(57)【要約】【課題】種々の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の製造方法を提供する。【解決手段】有機溶媒と水の含有比率を変更するグラジエント法によって、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤から当該リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させてリグニン分解物を複数に分画する分画工程を有する、リグニン分画物の製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒と水の含有比率を変更するグラジエント法によって、リグニン分解物を複数に分画する分画工程を有する、リグニン分画物の製造方法。
【請求項２】
前記分画工程は、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤から当該リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させてリグニン分解物を複数に分画する、請求項１に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項３】
前記グラジエント法は、有機溶媒の濃度が互いに異なる複数の溶液を用いて前記リグニン分画物を複数に分画するステップワイズグラジエント法である、請求項１又は２に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項４】
前記分画工程の前に、
植物をアルカリ分解し、セルロースを含む固形分が低減されたアルカリ分解物を含む反応液を得るアルカリ分解工程と、
前記反応液を酸性にして生じた沈殿の少なくとも一部を除去するｐＨ調整工程と、
合成吸着剤に前記リグニン分解物を吸着させる吸着工程と、を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項５】
前記分画工程において、前記有機溶媒を含む溶液を用いて前記リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる前に、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤を水で洗浄して前記リグニン分解物の少なくとも一部を含むリグニン分画物を得る、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項６】
前記水による洗浄を複数回に分けて行うことによって複数のリグニン分画物を得る、請求項５に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項７】
植物をアルカリ分解し、セルロースを含む固形分が低減されたアルカリ分解物を含む反応液を得るアルカリ分解工程と、
前記反応液を酸性にして生じた沈殿の少なくとも一部を除去するｐＨ調整工程と、
合成吸着剤にリグニン分解物を吸着させる吸着工程と、
リグニン分解物が吸着した合成吸着剤を水で洗浄してリグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる分画工程と、を有し、
前記分画工程では、水による洗浄を複数回に分けて行うことによって複数のリグニン分画物を得る、リグニン分画物の製造方法。
【請求項８】
前記分画工程で分画した複数のリグニン分画物のうち少なくとも２つを混合してリグニン分画物の混合物を得る混合工程を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリグニン分画物の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法によって得られる複数のリグニン分画物のうち、少なくとも一つのリグニン分画物を含む組成物。
【請求項１０】
抗酸化用、酵素阻害用、抗腫瘍用、又は抗癌用である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法で得られるリグニン分画物を、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤、又は抗癌剤の製造に使用するリグニン分画物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、リグニン分画物の製造方法及び使用方法、並びにリグニン分画物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物バイオマスからセルロースを分離して得られる黒液に含まれるリグニン成分の有効利用を図ることが検討されている。例えば、特許文献１では、金属イオンとリグニン含有材料とを接触させて、リグニン含有材料からリグニン由来成分を抽出する技術が提案されている。当該技術によって得られるリグニン抽出物は、抗アレルギー作用、シワ改善作用及びシミ改善作用等を有することが示されている。例えば、特許文献２では、鉄イオンの存在下でリグニン含有材料を発酵させて得られるリグニンの抽出物を細胞増殖阻害剤に用いることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−３０９２１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／０２４３５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
植物から得られるリグニン抽出物は、種々の成分を含むうえに、リグニンの分解物自体も広い分子量分布を有している。このため、植物からリグニンを単に抽出しただけでは、含有成分の有用性を見出すことは困難である。このため、リグニンの含有成分が有する作用及び効用は未だ十分に活用されていないと考えられる。
【０００５】
そこで、本開示は、種々の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の製造方法、並びに当該製造方法によって得られるリグニン分画物を含む組成物を提供する。また、本開示は、リグニン分画物を抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一側面は、有機溶媒と水の含有比率を変更するグラジエント法によって、リグニン分解物を複数に分画する分画工程を有する、リグニン分画物の製造方法を提供する。
【０００７】
