(57)【要約】【課題】ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための方法を提供すること。【解決手段】本方法は、前記調製物を、少なくとも約２４時間、最大約７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介したろ過に供するステップを含む。さらに、本発明は、少なくとも約２４時間のろ過におけるウイルスフィルターの使用に関し、ウイルスフィルターは、ウイルス性汚染物質を細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための最大約７５ｎｍの有効孔径を有する。いくつかの実施形態において、本発明に従ったろ過は、少なくとも約２０００Ｌ／ｍ２の容積において動作する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書および図面に記載の物、方法またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ウイルス学的安全性は、バイオ医薬品工業における重大な懸念である。リスクを軽減するための努力にもかかわらず、生物製剤の大規模なウイルス汚染に関与する出来事が工業においてますます懸念されている。高度にプロファイルされた事象としては、例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）の製造を停止させた、Ｇｅｎｚｙｍｅ社の２００９年のそのＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞培養物のＶｅｓｉｖｉｒｕｓ２１１７による汚染の検出およびＭｅｒｃｋ社の２０１０年のＲｏｔａｒｉｘ（登録商標）ワクチンのブタサーコウイルス１（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ１）による汚染が挙げられる。汚染の供給源は、細胞培養段階にあると考えられる。製造会社の経済的損害（ある報告書は、１００００Ｌのバイオリアクター汚染当たり推定１億を超える損失＋政府機関からの罰金であるとまとめている）に加えて、このような事象は、患者へのリスクを引き起こし、バイオ医薬製品の利用を妨害する（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０００、１６、４２５−４３４）。結果として、規制当局による監視が強化され、ウイルス汚染を検出し、防止し、修正するための新しい技術が要求される。
【０００２】
概して、ウイルス性汚染物質は、上流および下流のウイルス汚染に識別することができる。下流の汚染は、閉鎖系を適用することによって制御可能であるが、特に、上流汚染は、広範な試験によっても制御および検出が困難である。ウイルス性汚染物質はさらに、バイオ医薬品生産における動物由来材料の使用が起源でもあり得る。生産細胞系が外来ウイルス性汚染物質を含んでおらず、生産が動物由来材料の使用を伴っていない場合でも、ウイルス性汚染物質は、細胞培養培地を通して進入可能である。例えば、合成培地は、血清添加系において生産された組換え成長因子を添加されることがあり、無タンパク質培地は、それにもかかわらず、ろ過されたタンパク質加水分解物を含有し得る。しかし、大量の培地成分は、非滅菌容器に包装され得るので、ウイルス汚染は、たとえ完全な合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）においても起こり得る。従来の滅菌グレードフィルターは、ウイルス性汚染物質に対して設計されておらず、安全防護可能でもなく、したがって、他の基準を用いてウイルス学的安全性を確保する必要がある。
【０００３】
製造工程の１以上のチェックポイントにおける偶性ウイルスの検出は標準的な実施である。しかし、検出のみでは、特に、存在するウイルス性汚染物質が疑われていない、未知または新たに出現したウイルス性因子である場合、バイオ医薬製品のウイルス汚染に対する手段として不十分である。このようなウイルス性因子は、配列決定されたウイルスの大規模なコレクションを代表する、適切に設計されたＤＮＡマイクロアレイによっても、検出を逃れることができる。この課題は、細胞培養物を感染させるために必要とされる低レベルのウイルス性汚染物質および現在のところ限定された検出アッセイの感度によりさらに複雑になっている。
【０００４】
高力価のウイルス性汚染物質は、それらの正常範囲を超えた改変された細胞培養パラメーター、例えば、培養密度、タンパク質力価の形態で明らかにはできない。他方では、感染性アッセイは高度に特異的であり、各ウイルスに対して異なる条件を要求する。ウイルス汚染の結果として、下流の装置、流体および生成物は汚染される可能性があり、バッチ構成（ｂａｔｃｈ  ｓｅｔｕｐ）、廃棄物処理、売上喪失および除染において何百万ドルを負うことになる。ウイルスに対する原料の全体スクリーニングは、試料の不均質性およびバイオ医薬品生産工程に関与する大容積のため困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）１６、４２５〜４３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウイルスクリアランス技術は、２つの群：不活性化およびろ過のうちの１つに分類することができる。不活性化法は、ウイルス感染性の不可逆な喪失を探求し、一方ろ過方法は、ウイルス性汚染物質を機械的に減少させることを探求する。既存の不活性化法は、紫外線（ＵＶ）照射、ガンマ線照射、熱、低ｐＨもしくは高ｐＨ、または溶媒／洗浄剤曝露を用いる。ＵＶ照射が有効かつ不可逆的にウイルス活性を除外し得る場合、大規模な基盤においては実行困難であり、また調製済み培地には不適切であると思われる。オートクレーブ処理は熱安定性流体に対して可能であるが、感受性培地を変化させると思われる。高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理として公知の代替の方法は過酷ではないが、高価な装置、自動化および培地特徴を維持するための検証手順を要求する。低ｐＨもしくは高ｐＨへの曝露は、可能性のあるウイルス性汚染物質の範囲にわたり有効ではなく、培地の品質または容量オスモル濃度に負の影響を与え得る。溶媒／洗浄剤曝露は同様に、広範囲に使用される解決策ではなく、脂質エンベローブを有するウイルスに対してだけ有効である。したがって、理想的な方法は、コストの考慮と原料にウイルスクリアランスをもたらす必要性とのバランスを取るべきであり、成長速度および収量に妥協のない広範囲に使用される解決策を提供すべきである。
【０００７】
ウイルス保持ろ過は、適切なバランスを提示する。ウイルス保持ろ過は、培地成分を化学的に改変せず、熱感受性供給材料／培地への使用に適切である。さらに、ウイルス保持ろ過は、サイズ排除原理において動作するので、広範囲に使用される解決策である。しかし、ウイルス保持膜は高価である（およそ約２０００から５０００ＥＵＲ／ｍ２）。培地体積のろ過の比流量が低いという特徴が、必要な膜面積のコストのため、その方法を、大規模なバイオリアクター供給に適切な規模に対して経済的に負担となるものにする。例えば、ウイルスろ過を、滅菌グレードの培地ろ過と直列で連結した場合、ウイルスろ過は、バルク培地の汚染を防止するために、就労時間内、すなわちバルク培地の調製後最大２から１０時間で行わるべきであることが好ましい。したがって、この重要な時間窓内に留めるために広いろ過面積が必要であり、このことは順にコストを上げる。
【０００８】
驚くべきことに、前記先行技術ウイルスろ過の欠点が、細胞培養培地または細胞
培養培地の少なくとも１つの成分であるそれぞれの調製物を、少なくとも約２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介してろ過することにより克服可能であることが見出された。それぞれの調製物の要求される体積が、より長い時間枠、すなわち少なくとも２４時間でろ過される場合、ウイルスフィルターの容積（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ）は莫大に増加する。驚くべきことに、全ウイルス価の有意な減少が、長期間にわたって達成可能であることもさらに見出された。このことは、細胞培養系における上流のウイルス除去において特に有益である。
【０００９】
したがって本発明の方法は、スループットおよび容積をそれぞれ強化することによってウイルスろ過の経済効率を強化する。本発明に従った方法は、少なくとも２０００Ｌ／ｍ２の容積において動作し、それによって、大容量のウイルスフィルターの使用を最大化にするために役立ち、それに伴う有効コストを低下させ、大規模に実施可能であり、既存の生産工程に容易に統合可能な解決策を提示する。
【００１０】
本発明に従った方法および滅菌製造工程、特に滅菌調製物、例えば細胞培養培地およびバッファーが使用される工程におけるそれぞれのウイルスフィルターの発明的使用の莫大な影響は、下記の例を用いることにより理解可能である。１平方メートルのウイルスフィルター膜のコストが平均約３０００ＥＵＲであり、約１０ＥＵＲ／リットル培地かかる細胞培養培地が使用されると仮定して、その時、１０００Ｌのウイルスろ過済み培地のコストは１３ＥＵＲ／リットル培地であり、これにより、培地調製物の商品のコストは約３０％増加する。２０００Ｌがウイルスフィルター膜によりろ過可能である場合、その時、コストは１１．５０ＥＵＲに減少する。例えば５０００Ｌを超える容積のさらなる増加は、コストを、０．６ＥＵＲ／リットル培地未満に低下させ、これにより、ウイルスろ過済み培地を提供するための追加コストを大幅に低くする。結果として、特に、潜在的ウイルス汚染またはウイルス汚染の上流における除染にウイルスフィルターを使用する高いコストは、ウイルスろ過方法の容積を増加させることにより有意に減少する。
【００１１】
本発明は、ウイルスフィルターの高いコストおよび低い容積のこの問題に、それぞれ完全に対処する。ウイルスフィルターの容積は、ウイルスろ過を、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介して少なくとも約２４時間実施することにより増加可能である。驚くべきことに、使用する高価なウイルスフィルターの容積をより生かして、フィルターの完全性を維持しながら、容積の２から１００倍の増加をもたらすことが可能であることが見出された。容積の２から３倍の増加により、生産工程および関連する生産コストにすでに大きな影響を与えているが、本発明に従った方法により、容積の１００倍までの増加またはそれ以上を達成可能である。このことは優れた機会を提示し、細胞培養工程、特に、細胞培養工程、薬学的、診断的および／または化粧品および食品工程の上流におけるウイルス除去のウイルス安全性をさらに改善するために現在使用可能な高価なウイルスフィルターを用いても、ウイルス除去のコストを効率的にする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための方法を提供する。本方法は、前記調製物を、少なくとも約２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介したろ過に供するステップを含む。
【００１３】
さらに、本発明は、少なくとも約２４時間の、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物からウイルス性汚染物質を除去するためのろ過における最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターの使用に関する。
【００１４】
加えて、本発明は、細胞培養のために本発明の任意の方法に従って得ることができる、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物；薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物の使用に関する。
【００１５】
