(57)【要約】【課題】グラム陽性細菌を検出および処置するためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓバクテリオファージリシンの提供。【解決手段】本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属を含めたグラム陽性細菌、ならびに関連する状態を予防的および治療的に改善および処置するのに有用な方法、組成物、および製品を提供する。本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに由来するバクテリオファージリシン、特に、ＰｌｙＳｓ２溶菌酵素および／またはＰｌｙＳｓ１溶菌酵素、ならびにこれらの切断型を含めたこれらの改変体を組み込み、使用する、組成物および方法を提供する。ヒトを処置するための方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性細菌を検出および処置するためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓバクテリオファージリシンなど。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、病原性の細菌および抗生物質耐性の細菌を含め、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株を含めた、グラム陽性細菌、ならびに関連する状態を予防的および治療的に改善および処置するのに有用な方法、組成物、および製品に関する。本発明は、ＰｌｙＳｓ２溶菌酵素および／またはＰｌｙＳｓ１溶菌酵素、ならびにこれらの切断型を含めたこれらの改変体を含めた、単離Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓバクテリオファージリシンを組み込む組成物および製品、ならびにリシンポリペプチドおよび組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な疾病および他の状態に対してより多くの抗生物質が用いられるときに、薬物耐性細菌の発生が、医療における大きな問題となっている。院内感染は、米国で８番目に多い死因であり、大部分が薬物耐性および新興病原体に起因する。例えば、米国では、毎年５００，０００例を超えるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ症例が認められ、株のうちの６５％超が多剤耐性（ＭＲＳＡ）である。より多量の抗生物質の使用と、耐性を示す細菌の数とは、より長い処置期間を促している。さらに、それらの一部が患者に対して有害作用を及ぼしている広域で非特異的な抗生物質が、今や、いっそう頻繁に用いられている。この使用の増大と関連する問題は、粘膜内層を容易には透過しない抗生物質が多いことである。加えて、抗生物質に対してアレルギーである人々の数も増大していると考えられる。したがって、新たな抗菌法、とりわけ、病原性細菌を死滅させるのに新たなモダリティーを介して作用するか、または病原性細菌を死滅させるための新たな手段をもたらす抗菌法に対する商業上の必要性が存在する。
【０００３】
グラム陽性細菌は、ポリペプチドおよび多糖を含有する細胞壁により取り囲まれている。グラム陽性細菌細胞壁は、厚さが２０〜８０ｎｍであり、ペプチドグリカンによる多数の相互接合層からなる、広く厚い壁部として現れる。グラム陽性細菌細胞壁のうちの６０％〜９０％の間は、ペプチドグリカンであり、細胞の形状、堅い構造、浸透圧ショックに対する耐性を与える。細胞壁は、グラム染色のクリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に、したがって、「グラム陽性」に染色されることを可能とする。グラム陽性細菌には、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属が含まれるがこれらに限定されない。医学的に関与性である種には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓが含まれる。芽胞形成性であるＢａｃｉｌｌｕｓ属種は、炭疽病および胃腸炎を引き起こす。芽胞形成性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種は、ボツリヌス中毒症、破傷風、ガス壊疽、および偽膜性腸炎の一因となる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種は、ジフテリアを引き起こし、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種は、髄膜炎を引き起こす。
【０００４】
ペニシリンおよびセファロスポリンなど、細胞壁の合成を阻害する抗菌剤は、ペプチドグリカンのインターペプチドの連結に干渉し、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌いずれの細胞壁も脆弱化させる。グラム陽性細菌のペプチドグリカンが露出しているために、これらの抗生物質に対するグラム陽性細菌の感受性は大きい。真核細胞が、細胞壁を欠き、これらの薬物または他の細胞壁用薬剤に対して感受性でないことは有利である。
【０００５】
バクテリオファージを用いることにより細菌性疾患を処置する試みがなされている。しかし、疾患を防止するかまたはこれに対処するための、バクテリオファージの動物への直接的な導入には、特有の欠点がある。とりわけ、ファージが付着するには、細菌およびファージの両方が、適正で同期した増殖サイクルになければならない。加えて、細菌に付着するのに適正な数のファージを存在させなければならない；ファージが多すぎたり少なすぎたりすれば、付着も溶菌酵素の産生も生じないであろう。ファージはまた、十分に活性でなければならない。ファージはまた、ファージが攻撃しようとする生物に由来する細菌破砕物を含めた多くのものによっても阻害される。さらに、バクテリオファージの、細菌感染を処置するための直接的な使用を困難とするのは、ファージを非機能性とする免疫反応の可能性である。
【０００６】
新規の抗微生物療法には、バクテリオファージリシンなど、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス」）が含まれる。ファージは、これらのリシンを用いて、それらの細菌宿主の細胞壁を消化し、低張性溶菌を介して子孫ウイルスを放出する。精製された組換えリシンを、グラム陽性細菌へと外部から添加するときにも、類似の帰結が結果として生じる。リシンの、グラム陽性病原体に対する致死性の高い活性は、それらを、治療剤として開発するための魅力的な候補物質とする。バクテリオファージリシンはまず、病原性連鎖球菌の鼻咽頭保菌を根絶するために提起された（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．ら（２００１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４巻：２１７０〜２１７２頁；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．ら（２００１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：４１０７〜４１１２頁）。リシンとは、宿主の溶菌をウイルスアセンブリーの完遂と協調させるために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ファージにより用いられる溶菌機構の一部である（Ｗａｎｇ，  Ｉ．  Ｎ．ら（２０００年）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４巻：７９９〜８２５頁）。ファージは、細菌膜に小孔を開けるホリンと、細菌壁における結合を切断する、リシンと呼ばれるペプチドグリカンヒドロラーゼとの両方をコードする［６］。感染の後期に、リシンは、細胞壁マトリックスへと移行し、そこで、ペプチドグリカンの完全性に不可欠な共有結合を急速に加水分解し、細菌の溶菌および同時的な子孫ファージの放出を引き起こす。
【０００７】
リシンのファミリーメンバーは、触媒ドメインを特異性ドメインまたは結合ドメインへと融合させたモジュールデザインを呈示する（Ｌｏｐｅｚ，  Ｒ．ら（１９９７年）、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ、３巻：１９９〜２１１頁）。リシンは、細菌ゲノム内のウイルスプロファージ配列からクローニングし、処置に用いることができる（Ｂｅｒｅｓ，  Ｓ．Ｂ．ら（２００７年）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２巻（８号）：１〜１４頁）。外部から添加する場合、リシンは、グラム陽性細菌細胞壁の結合に到達することが可能である（図１）（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．（２００８年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１巻：３９３〜４００頁）。リシンは、多数のグラム陽性病原体（とりわけ、それらがそこからクローニングされる細菌）に対する致死性の高い活性を顕示することが示されており、それらの治療剤としての開発の可能性を提起している（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．（２００８年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１巻：３９３〜４００頁；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｌ．ら（２００１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：４１０７〜４１１２頁）。
【０００８】
バクテリオファージの溶菌酵素は、多様な投与経路を介する、被験体における多様な種類の感染に対する評価および特異的処置において有用な酵素として確立されている。例えば、特許文献１（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、臨床検体における、半精製のＣ群連鎖球菌ファージ関連リシン酵素による酵素的消化を介するＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。この酵素についての研究は、さらなる研究の基礎となり、疾患を処置する方法をもたらしている。ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓによる特許（特許文献２、特許文献３、および特許文献４）は、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌により産生されるリシン酵素の使用について開示している。米国特許第６，２４８，３２４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚組織への局所適用に適する担体における溶菌酵素の使用を介する、皮膚感染のための組成物について開示している。米国特許第６，２５４，８６６号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、消化管の細菌感染を処置するための方法であって、感染細菌に特異的な溶菌酵素を投与するステップを含む方法について開示している。少なくとも１つの溶菌酵素を消化管へと送達するための担体は、坐剤、浣腸、シロップ、または腸内用にコーティングされた丸薬からなる群から選択される。米国特許第６，２６４，９４５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、その細菌に特異的なバクテリオファージを感染させた細菌により産生される、少なくとも１つの溶菌酵素、ならびにこの溶菌酵素を患者へと送達するのに適する担体の非経口（筋内、皮下、または静脈内）導入により細菌感染を処置するための方法および組成物について開示している。
【０００９】
ファージ関連溶菌酵素は、各々が特異的菌株を死滅させるのに有効であると示されている多様なバクテリオファージから同定およびクローニングされている。米国特許第７，４０２，３０９号、同第７，６３８，６００号、およびＰＣＴ出願公報第ＷＯ２００８／０１８８５４号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を処置または軽減するための抗菌剤として有用な異なるファージ関連溶菌酵素を提供している。米国特許第７，５６９，２２３号は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのための溶菌酵素について記載している。米国特許第７，５８２２９１号では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属（バンコマイシン耐性株を含めたＥ．  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．  ｆａｅｃｉｕｍ）に有用なリシンについて記載されている。ＵＳ２００８／０２２１０３５は、Ｂ群連鎖球菌を死滅させるのに高度に有効な変異体であるＰｌｙ  ＧＢＳリシンについて記載している。ＷＯ２０１０／００２９５９では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた、ブドウ球菌に対する活性を伴うＣｌｙＳと称するキメラリシンについて詳述されている。
【００１０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓとは、世界中でブタに感染するグラム陽性病原体である。ブタからヒトへの人畜共通の伝染についての報告が増大している（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎ  Ｓ．ら（２００６年）、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻（５号）：５８５〜５６７頁）。Ｓ．ｓｕｉｓは、今後数年間においてヒト集団内で恒常的な存在となる可能性がある。ヒトおよびブタは、ペニシリンまたはゲンタマイシンで処置されてきたが、これらの抗生物質に対して耐性であるＳ．ｓｕｉｓ分離株が存在する（Ｃａｎｔｉｎ，  Ｍ．ら（１９９２年）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、４巻：１７０〜１７４頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，６０４，１０９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０１７，５２８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０５６，９５５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現行の従来の抗菌剤と関連する欠点および問題から、当技術分野では、さらなる特異的抗菌剤（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）が依然として必要とされており、また、特に、獲得耐性の危険性が高くない、スペクトルがより広域な薬剤も必要とされていることが明らかである。注目すべきことに、現在のところ、リシンが、病原性の細菌および臨床的に関与性の細菌のうちの複数の異なる種に対して広域の溶菌活性を顕示することは示されていない。
【００１３】
本明細書における参考文献の引用は、この参考文献が本発明に対する先行技術であることの容認としてはみなされないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