上記製造方法では、有機溶媒と水の含有比率を変更するグラジエント法によって、リグニン分解物を複数に分画している。このため、有機溶媒と水の含有比率に応じて、組成が互いに異なる複数のリグニン分画物を得ることができる。複数のリグニン分画物は、その組成が互いに異なるため、それぞれ異なる特性を有する。このため、複数のリグニン分画物の中から、必要とされる特性及び用途に適したリグニン分画物を適宜選択することによって、種々の用途に有効活用することができる。例えば、リグニン分画物を含む組成物を、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤に用いることができる。
【０００８】
上記分画工程は、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤から当該リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させてリグニン分解物を複数に分画してもよい。リグニン分解物が吸着した合成吸着剤からリグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる手段を採用することによって、ヘミセルロース及び中和塩等の不純物が低減されたリグニン分画物を得ることができる。
【０００９】
グラジエント法は、有機溶媒の濃度が互いに異なる複数の溶液を用いてリグニン分画物を複数に分画するステップワイズグラジエント法であってよい。これによって、抗酸化特性又は生理活性等が大きく異なるリグニン分画物が得られ易くなる。
【００１０】
上記製造方法は、分画工程の前に、植物をアルカリ分解し、セルロースを含む固形分が低減されたアルカリ分解物を含む反応液を得るアルカリ分解工程と、反応液を酸性にして生じた沈殿の少なくとも一部を除去するｐＨ調整工程と、合成吸着剤にリグニン分解物を吸着させる吸着工程と、を有してもよい。
【００１１】
上述のアルカリ分解工程と、ｐＨ調整工程と、吸着工程とを有することによって、ヘミセルロース及び中和塩等の不純物が低減されたリグニン分画物を、植物から効率的に製造することができる。
【００１２】
上記製造方法では、分画工程において、有機溶媒を含む溶液を用いてリグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる前に、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤を水で洗浄してリグニン分解物の少なくとも一部を含むリグニン分画物を得てもよい。このように水で洗浄することによって、有機溶媒を用いる場合とは異なる組成を有するリグニン分画物を得ることができる。このようなリグニン分画物は、例えば、中和塩、並びに、ヘミセルロース、ヘミセルロースの加水分解によって生じるオリゴ糖及び単糖等の糖を含んでいてもよい。このリグニン分画物を含む組成物を、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤等に用いてもよい。
【００１３】
上記水による洗浄を複数回に分けて行うことによって複数のリグニン分画物を得てもよい。これによって、抗酸化特性及び生理活性が互いに異なる複数のリグニン分画物を得ることができる。例えば、複数のリグニン分画物のうち、優れた酵素阻害特性を有するリグニン分画物を選択し、これを酵素阻害剤に用いてもよい。
【００１４】
本開示の一側面は、植物をアルカリ分解し、セルロースを含む固形分が低減されたアルカリ分解物を含む反応液を得るアルカリ分解工程と、反応液を酸性にして生じた沈殿の少なくとも一部を除去するｐＨ調整工程と、合成吸着剤にリグニン分解物を吸着させる吸着工程と、リグニン分解物が吸着した合成吸着剤を水で洗浄してリグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる分画工程と、を有し、分画工程では、水による洗浄を複数回に分けて行うことによって複数のリグニン分画物を得る、リグニン分画物の製造方法を提供する。複数のリグニン分画物を互いに混合して混合物としてもよい。
【００１５】
上記製造方法では、アルカリ分解工程とｐＨ調整工程で得られたリグニン分解物を合成吸着剤に吸着させている。合成吸着剤には、水溶性の成分が付着している。このため、水を用いる分画工程を行うことによって、有機溶媒を用いる場合とは異なる組成及び異なる特性（例えば抗酸化特性及び生理活性）を有するリグニン分画物を得ることができる。このようなリグニン分画物は、例えば、中和塩、並びに、ヘミセルロース、ヘミセルロースの加水分解によって生じるオリゴ糖及び単糖等の糖を含んでいてもよい。このリグニン分画物を含む組成物を、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤、及び抗癌剤等に用いてもよい。
【００１６】
分画工程で分画した複数のリグニン分画物のうち少なくとも２つを混合してリグニン分画物の混合物を得る混合工程を有していてもよい。これによって、所望の特性を有するリグニン分画物を得ることができる。
【００１７】
本開示の一側面は、上述のいずれかの製造方法によって得られる複数のリグニン分画物のうち、少なくとも一つのリグニン分画物を含む組成物を提供する。このような組成物は、リグニン分解物の溶出に用いる溶媒の組成に応じて、組成が互いに異なる複数のリグニン分画物の少なくとも一つを含む。このような組成物は、複数のリグニン分画物の中から、必要とされる特性及び用途に適したリグニン分画物を適宜選択することによって、種々の用途に有効活用することができる。当該組成物は、その特性から、抗酸化用、酵素阻害用、抗腫瘍用、又は抗癌用として好適に用いることができる。
【００１８】
本開示の一側面は、上述のいずれかに記載の製造方法によって得られる複数のリグニン分画物のうち、少なくとも一つのリグニン分画物を含む抗酸化剤、抗腫瘍剤、抗癌剤、又は酵素阻害剤を提供してもよい。
【００１９】
本開示の一側面は、上述のいずれかに記載の製造方法で得られるリグニン分画物を、抗酸化剤、抗腫瘍剤、抗癌剤、又は酵素阻害剤の製造に使用するリグニン分画物の使用方法を提供する。この使用方法によれば、リグニン分画物を抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤の用途に有効活用することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本開示によれば、種々の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の製造方法、並びに当該製造方法によって得られるリグニン分画物を含む組成物を提供することができる。また、本開示によれば、リグニン分画物を抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の使用方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、リグニン分画物の製造方法の一例を示す製造工程図である。
