(57)【要約】【課題】  スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止することを可能とする。【解決手段】  軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された培養容器とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟包材からなる培養容器であって、
対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、
接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された
ことを特徴とする培養容器。
【請求項２】
前記第一の側面部の内面側の基材及び前記第二の側面部の内面側の基材がポリオレフィンからなることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
【請求項３】
少なくとも前記第一の側面部の内面側に親水化処理が施されていることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。
【請求項４】
前記細胞接着抑制剤が、少なくともリン脂質ポリマー又はポリビニルアルコール誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。
【請求項５】
前記第一の側面部の内面側に複数のウェルが形成されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器。
【請求項６】
スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、
ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、
前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。
【請求項７】
スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、
ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、
前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェア培養に用いられる培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
【０００３】
また、最近では、ｉＰＳ細胞などの接着細胞を培養容器に接着させることなく、培養容器内で細胞を浮遊させて培養し、スフェア（凝集塊）を形成させることによって、細胞の培養効率を向上させる方法が用いられている。この場合、通常、培養容器内の底面には、細胞が接着しないように、細胞接着抑制剤を塗布（コーティング）しておく必要がある。
【０００４】
ここで、スフェアを形成する培養方法に関して、特許文献１には、細胞接着抑制剤が内面に塗布された、凹部を有する培養基材が提案されている。この培養基材は、リジッドなものであり、細胞接着抑制剤を内面に塗布することによって、スフェアは適切に形成し得ると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０３６０１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、細胞を効率的に大量に培養する場合には、容積の大きい培養容器を比較的容易に製造可能な、軟包材からなる培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を自動的に培養することが好ましい。
しかしながら、このような軟包材からなる培養容器は、一般にバッグ形状となるため、培養容器内の底面に細胞接着抑制剤を塗布すると、培養容器内の底面と上面が接触することによって、図８に示すように、底面に塗布された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りして、底面から剥がれてしまうという問題があった。
【０００７】
すなわち、このように細胞接着抑制剤の膜が底面から剥がれると、細胞がその細胞接着抑制剤の剥がれた底面部分に接着してしまうため、細胞はスフェアを適切に形成することができなくなり、スフェア培養が阻害されてしまうという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、培養容器内の底面と上面の基材を特定の条件で加工することによって、細胞接着抑制剤の膜が底面から上面に裏移りしない培養容器を製造することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、培養容器における細胞接着抑制剤を塗布する表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する表面の接触角ヒステリシスよりも大きくなるように、少なくとも細胞接着抑制剤を塗布する表面側に表面処理を施し、かつ、当該表面に細胞接着抑制剤の膜を形成することによって、細胞接着抑制剤の膜が剥がれて対面側に裏移りすることを防止することが可能となった。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止可能な培養容器、及び培養容器の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された構成としてある。
【００１１】
また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。
【００１２】
また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】静的水接触角及び接触角ヒステリシスについての説明図である。
【図２】実施例１（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理１回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、実施例２（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例１（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図３】比較例２（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：コロナ処理１回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例３（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理１回、上面：コロナ処理３回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例４（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：コロナ処理３回，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図４】実施例３（培養容器の基材：ＣＯＣ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）、比較例５（培養容器の基材：ＣＯＣ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図５】実施例４（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：ポリビニルアルコール）、比較例６（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：ポリビニルアルコール）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図６】実施例５（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理１回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）、実施例６（培養容器の基材：ＰＥ，下面：コロナ処理３回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）、比較例７（培養容器の基材：ＰＥ，下面：無処理、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー，５０℃７日間経過後）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図７】実施例６（培養容器の基材：ＰＥ，下面：エキシマ処理１回、上面：無処理，細胞接着抑制剤：リン脂質ポリマー）における細胞接着抑制剤の裏移り状況を撮影した写真を示す図である。
【図８】従来の培養容器の製造工程における細胞接着抑制剤の裏移りを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の培養容器、及び培養容器の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成されたことを特徴とする。
【００１６】
まず、静的水接触角と接触角ヒステリシスについて、図１を参照して説明する。
静的水接触角とは、静止した液体の表面が固体壁の表面に接するところで液面と固体面がなす角（図１のθｓ）を意味する。静的水接触角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強く、静的水接触角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強いという関係がある。
【００１７】
接触角ヒステリシスとは、水滴が固体壁の表面を滑落するときの前進接触角（θa）と、後退接触角（θr）との差（滑落時ヒステリシス（θa−θr））を意味する。
すなわち、水平に支持した固体壁の表面に水滴を摘下し、固体壁を徐々に傾けて、液滴が転落を開始したときの前進接触角と後退接触角にもとづき算出される。この接触角ヒステリシスは、固体壁の表面の動的な親水性（濡れ性）を示す指標として用いられる。接触角ヒステリシスが大きいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強く、接触角ヒステリシスが小さいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強いという関係がある。
