(57)【要約】      （修正有）【課題】対象における癌を処置するための同時投与、分離投与、又は順次投与用に適合させた組合せ医薬組成物の提供。【解決手段】ａ）（ｉ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター；並びに、ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを含む組合せ医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌を処置するための同時投与、分離投与、又は順次投与用に適合させた組合せ医薬組成物であって：
ａ）（ｉ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター、；並びに
ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター
を含む組合せ医薬組成物。
【請求項２】
ａ）コンジュゲートが、注射によって用量６０μg/kg以下、好ましくは用量１０μg/kg以下、最も好ましくは用量５μg/kg以下で投与され；
ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体又はそのフラグメントが、用量５００μg/kg以下、好ましくは用量１００μg/kg以下、最も好ましくは用量５０μg/kg以下の注射によって投与される、
請求項１記載の組合せ医薬組成物。
【請求項３】
抗体が、ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２、阻害性ＫＩＲ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２及びＡＤＯＲＡ２Ａのアンタゴニスト、好ましくはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストを含む群より選択される、請求項１又は２のいずれか記載の組合せ医薬組成物。
【請求項４】
抗体が、ＣＴＬ−Ａ４アンタゴニスト、好ましくはイピリムマブ又はチクリムマブ（ticilimumab）より選択される、請求項３記載の組合せ医薬組成物。
【請求項５】
抗体が、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、好ましくは１−７Ｆ９より選択される、請求項３記載の組合せ医薬組成物。
【請求項６】
抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２のアンタゴニスト、好ましくはニボルマブ、Ｍｅｒｃｋ３７４５、ＣＴ−０１１、ランブロリズマブ（lambrolizumab）、ＡＭＰ５１４、ＭＤＸ−１１０５又はＹＷ２４３．５５．Ｓ７０より選択される、請求項３記載の組合せ医薬組成物。
【請求項７】
抗体が、ＣＤ２７６アンタゴニスト、好ましくは８Ｈ９又はＭＧＡ２７１より選択される、請求項３記載の組合せ医薬組成物。
【請求項８】
ａ）コンジュゲートのポリペプチドｉ）及びｉｉ）が、融合タンパク質の状態に共有結合され；
ｂ）該コンジュゲート及び抗体又はそのフラグメントが連結されていない、
請求項１〜７のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物。
【請求項９】
インターロイキン１５が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物。
【請求項１０】
ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物。
【請求項１１】
コンジュゲートが、配列番号１６又は配列番号１７の配列を有する、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる２０１３年８月８日出願の欧州特許出願EP13003964.7の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規な「組合せ医薬組成物」、より具体的には癌を処置するための、特異的ＩＬ−１５スーパーアゴニストと、Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体との組合せに関する。
【０００３】
背景
適応免疫応答は、Ｔ細胞及びＢ細胞と呼ばれる２つの主要クラスのリンパ球の活性化、選択、及びクローン増殖を伴う。抗原と遭遇後に、Ｔ細胞が増殖し、抗原特異的エフェクター細胞に分化する一方で、Ｂ細胞は増殖し、抗体分泌細胞に分化する。
【０００４】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間のいくつかのシグナル伝達事象を要する多段階過程である。Ｔ細胞活性化が起こるために、休止Ｔ細胞に２種類のシグナルが送達されなければならない。
【０００５】
第１のタイプは、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）によって媒介され、免疫応答に特異性を付与する。
【０００６】
共刺激的な第２のタイプは、応答の強度を調節し、Ｔ細胞上の副受容体を介して送達される。これらの受容体は、免疫抑制受容体（例えばＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１、又は阻害性ＫＩＲ）及び共刺激受容体（例えばＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０又はグルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ））を含む。
【０００７】
免疫系の抗腫瘍応答を強化するように、免疫抑制受容体の阻害又は共刺激受容体の活性化に対する治療戦略が開発されている。
【０００８】
実際に組合せ戦略も構想されている。今のところ、被検化合物によっては結果が非常に有害である。
【０００９】
発明の概要
さて、本発明者らは、ＲＬＩという名の本発明者らの特異的化合物と、Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体との組合せが、非常に高い率の腫瘍寛解を招く一方で、そのような寛解は、ＲＬＩ又は免疫抑制受容体アンタゴニスト単独で得られる腫瘍寛解を考慮すると構想できないことを示す。
【００１０】
そのうえ、この相乗作用は、低用量のＲＬＩが低用量の抗ＰＤ１と組み合わされた低用量組合せでも得られた。驚くことに、そして以前の組合せに比べて、この組合せは、強力で相乗的な腫瘍成長阻害を提供した。
【００１１】
この強力な相乗作用は、新しい治療法を構想可能にする。
【００１２】
結果として、本発明は、対象における癌を処置するための同時投与、分離投与、又は順次投与用に適合させた組合せ医薬組成物であって：
１）（ｉ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター；並びに
２）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター
を、対象における癌を処置するための同時使用、分離使用、又は順次使用用の組合せ調製物として含む組合せ医薬組成物に関する。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、癌を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の：
１）上記コンジュゲート、それをコードする核酸配列、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及び
２）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはそのフラグメント、それをコードする核酸配列、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター
を同時に、別々に、又は順次に投与する段階を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＢＩＯＸＥＬＬ抗ＰＤ１を用いてマウス癌モデルにおいて使用された注射プロトコールを示す図である。
【図２】ＣＴ２６モデルにおけるＴＩＬの存在を示す図である。
【図３Ａ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｂ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｃ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｄ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｅ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｆ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図３Ｇ】マウスにおける抗ＰＤ１（ＲＰＭＩ１−１４）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【図４】抗ＰＤ１／ＲＬＩ組合せ処置についてのマウスの生存率を示す図である。
【図５】マウス癌モデルに使用された注射プロトコールを示す図である。
【図６】マウスにおける抗ＰＤ１（ｍＢＡＴ）とＲＬＩとの組合せ療法を示す図である。
【００１５】
詳細な説明
コンジュゲート
用語「インターロイキン１５」は、当技術分野においてその一般的な意味でＩＬ−２と構造的類似性を有するサイトカインを表す（GRABSTEIN et al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994）。このサイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ１５又はＭＧＣ９７２１としても公知である。このサイトカイン及びＩＬ−２は、多くの生物学的活性を共有し、共通のヘマトポイエチン受容体サブユニットに結合することが見出された。したがって、それらは、相互の活性をマイナスに調節しながら同じ受容体をかけて競合し得る。ＩＬ−１５がＴ細胞及びナチュラルキラー細胞の活性化及び増殖を調節すること、並びにＣＤ８＋メモリー細胞数がこのサイトカインとＩＬ２とのバランスによって制御されると示されることが立証されている。実施例に開示されているように、ＩＬ−１５の活性は、ｋｉｔ２２５細胞系を用いてその増殖誘導を決定することによって測定することができる（HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987)。
【００１６】
前記ＩＬ−１５又はその誘導体は、ｋｉｔ２２５細胞系の増殖誘導に対してヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％を有する。
【００１７】
前記インターロイキン１５は、哺乳類インターロイキン１５、好ましくは霊長類インターロイキン１５、より好ましくはヒトインターロイキン１５である。
【００１８】
哺乳類インターロイキン１５は、当業者によって簡単に同定されることができる。一例として、スス−スクロファ（Sus scrofa）（アクセッション番号ＡＢＦ８２２５０）、ラッツス−ノルベキクス（Rattus norvegicus）（アクセッション番号ＮＰ＿０３７２６１）、ムス−ムスクルス（Mus musculus）（アクセッション番号ＮＰ＿０３２３８３）、ボス−タウルス（Bos Taurus）（アクセッション番号ＮＰ＿７７６５１５）、オリクトラグス−クニクルス（Oryctolagus cuniculus）（アクセッション番号ＮＰ＿００１０７５６８５）、オビエス−アリエス（Ovies aries）（アクセッション番号ＮＰ＿００１００９７３４）、フェリス−カツス（Felis catus）（アクセッション番号ＮＰ＿００１００９２０７）、マカカ−ファスシクラリス（Macaca fascicularis）（アクセッション番号ＢＡＡ１９１４９）、ホモ−サピエンス（Homo sapiens）（アクセッション番号ＮＰ＿０００５７６）、マカカ−ムラッタ（Macaca Mulatta）（アクセッション番号ＮＰ＿００１０３８１９６）、カビア−ポルセルス（Cavia porcellus）（アクセッション番号ＮＰ＿００１１６６３００）、又はクロロセブス−サバエウス（Chlorocebus sabaeus）（アクセッション番号ＡＣＩ２８９）由来のインターロイキン１５を引用することができる。