【図２】図２は、リグニン分画物のＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）の分析結果を示すチャートである。
【図３】図３は、ＯＲＡＣ法（Oxygen Radical AbsorbanceCapacity）による抗酸化活性の評価結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト乳腺癌由来細胞（ＭＣＦ７）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ−Ｇ２）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒト子宮頸部癌細胞（Ｈｅｌａ）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト大腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト悪性黒色腫（Ｇ３６１）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト大腸癌由来細胞（ＨＣＴ１１６）の増殖抑制作用の評価結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）への毒性作用の評価結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、正常大腸細胞（ＣＣＤ８４１）への毒性作用の評価結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、α−グルコシダーゼ阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、リパーゼ（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）の阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、リパーゼ（最終濃度：８００μｇ／ｍＬ）の阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、場合により図面を参照して、本開示の一実施形態について説明する。ただし、以下の実施形態は、本開示を説明するための例示であり、本開示を以下の内容に限定する趣旨ではない。
【００２３】
本開示の一実施形態に係るリグニン分画物の製造方法は、植物をアルカリ分解し、セルロースを含む固形分が低減されたアルカリ分解物を含む反応液を得るアルカリ分解工程と、反応液を酸性にして生じた沈殿の少なくとも一部を除去してリグニン分解物を得るｐＨ調整工程と、リグニン分解物を、固形分を含む高分子リグニン分解物と当該高分子リグニン分解物よりも固形分が少ない低分子リグニン分解物とに分ける分離工程と、合成吸着剤に低分子リグニン分解物を吸着させる吸着工程と、低分子リグニン分解物が吸着した合成吸着剤から、水及び／又は有機溶媒を用いて低分子リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させる分画工程と、を有する。図１は、本実施形態のリグニン分画物の製造方法の一例を示す製造工程図である。図１の製造方法について詳細に説明する。
【００２４】
植物（バイオマス）としては、リグノセルロースを含む種々のものを用いることが可能であり、例えば、針葉樹及び広葉樹等の樹木を含む草木類のみならず、稲わら、麦わら、籾殻等の農産廃棄物、建設発生木材、製材工場残材等の産業廃棄物を用いることができる。植物のアルカリ分解は、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、又はアルカリ金属炭酸塩を用いて行う蒸解によって行うことができる。必要に応じて、公知の助剤等を用いてもよい。
【００２５】
アルカリ分解工程では、植物に含まれるリグニン及びヘミセルロースを溶解させる。これによって、セルロースを含む残渣（パルプ）を含む懸濁液が得られる。第１分離工程では濾過等の分離方法によって、懸濁液から残渣の少なくとも一部を除去して、懸濁液よりも固形分が低減された、アルカリ、リグニン分解物及びヘミセルロースを含む反応液が得られる。この反応液は、黒液と称されることもあり、ｐＨは例えば１０以上であってもよく、１２以上であってもよい。
【００２６】
ｐＨ調整工程では、反応液に酸を加えて反応液を酸性にする。酸としては例えば無機酸を用いる。無機酸は硫酸であってもよい。反応液のｐＨは、例えば５以下であってよく、４以下であってもよく、３．５以下であってもよい。反応液を酸性にすることによって、酸沈殿が生じる。酸沈殿は、例えば、リグニン分解物のうち、数平均分子量が大きいもの（例えば数平均分子量が１０００以上）を主成分として含有する。一方、沈殿しない液体（分散液又は溶液）は、リグニン分解物のうち、数平均分子量が小さいもの（例えば数平均分子量が１０００未満）を主成分として含有する。酸沈殿は、高分子リグニン分解物の他に硫酸ナトリウム等の中和塩を含有していてもよい。
【００２７】
第２分離工程では、酸沈殿を含む反応液の遠心分離又は濾過を行って、固形状の高分子リグニン分解物と液状（分散液又は溶液状）の低分子リグニン分解物とに分離する。リグニン分解物のうち、ベンゼン環を一つ有するものを単量体、ベンゼン環を二つ有するものを二量体としたとき、低分子リグニン分解物は、分解物全体に対する単量体及び二量体の割合が、高分子リグニン分解物よりも高い。低分子リグニン分解物は、二量体以上のオリゴマーを含有してよく、ヘミセルロース及び硫酸ナトリウム等の中和塩を含有してもよい。
【００２８】
リグニン分解物に含まれる単量体の数平均分子量は、例えば、１５０〜２１０である。リグニン分解物に含まれる二量体の数平均分子量は、例えば３００〜４２０である。これらの数平均分子量は、ＧＰＣ分析で求めることができる。
【００２９】
