(57)【要約】【課題】本発明の課題は、比較的容易に種々の薬物を担持して骨に輸送することができる骨標的薬物輸送担体として利用することができると共に、生体に対する毒性が低い化合物を提供することである。【解決手段】本発明に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、（ａ１）リン酸ジエステルまたはその塩の単位と、（ｂ）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステルの単位とを含有する。このようなリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、骨標的薬物輸送担体として利用することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ１）リン酸ジエステルまたはその塩の単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステルの単位とを含有するリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体。
【請求項２】
（ａ０）アルコキシ基を有するリン酸トリエステル単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸トリエステル共重合体の水溶液にトリメチルアミンを加えた後、その混合液にプロトンを接触させることによって、（ａ２）リン酸ジエステル単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位を含有するリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体を合成する、リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の合成方法。
【請求項３】
（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸エステル共重合体を備える、骨標的薬物輸送担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体およびその合成方法に関する。また、本発明は、骨標的薬物輸送担体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨を標的とする薬物輸送担体の開発が進められている（例えば、非特許文献１等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】勝見英正、「骨疾患治療の効率化を目指したＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍの開発」、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，２０１６年，第３１巻，第３号，第２４６−２４７頁
【非特許文献２】Yuya Hirano、Yasuhiko Iwasaki、”Bone-specific poly(ethylene sodium phosphate)-bearing biodegradable nanoparticles”、Colloids and Surface B: Biointerfaces、153、2017、p.104-110
【非特許文献３】Shiyi Zhang et al.、”Rapid and Versatile Construction of Diverse and Functional Nanostructures Derived from a Polyphosphoester-Based Biomimetic Block Copolymer System”、Journal of the American Chemical Society、2012、134、p.18467-18474
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、比較的容易に種々の薬物を担持して骨に輸送することができる骨標的薬物輸送担体として利用することができると共に、生体に対する毒性が低い化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１局面に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、（ａ１）リン酸ジエステルまたはその塩の単位（以下「リン酸ジエステル等単位」という。）と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステルの単位（以下「エチニレン基含有リン酸トリエステル単位」という。）とを含有する。このリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、（ａ１）リン酸ジエステル等単位と、（ｂ０）エチニレン基含有リン酸トリエステル単位とを主成分としてもよいし、（ａ１）リン酸ジエステル等単位と、（ｂ０）エチニレン基含有リン酸トリエステル単位とのみから構成されていてもよい。なお、ここで「主成分」とは５０モル％超を占める成分を意味し、そのモル比率は６０モル％超であることが好ましく、７０モル％超であることがより好ましく、８０モル％超であることがさらに好ましく、９０モル％超であることが特に好ましい。また、リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体中の（ａ１）リン酸ジエステル等単位は、骨に対する親和性を高める観点から７０モル％以上を占めることが好ましく、８０モル％以上を占めることがより好ましく、９０モル％以上を占めることがさらに好ましく、９５モル％以上を占めることが特に好ましい。リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体中の（ｂ０）エチニレン基含有リン酸トリエステル単位は、骨に対する親和性を低下させることなく薬物の担持能力を確保する観点から、３０モル％以下であることが好ましく、２０モル％以下であることがより好ましく、１０モル％以下であることがさらに好ましく、５モル％以下であることがさらに好ましく、３モル％以下であることが特に好ましい。
ところで、本発明の第１局面に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の化学構造式は、下式（１）の通りである。
