(57)【要約】【課題】  遠心分離などの煩雑な処理を行う必要がないにも関わらず、高い確度でフォトフェレーシス用液体試料に含有される被処理細胞をアポトーシスさせるまたはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導することができるフォトフェレーシスのための紫外光照射方法および当該紫外光照射方法に用いるマイクロデバイス、並びに、当該マイクロデバイスを備えるフォトフェレーシス用紫外光照射装置の提供。【解決手段】  紫外光照射方法は、壁部に流通路を備えるフォトフェレーシス用マイクロデバイスにおける、前記流通路内にフォトフェレーシス用液体試料を導入する工程と、前記フォトフェレーシス用液体試料に対して前記壁部を透過して紫外光を照射する工程と、を含み、前記流通路における、前記紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁部に流通路を備えるフォトフェレーシス用マイクロデバイスにおける、前記流通路内にフォトフェレーシス用液体試料を導入する工程と、前記流通路内に導入された前記フォトフェレーシス用液体試料に対して前記壁部を透過して紫外光を照射する工程と、を含み、
前記流通路における、前記紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とするフォトフェレーシスのための紫外光照射方法。
【請求項２】
前記フォトフェレーシス用液体試料が、血液であることを特徴とする請求項１に記載のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法。
【請求項３】
前記紫外光は、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含むものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法。
【請求項４】
前記紫外光は、前記流通路における前記フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と異なる方向に照射することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法。
【請求項５】
壁部に流通路を備え、前記流通路内にフォトフェレーシス用液体試料が導入され、前記流通路内に導入された前記フォトフェレーシス用液体試料に対して前記壁部を透過して紫外光が照射されるフォトフェレーシス用マイクロデバイスであって、
前記流通路における、前記紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とするフォトフェレーシス用マイクロデバイス。
【請求項６】
前記フォトフェレーシス用液体試料が血液であり、
前記壁部が、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含む紫外光を透過するものであることを特徴とする請求項５に記載のフォトフェレーシス用マイクロデバイス。
【請求項７】
前記流通路が互いに独立して複数備えられることを特徴とする請求項５または請求項６に記載のフォトフェレーシス用マイクロデバイス。
【請求項８】
前記フォトフェレーシス用マイクロデバイスが、円柱状の紫外光透過性を有するロッド体に、当該ロッド体の長手方向に伸びる貫通孔よりなる流通路が、複数、互いに独立して設けられたものよりなることを特徴とする請求項７に記載のフォトフェレーシス用マイクロデバイス。
【請求項９】
前記フォトフェレーシス用マイクロデバイスが、互いに貼り合わせられた第１の基板および第２の基板よりなり、当該第１の基板および当該第２の基板の少なくとも一方の接合面に、当該第１の基板および当該第２の基板の貼り合わせにより流通路となる流通路形成部分が設けられており、
第１の基板および第２の基板の少なくとも一方が紫外光透過性を有することを特徴とする請求項５〜請求項７のいずれかに記載のフォトフェレーシス用マイクロデバイス。
【請求項１０】
請求項５〜請求項９のいずれかに記載のフォトフェレーシス用マイクロデバイスと、
当該フォトフェレーシス用マイクロデバイスの外部から、当該フォトフェレーシス用マイクロデバイスの前記壁部を透過して前記流通路に対して紫外光を照射する光源と、を備えることを特徴とするフォトフェレーシス用紫外光照射装置。
【請求項１１】
前記光源が、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含む紫外光を放射するものであることを特徴とする請求項１０に記載のフォトフェレーシス用紫外線照射装置。
【請求項１２】
前記光源は、前記紫外光が前記流通路における前記フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と異なる方向に照射されるよう配置されていることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載のフォトフェレーシス用紫外光照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォトフェレーシス用マイクロデバイスおよび当該マイクロデバイスを備える紫外光照射装置、並びに、当該紫外光照射装置を用いたフォトフェレーシスのための紫外光照射方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体が持つ免疫は、人体を細菌・ウイルス、癌、寄生虫等の外敵（寄生体）から防御する役割を担っており、免疫は人間が生きていく上で不可欠な機構であると言える。しかしながら、一方で免疫反応は、アトピー性皮膚炎や乾癬等の皮膚病、関節リュウマチや全身性エリテマトーデス等の膠原病等の自己免疫疾患を引き起こす原因ともなる。自己免疫疾患とは、本来は細菌・ウイルスや腫瘍などの自己と異なる異物を認識し排除するための免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し、攻撃を加えることで発症する症状の総称である。
