(57)【要約】【課題】ハンチントン病を治療するまたは予防するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】本明細書において、Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質が提供され、このジンクフィンガータンパク質は、Ｆ１〜Ｆ４、Ｆ１〜Ｆ５、およびＦ１〜Ｆ６と順序付けられた、４つ、５つ、または６つのジンクフィンガードメインを含み、このジンクフィンガードメインは、表１Ｂの単一の列に示される認識ヘリックス領域配列を含む。【選択図】図１Ａ
2019022531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２９日に出願された米国仮出願第６１／６０５，０２８号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、遺伝子発現およびゲノム編集の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
ハンチントン舞踏病としても知られる、ハンチントン病（ＨＤ）は、進行性の運動、認知、および精神的混乱障害である。この疾患の平均発症年齢は、３５〜４４歳であるが、症例の約１０％においては、２１歳より前に発症し、この疾患の診断後の平均寿命は、１５〜１８年である。有病率は、西ヨーロッパ家系で１００，０００人中約３〜７人である。
【０００４】
ハンチントン病は、１９９０年代初期に最初に特徴付けられたトリヌクレオチド反復伸長障害の一例である（Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５６−７６５を参照されたい）。これらの障害は、３つのヌクレオチドの組の不安定な反復の局所的伸長を伴い、その伸長した反復が存在する遺伝子の機能喪失、毒性機能獲得、またはそれらの両方をもたらし得る。トリヌクレオチド反復は、非コードおよびコード遺伝子領域を含む、遺伝子のいずれの部分にも位置し得る。コード領域内に位置する反復は、典型的に、反復したグルタミンコードトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンコードトリプレット（ＣＧＡ）のいずれかを伴う。非コード配列内の伸長した反復領域は、遺伝子の異常な発現につながり得る一方で、コード領域内の伸長した反復（コドン反復障害としても知られる）は、ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を引き起こすことがある。異常なタンパク質に関連する病態生理学の正確な原因は、知られていないことが多い。典型的に、トリヌクレオチド伸長の対象となる野生型遺伝子において、これらの領域は、正常な集団において可変数の反復配列を含有するが、罹患した集団においては、反復の回数は、反復の回数の倍加から対数桁の増加まで増加し得る。ＨＤにおいて、反復は、巨大細胞質タンパク質ハンチンチン（Ｈｔｔ）のＮ末端コード領域内に挿入される。正常なＨｔｔ対立遺伝子は、１５〜２０回ＣＡＧ反復を含有する一方で、３５回以上の反復を含有する対立遺伝子は、ＨＤを引き起こす可能性がある対立遺伝子と見なされ、疾患を発症する危険性を付与し得る。３６〜３９回反復を含有する対立遺伝子は、不完全に浸透性であると見なされ、それらの対立遺伝子を内部に持つそれらの個人は、疾患を発症することもしないこともある（または後年に症状を発症することがある）一方で、４０回以上の反復を含有する対立遺伝子は、完全に浸透性であると見なされる。実際、これほど多くの反復を有するＨＤ対立遺伝子を持つ無症候性の人物は、何ら報告されてこなかった。若年発症型ＨＤ（２１歳未満）を有する個人はしばしば、６０回以上のＣＡＧ反復を有することが見出されている。ＣＡＧ反復の増加に加えて、ＨＤが反復配列内で＋１および＋２フレームシフトを伴い得、その結果、その領域が、ポリ−グルタミンではなくポリ−セリンポリペプチド（＋１フレームシフトの場合にはＡＧＣ反復によってコードされる）トラックをコードすることになることもまた示されてきた（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３：８９３−８９６）。
【０００５】
ＨＤにおいて、変異Ｈｔｔ対立遺伝子は、通常、優性形質として一方の親から遺伝する。ＨＤ患者から生まれた子供は、他方の親がその障害に罹患していなかった場合、疾患を発症する５０％の可能性を有する。場合によっては、親は、中間のＨＤ対立遺伝子を有し、無症候性であり得るが、反復伸長に起因して、その子供は疾患を呈する。加えて、ＨＤ対立遺伝子はまた、精子形成中の反復領域の不安定な性質に起因して重症度の増加または発症年齢の低下が数世代にわたって観察される、表現促進として知られる現象も表示し得る。
【０００６】
さらに、Ｈｔｔにおけるトリヌクレオチド伸長は、線条体における中型有棘細胞のγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射ニューロンのニューロン欠損につながり、このニューロン欠損は、新皮質においても生じる。エンケファリンを含有し、かつ淡蒼球外節に投射する中型有棘ニューロンは、Ｐ物質を含有し、かつ淡蒼球内節に投射するニューロンよりも影響を受ける。ハンチントン病を有する人々において侵される他の脳領域には、黒質、皮層３、５、および６、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉における角回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核、ならびに視床の正中中心核−束傍核複合体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌｐａｒａｆａｓｃｉｃｕｌａｒ）（Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  ３６９：２１８−２２８）が含まれる。
【０００７】
正常なＨｔｔタンパク質の役割は、十分に理解されていないが、それはニューロン形成、アポトーシス細胞死、および小胞輸送に関与し得る。加えて、野生型Ｈｔｔが、線条体ニューロンの生存促進因子である、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を刺激するという証拠が存在する。ＨＤの進行がＨＤのマウスモデルにおいてＢＤＮＦ発現の減少と相関すること（Ｚｕｃｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（２）：１３３−１３９）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介性遺伝子送達を介したＢＤＮＦまたはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のいずれかの送達がＨＤのマウスモデルにおいて線条体（ｓｔｒａｉｔａｌ）ニューロンを保護し得ることが示されてきた（Ｋｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（５）：６８２−６８８）。
【０００８】
ＨＤに対する治療選択肢は、現在のところ非常に限定されている。化合物ゲルダナマイシンによるシャペロニンの過剰発現または熱ショック応答の誘導等の、伸長したポリ−グルタミントラクトを通じて生じるタンパク質凝集に関連する毒性を予防するように設計された、いくつかの可能性のある手法は、インビトロモデルにおいてこれらの毒性の低減を示してきた。他の治療は、疾患の臨床徴候におけるアポトーシスの役割を標的とする。例えば、一方の親がＨＤ対立遺伝子を含有し、他方の親がカスパーゼ１の優性阻害の対立遺伝子を有した場合のマウスの対合の子孫における動物モデルで、カスパーゼ活性の遮断を介した疾患症状の緩徐化が示されてきた。さらに、カスパーゼによる変異ＨＤ  Ｈｔｔの切断は、疾患の病原性において役割を果たし得る。カスパーゼ−６耐性変異Ｈｔｔを担持するトランスジェニックマウスは、カスパーゼ非耐性変異Ｈｔｔ対立遺伝子を担持するマウスと比較して、正常なニューロン機能を維持することが見出され、線条体神経変性を発症しなかった（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２５：１１７９−１１９１を参照されたい）。アポトーシス経路のメンバーを標的とする分子もまた、総体症状に対する緩徐化効果を有することが示されてきた。例えば、両方ともカスパーゼ活性を阻害する、化合物ｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびミノサイクリンは、マウスにおいて疾患徴候を緩徐化することが示されてきた。薬物レマセミドもまた、この化合物がＮＤＭＡ受容体への変異Ｈｔｔの結合を阻止して、神経細胞への毒性作用の行使を阻止すると考えられたため、ヒトの小規模なＨＤ治験において使用されてきた。しかしながら、これらの治験において、ニューロン機能の統計的に有意な改善は、何ら観察されなかった。加えて、ハンチントン研究グループは、補酵素Ｑを使用して無作為二重盲検試験を行った。補酵素Ｑ１０で治療された患者の間でより緩徐な疾患進行の傾向が観察されたものの、総計の機能的能力の低下速度における有意な変化は何ら存在しなかった。（Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（同書））。米国特許公開第２０１１／００８２０９３号は、Ｈｔｔに標的を定められた特異的なジンクフィンガータンパク質を開示する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）６：７５６〜７６５
【非特許文献２】Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００６）４３：８９３〜８９６
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒ、Ｌａｎｃｅｔ（２００７）３６９：２１８−２２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
故に、ハンチントン病の治療および予防のための組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ハンチントン病を治療するための方法および組成物が本明細書に開示される。特に、ハンチントン疾患を治療するためにＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子を修飾する（例えばその発現を調節する）ための方法および組成物が本明細書に提供される。ハンチントン病の動物モデルを生成するための方法および組成物もまた提供される。
【００１２】
故に、一態様において、ＨＤ対立遺伝子（例えばＨｔｔ）の発現を調節する、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質）が提供される。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）があらかじめ選択された標的部位に結合するように改変された（例えば、選択および／または合理的設計によって）、非天然型ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多いジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーが、選択された配列（複数可）（例えば遺伝子（複数可））における標的副部位に結合する認識ヘリックスを有する。同様に、本明細書に記載されるＴＡＬＥタンパク質のいずれも、任意の数のＴＡＬＥ  ＲＶＤを含んでもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的ＤＮＡ結合を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）は、非天然型である。ある特定の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、表１Ａおよび１Ｂに示される認識ヘリックスを有する。他の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、表２Ａおよび２Ｂに示される標的配列に結合する。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、表２Ｃにおける認識ヘリックスを含む。ある特定の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、例えば、対象への投与のために、医薬組成物へと製剤化される。
【００１３】
一態様において、ＨｔｔのＣＡＧ反復領域の完全にまたは部分的に外側の配列に結合する、抑制因子（ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦ）が提供される。別の態様において、ＨｔｔのＣＡＧ反復領域内の配列に結合する、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ抑制因子（ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦ）が提供される。いくつかの実施形態において、これらのＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦは、野生型の反復トラクトの長さと比べて、伸長したトリヌクレオチドトラクトに優先的に結合し、それによって伸長した対立遺伝子の優先的な抑制を達成する。いくつかの実施形態において、これらのＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦは、ＤＮＡに結合したときに多量体化を可能にする、タンパク質相互作用ドメイン（または「二量体化ドメイン」）を含む。いくつかの実施形態において、これらのＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦは、多数のＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質によって、伸長した対立遺伝子が野生型対立遺伝子よりもより効率的に結合されるように、反復配列への協同的なＤＮＡ結合を達成して、変異対立遺伝子の優先的な抑制を可能にする。これらの協同的に結合するＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦは、ＤＮＡに結合したときに多量体化を可能にするタンパク質相互作用ドメインをさらに含有することもしないこともある。いくつかの実施形態において、ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦは、所与のサイズの多量体の安定な複合体を形成し、故に、ある特定の最小サイズを上回るＣＡＧトラクトと優先的に相互作用することが可能であり、その最小サイズは、野生型ＣＡＧトラクトの長さを超える。
【００１４】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される（例えば、２本の手を持つ（ｔｗｏ−ｈａｎｄｅｄ）、多量体化等）ＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質は、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を優先的に修飾する。いくつかの実施形態において、ＺＦＰまたはＴＡＬＥは、伸長したトラクトがポリ−グルタミンをコードする変異Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合する一方で、他の実施形態において、ＺＦＰまたはＴＡＬＥは、伸長トラクトがポリ−セリンをコードする変異Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合する。故に、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦは、Ｈｔｔ対立遺伝子の野生型および変異型の両方を調節する。ある特定の実施形態において、ＺＦＰまたはＴＡＬＥは、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみを調節する。他の実施形態において、ＺＦＰまたはＴＡＬＥは、Ｈｔｔの変異型のみを調節する。
【００１５】
他の実施形態において、伸長したＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子に関連する既知のＳＮＰに優先的に結合する、抑制型ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦが提供される。このようにして、ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦは、ＳＮＰを含有する変異Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的であることにより、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の特異的抑制を可能にする。別の態様において、野生型対立遺伝子に関連するＳＮＰと相互作用することによって野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を特異的に活性化する、ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦが提供される。このようにして、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみが活性化される。
【００１６】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＴＡＬＥタンパク質は、融合タンパク質の一部として制御ドメイン（または機能的ドメイン）と作動的に連結させることができる。機能的ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、および／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。ＺＦＰまたはＴＡＬＥとの融合のために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することによって、かかる融合タンパク質を使用して、遺伝子発現の活性化または抑制のいずれかを行うことができる。いくつかの実施形態において、変異Ｈｔｔ発現を下方制御するために使用することができる転写抑制ドメインに融合された、本明細書に記載される変異Ｈｔｔに標的を定められたＺＦＰまたはＴＡＬＥを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を上方制御することができる転写活性化ドメインに融合された、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に標的を定められたＺＦＰまたはＴＡＬＥを含む、融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態において、制御ドメインの活性は、細胞の転写機構との相互作用が外因性リガンドの不在下では起こらないように、外因性小分子またはリガンドによって制御される。かかる外部リガンドは、転写機構とのＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦの相互作用の程度を調節する。制御ドメイン（複数可）は、１つ以上のＺＦＰまたはＴＡＬＥの間、１つ以上のＺＦＰまたはＴＡＬＥの外部、およびそれらの任意の組み合わせを含む、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのうちの１つ以上の任意の部分（複数可）に作動的に連結されてもよい。本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも、医薬組成物へと製剤化されてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質の一部としてヌクレアーゼ（切断）ドメインと作動的に連結させることができる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系等のヌクレアーゼ系を、特異的な単一ガイドＲＮＡと共に利用して、ヌクレアーゼの標的をＤＮＡにおける標的箇所に定めてもよい。ある特定の実施形態において、かかるヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ融合物は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはニューロン幹細胞等の幹細胞内の変異Ｈｔｔ対立遺伝子を標的とするために利用されてもよく、このヌクレアーゼ融合物の活性は、野生型の数のＣＡＧ反復を含有するＨｔｔ対立遺伝子をもたらすであろう。ある特定の実施形態において、修飾された幹細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
なおも別の態様において、本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。別の態様において、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび単一ガイドＲＨＡをコードするポリヌクレオチドが提供される。かかるポリヌクレオチドは、ハンチントン病を治療することが望ましい対象に投与することができる。
【００１９】
依然としてさらなる態様において、本発明は、ハンチントン病の研究のための特異的モデル系を生成するための方法および組成物を提供する。ある特定の実施形態において、特定の長さ（例えば、５０、８０、１０９、および１８０回ＣＡＧ反復）のトリヌクレオチド伸長トラクトが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ主導型標的組み込みを使用して野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に挿入される、細胞株および動物系統を生成するために、胚性幹細胞を使用して変異Ｈｔｔ対立遺伝子を生成するモデルが、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、モデル系は、インビトロ細胞株を含む一方で、他の実施形態において、モデル系は、トランスジェニック動物を含む。本明細書に記載される動物モデルのいずれかにおいて、動物は、例えば、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）またはラビットであってもよい。
【００２０】
なおも別の態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組み込み能を有するもしくは組み込み欠損型レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。故に、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的組み込みのためのドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）もまた本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組み込み能を有するレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープで、または他のエンベロープでシュードタイピングされる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、標的対立遺伝子（例えば、変異Ｈｔｔ）が発現マーカーでタグされた、ハンチントン病に対するモデル系が提供される。ある特定の実施形態において、変異対立遺伝子（例えば変異Ｈｔｔ）がタグされる。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子（例えば野生型Ｈｔｔ）がタグされ、さらなる実施形態において、野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の両方が別個の発現マーカーでタグされる。ある特定の実施形態において、モデル系は、インビトロ細胞株を含む一方で、他の実施形態において、モデル系は、トランスジェニック動物を含む。
