(57)【要約】【課題】抗原と１つ以上の生体分子アジュバントとを含むワクチン、及びそのようなワクチンの投与方法を提供すること。【解決手段】抗原と１つ以上の生体分子アジュバントとを含むワクチンを、本明細書において開示する。また、対象において免疫反応を増大させるための方法を、本明細書において開示する。本方法は、それを必要とする対象に、該ワクチンを投与することを含み得る。【選択図】図２
2019031528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧからなる群から選択される１つ以上のアジュバントとを含むワクチン。
【請求項２】
前記１つ以上のアジュバントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列、またはその組み合わせによりコードされる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記１つ以上のアジュバントが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４に記載のとおりのアミノ酸配列、またはその組み合わせをコードする核酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記抗原が第１の核酸によりコードされ、かつ前記アジュバントが第２の核酸によりコードされる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
請求項４に記載の抗原と同様にコードされた核酸配列を含む抗原ペプチド、及び請求項４に記載のアジュバントと同様にコードされた核酸配列を含むアジュバントペプチドをさらに含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記抗原が、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、及びその断片からなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ＨＩＶ抗原が、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及び任意のその組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及び任意のその組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記熱帯熱マラリア原虫抗原が、スポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原を含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ＨＰＶ抗原が、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１１】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記第２の核酸が、発現ベクターをさらに含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項１３】
それを必要とする対象に、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、前記対象において免疫反応を増大させるための方法。
【請求項１４】
前記ワクチンの投与が、筋肉内投与及び皮内投与の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチンの投与が電気穿孔法を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象における免疫反応を約５０％〜約１５０％増大させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象における免疫反応を約９０％〜約１３０％増大させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象における免疫反応を約１０５％増大させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象における免疫反応を少なくとも約２．５倍に増大させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象における免疫反応を少なくとも約１．５倍に増大させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号５と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号７と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号９と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号１１と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号１３と９５％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、及びその組み合わせからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２２】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記核酸分子が１つ以上のプラスミドである、請求項２１に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗原と１つ以上の生体分子アジュバントとを含むワクチン、及びそのようなワクチンの投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／８００，３２８号に対する優先権を主張するものである。この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府の権益の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により認められた契約番号５−Ｐ３０−ＡＩ−０４５００８−１３に基づく政府支援を用いて成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
背景
ワクチンは、特定の疾患に対する保護及び／またはその治療を提供するために、個体において免疫反応を刺激するために使用される。一部のワクチンは、免疫反応を誘導する抗原を含む。一部の抗原は、強い免疫反応を誘発する一方で、他の抗原は、弱い免疫反応を誘発する。抗原に対する弱い免疫反応は、ワクチンと共にアジュバントを含めることにより強化され得る。アジュバントは、細菌及び／または病原体のアルミニウム塩、オイル、エマルジョン、滅菌構成成分などの多くの異なる形態で存在する。
【０００５】
分子アジュバントをコードする合成遺伝子も同時送達することにより、ＤＮＡワクチン誘導性免疫を高めることができる。これらのアジュバントの多くは、免疫反応及び／または防御有効性の規模または種類を増やすことによりワクチン誘導性免疫を高めることが実証されているサイトカイン及びケモカインを含んでいる。分子アジュバントを使用することにより、免疫反応を、病原体（すなわち、感染因子）特異的抗原または非病原体（すなわち、癌）抗原に対する最適な有効性のために高度にカスタマイズし、また機能的に適合させることができる。
【０００６】
これらの分子アジュバントに加えて、ワクチンはまた、多くの異なる経路（例えば、注射、経口など）で、多くの異なる組織（例えば、筋肉内、皮内など）に投与される。必ずしも各送達方法は等しくなく、個体集団内で比較的高いコンプライアンスを必要とする一方で、他の送達方法は、ワクチンの免疫原性及び／または安全性に影響を及ぼし得る。病原性及び非病原性抗原に対する最適な有効性のためにカスタマイズ可能で、機能的に適合させたワクチン接種を提供するために、安全で、より有効なアジュバント、とりわけ、特定の送達方法と組み合わせた分子アジュバントを開発することが、当技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、抗原と、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧからなる群から選択される１つ以上のアジュバントとを含むワクチンに関する。ワクチンの抗原は、第１の核酸によりコードされ、アジュバントは、第２の核酸によりコードされる。ワクチンの第１及び第２の核酸は、発現ベクターから発現され得る。ワクチンの抗原は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、またはそれらの断片からなる群から選択される。ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原、及びその組み合わせからなる群から選択され得る。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及び任意のその組み合わせからなる群から選択され得る。インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びその組み合わせからなる群から選択される。熱帯熱マラリア原虫抗原は、スポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原を含み得る。ワクチンはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。
【０００８】
本発明はさらに、対象において免疫反応を増大させるための方法であって、それを必要とする対象に請求項１に記載のワクチンを投与することを含み、その際、該ワクチンの投与が、筋肉内投与及び皮内投与の少なくとも１つを含む方法に関する。該ワクチンは、電気穿孔法により投与することもできる。本方法は、対象の皮膚組織及び筋肉組織の少なくとも１つで生じる免疫反応を増大させ、また、対象における免疫反応を約５０％〜約１５０％、または９０％〜１３０％の間、または１０５％増大させる。ワクチン接種方法において、アジュバントは、それを必要とする対象における免疫反応を少なくとも約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、または４．０倍に増大させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｂ】分子アジュバントの構築及び発現及び確認を示す。（Ａ）マウスＲｅｌＡまたはＴ−ｂｅｔ一次配列を、遺伝子的に最適化し、合成し、次いで、改変型ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングした。最適化は、Ｋｏｚａｋ配列が先行し、Ｎ末端に融合しているＩｇＥリーダーペプチド（ＩｇＥ）の包含を伴った。この図は、サブクローニングのために使用された制限酵素、翻訳開始部位（右矢印）、ＩｇＥリーダーペプチド（ＩｇＥ；斜線のバー）、タンパク質長（ａａ）、及び導入遺伝子（白色文字を有する黒色部）を示し；（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲｅｌＡ、ｐＴｂｅｔ、または空のベクター対照（ｐＶａｘ１）をトランスフェクションした後に、核抽出物からのタンパク質発現をウェスタン免疫ブロット法により分析した。タンパク質の相対的サイズ（ｋＤａ）を、示されているとおり、タンパク質特異的Ａｂを使用する検出分析により決定した。
【図１Ｃ−Ｄ】分子アジュバントの構築及び発現及び確認を示す。（Ｃ）ＲｅｌＡ強力誘導性κＢ依存性転写の過剰発現。ＨｅＬａ細胞に、ＲｅｌＡ／ｐ６５をコードする発現ベクターと共に、ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を一過性にトランスフェクトした。引き続いて、同時トランスフェクトされた細胞を４８時間にわたって成長させ、ルシフェラーゼ活性を、実施例１において記載されているとおりに決定した；（Ｄ）ＩＦＮ−γのＴ−ｂｅｔ刺激産生の過剰発現：天然ＣＤ４  Ｔ細胞に、ｐＴ−ｂｅｔまたはｐＶａｘ１のいずれかをトランスフェクトし、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で刺激し、続いて、実施例１に記載されているとおりの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、ＩＦＮ−γ産生を測定した。ＩＦＮ−γレベルはμｇ／ｍＬとして表されている。
【図２】転写因子アジュバント抗原特異的ＤＮＡワクチンが、Ｔ細胞免疫を増強することを示す。（Ａ）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４／群）に、２週間隔で、３回、ＨＩＶ−１  ｐＧａｇまたはｐＥｎｖのみを、ｐＧａｇまたはｐＥｎｖをｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔのいずれかと同時送達してワクチン接種した。他の対照群は、ｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔのみ、またはｐＶａｘ１対照であった。Ｔ細胞反応（ＣＤ８＋及びＣＤ４＋）を、３回目の免疫化の１週間後にＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析し、サブタイプＢ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（Ｂ）またはＧａｇ（Ｃ）ペプチドプールで再刺激した後の１０６個のＭＡＣＳ精製Ｔ細胞当たりのＩＦＮ−γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の結果が示されている。試料を３連で行い、エラーバーはＳＥＭを表し、統計的に有意な値は、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１で示されており、この際、これは、グラフで提供されている示されているワクチン接種群の間での比較に関する。実験を２回行ったが、独立して、同様の結果を伴った。
【図３】ｐＲｅｌＡの同時投与を伴うＤＮＡワクチン接種の後に、Ｔ細胞の増殖能力が増大することを示す。増殖反応を、ｐＥｎｖもしくはｐＧａｇのみ、ｐＲｅｌＡ分子アジュバントを伴うｐＥｎｖもしくはｐＧａｇ、または空のベクター対照ｐＶａｘ１のみの３回目のワクチン接種の７日後に測定した。脾細胞を、様々な濃度：０．５（白色のバー）、１．０（薄灰色のバー）、及び５．０（濃灰色のバー）の組換えＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（Ａ）またはＧａｇ（Ｂ）と共にインキュベートし、引き続いて、２４時間にわたって、トリチウム標識（３Ｈ）−チミジンでパルス処理した（ｐｕｌｓｅｄ）。組み込まれたチミジンを、Ａｇ刺激ウェルの平均ｃｐｍ（カウント毎分）を非刺激ウェルの平均ｃｐｍで割って算出した刺激指数（ＳＩ）として表した。ｐＲｅｌＡアジュバントマウスでのＳＩの増加倍数を、Ｅｎｖ（Ａ、右のパネル）またはＧａｇ（Ｂ、右のパネル）の各濃度について示した。試料を３連で試験した。エラーバーはＳＥＭを表し、統計的に有意な値は、グラフに示されている指示されている群の比較について提供されている。＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１。
【図４】ｐＥｎｖワクチン接種及び同時投与された転写分子アジュバントでのＢ細胞反応の改善を示す。Ｂ細胞／抗体反応を、ｐＥｎｖのみ、ｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔのいずれかと組み合わせたｐＥｎｖ、各分子アジュバントのみ、または空のベクター対照プラスミド（ｐＶａｘ１）での３回目の免疫化の７日後のワクチン接種マウス（ｎ＝４／群）の血清で評定した。抗Ｅｎｖ  ｐ１２０抗体結合力価を、ＥＬＩＳＡにより決定した。データは、平均エンドポイント力価として表されている。統計的に有意な値が示されている；＊＊＊  ｐ＜０．００１（ｐＥｎｖのみと、ｐＥｎｖ＋ｐＲｅｌＡまたはｐＥｎｖ＋ｐＴ−ｂｅｔとの比較）及び＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１（ｐＲｅｌＡのみとｐＥｎｖ＋ｐＲｅｌＡまたはｐＴ−ｂｅｔのみとｐＥｎｖ＋ｐＴ−ｂｅｔとの比較）。
【図５】分子アジュバントが、免疫化部位においてＢ細胞集団の増強を誘導することを示す。筋肉からの細胞培養をＢ２２０の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。単離細胞を、３日間にわたって培養培地中でインキュベートし、次いで、これらの細胞をＤＣサブセット（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１１ｂ＋）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋）、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセット）で染色して、単球／樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞を個々に識別した。そのような分別染色により、その後のＢ２２０発現の分析からの樹状細胞及びＴ細胞の除外が可能になった。ヒストグラムは、特異的ｍＡｂ、さらには、対照としてアイソタイプマッチした無関連ｍＡｂを使用して、もっぱらＢ細胞上でのＢ２２０＋発現を示す。対照として使用したアイソタイプマッチした無関連Ａｂのプロファイル（陰をつけたエリア）も、パネルに示されている。ＭＦＩ＝平均蛍光強度であり、これは、Ｂ２２０発現Ｂ細胞のレベルに比例する。
【図６】トランスフェクトされた細胞の、ＲｅｌＡタンパク質についての免疫染色を示す。
【図７】インターロイキン−２（ＩＬ−２）濃度対抗原をプロットしたグラフを示す。
【図８Ａ−Ｂ】（Ａ，Ｂ）ＲｅｌＡアジュバントマウスにおける合計ＩｇＧ産生を示す。
【図８Ｃ−Ｄ】（Ｃ、Ｄ）Ｔ−ｂｅｔアジュバントマウスにおける合計ＩｇＧ産生を示す。
【図９】処置群対相対的発現（百分率）をプロットしたグラフを示す。
【図１０】免疫化計画を模式的に示す。
【図１１】処置群対１０6個の脾細胞当たりのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）スポット形成コロニー（ＳＦＣ）をプロットしたグラフを示す。
【図１２】処置群対１０6個の脾細胞当たりのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）スポット形成コロニー（ＳＦＣ）をプロットしたグラフを示す。
【図１３】逆数力価（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｔｉｔｅｒ）対ＯＤ４５０ｎｍをプロットしたグラフを示す。
【図１４】（Ａ）Ｅｏｍｅｓをコードするプラスミドの図；及び（Ｂ）ウェスタンブロットのイメージを示す。
【図１５】免疫化計画を模式的に示す。
【図１６】処置群対１０6個の脾細胞当たりのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）スポット形成コロニー（ＳＦＣ）をプロットしたグラフを示す。
【図１７】ウェスタンブロットを示す。
【図１８】免疫化計画を模式的に示す。
【図１９】ペプチドプール対１０6個の脾細胞当たりのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）スポット形成コロニー（ＳＦＣ）をプロットしたグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
本発明は、分子アジュバントとして使用することにより、対象において抗原に対する免疫反応を増大させるために使用することができるワクチンに関する。分子アジュバントは、転写因子、同時刺激分子、ケモカイン、またはサイトカインであり得る。分子アジュバントは、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、ＳＴＩＮＧ、またはその組み合わせであり得る。
【００１１】
一部の場合には、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、またはＳＴＩＮＧは、抗原のみを含むワクチンと比較して、抗原の源または投与経路にかかわらず、より大きな免疫反応を対象において誘発するので、汎用アジュバントとして機能し得る。Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、またはＳＴＩＮＧはさらに、ウイルス性抗原及び寄生虫抗原の両方、例えば、個々にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、及び熱帯熱マラリア原虫抗原の免疫反応を増強し得る。一部の場合には、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の増大により実証されるとおり、筋肉及び皮膚組織の両方において免疫反応をさらに増強し得る。
【００１２】
また、本発明のワクチンは、予想外にも、抗原に対する免疫反応を増大させるように、エピトープの提示を変更または改変し得る。そのような変更は、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧに依存し得る。一部の例では、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧは、免疫系に、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧの不在下で免疫系により認識されるエピトープに加えて、抗原中の新たなエピトープを認識させ得る。他の場合には、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧは、免疫系によるエピトープ認識のランドスケープを再配置して、組織全体にわたって、また、抗原のアイデンティティまたは源を問わず、抗原に対する免疫反応を増大させ得る。
【００１３】
１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
【００１４】
本明細書で使用する「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及びその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００１５】
本明細書で使用する、「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のワクチンに添加される任意の分子を意味し得る。
【００１６】
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳類の細胞中の発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終了シグナルをさらに含むことができる。
【００１７】
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック（例えば、Ａ-Ｔ／Ｕ及びＣ-Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味する。
【００１８】
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味する。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００１９】
本明細書で使用する、「断片」または「免疫原性断片」は、哺乳類において免疫反応を誘発及び／または増大させることができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載するタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、以下に記載する核酸配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、下記に記載する核酸配列の少なくとも１つの少なくとも２０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも１００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも１５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも２００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも２５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも３５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも４５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも５５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも６５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも７５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも８５０ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９００ヌクレオチドまたはそれ以上、少なくとも９５０ヌクレオチドまたはそれ以上、あるいは少なくとも１０００ヌクレオチドまたはそれ以上を含み得る。
