(57)【要約】      （修正有）【課題】重篤な肢虚血、末梢動脈疾患、創傷治癒、血管疾患、循環器疾患、冠動脈疾患、心臓血管疾患、糖尿病等に起因する低酸素症又は虚血を治療する新規方法の提供。【解決手段】低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を含む治療剤。前記治療剤の投与により、血管新生促進又は誘導、毛細血管密度増加、側副血管形成促進、血管径拡大等の作用を発現し、被患組織の組織かん流を増加させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を含む治療剤。
【請求項２】
ＨＩＦ−１αは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号３に記載のヌクレオチド配列、配列番号５に記載のヌクレオチド配列、配列番号１と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、または配列番号５と９５％以上同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
ＨＩＦ−１αは配列番号５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列、配列番号２と９５％以上同一であるアミノ酸配列、配列番号４と９５％以上同一であるアミノ酸配列、または配列番号６と９５％以上同一であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項２に記載の治療剤。
【請求項５】
配列番号６に記載のアミノ酸配列をさらに含む、請求項３に記載の治療剤。
【請求項６】
ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１αが細胞内でヒドロキシル化されないように、変異される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項７】
ＨＩＦ−１αのプロリン残基は細胞内でヒドロキシル化されない、請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
薬学上許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項９】
被検体において低酸素症または虚血を治療する方法であって、当該方法は、前記被検体に請求項１に記載のワクチンを投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記ワクチンを投与することは電気穿孔を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤を投与することは筋肉内投与および皮内投与の少なくとも一を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記低酸素症または虚血は、重篤な肢虚血、末梢動脈疾患、創傷治癒、血管疾患、循環器疾患、冠動脈疾患、心臓血管疾患または糖尿病に関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記低酸素症または虚血は、重篤な肢虚血に関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンが投与されない被検体に比べて、前記ワクチンが投与された被検体において、毛細血管密度を高くし、側副血管形成を促進し、血管径を大きくする、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチンが投与されない被検体に比べて、前記ワクチンが投与された被検体において、組織かん流が大きくなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンが投与されない被検体に比べて、前記ワクチンが投与された被検体において、組織壊死が減少する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号５、及び配列番号５と９５％以上同一であるヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列はプラスミドである、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号６、及び配列番号６と９５％以上同一であるアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むアミノ酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／８００，７０３号に対する優先権を主張するものである。この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた契約番号Ｋ１２ＨＬ０８３７７２‐０１の下で米国政府の支援により行われたものである。政府は、この発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、低酸素誘導因子‐１アルファ（Ｈ１Ｆ‐１α）を有する組成物と、低酸素症または虚血の治療方法とに関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物では、胚発生および成人の恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）の維持は、哺乳動物の組織および細胞に酸素（Ｏ2）および他の栄養を供給する機能的血管系の確立に依存する。これらの組織および細胞への局所的な酸素の供給は、既存の血管音、新しい血管の確立（血管形成）、増加した血流を受け入れるための既存の血管の再形成（動脈形成）における過渡変化によって、循環系により調節される。生理的および病理学的条件下での組織かん流は低酸素誘導因子‐１（ＨＩＦ‐１）により調節される。
【０００５】
ＨＩＦ‐１は、酸素調節アルファサブユニット（Ｈ１Ｆ‐１α）および構成的に発現されるベータサブユニット（ＨＩＦ‐１β）から成るヘテロダイマー転写因子である。Ｈ１Ｆ‐１は、血管音、血管形成および／または動脈形成への効果によって血管恒常性に関与する遺伝子の転写を誘導することにより、後生動物生命体の有核細胞における低酸素症および虚血への適応応答を介在する。重篤な肢虚血（ＣＬＩ）などの病態において、減少した組織かん流と、安静時の虚血性痛み、潰瘍および／または壊疽の兆候と、最終的な肢切断とに繋がるＨＩＦ‐１を阻止することが可能である。
【０００６】
したがって、被患組織の組織かん流を増加させることと、虚血および低酸素症への通常の生理反応を回復させることとを含む、虚血および／または低酸素症に関連する疾病を治療する組成物の同定および方法の開発の必要性が存在する。
【０００７】
本発明は、低酸素誘導因子‐１アルファ（ＨＩＦ‐１α）を有する治療剤に関する。本発明はまた、その治療剤を必要とする被検体において低酸素症または虚血の治療方法に関する。その方法は、被検体に対してその治療剤を投与することを有し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】低酸素誘導因子‐１アルファ（ＨＩＦ‐１α）タンパク質の特徴を示す模式図である。
【図２】実験的研究設計の概要の模式図であって、ここで、ＥＰは電気穿孔法、ＨＩＦ‐１ａは低酸素誘導因子‐１アルファ、ＩＭは筋肉注射、ＬＤＰＩはレーザドップラかん流イメージャ、ｐＶＡＸはエンプティバックボーンプラスミドＤＮＡ（ｅｍｐｔｙ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）である。
【図３Ａ】（Ａ）はレーザドップラかん流イメージャにより記録された代表的な画像を示す。
【図３Ｂ】（Ｂ）は肢かん流比（結紮部分／非結紮部分）に対して大腿動脈結紮後の日数をプロットしたグラフである。
【図３Ｃ】（Ｃ）は肢運動スコアに対して大腿動脈結紮後の日数をプロットしたグラフである。
【図３Ｄ】（Ｄ）は３未満のパーセント肢壊死スコアに対して処理群をプロットしたグラフである。
【図４】手術後の後肢回復の全体的な様子を示し、（Ａ）はＨＩＦ‐１αをコードするＤＮＡと電気穿孔法（ＥＰ）との組み合わせにより処理されたマウスを示し、（Ｂ）はＨＩＦ‐１αをコードするＤＮＡの筋肉（ＩＭ）注射により処理されたマウスを示し、（Ｃ）ｐＶＡＸ１  ＤＮＡ（エンプティベクトル制御）およびＥＰの組み合わせにより処理されたマウスを示し、（Ｄ）は偽処理された肢を示し、図４Ａ乃至４Ｄの各々において、矢印は被患肢を示す。
【図５Ａ−Ｂ】（Ａ）はヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された内転筋組織薄片の代表的な顕微鏡写真（元の倍率、２００倍）を示し、（Ｂ）は処理グループ対組織壊死（面積割合）をプロットしたグラフを示す。
【図５Ｃ−Ｄ】（Ｃ）はＣＤ３１＋毛細血管に対して染色された内転筋組織の代表的な顕微鏡写真（元の倍率、２００倍）を示し、（Ｄ）は処理グループ対毛細血管密度（ＣＤ３１＋細胞／ＨＰＦ）をプロットしたグラフを示す。
【図６】（Ａ）は全動脈数（ＳＭＡ＋血管／ＨＰＦ）に対する処理群を示し、（Ｂ）は血管面積に対する処理群をプロットしたグラフを示す（μｍ2）。
【図７Ａ】（Ａ）はマウスＨＩＦ‐１αをコードする核酸配列を示し、ここで、下線はＩｇＥリーダー配列をコードする開始コドンおよびヌクレオチドを示し、二重下線および太字はプロリンの代わりのアラニンをコードするコドンを示す。
【図７Ｂ】（Ｂ）はマウスＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列を示し、ここで、下線はＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列に結合した開始メオチニンおよびＩｇＥリーダー配列を示し、二重下線および太字は、ＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列における野生型プロリン残基の代わりとなったアラニン残基を示す。
【図８Ａ】（Ａ）はマウスＨＩＦ‐１αをコードする核酸配列を示し、ここで、５’端部の下線はクローニング目的のＢａｍＨＩ制御部位（すなわち、ＧＧＡ  ＴＣＣ）およびコザック配列（すなわち、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を示し、３’端部の下線は、終止コドン（すなわち、ＴＧＡ  ＴＡＡ）およびクローニング目的のＸｈｏＩ制御部位（すなわち、ＣＴＣ  ＧＡＧ）を示し、二重下線および太字はプロリンの代わりのアラニンをコードするコドンを示す。
【図８Ｂ】（Ｂ）はマウスＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列を示し、ここで、二重下線および太字は、ＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列における野生型プロリン残基の代わりとなったアラニン残基を示す。
【図９Ａ】（Ａ）はヒトＨＩＦ‐１αをコードする核酸配列を示し、ここで、二重下線および太字はプロリンの代わりのアラニンをコードするコドンを示す。
【図９Ｂ】（Ｂ）はヒトＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列を示し、ここで、二重下線および太字は、ＨＩＦ‐１αのアミノ酸配列における野生型プロリン残基の代わりとなったアラニン残基を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、低酸素症または虚血を治療する治療剤に関する。治療剤は、低酸素誘導因子‐１アルファ（ＨＩＦ‐１α）を有し得る。治療剤は、血管新生を促進または誘導し得る。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、毛細血管密度を高くし、側副血管形成を促進し、血管径を大きくすること、またはそれらの組み合わせが可能である。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織かん流を増加させることが可能である。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織壊死を減少させることが可能である。
【００１０】
したがって、治療剤は、低酸素症または虚血の治療方法で用いられることが可能である。低酸素症または虚血は重篤な肢虚血に関連付けられる。
１．定義
【００１１】
