(57)【要約】【課題】新規のキネシン阻害剤および該キネシン阻害剤を含む抗癌剤、および新規のキネシン阻害剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本願発明のキネシン阻害剤および該阻害剤を含む抗癌剤は、下記一般式１で示される構造を有する化合物を含有する：【化１】2019189590.tif 000009  上記一般式１では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で示される構造を有する化合物を含有する、キネシン阻害剤：
【化１】
2019189590.tif 000007
上記一般式１では、
Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、
Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。
【請求項２】
下記一般式２で示される構造を有する化合物を含有する、請求項１に記載のキネシン阻害剤：
【化２】
2019189590.tif 000008
上記一般式２では、
Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、
Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。
【請求項３】
Ｒ１および／またはＲ２は、オキシ基を含む有機基である、請求項１または２に記載のキネシン阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のキネシン阻害剤を含む、抗癌剤。
【請求項５】
キネシン遺伝子を過剰発現することによって増殖が阻害されている形質転換体を、候補物質を含有する培地にて培養する培養工程、および
上記培養工程において、形質転換体の増殖が回復したと認められた培地に含まれる候補物質を、キネシン阻害剤として選別する選別工程、を含む、キネシン阻害剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキネシン阻害剤、該阻害剤を含む抗癌剤およびキネシン阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、日本では最も高い死因となる疾患である。癌の治療法については、様々な治療法（例えば、手術療法、放射線療法、化学療法および免疫療法等）が開発されているが、未だに完璧な治療法は無く、癌の病態に応じて各治療法が選択されている。
【０００３】
その中で化学療法は一般的な治療法であるが、癌の原因となる遺伝子は１つでは無いため、多剤併用療法が用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Wu., et al., ACS Chem. Biol., 8, 2201-2208，2013
【非特許文献２】B. Yang, et al., J. Med. Chem., 57, 9958-997- 2014
【非特許文献３】C. A. Watts, et al., Chem. Biol., 20, 1399-1410，2013
【非特許文献４】W. Zhang, et al., Biochem J., 473, 1027-1035，2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
２０００年代に入り、癌遺伝子および癌抑制遺伝子に作用する様々な分子標的薬が、癌の治療において実用化されているが、新たな分子標的薬の開発が現在も求められている。
【０００６】
本発明の一態様は、新規のキネシン阻害剤、該キネシン阻害剤を含む抗癌剤、および、キネシン阻害剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るキネシン阻害剤は、以下の構成を有する。
【０００８】
〔１〕下記一般式１で示される構造を有する化合物を含有する、キネシン阻害剤：
【０００９】
【化１】
2019189590.tif 000002
【００１０】
上記一般式１では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。
【００１１】
〔２〕本発明の一態様に係るキネシン阻害剤は、下記一般式２で示される構造を有する化合物を含有していることが好ましい：
【００１２】
【化２】
2019189590.tif 000003
【００１３】
上記一般式２では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。
【００１４】
〔３〕本発明の一態様に係るキネシン阻害剤は、Ｒ１および／またはＲ２は、オキシ基を含む有機基であってもよい。
【００１５】
〔４〕本発明の一態様に係る抗癌剤は、〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のキネシン阻害剤を含む抗癌剤であってもよい：
