(57)【要約】【課題】ＣｓｇＡタンパク質に機能性ペプチドドメインを遺伝的に付加することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のバイオフィルムの機能的特性をプログラムすることを可能にする。【解決手段】改変されたｃｕｒｌｉ線毛、例えばＣｓｇＡポリペプチドに関連する方法及び組成物を記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は機能化されたバイオフィルムに関する。【選択図】図２Ａ
2019022491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｓｇＡポリペプチドに隣接するＣ末端提示タグを有するＣｓｇＡポリペプチドを含む、改変ＣｓｇＡポリペプチドであって、
前記提示タグが、活性ポリペプチド及びリンカー配列を含み、
前記リンカー配列が、前記提示ポリペプチドのＮ末端側に位置し、
前記リンカー配列が少なくとも６アミノ酸を含む、
ポリペプチド。
【請求項２】
前記リンカー配列が、グリシン残基及びセリン残基からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記提示タグ及び／又は前記活性ポリペプチドが、
金属結合ドメイン（ＭＢＤ）；ＳｐｙＴａｇ；グラフェン結合（ＧＢＰ）；カーボンナノチューブ結合（ＣＢＰ）；金結合（Ａ３）；ＣＴ４３；ＦＬＡＧ；Ｚ８；Ｅ１４；ＱＢＰ１；ＣＬＰ１２；及びＡＦＰ８
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜請求項２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記活性ポリペプチドがコンジュゲーションドメインを含む、請求項１〜請求項２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記コンジュゲーションドメインが、
ＳｐｙＴａｇ；ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）；ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）；及びＬＰＸＴＧモチーフを含むペプチド
からなる群から選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のベクター、核酸配列、又はポリペプチドを含む改変微生物細胞。
【請求項９】
コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドを発現する、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
パートナーコンジュゲーションドメインを含む機能化ポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
第１の細胞型及び第２の細胞型を含む細胞集団であって、前記第１の細胞型が、請求項９に記載の細胞であり、前記第２の細胞型が、パートナーコンジュゲーションドメインを含む機能化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、細胞集団。
【請求項１２】
請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞を含むバイオフィルム。
【請求項１３】
バイオフィルムの生成に適した条件下で請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより生成するバイオフィルム。
【請求項１４】
請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞を含む、請求項１３に記載のバイオフィルム。
【請求項１５】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むフィラメントを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
タンパク質性ネットワークを含む、請求項１５〜請求項１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
さらなるタンパク質性バイオフィルム構成要素を更に含む、請求項１５〜請求項１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞を更に含む、請求項１５〜請求項１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記バイオフィルム内に、又は前記組成物を用いて、又は前記細胞表面上にポリペプチドを提示するための、請求項８〜請求項１９のいずれか一項に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用。
【請求項２１】
生体触媒作用；産業用生体触媒作用；固定化された生体触媒作用；化学生産；濾過；水溶液からの分子の単離；水の濾過；バイオレメディエーション；ナノ粒子合成；ナノワイヤー合成；光学活性材料の提示；バイオセンサー；表面コーティング；治療用バイオマテリアル；生物学的スキャフォールド；物体の構造的補強；及び治療剤のデリバリーシステム、
からなる群から選択される用途における、請求項８〜請求項１９のいずれか一項に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体を参照により本明細書に援用する２０１３年４月２３日付で提出された米国特許仮出願第６１／８１４，９０８号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本明細書に記載の技術は、改変されたポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む細菌、及び前記細菌細胞を含むバイオフィルムに関する。
【背景技術】
【０００３】
自然界では、ほとんどの細菌はバイオフィルムコミュニティーとして存在し、厳しい環境から防御するタンパク質、糖、脂質、及び細胞外ＤＮＡのナノスケールの保護的な自己生成スキャフォールド中に存在する。バイオフィルム形成は、天然表面及び人工表面の両方において細菌の接着及びコロニー形成に必須である。これらの高度に進化した細胞外マトリックスは、有益なナノバイオテクノロジー工学プラットフォームとして未開発の可能性を秘めている。廃水処理及びバイオトランスフォーメーション等の有益な目的のためのバイオフィルムの利用を調べている多くの研究があるが、これらの努力は、種々の望ましい性質を偶然進化させた天然生物の利用に焦点を合わせている。分子レベルでバイオフィルムの構造を合理的に改変する努力はなされてこなかった。今日まで、バイオフィルム構成要素を容易に改変するための強力で適用範囲の広い技術は存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書は、ＣｓｇＡタンパク質に機能性ペプチドドメインを遺伝的に付加することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のバイオフィルムの機能的特性をプログラムすることを可能にする技術を記載する。新規なＣｓｇＡ−ペプチドが分泌、組織化された後、アミロイドナノファイバーネットワークがその表面に非常に高密度にペプチドを提示する。すると、提示ペプチドの配列に従ってバイオフィルムの機能が強化される。本明細書中で、ｃｕｒｌｉ線毛の形成を妨げることなく種々の長さ及び二次構造の機能性ペプチドドメインをＣｓｇＡに付加できることを示す。最後に、ペプチドドメインが分泌及び組織化後にバイオフィルムの状況下でそれらの機能を維持していることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本明細書は、ＣｓｇＡポリペプチドに隣接するＣ末端提示タグを有するＣｓｇＡポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドであって、提示タグが、活性ポリペプチド及びリンカー配列を含み、リンカー配列が、提示ポリペプチドのＮ末端側に位置し、リンカー配列が、少なくとも６アミノ酸を含む、ポリペプチドを記載する。いくつかの実施形態では、リンカー配列はグリシン残基及びセリン残基からなる。いくつかの実施形態では、提示タグ及び／又は活性ポリペプチドは、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）；ＳｐｙＴａｇ；グラフェン結合（ＧＢＰ）；カーボンナノチューブ結合（ＣＢＰ）；金結合（Ａ３）；ＣＴ４３；ＦＬＡＧ；Ｚ８；Ｅ１４；ＱＢＰ１；ＣＬＰ１２；及びＡＦＰ８からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【０００６】
一態様では、本明細書は、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列を記載する。一態様では、本明細書は、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを記載する。一態様では、本明細書は、ベクター、核酸配列、又は改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む改変微生物細胞を記載する。一態様では、本明細書は、本明細書に記載の細胞を含むバイオフィルムを記載する。一態様では、本明細書は、バイオフィルムの生成に適した条件下で本明細書に記載の細胞を培養することにより生成するバイオフィルムを記載する。
【０００７】
一態様では、本明細書は、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む組成物を記載する。いくつかの実施形態では、組成物は、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含むフィラメントを含む。いくつかの実施形態では、組成物はタンパク質性ネットワークを含む。いくつかの実施形態では、組成物は更に、さらなるタンパク質性バイオフィルム構成要素を含む。いくつかの実施形態では、組成物は更に、本明細書に記載の細胞を含む。
【０００８】
一態様では、本明細書は、バイオフィルム内に、又は組成物を用いて、又は細胞表面にポリペプチドを提示するための本明細書に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用を記載する。一態様では、本明細書は、生体触媒作用；産業用生体触媒作用；固定化された生体触媒作用；化学生産；濾過；水溶液からの分子の単離；水の濾過；バイオレメディエーション；ナノ粒子合成；ナノワイヤー合成；光学活性材料の提示；バイオセンサー；表面コーティング；治療用バイオマテリアル；生物学的スキャフォールド；物体の構造的補強；及び治療剤のデリバリーシステムからなる群から選択される用途における本明細書に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用を記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは本明細書に記載の改変バイオフィルムの実例による説明を示す図である。図１Ａは細菌バイオフィルムの分子的改変の図を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂの左は、ＣｓｇＡ−ＭＢＤ融合体（Ｎ末端又はＣ末端、種々の可変（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカー使用）の挿入ライブラリーの模式図である。右は、挿入ライブラリーのコンゴーレッドプレートアッセイの画像である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｃ３部位への種々のペプチド／ポリペプチド挿入の表を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、コンゴーレッドプレート上での種々のＣｓｇＡ融合体の画線（ｓｔｒｅａｋ）を示す図である。赤色はｃｕｒｌｉ形成を示している。
【図１Ｅ】図１Ｅは、上が野生型ｃｕｒｌｉナノファイバー（＋ＣｓｇＡ）、中央がＣｕｒｌｉ−ＭＢＤ融合体、下がＣｕｒｌｉ−ＳｐｙＴａｇ融合体のＴＥＭを示す図である。矢印はｃｕｒｌｉ線毛を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、上が野生型ｃｕｒｌｉナノファイバー（＋ＣｓｇＡ）、下がＣｕｒｌｉ−ＳｐｙＴａｇ融合体のＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図である。矢印はｃｕｒｌｉ線毛を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃはｃｕｒｌｉ線毛の機能化を示す図である。図２Ａは、２つの構成要素、（１）自己組織化してｃｕｒｌｉナノファイバーを形成する分泌されたＣｓｇＡモノマー及び（２）相互作用性タンパク質ドメイン（灰色の丸で示す）と特異的に強く相互作用して複合体を形成できるペプチド、を含むペプチド提示ｃｕｒｌｉバイオフィルムへのタンパク質の付着の模式図である。ＣｓｇＡをペプチドにＣ３挿入部位で融合させ、相互作用ドメインに融合させた可変タンパク質（紫色の六角形）からなる融合タンパク質を共発現させることにより、標的タンパク質を改変ｃｕｒｌｉナノファイバー上に提示することができる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、精製Ｖｅｎｕｓ−ＳＣタンパク質添加後のｃｕｒｌｉバイオフィルムの蛍光顕微鏡画像を示す図である。列１：野生型ｃｕｒｌｉバイオフィルムはＶｅｎｕｓ−ＳＣタンパク質融合体に結合しない。列２：共有イソペペチド結合を形成できないＶｅｎｕｓ−ＳＣ（Ｅ７７Ｑ）変異体に暴露した時の、ＳＴペプチドタグを提示するＣｕｒｌｉバイオフィルム。列３：ＳＴペプチドタグを提示するように改変されたｃｕｒｌｉバイオフィルムのみがＶｅｎｕｓ−ＳＣとの特異的相互作用を示す。全ての画像は蛍光顕微鏡画像であり、赤色のチャンネルは細菌ＤＮＡを示し（ＳＹＴＯ−６１）、ＧＦＰチャンネルはＶｅｎｕｓ−ＳＣ蛍光タンパク質レポーターの存在を示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、融合タンパク質を含む細胞溶解物を用いた実験の結果を示す図である。ＳＹＴＯ−６１チャンネル及びＧＦＰチャンネルのオーバーレイ画像は、野生型ｃｕｒｌｉへの非精製Ｖｅｎｕｓ−ＳＣの結合がないこと（ｉ）、ｃｕｒｌｉ−ＳＴバイオフィルム及びｃｕｒｌｉ−ＳＴへの非精製Ｖｅｎｕｓ−ＳＣ（Ｅ７７Ｑ）変異体の結合がないこと（ｉｉ）、並びにｃｕｒｌｉ−ＳＴバイオフィルムへの未精製Ｖｅｎｕｓ−ＳＣ変異体の結合成功（ｉｉｉ）を示している。
【図３】図３はＣｓｇＡ−ペプチド融合体の許容可能な部位及びリンカーのスクリーニングの模式図である。Ｎ末端又はＣ末端融合部位を有するＣｓｇＡキメラタンパク質のパネルをコードする遺伝子。ＭＢＤをｃｓｇＡに、直接（Ｎ１、Ｃ１）、短いリンカーを用いて（Ｎ２、Ｃ２）、又は長いリンカーを用いて（Ｎ３、Ｃ３）融合させた。ペリプラズム及び細胞外空間への搬出を促進するためにそれぞれＳｅｃ及びＮ２２配列をＮ末端に維持した。
【図４】図４は種々の機能性ペプチドを提示するＢＩＮＤバイオフィルムをデザインするためのＣ３デザインのモジュール性を示す図である。様々なサイズ、二次構造、及び機能にわたるようにペプチドドメインのパネルを選択した。６アミノ酸可変リンカーを介して各ペプチドをＣｓｇＡのＣ末端に遺伝的に融合させた。スポットした培養物をＹＥＳＣＡ−ＣＲプレート上で４８時間成長させた。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは３０４Ｌステンレス鋼へのＭＢＤ−ＢＩＮＤバイオフィルムのプログラムされた接着を示す図である。図５Ａは、３０４Ｌ鋼片にスポットし、乾燥させた後、水中で激しく洗浄した、ｃｕｒｌｉを発現しない細胞（左）、野生型ＣｓｇＡを発現する細胞（中央）、及びＭＢＤ提示ｃｕｒｌｉを発現する細胞（右）を示す写真画像である。ＳＥＭを用いて表面上の各スポットをイメージングした。ｃｕｒｌｉタンパク質を発現しない細胞（５Ｂ）又は野生型ＣｓｇＡを発現する細胞（５Ｃ）は鋼表面に接着せず、ＣｓｇＡ−ＭＢＤ融合体を発現する細胞（５Ｄ）は残った。
【図６−１】図６Ａ〜図６ＦはＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを用いたｃｕｒｌｉバイオフィルム上への全長タンパク質の共有結合による固定化を示す図である。ｃｕｒｌｉを発現しない（６Ａ）、野生型ＣｓｇＡを発現する（図６Ｂ〜６Ｃ）、及びＳｐｙＴａｇ−ＢＩＮＤバイオフィルムを発現する（図６Ｄ〜６Ｅ）ＰＨＬ６２８（ΔｃｓｇＡ）株のＴＥＭ及びＳＥＭ画像。
【図６−２】図６ＦはＰＬＬ修飾ガラス基質上で成長させた後、細胞の存在を確認するために核酸染色により可視化し（ＳＹＴＯ６１）、その後ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ（ＧＦＰ）で処理したバイオフィルムを示す図である。バイオフィルムの蛍光顕微鏡観察により、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓの適切な組合せでのみ顕著にタンパク質が固定化されることが明らかになった。ｗｔ−ＣｓｇＡを発現するバイオフィルム又はＳｐｙＴａｇと共有結合を形成できないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＱ）変異体で処理されたものは蛍光タンパク質を固定化できない。全ての画像は同じ縮尺であり（スケールバー＝５μｍ）、バイオフィルムでコーティングされた基質表面全体を表す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、Ｃ３変異体（図７Ａ）及び比較のためのｗｔ−ＣｓｇＡ（図７Ｂ）を発現する細胞のＴＥＭ画像を示す図である。
【図８】図８Ａ〜８ＤはＢＩＮＤを用いた触媒バイオフィルムの作製を示す図である。図８Ａは、１４アミノ酸ＳｐｙＴａｇに融合させたＣｓｇＡ（ＣｓｇＡ−ＳＴ）を発現するＥ．ｃｏｌｉを示す図である。図８Ｂは、細菌表面のアミロイド繊維へと組織化されたＣｓｇＡ−ＳＴを示す図である。細菌がバイオフィルムを形成する際、ＳＴを発現するｃｕｒｌｉ線毛が細胞の周囲に重合体マトリックスを作っている。図８Ｃは、この重合体マトリックスがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させた酵素で共有結合的に修飾されていることを示している。図８Ｄは、基質から生成物への変換が高表面積の触媒表面上で起こることを示している。
【図９】図９はＰＢＳ中でのアミラーゼＳＣと剪断されたｃｕｒｌｉ線毛との間のコンジュゲーション反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。１個の星はアミラーゼＳＣ＋ＣｓｇＡ−ＳＴコンジュゲートを示し、２個の星はアミラーゼＳＣを示す。レーン（１）ＣｓｇＡ＋アミラーゼＳＣ沈殿画分、（２）ＣｓｇＡ−ＳＴ＋アミラーゼＳＣ沈殿画分、（３）ＣｓｇＡ＋アミラーゼＳＣ可溶性画分、（４）ＣｓｇＡ−ＳＴ＋アミラーゼＳＣ可溶性画分。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは９６ウェルフィルタープレート上に固定化されたバイオフィルムを示す図である。図１０ＡはＣｓｇＡ  ＷＴ発現細胞、図１０ＢはＣｓｇＡ−ＳＴ発現細胞を、蛍光顕微鏡ＤＡＰＩ染色を用いて可視化したものを示す。共焦点顕微鏡は、ほとんど単層又は２層の細菌を示している。細菌の量の差は、細胞播種が生物量ではなくｃｕｒｌｉに対して標準化されていることによる。共焦点画像のスケールバーは１０μｍである。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂはバイオフィルム上へのアミラーゼＳＣ固定化を示す図である。ＣｓｇＡ  ＷＴ及びＣｓｇＡ−ＳＴ発現バイオフィルムをアミラーゼＳＣと１．５時間インキュベートする。図１１Ａは、２０〜１５００ｐｍｏｌのアミラーゼＳＣとインキュベートした約４×１０７細胞を含むバイオフィルムのグラフを示す図である。点線は１サイトの飽和結合フィット（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｉｔ）を示している。図１１Ｂは、７５０ｐｍｏｌのアミラーゼＳＣとインキュベートした、細胞数増加に伴うバイオフィルムのグラフを示す図である。活性は、反応１００μＬについて放出される生成物のｍＭで記載されている。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは種々のｐＨでの固定化アミラーゼＳＣの活性を示す図である。ＣｓｇＡ  ＷＴ及びＣｓｇＡ−ＳＴ発現バイオフィルムをｐＨ２〜１２のＰＢＳと２時間インキュベートする。図１２Ａは、溶液中のアミラーゼＳＣと比較したバイオフィルムの活性のグラフを示す図である。図１２Ｂは、ｐＨ７での活性と比較して示した細胞の代謝活性のグラフを示す図である。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｄは有機溶媒中のバイオフィルムの活性を示す図である。アミラーゼＳＣで機能化したバイオフィルムを、水混和性及び非混和性の有機溶媒中でインキュベートする。図１３Ａは、溶媒のパネル中でインキュベートした後のバイオフィルム上のアミラーゼＳＣの活性のグラフを示す図である。図１３Ｂは、有機溶媒の分配係数に対してプロットした図１３Ａの活性のグラフを示す図である。
【図１３−２】図１３Ｃは、混和性有機溶媒の種々の溶媒画分中におけるバイオフィルム上でのアミラーゼＳＣの活性のグラフを示す図である。図１３Ｄは、溶媒のパネル中でインキュベートした後の細胞の代謝活性のグラフを示す図である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは溶液中の野生型αアミラーゼと比べたアミラーゼＳＣの安定性を示す図である。図１４Ａは、種々の温度に３０分間曝した後の２つの酵素の活性のグラフを示す図である。図１４Ｂは、４℃、２５℃、３７℃で６４日間貯蔵した後の活性のグラフを示すである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂはインビトロでの酵素の反応速度論を示す図である。図１５Ａは、種々の濃度の比色基質、４−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−マルトペンタオシド（ｐＮＰＭＰ）を用いたアミラーゼＳＣの活性のグラフを示す図である。図１５Ｂはミカエリスメンテン分析を示す図である。
【図１６−１】図１６Ａ〜図１６ＢはＢＩＮＤシステムの遺伝的プログラミング及びモジュール性を示す図である。図１６Ａは、ＢＩＮＤプラットフォーム中でｃｓｇＡ細胞がアミロイド形成ドメイン（ＣｓｇＡ）と機能性ペプチドドメインとからなる融合タンパク質を異種的に発現及び分泌することを示す図である。この融合タンパク質は自己組織化してアミロイドナノファイバーの細胞外ネットワークを形成し、プログラムされた非天然機能を有するバイオフィルム材料が得られる。
【図１６−２】図１６Ｂは、強度定量（ＩｍａｇｅＪ（商標））を用いた４連（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）のＹＥＳＣＡ−ＣＲスポット培養からのコンゴーレッド結合の定量的評価を示す図であり、各ＣｓｇＡ−ペプチド融合体で生成した相対的アミロイドが測定され、野生型ＣｓｇＡを基準として標準化されている。ＹＥＳＣＡ−ＣＲ寒天上の培養スポットの代表的セットを上に示す。
【図１６−３】図１６Ｃ〜１６Ｐは、ＬＳＲ１０（ＭＣ４１００、ｃｓｇＡ）細胞に形質転換したペプチド融合ＢＩＮＤライブラリーのＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図である。ＣｓｇＡなし（図１６Ｃ）、ｗｔ−ＣｓｇＡ（図１６Ｄ）、及びＢＩＮＤペプチドパネル（表１参照）：ＨＩＳ（図１６Ｅ）、ＧＢＰ（図１６Ｆ）、ＦＬＡＧ（図１６Ｇ）、ＣＮＢＰ（図１６Ｈ）、Ａ３（図１６Ｉ）、ＣＬＰ１２（図１６Ｊ）、ＱＢＰ１（図１６Ｋ）、ＳｐｙＴａｇ（図１６Ｌ）、ＭＢＤ（図１６Ｍ）、ＣＴ４３（図１６Ｎ）、ＡＦＰ８（図１６Ｏ）、及びＭｍｓ６（図１６Ｐ）。スケールバー、１μｍ。
【図１６−４】図１６Ｃ〜１６Ｐは、ＬＳＲ１０（ＭＣ４１００、ｃｓｇＡ）細胞に形質転換したペプチド融合ＢＩＮＤライブラリーのＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図である。ＣｓｇＡなし（図１６Ｃ）、ｗｔ−ＣｓｇＡ（図１６Ｄ）、及びＢＩＮＤペプチドパネル（表１参照）：ＨＩＳ（図１６Ｅ）、ＧＢＰ（図１６Ｆ）、ＦＬＡＧ（図１６Ｇ）、ＣＮＢＰ（図１６Ｈ）、Ａ３（図１６Ｉ）、ＣＬＰ１２（図１６Ｊ）、ＱＢＰ１（図１６Ｋ）、ＳｐｙＴａｇ（図１６Ｌ）、ＭＢＤ（図１６Ｍ）、ＣＴ４３（図１６Ｎ）、ＡＦＰ８（図１６Ｏ）、及びＭｍｓ６（図１６Ｐ）。スケールバー、１μｍ。
【図１７】図１７はＣ３挿入部位に基づくＢＩＮＤシステムの三次元タンパク質モデルを示す図である。自己組織化ＣｓｇＡアミロイドドメインは、ＡｇｆＡ相同性モデル上でのＣｓｇＡ配列のタンパク質スレッディングに由来する。ペプチドドメインの例であるＳｐｙＴａｇ（表１参照）及び６残基可変リンカーが示されている。このペプチド構造はＰｅｐＦｏｌｄを用いて予測され、全ての構造操作はＰｙＭｏｌを用いて行われた。
【図１８−１】図１８Ａ〜図１８Ｅは、ＢＩＮＤバイオフィルムを、基質又はナノ粒子のバイオテンプレートに接着するようプログラムできることを示す図である。成長させた培養物を３０４Ｌ鋼片にスポットし、４８時間インキュベートすることにより、ｃｕｒｌｉを発現しないＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞、野生型ＣｓｇＡを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞、及びＣｓｇＡＭＢＤを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞の接着を試験した。ｃｕｒｌｉタンパク質を発現しない細胞（図１８Ａ）又は野生型ＣｓｇＡを発現する細胞（図１８Ｂ）は、ＭＢＤ−ＢＩＮＤシステムを発現する細胞（図１８Ｃ）と異なり、鋼表面に接着しなかった；スケールバー、１０μｍ。（図１８Ｃ）の挿入図は、バイオフィルム修飾鋼表面を示している。スケールバー、１μｍ。銀ナノ粒子はＡｇＮＯ３水中でインキュベートしたＡ３−ＢＩＮＤバイオフィルムによるテンプレートである。野生型ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−Ａ３のいずれかを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞を、１４７ｍＭ  ＡｇＮＯ３中で４時間インキュベートした後、ＴＥＭにより分析した（図１８Ｄ及び１８Ｅ）。
【図１８−２】図１８Ａ〜図１８Ｅは、ＢＩＮＤバイオフィルムを、基質又はナノ粒子のバイオテンプレートに接着するようプログラムできることを示す図である。成長させた培養物を３０４Ｌ鋼片にスポットし、４８時間インキュベートすることにより、ｃｕｒｌｉを発現しないＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞、野生型ＣｓｇＡを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞、及びＣｓｇＡＭＢＤを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞の接着を試験した。ｃｕｒｌｉタンパク質を発現しない細胞（図１８Ａ）又は野生型ＣｓｇＡを発現する細胞（図１８Ｂ）は、ＭＢＤ−ＢＩＮＤシステムを発現する細胞（図１８Ｃ）と異なり、鋼表面に接着しなかった；スケールバー、１０μｍ。（図１８Ｃ）の挿入図は、バイオフィルム修飾鋼表面を示している。スケールバー、１μｍ。銀ナノ粒子はＡｇＮＯ３水中でインキュベートしたＡ３−ＢＩＮＤバイオフィルムによるテンプレートである。野生型ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−Ａ３のいずれかを発現するＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞を、１４７ｍＭ  ＡｇＮＯ３中で４時間インキュベートした後、ＴＥＭにより分析した（図１８Ｄ及び１８Ｅ）。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｇはｃｕｒｌｉバイオフィルム上への全長タンパク質の共有結合による固定化を示す図である。図１９Ａは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインに融合したタンパク質を１３残基のＳｐｙＴａｇを提示するＢＩＮＤバイオフィルム上に共有結合で付着させるための、イソペプチド結合を形成するスプリットタンパク質Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＦｂａＢアドヘシンシステム（２４）を用いる、タンパク質ＢＩＮＤ固定化戦略を示す模式図である。
【図１９−２】図１９Ｂ〜１９Ｇは、ｃｕｒｌｉを発現しない（図１９Ｂ及び１９Ｅ）、野生型ＣｓｇＡを発現する（図１９Ｃ及び１９Ｆ）、及びＳｐｙＴａｇ−ＢＩＮＤバイオフィルムを発現する（図１９Ｄ及び１９Ｇ）ＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ株のＴＥＭ及びＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図である。スケールバー、１μｍ。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｎは、ＣｓｇＡなし（図２０Ａ）、ｗｔ−ＣｓｇＡ（図２０Ｂ）、及びＢＩＮＤペプチドパネル（表１参照）：ＨＩＳ（図２０Ｃ）、ＧＢＰ（図２０Ｄ）、ＦＬＡＧ（図２０Ｅ）、ＣＮＢＰ（図２０Ｆ）、Ａ３（図２０Ｇ）、ＣＬＰ１２（図２０Ｈ）、ＱＢＰ１（図２０Ｉ）、ＳｐｙＴａｇ（図２０Ｊ）、ＭＢＤ（図２０Ｋ）、ＣＴ４３（図２０Ｌ）、ＡＦＰ８（図２０Ｍ）、及びＭｍｓ６（図２０Ｎ）をＬＳＲ１０（ＭＣ４１００、ｃｓｇＡ）細胞中に形質転換したペプチド融合体ＢＩＮＤライブラリーのＴＥＭ画像を示す図である。スケールバー、１μｍ。
【図２０−２】図２０Ａ〜２０Ｎは、ＣｓｇＡなし（図２０Ａ）、ｗｔ−ＣｓｇＡ（図２０Ｂ）、及びＢＩＮＤペプチドパネル（表１参照）：ＨＩＳ（図２０Ｃ）、ＧＢＰ（図２０Ｄ）、ＦＬＡＧ（図２０Ｅ）、ＣＮＢＰ（図２０Ｆ）、Ａ３（図２０Ｇ）、ＣＬＰ１２（図２０Ｈ）、ＱＢＰ１（図２０Ｉ）、ＳｐｙＴａｇ（図２０Ｊ）、ＭＢＤ（図２０Ｋ）、ＣＴ４３（図２０Ｌ）、ＡＦＰ８（図２０Ｍ）、及びＭｍｓ６（図２０Ｎ）をＬＳＲ１０（ＭＣ４１００、ｃｓｇＡ）細胞中に形質転換したペプチド融合体ＢＩＮＤライブラリーのＴＥＭ画像を示す図である。スケールバー、１μｍ。
【図２１】図２１Ａ〜２１ＢはＦＬＡＧタグ化ＢＩＮＤ及び野生型ＣｓｇＡナノファイバーの免疫金ＴＥＭを示す図である。図２１Ａは、ＦＬＡＧ−ＢＩＮＤを発現するＬＳＲ１０細胞を示しており、図２１Ｂは、抗ＦＬＡＧ一次抗体及び１５ｎｍ金ナノ粒子標識二次抗体を用いてプローブした野生型ｃｕｒｌｉを示す。サンプルを０．１％ＢＳＡのＰＢＳでブロッキングし、０．０１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で洗浄した後、１％ウラニルホルマートで染色し、ＴＥＭによりイメージングした。スケールバー、５００ｎｍ。
【図２２】図２２は、ＦＬＡＧ−ＢＩＮＤバイオフィルムが広範な二次元アミロイドシートとして生じることを示す画像を示す図である。Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅメンブレン上に濾過された、ＣｓｇＡ−ＦＬＡＧで形質転換したＬＳＲ１０細胞により形成されたメッシュ様シートのＳＥＭ画像を種々の拡大率で示す。各画像中の矢印は、アミロイド膜の先端（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に記載されている技術の実施形態は、細菌バイオフィルムをどのように機能化するかについての本発明者らの発見に関する。より具体的には、本発明者らは、新規な特性又は活性を有する改変ＣｓｇＡを含むバイオフィルムを提供する機能又は活性を有するポリペプチドを含むように、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムの主要構成要素であるＣｓｇＡを改変できることを発見した。
【００１１】
