(57)【要約】      （修正有）【課題】甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤および飼料の提供。【解決手段】β−１，４−マンノビオースを３重量％以上含有する甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤および飼料。【効果】β−１，４−マンノビオースを飼料に添加すること、又はそのまま飼料として使用することによって、甲殻類におけるウイルス性の疾病に対して抵抗性を増進するようになり、その生存率を著しく高めるできるものであり、当該養殖業者に対して有効に働くものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
【請求項２】
β−１，４−マンノビオースがコプラミール、パーム核ミールまたはコーヒー粕由来である、請求項１記載の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
【請求項３】
β−１，４−マンノビオースがマンナン含有天然物にマンナン分解酵素を作用させて生成したものである、請求項１記載の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
【請求項４】
β−１，４−マンノビオースの含有量が３重量％以上である、請求項１〜３記載の魚甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
【請求項５】
β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤含有飼料。
【請求項６】
甲殻類にβ−１，４−マンノビオースを含有する組成物を投与することを特徴とするウイルス性疾病の予防法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲殻類の養殖においてβ−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする、甲殻類のウイルス性疾病に対する抵抗性を増進する添加剤、およびこれを含有する飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲殻類の養殖業においてウイルス性の疾病は甲殻類の大量斃死等の原因となり、甲殻類養殖業における大きな問題のひとつとなっている。甲殻類のウイルス性疾病は、感染すると100％致死するものや、死亡率は低いが、摂食行動、発育不良を伴うものがあり、いずれにしろ、罹患するとその生産性が著しく低下してしまい当該生産業者にとっては、ウイルス感染防止は重要な課題である。
【０００３】
ウイルス病の代表的なものとしては、ホワイトスポット症候群と言われる、ホワイトスポットウイルスによる疾病（ＷＳＳＶ）、タウラ症候群と言われる、タウラウイルスによる疾病（ＴＳＶ）、伝染性皮下造血器壊死症ウイルスによる疾病（ＩＨＨＮＶ）、バキュロウイルス性中腸腺壊死症（ＢＭＮ）などがある。
【０００４】
たとえばＷＳＳＶは、感染すると、白点の症状がでて、3-10日以内に100％の致死率に達する。また、ＴＳＶは稚エビ放流後、5-20日以内に感染が始まり、体全体が薄赤く変色する。これにより摂食行動が抑制され、徐々に弱り、柔らかい殻と、内容物のない胃が観察される。ＴＳＶは感染したエビを、急性期、移行期、慢性期に分けられ、感染初期の急性期に死亡率が著しく高くなる。急性期を生き残ったエビは、慢性期にはいると死亡率は著しく低くなり、赤色に変色したものも元に戻り、摂食行動も通常に戻る。現在この二つのウイルス性疾病が中国、東南アジアにおいて大きな脅威となっている。
【０００５】
これらのウイルス性疾病の防除対策としては、抗生物質や抗ウイルス剤といった薬剤が使用されてていた。しかしながら近年、これらの薬剤の使用により耐性菌や耐性ウイルスの出現がヒトの健康までにも影響を及ぼすことが懸念されて、使用を控える傾向が強まってきた。
【０００６】
このような環境において、薬剤を使用しない抗ウイルス剤も提案されている。例えば、タウラウイルスに対して、特殊な配列をもつ合成ペプチドをワクチンとして摂取させる方法（特許文献1）や、補酵素Ｑを飼料に添加する方法（特許文献２）、さらにはオリゴ糖を飼料に添加する方法（特許文献３）などが開示されている。しかしながら、未だ一般的には実用化されていないのが現状である。
【０００７】
またウイルス性疾病以外の防除対策として、マンノビオースを含む素材に関しては、パーム核ミール、コプラミール、コーヒー粕、グアーミール等には、マンノースを構成糖とするマンナンが豊富に含有されることが知られており、これら天然原料に酵素を作用させて調製したマンノビオースを主成分とするマンノオリゴ糖類を含む組成物を添加された飼料は、ビブリオ菌で感染させた、バナメイエビの生存率を高めることが報告されている（非特許文献1）。また、甲殻類ではないが、ブロイラーにおいて、同じマンノビオースを主成分とするマンノオリゴ糖を含む組成物を添加された飼料は、有害細菌であるサルモネラ菌の定着を抑制し、対外へ排出する排菌効果を有することが知られている（非特許文献2）。このように、マンノビオースを主成分とするマンノオリゴ糖を含む組成物もしくはそれらが添加された飼料は、病原菌に対して有効に作用することが示唆されている。これは、マクロファージの病原菌を認識するレセプターに直接マンノビオースが働きかけて、マクロファージを活性化させ、その貪食能を向上せしめて、抗原提示を行い、積極的なＩｇＡ抗体を産出することにより病原菌抵抗性を高めていると推定されている（非特許文献3）。しかしながら、この作用スキームでは、マクロファージ上のマンノビオースレセプターも異なるウイルス性疾病に対しては期待できるものではない。