〔５〕本発明の一態様に係るキネシン阻害剤のスクリーニング方法は、キネシン遺伝子を過剰発現することによって増殖が阻害されている形質転換体を、候補物質を含有する培地にて培養する培養工程、および上記培養工程において、形質転換体の増殖が回復したと認められた培地に含まれる候補物質を、キネシン阻害剤として選別する選別工程、を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一態様によれば、新規なキネシン阻害剤を提供することができる。
【００１７】
本発明の一態様によれば、新規なキネシン阻害剤が含まれる、新規な抗癌剤を提供できる。
【００１８】
本発明の一態様によれば、低濃度にて癌細胞に毒性を示す、抗癌剤を提供できる。
【００１９】
本発明の一態様によれば、キネシン遺伝子を過剰発現することによって増殖が阻害されている形質転換体の、生育が回復することを確認するスクリーニング方法を用いる。これによって、簡便にキネシン阻害剤および抗癌剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例における、サンプルから精製された各成分を示すグラフである。
【図２】実施例における、ＴＹ−２７株の生育を示す像、および、各成分のスポット量と、生育円との関係を示す表、である。
【図３】実施例における、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃの構造を示す図である。
【図４】実施例における、ＴＹ−２７株、ＴＹ−９４株およびＨｏｓｔ株について、生育の有無を示す像である。
【図５】実施例における、ＨＬ６０の細胞生存率を示すグラフである。
【図６】実施例における、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞生存率を示すグラフである。
【図７】一般式１、一般式２および一般式３に含まれる化合物の構造を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２２】
〔１．本発明の概要説明〕
キネシン（例えば、減数分裂期キネシン（ｍｅｉｏｔｉｃ ｋｉｎｅｓｉｎ）ＨＳＥＴ（キネシン−１４ファミリー））は、微小管モータータンパク質の一つであり、中心体の過剰な複製の結果生じる中心体クラスタリングを引き起こすタンパク質である。
【００２３】
本発明者は、キネシンの機能を阻害することで、中心体クラスタリングが阻害され、その結果、癌細胞の増殖を阻害できるのではないか、と考えた。そこで、本発明者は、まず、キネシン阻害剤のスクリーニング方法を、新たに開発した。
【００２４】
本発明者は、新たなキネシン阻害剤のスクリーニング方法を用いて、公知の抗癌剤３２８種をスクリーニングした。しかしながら、公知の抗癌剤は、上記キネシン阻害剤のスクリーニング方法において、キネシン阻害剤としては判定されなかった。
【００２５】
更に、本発明者は、上記キネシン阻害剤のスクリーニング方法を用いて、天然資源物から抽出されたサンプル９９４種についてスクリーニングを行った。その結果、９種のサンプル（セイタカアワダチソウ、カラタチ、アボガド、サワラ、Hyamridhi、セージ、リコリス、ミツバ、ヤマウルシ）において、キネシン阻害活性が認められた。該サンプルのうち、セイタカアワダチソウ（種族名：Solidago altissima）の根に由来するサンプルにおいて、特に強い、キネシン阻害活性が認められた。そこで、キネシン阻害活性が強いサンプルを更に単離精製し、キネシン阻害活性を有する化合物群の構造を同定した。
【００２６】
上記化合物群に属する各化合物は、類似した構造を有する、新規のキネシン阻害剤であった。また、上述の各化合物を癌細胞へ滴下すると、癌細胞の生存率が低下した。この結果から、得られた化合物が有する新規の構造が、抗癌性に寄与していることが示唆された。
【００２７】
〔２．キネシン阻害剤〕
本実施形態におけるキネシン阻害剤は、下記一般式１で示される構造を有する化合物を含有する。
【００２８】
【化３】
2019189590.tif 000004
【００２９】
なお、上記一般式１では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。なお、上記一般式１で示される構造を有する化合物は、あらゆる立体異性体、および／または、あらゆる光学異性体であり得る。
【００３０】
本明細書において、「キネシン」とは、キネシンスーパーファミリーに分類され得る、あらゆるキネシンを意図する。該キネシンとしては、例えば、キネシン−１４ファミリー、（ＫＩＦＣ１／ＨＳＥＴ／ＫＮＳＬ２、ＫＩＦＣ２、ＫＩＦＣ３、ＫＩＦ２５／ＫＮＳＬ３）等が挙げられる。また、本明細書において、「キネシン阻害剤」とは、キネシンの機能を阻害する活性（以降、キネシン阻害活性と称する）を有する阻害剤を意図する。
【００３１】
本発明の一態様に係るキネシン阻害剤では、Ｒ１および／またはＲ２は、オキシ基を含む有機基であってもよい。上記構成によれば、より高いキネシン阻害活性を示すキネシン阻害剤を実現することができる。
【００３２】
上記オキシ基を含む有機基としては、例えば、チグロイルオキシ基、アセチルオキシ基、ベンジルオキシ基、アシルオキシ基等が挙げられる。