一態様では、本明細書に記載されている技術は、ＣｓｇＡポリペプチドに隣接するＣ末端提示タグを有するＣｓｇＡポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドに関する。提示タグは、活性ポリペプチド及びリンカー配列を含み、リンカー配列は、提示ポリペプチドのＮ末端側に位置し、リンカー配列は少なくとも６アミノ酸を含む。本明細書において、「ＣｓｇＡ」（改変ＣｓｇＡポリペプチドとは区別される）とは、ｃｕｒｌｉの主な構造サブユニットを意味する。ＣｓｇＡ及びそのホモログの配列は複数の種で知られており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｓｇＡの配列が知られている（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ＮＯ：９４９０５５；配列番号１（ポリペプチド））。いくつかの実施形態では、「ＣｓｇＡ」はＥ．ｃｏｌｉ  ＣｓｇＡを指す。いくつかの実施形態では、「ＣｓｇＡ」は、配列番号１に対して少なくとも８０％の相同性（例えば、８０％以上の相同性、９０％以上の相同性、又は９５％以上の相同性）を有するポリペプチド、例えば、ＣｓｇＡの天然の変異体若しくはバリアント、ＣｓｇＡのホモログ、又はＣｓｇＡの改変された変異体若しくはバリアントを指す。
【００１２】
本明細書において、「改変ＣｓｇＡポリペプチド」とは、ＣｓｇＡポリペプチドに隣接するＣ末端提示タグ、例えばＣｓｇＡポリペプチドのｃ末端に位置するポリペプチド提示タグ、を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、提示タグは、配列番号１のＣｓｇＡポリペプチドのＣ末端に位置する。提示タグはＣｓｇＡポリペプチドに隣接し、すなわち、ＣｓｇＡポリペプチドの全体が提示タグのＮ末端に位置し、例えば、提示タグはＣｓｇＡポリペプチドの配列を中断しない。
【００１３】
本明細書において、「提示タグ」とは、ＣｓｇＡポリペプチドを含むポリペプチドのＣ末端に位置するように改変されたポリペプチドである。いくつかの実施形態では、提示タグは１００以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提示タグは５０以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提示タグは４０以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提示タグは３０以下のアミノ酸を含む。
【００１４】
本明細書において、提示タグは、Ｎ末端からＣ末端において、リンカー配列及び活性ポリペプチドを含む。リンカー配列は少なくとも６アミノ酸のポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約６アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約６アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約３０アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約４０アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約６アミノ酸〜約３０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約２０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約６アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約６〜約１０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、可変ポリペプチド、例えば強固な二次及び／又は三次構造を有さないポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列はグリシン残基及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列に含まれるアミノ酸の少なくとも５０％はグリシン残基又はセリン残基であり、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれより大きい割合がグリシン残基又はセリン残基である。いくつかの実施形態では、リンカー配列はグリシン残基及びセリン残基からなる。
【００１５】
本明細書において、「活性ポリペプチド（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、バイオフィルム中に存在する時に、そのポリペプチドの活性がない時にはバイオフィルムが有していなかった特性、機能、又は活性をバイオフィルムに付与するような、活性又は機能を有するポリペプチドを指す。したがって、活性ポリペプチドは、例えば、酵素、別の分子に結合するポリペプチド、結合ドメイン、別の分子によって結合されるペプチド（例えば、リガンド又はエピトープ）等であり得る。活性ポリペプチドとして用いるためのポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）；ＳｐｙＴａｇ；グラフェン結合（ＧＢＰ）；カーボンナノチューブ結合（ＣＢＰ）；金結合（Ａ３）；ＣＴ４３；ＦＬＡＧ；Ｚ８；Ｅ１４；ＱＢＰ１；ＣＬＰ１２；及びＡＦＰ８が含まれる。これらの例示的な実施形態の配列を本明細書中、例えば図１Ｃ及び表１に示す。
【００１６】
いくつかの実施形態では、活性ポリペプチドは、改変ＣｓｇＡポリペプチドの一部として存在する場合、機能性である。本明細書において、ポリペプチドは、ポリペプチドが単離されたポリペプチドとしてそれが有する活性（例えば、酵素活性又は結合活性）の少なくとも約５０％を保持している場合、「機能性」であると言われるか、「機能性ポリペプチド」と表現される。当業者は、例えば質量分析法（ＭＳ、例えばとりわけ、ＭＡＤＬＩ／ＴＯＦ、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ等を含む）により、反応産物の増加及び／又は反応基質の減少を、あるいは、例えばイムノアッセイにより、結合パートナーへの結合の増加又は減少を、容易に検出することができる。いくつかの実施形態では、機能性活性ポリペプチドは、単離されたポリペプチドの活性の少なくとも５０％、例えば単離されたポリペプチドの活性の５０％以上、活性の６０％以上、活性の７５％以上、活性の９０％以上を保持し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、活性ポリペプチドはコンジュゲーションドメインであり得る。そのような実施形態は、例えば標的タンパク質がＣｓｇＡとの融合体として発現させるには大き過ぎる場合に、バイオフィルム中に標的タンパク質を固定化することを可能にし得る。改変ＣｓｇＡポリペプチド上に存在するコンジュゲーションドメインは、標的タンパク質の一部として存在するパートナーコンジュゲーションドメインに特異的に結合することにより標的タンパク質をバイオフィルム中に取り込むことができる。本明細書において、「コンジュゲーションドメイン」とは、例えばバイオフィルムの成長に適した条件下で、パートナーコンジュゲーションドメインに特異的に結合できる及び／又は特異的に結合され得るポリペプチドを意味する。コンジュゲーションドメインは、例えば約１００アミノ酸以下のサイズ、約７５アミノ酸以下のサイズ、約５０アミノ酸以下のサイズ、約４０アミノ酸以下のサイズ、またはそれより小さいサイズであり得る。パートナーコンジュゲーションドメインは、コンジュゲーションドメインとほぼ同じサイズであってもよく、それより大きくてもよく、例えば、パートナーコンジュゲーションドメインは、約４０００アミノ酸以下のサイズ、約３０００アミノ酸以下のサイズ、約２０００アミノ酸以下のサイズ、約１０００アミノ酸以下のサイズ、約５００アミノ酸以下のサイズ、約２００アミノ酸以下のサイズ、約１００アミノ酸以下のサイズ、約７５アミノ酸以下のサイズ、約５０アミノ酸以下のサイズ、約４０アミノ酸以下のサイズ、又はそれより小さいサイズであり得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションドメイン及びパートナーコンジュゲーションドメインの結合は共有結合である。コンジュゲーションドメインの例は当該技術分野で公知であり、ＳｐｙＴａｇ；ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）；ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）；及びＬＰＸＴＧモチーフを含むペプチドが含まれるが、これに限定されない。同様に、パートナーコンジュゲーションドメインも当該技術分野で公知であり、それぞれＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ストレプトアビジン；ストレプトアビジン；及びアミノグリシンを含むペプチドが含まれるが、これに限定されない。コンジュゲーションドメイン及びパートナーコンジュゲーションドメインを含むコンジュゲーションシステムの更なる説明は、例えば、それぞれの全体を参照により本明細書に援用するMao et al. J Am Chem Soc 2004 126:2670-1; Zakeri et al. PNAS 2012 109:E690-E697；及びMaeda et al. Appl Environ Microbil 2008 74:5139-5145に記載されている。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションドメインを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドは配列番号３の配列を有するか、配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００１８】
活性ポリペプチドがコンジュゲーションドメインである場合、パートナーコンジュゲーションドメインを含む標的ポリペプチドは更に「機能化ポリペプチド（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含んでよい。本明細書において、「機能化ポリペプチド」とは、それがバイオフィルム中に存在する時に、ポリペプチドがない場合にバイオフィルムが有さなかった特性、機能、又は活性をバイオフィルムに付与するような、活性又は機能を有するポリペプチドを指す。機能化ポリペプチドは任意のサイズのものであってよく、改変ＣｓｇＡポリペプチドの一部でない。例示的な機能化ポリペプチドには、例えば、酵素、別の分子に結合するポリペプチド、抗体等が含まれ得る。いくつかの実施形態では、機能化ポリペプチド及びコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドは更に、細胞外局在化タグ、例えば、ポリペプチドを発現する細胞にポリペプチドを分泌させる配列を含み得る。
【００１９】
コンジュゲーションドメインを含む改変ＣｓｇＡポリペプチド（又はそのポリペプチドを含む細胞及び／若しくはバイオフィルム）をパートナーコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドと接触させることにより、機能化された改変ＣｓｇＡポリペプチド又は機能化されたバイオフィルムを得ることができる。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドとパートナーコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドとを一定時間接触させて維持する（すなわち「結合ステップ」）。いくつかの実施形態では、結合ステップの後に、例えば過剰な未結合ポリペプチドを除去するための、洗浄ステップが続く。
【００２０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションドメインを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドは、アルブミンの存在下でパートナーコンジュゲーションドメインに結合する（すなわち、「結合ステップ」）。いくつかの実施形態では、アルブミンはＢＳＡである。いくつかの実施形態では、アルブミンは約０．１％〜約１０％で存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは約０．５％〜約５％で存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは約１％〜約２％で存在する。いくつかの実施形態では、結合ステップは、少なくとも約２時間、例えば、約２時間以上、約６時間以上、約１２時間以上、又は約２４時間以上行われる。いくつかの実施形態では、結合ステップはアルブミンの存在下で行われる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、洗浄ステップは約１０分〜約６時間行われる。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは約３０分〜約３時間行われる。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは約９０分行われる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、洗浄ステップ中に撹拌（例えば振盪）される。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、アルブミン溶液中でポリペプチドを洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、アルブミンはＢＳＡである。いくつかの実施形態では、アルブミンは約０．０１％〜約３％で存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは約０．１％〜約１％で存在する。いくつかの実施形態では、アルブミンは約０．３％で存在する。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは２回以上の連続的洗浄を含む。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは３回の連続的洗浄を含む。
【００２２】
本明細書において、「特異的結合」という用語は、２つの分子、化合物、細胞、及び／又は粒子間の化学的相互作用を指し、第１の実体は、標的でない第３の実体に結合するより大きな特異性及び親和性で標的である第２の実体に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、第３の非標的実体への親和性の少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、又はそれより大きい、第２の標的実体への第１の実体の親和性を意味し得る。所与の標的に特異的な試薬とは、使用されているアッセイの条件下でその標的への特異的結合を示すものである。
【００２３】
一態様では、本明細書は、本明細書に記載されている改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列を記載する。一態様では、本明細書は、本明細書に記載されている改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを記載する。本明細書において、「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達又は異なる宿主細胞間の移行のためにデザインされた核酸コンストラクトを指す。本明細書において、ベクターはウイルス性であってよく、非ウイルス性であってもよい。標的細胞中への遺伝子の移行に有用な多くのベクターが利用可能であり、例えば、ベクターは、エピソーマルベクター、例えばプラスミド、ウイルス由来ベクターであってよく、あるいは、相同組換え又はランダム組込みを介して標的細胞ゲノム中に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターであってよい。本明細書において、「発現ベクター」という用語は、細胞中に異種核酸断片を組み込んで発現させることができるベクターを指す。発現ベクターは付加的要素を含んでよく、例えば、発現ベクターは、２つの生物中で維持されることができるように２つの複製系を有してよい。ベクターに組み込まれる核酸は、発現調節配列がそのポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を調節及び制御する時、発現調節配列に機能可能に連結し得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸はプラスミドの一部中に存在し得る。プラスミドベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ  ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−又はＫＳ＋／−（参照により本明細書に援用するカリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン社の「Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」  Ｃａｔａｌｏｇ  （１９９３）参照）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（参照によりその全体を援用するStudier et. al., “Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes," Gene Expression Technology , vol. 185 (1990)参照）が含まれ得るが、これに限定されない。
【００２５】
本明細書において、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子へとパッケージングされる能力を有する、核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりにトランスジェニック遺伝子を含み得る。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボで任意の核酸を細胞中に移行させる目的で使用され得る。多くのウイルスベクターが当該技術分野で公知であり、細胞中への核酸のキャリアとして用いることができる（例えば、ラムダ・ベクター・システムｇｔ１１、ｇｔ  ＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ  ４）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は構成的に発現され得る。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は構成的プロモーターに作動可能に連結していてよい。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は誘導発現され得る。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結してよい。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、天然ＣｓｇＡプロモーターに作動可能に連結してよい。
【００２７】
本明細書において、「誘導性プロモーター」とは、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）又は誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の非存在下、非影響下、又は接触していない時より、誘導物質又は誘導剤の存在下、影響下、又は接触時に、転写活性を開始又は増大させることを特徴とするものである。「誘導物質」又は「誘導剤」は、内因的であってもよく、又は誘導性プロモーターからの転写活性の誘導に活性であるように投与される通常外来性の化合物又はタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、誘導物質又は誘導剤、例えば、化学物質、化合物、又はタンパク質自体が、それ自体が誘導性プロモーター又は調節の下にあってもよい核酸配列の転写又は発現によるものであってよい（例えば、誘導物質が転写抑制タンパク質であってもよい）。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、ｌａｃオペロンプロモーター、窒素感受性プロモーター、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、塩誘導性プロモーター、及びテトラサイクリン、ステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター等が含まれるが、これに限定されない。原核系で使用するための誘導性プロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、ベータ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム（Chang et al., Nature, 275: 615 (1978)（参照により本明細書に援用する）；参照により本明細書に援用するGoeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)）、ａｒａＢＡＤプロモーターを含む、アラビノースプロモーターシステム（参照により本明細書に援用するGuzman et al., J . Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)；参照により本明細書に援用するGuzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995)；参照により本明細書に援用するSiegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)）、ラムノースプロモーター（参照により本明細書に援用するHaldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)）、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（参照により本明細書に援用するGoeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)）、ＰＬｔｅｔＯ−１及びＰｌａｃ／ａｒｅ−１プロモーター（参照により本明細書に援用するLutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)）、並びにｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーター（参照により本明細書に援用するdeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)）を参照されたい。
【００２８】
本明細書に開示されている方法及びシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、１又は複数の生理的条件、例えばｐＨ、温度、放射線、浸透圧、塩のグラジエント、細胞表面結合、及び１又は複数の外来性又は内在性誘導剤の濃度の変化によって誘導することができる。外来性の誘導物質又は誘導剤は、アミノ酸及びアミノ酸アナログ、単糖及び多糖、核酸、タンパク質転写活性化因子及び抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモン、並びにその組合せを含み得る。特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、化学物質濃度、金属、温度、放射線、栄養の変化、又はｐＨの変化等の環境条件の変化に応答して活性化又は抑制される。したがって、本明細書に開示されている方法及びシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、並びに／又はそのハイブリッド及び組合せであり得る。適切な環境的誘導物質には、熱への暴露（すなわち、熱パルス又は一定した熱暴露）、種々のステロイド化合物、２価カチオン（Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋を含む）、ガラクトース、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド）、並びに他の天然及び合成の誘導剤及び無償性誘導物質（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｒ）への暴露が含まれるが、これに限定されない。
【００２９】
本明細書に開示されている方法及びシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは更に、環境的な外部物質又は別の遺伝子産物の作用により不活性化される「転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）」により抑制されるものを含む。そのような誘導性プロモーターは更に、本明細書に記載されている生物学的スイッチコンバーターの所与のモジュール又は構成要素中にある他の種類のプロモーターとの区別が必要な場合、「抑制可能なプロモーター（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」と呼ばれることもある。本発明での使用に好ましい抑制因子は、生理学的に穏和な薬剤による不活性化に感受性である。したがって、ｌａｃＯオペレーター配列を含むように改変されたプロモーター配列の発現の調節にｌａｃリプレッサータンパク質を用いる場合、ＩＰＴＧで宿主細胞を処理することで、ｌａｃＯオペレーター配列を含む改変プロモーターからｌａｃリプレッサーが解離して転写が可能になる。同様に、ｔｅｔＯオペレーター配列を含むように改変されたプロモーター配列の発現を調節するためにｔｅｔリプレッサーが用いられる場合、テトラサイクリンで宿主細胞を処理することで、改変プロモーターからｔｅｔリプレッサーが解離し、改変プロモーターの下流の配列の転写が可能になる。
【００３０】
一態様では、本明細書は、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む及び／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む改変微生物細胞を記載する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドは、コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含み得る改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする及び／又は含む細胞が、パートナーコンジュゲーションドメインと機能化ポリペプチドとを含む第２の改変ポリペプチドを更にコードしてよい及び／又は含んでよい。いくつかの実施形態では、本明細書は、２つの細胞型を含む細胞集団を記載し、第１の細胞型は、コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードし及び／又は含み、第２の細胞型は、パートナーコンジュゲーションドメイン及び機能化ポリペプチドを含む第２の改変ポリペプチドをコードする及び／又は含む。すなわち、本明細書中では、１個の細胞が、コンジュゲーションドメインを有するＣｓｇＡポリペプチドを含み、更にそのＣｓｇＡポリペプチドに結合する及び／又は結合されるポリペプチドを含んでよい；あるいは、第１の細胞がコンジュゲーションドメインを有するＣｓｇＡポリペプチドを含み、第２の細胞が、そのＣｓｇＡポリペプチドに結合する及び／又は結合されるポリペプチドを含んでもよいと考えられる。更に、コンジュゲーションドメインを有する改変ＣｓｇＡポリペプチドを、パートナーコンジュゲーションドメイン及び機能化ポリペプチドを有する第２のポリペプチドと接触させてもよいと考えられ、例えば、第２のポリペプチドを生成（例えば細菌又は真核細胞により）及び／又は合成（及び必要に応じて単離又は精製）した後、例えば改変ＣｓｇＡポリペプチドが細胞表面上及び／又はバイオフィルム中に存在する時に、改変ＣｓｇＡポリペプチドと接触させることができると考えられる。
【００３２】
本明細書に記載されている方法及び組成物の細菌細胞は任意の種のものであり得る。好ましくは、細菌細胞は、培養及び遺伝子操作に適した種及び／又は株のものである。いくつかの実施形態では、細菌細胞はグラム陽性細菌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細菌細胞はグラム陰性細菌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている技術の細菌細胞の親株はタンパク質発現用に最適化された株であり得る。本技術における使用に適した細菌の種及び株の非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１、及び上記のいずれかの誘導体が含まれる。タンパク質発現のための細菌株は市販されており、例えばＥＸＰＲＥＳＳ（商標）  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（カタログ番号Ｃ２５２３；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；マサチューセッツ州、イプスウィッチ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、野生型ＣｓｇＡを発現する細胞に含まれる。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、細胞が野生型ＣｓｇＡを発現しないようにする目的等のため、野生型ＣｓｇＡ遺伝子の変異及び／又は欠失を有する細胞に含まれる。いくつかの実施形態では、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、改変ＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸によって細胞中の野生型ＣｓｇＡが置換されるようにする等のため、相同組換えにより細胞に導入される。
【００３４】
一態様では、本明細書は、１若しくは複数の改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む且つ／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む改変微生物細胞を含むバイオフィルムを記載する。本明細書において、「バイオフィルム」とは、表面に接着できる又は接着している微生物の塊（ｍａｓｓ）を指す。バイオフィルムは、細胞外重合性物質のマトリックス、例えば、限定されるものではないが、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、グリオペプチド、及び多糖を含む。バイオフィルムの性質、例えばその構造及び組成は、バイオフィルム中に存在する具体的な細菌種に依存し得る。バイオフィルム中に存在する細菌は通常、単離された細菌又はコロニー中の細菌等、バイオフィルム中に存在しない対応する細菌とは遺伝的又は表現型的に異なる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている技術は、バイオフィルムの生成に適した条件下で改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む（及び／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む）改変微生物細胞を培養することにより生成するバイオフィルムに関する。バイオフィルムの生成に適した条件としては、微生物細胞が対数増殖及び／又はポリペプチド合成できる条件が含まれ得るが、これに限定されない。条件は、選択される微生物細胞の種及び株によって変わり得る。微生物細胞の培養条件は当該技術分野で周知である。バイオフィルム生成は、当該技術分野で周知の方法、例えば、細胞を抑制濃度以下のベータ−ラクタム又はアミノグリコシド系抗生物質と接触させること、細胞を流体の流れに曝すこと、細胞を外来性ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）と接触させること、又は細胞をクオラムセンシングシグナル分子と接触させることにより、誘導及び／又は強化することもできる。いくつかの実施形態では、バイオフィルムの生成に適した条件は、ＣｓｇＤを外因的に発現させること等により、ＣｓｇＡの発現及び分泌を増大させる条件も含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、バイオフィルムは、バイオフィルムを生成する細胞を含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書は、本明細書に記載の改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む組成物を記載する。
