(57)【要約】    【課題】表皮細胞増殖機能を高める中分子量ヒアルロン酸またはその塩を利用することで表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤などを提供することを課題とする。    【解決手段】本発明の表皮改善剤等は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下であり、ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上であることを特徴としている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上である、表皮改善剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下である、表皮改善剤。
【請求項３】
ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下であり、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上である、表皮改善剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の表皮改善剤を含有する、皮膚外用組成物。
【請求項５】
アスコルビン酸の誘導体、トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種をさらに含む、請求項４に記載の皮膚外用組成物。
【請求項６】
更年期における皮膚の老化を抑制するための、請求項４又は５に記載の皮膚外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮改善剤、及び、該表皮改善剤を含む皮膚外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、表皮の機能を改善する表皮改善剤として、（Ａ）リン脂質誘導体および／又はリン脂質重合体、（Ｂ）加水分解ヒアルロン酸および／又はその塩、（Ｃ）ビルベリー抽出物、並びに（Ｄ）非イオン性界面活性剤および／又はシリコーン系界面活性剤を含有してなる表皮改善剤が知られている（特許文献１）。
【０００３】
特許文献１に記載の表皮改善剤は、平均分子量が１万以下の加水分解ヒアルロン酸（Ｂ）や、その他の上記成分を含むため、表皮の角質層を十分に保湿でき、加齢等によって低下した表皮の機能をやや改善できる。
【０００４】
ところが、特許文献１に記載の表皮改善剤は、角質層を形成する表皮細胞が増殖する機能の指標となるＫｉ−６７の陽性細胞数を十分には増やせない。斯かる陽性細胞数を十分に増やせないことから、表皮細胞増殖機能を十分に高めることができず、低下した表皮の機能を必ずしも十分に改善できないという問題を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１４９６２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題点等に鑑み、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるＫｉ−６７の陽性細胞数を十分に増やすことで、表皮細胞増殖機能を高め、低下した表皮の機能を十分に改善できる表皮改善剤及び皮膚外用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上であることを特徴としている。
【０００８】
本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下であることを特徴としている。
【０００９】
本発明に係る表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、
前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下であり、
前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上であることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る皮膚外用組成物は、上記のいずれかの表皮改善剤を含有することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る皮膚外用組成物は、アスコルビン酸の誘導体、トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種をさらに含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に係る皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化を抑制するためのものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるＫｉ−６７の陽性細胞数を十分に増やすことで、低下した表皮細胞増殖機能を高め、表皮の機能を十分に改善できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】角質層のタンパク質の量を指標にして角質強度を評価した結果を示すグラフ。