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
【００１２】
本明細書で使用する「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、および「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００１３】
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、本明細書に記載の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
【００１４】
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【００１５】
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００１６】
本明細書で使用する「断片」は、たとえば、血管音、血管形成および／または動脈形成に対する効果によって、しかしそれらに限定されずに、哺乳動物の血管恒常性における変化に変更をもたらすまたは影響することが可能であるポリペプチドをコードする核酸配列または核酸配列の一部を意味する。断片は、下で述べるタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されたＤＮＡ断片であり得る。断片は、下で述べるタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されたＤＮＡ断片であり得る。断片は、下で述べる核酸配列の１つまたは複数の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％を有し得る。いくつかの実施形態においては、断片は、下で述べる核酸配列の少なくとも１つの、少なくとも２０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも１００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも１５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも２００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも２５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９００個のヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９５０個のヌクレオチドまたはそれ以上、もしくは少なくとも１０００個のヌクレオチドまたはそれ以上を有し得る。
【００１７】
ポロペプチド配列に対する「断片」は、たとえば、血管音、血管形成および／または動脈形成に対する効果によって、しかしそれらに限定されずに、哺乳動物の血管恒常性における変化に変更をもたらすまたは影響することが可能であるポリペプチドを意味する。断片は、下で述べる種々のアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されたポリペプチド断片であり得る。断片は、下で述べるタンパク質の１つまたは複数の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％を有し得る。いくつかの実施形態において、断片は、下で述べるタンパク質の少なくとも１つの、少なくとも２０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも３０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも４０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも５０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも６０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも７０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも８０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも９０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１００個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１１０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１２０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１３０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１４０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１５０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１６０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１７０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１８０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも１９０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも２００個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも２１０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも２２０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも２３０個のアミノ酸またはそれ以上、少なくとも２４０個のアミノ酸またはそれ以上を有し得る。
【００１８】
本明細書で使用する「遺伝子構築物」または「構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物または構築物を指す。
【００１９】
本明細書で使用する「低酸素症」は、雰囲気の酸素（Ｏ2）濃度の減少を意味する。
【００２０】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００２１】
本明細書で使用する「虚血」は、酸素（Ｏ2）濃度利用性が組織代謝性要求に適合するのに十分であるように、組織かん流が低下した状態を意味する。
【００２２】
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２３】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００２４】
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００２５】
本明細書で使用する、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または、天然および合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
【００２６】
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００２７】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質またはアミノ酸配列のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端に結合する。
【００２８】
本明細書で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００２９】
本明細書で用いられる「対象」は、本明細書に記載の治療剤で免疫を得ることを望むかまたは必要とする哺乳類を意味する。哺乳類は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはネズミであり得る。
【００３０】
本明細書で使用する「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００３１】
本明細書で使用する「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のアミノ酸の領域に渡って、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドに渡って、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることも意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで動物を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に動物に本発明の治療剤を投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、動物に本発明の治療剤を投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、動物に本発明の治療剤を投与することを含む。疾患は低酸素症および／または虚血と関連があり得る。  
【００３３】
核酸に関して本明細書で使用する「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００３４】
「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものであるペプチドまたはポリペプチドとさらに定義され得る。「生物学的活性」の代表的な例には、特委抗体により結合されるべきまたは免疫応答を促進すべき能力がある。変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００３５】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００３６】
本明細書で使用する「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターであり得、好適には、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つまたは複数の異種核酸配列を含み得る。
【００３７】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６および９に加えて７および８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明示的に企図される。
２．治療剤
【００３８】
治療剤は、薬剤、薬剤の断片、薬剤の変異体またはそれらの組み合わせを有し得る。薬剤は、血管新生を促進または誘導し得る。薬剤は、血管音、血管形成および／または動脈形成を促進または誘導し得る。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、毛細血管密度を高くし、側副血管形成を促進し、血管径を大きくすることが、またはそれらの組み合わせが可能である。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織かん流を増加させることが可能である。治療剤は、治療剤が投与されない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織壊死を減少させることが可能である。
【００３９】
本発明の治療剤は、当該治療剤自体が病気を引き起こさずまたは死にいたらさず、病気を防ぎ、投与が容易であり、副作用が殆どなく、生物学的安定性があり、服用当たりの費用が低いように、安全である有効な治療剤に求められる特徴を有し得る。治療剤は、薬剤を含むことにより上記特徴の一部またはすべてを得ることが可能である。
ａ．薬剤
【００４０】
治療剤は薬剤を有し得る。薬剤は、核酸配列、アミノ酸配列またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。また、核酸配列は、ペプチド結合により薬剤に連結しているリンカーまたはタグ配列をコードする付加配列を含み得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
