおよびＺＦＹに対するそれぞれのモノプレックスデジタルＰＣＲアッセイによって分析した。正倍数体およびＴ１３のサンプルにおけるマーカー１３ＡのＺＦＹに対する比率は有意に異なっていた（マンホイットニー順位和検定、Ｐ値＝０．０２３）。正倍数体サンプルについて、マーカー１３ＡのＺＦＹに対する比率の平均±１．９６ＳＤとして定義される正常参照範囲は１．４０〜２．１０であった。１例を除くＴ１３の全ての例で、比率は参照範囲の上限を超えていた（図２０）。
【０１９７】
ＩＩＩ．結論
この実施例では、第１３染色体上の胎児性エピジェネティックマーカーとしての高度にメチル化されたマーカー１３ＡおよびＹ染色体上の胎児性遺伝マーカーとしてのＺＦＹを用いて、妊娠第１期および第２期の間に得た胎盤組織における胎児の第１３染色体の量を推測するためにＥＧＧアプローチが適用可能であることを示した。正倍数体とＴ１３の胎盤組織においてこのような相対的染色体量を比較することにより、１３トリソミーを検出することが可能である。このアプローチは、母体血漿中の胎児性第１３染色体の相対的染色体量を推測し、１３トリソミーを非侵襲性に検出するために適用できる可能性がある。
【０１９８】
本出願に引用される全ての特許、特許出願、およびGenBank受入番号を含むその他の出版物は、あらゆる目的のために、その全体が参照により取り込まれる。
【０１９９】
配列表
配列番号１ dbSNP のrs6636 (ウェブサイト ncbi.nlm.nih.gov/snpより取得)
GAAGATTTTC CAAACTACTT TATGTCATTT AGCTTCTATT TTCTGAAGGG CTTTCTTTGG
TGCCATGTAC TCAGATCAGT CAGTTGACTG AAAGATGATC ATGTTTTCTT CGTAAAGATT
TAAGCAATTG GCAACTACAA AGACATTATT TTCTTACTGT TCTATATCAT GTACTGTTGC
TGACATTACA AAAAGGGTCT GGAAGGGAAA CCGTGTCACT GTTTTATCTT TTTTCTTTAA
AATACAAAAG TATCCCAACT AATCATTTAT TATGGTCAGC TTGTTTTACA TGTCCCCTAT
[C/G]
ATGAGAAATG CTATCAACAT CTGTGATTTC TAAGAGTCTT ACCAAATTGT TACTTTAATT
CTTGTGTCCT GCTGAGTGGT TTTTCTTTTA AAATACCATT TTTATCACCC TGTGGCACTG
GGTGTGTTAC TGCGATTACA CTGATGATTC TGAGCTGTGC TTCTTCAAGT AGCTCAGTTC
TTGCGTTTTA TATTAGGTAA CAGTTTTGTG ATGCTTTTGT GCATTCTTTG TCATCTCTTC
TGAGTTTTCG AATCTGTCAT AAATAAACTT TTTCACTATG CACCTGGTAA CATCTGAGTT
配列番号２  SNP rs6636の１００ｂｐ上流および下流を含むＤＮＡ配列 (ウェブサイトgenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayより取得)
GGAAGGGAAACCGTGTCACTGTTTTATCTTTTTTCTTTAAAATACAAAAG
TATCCCAACTAATCATTTATTATGGTCAGCTTGTTTTACATGTCCCCTAT
[C/G]
ATGAGAAATGCTATCAACATCTGTGATTTCTAAGAGTCTTACCAAATTGT
TACTTTAATTCTTGTGTCCTGCTGAGTGGTTTTTCTTTTAAAATACCATT
【０２００】
[表１]  従来のリアルタイムＰＣＲおよびデジタルＰＣＲアッセイのためのオリゴヌクレオチド配列および特異的なＰＣＲ条件。
【０２０１】
【表１】
2013501514.tif 000003
【０２０２】
[表２]  名称および遺伝子座の位置、プライマー配列、反応条件、ならびに結果を含む、５１のＣＯＢＲＡアッセイに関する情報の一覧。
【０２０３】
【表２−１】
2013501514.tif 000004
【０２０４】
【表２−２】
2013501514.tif 000005
【０２０５】
【表２−３】
2013501514.tif 000006
【０２０６】
【表２−４】
2013501514.tif 000007
【０２０７】
【表２−５】
2013501514.tif 000008
【０２０８】
【表３】
2013501514.tif 000009
【０２０９】
［表４］デジタルＰＣＲ分析に用いたサンプルについての情報。（Ａ）胎盤組織サンプル、（Ｂ）母体血漿サンプル。
【０２１０】
【表４】
2013501514.tif 000010
【０２１１】
各遺伝子座のコピー数、ならびにＨＬＣＳのＲＡＳＳＦ１Ａに対する比率、およびＨＬＣＳのＺＦＹに対する比率を示す。コピー数はポアソン分布のために明細書中の式を用いて補正した。
