(57)【要約】      （修正有）【課題】重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子をアセンブルする方法の提供。【解決手段】重複オリゴヌクレオチドのセットをＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤と接触させて、アセンブリ混合物を形成することを含む方法を提供する。一実施形態では、密集化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。密集化剤の存在により、本発明の核酸アセンブリ過程が促進される。アセンブリ混合物は次に、複数回のサイクルにかけられ、各サイクルはアニーリング段階、伸長段階、および変性段階を含み、所望の核酸分子はそれによりアセンブルされる。いくつかの実施形態において、該段階のうちの一つまたは複数は時間に変動がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重複オリゴヌクレオチドのセットから単一工程で核酸分子をアセンブルする方法であって、
（ａ）重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ；ｄＮＴＰの混合物；およびポリエチレングリコールと接触させて、アセンブリ混合物を形成すること；
（ｂ）前記アセンブリ混合物を、各サイクルがアニーリング段階、伸長段階、変性段階のうちの一つまたは複数を含む複数回のサイクルにかけること；
（ｃ）それによって、単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから前記核酸分子をアセンブルすること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドのセットが末端オリゴヌクレオチドおよび非末端オリゴヌクレオチドを含み、該末端オリゴヌクレオチドが該非末端オリゴヌクレオチドよりも高い濃度でアセンブリ混合物中に与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１回のアニーリング段階が５０℃〜７７℃の温度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
あるサイクルの伸長段階の時間がその前のサイクルの伸長段階と比較して延長されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼがパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の改変ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドのセットが１つの遺伝子にアセンブルされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ８０００である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＰＥＧの濃度が０．０２５％以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＥＧの濃度が０．３７５％以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニーリング段階が６７℃で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニーリング段階および前記伸長段階が６７℃で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子が１ｋｂ長よりも大きい、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が２ｋｂ長よりも大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が３ｋｂ長よりも大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも５種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも６０種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも７５種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アセンブルされた前記核酸分子が２ｋｂよりも大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アセンブルされた前記核酸分子が３ｋｂより大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階の時間が第一伸長段階に対して漸増する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記重複ヌクレオチドのセットが１００種類超のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
一つまたは複数の段階が時間に変動がある段階である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記伸長段階が１サイクル毎に約１５秒だけ累積的に延長される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数回のサイクルが少なくとも２５回のサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
アセンブルされた前記核酸分子が一つまたは複数のＡＴリッチ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１２年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，９４６号の利益を主張するものであり、該米国仮特許出願は、表、図、および特許請求の範囲を全て含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は核酸分子のアセンブリに関する。本発明は、特に、多様な合成代謝経路の構築、自動ＤＮＡアセンブリ、および大きなＤＮＡ断片のロバストエンジニアリング等の多様な領域に応用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
以下の背景の記述は、本発明の理解の補助のために提供されるものであるが、本発明に対する先行技術であること、またはそれの記述であることを認めるものではない。
【０００４】
合成遺伝子の構築は分子生物学の多くの領域に応用される。ＤＮＡ配列は種々の方法を用いてアセンブルされることができる。これらの方法は一般的に、合成および増幅という二工程の過程を含み、第一工程では、重複オリゴヌクレオチドのセットが、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され、重複領域間の相同性によるオリゴヌクレオチドのセルフプライミングに基づいてアセンブルされる。第二工程では、アセンブルされた核酸が増幅のために追加のプライマー対を用いたＰＣＲにかけられ、完全長の遺伝子産物が増幅される。いくつかの利用可能な方法は、アセンブリ過程の間に次第により長いＤＮＡ断片を構築するものとして、ＤＮＡポリメラーゼに頼ってきた。
【０００５】
他の核酸アセンブリ技術では、元の遺伝子アセンブリ混合物中に増幅プライマーが含まれていた。これらの方法は、不充分であるか、より小さな遺伝子しかアセンブルすることができないか、または、難しいヌクレオチド内容物を有する核酸（例えば、ＡＴ配列またはＧＣ配列に富んだ核酸）をアセンブルすることができなかった。
【０００６】
通常、核酸構築物のアセンブリは少なくとも２つの工程、すなわちオリゴヌクレオチドの予備アセンブリのための第一工程、並びに予備アセンブリの産物を別々のＰＣＲ工程で増幅およびアセンブルするための第二工程、を必要とする。
【０００７】
所望の核酸または遺伝子のアセンブリおよび増幅を単一工程で達成可能であり、かつ以前に入手可能であったものよりも大きなサイズの核酸および遺伝子の合成も可能である、核酸または遺伝子をアセンブルするための方法を有することは有利であるだろう。該アセンブリを単一工程で実行することが可能な方法を有することは有利であるだろう。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明では、重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子を単一工程でアセンブルする方法が開示される。該方法は、重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤（crowding agent）と接触させることによりアセンブリ混合物を形成することを含む。一実施形態では、密集化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。密集化剤の存在により、本発明の核酸アセンブリ過程が促進される。アセンブリ混合物は次に、複数回のサイクルにかけられ、各サイクルは変性段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、所望の核酸分子がこれによりアセンブルされる。いくつかの実施形態において、該段階のうちの一つまたは複数は時間に変動がある。該方法は単一工程で実行することができる。
【０００９】
一態様において、本発明は、重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子を単一工程でアセンブルする方法を提供する。該方法は、（ａ）重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、およびポリエチレングリコールと接触させて、アセンブリ混合物を形成すること；（ｂ）該アセンブリ混合物を、各サイクルが変性段階、アニーリング段階、および伸長段階を含む複数回のサイクルにかけること、（ｃ）これにより単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子をアセンブルすること、を含む。
【００１０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、末端オリゴヌクレオチドおよび非末端オリゴヌクレオチドを含有し、末端オリゴヌクレオチドは非末端オリゴヌクレオチドよりも高い濃度でアセンブリ混合物中に与えられる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアニーリング段階は、５７℃〜７７℃の温度で起こる。各サイクルの伸長段階の時間は、その前のサイクルの伸長段階と比較して延長され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，  Ｏｙ、フィンランド）等の熱安定性（ｈｅａｔ−ｓｔａｂｉｌｅ）ＤＮＡポリメラーゼであり得る。オリゴヌクレオチドのセットは１つの遺伝子にアセンブルされ得る。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールはＰＥＧ８０００である。ＰＥＧの濃度は０．０２５％（ｗ／ｖ）以上、または０．３７５％（ｗ／ｖ）以上であり得る。アニーリング段階は６７℃で起こり得、アニーリング段階および伸長段階は単一の段階に組み合わされ得る。種々の実施形態において、核酸分子は１ｋｂ長より大きい、または２ｋｂ長より大きい、または３ｋｂ長より大きい場合がある。重複オリゴヌクレオチドのセットは、少なくとも５種類のオリゴヌクレオチド、または少なくとも６０種類のオリゴヌクレオチド、または少なくとも７５種類のオリゴヌクレオチドを有し得る。