本発明に従ったすべての方法および使用は、少なくとも約２０００Ｌ／ｍ２、好ましくは少なくとも約３０００Ｌ／ｍ２、最も好ましくは少なくとも約５０００Ｌ／ｍ２の容量において動作可能である。加えて、この調製物はろ過に供され、ろ過は、それぞれ少なくとも２４時間、または少なくとも約４８時間から約７ヶ月まで、または約７２時間から約３ヶ月までの間実施される。ろ過は、約２℃から約６０℃、または約１０から約４０℃、好ましくは約１５から約３７℃の温度において実施される。
【００１６】
本発明のすべての実施形態において、ろ過は、約１００ｍｂａｒから約４０００ｍｂａｒ、好ましくは約２００ｍｂａｒから約３５００ｍｂａｒ、最も好ましくは約１０００ｍｂａｒから約３０００ｍｂａｒの範囲の圧力において実施される。
【００１７】
本発明のすべての実施形態において、使用されるウイルスフィルターは、あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）を達成する。
【００１８】
驚くべきことに、ろ過工程を少なくとも約２４時間動作する場合、ウイルスフィルターの容積が莫大に増加することが見出されている。通常、細胞培養のための調製物、例えばバルク細胞培養培地またはバッファーは、バルク調製物の調製後、細菌またはウイルスの成長による調製物の汚染を回避するために、約２から約１０時間以内にバッチ式でろ過される。実施において、使用するウイルスフィルターの最大容量は、それぞれの調製物を約２から約１０時間の時間枠内でろ過するろ過工程において殆ど生かされないことが判明している。したがって、過剰なフィルター面積を使用しなければならない。これとは対照的に、本発明の方法を使用することにより、使用する高価なウイルスフィルターの容積をより生かして、フィルターの完全性を維持しながら、容積の２から１００倍の増加をもたらすことが可能であることが見出されている。容積の２から３倍の増加により、生産工程および関連する生産コストにすでに大きな影響を与えているが、本発明に従った方法により、容積の１００倍までの増加またはそれ以上を達成可能である。このことは優れた機会を提示し、ウイルス除去のコストを、細胞培養工程、特に、細胞培養工程、薬学的、診断的および／または化粧品および食品工程の上流のウイルス除去におけるウイルスの安全性をさらに改善するために現在使用可能な高価なウイルスフィルターを用いても効率的にする。
【００１９】
本発明の特定の好ましい実施形態は、下記のある実施形態の詳細な説明および特許請求の範囲により明らかになると思われる。
【００２０】
本発明のより具体的な説明は、添付の図面に例示される、本発明のある例示的実施形態を参照することによりなされる。これらの図面は本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の例示的実施形態を例示するものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではないことに留意されたい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための方法であって、
ａ）上記調製物を、少なくとも約２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介したろ過に供するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
上記ろ過が、少なくとも約２０００Ｌ／ｍ２、好ましくは少なくとも約３０００Ｌ／ｍ２、最も好ましくは少なくとも約５０００Ｌ／ｍ２の容積において動作する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記調製物が、少なくとも約４８時間から約７ヶ月まで、好ましくは約７２時間から約３ヶ月までの間ろ過に供される、項目１から２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
ｂ）ろ液を、細胞培養物または細胞培養培地の成分でもある他の成分に供給するステップ、
をさらに含む、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記ろ過が連続ろ過である、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
ろ過が、約２℃から約６０℃、好ましくは約１０℃から約４０℃、最も好ましくは約１５℃から約３７℃の温度において実施される、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記ウイルスフィルターが、あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）および最も好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも６Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）を達成する、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
ろ過が、直列、並列またはそれらの両方の混合で配置された２つ以上のフィルターを使用して実施される、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
ろ過が、Ｙ字接合部を含む管の系において並列に配置された２つのフィルターを使用して実施され、そして各フィルターが、上記Ｙ字接合部の分枝および調製物供給源と流体連結している、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ろ過が、約１００ｍｂａｒから約４０００ｍｂａｒ、好ましくは約１００ｍｂａｒから約３５００ｍｂａｒ、最も好ましくは約１０００ｍｂａｒから約３０００ｍｂａｒの範囲の圧力において実施される、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記ウイルスフィルターがオートクレーブ処理可能である、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記細胞培養培地がダイズ加水分解物を含む、項目１から１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための、少なくとも２４時間のろ過における、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターの使用。
（項目１４）
上記ろ過が、少なくとも２０００Ｌ／ｍ２、好ましくは少なくとも３０００Ｌ／ｍ２、最も好ましくは少なくとも５０００Ｌ／ｍ２の容積において動作する、項目１３に記載の使用。
（項目１５）
ろ過が、少なくとも約４８時間から約７ヶ月まで、好ましくは約７２時間から約３ヶ月までの間実施される、項目１３から１４のいずれかに記載の使用。
（項目１６）
上記ろ過が連続ろ過である、項目１３から１５のいずれかに記載の使用。
（項目１７）
ろ過が、約２℃から約６０℃、好ましくは約１０℃から約４０℃、最も好ましくは約１５℃から約３７℃の範囲の温度において実施される、項目１３から１６のいずれかに記載の使用。
（項目１８）
上記ウイルスフィルターが、あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）および最も好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも６Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）を達成する、項目１３から１７のいずれかに記載の使用。
（項目１９）
ろ過が、直列、並列またはそれらの両方の混合で配置された２つ以上のフィルターを使用して実施される、項目１３から１８のいずれかに記載の使用。
（項目２０）
ろ過が、Ｙ字接合部を含む管の系において並列に配置された２つのフィルターを使用して実施され、そして各フィルターが、上記Ｙ字接合部の分枝および調製物供給源と流体連結している、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
ろ過が、約１００ｍｂａｒから約４０００ｍｂａｒ、好ましくは約１００ｍｂａｒから約３５００ｍｂａｒ、最も好ましくは約１０００ｍｂａｒから約３０００ｍｂａｒの範囲の圧力において実施される、項目１３から２０のいずれかに記載の使用。
（項目２２）
上記ウイルスフィルターがオートクレーブ処理可能である、項目１３から２１のいずれかに記載の使用。
（項目２３）
上記細胞培養培地がダイズ加水分解物を含む、項目１３から２２のいずれかに記載の使用。
（項目２４）
細胞培養のために項目１から１２のいずれかに従って得ることができる細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物；薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、全てが３種の異なるダイズ加水分解物のロット（Ｋｅｒｒｙ  ＨｙＰｅｐ１５１０  ＃１、ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ  ＃１および＃２）を添加した細胞培養培地と組み合わされた異なるフィルターを使用する、流量が調節されたウイルスろ過（図１Ｃ）を適用して実施されたウイルスろ過動態を示す図である。適用したフィルターおよび実験条件（実施例１から実施例４もまた参照されたい）：フィルターＡ：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ、１８０ｃｍ２、３０℃において流量約３０Ｌ／（ｍ２×時間）フィルターＢ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ  ３．１ｃｍ２；３０℃において流量約４０−６０Ｌ／（ｍ２×時間）。ろ過を、最大９日まで、または最大圧力が２０００ｍｂａｒを超えるまで実施した。図１Ａは、容積を、最低約４０００Ｌ／ｍ２から約１２０００Ｌ／ｍ２の範囲で、時間に対してプロットされた、ろ過体積／膜表面積として示している。ろ過の終わりの最大圧力は、フィルタータイプに依存して約６００ｍｂａｒから２４００ｍｂａｒの間であった（図１Ｂ）。概して、ダイズ加水分解物の間の差は、容積および最大圧力に対してかなり小さい。
【図２】図２は、異なるフィルターおよび３種の異なるダイズ加水分解物ロット（Ｋｅｒｒｙ  ＨｙＰｅｐ  １５１０  ＃１、ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ  ＃１および＃２）を添加された細胞培養培地を使用する、流量が調節されたウイルスろ過（図２Ｃ）を適用して実施されたウイルスろ過動態を示す図である。適用したフィルターおよび実験条件（実施例１から実施例４もまた参照されたい）：フィルターＡ：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ、１８０ｃｍ２；３０℃において流量約３０Ｌ／（ｍ２×時間）フィルターＤ：Ａｓａｈｉ  ＢｉｏＥＸ  １０ｃｍ２；周囲温度（約２２℃）において流量約２０Ｌ／（ｍ２×時間）。図１に記載の実験とは対照的に、ろ過は、８１日までの長期の間、または２０００ｍｂａｒの圧力に到達するまで実施された。図２Ａは、容積を、最低１６０００Ｌ／ｍ２（フィルターＡおよびＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＃２に対して）から約３５０００Ｌ／ｍ２（フィルターＤおよび３種の異なる加水分解物ロットすべてに対して）に及ぶ、時間に対してプロットされた、ろ過された体積／膜表面積として示している。ろ過の終わりの最大圧力は、フィルタータイプに依存して約１２００ｍｂａｒから２０００ｍｂａｒの間であった（図２Ｂ）。概して、ダイズ加水分解物の間の差は、容積および最大圧力に対してかなり小さい。