【０２１２】
［表５］ＨＬＣＳ、ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰ、およびベータアクチンアッセイのためのオリゴヌクレオチド配列。
【０２１３】
【表５】
2013501514.tif 000011
【０２１４】
［表６］（Ａ）モック消化した胎盤ＤＮＡ、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化した胎盤ＤＮＡサンプルにおける、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する比率。１Ｔ、妊娠第１期；２Ｔ、妊娠第２期；３Ｔ、妊娠第３期。
【０２１５】
【表６】
2013501514.tif 000012
【０２１６】
［表７］（Ａ）モック消化した胎盤ＤＮＡ、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化した胎盤ＤＮＡサンプルにおける、ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する比率。１Ｔ、妊娠第１期；２Ｔ、妊娠第２期；３Ｔ、妊娠第３期。
【０２１７】
【表７】
2013501514.tif 000013
【０２１８】
［表８］ベータアクチンのリアルタイムｑＰＣＲ分析により評価した消化効率。（Ａ）ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｃに対する比率分析のためのサンプル。（Ｂ）ＨＬＣＳのＴＭＥＤ８−Ｇに対する比率分析のためのサンプル。１Ｔ、妊娠第１期；２Ｔ、妊娠第２期；３Ｔ、妊娠第３期。
【０２１９】
【表８】
2013501514.tif 000014
【０２２０】
［表９］ＴＭＥＤ８−Ｃ／Ｇ  ＳＮＰアッセイの特異性。胎盤の遺伝子型をサンプル番号の後に示す。コピー数はポアソン分布のために補正した。（Ａ）ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｃの二本鎖アッセイ。（Ｂ）ＨＬＣＳおよびＴＭＥＤ８−Ｇの二本鎖アッセイ。
【０２２１】
【表９】
2013501514.tif 000015
【０２２２】
［表１０］マーカー１８Ａおよびベータアクチンに対する、Epityperおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンス分析に関する、亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマー配列。
【０２２３】
【表１０】
2013501514.tif 000016
【０２２４】
［表１１Ａ］亜硫酸水素塩によるシークエンス分析の反応条件。
【０２２５】
【表１１Ａ】
2013501514.tif 000017
【０２２６】
［表１１Ｂ］Epityper分析の反応条件。
【０２２７】
【表１１Ｂ】
2013501514.tif 000018
【０２２８】
[表１２]マーカー１８Ａ、ＺＦＹ、およびベータアクチンのｑＰＣＲ／デジタルＰＣＲアッセイのためのオリゴヌクレオチド配列。
【０２２９】
【表１２】
2013501514.tif 000019
【０２３０】
[表１３Ａ]亜硫酸水素塩によるシークエンス分析の反応条件。
【０２３１】
【表１３Ａ】
2013501514.tif 000020
【０２３２】
[表１３Ｂ] Epityper分析の反応条件。
【０２３３】
【表１３Ｂ】
2013501514.tif 000021
【０２３４】
[表１４]マーカー１３ＡおよびＺＦＹそれぞれのデジタルＰＣＲアッセイのためのオリゴヌクレオチド配列。
【０２３５】
【表１４】
2013501514.tif 000022
【図１】
2013501514.tif 000023
【図２】
2013501514.tif 000024
【図３】
2013501514.tif 000025
【図４】
2013501514.tif 000026
【図５】
2013501514.tif 000027
【図６】
2013501514.tif 000028
【図７】
2013501514.tif 000029
【図８】
2013501514.tif 000030
【図９】
2013501514.tif 000031
【図１０】
2013501514.tif 000032
【図１１】
2013501514.tif 000033
【図１２】
2013501514.tif 000034
【図１３】
2013501514.tif 000035
【図１４】
2013501514.tif 000036
【図１５】
2013501514.tif 000037
【図１６】
2013501514.tif 000038
【図１７】
2013501514.tif 000039
【図１８】
2013501514.tif 000040
【図１９】
2013501514.tif 000041
【図２０】