【００３８】
ｃｕｒｌｉを形成できる細胞、例えばＣｓｇＡ、ＣｓｇＢ、ＣｓｇＣ、ＣｓｇＤ、ＣｓｇＥ、ＣｓｇＦ、及びＣｓｇＧ又はそのサブセットを発現する細胞によって発現される場合、ＣｓｇＡ単位が組織化されてｃｕｒｌｉフィラメント、例えばＣｓｇＡの重合体鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのフィラメントは組成物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、フィラメントは、タンパク質性ネットワークの一部であり得、例えば複数のフィラメントが、例えば互いに絡み合っていてよく、重なっていてよく、及び／又は接触してよい。いくつかの実施形態では、タンパク質性ネットワークは、さらなるバイオフィルム構成要素、例えばＥ．ｃｏｌｉバイオフィルム中に通常見出される物質を含み得る。バイオフィルム構成要素の非限定的な例としては、バイオフィルムタンパク質（例えば、ＦｉｍＡ、ＦｉｍＨ、Ａｇ４３、ＡｉｄＡ、及び／又はＴｉｂＡ）及び／又は非タンパク質性バイオフィルム構成要素（例えば、セルロース、ＰＧＡ、及び／又はコロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））が含まれ得る。いくつかの実施形態では、組成物は、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む及び／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む改変微生物細胞を更に含み得る。
【００３９】
一態様では、本明細書は、バイオフィルム内、組成物内、及び／又は細胞表面上等でポプリペプチドを提示するための、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む（及び／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む）細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用を記載する。本明細書において、「提示する（ｄｉｓｐｌａｙ）」とは、ポリペプチドが細胞外環境と接触できるように（例えば活性ポリペプチドとして）ポリペプチドを発現させることを指す。提示されるポリペプチドは、結合パートナーと結合すること、酵素反応を触媒すること、及び／又は単離されたポリペプチドとしてそれが発揮する任意の他の活性を発揮することができる。
【００４０】
本明細書中で、バイオフィルム内に提示されたポリペプチド（例えば、活性ポリペプチド及び／又は機能化ポリペプチド）は、そのポリペプチドの可溶性バージョンより高い活性を保持している態様が想定される。本明細書中で、バイオフィルム内に提示されたポリペプチド（例えば、活性ポリペプチド及び／又は機能化ポリペプチド）は、例えば高又は低ｐＨ、有機溶媒、乾燥、高又は低温、放射線等の活性低下条件に曝された時に、そのポリペプチドの可溶性バージョンより高い活性を保持している態様が想定される。
【００４１】
一態様では、本明細書は、生体触媒作用；産業用生体触媒作用；固定化された生体触媒作用；化学生産；濾過；水溶液からの分子の単離；水の濾過；バイオレメディエーション；ナノ粒子合成；ナノワイヤー合成；光学活性材料の提示；バイオセンサー；表面コーティング；治療用バイオマテリアル；生物学的スキャフォールド；物体の構造的補強；及び治療剤のデリバリーシステム、からなる群から選択される用途における、改変ＣｓｇＡポリペプチドを含む（及び／又はそのようなポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を含む）細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用を記載する。そのような応用及びそれに用いるための具体的な活性ポリペプチドの非限定的な実施形態の例が本明細書の実施例に記載されている。
【００４２】
本明細書中で、細胞、組成物、及び／又はバイオフィルムは、それぞれが異なる活性ポリペプチドを含む複数の異なる改変ＣｓｇＡポリペプチドを含み得ると考えられる。例えば、酵素活性ポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチド及び結合ドメイン活性ポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドを含み得ると考えられる。細胞、組成物、及び／又はバイオフィルムは、１又は複数の改変ＣｓｇＡポリペプチド、例えば１、２、３、４、５、６、又はこれより多くの改変ＣｓｇＡポリペプチドを含み得る。
【００４３】
本明細書に記載されている方法及び組成物の例示的、非限定的な実施形態を以下に示す。
【００４４】
酵素提示のための生体触媒スキャフォールドとしてのＢＩＮＤ。バイオフィルムは、厳しい条件に耐えられ、表面に付着する性質、およびスケーラビリティのため、種々の生化学的変換の触媒として魅力的である。
【００４５】
一般的に、バイオトランスフォーメーションは生きた細胞内の酵素により又は細胞表面上に提示された酵素により触媒される。どちらのアプローチも、ホールセルの場合には基質の溶解度及び物質輸送に関連する、又は表面提示の場合には細胞膜上の利用可能な表面積が限定的であることに関連する、内在的な制限がある。本明細書は、酵素の部位特異的な共有結合的表面固定化のための基質として機能できるようなバイオフィルム細胞外マトリックスの合理的デザインを可能にするバイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ（Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ＢＩＮＤ）と呼ばれる技術の開発を記載する。付着ドメインＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させたαアミラーゼを、捕捉ドメインＳｐｙＴａｇを用いて、ｃｕｒｌｉ線毛を提示しているＥ．ｃｏｌｉバイオフィルム上に固定化した。遊離の酵素と比べた時、バイオフィルム表面に固定化されたαアミラーゼは、厳しいｐＨ条件及び水に非混和性の有機溶媒への暴露から保護された。この研究は、多用途の調節可能な生体触媒表面を作製するためのＥ．ｃｏｌｉの細胞外重合体マトリックスの新規な使用法の基礎を築くものである。
【００４６】
表面保護のための生きたコーティングとしてのＢＩＮＤ。多くの応用で用いられる表面は、摩耗、化学的分解（すなわち、腐食）、並びに化学的及び生物学的ソースからの付着物に対する抵抗性を付与するための保護的コーティングを必要とする。ＢＩＮＤプラットフォームは、改変バイオフィルムが固定化された表面に様々な保護機能を示すようにプログラムできる生きた表面コーティング材料を作製する方法を提供する：（１）表面への強力な接着、（２）殺菌剤、還元剤等のように分解又は付着物を防ぐ局所的環境中に可溶性実体を分泌する能力、（３）下にある基質中に形成されている割れ目を埋めるようにバイオポリマー物質を分泌する能力、又は（４）外部から供給された構成材料（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）に由来するミネラル又は他の規則的材料（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の成長のテンプレートとなる能力。
【００４７】
全サイクルに多量の培地を必要とし、且つしばしば代謝副産物を生成するため所望の生成物を単離するための処理が必要となる複雑な混合物を生じるホールセル発酵プロセスに比べて、酵素的に得られる１３ＰＤＯははるかに低いコストで生産できる可能性がある。ＢＩＮＤプラットフォーム技術は、多段階精製及び単回培養ステップを用いた固定化を行わず、また、高価な合成スキャフォールドの代わりに超安定な自己生成スキャフォールドを用いることにより、固定化酵素生体触媒に通常伴うコスト障壁を低減する。グリセロールからの微生物による１３ＰＤＯの代謝産物は２酵素ステップから生じる。第１ステップは、グリセロールデヒドラターゼ（Ｇｄｈ）によるグリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）への酵素的脱水である。次に、３ＨＰＡは、酸化還元酵素１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｐｄｈ）により１３ＰＤＯへと還元される。Ｇｄｈ及びＰｄｈはどちらも広く研究されており、１，３−ＰＤＯ産生微生物のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａで最もよく研究されている。デュポン法では、産業規模での発酵プロセスに、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングしたＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ遺伝子が用いられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、機能化ポリペプチドはグリセロールデヒドラターゼを含み得る。いくつかの実施形態では、機能化ポリペプチドはＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのグリセロールデヒドラターゼを含み得る。いくつかの実施形態では、機能化ポリペプチドはプロパンジオールデヒドロゲナーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、機能化ポリペプチドはＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのプロパンジオールデヒドロゲナーゼを含み得る。
【００４９】
ＢＩＮＤを用いた有価金属の生物的回収（Ｂｉｏｒｅｃｏｖｅｒｙ）又は汚染金属の除去。金属の除去及び回収は、鉱業、リサイクリング、及び水処理をはじめとする複数の産業で非常に有意義である。ＢＩＮＤプラットフォームは、特異的な金属イオン及び粒子に対する高い親和性及び選択性を有する改変結合タンパク質を提示する方法を提供する。ＢＩＮＤプラットフォームは、全長タンパク質を高密度でスケーラブルに提示できるので、他のバイオソープション法と比べて顕著に進歩している。これらの応用へ組換えタンパク質を使用すると、それらの作製に必要な生成及び精製プロトコールのため、ほとんどの場合、桁違いに費用がかかる。本明細書中で、金属イオン及び粒子の分離媒体として機能し得るバイオフィルムベースの材料が考察される。
【００５０】
治療用バイオフィルムを合成するためのプロバイオティックＥ．ｃｏｌｉの改変。本明細書中で、体内での使用に適したバイオフィルムベース材料が考察される。ＢＩＮＤプラットフォームは、生体組織へのバイオフィルムベース材料の接着をプログラムする手段を提供する。そのような材料は、体内におけるバイオフィルムの残留時間及び局在化を調節することができる。これらの材料は、特定の位置で自身を構築し、ｃｕｒｌｉナノファイバーと組織との直接的相互作用により生体組織の特性を変え、可溶性生体分子を分泌して局所的生物学的プロセスを変える能力を有する。
【００５１】
便宜のため、明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語及び語句の意味を以下に記載する。特に断りのない限り、又は文脈から暗に意味されない限り、以下の用語及び語句は以下に記載する意味を含む。本発明の範囲は請求項によってのみ限定されるので、定義は、特定の実施形態を説明する助けとして記載するものであり、特許請求される発明を限定することを意図していない。特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用と本明細書に記載の定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書に記載の定義が優先されるものとする。
【００５２】
便宜のために、明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集めた。
【００５３】
「増加／増大／上昇（ｉｎｃｒｅａｓｅ／ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「強化／増大（ｅｎｈａｎｃｅ）」、又は「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は全て、統計的に有意な量の増加を意味して本明細書中で使用される。いくつかの実施形態では、「増加／増大／上昇」、「強化／増大」、又は「活性化」という用語は、基準レベルと比べて少なくとも１０％の増加、例えば少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％の増加、あるいは基準レベルと比べて１０〜１００％の間の任意の増加、又は少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の増加、あるいは基準レベルと比べて２倍〜１０倍の間又はこれを超える任意の増加を意味し得る。
【００５４】
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に用いられ、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合した一連のアミノ酸残基を意味する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズ又は機能に関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）及びアミノ酸アナログを含むアミノ酸の重合体を指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」はしばしば、比較的大きなポリペプチドに言及して使用され、「ペプチド」という用語はしばしば、小さなポリペプチドに言及して使用されるが、当該技術分野におけるこれらの用語の用法は重複している。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、遺伝子産物及びその断片を指す場合、本明細書中では交換可能に使用される。したがって、典型的なポリペプチド又はタンパク質としては、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、並びに上記のその他の同等物、バリアント、断片、及びアナログが含まれる。
【００５５】
本明細書において、「バリアント」とは、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、１又は複数の欠失、挿入、又は置換のために天然又は参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比較した時に１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含むが参照タンパク質に関連する生物学的活性を保持しているバリアントタンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。アミノ酸配列に関して、当業者には、コードされる配列中の１個のアミノ酸又は小さなパーセンテージ（すなわち、５％以下、例えば、４％以下、又は３％以下、又は１％以下）のアミノ酸を変化させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加が、変化によりアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換される「保存的に修飾されたバリアント」であると理解される。いくつかの変化は、バリアント（保存的であってもなくても）が野生型又は天然ポリペプチドの活性の１００％超、例えば、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、５００％、１０００％、又はこれより高い活性を有するように、関連する活性を潜在的に向上させ得ると考えられる。
【００５６】
置換できるアミノ酸残基を同定する方法の１つは、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来のＣｓｇＡを他の種に由来するＣｓｇＡポリペプチドとアラインメントさせることである。アラインメントは、機能に必要であると考えられる残基だけでなく、逆に、変化が許容されると考えられる残基に関する指針も提供し得る。例えば、アラインメントが、対応する位置に２つの同じ又は類似のアミノ酸を示す場合、この部位は機能的に重要である可能性がより高い。逆に、アラインメントが、対応する位置にサイズ、電荷、疎水性等が著しく異なる残基を示す場合、その部位は機能性ポリペプチド中での変化を許容する可能性がより高い。そのようなアラインメントは当業者に容易に作成され、例えば、ワールドワイドウェブｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／上で自由に利用可能なＢＬＡＳＴＰプログラムのアラインメントツールのデフォルト設定を用いて作成される。更に、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、例えば自由に利用可能な配列データベースで相同配列をサーチすることにより、又はホモログを示すアノテーションについてそれらのデータベースをクエリーする（例えば、遺伝子名を含む又は遺伝子の活性を説明する文字列をサーチする）ことにより、任意の所与のポリペプチド又は核酸配列のホモログを見つけることができる。そのようなデータベースは、例えばワールドワイドウェブｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／上に見出すことができる。
【００５７】
バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも高い割合で同一であり得る。天然配列と変異配列との間の相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、ワールドワイドウェブ上のこの目的で一般的に使用される自由に利用可能なコンピュータープログラムを用いて２つの配列を比較することにより決定することができる。バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、それが由来する配列（本明細書中では「元の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）」配列と呼ぶ）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれより高い割合で類似していてよい。元の配列と変異配列との間の類似性の程度（パーセント類似性）は、例えば類似性マトリックスを用いて決定することができる。類似性マトリックスは当該技術分野で周知であり、類似性マトリックスを用いて２つの配列を比較するための複数のツールがオンライン上で自由に利用可能であり、例えばデフォルトのパラメーターセットのＢＬＡＳＴｐ（ワールドワイドウェブｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能）が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、バリアントは保存的置換バリアントである。バリアントは、例えば天然ヌクレオチド配列の変異により得ることができる。本明細書において、「バリアント」とは、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、１又は複数の欠失、挿入、又は置換のために天然又は参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比べた時に１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含むが参照タンパク質と比べて関連する生物学的活性を保持しているバリアントタンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。アミノ酸配列に関して、当業者には、コードされている配列中の１個のアミノ酸又は小さいパーセンテージ（すなわち、５％以下、例えば、４％以下、又は３％以下、又は１％以下）のアミノ酸を変化させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加が、変化によりアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換される場合、「保存的に修飾されたバリアント」であると理解される。いくつかの変化は、バリアント（保存的であってもなくても）が野生型酵素の活性の１００％超、例えば１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、５００％、１０００％、又はこれより高い活性を有するように、関連活性を潜在的に向上させ得ると考えられる。
【００５９】
元の配列と変異配列との間の類似性の程度（パーセント類似性）は、例えば類似性マトリックスを用いて決定することができる。類似性マトリックスは当該技術分野で周知であり、類似性マトリックスを用いて２つの配列を比較するための複数のツールがオンライン上で自由に利用可能であり、例えばデフォルトのパラメーターセットのＢＬＡＳＴｐ（ワールドワイドウェブｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能）が挙げられる。所与のアミノ酸を、類似した生理化学的特徴を有する残基で置換することができる（例えば１個の脂肪族残基による別の脂肪族残基の置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａによる互いの置換）又は１個の極性残基による別の極性残基の置換（例えば、Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｇｌｕ及びＡｓｐ；又はＧｌｎ及びＡｓｎの間））。その他のそのような保存的置換、例えば、類似した疎水性特性を有する領域全体の置換も周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、天然又は参照ポリペプチドの所望のアポトーシス活性が保持されていることを確認するための本明細書に記載のアッセイのいずれかを用いて試験することができる。機能的に類似したアミノ酸を記載した保存的置換表は当該技術分野で周知である。これに加えて、そのような保存的に修飾されたバリアントとしては、本開示と一致する多型バリアント（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、種間ホモログ、及びアレルが挙げられ、これらも排除されない。典型的には、互いの保存的置換には以下が含まれる：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)参照）。ポリペプチドの適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を向上させるため及び異常な架橋結合を防ぐために、一般的にセリンで、置換することができる。逆に、安定性を向上させるため又はオリゴマー化を促進するために、ポリペプチドにシステイン結合を付加することができる。
【００６０】
本明細書において、「核酸」又は「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそのアナログの単位が組み込まれた任意の分子、好ましくは重合体分子を指す。核酸は１本鎖又は２本鎖であり得る。１本鎖核酸は、変性２本鎖ＤＮＡの１本の核酸鎖であり得る。あるいは、２本鎖ＤＮＡに由来しない１本鎖核酸であってもよい。一態様では、核酸はＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸はＲＮＡであり得る。好適な核酸分子は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ等のＤＮＡである。他の好適な核酸分子は、ｍＲＮＡ等のＲＮＡである。
【００６１】
「統計的に有意」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般的に２標準偏差（２ＳＤ）以上の差を意味する。
【００６２】
実施例以外、又は別の断り書きがなされている場合以外、本明細書中で使用される成分の量又は反応条件を示す全ての数字は全ての場合において「約」という用語で修飾されているものと理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージと一緒に用いられた場合、±１％を意味し得る。
【００６３】
本明細書において、「含む」という用語は、組成物、方法、及びその組成物又は方法に必須なその各構成要素に関して使用されるが、不特定の要素（必須であってもなくてもよい）を含めることを除外しない。
【００６４】
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びその各構成要素を指し、その実施形態の説明中に列挙されていない要素に対して排他的である。
【００６５】
本明細書において、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的且つ新規な又は機能的な特徴に実質的に影響を与えない要素の存在を許す。
【００６６】
単数形（ａ、ａｎ、ｔｈｅ）の用語は、文脈中に特に明記されていない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は」、「若しくは」、「あるいは」という語は、文脈中に特に明記されていない限り、「及び」、「並びに」を含むことが意図される。本明細書に記載のものと類似又は同等な方法及び材料を本開示の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。「ｅ．ｇ．」という略語は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を指して本明細書中で使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「例えば」と同義である。
【００６７】
細胞生物学及び分子生物学における一般的な用語の定義はEncyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, Jones & Bartlett Publishing出版, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8); 及びCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.に見出すことができる。
【００６８】
特に断りのない限り、本発明は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); 又はMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); 及びCurrent Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.)に記載されているように標準的な手順を用いて行われ、これら全ての全体を参照により本明細書に援用する。
【００６９】
その他の用語は、本明細書中の本発明の種々の態様の説明中で定義されている。
【００７０】
本願中で引用される参照文献、付与された特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の出版物を、例えば本明細書に記載の技術に関連して用いられ得るそのような出版物に記載されている方法を説明及び開示する目的で、明示的に参照により本明細書に援用する。これらの出版物は、本願の出願日の前に単独でそれらの開示が提供されている。この点に関して、過去の発明のため又は任意の他の理由のために本発明者らがそのような開示に先行する権利がないことを認めていると解釈されるべきではない。日付に関する全ての記載又はこれらの文献の内容に関する表現は出願人らに利用可能な情報に基づいており、日付又はこれらの文献の内容の正確さを認めるものではない。
【００７１】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること又は開示されている正確な形態に開示を限定することを意図しない。開示の具体的実施形態及び開示のための例を説明のために本明細書に記載するが、関連分野の当業者に理解されるように、本開示の範囲内で種々の同等な改変が可能である。例えば、方法ステップ又は機能を所与の順番で記載しているが、別の実施形態では異なる順番で機能が行われてもよく、又は機能が実質的に同時に行われてもよい。本明細書に記載されている開示の教示は適宜別の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載されている種々の実施形態を組み合わせて更なる実施形態とすることができる。本開示の態様は、必要であれば、上記参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いるように改変して、本開示の更に別の実施形態とすることができる。更に、生物学的機能的同等性の考慮から、生物学的又は化学的作用の種類又は量に影響を与えることなくタンパク質構造にいくつかの変化を施すことができる。これら及び他の変化が詳細な説明に鑑みて本開示になされ得る。全てのそのような変更が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【００７２】
上記実施形態の任意の具体的要素を組み合わせてもよく、別の実施形態の要素の代わりにしてもよい。更に、本開示の特定の実施形態に関連した利点をこれらの実施形態との関連で説明したが、別の実施形態もそのような利点を示し得、本開示の範囲に含まれるために全ての実施形態が必ずそのような利点を示す必要はない。
【００７３】
本明細書に記載の技術を、更なる限定と解釈されるべきではない以下の実施例により更に説明する。
【００７４】
本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態は以下の番号を付した項目のいずれかにより定義することができる：
１．ＣｓｇＡポリペプチドに隣接するＣ末端提示タグを有するＣｓｇＡポリペプチドを含む、改変ＣｓｇＡポリペプチドであって、
提示タグが、活性ポリペプチド及びリンカー配列を含み、
リンカー配列が、提示ポリペプチドのＮ末端側に位置し、
リンカー配列が少なくとも６アミノ酸を含む、
ポリペプチド。
２．リンカー配列が、グリシン残基及びセリン残基からなる、第１項に記載のポリペプチド。
３．提示タグ及び／又は活性ポリペプチドが、
金属結合ドメイン（ＭＢＤ）；ＳｐｙＴａｇ；グラフェン結合（ＧＢＰ）；カーボンナノチューブ結合（ＣＢＰ）；金結合（Ａ３）；ＣＴ４３；ＦＬＡＧ；Ｚ８；Ｅ１４；ＱＢＰ１；ＣＬＰ１２；及びＡＦＰ８
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、第１項〜第２項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
４．活性ポリペプチドがコンジュゲーションドメインを含む、第１項〜第２項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
５．コンジュゲーションドメインが、
ＳｐｙＴａｇ；ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）；ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）；及びＬＰＸＴＧモチーフを含むペプチド
からなる群から選択される、第４項に記載のポリペプチド。
６．第１項〜第５項のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
７．第６項に記載の核酸配列を含むベクター。
８．第１項〜第７項のいずれか一項に記載のベクター、核酸配列、又はポリペプチドを含む改変微生物細胞。
９．コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含む改変ＣｓｇＡポリペプチドを発現する、第７項に記載の細胞。
１０．パートナーコンジュゲーションドメインを含む機能化ポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、第９項に記載の細胞。
１１．第１の細胞型及び第２の細胞型を含む細胞集団であって、第１の細胞型が、第９項に記載の細胞であり、第２の細胞型が、パートナーコンジュゲーションドメインを含む機能化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、細胞集団。
１２．第８項〜第１１項のいずれか一項に記載の細胞を含むバイオフィルム。