【００２２】
さらに、核酸および／またはタンパク質（例えば、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥまたはＺＦＰもしくはＴＡＬＥを含む融合タンパク質）を含む医薬組成物もまた提供される。例えば、ある特定の組成物は、制御配列に作動可能に連結された本明細書に記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥのうちの１つをコードする配列を含む核酸を、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含み、この制御配列は、細胞内でのその核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態において、コードされるＺＦＰまたはＴＡＬＥは、ＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子を調節するＺＦＰまたはＴＡＬＥ、および神経栄養因子を調節するＺＦＰまたはＴＡＬＥを含む。タンパク質ベースの組成物は、本明細書に開示されるさらなるＺＦＰまたはＴＡＬＥのうちの１つ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００２３】
なおも別の態様において、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む、単離された細胞もまた提供される。
【００２４】
別の態様において、本明細書に記載される方法および組成物を使用してハンチントン病を治療するおよび／または予防するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質がウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばプラスミド）、および／またはそれらの組み合わせを使用して送達され得る、組成物を伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥを含む、または本発明のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系により改変された、幹細胞集団を含む、組成物を伴う。
【００２５】
これらのおよび他の態様は、本開示を全体として考慮すると、当業者に容易に明らかとなろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
Ｈｔｔ遺伝子に結合する非天然型ジンクフィンガータンパク質であって、上記ジンクフィンガータンパク質は、Ｆ１〜Ｆ４、Ｆ１〜Ｆ５、およびＦ１〜Ｆ６と順序付けられた、４つ、５つ、または６つのジンクフィンガードメインを含み、上記ジンクフィンガードメインは、表１Ｂの単一の列に示される認識ヘリックス領域配列を含む、ジンクフィンガータンパク質。
（項目２）
上記ジンクフィンガータンパク質は、上記Ｈｔｔ遺伝子の上記ＣＡＧ反復領域の外側のみに結合するか、またはその外側に部分的に結合する、項目１に記載のジンクフィンガータンパク質。
（項目３）
上記ジンクフィンガータンパク質は、上記Ｈｔｔ遺伝子の上記ＣＡＧ反復領域内の配列に結合する、項目１に記載のジンクフィンガータンパク質。
（項目４）
ＤＮＡに結合したときにジンクフィンガータンパク質の多量体化を可能にする、二量体化ドメインをさらに含む、項目１〜３のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質および機能的ドメインを含む、融合タンパク質。
（項目６）
上記機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、およびヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目７）
項目１〜４に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質または項目５または６に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目８）
項目１〜４に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質、項目５または６に記載の１つ以上の融合タンパク質、あるいは項目７に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
（項目９）
項目１〜４に記載の１つ以上のジンクフィンガータンパク質、項目５または６に記載の１つ以上の融合タンパク質、あるいは項目７に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
（項目１０）
細胞内のＨｔｔ遺伝子の発現を修飾する方法であって、上記細胞に、項目５に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを投与することを含む、方法。
（項目１１）
上記Ｈｔｔ遺伝子は、少なくとも１つの変異対立遺伝子を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記Ｈｔｔ遺伝子は、野生型である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
上記融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、上記Ｈｔｔ遺伝子の発現は、不活性化される、項目１０〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
細胞内のＨｔｔ遺伝子を修飾する方法であって、上記方法は、上記細胞に、項目５に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを投与することを含み、上記１つ以上の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含み、上記Ｈｔｔ遺伝子の上記配列は修飾される、方法。
（項目１５）
ハンチントン病を治療する方法であって、上記方法は、上記細胞に、項目５に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、治療を必要とする対象に対して投与することを含む、方法。
（項目１６）
ハンチントン病の研究のためのモデル系を生成する方法であって、項目１４に記載の方法に従ってＨｔｔ遺伝子を修飾することを含む、方法。
（項目１７）
上記Ｈｔｔ遺伝子は、１つ以上の変異対立遺伝子を含むように修飾される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記変異対立遺伝子は、伸長したトリヌクレオチド反復を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記細胞は、胚性幹細胞を含む、項目１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】（パネルＡ〜Ｅ）野生型および変異（ハンチントン病、ＨＤ）ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子ならびにそれらの対立遺伝子に結合する種々のＺＦＰ−ＴＦを描写する略図である。図１Ａは、ＣＡＧ反復の外側で結合し、したがって野生型対立遺伝子および変異（ＨＤ）対立遺伝子に均等に結合することが予測される、ＺＦＰ設計を示す。「ＫＲＡＢ」は、ＫＯＸ１遺伝子からのＫＲＡＢ抑制ドメインを指し、「ＺＦＰ」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質を指す。「標準ＺＦＰ  ＴＦ」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインがＫＲＡＢ抑制ドメインに連結されている、ＺＦＰ転写因子融合タンパク質である。
【図１Ｂ】（パネルＡ〜Ｅ）野生型および変異（ハンチントン病、ＨＤ）ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子ならびにそれらの対立遺伝子に結合する種々のＺＦＰ−ＴＦを描写する略図である。図１Ｂは、ＣＡＧ領域内で結合するように設計されたＺＦＰ−ＴＦを示す。
【図１Ｃ】（パネルＡ〜Ｅ）野生型および変異（ハンチントン病、ＨＤ）ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子ならびにそれらの対立遺伝子に結合する種々のＺＦＰ−ＴＦを描写する略図である。図１Ｃは、ジンクフィンガードメインの２つのクラスタが強固なタンパク質配列によって分離されるＺＦＰ転写因子である、「２本の手を持つＺＦＰ  ＴＦ」を描写する。機能的（抑制）ドメインは、この図において１つのＺＦＰの外側に描写されるが、機能的ドメインは、ＺＦＰの間にあっても、タンパク質のいずれかの末端上でＺＦＰの外側にあってもよいことが明らかであろう。
【図１Ｄ】（パネルＡ〜Ｅ）野生型および変異（ハンチントン病、ＨＤ）ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子ならびにそれらの対立遺伝子に結合する種々のＺＦＰ−ＴＦを描写する略図である。図１Ｄは、多量体化ドメイン（斑点ボックスとして描写される）を通じて多量体化することが可能であるＺＦＰ  ＴＦである、「多量体化ＺＦＰ  ＴＦ」を描写する。
【図１Ｅ】（パネルＡ〜Ｅ）野生型および変異（ハンチントン病、ＨＤ）ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子ならびにそれらの対立遺伝子に結合する種々のＺＦＰ−ＴＦを描写する略図である。図１Ｅは、２つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが柔軟なリンカーによって連結され、またＫＲＡＢドメインにも融合された、ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＲＡＢ構成を描写する。全ての融合タンパク質において、機能的ドメインがＤＮＡ結合ドメインのいずれの末端上にもあり得、ＤＮＡ結合ドメインが広範な数のジンクフィンガーを含んでもよいことは、当業者に明らかとなろう。また、機能的ドメイン（例えば、活性化、抑制、切断ドメイン）も黒の菱形を有するボックスとして図１に描写される。図に提示される例となるモデルがＴＡＬＥ  ＴＦにも同様に適用され得ることは、当業者に明らかとなろう。
【図２Ａ】（パネルＡ〜Ｅ）ＣＡＧ反復配列に結合しないＺＦＰ  ＴＦを使用した、図１Ａに記載されるＺＦＰによるＨｔｔの両方の対立遺伝子の抑制を描写する。表１Ａおよび１Ｂに示されるＺＦＰ識別番号は、バーの下に示される。図２Ａは、ヒト遺伝子における５つの遺伝子座を標的とするＺＦＰを使用した、ＨＥＫ２９３細胞内のヒトＨｔｔ対立遺伝子の抑制を描写する。ヒトＨｔｔ遺伝子の図表が示され、ＺＦＰ結合部位の箇所が示される。各ＺＦＰ群について、各バーは、独立したトランスフェクションを表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＧＦＰ対照または１８８５６  ＺＦＰ  ＴＦ抑制因子（ＫＯＸ１のＫＲＡＢ抑制ドメインを含む）でトランスフェクトされた、ＨＥＫ２９３細胞内のＨｔｔタンパク質レベルを示すウェスタンブロットを描写し、ここでＮＦκＢ  ｐ６５レベル（「ｐ６５」）を使用して、均等なタンパク質ローディングを確認した。ウェスタンブロットは、ＺＦＰ−ＴＦによるＨｔｔ発現の抑制を確認する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞内のマウスＨｔｔ特異的ＺＦＰについての、図２Ａと同様のデータの組を描写する。図２Ａにあるように、マウスＨｔｔ遺伝子の図表が示され、ＺＦＰ結合部位の箇所が示される。
【図２Ｄ】図２Ｄおよび２Ｅは、異なる用量のＺＦＰ−ＴＦ  ｍＲＮＡをトランスフェクションに使用した、不死化線条体細胞内のマウスＨｔｔ遺伝子発現（ＲＮＡ）の抑制を実証する。図２Ｂを除く全ての場合において、Ｈｔｔ  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定し、アクチンｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。
【図２Ｅ】同上。
【図３Ａ】（パネルＡ〜Ｇ）図１Ｂに例示される、ＣＡＧ反復領域内で結合するＺＦＰを使用することによる変異Ｈｔｔの選択的抑制を描写する。このモデルは、変異対立遺伝子におけるより長いＣＡＧ反復領域が、ＣＡＧ標的化ＺＦＰ抑制因子分子の増加した結合を可能にすることを例示する。図３Ａは、ＨＥＫ２９３細胞内のＣＡＧ標的化ＺＦＰによる内因性Ｈｔｔ遺伝子（正常なＣＡＧ反復長を有する）に対する異なる抑制因子活性を描写する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１０〜４７回ＣＡＧ反復の範囲の様々な長さのＣＡＧ反復を含有するＨｔｔプロモーター／エクソン１断片によって調節される、ルシフェラーゼレポーターの抑制を示す。ＣＡＧ１０（２つの示される条件の各々に対する最も左側のバー）は、１０回ＣＡＧ反復による結果を示し、ＣＡＧ１７（２つの示される条件の各々に対する左から２番目のバー）は、１７回ＣＡＧ反復による結果を示し、ＣＡＧ２３（２つの示される条件の各々に対する右から２番目のバー）は、２３回ＣＡＧ反復による結果を示し、ＣＡＧ４７（２つの示される条件の各々に対する最も右側のバー）は、４７回ＣＡＧ反復による結果を示す。グラフの上の略図は、この系において使用されたＨｔｔプロモーター、エクソン１、ＣＡＧ反復、およびレポータールシフェラーゼ遺伝子の配列を描写する。データは、ＣＡＧの数を増加させることが、ＣＡＧ標的化ＺＦＰによるＨｔｔプロモーターからの減少した発現につながることを実証する。
【図３Ｃ】さらに、図３Ｃは、試験された全ての用量で、比較的弱いＣＡＧ標的化ＺＦＰが、正常な長さのＣＡＧ反復ならびに強力なＣＡＧ抑制因子を含有するルシフェラーゼレポーターを抑制しないが、それが、強力なＣＡＧ標的化ＺＦＰと同様の、伸長したＣＡＧ反復を含有するルシフェラーゼレポーターの抑制を主導することを実証する。「ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ２３−イントロン１」（各対の左側のバー）は、野生型対立遺伝子からの発現に対応する一方で、「ｐＲＬ−ＨｔｔＣＡＧ４７−イントロン１」（各対の右側のバー）は、伸長した変異Ｈｔｔ対立遺伝子（４７回ＣＡＧ反復を含有する）からの発現と相関する。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＨｄＨ（Ｑ１１１／Ｑ７）ノックインマウスに由来する不死化マウス線条体細胞内のＣＡＧ標的化ＺＦＰによる変異Ｈｔｔ（１１１  ＣＡＧ）の抑制を描写するグラフである。野生型発現は、各対の左側のバーに、ノックイン発現は、各対の右側のバーに示される。ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合された、明記されるＺＦＰを含むＺＦＰ−ＴＦを、トランスフェクションにおいて３つの異なる濃度のＺＦＰ  ｍＲＮＡを使用して試験した。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＨＤ患者由来の線維芽細胞株（ＣＡＧ１５／７０）におけるＣＡＧ標的化ＺＦＰによる変異Ｈｔｔ抑制を描写する。この線維芽細胞株において、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子は、１５回ＣＡＧ反復（「０９９Ｔ（ＣＡＧ１５）」、各々示される条件の中央のバー）を含み、伸長した変異Ｈｔｔ対立遺伝子は、７０回ＣＡＧ反復（「０９９Ｃ（ＣＡＧ７０）」、各々示される条件の右側のバー）を含む。
【図３Ｆ】図３Ｆは、４つの異なるＨＤ患者由来の線維芽細胞株における変異Ｈｔｔ発現の選択的抑制を示す。各群の上の数字は、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子上のＣＡＧ反復の回数（例えば、１５または１８回）、および変異対立遺伝子上のＣＡＧ反復の回数（例えば、７０、６７、４５、および４４回）を示し、ここで２つの異なる用量のＺＦＰ  ｍＲＮＡが試験された。各対の左側のバーは、野生型Ｈｔｔ発現を示し、各々の右側のバーは、変異Ｈｔｔの発現を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６４０、３２５２８、および３０６５７の存在下でウェスタンブロット分析によってアッセイした、ＨＤ由来患者線維芽細胞内のＨｔｔ発現を描写する。より緩徐に移動するタンパク質バンドは、伸長した変異Ｈｔｔ対立遺伝子によってもたらされたものである。３２５２８は、Ｈｔｔの転写開始部位（ＴＳＳ）に結合し、故に、両方の対立遺伝子からの発現を阻害する一方で、３０６４０および３０６５７は、ＣＡＧ反復（ＣＡＧ）に結合する。
【図４】（パネルＡおよびＢ）ＣＡＧ反復に標的を定められたＺＦＰのパネルによるＨＤ患者由来の線維芽細胞株における変異Ｈｔｔの抑制を描写する。０．１ｎｇ〜３μｇの様々なＲＮＡ濃度を使用した。図４Ａおよび４Ｂにおいて、各々示される条件の左側のバーは、総計のＨｔｔ発現を示し、中央のバーは、線維芽細胞内のＨｔｔの発現を示し、このＨｔｔ対立遺伝子は、１８回ＣＡＧ反復（「０９９Ｔ（ＣＡＧ１８）」）を含み、伸長した変異Ｈｔｔ対立遺伝子は、４５回ＣＡＧ反復０９９Ｔ（ＣＡＧ４５）を含む。
【図５】ＨＤ患者由来の線維芽細胞内のＨｔｔおよび他のＣＡＧ含有遺伝子の発現に対するＣＡＧ標的化ＺＦＰ抑制因子の効果を示す。各々示される条件の下の左側のバーは、３０６４０による結果を示し、各々示される条件の下の中央のバーは、３０６７５による結果を示し、右側のバーは、偽トランスフェクションを示す。
【図６】（パネルＡおよびＢ）３つのＣＡＧ標的化ＺＦＰのゲノム全域にわたる特異性を検査する実験を描写する。図６Ａは、３０６４０、３０６４５、または３３０７４を使用してＨＤ線維芽細胞（ＣＡＧ１８（中央のバー）／ＣＡＧ４５、右側のバー）の６つの生物学的反復実験試料（６つの別個のトランスフェクション）に対して行われた、Ｈｔｔ抑制のｑＰＣＲ分析を描写する。ｑＰＣＲによる４つの最も類似した反復実験試料を次いで、マイクロアレイ分析のために選択し、そのデータが図６Ｂに提示される。
【図７】ＣＡＧ１７／６９ニューロン幹細胞（ＮＳＣ）中のＨｔｔ抑制を描写する。細胞を示される用量のＺＦＰ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。示される用量の各々の下の左側のバーは、ＣＡＧ１７細胞内での結果を示し、中央のバーは、野生型細胞内での結果を示し、右側のバーは、ＣＡＧ６９細胞内での結果を示す。
【図８】ＺＦＰ  ＴＦで処理されたＨＤ胚性幹細胞（ＥＳＣ）（ＣＡＧ  １７／４８）から分化したニューロンにおけるＨｔｔ発現を描写する。細胞を示される用量のＺＦＰ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。
【図９】ＺＦＰ  ＴＦ  ３０６４０での処置に次ぐ、Ｒ６／２マウスにおける変異Ｈｔｔ導入遺伝子発現の抑制を描写する。
【図１０−１】（パネルＡ〜Ｄ）図１Ｄに例示される、伸長したＣＡＧ反復を特異的に標的とする多量体化ドメインを有するＺＦＰを描写する。図１０Ａは、次の４つの構成要素を有する単一のＺＦＰを示す：（ｉ）ＫＯＸ抑制因子ドメイン（「抑制因子」とラベルされた楕円形）；（ｉｉ）（ＣＡＧ）Ｎに結合する２〜６つのフィンガーのアレイ（２つが示される、「Ｚ」とマークされた小さい楕円形）またはこの配列の並べ替え；および（ｉｉｉ）アンチパラレル構成で相互作用する２つの二量体化ドメイン（「ｄ１」および「ｄ２」とラベルされた長方形）。これらのドメインは、ＺＦＰがＣＡＧトラクトの主溝内で重合体化することを可能にする。図１０Ｂは、３つのＺＦＰの多量体による結合事象の概略を示す。任意の数の多量体を使用することができ、機能的ドメインは、個々のＺＦＰのうちの１つ以上の上のいずれの場所に位置付けられてもよく、これらの図表は、ＴＡＬＥ−ＴＦにも同様に適用可能であることが明らかとなろう。
【図１０−２】図１０Ｃは、二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）の間の相互作用を介して多量体化するように設計される、４つのＺＦＰ単量体足場のタンパク質配列を示す。足場は、ＤＺ１（配列番号１８０）、ＤＺ２（配列番号１８１）、ＤＺ３（配列番号１８２）、およびＤＺ４（配列番号１８３）と名付けられる。二量体化ジンクフィンガードメインは、下線を引かれる一方で、抑制ドメインおよび核局在化配列は、（それぞれ）太字の下線および斜体文字によって示される。
【図１０−３】図１０Ｄは、コイルドコイル（ＣＣ）の間の相互作用を介して多量体化するように設計される、７つのＺＦＰ単量体足場のタンパク質配列を示す。足場は、ＣＣ１（配列番号１８４）、ＣＣ２（配列番号１８５）、ＣＣ３（配列番号１８６）、ＣＣ４（配列番号１８７）、ＣＣ５（配列番号１８８）、ＣＣ６（配列番号１８９）、およびＣＣ７（配列番号１９０）と名付けられる。コイルドコイル配列は、下線を引かれる一方で、抑制ドメインおよび核局在化配列は、（それぞれ）太字の下線および斜体文字によって示される。設計間で異なるであろう各足場のＺＦＰ領域の箇所は、「［ＺＦＰ］」によって示される。設計間で異なるであろう各足場の（ＤＮＡ結合）ＺＦＰ領域の箇所は、「［ＺＦＰ］」によって示される。
【図１０−４】同上。
【図１１Ａ】（パネルＡおよびＢ）二量体化ドメインを有するＺＦＰ−ＴＦの活性を描写する。図１１Ａにおいて、「コイルドコイル」（ＣＣ）ドメインを有するＺＦＰ−ＴＦを、ルシフェラーゼレポーターにより試験した。ｐＲＬ−Ｈｔｔ  ＣＡＧ１７（各対の左側のバー）は、１７回ＣＡＧを有するヒトＨｔｔプロモーター／エクソン１断片によって調節される、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターを表し、ｐＧＬ３−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７（各対の右側のバー）は、４７回ＣＡＧ反復を有するヒトＨｔｔプロモーター／エクソン１断片によって調節される、ホタルルシフェラーゼレポーターを表す。種々の二量体化ドメインの説明については、実施例１０における本文を参照されたい。
【図１１Ｂ】図１１Ｂにおいて、二量体化ジンクフィンガー「ＤＺ」ドメインを有するＺＦＰを同じルシフェラーゼレポーターにより試験したところ、いくつかのＺＦＰ−ＴＦ二量体化ドメインによる増加した抑制が実証される。各二重組における左側のバーは、１７回ＣＡＧ反復Ｈｔｔ対立遺伝子からの発現を示す一方で、右側のバーは、４７回ＣＡＧ反復Ｈｔｔ対立遺伝子からの発現を示す。
【図１２】（パネルＡおよびＢ）ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸタンパク質によるＨｔｔの抑制を描写する。図１２Ａは、野生型（左側のバー）、ＣＡＧ１８（中央のバー）、およびＣＡＧ４５（右側のバー）（図１２Ａ）ＨＤ線維芽細胞内の、単一の３３０８８および３３０８４  ＺＦＰ−ＴＦによるＨｔｔの抑制、ならびに３３０８８〜３３０８８および３３０８８〜３３０８４  ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸタンパク質による抑制を描写する。図１２Ｂは、野生型（左側のバー）、ＣＡＧ  ２０（中央のバー）、およびＣＡＧ４１（左側のバー）ＨＤ線維芽細胞内の、３３０８８〜３３０８８および３３０８８〜３３０８４  ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸによるＨｔｔ抑制を描写する。
