(57)【要約】【課題】自己免疫疾患を治療又は予防することができる新規な技術を提供する。【解決手段】  自己抗原が原因となる自己免疫疾患の治療又は予防剤であって、自己抗原に応答する免疫細胞に障害を与える薬物と、薬物が封入されている薬物担体と、薬物担体の表面に結合しているリンカー分子と、リンカー分子を介して薬物担体の表面に保持されている自己抗原とを有する薬物送達体と、を備える自己免疫疾患の治療又は予防剤。 【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗原が原因となる自己免疫疾患の治療又は予防剤であって、
前記自己抗原に応答する免疫細胞に障害を与える薬物と、
前記薬物が封入されている薬物担体と、前記薬物担体の表面に結合しているリンカー分子と、前記リンカー分子を介して前記薬物担体の表面に保持されている前記自己抗原とを有する薬物送達体と、を備える自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記薬物担体が、リポソームである請求項１に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である請求項１又は２に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が、臓器特異的自己免疫疾患である請求項１から３のいずれか一つに記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記臓器特異的自己免疫疾患が、多発性硬化症であり、
前記自己抗原が、配列表の配列番号２で表されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同じアミノ酸配列のペプチドである請求項４に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記自己抗原が、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列のＭＯＧ３５−５５である請求項５に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項７】
前記臓器特異的自己免疫疾患が、多発性硬化症または実験的自己免疫性脳脊髄炎であり、
前記自己抗原が、配列表の配列番号１で表されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同じアミノ酸配列のペプチドである請求項４に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【請求項８】
前記自己抗原が、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列のＭＯＧ３５−５５である請求項７に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自身を構成する成分（自己抗原）に免疫細胞が応答し、自身の臓器や組織などを免疫細胞が損傷する疾患である。この自己免疫疾患に対して効果を示す薬物としては、免疫抑制剤やステロイドが知られている。しかしながら、これらの薬物は、自己抗原に対して応答する免疫細胞や、損傷により変異した細胞だけでなく、正常な細胞にまで作用してしまうため、副作用を生じさせることが知られている。
【０００３】
薬物送達システム（ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）は、薬物を目的部位に選択的に送達するための技術の総称である。この薬物送達システムでは、薬物を目的部位に選択的に送達するために、リポソームや高分子ミセルなどの薬物担体に薬物を封入して得られる薬物送達体を使用するとともに、該薬物送達体について目的部位を標的化している（例えば、特許文献１）。目的部位の標的化は、目的部位に特異的に結合する糖鎖などの機能性分子を、薬物担体の表面に形成することにより行われる。標的化した薬物送達体は、機能性分子と目的部位との特異的な結合により、薬物を目的部位に選択的に送達することができ、薬物による副作用を抑制することができる。
【０００４】
特許文献２には、Ｅ−セレクチン，Ｌ−セレクチン，およびＰ−セレクチンのいずれかが発現している細胞を標的とし、Ｅ−セレクチン等に結合する所定の糖鎖を用いて標的化した免疫抑制剤やステロイドを封入したリポソームを含む自己免疫疾患の治療剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１７０８０７号公報
【特許文献２】国際公開第２００５/０１１６３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
標的化した従来の薬物送達体は、生体内に投与されると、血液やリンパ液を利用して全身に運ばれる。そして、薬物送達体が目的部位付近に運ばれると、薬物送達体表面の機能性分子が目的部位に特異的に結合し、薬物が放出される。このように、従来の薬物送達体における標的化は、薬物送達体を目的部位に向かわせる能動的な送達を行う技術である。
【０００７】
しかしながら、薬物送達体を目的部位に向かわせる能動的な送達は、薬物送達体が目的部位付近に運ばれるまでは、血流やリンパ液の流れに依存する。このため、血流やリンパ液の流れによっては、薬物送達体が目的部位付近まで到達しないことが考えられる。また、血液やリンパ液を流れる薬物送達体が、血液やリンパ液が流れ込む臓器や組織などに蓄積し、薬物による副作用が引き起こされることも考えられる。
【０００８】
本発明は、自己免疫疾患を治療又は予防することができる新規な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）自己抗原が原因となる自己免疫疾患の治療又は予防剤であって、前記自己抗原に応答する免疫細胞に障害を与える薬物と、前記薬物が封入されている薬物担体と、前記薬物担体の表面に結合しているリンカー分子と、前記リンカー分子を介して前記薬物担体の表面に保持されている前記自己抗原とを有する薬物送達体と、を備える自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（２）前記薬物担体が、リポソームである（１）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（３）前記免疫細胞が、Ｔ細胞である（１）又は（２）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（４）前記自己免疫疾患が、臓器特異的自己免疫疾患である（１）から（３）のいずれか一つに記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（５）前記臓器特異的自己免疫疾患が、多発性硬化症であり、前記自己抗原が、配列表の配列番号２で表されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同じアミノ酸配列のペプチドである（４）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（６）前記自己抗原が、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列のＭＯＧ３５−５５である（５）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（７）前記臓器特異的自己免疫疾患が、多発性硬化症または実験的自己免疫性脳脊髄炎であり、前記自己抗原が、配列表の配列番号１で表されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同じアミノ酸配列のペプチドである請求項（４）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