【０００６】
【化１】
2019026661.tif 000003
【０００７】
上式（１）中、ＸはＨ又はアルカリ金属イオンを示し、Ｒ１およびＲ２はアルキレン基を示し、Ｒ３はエチニレン基を含むペンダント基を示す。ここで、エチニレン基は、末端に位置することが好ましく、エチニレン基の末端には水素原子（Ｈ）が結合されるのが好ましい。上記アルカリ金属イオンはナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）であることが好ましく、Ｒ１およびＲ２はエチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２−）であることが好ましく、Ｒ３は３−ブチン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）であることが好ましい。
【０００８】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の特定のリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、クリック反応や、チオール基との反応を利用することによりエチニレン基に対して比較的容易に種々の薬物を担持することができる。また、このリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、薬物を骨に輸送することができる骨標的薬物輸送担体として利用することができるのみならず、生体適合性が高いことが判明した。したがって、この特定のリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、上述の課題を解決することができる。
【０００９】
本発明の第２局面に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の合成方法は、第１局面に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の合成方法である。このリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の合成方法では、（ａ０）アルキル基を有するリン酸トリエステル単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸トリエステル共重合体の水溶液にトリメチルアミンが加えられた後、その混合液にプロトンが接触させられることによって、（ａ２）リン酸ジエステル単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位を含有するリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体が合成される。なお、上述の混合液にプロトンを接触させる方法としては、混合液を陽イオン交換樹脂に通液させること等が挙げられる。
【００１０】
ところで、この合成方法を化学反応式で示すと、以下の化学反応式（Ａ）に示される通りとなる。
【００１１】
【化２】
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【００１２】
上式（Ａ）中、Ｒ１およびＲ２はアルキレン基を示し、ＲＳはアルキル基を示し、Ｒ３はエチニレン基を含むペンダント基を示す。なお、Ｒ１およびＲ２はエチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２−）であることが好ましく、ＲＳはメチル基であることが好ましく、Ｒ３は３−ブチン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）であることが好ましい。
【００１３】
また、（ａ０）アルキル基を有するリン酸トリエステル単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸トリエステル共重合体を合成する方法としては、例えば、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）の存在下、以下の化学構造式（２）に示される化合物と、化学構造式（３）に示される化合物とを開環重合させる方法等が挙げられる。
【００１４】
【化３】
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【００１５】
【化４】
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【００１６】
上式（２）および（３）中、Ｒ１、Ｒ２、ＲＳおよびＲ３は、上述と同様の基（グループ）を示す。なお、上述の化学構造式（２）に示される化合物としては、例えば、２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン、２−エトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン等の２−アルコキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン等が挙げられる。また、上述の化学構造式（３）に示される化合物としては、例えば、２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン等が挙げられる。
【００１７】
本発明の第３局面に係る骨標的薬物輸送担体は、特定のリン酸エステル共重合体を備える。その特定のリン酸エステル共重合体は、（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有する。このリン酸エステル共重合体は、クリック反応を利用することによりエチニレン基に対して比較的容易に種々の薬物を担持することができる。また、なお、この特定のリン酸エステル共重合体は、骨との親和性が極めて高く、骨標的薬物輸送担体として機能するのみならず骨の改質剤としても機能する。このため、この骨標的薬物輸送担体は、骨標的薬物輸送担体兼骨改質剤とも言える。さらに、このリン酸エステル共重合体は、生体に対する毒性が低いことが判明した。したがって、この骨標的薬物輸送担体は、生体毒性の低い有用な骨標的薬物輸送担体として利用することができる。
【００１８】