【図１３Ａ】（パネルＡ〜Ｅ）マウスＨｔｔの活性化を描写する。図１３Ａは、ｐ６５活性化ドメインに融合されたＺＦＰを使用した、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞内のＲＮＡレベルでのマウスＨｔｔ遺伝子のＺＦＰ−ＴＦ主導型の上方制御を実証する。二重バーは、二重トランスフェクションを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＺＦＰによって主導される増加したＨｔｔタンパク質産生を実証する、ウェスタンブロットを描写する。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、野生型マウスＨｔｔ対立遺伝子、およびマウス配列（エクソン１のほとんどおよびイントロン１の一部、野生型対立遺伝子の略図の上の線）が、ＣＡＧ伸長を有する対応するヒト配列で置換された（ノックイン対立遺伝子の略図上の線）、「ノックイン」Ｈｔｔ対立遺伝子を描写する。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ノックイン対立遺伝子が、ＺＦＰ（ＡおよびＢに示される）がマウス配列に特異的に結合するように設計されることを可能にするのに十分な配列の発散を有するように、対応するヒト配列（配列番号１９２）で置換されたマウス配列（配列番号１９１）間のアライメントを描写する。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ＨｄｈＱ１１１／Ｑ７ノックインマウスに由来する不死化線条体細胞内の野生型マウスＨｔｔ対立遺伝子の特異的活性化を描写する。左側のバーは、野生型細胞内での結果を示し、右側のバーは、ノックイン変異対立遺伝子細胞内での結果を示す。
【図１４】（パネルＡおよびＢ）Ｈｔｔ特異的ＺＦＮ対でのＫ５６２細胞の処置に次ぐ、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）の結果を描写する。活性ＺＦＮについてのＮＨＥＪ活性（インデル）パーセントは、対応するレーンの底部に示される。「ＧＦＰ」は、ＧＦＰコードプラスミドでトランスフェクトされた細胞を示す。図１４Ａは、先のＨｔｔエクソンを切断するＺＦＮからの結果を描写する一方で、図１４Ｂは、停止コドン近くを切断するＺＦＮからの結果を描写する。不活性ＺＦＮ対もまた観察した（インデル百分率で注釈を付けられていないレーン）。
【図１５】いくつかの候補ＴＡＬＥ−ＴＦタンパク質についてのＨｔｔ抑制結果のグラフを描写する。ＴＡＬＥ−ＴＦをＨＤ患者由来の線維芽細胞内（ＣＡＧ  ２０／４１）で試験した。結果は、ＴＡＬＥ  ＴＦのうちのいくつかが全体的なＨｔｔ発現を抑制することにおいて活性であった一方で、他のものが変異Ｈｔｔに優先的な抑制を示したことを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ハンチントン病（ＨＤ）を治療するための組成物および方法が本明細書に開示される。特に、ハンチントン病を治療するまたは予防することにおいて使用するために、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ  ＴＦ）またはＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）を含むＨｔｔ調節転写因子およびかかるタンパク質を利用する方法が提供される。例えば、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を抑制する、または野生型Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を活性化する、ＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦが提供される。加えて、ＨＤに関連する遺伝子のゲノム構造を修飾するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が提供される。例えば、Ｈｔｔの変異型の部分を特異的に改変することが可能であるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が提供される。これらには、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質または遺伝子操作されたＴＡＬＥタンパク質、すなわち、既定の核酸標的配列に結合する非天然型タンパク質を使用した、組成物および方法が含まれる。
【００２８】
故に、本明細書に記載される方法および組成物は、ハンチントン病の治療および予防のための方法を提供し、これらの方法および組成物は、標的遺伝子を調節することが可能であるジンクフィンガー転写因子またはＴＡＬＥ転写因子、ならびにＨｔｔを修飾するまたは編集することが可能な遺伝子操作されたジンクフィンガーおよびＴＡＬＥヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含むことができる。
【００２９】
概要
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指定されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９および第３版２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期改訂版、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３０】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状立体配座であり、かつ１本鎖または２本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を指す。本開示の目的のために、これらの用語は、重合体の長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成する。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために交換可能に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸重合体にも適用される。
【００３２】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。かかる相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、すなわち、結合親和性の増加は、Ｋｄの低下と相関している。
【００３３】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合する（そしてホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができ、かつ／または、それは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
【００３４】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的な様態でＤＮＡに結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
【００３５】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともある程度の配列相同性を示す。
【００３６】
ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域の遺伝子操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤの遺伝子操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。したがって、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、非天然型であるタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その設計／組成が、主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納するデータベース内で情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、また、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、ならびに米国特許公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
【００３７】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、および同第ＷＯ２０１１／１４６１２１号（米国特許公開第２０１１０３０１０７３号）を参照されたい。
【００３８】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞内の２本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与し得る。かかる特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
【００３９】
本開示の方法において、本明細書に記載される１つ以上の標的化ヌクレアーゼは、既定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）に２本鎖切断を作製し、その切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。２本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを容易にすることが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよいか、または代替として、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した切断の修復のための鋳型として使用され、その結果、ドナー内のヌクレオチド配列の全てまたは一部の細胞クロマチンへの導入をもたらす。故に、細胞クロマチン内の第１の配列は、改変することができ、特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列へと変換することができる。故に、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味における配列の置換）を表すと理解することができ、あるポリヌクレオチドの、別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要ではない。
【００４０】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、細胞内のさらなる標的部位のさらなる２本鎖切断のために、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質のさらなる対が使用され得る。
【００４１】
細胞クロマチン内の目的領域内の配列の標的組換えおよび／または置換および／または改変のための方法のある特定の実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を用いた相同組換えによって改変される。切断領域に対して相同な配列が存在する場合、かかる相同組換えは、細胞クロマチン内の２本鎖切断の存在によって刺激される。
【００４２】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的領域のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含有することができ、それによって、目的領域内に非同一配列を挿入するための相同組換えを刺激する。故に、ある特定の実施形態において、目的領域内の配列と相同であるドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列に約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、１００を超える連続的な塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある特定の場合、新たな配列が目的領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的領域には存在しない配列を含有することがでる。これらの事例において、非相同配列には、一般に、５０〜１，０００塩基対（もしくはその間の任意の整数値）の配列、または目的領域内の配列と相同もしく同一である１，０００を超える任意の数の塩基対が隣接する。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム内に挿入される。
【００４３】
本明細書に記載される方法のいずれも、目的遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる、細胞内の１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化に使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を含む細胞株もまた提供される。
【００４４】
さらに、本明細書に記載される標的組み込みの方法を使用して、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、ならびに１つ以上の調節要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
【００４５】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない、多様な方法によって開始することができる。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能であり、２本鎖切断は、２つの別個の１本鎖切断事象の結果として生じる可能性がある。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドが、標的とする２本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【００４６】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と組み合わさって、切断活性（好ましくは、２本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すように交換可能に使用される。
【００４７】
「遺伝子操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された切断ハーフドメイン）と共に偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。また、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、および同第２０１１／０２０１０５５号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状、環状、または分岐状であり得、１本鎖または２本鎖のいずれでもあり得る。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００４９】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のうちのそれぞれ２つを含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、（生物に依存して可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核および真核の両方の、全ての種類の細胞核タンパク質を包含することが意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５０】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合であるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００５１】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５２】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。
【００５３】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在する」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体筋細胞に対する外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対する外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。
【００５４】
外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体）、または上記分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、１本鎖または２本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸は、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質介在性導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入、およびウイルスベクター媒介性導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列が、もともとマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入されてよい。
【００５６】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然型エピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００５７】
「融合」分子は、好ましくは共有結合的に、２つ以上のサブユニット分子が連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達からもたらされ得るか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に送達され、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成することによってもたらされ得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結もまた、細胞内のタンパク質の発現に関与する可能性がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００５９】
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称される）は、ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦのアミノ末端領域、カルボキシ末端領域、またはアミノおよびカルボキシ末端領域で組み込まれるドメインである。これらのドメインは、複数のＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦ単位の多量体化を可能にし、その結果、トリヌクレオチド反復ドメインのより大きなトラクトが、野生型の数の長さを有するより短いトラクトと比べて、多量体化ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦによって優先的に結合されるようになる。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインはまた、小分子によって制御されてもよく、その多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下でのみ別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にするために適正な立体配座をとる。このようにして、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を制御することができる。
【００６０】
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記を参照されたい）をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域（かかる制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６１】
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００６２】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節には、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰもＴＡＬＥタンパク質も含まない細胞と比較した、遺伝子発現におけるいずれの低減も指す。故に、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００６３】
「目的領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列等である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであり得る。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム内に存在し得る。目的領域は、遺伝子のコード領域内、転写される非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
【００６４】
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）という用語は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように構成要素が配置された、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並置を指して交換可能に使用される。例示説明として、転写制御配列が、１つ以上の転写制御因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを調節する場合、プロモーター等の転写制御配列がコード配列に作動的に連結される。転写制御配列は、一般に、コード配列と共にシスに作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが近接していない場合でも、コード配列に作動的に連結された転写制御配列である。
【００６６】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同じ機能を、他の構成要素との連結において実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは作動的に連結している。遺伝子発現を制御することが可能なドメインに融合されたＺＦＰは、集合的に「ＺＦＰ−ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と称される一方で、遺伝子発現を制御することが可能なドメインに融合されたＴＡＬＥは、集合的に「ＴＡＬＥ−ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と称される。ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチド（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合可能である一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動的に連結している。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチド（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチドにおいて、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合可能である一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動的に連結している。
