(57)【要約】      （修正有）【課題】眼の異常の処置のための、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばヒト幹細胞）の使用方法の提供。【解決手段】眼の異常を有する対象を処置する方法であって、前記対象の眼細胞を再生するために有効な量の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を前記対象に投与することを含む前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目の異常を有する対象を処置する方法であって、前記対象の眼細胞を再生するために有効な量の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を前記対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２】
眼の異常が角膜疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
角膜異常が角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）を原因とする盲目である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
眼の異常が網膜疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
網膜疾患が黄斑変性である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
網膜疾患が網膜炎である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
眼の異常が眼創傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が眼移植片として投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同種他家由来幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同系幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が皮膚幹細胞ではない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、投与ステップに先立ってex vivoで増殖させられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象が、１〜約１０７個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を移植によって投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、担体または基質と一緒に投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
基質がフィブリンゲル、羊膜、アミノグリカン、またはその組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象が哺乳動物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
眼細胞の混合集団から角膜輪部幹細胞を単離する方法であって、
眼細胞の混合集団を提供すること；および
混合集団からＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を単離すること
を含む前記方法。
【請求項２２】
ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトＡＢＣＢ５に選択的に結合する抗体と混合集団の細胞を接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
移植用の眼細胞調製物を選抜する方法であって、
眼細胞調製物中にあるＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を同定すること；
ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を前記の細胞調製物の全細胞数と比較すること；および
前記の比較に基づいて、移植用の眼細胞調製物を選抜すること
を含む前記方法。
【請求項２５】
細胞調製物が眼移植片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトＡＢＣＢ５に選択的に結合する抗体と眼細胞調製物の細胞を接触させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
幹細胞を染色する色素と眼細胞調製物の細胞を接触させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数が細胞調製物の全細胞数の０．０３％超である場合、移植用の眼細胞調製物を選抜することを含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数が細胞調製物の全細胞数の０．１％超である場合、移植用の眼細胞調製物を選抜することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象への移植用の眼移植片を作製する方法であって、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を基質に播種して、眼移植片を作製することを含む方法。
【請求項３２】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同種他家由来幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同系幹細胞である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が皮膚幹細胞ではない、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、播種ステップに先立ってex vivoで増殖させられる、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
基質がフィブリンゲル、羊膜、アミノグリカン、またはその組み合わせを含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
対象への移植用の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された眼移植片。
【請求項４１】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同種他家由来幹細胞である、請求項４０に記載の眼移植片。
【請求項４２】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が同系幹細胞である、請求項４０または４１に記載の眼移植片。
【請求項４３】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の眼移植片。
【請求項４４】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞がＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、請求項４３に記載の眼移植片。
【請求項４５】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が皮膚幹細胞でない、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の眼移植片。
【請求項４６】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の眼移植片。
【請求項４７】
眼細胞再生を促進する方法であって、角膜輪部幹細胞をＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞として同定すること、および眼細胞再生を促進するために有効な量のＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞をその必要がある対象に投与すること、を含む前記方法。
【請求項４８】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が眼移植片として投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が同種他家由来幹細胞である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が同系幹細胞である、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、投与ステップに先立ってex vivoで増殖させられる、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
対象が、１〜約１０７個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を移植によって投与される、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
対象が哺乳動物である、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
角膜輪部幹細胞の単離された調製物であって、細胞表面上のＡＢＣＢ５の発現を特徴とする前記調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／７６６，４２４号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）の下における利益を主張し、その全体を参照によって組み込む。
連邦政府資金による研究
本発明は、国立衛生研究所および国立癌研究所から授与された５Ｒ０１ＣＡ１１３７９６による政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
角膜輪部幹細胞はマウスでは遅い細胞周期の標識保持細胞として同定されている。角膜輪部幹細胞はヒトでは核内転写因子ΔΝｐ６３αを発現し、ＫＲＴ１２などの角膜上皮分化マーカーの発現を欠く［２、８］（図１Ａ）。角膜輪部幹細胞はＴＡ細胞を生じ、それらは眼発生のマスター制御因子ＰＡＸ６を発現し［９］、角膜の発生および再生中に角膜輪部の外へ移動して、ＫＲＴ１２（＋）角膜中央上皮を生ずる［１０］。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明は、いくつかの側面では、例えば角膜疾患および／または網膜疾患などの眼の異常の処置のための、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばヒト幹細胞）の使用に一般的に関する。本発明は、ＡＢＣＢ５が眼の幹細胞によって発現されており、かかるＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が正常な眼の発生に必要であり、眼創傷（例えば眼表面創傷）を有する対象に対して投与されたときそれらの細胞が細胞再生の能力があるという発見に一部基づいている。例えば、ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は正常な角膜発生に必要であり、角膜再生の能力がある。同様に、ＡＢＣＢ５（＋）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は正常な網膜発生に必要であり、網膜再生の能力がある。
したがって本発明のいくつかの側面では、眼の異常を有する対象を処置する方法が本明細書において提供され、これは対象の眼細胞を再生するために有効な量の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を対象に対して投与することを含む。
いくつかの態様では眼の異常は角膜疾患である。いくつかの態様では、角膜疾患は角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）を原因とする盲目である。「角膜上皮幹細胞疲弊症」は、本明細書では、重症もしく両眼性、片眼性、または部分ＬＳＣＤを指す［５］。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が対象に投与されて、角膜疾患を処置する。
【０００４】
いくつかの態様では眼の異常は網膜疾患である。いくつかの態様では網膜疾患は黄斑変性である。いくつかの態様では網膜疾患は網膜炎である。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）網膜幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＲＰＥ幹細胞）が対象に投与されて、角膜疾患を処置する。
いくつかの態様では眼の異常は眼創傷である。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は眼移植片として投与される。いくつかの態様では、眼移植片は１〜約１０７個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を含有する。いくつかの態様では、１０７個超の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が眼移植片として投与され得る。
本発明の別の側面では、眼細胞の混合集団から角膜輪部幹細胞を単離する方法が本明細書において提供され、この方法は、眼細胞の混合集団を提供すること、およびこの混合集団からＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を単離することを含む。
本発明のさらに別の側面では、眼移植片中にあるＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を同定し、ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を移植片中にある全細胞数と比較し、この比較に基づいて移植用の眼移植片を選抜する方法が本明細書において提供される。
【０００５】
いくつかの態様では、方法は、ヒトＡＢＣＢ５に対して選択的に結合する抗体と混合集団の細胞を接触させることを含む。
本発明のさらに別の側面では、対象への移植用の眼移植片を作製する方法が本明細書において提供され、この方法は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を基質に播種して眼移植片を作製することを含む。
いくつかの態様では、基質はフィブリンゲル、羊膜、アミノグリカン、またはその組み合わせを含む。いくつかの態様では基質は人工角膜である。かかる態様では、基質、例えば人工角膜は無細胞性コラーゲンを含む。
本発明のいくつかの側面では、対象への移植用の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された眼移植片が本明細書において提供される。
【０００６】
本発明のさらに別の側面では、眼細胞再生を促進する方法が本明細書において提供され、角膜輪部幹細胞をＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞として同定することと、眼細胞再生を促進するために有効な量のＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞をその必要がある対象に対して投与することとを含む。
本発明のさらに別の側面では、細胞表面へのＡＢＣＢ５の発現を特徴とする角膜輪部幹細胞の単離された調製物が本明細書において提供される。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は眼移植片として投与される。
いくつかの態様では、対象は、１〜約１０７個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を移植によって投与される。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である。
【０００７】
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は同種他家由来幹細胞である。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は同系幹細胞である。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞はＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞である。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は皮膚幹細胞（例えば間葉系幹細胞）ではない。
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、投与ステップに先立ってex vivoで増殖させられる。
いくつかの態様では対象は哺乳動物である。いくつかの態様では哺乳動物はヒトである。
【０００８】
本発明の一部の側面ではキットが本明細書において提供され、上記の移植片または幹細胞調製物のいずれかのものを収容する容器と、移植片または調製物をその必要がある対象に対して投与するための説明書とを含む。
眼の異常を処置するための本発明の移植片または幹細胞調製物の使用も、本発明の一側面として提供される。
眼の異常を処置するための本発明の幹細胞調製物の医薬品を製造するための方法も提供される。
本発明は、その適用に際して、以下の説明に記載または図面に例示される構成の詳細および構成要素の配列に限定されない。本発明は他の態様も可能であり、種々の方法で行うことまたは実施することが可能である。上記の態様および側面のそれぞれは任意の他の態様または側面と結合され得る。さらに、本明細書で用いられる語法および用語は説明の目的のためであり、限定するものと見なされるものではない。「含む」、「含んでなる」、または「有する」、「含有する」、「伴う」、およびそれらの変形の使用は、本明細書においては、その後に挙げられる項目およびその均等物、ならびに追加の項目を包含することを意図されている。