2013501514.tif 000042
【配列表】
2013501514000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月13日(2012.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、妊婦に担持されている胎児の染色体異数性を検出するための方法：
（ａ）妊婦から採取された生体サンプル中の胎児由来のメチル化マーカーの量を決定する工程。ここでメチル化マーカーは染色体異数性に関連する染色体上、または染色体異数性に関連する染色体の部位内に位置し、かつ胎児由来のメチル化マーカーは、差次的なＤＮＡメチル化によって、母体由来のその対応物から区別される；
（ｂ）サンプル中の胎児由来の遺伝マーカーの量を決定する工程。ここで遺伝マーカーは参照染色体上に位置し、かつ胎児由来の遺伝マーカーは、ポリヌクレオチド配列における相違、または遺伝マーカーが母体ゲノムに存在しないことによって、サンプル中の母体由来のその対応物から区別される；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から得られた量の比率を決定する工程；および
（ｄ）前記比率を標準コントロールと比較する工程。ここで前記比率が標準コントロールよりも高いかまたは低い場合に、胎児における染色体異数性の存在が示唆される。
【請求項２】
胎児由来のメチル化マーカーが胎盤に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
母体由来の対応物が妊婦の血液細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胎児由来のメチル化マーカーが母体由来のその対応物よりも高度にメチル化されているか、胎児由来のメチル化マーカーが母体由来のその対応物よりも低度にメチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが母体の全血、血清、血漿、尿、羊水、生殖器洗浄液、胎盤組織サンプル、絨毛膜絨毛サンプルであるか、または母体血から分離された胎児の細胞を含むサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが胎児の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
メチル化マーカーがホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）遺伝子の一部であるか、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）遺伝子に近接するか、ＨＬＣＳ遺伝子の推定プロモーターであるか、または、マーカー１８Ａもしくはマーカー１３Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを差次的に修飾する試薬でサンプルを処理することを含む、請求項１に記載の方法であって、
試薬が、
（ｉ）亜硫酸水素塩、またはメチル化状態に基づいてＤＮＡに結合するタンパク質もしくは化学物質、
（ｉｉ）メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素、または
（ｉｉｉ）非メチル化ＤＮＡを優先的に切断する酵素、
を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、遺伝マーカーが、
（ｉ）母体ゲノムに存在しないもの、
（ｉｉ）Ｙ染色体上に位置するもの、
（ｉｉｉ）Ｙ連鎖ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）遺伝子、
（ｉv）胎児由来であって、遺伝的多型性によって母体由来の遺伝マーカーから区別されるもの、
（ｖ）胎児由来であって、一塩基多型（ＳＮＰ）、単純タンデムリピート多型、または挿入−欠失多型を含む遺伝的多型性によって母体由来の遺伝マーカーから区別されるもの、または
（ｖｉ）ＴＭＥＤ８遺伝子内のＳＮＰ  ｒｓ６６３６、
を含む、方法。
【請求項１０】
複数のメチル化マーカーまたは遺伝マーカーが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）または（ｂ）が、メチル化マーカーもしくは遺伝マーカーの増幅を含む、請求項１に記載の方法であって、増幅が、
（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、
（ｉｉ）核酸配列に特異的な増幅、または
（ｉｉｉ）メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、工程（ａ）または（ｂ）が、
（ｉ）分子計数により行われるか、
