(57)【要約】【課題】桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物について、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤としての新規の食品及び医薬用途並びに新規の脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤を提供する。【解決手段】Ｌｉｐｉｎ１産生促進剤は、桑葉を有効成分とし、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられる。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
桑葉を有効成分とする、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤。
【請求項２】
桑葉を有効成分とする、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物。
【請求項３】
桑葉を有効成分とする、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物。
【請求項４】
桑葉を有効成分とする、脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤。
【請求項５】
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤。
【請求項６】
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物。
【請求項７】
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物。
【請求項８】
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする、脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤。
【請求項９】
前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である、
ことを特徴とする請求項１又は５に記載のＬｉｐｉｎ１産生促進剤。
【請求項１０】
前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である、
ことを特徴とする請求項２又は６に記載のＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物。
【請求項１１】
前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である、
ことを特徴とする請求項３又は７に記載のＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌｉｐｉｎ１産生促進剤、Ｌｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物、Ｌｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物及び脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
桑葉は、血糖値上昇抑制作用及び糖吸収抑制作用を有することが知られており、古くから糖尿病を予防する目的などのため、健康茶として湯で煮出したりして利用されてきた（非特許文献１）。桑葉の血糖値上昇抑制作用を有する有効成分としては、１−デオキシノジリマイシンが知られており、１−デオキシノジリマイシンを含む桑葉エキスが食後の血糖値上昇を抑制することが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
Ｌｉｐｉｎ１は、肝臓、脂肪組織、骨格筋などの脂質代謝が盛んな臓器で主に発現し、生体内での脂質代謝に関与する因子として知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｓａｙａｓｕ    Ｋｉｍｕｒａ著、「和漢医薬学雑誌（Ｊ．Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ    Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）」１２，２１４−２１９，１９９５
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｕｂｌｉｃｉｔｙ＿ｒｅｐｏｒｔ／ｐｒｅｓｓ／ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ／ｔａｒｃ／０１２９０６．ｈｔｍｌ（２０１８年３月６日インターネット検索）
【非特許文献３】Ｋｅｎｊｉ  ＩＳＨＩＭＯＴＯ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １３１（８）１１８９−１１９４，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤に関与する桑葉、１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドについては、今まで報告がなされていなかった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物について新規の食品及び医薬用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物について、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤としての新規の食品及び医薬用途並びに新規の脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、
桑葉を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【０００８】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【０００９】
本発明の第２の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物は、