添付の図面は一定の縮尺で描画されることを意図されていない。明快さのために、各図面においてあらゆる構成要素が標識を付されているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】図１Ａは、角膜構造および角膜輪部幹細胞ニッチの略図を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢｒｄＵ標識された解離したマウス角膜細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示しており、角膜輪部における標識保持細胞集団の存在を同定している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、マウス角膜輪部におけるＡＢＣＢ５およびＢｒｄＵの共発現を示す免疫蛍光画像を示している。
【図１Ｄ】図１Ｄは、マウス角膜輪部におけるＡＢＣＢ５およびＢｒｄＵの共発現を示す代表的なフローサイトメトリー分析を示している。棒グラフ（右）は、独立した実験の定量分析を例示している（ｎ＝４）。
【図１Ｅ−Ｆ】図１Ｅは、基底上皮層におけるＡＢＣＢ５発現（緑色）を示すヒト角膜の接線方向の角膜輪部断面の代表的な免疫組織化学分析を示している。図１Ｆは、ＡＢＣＢ５（赤色）とΔΝｐ６３α（緑色）との共発現を示すヒト角膜の接線方向の角膜輪部断面の代表的な免疫組織化学分析を示している。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＡＢＣＢ５とΔΝｐ６３αとの共発現を示すヒト角膜輪部上皮細胞の代表的なサイトメトリー分析を示している。棒グラフは、ＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）細胞のΔΝｐ６３α発現（左パネル）と、ΔΝｐ６３α（＋）およびΔΝｐ６３α（−）細胞のＡＢＣＢ５発現（右パネル）とを示している。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３実験として示されている。
【図１Ｈ−Ｉ】図１Ｈは、ＡＢＣＢ５およびＫＲＴ１２共発現の２色フローサイトメトリー分析を示している。図１Ｉは、角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の患者の（手術時に実施された）およびそれらの各ドナーの角膜輪部生検におけるＡＢＣＢ５発現の代表的な免疫組織化学分析を示している。棒グラフは健康なドナーおよびＬＳＣＤの患者におけるＡＢＣＢ５（＋）細胞（緑色）の個数を示している（患者／ドナーあたりｎ＝８断面）。
【００１０】
【図２Ａ】図２Ａは、マウスＡｂｃｂ５遺伝子座および蛋白質トポロジーの模式図を示している。トポロジー構造はTMHMM膜トポロジー予測アルゴリズムによって決定され、TOP02ソフトウェアを用いて表示された。Ａｂｃｂ５ノックアウト（ＫＯ）（変異体）マウスにおいて欠失しているアミノ酸残基は赤色で強調されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ａｂｃｂ５ＫＯマウスの作製に用いられた戦略の図式的な概略を示している。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ｃの左パネルは、マウスのジェノタイピングに用いられたゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の電気泳動像を示しており、１１３塩基対の野生型（ＷＴ）アレルおよび３２２塩基対の欠失アレルを実証している。図２Ｃ右パネルは、ＡＢＣＢ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）3C2-1D12によるマウス蛋白質溶解液のウェスタンブロットを示している。これは、予測されたサイズの８０ｋＤ蛋白質バンドの喪失をＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおいて示した。図２Ｄは、マウスＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯ角膜の表現型的なキャラクタリゼーションの画像を示しており、スリットランプ検査（左パネル）、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（中央パネル）、および４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（右パネル）を用いた。下の棒グラフは、Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスの角膜中央および角膜輪部におけるＤＡＰＩ（＋）上皮細胞数を示している。示されたデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４実験を表している。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおけるＬＣ‐ビオチン拡散分析およびＰＡＸ６、ＫＲＴ１２、およびＫＲＴ１４の免疫蛍光蛋白質発現分析を示している。棒グラフは、Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスにおけるＰＡＸ６（＋）およびＫＲＴ１２（＋）上皮細胞（パーセント）を示している。示されているデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝６実験を表している。
【図２Ｆ】図２Ｆは、上皮創面切除創傷の４８時間後のＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯ角膜のＨ＆ＥおよびＤＡＰＩ染色を示している。棒グラフ（下）は、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの断面毎のＤＡＰＩ（＋）細胞数を示している。示されているデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４実験を表している。
【図２Ｇ】図２Ｇは、上皮創面切除創傷の４８時間後のＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部および角膜中央について、Ｋｉ６７の免疫蛍光分析を示している。棒グラフ（下）は、角膜輪部および角膜のＫｉ６７（＋）のパーセンテージ、Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスを示している（それぞれ平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４実験）。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＴＵＮＥＬ染色の免疫蛍光分析を、上皮創面切除創傷の４８時間後のＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部および角膜中央について示している。棒グラフ（下）は、Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスの角膜輪部および角膜におけるＴＵＮＥＬ＋上皮細胞の割合を示している（それぞれ平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４実験）。
【００１１】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、フローサイトメトリー分析を示しており、８週間の追跡後のＡｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴ角膜輪部上皮細胞中のＢｒｄＵ標識保持細胞の喪失を示している。図３Ｂはフローサイトメトリー分析を示しており、１週間の追跡後のＡｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴ角膜輪部上皮細胞中のＢｒｄＵ標識保持細胞の喪失を示している（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝６実験）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部および角膜におけるＫｉ６７発現の免疫蛍光分析を示している。右側の棒グラフは、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおける角膜輪部および角膜中のＫｉ６７（＋）細胞のパーセンテージを示している。示されているのは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝３実験）。
【図３Ｄ−Ｅ】図３Ｄは、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯ角膜におけるｐ５３、ｐ６３、ｐ２１、およびｐ１６のｍＲＮＡ発現のグラフを示している。棒は、Ａｂｃｂ５ＫＯマウスの相対的なｍＲＮＡ発現レベルをＡｂｃｂ５ＷＴマウスのｍＲＮＡ発現レベルのパーセンテージで表している（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４実験）。図３Ｅは、ＡＢＣＢ５が細胞周期制御ならびに正常な角膜発生および再生に果たす役割の図式的な概略を示している。Ａｂｃｂ５ＫＯマウスにおけるＡＢＣＢ５発現の消滅（青色）は、ＢｒｄＵ（＋）標識保持細胞の喪失および重要な細胞周期制御因子（ｐ６３を含む）の下方制御をもたらす。これは増大した細胞増殖をもたらす（Ａｂｃｂ５ＫＯマウスにおける増強されたＫｉ６７発現によって示されている）。増大した増殖と細胞周期からの脱出の不能とは重大な分化の欠損を説明しており、これはＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおける減少したＰＡＸ６およびＫＲＴ１２発現ならびにアポトーシスの増大した割合（増強されたＴＵＮＥＬ染色によって示されている）を証拠としている。
【００１２】
【図４Ａ】図４Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスに移植されたマウス同系ドナー細胞移植片の分析を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫不全ＮＳＧレシピエントマウスに移植されたヒト異種ドナー細胞移植片の分析を示している。画像は、実験的に誘導されたＬＳＣＤの処置のために実施された移植の５週間後の組織を示している。図４Ａおよび４Ｂにおいて、レシピエントマウスは、ドナー細胞なし（それぞれ横列２）、ＡＢＣＢ５（−）細胞（それぞれ横列３）、未分離の角膜輪部上皮細胞（それぞれ横列４）、またはＡＢＣＢ５（＋）細胞（それぞれ横列５）を含有するフィブリンゲル移植片を受容した。参照として、正常な未処置の（誘導されたＬＳＣＤなしの）Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＳＧマウス角膜がそれぞれ図４Ａおよび図４Ｂの横列１に示されている。角膜透明度がスリットランプ検査によって評価された（図４Ａ、４Ｂ、縦列１）。上皮の健全性および再生は、血管新生に関係する杯細胞検出については過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）（図４Ａ、縦列４）、分化した角膜上皮細胞の検出についてはＫｒｔ１２染色（緑色）（図４Ａ、４Ｂ、縦列５）によって、上皮の厚さおよび重層化についてはＨ＆Ｅ染色によって評価された（縦列２は２０×倍率、縦列３は４０×倍率）。核はＤＡＰＩによって染色された（赤色）。右側の棒グラフは、移植の５週間後のレシピエント角膜中のマウスＫＲＴ１２（＋）細胞（図４Ａ）またはヒトＫＲＴ１２（＋）細胞（図４Ｂ）の割合を示している。（図４Ｂ）の右下のパネルは、角膜修復へのヒトドナー細胞の寄与の評価のためにヒト細胞を移植されたマウスの眼のＲＴ‐ＰＣＲ分析を示している。
【００１３】
【図５Ａ】図５Ａは、ＢｒｄＵ瞬間標識追跡実験の実験設計の図式的な概略を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、代表的なフローサイトメトリー分析を示しており、８週間の追跡に先立ってＢｒｄＵを受容しなかったＷＴマウス（左の２つのパネル）またはＢｒｄＵを受容したＷＴマウス（右の２つのパネル）の角膜輪部上皮細胞中のＢｒｄＵ標識保持細胞の特異的染色を示す。角膜輪部上皮細胞が採取され、抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂ）またはアイソタイプ対照Ａｂによって染色された。ゲート内のＢｒｄＵ陽性細胞の割合が各プロットに示されている。
【００１４】
【図６】図６は、ヒトドナー角膜の接線方向の角膜輪部断面の略図を示し、角膜輪部上皮の位置を示す。ＡＢＣＢ５（＋）細胞（緑色の細胞として図示されている）は基底上皮層中にあるのが見られた。
【図７】図７は、ＬＳＣＤの患者（患者１）の角膜輪部生検を示している。角膜輪部生検は、死体ドナー（ドナー１）の眼から全層角膜移植＋角膜輪部同種移植片を受容するために先立って、化学熱傷の患者１から得られた。生検の連続断面はＨ＆Ｅ、アイソタイプ対照Ａｂ、またはＡＢＣＢ５ｍＡｂによって染色された。ドナー１の角膜輪部上皮のＡＢＣＢ５染色はＡＢＣＢ５陽性細胞巣を示した。一方、ＡＢＣＢ５陽性は患者１の角膜輪部上皮においては減少していた。免疫蛍光染色の写真は２０×倍率の連続写真のモンタージュである。
【図８】図８は、ＬＳＣＤの患者（患者２）の角膜輪部生検を示している。角膜輪部生検は、患者の正常な対側眼（ドナー２）から角膜輪部自家移植を受容するために先立って、自己免疫性角膜融解、周辺部角膜潰瘍、および部分角膜上皮幹細胞疲弊症を有する患者２から得られた。生検の連続断面はＨ＆Ｅ、アイソタイプ対照Ａｂ、またはＡＢＣＢ５ｍＡｂによって染色された。ＡＢＣＢ５陽性はドナー２の角膜輪部上皮の基底層に存在していた。一方、患者２の角膜輪部には劇的に減少した上皮層が観察され、ＡＢＣＢ５染色は観察されなかった。免疫蛍光染色の写真は２０×倍率の連続写真のモンタージュである。
【００１５】
【図９】図９は、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部または角膜中央上皮の代表的なフローサイトメトリー分析を示している。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）は、細胞のサイズおよび顆粒度をそれぞれ示す。Ａｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜中央上皮はＡｂｃｂ５ＷＴ上皮（左パネル）と比較して上皮細胞の減少した個数を示した。これはより小さい細胞（左ゲート）ではなくより大きい細胞（右ゲート）の減少によって引き起こされている。角膜輪部上皮細胞の個数の減少はなかった（右パネル）。４つの眼から集められた試料の代表的な結果が示されている（ｎ＝３実験）。
【図１０】図１０は、Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部（上）または角膜中央（下）から集められた上皮細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示している。回収された細胞はアイソタイプ対照抗体、抗Ｐａｘ６抗体、または抗Ｋｒｔ１２抗体によって染色された。ＰＡＸ６（＋）およびＫＲＴ１２（＋）上皮細胞の減少した度数がＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜中央にあり、それに対応するＰＡＸ６（＋）細胞の減少した度数がＡｂｃｂ５ＫＯマウスの角膜輪部にあった。赤色のゲートは、アイソタイプ対照染色と比較されたＰＡＸ６（＋）またはＫＲＴ１２（＋）細胞を示している。ｎ＝３実験の代表的な分析が示されている。
【００１６】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａは、２ｍｍのトレフィンによってマークされた創面切除されるべき創傷部位と、除去された上皮を示している。図１１Ｂは、中央上皮創面切除直後の角膜のＤＡＰＩ染色された断面を示しており、創傷端および露出された角膜中央実質を図示している。画像は１０×倍率の連続写真のモンタージュである。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ｃは、創面切除の１、２４、および４８時間後の角膜上皮創傷閉鎖のモニタリングの蛍光画像を示している。図１１Ｄは、創傷閉鎖速度のグラフを示している。Ａｂｃｂ５ＷＴとＡｂｃｂ５ＫＯマウスとの間では有意に異ならなかった（ｎ＝２重実験の合計）。
【図１２】図１２は、角膜上皮創面切除創傷の４８時間後のＡｂｃｂ５ＷＴ（上）およびＡｂｃｂ５ＫＯ（下）マウスの代表的なＤＡＰＩ染色されたコンポジット角膜断面を示しており、Ａｂｃｂ５ＫＯマウスの減少した上皮細胞数を示している。白い点線は上皮を実質から区別している。白枠は２０×倍率で示された部位を表している（モンタージュ画像は１０×倍率である）。白線は上皮細胞が計数された部位を画定している。上皮細胞は、２つの別個の実験において３重のマウス／群の少なくとも３つの連続したコンポジット断面中の標準化された部位について計数された（データは図２Ｆに示されている）。
【００１７】
【図１３】図１３は、角膜上皮創面切除創傷の４８時間後のＡｂｃｂ５ＷＴ（上）およびＡｂｃｂ５ＫＯ（下）マウスの代表的なＴＵＮＥＬ染色されたコンポジット角膜断面を示している。Ａｂｃｂ５ＫＯマウスの増大したアポトーシス細胞数を示している。白枠によって画定された部位は２０×倍率で示されている（モンタージュ画像は１０×倍率）。ＴＵＮＥＬ陽性上皮細胞の個数が計数され、２重の実験のデータが図２Ｈにまとめられている。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは、ドナー角膜からのＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）角膜輪部上皮細胞の回収および分離、それに続くドナー細胞を含有するフィブリンゲルの調製の略図を示している。図１４Ｂは、レシピエントマウスの角膜上皮幹細胞疲弊症の誘導およびドナー移植片の移植の略図を示している。
【００１８】
【図１５Ａ】図１５Ａは、代表的なフローサイトメトリー分析を示しており、マウスドナー角膜輪部上皮細胞のソーティングゲートおよび生存率を示している。生存率はＤＡＰＩを排除する細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ソーティング後分析を示しており、マウスドナーから単離された角膜輪部上皮細胞のＡＢＣＢ５（＋）が濃縮およびＡＢＣＢ５（−）が濃縮された亜集団の純度および生存率を示す。生存率はＤＡＰＩを排除する細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、代表的なフローサイトメトリー分析を示しており、ヒトドナー角膜輪部上皮細胞のソーティングゲートおよび生存率を示している。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ソーティング後分析を示しており、ヒトドナーから単離された角膜輪部上皮細胞のＡＢＣＢ５（＋）が濃縮およびＡＢＣＢ５（−）が濃縮された亜集団の純度および生存率を示す。生存率はＤＡＰＩを排除する細胞のパーセンテージとして示されている。