その最も広い態様では、本発明は、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を含めた、グラム陽性細菌に対して広域の死滅活性を有するリシンを提供する。本発明は、異なる目に由来する細菌を死滅させることが可能なバクテリオファージリシンを提供する。ある態様では、Ｂａｃｉｌｌｉの異なる目、特に、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に由来する１または複数の細菌を死滅させることが可能なリシンポリペプチドが提供される。本発明は、２つの異なる目、特に、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に由来する細菌を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて死滅させることが可能であり、このことが裏付けられているリシンポリペプチドを提供する。本発明のリシンは、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌を、混合培養物およびｉｎ  ｖｉｖｏの混合感染において死滅させることが可能である。したがって、本発明は、複数のグラム陽性細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数が疑われるかまたは存在する場合における細菌、培養物、または感染の処置、コロニー除去、および／または除染を想定する。特に、本発明は、複数種類のＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、複数種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、または少なくとも一種類のＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、および一種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌が疑われるか、存在するか、または存在しうる場合における細菌、培養物、または感染の処置、コロニー除去、および／または除染を想定する。
【００１５】
本発明によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌に由来するバクテリオファージリシンが提供される。２つの例示的で異なる固有のリシン、特に、その活性の切断型を含めたＰｌｙＳｓ１、およびＰｌｙＳｓ２を、単離および特徴付けした。本発明のリシンポリペプチドは、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を含めたグラム陽性細菌に対して広域の死滅活性を顕示する点で固有である。このような一態様では、ＰｌｙＳｓ２リシンが、本明細書でマウスにより裏付けられる通り、動物モデルにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌を死滅させることが可能である。ＰｌｙＳｓ２は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）など、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して有効である。さらなるこのような態様では、ＰｌｙＳｓ１リシンが、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、またはバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）など、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌の増殖を低減しうる。本発明は、リシンポリペプチドを含む組成物および製品、ならびに細菌の増殖、コロニー形成、および感染を、防止および処置する方法を包含する。
【００１６】
本発明のある態様では、グラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法が提供される。
【００１７】
したがって、グラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法が提供される。
【００１８】
上記の方法のさらなる態様では、組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む。
【００１９】
本発明は、グラム陽性細菌を死滅させる方法であって、細菌を、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離リシンポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその切断型もしくは改変体を含む方法を提供する。この方法のある態様では、組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離切断型リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性または９９％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む。
【００２０】
グラム陽性細菌を死滅させる上記の方法のある態様では、特に、ヒトによる使用またはヒトにおける使用が意図される溶液、物質、またはデバイスを滅菌または除染するように、方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される。
【００２１】
本発明は、グラム陽性細菌の集団を低減するための方法であって、細菌を、グラム陽性細菌のうちの少なくとも一部を死滅させるのに有効な量の単離ポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法を提供する。この方法のある実施形態では、組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む。
【００２２】
本発明は、グラム陽性細菌の集団を低減するための方法であって、細菌を、グラム陽性細菌のうちの少なくとも一部を死滅させるのに有効な量の単離ポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、単離ポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチド、またはグラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその切断型もしくは改変体を含む方法をさらに提供する。この方法のある態様では、組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む。
【００２３】
グラム陽性細菌の集団を低減するための上記の方法のある態様では、方法が、特に、ヒトによる使用またはヒトにおける使用が意図される溶液、物質、またはデバイスを滅菌または除染するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される。
【００２４】
本発明は、ヒトにおける抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染を処置するための方法であって、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染を有するヒトへと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、ヒトにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの数を低減し、感染をコントロールする方法をさらに提供する。
【００２５】
この方法のある態様では、組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを死滅させるのに有効なその改変体を、代替的にまたはさらに含みうる。
【００２６】
本発明の方法はまた、ヒトにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有する被験体へと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、ヒトにおけるグラム陽性細菌の数を低減し、感染をコントロールする方法も包含する。
【００２７】
上記の方法において用いられる組成物は、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を、代替的にまたはさらに含みうる。
【００２８】
本発明は、病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるヒト被験体を処置するための方法であって、被験体へと、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む方法を加えて包含する。この方法の特定の態様では、被験体が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなど）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓなど）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌（Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなど）、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓなど）のうちの１つ、またはこれらのうちの１もしくは複数に曝露されたか、またはその危険性がある。被験体は、ヒトでありうる。被験体は、ヒトの成人、小児、乳児、または胎児でありうる。
【００２９】
本発明の組成物および方法において用いられるリシンポリペプチドの改変体は、配列番号１、２、または３を含めて、本明細書で例示されるリシンポリペプチド（複数可）のうちの１または複数と実質的に同一でありうる。本発明の組成物および方法において用いられるリシンポリペプチドの改変体は、アミノ酸配列における、配列番号１、２、または３を含めて、本明細書で例示されるリシンポリペプチド（複数可）と比較した、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【００３０】
任意のこのような、上記の１または複数の方法では、感受性であるか、死滅させるか、または処置される細菌を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から選択することができる。
【００３１】
本発明の方法のうちのいずれかによれば、感受性細菌または処置もしくは脱コロニー化される細菌は、抗生物質耐性細菌でありうる。細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、またはバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）でありうる。感受性細菌は、特に、ヒトに対して、臨床的に関与性の細菌の場合もあり、病原性の細菌の場合もある。方法（複数可）のある態様では、リシンポリペプチド（複数可）が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を死滅させるのに有効である。
【００３２】
本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤、または希釈剤を含めた担体をさらに含みうる。本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、ポリペプチドの感染部位への送達に適するビヒクルをさらに含みうる。本発明の方法のうちのいずれかによれば、その組成物は、１または複数の抗生物質をさらに含みうる。
【００３３】
本発明は、１または複数の本発明のリシンポリペプチドを含む、治療用組成物および医薬組成物を含めた組成物を提供する。
【００３４】
したがって、本発明は、グラム陽性細菌を死滅させるための医薬組成物であって、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離リシンポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００３５】
ある実施形態では、医薬組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を、代替的にまたはさらに含みうる。
【００３６】
本発明のある態様では、グラム陽性細菌を死滅させるための医薬組成物であって、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドを含み、第１の単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の単離ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む医薬組成物が提供される。
【００３７】
そのさらなる態様では、治療用組成物または医薬組成物を含めた組成物が、修飾を伴う配列番号２のアミノ酸配列を有する切断型リシンであって、エンドペプチダーゼドメインおよびグルコサミニダーゼドメインからなる群から選択される唯一の触媒ドメインを含む切断型リシンを含みうる。組成物のさらなる態様では、切断型リシンが、配列番号１のグルコサミニダーゼドメインを包含しない。切断型リシンは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を特に有しうる。
【００３８】
本発明は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む組成物を含有する容器と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌に曝露されたか、またはこれらへの曝露と符合する症状を呈示する患者の処置における組成物の使用のための指示書とを含む製品であって、組成物の使用のための指示書が、組成物を用いるための方法を示し、その方法が、
ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌に曝露されたことが疑われる患者を同定するステップと、
ｂ）有効量の組成物を、患者へと投与するステップと
を含む製品を包含する。
【００３９】
本発明の物品の一態様では、組成物の単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する。本発明の物品のさらなる態様では、組成物が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を、代替的にまたはさらに含む。
【００４０】
本発明の組成物は、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群から選択される、１または複数の菌株に対する死滅活性を特に顕示するかまたは有することが可能である。
【００４１】
本発明はまた、本発明のリシンポリペプチドをコードする核酸も提供する。したがって、切断型リシンまたは全リシンであるＳ．ｓｕｉｓリシンＰｌｙＳｓ１、およびＰｌｙＳｓ２をコードする核酸が提供される。例示的な核酸配列を、図３および図４に提示する。本明細書では、その改変体を含めた、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のポリペプチドをコードすることが可能な核酸が提供される。
【００４２】
本発明はまた、Ｓ．ｓｕｉｓリシンまたはＳ．ｓｕｉｓリシンポリペプチドをコードする、組換えＤＮＡ分子もしくはクローニングされた遺伝子、またはその縮重改変体にも関し、核酸分子、特に、切断型リシンもしくは全リシンであるＰｌｙＳｓ１リシンポリペプチド、および／またはＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチドをコードする、組換えＤＮＡ分子またはクローニングされた遺伝子は、図３および図４に示されるヌクレオチド配列を有するか、または図３および図４に示されるＤＮＡ配列と相補的であることが好ましい。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書のリシンポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子、または核酸配列の完全なＤＮＡ配列を、発現制御配列へと作動可能に連結することができ、これを、適切な宿主へと導入することができる。したがって、本発明は、本リシンポリペプチド（複数可）をコードするＤＮＡ配列、より具体的には、上記ならびに図３および図４で示した配列から決定される完全なＤＮＡ配列を含む、核酸配列、クローニングされた遺伝子、または組換えＤＮＡ分子で形質転換された細菌宿主を含めた単細胞宿主へと拡張される。
