(57)【要約】【課題】新規で効果の高い育毛剤を提供すること。【解決手段】幹細胞培養上清を含有することを特徴とする育毛剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞培養上清を含有することを特徴とする育毛剤。
【請求項２】
臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清であることを特徴とする請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
臍帯由来間葉系幹細胞が、ワルトンゼリー（Wharton's jelly）由来であることを特徴とする請求項２に記載の育毛剤。
【請求項４】
経皮投与用であることを特徴とする請求項４に記載の育毛剤。
【請求項５】
注射剤であることを特徴とする請求項５に記載の育毛剤。
【請求項６】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の育毛剤を患部へ浸透注入することを特徴とする育毛方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤に関し、特に、幹細胞培養上清を含有する新規で効果の高い育毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
何時までも豊富で黒い髪の毛を維持すると言うことは、若く見せるために老若男女誰しもが願うところである。しかしながら、加齢現象や遺伝的素因、更には社会的ストレス等が原因となり、徐々に髪の毛が脱落していき薄毛や禿の原因となっている。脱毛には大きく分けて生理的な自然脱毛と病的に起こる異常脱毛がある。自然脱毛は１日に５０〜８０本ぐらいであり、１００本を超える異常脱毛は、ストレスの蓄積、神経の使い過ぎ、頭皮の手入れ不足、頭皮の血行不足、ホルモンバランスの乱れ、動物性食品のとりすぎ、栄養不足、食事のバランスのかたよりが原因とされている。こう言った脱毛症を予防・改善するために各種メーカーが育毛剤の開発・販売に力を入れている。
【０００３】
例えば、毛髪用化粧品原料として、例えば、毛髪用化粧料組成物(特許文献１）および毛髪処理用剤組成物（特許文献２）が知られている。特許文献１記載の毛髪用化粧料組成物は、果実や野菜等をカタラーゼ陽性微生物(例えば、バチルス・コアグランス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ)で発酵させた発酵物を含有するものである。果実や野菜として、育毛活性があることが知られているジャガイモ、小松菜およびオレンジが使用されている。
【０００４】
一方、特許文献２記載の毛髪処理用剤組成物は、米糠類や大豆類を含む培地に納豆菌または枯草菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ)を接種し、発酵培養して得られた発酵抽出物を含有するものである。ここで、用いられる米糠(特開平９−２４１１３２号公報)や大豆（特開平９−０５９１６６号公報）等の培地成分は育毛活性があることが知られている。
【０００５】
このように、特許文献１または２記載の組成物では、発酵に使用する微生物以外の原料(培地)が育毛活性を有する。しかしながら、これまで開発されてきた育毛剤は、育毛作用の一方が不充分であったり、皮膚刺激等の副作用を引き起こす場合があり、今のところ十分な効果を有するものが得られていないのが現状であり、育毛作用に優れる育毛剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１５４１５号公報
【特許文献２】特開２０００−３２７５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、従来からより効果的に薄毛を改善できる新規で効果の高い育毛剤の提案が従来から望まれている。
【０００８】
本願発明は、上記課題に鑑み、新規で効果の高い育毛剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上のような状況に鑑みて、本発明者らは、育毛促進効果に優れ、安全性の高い育毛剤を求めて、鋭意研究を重ねた結果、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、特に、臍帯由来間葉系幹細胞がワルトンゼリー（Wharton's jelly）由来である幹細胞培養上清が優れた育毛促進効果を有することを見出した。より具体的には、安全性が高く、使用性に優れ、著しい養毛促進効果を有し、禿や薄毛の予防・改善に有用であることを見出し、発明を完成させるに至った。なお、本発明における育毛には、発毛の概念が含まれるものである。
即ち、本発明は次に示す技術に関するものである。
【００１０】
本願第１発明の育毛剤は、幹細胞培養上清を含有することを特徴とする。
【００１１】
本願第２発明の育毛剤は、本願第１発明において、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清であることを特徴とする。
【００１２】
本願第３発明の育毛剤は、本願第２発明において、臍帯由来間葉系幹細胞が、ワルトンゼリー（Wharton's jelly）由来であることを特徴とする。
【００１３】
本願第４発明の育毛剤は、経皮投与用であることを特徴とする。
【００１４】
本願第５発明の育毛剤は、注射剤であることを特徴とする。
【００１５】
本願第６発明の育毛方法は、第１発明ないし第４発明のいずれかに記載の育毛剤を患部へ浸透注入することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
上記発明によれば、新規で効果の高い育毛剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】臍帯の模式断面図である。
【図２】注射機器の構成図であり、（ａ）は側面図、（ｂ）は平面図である。
【図３】被験者Ａへの育毛剤の投与前後の頭髪の状態を示す写真であり、（ａ）は投与前、（ｂ）は投与後である。
【図４】被験者Ｂへの育毛剤の投与前後の頭髪の状態を示す写真であり、（ａ）は投与前、（ｂ）は投与後である。
【図５】被験者Ｃへの育毛剤の投与前後の頭髪の状態を示す写真であり、（ａ）は投与前、（ｂ）は投与後である。
【図６】被験者Ｄへの育毛剤の投与前後の頭髪の状態を示す写真であり、（ａ）は投与前、（ｂ）は投与後である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、幹細胞上清、好ましくは臍帯由来の間葉系幹細胞の培養上清、より好ましくはワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ  ｊｅｌｌｙ）の培養上清を含む新規で効果の高い育毛剤および該育毛剤を用いた育毛方法を提供するものである。