【００１１】
一実施形態では、核酸分子は２ｋｂ長より大きく、第一伸長段階は５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階は時間に変動がある段階である。別の実施形態では、核酸分子は３ｋｂより大きく、第一伸長段階は５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階の時間は第一伸長段階に対して漸増する。オリゴヌクレオチドのセットは１００種類超のオリゴヌクレオチドを含有し得る。前記段階のうちの一つまたは複数は時間に変動のある段階であり得る。特定の実施形態では、伸長段階は時間に変動のある段階である。伸長段階は１サイクル毎に約１５秒だけ累積的に延長され得、複数回のサイクルは少なくとも２５回のサイクルであり得る。核酸分子は一つまたは複数のＡＴリッチ配列を有し得る。
【００１２】
上記の発明の概要は限定するものではなく、本発明の他の特徴および利点は、下記の発明の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、重複オリゴヌクレオチドの図を示し、オリゴヌクレオチドＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＣおよびＤ、ＤおよびＥ、並びにＥおよびＦは、重複オリゴヌクレオチドであり、向かい合う隣接オリゴヌクレオチドである。図１Ｂは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片間の相同配列または重複配列を示す。
【図２】遺伝子Ａに関する、ギャップ有りオリゴヌクレオチドのセットおよびギャップ無しオリゴヌクレオチドのセットの図が示される。
【図３】本発明の方法による、オリゴヌクレオチドからの２．３ｋｂの遺伝子（ｍｕｔＳ）のアセンブリを示すゲルが図示される。
【図４】本発明の方法による、オリゴヌクレオチドからの３．７ｋｂの遺伝子のアセンブリを示すゲルが図示される。
【図５】本発明の方法による、オリゴヌクレオチドからのＡＴリッチＤＮＡのアセンブリを示すゲルが図示される。
【図６】本発明の方法により７ｋｂの分子を作製するための７つのＤＮＡ断片のアセンブリを示すゲルが図示される。
【図７】本発明の方法による、８６種類のオリゴヌクレオチドからのｍｕｔＳ遺伝子のアセンブリを示すゲルが図示される。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、種々のインフルエンザウイルス株からの核酸構築物ＨＡ（Ｈ）およびＮＡ（Ｎ）のアセンブリを示す０．８％プレキャストアガロースゲルを示し、核酸構築物ＨＡ（Ｈ）およびＮＡ（Ｎ）はそれぞれ、本発明の方法を用い、本発明の系において、９６種類のプールされたオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。構築物ＨＡおよびＮＡは共におよそ３ｋｂである。図８Ａ - レーン１：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１）＿ＨＡ；レーン２：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１）＿ＮＡ；レーン３：Ｘ１７９Ａ＿ＴＤ（Ｈ１Ｎ１）＿ＨＡ；レーン４：Ｘ１７９Ａ（Ｈ１Ｎ１）＿ＮＡ；レーン５：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１＿ＣＤＣ／Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＨＡ；レーン６：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）＿ＮＡ；レーン７：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／２５６／２０１１＿Ｐ２／Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＨＡ；レーン８：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／２５６／２０１１＿Ｐ２／Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＮＡ；スタンダードレーン。図８Ｂ - スタンダードレーン；レーン１：Ｂ／Ｔｅｘａｓ／０６／２０１１＿ＢＸ−４５＿ＨＡ；レーン２：Ｂ／Ｔｅｘａｓ／０６／２０１１＿ＢＸ−４９＿ＮＡ；レーン３：Ｂ／Ｎｅｗ＿Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／ｌ／２０１２＿ＨＡ；レーン４：Ｂ／Ｎｅｗ＿Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／ｌ／２０１２＿ＮＡ；レーン５：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＿ＨＡ；レーン６：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＿ＮＡ；レーン７：Ｂ／Ｎｅｖａｄａ／０３／２０１１＿ｖ２＿ＨＡ；レーン８：Ｂ／Ｎｅｖａｄａ／０３／２０１１＿ｖ２＿ＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の方法を利用することで、所望の核酸分子のアセンブリを単一工程で達成することができる。従って、本発明により、数百種類のオリゴヌクレオチドをアセンブルする所要時間および費用の両方が減少する。従って、本発明は、多様な合成代謝経路の構築、自動ＤＮＡアセンブリ、および大きなＤＮＡ断片のロバストエンジニアリングに関する目標を容易なものにする。本発明は、アセンブリ混合物中の密集化剤の包含が核酸分子のアセンブリに有利な特性を与えるという発見に部分的に基づいている。一実施形態では、密集化剤はポリエチレングリコールである。いかなる特定の理論にも制限されることを望むものではないが、本発明者らは、アセンブリ混合物中の密集化剤の包含が、相補的オリゴヌクレオチドがそれぞれの他のオリゴヌクレオチドにより高い特異性でアニーリングすることを助長することによって、核酸アセンブリ反応のロバスト性を増加させると考えている。
【００１５】
本発明は、アセンブリ混合物中に密集化剤が包含されることの利点を利用しているが、核酸アセンブリにおけるアニーリングおよび伸長の反応温度および反応時間の最適化の利点も利用している。アニーリングおよび伸長を単一工程に組み合わせることによって、オリゴヌクレオチドのセットにおけるオリゴヌクレオチド配列は、特異的にアニーリングし核酸伸長の鋳型として機能することが可能になる。該方法は、以前に可能であったよりも長い核酸断片のアセンブリをより低コストで可能にする。いくつかの実施形態において、１ｋｂ超かつ７ｋｂ以下およびそれより長い核酸断片がアセンブルおよび増幅され得る。本発明の方法は、高ＡＴ含量または高ＧＣ含量を有する核酸分子のアセンブリおよび／または増幅も可能にする。さらに、本発明の方法は、核酸アセンブリ工程の排除、および反応混合物に含まれるある種の酵素の除去を可能にする。本方法は、以前に可能であったよりも有意により大きな数のオリゴヌクレオチドのアセンブリも可能にする。百を超える一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、本方法によって混合物からアセンブルされ得、数十の二本鎖ＤＮＡ断片が本方法を用いてアセンブルされ得る。ＡＴまたはＧＣリッチ配列を有する核酸をアセンブルするために要する時間および労力は、本発明の方法を用いることで劇的に減少している。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、アセンブリが所望される長さの核酸またはその断片を含む一本鎖重複オリゴヌクレオチドのセットを、該セットとＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤とを接触させることによりアセンブルするための、単一工程または一工程法である。「単一工程」または「一工程」とは、反応成分が反応器に入れられた後、該容器を再び開く必要無しに、所望の核酸分子のアセンブリおよび増幅が達成されることを意味する。従って、本発明の方法は、核酸構築物のアセンブリを単一工程に統合し、それにより予備アセンブリ工程およびＰＣＲ増幅およびアセンブリ工程を単一の反応工程に組み合わせる機会を与える。一本鎖の重複オリゴヌクレオチドは同時にアセンブルされ得る。
【００１７】
方法
本発明は、重複オリゴヌクレオチド断片のセットから核酸分子をアセンブルするための方法を提供する。重複オリゴヌクレオチドのセットは少なくとも２種類の重複オリゴヌクレオチドを意味するが、他の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、本明細書で説明されるようないかなる数のオリゴヌクレオチドも含有し得、例えば、少なくとも５０種類または少なくとも７０種類または少なくとも１００種類または少なくとも１５０種類のオリゴヌクレオチドを含有し得る。重複オリゴヌクレオチドのセットは、各オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部が該セットの少なくとも１種類の他のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）に対して相補的でありかつオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にする配列を有するオリゴヌクレオチドを含有する。種々の実施形態において、該セットのオリゴヌクレオチドは、約６０塩基長〜約７０塩基長であり得る。６０塩基のオリゴヌクレオチドは、向かい合う隣接する（アンチセンス）オリゴヌクレオチドと約３０ｂｐ重複し得る。７０塩基のオリゴヌクレオチドは、その向かい合う隣接する（アンチセンス）オリゴヌクレオチドと約３５ｂｐ重複し得る（図１ａ参照）。アセンブルされる核酸分子の各鎖は、適切なオリゴヌクレオチド断片に分割され得る。いくつかの実施形態において、これは、配列を本明細書に記載されるような適切な長さの適切な数の重複断片に分割する適切なソフトウェアを用いて行われるが、他の実施形態では、単に適切な分割点を特定することによって行われる。重複オリゴヌクレオチドのセットは、ＤＮＡ合成機またはオリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。種々の実施形態において、該セットの重複オリゴヌクレオチドは、向かい合う隣接する（アンチセンス）オリゴヌクレオチドと、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも３０ヌクレオチドまたは少なくとも４０ヌクレオチドまたは５０超のヌクレオチドまたは６０超のヌクレオチドが重複する。アセンブルされるオリゴヌクレオチドのセットは、適切な容器中に適切な緩衝液を用いてプールされ得る。アセンブリ混合物は、本明細書に記載されるようなＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および密集化剤も含有する。次に、アセンブリ混合物は、アニーリング段階、伸長段階、および変性段階のうちの一つまたは複数を含む、一回または複数回の核酸アセンブリ段階のサイクルにかけられる。該段階は記載の順で行われ得るが、いくつかの実施形態ではいかなる順序でも行われ得る。各段階の条件は本明細書に記載される。結果として、重複オリゴヌクレオチドのセットから所望の核酸分子がアセンブルされ、これは一実施形態では単一工程で行われる。
