【手続補正書】
【提出日】平成14年1月25日(2002.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】バラバスタチンの微生物的製造方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】下記式（Ｉ）：
【化１】
2003528576.tif 000001
の化合物を、一般式に（ＩＩ）
【化２】
2003528576.tif 000002
の化合物より製造するための微生物的方法であって、
前記式中Ｒ＋がアルカリ金属又はアンモニウムイオンを表すものであり、発酵により式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できる株によるものであり、そして
ａ）−式中のＲ＋は上記の通りである式（ＩＩ）の化合物を６β−加水分解できるミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の微生物を、同化可能な炭素と窒素源及び鉱物塩を含む栄養培地中で２５−３２℃にて培養する段階、その後に
ｂ）発達した培養物に、変換されるべき基質を供給する段階、続いて
ｃ）生物変換終了時まで基質を発酵する段階、そして
ｄ）培養液より式（Ｉ）の化合物を分離し、必要に応じて同物質を精製する段階、
を含む生物変換の過程で形成された、式（Ｉ）の化合物を分離、精製することによることによる微生物的工程に関する。
【請求項２】微生物が約２５ないし約３７℃の温度で培養される、請求項９記載の工程。
【請求項３】微生物が約２５ないし約３７℃の温度で培養される、請求項１０記載の工程。
【請求項４】栄養培地が水性溶液である請求項９記載の工程。
【請求項５】栄養培地が更に無機塩を含む請求項９記載の工程。
【請求項６】ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２６８で寄託された、一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるミクロモノスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）ＩＤＲ−Ｐ３株又はその突然変異株が培養される、請求項９記載の工程。
【請求項７】ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７１で寄託された一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるミクロモノスポラ  パープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＩＤＲ−Ｐ４株又はその突然変異株が培養される、請求項９記載の工程。
【請求項８】ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７２で寄託された、一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるミクロモノスポラ  エチノスポラ亜種エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ６株又はその突然変異株が培養される、請求項９記載の工程。
【請求項９】ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７３で寄託された、一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるミクロモノスポラメガロミセラ亜種ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ ｓｐｐ．ｎｉｇｒｏ）ＩＤＲ−Ｐ６株又はその突然変異株が培養される、請求項９記載の工程。
【請求項１０】ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７４で寄託された、一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるミクロモノスポラロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）ＩＤＲ−Ｐ７株又はその突然変異株が培養される、請求項９記載の工程。
【請求項１１】前記Ｒ＋がナトリウムイオンである、請求項９記載の工程。
【請求項１２】発酵中に形成される式（Ｉ）の化合物が、陰イオン交換樹脂上への吸着又は水−非混合性有機溶媒による抽出とそれに続くその中間体としてのラクトン誘導体又はその第２アミン塩の分離、又は非イオン性吸着樹脂を用いたクロマトグラフィーによる発酵ブロスの有機溶媒抽出物から得たアルカリ性水性抽出物の精製により培養ブロスから分離される、請求項９ないし１８に記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はパラバスタチンの調整に関する微生物的方法に関する。
【０００２】
発明の背景
高コレステロール血症はアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈性心疾患の主要リスクとして認識されている。コレステロールの生合成は、高コレステロール血症の主要寄与因子である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール生合成の速度決定段階でのＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸塩への変換を触媒する。この２０年間、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ＥＣ．１．１．１．３４）が徹底的に研究されてきた。各種真菌種により生合成されたメビノリン及び関連化合物がこの酵素の競合的阻害剤であることが見いだされている［Ｅｎｄｏ．Ａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２９、１３４６−１３４８（１９７６）：Ｅｎｄｏ．Ａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ。７２，３２３−３２６（１９７６）：Ｋｕｏ、Ｈ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉ。４８，１９９１−１９９８（１９８３）］。
【０００３】
プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）はコンパクチン（Ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、シムバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）及びアトロバスタチン（ｓｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）と共に、この系統のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のメンバーである。プラバスタチンは一連のコンパクチンに関する代謝研究のなか［Ａｒａｌ，Ｍ．ら、Ｓａｎｋｙｏ Ｋｅｎｋｙｕｓｈｏ Ｎｅｍｐｏ、４０、１−３８（１９８８）］で、コンパクチンの主要なイヌ代謝物としてまず単離された（Ｔａｎａｋａ、Ｍら、未発表）。
組織選択性がパラバスタチン特有の特徴である。プラバスタチンは肝臓及び小腸でのコレステロール合成を選択的に阻害するが、その他臓器のコレステロール合成は弱くしか阻害しない。Ｋｏｇａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０、１０４５、１１５−１２０。プラバスタチンはその他ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に比べ毒性が低いという利点がある。
【０００４】
コンパクチンは各種属の真菌の各種属、及び放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）群のノカルジアＮｏｃａｒｄｉａ属、マズラミセテス（Ｍａｄｕｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）群のアクチノマズラ（Ａｃｔｉｎｏｍｕｄｕｒａ）属、及びステプトミセス（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）群のストレプトミセス属にあって、特にストレプトマイセスロセオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）及びストレプトマイセスカルボフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）に属する細菌を用いた微生物的ヒドロキシル化によりプラバスタチンに変換できる（米国特許第５，１７９，０１３号、米国特許第４，４４８，９７９号、米国特許第４，３４６，２２７号、米国特許第４，５３７，８５９号、日本国特許第５８−１０５７２号）。
プラバスタチンの製造への真菌の使用には問題がある。一般に真菌は培地に加えられた高負荷量のコンパクチンに耐性ではない［Ｓｅｒｉｚａｗａ、Ｎ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３６、８８７−８９１（１９８３）］。
【０００５】
チトクロームＰ４５０系はストレプトマイセスカルボフィルス菌によるコンパクチンからプラバスタチンへのヒドロキシル化に必要であることが示されている［Ｍａｔｕｓｏｋａ、Ｔ．ら、Ｅｕｒ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４，７０７−７１３（１９８９）］。チトクロームＰ４５０システムの使用に伴う問題は、それが単一蛋白質というよりはむしろ複合蛋白質であるため組換え体ＤＮＡ操作が難しいことである。
高濃度のコンパクチンに耐えることができ、発光ブロス中に高い収率かつ高濃度でプラバスタチンを産生できる、プラバスタチンを調整するための改良型微生物工程が求められている。
【０００６】
発明の概要
本発明はプラバスタチンの調整に関する新規微生物的工程を提供する。より具体的には、本発明は、下記式（Ｉ）：
【化３】
2003528576.tif 000003
のプラバスタチンを、一般式（ＩＩ）：
【０００７】
【化４】
2003528576.tif 000004
【０００８】
の化合物から微生物的製造する方法において、前記式中Ｒ＋がアルカリ金属又はアンモニウムイオンを表すものであり、一般式（ＩＩ）の化合物を６β位置でヒドロキシル化できる原核生物であるアクチオプラネテス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｔｅｓ）群のミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属を用いる方法を提供する。
【０００９】
本発明はプラバスタチンの製造に関する新規微生物的工程を提供する。
本発明は既知微生物的システムで可能な場合に比べより高濃度且つ有利な条件下にプラバスタチンを産生する微生物を見いだすことを目的とした研究の蓄積である。６，０００株を越える数の放線菌がスクリーニングされた。その内僅かに１０株の微生物のみがコンパクチンのナトリウム塩をヒドロキシル化しプラバスタチンを産生できることが判明した。
【００１０】
具体的には以下の種がこの能力を有していた：ストレプトマイセス・バイオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ Ｎｏ．１／４３（Ｋａｍｐｆｅｒら、１９９１）、ストレプトマイセス・ロチェイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｃｈｅｉ）Ｎｏ１／４１（Ｂｅｒｇｅｒら、１９８９）、ストレプトマイセス・レシストミチフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｆｕｓ）Ｎ．１／４４（Ｌｉｎｄｅｎｂｅｉｎ １９５２）、ストレプトマイセス・ラナタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｎａｔｕｓ（Ｆｒｏｍｍｅｒ １９５９）、ストレプトマイセス種Ｎ０．１／２８、ミクロモノスポラ種Ｎｏ．ＩＤＲ−Ｐ３、ミクロモノスポラ・パープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）Ｎｏ．ＩＤＲ−Ｐ４（ＬｕｅｄｅｍａｎｎとＢｒｏｄｓｋｙ １９６４）、ミクロモノスポラ・メガロミセア亜種ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｒｍｉｃｅａ ｓｓｐ．ｎｉｇｒａ）Ｎｏ．ＩＤＲ−Ｐ６（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら １９６９）、ミクロモノスポラ・ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｚａｒｉａ）Ｎｏ．ＩＤＲ−Ｐ７（Ｈｏｒａｎ及びＢｒｏｄｓｋｙ １９８６）。ミクロモノスポラ属の種がコンパクチンの酸形状の塩がプラバスタチンに変換できるか従来不明であったことから、我々は陽性とスクリーニングされたミクロモノスポラについて詳細に研究した。