１３．バイオフィルムの生成に適した条件下で第８項〜第１１項のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより生成するバイオフィルム。
１４．第８項〜第１１項のいずれか一項に記載の細胞を含む、第１３項に記載のバイオフィルム。
１５．第１項〜第６項のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
１６．第１項〜第６項のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むフィラメントを含む、第１５項に記載の組成物。
１７．タンパク質性ネットワークを含む、第１５項〜第１７項のいずれか一項に記載の組成物。
１８．さらなるタンパク質性バイオフィルム構成要素を更に含む、第１５項〜第１８項のいずれか一項に記載の組成物。
１９．第８項〜第１１項のいずれか一項に記載の細胞を更に含む、第１５項〜第１９項のいずれか一項に記載の組成物。
２０．バイオフィルム内に、又は組成物を用いて、又は細胞表面上にポリペプチドを提示するための、第８項〜第１９項のいずれか一項に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用。
２１．生体触媒作用；産業用生体触媒作用；固定化された生体触媒作用；化学生産；濾過；水溶液からの分子の単離；水の濾過；バイオレメディエーション；ナノ粒子合成；ナノワイヤー合成；光学活性材料の提示；バイオセンサー；表面コーティング；治療用バイオマテリアル；生物学的スキャフォールド；物体の構造的補強；及び治療剤のデリバリーシステム、
からなる群から選択される用途における、第８項〜第１９項のいずれか一項に記載の細胞、組成物、又はバイオフィルムの使用。
【実施例】
【００７５】
実施例１
本明細書は、細菌バイオフィルムの主要なタンパク質性構成要素を遺伝的に修飾して機能性ペプチドを提示するようにすることにより、幅広い有益な応用、限定されるものではないが例えば産業用生体触媒作用、バイオレメディエーション、バイオエネルギー、物質のテンプレーティング、及びバイオセンシングのためにバイオフィルムをリプログラミングする方法を説明する。この技術は、分泌されたタンパク質の自己組織化により形成される細胞表面に固定されたアミロイド細線維からなるＥ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステムに基づく（図１Ａ〜１Ｆ）。本明細書に記載の技術は、機能性ペプチドドメインを分泌タンパク質に付加することにより、これが組織化された後、アミロイド細線維ネットワークが機能（例えば、種々の生物学的及び化学的実体への結合）の増大を示すようにすることができることを示している。更に、この細胞外マトリックス−ペプチド提示技術は任意のタンパク質の固定化に適応させることができる。
【００７６】
結果
【００７７】
融合ドメインをＣｕｒｌｉナノファイバー上に提示させることができる。
【００７８】
多くの微生物は、細胞外マトリックス物質としてバイオフィルムを生成して種々の表面にコロニー形成し、環境ストレスから自身を保護する。これらのバイオフィルムの主要な構造的構成要素の１つが、タンパク質で構成されるナノスケールの繊維である。細菌はこれらのタンパク質を細胞外環境に分泌し、そこでタンパク質モノマーが自然に、細胞表面上に固定された重合体鎖へと自己組織化する。これらのタンパク質ナノファイバーは、アミロイド形成性の構造的特徴を示すことが知られており、非常に強固である。これらは、表面への接着の仲介、宿主細胞への侵入、及び有害金属の捕捉を含む複数の進化上の利点を与えることが示されている１〜３。大部分の現在のバイオフィルム研究は、ヒトの健康に有害なバイオフィルムを阻害する又は分散させることに焦点を合わせている。ほぼあらゆる表面上における接着及び存続メカニズムとしてのバイオフィルムの形成は、生物医学業界及び食品業界において感染症の大きなリスクとなる４。本明細書は、有益な応用にバイオフィルムを使用するプラットフォーム技術を記載する。本明細書中で、ｃｕｒｌｉ等の線毛形成ナノファイバーの遺伝的融合体の発現及び分泌の成功により機能性ペプチドをバイオフィルム中へと改変できることが実証されている。
【００７９】
本明細書に記載されている技術の主な態様は以下を含むが、これに限定されない：種々の物理的、化学的、及び生化学的機能をバイオフィルムのタンパク質構造構成要素中に遺伝的にプログラムする能力；ｃｕｒｌｉナノファイバー又は任意のそのような同様な細胞外自己組織化タンパク質ベースアミロイド繊維で構成されるバイオフィルム；１又は複数のｃｕｒｌｉ単位又は自己組織化ドメインと、種々の長さのスペーサードメインと、タンパク質のＣ末端の任意の長さのペプチド「活性」ドメインと、を含む自己組織化タンパク質ドメインで構成されるバイオフィルムナノファイバーの改変単位；タンパク質のＮ末端は、場合により、ペリプラズム局在及び／又は細胞外空間へのタンパク質分泌を可能にする種々のドメインを更に含んでよく；ペプチド活性ドメインは、基質接着、任意の生体分子若しくは化学物質への結合を可能にし、触媒活性を自ら有し、外部局在タンパク質と協調して触媒活性に関与し、無機構造のテンプレートとなることができ、細胞中で生理的反応を誘導でき、溶液中でイオンに結合でき、自己重合若しくは他の分子と重合でき、光学活性であり、電気伝導性を付与し、且つ／又は刺激反応性の挙動を導く、任意のペプチドであってよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質ドメインと特異的に相互作用するペプチドタグをｃｕｒｌｉナノファイバー上に発現させて共有結合性又は非共有結合性の複合体を形成させることにより、タンパク質を改変ｃｕｒｌｉバイオフィルム上に固定化することができる。この相互作用性タンパク質ドメインに融合させた任意の標的タンパク質を、このようにして改変ｃｕｒｌｉ−ペプチドタグバイオフィルムを融合タンパク質に曝すことにより、バイオフィルム上に提示することができる。この融合タンパク質はシス又はトランスで発現させてよく、種々の純度で使用され得る。
【００８０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステムは小さなタンパク質モノマー、ＣｓｇＡで構成され、ＣｓｇＡは、細胞によって分泌されて非常に強固なアミロイドナノファイバーへと細胞外で自己組織化し、外膜に結合した相同なタンパク質ＣｓｇＢにより細胞表面に固定される５。生じたｃｕｒｌｉナノファイバーは直径約７ｎｍであり、絡まってカールした塊を形成し、洗剤中での煮沸に抵抗性である。アミロイドナノファイバーをモノマーへと解離させるには、約９０％のギ酸中でｃｕｒｌｉ線毛をインキュベートする必要がある。本発明者らは、細胞外ｃｕｒｌｉ線毛形成能を維持したままＣｓｇＡタンパク質との遺伝的融合体を作製できることを実証した（図１Ａ）。これは、ステンレス鋼表面に強く結合することが知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．由来のペプチドドメインである金属結合ドメイン（ＭＢＤ）６に種々の可変リンカーによりＮ末端又はＣ末端で融合させたＣｓｇＡからなる変異体のパネル（図１Ｂ、左に模式的に示す）を作成することにより達成された。ｃｓｇＡバリアントをプラスミドにクローニングし、野生型ｃｓｇＡ遺伝子を欠損しているが残りのｃｕｒｌｉプロセシング機構は含むＥ．ｃｏｌｉ（ＬＳＲ１０）株に形質転換した。したがって、誘導後、アミロイド形成は、異種改変ＣｓｇＡ融合変異体のみに起因し得る。低塩培地上での細菌コロニーのコンゴーレッド（ＣＲ）染色が、アミロイド細線維形成の標準的な比色分析指標であり、細菌の赤色によってＣｕｒｌｉ線毛形成の成功が示される。挿入パネルの結果は、ＣｓｇＡのＣ末端とＭＢＤとの間に最も長いリンカーを有するＣ３融合体のみがはっきり認識できる量のアミロイド繊維を形成できることを示している。
【００８１】
ＣｓｇＡのＣ末端に融合させることができる機能性ドメインの範囲を調べるために、可変リンカーは保持したまま、サイズが７〜５９残基の種々の機能性ペプチド及びタンパク質ドメインのライブラリーを選択し、Ｃ末端領域にクローニングした（図１Ｃ）。ＣＲプレートに画線したｃｕｒｌｉ融合体コンストラクトの図１Ｄは、種々の小さな機能性ペプチドが、ｃｕｒｌｉ機構に許容され、ＣＲ染色によって示されるようにｃｕｒｌｉナノファイバーを形成するが、５９アミノ酸のＭｍｓ６ドメインはアミロイド陽性ＣＲ染色を示さないことを示している。いくつかのＣｓｇＡ融合タンパク質から得られたｃｕｒｌｉ線毛を可視化したＴＥＭ及びＦＥ−ＳＥＭの画像はこのデータを支持しており、Ｃ３挿入部位でのＭＢＤペプチド融合体及びＳｐｙＴａｇペプチド融合体は目に見えるナノファイバーを生成している（図１Ｅ〜１Ｆ）。これらの結果は、（１）細胞からの分泌及び細胞外でのアミロイド繊維への組織化のための細胞ｃｕｒｌｉ機構によるプロセシングを維持しながらＣｓｇＡへの遺伝的融合体を作製することが可能であること、及び（２）可変リンカーを用いたＣ末端挿入部位が、ｃｕｒｌｉ分泌及び組織化にとって最も許容性のコンストラクト構成であることを示している。
【００８２】
Ｃｕｒｌｉ提示融合ペプチドドメインは機能性であり、タンパク質提示のスキャフォールドとして用いることができる。
【００８３】
細胞外で組織化された改変ｃｕｒｌｉナノファイバー上に提示された時にペプチドドメインが機能性であるか試験するために、タンパク質ドメインと特異的に相互作用するペプチドタグを改変ｃｕｒｌｉシステムで発現させた（図２Ａ）。このシステムは、タンパク質ドメイン（「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」と呼ばれ、本明細書中では「ＳＣ」と呼ばれる）がペプチドタグ（「ＳｐｙＴａｇ」と呼ばれ、本明細書中では「ＳＴ」と呼ばれる）とイソペプチド結合を特異的且つ強固に形成できる、最近実証された共有結合性捕捉プラットフォームである７。したがって、ｃｕｒｌｉバイオフィルム上の機能的に提示されたＳＴペプチドは、任意の標的タンパク質に融合させることができる外部から添加されるＳＣタンパク質ドメインと不可逆的結合を形成する。ＳＣドメインに蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）を付加したレポーター融合タンパク質をデザインし、発現させ、精製した。この精製Ｖｅｎｕｓ−ＳＣタンパク質を、ペプチドを提示していない野生型ｃｕｒｌｉバイオフィルムに添加した時には、バイオフィルムへの蛍光の局在は観察されなかった（図２Ｂ、列１）。しかし、ＳＴペプチドを提示するバイオ改変ｃｕｒｌｉバイオフィルムをＶｅｎｕｓ−ＳＣタンパク質に暴露した時には、バイオフィルムに局在化した顕著な蛍光が観察された（図２Ｂ、列２）。対照的に、ＳＴペプチドとの共有結合を触媒できないＶｅｎｕｓ−ＳＣ（Ｅ７７Ｑ）変異体は、強い局在化した蛍光を示していない（図２Ｂ、列３）。これらの結果は以下を示している：（１）ｃｕｒｌｉナノファイバー上に提示されたペプチドが機能的且つアクセス可能な形態で発現されていること、及び（２）本発明者らの改変ｃｕｒｌｉバイオフィルム技術により提示されるペプチドと相互作用するタンパク質ドメインに標的タンパク質を融合させることにより、標的タンパク質をペプチド機能化ｃｕｒｌｉバイオフィルム上に固定化できること。
【００８４】
発現されたタンパク質の精製はタンパク質固定化戦略に必要ではない。むしろ、現在使用されているアフィニティー精製技術（すなわち、キチン結合又はＮｉ−ＮＴＡビーズ）の多くと同様に、ｃｕｒｌｉ−ＳｐｙＴａｇシステムは、徹底的な精製なしに細胞溶解物からＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−融合タンパク質を捕捉することができる。本発明者らの実験中で、Ｖｅｎｕｓ−ＳＣ及びＶｅｎｕｓ−ＳＣ（Ｅ７７Ｑ）を発現させ、細胞を溶解してタンパク質を遊離させ、細胞片をペレット化し、清澄化した細胞溶解物を直接バイオフィルムに添加した。精製タンパク質を用いた上記実験と同様に、Ｖｅｎｕｓ−ＳＣは、ＳＴなしのｃｕｒｌｉを発現するバイオフィルムには捕捉されない（図２Ｃ（ｉ））が、ｃｕｒｌｉ−ＳＴを発現するバイオフィルムには捕捉される（図２Ｃ（ｉｉ））。やはり、Ｖｅｎｕｓ−ＳＣ（Ｅ７７Ｑ）変異体はこれらのｃｕｒｌｉ−ＳＴバイオフィルムに捕捉されない（図２Ｃ（ｉｉｉ））。これは、精製及び機能性材料合成を１つのステップにまとめる（すなわち、細菌がバイオフィルムスキャフォールド及び固定化対象である標的タンパク質の両方を生成する）ので、改変ｃｕｒｌｉプラットフォームの頑強性に寄与する。産業的バイオトランスフォーメーションプロセスのための革新的な技術としての応用が考えられ、複数の複雑なバイオリアクターステップを単一の遺伝的にプログラムされた培養に統合することができる。これにより、全体的なコストが低減し、産業への応用上の主な懸念であるシステムセットアップ８の効率が上昇する。
【００８５】
ｃｕｒｌｉペプチド提示技術を用いたバイオフィルム上へのタンパク質固定化は、相互作用性のペプチドタグ及びタンパク質ドメイン、例えば、限定されるものではないが、ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステム７、ＢＣＣＰ−ビオチンリガーゼ−ストレプトアビジンシステム９、又はＳｏｒｔａｓｅ仲介ライゲーション１０からなる種々の技術のいずれも用いることができる。本明細書に記載の技術は、酵素的、光学活性、電子活性、バイオテンプレート的、構造的、刺激反応性、及び結合性タンパク質又はその任意の組合せのバイオフィルム固定化に幅広く適用可能である。
【００８６】
応用
【００８７】
本明細書に記載されているｃｕｒｌｉシステムは、別の化学的若しくは生物学的実体を特異的に固定化するように又は特異的結合特性を示すようにプログラムできる生物学的に生成するペプチド機能化表面コーティングである。提示されるペプチドは、無機ナノ粒子（特に、興味のある光電子特性又は磁気応答性を有するもの）、カーボンベースナノ構造（すなわち、伝導性を付与し得るグラフェン又はナノチューブ）、又は環境毒素（すなわち、ホルモン又は有害金属）等のその他の外部から添加された機能性構成要素への結合等の固有の特性を有し得る。改変バイオフィルムは、無機又は有機材料形成のテンプレートとなるペプチドを提示するように用いることもできる。種々の材料に特異的に結合するペプチドを用いてバイオフィルムを機能化することにより、遺伝的にプログラム可能な様式でこれらの材料の表面コーティングが可能になる。更に、生体触媒作用、バイオテンプレーティング、又はバイオセンシングにおける応用に有用であり得る、任意のタンパク質を固定化及び提示するための生きたバイオフィルムを用いる応用が特に考えられる。同じ目的を果たす他の改変されたシステムとは対照的に、本明細書に記載されている材料の合成及び組織化は、プログラムされたナノ材料を生産するための工場として働く細菌細胞によって完全に達成される。
【００８８】
潜在的な具体的応用例としては以下が含まれる：
・ペプチド／固定化タンパク質自体に由来する又はテンプレーティングされる材料の誘導に由来する、プログラム可能な光学的特性、磁気抵抗特性、又は半導体の特性を有する、生物学的に生成されたナノ材料。
・ｃｕｒｌｉバイオフィルム上に触媒ペプチド又は酵素を提示することにより、バイオフィルムの接着に種々の固定化基質を用いることができ、任意のバイオリアクターデザインで用いることができる、高効率な固定化された生体触媒作用のためのシステムが考えられる。
・ペプチド／固定化タンパク質は、バイオフィルムが組織スキャフォールド又はワクチン送達材料として働くことを可能にする生物学的に活性な生体分子をコードしてもよい。
・合成ホルモン、小分子、又は有害金属等の環境毒素に結合する又はこれを酵素的に中和するペプチド／固定化タンパク質の発現を、バイオレメディエーションのためのバイオフィルムに基づく技術として用いることができる。
・本明細書に記載されているバイオフィルム上に金、銀、白金、及びロジウム等の貴金属に特異的に結合できるペプチドを発現させることにより、そのような貴重な物質を高い収益性で回収するための非常に広い活性表面積が得られ得る。
・ｃｕｒｌｉナノファイバーは、本来的に伝導性であるペプチド／タンパク質の提示により、又は伝導性である材料のテンプレーティング／固定により、多くの先端材料用途のための伝導性ナノワイヤーとして改変することができる。
・ＦｅＰＯ４等の伝導性又は半伝導性材料のテンプレートとなることができるペプチドのｃｕｒｌｉバイオフィルム上での発現に基づくエネルギー貯蔵のためのナノワイヤーを作製するための細菌の使用。
・提示ペプチドを介して鋼、ガラス、又は金等の特異的基質に強く結合するように細菌を特異的に改変することができる。そのような物質特異的結合は、バイオフィルムに基づくバイオセンシング技術の基礎を形成することができる。
・ｃｕｒｌｉナノファイバーマトリックスは、別の物質の機械的特性を強化する又は変化させるために、他の分子と相互作用するペプチド／タンパク質を提示するように改変することもできる。
・ｃｕｒｌｉを特異的物質に接着するように改変することにより、バイオフィルムは、適応及び再生に関する利点、例えば幅広い固定化基質上での生体触媒作用、物質に対する腐食耐性、微生物燃料電池用途でのバイオフィルム被覆度の増大、を提供できる生きたコーティングとして働くことができ、又は環境応答性有機（バイオフィルム）−無機（基質）材料として働くことができる。
【００８９】
考察
【００９０】
バイオフィルムはバイオレメディエーション及び廃水処理のための技術に大規模に使用されている１１〜１３。微生物燃料電池１４〜１９、生体触媒作用８、２０〜２４、及び腐食防止２５〜２７等の更に別の応用のためのバイオフィルムの使用が研究されてきた。しかし、これらの応用は、天然微生物の固有の能力に頼っている。例えば、水試料から重金属を除去するために使用されるバイオフィルムは、金属イオンを捕捉する能力を有することが知られている土壌細菌を用い；燃料電池で使用される微生物はほとんどの場合、導電性細胞外構成要素を天然に生産することが知られているものである。これら既存の方法の大きな欠点の１つは、結合される又は生物的に触媒される基質を内部移行させることができる細胞が必要なことである。これにより動力学的拡散障壁（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）が加わるので、プロセスの効率が非常に制限される。対照的に、本明細書に記載の技術は、合理的な遺伝子操作アプローチに基づく完全に新規な能力により能力が強化された又は増大した細菌バイオフィルム構成要素（ｃｕｒｌｉ）を提供する。
【００９１】
これは前述した基質アクセス性の障壁を回避するが、ｃｕｒｌｉに基づくペプチド提示システムは従来の細胞表面提示システム２８〜３１と比べて複数の明確な利点を有する。本明細書に記載の技術では、各細胞が改変ナノファイバーを生成する工場として働くので、ペプチド提示に利用可能なスキャフォールドの機能的表面積が大幅に増加する。更に、以前の細胞表面提示システムは細胞の溶解を引き起こし得る厳しい条件に弱いが、ｃｕｒｌｉ線毛は非常に安定であり、細胞除去後にも存在できる。
【００９２】
本明細書に記載の技術は、タンパク質の固定化を含むプログラム可能な機能化されたバイオフィルムを提供し、これは先行技術と比べて進歩であり、このプラットフォーム技術の応用可能性を大幅に拡大する。更に、本発明の技術は、線毛システム（ｆｉｍｂｒｉａｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して、ｃｕｒｌｉナノファイバーが単一モノマータンパク質ＣｓｇＡの自己組織化により形成される点で線毛提示（ｆｉｍｂｒｉａｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）より好ましい。ｃｕｒｌｉがＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムの主要タンパク質構成要素を形成し、単一タンパク質モノマーで構成されるシンプルな遺伝的システムであることは、本明細書に記載の改変ｃｕｒｌｉプラットフォームに明確な利点を提供する。
【００９３】
本明細書に記載の技術には、生体触媒作用、金属回収、及び電気生物学的用途を含む、しかしこれに限定されない、複数の用途があると考えられる。しかし、改変バイオフィルムは、プログラム可能な機能を有する表面コーティングが必要な任意の用途に有用であり得る。材料自体として働くことに加え、ｃｕｒｌｉに基づくシステムは、所望の挙動を有する自己組織化タンパク質を迅速に同定するための、又はそれに進化させるための、スクリーニングツールとして有用であり得る。ｃｕｒｌｉバイオフィルムの細胞外的性質、その固有の高い安定性、及び高表面積材料への大きな可能性が、種々の生体触媒作用、バイオレメディエーション、及び生体臨床医学用途におけるこの技術を非常に価値のあるものにしている。
【００９４】
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36. White, A.P., Collinson, S.K., Banser, P.A., Dolhaine, D.J. & Kay, W.W. Salmonella enteritidis fimbriae displaying a heterologous epitope reveal a uniquely flexible structure and assembly mechanism. J Mol Biol 296, 361-72 (2000).
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【００９５】
実施例２
【００９６】
細菌の病原性及び存続における役割のため、バイオフィルムに関する多数の研究が、その形成防止及び分散促進に焦点を合わせてきた。しかし、これにより、バイオフィルムを機能性材料として開発する機会が見過ごされてきた。本明細書中で、薄いアミロイド形成ナノファイバーからなるバイオフィルムマトリックスの主要タンパク質性構成要素であるＥ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステム上で機能性ペプチドの提示が遺伝的に改変されている新規な技術プラットフォーム、バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ（ＢＩＮＤ）を記載する。そのようなシステム中の細菌は、カスタマイズされた先端バイオマテリアル及びプログラム可能な表面コーティングの生産、組織化、及び後処理のための生きた工場として機能すると考えられる。本明細書中で、分泌されたＣｓｇＡキメラがｃｕｒｌｉ線毛ネットワークへと自己組織化する能力を保持しつつ、ペプチドの提示を可能にする、構造的ｃｕｒｌｉ遺伝子ｃｓｇＡ中の融合部位が同定される。様々なサイズ及び二次構造の機能性ペプチドのライブラリーをｃｕｒｌｉバイオフィルム中に組換え的に組み込み、ｃｕｒｌｉ提示システムのモジュール性及び柔軟性を実証した。更に、ＢＩＮＤナノファイバーの動態及び安定性を確かめ、ペプチドがデザインされた通りに完全に提示されていることを示す。最後に、ＢＩＮＤバイオフィルム中でのペプチド機能性の保持を３つの広い応用、すなわち改変された接着、ペプチド触媒作用、及びタンパク質固定化において実証した。
【００９７】
イントロダクション
【００９８】
自然界では、ほとんどの細菌はバイオフィルムコミュニティーとして存在し、厳しい環境から防御するタンパク質、糖、脂質、及び細胞外ＤＮＡのナノスケールの保護的な自己生成スキャフォールド中に存在する５。バイオフィルム形成は、天然表面及び人工表面の両方において細菌の接着及びコロニー形成に必須である。２０世紀半ばにおけるバイオフィルムの特徴解析により、微生物の存続及び病原性におけるそれらの主要な役割が明らかになり、近年、バイオフィルムの防止及び分散に関する多くの研究がなされることになった６、７。しかし、これらの高度に進化した細胞外マトリックスは、有益なナノバイオテクノロジー工学プラットフォームとしての未開発の可能性を秘めている。廃水処理８〜１０及びバイオトランスフォーメーション１１〜１３等の有益な目的のためのバイオフィルムの利用を調べている多くの研究があるが、これらの努力は、種々の望ましい性質を偶然進化させた天然生物の使用に焦点を合わせている。本発明者らの知る限り、分子レベルでバイオフィルムの構造を合理的に改変する努力は全くなされてこなかった。今日まで、バイオフィルム構成要素を容易に改変するための強固で応用範囲の広い技術は存在していない。
【００９９】
バイオフィルムをベースとする材料の分子組成を調節するための本明細書に記載されているアプローチは、一部のＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムのタンパク質性構成要素であるｃｕｒｌｉシステムに基づく。ｃｕｒｌｉシステムは、小さな１３ｋＤａタンパク質モノマーＣｓｇＡで構成され、ＣｓｇＡは細胞によって分泌され、自己組織化して非常に強固なアミロイドナノファイバーを形成し、相同な外膜タンパク質ＣｓｇＢによって細胞表面に固定される１４〜１６。生じたｃｕｒｌｉナノファイバーは、直径が約７ｎｍであり、細胞を封入する絡まったカールした塊を形成する１７。Ｃｕｒｌｉ生合成は、７個の遺伝子（ｃｓｇＡ〜Ｇ）を含むオペロンによって促進される１８。これらのうち、ＣｓｇＡは主要な構造的構成要素であるが１９、他のタンパク質はアミロイド繊維の核形成（ＣｓｇＢ）２０、又はＣｓｇＡのプロセシング（ＣｓｇＥ、Ｆ）２１、２２、分泌（ＣｓｇＣ、Ｇ）２３、２４、及び転写の調節（ＣｓｇＤ）１７に関与する。ｃｕｒｌｉシステムは、本明細書で考えられている物質改変プラットフォームの種類を受け入れられる複数の特徴を示すので、この技術に選択された。第１に、ＣｓｇＡによって形成されたアミロイド繊維は非常に強固であり、ＳＤＳ中での煮沸に耐えることができ２５、そのため、厳しい環境中での使用可能性が高い。第２に、細胞外繊維ネットワークは主に単一タンパク質で構成されるので、単一遺伝子を操作することでその構造的特徴を容易に調節することができる。最後に、類似の細胞外アミロイドシステムが他の生物、特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ２６、２７及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ２８に存在するが、ｃｕｒｌｉシステムははるかに最もよく研究されており、Ｅ．ｃｏｌｉ中で自然に生じ、単一構造タンパク質からなるため、非常に遺伝子的に扱いやすい。これらの他の線毛システムの一部は潜在的ワクチン送達剤として研究されてきたが２９、他のバイオフィルムに基づく生物工学的応用におけるそれらの使用に関する研究はなされていない。
【０１００】
本明細書は、「バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ」（ＢＩＮＤ）と呼ばれる戦略を記載し、これはＣｓｇＡタンパク質に機能性ペプチドドメインを遺伝子的に付加することによりＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムの機能的特性のプログラミングを可能にする。新規なＣｓｇＡ−ペプチドが分泌及び組織化された後、アミロイドナノファイバーネットワークがその表面に非常に高密度でペプチドを提示する。すると、提示ペプチドの配列に従ってバイオフィルムの機能が増強される。本明細書中で、ｃｕｒｌｉ線毛の形成を妨げることなく種々の長さ及び二次構造の機能性ペプチドドメインをＣｓｇＡに付加できることが示される。更に、ＣｓｇＡ変異体の自己組織化動態に対するペプチドドメイン融合の影響を定量する。最後に、ペプチドドメインが、分泌及び組織化後にバイオフィルムの状況下でその機能を維持していることを示す。
【０１０１】
結果
【０１０２】
プログラム可能な機能化バイオフィルムのためのＢＩＮＤのデザイン
【０１０３】
本明細書に記載のＢＩＮＤプラットフォームをデザインするために、複数の考慮すべき事項を考慮した。システムは、バイオフィルム中への任意の機能性ペプチドドメインの容易な組込みが可能なように、遺伝子的に扱い易く且つモジュール式でなければならない。したがって、バイオフィルム塊のバルクを形成する多糖バイオポリマー３０、３１は、その合成を改変が難しい複数酵素経路に頼っているので３２、使用が除外される。細胞に固定されたナノスケールタンパク質繊維を形成する、線毛として知られるバイオフィルムのタンパク質性構成要素を最適なスキャフォールドとして選択した。細菌の線毛システムのうち、ｃｕｒｌｉシステムはこれらのアミロイドナノファイバーが主に単一の自己組織化タンパク質ＣｓｇＡで構成されるので、これを選択した。これは、組織化されたネットワーク中での機能性ドメインの提示を最大化し、システムの複雑さを大幅に単純化する。更に、このシステムはＥ．ｃｏｌｉに天然のものであり、一緒に働く多くの遺伝子ツール及び発現技術が提供される。したがって、最初に、ＣｓｇＡのＮ末端又はＣ末端への機能性ドメインの融合体を試験することにした。
【０１０４】
ＣｓｇＡへのＣ末端ペプチド融合体はＣｕｒｌｉナノファイバーを形成することができる
【０１０５】
ｃｕｒｌｉ線毛を形成する能力を維持しているＣｓｇＡタンパク質への遺伝的融合体を作製することを目標とした。これは、ステンレス鋼表面に強く結合することが知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．由来のペプチドドメインである金属結合ドメイン（ＭＢＤ）３３にＮ末端又はＣ末端で融合させたＣｓｇＡからなる変異体のパネル（図３Ａに模式的に示す）を作成することにより達成された。各末端につき３つのバリアントを作製した：ＭＢＤをＣｓｇＡに直接又は短い隣接リンカー（ＧＳ）若しくは長い隣接リンカー（ＧＳＧＧＳＧ）を用いて連結した。ｃｓｇＡバリアントをプラスミドにクローニングし、野生型ｃｓｇＡ遺伝子を欠損しているが残りのｃｕｒｌｉプロセシング機構を含むＥ．ｃｏｌｉ（ＬＳＲ１０）株３４に形質転換した。したがって、誘導後、アミロイド形成は、異種改変ＣｓｇＡ融合変異体のみに起因し得る。ｃｕｒｌｉ線毛生成の読取りには、低塩培地上での細菌コロニーのコンゴーレッド（ＣＲ）染色を用いた。これはアミロイド細線維形成の標準的な比色分析指標である１４。挿入パネルの結果は、ＣｓｇＡのＣ末端とＭＢＤとの間に最も長いリンカーを有するＣ３融合体のみがはっきり認識できる量のアミロイド繊維を形成できることを示している（図１Ｂ）。他の融合体は、ＣＲ染色で染色されないことからわかるように、許容されない（図１Ｂ）。ＣｓｇＡ融合タンパク質から生じたｃｕｒｌｉ線毛を可視化したＴＥＭ画像はこのデータを裏付けており、Ｃ３挿入部位は目に見えるナノファイバーを生成する（非掲載データ）。これらの結果は、細胞からの分泌及びアミロイド繊維への細胞外組織化を阻害することなくＣｓｇＡへのＣ末端遺伝子融合体を作製できることを明白に示している。
【０１０６】
Ｃ３デザインはＣｕｒｌｉバイオフィルムへの種々のペプチドのモジュール方式での組込みを可能にする。
【０１０７】
ＣｓｇＡのＣ末端に融合させることができる機能性ドメインのモジュール性を調べるために、Ｃ３の６アミノ酸可変リンカーを維持しつつ、サイズが７〜５９アミノ酸のペプチドドメイン融合体のライブラリーを作成した（表１）。ライブラリーは更に種々の二次構造を表し、ほとんどのペプチドは決まったコンフォメーションを示すようにデザインされていないが、ＭＢＤ及びＭｍｓ６３５は細胞内ジスルフィド結合を含み、これによって、より強固なコンフォメーションにロックされると考えられる。最後に、タンパク質の捕捉３６並びに無機ナノ粒子３７〜３９及び表面３３への結合を含む種々の技術へのＢＩＮＤシステムの将来の応用に有用であり得る種々の機能にまたがるようにライブラリーのメンバーをデザインした。ライブラリーメンバーをＬＳＲ１０細胞にクローニングし、ＣＲ染色によりｃｕｒｌｉに基づくアミロイドネットワークの形成について調べた。ほとんどのライブラリーメンバーの陽性ＣＲ染色（図２Ａ）及び定量分析（図４）は、小さなペプチド融合体がｃｕｒｌｉ搬出機構に許容され、細胞外アミロイドネットワークへの組織化に成功することを示唆している。陽性の染色がなかった唯一の変異体は５９アミノ酸Ｍｍｓ６ドメインであった。ＣｓｇＡは、折り畳まれていない配座異性体としてＣｓｇＧ複合体により外膜を横切って輸送されると考えられている１５。理論により限定するものではないが、ＣｓｇＧ複合体のポアサイズが約２ｎｍと推定されている２４ことを考えると、このことは、より大きな折り畳まれたドメインはｃｕｒｌｉ搬出機構と適合しないかもしれないことを示唆している。
【０１０８】
修飾ｃｕｒｌｉバイオフィルムのＴＥＭイメージングは、ＣｓｇＡ−ペプチド融合体がｗｔ−ＣｓｇＡで観察されるのと類似したナノスケールの繊維へと組織化すること示唆している（非掲載データ）。繊維は、特徴的な絡まったカールした形態を示し、細胞表面に密接に結合しているように見える。繊維のナノ構造を容易に識別できるように希釈サンプルで意図的にＴＥＭ画像を得た。完全に広がっているように見えるこれらの画像中の繊維は、サンプル調製中の乾燥プロセスのアーチファクトであると考えられ、自然の繊維形態を表していない。更に、ＳＥＭイメージングは、修飾ｃｕｒｌｉバイオフィルムが、細胞間の繊維の高度に相互接続されたネットワークを維持しながら、非常に高密度且つ複数の細胞層の厚さであり得ることを示している（非掲載データ）。
【０１０９】