【００１９】
【図１６】図１６は、レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの代表的なＨ＆Ｅのコンポジット角膜断面を示している。誘導された角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）を受容した後に、次の同系マウス角膜輪部上皮細胞の亜集団を含有するドナーフィブリンゲル移植片の移植を行った５週間後。（ｉ）細胞なし（負の対照）、（ｉｉ）ＡＢＣＢ５（＋）細胞、（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ５（−）細胞、または（ｉｖ）未分離の細胞。正常な未処置の角膜（ＬＳＣＤなし）が正の対照を務めた。正の対照は典型的な重層化した角膜上皮および虹彩角膜角を示した。細胞を含まない移植片を受容したマウスは、ＬＳＣＤ後に起こる典型的な結膜化を示した。すなわち、重層化していない結膜上皮が角膜を覆い、広範囲の炎症、血管新生、および実質浮腫がある。癒着（虹彩が角膜に固着する箇所）は強い前部炎症に典型的である。対照的に、ＡＢＣＢ５（＋）細胞の移植片を受容したマウスは復元された重層角膜上皮を示し（ＡＢＣＢ５（−）細胞では示さなかった）、炎症、血管新生、実質浮腫、または癒着の徴候はなかった。未分離の角膜輪部上皮細胞の移植片を受容したマウスは、重層化していない上皮を含む実質浮腫の部位を示した。一方、角膜の他の部分は正常な重層上皮細胞を含有していた。
【００２０】
【図１７】図１７は、レシピエントの免疫不全ＮＳＧマウスの代表的なＨ＆Ｅのコンポジット角膜断面を示している。ＬＳＣＤ誘導と、それに続いて行われた次のヒト角膜輪部上皮細胞の亜集団を含有するドナーフィブリンゲル移植片の移植の５週間後。（ｉ）細胞なし（負の対照）、（ｉｉ）ＡＢＣＢ５（＋）細胞、（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ５（−）細胞、および（ｉｖ）未分離の細胞。正常な未処置のＮＳＧ角膜（ＬＳＣＤなし）が正の対照を務めた。正の対照は典型的な重層角膜上皮および虹彩角膜角を示す。細胞を含まない移植片を受容したマウスは、ＬＳＣ疲弊症後に起こる結膜化の徴候を示した。すなわち、重層化していない結膜上皮が角膜を覆っており、広範囲の血管新生および癒着がある（前部炎症はＮＳＧマウスではそれらの免疫不全によって抑えられた）。対照的に、ＡＢＣＢ５（＋）細胞を含有する移植組織を受容したマウスは復元された重層上皮の部位を示したが、ＡＢＣＢ５（−）細胞移植片を受容したマウスは示さなかった。
【００２１】
【図１８】図１８は、レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの代表的な免疫蛍光Ｋｒｔ１２染色（緑色）を示している。ＬＳＣＤ誘導後、次の同系マウス角膜輪部上皮細胞の亜集団を含有するドナーフィブリンゲル移植片の移植の５週間後。（ｉ）細胞なし（負の対照）、（ｉｉ）ＡＢＣＢ５（＋）細胞、（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ５（−）細胞、または（ｉｖ）未分離の細胞。正常な未処置のマウス角膜（ＬＳＣＤなし）はここでは正の対照として示されており、ＫＲＴ１２染色の高い強度を示した。予想通りに、細胞を含有しない移植片を受容したマウスはＫＲＴ１２発現を示さなかった。対照的に、ＡＢＣＢ５（＋）細胞を移植されたマウスは、未分離の角膜輪部上皮細胞を移植されたマウスと比較してかなり増強されたＫＲＴ１２発現を示した。ＫＲＴ１２発現は、ＡＢＣＢ５（−）細胞を移植されたマウスでは検出されなかった。白枠は４０×倍率で示された部位を表している。モンタージュ画像は１０×倍率で示されている。
【００２２】
詳細な説明
角膜上皮のホメオスタシスおよび再生は、眼の基底角膜輪部上皮にある角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）の集団によって保たれている［１〜３］。それらの細胞は新たな角膜細胞を生じて損傷したものと交換するが、負傷または疾患を原因とするＬＳＣの喪失は世界的に盲目の主因である［４］。健康な眼由来のＬＳＣの移植は、多くの場合にはＬＳＣＤの患者に利用可能な唯一の治療オプションである。移植の奏功は移植片中にあるＬＳＣの度数に第一に依存している［５］。しかしながら本発明以前には、この細胞亜集団の予期された濃縮を可能にする角膜輪部幹細胞遺伝子は報告されていなかった［５］。
【００２３】
本発明は、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー５（ＡＢＣＢ５）［６、７］がＬＳＣをマークし、且つ角膜輪部幹細胞維持、角膜発生および修復に必要であるという発見、およびドナーから予期して単離されたＡＢＣＢ５陽性（ＡＢＣＢ５（＋））ＬＳＣが移植によって角膜を復元する能力を有するという発見に一部基づいている。したがって、本発明の種々の側面および態様は、眼の異常を有する対象を処置する方法、眼のＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を単離する方法、移植用の眼移植片を選抜および／または作製する方法、眼細胞再生を促進する方法、さらにはそれらの細胞表面へのＡＢＣＢ５の発現を特徴とする単離された眼幹細胞を含有する移植片および調製物に関する。
【００２４】
本発明の発明者は、野生型マウスのin vivoの標識保持ＬＳＣおよび健康なヒトのΔΝｐ６３α陽性ＬＳＣの表面にＡＢＣＢ５が一様に発現されているということを本明細書において立証する。それらの知見と一致して、本発明者は、ＡＢＣＢ５陽性角膜輪部幹細胞の度数がＬＳＣＤ患者においてかなり減少しているということも立証する。新規に作製されたＡｂｃｂ５ノックアウト（ＫＯ）マウスを用いたＡＢＣＢ５の機能喪失研究は、増強された増殖およびアポトーシスを原因とする静止ＬＳＣの枯渇を引き起こし、不良な角膜分化および創傷治癒をもたらした。これは、ＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣが角膜を復元するという実証された能力を説明する。マウス遺伝子ＫＯ、in vivoの角膜輪部幹細胞の追跡、および角膜輪部幹細胞移植モデルの結果、ならびにヒト生検標本の表現型的および機能的な移植片分析による並行して得られた知見は、ＡＢＣＢ５が哺乳動物のＬＳＣを同定するという収束的な一連の証拠を示している。角膜発生および修復に必須の機能を有する分子的に定義されたＬＳＣの同定および予期された単離は、角膜疾患、特にＬＳＣＤを原因とする角膜性の盲目の処置にとって重要な意味を有する。
【００２５】
「ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞」は、本明細書で用いられる場合、自己複製および分化して多数の成体細胞系譜の成熟細胞になる能力を有する細胞を指す。それらの細胞は細胞表面へのＡＢＣＢ５の発現を特徴とする。本発明の一部の実施形態ではＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は角膜輪部幹細胞である。いくつかの態様ではＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は網膜幹細胞である。ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は眼の基底角膜輪部上皮または網膜色素上皮（ＲＰＥ）から得られる（例えば、単離または誘導され得る）。いくつかの態様ではＡＢＣＢ５（＋）幹細胞はヒトの眼から得られる。他のＡＢＣＢ５（＋）幹細胞型（例えば角膜中央から得られるもの）が本発明の種々の側面および態様に用いられ得る。
【００２６】
ＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞は、基底角膜輪部上皮またはＲＰＥの眼細胞を含む眼組織の試料を単離し、次にＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を精製することによって対象から得られる。当業者には当然のことながら、試料はいくつもの方法でＡＢＣＢ５を有する眼幹細胞を濃縮され得る。例えば、眼幹細胞は、細胞表面分子上のＡＢＣＢ５と抗体または他の結合分子との結合によって選抜され得る。眼細胞はドナーからそのまま得られ、または凍結保存による保存から戻され得る。眼幹細胞は、例えばＡＢＣＢ５に対する抗体を用いて単離され、標準的な手法を用いる培養によってまたは例えば液体窒素中で凍結されて、後の使用のために維持され得る。眼から細胞を得るために本発明で用いられ得る方法の限定しない例は例の項に記載されており、図１４Ａに図示されている。
【００２７】
本発明は、ＡＢＣＢ５結合分子（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメントなど）を用いて眼細胞の混合集団からＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を分離するいずれかの好適な方法を考慮する。したがって本発明にはＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の集団を作製する方法が含まれ、これは、眼細胞の細胞懸濁液を提供するステップと、ＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ表面のエピトープ（ＡＢＣＢ５を含む）を認識するモノクローナル抗体または複数のモノクローナル抗体の組み合わせと細胞懸濁液を接触させるステップと、モノクローナル抗体に結合された細胞を細胞懸濁液から分離および回収するステップとを含む。モノクローナル抗体は固相に連結されて、眼組織試料から角膜輪部幹細胞を捕捉するために用いられ得る。結合した細胞は、次に抗体および固相の性質に応じて公知の方法によって固相から分離され得る。
【００２８】
「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いられる場合、何らかの抗原の同一のエピトープに結合する免疫グロブリンの単一クローン集団から得られる抗体を指す。本発明の細胞集団を調製するために適切なモノクローナルベースのシステムは、ポジティブまたはネガティブ選抜用の抗体を用いる磁性ビーズ／常磁性粒子カラム、ビオチンまたはストレプトアビジン親和性に基づく分離、および他の細胞の懸濁液中に混合された免疫蛍光染色されたＬＳＣの高速フローサイトメトリーソーティングを含む。したがって、本発明の方法は、表面抗原ＡＢＣＢ５に対して作製されたモノクローナル抗体（例えば、選択的にＡＢＣＢ５に結合するモノクローナル抗体）を用いるＬＳＣの集団の単離および強化を含む。一部の例では、選択的にＡＢＣＢ５に結合する市販抗体または抗体フラグメントが、本明細書に開示の方法に用いられ得る。かかる抗体は、そのモノクローナル抗体が他の抗原（すなわちＡＢＣＢ５以外の抗原）に結合する親和性よりも高い親和性によってＡＢＣＢ５に結合するまたは結合し得る場合、選択的にＡＢＣＢ５に結合すると見なされる。かかる結合は、標準的な蛋白質間相互作用試験（例えば、抗体‐抗体またはリガンド‐受容体試験）、例えば競合試験、飽和試験、または標準的な免疫試験（限定なしに、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定、および放射免疫フィルター結合試験を含む）などによって測定または確認され得る。
【００２９】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えば、ＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は単離され得る。「単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞」は、本明細書で用いられる場合、それが元々見いだされた生物から取り出された細胞、またはかかる細胞の子孫を指す。単離された細胞は、天然の環境とは異なる条件に置かれた細胞も指す。かかる細胞は、後で第２の生物に導入され得、またはそれが単離された元の生物（または、それが遺伝されて来た細胞もしくは細胞の集団）に再導入され得る。かかる細胞は、本発明の方法に従って操作された後でも単離された細胞と見なされる。用語「単離された」は、他の細胞との組み合わせもしくは混合物としてのまたはin vivo環境においてのその細胞の爾後の使用を排除しない。
【００３０】
「組成物」は、本明細書においては単離された細胞調製物または移植片を指し得、組織移植片および人工移植片（例えば無細胞性コラーゲン移植片）を含む。本発明の組成物は、一部の例では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮されている。組成物は、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が調製物中に存在する主な細胞亜型である場合、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮されていると見なされる。例えば、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された組成物は、組成物の細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）である組成物である。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された組成物は、組成物の細胞の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満がＡＢＣＢ５（−）細胞であるものである。いくつかの態様では組成物の細胞は眼細胞のみである。すなわちいくつかの態様では組成物は非眼細胞を含有しない。いくつかの態様では組成物はＡＢＣＢ５（−）細胞を含有しない。
【００３１】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は実質的に純粋な調製物として調製され得る。用語「実質的に純粋」は、本明細書で用いられる場合、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）以外の細胞を実質的に含まない調製物を指す。例えば、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の実質的に純粋な調製物は、調製物中にある全細胞の少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％パーセントがＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）であるような調製物であり得る。
いくつかの態様では、単離されたおよび／または実質的に純粋なＡＢＣＢ５（＋）細胞調製物は、完成した医薬容器（例えば注射用バイアル、アンプル、または輸液バッグ）中に、望まれ得るいずれかの他の成分（例えば細胞を保存するため、または細菌増殖を抑えるための薬剤）と一緒に詰められ得る。細胞調製物は単位剤形であり得る。
【００３２】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は眼の異常を処置するために有用である。いくつかの態様では眼の異常は眼創傷であり、眼の瘢痕化に至り得、これは翻って低下した視力または盲目を引き起こし得る。いくつかの態様では、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）が用いられて、角膜疾患、例えば角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）を原因とする盲目などを処置し得る。いくつかの態様では、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えば、ＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣおよび／またはＡＢＣＢ５（＋）ＲＰＥ幹細胞）が用いられて、網膜疾患、例えば黄斑変性または網膜炎／網膜色素変性症などを処置し得る。黄斑変性は黄斑の変質を含む一群の異常を指し、鋭敏ではっきりした視界に必要な中央視力の喪失を引き起こす。これは６５歳以上の者の視力喪失および盲目の主因である。黄斑変性はＡＭＤまたはＡＲＭＤ（加齢黄斑変性）とも呼ばれ得る。網膜炎は網膜の炎症を指し、盲目に至り得る。網膜色素変性症は遺伝的な異常または炎症反応の結果であり得、中央視力喪失に至り得る進行性の周辺視力喪失および夜間視力障害（夜盲症）を特徴とする一群の遺伝性疾患を指す。
【００３３】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣおよび／またはＡＢＣＢ５（＋）ＲＰＥ幹細胞）は、対象の眼細胞を再生するために有効な量（本明細書ではＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の「有効な量」と呼ばれる）で、その必要がある対象に対して投与され得る。いくつかの態様では、１〜約１０７個のＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が対象に対して投与される。いくつかの態様では、１個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が対象に対して投与される。いくつかの態様では、約１０１〜約１０７、約１０１〜約１０６、約１０１〜約１０５、約１０１〜約１０４、約１０１〜約１０３、約１０１〜約１０２個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が対象に投与される。いくつかの態様では、約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７個、またはそれより多い単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が対象に投与される。いくつかの態様では、約１０１個未満の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が対象に投与される。
【００３４】
いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は（例えば、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞調製物または移植片の形態の組成物として）、対象に対して複数回投与され得る。したがっていくつかの態様では、対象は、数週間、数ヶ月間、または数年間に渡って、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の複数の用量または移植片（例えば２、３、４、またはそれより多い）を投与され得る。いくつかの態様では、幹細胞は１回目の適用の３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、または２４ヶ月後に再度投与される。適用の回数および頻度は、例えば１回目の幹細胞投与／移植後に達成された細胞再生の程度によって決まり得る。幹細胞の適用の回数および頻度は、医療従事者（例えば、外科医、内科医）によって判断され得る。
【００３５】
いくつかの態様では、眼の異常を有する対象が眼創傷（例えば、死、損傷、または感染眼細胞）を例えば角膜上皮に有する。すなわち、本発明の眼の異常を有する対象においては角膜上皮が負傷し得る。ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の移植片が角膜を復元するために用いられ得るということが発見された。したがっていくつかの態様では、対象の角膜上皮表面の健全性はＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣの有効な量の投与後に復元される。角膜再生は例えば角膜透明度（例えば、不透明ではなく透明な角膜の発達）および／または視力に基づいて評価され得る。眼細胞／幹細胞移植の奏功（例えば、細胞再生の程度、視力）を評価する方法は当分野では公知であり、それらの任意のものが本発明に用いられ得る。眼細胞/幹細胞移植の奏功を評価する方法の例は、限定なしに、スリットランプイメージング、ハイデルベルク網膜トモグラフィー（ＨＲＴ）、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、および２光子イメージングを含む。他の例は、限定なしに、ローズベンガル（４，５，６，７‐テトラクロロ‐２’，４’，５’，７’‐テトラヨードフルオレセイン）色素および他の上皮染色溶液の使用を含む。
【００３６】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は対象にとって自家（同じ対象から得られる）または非自家（対象にとって同種他家由来または同系の細胞など）であり得る。または、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は対象にとって異種である供給源から得られる。
「同種他家由来」は、対象と同じ種に属するまたは対象と同じ種から得られるが、遺伝学的には異なる細胞を指す。したがって、同種他家由来ヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は、角膜輪部幹細胞の所期のレシピエント以外の者から得られる角膜輪部幹細胞である。「同系」は、対象と遺伝学的に同一または非常に近縁であり且つ免疫適合性である（すなわち、同一の遺伝子型を有する個体または組織から得られる）細胞を指す。「異種」は、対象とは異なる種の生物に由来するまたはそれから得られる細胞を指す。
【００３７】
本発明のＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）は、投与ステップに先立ってex vivoで増殖させられ得る。したがっていくつかの例では、ＡＢＣＢ５発現は、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）をin vitroで同定し、単離し、クローニングし、増やし、増殖させるための基盤を提供する。本発明は、ＡＢＣＢ５に結合する作用物質（例えば単離されたペプチド、例えば抗体）を用いてＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を他の細胞から分離するいくつかの好適な方法も考慮する。単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、適切な培養環境中で、例えば培地、サプリメント、および試薬の組み合わせを用いて維持され得る。任意に、フィーダー細胞集団またはフィーダー細胞集団から得られた馴化培地が、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞集団を増殖させるために用いられ得る。
【００３８】
本発明の幹細胞増殖のために用いられ得る接着、結合、およびマトリックス因子は、限定なしに、Ｅ‐カドヘリン、コラーゲン、フィブロネクチン、スーパーフィブロネクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ＩＣＡＭ‐Ｉ、ラミニン、オステオポンチン、プロテオグリカン、Ｅ‐セレクチン、Ｌ‐セレクチン、ＶＣＡＭ、およびビトロネクチンを含む。
本発明の幹細胞増殖のために用いられ得る生物活性物質およびサプリメントは、限定なしに、酵素（例えばカテプシンＧ、Ｆｌｔ‐３／Ｆｃ）、蛋白質およびペプチド（例えば、アクチビンＡ、アルブミン、アンギオゲニン、アンジオポエチン、ＢＡＸ阻害ペプチド、ヘレグリンβ‐１、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、ビタミン、ホルモン、ならびに種々の他の物質（例えばＬ‐アスコルビン酸、デキサメタゾン、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、胚液（ウシ）、ｆｌｔ３リガンド、プロゲステロン、レチノイン酸、酢酸レチニル、トロンボポエチン、およびＴＰＯ）、抗体、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、ならびに受容体を含む。
【００３９】
本発明の幹細胞増殖のために用いられ得る培養試薬は、限定なしに、抗生物質（例えば、シクロヘキシミド、エトポシド、ゲンタマイシン、マイトマイシン、ペニシリン‐ストレプトマイシン）、古典的培地（例えば、Claycomb培地、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、最小必須培地）、細胞凍結培地‐ＤＭＳＯ、Ｌ‐グルタミン不含Claycomb培地、Stemline（登録商標）培地（Sigma-Aldrich、米国）を含む。
本明細書で用いられる場合、対象は哺乳動物、例えばヒト、非ヒトの霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類などであり得る。ヒトＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）およびヒト対象は特に重要な態様である。
本発明の組成物は幹細胞（例えば角膜輪部幹細胞）または幹細胞の単離された調製物を含み得、それらの幹細胞はそれらの細胞表面へのＡＢＣＢ５の発現を特徴とする。組成物は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）が濃縮された調製物であり得、または、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣ）の実質的に純粋な集団を含み得る。組成物は、本明細書に記載される眼移植片を包含することが意図される。
【００４０】
組成物は、いくつかの態様では、細胞再生および分化を促進するためのさらなる生物活性物質およびサプリメントを含み得る。本発明に用いられ得るかかる生物活性物質およびサプリメントは上記であり、限定なしに、種々の酵素、蛋白質およびペプチド、ビタミン、抗体、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、ならびに受容体を含む。一部の実施形態では、組成物は免疫抑制剤および／または抗血管発生剤を含み得る。例えばいくつかの態様では組成物はシクロスポリン（例えばＣｙＡ）を含み、これは移植片拒絶を予防および／または処置するために用いられ得る。いくつかの態様では、組成物はベバシズマブ（例えばAVASTIN（登録商標））を含み得る。抗血管発生剤の使用が、いくつかの例では血管形成（これは移植後に頻繁に起こり、移植片拒絶をもたらし得る）を防ぐために用いられ得る。いくつかの態様では、免疫抑制剤および／または抗血管発生剤は組成物の成分としては投与されず、その代わりにＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の投与の前または後に独立に投与される。
【００４１】
いくつかの態様では組成物は外用投与用に調合される。外用投与用に調合される組成物の例は眼移植片である。本発明の移植用の眼移植片は、ＡＣＢＣ５（＋）幹細胞（例えばＡＣＢＣ５（＋）ＬＳＣ）と任意に他の眼細胞および眼細胞再生を促進する生物活性因子（例えばサイトカイン、成長因子）とを含有する基質を指す。この基質は対象の眼に移植またはインプラントされて、損傷または感染組織を交換（例えば眼創傷を処置）し得る。眼移植片は、眼細胞（例えば角膜および／または網膜細胞など）を含む細胞の混合集団を含有し得る。いくつかの態様では、移植用の眼移植片はＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣが濃縮されている。
【００４２】
角膜は虹彩、瞳孔、および前眼房を覆う眼の透明な前部である。角膜は前眼房および水晶体と一緒になって光を屈折させ、角膜は眼の全屈折力の約２／３を占める。霊長類の角膜は５つの層、すなわち角膜上皮（多細胞上皮組織層）、ボーマン層（コラーゲン繊維の密な層）、角膜実質（コラーゲン繊維（例えばＩ型コラーゲン原繊維）および角膜実質細胞からなる中間層）、デスメ膜（角膜上皮細胞が誘導される元の薄層であり、ＩＶ型コラーゲン原繊維から構成される）、および角膜内皮（ミトコンドリアに富む細胞の単層扁平または低立方層）を有する。本発明の組成物は単離された調製物および眼移植片を含み、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞に加えて５つの角膜層の細胞亜型のいずれか１つまたは２つ以上を含み得る。いくつかの態様では、組成物は５つの角膜層の細胞亜型のいずれか１つまたは２つ以上を含まない。
【００４３】
網膜は、眼の内表面を内張りしている組織の感光性層である。網膜そのものはシナプスによって相互連結されたニューロンの数層を有し、それらは光受容体細胞、例えば桿体、錐体、および神経節細胞を含んでいる。本発明の組成物（単離された調製物および眼移植片を含む）は、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞に加えて網膜の神経細胞亜型（ＲＰＥの網膜上皮細胞を含む）のいずれか１つまたは２つ以上を含み得る。いくつかの態様では、組成物は網膜の神経細胞亜型のいずれか１つまたは２つ以上を含まない。
移植への使用を意図される組成物（例えば眼移植片）の細胞は、同種他家由来または同系であり得る。いくつかの態様では、細胞は皮膚幹細胞（例えば間葉系幹細胞）ではない。したがっていくつかの態様では、本発明の組成物の細胞はＡＢＣＢ５（＋）間葉系幹細胞を含有しない（すなわち排除する）。
【００４４】
いくつかの態様では、組成物（眼移植片も含む）はＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮されている。いくつかの態様では眼移植片はＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣが濃縮されている。いくつかの態様では眼移植片はＡＢＣＢ５（＋）ＲＰＥ幹細胞が濃縮されている。例えば、眼移植片は、ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が移植片中に存在する主な細胞亜型である場合、濃縮されたＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣと見なされる。例えば、眼移植片は、ＬＳＣが移植片中の他の細胞亜型よりも多い場合、ＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣが濃縮されていることになる。いくつかの態様では、移植片の細胞の少なくとも５０％がＡＢＣＢ５（＋）幹細胞またはＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である。例えばいくつかの態様では、眼移植片の細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がＡＢＣＢ５（＋）幹細胞またはＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である。いくつかの態様では、眼移植片の細胞の１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満がＡＢＣＢ５（−）細胞である。
【００４５】
本発明の組成物は例えば創傷治癒を促進する生体適合性材料などの基質を含み得、それらは例えばフィブリンゲルなどの生分解性の足場を含む。フィブリンゲルは、血液凝固に関与する重要な蛋白質のフィブローゲンおよびトロンビンから通常は調製される。本発明に用いられ得る基質の他の例は、限定なしに、羊膜、アミノグリカン足場、および接着剤を含む。ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が基質に対して加えられて、例えば移植用の眼移植片となり得る。
【００４６】
本発明の組成物は、例えば角膜または網膜の表面に移植され得る。したがっていくつかの態様では、組成物は外用投与される。幹細胞移植片が眼に移植される場合には、移植片は縫合されて固定され得る。別の態様では幹細胞組成物は注射される。いくつかの態様では組成物は静脈内、動脈内、または血管内注射される。他の投与経路も考えられる。当然のことながら、本発明の組成物および／またはＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は担体有りでもなしでも投与され得る。したがっていくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の実質的に純粋な集団は、例えば眼の異常を処置するために対象に投与され得る。
【００４７】
ＡＢＣＢ５発現は移植用の眼細胞調製物（例えば移植片）を選抜するために用いられ得、それによって、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された眼細胞調製物の選抜を可能にする。本発明のかかる方法は、眼細胞調製物中にあるＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞）の個数を特定することと、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数を細胞調製物の全細胞数と比較することと、この比較に基づいて、移植用の眼細胞調製物を選抜することとを含む。眼細胞調製物中にあるＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数は、選択的にＡＢＣＢ５に結合する任意の１つまたは２つ以上の公知分子を用いて特定され得る。例えばいくつかの態様では、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、選択的にＡＢＣＢ５に結合する抗体または他の結合分子と細胞を接触させることによって同定され得る。生存性色素（例えば、ローダミンまたは他の幹細胞マーカー色素）もＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を同定するために用いられ得る。ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、関連する他の特異的マーカーの存在または不在に基づいても単離され得る。例えば、幹細胞特異的マーカーを認識するための作用物質が用いられ得る。例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、パニング法、磁性粒子選別、パーティクルソーター選別、および当業者に公知の他の方法（密度分離を含む）を用いてＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を分離および単離するために、幹細胞表面の細胞表面マーカーまたは抗原を認識して結合する標識抗体が用いられ得る。
【００４８】
典型的には、眼細胞調製物は、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えばＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞）が濃縮されている場合に移植用に選抜され得る。かかるＡＢＣＢ５（＋）が濃縮された細胞調製物は移植の奏功率を増大させる。いくつかの態様では、眼細胞調製物（例えば移植片）は、全細胞数の少なくとも０．０３％がＡＢＣＢ５（＋）である場合移植用に選抜され得る。いくつかの態様では、眼細胞調製物は、全細胞数の少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１０％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２０％、少なくとも０．３０％、少なくとも０．４０％、少なくとも０．５０％、少なくとも０．６０％、少なくとも０．７０％、少なくとも０．８０％、少なくとも０．９０％、少なくとも１．０％、少なくとも２．０％、少なくとも３．０％、少なくとも４．０％、少なくとも５．０％、少なくとも１０．０％、少なくとも２０．０％、少なくとも３０．０％、少なくとも４０．０％、少なくとも５０．０％、少なくとも６０．０％、少なくとも７０．０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％がＡＢＣＢ５（＋）である場合、移植用に選抜される。
【００４９】
本発明のＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、人工移植片、例えば人工角膜移植片などを調製／作製するためにも用いられ得る。かかる移植片は、無細胞性コラーゲンまたは他の無細胞性生体適合性材料製であり得る。いくつかの態様では、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は無細胞性マトリックス上に播種されて、人工移植片、例えば人工角膜などを生ずる。
眼移植片などの外用投与用の組成物は、当分野で公知の任意の手段、例えばRama, J. et alによって記載されたもの［５］などによって投与され得る。