【００１９】
＜実施例＞
以下、図面を参照して、本発明の実施例について説明するが、初めに、幹細胞培養上清を含む育毛剤について説明した後、該育毛剤を用いた実施例について説明する。なお、以下の説明において育毛という場合、発毛の概念を含むものである。例えば、育毛効果という場合、発毛を含む育毛効果のことをいい、育毛促進という場合、発毛を含む育毛促進のことをいう。
【００２０】
＜育毛剤＞
本実施例に係る育毛剤は、幹細胞を培養することによって得られた幹細胞培養上清を有効成分として含む。ここで、本実施例の育毛剤に有効成分として含まれる培養上清の対象となる幹細胞は特に限定されないが、臍帯由来の間葉系幹細胞であることが好ましく、ワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ  ｊｅｌｌｙ）由来の幹細胞であることがより好ましい。臍帯由来の間葉系幹細胞の培養上清には幹細胞を培養する際に産出される種々のサイトカインが含まれ、これらサイトカインには、育毛に欠かせない細胞増生因子や成長因子を含んでいる。
【００２１】
本実施形態に係る育毛剤は、分娩後に医療廃棄物として処分されてしまう臍帯から採取可能な臍帯由来幹細胞を培養した培養上清を用いている。臍帯は、全長約３０〜７０ｃｍの胎児由来の組織であり、経膣分娩および帝王切開にて娩出された臍帯の血管周囲の「ワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ  ｊｅｌｌｙ）」からは、大量の臍帯由来間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ:  ＵＣＭＳＣ）が採取できる。本発明者らは、臍帯由来の間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ:  ＢＭＭＳＣ）よりも有意に高い増殖能を示すことから、臍帯由来の間葉系幹細胞の培養上清を用いて育毛の実験を行い、臍帯由来の間葉系幹細胞の培養上清が育毛のための細胞源として極めて有用であることを見出した。
【００２２】
＜臍帯由来幹細胞の培養上清＞
本実施例における臍帯由来幹細胞の培養上清は、臍帯から得られる幹細胞を培養して得られた培養上清を意味する。また「未処理の幹細胞培養上清」と記載する場合は、幹細胞を培養して得られた培養上清そのもの、あるいは当該培養上清を変質したり体積変化させたりしないで保存したものをいう。また、臍帯由来幹細胞の培養上清の原液と記載する場合もある。なお、処理とは、未処理の臍帯由来幹細胞の培養上清に対し、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩等することをいう。
【００２３】
本実施例中、幹細胞は、哺乳類の間葉系細胞のことをさし、間葉系細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等、間葉系に属する細胞への分化能を持つとされる細胞のことをいう。本実施例中、特定の由来名が記載されている幹細胞は、その組織から分離された幹細胞であることを示す。例えば「臍帯由来幹細胞」であれば、臍帯から分離された幹細胞であることを示す。
【００２４】
本実施例における「培養上清」とは、幹細胞が増殖し得る条件の下、幹細胞が増殖し得る培養液で幹細胞を培養して得られた培養液（培養後の培養液）から幹細胞を除去したものを意味する。例えば、培養上清から、例えば、残存培地成分（培養前の培養液の成分のうち培養後の培養液中に残存している成分）、培養液の水分などの本実施例における育毛の促進に寄与しない成分の少なくとも一部を除去したもの、培養上清を濃縮したもの、あるいは培養液の水分を凍結乾燥したものも本実施例に係る幹細胞の培養上清に含まれる。なお、簡便性の観点からは培養後の培養液から幹細胞を除去したものをそのまま培養上清として用いることが好ましい。
【００２５】
また、「臍帯由来幹細胞の培養上清」は臍帯由来幹細胞を培養して得られる培養液であり、かつ細胞成分を含まない。本実施例に係る育毛剤は、臍帯由来幹細胞の培養上清を有効成分として含むものである。本実施例に係る育毛剤は、幹細胞または他の細胞を有効成分として含む促進剤、組成物、医薬組成物、治療剤、予防剤等とは明確に区別され、臍帯由来幹細胞の培養上清は、例えば培養後に細胞成分を分離除去することによって、本開示の促進剤等に使用可能な培養上清を得ることができる。具体的には、各種処理（例えば、遠心分離処理、透析、膜分離等）を適宜施すことで、細胞成分を含まない培養上清を調製することができる。
【００２６】
＜作用機序の推測＞
現在、日本では、食生活の変化や社会的なストレスの増大等に伴い、脱毛症の人口は増加しつつある。頭部脱毛の原因としては、毛包や皮脂腺等の器官における男性ホルモンの活性化、毛乳頭や毛包への血流量の低下による栄養物質の供給不足、上皮組織の角化異常等によるふけの過剰発生、過剰な皮脂分泌、過酸化物の生成による頭皮の異常、栄養摂取のアンバランス、ストレス等の多様な原因が考えられる。
【００２７】
毛髪は、成長期、退行期および休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って成長および脱落を繰り返している。このヘアサイクルのうち、休止期から成長期にかけての新たな毛包が形成されるステージが育毛に最も重要であると考えられており、このステージにおける毛包上皮系細胞の増殖乃至分化に重要な役割を果たしているのが毛乳頭細胞であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛根近傍にある外毛根鞘細胞とマトリックス細胞とからなる毛包上皮系細胞の内側にあって基底膜に包まれている毛根の根幹部分に位置する細胞である。毛乳頭細胞は、種々のサイトカインを産生することにより毛成長をコントロールすることが近年報告されており、毛包上皮系細胞に働きかけてその増殖を促進する等、毛包上皮系細胞の増殖乃至分化および毛髪の形成において重要な役割を担っている。
【００２８】
育毛を促進するサイトカインとして以下のものが知られている。
（１）肝細胞成長因子（ＨＧＦ）・・・・・・前期分化過程の延長
（２）肝細胞拡散因子（ＳＣＦ）・・・・・・前期分化過程の延長
（３）角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）・・・毛の密度を高め、毛を太くする
（４）繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−７）・・・毛の密度を高め、毛を太くする
（５）インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）・・・毛の伸びを促進し、退行期への移行を遅らせる