（８）前記自己抗原が、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列のＭＯＧ３５−５５である（７）に記載の自己免疫疾患の治療又は予防剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、自己免疫疾患を治療又は予防することができる新規な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、薬物送達体の概略図である。
【図２】図２は、多発性硬化症が発症するメカニズムを説明する図である。
【図３】図３は、多発性硬化症を治療するメカニズムを説明する図である。
【図４】図４は、治療剤の製造方法の一例を説明するフローチャートである。
【図５】図５は、抗ＭＯＧ抗体に対する結合性試験の結果を示す図である。
【図６】図６は、多発性硬化症の治療試験１の結果（０日から１９日までの神経症状）を示す図である。
【図７】図７は、多発性硬化症の治療試験２の結果（０日から３６日までの神経症状）を示す図である。
【図８】図８は、多発性硬化症の治療試験２の結果（１０１日後の神経症状）を示す図である。
【図９】図９は、多発性硬化症の治療試験２の結果（０日から１０１日までの生存率）を示す図である。
【図１０】図１０は、多発性硬化症の治療試験２の結果（０日から５７日までの平均体重）を示す図である。
【図１１】図１１は、配列番号１〜４のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
【００１３】
本実施形態の治療剤は、自己免疫疾患の治療剤である。自己免疫疾患は、自身を構成する成分（自己抗原）に自身の免疫細胞が応答し、自身の臓器，組織，細胞などが免疫細胞によって損傷される疾患の総称である。
【００１４】
まず、本実施形態の治療剤に含まれる成分について説明する。本実施形態の治療剤は、少なくとも薬物送達体を含む。薬物送達体は、自己抗原に応答する免疫細胞に障害を与える薬物と、薬物が封入されている薬物担体と、薬物担体の表面に結合しているリンカー分子と、リンカー分子に結合することによりリンカー分子を介して薬物担体の表面に保持されている自己抗原と、を備える。
【００１５】
薬物担体は、薬物が封入される担体であり、例えば、リポソームなどの脂質ナノ粒子や高分子ミセルを用いることができる。
【００１６】
脂質ナノ粒子は、脂質の膜で構成される１ｎｍ以上１０００ｎｍ未満の粒径（直径）の粒子であり、膜の内部には、薬物を封入できる内腔が形成されている。脂質ナノ粒子の膜は、１枚であってもよく、２枚以上であってもよい。膜を構成する脂質としては、例えば、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、長鎖脂肪族アルコール、長鎖脂肪酸の脂肪族アルコールエステル、ステロール類、コレステロールエステル、リン脂質、脂肪族アミン、ワックス類、セラミド、植物油、水素化（硬化）植物油、魚油、藻類油、石油由来の油、短鎖脂肪族アルコール、中鎖脂肪族アルコールまたは短鎖アルコールとの脂肪酸エステル、中鎖脂肪酸トリグリセリド、脂肪族アルコールエーテルなどが挙げられる。
【００１７】
リポソームは、脂質ナノ粒子のうち、リン脂質を含む内膜及び外膜の２枚の膜（以下、「脂質二重膜」ともいう）で構成される粒子である。リポソームは、内膜の内部に形成される第１の内腔と、内膜と外膜との間に形成される第２の内腔を有しており、これら２つの内腔のいずれか又は両方に薬物を充填することができる。リポソームの粒子径は、例えば、３０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満とすることができる。
【００１８】
脂質二重膜に含まれる具体的なリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、１−パルミトイル２−オレオイルホスファチジルコリン（POPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）を挙げることができる。なお、これらのリン脂質は、２種類以上を組合せて用いることもできる。
【００１９】
リポソームを構成する脂質二重膜は、リン脂質以外に、糖脂質、ステロール類、カチオン性脂質などの両親媒性の脂質を含んでいてもよい。なお、両親媒性の脂質とは、分子内に親水基と疎水基の両方を持つ脂質である。
【００２０】
糖脂質としては、例えば、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。なお、これらの糖脂質は、２種類以上を組合せて用いることもできる。
【００２１】
ステロール類としては、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、ラノステロールを挙げることができる。なお、これらのステロール類は、２種類以上を組合せて用いることもできる。
【００２２】
カチオン性脂質は、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）およびＮ−［１−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどを挙げることができる。なお、これらのカチオン性脂質は、２種類以上を組合せて用いることもできる。
【００２３】
リポソームを構成する脂質二重膜において、リン脂質などの上述した脂質は、親水基と疎水基のいずれか一方が膜の内側に配置され、親水基と疎水基のいずれか他方が膜の外側に配置されるように配列されている。また、内膜と外膜において、親水基と疎水基の配置は逆となっている。つまり、内膜を形成する脂質の親水基が内膜の内側に配置される（疎水基が内膜の外側に配置されている）場合、外膜を形成する脂質の親水基は、外膜の外側に配置される（疎水基は、外膜の内側に配置される）。また、内膜を形成する脂質の親水基が内膜の外側に配置される（疎水基が内膜の内側に配置される）場合、外膜を形成する脂質の親水基は、外膜の内側に配置される（疎水基が外膜の外側に配置される）。親水基と疎水基の配置は、リポソーム製造の際に使用する溶媒や内腔に充填する薬物の性質（親水性，疎水性）を変更することなどにより調整することができる。
【００２４】