本発明の方法の一例を次に挙げる。ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が入手され、フィブリンゲル上で培養される（例えば、致死放射線照射されたフィーダー細胞、例えば3T3-J2細胞を用いる）。３６０°の角膜輪部の角膜周縁結膜切開術（peritomy）が実施され、線維血管性の角膜パンヌスが慎重に除去される。フィブリン培養されたＡＢＣＢ５（＋）上皮シートが、角膜輪部に及ぶ準備された角膜創傷ベッド（例えば、結膜のイングロースとの競合を減らすために約２〜３ｍｍ）上に置かれる。結膜は次にフィブリンシート端部の上に縫合糸（例えば８．０バイクリル縫合糸）で縫合され、シートの境界を保護し、表面に接着するのを助ける。眼瞼は閉鎖されて（例えばSTERI-STRIP（商標）（3M（商標）NEXCARE（商標））を用いる）１週間眼帯したままにされる。
【００５０】
本発明は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えば、ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞またはＡＢＣＢ５（＋）角膜幹細胞）を用いて全能性、複能性、または多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））を作製することも考え、それらからは他の細胞、組織、および／または動物個体が発生し得る。したがって、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が全能性、複能性、または多能性幹細胞になるよう直接的にリプログラミングまたは誘導する方法が、本発明の一部の側面では提供される。用語「リプログラミング」は、本明細書で用いられる場合、細胞または細胞の集団（例えば単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞）の発生能を逆転させるプロセスを指す。したがって、リプログラミングは、細胞をより高い発生能を有する状態にさせる（すなわちより分化していない状態に戻す）プロセスを指す。リプログラミングされるべき細胞は、リプログラミングに先立って部分的または最終的に分化し得る。いくつかの態様では、リプログラミングは、全能性、複能性、または多能性状態を有する細胞の分化状態に至る分化状態の完全または部分的な逆転（すなわち細胞の発生能の増大）を包含する。いくつかの態様では、リプログラミングは、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を全能性、複能性、または多能性状態にさせて、細胞が胚性幹細胞の発生能（すなわち胚性幹細胞の表現型）を有するようにすることを包含する。リプログラミングは、さらなる操作を受けたときに全能性、複能性、または多能性状態への完全なリプログラミングを細胞がよりされやすくなる状態に至る、細胞の分化状態の部分的な逆転も包含している。
【００５１】
全能性、複能性、または多能性幹細胞は、いくつかのリプログラミング因子を用いてＡＢＣＢ５（＋）幹細胞から作製され得る（本明細書では「リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞」と呼ばれる）。所産の細胞は単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞よりも高い発生能を有し、したがってさらなる操作用の幹細胞の供給源となり得る。「リプログラミング因子」は、本明細書において用いられる場合、発生能を変えさせる因子を指し、その発現は、あまり分化していないまたは未分化の状態（例えば、多能性状態または部分的多能性状態の細胞）への細胞（例えば単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞）のリプログラミングに寄与する。リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ‐ＭＹＣを含む（または「山中因子」として知られており［３２］、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。他のリプログラミング因子は、限定なしに、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＮＲ５Ａ２、ＬＩＮ２８、１‐ＭＹＣ、ｎ‐ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＢＸ３、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８を含む。上記の転写因子の２つ以上のいずれかの組み合わせが用いられて、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞をリプログラミングし得る。細胞をリプログラミングして全能性、複能性、または多能性状態にする方法はStadtfeldおよびHochedlingerによって記載されており［３３］、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５２】
リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞は、本発明のいくつかの態様では、基礎的および／または臨床的な適用のために用いられ得、それらは疾患モデリング、薬物毒性スクリーニング／創薬、遺伝子治療、および細胞置換療法を含む。
例えば、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞は種々の異常（例えば遺伝学的な異常）を処置するために用いられ得、それらは限定なしに鎌状赤血球貧血、パーキンソン病、血友病Ａ、虚血性心疾患などの心疾患、アルツハイマー病、脊髄損傷、脳卒中、熱傷、糖尿病、骨関節炎、および関節リウマチを含む。
いくつかの態様では、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞は、臓器移植において患者と遺伝学的に適合した細胞型を提供するために用いられ得る。
リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の他の基礎的および臨床的使用も考えられる。
【００５３】
リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞から分化した細胞を作製するための方法も、本明細書において提供される。方法は、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞中において、より成熟した分化した細胞型（例えば血球、血小板、間質細胞、骨細胞、筋細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、または神経細胞など）への分化を促進するために必要ないずれかの１つまたは２つ以上の分化因子を発現させることを含んでなる。本明細書で用いられる場合、用語「分化因子」は、発生能を変えさせる因子、例えば蛋白質、または細胞が所望の細胞型に分化するよう誘導する低分子を指す。例えば分化因子は細胞の発生能を低下させる。特定の細胞型への分化は複数の分化因子の同時的および／または連続的な発現を必要とし得る。方法は、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞を分化を促進する条件下において育て、分化した細胞を生じさせることをさらに含んでなる。
【００５４】
したがって、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞は本発明の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞（例えば、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞または単離されたＡＢＣＢ５（＋）ＲＰＥ幹細胞）から作製され得、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞は分化して１つまたは２つ以上の所望の細胞型になり得る。「幹細胞」は、本明細書で用いられる場合、自己複製する能力を有し且つ複数の細胞型に分化する発生能を有する未分化のまたは部分的に分化した細胞を指す。「多能性細胞」は、種々の条件下において全ての３つの胚葉、すなわち内胚葉（例えば腸組織）、中胚葉（血液、筋肉、および血管を含む）、および外胚葉（例えば皮膚および神経）に特徴的な細胞型に分化する発生能を有する細胞である。「複能性」細胞は、３つの胚葉全てではないが１つまたは２つ以上の胚葉の細胞に分化する発生能を有する細胞である。それらの細胞は例えば成体幹細胞、例えば造血幹細胞および神経幹細胞などを含む。「全能性」細胞は、個体のあらゆる分化した細胞（胚体外組織を含む）に分化する発生能を有する細胞である。幹細胞は何らかの分化した表現型の傾向を有し得る。ただし、これらの細胞は逆転して幹細胞表現型を再発現するように誘導され得る。このプロセスは「脱分化」または「リプログラミング」と呼ばれる。
【００５５】
本発明の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞、リプログラミングされたＡＢＣＢ５（＋）細胞、および分化した細胞は、それらの細胞型用の標準的な条件下において操作され得る。細胞の処置はin vitro、ex vivo、またはin vivoで実施され得る。例えば、細胞は個体中または培養培地中に存在し得る。操作は高または低酸素条件下で実施され得る。
「培養培地」は、細胞の生存度を維持し増殖を支える栄養素を含有する。典型的な培養培地は、塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースもしくは他の糖、抗生物質、血清もしくは血清代替品、および／またはペプチド成長因子などの他の成分を含む。全能性、複能性、および多能性細胞を誘導および維持するために用いる細胞培養培地は、当分野で公知である。培養培地は、細胞特異的な成長因子、例えばアンギオゲニン、骨形成蛋白質‐１、骨形成蛋白質‐２、骨形成蛋白質‐３、骨形成蛋白質‐４、骨形成蛋白質‐５、骨形成蛋白質‐６、骨形成蛋白質‐７、骨形成蛋白質‐８、骨形成蛋白質‐９、骨形成蛋白質‐１０、骨形成蛋白質‐１１、骨形成蛋白質‐１２、骨形成蛋白質‐１３、骨形成蛋白質‐１４、骨形成蛋白質‐１５、骨形成蛋白質受容体ＩＡ、骨形成蛋白質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体ニュートロフィック因子、毛様体ニュートロフィック因子受容体‐α、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球走化因子２‐α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２‐β、β‐内皮細胞成長因子、エンドセリア１、上皮成長因子、上皮由来好中球誘引因子、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、
【００５６】
線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子ｂ、線維芽細胞増殖因子ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体‐α‐１、グリア細胞株由来好中球因子受容体‐α‐２、ＧＲＯ、ＧＲＯ‐α、ＧＲＯ‐β、ＧＲＯ‐γ、ヘパリン結合性上皮成長因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合蛋白質、ケラチノサイト増殖因子、白血病阻止因子、白血病阻止因子受容体‐α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン‐３、ニューロトロフィン‐４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体‐α、血小板由来成長因子受容体‐β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子‐α、トランスフォーミング増殖因子‐β、トランスフォーミング増殖因子‐β‐１、トランスフォーミング増殖因子‐β‐１‐２、トランスフォーミング増殖因子‐β‐２、トランスフォーミング増殖因子‐β‐３、トランスフォーミング増殖因子‐β‐５、潜在型トランスフォーミング増殖因子‐β‐１、トランスフォーミング増殖因子‐β結合蛋白質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子‐β結合蛋白質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子‐β結合蛋白質ＩＩＩ、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮成長因子、ならびにそれらのキメラ蛋白質および生物または免疫活性フラグメントも含み得る。
【００５７】
細胞の分化状態が評価され得、これにはかかる評価を行うための当分野で公知の任意の方法を用い得る。例えば、本明細書に記載の方法に従って処置された細胞の分化状態は、同じリプログラミングもしくは分化因子の発現をもたらすＤＮＡを送達するウィルスベクターを用いたＤＮＡによって処置された細胞または未処置の細胞と比較され得る。
以下の例は本発明の実施の具体例を示すために提供されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。当業者には当然のことながら、本発明は種々の組成物および方法としての適用を見いだすであろう。
【実施例】
【００５８】
例
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＮＯＤ．Ｃｇ-Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）、Ｂ６；ＳＪＬ-Ｔｇ（ＡＣＴＦＬＰｅ）９２０５Ｄｙｍ／Ｊ、およびＢ６．ＦＶＢ-Ｔｇ（ＥＩＩａ-ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／ＪマウスはJackson Laboratory（メイン州バーハーバー）から購入された。Ａｂｃｂ５ノックアウト（ＫＯ）マウスは下記のように作製された。全ての動物はボストン小児病院およびスケペンス眼研究所（ハーバード大医学部）の施設ガイドラインに従って維持された。４〜１２週齢のマウスが以下の実験に用いられた。
【００５９】
＜例１．ＡＢＣＢ５は角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）の分子マーカーである＞
ＡＢＣＢ５が哺乳動物の眼の遅い細胞周期の標識保持角膜輪部幹細胞のマーカーであるかどうかを検討するために、in vivoのＢｒｄＵベースの「瞬間標識追跡」実験［２］が実施された。Ａｂｃｂ５野生型（ＷＴ）マウスが９日間に渡って毎日の全身ＢｒｄＵ投与を受け、遅い細胞周期の細胞を標識した（瞬間標識）。次に８週間のＢｒｄＵなしの期間（追跡）があり、その後で角膜輪部幹細胞の標識保持の評価を行った（図５Ａ）。解離したマウス角膜および角膜輪部上皮細胞のフローサイトメトリー分析は、ＢｒｄＵ標識保持細胞が角膜輪部において検出可能であるが、角膜中央では検出可能でないということを明らかにした（図１Ｂおよび図５Ｂ）。全厚のマウス角膜のＢｒｄＵ免疫組織化学染色は、標識保持角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）が以前の知見と一致して［２］マウス角膜輪部上皮の基底層にあるということを裏付けた（図１Ｃ）。さらに、標識保持ＬＳＣはＡＢＣＢ５を発現した（図１Ｃ）。フローサイトメトリーによる定量は、ＡＢＣＢ５（＋）細胞が顕著にＢｒｄＵ陽性であると立証した（９０．５±０．５％、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。ＡＢＣＢ５／ＢｒｄＵ二重陽性細胞が全ての角膜輪部上皮細胞のうち１．８％を構成した４（図１Ｄ）。
【００６０】
マウスによる知見と同様に、ヒトＡＢＣＢ５（＋）細胞も角膜輪部上皮の基底層にあった（図１Ｅおよび図６）。免疫組織化学分析は、ＡＢＣＢ５（＋）細胞が角膜輪部幹細胞マーカーΔΝｐ６３αを共発現すること（図１Ｆおよび１Ｇ）、角膜分化マーカーＫＲＴ１２の発現の不在を示した（図１Ｈ）。フローサイトメトリーは、ＡＢＣＢ５（＋）細胞がかなりのレベルのΔΝｐ６３α（それぞれ２８．９±５．７％および０．１±０．１％、Ｐ＝０．０３６４）を発現するがＡＢＣＢ５（−）細胞は発現しないということも示しており（図１Ｇ）、本質的に全てのΔΝｐ６３α（＋）ＬＳＣがＡＢＣＢ５を発現していることを示した（ΔΝｐ６３α（＋）ＬＳＣは９５．３±４．８％、ΔΝｐ６３α（−）細胞は３．６±２．１％。Ｐ＝０．００３２）。さらに、ヒト角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）患者は健康なドナーと比較して有意に減少したＡＢＣＢ５（＋）の度数を示した（それぞれ２．８±１．６％および２０．０±２．６％、Ｐ＜０．０００１）（図１Ｉ、図７および８、表１）。
【表１】
2019189600.tif 000002
【００６１】
Ａｂｃｂ５ＷＴマウスの標識保持角膜輪部幹細胞および健康なヒトのΔΝｐ６３α（＋）ＬＳＣの表面へのＡＢＣＢ５の発現と、臨床ＬＳＣＤ患者における減少したＡＢＣＢ５（＋）細胞の度数という並行して得られた知見とは、ＡＢＣＢ５がＬＳＣを標識付けるということを示した。
【００６２】
＜例２．ＡＢＣＢ５は角膜発生および再生を制御する＞
角膜発生および再生にＡＢＣＢ５（＋）ＬＳＣが果たす可能な機能上の役割を検討するために、マウスＡｂｃｂ５遺伝子（GenBank JQ655148）のエクソン１０の欠失を有するＡｂｃｂ５ＫＯマウスが作製された。エクソン１０（マウスＡｂｃｂ５遺伝子）は分子の機能上重要な細胞外ドメインをコードし、ヒトＡＢＣＢ５の細胞外ループに関係したアミノ酸残基４９３〜５０８（GenBank NM_178559）に対して相同である。
【００６３】
条件付きノックアウトターゲティング構築物が組み換え（すなわち、組み換えによる遺伝子操作）によってまず作製された［２５］。簡潔には、２つのｌｏｘＰ部位に挟まれたネオマイシン耐性カセット（プラスミドｐＬ‐４５２に基づく）が、ＢＡＣクローンRP23-161L22中、マウスＡｂｃｂ５遺伝子のエクソン１０（GenBank受入番号JQ655148）の４５８塩基対上流に挿入された（図２Ａおよび２Ｂ）。ＢＡＣクローンのターゲティング領域はギャップ修復によってpL-253プラスミド中に回収された。回収されたプラスミドはエクソン１０の上流の６００６塩基対（これは挿入されたｎｅｏカセットを含んでいない）とエクソン１０の下流の６３８４塩基対とを含有した。ネオマイシン耐性カセットがＣｒｅリコンビナーゼのアラビノース誘導によって切り出され、エクソン１０の上流の１つのｌｏｘＰ部位を残した。２つのＦＲＴ部位および１つのｌｏｘＰ部位によって挟まれたネオマイシン耐性カセット（プラスミドpL-451に基づく）が、エクソン１０の４６０塩基対下流に挿入されて、ターゲティング構築物を完成した。ターゲティングプラスミドはＤＮＡシーケンシングおよび制限酵素マッピングによって点検された。線状化されたプラスミドがＴＣ１（１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ由来）胚性幹（ＥＳ）細胞にトランスフェクションされ、G418（Sigma-Aldrich、ミズーリ州）およびフィアルリジン（Moravek Biochemicals、カリフォルニア州）によって選抜された。耐性コロニーは増殖させられ、ロングレンジＰＣＲによってスクリーニングされて、ターゲティングされたクローンを同定した［２２］。左腕は5'-GTTGAGGGGAGCAGCCAGAGCAAGGTGAGAAAGGTG-3'（配列番号１）および5'-TTAAGGGTTATTGAATATGATCGGAATTGGGCTGCAGGAATT-3'（配列番号２）プライマーによって増幅され、６２５０塩基対のＰＣＲ産物を生じた（図２Ｂ）。