また、第３局面に係る発明は、「（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸エステル共重合体を、骨を標的とする薬物輸送担体として使用する方法」や、「（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸エステル共重合体を担体として使用して薬物を骨に輸送する方法」、「薬物輸送担体としての使用のための、（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸エステル共重合体」、「骨に薬物を輸送するための担体の製造のための、（ａ３）リン酸ジエステル塩単位と、（ｂ０）エチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）を含むペンダント基を有するリン酸トリエステル単位とを含有するリン酸エステル共重合体の使用」と表現することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの赤外線吸収スペクトルである。
【図３】リン酸トリエステル共重合体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】２匹のマウスに蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液およびＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液をそれぞれ投与した後の各マウスの尾骨のＩＶＩＳ像である。なお、本図の上側のＩＶＩＳ像が蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの尾骨のＩＶＩＳ像であり、本図の下側のＩＶＩＳ像がＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの尾骨のＩＶＩＳ像である。
【図６】２匹のマウスに蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液およびＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液をそれぞれ投与した後に同マウスを屠殺して得られた各マウスの左大腿骨背部のＩＶＩＳ像である。なお、本図の上側のＩＶＩＳ像が蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの左大腿骨背部のＩＶＩＳ像であり、本図の下側のＩＶＩＳ像がＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの左大腿骨背部のＩＶＩＳ像である。
【図７】血液凝固活性試験におけるリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体またはポリリン酸添加前の液の写真図である。
【図８】血液凝固活性試験におけるリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の添加系の写真図である。
【図９】血液凝固活性試験におけるポリリン酸の添加系の写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜実施例＞
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００２１】
１．リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体およびリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の合成
（１）２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの合成
先ず、３００ｍＬ容量の三ツ口フラスコにシリンジで２００ｍＬの超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた後に、その三ツ口フラスコの底部分を、−５℃〜−１０℃の不凍液入りの容器に浸け、さらに三ツ口フラスコ中の超脱水テトラヒドロフランを羽根つき攪拌機で攪拌して超脱水テトラヒドロフランを十分に冷却した。
【００２２】
次に、９ｍＬ（１１９．４ｍｍｏｌ）の３−ブチン−１−オールをシリンジで先の三ツ口フラスコに加えた後さらに、１８ｍＬ（１２９．８ｍｍｏｌ）のテトラエチルアミン（ＴＥＡ）をシリンジで同三ツ口フラスコに加えた。
【００２３】
次いで、滴下漏斗に１７．０７ｇ（１１９．４ｍｍｏｌ）の２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）および５０ｍＬの超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。
【００２４】
上述の滴下漏斗の脚部を上述の三ツ口フラスコの口の一つに挿通して固定した後、羽根つき攪拌機の羽根を３００ｒｐｍで回転させて三ツ口フラスコ中の混合液を攪拌させながら、滴下漏斗から２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン溶液を三ツ口フラスコ内の混合液に滴下した。なお、この際、三ツ口フラスコの底部分を、−５℃〜−１０℃の不凍液入りの容器に浸けたままとし、反応液の温度を−５℃〜−１０℃に保つようにした。滴下開始から２０分後に滴下を完了し、その後、滴下開始から１２時間後まで攪拌を継続した。なお、このときの化学反応は、以下の化学反応式（Ｂ）に示される通りである。
【００２５】
【化５】
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【００２６】
三ツ口フラスコ中の反応液を減圧濾過した後、その濾液をロータリーエバポレーターにより濃縮した。最後に、その濃縮物を減圧蒸留して精製した。なお、減圧蒸留は０．４ｋＰａの圧力下、オイルバスの温度を１４０〜１５０℃にして実施した。なお、このとき、内部に挿通した水銀温度計は１１０〜１１５℃を示していた。
【００２７】
（２）２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの同定