高分子ミセルは、親水性ポリマーと疎水性ポリマーのブロック共重合体により形成される１枚の膜の粒子であり、膜の内部に薬物を封入できる内腔が形成されている。高分子ミセルの粒径は、例えば、１０〜１００ｎｍとすることができる。
【００２５】
高分子ミセルの膜を形成するブロック共重合体としては、例えば、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリエチレンイミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアリルアミンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリリジンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリルアミド−ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリビニルピロリドン−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリル酸エステル−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリメタクリル酸−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体を用いることができる。なお、これらのブロック共重合体は、２種類以上を組合せて用いることができる。
【００２６】
高分子ミセルの膜を形成するブロック共重合体は、親水性ポリマーと疎水性ポリマーのいずれか一方が膜の内側に配置され、親水性ポリマーと疎水性ポリマーのいずれか他方が膜の外側に配置されるように配列されている。親水性ポリマーと疎水性ポリマーの配置は、高分子ミセル製造の際に使用する溶媒や膜の内腔に充填される薬物の性質（親水性，疎水性）を変更することなどにより調整することができる。
【００２７】
薬物担体の割合は、特に限定されず当業者が適宜設定できるが、薬物等が封入されている薬物送達体１００質量％に対し、８０質量％以上９８質量％以下とすることが、薬物を薬物担体の内部に安定して保持できる観点から好ましい。
【００２８】
薬物担体の表面には、自己抗原を薬物送達体の表面に保持するためのリンカー分子が結合している。リンカー分子は、自己抗原を薬物送達体の表面に保持できる物質であればよく、薬物担体を構成する成分等に応じて当業者が適宜設定でき、特に限定されない。例えば、リンカー分子として、アミノ酸や炭素鎖やＰＥＧ脂質誘導体（ポリエチレングリコール脂質誘導体）を用いることができる。より具体的なリンカー分子としては、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｄｉｓｔｅａｒｙｌｐｈoｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）やＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅを挙げることができる。なお、リンカー分子としてポリエチレングリコール誘導体を用いる場合、ポリエチレングリコールの分子量は、例えば５００〜６，０００とすることができる。また、ポリエチレングリコール誘導体には、分子量の異なる２種以上のポリエチレングリコールを組み合わせて用いることができる。分子量の異なる２種以上のポリエチレングリコールを組み合わせて用いる場合には、一つのポリエチレングリコールの分子量は、例えば、５００〜２，０００とすることができる。なお、これらＰＥＧ脂質誘導体は、２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
リンカー分子の割合は特に限定されず当業者が適宜設定できるが、薬物等が封入されている薬物送達体１００質量％に対し、１質量％以上１５質量％以下とすることが、薬物を薬物担体の内部に安定して保持できる観点や免疫細胞に対する障害性を薬物送達体（薬物担体）に付与できる観点から好ましい。
【００３０】
薬物担体の表面には、自己抗原がリンカー分子を介して保持されている。例えば、自己抗原は、リンカー分子における薬物担体に結合している端部とは反対側の端部において、リンカー分子と結合している。
薬物担体の表面に保持される自己抗原は、本実施形態の治療剤の対象である自己免疫疾患の原因となる自己抗原であればよく、治療剤を投与する個体から採取した自己抗原であってもよく、治療剤を投与する個体とは異なる別の個体から採取した自己抗原であってもよい。また、化学的に合成された自己抗原であってもよい。自己抗原として作用する物質として、例えば、タンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸を挙げることができ、対象となる疾患に応じて適宜選択することができる。なお、本明細書において、タンパク質とは、５０個以上のアミノ酸から構成されるポリペプチドであり、ペプチドとは、２個以上５０個未満のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。
【００３１】
薬物担体の表面に保持される自己抗原の数は特に限定されないが、例えば、１個以上２０，０００個以下とすることが好ましく、２個以上１０，０００個以下とすることがより好ましい。自己抗原の数が２個以上である場合、抗原の数が１個である場合と比較して、薬物担体の表面に保持される自己抗原に免疫細胞がより応答しやすくなる多価効果という効果が発揮される。なお、薬物担体の表面に保持される自己抗原の数は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することができる。
【００３２】
自己抗原の割合は当業者が適宜設定でき、特に限定さないが、薬物等が封入されている薬物送達体１００質量％に対し、０．００６質量％以上３０質量％以下とすることが免疫細胞から認識されやすくなる観点から好ましい。
【００３３】
薬物担体の内腔に封入されている薬物は、自己抗原に応答する免疫細胞に障害を与える薬物である。具体的な薬物としては、例えば、ドキソルビシン，ダウノルビシン，ビンクリスチンなどの抗がん剤や、メトトレキサートなどの抗がん剤と抗リウマチ剤の両方として作用する薬剤や、タクロリムス，シクロスポリン、フィンゴリモドなどの免疫抑制剤や、ベルテポルフィンなどの光増感剤を挙げることができる。
【００３４】
ここで、自己抗原に応答する免疫細胞とは、自己抗原を認識する免疫細胞だけではなく自己抗原を排除する免疫細胞を含む概念である。自己抗原に応答する具体的な免疫細胞としては、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞，ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球を挙げることができる。また、免疫細胞に障害を与えるとは、免疫細胞を死滅（消滅）するだけではなく、免疫細胞の機能を発揮できない状態にしたり、免疫細胞の機能を抑制したりすることを含む概念である。
【００３５】