【００４４】
当然ながら、本発明は、本明細書で例示される公知の組換え法を含めた、リシンポリペプチド（複数可）を調製するための複数の手段を想定し、したがって、本発明は、このような合成調製物を、その範囲内に網羅することを意図する。本明細書で開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の単離は、このような組換え法によるリシンポリペプチド（複数可）の複製を容易とし、したがって、本発明は、宿主系において組換えＤＮＡ法により発現させるための、開示されるＤＮＡ配列から調製される発現ベクター、および結果として得られる形質転換された宿主へと拡張される。
【００４５】
本発明の特定の実施形態の他の好ましい特徴によれば、生物学的に活性なリシンポリペプチド（複数可）を作製するための組換え発現系が提供される。ポリペプチド、特に、１または複数の本発明のリシンポリペプチドを調製するためのプロセスであって、１もしくは複数の本発明のリシンポリペプチドをコードするか、または本発明のリシンポリペプチド（複数可）を発現させることが可能な発現ベクターを含有する宿主細胞を培養するステップと、ポリペプチド（複数可）を回収するステップとを含むプロセスが提供される。
【００４６】
本発明の診断的有用性は、本リシンポリペプチドの、グラム陽性細菌の存在についてスクリーニングするか、感受性のグラム陽性細菌の存在についてスクリーニングするか、または１もしくは複数の本発明のリシンポリペプチドによる死滅もしくは溶菌に対する細菌の感受性を決定するためのアッセイにおける使用へと拡張される。
【００４７】
本発明は、天然でもたらされる抗体および組換えにより調製される抗体を含めた、リシンポリペプチド（複数可）に対する抗体、または、代替的に、リシンポリペプチドの切断標的に対する抗体の開発へと拡張される。このような抗体には、公知の遺伝子技法により調製されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方のほか、二特異性（キメラ）抗体、および他の機能性であって、それらを、リシン活性を調節するそれらの能力と結びつくさらなる診断的使用に適合させる他の機能性を包含する抗体が含まれるであろう。
【００４８】
本明細書では、改変され、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質であり、または標識されたリシンポリペプチドが、想定および提供される。キメラタンパク質または融合タンパク質では、本発明のリシンポリペプチド（複数可）を、リシンポリペプチド（複数可）のさらなる機能をもたらす場合もあり、これらの使用または適用を増強する場合もある実体であって、例えば、タグ、標識、ターゲティング部分、またはリガンド、細胞結合モチーフもしくは細胞結合剤、または細胞認識モチーフもしくは細胞認識剤、抗菌剤、抗体、抗生物質を含めた実体へと共有結合的に付着することができる。例示的な標識には、アイソトープである３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなどの放射性標識が含まれる。標識は、酵素であることが可能であり、標識したリシンポリペプチドの検出は、現在使用されているか、または受容されている、当技術分野で公知の比色分析、分光光度分析、蛍光分光光度分析、電流測定、または気体定量技法のうちのいずれかにより達成することができる。
【００４９】
例えば、本発明は以下の項目も提供する。
（項目１）
グラム陽性細菌を死滅させるための医薬組成物であって、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離リシンポリペプチドを含む、医薬組成物。
（項目２）
有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
グラム陽性細菌を死滅させるための医薬組成物であって、少なくとも２つの単離リシンポリペプチドを含み、第１の前記単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含み、第２の前記単離ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、医薬組成物。
（項目４）
修飾を伴う配列番号１のアミノ酸配列を有する切断型リシンを含む組成物であって、前記切断型リシンが、エンドペプチダーゼドメインおよびグルコサミニダーゼドメインからなる群から選択される唯一の触媒ドメインを含む組成物。
（項目５）
前記切断型リシンが、配列番号１の前記グルコサミニダーゼドメインを包含しない、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記切断型リシンが、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を有する、項目４に記載の組成物。
（項目７）
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む組成物を含有する容器と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌に曝露されたか、またはこれらへの曝露と符合する症状を呈示する患者の処置における前記組成物の使用のための指示書とを含む製品であって、前記組成物の使用のための前記指示書が、前記組成物を用いるための方法を示し、前記方法が、
ｃ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌に曝露されたことが疑われる前記患者を同定するステップと、
ｄ）有効量の前記組成物を、前記患者へと投与するステップと
を含む、製品。
（項目８）
前記単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、項目７に記載の製品。
（項目９）
前記組成物が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドをさらに含む、項目７に記載の製品。
（項目１０）
前記組成物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＥＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群から選択される１または複数の菌株に対する死滅活性を有する、項目７に記載の製品。
（項目１１）
配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む１または複数のＳ．ｓｕｉｓリシンポリペプチドをコードすることが可能な核酸。
（項目１２）
図３または図４に示されるコードヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列を含む、項目１１に記載の核酸。
（項目１３）
ａ）図３のＤＮＡ配列、
ｂ）図４のＤＮＡ配列、
ｃ）標準的なハイブリダイゼーション条件下で、前出のＤＮＡ配列のうちのいずれかとハイブリダイズするＤＮＡ配列、および
ｄ）発現において前出のＤＮＡ配列のうちのいずれかによりコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択される、Ｓ．ｓｕｉｓリシンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはその縮重改変体を含む、組換えＤＮＡ分子またはその断片。
（項目１４）
前記ＤＮＡ配列が発現制御配列へと作動可能に連結されている、項目１３に記載の組換えＤＮＡ分子。
（項目１５）
項目１３に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。
（項目１６）
グラム陽性細菌を死滅させる方法であって、前記細菌を、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、前記単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、方法。
（項目１７）
前記組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細菌が、抗生物質耐性細菌である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記リシンポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を死滅させるのに有効である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記細菌が、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、またはバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
グラム陽性細菌の集団を低減するための方法であって、前記細菌を、前記グラム陽性細菌のうちの少なくとも一部を死滅させるのに有効な量の単離ポリペプチドを含む組成物と接触させるステップを含み、前記単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、方法。
（項目２２）
前記組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記細菌が、抗生物質耐性細菌である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株を死滅させるのに有効である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌が、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、またはバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）である、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
ヒトにおける抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染を処置するための方法であって、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染を有するヒトへと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、前記ヒトにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
（項目２７）
前記組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
ヒトにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌感染を処置するための方法であって、細菌感染を有するヒトへと、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、これにより、前記ヒトにおける前記グラム陽性細菌の数を低減し、前記感染をコントロールする、方法。
（項目２９）
前記組成物が、有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体をさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＥＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
病原性グラム陽性細菌に曝露されたか、またはこれへの曝露の危険性があるヒト被験体を処置するための方法であって、前記ヒト被験体へと、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な量の単離リシンポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記単離リシンポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、方法。
（項目３２）
前記被験体が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに曝露されたか、またはその危険性がある、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ヒトにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数により引き起こされるグラム陽性細菌による感染または汚染を軽減するかまたはコントロールするための方法であって、前記ヒトの外表面または皮膚を含めた前記ヒトを、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離ポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含み、これにより、前記グラム陽性細菌の数を低減し、前記感染または汚染をコントロールする、方法。
（項目３４）
投与される前記組成物が、局所適用もしくは皮膚適用、またはヒトの皮膚もしくは外表面への投与に適する組成物である、項目９に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、担体をさらに含む、項目１６、２１、２６、２８、３１、または３３のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記組成物が、前記ポリペプチドの感染部位への送達に適するビヒクルをさらに含む、項目１６、２１、２６、２８、３１、または３３のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記組成物が、１または複数の抗生物質をさらに含む、項目１６、２１、２６、２８、３１、または３３のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数のグラム陽性細菌による汚染または感染を処置またはコントロールするのに使用するための組成物であって、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む単離リシンポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、組成物。
（項目３９）
局所投与、経口投与、または非経口投与に適し、１種類または複数種類のグラム陽性細菌を死滅させるのに有効である、項目１６に記載の組成物。
（項目４０）
グラム陽性細菌を死滅させることが可能な単離リシンポリペプチドであって、前記リシンが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌のうちの１または複数の種の組合せを含めた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌の各々のうちの１または複数の株を死滅させることが可能である、単離リシンポリペプチド。
（項目４１）
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む単離リシンポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なその改変体を含む、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４２）
Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目の両方の細菌を死滅させることが可能である、項目４０に記載のリシンポリペプチド。
以下の例示的な図面を参照しながら進められる以下の記載を概観することにより、当業者には、他の目的および利点が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、溶菌サイクルをリシンによる処理と対比させて示す図である。組換えにより発現させ精製したリシンは、ファージがその宿主内から発現させるリシンと全く同様に細菌を溶解させることが可能である。