低分子リグニン分解物は、遠心分離を行った後、上清（上澄み）を採取することによって取得してもよい。上清は固形分を含んでいてよく、濁っていてもよい。上澄みの濾過を行って、固形分を低減してもよい。
【００３０】
樹脂吸着工程では、例えば、合成吸着剤と低分子リグニン分解物（例えば上清）とを混合し、合成吸着剤に低分子リグニン分解物を吸着させる。合成吸着剤としては、多孔質構造を有する疎水性吸着剤を適宜用いることが可能であり、例えば芳香族系合成吸着剤であってよく、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤等であってもよい。樹脂吸着工程では、低分子リグニン分解物が合成樹脂に吸着する。その後、溶媒を除去し、低分子リグニン分解物が吸着した合成吸着剤を、例えばカラム等の容器に収容する。
【００３１】
別の実施形態では、合成吸着剤に低分子リグニン分解物を吸着させる前に、合成吸着剤をカラム等の容器に充填し、低分子リグニン分解物（例えば上清）を流通させることによって合成吸着剤に低分子リグニン分解物を吸着させてもよい。これによって、吸着後に溶媒を除去する操作等を省略することができる。
【００３２】
分画工程では、合成吸着剤が収容されたカラムの中を、水、有機溶媒、及びこれら混合物の少なくとも一つを流通させて、合成吸着剤に吸着している低分子リグニン分解物の少なくとも一部を溶出させてリグニン分画物を得る。一例では、水、有機溶媒と水の混合溶媒、及び有機溶媒を用いたステップワイズグラジエント法によって、リグニン分画物を得てよい。
【００３３】
このようなステップワイズグラジエント法を行う場合、水、有機溶媒と水を含有し、両者の混合割合が異なる複数の混合溶媒、及び有機溶媒を準備する。有機溶媒としては、水と任意の割合で混和する極性溶媒が挙げられる。そのような溶媒として、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコール、及びブチルアルコール等のアルコール類、並びに、エチレングリコール、アセトン、テトラヒドロフラン及び１，４−ジオキサン等が挙げられる。混合溶媒としては、例えば、有機溶媒と水の含有比率（重量基準）が、有機溶媒：水＝５〜９５：９５〜５のものが挙げられる。このような混合溶媒を１種以上準備する。本開示では、純度が９９重量％以上の有機溶媒は、混合溶媒ではなく有機溶媒と称する。
【００３４】
分画工程の一例では、まず、合成吸着剤が収容されたカラム中を、水を流通させて水による洗浄を行う。水によって低分子リグニン分解物に含まれていた中和塩及びヘミセルロース等を含む第１リグニン分画物が得られる。なお、水による洗浄は、複数回に分けて行ってもよい。これによって、中和塩及びヘミセルロース等の含有量が互いに異なる複数の第１リグニン分画物が得られる。なお、最初に得られる洗浄水は中和塩等を高濃度で含む場合があることから、回収せずに廃棄してもよい。
【００３５】
複数の第１リグニン分画物は、互いに特性が異なることから、求められる特性及び用途に応じて、複数の第１リグニン分画物のうち一つを選択して単独で用いてもよいし、複数の第１リグニン分画物の中から２つ以上を選択して組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
次に、合成吸着剤が収容されたカラム中を、有機溶媒と水の含有比率が互いに異なる混合溶媒を順次流通させる。混合溶媒を流通させることによって、合成吸着剤に吸着していた低分子リグニン分解物の少なくとも一部が溶出する。一つの混合溶媒ごとにカラムからの流出液を分取することによって、互いに組成が異なる複数の第２リグニン分画物が得られる。混合溶媒における有機溶媒の比率を大きくなるにつれて、低分子リグニン分解物のうち分子量の大きい分解物が溶出し易くなる傾向にある。したがって、有機溶媒と水の含有比率が低い方から順に流通させると分子量が小さい分解物から順に溶出し易くなる傾向となる。
【００３７】
複数の第２リグニン分画物は、互いに特性が異なることから、求められる特性及び用途に応じて、複数の第２リグニン分画物のうち一つを選択して単独で用いてもよいし、複数の第１リグニン分画物の中から２つ以上を選択して組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
最後に、合成吸着剤が収容されたカラム中を、有機溶媒を流通させる。混合溶媒を流通させることによって、合成吸着剤に吸着していた低分子リグニン分解物の少なくとも一部が溶出し第３リグニン分画物が得られる。水による洗浄と同様に、有機溶媒は複数回流通させ、一回ごとにカラムからの流出液を分取することによって、互いに組成が異なる複数の第３リグニン分画物を得てもよい。通常、第１リグニン分画物、第２リグニン分画物及び第３リグニン分画物のうち、第３リグニン分画物が、分子量が最も大きいリグニン分解物を含む。
【００３９】
複数の第３リグニン分画物は、互いに特性が異なることから、求められる特性及び用途に応じて、複数の第３リグニン分画物のうち一つを選択して単独で用いてもよいし、複数の第１リグニン分画物の中から２つ以上を選択して混合してもよい。
【００４０】
第１リグニン分画物、第２リグニン分画物及び第３リグニン分画物のそれぞれから選択される一つ以上のリグニン分画物を混合する混合工程を行って、新たなリグニン分画物としてもよい。第１リグニン分画物を得ること及び第３リグニン分画物を得ることは必須ではなく、例えば、分画工程の最初から有機溶媒と水を含む混合溶媒から流通させてもよい。
【００４１】
上記例では、ステップワイズグラジエント法によってリグニン分画物を得ていたが、これに限定されない。例えば、カラムを流通させる溶媒組成を連続的に変更し、流出液を所定量毎に分けるリニアグラジエント法によってリグニン分画物を得てもよい。リニアグラジエント法では、水に対する有機溶媒の比率を徐々に大きくすると分子量が小さい分解物から順に溶出し易くなる傾向となる。
【００４２】
以上の分画工程で得られる各リグニン分画物は、減圧留去又は凍結乾燥等の手法によって濃縮又は固形化してもよい。各リグニン分画物は、その組成に応じて、種々の特性を有する。例えば、第２リグニン分画物のうち、有機溶媒を３０〜９０重量％含有する水溶液を用いて分画されるリグニン分画物は、優れた抗酸化活性を有する。優れた抗酸化活性を有するリグニン分画物は、例えば、化粧品及び食品に含有されてもよい。
【００４３】