【図２】水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を指標にして角質強度を評価した結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る表皮改善剤の実施形態について以下に説明する。
【００１６】
本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、該ヒアルロン酸又はその塩の総量に対して、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上である。
又は、本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、該ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下である。
本実施形態の表皮改善剤は、上記のヒアルロン酸又はその塩を含むことから、表皮細胞増殖機能の指標マーカーを高めて、表皮細胞増殖機能を十分に高めることができる。よって、低下した表皮の機能を十分に改善できる。
【００１７】
本実施形態の表皮改善剤は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、前記ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下であり、且つ、前記ヒアルロン酸又はその塩のうち、分子量が５０，０００以上４００，０００以下の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が占める割合は、４０％以上であることが好ましい。
【００１８】
上記のヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とが結合した二糖単位がつながった鎖状構造を有する、ムコ多糖高分子化合物である。上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩は、一般的な方法によって得ることができる。例えば、数平均分子量が１００万程度の高分子量ヒアルロン酸又はその塩を、酵素や希酸によって加水分解した後に、透析処理することによって得ることができる。具体的には、数平均分子量が１００万程度の高分子量ヒアルロン酸（キューピー社、製品名「ヒアルロンサンＨＡ」）を希塩酸によって室温で加水分解処理した後、得られた低分子物を透析処理によって取り除くことで、上記の中分子量ヒアルロン酸を含む表皮改善剤を調製できる。
上記の中分子量ヒアルロン酸の製造方法は、特に限定されず、中分子量ヒアルロン酸として市販品を用いることもできる。市販品としては、例えば、キッコーマンバイオケミファ社製、製品名「ヒアルロン酸Ｎａ−ＦＣＨＳＵ」が挙げられる。
【００１９】
ヒアルロン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩などが挙げられる。ヒアルロン酸の塩の分子量は、後述するＧＰＣ測定によって得られる値である。
【００２０】
本実施形態の表皮改善剤において、ヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下である。詳しくは、上記の表皮改善剤に含まれるヒアルロン酸又はその塩の数平均分子量は、１００，０００以上３００，０００以下である。
数平均分子量が１００，０００以上３００，０００以下であることにより、表皮細胞増殖機能を十分に高め、低下した表皮の機能を十分に改善できる。
【００２１】
上記の数平均分子量は、１００，０００よりも大きく２００，０００以下であることが好ましい。１５０，０００以上であることがより好ましい。これにより、表皮細胞増殖機能をより十分に高め、低下した表皮の機能をより十分に改善できるという利点がある。
【００２２】
上記の数平均分子量は、後述するＧＰＣ測定において、分子量が５，０００以上４００万以下の範囲におけるヒアルロン酸の数平均分子量である。
【００２３】
本実施形態の表皮改善剤は、分子量が５０，０００未満のヒアルロン酸又はその塩をさらに含んでもよく、また、分子量が４００，０００よりも大きいヒアルロン酸又はその塩をさらに含んでもよい。
【００２４】
上記の分子量及び数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定される。上記の分子量は、標準プルラン・グルコース換算値である。なお、平均分子量の値については、重量平均分子量ではなく、数平均分子量の値を採用する。上記の分子量及び数平均分子量の測定方法については、実施例において詳しく説明する。
【００２５】
本実施形態の表皮改善剤において、ヒアルロン酸及びその塩の全体に対して、分子量が５万〜４０万の範囲のヒアルロン酸（中分子量ヒアルロン酸）が占める割合（含有率）は、４０％以上である。これにより、表皮細胞増殖機能の指標マーカーであるＫｉ−６７の陽性細胞数を十分に増やすことができ、表皮を活性化し、低下した表皮機能を十分に改善できる。斯かる割合は、５５％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましい。
【００２６】