【００１９】
本明細書に使用される用語「哺乳類インターロイキン１５」は、配列番号１のコンセンサス配列を表す。
【００２０】
霊長類インターロイキン１５は、当業者によって簡単に同定されることができる。一例として、スス−スクロファ（アクセッション番号ＡＢＦ８２２５０）、オリクトラグス−クニクルス（アクセッション番号ＮＰ＿００１０７５６８５）、マカカ−ファスシクラリス（アクセッション番号ＢＡＡ１９１４９）、ホモ−サピエンス（アクセッション番号ＮＰ＿０００５７６）、マカカ−ムラッタ（アクセッション番号ＮＰ＿００１０３８１９６）、又はクロロセブス−サバエウス（アクセッション番号ＡＣＩ２８９）由来のインターロイキン１５を引用することができる。
【００２１】
本明細書に使用される用語「霊長類インターロイキン１５」は、配列番号２のコンセンサス配列を表す。
【００２２】
ヒトインターロイキン１５は、当業者によって簡単に同定されることができる、配列番号３のアミノ酸配列を表す。
【００２３】
本明細書に使用される用語「インターロイキン１５誘導体」は、配列番号：１、配列番号２及び配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２．５％（すなわちアミノ酸置換約１０個に対応する）、好ましくは少なくとも９６％（すなわちアミノ酸置換約５個に対応する）、より好ましくは少なくとも９８．５％（すなわちアミノ酸置換約２個に対応する）又は少なくとも９９％（すなわちアミノ酸置換約１個に対応する）の同一率を有するアミノ酸配列を表す。そのような誘導体は、当業者によって、その個人的知識及び本特許出願の教示を考慮して簡単に同定されることができる。そのような誘導体の一例として、国際特許出願であるＰＣＴ国際公開公報第２００９／１３５０３１号に記載されている誘導体を引用することができる。天然アミノ酸が化学修飾アミノ酸によって置き換えられ得ることも了解されている。典型的には、そのような化学修飾アミノ酸は、ポリペプチドの半減期を増大させる。
【００２４】
本明細書に使用される２つのアミノ酸配列間の「同一率」は、比較されるべき２つの配列間で同一のアミノ酸の率であって、該配列の最良のアライメントで得られた率を意味し、この率は、純粋に統計的であり、これら２つの配列間の差は、アミノ酸配列にわたりランダムに分布している。本明細書に使用される「最良のアライメント」又は「最適なアライメント」は、決定された同一率（下記参照）が最高であるアライメントを意味する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、最良のアライメントに従って予め整列されたこれらの配列を比較することによって実現され；この比較は、局所類似領域を同定及び比較するために比較セグメントに関して実現される。比較を行うために最良の配列アライメントは、手作業以外に、SMITH及びWATERMAN（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）によって開発された全体的相同性アルゴリズムを使用することによって、NEDDLEMAN及びWUNSCH（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）によって開発された局地的相同性アルゴリズムを使用することによって、PEARSON及びLIPMAN（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）によって開発された類似性方法を使用することによって、そのようなアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA中のGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA）を使用することによって、MUSCLE多重アライメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって、実現することができる。最良の局地的アライメントを得るために、好ましくはBLOSUM 62行列を用いたBLASTソフトウェアを使用することができる。２つのアミノ酸配列間の同一率は、最適に整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され、アミノ酸配列は、これら２つの配列間の最適なアライメントを得るために、参照配列に対して付加又は欠失を包含することが可能である。同一率は、これら２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較された位置の総数で割り、得られた結果に１００をかけてこれら２つの配列間の同一率を得ることによって計算される。
【００２５】
好ましくは、インターロイキン１５誘導体は、ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストである。当業者は、ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストを簡単に同定することができる。ＩＬ−１５アゴニスト又はＩＬ−１５スーパーアゴニストの一例として、国際特許出願である国際公開公報第２００５／０８５２８２号又はZHUら（J. Immunol., vol.183(6), p:3598-607, 2009）に開示されたものを引用することができる。
【００２６】
なお好ましくは、該ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストは、（配列番号３のヒトＩＬ−１５の配列に関して）Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｙ及びＮ７２Ｐを含む／からなる群より選択される。
【００２７】
本明細書に使用される用語「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＩＬ−１５Ｒαのシグナルペプチドの後の最初のシステイン残基（Ｃ１）から開始し、該シグナルペプチドの後の４番目のシステイン残基（Ｃ４）で終止するドメインを表す。ＩＬ−１５Ｒαの細胞外領域の部分に対応する該スシドメインは、それがＩＬ−１５に結合するために必要である（WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001）。
【００２８】
ＩＬ−１５Ｒα又はその誘導体の該スシドメインは、ヒトインターロイキン−１５に対するヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％を有する。該結合活性は、WEIらに開示される方法によって簡単に決定することができる（上記、2001）。
【００２９】
ＩＬ−１５Ｒαの該スシドメインは、哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、好ましくは霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、より好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインである。
【００３０】
哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者によって簡単に同定されることができる。一例として、ラッツス−ノルベキクス（アクセッション番号ＸＰ＿００２７２８５５５）、ムス−ムスクルス（アクセッション番号ＥＤＬ０８０２６）、ボス−タウルス（アクセッション番号ＸＰ＿００２６９２１１３）、オリクトラグス−クニクルス（アクセッション番号ＸＰ＿００２７２３２９８）、マカカ−ファスシクラリス（アクセッション番号ＡＣＩ４２７８５）、マカカ−ネメストリナ（Macaca nemestrina）（アクセッション番号ＡＣＩ４２７８３）、ホモ−サピエンス（アクセッション番号Ｑ１３２６１．１）、マカカ−ムラッタ（アクセッション番号ＮＰ＿００１１６６３１５）、ポンゴ−アベリイ（Pongo abelii）（アクセッション番号ＸＰ＿００２８２０５４１）、セルコセブス−トルクアツス（Cercocebus torquatus）（アクセッション番号ＡＣＩ４２７８４）、カリトリクス−ジャックス（Callithrix jacchus）（アクセッション番号ＸＰ＿００２７５００７３）、又はカビア−ポルセルス（アクセッション番号ＮＰ＿００１１６６３１４）由来のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインを引用することができる。
【００３１】
本明細書に使用される用語「哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」は、配列番号４のコンセンサス配列を表す。
【００３２】
好ましくは、哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号５のコンセンサス配列を表す。
【００３３】
霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者によって簡単に同定されることができる。一例として、オリクトラグス−クニクルス、マカカ−ファスシクラリス、マカカ−ネメストリナ、ホモーサピエンス、マカカ−ムラッタ、ポンゴ−アベリイ、セルコセブス−トルクアツス、又はカリトリクス−ジャックス由来のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインを引用することができる。
【００３４】
本明細書に使用される用語「霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」という用語は、配列番号６のコンセンサス配列を表す。
【００３５】
好ましくは、霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号７のコンセンサス配列を表す。
【００３６】
ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者によって簡単に同定されることができ、配列番号８のアミノ酸配列を表す。
【００３７】
好ましくは、ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号９を表す。
【００３８】
本明細書に使用される用語「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの誘導体」は、配列番号：４、配列番号５、配列番号６、配列番号：７、配列番号８、及び配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％（すなわち約５個のアミノ酸置換に対応する）、好ましくは少なくとも９６％（すなわち約２個のアミノ酸置換に対応する）、より好ましくは少なくとも９８％（すなわち約１個のアミノ酸置換に対応する）の同一率を有するアミノ酸配列を表す。そのような誘導体は、Ｌ−１５Ｒαのスシドメインの４個のシステイン残基を含み、当業者の一般的知識及び本特許出願の教示を考慮して当業者によって簡単に同定されることができる。化学修飾されたアミノ酸によって天然アミノ酸が置き換えられ得ることも理解されている。典型的には、そのような化学修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を増大させることができる。