【０００８】
特許文献4には、β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする水産養殖用の飼料が成長性を改善し、それらの残留による人体の影響に問題がない飼料を得られることが記載されているが、これは、マンノビオースが腸管の働きを向上することによってなされることを利用したもので、ウイルス性疾病に関しては明示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第5675348号公報
【特許文献２】国際公開第2014/003069 号パンフレット
【特許文献３】特開平10-45605号公報
【特許文献４】特開2010-57518号公報
【非特許文献１】Poultry Science, 687, p.1357-1360, 1989
【非特許文献２】応用糖質科学  第5巻  第2号  105-112（2015）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
甲殻類のウイルス性疾病に対する抵抗性を増進する添加剤、飼料を提供することに関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、意外にも、甲殻類へのストレスや、薬剤の甲殻類への悪影響や残留の問題を伴わずに、β−１，４−マンノビオースを含有する防除剤を用いることで、ウイルス性疾病による死亡を劇的に改善することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
（２）β−１，４−マンノビオースがコプラミール、パーム核ミールまたはコーヒー粕由来である、（１）記載の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
（３）β−１，４−マンノビオースがマンナン含有天然物にマンナン分解酵素を作用させて生成したものである（１）記載の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
（４）β−１，４−マンノビオースの含有量が３重量％以上である（１）から（３）記載の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤。
（５）β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤含有飼料
（６）甲殻類にβ−１，４−マンノビオースを含有する組成物を投与することを特徴とするウイルス性疾病の予防法
を骨子とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の甲殻類におけるウイルス抵抗性増進剤および飼料は、これを飼料に添加することによって、またはそのまま飼料として使用することによって、甲殻類のウイルス性疾病による死亡率を改善することができ、甲殻類へのストレスや、薬剤の甲殻類への悪影響や残留の問題を伴わずに、ウイルス性疾病に対する抵抗性の増進を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例２の生存率を表したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の甲殻類のウイルス性抵抗性増進剤及び飼料は、β−１，４−マンノビオースを含有することを特徴とする。
【００１６】
（β１，４−マンノビオース）
本発明の甲殻類のウイルス性抵抗性増進剤及び飼料は、β−１，４−マンノビオース（以下、単にマンノビオースともいう）は、マンノース２分子がβ−１，４−グリコシド結合してなるものである。本発明で用いられるβ−１，４−マンノビオースは、例えば、マンノースを合成する方法や、β−１，４−マンナン（以下、単にマンナンともいう）を分解する方法により得ることができる。
【００１７】
（β１，４−マンノビオースの製造方法）
β−１，４−マンナンを分解する方法は、原料の資源性及び反応効率の点でより好ましく、より簡便にβ−１，４−マンノビオースを得ることができる。この方法では、例えば、マンナンを豊富に含有するパーム核ミール、コプラミール、コーヒー豆粕、グアーガム、ローカストビーンガムなどのマンナン含有天然物又はこれらの天然物から抽出したマンナンに、マンナン分解酵素を作用させて、β−１，４−マンノビオースを得ることができる。
【００１８】