【００６７】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または、１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【００６８】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、かつ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物を意味する。故に、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
【００６９】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしも必要でないが好ましくは通例のアッセイにおいて、容易に測定される、タンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗体の耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色したタンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに向上した細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
【００７０】
ＤＮＡ結合ドメイン
Ｈｔｔを含むが、これらに限定されない、トリヌクレオチド反復を含む任意の遺伝子において標的配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が、本明細書に記載される。任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができる。
【００７１】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択の標的部位に結合するように遺伝子操作されているという点で非天然型である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然型ジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することができる。遺伝子操作方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはカドラプレット）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連している。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、例となる選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００７４】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。また、６アミノ酸長以上の例となるリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００７５】
標的部位の選択、ＺＦＰ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳述される。
【００７６】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。また、６アミノ酸長以上の例となるリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００７７】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｈｔｔ遺伝子における（配列特異的様態で）標的部位に結合し、Ｈｔｔの発現を調節する、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質である。ＺＦＰは、変異Ｈｔｔ対立遺伝子または野生型Ｈｔｔ配列のいずれかに選択的に結合することができる。Ｈｔｔ標的部位は、典型的に、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多いフィンガー）を含む可能性がある。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのある特定のものは、４、５、または６個のフィンガーを含む一方で、いくつかのＺＦＰは、８、９、１０、１１、または１２個のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識する一方で、６つのフィンガーを含むＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ＺＦＰはまた、１つ以上の制御ドメインを含む融合タンパク質であり得、そのドメインは、転写活性化または抑制ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。これらのジンクフィンガータンパク質はゆえに、８、９、１０、１１、１２個、またはそれよりも多いフィンガーを含むことができる。いくつかの実施形態において、２つのＤＮＡ結合ドメインは、１つのＤＮＡ結合ドメインが４つ、５つ、または６つのジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインがさらなる４つ、５つ、または５つのジンクフィンガーを含むように、伸長可能な柔軟なリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、もしくは１２個、またはそれよりも多いフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカー等の不定型のリンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの制御ドメインに融合され、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ」構造と考えることができる。これらの実施形態の具体的な例は、柔軟なリンカーで連結され、ＫＯＸ抑制因子に融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」、および２つのＺＦＰ−ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合された「ＺＦＰ−ＫＯＸ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と称され得る。
【００７８】
代替的に、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００７９】
「２本の手を持つ」ジンクフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続の標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスタが介在するアミノ酸によって分離される、タンパク質である。２本の手を持つ種類のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスタが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスタが、カルボキシル末端に位置する、ＳＩＰ１である（Ｒｅｍａｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８（１８）：５０７３−５０８４を参照されたい）。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスタは、固有の標的配列に結合可能であり、２つの標的配列の間の間隔は、多くのヌクレオチドを含むことができる。２本の手を持つＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合された、機能的ドメインを含んでもよい。故に、機能的ドメインは、ＺＦＰの一方もしくは両方の外部に結合されてもよく（図１Ｃを参照されたい）、またはそれらのＺＦＰの間に位置付けられ（両方のＺＦＰに結合され）てもよい（図４を参照されたい）ことが明らかとなろう。
【００８０】
Ｈｔｔ標的化ＺＦＰの具体的な例は、表１Ａおよび１Ｂに開示される。この表における最初の列は、ＺＦＰの内部参照名（番号）であり、表２Ａおよび２Ｂの第１列における同じ名称に対応する。「Ｆ」は、フィンガーを指し、「Ｆ」の後の番号は、どのジンクフィンガーであるかを指す（例えば、「Ｆ１」は、フィンガー１を指す）。
【表１−１】
2019022531.tif 000003
【表１−２】
2019022531.tif 000004
【表１−３】
2019022531.tif 000005
【表１−４】
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【表１−５】
2019022531.tif 000007
【表１−６】
2019022531.tif 000008
【００８１】
これらのタンパク質の標的部位についての配列および箇所は、表２Ａおよび２Ｂに開示される。表２Ａおよび２Ｂは、示されるジンクフィンガータンパク質についての標的配列を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触している標的部位におけるヌクレオチドは、大文字で示され、接触していないヌクレオチドは、小文字で示される。
【表２−１】
2019022531.tif 000009
【表２−２】
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【表２−３】
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【００８２】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、天然型または遺伝子操作された（非天然型）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存された３型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリアに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照されたい）。ＴＡＬＥは、縦列反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説についてはＳｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００８３】
これらのＴＡＬＥの特異性は、縦列反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、反復は、典型的に互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ，（同書））。反復の多型性は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変二残基（ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）の正体と、ＴＡＬＥの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に１対１の対応関係が存在するようである（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照されたい）。実験的に、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードが決定されている。これらのＤＮＡ結合反復を、新たな反復の組み合わせおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用し、植物細胞内の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することが可能である人工転写因子を作製した（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（同書））。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質を、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）を得た。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ（（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）。また、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質と共に使用されるように設計された二量体化ドメインの具体的な例が、表３に列挙される。２種類のドメイン、コイルドコイル（ＣＣ）、および二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）のアミノ酸配列が列挙される。
【表３】
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【００８５】
融合タンパク質
本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）および異種制御（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）を含む、融合タンパク質もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連因子と修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素およびそれらの関連因子と修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連因子と修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００７／０２１８５２８号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
活性化を達成するのに好適なドメインには、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７））、核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能的ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、６４３９−６４４７）が含まれる。さらなる例となる活性化ドメインには、Ｏｃｔ  １、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例となる活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：８７−９９、Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照された��。
【００８７】
ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間の融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが、機能的ドメインとして好適であることは当業者に明白であろう。標的遺伝子に対して活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化等）を動員することが可能である、本質的に任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能的ドメインとして使用するのに好適なインスレータードメイン、局在化ドメイン、およびＩＳＷＩ含有ドメイン、および／またはメチル結合ドメインタンパク質等のクロマチン再構成タンパク質は、例えば、譲受人共通の米国特許出願第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号に、ならびに譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／４４３７６号に記載される。
【００８８】
例となる抑制ドメインには、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２が含まれるが、これらに限定されない。さらなる例となる抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：３０５−３２１、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。
【００８９】
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的共役方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた任意に、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原からのもの等）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニン等）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、融合物の構成要素の中でも翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。
【００９０】
一方の機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との間の融合物は、当業者に既知の生化学的共役方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３９３０−３９３５。
【００９１】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的部位は、細胞クロマチンのアクセス可能領域に存在する。アクセス可能領域は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０１／８３７３２号に記載されるように決定することができる。標的部位が細胞クロマチンのアクセス可能領域に存在しない場合、１つ以上のアクセス可能領域は、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０１／８３７９３号に記載されるように生成することができる。さらなる実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位がアクセス可能領域にあるか否かに関わらず、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、かかるＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することが可能である。この種類の「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核内因子３（ＨＮＦ３）に見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２４４−２５４。
【００９２】
当業者に既知であるが、融合分子は、薬学的に許容される担体と共に製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５、および譲受人共通の国際公開第ＷＯ００／４２２１９号を参照されたい。
【００９３】
融合分子の機能的構成要素／ドメインは、一旦、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能な、多様な異なる構成要素のうちのいずれからも選択することができる。よって、機能的構成要素には、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子、およびサイレンサー等の種々の転写因子ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９４】
さらなる例となる機能的ドメインは、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号に開示される。
【００９５】
外因性小分子またはリガンドによって制御される機能的ドメインもまた、選択されてもよい。例えば、機能的ドメインが外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でのみその活性な立体配座をとる、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術が用いられてもよい（例えば、米国公開特許第２００９０１３６４６５号を参照されたい）。故に、ＺＦＰまたはＴＡＬＥは、制御可能な機能的ドメインに作動可能に連結されてもよく、そのＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦの結果として生じる活性は、外部リガンドによって調節される。
【００９６】
ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用して、達成され得る。遺伝子操作されたヌクレアーゼ技術は、天然型ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子操作に基づく。例えば、調整されたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの遺伝子操作が、記載されている。（  Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（２０）：ｅ１７８、Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−４５８）を参照されたい。加えて、ＺＦＰの遺伝子操作もまた記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第７，１６３，８２４号、および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
【００９７】
加えて、ＺＦＰおよびＴＡＬＥをヌクレアーゼドメインに融合してＺＦＮおよびＴＡＬＥＮが作製されており、これは、それらの遺伝子操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを通じてそれらの意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合部位付近でＤＮＡの切断を引き起こすことが可能である、機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。より最近では、多様な生物におけるゲノム修飾のためにＺＦＮが使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
【００９８】
故に、本明細書に記載される方法および組成物は、広く適用可能であり、任意の目的ヌクレアーゼを伴ってもよい。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでもよく、または代替的に、天然型ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが、選択された標的部位に結合するように改変されてもよい（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。