【００３９】
好ましい一実施態様によると、コンジュゲートは、（ｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン又はそれらの誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００４０】
ＩＬ−１５Ｒαのヒンジドメインは、スシドメインの後の最初のアミノ残基で開始し、最初の潜在的グリコシル化部位の前の最後のアミノ酸残基で終止するアミノ酸配列として定義される。ヒトＩＬ−１５Ｒαにおいて、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、このＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインの後で、該スシドメインに対してＣ末端位に位置する１４個のアミノ酸からなり、すなわち、該ＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ領域は、前記（Ｃ４）システイン残基の後の最初のアミノ酸で開始し、（標準的な「Ｎ末端からＣ末端」方向で数えて）１４番目のアミノ酸で終止する。
【００４１】
ＩＬ−１５Ｒαの該スシドメイン及びヒンジドメインは、哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、好ましくは霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、より好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインである。
【００４２】
哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者によって簡単に同定されることができる。本明細書に使用される用語「哺乳類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」は、配列番号１０のコンセンサス配列を表す。
【００４３】
霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者によって簡単に同定されることができる。本明細書に使用される用語「霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」は、配列番号１１のコンセンサス配列を表す。
【００４４】
ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者によって簡単に同定されることができる。本明細書に使用される用語「ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」は、配列番号１２のコンセンサス配列を表す。
【００４５】
本明細書に使用される用語「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインの誘導体」は、配列番号：１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９３％（すなわち約５個のアミノ酸置換に対応する）、好ましくは少なくとも９７％（すなわち約２個のアミノ酸置換に対応する）、より好ましくは少なくとも９８％（すなわち約１個のアミノ酸置換に対応する）の同一率を有するアミノ酸配列を表す。そのような誘導体は、Ｌ−１５Ｒαのスシドメインの４個のシステイン残基を含み、当業者によって、本特許出願のその一般的な知識及び教示を考慮して簡単に同定されることができる。天然アミノ酸は、化学修飾されたアミノ酸によって置き換えられ得ることも理解されている。典型的には、そのような化学修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を増大させることができる。
【００４６】
コンジュゲートのポリペプチドｉ）及びｉｉ）の両方が、米国特許第８，１２４，０８４Ｂ２号に開示される複合体のように非共有結合的に連結され得る。該コンジュゲート又は複合体は、適切な量のポリペプチドｉ）を提供すること、適切な量のポリペプチドｉｉ）を提供すること、両方のポリペプチドを適切なｐＨ及びイオン条件で、複合体（すなわちコンジュゲート）を形成させるために十分な時間混合すること、並びに場合により該複合体を濃縮又は精製することによって簡単に得ることができる。複合体（すなわちコンジュゲート）のポリペプチドは、例えば、標準的な方法に従ってペプチド合成装置を使用して；細胞又は細胞抽出物中に各ポリペプチドを別々に発現させ、次にポリペプチドを単離及び精製することによって、形成させることができる。場合により、本発明の治療用ポリペプチド複合体は、ポリペプチドｉ）及びｉｉ）の両方を同じ細胞又は細胞抽出物中に発現させ、次に、例えばリンホカイン部分、リンホカイン受容体部分、又は複合体に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技法を用いて、複合体を単離及び精製することによって形成させることができる。
【００４７】
コンジュゲートのポリペプチドｉ）及びｉｉ）の両方は、また、二官能性タンパク質カップリング剤を使用して、又は融合タンパク質の状態に、共有結合され得る。
【００４８】
二官能性タンパク質カップリング剤は、それらを使用する方法などで当業者に周知であり、例として、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリレン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を含む。
【００４９】
用語「融合タンパク質」は、本来は別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子を繋ぐことによって生み出されたタンパク質を表す。融合タンパク質は、キメラタンパク質としても公知である。この融合遺伝子の翻訳によって、本来のタンパク質のそれぞれに由来する機能的性質を有する単一ポリペプチドが生じる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療法への使用のために組換えＤＮＡ技法によって人工的に生み出される。組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子操作によって生み出されたタンパク質である。これは、典型的には第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次にライゲーション又はオーバーラップ伸長ＰＣＲによってフレーム内に第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列を付加することを伴う。そのＤＮＡ配列は、次に細胞によって単一のタンパク質として発現される。両方の本来のタンパク質の完全配列又はどちらかの一部のみを含むようにそのタンパク質を加工することができる。
【００５０】
好ましい一実施態様では、コンジュゲートは融合タンパク質である。
【００５１】
インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対してＣ末端又はＮ末端位置にある可能性がある。好ましくは、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対してＣ末端位置にある。
【００５２】
インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列及びＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列は、第１の「リンカー」アミノ酸配列によって分離され得る。該第１の「リンカー」アミノ酸配列は、融合タンパク質が適正な二次構造及び三次構造を確実に形成するに足る長さであり得る。
【００５３】
第１のリンカーアミノ酸配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意に影響せずに変動し得る。典型的には、第１のリンカーのアミノ酸配列は、少なくとも１個であるが３０個未満のアミノ酸、例えばアミノ酸２〜３０個、好ましくはアミノ酸１０〜３０個、より好ましくはアミノ酸１５〜３０個、なおより好ましくはアミノ酸１５〜２５個、最も好ましくはアミノ酸１８〜２２個のリンカーを含む。
【００５４】
好ましいリンカーのアミノ酸配列は、コンジュゲートに適正なコンフォメーション（すなわちＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を介して適正なシグナル伝達活性を可能にするコンフォメーション）を採用させるアミノ酸配列である。
【００５５】
最も適切な第１のリンカーのアミノ酸配列は、（１）可動性の伸長コンフォメーションを採用し、（２）融合タンパク質の機能的ドメインと相互作用できる秩序化二次構造を発生する傾向を示さず、（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進することができる最小限の疎水性又は荷電性を有する。
【００５６】
好ましくは、第１のリンカーのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＧｌｎ（Ｑ）を含む群より、最も好ましくはＧｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、及びＳｅｒ（Ｓ）を含む群より選択される中性に近いアミノ酸を含む。
【００５７】
リンカー配列の例は、米国特許第５，０７３，６２７号及び同第５，１０８，９１０号に記載されている。
【００５８】
より格別に本発明に適する例示的な可撓性リンカーは、配列番号：１３（ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ）、配列番号１４（ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）又は配列番号１５（ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ）の配列によってコードされる可動性リンカーを含む。
【００５９】
なお好ましくは、コンジュゲートは、配列番号１６又は配列番号１７の配列を有する融合タンパク質である。
【００６０】
免疫抑制受容体のアンタゴニスト抗体
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に繋がった４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの同一の重（Ｈ）鎖（全長の場合約５０〜７０kDa）及び２つの同一の軽（Ｌ）鎖（全長の場合約２５kDa）を含む四量体に対応する免疫グロブリン分子を表す。軽鎖は、カッパ及びラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュウ、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥとして定義する。各重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲと略記）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡについて３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）；並びにＩｇＭ及びＩｇＥについて４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）からなる。各軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲと略記）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域によって分散された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分することができる。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知の慣例に従う。抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、各軽／重鎖対の可変領域に依存し、主としてＣＤＲによって決定される。