（ｉｉ）デジタルポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、アレイキャプチャー、核酸配列に基づく検出、大量に平行して行うゲノムシークエンシング、単一分子のシークエンシング、またはカラーコードプローブ対によるポリヌクレオチドの多重検出を含むか、または、
（ｉｉｉ）マススペクトロメトリー、またはマイクロアレイ、蛍光プローブ、もしくは分子標識へのハイブリダイゼーションを含むか、
である、方法。
【請求項１３】
染色体異数性に関連する染色体が、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、またはＸ染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記比率が、標準コントロールより少なくとも１標準偏差まで高いこと、標準コントロールより少なくとも１標準偏差まで低いこと、標準コントロールより少なくとも２標準偏差まで高いこと、標準コントロールより少なくとも２標準偏差まで低いこと、標準コントロールより少なくとも３標準偏差まで高いこと、または、標準コントロールより少なくとも３標準偏差まで低いことが、胎児に染色体異数性のあることを示す、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】ＨＬＣＳ領域Ｂ２のクローニングおよび亜硫酸水素塩によるシークエンシングの結果を示した図である。個々のＣｐＧ部位は、転写開始点（位置０）に対して定義したヌクレオチドの位置により、最初から通し番号を付けた。最初のＣｐＧ部位（−２３２）は、ＵＣＳＣゲノムブラウザのHuman March 2006 (hg18)アセンブリのchr21: 37275031 (逆鎖)に相当する。続く各列は、クローニングによって調べられた単一ＤＮＡ分子内のＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を示す。黒丸および白丸は、それぞれメチル化および非メチル化ＣｐＧ部位を表す。２１トリソミー、正常第１期、および正常第３期の胎盤組織サンプルからのクローンを、それぞれ「Ｔ２１  ＰＬＮ」、「正常ＰＬＮ  第１」、および「正常ＰＬＮ  第３」の接頭辞により標識し、母体血細胞からのクローンを「ＭＢＣ」の接頭辞により標識した。異なる妊婦由来の胎盤および母体血細胞は、接頭辞に続くサンプル番号によって同定した。
【図２】遺伝子量実験のデジタルリードアウトを示した図である。ＨＬＣＳおよびＲＡＳＳＦ１Ａアッセイはモノプレックスで行い、ＺＦＸ／Ｙアッセイはデュプレックスの様式で行った。各チップを１２のパネルに分け、各パネルは７６５の反応ウェルに区分した。標的分子を有する反応ウェルを赤または青のカラードットで示し、増幅のみられない反応ウェルを灰色のカラードットで示す。ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＺＦＹを赤で示す。ＺＦＸを青で示す。（Ａ）酵素により消化した正倍数体の胎盤ＤＮＡサンプルに対するデジタルＰＣＲの結果の図示である。各サンプルについて４パネルを計算に入れると、各チップは３サンプルを収容することになる。（Ｂ）酵素により消化した正倍数体の母体血漿ＤＮＡサンプルに対するデジタルＰＣＲの結果の図示である。サンプルからのＤＮＡは、１２パネル全てに均等に分配した。母体血漿の分析については、ＺＦＹ（胎児ＤＮＡ）のコピー数が、ＺＦＸ（胎児プラス母体ＤＮＡ）のそれよりもかなり少ないことに留意されたい。
【図３】正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプルの遺伝子量の比較を示した図である。（Ａ）ＲＡＳＳＦ１Ａに対するＨＬＣＳの比率。（Ｂ）ＺＦＹに対するＨＬＣＳの比率。正常の参照範囲を点線で示す。
【図４】正倍数体および２１トリソミーの母体血漿ＤＮＡサンプルの遺伝子量の比較を示した図である。各サンプルについて、ＺＦＹに対するＨＬＣＳの比率をプロットした。正常の参照範囲を点線で示す。
【図５】４種のデジタルＰＣＲアッセイ（ＨＬＣＳ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＺＦＹ、およびＺＦＸ：配列番号３、４、５および６）のゲノム配列を示した図である。ＵＣＳＣゲノムブラウザのMarch 2006ヒト参照配列（NCBI Build 36.1）における染色体位置を示す。下線で示したヌクレオチドは酵素認識部位を表す。大文字による太字のヌクレオチドは、順方向および逆方向プライマーを表す。小文字による太字のヌクレオチドは、ＭＧＢ（minor groove binding）プローブ配列を表す。
【図６】（Ａ）ＨＬＣＳ領域Ｂ２、および（Ｂ）Ｃ２１またはｆ８１についての、ＣＯＢＲＡの結果のゲル電気泳動を示した図である。２サンプルの２１トリソミーの胎盤（Ｔ２１  ＰＬＮ）、２サンプルの第１期正常胎盤（正常ＰＬＮ  第１）、２サンプルの第３期正常胎盤（正常ＰＬＮ  第３）、および２サンプルの第１期母体血細胞（ＭＢＣ）を分析した。ＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ酵素と共に（＋）、または酵素なしで（−）インキュベートした。ＤＮＡのメチル化は、サイズがより小さい消化産物の出現によって検出した。ゲル電気泳動において、１ｋｂラダー（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）（Ｍ）を用いた。