【００１８】
重複（一本鎖）オリゴヌクレオチドは、重複（二本鎖）核酸断片とは区別される。いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、それらの向かい合う隣接する（またはアンチセンス）オリゴヌクレオチドと相補的配列において重複しており、これにより、これらのオリゴヌクレオチドがそれぞれの他のオリゴヌクレオチドとアニーリングすることが可能となり、結果として生じるギャップはＤＮＡポリメラーゼによって埋められ得、その実施形態は図１ａに示される。一本鎖オリゴヌクレオチドが核酸断片にアセンブルされる場合、複数の核酸断片がアセンブルされることで、より大きなＤＮＡ構築物に達し得る。核酸断片（二本鎖）はまた、図１ｂに示されるように、例えばそれら各々の末端において、断片間または重複配列間で相同性を有し得る。断片上の重複配列は、例えば「チューバック（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）」および修復法または本明細書に記載の他の方法によって断片をより大きな構築物にアセンブルするのに利用され得る。ｄｓＤＮＡ断片のセットをアセンブルすることが所望される場合、これらの重複核酸断片は、本方法のサイクルの変性、アニーリング、および伸長段階にかけられる際、重複オリゴヌクレオチドとなる。従って本方法は、重複一本鎖オリゴヌクレオチドから核酸断片をアセンブルするのに有用であり、その一例は図１ａに示され、さらに、本方法は、重複配列（または断片間の相同性）を有する複数の二本鎖核酸断片をアセンブルするのにも有用であり、その一例は図１ｂに示されている。別の実施形態では、核酸断片は一本鎖オーバーハングを有し、これは、ｄｓＤＮＡの一方または両方の鎖がｄｓＤＮＡの二本鎖領域を超えて伸長し一本鎖オーバーハングを残すことを意味している。本発明の方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡ断片の混合物のアセンブリにも有用であり、該混合物中で、オリゴヌクレオチドはｄｓＤＮＡからのオーバーハングにアニーリングし得、これにより、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびｄｓＤＮＡ断片を架橋または連結する方法が得られる。
【００１９】
本発明は、アセンブリ法におけるアニーリング段階および伸長段階のために最適化された温度および／または時間も提供する。一実施形態では、本発明はアニーリングおよび伸長を単一の段階に組み合わせ、それにより、相補ＤＮＡ配列が特異的にアニーリングしＰＣＲ伸長の鋳型として機能することを可能にしている。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、本発明者らは、密集化剤の添加が、相補的オリゴヌクレオチドのさらに高度に特異的なアニーリングを促進し、これによりＰＣＲ反応および核酸アセンブリのロバスト性が増加すると考える。
【００２０】
一実施形態では、本発明の方法では、ＰＣＲのアニーリングおよび伸長に単一工程および単一温度（すなわち、等温）が利用される。一実施形態では、アニーリング段階および伸長段階は組み合わされ、等温で、例えば約６７℃の温度で行われる。他の実施形態では、少なくともアニーリング段階は、５７℃〜７７℃または５０℃〜７７℃の温度で起こり、あるいは、アニーリング段階および伸長段階は組み合わされ、５７℃〜７７℃または５０℃〜７７℃の温度で起こる。異なる実施形態において、約５０℃±２℃のアニーリングおよび伸長の温度は、ＡＴリッチＤＮＡ配列のアセンブリに有用であり得る。約６７℃±２℃のアニーリングおよび伸長の温度は、ＧＣリッチＤＮＡ配列のアセンブリに有用であり得る。
【００２１】
本方法により、以前の方法を用いて可能であったよりも極めて長いＤＮＡ分子のアセンブリが可能となる。予想外にも、本発明の方法を利用することで、以前にアセンブリ可能であったよりも約４倍長いＤＮＡ分子がアセンブリ可能であることが発見された。本方法を用いることで、約１ｋｂサイズの、または１ｋｂよりも大きなＤＮＡ断片をアセンブルすることができる。他の実施形態では、２ｋｂ超または３ｋｂ超または約３．５ｋｂ超または４ｋｂ超または５ｋｂ超または６ｋｂ超または約７ｋｂまたは７ｋｂ超のＤＮＡ分子がアセンブリ可能である。さらに別の実施形態において、本方法は、１〜４ｋｂまたは１〜５ｋｂまたは１〜６ｋｂまたは１〜７ｋｂまたは１〜８ｋｂまたは１〜９ｋｂまたは１〜１０ｋｂまたは２〜５ｋｂまたは２〜７ｋｂまたは２〜８ｋｂまたは２〜１０ｋｂのＤＮＡ分子のアセンブリを可能にする。
【００２２】
本発明の方法は、非常に多くの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドを核酸断片にアセンブルするのにも有用である。種々の実施形態において、本方法を用いることで、オリゴヌクレオチドが６０種類超のセットまたはオリゴヌクレオチドが８０種類超もしくは１００種類超もしくは１２０種類超もしくは１４０種類超もしくは１６０種類超もしくは１８０種類超もしくは２００種類超のセットまたはオリゴヌクレオチドが６０〜２００種類もしくは６０〜３００種類のセットを二本鎖核酸断片にアセンブルすることができる。
【００２３】
密集化剤
密集化剤は、分子密集を起こす、増強する、または促進する作用剤である。密集化剤は水分子と結合し得る。一実施形態では、密集化剤は水分子と結合し、タンパク質または核酸分子には結合しない。分子密集は、溶液中の他の分子が利用可能な溶媒の体積を高分子が減少させることによって起こり得る。いくつかの実施形態において、密集化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いかなる適切なＰＥＧも本発明の組成物および方法においても使用可能である。種々の実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ１２０００またはＰＥＧ１００００またはＰＥＧ８０００またはＰＥＧ４０００またはＰＥＧ２０００またはＰＥＧ１０００である。他の実施形態では、ＰＥＧは、４０００超、または６０００超または８０００超または１００００超または１２０００超の分子量を有する。他の実施形態では、ＰＥＧは４０００未満、または６０００未満または８０００未満または１００００未満または１２０００未満の分子量を有する。さらに他の実施形態では、ＰＥＧは、様々なサイズのＰＥＧ分子の混合物（例えば、上記ＰＥＧ分子のあらゆる組み合わせ）として与えられる。ＰＥＧは、本発明の方法において、例えば、０．０１８８％または０．０３７５％または０．０７５％または０．３％または０．４５％または０．６％または０．７５％または１．０％（全てｗ／ｖ）等のあらゆる適切な濃度で与えられ得る。本発明の方法の他の実施形態では、ＰＥＧは、０．０１８８％超または０．０３７５％超または０．０７５％超または０．３％超または０．４５％超または０．６％超または０．７５％超または１．０％超（全てｗ／ｖ）の濃度で与えられる。さらに別の実施形態では、ＰＥＧは、本発明の方法において、０．０１８８％未満または０．０３７５％未満または０．０７５％未満または０．３％未満または０．４５％未満または０．６％未満または０．7５％未満または１．０％未満の濃度で与えられる。ＰＥＧは有用な密集化剤であるが、例えば、アルブミン、フィコール（例えば、フィコール７０）および他の高質量分岐多糖類（例えば、デキストラン）等のさらなる密集化剤も本方法において使用可能である。当業者は本開示を参照することで本発明において有用なさらなる密集化剤を理解するであろう。
【００２４】
アセンブリ混合物
一実施形態では、アセンブリ混合物は、重複オリゴヌクレオチドのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤の組み合わせである。アセンブリ混合物は、実行される方法に望ましい追加成分を含有してもよい。いくつかの実施形態において、密集化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施形態では、ＰＥＧはＰＥＧ８０００であるが、当業者は本明細書によって、他の密集化剤も本発明に有用であることを理解するだろう。密集化剤がＰＥＧである場合、様々な分子量が用いられ得、または本明細書で開示されるあらゆるサイズのＰＥＧの混合物等の様々なサイズのＰＥＧの混合物が用いられ得る。アセンブリ混合物は通常は溶液として存在するが、いくつかの実施形態では、乾燥混合物であり得る。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰは、本方法に供される場合、重複オリゴヌクレオチドがアニーリングして二本鎖ＤＮＡ分子を生成する際に該重複オリゴヌクレオチドを重合するのに充分な量で存在する。密集化剤はいかなる密集化剤でもよく、いかなる有用な濃度でも存在していてもよい。
【００２５】
本方法は、アセンブリ混合物を複数回のサイクル（すなわち、一回または複数回のサイクル）にかけることを含む。一サイクルは、アニーリング段階、伸長段階、および変性段階のうちの一つまたは複数を含み得る。一サイクルは、これらの種類の段階のいずれかのうち２つ以上を含んでいてもよい。アニーリングは、あるオリゴヌクレオチドを別のオリゴヌクレオチド上の相補的な配列へ水素結合によって対合させ、二本鎖核酸を形成することを含む。アニーリングはいかなる有効な方法によっても起こってもよく、１つの方法は、アセンブリ混合物の温度を下げて相補的な配列同士のアニーリングを可能にすることである。従って、アニーリング段階中、重複オリゴヌクレオチドのセットはアニーリングして、アセンブルされる核酸分子の長さの一部分または全部を形成し、ヌクレオチドが存在しないギャップを残すが、これは、このような領域が重複配列の間に存在しているためである。伸長段階中、アニーリングされたオリゴヌクレオチドのセットはＤＮＡポリメラーゼによる作用を受け、ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングして塩基対を形成するための相補的な塩基が存在しなかった、領域に残されたギャップを埋める。このように、伸長段階（複数可）は部分的または完全な二本鎖核酸分子を形成する。リガーゼは、アニーリングしたオリゴヌクレオチド鎖を連結するのに適した濃度でアセンブリ混合物中に任意選択的に存在する。しかし、多くの実施形態では、リガーゼは必要ではなく、ライゲーションは自発的に起こる。変性段階中、二本鎖核酸分子は一本鎖オリゴヌクレオチドに変性される。変性は熱変性によって行われ得る。一つまたは複数のこのような段階の複数回のサイクルを通じて、所望の核酸分子は重複オリゴヌクレオチドのセットからアセンブルされる。一実施形態では、本方法は単一工程で実行される。