【０００３】
昨今では、かかる免疫反応を適切に制御し、少ない副作用の下で過剰な免疫反応を抑制することが、現代の医学における最重要課題の一つとして挙げられている。臓器移植の分野においても、免疫反応の制御が最重要の課題であることはよく知られていることである。
従来、過剰免疫の抑制には、免疫抑制剤を投与する方法が一般的に利用されていたが、免疫抑制剤の投与による副作用が問題視されていた。
【０００４】
このような背景の下、近年、免疫抑制の分野においてフォトフェレーシス（体外循環式光化学療法）が注目を集めている。フォトフェレーシスとは、一般的には、体外に取り出した血液にソラレン（psolaren）誘導体等の感光医薬を添加し、活性化したＴ細胞に吸収させた後、当該血液に紫外光を照射して感光医薬を活性化させて、当該Ｔ細胞をアポトーシスさせる、あるいはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導し、これにより、過剰な免疫反応を抑制する方法である。
フォトフェレーシスにおいては、感光医薬の添加は必ずしも必要ではなく、また、仮に感光医薬を添加してフォトフェレーシスに係る紫外光の照射処理が行われ、患者の体内に戻された血液に感光医薬が含まれている場合であっても、紫外光の照射が終了すれば当該感光医薬の活性化状態は継続されないので、免疫抑制剤の投与による免疫抑制方法と比較して患者に副作用が生じるおそれが極めて低い。このため、フォトフェレーシスは、免疫抑制剤を投与する場合と比べて副作用の少ない免疫抑制法として注目を集めている。また、欧米各国では、ステロイド等の免疫抑制剤が効かない自己免疫疾患の治療や、骨髄移植等の移植治療時の免疫抑制に対するフォトフェレーシスの臨床応用が急速に増大している。
【０００５】
フォトフェレーシスを実行するに際しては、上述のように血液中の白血球の一種であるＴ細胞に紫外光を照射する必要がある。しかしながら、血液中にはＴ細胞の他に赤血球が含まれており、赤血球に含まれるヘモグロビンは紫外光に対して大きな吸光度を示す性質を有する。しかも、血液に含まれる血球中、白血球が３％程度であるのに対して赤血球は９６％程度と、白血球に比して多くの赤血球が含有されている。このため、赤血球を含んだ状態の血液に対して紫外光を照射した場合、赤血球中のヘモグロビンによって照射された紫外光が吸収される結果、真に紫外光を照射したい対象であるＴ細胞に対して効果的に紫外光を照射できない、という問題を有する。また、Ｔ細胞を免疫寛容に誘導するために必要なエネルギー量の紫外光を当該Ｔ細胞に照射するには、光源から高強度の紫外光を照射する必要があるが、このような高強度の紫外光が血液成分に照射されることによって赤血球の溶血や血漿蛋白の変成等の悪影響が生じてしまうおそれがある、という問題もある。
【０００６】
このような問題を解決するために、従来のフォトフェレーシスを実行するに際しては、患者から採取した血液に感光医薬を添加後、当該血液を遠心分離して白血球のみを取り出し、この取り出した白血球を厚さ数ｍｍ程度の平たい紫外光透過性を有する容器内に入れ、当該容器の厚み方向に当該容器を介して紫外光を照射し、その後、赤血球や血漿と再混合し、再び患者の体内に戻すという手順を経ていた。
しかしながら、このような従来のフォトフェレーシスにおいては、複雑な手順が必要となることや、患者の体力的負担の増大、医療コストの高騰等の問題があった。
【０００７】
このような問題を解決するために、特許文献１には、遠心分離のような複雑かつ高コストの処理を要することなく行うことができるフォトフェレーシス処理方法が開示されている。具体的には、血液を、多孔質体に形成された微細な貫通孔に導入し、この状態において多孔質体の外部から紫外光を照射する方法が提案されている。
【０００８】
しかしながら、特許文献１に開示されたフォトフェレーシス処理方法は、以下のような問題点がある。例えば、多孔質体に形成された複数の貫通孔は、その貫通方向が均一ではないので、各Ｔ細胞への紫外光の照射量が均一とはならず、従ってＴ細胞をアポトーシスさせる効果が十分に得られない、という問題がある。また、多孔質体に形成される貫通孔の直径は、例えば白血球の直径（１５μｍ）よりもやや大きくする目的で１５〜５０μｍに設定されているが、一般的に、多孔質体における複数の貫通孔の直径を高い精度で均一化させることは難しいので、多孔質体に血液を導入するときに当該血液が詰まってしまうか、詰まらないにしても血液の導入に長時間を要してしまう、という問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４４６８９７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、遠心分離などの煩雑な処理を行う必要がないにも関わらず、高い確度でフォトフェレーシス用液体試料に含有される被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導することができるフォトフェレーシスのための紫外光照射方法および当該紫外光照射方法に用いるマイクロデバイス、並びに、当該マイクロデバイスを備える紫外光照射装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法は、壁部に流通路を備えるフォトフェレーシス用マイクロデバイスにおける、前記流通路内にフォトフェレーシス用液体試料を導入する工程と、前記流通路内に導入された前記フォトフェレーシス用液体試料に対して前記壁部を透過して紫外光を照射する工程と、を含み、
前記流通路における、前記紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする。
【００１２】
