【手続補正書】
【提出日】平成13年2月7日(2001.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】微粒子デリバリーシステムおよび使用の方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】被験体の免疫システムの調節のための薬物の製造における免疫活性剤の使用であって、その薬物が、１以上の免疫活性剤を伴う（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）複数の微粒子を含むものである使用。
【請求項２】前記微粒子が、有孔ミクロ構造を含む請求項１の使用。
【請求項３】前記微粒子が界面活性剤を含む請求項１または２の使用。
【請求項４】前記界面活性剤が、リン脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、生体適合性のフッ素化界面活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項３の使用。
【請求項５】前記界面活性剤がリン脂質である請求項３または４の使用。
【請求項６】前記リン脂質が、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項５の使用。
【請求項７】前記微粒子が、非水性懸濁媒体中に分散される請求項１〜６のいずれかの使用。
【請求項８】前記非水性懸濁媒体が、ヒドロフルオロアルカン、フルオロカーボン、パーフルオロカーボン、フルオロカーボン／炭化水素ジブロック、炭化水素、アルコール、エーテルまたはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる化合物を含む請求項７の使用。
【請求項９】前記非水性懸濁媒体が、液体フルオロケミカルおよびヒドロフルオロアルカン推進剤からなる群から選ばれる化合物を含む請求項７または８の使用。
【請求項１０】微粒子の平均の空気力学的な直径が０．５〜５μｍの間にある請求項１〜９のいずれかの使用。
【請求項１１】微粒子の平均の幾何学的直径が、約５μｍ未満である請求項１〜１０のいずれかの使用。
【請求項１２】前記免疫活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、およびウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物からなる群から選ばれる請求項１〜１１のいずれかの使用。
【請求項１３】前記免疫活性剤がワクチンを含む請求項１〜１２のいずれかの使用。
【請求項１４】被験体の免疫システムの調節が、異物抗原または病原性粒子への免疫応答の誘発、局在性または全身性の受動免疫の誘導、免疫応答の刺激、または免疫反応の下方調節のいずれかを含む請求項１〜１３のいずれかの使用。
【請求項１５】前記薬物が、局所的、筋肉内、皮内、経皮、腹腔内、鼻、肺、膣、直腸、耳、口、または眼投与を用いてデリバリーされる請求項１〜１４のいずれかの使用。
【請求項１６】被験体における免疫応答を誘導するために吸入されるワクチンの製造における免疫活性剤の使用であって、それにより、そのワクチンが１以上の免疫活性剤を伴う複数の微粒子を含み、且つそのワクチンが被験体の呼吸パスに投与されるものである使用。
【請求項１７】前記微粒子が有孔ミクロ構造を含む請求項１６の使用。
【請求項１８】前記微粒子が界面活性剤を含む請求項１６または１７の使用。
【請求項１９】前記免疫活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、ウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物からなる群から選ばれる請求項１６〜１８のいずれかの使用。
【請求項２０】前記ワクチンが乾燥粉体吸入器を用いて投与される請求項１６〜１９のいずれかの使用。
【請求項２１】前記微粒子が非水性懸濁媒体中に分散される請求項１６〜１９のいずれかの使用。
【請求項２２】前記非水性懸濁媒体が、液体フルオロケミカルおよびヒドロフルオロアルカン推進剤からなる群から選ばれる化合物を含む請求項２１の使用。
【請求項２３】前記ワクチンが、用量計量型吸入器、ネブライザー、アトマイザー、鼻ポンプ、スプレーボトル、または液滴の直接滴下を用いて投与される請求項２１または２２の使用。
【請求項２４】微粒子の平均の空気力学的な直径が、０．５〜５μｍの間にある請求項１６〜２３のいずれかの使用。
【請求項２５】前記微粒子の平均の幾何学的な直径が、約５μｍ未満である請求項１６〜２４のいずれかの使用。
【請求項２６】前記誘導された免疫応答が、粘膜の免疫を含む請求項１６〜２５のいずれかの使用。
【請求項２７】被験体に生物活性剤を投与するためのシステムであって；
リザーバを含む投与装置と；
前記リザーバ中の粉体とを含み；前記粉体が、１以上の生物活性剤を伴う複数の微粒子を含み、それにより粉体が投与により被験体の免疫システムの調節を与えるシステム。
【請求項２８】前記投与装置が、乾燥粉体吸入器または粉体インジェクターを含む請求項２７のシステム。
【請求項２９】前記微粒子が非水性懸濁媒体中に分散される請求項２７のシステム。
【請求項３０】前記非水性懸濁媒体が、液体のフルオロケミカルおよびヒドロフルオロアルカン推進剤からなる群から選ばれる化合物を含む請求項２９のシステム。
【請求項３１】前記投与装置が用量計量型吸入器、アトマイザー、スプレーボトル、アトマイザー、鼻ポンプ、滴剤の滴下器、または針無しのインジェクターを含む請求項２９のシステム。
【請求項３２】前記微粒子が有孔ミクロ構造を含む請求項２７〜３１のいずれかのシステム。
【請求項３３】前記微粒子が界面活性剤を含む請求項２７〜３２のいずれかのシステム。
【請求項３４】前記界面活性剤が、リン脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、生体適合性のフッ素化界面活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項３３のシステム。
【請求項３５】前記界面活性剤がリン脂質である請求項３３または３４のシステム。
【請求項３６】前記微粒子が約５μｍ未満の平均の幾何学的直径を有する請求項２７〜３５のいずれかのシステム。
【請求項３７】前記生物活性剤が免疫活性剤を含む請求項２７〜３６のいずれかのシステム。
【請求項３８】前記免疫活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、ウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物からなる群から選ばれる請求項３７のシステム。
【請求項３９】前記免疫活性剤がワクチンを含む請求項３７または３８のシステム。
【請求項４０】その必要な際に被験体の免疫応答を調節するための組成物であって；その組成物が、１以上の免疫活性剤を伴う複数の有孔ミクロ構造を含み；前記有孔ミクロ構造が約０．５ｇ／ｃｍ３ 未満のバルク密度を有する組成物。
【請求項４１】前記有孔ミクロ構造が界面活性剤を含む請求項４０の組成物。
【請求項４２】前記界面活性剤が、リン脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、生体適合性のフッ素化界面活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項４１の組成物。
【請求項４３】前記界面活性剤がリン脂質である請求項４１または４２の組成物。
【請求項４４】前記微粒子が約５μｍ未満の平均の幾何学的直径を有する請求項４０〜４３のいずれかのいずれかの組成物。
【請求項４５】有孔ミクロ構造の平均の空気力学的直径が、０．５〜５μｍの間にある請求項４０〜４４のいずれかの組成物。
【請求項４６】有孔ミクロ構造が、中空多孔質ミクロスフェアを含む請求項４０〜４５のいずれかの組成物。
【請求項４７】前記免疫活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、ウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物からなる群から選ばれる請求項４０〜４６のいずれかの組成物。
【請求項４８】前記有孔ミクロ構造が非水性懸濁媒体中に分散される請求項４０〜４７のいずれかの組成物。
【請求項４９】被験体における強化された免疫応答を与えるための薬物の製造における生物活性剤の使用であって；それにより、その薬物が、１以上の免疫活性剤を伴う複数の微粒子を含み；その薬物が、水性キャリア中の匹敵する免疫活性剤に対して、強化された免疫応答を誘発するものである使用。
【請求項５０】前記生物活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、およびウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物からなる群から選ばれる請求項４９の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
【０００２】
本発明は、一般的に、少なくとも１つの生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）剤を含む（その選ばれた態様においては、免疫活性（ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖｅ）剤を含むことができる）微粒子の投与のための組成物および方法に関する。この点で、本発明は、例えば、気道、胃腸管、または泌尿生殖器の経路を用いて生物活性剤の局所的および全身的なデリバリーを与える。特に好ましい態様において、開示された組成物は用量計量型（ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）吸入器、乾燥粉体吸入器、アトマイザーまたはネブライザー等の吸入器具とともに、粘膜の表面への標的型デリバリーのために用いられるであろう。
発明の背景
【０００３】
脊椎動物は、環境からの病原体に対する、並びに内部で発現する腫瘍細胞等の異常型（ａｂｅｒｒａｎｔ）細胞に対する防御として、免疫応答を開始する能力を有する。これは、好中球および単球／マクロファージ系統（ｌｉｎａｇｅ）の細胞によって媒介される自然免疫または受動的な免疫の形、または特定の抗原性配列に対するリンパ球によって媒介される獲得性または能動的な免疫の形をとることができる。能動的な免疫応答は、それら自身が２つの枝（ａｒｍｓ）、体循環に晒された抗原を中和し、および専門の食細胞による取り込みを助長するために役立つ特異的抗体の産生を必要とする液性の反応、および体内の感染されたまたは異常な細胞認識のために必要な細胞性の枝、に更に再分割することができる。
【０００４】
両方の場合において、特異的な応答は、抗原の細胞内過程によって誘導される。抗原が細胞の経路を通して処理されるとき、結果として生じるペプチドが初期のＭＨＣクラスＩ分子に結合され、それがエフェクターＴ細胞への適当な現出（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を容易にする。ＭＨＣクラスＩ現出は、細胞毒性リンパ球の認識に有利である。対照的に、細胞内取り込み経路を経た細胞内の過程は、体液性枝の刺激に含まれるＴヘルパー応答に有利なＭＨＣクラスＩＩ分子の現出を生じる。ワクチン接種のゴールは、免疫系が活性化（ｐｒｉｍｅｄ）されて病原性感染に応答するように、両方の応答とも活性化し、且つ記憶Ｔ細胞を生成することである。このような応答は、共刺激的（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子発現を促進するシグナルの共投与、いわゆるアジュバントによって促進される。液性および細胞性免疫応答の両方のエンゲージメントは、広いベースの免疫をもたらし、且つ細胞内の病原体のための好ましいゴールである。適切な共刺激分子発現の欠如は、Ｔ細胞不応答性の状態をもたらす可能性がある。
【０００５】
この点で、免疫応答の調節は、２つの方向、病原性因子またはその抗原に対して向けられた免疫応答を誘導するか、または慢性炎症をもたらす自己エピトープに対してマウントされる不適当な応答を抑制する、のいずれか一つの方向を取ることができる。このような自己エピトープに対する慢性応答は、糖尿病、典型的にはタイプＩ、多発性硬化症、リューマチ関節炎またはループス・エリスレマトージス（ｅｒｙｔｈｒｅｍａｔｏｓｉｓ）等の種々の自己免疫疾患に結びつく。いずれの場合においても、活性剤は、しばしば比較的複雑なペプチド、タンパク、ＲＮＡ、またはＤＮＡに基づく因子、または古典的な薬剤を代表する小さい化学的因子よりむしろ他の巨大分子構造の形を取る。経口的に投与されるとき、これらの複合生物活性剤は、貧弱な生体利用性を一般に示し、したがって、侵襲的で（ｉｎｖａｓｉｖｅ）非経口的な注射によって伝統的に投与されている。最近、しかしながら、比較的大きい生体分子が、例えば吸入等の粘膜の経路によりデリバリーできることが示唆されている。呼吸の粘膜を経た投与がＧＩ路の消化酵素を迂回するため、吸入を介するこれらの剤の体循環へのデリバリーは特に魅力的である。更に、体循環との交換のために利用可能な大きい表面積により、それはペプチドとタンパクのための増大されたポテンシャルを生体利用性に対して与える。経口的な生体利用性のための分子量カットオフは一般に５００ダルトンの範囲にあるが、より大きい分子量のペプチドホルモンまたは類似体（例えば１．８ｋＤのデスモプレッシン、５．８ｋＤのインシュリン、９．５ｋＤの副甲状腺ホルモン）は、体循環への鼻または肺の無傷の粘膜を横切って吸収されることが示されている。
【０００６】
分解なしでタンパク、ペプチド、ウィルス性およびＤＮＡ処方の効果的デリバリーを考慮に入れる他に、粘膜の表面への標的型デリバリーは、それがＭＡＬＴ（粘膜協同型リンパ組織）リンパ系の範囲内での局所的免疫応答を誘導するならば、それ自体で利益を提供することができる。粘膜のワクチン接種は、そのエントリのポートが典型的には体と外部環境を結びつけている粘膜の表面の一つにある、病原体に対してデザインされたワクチンのために、特に重要である。ＭＡＬＴリンパ系は、粘膜の粘膜固有層の範囲内にある。外部抗原が局所的樹状（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）細胞に現出される時、Ｂ細胞前駆体の局所的増幅および成熟があり、そしてそれは、典型的には抗原の全身的なデリバリーによって誘導されるｌｇＧ抗体に加えてＩｇＡおよびＩｇＭ抗体を製造する。前者は、粘膜の表面を横切ってルーメンへのトランスサイトーシスとして知られるプロセスによって、分化された輸送レセプターを介して分泌される。そこで、それらは粘膜の表面で侵略する病原体に対する防御の最初の系統を与える。最近の証拠は、結合性の病原性抗原に加えて、免疫複合体の結果として生じる形成が、それ自体で（ｉｎ ａｎｄ ｏｆ ｉｔｓｅｌｆ）、ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃな経路を通して起こっているウィルス性伝染を抑制することを示す。病原体に由来する抗原に対してこの最初の系統の免疫応答を与えることによって、粘膜の免疫化は、それにより生物体が侵入する病原体を先ず妨害する効率を、大い強化すべきである。
【０００７】
以前のいくつかの試みが、この取り込みメカニズムを利用して、ペプチドまたはタンパク質の効果的なデリバリーを与えるためになされた。例えば、米国特許第５，７５６，１０４号は、鼻腔内のワクチン処方のためのリポソーム処方の使用を記述している。これらの処方は、リポソームを有する水性（ａｑｕｅｏｕｓ）キャリアと、遊離の抗原性材料を含むように見える。それらの処方は免疫応答を誘導することが見出されたが、それらは極めて不安定で、且つ時間で分解に影響されやすいように見える。実際的な意味では、これは実質的な欠点である。
【０００８】
このような限界を克服し、デリバリー効率更に増大させる試みは、比較的に大きい生体分子の投与のための乾燥粉体を発達させた。残念ながら、従来の粉体製剤（すなわち微粉化された）は、しばしば、長い期間にわたって正確で、再現性ある投薬を行うことが出来ない。ある程度、これは、パウダーが微粉間の疎水性または静電的な相互作用のために凝集する傾向があるからである。このような凝集は、凝集を抑制するためのより大きいキャリア粒子（すなわちラクトース）の使用により部分的に克服することができる。しかしながら、これらのより大きい粒子および結合された薬物は、しばしば標的細胞に着くことができず、不均等なデリバリープロファイルを生ずる。更に、キャリア分子を含む粗製混合物は、あるとしても、取り込まれた生体分子のための保護を殆ど与えない。したがって、上で記述される水性組成物と同様に、このような製剤は、時間とともに分解および活性のロスを受け易い。
【０００９】
より最近、コンベンショナルな先行技術パウダーおよび水性製剤に伴う限界を克服するために、改善された処方方法が着手された。この点について、参照することによりここに取り込む米国特許出願シリアル番号０９／２１８，２０９号および０９／２１９，７３６号は、ミクロ微粒子状の形で生物活性剤を含む製剤を生成するための方法およびプロセスを記述している。結果として得られるパウダー（望ましくは、それは中空の、多孔性の形態を示す）は、乾燥粉体インヘイラー（ＤＰＩｓ）等の吸入器具のために適当であり、または、非水性液体（すなわちヒドロフルオロアルカンまたはフルオロカーボン）中に懸濁された際には、用量計量型吸入器（ＭＤＩｓ）およびネブライザーのために適当である、更に、処方プロセスの間に用いられる緩和な条件は生物的活性の保持をサポートして、それらの製剤を、タンパクとペプチドと、並びにウィルス等のより複雑な高分子の構造とともに使用するために特に適合性を有する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ようにする。加えて、結果として得られる粉体は非常に低い残留含水量（それは、推進剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ）等の短鎖フルオロカーボンまたはフルオロケミカル中、またはパーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）等のより長鎖フルオロケミカル中の処方まによって更に維持することができる）を有するため、これらの処方が不安定な生物活性剤の貯蔵のために安定した手段を与える。
【００１０】
強化された安定性の他に、ミクロ微粒子の好ましい中空の、多孔性の形態は、特に吸入療法と適合性を有する空気力学的な特性を与える。更に、粒状の特性は、例外的に安定したディスパージョンの形成を与え、ＨＦＡ−１３４ａ等のヒドロフルオロアルカン推進剤並びにＰＦＯＢ等の他であるだけでなくフルオロカーボン液体ビヒクルと、それらとを特に適合性を有するようにする。従って、乾燥の形態でまたは非水性ディスパージョンのいずれで用いられても、ミクロ微粒子は、良好な用量再現性、および優れたプルーム特性（推進剤または乾燥粉体スプレーの一つの尺度）、および呼吸できる分率としてデリバリーされる用量（器具または喉での沈着に対する）高いパーセンテージの一様性の基準）を与える。これらの性質は、開示された微小粒子がの肺中の深くまで、実質的な理論的利点を与えることを示唆する。体循環へのデリバリーが望まれる場合に、タンパク質およびペプチド等の大きい巨大分子の取り込みが肺胞の（ａｌｖｅｏｌｉ）レベルで最適であるため、このような深い沈着は好ましい。
【００１１】
このようなミクロ微粒子処方の使用はコンベンショナルな先行技術デリバリー方法に対する実質的な改良であるが、強化された生理応答を生じる生物活性剤、免疫調節剤、または免疫活性剤の標的型デリバリーを与えるニーズはまだ残る。
【００１２】
従って、本発明の目的は、強化された免疫応答の生成を与える組成物、システムおよび方法を提供することにある。
【００１３】
他の目的は、ワクチンおよび免疫調節剤を含む免疫活性剤を、それを必要とする際の患者の粘膜の表面への効果的なデリバリーを提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、活性を維持するために冷蔵または凍結を必要としないワクチンおよび他の生物活性な処方を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、吸入療法を介する受動的および能動的な免疫の確立を提供することにある。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、免疫を授けるか、またはそれを必要とする際の患者の免疫システムを下方に調節するために用いることができる免疫活性剤の安定製剤を提供することにある。
発明の概要
【００１７】
処方これらおよび他の目的は、ここで開示される請求される本発明により与えられる。そのために、本発明の方法および関連する組成物は、広い面では、粉体または微粒子形で選ばれた標的サイトへの活性剤の改善されたデリバリーを与える。より詳しくは、開示された方法および組成物は、投与の後に、取り込まれた生物活性剤（好ましくは免疫活性剤を含む）の活性を強化するか、増大させために用いることができることが驚くべきことに見出された。この点について、本発明のワクチンは、相当する先行技術ワクチン処方によって誘導されるより一桁（ｏｒｄｅｒ）または、それより大きい強度の強化された免疫応答を誘導させることができる「アジュバント効果」を示すように見える。この有効性における予想外の改良に加えて、比較的に穏やかな処方技術は、任意の取り込まれた剤の活性を保護し、強化する組成物および微粒子形態と組み合わせることができる。これは、でもの活性を保護して、強化する組成物は、冷蔵または凍結の必要なしで、それらの生物的活性を保持する比較的有効な製剤の形成を与える。薬物デリバリーのための先行技術の粉体またはディスパージョンとは異なり、本発明は好ましくは粒子の間の引力を低減する新しい技術を用いて、改善された流動性および分散性を生じる。これらの粉体が非水システム懸濁媒体（例えば液体のフルオロケミカル）に取り込まれた際には、これらの同じ特性は、更に剤分解の割合を低減することができる低減されたフロキュレーション（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）、沈降またはクリーミングを与える。最後に、粘膜の表面等の選ばれた標的サイトへの開示された微粒子またはディスパージョンの投与は、更に生物活性を最適化するか、強化するために役立つことができる。従って、本発明のディスパージョンまたは粉体は、用量計量型吸入器、乾燥粉体吸入器、アトマイザー、エーロゾライザー、鼻ポンプ、スプレーボトル、ネブライザーまたは液体の用量点滴注入（ＬＤＩ）技術とともに、生物活性剤を効果的にデリバリーするために用いることができる。
【００１８】
特に有益な開示された粒状の処方技術の特徴は、広範囲の生物活性な構造が、それらの疎水性または親水性とは無関係に、安定化ディスパージョンまたは粉体中に取り込むことができるということである。好ましい態様において、生物活性な粉体は比較的緩和なスプレードライ法を用いて製造される。このような適合性を有する粒状処方技術のため、ペプチド、タンパク質または遺伝物質（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）等のより大きい、より不安定な生体分子は、悪影響または活性の過度のロスなしに、開示された組成物に容易に取り込むことができる。これらの同じ処方技術および得られる微粒子は、更に、従来の投与技術およびシステムを用いて、比較的高い服用量（約１０ｍｇ）の生物活性剤の取り込みおよびデリバリーを与える。従って、乾燥粉体または安定化ディスパージョンのいずれで投与されても、開示された製剤によって与えられる新しい粒子製作技術および強化された応答は、粘膜等の標的サイトへの生物活性剤の効果的デリバリーをもたらす。
【００１９】
本発明に関して、用語「生物活性剤」は、ホルモン、サイトカインまたはケモカイン、または免疫活性剤等の任意の活性なペプチドおよびタンパク質を言う。すなわち、開示された組成物および方法はほぼ任意の生物活性剤と適合性を有するが、例えば外部抗原または病原体への免疫応答を誘導するか、または能動的な免疫応答を下方調整する等の免疫応答を調整するために設計された免疫活性剤のデリバリーまたは投与のために、それらが驚くべきことに効果的であることが見出された。したがって、ここで用いるように、用語「免疫活性剤」または「免疫学的活性剤」は、生理学的または免疫性の応答を誘導するために使用できるか、または被験体における既存の応答を調整することができる任意の分子を含む。このような免疫活性剤または生物学的製剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンス構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む遺伝物質、並びにウィルス、ファージおよびバクテリアを含む微生物を含むことができる。
【００２０】
加えて、補因子、増強物質または透過増強剤として機能することができる分子は、ここで記述される微粒子で容易に共同で処方することできる。当業者は、取り込み、現出または生体利用性を改善するために作用する任意の化合物でも、ここでの教示に従って増強物質または透過増強剤として機能することができると認めるであろう。例えば、細胞の膜透過性を変えることができるか、増大させことができる化合物は、増強物質または透過増強剤として機能することができる。例示的な増強物質または透過増強剤は、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ、クエン酸）、洗浄剤または界面活性剤（例えば９−ラウリルエーテル）、脂肪酸（例えばオレイン酸）、および胆汁酸塩（例えばナトリウムグリココレート）を含む。特に好ましい透過増強剤は、約１０未満の炭素の鎖長を有する比較的短い鎖のリン脂質を含む。生物活性剤で、および更に詳細に下で議論されるように、選ばれた増強物質または透過増強剤は、種々の濃度で、微粒子中、またはそれに関連した取り込むことができる。
【００２１】
本発明の微粒子、ミクロ微粒子状粒子、または有孔（ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ）ミクロ構造に関して、当業者は、それらが所望の物理的な特性または形態を与えている任意の医用（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）材料で形成することができると認めるであろう。この点について、有孔ミクロ構造は、好ましくは、表面相互作用を最小にし、剪断力を低減することにより引力を低減するように作用するポア、ボイド、または他の間隙を含む。この形態は、凝集を低減して、分散性を改善するように作用する。更に、これらの制約があるとすれば、ミクロ構造マトリックスを形成するために任意の医用材料でもまたはコンフィグレーションが使用できることが認められる。選ばれた材料については、ミクロ構造は、好ましい態様において、透過増強剤の働きをする少なくとも１つの界面活性剤を取り込むことは好ましい。好ましくは、この界面活性剤は、製薬使用のために承認されたリン脂質または他の界面活性剤または両親媒性物質を含む。同様に、ミクロ構造が少なくとも１つの生物活性剤または生物学的製剤を取り込むことが好ましい。コンフィグレーションに関して、本発明の選ばれた態様は、他のボイド含有構造または有孔構造も考えられるが、大きい内部ボイドを画する比較的薄い多孔性壁を有する、スプレードライされた中空ミクロスフェアを含む。
【００２２】
中空および／又は多孔性の有孔ミクロ構造の使用が、先行技術の粉体製剤およびディスパージョンを支配するファンデルワールス力等の、引力的な分子間力を実質的に低減できることが、予期せずに見出された。この点について、粉体状組成物は、吸入療法のために所望の特性を与えつつ、製剤の流動性に寄与する、典型的には比較的低いバルク密度を有する。より詳しくは、比較的低い密度の有孔（または多孔質）ミクロ構造またはミクロ微粒子の使用は、粒子間の引力を顕著に低減して、それにより、結果として生じる粉体の流動性を達成するために必要な剪断力を低下させる。有孔ミクロ構造の比較的に低い密度は、吸入療法で用いられた際に、優れた空気力学性能を与える。ディスパージョンにおいて、これらの粉体の物理的特性は、安定製剤の形成を与える。更に、ここでの教示に従ってディスパージョン成分を選ぶことによって、粒子間引力は更に低減され、強化された安定性を有する処方または製剤を与えることができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様が有孔ミクロ構造または多孔質微粒子を含むが、ここでの教示と適合性を有する粉体またはディスパージョンを製造するために、比較的に非多孔性または固体微粒子も用いることができる。すなわち、比較的無孔または固体の微粒子のディスパージョンを含む粉体も、本発明の範囲内であると考えられる。この点について、このような比較的無孔の微粒子は、微粉化した粒子、ミルド粒子またはナノクリスタルを含むことができる。したがって、ここで用いたように用語「微粒子」広く解釈され、有孔ミクロ構造と比較的無孔の粒子の両方を含む、任意のポロシティおよび密度の粒子を含むように維持される。
【００２４】
以前に言及したように、開示された粉体は、適当な非水性懸濁媒体中に分散されて、選ばれた生物活性剤を含む安定化ディスパージョンを与えることができる。このようなディスパージョンは、特に用量計量型吸入器、アトマイザー、鼻ポンプ、スプレーボトル、およびネブライザーにおいて有用である。本発明の他の態様は、直接の点滴注入技術を用いて肺または鼻腔に直接投与することができる安定化ディスパージョンを含む。いずれの場合にも、特に好ましい懸濁媒体は、室温で液体であるフルオロケミカル（すなわち、パーフルオロカーボンまたはフルオロカーボン）、またはフッ素化推進剤（すなわちヒドロフルオロアルカンまたはクロロフルオロカーボン）を含む。それらの有益な湿潤特性のため、若干のフルオロケミカルは肺または他の粘膜の表面により深く粒子のディスパージョンを与えることができる、それにより浸透移行性デリバリーを改善できる。更に、このような懸濁媒体は、無水である傾向があり、それにより取り込まれた生物活性剤の加水分解的な分解を遅らせる。最後に。フルオロケミカルは、一般に静菌的であり、したがって適合性を有する製剤における微生物の成長と付随するタンパク質分解崩壊の可能性を減少させる。
【００２５】
開示された粉体または安定化ディスパージョンのデリバリーに関して、本発明の他の面は、１以上の生物活性剤または生物学的製剤の患者への投与のための吸入システムに向けられる。上述したように、本発明と適合性を有する例示的な吸入器具は、アトマイザー、鼻ポンプ、ネブライザー、スプレーボトル、乾燥粉体吸入器、用量計量型吸入器またはネブライザーを含む。好ましい態様において、これらの吸入システムは、エアロゾルとして生物活性剤を所望の生理学的なサイト（例えば粘膜の表面）にデリバリーする。本出願の目的のために、用語「エアロゾル化された」は、文脈上の拘束によって別に規定されない限り、微細な固体または液体の粒子のガス状ディスパージョンを意味するように維持される。すなわち。例えば、エアロゾルまたはエアロゾル化された薬は、例えば、乾燥粉体吸入器、用量計量型吸入器、アトマイザー、スプレーボトルまたはネブライザーによって発生することができる。もちろん、以下により詳細に説明されるように、本発明の組成物は、直接に（例えば従来の注射または針無しの注射によって）、または液体の用量点滴注入等の技術を用いてデリバリーすることができる。特に好ましい態様においては、本発明の組成物が粘膜の表面（例えば吸入を通して）で接触され、粘膜および全身の免疫を誘導する。
【００２６】