【００１１】
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）は細菌分類学上放線菌群の属の一つである。アクチノミセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目及びアクチノプラネテス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｔｅｓ）の属を越えた群では、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属はアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）やダクチロスポランギウム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｇｉｕｍ）の様な胞子嚢形成放線菌により密接に関係していること、そして関連付けられてきたサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）及びサーモモノアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の様な単胞子嚢属とは明確に異なっていることが示されている。アクチノプラネテス属は似た走化性特性と核酸親和性を有する。それらは直径０．２−１．６μｍの非分節型の分岐し、隔壁を持つ菌糸を伸ばすグラム陽性の非抗酸菌である。中空の菌糸体がまれに発生するか、散在する。Ｇｅｎｕｓ Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ Ｋｒｓｋｏｖ、１９２３。
【００１２】
ミクロモノスポラ  カラセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈａｌｃｅａ（Ｆｏｕｌｅｒｔｏｎ，１９０５）はよく分化した分岐状の隔壁を持つ菌糸体を形成する。不動性の胞子が無柄型で、又は時に分岐状の集団を形成する短いあるいは長い担胞子体の上に単独で形成される。担胞子体の発生は短軸性であるか、またはある場合には仮軸性である。中空型の菌糸体は存在しないか、又は一部の培養体に於いて制限された白色または灰色のブルームの様な不定形を呈する。細胞壁はメソ−ジアミノピメリン酸及び／又はその３−ヒドロキシ誘導体とグリシンを含む。
【００１３】
細胞の加水分解中にはキシロース及びアラビノースが存在する。特徴的なリン脂質はホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールとホスファチジルイノシトールマンノシドである。ミクロモノスポラ  カラセアは好気性から微好気性であり、有機栄養性である。それらは６以下のｐＨに感受性である。増殖は通常は２０℃ないし４０℃の間で起こるが、５０℃より高い温度では増殖しない、Ｏｒｓｋｏｖ、１９２３。
【００１４】
ミクロモノスポラ属に属する明らかに異なる複数の種が６β位置でコンパクチンを海水分解することが観察されており、従って６位置でコンパクチンを加水分解する能力はミクロモノスポラ属の種に広く共通していると考えられている。本発明のミクロモノスポラはコンパクチン基質をプラバスタチンに変換することができる野生型及び突然変異株を含む。発明の特定好適実施態様を更に記述すること、及び具体的実施例によりそれを例示するのに用いられる好適ミクロモノスポラは、０．１ｇ／リットルのコンパクチン酸ナトリウム塩濃度に於いて約９０％を越える高い加水分解酵素能力もつことで選択された。
【００１５】
ミクロモノスポラの次の株は１９９９年４月１３日に、ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）にある国立農業産業微生物コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７１のミクロモノスポラ・パープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＩＤＲ−Ｐ４；ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７２のミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ６；ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７３のミクロモノスポラ・メガロミセラ亜種ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ ｓｐｐ．ｎｉｇｒｏ）ＩＤＲ−Ｐ６；及びＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７４のミクロモノスポラ・ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）ＩＤＲ−Ｐ７を寄託した。
【００１６】
単離されたミクロモノスポラ種、番号ＩＤＲ−Ｐ３は１９９８年１０月１３日に、ハンガリー、ブダペストにある国立農業産業微生物コレクションに番号ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２６８で寄託された。株番号ＩＤＲ−Ｐ３のミクロモノスポラ種は、ハンガリー（Ｈｕｎｇａｒｙ）、レークバラトン（Ｌａｋｅ Ｂａｌａｔｏｎ）の泥サンプルから単離された。大規模発酵に好適な条件の下高濃度のコンパクチンナトリウム塩からプラバスタチンを製造することに加え、この種はその他の構造関連化合物を極微量にしか生合成しない。即ち、本種はプラバスタチンの工業製造に極めてよく適合している。
【００１７】
ミクロモノスポラＩＤＲ−Ｐ３の培養体の分類学的特徴を以下にまとめる。微細構造上の特徴：基質の菌糸体はよく分解した、直線ではなく彎曲した分枝型の微小繊維より成る。スライド培養では、分岐型菌糸の単足性システム（担胞子体）が観察されるだろう。胞子は単一の、直径約１．８μｍの球形であり、菌糸上に均一に分散している。胞子は無柄であるか、または短形の短胞子体の末端上にある。いずれの培養体の場合も、おそらくは成熟胞子は培地中に直ぐに放出されるために胞子は芽胞形成中の菌糸上には観察されない。
【００１８】
培養−形態学的特性：
ツェパック（Ｃｚｅｐａｋ）−ショ糖寒天：中程度の増殖。コロニーは点状の黒色の胞子形成域により覆われた赤色である。
グルコース−アスパラギン寒天：増殖は点状の盛り上がった赤−茶色又は黒色のコロニーとして記録された。赤色の拡散性の色素。
栄養寒天：良好な増殖を示す、盛り上がった赤−茶色又は黒色のコロニー。培地中に赤−茶色の外色素。
【００１９】
酵母抽出物−麦芽抽出寒天（ＩＳＰ培地２）：よく発達した盛り上がりしわの寄った茶色のコロニーで、部分的に黒色の胞子形成域、又は制限された白色または灰色のブルームの外観を持つ“偽中空菌糸体”で覆われている。
無機塩−澱粉寒天（ＩＳＰ培地４）：赤−茶色の盛り上がり、しわの寄ったコロニーの中度の増殖。明るい赤色の可溶性色素。
グリセロール−アスペラギン寒天（ＩＳＰ培地５）：痕跡程度に増殖した、灰色がかった白色又は明るいオレンジ色の、平坦なコロニー、明るい赤色の可溶性色素。
観察した幾つかの培地では、可溶性色素は特異的な指示的な特徴を有している：酸性ｐＨ域で黄色になり、塩基性ｐＨ域では暗く曇った赤色に変化する。
【００２０】
炭素源の利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｌ−ラムノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ショ糖、Ｄ−トレハロース及びＤ−キシロース上ではよく増殖し、これらを積極的に利用した。アドニトール、ダルシトール、ミオ−イノシトール、イヌリン、Ｄ−メレジトース、Ｄ−ラフィノースは利用されない。Ｄ−ガラクトース、グリセロール、Ｄ−メリビオース及びＤ−サリシンによる増殖は、負のコントロール培地に比べわずかに良好であった。
【００２１】
窒素源の利用：酵母抽出物及びＮＺ−アミンにより良好な増殖、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン酸、ＮＨ４ＮＯ３及びＮａＮＯ３の利用無し。
その他の生理学的−生化学的特徴：セルロース及び澱粉は加水分解され、ミルクは強く消化される。硝酸塩還元試験は陰性である。炭酸カルシウムなしではジャガイモスライス上で無増殖（ｐＨ５．８−６．０）。
【００２２】
ハンガリー、ブダペストにある国立農業産業微生物コレクションに寄託されたミクロモノスポラ株に関する我々の研究に拠れば、発明の好適形態は下記式（Ｉ）：
【化５】
2003528576.tif 000005
のプラバスタチンを、一般式に（ＩＩ）：
【００２３】
【化６】
2003528576.tif 000006
【００２４】
の化合物から製造するための新規微生物的方法にあって、前記式中Ｒ＋がアルカリ金属又はアンモニウムイオンを表すものであり、式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できる株を好気的発酵により液中培養され、そして生物変換の過程で形成された式（Ｉ）の化合物を分離、精製することによるものであって、前記工程が：ａ）式（ＩＩ）の化合物−式中のＲ＋は上記である−を６β−加水分解できるミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の微生物を同化可能な炭素と窒素源及び鉱物塩を含む栄養培地中、２５−３２℃にて培養すること、その後にｂ）生物変換終了まで基質を供給すること、ｃ）生物変換終了時まで基質を発酵すること、そしてｄ）培養ブロスより式（Ｉ）の化合物を分離し、必要に応じて同化合物を精製することを含む新規微生物的工程に関する。
【００２５】
さらにより好ましい実施態様によればプラバスタチンは、ミクロモノスポラ・パープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＩＤＲ−Ｐ４［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７１］、ミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ６［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７２］、ミクロモノスポラ・メガロミセラ亜種ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ ｓｐｐ．ｎｉｇｒｏ）ＩＤＲ−Ｐ６［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７３］及びミクロモノスポラ・ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）ＩＤＲ−Ｐ７「ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７４］より成るグループから選択されたミクロモノスポラの野生株又は突然変異株より製造される。発明の最適実施態様によれば、プラバスタチンはミクロモノスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）ＩＤＲ−Ｐ３［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２６８］を用い製造される。
【００２６】
本発明はインサイチュー発酵、即ちバッチ培養体又は連続バッチ培養技術を使い活発の増殖中の微生物存在下に実施されるヒドロキシル化により実施できる。  ヒドロキシル化は式（ＩＩ）の化合物を増殖培地に加えるときに、フラスコ培養器を振盪させる様な攪拌により、又はファーメンター中に通気し攪拌することにより実施される。この様な場合、消泡剤を使用してもよい。
【００２７】
微生物は炭素及び窒素源、ならびに無機塩と微量元素を含む適当な栄養培地を用い培養され、維持されるだろう。典型的な同化性炭素源にはグルコース、グリセロール、デキストリン、澱粉、ラムノース、キシロース、ショ糖、可溶性澱粉等が含まれる。典型的な同化性窒素源にはダイズミール、コーン浸漬液、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、クエン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が含まれる。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の無機塩もまた培養培地に加えられるだろう。微生物の増殖に好適な培地は、実施例中に記載されている。
【００２８】
好ましくは、培養体は攪拌された液体培地である。ヒドロキシル化実施に好ましい温度範囲は約２５℃ないし３７℃であり、最適には約２５℃ないし３２℃である。好適ｐＨは約６．０ないし９．０であり、最適には約７．０ないし８．５である。好適振盪条件は約２００ｒｐｍないし４００ｒｐｍであり、最適には約２５０ｒｐｍである。
いずれのコンパクチン濃度を利用してもプラバスタチンが製造されるだろう。約０．１ないし１０ｇ／リットル、より好ましくは約０．３ないし３．０ｇ／リットルのコンパクチン濃度がインサイチューヒドロキシル化に好適である。コンパクチンからプラバスタチンへの変換のパーセンテージは発明の工程の重要な特徴ではない。しかし、変換は好ましくは約３０％以上、好ましくは約６０％以上、さらにより好ましくは約９０％以上で起こる。
【００２９】
発酵ブロスの組成は実施例記載の条件を用いた高性能液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）によりモニターされる。
プラバスタチンは、例えば抽出−再抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー又は沈殿といった方法により発酵ブロスから単離できる。以下の単離工程はミクロモノスポラの生合成産物としてプラバスタチンを単離するのに好適である。しかしこれら工程はコンパクチンより出発してプラバスタチンを獲得する好ましい様式を完全に開示することだけを目的に提供されたものであり、いかなる形でも本発明を限定することを意図するものではない。
【００３０】
生物変換が終了した後、プラバスタチンは発酵ブロスより、又は細菌細胞分離後に得られる濾液から抽出することができる。細菌細胞は濾過又は遠心分離により取り除くことができる。しかし、特に工業スケールでは全ブロス抽出を実施することが有益である。抽出溶媒は水と全く混合しないいずれかの溶媒である。好ましい抽出溶媒は低水溶解性を有する。特に好ましい溶媒には酢酸エチル及び酢酸イソブチルの様な脂肪族アルコキシ成分を含む、２−４個の炭素原子を有する酢酸エステルが含まれる。
【００３１】
我々の実験では、プラバスタチンはブロスの有機抽出物より第２アミンを持つ結晶塩として沈殿できることが分かっていた。更に、アルキル−、シクロアルキル−、アラルキル−、又はアリール−置換基を含む複数の第２アミンが特に塩形成に好適であることも見いだされた。特に、次の第２アミンが最適であるが、これは一部にそれらの毒性が低いことに拠る：ジオクチルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びジベンジルアミン。
【００３２】
プラバスタチンの有機第２アミン塩を単離する方法はジベンジルアミンを用い例示されている。ジベンジルアミン塩の単離は、抽出物のプラバスタチン含有量に関し１．５当量のジベンジルアミンを加え、続いて抽出物を真空蒸留により基の容積の５％までに濃縮してから、０．２当量比の濃度になるまで更にジベンジルアミンを加えることで実施される。濃縮体より結晶性のジベンジルアミン塩が沈殿される。結晶性粗産物は真空下に濾過され乾燥され、チャコールを用いてメタノール又はアセトン液中に清浄化された。アセトンから再結晶化することでプラバスタチンジベンジルアミン塩は更に精製することができる。
【００３３】
プラバスタチンの有機型第２アミン塩は、水酸化ナトリウム又は名取り組むアルコキシドによりプラバスタチンに転換することができる。好ましいナトリウムアルコキシドはナトリウムエトキシドである。
第２アミン塩中間体を介したプラバスタチンの単離は既知の単離方法に比べ単純な方法である。この方法では、人為産物は形成されない。生物変換の副産物及び微生物をヒドロキシル化することで生合成された各種代謝産物からのプラバスタチンの分離は好都合に溶解することができる。
【００３４】
発酵ブロスからのプラバスタチンの単離に関する別の工程は、生物変換がプラバスタチンをその酸形状で生ずるという利点を有している。即ち、プラバスタチンはブロスより陰イオン交換樹脂カラムへの吸着により、好ましくはブロスの濾液より単離できる。Ｄｏｗｅｘ（商標）Ａ１４００（ＯＨ−型）、Ｄｏｗｅｘ（商標）１ｘ２（ＯＨ−型）、Ｄｏｗｅｘ（商標）２ｘ４（ＯＨ−型）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＡ９００（０Ｈ−）樹脂の様な、第４アンモニウム活性基を持ったポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマーの様な強塩基性陰イオン交換樹脂は、ブロスからのプラバスタチン遊離型酸の吸収に好適である。
【００３５】
陰イオン交換樹脂上に吸着された物質は、酢酸水溶液又はアセトン及び塩化ナトリウムを含む水との混合液により、カラムから溶出することができる。アセトン：水（１：１）の混合液の１％の塩化ナトリウム液が特に好適な溶出液である。プラバスタチン含有分画はまとめられ、真空蒸留によりアセトンが取り除かれる。濃縮液のｐＨは１５％硫酸により３．５−４．０の範囲に調節され、酸性化された水溶液は酢酸エチルにより抽出される。プラバスタチンは１／１０ないし１／２０容積比の５％炭酸水素ナトリウム又はその他の穏やかなアルカリ塩基性液（ｐＨ７．５−８．０）を用いて酢酸エチル抽出液から再抽出できる。
【００３６】
プラバスタチンはアルカリ水性抽出液より、非イオン性吸着樹脂を使ったカラムクロマトグラフィーにより純粋形状で回収することができる。ある方法では、抽出中にアルカリ水相中に溶解した残存酢酸エチルは真空蒸留により除かねばならず、続いて水性抽出液はＤｉａｌｏｎＨＰ−２０カラムにかけられる。カラムに吸着されたプラバスタチンは徐々にアセトン含有量が増加されるアセトン水により溶出、精製され、次に単一成分としてプラバスタチンを含むクロマトグラフィー分画がまとめられ、真空下に濃縮される。濃縮体はチャコールで清浄化され、凍結乾燥される。次にプラバスタチンはエタノール−エチルアセトン混合体から結晶化され、医薬品応用に利用可能な品質のプラバスタチンを得る。
【００３７】
プラバスタチンを単離する別の方法は、プラバスタチンをラクトン化しブロス中のその他酸性有機物質からの分離を改善する。抽出前に発酵ブロス又はブロス濾過液のｐＨを無機酸、好ましくは硫酸希釈液により３．５−３．７に調節する。次にブロスを水−非混合性有機溶媒、好ましくは酢酸エチル又は酢酸イソブチルの様な脂肪属アルコキシ成分を含む２−４炭素原子を持つ酢酸エステルで抽出される。酢酸エチル抽出物は水で洗浄され、無水硫酸ナトリウムにより乾燥される。
【００３８】
次にプラバスタチンはそのラクトンに変換される。ラクトン環の閉鎖は、室温にて連続攪拌されている乾燥酢酸エチル液中にて触媒量のトリフルオロ酢酸を使用し実施される。ラクトン環の閉鎖は薄層クロマトグラフィー（“ＴＬＣ”）にて行われる。ラクトン形成後、酢酸エチル液は５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄され、続いて水で洗浄される。酢酸エチル液は無水硫酸ナトリウムで乾燥され、酢酸エチルは真空下に蒸発させられる。残渣は酢酸柄チエルとヘキサンの混合液で、酢酸エチル含有量が漸次増加しながら溶出されるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製される。
【００３９】
精製されたプラバスタチンラクトンは室温、エタノール中に等量以上の水酸化ナトリウムにより加水分解され、プラバスタチンナトリウムに変換される。プラバスタチンナトリウム塩が形成された後、プラバスタチンナトリウムはアセトンにより沈殿させることができる。沈殿は濾過され、アセトンとｎ−ヘキサンにより洗浄され、真空下に乾燥される。プラバスタチンナトリウムはエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化され、医薬品応用可能な品質のプラバスタチンナトリウムを得ることができる。
【００４０】
プラバスタチン単離の別の方法は、ＳｅｐＨａｄｅｘＬＨ−２０ゲルのクロマトグラフィーを利用する。純度９９．５％（ＨＰＬＣにより測定）を越えるプラバスタチンは、ＳｅｐＨａｄｅｘＬＨ−２０ゲルを利用したクロマトグラフィーにより作ることができる。
特定の好適実施態様に関し発明を記載するために、ミクロモノスポラを用いたプラバスタチンの生合成の発明工程及びプラバスタチンの分離について、以下実施例を用い詳細に例示する。
【００４１】
実施例
高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）はＷａｔｅｒｓ（商標）社製装置を用い実施された。ＨＰＬＣ条件：カラムパッケージングＷａｔｅｒｓ ＮｏｖａＰａｃｋＣ１８５μｍ逆相パッケージング；ＵＶ検出：λ＝２３７ｎｍ：注入容積：１０μｌ；流速：０．６−０．９ｍｌ／分直線勾配；勾配溶出：溶媒Ａ＝アセトニトリル−０．１ ＭＮａＨ２ＰＯ４水（２５：７５）、溶媒Ｂ＝アセトニトリル−水（Ｈ３ＰＯ４にてｐＨ２）（７０：３０）。勾配プログラムを表１に示す。
【００４２】
【表１】
2003528576.tif 000007
【００４３】
実施例１．
可溶性澱粉ゲル培地（“ＳＭ”、表２）をｐＨ７．０に調節し、続いて１２１℃にて２５分間滅菌した。
【表２】
2003528576.tif 000008
【００４４】
次にＳＭ培地にミクロモノスポラ種ＩＤＲ−Ｐ３［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２６８］を接種した。７−１０日齢のミクロモノスポラ種ＩＤＲ−Ｐ３［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２６８］の可溶性澱粉寒天（ＳＭ）傾斜培地より得た胞子から胞子の蒸留水懸濁液（５ｍｌ）を調整した。
この懸濁液を用い、Ｔ１培地のｐＨを７．０に調節し１２１℃にて２５分間滅菌した後、５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中のＴ１接種培地（１００ｍｌ、表３）に接種した。
【００４５】
【表３】
2003528576.tif 000009
【００４６】
培養体は回転式シェーカー（２５０ｒ．ｐ．ｍ；振幅：２．５ｃｍ）上にて３日間、３２℃にて振盪した。次にこの接種菌培養体の一部５ｍｌを用い、事前にｐＨ７．０に調節され１２１℃にて２５分間滅菌されたＴＴ培地（１００ｍｌ、表４）を含む１０本のエーレンマイヤーフラスコに接種した。
【００４７】
【表４】
2003528576.tif 000010
【００４８】
細菌は３２℃にて７２時間インキュベーションされた。次にコンパクチンのナトリウム塩（５０ｍｇ）が各フラスコに蒸留水液として加えられ、生物変換を更に３２℃で９６時間持続した。コンパクチンナトリウム塩からプラバスタチンへの変換はＨＰＬＣにより８２％と測定された。
発酵終了後、培養体を一つにまとめた。プラバスタチンは平均濃度４１０μｇ／ｍｌで形成された。プラバスタチンは次の様にして単離された。発酵ブロスは２５００ｒ．ｐ．ｍにて２０分間遠心分離された。ブロス上清と細菌細胞とが分離された。水（２５０ｍｌ）が細菌細胞に加えられ、懸濁液を１時間攪拌した後濾過した。上清及び濾液が一つにまとめられた。ｐＨは１５％硫酸により４．０に調節された。酸性濾液／上清混合液は酢酸エチル（３×３００ｍｌ）により抽出され、無水硫酸ナトリウムで乾燥され、真空下に１００ｍｌの容積まで濃縮された。
【００４９】
プラバスタチンラクトンは、触媒量のトリフルオロ酢酸を連続攪拌しながら室温にて加えることでプラバスタチンより調製された。プラバスチチンラクトンの形成はＴＬＣ：吸着体：Ｋｌｅｓｅｌｇｅｌ（シリカゲル）６０Ｆ２５４ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ）をアルミフォイル上でベーキングしたもの；展開溶媒：アセトン：ベンゼン：酢酸（５０：５０：１．５）混合液；検出：リン酸モリブデン試薬；Ｒｆ（プラバスタチンラクトン）＝０．７によりモニターされた。ラクトン化終了後、酢酸エチルは５％の炭酸水素ナトリウム水溶液（２×２０ｍｌ）、続いて水（２０ｍｌ）で洗浄され、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させられた。
【００５０】
酢酸エチルは真空下に蒸発させられた。残渣（０．５ｇ）は１０ｇのＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０吸着剤（カラム直径：１．２ｃｍ）と極性を増加する酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合液で溶出される勾配カラムクロマトグラフィーにより分離された。プラバスタチンラクトンはカラムより、６０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンの混合液により溶出された。プラバスタチンラクトンを含む分画はまとめられ、真空下で蒸発させられた。残渣（２３０ｍｇ）はエタノール（５ｍｌ）に溶解され、続いて１１０モルの水酸化ナトリウムが！Ｍのエタノール液として攪拌しながら加えられた。
【００５１】
攪拌は３０分間、室温で続けられた。次に溶液は０．２ｍｌまで濃縮された。アセトン（４ｍｌ）が濃縮液に加えられた。この混合液を＋５℃に一晩保った。沈殿を濾過し、アセトン（２ｍｌ）、続いてｎ−ヘキサン（２ｍｌ）にて洗浄してから、室温にて真空下に乾燥した。得られた粗プラバスタチンはエタノールに溶解された。溶液をチャコールで清浄化し、プラバスタチン（１７０ｍｇ）をエタノール−酢酸エチル混合液から結晶化した。
特性分析：
【００５２】
融点：１７０−１７３℃（溶解）
［α］Ｄ２０＝＋１５６°（ｃ＝０，５、水中）。
紫外線吸収スペクトル（２０μｇ／ｍｌ、エタノール中）：λｍａｘ＝２３１、２３７、２４５ｎｍ（ｌｏｇε＝４．２６３；４．３１１；４．１３６）。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：ｖＯＨ３４１５、ｖＣＨ２９６５、ｖＣ−０ １７３０、ｖＣＯＯ−１６７５ｃｍ−１。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｃ２Ｏ、δ、ｐｐｍ）：０．８６、ｄ、３Ｈ（２−ＣＨ３）；５．９２、ｄｄ、Ｊ＝１０．０及び５．４Ｈｚ、１Ｈ（３−Ｈ）；５．９９、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ（４−Ｈ）；５．５２、ｂｒ、１Ｈ（５−Ｈ）；４．２４、ｍ、１Ｈ（６−Ｈ）；５．３４、ｂｒ、１Ｈ（８−Ｈ）；４．０６、ｍ、１Ｈ（β−Ｈ）、３．６５、ｍ、１Ｈ（δ−Ｈ）；１．０５、ｄ、３Ｈ（２‘−ＣＨ３）；０．８２、ｔ、３Ｈ（４’−Ｈ３）。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、δ、ｐｐｍ）：１５．３、ｑ（２−ＣＨ３）；１３９．５、ｄ（Ｃ−３）；１２９、ｄ（Ｃ−４）；１３８．１、ｓ（Ｃ−４ａ）；１２７．７、ｄ（Ｃ−５）；６６．６、ｄ（Ｃ−６）；７０．１、ｄ（Ｃ−８）；１８２．６、ｓ（ＣＯＯ−）；７２．６、ｄ（Ｃ−β）；７３．０、ｄ（Ｃ−δ）；１８２．０，ｓ（Ｃ−１‘）；１８．８、ｑ（２’−ＣＨ３）；１３．７、１（Ｃ−４‘）。
【００５４】
ポジティブＦＡＢマススペクトル（特性イオン）：４６９［Ｍ＋Ｎａ］＋；４４７［Ｍ＋Ｈ］＋。
ネガティブＦＡＢマススペクトル（特性イオン）：４４５［ＭーＨ］−；４２３［Ｍ−Ｎａ］−、ｍ／ｚ１０１［２−メチル−ブチル酸−Ｊ］。
【００５５】
実施例２．
生物変換培地ＭＴ（表５）はｐＨ７．０に調節され、１２１℃にて２５分間滅菌された。
【表５】
2003528576.tif 000011
【００５６】
ＭＴ生物変換培地（１００ｍｌ）をそれぞれ含む１０本の５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコに、実施例１で調製された接種培養体を接種し、２８℃にて９６時間インキュベーションした。コンパクチンのナトリウム塩（５０ｍｇ）を最小量の蒸留水に溶解し、各フラスコに加えた。７２時間発酵し続けた。次に新たに５０ｍｇのコンパクチンナトリウム塩の蒸留水溶液を各培養体に加え、更に７２時間発酵を続けた。
【００５７】
培養体を一つにまとめ、プラバスタチンをブロスから以下の手順で単離した。まとめられた、ＨＰＬＣアッセイによれば７５０ｍｇのプラバスタチンを含む培養体を２５００ｒ．ｍ．ｐ．で２０分間遠心分離した。分離された細菌細胞を水（２５０ｍｌ）と共に１時間攪拌し、濾過した。上清と濾過液をまとめ、得られた液のｐＨを１５％の硫酸で３．５−４．０に調節した。この溶液を酢酸エチル（３ｘ３００ｍｌ）で抽出した。次に１５０モル％のジベンジルアミン−プラバスタチン含有量に対し計算された−を酢酸エチル抽出物に加えた。エチル酢酸抽出物を約３０ｍｌ容積まで蒸発させ、懸濁液を一晩０−５℃に維持した。沈殿したプラバスタチンジベンジルアンモニウム塩を濾過し、フィルター上にて冷酢酸エチルとｎ−ヘキサンを用い洗浄し、真空下に乾燥させた。
【００５８】
粗プラバスタチンジベンジルアンモニウム塩（１．１ｇ）をアセトン（３３ｍｌ）に６２−６６℃で溶解した。溶液をチャコール（０．１ｇ）で３０分間清浄化した。濾過により溶液からチャコールを除き、温めたアセトン（１０ｍｌ）で洗浄した。濃縮液から結晶を沈殿させ、再度６２−６６℃にて溶解した。この溶液を＋５℃に一晩置いた。沈殿を濾過し、冷アセトンとｎ−ヘキサンにて洗浄し、真空下に乾燥させた。こうして得たプラバスタチンジベンジルアンモニウム塩（０．７ｇ）をエタノール（１０ｍｌ）に懸濁し、続いて１１０モル％の水酸化ナトリウムを１Ｍの水溶液の形でこの溶液に加えた。
【００５９】
アルカリ溶液を室温にて３０分間攪拌し続けた。水（３０ｍｌ）を加え、溶液のｐＨを中性化した。エタノールを真空下に蒸留し除いた。得られた濃縮水溶液を５０ｍｌのＤｉａｉｏｎＨＰ２０樹脂で満たされたカラムを用いた勾配カラムクロマトグラフィーにより分離した（カラム直径：１．５ｃｍ）。カラムは５％づつアセトン濃度を増加するアセトン−脱イオン化水混合液で溶出した。プラバスタチンは１５％アセトン−脱イオン水混合液によりカラムから溶出できた。分画は実施例１記載のＴＬＣ法により分析された；Ｒｆ（プラバスタチン）＝０．５。プラバスタチンを含む分画をまとめ、アセトンを真空下に蒸発させた。
水性残渣を凍結乾燥して、クロマトグラフィー的に純粋なプラバスタチン（３９０ｍｇ）を得た。
【００６０】
実施例３．
ＴＴ／２培地（４．５Ｌ、表６）を研究用ファーメンター中にて１２１℃、４５分間滅菌し、実施例１記載の如くに調製されたミクロモノスポラ種ＩＤＲ−Ｐ３接種菌振盪培養体を接種した。
【表６】
2003528576.tif 000012
【００６１】
次にこの培地を２８℃にインキュベーションし、１５０Ｌ／時で無菌空気を通気し、フラットブレードスターラーにより３００ｒ．ｐ．ｍにて攪拌した。７２時間発酵を続け、コンパクチンのナトリウム塩（２．５ｇ）を培養体に加えた。生物変換４８時間目までにコンパクチン基質は発酵ブロスから消費された。追加のコンパクチンナトリウム塩（２．５ｇ）を培養体に加えた。第２回目に投与されたコンパクチン基質は２４時間で消費された。コンパクチンナトリウム塩のプラバスタチンへの変換率は９０％であった。
【００６２】
実施例４．
ＴＴ／１発酵培地（４．５Ｌ、表７）をｐＨ７．０に調節し、研究用ファーメンター中にて１２１℃、４５分間滅菌した。
【表７】
2003528576.tif 000013
【００６３】
ＴＴ／１培地に、実施例１記載の如くに調製されたミクロモノスポラ種ＩＤＲ−Ｐ３接種菌振盪培養体を接種した。次にこの培養体を２８℃にインキュベーションし、２００Ｌ／時で無菌空気を通気し、フラットブレードスターラーにより４００ｒ．ｐ．ｍにて９６時間攪拌した。コンパクチンのナトリウム塩（２．５ｇ）を滅菌濾過水溶液として培養体に加えた。発酵は２８℃にて実施された。発酵５日目までにコンパクチンは発酵ブロスから消費された。追加のコンパクチンナトリウム塩（７．５ｇ）を２．５ｇづつ間欠的に２日間かけて加えた。追加のコンパクチンナトリウム塩は初回投与から４日以内に完全にプラバスタチンに変換された。発酵終了時、コンパクチンナトリウム塩（１０ｇ）がプラバスタチンに変換された（９ｇ、９０％）。
【００６４】