桑葉を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【００１０】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【００１１】
本発明の第３の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物は、
桑葉を有効成分とし、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられる。
【００１２】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【００１３】
本発明の第４の観点に係る脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤は、
桑葉を有効成分とする。
【００１４】
本発明の第５の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【００１５】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【００１６】
本発明の第６の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物は、
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【００１７】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【００１８】
本発明の第７の観点に係るＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物は、
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【００１９】
例えば、前記脂肪抑制は、肝脂肪抑制である。
【００２０】
本発明の第８の観点に係る脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤は、
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物について、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤としての新規の食品及び医薬用途並びに新規の脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実験計画について説明した模式図である。
【図２】ウェスタンダイエット（ＷＤ）及び通常食餌の組成を示す図である。
【図３】投与１２週目の体重、肝臓／体重重量、血漿トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、グルコース（ＧＬＵ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を示す図である（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）。アスタリスクは、ノーマルダイエット（ＮＤ）群に対するウェスタンダイエット（ＷＤ）群又は桑葉粉末（ＭＬ）群を比較した際の統計的有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４】血清の生化学的検査の結果を示すグラフ図である。
【図５】肝臓をホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した肝臓組織像を示す図である。
【図６】ＲＮＡシークエンスの主成分分析の二次元主成分プロットを示す図である。第１の主成分はＸ軸に対して示され、第２の主成分はＹ軸に対して示される。主成分識別子の後の値は、この特定の主成分によって説明される分散の割合を示す。シンボルの形状は、処置に基づいて割り当てられる（ＷＤ：プラス、ＭＬ：円、ＮＤ：クロス）。
【図７】特異的に発現した遺伝子のベン図を示す図である。各エリアの数字はＤＥＧの数を示す。このベン図は、ＮＤ群対ＷＤ群（上の円）、ＷＤ群対ＭＬ群（左の円）及びＮＤ群対ＭＬ群（右の円）からのＤＥＧのオーバーラップを要約している。
【図８】特異的に発現した遺伝子の発現値のヒートマップを示す図である。各列は１つのサンプルに対応し、各行は遺伝子に対応する。遺伝子は、サンプルのセットに対するそれらの発現プロファイルの類似性によって階層的にクラスター化され、サンプルは、それらの特徴に対する発現パターンの類似性によって階層的にクラスター化される。特異的に発現した遺伝子（２５０）のみをヒートマップ作成に用いた。
【図９】Ｖｏｌｃａｎｏ  Ｐｌｏｔの結果を示す図である。
【図１０】Ｌｉｐｉｎ１遺伝子の発現量について遺伝子発現推定量（ＲＰＫＭ）を用いて比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進剤について詳細に説明する。
【００２４】
本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。
【００２５】
本実施形態においては、桑葉として、クワ科クワ属の桑の葉であれば、産地又は収穫時期に関係なく用いることができる。また、例えば、桑葉を乾燥（凍結乾燥を含む）させて粉末化したもの（乾燥粉末）、桑葉を抽出処理を行うことにより得られたものであってもよい。上記の抽出処理は、例えば、水、エタノール等の抽出溶媒に桑葉を、例えば６０〜１００℃で数分間、又は、例えば常温で５〜２４時間浸漬して行われてもよい。桑葉を乾燥させ、例えば、粉末化した後に、抽出処理を行ってもよい。抽出処理により得られた液を用いることもできるし、その液をろ過した後のろ液又は遠心分離した後の上清を用いることもできる。また、抽出処理により得られた液、又はその液をろ過した後のろ液若しくは遠心分離した後の上清から、抽出溶媒を除去したものを用いることもできる。ろ過方法としては、例えば、フィルターろ過が挙げられる。抽出溶媒の除去は、例えば、加温下で抽出溶媒を蒸発させることにより行われる。この処理は、常圧（大気圧）下で行ってもよく、また減圧下で行ってもよい。
【００２６】