【図２】図２は、ＰｌｙＳｓ２ドメインを示す図である。触媒ドメインは、残基８〜１４６に対応する。１６残基のリンカーが存在する。結合ドメインは、残基１６２〜２２８に対応する。
【図３−１】図３Ａおよび３Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。全長ＰｌｙＳｓ１（配列番号１）および切断型ＰｌｙＳｓ１（配列番号２）のアミノ酸配列が提示される。エンドペプチダーゼドメイン（配列番号６）、二重ＣＰＬ−７ドメイン（配列番号７）、およびグルコサミニダーゼドメイン（配列番号８）が示される。
【図３−２】図３Ａおよび３Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。全長ＰｌｙＳｓ１（配列番号１）および切断型ＰｌｙＳｓ１（配列番号２）のアミノ酸配列が提示される。エンドペプチダーゼドメイン（配列番号６）、二重ＣＰＬ−７ドメイン（配列番号７）、およびグルコサミニダーゼドメイン（配列番号８）が示される。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、リシンＰｌｙＳｓ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のほか、タンパク質ドメイン解析を提示する図である。ＰｌｙＳｓ２のアミノ酸配列は、配列番号３に対応する。ＰｌｙＳｓ２リシンのＣＨＡＰドメインおよびＳＨ−３ドメインに影を付すが、ＣＨＡＰドメインはＬＮＮ・・・で始まり、・・・ＹＩＴで終わり（配列番号４）、ＳＨ−３ドメインは、ＲＳＹ・・・で始まり、・・・ＶＡＴで終わる（配列番号５）。
【図５】図５は、ｐＢＡＤ２４ベクターを示す図である。配列は、Ｔ７ポリメラーゼのためのｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーターで始まり、ＰｌｙＳｓ２で終わる。アンピシリンは、細胞を増殖させるときにプラスミドの保持を確保するための選択マーカーとして用いられる。
【図６】図６は、ＰｌｙＳｓ２の精製を示す。全ての試料を、４〜１２％のビス−トリスゲル上、２００Ｖで約４０分間にわたり泳動させ、クーマシー染色した。Ａ．約２６ｋＤａのＰｌｙＳｓ２を含有するＤＥＡＥカラムのフロースルーを示す図である。Ｂ．１０Ｌの調製物から精製したＰｌｙＳｓ２の６つの代表的な画分を示す図である。Ｃ．全ての画分を併せてプールした後のＰｌｙＳｓ２の純度を示す、約２６ｋＤａにおける単一のバンドを示す図である。
【図７Ａ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｂ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｃ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図７Ｄ】図７は、ＰｌｙＳｓ２の特徴付けの多様な側面を示す図である。Ａ．ＰｌｙＳｓ２活性に最適なｐＨを調べるために、５０μＬの多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液を、１９５μＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株細胞および５μＬのリシンと混合した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０で最も強力な活性を有した。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ９．７まで、急性の活性を有することが示された。Ｂ．１９５μＬの細胞、５μＬのリシンを、５０μＬの多様な濃度のＮａＣｌへと添加し、ＰｌｙＳｓ２に最適な塩濃度を決定した。Ｃ．ＰｌｙＳｓ２の温度安定性を決定するため、ＰｌｙＳｓ２を、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μＬの細胞へと添加した。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２を、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加し、それが補因子を要求するかどうかを決定した。全ての試験について、対照では、ｄｄ  Ｈ２ＯでＰｌｙＳｓ２を置きかえた。
【図８】図８は、高ｐＨレベルまでのビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対して決定された、ＰｌｙＳｓ２の最適なｐＨを示す図である。
【図９】図９は、緩衝液中、３７℃で最長４８時間にわたる保管後における７９９７株に対する死滅の有効性を評価することにより、精製ＰｌｙＳＳ２の安定性を決定したことを示す図である。
【図１０】図１０は、緩衝液中、−８０℃で最長７カ月間にわたるリシンの保管後においてＰｌｙＳｓ２リシンにより処理したときの、ＯＤ６００による増殖で評価される７９９７株の死滅の有効性を示す図である。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１のｐＨ依存性を示す図である。（Ａ）７７１１株宿主細胞を、４．６〜８．０のｐＨ値の範囲でリン酸クエン酸緩衝液（４０／２０ｍＭの）中に懸濁させたことを示す図である。ΔＰｌｙＳｓ１を添加し（１１０μｇ／ｍｌ）、ＯＤ６００を３７℃で６０分間にわたり測定した（水平軸）。垂直軸は、各時点における、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。各ｐＨ値について、曲線は、３回の独立した実験の試行の平均を示す。全体として、活性は、緩衝範囲の上端において最大であった。（Ｂ）この図では、ビス−トリス−プロパン（４０ｍＭの）を、ｐＨ範囲が７．０〜９．７の緩衝剤として使用したことが示される。ここでもまた、ΔＰｌｙＳｓ１を１１０μｇ／ｍｌまで添加した。各曲線は、３回の実験の試行の平均を示す。定量的なＯＤ減衰度は一般に、リン酸−クエン酸中より小さかったが、最大の活性は、ｐＨ＝９．０で観察された。
【図１２】図１２は、ΔＰＬｙＳＳ１のＮａＣｌ依存性を示す図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７７１１細胞を、ｐＨ＝７．８のリン酸−クエン酸緩衝液中に懸濁させた（４０／２０ｍＭの）。ＮａＣｌを上記の濃度まで添加した後、ΔＰｌｙＳｓ１を１１０μｇ／ｍｌで添加した。６００ｎｍにおける光学密度を、３７℃で６０分間にわたり観察した。この図では、垂直軸が、各ＮａＣｌ濃度について、３回の独立した実験にわたり平均された、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１のＤＴＴ感受性およびＥＤＴＡ感受性についての評価を提示する図である。（Ａ）ΔＰｌｙＳｓ１を、７７１１細胞への添加前に、５ｍＭのＤＴＴ（大幅なモル濃度過剰）と共に１時間にわたりプレインキュベートしたところ、活性が変化しなかったことを示す図である。（Ｂ）ここでは、ΔＰｌｙＳｓ１の添加（１１０μｇ／ｍｌ  リシン）前に、緩衝化された細胞懸濁液中に多様な濃度のＥＤＴＡを含めたことを示す図である。いずれの画像についても、垂直軸は、各条件について、３回の独立した実験にわたり平均された、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００の比を表す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ΔＰｌｙＳｓ１の温度安定性を示す図である。（Ａ）ΔＰｌｙＳｓ１原液を、上記の温度の各々で３０分間にわたり保持した後、７７１１細胞へと添加した（２７０μｇ／ｍｌの最終酵素濃度、最終温度＝３７℃、理想的な緩衝条件）ことを示す図である。この画像中の曲線は、３回にわたる個別の実験の試行の平均を表す。各場合では、完全な活性の喪失が、４５℃〜５０℃の間の試料において観察された。３つの最高温度の試料は、変性時におけるΔＰｌｙＳｓ１のフロキュレーションに起因して、処理されていない対照より若干高値のＯＤ６００の読取りを示す。（Ｂ）上記の実験を繰り返したが、アッセイ前に６時間にわたる熱処理を伴ったことを示す図である。この長いインキュベーション時間において、４５℃の試料は、ある程度の活性の喪失を示したが、完全な活性の喪失ではなかった。４０℃の試料は、本質的に天然の活性を維持した。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、（Ａ）ＰｌｙＳｓ２が、８ｕｇ／ｍＬ以上において、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対する急性の溶菌活性を有することを示す図であり、（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価される、Ｓ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰｌｙＳｓ２の異なる種および株に対する活性を提示する図である。Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７を、各試験のための陽性対照として用いた。Ａ．Ｓ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｂ．異なる細菌種および２つのＳ．ｓｕｉｓ株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。Ｃ．連鎖球菌およびブドウ球菌のＰｌｙＳｓ２に対する感度を示す図である。Ｄ．ＰｌｙＳｓ２による処理に対する感受性について調べた多様な種を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、複数の種、血清型、および菌株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。各場合において、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００を、棒グラフで示した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株のバーは赤色で着色され、Ｓ．ｓｕｉｓ株に対応するバーは橙色である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌および他の目的の細菌のバーは、紫色で示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、複数の種、血清型、および菌株に対するＰｌｙＳｓ２活性を示す図である。各場合において、処理された場合のＯＤ６００／未処理の場合のＯＤ６００を、棒グラフで示した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株のバーは赤色で着色され、Ｓ．ｓｕｉｓ株に対応するバーは橙色である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌および他の目的の細菌のバーは、紫色で示す。
【図１８】図１８は、ＰｌｙＳＳ２を、そのブドウ球菌株を死滅させる能力について、標準的なＭＩＣ解析により調べたことを示す図である。バンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン中間感受性（ＶＩＳＡ）、およびメチシリン耐性（ＭＲＳＡ）のブドウ球菌など、耐性ブドウ球菌が試験に組み入れられた。試験された３つのＶＲＳＡ株は、公知の分離株全てのうちの半分を表す。
【図１９】図１９は、ΔＰｌｙＳｓ１による溶菌活性を提示する図である。この例では、３つのＳ．ｓｕｉｓ株：ＰｌｙＳｓ１が元来そこからクローニングされた血清型７株である７７１１株（すなわち、宿主株）；種の標準菌株である血清型２分離株であるＳ７３５株；および毒性の高い血清型９株である７９９７株についてのＯＤ低下曲線が示される。細菌は、２０ｍＭのｐＨ７．８リン酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ（最適状態として規定される）中に懸濁させた。ΔＰｌｙＳｓ１は、ある濃度範囲（挿入図により示す）で細胞へと添加した。各試料について、３７℃で１時間にわたり（水平軸）、６００ｎｍにおける光学密度（垂直軸）を測定した。この画像では、全ての曲線が、３または４回の独立した実験の試行の平均を表す。
【図２０】図２０は、ΔＰｌｙＳｓ１によるＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１の増殖の阻害を示す図である。ΔＰｌｙＳｓ１を上記の最終濃度で、ＢＨＩブロス中のＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１株の希釈懸濁液へと添加した。各試料の光学密度は、９６ウェルプレートフォーマットで一晩にわたり継続的に測定した。全体として、細菌の増殖は、用量依存的な様式で遅延した。しかし、ここでは、緩衝液中で溶菌を誘導するのに十分な酵素濃度（１３０および５０μｇ／ｍｌ）の場合、効果はごくわずかであった。さらに、上記のΔＰｌｙＳｓ１濃度のうちのいずれも、増殖を完全には阻害しなかった（よって、ＭＩＣを割り当てることはできないであろう）。処理された試料の全てについて、最終光学密度は、実際に、未処理試料の最終光学密度より高値であることが注目されるであろう。これは、溶菌酵素の存在下で生じた、凝集した細菌破砕物の蓄積によるアーチファクトである。
【図２１】図２１は、ΔＰｌｙＳｓ１についての菌株パネルを提示する図である。図１９ならびに表３および４に提示される情報を、１３０μｇ／ｍｌおよび３２．５μｇ／ｍｌという２つのＰｌｙＳｓ１濃度について、グラフにまとめる。画像中、Ｓ．ｓｕｉｓ株は、２つの赤色星印で示され、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の連鎖球菌は、単一の黒色星印で示される。１時間後における光学密度応答（未処理の場合のＯＤ６００と比べた、処理された場合のＯＤ６００の比）が示される。Ｓ．ｓｕｉｓ株の血清型の定義については、表３を参照されたい。
【図２２】図２２は、ＰｌｙＳｓ２の、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株およびＳ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対する溶菌活性についての、ＣＦＵ死滅アッセイの結果を提示する図である。
【図２３】図２３は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる、ＰｌｙＳＳ２に対する、抗生物質であるムピロシンと比較した耐性アッセイの結果を示す図である。ＭＲＳＡ  ＭＷ２株、ＭＳＳＡ  ８３２５株、またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５株のうちのいずれも、各株を、濃度を段階的に増大させるＰｌｙＳｓ２へと曝露した後において、ＰｌｙＳｓ２に対する耐性を発生させなかった。ＭＷ２および８３２５のいずれもが、陽性対照であるムピロシンに対する耐性を発生させた。
【図２４】図２４は、ＭＲＳＡ菌血症を伴うマウスの生存を、１０日間にわたり示す図である。ＰｌｙＳｓ２は、試験されたマウスのうちの９５％から菌血を除去した。対照のうち、生存したのはわずかに５％であった。
【図２５】図２５は、異なる種および株に対するＰｌｙＳｓ２活性を提示する図である。対数期の培養物を、リン酸緩衝液中で、６０分間にわたり、３２μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２へと曝露した。処理された試料の最終ＯＤ６００を、未処理試料の最終ＯＤ６００で除して、上記の正規化された値を求めた。複数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、およびＶＩＳＡが含まれるがこれらに限定されない）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＢａｃｉｌｌｕｓ属を、ＰｌｙＳｓ２活性に対する感受性について調べた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、グラム陰性対照として調べた。