【図３】図３は、約２２℃において、フィルターＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ  １８０ｃｍ２）およびダイズ加水分解物ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ、Ｌｏｔ＃２を含有する培地を使用して観察された、フラックスと圧力差との間の関係を示すグラフである（実施例５を参照されたい）。最低圧力差約１００ｍｂａｒは検出可能な最低比流量を達成するために必要であり、最低圧力差はその後、比流量と圧力差との間の明らかな線形比例相関関係で徐々に上昇している。
【図４】図４は、フィルターＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＣＰＶ、１８０ｃｍ２）およびダイズ加水分解物Ｋｅｒｒｙ  ＨｙＰｅｐ  １５１０  ＃２を含む培地を使用する、圧力調節ろ過と流量調節ろ過との間の差を示す図である（実施例１から実施例４を参照されたい）。ろ過は、１９日間実施され、この時間において容積約６０００−７０００Ｌ／ｍ２に達した。流量調節ろ過の最終圧力は、圧力調節ろ過の圧力と同等であり（図４Ｂを参照されたい）、圧力調節ろ過の最終比流量は、流量調節ろ過の流量と同等であった（図４Ｃを参照されたい）。これは、ウイルスろ過に対する両方の調節戦略は、同等の容積をもたらし得ることを実証している。
【図５】図５は、実施例６に記載される、ウイルスろ過培地  対  非ウイルスろ過培地を使用する、１０Ｌのバイオリアクター実験の結果を示す図である。細胞培養培地は、実験開始前にフィルターＡによりバッチ式にウイルスろ過された。実験は、３種の異なるダイズ加水分解物（Ｋｅｒｒｙ  ＨｙＰｅｐ  １５１０、Ｌｏｔ＃１；ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ、Ｌｏｔ＃１およびＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ、Ｌｏｔ＃２）を添加された細胞培養培地を各々使用して並行して実施された。データは、４週間の連続細胞培養の最後３週から計算した。それぞれのウイルスろ過培地（Ｓｏｙ１ＮＦ、Ｓｏｙ３ＮＦおよびＳｏｙ２ＮＦ）対それらの非ろ過参照（Ｓｏｙ１、Ｓｏｙ３およびＳｏｙ２）の間に、比生産性（図５Ａ）、体積生産性（図５Ｂ）および比成長速度（図５Ｃ）の差は検出できなかった。
【図６】図６は、実施例７に記載される、ウイルスろ過培地  対  非ウイルスろ過培地を使用する、１２０Ｌのバイオリアクター実験の結果を示す図である。細胞培養培地は、バイオリアクターの培地供給ラインのインラインで、フィルターＥ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ、２０００ｃｍ２）およびフィルターＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ  ８５０ｃｍ２）を交互に使用して、約５８日間連続モードでウイルスろ過された。ウイルスろ過培地の供給の時間間隔および容積を、図６Ａに示す。データは、異なるフィルターを使用する間隔に関して計算された。それぞれのウイルスろ過培地対非ろ過参照の間に、比成長速度（図６Ｂ）および体積生産性（図６Ｃ）に関して差は検出できなかった。
【図７】図７は、ダイズ加水分解物ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ＃５  ＵＦを含有するＭＭＶスパイク培地の、フィルターＧ（ＡＳＡＨＩ  Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎ）ウイルスフィルターによるろ過の過程において採取された、逐次的なろ液試料中に見出されるＭＭＶ感染価（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｉｔｅｒ）［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］の変化を示す図である（実施例８を参照されたい）。ウイルスの低レベルの漏出（ｂｒｅａｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）が、２から３日以内に観察された。それにもかかわらず、ウイルス除去は有効であったと見なされた。
【図８】図８は、ダイズ加水分解物（試行番号１、ダイズ加水分解物ＤＭＶ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ＃５；試行番号２、ダイズ加水分解物ＤＭＶ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ＃４）を含有するＭＭＶスパイク培地の、フィルターＤ（Ａｓａｈｉ  ＢｉｏＥＸ）ウイルスフィルターによるろ過の過程において採取された、逐次的なろ液試料中に見出されるＭＭＶ感染価［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］の変化を示す図である（実施例９を参照されたい）。ウイルスの漏出は観察されず、ウイルス除去は有効かつ完璧であると見なされた。
【図９】図９は、実施例１０に記載のＭＭＶスパイク培地のろ過の過程において採取された、逐次的なろ液試料中に見出されるＭＭＶ感染価［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］の変化を示す図である。ウイルスの漏出は、試行番号１および番号２（フィルターＤ）に関しては観察されず、ダイズ加水分解物含有培地からの有効かつ完璧なウイルス除去をもたらした。低レベルのウイルスの漏出が、試行番号３および番号４（フィルターＩ）ならびに試行番号５および番号６（フィルターＧ）に観察され、ダイズ加水分解物含有培地からの、有効であるが完璧ではないウイルス除去をもたらした。より有意なウイルスの漏出が、試行番号７（フィルターＢ）および試行番号８（フィルターＨ）に関して観察され、有意性の限界におけるウイルス除去係数の低下をもたらした。しかし、すべてのフィルターにより少なくとも１つの実験において、約１ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍＬを超える最小の全力価の減少を達成することができた。
【００２２】
【表１】
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【図１０】図１０は、実施例１１に記載のように実施されたウイルスろ過の動態を示す図である。圧力は、動作条件の最悪の場合をシミュレートする意図的な圧力および流れの中断を除いて、０．８から１．２ｂａｒの間（平均１．１ｂａｒ）に維持された。初期流量約３８Ｌ／（ｍ2×時間）が達成され、実験の終わりまでに徐々に低下したが、最低流量４Ｌ／（ｍ2×時間）が維持できた。圧力の中断を含む全期間は３０日であった。およそ６５００Ｌ／ｍ2がフィルターを通過した。
【図１１】図１１は、実施例１１に記載のＭＭＶスパイク培地のろ過の過程において採取された、逐次的なろ液試料中に見出されるＭＭＶ感染価［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）］の変化を示す図である。ウイルスの漏出は、アッセイされた２０の画分のいずれにおいても観察されなかった。ウイルス負荷は、画分体積に依存して、＜０．９［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］から＜２．８［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］の範囲であった。ろ液全体のウイルス負荷は、＜３．０［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］であり、これをスパイクされた材料の初期ウイルス負荷（すなわち、８．５［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］）から引いた場合、＞５．５ｌｏｇ１０の全ウイルス減少係数をもたらした。これは、有効かつ完璧とみなされた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための方法を提供する。本方法は、前記調製物を、少なくとも約２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介したろ過に供するステップを含む。
【００２４】
さらに、本発明は、少なくとも約２４時間の、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物からのウイルス性汚染物質の除去のためのろ過における最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターの使用に関する。
【００２５】
加えて、本発明は、細胞培養のために本発明の任意の方法に従って得ることができる、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物；薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物の使用に関する。
【００２６】
本発明のすべての実施形態において、調製物はウイルスろ過に供され、このウイルスろ過またはウイルスフィルターの使用は、少なくとも約２４時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約１週、約２週、約３週、約４週、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月または約７ヶ月の間実施される。さらに一実施形態において、調製物はウイルスろ過に供されるか、またはウイルスろ過は、約１週から約３週、約２週から約３週、約１週から約４週、約２週から約４週、約１週から約７ヶ月、約１ヶ月から約５ヶ月、約２ヶ月から約５ヶ月、約２ヶ月から約４ヶ月、約２ヶ月から約３ヶ月または少なくとも約２４時間から約７ヶ月まで、または約４８時間から約５ヶ月まで、または約７２時間から約３ヶ月までの間実施される。さらに一実施形態において、調製物はウイルスろ過に供されるか、またはウイルスろ過は、約４８時間より長くから約７ヶ月まで、好ましくは約１週から約５ヶ月または約３週から約３ヶ月または約２ヶ月から約３ヶ月の間実施される。
【００２７】
本発明に従った方法は、少なくとも約２０００Ｌ／ｍ２または少なくとも約３０００Ｌ／ｍ２または少なくとも約４０００Ｌ／ｍ２または少なくとも約５０００Ｌ／ｍ２、少なくとも約７５００Ｌ／ｍ２、少なくとも約１００００Ｌ／ｍ２または少なくとも約２００００Ｌ／ｍ２の容積において動作可能である。この点において、「容積」は、ろ液の流れが低下する、または背圧がフィルター膜の詰まりのため望ましくない動作条件に上昇する前に、ウイルスフィルター膜の指定された面積を介してろ過可能な溶液の体積を指す。
【００２８】
全ての実施形態を含む本発明が、単独で、またはウイルス汚染の最小化、例えばスクリーニング、ソーシング（ｓｏｕｒｃｉｎｇ）、検出、ウイルス不活性化、吸着保持などの当該分野において公知の他のアプローチと併せて採用可能であることが企図される。本方法は、生産工程早期において、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物を介した望ましくないウイルス性因子の進入を標的とし、ウイルス減少機序を提供する。本発明の利点としては、大規模基盤における実行の容易さ、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である所与の体積の調製物を処理するために必要とされるフィルター膜面積の減少、結果として続くそれらによるコストの削減が挙げられる。特に、本発明に従った調製物のウイルスろ過は、連続製造工程、例えば、潅流などの連続細胞培養工程またはバイオリアクター系などのケモスタットに容易に統合される。
【００２９】