【図７】４サンプルの胎盤組織および８サンプルの母体血細胞から得られたＨＬＣＳ  ＤＮＡの定量を示した図である。サンプルのメチル化指数は、酵素消化後のＨＬＣＳのコピー数を、モック消化により得られたコピー数で割ることによって算出した。「正常ＰＬＮ」は胎盤ＤＮＡを表し、「ＭＢＣ」は母体血細胞ＤＮＡを表す。
【図８】血漿における産後のクリアランスを示した図である。母体血漿サンプル中の（Ａ）制限酵素消化による（＋）、または（Ｂ）制限酵素消化なしの（−）、ＨＬＣＳの検出。「前」は出産前の血漿サンプルを表し、「後」は出産後の血漿サンプルを表す。同一被験者に由来する対のサンプルは、線で結ばれた同一のシンボルによって示す。
【図９】（Ａ）モック消化による、ＴＭＥＤ８−Ｃに対するＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化による、ＴＭＥＤ８−Ｃに対するＨＬＣＳの比率を決定することによる、正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１０】（Ａ）モック消化による、ＴＭＥＤ８−Ｇに対するＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＢｓｔＵＩ消化による、ＴＭＥＤ８−Ｇに対するＨＬＣＳの比率を決定することによる、正倍数体および２１トリソミーの胎盤組織ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１１】（Ａ）ＴＭＥＤ８−Ｃ対立遺伝子に対する高度メチル化ＨＬＣＳの比率、および（Ｂ）ＴＭＥＤ８−Ｇ対立遺伝子に対する高度メチル化ＨＬＣＳの比率を決定することによる、ＢｓｔＵＩにより消化した正倍数体および２１トリソミーの母体血漿ＤＮＡサンプル中の染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【図１２】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより決定した、６対の第１期正倍数体胎盤および母体血細胞におけるマーカー１８ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。各サンプルについて全８クローンをスコア化した。メチル化部位を黒丸で表し、非メチル化部位を白丸で表す。各ＣｐＧ部位におけるメチル化指数（ＭＩ）を、各ＣｐＧ部位のクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって得た。メチル化部位の頻度は、各サンプルについてクローン化されたＣｐＧ部位の総数に対するクローン化されたメチル化ＣｐＧ部位の数によって得た。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼによる認識部位の位置を、ＣｐＧ部位のゲノムの位置それぞれの隣に示した。ゲノムの位置は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（genome.ucsc.edu）のHuman Genome March 2006 (hg18)アセンブリに従って定義した。
【図１３】Epityperアッセイにより分析した、正倍数体（ｎ＝６）およびＴ１８（ｎ＝６）胎盤中のマーカー１８ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。Ｔ１８および正倍数体の胎盤は全て第１期に取得した。マンホイットニー順位和検定を用い、各ＣｐＧ単位において、正倍数体のケースのメチル化指数（ＭＩ）をＴ１８のケースと比較した。
【図１４】母体血漿中の、消化抵抗性マーカー１８Ａの配列の特性を示した図である。（Ａ）胎児の出産前および出産後の、母体血漿中の消化抵抗性マーカー１８ＡのＤＮＡ濃度。（Ｂ）雄性胎児を有する妊婦における、確立された胎児の遺伝マーカーであるＺＦＹの濃度に対する、消化抵抗性マーカー１８ＡのＤＮＡ濃度の相関。
【図１５】正倍数体（ｎ＝５）および１８トリソミー（Ｔ１８）（ｎ＝５）の胎盤ＤＮＡサンプルにおける、Ｙ染色体（ＺＦＹ）に対する第１８染色体（マーカー１８Ａ）の相対量を示した図である。正常参照範囲（平均±１．９６ＳＤ）を点線で表す。
【図１６】正倍数体（ｎ＝２７）および１８トリソミー（Ｔ１８）（ｎ＝９）の母体血漿サンプルにおける、Ｙ染色体（ＺＦＹ）に対する胎児の第１８染色体（マーカー１８Ａ）の相対量を示した図である。正常参照範囲（平均±１．９６ＳＤ）を点線で表す。