【図２６】図２６は、ＰｌｙＳｓ２の多様な株に対する殺菌効果を示す図である。処理の６０分後における１２８μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２の殺菌効果。対数スケールに沿ってＣＦＵカウントの低減を示す。特徴的なことに、ＰｌｙＳｓ２は、ＭＲＳＡ  ＭＷ２に対して著明な活性を及ぼした。ＰｌｙＳｓ２が、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを劇的に低減したことは注目に値する。陰性対照であるＥ．  ｃｏｌｉの数の低減は認められなかった。
【図２７】図２７は、多様なグラム陽性細菌に対するＰｌｙＳｓ２の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す図である。予測される通り、ＭＲＳＡ  ＭＷ２に対するＭＩＣは低値であり、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５に対するＭＩＣは高値であった。ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、溶菌活性および殺菌試験と相関する。したがって、ＰｌｙＳｓ２の、陰性対照であるＥ．  ｃｏｌｉに対するＭＩＣは、測定不能であった。
【図２８−１】図２８は、ＰｌｙＳｓ２がマウスを、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染により引き起こされる死亡から防御したことを示す。ＦＶＢ／ＮＪマウスに、約５×１０５ＣＦＵのＭＲＳＡ  ＭＷ２株、約１×１０７個のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５株、または同じ濃度での上記の接種物に由来する両方の細菌の組合せ（混合感染）を含有する５％の粘素を腹腔内注射した。感染の３時間後、全ての感染群（Ａ〜Ｃ）におけるマウスに、２０ｍＭのリン酸緩衝液対照、１ｍｇのＣｌｙＳ、１ｍｇのＰｌｙＣ、または混合感染のための１ｍｇのＰｌｙＣに加えた１ｍｇのＣｌｙＳの組合せによる腹腔内注射を１回施した。ＰｌｙＳｓ２処置は、ＭＲＳＡ感染に対する１ｍｇ（Ａ）、またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよび混合感染に対する２ｍｇ（Ｂ〜Ｃ）からなった。マウスを、生存について、１０日間にわたりモニタリングした。４回の独立した実験に由来する結果を組み合わせ、カプランマイヤー生存曲線によりマウスの生存データをプロットした。
【図２８−２】図２８は、ＰｌｙＳｓ２がマウスを、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染により引き起こされる死亡から防御したことを示す。ＦＶＢ／ＮＪマウスに、約５×１０５ＣＦＵのＭＲＳＡ  ＭＷ２株、約１×１０７個のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５株、または同じ濃度での上記の接種物に由来する両方の細菌の組合せ（混合感染）を含有する５％の粘素を腹腔内注射した。感染の３時間後、全ての感染群（Ａ〜Ｃ）におけるマウスに、２０ｍＭのリン酸緩衝液対照、１ｍｇのＣｌｙＳ、１ｍｇのＰｌｙＣ、または混合感染のための１ｍｇのＰｌｙＣに加えた１ｍｇのＣｌｙＳの組合せによる腹腔内注射を１回施した。ＰｌｙＳｓ２処置は、ＭＲＳＡ感染に対する１ｍｇ（Ａ）、またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよび混合感染に対する２ｍｇ（Ｂ〜Ｃ）からなった。マウスを、生存について、１０日間にわたりモニタリングした。４回の独立した実験に由来する結果を組み合わせ、カプランマイヤー生存曲線によりマウスの生存データをプロットした。
【図２９−１】図２９は、ＭＲＳＡの分離株に対するＰｌｙＳｓ２およびバンコマイシンの活性を示す図である。
【図２９−２】図２９は、ＭＲＳＡの分離株に対するＰｌｙＳｓ２およびバンコマイシンの活性を示す図である。
【図３０】図３０は、ＰｌｙＳｓ２の酵素ドメインアライメントを、ＣｌｙＳと対比して提示する図である。連鎖球菌のリシンであるＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＣのＣＨＡＰドメイン（サブユニットＡ、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＰ４２３１０）をアラインメントする。アミノ酸の同一性を、下方の星印および強調表示で示す。推定触媒残基（システインおよびヒスチジン、これにちなんでドメインが名付けられている）の位置を矢印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明によれば、当技術分野の技量の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法が使用されうる。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．編（１９９４年）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ編（１９９４年））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」巻Ｉ〜ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．編（１９９４年）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照されたい。
【００５２】
したがって、本明細書に現れる場合、以下の用語は、以下および本節で提起され示される定義を有するものとする。
【００５３】
本明細書では、「Ｓ．ｓｕｉｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ１リシン」、「ＰｌｙＳｓ１」、「全ＰｌｙＳｓ１」、「切断型ＰｌｙＳｓ１」、「ΔＰｌｙＳｓ１」、「ＰｌｙＳｓ２リシン」、「ＰｌｙＳｓ２」という用語、および具体的に列挙されているわけではない任意の変形を互換的に用いることができ、本出願および特許請求の範囲全体にわたって用いられる通り、単一または複数のタンパク質を含めたタンパク質性物質にも言及し、本明細書で記載され、図３および図４に示されるアミノ酸配列データ（配列番号１、２および／または３）、ならびに本明細書および特許請求の範囲に示される活性プロファイルを有するタンパク質にも及ぶ。したがって、実質的に同等な活性または活性の変化を提示するタンパク質も同様に想定される。これらの修飾は、例えば、部位指向変異誘発を介して得られる修飾など、意図的な場合もあり、複合体またはその記名サブユニットの産生細胞である宿主における変異を介して得られる修飾など、偶発的な場合もある。「Ｓ．ｓｕｉｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓリシン（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ１リシン」、「ＰｌｙＳｓ１」、「全ＰｌｙＳｓ１」、「切断型ＰｌｙＳｓ１」、「ΔＰｌｙＳｓ１」、「ＰｌｙＳｓ２リシン」、「ＰｌｙＳｓ２」という用語はまた、具体的に本明細書で列挙されるタンパク質のほか、全ての実質的に相同な類似体、断片、または切断型、および対立遺伝子変異をそれらの範囲内に包含することも意図する。
【００５４】
ポリペプチドおよび溶菌酵素
「溶菌酵素」は、適切な条件下で相応な時間にわたり、１または複数の細菌を死滅させる任意の細菌の細胞壁溶解酵素を包含する。限定なしに述べると、溶菌酵素の例には、多様なアミダーゼである細胞壁溶解酵素が含まれる。
【００５５】
「Ｓ．ｓｕｉｓ溶菌酵素」は、適切な条件下で、相応な時間にわたり、少なくとも１つまたは複数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌を死滅させることが可能な溶菌酵素を包含する。
【００５６】
「バクテリオファージの溶菌酵素」とは、バクテリオファージから抽出もしくは単離された溶菌酵素、または溶菌酵素の機能性を維持する類似のタンパク質構造を有する合成された溶菌酵素を指す。
【００５７】
溶菌酵素は、具体的には、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を切断して、細菌の細胞壁を破壊することが可能である。今日ではまた、細菌細胞壁のペプチドグリカンは、大半の細菌間で高度に保存されており、少数の結合を切断するだけで細菌の細胞壁を破壊しうることも前提とされている。バクテリオファージの溶菌酵素は、アミダーゼでありうるが、他の種類の酵素も可能である。これらの結合を切断する溶菌酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼ、またはＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼなど、多様なアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４年）は、Ｃ１連鎖球菌のファージリシン酵素が、アミダーゼであることについて報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７年、１９９０年）は、Ｃｐ−１ファージに由来する、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＣｐ１リシンが、リゾチームであることについて報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２年）は、ｐｈｉ  ６Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージに由来する溶菌酵素が、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸（ｍｅｌｏ−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびＤ−アラニンにより形成されるペプチド架橋を分割するエンドペプチダーゼであることについて報告した。Ｅ．  ｃｏｌｉのＴ１ファージおよびＴ６ファージの溶菌酵素も、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属のファージ（ｐｌｙ）に由来する溶菌酵素と同様に、アミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６年）。当技術分野ではまた、細菌の細胞壁を切断することが可能な他の溶菌酵素も公知である。
【００５８】
「バクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素」は、例えば、宿主細菌に対して少なくとも何らかの細胞壁溶解活性を有することにより宿主細菌を死滅させることが可能なポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、天然配列の溶菌酵素およびその改変体を包含する配列を有しうる。ポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）など、多様な供給源から単離することもでき、Ｇａｒｃｉａらにより記載されており、また、本明細書でも提示される組換え法または合成法などの組換え法または合成法により調製することもできる。このポリペプチドは、カルボキシル末端側においてコリン結合部分を含むことが可能であり、アミノ末端側における細胞壁ペプチドグリカンを切断することが可能な酵素活性（ペプチドグリカン中のアミド結合に対して作用するアミダーゼ活性など）によって特徴付けられうる。ＰｌｙＧＢＳリシンなど、複数の酵素活性、例えば、２つの酵素ドメインを包含する溶菌酵素が記載されている。一般的に述べれば、溶菌酵素は、分子量が２５，０００〜３５，０００ドルトンの間にある可能性があり、単一のポリペプチド鎖を含む可能性があるが、これは、酵素鎖に応じて変化しうる。分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム変性ゲルによる電気泳動および分子量マーカーとの比較に基づくアッセイを介して、最も便利に決定することができる。
【００５９】
「天然配列のファージ関連溶菌酵素」は、細菌に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。このような天然配列の酵素は、単離することもでき、組換え手段または合成手段により作製することもできる。
【００６０】
「天然配列の酵素」という用語は、酵素の天然に存在する形態（例えば、代替的なスプライシング形態または変化形態）および天然に存在する改変体を包含する。本発明の一実施形態では、天然配列の酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに由来する遺伝子により遺伝的にコードされる成熟ポリペプチドまたは全長ポリペプチドである。Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、３巻：１９９〜２１１頁（１９９７年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ、８６巻：８１〜８８頁（１９９０年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：９１４〜９１８頁（１９８８年）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：９１４〜９１８頁（１９８８年）；Ｇａｒｃｉａら、「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｊ．  Ｊ．  ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓ編、１９８７年）；Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、１００巻：４３９〜４４８頁（１９９２年）；Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻：５０６４〜５０７０頁（１９９０年）；Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６４巻：６２１〜６２４頁（１９８７年）；ならびにＳａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ、６１巻：１３〜１９頁（１９８７年）などの刊行物で認知されている通り、当然ながら、多数の改変体が可能および公知である。これらの参考文献の各々の内容、特に、配列表、および配列相同性についての言明を含めた、配列を比較する関連の説明文は、具体的に、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【００６１】
「改変体配列による溶菌酵素」は、溶菌酵素のポリペプチド配列とは異なるが、機能的活性を保持するポリペプチド配列によって特徴付けられる溶菌酵素を包含する。一部の実施形態では、溶菌酵素が、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と特定のアミノ酸配列の同一性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージにより遺伝的にコードされうる。例えば、一部の実施形態では、機能的に活性な溶菌酵素が、細菌の細胞壁を破壊することにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌、ならびに表１および図９および１０において示される他の感受性細菌を含め、本明細書で提示される他の感受性細菌を死滅させうる。活性の溶菌酵素は、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、または９９．５％のアミノ酸配列の同一性を有しうる。このようなファージ関連溶菌酵素の改変体には、例えば、溶菌酵素ポリペプチドであって、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、本明細書の溶菌酵素配列（複数可）の配列のＮ末端またはＣ末端において１または複数のアミノ酸残基を付加するか、または欠失させた溶菌酵素ポリペプチドが含まれる。特定の態様では、ファージ関連溶菌酵素が、天然のファージ関連溶菌酵素配列と少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列の同一性、特に、少なくとも約９０％（例えば、９０％）のアミノ酸配列の同一性を有するであろう。最も具体的には、ファージ関連溶菌酵素の改変体が、図３および図４、または配列番号１、２、もしくは３のうちのいずれかに提示される、天然のファージに関連する本明細書の溶菌酵素配列（複数可）と少なくとも約９５％（例えば、９５％）のアミノ酸配列の同一性を有するであろう。