【００２０】
本明細書で使用する、断片または免疫原性断片はまた、哺乳類において免疫反応を誘発及び／または増大させることができるポリペプチド配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載する様々なアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。断片は、以下に記載するタンパク質の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、以下に記載するタンパク質の少なくとも１つの少なくとも２０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも３０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも４０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも５０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも６０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも７０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも８０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも９０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１００アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１１０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１２０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１３０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１４０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１５０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１６０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１７０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１８０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも１９０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも２００アミノ酸またはそれ以上、少なくとも２１０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも２２０アミノ酸またはそれ以上、少なくとも２３０アミノ酸またはそれ以上、あるいは少なくとも２４０アミノ酸またはそれ以上を含み得る。
【００２１】
本明細書で使用する、「遺伝子構築物」または「構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物または構築物を指す。
【００２２】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味する。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００２３】
本明細書で使用する、「免疫反応」は、抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳類の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫反応は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００２４】
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２５】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００２６】
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００２７】
本明細書で使用する、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または、天然及び合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
【００２８】
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現及び／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００２９】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【００３０】
本明細書で用いられる「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫を得ることを望むかまたは必要とする哺乳類を意味する。哺乳類は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはネズミであり得る。
【００３１】
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは、（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００３２】
本明細書で使用する、「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００３３】
本明細書で使用する、「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。「実質的に同一」はまた、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域に渡って、第１の核酸配列と第２の核酸配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。
【００３４】
本明細書で使用する、「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで動物を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００３５】
核酸に関して本明細書で使用する、「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
【００３６】
「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドと、さらに定義することができる。「生物活性」の代表的な例には、特異抗体に結合するか、または免疫反応を促進する能力が含まれる。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性及び免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００３７】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００３８】
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種の核酸配列を含有または包含してよい。
【００３９】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６及び９に加えて７及び８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に企図される。
【００４０】
２．ワクチン
抗原とアジュバントとを含むワクチンが本明細書において提供される。該ワクチンは、個体において抗原提示及び抗原に対する全免疫反応を増大させることができる。抗原とアジュバントとの組み合わせは、抗原のみを含むワクチンよりも効率的に免疫系を誘導する。該ワクチンはさらに、抗原内のエピトープ提示をさらに変更して、抗原のみを含むワクチンよりも、抗原に対して大きな免疫反応を誘導することができる。該ワクチンはさらに、筋肉及び皮膚などの異なる組織に投与した場合に、免疫反応を誘導することができる。
【００４１】
本ワクチンは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００４２】
本ワクチンは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、対象において、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大またはブーストし得る。該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を約７５％〜約２００％増大させ得る。あるいは、該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、約９０％〜約１３０％増大し得る。該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【００４３】
本発明のワクチンは、安全であることなど、有効なワクチンに必要な特徴を有し得るため、ワクチン自体は、病気または死を引き起こさず；ウイルスまたは細菌などの生病原体に対する暴露から生じる病気に対して防御し、細胞の感染を防止する中和抗体を誘導し；細胞内病原体に対して防御Ｔ細胞を誘導し、投与し易く、副作用もほとんどなく、生物学的安定性や投与量当たりの低コスト化をもたらすことができる。該ワクチンは、下記で検討するとおりのアジュバントと抗原を組み合わせることにより、これらの特徴の一部または全部を達成し得る。
【００４４】
ａ．アジュバント
ワクチンは、アジュバントを含み得る。分子アジュバントは、転写因子、同時刺激分子、ケモカイン、またはサイトカインであり得る。分子アジュバントは、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、ＳＴＩＮＧ、またはその組み合わせであり得る。
【００４５】
アジュバントは、核酸配列、アミノ酸配列、またはその組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはその組み合わせであり得る。また、核酸配列は、リンカーをコードする付加配列、または、ペプチド結合によりアジュバントに連結しているタグ配列を含み得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってよい。
【００４６】
（１）ＲＥＬ−Ａ
アジュバントは、転写因子Ｒｅｌ−Ａ（ＲｅｌＡ）であり得る。Ｒｅｌ−Ａ及びｃ−Ｒｅｌは、転写活性化能を持つ。特に、Ｒｅｌ−Ａは、炎症及び細胞生存における重要な成分である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、Ｒｅｌ−Ａは、κＢ依存性転写を強力に活性化することが示されている。この重要な転写因子は、適応免疫の改善を組織化し得る複数の炎症因子及び生存因子の遺伝子発現を調節する。ｐ６５としても公知のＲｅｌ−Ａは、ヒトにおいてはＲｅｌ−Ａ遺伝子によりコードされる。
【００４７】
Ｒｅｌ−Ａは、ＮＦ−κＢ複合体の一部である。ＮＦ−ｋＢ１（ｐ５０）またはＮＦ−κＢ２（ｐ５２）は、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５としても公知）、またはＲｅｌ−Ｂに結合して、ＮＦ−κＢ複合体を形成する。この二量体は、その阻害因子Ｉ−κＢに結合して細胞質内に存在する。外部刺激が、阻害因子のリン酸化及び２６Ｓプロテアソームによるそのユビキチン媒介分解を誘導する。次いで、放出されたＮＦ−κＢは、核に移動して、転写遺伝子活性化を誘導する。
【００４８】
ＮＦ−κＢは、ＤＮＡの転写を制御する二量体転写因子である。ＮＦ−κＢは、ほぼすべての動物細胞種において見出され、ストレス、サイトカイン、遊離のラジカル、紫外線照射、酸化ＬＤＬ、及び細菌性またはウイルス性抗原などの刺激に対する細胞反応に関係している。ＮＦ−κＢは、感染に対する免疫反応の調節において鍵となる役割を果たす（カッパ軽鎖は、免疫グロブリンの重要な構成要素である）。ＮＦ−κＢの不適当な調節は、癌、炎症性及び自己免疫疾患、敗血症性ショック、ウイルス感染症、ならびに不適正な免疫発現に結びつけられている。ＮＦ−κＢは、シナプス可塑性及びメモリのプロセスにも関係している。
【００４９】
Ｒｅｌ−Ａは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＲｅｌ−Ａを含ませることにより、Ｒｅｌ−Ａを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＲｅｌ−Ａを含ませることにより、Ｒｅｌ−Ａを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＲｅｌ−Ａを含ませることにより、Ｒｅｌ−Ａを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００５０】
Ｒｅｌ−Ａは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。Ｒｅｌ−Ａは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【００５１】
Ｒｅｌ−Ａはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【００５２】
Ｒｅｌ−Ａは、対象において抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、Ｒｅｌ−Ａは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、Ｒｅｌ−Ａは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、Ｒｅｌ−Ａは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【００５３】
他の実施形態において、Ｒｅｌ−Ａは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、少なくとも０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【００５４】
他の場合には、Ｒｅｌ−Ａは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【００５５】
また、Ｒｅｌ−Ａは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【００５６】
Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、翻訳の効率を増大させるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＲｅｌ−Ａの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、Ｒｅｌ−Ａをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【００５７】
Ｒｅｌ−Ａは、配列番号２をコードする最適化核酸配列の配列番号１であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒｅｌ−Ａは、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、Ｒｅｌ−Ａは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。Ｒｅｌ−Ａは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態は、配列番号１の断片に関する。断片は、配列番号１の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００５９】
配列番号１の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００６０】
配列番号２の断片を提供することができる。断片は、配列番号２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００６１】
配列番号２の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号２に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲｅｌ−Ａタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００６２】
（２）Ｔ−ｂｅｔ
アジュバントは、転写因子Ｔ−ｂｅｔであり得る。Ｔ−ｂｅｔ、Ｔ−ＰＥＴ、ＴＢＥＴ、及びＴＢＬＹＭとしても公知のＴ−ｂｏｘ転写因子ＴＢＸ２１は、ヒトにおいてはＴＢＸ２１遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、共通のＤＮＡ結合ドメイン、Ｔ−ｂｏｘを共有する遺伝子の系統的保存ファミリーのメンバーである。Ｔ−ｂｏｘ遺伝子は、発生過程の調節に関係する転写因子をコードする。Ｔ−ｂｅｔは、マウスＴｂｘ２１／Ｔｂｅｔ遺伝子のヒトオルソログである。マウスにおける研究により、Ｔｂｘ２１タンパク質は、ホールマークであるＴｈ１サイトカイン、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の発現を制御するＴｈ１細胞特異的転写因子であることが示されている。また、ヒトオルソログの発現は、Ｔｈ１及びナチュラルキラー細胞におけるＩＦＮ−γ発現と相関しており、これは、未感作Ｔｈ前駆体細胞からのＴｈ１系列の発生の開始におけるこの遺伝子の役割を示唆している。Ｔ−ｂｅｔの異所性発現は、ＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化すると共に、内因性ＩＦＮ−γ産生を誘導する。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１遺伝プログラムの活性化と、対抗するＴｈ２プログラムの抑制との両方により、未感作Ｔｈｐ細胞からのＴｈ１系列の発生を開始する。
【００６３】
Ｔ−ｂｅｔは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＴ−ｂｅｔを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＴ−ｂｅｔを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＴ−ｂｅｔを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００６４】
Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。Ｔ−ｂｅｔは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【００６５】
Ｔ−ｂｅｔはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【００６６】
Ｔ−ｂｅｔは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、Ｔ−ｂｅｔは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、Ｔ−ｂｅｔは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、Ｔ−ｂｅｔは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【００６７】
他の実施形態において、Ｔ−ｂｅｔは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【００６８】
他の場合には、Ｔ−ｂｅｔは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【００６９】
また、Ｔ−ｂｅｔは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【００７０】
Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドンおよび及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＴ−ｂｅｔの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【００７１】
Ｔ−ｂｅｔは、配列番号４をコードする最適化核酸配列の配列番号３であり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ−ｂｅｔは、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、Ｔ−ｂｅｔは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。Ｔ−ｂｅｔは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００７２】
いくつかの実施形態は、配列番号３の断片に関する。断片は、配列番号３の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００７３】
配列番号３の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号３に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００７４】
配列番号４の断片を提供することができる。断片は、配列番号４の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００７５】
配列番号４の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号４に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００７６】
（３）エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ；Ｅｏｍｅｓ）
アジュバントは、転写因子Ｅｏｍｅｓであり得る。Ｅｏｍｅｓは、転写活性化因子能を持つ。特に、Ｅｏｍｅｓは、様々な種における発生の間に、中間始原細胞及びそれらの後代の増殖において鍵となる役割を果たす。
【００７７】
Ｅｏｍｅｓは、細胞性及び／または体液性免疫反応を誘導し得る。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、Ｅｏｍｅｓは、抗ウイルス性反応の一部として活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現され、引き続いて、成熟及びエフェクター機能を調節することが示されている。また、Ｅｏｍｅｓは、免疫反応の間に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に関係しており、その際、Ｅｏｍｅｓは、溶解性エフェクター細胞の発現を調節している。特に、Ｅｏｍｅｓは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させることができる。さらに、多数の研究により、ＩＦＮ−γ調節に加えて、Ｅｏｍｅｓは、細胞溶解性エフェクター系列の特性を引き出すために重要であることが示唆されている。
【００７８】