【００９９】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然型メガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。例となるホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は既知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。
【０１００】
天然型メガヌクレアーゼ由来、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の、ＤＮＡ結合ドメインを使用して、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞、およびマウスにおいて部位特異的ゲノム修飾が促進されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する同種の遺伝子（Ｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）または認識配列が導入された事前に遺伝子操作されたゲノムいずれかの修飾に限定されてきた（Ｒｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６、Ｃｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３３：９５６−６５、Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０、Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１、Ｇｏｕｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）。したがって、医学的にまたは生物工学的に関連性のある部位において新規の結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを遺伝子操作するための試みがなされてきた（Ｐｏｒｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号、同第２００６０２０６９４９号、同第２００６０１５３８２６号、同第２００６００７８５５２号、および同第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼからの天然型または遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインはまた、異種ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）からの切断ドメインに作動可能にも連結されている。
【０１０１】
他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、選択遺伝子および切断ドメインまたは切断ハーフドメインにおいて標的部位に結合するように遺伝子操作された、ジンクフィンガータンパク質を含む。
【０１０２】
上に詳述されるように、ジンクフィンガー結合ドメインは、選択配列に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然型ジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することができる。遺伝子操作方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはカドラプレット）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連している。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、例となる選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および同第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【０１０４】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１３５）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号１３６）、ＴＧＱＫＰ（配列番号１３７）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号１３８））を含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。また、米国仮特許公開第２０１１０２８７５１２号も参照されたい。
【０１０５】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化された、規則的に間隔が空いた、短い回文型の反復（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ））ヌクレアーゼ系は、ゲノム遺伝子操作に使用され得る細菌系に基づいて最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応的免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入体のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。このｃｒＲＮＡは次いで、部分的に相補的な領域を通じて、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同な領域に導く。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって指定される部位でＤＳＢの平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、今では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子に組合され得るように遺伝子操作されており（「単一ガイドＲＮＡ」）、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに匹敵する部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが任意の所望の配列を標的とするように導くように遺伝子操作され得る（Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，ｐ．８１６−８２１、Ｊｉｎｅｋｅｔ  ａｌ，（２０１３），ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１、およびＤａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ，（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００５６３）。故に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム内の所望の標的においてＤＳＢを作製するように遺伝子操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害因子を使用して誤りがちな（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）修復の増加を引き起こすことによって影響を受け得る。
【０１０６】
ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ等のヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよく、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼの切断ドメインである。異種の切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例となるエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；またＬｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。
【０１０７】
同様に、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つ切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする互いの空間的定位に切断ハーフドメインを配置するように、２つの融合タンパク質のための標的部位は互いに対して好ましく配置される。故に、ある特定の実施形態において、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれよりも多い対）。一般に、切断部位は、標的部位の間に位置する。
【０１０８】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合すること、および結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上ではその認識部位から９ヌクレオチドで、また他方の鎖上ではその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。故に、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および遺伝子操作されていることもされていないこともある１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１０９】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例となるＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部分は、切断ハーフドメインとみなされる。故に、ジンクフィンガー−またはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化２本鎖切断および／または標的化置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する、単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−またはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列改変に対するパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
【０１１０】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
【０１１１】
例となるＩＩＳ型制限酵素は、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載され、その全体が本明細書に組み込まれる。さらなる制限酵素も、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および米国出願第１１／８０５，８５０号（２００７年５月２３日出願）（これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する１つ以上の遺伝子操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。偏性のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例となる遺伝子操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断ハーフドメインが４８６および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。
【０１１３】
故に、一実施形態において、４９０における変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される遺伝子操作された切断ハーフドメインをもたらすことによって、また、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表記される遺伝子操作された切断ハーフドメインをもたらすことによって、調製された。本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、異常な切断を最小限に抑えたまたは消滅させた偏性のヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号および同第２０１１／０２０１０５５号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が全目的で組み込まれる。ある特定の実施形態において、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に、変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態において、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に、変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態において、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に、変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。（米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい）。
【０１１４】
本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的な変異誘発によって、調製することができる。
【０１１５】
代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてインビボで組み立てられてもよい（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかるスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現されてもよく、または、１つのオープンリーディングフレーム内に連結させることができ、個々の構成要素は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナス（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１を参照されたい）およびラルストニア（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照されたい）に由来するものと同様のＴＡＬエフェクター由来の遺伝子操作されたドメインである。また、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０７９４３０号も参照されたい。
【０１１７】
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）は、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載される酵母ベースの染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの調節下にあってもよい。
【０１１８】
送達
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、それらをコードするポリヌクレオチド、ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦタンパク質の注射による手段、またはＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡの使用による手段を含む、任意の好適な手段によって標的細胞に送達されてもよい。好適な細胞には、真核および原核細胞および／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。かかる細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにヨトウガ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス属、ピチア属、およびシゾサッカロミセス属等の真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞にはまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、ニューロン幹細胞、および間葉系幹細胞等の、幹細胞が含まれる。
【０１１９】
本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載され、それらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
本明細書に記載されるジンクフィンガー、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達されてもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない、任意のベクター系が使用されてもよい。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも、１つ以上のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質コード配列を含み得ることが明らかとなろう。故に、１つ以上のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が細胞に導入されるとき、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする配列は、同じベクター上または異なるベクター上に担持されてもよい。複数のベクターが使用されるとき、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする配列を含んでもよい。
【０１２１】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。かかる方法をまた使用して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を細胞にインビトロで投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームのゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【０１２２】
核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。好ましい実施形態において、１つ以上の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ））キャップまたはその変異体が好ましい。米国特許第ＵＳ７０７４５９６号および同第ＵＳ８１５３７７３号を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
さらなる例となる核酸送達系には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが含まれる（例えば、米国公開特許第６００８３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適である、陽イオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号のものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）へのものであり得る。
【０１２４】
免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１２５】
さらなる送達方法は、送達対象の核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージングする使用法を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、その抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いで、エンドサイトーシスによりＥＤＶが細胞内に取り込まれる。一旦、細胞内に取り込まれると、その内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３を参照されたい）。
【０１２６】
遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスの標的を体内の特定の細胞に定め、ウイルスのペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができるか（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を治療するために使用することができ、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い導入効率が観察されている。
【０１２７】
レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって改変することができ、標的細胞の可能性のある標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するかまたは感染させることが可能であり、かつ典型的には高いウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次いでそれらを使用して、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／米国公開第９４／０５７００号を参照されたい）。
【０１２８】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸を用いて細胞に形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、いくつかの刊行物に記載される。
【０１２９】
現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床治験における遺伝子導入に利用可能であり、それらは、ヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。
【０１３０】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験に使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターについて５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１３１】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく、有望な代替の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６等のシュードタイピングされたＡＡＶもまた、本発明において使用することができる。
【０１３２】