（１）ＨＩＦ‐１α
【００４１】
薬剤は、低酸素誘導因子‐１アルファ（ＨＩＦ‐１α）、その断片、その変異体またはそれらの組み合わせであり得る。ＨＩＦ‐１αは、転写因子ＨＩＦ‐１の２つのサブユニットのうちの１つである。他のサブユニットはＨＩＦ‐１βである。したがって、ＨＩＦ‐１は、アルファサブユニットおよびベータサブユニットのヘテロダイマーであり、ベータサブユニットは構成的に発現され、アルファサブユニットの安定性は酸素濃度により調整される。
【００４２】
両方のサブユニットは、転写因子のｂａｓｉｃ  Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ  ＰＥＲ−ＡＲＮＴ−ＳＩＭ（ｂＨＬＨ−ＰＡＳ）ファミリーのメンバーである。図１に示すように、ＨＩＦ−１αは、ｂＨＬＨドメインおよび２つのＰＡＳドメイン、ならびにＮ末端トランス活性化ドメイン（ＮＴＡＤ）およびＣ末端トランス活性化ドメイン（ＣＴＡＤ）を含む。さらに、ＨＩＦ−１αは、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）、すなわち、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２およびＰＨＤ３、を含む酵素によりヒドロキシル基が導入された２つのプロリン残基（たとえば、ヒトＨＩＦ−１αにおけるＰ４０２およびＰ５６４）と、ＨＩＦを阻止する因子（ＦＩＨ）を介してヒドロキシル基が導入されたＣＴＡＤ（たとえば、ヒトＨＩＦ−１αにおけるＮ８０３）に位置付けられたアスパラギン残基とを含む。この残基は、酸素の存在下でＨＩＦ−１αにおいてヒドロキシル化される。
【００４３】
具体的には、ヒドロキシル基が導入されたアスパラギン残基は、ＨＩＦ−１αと転写コアクチベータとの間の反応を立体的に阻止する一方、ヒドロキシル基が導入されたプロリン残基は、フォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍サプレッサータンパク質（ｐＶＨＬ）により認識され、結合される。ｐＶＨＬは、エロンジンＢ、エロンジンＣおよびカリン２を含む複合体で見つけられ、ユビキチンリガーゼＥ３活性を有する。この複合体は、２６Ｓプロテアソームを介する分解により後続される、ヒドロキシル基が導入されたＨＩＦ−１αのユビキチン化を媒介する。
【００４４】
したがって、酸素正常状態にある場合、ＨＩＦ−１αは、転写コアクチベータと反応するのは不安定であるおよび／または反応することはできないために、ＨＩＦ−１は非活性である。低酸素または虚血性状態においては、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化は低減または抑制され、それにより、ＨＩＦ−１αを安定化することおよびＨＩＦ−１に適応的に媒介させるようにすることが低酸素症および虚血に対して応答する。この適応的応答は、血管音、血管形成および／または動脈形成への効果により血管恒常性に関連する遺伝子の転写を誘導することを含み得る。
【００４５】
しかし、病態時には、ＨＩＦ−１は抑制され得、減少した組織かん流、安静時の虚血性痛み、潰瘍および／または壊疽の兆候、ならびに最終的な切断に繋がる。そのような病態は重篤な肢虚血を含んでもよい。
【００４６】
したがって、治療剤は、低酸素症および／または虚血を含む病態を治療するために用いられ得る。低酸素症およびまたは虚血は、重篤な肢虚血、末梢動脈疾患、創傷治癒、血管疾患、循環器疾患、冠動脈疾患、心臓血管疾患、糖尿病またはそれらの組み合わせに関連し得る。低酸素症または虚血は重篤な肢虚血に関連し得る。
【００４７】
治療剤は、治療剤が投与されていない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、毛細血管密度を高くすること、側副血管形成を促進すること、血管径を大きくすること、またはそれらの組み合わせが可能である。治療剤は、治療剤が投与されていない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織かん流を増加させることが可能である。治療剤は、治療剤が投与されていない被検体に比べて、治療剤が投与された被検体において、組織壊死を減少させることが可能である。
【００４８】
ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、任意種類の数の生物、たとえば、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびヒト（ホモサピエンス）に由来し得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、コドン使用および対応するＲＮＡ転写に関して最適化され得る。ＨＩＦ‐１αをコードする核酸は、発現のために最適化されたコドンおよびＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、翻訳の効率を高めるようコザック配列（たとえば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を有し得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、翻訳終止の効率を高めるよう複数の終止コドン（たとえば、ＴＧＡ  ＴＧＡ、ＴＧＡ  ＴＡＡなど）を有し得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列もコードし得る。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＨＩＦ−１αの５‘に位置できる。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列がないまたはそれを含まない。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、異種核酸配列であり得る、および／または１つまたは複数の異種核酸配列を含み得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸または残基が他のアミノ酸または残基と置換されるように、突然変異され得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ヒドロキシル化され得るＨＩＦ−１αのアミノ酸配列における１つまたは複数の残基（たとえば、プロリン、アスパラギン等）がヒドロキシル化され得ない残基と置換されるように、突然変異され得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列における１つまたは複数のプロリン残基が、ヒドロキシル化され得ない残基と置換されるように、突然変異され得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列がｐＶＨＬにより認識および／または結合され得ないように、突然変異され得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列がユビキチン化され得ないように、突然変異され得る。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列、たとえば、２６Ｓプロテアソームが分解され得ないように、突然変異され得るが、それに限定されない。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列が細胞および／または組織における酸素濃度に拘らず安定し、ゆえに、ＨＩＦ−１αタンパク質が細胞および／または組織内に集積し得るように、突然変異され得る。
【００５０】
マウスＨＩＦ−１αは、配列番号２をコードする核酸配列の配列番号１であり得る（図７Ａおよび７Ｂ）。配列番号２は、２つのプロリン基がアラニンと置換された、マウスＨＩＦ−１αのアミノ酸配列である。この置換は、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を、ゆえに、ｐＶＨＬによるＨＩＦ−１αの認識を、抑制または低減させ得る。配列番号２は、ＩｇＥリーダー配列に結合されたペプチドを介して連結されたマウスＨＩＦ−１αのアミノ酸配列である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、マウスＨＩＦ−１αは、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、マウスＨＩＦ−１αは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。マウスＨＩＦ−１αは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、マウスＨＩＦ−１αは、配列番号４をコードする核酸配列の配列番号３であり得る（図８Ａおよび８Ｂ）。配列番号４は、２つのプロリン残基が図８Ｂに示すアラニンと置換された、マウスＨＩＦ−１αのアミノ酸配列である。この置換は、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を、ゆえに、ｐＶＨＬによるＨＩＦ−１αの認識を、抑制または低減させ得る。配列番号４は、ＩｇＥリーダー配列に結合されたペプチドを介して連結されていないマウスＨＩＦ−１αのアミノ酸配列である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、マウスＨＩＦ−１αは、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、マウスＨＩＦ−１αは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。マウスＨＩＦ−１αは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列であり得る。
【００５４】
ヒトＨＩＦ−１αは、配列番号６をコードする核酸配列の配列番号５であり得る（図９Ａおよび９Ｂ）。配列番号６は、２つのプロリン残基が図９Ｂに示すアラニンと置換された、ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸配列である。この置換は、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を、ゆえに、ｐＶＨＬによるＨＩＦ−１αの認識を、抑制または低減させ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ヒトＨＩＦ−１αは、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ヒトＨＩＦ−１αは、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ヒトＨＩＦ−１αは、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態は、配列番号１、配列番号３および配列番号５の断片に関する。断片は、配列番号１、配列番号３および／または配列番号５の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、たとえば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含み得ない。
【００５７】
配列番号１、配列番号３および／または配列番号５の断片に同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸の断片が得られる。かかる断片は、配列番号１、配列番号３および／または配列番号５に９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１α核酸配列の断片に９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１α核酸配列の断片に９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１α核酸配列の断片に９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１α核酸配列の断片に９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、たとえば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含み得ない。
