(57)【要約】      （修正有）【課題】一般食品、健康食品、機能性食品及び化粧品において有用で安全性の高いＮｒｆ２活性化剤の提供。【解決手段】ボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物または式(１)で表されるピラノクマリン化合物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。2019026630.tif 000005（Ｒ１はＣＨ３ＣＯ；Ｒ２はＣＨ３ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ、（ＣＨ３）２Ｃ＝ＣＨＣＯ）、（ＣＨ３）ＣＨ−ＣＨ２ＣＯ又はＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ）【選択図】図３
2019026630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物によるＮｒｆ２活性化剤。
【請求項２】
【化１】
2019026630.tif 000004
（式中のＲ１はＣＨ３ＣＯ基、Ｒ２はＣＨ３ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ基（シス体、トランス体）、（ＣＨ３）２Ｃ＝ＣＨＣＯ基、（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２ＣＯ基、ＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基による誘導体、またはＲ１がＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基とＲ２がＣＨ３ＣＯ基からなる化合物。）
【請求項３】
請求項１ないし２の何れか一項に記載のＭｒｆ２活性化剤による酸化ストレス軽減と酸化ストレスに伴う各種疾患の予防剤
【請求項４】
前記Ｎｒｆ２活性化剤が経口投与または皮膚に外用される、請求項２ないし３の何れか一項に記載のＭｒｆ２活性化剤と請求項１〜３に記載のＮｒｆ２活性化剤含有食品または化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、一般食品分野、健康食品分野及び機能性食品分野、及び化粧品分野において安全性が高く、効果の高いボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及び含有するピラノクマリン化合物によるＮｒｆ２活性剤の酸化ストレス軽減による疾患予防に関する。
【背景技術】
【０００２】  我々好気生物は酸素の活用による高エネルギー獲得の一方で、生体内には酸化力の強い活性酸素（ＲＯＳ）や活性窒素（ＲＮＳ）が生じる。この過剰なＲＯＳやＲＮＳによる細胞障害、あるいは生じた過酸化物による動脈硬化症、心筋梗塞、発癌など、様々な疾患の要因となる。また、紫外線による皮膚の炎症に伴う過剰なＲＯＳやＲＮＳ産生による酸化ストレスは、シミ、ソバカス、シワの要因になる（非特許文献１、２）。【０００３】  この酸化ストレスによる各種疾患予防に対応するため、生体内では抗酸化ンパクのＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素（ＮＱＯ１）、チオレドキシン、ヘムオシゲナーゼ１（ＨＯ−１）や解毒酵素のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等を発現させて防御する。これら酵素やタンパク質発現には、細胞質内でＫｅｅｐ１に結合している転写因子のＮｒｆ２が、酸化ストレスや新電子性物質に応答し、Ｋｅｅｐ１から解離して核内へ移行する。核内に移行したＮｒｆ−２は抗酸化応答配列（ＡＲＥ）に結合して、抗酸化タンパク質や解毒酵素を発現させることで細胞の保護、生存にはたらく（非特許文献３）。【０００４】  Ｎｒｆ２活性化剤を含むクコシ植物抽出物や（特許文献１）また、Ｎｒｆ２活性化剤としては、フラボノイドのヘスペリジン誘導体やセプトリンなどが報告されている（特許文献１、２、３）。【０００５】  該文献ではＮｒｆ２活性評価は活性に伴う抗酸化タンパクなどの発現レベルでの実証には至っていない。また該文献３では海洋生物からの抽出、分離物であり、その実用化には量的な課題が残る。【０００６】  ボタンボウフウは長命草やサクナとも呼ばれ、伝統的食材として利用されている。含有成分のピラノクマリン化合物（式１）は脂肪細胞に作用し、中性脂肪の合成を抑制する抗肥満作用が明らかにされている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−２１１１０７号公開
【特許文献２】特開２０１１−２５６１２６号公開
【特許文献３】特許２０１６−１８３１１１号公開
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】谷口直之、遠藤猛、酸化ストレス・レドックスの生化学、２０００年
【非特許文献２】岡新一、淀井淳司、医学のあゆみ、２１８巻、１号、２００６年
【非特許文献３】Ｋａｓｐａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４７，１３０４‐１３０９、２００９年
【非特許文献４】Ｎａｏｙｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ．２９、１９−２８、２０１７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００９】  本発明はボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物を有効成分とする一般食品分野、健康食品分野、機能性食品分野及び薬用化粧品において、酸化ストレス低減効果のあるＮｒｆ２活性化剤を提供することである。【００１０】  表１にボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物より分離されたピラノクマリン化合物（式１）の略名を列記する。【００１１】
【表１】
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【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明ではボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤を提供する。本発明の要旨は、以下の通りである。【００１３】  本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ボタンボウフウ抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物にＮｒｆ２活性化作用を見出し、このＮｒｆ２活性化剤により酸化ストレス軽減させることで、動脈硬化症、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性疾患、眼疾患、難聴障害、リウマチ、皮膚疾患、癌等の疾患を予防できることを見出した。【００１４】  すなわち、本発明の様態においては、下記の１〜３のＮｒｆ２活性化剤を提供する。