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法においては、前記フォトフェレーシス用液体試料が、血液である構成とすることができる。
【００１３】
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法においては、前記紫外光は、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含むものであることが好ましい。
【００１４】
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法においては、前記紫外光は、前記流通路における前記フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と異なる方向に照射することが好ましい。
【００１５】
本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスは、壁部に流通路を備え、前記流通路内にフォトフェレーシス用液体試料が導入され、前記流通路内に導入された前記フォトフェレーシス用液体試料に対して前記壁部を透過して紫外光が照射されるものであって、
前記流通路における、前記紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする。
【００１６】
本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスにおいては、前記フォトフェレーシス用液体試料が血液であり、
前記壁部が、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含む紫外光を透過するものであることが好ましい。
【００１７】
本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスにおいては、前記流通路が互いに独立して複数備えられる構成とすることができる。
【００１８】
本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスは、円柱状の紫外光透過性を有するロッド体に、当該ロッド体の長手方向に伸びる貫通孔よりなる流通路が、複数、互いに独立して設けられたものとすることができる。
【００１９】
本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスは、互いに貼り合わせられた第１の基板および第２の基板よりなり、当該第１の基板および当該第２の基板の少なくとも一方の接合面に、当該第１の基板および当該第２の基板の貼り合わせにより流通路となる流通路形成部分が設けられており、
第１の基板および第２の基板の少なくとも一方が紫外光透過性を有するものとすることができる。
【００２０】
本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置は、上記のフォトフェレーシス用マイクロデバイスと、
当該フォトフェレーシス用マイクロデバイスの外部から、当該フォトフェレーシス用マイクロデバイスの前記壁部を透過して前記流通路に対して紫外光を照射する光源と、を備えることを特徴とする。
【００２１】
本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置においては、前記光源が、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含む紫外光を放射するものである構成とすることができる。
【００２２】
本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置においては、前記光源は、前記紫外光が前記流通路における前記フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と異なる方向に照射されるよう配置されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法においては、紫外光の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下に規制された流通路に被処理細胞を含有するフォトフェレーシス用液体試料が導入される。これにより、流通路におけるフォトフェレーシス用液体試料の詰まりの発生を抑制することができるので、フォトフェレーシス用液体試料への紫外光の照射を迅速に行うことができながら、フォトフェレーシス用液体試料に含有される被処理細胞に高い均一性で紫外光を照射することができる。従って、遠心分離を行う必要がないにも関わらず、高い確度でフォトフェレーシス用液体試料に含有される被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導することができる。その結果、フォトフェレーシスにおいて、フォトフェレーシス用液体試料の遠心分離などの煩雑な処理に要する時間を大幅に短縮することができると共に、患者の負担を大幅に軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置の構成の一例における要部を模式的に示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向に沿った断面図である。
【図２】本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスの構成の一例を示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と垂直な方向に沿った断面図である。
【図３】本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスの別の構成例を示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と垂直な方向に沿った断面図である。