【００２６】
プライマー
いくつかの実施形態において、アセンブリ混合物はプライマーをさらに含む。一実施形態では、プライマーは末端オリゴヌクレオチドにそれらの５'末端においてアニーリングする。末端オリゴヌクレオチドは、アセンブルされる核酸分子を形成するオリゴヌクレオチド鎖の５'末端を形成するオリゴヌクレオチド断片である（一例は、図１中のオリゴヌクレオチドＡおよびＦ）。本明細書に記載されるように、アセンブルされる核酸分子は、重複オリゴヌクレオチド断片のセットからアセンブルされる。オリゴヌクレオチド断片がアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼがギャップを埋めると、所望の核酸分子がアセンブルされる。プライマーは、本方法において機能するいかなる好都合なサイズのものであってもよい。種々の実施形態において、プライマーは、約１０ヌクレオチド、もしくは約１５ヌクレオチド、もしくは約１８ヌクレオチドもしくは約２０ヌクレオチドもしくは約２５ヌクレオチドもしくは約３０ヌクレオチドもしくは約３５ヌクレオチドもしくはそれ以上、または、１０〜２０ヌクレオチドもしくは５〜１５ヌクレオチドもしくは１５〜２５ヌクレオチドもしくは２０〜４０ヌクレオチドもしくは３０〜５０ヌクレオチドもしくは４０〜６０ヌクレオチドもしくは５０〜７０ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、プライマーは約６０ヌクレオチドである。
【００２７】
別の実施形態では、プライマーはアセンブリ混合物中に存在しないが、末端オリゴヌクレオチドはその他の（非末端）オリゴヌクレオチドより高い濃度で存在する。末端オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるようないかなる適切な長さのものであってもよいが、一実施形態では、末端オリゴヌクレオチドは約６０ヌクレオチド長である。また、末端オリゴヌクレオチドは特定の適用に応じて様々な濃度で存在していてもよいが、一実施形態では約５００ｎＭの濃度で存在する。末端オリゴヌクレオチドの１例は、図１中のオリゴヌクレオチドＡおよびＦである。別の実施形態では、プライマーおよび末端オリゴヌクレオチドの混合物が利用される。非末端オリゴヌクレオチドは末端オリゴヌクレオチドではないオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
オリゴヌクレオチド
本発明で利用されるオリゴヌクレオチドはいかなる適切な長さであってもよい。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、４０〜８０個のヌクレオチド、または４０〜６０個のヌクレオチド、または５０〜７０個のヌクレオチド、または約６０個のヌクレオチドを含む。しかし、他の実施形態では、本発明で利用されるオリゴヌクレオチドは、本方法で機能するいかなる長さのものであってもよい。さらなる例としては、限定はされないが、２０〜４０個のヌクレオチド、３０〜５０個のヌクレオチド、４０〜６０個のヌクレオチド、または５０〜７０個のヌクレオチド、または６０〜８０個のヌクレオチド、または約２０個のヌクレオチド、または約３０個のヌクレオチド、または約４０個のヌクレオチド、または約５０個のヌクレオチド、または約６０個のヌクレオチド、または約７０個のヌクレオチド、または約８０個のヌクレオチド、または８０超個のヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドのセット中のオリゴヌクレオチドは、ギャップが存在しない、すなわち、ギャップが存在しないアライメントを利用する。ギャップが存在しないアライメントとは、該セットのオリゴヌクレオチドがアライメントされた場合に、アセンブルされる遺伝子の全てのヌクレオチドおよび／または配列が少なくとも該セットの２種類のオリゴヌクレオチド中に示されることを意味する。他の実施形態では、ギャップが存在するオリゴヌクレオチドのセットが用いられる。ギャップが存在するオリゴヌクレオチドおよびギャップが存在しないオリゴヌクレオチドの１例が図２に示される。
【００３０】
異なる実施形態において、アセンブリ混合物は、オリゴヌクレオチドが少なくとも５種類もしくは少なくとも１０種類もしくは少なくとも２５種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも５０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも６０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも７０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも８０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも９０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも１００種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも１１０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも１２０種類のセット、またはオリゴヌクレオチドが少なくとも１５０種類のセットを含有する。オリゴヌクレオチドのセットは本発明による一工程反応でアセンブルされる。他の実施形態では、アセンブリ混合物は、５０〜１００種類のオリゴヌクレオチド、または７５〜１２５種類のオリゴヌクレオチド、または１００〜１５０種類のオリゴヌクレオチドを含有する。
【００３１】
異なる実施形態において、アセンブリ混合物中のオリゴヌクレオチドは約２．５ｎＭまたは２．０ｎＭ〜３．０ｎＭの濃度で存在する。末端プライマーを用いる実施形態において、末端プライマーは約５００ｎＭまたは約４００ｎＭ〜約６００ｎＭの濃度で存在し得る。当業者は本明細書を参照して、オリゴヌクレオチドおよび／または末端プライマーの特定の濃度が、選択される反応条件に応じて変化し得ることを理解するであろう。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼ
本方法で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、いかなる適切なＤＮＡポリメラーゼであってもよい。特定の実施形態では、処理能力の増加を可能にするために処理能力が増強されたドメインを含有する酵素であるパイロコッカス様酵素も適切である。いかなるＤＮＡポリメラーゼも用いられ得るが、高精度および高処理能力を与えるＤＮＡポリメラーゼが最も効果的である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは５'→３'ＤＮＡポリメラーゼ活性または３'→５'エキソヌクレアーゼ活性も有し得る。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ増幅反応における産物の増幅中に平滑末端を生成する。本発明で用いられ得るＤＮＡポリメラーゼのさらなる非限定例としては、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、これは、天然の酵素よりも優れた活性および／またはより高い精度を与えるために一つまたは複数のドメインで修飾されていてもよい。修飾には、ＤＮＡアセンブリ手順におけるより有利な特性を酵素に与えるための、酵素の核酸配列における変化が含まれ得る。ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性であり得る。ＤＮＡポリメラーゼはこれら特性の全てまたは一部のみを有し得、当業者は本明細書により、どの特性が本方法の特定の適用において有利に用いられ得るか、並びにどの反応条件およびどの緩衝液成分が特定のＤＮＡポリメラーゼに適しているかを理解するであろう。本発明の方法に適した１つのＤＮＡポリメラーゼは、市販のＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）である。他のＤＮＡポリメラーゼも適切であり得る。一実施形態では、マスターミックスは、１００％ＤＭＳＯ中に、適切な濃度（例えば、１．５ｍＭ）のＭｇＣｌ２、および適切な濃度（例えば、最終反応濃度において各ｄＮＴＰが２００μＭ）のｄＮＴＰ混合物と一緒に、ＤＮＡポリメラーゼを含有し得る。
【００３３】
例えば、ＩＳＯ緩衝液等の、いかなる適切な反応緩衝液をも本発明のアセンブリ反応に用いてもよい。当業者は、本明細書で開示される本方法を行うのに適したさらなる緩衝液および条件を理解するであろう。
【００３４】
サイクルおよび段階
本方法の一サイクルは、一回または複数回のアニーリング段階、一回または複数回の伸長段階、および一回または複数回の変性段階等の、一つまたは複数の段階から成る。一実施形態では、一サイクルはアニーリング段階、伸長段階、および変性段階を有するが、いくつかの実施形態では、一サイクルは各種類の段階の２つ以上を有し得る。本方法は、アセンブリを実行するのに必要ないかなる好都合な数のサイクルも利用することができる。種々の実施形態において、約２５サイクルまたは約３０サイクルまたは約３５サイクルが本方法に含まれる。他の実施形態では、２０超のサイクルまたは２５超のサイクルまたは３０超のサイクルまたは３５超のサイクルが方法に含まれる。さらに別の実施形態では、２５未満のサイクルまたは３０未満のサイクルまたは３５未満のサイクルが本方法に含まれる。
【００３５】
本方法のいくつかの実施形態において、前記段階の一つまたは複数は、時間に変動がある段階であり得る。該段階のいずれか１つが時間に変動がある段階であってもよいし、あるいは該段階の全てまたはあらゆる組み合わせの段階が時間に変動がある段階であってもよく；従って、時間に変動があるアニーリング段階および／または時間に変動がある伸長段階および／または時間に変動がある変性段階が存在し得る。時間に変動がある段階は、サイクル間で変動するまたは変化する時間、実行される段階である。あるサイクルの、時間に変動がある段階（例えば、時間に変動がある伸長段階）の長さは、その前のサイクルの同じ段階と比較して、または該サイクルの最初のそのような段階と比較して、または本方法の最初のサイクルの該段階と比較して、増加または減少し得る。例えば、一実施形態では、各サイクルの伸長段階は時間に変動がある段階である。従って、一実施形態では、サイクルの最初の伸長段階は約６７℃で約６分間実行され、一回または複数回のその後のサイクルにおいて、伸長段階は約１５秒ずつ増加し得る。別の実施形態では、時間に変動がある段階の時間は、本方法の第二のサイクルと比較して増加または減少し得る。時間の伸びは累積的であり得るため、サイクル１が６分間の伸長段階を有する場合、サイクル２の伸長段階は約６分１５秒間（１：１５）であり得、サイクル３は約６：３０（すなわち、１サイクル毎に約１５秒間累積的に増加する）、等であり得る。種々の実施形態において、時間に変動がある段階における時間増加は、約５秒間、または約１０秒間、または約１５秒間、または約２０秒間または約２５秒間または約３０秒間または約４５秒間または約１分間の増加であり得る。該段階のいずれかにおける増加は、あるサイクルから次のサイクルに対して、時間に変動があり、かつ／または累積的もしくは非累積的であり得る。いくつかの実施形態において、一つまたは複数のアニーリング段階および／または変性段階は、例えば、段階の時間を累積的か非累積的かにかかわらず上記のいずれかの時間だけ延長することによって、時間に変動がある。組み合わされたアニーリング／伸長段階は、本明細書に記載されるように、時間に変動があり得る。異なる実施形態において、少なくとも２回のサイクルまたは少なくとも３回のサイクルが、時間に変動がある段階を利用し得る。