本発明の粉体または安定化ディスパージョンが粘膜の表面への生物活性剤の投与に特に適当であるが、体の任意の位置への化合物の局所的または全身の投与のために用いることができることが認められる。したがって、好ましい態様において、（これらに限定されないが）消化管、気道、局所的に、筋肉内に、非経口的に、皮内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹膜内に、鼻内に、膣内に、直腸内に、耳内に、バッカル的に、経口的に、または眼内に、含む多くの異なる経路を用いて投与することができることが強調されるべきである。この点で、当業者は、投与の選ばれた経路が主に生物活性剤の選択と所望の被験体の応答によって決定されることを認めるであろう。
【００２７】
他の目的、特徴および本発明の利点は、以下の詳細な説明およびその例示的な好ましい態様をの考慮から、当業者には明らかであろう。
好ましい態様の詳細な説明
【００２８】
Ａ．序説
【００２９】
本発明は多くの異なる形で具体化することができるが、ここで開示しおよびその実例となる特定の態様は、本発明の原理を例証する。本発明は説明された特定の態様に限られないことを強調すべきである。
【００３０】
上述したように、本発明は、生物活性剤のデリバリーのために有利に使用できる粉体またはミクロ微粒子を含む組成物、方法、およびシステムを提供する。好ましくは、生物活性剤は、活性ペプチドまたはタンパク質または免疫活性剤を含むであろう。本発明の文脈において、免疫活性剤は、ワクチン、免疫グロブリンまたは自己抗原等の、免疫応答を誘導するために、または既存の応答を調整するために使用可能な任意の分子をも含むことができる。当業者は、開示された粉体が乾燥状態（例えばＤＰＩまたはガス駆動の粉体インジェクターで）で、または安定化ディスパージョンの形（例えば、アトマイザー、スプレーボトル、ＭＤＩ、ＬＤＩ、針無しのインジェクター、シリンジ、鼻ポンプまたはネブライザー）で生物活性剤をデリバリーするために有利に使用可能なことを認めるであろう。特に好ましい態様において、粉体またはミクロ微粒子は、ここで開示されるように、ボイド、ポア、欠損、中空、スペース、間隙スペース、アパーチュア、パーフォレーション、またはホールを示し、画し、または含む構造上のマトリックスを含む有孔ミクロ構造を含むであろう。これらの有孔ミクロ構造粉体は、それらを吸入療法のために特に有用にする空気力学の特性を有し、および推進剤または非水性デリバリービヒクルで安定化されたディスパージョンの形を与える形態を示す。より一般的には、開示された生物活性な粉体の形成中に使用される比較的緩和な条件、および適合性を有するデリバリー方法に伴う利点は、比較的に壊れやすい生物学的製剤の効率的な投与を与える。
【００３１】
任意の特定の理論にもよって束縛されることを望まないが、開示された組成物を形成し、貯蔵し、および投与するために用いられる比較的緩和な方法が、一般に不安定な剤において生物的活性の効果的保持を与えると考えられる。この点について、好ましい処方は、それらの活性を維持するために冷蔵を必要としない。更に、開示された粉体に用いられる適当な化合物の選択、および選ばれた生理学的なサイト（例えば粘膜の表面）へのデリバリーは、取り込まれた剤または複数の剤の取り込みを促進し、並びにその活性を強化することができる。加えて、本発明の組成物および／又はデリバリー技術は、選ばれた剤の投与に続く強化された免疫応答または生物活性を与えることができる予想外の「アジュバントな効果」を生ずるように思われる。より具体的には、例において議論されるように、本発明は、完全フロイントアジュバントにおける抗原が有する投与によって達成されるそれに匹敵する（すなわち、従来の薬剤処方の一桁またはより多くのマグニチュードで）免疫応答を誘導するために用いることができる。したがって、本発明は、活性局所的または全身の免疫化を誘導するために、または受動免疫化、免疫調節、ホルモンの制御または遺伝子療法を達成するために、活性ペプチド、タンパク質、遺伝物質または病原性粒子（生存または不活化されたのいずれも）の効果的デリバリーを与える。
Ｂ．生物活性剤
【００３２】
広い面において、このような粉体を取り込んだディスパージョンを含む本発明の粉体またはミクロ微粒子の組成物は、好ましくは少なくとも一つの生物活性剤を含む。ここで用いられるように用語「生物活性剤」は、任意の活性ペプチド、またはタンパク質または任意の免疫活性剤をも含むように維持される。後者に関して、本発明の特に好ましい態様は、免疫応答を調整することができるように設計された免疫活性剤を含むであろう。ここでの教示に従って、被験体免疫応答の調節は、潜在的な病原性感染または異物抗原に対する応答を誘導すること、または既存の免疫応答を刺激すること、局所的または全身性の受動的免疫を誘導すること、または自己免疫の応答またはアレルギー応答を抑制することを含む。本出願の目的のために用語「生物活性剤」または「免疫活性剤」は、被験体で所望の生理学的または免疫性の応答を与える、任意の分子または生物体、またはそれらの類似体、同族体または誘導体を含むように広く解釈される。用語「生物活性剤」は、文脈上の拘束によって別に規定されない限り、「免疫活性剤」およびその同等物をも含むように維持される。本発明とともに使用できる例示的な生物活性剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合またはキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）タンパク質、免疫グロブリン、ＤＮＡ、ＲＮＡに、組換えおよびアンチセンスの構造物を含む遺伝物質、ウィルス、ファージ、バクテリア性炭水化物およびバクテリアを含む微生物、並びに増強物質（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）、コファクターまたは透過増強剤として機能することができるより小さい分子を含む。本発明に従う生物活性な組成物は、ワクチン、免疫調節剤、遺伝子療法応用のためにレプリコンまたはエフェクターとしての用途がある。
【００３３】
本発明の粉体またはミクロ粒子組成物は、１以上の生物活性剤（または複数の剤）のみ（すなわち、１００％質量／質量（重量／重量）まで）を含んでいてもよいと認められるであろう。しかしながら、選ばれた態様において、有孔ミクロ構造は、その活性に依存して、遙かに少ない生物活性剤を含むことができる。従って、高度に活性の材料に対しては、ミクロ微粒子または有孔ミクロ構造は、（約０．１質量％（重量％）（ｗ／ｗ）を超える濃度が好ましいが）０．００１質量％（重量％）ほどに少量をも取り込むことができる。本発明の他の態様は、約５質量％（重量％）、１０質量％（重量％）、１５質量％（重量％）、２０質量％（重量％）、２５質量％（重量％）、３０質量％（重量％）または４０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）さえ超える任意の生物活性剤または生物学的製剤を含むことができる。更により好ましくは、開示された粉体は、約５０質量％（重量％）、６０質量％（重量％）、７０質量％（重量％）、７５質量％（重量％）、８０質量％（重量％）または９０質量％（重量％）さえ超える生物活性剤を含むことができる。本発明の粉体または有孔ミクロ構造に取り込まれる生物活性剤の正確な量は、剤の選択、必要な用量、投与の方法および実際に用いられる剤の形に依存する。当業者は、このような決定が、本発明の教示と組み合わせた周知の薬理学的技術を用いることによってできることを認めるであろう。
【００３４】
薬学製剤に関して、免疫応答を含む、生理応答を誘導する目的で、開示された粉体または有孔ミクロ構造で処方することができる任意の生物活性剤も、明白に、本発明の範囲内と考えられる。ここでの教示に従って、選ばれた１または複数の生物活性剤は、所望の効力を与え、且つ選ばれた製造技術と適合性を有する任意の形の粉体または有孔ミクロ構造と結びつけられ（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、またはそれらの中に取り込むことができる。ここで用いるように、用語「結びつけられた」または「結びつけ」は、粒子、ミクロ微粒子、構造上のマトリックス、または有孔ミクロ構造が、生物活性剤を含み、取り込み、吸着し、吸収し、生物活性剤でコートされ、または生物活性剤により形成されることを意味する。適当な場合には、剤は塩（例えば、アルカリ金属、またはアミン塩、または酸付加塩）またはエステルとしてまたは溶媒和化合物（水和物）として使用できる。この点について、生物活性剤の形は、その化合物の活性および／又は安定性を最適化し、懸濁媒体中の剤の溶解性を最小にし、および／又は凝集を最小にために選ぶことができる。
【００３５】
少なくともある程度までは、本発明で与えられる利点は、開示された粉体によって与えられるユニークな処方、貯蔵およびデリバリー面に存する。この点で、および以下でより詳細に議論されるように、開示された粉体または有孔ミクロ構造が形成できる条件は、比較的緩和である。すなわち、生物活性剤を含む微粒子は、本発明に従って、活性な化合物または剤を極端な物理的または化学的条件に晒すことのないように形成することができる。これは、簡単に分解され、または不活化される可能性がある、タンパク質、遺伝物質または弱毒化ウィルス等の比較的大きい巨大分子または剤に関して、極めて重要である。更に、本発明の選ばれた態様は、非水性懸濁媒体を含む比較的安定なディスパージョンを形成することによって、更に、取り込まれた剤の生物的活性を維持するために役立つ。懸濁媒体（好ましくは、液体のフルオロケミカルまたはフルオロケミカル推進剤）中の活性粉体のディスパージョンは、静菌的および無水の両方の傾向があり、それにより取り込まれた剤の加水分解またはタンパク質分解性崩壊を抑制する。このような組成物が、長い貯蔵期間にわたって活性の比較的に高いレベルを維持することが判明したと認められる。最後に、開示された粉体の組成物およびそのデリバリー技術が、結合された生物活性剤の活性を強化し、または高めることができることは、驚くべきことに見出された。一緒にして、本発明のこれらの利点は、選ばれた生理学的なサイトに対する活性剤の高度なデリバリーと効力を与える。
【００３６】
上記で示されるように、本発明の組成物、方法およびシステムは、ペプチド、ポリペプチド、バクテリア性炭水化物、ウィルスおよび遺伝物質等の生物活性剤のデリバリーのために有用である。この点で、開示された本発明は、能動免疫化のためのワクチン（例えば粘膜および全身のワクチン接種）、受動免疫化のための免疫グロブリン、自己免疫疾患の治療のための免疫調節薬、活性ペプチドまたはタンパク質、および遺伝子療法またはワクチン接種のためのエフェクターおよび発現ベクターの投与のために有用である。以下で更に詳細に説明されるように、選ばれた剤を含む粉体は種々の異なる手段によって形成することができる。好ましくは、粉体またはミクロ微粒子は、有孔ミクロ構造の形であって、取り込まれた生物活性剤の安定性および／又は効力を強化するために追加的な成分を含むであろう。所望により、粉体は安定化ディスパージョンを与えるために懸濁媒体で処方することができる。
【００３７】
生物活性剤の特に好ましいクラスは、直ちに下で更に詳細に議論される。
Ｂ（ｉ）．抗原およびワクチン（能動免疫化のため）
【００３８】
ここでの教示に従って、特に好ましい生物活性剤は、ワクチンを含むことができる。本明細書と添付の例を通じて議論されるように、適合性を有するワクチンは、不活化または死滅し微生物（例えば、ウィルス）、弱毒化した生存微生物、ファージ、タンパク質、ペプチドまたは炭水化物（例えばバクテリア性炭水化物）等のサブユニットワクチン、融合タンパク質またはキメラ抗体等のレプリコン、ウィルス性ベクター、およびプラスミドおよび組換え分子を含む遺伝物質を含むことができる。どのタイプの剤または生物学的製剤が選ばれるかに関係なく、結果として生じる粉体状組成物は、１以上の標的抗原に対して被験体を免疫するために使用可能である。更に、開示された本発明に伴うアジュバント効果または強化された免疫は、特に効果的な免疫化を与える。
【００３９】
ここで定義されるように、「標的抗原」は、抗原、典型的には、それに対して免疫応答を誘導することが好ましいタンパク質またはペプチドの部分を言う。このような抗原は、ウィルス、バクテリア、原生動物、菌類、イーストまたは寄生性の抗原等の病原体中に含まれる可能性があり、または細胞（例えば癌細胞）中に含まれる可能性がある。腫瘍抗原およびウィルス性抗原は、特に好ましい標的抗原である。遺伝のワクチンの場合、１以上の標的抗原は、投与された遺伝物質で、自己由来の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞の移入または形質転換に続くホストによって発現されるであろう。逆に、キメラまたは融解タンパク質または死滅したまたは弱毒化した微生物を含むそれらを含む、タンパク質またはペプチドベースのワクチンにおいては、標的抗原または複数の抗原が直接に免疫システムに与えられる。いずれにせよ、本発明の粉体またはディスパージョンを用いる標的抗原の現出は、所望の免疫応答を誘導させるであろう。興味あることに、生存ウィルス、または生存および死滅したウィルスの組み合わせが、ここでの教示に従ってワクチンとして使われたとき、被験体により特に激しい免疫応答が生じることが判明した。
【００４０】
当業者は、一般に、効果的な抗ウィルス性の免疫応答が、典型的にはＴｈ１／ＣＴＬ細胞応答とＢ細胞により媒介された体液性免疫とを含む両方の細胞により媒介された応答を含むことを認めるであろう。一般に精製されたタンパク質または死滅した微生物は、ＣＩＬ応答のないＢ、Ｔｈ２を誘導し、サブユニットまたは死菌ワクチンを含むある処方、並びに生ワクチンは、ＣＴＬ応答を伴うＢ、Ｔｈ１を誘導することができる。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、投与により、Ｂ、Ｔｈ１およびＣＴＬ応答を含む広範囲の免疫応答を誘導するであろう。しかしながら、ワクチン接種の間の生存ウィルス感染は、容認できない副作用をもたらす可能性がある。したがって、成功したワクチン接種ストラテジーでの目標は、過度の副作用を負うことなく免疫の細胞および液性の両方のブランチを保証することである。以下に述べるように、本発明の組成物は投与により、両方のタイプの応答を誘導するために使用できる。
【００４１】
この点で、適合性を有するワクチンは、標的抗原に対してＢ細胞応答、Ｔ細胞応答、またはそれらの組み合わせを生ずる任意の分子、生物体または化合物を含むことができる。それ自体で、実際にホスト免疫システムに現出された剤は、（直接に、または宿主細胞の形質転換の後のいずれでも）天然に存在する標的抗原の類似体、同族体または誘導体、または標的抗原を含む分子であることができる。更に、免疫化は、本質的に、現出される標的抗原のタイプおよびデリバリーの形に従って、局所または全身性であり得る。例えば、特に好ましい態様において、免疫原の応答は、本質的に主に粘膜性（例えば、粘膜関連のリンパ組織［ＭＡＬＴ］リンパシステムで）であろう。以前に議論したように、異物抗原が局所的樹状細胞によって現出されるとき、Ｔ細胞およびＢ細胞の局所的増幅と成熟があり、それは、典型的には抗原の全身性デリバリーによって誘導されるＩｇＧ抗体に加えて、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体を産生する。特に鼻のパスと副鼻洞において、このような局所的な免疫化は、特にインフルエンザウィルスとＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウィルス等の空気伝染性病原体による感染の防止に効果的であることが判明した。
【００４２】
より一般的には、本発明のワクチン組成物は、多くの病原体から１以上の標的抗原を含むことができる。例えば、（これに制限されずに）標的抗原は、インフルエンザウィルス、ｔサイトメガロウィルス、ヘルペスウィルス（ＨＳＶ−ｌとＨＳＶ−ＩＩを含む）、種痘疹ウィルス、肝炎ウィルス（これらに限定されないが、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ型肝炎を含む、水痘ウィルス、ロタウィルス、乳頭腫ウィルス属、麻疹ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、コクサッキーウィルス、ポリオウィルス、エンテロウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス（これらに限定されないが、ＨＩＶ−１またはＨｌＶ２を含む）、ＲＳウィルス、風疹ウィルス、ストレプトコッカス菌（ストレプトコッカス・ニューモニアエ等）、スタフィロコッカス菌（スタフィロコッカスアウレウス等）、ヘモフィルス菌（例えばヘモフィルス・ｕｎｆｌｕｅｎｚａｅ、リステリア菌（例えばリステリア・モノサイトゲネス）、クレプシュラ菌、グラム陰性バシラス菌、エシェリヒア菌（大腸菌等）、サルモネラ菌（サルモネラｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ 等）、ビブリオ菌（コレラ菌等）、エルシニア菌（エルシニアｐｅｓｔｉｓまたはエルシニア ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス菌、ナイセリア菌、（ナイセリアｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）、コルネバクテリウム（コルネバクテリウムｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ等）、クロストリジウム菌（クロストリジウムｔｅｔａｎｉ等）、マイコ血漿（マイコ血漿ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等）、カンジダイースト、アスペルギルス菌、Ｍｕｃｏｒ 菌類、トキソ血漿、アメーバ、マラリア原虫、トリパノゾーマ寄生虫、リーシュマニア寄生虫、蠕虫、その他の中に含まれる可能性がある。このような標的抗原の特定の非制限的な例は、赤血球凝集素、核タンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、ＨＢＳタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１２０、ＨＩＶのｎｅｆタンパク質、およびリステリオリジンを含む。
【００４３】
どのタイプの抗原が標的抗原として選ばれるかに無関係に、それは少なくとも１つの関連するエピトープを含む。ここで用いるように、用語「関連するエピトープ」は、免疫システムにアクセスできる標的抗原中に含まれるエピトープを言う。例えば、関連するエピトープは、細胞への微生物の透過の後、処理することができ、または微生物または微生物タンパク質の表面で、抗体によって認識することができる。好ましくは、エピトープに向かう免疫応答は、有益な効果を授ける；例えば、標的抗原がウィルスタンパク質である場合に、標的抗原の関連するエピトープに向かう免疫応答は、少なくとも部分的にウィルスの感染性または病原性を中和する。当業者は、関連するエピトープがＢ細胞またはＴ細胞エピトープであってもよいと認識するであろう。
【００４４】
ここで用いられるように、用語「Ｂ細胞エピトープ」は、Ｂ細胞によって抗体製造を誘導することができる、より大きいタンパク質内に含まれるペプチド配列を含むペプチドを言う。
【００４５】
例えば（これらに制限されることなく）、ヒト免疫免疫不全ウィルス（「ＨＩＶ」）タイプ１のエンベロープタンパク質の高頻度可変領域３のループ（「Ｖ３ループ」）がＢ細胞エピトープであることが知られている。本発明に従って使用できるＢ細胞エピトープの他の例は、（これらに制限されないが）免疫ドミナントＢ細胞エピトープであることが示された（Ｌｉら、（１９９２）Ｊ． Ｖｉｏｌ．、 ６６：３９９〜４０４）インフルエンザＨＡ  １の赤血球凝集素のサイトＢ等の、インフルエンザウィルス株に関連するエピトープ；麻疹ウィルス性Ｆタンパク質のエピトープ（残基４０４〜４１４、Ｐａｒｌｉｄｏｓら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２６７５〜２６８０）；残基１３２〜１４５からの肝炎ウィルスのｐｒｅ−Ｓ１領域のエピトープ（Ｌｃｌｅｒｃ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３５４５〜３５５２）；および足口病（ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ）ＶＰ１タンパク質のエピトープ（残基１４１〜１８０、クラークら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３３０３８１〜３８４ｌ）等の公知のＢ細胞エピトープを含む。使用可能な更なるＢ細胞エピトープは、公知であるか、またはＣａｔｏｎ ら、１９８２、Ｃｅｌｌ、３１：４１７〜４２７で記述されたように、当該技術で公知の方法によって、確認することができる。
【００４６】
本発明の追加的な態様において、ペプチドはＴ細胞エピトープを含むことができる。ここで用いるように、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ自己抗原と関連して、Ｔ細胞によって認識されるとき、機能的にＴ細胞を活性化する、より大きいタンパク質内のペプチド配列を含むペプチドを言う。この点について、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ自己抗原の文脈において、ヘルパーＴ細胞と認識することができ、それにより、Ｔｈ細胞を通じてＢ細胞抗体産生の容易化を促進するＴｈエピトープを与える。
【００４７】
例えば、これらに制限されずに、ＰＲ８株のインフルエンザＡ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質は、アミノ酸残基１１０〜１２０でＴｈエピトープを有する。他の公知のＴ細胞エピトープの例は、（これらに制限されないが）破傷風トキソイドの２つの無差別のエピトープ（Ｈｏら、１９９０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７７〜４８３）；チトクロームｃのエピトープ（残基８８〜１０３）；ミコバクテリアの熱ショックタンパク質のエピトープ（残基３５０〜３６９、Ｖｏｒｄｅｒｍｉｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２０６１〜２０６７）；雌鶏卵白リゾチームのエピトープ、（残基４８〜６１、Ｎｅｉｌｓｏｎｅｔら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：７３８０〜７３８３）；ストレプトコッカスＡ  Ｍタンパク質エピトープ（残基３０８〜３１９、Ｒｏｓｓｉｔｅｒら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１２４４〜１２４７）；およびスタフィロコッカスヌクレアーゼタンパク質のエピトープ（残基８１〜１００、ｄｅ Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ、１９９２、Ｄｅｌｌ、６８：１〜２０）を含む。本発明とともに用いることができる更なるＴｈエピトープは、公知であるか、または当該技術において公知である方法によって容易に確認することができる。
【００４８】
更なる例として、関連するエピトープがＣＴＬエピトープであることができ、それはＭＨＣクラスＩ自己抗原の文脈、細胞毒Ｔ細胞によって認識されることができ、それにより標的抗原を含む細胞のＣＴＬにより媒介された溶解を促進することができる。このようなエピトープの非制限的な例は、それぞれアミノ酸残基１４７〜１６１および３６５〜３７９に対応するインフルエンザウィルス核タンパク質を含む（テイラーら、１９８９、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２６：２６７）；タウンゼンドら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：６７４）；ＬＳＭＶペプチド（アミノ酸残基３３〜４１；Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ ら、１９７４、Ｎａｔｕｒｅ、２４８：７０１〜７０２）；およびアミノ酸残基２５７〜２６４に対応する卵アルブミンペプチド（Ｃｅｒｂｏｎｅら、１９８３、Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６３：６０３〜６１２）を含む。
【００４９】
遺伝のワクチンに関して、１以上の標的抗原は、投与された遺伝物質で自己由来の細胞で移入または形質転換の後のホストによって発現される。発現された１つ以上の抗原は、次いで被験体で所望の免疫応答を誘導する。当業者は、その遺伝物質が裸の分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の形で、またはウィルスの形で粉体と結合できることを認識するであろう。いずれにせよ、本発明と適合性を有する核酸は、好ましくは１以上の関連するエピトープをコード化して、所望により、関連するエピトープの発現および／又は安定性および／又は免疫原性を調節するエレメントを更に含むことができる。
【００５０】
例えば、遺伝の構造物内でコード化されたエピトープの発現を調節するエレメントは、（これらに制限されないが）プロモータ／エンハンサ・エレメント、転写開始サイト、ポリアデニル化サイト、転写終止サイト、リボソーム結合部位、翻訳スタートコドン、翻訳終止コドン、シグナルペプチド、その他を含む。具体的な例は、（これらに制限されないが）サイトメガロウィルスの初期の初期遺伝子のプロモータおよびイントロンＡ配列（ＣＭＶまたはＳＶ４０ウィルス（「ＳＶ４０」）；モンゴメリーら、１９９３、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２：７７７〜７８３）を含む。または１を越えるエピトープは、同じオープン読み枠内に発現することができる。本発明に従って使用できる遺伝のワクチンの例は、およびそれらの製造のための方法は、それらの内用を参照することによりここに取り込む、メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）およびＶｉｃａｌ社による国際出願公開第ＷＯ９４／２１７９７号、Ｍｔ． Ｓｉｎａｉによる国際出願公開第ＷＯ９７／２１６８７号、米国特許第５，５８９，４６６号および５，５８０，８５９号中に、およびＶｉｃａｌ社による国際出願公開第ＷＯ９０／１１０９２号に記述されている。
【００５１】
関連するエピトープの強化された安定性および／又は免疫原性を与えるために、より大きいペプチドまたはタンパク質の文脈において、エピトープを与えることは好ましいであろう。例えば、関連するエピトープは、キメラ抗体の可変部中に、または融合タンパク質の部分として発現することができる。他の好ましい態様においては、１以上の関連するエピトープを含む全長タンパク質（例えばウィルス性コートタンパク質）を投与することは、有利であろう。代わりに、免疫原性ペプチドまたはタンパク質の組み合わせまたはカクテルを含む粉体または有孔ミクロ構造を投与することは、好ましいであろう。この点について、関連するエピトープが同じまたは異なる病原体に由来することができると認識される。後者に関して、日和見性の病原体は、一次的な疾患原因剤とともに目標とすることができる。広い標的範囲に加えて、開示された組成物は、種々のエピトープ組み合わせを含むことができる。例えば、本発明の組成物は、Ｂ細胞エピトープの混合物、Ｔ細胞エピトープの混合物、またはＢおよびＴ細胞の組み合わせを含む核酸またはペプチドまたはタンパク質含むことができる。
【００５２】
より具体的には、１を越える関連するエピトープを含むか、または発現する組成物の投与は、予想外の相乗効果を示すことができる。このような組み合わせワクチンは、単一の関連するエピトープをコード化している単一の核酸種を含む組成物に比べて、選ばれた１以上の病原体に関して、所望の免疫を授けることで遙かにより効率的なことが証明できると認識される。当業者は、このような相乗作用が、単一エピトープのワクチンと比べて、より少ない用量とより頻度の少ない投与で発生されるべき効果的な免疫予防的または免疫治療的な応答を与えることができたと更に認識するであろう。更に、このような複数エピトープのワクチン組成物の使用は、選ばれた病原体による標的抗原の種または迅速突然変異の範囲内での天然表現型変化に対して、誘導されたマルチサイト免疫をより耐性とする傾向があるため、より包括的な保護を与えることができる。もちろん、効果的な免疫は、単一のＢまたはＴ細胞をコード化しているワクチンによって付与することもでき、このような組成物も、明らかに本発明の範囲内であると考えられる。
【００５３】
抗原それ自体に加えて、本発明は、処方された抗原の免疫原性を強化し、または改質するために、粒子のシェルそれ自体の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）成分のマニピュレーションを許容する。例えば、抗原取り込みがマンノースレセプターにより促進される際に、樹状細胞による効率的な抗原捕獲が促進されることがことが示され、それゆえに、リソソームのコンパートメントに対するターゲッティングを改善する（Ｓａｌｕｓｔｏら、Ｊ．Ｅｘｐｔ． Ｍｅｄ．１８２：３８９〜４００、１９９５）。したがって、微粒子に対する、細胞上のレセプターに結合するマンナンまたは他の多糖類の低いパーセントの取込みは、微粒子の免疫原性を強化すると予測される。更に、以下により詳細に述べるように、ＡＰＣ応答を促進するためのコファクターまたはサイトカインの使用は、必要に応じて、免疫応答を強化し、または抑制することに役立つ。本発明は、局所的樹状細胞または他のＡＰＯに向けた、粘膜または他のデリバリーの標的サイトの範囲内で（例えば経皮的に）刺激局所的免疫応答を増大させことができるコファクターで、抗原の共処方（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を許容する。局所的環境内におけるＡＰＣ活性化を容易にして、且つ抗原取り込みおよび現出を強化することによって、本発明で与えられるこのような組み合わせ処方は、結果として得られる免疫応答の増大された効率をもたらすことができた。
【００５４】
より一般的には、被験体に免疫または予防接種をしたとき、本発明の方法および組成物は、強化された免疫応答を与える。開示された微粒子によって与えられるこの「アジュバント効果」は、アジュバント（すなわちミョウバン（ａｌｕｍ）または完全フロイントアジュバント）とともに投与される抗原によって誘導されるそれに匹敵する免疫応答を誘導するために使用できる。本発明と違って、当業者は、このような従来のアジュバントが典型的には好ましくない副作用と関連して、多くの場合で、ヒトのために、利用できないことを認識するであろう。逆に、本発明は、潜在的に有毒なアジュバントの投与なしで、強化された免疫応答（すなわち、抗体価のためのＣＴＬレベル等の技術認識テクニックを用いて現出される比較できる抗原によって発生するそれよりも、大きい免疫応答）を与えることができる。如何なる特定の理論にもよって束縛されることを欲っしないが、観察された増進が、少なくとも部分的には、微粒子のコンフィグレーションまたは形態、抗原放出プロフィル、および微粒子内で可能な抗原凝集の結果であると思われる。いずれにせよ、その効果はより低いレベルの抗原および／又はより少ない接種で、臨床上有用な免疫応答を生成させる。
【００５５】