上述の精製物を重水に溶解させて重水溶液を調製した。その重水溶液を日本電子株式会社製の４００ＭＨｚ核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置にセットして測定を行ったところ、図１に示される１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られた。この１Ｈ−ＮＭＲスペクトルからその精製物が２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランであることが同定された。
【００２８】
また、同精製物をＫＢｒと混ぜて錠剤化し、その錠剤を日本分光株式会社製のフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ）にセットして測定を行ったところ、図２に示される赤外線吸収スペクトルが得られた。この赤外線吸収スペクトルからその精製物に−Ｃ≡ＣＨ基およびリン酸エステル基が含まれていることが確認された。
【００２９】
（３）リン酸トリエステル共重合体の合成
先ず、重合管に強力攪拌子を入れた後、その重合管に三方コックを取り付けた。なお、この三方コックの２つの口にはそれぞれダイアフラムポンプ、アルゴンガスタンクを接続した。残った一つの口をモノマー等の化合物の注入用の口として利用した。
【００３０】
次に、ダイアフラムポンプを作動させると共にアルゴンガスタンクの弁を開状態とした後、三方コックを操作して重合管とダイアフラムポンプとを連通させて重合管内を減圧した。なお、この減圧操作の際、重合管をアルコールランプであぶって加熱した。次に、三方コックを操作して重合管とアルゴンガスタンクを連通させて重合管にアルゴンガスを注入した。そして、この減圧操作とアルゴンガス注入操作を数回繰り返した。このようにしてアルゴンガス封入重合管を２本用意した。
【００３１】
次いで、三方コックを操作してシリンジの挿通孔を確保してアルゴンガス封入重合管に４．９７ｇ（３６ｍｍｏｌ）の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランおよび０．７０４ｇ（４ｍｍｏｌ）の２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランをそれぞれシリンジで加えた後、三方コックを操作してこのモノマー充填重合管とダイアフラムポンプとを連通させてモノマー充填重合管内を減圧することによりモノマー充填重合管を２時間脱気した。
【００３２】
続いて、三方コックを操作してモノマー充填重合管とアルゴンガスタンクを連通させてモノマー充填重合管にアルゴンガスを注入した。そして、そのアルゴンガス封入モノマー充填重合管を氷浴に浸けて十分に冷却した後に、三方コックを操作してシリンジの挿通孔を確保してアルゴンガス封入モノマー充填重合管に２０μＬ（０．５ｍｍｏｌ）のメタノール（重合開始剤）および２ｍＬのジクロロメタンをそれぞれシリンジで加えた。そして、その開始剤添加重合管を十分に攪拌した。
【００３３】
さらに続いて、三方コックを操作してシリンジの挿通孔を確保して開始剤添加重合管に７０．３μＬ（０．４７ｍｍｏｌ）のジアザビシクロウンデセンをシリンジで加えた。その後、三方コックを操作してジアザビシクロウンデセン添加重合管を完全に密閉状態とし、そのジアザビシクロウンデセン添加重合管を振盪機で３時間、振盪させた。なお、このときの重合反応は、以下の重合反応式（Ｃ）に示される通りである。
【００３４】
【化６】
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【００３５】
振盪終了後、即座に三方コックを操作してシリンジの挿通孔を確保してジアザビシクロウンデセン添加重合管にシリンジで少量の酢酸（重合停止剤）を加えた。
【００３６】
その後、重合管からその内容物を取り出し、その内容物をジクロロメタンで希釈した後にその希釈液にトルエンを加えて、沈殿物を得た。さらに、得られた沈殿物をエタノールに溶解させた後、そのエタノール溶液にジエチルエーテルを加えて、再び沈殿物を得た。その沈殿物をデシケータに静置して減圧乾燥させ、目的のリン酸トリエステル共重合体を得た。なお、このリン酸トリエステル共重合体の収量は３．６５ｇであり、収率は６４．３％であった。
【００３７】
（４）リン酸トリエステル共重合体の物性測定
上述の通りして得られたリン酸トリエステル共重合体を重水に溶解させて重水溶液を調製した。その重水溶液を日本電子株式会社製の４００ＭＨｚ核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置にセットして測定を行ったところ、図３に示される１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られた。この１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク面積比からリン酸トリエステル共重合体中の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン由来単位と２−ブチノキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン由来単位とのモル比率が９４：６であることが判明した。また、ゲルクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により同リン酸トリエステル共重合体の分子量および分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定したところ、その数平均分子量は０．８７×１０４であり、その分散度は１．２１であった。なお、このときの測定条件等は以下の通りであった。
【００３８】
・送液ポンプ：ＰＵ−２０８０
・移動相流速：０．７５ｍＬ／分
・カラム：ＰＬｇｅｌ  ５μｍ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（ポリマーラボラトリーズ社製）
・検出器：ＲＩ−２０３１（日本分光株式会社製）
・展開溶媒：クロロホルム（ＣＨＣｌ３）
【００３９】
また、このリン酸トリエステル共重合体の収率（＝リン酸トリエステル共重合体の質量／仕込みモノマーの質量×１００）は６４．４％であった。
【００４０】
（５）リン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体の合成