【００１８】
本実施形態の培養容器を構成する軟包材としては、ポリオレフィンを用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等を用いることがより好ましい。特に、少なくとも培養容器の第一の側面部の内面側と第二の側面部の内面側を、ポリオレフィンを用いて構成することが好ましい。
【００１９】
第一の側面部の内面側、及び第二の側面部の内面側は、培養容器内の表面を構成し、細胞培養時において、通常、第一の側面部の内面側が底面となるように培養容器を配置して用いられることを想定している。
すなわち、一般的に細胞培養に使用される培養液の比重は細胞の比重よりも小さいため、培養容器を静置させたときに細胞は、下方に沈降する。このため、通常は、第一の側面部の内面側が底面となるように、培養容器が配置される。
一方、仮に、培養液の比重が細胞の比重よりも大きい場合には、培養容器を静置させたときに細胞は上方に集まると考えられるため、第一の側面部の内面側が上面となるように、培養容器を配置することとなる。
【００２０】
本実施形態の培養容器は、一般的にバッグ形状であり、対面する二つの側面部を備えている。そして、これら側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、異なる値を示すように、少なくとも一方の側面部の内面側に、表面処理が施されている。
このとき、培養容器における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面側（一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面側（一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きくなるように、培養容器の内面に対して表面処理が施される。
表面処理としては、親水化処理を行うことが好ましい。親水化処理の方法としてコロナ処理やエキシマ処理などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
具体的には、例えば以下の（Ａ）〜（Ｆ）ようにすることができるが、これらに限定されない。なお、以下において、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面を第一の側面、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面を第二の側面と称する。
【００２２】
（Ａ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｂ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｃ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（Ｄ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｅ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｆ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。
【００２３】
また、本実施形態の培養容器では、以下の（ａ）〜（ｋ）ような表面処理方法は行われない。その理由は、これらの表面処理方法によれば、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側の接触角ヒステリシスよりも小さくなるか、又は同じになるためである。
【００２４】
（ａ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にも表面処理を行わない。
（ｂ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（ｃ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｄ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にもコロナ処理を１回行う。
（ｅ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｆ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にもコロナ処理を３回行う。
（ｇ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。
（ｈ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｉ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にもエキシマ処理を１回行う。
（ｊ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｋ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にもエキシマ処理を３回行う。
【００２５】
本実施形態において、細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いても良い。
【００２６】
本実施形態の培養容器は、細胞接着抑制剤の膜が形成される側面部の内面側に、複数のウェルが形成されたものとすることも好ましい。本実施形態の培養容器において、このようなウェルを形成することで、細胞を各ウェル内に集めることができるため、例えば、スフェア培養の初期段階における細胞密度を高めることができ、スフェアの形成効率を向上させることが可能となる。
【００２７】
また、本実施形態の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することを特徴とする。
【００２８】
また、本実施形態の培養容器の製造方法を、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、フィルム又はシートの他の一部に第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、フィルム又はシートの第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法とすることも好ましい。
【００２９】
すなわち、本実施形態の培養容器の製造方法では、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施すと共に、このフィルム又はシートを用いて培養容器を製袋することで、接触角ヒステリシスの値が異なる側面部を備えた培養容器を形成する。
具体的には、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側（第一の側面部の内面側、一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側（第二の側面部の内面側、一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きい培養容器を形成する。
【００３０】
そして、このような培養容器の第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することで、細胞接着抑制剤の膜が容易に剥がれることのない培養容器を製造することが可能となっている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、スフェアを好適に形成可能な培養容器を製造することが可能である。
【００３１】
以上説明したように、本実施形態の培養容器、及び培養容器の製造方法によれば、培養容器内における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きい培養容器を得ることができる。
このような培養容器に塗布された細胞接着抑制剤は、塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないため、スフェア培養を適切に行うことが可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施形態に係る培養容器において、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きければ、細胞接着抑制剤が塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないことを確認するために行った実験について詳細に説明する。
【００３３】
（実施例１）
ポリオレフィンからなる長方形のフィルムを準備して、図２に示すように、その左半分側の正方形部分を培養容器における底面と想定し、その右半分側の正方形部分を培養容器における上面と想定した。そして、底面に細胞接着抑制剤を塗布した後、上面を底面に重ね合わせて荷重をかけ、その後、上面を底面から剥離して、細胞接着抑制剤が上面に裏移りしたか否かを目視により判定した。具体的には、以下のように行った。
【００３４】
まず、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製、以下同様）を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００３５】
静的水接触角及びヒステリシスの測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ  ７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。
具体的には、静的水接触角（θｓ）は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。また、接触角ヒステリシス（θａ−θｒ）は、フィルム上に純水３０μｌを滴下し、１秒毎に１°ずつ測定台を傾け、滑落時の前進接触角（θａ）と後退接触角（θｒ）を接線法により算出して得た。
【００３６】
次に、底面に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