このアジュバント効果によって、組成物と本発明の方法によって与えられる免疫応答は、先行技術接種技術と比較して強化される。特に、本発明の組成物によって誘導される免疫応答は、水性キャリアを可溶化され、または懸濁され同じ抗原の静脈内または腹膜腔内投与によって起こる免疫応答よりも、一般に大きい。もちろん誘導された免疫応答の大きさは、以下の例で述べられた適合性を有する方法を含む、当該技術において周知公知である種々の技術の任意の一つを用いて測定することができる。このような比較を用い、上述した先行技術方法を用いる同じ抗原の投与によって起こるそれよりも、本発明の製剤は、好ましくは２５％、５０％、７５％、または１００％大きいを免疫応答を誘導する。より好ましくは、本発明は、水性キャリア中の抗原を用いて得られたベースライン応答よりも、２倍、３倍、４倍または５倍大きい応答を誘導するであろう。より好ましい態様において、開示された製剤および方法は、ベースライン応答より、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍大きい１０免疫応答を誘導するであろう。更に、他の態様は、ベースラインより２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または２桁も大きい応答を産生することができる。当業者は、開示された微粒子のこれらの新しく、従って今まで予想外の性質が、被験体における所望の免疫応答を生成することにそれらを極めて効果的にすると認識するであろう。
【００５６】
前記のアジュバント効果の他のに、ここでの教示に従って強化された免疫応答に、他のメカニズムも寄与がすることができる。例えば、生存および死滅したウィルスの組み合わせが、死滅したウィルス単独でによって与えられるそれよりも、遙かに強い応答を誘導することが、驚くべきことに判明した。より具体的には、好ましい態様において、粒子製作中にある程度まで、死滅しまたは不活化したする生存弱毒化ウィルスを用いて、粉体を製作することができる。以下の例に関連して示されるように、生存および死滅したウィルスのこの混合物は、驚くほど強いまたは強化された免疫応答を誘導するように思われる。更に、ここでの教示に合わせて、選ばれたウィルスまたはウィルス混合物が、天然に存在する不活化された、または弱毒化含むことができ、または１以上の異物抗原を発現するよに設計することができる。本発明により提供される生存ウィルスを処方する代替方法は、粒子マトリックス内に、ウィルス性レセプターを処方しし、続いて製作の後（すなわちスプレードライの後）の粒子に選ばれたウィルスを結合することを含む。現在良好に定義された多種多様な細胞のウィルス性レセプター、例えば、レトロウィルスレセプター、ＣＣＲ５、ＨＩＶのための細胞のレセプター、ポリオウィルスレセプターとして機能することができるプロラクチンレセプター、ＨＳＶ１と結合するＩｇＧＦｃ領域、およびインフルエンザウィルスと結合するレセプターがある。
【００５７】
選ばれる抗原または抗原の形（ウィルス、ペプチド、遺伝物質、等）に関係なく、当業者は、更に、被験体の効果的な免疫化が、１を越える接種より含むことができると認識するであろう。ここで用いるように、用語「免疫化する」または「免疫化」または関連する用語は、ここで、標的抗原またはエピトープに対して、実質的な免疫応答（抗体またはエフェクターＣＴＬ等の細胞の免疫性からなる）を開始する能力を授けることを言う。これらの用語は、完全な防御免疫がつくられることを必要とせず、むしろ、ベースラインより実質的に大きい防御免疫応答が産生されることを言う。例えば、哺乳類は、標的抗原への細胞のおよび／又は液性の免疫応答が本発明の方法の応用に続いて強化されるならば、標的抗原に対して免疫化されたと考えることができる。Ｂ細胞またはＴ細胞応答の両方の増進を示すアッセイは周知であり、当業者によって簡単に実行することができた。好ましくは、免疫化は、標的抗原を発現している病原体によって引き起こされまたは誘発された（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）疾患への有意な耐性を生じる。
【００５８】
ここで用いるように、用語「接種」は、本開示に従って、関連するエピトープを含む、または関連するエピトープを生成しまたは発現することができる少なくとも１つのワクチンを含む組成物を投与する、または導入することを言う。効果的な免疫応答を単一の接種によって誘導することができるが、被験体の効果的な免疫化は、多数の接種または以降のブースターまたは複数ブースターを含むことができる。従って、所望の免疫予防的な効能を達成するために、本発明の方法は１回、２回、３回、４回または５回の接種さえ含むことができる。更に、上述したように、投与されたワクチンは、粘膜の表面接触するか、および／又はそれにより吸収されることが好ましい。特に好ましい態様において、粘膜表面は、口または鼻のパスまたは空洞、肺の気道に関連する。当業者は、本発明のワクチン組成物（すなわち、粉体またはディスパージョン）が、新生児（０〜６月）、乳児（６月〜２年）、子供（２年〜１３年）または大人（１３年より大）にワクチン接種をするために使用できると更に認識するであろう。
【００５９】
Ｂ（ｉｉ）．免疫グロブリン（受動免疫療法）
【００６０】
本発明の方法および組成物は、局在性および全身性能動免疫を誘導するための有効な手段を与えるが、それらはまた、局在性または全身性の受動免疫の誘導のためにも使用可能である。特に、開示された粉体および微粒子は、感染または疾患に関して迅速予防法または療法を与えるために、免疫グロブリンまたはフラグメントまたはその部分を投与するためにも使用可能である。投与された免疫グロブリン（それはモノクローナル性またはかポリクローナル性であり得る）は、標的病原体上の少なくとも１つの抗原を認識する。好ましくは、認識された抗原または複数の抗原は、１以上の比較的保存されたエピトープを含む。本発明の目的のために、投与された組成物は、中和、治療または予防の抗体またはそれらの組み合わせを含むことができる。特に好ましい態様において、投与された組成物は、モノクローナル抗体または免疫活性なフラグメントの１以上の種を含むであろう。
【００６１】
投与に続いて、活性免疫グロブリンまたは複数の免疫グロブリンは、デリバリーのサイトで機能するか、または体循環に取り込まれる。投与のサイトで保持される抗体は、治療されたサイト（すなわち粘膜の表面）で接触する任意の標的感染症要因（例えば空気伝染性ウィルス）と迅速に結合することができ、以降の感染を防ぐか、または微生物を取り除く。または、本発明の好ましい態様によって与えられる循環する抗体の比較的高いレベルは、血流から標的病原体の迅速なリアランスを許容し、それにより感染に伴う徴候を防ぐか、または少なくとも改善する。もちろん、被験体の寿命の間続くことができる能動免疫と異なり、受動的な免疫化は比較的一過性であり、デリバリーされた免疫グロブリン用量が循環で残る限り続くと認識され。
【００６２】
上述したように、標的病原体上の抗原または複数の抗原を認識する、任意の免疫グロブリンまたはそれらの免疫活性なフラグメントは、所望の免疫を被験体に授けるために使用可能である。特定の病原体および／又は抗原および／又はエピトープに対して、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を与える能力は、当該技術において周知である。実際に投与される抗体の形に関して、天然のおよび設計された抗体の両方ともここでの教示と両立でき、それらは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む異なるクラスの抗体であることが認識される。同様に、Ｆ（ａｂ’）２ 、ＦａｂまたはＦｖを含む任意の免疫活性なフラグメントでもまたは免疫グロブリンのドメインは、所望の防御を与えるために使用できる。設計された抗体に関して、ヒト化された構造物（すなわちキメラ抗体）は、特に好ましい。このような免疫グロブリンは、典型的にはネズミ抗体の抗原結合相補性の決定領域（ＣＤＲｓ）を含むが、分子の残部は、異物と認識されないヒトの抗体配列を含む。例えば、参照することによりここに取り込むジョーンズら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、１９８６を参照。ヒトのポリクローナル性のＩｇＧは典型的には被験体によって異物として認識されないため、まれに投与され、体によって迅速に除去されないならば、これらの抗体は好ましくない副作用をる産生する傾向を有しない。
【００６３】
受動免疫は、容易に伝染される病原体、特に空気または水伝染性のものによる感染のチャンスを防ぎ、または低減することに効果的である。従って、適当な免疫グロブリンを含む本発明の粉体およびディスパージョンは、インフルエンザまたはＲＳウィルス等の呼吸ウィルスおよび病原体に対して特に効果的である。例えば、液体のフルオロカーボン媒体中の免疫グロブリンを担持する（ｌａｄｅｎ）有孔ミクロ構造を含む安定化ディスパージョンは、アトマイザーまたはスプレーボトルを介して鼻道（ｎａｓａｌ ｐａｓｓａｇｅ）に与えることができた。必要に応じて簡単に投与することができた組成物は、コールドウィルス（オルトミクソウィルス、Ｐａｒａｍｙｘｏウィルス、 Ｒｈｉｎｏウィルス）等の標的病原体に関して、局所的および全身の受動免疫を与える。同様に、容易に投与された組成物は、本発明に従って与えられて、コレラ菌等の水伝染性の因子に対して保護を与えることができた。ここで開示された受動免疫は、（これらに制限されないが）狂犬病ウィルス、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ）ウィルス、ＨＩＶおよび破傷風菌を含む種々の生物体に関する、少なくとも若干の保護を与えるために用いることができた。開示された組成物によって受動免疫を付与できる他の感染因子は、当業者によって簡単に確認することができる。
【００６４】
Ｂ（ｉｉｉ）．腫瘍抗原
【００６５】
他の態様において、標的抗原は、腫瘍抗原であることができる。当業者は、腫瘍抗原がしばしば、それから腫瘍が誘導される組織のタイプに制限されるか、または悪性形質転換の過程で変異されるかのいずれかの細胞タンパク質から誘導されるペプチドフラグメントであると認識するであろう。他の腫瘍抗原は、しばしば、腫瘍細胞によって、異常発現されるか、および／又は、転写の誤りから生じている「新生」抗原、腫瘍細胞に特有な突然変異のためのＲＮＡプロセシングである。代わりに、正常なタンパク質の翻訳後の修飾（例えばグリコシル化）における変化は、免疫システムによって正常には認識されない（例えば、ムチンの場合のＭＵＣ１）今まで隠された（陰性の）エピトープを現すのを助長することができる。腫瘍抗原に伴うＢ細胞エピトープは、腫瘍細胞の表面で発現されて、特異的抗体によって認識される。これに対して、Ｔ細胞エピトープは２つのタイプ：腫瘍関連抗原から誘導されるＭＨＣクラスＩ−制限ペプチド類であるＣＴＬエピトープ、および腫瘍抗原から誘導されるＭＨＣクラスＩＩ−制限されたペプチド類であるＴｈエピトープである。Ｔｈエピトープが、大部分は細胞（ＡＰＣ）をＣＤ４＋Ｔ細胞に与える抗原によって現出されるが、ＣＴエピトープは、ＡＰＣ並びに腫瘍細胞によって現出され、腫瘍−特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。例示的な腫瘍抗原は、（これらに制限されないが）癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）抗原）、メラノーマ関連抗原、アルファフェトタンパク質、乳頭腫ウィルス属抗原、エプスタインバー抗原、ＭＵＣ１、ｐ５３、その他を含む。他のいくつかの腫瘍抗原は、報告されるところによると、それら個々の全体を参照することによりここに取り込む、Ｂｏｏｎ ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：７２５〜７２９，１９９６；Ｄｉｓｉｓ．Ｍ．Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６３７〜６４２（１９９６）：ロビンス，Ｐ．Ｆ．ら．Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６２８〜６３６、１９９６；Ｓａｌｇａｌｌｅｒ ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ．、６８１２２〜１３６（１９９８）に記述されたように、自己由来の細胞毒Ｔリンパ球により認識される。
【００６６】
Ｂ（ｉｖ）  免疫調節
【００６７】
自己免疫疾患は、自己反応性（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）のＴおよびＢ細胞、並びに調節性またはエフェクター役割を発揮できる他の免疫性の細胞サブタイプによって媒介される。器官−特異的自己エピトープを認識するＴ細胞が、糖尿タイプＩ、多発性硬化症（ＭＳ）またはリウマチ様関節炎（ＲＡ）等の自己免疫疾患の病因での重要なエレメントであると思われる。体のある位置で現出される抗原を認識するＣＤ４＋、および特定の場合には、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、組織を浸潤させ、種々の細胞タイプの破壊および持続性の炎症の誘発する可能性がある。ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＴＮＦ−およびＬＴ−を産生するＣＤ４＋Ｔｈ１細胞は病原であるとみなされるが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−９を産生するＣＤ４＋Ｔｈ２細胞は、自己免疫と比較して非病原性とみなされ、特定の状況において疾患を抑制することができる。更に、ＴＧＦ−およびＩＬ−１０を分泌するために、抗原への粘膜暴露によって誘導されるＴｈ３細胞は、粘膜誘導の耐性の重大メディエータであると思われる。
【００６８】
自己免疫疾患を防ぐ、または抑制するためのストラテジーとして、自己反応性のＴ細胞は、良好な治療標的を与える。自動免疫病の原因となる病原性の自己反応性のＴ細胞を不活性化（一般に、必ずしも「除去」に限定されない、「耐性」の表示）するいくつかの手段は：（１）高レベルの抗原に長年の暴露を与えることによって、直接に病原性細胞を止めるか、または反応遅延（ａｎｅｇｉｚｅ）させること；（２）非専門のＡＰＣまたはある種の調整因子の文脈でそれらを抗原にさらすことによって、病原性Ｔ細胞の機能を反応遅延、またはスイッチする：および（３）疾患のサイトに移行して、病原性Ｔ細胞の機能を抑制するＴｈ２／Ｔｈ３表現型の抗原−特異的なＴｈ抑制細胞を誘導することがある。
【００６９】
驚くべきことに、耐性が本発明に従って、吸入療法の使用を通じて誘導できることが見出された。免疫耐性誘導の標的場所としての気道の利点は、２倍である：第１に、それは、複雑な抗原を局所的および全身にデリバリーする非侵襲的な経路であり：且つ、第２におよび粘膜の免疫性は、投与された抗原に対するＴｈ２／Ｔｈ３サプレッサを含む可能性がある。このような抗原は、全部の自己抗原（組換え、または精製された）、抗原フラグメント（当該技術で周知である分子生物学または生化学的なテクニックによって得られる）またはエピトープに限られるペプチドであることができる。他の態様において、それらは、ウィルス成分、ファージ、キメラ抗体、融合タンパク質、レプリコン、バクテリアとして取り込まれ、または核酸ベースで、またはウィルス性ベクターを介してデリバリーされる。それらは、体細胞上でのレセプターのための免疫グロブリンまたは任意の天然または合成のリガンド等の自己分子で取り込むことができる。それらは、単離された、個々の成分としてまたは混合物で投与することができる。糖尿タイプＩのための例は、（これらのペプチドおよび抗原に制限されない）：ＧＡＤ６５（グルタミン酸のデカルボキシラーゼ６５、Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０、３４７：１５１）、インシュリン（パーマーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８３、２２２：１３３７）、ＩＣＡ５Ｉ２／ＩＡ−２（膵島細胞抗原５１２；ラビンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、１５２：３１８３）を含む。ＭＳの場合。このようなタンパク質およびペプチドは、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、１９９５、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ．、１：７９；ウォーレンら（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：１１０６１；ＰＬＰ ．トランスアルドラーゼ．２’，３環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＭＯＧおよびＭＡＧ（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｌ．、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ（３７５：７３９）である。自己免疫疾患の他に、本発明の組成物および方法は、アレルギー抗原によって起こる免疫応答を下方調節するためにも使用できると認識される。
【００７０】
Ｂ（ｖ）．活性ペプチドおよびタンパク質
特定のペプチドおよびタンパク質は、異物または自己抗原に対する免疫応答を調整し、上方調整し、または下方調整する能力を有することが知られている。このようなペプチドまたはタンパク質は、ある種のプロセスの活性化または阻害をもたらす内因性レセプターを働かせる（ｅｎｇａｇｉｎｇ）することによって、または内因性エレメントのリガンド−リセプター結合を妨げることによって作用できる。このようなタンパク質またはペプチドの例は、自己免疫の抑止をもたらす免疫調節機能を発揮するサイトカイン：インターフェロン、天然の、または他の分子に結合し、取り込まれ、または複雑なフラグメントの形でのＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−９である。他のサイトカインは、微生物または腫瘍細胞に対して増大された免疫をもたらす免疫活性化剤の働きをすることができる：ＩＬ−１２、ＩＬ−２、インターフェロン、インターフェロン、ＴＮＦ−、ＴＮＦ、リンホトキシンおよびＧＭ−ＭＳＦ。例えば、ＧＣ−ＭＳＦ、ＩＦＮ−ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−αの共投与は、免疫応答および抗原現出を強化することが示された。しかしながら、多くの場合のこのような剤の全身性デリバリーは容認できない副作用をもたらし、およびこれらの多能な因子の標的型デリバリーに向けられた、協奏的エフォートをもたらした。本発明は、有利に、局所的樹状細胞または他のＡＰＣ現出に向けられた粘膜または他のデリバリー（例えば経皮的または皮内的）の目標サイト内での局所的免疫応答刺激を増大させることができるコファクターとの、選ばれた抗原または複数の抗原の共処方を許容する。局所的環境におけるＡＰＣ活性化を容易にし、抗原取り込みおよび現出を強化することによって、本発明のこのような組み合わせ処方は、結果として得られる免疫応答の増大された効率を与えることができた。
【００７１】
本発明に従って使用可能な他の活性タンパク質またはペプチドは、天然の形で、またはリンパ球の漸加（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を増大させ、調整し、または抑制することができる他の分子とのフラグメント、構造物または複合体としてのケモカインを含む。例えば、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）−１、エオタキシン−２、ＴＡＲＣ、ＭＩＰ−３ｂ、ＳＬＣはＴｈ２細胞の漸加を媒介すると考えられるが、ＭＩＧ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−ｌ、ＭＩＰ−１とＲＡＮＴＥＳは、Ｔｈ１細胞の漸加を媒介すると考えられる（Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１８７：８７５）；Ｗａｒｄら（１９９８）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、９：１）。同様に、天然の形での、または他の分子とのフラグメント、組み換え構造物、または複合体としての、サイトカイン、またはケモカインレセプターは、ある種のリンパ球の漸加または活性化を抑制することができる。進行中のＴｈｌ応答を抑制する可能性があるサイトカインおよびケモカインレセプターの例は、ＩＬ−１２レセプター、ＩＦＮ−レセプター、ＩＬ−２レセプター、ＴＮＦ−レセプター、ＣＸＣＲ３またはＣＣＲ５を含む。進行中のＴｈ２応答を抑制する可能性があるサイトカインおよびケモカインレセプターの例は、ＩＬ−４レセプター、ＩＬ−１３レセプター、ＩＬ−９レセプター、ＩＬ−１０レセプター、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４ またはＣＣＲ７である。もちろん、極めて適合性を有する化合物は、サイトカイン、ケモカインまたはそれらのレセプターに限られず、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）およびホーミングレセプターのような他のリガンドまたはレセプター（天然、他の分子とのフラグメント、構造物または複合体の形で）を含むことができると認識される。好ましい態様において、これらの化合物のカテゴリーは、免疫応答を強化し、抑制しまたは調整するために、気道を介して局所的にまたは全身的のいすれでも処方し、投与することができる。
【００７２】
本発明に従う有孔ミクロ構造は、所望により、２つ以上の活性成分の組み合わせを含むことができることが、更に認識される。それらの剤は、有孔ミクロ構造の単一の種であるか、または別個に有孔ミクロ構造の分離した種の組み合わせで与えることができる。例えば、２以上の活性または生物活性剤は、単一の供給原料製剤中に取り込み、スプレードライして、複数の生物活性剤を含む単一のミクロ構造種を与えることができる。逆に、個々の剤を個々のストックに加えて、別個にスプレードライして、異なる組成を有する複数のミクロ構造種を与えることができた。これらの個々の種は、任意の所望の比率で、懸濁媒体または乾燥粉体調剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）コンパートメントに加えて、後述するようにエアロゾルデリバリーシステムに配置することができた。
【００７３】
前述のことに基づいて、多種多様な生物活性剤が開示された粉体中に取り込むことができることは、当業者によって認識されるであろう。したがって、上記の好ましい生物活性剤のリストは、例示的なだけであり、制限的と意図されていない。生物活性剤の適当な量および投与のタイミングが、すでに既存の情報に従っておよび過度の実験なしで製剤について決定することができることが、当業者によって認識されるであろう。
Ｃ．粉体組成物
【００７４】
上記の議論から理解できるように、本発明は、多種多様な生物活性剤をデリバリーするために効果的に使用できる。微粒子が生物活性剤のみによって形成することができるが、それらは好ましくは、選ばれた態様において、吸収促進薬、増強物質、賦形剤または構造成分を含むことができる１以上の追加的な材料を含む。より一般的には、微粒子（すなわち構造的マトリックス）は、任意の取り込まれた活性剤と適合性を有する物理的および化学的特性を有する任意の材料から形成され、またはこれらを含むことができる。多種多様な材料が粉体を形成するために使用可能であるが、特に好ましい製薬の態様において、微粒子はリン脂質またはフッ素化界面活性剤等の界面活性剤と組み合わされ、または含む。必須ではないが、適合性を有する界面活性剤の取込みは、粉体流動性を改善し、エアロゾル効率を増大させ、ディスパージョン安定性を改善し、およびディスパージョンの製剤を容易にすることができる。更に、選ばれた界面活性剤は吸収促進薬としても機能することができ、それにより取り込みを増大させ、選ばれた剤の生物活性を改善することができる。もちろん、本発明の粉体がは、伝統的な非界面活性剤の賦形剤以外の何物でもないもの、および取り込まれた１以上の生物活性剤を用いて、形成することもできると認識されるであろう。
【００７５】
示したように、開示された粉体は所望により、一以上の界面活性剤を伴い、または含むことができる。ここでの教示に従って、これらの化合物は、任意の取り込まれた生物活性を安定化させ、非水性媒体中に懸濁された微粒子の安定化を助長し、または標的サイトで剤の取り込みを強化するために役立つことができる。開示された微粒子と関連するそれらの界面活性剤の他に、微小粒子がディスパージョン媒体液相で処方される場合には、混合できる界面活性剤を所望により組み合わせることができる。本発明を実施するために必須でないが、界面活性剤の使用が、更に、ディスパージョン安定性、粉体流動性を増大させ、手順を単純化し、またはデリバリーの効率を増大できることが、当業者によって認識されるであろう。もちろん、液相における１以上、および有孔ミクロ構造に伴う１以上の使用を含む、界面活性剤の組み合わせは、本発明の範囲内にあると考えられる。「伴う（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、または含む」は、微粒子または有孔ミクロ構造が、界面活性剤を取り込み、吸着し、吸収し、それでコートされ、または界面活性剤によって形成可能であることを意味する。
【００７６】
広義に、本発明における使用に適当な界面活性剤は、有孔微小粒子の形成を助長し、強化された懸濁安定性、改善された粉体分散性、または減少された粒子凝集を与える任意の化合物または組成物を含む。界面活性剤は、単一化合物、または（例えば補助活性剤の場合）化合物の任意の組み合わせをも含むことができる。特に好ましい界面活性剤は、非フッ素化で、飽和および不飽和の脂質、非イオン性洗浄剤、非イオンブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。安定化ディスパージョンを含むそれらの態様において、このような非フッ素化界面活性剤は、好ましくは、懸濁媒体中で比較的不溶解性である。前記の界面活性剤に加えて、適当なフッ素化界面活性剤がここでの教示と両立でき、および所望の製剤を与えるために使用可能であることは、強調すべきである。
【００７７】
天然と合成的源からの脂質（リン脂質を含む）は、特に本発明と両立でき、微粒子または構造的マトリックスを形成するために種々の濃度で際に使用可能である。一般的に適合性を有する脂質は、約４０℃を超えるゲル−液晶相転移を有するものを含む。好ましくは、取り込まれた脂質は、比較的長い鎖（すなわち、Ｃ１６〜Ｃ２２）の飽和脂質であり、より好ましくはリン脂質を含む。開示された安定化製剤で有用な例示的なリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコリン、短鎖ホスファチジルコリン、長鎖飽和ホスファチジルエタノールアミン、長鎖飽和したホスファチジルセリン、長鎖飽和ホスファチジルグリセロール、長鎖飽和ホスファチジルイノシトール、糖脂質、ガングリオシドＧＭｌ、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン；ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸またはポリビニルピロリドン等のポリマー鎖を有する脂質；スルホン化モノ、ジおよび多糖を有する脂質；パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸等の脂肪酸；コレステロール、コレステロールエステルおよびコレステロールは、ヘミスクシネートを含む。
【００７８】
適合性を有する非イオン性洗浄剤は：ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを含むソルビタンエステル；オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル、グリセロールエステルおよびショ糖エステルを含む。他の適当な非イオン性洗浄剤は、その全体を参照することによりここに取り込む、マッカティオン（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ）のエマルション化剤および洗浄剤（ニュージャージー州グレンロックのＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社）を用いて、簡単に確認することができる。好ましいブロックコポリマーは、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ；登録商標）Ｆ−６８）、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７）およびポロキサマー３３８を含む、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのジブロックおよびトリブロックコポリマーを含む。ナトリウムスルホサクシネートおよび脂肪酸石鹸等のイオン性界面活性剤も、利用することができる。好ましい態様において、ミクロ構造はオレイン酸またはそのアルカリ塩を含むことができる。それらの優れた生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）特性のため、リン脂質、およびリン脂質とポロキサマーとの組み合わせは、ここで開示される製薬の態様のために、特に適当である。
【００７９】
上記した界面活性剤に加えて、カチオン性界面活性剤または脂質が、ＲＮＡまたはＤＮＡのデリバリーの場合に特に好ましい。適当なカチオンの脂質の例は：ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＴＡＰ、１，２−ジオレイロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）；およびＤＯＴＢ、１，２−ジオレイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロールを含む。ポリリジンおよびポリアルギニン等のポリカチオン性アミノ酸も、考えられる。
【００８０】
上で列挙された界面活性剤の他に、広範囲にわたる界面活性剤が本発明とともに所望により使用できることは、更に認識される。更に、与えられた応用のために、最適な界面活性剤またはそれらの組み合わせは、過度の実験を必要としない経験的な研究によって、容易に決定できる。更に詳細に以下で議論されるように、微粒子または構造的マトリックスを含む界面活性剤は、有孔ミクロ構造を形成するためのプロセシングの間に使用される前駆体の水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルション（すなわち、スプレードライ供給原料）の形成でも有用であることができる。
【００８１】
先行技術処方と異なり、界面活性剤または生体適合性の壁形成材料（例えばリン脂質）の比較的高いレベルの取込みが、開示された出願の粉体分散性を改善し、懸濁安定性を増大させ、粉体凝集を減少させるために使用可能なことが、驚くべきことに見出された。すなわち、質量対質量（重量対重量）のベースで、有孔ミクロ構造の微粒子または構造的マトリックスが比較的高いレベルの界面活性剤を含むことができる。この点について、微粒子は、好ましくは、約１質量％（重量％）、５質量％（重量％）、１０質量％（重量％）、１５質量％（重量％）、１８質量％（重量％）、または２０質量％（重量％）ｗ／ｗさえ越える界面活性剤を含むであろう。より好ましくは、ミクロ微粒子またはミクロ構造は、約２５質量％（重量％）、３０質量％（重量％）、３５質量％（重量％）、４０質量％（重量％）、４５質量％（重量％）または５０質量％（重量％）ｗ／ｗを超える界面活性剤を含むであろう。例示的な更に他の態様は、界面活性剤または複数の界面活性剤が、約５５質量％（重量％）、６０質量％（重量％）、６５質量％（重量％）、７０質量％（重量％）、７６質量％（重量％）、８０質量％（重量％）。８５質量％（重量％）、９０質量％（重量％）または９５質量％（重量％）ｗ／ｗさえ超えて存在する微粒子を含であろう。選ばれた態様において、粉体は、本質的に界面活性剤（リン脂質等）の１００質量％（重量％）ｗ／ｗを含むであろう。当業者は、このような場合、、微粒子または構造的マトリックスの残部が、（適用可能な場合には）生物活性剤、賦形剤または他の添加剤を含む可能性があることを認識するであろう。