ブロスからは以下の様にして１８００μｇ／ｍｌの濃度のプラバスタチンが単離された。培養ブロス（５Ｌ）が２５００ｒ．ｐ．ｍ、２０分間の遠心分離にかけられ、上清が細菌細胞から分離された。水（２Ｌ）が分離された細胞に加えられ、得られた懸濁液は１時間攪拌され、濾過された。上清と濾過液をまとめ、Ｄｏｗｅｘ（商標）Ａ１４００（ＯＨ−）樹脂を含むカラム（３００ｇ、カラム直径：４ｃｍ）に流速５００ｍｌ／時で通過させた。樹脂床は脱イオン水（１Ｌ）で洗浄された。次にカラムを１０ｇの塩化ナトリウムを含む１：１アセトン−水混合（１Ｌ）で溶出し、５０ｍｌの分画に集めた。この分画を実施例１記載のＴＬＣ法にて分析した。
【００６５】
産物を含む分画をまとめ、アセトンを真空下に蒸留して除いた。濃縮液のｐＨを１５％の硫酸にて３．５−４．０に調節した。この濃縮液を酢酸エチル（２ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。まとめた酢酸エチル抽出液に脱イオン水（４０ｍｌ）を加えた。水相のｐＨを１Ｍの水酸化ナトリウムで７．５−８．０に調節した。１５分間攪拌した後、水相と酢酸エチル相を分離した。水性アルカリ抽出を２回繰り返した。アルカリ水溶液をまとめたものを５０ｍｌ容積まで濃縮し、残渣をＤｉａｉｏｎ（商標）ＨＰ２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｏ．Ｊａｐａｎ、６００ｍｌ、カラム直径３．８ｃｍ）により分離した。カラムを脱イオン水（６００ｍｌ）にて洗浄し、続いて５％づつアセトン濃度を増加しながらアセトン−脱イオン水混合液にて溶出した。溶出液は５０ｍｌ分画に集めた。溶出液は実施例１記載のＴＬＣ法により分析された。
【００６６】
プラバスタチンは１５％アセトン−脱イオン水混合的中にカラムより溶出された。ＴＬＣにより純粋なプラバスタチンを含む分画と決定された分画をまとめ、溶液を真空下に１５０ｍｌまで濃縮した。濃縮溶出液をチャコール（０．６ｇ）上に室温にて１時間攪拌し、清浄化した。チャコールを濾過して除き、濾液を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥プラバスタチン（６．５ｇ）をエタノール及び酢酸エチル混合液から２回結晶化した。沈殿を濾過し、酢酸エチル（２０ｍｌ）及びｎ−ヘキサン（２０ｍｌ）で洗浄、室温にて真空下に乾燥させクロマトグラフィー上純粋なプラバスタチンを得た（４．６ｇ）。
【００６７】
実施例５．
実施例１の滅菌可溶性澱粉培地ＳＭにミクロモノスポラエチノスポラ亜種エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒｅ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ． ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ５［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７２］細菌株を接種し、１０日間インキュベーションした。１０日齢の可溶性澱粉培地から得た胞子を使い胞子の蒸留水懸濁液を調製し、この懸濁液を用いて５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中にある実施例１記載の滅菌Ｔ１接種培地１００ｍｌに接種した。培養体をロータリーシェーカー（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、振幅２．５ｃｍ）にて３日間、２８℃攪拌した。
【００６８】
次に得られた培養体の一部５ｍｌを、それぞれが１００ｍｌの、前もって１２１℃、２５分間にて滅菌された生物変換培地ＴＴ／１を含む１０本の５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移した。ＴＴ／１培地の組成は実施例３に記載されている。フラスコにロータリーシェーカーにて攪拌しながら（２５０ｒ．ｐ．ｍ．，振幅２．５ｃｍ）、３日間、２５℃にてインキュベーションした。コンパクチンナトリウム塩（１０ｍｇ）を滅菌濾過した水溶液として各フラスコに加えた。１６８時間、２５℃にて発酵を続けた。生物変換終了時では発酵ブロスのプラバスタチン含有量はＨＰＬＣにより決定したところ４０μｇ／ｍｌであった。
【００６９】
実施例６．
接種、インキュベーション、発酵、及び基質添加は、ミクロモノスポラメガロミセア亜種ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒｅ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ ｓｐｐ．ｎｉｇｒａ）ＩＤＲ−Ｐ６［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７３］菌株を使い、実施例５記載の如くに実施された。１６８時間後の発酵ブロスのプラバスタチン含有量はＨＰＬＣにより５０μｇ／ｍｌと決定された。
【００７０】
実施例７．
ミクロモノスポラパープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒｅ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＩＤＲ−Ｐ４［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７１］菌株（５ｍｌ）の接種培養体は実施例１記載の如くに調製された。接種培養体を用い、ｐＨを７．０に調製し１２１℃にて２５分間滅菌された後の５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中のＴＴ／１４培地（１００ｍｌ、表８）に接種した。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
フラスコをロータリーシェーカー（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、振幅２．５ｃｍ）にて３日間振盪した。コンパクチンナトリウム塩の添加、生物変換及びプラバスタチン含有量の決定は実施例５記載の如くに実施された。生物変換終了時の発酵ブロスのプラバスタチン含有量はＨＰＬＣにより測定され、４０μｇ／ｍｌであった。
【００７３】
実施例８．
接種、インキュベーション、発酵、及び基質添加は、ミクロモノスポラメガロミセアロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒｅ ｒｏｓａｒｉａ）ＩＤＲ−Ｐ７［ＮＣＡＩＭ Ｐ（Ｂ）００１２７４］菌株を使い、実施例１記載の方法に従い実施された。生物変換終了時、発酵ブロス中にはＨＰＬＣにより測定した場合に、３５０μｇ／ｍｌのプラバスタチンが存在していた。
上記の如く発明を特定の好適実施態様及び実施例を参照しながら記述したが、当業者は上記及び添付クレームの発明の精神及び範囲から逸脱しない変型を認識するだろう。