１．本発明のＮｒｆ２活性化剤を有効成分として含有する酸化ストレスによる疾患予防剤。
２．Ｎｒｆ２活性化剤を含有する植物による酸化ストレス軽減食素材あるいは化粧品原料
３．また、前記Ｎｒｆ２活性化剤が経口投与、あるいは皮膚外用の上記の何れかに記載の酸化ストレス軽減効果のある食品や化粧品を提供する。
【発明の効果】
【００１５】  本発明に用いるボタンボウフウ抽出物に含有するピラノクマリン化合物（式１）は、ボタンボウフウの他にも該剤を含むすべての植物が抽出物原料となる。また、原料そのままでも、食品素材や化粧品原料として用いることができる。本発明におけるＮｒｆ２活性化剤含有食品は、本発明に係るＮｒｆ２活性化剤が、食品素材、化粧品原料及び飼料成分の１種以上に含有され、水溶液、乳化液、水分分散、ペースト、ゲル状、あるいは、乾燥物形態の粉末、顆粒状、正型体状等でもよい。また、本発明のＮｒｆ２活性化剤含有食品は、ヒトが摂取するものに限るものではなく、牛、豚などの家畜、犬や猫といったペットの餌にも本発明のＮｒｆ２活性化剤含有食品は含まれる。このＮｒｆ２活性化剤含有食品及び化粧品は、公知の加工法で製造できる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】実施例
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】細胞培養
ＲＡＷ２６４．７細胞は，ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清，１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を用いて，インキュベータ（５％ＣＯ２，３７℃）で培養した．
【実施例２】
【００１８】Ｎｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達活性試験
試験化合物のＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達活性は、レポーターアッセイで行った。レポーターアッセイには、ＡＲＥとルシフェラーゼがコードされたプラスミドを、細胞にトランスフェクションし、核内に移行したＮｒｆ２がＡＲＥに結合すると増加するルシフェラーゼ活性をルシフェリン添加による発光強度として測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の前培養を２４時間行った後に、培養細胞にボタンボウフウの５０％エタノール抽出物（ピラノクマリン化合物（式１）を全て含む）の１００、２００、４００μｇ／ｍｌを添加し、ｐＧＬ４．３７プラスミドとＦｕＧＥＮＥ６の混合液を２０μｌ加えて、２４時間培養した。培養後の細胞はＬｙｓｉｓバッファーで融解し、回収した細胞懸濁液（５０μｌ）にルシフェリン（５０μｌ）を添加した時の反応液の発光強度を測定した。また、細胞懸濁液のタンパク量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定し、活性は細胞のタンパク質量あたりの発光強度で表示した。その結果、抽出物に濃度依存でＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル活性が示され、酸化ストレスの軽減効果が明らかとなった（図１）。
【実施例３】
【００１９】ＨＯ−１タンパク質の発現試験
ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は２４時間の前培養を行い、抽出物及びピラノクマリン化合物（表１）より選択した試験化合物（最終濃度（μＭ）２５，５０，１００）を添加して、２４時間培養した。回収した培養細胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で各々のタンパク質を分離し、ウエスタンブロット分析法でＨＯ−１とβ−Ａｃｔｉｎ（発現コントロールのハウスキーピングタンパク質）の検出を行った。図２（ａ）に抽出物及び図３（ａ）にピラノクマリン化合物１、２、３のＨＯ−１タンパク発現のウエスタンブロットの結果を示した。各々の発現量（ＨＯ−１／β−Ａｃｔｉｎ）を試験化合物未処理（コントロール）の１００％に対する発現率として算出した（図２（ｂ）、図３（ｂ））。本結果より、抽出物にＮｒｆ２活性化を伴う抗酸化タンパク質ＨＯ−１の発現を認めた。また、含有しているピラノクマリン化合物１、２、３も同様に濃度依存でＨＯ−１を発現させた。以上の結果より、ボタンボウフウ抽出物及びその含有するピラノクマリン化合物（表１）はＮｒｆ２を活性化させ抗酸化タンパクを発現させることで、酸化ストレスを軽減させることが示された。
【実施例４】
【００２０】細胞毒性試験
ボタンボウフウ抽出物及びその含有物の細胞毒性試験はＭＴＴ法で行った。ＭＴＴは生細胞に取り込まれるとミトコンドリアで還元され、青紫色のホルマザンを生成する。ＲＡＷ２６４．７細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は実施３と同様に試料処理した細胞に、０．０５％ＭＴＴ試薬（ｗ／ｖ  ｉｎ  ＰＢＳ）を５００μｌ添加して、ＣＯ２インキュベーターで２時間反応させた。反応後に、上清を完全に取り除き２５０μｌのＤＭＳＯでホルマザンを抽出して、吸光波長５４０ｎｍと対照波長６５５ｎｍをマイクロプレートリーダーで測定した。抽出物及び試験化合物の細胞毒性は、試験試料未処理細胞（コントロール）の１００％に対する生存率で算出した。本試験の結果より、ボタンボウフウ抽出物及び含有するピラノクマリン化合物にも細胞毒性は認められなかった。また、ボタンボウフウは食素材として食歴があり、安全性に問題はないことは担保されている。従って、本発明のボタンボウフウ及びピラノクマリン化合物は、効果的で、且つ安全性の高いＮｒｆ２活性化作用をもつ酸化ストレス予防剤であることが実証された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ボタンボウフウ抽出物によるＮｒｆ２−ＡＲＥシグナル伝達の活性を示す。
【図２】ボタンボウフウ抽出物によるＨＯ−１タンパク発現（ａ）とその発現活性率（ｂ）を示す。
【図３】ピラノクマリン化合物１、２、３によるＨＯ−１タンパク発現（ａ）とその発現活性率（ｂ）を示す。
【図４】ボタンボウフウ抽出物及びピラノクマリン化合物１、２、３による細胞毒性試験の結果を示す。
【産業上の利用可能性】
【００２２】  本発明によれば、一般食品分野、健康食品分野及び機能性食品分野に、ボタンボウフウ抽出物及び、その有効成分のピラノクマリン化合物のＮｒｆ２活性化剤が、健康食品等に利用され、国民の健康保持にも貢献する食品を開発できる。また、皮膚外用剤の有効成分として利用すれば、紫外線などの酸化ストレスによる皮膚障害を予防でき、薬用美容化粧品として活用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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