【図４】本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスのさらに別の構成例を示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と垂直な方向に沿った断面図である。
【図５】本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスのさらに別の構成例を示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と垂直な方向に沿った断面図である。
【図６】本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスのさらに別の構成例を示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向と垂直な方向に沿った断面図である。
【図７】実験例１の結果を示すグラフである。
【図８】実験例２に用いた実験用フォトフェレーシス装置の概略を説明する概略図である。
【図９】実験例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明のフォトフェレーシス用マイクロデバイスおよび紫外光照射装置、並びに、フォトフェレーシスのための紫外光照射方法の実施の形態について説明する。
【００２６】
〔紫外光照射装置〕
図１は、本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置の構成の一例における要部を模式的に示す、フォトフェレーシス用液体試料の流通方向に沿った断面図である。
本発明のフォトフェレーシス用紫外光照射装置（以下、単に「紫外光照射装置」という。）は、フォトフェレーシス（体外循環式光化学療法）において行われる一連のフォトフェレーシス処理において被処理細胞を含有するフォトフェレーシス用液体試料に紫外光を照射する装置である。紫外光照射装置は、具体的には、紫外光透過性を有する壁部１１、および、当該壁部１１を貫通する流通路１２を備えるフォトフェレーシス用マイクロデバイス（以下、単に「マイクロデバイス」という。）１０と、当該マイクロデバイス１０の外部から、当該マイクロデバイス１０の壁部１１を透過して流通路１２に導入されたフォトフェレーシス用液体試料Ｓに対して紫外光を照射する光源２０とを備えるものである。
マイクロデバイス１０は、フォトフェレーシス処理毎に交換可能なディスポーザブルのものとされる。
【００２７】
〔フォトフェレーシス用液体試料〕
フォトフェレーシス用液体試料Ｓは、紫外光を照射することによりアポトーシスさせる目標となる細胞（以下、「被処理細胞」ともいう。）を含有する細胞含有液であり、具体的には、血液、髄液、リンパ液、およびこれらを生理食塩水等で希釈した液体などが挙げられ、特に、血液成分が分離されていない血液（全血）が挙げられる。
フォトフェレーシス用液体試料が血液である場合において、被処理細胞は例えば白血球、特にＴ細胞とされる。
【００２８】
〔マイクロデバイス〕
本発明のマイクロデバイス１０は、紫外光透過性を有する壁部１１、および、当該壁部１１を貫通して伸びる流通路１２を備える。本発明のマイクロデバイス１０は、この流通路１２内に被処理細胞を含むフォトフェレーシス用液体試料Ｓが導入され、当該流通路１２内に導入されたフォトフェレーシス用液体試料Ｓに対して壁部１１を透過して光源２０からの紫外光が照射されるものである。
具体的には、マイクロデバイス１０は、図２に示されるように、円柱状の細管よりなるものとすることができる。この細管の管内部が流通路１２とされ、管壁がマイクロデバイス１０の壁部１１とされる。このマイクロデバイス１０において、流通路１２とは、両端にフォトフェレーシス用液体試料Ｓの導入口および導出口を１つずつ有し、この導入口および導出口が単一の経路で連通されたものをいう。
【００２９】
そして、本発明のマイクロデバイス１０においては、流通路１２における、光源２０からの紫外光の照射方向の長さ（以下、「照射方向長さ」ともいう。）が７０μｍ以上５００μｍ以下とされ、１００μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以上３００μｍ以下であることが特に好ましい。
流通路１２の照射方向長さが５００μｍ以下であることにより、流通路１２における紫外光の照射方向の底部（図１および図２において下部）まで光源２０からの紫外光を到達させることができ、従って、被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えて免疫寛容に誘導することができる効果が高い確度で得られる。また、流通路１２の紫外光の照射方向長さが７０μｍ以上であることにより、フォトフェレーシス用液体試料Ｓに含有される成分にかかわらず、流通路１２においてフォトフェレーシス用液体試料Ｓの成分の詰まりなどが発生して当該フォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通が阻害されることがなく、特にフォトフェレーシス用液体試料Ｓが血液である場合に当該血液の血球成分が流通路１２に詰まることを抑止することができる。
【００３０】
流通路１２における紫外光の照射方向の長さ（照射方向長さ）とは、流通路１２に照射される紫外光の進行方向Ｃ（図２において上下方向）に沿った長さをいう。例えば、放電ランプのように斜め光成分を含む拡散光を照射する光源を用いる場合、図２に示す紫外光の進行方向Ｃが照射方向である。
図２に示す細管よりなるマイクロデバイス１０においては、マイクロデバイス１０の照射方向長さｄは、例えばマイクロデバイス１０に対してフォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向（流通路１２を構成する細管の伸びる方向）に垂直な方向に紫外光が照射される場合、当該マイクロデバイス１０を構成する細管の内径に相当する。