１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドの構造式を以下に示す。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、生体内又は生体外におけるＬｉｐｉｎ１の産生を促進させることができる。例えば、桑葉を哺乳動物に投与する場合、桑葉投与前及び投与後に肝生検を行い、肝臓のＬｉｐｉｎ１発現量をＲＮＡシークエンス等で測定し、又は、桑葉投与前及び投与後の血清中Ｌｉｐｉｎ１タンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法等により測定し、投与前に比べて投与後の肝臓のＬｉｐｉｎ１発現量又は血清中Ｌｉｐｉｎ１タンパク質濃度が上昇していることを確認することで、Ｌｉｐｉｎ１産生促進作用を評価することができる。また、例えば、桑葉を哺乳動物由来の細胞を含む培地に添加して培養し、桑葉非添加のコントロール培地に比べて培地中のＬｉｐｉｎ１タンパク質濃度が上昇していることを確認することで、又は経時的な培地中Ｌｉｐｉｎ１タンパク質濃度の上昇を確認することで、Ｌｉｐｉｎ１産生促進作用を評価することができる。本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、例えば、肝臓におけるＬｉｐｉｎ１の産生を促進させることができる。
【００２９】
本明細書において、「脂肪抑制」とは、体内において脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制することで、中性脂肪（ＴＧ）値の低下、肝臓の脂肪蓄積低減等がもたらされることを意味する。「脂肪抑制」は、好ましくは「肝脂肪抑制」である。「肝脂肪抑制」とは、例えば、肝臓の脂肪を減少させることで肝臓／体重重量（体重あたりの平均肝臓重量）を減少させ、又は肝臓の脂肪滴の数を減少させることを意味する。また、「肝障害抑制」とは、例えば、肝保護作用により、ＡＳＴ及びＡＬＴ値の低下、肝臓重量の減少、肝炎の治癒等がもたらされることを意味する。本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進剤は、生体内におけるＬｉｐｉｎ１産生を促進することで、脂肪肝又は肝障害を予防又は治療することができる。
【００３０】
次に、本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物について詳細に説明する。
【００３１】
本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進用食品組成物は、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。桑葉、１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド、ルテオリン７−グルコシド、脂肪抑制、肝障害抑制等の詳細については、前述同様である。
【００３２】
本実施形態による食品組成物としては、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態、性状等については特に制限されず、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を含有させること以外は、通常の飲食品に用いられる原料を用いて、公知の方法によって製造することができる。
【００３３】
本実施形態による食品組成物は、常法により、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ゲル状、クリーム状、ペースト状、懸濁液状、水溶液状、乳液状、粉末状等の飲食用に適した形態に加工することができる。また、飲食品中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。さらに、味質の改善のために、本発明の効果を損なわない範囲で、糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、グリセリン等を添加することができる。なお、既存の飲食品に、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を含有させて用いる場合、ベースとなる飲食品としては、本発明の効果を奏することのできる飲食品であれば、適宜選択され得る。
【００３４】
本実施形態による食品組成物中に含まれる桑葉の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、１質量％以上、３質量％以上、５質量％以上、又は１０質量％以上であってもよい。食品組成物中の桑葉の含有量の上限は特に制限されないが、例えば、９５質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、又は４０質量％以下であってもよい。
【００３５】
本実施形態による食品組成物中に含まれる１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、０．０１質量％以上、０．０２質量％以上、０．０３質量％以上、０．０５質量％以上、又は０．１質量％以上であってもよい。食品組成物中の桑葉の含有量の上限は特に制限されないが、例えば、９５質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、又は４０質量％以下であってもよい。
【００３６】
次に、本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物について詳細に説明する。
【００３７】
本実施形態によるＬｉｐｉｎ１産生促進用医薬組成物は、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とし、脂肪抑制又は肝障害抑制のために用いられる。桑葉、１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド、ルテオリン７−グルコシド、脂肪抑制、肝障害抑制等の詳細については、前述同様である。
【００３８】
本実施形態による医薬組成物の投与方法は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与、局所投与等、適宜選択され得る。また、医薬品中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。投与剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。
【００３９】