【００６１】
本明細書に使用される用語「抗体」は、本質的にモノクローナル抗体を表す。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体及び／又はヒト化抗体の可能性がある。
【００６２】
有利には、抗体という用語は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのＩｇＧを表す。好ましくは、抗体という用語は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２、より好ましくはＩｇＧ２ａを表す。
【００６３】
「キメラ抗体」は、マウス免疫グロブリン由来の可変領域及びヒト免疫グロブリンの定常領域から構成される抗体を意味する。この変化は、ヒト抗体の定常領域をマウス定常領域で単に置換することで、医薬用途に許容し得るために足る低免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラを生じさせることからなる。そのようなキメラ抗体を産生させるためのいくつかの方法がなお報告されており、したがって、当業者一般的知識の部分を形成している（例えば米国特許第５，２２５，５３９号参照）。
【００６４】
「ヒト化抗体」は、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変化させることによってヒト抗体生殖系列から得られたアミノ酸配列から一部又は完全に構成される抗体を意味する。抗体の可変領域、すなわち最終的にはＣＤＲのヒト化は、当技術分野において今や周知の技法によって行われる。一例として、英国特許出願GB2188638A及び米国特許第５，５８５，０８９号は、置換される唯一の抗体部分が相補性決定領域、すなわち「ＣＤＲ」である組換え抗体が産生される工程を開示している。マウスＣＤＲ並びにヒト可変領域フレームワーク及び定常領域からなる抗体を作製するために、ＣＤＲ移植技法が使用されている（例えばRIECHMANN et al., Nature , vol.332, p: 323-327, 1988を参照されたい）。これらの抗体は、Ｆｃ依存性エフェクター機能に必要であるが、抗体に対する免疫応答を誘起する見込みがずっと低いヒト定常領域を保有する。一例として、可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に無傷なまま残される、又はＣＤＲはヒトゲノム由来の配列と置き換えられさえする。完全ヒト抗体は、免疫系がヒト免疫系に対応するように変化された遺伝子改変マウスにおいて産生される。上述のように、単鎖形態を示すフラグメントを含む、抗体の免疫学的特異的フラグメントを採用することは、本発明の方法における使用にとって十分である。
【００６５】
さらにヒト化抗体は、ヒトフレームワーク及び非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体であって、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一の、すなわち少なくとも約８５又は９０％、好ましくは少なくとも９５％同一の抗体を表す。したがって、ヒト化抗体の全ての部分は、可能性があることにはＣＤＲを除き、１つ以上の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、典型的にはキメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。一例として、ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下のように実施され得る：アミノ酸が以下の範疇に入るとき、使用されるべきヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークのアミノ酸は、ＣＤＲ提供非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークのアミノ酸によって置き換えられ：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸は、その位置でヒト免疫グロブリンにしては普通でなく、一方でドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって典型的であり；（ｂ）アミノ酸の位置はＣＤＲの１つのすぐ隣であり；又は（ｃ）フレームワークのアミノ酸の任意の側鎖原子は、３次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲアミノ酸の任意の原子から約５〜６オングストローム（中心から中心）以内である（QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸のそれぞれ及びドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸が、その位置でヒト免疫グロブリンにしては普通でない場合、そのようなアミノ酸は、その位置でヒト免疫グロブリンに典型的なアミノ酸によって置き換えられる。
【００６６】
本明細書に使用される用語「抗体フラグメント」は、その抗体対応物と同じ抗原と反応する能力のある抗体フラグメントを表す。そのようなフラグメントは、当業者によって簡単に同定されることができ、一例としてＦａｂフラグメント（例えばパパイン消化による）、Ｆａｂ’フラグメント（例えばペプシン消化及び部分還元による）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（例えばペプシン消化による）、Ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分還元及び再集合による）フラグメントを含み、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ；例えば分子生物学的技法による）フラグメントも本発明によって包含される。
【００６７】
そのようなフラグメントは、当技術分野において公知及び／又は本明細書記載の酵素的切断、合成又は組換え技法によって産生させることができる。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して、多様な切断型の状態で産生させることもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の様々な部分を従来技法によって化学的に一緒に繋ぐことができ、又は遺伝子操作技法を用いて隣接タンパク質として調製することができる。
【００６８】
好ましくは、該抗体フラグメントはｓｃＦｖフラグメントである。
【００６９】
用語「Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体」は、ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１、又は阻害性ＫＩＲなどの免疫抑制受容体又はそれらのリガンドのいずれかと結合することでダウンレギュレーションシグナルを防止することにより免疫活性化を促進することによって、この受容体と拮抗する抗体を表す。免疫抑制受容体アンタゴニスト抗体の一例として、ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２、阻害性ＫＩＲ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２及びＡＤＯＲＡ２Ａのアンタゴニストに対応する抗体、好ましくはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体を引用することができる。
【００７０】
ＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５２とも呼ばれる細胞傷害性リンパ球関連抗原）は、１９８７年に発見された（BRUNET et al., Nature, vol.328, p:267-270, 1987）。ＣＴＬ−Ａ４の役割は、主としてＴ細胞活性化を阻害することであり、これは、大規模なリンパ球増殖を患うＣＴＬ−Ａ４欠損マウスにおいて示された（CHAMBERS et al., Immunity, vol.7, p:8855-8959, 1997）。今や、ＣＴＬ−Ａ４の遮断がＴ細胞応答をインビトロ（WALUNAS et al., Immunity, vol.1, p:405-413, 1994）及びインビボ（KEARNEY, J. Immunol, vol.155, p:1032-1036, 1995）で高めること、並びに抗腫瘍免疫を増大させること（LEACH, Science, vol.271, p:1734-1736, 1996）も示されている。ＣＴＬ−Ａ４アンタゴニストに対応する抗体の一例として、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第０１／１４４２４号に開示されるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及び１０Ｄ１とも呼ばれ、MEDAREXから入手可能であり、BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANYによってYERVOY（商標）として販売されている）、国際公開公報第００／３７５０４号に開示されるチクリムマブ（ticilimumab）（１１．２．１及びＣＰ−６７５，２０６としても公知）、並びに国際特許出願である国際公開公報第９８／４２７５２号、国際公開公報第０１／１４４２４号、国際公開公報第２００４／０３５６０７号、及び国際公開公報第２０１２／１２０１２５号、EP1212422及びEP1262193、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第５，９７７，３１８号、同第６，０５１，２２７号、同第６，２０７，１５６号、同第６，６８２，７３６号、同第６，９８４，７２０号、同第７，１０９，００３号、及び同第７，１３２，２８１号に開示されるＣＴＬ−Ａ４抗体も引用することができる。
【００７１】