【００３６】
サイクルの第一伸長段階（または任意のサイクルの任意の伸長段階）は、伸長段階のみであってもよいし、あるいはアニーリングおよび伸長の両方が同じ段階で起こる組み合わされたアニーリング／伸長段階であってもよい。異なる実施形態において、サイクルの第一の組み合わされたアニーリング／伸長段階（またはその後の組み合わされたアニーリング／伸長段階）は、アセンブルされる核酸１キロベース当たり少なくとも３０秒、またはアセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも１分、またはアセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも１．５分、またはアセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも２分、またはアセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも２．５分、またはアセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも３分の時間起こり得る。異なる実施形態において、サイクルの第一伸長段階または組み合わされたアニーリング／伸長段階は、約１５秒間、または約３０秒間、または約４５秒間、または約１分間、または約２分間、または約３分間、または約４分間、または約５分間、または約６分間、または約７分間、または約８分間、または約９分間、または約１０分間であり得る。本明細書に記載されるように、その後の伸長段階または組み合わされたアニーリング／伸長段階は、本明細書に記載されるように、時間に変動があり得、および累積的に増加し得、または同じ時間のものであり得る。
【００３７】
変性段階中、核酸分子は変性される。一実施形態では熱変性が用いられる。熱変性は約９８℃の温度で起こり得る。しかし、核酸分子を変性する働きをするいかなる温度を用いてもよく、例えば、７０℃超もしくは７０℃未満または８０℃超もしくは８０℃未満または９０℃超もしくは９０℃未満または９８℃超等である。当業者は本開示を参照することで、正確な変性温度が核酸分子の正確な組成および長さに依存することを理解するであろう。変性段階の時間も、核酸分子の正確な組成および長さに依存して変動し得る。いくつかの実施形態において、変性段階は３０秒間起こり得る。しかし他の実施形態では、変性段階の長さは３０秒超または３０秒未満であり得る。
【００３８】
アニーリング段階中、オリゴヌクレオチドのセットのオリゴヌクレオチドはそれらの相補的な（アンチセンス）配列を見つけ出し、水素結合による二本鎖核酸の形成によってアニーリングする。該核酸配列はギャップが存在する領域を有する。アニーリング段階中、オリゴヌクレオチドのセットと共に他のアセンブリ混合物成分も存在し得、該成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤（例えば、ポリエチレングリコール）が含まれ得る。適切な緩衝液、緩衝液成分、所望により任意のリガーゼ、および追加成分等の、追加成分も存在し得る。
【００３９】
伸長段階中、ＤＮＡポリメラーゼはｄＮＴＰを重合させ、オリゴヌクレオチドのセットのハイブリダイゼーションまたはアニーリングによって残されたギャップを埋める（例えば、図１参照）。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、伸長段階およびアニーリング段階は単一の段階に組み合わされ得る。種々の実施形態において、種々の実施形態におけるアニーリング段階または組み合わされたアニーリング／伸長段階で用いられる温度は、約６５℃、または約６６℃、約６７℃、または約６８℃、または約６９℃、または約６５〜約６９℃、または約６６℃〜約６８℃であり得る。組み合わされたアニーリング／伸長段階の時間は、アセンブルされる核酸配列の長さに依存して変動し得る。種々の実施形態において、組み合わされたアニーリング／伸長段階は、約１分間、または約２分間、または約３分間、または約４分間、または約５分間、または約６分間、または約７分間、または約８分間、または約９分間、または約１０分間であり得る。種々の実施形態において、組み合わされたアニーリング／伸長段階の時間および温度は、約１ｋｂ以下の核酸配列に対して６７℃１分間であり得る。他の実施形態では、組み合わされたアニーリング／伸長段階は、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、または約２ｋｂ〜約６ｋｂ、または約３ｋｂ〜約４ｋｂ、または約３ｋｂ〜約６ｋｂ、または約２ｋｂ〜約７ｋｂ、または約２ｋｂ〜約８ｋｂの核酸配列に対して約６７℃で約６分間行われ得る。時間に変動がある形式において、組み合わされたアニーリング／伸長段階は、各サイクル毎に適切な時間だけ累積的に増加し得る。例えば、いくつかの実施形態において、組み合わされたアニーリング／伸長段階の時間は、１サイクル毎に約１５秒間または１サイクル毎に約１０秒間または１サイクル毎に約２０秒間、累積的に増加し得る。サイクルの数は特定の適用に応じて変化し得るが、種々の実施形態において、約３０サイクルが用いられ得、あるいは約２５サイクル、または約３５サイクル、または約４０サイクルが用いられ得る。いかなる適切な数のサイクルも用いることができる。さらなる例として、２０超のサイクルまたは２５超のサイクルまたは３０超のサイクルまたは３５超のサイクルが挙げられる。
【００４０】
ＡＴリッチ配列を有するＤＮＡ鎖は多くの場合アセンブルすることが難しい。本発明の方法は、ＡＴリッチ配列を有するＤＮＡ分子を容易にアセンブルすることができる。種々の実施形態において、ＡＴリッチ配列は６０超％または６５超％または７０超％のＡＴ含量を有し得る。本方法は、不適切な鎖の分離および二次構造形成のためにアセンブルすることが同じく多くの場合に難しい高ＧＣ含量を有する核酸もアセンブルすることができる。ＡＴリッチ領域を有する核酸配列に対して、組み合わされたアニーリング／伸長段階を用いる実施形態においては、より低い温度を用いることが望ましい。このことから、ＡＴリッチ核酸配列をアセンブルするための一実施形態では、アニーリング／伸長段階の温度は、約６２℃、または約６３℃、または約６４℃、または約６５℃、または約６６℃または約６７℃であり得る。一実施形態における該組み合わされた段階の時間は、約４分間である。しかし、他の実施形態では、該組み合わされた段階の時間は、約３分間または約５分間である。特定の実施形態では、組み合わされたアニーリング／伸長段階は、６５℃で約４分間実行される。ＡＴリッチ配列に対する該段階は、本明細書に記載されるように、時間に変動があり得る。
【００４１】
キット
別の態様では、本発明は本発明の方法を実行するためのキットを提供する。一実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、および密集化剤を含有する。キットは、本発明の方法を実行するための説明書および／または本方法の実行についての情報を提供するウェブサイトもしくは他のリソースに使用者を誘導する情報も含有し得る。キットに含有されるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および密集化剤は、別々の容器に提供されてもよいし、あるいは同じ容器に提供されてもよい。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および密集化剤は、本明細書に記載のいずれであってもよい。
【実施例】
【００４２】
実施例１：１ｋｂ未満のＰＣＲ産物のアセンブリ
本実施例は、密集化剤（ここではＰＥＧ８０００）の存在下および非存在下での１ｋｂ未満のＰＣＲ産物に対する一工程遺伝子アセンブリ法の比較を示すものである。
【００４３】
以下の長さを有する３つの遺伝子を選択した：遺伝子１：３２種類のオリゴヌクレオチド；遺伝子２：２８種類のオリゴヌクレオチド；遺伝子３：３０種類のオリゴヌクレオチド；遺伝子４：３１種類のオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチドは全て６０〜７０塩基長であった。６０塩基のオリゴヌクレオチドは、３０塩基のオーバーハングを有し、７０塩基のオリゴヌクレオチドは３５塩基のオーバーハングを有していた。各遺伝子について、全てのオリゴヌクレオチドは、５μｌの各オリゴ（１００μＭストック）を加えることにより、５０ｍｌチューブ中にプールした。１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることで体積を２０ｍｌに調整して、２５ｎＭ／オリゴの最終オリゴヌクレオチド濃度を得た。
【００４４】
０．７５％ＰＥＧ８０００を用いてＩＳＯストック緩衝液を調製した。ＩＳＯ緩衝液はＰＥＧをＰＣＲ反応に送達する手段として用いられる。ＩＳＯ緩衝液は、所望の量のＰＥＧ−８０００、６００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＤＴＴ、それぞれ８００μＭの４種のｄＮＴＰおよび４ｍＭ  ＮＡＤを含有する。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に添加して０．３７５％ｗ／ｖの最終ＰＥＧ濃度を得た。Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびＭｇＣｌ２含有の反応緩衝液を含有する。当業者は、市販のミックスが大きな利便性を与えるが、他の適切な緩衝液を調製してもよいことを理解するであろう。
【００４５】
ＰＥＧ８０００を用いずにオリゴヌクレオチドをアセンブルするため、０．５および１μｌの上記２５ｎＭ／オリゴ混合物を用いて反応をセットアップし、その後２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）、水、並びにＡおよびＢプライマーをチューブに加えた。全ＰＣＲ体積は２０μｌであった。
【００４６】