Ｅｏｍｅｓは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＥｏｍｅｓを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＥｏｍｅｓを含ませることにより、Ｅｏｍｅｓを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＥｏｍｅｓを含ませることにより、Ｅｏｍｅｓを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００７９】
Ｅｏｍｅｓは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。Ｅｏｍｅｓは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【００８０】
Ｅｏｍｅｓはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【００８１】
Ｅｏｍｅｓは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、Ｅｏｍｅｓは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、Ｅｏｍｅｓは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、Ｅｏｍｅｓは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【００８２】
他の実施形態において、Ｅｏｍｅｓは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【００８３】
他の場合には、Ｅｏｍｅｓは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【００８４】
また、Ｅｏｍｅｓは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【００８５】
Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。Ｅｏｍｅｓをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＥｏｍｅｓの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、Ｅｏｍｅｓをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【００８６】
Ｅｏｍｅｓは、配列番号６をコードする最適化核酸配列の配列番号５であり得る。いくつかの実施形態において、Ｅｏｍｅｓは、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、Ｅｏｍｅｓは、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。Ｅｏｍｅｓは、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態は、配列番号５の断片に関する。断片は、配列番号５の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００８８】
配列番号５の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号５に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００８９】
配列番号６の断片を提供することができる。断片は、配列番号６の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００９０】
配列番号６の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号６に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＥｏｍｅｓタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００９１】
（４）ＦＬＴ３Ｌ
アジュバントは、ＦＬＴ３Ｌであり得る。ＦＬＴ３Ｌは、造血性サイトカインである。ＦＬＴ３Ｌは、クラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＦＬＴ３Ｌは、骨髄ストローマ細胞及び骨髄系細胞において発現され、両方とも、Ｂ細胞及びＴ細胞由来である。
【００９２】
ＦＬＴ３Ｌは、細胞性及び／または体液性免疫反応の調節において鍵となる役割を果たす。特に、ＦＬＴ３Ｌは、樹状細胞の調節における役割と共に、先天免疫と適応免疫との連結における役割を実証している。特に、ＦＬＴ３Ｌは、樹状細胞の発生を制御し、その際、ＦＬＴ３Ｌは、形質細胞様樹状細胞及びＣＤ８に重要である。さらに、ＦＬＴ３Ｌは、マウス、さらにはヒトにおいて、骨髄系細胞及びリンパ樹状細胞の両方の大規模展開を誘導する。
【００９３】
樹状細胞は、ＩＦＮ−γの強力な産生体である。したがって、ＦＬＴ３Ｌは、最低でも、樹状細胞のその調節により、ＩＦＮ−γの発現をアップレギュレーションし得る。
【００９４】
ＦＬＴ３Ｌは、細胞性及び／または体液性免疫反応を誘導し得る。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＦＬＴ３Ｌは、抗ウイルス性反応の一部として活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現され、引き続いて、成熟及びエフェクター機能を調節することが示されている。また、ＦＬＴ３Ｌは、免疫反応の間に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に関係しており、その際、ＦＬＴ３Ｌは、溶解性エフェクター細胞の発現を調節している。特に、ＦＬＴ３Ｌは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させることができる。さらに、多数の研究により、ＩＦＮ−γ調節に加えて、ＦＬＴ３Ｌは、細胞溶解性エフェクター系列の特性を引き出すために重要であることが示唆されている。
【００９５】
ＦＬＴ３Ｌは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＦＬＴ３Ｌを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＦＬＴ３Ｌを含ませることにより、ＦＬＴ３Ｌを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＦＬＴ３Ｌを含ませることにより、ＦＬＴ３Ｌを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００９６】
ＦＬＴ３Ｌは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。ＦＬＴ３Ｌは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【００９７】
ＦＬＴ３Ｌはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【００９８】
ＦＬＴ３Ｌは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、ＦＬＴ３Ｌは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、ＦＬＴ３Ｌは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、ＦＬＴ３Ｌは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【００９９】
他の実施形態において、ＦＬＴ３Ｌは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【０１００】
他の場合には、ＦＬＴ３Ｌは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【０１０１】
また、ＦＬＴ３Ｌは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【０１０２】
ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＦＬＴ３Ｌの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【０１０３】
ＦＬＴ３Ｌは、配列番号８をコードする最適化核酸配列の配列番号７であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３Ｌは、配列番号７に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＦＬＴ３Ｌは、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ＦＬＴ３Ｌは、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態は、配列番号７の断片に関する。断片は、配列番号７の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１０５】
配列番号７の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号７に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１０６】
配列番号８の断片を提供することができる。断片は、配列番号８の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１０７】
配列番号８の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号８に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＦＬＴ３Ｌタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１０８】
（５）ＴＷＥＡＫ
アジュバントは、ＴＷＥＡＫであり得る。ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死ファミリーのメンバーである。ＴＷＥＡＫは、多機能性サイトカインであり、そのシグナル伝達は、受容体線維芽細胞成長因子誘導性１４ｋＤａタンパク質、Ｆｎ１４／ＴＷＥＡＫＲと結合するその高い親和性に関係する。具体的には、ＴＷＥＡＫは、これだけに限定されないが、細胞分化の阻害、細胞運動性（例えば、遊走、侵襲）、細胞萎縮、細胞増殖、細胞生存、及び炎症反応を含めた細胞機能に関係している。
【０１０９】
ＴＷＥＡＫは、細胞性及び／または体液性免疫反応の調節において鍵となる役割を果たす。特に、先天免疫及び適応免疫反応の白血球がＴＷＥＡＫを放出する。引き続いて、ＴＷＥＡＫは、負傷及び／または罹患組織においてアップレギュレーションされるＦｎ１４／ＴＷＥＡＫＲに結合する。次いで、ＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４／ＴＷＥＡＫＲの複合体は、上記で挙げたとおりの細胞反応を調節する。加えて、ＴＷＥＡＫは、樹状細胞の生存、さらには、樹状細胞及びＴ細胞の活性化に関係し得る。
【０１１０】
ＴＷＥＡＫは、ＩＦＮ−γによりモジュレートされ得る。研究により、ＩＦＮ−γ刺激された単球は、ＴＷＥＡＫ発現の顕著な増大をもたらすことが示されている。
【０１１１】
ＴＷＥＡＫは、細胞性及び／または体液性免疫反応を誘導し得る。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＴＷＥＡＫは、抗ウイルス性反応の一部として活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現され、引き続いて、成熟及びエフェクター機能を調節することが示されている。また、ＴＷＥＡＫは、免疫反応の間に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に関係しており、その際、ＴＷＥＡＫは、溶解性エフェクター細胞の発現を調節している。特に、ＴＷＥＡＫは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させ得る。さらに、多数の研究により、ＩＦＮ−γ調節に加えて、ＴＷＥＡＫは、細胞溶解性エフェクター系列の特性を引き出すために重要であることが示唆されている。
【０１１２】
ＴＷＥＡＫは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＴＷＥＡＫを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＴＷＥＡＫを含ませることにより、ＴＷＥＡＫを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＴＷＥＡＫを含ませることにより、ＴＷＥＡＫを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【０１１３】
ＴＷＥＡＫは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。ＴＷＥＡＫは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【０１１４】
ＴＷＥＡＫはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【０１１５】
ＴＷＥＡＫは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、ＴＷＥＡＫは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、ＴＷＥＡＫは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、ＴＷＥＡＫは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【０１１６】
他の実施形態において、ＴＷＥＡＫは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、少なくとも０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【０１１７】
他の場合には、ＴＷＥＡＫは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【０１１８】
また、ＴＷＥＡＫは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【０１１９】
ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。ＴＷＥＡＫをコードする核酸を、コドン利用および及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＴＷＥＡＫの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【０１２０】
ＴＷＥＡＫは、配列番号１０をコードする最適化核酸配列の配列番号９であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号９に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ＴＷＥＡＫは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態は、配列番号９の断片に関する。断片は、配列番号９の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１２２】
配列番号９の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号９に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１２３】
配列番号１０の断片を提供することができる。断片は、配列番号１０の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１２４】
配列番号１０の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１０に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＴＷＥＡＫタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１２５】
（６）ＧＩＴＲＬ
アジュバントは、ＧＩＴＲＬであり得る。ＧＩＴＲＬは、自然及び後天性免疫反応をモジュレートする腫瘍壊死ファミリーのメンバーである。ＧＩＴＲＬは、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞、及びＢ細胞の細胞表面上で発現される。ＧＩＴＲＬは、その同源受容体ＧＩＴＲと反応する。
【０１２６】
ＧＩＴＲＬは、細胞性及び／または体液性免疫反応の調節において鍵となる役割を果たす。具体的には、ＧＩＴＲＬは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で発現され、その際、これは、細胞活性化の後に、アップレギュレーションされる。ＧＩＴＲＬ誘導性シグナル伝達はＥＲＫ１／２により媒介され、次いで、これは、転写因子ＮＦ−κＢの活性化の引き金を引く。ＮＦ−κＢは、ケモカイン、ＭＭＰ、及びサイトカインを含めた複数の炎症誘発性メディエーターの発現を制御する。
【０１２７】
ＧＩＴＲＬは、ＩＦＮ−γの発現をアップレギュレーションし得る。
【０１２８】
ＧＩＴＲＬは、細胞性及び／または体液性免疫反応を誘導し得る。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＧＩＴＲＬは、抗ウイルス性反応の一部として活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現され、引き続いて、成熟及びエフェクター機能を調節することが示されている。また、ＧＩＴＲＬは、免疫反応の間にＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に関係しており、その際、ＧＩＴＲＬは、溶解性エフェクター細胞の発現を調節している。特に、ＧＩＴＲＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させ得る。さらに、多数の研究により、ＩＦＮ−γ調節に加えて、ＧＩＴＲＬは、細胞溶解性エフェクター系列の特性を引き出すために重要であることが示唆されている。
【０１２９】
ＧＩＴＲＬは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＧＩＴＲＬを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＧＩＴＲＬを含ませることにより、ＧＩＴＲＬを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＧＩＴＲＬを含ませることにより、ＧＩＴＲＬを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【０１３０】
ＧＩＴＲＬは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。ＧＩＴＲＬは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【０１３１】
ＧＩＴＲＬはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【０１３２】
ＧＩＴＲＬは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、ＧＩＴＲＬは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、ＧＩＴＲＬ  Ｋは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、ＧＩＴＲＬは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【０１３３】
他の実施形態において、ＧＩＴＲＬは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【０１３４】
他の場合には、ＧＩＴＲＬは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【０１３５】
また、ＧＩＴＲＬは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【０１３６】
ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。ＧＩＴＲＬをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＧＩＴＲＬの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【０１３７】
ＧＩＴＲＬは、配列番号１２をコードする最適化核酸配列の配列番号１１であってよい。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲＬは、配列番号１１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＧＩＴＲＬは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。ＧＩＴＲＬは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態は、配列番号１１の断片に関する。断片は、配列番号１１の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１３９】
配列番号１１の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１１に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１４０】
配列番号１２の断片を提供することができる。断片は、配列番号１２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１４１】
配列番号１２の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１２に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＧＩＴＲＬタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１４２】
（７）ＳＴＩＮＧ
アジュバントは、ＳＴＩＮＧであり得る。ＳＴＩＮＧは、細胞性及び／または体液性免疫反応において鍵となる役割を有する膜貫通タンパク質である。ＳＴＩＮＧは、細胞がｄｓＤＮＡに直面したときに活性化されて、ＴＬＲの不在下で１型ＩＦＮのアップレギュレーションをもたらすＤＮＡセンサーである。１型ＩＦＮは、抗原特異的Ｂ細胞ならびにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するので、最適なＤＮＡワクチン誘導性免疫に必須である。ＳＴＩＮＧは、１型ＩＦＮの有効な産生に必須であることが示されている。
【０１４３】
ＳＴＩＮＧは、ＩＦＮ−γの発現をアップレギュレーションし得る。
【０１４４】
ＳＴＩＮＧは、細胞性及び／または体液性免疫反応を誘導し得る。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＳＴＩＮＧは、抗ウイルス性反応の一部として活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現され、引き続いて、成熟及びエフェクター機能を調節することが示されている。また、ＳＴＩＮＧは、免疫反応の間に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に関係しており、その際、ＳＴＩＮＧは、溶解性エフェクター細胞の発現を調節している。特に、ＳＴＩＮＧは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させ得る。さらに、多数の研究により、ＩＦＮ−γ調節に加えて、ＳＴＩＮＧは、細胞溶解性エフェクター系列の特性を引き出すために重要であることが示唆されている。
【０１４５】
ＳＴＩＮＧは、別個のシグナル伝達経路により、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＦＮ誘導性ケモカイン、及び腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）などの炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現の引き金を引き得る。ワクチンにＳＴＩＮＧを含ませることにより、Ｔ−ｂｅｔを含まないワクチンと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＳＴＩＮＧを含ませることにより、ＳＴＩＮＧを含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＳＴＩＮＧを含ませることにより、ＳＴＩＮＧを含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【０１４６】