ＰＤ−１としても公知のプログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１又はＣＤ２７９とも呼ばれる）は、約５５kDのＩ型膜糖タンパク質である。ＰＤ−１は、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞に中等度に発現され、リンパ球、単球及び骨髄性細胞上のＴ／Ｂ細胞受容体シグナル伝達によってアップレギュレーションされるＣＤ２８共刺激遺伝子ファミリーの受容体である。ＰＤ−１は、別個の発現プロファイルを有する２つの公知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）（広く、すなわちナイーブリンパ球、活性化Ｂ及びＴ細胞、単球並びに樹状細胞上に発現される）並びにＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）（その発現は限定され、すなわち活性化樹状細胞、マクロファージ及び単球並びに血管内皮細胞上である）を有する。いくつかのマウス同系腫瘍モデルにおいてＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のいずれかの遮断は腫瘍の成長を有意に阻害し、又は完全退縮を誘導した。したがって、ＰＤ−１は、免疫調節及び末梢寛容の維持に重要な役者として認識されている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２アンタゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第２００６／１２１１６８号に開示されるニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８又はＭＤＸ１１０６としても公知；抗ＰＤ−１抗体、BRISTOL-MYERS SQUIBB）、国際公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されるＭｅｒｃｋ３７４５（ＭＫ−３４７５又はＳＣＨ−９００４７５としても公知、抗ＰＤ−１抗体）、国際公開公報第２００９／１０１６１１号に開示されるＣＴ−０１１（ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても公知、抗ＰＤ−１抗体）、国際公開公報第２００８／１５６７１２号に開示されるランボロリズマブ（lambrolizumab）、国際公開公報第２０１０／０２７４２３号、同第２０１０／０２７８２７号、同第２０１０／０２７８２８号、及び同第２０１０／０９８７８８号に開示されるＡＭＰ５１４、並びにまた国際特許出願である国際公開公報第２００４／０５６８７５号、同第２００６／０５６８７５号、同第２００８／０８３１７４号、同第２０１０／０２９４３４号、同第２０１０／０２９４３５号、同第２０１０／０３６９５９号、同第２０１０／０８９４１１号、同第２０１１／１１０６０４号、同第２０１２／１３５４０８号、及び同第２０１２／１４５４９３号に開示される抗体を引用することができる。該ＰＤ−１アンタゴニストは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００７／００５８７４号に開示されるＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９としても公知、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、又は国際公開公報第２０１０／０７７６３４号に開示されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（ＭＰＤＬ３２８０Ａ若しくはＲＧ７４４６としても公知；抗ＰＤ−Ｌ１抗体）などの抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応し得る。
【００７２】
キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と呼ばれる免疫系の重要な細胞上に見出される細胞表面タンパク質のファミリーである。それらは、全ての細胞型上に発現されるＭＨＣクラスＩ分子と相互作用することによってこれらの細胞の殺滅機能を調節する。この相互作用は、特徴的な低レベルのクラスＩＭＨＣを表面に有するウイルス感染細胞又は腫瘍細胞をＮＫ細胞が検出できるようにする。大部分のＫＩＲは阻害性であり、それらのＭＨＣ認識がそれらのＮＫ細胞の細胞傷害活性を抑制することを意味する。限られた数のＫＩＲだけが細胞を活性化する能力を有する。
【００７３】
阻害性ＫＩＲは、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する長い細胞質尾部を有し、それは、それらのＭＨＣクラスＩリガンドと結合するとＮＫ細胞に阻害性シグナルを伝達する。公知の阻害性ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＫＩＲ３ＤＬ３を含むＫＩＲ２ＤＬ及びＫＩＲ３ＤＬサブファミリーのメンバーを含む。阻害性ＫＩＲアンタゴニストに対応する抗体の一例として、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００６／００３１７９号に開示される抗体１−７Ｆ９を引用することができる。
【００７４】
Ｂ７リガンドファミリーのメンバーは、免疫細胞による、最近になっては腫瘍細胞による、強い免疫調節活性を有することが公知であり、このファミリーは、ＣＤ２７６及びＶＴＣＮ１を含む。
【００７５】
ＣＤ２７６（分化クラスター２７６）（Ｂ７Ｈ３、Ｂ７−Ｈ３；Ｂ７ＲＰ−２；４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３としても公知）は、樹状細胞及び活性化Ｔ細胞において最初に同定されたＢ７リガンドファミリー由来のＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ２７６は、一部の固形腫瘍によって発現され、Ｔ細胞介在性免疫応答の調節に関与すると考えられる。さらに特定的には、ＣＤ２７６は、Ｔ−ヘルパー免疫応答をダウンレギュレーションし、免疫を抑制すると思われる（SUH et al., 2003）。ＣＤ２７６アンタゴニストの一例として、特許出願であるUS2005/0169932及び国際公開公報第２００８／１１６２１９号に開示される抗体８Ｈ９、並びに国際公開公報第２０１１／１０９４００号に開示されるＭＧＡ２７１などの他の抗体を引用することができる。
【００７６】
Ｂ７Ｘ；Ｂ７Ｈ４；Ｂ７Ｓ１；Ｂ７−Ｈ４としても公知のＶＴＣＮ１（V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1）もＢ７ファミリーのメンバーである。ＶＴＣＮ１は、Ｔ細胞応答の阻害性調節に役割を果たすと考えられ、研究によって、高レベルのこのタンパク質が腫瘍の進行と相関関係にあることが示された。ＶＴＣＮ１アンタゴニストの一例として、国際公開公報第２００９／０７３５３３号に開示される抗体を引用することができる。
【００７７】
ＣＤ２７２としても公知のＢＴＬＡ（B- and T-lymphocyte attenuator）は、Ｔ細胞の活性化中に誘導され、Ｔｈ２細胞ではなくＴｈ１細胞上に発現され続ける。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス侵入仲介因子（ＨＶＥＭ）、ＴＲ２；ＡＴＡＲ；ＨＶＥＡ；ＣＤ２７０；ＬＩＧＨＴＲとしても公知の腫瘍壊死因子（受容体）メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）との相互作用を介してＴ細胞阻害を表す。ＴＮＦＲＳＦ１４は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）侵入の細胞性仲介因子として同定された。この受容体の細胞質領域は、免疫応答を活性化するシグナル伝達経路を仲介し得るいくつかのＴＲＡＦファミリーのメンバーと結合することが見出された。最後に、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答をマイナスに調節する。ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭアンタゴニストの一例として、国際公開公報第２００８／０７６５６０号、同第２０１０／１０６０５１号、及び同第２０１１／０１４４３８号に開示される抗体を引用することができる。
【００７８】
ＬＡＧ３（Lymphocyte-activation gene 3、ＣＤ２２３としても公知）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する。ＬＡＧ３アンタゴニストの一例として、国際公開公報第２０１０／０１９５７０号に開示される抗体を引用することができる。
【００７９】
ＨＡＶＣＲ２（Hepatitis A virus cellular receptor 2、Ｔｉｍ−３、ＫＩＭ−３；ＴＩＭＤ３；Ｔｉｍ−３；及びＴＩＭＤ−３としても公知）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＴｈ１特異的細胞表面タンパク質である。ＨＡＶＣＲ２は、マクロファージの活性化を調節し、Ｔｈ１介在性自己免疫応答及び同種免疫応答を阻害することで免疫寛容を促進する。ＨＡＶＣＲ２アンタゴニストの一例として、国際公開公報第２０１３／００６４９０Ａ号に開示される抗体を引用することができる。
【００８０】
ＡＤＯＲＡ２Ａ（adenosine A2A receptor、Ａ２ａＲ、ＲＤＣ８；又はＡＤＯＲＡ２としても公知）は、複数のクラス及びサブタイプに細分されるグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する。このタンパク質は、心調律及び循環、脳及び腎血流、免疫機能、疼痛調節、及び睡眠などの多数の生物学的機能に重要な役割を果たす。これは、炎症性疾患及び神経変性障害などの病態生理学的状態に関係づけられている。
【００８１】
前記抗体又はそのフラグメントと前記コンジュゲートとは、連結されていない。
【００８２】
核酸及びベクター
本明細書に使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、好ましくはＤＮＡを表す。
【００８３】
好ましくは、そのような「ポリヌクレオチド」は、原核又は真核細胞内、好ましくは真核細胞内での核酸の発現を指令する遺伝子発現配列に作動的に連結されている。「遺伝子発現配列」は、作動的に連結された免疫サイトカインの核酸の効率的な転写及び翻訳を促進するプロモーター配列又はプロモーター−エンハンサー組合せなどの任意の調節性ヌクレオチド配列である。遺伝子発現配列は、例えば構成的プロモーター又は誘導性プロモーターなどの哺乳類プロモーター又はウイルスプロモーターであり得る。
【００８４】
構成的哺乳類プロモーターは、非限定的に、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼに対するプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、ヒト伸長因子プロモーター及び他の構成的プロモーターを含む。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターは、例えば、シミアンウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来のプロモーター、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。
【００８５】
遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある種の金属イオンの存在下で誘導されて、転写及び翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【００８６】
一般的に遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、それぞれ転写及び翻訳の開始に関係する５’非転写配列及び５’非翻訳配列を含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動的に繋がれた核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、任意で、所望によりエンハンサー配列又は上流のアクティベーター配列を含む。本明細書に使用されるように、本発明の免疫サイトカインをコードする核酸配列及び遺伝子発現配列は、本発明の免疫サイトカインのコード配列の発現すなわち転写及び／又は翻訳を遺伝子発現配列の影響下又は制御下に置く方法でそれらが共有結合されている場合、「作動的に連結されている」と言われる。