ＰＥＧ８０００を用いてオリゴヌクレオチドをアセンブルするため、０．５および１μｌの上記２５ｎＭ／オリゴ混合物を用いて反応をセットアップし、その後２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）を、０．０３７５％  ＰＥＧ８０００、水、並びにＡおよびＢプライマーと一緒にチューブに加えた。総ＰＣＲ体積は２０μｌであった。
【００４７】
【表１】
2019022503.tif 000002
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃３０秒の変性段階
工程２：６７℃１分間の組み合わされた第一アニーリング／伸長段階
工程３：アニーリング／伸長段階の時間を１５秒／サイクル累積的に延長
工程１〜３を合計３０サイクル繰り返す
合計反応時間：約２．５時間
【００４８】
１．２％ＤＮＡゲルに５μｌの上記反応物を泳動した。ゲルは、アニーリングおよび伸長の温度を６７℃で組み合わせることにより、ギャップが存在しないオリゴのロバストな増幅が達成され得ることを示した。ＰＥＧ存在下でアセンブルされたオリゴヌクレオチド試料は、ＰＥＧ非存在下でアセンブルされた試料よりも実質的により明確なゲルバンドをもたらした。
【００４９】
実施例２：２．３ｋｂ遺伝子のアセンブリ
本実施例は、ＰＥＧ８０００の存在下および非存在下での、ギャップが存在しない８６種類のオリゴヌクレオチドからの２．３ｋｂ遺伝子（ｍｕｔＳ）の一工程ＰＣＲアセンブリを示すものである。
【００５０】
５μｌの各オリゴ（１００μＭストック）を加えることによりオリゴを５０ｍｌチューブ中にプールした。１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることで体積を２０ｍｌに調整し、２５ｎＭ／オリゴの最終オリゴ濃度を得た。０．７５％ＰＥＧ８０００ストックを水中で調製した。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて０．００５４％、０．０１８８％、０．０３７５％、０．０７５％、および０．１５％の最終ＰＥＧ濃度を得た。用いたオリゴヌクレオチドは全て６０〜７０塩基長であった。６０塩基オリゴヌクレオチドは３０塩基のオーバーハングを有し、７０塩基オリゴヌクレオチドは３５塩基のオーバーハングを有していた。
【００５１】
ＰＥＧ８０００を用いずに８６種類のオリゴをアセンブルするために、０．５、１．０、１．５、および２．５μｌ（図３のレーン７〜１０に対応し、レーンＭは標準マーカーレーンである）の上記２５ｎＭオリゴ混合物を、４つのＰＣＲチューブに加え、次にＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、水、およびプライマーを総ＰＣＲ体積が２０μｌになるように加えた。
【００５２】
ＰＥＧ８０００を用いて８６種類のオリゴをアセンブルするため、１μｌの２５ｎＭオリゴ混合物を５つのＰＣＲチューブに加え、次に０．００５４％、０．０１８８％、０．０３７５％、０．０７５％、および０．１５％（図３のレーン１〜５に対応）の最終ＰＥＧ８０００濃度を有するＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、水、並びにプライマーを総ＰＣＲ体積が２０μｌとなるように加えた。
【００５３】
【表２】
2019022503.tif 000003
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃で３０秒間
工程２：６７℃で６分間
工程３：１５秒／サイクルずつ時間を延長
工程１〜３を合計３０回繰り返す
合計反応時間：約６時間
【００５４】
１．２％ＤＮＡゲルに５μｌの上記反応混合物を泳動した。ゲルを図３に示す。ゲルは、ＰＣＲ条件のみでは大きなＤＮＡ断片をアセンブルするのに不充分であること、およびＰＥＧ８０００のみ（他のＩＳＯ成分無し）でアセンブリの成功が可能となることを示している。本実施例はまた、アセンブルされる核酸１ｋｂ当たり少なくとも２．５分間の組み合わされた第一サイクルアニーリング／伸長段階を与えることにより、２．３ｋｂ遺伝子（ｍｕｔＳ）のアセンブリに成功したことを示している。
【００５５】
実施例３：１２４種類のオリゴからの３．７ｋｂ遺伝子のアセンブリ
本実施例は、ギャップが存在しない１２４種類のオリゴからの、３．７ｋｂ遺伝子（ＭｅｔＨ）の、ＰＥＧ８０００有りおよび無しの一工程ＰＣＲを示すものである。使用した全てのオリゴヌクレオチドは６０〜７０塩基長であった。６０塩基オリゴヌクレオチドは３０塩基のオーバーハングを有し、７０塩基オリゴヌクレオチドは３５塩基のオーバーハングを有していた。
【００５６】
５μｌの各オリゴ（１００μＭストック）を加えることによりオリゴを１５ｍｌチューブ中にプールした。１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることで体積を１０ｍｌに調整し、５０ｎＭ／オリゴの最終オリゴ濃度を得た。ＩＳＯストック緩衝液を０．７５％ＰＥＧ８０００を用いて調製した。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて０．０１８８％、０．０３７５％、０．０７５％、０．３％および０．４５％の最終ＰＥＧ８０００濃度を得た。
【００５７】
ＰＥＧ８０００を用いずにオリゴをアセンブルするために、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０μｌ（それぞれ図４のレーン１〜５に示される）の上記５０ｎＭ／オリゴ混合物を、５つのＰＣＲチューブに加え、次にＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、水、およびプライマーを総ＰＣＲ体積が２０μｌになるように加えた。
【００５８】
ＰＥＧ８０００を用いてオリゴをアセンブルするため、１μｌの５０ｎＭオリゴ混合物を５つのＰＣＲチューブに加え、次にＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを、０．０１８８％、０．０３７５％、０．０７５％、０．３％、および０．４５％のＰＥＧ８０００（図４のレーン６〜１０に示される）、水、並びにプライマーと一緒に、総ＰＣＲ体積が２０μｌとなるように加えた。
【００５９】
【表３】
2019022503.tif 000004
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃で３０秒間
工程２：６７℃で６分間
工程３：１５秒／サイクルずつ時間を延長
工程１〜３を合計３５回繰り返す
合計反応時間：約７時間
【００６０】
１．２％ＤＮＡゲルに３μｌの上記反応物を泳動した。ゲルを図４として示す。結果は、３．７ｋｂ遺伝子が本発明によりオリゴからアセンブリ可能であることを示した。
【００６１】
実施例４：ＡＴリッチ遺伝子のアセンブリ
本実施例は、ギャップが存在しない７０種類のオリゴヌクレオチドからの、ＡＴリッチ２．１ｋｂ遺伝子（ｄｈａＢ１）の、ＰＥＧ８０００有りおよび無しの一工程ＰＣＲアセンブリを示すものである。ＰＥＧ８０００有りおよび無しでの、ギャップが存在しない６３種類のオリゴヌクレオチドからのＡＴリッチ１．７ｋｂ遺伝子（ｄｈａＢ）のアセンブリも示される。使用した全てのオリゴヌクレオチドは６０〜７０塩基長であった。６０塩基オリゴヌクレオチドは３０塩基のオーバーハングを有し、７０塩基オリゴヌクレオチドは３５塩基のオーバーハングを有していた。
【００６２】
５μｌの各オリゴ（１００μＭストックから）を加えることによりオリゴを５０ｍｌチューブ中にプールした。１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることで体積を２０μｌに調整し、２５ｎＭ／オリゴの最終オリゴ濃度を得た。
【００６３】
ＩＳＯストック緩衝液を０．７５％ＰＥＧ８０００を用いて調製した。ＩＳＯストック緩衝液は実施例１に記載される成分を有する。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて０．０３７５％の最終ＰＥＧ８０００濃度を得た。
【００６４】
ＰＥＧ８０００を用いずにオリゴをアセンブルするために、０．５、１．０、１．５、および２．０μｌ（図５の「ＰＥＧ無し」ゲルに、１．７ｋｂ遺伝子についてはそれぞれレーン１〜４に示され、２．１ｋｂ遺伝子についてはそれぞれレーン５〜８に示される）の上記２０ｎＭオリゴ混合物を、５つのＰＣＲチューブに加え、次にＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、水、およびプライマーを総ＰＣＲ体積が２０μｌになるように加えた。
【００６５】
ＰＥＧ８０００を用いてオリゴをアセンブルするために、０．５、１．０、１．５、および２．０μｌ（図５の「ＰＥＧ有り」ゲルに、１．７ｋｂ遺伝子についてはそれぞれレーン１〜４に示され、２．１ｋｂ遺伝子についてはそれぞれレーン５〜８に示される）の２５ｎＭオリゴ混合物を、５つのＰＣＲチューブに加え、次にＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを、０．０３７５％ＰＥＧ８０００、水、およびプライマーと一緒に、総ＰＣＲ体積が２０μｌになるように加えた。
【００６６】
【表４】
2019022503.tif 000005
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃で３０秒間
工程２：６７℃で４分間
工程３：１５秒／サイクルずつ時間を延長
工程１〜３を合計３０回繰り返す
合計反応時間：約５時間
【００６７】
１．２％ＤＮＡゲルに３μｌの上記反応物を泳動した。ゲルを図５として示す。結果は、アセンブリ条件のみでは大きなＡＴリッチ（７０％）ＤＮＡ断片をアセンブルするのに不充分であること、および密集化剤（ＰＥＧ８０００）の添加がアセンブリの成功を容易にすることを示している。また、組み合わされたアニーリング／伸長段階中に温度を下げることで、ＡＴリッチＤＮＡのアセンブリを促進することができることも示している。
【００６８】
実施例５：７種類の重複ｄｓＤＮＡ断片からの７ｋｂＤＮＡ産物のアセンブリ
本実施例は、７ｋｂ分子を作製するための７種類のＤＮＡ断片の、ＰＥＧ８０００有りまたは無しでの、一工程ＰＣＲアセンブリを示すものである。各断片と３０ｂｐの相同性（重複）を有する７種類のＤＮＡ断片（５０ｎｇ〜１００ｎｇ）をプールした。２５０ｂｐの断片１；２，０００ｂｐの断片２；１，０００ｂｐの断片３；７００ｂｐの断片４；１，５００ｂｐの断片５；１，０００ｂｐの断片６；および１，８００ｂｐの断片７。
【００６９】
０．７５％ＰＥＧ８０００のストックを水中で調製した。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて０．０３７５％および０．０７５％の最終ＰＥＧ８０００濃度を得た。
【００７０】
ＰＥＧ８０００無しで７種類のＤＮＡ断片をアセンブルするため、３．５μｌの断片混合物をＰＣＲチューブに加え、その後Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、水、およびプライマーを加えた。
【００７１】