（６）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ） ・・・毛周期の制御
（７）神経膠細胞由来向神経因子（ＧＮＤＦ） ・・・退行期の細胞死（アポトーシス）を抑制している
（８）神経終末から分泌される因子（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ） ・・・成長期を誘導して進行を早める
【００２９】
また育毛を抑制するサイトカインとして以下のものが知られている。
（９）ＴＧＦ−β１・・・・・・成長期毛から退行期毛にすぐに移行させる
（１０）ＴＧＦ−β２・・・・・・成長期毛包から退行期毛包にすぐに移行させる
（１１）繊維芽細胞成長因子-5（ＦＧＦ−５） ・・・成長期後期毛に促進させる
（１２）脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）および（ＮＴ−４） ・・・毛乳頭の増殖因子を抑制し、退行期を誘導する
（１３）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ） ・・・成長期後期毛に促進させる
（１４）表皮成長因子（ＥＧＦ） ・・・退行期を誘導する
（１５）神経終末から分泌される因子（ＣＧＲＰ） ・・・成長期を抑制する
【００３０】
このように、上記（１）〜（８）のサイトカインの産出を促進させるか、或いは上記（９）〜（１５）のサイトカインの産生を阻害させることで育毛を促すことができると推測される。上述したように臍帯由来幹細胞などの幹細胞の培養上清には、１５０種類以上のたんぱく質成分が含まれており、そこには、サイトカインやケモカイン、エクソソームタンパク等と呼ばれる細胞活性のカギとなる情報伝達物質が豊富に含まれている。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞拡散因子（ＳＣＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＭＣＰ−１1（単球走化性タンパク）、エクソソーム等が含まれていることが知られている。従って、上記育毛を促進するサイトカインを豊富に含む臍帯由来幹細胞の培養上清を患部へ投与することで、上記培養上清に含まれる種々のサイトカインが毛乳頭細胞に働きかけてその増殖が促進され育毛に顕著な効果が表れるものと推測される。
【００３１】
また、ＶＥＧＦは、血管新生に関与する糖蛋白質であり、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、血管内皮細胞の細胞分裂や遊走、分化等を刺激する。毛乳頭細胞は、増殖因子の一つとしてＶＥＧＦを産生することで、毛球部周囲の血管の新生を促進することが知られている。これにより、毛乳頭細胞に血管を介して必要な栄養素が供給され、毛乳頭細胞の細胞分裂が促される。従って、臍帯由来幹細胞の培養上清に豊富に含まれるＶＥＧＦにより毛球部周囲の血管の新生が促進され、毛乳頭細胞が賦活化されて多くの栄養分が毛母細胞に対して与えられる。これにより、毛母細胞が活性化して発毛が促進されるとともに毛髪の成長期が長期化すると推測される。
【００３２】
なお、本実施例の培養上清には、細胞自体は含まれないことから免疫拒絶反応を起こすこともない。このため、他人の幹細胞から作製した培養上清であっても使用することができ適用範囲が非常に高いという特徴がある。また、あらかじめ作製した培養上清を保存しておけば、必要な時にすぐに使用することができる等、利便性が非常に高い。このため、培養上清の利用は、次世代の治療法として期待されている。従って、本実施例に係る育毛剤による育毛の促進において、臍帯由来の幹細胞培養上清中の多くの種類の因子が関与するものと推測できる。また、上述のように、臍帯由来幹細胞の培養上清の投与によって、毛包上皮系細胞に働きかけてその増殖を促進することができるので、本実施例に係る育毛剤の効果は、“準根治的”または“根治的”であるということができる。
【００３３】
また、臍帯由来幹細胞の培養上清の調製においては、必ずしもこれを含む促進剤を適用する者自身の幹細胞を用いなければならないわけではない。加えて、ヒト以外の哺乳類（ウシ、ウマ、ブタ、サルおよび羊など）から得られた臍帯由来の幹細胞の培養上清（非ヒト由来の臍帯由来幹細胞の培養上清）は、ヒトおよびヒト以外の前記哺乳類に対して十分な育毛の効果を有する。さらに、ヒトの臍帯由来の幹細胞の培養上清（ヒト由来の臍帯由来幹細胞の培養上清）は、ヒト以外の前記哺乳類に対しても育毛に対して十分な効果を有するものと推測できる。
【００３４】
臍帯由来幹細胞の培養上清の調製に用いられる幹細胞は、哺乳類の臍帯由来幹細胞である。前記哺乳類としては、ヒト細胞との遺伝的類似性が高いこと、および感染の危険性が低いことから、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびサルからなる群から選ばれるものであることが好ましい。また、臍帯由来幹細胞の培養上清の調製に用いる臍帯由来幹細胞は、何ら外部からの遺伝子操作等をされていない単なる幹細胞であるので、腫瘍細胞とは異なり、それらから分泌されるファクターも幹細胞と同様に安全性が担保されている。また、後述するように、本実施例では育毛剤を患部へ浸透注入することで、症状の改善や予防を必要とする者に対して苦痛等を与えることなく効率的に患部へ本実施例に係る育毛剤を投与することができ、薄毛等の症状を改善または予防できる。
【００３５】
以上のように本実施例に係る育毛剤は、多くの種類のサイトカイン類を含む混合物であるが、これらに含まれる臍帯由来幹細胞の培養上清中のサイトカイン類を含む混合物は、臍帯由来幹細胞の培養上清の一部としてまたは臍帯由来幹細胞の培養上清全体から単離されたサイトカイン類の混合物として使用され得る。臍帯由来幹細胞の培養上清から単離されたサイトカイン類の混合物中、サイトカイン類の一部を１または複数の公知の対応するサイトカイン類で置き換えてもよい。
【００３６】
<臍帯由来幹細胞の調製>
「臍帯由来幹細胞」とは、胎児と胎盤とを結ぶ臍帯中に存在する細胞であり、臍帯中に含まれ造血幹細胞を豊富に含有する臍帯血も含む。臍帯は、太さ２ｃｍ、全長約３０〜７０ｃｍほどの管状組織であり、図１に示すように２本の動脈および１本の静脈を内包するが、これらの血管の周囲にはワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ  ｊｅｌｌｙ、以下「ＷＪ」ともいう）と呼ばれる組織が存在する。本開示における臍帯由来幹細胞としては、特に限定されないが増殖能等の観点からＷＪ由来の幹細胞を使用することが好ましい。
【００３７】
臍帯由来幹細胞は、以下のように、（１）臍帯の採取、（２）酵素処理、（３）細胞培養および（４）細胞の回収を、この順で行うことによって調製することができる。
【００３８】
（１）臍帯の採取