【００８７】
５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導が、本発明の免疫サイトカインの転写を招くならば、そして２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入を招く、（２）プロモーター領域が本発明の免疫サイトカインの転写を指令する能力を妨害する、又は（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害する、ことがないならば、２つのＤＮＡ配列は、作動的に連結されていると言われる。したがって、遺伝子発現配列は、遺伝子発現配列がその核酸配列の転写をもたらす能力があり、その結果、生じた転写物が所望のポリペプチドに翻訳されるならば、本発明の免疫サイトカインをコードする核酸配列に作動的に連結されている。
【００８８】
プレｍＲＮＡ分子が組換え分子の産生収率を改善するとしばしば実証されているので、有利には、該核酸配列は、イントロンを含む。任意のイントロン配列を使用してもよく、一例として、ZAGOら（Biotechnol. Appl. Biochem., vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009）及びCAMPOS-DA-PAZら（Mol. Biotechnol., vol.39(2), p:155-8, 2008）に開示されるものを引用することができる。
【００８９】
コンジュゲート又は免疫調節性抗体をコードするポリヌクレオチドは、単独で又はベクターに関連してインビボ送達され得る。
【００９０】
「ベクター」は、その最も広い意味で本発明の免疫サイトカインをコードする核酸を細胞に送達することを促進する能力のある任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じるであろう分解の程度よりも少ない分解で核酸を細胞に輸送する。一般的には、本発明に有用なベクターは、非限定的に、プラスミド、コスミド、ファージミド、エピソーム、人工染色体、ウイルス、免疫サイトカインの核酸配列の挿入又は組込みによって操作されたウイルス又は細菌源から得られた他の媒体を含む。
【００９１】
プラスミドベクターは、好ましい種類のベクターであり、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。プラスミドの非限定的な例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含み、他のプラスミドは、当業者に周知である。追加的に、ＤＮＡの特異的フラグメントを除去及び付加するために、制限酵素及びライゲーション反応を使用してプラスミドをカスタム設計してもよい。
【００９２】
好ましくは、ベクターは、細菌及び哺乳類細胞の両方において活性な選択マーカーを含むことができる。
【００９３】
医薬組成物及び治療方法
本明細書に使用される用語「対象」は、齧歯類、ネコ、イヌ又は霊長類などの哺乳類、最も好ましくはヒトを意味する。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含み得る。
【００９５】
表現「薬学的に許容し得る」は、生理学的に耐容性であり、ヒトに投与した場合に典型的には急性胃蠕動、めまいなどのアレルギー反応又は類似の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を表す。好ましくは、本明細書に使用される表現「薬学的に許容し得る」は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認可能なこと、又は動物、より特定的にはヒトにおける使用のために米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に挙げられていることを意味する。
【００９６】
用語「担体」は、化合物が一緒に投与される溶媒、佐剤、賦形剤、又は媒体を表す。そのような医薬担体は、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成起源のものを含む、水及び油などの無菌液体であり得る。
【００９７】
本発明に関連して、本明細書に使用される用語「処置する」又は「処置」は、そのような用語があてはまる障害若しくは状態又はそのような障害若しくは状態の１つ以上の症状を後退させる、緩和する、進行を阻害する、又は予防することを意味する。本明細書に使用される表現「癌を処置する」は、癌細胞の成長の阻害を意味する。好ましくは、そのような処置は、腫瘍成長の後退、すなわち計測可能な腫瘍のサイズの減少にも至る。最も好ましくは、そのような処置は、腫瘍の完全退縮に至る。
【００９８】
表現「治療有効量」は、癌細胞の成長を阻害するために十分な、好ましくは腫瘍成長の後退を誘導するために十分な量を表す。投与された用量は、様々なパラメーターの関数として、特に使用される投与様式、関連する病理、又はその代わりに所望の処置期間の関数として採用することができる。もちろん、医薬組成物の形態、投与経路、投薬量及び投与計画は、処置されるべき状態、病気の重症度、対象の年齢、体重及び性別などにもちろん依存する。下記に提供される有効用量の範囲は、本発明を限定することを意図せず、好ましい用量範囲を表すものである。しかし、過度な実験なしに当業者によって理解され、決定可能なように、好ましい用量は、個別の対象に合わせることができる。
【００９９】
本発明の組合せの著しい効率を考慮して、当業者は、対象を処置するために両方の個別の化合物を非常に低用量で使用することを計画することができる。
【０１００】
非限定的な例として、本発明の免疫抑制受容体アンタゴニスト抗体は、注射によって用量５００μg/kg以下、好ましくは用量１００μg/kg以下、最も好ましくは用量５０μg/kg以下で投与することができる。
【０１０１】
好ましくは、該免疫抑制受容体アンタゴニスト抗体は、注射によって用量少なくとも１μg/kg対象、好ましくは少なくとも５μg/kg対象、最も好ましくは用量少なくとも１０μg/kg対象で投与することができる。
【０１０２】
非限定的な例として、本発明のコンジュゲートは、注射によって用量６０μg/kg以下、好ましくは用量１０μg/kg以下、最も好ましくは用量５μg/kg以下で投与することができる。
【０１０３】
好ましくは、該コンジュゲートは、注射によって用量少なくとも０．５μg/kg対象、好ましくは少なくとも０．７μg/kg対象で、最も好ましくは少なくとも用量０．８μg/kg対象で投与することができる。
【０１０４】
一例として、投与段階は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内、腫瘍内又は皮下投与などに対応することができる。好ましくは、これらの投与段階は、注射に対応する。したがって、コンジュゲート、免疫調節抗体若しくはそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、注射されることを意図する製剤にとって薬学的に許容し得る媒体と関連している。これらは、特に、等張無菌塩類溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど又はそのような塩の混合物）、又は場合により無菌水又は生理学的塩類溶液を添加したときに注射液の構成を許す乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【０１０５】
コンジュゲート、免疫調節抗体若しくはそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを、緩衝液若しくは水に溶解させてもよく、あるいはエマルション、マイクロエマルション、ヒドロゲル（例えばＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡトリブロックコポリマー系ヒドロゲル）、マイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロパーティクル、ナノパーティクル（例えば乳酸−グリコール酸コポリマーマイクロパーティクル（例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）；乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリグルタミン酸のマイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロパーティクル若しくはナノパーティクル）中に、リポソーム中に、又は他のガレヌス製剤中に組み入れてもよい。いかなる場合でも、製剤は無菌でなければならず、かつ許容し得るシリンジ通過性の程度まで流動性でなければならない。製剤は、製造及び保存の条件で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【０１０６】
遊離塩基又は薬学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中に調製することができる。
【０１０７】
分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物並びに油中に調製することができる。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するために保存料を含有する。
【０１０８】
本発明のコンジュゲート、免疫抑制受容体アンタゴニスト抗体若しくはそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、中性又は塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。
【０１０９】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。ポリペプチドは、また、その生物学的利用能（biodisponibility）を増加させるように、一例としてペグ化により修飾され得る。
【０１１０】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散物の場合は必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【０１１１】
注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、ポリオール、半減期増大共有結合及び非共有結合製剤の使用によりもたらすことができる。
【０１１２】
加水分解及び変性を含む、ペプチドの不安定性又は分解の多くの原因がある。疎水性相互作用は分子が一緒にクランピングすること（すなわち凝集）を引き起こし得る。そのような問題を減少又は防止するために、安定化剤を加えてもよい。
【０１１３】
安定化剤は、シクロデキストリン及びその誘導体を含む（米国特許第５，７３０，９６９号を参照されたい）。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン及びグリセリンなどの適切な保存料もまた、最終製剤を安定化するために添加することができる。イオン性及び非イオン性界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、及びそれらの混合物より選択される安定化剤を製剤に添加してもよい。アルカリ金属塩又は塩化マグネシウムの添加はペプチドを安定化し得る。ペプチドはまた、それを、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、デキストリン及びアルギン酸塩からなる群より選択されるサッカリドと接触させることによって安定化され得る。添加できる他の糖は、単糖、二糖、糖アルコール、及びそれらの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）を含む。ポリオールはペプチドを安定化し得、水混和性又は水溶性である。適切なポリオールは、ポリヒドロキシアルコール、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース、及びそれらのポリマーを含む単糖及び二糖であり得る。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸及びリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、及び硫酸アンモニウムを含む、様々な賦形剤もまた、ペプチドを安定化し得る。