【００３１】
また、流通路１２の幅、すなわち紫外光の照射方向（図１のＹ方向））と、フォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向（図１のＸ方向）とにそれぞれ垂直な方向（図１における紙面と垂直な方向（Ｚ方向））の幅（以下、「流通路幅」ともいう。）は、例えば７０〜５００μｍとされる。
また、流通路１２における、紫外光が照射される領域（以下、「光照射領域」ともいう。）Ｒのフォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向の長さ（以下、「照射長さ」ともいう。）は、紫外光の種類や強度、当該流通路１２におけるフォトフェレーシス用液体試料Ｓの流速などに基づいて適宜に決定することができる。
【００３２】
壁部１１の厚み、すなわち当該壁部１１における紫外光の照射方向の厚みｔは、当該壁部１１を構成する材質、特に紫外光の透過率によっても異なるが、例えば１〜５ｍｍ程度とされることが好ましい。
壁部１１の厚みが過小である場合は、マイクロデバイス１０が耐久性に劣るものとなるおそれがある。また、壁部１１の厚みが過大である場合は、被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導する効果が所期の確度で得られるだけのエネルギー量の紫外光を流通路１２の底部まで到達させることができないおそれがある。
【００３３】
このマイクロデバイス１０を構成する細管は、例えば石英ガラス、アルカリガラス、硼珪酸ガラスなどのガラス；シリコーン樹脂、シクロオレフィン樹脂（シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）やシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）など）、アクリル樹脂などの合成樹脂などよりなるものとすることができる。
【００３４】
〔光源〕
本発明の紫外光照射装置に備えられる光源２０は、紫外光を放射するものであり、特に２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光を含む紫外光を放射するものであることが好ましい。
２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の光は、いわゆるＵＶＢと呼ばれる中波長紫外域の光である。このようなＵＶＢをフォトフェレーシスに用いることにより、ソラレン誘導体等の感光医薬を用いなくとも、フォトフェレーシス用液体試料ＳにＵＶＢを照射することのみで被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えて免疫寛容に誘導することができる。
なお、フォトフェレーシスにいわゆるＵＶＡと呼ばれる長波長紫外域（３２０〜４００ｎｍ）の光を用いる場合には、ＵＶＡはＵＶＢよりも長波長の光であるためにそのエネルギーが小さいので、被処理細胞をアポトーシスさせるためには、ソラレン誘導体等の感光医薬をフォトフェレーシス用液体試料Ｓに添加した状態でＵＶＡを照射することが必要となる。
【００３５】
このようなＵＶＢを放射する光源２０としては、例えばＬＥＤ素子、ＸｅＣｌエキシマ放電ランプ、メタルハライドランプ、蛍光ランプ、水銀ランプなどを用いることができる。
光源２０には、ＬＥＤ素子やランプから放射される光のうち、２８０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域のＵＶＢ以外の波長域の光を遮断する光学フィルタが備えられていてもよい。
【００３６】
光源２０としては、マイクロデバイス１０における流通路１２の全流通路幅にわたって、かつ、所期の長さ（光照射領域Ｒの照射長さ）にわたって紫外光を照射することができる形状の光を照射することができるものを用いることができる。具体的には、例えば１つの流通路１２を有する細管からなるマイクロデバイス１０に対しては、光源２０として棒状光源を用いることが好ましい。また、後述するように複数の流通路が互いに平行に伸びるよう面状に並べられて配置されたマイクロデバイスにおいては、光源として面状光源を用いることが好ましい。
【００３７】
光源２０は、当該光源２０から放射される紫外光がマイクロデバイス１０の流通路１２におけるフォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向と異なる方向に照射されるよう配置されることが好ましい。具体的には、フォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向に略垂直となる方向に照射されることが好ましい。
【００３８】
〔紫外光照射方法〕
本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法は、フォトフェレーシス（体外循環式光化学療法）において行われる一連のフォトフェレーシス処理における被処理細胞に紫外光を照射する方法であって、マイクロデバイス１０の流通路１２内にフォトフェレーシス用液体試料Ｓを導入する工程と、この流通路１２に導入されたフォトフェレーシス用液体試料Ｓに対して壁部１１を透過して光源２０から紫外光を照射する工程とを含む。
本発明に係る紫外光照射方法は、具体的には、上記のような紫外光照射装置を用いて以下のように行われる。以下においては、フォトフェレーシス用液体試料Ｓを血液として説明する。
【００３９】
まず、患者から採取された血液を、フォトフェレーシス用液体試料Ｓとして例えば輸液ポンプなどによってマイクロデバイス１０の流通路１２に当該流通路１２の一端の導入口から導入する。流通路１２に導入された血液は、流通路１２内を一定の流速で一方向（図１において右方向）に流通される。そして、光源２０からの紫外光が、マイクロデバイス１０の壁部１１を透過して流通路１２における光照射領域Ｒ内を流通される血液に照射される。