【００３３】
上記一般式１で示される構造を有する化合物としては、例えば、コラベン酸、ソリダゴン酸、６β−チグロイルオキシコラベン酸、コラベン酸アナログ（６β−チグロイルオキシコラベン酸analogue）等が挙げられる。
【００３４】
上記一般式１で示される構造を有する化合物は、合成された化合物であっても良いし、天然資源から抽出された化合物であっても良い。
【００３５】
上記化合物を含む上記天然資源としては、例えば、（セイタカアワダチソウ、カラタチ、アボガド、サワラ、Hyamridhi、セージ、リコリス、ミツバ、ヤマウルシ）等から選択され得る。
【００３６】
また、本実施形態におけるキネシン阻害剤は、下記一般式２で示される構造を有する化合物を含有していることが好ましい。
【００３７】
【化４】
2019189590.tif 000005
【００３８】
なお、上記一般式２では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。上記構成によれば、キネシン阻害活性が著しく高い、キネシン阻害剤を実現することができる（図７の（ａ）を参照）。
【００３９】
上記一般式２では、Ｒ１および／またはＲ２は、オキシ基を含む有機基であってもよい。上記構成によれば、著しく高いキネシン阻害活性を示すキネシン阻害剤を実現することができる。
【００４０】
上記オキシ基を含む有機基としては、例えば、チグロイルオキシ基、アシルオキシ基等が挙げられる。
【００４１】
上記一般式２で示される構造を有する化合物は、コラベン酸アナログ（６β−チグロイルオキシコラベン酸analogue）であることが好ましい。
【００４２】
また、本実施形態におけるキネシン阻害剤は、下記一般式３で示される構造を有する化合物を含有していることが好ましい。
【００４３】
【化５】
2019189590.tif 000006
【００４４】
なお、上記一般式３では、Ｒ１は、Ｈ、または、任意の有機基であり、Ｒ２は、Ｈ、または、任意の有機基である。上記構成によれば、高いキネシン阻害活性を示すキネシン阻害剤を実現することができる（図７の（ｂ）を参照）。
【００４５】
本発明の一態様に係るキネシン阻害剤では、Ｒ１および／またはＲ２は、オキシ基を含む有機基であってもよい。上記構成によれば、高いキネシン阻害活性を示すキネシン阻害剤を実現することができる。
【００４６】
上記オキシ基を含む有機基としては、例えば、アシルオキシ基、アセチルオキシ基等が挙げられる。
【００４７】
上記一般式３で示される構造を有する化合物としては、例えば、コラベン酸、ソリダゴン酸、６β−チグロイルオキシコラベン酸等が挙げられる。上記一般式３で示される構造を有する化合物は、ソリダゴン酸、または、コラベン酸であることが好ましい。
【００４８】
上記キネシン阻害剤は、一般式１、一般式２および一般式３で示される化合物のうち１つを含んでいても良いし、複数を含んでいてもよい。さらに、上記キネシン阻害剤は、上述の化合物の誘導体を含んでいてもよい。
【００４９】
本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。
【００５０】
上記他の官能基の例としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリールアルキル基、アリールアルコキシ基、アリールアルキルチオ基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、アリル基、アミノ基、置換アミノ基、シリル基、置換シリル基、シリルオキシ基、置換シリルオキシ基、アリールスルフォニルオキシ基、アルキルスルフォニルオキシ基、ニトロ基などが挙げられる。上記他の原子の例としては、炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、リン原子、ハロゲン原子などが挙げられる。
【００５１】
上記キネシン阻害剤中に含まれる有効成分（具体的には、一般式１で示される化合物、一般式２で示される化合物、一般式３で示される化合物、または、当該化合物の誘導体）の含有量としては、特に限定されないが、キネシン阻害剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００５２】
また、上記キネシン阻害剤は、上記キネシン阻害剤が有するキネシン阻害活性を阻害しない成分であれば、一般式１、一般式２および一般式３で示される化合物、並びに、これらの誘導体とは異なる成分が含まれていてもよい。
【００５３】
上記異なる成分としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、および、安定化剤などを挙げることができる。
【００５４】