【００６２】
本明細書では、同定されたファージ関連溶菌酵素配列に関する「アミノ酸配列の同一性パーセント」を、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、同じリーディングフレーム内で配列を整列させ、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後における、ファージ関連溶菌酵素配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義する。
【００６３】
本明細書では、同定されたファージ関連溶菌酵素配列に関する「核酸配列の同一性パーセント」を、配列を整列させ、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後における、ファージ関連溶菌酵素配列中のヌクレオチドと同一な候補配列中のヌクレオチドの百分率と定義する。
【００６４】
２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を、最適な比較を目的として整列させる（例えば、第１のヌクレオチド配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド位置またはアミノ酸位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸により占められる場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間における同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／全ての位置の数×１００）。
【００６５】
２つの配列間における同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、本発明のヌクレオチド配列と所望の同一性を有する配列を同定するのに用いうる、ＮＢＬＡＳＴプログラムへと組み込まれている。比較を目的としてギャップを施したアライメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）において記載される通りに使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、各々のプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより提供されているプログラムを参照されたい。一実施形態では、配列比較のためのパラメータを、Ｗ＝１２に設定することができる。パラメータはまた、変化させることもできる（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。値「Ｗ」は、２つの配列を、同一性の領域を含有する配列として同定するプログラムのためには、どのくらい多くの連続ヌクレオチドが同一でなければならないのかを決定する。
【００６６】
「ポリペプチド」は、直鎖状に接合された複数のアミノ酸を含むポリマー分子を包含する。一部の実施形態では、ポリペプチドが、天然に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされる分子に対応しうる。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸が類似の特性を有するアミノ酸で置きかえられる保存的置換であって、ポリペプチドの機能を変化させない保存的置換を包含しうる（例えば、Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ  Ｖ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１章、９〜１３頁、１９９４年を参照されたい）。
【００６７】
「改変溶菌酵素」という用語は、シャフリングされた溶菌酵素および／またはキメラ溶菌酵素を包含する。
【００６８】
特異的ファージを感染させた細菌に特異的なファージ溶菌酵素は、問題となる細菌の細胞壁を有効かつ効率的に分解することが見出されている。溶菌酵素は、タンパク質分解性の酵素活性を欠くと考えられ、したがって、細菌細胞壁の消化時に存在するときも、哺乳動物のタンパク質および組織に対しては非破壊的である。参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、「Ｒａｐｉｄ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４巻：２１７０〜２１７２頁（２００１年１２月７日）、およびＳｃｉｅｎｃｅ誌によりオンラインで公表されているこの文献に対する補遺資料により示される通り、Ｐａｌなど、精製された肺炎球菌のバクテリオファージの溶菌酵素は、多様な肺炎球菌を死滅させることが可能である。Ｌｏｅｆｆｌｅｒらは、これらの実験を介して、接触後数秒間以内に、溶菌酵素であるＰａｌが、最も高頻度で単離される血清群およびペニシリン耐性株（ｓｔａｉｎ）を含めたＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１５の臨床株（ｓｔａｉｎ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて死滅させうることを示している。Ｐａｌによるマウスの処置はまた、血清型１４の鼻腔内保菌を、用量依存的な様式で消失させるかまたは著明に低減することも可能であった。さらに、Ｐａｌの作用は、他のファージ溶菌酵素と同様であるが、抗生物質とは異なり、むしろ標的の病原体に特異的であることが見出されているために、正常微生物叢は本質的に無傷に保持される可能性が高い（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．  Ｊ．  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｇ．  Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ、Ｓ．  Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６巻、１２３１〜４１頁（１９９５年））。これに対し、本発明のリシンポリペプチドは、顕著に広範で臨床的に有意な殺菌プロファイルを有する。本明細書で裏付けられる通り、例えば、単離されたＳ．ｓｕｉｓリシンであるＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓを死滅させるのに有効であり、また、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（ＧＢＳ）を含めた他の多様なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属株、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属も死滅させるのに有効である。したがって、本発明のリシンは、既に報告または想定されている任意のリシンと異なり、細菌細胞死滅の広域性を裏付けている。
【００６９】
本発明の溶菌酵素またはポリペプチドは、特定のバクテリオファージに感染させた後の細菌生物に、感染の症状を有する他の患者へと曝露されている患者を発病から防御するための予防的処置として産生させる場合もあり、感染から病気に既に罹患している患者のための治療的処置として産生させる場合もある。本明細書では、リシンポリペプチド配列およびリシンポリペプチドをコードする核酸が提供されるので、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、本明細書で例示される方法を含めた当技術分野の標準的な方法を用いて、ファージゲノムから単離された溶菌酵素の遺伝子を介し、この遺伝子を遺伝子導入ベクターへと挿入し、前記遺伝子導入ベクターを発現系へとクローニングして作製することが好ましい場合がある。溶菌酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、切断型の場合もあり、キメラの場合もあり、シャフリングされている場合もあり、「天然」の場合もあり、組み合わせることが可能である。本明細書には、関与性の米国特許第５，６０４，１０９号が参照によりその全体において組み込まれる。「改変」溶菌酵素は、多数の方式で作製することができる。好ましい実施形態では、ファージゲノムに由来する、改変溶菌酵素の遺伝子を、遺伝子導入用ベクターまたは可動性ベクター、好ましくは、プラスミドへと挿入し、このプラスミドを、発現ベクターまたは発現系へとクローニングする。本発明のリシンポリペプチドまたはリシン酵素を作製するための発現ベクターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、または他の多数の適切な細菌に適しうる。ベクター系はまた、無細胞の発現系でもありうる。当技術分野では、遺伝子または遺伝子のセットを発現させるこれらの方法の全てが公知である。溶菌酵素はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージを感染させることにより創出することもでき、この場合、前記少なくとも１つの溶菌酵素は、前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの細胞壁をもっぱら溶解させ、他の、例えば、存在する天然細菌叢または片利共生細菌叢に及ぼす影響はせいぜい最小限である。
【００７０】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドへと作動可能に連結した本発明のポリペプチドの全部または（好ましくは生物学的に活性な）一部を含む。キメラタンパク質またはキメラペプチドは、例えば、２つ以上の活性部位を有する２つ以上のタンパク質を組み合わせることにより作製する。キメラタンパク質およびキメラペプチドは、同じ分子において独立に作用する場合もあり、異なる分子において作用する場合もあり、よって、２つ以上の異なる細菌感染を同時に処置する可能性を有する。キメラタンパク質およびキメラペプチドはまた、細胞壁を１つより多い場所で開裂させることにより、したがって、単一のリシン分子またはリシンキメラペプチドによる、より急速または有効な（または相乗作用的）死滅を潜在的にもたらすことにより、細菌感染を処置するのに用いることもできる。
【００７１】
ＤＮＡ構築物またはペプチド構築物の「異種」領域とは、天然における大型分子と会合しては見出されない、大型のＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントまたは大型のペプチド分子内の同定可能なペプチドセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、この遺伝子には通常、供給源生物ゲノム内では哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡが隣接する。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ゲノムのコード配列が、イントロン、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成的配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変異または天然に存在する変異イベントは、本明細書で規定されるＤＮＡまたはペプチドの異種領域をもたらさない。
【００７２】
「作動可能に連結する」という用語は、本開示のポリペプチドと異種ポリペプチドとを、インフレームで融合させることを意味する。異種ポリペプチドは、本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合させることができる。キメラタンパク質は、化学的合成により酵素的に作製されるか、組換えＤＮＡ法により作製される。多数のキメラ溶菌酵素が作製および研究されている。バクテリオファージｐｈｉ  Ｘ１７４およびＭＳ２のそれぞれの溶菌タンパク質であるＥおよびＬから構築されたキメラ溶菌遺伝子である遺伝子Ｅ−Ｌを内部欠失にかけて、溶菌特性または死滅特性を変化させた、新たな一連のＥ−Ｌクローンを創出した。この研究では、親遺伝子であるＥ、Ｌ、Ｅ−Ｌ、およびＥ−Ｌの内部切断形態の溶菌活性を探索し、異なる膜貫通ドメインの構築の差違に基づき、異なる溶菌機構を特徴付けた。電子顕微鏡検査法、ならびに細胞質空間およびペリプラズム空間へのマーカー酵素の放出により、２つの異なる溶菌機構は、これらの溶菌タンパク質の、Ｅ．  ｃｏｌｉの内膜または内膜および外膜に対する透過に応じて識別しうることが明らかとなった（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．（１９９８年）、１６４巻（１号）：１５９〜６７頁（参照により本明細書に組み込まれる））。有用な融合タンパク質の一例は、本開示のポリペプチドをＧＳＴ配列のＣ末端へと融合させたＧＳＴ融合タンパク質である。このようなキメラタンパク質は、本開示の組換えポリペプチドの精製を容易としうる。
【００７３】
別の実施形態では、キメラタンパク質またはキメラペプチドが、そのＮ末端において異種シグナル配列を含有する。例えば、本開示のポリペプチドの天然のシグナル配列を除去して、別のタンパク質に由来するシグナル配列で置きかえることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を、異種シグナル配列として用いることができる（参照により本明細書に組み込まれる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年）。真核生物の異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）の分泌配列が含まれる。さらに別の例では、有用な原核生物の異種シグナル配列に、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
【００７４】
融合タンパク質により、リシンポリペプチドを、異なる能力を有するタンパク質またはポリペプチドと組み合わせることもでき、このリシンポリペプチドにさらなる能力または付加的な特徴を与えることもできる。融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの全部または一部を、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列へと融合させた、免疫グロブリン融合タンパク質でありうる。免疫グロブリンは、抗体、例えば、感受性細菌または標的の細菌の表面タンパク質またはエピトープを指向する抗体でありうる。免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物へと組み込み、被験体へと投与して、リガンド（可溶性リガンドまたは膜結合リガンド）と細胞の表面におけるタンパク質（受容体）との間の相互作用を阻害し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシグナル伝達を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドのコグネイトリガンドのバイオアベイラビリティーを改変しうる。リガンド／受容体間相互作用の阻害は、細菌と関連する疾患および障害を処置するため、かつ、細胞の生存を調節する（すなわち、促進または阻害する）ために治療的に有用でありうる。さらに、本開示の免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドに対して方向付けられた抗体を被験体において産生させ、リガンドを精製し、スクリーニングアッセイにおいて受容体のリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原としても用いることができる。本開示のキメラタンパク質およびキメラペプチドならびに融合タンパク質および融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法により作製することができる。