ＳＴＩＮＧは、ＩＬ−２のより多い産生により、Ｔ細胞反応経路を刺激し得る。ＳＴＩＮＧは、「エフェクター」Ｔ細胞となるようにＴ細胞の成長、増殖、及び分化を刺激し、また、ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒの発現を刺激し得る。次いで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の成長、分化、及び生存を刺激する。ＩＬ−２は、自己と非自己とを区別するために必要とされるので、ＩＬ−２を刺激することにより、自己細胞と非自己細胞との間の免疫系の調節が実行される。
【０１４７】
ＳＴＩＮＧはさらに、ＩｇＧのＢ細胞産生を増大させることにより、適応免疫系を刺激し得る。
【０１４８】
ＳＴＩＮＧは、対象において抗原に対する免疫反応を増大またはブーストし得る。抗原は、以下においてより詳細に検討する。いくつかの例では、ＳＴＩＮＧは、抗原に対する免疫反応を約７５％〜約２００％増大させることができる。あるいは、ＳＴＩＮＧは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、約９０％〜約１３０％増大し得る。さらに他の代替実施形態において、ＳＴＩＮＧは、抗原に対する免疫反応を増大させ得、これらは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【０１４９】
他の実施形態において、ＳＴＩＮＧは、それを必要とする対象に投与されたワクチンからの特定の抗原に対する免疫反応を、少なくとも０．５倍、１．０倍、１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストし得る。
【０１５０】
他の場合には、ＳＴＩＮＧは、個体における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において、抗原における少なくとも１つのエピトープの免疫系認識を変更または改変し得る。抗原は、以下でより詳細に記載される。そのような少なくとも１つのエピトープの認識の改変は、抗原のみに対応する核酸を含むワクチンを投与された対象と比較して、本明細書に記載のワクチンを投与された対象においてより大きな免疫反応を誘導し得る。
【０１５１】
また、ＳＴＩＮＧは、例えば、以前には認識されなかったエピトープが、免疫系により認識されるようにし、それによって、抗原に対する対象の免疫反応を増大させることにより、抗原における１つ以上のエピトープの提示を変更または変化させ得る。提示の変更、したがって免疫反応の増大は、対象における任意の数の組織、例えば、皮膚組織及び筋肉組織において起こり得る。
【０１５２】
ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、任意の数の生体、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）からのものであり得る。ＳＴＩＮＧをコードする核酸を、コドン利用及び対応するＲＮＡトランスクリプトに関して最適化することができる。ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、発現に関して最適化されたコドン及びＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、翻訳の効率を上げるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、翻訳終結の効率を上げるための複数の停止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。また、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸中のＳＴＩＮＧの５’側に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【０１５３】
ＳＴＩＮＧは、配列番号１４をコードする最適化核酸配列の配列番号１３であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧは、配列番号１３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＳＴＩＮＧは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする核酸配列であり得る。ＳＴＩＮＧは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態は、配列番号１３の断片に関する。断片は、配列番号１３の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１５５】
配列番号１３の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１３に対して９５％またはそれ以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧ核酸配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧ核酸配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧ核酸配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧ核酸配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１５６】
配列番号１４の断片を提供することができる。断片は、配列番号１４の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１５７】
配列番号１４の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を提供することができる。そのような断片は、配列番号１４に対して９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧタンパク質配列の断片に対して９６％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧタンパク質配列の断片に対して９７％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧタンパク質配列の断片に対して９８％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＳＴＩＮＧタンパク質配列の断片に対して９９％またはそれ以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１５８】
ｂ．抗原
ワクチンは、抗原またはその断片もしくは変異体を含み得る。抗原は、対象において免疫反応を誘導する任意のものであり得る。精製抗原は、通常、それ自体で強い免疫原性を有さず、したがって、上記のとおりのアジュバントと組み合わされる。抗原により誘導される免疫反応は、アジュバントと組み合わせた場合に、ブーストまたは増大され得る。そのような免疫反応は、体液性免疫反応及び／または細胞性免疫反応であり得る。いくつかの実施形態において、アジュバントと抗原との組み合わせは、対象における細胞性免疫反応をブーストまたは増大させ得る。
【０１５９】
抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはその組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはその組み合わせであり得る。また、核酸配列は、ペプチド結合により抗原に連結しているリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含み得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはその組み合わせであり得る。
【０１６０】
抗原は、任意の数の生体、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳類に由来するタンパク質、核酸、またはその断片、またはその変異体、またはその組み合わせに含まれ得る。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。好ましくは、抗原は、インフルエンザまたはＨＩＶに関連し得る。
【０１６１】
一部の抗原は、強い免疫反応を誘導し得る。他の抗原は、弱い免疫反応を誘導し得る。抗原は、上記のとおりのアジュバントと組み合わせた場合に、より強い免疫反応を誘発し得る。
【０１６２】
（１）ウイルス性抗原
抗原は、ウイルス性抗原、またはその断片、またはその変異体であり得る。ウイルス性抗原は、次の科のいずれかからのウイルスに由来し得る：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリチウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科。ウイルス性抗原は、乳頭腫ウイルス、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血性熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペス２型（陰部ヘルペス）、帯状ヘルペス（水痘−帯状疱疹、水痘としても知られている）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、チクングニヤウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、または発癌性ウイルスに由来し得る。
【０１６３】
（ａ）肝炎抗原
アジュバントは、肝炎ウイルス性抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及び／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に由来する抗原または免疫原であり得る。いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、及びＨＥＶに由来する抗原の１つ以上をコードするプラスミド（複数可）などの異種の核酸分子（複数可）であり得る。肝炎抗原は、全長タンパク質または全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。
【０１６４】
肝炎抗原は、コンセンサス配列及び／または発現を改善するための１つ以上の修飾を含み得る。構築物の免疫原性を増大させるためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高度に効率的な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含めた遺伝子修飾が、修飾されたコンセンサス配列に含まれ得る。コンセンサス肝炎抗原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでよく、また、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでよい。対応するコドン最適化免疫原よりも強く広い細胞性免疫反応を誘発するように、免疫原を設計することができる。
【０１６５】
肝炎抗原は、ＨＡＶに由来する抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであり得る。
【０１６６】
肝炎抗原は、ＨＣＶに由来する抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１及びＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、及びＮＳ５ｂ）、その断片、その変異体、またはその組み合わせであり得る。
【０１６７】
肝炎抗原は、ＨＤＶに由来する抗原であり得る。肝炎抗原は、デルタ型ＨＤＶ抗原、その断片、またはその変異体であり得る。
【０１６８】
肝炎抗原は、ＨＥＶに由来する抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であり得る。
【０１６９】
肝炎抗原は、ＨＢＶに由来する抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ遺伝子によりコードされるＨＢＶタンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってよい。肝炎抗原は、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質またはコンセンサスＨＢＶ表面タンパク質であり得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７１】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７２】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７４】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７６】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス核ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。
【０１７８】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８０】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８１】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８３】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８４】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８５】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥ配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。
【０１８６】
（ｂ）ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原
アジュバントは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、及び／または他の癌の原因となるＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、及び５８型に由来し得る。ＨＰＶ抗原は、陰部疣贅の原因となり、また、頭頸部癌の原因となることが知られているＨＰＶ６及び１１型に由来し得る。
【０１８７】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型からのＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７ドメインであり得る。例えば、ＨＰＶ１６型（ＨＰＶ１６）では、ＨＰＶ１６抗原には、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、その断片、変異体、または組み合わせが含まれ得る。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ６  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３３  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ５２  Ｅ６及び／もしくはＥ７、またはＨＰＶ５８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、その断片、変異体、または組み合わせであり得る。
【０１８８】
（ｃ）ＲＳＶ抗原
また、アジュバントは、ＲＳＶ抗原、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本発明では「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、及び「Ｆタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡ及びＢとの間で保存され得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の単量体、二量体、もしくは三量体、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０１８９】
ＲＳＶ  Ｆの後融合形態は、免疫化動物において抗体を中和する高い力価を誘発し、ＲＳＶ攻撃から動物を保護する。本発明は、特許請求の範囲に記載のワクチンにおいてこの免疫反応を利用する。本発明によれば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前融合形態または後融合形態であってよい。
【０１９０】
また、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、及び「Ｇタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡ及びＢの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３、またはその断片もしくは変異体に由来するＲＳＶ  Ｇ  タンパク質であり得る。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０１９１】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１  タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）に由来するＲＳＶ  ＮＳ１  タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。また、ＲＳＶ抗原ヒトは、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）に由来するＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）に由来するＲＳＶ  Ｎ  タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶホスホタンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）に由来するＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。また、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ  Ｍａｔｒｉｘタンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）に由来するＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０１９２】
さらに他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）に由来するＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。また、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ  Ｍａｔｒｉｘタンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）に由来するＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶ  Ｍａｔｒｉｘタンパク質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）に由来するＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原ヒトは、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）に由来するＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０１９３】
さらなる実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列であり得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムによりコードされるタンパク質のいずれかなどのヒトＲＳＶタンパク質または組換え抗原であり得る。
【０１９４】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、これだけに限定されないが、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化アミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、最適化アミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株に由来するＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３に由来するＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片、またはその変異体であり得る。
【０１９５】
（ｄ）インフルエンザ抗原
アジュバントは、インフルエンザ抗原、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。インフルエンザ抗原は、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して、哺乳類において免疫反応を誘発し得るものである。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、その変異体、その断片、またはその組み合わせを含み得る。インフルエンザ血球凝集素抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株の異なるセットに由来する２種の異なるコンセンサス配列の一部を含むハイブリッド配列、またはインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザ血球凝集素抗原は、インフルエンザＢに由来し得る。
【０１９６】
また、インフルエンザ抗原は、免疫反応を誘導し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して有効であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含み得る。抗原は、無傷のインフルエンザウイルスにおいて存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提示し得る。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株など、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株からの血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス血球凝集素抗原配列であってよい。抗原は、２種の異なるコンセンサス血球凝集素抗原配列またはその一部の組み合わせに由来し得るハイブリッドコンセンサス血球凝集素抗原配列であってよい。２種の異なるコンセンサス血球凝集素抗原配列のそれぞれは、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株など、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株の異なるセットに由来してよい。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス血球凝集素抗原配列であってよい。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であり得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、コンセンサス血球凝集素抗原、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質であり得る。コンセンサス血球凝集素抗原は、互いに異なるセットの配列にそれぞれ由来する２種の異なるコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であってよい。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサス血球凝集素抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質など、インフルエンザＢ株からの血球凝集素配列に由来するコンセンサス血球凝集素タンパク質であってよい。