【０１１４】
以下に、アミノ酸配列、核酸配列及び実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、本発明は実施例の詳細に限定されることを意図するわけではない。むしろ本発明は、本明細書の実施例に明確に言及されていないが、当業者が過度の努力なしに見出す詳細を含む任意の実施態様に関する。
【０１１５】
実施例
１）ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１癌モデル
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの右脇腹にＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した（２．１０５／匹）。９日目に腫瘍が２０〜３０mm２に達したとき、マウスを２５０μg/匹の抗ＰＤ１（BIOXCELL、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）単独又はアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ａ；BIOXCELL、クローン２Ａ３、＃ＢＥ００８９）で処置した。抗ＰＤ１（α−ＰＤ１）又はアイソタイプ対照（２Ａ３）を９、１２及び１５日目に注射した。１３日から３７日にかけて、マウスを週に２回、ＲＬＩ  ＣＨＯ（１００４−１４ｐ） ２μgで、又は対照群ではＰＢＳで処置した。腫瘍を週に３回ノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm２に達したとき又は潰瘍化したときにマウスを屠殺した。
【０１１６】
プロトコールを図１に示す。担ＣＴ２６腫瘍マウスは、９〜１５日目に抗ＰＤ１又はアイソタイプ対照の投与を３回受けた（２５０μg/回）。ＲＬＩ処置（２μg/回）は、１３〜３７日目に週２回注射して行った。
【０１１７】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ１リガンド；（DURAISWAMY et al., Cancer Res., Jun 5, 2013）を発現した。そしてＰＤ１受容体を高度に発現しているＴ細胞によって浸潤される。図２に、ＣＴ２６モデルにおいて高頻度の腫瘍浸潤ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＰＤ−１及びＴｉｍ−３を共発現することを示す。担ＣＴ２６腫瘍マウスから分離した脾臓及び腫瘍を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脾臓（左欄）及び腫瘍（右欄）におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞上でのＴｉｍ−３及びＰＤ−１の共発現を示す。
【０１１８】
図３に、以前に記載されたプロトコールに従って抗ＰＤ１（ａＰＤ１）若しくは対照（２Ａ３）、ＲＬＩ若しくは対照（ＰＢＳ）又は両方の処置の組合せ（ａＰＤ１＋ＲＬＩ）で処置された担ＣＴ２６腫瘍マウスにおける腫瘍サイズの進展を示す。（Ａ）各群における腫瘍の成長（ｎ＝５匹／群）。（Ｂ）Ａと同様であるが２回目の実験から。Ｃ．各群において腫瘍が完全に退縮したマウスの率。（Ｄ〜Ｇ）。対照処置群についての各マウスにおける腫瘍の成長（実験１及び２をまとめる、ｎ＝１０）（Ｄ）；ＲＬＩ単独処置群（Ｅ）；ａＰＤ１単独処置群（Ｆ）及びａＰＤ１＋ＲＬＩ処置群（Ｇ）。二元ＡＮＯＶＡを用いた統計検定で判定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【０１１９】
図４に、抗ＰＤ１／ＲＬＩの組合せ処置がマウスにおける全生存を増加させることを示す。Ａ．各処置群における全生存（１群あたりｎ＝１０）。
【０１２０】
したがって、結果は、抗ＰＤ１＋ＲＬＩの組合せ処置が単独群に比べて抗腫瘍効果を高めることを示している。特に、ＲＬＩ／ａＰＤ１処置は、完全に腫瘍が退縮したマウスの数及び全生存数を増加させる（図３Ｃ及び４）。驚くことに、ＲＬＩ及び抗ＰＤ１の組合せで処置され、完全寛解後、１４５日目にＣＴ２６腫瘍で再攻撃された無腫瘍マウスはどれも腫瘍成長を示さなかったので、防御抗腫瘍免疫の持続を示唆している（データは示さず）。これらの結果は、ｉ）腫瘍接種後のＤ１０から処置を開始した場合、ＲＬＩは単独で腫瘍成長に無効であった、ｉｉ）そのとき、抗ＰＤ１は生存率を高めたが、完全退縮を誘導することは、まれであった（５．９％）ことを立証した別系列の実験で確認された。抗ＰＤ１及びＲＬＩの組合せは、生存率及び長期継続寛解であった完全寛解（３０．４％）を増大させた。マウスが全退縮後の１４５日目にまだ無腫瘍であり、治癒後のマウスの再攻撃が腫瘍復活を決して示さなかったので、この組合せは、効果的な抗腫瘍メモリー免疫応答を誘導した（データは示さず）。
【０１２１】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの右脇腹にＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した（２．１０５/匹）。１０日目に、マウスに低用量の抗ＰＤ１（クローンｍＢＡＴ、１２μg/m匹）若しくは対照、ＲＬＩ  ＣＨＯ（１００４−１５ｐ）２μg若しくは対照、又は両方の処置の組合せをｉ．ｐ．で受けさせた。１週間後（１７日目）に、マウスに、抗ＰＤ１、ＲＬＩ又は対照の２回目の注射を受けさせる。腫瘍を２日毎にノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm２に達したとき又は潰瘍化したときにマウスを屠殺した。プロトコールを図５に示す。
【０１２２】
図６に、ＲＬＩと組み合わせた低い抗ＰＤ１のｉ．ｐ注射で２回処置された担ＣＴ２６腫瘍マウスにおけるＣＴ２６腫瘍の成長を示す。二元ＡＮＯＶＡを用いた統計検定で判定した。＊＊＊ｐ＜０，００１。
【０１２３】
結果は、低用量の抗ＰＤ１又はＲＬＩは単独で原発性皮下腫瘍の成長阻害を支援できないことを示している。しかし、低用量の抗ＰＤ１をＲＬＩと組み合わせることで腫瘍の成長阻害が可能になった。この実験から、ＲＬＩが最適以下の用量の抗ＰＤ１処置であっても抗ＰＤ１戦略と相乗作用して腫瘍成長と闘うことができたと確認された。
【０１２４】
結局、この低用量の組合せが顕著な相乗性を招き、強い腫瘍成長阻害を招くと思われる。
【０１２５】
２）転移性黒色腫
０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹にＢ１６Ｆ１０細胞３×１０４個をｉ．ｄ．注射することによってＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植した。７〜２５日目にＲＬＩ  ＣＨＯ ２μgを１週間に２回ｉ．ｐ．注射したＲＬＩ  ＣＨＯ（２μg/匹）と組み合わせて又は組み合わせずに、マウスを抗ＣＴＬＡ−４（クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００又はクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）でｉ．ｐ．処置した。注射１回あたりの抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の用量は、３日目に２００μgに加えて６及び９日目に１００μｇである。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプの投与を受けた。腫瘍サイズ及び発生率を身体検査により経時的にモニターした。
３）進行肺癌
腫瘍細胞系ＴＣ−１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代肺上皮細胞から得られ、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ６／Ｅ７及びｃ−Ｈａ−Ｒａｓを共トランスフォーメーションされている。ＴＣ−１肺癌細胞１０５個をＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の真皮上層中にｓ．ｃ．注射する。腫瘍がサイズ≒１５〜２０mm2で明らかに目に見え、触知可能になったときに対応する、腫瘍接種後１０日目に処置を開始する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００若しくはクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（２５０μg/匹、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）を３つの単一時点で（１０、１４、１７日目）与え、ＲＬＩ（２μg/匹）を１０、１３及び１８日目に与える。エンドポイントとして１週間に２回測定した腫瘍成長を用いて、単一薬剤に対して各抗体とＲＬＩとの対組合せを用いた処置を比較する。対応する用量の抗体アイソタイプの投与を対照群に受けさせた。
【０１２６】
４）進行膀胱癌
ＭＢ４９腫瘍細胞系は、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスからの膀胱上皮起源の発癌物質誘導腫瘍を起源とする。ＭＢ４９膀胱ガン細胞１０６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の真皮上層中にｓ．ｃ．注射する。腫瘍がサイズ≒１５mm2で明らかに目に見え、触知可能になったときに対応する、腫瘍接種後６日目に処置を開始する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００若しくはクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（１００μg/匹、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）を４つの単一時点で（６、９、１２日目）与え、ＲＬＩ（２μg/匹）を７、８、１０、１１、１３、１４、及び１６、１７日目に与える。単一薬剤に対して各抗体とＲＬＩとの対組合せを用いた処置を比較する。対応する用量の抗体アイソタイプの投与を対照群に受けさせた。腫瘍を１週間に３回ノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm２に達したとき又は潰瘍化したときにマウスを屠殺した。
【０１２７】
５）乳癌
