(57)【要約】【課題】  新たな微生物を提供すること。【解決手段】  配列番号1の塩基配列を有するDNAを含む微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の塩基配列を有するDNAを含む微生物。
【請求項２】
腸内細菌科に属する、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
受託番号NITE P-02503で特定される、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列を有するDNAを含み、下記の特性（１）〜（８）を有する微生物。
（１）グラム染色性: 陰性
（２）細菌の形態： 桿菌
（３）芽胞性： 無し
（４）運動性： 有り
（５）色素の生成: 無し
（６）酸素に対する態度: 好気性 
（７）VPテスト: 陰性 
（８）貧栄養耐性: 有り
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
新たな微生物が開示される。
【背景技術】
【０００２】
生育に必須となる栄養素が極めて低い状態を貧栄養状態と言う。また、大腸菌や酵母などをはじめとした、広範に産業利用されている微生物は、貧栄養状態では著しく生育が阻害される、または生育ができなくなる。
【０００３】
貧栄養状態で好ましく生育する貧栄養細菌としては、例えばKlebsiella属 （非特許文献1）、Methylobacterium属 （非特許文献2）、Ochroconis属 （非特許文献3）及びRheinheimera属 （非特許文献4）に属する各種細菌がある。それらのうち、特にMethylobacterium属細菌は、水道水などのほとんど有機物を含有しない水中においても良好に増殖できることが知られている （非特許文献5）。
【０００４】
一方で、多種の貧栄養細菌は、25〜30℃に至適増殖温度を有し、世代時間が約5時間前後であるため、肉眼でコロニーを確認できるまでに増殖するには、最低3〜5日を要する（非特許文献2）。
【０００５】
一般的に、広範に産業利用されている大腸菌Escherichia coli （非特許文献5）の世代時間が15〜20分前後、出芽酵母Saccharomyces cerevisiae （非特許文献6）の世代時間が1〜2時間前後と言われていることから、貧栄養細菌の世代時間は非常に長く、増殖速度が遅い。
【０００６】
また、多種の貧栄養細菌は、栄養素が豊富な培地を利用して培養すると、増殖が阻害される（非特許文献2）。このため、貧栄養細菌を利用した有用物質の生産例は、大学等の研究室レベルから企業等の産業レベルにおいても些少である。
【０００７】
従って、貧栄養状態でも生育可能な微生物の提供は、産業応用への布石となり、微生物を利用した有用物質生産の新局面を開拓するものと期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Biosci. Bioeng. (2013) 115:76-81
【非特許文献２】麻布大学雑誌(2007) 15・16:243-247
【非特許文献３】Mycol. Progress (2015) 14:6
【非特許文献４】Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2007) 57:2376-2380
【非特許文献５】Current Biology (2010) 20:1099-1103
【非特許文献６】Microbiol. Rev. (1988) 52:536-553
【非特許文献７】Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 第9版
【非特許文献８】Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria 第3版
【非特許文献９】Can. J. Biochem. Physiol. (1959) 37:911-917
【非特許文献１０】Trends Microbiol. (2003) 11: 479-487
【非特許文献１１】Mol. Biol. Evol. (1987) 4:406-425
【非特許文献１２】Nucleic Acids Res. (1994) 22:4673-4680
【非特許文献１３】J. Clin. Microbiol. (2005) 43:3297-3303
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