経膣分娩および帝王切開にて娩出された臍帯を回収する。臍帯血を除去した後、無菌処理を行う。無菌処理にはポピドンヨードなどを用いることができる。臍帯をメスで切開し開き、臍帯静脈・臍帯動脈を周囲のワルトンゼリーとともに分離する。
【００３９】
（２）酵素処理
分離・回収した組織をコラゲナーゼ等で処理した後、臍帯動静脈を取り除く。続いて５分間の遠心操作（５０００回転／分）により臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣＭＳＣ）として回収する。
【００４０】
（３）細胞培養
上記臍帯由来幹細胞を４ｃｃの５体積％〜１５体積％のウシ血清（ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、以下「ＣＳ」ともいう）を含有した５０ユニット／ｍｌ〜１５０ユニット／ｍｌの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、以下「ＤＭＥＭ」ともいう）あるいは間葉系幹細胞用培地に懸濁し、付着性細胞培養用ディッシュ、例えば１２ウェル〜９６ウェルディッシュに播種する。５体積％の二酸化炭素（以下「ＣＯ２」ともいう）雰囲気下、３７℃に調整したインキュベータで培養する。サブコンフルエント（培養容器の表面の約７０面積％を細胞が占める状態）またはコンフルエントに達したときに細胞を０．０５体積％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理する。
ディッシュから剥離したＵＣＭＳＣ（臍帯由来間葉系幹細胞）を直径１０ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜１５回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば−１９８℃）。このように保存し、将来の治療に適用すれば、安全で且つ低侵襲な自己細胞による再生医療（育毛治療）が提供できる。尚、様々なドナーから回収した細胞を臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣＭＳＣ）バンクの形態で保存することにしてもよい。
【００４１】
（４）細胞の回収
次に、細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。このようにして得られた細胞を、臍帯由来（ワルトンゼリー由来）幹細胞として次の臍帯由来（ワルトンゼリー由来）幹細胞培養上清（ＷＪ−ＣＭ）の調製に用いることができる。なお、由来を特定しない幹細胞培養上清をＣＭともいうことがある。
【００４２】
尚、基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ギブコ社製等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（シグマ社製、ギブコ社製等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ギブコ社製）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍまたはｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、以下「ＦＢＳ」または「ＦＣＳ」ともいう）、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、以下「ＢＳＡ」ともいう）、ペニシリン、ストレプトマイシンその他の抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
【００４３】
<臍帯由来幹細胞の培養上清の調製>
臍帯由来幹細胞の培養上清を得るには、まず、上記のように、哺乳類の組織から臍帯由来幹細胞を得る。なお、哺乳類としては、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびサルからなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【００４４】
次に、上記の方法で得られた臍帯由来幹細胞を、基本培地、例えば、血清として１０体積％のＦＢＳなどの動物血清を加えた培地（ＤＭＥＭ等）を用いて、５体積％ＣＯ２雰囲気下、３７℃の条件下に、２４時間〜４８時間培養する。その後、２００ｇ〜５００ｇで３分間〜７分間遠心処理を行うか、あるいは臍帯由来幹細胞を通過させない分離膜を利用して臍帯由来幹細胞の培養上清を得ることができる。臍帯由来幹細胞の培養上清に用いる臍帯由来幹細胞の継代数の制限は特にないが、標的組織の改善または予防能力および標的となる組織の種類の幅広さという観点から、１〜１５が好ましく、さらに３〜９がより好ましい。培養上清の回収には、例えば、コマゴメピペット等を使用することもできる。回収した臍帯由来幹細胞の培養上清は、そのまま本開示の促進剤の有効成分として使用してもよく、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結乾燥、希釈その他の処理の後に、本開示の促進剤の有効成分として使用してもよい。
【００４５】
上記の臍帯由来幹細胞の培養上清の調製の場合に、血清や培地等は、適宜その有無、種類および添加濃度を設定すればよい。なお、血清を含まないことで、本開示の促進剤の安全性が高められる場合がある。このため、血清を含まない促進剤を得るために、例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で臍帯由来幹細胞を培養することによって、血清を含まない臍帯由来幹細胞の培養上清を調製することができる。１回または複数回の継代培養を行うことにし、最後または最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない臍帯由来幹細胞の培養上清を得ることができる。一方、回収した臍帯由来幹細胞の培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない臍帯由来幹細胞の培養上清を得ることができる。血清を含まない「臍帯由来幹細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後または最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。なお、血清を含まない場合の基本培地は、上記したものと同様である。
【００４６】
臍帯由来幹細胞の培養上清を得るための培養時間は、適宜調整される。培養温度は例えば３６℃〜３８℃、例えば３７℃、であり、ＣＯ２濃度（雰囲気）は４体積％〜６体積％、好ましくは５体積％、である。また、培養は、例えば非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）により行ってもよい。