本実施形態による医薬組成物の投与量及び投与間隔は、患者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１日に１〜３回投与であってもよいが、これに制限されるものではない。なお、本実施形態による医薬組成物の投与は、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。
【００４０】
本実施形態による医薬組成物中に含まれる桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物の量は、前述同様である。
【００４１】
次に、本実施形態による脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤について詳細に説明する。
【００４２】
本実施形態による脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤は、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物を有効成分とする。桑葉、１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド、ルテオリン７−グルコシドの詳細については、前述同様である。
【００４３】
本明細書において、「脂肪肝の予防又は治療」とは、例えば、肝臓の脂肪を減少させることで肝臓／体重重量（体重あたりの平均肝臓重量）を減少させ、又は肝臓の脂肪滴の数を減少させることを意味する。また、「肝障害の予防又は治療」とは、例えば、肝保護作用により、ＡＳＴ及びＡＬＴ値の低下、肝臓重量の減少、肝炎の治癒等がもたらされることを意味する。本実施形態による脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤は、生体内におけるＬｉｐｉｎ１産生を促進することで、脂肪肝又は肝障害を予防又は治療することができる。
【００４４】
以上説明したように、桑葉又は１−デオキシノリジマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドからなる群より少なくとも１つ選択される化合物について、脂肪抑制及び肝障害抑制のために用いられるＬｉｐｉｎ１産生促進剤としての新規の食品及び医薬用途並びに新規の脂肪肝又は肝障害の予防又は治療剤が提供される。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
脂質及び糖質を高配合した飼料（ウェスタンダイエット：ＷＤ）をマウスに長期間与えると体重増加と共に、メタボリックシンドローム様症状が現れることが知られている。糖吸収抑制作用を有することで知られる桑葉粉末（ＭＬ）を、ＷＤと共にマウスに長期投与することで、メタボリックシンドロームに対する予防効果を検討した。
【００４７】
実験の概要を図１に示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、雄）を以下の３群に分けた。各群において、食餌は自由摂取とし、約８０日間飼育した。なお、ＷＤの組成を図２に示す。
【００４８】
桑葉粉末（ＭＬ）は、熊本県産ハヤテサカリ栽培種を乾燥させ、微粉末としたものを使用した（ヘルスエイジ社より購入、ロット番号：１６０４）。
【００４９】
桑葉粉末の１−デオキシノジリマイシン含量を測定した。分析カラムには、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０  ３μｍを用い、溶離液には、０．１％のギ酸を添加した水／アセトニトリル混合溶媒を使用した。標準品を用いて検量線を作成した結果、０．０５〜５．０ｍｇ／Ｌの濃度範囲において、良好な直線性（ｒ＝０．９９９）が得られた。本分析条件での装置定量下限（Ｓ／Ｎ＝１０で算出）は、０．０１５ｍｇ／Ｌとなった。
【００５０】
桑葉粉末を実試料として、温水抽出、希釈、ろ過の前処理を行い、抽出液に含まれる１−デオキシノジリマイシン含量の定量を行った。前処理方法について説明する。試料２ｇに純水２０ｍＬを加えて、９０℃加温下で、純水を足しながら攪拌することで温水抽出した。その後、フィルター（酢酸セルロース製、細孔０．４５μｍ）を用いてろ過を行い、ろ液に純水を加えて、２０ｍＬにメスアップした。溶液１ｍＬに、アセトニトリルを１ｍＬ加えて攪拌し、フィルター（ＰＴＦＥ製、細孔０．５μｍ）を用いて再度ろ過を行った。溶離液を用いて２０倍に希釈し、ＬＣ／ＭＳ測定に供した。分析条件を以下に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
ＬＣ／ＭＳ測定の結果、桑葉粉末には、１−デオキシノジリマイシンが２５０ｍｇ／１００ｇ含有していることが確認された。
【００５３】
次に、桑葉粉末について、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）及び液体クロマトグラフィ−飛行時間型質量分析計（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ）によるメタボローム解析を行った。
【００５４】
（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ測定用前処理）
桑葉粉末試料を破砕用チューブに入れ、そこに内部標準物質５０μＭを含んだ６００μＬのメタノール溶液を添加し、冷却下にて破砕機を用いて破砕（１，５００ｒｐｍ，１２０秒×１回）した。破砕後、６００μＬのクロロホルム及び２４０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて撹拌し、遠心分離（２，３００×ｇ，４°Ｃ，５分）を行った。遠心分離後、水層を限外ろ過チューブ（ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ，ＨＭＴ，遠心式フィルターユニット  ５ｋＤａ）に２００μＬ移し取った。これを遠心（９，１００×ｇ，４°Ｃ，１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して測定に供した。
【００５５】
（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ測定用前処理）