斯かる現状を踏まえ、新たな微生物を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく日夜鋭意研究を重ねていたところ、腸内細菌科に属する細菌であって、貧栄養状態においても生育可能な細菌を発見し、atpD遺伝子の相同性と分子生物学的な違い等から新属新種細菌であることを見出した。また、このような性質等から当該細菌が極めて有用な微生物であることを確認した。かかる知見に基づき、下記に代表される発明が提供される。
【００１１】
項１．配列番号1の塩基配列を有するDNAを含む微生物。
項２．腸内細菌科に属する、項１に記載の微生物。
項３．受託番号NITE P-02503で特定される、項１又は２に記載の微生物。
項４．配列番号１の塩基配列を有するDNAを含み、下記の特性（１）〜（８）を有する微生物。
（１）グラム染色性: 陰性
（２）細菌の形態： 桿菌
（３）芽胞性： 無し
（４）運動性： 有り
（５）色素の生成: 無し
（６）酸素に対する態度: 好気性 
（７）VPテスト: 陰性 
（８）貧栄養耐性: 有り。
【発明の効果】
【００１２】
一実施形態において、貧栄養状態で生育する微生物が提供される。この微生物は、その生育に用いる培地に添加する栄養成分の量を低減することを可能にする。よって、この微生物を例えば宿主として用いることにより、より低コストでタンパク質等の組み換え生産を行うことが可能である。一実施形態において、D-スクロース、D-セロビオース、D-トレハロース、D-マルトースなどの多糖類、D-グルコース、L-ソルボース、D-フルクトースなどの六炭糖、D-キシロース、D-リキソース、D-リボースなどの五炭糖等の幅広い糖類を資化する能力を有する微生物が提供される。この微生物を利用することにより、廃糖蜜やバイオマス由来の糖化液など多種の糖類が含まれた培地を有効利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Oligoenterobacter oligotrophica 6株のatpD遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】Oligoenterobacter oligotrophica 6株及びその近縁微生物の分子系統樹を示す図である。図中において、横棒は、各微生物種間のatpD遺伝子の塩基配列の相同性を示す。縦棒は、各微生物の系統樹上の位置関係を示す。各目盛りは、atpD遺伝子の塩基配列の相同性について、100個の塩基中1個が相違した時の横棒の長さを示す。また、数字は、相同性が同一と出た結果が1000回にうち何回出たかを示す。
【図３】Oligoenterobacter oligotrophica 6株の生育可能pHを示す。横軸は培養pHであり、縦軸はOD600値である。
【図４】Oligoenterobacter oligotrophica 6株の生育可能温度を示す。横軸は培養温度であり、縦軸はOD600値である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一実施形態において、微生物は、配列番号1の塩基配列を有するDNAを含むことが好ましい。配列番号１の塩基配列は、ATP加水分解酵素を構成するサブユニットをコードする遺伝子（atpD遺伝子）の塩基配列である。
【００１５】
ATP加水分解酵素は、アデノシン三リン酸のアデノシン二リン酸とリン酸への加水分解を触媒する。このとき発生するエネルギーは、生体内で様々な反応に利用される。従って、atpD遺伝子は配列の保存性が高く、真核生物や原核生物を問わず全ての種に存在し、生体内での機能変化に伴う遺伝子の変異が生じる可能性が極めて少ない。このため、atpD遺伝子を利用した系統解析は、微生物（特に、腸内細菌に分類される微生物）の進化系統を明らかにするための効果的な手法である。
【００１６】
配列番号１の塩基配列を有するDNAを含む微生物の種類は、任意であり特に制限されない。微生物は、原核生物及び真核生物のいずれでもよい。原核生物としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）及びそれ以外の腸内細菌を挙げることができる。真核生物としては、例えば、酵母及び糸状菌等を挙げることができる。一実施形態において、微生物は、腸内細菌科（エンテロバクター科）に属することが好ましい。
【００１７】
配列番号１の塩基配列を有するDNAを含む微生物は、本来的に当該DNAを有する微生物でも、当該DNAを導入された微生物でもよい。DNAの導入には、微生物の種類に応じたベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター等）を用いることができる。ベクターは、当該DNAの他に、プロモーター及びターミネーター等の各種調節領域を有していてもよい。配列番号１の塩基配列を有するDNAは、例えば、化学合成によって得ることができる。
【００１８】
配列番号１の塩基配列を有するDNAとしては、例えば、受託番号NITE P-02503として、2017年6月28日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD)に受託された微生物を挙げることができる。この微生物は、腸内細菌科のOligoenterobacterという新たな属に属し、Oligoenterobacter oligotrophica６株と命名されている。ここでは、「６株」又は「分離株６」とも称する。
【００１９】
一実施形態において、微生物は、貧栄養耐性を備えていることが好ましい。貧栄養耐性とは、微生物は、栄養源に乏しい環境下でも生育する能力を意味する。具体的には、後述する実施例で採用した、滅菌水に寒天末を終濃度1.5重量％で添加し、１NのKOHでpHを7.2に調整する以外は、微生物の栄養源となる物質を加えないで調製した培地（硫酸塩濃度1.5重量％以下、鉄イオン濃度0.015重量％以下、カルシウム濃度1.0重量％以下）で生育する場合に、貧栄養耐性を備えていると判断する。貧栄養耐性を備えている微生物としては、例えば、Oligoenterobacter oligotrophica６株を挙げることができる。よって、一実施形態において、好ましい微生物は、Oligoenterobacter oligotrophica６株である。
【００２０】
一実施形態において、微生物は、下記の形態的特性、培養的特性、及び生理学的特性の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又は全てを満たすことが好ましい。
【００２１】
(a) 形態的性質 
細胞の形状: 桿菌
運動性の有無: 有
胞子の形成: 無
細胞の多形性: 無し
【００２２】
【表１】
2019022462.tif 000002
【００２３】
細胞壁の脂肪酸の抽出は、Sherlock Microbial Identification System (Version 6.0) (MIDI社製、アメリカ)を用いて行われるものである。また、脂肪酸組成の分析は、TSBA6データベース (MIDI社製、アメリカ)を利用して行われるものである。
【００２４】
【表２】
2019022462.tif 000003
【００２５】
キノンの抽出は、非特許文献9に従って総脂質を抽出した後に、固相抽出カラム(Waters社製、アメリカ)を用いた分離・精製により行われるものである。キノンの測定は、超高速液体クロマトグラフACQUITY UPLC system (Waters社製、アメリカ)を用いて分析されるものである。分析条件は以下の通りである。分離カラム：Eclipse Plus C18, 3.0 (I.D.) × 150 mm, pore size 3.5 mm (Agilent technologies社製、アメリカ)、カラム温度：35℃、分離溶媒：メタノール:磯プロパノール=3:1、流速：0.5 mL/min、検出器：他波長検出器model UPPDA-E (Waters社製、アメリカ)。
【００２６】
(b) 培養的性質
以下は、普通ブイヨン寒天平板培養で24時間培養して観察した特性である。 
生育状況: 良好な生育を示す 
集落の形態: 円形、全縁滑らか、低凸状 
集落の色調: 褐色
以下は、普通ブイヨン液体培養24時間培養して観察した特性である。 
表面発育: 無し 
混濁状態:一様に分布、沈殿物無し
生育pH: 5〜10の範囲で良好な生育 (図3)。
生育温度: 20〜40℃の範囲で良好な生育(図4)。
【００２７】
(c)生理学的性質
グラム染色性: 陰性 
酸素に対する態度: 好気性 
色素の生成: 無し 
インドール産生: 無し （RapiD20E (bioMerieux社製、フランス)を使用して測定）
VPテスト: 陰性 （RapiD20E (bioMerieux社製、フランス)を使用して測定）
【００２８】
【表３】
2019022462.tif 000004
2019022462.tif 000005
【００２９】
糖の資化を含めた種々の炭素源の資化性能は、API 20E (bioMerieux社製、フランス)とAPI 50CHE (bioMerieux社製、フランス)を使用して測定されるものである。
【００３０】
【表４】
2019022462.tif 000006
【００３１】
上記酵素活性は、API-ZYM (bioMerieux社製、フランス)を使用して測定されるものである。
【００３２】
一実施形態において、微生物は、グラム染色陰性、桿菌、芽胞性無し、運動性、色素非産生で、エスクリン、ガラクチトール、尿素を資化することが好ましい。
【００３３】
コロニーの形態は、1.5%寒天末 (ナカライテスク社製)が含有されたで寒天培地を用いて37℃で24時間培養した後に観察されるものである。
【００３４】
液体培地での諸性質は普通ブイヨン培地 (極東製薬工業社製)で12時間培養後、培養液を観察して見出されるものである。ここで観察には光学測定機Eppendorf BioSpectrometer (Eppendorf社製、ドイツ)を用いることができる。
【実施例】
【００３５】
[実施例1  微生物の分離・取得]
微生物の分離源として、2015年8月27日に広島県東広島市西条町御薗宇の土壌や腐葉土から10数件の試料を採取した。サンプル各1 gを滅菌水 10 mLに懸濁し供試液とした。
【００３６】
微生物の分離に使用する寒天培地は、以下のようにして調整した。まず、滅菌水に寒天末を終濃度1.5%になるよう加え、1N KOHの添加により、pH 7.2に調整した。121℃で20分間煮沸することで滅菌処理を行い、固化したプレートを寒天培地として利用した。
【００３７】
供試液を寒天培地に塗布し、37℃で24時間平板培養後、生育してきた菌株を貧栄養耐性細菌として取得した。
【００３８】
上記の結果から、腐葉土から調整した供給液からコロニーを1株分離した。対照として、E. coli DH5α株 (RBC Bioscience社製、台湾)を寒天培地中に塗布し、同様に平板培養した。その結果、本分離株では、コロニー形成が確認できたが、E. coli DH5α株ではコロニー形成は確認できなかった。そこで、本分離株を6株と命名して下記の実験に利用した。
【００３９】
[実施例2  atpD遺伝子の塩基配列決定]
分離菌体を普通ブイヨン培地 (pH 7.2) 4 mLに植菌し、37℃で12時間浸透培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、染色体DNAをillustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare社製、イギリス)を利用して抽出した。
【００４０】
atpD遺伝子の増幅は、抽出した染色体DNAを鋳型として利用し、PCRにより行った。PCRは、KOD-Plus-Neo (東洋紡社製)にて製造業者の指示に従って実行した。反応液は、プライマーを各0.3μM、上記の鋳型DNAを50 ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、94℃にて2分間加熱、98℃にて10秒間の熱変性、50℃にて30秒間のアニーリング、68℃にて1分間の伸長反応を１サイクルとして、30サイクルの増幅反応を行った。
【００４１】
プライマーとしては、下記の塩基配列を有するものを使用した。
atpD遺伝子増幅用フォワードプライマー
5'-TGGCTACTGGAAAGATTGTCCAGG-3' (配列番号2)
atpD遺伝子増幅用リバースプライマー
5'-TTAAAGTTTTTTGGCTTTTTCCAC-3' (配列番号3) 
【００４２】
PCR後の溶液を、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega社製、アメリカ)により精製し、アガロースゲル電気泳動によりPCR増幅産物を確認した。その結果、予想される増幅産物(約1.5 kbp)の取得が確認できた。増幅産物のプラスミドpTA2へのクローニングを、TArget CloneTM (東洋紡社製)にて製造業者の指示に従って実行し、プラスミドatpD/pTA2を取得した。
【００４３】
得られたatpD/pTA2のシーケンス試料は、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社製、アメリカ)にて製造業者の指示に従って調製し、3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems社製)を利用して塩基配列を解読した。解読した塩基配列を図１に示す。
【００４４】
[実施例３  帰属分類群の決定]
上記のとおり決定した分離株のatpD遺伝子の塩基配列と、GenBankデータベース中に登録されている腸内細菌科に属する標準株のatpD遺伝子の塩基配列との相同検索を行った。
【００４５】
Voges-Proskauer試験（VP試験）を行い、本株はVP試験陰性であることを確認した。VP試験は、腸内細菌科に属する細菌を同定するための効果的な手法である。VP試験では、エムデン-マイヤーホフ経路（EM経路）で生じたピルビン酸が、ブチレングリコール発酵によりアセトイン（3-ヒドロキシ-2-ブタノン）に代謝されるかを調べ、EM経路は、10種類以上の酵素が関与する代謝経路であり、腸内細菌科に属する細菌に存在するからである。
【００４６】
次に、atpD遺伝子の塩基配列との相同検索の結果とVP試験の結果に基づいて近隣結合法(非特許文献11)とCLUSTAL W version 1.83 (非特許文献12)により分子系統樹を作製し、帰属分類群の検討を行った。図２にその結果を示す。分子系統樹の樹形から、本分離株は、腸内細菌科に属することが推察された。
【００４７】
[実施例5  分離株の生化学的な解析]
本分離株の生化学的な解析を行った結果は下記のとおりである。
【００４８】
(a) 形態的性質 
細胞の形状: 桿菌
運動性の有無: 有
胞子の形成: 無
細胞の多形性: 無し
【００４９】
【表５】
2019022462.tif 000007
【００５０】
【表６】
2019022462.tif 000008
【００５１】
(b) 培養的性質
以下は、普通ブイヨン寒天平板培養で24時間培養して観察した特性である。 普通ブイヨンは、極東製薬工業社製のものを使用した。
生育状況: 良好な生育を示す 
集落の形態: 円形、全縁滑らか、低凸状 
集落の色調: 褐色
以下は、普通ブイヨン液体培養24時間培養して観察した特性である。 
表面発育: 無し 
混濁状態:一様に分布、沈殿物無し
生育pH: 5〜10の範囲で良好な生育 (図３)。
生育温度: 20〜40℃の範囲で良好な生育(図４)。
【００５２】
(c)生理学的性質
グラム染色性: 陰性 
酸素に対する態度: 好気性 
色素の生成: 無し 
インドール産生: 無し 
VPテスト: 陰性 
【００５３】
【表７】
2019022462.tif 000009
2019022462.tif 000010
【００５４】
【表８】
2019022462.tif 000011
【００５５】
[実施例6  最類縁種との比較]
atpD遺伝子の相同性及びVP試験の結果に基づいた分子系統樹の樹形から、6株と最も類縁性の高いとされたE. hormaechei ssp. hormaechei ATCC49162T (非特許文献13)と、同様に類縁なE. hormaechei ssp. steigerwaltii EN-562T (非特許文献13)の2種の細菌を選び、各種炭素源に対する資化性の有無を比較した。その結果を表９に示す。
【００５６】
【表９】
2019022462.tif 000012
【００５７】
表９の結果から、６株は、類縁種であるE. hormaechei ssp. hormaechei ATCC49162T及びE. hormaechei ssp. steigerwaltii EN-562Tとは異なる炭素資化性を有することが分かる。
【００５８】
次に、E. hormaechei ssp. hormaechei ATCC49162T及びE. hormaechei ssp. steigerwaltii EN-562TとatpD遺伝子の同一性を比較した。その結果を表１０に示す。
【００５９】
【表１０】
2019022462.tif 000013
【００６０】
表１０に示すように、6株と最も類縁なE. hormaechei ssp. hormaechei ATCC49162TとのatpD遺伝子の同一性は98.3%であった。
【００６１】
以上の知見より、6株は、atpD遺伝子の相同性解析及びVP試験の結果、分子生物学的性質の結果から、Enterobacter属の公知の種とは区別される。これらのことから、本発明者らは6株を腸内細菌科に属する新属新種の細菌と判定し、Oligoenterobacter oligotrophica 6株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD) (日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室)に、受託日2017年6月28日に受託番号NITE P-02503として寄託した。
【図１】
2019022462.tif 000014
【図２】
2019022462.tif 000015
【図３】
2019022462.tif 000016
【図４】
2019022462.tif 000017
【配列表】
2019022462000001.app