【００４７】
また、上記で得られた臍帯由来幹細胞の培養上清は、種々の成長因子を含み、高度な精製をしなくとも、種々の作用を示す。すなわち、各種の症状の改善または予防に使用できる育毛剤を、簡易な工程で製造できるため、高度精製に伴う各種成長因子の生理活性の低下を回避することができる。
【００４８】
上記の臍帯由来幹細胞の培養上清を水溶液やその他の溶剤で希釈したものを育毛剤として使用することもできる。この場合に、水溶液としては、水および緩衝液を用いることができる。また、その他の溶剤としては、本発明の育毛剤の効果が得られる範囲で有機溶剤などを用いることができる。また、水および緩衝液に用いる水としては、イオン交換水、精製水および超純水等を用いることができる。これらの水は、汎用な製造装置で調製することもできるし、購入することもできる。
【００４９】
未処理の臍帯由来幹細胞の培養上清を水溶液等に希釈して育毛剤として使用する場合には、臍帯由来幹細胞を培養した時の培養条件、対象となる症状等の種類および症状等の程度を考慮して適宜上清を希釈することが好ましいが、前記未処理の臍帯由来の幹細胞培養上清の育毛剤中に対する濃度（％）（１００×未処理の臍帯由来幹細胞の培養上清の体積／育毛剤の体積）としては、５０％〜１５００％の濃度で用いることが好ましく、１０００％の濃度で用いることがより好ましい。なお、１０００％とは、培養上清が１０倍に濃縮されることを意味する。５０％以上であると臍帯由来幹細胞の培養上清による育毛の促進すなわち症状の改善効果をより高め、１５００％以下であることで臍帯由来幹細胞の培養上清中の因子の沈着をより防ぐことができ経済的となる。
【００５０】
<臍帯由来幹細胞の培養上清の濃縮方法>
本実施例の育毛剤には、濃縮した臍帯由来幹細胞の培養上清を含ませてもよい。臍帯由来幹細胞の培養上清の濃縮方法としては、通常行われている方法を適用することができる。濃縮方法の例としては、例えば、以下の二つの方法を挙げることができる。
（１）   スピンカラム濃縮法
臍帯由来幹細胞の培養上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて濃縮する（最大７５倍濃縮）。具体的な操作手順は次の通りである。
（ｉ）  培養上清（最大１５ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ−１０Ｋへ投入し、４０００ｇで約６０分間遠心し、２００μｌまで濃縮する。
（ｉｉ）  上記チューブへ培養上清と同量の滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、以下「ＰＢＳ」ともいう）を投入し、再度４０００ｇで約６０分間遠心し、ベース溶液をＰＢＳへ置換する。
（ｉｉｉ）  得られた溶液２００μｌをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮した臍帯由来幹細胞の培養上清とする。
【００５１】
（２）エタノール沈殿濃縮法
臍帯由来幹細胞の培養上清をエタノール沈殿法を用いて濃縮する（最大１０倍濃縮）。具体的な操作手順は次の通りである。
（ｉ）  培養上清５ｍｌに対し１００体積％エタノール４５ｍｌを加え、混和し、−２０℃で６０分間放置する。
（ｉｉ）  ４℃、１５０００ｇで１５分間遠心する。
（ｉｉｉ）  上澄みを除去し、９０％エタノール１０ｍｌを加え、よく攪拌する。
（ｉｖ）  ４℃、１５０００ｇで５分間遠心する。
（ｖ）  上澄みを除去し、得られたペレットを滅菌水５００μｌに溶解し、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮した臍帯由来幹細胞の培養上清とする。
【００５２】
なお、適用される被検体の状態に応じて、期待される症状の改善または予防効果が維持されることを条件として、育毛剤に上記以外の他の成分を追加的に使用してもよい。育毛剤において追加的に使用され得る成分の一例は以下の通りである。
（１）生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。
【００５３】
（２）ゲル化材料
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、育毛剤の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
【００５４】
（３）その他
ヒト等に用いることが許される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））等を含有させてもよい。
【００５５】
育毛剤の最終的な形態は特に限定されない。形態の例は液体状（液状、ゲル状など）および固体状（粉状、細粒、顆粒状など）である。育毛剤の投与量としては、症状の改善または予防上有効な量であればよい。育毛剤は、臍帯由来幹細胞の培養上清を有効成分とするため、症状の改善または予防に用いる際には、有効成分の含有量を適宜調整すればよく、後述するように有効成分を濃縮して用いてもよい。
【００５６】
＜投与方法＞
次に、上述のようにして得られた育毛剤の投与方法について説明する。本実施例に係る育毛剤は、患部への注射もしくは浸透注入により直接投与することが好ましい。塗布の場合、育毛剤に含まれるサイトカインを毛乳頭細胞まで十分に届けることが難しくなるためである。患部への注射（局部注射：以下「局注」ともいう）もしくは浸透注入により直接投与することで、育毛剤に含まれるサイトカインを毛乳頭細胞の近傍に十分な量を届けることが可能となり、育毛が促進される。なお、局注により本実施形態の育毛剤を投与する際には、毛乳頭細胞の存在する真皮範囲内（皮下１〜３ｍｍの範囲内）に投与することが好ましい。
【００５７】
患部への注射（局注）により、実施例に係る育毛剤を投与する場合、複数（図２の例では、縦３本×横３本の合計９本）の微小針２１０ａを有する施術モジュール２１０により育毛剤を患部へ投与することが好ましい。微小針２１０ａ内の軸心方向には、液状の育毛剤を投与するための貫通孔（不図示）が設けられており、微小針２１０ａの先端を所定深さ（好ましくは、毛乳頭細胞の存在する皮下１〜３ｍｍの範囲内）まで皮膚内へ挿入した後、貫通孔を通じて本実施例の育毛剤が投与される。また、施術モジュール２１０には、例えば、マイクロモータ等を備え、微小針２１０ａの突出量Ｔ（皮膚内への侵入距離）が調整できることが好ましい。これにより毛乳頭細胞が存在する真皮層へと育毛剤を投与することができる。
【００５８】
また、浸透注入により実施例に係る育毛剤を投与する場合、炭酸ガスのジェット噴射でピストンを押し、先端の小さな浸入点（例えば、直径３０ミクロン穴)から薬剤を射出する。この手法では、注射針よりも小さな浸入点から、確実に育毛剤を注入・浸透させることができ、安全かつ、痛みを押さえて投与することができる点で注射針に優れる手法である。浸透注入では、注射針と比較して感じる痛みが軽減されるため麻酔なしで施術することが可能となる。