上記の中分子量ヒアルロン酸の割合（含有率）は、ＧＰＣ測定で得られた結果を基にして、下記のような方法によって決定される。
ＧＰＣ測定によって得られた分子量分布曲線を基にして、積分分布を示すスライスデータを求める。スライスデータを基にして、５万〜４０万の指定分子量範囲で分画し、上記の割合（含有率）を算出する。
【００２７】
上記の表皮改善剤は、中分子量ヒアルロン酸又はその塩を０．０２質量％以上５質量％以下含むことが好ましい。
【００２８】
上記の表皮改善剤は、分子量が５０，０００以上４００，０００以下のヒアルロン酸又はその塩（中分子量ヒアルロン酸）を多く含むため、表皮細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現を十分に高めることができ、表皮の機能を十分に改善することができる。ところで、女性ホルモン（エストラジオール）も、表皮細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現を促進できるが、上記のヒアルロン酸又はその塩に比べて、刺激性が高い。そのため、女性ホルモンを累積的に人体等に使用すると、副作用が生じ得る
【００２９】
なお、皮膚の老化によって、皮膚コラーゲンが減少し、表皮が薄くなることが知られている。これに対して、皮膚の老化に伴って上昇するコルチゾール修飾酵素を阻害することで、表皮細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７陽性細胞を増加させることができ、Ｋｉ−６７陽性細胞の増加に伴って、表皮が肥厚するとともに、表皮が改善されることが報告されている（コスメトロジー研究報告Vol.22, 123-129、2014）。
【００３０】
上記の表皮改善剤は、Ｋｉ−６７などの表皮細胞増殖因子の発現を促進できる他、デスモグレイン（デスモグレイン−１）の細胞接着作用を高めることもできる。これにより、上記の表皮改善剤は、更年期において皮膚の表皮の機能が低下して角質強度が低下することを抑制することができる。即ち、上記の表皮改善剤は、角質強度を高める作用を有する。これによっても、表皮（角質層）の機能を十分に改善することができる。
【００３１】
角質強度とは、角質層内部のｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（整合性）を示し、その強度は角質細胞同士の接着状態に依存している。角質強度は、角質層に対してテープストリッピングをした後に、角質層のタンパク質の量や水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定し、その結果を指標にして、推定できる。
【００３２】
上記の表皮改善剤は、更年期の年齢に達して女性ホルモンの分泌が減少した女性に適用することによって、更年期において表皮機能が低下したり、角質強度が減少（角質層結合力が減少）したりする、表皮の老化を抑制できる。上記の表皮改善剤は、例えば簡略更年期指数（ＳＭＩ）が２０以上の女性に適用されることにより、適用された女性に高い満足度を与えることができる。更年期障害に伴う皮膚の老化については、下記のような研究が行われている。
【００３３】
更年期は、女性においては、女性ホルモンの分泌量が急激に低下する時期であり、おおむね４５〜５５歳の時期である。更年期には、皮膚のタルミ、カサツキ、ハリの低下、皮膚弾性の低下などが目立つようになり、更年期における皮膚は、老化現象を起こすと考えられている。近年、卵巣を摘出したマウスを更年期モデルとして活用して研究を行った結果、更年期になると、皮膚の萎縮や角質強度の低下がマウスでも起こることが報告されている。一般的に、更年期の女性では、女性ホルモンの分泌が急激に減少することが知られている。これに伴い、皮膚の老化が進行して、皮膚のタルミが増加し、ハリが低下し、皮膚弾性が低下することが報告されている（日本更年期医学会雑誌、第８巻、p.33-40 [2000]）。このような現象が起こる原因の一つとして、更年期に女性ホルモンの分泌量が低下することに伴って、皮膚のコラーゲン等の量が減少することが報告されている（Maturitus 15 p.113-119 1992, Br J Obstet Gynecol 100 p.154-156 1993）。しかしながら、更年期にコラーゲン量が減少するメカニズムは、解明されていない。
これに対して、コラーゲン量の減少を防止する方法として、女性ホルモンを女性に投与する方法が知られているが、それ以外の有効な方法は、特に見出されていない。一方で、女性ホルモンを投与すると、副作用が発生するという危惧があり、女性ホルモンを配合した製剤を製品として販売することは、安全性の点で制限される場合が多く、現実的でない。
【００３４】
上記の表皮改善剤は、通常、皮膚の表皮（角質層）に塗布されて使用される。上記の表皮改善剤は、経口投与されて使用されてもよい。
【００３５】
次に、本発明に係る皮膚外用組成物の実施形態について説明する。
【００３６】
本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の表皮改善剤を含む。本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の表皮改善剤以外に、アスコルビン酸（ビタミンＣ）やトコフェロール（ビタミンＥ）の誘導体などの活性酸素ラジカル消去剤、キチンの誘導体、キトサンの誘導体、高級アルコール、液状油、乳化剤、又は、水溶性高分子化合物などをさらに含むことが好ましい。