上記緩衝剤の例としては、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、クエン酸、クエン酸塩、酢酸、酢酸塩、炭酸、炭酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、および、トロメタモールなどが挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムなどが挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、および、ホウ酸カリウムなどが挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、および、クエン酸三ナトリウムなどが挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、および、酢酸カリウムなどが挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、および、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、および、酒石酸カリウムなどが挙げられる。
【００５５】
ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウムなどが挙げられる。
【００５６】
上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、塩化マグネシウムなど）、および、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、および、マンニトールなど）が挙げられる。
【００５７】
上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、および、クロロブタノールなどが挙げられる。
【００５８】
上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、および、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５９】
上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、および、アテロコラーゲンなどが挙げられる。
【００６０】
上記キネシン阻害剤中に含まれる異なる成分の含有量としては、特に限定されないが、キネシン阻害剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００６１】
〔３．キネシン阻害剤を含む抗癌剤〕
本実施形態における抗癌剤は、キネシン阻害剤を含む抗癌剤である。ここで、本実施形態における抗癌剤に含まれるキネシン阻害剤については上述と同様であるため、ここでは説明を省略する。
【００６２】
上記抗癌剤を適用可能である癌としては特に限定されず、例えば、乳癌、膀胱癌、大腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、黒色腫、甲状腺癌、子宮体癌、腎臓癌、子宮頸癌、膵癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、白血病等が挙げられる。
【００６３】
癌の病態に応じて、本実施形態の抗癌剤の使用が適宜決定される。例えば、本実施形態の抗癌剤を使用する場合、乳癌への使用が好ましい。
【００６４】
本実施形態の抗癌剤が使用可能な癌細胞は特に限定されない。本発明においては、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞等が挙げられる。また、細胞が由来する動物種も特に限定されず、動物種は、非ヒト哺乳類またはヒトであっても良い。非ヒト哺乳動物の例としては、霊長類（サル、類人猿など）、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。上述の非ヒト哺乳動物は、家畜またはコンパニオンアニマルであってもよく、野生動物であってもよい。
【００６５】
上記抗癌剤中に含まれる上記キネシン阻害剤の含有量としては、特に限定されないが、抗癌剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００６６】
また、上記抗癌剤は、上記キネシン阻害活性を阻害しない成分であれば、上記キネシン阻害剤と異なる他の成分（例えば、上述した緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、および、安定化剤など）が含まれていてもよい。
【００６７】
上記抗癌剤中に含まれるキネシン阻害剤と異なる成分の含有量としては、特に限定されないが、抗癌剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００６８】
〔４．キネシン阻害剤のスクリーニング方法〕
本実施形態のスクリーニング方法は、キネシン遺伝子を過剰発現することによって増殖が阻害されている形質転換体を、候補物質を含有する培地にて培養する培養工程、および上記培養工程において、形質転換体の増殖が回復したと認められた培地に含まれる候補物質を、キネシン阻害剤として選別する選別工程、を含む、キネシン阻害剤のスクリーニング方法である。
【００６９】