ＣｓｇＡ−ペプチド融合体のインビトロ自己組織化動態。
【０１１０】
ＣｓｇＡの自己組織化に対するペプチドドメイン融合の影響を決定するために、インビトロでの精製及び組織化実験に複数のバリアントを選択した。精製のために、ＣｓｇＡ−ペプチド融合体を、Ｈｉｓタグ及びそれに続くエンテロキナーゼ切断配列に付加した。タンパク質がペリプラズムに搬出されないように、及び細胞溶解物からのアフィニティー精製後にエンテロキナーゼ切断により、天然Ｓｅｃタグのプロセシング後に対応するＬＳＲ１０形質転換体によって分泌されるものと同じタンパク質が生じるように、精製する配列をＳｅｃタグの代わりに挿入した４０。精製タンパク質は、確立されているチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイを用いて組織化動態についてモニタリングすることができる。
【０１１１】
ＢＩＮＤで提示されたペプチドの機能性。
【０１１２】
ＢＩＮＤシステムは、ｃｕｒｌｉベースのバイオフィルムに種々の新規な機能を導入することができる。したがって、ＣｓｇＡ−ペプチドキメラの分泌及び組織化の確認に加えて、融合させたペプチドドメインが、完全に形成されたバイオフィルムの状況下で同種の機能を維持していることを実証しようと努めた。そこで、２つのペプチドを表１から選択し（ＭＢＤ及びＳｐｙＴａｇ）、それらがバイオフィルムの性能を増強する能力を調べた。ＭＢＤは、鋼への親和性を有するのでステンレス鋼表面へのｃｕｒｌｉベースバイオフィルムの接着を強化すると考えられるため、選択された。この仮説を試験するために、ＣｓｇＡ−ＭＢＤ変異体を発現するＬＳＲ１０細胞を培養中で成長させ、誘導後、ステンレス鋼３０４Ｌ片上にスポットし、風乾した。陰性対照として、ｗｔ−ＣｓｇＡを発現する細胞及びＣｓｇＡを発現しない細胞で同じ手順を繰り返した。各片は、並んだ３つのスポット（各培養から１つ）を含んだ。その後、片を水性バッファー中に入れてボルテックスすることにより強く洗浄した（図５Ａ）。ＣｓｇＡ−ＭＢＤ融合体で構成されたバイオフィルムは洗浄手順に明らかに耐えたが、ｗｔ−ＣｓｇＡを発現する又はＣｓｇＡを発現しないものは表面から容易に洗い落とされた（図５Ｂ〜５Ｄ）。このデータに基づき、所望の機能を示すように事前に選択したペプチドドメインを付加することにより、非天然表面へのｃｕｒｌｉベースバイオフィルムの接着を人工的に強化できると結論付けられる。
【０１１３】
ＢＩＮＤシステムの有用性の第２の実証として、全長タンパク質をｃｕｒｌｉマトリックスに固定化するための手段としてＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ変異体を調べた。ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、１３アミノ酸ペプチド（ＳｐｙＴａｇ）及び１５ｋＤａタンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）に分割されたＣｎａＢ２タンパク質を用いるタンパク質捕捉のための近年開発された戦略である３６。２つの断片が一緒になると、分子間イソペプチド結合の形成を触媒する。この戦略を用いて、完全に遺伝子的にコード可能な構成要素を用いてｃｕｒｌｉネットワークとより大きなタンパク質との間の共有結合形成を可能にすることにより、ｃｕｒｌｉ搬出機構の見かけのサイズの制限を回避しようとした。そこで、ＣｓｇＡを過剰生産するように改変したＥ．ｃｏｌｉ株であるＰＨＬ６２８細胞を用いて、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇキメラを含むを提示するバイオフィルムを表面修飾ガラス基質上に形成した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を用いてＳｐｙＴａｇドメインの存在及び機能性を調べた。Ｖｅｎｕｓは、光学的性質が強化された緑色蛍光タンパク質バリアントである。細胞の存在を調べるために、ガラスに固定化されたバイオフィルムを核酸染色（ＳＹＴＯ  ６１、インビトロジェン社）で処理した。その後、ＳｐｙＣａｔｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ又は共有結合形成しない変異体であるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＥＱ−Ｖｅｎｕｓのいずれかを含む溶液で処理した。徹底的な洗浄ステップ後、蛍光顕微鏡法を用いてバイオフィルムをイメージングした。ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するバイオフィルム及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ処理の適切な組合せでのみ、２つの蛍光シグナルが顕著に共局在した（図６Ｆ）。ｗｔ−ＣｓｇＡを発現するバイオフィルムは蛍光タンパク質を捕捉できなかった。同様に、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するバイオフィルムは、非機能性ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＥＱ−Ｖｅｎｕｓ変異体で処理された時には緑色蛍光を示さなかった。総合すると、これらの結果は、ＳｐｙＴａｇペプチドをＣｓｇＡに融合させることができること及びＳｐｙＴａｇペプチドがｃｕｒｌｉネットワーク形成後に機能を維持していることを示唆している。
【０１１４】
考察
【０１１５】
本明細書が示す単純明快な自己組織化システムは、遺伝子改変により細菌細胞外マトリックス組成物の正確な分子的調節を可能にし、生きたシステムから機能性バイオナノ材料を作製するための、更にはおそらく生きた機能性材料を作製するためのプラットフォームを確立する。そのような合成生物学プラットフォームには多くの利点がある：無機材料への結合又は無機材料合成のバイオテンプレーティング、特定の表面へのバイオフィルム接着の強化、又は他の生体分子を固定化するためのスキャフォールド様表面コーティングの提供等の有用な特徴を有する種々のペプチドを提示するようにｃｕｒｌｉ線毛を改変することができる。バイオフィルム自体は、生合成的に作製され、石油由来の構成原材料（ｒａｗ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を必要としない点で、「グリーンな」（すなわち、環境に優しい）材料である。更に、バイオフィルムは、自己生成的及び自己修復的な再生可能材料となり得る。
【０１１６】
表面修飾及び機能化は我々の社会のほぼ全ての状況でいたるところにおいて見られる。しかし、生物学的に由来する表面コーティングは使用されていない。生命は、表面の細菌コロニー形成を可能にする初期の進化上の適応である非常に効率的なコーティング戦略を進化させてきた４１。応用技術へのバイオフィルムの現在の応用では、薄膜生体触媒又はバイオレメディエーションのための所望の機能を生成するために天然のバイオフィルム又はバイオフィルム形成細菌の共培養物が用いられる４２。バイオフィルムの機能性をプログラムできないこと及びバイオフィルム形成の時間的力学（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を調節できないことにより、これらの応用は限定的なままであり、他の産業におけるバイオフィルムに基づく技術の採用は大きく妨げられている。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステムは、腸管病原性株の宿主−細胞接着において中心的役割を果たし、バイオフィルムの形成に重要である２５。Ｃｕｒｌｉは、バイオフィルム阻害化合物の開発のため４３及び機能性細菌アミロイドのため１８のモデルシステムとして広く研究されてきた。本明細書中で、ｃｕｒｌｉシステムは、単一の遺伝子的にプログラム可能な単位である自己組織化ＣｓｇＡタンパク質で主に構成されるので、プログラム可能なバイオフィルムプラットフォームとして理想的であることが示される。
【０１１８】
材料及び方法
【０１１９】
細胞株及びプラスミド
【０１２０】
全てのクローニング及びタンパク質発現は、それぞれＭａｃｈ１（商標）（インビトロジェン社）及びＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞（ＥＭＤ社）中で行われた。ｃｓｇＡ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２ゲノムＤＮＡから単離され、Ｔｒｃプロモーターの調節下にあるＣｏｌＥ１プラスミドであるｐＢｂＥ１ａ４４にクローニングされた。ｐＥＴ３０ａプラスミド（ＥＭＤ社）を用い、ＣｓｇＡタンパク質の天然Ｎ２２領域をエンテロキナーゼ切断部位の直後にクローニングして発現ベクターを構築した。ペプチドインサート領域は、完全に合成されたか（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社）、オーバーラップエクステンションによりＰＣＲで生成された。全てのクローニングは、報告されているように等温ギブソン・アセンブリー４５を用いて行われ、ＤＮＡシークエンシングにより確認された。
【０１２１】
Ｃｕｒｌｉバイオフィルム形成
【０１２２】
ｃｕｒｌｉを生成するために、ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−ペプチド融合体をコードするｐＢｂＥ１ａプラスミドでＬＳＲ１０細胞又はＰＨＬ６２８細胞を形質転換した。陰性対照として、空のｐＢｂＥ１ａプラスミドで細胞を形質転換した。その後、１０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び２０ｇ／Ｌの寒天を含むＹＥＳＣＡ−ＣＲプレート上に細胞を画線又はスポットした。全ての培地成分はフィッシャー社製である。プレートには１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン、０．５ｍＭのＩＰＴＧ、２５ｍｇ／ｍＬのコンゴーレッド、及び５ｍｇ／ｍＬのブリリアントブルーＧ２５０を補った。その後、プレートを２５℃で４８時間インキュベートし、次いで、イメージングしてコンゴーレッド結合の程度を決定した。スポットしたプレートでは、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートに２０ｍＬをスポットする前に、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．２ｍＭのＩＰＴＧを補ったＹＥＳＣＡ液体培地中で２５℃にて４８時間形質転換体を成長させた。この同じＹＥＳＣＡ液体誘導手順を用いてＣｓｇＡ精製及び電子顕微鏡観察のためのサンプルを調製した。
【０１２３】
定量的コンゴーレッド結合アッセイ
【０１２４】
コンゴーレッド結合の測定は、以前に公開されている方法を改変して行った。簡潔に述べると、ＹＥＳＣＡプレート上で２５℃で４８時間成長させた形質転換体培養物を掻き取り、ＰＢＳ中に穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液のＯＤ６００を３に調整した。この懸濁液１ｍＬに、コンゴーレッド溶液を終濃度０．００１％で加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をペレット化し、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１マイクロプレートリーダーを用いて上清２００μＬの４９０ｎｍの吸光度を測定した。この測定値からＰＢＳ＋コンゴーレッド対照を引いた量としてコンゴーレッド結合の量を求めた。全てのサンプルはトリプリケートで行った。
【０１２５】
キメラＣｓｇＡ精製
【０１２６】
Ｒｏｓｅｔｔａ細胞形質転換体を対数増殖期中期までＬＢ中で成長させ、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導した。細胞をペレット化した後、その後の精製のために−２０℃で凍結した。ペレットを解凍し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ社）、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、５０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ、及びプロテアーゼ阻害剤（ロシュ社）中で溶解した。３０分後、溶解物を、８塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ  ＴｒｉｓのｐＨ７．５の溶液中に希釈し、１６時間インキュベートして凝集体を溶解した。不溶性の塊を１８，０００ｒｐｍで３０分の遠心によりペレット化し、清澄化した溶解物を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社）と２時間インキュベートした。その後、タンパク質が結合した樹脂を８塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄し、２００ｍＭイミジアゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）を補った同じバッファーで溶離させた。溶出液をＥＫ切断バッファー（１Ｍ尿素、２０ｍＭメチルアミン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中に透析した後、３μｇのエンテロキナーゼ（ロシュ社）と２４時間インキュベートした。その後、切断されたＣｓｇＡタンパク質を凍結乾燥し、１００μＬのＨＦＩＰで処理して全てのｃｕｒｌｉ線毛を溶解し、乾燥粉末として保存した。
【０１２７】
ＴｈＴ動態アッセイ
【０１２８】
ＴｈＴアッセイの直前に、切断されたＨＦＩＰ処理タンパク質を８Ｍ塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び５０ｍＭ  ＴｒｉｓにｐＨ７．５で再度可溶化した。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５ゲル濾過カラム上でＦＰＬＣ精製して二量体及びオリゴマーを除去した。その後、単量体ＣｓｇＡ融合体を含む画分を脱塩し、ＵＶの吸光度により濃度を決定した。すぐに、３０μＭのＣｓｇＡ融合体又は野生型タンパク質及び４０μＭ  ＴｈＴを用いてＴｈＴアッセイを行った。蛍光はＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２プレートリーダーを用いて４３８ｅｘ／４９５ｅｍで測定された。
【０１２９】
ＴＥＭ及びＳＥＭ
【０１３０】
Ｃｕｒｌｉ形成した野生型又はＢＩＮＤ細胞サンプルを、誘導したＹＥＳＣＡ培養物から直接取り出すか、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートから掻き取り、ミリポアＨ２Ｏに再懸濁した。ＴＥＭ分析では、５ｍＬのサンプルをフォルムバール−カーボングリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上にスポットし、ミリポアＨ２Ｏで２回洗浄し、１％ウラニルホルマートで１５秒間染色した後、ＪＥＯＬ  １２００  ＴＥＭを用いて分析した。ＳＥＭ分析では、サンプルをＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターに減圧下でアプライし、ミリポアＨ２Ｏで洗浄し、２％グルタルアルデヒド＋２％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定した。その後、サンプルをミリポアＨ２Ｏで洗浄し、増加エタノールステップグラジエントで脱水し、ヘキサメチルジシラザンのステップグラジエントを用いて乾燥させた後、金スパッタリングし、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ  ＦＥ−ＳＥＭを用いて分析した。
【０１３１】
免疫金ＴＥＭ
【０１３２】
ＦＬＡＧタグを提示するＢＩＮＤ細胞の抗ＦＬＡＧ免疫金標識のために、前述したように最初に細胞をＴＥＭグリッドに接着させた。その後、グリッドをブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で３回洗浄し、一次抗ＦＬＡＧマウス抗体とＰＢＳの１：１０００希釈物を含む液滴上にＸＸ分浮かせ、ブロッキングバッファーで再度洗浄した後、１：１０００希釈された抗マウス１５ｎｍ金コンジュゲート抗体の液滴上に浮かせた。最後にＰＢＳで３回、次いでミリポアＨ２Ｏで洗浄した後、１％ウラニルホルマートで１５秒間グリッドを染色し、ＪＥＯＬ  １２００  ＴＥＭを用いてイメージングした。
【０１３３】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓの構築及び発現
【０１３４】
ｐＤＥＳＴ１４−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを含むＲｏｓｅｔｔａ細胞を、ＬＢ中３７℃で、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと共に５ｍＬの培養液中で一晩成長させた。アンピシリンを補った５００ｍＬ培養液に一晩の培養物を接種し、ＯＤが０．６になるまで３７℃で６時間成長させた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８℃で一晩発現させた。細胞を回収及び溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムでＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを精製した。タンパク質を回収し、バッファーを５０ｍＭリン酸バッファー５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に交換し、濃縮し、その後の使用まで−８０℃で保存した。
【０１３５】
蛍光バイオフィルムイメージング
【０１３６】
Ｌｅｉｃａ  ＴＩＲＦ  ＤＭ１６０００Ｂ機器を用いて落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）モードで蛍光画像を撮った。ガラス製カバースリップ（Ｎｏ：１．５）をそれぞれ３０秒プラズマ活性化した。スライドを０．０１ｗ／ｖ％のＰＬＬ溶液に２時間浸漬した後、６０℃のインキュベーター中に２時間置いた。ＰＨＬ６２８  ＷＴ及びＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ（ＳＴ）細胞を２０ｍＬの培養液中で、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＹＥＳＣＡブロス中でＯＤが０．６になるまで３７℃で６時間成長させた。カバースリップを培養液中に落とし、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ及び３％ＤＭＳＯを用いてｃｕｒｌｉ発現及びバイオフィルム形成を誘導した。培養液を２５℃、１５０ｒｐｍで４８時間振盪した。スライドを培養液から取り出し、洗浄バッファー（１×ＰＢＳ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で２０分間の洗浄を３回行った。洗浄後、０．５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ  Ｖｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又はＶｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＱ）溶液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ）をスライドに添加した。バイオフィルムを１時間インキュベートした後、洗浄バッファーで２０分間の洗浄を２回行った。その後、バイオフィルムをＳｙｔｏ  ６１（１０μＭ）で２０分間染色し、洗浄バッファーで２×１５分間、１５０ｒｐｍで振盪しながら洗浄した。その後、６０倍及び１００倍の油浸レンズ（ｏｉｌ  ｌｅｎｓ）を用いて落射蛍光モードでスライドをイメージングした。
【０１３７】
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【０１３８】
【表１】
2019022491.tif 000003
【０１３９】
実施例３：改変Ｃｕｒｌｉナノファイバー由来のプログラム可能なバイオフィルムをベースとする材料
【０１４０】
細菌の病原性及び存続における役割のため、バイオフィルムに関する多数の研究が、その形成防止及び分散促進に焦点を合わせてきた。しかし、これにより、バイオフィルムを機能性材料として開発する機会が見過ごされてきた。本明細書中で、薄いアミロイド形成ナノファイバーからなるバイオフィルムマトリックスの主要タンパク質性構成要素であるＥ．ｃｏｌｉ  ｃｕｒｌｉシステム上で機能性ペプチドの提示が遺伝的に改変されている新規な技術プラットフォーム、バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ（ＢＩＮＤ）を記載する。本明細書中、そのようなシステム中の細菌は、カスタマイズされた先端バイオマテリアル及びプログラム可能な表面コーティングの生産、組織化、及び後処理のための生きた工場として機能できると考えられる。本明細書中で、分泌されたＣｓｇＡキメラがｃｕｒｌｉ線毛ネットワークへと自己組織化する能力を保持しつつ、ペプチドの提示を可能にする、構造的ｃｕｒｌｉ遺伝子ｃｓｇＡ中の融合部位が同定される。様々なサイズ及び二次構造の機能性ペプチドのライブラリーをｃｕｒｌｉバイオフィルム中に組換え的に組み込み、ｃｕｒｌｉ提示システムのモジュール性及び柔軟性を実証した。更に、ＢＩＮＤナノファイバーの動態及び安定性を確かめ、ペプチドがデザインされた通りに完全に提示されていることを示す。最後に、ＢＩＮＤバイオフィルム中でのペプチド機能の保持を３つの広い応用、すなわち改変された接着、ペプチド触媒作用、及びタンパク質固定化において実証した。
【０１４１】
ルイ・パスツール及びロベルト・コッホが１９世紀に疾患の細菌論を発展させた時、微生物の唯一の役割はヒトの健康に対する主な脅威であると考えられた１、２。しかし、Ｌｏｂｂａｎ、Ｃｏｈｅｎ、及びＢｏｙｅｒによる微生物研究の進歩及び組換えＤＮＡ技術の出現により、我々は、実質的に微生物生化学を制御可能なものにし、微生物を遺伝子操作して無数の技術のための生体分子を作製できる時代に突入した３、４。本明細書に記載されているように、細菌バイオフィルムも同様な軌道に乗り出そうとしている。自然界では、ほとんどの細菌はバイオフィルムコミュニティーとして存在し、厳しい環境から防御するタンパク質、糖、脂質、及び細胞外ＤＮＡのナノスケールの保護的な自己生成スキャフォールド中に存在する５。バイオフィルム形成は、天然表面及び人工表面の両方において細菌の接着及びコロニー形成に必須である。２０世紀半ばにおけるバイオフィルムの特徴解析により、微生物の存続及び病原性におけるそれらの主要な役割が明らかになり、これにより、近年、バイオフィルムの防止及び分散に関する多くの研究がなされることになった６、７。しかし、これらの高度に進化した細胞外マトリックスは、有益なナノバイオテクノロジー工学プラットフォームとしての未開発の可能性を秘めている。廃水処理８〜１０及びバイオトランスフォーメーション１１〜１３等の有益な目的のためのバイオフィルムの利用を調べている多くの研究があるが、これらの努力は、種々の望ましい性質を偶然進化させた天然生物の使用に焦点を合わせている。本発明者らの知る限り、分子レベルでバイオフィルムの構造を合理的に改変する努力は全くなされてこなかった。今日まで、バイオフィルム構成要素を容易に改変するための強固で応用範囲の広い技術は存在していない。
【０１４２】
バイオフィルムをベースとする材料の分子組成を調節するための本明細書に記載されているアプローチは、一部のＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムのタンパク質性構成要素であるｃｕｒｌｉシステムに基づく。ｃｕｒｌｉシステムは、小さな１３ｋＤａタンパク質モノマーＣｓｇＡで構成され、ＣｓｇＡは細胞によって分泌され、自己組織化して非常に強固なアミロイドナノファイバーを形成し、相同な外膜タンパク質ＣｓｇＢによって細胞表面に固定される１４〜１６。生じたｃｕｒｌｉナノファイバーは、直径が約７ｎｍであり、細胞を封入する絡まったカールした塊を形成する１７。Ｃｕｒｌｉ生合成は、７個の遺伝子（ｃｓｇＡ〜Ｇ）を含むオペロンによって促進される１８。これらのうち、ＣｓｇＡは主要な構造的構成要素であるが１９、他のタンパク質はアミロイド繊維の核形成（ＣｓｇＢ）２０、又はＣｓｇＡのプロセシング（ＣｓｇＥ、Ｆ）２１、２２、分泌（ＣｓｇＣ、Ｇ）２３、２４、及び転写の調節（ＣｓｇＤ）１７に関与する。ｃｕｒｌｉシステムを利用したのは、本明細書で考えられている物質改変プラットフォームの種類を受け入れられる複数の特徴を示すためである。第１に、ＣｓｇＡによって形成されたアミロイド繊維は非常に強固であり、ＳＤＳ中での煮沸に耐えることができ２５、そのため、厳しい環境中での使用可能性が高い。第２に、この細胞外繊維ネットワークは主に単一タンパク質で構成されるので、単一遺伝子を操作することでその構造的特徴を容易に調節することができる。最後に、類似の細胞外アミロイドシステムが他の生物、特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ２６、２７及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ２８に存在するが、ｃｕｒｌｉシステムははるかに最もよく研究されており、Ｅ．ｃｏｌｉ中で自然に生じ、単一構造タンパク質からなるため、非常に遺伝子的に扱いやすい。これらの他の線毛システムの一部は潜在的ワクチン送達剤のための細胞表面提示技術として研究されてきたが２９、他のバイオフィルムに基づく生物工学的応用におけるそれらの使用に関する研究はなされていない。
【０１４３】
本明細書は、「バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ」（ＢＩＮＤ）と呼ばれる戦略を記載し、これはＣｓｇＡタンパク質に機能性ペプチドドメインを遺伝子的に付加することによりＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムの機能的特性のプログラミングを可能にする。新規なＣｓｇＡ−ペプチドが分泌及び組織化された後、アミロイドナノファイバーネットワークがその表面に非常に高密度でペプチドを提示する。すると、提示ペプチドの配列に従ってバイオフィルムの機能が増強される。本明細書中で、ｃｕｒｌｉ線毛の形成を妨げることなく種々の長さ及び二次構造の機能性ペプチドドメインをＣｓｇＡに付加できることが示される。更に、ＣｓｇＡ変異体の自己組織化動態に対するペプチドドメイン融合の影響を定量する。最後に、本明細書中で、ペプチドドメインが、分泌及び組織化後にバイオフィルムの状況下でその機能を維持していることを示す。
【０１４４】
結果
【０１４５】
プログラム可能な機能化バイオフィルムのためのＢＩＮＤのデザイン。本発明者らのＢＩＮＤプラットフォームをデザインするために、複数の考慮すべき事項を考慮した。システムは、バイオフィルム中への任意の機能性ペプチドドメインの容易な組込みが可能なように、遺伝子的に扱い易く且つモジュール式でなければならない。したがって、バイオフィルム塊のバルクを形成する多糖バイオポリマー３０、３１は、その合成を改変が難しい複数酵素経路に頼っているので３２、使用が除外される。細胞に固定されたナノスケールタンパク質繊維を形成する線毛として知られるバイオフィルムのタンパク質性構成要素を最適なスキャフォールドとして選択した。細菌の線毛システムのうち、ｃｕｒｌｉシステムは、これらのアミロイドナノファイバーが主に単一の自己組織化タンパク質ＣｓｇＡで構成されるので、これを選択した。これは、組織化されたネットワーク中における機能性ドメインの提示を最大化し、システムの複雑さを大幅に単純化する。更に、このよく研究されたシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉに天然のものであり、一緒に働く多くの遺伝子ツール及び発現技術が提供される。したがって、本発明者らは最初に、ＣｓｇＡのＮ末端又はＣ末端への機能性ドメインの融合体を試験することにした。
【０１４６】
ＣｓｇＡへのＣ末端ペプチド融合体はＣｕｒｌｉナノファイバーを形成することができる。本明細書は、ｃｕｒｌｉ線毛を形成する能力を維持しているＣｓｇＡタンパク質への遺伝的融合体の作製を記載する。これは、ステンレス鋼表面に強く結合することが知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．由来のペプチドドメインである金属結合ドメイン（ＭＢＤ）３３にＮ末端又はＣ末端で融合させたＣｓｇＡからなる変異体のパネル（図３に模式的に示す）を作成することにより達成された。各末端につき３つのバリアントを作製した：ＭＢＤをＣｓｇＡに直接又は短い隣接リンカー（ＧＳ）若しくは長い隣接リンカー（ＧＳＧＧＳＧ）を用いて連結した。ｃｓｇＡバリアントをプラスミドにクローニングし、野生型ｃｓｇＡ遺伝子を欠損しているが残りのｃｕｒｌｉプロセシング機構を含むＥ．ｃｏｌｉ（ＬＳＲ１０）株３４に形質転換した。したがって、誘導後、アミロイド形成は、異種改変ＣｓｇＡ融合変異体のみに起因し得る。ｃｕｒｌｉ線毛生成の読取りには、低塩培地上での細菌コロニーのコンゴーレッド（ＣＲ）染色を用いた。これはアミロイド細線維形成の標準的な比色分析指標である１４。挿入パネルの結果は、ＣｓｇＡのＣ末端とＭＢＤとの間に最も長いリンカーを有するＣ３融合体のみがはっきり認識できる量のアミロイド繊維を形成できることを示している（図１Ｂ）。他の融合体は、ＣＲ染色で染色されないことからわかるように、許容されない（図１Ｂ）。ＣｓｇＡ融合タンパク質から生じたｃｕｒｌｉ線毛を可視化したＴＥＭ画像はこのデータを裏付けており、Ｃ３挿入部位は目に見えるナノファイバーを生成する（図７Ａ；比較のための野生型ｃｕｒｌｉを図７Ｂに示す）。これらの結果は細胞からの分泌及びアミロイド繊維への細胞外組織化を阻害することなくＣｓｇＡへのＣ末端遺伝子融合体を作製できることを明白に示している。
【０１４７】
Ｃ３デザインはＣｕｒｌｉバイオフィルムへの種々のペプチドのモジュール方式での組込みを可能にする。
ＣｓｇＡのＣ末端に融合させることができる機能性ドメインのモジュール性を調べるために、本発明者らは、Ｃ３の６アミノ酸可変リンカーを維持しつつ、サイズが７〜５９アミノ酸のペプチドドメイン融合体のライブラリーを作成した（表１）。ライブラリーは更に種々の二次構造を表し、ほとんどのペプチドは決まったコンフォメーションを示すようにデザインされていないが、ＭＢＤ及びＭｍｓ６３５は細胞内ジスルフィド結合を含み、これによって、より強固なコンフォメーションにロックされると考えられる。最後に、タンパク質の捕捉３６並びに無機ナノ粒子３７〜３９及び表面３３への結合を含む種々の技術へのＢＩＮＤシステムの将来の応用に有用であり得る種々の機能にまたがるようにライブラリーのメンバーをデザインした。ライブラリーメンバーをＬＳＲ１０細胞にクローニングし、ＣＲ染色によりｃｕｒｌｉに基づくアミロイドネットワークの形成について調べた。ほとんどのライブラリーメンバーの陽性ＣＲ染色（図２Ａ）及び定量分析（図４）は、小さなペプチド融合体がｃｕｒｌｉ搬出機構に許容され、細胞外アミロイドネットワークへの組織化に成功することを示唆している。陽性の染色がなかった唯一の変異体は５９アミノ酸Ｍｍｓ６ドメインであった。ＣｓｇＡは折り畳まれていない配座異性体としてＣｓｇＧ複合体により外膜を横切って輸送される１５と考えられているので、このことは全く予想されないわけではなかった。ＣｓｇＧ複合体のポアサイズが約２ｎｍと推定されている２４ことを考えると、このことは、より大きな折り畳まれたドメインはｃｕｒｌｉ搬出機構と適合しないかも知れないことを示唆している。
【０１４８】
修飾ｃｕｒｌｉバイオフィルムのＴＥＭイメージングは、ＣｓｇＡ−ペプチド融合体がｗｔ−ＣｓｇＡで観察されるのと類似のナノスケールの繊維へと組織化することを示している（非掲載データ）。繊維は、特徴的な絡まったカールした形態を示し、細胞表面と密接に結合しているように見える。繊維のナノ構造を容易に識別できるように希釈サンプルで意図的にＴＥＭ画像を得た。完全に広がっているように見えるこれらの画像中の繊維は、サンプル調製中の乾燥プロセスのアーチファクトであると考えられ、自然の繊維形態を表していない。更に、ＳＥＭイメージングは、修飾ｃｕｒｌｉバイオフィルムが、細胞間の繊維の高度に相互接続されたネットワークを維持しながら、非常に高密度且つ複数の細胞層の厚さであり得ることを示している（非掲載データ）。
【０１４９】