【００３７】
上記の皮膚外用組成物は、分子量を問わずヒアルロン酸又はその塩を０．０４質量％以上１０質量％以下含むことが好ましい。上記の皮膚外用組成物は、上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩を０．０２質量％以上５質量％以下含むことが好ましい。
上記の皮膚外用組成物は、中分子量ヒアルロン酸よりも分子量が大きいヒアルロン酸や、中分子量ヒアルロン酸よりも分子量が小さい加水分解ヒアルロン酸等をさらに含んでもよい。上記の皮膚外用組成物においては、本実施形態のように、ヒアルロン酸及びその塩の全体に対して、分子量が５万〜４０万の範囲のヒアルロン酸（中分子量ヒアルロン酸）が占める割合（含有率）が４０％以上であることが好ましい。これにより、表皮を十分に活性化でき、低下した表皮機能を十分に改善することができる。
【００３８】
本実施形態の皮膚外用組成物は、アスコルビン酸の誘導体、トコフェロールの誘導体、キチンの誘導体、及び、キトサンの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種をさらに含むことがより好ましい。
【００３９】
アスコルビン酸の誘導体は、両親媒性を示すものであることが好ましい。アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ、アスコルビン酸セチルエーテル、グリセリルアスコルビン酸、ミリスチル３−グリセリルアスコルビン酸等が挙げられる。
【００４０】
トコフェロールの誘導体は、両親媒性を示すものであることが好ましい。トコフェロールの誘導体としては、例えば、ニコチン酸トコフェロール、リン酸トコフェロールナトリウム塩、コハク酸トコフェロール、トコフェリルリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００４１】
キチンの誘導体としては、例えば、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチン、ミリストイル化キチン塩等が挙げられる。
【００４２】
キトサンの誘導体としては、例えば、カルボキシメチルキトサン、キトサン乳酸塩、又は、部分ミリストイル化カルボキシメチルキトサン等の部分アシル化カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルキトサンサクシナミド、カルボキシメチルキトサンミリスタミド、ヒドロキシプロピルキトサン、カルボキシメチルキトサンラウラミド等が挙げられる。
【００４３】
上記の高級アルコールは、炭素数が１０以上２４以下の脂肪族アルコールである。具体的に、高級アルコールとしては、ベヘニルアルコール、アラキジルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール、ヒドロキシステアリルアリコールの少なくとも１種が好ましい。本実施形態の皮膚外用組成物が、高級アルコールとアルキルグルコシドとの複合体（ＳＥＰＰＩＣ社、ＭＯＮＴＡＮＯＶシリーズ）を含むことにより、上記の中分子量ヒアルロン酸又はその塩の作用が高まる。斯かる複合体を含む皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化を抑制するための組成物として好ましい。
【００４４】
液状油としては、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、エチルヘキサン酸セチル、トリ-エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、パルミチン酸セチル、イソステアリン酸−２−ヘキシルデシル、ステアリン酸ステアリル、ミリスチン酸イソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸ネオペンチルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジイソステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸プロピレングリコール等のエステル系液状油剤が挙げられる。また、コメ油、コメヌカ油、月見草油、アルガン油、コムギ胚芽油、オリーブ油、ホホバ油、ブドウ種子油、カミツレ油、ローズマリ−油、ウイキョウ油等の植物系液状油、卵黄油などの動物系液状油が挙げられる。本実施形態の皮膚外用組成物において、液状油は、後述する乳化剤によって水中に分散されて乳化される。
【００４５】
乳化剤としては、例えば、脂肪酸モノグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の非イオン系界面活性剤、塩化ベンザルコニウム等のカチオン系界面活性剤、両性界面活性剤、又は、アニオン界面活性剤等が挙げられる。
【００４６】