【００５８】
配列番号２、配列番号４および配列番号６の断片が得られる。断片は、配列番号２、配列番号４および／または配列番号６の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、たとえば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含み得ない。
【００５９】
配列番号２、配列番号４および／または配列番号６の断片に同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の断片が得られる。かかる断片は、配列番号２、配列番号４および／または配列番号６に９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１αタンパク質配列の断片に９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１αタンパク質配列の断片に９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１αタンパク質配列の断片に９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＨＩＦ−１αタンパク質配列の断片に９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、たとえば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含み得る。他の実施形態において、断片は、リーダー配列を含み得ない。
ｂ．ベクター
【００６０】
治療剤は、薬剤をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターは、薬剤を発現することができる。ベクターは、薬剤をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００６１】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられるプラスミドである。発現ベクターが細胞の中に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞性転写および翻訳機械リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用する調節配列を含み、かつ、発現ベクター上に運搬された遺伝子の効率的な転写をもたらすように操作されることが多い。本発明のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡを発現するため、多量の安定したタンパク質を発現する。
【００６２】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子の間の距離の調節、転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブルな翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
（１）発現ベクター
【００６３】
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞内において特定のヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。ベクターは、薬剤コードヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモーターを有してもよく、これは、終止シグナルに機能的に連結し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含み得る。対象のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であってもよく、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に晒された場合にのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または臓器もしくは発生の段階に特異的であり得る。
（２）環状および線状ベクター
【００６４】
ベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド）。
【００６５】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、抗原またはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原、またはアジュバントに翻訳できるようにすることが可能な発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【００６６】
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）であり、これは、電気穿孔を介して対象に効率よく送達され、かつ、所望の薬剤を発現することができる。ＬＥＣは、任意のリン酸バックボーンを欠いた任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、薬剤をコードしてもよい。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。薬剤の発現は、プロモーターにより制御されてもよい。ＬＥＣは、任意の抗生物質抵抗性遺伝子および／またはリン酸バックボーンを含んでいなくてもよい。ＬＥＣは、所望の薬剤遺伝子発現に関連しない他の核酸配列を含んでいなくてもよい。
【００６７】
ＬＥＣは、線状にすることが可能な任意のプラスミド由来であってもよい。プラスミドは、薬剤発現可能であってもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、薬剤をコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を薬剤に翻訳できるようにすることが可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【００６８】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（プエルトリコ／３４）およびｐＭ２（ニューカレドニア／９９）由来であってもよい。
（３）プロモーター、イントロン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナル
【００６９】
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素であり、本明細書に記載の薬剤配列を転写する。異種核酸の発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、ベクターの転写開始部位から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置され得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく対応し得る。
【００７０】
プロモーターは、薬剤をコードする核酸配列と、転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルとに機能的に連結し得る。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内で効率的な発現を示す他のプロモーターであってもよい。
【００７１】
ベクターは、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を持つエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率よい終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、異なる遺伝子から得てもよい。
ｃ．治療剤の賦形剤および他の成分
【００７２】
治療剤は、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【００７３】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で治療剤中に存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝的構築物と一体化させて投与してもよい。ＤＮＡプラスミド治療剤は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。治療剤中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００７４】
治療剤は、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるような遺伝的促進剤をさらに含み得る。
【００７５】
治療剤は、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能な治療剤医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。治療剤は、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。治療剤は、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
３．治療方法
【００７６】
本発明はまた、治療を必要とする被検体における低酸素症または虚血の治療方法に関する。この方法は、被検体に本明細書で開示している治療剤を投与することを含み得る。治療剤が投与される被検体は、毛細血管密度を高くすること、側副血管形成を促進すること、血管径を大きくすること、またはそれらの組み合わせが可能である。治療剤が投与される被検体において、組織かん流が増加し得る。治療剤が投与される被検体において、組織壊死が減少し得る。
【００７７】
低酸素症または虚血は、重篤な肢虚血、末梢動脈疾患、創傷治癒、血管疾患、循環器疾患、冠動脈疾患、心臓血管疾患、糖尿病またはそれらの組み合わせに関連し得る。低酸素症または虚血は重篤な肢虚血に関連し得る。治療方法は、治療を必要とする被検体において、重篤な肢虚血を低減、除去または防止し得る。
【００７８】
治療剤の用量は、１μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよい。治療剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日おきに投与することができる。効果的な治療のための治療剤の投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であってもよい。
ａ．投与
【００７９】
治療剤を、薬学技術分野の当業者に周知の標準的な技術に従って調製することができる。かかる組成物を、特定の対象の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の用量および技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、またはマウスなどの哺乳類であり得る。
【００８０】
治療剤を、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与において、治療剤は、免疫反応を誘導するのに十分な量で投与される。治療的適用の場合、治療剤は、治療的作用を誘発するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のための有効量は、例えば、投与されるワクチン療法の特定の組成物、投与様式、疾患の段階および重症度、患者の全身健康状態、および処方する医師の判断に依存するであろう。
【００８１】