複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように遺伝子操作され、その後、複製欠損型ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞内で伝播させられる。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む、複数の種類の組織にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床治験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１３３】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子が形成される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、他のウイルス配列が、発現対象のタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠落したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡが細胞株にパッケージングされ、それは他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、相当な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスのほうがより感受性の高い熱処理によって、低減することができる。
【０１３４】
多くの遺伝子治療の用途において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選定される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選定された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように、遺伝子操作することができる。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。かかるベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを選好する特異的な取り込み配列を含有するように遺伝子操作することができる。
【０１３５】
遺伝子治療ベクターは、下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によって、インビボで送達することができる。代替的に、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞等の細胞にエクスビボで送達することができ、続いて、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。
【０１３６】
診断、研究のため、または遺伝子治療のための（例えば、宿主生物へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介した）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸でトランスフェクトされ（遺伝子．ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、対象生物（例えば、患者）に再注入される。好ましい実施形態において、１つ以上の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ））キャップまたはその変異体が好ましい。米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。エクスビボトランスフェクションに好適な種々の細胞型は、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））、ならびに患者からの細胞の単離および培養方法の考察についてはその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【０１３７】
一実施形態において、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のために幹細胞がエクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用することの利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化し得るか、または哺乳動物（細胞のドナー等）に導入され得、それらがその骨髄中で生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型へとインビトロで分化させるための方法が知られている（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。
【０１３８】
幹細胞は、形質導入および分化のために、既知の方法を使用して単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）等の、所望されない細胞に結合する抗体でパンニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。
【０１３９】
修飾された幹細胞もまた、いくつかの実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスへの耐性を与えられたニューロン幹細胞が治療用組成物として使用されてもよく、その幹細胞はまた、本発明のＺＦＰ  ＴＦも含有する。アポトーシスへの耐性は、幹細胞内でＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許公開第２０１００００３７５６号を参照されたい）、または例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再び使用してカスパーゼにおいて妨害されるものによって、生じ得る。これらの細胞は、変異または野生型Ｈｔｔを制御することが知られているＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦでトランスフェクトすることができる。
【０１４０】
治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替的に、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによる。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路が使用されてもよいが、特定の経路が、別の経路より即時的かつより効果的な反応を提供できる場合が多い。
【０１４１】
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示される。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。
【０１４２】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターには、非組み込み型レンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２５：２１７−２２２を参照されたい。
【０１４３】
薬学的に許容される担体は、部分的に、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、決定される。したがって、下に記載されるように、多種多様な好適な医薬組成物の製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。
【０１４４】
上述のように、開示される方法および組成物は、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞を含むが、これらに限定されない、任意の種類の細胞内で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株は、当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、ヨトウガ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、ならびにサッカロミセス属、ピチア属、およびシゾサッカロミセス属等の真菌細胞を含むが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体、および誘導体もまた使用することができる。
【０１４５】
適用
開示される組成物および方法は、治療適用および研究適用を含むが、これらに限定されない、Ｈｔｔ対立遺伝子を調節することが望ましい任意の適用のために使用することができる。
【０１４６】
Ｈｔｔ抑制ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦを治療剤として使用することができる疾患および病態には、ハンチントン病が含まれるが、これらに限定されない。さらに、Ｈｔｔの変異対立遺伝子に特異的なＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを含む方法および組成物を、ハンチントン病の治療のための治療薬として使用することができる。
【０１４７】
ＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子を抑制するＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦはまた、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦを含むが、これらに限定されない神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）因子を活性化するＺＦＰ−ＴＦまたはＴＡＬＥ−ＴＦと併用されてもよい。これらのＺＦＰまたはＴＡＬＥ（またはこれらのＺＦＰまたはＴＡＬＥをコードするポリヌクレオチド）は、同時に（例えば、同じ医薬組成物中で）投与されてもよく、または任意の順序で順次に投与されてもよい。
【０１４８】
ハンチントン病を治療するための方法および組成物はまた、幹細胞内のＨｔｔ対立遺伝子の変異体コピーがＨｔｔ特異的ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを使用して野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に対して修飾された、幹細胞組成物を含む。
【０１４９】
本発明の方法および組成物はまた、これらの障害の研究を可能にする、インビトロおよびインビボモデル、例えば、トリヌクレオチド反復障害の動物モデルの設計および実現にも有用である。好適なインビトロモデルの非限定的な例としては、線維芽細胞を含む、任意の生物由来の細胞または細胞株が挙げられる。動物モデルとして使用するのに好適な動物の非限定的な例としては、無脊椎動物（Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ）、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）が挙げられる。
【実施例】
【０１５０】
実施例１：Ｈｔｔ標的化ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）およびＺＦＮの設計および構築
Ｈｔｔを標的とするジンクフィンガータンパク質を、本質的に米国特許第６，５３４，２６１号に記載されるように遺伝子操作した。表１Ａおよび１Ｂは、例となるＨｔｔ標的化ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの認識ヘリックスを示す一方で、表２Ａおよび２Ｂは、これらのＺＦＰの標的配列を示す。
【０１５１】
１つの連続したジンクフィンガーのアレイを有するＺＦＰを、ＣＡＧ反復領域の完全に内側の部位を標的とするように設計した（図１Ｂ）。かかるＺＦＰは、より高い親和性および／またはより高い正味占有率で、より長い変異トラクトに結合し得、変異対立遺伝子の選択的抑制を達成する。ＣＡＧ領域の部分的にまたは全体的に外側にある部位を標的とし、したがって野生型および変異対立遺伝子に均等に結合し、両方の対立遺伝子からの発現を同様の効率で制御する、ＺＦＮもまた設計した（図１Ａ）。ＣＡＧ領域を認識するようにジンクフィンガータンパク質を設計するとき、１フィンガーおよび２フィンガーモジュールの組を「ミックス・アンド・マッチ」の組み合わせで用いることができる。それらのモジュールが下の表２Ｃに示される。
【表４】
2019022531.tif 000013
【０１５２】
多量体化ＺＦＰ  ＴＦもまた上述のように構築するが、ベクターがまた、ＺＦＰ  ＴＦをコードする配列に作動可能に連結される、トリヌクレオチド反復のトラクトに沿って発現されたタンパク質の多量体化を可能にする、１つ以上のタンパク質相互作用ドメイン（二量体化またはタンパク質相互作用ドメインとも呼ばれる）をコードする配列も含有することを除く。図１Ｄおよび図１０を参照されたい。表３は、ＣＡＧ反復領域に標的を定められたＺＦＰと共に使用される、二量体化ドメイン設計を示す。図１０Ｃは、二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）ＤＺ１〜ＤＺ４の間の相互作用を介して多量体化するように設計される、４つのＺＦＰ単量体足場のタンパク質配列を示す。設計は、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．（２００６）２：２００６．２０１１に記載される作業に基づく。図１０Ｄは、コイルドコイル（ＣＣ）ＣＣ１〜ＣＣ７の間の相互作用を介して多量体化するように設計される、７つのＺＦＰ単量体足場のタンパク質配列を示す。ＣＣ番号１の設計は、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１），１２３：３１５１−３１５２）に記載される作業に基づく一方で、ＣＣ番号２、ＣＣ番号３、およびＣＣ番号４は、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００），１２２：５６５８−５６５９）に基づく。ＣＣおよびＤＺドメインは、ＺＦＰがＣＡＧトラクトの主溝内で重合体化することを可能にする（図１０Ｂに描写される）。適切な結合特性を有するフィンガーアレイおよび二量体化ドメインを選定することによって、疾患対立遺伝子の伸長したＣＡＧトラクトに対してのみ効率的な結合が生じるであろう。
【０１５３】
ＺＦＰ−ＴＦを、核局在化配列、Ｈｔｔ対立遺伝子に標的を定められた遺伝子操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（表１Ａおよび１Ｂ）、およびヒトＫＯＸ１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制ドメインを含む融合タンパク質として構築した。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｄを参照されたい。設計されたＤＮＡ結合ドメインは、３〜６つのフィンガーモジュールを含有し、９〜１８ｂｐ配列を認識する（表２Ａおよび２Ｂ）。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触している標的部位におけるヌクレオチドは、大文字で示され、接触していないヌクレオチドは、小文字で示される。２つのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが柔軟なリンカーで融合され、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合された、ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ分子もまた構築した（図１Ｅ）。ＤＮＡ結合ドメインを表２Ａおよび２Ｂから選定した。
【０１５４】
実施例２：ヒトおよびマウス細胞内のＨｔｔの両方の対立遺伝子の抑制
Ｈｔｔの両方の対立遺伝子を抑制するために（対立遺伝子非特異的）、ＺＦＰを、Ｈｔｔプロモーターおよびエクソン１領域に結合するように設計し、この標的部位は、完全にＣＡＧ反復内にはなかった。図１Ａを参照されたい。Ｈｔｔ抑制ＺＦＰ  ＴＦの活性を試験するために、ＺＦＰ  ＴＦをヒト細胞内にトランスフェクトし、Ｈｔｔの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して監視した。
【０１５５】
ヒトＨＥＫ２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９７７）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ    ３６：５９−７４）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養し、１ｅ５細胞を、製造業者の指示に従ってＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）により、示されるＺＦＰ−ＫＯＸ融合物をコードする１μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。
【０１５６】
トランスフェクトされた細胞を２日間インキュベートし、内因性ヒトハンチンチン（Ｈｔｔ）および正規化対照β−アクチン（ＡＣＴＢ）のレベルを、リアルタイムＰＣＲによって、それぞれＨｓ００９１８１７６＿ｍ１および４３５２９３５Ｅプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、標準プロトコルに従って分析した。Ｈｔｔレベルを、偽トランスフェクトされた試料（１として設定）のレベルに対して正規化したＨｔｔ／ＡＣＴＢ比として表した。
【０１５７】
図２Ａに示されるように、Ｈｔｔ標的化ＺＦＰは、Ｈｔｔ発現を抑制した。ウェスタンブロット分析を、標準プロトコルを使用して行って、Ｈｔｔタンパク質レベルの低減を確認した（図２Ｂ）。ｐ６５タンパク質をローディング対照として使用した。
【０１５８】
マウスＨｔｔ特異的ＺＦＰ  ＴＦ抑制因子を、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（Ｋｌｅｂｅ＆Ｒｕｄｄｌｅ（１９６９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：６９Ａ）内に、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一過性でトランスフェクトした。ｍＨｔｔおよびＡＣＴＢ  ｍＲＮＡレベルを、トランスフェクション後４８時間時点で、それぞれＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットＭｍ０１２１３８２０  ｍ１および４３５２９３３Ｅを使用して測定した。ＺＦＰでトランスフェクトされた試料についてのｍＨｔｔ／ＡＣＴＢ比を、ＧＦＰ対照（１として設定）のそれらに対して正規化した。
【０１５９】
図２Ｃに示されるように、ＺＦＰは、マウスＨｔｔ発現を抑制した。加えて、マウスＨｔｔ特異的ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子は、Ｈｔｔノックインマウスに由来する、不死化線条体細胞内のマウスＨｔｔ、ＳＴＨｄｈ（Ｑ１１１／Ｑ７）を抑制することができる（Ｔｒｅｔｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  ９：２７９９−２８０９）。図２Ｄおよび２Ｅを参照されたい。示されるＺＦＰについてのｍＲＮＡを、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して生成し、０．１、０．５、または２μｇのこれらのｍＲＮＡを、上述のようにＡｍａｘａヌクレオフェクターを使用してトランスフェクトした。細胞を、上述のｍＨｔｔおよびＡＣＴＢ発現分析のためにトランスフェクションの４８時間後に採取した。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞内の抑制と比較して線条体細胞内のより有意な抑制が観察されたが、それは線条体（ｓｔｒａｉｔａｌ）細胞内のｍＲＮＡトランスフェクションを介して達成される強化されたトランスフェクション効率の結果であり得る。
【０１６０】
実施例３：ヒトおよびマウス細胞内の変異Ｈｔｔの選択的抑制
変異Ｈｔｔ対立遺伝子の選択的抑制を達成するために、ＺＦＰをＣＡＧ反復内で結合するように設計した。図１Ｂは、１種類のかかるＺＦＰを示し、このうちジンクフィンガーの連続したアレイが抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ１からのＫＲＡＢドメイン）に連結され、これらのＺＦＰは、転写抑制に必要とされる閾値占有率が伸長したＣＡＧ反復上でのみ確立され得るように、適切な親和性をもって設計することができる。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅは、伸長したＣＡＧ反復への特異的結合を可能にし得るＺＦＰ設計の３つの他の例を示す。
【０１６１】
図１Ｂに例示されるように設計されたＺＦＰをＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｈｔｔ発現を評価した。ＺＦＰコード構築物をＨＥＫ２９３細胞内に、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、標準プロトコルを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、総ＲＮＡを単離し、内部対照β−アクチン（ＡＣＴＢ）と比べた内因性ヒトハンチンチン（Ｈｔｔ）のレベルを、リアルタイムＰＣＲによって、それぞれＨｓ００９１８１７６＿ｍ１および４３５２９３５Ｅプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。ＺＦＰでトランスフェクトされた試料についてのＨｔｔ／ＡＣＴＢ比を、ＧＦＰ対照（１として設定）のそれらに対して正規化した。
【０１６２】
図３Ａに示されるように、上鎖または下鎖のいずれかで、ＨＥＫ２９３細胞内のＣＡＧ反復に結合するように設計されたＺＦＰ抑制因子（ＫＲＡＢ抑制ドメインと融合）（図１Ｂ）は、Ｈｔｔ発現を有効に抑制した。図３Ａは、発現を二重トランスフェクションで測定し（図における別々のバー）、複数のリアルタイムＰＣＲアッセイを完了した（エラーバー）、転写の抑制因子を描写する。個々のＺＦＰによる異なるレベルの抑制は、それらがＣＡＧ反復領域への異なる親和性を有することを示唆する。ＨＥＫ２９３細胞内のＨｔｔ対立遺伝子は１６回および１７回ＣＡＧを有するので、この結果はまた、３０６４０等の「より弱い」ＺＦＰが、野生型（伸長していない）ＣＡＧ反復長を有するＨｔｔ対立遺伝子を効果的に抑制しないことも示唆する。
【０１６３】
３０６４０等のＺＦＰが、伸長したＣＡＧ反復を有するＨｔｔ対立遺伝子の転写を抑制し得るかどうかを試験するために、異なるＣＡＧ反復長を含有するＨｔｔプロモーター／エクソン１断片によって調節されるルシフェラーゼレポーターを構築した。最初に、ヒトＨｔｔプロモーター／エクソン１断片を、ＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡから、次の順方向プライマー：
５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＣＧＡＣ（配列番号１３９）
および次の逆方向プライマー：
５’ＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＴＣＴ．（配列番号１４０）を使用して増幅した。
【０１６４】
順方向プライマーは、ＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆方向プライマーは、Ｈｔｔの最初のＡＴＧをＴＡＧに変更し、ＡｖｒＩＩ部位を作製し、また、ＨｉｎｄＩＩＩ部位も含む。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結反応させ、それを同じ酵素で消化して、構築物ｐＲＬ−Ｈｔｔを生成した。次いで、ヒトＨｔｔエクソン１断片（最初のＡＴＧを除いたコード配列）を、ＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡまたは伸長したＣＡＧ反復を有するＨＤ患者由来のゲノムＤＮＡから、次の順方向プライマー：
５’ＧＣＣＴＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣ（配列番号１４１）
および次の逆方向プライマー：５’
５’ＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧ（配列番号１４２）を使用して増幅した。