本実施形態のスクリーニング方法における培養工程では、キネシン遺伝子を過剰発現することによって、形質転換体の増殖を阻害する。上記形質転換体の宿主としては、酵母等が挙げられる。遺伝子破壊株または過剰発現株の作製を容易に行えるという観点からは、宿主としては酵母を用いることが好ましい。その理由の１つとして、スクリーニングを実施する時、各種薬剤に対する透過性を高めるために、宿主が有する多剤排出トランスポーター（例えば、Ｂｆｒ１およびＰｍｄ１）を欠損させることが好ましいためである。
【００７０】
上記宿主として用いられる酵母としては、分裂酵母（Shizosaccharomyces pombe）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。ヒトの疾病に関わる遺伝子への研究により優れているという観点から、宿主としては分裂酵母を用いることが好ましい。
【００７１】
上記培養工程において宿主として用いられる上記分裂酵母としては、例えば、ＹＡ８株、ＳＡＫ９３１株（h- caf5::bsdR pap1△ pmd1△ mfs1△ bfr1△ dnf2△erg5::ura4+ leu1 ura4 ade6-M210：A. Takemoto et al., J. Cell Sci. 129, 1250-1259, 2016、川島茂裕博士（東京大学）より供与）等が挙げられる。
【００７２】
過剰発現させるキネシン遺伝子としては、中心体クラスタリングに関与するキネシンタンパク質をコードする遺伝子を意図する。該キネシン遺伝子としては、例えば、Ｋｉｎｅｓｉｎ−１４ｆａｍｉｌｙ（具体的に、ＫＩＦＣ１／ＨＳＥＴ／ＫＮＳＬ２，ＫＩＦＣ２，ＫＩＦＣ３，ＫＩＦ２５／ＫＮＳＬ３）等が挙げられる。
【００７３】
より具体的に、キネシン遺伝子としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＮＣ＿０００００６．１２（ＫＩＦＣ１）、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＮＣ＿０００００８．１１（ＫＩＦＣ２）、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＮＣ＿００００１６．１０（ＫＩＦＣ３）、または、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＮＣ＿０１８９１７．２（ＫＩＦ２５）のキネシン遺伝子を挙げることができるが、勿論、本発明は、これらに限定されない。
【００７４】
また、過剰発現させるキネシン遺伝子は、ＨＳＥＴの酵母のホモログ（例えば、ｐｋｌ１またはｋｌｐ２）であってもよいし、ヒトのホモログ（例えば、上述のＫＩＦＣ２、ＫＩＦＣ３、ＫＩＦ２５）であってもよい。本発明者は、ヒト由来のＨＳＥＴの過剰発現により、細胞増殖阻害が生じることを新規に発見した（M. Yukawa et al., J. Cell Sci. 131, 1-11, 2018）。それ故に、本発明におけるキネシン阻害剤のスクリーニング方法は、酵母のホモログのみならず、ヒトのホモログ（例えば、上述のＫＩＦＣ２、ＫＩＦＣ３、ＫＩＦ２５）の過剰発現系を用いたスクリーニング方法であってもよい。
【００７５】
上述のキネシン遺伝子を過剰発現させる手法としては特に限定されず、公知の手法が用いられる。宿主に導入されたキネシン遺伝子が恒常的に発現すると、当該宿主が死滅する虞がある。それ故に、宿主に導入されたキネシン遺伝子は、発現を誘導可能に制御されていることが好ましい。当該制御は、周知のプロモーターを用いて行うことができる。
【００７６】
上記培養工程において用いられる培地の成分および形態は、特に限定されない。例えば、検出対象である培地の形態は、液体状であってもよいし、固体状であってもよい。また、上記培養工程において用いられる培養条件は、宿主に合わせて、適宜、選択することができる。
【００７７】
また、本実施形態のスクリーニング方法は、上記培養工程において、形質転換体の増殖が回復したと認められた培地に含まれる候補物質を、キネシン阻害剤として選別する選別工程を含む。
【００７８】
上記培養工程において、形質転換体の増殖が回復したことを確認する方法としては、以下の方法が挙げられる。
【００７９】
例えば、培地として固体培地を用いた場合、キネシン遺伝子を過剰発現させた形質転換体を塗布した固形培地の上に、キネシン阻害剤の候補物質を滴下し、滴下した略円形状の領域（以降、生育円と称する）、および、その近傍において、上記形質転換体の生育が認められた場合に、上記形質転換体の増殖が回復したと判定できる。また、上記選別工程において、上記形質転換体の増殖が回復した場合の、培地に含まれる候補物質を、キネシン阻害剤として選択することができる。
【００８０】
本実施形態におけるスクリーニングに供される上記候補物質としては、人工的に合成された化合物であってもよいし、天然資源から抽出された化合物であってもよい。
【実施例】
【００８１】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【００８２】
＜１．ＨＳＥＴ過剰発現分裂酵母株ＴＹ−２７の構築＞