各リグニン分画物の少なくとも一つを含む組成物は、優れた抗酸化活性及び生理活性を有する。組成物は溶液又は分散液状であってもよいし、固形状であってもよい。組成物は、抗酸化用組成物としてもよいし、抗腫瘍用組成物、抗癌用組成物、又は酵素阻害用組成物等の医薬組成物としてもよい。上記製造方法で得られるリグニン分画物の少なくとも一つは、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤としてもよい。各リグニン分画物の少なくとも一つは、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤の製造に使用されてもよい。
【００４４】
このように、本実施形態によれば、種々の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の製造方法、並びに当該製造方法によって得られるリグニン分画物を含む組成物が提供される。リグニン分画物は植物由来であるうえに、優れた抗酸化作用、抗腫瘍作用及び酵素阻害作用を有するため、極めて有用である。例えば、抗酸化剤として、食品及び化粧品に添加してもよい。上記組成物は、例えば、抗酸化用組成物であってよく、抗腫瘍活性又は酵素阻害活性を有する薬学的組成物であってよい。
【００４５】
本開示のリグニン分画物を用いて、抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤、又は抗癌剤が提供される。また、本開示は、優れた作用を有する抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤、又は抗癌剤を提供することが可能なリグニン分画物の使用方法が提供される。
【００４６】
酵素阻害剤は、リパーゼ阻害剤、α−グルコシターゼ阻害剤、又はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤であってよい。抗腫瘍剤及び抗癌剤は、例えば、悪性黒色腫、大腸癌、肝臓癌、乳腺癌、子宮頸部癌を対象とするものであってよい。酵素阻害剤、抗腫瘍剤及び抗癌剤は、溶液状にして、皮下又は静脈注射用製剤としてもよいし、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等の固形製剤、或いは、シロップ剤、注射剤等の液状製剤として経口用製剤としてもよい。
【００４７】
以上、本発明の幾つかの実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例及び比較例を参照して本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
＜リグニン分画物の調製＞
試料として、宮崎県延岡市産のモウソウチクを採取した。切り出したタケから、枝葉、上部、下部を切断して取り除いた。得られた稈を、機械を用いて切断して、約２ｃｍ四方のサイズを有するタケチップを得た。風袋重量を秤量したタケチップを１０５℃の乾燥器に２４時間保管し、絶乾重量を秤量した。乾燥前の重量と絶乾重量から含水率を求めた。
【００５０】
乾燥後のタケチップ６６ｋｇと苛性ソーダ１６．２３ｋｇを、地球釜を用いて混合した。地球釜を１００℃まで加熱した後、高温の蒸気を供給してさらに昇温した。蒸気の噴射を開始してから９分後に釜内の温度が１６０℃に到達したのを確認して蒸気を停止した。加熱開始から２９４分後に蒸気の供給を止めて反応を停止させた。反応終了後の固体（残渣）：液体の重量比は１：２．９５であった。一晩放冷後、残渣を濾過で取り除き、約１１１ｋｇの反応液を回収した。反応液を攪拌して均質化した後、全体のうち６０ｋｇを別の容器に移し、９８％濃硫酸３．２６ｋｇを添加してｐＨ３．０に調整した。ｐＨ３．０に調整したところ、反応液中には沈殿が生成した。
【００５１】
沈殿を含む反応液を十分に攪拌した後、そのうちの４Ｌをプラスチックビーカーに取り出した。２５０ｍＬサイズの遠沈管を用いて、４℃、８０００ｒｐｍ、２０分間の条件で遠心分離を行った。上清（濁りあり）を別容器に取り出し、グラスファイバーフィルターを用いてフィルター濾過を行い、濁りが低減された上清を得た。一方、遠心分離で得られた酸沈殿は、純水を用いて遠心分離（条件：４℃、８０００ｒｐｍ、２０分間）を３回繰り返し行って洗浄し、凍結乾燥をして回収した。ここで回収した凍結乾燥物（高分子リグニン分解物）を、後述のＦｒ．１として評価試験に供した。
【００５２】
オープンカラム（口径１０．６ｃｍ×長さ８０．０ｃｍ）のコック部分に脱脂綿を詰め、樹脂として、ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ２０（商品名、三菱ケミカル株式会社製、充填量：１０００ｍＬ）を入れた。以下の溶媒をカラム内に導入して、樹脂の前洗浄を行った。前洗浄は、純水（２Ｌ×３回）、５０重量％ＥｔＯＨ（１Ｌ×１回）、９９．８重量％ＥｔＯＨ（１Ｌ×２回）、５０重量％ＥｔＯＨ（１Ｌ×１回）、及び、純水（１Ｌ×３回）の順に行った。なお、括弧内の数値は、１回当たりの洗浄量と洗浄回数を示す。洗浄後、樹脂をカラムから取出して、余分な水を除去した。
【００５３】
５Ｌの三角フラスコ２本に、洗浄後の樹脂を半量ずつ入れ、それぞれにグラスファイバーフィルターを用いてフィルター濾過して得られた上述の上清を１．２５Ｌずつ加えた。攪拌によって樹脂に上清に含まれるリグニン分解物を吸着させた。紫外可視分光光度計（ＵＶ−２４５０）を用い、フラスコ内の液体の２７０ｎｍにおける吸光度を計測することによって吸着状況を確認しながら攪拌を継続した。吸光度が安定した時点で攪拌を終了した。
【００５４】
攪拌終了後、リグニン分解物（低分子リグニン分解物）を吸着させた樹脂を溶液とともにオープンカラムに移した。三角フラスコ内に付着した樹脂を純水５６０ｍｌで洗浄し、このオープンカラムに加えた。オープンカラムのコックを開き、樹脂層の上側にある溶液が無くなるまで滴下して得た画分をスルー画分とした。以降、以下の表１に示す要領で溶媒を注入し、８つの水溶出画分（最初のものから順番に、水溶出画分１〜８と称する。）と、６つのエタノール溶出画分（最初の画分から順番に、エタノール溶出画分１〜６と称する。）を順次得た。水溶出画分はポリ容器内で保管し、エタノール溶出画分はフラスコ容器内で保管した。
【００５５】
６つのエタノール溶出画分と樹脂吸着をさせる前の上清から、溶媒を除去して得られた各リグニン分画物のＧＰＣ分析を行った。ＧＰＣ分析は、日本分光株式会社製の装置（名称：ＰＵ−９８０）に市販のカラム（ＴＳＫ−ｇｅｌ  α−３０００）を装着して行った。
【００５６】