【００８２】
以下で議論されるように、界面活性剤は任意のタイプの微粒子に取り込むことができる。すなわち、前記の界面活性剤レベルは、有孔ミクロ構造で好ましく使用されるが、それらは比較的に非多孔性、または実質的に固体の微粒子を含む粉体または安定化ディスパージョンを与えるために使用可能である。本発明の選ばれた態様が界面活性剤の高レベルに伴う有孔ミクロ構造を含むであろうが、適合性を有する粉体は、等価な界面活性剤濃度の比較的低いポロシティの微粒子を用いて形成することができる。好ましくは、このような微粒子は、約５質量％（重量％）ｗ／ｗを超えるオーダーで、界面活性剤の比較的に高いレベルを含むであろう。この点で、このような態様は、特に本発明の範囲内にあると考えられる。
【００８３】
本発明の他の好ましい態様において、微粒子は所望により合成または天然のポリマーまたはそれらの組み合わせを含む。この点で、有用なポリマーは、ポリ乳酸、ポリ乳酸−コ−グリコリド、シクロデキストリン、ポリアクリレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリアンハイドライド、ポリラクタム、ポリビニルピロリドン、単糖、二糖または多糖（デキストラン、デンプン、キチン、キトサン、その他）、ヒアルロン酸、タンパク質（アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、その他）を含む。微小粒子の製造のために有用であると証明できるポリマー性樹脂の例は：スチレン−ブタジエン、スチレン−イソプレン、スチレン−アクリロニトリル、エチレン−ビニルアセテート、エチレン−アクリレート、エチレン−アクリル酸、エチレン−メチルアクリレート、エチレン−エチルアクリレート、ビニル−メチルメタクリレート、アクリル酸−メチルメタクリレートおよび塩化ビニル−ビニルアセテートを含む。当業者は、適当なポリマーを選ぶことによって、微粒子のデリバリー効率および／又はディスパージョンの安定性が、活性、またはバイオ活性剤の有効性を最適化するために適合して仕立てる（ｔａｉｌｏｒｅｄ）ことができると認識するであろう。
【００８４】
上記したポリマー材料および界面活性剤の他に、構造を与えるため、および好ましい態様において有孔ミクロ構造（すなわちラテックス粒子等のミクロスフェア）を形成するために、微粒子内にまたはそれに加えて、種々の賦形剤を取り込むことができる。この点について、選択的な溶媒抽出等の製造後（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）の技術を用いて、リジッド化成分を除去することができると認識されるであろう。適合性を有する賦形剤は、（これらに制限されないが）単糖、二糖および多糖を含む炭水化物を含むことができる。例えば、デキストロース等（無水物および一水和物）、ガラクトース、マンニトール、Ｄ−マンノース、ソルビトール、ソルボース、その他等の単糖；ラクトース、マルトース、ショ糖、トレハロースその他等の二糖；ラフィノースその他等の三糖；およびデンプン（ヒドロキシエチルデンプン）、シクロデキストリンおよびとマルトデキストリンその他等の炭水化物を含むことができる。アミノ酸も適当な賦形剤であり、グリシンが好ましい。炭水化物およびアミノ酸の混合物は、更に本発明内にあるように維持される。無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、その他）、有機塩（例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、トロメタミン塩酸塩、その他）両方、および緩衝剤の包含も考えられる。炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたはカンファー等の有機固体および塩の包含も、考えられる。
【００８５】
上述した化合物とともに、粒子の剛性、製造収率、デリバリー効率、および沈着、貯蔵寿命および患者受容性を改善するために、他の賦形剤をミクロスフィアに添加することが好ましい。このような任意的な賦形剤は、（これらに制限されないが）：着色剤、味マスキング剤、緩衝剤、吸湿剤、酸化防止剤、および化学安定剤を含む。更に、上述したように、微粒子は、関連する生物活性剤の取り込みを強化し、誘導し、または調整することができる化合物を含むことができる。更に、本発明の微粒子は、抗体、コファクター、レセプター、リガンド、および優先して微粒子に向かう、または標的サイトで細胞に関連する分子に結合するのを許容する基質等のターゲッティング分子を含むことができる。例えば、微粒子は、免疫活性な化合物および粘膜の細胞レセプターをターゲッティングする抗体を含むように形成することができた。このようなターゲッティング分子は、たぶん標的粘膜のサイトで生物活性粒子の濃度を増大させ、および更に任意の局所的な免疫応答を強化するであろう。粘膜または他の標的細胞の表面で、優先して発現されるレセプターに向かうリガンドが、所望のサイトで微粒子の結合を増大させるためにも使用できたと認識されるであろう。
【００８６】
また、好ましい態様は、接触の点での滞留時間を引き伸ばし、または粘膜を通る透過を強化する荷電種を含むことができる、またはそれによりコートされることができる有孔ミクロ構造を含む。例えば、カチオン性電荷が形成されたミクロ微粒子を遺伝物質等の負荷電の生物活性剤と結合させるために使用できるが、アニオン性電荷は粘膜付着に有利なことが知られている。電荷は、ポリアクリル酸、ポリリジン、ポリ乳酸およびキトサン等のポリアニオン性またはポリカチオン性材料の結合または取込みを介して付与することができる。
【００８７】
Ｄ．粉体の形態
【００８８】
当業者は、それらが所望の安定性およびデリバリー特性を与える限り、種々の組成物、コンフィグレーションおよび形態の粉体または微粒子が、本発明に従って使用できると認識するであろう。この点で、いくつかの応用のために（例えばエアガンまたは針無しのインジェクターを介する安定化ディスパージョンの皮内投与のために）、比較的濃い固体粒子または粉体を使用することが有利である可能性があり、他の態様（例えばＤＰＩ投与）においては、比較的多孔性の、空気力学的に軽い有孔ミクロ構造は好ましいであろう。したがって、本発明を以下において好ましい態様に関して述べるが、それは如何なる特定の粒子組成にも、コンフィグレーションにも、または形態にも限られないことが強調されなければならない。むしろ、微粒子特性（電荷、密度、組成物、その他）の選択は、主に投与の形、標的型デリバリーサイト、および生物活性剤の選択に基づく。
【００８９】
ここでの教示に従って、種々の微粒子のコンフィグレーション（微粉化された、およびミリングされた微粒子を含む）を使用することができるが、本発明は、乾燥粒子の間の凝集力を低減するためのユニークな方法および組成物を提供し、それにより改善されたデリバリー効率を生じることできる微粒子凝集を最小にすることができる。従って、選ばれた開示された製剤は、能率的にエアロゾル化し、肺または鼻のパス内に一様にデリバリーされて、深く浸透できる、高度に流動性での乾燥粉体を与える。更に、選ばれた粉体コンフィグレーションおよび形態が、非水性の懸濁媒体と組み合わされた際に、比較的安定デスパージョンを与えることが判明した。いずれにせよ、開示された微粒子は、投与により驚くほど低い喉沈着を生じるように製作することができる。
【００９０】
以前に議論したように、本発明の特に好ましい態様は、構造的マトリックスを含む多孔性または有孔ミクロ構造の形での、粉体または微粒子を取り込む。ここで用いる用語「構造的マトリックス」または「ミクロ構造マトリックス」は同意義であり、所望の特性を与える複数のボイド、アパーチュア、中空、欠陥、ポア、ホール、裂け目、その他を画する有孔ミクロ構造を形成する任意の固体成分を意味するように維持される。選ばれた態様において、構造的マトリックスによって定義される有孔ミクロ構造は、少なくとも１つの界面活性剤を取り込んでいるスプレー乾燥された中空多孔質ミクロスフェアを含む。マトリックス成分を変えることによって、分散安定性またはデリバリー効率を増大させるように、構造的マトリックスの密度は調節することができることが、更に認識される。
【００９１】
微粒子または有孔ミクロ構造の絶対的な形（形態に対して）は、一般に重要（ｃｒｉｔｉｃａｌ）でなく、所望の特性を与えるあらゆる全体的コンフィグレーションが本発明の範囲内と考えられる。したがって、好ましい態様は、ほぼミクロスフィア的な形を含むことができる。しかしながら、潰され、または変形または砕かれた微粒子も、適合性を有する。この警告で、本発明の特に好ましい態様は、スプレー乾燥された中空の、多孔性のミクロスフェアを含むことが更に認識されるであろう。いずれの場合でも、有孔ミクロ構造の開示された粉体が、（これらに制限されないが）懸濁安定性の増大、改善された分散性、優れたサンプリング特性、キャリア粒子の脱離、および強化された空気力学を含むいくつかの利点を与える。
【００９２】
分散性、ディスパージョン安定性、を最大にし、および投与において分配を最適化するために、微粒子または有孔ミクロ構造の平均の幾何粒径は、好ましくは約０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍである。大径粒子（すなわち５０μｍを超える）がディスパージョンから凝集または分離する傾向があり、潜在的にデバイスを詰まらせる可能性があるため、バルブまたは小さいオリフィスが使用される応用においては、大径粒子がむしろ好ましくない可能性があることが認識されるであろう。特に好ましい態様において、有孔ミクロ構造の平均の幾何粒径（または直径）は、２０μｍまたは１０μｍ未満である。より好ましくは、平均の幾何直径は、約７μｍまたは５μｍ未満、より好ましくは約４μｍまたは２．５μｍ未満でさえある。他の好ましい態様は、有孔ミクロ構造の平均の幾何直径が約１μｍと５μｍの間である製剤を含む。特に好ましい態様において、有孔ミクロ構造は、直径で約１〜１０μｍ、または１〜５μｍの乾燥した、中空で、多孔性の粉体であって、約０．１〜約０．５μｍのシェル厚のミクロスフィア的なシェルを含むであろう。ディスパージョンおよび構造的マトリックス成分の微粒子濃度が、選ばれた粒径のデリバリー特性を最適化するために調節することができることが、本発明の特定の利点である。
【００９３】
本明細書を通して言及されるように、ミクロ構造のポロシティは、分散性（例えばＤＰＩで）またはディスパージョン安定性（例えばＭＤｉｓ、ジェットガンまたはネブライザーのために）を確立すす際に有意な役を果たすことができる。この点で有孔ミクロ構造の平均のポロシティは、最近のイイメージング技術が組み合わされる電子顕微鏡法を介して決定することができる。より具体的には、製剤のポロシティ定量するために、有孔ミクロ構造の代表的な試料の電子顕微鏡写真を得て、デジタル的に分析することができる。このような方法論は周知であり、且つ過度の実験をすることなく達成することができる。
【００９４】
本発明の目的なために、微粒子または有孔ミクロ構造の平均のポロシティ（すなわち、内部および／又は中央のボイドに開いている粒子表面積のパーセンテージ）は、約０．５％〜約８０％の範囲にあることができる。より好ましい態様において、平均ポロシティは、約２％〜約４０％の範囲にある。選ばれた製造パラメータに基づいて、平均のポロシティは、ミクロ構造の表面積の約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％より大きくてもよい。他の態様において、ミクロ構造の平均のポロシティは、約４０％、５０％、６０％、７０％または６０％さえ超えることができる。孔自体について、それらは平均孔サイズで典型的には約５ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲にあり、好ましくは、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲にある。特に好ましい態様において、平均の孔サイズは、約５０ｎｍ〜約１００までｎｍの範囲にある。更に詳細に以下で議論されるように、孔サイズおよびポロシティが、取り込まれた成分および産生パラメータの慎重な選択によって、厳密に制御できることが本発明の重要な利点である。
【００９５】
この点について、微粒子または有孔ミクロ構造の粒子形態および／又は中空設計は、ここで開示された乾燥粉体処方の分散性または凝集性に対して重要な役割を演ずる。すなわち、典型的には乾燥粒子の間に存在するファンデルワールス、静電的引力および液体のブリッジング力を低下させることにより、微細な粉体の固有の結合力特性が克服できることが、驚くべきことに発見された。より具体的には、ここでの教示に従って、改善された粉体分散性は、粒子形態および密度、並びに湿度および電荷の対照を設計することによって与えることができる。そのために、本発明の好ましい態様は、孔、ボイド、中空、欠陥または粒子の間で表面接触面積を低減する他の間隙スペースを有する有孔ミクロ構造を含み、それにより粒子間力を最小にするようにしている。加えて、ここでの教示に従うリン脂質およびフッ素化発泡剤等の界面活性剤の使用が、電荷および静電力の強度、並びに含水量を和らげることによって、粉体の流れ性質の改良に寄与することができる。
【００９６】
大部分の細粉（例えば＜５μｍ）は、粉体をデリバリーし、エアロゾル化し、および／又はパックしようとするとき、問題を含むことがありえる貧弱な分散性を示す。粒子相互作用を対照する主要な力は、典型的には、長距離および短距離力に分割することができる。長距離力は重力的引力および静電力を含み、他方、相互作用は分離距離または粒径の二乗として変化する。乾燥粉体のための重要な短距離力は、ファンデルワールス相互作用、水素結合および液体ブリッジを含む。後者の２つの短距離力は、粒子の間での接触が既にある場合に起こるという点で、他のものと異なる。ここで記述している有孔ミクロ構造の使用により、これらの引力を実質的に減殺し、または低減できることは、本発明の主要な利点である。
【００９７】
当業者は、ファンデルワールス（ＶＤＷ）引力が短い範囲で起こって、且つ、少なくとも部分的に、相互に作用している粒子間の表面接触に依存すると認識するであろう。２つの粒子がお互いに接近するとき、ＶＤＷ力は接触面積の増大でとともに増大する。２つの乾燥の粒子に対して、ＶＤＷ相互作用力の大きさ、Ｆ０ＶＤＷは以下の式を用いて計算することができる：
【数１】
2003535017.tif 000001
（式中、ｈはプランク定数であり、ωは角周波数であり、ｄ０は、付着力が最大である距離であり、およびｒ１およびｒ２ は、２つの相互作用している粒子の半径である）。したがって、乾燥粉体のためのＶＤＷ力の大きさおよび強度を最小にするｍたの一つの方法は、接触の粒子間面積を減少させることであると認識されるであろう。ｄ０の大きさが、接触のこの面積の反映であることは、重要である。２つの対向している物体間の接触の最小の面積は、粒子は完全な球である場合に起こるであろう。加えて、粒子が非常に多孔性であるならば、接触の面積は更に最小にされるであろう。したがって、本発明の有孔ミクロ構造は、粒子間接触、および対応するＶＤＷ力を低減するように作用する。ＶＤＷ力でのこの低減が主に、幾何粒径の増大よりむしろ本発明の粉体のユニークな粒子形態の結果であることに注目することは、重要である。この点について、本発明の特に好ましい態様が比較的低いＶＤＷ引力を示す平均または小さい微粒子（例えば平均の幾何直径＜１０μｍ）を有する粉体を与えることが認識される。
【００９８】
更に、上記に示されたように、粒子のどちらか、または両方ともが電気的にチャージされた場合に、粉体に影響を及ぼす静電力が起こる。この現象は、電荷の類似性または非類似性に依存して、粒子間の引力または反発で起こるであろう。最も単純な場合、電荷はクーロンの法則を用いて記述することができる。粒子間の静電力を調整し、または減少させる一つの方法は、粒子のどちらか、または両方が非電導性表面を有するかどうかである。従って、有孔ミクロ構造粉体が、比較的に非電導性である賦形剤、界面活性剤または活性剤を含むならば、粒子で発生する任意の電荷でも不規則に表面に分布される。その結果、高い電荷の保持が材料の比抵抗によって書き取る時から、非電導性成分を含む粉体の電荷半減期は比較的短い。抵抗性のまたは非導電性の成分は、効率的な電子供与体または受容体のどちらとしても機能しない材料である。
【００９９】
参照することによりここに取り込むＤｅｒｊａｇｕｉｎら（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｖ．Ｍ．、Ｙｕｓｈｃｈｅｎｋｏ、ＶＳ．、およびＤｅｒｊａｇｕｉｎ、Ｂ．Ｖ．、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、１９８０、７７、１１５〜１１９）は、電子を受容し、または供与するそれらの機能のための分子群をランクするリスト与える。この点について、例示的な群は、次のようにランクを付けることができる：
【０１００】
供与体：−ＮＨ２＞−ＯＨ＞−ＯＲ＞ＣＯＯＲ＞−ＣＨ３＞−Ｃ６Ｈ５＞−ハロゲン＞−ＣＯＯＨ＞−ＣＯ＞−ＣＮ受容体：
【０１０１】
本発明は、比較的非伝導性の材料の使用により、開示された粉体で静電効果の低減を与える。上記のランキングを用いて、好ましい非伝導性の材料は、ハロゲン化されたおよび／又は水素化された成分を含む。それらが粒子荷電への抵抗性を有するため、リン脂質およびフッ素化発泡剤等の材料（それは、スプレードライした粉体で、ある程度まで保持できる）は好ましい。粒子中の残留発泡剤（例えばフルオロケミカル）は、比較的低いレベルであっても、典型的にはスプレードライおよびサイクロン分離の間に付与されるため、微粒子または有孔ミクロ構造の荷電を最小化するのを助長すると認識されるであろう。一般的な静電原理およびここでの教示に基づき、当業者は、過度の実験なしで開示された粉体の静電カを低減するために役立つ追加的な材料を確認することができるであろう。この点について、非常にチャージされた剤は、単純なｐＨ調整または反対にチャージされた化合物（例えばカチオン性脂質と結合した核酸）とのキレート化により、静電的的に修正することができる。更に、必要であるならば、通電および荷電技術を用いて、静電力を操作して、最小にすることもできる。
【０１０２】
上述した驚くべき利点に加え、本発明は更に、水素および液体結合の減衰または低減を与える。当業者に公知のように、水素結合、および液体ブリッジングの両方は、粉体によって吸収された水分から生ずる。一般に、より高い湿度は、親水性の表面に対して、より高い粒子間力を生ずる。これは、ラクトース等の比較的に親水性の化合物を使用する傾向がある、吸入療法のための先行技術処方における本質的な問題である。しかしながら、ここでの教示に従って、吸着水による付着力は、接触表面の疎水性を増大させることによって調整または低減することができる。当業者は、粒子疎水性における増加が、賦形剤の選択および／又は流動床を用いて使用されるもの等の、製造後のスプレードライコーティング技術の使用により達成することができると認識できる。従って、好ましい賦形剤は、リン脂質、脂肪酸石鹸およびコレステロール等の疎水性界面活性剤を含む。ここでの教示の点から、当業者が過度の実験なしで同様の望ましい性質を示す材料を同定できるであろうことが言える。
【０１０３】
それらが乾燥粉体または非水性の懸濁媒体との組み合わせのいずれとして使われるにせよ、微粒子または有孔ミクロ構造は「乾燥」状態で好ましく与えられるであろう。すなわち、微小粒子は、外界温度での貯蔵の間に粉体を化学的および物理的に安定したままとさせ、且つ簡単に分散可能であるままとさせる含水量を有するであろう。従って、微小粒子の含水量は、典型的には６質量％（重量％）未満であり、好ましくは３質量％（重量％）未満である。いくつかの例において、含水量は１質量％（重量％）程度に低い。もちろん、含水量は、少なくとも部分的には、処方によって規定され、使用されるプロセス条件、例えば、入口温度、フィード濃度、ポンプ速度、発泡剤タイプ、濃度およびポスト乾燥によって対照されると認識されるであろう。
【０１０４】
当業者によって知られているように、安息角または剪断力等の方法は、乾燥粉体の流れ性質を評価するために使用可能である。安息角は、フラットな表面上に粉体の円錐を注いだ際に、形成される角度として定義される。４５°〜２０°の範囲にある安息角を有する粉体が好ましく、適当な粉体流れを示す。より具体的には、３３°〜２０°の間の安息角を有する粉体は、比較的低い剪断力で流動し、吸入療法（例えばＤＰＩｓ）に用いられる製剤処方のにおいて特に有用である。剪断インデックスは、測定するために安息角より時間がかかるが、より信頼性があり、決定が容易であると考えられる。当業者は、ＡｍｉｄｏｎおよびＨｏｕｇｈｔｏｎによって概説された実験的手順（参照することによりここに取り込む、Ｇ．Ｅ．Ａｍｉｄｏｎ およびＭ．Ｅ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｐｈａｒｍ． Ｍａｎｕｆ．、２、２０、１９８５）が、本発明の目的のための剪断インデックスを評価するために使用可能であると認識するであろう。これも参照することによりここに取り込むＳ． ＫｏｃｏｖａおよびＮ． Ｐｉｐｅｌ、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、 ８、３３〜３５、１９７３に記述されているように、剪断インデックスは降伏ストレス、内部摩擦の有効角、引張強さ、および比凝集力等の粉体パラメータから評価される。本発明において、約０．９８未満の剪断インデックスを有する粉体が好ましい。より好ましくは、開示された組成物、方法およびシステムで用いられる粉体は、約１．１未満の剪断力インデックスを有するであろう。特に好ましい態様において、剪断インデックスは、約１．３未満、または約１．５未満でさえあろう。もちろん、異なる剪断力インデックスを有する粉体は、重要なサイトにおける活性または生物活性剤の効果的な沈着の結果で、使用可能である。
【０１０５】
粉体の流れ性質が、バルク密度測定と良好に相関することが示されたも、認識されるであろう。この点については従来の先行技術の考察（Ｃ．Ｆ．ハーウッド、Ｊ．Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、 ６０、１６１〜１６３，１９７１）は、バルク密度の増大が、材料の剪断インデックスによって予測されるように、改善された流れ性質と相関すると考えた。逆に、本発明の有孔ミクロ構造のために、比較的低いバルク密度を有する粉体により優れた流れ性質が示されたことが、驚くべきことに判明した。すなわち、本発明の中空の多孔性の粉体は、実質的に孔が全くない粉体に対して、優れた流れ性質を示した。このため、特に良い流れ性質を示す０．５ｇ／ｃｍ３ 未満のバルク密度を有する粉体を提供可能であることが判明した。より驚くべきことに、優れた流れ性質を示す０．３ｇ／ｃｍ３ 未満、約０．１ｇ／ｃｍ３未満、更には０．０５ｇ／ｃｍ３未満の桁のバルク密度を有する有孔ミクロ構造粉体が提供可能であることが判明した。優れた流動性を有する低いバルク密度粉体を製造する能力は、本発明の新規且つ予想外の性質を更に引き立たせる。
【０１０６】
これらの低いバルク密度は、ＤＰＩｓとともに開示された粉体を用いるとき、特に有利である。具体的には、異常に低いバルク密度を有する粉体を与えることによって、本発明は、乾燥粉体吸入器具のために商業的に実行可能な最小の充填重量の低減を与える。すなわち、ＤＰＩｓのために最も多くの設計されるユニット用量容器は、固定された体積または重力技術を用いて満たされる。多くの先行技術とは逆に、本発明は、生物活性剤およびインシピエントまたはバルキング剤が吸入された粒子全体を構成する（ｍａｋｅ−ｕｐ）粉体を与える。非常に低いバルク密度を有する粒子を与えることによって、ユニット用量容器に満たすことができる最小限の粉体質量は低減され、それはキャリア粒子の必要性を除去する。すなわち、本発明の粒子の比較的低い密度は、キャリア粒子の使用なしで、比較的低用量の薬剤化合物の再現性ある投与を与える。更に、キャリア粒子の除去は、先行技術の大きいラクトース粒子がそれらのサイズのために喉および上部気道に衝撃を与える傾向があるため、喉沈着および任意の「ギャグ」効果を最小化するように作用する。
【０１０７】
有孔ミクロ構造粉体によって与えられる低減された引力（例えば、ファンデルワールス、静電、水素と液体ブリッジング、その他）および優れた流動性は、吸入療法（例えば、ＤＰＩｓ、ＭＤＩｓ、ネブライザー等の吸入器具における）のための製剤における、それら特に有用とすると認識されるであろう。優れた流動性とともに、ミクロ構造の有孔、多孔性のおよび／又は中空設計も、放出された際の粉体の結果として生じるエアロゾル性質において重要な役割を演ずる。この現象は、ＭＤＩまたはネブライザーの場合、またはＤＰＩの場合のように乾燥形での有孔ミクロ構造のデリバリーにおいて、ディスパージョンとしてエアロゾル化された微粒子または有孔ミクロ構造のためにも有効である。この点で、分散された微小粒子の有孔構造および比較的に高い表面積は、匹敵するサイズの非有孔粒子より容易に、より長い距離で吸入の間にガスの流れに沿って、それらが運ばれることを可能にする。
【０１０８】
より具体的には、それらの高いポロシティのため、粒子の密度は実質的に１．０ｇ／ｃｍ３未満、典型的には０．５ｇ／ｃｍ３未満、よりしばしば０．１ｇ／ｃｍ３の桁、および０．０１ｇ／ｃｍ３程度に低い。幾何粒径と異なり、有孔ミクロ構造の空気力学的粒径、ｄａｅｒ は、実質的に粒子密度、ρ：ｄａｅｒ＝ｄｇｅｏρ（式中、ｄｇｅｏは幾何直径である）に依存する。０．１ｇ／ｃｍ３の粒子密度に対して、ｄａｅｒは約３倍ｄｇｅｏより小さくなり、肺の周辺（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）領域への増大された粒子沈着、および対応して喉におけるより少ない沈着をもたらす。この点について、有孔ミクロ構造の平均の空気力学的な直径は、好ましくは約５μｍ未満、より好ましくは約３μｍ未満、特に好ましい態様においては、約２μｍ未満である。このような粒子分布は、ＤＰＩ、ＭＯまたはネブライザーを用いて投与されるか否かに関係なく、生物活性剤の深い肺沈着を増大させように作用する。
【０１０９】
以降の例で示されるように、本発明のエアロゾル処方の粒径分布は、カスケードインパクション等の従来の技術によって、または飛行時間分析法によって、測定可能である。加えて、参照することによりここに取り込む提案された米国薬局方の方法（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｐｒｅｖｉｅｗｓ、２２（１９９６）３０６５）に従って、吸入器具から放出された用量は決定された。これらおよび関連する技術は、肺に効率的に沈着する可能性があるそれらの微粒子に対応するエアロゾルの「微粒子分率」が計算されることを可能にする。ここで用いるように、語「微粒子分率」は、ＤＰＩ、ＭＤＩまたはネブライザーのマウスピースから、８段のアンデルセンカスケードインパクターのプレート２−７の上へ、作動につきデリバリーされる活性薬物の総量のパーセンテージを言う。このような測定に基づき、本発明の処方は、好ましくは有孔ミクロ構造の重量に基づき約２０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）以上の微粒子分率を有するであろうし、より好ましくは、それらは約２５質量％（重量％）〜９０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）、更に好ましくは約３０〜８０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）の微粒子分率を示すであろう。本発明の選ばれた態様において、約３０質量％（重量％）、４０質量％（重量％）、５０質量％（重量％）、６０質量％（重量％）、７０質量％（重量％）、８０質量％（重量％）または９０質量％（重量％）さえ超える微粒子分率を好ましくは含む。
【０１１０】
更に、本発明の処方が先行技術製剤と比較した際に、誘導ポート上で、およびインパクターのプレート０および１上で、比較的低い沈着割合を示すことも見出された。これらのコンポーネントへの沈着は、ヒトにおける喉での沈着とリンクする。より具体的には、最も商業的に入手可能なＭＤＩｓおよびＤＰＩｓは、全用量の約４０〜７０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）の喉沈着をシミュレーションした一方で、本発明の処方は、典型的には約２０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）未満を沈着させる。したがって、本発明の好ましい態様は、約４０質量％（重量％）、３５質量％（重量％）、３０質量％（重量％）、２５質量％（重量％）、２０質量％（重量％）、１５質量％（重量％）または１０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）未満の喉沈着さえシミュレーションした。当業者は、本発明によって与えられる喉沈着における有意な減少が、喉刺激作用等の関連する局所的副作用における対応する減少を生じることを認識するであろう。
【０１１１】
本発明により与えられる有利な沈着プロフィルに関して、ＭＤＩ推進剤が、典型的には喉の後方の方向へ、器具から懸濁粒子を高速度で押し出すことは周知である。先行技術の処方が、典型的には大径粒子および／又は凝集体の有意なパーセンテージを含むため、放出された用量の２／３程度に多い量以上が喉に衝撃を与える可能性がある。更に、従来の粉体製剤の好ましくないデリバリープロフィルはまた、ＤＰＩ器具で生ずるような、低い粒子速度の条件下で示される。一般的に、凝集し易い固体の、濃い微粒子をエアロゾル化する際に、この問題は固有である。それでも、上述したように、本発明の安定化ディスパージョンの新規且つ予想外の性質は、ＤＰＩ、ＭＤＩアトマイザーまたはネブライザー等の吸入器具からの投与に際して、驚くほど低い喉沈着しか生じない。
【０１１２】
如何なる特定の理論によっても束縛されることを欲っしないが、本発明によって与えられる低減された喉沈着は、粒子凝集における減少から、および取り込まれたミクロ構造の中空のおよび／又は多孔質形態から生ずるように思われる。すなわち、分散されたミクロ構造の中空および多孔質の性質は、中空／多孔質ウィフル（ｗｈｉｆｆｌｅ）ボールがベースボールより迅速に減速するように、推進剤流れ（またはＤＰＩｓの場合ガス流れ）中の粒子の速度を遅くする。従って、喉の後部に衝撃を与え、付着するよりはむしろ、比較的遅く移動する粒子は、患者により吸入され易い。更に、粒子の非常に多孔性の性質は、有孔ミクロ構造内の推進剤を迅速に去らせ、喉に衝撃を与える前に粒子密度を低下させる。したがって、投与された生物活性剤の実質的により高いパーセンテージが、それが能率的に吸収可能な肺の気道に沈着される。
【０１１３】
Ｅ．粉体形成
【０１１４】
上記の節から理解されるように、本発明のミクロ微粒子には、種々の成分を結合させ、または取り込むことができる。同様に、いくつかの技術は、所望の形態（例えば有孔または中空／多孔質コンフィグレーション）、分散性および密度を有する微粒子を与えるために使用可能である。他の方法の中で、本発明と適合性を有する微粒子は、スプレードライ、減圧乾燥、溶媒抽出、エマルション化、凍結乾燥、およびそれらの組み合わせを含む技術によって形成することができる。これらの技術の多くの基本的な概念が当該技術で周知であり、ここでの教示の点から、所望の粒子コンフィグレーションおよび／又は密度を与えるように、それらを適合させるために過度の実験を必要としないことが、更に認識されるであろう。
【０１１５】
いくつかの手順が一般的に本発明と適合性を有するが、特に好ましい態様は、典型的には、スプレードライによって形成された微粒子または有孔ミクロ構造を含む。周知であるように、スプレードライは液体のフィードを乾燥した微粒子の形に変換する一段階過程である。薬剤応用に関して、吸入を含む種々の投与経路のための粉体物質を与えるために、スプレードライが使われてきたと認識されるであろう。例えば、参照することによりここに取り込む吸入エアロゾルズ：「治療の物理学的および生物学的基礎」、Ａ． Ｊ． Ｈｉｃｌｅｙ編集、マーセルデッカー社、ニューヨーク、１９９６におけるＭ． Ｍ． ＳａｃｈｅｔｔｉおよびＭ ．Ｍ． Ｖａｎ Ｏｏｒｔを参照。