スクリーニングの実施時に、薬剤の浸透性をより高めるために、予め主要な二つの多剤排出トランスポーター（Ｂｆｒ１およびＰｍｄ１）が欠損された分裂酵母ＹＡ８株（h- bfr1::ura4+ pmd1::hisG leu1-32 ura4-D18：Y. Arita, Mol Biosyst 7, 1463-1472 (2011)、八代田陽子博士、吉田稔博士（理化学研究所）より供与）を宿主として用いた。この株にＨＳＥＴ過剰発現用プラスミド（pREP41-GFP-HSET）を導入して、ＴＹ−２７株を構築した。
【００８３】
ＨＳＥＴ過剰発現用プラスミド（pREP41-GFP-HSET）の作製方法を以下に説明する。HSET cDNA(DNAForm, Clone ID: 40117894, Yokohama, Japan)を鋳型として、予めSalIおよびBamHIの制限酵素部位を導入した以下のオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法により、HSET cDNAのＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片およびベクタープラスミドpREP41-GFP（R. A. Craven, Gene, 221, 59-68 (1998)）を、制限酵素（SalIおよびBamHI）を用いて切断し、ＨＳＥＴとＧＦＰとの融合タンパク質を発現可能なように、ベクタープラスミドpREP41-GFP内に、ＤＮＡ断片を挿入した。
【００８４】
MY280: 5’-CCCAGGGGGTCGACTATGGACCCGCAGAGGTCCCCCCTATT-3’（配列番号１）
MY281: 5’-CTTTCCCCGGATCCTCACTTCCTGTTGGCCTGAGCAGTAC-3’（配列番号２）。
【００８５】
＜２．スクリーニング条件の設定およびＴＹ−２７株における生育回復活性の測定＞
ＨＳＥＴの過剰発現により生育が抑制されたＴＹ−２７株を用いた。ＨＳＥＴの活性が阻害されたときに、ＴＹ−２７株の生育回復を肉眼で検出できる培養条件として、ＴＹ−２７株を培地１ｍＬあたり４.６×１０４ ｃｅｌｌｓ植え、かつ、サンプルに対する暴露条件を２８℃、および３日に設定した。
【００８６】
Ｔｈｉａｍｉｎｅを含んだＰＭＧ培地（Pombe Minimal Glutamate medium）を用いて、ＴＹ−２７株の前培養および本培養を行った。本培養時においてＯＤ５９０＝０．８の時に、菌体を、Ｔｈｉａｍｉｎｅを抜いたＰＭＧ培地で２回洗浄し、洗浄後の菌体を４００μｌ、５０℃に保温しているＴｈｉａｍｉｎｅを抜いたＰＭＧ寒天培地４９．６ｍｌへ混ぜ込み、プレート１枚につき１２．５ｍｌのＰＭＧ寒天培を含有するプレートを、４枚作製した。スクリーニングに使用した天然資源サンプル（後述）は、ＭｅＯＨで抽出し１０ｍｇ／ｍｌに調製したものを、２μｌまたは５μｌ、プレート上にスポットし、上記の条件で生育回復活性を評価した。
【００８７】
以下に、ＰＭＧ培地（Pombe Minimal Glutamate medium）（１Ｌあたり）の組成を示す。
フタル酸水素カリウム:３ｇ
リン酸水素二ナトリウム:２．２ｇ
L-グルタミン酸-ナトリウム塩:３．７５ｇ
グルコース:２０ｇ
アデニン:２２５ｍｇ
ヒスチジン:２２５ｍｇ
ウラシル:２２５ｍｇ
リシン塩酸塩:２２５ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ：５ｍｇ
※1 Salts stock:２０ｍｌ
※2 Vitamins Stock:１ｍｌ
※3Minerals Stock:１００μｌ
(寒天培地の場合)Ａｇａｒ：２０ｇ
[※1 Salts stock]
ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ：５２．５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ:０．７３５ｇ／Ｌ
ＫＣｌ:５０ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４:２ｇ／Ｌ
[※2 Vitamins stock]
パントテン酸:１ｇ／Ｌ
ニコチン酸:１０ｇ／Ｌ
イノシトール:１０ｇ／Ｌ
ビオチン:１０ｍｇ／Ｌ
[※3 Minerals stock]
ホウ酸:５ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４:４g／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ:４ｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ:２ｇ／Ｌ
モリブデン酸: ０．４ｇ／Ｌ
ＫＩ:１ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ:０．４ｇ／Ｌ
クエン酸:１０ｇ／Ｌ