【００３７】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことにより、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
【００３８】
（実施例２）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００３９】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、裏移りしていなかった。本実験では底面をより強く親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が一層向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
【００４０】
（比較例１）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００４１】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００４２】
（比較例２）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理を行わなかった。一方、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
【００４３】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面が疎水性のままである一方、上面が強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００４４】
（比較例３）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施し、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
【００４５】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面よりも上面がより強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００４６】
（比較例４）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
【００４７】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も同様に強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。
このように、比較例２〜４の結果から、上面が強く親水化されていると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが分かった。
【００４８】
（実施例３）
フィルムの材料と表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５５．２°であり、接触角ヒステリシスは４８．８°であった。また、上面の静的水接触角は９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。
【００４９】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
【００５０】
（比較例５）
表面処理の条件を実施例３と異なるものとし、その他の条件については、実施例３と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は、９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。
【００５１】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００５２】
（実施例４）
細胞接着抑制剤の種類とそのコーティング方法、及び表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ２で照射して硬化させた。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００５３】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
すなわち、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。
【００５４】
（比較例６）
表面処理の条件を実施例４と異なるものとし、その他の条件については、実施例４と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ２で照射して硬化させた。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００５５】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００５６】
（実施例５）
実施例１と同じ条件でフィルムに表面処理を行った後、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
【００５７】
５０℃で７日間経過後、コロナ処理を１回行った底面の静的水接触角は８７．８°であり、接触角ヒステリシスは４３．９°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスは、実施例１と比較して大きな変化は見られなかった。
【００５８】
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
【００５９】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
【００６０】
ここで、静的水接触角は、空気と触れている時の最表層の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでしまった結果、その数値が疎水性を示す値にまで変化したと考えられる。
これに対して、接触角ヒステリシスは、最表層と少し内側の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでも、その数値がほとんど変化しなかったと考えられる。
そして、このように底面の静的水接触角は疎水性の数値を示すものの、底面の接触角ヒステリシスが親水化された数値を示す場合に、底面は親水化されていると言えることが、上記の通り、明らかとなった。
【００６１】
（実施例６）
表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
【００６２】
このとき、コロナ処理を３回行った底面の静的水接触角は８５．３°であり、接触角ヒステリシスは４４．５°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスには、大きな変化は見られなかった。
【００６３】
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
【００６４】
その結果、実施例５と同様に、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
【００６５】
（比較例７）
表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００６６】
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
【００６７】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。
【００６８】
（実施例７）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してエキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を用いてエキシマ処理を１回施した。このとき、エキシマ処理の条件は１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、テーブル移動速度５ｍｍ／ｓｅｃとした。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は７６．２°であり、接触角ヒステリシスは４１．８°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
【００６９】
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
すなわち、親水化処理の方法をコロナ処理とは異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。
【００７０】
以上の通り、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性を上面の基材と細胞接着抑制剤の密着性よりも相対的に向上させることができ、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離を防止できることが明らかとなった。一方、培養容器内の上面を強く親水化すると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが明らかとなった。
また、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することにより、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止できることが分かった。
【００７１】
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、培養容器の基材としてポリエチレンと環状オレフィンコポリマーを用いたが、ポリオレフィンであればその他の基材を用いても良い。また、表面処理としては、接触角ヒステリシスの値にもとづき親水化が示されるものであれば、コロナ処理などに限定されず、その他の処理を用いることもできる。さらに、培養容器内の上面及び下面に細胞接着抑制剤の膜を形成するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、ｉＰＳ細胞などをスフェア培養する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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