【０１１６】
一般的に、スプレードライは、高度に分散された液体と、液滴の蒸発および乾燥を与えるための充分な体積の熱い空気とをまとめることから成る。スプレードライまたはフィード（または供給原料）となるための製剤は、任意の水性溶液、経過ディスパージョン、スラリー、コロイドディスパージョンまたは選ばれたスプレードライ装置を用いてアトマイズできるペーストでありえる。好ましい態様において、供給原料は、エマルション、逆エマルション、ミクロエマルション、複エマルション、微粒子ディスパージョンまたはスラリー等のコロイド系を含む。典型的には、フィードは、溶媒を蒸発させて、乾燥した生成物をコレクターに運ぶ暖かい濾過された空気の流れにスプレーされる。費やされる空気は、次いで溶媒とともに排気される。当業者は、所望の生成物を与えるために、装置のいくつかの異なるタイプが使用できると認識するであろう。例えば、Ｂｕｃｈｉ社またはＮｉｒｏ社によって製造される商用のスプレードライ装置、所望のサイズ、形態および密度の粒子を効果的に製造するであろう。
【０１１７】
これらのスプレードライ装置、および特にそれらのアトマイザーは、専門化された応用、すなわち重複ノズル技術を用いる２つの溶液の同時のスプレー）のために改造、またはカスタマイズすることができることが、更に認識されるであろう。より具体的には、Ｗ／Ｏ型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）エマルションは、１つノズルからアトマイズすることができ、およびマンニトール等の反被着剤を含む溶液は第二ノズルから共アトマイズすることができる。他の場合において、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ポンプを用いるカスタム設計のノズルを通してフィード溶液を押し出すことは、好ましいであろう。所望の形態および／又は組成物を含むミクロ構造が製造されるならば、装置の選択は重要でなくて、ここでの教示を考慮して容易に当業者にとって明らかであろう。
【０１１８】
結果として生じるスプレードライされた粉体は典型的には、ほぼ球状の形、大きさにおいてほぼ均一、およびしばしば中空であるが、取り込まれる薬物およびスプレードライ条件に依存して、形状におけるいくらかの程度の不規則はあり得る。多くの例において、ディスパージョン安定性、および微粒子または有孔ミクロ構造の分散性は、膨張剤（または発泡剤）それらの製造で使用されるならば改善されるように思われる。特に好ましい態様は、分散または連続相として膨張剤を有するエマルションを含むことができる。膨張剤は、好ましくは、例えば商業的に入手可能なミクロ流動化装置を約３４，４７４ｋＰａ〜１０３，２４１ｋＰａ（５，０００〜１５，０００ｐｓｉ）の圧力で用いて、界面活性剤とともに分散される。これはプロセスは、エマルション、好ましくは取り込まれた界面活性剤によって安定され、典型的には水性連続相中に分散された水非混和性の膨張剤のサブミクロン液滴を含むもの、を形成する。これおよび他の技術を用いるこのようなエマルションの形成は、当該技術においてありふれており、且つ当業者に周知である。発泡剤は、好ましくは、スプレードライ過程で蒸発して、選ばれた態様においては、比較的に中空の、多孔性の空気力学的に軽いミクロスフィアを後に残すフッ素化合物（例えば、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデカリン、パーフルオロブチルエタン）である。以下で更に詳細に議論されるように、他の適当な液体の発泡剤は、非フッ素化油、クロロホルム、フレオン、エチルアセテート、アルコールおよび炭化水素を含む。窒素および二酸化炭素も、適当な発泡剤として考えられる。
【０１１９】
上述した化合物の他に、製造後のステップでの昇華により減圧下で除去できる無機および有機物質も、本発明と適合性を有する。これらの昇華性化合物は、スプレードライフィード溶液中にミクロ化された結晶として溶解または分散可能であり、炭酸アンモニウムおよびカンファーを含むことができる。本発明と適合性を有する他の化合物は、フィード溶液中に分散でき、またはその場で（ｉｎ−ｓｉｔｕ）製造できるリジッド化性の固体構造を含む。これらの構造は、次いで、製造後の溶媒抽出ステップを用いて、初期の粒子生成後に抽出される。例えば、ラテックス粒子は分散でき、その後他の壁形成性化合物とともに乾燥され、次いで適当な溶媒で抽出される。
【０１２０】
微粒子は好ましくは上記しれた発泡剤を用いて製造されるが、いくつかの例において、追加的な発泡剤は必須でなく、薬剤および／又は賦形剤および１以上の界面活性剤の水性分散液は、直接スプレードライされると認識されるであろう。このような場合に、その処方は中空の、比較的多孔性の微小粒子の形成をもたらすことができるプロセス条件（例えば、高温）に従うことができる。更に、薬物は、このような技術における使用に特に適当とするような特別な物理化学的性質（例えば高い結晶化度、高い溶融温度、界面活性、その他）を有することができる。
【０１２１】
発泡剤が使用されるとき、得られる微粒子のポロシティおよび分散性の程度は、少なくとも部分的には、発泡剤の性質、供給原料（例えば、エマルションとして）でのその濃度、およびスプレードライ条件に依存するように思われる。ポロシティ、およびディスパージョンにおける分散性を制御することに関して、従来は発泡剤として好ましくないとされていた化合物の使用が、特に好ましい特性を有する有孔ミクロ構造を与えることができることが、驚くべきことに見出された。より具体的には、本発明のこの新規で、予想外の面において、比較的高い沸点（すなわち約４０℃を超える）を有するフッ素化合物の使用が、特に多孔質である微粒子を製造するために使用可能なことが見出された。このような有孔ミクロ構造は、特に吸入療法に適している。この点について、約４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃または９５℃さえ超える沸点を有するフッ素化または部分的フッ素化発泡剤を用いることができる。特に好ましい発泡剤は、水の沸点、すなわち、１００℃を越える沸点を有する（例えばパーフルブロン（ｐｅｒｆｌｕｂｒｏｎ）、パーフルオロデカリン）。加えて、それらが０．３μｍ未満の平均の重みつけ（ｍｅａｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）粒径を有する安定なエマルションディディスパージョンの製造を容易にするため、比較的に低水溶性（＜１０−６Ｍ）を有する発泡剤が好ましい。
【０１２２】
以前に記述されたように、これらの発泡剤は、好ましくは、スプレードライの前に、エマルション化された供給原料内に取り込まれる。本発明の目的のために、この供給原料がまた、好ましくは１以上の生物活性剤、１以上の界面活性剤または１以上の賦形剤をも含むであろう。もちろん、上述したされた成分の組み合わせも、本発明の範囲内にある。高沸点（＞１００℃）フッ素化発泡剤が本発明の１つの好ましい面を含むが、同様の沸点（＞１００℃）を有する非フッ素化発泡剤も、適合性を有する微粒子を与えるために使用可能であると認識されるであろう。本発明における使用に適当な例示的な非フッ素化発泡剤は、式：
【０１２３】
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２またはＲ１−Ｘ
（式中、Ｒ１またはＲ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族、環式またはそれらの組み合わせであり、Ｘは炭素、イオウ、窒素、ハロゲン、リン、酸素、およびそれらの組み合わせ我を含む任意の基である）
を含む。
【０１２４】
如何なる形であれ本発明を制限しないが、水性フィード成分がスプレードライの間に蒸発するため、それが粒子表面で薄い外被を残すと仮定される。スプレーの初期の瞬間に形成される、得られた粒子壁または外被は、何百ものエマルション液滴（約２００〜３００ｎｍ）として、任意の高沸点発泡剤をトラップするように思われる。乾燥過程が続くに従い、微粒子の増大の内側の圧力は増大して、それにより取り込まれた発泡剤の少なくとも一部を蒸発させ、および比較的薄い外皮を介してそれを押し出す。これのベント、またはガス抜きは、見かけ上（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ）ミクロ構造における孔または他の欠陥の形成をもたらす。同時に、残っている微粒子の成分（おそらく、いくらかの発泡剤を含む）、粒子が固化するにつれて、内部から表面に移行する。この移行は、増大された内部粘性に起因する物質移動に、増大された抵抗性の結果、乾燥過程の間に、見かけ上遅くなる。一旦移行が生ずるならば、粒子が固化して、ボイド、孔、欠陥、中空、スペース、アパーチュア、パーフォレーション、またはホールを残す。孔または欠陥の数、それらのサイズ、および得られる壁厚さは、選ばれた発泡剤の処方および／又は性質（例えば沸点）、エマルション中のその濃度、全固体物濃度、およびスプレードライ条件に主に依存する。明細書を通して言及するように、この好ましい粒子形態が、少なくとも部分的には、改善された粉体分散性、懸濁安定性および空気力学に寄与するように思われる。
【０１２５】
これらの比較的高沸点の発泡剤の実質的な量が、結果として生じるスプレードライ生成物中で保持できることが、驚くべきことに判明した。すなわち、ここで記述されたスプレードライ微粒子は、残留発泡剤の１質量％（重量％）、３質量％（重量％）、５質量％（重量％）、１０質量％（重量％）、２０質量％（重量％）、３０質量％（重量％）または４０質量％（重量％）（ｗ／ｗ）の程度に多く含むことができる。このような場合に、この保持された発泡剤によって生ずる増大された粒子密度の結果、より高い製造収率が得られた。保持されたフッ素化発泡剤が、微粒子の表面特性を変え、それによりプロセシングの間の粒子凝集を最小にし、ディディスパージョン安定性を更に増大できることが、当業者によって認識されるであろう。粉体中の残留フッ素化発泡剤は、また、バリヤーを与えることによって、または製造の間に引力（例えば静電力）を低減することによって、粒子間の凝集力を低減することもできる。乾燥粉体吸入器とともに開示されたミクロ構造を用いるとき、この凝集力における低減は、乾燥粒子吸入器との組み合わせで開示されたミクロ構造を使用する際に、特に有利であることができる。
【０１２６】
更に、残留発泡剤の量は、プロセス条件（例えば出口温度）、発泡剤濃度または沸点により対照できる。出口温度が沸点またはより高いならば、発泡剤は粒子を逃れ、および製造収率は減少する。好ましい出口温度は、発泡剤沸点より、一般に２０、３０、４０、５０、６０、１０、８０、９０または１００℃低く操作されるであろう。より好ましくは、出口温度と沸点の間の温度差は、５０〜１５０℃の範囲にある。粒子ポロシティ、製造収率、静電性および分散性は、第一に、選ばれた活性剤および／又は賦形剤に適しているプロセス条件（例えば出口温度）の範囲を確認することによって最適化することができると、当業者によって認識されるであろう。好ましい発泡剤は、温度差が少なくとも２０℃で１５０℃までであるように、最高の出口温度を用いて選ぶことができる。いくつかの場合で、例えば、超臨界条件下で、または凍結乾燥技術を用いて微粒子を製造する際等に、温度差は、この範囲外側にある可能性がある。当業者は、発泡剤の好ましい濃度は、ここでの例で記述されるそれらと同様の技術を用いて、過度の実験なしで決定できることを更に認識するであろう。
【０１２７】
残留発泡剤が選ばれた態様において有利であり得るが、スプレードライした生成物から任意の発泡剤を実質的に除去することは、好ましいであろう。この点で、残留発泡剤は、減圧オーブン中で製造後の蒸発ステップで容易に除去することができる。更に、このような製造後の技術は、微粒子で有孔を与えるためにも使用することができる。例えば、孔は、生物活性剤と、減圧下で形成された微粒子から除去可能な賦形剤とをスプレードライすることによって形成することができる。
【０１２８】
いずれにせよ、供給原料での発泡剤の例示的な濃度は、２％〜５０％（ｖ／ｖ）の間、より好ましくは約１０％〜４５％（ｖ／ｖ）の間である。他の態様において、発泡剤濃度は好ましくは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％（ｖ／ｖ）さえ越えることが好ましいであろう。それでも、他の供給原料エマルションは、３５％、４０％、４５％または５０％（ｖ／ｖ）の選ばれた化合物さえ含むことができる。
【０１２９】
好ましい態様において、フィードで用いられる発泡剤の濃度を確認する他の方法は、前駆体またはフィードエマルション中の発泡剤の濃度と、安定化界面活性剤（例えば、ホスファチジルコリンまたはＰＣ）のそれとの比として、それを与えることである。フルオロカーボン発泡剤（例えばパーフルオロオクチルブロミド）のために、および説明の目的のために、この比は、ＰＦＣ／ＰＣ比と呼ばれた。より一般的には、適合性を有する発泡剤および／又は界面活性剤が本発明の範囲の外にあることなく、例示的な化合物の代用にすることができると認識されるであろう。いずれにせよ、典型的なＰＦＣ／ＰＣ比は、約１〜約６０、より好ましくは、約１０〜約５０の範囲にある。好ましい態様のために、その比は一般に約５、１０、２０、２５、３０、４０または５０さえ超えるであろう。より高いＰＦＣ／ＰＣ比の使用は、一般に、より中空で多孔性の性質の構造を与えると認識すべきである。より具体的には、約４．８を超えるＰＦＣ／ＰＣ比を使用する方法は、ここで開示された乾燥粒子処方およびディスパージョンと適合性を有する構造を与える傾向があった。
【０１３０】
比較的高い沸点発泡剤は本発明の１つの好ましい面を含むが、他の発泡または膨張剤も、適合性を有するミクロ構造を与えるために使用可能と認識されるであろう。従って、発泡剤は、所望のミクロ構造を製造する目的でフィード溶液に組み込むことができる任意の揮発性物質をも含むことができる。発泡剤は、初期の乾燥過程の間で、または減圧乾燥または溶媒抽出等の製造後のステップで、除去することができる。適当な剤は：
【０１３１】
１．溶液を飽和させるために用いられる塩化メチレン、アセトン、エチルアセテートおよびアルコール等の水性溶液と混合できる、溶解された低沸点（１００℃未満）剤；
【０１３２】
２．高い圧力で用いられる、ＣＯ２またはＮ２等のガス、またはフレオン、ＣＦＣｓ、ＨＦＡｓ、ＰＦＣｓ、ＨＦＣｓ、ＨＦＢｓ、フルオロアルカン、および炭化水素等の液体；
【０１３３】
３．本発明の用途に適当な非混和性の低沸点（１００℃未満）液体のエマルションは、一般に式：
【０１３４】
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２またはＲ１−Ｘ
（式中、ＲｌまたはＲ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族、環式またはそれらの組み合わせであり、Ｘは、炭素、イオウ、窒素、ハロゲン、リン、酸素およびそれらの組み合わせを含む任意の基である）
である。
【０１３５】
４．アンモニウム塩、カンファー、その他等の、製造後のステップで、昇華によって減圧下に除去することができる溶解されるか、または分散された塩または有機物、
【０１３６】
５．製造後の溶媒抽出を用いる初期の粒子生成後に抽出することができる分散された固体、
を含む。
【０１３７】
より低沸点の膨張剤に関して、それらは、界面活性剤溶液の約１％〜４０％（ｖ／ｖ）の量で、典型的には供給原料に添加される。約１５％（ｖ／ｖ）の膨張剤は、本発明の方法で使用できるスプレードライ粉体を製造することが判明した。
【０１３８】
どの発泡剤が最終的に選ばれるにせよ、適合性を有する微粒子がＢｕｅｃｈｉミニスプレードライ装置（Ｂ−１９１型、スイス）等の商業的に入手可能な設備を用いて製造できることが判明した。当業者によって認識されるように、スプレードライ装置の入口温度と出口温度は、所望の粒子サイズを与え、取り込まれた生物活性剤の活性を維持するように、調節することができる。この点で、入口および出口温度は、処方成分および供給原料の組成物の溶融特性に従って調節される。入口温度は、従って、フィードの組成および所望の微粒子の特性に従って、６０℃〜１７０℃の間であることができ、出口温度は約４０℃〜１２０℃の間であることができる。好ましくは、これらの温度は、入口に対して９０℃〜１２０Ｄ℃、および出口に対して６０℃〜９０℃である。スプレードライ設備で使用される流速は、一般に毎分約３ｍｌ〜毎分約１５ｍｌであろう。アトマイザー空気流速は、毎分２５リットル〜毎分約６０リットルの値の間を変化する。商業上入手可能なスプレードライ装置は、当業者に周知であり、任意の特定のディスパージョンのための適当な設定は、以下に続く例への相応の参照とともに、実験的なテストを介して容易に決定することができる。
【０１３９】
ミクロ微粒子が好ましくは、エマルションの形のフッ素化発泡剤を用いて形成されるが、非フッ素化油が、ミクロ構造を低下させることなく、生物活性剤のローディング容量を増大させるために使用可能と認識されるであろう。この場合、非フッ素化油の選択は、活性または生物活性剤の溶解性、水溶性、沸点および引火点に基づく。生物活性剤は、油に溶解され、フィード溶液においてその後エマルション化されるであろう。好ましくは、油は選ばれた剤に関して、実質的な可溶化キャパシティ、より低い水溶性（＜１０−３Ｍ）、水より高い沸点、および乾燥出口温度より高い引火点）を有する。可溶化キャパシティを増大させるための非フッ素化油への助溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）の、および界面活性剤の添加も、本発明の範囲内にある。
【０１４０】
特に好ましい態様において、水性組成物中で制限された溶解性を有する生物活性剤を可溶化するために、非フッ素化油を使用えきる。非フッ素化油の使用は、疎水性ペプチドおよびタンパク質のローディング容量を増大させるための特定の用途である。好ましくは、これらを可溶化するための油または油混合物は、１．３６〜１．４１の間の屈折率を有する（例えば酪酸エチル、炭酸ブチル、ジブチルエーテル）。加えて、温度および圧力等のプロセス条件は、選ばれた剤の溶解性を押し上げるために調節することができる。剤のローディング容量を最大にするための適当な油または油混合物およびプロセシング条件の選択は、ここでの教示を考慮して、当業者の範囲内であり、および過度の実験なしで達成可能と認識されるであろう。
【０１４１】
本発明の特に好ましい態様は、リン脂質等の界面活性剤と、少なくとも１つの生物活性剤を含む。他の態様は、それが更に、任意の選ばれた界面活性剤に加えて、例えば炭水化物（すなわちグルコース、ラクトースまたはデンプン）等の親水性部分を含むことができる賦形剤を更に含むことができるスプレードライ製剤を含む。この点について、種々のデンプンおよび誘導体化されたデンプンは、本発明における使用に適している。他の任意的な成分は、粘度調整剤、リン酸緩衝剤または他の従来の生体適合性の緩衝剤等の緩衝剤または酸または塩基等のｐＨ調整剤、および浸透圧剤（等張性、高モル濃度（ｍｏｌａｒｉｔｙ）または低モル濃度を与えるため）を含むことができる。適当な塩の例は、リン酸ナトリウム（一塩基性および二塩基性）、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウムおよび他の生理的に許容できる塩を含む。
【０１４２】
如何なる成分が選ばれるにせよ、微粒子製造における第一段階は典型的には供給原料製造含む。好ましくは、選択された薬物は、濃厚溶液を製造するために水中に溶解される。薬物は、特に水不溶性剤の場合、エマルション中にで直接分散することもできる。または薬物は固体粒子ディスパージョンの形で取り込むことができる。用いられる活性または生物活性剤の濃度は、最終的な粉体で必要な剤の量、および使用されるデリバリー器具（例えばＭＤＩまたはＤＰＩのための微粉用量）の性能に依存する。必要に応じて、ポロキサマー１８８またはスパン（ｓｐａｎ）８０等の補助界面活性剤は、この付加的な溶液へ分散されてもよい。加えて、糖およびデンプン等の賦形剤も、加えることができる。
【０１４３】
選ばれた態様において、水中油型エマルションが、次いで別の容器で形成される。使用される油は、好ましくは、長鎖飽和リン脂質等の界面活性剤を用いてエマルション化されるフルオロカーボン（例えばパーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデカリン）である。例えば、１グラムのリン脂質は、１５０ｇの熱い蒸留水（例えば６０℃）中に、適当な高剪断の機械的ミクサー（例えばウルトラ−トゥラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）のＴ−２５型ミクサー）を８０００ｒｐｍで５分間用いてされてにおいて均質化することができる。典型的には、５〜２５ｇのフルオロカーボンが、混合しつつ、分散された界面活性剤溶液に滴下される。水エマルション中の結果として生じるパーフルオロカーボンは、次いで、粒子サイズを低減するために高圧ホモジナイザを用いて処理される。例えば、そのエマルションは８２，７３７〜１０３，４２１ｋＰａ（１２，０００〜１８，０００ｐｓｉ）で、別個の５パスで処理することができ、且つ５０〜８０℃に維持することができる。
【０１４４】
生物活性剤溶液およびパーフルオロカーボンエマルションは、次いで、組み合わされ、スプレードライ装置に供給することができる。エマルションが好ましくは水性連続相を含むために、２つの製剤は典型的には混和性であろう。生物活性剤は本議論の目的のために別々に可溶化されるが、他の態様においては、活性または生物活性剤は、エマルション中に直接可溶化（または分散）することができると認識されるであろう。このような場合に、活性または生物活性なエマルションは、分離した薬物製剤を組み合わせることなく、単にスプレードライされる。
【０１４５】
いずれにせよ、入口および出口温度、フィード速度、微粒化圧力、乾燥空気の流速およびノズルのコンフィグレーション等の操作条件は、結果として生じる乾燥構造の必要な粒径、および製造収率を与えるために、製造者のガイドラインに従って調節することができる。例示的な設定は、次の通りである：６０℃〜１７０℃の間の空気入口温度；４０℃〜１２０℃の間の空気出口；毎分約３ｍｌ〜１５ｍｌの間のフィード速度；および３００Ｌ／分の吸引空気流量、および２５〜５０の間の微粒化空気流速。適当な装置およびプロセシング条件の選択は、ここでの教示を考慮した当業者の範囲内であって、過度の実験なしで達成することができる。いずれにせよ、これらおよび実質的に均等の方法の使用は、肺へのエアロゾル沈着に適当な粒径を有する、中空の多孔性の空気力学的に軽いミクロスフェアの形成を与える。中空および多孔質であるミクロ構造は、外観上、ほぼハチの巣状、または発泡体状である。特に好ましい態様において、有孔ミクロ構造は、中空、多孔質、スプレードライされたミクロスフェアを含む。
【０１４６】
スプレードライとともに、本発明において有用な有孔ミクロ構造は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって形成することができる。当業者は、凍結乾燥が、それが凍結した後に、水が組成物から昇華されるフリーズドライプロセスであると認識するであろう。凍結乾燥プロセスに伴う特定の利点は、水溶液中で比較的不安定である生物学的製剤および他の薬剤が、高い温度（それにより、有害な熱効果を除去して）なしで乾燥することができ、次いで、安定性の問題が殆どない乾燥状態で貯蔵できるということである。本発明に関して、このような技術は、生理学的な活性を低下（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）させることなく、微粒子または有孔ミクロ構造での、ペプチド、タンパク質、遺伝物質および他の天然および合成高分子とのないの取込みと、特に適合性を有する。凍結乾燥された微粒子を与える方法は当業者に公知であり、ここでの教示に従って適合性を有するミクロ構造を与えることは、明らかに、過度の実験を必要としない。微細な気泡状の構造を含む凍結乾燥されたケークは、５μｍまたは１０μｍ未満で平均直径を有する粒子を与えるために、当業者において公知の技術を用いて微粉化することができる。したがって、所望の特性を有するミクロ構造を与えるために凍結乾燥プロセスが使用できる範囲で、それらは本発明の範囲内にあると明白に考えられる。
【０１４７】
上記技術の他に、本発明の微粒子および有孔ミクロ構造は、また、壁形成剤を含むフィード溶液（エマルションまたは水性）が、減圧力下で迅速に加熱油（例えばパーフルブロンまたは他の高沸点ＦＣｓ）のリザーバに添加される方法を用いて形成することができる。フィード溶液の水および揮発性溶媒は、迅速に沸騰され、および蒸発される。このプロセスは、パフ化米またはポップコーンと同様に、壁形成剤から有孔構造を与えるために使用可能である。好ましくは、壁形成剤は加熱油中に不溶である。結果として生じる粒子は、次いでフィルタリング技術を用いて加熱油から分離され、その後、減圧下で乾燥することができる。
【０１４８】
加えて、本発明の粒子または有孔ミクロ構造は、二重エマルション方法を用いて形成することもできる。二重エマルション方法においては、薬物は第１に音波処理または均質化によって有機溶媒（例えば塩化メチレン）中に溶解されたポリマー中に分散される。この第１次のエマルションは、ポリビニルアルコール等のエマルション化剤を含む連続水相中で、複エマルションを形成することによって次いで安定化される。従来の技術および装置を用いる蒸発または抽出により、次いで有機溶媒が除去される。結果として生じる微小粒子は、次いで、本発明に従ってそれらを適当な懸濁媒体と組み合わせ、または使用される前に、洗浄され、濾過され、および乾燥される。
【０１４９】
Ｆ．投与
【０１５０】
ミクロ微粒子の製造のために如何なる方法が最終的に選ばれるにせよ、結果として生じる粉体は、粉体形で、または非水性の懸濁媒体を含むディスパージョンとしてそれらが効果的に用いられるような多数の有利な性質を有する。特に好ましい態様において、乾燥粉体またはディスパージョンの形のいずれでも、吸入療法を介して、生物活性な組成物が気道（すなわち肺および／又は鼻道）の粘膜の表面に投与されるであろう。このような投与は、ＭＤＩｓ、ＤＰＩｓ、ネブライザー、鼻ポンプ、アトマイザー、スプレーボトルを用いて、または滴の形での直接の点滴注入より行うことができる。しかしながら、吸入療法は本発明と極めて適合性があるが、投与の他の形および／又は経路も、有用であると認識されるであろう。
【０１５１】
この点について、本発明の粉体および安定化ディスパージョンは、体の任意の位置に対する化合物の局所的または全身の投与のためにも使用できる。したがって、好ましい態様において、（これらに制限されないが）局所的、筋肉内、経皮的、皮内、腹腔内、鼻、肺、バッカル、膣、直腸、耳に、または目への投与を含む多くの異なる経路を用いて製剤を投与できることが強調されるべきである。好ましい標的サイトは、例えば、胃腸管、尿生殖路または気道に見出すことができる。より一般的には、本発明の安定化ディスパージョンは、局所的に、または任意の体腔への投与によって剤をデリバリーするために使用できる。好ましい態様において、体腔は腹膜、副鼻洞空洞、直腸、尿道、胃、鼻腔、膣、耳道、口腔、頬側嚢および肋膜からなる群から選ばれる。当業者は、投与の選択された経路が主に生物活性剤の選択と被験体の所望の応答によって決定されると認識するであろう。
【０１５２】
開示された粉体または安定化ディスパージョンのデリバリーに関して、本発明他の面は、患者への１以上の生物活性剤、または生物学的製剤の投与のためのシステムに向けられる。上記したように、本発明と適合性を有する例示的な吸入器具は、アトマイザー、鼻ポンプ、ネブライザーまたはスプレーボトル、乾燥粉体吸入器、用量計量型吸入器またはネブライザーを含むことができる。好ましい態様においては、これらの吸入システムは、エアロゾルとして生物活性剤を所望の生理学的サイト（例えば粘膜の表面）にデリバリーするであろう。文脈上の拘束によって別に規定されない限り、本出願の目的のために、用語「エアロゾル化される」は、微細な固体または液体の粒子のガス状ディスパージョンを意味するように維持される。すなわち、エアロゾル、またはエアロゾル化された薬物は、例えば、乾燥粉体吸入器、用量計量型吸入器、アトマイザー、スプレーボトルまたはネブライザーによって発生させることができる。もちろん、以下で更に詳細に説明されるように、本発明の組成物は、直接に（例えば、従来の注射または針無しの注射により）、または液体用量点滴注入等の技術を用いて、デリバリーすることができる。従って、本発明の更なる面は、開示された粉体またはディスパージョンを含む針無しのインジェクター（例えば、加圧気体ガン）に向けられる。
【０１５３】
Ｆ（ｉ）．乾燥粉体吸入器
【０１５４】
吸入療法に関して、当業者は、本発明の粉体、特に有孔ミクロ構造を含むものが、特にＤＰＩｓにおいてで有用であると認識するであろう。従来のＤＰＩｓ、または乾燥粉体吸入器は、粉体状処方と、単独でまたはラクトースキャリア粒子とのブレンドで、薬物の所定の用量が吸入のための乾燥粉体の微細なミストまたはエアロゾルとしてデリバリーされる器具とを含む。有用なＤＰＩ薬物は、典型的には、それらが０．５〜２０μｍまでの間のサイズを有する個々の粒子に容易に分散するように処方される。粉体は、吸気によって、または加圧された空気等の外部のあるデリバリー力によって作動される。ＤＰＩ処方は、典型的には単一用量ユニットでパックされ、または用量の器具へのマニュアル移行によって、多数の用量を計測可能なリザーバシステムを使用する。
【０１５５】
ＤＰＩｓは、一般に、使用される用量デリバリーシステムに基づいて分類される。この点で、ＤＰＩｓの２つの主要なタイプは、ユニット用量デリバリー器具と、バルクリザーバデリバリーシステムとを含む。ここで用いるように、用語「リザーバ」は一般のセンスで使用され、文脈上の拘束によって別に規定されない限り、両方のコンフィグレーションを包含するように維持される。いずれにせよ、ユニット用量デリバリーシステムは、単一のユニットとして器具に与えられる粉体処方の用量を必要とする。このシステムにより、処方は、フォイル包装され、または水分侵入を防ぐためにブリスターストリップで与えることができる投与ウェルに予備充填される。他のユニット用量パッケージは、硬質ゼラチンカプセルを含む。ＤＰＩｓのために設計された大部分のユニット用量容器は、固定体積技術を用いて充填される。その結果、粉体流動性とバルク密度によって規定されるユニットパッケージ内に計量できる最小用量に、物理的限界（ここで密度）がある。
【０１５６】
上述したように、本発明の粉体は、先行技術キャリア製剤に伴う困難の多くを取り除く。すなわち、ＤＰＩ性能における改良は、ここで開示されたように、粒径、空気力学、形態および密度、湿度、および電荷を調節することによって得ることができる。この点で、本発明は、薬物、賦形剤または増量剤が、好ましくは有孔ミクロ構造と組み合わされ、または有孔ミクロ構造を含む処方を与える。上述したように、本発明に従う好ましい組成物は、典型的には０．１ｇ／ｃｍ３ 未満、しばしば０．０５未満ｇ／ｃｍ３ のバルク密度を有する粉体を産する。従来のＤＰＩより低い大きさのオーダーのバルク密度を有する粉体を提供することにより、選ばれた生物活性剤の遙かに低い用量がユニット用量容器に充填され、またはリザーバベースのＤＰＩｓを介して計量することが可能となる。効果的に小さい量を計量する能力は、ホルモン等の比較的効能ある生物活性剤のために重要である。更に、関連キャリア粒子なしで効果的に微粒子をデリバリーする能力は、生成物処方および充填を単純化し、および好ましくない副作用を低減する。
【０１５７】