ＣｓｇＡ−ペプチド融合体のインビトロ自己組織化動態。ＣｓｇＡの自己組織化に対するペプチドドメイン融合の影響を決定するために、インビトロでの精製及び組織化実験に複数のバリアントを選択した。精製のために、ＣｓｇＡ−ペプチド融合体を、Ｈｉｓタグ及びそれに続くエンテロキナーゼ切断配列に付加した。タンパク質がペリプラズムに搬出されないように、及び細胞溶解物からのアフィニティー精製後にエンテロキナーゼ切断により、天然Ｓｅｃタグのプロセシング後に対応するＬＳＲ１０形質転換体により分泌されるものと同じタンパク質が生じるように、精製する配列をＳｅｃタグの代わりに挿入した４０。精製タンパク質を、確立されているチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイを用いて組織化動態についてモニタリングした。
【０１５０】
ＢＩＮＤで提示されたペプチドの機能性。本明細書に記載のＢＩＮＤシステムは、ｃｕｒｌｉベースのバイオフィルムに種々の新規な機能を導入することができる。したがって、ＣｓｇＡ−ペプチドキメラの分泌及び組織化の確認に加えて、融合させたペプチドドメインが完全に形成されたバイオフィルムの状況下で同種の機能を維持していることを実証しようと努めた。そこで、２つのペプチドを表１から選択し（ＭＢＤ及びＳｐｙＴａｇ）、それらがバイオフィルムの性能を増強する能力を調べた。ＭＢＤは、鋼への親和性を有するのでステンレス鋼表面へのｃｕｒｌｉベースバイオフィルムの接着を強化すると考えられるため、選択された。この仮説を試験するために、ＣｓｇＡ−ＭＢＤ変異体を発現するＬＳＲ１０細胞を培養中で成長させ、誘導後、ステンレス鋼３０４Ｌ片上にスポットし、風乾した。陰性対照として、ｗｔ−ＣｓｇＡを発現する細胞及びＣｓｇＡを発現しない細胞で同じ手順を繰り返した。各片は、並んだ３つのスポット（各培養から１つ）を含んだ。その後、片を水性バッファー中に入れてボルテックスすることにより強く洗浄した（図５Ａ）。ＣｓｇＡ−ＭＢＤ融合体で構成されたバイオフィルムは洗浄手順に明白に耐えたが、ｗｔ−ＣｓｇＡを発現する又はＣｓｇＡを発現しないものは表面から容易に洗い落とされた（図５Ｂ〜５Ｄ）。
【０１５１】
これらのデータは、所望の機能を示すように事前に選択したペプチドドメインを付加することにより非天然表面へのｃｕｒｌｉベースバイオフィルムの接着を人工的に強化できることを示している。
【０１５２】
ＢＩＮＤシステムの有用性の第２の実証として、全長タンパク質をｃｕｒｌｉマトリックスに固定化するための手段としてＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ変異体を調べた。ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、１３アミノ酸ペプチド（ＳｐｙＴａｇ）及び１５ｋＤａタンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）に分割されたＣｎａＢ２タンパク質を用いる、タンパク質捕捉のための近年開発された戦略である３６。２つの断片が一緒になると、分子間イソペプチド結合の形成を触媒する。完全に遺伝子的にコード可能な構成要素を用いてｃｕｒｌｉネットワークとより大きなタンパク質との間の共有結合形成を可能にすることにより、ｃｕｒｌｉ搬出機構の見かけのサイズの制限を回避するために、この戦略を用いた。そこで、ＣｓｇＡを過剰生産するように改変したＥ．ｃｏｌｉ株であるＰＨＬ６２８細胞を用いて、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇキメラを含むを提示するバイオフィルムを表面修飾ガラス基質上に形成した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を用いてＳｐｙＴａｇドメインの存在及び機能性を調べた。Ｖｅｎｕｓは、光学的性質が強化された緑色蛍光タンパク質バリアントである。細胞の存在を調べるために、ガラスに固定化されたバイオフィルムを核酸染色（ＳＹＴＯ  ６１、インビトロジェン社）で処理した。その後、ＳｐｙＣａｔｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ又は共有結合形成しない変異体であるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＥＱ−Ｖｅｎｕｓのいずれかを含む溶液で処理した。徹底的な洗浄ステップ後、蛍光顕微鏡法を用いてバイオフィルムをイメージングした。ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するバイオフィルム及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ処理の適切な組合せでのみ、２つの蛍光シグナルが顕著に共局在した。（図６Ｆ）。ｗｔ−ＣｓｇＡを発現するバイオフィルムは蛍光タンパク質を捕捉できなかった。同様に、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するバイオフィルムは、非機能性ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＥＱ−Ｖｅｎｕｓ変異体で処理された時には緑色蛍光を示さなかった。総合すると、これらの結果は、ＳｐｙＴａｇペプチドをＣｓｇＡに融合させることができること及びＳｐｙＴａｇペプチドがｃｕｒｌｉネットワーク形成後に機能を維持していることを示している。
【０１５３】
考察
【０１５４】
本明細書が示す単純明快な自己組織化システムは、遺伝子改変により細菌細胞外マトリックス組成物の正確な分子的調節を可能にし、生きたシステムから機能性バイオナノ材料を作製するための、更にはおそらく生きた機能性材料を作製するためのプラットフォームを確立する。そのような合成生物学プラットフォームには多くの利点がある：無機材料への結合又は無機材料の合成のバイオテンプレーティング、特定の表面へのバイオフィルム接着の強化、又は他の生体分子を固定化するためのスキャフォールド様表面コーティングの提供等の有用な特徴を有する種々のペプチドを提示するようにｃｕｒｌｉ線毛を改変することができる。バイオフィルム自体は、生合成的に作製され、石油由来の構成原材料（ｒａｗ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を必要としない点で、「グリーンな」（すなわち、環境に優しい）材料である。更に、バイオフィルムは、自己生成的及び自己修復的な再生可能材料となり得る。
【０１５５】
表面修飾及び機能化は我々の社会のほぼ全ての状況でいたるところにおいて見られる。しかし、生物学的に由来する表面コーティングは使用されていない。生命は、表面の細菌コロニー形成を可能にする初期の進化上の適応である非常に効率的なコーティング戦略を進化させてきた４１。応用技術へのバイオフィルムの現在の応用では、薄膜生体触媒又はバイオレメディエーションのための所望の機能を生成するために天然のバイオフィルム又はバイオフィルム形成細菌の共培養物が用いられる４２。バイオフィルムの機能性をプログラムできないこと及びバイオフィルム形成の時間的力学（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を調節できないことにより、これらの応用は限定的なままであり、他の産業におけるバイオフィルムに基づく技術の採用は大きく妨げられている。
【０１５６】
Ｅ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステムは、腸管病原性株の宿主−細胞接着において中心的役割を果たし、バイオフィルムの形成に重要である２５。Ｃｕｒｌｉは、バイオフィルム阻害化合物の開発のため４３及び機能性細菌アミロイドのため１８のモデルシステムとして広く研究されてきた。本明細書中で、ｃｕｒｌｉシステムは、単一の遺伝子的にプログラム可能な単位である自己組織化ＣｓｇＡタンパク質で主に構成されるので、プログラム可能なバイオフィルムプラットフォームであり得ることが示される。
【０１５７】
材料及び方法
【０１５８】
細胞株及びプラスミド。全てのクローニング及びタンパク質発現は、それぞれＭａｃｈ１（インビトロジェン社）及びＲｏｓｅｔｔａ細胞（ＥＭＤ社）中で行われた。ｃｓｇＡ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２ゲノムＤＮＡから単離され、Ｔｒｃプロモーターの調節下にあるＣｏｌＥ１プラスミドであるｐＢｂＥ１ａ４４にクローニングされた。ｐＥＴ３０ａプラスミド（ＥＭＤ社）を用い、ＣｓｇＡタンパク質の天然Ｎ２２領域をエンテロキナーゼ切断部位の直後にクローニングして発現ベクターを構築した。ペプチドインサート領域は、完全に合成されたか（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社）、オーバーラップエクステンションによりＰＣＲで生成された。全てのクローニングは、報告されているように等温ギブソン・アセンブリー４５を用いて行われ、ＤＮＡシークエンシングにより確認された。
【０１５９】
Ｃｕｒｌｉバイオフィルム形成。ｃｕｒｌｉを生成するために、ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−ペプチド融合体をコードするｐＢｂＥ１ａプラスミドでＬＳＲ１０細胞又はＰＨＬ６２８細胞を形質転換した。陰性対照として、空のｐＢｂＥ１ａプラスミドで細胞を形質転換した。その後、１０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び２０ｇ／Ｌの寒天を含むＹＥＳＣＡ−ＣＲプレート上に細胞を画線又はスポットした。全ての培地成分はフィッシャー社製である。プレートには１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン、０．５ｍＭのＩＰＴＧ、２５ｍｇ／ｍＬのコンゴーレッド、及び５ｍｇ／ｍＬのブリリアントブルーＧ２５０を補った。その後、プレートを２５℃で４８時間インキュベートし、次いで、イメージングしてコンゴーレッド結合の程度を決定した。スポットしたプレートでは、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートに２０ｍＬをスポットする前に、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．２ｍＭのＩＰＴＧを補ったＹＥＳＣＡ液体培地中で２５℃にて４８時間形質転換体を成長させた。この同じＹＥＳＣＡ液体誘導手順を用いてＣｓｇＡ精製及び電子顕微鏡観察のためのサンプルを調製した。
【０１６０】
定量的コンゴーレッド結合アッセイ。コンゴーレッド結合の測定は、以前に公開されている方法を改変して行った。簡潔に述べると、ＹＥＳＣＡプレート上で２５℃で４８時間成長させた形質転換体培養物を掻き取り、ＰＢＳ中に穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液のＯＤ６００を３に調整した。この懸濁液１ｍＬに、コンゴーレッド溶液を終濃度０．００１％で加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をペレット化し、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１マイクロプレートリーダーを用いて上清２００μＬの４９０ｎｍの吸光度を測定した。この測定値からＰＢＳ＋コンゴーレッド対照を引いた量としてコンゴーレッド結合の量を求めた。全てのサンプルはトリプリケートで行った。
【０１６１】
キメラＣｓｇＡ精製。Ｒｏｓｅｔｔａ細胞形質転換体を対数増殖期中期までＬＢ中で成長させ、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導した。細胞をペレット化した後、その後の精製のために−２０℃で凍結した。ペレットを解凍し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商標；ＥＭＤ社）、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、５０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ、及びプロテアーゼ阻害剤（ロシュ社）中で溶解した。３０分後、溶解物を、８塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ  ＴｒｉｓのｐＨ７．５の溶液中に希釈し、１６時間インキュベートして凝集体を溶解した。不溶性の塊を１８，０００ｒｐｍで３０分の遠心によりペレット化し、清澄化した溶解物を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社）と２時間インキュベートした。その後、タンパク質が結合した樹脂を８塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄し、２００ｍＭイミジアゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）を補った同じバッファーで溶離させた。溶出液をＥＫ切断バッファー（１Ｍ尿素、２０ｍＭメチルアミン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中に透析した後、３μｇのエンテロキナーゼ（ロシュ社）と２４時間インキュベートした。その後、切断されたＣｓｇＡタンパク質を凍結乾燥し、１００μＬのＨＦＩＰで処理して全てのｃｕｒｌｉ線毛を溶解し、乾燥粉末として保存した。
【０１６２】
ＴｈＴ動態アッセイ。ＴｈＴアッセイの直前に、切断されたＨＦＩＰ処理タンパク質を８Ｍ塩酸グアニジン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び５０ｍＭ  ＴｒｉｓにｐＨ７．５で再度可溶化した。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５ゲル濾過カラム上でＦＰＬＣ精製して二量体及びオリゴマーを除去した。その後、単量体ＣｓｇＡ融合体を含む画分を脱塩し、ＵＶの吸光度により濃度を決定した。すぐに、３０μＭのＣｓｇＡ融合体又は野生型タンパク質及び４０μＭ  ＴｈＴを用いてＴｈＴアッセイを行った。蛍光はＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２プレートリーダーを用いて４３８ｅｘ／４９５ｅｍで測定された。
【０１６３】
ＴＥＭ及びＳＥＭ。Ｃｕｒｌｉ形成した野生型又はＢＩＮＤ細胞サンプルを、誘導したＹＥＳＣＡ培養物から直接取り出すか、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートから掻き取り、ミリポアＨ２Ｏに再懸濁した。ＴＥＭ分析では、５ｍＬのサンプルをフォルムバール−カーボングリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上にスポットし、ミリポアＨ２Ｏで２回洗浄し、１％ウラニルホルマートで１５秒間染色した後、ＪＥＯＬ  １２００  ＴＥＭを用いて分析した。ＳＥＭ分析では、サンプルをＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターに減圧下でアプライし、ミリポアＨ２Ｏで洗浄し、２％グルタルアルデヒド＋２％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定した。その後、サンプルをミリポアＨ２Ｏで洗浄し増加エタノールステップグラジエントで脱水し、ヘキサメチルジシラザンのステップグラジエントを用いて乾燥させた後、金スパッタリングし、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ  ＦＥ−ＳＥＭを用いて分析した。
【０１６４】
免疫金ＴＥＭ。ＦＬＡＧタグを提示するＢＩＮＤ細胞の抗ＦＬＡＧ免疫金標識のために、前述したように最初に細胞をＴＥＭグリッドに接着させた。その後、グリッドをブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で３回洗浄し、一次抗ＦＬＡＧマウス抗体とＰＢＳの１：１０００希釈物を含む液滴上にＸＸ分浮かせ、ブロッキングバッファーで再度洗浄した後、１：１０００希釈された抗マウス１５ｎｍ金コンジュゲート抗体の液滴上に浮かせた。最後にＰＢＳで３回、次いでミリポアＨ２Ｏで洗浄した後、１％ウラニルホルマートで１５秒間グリッドを染色し、ＪＥＯＬ  １２００（商標）  ＴＥＭを用いてイメージングした。
【０１６５】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓの構築及び発現。ｐＤＥＳＴ１４−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを含むＲｏｓｅｔｔａ細胞を、ＬＢ中３７℃で、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと共に５ｍＬの培養液中で一晩成長させた。アンピシリンを補った５００ｍＬ培養液に一晩の培養物を接種し、ＯＤが０．６になるまで３７℃で６時間成長させた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８℃で一晩発現させた。細胞を回収及び溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムでＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを精製した。タンパク質を回収し、バッファーを５０ｍＭリン酸バッファー５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に交換し、濃縮し、その後の使用まで−８０℃で保存した。
【０１６６】
蛍光バイオフィルムイメージング。Ｌｅｉｃａ  ＴＩＲＦ  ＤＭ１６０００Ｂ（商標）機器を用いて落射蛍光モードで蛍光画像を撮った。ガラス製カバースリップ（Ｎｏ：１．５）をそれぞれ３０秒プラズマ活性化した。スライドを０．０１ｗ／ｖ％のＰＬＬ溶液に２時間浸漬した後、６０℃のインキュベーター中に２時間置いた。ＰＨＬ６２８  ＷＴ及びＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ（ＳＴ）細胞を２０ｍＬの培養液中で、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＹＥＳＣＡブロス中で３７℃、６時間、ＯＤが０．６になるまで成長させた。カバースリップを培養液中に落とし、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ及び３％ＤＭＳＯを用いてｃｕｒｌｉ発現及びバイオフィルム形成を誘導した。培養液を２５℃、１５０ｒｐｍで４８時間振盪した。スライドを培養液から取り出し、洗浄バッファー（１×ＰＢＳ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で２０分間の洗浄を３回行った。洗浄後、０．５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ  Ｖｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又はＶｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＱ）溶液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ）をスライドに添加した。バイオフィルムを１時間インキュベートした後、洗浄バッファーで２０分間の洗浄を２回行った。その後、バイオフィルムをＳｙｔｏ  ６１（１０μＭ）で２０分間染色し、洗浄バッファーで２×１５分間、１５０ｒｐｍで振盪しながら洗浄した。その後、６０倍及び１００倍の油浸レンズを用いて落射蛍光モードでスライドをイメージングした。
【０１６７】
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【０１６８】
実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムのＣｕｒｌｉ線毛上へのオルトゴナル（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）酵素固定化
【０１６９】
バイオフィルムは厳しい条件に耐えられ、表面に自然に付着し、スケーラブルであるので、触媒作用にバイオフィルムを用いることが望ましい。しかし、細胞膜を横切る基質の物質輸送が必要であるため、バイオフィルムを用いたホールセル触媒作用には制限がある。細菌表面上の酵素提示は、酵素を膜貫通タンパク質又は表面提示タンパク質と共発現させる必要があること及び細菌の表面積が限定されていることから、限定的な成功しか収めていない。バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ（ＢＩＮＤ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムの細胞外マトリックスに共有結合的及び部位特異的にオルトゴナル酵素を付着させるための本明細書に記載のプラットフォームが開発された。付着ドメインＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させたαアミラーゼを、捕捉ドメインＳｐｙＴａｇを有するｃｕｒｌｉ線毛を提示するＥ．ｃｏｌｉバイオフィルム上に固定化した。本明細書中に、バイオフィルムが遊離酵素と比べて酵素を厳しいｐＨ条件から保護したことが示されている。更に、バイオフィルムは、非混和性有機溶媒中での変性から固定化αアミラーゼを保護した。多用途の調節可能な生体触媒表面を作製するためのＥ．ｃｏｌｉの細胞外重合体マトリックスを用いる新規な方法が本明細書に記載される。
【０１７０】
生体触媒作用は、複雑な化学的変換をスケーラブルに行うことができ２、化学合成に代わる環境に優しい代替１を提供する。生体触媒の主な種類はホールセル改変微生物３、細胞溶解物、又は精製酵素４である。自然は、大きく複雑な分子の立体選択的中間体を生み出す触媒作用を行うことができるように酵素を進化させており、これは合成化学分野が未だ再現しようと試みている偉業である。更に、ホールセル触媒作用では、複数酵素経路により、グルコース等の簡単なインプット分子が価値の高い生成物へと変換される５。
【０１７１】
これらの生体触媒には利点があるが、それらはそれぞれに欠点もある。ホールセル触媒は、基質の水への溶解度６、細胞膜を横切る基質又は生成物の拡散障害による物質輸送の制限７、及び副産物又は副反応の発生４のため、それらが触媒できる反応の種類が制限される。細胞は固定化されていないので、生成物を単離するために反応混合物から細胞を分離しなければならない。固定化酵素は物質輸送又は単離の問題はないが、大規模に酵素を精製するにはコストが大きく８、精製９又は固定化プロセスが酵素の活性に悪影響を及ぼし得る。精製酵素は一般的に不安定であるため、しばしば、大規模な応用に用いられる場合、多孔質表面に固定化されるが、これは触媒のコストを上昇させる１０。水性溶媒中への基質不溶性の問題に取り組むために二相の水システムが開発されたが、これらのシステムは、細胞毒性、有機溶媒への長時間の暴露による生体触媒の不活性化、及び激しい混合による剪断に由来する触媒の変性という問題に直面している１１。
【０１７２】
バイオフィルムは、互いに及び／又は表面若しくは界面に接着したマトリックスに封入された細菌である１２。バイオフィルム中の細菌は毒性化学物質１３、金属１４、及び物理的ストレス１５からの保護を提供する細胞外重合体マトリックスを分泌するので、これらはホールセル触媒作用に伝統的に用いられるようなプランクトン細胞にはない多くの利点を有する。同時に、これらは、自然の生物学的環境中で必要な酵素の安定化８、再生可能性、及び改変により活性を調節できることを含むホールセル触媒の利点を保持している。
【０１７３】
現在の表面提示技術は、２つ以上の酵素及び酵素複合体を共提示することの困難性、及び細菌の有限な表面積による提示される酵素数の制限等により、大きく制限を受ける。
【０１７４】
現在の技術的制限に取り組むための新規なバイオフィルム固定化プラットフォームであるバイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ（ＢＩＮＤ）を本明細書に記載する。ＢＩＮＤはＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムのタンパク質性構成要素ｃｕｒｌｉ線毛を機能性ペプチドで修飾する。ｃｕｒｌｉ生合成中、ｃｕｒｌｉモノマーＣｓｇＡが、外膜輸送されたＣｓｇＧを介して分泌され、膜貫通タンパク質ＣｓｇＢ上に固定され、その後、直径約７ｎｍのアミロイド繊維へと自己組織化する１７。複数のＣｓｇＡ−機能性ペプチドキメラをｃｕｒｌｉ発現経路を介して分泌させることができる。このＣｓｇＡ−ペプチドがｃｕｒｌｉ線毛へと組織化する時、ペプチドは、線毛を修飾するため、金属、ナノ粒子を捕捉するため、又は接着のために用いることができる機能的ハンドルとなる１８。ＢＩＮＤは、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルム細胞外マトリックスの巨大且つ不活性な重合体ネットワークを固定化表面に変換することによる触媒的表面の作製を可能にする。反応の基質及び生成物はどの膜も通過する必要がないので、このアプローチは生体触媒の物質輸送の問題を解決する。
【０１７５】
Ｒｅｍａｕｔのグループの発現系は、より本来的な構造を有するタンパク質、例えば、ＣｓｇＧの内径（約２．５ｎｍ）より大きなループを形成するジスルフィド結合を含むタンパク質について制限がある１９。本明細書に記載の研究は、ｃｕｒｌｉ線毛上にタンパク質を提示するためのより一般化可能な方法を提供するものである。その結果、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇシステムが用いられた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、１４アミノ酸ＳｐｙＴａｇとのイソペプチド結合の形成を触媒する２０。以前に示されているように、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇは、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとのコンジュゲーションにアクセス可能な、ほぼ天然のｃｕｒｌｉ線毛へと組織化する１８。
【０１７６】
本明細書中で、大きな酵素、αアミラーゼをＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムのｃｕｒｌｉ線毛上に固定化するためにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇシステムを用いることができることが示されている（図８Ａ〜８Ｄ）。この反応は強く、複雑な混合物中でも、２つの構成要素間の部位特異的付着を形成することができる。フィルター−プレートアッセイを用いてバイオフィルム上での酵素の活性を特徴付け、細胞の代謝活性が失われている場合でも、様々なｐＨ及び有機溶媒インキュベーション条件下でαアミラーゼ活性が保持されていることが示された。
【０１７７】
材料及び方法
【０１７８】
細胞株及びプラスミド。全てのクローニング及びタンパク質発現は、それぞれＭａｃｈ１（商標）（インビトロジェン社）及びＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞（ＥＭＤ社）中で行われた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｓｇＡ及びｃｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇ遺伝子を、以前に報告されているように、Ｔｒｃプロモーター調節下にあるＣｏｌＥ１プラスミドであるｐＢｂＥ１ａにクローニングした。１０ｇ／Ｌのカザミノ酸（フィッシャー社、ＢＰ１４２４）、１ｇ／Ｌの酵母抽出物（フィッシャー社、ＢＰ１４２２）を含むＹＥＳＣＡ培地中でＣｓｇＡを発現させた。αアミラーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０から単離された。ｐＤＥＳＴ１４中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ遺伝子はＡｄｄＧｅｎｅ（３５０４４）から取得した。アミラーゼをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端に挿入し、コンストラクトをｐＥＴ２８ｂベクターに移し、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（シグマ社  Ｔ０９１８）中で成長させたＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞中で発現させた。ｃｓｇＡ欠失変異体はＰＨＬ６２８−ΔｃｓｇＡ（ＭＧ１６５５  ｍａｌＡ−Ｋａｎ  ｏｍｐＲ２３４  ΔｃｓｇＡ）とした。Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ４０００（商標）を用いて細胞を溶解した。ミリポア社製ＰＣＦ及び親水性ＰＴＦＥフィルタープレート（ＰＣＦＭＳＳＬＢＰＣ１０、ＭＳＲＬＮ０４１０）及びＭｉｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）バキュームマニホールドセットアップをフィルタープレートアッセイに用いた。アミラーゼ活性については、４−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−マルトペンタオシド（ｐＮＰＭＰ、シグマ社、６６０６８−３８−０）を基質として用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のαアミラーゼ（シグマ社、Ａ３４０３）を標準として用いた。
【０１７９】
Ｃｕｒｌｉ発現。各実験の前にＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−ＳＴ融合体をコードするｐＢｂＥ１ａプラスミドでＰＨＬ６２８細胞を形質転換した。その後、１０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び１５ｇ／Ｌの寒天を含むＹＥＳＣＡプレートに細胞を画線した。プレートには１００ｇ／ｍＬのアンピシリンを補った。アンピシリンを含むＹＥＳＣＡ中で、３０℃でＯＤが０．４〜０．６になるまでＰＨＬ６２８細胞を成長させた。０．３ｍＭ  ＩＰＴＧでＣｕｒｌｉ発現を誘導した。培養物を２５℃及び１５０ｒｐｍで１８時間２４時間振盪した。
【０１８０】
定量的コンゴーレッド（ＣＲ）結合アッセイ。コンゴーレッド（ＣＲ）結合の測定は、以前に公開されている方法を改変して行った。簡潔に述べると、ＹＥＳＣＡ中で成長させた１ｍＬの誘導された培養物を５０００ｇで１０分間ペレット化し、ＰＢＳに穏やかに再懸濁した。１５０μＬの０．２ｍＭコンゴーレッド水溶液をこれに加え、２５℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞を２１０００ｇでペレット化し、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１マイクロプレートリーダーを用いて上清２００μＬの４９０ｎｍの吸光度を測定した。この測定値からＰＢＳ＋コンゴーレッド対照を引いた量としてコンゴーレッド結合の量を求めた。標準曲線を用いてコンゴーレッドの吸光度を濃度に変換した。
【０１８１】
アミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ発現。ｐＥＴ２８ｂアミラーゼ−Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒを含むＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンと共に、３０℃、ＬＢ中で５ｍＬの一晩培養物中で成長させた。１Ｌのｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈにカナマイシンを１００ｍｇ／Ｌまで補って、一晩の培養物を接種し、ＯＤが０．４になるまで３０℃で５時間成長させた。アミラーゼＳＣ発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、２０℃で一晩発現させた。細胞を回収し、ＴＢＳＴ中で溶解し、アミラーゼＳＣをＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した。タンパク質を回収し、バッファーをＰＢＳに交換し、１日以内に実験に用いた。
【０１８２】