０日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺に４Ｔ１乳癌細胞５×１０４個を接種する。腫瘍がサイズ≒１５〜２０mm2で明らかに目に見え、触知可能になったときに対応する、腫瘍接種後１０日目に処置を開始する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００若しくはクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（２５０μg/匹、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（２００μg/匹、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）を４つの単一時点で（１０、１３、１６日目）与え、ＲＬＩ（２μg/匹）を１０、１１、１３、１４、１６、１７、及び１９、２０日目に与える。単一薬剤に対して各抗体とＲＬＩとの対組合せを用いた処置を比較する。対応する用量の抗体アイソタイプの投与を対照群に受けさせた。腫瘍を１週間に３回ノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算する：長さ×幅。マウスを２７日目に屠殺する。肺転移結節を双眼顕微鏡で計数する。
６）卵巣癌
ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣癌細胞系は、マウス卵巣上皮乳頭漿液性腺癌細胞系から以前に開発された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹にいずれかのＩＤ８腫瘍細胞５×１０６個を皮下移植する。腫瘍がサイズ≒１５〜２０mm2で明らかに目に見え、触知可能になったときに対応する、腫瘍接種後１０日目に処置を開始する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００若しくはクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（２５０μg/匹、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（２００μg/匹、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）を４つの単一時点で（１０、１３、１６日目）与え、ＲＬＩ（２μg/匹）を１０、１１、１３、１４、１６、１７、及び１９、２０日目に与える。エンドポイントとして１週間に２回測定した腫瘍成長を用いて、単一薬剤に対して各抗体とＲＬＩとの対組合せを用いた処置を比較する。対応する用量の抗体アイソタイプの投与を対照群に受けさせた。腫瘍を１週間に３回ノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算する：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm２に達したとき又は潰瘍化したときにマウスを屠殺する。
【０１２８】
７）前立腺ガン：ＲＭ−１
Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスにＲＭ−１マウス前立腺癌細胞２×１０５個をｓ．ｃ．接種する。腫瘍がサイズ≒１５〜２０mm2で明らかに目に見え、触知可能になったときに対応する、腫瘍接種後３日目に処置を開始する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（１００μg/匹、クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  １００若しくはクローン：９Ｄ９）又は抗ＰＤ−１（２５０μg/匹、クローンＲＰＭ１−１４、＃ＢＥ０１４６）又は抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（２００μg/匹、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）を３つの単一時点で（３、６、９日目）与え、ＲＬＩ（２μg/匹）を６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６及び１８、１９日目に与える。エンドポイントとして１週間に２回測定した腫瘍成長を用いて、単一薬剤に対して各抗体とＲＬＩとの対組合せを用いた処置を比較する。対応する用量の抗体アイソタイプの投与を対照群に受けさせた。腫瘍を１週間に３回ノギスで測定し、以下のように腫瘍面積を計算する：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm２に達したとき又は潰瘍化したときにマウスを屠殺した。
【図１】
2019189638.tif 000002
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月2日(2019.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組合せ医薬組成物であって：
ａ）（ｉ）ｋｉｔ２２５細胞系の増殖誘導に対してヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％を有する、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びｉｉ）ヒトインターロイキン−１５に対するヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％を有する、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター、；並びに
ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはその抗体対応物と同じ抗原と反応する能力のあるそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター
を含み、
ここで、前記コンジュゲート及び抗体又はそのフラグメントは連結されていない、
組合せ医薬組成物。
【請求項２】
（ｉ）ｋｉｔ２２５細胞系の増殖誘導に対してヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％を有する、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びｉｉ）ヒトインターロイキン−１５に対するヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％を有する、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを含む、対象における癌を処置する用途のための医薬組成物であって、
該用途は、（ａ）前記医薬組成物と、（ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体若しくはその抗体対応物と同じ抗原と反応する能力のあるそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターとを同時投与、分離投与、又は順次投与することを含む、
医薬組成物。
【請求項３】
Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体、そのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを含む、対象における癌を処置する用途のための医薬組成物であって、
該用途は、（ａ）前記医薬組成物と、（ｂ）（ｉ）ｋｉｔ２２５細胞系の増殖誘導に対してヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％を有する、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、及びｉｉ）ヒトインターロイキン−１５に対するヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％を有する、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン若しくはその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート；それをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターとを同時投与、分離投与、又は順次投与することを含む、
医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組合せ医薬組成物、又は請求項２又は３に記載の癌を処置する用途のための医薬組成物であって、対象における癌を処置する用途のための同時投与、分離投与、又は順次投与用に適合させた、組合せ医薬組成物、又は医薬組成物。
【請求項５】
ａ）コンジュゲートが、注射によって用量６０μg/kg以下、好ましくは用量１０μg/kg以下、最も好ましくは用量５μg/kg以下で投与され；
ｂ）Ｔ細胞活性化の阻害に関係づけられている免疫経路に拮抗する抗体又はそのフラグメントが、用量５００μg/kg以下、好ましくは用量１００μg/kg以下、最も好ましくは用量５０μg/kg以下の注射によって投与される、
請求項１〜４のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項６】
抗体が、ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２、阻害性ＫＩＲ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２及びＡＤＯＲＡ２Ａのアンタゴニスト、好ましくはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストを含む群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項７】
抗体が、ＣＴＬ−Ａ４アンタゴニスト、好ましくはイピリムマブ又はチクリムマブ（ticilimumab）より選択される、請求項６記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項８】
抗体が、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、好ましくは１−７Ｆ９より選択される、請求項６記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項９】
抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２のアンタゴニスト、好ましくはニボルマブ、Ｍｅｒｃｋ３７４５、ＣＴ−０１１、ランブロリズマブ（lambrolizumab）、ＡＭＰ５１４、ＭＤＸ−１１０５又はＹＷ２４３．５５．Ｓ７０より選択される、請求項６記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項１０】
抗体が、ＣＤ２７６アンタゴニスト、好ましくは８Ｈ９又はＭＧＡ２７１より選択される、請求項６記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項１１】
ａ）コンジュゲートのポリペプチドｉ）及びｉｉ）が、融合タンパク質の状態に共有結合され；
ｂ）該コンジュゲート及び抗体又はそのフラグメントが連結されていない、
請求項１〜１０のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項１２】
インターロイキン１５が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項１３】
ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【請求項１４】
コンジュゲートが、配列番号１６又は配列番号１７の配列を有する、請求項１〜１３のいずれか一項記載の組合せ医薬組成物、又は癌を処置する用途のための医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月31日(2019.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019189638000001.pdf