水溶性高分子化合物としては、例えば、アラビアゴム、クインシード、寒天、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、カルボキシエチルセルロース塩、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタクリレート、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
【００４７】
本実施形態の皮膚外用組成物は、上記の他にも、一般的な化粧料や外用剤等に配合される成分を、本実施形態の効果や機能を阻害しない範囲で、含み得る。本実施形態の皮膚外用組成物が含み得る成分としては、例えば、ジプロピレングリコール、グリセリン、ペンチレングリコール、プロピレングリコール、ジグリセリン等の多価アルコール類、トリメチルシロキシケイ酸、メチルフェニルポリシロキサン等のシリコーン化合物類、パーフルオロポリエーテル等のフッ素化合物類等の液状油剤が挙げられる。また、本実施形態の皮膚外用組成物が含み得る成分としては、例えば、保湿柔軟化剤、抗酸化剤、収斂剤、美白剤、抗菌剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、水溶性ビタミン類、油溶性ビタミン類、酵素等の医薬部外品原料規格、化粧品種別配合成分規格、化粧品原料基準、日本薬局方、食品添加物公定書規格等に記載の成分が挙げられる。
【００４８】
本実施形態の皮膚外用組成物は、更年期における皮膚の老化（老化症状）を抑制するためのものであることが好ましい。更年期における皮膚の老化症状としては、例えば、皮膚のタルミ、カサツキ、ハリの低下、皮膚弾性の低下などが挙げられる。
【００４９】
本実施形態の皮膚外用組成物は、例えば、固形状、溶液やエマルジョンなどの液状、粉末状（パウダー）、ゲル状などの状態になり得る。
【００５０】
本実施形態の皮膚外用組成物の具体的な用途は、例えば、化粧料である。化粧料の具体例は、１）局所又は全身用の皮膚洗浄料又は皮膚塗布用化粧料、２）頭皮・頭髪に適用する薬用及び／又は化粧用の頭髪用化粧料、３）浴湯に投じて使用する浴用化粧料、４）皮膚貼付用シート、化粧用シート、化粧用コットン、ウェットティッシュなどの皮膚貼付用化粧料などである。より具体的な例としては、ローション、乳液、クリーム、軟膏、ジェル、美容液、オイルなどの基礎化粧料、又は、ファンデーション、口紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラなどのメークアップ化粧料などが挙げられる。また、例えば、顔面用含浸パックなどのシート、ミスト用などのスプレー、アンプルなどにおいて、皮膚外用組成物が用いられる。
【００５１】
本実施形態の皮膚外用組成物は、皮膚（頭皮を含む）の表皮に塗布するなどして適用されることが可能な皮膚外用剤などであり、薬事法上の化粧料、医薬部外品、医薬品等の分類には特に拘束されず、様々な分野に適用される。
【００５２】
本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般の表皮改善剤及び皮膚外用組成物において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【００５３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１，２）
実施例１の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロン酸Ｎａ−ＦＣＨＳＵ」（キッコーマンバイオケミファ社製）を用意した。実施例２の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロンサンＨＡ−ＬＱＨ」（キューピー社製）を希塩酸に溶解した後、室温で２時間処理し、透析処理後、凍結乾燥することによって調製したものを用意した。
【００５５】
（比較例１〜４）
比較例１の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロン酸Ｎａ−ＦＣＨ６０」（キッコーマンバイオケミファ社製）を用意した。比較例２の表皮改善剤として、製品名「ヒアルロンサンＨＡ−ＬＱ」（キューピー社製）を用意した。比較例３の表皮改善剤として、製品名「ヒアロオリゴ」（キューピー社製）を用意した。比較例４の表皮改善剤として、製品名「マイクロヒアルロン酸」（キッコーマンバイオケミファ社製）を用意した。
【００５６】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を利用して、各実施例、各比較例に含まれるヒアルロン酸（ナトリウム塩）の数平均分子量を、以下のようにして求めた。また、下記の条件により、ＧＰＣ測定を行い、分子量分布曲線から、分子量が５万〜４０万の範囲の中分子量ヒアルロン酸又はその塩が、全ヒアルロン酸又はその塩に占める割合（含有率）を求めた。
【００５７】
＜ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量の測定＞
（１）前処理方法
試料を溶離液にて溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターでろ過したものを測定溶液として調製した。
（２）測定条件
測定機器：島津製作所社製  製品名「ＧＰＣ−ＨＰＬＣ  コントローラー  ＳＣＬ−１０ＡＶＰ」
カラム：TSKgel GMPWXL×２＋G2500PWXL×１