また、天然資源サンプルとしては、本発明者が独自で採取、購入または外部から供与を受けた天然資源である９９４種の植物・食品由来メタノール抽出物ライブラリーを用いた。９９４種の植物・食品由来メタノール抽出物ライブラリーのうち、セイタカアワダチソウ、カラタチ、アボガド、サワラ、Hyamridhi、セージ、リコリス、ミツバ、ヤマウルシの９種のライブラリーにて生育回復活性が認められた。
【００８８】
＜３．セイタカアワダチソウからの活性物質の単離精製＞
セイタカアワダチソウの根８６２．４ｇをメタノールで、３日間、室温において抽出し、濃縮させて乾固させることにより２３．０ｇの抽出物を得た。該抽出物を少量のメタノールに溶解した後、溶解後の抽出物を１０倍量の水に分散させ、当該混合物を等量の酢酸エチルで２回抽出し、濃縮させて乾固させることにより９．４ｇの抽出物を得た。
【００８９】
該抽出物のうち４．２ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（クロロホルム：メタノール＝９：１）を用いて活性物質を溶出させた。
【００９０】
溶出後に得られた活性物質のうち３５２．６ｍｇを、ＨＰＬＣにて精製（溶出条件：８５％メタノール−０．１％酢酸）した。具体的には、精製時に検出された３つのピーク（図１の（ａ）および（ｂ）を参照）に相当する成分を単離し、各々を、成分Ａ、成分Ｂ、および、成分Ｃとした。なお、成分Ａおよび成分Ｂは白色粉末、成分Ｃは黄色のオイルとして単離された。
【００９１】
＜４．活性物質の構造の同定＞
上述の成分Ａ、成分Ｂ、および成分Ｃの構造を、EIMS、HREIMS、1次元NMR（1H、13C）、DEPT、2次元NMR（COSY、HMQC、HMBC、NOESY）などにより同定した。その結果を図３に示す。図３は、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃの構造を示す図である。成分Ａはsolidagonic acid（図３の（ａ）を参照）、成分Ｂはkolavenic acid analog（６β−チグロイルオキシコラベン酸analogue）（図３の（ｂ）を参照）、および、成分Ｃはkolavenic acid（図３の（ｃ）を参照）であることがわかった。尚、成分Ｂのkolavenic acid analogの構造は、これまでに報告されていた６β−チグロイルオキシコラベン酸の構造（越野広雪、栗澤尚瑛、木村賢一、小市俊悟、佐藤寛子、CAST/CNMRシステムを用いたClerodane型ジテルペンの13C NMRの帰属と構造の評価、第56回NMR討論会、11月14日〜16日、首都大学東京、講演要旨集p38）とは異なる、新たな構造であった。
【００９２】
＜５．３種の成分を用いた、ＴＹ−２７株に対する生育回復活性の評価＞
上述の＜２．スクリーニング条件の設定およびＴＹ−２７株における生育回復活性の測定＞に記載した方法と同様の方法によって、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃを用いた場合のＴＹ−２７株に対する生育回復活性の評価を行った。
【００９３】
その結果を図２に示す。図２は、ＴＹ−２７株の生育回復活性を示す像、および、各成分のスポット量と、生育円との関係、を示している。ここで、図２の（ａ）の像は成分Ａを、（ｂ）の像は成分Ｂを、および（ｃ）の像は成分Ｃを用いた結果を示している。また、「生育円」とは、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃを培地へスポットすることにより、形質転換体の増殖が認められた略円形状の領域を示す。さらに、「阻止円」とは、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃを培地へスポットした場合において、形質転換体の増殖が認められなかった略円形状の領域を示す。また、像中に示される数字は、図２の各表に記載されている生育円の番号（Ｎｏ．）に対応しており、かつ、像中に見られる点線の円は、各成分における最小のスポット量が滴下された箇所の生育円を示す。
【００９４】
図２に示す通り、（ａ）〜（ｃ）のいずれにおいても生育円が認められた。また、（ａ）〜（ｃ）の像において、生育円が認められた最小のスポット量は、（ａ）が３１０μｇ、（ｂ）が０．２ｎｇ、（ｃ）が１０ｎｇであった。このことから、成分Ｂが最も低濃度において生育回復活性を示したことがわかった。さらに、生育円が認められた最小のスポット量の濃度を比較すると、成分Ｂの生育回復活性が最も強く、成分Ｃの生育回復活性が２番目に強く、成分Ａの生育回復活性が３番目に強いことがわかった。
【００９５】
＜６．３種の成分を用いた、ＴＹ−９４株に対する生育回復活性の評価＞
上述の２および５に記載した方法および成分と同様の、方法および成分によって、ＨＳＥＴの酵母ホモログであるｐｋｌ１を過剰発現させた株（以降、ＴＹ−９４株と称する）に対する生育回復活性の評価を行った。その結果を図４に示す。
【００９６】
図４は、ＴＹ−２７株、ＴＹ−９４株およびＨｏｓｔ株（空ベクターを導入したコントロール）について、生育回復活性の有無を示す像である。ここで、（ａ）の像は成分Ａを、（ｂ）の像は成分Ｂを、および（ｃ）の像は成分Ｃを用いた結果を示している。図４に示される通り、空ベクターを導入したホスト株においては、生育回復活性が認められなかった。一方、ＴＹ−９４株においては、ＴＹ−２７株と同様の生育回復活性が認められた。