治療剤は、ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７〜６４８（１９９７）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９６年１２月３日に公布された米国特許第５，５８０，８５９号）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９７年１２月３０日に公布された米国特許第５，７０３，０５５号）；およびカーソン（Ｃａｒｓｏｎ）ら（１９９７年１０月２１日に公布された米国特許第５，６７９，６４７号）に記載されているように当該技術分野で周知の方法によって投与され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。治療剤のＤＮＡは、例えば、粒子またはビーズと複合体を形成して、これをワクチン銃を用いて個体に投与することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを承知している。
【００８２】
治療剤を、多様な経路によって送達してもよい。典型的な送達経路には、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が含まれる。他の経路には、経口投与、鼻腔内、および膣内経路が含まれる。特にＤＮＡ治療剤に関して、治療剤を、個体の組織の間質空間に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，７０３，０５５号、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。治療剤は、筋肉に投与してもよいし、または、皮内または皮下注射を通して、あるいは、イオン導入法（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による経皮投与を通して投与してもよい。治療剤の表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激物質に対する免疫反応を刺激するために、表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
また、治療剤を、鼻腔内経路を通して投与するために調製することができる。担体が固体であって鼻腔投与に適した製剤には、粒径、例えば約１０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する目の粗い粉末が含まれ、鼻から吸うように投与される、すなわち、鼻に近づけて保持した粉末容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。製剤は、点鼻スプレー、点鼻薬、またはネブライザーによるエアロゾル投与であってもよい。製剤は、治療剤の水溶液または油性溶液を含み得る。
【００８４】
治療剤は、懸濁剤、シロップ、またはエリキシル剤などの液体調製物であり得る。また、治療剤は、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射投与）用の製剤、例えば、滅菌懸濁液またはエマルションであり得る。
【００８５】
治療剤は、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリクスに組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ巻〜ＩＩＩ巻（第２版、１９９３）、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、作製および投与が比較的単純な、非毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【００８６】
治療剤は、米国特許第７，６６４，５４５号に記載の方法によりエレクトロポレーションを介して投与することができる。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、米国特許第６，３０２，８７４；同第５，６７６，６４６号；同第６，２４１，７０１号；同第６，２３３，４８２号；同第６，２１６，０３４号；同第６，２０８，８９３号；同第６，１９２，２７０号；同第６，１８１，９６４号；同第６，１５０，１４８号；同第６，１２０，４９３号；同第６，０９６，０２０号；同第６，０６８，６５０号；および同第５，７０２，３５９号に記載の方法および／または装置によってであってもよく、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、最小侵襲装置を介して行ってもよい。
【００８７】
最小侵襲性電気穿孔装置（「ＭＩＤ」）は、上述の治療剤および関連流体を体組織に注入する装置であり得る。装置は、中空針、ＤＮＡカセット、および流体送込み手段を含んでもよく、装置は、針の体組織への挿入中にＤＮＡを体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間にＤＮＡおよび関連流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入されるＤＮＡのより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減され得る。
【００８８】
ＭＩＤは、針を使用せずに治療剤を組織に注入することができる。ＭＩＤは、治療剤が組織表面を貫通し、下層の組織および／または筋肉に入るような力で、治療剤を小さなストリームまたはジェットとして注入することができる。小さなストリームまたはジェットの背後にある力は、マイクロオリフィスを通じた二酸化炭素などの圧縮ガスを瞬時に膨張させることで提供することができる。最小侵襲性電気穿孔装置およびそれらの使用方法の例については、米国公開特許出願第２００８０２３４６５５号；米国特許第６，５２０，９５０号；米国特許第７，１７１，２６４号；米国特許第６，２０８，８９３号；米国特許第６，００９，３４７号；米国特許第６，１２０，４９３号；米国特許第７，２４５，９６３号；米国特許第７，３２８，０６４号；および米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
ＭＩＤは、痛みを伴わずに組織を貫通する液体の高速ジェットを生成する注射器を含み得る。かかる針なし注射器は市販されている。本明細書で利用することができる針なし注射器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号；同第４，４４７，２２３号；同第５，５０５，６９７号；および同第４，３４２，３１０号に記載のものが挙げられ、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
直接的または間接的な電気輸送に適した形態の所望の治療剤を、針なし注射器を用いて、治療対象組織に導入する（例えば、注入する）ことができる。これは、通常、組織表面に注射器を接触させ、治療剤を組織に貫通させるのに十分な力で薬剤をジェット送達させて行う。例えば、治療対象組織が粘膜、皮膚、または筋肉の場合、薬剤を角質層を通じて皮層へ、または下層組織および筋肉それぞれへと貫通させるのに十分な力で、粘膜または皮膚表面に向けて薬剤を発射する。
【００９１】
針なし注射器は、全タイプの組織、特に、皮膚および粘膜に治療剤を送達するのに適している。いくつかの実施形態において、針なし注射器は、治療剤を含む液体を表面および対象の皮膚または粘膜に進ませるのに用いることができる。本発明の方法を用いて治療することができる様々なタイプの組織の代表的な例としては、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００９２】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針状電極を有し得る。例えば、長方形または正方形パターンにセットされた複数の電極アレイにおける複数対の電極間にパルスを発生させることで、一対の電極間にパルスを発生させるよりも優れた結果がもたらされる。「薬剤および遺伝子の仲介送達用針電極（Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｓ）」と題された米国特許第５，７０２，３５９号に開示されているものは、針アレイであり、治療的処置中に複数対の針にパルス発生させ得るものである。参照によりその内容全体が完全に本明細書に組み込まれる該出願において、針は、円形配列で設置されているが、対向する対の針状電極間にパルスを発生させることが可能な接続器および切替装置を有する。一対の針状電極を用いて、組み換え発現ベクターを細胞に送達することができる。かかる装置およびシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、ＤＮＡの注入、および、通常の注射針に似た単一針によるエレクトロポレーションが可能な単一針装置を用いて、現在使用されている装置によって送達する場合よりも低い電圧パルスを印加することで、患者が受ける電気が走ったような感覚を減らすことができる。
【００９３】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを含み得る。アレイは、同一直径または異なる直径の２つ以上の針を含み得る。針は等間隔または不等間隔に配置されていてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ；または０．０１５インチ〜０．０２０インチであり得る。針は、直径０．０１７５インチであり得る。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔で配置されていてもよい。
【００９４】
ＭＩＤは、１つのパルス発生器と、治療剤を送達し、シングルステップでエレクトロポレーションパルスを与える２つ以上の針注射器とからなり得る。パルス発生器により、パーソナルコンピュータ操作によるフラッシュカード経由でパルスや注入パラメータをフレキシブルにプログラミングできるだけでなく、エレクトロポレーションおよび患者データを包括的に記録・保存することができる。パルス発生器は、様々な電圧パルスを短時間で送達することができる。例えば、パルス発生器は、長さ１００ミリ秒（ｍｓ）の１５ボルトのパルスを３回送達することができる。かかるＭＩＤの例としては、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されているイノビオバイオメディカル社（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製のＥｌｇｅｎ１０００システムであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
ＭＩＤは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（イノビオファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）装置およびシステムであってもよく、これは、生体または植物の選択された組織の細胞へＤＮＡなどの高分子の導入を円滑にするためのモジュール式の電極システムである。モジュール式の電極システムは、複数の針状電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針状電極への導電性連結を提供する電気接続器；および電源を含み得る。操作者は、支持構造に搭載される複数の針状電極を握り、生体または植物の選択された組織の中へそれをしっかりと挿入することができる。次いで皮下注射針を介して選択された組織の中に高分子を送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が活性化され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが印加される。印加された定電流の電気パルスは複数の電極間で細胞への高分子の導入を促進する。細胞の過熱による細胞死は、定電流パルスにより組織内の電力消費を制限することで最小化される。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置およびシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ１０００システム（イノビオファーマシューティカルズ社製）であり得る。Ｅｌｇｅｎ１０００システムは、中空針と流体送込み手段とを備える装置を含んでもよく、該装置は、針の体組織への挿入中に本明細書に記載の治療剤である流体を体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入される流体量のより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減されると考えられる。
【００９７】