【図１７】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより決定した、３対の第１期正倍数体胎盤および母体血細胞におけるベータアクチン遺伝子の領域のＤＮＡメチル化レベルを示した図である。亜硫酸水素塩シークエンシングデータの説明については、図１２を参照されたい。この領域は、酵素消化の効率を調べるためのコントロールアッセイの開発に用いられた。
【図１８】クローン化亜硫酸水素塩シークエンシングにより分析した、正倍数体胎盤（ｎ＝６）および母体血細胞（ｎ＝６）におけるマーカー１３ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。全てのサンプルは第１期に取得した。各サンプルについて全８クローンをスコア化した。メチル化部位を黒丸で表し、非メチル化部位を白丸で表す。各ＣｐＧ部位におけるメチル化指数（ＭＩ）を、各ＣｐＧ部位のクローンの総数に対するメチル化クローンの数によって得た。メチル化部位の頻度は、各サンプルについてクローン化されたＣｐＧ部位の総数に対するクローン化されたメチル化ＣｐＧ部位の数によって得た。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼによる認識部位の位置を、ＣｐＧ部位のゲノムの位置それぞれの次に標識した。ゲノムの位置は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（genome.ucsc.edu）のHuman Genome March 2006 (hg18)アセンブリに従って位置付けた。
【図１９】Epityperアッセイにより分析した、正倍数体（ｎ＝５）およびＴ１３（ｎ＝５）胎盤中のマーカー１３ＡのＤＮＡメチル化レベルを示した図である。４サンプルの１３トリソミー（Ｔ１３）胎盤は第１期に取得したが、１サンプルは第２期に取得した。正倍数体の胎盤は全て第１期に取得した。マンホイットニー順位和検定を用い、各ＣｐＧ単位において、正倍数体のケースのＭＩをＴ１３のケースと比較した。
【図２０】ＺＦＹに対する消化抵抗性マーカー１３Ａの比率を決定することにより、正倍数体（ｎ＝１０）および１３トリソミー（Ｔ１３）（ｎ＝５）胎盤ＤＮＡサンプルにおける染色体量の比較を示した図である。正常参照範囲を点線で表す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
胎盤および母体血細胞におけるマーカー１３Ａのメチル化状態の分析
クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングによるＤＮＡメチル化の分析
マーカー１３Ａのメチル化状態を、クローニングおよび亜硫酸水素塩を用いたシークエンシングにより、６組の胎盤組織および母体血細胞において分析した。EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を製造者の指示に従って用いることにより、抽出したＤＮＡの亜硫酸水素塩による変換を行った。亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１３Ａ領域を標的とした順方向プライマー５’−ａｇｇａａｇａｇａｇＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’ （配列番号７）および逆方向プライマー５’−ｃａｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｇｇｃｔＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴ−３’ （配列番号８）によるＰＣＲ増幅に供した。このプライマーセットはEpityperアッセイによる分析のために設計したが、亜硫酸水素塩によるシークエンス分析のために、亜硫酸水素塩によって変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅にも適用した。ＰＣＲ条件については、表１３Ａに要約する。続いて、pGEM-T Easy クローニングキット（Promega）を製造者の指示に従って用い、ＰＣＲ産物をプラスミドベクター内へＴＡクローニングした。クローニングは、大腸菌株JM109（Promega）により行った。次にクローンからの挿入断片を、Ｔ７およびＳＰ６プロモータープライマー（Promega）を製造者の指示に従って用いることによって増幅した（反応条件を、表１３ＡのコロニーＰＣＲアッセイの副題の下に要約する）。ＰＣＲ産物を次に、BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 キット（Applied Biosystems）を製造者の指示に従って用いるシークエンシング反応に供した（反応条件を、表１３Ａのシークエンシング反応の副題の下に要約する）。次にＤＮＡをエタノール沈殿し、１０μＬのＨｉ−Ｄｉホルムアミドに再懸濁して、3100 DNA Analyzer（Applied Biosystems）によりシークエンシングした。シークエンスデータは、SeqScape v2.5ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて分析した。本発明者らは、非ＣｐＧシトシン残基における変換率を調べることにより、各クローンの亜硫酸水素塩による変換が＞９９％であることを確保した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