流通路１２においては、血液中に含まれる被処理細胞（白血球Ｓ１）が、赤血球Ｓ２と混ざり合いながら流通される。流通路１２においては、紫外光の照射方向の長さが白血球よりも若干大きい７０〜５００μｍの範囲とされているので、流通路１２の長手方向（流通方向）に沿って並列に白血球が整列されやすい環境が創出される。従って、マイクロデバイス１０の壁部１１を透過した紫外光の一部は、流通路１２内を流通される血液中の赤血球Ｓ２によって吸収されることなく被処理細胞（白血球Ｓ１）に照射される。被処理細胞（白血球Ｓ１）は、流通路１２における光照射領域の始端から終端に至るまでの間に、光源２０からの紫外光を受ける。そして、白血球Ｓ１に紫外光が照射されることによって、当該白血球Ｓ１がアポトーシスする、またはダメージを受けて免疫寛容が誘導される。紫外光が照射された血液は、その後さらに流通路１２内を流動後、導出口から排出され、再度患者の体内に戻される。
【００４０】
フォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通路１２における流速は、フォトフェレーシス用液体試料Ｓの種類、光源２０の種類や放射される紫外光の波長や照射量、流通路１２における流通路幅や光照射領域の長さなどによっても異なるが、被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えて免疫寛容に誘導する効果が得られるだけのエネルギー量の紫外光（積算光量）が得られる速度であればよい。
【００４１】
以上のような紫外光照射方法においては、紫外光の照射方向長さが７０μｍ以上５００μｍ以下に規制された流通路１２に被処理細胞を含有するフォトフェレーシス用液体試料Ｓが導入される。これにより、流通路１２におけるフォトフェレーシス用液体試料Ｓの詰まりの発生を抑制することができるので、フォトフェレーシス用液体試料Ｓへの紫外光の照射を迅速に行うことができ、しかも、フォトフェレーシス用液体試料Ｓに被処理細胞と共に被処理細胞以外の成分が含有されて流通路に流通されていても、フォトフェレーシス用液体試料Ｓに含有される被処理細胞に高い均一性で紫外光を照射することができる。従って、感光医薬を用いず、かつ、遠心分離を行う必要がないにも関わらず、高い確度でフォトフェレーシス用液体試料Ｓに含有される被処理細胞をアポトーシスさせる、またはダメージを与えることにより免疫寛容に誘導することができる。その結果、フォトフェレーシスにおいて、フォトフェレーシス用液体試料Ｓの遠心分離などの煩雑な処理に要する時間を大幅に短縮することができると共に、患者の負担を大幅に軽減することができる。
【００４２】
以上、本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法、マイクロデバイスおよび紫外光照射装置の実施の形態について具体的に説明したが、本発明は以上の例に限定されるものではなく、種々の変更を加えることができる。
例えば、マイクロデバイスは、流通路が互いに独立して複数備えられたものであってもよい。
具体的には、図３に示されるように、マイクロデバイス３０は、円柱状の紫外光透過性のロッド体３１に、当該ロッド体３１の長手方向に伸びる貫通孔よりなる流通路３２が、複数、互いに独立して平行に設けられたものとすることができる。このロッド体３１においては、当該ロッド体３１の中心軸を含む面と略平行に離間した仮想面Ａ上に、複数の流通路３２が平行かつ等間隔に並んで配置されると共に、当該仮想面Ａと、ロッド体３１の中心軸を含む面を挟んで面対称となる仮想面Ｂ上に、複数の流通路３２が平行かつ等間隔に並んで配置されている。
このマイクロデバイス３０を備える紫外光照射装置においては、全ての流通路３２について、他の流通路３２を介さないで光源からの紫外光が照射されるよう、光源が配置される。具体的には、このマイクロデバイス３０に対しては、仮想面Ａ側（図３において上側）と、仮想面Ｂ側（図３において下側）とから、それぞれロッド体３１を透過して紫外光を照射することが好ましい。さらに、紫外光を照射するための光源は、流通路３２の配置幅に対応した幅を有する面状光源であることが好ましい。
このマイクロデバイス３０においては、全ての流通路３２の照射方向長さが、７０μｍ以上５００μｍ以下とされていることが好ましい。
【００４３】
また、図４に示されるように、マイクロデバイス４０は、円柱状の紫外光透過性のロッド体４１に、当該ロッド体４１を貫通して長手方向に伸びる幅広のスリットよりなる流通路４２が２つ、互いに独立してスリットが伸びる面方向が互いに平行となるよう設けられたものとすることができる。このロッド体４１においては、当該ロッド体４１の中心軸を含む面を挟む状態に２つの流通路４２が対称に配置されている。
このマイクロデバイス４０を備える紫外光照射装置においては、２つの流通路４２について、互いに他の流通路４２を介さないで光源からの紫外光が照射されるよう、光源が配置される。具体的には、このマイクロデバイス４０に対しては、ロッド体４１の中心軸を含む面の上側（図４において上側）と、下側（図４において下側）とから、それぞれロッド体４１を透過して紫外光を照射することが好ましい。さらに、紫外光を照射するための光源は、流通路４２を構成するスリットの幅（図４において左右方向の幅）に対応した幅を有する面状光源であることが好ましい。
このマイクロデバイス４０においては、２つの流通路４２の照射方向長さが、それぞれ７０μｍ以上５００μｍ以下とされていることが好ましい。
【００４４】
また、図５に示されるように、マイクロデバイス５０は、円柱状の紫外光透過性を有するロッド体に、当該ロッド体の長手方向に伸びる貫通孔よりなる流通路が、複数、互いに独立して設けられたものとすることができる。このマイクロデバイス５０のロッド体５１には、ロッド体５１を貫通して当該ロッド体５１の長手方向に伸びる複数の空孔よりなる流通路５２が、ロッド体５１の中心軸Ｐを取り囲んで規則的に配置される状態に、互いに独立して形成されている。ロッド体５１における流通路５２は、中心軸Ｐから等距離であり、かつ、隣接する流通路５２が互いに等間隔となるよう並んで配置されている。