【０１６５】
順方向プライマーは、ＡｖｒＩＩ部位を導入し、逆方向プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物をＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＲＬ−Ｈｔｔベクターに連結反応させ、それを同じ酵素で消化した。１０、１７、２３、または４７回ＣＡＧ反復を有するクローン（ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ（ｘ））を、配列決定によって特定した。
【０１６６】
ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ（ｘ）レポーター（３００ｎｇ）およびｐＧＬ３−プロモーターレポーター（１００ｎｇ、正規化対照として使用、Ｐｒｏｇｅｍａ）を、ＨＥＫ２９３細胞内に、１００ｎｇのＺＦＰ  ３０６４０発現ベクターを用いてまたは用いずにトランスフェクトした。ホタル（ｐＧＬレポーター）およびウミシイタケ（ｐＲＬレポーター）ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。ウミシイタケルシフェラーゼレベルを、同じトランスフェクトした試料からのホタルルシフェラーゼのレベルに対して正規化し、「レポーターのみ」の試料のウミシイタケ／ホタル比に対してさらに正規化した。
【０１６７】
図３Ｂに示されるように、ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６４０によるルシフェラーゼレポーターの抑制は、ＣＡＧ反復の長さと共に増加することから、３０６４０のＤＮＡ結合親和性と同様のＤＮＡ結合親和性を有するＺＦＰが、伸長したＣＡＧ反復を介したＨｔｔプロモーター活性を抑制し得、またの抑制のレベルがＣＡＧ反復長に依存することが示唆される。
【０１６８】
図３Ｃは、図３Ｂにおけるものと同様の実験を示すが、「強力な」ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６５７もまた試験し、３０６４０および３０６５７の両方を示される複数の用量で試験したことを除く。各用量レベルで、３０６４０は、ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ２３レポーターよりもｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７レポーターのより大きい抑制を提供した（ＣＡＧ反復長依存性の抑制）一方で、３０６５７は、両方のレポーターを同様のレベルで抑制した。ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ２３レポーターに対して、３０６４０は、各用量レベルで３０６５７よりも低い抑制を提供したことから、正常なＣＡＧ反復長を有する内因性Ｈｔｔ対立遺伝子（ＨＥＫ２９３細胞、図３Ａ）に対するそれらの活性における差異が要約されるが、ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７レポーターに対しては、３０６４０および３０６５７は、各用量レベルで同様の抑制を提供したことから、３０６４０等の「より弱い」ＺＦＰが、伸長したＣＡＧ反復を通じたＨｔｔプロモーターを効率的に抑制し得ることが示唆され、これは、伸長したＣＡＧ標的のみが、抑制に必要とされる閾値占有率がかかるＺＦＰによって確立されることを可能にし得るためである可能性が最も高い。
【０１６９】
図３Ｄは、ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６４０および３０６５７（ＫＯＸ１のＫＲＡＢ抑制ドメインに融合）が、Ｈｄｈ（Ｑ１１１／Ｑ７）ノックインマウスに由来する不死化線条体細胞内のノックインＨｔｔ対立遺伝子（ＣＡＧ１１１）を抑制し得ることを示し、ルシフェラーゼレポーターのＣＡＧ反復長依存性の抑制を主導する、３０６４０等のＺＦＰがまた、伸長したＣＡＧ反復を有する内因性Ｈｔｔ対立遺伝子からの発現も抑制し得ることを実証する。示されるＺＦＰについてのｍＲＮＡを、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して生成し、Ｈｄｈ（Ｑ１１１／Ｑ７）細胞内に、示される用量で、Ａｍａｘａヌクレオフェクターを使用してトランスフェクトした。野生型マウスＨｔｔ対立遺伝子からの発現を検出するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、順方向プライマーＣＡＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１９３）および逆方向プライマーＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧ（配列番号１９４）を使用し、ノックインＨｔｔ対立遺伝子からの発現を検出するために、順方向プライマーＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号１９５）および逆方向プライマーＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧ（配列番号１９６）を使用した。
【０１７０】
図３Ｅは、それぞれ正常なＨｔｔ対立遺伝子および変異Ｈｔｔ対立遺伝子上に１５回および７０回ＣＡＧを有するＨＤ患者由来の線維芽細胞株（ＧＭ２１７５６、Ｃｏｒｉｅｌｌ）において、ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６４０および３０６５７を試験した結果を示す。ＳＮＰベースの対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲアッセイを最初に確立して、野生型または変異Ｈｔｔ対立遺伝子からの特異的検出を可能にする。ＳＮＰ（ｒｓ３６３０９９  Ｔ／Ｃ）の位相調整（ｐｈａｓｉｎｇ）をＣａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２０１１）１９：２１７８−８５）によって決定した。「Ｔ」は、正常な対立遺伝子上にあり、「Ｃ」は、変異対立遺伝子にある。変異対立遺伝子（０９９Ｃ）からのＨｔｔ発現を検出するために、線維芽細胞からのｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ（ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、順方向プライマー０９９Ｃ．Ｆ（５’ＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣ、配列番号１４３）および逆方向プライマー０９９．Ｒ５（５’ＴＣＧＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＧ、配列番号１４４）を使用して増幅し、アニーリング／伸長温度は５５．６℃であった。野生型対立遺伝子（０９９Ｔ）からのＨｔｔ発現を検出するために、線維芽細胞ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲを、順方向プライマー０９９Ｔ．Ｆ（５’ＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴ、配列番号１４５）、逆方向プライマー０９９．Ｒ５、および３’リン酸化ブロッカーオリゴ０９９Ｔ．ＢＬ（５’ＡＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣ−３’ホス、配列番号１４６）を使用して行い、アニーリング／伸長温度は５８．３℃であった。総ヒトハンチンチン（ｈＨｔｔ、野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の両方）レベルおよび正規化対照β−アクチン（ＡＣＴＢ）レベルを、リアルタイムＰＣＲによって、それぞれプライマー／プローブＨｓ００９１８１７６＿ｍ１および４３５２９３５Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。図３Ｅに示される実験について、示されるＺＦＰについてのｍＲＮＡを、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して生成し、１μｇのｍＲＮＡを、上記のようにＡｍａｘａヌクレオフェクターを使用してトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取し、正常（ＣＡＧ１５、０９９Ｔ）Ｈｔｔ対立遺伝子、変異（ＣＡＧ７０、０９９Ｃ）Ｈｔｔ対立遺伝子、および総Ｈｔｔ（ｈＨｔｔ）からのｍＲＮＡレベルを上述のように定量し、ＡＣＴＢのレベルに対して正規化し、各試料についてのＨｔｔ／ＡＣＴＢ比を偽トランスフェクトされた試料のそれに対してさらに正規化した。「強力な」ＣＡＧ標的化ＺＦＰ  ３０６５７は、予想通り、両方の対立遺伝子を抑制した（ＨＥＫ２９３細胞内のその活性に基づく、図３Ａ）。レポーターのＣＡＧ反復長依存性の抑制を示した、ＺＦＰ  ３０６４０は、野生型対立遺伝子の１０％未満の抑制を提供した一方で、変異対立遺伝子を９０％超抑制した。各試料中の総Ｈｔｔのレベルは、同じ試料中の野生型Ｈｔｔのレベルおよび変異Ｈｔｔレベルと一致していた。
【０１７１】
ＺＦＰ−３０６４０もまた、正常な線維芽細胞株ならびにＨｔｔ遺伝子において異なるＣＡＧ反復長を含有する他のＨＤ線維芽細胞株において試験した（図３Ｆを参照されたい）。各対立遺伝子からのＨｔｔ発現を上述のように検出した。正常な線維芽細胞株（ＣＡＧ１８／１８）においてＨｔｔ抑制は何ら観察されなかった。対照的に、対立遺伝子の優れた識別が、ＣＡＧ  １５／６７およびＣＡＧ１５／７０株において、高用量および低用量両方のトランスフェクトされた３０６４０  ｍＲＮＡで観察され、同様の結果が、変異対立遺伝子上で中間のＣＡＧ反復長を有する２つのＨＤ線維芽細胞株（ＣＡＧ  １８／４４およびＣＡＧ  １８／４５）についても得られた（伸長した対立遺伝子は、高用量および低用量両方の３０６４０で約８０％抑制されるが、なおもＣＡＧ１８対立遺伝子は、影響を受けないままであった）。まとめると、これらのデータは、３０６４０等の対立遺伝子特異的抑制因子が、ＣＡＧ１８／４４およびＣＡＧ１８／４５等のより優勢な疾患遺伝子型の関連において、強力なＣＡＧ対立遺伝子長の選択性を維持し得ることを示す。
【０１７２】
ウェスタンブロット分析を使用して、３０６４０等のＺＦＰが、２つの患者由来線維芽細胞株内の変異Ｈｔｔタンパク質レベルを選択的に下方制御することを示し、ｑＰＣＲアッセイによって示される対立遺伝子特異的制御を確認した（図３Ｇを参照されたい）。ＺＦＰを、３００ｎｇ用量でｍＲＮＡトランスフェクション（Ａｍａｘａヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ））によって、１．５ｅ５細胞の４つの反復実験試料に送達し、プールしてから、１２ウェルプレートにプレートした。４８時間時点で、細胞を洗浄し、タンパク質抽出物調製のために採取した。およそ２．５μｇの抽出物を５％トリス−酢酸塩ゲル上にローディングし、ＭＡＢ２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって検出した。さらに、同じ試料を４〜１５％トリス−ＨＣｌ  ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にローディングし、ローディング対照として抗B−アクチン（１：２０，０００、Ｓｉｇｍａ）による検出のために標準方法を使用して転写した。Ｈｔｔ  ｍＲＮＡを測定するｑＰＣＲ研究に基づいて、３０６４０は、ＣＡＧ反復を標的とする対立遺伝子特異的抑制因子であり、３２５２８は、転写開始部位（ＴＳＳ）を標的とする２対立遺伝子の抑制因子であり、３０６５７は、使用された用量で両方のＨｔｔ対立遺伝子を抑制するＣＡＧ標的化抑制因子である。ウェスタンブロットは、３０６４０が両方のＨＤ患者由来の細胞株において変異Ｈｔｔ（上部のバンド）のレベルを特異的に低減した一方で、３２５２８および３０６５７が両方の対立遺伝子を同様に抑制したことを示した。
【０１７３】
実施例４：Ｈｔｔの対立遺伝子特異的抑制を主導するさらなるＣＡＧ標的化ＺＦＰ設計。
図４Ａは、ＣＡＧ１８／４５  ＨＤ線維芽細胞株において、ＺＦＰ−ＴＦ  ３０６４０、３０６４３、３０６４５、および３３０７４（全てがＣＡＧ反復に標的を定められ、ＫＲＡＢ抑制ドメインを使用する）を試験した結果を示す。異なる量のＺＦＰ  ｍＲＮＡを、Ａｍａｘａヌクレオフェクターを使用して、示されるようにトランスフェクトし、変異Ｈｔｔ（右側のバー）、野生型Ｈｔｔ（中央のバー）、および総Ｈｔｔ（両方の対立遺伝子、左側のバー）の発現を、トランスフェクション後２４時間時点で上述のように測定した。ＺＦＰ  ３０６４０、３０６４５、および３３０７４は、３μｇ〜１０ｎｇのＺＦＰ
ｍＲＮＡ用量範囲全体にわたって対立遺伝子特異的抑制を主導する一方で、３０６４３は、３０ｎｇ以上である用量で両方の対立遺伝子を有意に抑制するように思われ、１０ｎｇ用量で対立遺伝子選択性を示し始める。
【０１７４】
図４Ｂは、ＣＡＧ１５／７０  ＨＤ線維芽細胞株において、ＺＦＰ  ３０６４３、３０６４８、３０６５７、および３０６５８（全てがＣＡＧ反復に標的を定められ、ＫＲＡＢ抑制ドメインを使用する）を試験した結果を示す。異なる量のＺＦＰ  ｍＲＮＡを、Ａｍａｘａヌクレオフェクターを使用して、示されるようにトランスフェクトし、変異Ｈｔｔ（右側のバー）、野生型Ｈｔｔ（中央のバー）、および総Ｈｔｔ（両方の対立遺伝子、左側のバー）の発現を、トランスフェクション後２４時間時点で上述のように測定した。前の図で試験されたＺＦＰ（３０６４０、３０６４５、および３３０７４）と比較して、これらのＺＦＰは、より低い用量で変異Ｈｔｔ特異的抑制を主導する。これらの結果は、インビボで（例えば、ＨＤ患者の脳内で）達成され得るＺＦＰ発現レベルに依存して、変異Ｈｔｔの対立遺伝子特異的抑制が適切なＺＦＰ設計を使用して達成され得ることを示唆する。
【０１７５】
実施例５：代替的なＣＡＧ含有遺伝子の抑制
実施例３（図３Ｅ）において単離されたＲＮＡを使用して、他のＣＡＧ反復含有遺伝子の抑制を分析し、その結果が図５に描写される。次の遺伝子の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲを使用して検査し、アクチンのそれらに対して正規化した：アタキシン２（「ＡＴＸＮ２」）、ダイナミン（「ＤＮＭ１」）、Ｆボックスオンリータンパク質１１（「ＦＢＸＯ１１」）、硝酸塩レダクターゼ（「ＮＡＰ」）、複製起点認識複合体サブユニット４（「ＯＲＣ４」）、ホスホキナーゼ（「ＰＨＫ」）、ＯＣＴ３／４タンパク質（「ＰＯＵ３」）、ＴＨＡＰドメイン含有アポトーシス関連タンパク質２（「ＴＨＡＰＩＩ」）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（「ＴＢＰ」）、およびスタニオカルシン１（「ＳＴＣ１」）。加えて、転写開始部位（ＴＳＳ）に対するＣＡＧ反復配列の箇所を書き留め、それは図３Ｆにおいて「ＴＳＳ＠」として示され、ここで「＋」は、ＴＳＳの下流であるＣＡＧ反復の塩基の位置を示し、「−」は、ＴＳＳの上流であるＣＡＧ反復の塩基の位置を示す。また、ＣＡＧ反復の数（「番号ＣＡＧ」）が各遺伝子につき示される。
【０１７６】
データは、３０６４０による伸長した変異Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制が、高度に特異的であり、ＣＡＧ反復がそれらのそれぞれの転写（ｔｒａｎｓｃｒｏｐｔｉｏｎ）開始部位に比較的近接しているＣＡＧ反復含有遺伝子のサブセットのみが、３０６４０等のＺＦＰの抑制標的であり得ることを実証する。
【０１７７】
実施例６：Ｈｔｔの対立遺伝子特異的ＺＦＰ抑制因子のゲノム全域にわたる特異性
ＨＤ線維芽細胞（ＣＡＧ１８／４５）をトランスフェクトして、ＣＡＧ標的化ＺＦＰのゲノム全域にわたる特異性をマイクロアレイ分析によって研究した（図６）。ＺＦＰを、示される用量でｍＲＮＡトランスフェクション（Ａｍａｘａヌクレオフェクション）によって送達、すなわち、ＺＦＰ  ３０６４０、３０６４５、および３３０７４を、それぞれ７５ｎｇ、１５ｎｇ、および１５ｎｇ用量で六重にトランスフェクトした。ＧＦＰ−Ｋｏｘ  ｍＲＮＡ（１５０ｎｇ）を対照としてトランスフェクトし、それを担体として使用して、全ての試料中のトランスフェクトされたｍＲＮＡの総量を１５０ｎｇにした。ＣＡＧ１８（０９９Ｔ、中央のバー）およびＣＡＧ４５（０９９Ｃ、右側のバー）対立遺伝子からの発現を、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲ試薬によって、トランスフェクション後２４時間時点で上述のように測定した（試料（１〜６）の各々は、生物学的反復実験試料（別個のトランスフェクション）である）。ＨｔｔレベルをＧＡＰＤＨのそれらに対して正規化した。Ｈｔｔの変異対立遺伝子特異的抑制が３つ全てのＺＦＰについて観察された。４つの最も類似した反復実験試料を次いで、マイクロアレイ分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３プラス２．０）のために次のように選定した：ＧＦＰ反復実験試料１、３、４、および６；３０６４０反復実験試料２、３、５、および６；３０６４５反復実験試料２、３、５、および６；ならびに３３０７４反復実験試料１、３、４、および５をマイクロアレイ分析に使用した。Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）を使用して、各プローブセットからの原シグナルを正規化し、Ｔ検定を使用してＺＦＰでトランスフェクトされた試料をＧＦＰでトランスフェクトされた試料と比較し、「変更」呼び出しを、対照試料と比べて２倍超の差異および０．０５未満のＴ検定Ｐ値を有する遺伝子（プローブセット）に対して行った。その基準に基づいて、３０６４０は、スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）および伸長したシナプトタグミン様タンパク質１（ＥＳＹＴ１）の２つの遺伝子のみを抑制し、３０６４５および３３０７４は、それぞれＳＴＣ１およびインターロイキン１７受容体Ａ（ＩＬＲ１７ＲＡ）である各々１つの遺伝子しか抑制しなかった。アレイ上のＨｔｔプローブセットが野生型Ｈｔｔ  ｍＲＮＡおよび変異Ｈｔｔ  ｍＲＮＡの両方を検出するので、Ｈｔｔは抑制された（２倍超の抑制）遺伝子として検出されなかった。この実験は、変異Ｈｔｔ特異的ＺＦＰが、Ｈｔｔの効率的な対立遺伝子特異的抑制を主導するレベルで発現されるとき、ゲノム全域にわたる非常に高い特異性をもって作動し得ることを実証する。
【０１７８】
実施例７：ＨＤ神経幹細胞（ＮＳＣ）における対立遺伝子特異的抑制
ＨＤ  ｉＰＳＣ／ＥＳＣをアキュターゼにより継代し、マトリゲルコーティングプレート上で、Ｅ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。神経幹細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して誘導した。簡潔に述べると、ｉＰＳＣ／ＥＳＣを、ゲルトレックス（ｇｅｌｔｒｅｘ）コーティングされた６ウェル皿中に２００，０００細胞／ウェルで播種し、１０〜２０％コンフルエントとなったときに培地をＳｔｅｍＰｒｏ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍに変更した。培地を２日毎に変更し、７日目にＮＳＣを採取し、増殖させた。ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＮＳＣを培養した。ＨＤ  ＮＳＣ（ＣＡＧ１７／６９、Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＧＭ２３２２５  ｉＰＳＣに由来）を、１．５または０．５μｇのＺＦＰ  ｍＲＮＡで、ヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量した。Ｈｔｔ発現の対立遺伝子特異的検出を、ＳＮＰ（ｒｓ１１４３６４６）ベースの遺伝子型決定アッセイ４３５１３７６番（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。試験されたＺＦＰ用量で、３０６４０は、変異Ｈｔｔの対立遺伝子特異的抑制を提供し、３０６４３は、野生型Ｈｔｔの約５０％の抑制および変異Ｈｔｔの約９０％の抑制を提供し、３０６４８は、両方の対立遺伝子を抑制した（図７）。これらのＺＦＰの挙動は、ＨＤ線維芽細胞内のそれと一致していた（図４）。各試料についての総Ｈｔｔレベル（中央のバー）は、変異Ｈｔｔのレベルおよび野生型Ｈｔｔレベルと一致していた。
【０１７９】
実施例８：分化したＨＤニューロンにおけるＨｔｔ抑制
ＨＤ  ＮＳＣをアキュターゼにより、ゲルトレックスコーティングされたプレート上で継代した。培地を、（ｂＦＧＦおよびＥＧＦ）を含まないＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  ｍｅｄｉｕｍを含有する神経分化培地に変更することによって、ニューロン分化を誘導した。培地を最大２１日間にわたって３〜４日毎に変更した。ニューロンを、神経分化培地中の培養によってＮＳＣ（ＣＡＧ１７／４８、ＨＤ  ＥＳＣに由来）から誘導した。神経誘導後１５日目に、細胞を１．０または０．５μｇのＺＦＰ  ｍＲＮＡで、ヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量した。この患者の株は、野生型および変異ＨｔｔのｑＰＣＲベースの対立遺伝子特異的検出を可能にするＳＮＰを含有しないので、総Ｈｔｔレベルしか測定することができない。我々は、３０６４０および３３０７４がＨＤ線維芽細胞およびＮＳＣにおいてＣＡＧ１８対立遺伝子もＣＡＧ１７対立遺伝子も抑制しないことを示したので、３０６４０処理および３３０７４処理試料中で観察された総Ｈｔｔのレベルは、変異対立遺伝子（ＣＡＧ４８）の対立遺伝子特異的抑制と一致している。試験されたＺＦＰ用量での３０６４３および３０６４８によるより強力な抑制もまた、ＨＤ線維芽細胞内のこれらのＺＦＰの挙動と一致している（図８）。
【０１８０】
実施例９：ＣＡＧ標的化抑制因子は、Ｒ６／２マウスにおける変異Ｈｔｔ導入遺伝子を抑制する
Ｒ６／２マウス（約１２０回ＣＡＧ反復を有する変異ヒトＨｔｔエクソン１の導入遺伝子を担持する、Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｃｅｌｌ  １５：１９７を参照されたい）に、ＣＭＶプロモーターによって主導されるＺＦＰ  ３０６４０−ＫＯＸまたはＧＦＰのいずれかをコードする組替えＡＡＶ２／６の３ｅ１０ベクターゲノムの定位的な両側線条体注射を与えた。マウスに５週齢時点で注射し、分子分析のために８週齢時点で屠殺した。左および右線条体を各半球から切り離し、急速冷凍した。変異Ｈｔｔ導入遺伝子の抑制を評価するために、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により各線条体から抽出し、続いてＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。その後、Ｒ６／２導入遺伝子発現をｑＰＣＲによって測定し、３つの参照遺伝子（Ａｔｐ５ｂ、Ｅｉｆ４ａ２、ＵｂＣ）の幾何平均に対して、Ｂｅｎｎらによって以前に記載されたように正規化した（（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：３，１７）。我々は、４つのＺＦＰ処理線条体において、４つのＧＦＰ処理対照線条体と比べて変異Ｈｔｔ導入遺伝子の統計的に有意な抑制（Ｐ＜０．００１）を観察した（図９）。平均Ｒ６／２抑制は、ＧＦＰ処理対照の６４．９％であった。線条体の完全な網羅が単回の定位的な注射を使用しては達成されなかったこと、およびＡＡＶ２／６がニューロン細胞に優先的に形質導入することから、観察された抑制（約３５％）の倍率は、ＡＡＶベクターにより形質導入された細胞内の実際の抑制を過小評価する可能性が高い。
【０１８１】
実施例１０：二量体化／多量体化ドメインを有するＺＦＰを使用した変異Ｈｔｔの選択的抑制