薬物の割合は当業者が適宜設定でき特に限定されないが、薬物等が封入されている薬物送達体１００質量％に対し、１質量％以上１５質量％以下とすることが、薬物を薬物担体の内部に安定して保持できる観点や免疫細胞に対する障害性を薬物送達体（薬物担体）に付与できる観点から好ましい。
【００３６】
薬物送達体の平均粒子径は、特に限定されるものではないが、１ｎｍ以上１，０００ｎｍ未満とすることができ、３０ｎｍ以上２００ｎｍ以下とすることが好ましい。平均粒子径が３０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることにより、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果）により免疫細胞に薬物送達体が集積しやすい効果がある。なお、平均粒子径とは、体積平均粒径を示し、動的光散乱法により測定される値をいう。平均粒子径は、例えば、ゼータサイザーナノ（スペクトリス社マルバーンインストゥルメンツ製）を用いて測定することができる。
【００３７】
本実施形態の治療剤は、上述した薬物送達体の他に、薬学上許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、湿潤剤、溶剤、希釈剤（溶媒）などの他の成分を含んでいてもよい。
【００３８】
本実施形態の治療剤は、その形態（剤形）は特に限定されず、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、水剤などの経口投与用製剤、注射剤、軟膏剤、点眼剤、坐剤、貼付剤、ローション剤の形態とすることができる。好ましい治療剤の形態は、注射剤である。本実施形態の治療剤が注射剤である場合、薬物送達体が分解されずに血液中に導入されやすくなる。
【００３９】
自己免疫疾患は、全身が障害される全身性自己免疫疾患と、特定の臓器だけが障害される臓器特異的自己免疫疾患の２種類に分類することができる。本実施形態の治療剤は、自己抗原が原因となる自己免疫疾患であれば、いずれに分類される自己免疫疾患に対しても治療剤として用いることができる。
【００４０】
本実施形態の治療剤で治療できる自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ，全身性エリテマトーデス，抗リン脂質抗体症候群，多発性筋炎，皮膚筋炎，強皮症，シェーグレン症候群，IgG4関連疾患，血管炎症候群，混合性結合組織病などの全身性自己免疫疾患や、橋本病，バセドウ病，アジソン病，自己免疫性溶血性貧血，特発性血小板減少性紫斑病，潰瘍性大腸炎，原発性胆汁性肝硬変症，膜性腎炎，重症筋無力症，多発性硬化症，リウマチ熱，尋常性天疱症，水晶体誘発性ブドウ膜炎などの臓器特異的自己免疫疾患を挙げる事ができる。
【００４１】
自己免疫疾患では、免疫細胞が自己抗原を認識して自己抗原を排除しようとするため、自身の臓器や組織などが損傷される。本実施形態の治療剤では、免疫細胞が認識して排除しようとする自己抗原が薬物担体（薬物送達体）の表面に保持されており、薬物担体（薬物送達体）の内部には、その免疫細胞を障害する薬物が封入されている。このため、本実施形態の治療剤が体内に導入されると、免疫細胞は、薬物送達体の表面に保持される自己抗原を認識して排除しようとする。このとき、薬物送達体に対する免疫細胞の刺激で、薬物担体（薬物送達体）に封入される薬物が放出され、免疫細胞に障害が与えられる。このため、自己抗原に応答する免疫細胞が障害され、自己免疫疾患を治療することができる。
【００４２】
上述したように、本実施形態の治療剤は、薬物送達体を免疫細胞に向かわせる能動的な送達を行う技術ではなく、薬物送達体（具体的には、その表面に保持される自己抗原）を免疫細胞に認識させ、免疫細胞を薬物送達体に向かわせる受動的な送達を行う技術である。このため、血流やリンパ液の流れによって、薬物送達体が移動しにくくなったとしても、免疫細胞が薬物送達体に向かい、薬物送達体に到達することができる。また、臓器や組織に薬物送達体が蓄積したとしても、免疫細胞が薬物送達体に向かい、薬物送達体に到達することができる。従って、薬物送達体の蓄積によって生じる副作用を抑制することができる。このように、本実施形態の治療剤は、従来の技術とは異なる新規な技術を提供することができる。
【００４３】
次に、本発明の治療剤を多発性硬化症の治療剤に応用した実施形態について、図１を用いて説明する。図１は、多発性硬化症の治療剤に含まれる薬物送達体の概略図である。
【００４４】
図１に示すように、多発性硬化症の治療剤に含まれる薬物送達体１は、薬物３が封入される薬物担体２と、薬物担体２の表面に結合するリンカー分子４と、リンカー分子４を介して薬物担体２の表面に保持される自己抗原５を有する。
【００４５】
薬物担体２は、ステロール類及びリン脂質からなる内膜２ａ及び外膜２ｂによって構成されるリポソームである。ステロール類とリン脂質の具体的な組み合わせとしては、例えば、コレステロールとジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、「ＤＰＰＣ」ともいう）を挙げることができる。内膜２ａ，外膜２ｂがコレステロールとＤＰＰＣにより構成される場合、コレステロールとＤＰＰＣのモル比（コレステロール：ＤＰＰＣ）は、特に限定されないが、内膜２ａ及び外膜２ｂを安定して維持できる観点から１：５〜１：１とすることが好ましい。
【００４６】
内膜２ａにおいて、リン脂質とステロール類の親水基は、内膜２ａの内側に配置され、リン脂質とステロール類の疎水基は、内膜２ａの外側に配置されている。外膜２ｂにおいて、リン脂質とステロール類の親水基は、外膜２ｂの外側に配置され、リン脂質とステロール類の疎水基は、外膜２ｂの内側に配置されている。内膜２ａの内部には、第１の内腔２ｃが形成されており、内膜２ａと外膜２ｂとの間には、第２の内腔２ｄが形成されている。
【００４７】
第１の内腔２ｃには、薬物３が封入されている。内腔２ｃは、内膜２ａを構成するリン脂質とステロール類の親水基に囲まれた空間であるため、薬物２としては、ダウノルビシン，ドキソルビシンなど親水性薬物が用いられる。ここで、薬物送達体１では、第２の内腔２ｄに薬物は封入されていないが、例えばメトトレキサート、タクロリムス，シクロスポリンなどの疎水性薬物を薬物担体２に封入する場合、膜２ａ，２ｂを構成するリン脂質とステロール類の疎水基に囲まれた第２の内腔２ｄに、これらの疎水性薬物を封入することができる。
【００４８】
薬物送達体１の表面には、複数のリンカー分子４が結合している。リンカー分子４としては、薬物担体２を構成するリン脂質に結合できるとともに、後述する抗原（例えばペプチド）に結合できるＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳや、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅなどの活性化ＰＥＧ脂質誘導体を用いることができる。
【００４９】