本発明の粉体が特に単一の作動で生物活性剤の比較的高い服用量をデリバリーすることにおいて、効果的と認識されるであろう。先行技術と異なり、その粉体状処方は、効果的な充填およびデリバリーのために増量剤の使用を必要とせず、したがって、重量−重量ベースで生物活性剤のより高いレベルを含むことができる。重要なことに、開示された組成物は、単一の作動で約１０ｍｇ程度に多い生物活性剤をデリバリーするために使用できる。このような利点は、例えば、他の適合性を有する剤ほどには有力でない可能性がある受動免疫化のための免疫調節剤または抗体をデリバリーする際に、恐らく特に重要であろう。もちろん、この議論が特にＤＰＩｓの使用に向けられているが、この同じ利点は、ディスパージョン、およびＭＤＩｓ、鼻ポンプおよび針無しのインジェクター等の他の形の投与にも等しくに適用できる。
【０１５８】
前記の利点に加えて、本発明の好ましい態様は、それらを特にＤＰＩｓのために、効果的にする良好な空気力学の性質を示す。より具体的には、微小粒子の有孔構造と比較的高い表面は、吸入の間、匹敵するサイズの比較的に非有孔の粒子と比べて、より容易に、およびより長い距離で、ガスの流れでそれらが運ばれることを可能にする。それらの高いポロシティと低比重のため、ＤＰＩによる有孔ミクロ構造の投与は、鼻道および肺の周辺における粘膜の表面等の標的サイトでの増大された粒子沈着と、これに対応して、喉でのより少ない沈着を与える。このような粒子分布は、全身性投与のために好ましい、投与された剤の深い肺沈着を増大させるために使用することができる。更に、先行技術ＤＰＩ製剤に対する実質的な改良において、本発明の低い密度、高度に多孔性の粉体は、好ましくはキャリア粒子の必要性を除去する。
【０１５９】
Ｆ（ｉｉ）．安定化された分散性
【０１６０】
乾燥粉体コンフィグレーションでのそれらの使用とともに、本発明の粉体は、安定化ディスパージョンを与えるために懸濁媒体中の取り込むことができると認識されるであろう。好ましくは、安定化ディスパージョンは、非水性ディスパージョンを含む。数ある使用の中で、安定化ディスパージョンは、ＭＤＩｓ、アトマイザーまたはスプレーボトル、鼻ポンプ、針無しのインジェクター、ネブライザーまたは液体の用量点滴注入（ＬＤＩ技術）を用いて、患者の肺の気道への生物活性剤の効果的デリバリーを与える。
【０１６１】
当業者は、開示されたディスパージョンまたはディスパージョンの強化された安定性が、主に、懸濁粒子の間でのファンデルワールス引力を下げることによって、および懸濁媒体と粒子の間で密度における差違を低減することによって、達成されることを認識するであろう。ここでの教示に従って、懸濁安定性の増大は、それが次いで適合性を有する懸濁媒体中に分散される有孔ミクロ構造を設計することによって付与することができる。上述したように、有孔ミクロ構造は、流体懸濁媒体を微粒子の境界に自由に浸透させ、または灌流（ｐｅｒｆｕｓｅ）させる孔、ボイド、中空、欠損、または他の介在（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）スペースを含む。特に好ましい態様は、中空および多孔質の両方である、外観においてほぼハチの巣状または発泡体状の有孔ミクロ構造を含む。特に好ましい態様においては、有孔ミクロ構造は、中空、多孔性のスプレードライされたミクロスフェアを含む。もちろん、比較的無孔の、固体の微粒子を含む他の態様において、強化された安定性は、微粒子成分（例えば界面活性剤）の選択を介して付与することができる。
【０１６２】
有孔ミクロ構造が懸濁媒体（すなわちヒドロフルオロアルカン推進剤または液体のフルオロカーボン）中に配置される、懸濁媒体は粒子に浸透することができ、それにより、連続相および分散相が見分けがつかないホモ分散性を作る。画されたまたは「仮想」粒子（すなわち、ミクロ微粒子マトリックスによって境界線を描かれた（ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄ）体積を含む）それらが懸濁される媒体中のほぼ全体で作製されるため、粒子凝集（フロキュレーション）を駆動する力は最小にされる。加えて、画された粒子と連続相との間の密度における差違は、ミクロ構造を媒体で充填させることによって最小にされ、それにより粒子クリーミングまたは遠心沈降を効果的に遅くさせる。従って、本発明の微粒子と安定化ディスパージョンは、多くのエアロゾル化技術（例えばＭＤＩ、スプレーボトルを介する微粒化、鼻ポンプ、ネブライゼーション、その他等と、特に適合性を有する。更に、安定化ディスパージョンは、（これらに限定されないが）液体の用量点滴注入、針無しの注入、従来の注入および局所適用を含む投与の他の経路と適合性を有する。
【０１６３】
先行技術組成物と異なり、本発明の好ましいディスパージョンは、粒子の間で反発を増大させず、粒子の間でむしろ引力を減少させるように設計されている。この点で、非水性媒体中のフロキュレーションを駆動する主要な長所がファンデルワールス引力であると認識すべきである。上述したように、ＶＤＷ力は、量子力学起原であって、変動している双極子の間（すなわち誘起双極子−誘起双極子の相互作用）で、引力として視覚化することができる。ディスパージョン力は、極めて短距離で、および原子間の距離の６乗としてのスケールである。２つの巨視的な物体が互いに接近する時は、原子間のディスパージョン引力は総計される。結果として生じる力は、かなりより長距離で、相互に作用している物体の幾何学に依存する。
【０１６４】
より具体的には、２つの球状粒子に対して、ＶＤＷポテンシャル（ＶＡ）の大きさは、：
【０１６５】
【数２】
2003535017.tif 000002
（式中、Ａｅｆｆは、粒子および媒体の性質を説明する有効Ｈａｍａｋｅｒ定数であり、Ｈ０ は粒子間の距離であり、Ｒ１およびＲ２は、球状の粒子１および２の半径である）
により近似することができる。有効Ｈａｍａｋｅｒ 定数は、分散粒子と懸濁媒体の分極率における差違に比例する：
【数３】
2003535017.tif 000003
（式中、ＡＳＭおよびＡＰＡＲＴは、それぞれ、懸濁媒体および粒子のためのハメーカー（Ｈａｍａｋｅｒ）定数である）。懸濁粒子と分散媒が本質的に類似してくると、ＡＳＭおよびＡＰＡＲＴが大きさにおいてより近くなり、ＡｅｆｆおよびＶＡ は、より小さくなる。すなわち、懸濁媒体に伴うハメーカー定数と、分散粒子に伴うハメーカー定数の間で差違を低減することによって、有効ハメーカー定数（および対応するファンデルワールス引力）は、低減することができる。
【０１６６】
ハメーカー定数における差違を最小にする一つの方法は、上述したように連続相および分散相の両方が本質的に見分けがつかない、「ホモディスパージョン」を作製することである。有効ハメーカー定数を低減するために粒子の形態を利用する他に、構造的マトリックス（有孔ミクロ構造を画する）の成分は、懸濁媒体のそれに比較的近いハメーカー定数を示すように好ましくは選ばれるであろう。この点で、ディスパージョン成分の適合性を決定するため、および製剤の安定性に関して良好な指標を与えるために、懸濁媒体および微粒子成分のハメーカー定数の実際の値を使用することができる。代わりに、測定可能なハメーカー定数と符号するが、より容易により識別可能な特徴的な物理的な値を用いて、比較的に適合性を有する微粒子または有孔ミクロ構造成分と、懸濁媒体とを選ぶことができるであろう。
【０１６７】
この点で、多くの化合物の屈折率値が、対応するハメーカー定数に応じて変化する（ｓｃａｌｅ ｗｉｔｈ）傾向があることが判明した。したがって、容易に実質的にの屈折率値は、それに関して、懸濁媒体および粒子賦形剤の組み合わせが、比較的低い有効ハメーカー定数、およびこれに伴う安定性を有するディスパージョンを与えるであろうところの、かなり（ｆａｉｒｌｙ）良好な指標を与えるために使用可能である。化合物の屈折のインデックスが広く利用でき、または容易に誘導できるため、このような値の使用により、過度の実験をすることなく、本発明に従う安定化ディスパージョンの形成が可能となると認識されるであろう。説明のみの目的で、開示されたディスパージョンと適合性を有するいくつかの化合物の屈折のインデックスを、直ぐ下の表Ｉに与える：
【０１６８】
【表１】
2003535017.tif 000004
【０１６９】
上述した適合性を有するディスパージョン成分と調和して、当業者は、複数の成分が約０．５未満の屈折率差を有するディスパージョンの形成が好ましいことを認識するであろう。すなわち。懸濁媒体の屈折率は、好ましくは粒子または有孔ミクロ構造に伴う屈折率のうちの約０．５の範囲内にある。懸濁媒体および粒子の屈折率は直接測定することができ、または個々それぞれの相における主成分の屈折率を用いて近似できることが、更に認識されるであろう。微粒子または有孔ミクロ構造に対して、主要な成分は、重量パーセントベースで決定できる。懸濁媒体に対して、主要な成分は、典型的には体積パーセントベースで導かれる。本発明の選ばれた態様において、屈折率差の値は、好ましくは約０．４５未満、約０．４、約０．３５または約０．３未満でさえあるであろう。低い屈折率差が、より高いディスパージョン安定性を暗示するならば、特に好ましい態様は、約０．２８未満、約０．２５、約０．２、約０．１５または約０．１未満の指数差を含む。当業者は、本開示を与えられたならば、過度の実験なしで、どの賦形剤が特に適合性を有するかについて決定できることが言える。好ましい賦形剤の最終的な選択は、また、生体適合性、規則の事情、製造の容易さ、コストを含む他の要素よって影響される。
【０１７０】
上述したように、粒子と連続相の間の密度差の最小化は、懸濁媒体が粒子体積の大部分を構成するように、有孔および／又は中空ミクロ構造を用いることによって達成することができる。ここで用いるように、用語「粒子体積」は、それらが固体（すなわち粒子境界によって定義される体積）であるならば、取り込まれた中空／多孔質粒子によって置き換えられるであろう懸濁媒体の体積に対応する。説明の目的のため、および上述したように、これらの流体充填された微粒子の体積は、「仮想的な微粒子」と言うことができる。好ましくは、生物活性剤／賦形剤シェルまたはマトリックスの平均体積（すなわち、有孔ミクロ構造によって実際に置き換えられる媒体の体積）は、平均の粒子体積の８０％未満（または仮想微粒子の８０％未満）を含む。より好ましくは、ミクロ微粒子マトリックスの体積は、平均の粒子体積の約５０％、４０％、３０％または２０％未満さえ含む。より好ましくは、シェル／マトリックスの平均体積は、平均の粒子体積の約１０％、５％、３％または１％未満を含む。当業者は、このようなマトリックスまたはシェル体積が、典型的には、そこに見出される懸濁媒体によって圧倒的に規定される仮想粒子密度に、殆ど寄与しないと認識するであろう。
【０１７１】
このようなミクロ構造の使用は、仮想粒子の見掛けの密度が、引力的なファンデルワールス力を実質的に除去している懸濁媒体のそれに近似させると、更に認識されるであろう。更に上述したように、ミクロ微微粒子マトリックスの成分が、懸濁媒体の密度に近似するために、可能な与えられた他の考慮をできる限り多くするように、選ぶことが好ましい。したがって、本発明好ましい態様において、仮想粒子と懸濁媒体は、約０．６ｇ／ｃｍ３ 未満の密度差を有するであろう。すなわち、仮想粒子の平均の密度（マトリックス境界によって画されるように）は、懸濁媒体の約０．６ｇ／ｃｍ３ の範囲内にある。より好ましくは、仮想粒子の平均の密度は、選ばれた懸濁媒体の０．５、０．４．０．３または０．２ｇ／ｃｍ３ の範囲内にあるであろう。より好ましい態様において、密度差は、約０．１、０．０５．０．０１未満、または０．００５ｇ／ｃｍ３ 未満の範囲内にあるであろう。
【０１７２】
前記の利点に加えて、開示された微粒子の使用は、懸濁物中の遙かに高い体積の粒子分率を含むディスパージョンを形成させる。密充填（ｃｌｏｓｅ ｐａｃｋｉｎｇ）にアプローチする体積分率での先行技術ディスパージョンの処方が、一般に、ディスパージョン粘弾性挙動の劇的な増大を生ずることが認識されるべきである。このタイプのレオロジー的挙動は、ＭＤＩまたはネブライザー応用に適当でない。当業者は、粒子の体積分率が粒子の見かけ体積（すなわち粒子体積）と、そのシステムの総容積への比として定義できることを認識するであろう。各システムは、最大体積分率または充填分率を有する。例えば、単一の立方配置での粒子が０．５２の最大充填分率に到達し、他方、面心立方／六方晶の密充填コンフィグレーションにおけるそれらが約０．７４の最大充填分率に到達する。非球状粒子または多分散システムに対して、誘導された値は異なる。したがって、最大充填分率は、しばしば与えられたシステムのための経験的なパラメータであると思われる。
【０１７３】
ここで、本発明の好ましい微粒子が、密充填に近似する高い体積分率でさえ、好ましくない粘弾性な挙動を示さないことが、驚くべきことに判明した。逆に、それらは、固体粒子を含む同様な懸濁物と比較して、殆どまたは全く降伏応力を有さない自由流れの、低粘度懸濁物のままである。開示された懸濁物の低い粘度は、少なくとも大部分は、流体充填された中空、多孔質粒子の間の比較的低いファンデルワールス引力のためであると思われる。従って、選ばれた態様において、開示されたディスパージョンの体積分率は、約０．３を超える。他の態様は、密充填条件に近似するより高い値で、０．３〜０．８のオーダー、または０．５〜約０．８のオーダーのパッキング値を有していてもよい。更に、体積分率が密充填に近似するとき、粒子沈降が当然に減少する傾向があるため、比較的濃縮された濃いディスパージョンの形成は、処方の安定性を更に増大させことができる。
【０１７４】
本発明の方法および組成物は比較的に濃縮された懸濁物を形成するために使用できるが、安定化因子は、遙かに低いパッキング体積で等しく良好に機能し、且つこのようなディスパージョンは、本開示の範囲内にると考えれれる。この点について、低い体積分率を含むディスパージョンが、先行技術のテクニックを用いて安定させることは極めて難しいと認識されるであろう。逆に、ここで記述したように、生物活性剤を含む微粒子を取り込んでいるディスパージョンは、低い体積分率でさえ特に安定である。したがって、本発明は、安定化ディスパージョン、特に０．３未満の体積分率で形成され、使用されるべき呼吸のためのディスパージョンを当てる。好ましいいくつかの態様において、体積分率は約０．０００１〜０．３、より好ましくは、約０．００１〜０．０１である。更に、他の好ましい態様は、約０．０１〜約０．１まで体積分率を有する安定化ディスパージョンを含む。
【０１７５】
本発明の有孔ミクロ構造は、微粉化された生物活性剤の希薄ディスパージョンを安定させるためにも使用できる。このような態様において、有孔ミクロ構造は懸濁物中の粒子の体積分率を増大させるめに添加することができ、それによりクリーミングまたは沈降に対する懸濁安定性を増大させる。更に、これらの態様において、取り込まれたミクロ構造は、また、微粉化された薬物粒子の近いアプローチ（凝集）を防ぐように作用することができる。このような態様において取り込まれた有孔ミクロ構造は、必ずしも生物活性剤を含まなくてもよいと認識すべきである。むしろ、それらは界面活性剤を含む、種々の賦形剤のみで形成することができる。
【０１７６】
当業者は、本発明の安定化懸濁物またはディスパージョンが、それが容器またはリザーバに次いで配置できる選ばれた懸濁媒体中の、ミクロ構造の分散によって製造できると更に認識するであろう。この点について、本発明の安定化製剤は、最終的な所望のディスパージョン濃度を製造するために、充分な量で成分を単に混合することによって作製できる。ミクロ構造は、機械的エネルギーなしで容易に分散されるが、分散（例えば、音波処理を用いて）を助長するための機械的エネルギーの印加も考えられる。代わりに、複数の成分は単純な振盪または他のタイプの攪拌によって混合することができる。そのプロセスは、好ましくは、懸濁安定性に対する水分の悪影響を除くために、無水条件下で行われる。一旦形成されたならば、そのディスパージョンは、フロキュレーションまたは沈降に対して低減された感受性を有する。
【０１７７】
本明細書を通して示したように、本発明のディスパージョンは好ましくは安定される。広義に、用語「安定化ディスパージョン」は、生物活性剤の効果的デリバリーを与えるために必要とされる程度に、凝集、フロキュレーションまたはクリーミングに対して抵抗性を有する任意のディスパージョンを意味するように維持される。更に、開示されたディスパージョンおよび粉体が室温で安定であって、それらの活性を効果的に維持するために冷蔵または凍結を必要としないことは、本発明の重要な利点である。貯蔵寿命を引き伸ばす他に、注目に値する温度安定性は、出荷（ｓｈｉｐｐｉｎｇ）および投与を著しく単純化する。
【０１７８】
当業者は、与えられたディスパージョンの安定性を評価するために使用可能ないくつかの方法があると認識するであろうが、本発明の目的のための好ましい方法は、動的光沈降法を用いるクリーミングまたは沈降時間の決定を含む。好ましい方法は、懸濁粒子を遠心力に供し、時間の関数として懸濁物の吸光度を測定することを含む。吸光度における迅速な減少は、貧弱な安定性を有する懸濁物を確認する。当業者が過度の実験なしで、その手順を特定のディスパージョンに適応可能なことが言える。
【０１７９】
本発明の目的のために、クリーミング時間は、懸濁された薬物微粒子が懸濁媒体の体積の１／２までクリーム化するのための時間として定義される。同様に、沈降時間は、微粒子が液体媒体の体積の１／２に沈降物するために必要とされる時間として定義することができる。上述した光沈降技術の他に、製剤のクリーミング時間を決定する比較的簡単な方法は、シールされたガラスバイアル中に微粒子のディスパージョンを与えることである。バイアルは攪拌または振盪されて比較的均一なディスパージョンを与え、それは次いで、わきに置かれ、適当な機器を用いて、または目視査によって観察される。懸濁粒子が懸濁媒体の体積の１／２までクリーム化するため（すなわち、懸濁媒体の上半分まで上昇する）、または体積の１／２まで沈降する（すなわち、媒体の１／２の底に落ちつく）ために必要な時間が、次いで記録される。１分より長いクリーミング時間を有するディスパージョン処方が好ましく、適当な安定性を示す。より好ましくは、安定化されたディスパージョンは、１、２、５、１０、１５、２０または３０分より長いクリーミング時間を含む。特に好ましい態様において、安定化ディスパージョンは、約１、１．５、２、２．５または３時間を超えるクリーミング時間を示す。沈降時間のための実質的に均等の期間は、適合性を有するディスパージョンを示す。
【０１８０】
他の成分を本発明の安定化ディスパージョンに含むことができると理解されるであろう。例えば、浸透圧剤、安定剤、キレート化剤、緩衝剤、粘度調節剤、塩および糖を、最大寿命および投与の容易さを微調整するために、安定化ディスパージョンに添加することができる。このような成分は、直接懸濁媒体に添加することができ、または有孔ミクロ構造と組み合わせ、またはその中に取り込むことができる。滅菌性、等張性および生体適合性等の考慮は、開示された組成物に従来の添加剤の使用を支配する可能性がある。このような剤の使用は当業者にとって理解されるであろうし、特定の量、比および剤のタイプは、過度の実験なしで経験的に決定することができる。
【０１８１】
Ｆ（ｉｉｉ）．計量型用量吸入器
【０１８２】
上述したように、安定化ディスパージョンは、好ましくは、用量計量型吸入器等のエアロゾル適用を介して、患者の鼻または肺の気道に投与することができる。このような安定化製剤の使用は、優れた用量再現性、および上述したように標的サイトで改善された沈着を与える。ＭＤＩｓは当該技術において周知であり、過度の実験なしでクレームされたディスパージョンの投与のために容易に使用することができた。呼吸活性化型ＭＤＩｓ、並びに既に開発され、または将来開発されるであろう他のタイプの改善を含むものも、安定化ディスパージョンおよび本発明で両立でき、およびそれらの範囲内と考えられる。
【０１８３】
ＭＤＩカニスターは、一般に、プラスチックまたはプラスチック−コートされたガラスボトル、または好ましくは、所望により陽極酸化され、ラッカーコートされ、および／又はプラスチックコートされていてもよい金属（例えばアルミニウム）等の推進剤の蒸気圧に耐えることができる容器またはリザーバを含み、その容器が計量型バルブで閉じられている。計量型バルブは、作動につき処方の計量された量をデリバリーするように設計されている。バルブは、そのバルブを介する推進剤のリークを防ぐためのガスケットを取り込む。ガスケットは、例えば、低密度ポリエチレン、クロロブチル、白および黒のブタジエン−アクリロニトリルゴム、ブチルゴム、およびネオプレン等の任意の適当なエラストマー性材料を含むことができる。適当なバルブは、例えばフランスのバロア社（Ｖａｌｏｉｓ）（例えば、ＤＦＩＯ、ＤＦ３０、ＤＦ３１／５０ＡＣＴ、ＤＦ６０）、ベスパク社（Ｂｅｓｐａｋ ｐｌｃ、ＬＴＫ）（例えばＢＫ３００、ＢＫ３５６）、および３Ｍ−ネオテクニックＬＴＫ（例えば、スプレーマイザー（Ｓｐｒａｙｍｉｓｅｒ））等のエアロゾル産業界で周知の製造者から商業的に入手可能である。
【０１８４】
個々の充填されたカニスターは、患者の肺または口または鼻の空洞への薬物の投与のための用量計量型吸入器を形成するために、使用の前に、便利に適当なチャネリング器具または作動装置にはめ込まれる。適当なチャネリング器具は、それにより、例えば、患者の鼻または口（例えばマウスピース作動装置）に対して、充填されたカニスターから計量バルブを介して薬物がデリバリーできる、例えばバルブ作動装置および円柱形または円錐形状のパスを含む。計量型用量吸入器は、例えば、作動につき１０〜５０００マイクログラムの範囲で生物活性剤等の、作動につき固定されたユニット薬用量をデリバリーするように設計されている。典型的には、単一充填型のカニスターは、数十または数百のショットまたは用量を与える。
【０１８５】
ＭＤＩｓに関して、推進剤として作用するために適当な蒸気圧を有する任意の生体適合性の懸濁媒体をも使用できることは、本発明の利点である。特に好ましい懸濁媒体は、用量計量型吸入器との使用に適合性を有する。すなわち、それらは計量型バルブの作動および関連する圧力の放出の際に、エアロゾルを形成できるであろう。一般的に、選ばれた懸濁媒体は、生体適合性（すなわち、比較的に非毒性）で、生物活性剤を含む懸濁された有孔ミクロ構造に関して非反応性であるべきである。好ましくは、懸濁媒体は、有孔ミクロスフェア中に取り込まれる任意の成分に対して実質的な溶媒の働きをしない。本発明の選ばれた態様は、フルオロカーボン（他のハロゲンで置換されたものを含む）、ヒドロフルオロアルカン、パーフルオロカーボン、炭化水素、アルコール、エーテルまたはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる懸濁媒体を含む。懸濁媒体は、特定の特性を付与されるために選ばれる種々の化合物の混合物を含むことができると認識されるであろう。
【０１８６】
本発明のＭＤＩ懸濁媒体に用いられる特に適当な推進剤は、室温での圧力下の液化性でき、吸入または局所的使用において安全であり、毒物学的に無害で、副作用のないような推進剤ガスである。この点について、適合性を有する推進剤は、用量計量型吸入器の作動の際に、エアロゾルを能率的に形成するために充分な蒸気圧を有する、任意の炭化水素、フルオロカーボン、水素含有フルオロカーボンまたはそれらの混合物を含むことができる。それらの推進剤（典型的にはヒドロフルオロアルカンまたはＨＦＡｓと呼ばれる）は、特に適合性を有する。例えば、適当な推進剤は、短鎖炭化水素、 ＣＨ２ＣｌＦ、ＣＣｌ２Ｆ２ＣＨＣｌＦ、ＣＦ３ＣＨＣｌＦ、ＣＨＦ２ＣＣｌＦ２、ＣＨＣｌＦＣＨＦ２、ＣＦ３ＣＨ２Ｃｌ、およびＣＣｌＦ２ＣＨ３等の Ｃ１〜Ｃ４水素含有クロロフルオロカーボン；ＣＨＦ２ＣＨＦ２、ＣＦ３ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２ＣＨ３ およびＣＦ３ＣＨＦＣＦ３等のＣ１〜Ｃ４水素含有フルオロカーボン（例えばＨＦＡｓ）；およびＣＦ３ＣＦ３およびＣＦ３ＣＦ２ＣＦ３ 等のパーフルオロカーボンを含む。好ましくは、単一のパーフルオロカーボンまたは水素含有フルオロカーボンが推進剤として使用される。推進剤として特に好ましいものは、１，ｌ，１，２−テトラフルオロエタン（ＣＨ３ＣＨ２Ｆ）（ＨＦＡ−１３４ａ）、および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＣＦ２ＣＨＦＣＦ３）（ＨＦＡ−２２７）、パーフルオロエタン、モノクロロジフルオロメタン、１，１−ジフルオロエタン、およびそれらの組み合わせである。その処方は、成層圏のオゾンを枯渇させる成分を含まないことが好ましい。ＣＣｌ３Ｆ、ＣＣ１２Ｆ２とＣＦ３ＣＣｌ３等のクロロフルオロカーボンを実質的に含まなくことが特に好ましい。
【０１８７】
本発明の好ましい態様は生態学的に優しい懸濁媒体を含むが、従来のクロロフルオロカーボンおよび置換されたフッ素化合物も、ここでの教示に従って懸濁媒体として使用できる。この点で、環境的な懸念が伴う可能性があるものの、ＦＣ−１１（ＣＣｌ３Ｆ）、ＦＣ−１１Ｂ１（ＣＢｒＣｌ２Ｆ）、ＦＣ−１１６２（ＣＢｒ２ＣｌＦ）、ＦＣ１２Ｂ２（ＣＦ２Ｂｒ２）、ＦＣ２１（ＣＨＣｌ２Ｆ）、ＦＣ−２１Ｂ１（ＣＨＢｒＣｌＦ）、ＦＣ−２１Ｂ２（ＣＨＢｒ２Ｆ）、 ＦＣ−３１Ｂ１（ＣＨ２ＢｒＦ）、ＦＣ１１３Ａ（ＣＣｌ３ＣＦ３）、 ＦＣ−１２２（ＣＣｌＦ２ＣＨＣｌ２）、ＦＣ−１２３（ＣＦ３ＣＨＣｌ２）、ＦＣ−１３２（ＣＨＣｌＦＣＨＣｌＦ）、ＦＣ−１３３（ＣＨＣｌＦＣＨＦ２）、ＦＣ−１４１（ＣＨ２ＣｌＣＨＣｌＦ）、ＦＣ−１４１Ｂ（ＣＣｌ２ＦＣＨ３）、 ＦＣ−１４２（ＣＨＦ２ＣＨ２Ｃｌ）、ＦＣ−１５１（ＣＨ２ＦＣＨ２Ｃｌ）、 ＦＣ−１５２（ＣＨ２ＦＣＨ２Ｆ）、ＦＣ−１１１２（ＣＣｌＦ＝ＣＣｌＦ）、ＦＧ−１１２１（ＣＨＣｌ＝ＣＦＣｌ）およびＦＣ１１３１（ＣＨＣｌ＝ＣＨＦ）の全ては、ここでの教示と適合性を有する。従って、これらの化合物の各々は、単独または他の化合物（すなわち揮発性がより小さいフルオロカーボン）と組み合わせて、本発明に従って呼吸性のディスパージョンを安定させるために使用できる。
【０１８８】
前記の態様とともに、本発明の安定化ディスパージョンは、必要とする際の患者の肺の気道に投与できるエアロゾル化された薬物を与えるように、ネブライザーとともに用いることもできる。ネブライザーは当該技術において周知であり、過度の実験なしでクレームされたディスパージョンの投与のために容易に使用することができた。呼吸活性化ネブライザー、並びに既に開発された、または開発されるであろう改良の他のタイプを含むものも、安定化ディスパージョンと適合性を有し、本発明の範囲内と考えられる。
【０１８９】
ネブライザーは、バルク液体を呼吸可能なガス中に懸濁された小さい液滴に変換するエアロゾルによって動く。ここで、（好ましくは、肺の気道に）投与されるべきエアロゾル化された薬物は、生物活性剤を含む有孔ミクロ構造と組み合わされた懸濁媒体の小さい液滴を含む。このような態様において、本発明の安定化ディスパージョンは、ネブライザーと操作可能に結合される流体リザーバ中に、典型的には配置される。与えられる製剤の特定の体積、リザーバを充填する手段、その他は主に、個々のネブライザーの選択に依存し、充分に当業者の範囲内にある。もちろん、本発明は、単一用量ネブライザーおよび多数回投与ネブライザーと、完全に適合性を有する。
【０１９０】
本発明は、好ましくはフッ素化合物（すなわちフルオロケミカル、フルオロカーボン、またはパーフルオロカーボン）を含む懸濁媒体を有する安定化ディスパージョンを与えることによって、これらおよび他の困難を克服する。本発明の特に好ましい態様は、室温での液体であるフルオロケミカルを含む。上述したように、このような化合物の使用は、連続相として、または懸濁媒体としてのいずれでも、先行技術の液体吸入製剤に勝るいくつかの利点を与える。この点について、多くのフルオロケミカルは肺における安全性と生体適合性の証明された歴史を有することは、充分に確立されている。更に、水溶液に対比して、フルオロケミカルは肺の投与の後の気体交換に否定的に衝撃を与えない。逆に、それらが実際に気体交換を改善できること、およびそれらのユニークな湿潤性特性により、粒子のエアロゾル化された流れを、肺の中に深く運んで、それにより所望の薬剤化合物の全身性デリバリーを改善する。加えて、フルオロケミカルの比較的に非反応性の性質は、取り込まれた生物活性剤の任意の分解（タンパク質分解または加水分解による）を遅らせるように作用する。
【０１９１】
いずれにせよ、ネブライザー媒介されたエアロゾル適用は、液滴の増大された表面積を与え、いくつかの場合には、微粉化され、またはエアロゾル化された薬物の輸送を与えるために、典型的には、エネルギーの入力を必要とする。エアロゾル適用の１つの共通の方法は、ノズルから流体の流れを押し出して放出させ、それにより液滴が形成される。霧状にされた投与に関して、肺中へ深く輸送されるために充分に小さくなるように、追加的なエネルギーが液滴に一般的に付与される。従って、高速ガス流れまたは圧電結晶によって与えられるような、追加的なエネルギーが必要である。ネブライザーの２つのポピュラーなタイプ、ジェットネブライザおよび超音波ネブライザーは、アトマイゼーションの間に、追加的なエネルギーを流体に印加する前記の方法に依存する。
【０１９２】
ネブライゼーションを介する体循環への生物活性剤の肺デリバリーに関して、最近の研究は、計量型溶液とも呼ばれる移動式の手で持てる（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）超音波ネブライザーの使用に集中した。単一ボラス（ｂｏｌｕｓ）ネブライザーとして知られるこれらの器具は、一回または二回の呼吸における深い肺デリバリーに対して効率的な粒径を有する水溶液中の薬剤の単一ボラスをエアロゾル化する。これらの器具は、３つの広いカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは、Ｍｕｅｔｔｅｒｌｅｉｎ ら（Ｊ． Ａｅｒｏｓｏｌ Ｍｅｄ． １９８８；１：２３１）によって記述されたもの等の純粋の圧電気の単一ボラスネブライザーを含む。他のカテゴリーにおいて、所望のエアロゾル雲は、米国特許第３，８１２，８５４号に記述されたもの等のミクロチャネル押出単一ボラスネブライザーによって生成することができる。最後に、第３のカテゴリーは、環状の加圧単一ボラスのネブライザーを記述しているロバートソンら（ＷＯ９２／１１０５０号）によって例証された器具を含む。前記の参照の各々は、それらの全部でここで取り込む。大部分の器具は手で作動されるが、存在するいくつかの器具は、呼吸で作動される。器具が患者の回路を介する呼吸感じるとき、エアロゾルを放出することによって呼吸作動の器具は動く。呼吸作動のネブライザーは、患者のための吸入ガスを含む、エアロゾルを空気流れの中に放出するためのベンチレータ回路とインラインに配置されてもよい。
【０１９３】
どのタイプのネブライザーが使用されるかに関係なく、または生体適合性の非水性化合物が懸濁媒体として使用できることは、本発明の利点である。好ましくは、それらはそれらへのにエネルギーの印加によりエアロゾルを形成することができる。一般的に、選ばれた懸濁媒体は、生体適合性であるべきであり（すなわち比較的に非毒性）、および生物活性剤を含む懸濁された有孔ミクロ構造に対して非反応性であるべきである。好ましい態様は、懸濁媒体が、フルオロケミカル、フルオロカーボン（他のハロゲンで置換されたものを含む）、パーフルオロカーボン、フルオロカーボン／炭化水素ジブロック、炭化水素、アルコール、エーテルまたはそれらの組み合わせから成る群から選ばれた懸濁媒体を含む。懸濁媒体は、特定の特性を付与するために選ばれた種々の化合物の混合物を含むことができると認識されるであろう。
【０１９４】
ここでの教示に従って、懸濁媒体は、炭化水素、フルオロカーボンまたは炭化水素／フルオロカーボンジブロックを含む多くの異なる化合物の任意の一つを含むことができる。一般に、考えられる炭化水素または高度にフッ素化されたパーフルオロ化された化合物は、線状または分岐または環式、飽和または不飽和の化合物であることができる。これらのフルオロケミカルと炭化水素の従来の構造上の誘導体も、本発明の範囲内にあると考えられる。これらの全くまたは部分的にフッ素化された化合物を含む選ばれた態様は、１以上のヘテロ−原子および／又は臭素または塩素の原子を含むことができる。好ましくは、これらのフルオロケミカルは、２〜１６個の炭素原子を含み、（これらに制限されないが）線状、環式または多環パーフルオロアルカン、ビス（パーフルオロアルキル）アルケン、パーフルオロエーテル、パーフルオロアミン、パーフルオロアルキルブロミドおよびパーフルオロアルキルクロリド（例えばジクロロオクタン）を含む。懸濁媒体に用いられる特に好ましいフッ素化合物は、パーフルオロオクチルブロミドＣ８Ｆ１７Ｂｒ（ＰＦＯＢまたはパーフルブロン）、ジクロロフルオロオクタンＣ８Ｆ１６Ｃｌ２、およびヒドロフルオロアルカン、パーフルオロオクチルエタンＣ８Ｆ１７Ｃ２Ｈ５（ＰＦＯＥ）を含むことができる。他の態様に関して、パーフルオロヘキサンまたはパーフルオロペンタンの懸濁媒体としての使用は、特に好ましい。