ＰＥＧ８０００有りで７種類のＤＮＡ断片をアセンブルするため、３．５μｌの断片混合物を２つのＰＣＲチューブに加え、その後Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを０．０３７５％および０．０７５％の最終ＰＥＧ濃度で加え、次いで水、並びにプライマーＡおよびＢを加えた。
【００７２】
【表５】
2019022503.tif 000006
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃で３０秒間
工程２：６７℃で６分間
工程３：１５秒／サイクルずつ時間を延長
工程１〜３を合計３０回繰り返す
合計反応時間：約７時間
【００７３】
１．２％ＤＮＡゲルに３μｌの上記反応物を泳動した。ゲルを図６として示す。レーン１はＰＥＧを含有せず、レーン２は０．０３７５％ＰＥＧを含有し、レーン３は０．０７５％ＰＥＧを含有し、レーンＭはマーカーレーンである。結果は、アニーリングおよび伸長の温度を６７℃で組み合わせることによって重複ＤＮＡ断片のロバストな増幅が達成されることを示している。ＰＥＧ８０００は産物を増加させる。
【００７４】
実施例６：ｍｕｔＳ（８６種類のオリゴ）のアセンブリ
本実施例は、ＰＥＧおよびＩＳＯを比較する、ｍｕｔＳ（８６種類のオリゴ）の一工程ＰＣＲアセンブリを示すものである。使用した全てのオリゴヌクレオチドは６０〜７０塩基長であった。６０塩基オリゴヌクレオチドは３０塩基のオーバーハングを有し、７０塩基オリゴヌクレオチドは３５塩基のオーバーハングを有していた。
【００７５】
５μｌの各オリゴ（１００μＭストック）を加えることによりオリゴを５０ｍｌチューブ中にプールした。１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることで体積を２０ｍｌに調整し、２５ｎＭ／オリゴの最終オリゴ濃度を得た。
【００７６】
０．７５％ＰＥＧ８０００のストックを水中で調製した。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて０．０１８８％、０．０２８％、０．０３７５％および０．０７５％の最終ＰＥＧ８０００濃度を得た。
【００７７】
０．７５％ＰＥＧ８０００のストックを、実施例１に記載される成分を有するＩＳＯ緩衝液中で調製した。ストックを２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ,  Ｏｙ、フィンランド）に加えて、それぞれ図７のレーン１〜４として示される０．０１８８％、０．０２８％、０．０３７５％および０．０７５％の最終ＰＥＧ８０００濃度を得た。レーン５〜８はＰＥＧを含有していなかった。Ｍはマーカーレーンである。
【００７８】
【表６】
2019022503.tif 000007
以下のアセンブリプロトコルを用いた。
工程１：９８℃で３０秒間
工程２：６７℃で６分間
工程３：１５秒／サイクルずつ時間を延長
工程１〜３を合計３０回繰り返す
合計反応時間：約６時間
【００７９】
１．２％ＤＮＡゲルに３μｌの上記反応物を泳動した。ゲルを図７として示す。結果は、ＰＥＧがＰＣＲを介したＤＮＡアセンブリを向上させるＩＳＯ中の成分であることを示している。
【００８０】
実施例７：最小ゲノムの複数の部分アセンブリのアセンブリ
マイコプラズマ属由来の最小ゲノムを、ＡＲＣＨＥＴＹＰＥ（商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州）ソフトウェアプログラムを用いて、それぞれおよそ１．４ｋｂの３７０個の提唱された断片に分割した。これらの３７０個の断片のそれぞれを、次に約４４個の（ギャップが存在しない）オリゴヌクレオチドに分割し、それぞれのオリゴはおよそ７０ヌクレオチド長であり、向かい合う隣接するオリゴと重複するおよそ３５個のヌクレオチドを含有していた（すなわち、それぞれの隣接する二本鎖ＤＮＡ上の反復配列のおよそ３５個のヌクレオチド）。断片の隣接（または「末端」）オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴ＃１およびオリゴ＃４４）は、３７０個の断片全てに共通な配列である３０個のヌクレオチド（ＰＣＲ増幅用）およびインサートをベクターから放出させるための制限酵素認識部位（例えばＮｏｔＩ）を含有する配列である８個の塩基を含有していた。また、３７０個の断片のそれぞれは、その後のアセンブリ段階のため組み換えられるように、隣接する二本鎖核酸断片に対し６０ヌクレオチドの重複配列を含有していた。
【００８１】
３７０個の部分アセンブリのそれぞれを構成するオリゴヌクレオチドをプールした後、それらを１オリゴにつき２００ｎＭの濃度に希釈した。オリゴヌクレオチドのアセンブリおよび得られる産物の増幅を単一工程で両方行うアセンブリ反応を以下に示す。
５０μｌ  ２×Ｑ５ポリメラーゼミックス（ＮＥＢ）
０．８μｌ  ５％ＰＥＧ８０００
０．５μl  プライマー１［ｐＵＣ１９  インサート  Ｆ］
０．５μl  プライマー２［ｐＵＣ１９  インサート  Ｒ］
１．２５μｌ  ２００ｎＭの上記オリゴプール
４６．９５μｌ  水
【００８２】
これらの高Ａ／Ｔ含量ＤＮＡ試料について、６０℃以下でアニーリング／伸長させることが有益であることが分かった。
【００８３】
以下のサイクル条件を用い、広範囲のＤＮＡ配列にわたって作動させた。
サイクル条件：
１．  ９８℃で１分間
２．  ９８℃で１０秒間
３．  ５７℃で３０秒間
４０Ｃにゆっくりと冷却（０．１Ｃ／秒）
４．  ４０℃で３０秒間
３．  ５７℃で６分間
サイクル毎に１５秒延長
４．  工程２にさらに２９回移行
５．  ７２Ｃで５分間
６．  １０℃−−−
【００８４】
その後、複数のアセンブリはさらなるアセンブリ段階にかけることができ、そこで、１．４ｋｂの構築物をそれぞれ６．７ｋｂの７４個の構築物にアセンブルした。その後、これらの６．７ｋｂの構築物を、それぞれ５０〜７５ｋｂの８個の構築物にアセンブルし、これらを次に４８３ｋｂの最小マイコプラズマゲノムにアセンブルした。
【００８５】
実施例８：機能的ＨＡおよびＮＡ  ＤＮＡ分子およびタンパク質部分の合成
本実施例は、オリゴヌクレオチドプールからのＨＡおよびＮＡ遺伝子のＤＮＡ構築物の自動アセンブリを示すものである。インフルエンザウイルスは、中央コアを包む糖タンパク質を含有するウイルス外被でできている。中央コアはウイルスＲＮＡゲノムおよびＲＮＡをパッケージングし保護する他のウイルスタンパク質を含有している。インフルエンザゲノムは典型的には、８個のＲＮＡ小片を含有しており、そのそれぞれはウイルスタンパク質をコードする１つまたは２つの遺伝子を含有している。インフルエンザＡの場合、ゲノムは、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む１１種のタンパク質をコードする１１個の遺伝子を８個のＲＮＡ小片上に含有している。他のタンパク質としては、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２およびＰＢ２が挙げられる。
【００８６】
赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）はウイルス粒子の外側に存在する糖タンパク質である。これらの糖タンパク質は、宿主細胞への結合およびウイルス粒子の複製の補助を含む、ウイルスの生活環における重要な機能を有している。従って、これらのタンパク質を含有する構築されたウイルスは、ワクチンの作製において有用である。
【００８７】
オリゴヌクレオチドの合成およびアセンブリ
ＨＡおよびＮＡ遺伝子のＤＮＡ構築物の配列を示す９６種類のオリゴヌクレオチドのプールを本発明のアセンブリ装置に与えた。ＨＡおよびＮＡ構築物はおよそ３ｋｂ長であり、本方法において９６種類のオリゴヌクレオチドからアセンブルした。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅用のプライマー結合ドメイン、並びにＤＮＡアセンブリのための、必要であれば大きな断片をアセンブルするための、増幅後にプライマー結合ドメインを放出し重複領域を露出させるＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含有していた。
【００８８】
アセンブル装置は、統合熱サイクル能を有するＢＩＯＭＥＫ（登録商標）ＮＸＰ、Ｓｐａｎ−８  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、フラートン、カリフォルニア州）を利用した。
【００８９】
アセンブリ装置は、過程中にいくつかの異なる工程、すなわち、１）オリゴヌクレオチドを増幅するためのＰＲＣ１増幅；２）ＰＣＲ１増幅オリゴヌクレオチドに対するエラー補正工程；３）補正されたオリゴヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲ２工程；４）純粋な増幅オリゴヌクレオチドを得るためのＰＣＲ産物精製工程；５）オリゴヌクレオチド産物を遺伝子にアセンブルするためのアセンブリ工程、を実行するようにプログラムした。各過程は反応容器（９６ウェルプレート）の別々の反応域で実行することができ、反応域は９６ウェルプレート上の一つまたは複数のカラムであってよい。アセンブリ反応は５０℃で３０〜６０分間であり、反応は温度変化しその後１０℃に固定される。
【００９０】
第一ＰＣＲおよびエラー補正
それぞれのアセンブルされた産物に対し、ＰＣＲ反応を自動化した様式で実行した。
２５μｌの２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｙ，  Ｏｙ、フィンランド）
２μｌの１％ＰＥＧ８０００
０．２５μｌの末端プライマー１（１００μＭ）
０．２５μｌの末端プライマー２（１００μＭ）
２０μｌのＭＢＧ水
ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを含有する反応容器の反応域に、２．５μｌの上記オリゴプールを５０ｎＭで鋳型として移した（またはその後に混合する）。
２．  以下のパラメーターを用いて熱サイクルを生じさせた。
９８℃で１分間
３０回（９８℃で３０秒間、６５Ｃで６分間、および１５秒／サイクルずつそれを延長
７２℃で５分間
１０℃で最後まで（ｆｏｒｅｖｅｒ）
【００９１】
ＰＣＲ精製
ＰＣＲ産物をＡＭＰＵＲＥ（登録商標）ＸＰ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ，  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、ベバリー、マサチューセッツ州）を用いて精製した。
【００９２】
複数の部分アセンブリを組み合わせてプラスミドベクター内のＨＡおよびＮＡ遺伝子を作製するためのＧＩＢＳＯＮ  ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃs、サンディエゴ、カリフォルニア州）
およそ３ｋｂの核酸アセンブリを作製した。電気泳動ゲルを図８に示す。これらの遺伝子には既に、哺乳類細胞へのトランスフェクション後の発現のためのプロモーター領域（ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩ）が含まれている。
【００９３】