また、薬物送達体１の表面には、リンカー分子４を介して複数の自己抗原５が保持されている。自己抗原５は、多発性硬化症の原因となるペプチドとすることができる。多発性硬化症の原因となるペプチドとしては、例えば、配列表（又は図１１）の配列番号１（マウスのアミノ酸配列）や配列表（又は図１１）の配列番号２（ヒトのアミノ酸配列）に示すミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同じアミノ酸配列のペプチドを使用することができ、例えば、２１個以上５０個未満のアミノ酸により構成することができる。より具体的な自己抗原５としては、例えば、配列表（又は図１１）の配列番号３（マウスのアミノ酸配列）や配列表（又は図１１）の配列番号４（ヒトのアミノ酸配列）に示すように、配列番号１や２に含まれる連続する２１個のアミノ酸から構成されるペプチド（以下、「ＭＯＧ３５−５５」ともいう）を使用することができる。
【００５０】
次に、図２〜図３を用いて、薬物送達体１を含む治療剤による多発性硬化症の治療メカニズムを説明する。
【００５１】
図２は、多発性硬化症が発症するメカニズムを説明する図である。多発性硬化症は、免疫細胞が神経細胞を障害する臓器特異的自己免疫疾患である。図２に示すように、神経細胞１００は、細胞体１０１と細胞体１０１から延びる軸索１０２と軸索１０２に巻き付く複数の髄鞘（ミエリン鞘）１０３を有しており、活動電位を発生させて他の細胞に情報を伝達する細胞である。多発性硬化症は、神経細胞１００を構成するこれらの成分のうち、髄鞘１０３に含まれるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質又はそのペプチド断片を自己抗原５として、Ｔ細胞５０が髄鞘１０３を損傷することを原因の一つとして発症すると考えられている。
【００５２】
図３は、薬物送達体１を含む本実施形態の治療剤により、多発性硬化症を治療するメカニズムを説明する図である。多発性硬化症の患者に対し、薬物送達体１を含む本実施形態の治療剤を投与すると、図３に示すように、Ｔ細胞５０は、髄鞘１０３に含まれる自己抗原５に応答するように、薬物送達体１の表面に保持される自己抗原５に応答する。このとき、薬物送達体１に対するＴ細胞５０の刺激により、薬物送達体１に封入される薬物２が放出され、Ｔ細胞５０に障害を与える。この結果、Ｔ細胞５０による髄鞘１０３の損傷が抑制され、多発性硬化症が治療される。
【００５３】
なお、薬物送達体１は、自己免疫疾患の治療だけでなく、自己免疫疾患の予防に使用することもできる。自己免疫疾患が発症する前に、薬物送達体１を含む自己免疫疾患の予防剤を投与しておけば、免疫細胞が自己抗原に対して応答するようになった際に、自己抗原に応答する免疫細胞を即座に障害することができ、臓器や組織の損傷を予防できる。なお、薬物送達体１を含む自己免疫疾患の予防剤には、薬物送達体１だけでなく、上述した薬学上許容される他の成分が含まれていてもよい。また、形態（剤形）についても特に限定されず、例えば上述した形態とすることができる。
【００５４】
次に、本実施形態の治療剤の製造方法について説明する。図４は、本実施形態の治療剤の製造方法を説明するフローチャートである。
【００５５】
ステップＳ１０１では、薬物を内封した薬物担体を取得する。薬物を内封した薬物担体を取得する方法は、薬物担体の種類に応じて適宜設定することができる。
【００５６】
薬物担体をリポソームなどの脂質ナノ粒子とする場合、例えば、Ｂａｎｇｈａｍ法、超音波処理法、有機溶媒抽出法、凍結融解法、リモートローディング法（ｐＨ勾配法ともいう）などの従来公知の技術を用いて、薬物を内封した脂質ナノ粒子を得ることができる。Ｂａｎｇｈａｍ法は、容器内で脂質（リン脂質など）を有機溶媒に溶解し、次いで有機溶媒を蒸発させて容器内面上に薄膜を作製した後、この薄膜に水又はリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」ともいう）を加えて薄膜を膨潤させるとともに薬物を加え、さらに容器を振盪することにより、薬物を内封した脂質ナノ粒子を得る方法である。超音波処理法は、Ｂａｎｇｈａｍ法で脂質ナノ粒子を得た後、その脂質ナノ粒子にさらに超音波処理を施して、薬物を内封した脂質ナノ粒子を得る方法である。有機溶媒抽出法は、有機溶媒に溶かした脂質（リン脂質など）を、薬物を含む水溶液に注入することにより脂質ナノ粒子を得る方法である。凍結融解法は、薬物及び脂質（リン脂質など）を混合した有機溶媒を凍結乾燥して水又はＰＢＳを加えた後、液体窒素で凍結し、これを解凍することにより、薬物を内封した脂質ナノ粒子を得る方法である。リモートローディング法は、脂質（リン脂質など）を混合した有機溶媒を蒸発させて容器内面上に薄膜を作製した後、この薄膜に硫酸アンモニウムやクエン酸緩衝液（ｐＨ３〜６程度に調整）を加えて薄膜を水和させて脂質ナノ粒子を得た後、透析法や超遠心法などにより脂質ナノ粒子の外液を中性緩衝液（例えば、純水やヘペス緩衝液（ｐＨ６〜８程度））に置換し、そこに薬物を加えて容器を振盪することにより、薬物を内封した脂質ナノ粒子を得る方法である。
【００５７】
薬物担体を高分子ミセルとする場合には、例えば、封入法，溶媒揮散法，透析法などの従来公知の技術を用いて、薬物を内封した高分子ミセルを得ることができる。封入法は、薬物をブロック共重合体が分散した水溶液に混合して撹拌することにより、薬物を内封した高分子ミセルを得る方法である。溶媒揮散法は、薬物を含む有機溶媒とブロック共重合体が分散した水溶液とを混合し、撹拌しながら有機溶媒を揮散させることにより、薬物を内封した高分子ミセルを得る方法である。透析法は、有機溶媒に薬物及びブロック共重合体を溶解した後、得られる溶液を透析膜を用いてＰＢＳ及び／又は水に対して透析し、薬物を内封した高分子ミセルを得る方法である。
【００５８】
なお、上述した方法において、有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５９】
ステップＳ１０２では、リンカー分子と自己抗原を結合する。リンカー分子と自己抗原の結合は、リンカー分子と自己抗原の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことが出来る。
【００６０】
自己抗原がペプチドである場合、ペプチドと結合可能な反応基を有するリンカー分子を、ペプチドとともに溶媒中で混合することにより、リンカー分子と自己抗原を結合することができる。ペプチドと結合可能な反応基としては、例えば、Ｎ−スクインシンイミドやマレイミドを用いることができる。Ｎ−スクインシンイミドを有するリンカー分子としては、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（［１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）］−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅ（ＰＥＧＭＷ例えば、２０００］）を挙げることができる。なお、リンカー分子とペプチドとを混合する溶媒としては、例えば、純水やホウ酸水溶液を用いることができる。
【００６１】