図２にＧＰＣ分析結果を示す。図２中、ＥｔＯＨ５％，１０％，２０％，５０％，８０％，９９％は、それぞれ、エタノール溶出画分１，２，３，４，５，６から溶媒を除去して得られたリグニン分画物の分析結果を示す。図２に示すとおり、エタノール溶出画分１〜４から得られたリグニン分画物は、エタノール溶出画分５，６から得られたリグニン分画物よりも、リグニン分解物の単量体（分子量１５０〜２１０）及び二量体（３００〜４２０）に相当する成分を多く含有することが確認された（一点鎖線で囲まれる領域）。一方、エタノール溶出画分５，６から得られたリグニン分画物は、エタノール溶出画分１〜４から得られたリグニン分画物よりも、リグニン分解物の二量体以上の成分（オリゴマー）を多く含有することが確認された（破線で囲まれる領域）。
【００５７】
水溶出画分１〜８のうち、水溶出画分２と水溶出画分３、水溶出画分４と水溶出画分５、及び、水溶出画分６〜８を、それぞれ混合して、混合画分Ｆｒ．２，Ｆｒ．３，Ｆｒ．４を得た。また、エタノール溶出画分１とエタノール溶出画分２を混合して、混合画分Ｆｒ．５を得た。水溶出画分１、混合画分Ｆｒ．２〜５、及びエタノール溶出画分３〜６（Ｆｒ．６〜Ｆｒ．９）を、それぞれ、エバポレーターで減圧濃縮した。濃縮後、乾固して得られたそれぞれのリグニン分画物の重量を測定した。測定結果は表１に示すとおりであった。表１に示すとおり、リグニン分画物Ｆｒ．２〜Ｆｒ．９の抗酸化活性及び生理活性を以下のとおり評価した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
＜抗酸化活性評価＞
抗酸化活性には、ポリフェノール、テルペノイド、及びビタミン等の多くの物質がそれぞれ異なるメカニズムで関与する。このため、複数の抗酸化活性評価方法を行った。すなわち、ＯＲＡＣ法（Oxygen Radical AbsorbanceCapacity）、ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去活性、及びＳＯＤ（Super Oxide Dismutase）様活性によってリグニン分画物の抗酸化活性を評価した。
【００６０】
（ＯＲＡＣ法）
表１のＦｒ．２〜Ｆｒ．９、及び、ｐＨ調整によって得られたＦｒ．１（高分子リグニン分解物）を、リン酸緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ：７．４）に溶解して試料を調製した。この試料を９６ウェルプレートに２０μＬずつ入れた。それぞれのウェルにフルオレセインを２００μＬずつ添加した後、３７℃で１０分間インキュベートした。２，２’−アゾビス−（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を各ウェルに７５μＬずつ添加した。マイクロプレートリーダー（商品名：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）により，３０秒間隔で９０分間蛍光強度を測定した。
【００６１】
ＯＲＡＣ法による抗酸化活性の評価は、ＡＡＰＨの熱分解の際に時間依存的に産生されるペルオキシラジカルが、蛍光シグナルを抑制する原理を利用する。サンプルの抗酸化活性に応じ、蛍光強度が抑制され、曲線下面積（ＡＵＣ）として表される。抗酸化活性値は，４点濃度（６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ）のトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）で作成した検量線を用いて、Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９の各１ｍｇあたりのＴｒｏｌｏｘ当量（ｍｇ  ＴＥ／ｍｇ）として算出した。測定は、各溶解液あたり３回ずつ実施し、平均値を算出した。結果は表２及び図３に示すとおりであった。
【００６２】
（ＤＰＰＨラジカル消去活性）
Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９とメタノールとを１：１の重量比で配合して試料としてメタノール溶液を調製した。９６ウェルプレートの各ウェルに、試料３０μＬと、０．２ｍＭの２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）のメタノール溶液１５０μＬとを入れ、遮光下で２０分間静置した（Ａ）。これと同時に、別のウェルに試料３０μＬとメタノール１５０μＬとを入れた（Ｂ）。
【００６３】
その後、マイクロプレートリーダー（商品名：Ｅｌｘ８００、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製，米国）で吸光度（５１５ｎｍ）を測定した。各試料自体が有する吸光度を差し引くため，（Ａ）−（Ｂ）の値によりＤＰＰＨラジカル消去活性を算出した。なお、測定は３回実施して平均値を算出した。検量線は、４点濃度（０，３１０μＭ，６２０μＭ，１２４０μＭ）のＴｒｏｌｏｘで作成し、Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９の各１ｍｇあたりのＴｒｏｌｏｘ当量（ｍｇ  ＴＥ／ｍｇ）として算出した。結果は表２に示すとおりであった。
【００６４】
（ＳＯＤ様活性）
ＳＯＤ様活性については、ＳＯＤ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ−ＷＳＴ（製品名、同仁化学研究所製）を用いて測定した。Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９をＤＭＳＯに溶解したそれぞれの試料とブランク（ＤＭＳＯ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに２０μＬずつ入れた。各ウェルに上記キットのWST Working solutionを２００μＬずつ加え、プレートミキサーで混合した。その後、上記キットのEnzyme working solutionを２０μＬずつ加え、３７℃で２０分間インキュベートした。プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、各試料のＩＣ５０値（５０％阻害濃度）を算出した。結果は表２に示すとおりであった。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
いずれの評価法においても、Ｆｒ．７及びＦｒ．８が特に優れた抗酸化活性を有することが確認された。
【００６７】
＜細胞試験（ＭＴＴ試験）＞
Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９のがん細胞に対する増殖抑制効果をＭＴＴ試験により評価した。また、正常細胞についてもＭＴＴ試験を行い、細胞毒性も評価した。まず、以下のとおり、８種類のヒト由来細胞（６種類の腫瘍（癌）細胞と２種類の正常細胞）、対照物質及び液体培地を準備した。
【００６８】
（１）腫瘍（癌）細胞
・ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌由来細胞）
・Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝臓癌細胞）
・Ｈｅｌａ（ヒト子宮頸部癌細胞）
・Ｃａｃｏ−２（ヒト大腸癌細胞）
・Ｇ３６１（ヒト悪性黒色腫）
・ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来細胞）
（２）正常細胞
・ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚繊維芽細胞）
・ＣＣＤ８４１（正常大腸細胞）
（３）対照試料物質
・陰性対照物質（ＮＣ）：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
・陽性対照物質（ＰＣ）：５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）
（４）準備した液体培地と細胞との対応関係
・D-MEM  Dulbecco’s Modified Eagle Medium  …NHDF, Hela, Caco-2
・E-MEM Eagle’s Minimal Essential Medium  …CCD841, Hep-G2, MCF7
・McCoy’s 5A Modified Medium              …G361, HCT116
（上述の液体培地に１０重量％の組織培養用ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１重量％のストレプトマイシン  ペニシリン（ＳＰ）を添加したものを液体培地Ａとした。上述の液体培地に０．５重量％のＦＢＳと１重量％のＳＰを添加したものを液体培地Ｂとした。）
【００６９】
次に、Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９をそれぞれＤＭＳＯに溶解して２０ｍｇ／ｍＬの濃度の試料を調製した。５−ＦＵは、ＤＭＳＯで２０ｍｍｏｌ／ｍＬに希釈した。適宜継代を行った各細胞を、１．０×１０５セル／ｍＬ（ＮＨＤＦとＭＣＦ−７は４．０×１０５セル／ｍＬ）の濃度に調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ播種した。その後、ＣＯ２インキュベーター内（温度：３７℃、雰囲気：５．０体積％ＣＯ２）で２４時間培養した。
【００７０】
各ウェルの培地を吸引した後、各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬで洗浄し、液体培地Ａ、及び、液体培地Ｂで１００倍に希釈した各サンプルを、それぞれ５０μＬずつ各ウェルに添加した。添加後の最終濃度は、ＰＣ：１００μｍｏｌ／ｍＬ、Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９：１００μｇ／ｍＬであった。各サンプルの評価数（ｎ）は６とした。
【００７１】
インキュベーター内で各サンプルを７２時間培養した後、各ウェル内の溶液を吸引し、培地で希釈して５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したＭＴＴ（3-(4,5-dimehylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide）を、５０μＬずつ各ウェルに添加した。インキュベーター内で４時間培養した後、各ウェル内の溶液を吸引した。その後、色素の溶解のため塩酸−イソプロパノール溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、暗所及び室温の条件で４時間静置した。ｉＭａｒｋ  マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、次式により細胞生存率を算出した。結果は、表３に示すとおりであった。
細胞生存率（％）＝（各ウェルの吸光度の平均値／ＮＣの吸光度の平均値）×１００
【００７２】
【表３】
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【００７３】
Ｆｒ．８、Ｆｒ．９は、他の試料に比べて、いずれのがん細胞に対しても、高い細胞増殖抑制作用を有していた。このことはリグニン分解物のうち二量体以上のもの（オリゴマー）が高い細胞増殖抑制作用を有することを示唆している。Ｆｒ．９は、特にＨｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｌａ，Ｇ３６１及びＨＣＴ１１６に対して高い細胞増殖抑制作用を示した。図４，図５，図６，図７，図８，図９，図１０及び図１１は、表２の結果をグラフにしたものである。
【００７４】
＜酵素阻害活性の評価＞
（α−グルコシダーゼ阻害活性の評価試験）
Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９、ブランク及び対照のそれぞれについて３本ずつ反応チューブを作製した（ｎ＝３）。具体的には、各反応チューブに、リグニン分画物をＤＭＳＯに溶解して得た２０μｇ／Ｌの溶液、α−グルコシダーゼ、及びスクロースを、１００μＬずつ又は５０μＬずつ配合し、ボルテックスで３秒間混合して、合計３００μＬと１５０μＬの測定試料を調製した。また、リグニン分画物を含まず、α−グルコシダーゼ及びスクロースのみを含む試料をブランクとして調製した。また、対照として、上記溶液の代わりにＤＮＪ（１−デオキシノジリマイシン）を３００μｇ／Ｌの濃度で含む溶液を含有する測定試料を調製した。
【００７５】
各反応チューブをチューブラックに立てて、菌培養インキュベーター内のシェイカー上にセットし、３７℃で３０分間、撹拌しながら反応させた。ブロックインキュベーター（ＰＣＲ機）を１００℃にセットし、各反応チューブを１０分間加熱した。加熱後、室温（４℃）に下がるまで、約３分間待った。
【００７６】