このマイクロデバイス５０を備える紫外光照射装置においては、全ての流通路５２について、他の流通路５２を介さないで光源からの紫外光が照射されるよう、光源が配置される。このマイクロデバイス５０に対しては、異なる三方向からそれぞれロッド体５１を透過して紫外光を照射することが好ましい。具体的には、３つの光源（図示せず）が、その光軸がいずれもマイクロデバイス５０の流通路５２におけるフォトフェレーシス用液体試料Ｓの流通方向（図５において紙面と垂直な方向）に略垂直となり、かつ、互いに１２０度の交差角で中心軸Ｐにおいて交差するよう、配置される。
このマイクロデバイス５０においては、全ての流通路５２の照射方向長さが、７０μｍ以上５００μｍ以下とされていることが好ましい。
【００４５】
さらに、マイクロデバイスは、１つの流通路を有する細管が複数、組み合わせられて構成されたものであってもよい。
【００４６】
以上のような複数の流通路を有するマイクロデバイスによれば、合計の流通路幅を増大させることができるために、フォトフェレーシス処理の速度を向上させることができる。
【００４７】
また例えば、マイクロデバイスは、細管やロッド体などの円柱状のものに限定されず、図６に示されるように、ガラスまたは合成樹脂などの紫外光透過性を有する小さなマイクロチップ基板６１Ａ上に、微細加工技術によってマイクロ流路が形成された平板状のマイクロチップ６０よりなるものであってもよい。
具体的には、マイクロチップ６０は、一対のマイクロチップ基板６１Ａ，６１Ｂよりなり、一方のマイクロチップ基板６１Ａの表面にマイクロ流路（流路形成部分）が形成された状態において当該一対のマイクロチップ基板６１Ａ，６１Ｂが対向して接合されてマイクロ流路が閉塞されることにより、内部にフォトフェレーシス用液体試料Ｓが流れる流通路６２が形成されたものとされる。このマイクロチップ６０においては、マイクロ流路が形成された一方のマイクロチップ基板６１Ａがポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーンゴムよりなり、他方のマイクロチップ基板６１Ｂが石英ガラスよりなる。
マイクロチップ６０において、流通路６２は、１つまたは複数形成される。図６においては、６本の流通路６２が形成されている。
このマイクロチップ６０を備える紫外光照射装置においては、全ての流通路６２について、他の流通路６２を介さないで光源からの紫外光が照射されるよう、光源が配置される。具体的には、このマイクロチップ６０に対しては、紫外光透過性の良好な材料による基板側から、すなわち他方のマイクロチップ基板６１Ｂ側から当該他方のマイクロチップ基板６１Ｂを透過して紫外光を照射することが好ましい。さらに、紫外光を照射するための光源は、流通路６２の配置幅に対応した幅を有する面状光源であることが好ましい。
このマイクロチップ６０においては、全ての流通路６２の照射方向長さが、７０μｍ以上５００μｍ以下とされていることが好ましい。
【００４８】
また、本発明のフォトフェレーシスのための紫外光照射方法は、処理速度の向上性の観点からフロー照射式すなわち連続的にフォトフェレーシス用液体試料をマイクロデバイスの流通路に循環させながら行うことが好ましいが、バッチ照射式で行うこともできる。
【００４９】
以下、本発明の実験例について説明する。
【００５０】
〔実験例１〕
フォトフェレーシスの主なメカニズムとして、紫外光の照射によって、活性化しているＴ細胞がアポトーシスに陥り免疫抑制が働くことが挙げられる。以下において、本発明に基づく方法によってＴ細胞のアポトーシス誘導が可能か確認した。
未処理のＪｕｒｋａｔ細胞：ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（理研セルバンク製）に対して、細胞増殖アッセイ用試薬「CellTrace Far Red Cell Proliferation Kit」（Thermo Fisher Scientific 社製）を添加し、３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて１０分間培養した後、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて５分間培養した。その後、遠心分離を行って上清を除去することによりラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞を得た。得られたラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞を、１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈してＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液を調製した。Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液：血液が容量比で０％（１００：０）、５％（９５：５）、１０％（９０：１０）、２０％（８０：２０）、５０％（５０：５０）、７０％（３０：７０）濃度となるようそれぞれ混合液〔１〕〜〔６〕を調製した。
各混合液〔１〕〜〔６〕について、長さ５０ｍｍの石英細管に充填し、分光照射器にて紫外光を照射した。照射する紫外光は、照射波長が２９０ｎｍのものであり、照射量は１０ｍＪ／ｃｍ2 （放射照度：０．１６ｍＷ／ｃｍ2 、照射時間：６３秒間）である。石英細管の内径は２００μｍ、３００μｍ、６００μｍ、９００μｍのものをそれぞれ使用した。石英細管の外径はすべて３ｍｍである。