また、この方法において使用されるマンナン分解酵素としては、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、ヘミセルラーゼ等、マンナンを分解してマンノビオースを生成する活性を有するものであればいずれでもよいが、Aspergillus niger由来のもので、市販されているもの（例えばヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」（天野製薬株式会社製）、スミチームＡＣＨ（新日本化学工業株式会社製）、セルロシンＧＭ５（阪急バイオインダストリー株式会社）等を好ましく使用できる。また、これらのほか、キシラナーゼ、セルラーゼとして市販されているものであっても、当該加水分解活性を有するものも使用でき、例えば、セルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト薬品工業株式会社製）を使用できる。特に、マンノシダーゼ（exo型）活性が低く、マンナナーゼ（endo型）活性が高いヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」（天野製薬株式会社製）、スミチームＡＣＨ（新日本化学工業株式会社製）が、マンノースの生成を抑え、多量にマンノビオースを生成させることができる点で好ましい。
【００１９】
さらに、この方法では、マンナン分解酵素は、水に溶解又は分散させた酵素液として、マンナン含有天然物又はこれから抽出したマンナンに作用させる。そして、マンナン含有天然物を用いる場合において効率的な反応を行うためには、マンナン含有天然物、マンナン分解酵素及び水からなる反応系における水分の調整が重要である。水を添加することにより、マンナン類の繊維質を十分に膨潤させ、酵素液を接触しやすくすることができる。水分調整のための水の添加量としては、マンナン１００重量部に対して、５０〜１００００重量部が好ましく、より好ましくは５０〜１５００重量部であり、さらに好ましくは５０〜５００重量部である。水分量が少ないと、酵素反応が進みにくい傾向があり、水分量が多い場合は、酵素反応効率が低下する傾向になる。
【００２０】
また、酵素量、反応時間としては、マンノビオースが出来るだけ多く生成するように酵素を選択し、反応時間を調整することができる。但し、マンナナーゼ（endo型）活性が高い酵素は、通常、マンノシダーゼ（exo型）活性も有していることから、酵素反応の時間が長すぎると、マンノビオースが分解されてマンノース量が増加してしまうため、反応時間は必要以上に長い時間としないことが好ましい。これら酵素反応条件は、マンノビオース生成量ができるだけ多くなるように適宜設定される。この場合、β−１，４−マンノビオースがマンノースより多く含まれるよう設定するのが好ましい。例えば、β−１，４−マンノビオースに対するマンノースの割合は、６０重量％以下が好ましく、より好ましくは２０重量％以下である。以上のようにして、例えば、原料としてコプラルミール（マンナン含有量は、およそ３０％）を用いて３〜３６時間反応させた場合、マンノビオース量は、使用する酵素の種類や量、時間にもよるが、原料１００重量部に対して、５〜１５重量部程度まで生成させることができる。
【００２１】
（β１，４−マンノビオースの含有量）
このようにして生成したマンノビオースを含有する酵素処理物（β−１，４−マンノビオース含有組成物）は、不溶物を除去する等してマンノビオース濃度を高めて甲殻類のウイルス性抵抗性増進剤としても良いが、濃縮のためのコストを要するため、寧ろ、不溶物などは除去せず、そのまま、又は必要に応じた乾燥を行って防除剤とするのが良い。この場合、防除剤中に、マンノビオースとして３重量％以上含有するものが好ましい。より好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは７重量％以上、さらに好ましくは９重量％以上である。この防除剤は、飼料に配合して使用することができる。一方、酵素処理物からマンノビオース等を水抽出物したものを、そのまま飼料に添加する防除剤として使用することもできる。この場合も、当該水抽出物は、マンノビオースの他にマンノースやマンノオリゴ糖類などを含有するが、特にマンノビオースのみを抽出、精製する必要はなく、むしろこれらが含まれていることが好ましい。
【００２２】
本発明の甲殻類のウイルス性抵抗性増進剤は、飼料に添加する場合、配合飼料中の含有量がマンノビオースとして０．００１〜２．００重量％となるように混合することが好ましい。更に好ましくは０．００５〜１．００％、最も好ましくは０．０１〜０．５０％となるように添加するのが良い。また、別途本発明の甲殻類のウイルス性抵抗性増進剤とミネラルやビタミンとプレミックス飼料を作成し、飼料とは別に、先の飼料に対する添加量にみあった量を別で甲殻類給与することもできる。
【００２３】
（甲殻類）
本発明対象である甲殻類は、特に限定されるものではなく、例えば、エビ類、カニ類、シャコ類、ザリガニ類、オキアミ類、ミジンコ類などがあげられる。これらの甲殻類の中で特に好適なのは、限定されるものではないが、クルマエビ科、オキエビ科、サクラエビ科、タラバエビ科、アカザエビ科、イセエビ科、セミエビ科、アメリカザリガニ科、アサヒが二科、クモガ二科、クリが二科、ワタリガニ科、イワガニ科、サワガニ科などがあげられる。
【００２４】
（甲殻類のウイルス性疾病）
甲殻類のウイルス性疾病には、急性ウイルス血症（ＰＡＶ）、中膿腺壊死症（ＢＭＮ）、タウラ症候群（ＴＳＶ）、伝染性皮下造血器壊死症（ＩＨＨＮＶ）、イエローヘッド病（ＹＨＶ）などがあげられるがこれに特に限定されるものではない。
【００２５】
（飼料としての使用）