（7.8mm I.D.×300mm×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ．
検出器：ＲＩ検出器（Viscotek LR125 Laser Refractometer）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
分子量標準：標準プルラン・グルコース（American Polymer Standards Corp.社製）
（３）分子量及び数平均分子量の測定
分子量：上記の標準プルラン・グルコースの換算値
数平均分子量：付属ソフトウェア  データ解析ソフト「マルチステーションＧＰＣ−８０２０」（東ソー社製）
【００５８】
実施例１及び２、比較例１〜４の表皮改善剤について、上記のようにしてＧＰＣ測定を行った。測定結果を表１に示す。
なお、ＧＰＣ測定において、５，０００以上４００万以下の分子量範囲における、数平均分子量を求めた。また、５，０００以上４００万以下の分子量範囲のヒアルロン酸の量を基準にして、分子量が５万〜４０万の範囲の中分子量ヒアルロン酸の含有率を求めた。
【００５９】
【表１】
2019026559.tif 000002
【００６０】
＜表皮細胞増殖機能に関わる評価＞
三次元ヒト皮膚モデル（クラボウ社製、ＥＦＴ−４００、表皮モデル）の表面に、下記の各液（５０μＬ）をそれぞれ添加し、３７℃、５容量％ＣＯ２存在下で、皮膚モデルを培養した。培地として、皮膚モデル用培地「ＥＦＴ−４００ＭＭ」（クラボウ社製）を用いた。
・ＰＢＳ（−）：コントロール
・実施例１，２及び比較例１〜４の各ヒアルロン酸の１．０質量％水溶液
・エストラジオール製剤（市販品  製品名「エストロジェル」）  陽性対照
β−エストラジオール（シグマ  Ｅ２７５８）の０．０６重量％水溶液
（エストラジオール分散のためのエタノールを１％含む）
４日間培養後、皮膚モデルの表面を生理食塩水で１０回洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、定法に従い薄切切片を作製した。以下の方法で免疫染色を行い、Ｋｉ−６７陽性細胞の数を確認した。
【００６１】
（Ｋｉ−６７陽性細胞の数の確認）
薄切切片を脱パラフィン処理した後に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｏｎｅ（ナカライテスク社製  ＃０３９５３０９５）に室温で１５分間浸漬し、非特異タンパクのブロッキングを行った。生理食塩水で洗浄した後、一次抗体であるAnti-Human Ki-67 Mouse monoclonal antibody clone:MIB-1（ＤＡＫＯ社製  ＃Ｍ７２４０）を５００倍希釈したものに、４℃で一晩浸漬した後、生理食塩水で洗浄した。次に、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧポリクロナール抗体（ニチレイ社製＃４２４１３４）と、室温で３０分間反応させた。さらに、3-Amino-9-ethyl-arbazole（ＡＥＣ）と室温で２０分間接触させて、発色させた後、ヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ社製）を用いて対比染色した。この皮膚切片像の拡大画像から、Ｋｉ−６７陽性細胞の数を測定した。結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2019026559.tif 000003
【００６３】
＜角質強度を評価する試験＞
表２からも明らかなように、各実施例のヒアルロン酸（表皮改善剤）によって、皮膚表皮に見られるＫｉ−６７陽性細胞の数が、コントロールと比較して２．２３〜２．６５倍に増えた。このことから、各実施例のヒアルロン酸が、Ｋｉ−６７陽性細胞数を増やし、表皮細胞増殖機能を高める作用を有することが確認された。その作用は、各比較例のヒアルロン酸よりも優れ、エストラジオールを女性ホルモンとして含有するエストラジオール製剤と同等かそれ以上であった。一方、陽性対照のエストラジオール含有製剤は、Ｋｉ−６７陽性細胞を増殖させる高い作用を有するが、皮膚細胞に対して毒性を示した。
【００６４】
続いて、角質層に対してテープストリッピングをした後に、角質層のタンパク質の量を測定すること、また、水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定することによって、角質強度を評価した。
角質強度は、角質層内部のｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（整合性）を示す。角質強度は、角質細胞同士の接着状態に依存する。角質細胞同士は、コルネオデスモソームによって接着している。角質層では、角質細胞が外側へ移動するに従ってコルネオデスモソームが分解され、角質細胞が最外層で剥離する。角質強度が弱い状態とは、角質層内部においてコルネオデスモソームによって接着している角質細胞同士の接着が弱いために、角質細胞が剥がれやすい状態である。そこで、テープストリッピングを行うと、最外層の角質細胞だけでなく、内側の角質細胞も重なった状態で剥がれ（重層剥離が起こり）、テープストリッピング後の水分蒸散量が多くなる。従って、角質層に対してテープストリッピングをした後に、テープ側に付着した角質層のタンパク質の量（重層剥離量）を測定することによって、角質強度を評価することができる。また、テープストリッピング前後の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の差によって、角質強度を評価することができる。