【００６４】
右腕は5'-TGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT-3'（配列番号３）および5'-CTGGTCCCTCTCCTGTGATCTACACAGGCC-3'（配列番号４）プライマーによって増幅され、６３８４塩基対のＰＣＲ産物を生じた（図２Ｂ）。２つのＡｂｃｂ５をターゲティングされたＥＳクローンが同定された。これらのクローンは増やされ、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入され、次に偽妊娠雌の子宮に移された。高率キメラ雄マウス（Ａｂｃｂ５ｎｅｏ‐ｌｏｘＰ／ｗｔ）がＣ５７ＢＬ／６背景に掛け合わされて生殖系列伝達を得た。Ａｂｃｂ５ｎｅｏ‐ｌｏｘＰアレルの生殖系列伝達は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって、5'-GGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGG-3'（配列番号５）、5'-GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3'（配列番号６）、および5'-TTTCAGCTTCAGTTTATCACAATGTGGGTT-3'（配列番号７）プライマー（３８５塩基対のターゲティングされたアレルおよび２８４塩基対のＷＴアレルを増幅するように設計されている）を用いて確かめられた。ヘテロ接合のＡｂｃｂ５ｎｅｏ‐ｌｏｘＰマウスは次にｈＡＣＴＢ‐ＦＬＰｅトランスジェニックマウス［２６］と掛け合わされて、ネオマイシン耐性カセットを除去した。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析が実施されて、Ａｂｃｂ５ｌｏｘＰ／ｗｔマウスのゲノム中のネオマイシン耐性カセットの除去が、5'-ACTTGGTGCGGTGACTCTGAATTTTGC-3'（配列番号８）および5'-TAGCAACATTTCTGGCATTTTAGGCTG-3'（配列番号９）プライマー（４９４塩基対のネオマイシン耐性カセット‐欠失アレルおよび３９０塩基対のＷＴアレルを増幅するように設計された）を用いて確かめられた。Ａｂｃｂ５ＫＯ動物におけるＡＢＣＢ５蛋白質発現の消滅はマウス組織のウェスタンブロットによって確認された（図２Ｃ）。Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯ細胞溶解液が、モノクローナルＡＢＣＢ５抗体3C2-1D12［６、２７］（５．５μｇ／ｍｌ）またはα‐チューブリンウサギポリクローナル抗体（１：５０００希釈）（Abcam、マサチューセッツ州）を用いてイムノブロットされた。ＨＲＰ接合特異的２次抗体（１：５０００希釈）（Jackson ImmunoResearch、ペンシルバニア州）による処置後に、増強された化学発光によってフィルム上で信号が可視化された。
【００６５】
ＡＢＣＢ５機能の完全な喪失の結果を確認するために、Ａｂｃｂ５ｌｏｘＰマウスをＥｌｌａ‐Ｃｒｅマウス（これはＣｒｅリコンビナーゼを受精卵の段階において発現する）［１４、１５］と交配することによって、マウスＡｂｃｂ５遺伝子のエクソン１０が欠失させられた（図２Ｂ）。２つのｌｏｘＰ部位間のゲノム領域の欠失は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって、5'-GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3'（配列番号１０）、5'-GCAAATGTGTACTCTGCGCTTATTTAATG-3'（配列番号１１）、および5'-TGGTGCAGACTACAGACGTCAGTGG-3'（配列番号１２）プライマー（３２２塩基対のｃｒｅ欠失アレル（ヌル）および１１３塩基対のＷＴアレルを増幅するように設計されている）を用いて確かめられた（図２Ｃ）。エクソン１０の生殖系列欠失を有するヘテロ接合のＡｂｃｂ５ｎｕｌｌ／ＷＴマウスが掛け合わされて、ホモ接合Ａｂｃｂ５ｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ変異体（Ａｂｃｂ５ＫＯマウス）を作製した。マウスは１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ／Ｃ５７ＢＬ／６混合遺伝的背景に維持され、同腹仔が実験分析の対照として用いられた。
【００６６】
Ａｂｃｂ５ＫＯマウスは生産であり、身体検査では出生時にそれらのＷＴ同腹仔と区別不可能であるように見え、スリットランプ検査によって検出可能なＡｂｃｂ５ＫＯ角膜の全体的な解剖学的障害はなかった（図２Ｄ）。しかしながら、変異体角膜の組織学的分析は、ＷＴ対照と比較して角膜上皮の扁平化を特徴とする重大な発生異常を示し、角膜中央では上皮細胞数がかなり減少しており、角膜輪部では減少していなかった。これはヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色、およびフローサイトメトリーによって示された（角膜中央：それぞれ２６８８±３９９細胞および４４２７±３４６細胞、Ｐ＝０．０１６５。角膜輪部：それぞれ３０１５±４３３細胞および３６２９±９４細胞、Ｐ＝０．２３７７）（図２Ｄおよび図９）。Ａｂｃｂ５ＫＯ角膜は、ＬＣビオチン染色によって確認したところ重度の上皮タイトジャンクション欠損も示した（図２Ｅ）。変異体マウスは、ＷＴマウスと比較して有意に減少した角膜輪部および角膜のＰＡＸ６および角膜ＫＲＴ１２の発現を示した（角膜輪部ＰＡＸ６はそれぞれ０．３±０．３％および１８．０±４．６％、Ｐ＝０．０１８１。角膜ＰＡＸ６はそれぞれ８．３±４．６％および４２．０±７．６％、Ｐ＝０．０１９２。角膜ＫＲＴ１２はそれぞれ６．５±６．５％および４７．７±８．２％、Ｐ＝０．０３８２）（図２Ｅ、図１０）。これは、正常な角膜発生に果たすＡＢＣＢ５の新規の必須な役割を立証している。
【００６７】
＜例３．ＡＢＣＢ５は角膜輪部幹細胞の静止を制御する＞
角膜再生が完全なＡＢＣＢ５機能に依存的かどうかを確認するために、Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＷＴマウスが角膜中央上皮創面切除創傷を受け、次に角膜再生の評価が行われた（図１１Ａ〜１１Ｄ）。ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ体重、Hospira、イリノイ州）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Burns Veterinary Supply、ニューヨーク州）の腹腔内注射による麻酔、次に各眼への０．５％プロパラカイン点眼液（Akorn、イリノイ州）の１滴の外用後に、２ｍｍのトレフィンによって角膜中央の部位を画定し、基底膜を無傷に残したまま小型メスによって円内の上皮を除去することによって２ｍｍ径の上皮創傷が作られた。各動物について、手術は右眼に実施された。Ak-Spore眼軟膏（バシトラシン亜鉛、ネオマイシン硫酸塩、および硫酸ポリミキシンＢ。Akorn、イリノイ州）が創傷の直後に両眼に塗布され、次の４８時間は毎日２回塗布されて、角膜の感染および乾燥を予防した。１ｍｇ／ｋｇの用量の術後４８時間に渡る１２時間毎のBuprenex（Reckitt Benckiser Pharmaceuticals、バークシャー、３０英国）の皮下注射によって無痛がもたらされた。創傷治癒は既出のように追跡された［２９］。動物は術後４８時間目に安楽死させられ、角膜上皮タイトジャンクションの健全性が既出のように実施されたＬＣ‐ビオチン染色法を用いて評価された［３１］。簡潔には、ＬＣ‐ビオチン染色溶液が、１ｍｇ／ｍｌのEZ-Link-Sulfo-NHS-LC-ビオチン（Pierce、イリノイ州）をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Lonza、メリーランド州）＋２ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＣａＣｌ２中に溶解することによって調製され、安楽死時に１５分間、創傷有りおよび創傷なしの眼に加えられた。眼はＰＢＳ（Lonza、メリーランド州）によって濯がれて摘出され、凍結切片作製用にTissue-Teck OCT（Sakura Finetek、カリフォルニア州）中に置かれた。
【００６８】
Ａｂｃｂ５ＷＴとＡｂｃｂ５ＫＯマウスとの間で創傷閉鎖の速度に有意な差は観察されなかった（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。しかしながら、組織学的分析は、Ａｂｃｂ５ＫＯマウスではＡｂｃｂ５ＷＴマウスと比較して重度に異常な角膜復元を明らかにした。これは、上皮の非常に乱れた外見と減少した上皮細胞数（それぞれ４０３．３±２９．７および７３７．２±２８．２、Ｐ＜０．０００１）（図２Ｆおよび図１２）、増強されたＫｉ６７発現によって示されるかなり増大した細胞増殖（角膜輪部：それぞれ５４．０±５．０％および０．３±０．２％、Ｐ＜０．０００１。角膜：それぞれ４１．２±１２．８％および１．０±０．５％、Ｐ＝０．０２５７）（図２Ｇ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって示されるアポトーシスのかなり増強された割合（角膜輪部：それぞれ４１．２±１２．８％および１．０±０．５％、Ｐ＝０．００１。角膜：それぞれ４９．０±１．０％および０．４±０．３％、Ｐ＜０．０００１）を特徴とする（図２Ｈおよび図１３）。
【００６９】
解離したマウス角膜輪部上皮細胞の瞬間標識追跡ＢｒｄＵ標識（図５Ａおよび５Ｂ）およびフローサイトメトリー分析は、初期の１週間の追跡期間後に、Ａｂｃｂ５ＫＯ由来およびＡｂｃｂ５ＷＴ由来標本のＢｒｄＵ標識された上皮細胞数に有意な差は存在しないということを明らかにし、これはＡｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴ角膜輪部細胞による同等のＢｒｄＵ取り込みを示していた（それぞれ１．９±０．７％および１．５±０．４％、Ｐ＝０．６９７１）。対照的に、８週間の追跡期間後には、標識保持ＬＳＣの度数は、Ａｂｃｂ５ＫＯマウスではＡｂｃｂ５ＷＴ対照と比較して顕著且つ有意に（８９％）減少していた（度数はそれぞれ０．１±０．１％および０．９±０．３％、Ｐ＝０．０１５２）（図３Ａおよび３Ｂ）。これは、ＡＢＣＢ５機能の消滅が、通常は静止ＬＳＣの細胞増殖を誘導するということを立証している。この結果と一致して、Ｋｉ６７発現（細胞増殖を意味する）は、Ａｂｃｂ５ＫＯ角膜ではＡｂｃｂ５ＷＴ対照角膜と比較して有意に増強されていた（角膜輪部はそれぞれ２４．０±５．０％および１．５±１．５％、Ｐ＜０．０００１。角膜は５３．０±１６．０％対１１．０±２．１％、Ｐ＝０．０２９７）（図３Ｃ）。さらに、実証された増大した増殖と一致して、ＲＮＡ発現のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、ＷＴ対照と比較して、Ｇ０／Ｇ１細胞周期チェックポイントおよび細胞静止を調節する細胞周期制御因子のｐ５３ファミリー（ｐ５３およびｐ６３）およびＣｉｐ／Ｋｉｐファミリー（ｐ２１およびｐ２７）のＡｂｃｂ５ＫＯ角膜上皮細胞における有意な下方制御を明らかにした（ＷＴのｐ５３の４１．６±１６．４％、Ｐ＝０．０３７７。ＷＴのｐ６３の３１．２±１３．８％、Ｐ＝０．０１５５。ＷＴのｐ２１の３７．２±１３．８％、Ｐ＝０．０１９７。ＷＴのｐ２７の３６．８±７．０％、Ｐ＝０．００２９）（図３Ｄ）。したがって、ＡＢＣＢ５は遅い細胞周期のＬＳＣの維持に必要である。細胞周期からの脱出はＬＳＣの維持、したがって正常な分化に必須であるので、これらの結果はＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおいて観察された角膜分化不全の説明を提供する（図３Ｅ）。
【００７０】
＜例４．角膜上皮幹細胞疲弊症の処置にＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が果たす再生的な役割＞
ＡＢＣＢ５が移植片中の角膜輪部幹細胞の予期された濃縮用の分子マーカーであり、移植の成果を改善するかどうかを検討するために、移植された角膜輪部上皮細胞の角膜再生能が検討された（図１４Ａおよび１４Ｂならびに図１５Ａ〜１５Ｃ）。マウスドナー角膜輪部上皮細胞が、誘導された角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の同系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウスの眼に移植された。ヒトドナー角膜輪部上皮細胞が、誘導された角膜上皮幹細胞疲弊症の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ‐ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの眼に移植された。４種類のドナー移植片、すなわち（ｉ）ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部上皮細胞、（ｉｉ）ＡＢＣＢ５（−）角膜輪部上皮細胞、（ｉｉｉ）未分離の角膜輪部上皮細胞、および（ｉｖ）細胞を含有しない移植片（フィブリンゲル担体のみ）が実施された（フィブリンゲル担体／移植片あたり５００細胞、１片眼移植片／マウス、ｎ＝５マウス／処置群）（表２）。
【表２】
2019189600.tif 000003
【００７１】
移植の３日前に、マウスおよびヒトのドナー細胞がフィブリン担体上に播種された。担体は、フィブリノーゲンおよびトロンビンストック溶液（TISSUCOL-Kit Immuno、Baxter、独国）を１．１％ＮａＣｌおよび１ｍＭのＣａＣｌ２中に溶解して、既出のように１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンおよび３ＩＵ／ｍｌのトロンビンの最終濃度にすることによって調製された［３０］。移植日に、Algerbrush II角膜錆取器と０．５ｍｍのバー（AMBLER Surgical、ペンシルバニア州）によって角膜および角膜輪部上皮を除去することによって、麻酔されたレシピエントマウスの両眼性ＬＳＣＤが誘導された［１６］。ＬＳＣＤの誘導に続いて、レシピエントマウスはフィブリンゲル担体ベースの移植片を受容し、それらは４つの縫合線によって縫合された。
【００７２】
眼瞼が８-０ナイロン縫合糸によって縫合され、眼を閉鎖したままにした。Ak-Spore眼軟膏（バシトラシン亜鉛、ネオマイシン硫酸塩、および硫酸ポリミキシンＢ。Akorn、イリノイ州）が創傷の直後に両眼に塗布され、次の４８時間は毎日２回塗布されて、角膜の感染および乾燥を予防した。術前に与えられた５〜１０ｍｇ／ｋｇのMetacam（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals、コネチカット州）の皮下注射、および術後２４時間に渡る１２時間毎の０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇのBuprenex（Reckitt Benckiser Pharmaceuticals、バークシャー、英国）の皮下注射によって、無痛がもたらされた。さらに、術後回復後に、マウスは抗炎症Inflanefran Forte点眼液（Allergan、マサチューセッツ州）によって最初の５日間、次に１％アバスチン（ベバシズマブ、Genentech、カリフォルニア州）点眼液によって毎日５日間処置された。スリットランプ検査が安楽死まで毎週実施された。眼は死後摘出され、１０％緩衝ホルマリン中でメタクリレート包埋用に固定（Technovit、Heraeus Kulzer、独国）またはTissue-Teck OCT中で瞬間凍結された（Sakura Finetek、カリフォルニア州）。
【００７３】
同系マウスＡｂｃｂ５（−）角膜輪部細胞移植片または担体のみの負の対照のレシピエントは、移植の５週間後に分析されたときに、不透明な角膜、浸潤する杯細胞を伴う上皮結膜化、および分化したＫＲＴ１２（＋）細胞の不在（それぞれ０％）を示した。これは持続性のＬＳＣＤと一致している（図４Ａ、図１６）。未分離の角膜輪部細胞を含有する同系移植片のレシピエントは部分的な角膜復元を示し、検出可能な分化したＫＲＴ１２（＋）細胞が角膜中央に存在したが（細胞の１７％。ＡＢＣＢ５（−）または担体のみの処置レジメンと比較して有意に増強された。Ｐ＜０．０１）、ＬＳＣＤに特徴的な杯細胞および上皮結膜化の残存を示した（図４Ａ、図１６）。対照的に、同系ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞移植片は、透明な角膜の発生と正常な組織像をレシピエントマウスにもたらし、より多い分化したＫＲＴ１２（＋）角膜上皮細胞数を生じさせ（細胞の４７％。未分離またはＡＢＣＢ５（−）角膜輪部細胞の処置レジメンと比較または担体のみの対照と比較して有意に増大した。Ｐ＜０．００１）、杯細胞形成または上皮結膜化を防いだ（図４Ａ、図１６）。
【００７４】
単離したてのヒトＡＢＣＢ５（−）角膜輪部細胞移植片または担体のみの負の対照の免疫不全ＮＳＧレシピエントも、上皮結膜化と分化したＫＲＴ１２（＋）細胞の不在（それぞれ０％）とを移植の５週間後に示した。これは持続性のＬＳＣＤと一致している（図４Ｂ、図１７および１８）。単離したてのヒト未分離角膜輪部細胞移植片の免疫不全ＮＳＧレシピエントは、マウス未分離角膜輪部細胞移植実験の知見と同様に部分的な角膜復元を示し、分化したＫＲＴ１２（＋）細胞の検出可能性を角膜中央に有したが（細胞の１２％。ＡＢＣＢ５（−）または担体のみの処置レジメンと比べて有意に増強された。Ｐ＜０．０１）、ＬＳＣＤに特徴的な上皮結膜化の残存を示した（図４Ｂ、図１７）。驚くべきことに、単離したてのヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞移植片のみが、透明な角膜の発生と正常な組織像をレシピエントＮＳＧマウスにもたらし、多数のＫＲＴ１２＋細胞を含有する重層上皮層の存在（細胞の３１％。担体のみと比較またはＡＢＣＢ５（−）もしくは未分離角膜輪部細胞処置レジメンと比較して有意に増大した。Ｐ＜０．００１）およびＬＳＣＤに特徴的な上皮結膜化の不在をもたらした（図４Ｂ、図１７）。