ジンクフィンガー転写因子を、短いＣＡＧ反復と長いＧＡＧ反復との間をよりよく識別するように遺伝子操作するために、我々は、個々のジンクフィンガー転写因子のＤＮＡ結合親和性を減少させると同時に、ＣＡＧ反復内の隣接した副部位に結合した融合タンパク質の異なるコピー間の相互作用強度を増加させることにした。個々のジンクフィンガー転写因子のＤＮＡ結合親和性を減少させるために、我々は、より少数のジンクフィンガーを有するかつ／または最適に満たない親和性でＤＮＡに結合することが予想されるアミノ酸配列を有する、ジンクフィンガードメインを生成した。ＣＡＧ反復内の隣接した副部位に結合した融合タンパク質の異なるコピー間の相互作用強度を増加させるために、我々は、種々の二量体化ドメインを我々のジンクフィンガー転写因子に融合した。二量体化ドメインは、「パラレル」な様式で相互作用し、それらを含有する融合タンパク質の「頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）」または「尾−尾（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」二量体を産出することができる。１つの可能性のある二量体化戦略は、「頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」配向で結合する、同一のＺＦＰ−転写因子融合物のアレイを必要とし、故に、この戦略は、「アンチパラレル」な様式で相互作用する二量体化ドメインを必要とする。例えば、ＭｃＣｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：３１５１−３１５２）および二量体化ジンクフィンガーペプチド（Ｇｉｅｓｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２００６．２０１１）を参照されたい。
【０１８２】
二量体化構築物（ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）ＣＣ１およびＣＣ２は、アンチパラレルなコイルドコイルの対に基づいた（ＭｃＣｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（同書）、Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２２：５６５８−５６５９）。二量体化構築物ＣＣ３およびＣＣ４は、それぞれ４つの残基または７つの残基のいずれかが欠如している、ＣＣ２の切頭バージョンであった。二量体化構築物ＤＺ１、ＤＺ２、ＤＺ３、およびＤＺ４は、二量体化ジンクフィンガードメインの対に基づいた（Ｇｉｅｓｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ，（同書））。各場合において、その対の一方のメンバーをジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に融合し、その対の他方のメンバーをジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に融合した。グリシンおよびセリン残基が豊富な短いリンカーを使用して、二量体化ドメインをジンクフィンガー結合ドメインに融合した。本発明のさらなる実施形態は、代替的な長さおよび／またはアミノ酸組成を有するリンカーを利用する。１つ以上の残基が除去された、または１つ以上のグリシンもしくはセリン残基が他のアミノ酸残基に変更された、リンカーは、これらのリンカーの柔軟性を低減することになり、長いＣＡＧ反復と短いＣＡＧ反復との間の改善された識別をもたらし得る。
【０１８３】
変異Ｈｔｔ対立遺伝子の選択的抑制を達成するために、ＺＦＰを図１Ｄならびに図１０Ａおよび４Ｂに例示されるように設計した。図１０Ｃおよび１０Ｄは、多量体化ドメインの配列を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＣおよびＤＺドメインを含むＺＦＰ−ＴＦがそれぞれそれらの標的を抑制する能力を測定するように設計された、実験の結果を描写する。これらの実験のために、示されるＺＦＰ構築物（５０ｎｇ）を、ｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ１７（２００ｎｇ）、ｐＧＬ３−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７（２００ｎｇ）、およびｐＶａｘ−ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ、１０ｎｇ、正規化対照として使用）で、ＨＥＫ２９３細胞内に共トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性および分泌型アルカリホスファターゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。各試料についてのウミシイタケルシフェラーゼ（ＣＡＧ１７）／ＳＥＡＰおよびホタルルシフェラーゼ（ＣＡＧ４７）／ＳＥＡＰ比を、レポーターのみの試料のそれらに対して正規化した。ｐＧＬ３−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７レポーターをｐＲＬ−Ｈｔｔ−ＣＡＧ４７レポーターと同じように構築したが（実施例３を参照されたい）、ｐＧＬ−プロモーター構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ）をｐＲＬ−ＴＫ構築物の代わりに使用したことを除く。
【０１８４】
図１１Ａに示されるように、３つのＺＦＰは、１つ以上のＣＣドメイン含有構築物として試験したとき、同じＺＦＰを有するがＣＣドメインのない構築物と比較して、一方または両方のレポーターの抑制を強化した。図１１Ｂは、ＤＺ１およびＤＺ３ドメインが両方のレポーター上で３２２２０の抑制を強化したことを示す。
【０１８５】
これらの結果は、ＣＣおよびＤＺドメインが一般に多量体化したＺＦＰの親和性を増加させることができ、またＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインの設計が最適なＣＡＧ反復長の識別をもたらし得ることを示唆する。
【０１８６】
実施例１１：ＺＦＰ−ＺＦＰ−Ｋｏｘ設計による変異Ｈｔｔの選択的抑制
ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ設計のものであるＺＦＰ  ＴＦをＨＤ線維芽細胞内で試験した。これらの実験において、２つのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインを柔軟なリンカー（ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＡＡＭＡＥＲＰＦＱ、配列番号１７９）で一緒に連結し、ＫＯＸ抑制ドメインに融合した。リンカーを保存されたヒスチジンとシステインとの間に配置した。タンパク質を、示される用量のＺＦＰ  ｍＲＮＡを使用して上述のように試験した。ＣＡＧ１８／４５（図１２Ａ）およびＣＡＧ２０／４１（図１２Ｂ）ＨＤ線維芽細胞株におけるこれらの結果は、活性のより低いＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインをこの様式で連結することが、対立遺伝子特異的抑制を主導する複合的なＺＦＰをもたらし得ることを実証した。
【０１８７】
実施例１２：マウス細胞内のＨｔｔの活性化
本明細書に記載されるＺＦＰをまた、Ｈｔｔ発現を活性化するそれらの能力について評価した。マウスＨｔｔの＋２００〜＋４６７ｂｐ領域（転写開始部位に対して）に標的を定められたＺＦＰを、ＮＦκＢ  ｐ６５サブユニットの転写活性化ドメインに融合した。この標的化する領域を選定したのは、この断片が、ＨＤの種々のノックインマウスモデルにおけるヒトＨｔｔからの対応する配列（エクソン１配列の大部分およびいくつかのイントロン１配列）によって置換されたためであり（Ｍｅｎａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ  ４６５１：１１−２６、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８：１１５−１２２）、したがってこの領域に標的を定められたＺＦＰは、それらの動物において野生型対立遺伝子を選択的に活性化することができるが、ノックイン対立遺伝子は活性化しない。
【０１８８】
ＺＦＰをＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（これらの細胞内で両方のＨｔｔ対立遺伝子は野生型である）内にトランスフェクトし、マウスＨｔｔおよびＡＣＴＢ  ｍＲＮＡレベルを、実施例２（二重トランスフェクションおよび複数のアッセイ）に記載されるように測定した。
【０１８９】
図１３に示されるように、偽トランスフェクションと比較したＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルの増加を、両方のＺＦＰ−ＴＦを使用して検出した。図１３Ａを参照されたい。増加したＨｔｔタンパク質レベルをウェスタンブロットによって確認した。図１３Ｂを参照されたい。
【０１９０】
ノックインＨｔｔ対立遺伝子の生成が図１３Ｃに例示され、配列アライメント（図１３Ｄ）は、置換されたマウス配列と対応するヒト配列との間の発散を示す。図１３Ｅは、かかるＺＦＰ活性化因子を、ＨｄｈＱ１１１／Ｑ７ノックインマウスに由来する不死化線条体細胞内にトランスフェクトしたときに、野生型Ｈｔｔのみが選択的に活性化されたことを示す。
【０１９１】
実施例１３：インビボでのＨｔｔ発現の制御
インビボでのＨｔｔ特異的ＺＦＰ  ＴＦの有効性を試験するために、ＺＦＰをコードするＡＡＶ２ベクターを産生する。これらのＡＡＶ２ベースの構築物を次いで、マウスの脳に送達する。ヒトＨｔｔ特異的ＺＦＰ  ＴＦについては、ＡＡＶベクターを、Ｒ６．２マウスまたはＢＡＣ  ＨＤマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６またはＦＶＢ／Ｎ株）に送達して、ヒト導入遺伝子の抑制、ならびにＨＤ様表現型の変化を評価する。マウスＨｔｔ特異的ＺＦＰ（活性化因子または抑制因子）については、ＡＡＶベクターを、野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６またはＦＶＢ／Ｎ）またはヒトＨｔｔノックインマウス（ＨｄｈＱ１１１／Ｑ７、ＨｄｈＱ１４０／Ｑ７、またはＨｄｈＱ１７５／Ｑ７）に送達して、内因性マウスＨｔｔ発現の活性化または抑制を評価する。ＣＡＧ伸長対立遺伝子を優先的に標的とするＺＦＰについては、ＡＡＶベクターを、Ｒ６．２マウスまたはヒトＨｔｔノックインマウス（ＨｄｈＱ１１１／Ｑ７、ＨｄｈＱ１４０／Ｑ７、またはＨｄｈＱ１７５／Ｑ７）に送達して、野生型対立遺伝子対伸長したＨｔｔ対立遺伝子の選択的抑制を検査する。屠殺に次いで、脳組織をＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＨｔｔ発現について分析し、Ｈｔｔ遺伝子がＺＦＰ−ＴＦによって調節されることを実証する。
【０１９２】
実施例１４：神経栄養因子およびＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子特異的ＺＦＰ  ＴＦの共トランスフェクション
上で特定されたＨｔｔ特異的ＺＦＰ  ＴＦを、脳神経栄養因子に特異的なＺＦＰ  ＴＦと共トランスフェクトする。使用された脳神経栄養因子に特異的なＺＦＰ  ＴＦは、ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦのいずれかに特異的である。
【０１９３】
実施例１５：Ｈｔｔ標的化ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計および構築
ヒトＨｔｔおよびマウスＨｔｔを標的とするＺＦＮを、ＣＡＧ反復に隣接する配列、すなわち最初のコードＡＴＧ、停止コドンの近くの配列、ならびに先のエクソンにおける配列を標的とするように設計した。ＺＦＮを設計し、プラスミドまたはアデノウイルスベクターに、本質的にＵｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６−６５１、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：８０８−８１６、および米国特許公開第２００８／０１３１９６２号に記載されるように組み込んだ。
【０１９４】
実施例１６：Ｈｔｔ特異的ＺＦＮの切断活性
切断活性を試験するために、上述のヒトＨｔｔ特異的ＺＦＮの対をコードするプラスミドをＫ５６２細胞内にトランスフェクトした。Ｋ５６２細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、推奨されるように、１０％の適格な仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｃｙｃｌｏｎｅ）を補充したＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）プロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスチックウェアから分離した。トランスフェクションのために、１００万個のＫ５６２細胞を、２μｇのジンクフィンガーヌクレアーゼプラスミドおよび１００μＬのＡｍａｘａ溶液Ｔと混合した。細胞を、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（商標）中で、プログラムＵ−２３を使用してトランスフェクトし、１．４ｍＬの温かいＦ−１２培地＋１０％ＦＣＳ中に回収した。
【０１９５】
ゲノムＤＮＡを採取し、意図される切断部位を包含するＨｔｔの遺伝子座の一部分をＰＣＲ増幅した。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＨｉＦｉポリメラーゼを使用したＰＣＲを次のように行った：最初の９４℃で３分間の変性の後、３０サイクルのＰＣＲを、９４℃で３０秒間の変性ステップ、続いて５８℃で３０秒間のアニーリングステップ、続いて６８℃で３０秒間の伸長ステップにより行なう。３０サイクルの完了後、反応物を６８℃で７分間、次いで１０℃で無期限にインキュベートした。
【０１９６】
Ｋ５６２  Ｈｔｔ特異的ＺＦＮ処理細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によって、例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２００８０１５９９９６号に記載されるように検査した。
【０１９７】
マウスＨｔｔ特異的ＺＦＮの対をコードするプラスミドを、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞内で同様の様式で試験した。
【０１９８】
図１４ＡおよびＢは、ＺＦＮが、以前に記載されたようにアッセイされると、観察されたインデルの量の分だけ、８〜４０％の間の遺伝子修飾効率でＨｔｔ遺伝子を標的とすることが可能であったことを示す。
【０１９９】
実施例１７：様々な長さのトリヌクレオチド反復の標的化組み込み
上述のＣＡＧ反復に隣接する配列に対して最も大きい切断活性を有するＨｔｔ特異的ＺＦＮを、標的化組み込み戦略に使用して、様々な長さのＣＡＧ反復をＨｔｔの野生型コピーに導入する。５０、８０、１０９、および１８０回反復ＣＡＧ単位を含有するドナーを構築する。これらのドナーを次いで、上述のＨｔｔ特異的ＺＦＮをコードするプラスミドと共にＫ５６２細胞内にトランスフェクトする。ドナー組み込みの検証を、ゲノムＤＮＡ単離、ＰＣＲ増幅（上述のように）、続いて目的領域の配列決定によって達成する。
【０２００】
ドナー対立遺伝子のＨｔｔ対立遺伝子への標的化組み込みをもたらす、K５６２細胞内で特定されたＺＦＮを使用して、可変長ドナー核酸をヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に挿入する。ドナー組み込みの成功を、上述のようにゲノムＤＮＡ単離、ＰＣＲ、および配列決定によって検証する。
【０２０１】
実施例１８：野生型および／または変異Ｈｔｔの妨害／ノックアウト
先のエクソンを切断するＺＦＮは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の結果として小さい挿入または欠失（インデル）をもたらし得、これはＨｔｔの一方または両方の対立遺伝子が妨害された細胞モデルを生成し得る。
【０２０２】
示されるＺＦＮ対を上述のように調製し、切断活性について、Ｃｅｌ  １ミスマッチを使用して、実施例８について記載されるように試験した。これらのＺＦＮ対は、ヒトＨｔｔの先のエクソンを標的とする故に、それを使用して、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子または変異Ｈｔｔ対立遺伝子のいずれかをノックアウトしてもよい。
【０２０３】
図１４Ａに示されるように、ＺＦＰ対２９６２７／２９６２８、２９６３１／２９６３２（エクソン１２）、および２９６３７／２９６３８（エクソン１８）は、Ｈｔｔ遺伝子を切断した故に、それを利用してノックアウト細胞株を生成することができる。
【０２０４】
実施例１９：野生型およびＨＤ  Ｈｔｔ対立遺伝子の発現タグ付け  最初のまたは最後のコードエクソンに対して最も大きい切断活性を有するＺＦＮを使用して、野生型および変異Ｈｔｔ対立遺伝子を異なるレポータータンパク質でタグ付けする。各レポーター（ＡおよびＢ）に対するドナーＤＮＡを、先頭のＺＦＮ対（複数可）の切断部位に基づいて設計して、レポーター遺伝子の標的化組み込みがＨｔｔへのフレーム内融合をもたらすことを可能にする。最も高い組み込み頻度を提供するドナーＤＮＡ構築物を選択するために、ドナーＤＮＡを、先頭のＺＦＮ対（複数可）と、Ｋ５６２細胞内に共トランスフェクトする。
【０２０５】
ＺＦＮ対を上述のように調製し、切断活性について、Ｃｅｌ  １ミスマッチを使用して、実施例８について記載されるように試験した。使用されたＺＦＮ対は、Ｈｔｔコード配列の３’末端を標的とする故に、それを使用して、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子または変異Ｈｔｔ対立遺伝子のいずれかを標的としてもよい。図１４Ｂに示されるように、ＺＦＰ対２５９１７／２５９１６、２５９２０／２５９２１、および２５９２３／２５９２２は、Ｈｔｔ遺伝子を切断することが可能であった故に、それを利用してレポータータグを導入することができる。
【０２０６】
レポーターＡのために選択されたドナーＤＮＡ構築物ならびに対応するＺＦＮを、変異Ｈｔｔ遺伝子を担持する対象に由来する細胞（例えば、線維芽細胞、誘導多能性細胞）に送達し、クローンを誘導し、レポーターＡの標的組み込みのためにスクリーニングする。ヘテロ接合型事象が所望され、標的化対立遺伝子をＰＣＲによって特定する。単一のレポータータグ付きＨｔｔ対立遺伝子および他方の対立遺伝子上の非修飾ＺＦＮ標的配列を含有するクローンを選択し、レポーターＢのためのドナー構築物および対応するＺＦＮをトランスフェクトして、第２の対立遺伝子をレポーターＢでタグ付けする。
【０２０７】
結果として生じるマウス胚性幹細胞クローンは、各対立遺伝子からの発現の追跡を可能にする２つの異なるマーカーでタグされた野生型Ｈｔｔ対立遺伝子および変異対立遺伝子を含有し、これらの細胞を使用して、トリヌクレオチド反復障害のマウスモデルを、標準プロトコルを使用して生成する。
【０２０８】
実施例２０：Ｈｔｔに対する活性ＴＡＬＥ−ＴＦタンパク質の構築
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＫｏｘ１タンパク質（ＴＡＬＥ  ＴＦ）からのＫＲＡＢ抑制ドメインに連結し、それを使用して、ＨＤ患者（ＣＡＧ  ２０／４１）由来の線維芽細胞内のＨｔｔ遺伝子の抑制を試験する。ＴＡＬＥタンパク質の構築を以前に記載されたように行い（譲受人共通の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号および譲受人共通の米国特許出願第１３／６７９，６８４号を参照されたく、それらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる）、３つの異なるＣ末端構造：＋６３、＋２３１、および＋２７８を用いて米国公開特許第２０１１０３０１０７３号に記載されるように構築した。ＴＡＬＥ  ＴＦ発現プラスミドを構築するために、以前に記載されたＴＡＬＥＮ発現プラスミド（米国公開特許第２０１１０３０１０７３号を参照されたい）を使用したが、ＴＡＬＥＮ内に使用されたＦｏｋＩドメインをＫＲＡＢ抑制ドメインで置換したことを除く。ＴＡＬＥタンパク質およびＫＲＡＢドメインのＣ末端の連結が下に示され、ここでＫＲＡＢドメイン配列は下線によって示される。太字および斜体文字は、三重フラッグタグを示し、太字文字は、核局在化配列を示し、「［反復］」は、ＴＡＬＥ反復単位アレイ（全反復とＣ末端半反復）の箇所を示し、波線を引かれた部分は、ＫＲＡＢドメインの配列を示す：
【化１】
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【０２０９】
塩基認識を、正準のＲＶＤ塩基の対応関係（「ＴＡＬＥコード」：ＮＩはＡに、ＨＤはＣに、ＮＮはＧに（半反復におけるＮＫ）、ＮＧはＴに対応）を使用して達成した。ＴＡＬＥ  ＴＦのうちのいくつかにおいて、タンパク質は、ＤＮＡのセンス（５’−３’）鎖に結合するように設計される一方で、他のものにおいて、ＴＡＬＥ  ＴＦは、アンチセンス（３’−５’）鎖に結合するように設計される。ＴＡＬＥ  ＴＦのこのセットを、Ｈｔｔ遺伝子のＣＡＧ反復を標的とするように設計した。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質はしばしば、標的の５’末端で「Ｔ」ヌクレオチド塩基と優先的に相互作用し、したがって、標的がＣＡＧ反復領域であることから、アンチセンスＤＮＡ鎖に結合し、故に標的の５’末端（３ｎｄ）に塩基「Ｔ」を有するＣＴＧ反復配列に結合するタンパク質が、よりよい結合親和性および特異性を有し、故に抑制因子活性を有することが予測され得る。
【０２１０】
試験されたＴＡＬＥ  ＴＦについての標的および数値識別子が下の表４に示される。数値識別子は、「ＳＢＳ番号」とラベルされ、センス（Ｓｅｎｓｅ）またはアンチセンス（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖に対する特異性は、（「Ｓ／Ａ」）と示され、標的、反復単位またはＲＶＤの数、およびＣ末端の種類も同様に示される。
【表５】
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【０２１１】
表におけるＴＡＬＥ  ＴＦを次いで、ＨＤ患者（ＣＡＧ  ２０／４１）由来の線維芽細胞内でＨｔｔ抑制について試験し、その結果が図１５に示される。この実験において、細胞を１０００ｎｇ、１００ｎｇ、または１０ｎｇのいずれかのＴＡＬＥ−ＴＦコードｍＲＮＡでトランスフェクトした。アッセイされた各ＴＡＬＥ  ＴＦについての結果が、３つのトランスフェクトされたｍＲＮＡ量を表す、３つからなる群で示される。各群において、３つの試料もまた存在し、左側のバーは、総Ｈｔｔ発現を示し、中央のバーは、ＣＡＧ２０  Ｈｔｔ対立遺伝子からの発現を示し、右側のバーは、ＣＡＧ４１  Ｈｔｔ対立遺伝子からの発現を示す。データは、両方のＨｔｔ対立遺伝子を抑制可能であったいくつかのＴＡＬＥ  ＴＦが存在する一方で（例えば、１０２４５４を参照されたい）、他のＴＡＬＥ  ＴＦが伸長したＣＡＧ反復を有する変異Ｈｔｔを選択的に阻害可能であった（例えば、１０２４５１および１０２４７２を参照されたい）ことを実証する。
【０２１２】
本明細書において言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
理解の明確さを目的として、例示説明および実施例を用いてある程度詳細に開示を提供してきたが、当業者には、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が実施され得ることは明白であろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2019022531000001.pdf