【０１９５】
より一般的には、本発明における使用が考えられる例示的なフルオロケミカルは、ハロゲン化されたフルオロケミカル（すなわち、ＣｎＨ２ｎ＋１Ｘ、ＸＣｎＦ２ｎＸ、（式中、ｎ＝２〜１０、Ｘ＝Ｂｒ、ＣｌまたはＩ））、および特に、１−ブロモ−Ｆ−ブタン、ｎ−Ｃ４Ｆ９Ｂｒ、 １−ブロモ−Ｆ−ヘキサン（ｎ−Ｃ６Ｆ１３Ｂｒ）、１−ブロモ−Ｆ−ヘプタン（ｎ−Ｃ７Ｆ１５Ｂｒ）、 １，４−ジブロモ−Ｆ−ブタンおよび１，６−ジブロモ−Ｆ−ヘキサンを含む。他の有用な臭素化されたフルオロケミカルは、Ｌｏｎｇへの米国特許第３，９７５，５１２号に開示され、これを参照することによりここに取り込む。パーフルオロオクチルクロリド（ｎ−Ｃ８Ｆ１７Ｃｌ）、１，８−ジクロロ−Ｆ−オクタン（ｎ−ＣｌＣ８Ｈ１６Ｃｌ）、１，６−ジクロロ−Ｆ−ヘキサン（ｎ−ＣｌＣ６Ｆ１２Ｃｌ）、 および１、４−ジクロロ−Ｆ−ブタン（ｎ−ＣｌＣ４Ｆ８Ｃ１）等のクロリド置換基を有する特定のフルオロケミカルも好ましい。
【０１９６】
エステル、チオエーテルおよびとアミン等の他のリンケージを含むんで、ハロゲン化フルオロケミカル、フルオロカーボン、フルオロカーボン−炭化水素化合物も、本発明における懸濁媒体としての使用に適している。例えば、一般式 ＣｎＦ２ｎ＋１ＯＣｍＦ２ｍ＋１、またはＣｎＦ２ｎ＋１ＣＨ＝ＣＨＣｍＦ２ｍ＋１、（式中、ｎ およびｍは同一または異なり、ｎおよびｍは約２〜約１２の整数である）を有する化合物（例えば、Ｃ４Ｆ９ＣＨ＝ＣＨＣ４Ｆ９（Ｆ−４４Ｅ）、ｉ−Ｃ３Ｆ９ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｆ１３（Ｆ−ｉ３６Ｅ）、 およびＣ６Ｆ１３ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｆ１３（Ｆ−６６Ｅ）として）は、ここでの教示と適合性を有する。有用なフルオロケミカル炭化水素ジブロックおよびトリブロック化合物は、一般式ＣｎＦ２ｎ＋１−ＣｍＦ２ｍ＋１、またはＣｎＦ２ｎ＋１−ＣｍＦ２ｍ−１（式中、ｎ＝２〜１２；ｍ＝２〜１６）、またはＣｐＦ２ｐ＋１−ＣｎＦ２ｎ−ＣｍＦ２ｍ＋１ （式中、ｐ＝２〜１２；ｍ＝１〜１２；ｎ＝２〜１２）を有するものを含む。このタイプの好ましい化合物は、Ｃ８Ｆ１７Ｃ２Ｈ５、Ｃ６Ｆ１３Ｃ１０Ｈ２１、Ｃ８Ｆ１７Ｃ８Ｈ１７、Ｃ６Ｆ１３ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｈ１３、 およびＣ８Ｆ１７ＣＨ＝ＣＨＣ１０Ｈ２１を含む。置換されたエーテルまたはポリエーテル（すなわち、ＸＣｎＦ２ｎＯＣｍＦ２ｍＸ、ＸＣＦＯＣｎＦ２ｎＯＣＦ２Ｘ（式中ｎ、およびｍ＝１〜４、Ｘ＝Ｂｒ、ＣｌまたはＩ）、およびフルオロケミカル−炭化水素エーテルジブロックまたはトリブロック（すなわち、ＣｎＦ２ｎ＋１−Ｏ−ＣｍＦ２ｍ＋１Ｈ（式中、ｎ＝２〜１０；ｍ＝２〜１６）、ＣｐＦ２ｐ＋１−Ｏ−ＣｍＦ２ｍ−Ｏ−ＣｐＦ２ｐ＋１ （式中、ｐ＝２〜１２；ｍ＝１〜１２；ｎ＝２〜１２）も、ＣｎＦ２ｎ＋１−Ｏ−ＣｎＦ２ｎ−Ｏ−ＣｍＦ２ｍ＋１ （式中、ｎ、ｍおよびｐは、１〜１２である）と同様に使用できる。更に、応用に応じて、パーフルオロアルキル化エーテルまたはポリエーテルは、クレームされたディスパージョンと適合性を有することができる。
【０１９７】
Ｃ１０Ｆ１８等の多環および環式フルオロケミカル（例えばＦ−デカリンまたはパーフルオロデカリン）、パーフルオロパーヒドロフェナントレン、パーフルオロテトラメチルシクロヘキサン（ＡＰ−１４４）およびパーフルオロ−ブチルデカリンも、本発明の範囲内にある。追加的な有用なフルオロケミカルは、Ｆ−トリプロピルアミン（「ＦＴＰＡ」）およびＦ−トリブチルアミン（「ＦＴＢＡ」）、Ｆ−４−メチルオクタヒドロキノリジン（「ＦＭＯＱ」）、Ｆ−Ｎ−メチルデカヒドロイソキノリン（「ＦＭＩＱ」）、Ｆ−Ｎ−メチルデカヒドロキノリン（「ＦＨＱ」）、Ｆ−Ｎ−シクロヘキシルピロリジン（「ＦＣＨＰ」）およびＦ−２−ブチルテトラヒドロフラン（「ＦＣ−７５」または「ＦＣ−７７」）等のパーフルオロ化アミンを含む。更に他の有用なフッ素化合物は、パーフルオロフェナントレン、パーフルオロメチルデカリン、パーフルオロジメチルエチルシクロヘキサン、パーフルオロジメチルデカリン、パーフルオロジエチルデカリン、パーフルオロメチルアダマンタン、パーフルオロジメチルアダマンタンを含む。パーフルオロオクチルハイドライド等の非フッ素置換基を有する他の考えられるフルオロケミカル、および異なる数の炭素原子を有する類似化合物も、有用である。当業者は、他の種々に修飾されたフルオロケミカルが、本出願で用いるようなフルオロケミカルの広い定義内に包含され、本発明における使用に適当していることを更に認識するであろう。従って、本発明の安定化ディスパージョンを形成するために、前述の化合物の各々が単独で、または他の化合物との組み合わせで使用できる。
【０１９８】
懸濁媒体として有用な可能性がある追加的な例証的なフルオロカーボンまたはフッ素化合物のクラスは、（これらに制限されないが）フルオロヘプタン、フルオロシクロヘプタン、フルオロメチルシクロヘプタン、フルオロヘキサン、フルオロシクロヘキサン、フルオロペンタン、フルオロシクロペンタン、フルオロメチルシクロペンタン、フルオロジメチルシクロペンタン、フルオロメチルシクロブタン、フルオロジメチルシクロブタン、フルオロトリメチルシクロブタン、フルオロブタン、フルオロシクロブタン、フルオロプロパン、フルオロエーテル、フルオロポリエーテル、およびとフルオロトリエチルアミンを含む。このような化合物は、一般に環境的に健全で、生物学的に非反応性である。
【０１９９】
エネルギーの印加の際にエアロゾルを製造できる任意の液体もネブライザーとともに使用可能である、選ばれた懸濁媒体は、約５０６，６２５Ｐａ（５気圧）未満、より好ましくは約２０２，６５０Ｐａ（２気圧）未満の蒸気圧を好ましくは有するであろう。特に明記しない限り、ここで記述される全ての蒸気圧は、２５℃で測定される。他の態様において、好ましい懸濁媒体化合物は、約６６６．６Ｐａ〜約１０１，３２５Ｐａ（約５Ｔｏｒｒ〜約７６０Ｔｏｒｒ）のオーダーの蒸気圧を有し、より好ましい化合物は、約１０６７Ｐａ〜約７９９９３Ｐａ（約８Ｔｏｒｒ〜約６００Ｔｏｒｒ）のオーダーの蒸気圧を有し、とりわけ好ましい化合物は約１３３３Ｐａ〜約４６６３Ｐａ（約１０Ｔｏｒｒ〜約３５０Ｔｏｒｒ）のオーダーの蒸気圧を有する。このような懸濁媒体は、効果的な換気療法を与えるために圧縮空気ネブライザー、超音波ネブライザーまたは機械的アトマイザーとともに使用可能である。分散された生物活性剤の安定性または生体利用性を更に強化するた選ばれた特定の物理的特性を有する懸濁媒体を与えるために、より揮発性の化合物を、より低い蒸気圧の成分に混合することができる。
【０２００】
ネブライザーに向けられる本発明の他の態様は、周囲の条件（すなわち１気圧）下で、選ばれた温度で沸騰する懸濁媒体を含む。例えば、好ましい態様は、０℃より上、５℃より上、１０℃より上、１５℃より上、または２０℃より上で沸騰する懸濁媒体化合物を含むであろう。他の態様において、懸濁媒体化合物は、２５℃以上で、または３０℃より上で沸騰することができる。更に、他の態様において、選ばれた懸濁媒体化合物は、ヒト体温（すなわち３７℃）以上で、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃、８５℃、または１００℃より上で沸騰することができる。
【０２０１】
Ｆ（ｖ）．直接投与
【０２０２】
ＭＤＩおよびネブライザーとともに、本発明の安定化ディスパージョンは、種々の経路を用いて種々の標的サイトに、生物活性剤を投与するために使用可能と認識されるであろう。例えば、開示された組成物は、液体の用量点滴注入（ＬＤＩ）技術とともに、直接肺にデリバリーすることができる。代わりに、安定化ディスパージョンは、鼻ポンプ、スプレーボトルまたはアトマイザーを用いて鼻道における粘膜の表面に効果的にデリバリーすることができた。まだ他の態様において、開示されたディスパージョンは、従来の注入を用いて、または圧縮ガスを用いる針無しのインジェクターにより、標的サイトに（例えば筋肉内に、または皮膚内に）投与することができた。後者は、針無しの接種の場合に特に好ましい。更に他の態様は、眼または耳等、またはより好ましくは、泌尿生殖器管または胃腸管におけるそれら等の粘膜表面の標的サイトへのディスパージョンの局所的デリバリーに向けられる。このような技術は、取り込まれた生物活性剤の透過を強化するために更にイオン泳動を使用することができる。いずれにせよ、安定化ディスパージョンは取り込まれた剤の活性を保存しつつ、優れた用量再現性を与える。
【０２０３】
当業者は、前記のデリバリー技術と適合性を有する懸濁媒体が、ネブライザーとの使用に対して上述したものと同様であることを認識するであろう。すなわち、安定化ディスパージョンは、フルオロケミカル、フルオロカーボン（他のハロゲンで置換されたものを含む）、パーフルオロカーボン、フルオロカーボン／炭化水素ジブロック、炭化水素、アルコール、エーテルまたはそれらの組み合わせからなる群から選ばれた懸濁媒体を好ましくは含む。特に好ましくは、本出願の目的のために、このようデリバリー技術のための適合性を有する懸濁媒体は、ネブライザーでの使用とともに受器で列挙されたものと同等である。特に好ましい態様において、選ばれた懸濁媒体は、周囲の条件下の液体であるフルオロケミカルを含む。
【０２０４】
更に、液体の用量点滴注入が、安定化ディスパージョンの肺への直接の投与を含むと認識すべきである。この点について、生物活性な化合物の直接の肺投与は、特に、肺の疾患部分の貧弱な血管循環が静脈内薬物デリバリーの有効性を低減するような、疾患の治療において特に効果的である。ＬＤＩに関して、安定化ディスパージョンは、部分的な液体換気または全体の（ｐｌｕｍｏｎａｒｙ）液体換気とともに好ましくは使用される。更に、本発明は、投与より前の、投与の間の、またはその後の薬剤微粒ディスパージョン内への生理学的に許容可能なガス（例えば一酸化窒素または酸素）の治療上有益な量を導入することを更に含むことができる。
【０２０５】
ＬＤＩのために、本発明のディスパージョンは、肺デリバリー導管を用いて、肺に投与することができる。当業者は、ここで用いるように、用語「肺デリバリー導管」が、肺内への液体の点滴注入または投与を与える任意の器具または装置またはそれらの部分を含むように、広義に解釈されると認識するであろう。この点で、肺デリバリー導管またはデリバリー導管は、それを必要とする際の患者の少なくとも肺気道の部分に、開示されたディスパージョンの投与または点滴注入を与える任意のボア、ルーメン、カテーテル、チューブ、導管、シリンジ、作動装置、マウスピース、気管内チューブまたは気管支鏡を意味するように維持される。デリバリー導管は、液体換気機またはガス換気機を伴ってもよく、または伴わなくてもよいと認識されるであろう。特に好ましい態様において、デリバリー導管は、気管内チューブまたは気管支鏡を含む。
【０２０６】
本発明の安定化ディスパージョンは患者の肺の機能的残気量（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）まで投与することができるが、選ばれた態様は、遙かに小さい体積（例えば１ミリリットル以下のオーダー）の肺の投与を含むと認識されるであろう。例えば、治療されるべき疾患に依存して、投与される体積は、１、３、５、１０、２０、５０、１００、２００または５００ミリリットルのオーダーであることができる。好ましい態様において、液体の体積は、０．２５または０．５パーセントＦＲＣ未満である。特に好ましい態様のために、液体の体積は、０．１パーセントＦＲＣ以下である。安定化ディスパージョンの比較的少ない体積の投与に関して、懸濁媒体（特にフルオロケミカル）の湿潤性およびスプレッド特性が肺における活性剤の一様な分布を容易にすると認識されるであろう。しかしながら、他の態様において、０．５を超える、０．７５または０．９パーセントＦＲＣより大きい体積のディスパージョンを投与することは、好ましい可能性がある。もちろん、少なくともいくつかのフルオロケミカルに伴う非凡な湿潤およびスプレッド特性は、鼻道等の他の粘膜の表面への投与に関して、それらを特に適合性にさせる。
【０２０７】
ここで開示される粉体および安定化とディスパージョンに関して、当業者は、それらが滅菌され、プレパッケージされたキット形で、医師または他の健康管理の専門家に有利に供給することができると認識するであろう。より具体的には、すぐ患者に投与できる安定粉体、または予め形成されたディスパージョンとして、処方を供給することができる。逆に、別個の、すぐ混合できる複数の成分として、それらを提供することもできる。すぐ使用できる形で提供された際には、粉体またはディスパージョンは、一回使用の容器またはリザーバで、並びに多数回使用の容器またはリザーバでパッケージすることができる。いずれにせよ、容器またはリザーバは、こで記述されるように、選ばれた吸入または投与器具と組み合わせることができ、且つ用いることができる。個々の成分として（例えば、粉体状ミクロスフェアとして、およびニートな懸濁媒体として）提供された際には、次いで、いつでも使用前に指示されたように容器内の内容物を単に組み合わせることによって、安定化された製剤を形成できる。加えて、ユーザーが必要に応じてそれらを次いで投与することができるように、このようなキットは、すぐに混合できる多くプレ包装された投与ユニットを含むことができる。
【０２０８】
Ｇ．例
【０２０９】
上記の記述は、以下の例を参照することにより、より充分に理解されるであろう。このような例は、しかしながら、本発明を実施する好ましい方法の単なる代表的なもののみであって、いかなる方法でも、本発明の範囲を制限することと読まれ、または解釈されるべきではない。
【０２１０】
Ｉ．スプレードライによるＨＡペプチドの中空多孔質粒子の製造
【０２１１】
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：５１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術によって、中空多孔性のＨＡ１１０−１２０ペプチド（インフルエンザウィルス粒子の赤血球凝集素のアミノ酸残基１１０〜１２０）粒子（「プルモ・スフィア」（ＰｕｌｍｏＳｈｅｒｅｓ；商標））を製造した。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。粒子収集を助長するためにサイクロン出口ポートに、１５０メッシュのステンレス鋼スクリーンを置いた。
【０２１２】
製剤Ａ：ｌ８ｍｇのＨＡ１１０〜１２０のペプチド（カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）社、エメリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、カリフォルニア州）と、ｌｍｇのヒドロキシエチル澱粉（味の素、日本）とを溶解するために、５ｇの脱イオン水を用いた。
【０２１３】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質（０．３ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を、３３ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝５０〜６０℃）中でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型）を８０００ ｒｐｍで２〜５分間（Ｔ＝６０〜７０℃）用いて均質にした。８グラムのパーフルブロン（パーフルオロオクチルブロミド：アトケム（Ａｔｏｃｈｅｍ）、パリ、フランス）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２１４】
製剤Ｂの８分の１を分離し、製剤Ａに添加した。得られたＨＡペプチド／パーフルブロンのエマルションフィード溶液を、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。粉体をサイクロンで集め、篩分けスクリーンを、パーフルブロンを用いて収集ジャー内に洗浄した。パーフルブロン中のＨＡ懸濁液を、その後−６０℃で凍結させ、凍結乾燥した。易流動性（ｆｒｅｅ ｆｌｏｗｉｎｇ）の白い粉体を得た。
【０２１５】
ＩＩ．ＨＡペプチドを含む中空多孔質微粒子のインビトロ活性
【０２１６】
プルモ・スフィア（ＨＡ−Ｐｕｌ）でのＨＡペプチドの、抗原を現出している細胞を活性化する機能性を、ニートなＨＡペプチドと比較した。例ｌからのＨＡペプチドのプルモ・スフィアを、５ｍｇ／ｍｌ（処方の重量／体積）の濃度で、滅菌ＰＢＳでインキュベートした。得られたＨＡ−Ｐｕｌ−ＰＢＳ溶液のシリアル希釈を、完全ＲＰＭＩ−ｌ０％ＦＣＳ中のＭｌ２抗原を現出している細胞（１×１０４／ウェル）およびＨＡ特異的ＴｃＨ（２×１０４／ウェル）を含むマイクロウェルに添加した。ＴｃＨセルラインは、ＩＬ−２プロモータ（ＩＬ−２／−ｇａｌ）によって制御されるリポーター遺伝子を有する。
【０２１７】
３７℃で１２時間のインキュベーションの後、マイクロウェルプレートを遠心分離し、パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒドで細胞を４℃、５分間で固定して、ＰＢＳで洗浄し、Ｘ−ｇａｌ基質を一晩中加えた。ウェルあたり５００個の細胞につき活性ＴｃＨの数を、光学顕微鏡を用いてカウントした。ウェルあたりの活性ＴｃＨの総数は、細胞の総数に青い細胞のパーセンテージを掛けることによって見積もった。図１に示す結果は、処方中の活性ペプチドの存在を示す。標準の活性化曲線（ＨＡ食塩水（ｓａｌｉｎｅ））による比較は、活性ペプチドの濃度が約５％質量／質量（重量／重量）であることを示し、それは逆相−ＨＰＬＣ測定と一致した。
【０２１８】
ＩＩＩ．ＨＡペプチドプルモスフィアの作用のメカニズム
【０２１９】
Ｔ細胞エピトープＨＡ１１０−１２０（ＨＡ−Ｐｕｌ）を含むプルモ・スフィアミクロ粒子の内面化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）およびプロセシングの必要性を検討した。パーフルブロン中に懸濁されたＨＡ−Ｐｕｌ（５００ｎＭ／ウェル  ＨＡ１１０化１２０のペプチド）を風乾（ａｉｒ−ｄｒｉｅｄ）し、および非固定、またはパラホルムアルデヒド固定のＭ１２抗原現出細胞（ＡＰＣ）細胞と、完全ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中の特異的ＴｃＨ細胞の存在下でインキュベートし、および同様の濃度でＰＢＳ中に懸濁されたＨＡ−Ｐｕｌ、およびニートなＨＡペプチドと比較した。それが細胞内プロセシングを必要とする（ｄｏｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｑｕｉｒｅ）ことから、ショ糖−精製したＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウィルス（１５ｇ／ｍｌ）をポジティブ対照として使用した。ネガティブ対照は、ＮＰ１４７−１５５ペプチドと、処方されていないＮＰペプチドと、無関係な無関係なウィルスとからなっていた。例ＩＩにおいて記述した細胞の数および成長条件が、続いた。細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌ基質にさらした。結果を、活性ＴｃＨｌの％として表した。
【０２２０】
図２は、固定した、および非固定のＡＰＣが、ニートなＨＡペプチドとＨＡＰｕｌを現出できたことを示す。対照的に、生存ＡＰＣのみが、ウィルス性状況からＨＡペプチドを現出することができた。更に、処方された、およびニートなＮＰペプチド、並びにＢ／Ｌｅｅウィルスは、特異的ＴｃＨを活性化しなかった。結果は、ＨＡ−Ｐｕｌの内面化およびプロセシングが、ＴｃＨの活性化の必要条件でないことを示す。むしろ、ＨＡ−ペプチドは、容易にプルモ・スフィアから放出され、Ｍ１２  ＡＰＣ上でＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉ−Ｅｄ ）に結合して、ＴＣＲのエンゲージメントおよびＴｃＨの活性化を生じる。このプロセシングステップを、ＰＢＳまたはパーフルブロン中でデリバリーされたＨＡ−Ｐｕｌ、並びにニートなＨＡペプチドに対して観察した。更に、これらの結果は、プルモ・スフィア中で処方され、パーフルブロン中で安定化されたＨＡ  １１０−１２０のペプチドが、その免疫原性を保持することを証明する。
【０２２１】
ＩＶ．スプレードライによる蛍光ラベルした中空多孔質ＨＡペプチド粒子の製造
【０２２２】
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：５１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術によって、中空多孔性のＨＡ−フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）１１０−１２０ペプチド／テキサスレッドＤＨＰＥ粒子を製造した。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。粒子収集を助長するためにサイクロン出口ポートに、１５０メッシュのステンレス鋼スクリーンを置いた。
【０２２３】
製剤Ａ：２０ｍｇのＨＡ−フルオロセイン  １１０〜１２０のペプチド（カイロン社、エメリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、カリフォルニア州）と、ｌｍｇのヒドロキシエチル澱粉（味の素、日本）とを溶解するために、５ｇの脱イオン水を用いた。
【０２２４】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質（０．３ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）、および０．３ｍｇの蛍光色素、テキサスレッドＤＨＰＥ（モレキュラープローブ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、３ｍｇ）を、先ずクロロホルムに溶解した。クロロホルムを、次いでＢｕｃｈｉ ＲｏｔｏＶａｐ を用いて除去した。そのＥｌ００−３／テキサスレッドＤＨＰＥ薄膜を、次いで３３ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝６０〜７０℃）中に分散させた。その界面活性剤を、更に、でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型）を１０，０００ｒｐｍ で約２分間（Ｔ＝５０〜６０℃）用いてプロセシングした。８グラムのパーフルブロン（アトケム、パリ、フランス）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２２５】
製剤Ｂの８分の１を分離し、製剤Ａに添加した。得られたＨＡペプチド／テキサスレッドＤＨＰＥ／パーフルブロンのエマルションフィード溶液を、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。粉体をサイクロンで集め、篩分けスクリーンを、パーフルブロンを用いて収集ジャー内に洗浄した。パーフルブロン中のＨＡ懸濁液を、その後−６０℃で凍結させ、凍結乾燥した。易流動性の蛍光フクシア色の粉体を得た。
【０２２６】
Ｖ．蛍光ラベルしたＨＡプルモスフィアの生体利用性
【０２２７】
例ＩＶのように製造したフルオロセイン−ＨＡペプチド（２０％質量／質量（重量／重量％））を、パーフルブロン中に懸濁した。メトファン（Ｍｅｔｏｆａｎ）麻酔したマウスを、７０ｇのペプチド用量に対応する、パーフルブロン中のｆ−ＨＡＰｕｌの７０  ｌ体積で、鼻内に（ｉ．ｎ．）接種した。血液サンプルを目ブリージングによってヘパリン処理チューブ内に集め、血漿を分離し、ペプチドの濃度を蛍光分析で測定した。対照として、滅菌食塩水（全ての群に対してｎ＝４）の７０  ｌ中の７０ｇのｆ−ＨＡペプチドの静脈内（ｉ．ｖ．）接種を使用した。
【０２２８】
図３は、時間に対するｆ−ＨＡペプチドの血清濃度を示す。ｉ．ｎ．−デリバリーされたｆ−ＨＡペプチドの絶対生体利用性は約５％であり、Ｔｍａｘ は２０分で生じた。ｉ．ｖ．投与に対する連続的な対数的減少と、ｉ．ｎ．投与の場合の一過性の増大と、後に続く指数関数的な減少で、薬物動態的なプロフィルは２つの投与経路の間で異なっていた。６時間までの総クリアランスで、ｆ−ＨＡの除去は、尿（図示しない）を介して生ずる。
【０２２９】
この例は、Ｐｕｌ中で処方されたＴ細胞エピトープ（約１．４ｋＤａの分子量）のｉ．ｎ．投与が全身性デリバリーと適合性を有することを示す。
【０２３０】
ＶＩ．スプレードライによるヒトＩｇＧ中空の多孔質微粒子の製造
【０２３１】
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：６１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術によって、中空多孔性のヒトＩｇＧ粒子を製造した。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。
【０２３２】
製剤Ａ：５５ｍｇのヒトＩｇＧ（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）と、３．２ｍｇのヒドロキシエチル澱粉（味の素、日本）とを溶解するために、２ｍｇの正常食塩水（バクスター、シカゴ、イリノイ州）を用いた。
【０２３３】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質、０．４１５ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を、４０．３ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝５０〜６０℃）中でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型） を８０００ｒｐｍで２〜５分間（Ｔ＝６０〜７０℃）用いて均質にした。５．２ｇのパーフルブロン（アトケム、パリ、フランス）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２３４】
製剤Ｂの８分の１を分離し、製剤Ａに添加した。得られたＩｇＧ／パーフルブロンのエマルションフィード溶液を、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。粉体をサイクロンで集め、篩分けスクリーンを、パーフルブロンを用いて収集ジャー内に洗浄した。パーフルブロン中のＩｇＧ懸濁液を、その後−６０℃で凍結させ、凍結乾燥した。易流動性の白い粉体を得た。中空多孔性のＩｇＧ粒子は、飛行時間型の分析法（Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ、Ａｍｈｅｒｓｔ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、マサチューセッツ州） によって決定された２．３７３±１．８８μｍの体積−重み平均空気力学的直径を有していた。
【０２３５】
ＶＩＩ．  ポリクローナル性ヒトＩｇＧプルモ・スフィアのインビトロ活性
【０２３６】
例ＩＶからのポリクローナル性ヒトＩｇＧプルモ・スフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ）の処方を、捕捉ｈＩｇＧ酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて活性について確認した。パーフルブロン中の５ｍｇ／ｍＬのｈＩｇＧ−ＰｕＬ懸濁液を製造し、ウェル中へピペットで移し、風乾した。ＰＢＳを乾燥したｈＩｇＧ−Ｐｕｌに添加して、一晩中をインキュベートさせた。水和されたｈＩｇＧ−Ｐｕｌ溶液を希釈して、コーティング緩衝剤（ｄｉｌ．１：１０００、シグマ・イムノケミカル）中のマウス抗ヒトｋ鎖モノクローナル抗体でコートした酵素免疫吸着測定法プレート移し、その後、１５％のヤギ血清を含むＰＢＳで室温、２時間でブロックした。ウェルを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼのコンジュゲート（ＰＢＳ−１５％ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ中、１：１０００）を用い、その後ｐＮＰＰ基質を添加することによりアッセイを行った。４０５ｎｍに設定した自動プレートリーダーを用いて、光学濃度（ＯＤ）を読んだ。食塩水（標準）中のｈＩｇＧ、およびブランクのプルモ・スフィアと混合したｈＩｇＧを、アッセイ上での脂質の効果を除外するための対照として使用した。ブランクのプルモ・スフィアは、リン脂質とデンプンのみから成っていた。
【０２３７】
図４は、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ、ｈＩｇＧおよびｈＩｇＩＧ＋ブランクのプルモ・スフィアのためのキャリブレーション曲線を示す。ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ処方は、約２０質量％（重量％）のｈＩｇＧを含むと決定された。加えて、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌは、ｋ軽鎖および重鎖エピトープの発現を保持した。
【０２３８】
ＶＩＩＩ．プルモスフィア処方からのＨＡ１１０−１２０ペプチドおよびヒトＩｇＧの溶解動態
【０２３９】
プルモ・スフィアからの抗原およびｈＩｇＧ放出の動態を、０．ｌｕｍ直径フィルタを備えた溶解チャンバと、適合した２４ウェル平底セル培養プレートを用いて測定した。例ｌおよびＶＩからのプルモ・スフィア粉体の約３ｍｇを、溶解チャンバの下部コンパートメントに配置して、同時に滅菌ＰＢＳにさらした（１．３ｍ１／ウェル）。呼吸パターンをシミュレーションするために、プレートを３７℃で水平の振盪機（３０ＲＰＭ）上に配置した。２５μｌサンプルを、上部コンパートメントから集め、ｈＩｇＧの場合の捕捉ＥＬＩＳＡ（図５Ａ）、またはフルオロセインでラベルしたＨＡペプチド処方（ｆ−ＨＡ）の場合のバイオアッセイ（図５Ｂ）で分析した。ｆ−ＨＡに対する結果を、蛍光分析（図示せず）によって独立に確認した。ｈＩｇＧおよびＨＡペプチドプルモ・スフィアの溶解動態を、それらのそれぞれの水性対照と比較した。
【０２４０】
図５Ａおよび５Ｂに示す結果は、パーセント放出として表した。迅速な拡散制御の放出は、ＨＡペプチド処方に対して観察され、水性対照との間の差違は無かった。完全溶解は、２時間以内に生じた。対照的に、より遅い浸食制御動態は、ｈＩｇＧに対して観察された。完全溶解は、水のＩｇＧ対照に対する１時間と比較して、６時間より長い時間を必要とした。ここで記述した結果は、プルモ・スフィアからの溶解動態が、少なくとも部分的に、処方された化合物の分子量（それぞれ、１．４ｋＤａおよび１５０ｋＤａ）に依存することを証明する。それはまた、親水性および疎水性における差違は、同様の効果を有する可能性があることが認識されるであろう。
【０２４１】
ＩＸ．  ｈＩｏＧプルモスフィアの生体利用性
【０２４２】