【００９７】
＜７．３種の成分を用いた、ＨＬ６０に対する毒性の評価＞
上述の３種の成分が、ヒト急性前骨髄性白血病細胞であるＨＬ６０に与える毒性を評価した。培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ含有、１０％  非働化済ＦＢＳ、１%  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ （５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍｌ））を用いた。
【００９８】
ＨＬ６０を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように希釈し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに希釈後の細胞を、９８μｌずつ播種した。ＭｅＯＨで任意の濃度に希釈された上述の成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃの各サンプルを、２μｌずつ培地へ加え、３７℃で２日間培養した。
【００９９】
培養後、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を求めた。なお、細胞生存率は、[薬剤処理細胞の吸光度（５６０ｎｍ）/コントロール（メタノール処理）細胞の吸光度（５６０ｎｍ）]×１００（％）として算出した。
【０１００】
その結果を図５へ示す。図５は、ＨＬ６０の細胞生存率を示すグラフである。ここで、図５の（ａ）は成分Ａ、（ｂ）は成分Ｂ、および（ｃ）は成分Ｃをそれぞれ用いた結果を示している。各成分を滴下されたＨＬ６０のＩＣ５０は、（ａ）において１００μＭ以上、（ｂ）において１０．８μＭ、および（Ｃ）において７８．７μＭであった。従って、ヒト急性前骨髄性白血病細胞に対する毒性は、成分Ｂが最も強く、成分Ｃが２番目に強く、成分Ａが３番目に強いことが確認された。つまり、各成分が有する、癌細胞への毒性の強さの順位は、上述の５において検証された回復活性の強さの順位と同様であった。
【０１０１】
＜８．成分Ｂを用いた、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する毒性の評価＞
上述の成分Ｂが、ＨＳＥＴを過剰発現していないヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７および、ＨＳＥＴを過剰発現しているヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１に与える毒性を評価した。具体的には、培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ含有、１０％  非働化済ＦＢＳ、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍｌ））を用いた。
【０１０２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＭＣＦ−７を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように希釈し、それぞれ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに９８μｌずつ播種した。ＭｅＯＨで任意の濃度に希釈した上述の成分Ｂ２μｌを培地へ加え、３７℃で２日間培養した。培養後、上述した方法にしたがって細胞生存率を算出した。
【０１０３】
その結果を図６に示す。図６は、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１における細胞生存率を示すグラフである。図６に示す通り、各成分を滴下されたＭＣＦ−７のＩＣ５０は、１２６．６μＭであった。一方、各成分を滴下されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＩＣ５０は、８５．４μＭであった。この結果から、ＨＳＥＴを過剰発現していないＭＣＦ−７に比べ、ＨＳＥＴを過剰発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、約１．５倍高い毒性が認められた。
【０１０４】
以上の結果から、ＨＳＥＴ過剰発現分裂酵母の生育回復活性を指標に、天然資源よりヒト癌細胞に作用する成分が単離でき、かつ、該成分はＨＳＥＴを過剰発現しているヒト乳癌細胞に強く作用することが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、医療の分野において広範囲に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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