桑葉粉末試料を破砕用チューブに入れ、そこに内部標準物質２０μＭを含んだ５００μＬの１％ギ酸−アセトニトリル溶液を添加し、冷却下にて破砕機を用いて破砕（１，５００ｒｐｍ，１２０秒×１回）した。そこに１６７μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、更に破砕（１，５００ｒｐｍ，１２０秒×１回）した。これを遠心分離（２，３００×ｇ，４°Ｃ，５分）し、上清を採取した。沈殿に５００μＬの１％ギ酸−アセトニトリル及び１６７μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて撹拌し、遠心分離後上清を採取し、先の上清と混合した。これを限外ろ過チューブ（ＮＡＮＯＳＥＰ  ３Ｋ  ＯＭＥＧＡ，ＰＡＬＬ）に３５０μＬ×３本移し取り、これを遠心（９，１００×ｇ，４°Ｃ，１２０分）し、限外ろ過処理を行った。次いで、固相抽出を用いてリン脂質を除去した。ろ液を乾固させ、１００μＬの５０％イソプロパノール水溶液（ｖ／ｖ）に溶解して測定に供した。
【００５６】
ＣＥ−ＴＯＦＭＳ測定について以下に示す。
【００５７】
【表２】
2019189576.tif 000005
【００５８】
ＬＣ−ＴＯＦＭＳ測定について以下に示す。
【００５９】
【表３】
2019189576.tif 000006
【００６０】
（データ処理）
検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．１７．１．１１（慶應義塾大学開発）を用いて、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が３以上のピークを自動抽出し、質量電荷比（ｍ／ｚ）、ピーク面積値、ＣＥ−ＴＯＦＭＳでは泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）、ＬＣ−ＴＯＦＭＳでは保持時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＲＴ）を得た。得られたピーク面積値は下記の式を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ＋やＫ＋などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴ又はＲＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
【００６１】
【数１】
2019189576.tif 000007
【００６２】
（候補代謝物質検索）
検出されたピークに対してｍ／ｚとＭＴ又はＲＴの値をもとにライブラリに登録された全物質との照合、検索を行った。検索のための許容誤差はＭＴで±０．５ｍｉｎ、ＲＴで±０．３ｍｉｎ、ｍ／ｚで±１０ｐｐｍ（下式）（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）及び±２５ｐｐｍ（下式）（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ）とした。
【００６３】
【数２】
2019189576.tif 000008
【００６４】
その結果、桑葉粉末に、１−デオキシノリジマイシンの他に、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドが含まれていることが確認された。
【００６５】
（動物）
６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（日本チャールス・リバー社より購入）を、１２時間の明暗サイクル、２３℃±１℃の温度及び５５％±１５％の湿度の条件下で個々のケージに収容して飼育した。
【００６６】
１週間の馴化後、マウスを（ｉ）正常飼料を与えた群（以下、「ＮＤ」という）、（ｉｉ）ＷＤを与えた群（以下、「ＷＤ」という）及び（ｉｉｉ）ＷＤとともに桑葉粉末（ＭＬ）を与えた群（以下、「ＭＬ」という）の３群に分けた（各群ｎ＝８）。マウスに脂肪肝を誘発するために使用されたＷＤは、Ｆ２ＷＴＤ（ショ糖３４％、無塩バター２０％、４１７ｋｃａｌ）を含有していた（図２）。正常飼料（３５９ｋｃａｌ）は、オリエンタル酵母工業社より購入した。ＭＬ群の飼料には、桑葉粉末（ＭＬ）を、ＷＤ飼料をベースに１％（Ｗ／Ｗ）配合した。
【００６７】
なお、本試験は、北海道薬科大学の実験動物の管理及び使用に関する指針（１９９８年、２００１年及び２００７年に改訂）に準拠しており、プロトコル承認番号はＨ２７−００８である。
【００６８】
（血漿生化学検査及び肝組織学的分析）
１２週目に、すべてのマウスをイソフルラン麻酔下で処置し、血液及び肝臓サンプルを得た。ＥＤＴＡ含有血漿分離管（ＰＳＴ）（ＢＤジャパン社）を用いて、マウスの心臓から採血した。各血漿サンプルを全血から採取し、１２，０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、−８０℃で保存した。ＤＲＩ−ＣＨＥＭ  ４０００装置（富士フィルムメディカル）を用いて、血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、グルコース（ＧＬＵ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値を測定した。
【００６９】
各肝臓試料を１０％中性緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、薄切片（５μｍ）に切断した。これらの切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）溶液で染色した。２０×及び６０×対物レンズを備えたオリンパスＡＸ７０光学顕微鏡（オリンパス社）を用いて、ＨＥ染色された肝臓組織の組織学的検査を行った。
【００７０】
（ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いた肝臓の遺伝子発現の全体的解析）
肝臓を解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に保存した。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  キット（キアゲン社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ  ６０００ナノキットを用いた２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー社）を用いて、ＲＮＡ定性及び定量について評価した。
【００７１】