ＣｓｇＡコンジュゲーションゲル。ＰＨＬ６２８  ＷＴ及びＳＴの種培養（ｓｔａｒｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ中で一晩（ＯＮ）成長させた。種培養物を用いて５０ｍＬの細菌を成長させ、ＯＤ０．６でｃｕｒｌｉ生成を誘導した。細胞にｃｕｒｌｉを２４時間発現させた。細胞を４７００ｇで１０分間遠心沈殿（ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）し、上清を捨てた。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む３ｍＬのＰＢＳに再度溶解した。プローブソニケーターを１５Ｗで用いて５サイクル（１分オン、０．５分オフ）、細胞を超音波処理した。細胞を再度４７００ｇで１０分間遠心沈殿させた。１００μＬの上清を２１０００ｇで遠心沈殿させ、ＣＲアッセイを用いてｃｕｒｌｉの存在を確認した。残りの上清は、先に単離したアミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと一緒に２４時間インキュベートした。この溶液にＮａＣｌを２００μＭまで加え、溶液を２１０００ｇで１０分間遠心沈殿させた。上清を除去し、ペレットを１ｍＬのＨ２Ｏで１回洗浄し、再度、２１０００ｇで１０分間遠心沈殿させた。ｓｐｅｅｄ  ｖａｃを用いて別個のチューブ中でペレット及び上清を乾燥させた。残渣を１．５ｍＬのギ酸及び０．２ｍＬのＨＦＩＰに再度溶解し、ｃｕｒｌｉ線毛をモノマーへと分解し、溶媒を再度蒸発させた。残渣を、４Ｍ尿素を含むＬａｅｍｌｉバッファーに溶解し、５分間加熱し、７５Ｖで２時間ゲル上で流した。
【０１８３】
インビトロアミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ活性アッセイ。ｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−マルトペンタオシド（ｐＮＰＭＰ）を、この五糖由来の加水分解４−ニトロフェノール（ｐＮＰ）を４０５ｎｍでモニタリングできるので、アミラーゼ活性を測定するための基質として選択した。ｐＮＰの吸光度はプロトン化状態に依存するので、本発明者らは、全ての反応を９６ウェルプレートフォーマット中のｐＨ７．４のＰＢＳ中で行った。
【０１８４】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてアミラーゼＳＣ及びαアミラーゼ（シグマ社）の濃度を測定し、１．３５ｍＭに希釈した。８５μＬの０．０６５〜２ｍＭ  ｐＮＰＭＰを含むｄｄＨ２Ｏを、５０μｌのＰＢＳ中タンパク質に加えた。ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍ、一晩（ＯＮ）で活性を測定した。
【０１８５】
Ｃｕｒｌｉバイオフィルムフィルタープレートアッセイ。ＣｓｇＡ及びＣｓｇＡ−ＳＴ発現ＰＨＬ６２８細胞を上記と同様に２５℃、１５０ｒｐｍで１８時間培養した。定量的コンゴーレッド結合アッセイを用いてＣｕｒｌｉ含有量を測定した。５０〜１００μＬの細胞（ＣＲ吸収を基準に標準化）を、２〜４％のＢＳＡで１．５時間ブロッキングしたＰＴＦＥメンブレンフィルタープレートのミリポア社製ＰＣＦ上に移した。バキュームマニホールドを用いて培地を濾過した。細胞を２００μＬ  ＰＢＳで２回洗浄した。５０μＬの１〜２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のアミラーゼＳＣと共に細胞を一晩（ＯＮ）インキュベートした。真空濾過を用いて液体を除去し、１５０μＬの０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳで素早く３回、振盪しながら９０分間にわたり更に３回、バイオフィルムを洗浄した。
【０１８６】
水混和性溶媒中での活性アッセイでは、５０μＬの２×溶媒溶液（ＰＢＳ中）を、５０μＬの２．５ｍＭ  ｐＮＰＭＰ（Ｈ２Ｏ中）と共に加えた。プレートをデスクトップシェーカー上に室温で１．５〜２時間置いた。実験の終わりに、上清を新しい９６ウェルプレート中に真空濾過し、４−ニトロフェノール遊離を４０５ｎｍで測定した。
【０１８７】
水非混和性溶媒中での活性アッセイでは、バイオフィルムを１００〜１５０μＬの溶媒と１時間インキュベートした。溶媒を除去し、細胞を１５０μＬの０．３％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で２回洗浄した。５０μＬのＰＢＳ及び５０μＬの２．５ｍＭ  ｐＮＰＭＰをバイオフィルムに加えた。プレートをデスクトップシェーカー上に室温で１．５時間置いた。実験の終わりに、新しい９６ウェルプレート中に上清を真空濾過し、ｐＮＰ遊離を４０５ｎｍで測定した。相対活性の基準はｐＨ７のＰＢＳ条件である。
【０１８８】
ＭＴＳアッセイ。プロメガ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒｅｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて細胞生存率を調べた。前述したように機能化バイオフィルムを作製した。バイオフィルムをｐＨ、混和性及び非混和性の有機溶媒に曝した後、バイオフィルムをＰＢＳで洗浄し、アッセイバッファーと１時間インキュベートし、濾過し、結果を４９０ｎｍで光学的に読み取った。相対代謝活性の基準はｐＨ７のＰＢＳ条件である。
【０１８９】
ＳＥＭ。ハーバード大学のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ＳｙｓｔｅｍｓでＺｅｉｓｓ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ  ＦＥＳＥＭを用いて走査型電子顕微鏡観察を行った。ＳＥＭイメージングのために、酵素結合バイオフィルムを２％グルテルアルデヒド  ４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定した後、水で２回洗浄した。フィルターメンブレンをフィルタープレートから脱離し、増加エタノールグラジエントで脱水し、臨界点乾燥機で乾燥した後、金スパッタリングし、ＦＥＳＥＭ上でイメージングした（作動電圧５ｋＶ）。
【０１９０】
共焦点顕微鏡観察。ＰＣＦプレートサンプル由来のアッセイした細胞及び固定された細胞の共焦点顕微鏡観察を行った。細胞をＤＡＰＩと２０分間インキュベートし、０．２％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で２時間にわたり４回洗浄した。ＰＣＦプレートからのメンブレンを切り取り、メンブレンを２つのカバースリップの間に置き、６３倍のグリセロールレンズを用いてＬｅｉｃａ  ＳＰ５  Ｘ  ＭＰ倒立共焦点顕微鏡でイメージングした。
【０１９１】
結果及び考察
【０１９２】
アミラーゼＳＣ安定性の特徴解析。重合体又は表面へのタンパク質の部位特異的な共有結合性の付着を可能にする現在用いられている方法は非常に少ない。これらは通常、翻訳後修飾、又は非天然アミノ酸を介したオルトゴナルな化学単位の導入を含む２１。本明細書に記載のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ技術は、生物学的に適合する反応条件で完全に遺伝子的に改変可能な構成要素を用いて共有結合性の翻訳後修飾を導入する点でユニークである。ＣｓｇＡ分泌機構（すなわち、搬出されたＣｓｇＧ）は大きな構造タンパク質に対する許容度が低いことが示されているので１９、ＣｓｇＡモノマーに直接酵素を融合させるよりも、ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ技術を選択した。
【０１９３】
広い用途、産業上の応用可能性、及び水溶性比色基質の商業的な入手し易さから、触媒性バイオフィルムの実証実験にαアミラーゼを用いた。複数のタンパク質（Ｉ２７ドメイン、ＭＢＰ、ＧＦＰ）がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへの付着に成功しているが２０、機能性酵素−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合体の作製が可能であることは過去に示されていない。２つのタンパク質を融合する時、融合されたドメインによる不安定化又は活性部位のブロッキングにより酵素の活性が減少するという問題がある。本発明者らは、アミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒコンストラクトをデザインする際、２つのタンパク質間に１３アミノ酸リンカーを含めてそのような不安定化の影響の軽減を試みた。
【０１９４】
アミラーゼＳＣの安定性を調べるために、アミラーゼＳＣ活性を６４日間にわたり、８０℃までの温度範囲で調べた。６４日に集められた活性データに見られるように、３７℃でも、αアミラーゼは活性を１３％しか失っておらず、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに付着させた場合でも、その活性低下は３０％と依然として比較的小さい。より広い温度範囲で見ると、アミラーゼＳＣは６０℃を超えた場合のみ、αアミラーゼより速く活性を失った（図１４Ｂ）。ほとんどの細胞ベースの応用の通常の作動範囲は６０℃より低いので、適切な温度で２つの酵素は同じように機能すると結論付けることができる。
【０１９５】
αアミラーゼをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに付着させることの活性への影響を決定するために、アミラーゼＳＣの動態研究をインビトロで行った。結果のミカエリスメンテン分析により、野生型αアミラーゼ及びアミラーゼ−ＳＣの間でＫｍ／ｋｃａｔ値がほぼ同じであることが示され（図１５Ａ〜１５Ｂ）、このことは融合タンパク質が野生型と同じ効率で反応を触媒できることを意味する。
【０１９６】
インビトロにおけるＳｐｙＴａｇ発現ｃｕｒｌｉ線毛へのアミラーゼＳＣの付着。アミラーゼＳＣがｃｕｒｌｉ線毛に付着できるためには、ＳｐｙＴａｇペプチドがアクセス可能でなければならない。バイオフィルム中では、このペプチドは、表面、他の細菌、他のタンパク質、又は近くのＳｐｙＴａｇペプチドとｃｕｒｌｉとの相互作用によってブロックされ得る。更に、酵素の大規模な精製は費用と時間がかかるので２２、複雑な混合物からの酵素の付着が固定化プラットフォームにとって望ましい性質である。
【０１９７】
ｃｕｒｌｉ線毛が組織化されつつ、適当な複雑な混合物中でアミラーゼＳＣがＣｓｇＡ−ＳＴに付着できることを示すために、アミラーゼＳＣを粗精製ｃｕｒｌｉ線毛とインキュベートし、変性ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルを用いて、結合したタンパク質を可視化した。８Ｍ尿素及びギ酸の使用を含む厳しいサンプル調製条件のため、全ての非特異的結合タンパク質が破壊され、共有結合した実体だけが１つのバンドとして流れると考えられる。ゲルのレーン１及び２（図９）に見られるように、約９０ｋＤａのバンド（ＣｓｇＡ−ＳＴ＋アミラーゼＳＣの合わせた重量）が、ＣｓｇＡ−ＳＴコンジュゲーション反応沈殿物で見られるが、ＣｓｇＡ野生型サンプルでは見られず、これはＣｓｇＡ−ＳＴへのアミラーゼＳＣの共有結合性コンジュゲーションを示している。コンジュゲートしなかったアミラーゼＳＣが可溶性画分に見られる。
【０１９８】
バイオフィルム上へのアミラーゼＳＣ固定化。９６ウェルフィルタープレートセットアップを用いて機能性バイオフィルムの触媒可能性を試験した。細胞を培養中で成長させ、ｃｕｒｌｉを１８時間発現させた後、９６ウェルフィルタープレートに移した。その後、バイオフィルムをアミラーゼＳＣで２４時間機能化し、ｐＮＰＭＰと反応させた。望ましい反応時間後、溶液を別の９６ウェルプレート中に濾過し、ｐＮＰの加水分解について分析した。
【０１９９】
バイオフィルムがフィルター上で細胞の単層又は２重層で構成されるように細胞の播種密度を選択した。これらの実験で用いたＭＧ１６５５  ΔｃｓｇＡ  ｏｍｐＲ２３４細胞はｃｕｒｌｉ及びセルロースの両方をその細胞外マトリックス中に発現して、大量の細胞外物質を生じ、上記細胞密度より高い密度ではこれによってフィルターがブロックされるので、この細胞密度が望ましかった。ＤＡＰＩで染色したバイオフィルムの共焦点蛍光画像を図１０Ａ〜１０Ｂに示す。図に見られるように、細胞は細胞外物質の厚いマット（ｍａｔｔｅ）で囲まれている。真空濾過による繊維の圧縮のため、画像上でｃｕｒｌｉとセルロースを区別するのは難しいが、細胞外マトリックスが大きなアクセス可能な表面積を形成していることは明らかである。このマトリックスはＳＥＭ画像上で中実（ｓｏｌｉｄ）に見えるが（非掲載データ）、ＳＥＭイメージングの前に同じサンプルにＤＡＰＩ染色を行い、小分子が通り抜けられることが示されたので、これは実際には多孔性である可能性が最も高い。
【０２００】
次に、バイオフィルム上で利用可能なＳｐｙＴａｇ部位を飽和させるアミラーゼＳＣの量を決定することを試みた。およそ４×１０７細胞のバイオフィルムを２０〜１５００ｐｍｏｌのアミラーゼＳＣとインキュベートし、バイオフィルム上の酵素の活性を測定した。図１１Ａに示されているように、インキュベーションバッファー中およそ２５０ｐｍｏｌ超のアミラーゼＳＣでバイオフィルムの最大活性に達している。これはバイオフィルムに実際に付着したアミラーゼＳＣの量を正確に反映していないことに留意することが重要であり、２０ｐｍｏｌの酵素でも、酵素のほとんどは反応液上清中に観察される（非掲載データ）。２０ｐｍｏｌのインキュベーション濃度で飽和シグナルとなっていると見るのではなく、正規の結合曲線が観察される理由は酵素拡散の制限によるものであると仮定する。すなわち、バイオフィルムはウェル全体に分布しているのではなく、９６ウェルプレートの底に位置しているので、インキュベーション時間内にアミラーゼＳＣの全てが結合に適したＣｓｇＡ−ＳＴを見つけられるわけではない。本稿の残りの実験では、部位の飽和を確実にするためにバイオフィルムを７５０ｐｍｏｌのアミラーゼＳＣとインキュベートした。
【０２０１】
ウェル当たりの細胞の量とバイオフィルムの活性との関係から、細胞数とアミラーゼＳＣの固定化に利用可能なｃｕｒｌｉの量との関係についての情報が得られる。バイオフィルムが厚い程、栄養素、抗生物質等の分子が底の細胞層に到達できる程度が低くなる１２、２３。これはプランクトン様細菌と比べて重要な進化上の利点を有するバイオフィルムを提供するが、本触媒システムの場合、バイオフィルムの厚さとアミラーゼＳＣが可能なコンジュゲーション部位に到達する能力及びアミラーゼ基質が触媒部位に到達できる能力との間に不可避なトレードオフがある。図１１Ｂは、バイオフィルムの活性が８×１０６ＣＦＵから７×１０７ＣＦＵ／ウェルの間で直線状に増加することを示している（上限はフィルターの詰まりによる）。これは、各細胞数増加に伴い付加されるｃｕｒｌｉが、その前にバイオフィルム中で見られたｃｕｒｌｉと同じ程度にアクセス可能であることを示している。線形回帰を用いると、この範囲でバイオフィルムに細胞１０７個が加わる毎に、本システム中で追加で４．６ｎｍｏｌ又は３．７％の総ｐＮＰＭＰが加水分解される。この数は、フィルターが常に振盪された場合又はフローシステムで使用された場合、更に高くなるだろう。
【０２０２】
種々のｐＨ下におけるバイオフィルム上でのアミラーゼＳＣ活性。酵素上の荷電残基のイオン化の変化は、タンパク質を部分的にアンフォールディングし、及び／又は活性部位を不安定化することにより、酵素の活性を乱し得る２４。ｃｕｒｌｉ線毛上に固定された酵素は、細胞、ｃｕｒｌｉ線毛、及び他の近くのタンパク質上のイオン化可能な基により生じる緩衝作用により、極端なｐＨによる活性減少をより受けにくいという仮説を立てた。
【０２０３】
ｐＨの関数としての酵素の活性をｐＨ２〜１２で測定した。この範囲は、αアミラーゼがｐＨ４及び１０付近で活性を失うことが以前に示されていること２５から選択された。図１２Ａに示されているように、バイオフィルムに付着させたアミラーゼＳＣはｐＨ４及び１０では１００％活性に近いが、これらの条件下で、溶液中のαアミラーゼはそれらのｐＨで活性の４０％を失っている。溶液相も固定化された酵素も、ｐＨ３未満又はｐＨ１１超では活性を示さず、このことは、固定化アミラーゼＳＣの周りの環境が部分的に緩衝されていることを示唆している。αアミラーゼほど安定でない酵素では、これらのバイオフィルムの保護効果は更により顕著であり得る。
【０２０４】
ｃｕｒｌｉ線毛上のアミラーゼＳＣと同じｐＨの影響が内部酵素活性に対しても観察可能であるかどうかを決定するためにバイオフィルムの代謝活性を調べた。図１２Ｂは、ｐＨ２及びｐＨ１２を除く全てのｐＨでバイオフィルムが代謝活性を有することを示している。ｐＨ７（標準化のｐＨ）よりｐＨ３〜６でより活性が高いのは、より低いｐＨによる細胞へのストレスにより、細胞が最適以下の環境条件を軽減しようとして代謝活性が上がる結果である可能性が最も高い。細胞内の酵素は細胞外マトリックス上の酵素よりも変性から保護されているので、ホールセルでｐＨ耐性がより高いのは妥当である。
【０２０５】
有機溶媒中におけるバイオフィルム上のアミラーゼＳＣ活性。触媒バイオフィルムの使用を成功させるためには、バイオフィルムが細菌の成長又は酵素の安定性に通常有利でない条件に耐えられる必要があると考えられる。この主な理由の１つは、多くの小分子酵素基質は水に溶解できないということである。この問題を回避しようとして、多孔質スキャフォールド上に酵素を固定化した後の有機溶媒中での使用２６〜２８、二相の水−有機系（ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）の使用２９、３０等の複数の方法が開発されている。これらのどちらの場合でも、有機溶解性分子は、酵素が反応を触媒できる水相に短時間入り、その後、有機相に再度出る。
【０２０６】
これらの二相の水−有機系同様、疎水性溶媒に曝された時、バイオフィルムは水和したままであり、酵素の周りに保護的シェルを提供すると仮説を立てた。これを試験するために、バイオフィルムを、水に混和性及び非混和性の有機溶媒のパネルとインキュベートし、バイオフィルムの活性及び生存率を調べた。ｐＮＰＭＰは水以外の溶媒に可溶性でないので、非混和性溶媒では、バイオフィルムを有機溶媒とインキュベートした後、活性測定中、溶媒をＰＢＳに交換した。図１３Ａに示されているように、アミラーゼＳＣの相対活性は、非混和性溶媒とのインキュベーションによりほんのわずかに影響を受けているが、混和性溶媒中では完全に消失している。
【０２０７】
疎水性の尺度である分配係数は、Ｓ字曲線的に生物活性と相関する３１。一般的に、水混和性溶媒はｌｏｇＰ＜０であり、０〜２のｌｏｇＰは極性有機化合物に対応し、ｌｏｇＰ＞２は主に非極性の化合物に対応する。ホールセル触媒では、２のｌｏｇＰが活性に必要である。分配係数に対してプロットした結果は、バイオフィルムをｌｏｇＰ＞０の溶媒中でインキュベートした時に酵素活性が保存され、ｌｏｇＰ＞２の溶媒ではほぼ１００％の活性が保持され、一方、ホールセル触媒では、ｌｏｇＰが０．６〜０．８の溶媒中で７０〜９０％の活性が保持されることを示している。これは、本システムのユニークな特徴であり、有機合成におけるこのバイオフィルムプラットフォームのより幅広い使用可能性を示している。
【０２０８】
アミラーゼＳＣが混和性有機溶媒に耐えられる限界があったのかを調べるために、１０〜５０％アセトニトリル、ジオキサン、ＤＭＦ、及びＤＭＳＯ中における活性を調べた（図１３Ｃ）。１０％溶媒中でも、バイオフィルムは活性の３０〜６０％を失い、５０％までにはほぼ全ての活性を失った。試験した溶媒の中で、ＤＭＳＯで活性の減少が最も少なかった。
【０２０９】
種々の生体触媒的応用へのＢＩＮＤ技術の有用性を理解するために、細胞自体が触媒と同時に生きたままでいることができるかどうかを知ることが重要である。有機溶媒中で細胞が死んだ場合、細胞がｃｕｒｌｉネットワーク及び酵素の両方を合成するようにプログラムされている場合に、細胞はそれらを再生することができない。この場合、ｃｕｒｌｉは、多数の付着ドメインを有すること以外は合成重合体システムと同様な高表面積重合体として機能する。細胞が生き続けられる場合、ｃｕｒｌｉ及び酵素の両方が再生され、それらの構成要素のいずれかの発現を外部から調節できる、組込み型の再生可能なシステムを想像することができる。本システムがどのカテゴリーに属するかを理解するために、細胞の代謝活性を細胞生存率の尺度として調べた（図１３Ｄ）。最も疎水性の溶媒であるデカン（ｌｏｇＰ＝５．６）が、インキュベーション後に細胞が生き続けた唯一の有機溶媒であった。
【０２１０】
しかし、有機溶媒とインキュベートした後の細胞死はこのシステムの有益な特徴となり得る。バイオフィルムリアクターを使用する場合の主な課題の１つは、細菌の成長を調節することが困難なことである。一般的に、細菌はリアクターを詰まらせるまで成長し、全システムの浄化及びバイオフィルムの交換の必要を生じさせる２２。本システムでは、触媒を破壊することなく細菌を殺すのに有機溶媒を用いることができ、この問題を効果的に解決する。
【０２１１】
結論
【０２１２】
本明細書は、改変バイオフィルムの細胞外マトリックス上にオルトゴナル酵素を固定化するための新規なプラットフォームを示している。ＢＩＮＤ技術を用いて、機能的ハンドルを提示するバイオフィルムをＥ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉネットワーク上に作った。その後、ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ技術を用いてαアミラーゼをバイオフィルムに部位特異的にコンジュゲートさせた。
【０２１３】
ＢＩＮＤシステムの新規性は、環境に優しくない合成重合体のスケーラブルな代替である機能化可能な重合体表面を作製できることである。ほとんどのそのような重合体と異なり、ＣｓｇＡ−ＳＴを発現するｃｕｒｌｉ線毛は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの融合タンパク質として発現させた任意の酵素により容易に修飾できる機能的ハンドルを提示する。合成重合体上に提示された酵素同様、ＢＩＮＤを用いた酵素提示は、ホールセル触媒中での基質と酵素の結合における物質輸送の制限なしに、生きた表面上での生体触媒作用を可能にする。
【０２１４】
更に、ｃｕｒｌｉ線毛の合成から酵素−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質の発現まで、システムの全ての部分が遺伝子的に調節可能であるので、このシステムは多くの応用に高度に適応可能である。ＢＩＮＤプラットフォームの中核は固定化戦略であり、本明細書は更に、ＢＩＮＤを酵素の提示に用いることができ、この際に酵素が厳しい環境条件から保護されることを示している。医薬の合成及び分解等の応用のための合成中間体の触媒作用のために酵素を最適化することに多くの研究努力が置かれ、将来も置かれるであろう。ＢＩＮＤシステムにより、研究者はｃｕｒｌｉに付着させる酵素を簡単に交換することが可能になり、これらの新しい酵素をホールセル又はバイオフィルム触媒に組み込むために細菌を再改変する必要がなくなる。
【０２１５】
ＢＩＮＤシステムのもう１つの利点は、細胞の機能的状態が触媒作用と無関係であることである。ホールセルバイオフィルム触媒作用では、細胞のほんの一部だけが実際の触媒機能を果たしており２２、３２、残りの細胞は成長中であるか、不活性であるか、死んでいる可能性がある。更に、細胞の代謝活性はバイオフィルム成熟プロセス中にシフトするため、実験の存続期間中、活性が一定でない３３。ＢＩＮＤでは酵素が外部重合体ネットワーク上に提示されるので、それらが反応を触媒する能力は細胞周期の段階に依存しない。
【０２１６】
本明細書中では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ固定化のみを用いることにより、又は固定化ドメインの組合せを用いることにより、ｃｕｒｌｉ上での複数の酵素の提示を可能にすると考えられる。これにより、複数の酵素ステップを介して分子を合成又は分解できるバイオフィルムが生成する。以前に示されているように、ナノスケールでの一連の酵素ステップのクラスター化には触媒プロセスの効率の点で利点がある３４。
【０２１７】
最後に、ＢＩＮＤを用いた酵素提示の開発は、同じ細菌にｃｕｒｌｉ及び酵素合成機構を組み込むことを可能にする。ｃｕｒｌｉ及び酵素合成機構を組み込むことにより、固定化された細菌による酵素−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合体の発現及び分泌が可能になり、別個のタンパク質単離ステップの必要がなくなる。これにより、完全に自己機能的な触媒表面が作られる。このような技術は、薬剤合成、廃水中の薬剤の分解、地下水からの汚染物質の除去、又はバイオエネルギーのための触媒表面の作製を含む多くの形態の「グリーンな」生体触媒作用に応用可能性がある。
【０２１８】
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【０２１９】
実施例５：改変Ｃｕｒｌｉナノファイバーに由来するプログラム可能なバイオフィルムベース材料
【０２２０】
自律的に生成し、再生可能であり、プログラム可能である、自己組織化する生きたシステムが次世代の先端バイオマテリアルである。本明細書は、バイオフィルムのタンパク質性構成要素であるアミロイド形成タンパク質ＣｓｇＡ（１）に種々のペプチドを遺伝子的に付加することによるＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムマトリックスのプログラム可能な機能化のための戦略として「バイオフィルム組込み型ナノファイバーディスプレイ」（ＢＩＮＤ）を記載する。ＣｓｇＡ融合タンパク質が、細胞搬出機構により首尾よく分泌され、アミロイドナノファイバーネットワークへと自己組織化し、目的のペプチドを高密度で提示する。提示されたペプチドドメインは、特異的表面への接着、ナノ粒子のテンプレーティング、タンパク質固定化、又はその組合せ等の種々の非天然機能をバイオフィルムに付与する。ＢＩＮＤは、バイオフィルムの広い機能化のための新規な戦略であり、デザイン可能なバイオマテリアルとしてのバイオフィルムの有用性を示している。
【０２２１】
前世紀に、本発明者らの理解における細菌システムの進歩は、もっぱら健康への脅威として考えられていた微生物の役割を、生体分子及び化学物質を生産するための遺伝子的にプログラム可能な工場として活用するところまで拡大した。細菌バイオフィルムは機能性先端材料と同様な軌道へと乗り出し始めた。自然界の細菌の大部分はバイオフィルムとして存在し、これは、細胞外多糖、タンパク質、及び他の生体分子構成要素のネットワーク中に落ち着いた細胞の組織化されたコミュニティーである（２）。この細胞外マトリックスは、厳しい環境から細菌を保護し、基質接着を仲介することにより、微生物の存続及び病原性を促進する。
【０２２２】
したがって、臨床感染においてバイオフィルムが果たすマイナスの役割のため、ほとんどのバイオフィルム研究はその根絶に焦点を合わせてきた。本明細書は、細菌がその構成原材料の合成、高次構造へのその組織化、及びその長期間の維持のための生きた工場として機能する、プログラム可能でモジュール的な自己組織化ナノ材料のプラットフォームとしてのバイオフィルムの資源化（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ）を記載する。エネルギー生成（３）、廃水処理（４）、及びバイオトランスフォーメーション（５）等の有益な目的のための天然バイオフィルムの使用に関する限定的な研究があるが、バイオフィルムの形成、形態、接着、及び機能を合理的に改変する方法がないため、その広い使用が妨げられている。今日までのバイオフィルムの改変は、バイオフィルム材料自体ではなく細胞集団を変えることに焦点を合わせてきた。種々の細胞外スキャフォールド上にペプチド及びタンパク質を提示する方法が存在するが（６）、バイオフィルムマトリックスの分子の構造及び特性を合理的に改変しようとする努力は、本発明者らの知る限り、全くなされていなかった。
【０２２３】
実用的な応用のためにバイオフィルム細胞外マトリックスを改変する本明細書に記載されている本発明のアプローチは、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムの主要なタンパク質性構造構成要素であるｃｕｒｌｉシステムに焦点を合わせている。Ｃｕｒｌｉは、細胞を封入する絡み合ったネットワークを形成する直径約７ｎｍの非常に強固な機能性アミロイドナノファイバーである。Ｃｕｒｌｉは、１３ｋＤａの小さな分泌型タンパク質である細胞外自己組織化ＣｓｇＡから形成される。相同な外膜タンパク質ＣｓｇＢが、ＣｓｇＡ組織化の核となり、更に細菌表面にナノファイバーを固定する。ｃｕｒｌｉ生合成オペロンは７個の遺伝子（ｃｓｇＡ〜Ｇ）を含み（１）、その生成物はＣｓｇＡ及びＣｓｇＢのプロセシング（ＣｓｇＥ、Ｆ）、分泌（ＣｓｇＣ、Ｇ）、及び転写制御（ＣｓｇＤ）を仲介する。
【０２２４】
ｃｕｒｌｉシステムは、本明細書に記載の合成生物学による種類の物質改変に理想的なプラットフォームとなる多くの特徴を示す。第１に、ｃｕｒｌｉナノファイバーは、主に１種類のタンパク質で構成されるので、通常の遺伝子操作方法を用いて非常に多様なバイオフィルム細胞外マトリックスを作るための扱い易い入口となる。対照的に、タンパク質合成機構と比べて多糖合成はしばしば多段階経路と関連しており、化学的に多様なモノマーへの許容度が限定されているので、バイオフィルムの菌体外多糖構成要素の改変はより困難であると考えられる。第２に、ＣｓｇＡにより形成される機能性アミロイド繊維は非常に強固であり、洗剤中での煮沸（７）及び溶媒中での長期インキュベーションに耐えられ、このことは厳しい環境での潜在的有用性を高めている。同様なアミロイドナノファイバーが、鋼に匹敵する強度及び絹に匹敵する機械的堅さを有することが示されており（８）、このことは、高アミロイド含有量のバイオフィルムが物理的に厳しい環境に耐え得ることを示唆している。第３に、機能性アミロイド細線維は多くの天然細菌バイオフィルム中で豊富であり、全生体量（ｂｉｏｖｏｌｕｍｅ）の最大１０〜４０％までを構成することがあり（９）、このことは、ｃｕｒｌｉを人工的に改変してバイオフィルムのかなりの部分を構成させることができることを示唆している。更に、類似の細胞外機能性アミロイドが多くの細菌により産生されているが、ｃｕｒｌｉシステムは最もよく研究されており、標準的なモデル細菌に天然のものであるので、改変物質開発の魅力的な出発プラットフォームである。最後に、近年の発見により、ｃｕｒｌｉシステムがアミロイド形成ポリペプチドを効率的に搬出でき、機能性ＣｓｇＡ−ラクダ抗体断片融合体を発現できることが示されており、このことは、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムマトリックス全体に機能性ペプチドを提示するための広くモジュール的な方法にｃｕｒｌｉシステムを使用できることを示している（１０、１１）。
【０２２５】
ＢＩＮＤシステムは、機能性ペプチドドメインをＣｓｇＡタンパク質に融合させることによるＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムマトリックスの正確な遺伝的プログラミングを可能にする（図１６Ａ）。本明細書中に、キメラＣｓｇＡバリアントが、天然の細胞搬出機構により分泌され、野生型システムに似たｃｕｒｌｉ線毛ネットワークへと組織化することを示す。更に、この技術が種々の長さ及び二次構造の幅広いペプチドドメインと適合することを示す。最後に、ペプチドドメインが、分泌及び組織化後に機能を維持しており、バイオフィルム全体に人工的機能を付与することを示す。３つの実証実験において、バイオフィルムに種々の機能、すなわち非生物的表面への特異的接着、ナノ粒子のテンプレーティング、及び任意の機能化組換えタンパク質の部位特異的共有結合固定化、をプログラムする能力が明らかにされる。
【０２２６】
ＣｓｇＡにペプチドを付加するための好適な融合点を決定するために、ステンレス鋼表面に強く結合することが知られている（１２）ペプチドドメインへのＮ末端及びＣ末端融合体からなるライブラリーを作製した（図３）。線状のペプチド及び環状に束縛されたペプチドのどちらも組込みが可能となるように末端融合体を選択した。種々の可変リンカー長を用いて各末端につき３つのバリアントを調製した。天然制御下で残りのｃｕｒｌｉプロセシング機構を保持しているＥ．ｃｏｌｉのｃｓｇＡ欠失株（ＬＳＲ１０）中でｃｓｇＡバリアントを発現させた（１３）。この株は鞭毛、セルロース、又はＬＰＳ  Ｏ多糖を生成しない（１４〜１６）。したがって、全ての細胞外繊維は、異種改変ＣｓｇＡ融合変異体の自己組織化のみに起因し得る。アミロイドを染色する比色分析用色素コンゴーレッド（ＣＲ）を用いて、種々の変異体のｃｕｒｌｉ生成の程度を決定した。このアッセイによれば、ＣｓｇＡとＭＢＤとの間に最も長いＣ末端リンカーを有するＣ３融合部位のみがかなりの量のアミロイド繊維を形成した（図１Ｂ）。Ｎ末端融合体は、ＣｓｇＧ特異的搬出認識配列に近接しているため、細胞搬出を阻害した可能性がある。Ｃ３変異体ｃｕｒｌｉ線毛の走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ、図１６Ｍ）及び透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ、図図２０Ｍ）による特徴解析により、これらが野生型ＣｓｇＡ繊維と類似の形態を示すことが確認された。
【０２２７】