【００６５】
更年期である４５〜５５歳の女性２１名を２群に分けた。一方の群を、プラセボローション使用群（１０名）とし、他方の群を、実施例１のヒアルロン酸を固形分で１質量％含有するローション使用群（１１名）とした。各ローションを１日２回（朝および晩）左腕に塗布した。試験開始前と、４週間経過後とにおいて、角質層のタンパク質の量、及び、水分蒸散量を以下の方法にて測定した。
【００６６】
【表３】
2019026559.tif 000004
【００６７】
（１．角質層のタンパク質の量の測定）
前腕内側部の角質層に、角質層採取用テープであるＤ−Ｓｑｕａｍｅ（ＣｕＤｅｒｍ社製）を貼り付け、同社の加圧装置を１０秒間押し当てた後に、テープを剥がし取った。角質層タンパク質量測定装置  ＳｑｕａｍｅＳｃａｎ８５０（ＣｕＤｅｒｍ社製）に、剥がし取ったテープをセットして、テープにおける角質層のタンパク質の量を測定した。この装置では、赤外線（８５０ｎｍ）吸収率からタンパク質の量を数値化できる。角質強度が弱い角質層は、角質層内部の接着が弱いため、テープストリッピングによって重層剥離する。このため、角質強度が弱い程、剥がれ取られるタンパク質の量は、多くなる。
試験を開始する前の角質層のタンパク質の量を１００とした。各モニターの４週間後における角質層のタンパク質の量を測定し、角質層のタンパク質の量の変化量を、下記の式によって算出した。結果を比較したグラフを図１に示す。
角質強度（角質層タンパク質の変化量）＝
４週間使用後の吸収率（Ａ８５０）／試験前の吸収率（Ａ８５０）
図１から把握されるように、ヒアルロン酸含有ローション使用群では、テープストリッピング後の角質層タンパク質の量が、プラセボローション使用群よりも、有意に少なくなった。
【００６８】
（２．水分蒸散量  ΔＴＥＷＬの測定）
前腕を洗浄した後、２３℃、湿度５０％環境下にて２０分間安静にした。その後、前腕内側部の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を、携帯型閉鎖チャンバー方式水分蒸散量測定装置  ＶＡＰＯＳＣＡＮ ＡＳ−ＶＴ１００ＲＳ（アサヒバイオメッド社製）を用いて測定した。
測定後、角質層採取用テープであるＤ−Ｓｑｕａｍｅ（ＣｕＤｅｒｍ社製）を前腕に貼り付け、同社の加圧装置を１０秒間押し当てた後に、テープを剥がし取った。同様にして合計１０回、角質層を取り、１０回目の角質層を取った後の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。角質強度は、下記の式から算出した値（ΔＴＥＷＬ）を基にして評価した。なお、角質強度は、角質層を取った後の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）と、角質層を取る前の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）との差が大きいほど弱く、差が小さいほど強い。結果を図２に示す。
ΔＴＥＷＬ＝４週間使用後の角質層を剥がす前のＴＥＷＬ−
４週間使用後の１０回角質層を剥がした後のＴＥＷＬ
図２から把握されるように、テープストリッピング前後の水分蒸散量の差（ΔＴＥＷＬ）も、ヒアルロン酸含有ローション使用群の方で、プラセボローション使用群よりも有意に少なくなった。
【００６９】
＜更年期における皮膚症状の改善作用の評価＞
更年期障害の重症度を示す指標としては、クッパーマン指数、簡略更年期指数（ＳＭＩ）、日本産婦人科学会による更年期症状評価表等がある。本評価では、日本人を対象として作成され、且つスコア化が可能なＳＭＩ更年期指数を用いた。ＳＭＩとは、簡略更年期指数［小山ら（１９９２）］の質問票に従って、更年期の重症度をスコア化したものである。５０点以下においては、食事や運動などの生活習慣を整える程度での改善が見込まれるが、５１点以上においては、医療機関を受診する必要がある。受診を必要とするレベルか否かの区切りとなるＳＭＩスコア５１点を境界として、モニターを２つのセグメントに分けた。
【００７０】
下記に示す組成の美容液を、以下の方法により調製した。下記の処方例は、美容液の処方の一例である。組成を下記に示す。
【００７１】
（美容液の組成）
配合成分                                      配合量（質量％）
油相
ミネラルオイル                                    ２．８
ポリオキシエチレン（20E.O）ステアリンソルビタン  ０．７
モノステアリン酸ソルビタン                        ０．２
アラキルアルコール                                １．５
アラキルグルコシド                                ０．５
ベヘニルアルコール                                ０．５
シア脂                                            １．５