本明細書に例示的に記載される発明は、本明細書で特に開示されていない、いかなる、要素または複数の要素、制限または複数の制限の非存在下でも、適切に実行することができる。従って、例えば、本明細書におけるそれぞれの例において、用語「を含む」、「から本質的に成る」および「から成る」のいずれも、その他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明のための用語として用いられており、限定のための用語ではなく、そのような用語および表現の使用において、示され記載される特徴またはその一部のいかなる等価物も除外するという意図はないが、特許請求される本発明の範囲内において種々の変更が可能であることは理解される。
【００９４】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本発明が、それによって、マーカッシュ群のいかなる個々の構成要素または構成要素の部分群によっても記載されることを理解するだろう。例えば、Ｘが臭素、塩素、およびヨウ素からなる群から選択されると記載されている場合、Ｘを臭素とする請求並びにＸを臭素および塩素とする請求が、完全に記述されている。
【００９５】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2019022503.tif 000008
【図２】
2019022503.tif 000009
【図３】
2019022503.tif 000010
【図４】
2019022503.tif 000011
【図５】
2019022503.tif 000012
【図６】
2019022503.tif 000013
【図７】
2019022503.tif 000014
【図８】
2019022503.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月19日(2018.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重複オリゴヌクレオチドのセットから単一工程で核酸分子をアセンブルする方法であって、
（ａ）重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ；ｄＮＴＰの混合物；およびポリエチレングリコールと接触させて、アセンブリ混合物を形成すること；
（ｂ）前記アセンブリ混合物を、各サイクルがアニーリング段階、伸長段階、変性段階のうちの一つまたは複数を含む複数回のサイクルにかけること；
（ｃ）それによって、単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから前記核酸分子をアセンブルすること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドのセットが末端オリゴヌクレオチドおよび非末端オリゴヌクレオチドを含み、該末端オリゴヌクレオチドが該非末端オリゴヌクレオチドよりも高い濃度でアセンブリ混合物中に与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１回のアニーリング段階が５０℃〜７７℃の温度で起こる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
あるサイクルの伸長段階の時間がその前のサイクルの伸長段階と比較して延長されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼがパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の改変ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドのセットが１つの遺伝子にアセンブルされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ８０００である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＥＧの濃度が０．０２５％以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＥＧの濃度が０．３７５％以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニーリング段階が６７℃で起こる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニーリング段階および前記伸長段階が６７℃で起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子が１ｋｂ長よりも大きい、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が２ｋｂ長よりも大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が３ｋｂ長よりも大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも５種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも６０種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも７５種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アセンブルされた前記核酸分子が２ｋｂよりも大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アセンブルされた前記核酸分子が３ｋｂより大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階の時間が第一伸長段階に対して漸増する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記重複ヌクレオチドのセットが１００種類超のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
一つまたは複数の段階が時間に変動がある段階である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記伸長段階が時間に変動がある段階である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記伸長段階が１サイクル毎に約１５秒だけ累積的に延長される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数回のサイクルが少なくとも２５回のサイクルを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
アセンブルされた前記核酸分子が一つまたは複数のＡＴリッチ配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
重複オリゴヌクレオチドのセットから単一工程で核酸分子をアセンブルする方法であって、
（ａ）重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ；ｄＮＴＰの混合物；およびポリエチレングリコールと接触させて、アセンブリ混合物を形成すること；
（ｂ）前記アセンブリ混合物を、各サイクルがアニーリング段階、伸長段階、変性段階のうちの一つまたは複数を含む複数回のサイクルにかけること；
（ｃ）それによって、単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから前記核酸分子をアセンブルすること、
を含む、方法。
［２］
前記オリゴヌクレオチドのセットが末端オリゴヌクレオチドおよび非末端オリゴヌクレオチドを含み、該末端オリゴヌクレオチドが該非末端オリゴヌクレオチドよりも高い濃度でアセンブリ混合物中に与えられる、［１］に記載の方法。
［３］
少なくとも１回のアニーリング段階が５０℃〜７７℃の温度で起こる、［１］に記載の方法。
［４］
あるサイクルの伸長段階の時間がその前のサイクルの伸長段階と比較して延長されている、［１］に記載の方法。
［５］
前記ＤＮＡポリメラーゼがパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の改変ＤＮＡポリメラーゼである、［１］に記載の方法。
［６］
前記オリゴヌクレオチドのセットが１つの遺伝子にアセンブルされる、［１］に記載の方法。
［７］
前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ８０００である、［１］に記載の方法。
［８］
ＰＥＧの濃度が０．０２５％以上である、［７］に記載の方法。
［９］
ＰＥＧの濃度が０．３７５％以上である、［７］に記載の方法。
［１０］
前記アニーリング段階が６７℃で起こる、［１］に記載の方法。
［１１］
前記アニーリング段階および前記伸長段階が６７℃で起こる、［１］に記載の方法。
［１２］
前記核酸分子が１ｋｂ長よりも大きい、［９］に記載の方法。
［１３］
前記核酸分子が２ｋｂ長よりも大きい、［１２］に記載の方法。
［１４］
前記核酸分子が３ｋｂ長よりも大きい、［１２］に記載の方法。
［１５］
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも５種類のオリゴヌクレオチドを含む、［１］に記載の方法。
［１６］
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも６０種類のオリゴヌクレオチドを含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記重複オリゴヌクレオチドのセットが少なくとも７５種類のオリゴヌクレオチドを含む、［１６］に記載の方法。
［１８］
アセンブルされた前記核酸分子が２ｋｂよりも大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階が時間に変動がある段階である、［１７］に記載の方法。
［１９］
アセンブルされた前記核酸分子が３ｋｂより大きく、第一伸長段階が５分間〜７分間であり、その後の複数の伸長段階の時間が第一伸長段階に対して漸増する、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記重複ヌクレオチドのセットが１００種類超のオリゴヌクレオチドを含む、［１９］に記載の方法。
［２１］
一つまたは複数の段階が時間に変動がある段階である、［１］に記載の方法。
［２２］
前記伸長段階が時間に変動がある段階である、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記伸長段階が１サイクル毎に約１５秒だけ累積的に延長される、［２２］に記載の方法。
［２４］
前記複数回のサイクルが少なくとも２５回のサイクルを含む、［１］に記載の方法。
［２５］
アセンブルされた前記核酸分子が一つまたは複数のＡＴリッチ配列を含む、［１］に記載の方法。
上記の発明の概要は限定するものではなく、本発明の他の特徴および利点は、下記の発明の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなる。