(57)【要約】【課題】一般食品分野、健康食品分野、機能性食品分野及び化粧品分野において有用且つ安全性の高いＮｒｆ２活性化剤を提供する。【解決手段】本発明はプテリキシンを有効成分として含有する一般食品分野、健康食品分野、機能性食品分野及び化粧品分野において、酸化ストレス低減効果のあるＮｒｆ２活性化剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
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【請求項２】
請求項１に記載の化合物のＮｒｆ２活性化剤による酸化ストレス低減効果。
【請求項３】
請求項１ないし２の何れか一項に記載のＭｒｆ２活性化剤による酸化ストレス軽減と酸化ストレスに伴う各種疾患の予防剤
【請求項４】
前記Ｎｒｆ２活性化剤が経口投与または皮膚に外用される、請求項２ないし３の何れか一項に記載のＭｒｆ２活性化剤と請求項１〜３に記載のＮｒｆ２活性化剤含有食品または化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、一般食品分野、健康食品分野及び機能性食品分野、及び化粧品分野において安全性が高く、効果の高いプテリキシン（式１）を含有するＮｒｆ２活性剤で酸化ストレスを軽減することによる酸化ストレスによる各種疾患予防に関する。
【背景技術】
【０００２】  我々好気生物は酸素の活用による高エネルギー獲得の一方で、生体内には酸化力の強い活性酸素（ＲＯＳ）や活性窒素（ＲＮＳ）が生じる。この過剰なＲＯＳやＲＮＳによる細胞障害、あるいは生じた過酸化物による動脈硬化症、心筋梗塞、発癌など、様々な疾患の要因となる。また、紫外線による皮膚の炎症に伴う剰なＲＯＳやＲＮＳ産生による酸化ストレスは、シミ、ソバカス、シワの要因になる（非特許文献１、２）。【０００３】  この酸化ストレスによる各種疾患予防に対応するため、生体内では抗酸化タンパクのＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素（ＮＱＯ１）、チオレドキシン、ヘムオシザーゼー１（ＨＯ−１）や解毒酵素のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等を発現させて防御する。これらタンパク発現には、細胞質内でＫｅｅｐ１に結合している転写因子のＮｒｆ２が、酸化ストレスや新電子性物質に応答し、Ｋｅｅｐ１から解離して核内へ移行する。核内に移行したＮｒｆ−２は抗酸化応答配列（ＡＲＥ）に結合して、抗酸化タンパク質や解毒酵素を発現させることで細胞の保護、生存にはたらく（非特許文献３）。【０００４】  Ｎｒｆ２活性化剤を含むクコシ植物抽出物や（特許文献１）また、Ｎｒｆ２活性化剤としては、フラボノイドのヘスペリジン誘導体やセプトリンなどが報告されている（特許文献２、３）。【０００５】  該文献ではＮｒｆ２活性評価は活性に伴う抗酸化タンパク質などの発現レベルでの評価と実証には至っていない。また該文献３では海洋生物からの抽出、分離物であり、その実用化には量的な課題が残る。【０００６】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−２１１１０７号公開
【特許文献２】特開２０１１−２５６１２６号公開
【特許文献３】特許２０１６−１８３１１１号公開
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】谷口直之、遠藤猛、酸化ストレス・レドックスの生化学、２０００年
【非特許文献２】岡新一、淀井淳司、医学のあゆみ、２１８巻、１号、２００６年
【非特許文献３】Ｋａｓｐａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４７，１３０４−１３０９、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明はプテリキシンを有効成分として含有する一般食品分野、健康食品分野、機能性食品分野及び薬用化粧品において、酸化ストレス低減効果のあるＮｒｆ２活性化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明ではプテリキシンを有効成分とするＮｒｆ２活性化剤を提供する。本発明の要旨は、以下の通りである。【００１１】  本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プテリキシンにＮｒｆ２活性化作用を見出し、このＮｒｆ２活性化剤による酸化ストレス軽減効果による種々の疾患を予防できることを見出した。【００１２】  すなわち、本発明の様態においては、下記の１〜３のＮｒｆ２活性化剤を提供する。
１．本発明のＮｒｆ２活性化剤を有効成分として含有する酸化ストレスによる疾患予防剤。
２．Ｎｒｆ２活性化剤を含有する植物による酸化ストレス軽減食素材
３．また、前記Ｎｒｆ２活性化剤が経口投与、あるいは皮膚外用の上記の何れかに記載の酸化ストレス軽減効果のある食品や化粧品を提供する。
【発明の効果】
【００１３】  本発明に用いるプテリキシンは、該剤を含むすべての植物が抽出物原料となる。また、原料そのままでも、食品素材として用いることができる。本発明におけるＮｒｆ２活性化剤含有食品は、本発明に係るＮｒｆ２活性化剤が、食品素材や飼料成分の１種以上に含有され、水溶液、乳化液、水分分散、ペースト、ゲル状、あるいは、乾燥物形態の粉末、顆粒状、正型体状等でもよい。また、本発明のＮｒｆ２活性化剤含有食品は、ヒトが摂取するものに限るものではなく、牛、豚などの家畜、犬や猫といったペットの餌にも本発明のＮｒｆ２活性化剤含有食品は含まれる。このＮｒｆ２活性化剤含有食品は、公知の加工法で製造できる。【００１４】
【発明を実施するための形態】
【００１５】実施例
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】細胞培養
ＲＡＷ２６４．７細胞は，ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清，１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を用いて，インキュベータ（５％ＣＯ２，３７℃）で培養した．
【実施例２】
【００１７】Ｎｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達活性試験
試験化合物のＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達活性は、レポーターアッセイで行った。レポーターアッセイには、ＡＲＥとルシフェラーゼがコードされたプラスミドを、細胞にトランスフェクションし、核内に移行したＮｒｆ２がＡＲＥに結合すると増加するルシフェラーゼ活性をルシフェリン添加による発光強度として測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の前培養を２４時間行った後に、培養細胞に試験化合物（最終濃度（μＭ）２５，５０，１００）を添加し、ｐＧＬ４．３７プラスミドとＦｕＧＥＮＥ６の混合液を２０μｌ加えて、２４時間培養した。Ｌｙｓｉｓバッファーで細胞を融解し、回収した細胞懸濁液（５０μｌ）にルシフェリン（５０μｌ）を添加した時の反応液の発光強度を測定した。また、細胞懸濁液のタンパク量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定し。活性は細胞のタンパク質量あたりの発光強度で表示した。その結果、図１に示されるようにプテリキシンのＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル活性化が示され、酸化ストレスの軽減効果が明らかとなった。
【実施例３】
【００１８】ＨＯ−１タンパク質の発現試験
ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は２４時間の前培養を行い、試験化合物（最終濃度（μＭ）２５，５０，１００）を添加して、２４時間培養した。回収した培養細胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で各々のタンパク質を分離し、ウエスタンブロット分析法でＨＯ−１とβ−Ａｃｔｉｎ（発現コントロールのハウスキーピングタンパク質）の検出を行った（図２）。ＨＯ−１／タンパクの発現量（ＨＯ−１／β−Ａｃｔｉｎ）は、試験化合物未処理（コントロール）の１００％に対する発現率として算出した（図３）。本結果より、プテリキシンはＮｒｆ２活性化を伴い抗酸化タンパクＨＯ−１を発現することで、酸化ストレスを軽減させることが示された（図２，３）。
【実施例５】
【００１９】細胞毒性試験
試験化合物の細胞毒性試験はＭＴＴ法で行った。ＭＴＴは生細胞に取り込まれるとミトコンドリアで還元され、青紫色のホルマザンを生成する。ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は実施３で処理した細胞に、０．０５％ＭＴＴ試薬（ｗ／ｖｉｎＰＢＳ）を５００μｌ添加して、ＣＯ２インキュベーターで２時間反応させた。反応後に、上清を完全に取り除き２５０μｌのＤＭＳＯでホルマザンを抽出して、吸光波長５４０ｎｍと対照波長６５５ｎｍをマイクロプレートリーダーで測定した。試験化合物の細胞毒性は、試験化合物未処理細胞（コントロール）の１００％に対する生存率で算出した（図４）。プテリキシンの評価濃度における細胞毒性がないことから、安全性の高いＮｒｆ２活性化剤であることが確認された。従って、本発明のプテリキシンは、効果的で、且つ安全性の高い、酸化ストレス予防剤であることが実証された。【００２０】
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｎｒｆ２活性化剤によるＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達活性を示す。
【図２】Ｎｒｆ２活性化剤によるＨＯ−１タンパク発現活性を示す。
【図３】Ｎｒｆ２活性化剤によるＨＯ−１タンパク発現量を示す。
【図４】Ｎｒｆ２活性化剤による細胞毒性試験の結果を示す。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、一般食品分野、健康食品分野及び機能性食品分野に、プテリキシンを有効成分とするＮｒｆ２活性化剤が提供され、国民の健康保持にも貢献する食品を開発できる。また、皮膚外用剤の有効成分として利用すれば、紫外線などの酸化ストレスによる皮膚障害を予防でき、薬用美容化粧品としての活用もできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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