本明細書において使用する場合の「温度」という用語は、本発明に従ってろ過される調製物、例えば細胞培養培地またはバッファーの、ウイルスフィルターを通過するときの温度に関係する。本発明に従った一実施形態において、温度は、約２℃から約６０℃の範囲である。一実施形態において、温度範囲の下限は、約２℃、約４℃、約８℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３７℃または約４０℃である。本発明に従った温度範囲の上限は、約１０℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３７℃、約４０℃、約５０℃または約６０℃である。一実施形態において、温度は約４℃から約４５℃の温度範囲内、または約１０℃から約４０℃または約２０℃から約４０℃または約３０℃から約３７℃の範囲の温度である。さらに、一実施形態において、温度は、約２０℃から約３０℃の範囲である周囲温度である。当然のことながら、調製物が、さらにいかなる加熱も冷却もされずにろ過に供される実施形態もまた好ましい。したがって、さらなる実施形態において、ろ過が実施されるそれぞれの場所の温度に左右されて、約１０℃から約３０℃の温度が使用される。別の実施形態において、例えば、ろ過前に液体調製物を予備加熱することによって、約３０℃から約３７℃の温度が使用される。調製物のこのろ過からもたらされるろ液は、バイオリアクターに連続供給可能である。
【００３０】
本発明の一実施形態において、ろ過は、約１００ｍｂａｒから約４０００ｍｂａｒまたは約２００ｍｂａｒから約３５００ｍｂａｒの範囲の圧力において実施される。一実施形態において、ウイルスろ過は、下限が約１００ｍｂａｒ、約２００ｍｂａｒ、約５００ｍｂａｒ、約１０００ｍｂａｒ、約１２００ｍｂａｒ、約１５００ｍｂａｒ、約２０００ｍｂａｒ、約２５００ｍｂａｒまたは約２８００ｍｂａｒである圧力範囲において実施される。上限は、約１２００ｍｂａｒ、約１５００ｍｂａｒ、約２０００ｍｂａｒ、約２５００ｍｂａｒ、約２８００ｍｂａｒまたは約３０００ｍｂａｒである。一実施形態において、ろ過は、約１０００から約４０００ｍｂａｒ、約１５００から約３５００ｍｂａｒ、１７００ｍｂａｒから約３３００ｍｂａｒまたは約１０００ｍｂａｒから約２０００ｍｂａｒの範囲の圧力で実施される。
【００３１】
温度および圧力の調整は、本発明のさらなる実施形態において、比流量および容積を制御するために利用可能である。ウイルスフィルターの使用の容積および期間のさらなる改善は、他の工程パラメーター、例えばろ過圧力および温度などを制御することによって得ることができる。例えば、いくつかの実施形態において、調製物を、約１０℃から約４０℃の温度、約１０００ｍｂａｒから約２０００ｍｂａｒの圧力においてろ過に供することが好ましいことが分かっている。
【００３２】
予備ろ過実験により、比流量に対するろ過されるべき調製物の温度の影響が実証された。ろ過温度を、保存温度約４℃を有する本発明に従った調製物から約１８℃から約３７℃の温度に上昇させた場合、流量の約５０から約１００％の増加が観察された。しかし、これらすべての実施形態は、少なくとも約２４時間のろ過の使用が、使用する高価なウイルスフィルターの容量をより生かして、フィルターの完全性を維持しながら、容積の２から１００倍の増加をもたらすことが可能であることの範囲内である。
【００３３】
好ましい一実施形態において、ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物から除去するための方法は、前記調製物を、少なくとも約１０日から約２ヶ月までの間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介して、圧力約１０００ｍｂａｒから２０００ｍｂａｒおよび温度１０℃から４０℃において、少なくとも２０００Ｌ／ｍ２の容積を有するろ過に供するステップを含む。当然のことながら、他のすべてのパラメーターをこの実施形態に組み合わせることができる。加えて、さらに好ましい実施形態として、前記方法は連続ろ過様式で実施され、調製物は細胞培養培地、例えばダイズ加水分解物を含む細胞培養培地または動物由来成分を含む細胞培養培地であることが好ましく、ろ液はバイオリアクター、特にケモスタットリアクターに連続して供給される。別の実施形態において、この実施形態はさらに、並列または直列に配置された少なくとも２つのウイルスフィルターを使用して実施することができる。
【００３４】
本明細書に記載のウイルスろ過方法を、細胞培養培地または細胞培養培地の１つの成分である任意の調製物、すなわち、動物細胞および好ましくは哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養における成長に適切な培地およびバッファーからウイルス汚染を減少させるために使用可能であることが企図される。通常、培養培地はバッファー、塩、エネルギー源、アミノ酸、ビタミンおよび微量必須元素を含有する。
【００３５】
「調製物」という用語は、本発明の意味において細胞培養培地の一部の可能性があり、培養において適切な細胞の成長を支援可能な任意の成分もまた含む。前記調製物は、例えばバッファーまたは少なくとも１つのアミノ酸もしくはタンパク質の溶液、少なくとも１つのビタミンの溶液；少なくとも１つの有機または無機の塩の溶液；または少なくとも１つの炭水化物または糖の供給源を含む溶液を含む。
【００３６】
本発明の文脈において、「Ｌｏｇ減少値」（ＬＲＶ）は、細菌またはウイルスなどの粒子の保持における膜の効率の尺度であり、供給流中の前記粒子数対ウイルスフィルター膜透過物中の粒子数の比の対数（底１０）として定義される。ＬＲＶ値は、所与のタイプの粒子に特異的である。本発明に従った一実施形態において、ウイルスフィルターは、あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも２Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも３Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも５Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも６Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも７Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも８Ｌｏｇ１０減少値を達成し、好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）を達成する。当然のことながら、ろ過されるべき調製物のウイルス性汚染物質または潜在的ウイルス性汚染物質のＬｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）はいずれも、生産工程の安全性を改善するために有益であることは、当業者には明らかである。したがって、特にこのパラメーターは、本発明の方法に使用される他のすべてのパラメーターと組み合わせることができる。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「フラックス」は「比流量」または「流量」と交換可能に使用され、膜を特徴付けるために使用される尺度であり、ろ液の流れの速度を指す（ウイルスろ過膜を透過する溶液の体積または重量／フィルター面積および時間、例えばＬ／（ｍ２×時間）で表される。本発明の文脈において、「特定の（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は定義された時間内を意味するが、「流量」が使用される場合にだけは、このパラメーターの単位からも、「比流量」が意味されることは明らかである。単位「リットル」で示される量「体積」の略称として、「ｌ」または「Ｌ」は交換可能に使用される。本発明の方法における比流量はある範囲内で変動してもよく、または所与のウイルスフィルターを使用するろ過工程の期間を通して実質的に固定されたままであってもよい。本発明の一実施形態において、比流量は、少なくとも２４時間から約７ヶ月までの間で、約５Ｌ／（ｍ２×時間）から約５００Ｌ／（ｍ２×時間）の範囲であってよい。フラックスの下限は、約５Ｌ／（ｍ２×時間）または約１０Ｌ／（ｍ２×時間）であってよい。上限は、約２５Ｌ／（ｍ２×時間）、約７５Ｌ／（ｍ２×時間）、約１００Ｌ／（ｍ２×時間）、約２００Ｌ／（ｍ２×時間）、約２５０Ｌ／（ｍ２×時間）、約３００Ｌ／（ｍ２×時間）または約５００Ｌ／（ｍ２×時間）であってよい。フラックスはさらに、約５Ｌ／（ｍ２×時間）から約１００Ｌ／（ｍ２×時間）、約１０Ｌ／（ｍ２×時間）から約１００Ｌ／（ｍ２×時間）または約１０Ｌ／（ｍ２×時間）から約２５Ｌ／（ｍ２×時間）の範囲であってよい。
【００３８】
「バッチろ過」は、さもなければ「バッチ式ろ過」またはバッチ様式で実施されるろ過としても公知であるが、本明細書において、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物の特定の全量または全体積が、ウイルスフィルターの容量に依存して、１つのバッチにおいてウイルスフィルターを介してろ過され、ろ液が、このろ液が使用または消費される工程に向かう、または供給される前にろ過工程が終了する工程を指す。
【００３９】
「連続ろ過」または「オンラインろ過」または「インラインろ過」という用語は、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物の特定の全量または全体積が、ウイルスフィルターの容量に依存して、連続してウイルスフィルターを介してろ過され、ろ液が、このろ液が使用または消費される工程にすでに向かっている、または供給されても未だろ過工程が続いているろ過工程を指す。
【００４０】
本発明のすべての実施形態は、バッチろ過または連続ろ過を使用して実施することができる。本発明の有益な効果は、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物を、少なくとも２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介して、ウイルス性汚染物質を前記調製物から除去するためにろ過に供することによって既に達成されている。
【００４１】
本発明に従った好ましい実施形態において、調製物が、少なくとも約２４時間、最大７５ｎｍの有効孔径を有するウイルスフィルターを介したろ過に供される、ウイルス性汚染物質を、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である前記調製物から除去するための方法は、連続ろ過として実施される。動作のこの様式は、生産された調製物のろ液が、このろ液が使用または消費される工程に直接および連続して供給可能であるという利点を有する。さらなる好ましい実施形態において、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分であるウイルスろ過された調製物は、バイオリアクター、より好ましくは連続供給細胞培養工程、例えば、ケモスタット工程、潅流工程またはフェドバッチ工程に使用される大規模バイオリアクターに、直接および連続して供給することができる。この実施形態は、一実施形態において圧力約１０００ｍｂａｒから２０００ｍｂａｒおよび温度１０℃から４０℃を使用して実施され、容積は少なくとも２０００Ｌ／ｍ２または少なくとも５０００Ｌ／ｍ２である。加えて、調製物のウイルスろ過が、少なくとも約２４時間または約４８時間から最大約７ヶ月までの間実施されることがさらに好ましく、少なくとも約１週から最大約５ヶ月の間がより好ましく、少なくとも約１から約３週または約３週から約３ヶ月の間が最も好ましく、少なくとも約２から約３ヶ月がさらに最も好ましい。当然のことながら、すべての他のパラメーターがこの実施形態と組み合わせることができる。加えて、ろ過されるべき調製物が細胞培養培地であり、ろ過様式が連続様式ろ過であることが好ましい。
【００４２】
当然のことながら、本発明に従った方法のいずれかに従って得ることができる、ウイルスろ過された調製物が、細胞培養；薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物に関連する他の生産工程に向かわせる、または供給されてもよいことは当業者には公知である。それらの実施形態においてもまた、調製物の連続ろ過が好ましい。
【００４３】
したがって、本発明はまた、細胞培養に関する本発明に従った方法のいずれかに従って得ることができる、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物；薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物の使用にも関する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ウイルスろ過される細胞培養培地は滅菌のものであり、またはさもなければ予備処理されている。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は動物性タンパク質または血清または他の動物由来成分を含むか、または動物性タンパク質非含有もしくは血清非含有もしくは動物由来成分非含有であるか、または前述の特徴のいずれかの組み合わせを保有する。他の実施形態において、細胞培養培地は、様々な濃度および種の植物または微生物由来の加水分解物、特にダイズ加水分解物を含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は、変動濃度の少なくとも１つのダイズ加水分解物（ｈｙｄｏｌｙｓａｔｅ）を含む、動物性タンパク質非含有培地である。しかし、特に、細胞培養工程、薬学的、診断的および／または化粧品調製物および食品調製物に使用する場合、それらの調製物のウイルス学的安全性をさらに改善するために、本発明に従った方法が、動物性タンパク質または血清または他の動物由来成分を含む調製物のウイルスろ過に特に適切であることは強調しておかねばならない。
【００４５】
「細胞培養培地」は、本発明の目的に関して、細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養における成長に適切な培地として定義される。細胞培養において適切な細胞の成長を支援することができる任意の培地が使用可能である。本発明に従った細胞培養培地は、任意の基礎培地、例えば、当業者に一般に公知であるＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭｃＣｏｙまたはＲＰＭＩに基づいてよい。基礎培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機の塩および炭水化物の供給源を含む多数の原料を含んでよく、各原料は、当業者に一般に公知である、細胞の培養を支援する量で存在する。培地は、補助物質、例えば、重炭酸ナトリウムなどの緩衝物質、酸化防止剤、機械的ストレスに対抗する安定剤またはプロテアーゼ阻害剤を含んでよい。必要に応じて、非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの混合物（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８．ＲＴＭ．、ＳＥＲＶＡ）を、消泡剤として加えることもできる。
【００４６】
本明細書において使用する場合、「動物性タンパク質含有培地」は、ヒト供給源または動物供給源に由来している任意のタンパク質を含む細胞培養培地である。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「タンパク質非含有培地」は、ヒト供給源または動物供給源に由来している任意のタンパク質が含まれない細胞培養培地である。
【００４８】
本発明に従った「動物性タンパク質非含有細胞培養培地」という用語は、高等多細胞非植物真核生物由来のタンパク質および／またはタンパク質成分を含有しない培地を指す。回避される典型的なタンパク質は、血清および血清由来物質中に見出されるタンパク質、例えば、アルブミン、トランスフェリン、インスリンおよび他の成長因子である。動物性タンパク質非含有細胞培養培地は、任意の精製された動物由来生成物および組換え動物由来生成物ならびにそれらのタンパク質消化物および抽出物またはそれらの脂質抽出物もしくは精製成分もまた含まない。動物性タンパク質およびタンパク質成分は、非動物性タンパク質、植物、例えばダイズ、ならびに下等真核生物、例えば酵母から得ることができる小型ペプチドおよびオリゴペプチド（通常１０〜３０アミノ酸長）とは識別されるべきであり、これらは、本発明に従った、動物性タンパク質非含有細胞培養培地に含まれてもよい。
【００４９】
「加水分解物」という用語は、動物由来もしくは植物由来の供給材料または酵母もしくは細菌由来の抽出物の任意の消化物を含む。本発明に従った細胞培養培地において、高度に精製されたダイズ加水分解物、精製されたダイズ加水分解物または粗ダイズ加水分解物であり得る「ダイズ加水分解物」が含まれ得る。
【００５０】
培地に適用される「血清含有」という用語は、血清を含有する任意の細胞培養培地を含む。
【００５１】
培地に適用される「血清非含有」という用語は、血清を含有しない任意の細胞培養培地を含む。「血清非含有」は、培地が、好ましくは０．１％未満の血清およびより好ましくは０．０１％未満の血清を有することと理解される。「血清」という用語は、フィブリンクロットおよび血液細胞の除去後に得られる血液の流体部分を指す。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ろ過工程から得られるろ液またはろ液の流れは、大規模細胞培養およびバイオリアクターにそれぞれ供給される。「大規模」細胞培養は、本明細書において使用する場合、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約３００Ｌ、少なくとも約４００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約１０００Ｌ、少なくとも約１５００Ｌ、少なくとも約２０００Ｌ、少なくとも約２５００Ｌ、少なくとも約３０００Ｌ、少なくとも４０００Ｌ、少なくとも約５０００Ｌ、少なくとも約７５００Ｌ、少なくとも約１００００Ｌまたは少なくとも約２００００Ｌの規模の細胞培養を指す。好ましい実施形態において、本発明に従った任意の方法で得られるろ液の流れは、好ましくは連続ろ過による、ケモスタット工程、潅流工程またはフェドバッチ工程に使用されるバイオリアクターに供給される。
【００５３】
本明細書において企図される細胞培養は、培養される細胞の種類および性質ならびに培養される細胞の成長相、例えば接着性細胞または非接着性細胞；成長細胞または成長停止細胞とは関係なく任意の細胞培養であってよい。
【００５４】
本発明に従って使用される「滅菌」という用語は、微生物および／またはウイルス汚染のない、または本質的にない物質を指す。この点で、「汚染物質」は、細胞培養培地または細胞培養培地の少なくとも１つの成分である調製物中の所望の成分とは異なる材料を意味する。「滅菌ろ過」の文脈において、滅菌ろ過という用語は、調製物が、滅菌フィルターを介してろ過され、細菌性および／またはマイコプラズマ性汚染物質を除去する機能的説明である。
【００５５】
「ウイルスろ過」という用語は、本明細書において「ナノろ過」という用語と交換可能に使用され、ろ過工程のために、規定された有効孔径を有するウイルスフィルターが使用されることを意味する。概して、それらのフィルターは、ウイルスを除去するための専用のものである。
【００５６】
本発明のすべての方法に従ったろ過による除去のために標的化されたウイルス性汚染物質は、当該分野において今のところ公知であるか、または将来発見される任意のウイルスであってよい。この定義は、ろ過により除去される潜在的ウイルス性汚染物質もまた含み、複数のウイルスが、本発明の方法により除去されることもさらに含む。例えば、ウイルス性汚染物質または潜在的ウイルス性汚染物質は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ  またはＲｅｏｖｉｒｉｄａｅのウイルス科のメンバーであり得る。より詳細には、ウイルス性汚染物質は、イヌパルボウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（ＣＰＶ）、マウス微小ウイルス（ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ）（ＭＶＭ）、カシェ渓谷ウイルス（Ｃａｃｈｅ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、ブンヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ノースウェイ脳炎ウイルス（Ｎｏｒｔｈｗａｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡ／Ｂウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス１／２／３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  １／２／３）、シミアンウイルス５（Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ５）、流行性耳下腺炎ウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、ウシＲＳウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、マウス肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ）、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ウシコロナウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、マウス肝炎ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ベシウイルス２１１７（Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ  ２１１７）、脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルスＢ−３（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ−３）、タイレルマウス脳脊髄炎ウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ  ｍｏｕｓｅ  ｅｎ��ｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシエンテロウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ブタエンテロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）、泡沫状ウイルス（Ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス１／２／３（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ  １／２／３）、トリレオウイルス（Ａｖｉａｎ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ブタサーコウイルス１（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  １）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、マウスガンマヘルペスウイルス６８（Ｍｕｒｉｎｅ  ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓ  ６８）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）、カエルウイルス３（Ｆｒｏｇ  ｖｉｒｕｓ  ３）、マウス微小ウイルス（ｃｕｔｔｅｒ）（ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ−ｃｕｔｔｅｒ）（ＭＶＭｃ）、ブルータングウイルス（ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＴＶ）、流行性出血熱ウイルス（Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＨＤＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤＶ）、ブタパルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ）（ＰＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）、レオウイルス３（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ  ３）およびマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭｕＬＶ）、Ａ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）またはパルボウイルスＢ１９（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｂ１９）からなる群のいずれかであってもよい。
【００５７】
「ウイルスフィルター」という用語は、本明細書において「ウイルス保持フィルター」、「ウイルス性フィルター」および「ナノフィルター」と交換可能に使用され、その特徴が全体としてフィルターをウイルスの保持に適切にし、この機能を果たすための有効孔径を有するフィルターを一般的に指す。これらの特徴は、例としては、膜特性、例えば形態、細孔の形状、細孔密度および均一性、有効孔径、膜の厚さなどが挙げられる。本発明において有用なウイルスフィルター膜は、サイズ排除および電荷により動作し、吸着保持との組み合わせ可能な膜を包含する。サイズ排除および吸着保持の機序は、必ずしも互いに排他的ではなく、フィルターは、１つまたは複数の機序を十分に採用することができる。
【００５８】
本発明において定義され、本発明の一実施形態において使用されるウイルスフィルターは、最大７５ｎｍの有効孔径の膜を有することによって特徴づけられる。本発明に従った一実施形態において、有効孔径の下限は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍである。本発明に従った前記実施形態において、有効孔径の上限は、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍまたは約７５ｎｍである。本発明のいくつかの実施形態においてウイルスフィルターは、約５から約７５ｎｍまたは約１０から約７５ｎｍまたは約１５から約７５ｎｍまたは約２０から約７５ｎｍまたは約１５から約５０ｎｍまたは約１５から約３５ｎｍの有効孔径を有する。
【００５９】
有効孔径は、本明細書において使用する場合、膜の特徴であり、有効性のレベルは、このようなサイズの粒子の対数減少係数により表されることを考慮して、膜により有効に保持可能な粒子のサイズを指す。
【００６０】
本発明の方法において使用されるウイルスフィルターは、少なくとも約２０００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約３０００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約４０００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約５０００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約７５００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約１００００Ｌ／ｍ２、もしくは少なくとも約２００００Ｌ／ｍ２の容積に耐えるために十分な構造を有するか、または約２４時間を超えて約７ヶ月まで、または好ましくは少なくとも約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約１週、約２週、約３週、約４週、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月もしくは約７ヶ月の間の期間動作可能である任意のフィルターであってよい。
【００６１】
当然のことながら、複数のフィルターが本発明に従った方法に使用される場合、異なるタイプのウイルスフィルターもまた、好ましくは並列または直列で、ろ過工程において使用され得、そして組み合わされ得る。
【００６２】
例示的ウイルスフィルターは、単一または多層の膜を含み、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、セルロース、変性セルロース、例えば銅アンモニア再生セルロース中空繊維またポリエーテルスルホンなどの材料で構築される。ウイルスフィルターの膜は、中性、負または正の電荷を有してもよい。膜は、イオン性膜であってもよく、すなわち膜は、陽イオンまたは陰イオンの基を含有してもよいが、ｐＨ条件に依存して、中性膜が好ましいこともある。ウイルスフィルター膜は、疎水性および親水性の膜から選択することができる。好ましい実施形態において、本発明に従った方法に使用されるウイルスフィルターの膜は、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）またはポリエーテルスルホンから作製される。
【００６３】
ウイルス除去の能力が実証されている例示的フィルターの製造業者は、排除することなく、Ａｓａｈｉ／Ｐｌａｎｏｖａ、ＰＡＬＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＧａｍｂｒｏおよびＡｍｅｒｓｈａｍ／ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが挙げられる。本発明における使用に適切なフィルターとしては、限定するものではないが、ＡｓａｈｉのＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎフィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、Ｐｌａｎｏｖａ  ３５Ｎフィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）およびＢｉｏＥＸフィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）が挙げられる。
【００６４】
当然のことながら、本発明の方法の１つに使用されるフィルターは、使用前にオートクレーブ処理可能および／またはオートクレーブ処理済みおよび／または、さもなければ滅菌されていることが望ましい。しかし、使用されるウイルスフィルターの無菌性を確実にするための他のすべての可能性が、本発明の実施に適切である。さらにフィルターは、使用前および／または使用後に完全性試験が可能であることが望ましい。好ましい実施形態において、本発明に従った方法において、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）またはポリエーテルスルホンの膜を有する、オートクレーブ処理され、完全性試験されたウイルスフィルターが使用される。
【００６５】
「ろ液」は「透過物」という用語と交換可能に使用され、フィルターまたは膜を横切る溶液およびフィルターまたは膜を横切った溶液を指す。
【００６６】
「保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）」は、本明細書において使用する場合、保持されて、フィルターまたは膜を横切らない溶液の成分およびフィルターまたは膜を横切らなかった溶液の成分を指す。
【００６７】
本発明において有用なウイルスろ過装置は、供給材料をフィルターセクションの前後に分割する、少なくとも１つのウイルスろ過膜構成要素を含む。ろ過装置は通常、圧力および流れを調節する手段、例えばポンプおよびバルブならびに流量計および圧力計および密度計を含む。装置はまた、いくつかのろ過膜構成要素を異なる組み合わせで、並列または直列またはその両方で配置されて含むことができる。
【００６８】
ろ過フラックスは圧力に従って変動する。概して、正常な作動範囲において、圧力が高くなるほど、フラックスが高くなる。フラックスは温度によっても変動する。作動温度の上昇によりフラックスも増加する。しかし、高温および高圧により、膜破壊の傾向も高くなる。無機膜に関しては、ポリマー膜よりも高温および高圧ならびに高ｐＨ範囲を使用することができる。
【００６９】
当業者には、本発明に従ったウイルスフィルターの代わりに、約５０００ダルトン未満または約１０００ダルトン未満の分子量カットオフを有するフィルターが、ウイルスを除去するためにも使用可能であることが、疑いなく明白である。この文脈において「分子量カットオフ」（ＭＷＣＯ）は、溶質の平均分子量を指定するフィルターの膜特徴であるが、粒子またはウイルスはこのフィルターの膜を透過しない。
【００７０】
本発明のウイルスろ過工程のｐＨ値は、ろ過されている調製物、好ましくは細胞培養培地またはバッファーの安定性および機能性を保存するために必要な任意の範囲に設定可能である。例えば、ｐＨ値は、約１から約１０、好ましくは約２から約８、または約３から約７、好ましくは約６．８から約８または最も好ましくは約７．０から約７．４５（生理学的ｐＨ値）に設定することができる。
【００７１】
本発明に従った方法は、細菌性汚染物質を除去する滅菌グレードのフィルターの下流の系に統合でき、それによって、「出発調製物」、すなわち本発明に従った任意の方法に使用される調製物であり得る、調製物の無菌供給材料の流れを生み出すこともまた企図される。
【００７２】
一実施形態において、本発明の方法は、直列で配置された２つ以上のフィルターを使用して実施可能である。これは、ウイルスクリアランス能力の増大およびウイルスフィルターの潜在的な故障または漏出に対する予防手段の利点を有する。代替の実施形態において、ろ過は、並列で配置された２つ以上のウイルスフィルターを使用して実施され、それによって、ウイルスフィルターの交換を、連続工程を中断させることなく可能にし、例えば詰まりによる想定外の培地の保留を予防できる。
【００７３】
さらに他の実施形態において、ろ過は、Ｙ字接合部を含む配管系において並列で配置された少なくとも２つのフィルターを使用して実施され、ここで各フィルターは、Ｙ字接合部の分枝および調製物供給源と流体連結している。いくつかの実施形態において、Ｙ字接合部はコネクタを含む。他の実施形態において、ろ過は、複数のフィルターを直列および並列の両方の配置で含有する構成を使用して実施される。本発明に関連して特に有用なものは、ろ過工程を中止することなく、メンテナンスの理由でフィルターの１つを交換する可能性を有するために、少なくとも第２のフィルターが、他の並列なフィルターまたは直列で配置されたフィルターと並列に連結された配列である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、フィルターは、使用前に完全性試験に供される。完全性試験は、空気‐水拡散（ａｉｒ−ｗａｔｅｒ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）ベースの試験の形態をとることができ、空気をフィルターに向かわせ、次いでフィルターを滅菌水に沈め、フィルターの漏れを示す気泡に関して調べる。
【００７５】
一実施形態において、ウイルスフィルターまたはウイルスフィルター膜は、ウイルスろ過手順の前に、例えば洗浄剤、特に酸性洗浄剤、アルカリ性洗浄剤および／またはエタノールによる洗浄により、予備処理されてもよい。