【００７５】
融合遺伝子は、自動式ＤＮＡ合成器を含めた従来の技法により合成することができる。代替的に、ＰＣＲによる遺伝子断片の増幅は、２つの連続遺伝子断片間の相補的な突出をもたらし、その後、これをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を発生させうる、アンカープライマーを用いて実行することもできる（すなわち、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。さらに、融合部分（すなわち、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分を、インフレームで本発明のポリペプチドへと連結するように、このような発現ベクターへとクローニングすることができる。
【００７６】
本明細書で用いられる、シャフリングされたタンパク質もしくはペプチド、シャフリングされた遺伝子産物、または複数の関連するファージタンパク質もしくはタンパク質のペプチド断片についてシャフリングされたペプチドは、ランダムに切断され、より活性のタンパク質またはより特異的なタンパク質へと再組立てされる。シャフリングされたオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド断片分子を選択またはスクリーニングして、所望の機能特性を有する分子を同定する。この方法は、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、米国特許第６，１３２，９７０号（「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）；Ｋａｕｆｆｍａｎ、米国特許第５，９７６，８６２号（「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｃｏｎｄｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」）、およびＨｕｓｅ、米国特許第５，８０８，０２２号（「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｄｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」）において記載されている。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。シャフリングを用いて、活性の大きな、例えば、活性が鋳型タンパク質の最大で１０〜１００倍であるタンパク質を創出することができる。鋳型タンパク質は、多種多様なリシンタンパク質の間で選択される。シャフリングされたタンパク質またはペプチドは、例えば、１または複数の結合ドメインおよび１または複数の触媒ドメインを構成する。各結合ドメインまたは触媒ドメインは、同じファージもしくは異なるファージ、または同じファージタンパク質もしくは異なるファージタンパク質に由来する。シャフリングされたドメインは、単独でまたは他の遺伝子もしくは遺伝子産物と組み合わせてペプチド断片へと翻訳可能な、遺伝子または遺伝子産物としてのオリゴヌクレオチドベースの分子であるか、あるいはペプチドベースの分子である。遺伝子断片には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＥＳＴ、ＳＮＩＰ、および単独でまたは他の分子と組み合わせてペプチドへの翻訳が可能であるかまたは不可能なオリゴヌクレオチド分子を生成させる他のオリゴヌクレオチドベースの分子のうちのいずれの分子も含まれる。
【００７７】
本明細書で開示されるタンパク質またはペプチドおよびペプチド断片の修飾形態または改変形態は、化学合成されるか、もしくは組換えＤＮＡ法により調製されるか、またはこれらの両方によるタンパク質またはペプチドおよびペプチド断片を包含する。これらの技法には、例えば、キメラ化およびシャフリングが含まれる。タンパク質またはペプチドを化学的合成により作製する場合、このタンパク質またはペプチドは、実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含まないことが好ましい、すなわち、このタンパク質またはペプチドは、このタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。したがってこのようなタンパク質調製物が有する目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物は、約３０％、２０％、１０％、５％の（乾燥重量で）未満である。
【００７８】
ポリペプチドのシグナル配列は、本開示のタンパク質およびペプチドならびにペプチド断片の粘膜への膜貫通移動および粘膜からの膜貫通移動を容易としうるほか、目的の分泌タンパク質または他のタンパク質の分泌および単離も容易としうる。シグナル配列は、１または複数の切断イベントによる分泌において成熟タンパク質から一般に切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられることが典型的である。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を経るときに、シグナル配列の成熟タンパク質からの切断を可能とする、プロセシング部位を含有する。したがって、本開示は、シグナル配列を有する、記載されたポリペプチドのほか、シグナル配列自体、およびシグナル配列の不在下におけるポリペプチド（すなわち、切断産物）にも関連する。本開示のシグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクター内で、通常は分泌されないか、または他の形で単離することが困難なタンパク質など、目的のタンパク質へと作動可能に連結することができる。シグナル配列が、発現ベクターが形質転換された真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を方向付けると、このシグナル配列は、続いてまたは同時に切断される。次いで、タンパク質は、当技術分野で認識される方法により細胞外培地から容易に精製することができる。代替的に、シグナル配列は、ＧＳＴドメインなどによる精製を容易とする配列を用いて、目的のタンパク質へと連結することができる。
【００７９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの他の改変体にも関連する。このような改変体は、アゴニスト（模倣体）として、またはアンタゴニストとして機能しうる改変アミノ酸配列を有しうる。改変体は、変異誘発、すなわち、個別の点変異または切断により発生させることができる。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性、またはこれらの生物学的活性のサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１または複数を、例えば、細胞内のシグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーであって、目的のタンパク質を包含するメンバーに競合的に結合することにより阻害しうる。したがって、機能の限定された改変体で処置することにより、特異的な生物学的効果を誘発することができる。被験体を、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体で処置することにより、被験体における副作用を、タンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて低減することができる。アゴニスト（模倣体）として、またはアンタゴニストとして機能する本開示のタンパク質の改変体は、本開示のタンパク質の変異体、すなわち、切断型変異体の組合せライブラリーを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態では、多様化させた改変体のライブラリーを、核酸レベルにおける組合せ変異誘発により発生させ、多様化させた遺伝子ライブラリーによりコードさせる。多様化させた改変体のライブラリーは、例えば、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが、個別のポリペプチドとして発現可能であるか、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（すなわち、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションすることにより作製することができる。本開示のポリペプチドの潜在的な改変体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するのに用いられうる多様な方法が存在する。当技術分野では、縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法が公知である（すなわち、全てが参照により本明細書に組み込まれるＮａｒａｎｇ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁を参照されたい）。
【００８０】
加えて、本開示のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを用いて、改変体、活性断片、または切断型のスクリーニングおよびその後の選択のための多様化させたポリペプチド集団を発生させることができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、目的の二本鎖のＰＣＲ用コード配列の断片を、ニッキングが分子１個当たり約１回だけ生じる条件下において、ヌクレアーゼで処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を包含しうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理を介して改質された二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として得られる断片ライブラリーを発現ベクターへとライゲーションすることにより発生させることができる。この方法により、サイズが多様な目的のタンパク質のＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを導出することができる。当技術分野では、点変異または切断により作製される組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための複数の技法が公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技法であって、ハイスループット解析に適する技法は、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングするステップと、適切な細胞を、結果として得られるベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出によりその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で、組合せ遺伝子を発現させるステップとを包含することが典型的である。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を増大させる技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、本開示のタンパク質の改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。タンパク質またはペプチド断片の免疫学的活性部分は、ファージ酵素を認識する抗体に結合する領域を包含する。この文脈では、実施形態によるタンパク質の最小の部分（またはこのタンパク質をコードする核酸）が、リシンタンパク質をもたらすファージに特異的なエピトープとして認識可能なエピトープである。したがって、抗体など、標的または受容体への結合を予測することが可能であり、一部の実施形態に有用な最小のポリペプチド（およびこのポリペプチドをコードする関連する核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、または１００アミノ酸の長さでありうる。わずか、８、９、１０、１１、１２、または１５アミノ酸の長さの小型の配列も、標的またはエピトープとして作用するのに十分な構造を確実に含むが、５、６、または７アミノ酸の長さのより短い配列も、条件によっては標的構造またはエピトープ構造を呈示し、ある実施形態では価値を有する。し��がって、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、および／または３に示される場合を含めた、本明細書で提供されるタンパク質（複数可）またはリシンポリペプチドの最小の部分は、わずか、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、または１６アミノ酸の長さのポリペプチドを包含する。
【００８１】
本明細書で記載される実施形態によるタンパク質またはペプチド断片の生物学的活性部分は、ファージタンパク質の全長タンパク質より少数のアミノ酸を包含し、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈示する本開示のファージタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。生物学的活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を伴うドメインまたはモチーフを含むことが典型的である。本開示のタンパク質またはタンパク質断片の生物学的活性部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００アミノ酸未満であるポリペプチドの場合もあり、１０、２５、５０、１００アミノ酸より長いポリペプチドの場合もある。さらに、タンパク質の他の領域が欠失しているかまたは付加されている他の生物学的活性部分も、組換え法により調製し、本明細書における実施形態のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１または複数について評価することができる。
【００８２】
当業者により察知される通り、このような小型のタンパク質および／または核酸（または大型分子のタンパク質領域および／もしくは核酸領域）と機能性を共有する相同タンパク質および相同核酸を調製することができる。相同でありうるこのような小型の分子および大型分子の短い領域は、とりわけ実施形態として意図される。このような有益な領域の相同性は、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、および／または３に示されるリシンポリペプチドを含めた、本明細書で提供されるリシンポリペプチドと比較して、少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、８５％であることが好ましく、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または少なくとも９９％であることが好ましい。これらの相同性パーセント値は、保存的アミノ酸置換に起因する改変を包含しない。
【００８３】