ＮＤ群（ｎ＝３）、ＷＤ（ｎ＝３）及びＭＬ群（ｎ＝３）の肝臓由来の全ＲＮＡ  １μｇをライブラリー調製に用いた。ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２（イルミナ社）を用いて、シークエンシングライブラリーを作製した。ライブラリーの作製手順は以下の通りである。全ＲＮＡをｍＲＮＡに精製した後、ｍＲＮＡを断片化して二本鎖ｃＤＮＡに変換した。インデックス配列を含むシークエンシングアダプターをｃＤＮＡの末端に連結した。ライブラリーについて１００ｂｐの読み取りを作成するように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００（イルミナ社）で配列決定した。
【００７２】
配列の読み取りをトリミングし、定性的にフィルタリングし、ＣＬＣゲノミクスワークベンチ  ｖ９．５．３（キアゲン社）におけるＲＮＡ−Ｓｅｑ  マッピングアルゴリズムでＧＲＣｍ３８（ｍｍ１０）にマッピングした。ＲＮＡ−ｓｅｑデータ解析は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｐｌｕｇｉｎ  １．５を用いたＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いて行った。
【００７３】
主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＰＣＡ）を行うために、各個々の遺伝子のトータルカウントを対数ＣＰＭ値として正規化し、２次元に投影した。２つの主成分は、２Ｄプロットにより特定される。第１の主成分はデータの変動が最も大きい方向を特定し、第２の成分は変動が２番目に大きい方向を特定した。
【００７４】
特異的に発現する遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅｓ：ＤＥＧ）の分析を行った。ＤＥＧを、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈのデジタル遺伝子発現試験ツールの実証的分析を用いて、偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：ＦＤＲ）補正ｐ値＜０．０５に基づき決定した。
【００７５】
各列は１つのサンプルに対応し、各行は１つの遺伝子に対応した、発現値の２次元ヒートマップを作成した。ユークリッド距離及び平均結合は、サンプル及び遺伝子の階層的クラスタリングのためのパラメータとして設定された。遺伝子の数を減少させるために、２５０のＤＥＧ（ＦＤＲ＜０００．１、絶対倍数変化＞４）のみをクラスタリングのために用いた。
【００７６】
（結果）
（体重の変化及び血漿生化学検査）
体重の変化及び血漿生化学検査の結果を図３に、血漿生化学検査のうちＴＧ、ＧＬＵ、ＡＳＴ及びＡＬＴの測定結果を図４に示す。ＷＤ群では、ＮＤ群と比較して、体重及び生化学的指標の有意な増加が観察された。一方、ＭＬ群では、ＷＤ群に比して肝臓／体重重量（体重あたりの平均肝臓重量）、ＴＧ、ＡＬＴ及びＡＳＴが抑制されていた。
【００７７】
（肝臓の組織学的分析）
ＨＥ染色による肝臓組織像を図５に示す。ＨＥ染色において、脂肪滴が白色切片として観察された。ＷＤ群（図５、中央）では、脂肪滴の沈着が数多く見られたのに対して、ＮＤ群（図５、左）及びＭＬ群（図５、右）では、脂肪滴のサイズはＷＤ群のそれよりも小さかった。また、ＭＬ群における肝臓組織の状態は、ＮＤ群のそれと類似していた。
【００７８】
（ＲＮＡ−Ｓｅｑによる肝臓の遺伝子発現解析）
サンプル及び各群の定性コントロールのために、ＰＣＡを行った。各群は、第１の主成分（２７．４％、横軸）で分離することができた（図６）。
【００７９】
ＤＥＧ（ＦＤＲ＜０．０５）をベン図により比較した（図７）。ＷＤ群と他の群との間のＤＥＧの数の差は、ＭＬ群よりもＮＤ群で大きかった。ＷＤ群とＮＤ群との間のＤＥＧの差は１６５４であった（９６２はＷＤ群でより大きく、６９２はＮＤ群でより大きかった）。ＷＤ群とＭＬ群との間のＤＥＧの差は７２２であった（３３６はＷＤ群でより大きく、３８６はＭＬ群でより大きかった）。ＮＤ群とＭＬ群との間のＤＥＧの差は４０２であった（１５５はＮＤ群でより大きく、２４７はＭＬ群でより大きかった）。
【００８０】
発現分析のために選択された２５０のＤＥＧを用いて、個々のマウスのクラスタリング（横軸）及び遺伝子間の情報（縦軸）を用いてヒートマップを作成した（図８）。サンプルのクラスタは、３つのグループに明確に分けられた。さらに、ＮＤ群及びＭＬ群はクレードを作った。
【００８１】
ＷＤ群とＭＬ群との間の発現パターンにおいて高度に変化したＤＥＧについて、Ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔにより解析した。その結果を図９に示す。ＭＬ群で、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子の著しい発現増強が認められた。また、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子の発現量について、遺伝子発現推定量（ＲＰＫＭ）を用いて比較した結果を図１０に示す。図１０において、各グループにおけるＬｉｐｉｎ１のＲＰＫＭの統計解析については、Ｔｕｋｅｙ法により実施した。ＭＬ群では、ＷＤ群に比してＲＰＫＭの値が高く、ＭＬ群でＬｉｐｉｎ１遺伝子の著しい発現増強が確認された（図１０）。
【００８２】
これらのことから、ＷＤ桑葉１％添加食によって、主に肝臓における脂肪肝様症状を抑制されることがわかった。これによって、桑葉、１−デオキシノジリマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドが、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子の発現増強を介して、肝障害及び脂肪肝を抑制することが示唆された。
【００８３】
本実施例による桑葉、１−デオキシノジリマイシン、アピゲニン７−グルコシド及びルテオリン７−グルコシドは、メタボリックシンドロームモデルマウスに対し抑制的に働き、特に脂質代謝への関与、肝重量の増加に伴う脂肪肝の形成を予防する可能性が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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