ケタミン／キシラジンで麻酔されたマウスに気管内で（２０  ｌのパーフルブロン中の２０ｇのｈＩｇＧ）、またはメトファンで麻酔されたマウスへ鼻ルートで（７０μｌのパーフルブロン中の７０ｇｈＩｇＧ）を介して、例ＶＩからのヒトＩｇＩＧプルモスフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌを）を投与した。滅菌ＰＢＳ中のｈＩｇＧの同一の体積を、対照群において静脈内投与した。種々の時間的間隔でマウスから血を抜き取り、およびｈＩｇＧの血清濃度を全ての群（ｎ＝３）で、捕捉酵素免疫吸着測定法によって評価した。ｉ．ｖ．対照と比較した血清濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下で面積から、絶対生体利用性を決定した。ＡＵＣ値は、台形法則を用いて計算した。
【０２４３】
血漿ｈＩｇＧ濃度曲線を、図６Ａ（ｉ．ｔ．）、および図６ＧＢ（ｉ．ｎ．）に示す。ｈＩｇＧ−Ｐｕｌの気管内デリバリーに対する絶対生体利用性は２７％であり、鼻腔内接種に対しては１．５％であった。両方の場合とも、Ｔｍａｘは、約２日で生じた。ウエスタンブロッティングは、気道を介するデリバリー後の循環するｈＩｇＧに対する分子量が、ニートな材料から区別できないことを示した。そのｈＩｇＧは、１４日を越える循環において持続することが観察された。
【０２４４】
Ｘ．気管の経路を介してデリバリーされたｈＩｇＧプルモスフィアへの抗体応答
【０２４５】
パーフルブロン中に懸濁された、例ＶＩからのｈＩｇＧ−プルモ・スフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ）で処理されたマウスにおける気管内投与（ｈＩｇＧの２０ｇ用量）を介する血液および気管支・肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の液の応答。マウスを、以下の対照でも処理した：食塩水中の２０μｇのｈＩｇＧ、ｉ．ｔ．；１食塩水中の１００μｇのｈＩｇＧ、ｉ．ｖ．およびｉ．ｔ．；完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇ、皮下、および食塩水、ｉ．ｔ．。個々の群を、三重実験（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。血液およびＢＡＬを、免疫化の２週後に集めた。
【０２４６】
抗原ｈＩｇＧ−マウスＩｇＧのタイターを、ｈＩｇＧまたは０．１％のＢＳＡでコートした酵素免疫吸着測定法プレートを用いて測定した。ウェルを、ＰＢＳ−１５％ヤギ血清でブロックして、血清またはＢＡＬの種々の希釈を用いて２時間インキュベートした。洗浄の後、抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼのコンジュゲート、およびこれに続くＰＮＰＰ基質の添加により、アッセイを行った。およびが続いた。プレートの光学濃度（ＯＤ）を、自動プレートリーダーを用いて５５０ｎｍで分析し、および結果を血清ＩｇＧの場合（図７Ａ）終点希釈タイターとして、またはＢＡＬ  ＩｇＧ（図７Ｂ）に対する平均ＯＤとして表した。
【０２４７】
これらの結果は、食塩水中でｈＩｇＧを受けた用量／経路を調和させた群と比較して、気管内経路を介してｈＩｇＧ−Ｐｕｌで処理しるマウスにおける、増大した全身性および局所的な液性の応答を示す。更に、気管内または静脈内経路を介して、食塩水中のｈＩｇＧのより高い用量を受けたマウスと比較して、応答が強化された。血清抗体のタイターは、ＣＦＡ中のｈＩｇＧでｓ．ｃ．免疫したマウスで測定されたものと同様であった。興味あることに、液性の応答は全身の生体利用性（データ示さず）と相関せず、局所免疫の関与を暗示した。
【０２４８】
ＸＩ．気管の経路を介してデリバリーされたｈＩｇＧプルモスフィアへのＴ細胞応答
【０２４９】
パーフルブロン中に懸濁された、例ＶＩからのｈＩｇＧ−プルモ・スフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ）により気管経路で免疫されたマウスの脾臓において誘導されたＴ細胞免疫のレベル。脾臓を単細胞懸濁に分離し、赤血球を除去するために低張緩衝剤で処理した。脾細胞を、４×１０６細胞／ｍｌで完全ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中に再懸濁し、２４−ウェルの平底プレート（１ｍｌ／ウェル）中で、６ｇ／ｍｌのｈＩｇＧの存在下でインキュベートした。７２時間のインキュベーションの後、上澄みを集め、酵素免疫吸着測定法（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）インターナショナル、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ 、カリフォルニア州）によって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−およびＩＬ−４の濃度を決定した。
【０２５０】
結果（図８）は、各群での個々のマウスの中のサイトカイン濃度の平均値として表され、ｈＩｇＧ食塩水対照と比較して、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌで免疫したマウスにおける全３個のサイトカインの強化された産生を示した。ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ処理した群に対する脾臓Ｔ細胞によるサイトカインの産生は、食塩水中のｈＩｇＧのｉ．ｖ．群に対して観察されたそれに匹敵した。これらの結果は、肺で活性化された記憶Ｔ細胞の全身性移行を強く示唆する。
【０２５１】
ＸＩ．鼻経路を介してデリバリーされたｈＩｇＧプルモスフィアへの抗体応答
【０２５２】
パーフルブロン中に懸濁され、または食塩水に溶解された例ＶＩからのプルモ・スフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ）として処方されたいずれかの鼻腔内滴下（２０ｇ）を介してｈＩｇＧを受けたマウスの液性の応答を確認した。免疫化後の種々の時間的間隔で血清を得て、ｈＩｇＧに対する特異的マウスＩｇＧのタイターを、例Ｘで記述した酵素免疫吸着測定法の手順を用いた測定した。それらの結果（図９）は、平均の終点タイター（ｎ＝３）として表され、食塩水と比較して、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌで処理したマウスにおける開始の動態がより速く、大きさが高く、免疫応答の被検体間（ｉｎｔｅｒｓｕｂｊｅｃｔ）再現性がより低いことを示した。
【０２５３】
ＸＩＩＩ．腹膜経路を介してデリバリーされたｈＩｇＧプルモ・スフィアへの抗体応答
【０２５４】
パーフルブロン中に懸濁された例ＶＩからのｈＩｇＧ−プルモ・スフィア（ｈＩｇＧ−Ｐｕｌ）で、腹膜（ｉ．ｐ．）経路（ｈＩｇＧの１００ｇ用量）を介して処理したマウスの体液性応答。マウスを、以下の対照でｌ００μｇのｈＩｇＧでもｉ．ｐ．処理した：食塩水中、多重膜ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）リポソーム食塩溶液（＋ｍｌ  ｌｉｐ）中、単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）ＤＰＰＣリポソーム食塩溶液（＋ｕｌ  ｌｉｐ）中、およびブランクのプルモ・スフィア食塩溶液（＋ｅｍｐｔｙ  Ｐｕｌ）中。ｈＩｇＧが全くないブランクのプルモ・スフィア溶液の追加的な対照群をも、テストした。ｍｌ ｌｉｐ（＞ｌ０μｌ）およびｕｌ ｌｉｐ（９０ｎｍ）の粒子メジアン径を、レーザ光散乱技術を用いて決定した。各群を、三重実験で行った。例Ｘと同じ酵素免疫吸着測定法技術を用いて、血清中のＩｇＧ体液免疫応答を７日および１４日で測定した。
【０２５５】
結果は終点タイターの平均として表され、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌで接種された動物に対する抗体価の一貫した増大を示した。特に図１０Ａおよびｌ０Ｂは、それぞれ７日および１４日での終点タイターを示す。空Ｐｕｈに加えられたＩｇＧは、食塩水中のｈＩｇＧに類似するタイターを誘導した。更に、ｈＩｇＧへのいずれのＤＰＰＣリポソーム製剤の添加も、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌで観察された増大した免疫を回復しなかった。従って、これらの結果は：（１）ｈＩｇＧ−Ｐｕｌの強化された免疫は、経路に依存する現象でない（例ＸおよびＸＩＩを参照）；（２）ｈＩｇＧ−Ｐｕｌの処方は、ｈＩｇＧの強化された免疫原性のための先行必要条件である；および（３）ＤＰＰＣまたはＰｕｌの他の成分は、独立したアジュバント効果を有しない、ことを証明する。更に、これらの結果は、ｈＩｇＧ−Ｐｕｌによって誘導された強化された免疫性の原因となるデリバリーの経路、並びに他の因子の重要性を解明する。
【０２５６】
ＸＩＶ．スプレードライによるインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）の中空多孔質粒子の製造
【０２５７】
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：６１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術により、８個の構造タンパク質複合体と８個の負荷電されたＲＮＡセグメントとを含む比較的複雑なエンベロープウィルスを含む、中空多孔性のインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）をミクロ粒子内に良好に取り込んだ。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。処方前に、ウィルスは生存しており、ショ糖勾配遠心分離によって精製した。
【０２５８】
製剤Ａ：ｌｍｇのヒドロキシエチル澱粉（味の素、日本）を秤量し、食塩水中０．６ｇのインフルエンザウィルスを含むチューブへ移した。
【０２５９】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質、０．１１１ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を、２０ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝５０〜６０℃）中でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型）を８０００ｒｐｍで２〜５分間（Ｔ＝６０〜７０℃）用いて均質にした。４．４ｇのパーフルブロン（アトケム、パリ、フランス）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２６０】
製剤Ｂの体積で８分の１を分離し、製剤Ａに添加した。得られたインフルエンザウィルス／パーフルブロンのエマルションフィード溶液を、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。粉体をサイクロンで集め、篩分けスクリーンを、パーフルブロンを用いて収集ジャー内に洗浄した。パーフルブロン中のＨＡ懸濁液を、その後−６０℃で凍結させ、凍結乾燥した。易流動性の白い粉体を得た。
【０２６１】
ＸＶ．インフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモ・スフィアのインビトロ活性
【０２６２】
スプレードライした粒子への生存ウィルス性抗原の取込みを、以下の技術を用いて確認した：例ＸＩＶからのインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモ・スフィア（ＷＳＮ−Ｐｕｌ）を、４０℃、６時間で５ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌ＰＢＳに溶解した。水和されたＷＳＮ−Ｐｕｌを、次いで９６−ウェルプレートにおいて３７℃、１時間で種々の希釈の非固定の、およびパラホルムアルデヒドで固体したＭ１２抗原を現出している細胞（ＡＰＣ）とともにインキュベートした。抗原標識（ｐｕｌｓｉｎｇ）の後、それらのＡＰＣを洗浄し、ＴｃＨとともに４時間インキュベートした。ホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド固定した細胞をＸ−ｇａｌ基質でインキュベートし、および陽性の細胞をカウントした。
【０２６３】
結果を、パーセント活性化ＴｃＨとして表した（図１ｌＡ）。ショ糖精製した生存ＷＳＮウィルスの種々の濃度を、対照（図１ｌＢ）として使用した。ＷＳＮ−Ｐｕｌ処方は、約５質量％（重量％）のインフルエンザウィルスを含むと決定された。非固定のＡＰＣのもののみがウィルスを活性化することができ、抗原が分解しなかったことを示した。感染ウィルスの滴定が、ＭＤＣＫ（メダイン  ダービー腎臓癌細胞）アッセイによって決定され（図１１Ｃ）、および全体のウィルスの約１％が、なお許容細胞中で感染および複製できることを示した。一緒に、これらの結果は、プルモ・スフィア粉体への比較的大きいインフルエンザウィルス抗原の成功した取込みを示す。
【０２６４】
ＸＶＩ．鼻経路を介してデリバリーされたインフルエンザウィルスＡＩＷＳＮＩ３２（Ｈ１Ｎ１）プルモスフィアへの抗体応答
【０２６５】
５ｇのウィルスおよび生存ウィルスの２×１０３ＴＣＩＤ５０（生存ウィルスの量に対応する全体の抗原ロードの１％）を含むインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモ・スフィア（ＷＳＮ−Ｐｕｌ）処方によるＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻内接種の後、ＷＳＮウィルスに対するウィルス特異的ＩｇＧ抗体応答の誘導を測定した。対照マウスを、２×１０３ ＴＣＩＤ５０生存ウィルス（全ウィルスのの０．０５ｇに対応）、またはＵＶ−死滅させたＷＳＮウィルス（５ｇ）で免疫化した。ｈＩｇＧで処理されたマウスからの血清を、ネガティブ対照として使用した。抗体応答を、以下の酵素免疫吸着測定法技術を用いて血清中で測定した：ウェルを、コーティング緩衝剤中で、ショ糖精製したＷＳＮウィルスでコートし、非哺乳類のタンパク質（ＳｅｒａＢｌｏｋ）でブロックし、血清サンプルのシリアル希釈とともにインキュベートした。サンプルを洗浄し、およびビオチンコンジュゲートのラット抗マウスｍＡｂ、続くストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼおよびｐＮＰＰ基質によって、アッセイを行った。結果を、終点タイター逆数の幾何平均として表した。接種群につき、マウスの数は３であった。
【０２６６】
図１２に示された結果は、７日および１４日での食塩水中のＷＳＮ−Ｐｕｌまたは生存ＷＳＮウィルス（ＷＳＮ／Ｉｏ）で免疫化されたマウスにおける高タイターのＩＧ抗体の誘導を示す。対照的に、特異的ＩｇＧの小さいタイターのみが、塩水中で死滅したウィルスで免疫されたマウスにおいて検出された。
【０２６７】
ＸＶＩＩ．鼻経路を介してデリバリーされたインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモ・スフィアへのＴ細胞応答
【０２６８】
Ｔ細胞応答を、上述したように免疫されたマウス（例ＸＶＩ）からのリンパ球のウィルスおよびエピトープ−特異的なサイトカイン産生に関して定義した。５ｇのウィルスおよび生存ウィルスの２×１０３ＴＣＩＤ５０（生存ウィルスの量に対応する全体の抗原ロードの１％）を含むインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモ・スフィア（ＷＳＮ−Ｐｕｌ）処方によるＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻内接種の後、Ｔ細胞応答の誘導を測定した。対照マウスを、２×１０３ＴＣＩＤ５０生存ウィルス（全ウィルスのの０．０５ｇに対応）、またはＵＶ−死滅させたＷＳＮウィルス（５ｇ）で免疫化した。検査した抗原は、ショ糖精製したＷＳＮウィルス、ＨＡ１１０−１２０のペプチド、およびＮＰ１４７−１５５ペプチドであった。未処理の食塩水の群を、対照として含せた。
【０２６９】
免疫化の１０日後に、フィコール勾配遠心によって末梢血液単核細胞（ＰＳＭＣ）を血液から単離した。応答細胞の種々の数を、完全ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中、３×１０５ 細胞／ウェルでニトロセルロース／抗−ＩＦＮまたは抗ＩＬ−４（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア）でインキュベートした。刺激細胞（マイトマイシン処理された脾細胞、５×ｌ０５ ／ウェル）、抗原、およびヒトｒＩＬ−２（２０  Ｕ／ｍｌ）を添加し、それらのプレートを４８時間共インキュベートした。細胞を次いでＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、抗サイトカイン抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）は一晩中インキュベートし、およびＨＲＰ−ストレプトアビジンコンジュゲート、これに続く不溶基質（ベクターラボラトリー）を用いてアッセイを行った。アッセイを水で停止させ、ウェルを風乾し、およびスポットを立体顕微鏡を用いてカウントした。
【０２７０】
結果を、バックグランド信号を差し引いた後の、ＩＦＮ−またはＩＬ−４／１０６ＰＢＭＣ を産生する特異的な細胞の頻度として表した。バックグランドは、再現的に６／１０６ 未満であった。ＰＢＭＣは、各群のマウスからプールした。図ｌ３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃにおける結果は、ＷＳＮ−ＰｕｌおよびＷＳＮウィルスによるワクチン接種が、一般に、ＩＦＮ−およびＩＬ−４を産生するＨＡ−、ＮＰ−およびＷＳＮ−特異的なＴ細胞を誘導したことを示す。対照的に、死滅したウィルスによる免疫化は、主に、ＩＬ−４を産生するＴ細胞を誘導した。更に、死滅したウィルスによる免疫化は、ＮＰ１４７−１５５のペプチドに対して特異的な、ＩＬ−４を産生するＴｃ２細胞の強化された部分個体群を誘導した。これらのデータは、生存対照および処方されたウィルス（すなわち、生存および死滅したウィルスを含む）によって誘発された細胞応答が、典型的な従来のワクチンに対応する死滅したウィルス対照によって誘発された応答より更に効果的であったことを示す。
【０２７１】
ＸＶＩＩＩ．鼻経路．を介してデリバリーされたインフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１Ｎ１）プルモスフィアで免疫されたマウスの感染性攻撃に対する防御
【０２７２】
例ＸＶＩＩに記述したように免疫したマウスを、免疫化の３週間後に、鼻経路を介してデリバリーされた１．２×１０６ のインフルエンザウィルスで攻撃した。ウィルス放散および体重変化の点での防御は、攻撃の４日後で定義した。結果を、図１４Ａおよびと１４Ｂに示す。
【０２７３】
鼻の洗浄液中のウィルスタイター測定を、生存ウィルスをＭＤＣＫアッセイで滴定することによって決定した。結果は、インフルエンザウィルスＡ／ＷＳＮ／３２（Ｈ１ＩＮ１）プルモ・スフィア（ＷＳＮ−Ｐｕｌ）または対照生存ＷＳＮウィルスで前もって免疫されたマウスにおいて、感染性ウィルスが無いことを示した（図１４Ａ）。ＵＶ死滅ＷＳＮウィルスで免疫されたマウス、または非投薬マウスは、鼻の洗浄液中でインフルエンザウィルスの顕著なタイターを示した。加えて、ＷＳＮ−ＰｕｌまたはＷＳＮウィルス（生存ウィルスの低用量）で免疫されたマウスは、攻撃の後にそれらの体重を保持した（図１４Ｂ）。非免疫化マウス、およびＵＶ死滅ＷＳＮウィルスで免疫されたマウスは、体重の顕著な低減、および続く死亡を示した（７日で、各群での２／３）。これらの結果は、ＷＳＮ−Ｐｕｌが粘膜のデリバリーの際に効果的なワクチン接種効率を与えることを証明した。
【０２７４】
ＸＩＸ．スプレードライによるＴＡ７  レトロウィルスの中空多孔質粒子の製造
【０２７５】
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：６１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術によって、ＴＡ７レトロウィルス粒子を製造した。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。
【０２７６】
製剤Ａ：ｌｍｇのＴＡ７レトロウィルスを溶解するために、２ｇの脱イオン水を用いた。
【０２７７】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質（０．３ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を、１６．５ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝５０〜６０℃）中でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型）を８０００ｒｐｍで２〜５分間（Ｔ＝６０〜７０℃）用いて均質にした。８．０ｇのパーフルブロン（アトケム、パリ、フランス）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２７８】
製剤Ｂの８分の１（体積で）を分離し、製剤Ａに添加した。得られたＴＡ７レトロウィルス／パーフルブロンのエマルションフィード溶液を、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。粉体をサイクロンで集め、篩分けスクリーンを、パーフルブロンを用いて収集ジャー内に洗浄した。パーフルブロン中のＴＡ７レトロウィルス懸濁液を、その後−６０℃で凍結させ、凍結乾燥した。易流動性の白い粉体を得た。
【０２７９】
例ＸＩＸ．ＴＡ７レトロウィルスのスプレードライ粒子のインビトロ活性
例ＸＩＸで製造したスプレードライ粒子に取込みした後、ＴＡ７レトロウィルスの活性を検査した。スプレードライしたＴＡ７レトロウィルス粒子を食塩水に溶解し、ヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞に１時間で加えた。接種の２４時間後、次いで、β−ｇａｌを用いてそれらの細胞をトランスジェニック発現について分析した。ニートおよびスプレードライしたＴＡ７レトロウィルス粒子の間で、差違は観察されなかった。これらの結果は、比較的に大きく且つ複雑なＴＡ７レトロウィルスが、見かけ上の活性のロスなしにスプレードライ粒子に効果的に取り込み可能であることを示す。
【０２８０】
ＸＸＩ．スプレードライによるウシ・ガンマグロブリンの中空の多孔質粒子の製造
吸引：１００％、入口温度：８５℃、出口温度：６１℃；フィードポンプ：１０％：Ｎ２ 流：８００Ｌ／ｈｒの条件下で、Ｂ−１９１のミニスプレードライヤー（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を用いるスプレードライ技術によって、ＴＡ７レトロウィルス粒子を製造した。そのフィードは、スプレードライの直前に２つの製剤（ＡおよびＢ）を混合することによって製造した。
【０２８１】
製剤Ａ：０．６ｇのＢＧＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、０．４２ｇのラクトース（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）、および２５ｍｇのプルロニックＦ−６８、ＮＦグレード（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニューヨ−ク州）を溶解するために、０．２％の食塩溶液の２１ｇを使用した。
【０２８２】
製剤Ｂ：リン脂質によって安定化された水中フルオロカーボン−エマルションを、以下のようにして製造した。そのリン脂質（０．３ｇのＥＰＣ−１００−３（リポイドＫＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を、３３ｇの熱い脱イオン水（Ｔ＝５０〜６０℃）中でウルトラ−トゥラックスミクサー（Ｔ−２５型）を８０００ｒｐｍで２〜５分間（Ｔ＝６０〜７０℃）用いて均質にした。３５ｇのＦ−デカリン（エアープロダクツ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ペンシルベニア州）を、混合の間、滴下で加えた。フルオロカーボンを加えた後、エマルションを少なくとも４分間混合した。得られた粗製エマルションを、次いで、１２４，１０６ｋＰａ（１８，０００ｐｓｉ）で５パスで高圧ホモジナイザ（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）に通した。
【０２８３】
製剤ＡおよびＢを組み合わせ、上述した条件下でスプレードライヤーに供給した。易流動性の白粉体を、サイクロン分離器で集めた。中空多孔質粒子は、飛行時間型の分析法（Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ、Ａｍｈｅｒｓｔ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、マサチューセッツ州）によって決定された１．２７±１．４２μｍの体積−重みつけ平均空気力学的直径を有していた。
【０２８４】
ＸＸＩＩ  ウシ・ガンマグロブリンＭＤＩ処方に対するアンデルセンカスケードインパクター結果
例ＸＸＩに従って製造した、ＢＧＧの多孔質粒子で処方された用量計量型吸入器（ＭＤＩ）の吸入性を、アンデルセンカスケードインパクターを用いて評価した。８３ｍｇの中空多孔質ＢＧＧ粒子を１０ｍｌのアルミニウム缶内に秤量し、４０℃、３〜４時間の窒素流れ下の減圧オーブンで乾燥した。その缶をＤＦ３１／５０ａｃｔ５０  ｌバルブ（米国バロア、グリニッジ、コネチカット州）を用いて圧着シールし、ステムによる超過圧により９．６４ｇのＨＦＡ−ｌ３４ａ（デュポン、ウィルミントン、デラウェア州）推進剤で充填した。
【０２８５】
装置の作動により、６１％の微粒子分率と６８μｇの微粉用量が観察された（図１５）。本例は、ＢＧＧ等の比較的大きい生物活性剤が処方でき、且つＭＤＩから効果的にデリバリーできることを説明している。
【０２８６】
当業者は、本発明がその精神または中心的な属性から逸脱することなく他の特定の形で具体化できると更に認識するであろう。本発明の前述した記述がその例示的な態様のみを開示するという点で、他の変形も本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。したがって、本発明は、ここで詳述した特定の態様に、限られない。むしろ、本発明の範囲および内容の指標として、添付の請求項が参照されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に従うミクロ構造における処方に従う機能性ＨＡペプチド（インフルエンザウィルスの赤血球凝集素の残基１１０〜１２０）のレベルの図示表現である。
【図２】
図２は、ミクロ構造中に処方された抗原が、Ｔ細胞を活性化するために細胞内プロセシングを必要としないという事実を説明する。
【図３】
図３は、鼻投与されたミクロ微粒子および静脈内注射を用いてデリバリーされたＨＡペプチドの血漿濃度を比較する。
【図４】
図４は、本出願で記述されたようなミクロ微粒子内で処方されたヒトＩｇＧに対するキャリブレーション曲線を選ばれた対照とともに表す。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＩｇＧ処方されたミクロ微粒子とＨＡペプチド処方されたミクロ微粒子のための放出動態を図で説明する。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＩｇＧ処方されたミクロ微粒子とＨＡペプチド処方されたミクロ微粒子のための放出動態を図で説明する。
【図６Ａ】
図６Ａは、処方されたミクロ微粒子を用いて気管内および鼻投与に従う血漿中のＩｇＧの持続性に示す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、処方されたミクロ微粒子を用いて気管内および鼻投与に従う血漿中のＩｇＧの持続性に示す。
【図７Ａ】
図７Ａは、本発明に従って処方されたミクロ微粒子として気管内投与されたＩｇＧに対する全身および局所的な抗体応答を示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、本発明に従って処方されたミクロ微粒子として気管内投与されたＩｇＧに対する全身および局所的な抗体応答を示す。
【図８】
図８は、ＩｇＧミクロ微粒子のマウスへの気管内部投与の後のＴ細胞応答を示すサイトカインのレベルを図で説明する。
【図９】
図９は、鼻腔内に投与されたＩｇＧミクロ微粒子に対するネズミの抗体応答を示す。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、ＩｇＧミクロ微粒子の腹腔内注射のそれぞれ７日および１４日後の、ネズミの抗体価を示す。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、ＩｇＧミクロ微粒子の腹腔内注射のそれぞれ７日および１４日後の、ネズミの抗体価を示す。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、ミクロ微粒子処方のウィルス、ウィルス性対照に対するＴ細胞応答、および処方および未処方ウィルス両方の感染タイターをそれぞれ説明する。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、ミクロ微粒子処方のウィルス、ウィルス性対照に対するＴ細胞応答、および処方および未処方ウィルス両方の感染タイターをそれぞれ説明する。
【図１１Ｃ】
図１１Ｃは、ミクロ微粒子処方のウィルス、ウィルス性対照に対するＴ細胞応答、および処方および未処方ウィルス両方の感染タイターをそれぞれ説明する。
【図１２】
図１２は、鼻腔内投与後の７日および１４日後で、ミクロ微粒子処方された生存および死滅したインフルエンザウィルスに対するネズミの抗体応答を示す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、対照抗原とともに、ウィルス性ミクロ微粒子または生存ウィルスまたは死滅したウィルス鼻腔内接種後のＴ細胞応答を示す因子のネズミのレベルを示す。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、対照抗原とともに、ウィルス性ミクロ微粒子または生存ウィルスまたは死滅したウィルス鼻腔内接種後のＴ細胞応答を示す因子のネズミのレベルを示す。
【図１３Ｃ】
図１３Ｃは、対照抗原とともに、ウィルス性ミクロ微粒子または生存ウィルスまたは死滅したウィルス鼻腔内接種後のＴ細胞応答を示す因子のネズミのレベルを示す。
【図１４Ａ】
図１４Ａは、生存および死滅したウィルスの両方を含むミクロ微粒子を、鼻腔内に接種されたマウスにおける、ウィルス性放散（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）および体重変化をそれぞれ説明する。
【図１４Ｂ】
図１４Ｂは、生存および死滅したウィルスの両方を含むミクロ微粒子を、鼻腔内に接種されたマウスにおける、ウィルス性放散（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）および体重変化をそれぞれ説明する。
【図１５】
図１５は、用量計量型吸入器からウシのガンマグロブリンを含む処方されたミクロスフェアの効率的なデリバリーを示すインビトロのアンデルセンカスケードインパクター研究の結果を示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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