温度４℃、回転数１５０ｒｐｍの条件で１５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清中に残留しているスクロースの濃度をバイオセンサーで測定した。各測定試料を１回ずつ分析し、ｎ＝３の分析データを取得した。これらの分析データをＡＳ１、ＡＳ２、ＡＳ３とし、以下の式によって、阻害活性率１，２，３を算出した。各式中、ＡＣは、ブランクの平均値である。そして、阻害活性率１，２，３の平均値をα−グルコシダーゼ阻害率として求めた。対照についても同様に阻害活性率１，２，３の平均値をα−グルコシダーゼ阻害率として求めた。結果を表４及び図１２に示す。
【００７７】
阻害活性率１＝［ＡＣ−ＡＳ１］／ＡＣ
阻害活性率２＝［ＡＣ−ＡＳ２］／ＡＣ
阻害活性率３＝［ＡＣ−ＡＳ３］／ＡＣ
【００７８】
【表４】
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【００７９】
表４及び図１２に示すとおり、Ｆｒ．１，Ｆｒ．７〜９が優れたα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。
【００８０】
（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性の評価試験）
（株）同仁化学研究所から市販されているＡＣＥ  ｋｉｔ−ＷＳＴ（以下、「キット」という。）を用いた。方法は、付属のマニュアルに従った。具体的には、Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９を３３μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したそれぞれの試料と、ブランク用の水を、ウェルに２０μＬずつ添加した。キット付属の基質緩衝液を２０μＬずつ各ウェルに添加した。続いて、酵素作動緩衝液を２０μＬずつ各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。キット付属の呈色液２００μＬを各ウェルに添加して酵素反応を行った。
【００８１】
室温で約１０分間経過した後、４５０ｎｍの波長の吸収をプレートリーダーで測定した。測定値から下記の計算式によりＡＣＥ阻害率を計算した。ブランク１は、３３３μｇ／ｍＬの濃度を有するサーディンペプチド水溶液であり、ブランク２は純水である。結果を表５及び図１３に示す。図１３のＦｒ．１〜Ｆｒ．９において、斜線が入った棒グラフは３３μｇ／ｍＬに希釈した場合の結果を示し、塗りつぶしの棒グラフは１０μｇ／ｍＬに希釈した場合の結果を示す。表６には、０．０２〜３３３μｇ／ｍＬの濃度を有するサーディンペプチド水溶液を用いた場合の結果を示す。図１３には表６の結果も併せて示す。図１３に示す番号は、表６の番号に対応する。
【００８２】
ＡＣＥ阻害率（％）＝［（ブランク１の吸光度−試料の吸光度）／
（ブランク１の吸光度−ブランク２の吸光度）］×１００
【００８３】
【表５】
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【００８４】
【表６】
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【００８５】
表５及び図１３に示すとおり、Ｆｒ．２〜Ｆｒ．４，Ｆｒ．８，Ｆｒ．９が高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００８６】
（リパーゼ阻害活性の評価試験）
Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９を、それぞれＤＭＳＯに溶解して調製した溶液２５μＬを、０．１ｍＭの濃度の４−メチルウンベリフェリルオレエート（４−ＭＵＯ）を含む緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む  １３ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）５０μＬと混合して試料を調製した。この試料に膵臓由来リパーゼを溶解してリパーゼの最終濃度を２００μｇ／ｍｌにして反応を開始した。
【００８７】
２５℃で３０分間インキュベートした後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μＬを加えて反応を停止させた。４−ＭＵＯにリパーゼが作用して遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定した（励起光の波長（Ｅｍ）：３５５ｎｍ、蛍光の波長（Ｅｘ）：４６０ｎｍ）。リグニン分画物を含まないジメチルスルホキシド溶液をネガティブコントロールとし、このネガティブコントロールの値を１００とした場合の各試料のリパーゼ阻害率を算出した。また、リパーゼの最終濃度を８００μｇ／ｍＬにして同様の評価を行い、リパーゼ阻害率を算出した。これらの結果は表７に示すとおりであった。また、図１４及び図１５には、リパーゼの最終濃度が２００μｇ／ｍＬの場合及び８００μｇ／ｍＬの場合のリパーゼ阻害率の算出結果を、それぞれ示した。
【００８８】
【表７】
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【００８９】
表７中、「Ｏｒｌ」はポジティブコントロールとして用いたオルリスタットの結果である。この結果から、本評価試験が適切に機能していることが確認された。表７及び図１４に示すとおり、リパーゼの最終濃度が２００μｇ／ｍＬの場合、Ｆｒ．１、Ｆｒ．８及びＦｒ．９が高い阻害活性を示した。また、リパーゼの最終濃度が８００μｇ／ｍＬの場合、Ｆｒ．１、Ｆｒ．２、Ｆｒ．３、Ｆｒ．４、Ｆｒ．７、Ｆｒ．８及びＦｒ．９が５０％以上の高い阻害活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本開示によれば、リグニンを種々の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の製造方法、並びに当該製造方法によって得られるリグニン分画物を含む組成物が提供される。また、本開示によれば、リグニン分画物を抗酸化剤、酵素阻害剤、抗腫瘍剤又は抗癌剤の用途に有効活用することが可能なリグニン分画物の使用方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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