【００７６】
本発明の一実施形態において、タンジェンシャルフローろ過もまた本発明に従った方法において実施できる。本発明の文脈において、「タンジェンシャルフローろ過」は、「クロスフローろ過」という用語と、本明細書において交換可能に使用される。タンジェンシャルフロー様式において、フィルターの上流側の液体流路は、フィルター表面とおよそ平行、または接線方向、または交差して誘導される。透過物の通過は、供給材料に対する保持液の流れを制限することによって容易にされ、系への背圧をもたらし、フィルター膜を介した透過物の移動を可能にする。膜表面を横切って掃引する一定の流動（ｃｕｒｒｅｎｔ）は、ろ過されている生成物中の汚染物質による詰まりを最小化する効果を有する。あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも２Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも３Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも５Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも６Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも７Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも８Ｌｏｇ１０減少値を達成し、または好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０の減少値（ＬＲＶ）を達成する任意のウイルスフィルターが適切である。すべてのｌｏｇ減少係数が、最大７５ｎｍの有効孔径のウイルスフィルターのいずれに対しても適用可能である。本発明に従った一実施形態において、ウイルスフィルターの有効孔径の下限は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍである。本発明に従った前記実施形態において、ウイルスフィルターの有効孔径の上限は、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍまたは約７５ｎｍである。本発明のいくつかの実施形態において、ウイルスフィルターは、約５から約７５ｎｍまたは約１０から約７５ｎｍまたは約１５から約７５ｎｍまたは約２０から約７５ｎｍまたは約１５から約５０ｎｍまたは約１５から約３５ｎｍの有効孔径を有する。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態において、正常フロー（ｎｏｒｍａｌ  ｆｌｏｗ）ろ過が使用される。本明細書において「正常フローろ過」は、「デッドエンド」、「シングルパス」および「直接フローろ過」と交換可能に使用され、液体の流路が通常フィルター表面に垂直に誘導され、フィルターモジュールの構築に依存して流体の流れがフィルター膜に接線方向に誘導されてもよいが、クロスフローろ過とは対照的に、保持液の再循環は適用されず、これがフィルター前後の比流量が同一であることを意味するウイルスフィルターろ過工程を指す。あるウイルス性汚染物質に対して少なくとも１Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも２Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも３Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも５Ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも６Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも７Ｌｏｇ１０減少値、またはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも８Ｌｏｇ１０減少値を達成し、または好ましくはあるウイルス性汚染物質に対して少なくとも４Ｌｏｇ１０の減少値（ＬＲＶ）を達成する任意のウイルスフィルターが適切である。すべてのｌｏｇ減少係数が、最大７５ｎｍの有効孔径のウイルスフィルターのいずれに対しても適用可能である。本発明に従った一実施形態において、ウイルスフィルターの有効孔径の下限は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍである。本発明に従った前記実施形態において、ウイルスフィルターの有効孔径の上限は、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍまたは約７５ｎｍである。本発明のいくつかの実施形態において、ウイルスフィルターは、約５から約７５ｎｍまたは約１０から約７５ｎｍまたは約１５から約７５ｎｍまたは約２０から約７５ｎｍまたは約１５から約５０ｎｍまたは約１５から約３５ｎｍの有効孔径を有する。
【００７８】
当業者には明らかなように、本発明のすべての実施形態は、目的に関して技術的に有用な任意の利用可能な系、例えば、可変速度また固定速度のぜん動ポンプ、遠心ポンプなどの支援により実行可能である。任意の種類の加圧容器または他の容器を使用して、ろ過工程の間一定圧力または可変圧力によるウイルスフィルターを介した流れを生み出すことができる。
【００７９】
当業者は、フィルターのタイプおよび様式（デッドエンドろ過またはタンジェンシャルフローろ過）の選択は、組成物、タンパク質含有量、分子量分布、不純物／微粒子負荷または加工される供給材料の任意の他の生化学的または物理的特性、工程の要件および制限（許容圧力、工程時間、ろ過される体積）または潜在的ウイルス性汚染物質の特徴、例えばウイルスサイズなどの要因に依存するものであることを理解しているであろう。工程内の完全性試験の利用可能性およびウイルスクリアランス研究のロジスティクスもまた、考慮しなければならない。デッドエンドろ過は一般的に、合理的な工程フラックスを得るために高純度の供給材料流を採用しなければならず、一方いくつかの実施形態において、タンジェンシャルフローろ過は、微粒子負荷が高い供給材料流に順応可能である。いくつかの好ましい実施形態において、正常フローろ過は、最大７５ｎｍの有効孔径を有する少なくとも１つのウイルスフィルターを使用する連続ろ過様式と組み合わせることが好ましい。当然のことながら、この実施形態もまた、本発明すべての他のパラメーターと組み合わせることができる。
【００８０】
当然のことながら、この発明は記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら、変動可能であることは理解されるべきである。本明細書に記載の専門用語は、特定の実施形態だけを説明する目的のためであって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるので  、限定を意図するものではないこともまた、理解されるべきである。  
【００８１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限の間の、文脈が明らかに他のことを示さない限り、下限の単位の１０分の１までの挟まれる各値および任意の他の規定された値またはその規定された範囲に挟まれた値は本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、このより小さい範囲に独立して含まれてよく、この規定された範囲において具体的に排除された任意の限界を前提として、さらに本発明に包含される。規定された範囲内の規定された範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれた限界のどちらかまたは両方を排除した範囲もまた本発明に含まれる。  
【００８２】
他のことが定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価の任意の方法および材料もまた、本発明の実践または試験に使用できるが、代表的な例示的方法および材料をこれから記載する。  
【００８３】
本明細書に引用されたすべての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許があたかも参照により組み込まれたことを具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日に先立つその開示のためであり、本発明が、先行発明に関してこのような刊行物に先行する権利を与える承認として解釈するべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、単独に確認されることが必要であり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
【００８４】
本明細書において使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除して起草できることも留意されたい。したがって、この言及は、請求項の要素の列挙または「否定的な」限定の使用に関連した「単に」、「だけ」などの排他的用語の使用に関する先行詞として機能することが意図される。
【００８５】
本開示を読む当業者には明らかなように、本明細書に記載および例示の各個別の実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特長から容易に分離またはこれらと組み合わせることができる、別々の構成要素および特長を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順番で、または論理的に可能な任意の他の順番で実施することができる。
【実施例】
【００８６】
本発明を例示するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に限定する意味のものではない。
【００８７】
実施例１：異なるウイルスフィルターおよび細胞培養培地による規模を縮小したウイルスろ過
異なる製造業者によるウイルスろ過膜（表２を参照されたい）を、異なるフィルターサイズおよび異なるロットおよび供給業者による４ｇ／Ｌ濃度のダイズ加水分解物を含有する細胞培養培地において、それらのろ過動態に関して評価した（表３を参照されたい）。細胞培養培地の組成および調製を、実施例２に記載する。ろ過実験を、加圧容器で圧力を調節することによって（図３、図４、図５ならびに図７、図８および図９におけるスパイク実験）、または流量を、例えばぜん動ポンプにより調節することによって（図１、図２、図３および図６）のいずれかで実施した。実験の温度および圧力調節に使用した他の装置は、表４に記載する。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
【表３】
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【００９０】
【表４】
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【００９１】
実施例２：細胞培養培地の調製
細胞培養培地の組成の概要を下記の表５に提供し、異なるダイズ加水分解物の組成は上記の表３に記載した。細胞培養培地の異なるバッチを、滅菌グレードのフィルター、例えばＰａｌｌ  Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標）ＩＩ  ＤＪＬ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ０．１μにより、実施例に記載の異なるウイルスろ過の前に滅菌ろ過した。ここに記載の培地調製を、図１から図１１に記載および示したすべての実験に使用した。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
実施例３：フィルターの調製：
ウイルスフィルターを、ウイルスフィルター製造業者の製品マニュアルに従って調製した。フィルターが無菌で送達および組み立てられない限り、フィルターを＞１２１℃において２０分間オートクレーブ処理した。