上述の通りにして得られたリン酸トリエステル共重合体３．６５ｇを水に溶解させた。そして、そのリン酸トリエステル共重合体水溶液をナスフラスコに移し、そのナスフラスコに３０％テトラメチルアミン（ＴＭＡ）水溶液８ｇ加えた。そして、そのナスフラスコに攪拌子を入れた後にそのナスフラスコをセプタムで密栓した。それから攪拌子入りのナスフラスコをマグネティックスターラーの上に配設して、ナスフラスコの内容物を室温で２４時間攪拌した。
【００４１】
次に、超純水で２回洗浄した陽イオン交換樹脂（オルガノ株式会社製強酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲ１２０）２１．７８ｇが入ったビーカーに、上記ナスフラスコの内容物を加えた後、そのビーカーの内容物を１時間攪拌した。そして、そのビーカーの内容物を濾紙で濾過し、その濾液を回収した。また、その濾液を濾紙で濾過し、再度その濾液を回収した。その後、その濾液を純水で６時間透析した。なお、このとき、透析膜としてＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＭＷＣＯ＝３５００を用いた。透析終了後にその濾液を凍結乾燥して目的のリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体を得た。なお、このときの化学反応は、以下の化学反応式（Ｄ）に示される通りである。
【００４２】
【化７】
2019026661.tif 000009
【００４３】
（６）リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の合成
上述の通りにして得られたリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体を少量の純水に溶かした後、そのリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてそのリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体水溶液のｐＨを７．０に調整した。次に、そのｐＨ調整済みのリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体水溶液を純水で６時間透析した。なお、このとき、透析膜としてＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＭＷＣＯ＝３５００を用いた。透析終了後にその濾液を凍結乾燥して目的のリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体を得た。なお、このときの化学反応は、以下の化学反応式（Ｅ）に示される通りである。
【００４４】
【化８】
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【００４５】
（７）リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の物性測定
上述の通りして得られたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体を重水に溶解させて重水溶液を調製した。その重水溶液を日本電子株式会社製の４００ＭＨｚ核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置にセットして測定を行ったところ、図４に示される１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られた。この１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク面積比からリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体中のリン酸ジエステル塩単位とリン酸トリエステル単位とのモル比率が９４：６であることが判明した。また、ゲルクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により同リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の分子量および分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定したところ、その数平均分子量は１．０９×１０４であり、その分散度は１．３７であった。なお、このときの測定条件等は以下の通りであった。
【００４６】
・送液ポンプ：ＰＵ−２０８０
・移動相流速：０．７５ｍＬ／分
・カラム：Shodex SB803+SB806M（昭和電工株式会社製）
・検出器：ＲＩ−２０３１（日本分光株式会社製）
・展開溶媒：酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩の水溶液。なお、ここで、酢酸ナトリウムの濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌであり、塩化ナトリウムの濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌであり、エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）の濃度は１．０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４７】
また、同リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の分子量の計算値は１．０９×１０４であった。また、ゲルクロマトグラフィー法でその分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）測定したところ、分散度は１．３７であった。
【００４８】
２．リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の物性評価
（１）リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の薬物輸送機能の検証
（１−１）蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の合成