【００５９】
なお、上記以外の投与方法としては、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与および鼻腔内投与等を挙げることができる。また、投与スケジュールとしては、例えば、１日間〜４０日間に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。また、育毛剤の投与期間（投与間隔）は、例えば、１日間〜４０日間であり、育毛の効果を観察観点から、好ましくは７日〜１４日の範囲内である。育毛剤の投与量としては、未処理の臍帯由来幹細胞培養上清の１０倍濃縮液を、ヒト一人の６０ｋｇ換算で２ｍｌ〜１２ｍｌを所定の投与間隔で投与することで症状の改善または予防を必要とする者等を低負担で効果的、経済的に症状を改善または予防することができる。
【実施例】
【００６０】
＜臍帯由来幹細胞の培養上清（ＷＪ−ＣＭ）の調製＞
正常発育したヒト新生児の臍帯より、ワルトンゼリーを採取し、３ミリ角の小片に分割し、２４穴チャンバー内にて、３７℃、５体積％ＣＯ２雰囲気下で、静置培養することでＷＪ由来の幹細胞を得た。培養液は、１０体積％牛胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｐａｒｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）およびギブコ社（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）製のペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍμｇ／ｍＬ）、アムフォテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ））入りのＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ社製、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた。
【００６１】
次に、上記にて得られたＷＪ（１×１０６個）を、１０ｍｌの上記培養液中で２４時間、３７℃、５体積％ＣＯ２雰囲気下で培養する。つぎに上清液を除去しリン酸緩衝液で２回洗浄し、さらに無血清培地で２回洗浄した。この後、ＷＪを無血清培地（上記培地中、１０％牛胎児血清を含まないもの）１０ｍｌ中で４８時間培養した。得られた培養液の上清液を１５００ｒｐｍで５分間遠心することで回収し、回収した上清液を再度３０００ｒｐｍで５分間遠心した後、さらに同じ操作を行って不純物を沈殿させたのち上澄みを採取することで、臍帯（ワルトンゼリー）由来幹細胞培養上清（ＷＪ−ＣＭ）がえられた。また、１０倍濃度のＷＪ−ＣＭは、上記で得られたＷＪ−ＣＭを限外濾過フィルタ（アミコンウルトラ１５、ミリポア社製）を用いて１０倍濃度に濃縮することで調製した。
【００６２】
＜育毛効果の評価＞
次に、育毛効果の評価について説明する。発明者らは、４名の被験者（各々被験者Ａ〜Ｄとする）に対し、上記のようにして得られた育毛剤（１０倍濃縮したＷＪ−ＣＭ）を患部（頭部の本来髪が生えている領域にも拘わらず毛の生えていない領域もしくは毛の薄い領域）へ投与し、施術処理前後での頭髪の状態が改善されるか、すなわち育毛効果が表れるかを評価した。なお、育毛剤の患部への投与は注射（局注）により行った。
【００６３】
以下、各被験者の属性および被験者に対して行った施術処理の内容について説明する。
表１に、被験者の属性（年齢、性別、症状）を示す。
【表１】
2019026573.tif 000003
【００６４】
上記表１に記載する通り、被験者Ａは、性別が男性、年齢が５７歳、症状が頭部薄毛である。また、被験者Ｂは、性別が男性、年齢が４６歳、症状が頭部薄毛である。また、被験者Ｃは、性別が男性、年齢が３６歳、症状が頭部薄毛である。また、被験者Ｄは、性別が女性、年齢が４３歳、症状が頭部薄毛である。
【００６５】
表２は、被験者Ａ〜Ｄの育毛状態をスコア化するための表であり、スコア値が高いほど育毛効果が高くなるようにスコア化している。本実施例では、以下の表２に示すようにスコアを４段階とした。
【表２】
2019026573.tif 000004
表２に示すように、毛成長が認められない場合をスコア１、毛成長が極めて僅かである場合（投与部位の１／４以下の面積に発毛）をスコア２、毛成長が認められる場合（投与部位の１／２の面積に発毛）をスコア３、毛成長が極めて強い場合（投与部位およびその周辺に発毛）をスコア４とした。
【００６６】
表３に被験者Ａへの育毛剤の投与日時、投与量および育毛状態のスコアを示す。
【表３】
2019026573.tif 000005
表３に記載する通り、被験者Ａには、２０１７年５月２０日および２０１７年６月１７日に、患部への注射（局注）により育毛剤（１０倍濃度のＷＪ−ＣＭ）を投与した。また、表３の投与量は、注射（局注）のワンショットの投与量ではなく、患部全体に投与した量の合計値である。すなわち、１回の施術で位置を変えながら複数回注射（局注）を行っているが、この複数回のトータル量が４ｍｌとなる。なお、発毛状態の確認は、次回投与日に行っている。つまり被験者Ａの場合、２０１７年５月２０日に投与した育毛剤の発毛および育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月１７日に確認している。
【００６７】
被験者Ａの場合、２０１７年５月２０日の投与後、２０１７年６月１７日に育毛の効果を目視にて確認したところ、すでに投与部位の１／２の面積に発毛が認められた（スコア３）。また、投与部位に発毛した毛髪の色は、育毛剤を投与していない部分の毛髪よりも色（黒色）が濃かった。
【００６８】
図３は、育毛剤の投与前後の被験者Ａの頭髪の状態を示す写真である。図３（ａ）は投与前（２０１７年５月２０日）の頭髪の状態を示す写真である。図３（ｂ）は投与後（２０１７年６月１７日）の頭髪の状態を示す写真である。図３の写真に示すとおり、育毛剤の投与前後において被験者Ａの頭髪に変化が表れていることがわかる。具体的には、育毛剤の投与後に被験者Ａの投与部位における頭髪が濃くなっており、育毛剤の投与により育毛が促進されていることがわかる。
【００６９】
表４に被験者Ｂへの育毛剤の投与日時および投与量を示す。
【表４】
2019026573.tif 000006