【００７５】
ヒトドナー細胞がこの異種移植モデルにおいて角膜復元を引き起こしたということを確かめるために、再生した角膜組織は、ＲＴ‐ＰＣＲによって、ヒト起源の全細胞の識別因子であるヒト特異的β２ミクログロブリン（β２Μ）の発現について、また、角膜分化のマーカーとしてのヒト特異的ＰＡＸ６およびＫＲＴ１２の発現について試験された。ヒトＡＢＣＢ５（＋）または未分離ヒト角膜輪部細胞を移植されたレシピエントの角膜上皮のみが、ヒト特異的β２Μ、ＰＡＸ６、およびＫＲＴ１２転写物を含有していた。一方、角膜復元を示さなかった担体のみを移植された対照の眼は含有しておらず、これはＲＴ‐ＰＣＲ試験系のヒト特異性を裏付けた（図４Ｂ）。さらに、未分離またはＡＢＣＢ５（＋）細胞移植片と比較してＡＢＣＢ５（−）の同様の生存率にもかかわらず（表２、図１５Ａ〜１５Ｃ）、ＡＢＣＢ５（−）細胞を移植された眼はヒト特異的なβ２Μ、ＰＡＸ６、またはＫＲＴ１２転写物発現を欠いていた（図４Ｂ）。これは、長期生着能がヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞集団に専ら含まれているということを示している。
【００７６】
本明細書に記載の例は、ＡＢＣＢ５（＋）細胞の度数が角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）において減少しているということ、ＡＢＣＢ５陽性は角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）が濃縮された遅い細胞周期およびΔＮｐ６３α陽性の集団の優先的な特徴であるということ、予期して単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞が専らＬＳＣＤを回復させる能力があるということを実証している。これは、ＡＢＣＢ５陽性がＬＳＣを定義するということを示唆している。これらの発見は、Ａｂｃｂ５遺伝子ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるＡＢＣＢ５の機能喪失がＬＳＣＤを引き起こし、ＬＳＣの自己複製能力の消滅によってＬＳＣ依存的な角膜発生および再生を損なうということを示すデータによってさらに裏付けられる。これらの結果はいくつかの重要な意味を有している。
【００７７】
第１に、ヒトＬＳＣの上首尾な濃縮はＬＳＣＤ治療の分野を決定的に進歩させる可能性を有している。なぜならば、長期的な臨床的奏功は移植片中にある角膜輪部幹細胞の度数に依存することが示されたからであり［５］、本発明以前には予期された角膜輪部幹細胞濃縮のマーカーは利用可能でなかったからである。実際に、これらの例は、移植片中への予期された角膜輪部幹細胞濃縮がＬＳＣＤの治療奏功率をかなり向上させ得るということを示している。角膜輪部幹細胞表面のＡＢＣＢ５発現は、モノクローナル抗体ベースの細胞ソーティング戦略とかなりの角膜輪部幹細胞濃縮とを本明細書に記載したように可能にする。これは、細胞内発現されたΔΝｐ６３αまたはそれに代わる角膜輪部幹細胞マーカー候補［１７］とは違っており、それらはＬＳＣＤからの回復の能力があるＬＳＣの予期された単離に上首尾に用いられては来なかった。このことは、臨床の角膜輪部幹細胞移植のための角膜輪部幹細胞単離用にも可能なマーカーとしてのＡＢＣＢ５の有望性を強調している。
【００７８】
第２に、本明細書に記載のデータは、幹細胞の静止の維持に果たすＡＢＣＢ５の新規のin vivoの生理的役割を明らかにしている。具体的には、新規に作製されたＡｂｃｂ５ＫＯマウスにおけるＡＢＣＢ５の機能の消滅は、遅い細胞周期のＬＳＣの喪失と、Ｇ０／Ｇ１細胞周期進行を制御する分子（角膜輪部幹細胞マーカーΔΝｐ６３αを含む）の阻害された発現とをもたらした。これは、通常は静止ＬＳＣによるＡＢＣＢ５とΔΝｐ６３αとの観察された共発現を説明し、Ａｂｃｂ５ＫＯ角膜において観察された分化した細胞の減少を伴う角膜輪部幹細胞増殖とアポトーシスとの誘導の説明を提供する。なぜなら、細胞が細胞周期から脱出する能力は幹細胞プールの維持および正常な分化の両方にとって重要だからである。
【００７９】
追加の材料と方法:
ＢｒｄＵ瞬間標識追跡実験：
４週齢のＡｂｃｂ５ＫＯマウスおよびそれらのＡｂｃｂ５ＷＴ同腹仔が、９日連続の５０ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、BD Pharmingen、カリフォルニア）の毎日の腹腔内注射を受けた（図５Ａ）。最後のＢｒｄＵ注射を受けた１週間または８週間後に屠殺されたＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスから単離された角膜および角膜輪部上皮細胞が、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光によって分析された。年齢を合わせたＡｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯの同腹仔の角膜輪部および角膜中央上皮細胞が実験の対照として用いられた。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学染色が用いられて、角膜輪部および角膜中央の上皮中にあるＢｒｄＵ陽性およびＢｒｄＵ陰性細胞の度数を求めた。
【００８０】
ヒトおよびマウス角膜細胞の単離：
同意ドナーに由来する死体ヒト角膜強膜組織がHeartland Lions Eye Banks（カンザスシティ、ミズーリ州）、Bascom Palmer Eye Institute（マイアミ、フロリダ州）、およびCarver College of Medicine（アイオワシティ、アイオワ州）から入手された。強膜辺縁部、虹彩、および櫛状靱帯の除去後に、角膜輪部および角膜中央が顕微鏡下で解剖された。角膜輪部および角膜中央組織は続いて２．４単位／ｍｌのDispase II（Roche Diagnostics、インディアナ州）と一緒に３７℃で１時間インキュベーションされ、次に０．５ＭのＥＤＴＡ（Invitrogen、カリフォルニア州）と一緒のインキュベーションが３７℃で１０回の５分サイクル行われ、上皮細胞を回収した［２２、２３］。マウス角膜輪部および角膜上皮細胞がＡｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスから次のように得られた。ＣＯ２ナルコーシスによる安楽死およびそれに続く眼摘出の直後に、角膜輪部および角膜中央組織がマイクロシザーズによって解剖顕微鏡下で分離され、低Ｃａ２＋ケラチノサイト血清不含培地（KSFM、Invitrogen、カリフォルニア州）中に置かれ、５分間２５０ｇで４℃において遠心された。上清の除去後に、組織ペレットは０．５％トリプシン溶液（Lonza、メリーランド州）中で消化された［２４］。移植実験のためには、ＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）角膜輪部上皮細胞が蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってＡＢＣＢ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）標識を用いて単離された［１８］。
【００８１】
簡潔には、ヒトまたはマウス角膜輪部上皮細胞が、１次ＡＢＣＢ５ｍＡｂ（２０μｇ／μｌ）によって３０分間４℃で標識され、過剰な抗体を除去するために洗浄され、その後に２次抗マウスＦＩＴＣ接合ＩｇＧと一緒の３０分間のインキュベーションが行われた。ＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）ソーティングゲートがModified Digital Vantageセルソーター（Becton DickinsonおよびMGH Pathology Flow Cytometry Core、Simches Research Building、ボストン）に設けられた（図１５Ａ〜１５Ｃに示されている）。７０ＭＷのＵＶレーザーを励起に用いて同定された全てのＤＡＰＩ（＋）細胞（１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ、Sigma-Aldrich、ミズーリ州。ソーティングの直前に添加された）を除外することによって、生細胞のみがソーティング用に選抜された。ＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）のソーティングされた細胞の純度および生存率は、試料が再分析される代表的なソーティング後分析によって求められた（図１５Ａ〜１５Ｃ）。ＡＢＣＢ５（＋）細胞の精製は、マウスＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞では２５５倍の増大（ソーティング前は０．３７％陽性、後は５１％陽性。表２）、ヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部細胞では２９２倍の増大（ソーティング前は０．０３％陽性、後は５９％陽性。表２）をもたらした。ＡＢＣＢ５（−）細胞の濃縮は、マウスおよびヒト試料の両方においてＡＢＣＢ５（＋）細胞の完全な不在をもたらした（表２）。
【００８２】
フローサイトメトリー分析：
ヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部上皮細胞がΔΝｐ６３αまたはＫＲＴ１２を共発現するかどうか、ならびにマウスＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部上皮細胞がＰＡＸ６およびＫＲＴ１２を共発現するかどうかを確認するために２色フローサイトメトリーが用いられ、既出のように実施された［１８］。ヒトおよびマウスのＡＢＣＢ５およびＫＲＴ１２の共発現分析のために、細胞はまずマウス抗ＡＢＣＢ５ｍＡｂと一緒にインキュベーションされ、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ‐ＩｇＧによって対比染色され、次にヤギポリクローナル抗ＫＲＴ１２抗体と一緒のインキュベーションおよびDylight 649ロバ抗ヤギＩｇＧによる対比染色を行った。ヒトＡＢＣＢ５およびΔΝｐ６３α共発現ならびにマウスＡＢＣＢ５およびＰＡＸ６共発現分析のためには、細胞はマウス抗ＡＢＣＢ５ｍＡｂと一緒にインキュベーションされ、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ‐ＩｇＧによって対比染色され、BD Cytofix/Cytoperm緩衝液（BD Biosciences、カリフォルニア州）中で透過処理され、ΔΝｐ６３αまたはＰＡＸ６Ａｂによって染色され、ヤギ抗ウサギAlexa 647‐ＩｇＧによって対比染色された。染色緩衝液またはBD Perm/Wash緩衝液（BD Biosciences、カリフォルニア州）による洗浄ステップが各ステップ間に実施された。２色フローサイトメトリーが、Ｆｌ１（ＦＩＴＣ）およびＦｌ４（Alexa 647および／またはDylight 649）スペクトルの蛍光放出の取得によって、Becton Dickinson FACScan（Becton Dickinson、ニュージャージー州）を用いて既出のように実施された［１８］。マウスＡＢＣＢ５およびＢｒｄＵの共発現分析は、FITC BrdU Flowキット（BD Biosciences、カリフォルニア）を用いてメーカーの説明書に従って実施された。ＡＢＣＢ５（＋）およびＡＢＣＢ５（−）細胞による上記マーカーの発現レベルの統計的な差は、対応がないｔ検定を用いて確認された。Ｐ＜０．０５の両側Ｐ値が有意と見なされた。
【００８３】
ＲＴ‐ＰＣＲおよび定量リアルタイムＰＣＲ：
細胞周期遺伝子の発現分析のためには、RT2 qPCR Grade RNA単離キットを用いて全ＲＮＡがＡｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴ角膜から単離され、次に、メーカーのプロトコールに従ってリバーストランスクリプターゼ‐ＰＣＲ用のRT2 First Strandキットを用いて逆転写された（SABiosciences、カリフォルニア州）。試料は、SYBR-Green qPCRマスターミックス（SABiosciences、カリフォルニア州）、マウス細胞周期アレイ（カタログ番号PAMM-020Z、SABiosciences、カリフォルニア州）、および反応速度論的ＰＣＲ（ABI7700 Sequence Detector、Applied Biosystems、カリフォルニア州）を用いて既出のように試験された［２８］。全ての定量値は、内在性の対照遺伝子グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ‐アクチンに対して正規化された。これは、全ＲＮＡの初期濃度および品質ならびに逆転写反応の効率の変動を説明するためである。Ａｂｃｂ５ＫＯおよびＡｂｃｂ５ＷＴマウスの間の遺伝子発現レベルの統計的な差は一標本ｔ検定を用いて確認された。Ｐ＜０．０５という両側のＰ値が有意と見なされた。ヒト特異的遺伝子転写物の検出には、全ＲＮＡが、移植を受けたマウス眼および無傷のマウスまたはヒト対照角膜からRNAeasy Plus単離キット（Qiagen、カリフォルニア州）を用いて単離され、次にHigh Fidelity RTキット（Applied Biosystems、カリフォルニア州）を用いて転写された。ＰＣＲが、Ｔａｑ２Ｘマスターミックス（New England Biolabs、マサチューセッツ州）および次の遺伝子特異的プライマーを用いて実施された。ヒトβ２‐ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ、NM_004048）：フォワードは5'-GTGTCTGGGTTTCATCCATC-3'（配列番号１３）、リバースは5'-AATGCGGCATCTTCAACCTC-3'（配列番号１４）。ヒトペアードボックス６（ＰＡＸ６、NM_000280.3）：フォワードは5'-CAGCGCTCTGCCGCCTAT-3'（配列番号１５）、リバースは5'-CATGACCAACACAGATCAAACATCC-3'（配列番号１６）。ヒトケラチン１２（ＫＲＴ１２、NM_000223.3）：フォワードは5'-GAAGCCGAGGGCGATTACTG-3'（配列番号１７）、リバースは5'-GTGCTTGTGATTTGGAGTCTGTCAC-3'（配列番号１８）。マウスβ‐アクチン（Ａｃｔｂ、NM_007393）：フォワードは5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3'（配列番号１９）、リバースは5'-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3'（配列番号２０）。
【００８４】
病理組織学および免疫組織化学染色：
完全なマウス眼組織を回収するためには、丸ごと切り離されたマウス頭部が４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定され、次に眼瞼が付いたまま眼が摘出され、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３０％ショ糖中において一晩４℃でインキュベーションされ、Tissue-Tek OCTコンパウンド（Sakura Finetek USA、カリフォルニア州）中に包埋され、瞬間凍結された。各組織塊の代表的なクリオスタット切片がヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色された。免疫蛍光染色のためには、クリオスタット切片（１０μｍ）が冷メタノール中で１０分間固定され、１×ＰＢＳ中の１０％２次血清＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロッキングされ、１次抗体（またはアイソタイプ対照）と一緒にインキュベーションされ、次に適切な２次抗体を１時間室温で与えた。次に数回の洗浄に続いて、スライドは、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＨａｒｄ‐ｓｅｔ封入剤中におかれてカバースリップされた。ＢｒｄＵ染色はBrdU In-situキット（BD Pharmingen、カリフォルニア州）を用いて行われ、続けて１：２５０希釈のウサギＡＢＣＢ５抗体による染色が行われた（NBP1-50547、Novus、コロラド州）。
【００８５】
ＴＵＮＥＬ染色はIn Situ Cell Deathキット（Roche、インディアナ州）を用いて行われ、ＤＡＰＩ（Invitrogen、マサチューセッツ州）が全ての有核細胞を染色するために用いられた。全ての組織切片はNikon Eclipse E800免疫蛍光顕微鏡を用いて分析された。コンポジット角膜写真はPhotoshop（Adobe）を用いて構築され、連続画像同士を重ね合わせてマッチングした。ステッチングは、追加された写真を５０％の透明度に変えて、画像同士をマッチングし、コンポジット写真を０％の透明度に戻すことによって行われた。角膜あたりの上皮細胞の平均個数（図２Ｄ）は、完全な角膜切片のコンポジット写真の２ｍｍのトレフィンによって画定された部位内のＤＡＰＩ陽性細胞数を計数することによって求められた。少なくとも３つのコンポジット角膜切片がマウスあたり分析され、５匹のマウスが４重の実験の群毎に分析された。Ｋｉ６７（図２Ｉおよび３Ｃ）、ＴＵＮＥＬ（図２Ｉ）、およびＫＲＴ１２（図４Ａおよび４Ｂ）を発現している上皮細胞の割合が、本明細書に記載の手法を用いて、ＤＡＰＩ陽性の角膜上皮細胞の全個数中の陽性細胞数を計数することによって求められた。Ａｂｃｂ５ＷＴおよびＡｂｃｂ５ＫＯマウスの間の比較は対応がないｔ検定を用いて実施された。移植実験の結果は、一元配置分散分析を用い、続いてボンフェローニの事後検定を行って比較された。Ｐ＜０．０５の違いが統計的に有意と見なされた。
【００８６】
抗体：