好適な融合部位を同定し、分泌及び組織化に対するペプチドの長さ及び構造の影響を試験するために１２個のペプチドドメイン融合体のライブラリーを作った。ライブラリーのメンバーは、長さが７〜５９アミノ酸にわたり、幅広い機能をコードし（１７〜２８）、これらを６アミノ酸可変リンカーを用いてＣｓｇＡのＣ末端に融合させた（表１、図１７）。ライブラリーのメンバーをＬＳＲ１０細胞中にクローニングし、ＣＲ染色によりｃｕｒｌｉの形成について調べた。ＣＲプレートにスポットした形質転換体の染色強度を測定することにより、ライブラリーのメンバー間のｃｕｒｌｉ生成の量的変化をモニタリングした（図１６Ｂ）。修飾ｃｕｒｌｉバイオフィルムのＳＥＭ（図１６Ｃ〜１６Ｐ）及びＴＥＭ（図２０Ａ〜２０Ｎ）は、細胞外アミロイドの生成についてのＣＲデータを裏付けている。全体的に、ほとんどの小さいペプチド融合体はｃｕｒｌｉ搬出機構に許容され、アミロイドネットワークへと組織化することができた。抗ＦＬＡＧ抗体を有するＣｓｇＡ−ＦＬＡＧ変異体を発現するＢＩＮＤバイオフィルムの免疫染色により、ペプチドドメインの存在及びアクセスし易さが確認された（図２１Ａ〜２１Ｂ）。陽性のＣＲ染色がなかった唯一の変異体は５９アミノ酸のＭｍｓ６タンパク質ドメインであり、このことから、長い配列又は固有の構造を有するポリペプチドが、ポアサイズが２ｎｍであるＣｓｇＧ外膜トランスポーターを介して効率的に搬出されない可能性があるという過去の報告（１０、２９）が確認された。ｃｕｒｌｉ生成株では、ＣｓｇＡ−ペプチド融合体はｗｔ−ＣｓｇＡと同様な形態のナノスケールの繊維へと組織化されている（図１６Ｃ〜１６Ｏ）。繊維は、特徴的な絡み合った形態を示し、メッシュ様のネットワークで細胞表面に密に結合しているようであり、任意の配列及び機能のペプチドがｃｕｒｌｉ線毛の表面に提示され得ることを示唆している。ＦＬＡＧ−ＢＩＮＤ等のＢＩＮＤバリアントのいくつかは、通常のｃｕｒｌｉバイオフィルムでは見られない広範囲にわたる薄い布地様の２Ｄメッシュを形成する能力を示し、このことは、このプラットフォームを操作してバイオフィルムの巨大分子構造を変えることもできることを示唆している（図２２）。
【０２２８】
ＢＩＮＤシステムの真価は、機能をモジュール方式で遺伝的にプログラムできる活性表面コーティングとして機能できることである。これらの能力のいくつかの証明として、３つのペプチドを表１から選択し（ＭＢＤ、Ａ３、及びＳｐｙＴａｇ）、それらがｃｕｒｌｉ生産性バイオフィルムに新しい機能を導入する能力、具体的には非生物的表面への接着を強化させる能力、無機ナノ粒子の成長のバイオテンプレートとなる能力、及び全長タンパク質を共有結合的に固定する能力を試験した。これらの実験には、ｃｕｒｌｉプロセシング機構を過剰発現し、ＣＲ陽性のバイオフィルムを生成できるｃｓｇＡ欠失株であるＰＨＬ６２８を用いた（図４）（３０）。
【０２２９】
ＢＩＮＤを界面材料開発の効率的なプラットフォームにするためには、特異的非生物的表面へのナノファイバーの接着を調整することが重要である。この能力の例として、最も多用途で広く用いられる鋼合金である３０４Ｌステンレス鋼への、ＭＢＤを提示するＥ．ｃｏｌｉ細胞の接着を試験した。ＣｓｇＡ−ＭＢＤ変異体を発現するＰＨＬ６２８細胞を３０４Ｌ片上にスポットし、４８時間接着させた後、非特異的結合細胞を除去するために水性緩衝液中で激しく洗浄した（図５Ａ）。ＣｓｇＡ−ＭＢＤ融合体で構成されるバイオフィルムは洗浄手順に耐えたが、ｗｔ−ＣｓｇＡを発現するもの又はＣｓｇＡを発現しないものは表面から容易に洗い落とされた（図１８Ｂ〜１８Ｅ）。この結果は、ＭＢＤを用いたＢＩＮＤプログラミングがバイオフィルムへの接着機能の付与に充分であることを示している。ＢＩＮＤプラットフォームのモジュール性は、非特異的バイオフィルム成長が不利益と見なされるバイオレメディエーション又は化学合成における用途のためのバイオフィルム接着をデザインするためのプラグ・アンド・プレイアプローチに適している。この能力は、バイオフィルム形成の空間的調節のためにパターン化された表面が用いられる応用、又は産業用バイオリアクターの場合にしばしばそうであるように、バイオフィルムの成長を特定の物質に限定することが望ましい応用において特に有用である。
【０２３０】
表面へのペプチド結合は物質のテンプレーティングを促進するために用いることもでき、これはＣｓｇＡ−Ａ３融合体で構成されるＢＩＮＤを用いて本明細書中で実証される。Ａ３ペプチドは、銀に結合するようにファージディスプレイによって過去に開発されたものであり、銀ナノ粒子のテンプレーティングを調節することが示されている。Ａ３−ＢＩＮＤバイオフィルムは、野生型バイオフィルムとは対照的に、ＡｇＮＯ３溶液から成長中の銀ナノ粒子に結合する能力の強化を示す（図１８Ｄ〜１８Ｅ）。短いペプチドを提示することに加え、任意の長さ及び次元の全長タンパク質を提示して人工的な触媒、電子輸送、又はセンシングの能力を有するバイオフィルムをプログラムするためにＢＩＮＤシステムを用いることができれば、ＢＩＮＤシステムの有用性は大幅に広がると考えられた。１３アミノ酸ペプチド（ＳｐｙＴａｇ）が１５ｋＤａタンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）とイソペプチド結合を形成する、分割アドへシンシステム（ｓｐｌｉｔ−ａｄｈｅｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（３１）を用いて、完全に遺伝子的にコード可能な戦略を用いて（図１９Ａ）、ＢＩＮＤネットワーク上にタンパク質を共有結合的に固定した。したがって、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇキメラを提示するバイオフィルムを、ＰＨＬ６２８細胞を用いてガラス基質上で成長させ、ｗｔ−ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇのいずれかが発現した時に特徴的ｃｕｒｌｉネットワークが形成された（図１９Ｂ〜１９Ｇ）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を用いてＳｐｙＴａｇドメインの存在及び機能性を調べた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ又は非機能性変異体（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＥＱ−Ｖｅｎｕｓ）のいずれかを用いた処理により、ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するバイオフィルムだけがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓに結合できることが明らかになった（図６Ｆ）。これらの結果は、ＳｐｙＴａｇペプチドをＣｓｇＡに融合させることができ、ペプチドがｃｕｒｌｉネットワーク形成後にその機能を維持していることを裏付けている。固定化プロセスを更に単純化するために精製タンパク質の代わりにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質を含む非精製細胞溶解物を用いても同様な結果が得られたことから（非掲載データ）、複雑な混合物中でもＣｓｇＡＳｐｙＴａｇ  ｃｕｒｌｉネットワークとその同族ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質との間の結合特異性が示された。ＢＩＮＤのこの特徴は、酵素再利用のための効率的固定化プロセスを開発するために、生体触媒作用の領域において特に有用である。
【０２３１】
本明細書は、ナノファイバースキャフォールドの作製、酵素の生合成、及び固定化反応の全てを、精製ステップなしに単一の改変細菌株によって達成することができる、ＢＩＮＤプラットフォームを用いたエレガントな戦略を記載する。
【０２３２】
ＢＩＮＤの重要な側面は、ｃｕｒｌｉ線毛のランダムな細胞外自己組織化により、種々のＣｓｇＡ融合体の発現によって多機能性のバイオフィルム表面が得られることである。したがって、ＢＩＮＤ構造は、接着、提示、分子的テンプレーティング、又はタンパク質固定化の任意の組合せにプログラムすることができる。この特徴は本明細書中で、ＣｓｇＡ−ＦＬＡＧ及びＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを共培養して、ＦＬＡＧタグを提示でき且つＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを介してＧＦＰを固定化できる二機能性ＢＩＮＤバイオフィルムが生成することにより実証される（非掲載データ）。
【０２３３】
本明細書中で、バイオフィルムに新たな機能を導入する目的での微生物細胞外マトリックス構成要素の合理的分子デザインのための戦略が実証される。これらの結果は、アミロイドベースの細胞外マトリックスへと自己組織化できる種々のキメラＣｓｇＡ−ペプチドコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉのｃｕｒｌｉシステムが分泌及び組織化できることを示している。融合させたペプチドドメインは、ネットワーク表面に高密度で提示され、組織化後でもその機能を維持している。本明細書中で、３つの別個の非天然機能（鋼表面への接着、銀ナノ粒子のテンプレーティング、及び共有結合によるタンパク質固定化）を、種々の改変ペプチド配列の所定の機能に基づきＥ．ｃｏｌｉバイオフィルム中にモジュール的に導入できることが示される。重要なことに、各機能的実証は、システムの再最適化を必要とせずに達成され、このことは、本システムに他の配列を容易に組み込んで様々な非天然機能を有する、更には一度に複数の新規な機能を有する材料を利用できることを示している。ＢＩＮＤは、既知のペプチド及びタンパク質の多様なレパートリーから引き出すことができる機能を有する界面ナノ材料の迅速な開発に役立つ。これらのバイオフィルムをベースとする材料は、細胞生存の助けとなり得る又はならないかもしれない幅広い環境で用いることができる。快適な環境では、バイオフィルムの封入された細胞は時間をかけて自己再生するように若しくは材料を修復させるように、又は環境要因に応答して材料を変化させるように誘導され得る。しかし、より厳しい環境では、強固な改変されたマトリックスは、メンテナンスを必要とせずに自身で機能し得る。本明細書に記載の方法及び組成物を用いて、類似の機能性アミロイドを有する多くの他の微生物バイオフィルム（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）に新しい機能を導入して各野生型株の特定の特徴を利用することができる。改変細菌が急速に増殖すること、及び外部マトリックスの生合成に石油由来の構成原材料を必要としないことを考えると、ＢＩＮＤは、幅広いサイズ規模及び環境にわたるカスタマイズされた界面材料を作製するためのスケーラブル且つ「グリーンな」アプローチとして有用であり得る。
【０２３４】
材料及び方法
【０２３５】
細胞株及びプラスミド。全てのクローニング及びタンパク質発現は、それぞれＭａｃｈ１（商標）（インビトロジェン社）及びＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞（ＥＭＤ社）中で行われた。ｃｓｇＡ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２ゲノムＤＮＡから単離され、Ｔｒｃプロモーターの調節下にあるＣｏｌＥ１プラスミドであるｐＢｂＥ１ａにクローニングされた。ペプチドインサート領域は、完全に合成されたか（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社）、オーバーラップエクステンションによりＰＣＲ生成された。全てのクローニングは、等温ギブソン・アセンブリーを用いて行われ、ＤＮＡシークエンシングにより確認された。
【０２３６】
Ｃｕｒｌｉバイオフィルム形成。ｃｕｒｌｉを生成するために、ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−ペプチド融合体をコードするｐＢｂＥ１ａプラスミドでＬＳＲ１０細胞又はＰＨＬ６２８細胞を形質転換した。陰性対照として、空のｐＢｂＥ１ａプラスミドで細胞を形質転換した。その後、１０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び２０ｇ／Ｌの寒天を含むＹＥＳＣＡ−ＣＲプレート上に細胞を画線又はスポットした。これらのプレートには、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．５ｍＭのＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍＬのコンゴーレッド、及び５μｇ／ｍＬのブリリアントブルーＧ２５０を補った。その後、プレートを２５℃で４８時間インキュベートし、次いで、イメージングしてコンゴーレッド結合の程度を決定した。スポットしたプレートでは、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートに２０μＬをスポットする前に、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．２ｍＭのＩＰＴＧを補ったＹＥＳＣＡ液体培地中で２５℃にて４８時間形質転換体を成長させた。
【０２３７】
ＴＥＭ及びＳＥＭ。Ｃｕｒｌｉ形成した野生型又はＢＩＮＤ細胞サンプルを、誘導したＹＥＳＣＡ培養物から直接取り出すか、ＹＥＳＣＡ−ＣＲプレートから掻き取り、ミリポアＨ２Ｏに再懸濁した。ＴＥＭ分析では、５μＬのサンプルをフォルムバール−カーボングリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上にスポットし、ミリポアＨ２Ｏで洗浄し、１％ウラニルホルマートで染色した後、ＪＥＯＬ  １２００  ＴＥＭを用いて分析した。ＳＥＭ分析では、サンプルをＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターに減圧下でアプライし、ミリポアＨ２Ｏで洗浄し、２％グルタルアルデヒド＋２％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定した後、１％四酸化オスミウムで固定した。その後、サンプルをミリポアＨ２Ｏ中で洗浄し、増加エタノールステップグラジエント、その後ヘキサメチルジシラザンステップグラジエントで脱水した後、金スパッタリングし、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ（商標）  ＦＥ−ＳＥＭを用いて分析した。
【０２３８】
免疫金ＴＥＭ。ＦＬＡＧタグを提示するＢＩＮＤ細胞の抗ＦＬＡＧ免疫金標識のために、前述したように最初に細胞をニッケルＴＥＭグリッドに接着させた。その後、グリッドをブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中で３回洗浄し、一次抗ＦＬＡＧマウス抗体とＰＢＳの１：１０００希釈物を含む液滴上に下向きに３０分間浮かせ、ブロッキングバッファー中で再度洗浄した後、１：１０００希釈された抗マウス１５ｎｍ金コンジュゲート抗体の液滴上に３０分間浮かせた。最後にＰＢＳ中で３回、次いでミリポアＨ２Ｏ中で洗浄した後、１％ウラニルホルマートで１５秒間グリッドを染色し、ＪＥＯＬ  １２００（商標）  ＴＥＭを用いてイメージングした。
【０２３９】
３０４Ｌステンレス鋼片へのＭＢＤ−ＢＩＮＤ結合。鋼合金３０４Ｌ片（アラバマ・スペシャルティ・プロダクツ社（Ａｌａｂａｍａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．））を目の細かい紙やすり、アセトン、ミリポア水でクリーンにし、１Ｍ  ＮａＯＨ中、８０℃で１時間、超音波処理し、ミリポア水で再度洗浄し、最後にアセトンですすいだ後、風乾した。ＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ形質転換体を前述したようにＹＥＳＣＡ培地中で成長させ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ及び３％ＤＭＳＯを添加することにより２５℃、１５０ｒｐｍで４８時間誘導した。細胞培養液をＯＤ６００＝１に標準化し、２０μＬを３０４Ｌ片上にスポットした。スポットされた片を無菌ペトリ皿中に置き、４℃に置いて蒸発を最小限に抑えて付着させた。４８時間後、片をＰＢＳで短時間すすぎ、ＰＢＳを満たしたチューブに入れ、ボルテックスの設定を５にして３０秒のボルテックスを３回行った。その後、前述したプロトコールに従い、片を固定し、ＳＥＭ画像を得た。
【０２４０】
銀ナノ粒子のテンプレーティング。ＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞を、野生型ＣｓｇＡ又はＣｓｇＡ−Ａ３を発現するプラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＹＥＳＣＡブロスで０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで４８時間誘導した。細胞及びｃｕｒｌｉをペレット化により単離した後、ＰＢＳ＋ＣＭに再懸濁した。ニッケルフォルムバール／カーボンＴＥＭグリッドを、これらの再懸濁サンプルの液滴に浮かべ、ＰＢＳ＋ＣＭで２回、ｍｐＨ２Ｏで３回洗浄した後、１４７ｍＭ  ＡｇＮＯ３を含む液滴上で４時間インキュベートした。次いで、グリッドをｍｐＨ２Ｏで３回洗浄し、ネガティブ染色し、前述したようにＴＥＭで分析した。
【０２４１】
バイオフィルム蛍光顕微鏡イメージング。対照、野生型ＣｓｇＡ、及びＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇを発現するプラスミドで形質転換したＰＨＬ６２８  ｃｓｇＡ細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２０ｍＬのＹＥＳＣＡブロス中で、ＯＤが０．６になるまで３０℃で成長させた。プラズマ活性化及びＰＬＬ機能化カバースリップを培養液に入れ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ及び３％ＤＭＳＯを加えることによりｃｕｒｌｉ発現及びバイオフィルム形成を誘導した。培養物を、２５℃、１５０ｒｐｍで４８時間成長させた。スライドを培養液から取り出し、１５０ｒｐｍで振盪しながら洗浄バッファー（１×ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で２０分間、３回洗浄した。洗浄後、０．５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ  Ｖｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又はＶｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｅ７７Ｑ）溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ中）をスライドに加えた。バイオフィルムを１時間インキュベートした後、洗浄バッファーを用いて２０分間の洗浄を２回行った。その後、サンプルをＳＹＴＯ−６１（１０μＭ）で２０分間染色し、１５０ｒｐｍで振盪しながら洗浄バッファーを用いて１５分間の洗浄を２回行った。その後、スライドをＬｅｉｃａ  ＴＩＲＦ  ＤＭ１６０００Ｂ（商標）を用いて６０倍及び１００倍で落射蛍光モードでイメージングした。多機能性ＢＩＮＤ実験では、初期ＯＤ６００＝２．５の細胞を、誘導条件下（ＹＥＳＣＡ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ、１００ｎｇ／ｍＬカルベニシリン、３％ＤＭＳＯ）でＭａｔＴｅｋ社のガラス底ディッシュ中で７２時間培養した。その後、バイオフィルムをＰＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、１％ＢＳＡのＰＢＳＴで１時間ブロッキングし、清澄化した細胞溶解物を含むＶｅｎｕｓ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと１時間インキュベートした。その後、ディッシュを穏やかに振盪しながら０．１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴで徹底的に洗浄した後、抗ＦＬＡＧ  ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０抗体（ピアース社）と１時間インキュベートした。サンプルを上記と同様に０．１％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴで洗浄し、２％グルタルアルデヒド＋２％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファーで１５分間固定し、その後、ＰＢＳ＋１０ｍＭグリシン中で４℃で一晩インキュベートして自己蛍光を除いた。全ての多機能性ＢＩＮＤサンプルをＬｅｉｃａ  ＳＰ５  Ｘ  ＭＰ（商標）倒立共焦点顕微鏡を用いて分析した。
【０２４２】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓの構築及び発現。ｐＤＥＳＴ１４−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを含むＲｏｓｅｔｔａ（商標）細胞形質転換体を、１００ｇ／ｍＬアンピシリンを補った５００ｍＬ培養液に接種し、ＯＤ０．６まで３７℃で６時間成長させた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓ発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８℃で一晩発現させた。細胞を回収及び溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｅｎｕｓを精製した。タンパク質を回収し、バッファーを５０ｍＭリン酸バッファー／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）に交換し、濃縮し、その後の使用まで−８０℃で保存した。Ｅ７７Ｑ変異体も同様に精製した。
【０２４３】
参照文献
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【０２４４】
配列番号１  ＣｓｇＡポリペプチド  ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ：ＮＰ＿４１５５６０
1 mkllkvaaia aivfsgsala gvvpqygggg nhggggnnsg pnselniyqy gggnsalalq
61 tdarnsdlti tqhgggngad vgqgsddssi dltqrgfgns atldqwngkn semtvkqfgg
121 gngaavdqta snssvnvtqv gfgnnatahq y
【０２４５】
配列番号２  ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇの核酸配列
ATGAAACTTTTAAAAGTAGCAGCAATTGCAGCAATCGTATTCTCCGGTAGCGCTCTGGCAGGTGTTGTTCCTCAGTACGGCGGCGGCGGTAACCACGGTGGTGGCGGTAATAATAGCGGCCCAAATTCTGAGCTGAACATTTACCAGTACGGTGGCGGTAACTCTGCACTTGCTCTGCAAACTGATGCCCGTAACTCTGACTTGACTATTACCCAGCATGGCGGCGGTAATGGTGCAGATGTTGGTCAGGGCTCAGATGACAGCTCAATCGATCTGACCCAACGTGGCTTCGGTAACAGCGCTACTCTTGATCAGTGGAACGGCAAAAATTCTGAAATGACGGTTAAACAGTTCGGTGGTGGCAACGGTGCTGCAGTTGACCAGACTGCATCTAACTCCTCCGTCAACGTGACTCAGGTTGGCTTTGGTAACAACGCGACCGCTCATCAGTACGGCAGCGGTGGTTCTGGCGCGCACATCGTTATGGTTGACGCGTACAAACCGACCAAATGA
【０２４６】
配列番号３  ＣｓｇＡ−ＳｐｙＴａｇのアミノ酸配列
MKLLKVAAIAAIVFSGSALAGVVPQYGGGGNHGGGGNNSGPNSELNIYQYGGGNSALALQTDARNSDLTITQHGGGNGADVGQGSDDSSIDLTQRGFGNSATLDQWNGKNSEMTVKQFGGGNGAAVDQTASNSSVNVTQVGFGNNATAHQYGSGGSGAHIVMVDAYKPTK
【０２４７】
配列番号４  アミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの核酸配列
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAACATTGGAAGCGCTTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGATGTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCAGGAGAACACCCAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGAGGCGGCGGTTCTGATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGCCATGGTTGATACCTTATCAGGTTTATCAAGTGAGCAAGGTCAGTCCGGTGATATGACAATTGAAGAAGATAGTGCTACCCATATTAAATTCTCAAAACGTGATGAGGACGGCAAAGAGTTAGCTGGTGCAACTATGGAGTTGCGTGATTCATCTGGTAAAACTATTAGTACATGGATTTCAGATGGACAAGTGAAAGATTTCTACCTGTATCCAGGAAAATATACATTTGTCGAAACCGCAGCACCAGACGGTTATGAGGTAGCAACTGCTATTACCTTTACAGTTAATGAGCAAGGTCAGGTTACTGTAAATGGCAAAGCAACTAAAGGTGACGCTCATATTTAA
【０２４８】
配列番号５  アミラーゼ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのアミノ酸配列
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHPIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQRGGGSDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
【図１Ａ】
2019022491.tif 000004
【図１Ｂ】
2019022491.tif 000005
【図１Ｃ】
2019022491.tif 000006
【図１Ｄ】
2019022491.tif 000007
【図１Ｅ】
2019022491.tif 000008
【図１Ｆ】
2019022491.tif 000009
【図２Ａ】
2019022491.tif 000010
【図２Ｂ】
2019022491.tif 000011
【図２Ｃ】
2019022491.tif 000012
【図３】
2019022491.tif 000013
【図４】
2019022491.tif 000014
【図５】
2019022491.tif 000015
【図６−１】
2019022491.tif 000016
【図６−２】
2019022491.tif 000017
【図７】
2019022491.tif 000018
【図８】
2019022491.tif 000019
【図９】
2019022491.tif 000020
【図１０】
2019022491.tif 000021
【図１１】
2019022491.tif 000022
【図１２】
2019022491.tif 000023
【図１３−１】
2019022491.tif 000024
【図１３−２】
2019022491.tif 000025
【図１４】
2019022491.tif 000026
【図１５】
2019022491.tif 000027
【図１６−１】
2019022491.tif 000028
【図１６−２】
2019022491.tif 000029
【図１６−３】
2019022491.tif 000030
【図１６−４】
2019022491.tif 000031
【図１７】
2019022491.tif 000032
【図１８−１】
2019022491.tif 000033
【図１８−２】
2019022491.tif 000034
【図１９−１】
2019022491.tif 000035
【図１９−２】
2019022491.tif 000036
【図２０−１】
2019022491.tif 000037
【図２０−２】
2019022491.tif 000038
【図２１】
2019022491.tif 000039
【図２２】
2019022491.tif 000040
【配列表】
2019022491000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月2日(2018.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞上に改変ＣｓｇＡポリペプチドを発現させることであって、前記改変ＣｓｇＡポリペプチドは、可変リンカー配列によってＣｓｇＡポリペプチドに融合されている活性ポリペプチドを含み、前記活性ポリペプチドはコンジュゲーションドメインを含む、前記発現させること；及び、
前記改変ＣｓｇＡポリペプチドを標的ポリペプチドに接触させることであって、前記標的ポリペプチドは、機能化ポリペプチドに融合されているパートナーコンジュゲーションドメインを含む、前記接触させること、
を含み、
前記活性ポリペプチドの前記コンジュゲーションドメインは、前記標的ポリペプチドの前記パートナーコンジュゲーションドメインに特異的に結合する、
バイオフィルム上に活性ポリペプチドを提示する方法。
【請求項２】
前記コンジュゲーションドメインが、ＳｐｙＴａｇ；ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）；ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）；及びＬＰＸＴＧモチーフを含むペプチド、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パートナーコンジュゲーションドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ；ストレプトアビジン；及びアミノグリシンを含むペプチド、からなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記可変リンカー配列が少なくとも６アミノ酸を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記可変リンカー配列がグリシン残基及びセリン残基からなる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記可変リンカー配列が６アミノ酸〜１００アミノ酸を有する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記可変リンカー配列が３０アミノ酸〜１００アミノ酸を有する、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記可変リンカー配列が６アミノ酸〜３０アミノ酸を有する、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記可変リンカー配列が２０アミノ酸〜５０アミノ酸を有する、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記可変リンカー配列が３０アミノ酸〜５０アミノ酸を有する、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能化ポリペプチドが酵素又は抗体である、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記コンジュゲーションドメイン又は前記機能化ポリペプチドがさらに細胞外局在化タグを含む、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳｐｙＴａｇが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣｓｇＡポリペプチドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＣｓｇＡポリペプチドである、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。