表４に記載する通り、被験者Ｂには、２０１７年４月１日、２０１７年５月１７日、２０１７年６月１７日および２０１７年６月２８日に、患部への注射（局注）により育毛剤（１０倍濃度のＷＪ−ＣＭ）を投与した。なお、本実施例では、患部（投与部位）の面積が広いため、患部全体に育毛剤が注入されるように施術位置（注射（局注）を行う位置）を変更しながら複数回注射（局注）にて育毛剤を投与している。また、表４の投与量は、注射（局注）のワンショットの投与量ではなく、患部全体に投与した量の合計値である。すなわち、１回の施術で位置を変えながら複数回注射（局注）を行っているが、この複数回のトータル量が４ｍｌとなる。なお、発毛状態の確認は、次回投与日に行っている。つまり被験者Ｂの場合、２０１７年４月１日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年５月１７日に確認し、２０１７年５月１７日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月１７日に確認し、２０１７年６月１７日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月２８日に確認している。
【００７０】
被験者Ｂの場合、２０１７年４月１日の投与後、２０１７年５月１７日に育毛の効果を目視にて確認したところ、毛成長が極めて僅かであった（スコア２）。被験者Ｂに対して、２０１７年５月１７日、２０１７年６月１７日、２０１７年６月２８日にさらに育毛剤の投与を行い、育毛の効果を確認したが２０１７年６月２８の検査において、投与部位の１／２の面積に発毛が認められた（スコア３）。また、投与部位に発毛した毛髪の色は、育毛剤を投与していない部分の毛髪よりも色（黒色）が濃かった
【００７１】
図４は、育毛剤の投与前後の被験者Ｂの頭髪の状態を示す写真である。図４（ａ）は、投与前（２０１７年４月１日）の頭髪の状態を示す写真である。図４（ｂ）は、投与後（２０１７年６月２８日）の頭髪の状態を示す写真である。図４の写真に示すとおり、育毛剤の投与前後において被験者Ｂの頭髪に変化が表れていることがわかる。具体的には、育毛剤の投与後に被験者Ｂの投与部位における頭髪が濃くなっており、育毛剤の投与により育毛が促進されていることがわかる。
【００７２】
表５に被験者Ｃへの育毛剤の投与日時および投与量を示す。
【表５】
2019026573.tif 000007
表５に記載する通り、被験者Ｃには、２０１７年４月５日、２０１７年４月２６日、２０１７年５月１７日,
２０１７年６月７日および２０１７年６月２８日に、患部への注射（局注）により育毛剤（１０倍濃度のＷＪ−ＣＭ）を投与した。また、表５の投与量は、注射（局注）のワンショットの投与量ではなく、患部全体に投与した量の合計値である。すなわち、１回の施術で位置を変えながら複数回注射（局注）を行っているが、この複数回のトータル量が４ｍｌとなる。なお、発毛状態の確認は、次回投与日に行っている。つまり被験者Ｃの場合、２０１７年４月５日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年４月２６日に行い、２０１７年４月２６日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年５月１７日に確認し、２０１７年５月１７日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月７日に確認し、２０１７年６月７日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月２８日に確認している。
【００７３】
被験者Ｃの場合、２０１７年４月５日の投与後、２０１７年４月２６日に育毛の効果を目視にて確認したところ、すでに投与部位の１／２の面積に発毛が認められた（スコア３）。被験者Ｃに対して、２０１７年４月２６日にさらに育毛剤の投与を行い、育毛の効果を確認したところ２０１７年５月１７日の検査において、投与部位およびその周辺に発毛が認められた（スコア４）。また、その後も、２０１７年５月１７日、２０１７年６月７日に育毛剤を投与し、目視にて育毛の効果を確認したが投与部位およびその周辺に発毛が認められた（スコア４）。なお、患者Ｃにおいても、投与部位に発毛した毛髪の色は、育毛剤を投与していない部分の毛髪よりも色（黒色）が濃かった。
【００７４】
図５は、育毛剤の投与前後の被験者Ｃの頭髪の状態を示す写真である。図５（ａ）は、投与前（２０１７年４月５日）の頭髪の状態を示す写真である。図５（ｂ）は、投与後（２０１７年６月２８日）の頭髪の状態を示す写真である。図５の写真に示すとおり、育毛剤の投与前後において被験者Ｃの頭髪に変化が表れていることがわかる。具体的には、育毛剤の投与後に被験者Ｃの投与部位における頭髪が濃くなっており、育毛剤の投与により育毛が促進されていることがわかる。
【００７５】
表６に被験者Ｄへの育毛剤の投与日時および投与量を示す。
【表６】
2019026573.tif 000008
表６に記載する通り、被験者Ｄには、２０１７年４月５日、２０１７年４月２９日、２０１７年５月２４日および２０１７年６月１４日に、患部への注射（局注）により育毛剤（１０倍濃度のＷＪ−ＣＭ）を投与した。また、表６の投与量は、注射（局注）のワンショットの投与量ではなく、患部全体に投与した量の合計値である。すなわち、１回の施術で位置を変えながら複数回注射（局注）を行っているが、この複数回のトータル量が６ｍｌとなる。なお、発毛状態の確認は、次回投与日に行っている。つまり被験者Ｄの場合、２０１７年４月５日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年４月２９日に確認し、２０１７年４月２９日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年５月２４日に確認し、２０１７年５月２４日に投与した育毛剤の育毛効果は、次回投与日の２０１７年６月１４日に確認した。
【００７６】
被験者Ｄの場合、２０１７年４月５日の投与後、２０１７年４月２９日に育毛の効果を目視にて確認したところ、すでに投与部位の１／２の面積に発毛が認められた（スコア３）。被験者Ｄに対して、２０１７年４月２９日、２０１７年５月２４日および２０１７年６月１４日にさらに育毛剤の投与を行い、育毛の効果を確認したが２０１７年５月２４日および２０１７年６月１４日の検査において、投与部位およびその周辺に発毛が認められた（スコア４）。なお、患者Ｄにおいても、投与部位に発毛した毛髪の色は、育毛剤を投与していない部分の毛髪よりも色（黒色）が濃かった。
【００７７】
図６は、育毛剤の投与前後の被験者Ｄの頭髪の状態を示す写真である。図６（ａ）は、投与前（２０１７年４月５日）の頭髪の状態を示す写真である。図６（ｂ）は、投与後（２０１７年６月１４日）の頭髪の状態を示す写真である。図６の写真に示すとおり、育毛剤の投与前後において被験者Ｄの頭髪に変化が表れていることがわかる。具体的には、育毛剤の投与後に被験者Ｄの投与部位における頭髪が濃くなっており、育毛剤の投与により育毛が促進されていることがわかる。
【００７８】
＜考察＞