流体の自動注入は、注入される流体の実際の投与量の自動的な監視および登録を容易にする。このデータは所望なら、証拠資料用に制御ユニットにより記憶できる。
【００９８】
注入速度は直線的であっても、非直線的であってもよく、注入は、針が治療対象の皮膚を通って挿入された後でかつそれらがさらに体組織に挿入される間に実行されることが理解されるであろう。
【００９９】
本発明の装置によって流体を注入するのに適した組織は、腫瘍組織、皮膚、または肝組織を含むが、筋肉組織であってもよい。
【０１００】
装置は、体組織への針の挿入をガイドする針挿入手段をさらに含む。流体の注入速度は、針の挿入速度により制御される。これは、注入速度に対し挿入速度を所望通りに整合できるように、針の挿入と流体の注入の両方を制御できるという利点を有する。それはまたユーザにとって装置をより操作しやすくする。所望なら、針を体組織に自動的に挿入する手段を設けることもできる。
【０１０１】
ユーザは、流体の注入を開始すべき時点を選ぶことができる。しかしながら理想的には、注入は針の先端が筋肉組織に到達したときに開始され、装置は針が流体の注入が始まる十分な深さまで挿入された時点を感知する手段を含む。これは、針が所望の深さ（これは通常は筋肉組織が始まる深さであろう）に到達したときに流体の注入が自動的に始まるようにできることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍ（この値は針が皮膚層を通り抜けるのに十分であると思われる）の値等の予め設定された針の挿入深さとなるように取ることもできる。
【０１０２】
感知手段は、超音波プローブを含み得る。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知する手段を含み得る。この場合、この手段はそれ自体、体組織内の針の深さを記録しなくてもよいが、むしろ針が種々のタイプの体組織から筋肉に移動しながらインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するようになっている。これらの代案のいずれも、比較的正確で操作が簡単な注入開始感知手段を提供する。所望なら針の挿入深さがさらに記録でき、それは流体の注入を制御するために使用でき、それにより針の挿入深さが記録されながら注入すべき流体の量が決定される。
【０１０３】
装置は、針を支持する基体と、中に基体を受容するハウジングとをさらに含み、基体がハウジングに対して第１の後方位置にあるときに針がハウジング内に引っ込められ、基体がハウジング内の第２の前方位置にあるときに針がハウジングから出ているように、基体はハウジングに対して移動可能である。これは、ハウジングが患者の皮膚の上に並べられ、そうして基体に対してハウジングを移動することにより針を患者の皮膚に挿入できるので、ユーザにとって好都合である。
【０１０４】
上に述べたように、針が皮膚に挿入されながら、針の長さに渡り流体が一様に分布するように制御された流体注入速度を達成することが望ましい。流体送込み手段は、制御された速度で流体を注入するようになっているピストン駆動手段を含み得る。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータにより駆動することもできる。しかしながら、ピストン駆動手段は、基体がハウジングに対して軸方向に移動されることにより作動され得る。流体送達の代わりの手段を設けてもよいことが理解されるであろう。従って、例えば、制御された、あるいは制御されない速度で流体を送達するために搾り出しができる閉じられた容器を注射器およびピストンシステムの代わりに設けることもできる。
【０１０５】
上記の装置は、どのようなタイプの注入にも使用できる。しかしながら、エレクトロポレーションの分野において特に有用であると考えられ、従って、それは、針に電圧を印加する手段をさらに含み得る。これは針が注入に使用されるだけでなく、エレクトロポレーション中の電極としても使用されることを可能にする。これは、電界が注入される流体と同じ領域に印加されることを意味するので特に好都合である。エレクトロポレーションには、前に注入された流体に電極を正確に合わせることが非常に難しいという問題が伝統的にあり、従って、注入された物質と電界の間の重なりを保証しようとして、ユーザは大きい領域に渡り必要以上に大量の流体を注入し、また大面積に渡り電界を印加する傾向にあった。本発明を使用すれば、電界と流体の良好な適合を達成しつつ、流体の注入量と電界の印加サイズの両方を減少できる。
【０１０６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０１０７】
４．実施例
実施例  １
実施例２乃至５についての材料および方法
【０１０８】
実施例２乃至５における下述に開示した実験においては、実施例１における本明細書で説明している方法を使用し、組織虚血中の血管形成のシミュレーションを研究した。特に、この研究では、組織虚血中のＨＩＦ−１αによる血管形成のシミュレーションを調査した。構成的に発現されたＨＩＦ−１α遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド（上記されていて、ゆえに、アラニン置換に対してプロリンを含む）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔（ＥＰ）または筋肉内（ＩＭ）注射のみにより投与された。
【０１０９】
方法の概要
【０１１０】
左大腿動脈結紮が、３つのグループ、すなわち、（１）ＨＩＦ−ＥＰ（ｎ＝１３）、（２）ＨＩＦ−ＩＭ（ｎ＝１４）および（３）空（ｅｍｐｔｙ）プラスミド（ｐＶＡＸ）−ＥＰ（ｎ＝１２）に割り当てられたマウスにおいて行われた。ＨＩＦ−１αまたはｐＶＡＸ  ＤＮＡ（５μｇ／μＬの２０μＬの各々）の単回用量が虚血内転筋に注入され、ＥＰにより後続された（グループ１および３）。グループ２のマウスは、ＨＩＦ−１αプラスミドＤＮＡのみのＩＭ注入を受ける。結紮前から結紮０、３、７、１４および２１日後まで、レーザドップラかん流イメージャにより定量化された肢かん流回復、肢機能および肢壊死が、下記で詳細に説明するように、測定された。２１日目に、生存していたマウス（グループ当たり４乃至５匹）が犠牲になり、内転筋組織が、下記で詳細に説明するように、ヘマトキシリンおよびエオシン、毛細血管密度（抗ＣＤ３１抗体）、および側副血管対抗平滑筋作用抗体を用いて、壊死のために変色した。
【０１１１】
詳細な方法
【０１１２】
実験プロトコル。実験が、次の変数を評価するように、すなわち、（１）超音波レーザドップラを用いて時間経過に伴う肢かん流の回復を評価し、（２）自然切断からの患肢救済および生存の程度を調査し、（３）組織壊死率を含む組織の組織学的特徴における改善を評価するように行われた（図２）。３９日の歳で性を一致させたＢａｌｂ／ｃマウスが、次の３つの処理グループ、すなわち、（１）１３匹のマウス（能動処理、ＨＩＦ−１α  ＤＮＡ／ＥＰ）、（２）１４匹のマウス（陽性制御、ＨＩＦ−１α  ＤＮＡ／ＩＭ）および（３）１２匹のマウス（陰性制御、空（ｅｍｐｔｙ）プラスミド［ｐＶＡＸ］  ＤＮＡ／ＥＰ）の１つに割り当てられた。左肢は介入を受けた一方、右肢は、マウス内の比較および測定される変数の調整のために、介入を受けなかった。２１日目の終了時に、平均してグループ当たり４乃至５匹のマウスが最終組織分析に含まれた。
【０１１３】
大腿動脈結紮。上記のマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）は、２５ｇ乃至３０ｇの重さであり、ペンシルベニア大学医学大学院における動物管理使用委員会ガイドラインによる承認後に対象とされて処理された。手術前に、マウスは、０．１ｍｌ／１０ｇ体重（マウス当たり０．２５ｍｌ乃至０．３０ｍｌ）でケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミン、ｐ  １０ｍｇ／ｋｇキシラジン）の腹腔内注射を用いて麻酔された。大腿動脈結紮は、上述のように行われた。７，８簡単にいえば、無菌的に、左大腿動脈が露出され、大腿神経および静脈から分離され、６．０シルク縫合（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖｅｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて大腿深動脈の起始部に対して末端で結紮された。皮膚は、次いで、結節４．０シルク縫合（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により閉じられた。
【０１１４】
プラスミド。左大腿動脈結紮直後に、内転筋は、３０ゲージ針を有するインスリンシリンジを用いて結紮箇所の遠位で、構成的に発現されたＨＩＦ−１ａプラスミドＤＮＡ（改変および最適化された）またはｐＶＡＸプラスミドＤＮＡが製造業者（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）の仕様にしたがって注射された。次のような処理が行われた：（１）ＨＩＦ−１αプラスミドＤＮＡの２０ｍＬ（５ｍｇ／ｍｌ）のＩＭ注入が実験グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）の左内転筋に投与され、ＥＰが後続した；（２）ＨＩＦ−１ａプラスミドＤＮＡの２０ｍＬ（５ｍｇ／ｍｌ）のＩＭ注入が、陽性制御グループ（ＨＩＦ−ＩＭ）の左内転筋に投与された；（３）ｐＶＡＸプラスミドＤＮＡの２０ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のＩＭ注入が陰性制御グループ（ｐＶＡＸＥＰ）の左内転筋に投与され、ＥＰが後続した。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ。プラスミドＤＮＡ注射直後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ方形波パルスＥＰが、３電極アレイＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＤＮＡ送達装置（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖｅｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、治療部位に対して行われた。３電極アレイは、二等辺三角形構成で３つの２６ゲージ個体ステンレススチール電極から構成される。特定のＥＰ条件が、電流０．１Ａ、２パルス、５２ｍｓ／パルス（５０乃至１００Ｖ）およびパルス間４秒で一定に設定された。プラスミド注射とＥＰとの間の継続時間は２０秒であった。プラスミド注射／ＥＰについての一連のイベントは次のようである：（１）一回使用電極アセンブリが、ハンドルのレセプタクル内に位置付けられ、ハンドルの開始ボタンが押される；（２）２０ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のＨＩＦ−１ａプラスミドＤＮＡのＩＭ注射が、３０ゲージ針を有するインスリンシリンジを用いて行われる；（３）すぐに、３アレイ針が、注射箇所の周りの領域に位置付けられる；（４）次いで、ハンドルの開始ボタンが押され、４秒時間を置いた後、パルスが送達される。続いて、アレイが内転筋から静かに除去される。同じシーケンスがｐＶＡＸ−ＥＰグループに対して繰り返される。
【０１１６】
肢かん流測定。ベースライン肢かん流測定が、レーザドップラかん流イメージャ（ＬＤＰＩ）を用いて手術前に行われ、すぐに大腿動脈の術後結紮を繰り返した。簡単にいえば、連続かん流測定が、ＬＤＰＩ（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）を用いる各時点で実行された。かん流比（結紮された肢／結紮されていない肢）が演算され、各時点で各マウスについて平均値が得られた。かん流信号が、（０）から（１０００）までの範囲のコードにおいて表示された。
【０１１７】
足運動および壊死スコア。  後肢の機能回復を評価するために、活動的な足の運動に基づくスコアリングシステムが、触ることにより、各時点で処理グループを認識できない目隠しされたオブザーバにより連続的に実行された。簡単にいえば、次のようにスコアリングが実行された：スコア０は、足を使わない；スコア１は、足を使う；スコア２は、活発に足を使う；スコア３は、全部の足を使う、または足先を広げる；スコア４は、自由闊達な運動。さらに、壊死の重症度が、各時点で安楽死を必要とするマウスを評価するように、同様に目隠しされたオブザーバによりスコアリングされた。簡単にいえば、次のようにスコアリングされた：スコア０は、壊死がない；スコア１は、チアノーゼ／変色がある；スコア２は、１つ乃至２つの足先の壊死／喪失；スコア３は、３つ乃至５つの足先の壊死／喪失；スコア４は、重篤な壊死（足の甲またはそれより上まで拡大している）である。３以上のスコアリングのまたは肢自動切断されたマウスは安楽死された。