【００９４】
実施例４：完全性試験
使用後、適切なサイズのフィルター（表２のフィルターＡ、Ｃ、ＥおよびＦ）を、それぞれの製造業者の推奨に従って洗浄した。フォワードフロー試験（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｆｌｏｗ  Ｔｅｓｔ）をＰａｌｌｔｒｏｎｉｃ  Ｆｌｏｗｓｔａｒ  ＸＣ（Ｐａｌｌ、ＵＳ）により製造業者の仕様書に従って実施した。本明細書に記載のろ過実験後に実施されたすべての完全性試験は、指定限界に適合した。
【００９５】
実施例５：圧力差とフラックスとの間の比例関係
圧力差と体積流量との関係を調査するために、細胞培養培地を、オートクレーブ処理されたウイルスフィルターを使用して周囲温度においてろ過に供した。培地を圧力容器に満たし、ウイルスフィルターを圧力容器に連結し、その後これを異なるレベルで加圧した。比流量および圧力差を、てんびんおよび圧力トランスデューサ―により測定し、時間をわたって記録した（図３）。
【００９６】
実施例６：１０Ｌの規模を縮小した発酵系モデル
ウイルスろ過を行った細胞培養培地および行わなかった細胞培養培地の比較を、組換えタンパク質を発現するＣＨＯ細胞発酵系を使用して実施した（図６）。成長速度および収量に関する性能を調査した。実施例２に記載の細胞培養培地を調製した。実験の一部は、滅菌ろ過だけされた培地で実施し、一方、他の部分は、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ  １８０ｃｍ２を使用してウイルスろ過を行った同じ培地で実施した。ろ過は２〜８℃において実施した。発酵実験を、Ｒｕｓｈｔｏｎタイプの撹拌型１０Ｌベンチトップバイオリアクターにおいて、インラインで調節されたｐＨ、ｐＯ２および温度により実施した。発酵のパラメーターの設定値および範囲は下記の通りであった：
ｐＨ：７．０５（６．８−７．３）
Ｔ：３７．０℃（３５−３９℃）
ＤＯ：２０％（空気飽和）（１０−６０％）  。
【００９７】
細胞をバッチ様式で増殖させ、次いでさらなるウイルスろ過を行った、または行わなかった培地を使用してケモスタット培養した。ケモスタット様式によるデータ（成長速度および生産性）を、４週の連続細胞培養から生成した。
【００９８】
細胞数をＣＡＳＹ測定により決定した。ケモスタット培養において、比成長速度（μ）は、以下：
μ＝Ｄ＋Ｉｎ（Ｘｔ１／Ｘｔ０）／（ｔ１−ｔ０）
により計算した。式中、Ｄは、培地供給速度／日および作業体積［１／ｄ］の比として計算された希釈率である。成長速度は、ＣＡＳＹ均質化細胞数から計算した。
【００９９】
生化学的分析のために、均質な懸濁物を、４００×ｇでＨｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ１  Ｓ−Ｒにおいて１０分間遠心分離し、１．０ｍＬのアリコートをエッペンドルフ管に調製し、≦−２０℃において保存した。無細胞上清を、発現された組換えタンパク質の活性に関して発色アッセイにより標準操作手順に従って分析した。
【０１００】
この実験における体積生産性Ｐは、下記の式により計算した：
Ｐ［Ｕ／（Ｌ×ｄ）］＝活性［ｍＵ／ｍＬ］＊希釈率［ｄ−１］
細胞特異的生産性ｑＰは、下記の式により計算した：
ｑＰ［ｍＵ／（１０Ｅ０６細胞×ｄ）］＝Ｐ［Ｕ／（Ｌ×ｄ］／細胞数［１０Ｅ０６細胞／ｍＬ］  。
【０１０１】
実施例７：１２０Ｌの規模を縮小した発酵系モデル
１２０Ｌの作業体積の培地を、組み換えタンパク質を発現するＣＨＯ細胞発酵系に添加する前に、その培地に実施された連続ウイルスろ過技術を、その成長速度および収量に対する影響に関して調査した（図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。この研究により、同じ細胞培養培地の３種の変形を使用する生産工程が比較された：ａ）標準培地；ｂ）Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶウイルスフィルターを使用してろ過された標準培地；およびｃ）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰウイルスフィルターを使用してろ過された標準培地。
【０１０２】
連続生産工程の間、２種の異なるウイルスフィルター（Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ  Ｍｉｄｉｃａｐ  サイズ２０００ｃｍ２およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ  サイズ８５０ｃｍ２）を、異なる時間間隔で交互に使用した。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＣＰＶフィルターを培養日Ｋ００−Ｋ１４、Ｋ２３−Ｋ３０およびＫ３９−Ｋ６３に使用し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＮＦＰフィルターを培養日Ｋ１４−Ｋ２３およびＫ３０−Ｋ３９に使用した。
【０１０３】
発酵のパラメーターの設定値および範囲は下記の通りである：
ｐＨ：７．０５（６．８−７．３）
Ｔ：３７．０℃（３５−３９℃）
ＤＯ：２０％（空気飽和）（１０−６０％）  。
【０１０４】
サンプリングおよび分析
細胞数を、ＣＡＳＹ（登録商標）細胞数および分析器システムにより決定した。生化学的分析のために、均質な懸濁物を、４００×ｇでＨｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ１
Ｓ−Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）において１０分間遠心分離した。無細胞上清を、発現された組換えタンパク質の活性に関して発色アッセイにより分析した。
【０１０５】
ケモスタット培養において、比成長速度（μ）は、以下：
μ＝Ｄ＋Ｉｎ（Ｘｔ１／Ｘｔ０）／（ｔ１−ｔ０）
により計算した。式中、Ｄは、培地供給速度／日および作業体積［１／ｄ］の比として計算された希釈率である。成長速度は、ＣＡＳＹ均質化細胞数から計算した。
【０１０６】
この実験における体積生産性Ｐは、下記の式により計算した：
Ｐ［Ｕ／（Ｌ＊ｄ）］＝活性［ｍＵ／ｍＬ］＊希釈率［ｄ−１］
細胞特異的生産性ｑＰは、下記の式により計算した：
ｑＰ［ｍＵ／（１０Ｅ０６細胞×ｄ）］＝Ｐ［Ｕ／（Ｌ＊ｄ］／細胞数［１０Ｅ０６細胞／ｍＬ］  。
【０１０７】
実施例８：ＡＳＡＨＩ  Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎウイルスフィルターによるウイルスろ過
ダイズ加水分解物含有培地（ＤＯＭＯ  ＳＥ５０  ＭＡＦ＃５）にＭＭＶをスパイクし、加圧された窒素ガス供給に連結されたタンク内に配置した。ＭＭＶスパイク材料をデッドエンド様式で１１００ｍｂａｒ（設定値）の定圧でインラインに構成された、１０ｃｍ2のＡＳＡＨＩ  Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎウイルスフィルターを通過させた。下記のパラメ
ーターの最小値および最大値を測定し、連続的に記録した：供給圧力；供給材料、ろ液および周囲の温度ならびにろ液重量（その変化を、ろ液流量の計算に使用した）。試料を、毎日７日目まで採取し、ＭＭＶウイルス価を分析した（図７）。
【０１０８】
実施例９：ＡＳＡＨＩ  Ｐｌａｎｏｖａ  ＢｉｏＥＸウイルスフィルターによるウイルスろ過
ダイズ加水分解物含有培地（試行番号１、ダイズ加水分解物ＤＭＶ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ＃５）；試行番号２、ダイズ加水分解物ＳＤＭＶ  ＳＥ５０  ＭＡＦ  ＵＦ＃４）にＭＭＶをスパイクし、加圧された窒素ガス供給に連結されたタンク内に配置した。ＭＭＶスパイク材料をデッドエンド様式で２０００ｍｂａｒ（設定値）の定圧でインラインに構成された、１０ｃｍ2のＡＳＡＨＩ  Ｐｌａｎｏｖａ  ＢｉｏＥＸウイルスフィルター
を通過させた。下記のパラメーターの最小値および最大値を測定し、連続的に記録した：供給圧力；供給材料、ろ液および周囲の温度ならびにろ液重量（その変化を、ろ液流量の計算に使用した）。試料を、毎日５日間採取し、ＭＭＶウイルス価を分析した（図８）。
【０１０９】
実施例１０：ウイルスろ過の概要
異なるダイズ加水分解物を含有する細胞培養培地にＭＭＶをスパイクし、加圧された窒素ガス供給に連結されたタンク内に配置した。異なるウイルスフィルターを、表６に列挙される異なるダイズ加水分解物と組み合わせて使用した。
【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
ろ過を、デッドエンド様式で、試行実験番号５および６を除くすべての試行に関して２ｂａｒ（設定値）の定圧において構成し、試行実験番号５および６は１．１ｂａｒの定圧（設定値）において実施した。下記のパラメーターの最小値および最大値を測定し、連続的に記録した：供給圧力；供給材料、ろ液および周囲の温度ならびにろ液重量（その変化を、ろ液流量の計算に使用した）。試料を、実験の試行時間の間に採取し、ＭＭＶウイルス価を分析した。全体のｌｏｇ減少を、ろ液中の全ウイルス感染負荷（ｔｏｔａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｌｏａｄ）と、ろ過前の全ウイルス感染負荷との差から計算した（図９）。
【０１１２】
実施例１１：ＭＭＶウイルススパイクでの長期ろ過
実施例２に記載の細胞培養培地にＭＭＶを５．０［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）］の力価までスパイクし、３０日の長期ろ過に２０ｎｍの孔径のウイルスフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｓｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ  ５ｃｍ２）によって供した。ろ過を、実施例９および実施例１０と同様の構成で実施したが、１．１ｂａｒの定圧（指定範囲：０．８ｂａｒから１．２ｂａｒ）を用い、ウイルスフィルターのチャレンジのための通常の圧力（ｒｅｇｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）および流れの中断を有した。実験の過程の流量を記録し、４Ｌ／（ｍ2×時間）より上に維持した（図１０）。
【０１１３】
ろ液の２０の試料を採取し（最大５回／週）、ＭＭＶウイルス価およびウイルス負荷を決定した。ウイルスの漏出は、アッセイした２０の画分のいずれにおいても観察されなかった。ウイルス負荷は、画分の体積に依存して＜０．９［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］から＜２．８［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］の範囲であった。ろ液の全ウイルス負荷は、＜３．０［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］であり、スパイク材料の初期ウイルス負荷（すなわち８．５［ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）］）から引いた場合、全ウイルス減少係数＞５．５ｌｏｇ１０をもたらした。これは、有効かつ完璧であるとみなされる（図１１）。
【０１１４】
前述の発明を、明確な理解の目的で、図解および実施例により少し詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および変形が本発明に実施可能であることは容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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