水相
実施例１のヒアルロン酸（固形分）                  ０．５
グリセリン                                        ５．０
１，３−ブチレングリコール                        ４．０
カルボキシメチルキトサンミリスタミド              ０．１
パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ              ０．１
精製水                                            残量（合計：１００にする）
【００７２】
美容液は、次のようにして調製した。油相を８０℃で加熱して溶解させた後、実施例１のヒアルロン酸（有効成分）を含む水相に、溶解させた油相を徐々に添加し、ホモミキサーで均一に分散（３０００ｒｐｍ、２分処理）させた。さらに、脱気しつつ、３０℃まで冷却しながら、ホモミキサー（３０００ｒｐｍ、２分処理）で均一に分散させた。そして、濾過することにより、美容液（乳化物）を調製した。
また、ヒアルロン酸を配合しない点以外は、同様にして、比較用の美容液を調製した。
【００７３】
簡略更年期指数（ＳＭＩ）が２６〜５０である、４５〜５５才の女性ボランティア２０名を被験者とした。年齢及びＳＭＩ値が均等になるように、被験者を２群（中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群：１０名、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群：１０名）に分けた。左右の頬部に、上記のごとく調製した美容液を１日に２回塗布し、８週間使用してもらった。終了後、自己評価によって、使用前と比較することで、肌の改善効果を評価した。
上記のごとく調製した中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善      （改善＋やや改善：７０％）
肌のカサツキが改善  （改善＋やや改善：８０％）
肌のハリ弾力が改善  （改善＋やや改善：５０％）
肌のかゆみが改善    （改善＋やや改善：５０％）
【００７４】
一方、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善      （改善＋やや改善：５０％）
肌のカサツキが改善  （改善＋やや改善：４０％）
肌のハリ弾力が改善  （改善＋やや改善：２０％）
肌のかゆみが改善    （改善＋やや改善：３０％）
【００７５】
実施例１のヒアルロン酸を含有する製剤は、改善＋やや改善の回答率が５０〜８０％を示したのに対して、比較用美容液を用いた場合、ほとんどの項目において、改善＋やや改善の回答率が５０％以下であった。本発明の皮膚外用組成物は、更年期の皮膚改善に有用であることが示唆された。
【００７６】
次に、簡略更年期指数（ＳＭＩ）が５１以上である、４５〜５５才の女性ボランティア２０名を被験者にして評価を同様に遂行した。年齢及びＳＭＩ値が均等になるように、被験者を２群（中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群：１０名、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群：１０名）に分けた。左右の頬部に、上記のごとく調製した美容液を１日に２回塗布し、８週間使用してもらった。終了後、自己評価によって、使用前と比較することで、肌の改善効果を評価した。
上記のごとく調製した中分子量ヒアルロン酸を含む美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善      （改善＋やや改善：８０％）
肌のカサツキが改善  （改善＋やや改善：９０％）
肌のハリ弾力が改善  （改善＋やや改善：７０％）
肌のかゆみが改善    （改善＋やや改善：６０％）
【００７７】
一方、中分子量ヒアルロン酸を含有しない美容液の使用群に関する結果を下記に示す。
使用前に比べて、
肌の状態が改善      （改善＋やや改善：４０％）
肌のカサツキが改善  （改善＋やや改善：４０％）
肌のハリ弾力が改善  （改善＋やや改善：２０％）
肌のかゆみが改善    （改善＋やや改善：２０％）
【００７８】
実施例１のヒアルロン酸を含有する製剤は、改善＋やや改善の回答率が６０〜９０％を示したのに対して、比較用美容液を用いた場合、ほとんどの項目において、改善＋やや改善の回答率が４０％以下であった。
簡略更年期指数（ＳＭＩ）が５１以上を示すモニターに対して、更に高い有用性を示すことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の表皮改善剤及び皮膚外用組成物は、例えば、皮膚外用剤として皮膚に塗布されて、表皮の角化を改善するために、好適に使用できる。
表皮の角化を改善することにより、皮膚のタルミ、カサツキ、ハリの低下、皮膚弾性の低下を抑制することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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