【０１１８】
壊死および血管形成についての組織摘出および免疫組織化学。組織摘出および形態学的分析が壊死分析のために２１日目に行われた。毛細血管成長および側副血管形成／再形成のための免疫組織化学が実行された。簡単にいえば、マウスは、ＣＯ2吸入により犠牲にされ、心臓内にリン酸緩衝生理食塩水がかん流され、続いて４％のパラホルムアルデヒドがかん流された。内転筋は解剖され、４％のパラホルムアルデヒド内に４８時間留められ、クライオスタットを用いて薄片化（１０乃至１５ｍｍの切開）前にパラフィン内に埋め込まれる。形態学的分析のために、薄片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、組織壊死率を評価するために、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇメディア（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）にマウントされた。免疫蛍光染色法が実行された。簡単にいえば、ＣＤ３１についての染色が、ヒトＣＤ３１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実行され、血管内皮細胞を検出するようにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ蛍光染料（Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ）で対比染色された。ａ−ＳＭＡに対するマウスモノクローナル抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）が用いられ、血管平滑筋細胞を検出するように、Ａｌｅｘａ５６８蛍光染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）で対比染色された。マイクロ波の照射が、抗原回復のために実行された。薄片は、ペルオキシダーゼ活性をブロックするように、０．３％過酸化水素中で培養された。タンパク質ブロッキング、二次ビオチン化抗体による培養およびアビジン−ビオチン相互作用が、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実行された。壊死、毛細血管成長および側副血管形成についての定量化が、組織スライド当たり２００倍の拡大率で平均して５つのランダムに選択された視野について行われ、分析がＩｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて実行された。
【０１１９】
統計的分析。概要統計が、サンプルの大きさおよび平均値±平均値の標準誤差として提供される。分析のために演算される変数は、各々の画像のＬＤＰＩ比および各時点でのマウス毎の平均ＬＤＰＩ比を含む。同時に、臨床的足運動、壊死スコアおよび免疫組織化学分析結果が評価された。これらのデータは、一の繰り返し因子（日）および一の非繰り返し因子（処理）を有する二因子混合効果実験デザインにしたがう。手術にしたがった、日が過ぎるに伴っての処理の効果改善の存在を認識して、連続的応答変数への処理の単純な効果が、各日についての一方向一定効果モデルに適切な変化の分析により評価された。統計的に重要な差が処理グループ間で見いだされたとき、処理グループの対間比較における差が、各日についての複数の比較に対するボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ）補正の適用により評価された。変化の分析に対する仮定が適切でないように現れたとき、ウイルコクスン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和ノンパラメトリック検定が実行された。肢壊死スコア対処理グループの分割表が、処理グループ間の肢壊死スコア差の分布を評価するためにピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）無修正χ2試験により分析された。すべての仮説の試験について、タイプＩ誤差（ａ）は、統計的重要性を表すために、０．０５に固定された。すべての分析は、ＳＴＡＴＡ（中間冷却）、バージョン１１統計ソフトウェア（ＳＴＡＴＡＣｏｒｐ，ＬＰ，Ｃｏｌｌａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて実行された。
実施例２
ＨＩＦ−１αＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰおよび肢血流回復
【０１２０】
肢血流回復が、ＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ媒介送達およびＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのＩＭ送達を受けたマウスの虚血組織において検査された。
【０１２１】
図３Ａは、注射されたプラスミド（低酸素誘導因子ＥＰ［ＨＩＦ−ＥＰ］および空バックボーンプラスミドＤＮＡ−ＥＰ［ｐＶＡＸ−ＥＰ］）または注射されたプラスミドのみ（低酸素誘導因子筋肉内注射［ＨＩＦ−ＩＭ］）の電気穿孔（ＥＰ）により後続される大腿動脈結紮後の後肢血流の時間的経過を示している。図３Ａは、代表的なレーザドップラかん流画像（ＬＤＰＩ）が示された日数に関して記録され、かん流信号がコードで表示され、すなわち、悪いかん流は（０）であり、良いかん流は（１０００）であった。
【０１２２】
血流の急性減少は、左肢（結紮され、白色矢印で示されている）において、大腿動脈結紮後０日で明らかである（図３Ａ）。したがって、これらのＬＤＰＩ測定は、０日における結紮されていない肢に比べて、結紮された肢において急性に減少した血流を示し、成功裏の大腿動脈結紮と矛盾がない（図３Ａ）。持続的血流回復が、他の２つのグループ（ＨＩＦ−ＩＭおよびｐＶＡＸ−ＥＰ）に比べて、ＨＩＦ−ＥＰにより処理されたグループにおいて観察された（図３Ａ）。
【０１２３】
さらに、連続ＬＤＰＩ測定が、結紮された肢において、しかし変化しやすい速度でかつ一貫性で、安定した血流回復を示した。血流回復は、能動処理グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）および陽性制御グループ（ＨＩＦＩＭ）において３日目乃至７日目で明らかであった。両方のグループにおいては１４日目で回復は低下するが、２１日目に回復は増加した。全体的に、ＨＩＦ−ＥＰマウスは、ＨＩＦ−ＩＭマウスと比べて、３日目から１４日目まで類似した血流回復を有していた。
【０１２４】
図３Ｂは、ＥＰにより後続される低酸素誘導因子１アルファ（ＨＩＦ−１α）ＤＮＡによる処理がマウスにおける肢かん流回復後大腿動脈結紮により改善されたことを示す。肢かん流回復が、ＬＤＰＩを用いて、術前の日から術後２１日目を経て連続的に行われた。平均かん流比（結紮された肢／結紮されていない肢）が、各時点においておよび各処理グループについて各マウスに対して演算された。データは、２１日目を経て統計的な重要性のために、平均値±平均値の標準誤差（各動物におけるエラーバー）と表された（Ｐ＜０．０５）。*ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ；Ｐ＜０．００１；**ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ；Ｐ＜０．０１；およびaＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ；Ｐ＜０．０５。ＨＩＦ−ＥＰとＨＩＦ−ＩＭとの間の肢血流における重要な改善が、２１日目に検出された（１．０３±０．１５対０．７８±０．０６４；図３Ｂ）。血流改善は、ｐＶＡＸ−ＥＰグループにおいてかなり遅い速度で維持された。
実施例３
ＨＩＦ−１αＤＮＡの肢機能回復およびｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ
【０１２５】
肢機能回復が、ＨＩＦ-１αＤＮＡプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏ−ＥＰ媒介送達およびＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのＩＭ送達を受けるマウスの虚血組織において検査された。
【０１２６】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、ＨＩＦ−ＥＰ、ＨＩＦ−ＩＭ、ｐＶＡＸ−ＥＰによる大腿動脈処理結紮および処理後の重篤な肢虚血の回復、ならびに正常な偽処理肢のそれぞれを示す。図３Ｃは、臨床足運動が、ＥＰにより後続されたＨＩＦ−１αＤＮＡにより処理されたマウスにおいて大腿動脈結紮後に改善されたことを示す。足運動は、虚血誘導後の機能性欠損を評価するための機能性読み取りパラメータとして、決定され、０乃至４でスコア付けされた。能動足運動は、ｐＶＡＸ−ＥＰマウスにおいてかなり悪化するが、２１日目にＨＩＦ−ＥＰマウスにおいてかなり改善された。そのデータは、統計的な重要性のために、平均値±平均値の標準誤差（各マウスにおけるエラーバー）と表された（Ｐ＜０．０５）。*ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ；Ｐ＜０．００１；**ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ；Ｐ＜０．０１；およびaＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ；Ｐ＜０．０５。
【０１２７】
これらのデータは、すべての３つの処理グループに対して０日目に急性肢機能性障害が存在したことを示す。ＨＩＦ−ＥＰおよびＨＩＦ−ＩＭマウスは、３日目乃至１４日目に肢機能の類似した改善を示した。足運動スコアにおける統計的に重要な差異が、２１日目にみられ（３．５±０．５８対２．４±１．１４；Ｐ＜０．０５）、足運動スコアは、ＨＩＦ−ＩＭマウスに比べて、ＨＩＦ−ＥＰマウスによりかなり高くなった。ｐＶＡＸ−ＥＰマウスは、２１日目を経るまですべてで肢機能回復が最悪であることを示した（図３Ｃ）。
実施例４
ＨＩＦ−１αＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰおよび肢壊死
【０１２８】
肢壊死が、ＨＩＦ-１αＤＮＡプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏ−ＥＰ媒介送達およびＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのＩＭ送達を受けるマウスの虚血組織において検査された。
【０１２９】
図３Ｄは、臨床肢壊死スコアが、ＥＰにより後続されたＨＩＦ−１αにより処理されたマウスにおいて２１日目を経て改善されたことを示す。０乃至４の臨床スコアリングシステムは、大腿動脈結紮後の肢壊死の割合を決定するように用いられ、３以上のスコアを有するマウスは重篤な壊死を有するとみなされ、安楽死された。多くのｐＶＡＸ−ＥＰマウスが、ＨＩＦ−ＥＰおよびＨＩＦ−ＩＭマウスに比べて、３以上のスコアで肢壊死を有し、ゆえに、安楽死が必要であった。データは、統計的な重要性のためにＰ＜０．０５において、３９匹のマウスについて２１日を経て、平均値±平均値の標準誤差（エラーバー）とまとめられた（ＨＩＦ−ＥＰ、ｎ＝１３；ＨＩＦ−ＩＭ、ｎ＝１４；ｐＶＡＸ−ＥＰ、ｎ＝１２）。
【０１３０】
これらのデータは、肢機能回復が、重篤な壊死または自然切断のための壊死の度合いおよび／または安楽死の必要性に関連することを示した。ＨＩＦ−ＥＰマウスは、肢壊死の割合が最も低く（肢壊死スコアが３以下）、ＨＩＦ−ＩＭマウスに比べて自然切断は安楽死を必要とし（７７％  ６  １２％対４３％  ６  １４％；Ｐ＜０．０５）、ＨＩＦ−ＥＰはｐＶＡＸ−ＥＰに比べてもそうである（７７％  ６  １２％対１７％  ６  １１％；Ｐ＜０．０１；図３Ｄ）ことを示した。
実施例５
組織壊死、毛細血管密度、側副血管および血管面積
【０１３１】