先ず、上述の通りにして得られたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体５５０ｍｇを２０体積％のｔ−ブタノール水溶液２．４３ｍＬに溶解させた。次に、その溶液に１０ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液（フナコシ株式会社製）２２０μＬを加えた。次いで、その混合液にさらに２．６ｍｏｌ／Ｌのアルコルビン酸ナトリウム５８．６μＬおよび１．６ｍｏｌ／Ｌの硫酸銅５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）９．５μＬを加えた。その後、その混合液を室温暗所で２４時間攪拌した。そして、その混合液を純水で３日間透析した。なお、このとき、透析膜としてＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＭＷＣＯ＝３５００を用いた。透析終了後にその混合液を凍結乾燥して目的の蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体を得た。なお、このときの化学反応は、以下の化学反応式（Ｆ）に示される通りである。
【００４９】
【化９】
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【００５０】
（１−２）マウス実験
（ｉ）マウス頭部・背部の除毛
マウスの頭部および背部にＥｐｉｌａｔ除毛クリーム（クラシエホールディングス株式会社製）を塗布した後、同除毛クリームをマウスの頭部および背部の皮膚になじませながらぬるま湯をかけて同部位の除毛を行った。
【００５１】
（ｉｉ）尾静脈ラインの準備
先ず、ＫＮ−３９２  ＳＰチューブ（株式会社夏目製作所製，ポリエチレン製，内径／外径＝０．２８／０．６１ｍｍ）を１．２ｍの長さに切断した。次に、同ＳＰチューブの先端に瞬間接着剤（東亜合成化学株式会社製アロンアルファ（登録商標））で２６Ｇ，３０Ｇ針を接着した。次いで、３０Ｇ  １ｍＬシリンジを用いて同ＳＰチューブにリン酸緩衝生理食塩水を満たした。続いてマウスの尾静脈に、その針を刺して静脈ラインを作製した。なお、針が尾静脈に正常に刺さっているかは、リン酸緩衝生理食塩水を抵抗感なく尾静脈に注入することができるか否かで確認することができる。そして、その針を瞬間接着剤（東亜合成化学株式会社製アロンアルファ（登録商標））でマウスの皮膚に接着した。マウスの尾が動いて針が血管を突き破らないように針挿入口を医療用紙テープで固定した。
【００５２】
（ｉｉｉ）コントロール蛍光液の調製
０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液（フナコシ株式会社製）をリン酸緩衝生理食塩水で１／１００に希釈した。同希釈液の発色を、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体のリン酸緩衝生理食塩水溶液の発色と比較したところ、ほぼ同等であった。また、それらの溶液のＩＶＩＳ像を比較したところ、両溶液の発色はほぼ同等であった。
【００５３】
（ｉｖ）ＩＶＩＳ測定条件
励起／吸光フィルタＥｘ／Ｅｍとして６２０／６７０ｎｍを採用した。
【００５４】
（ｖ）マウスへの投与実験
上述のようにして準備した尾静脈ラインを通じて２匹のマウスに０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液２００μＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液１５０μＬをそれぞれ投与した後、しばらくしてからマウスの尾骨のＩＶＩＳ像を得た（ｉｎ  ｖｉｖｏ観察）。それらのＩＶＩＳ像を図５に示す。図５の上側のＩＶＩＳ像は、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの尾骨のＩＶＩＳ像であり、図５の下側のＩＶＩＳ像は、０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの尾骨のＩＶＩＳ像である。両図から明らかなように、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの尾骨には蛍光の発光が認められるが、０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの尾骨には蛍光の発光が認められなかった。すなわち、リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は骨に特異的に吸着する能力を有することが立証された。
【００５５】
また、上述の尾骨のＩＶＩＳ像を得た後、両マウスを屠殺して各マウスから左大腿骨背部を採取し、その左大腿骨背部のＩＶＩＳ像を得た（ｅｘ  ｖｉｖｏ観察）。それらのＩＶＩＳ像を図６に示す。図６の上側のＩＶＩＳ像は、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの左大腿骨背部のＩＶＩＳ像であり、図６の下側のＩＶＩＳ像は、０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの左大腿骨背部のＩＶＩＳ像である。両図から明らかなように、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体／リン酸緩衝生理食塩水溶液を投与したマウスの左大腿骨背部には蛍光の発光が認められるが、０．１ｍｇ／ｍＬのＣｙ５  Ａｚｉｄｅ／ジメチルスルホキシド溶液を投与したマウスの左大腿骨背部には蛍光の発光が認められなかった。すなわち、リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は骨に特異的に吸着する能力を有することが立証された。
【００５６】
上記結果より、蛍光化リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は、骨に対して極めて優れた親和性があり、マウス内に投与された際、積極的に骨に吸着することが認められた。
【００５７】
（２）リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の血液凝固活性
（２−１）ヒト血小板貧血漿の調製
真空採血管（ニプロ株式会社製ネオチューブＮＰ−ＨＥ０９０９）を用いてヒト新鮮血を９ｍＬ採取した。そして、このヒト新鮮血を遠沈管に加えた後にさらに３．８質量％のクエン酸三ナトリウムを体積比で１／１０加えた。そして、この遠沈管を遠心分離機にセットして遠心分離機を１２，０００ｒｐｍで１５分間運転させた。遠沈管内の内容物の上澄みだけを回収し、ヒト血小板貧血漿を得た。