以下の１次抗体がフローサイトメトリー実験に用いられた。ウサギポリクローナル抗ΔＮｐ６３α抗体（クローンH-129、Santa Cruz、カリフォルニア州）、マウスモノクローナル抗ＡＢＣＢ５抗体（クローン3C2-2D12）［６］、ヤギポリクローナル抗サイトケラチン抗体（クローンL15、Santa Cruz、カリフォルニア州）、ウサギポリクローナル抗ＰＡＸ６抗体（Covance、カリフォルニア州）、ウサギポリクローナル抗ＡＢＣＢ５抗体（Novus Biologicals、コロラド州）、ウサギポリクローナルＩｇＧアイソタイプ対照抗体（Abcam、マサチューセッツ州）、マウスＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences、カリフォルニア州）、およびヤギＩｇＧアイソタイプ対照抗体（Santa Cruz、カリフォルニア州）。２次抗体は、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich、ミズーリ州）、Alexa 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、ニューヨーク州）、およびDylight 649ロバ抗ヤギ（Jackson ImmunoResearch、ペンシルバニア州）であった。ヒト病理組織および免疫組織化学分析のためには、１次抗体（マウスモノクローナル抗ＡＢＣＢ５（クローン3C2-1D12）［６］およびΔΝｐ６３αに対するウサギ抗体を１：７５希釈（sc8344、Santa Cruz、カリフォルニア州））、次にJackson ImmunoResearch（ペンシルバニア州）から入手された適切な２次抗体（ＦＩＴＣ‐ロバ抗ウサギを１：７５希釈またはAlexa Fluor 594‐ヤギ抗マウスを１：２５０希釈）が用いられた。
【００８７】
全ての例で、アイソタイプを一致させた抗体のウサギＩｇＧ（550875、BD Pharmingen、カリフォルニア州）およびマウスＩｇＧ１κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences、カリフォルニア州）が負の対照を務めた。病理組織および免疫組織化学分析のためには、マウス組織が、１次抗体（ウサギ抗ＡＢＣＢ５抗体を１：２５０希釈（NBP1-50547、Novus、コロラド州）、ウサギ抗Ｐａｘ６を１：３００希釈（PRB278P、Covance、カリフォルニア州）、ヤギ抗サイトケラチン１２（Ｌ１５）を１：５０希釈（scl7101、Santa Cruz、カリフォルニア州）、ウサギ抗サイトケラチン１４（AF64）を１：１０００希釈（PRB-155P、Covance、カリフォルニア州）、ウサギ抗Ｋｉ６７を１：２００希釈（ab66155、Abcam、マサチューセッツ州））、次にJackson ImmunoResearch（ペンシルバニア州）から入手された適切な２次抗体（ロバ抗ヤギAlexa Fluor 488を１：２５０希釈（705-545-003）、ロバ抗ウサギ Alexa Fluor 594を１：２０希釈（711-585-152）、ヤギ抗ウサギDyLight 549を１：２５０希釈（111-504-144）、またはＣｙ３‐ロバ抗ウサギを１：２５０希釈（711-165-152））によって染色された。全ての例で、アイソタイプを一致させた抗体（ウサギＩｇＧ（550875、BD Pharmingen、カリフォルニア州））およびヤギＩｇＧ（sc2028、SantaCruz、カリフォルニア州）が負の対照を務めた。
【００８８】
同時に提出される配列表（テキストファイルとして提出される）は参照によって本明細書に組み込まれる。
参考文献
下に挙げる参考文献のそれぞれは、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【００８９】
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面を以上で説明したが、当然のことながら、種々の変更、改変、および改良は当業者には容易に思い浮かぶであろう。かかる変更、改変、および改良は本開示の一部であると意図され、本発明の趣旨および範囲の内であると意図される。したがって、上記の説明および図面は単に例示のためである。
【００９０】
＜均等物＞
いくつかの本発明の態様が本明細書において説明および例示されて来たが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施するおよび／または結果および／または利点の１つまたは２つ以上を得るための種々の他の手段および／または構成を容易に思い浮かべるであろう。かかる変形および／または改変のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であると見なされる。さらに一般的には、当業者には当然のことながら、本明細書に記載のあらゆるパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることを意図されており、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は本発明の教示が用いられる具体的な適用によって決まる。当業者は、本明細書に記載の具体的な態様の多くの均等物を認識するであろう。または、単なる通常の実験を用いてそれらを確認できるであろう。したがって、当然のことながら、上記の実施形態は例として示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は具体的に説明および請求されたものとは別様に実施され得る。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載の１つ１つの特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、２つまたは３つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲に含まれる。
【００９１】
あらゆる定義は、本明細書において定められて用いられる場合、辞書的な定義、参照によって組み込まれる文書による定義、および／または定義される用語の通常の意味よりも優先されると理解されるものである。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、明らかに反対の定めがない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるものである。
用語「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、それによって結合された構成要素（すなわち、ある場合には接続的に存在し別の場合には離接的に存在する構成要素）の「一方または両方」を意味するものと理解される。「および／または」によって列挙された複数の構成要素も同様に解釈されるものとする（すなわちそれによって結合された構成要素の「１つまたは２つ以上」）。「および／または」の節によって具体的に示された構成要素以外の他の構成要素が、具体的に示されたそれらの構成要素に関係しているか無関係であるかにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、限定しない例として、「Ａおよび／またはＢ」に関する言及は、「含んでなる」などの開放式の用語と一緒に用いられたときには、一実施形態ではＡのみを指す（任意選択でＢ以外の構成要素を含む）。別の実施形態ではＢのみを指す（任意選択でＡ以外の構成要素を含む）。さらに別の実施形態では、ＡおよびＢを両方指す（任意選択で他の構成要素を含む）、などである。
【００９２】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、「または」は上で定めた「および／または」と同じ意味を有すると理解される。例えば、列挙された項目を分けているときには、「または」または「および／または」は包括的だと解釈されるものとする（すなわち、多数または一覧の構成要素のうち少なくとも１つ、さらには複数、および任意選択でさらなる挙げられていない項目の包含）。明らかに反対に定められた用語（「の１つのみ」または「の厳密に１つ」など）または特許請求の範囲において用いられる場合の「からなる」のみが、多数のまたは一覧の構成要素のうちの厳密に１つの構成要素の包含を指す。一般的には、用語「または」は、本明細書で用いられる場合、排他性の用語、例えば「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」、または「の厳密に１つ」に伴うときにのみ、排他的な選択肢（すなわち「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとして解釈される。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において用いられるときには、特許法の領域において用いられるその通常の意味を有するものとする。
【００９３】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、用語「少なくとも１つ」は、１つまたは２つ以上の構成要素の列挙に関する場合、構成要素の列挙に含まれる構成要素の任意の１つまたは２つ以上から選択される少なくとも１つの構成要素を意味すると理解されるべきであるが、構成要素の列挙において具体的に挙げられたそれぞれおよび全ての構成要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、構成要素の列挙に含まれる構成要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義は、用語「少なくとも１つ」が指している構成要素の列挙中に具体的に示された構成要素以外の構成要素が、具体的に示された構成要素に関係しているか無関係であるかにかかわらず任意選択で存在することも許容する。したがって、限定しない例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同義的に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同義的に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様では、少なくとも１つのＡを指し、任意選択で複数のＡを含み、Ｂは存在しない（且つ任意選択でＢ以外の構成要素を含む）。別の実施形態では、少なくとも１つのＢを指し、任意選択で複数のＢを含み、Ａは存在しない（且つ任意選択でＡ以外の構成要素を含む）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）および少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）を指す（且つ任意選択で他の構成要素を含む）、などである。
【００９４】
さらに当然のことながら、明らかに反対の定めがない限り、複数のステップまたは行為を含む本願によって請求される任意の方法では、方法のステップまたは行為の順序は方法のステップまたは行為が記載された順序に必ずしも限定されないこともまた理解されるべきである。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、および特許願は、それぞれが引用された内容に関して参照によって組み込まれるが、場合によってはその文書全体を包含する。
特許請求の範囲および上記の記載において、「を含んでなる」、「を含む」、「を持つ」、「を有する」、「を含有する」、「を伴う」、「を保持する」、「から構成される」などの全ての移行句は開放式である、すなわち「を含むが、それに限定されない」を意味するものと理解されるものとする。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみを、それぞれ閉鎖式または半閉鎖式の移行句とする。これは米国特許庁ＭＰＥＰ第２１１１．０３条に記載されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019189600.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ−Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2019189600.tif 000020
【図２Ｈ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
2019189600.tif 000034
【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月1日(2019.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼細胞の混合集団から角膜輪部幹細胞を単離する方法であって、
眼細胞の混合集団を提供すること；および
混合集団からＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を単離すること
を含み、
任意に、ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は、ＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である、前記方法。
【請求項２】
混合集団の細胞を、ヒトＡＢＣＢ５に選択的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植用の眼細胞調製物を選抜する方法であって、
眼細胞調製物中にあるＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を同定すること；
ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞の個数を、細胞調製物の全細胞数と比較すること；および
前記の比較に基づいて、移植のための眼細胞調製物を選抜すること、
を含み、
任意に、前記ＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は、ヒトＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、前記方法。
【請求項４】
細胞調製物が眼移植片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
眼細胞調製物の細胞を、ヒトＡＢＣＢ５に選択的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
眼細胞調製物の細胞を、幹細胞を染色する色素と接触させることを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数が、細胞調製物の全細胞数の０．０３％超である場合に、移植用の眼細胞調製物を選抜することを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞の個数が細胞調製物の全細胞数の０．１％超である場合に、移植用の眼細胞調製物を選抜することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象への移植用の眼移植片を作製する方法であって、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞を基質に播種して、眼移植片を作製することを含み、
任意に、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である、前記方法。
【請求項１０】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、同種他家由来幹細胞または同系幹細胞であり、および任意に、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、皮膚幹細胞ではない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、ＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞またはＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、播種ステップに先立ってex vivoで増殖させられる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
基質が、フィブリンゲル、羊膜、アミノグリカン、またはその組み合わせを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象への移植用の単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が濃縮された眼移植片であって、任意に、ＡＢＣＢ５（＋）幹細胞はＡＢＣＢ５（＋）ヒト幹細胞である、前記移植片。 
【請求項１５】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、同種他家由来幹細胞または同系幹細胞であり、および任意に、単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞は、皮膚幹細胞ではない、請求項１４に記載の眼移植片。
【請求項１６】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、ＡＢＣＢ５（＋）眼幹細胞またはＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞である、請求項１４または１５に記載の眼移植片。
【請求項１７】
角膜輪部幹細胞をＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞として同定すること、および眼細胞再生を促進するために有効な量のＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞をその必要がある対象に投与すること、を含む眼細胞再生を促進することにおける使用のための、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を含む組成物であって、
任意に、単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞は、単離されたＡＢＣＢ５（＋）ヒト角膜輪部幹細胞である、前記組成物。
【請求項１８】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞が眼移植片として投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、同種他家由来幹細胞または同系幹細胞である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離されたＡＢＣＢ５（＋）幹細胞が、投与ステップに先立ってex vivoで増殖させられる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、１〜約１０７個の単離されたＡＢＣＢ５（＋）角膜輪部幹細胞を移植によって投与される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、哺乳動物であり、任意にヒトである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
角膜輪部幹細胞の単離された調製物であって、細胞表面上のＡＢＣＢ５の発現を特徴とする、前記調製物。
【外国語明細書】
2019189600000001.pdf