組織壊死、毛細血管密度、側副血管および血管面積が、ＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏ−ＥＰ媒介送達およびＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのＩＭ送達を受けるマウスの虚血組織において検査された。
【０１３２】
壊死の、ＣＤ３１−陽性内皮細胞、およびα−ＳＭＡ陽性血管についてのヘマトキシリン、エオシンおよび免疫蛍光染料で２１日目に染色された内転筋組織薄片の代表的な顕微鏡写真が図５Ａおよび５Ｃのそれぞれに示されている。図５Ａは、陽性制御グループ（低酸素誘導因子−筋肉内注射［ＨＩＦ−ＩＭ］に比べて、陰性制御グループ（空バックボーンプラスミドＤＮＡ−電気穿孔［ｐＶＡＸ−ＥＰ］において結紮された筋肉内に壊死組織領域が存在することを示す、２１日目にヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された内転筋組織薄片の代表的な顕微鏡写真（元の倍率、２００倍）を示す。能動処理グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）においては、壊死浸潤炎症細胞はあまりない。
【０１３３】
図５Ｃは、毛細血管密度を定量化するよう、２１日目にＣＤ３１＋毛細血管に対して染色された内転筋組織の代表的な顕微鏡写真（元の倍率、２００倍）を示す。ＣＤ３１＋毛細血管の数は、陰性制御治療（ｐＶＡＸ−ＥＰ）および陽性制御（ＨＩＦ−ＩＭ）を受けた肢筋肉に比べて、ＨＩＦ−ＥＰ処理を受けた結紮された肢筋肉において、より多い。
【０１３４】
図５Ｂは、まとめられた定量的データが、陽性制御グループ（ＨＩＦ−ＩＭ）および陰性制御グループ（ｐＶＡＸ−ＥＰ）に比べて、能動処理グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）において壊死組織の面積の割合がかなり少ないことを表していることを、示している。データは、Ｐ＜０．０５で設定された統計的な重要性のために、平均値±平均値の標準誤差（エラーバー）として表された。*Ｐ＜０．００１（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ）；**Ｐ＜０．０１；（ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）；および#Ｐ＜０．０００１；（ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）。ＨＩＦ−ＥＰマウスは、２１日目の制御マウスに比べて、より少ない内転筋壊死を有する（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ、２０．７％±１．７５％対４４％±３．７３％；Ｐ＜０．００１；ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、２０．７％±１．７５％対６０．０５％±２．１７％；Ｐ＜０．０００１；およびＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、４４％±３．７３％対６０．０５％±２．１７％；Ｐ＜０．０１；図５Ｂ）。
【０１３５】
図５Ｄは、陰性制御グループ（ｐＶＡＸ−ＥＰ）および陽性制御グループ（ＨＩＦ−ＩＭ）に比べて、能動処理グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）においてＣＤ３１＋毛細血管密度がかなり高いことを示す定量的データのまとめを示している。データは、Ｐ＜０．０５で統計的な重要性のために、平均値±平均値の標準誤差（エラーバー）として表された。*Ｐ＜０．００１（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ）；**Ｐ＜０．００１；（ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）；および#Ｐ＜０．０００１；（ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）。毛細血管密度（ＣＤ３１＋内皮細胞）は、制御グループ（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ、９６．８３±５．７２血管／高電力フィールド［ｈｐｆ］対６２．８７±２．０血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００１；ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、９６．８３±５．７２血管／ｈｐｆ対３９．３７±２．７６血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．０００１；およびＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ／ＥＰ；６２．８７±２．０血管／ｈｐｆ対３９．３７±２．７６血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００１；図５Ｄ］に比べて、ＨＩＦ−ＥＰマウスの内転筋において増加した。
【０１３６】
図６Ａは、陰性制御グループ（空バックボーンプラスミドＤＮＡ−ＥＰ［ｐＶＡＸ−ＥＰ］）および陽性制御グループ（低酸素誘導因子−筋肉注射［ＨＩＦ−ＩＭ］）に比べて、能動処理グループ（低酸素誘導因子−電気穿孔［ＨＩＦ−ＥＰ］において滑らかな筋肉の働き（ＳＭＡ）＋血管（血管再構築／側副）がかなり活発であることを表す、まとめられた定量的なデータを示す。データは、Ｐ＜０．０５で統計的な重要性のために、平均値±平均値の標準誤差（エラーバー）として表された。*Ｐ＜０．０００１（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ）；**Ｐ＜０．０００１；（ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）；および#Ｐ＜０．００１；（ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）。側副血管数／血管再構築はまた、制御グループに比べて、ＨＩＦ−ＥＰマウスにおいて増加される（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ、７６．３３±１．９４血管／ｈｐｆ対３７．５±１．５６血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．０００１；ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸＥＰ、７６．３３±１．９４血管／ｈｐｆ対１８．５±１．３４血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００００１；およびＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、３７．５±１．５６血管／ｈｐｆ対１８．５±１．３４血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００１；図６Ａ）。
【０１３７】
図６Ｂは、陰性制御グループ（ｐＶＡＸ−ＥＰ）および陽性制御グループ（ＨＩＦ−ＩＭ）に比べて、能動処理グループ（ＨＩＦ−ＥＰ）において全面積（μｍ2）でＳＭＡ＋血管がかなり大きいことを示す定量的データのまとめを示す。統計的重要性がＰ＜０．０５に設定された。*Ｐ＜０．００１（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ）；**Ｐ＜０．０５；（ＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）；および#Ｐ＜０．０００１；（ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ）。全血管面積は、制御グループに比べて、ＨＩＦ−ＥＰマウスにおいてより大きい（ＨＩＦ−ＥＰ対ＨＩＦ−ＩＭ、１５５２１．６７±１２９８．１６μｍ2対７７８８．８７±３９２．０４μｍ2；Ｐ＜０．００１；ＨＩＦ−ＥＰ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、１５５２１．６７±１２９８．１６μｍ2対４６４０．２５±６１４．０１μｍ2；Ｐ＜０．０００１；およびＨＩＦ−ＩＭ対ｐＶＡＸ−ＥＰ、７７８８．８７±３９２．０４μｍ2対４６４０．２５±６１４．０１μｍ2；Ｐ＜０．０５；図６Ｂ）。
実施例６
実施例２乃至５の結果のまとめ
【０１３８】
上記の調査をまとめると、ＨＩＦ−１αＤＮＡプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ媒介送達は肢虚血のマウスモデルにおける新血管形成を改善した。具体的には、この調査は、ＨＩＦ−１αＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰが肢かん流（ＨＩＦ−ＥＰ：１．０３±０．１５対ＨＩＦ−ＩＭ：０．７８±０．０６４；Ｐ＜０．０５，対ｐＶＡＸ−ＥＰ：０．４１±０．０１９；Ｐ＜０．００１）と、肢機能回復（ＨＩＦ−ＥＰ：３．５±０．５８対ＨＩＦ−ＩＭ、２．４±１．１４；Ｐ＜０．０５、対ｐＶＡＸ−ＥＰ：２．４±１．１４；Ｐ＜０．００１）と、２１日目の肢自然切断（ＨＩＦ−ＥＰ：７７％±１２％対ＨＩＦ−ＩＭ：４３％±１４％；Ｐ＜０．０５対ｐＶＡＸ−ＥＰ：１７％±１１％；Ｐ＜０．０１）とをかなり改善した。
【０１３９】
上記調査はまた、内転筋組織壊死が減少され（ＨＩＦ−ＥＰ：２０．７％±１．７５％対ＨＩＦ−ＩＭ：４４％±３．７３；Ｐ＜０．００１、対ｐＶＡＸ−ＥＰ：６０．０５％±２．１７％；Ｐ＜０．０００１）、毛細血管密度が増加され（ＨＩＦ−ＥＰ：９６．８３±５．７２血管／高電力フィールド［ｈｐｆ］対ＨＩＦ−ＩＭ：６２．８７±２．０血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００１、対ｐＶＡＸ−ＥＰ：３９．３７±２．７６血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．０００１）、側副血管形成が増加し（ＨＩ−ＥＰ：７６．３３±１．９４血管／ｈｐｆ対ＨＩＦ−ＩＭ：３７．５±１．５６血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．０００１、対ｐＶＡＸ−ＥＰ：１８．５±１．３４血管／ｈｐｆ；Ｐ＜０．００００１）、および、血管はより大きくなった（ＨＩＦ−ＥＰ：１５５２１．６７±１２９８．１６μｍ2対ＨＩＦ−ＩＭ：７７８８．８７±３９２．０４μｍ2；Ｐ＜０．００１対ｐＶＡＸ−ＥＰ：４６４０．２５±６１４．０１μｍ2；Ｐ＜０．０００１）。
【０１４０】
したがって、上記データは、調査の最終点（すなわち、２１日目）を経てＨＩＦ−１αプラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ媒介送達を受けるマウスにおいて、肢かん流回復、生理的肢機能、ならびに、毛細血管レベル、血管再構築および組織形態学的特徴における改善された血管分布における統計的に重要な改善を示した。ＨＩＦ−１αプラスミドＤＮＡのＩＭ送達を受けたマウスは、この調査の最終点（すなわち、２１日目）を経て、これらのゲインを維持しなかった。これらのデータは、ＨＩＦ−１αプラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏＥＰ媒介送達を受けるマウスが肢壊死および自然切断についてかなり低い割合を有することも示した。
【０１４１】
前述の詳細な説明および添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
【０１４２】
開示された実施形態に対する、様々な変更および修正は当業者に明白であろう。そのような変更および修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤および／または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2019031511.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月18日(2018.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を含む治療剤。
【外国語明細書】
2019031511000001.pdf