本発明の増進剤を飼料に混合して使用する場合、他の通常の飼料原料として用いられる材料と自由に配合しても構わない。例えば、魚粉、ミートミール、脱脂粉乳、乾燥ホエー、オキアミミール、カゼイン、ゼラチンなどの動物性材料、酵母類、トウモロコシデンプン、デキストリンなどの糖類、大豆タンパク、小麦グルテン、トウモロコシツエインなどの植物性たん白質、トウモロコシ、マイロ、小麦、大麦、米、ライ麦、燕麦、ルーピン、甘薯、キャッサバなどの穀物類、大豆、おから、脱脂大豆などの豆類、菜種粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕などの植物性油粕類、米ヌカ、フスマ、麦ヌカなどの糟糠類、コーングルテンフィード、ビートパルプ、ビール粕、酒粕、コンニャク飛粉などの製造副産物類、綿実油、菜種油、トウモロコシ油、大豆油、ヒマワリ油、サフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油などの油脂類などが挙げられる。これらは単独で使用してもよいし又は二種以上の混合物として用いられることができる。飼料の給餌形態として、水分を含まない固形飼料（DP）および水分を含む団子状飼料（MP）の形態などがあるが、いずれの形態で給餌してもよいが、好ましくはエクストルーダー飼料（ＥＰ）が好ましい
【００２６】
さらに他に、飼料の品質の低下の防止、飼料の栄養成分その他有効成分の補給、飼料の含有している栄養成分の有効な利用の促進を目的に各種の添加物が用いられる。例えばアミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類、脂肪酸類などの栄養成分、酵素類、生菌剤、防カビ剤、抗酸化剤、乳化剤などを本防除剤の効果を阻害しない範囲で自由に配合することは差し支えない。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を示し、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例中の「部」、「％」は、特に断りがない限りそれぞれ「重量部」、「重量％」を表す。
【００２８】
（実施例１）
コプラミール（マンナン含有量３０％、水分４．４％）１００部に、酵素ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」（天野製薬株式会社製）０．２５部を溶解した酵素液１５０部を、６０℃で１２時間作用させた後、流動層乾燥装置（大河原製作所製）にて水分９．３％にまで乾燥させて、乾燥粉体１０６部を得た。この乾燥粉体のマンノビオース含有量およびマンノース含有量をイオン交換クロマトグラフィー法で測定したところ、β−１，４−マンノビオースが１２．７部、マンノースが１．４１部生成していた。
【００２９】
（実施例２、バナメイエビＴＳＶ感染モデルにおける生存率測定）
2-1飼料の作成
飼料の作成およびバナメイエビへの給餌方法は、公知の方法（Journal of Applied Microbiology ,107,1031-1041(2009)に基づいて実施した。すなわち本文献中のコントロール配合100部に実施例１で製造したβ−１，４−マンノビオースを含む増進剤1.0部を加えて混合したのち、エクストルーダー処理を行い、ＥＰ飼料を得た。対照区の飼料は、β-1,4マンノビオースを含まない飼料を作成した。
2-2給餌方法
供試動物として、バナメイエビ（体重約5g）を200 Lの0.8％塩分濃度も水槽に試験区、対照区各40尾ずつ飼育した。2-1で作成した飼料を試験開始日（ＴＳV感染日）7日前から試験開始50日後まで各試験区に一日3回給餌した。また、一日給餌量は、バナメイエビ体重の8％程度給餌した。 
2-3．TSV感染および生存率測定
TSVにより死亡したバナメイエビの頭胸部10gを滅菌海水40 ml中でホモジナイズし、得られた懸濁液を3000 rpm、4 ℃で、10分間遠心分離した。遠心分離後、上清中のウイルス量をRT mPCR法により測定し、海水中のウイルス量が1800 copies/mLになるように20 Lの0.8％塩分水に懸濁した。この中にバナメイエビを40尾ずつ2時間浸漬しタウラウイルスの人為感染を行い、200Ｌの水槽に戻した。その後継時的に、エビの生存率を測定した。実施例２の増強試験の結果を図１に示した。人為感染の７〜８日後に体表の寄生を初めて確認し、９日めから２日おきにシストを回収・計数を行った。感染３週間後までの合計シスト数は対照区の水槽３基の合計は１８４個となったのに対して、試験４％区の水槽３基の合計は
実施例２の飼養試験の生残率を図１に示した。飼養開始後７日目にＴＳＶ感染を行った後、対照区は、摂食行動が見られなくなり、著しく生存率が減少した、これに対して、試験区は明らかな生存率の向上が見られた。
【００３０】
以上のことから、本発明のβ−１，４−マンノビオースを含有する増強剤および飼料を用いることで、ウイルス性疾病における甲殻類の生存率を著しく高めることが見いだされた。これにより、甲殻類のウイルス性疾病に対して有効な天然の生理活性物質を含有する甲殻類の飼料を提供することができる。これを使用することで甲殻類へのストレスや、薬剤の甲殻類への悪影響や残留の問題を伴わずに安全に甲殻類のウイルス性疾病による体重減少や斃死を防ぐことができ、甲殻類養殖における経済性も向上することができる。
【図１】
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