【０１９８】
コンセンサス血球凝集素抗原はさらに、１つ以上の追加のアミノ酸配列要素を含んでよい。コンセンサス血球凝集素抗原は、そのＮ末端に、ＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含んでよい。コンセンサス血球凝集素抗原はさらに、容易に利用可能な抗体により検出され得る独特の免疫原性エピトープである免疫原性タグを含んでよい。そのような免疫原性タグの例は、コンセンサス血球凝集素のＣ末端上で連結していてよい９アミノ酸インフルエンザＨＡ  Ｔａｇである。いくつかの実施形態において、コンセンサス血球凝集素抗原はさらに、そのＮ末端上に、ＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列を、及びそのＣ末端上にＨＡタグを含んでよい。
【０１９９】
コンセンサス血球凝集素抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはその断片及び変異体からなるコンセンサス血球凝集素タンパク質であってよい。コンセンサス血球凝集素抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列またはその断片及び変異体を含むコンセンサス血球凝集素タンパク質であってよい。
【０２００】
コンセンサスＨ１タンパク質の例には、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなってよいもの、あるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡ  Ｔａｇ、またはＩｇＥリーダー配列及びＨＡ  Ｔａｇの両方などの追加の要素をさらに含むものが含まれる。
【０２０１】
コンセンサスＨ２タンパク質の例には、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなってよいもの、あるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡ  Ｔａｇ、またはＩｇＥリーダー配列及びＨＡ  Ｔａｇの両方をさらに含むものが含まれる。
【０２０２】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例には、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなってよいもの、あるいはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡ  Ｔａｇ、またはＩｇＥリーダー配列及びＨＡ  Ｔａｇの両方をさらに含むものが含まれる。
【０２０３】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢ血球凝集素タンパク質の例には、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなってよいものが含まれるか、あるいはこれは、ＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡ  Ｔａｇ、またはＩｇＥリーダー配列及びＨＡ  Ｔａｇの両方をさらに含んでよい。
【０２０４】
コンセンサス血球凝集素タンパク質は、コンセンサス血球凝集素核酸、その変異体、またはその断片によりコードされ得る。異なる株及び変異体からの複数の異なる血球凝集素配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサス血球凝集素タンパク質とは異なり、コンセンサス血球凝集素核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサス血球凝集素タンパク質配列が由来する複数の異なる血球凝集素配列における特定のアミノ酸配列をコードするために使用されるものとは異なり得る。コンセンサス核酸配列は、コドン最適化及び／またはＲＮＡ最適化されていてよい。コンセンサス血球凝集素核酸配列は、５’非翻訳領域にＫｏｚａｋ配列を含んでよい。コンセンサス血球凝集素核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、血球凝集素コード配列の５’である。Ｎ末端のリーダーは、分泌を促進し得る。Ｎ末端のリーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサス血球凝集素核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端上にあり得、これをコードする配列は、ＨＡコード配列の３’である。免疫原性タグは、独特のエピトープを提示し、容易に利用可能な抗体がそのために存在するので、そのような抗体を、タンパク質の発現を検出及び確認するためのアッセイにおいて使用することができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端にあるＨ  Ｔａｇであり得る。
【０２０５】
（ｅ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
アジュバントは、ＨＩＶ抗原またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。ＨＩＶ抗原は、免疫原のための修飾コンセンサス配列を含み得る。構築物の免疫原性を増大させるためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高度に効率的な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含めた遺伝子修飾が、修飾されたコンセンサス配列に含まれ得る。対応するコドン最適化免疫原よりも強く広い細胞性免疫反応を誘発するように、新規の免疫原を設計することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＡエンベロープタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＡコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。
【０２０７】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢエンベロープタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。
【０２０８】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＣコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＣエンベロープタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＣコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。
【０２０９】
さらなる実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＤコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＤエンベロープタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＤコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−ＲｅｖコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖコンセンサスタンパク質配列であり得る。
【０２１１】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ  ＤＮＡ配列構築物のＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列、Ｇａｇ  コンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質のためのコンセンサス配列に連結しているＩｇＥリーダー配列、またはコンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質配列であり得る。
【０２１２】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＭＰｏｌ  ＤＮＡ配列またはＭＰｏｌタンパク質配列であり得る。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、または任意のその組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であり得る。
【０２１３】
（２）寄生虫抗原
アジュバントは、寄生虫抗原またはその断片もしくは変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。寄生虫は、原生動物、蠕虫、または外部寄生虫であり得る。蠕虫（すなわち、ワーム）は、扁虫（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、または回虫（例えば、蟯虫）であり得る。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ、及びダニであり得る。
【０２１４】
寄生虫は、次の疾患の原因となる任意の寄生虫であり得る：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャガス病、肝ジストマ症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大肝蛭病、糸状虫症、ジアルジア虫症、顎口虫症、膜様条虫疾患、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエウジ病、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、アフリカ睡眠症、糞線虫症、テニヤ条虫症、トキソカラ症、トキソプラスマ症、旋毛虫症、及び鞭虫症。
【０２１５】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウシバエ、大腸バランチジウム、南京虫、条虫類（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、エントアメーバヒストリティカ、カンテツ、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫属、肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラスマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であり得る。
【０２１６】
（ａ）マラリア抗原
アジュバントは、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原またはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫に由来し得る。マラリアの原因となる寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であり得る。熱帯熱マラリア原虫抗原には、スポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原が含まれ得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ；ＬＳＡ１；ＴＲＡＰ；ＣｅｌＴＯＳ；及びＡｍａ１の１つ以上をコードするプラスミドなどの核酸分子であり得る。免疫原は、全長または全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。免疫原は、コンセンサス配列及び／または発現を改善するための修飾を含む。
【０２１８】
他の実施形態において、マラリア抗原は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるすべての全長熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列（全部で２８配列）の編集から設計された、ＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰのコンセンサス配列であり得る。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原（すなわち、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでよく、また、いくつかの実施形態において、ＨＡ  Ｔａｇを含んでよい。
【０２１９】
さらに他の実施形態において、マラリア抗原は、Ａｇ２とも称され、高度保存マラリア亜原虫抗原であるＣｅｌＴＯＳであり得る。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ抗原（すなわち、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでよく、また、いくつかの実施形態において、ＨＡ  Ｔａｇを含んでよい。
【０２２０】
さらなる実施形態において、マラリア抗原は、高度保存マラリア原虫抗原であるＡｍａ１であり得る。また、マラリア抗原は、いくつかの例では、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むＡｍａ１（すなわち、ＣｏｎＡｍａＩ免疫原）のコンセンサス配列であり得、また、いくつかの実施形態において、ＨＡ  Ｔａｇを含んでよい。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、いくつかの例では、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むコンセンサスＣＳ抗原（すなわち、コンセンサスＣＳ  免疫原）であり得、また、いくつかの実施形態において、ＨＡ  Ｔａｇを含んでよい。
【０２２２】
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載の２つ以上のＰＦタンパク質の組み合わせを含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質は、相互に直接隣接して連結しているか、またはその間にスペーサーまたは１つ以上のアミノ酸を伴って連結しているコンセンサスＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、及びＣｏｎＡｍａ１免疫原の２つ以上を含んでよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み；いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、かついくつかの実施形態において、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質は、ＣＳ及びＬＳＡ１；ＣＳ及びＴＲＡＰ；ＣＳ及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ及びＡｍａ１；ＬＳＡ１及びＴＲＡＰ；ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１及びＡｍａ１；ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰ及びＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含んでよい。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでよい。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでよい。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでよい。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結しているシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結している複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーが、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれてよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間のスペーサーは、タンパク質分解切断部位であってよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ワクチンが投与され、かつ／または吸収されることが意図されている細胞中に存在するプロテアーゼにより認識されるタンパク質分解切断部位であってよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれてよい、その際、スペーサーは、ワクチンが投与され、かつ／または吸収されることが意図されている細胞中に存在するプロテアーゼにより認識されるタンパク質分解切断部位であり、また、切断されると、各コンセンサスＰＦ免疫原のシグナルペプチドがコンセンサスＰＦ免疫原を細胞の外側に移動させるように、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結している複数のシグナルペプチドを含む。
【０２２４】
（３）細菌性抗原
アジュバントは、細菌性抗原またはその断片もしくは変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。細菌は、次の門のいずれかからの細菌であり得る：アシドバクテリウム門、放線菌門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、緑色硫黄細菌門、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門（Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ）、藍細菌門、デフェリバクター門、デイノコックス−テルムス門、ディクチオグオロムス門、エルシミクロミウム門、フィブロバクター門、ファーミキューテス門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、及びベルコミクロビウム門。
【０２２５】
細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。細菌は、好気性菌または嫌気性菌であり得る。細菌は、無機栄養細菌または有機栄養細菌であり得る。細菌は、中温菌、好中菌（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ）、好極限性細菌、好酸菌（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｅ）、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であり得る。
【０２２６】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原性細菌、食中毒菌、感染性細菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、または破傷風菌であり得る。細菌は、ミコバクテリア、破傷風菌、ペスト菌、炭疽菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム−ディフィシレであり得る。
【０２２７】
（ａ）結核菌抗原
アジュバントは、結核菌抗原（すなわち、ＴＢ抗原またはＴＢ免疫原）、またはその断片、またはその変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えば、Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂからのものであり得る。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、及びＥｓｘＷからのものであり得る。いくつかの実施形態において、ＴＢ抗原は、Ａｇ８５ファミリー及びＥｓｘファミリーからの結核菌免疫原の１つ以上をコードするプラスミドなどの異種核酸分子であり得る。免疫原は、全長または全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。免疫原は、コンセンサス配列及び／または発現を改善するための修飾を含み得る。コンセンサス免疫原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでよく、また、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでよい。
【０２２８】
（４）真菌抗原
アジュバントは、真菌抗原またはその断片もしくは変異体に随伴させるか、または組み合わせることができる。真菌は、アスペルギルス種、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ属酵母（例えば、カンジダアルビカンス）、コクシジオイデス、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）、皮膚糸状菌、フザリウム種、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ケカビ亜門、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、エキセロハイラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、またはクラドスポリウムであり得る。
【０２２９】
ｃ．ベクター
ワクチンは、抗原及びアジュバントをコードする１つ以上の異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターは、抗原及びアジュバントを発現することができる。１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられるプラスミドである。発現ベクターが細胞の中に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞性転写及び翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサー及びプロモーター領域として作用する調節配列を含み、かつ、発現ベクター上に運搬された遺伝子の効率的な転写をもたらすように操作されることが多い。本発明のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡを発現するため、多量の安定したタンパク質を発現する。
【０２３０】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子の間の距離の調節、転写終結配列及びＰＴＩＳ（ポータブルな翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【０２３１】
（１）発現ベクター
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミド及び線状核酸は、適切な対象細胞内において特定の異種ヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。ベクターは、抗原コードヌクレオチド配列またはアジュバントコードヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモーターを有してもよく、これは、終止シグナルに機能的に連結し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含み得る。対象のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であってもよく、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に晒された場合にのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または臓器もしくは発生の段階に特異的であり得る。
【０２３２】
（２）環状及び線状ベクター
ベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド）。
【０２３３】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、抗原またはアジュバントをコードする異種ＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原またはアジュバントに翻訳できるようにすることが可能な発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０２３４】
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）であり、これは、電気穿孔を介して対象に効率よく送達され、かつ、１つ以上の所望の抗原または１つ以上の所望のアジュバント発現することができる。ＬＥＣは、任意のリン酸バックボーンを欠いた任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原または１つ以上のアジュバントをコードしてもよい。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。抗原またはアジュバントの発現は、プロモーターにより制御されてもよい。ＬＥＣは、任意の抗生物質抵抗性遺伝子及び／またはリン酸バックボーンを含んでいなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現、または所望のアジュバンド発現に関連しない他の核酸配列を含んでいなくてもよい。
【０２３５】
ＬＥＣは、線状にすることが可能な任意のプラスミド由来であってもよい。プラスミドは、抗原またはアジュバント発現可能であってもよい。プラスミドは、アジュバントＲｅｌ−Ａ及び／またはＴ−ｂｅｔ発現可能であってもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、ｐｒｏｖａｘ、または、抗原をコードするか、またはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原またはアジュバントに翻訳できるようにすることが可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０２３６】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（プエルトリコ／３４）及びｐＭ２（ニューカレドニア／９９）由来であってもよい。
【０２３７】
（３）プロモーター、イントロン、停止コドン、及びポリアデニル化シグナル
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素であり、本明細書に記載の抗原配列またはアジュバント配列を転写する。異種核酸の発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、ベクターの転写開始部位から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置され得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく対応し得る。
【０２３８】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列と、転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルとに機能的に連結し得る。プロモーターは、アジュバントをコードする核酸配列と、転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルとに機能的に連結し得る。
【０２３９】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内で効率的な発現を示す他のプロモーターであってもよい。
【０２４０】
ベクターは、機能的スプライスドナー部位及び機能的スプライスアクセプター部位を持つエンハンサー及びイントロンを含み得る。ベクターは、効率よい終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、異なる遺伝子から得てもよい。
【０２４１】
ｄ．ワクチンの賦形剤及び他の成分
ワクチンは、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧ以外の担体、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【０２４２】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在してもよい。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝的構築物と一体化させて投与してもよい。ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０２４３】
薬学的に許容可能な賦形剤は、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ及びＳＴＩＮＧに加えて、アジュバントであり得る。追加のアジュバントは、別のプラスミドから発現される他の遺伝子であることが可能であり、または、ワクチン中に上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、欠失され、かつ、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列シグナル配列を有するＩＬ−１５を含むＣＤ８６からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２４４】
Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ及びＳＴＩＮＧに加えて、アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びその機能的断片をコードするものが挙げられる。
【０２４５】
ワクチンは、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるような遺伝的ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０２４６】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリー及び微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。ワクチンは、ゼラチン及びアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
【０２４７】
３．ワクチン接種方法
また、本発明は、ワクチンにより、異なる投与経路により対象において免疫反応を増大させる方法に関する。免疫反応の増大を使用して、対象における疾患を治療及び／または予防することができる。
【０２４８】
本方法は、対象に、本明細書に開示されているワクチンを投与することを含み得る。該ワクチンを投与された対象は、抗原のみを投与された対象と比較して、免疫反応の増大またはブーストを示し得る。いくつかの実施形態において、該ワクチンを投与された対象における免疫反応は、約１８％〜約６５０％増大し得る。あるいは、該ワクチンを投与された対象における免疫反応は、約４５％〜約２６０％増大し得る。さらに別の実施形態において、該ワクチンを投与された対象における免疫反応は、約９３％〜約１３０％増大し得る。
【０２４９】
他の実施形態において、投与ワクチンは、対象における免疫反応を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍に増大またはブーストすることができる。
【０２５０】
本ワクチンは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍のＩＦＮ−γ産生を誘導し得る。
【０２５１】
本ワクチンは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、対象における抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大またはブーストすることができる。該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を約７５％〜約２００％増大し得る。あるいは、該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、約９０％〜約１３０％増大し得る。該ワクチンは、抗原に対する細胞性及び／または体液性免疫反応を増大させ得、これは、アジュバントを含まないワクチンと比較して、約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％増大し得る。
【０２５２】
ワクチンの用量は、１μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であってもよい。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日おきに投与することができる。効果的な治療のためのワクチンの投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。
【０２５３】
ａ．投与
ワクチンを、薬学技術分野の当業者に周知の標準的な技術に従って調製することができる。かかる組成物を、特定の対象の年齢、性別、体重、及び状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の用量及び技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、またはマウスなどの哺乳類であり得る。
【０２５４】
ワクチンを、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与において、ワクチンは、免疫反応を誘導するのに十分な量で投与される。治療的適用の場合、ワクチンは、治療的作用を誘発するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のための有効量は、例えば、投与されるワクチン療法の特定の組成物、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の全身健康状態、及び処方する医師の判断に依存するであろう。
【０２５５】
ワクチンは、ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７〜６４８（１９９７）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９６年１２月３日に公布された米国特許第５，５８０，８５９号）；フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（１９９７年１２月３０日に公布された米国特許第５，７０３，０５５号）；及びカーソン（Ｃａｒｓｏｎ）ら（１９９７年１０月２１日に公布された米国特許第５，６７９，６４７号）に記載されているように当該技術分野で周知の方法によって投与され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ワクチンのＤＮＡは、例えば、粒子またはビーズと複合体を形成して、これをワクチン銃を用いて個体に投与することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを承知している。
【０２５６】
ワクチンを、多様な経路によって送達してもよい。典型的な送達経路には、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が含まれる。他の経路には、経口投与、鼻腔内、及び膣内経路が含まれる。特にＤＮＡワクチンに関して、ワクチンを、個体の組織の間質空間に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，７０３，０５５号、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ワクチンは、筋肉に投与してもよいし、または、皮内または皮下注射を通して、あるいは、イオン導入法（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による経皮投与を通して投与してもよい。ワクチンの表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激物質に対する免疫反応を刺激するために、表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５７】
また、ワクチンを、鼻腔内経路を通して投与するために調製することができる。担体が固体であって鼻腔投与に適した製剤には、粒径、例えば約１０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する目の粗い粉末が含まれ、鼻から吸うように投与される、すなわち、鼻に近づけて保持した粉末容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。製剤は、点鼻スプレー、点鼻薬、またはネブライザーによるエアロゾル投与であってもよい。製剤は、ワクチンの水溶液または油性溶液を含み得る。
【０２５８】
ワクチンは、懸濁剤、シロップ、またはエリキシル剤などの液体調製物であり得る。また、ワクチンは、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射投与）用の製剤、例えば、滅菌懸濁液またはエマルションであり得る。
【０２５９】
ワクチンは、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリクスに組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ巻〜ＩＩＩ巻（第２版、１９９３）、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、作製及び投与が比較的単純な、非毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０２６０】
ワクチンは、米国特許第７，６６４，５４５号に記載の方法により電気穿孔法を介して投与することができる。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。電気穿孔法は、米国特許第６，３０２，８７４；同第５，６７６，６４６号；同第６，２４１，７０１号；同第６，２３３，４８２号；同第６，２１６，０３４号；同第６，２０８，８９３号；同第６，１９２，２７０号；同第６，１８１，９６４号；同第６，１５０，１４８号；同第６，１２０，４９３号；同第６，０９６，０２０号；同第６，０６８，６５０号；及び同第５，７０２，３５９号に記載の方法及び／または装置によってであってもよく、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。電気穿孔法は、最小侵襲装置を介して行ってもよい。
【０２６１】
最小侵襲性電気穿孔装置（「ＭＩＤ」）は、上述のワクチン及び関連流体を体組織に注入する装置であり得る。装置は、中空針、ＤＮＡカセット、及び流体送込み手段を含んでもよく、装置は、針の体組織への挿入中にＤＮＡを体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間にＤＮＡ及び関連流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入されるＤＮＡのより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減され得る。
【０２６２】
ＭＩＤは、針を使用せずにワクチンを組織に注入することができる。ＭＩＤは、ワクチンが組織表面を貫通し、下層の組織及び／または筋肉に入るような力で、ワクチンを小さなストリームまたはジェットとして注入することができる。小さなストリームまたはジェットの背後にある力は、マイクロオリフィスを通じた二酸化炭素などの圧縮ガスを瞬時に膨張させることで提供することができる。最小侵襲性電気穿孔装置及びそれらの使用方法の例については、米国公開特許出願第２００８０２３４６５５号；米国特許第６，５２０，９５０号；米国特許第７，１７１，２６４号；米国特許第６，２０８，８９３号；米国特許第６，００９，３４７号；米国特許第６，１２０，４９３号；米国特許第７，２４５，９６３号；米国特許第７，３２８，０６４号；及び米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
ＭＩＤは、痛みを伴わずに組織を貫通する液体の高速ジェットを生成する注射器を含み得る。かかる針なし注射器は市販されている。本明細書で利用することができる針なし注射器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号；同第４，４４７，２２３号；同第５，５０５，６９７号；及び同第４，３４２，３１０号に記載のものが挙げられ、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６４】
直接的または間接的な電気輸送に適した形態の所望のワクチンを、針なし注射器を用いて、治療対象組織に導入する（例えば、注入する）ことができる。これは、通常、組織表面に注射器を接触させ、ワクチンを組織に貫通させるのに十分な力で薬剤をジェット送達させて行う。例えば、治療対象組織が粘膜、皮膚、または筋肉の場合、薬剤を角質層を通じて皮層へ、または下層組織及び筋肉それぞれへと貫通させるのに十分な力で、粘膜または皮膚表面に向けて薬剤を発射する。
【０２６５】
針なし注射器は、全タイプの組織、特に、皮膚及び粘膜にワクチンを送達するのに適している。いくつかの実施形態において、針なし注射器は、ワクチンを含む液体を表面及び対象の皮膚または粘膜に進ませるのに用いることができる。本発明の方法を用いて治療することができる様々なタイプの組織の代表的な例としては、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２６６】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針状電極を有し得る。例えば、長方形または正方形パターンにセットされた複数の電極アレイにおける複数対の電極間にパルスを発生させることで、一対の電極間にパルスを発生させるよりも優れた結果がもたらされる。「薬剤及び遺伝子の仲介送達用針電極（Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes）」と題された米国特許第５，７０２，３５９号に開示されているものは、針アレイであり、治療的処置中に複数対の針にパルス発生させ得るものである。参照によりその内容全体が完全に本明細書に組み込まれる該出願において、針は、円形配列で設置されているが、対向する対の針状電極間にパルスを発生させることが可能な接続器及び切替装置を有する。一対の針状電極を用いて、組み換え発現ベクターを細胞に送達することができる。かかる装置及びシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、ＤＮＡの注入、及び、通常の注射針に似た単一針によるエレクトロポレーションが可能な単一針装置を用いて、現在使用されている装置によって送達する場合よりも低い電圧パルスを印加することで、患者が受ける電気が走ったような感覚を減らすことができる。
【０２６７】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを含み得る。アレイは、同一直径または異なる直径の２つ以上の針を含み得る。針は等間隔または不等間隔に配置されていてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ；または０．０１５インチ〜０．０２０インチであり得る。針は、直径０．０１７５インチであり得る。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔で配置されていてもよい。
【０２６８】
ＭＩＤは、１つのパルス発生器と、ワクチンを送達し、シングルステップでエレクトロポレーションパルスを与える２つ以上の針ワクチン注射器とからなり得る。パルス発生器により、パーソナルコンピュータ操作によるフラッシュカード経由でパルスや注入パラメータをフレキシブルにプログラミングできるだけでなく、エレクトロポレーション及び患者データを包括的に記録・保存することができる。パルス発生器は、様々な電圧パルスを短時間で送達することができる。例えば、パルス発生器は、長さ１００ミリ秒（ｍｓ）の１５ボルトのパルスを３回送達することができる。かかるＭＩＤの例としては、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されているイノビオバイオメディカル社（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製のＥｌｇｅｎ１０００システムであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
ＭＩＤは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（イノビオファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）装置及びシステムであってもよく、これは、生体または植物の選択された組織の細胞へＤＮＡなどの高分子の導入を円滑にするためのモジュール式の電極システムである。モジュール式の電極システムは、複数の針状電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針状電極への導電性連結を提供する電気接続器；及び電源を含み得る。操作者は、支持構造に搭載される複数の針状電極を握り、生体または植物の選択された組織の中へそれをしっかりと挿入することができる。次いで皮下注射針を介して選択された組織の中に高分子を送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が活性化され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが印加される。印加された定電流の電気パルスは複数の電極間で細胞への高分子の導入を促進する。細胞の過熱による細胞死は、定電流パルスにより組織内の電力消費を制限することで最小化される。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置及びシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ１０００システム（イノビオファーマシューティカルズ社製）であり得る。Ｅｌｇｅｎ１０００システムは、中空針と流体送込み手段とを備える装置を含んでもよく、該装置は、針の体組織への挿入中に本明細書に記載のワクチンである流体を体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用時に流体送込み手段を作動するようになっている。これは、針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力が体組織中の流体のより一様な分布をもたらすという利点を有する。また、注入される流体量のより大きい面積に渡る分布により、注入中に体感される痛みが低減されると考えられる。
【０２７１】
流体の自動注入は、注入される流体の実際の投与量の自動的な監視及び登録を容易にする。このデータは所望なら、証拠資料用に制御ユニットにより記憶できる。
【０２７２】
注入速度は直線的であっても、非直線的であってもよく、注入は、針が治療対象の皮膚を通って挿入された後でかつそれらがさらに体組織に挿入される間に実行されることが理解されるであろう。
【０２７３】
本発明の装置によって流体を注入するのに適した組織は、腫瘍組織、皮膚、または肝組織を含むが、筋肉組織であってもよい。
【０２７４】
装置は、体組織への針の挿入をガイドする針挿入手段をさらに含む。流体の注入速度は、針の挿入速度により制御される。これは、注入速度に対し挿入速度を所望通りに整合できるように、針の挿入と流体の注入の両方を制御できるという利点を有する。それはまたユーザにとって装置をより操作しやすくする。所望なら、針を体組織に自動的に挿入する手段を設けることもできる。
【０２７５】
ユーザは、流体の注入を開始すべき時点を選ぶことができる。しかしながら理想的には、注入は針の先端が筋肉組織に到達したときに開始され、装置は針が流体の注入が始まる十分な深さまで挿入された時点を感知する手段を含む。これは、針が所望の深さ（これは通常は筋肉組織が始まる深さであろう）に到達したときに流体の注入が自動的に始まるようにできることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍ（この値は針が皮膚層を通り抜けるのに十分であると思われる）の値等の予め設定された針の挿入深さとなるように取ることもできる。
【０２７６】
感知手段は、超音波プローブを含み得る。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知する手段を含み得る。この場合、この手段はそれ自体、体組織内の針の深さを記録しなくてもよいが、むしろ針が種々のタイプの体組織から筋肉に移動しながらインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するようになっている。これらの代案のいずれも、比較的正確で操作が簡単な注入開始感知手段を提供する。所望なら針の挿入深さがさらに記録でき、それは流体の注入を制御するために使用でき、それにより針の挿入深さが記録されながら注入すべき流体の量が決定される。
【０２７７】
装置は、針を支持する基体と、中に基体を受容するハウジングとをさらに含み、基体がハウジングに対して第１の後方位置にあるときに針がハウジング内に引っ込められ、基体がハウジング内の第２の前方位置にあるときに針がハウジングか出ているように、基体はハウジングに対して移動可能である。これは、ハウジングが患者の皮膚の上に並べられ、そうして基体に対してハウジングを移動することにより針を患者の皮膚に挿入できるので、ユーザにとって好都合である。
【０２７８】
上に述べたように、針が皮膚に挿入されながら、針の長さに渡り流体が一様に分布するように制御された流体注入速度を達成することが望ましい。流体送込み手段は、制御された速度で流体を注入するようになっているピストン駆動手段を含み得る。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータにより駆動することもできる。しかしながら、ピストン駆動手段は、基体がハウジングに対して軸方向に移動されることにより作動され得る。流体送達の代わりの手段を設けてもよいことが理解されるであろう。従って、例えば、制御された、あるいは制御されない速度で流体を送達するために搾り出しができる閉じられた容器を注射器及びピストンシステムの代わりに設けることもできる。
【０２７９】
上記の装置は、どのようなタイプの注入にも使用できる。しかしながら、エレクトロポレーションの分野において特に有用であると考えられ、従って、それは、針に電圧を印加する手段をさらに含み得る。これは針が注入に使用されるだけでなく、エレクトロポレーション中の電極としても使用されることを可能にする。これは、電界が注入される流体と同じ領域に印加されることを意味するので特に好都合である。エレクトロポレーションには、前に注入された流体に電極を正確に合わせることが非常に難しいという問題が伝統的にあり、従って、注入された物質と電界の間の重なりを保証しようとして、ユーザは大きい領域に渡り必要以上に大量の流体を注入し、また大面積に渡り電界を印加する傾向にあった。本発明を使用すれば、電界と流体の良好な適合を達成しつつ、流体の注入量と電界の印加サイズの両方を減少できる。
【０２８０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０２８１】
４．実施例
実施例１
実施例２〜４のための材料及び方法
プラスミドワクチン構築物。ｐＲｅｌＡプラスミドＤＮＡ構築物は、全長マウスＮＦ−κＢサブユニットｐ６５／ＲｅｌＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＴＦ６５＿マウス）及び１型トランス活性化因子Ｔ−ｂｅｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＴＢＸ２１＿マウス）をそれぞれコードする。加えて、Ｉｇ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＢ５９４２４）を、Ｎ末端のメチオニンに代えて各配列のＮ末端に融合させて、発現を促進する。タンパク質発現を増強するための他の特許権下の修飾の中で（ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）製、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、各遺伝子を、マウスでの発現について、コドン最適化及びＲＮＡ最適化を含めて遺伝子的に最適化した。次いで、最適化遺伝子を、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、修飾ｐＶａｘ１哺乳類発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、カリフォルニア州カールスバッド）にサブクローニングした。次いで、これらの試薬を、この研究における分子アジュバントとして使用した。ｐＧａｇ及びｐＥｎｖプラスミドは、それぞれＨＩＶ−１タンパク質Ｇａｇ及びＥｎｖを発現する。
【０２８２】
トランスフェクション及びウェスタンブロット分析。ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＬあたり１００ＩＵのペニシリン、１ｍＬあたり１００μｇのストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、ニューヨーク州グランドアイランド）中で維持した。簡単には、製造者のプロトコルに従ってＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｏｎ  ８．０（オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ）製、メリーランド州ロックビル）を使用して、細胞にトランスフェクトし、引き続いて、２４〜４８時間にわたってインキュベートした。細胞を、氷冷ＰＢＳで採取し、遠心分離処理し、洗浄し、次いで、ウェスタン免疫ブロット分析のためにペレット化した。核抽出物（１０7個の細胞）を作製した。次いで、トランスフェクトされた細胞からの核タンパク質を、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びプロテアーゼ阻害薬カクテル（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）製、ウィスコンシン州マジソン）を含有する２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）に溶かした。各抽出物のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製、カリフォルニア州ハーキュリーズ）により測定し、抽出物を、使用するまで−７０℃においてアリコットで貯蔵した。標準的なウェスタンブロット分析を行った。細胞を、プロテアーゼ阻害薬（プロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤；ロシェ（Ｒｏｃｈｅ）製、インディアナ州インディアナポリス）を補充されたタンパク質溶解用緩衝液（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ含有）で処理した。次いで、溶解産物中のタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。ＲｅｌＡ及びＴ−ｂｅｔのためのタンパク質特異的検出抗体（セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マサチューセッツ州ダンバース）を、ブロットと共にインキュベートし、発現を、強化化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロット検出システム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して可視化した。
【０２８３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ及びＩＦＮ−ガンマ産生によるＲｅｌＡ／ｐ６５及びＴ−ｂｅｔの転写活性の確認。ルシフェラーゼ（ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ）を同時発現するＲｅｌＡ／ｐ６５発現ベクターを使用して、ＲｅｌＡ／ｐ６５の機能性を確認したが、これは、「アジュバント」ワクチン研究において使用する前に必要である。ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。簡単には、２９３個のＴ細胞（１０5細胞／ウェル）を、２４時間にわたって９６ウェルプレートに播種した。次いで、細胞に、ＲｅｌＡ／ｐ６５  Ｌｕｃ発現プラスミドをトランスフェクトし、続いて、６時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後に、細胞培養培地を除去し、新たな培地に代えた。トランスフェクションの２日後に、細胞を、６時間にわたって２０ｎｇ／ｍＬの組換えＴＮＦ−αで処理し、続いて、Ｍｉｃｒｏｌｕｍａｔ＋ルミノメーター（ＬＵＭＡＴ  ＬＢ９５０１、ベルトールドテクノロジーズ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、テネシー州オークリッジ）を使用することにより、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｐＴ−ｂｅｔ機能を確認するために、ｐＴ−ｂｅｔトランスフェクトされたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの産生を測定した。ＩＦＮ−γを測定する契機は、Ｔ−ｂｅｔとＩＦＮ−γ産生との直接的な相関を実証した以前に公開された研究に基づく。簡単には、この分析において、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓から単離された未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して精製した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ培地中で維持し、引き続いて、ｐＴ−ｂｅｔまたは陰性対照としてのｐＶａｘ１をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞を一晩にわたって抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８Ａｂ（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。引き続き、培養ＣＤ４＋Ｔ細胞から収集された上清中のＩＦＮ−γレベルを、標準的なＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２８４】
分析及びワクチン接種計画。成体の雌のＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２ｄ）マウスを、ザ・ジャクソンラボラトリー（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（メイン州バーハーバー）から購入した。マウスを、左大腿四頭筋への針注射により、ＰＢＳ２５μＬ中に再懸濁させたプラスミド２５μｇで筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫した。ワクチン接種の直後に、同じ部位でＥＰを続け、２週間隔で繰り返した。ＥＰ間接送達のために、イノビオファーマシューティカルズ社（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ,Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州ブルーベル）が供給する三つ又ＣｅｌｌＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流ＭｉｎｉｍａｌｌｙＩｎｖａｓｉｖｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＩＤ）を使用した。具体的には、方形波パルスを、２６ゲージ固体ステンレス鋼電極からなる三角３電極アレイ（皮内に２ｍｍ挿入）により送達し、０．１Ａｍｐの２つの定電流パルスを、１秒の遅延により離して５２ミリ秒／パルスにわたって送達した。ワクチン接種／分子アジュバント投与計画の間に、また、研究の終了を通じて、すべてのマウスを、起こり得る有害作用の発生について３日毎にモニターした。
【０２８５】
脾細胞、Ｔ細胞の単離、及びサイトカインの定量。脾臓を、３回目の免疫化の７〜８日後に採取した。簡単には、脾臓を、１０％ＦＢＳ、１倍抗生物質−抗カビ（ライフテクノロジー製、ニューヨーク州グランドアイランド）、及び１倍β−ＭＥ（ライフテクノロジー製、ニューヨーク州グランドアイランド）を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）製、バージニア州マナサス）に入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機械（セワードラボラトリーシステムズ（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、ニューヨーク州ボヘミア）を使用して脾臓を機械的に撹乱することにより、脾細胞を単離し、その結果生じた生成物を、４０μｍ細胞ストレーナ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製、カリフォルニア州サンホセ）を使用して濾過した。次いで、細胞を、５分間にわたって、ＲＢＣを溶解するためのＡＣＫ溶解用緩衝液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）製、メリーランド州ウォーカーズビル）で処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて使用するためにＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。ＣＤ４未感作Ｔ細胞を、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）製、カリフォルニア州オーバーン）を使用して脾臓から精製した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ培地中で維持し、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（それぞれ１μｇ／ｍＬ）で刺激した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体で刺激したら、培養細胞の培養上清中のサイトカイン産生レベルを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。
【０２８６】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析。標準的なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイをこの研究では使用した。簡単には、９６ウェルプレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製、マサチューセッツ州ビレリカ）を抗マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、ミネソタ州ミネアポリス）でコーティングし、２４時間にわたって４℃においてインキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで、２時間にわたって、遮断緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び５％スクロース）と共にインキュベートした。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（５×１０５細胞／ウェルを３連で平板培養）を脾細胞からＭＡＣＳ精製し（ミルテニーバイオテック製、カリフォルニア州オーバーン）、引き続いて、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ（コンセンサスサブタイプＢ）またはＥｎｖ（サブタイプＢ（ＭＮ））ペプチド（それらの個々のタンパク質の長さ全体にわたって１１アミノ酸重複の１５マー（ＮＩＨ  ＡＩＤＳリアジェントプログラム（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）製、メリーランド州ベセスダ）で刺激した。５％ＣＯ２中で３７℃における一晩にわたる１８〜２４時間の刺激の後に、プレートをＰＢＳ中で洗浄し、引き続いて、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入したビオチン化抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共に４℃においてさらに２４時間にわたってインキュベートした。次いで、プレートを再びＰＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（マブテック（ＭａｂＴｅｃｈ）製、スウェーデン、ナッカストランド（Ｎａｃｋａ  Ｓｔｒａｎｄ））を各ウェルに加え、２時間にわたって室温においてインキュベートした。最後に、プレートを再びＰＢＳ中で洗浄し、続いて、５〜３０分間にわたってＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｐｌｕｓ基質（マブテック（ＭａｂＴｅｃｈ）製、オハイオ州シンシナティ）と共にインキュベートした。外観検査に基づきスポット発生が完了したら、プレートを蒸留水ですすぎ、次いで、一晩にわたって室温において乾燥させた。スポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（セルラーテクノロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製、オハイオ州シェーカーハイツ）を使用してカウントした。
【０２８７】
Ｔ細胞増殖アッセイ。９６ウェルＵ底プレート内で、組換えＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｐｒ５５（Ｇａｇ）（ＮＩＨ  ＡＩＤＳレアジェントプログラム製、メリーランド州ベセスダ）またはＨＩＶ−１  ＭＮ  ＩＩＩＢ  ｇｐ１６０（Ｅｎｖ）（プロテインサイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）製、コネチカット州メリデン）の系列希釈（５、１、及び０．１μｇ／ｍＬ）の存在下で、培養培地中で１ウェルあたり１０５個の脾細胞をインキュベートすることにより、増殖反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定し、５％ＣＯ２と共に３７℃においてインキュベートした。トリチウム標識（３Ｈ）チミジンの組み込みを、０〜２４時間の期間にわたって１μＣｉ／ウェルの（３Ｈ）チミジンでパルス処理することにより測定した。次いで、プレートを収集し、取り込まれた３Ｈチミジンを、Ｂｅｔａプレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）製、マサチューセッツ州ウォルサム）において測定した。増殖反応を、Ａｇ刺激ウェルの平均ｃｐｍ（カウント毎分）を非刺激ウェルの平均ｃｐｍで割ることにより算出される刺激指数（ＳＩ）として表す。
【０２８８】
ＥＬＩＳＡ。３回目のワクチン接種の７日後に採取されたワクチン接種マウスからの血清を、ＥＬＩＳＡにより、組換えＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳレアジェントプログラム製）に対する抗体反応について試験した。簡単には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、組換えＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質（プロテインサイエンス製）でコーティングし、４℃においてインキュベートし、引き続いて、ＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。次いで、プレートを、２時間にわたって、ＰＢＳ及び０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０で遮断した。遮断溶液を除去した後に、予備希釈された（１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００）マウス血清１００μＬを加え、１時間にわたってインキュベートした。次いで、プレートを４回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ  ｍＡｂ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製、ミズーリ州セントルイス）と共にインキュベートした。最後に、プレートを再び洗浄し、続いて、１ウェルあたり基質溶液２００μｌ（Ｒ＆Ｄシステム製、ミネソタ州ミネアポリス）を加えた。引き続いて、１５分のインキュベーションの後に、（ＯＤ４０５ｎｍ）における光学密度を測定した。すべてのアッセイを３連で行った。
【０２８９】
フローサイトメトリー。筋肉組織（すなわち、注射／ワクチン接種の部位から）を無菌で取り除き、Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（ライフテクノロジー製、ニューヨーク州グランドアイランド）ですすぎ、約１×２ｍｍ平方に細かく刻み、たまに撹拌しながら、コラゲナーゼＡ２０ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ、ライフテクノロジー製、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、３７℃において、４５分間にわたって温浸した。細胞温浸物を滅菌３１μｍナイロンメッシュで濾過し、１０分間にわたって４００ｇにおいて遠心分離し、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ４ｍＬ中に再懸濁させた。
【０２９０】
フローサイトメトリー分析のために、免疫化マウス細胞からの１０6個の細胞を、氷冷緩衝液Ａ（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０１％ＮａＮ３）を含む懸濁液中で洗浄し、２０分間にわたって４℃において１：１００希釈蛍光標識特異抗体５０μＬと共にインキュベートした。利用した蛍光コンジュゲートされたＡｂは、ＦＩＴＣ−ＣＤ１１ｃ、ＰＥ−ＣＤ４、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−７５０−ＣＤ８α、及びＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＣＤ１１ｂ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製、カリフォルニア州サンホセ）であった。細胞を２回洗浄し、すぐに、フローサイトメーター（ベクトンディッキンソンＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ）製、カリフォルニア州サンホセ）で分析した。すべてのインキュベーション及び洗浄を、４℃において氷冷緩衝液Ａを用いて行った。細胞を一重項物質及び生細胞でゲートした。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）製、オレゴン州アッシュランド）を使用して分析した。
【０２９１】
統計的解析。群の分析を、マッチド両側不対ｔ検定により完了し、すべての値を平均±ＳＥＭとして表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析を使用して、統計的相違を決定した。すべてのデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５）（グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）製、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して分析した。群の間での統計的に有意な相違を、＊  ｐ＜０．１、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１と定義した。
【０２９２】
実施例２
アジュバントの構築及び発現
ｐＲｅｌＡ及びｐＴｂｅｔプラスミドは、それぞれ、全長マウスＮＦ−カッパＢサブユニットｐ６５／ＲｅｌＡ及び１型トランス活性化因子Ｔ−ｂｅｔをコードし得る。それぞれを、遺伝子的に最適化し、合成し、かつ修飾ｐＶａｘ１哺乳類発現ベクター（図１Ａ）にサブクローニングした。これらのプラスミドの発現を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、それぞれをトランスフェクトし、タンパク質産生を、標準的なウェスタン免疫ブロット法により評価した。トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後の両方で採取された細胞溶解産物において、特異的なＡｂを使用して、ＲｅｌＡに対応する約６５ｋＤａタンパク質を検出した（図１Ｂ）。同様に、抗Ｔ−ｂｅｔ  Ａｂを使用して、Ｔ−ｂｅｔを約５６ｋＤａタンパク質として検出した。いずれも、空のベクター対照であるプラスミドｐＶａｘ１をトランスフェクトされた細胞からの溶解産物には結合しないので、結合は、それらの個々のタンパク質について特異的であった。これらのデータにより、分子アジュバントはそれぞれ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のインビトロトランスフェクションで、それらの個々にコードされたタンパク質を発現することが実証された。さらに、ＩκＢ依存性転写を、ＲｅｌＡ（ｐ６５）の活性化を確認するために、ＨｅＬａ細胞、ルシフェラーゼ発現細胞系（図１Ｃ）において評価した。相対的ルシフェラーゼ活性により測定されるとおりのＲｅｌＡ発現の増大が、用量依存的に観察された。すなわち、３μｇから５μｇまたは１０μｇへのプラスミドの増大は、約１．５または２．５倍の相対的ルシフェラーゼ活性の増大をもたらした。Ｔ−ｂｅｔ発現は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ発現と相関し、したがって、このアッセイにおいて、ＩＦＮ−γは、Ｔ−ｂｅｔの機能的発現についての代用物として役立った（図１Ｄ）。
【０２９３】
加えて、ｐＲｅｌＡプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、かつ抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）抗体で染色した後のＲｅｌＡタンパク質発現の細胞内位置限定の免疫蛍光分析（ＩＦＡ）を、図６に示す。このＩＦＡによりさらに、ｐＲｅｌＡプラスミドからのＲｅｌＡの発現が確認された。
【０２９４】
実施例３
細胞性免疫の増大
次いで、ワクチン誘導性免疫の増強についてのｐＲｅｌＡ及びｐＴｂｅｔの寄与を評価した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４／群）に３回、ｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔ２５μｇを伴うか、もしくは伴わないｐＥｎｖもしくはｐＧａｇ２５μｇ、ｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔ２５μｇのみ、または対照プラスミド（ｐＶａｘ１）２５μｇをワクチン接種した（図２）。ワクチン及びアジュバントを、ｉｎ  ｖｉｖｏＥＰによりＰＢＳ２５μＬ中で送達した。動物を３５日目（すなわち、３回目のワクチン接種の７日後）に屠殺し、続いて、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによる免疫分析のために脾細胞を単離した。このアッセイでは、ＨＩＶ−１  ＥｎｖまたはＧａｇペプチドプールを、ＭＡＣＳ精製ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激のために使用し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ結果を図２に示す。ｐＥｎｖのみと比較して、ｐＥｎｖをワクチン接種され、かつｐＲｅｌＡを同時投与されたマウスにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応の両方が有意に増大したことが観察された。同様に、ｐＥｎｖのみと比較して、ｐＴｂｅｔの同時投与を伴うｐＥｎｖでの免疫化により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応（図２Ｂ）の有意な増大が実証された。
【０２９５】
異なるＡｇについてのＴ細胞ＩＦＮ−γ産生に対するこれら２つのアジュバントの増強効果を確認するために、本発明者らはまた、上記で行ったのと同様に、動物に、ｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔを伴うか、または伴わずにＨＩＶ−１Ｇａｇをワクチン接種した。ｐＥｎｖ群と類似して、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、ｐＧａｇのみをワクチン接種されたマウスと比較すると、ｐＧａｇで免疫化され、かつｐＲｅｌＡを同時投与されたマウスにおいて増大した（図２Ｃ）。ｐＧａｇのみでの免疫化と比較して、ｐＧａｇをワクチン接種され、かつｐＲｅｌＡを同時投与されたマウスにおいては、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応のさらに大きな増強が存在した（図２Ｃ）。さらに、ｐＴｂｅｔの随伴投与を伴うＨＩＶ−１  Ｇａｇでの免疫化により、ｐＧａｇのみでの免疫化に比較すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の増大が実証された（図２Ｃ）。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、ｐＲｅｌＡの同時送達で観察されたほどには有意に増大しなかった。また、ｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔのいずれかのみの投与は、ＩＦＮ−γ産生により測定されたとおり、ＧａｇまたはＥｎｖに対してＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれも顕著には活性化しなかった。したがって、これらのデータにより、転写因子アジュバントの同時投与は、２つの別々の抗原に対するＴ細胞反応の増強を促進したことが実証され、このデータは、免疫アジュバントの投与により、ワクチン誘発性細胞性免疫反応の幅の拡張が刺激されることを示唆している。
【０２９６】
ＲｅｌＡ分子アジュバントは、Ｔ細胞反応を特に高めると観察されたので、ｐＲｅｌＡの存在下または不在下で免疫化された細胞の増殖可能性を評価した。ワクチン接種された動物からの脾細胞を、３回目の免疫化から７日目に採取し、次いで、それらの同源Ａｇ、すなわち、ＨＩＶ−１  ＥｎｖまたはＧａｇで刺激した（図３）。ｐＥｎｖワクチン接種マウスにおいて、アジュバントされていない動物と比較すると、ｐＲｅｌＡアジュバントも投与されたマウスでは全てのＡｇ用量において、増殖が増強する傾向が存在した（図３Ａ）。この傾向は、ｐＧａｇワクチン接種された動物においても観察され、その際、全刺激インデックスが、ｐＲｅｌＡが同時送達された方が、より高かった（図３Ｂ）。さらに、図３Ａ、Ｂの両方には、全刺激インデックスに加えて、倍数増加グラフが含まれ、その際、「倍数」値は、単独のｐＥｎｖまたはｐＧａｇ群の刺激インデックスで割ったｐＥｎｖ＋ｐＲｅｌＡまたはｐＧａｇ＋ｐＲｅｌＡ群の刺激インデックスの比である。このように、ｐＥｎｖ及びｐＧａｇワクチン接種動物における刺激インデックスは、試験されたすべてのワクチン用量において、ｐＲｅｌＡアジュバントが含まれることにより増加した。これらの反応は、ｐＲｅｌＡアジュバントのみを投与された動物からの脾細胞においては、軽微な増殖しか観察されなかったので、ＨＩＶ  Ａｇに特異的であった。まとめると、これらの結果により、ｐＲｅｌＡ  ＤＮＡアジュバントは、２つの個別の特異的抗原に対するＡｇ特異的Ｔ細胞増殖反応を増強することが実証された。
【０２９７】
加えて、図７は、アジュバントＲｅｌＡを含むか、または含まないワクチンで免疫化されたマウスからのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示している。これらのデータにより、ワクチンにＲｅｌＡが含まれることで、ＩＬ−２産生が約３倍に有意に上昇することが実証された。
【０２９８】
実施例４
アジュバントワクチン接種での抗体反応の増強
観察されたアジュバント媒介性のＴ細胞ＩＦＮ−γ及び増殖反応の増大に基づき、Ｂ細胞誘導に対するこれらの分子アジュバントの効果を評価した。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ特異的ＩｇＧを、３回目のワクチン接種の７日後に、ワクチン接種された動物の血清において測定した。示されているとおり、マウスに、同時投与されるｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔを伴うか、もしくは伴わないｐＥｎｖか、ｐＲｅｌＡもしくはｐＴｂｅｔのみか、またはｐＶａｘ１対照プラスミドを投与した（図４）。１：５０〜１：５００の範囲の希釈では、測定可能なＩｇＧ反応が、ｐＥｎｖのみにより誘導されたが、１：１，０００の希釈では、もはや測定不可能であった。これらの反応が、ｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔアジュバントを含むことにより、ｐＥｎｖ群のみと比較すると、すべての希釈において増強された。具体的には、１：５０血清希釈において、相違が観察され、その際、ｐＲｅｌＡ及びｐＴｂｅｔの投与は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ特異的ＩｇＧ反応の誘導を有意に増強した（それぞれｐ＝０．０３８８及びｐ＝０．００６２）。ｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔアジュバントのみを投与されたマウスからの血清においては、軽微な抗体反応しか観察されなかったので、ＩｇＧ反応の増強は、Ｅｎｖに特異的であった。これらのデータにより、両方の転写因子アジュバントが体液性免疫反応の増強を誘発し、それは、ｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔのワクチン接種後に観察されたＩＦＮ−γレベル及びＴ細胞増殖反応の上昇と類似及び一致することが示唆されている。
【０２９９】
図８Ａは、ｐＲｅｌＡで同時免疫化されたＢａｌｂ／Ｃマウスの体液性免疫反応の増大を示している。ｐＶａｘ１、ｐＥｎｖ、またはｐＥｎｖ＋ｐＲｅｌＡをコードするプラスミドＤＮＡで免疫化されたマウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析。ＤＮＡ接種マウスからの血清中におけるｇｐ１２０に対するＩｇＧ抗体反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。マウスをいずれも、３回の免疫化で先に免疫化した。ＯＤ４０５は、４０５ｎｍにおける光学密度である。図８Ｂは、ＩｇＧサブクラスにスイッチングするアイソタイプに対するＲｅｌＡの示差効果を示している。脾臓Ｅｎｖ及びＥｎｖ＋ＲｅｌＡ細胞が発現する合計ＩｇＧ１及びＩｇＧ２を決定した。値は、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。値は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【０３００】
図８Ｃは、ｐＲｅｌＡで同時免疫化されたＢａｌｂ／Ｃマウスの体液性免疫反応の増大を示している。ｐＶａｘ１、ｐＥｎｖ、またはｐＥｎｖ＋ｐＴ−ｂｅｔをコードするプラスミドＤＮＡで免疫化されたマウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析。ＤＮＡ接種マウスからの血清におけるｇｐ１２０に対するＩｇＧ抗体反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。マウスをいずれも、３回の免疫化で先に免疫化した。ＯＤ４０５は、４０５ｎｍにおける光学密度である。図８Ｄは、ＩｇＧサブクラスにスイッチングするアイソタイプに対するＴ−ｂｅｔの示差効果を示している。脾臓Ｅｎｖ及びＥｎｖ＋Ｔ−ｂｅｔ細胞が発現する合計ＩｇＧ１及びＩｇＧ２を決定した。値は、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。値は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【０３０１】
抗体反応を増強する転写因子の能力についての有望な機構の１つは、活性化Ｂ細胞の数の増大を介し得る。これが生じているかどうかを評価するために、ワクチン接種部位におけるｐＲｅｌＡ投与された筋肉を、ｐＲｅｌＡの同時投与を伴うｐＥｎｖ免疫化の３日後に生検し、続いて、注射部位におけるＢ２２０＋Ｂ細胞の数を定量化した。図９は、相対的発現（百分率）を示している。結果は、ｐＲｅｌＡ及びｐＥｎｖのみは、ｐＶａｘ１投与のみと比較して、注射の部位へのＢ細胞輸送をわずかしか上昇させないことを示した（図５）。これは、個別のＦＡＣＳスキャンで示されたＭＦＩ（平均蛍光強度）値により示され、この値は、Ｂ２２０＋Ｂ細胞のレベルと正比例する。しかしながら、ｐＥｎｖワクチンと組み合わせてｐＲｅｌＡアジュバントを添加すると、注射部位でのＢ細胞の数がさらに増強された。
【０３０２】
まとめると、実施例２〜４のデータにより、ＤＮＡワクチン誘導性免疫を増強するための分子アジュバントとしての細胞転写因子ＲｅｌＡ及びＴ−ｂｅｔの使用が実証された。ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法（ＥＰ）によりプロトタイプのＤＮＡワクチンと共に同時送達すると、これらのアジュバントのいずれも、Ｔ細胞数及びＩＦＮ−γ産生の増強により、さらには、抗体レベルの増大により示されるとおり、抗原特異的Ｔ及びＢ細胞反応の増強を刺激した。ｐＥｎｖまたはｐＧａｇワクチンと併せてｐＲｅｌＡまたはｐＴｂｅｔのいずれかを同時投与すると、ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＮＦ−γ産生及び増殖により測定されるとおり、Ｔ細胞免疫が有意に増大した。さらに、Ｂ細胞数、さらには、抗原特異抗体力価の上昇により示されるとおり、Ｂ細胞／抗体レベルが増強された。これらの所見に一致して、転写因子を発現するプラスミドの同時投与の後に、血清中の抗原特異的ＩｇＧの全量が増大した。
【０３０３】
実施例５
アジュバントとしてＴＷＥＡＫまたはＧＩＴＲＬを用いての細胞反応
ｐＴＷＥＡＫプラスミドを、全長ＴＷＥＡＫをコードするヌクレオチド配列のコドン利用を最適化することにより構築した。次いで、この最適化されたヌクレオチド配列を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＶＡＸ１発現ベクターにクローニングした。
【０３０４】
ｐＧＩＴＲＬプラスミドを、全長ＧＩＴＲＬをコードするヌクレオチド配列のコドン利用を最適化することにより構築した。次いで、この最適化されたヌクレオチド配列を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＶＡＸ１発現ベクターにクローニングした。
【０３０５】
１０群のマウスが、研究に含まれた。各群にはマウス４匹がおり、各群のマウスは、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスであった。１つの群を抗原のみで免疫し（すなわち、ＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするＤＮＡ１５μｇ）、１つの群をＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするＤＮＡ１５μｇ及びｐＴＷＥＡＫ（「Ｔ」）７．５μｇで免疫し、１つの群をＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするＤＮＡ１５μｇ及びｐＴＷＥＡＫ（「Ｔ」）１０μｇで免疫し、１つの群をＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするＤＮＡ１５μｇ及びｐＧＩＴＲＬ（「Ｇ」）７．５μｇで免疫し、かつ１つの群をＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするＤＮＡ１５μｇ及びｐＧＩＴＲＬ（「Ｇ」）１０μｇで免疫した。
【０３０６】
免疫化を、ＭＩＤ−ＥＰシステムでの電気穿孔法に従って筋肉内（ＩＭ）で行った。具体的には、各免疫化について、ＤＮＡ２５μｇを、２９ゲージ針を備えたインスリン用シリンジを使用して注射した。各免疫化の１週間後に、マウスから、眼窩後出血により採血した。
【０３０７】
免疫化計画を、図１０に模式的に示す。マウスに、０日目に初回免疫し、次いで、１４日目及び２８日目に追加免疫した。３５日目にマウスを屠殺して、ＥＬＩＳＡ分析のための最終出血及びＥＬＳｓｐｏｔ分析のための脾細胞を採取した。
【０３０８】
ＥＬＩＳｓｐｏｔ分析の結果を、それぞれＴＷＥＡＫ及びＧＩＴＲＬについて図１１及び１２に示す。これらのデータにより、ＴＷＥＡＫは、ＴＷＥＡＫを含まないワクチンと比較して、抗原に対する細胞性免疫反応を増大させることが実証された（ＩＦＮ−γレベルの増大により証明される）。また、これらのデータにより、ＧＩＴＲＬは、ＧＩＴＲＬを含まないワクチンと比較して、抗原に対する細胞性免疫反応を増大させることが実証された（ＩＦＮ−γレベルの増大により証明される）。したがって、ＴＷＥＡＫ及びＧＩＴＲＬは、アジュバントとしてＴＷＥＡＫまたはＧＩＴＲＬを含まない同じワクチンと比較して、ＩＦＮ−γレベル及び抗原に対する細胞性免疫反応を増大させるアジュバントとして役立った。
【０３０９】
実施例６
アジュバントとしてＴＷＥＡＫまたはＧＩＴＲＬを用いての体液性免疫反応
ＴＷＥＡＫまたはＧＩＴＲＬをワクチンにおいてアジュバントとして使用した場合の体液性免疫反応を、マウスにおいて調べた。この調査では、実施例５において上記し、図１０において示されている免疫化スケジュールを使用した。体液性反応をＥＬＩＳＡにより測定し、その際、光学密度はＯＤ４５０において測定した。すべての実験群が、ナイーブに対して、約１５８までの逆数力価希釈において、光学密度の顕著な増大を示した。特に、１０μｇ用量のＧＩＴＲＬは、５０の逆数力価希釈における光学密度の３倍超の増大と共に、体液性反応の最も有意な増大を示した。希釈が５０００を超えて増大したときに、対照を超える実験群の相違は緩和された。
【０３１０】
実施例７
アジュバントとしてＥＯＭＥＳを用いての細胞反応
ｐＥＯＭＥＳプラスミドを、ＥＯＭＥＳをコードするヌクレオチド配列のコドン利用を最適化することにより構築した。次いで、この最適化されたヌクレオチド配列を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＶＡＸ１発現ベクターにクローニングした。ＩｇＥリーダー配列及びＫｏｚａｋ配列も、ＥＯＭＥＳをコードするヌクレオチド配列の５’側に位置させた。構築物の図を図１４Ａに示す。
【０３１１】
ｐＥＯＭＥＳプラスミドからのＥＯＭＥＳの発現を、ｐＥＯＭＥＳプラスミド及びｐＶＡＸ１プラスミド（陰性対照）を細胞にトランスフェクトすることにより確認した。図１４Ｂに示されているとおり、ＥＯＭＥＳは、ｐＥＯＭＥＳをトランスフェクトされた細胞において発現されたが、ｐＶＡＸ１をトランスフェクトされた細胞では発現されなかった。発現を、細胞にＤＮＡ１０μｇをトランスフェクトしたトランスフェクションの２日後に、溶解産物のウェスタンブロットにより分析した。
【０３１２】
マウス群が、研究に含まれた。各群にはマウス５匹がおり、各群のマウスは、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスであった。１つのマウス群をｐＶＡＸ１（陰性対照）で免疫し、１つの群を抗原のみで免疫し（すなわち、ＨＩＶ  ＥｎｖをコードするＤＮＡ、プラスミドはｐＨＩＶ−Ｅｎｖと称される）、１つの群をｐＨＩＶ−Ｅｎｖ及びｐＥＯＭＥＳで免疫した。
【０３１３】
免疫化を、ＭＩＤ−ＥＰシステムでの電気穿孔法に従って筋肉内（ＩＭ）で行った。具体的には、各免疫化について、ＤＮＡ２５μｇを、２９ゲージ針を備えたインスリン用シリンジを使用して注射した。各免疫化の１週間後に、マウスから、眼窩後出血により採血した。
【０３１４】
免疫化計画を、図１５に模式的に示す。マウスに、０週目に初回免疫し、次いで、２週目及び４週目に追加免疫した。５週目にマウスを屠殺して、ＥＬＳｓｐｏｔ分析のための脾細胞を採取した。
【０３１５】
ＥＬＩＳｓｐｏｔ分析の結果を、図１６に示す。これらのデータにより、ＥＯＭＥＳは、ＥＯＭＥＳを含まないワクチンと比較して、抗原に対する細胞性免疫反応を増大させることが実証された（ＩＦＮ−γレベルの増大により証明される）。したがって、ＥＯＭＥＳは、アジュバントとしてＥＯＭＥＳを含まない同じワクチンと比較して、ＩＦＮ−γレベル及び抗原に対する細胞性免疫反応を増大させるアジュバントとして役立った。
【０３１６】
実施例８
アジュバントとしてＳＴＩＮＧを用いての細胞反応
ｐＳＴＩＮＧプラスミドを、ＳＴＩＮＧをコードするヌクレオチド配列のコドン利用を最適化することにより構築した。次いで、この最適化されたヌクレオチド配列を、ｐＶＡＸ１発現ベクターにクローニングした。
【０３１７】
ｐＳＴＩＮＧプラスミドからのＳＴＩＮＧの発現を、ｐＳＴＩＮＧプラスミド及びｐＶＡＸ１プラスミド（陰性対照）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより確認した。図１７に示されているとおり、ＳＴＩＮＧは、ｐＳＴＩＮＧをトランスフェクトされた細胞において発現されたが、ｐＶＡＸ１をトランスフェクトされた細胞では発現されなかった。発現を、細胞にＤＮＡ１０μｇをトランスフェクトしたトランスフェクションの２日後に、溶解産物のウェスタンブロットにより分析した。
【０３１８】
マウス群が、研究に含まれた。各群にはマウス４匹がおり、各群のマウスは、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスであった。１つのマウス群をｐＶＡＸ１（陰性対照）で免疫し、１つの群を抗原のみで免疫し（すなわち、ＨＩＶ  ＥｎｖをコードするＤＮＡ、プラスミドはｐＨＩＶ−Ｅｎｖと称される）、１つの群をｐＨＩＶ−Ｅｎｖ及びｐＳＴＩＮＧ（２０μｇ）で免疫し、かつ１つの群をｐＨＩＶ−Ｅｎｖ及びｐＳＴＩＮＧ（５０μｇ）で免疫した。
【０３１９】
免疫化を、ＭＩＤ−ＥＰシステムでの電気穿孔法に従って筋肉内（ＩＭ）で行った。具体的には、各免疫化について、ＤＮＡを、２９ゲージ針を備えたインスリン用シリンジを使用して注射した。各免疫化の１週間後に、マウスから、眼窩後出血により採血した。
【０３２０】
免疫化計画を、図１８に模式的に示す。マウスに、０週目に初回免疫し、次いで、２週目及び４週目に追加免疫した。５週目にマウスを屠殺して、ＥＬＳｓｐｏｔ分析のための脾細胞を採取した。
【０３２１】
ＥＬＩＳｓｐｏｔ分析の結果を、図１９に示す。これらのデータにより、ＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧを含まないワクチンと比較して、抗原に対する細胞性免疫反応を増大させることが実証された（ＩＦＮ−γレベルの増大により証明される）。したがって、ＳＴＩＮＧは、アジュバントとしてＳＴＩＮＧを含まない同じワクチンと比較して、ＩＦＮ−γレベル及び抗原に対する細胞性免疫反応を増大させるアジュバントとして役立った。
【０３２２】
前述の詳細な説明及び添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
【０３２３】
開示された実施形態に対する、様々な変更及び修正は当業者に明白であろう。そのような変更及び修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤及び／または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2019031528000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月30日(2018.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と、Ｒｅｌ−Ａ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＧＩＴＲＬ、及びＳＴＩＮＧからなる群から選択される１つ以上のアジュバントとを含むワクチン。
【外国語明細書】
2019031528000001.pdf