以上のように、被験者Ａ〜Ｄに対して本実施例の育毛剤を注射（局注）により患部へ直接投与することで、投与部位の１／２の面積に発毛（スコア３）もしくは投与部位およびその周辺に発毛（スコア４）の効果を得ることができた。なお、発毛効果が投与部位の１／２の面積に発毛（スコア３）であった被験者Ａ，Ｂに関しては、今後も施術処理を行うことにより、投与部位およびその周辺に発毛（スコア４）の効果を得ることができるものと推測される。以上のように、被験者Ａ〜Ｄのすべてに対して、本実施例の育毛剤を注射（局注）により患部へ直接投与することで顕著な育毛効果を得ることができた。
【００７９】
＜総合評価＞
上記実施例の結果と評価から、本実施例の臍帯由来幹細胞の培養上清は、この培養上清に含まれる種々のサイトカインが毛乳頭細胞に働きかけてその増殖が促進され発毛および育毛に顕著な効果が表れることが示唆された。
【００８０】
＜その他の実施の形態＞
【００８１】
幹細胞の起源は、外胚葉、内胚葉または中胚葉に分類される。外胚葉起源の幹細胞は主に脳に存在し、神経幹細胞が含まれる。内胚葉起源の幹細胞は主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞等が含まれる。中胚葉起源の幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵臓幹細胞等が含まれる。
【００８２】
本発明では、培養上清の対象となる幹細胞は特に限定されないが、臍帯由来の間葉系幹細胞であることが好ましく、ワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ‘ｓ  ｊｅｌｌｙ）由来の幹細胞であることがより好ましい。本発明では、幹細胞培養上清が少なくとも２種以上のサイトカインを含むことが好ましく、特に、育毛を促進するサイトカインである、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞拡散因子（ＳＣＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経膠細胞由来向神経因子（ＧＮＤＦ）、神経終末から分泌される因子（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）からなる群より選択された2つ以上の組み合わせを含むことが更に好ましい。
【００８３】
本発明に用いられる幹細胞培養上清は、体性幹細胞の培養から得られる幹細胞培養上清に限定されず、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）等の培養から得られた幹細胞培養上清が含まれていてもよい。
【００８４】
体性幹細胞の培養上清は、体性幹細胞を培養して得られる培養液であり、細胞そのものを含まない。従って、例えば培養後に細胞成分を分離除去することによって、本発明に使用可能な培養上清を得ることができる。各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。
【００８５】
「幹細胞の培養上清」は、幹細胞を培養して得られる細胞そのものを含まない培養液と定義される。本発明の組成物は「幹細胞の培養上清」を有効成分として含むものであり、その一態様では組成物全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まない。当該態様の組成物はこの特徴によって、幹細胞自体は当然のこと、幹細胞を含む各種組成物と明確に区別される。この態様の典型例は、幹細胞を含まず、幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。
【００８６】
幹細胞の培養液には基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。但し、血清を含まない「幹細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後または最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。尚、基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ＧＩＢＣＯ社）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
【００８７】
幹細胞の培養には、通常用いられる条件をそのまま適用することができる。幹細胞の種類に応じた幹細胞の単離および選抜は、当業者であれば適宜行うことができる。
【００８８】
適用される被検体の状態に応じて、期待される美容効果が維持されることを条件として、本発明の組成物に他の成分を追加的に使用することを妨げない。本発明において追加的に使用され得る成分の一例は以下の通りである。
（ｉ）生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。
【００８９】
（ｉｉ）ゲル化材料
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
【００９０】
（ｉｉｉ）その他
製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、pH調整剤、成長（増殖）因子（例えば、内皮細胞増殖因子（VEGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、神経成長因子（NGF））等を含有させることにしてもよい。
【００９１】
なお、本実施形態に係る組成物の形態は、特に限定されるものではなく、一般の育毛剤において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。例えば、組成物の形態は、液状、ローション状、乳液状、クリーム状、軟膏状、半固形状、オイルジェル状およびシート状等の剤型とすることができる。
【００９２】
また、頭皮に投与して用いるものであれば、特に制限はなく、その形態としては、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、ローション剤、乳液剤、パック剤、湿布剤等の皮膚外用剤の形態を挙げることができる。
【００９３】
この発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報および特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【符号の説明】
【００９４】
２１０  施術モジュール
２１０ａ  微小針
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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