Ｔ１３および正倍数体の胎盤におけるマーカー１３Ａのメチル化状態の分析
EpityperアッセイによるＤＮＡメチル化の分析
標準的なMassCLEAVEプロトコル（Sequenom）（Ehrich et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:15785-90）に従って、Epityperアッセイを行った（プロトコルに含まれる個別の反応に対する条件の詳細を図１３Ｂに要約する）。簡単に述べると、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを、マーカー１３Ａ領域を標的とした順方向プライマー５’−ａｇｇａａｇａｇａｇＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’（配列番号７）および逆方向プライマー５’−ｃａｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｇｇｃｔＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴ−３’ （配列番号８）によるＰＣＲ増幅に供した。このプライマーセットにおいて、Ｔ７プロモータータグを逆方向プライマーの３’末端に付加し、１０ベースタグを該プライマーの５’末端に付加して、順方向と逆方向プライマーの間で融解温度が同等になるようにした。抽出したＤＮＡを、EZ DNA メチル化キット（ZymoResearch）を用いる亜硫酸水素塩による変換に製造者の指示に従って供し、ＰＣＲによって増幅した。次にＰＣＲ産物を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡにin vitro転写し、リボヌクレアーゼＡにより、ＡまたはＧ残基を有する塩基を特異的に切断した。切断反応によってＣｐＧを含む断片、またはＣｐＧ単位が生成し、これらの大きさはＣｐＧ部位のメチル化状態（すなわち亜硫酸水素塩による変換後の、メチル化および非メチル化ＣｐＧそれぞれに対するＣｐＧまたはＴｐＧ）に依存するであろう。次に産物を精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光光度計（MassARRAY Analyzer Compact）によって分離した。各ＣｐＧ単位のメチル化指数（ＭＩ）は、メチル化産物のピーク高さをメチル化および非メチル化産物のピーク高さの和で割ることによって算出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
【表１】
2013501514.tif 000043
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
【表２−１】
2013501514.tif 000044
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
【表２−２】
2013501514.tif 000045
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
【表２−３】
2013501514.tif 000046
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
【表２−４】
2013501514.tif 000047
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
【表２−５】
2013501514.tif 000048
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
【表５】
2013501514.tif 000049
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
【表１０】
2013501514.tif 000050
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
【表１２】
2013501514.tif 000051
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
【表１４】
2013501514.tif 000052
【国際調査報告】
2013501514.tif 000053
2013501514.tif 000054
2013501514.tif 000055