【００５８】
（２−２）血液凝固活性試験
測定用キュベットに攪拌子を投入した後、その測定用キュベットに、上述の通りにして得られたヒト血小板貧血漿４８０μＬ、０．３１５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液９．５１μＬ、１０Ｕ／ｍＬのＴｈｒｏｍｂｉｎ溶液５０．５μＬを加えた。そして、この測定用キュベットをマグネティックスターラーの上に配設して、測定用キュベットの内容物を３７℃で１５分間攪拌した。なお、この試験では、このようにして２つの測定用キュベットが用意された。次に、一方の測定用キュベットに５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体（上述の通りにして得られたもの）を６０μＬ加え、もう一方の測定用キュベットに５０ｍｍｏｌ／Ｌのポリリン酸（バイオエネックス株式会社製，平均鎖長６０−７０）を６０μＬ加えた。なお、両液共に終濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌであった。なお、この液の写真を図７に示した。そして、それらの測定用キュベットをマグネティックスターラーの上に配設して、測定用キュベットの内容物を室温で１０分間攪拌した後にその様子を観察したところ、ポリリン酸の添加系ではその液が懸濁したが（図８参照）、リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の添加系では液の懸濁は観察されなかった（図９参照）。すなわち、ポリリン酸の添加系ではその液中で血栓が形成されたが、リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の添加系では血栓が形成されることはなかった。
【００５９】
（３）リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体の生体適合性試験
「Yasuhiko Iwasaki et al.、”Comparative physicochemical properties and cytotoxicity of polyphosphoester ionomers with bisphosphonates”、Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition、［online］、英国、Taylor & Francis、２０１２年８月８日発行、第２４巻、第７号、p．８８２−８９５、インターネット（URL: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09205063.2012.710823）」では、「化学構造式（４）に示されるリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体のｘとｙとの比すなわちリン酸ジエステル塩単位とリン酸トリエステル単位とのモル比」と、「骨吸着性および生体適合性」との関係性が報告されている。この文献では、ｘが大きくなるほど、すなわちリン酸ジエステル塩単位が増えるほど、骨吸着性が良好になると報告されていると共に、リン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体はｘとｙとの比に寄らず良好な生体適合性を示すことが報告されている。上述の通りにして合成されたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は、同文献に示されるリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体と構造的に類似しており、同様の物性を示すものと思われる。したがって、上述の通りにして合成されたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体も、良好な骨吸着性および生体適合性を示すものと推察される。
【００６０】
【化１０】
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【００６１】
（４）リン酸ジエステル塩の骨改質性
「Sujit Kootala et al.、Anti-Resorptive Functions of Poly(ethylene sodium phosphate) on Human Osteoclasts、Macromolecular Bioscience、［online］、アメリカ合衆国、John Wiley & Sons, Inc.、２０１５年７月２９日発行、第１５巻、第１２号、ｐ．１６３４−１６４０、インターネット（URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mabi.201500166/abstract）」では、ポリリン酸ジエステル塩が破骨細胞の活性を抑制することが報告されている。上述の通りにして合成されたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は、同文献に示されるポリリン酸ジエステル塩と構造的に類似しており、同様の物性を示すものと思われる。したがって、上述の通りにして合成されたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体も、良好な破骨細胞活性抑制効果を示すものと推察される。よって、上述の通りにして合成されたリン酸ジエステル塩−リン酸トリエステル共重合体は、骨の改質効果も有するものと推察される。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係るリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、骨標的薬物輸送担体として利用することができるという特徴を有し、骨の治療や再生等に有用である。また、このリン酸ジエステル−リン酸トリエステル共重合体は、骨改質剤として利用することができるという特徴を有し、骨の強度や靭性の改質に有用であると思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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