ステップＳ１０３では、Ｓ１０１で得られた薬物担体（薬物が封入される薬物担体）の表面に、Ｓ１０２で得られたリンカー分子（自己抗原を結合したリンカー分子）を結合し、薬物送達体を得る。薬物担体の表面にリンカー分子を結合する方法は、従来公知の技術を用いることができ、薬物担体を構成する物質やリンカー分子の種類に応じて適宜設定することができる。
【００６２】
例えば、リポソーム（薬物担体）の表面に、Ｓ１０２で例示したペプチドが結合したリンカー分子を結合する場合、Ｓ１０２で生成したリンカー分子（自己抗原を結合したリンカー分子）を含む溶媒に、リポソームを混合することにより、薬物担体の表面にリンカー分子を結合できる。
【００６３】
これらステップＳ１０１〜ステップＳ１０３の工程により、薬物送達体を生成することができる。なお、ステップＳ１０３の工程では、薬物送達体を生成した後、必要に応じて、薬物担体の表面に結合していない状態にあるリンカー分子と薬物送達体とを分離する分離処理を行うことができる。分離処理には、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーや超遠心機を用いることができる。
【００６４】
ステップＳ１０４では、Ｓ１０３で得られた薬物送達体と、必要に応じて含有される他の成分とを混合し、所定の剤形（形態）に加工する。
【００６５】
上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０４の処理により、本実施形態の治療剤を得ることができる。
【００６６】
なお、上述した製造方法では、薬物を内封した薬物担体を取得（ステップＳ１０１）した後、リンカー分子と自己抗原を結合（ステップＳ１０２）しているが、リンカー分子と自己抗原を結合した後に、薬物を内封した薬物担体を取得してもよい。また、上述した製造方法では、リンカー分子と自己抗原を結合（ステップＳ１０２）した後、薬物担体の表面に自己抗原を結合したリンカー分子を結合（ステップＳ１０３）しているが、これらの工程は同時に行われてもよい。ステップＳ１０２とステップＳ１０３を同時に行う場合、例えば、純水中で、ペプチドと結合可能な反応基を有するリンカー分子と、ペプチドと、薬物を内封したリポソームと、を混合すればよい。また、上述した製造方法では、リンカー分子と自己抗原を結合（ステップＳ１０２）した後、薬物担体の表面に自己抗原を結合したリンカー分子を結合（ステップＳ１０３）しているが、リンカー分子を薬物担体に結合した後に自己抗原を薬物担体に結合しても良い。
【実施例】
【００６７】
次に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００６８】
＜実施例１：自己免疫疾患治療剤の製造＞
容器内で、ＤＰＰＣ（日本精化社製）とコレステロール（日本精化社製）を、モル比（ＤＰＰＣ：コレステロール）が２：１となるようにクロロホルム溶液にて混合し、その後エバポレーター（東京理化器械社製）でクロロホルムを留去して、さらに１時間真空乾燥させた。容器壁面に形成された脂質薄膜に、０．２５ｍｏｌ／ｌの硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．５）を加え水和させた。得られた水溶液を液体窒素中で凍結し、凍結物を５５℃に設定した恒温水槽を用いて融解した。凍結及び融解の操作を、３回繰り返し、リポソームを生成した。生成したリポソームを超音波処理機（ブランソン社製）にて５分間処理し、生成したリポソームを１００ｎｍ孔径のフィルターを装着したエクストルーダー（トランスフェラナノサイエンス社）に７回通すことでサイズ調整を行った。さらに生成したリポソームを純水中で透析することで、リポソーム外液の置換を行い、さらに超遠心機を用いて分離して、０．３ｍｏｌ／ｌのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に水和した。そこにドキソルビシン（協和発酵キリン社製）溶液をモル比（（ＤＰＰＣ：コレステロール：ドキソルビシン＝２：１：０．２４）となるように加え、６０℃で１時間振とう混合し、ドキソルビシンが封入されたリポソームを生成した。生成したリポソームは、４５３，０００ｇ，４℃に設定された超遠心機（日立社製）を用いて分離され、０．３ｍｏｌ／ｌのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に水和した。
【００６９】
マウスのＭＯＧ３５−５５（医学生物学研究所社製、配列を配列表の配列番号３に示す）を混合した０．３ｍｏｌ／ｌのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（日油社製，ＰＥＧの分子量の合計：２，０００）を加えて、４℃で２時間、ｐＨ７．４の状態で反応させ、その後エタノールアミンを加えることで反応を停止させ、ＭＯＧ３５−５５が結合したＤＳＰＥ−ＰＥＧ（以下、「ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５」ともいう）を得た。生成したＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５溶液とドキソルビシンが封入されたリポソームを混合し、５５℃で１時間反応させ、リポソームの表面にＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームは、４５３，０００ｇ，４℃に設定された超遠心機（日立社製）を用いて分離し、０．３ｍｏｌ／ｌのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に水和して、リポソーム溶液を得た。
【００７０】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソーム（以下、単に「逆標的化リポソーム」ともいう）における構成成分の含有量を分光光度計、ＨＰＬＣを用いて測定した。測定条件は、リポソーム溶液２０μｌにリン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳともいう）８８０μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液１００μｌを加え、５５℃で１５分間混合し、その後に分光光度計を用いて４８４ｎｍの吸光度を測定することで、ドキソルビシン量を算出した。また、リポソーム溶液５０μｌにテトラヒドロフラン５０μｌを加えて混合し、ＨＰＬＣを用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することで、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５量を算出した。なお、ＨＰＬＣの条件は、以下の条件とした。結果を後述する表１に示す。
＜ＨＰＬＣ測定条件＞ 
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ  ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３μｍ
測定波長：２８０ｎｍ
移動相：メタノール／超純水（４０→１００％）＋０．０５％トリフルオロ酢酸
流量：１ｍＬ／分
カラム温度：４５℃
【００７１】
［表１］
2019031481.tif 000003
【００７２】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームの平均粒子径を、ゼータサイザーナノ（スペクトリス社マルバーンインストゥルメンツ製）を用いて測定した。結果を後述する表２に示す。
【００７３】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソーム一つあたりにおける、ＭＯＧ３５−５５の数量は、リポソームに結合したＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５量（含有割合）から算出した。結果を後述する表２に示す。
【００７４】
［表２］
2019031481.tif 000004
【００７５】
＜試験例１：抗ＭＯＧ抗体に対する結合性試験＞
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソーム（逆標的化リポソーム）の抗ＭＯＧ３５−５５抗体への結合性を、以下に示す条件で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した。測定には、実施例１のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームを含む水溶液（以下、「実施例２」という）と、実施例１のリポソームを製造する工程においてＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合する処理を施すことなく製造した、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合していないリポソーム（ドキソルビシンは封入されているリポソーム）を含む水溶液（以下、「比較例１」という）とを使用した。実施例２の水溶液と比較例１の水溶液は、リポソームに含有されるＤＰＰＣを共に０．０１ｍｏｌ／ｌに調整した水溶液であり、具体的には、実施例１のリポソーム溶液又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５をリポソームに結合する処理を施すことなく取得したリポソーム溶液１０μｌに、０．０１ｍｏｌ／ｌヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．００３ｍｏｌ／ｌエチレンジアミン４酢酸、０．００５％（ｖ／ｖ）サーファクタントＰ２０を含んだ緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液）９９０μｌを加えて混合することにより取得した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）に、マウスコントロール抗体およびマウス抗ＭＯＧ３５−５５抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）が結合したセンサーチップを装着し、取得した実施例２及び比較例１の水溶液を、センサーチップが装着されたＢＩＲＥＣＯＲＥ（登録商標）に２０μｌ／ｍｉｎで流して、結合解離曲線を測定した。結果を後述する図５に示す。
＜ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件＞
センサーチップ：ＣＭ５
移動相：ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液
サンプル流速：２０μｌ／ｍｉｎ
サンプル注入時間：２分
サンプル注入後の待機時間：２．５分
洗浄液：１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．０）
洗浄液流速：３０μｌ／ｍｉｎ
洗浄液注入時間：３０秒
安定化時間：２分
【００７６】
図５に示す実施例２の結果から理解できるように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームはコントロール抗体への結合性は示さず、抗ＭＯＧ３５−５５抗体に高い結合性を示した。一方で、図５に示す比較例１の結果から理解できるように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合していないリポソームは、コントロール抗体、抗ＭＯＧ３５−５５抗体への結合性を示さなかった。これらの結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームは、抗ＭＯＧ３５−５５抗体への結合性を保持し、薬物担体表面に自己抗原としての抗原性を保持する逆標的化リポソームであることが理解できた。
【００７７】
＜試験例２：多発性硬化症の治療試験１＞
多発性硬化症のモデルを作成するため、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊマウス（メス，９週齢）に実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下、「ＥＡＥ」ともいう）を発症させる免疫処置を施した。具体的には、１ｍｇのＭＯＧ３５−５５を含む５００μｌのＰＢＳに、２．５ｍｇの結核死菌を含む完全フロイントアジュバント（コンドレックス社製）５００μｌを混合してエマルジョンを調製し、これを惹起剤とした。この惹起剤をマウスの背部皮下に２００μｌ投与した。さらに、惹起剤による処置日及びその２日後と４日後に、百日咳毒素（和光純薬工業社製）２００ｎｇを含むＰＢＳ２００μｌを尾静脈に投与した。
【００７８】
実施例３として、惹起剤による処置日から１０日後，１２日後，１４日後，１６日後に、マウスの体重１ｋｇあたり０．０５ｍｇのドキソルビシンが投与されるように、実施例１の逆標的化リポソームを混合したＰＢＳを、免疫処置した７匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００７９】
実施例４として、惹起剤による処置日から１０日後，１２日後，１４日後，１６日後に、マウスの体重１kｇあたり０．０１ｍｇのドキソルビシンが投与されるように、実施例１の逆標的化リポソームを混合したＰＢＳを、免疫処置した７匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００８０】
比較例２として、惹起剤による処置日から１０日後，１２日後，１４日後，１６日後に、ＰＢＳを、免疫処置した７匹のマウスの尾静脈に投与した。なお、ＰＢＳは、実施例３と同量投与した。
【００８１】
惹起剤による処置日以降、以下の基準に従い、各マウスの神経症状を評価した。結果を図６に示す。
グレード０：正常
グレード０．５：尾の異常（尾の先は床に着かない）
グレード１：尾の筋緊張低下（尾の先が常に床に着く）
グレード１．５：尾の半分以上が常に床に着く
グレード２：尾の完全下垂（尾全体が常に床に着く）
グレード２．５：歩行異常（腹部は床に着かない）
グレード３：歩行異常（腹部が常に床に着く）及び後肢の片麻痺（片後肢が完全に動か
ない）
グレード３．５：後肢の両麻痺（両後肢とも歩行に用いることはできないが動かすこと
はできる）
グレード４：後肢の完全麻痺（両後肢が完全に動かない）
グレード４．５：後肢の完全麻痺及び前肢の異常（両前肢とも動かすことはできる）
グレード５：後肢の完全麻痺及び前肢の麻痺（片前肢が完全に動かない）
グレード５．５：瀕死（後肢の完全麻痺+前肢の完全麻痺）
グレード６：死亡
【００８２】
図６に示す比較例２の結果から理解できるように、リポソームを投与しなかったマウスは、惹起剤による処置日から１８日後には、グレード４以上の神経症状を示していた。一方、図６に示す実施例３，４の結果から理解できるように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合したリポソームを投与したマウスは、惹起剤による処置日から１８日経過後も、グレード１程度の神経症状しか示さなかった。これら結果から、薬物送達体を含む本実施形態の治療剤が、ＥＡＥ、すなわち多発性硬化症を治療できることが理解できた。
【００８３】
＜試験例３：多発性硬化症の治療試験２＞
試験例２と同様の条件で、Ｃ５７ＢＬ/６ＪマウスにＥＡＥを発症させる免疫処置を施した。
【００８４】
実施例５として、惹起剤による処置日から１０日後，１４日後，１８日後，２２日後に、マウスの体重１ｋｇあたり０．４ｍｇのドキソルビシンが投与されるように、実施例１の逆標的化リポソームを混合したＰＢＳを、免疫処置した６匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００８５】
実施例１のリポソームを製造する工程において、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合する処理を施すことなく製造した、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合していないリポソーム（ドキソルビシンは封入されているリポソーム）を用意した。比較例３として、惹起剤による処置日から１０日後，１４日後，１８日後，２２日後に、マウスの体重１kｇあたり０．４ｍｇのドキソルビシンが投与されるように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５を結合していないリポソームを混合したＰＢＳを、免疫処置した６匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００８６】
比較例４として、惹起剤による処置日から１０日後，１４日後，１８日後，２２日後に、マウスの体重１ｋｇあたり０．４ｍｇのドキソルビシンを混合したＰＢＳを、免疫処置した７匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００８７】
実施例１のリポソームを製造する工程において、ドキソルビシンを使用することなく製造した、ドキソルビシンが封入されていないリポソーム（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５は結合されているリポソーム）を用意した。比較例５として、惹起剤による処置日から１０日後，１４日後，１８日後，２２日後に、リポソームに結合するＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＯＧ３５−５５が実施例５と同量投与されるように、ドキソルビシンが封入されていないリポソームを混合したＰＢＳを、免疫処置した６匹のマウスの尾静脈に投与した。
【００８８】
比較例６として、惹起剤による処置日から１０日後，１４日後，１８日後，２２日後に、ＰＢＳを、免疫処置した６匹のマウスの尾静脈に投与した。なお、ＰＢＳは、実施例５と同量投与した。
【００８９】
惹起剤による処置日以降、試験例２で用いた基準に従い、各マウスの神経症状を評価して、実施例５及び比較例３〜６のそれぞれについて、各マウスの神経症状のグレードを相加平均した値を算出した。惹起剤による処置日から３６日間の結果を図７に、惹起剤による処置日から１０１日後の結果を図８に示す。
【００９０】
また、実施例５及び比較例３〜６のそれぞれについて、惹起剤による処置日から１０１日間、死亡したマウスの数を測定し、下記（１）式に基づき、マウスの生存率の推移を確認した。加えて、実施例５及び比較例３〜６のそれぞれについて、惹起剤による処置日から５７日間、各マウスの体重を測定し、マウスの平均体重の推移を確認した。図９に生存率を、図１０に平均体重を示す。
2019031481.tif 000005
【００９１】
図７の結果から理解できるように、比較例３〜６では、最も神経症状が良い（グレードが低い）比較例５であっても、惹起剤による処置日から１６日後には、グレード３程度の神経症状を示していた。特に、比較例３、４、６では、惹起剤による処置日から１６日後以降も神経症状が悪化（グレードが上昇）しており、惹起剤による処置日から２２日後には、グレード４程度の神経症状を示していた。一方、実施例５では、惹起剤による処置日から１６日後であっても、グレード２未満の神経症状しか示さなかった。また、実施例５では、惹起剤による処置日から１６日後以降は神経症状が好転（グレードが下降）しており、惹起剤による処置日から２２日後以降には、グレード１程度の神経症状しか示さなかった。これら結果から、薬物送達体を含む本実施形態の治療剤が、ＥＡＥ、すなわち多発性硬化症を治療できることが理解できた。
【００９２】
また、図８の結果から理解できるように、比較例３〜６のうち最も神経症状が良い（グレードが低い）比較例５であっても、惹起剤による処置日から１０１日後に、グレード３．５以上（平均値）の神経症状を示していた。一方、実施例５では、惹起剤による処置日から１０１日後であっても、グレード１未満（平均値）の神経症状しか示さなかった。特に、実施例５で用いた６匹のマウスのうち２匹のマウスは、ＥＡＥが完治していた。また、図９の結果から理解できるように、実施例５では、惹起剤による処置日から１０１日経過してもマウスの生存率が１００％であった。この結果から、薬物送達体を含む本実施形態の治療剤が、ＥＡＥ、すなわち多発性硬化症の短期的及び長期的な治療に有用であることが理解できた。
【００９３】
また、図１０の結果から理解できるように、惹起剤による処置日から５７日間の間に、治療剤の投与や病状の進行による体重減少が見られなかった。これらの結果から、薬物送達体を含む本実施形態の治療剤が、ＥＡＥ、すなわち多発性硬化症を治療できる安全な治療剤であることが理解できた。
【符号の説明】
【００９４】
１      薬物送達体
２      薬物担体
３      薬物
４      リンカー分子
５      自己抗原
５０    Ｔ細胞
１００  神経細胞
１０１  細胞体
１０２  軸索
１０３  髄鞘
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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