紫外光の照射後、混合液〔１〕〜〔６〕を回収し、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて２４時間培養した後、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）解析により、ラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞のAnnexinV陽性すなわちアポトーシスの誘導比率を調べた。結果を図７に示す。
【００５１】
実験例１の結果から、石英細管の径が細いほどアポトーシスの誘導比率すなわちラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞をアポトーシスさせる効果が高く得られることが確認された。図７のグラフ中の値はＮ＝３の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【００５２】
〔実験例２〕
未処理のＪｕｒｋａｔ細胞：ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（理研セルバンク製）に対して、細胞増殖アッセイ用試薬「CellTrace Far Red Cell Proliferation Kit」（Thermo Fisher Scientific 社製）を添加し、３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて１０分間培養した後、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて５分間培養した。その後、遠心分離を行って上清を除去することによりラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞を得た。得られたラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞を、１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈してＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液を調製した。Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液：血液が容量比で２０％（８０：２０）濃度となるよう混合液〔Ａ〕を調製した。
一方、図８に示す実験用フォトフェレーシス装置を作製した。具体的には、長さ５０ｍｍ、外径３ｍｍ、内径３００μｍである石英細管７０の両端に各々シリコンチューブよりなる輸液チューブ７３，７４を取り付け、一方の輸液チューブ７３にはペリスタリックポンプよりなる輸送ポンプ７７を介在させた。石英細管７０の上部には、当該石英細管７０に紫外光が照射される状態にＬＥＤ照射器８０を設けた。
この実験用フォトフェレーシス装置を用いて、混合液〔Ａ〕を石英細管に流通させながらＬＥＤ照射器８０にて照射波長が２９０ｎｍの紫外光を照射する紫外光照射処理を行った。具体的には、供給用サンプルチューブ７８に入れられた混合液〔Ａ〕（図８において符号ＳＡで示す。）を輸送ポンプ７７によって輸液チューブ７３を介して石英細管７０に輸送し、当該石英細管７０、および他方の輸液チューブ７４を流通させながら回収用サンプルチューブ７９において回収した。混合液〔Ａ〕の流速は、石英細管の通過時間すなわち紫外光の照射時間が５．６秒間となる流速に設定した。
この紫外光照射処理を、紫外光の照射量が０ｍＪ／ｃｍ2 、６ｍＪ／ｃｍ2 、１１ｍＪ／ｃｍ2 、２０ｍＪ／ｃｍ2 、３５ｍＪ／ｃｍ2 、７１ｍＪ／ｃｍ2 となる条件でそれぞれ行った。紫外光の照射量は、表１に従って電流制御により放射照度を変化させることによって変更した。
紫外光の照射後、混合液〔Ａ〕を回収し、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ2 の条件下にて２４時間培養した後、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）解析により、ラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞のAnnexinV陽性すなわちアポトーシスの誘導比率を調べた。結果を図９に示す。
【００５３】
【表１】
2019181054.tif 000003
【００５４】
実験例２の結果から、フロー照射式すなわち連続的に混合液〔Ａ〕を石英細管に流通させながら紫外光を照射する方式においてもラベル済みＪｕｒｋａｔ細胞をアポトーシスさせる効果が得られ、紫外光の照射量に依存的にアポトーシス誘導比率が増加することが確認された。図９のグラフ中の値はＮ＝３の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【符号の説明】
【００５５】
１０  マイクロデバイス
１１  壁部
１２  流通路
２０  光源
３０  マイクロデバイス
３１  ロッド体
３２  流通路
４０  マイクロデバイス
４１  ロッド体
４２  流通路
５０  マイクロデバイス
５１  ロッド体
５２  流通路
６０  マイクロチップ
６１Ａ，６１Ｂ  マイクロチップ基板
６２  流通路
７０  石英細管
７３，７４  輸液チューブ
７７  輸送ポンプ
７８  供給用サンプルチューブ
７９  回収用サンプルチューブ
８０  ＬＥＤ照射器
Ｃ  進行方向
Ｐ  中心軸
Ｒ  光照射領域
Ｓ  フォトフェレーシス用液体試料
Ｓ１  白血球
Ｓ２  赤血球
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019181054.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図９】
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