アミノ酸残基のうちの少なくとも約７０％（好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、および好ましくは、少なくとも約９０、または９５％）が同一であるか、または保存的置換を表す場合、２つのアミノ酸配列は、「実質的に相同」である。リシンポリペプチドのアミノ酸のうちの１もしくは複数の、またはいくつかの、または最大１０％、または最大１５％、または最大２０％が、類似のアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換で置換されており、同等なリシンが、本明細書で開示されるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１リシンなどのリシンの活性プロファイル、抗菌効果、および／または細菌特異性を有する場合、同等なＰｌｙＳｓ２リシン、または同等なＰｌｙＳｓ１リシンなど、同等なリシンの配列は、実質的に相同である。
【００８４】
本明細書で記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性体形態にある残基は、そのポリペプチドにより免疫グロブリン結合の所望の機能的特性が保持される限りにおいて、任意のＬ−アミノ酸残基を置換することができる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指し、ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。以下の対応表では、アミノ酸残基の略記法を、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２４３巻：３５５２〜５９頁（１９６９年）における標準的なポリペプチドの用語法に準拠して示す。
【００８５】
【化１】
2019022504.tif 000002
本明細書では、全てのアミノ酸残基配列が、その左向きおよび右向きが従来のアミノ末端からカルボキシ末端への方向である慣例法により表されることに注意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の始端部または末端部におけるダッシュが、１または複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合を示すことに注意されたい。上記の表は、本明細書では代替的に出現しうる、三文字表記と一文字表記とを相互関連させるために示す。
【００８６】
本明細書のアミノ酸配列、あるいは本明細書のポリペプチド、および図３もしくは図４に示されるリシン配列、またはこれらの活性断片もしくは切断型を含めた本明細書のリシンをコードする核酸配列には、特定のコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンへと変化させるか、アミノ酸を別のアミノ酸に置換するか、または１もしくは複数のアミノ酸を欠失させるように、変異を施すことができる。一般に、可能な限り少数のアミノ酸変化またはヌクレオチド変化を施すことにより、このような変異を施すことができる。この種の置換変異を施して、結果として得られるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存的様式で（例えば、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸から、別の群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより）変化させることもでき、保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸に由来するコドンを、同じ群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより）変化させることもできる。このような保存的変化は一般に、結果として得られるタンパク質の構造および機能にもたらす変化が小さい。非保存的変化は、結果として得られるタンパク質の構造、活性、または機能を改変する可能性が大きい。本発明は、結果として得られるタンパク質の活性または結合特徴をそれほど改変しない保存的変化を含有する配列を包含すると考えられるものとする。
【００８７】
したがって、当業者は、本明細書で提供されるＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２リシンポリペプチドの配列の再検討、およびそれらの知識、ならびに他のリシンポリペプチドについて入手可能な公開情報に基づき、リシンポリペプチド配列においてアミノ酸変化またはアミノ酸置換を施すことができる。アミノ酸変化を施して、本明細書で提供されるリシン（複数可）の配列中の、１もしくは複数の、１または少数の、１もしくはいくつかの、１つ〜５つ、１〜１０、またはこのような他の数のアミノ酸を置きかえるかまたは置換して、変異体またはその改変体を発生させることができる。このような変異体またはその改変体は、ブドウ球菌、連鎖球菌、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌、もしくは腸球菌を含めた細菌を死滅させるための機能について予測される場合もあり、細菌を死滅させるための機能もしくは能力について調べる場合もあり、かつ／または本明細書で提供されるリシン（複数可）と同等な活性を有することについて予測される場合もあり、これについて調べる場合もある。したがって、例えば、本明細書の図４に示されるアミノ酸配列を修飾することにより、ＰｌｙＳｓ２の配列に対して変化を施し、例を含めた本明細書で記載および例示されているアッセイおよび方法を用いて、配列の変化を有する変異体または改変体を調べることができる。当業者は、本明細書のリシン（複数可）のドメイン構造に基づき、置換または置きかえに適する１もしくは複数のアミノ酸、１もしくはいくつかのアミノ酸、および／または合理的な保存的置換もしくは非保存的置換を含めた置換または置きかえに適さない１もしくは複数のアミノ酸を予測することができる。
【００８８】
この点で、例示的にＰｌｙＳｓ２リシンを参照すると、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチドリシンは、様々なクラスのプロファージ溶菌酵素を表すが、このリシンは、図４に示されるＮ末端のＣＨＡＰドメイン（システイン−ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）およびＣ末端のＳＨ３−５型ドメインを含むことが指摘される。これらのドメインは、アミノ酸配列の異なる影を付したカラー領域内に示され、ＣＨＡＰドメインは、ＬＮＮ・・・で始まる第１の影を付したアミノ酸配列領域に対応し、ＳＨ３−５型ドメインは、ＲＳＹ・・・で始まる第２の影を付した領域に対応する。ＣＨＡＰドメインは、複数の既に特徴付けされた連鎖球菌およびブドウ球菌のファージリシンに包含される。したがって、当業者は、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインおよび／またはＳＨ−３ドメインに対する置換または置きかえを合理的に施し、これらについて調べることができる。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに照らした配列比較を、ＣＨＡＰおよび／またはＳＨ−３ドメイン配列の一方または両方について行うこともでき、これをＰｌｙＳｓ２リシンの全長アミノ酸配列について行い、例えば、置換のためのアミノ酸を同定することもできる。図３０では、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインを、十分に特徴付けされた連鎖球菌のＰｌｙＣリシンのＣＨＡＰドメインと共に整列させることから、保存的な触媒残基が顕示されているが、全体としては中等レベルの同一性（２８％の配列同一性）が顕示されるにとどまる。図３０では、ＣＨＡＰドメインにおける保存的なシステインおよびヒスチジンのアミノ酸配列を矢印で示す。例えば、活性または能力を維持するように、保存的なシステイン残基およびヒスチジン残基が、ＰｌｙＳｓ２の変異体または改変体において、維持されると予測することは合理的である。図４および配列番号３のＰｌｙＳｓ２配列中のアミノ酸１９位のバリンにおいて、バリンをアラニンに置きかえている変異体または改変体が、図４および配列番号３のリシンと同様の様式で活性であり、グラム陽性細菌を死滅させることが可能であり、かつ、これらと同程度に有効であることは注目に値する。
【００８９】
以下は、アミノ酸の多様な群分けの一例である：
非極性のＲ基を伴うアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性のＲ基を伴うアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性のＲ基を伴うアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）  。
【００９０】
別の群分けは、フェニル基を伴うアミノ酸でありうる：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン  。
【００９１】
別の群分けは、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）による：
【００９２】
【化２】
2019022504.tif 000003
特に、好ましい置換は、
・正の電荷を維持しうるようなＡｒｇのＬｙｓへの置換であって、この逆も成り立つ置換；
・負の電荷を維持しうるようなＡｓｐのＧｌｕへの置換であって、この逆も成り立つ置換；
・遊離−ＯＨを維持しうるようなＴｈｒのＳｅｒへの置換；および
・遊離ＮＨ２を維持しうるようなＡｓｎのＧｌｎへの置換である。
【００９３】
例示的で好ましい保存的アミノ酸置換は、グルタミン酸（Ｅ）のグルタミン（Ｑ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；バリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；グルタミン（Ｑ）のリシン（Ｋ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；グルタミン酸（Ｅ）のリシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；セリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；イソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）への置換であって、この逆も成り立つ置換；アルギニン（Ｒ）のリシン（Ｋ）への置換であって、この逆も成り立つ置換のうちのいずれかを包含する。
【００９４】
アミノ酸置換はまた、特に、好ましい特性を伴うアミノ酸を置換するためにも導入することができる。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在性部位として導入することができる。Ｈｉｓは、特に、「触媒」部位（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用する可能性があり、生化学的触媒において最も一般的なアミノ酸である）として導入することができる。Ｐｒｏは、タンパク質構造においてβ−ターンを誘導する、その特に平面的な構造のために導入することができる。
【００９５】
本明細書で記載されるポリペプチドまたはエピトープは、抗体を生成させるのに用いることができ、また、リシンまたはリシンタンパク質を認識する分子への結合を検出するのにも用いることができる。別の実施形態は、通常の免疫化またはファージディスプレイ法などによるエピトープの使用であって、エピトープを用いて潜在的な結合剤のライブラリーをスクリーニングしうる使用を介して創出しうる抗体または他の特異的な結合剤などの分子である。このような分子は、リシンタンパク質の１もしくは複数のエピトープまたはリシンタンパク質をコードする核酸を認識する。エピトープを認識する抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ヒト化抗体の場合もあり、抗体タンパク質の部分の場合もある。エピトープを認識する分子は、そのエピトープに対して、その分子が血清アルブミンに対して示す結合の少なくとも１０倍強い特異的結合を示すことが所望される。特異的結合は、アフィニティー（Ｋｍ）として測定することができる。特異的結合は、同じ条件下における血清アルブミンに対する結合の少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８倍、なおまたはこれを超えて強いことがより所望される。
【００９６】
所望される実施形態では、抗体または抗体断片が、リシンタンパク質の存在を検出するか、または、代替的に、リシンタンパク質に対して感受性の細菌の存在を検出するのに有用な形態にある。さらなる実施形態では、抗体が、例えば、キメラタンパク質または融合タンパク質中の本発明のリシンポリペプチドに付着するか、またはこれと他の形で会合することが可能であり、リシンを、目的または標的の細菌細胞または株へと方向付けるのに用いられうる。代替的に、リシンポリペプチドは、抗体が、とりわけ、細菌上または細菌内の表面または表面下でそのエピトープに結合しうるように、例えば、細菌の細胞壁を完全にまたは部分的に溶解させるときに、抗体を方向付けるか、または抗体と共に作用するようにも用いられうる。例えば、本発明のリシンを抗連鎖球菌抗体に接合させ、この抗体をそのエピトープへと方向付けることができる。
【００９７】
当業者により察知される通り、抗体合成のための多様な形態および方法は公知である。抗体は、光学シグナルを創出する酵素であるＦｌｕｏｒ、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｐｈｏｒｅ、微小粒子、または放射性原子などのレポーター分子またはレポーター原子とコンジュゲートする（共有結合的に複合体化する）ことができる。抗体または抗体断片は、動物を免疫化した後でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて合成させることができ、例えば、抗体または抗体断片は、遺伝子組換え後に細胞培養を介して合成させることができる。抗体または抗体断片は、細胞合成と化学修飾との組合せにより調製することができる。
【００９８】
「抗体」とは、特異的エピトープに結合する、抗体およびその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及された抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記載されている。「抗体」という用語は、天然の場合であれ、部分的または完全に合成により作製される場合であれ、免疫グロブリンについて記載するものである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはこれと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も網羅する。この用語により、ＣＤＲ移植抗体もまた想定される。「抗体」とは、抗体および特異的エピトープに結合するその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及された抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記載されている。「抗体（複数可）」という用語は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つの全長ポリペプチド鎖を一般に含む野生型の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはその同等のＩｇ相同体（例えば、重鎖だけを含むラクダ科動物のナノボディー）を包含し、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する機能的な全長変異体、改変体、またはその誘導体も包含し、二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、多重特異性抗体、および二重可変ドメイン抗体も包含する；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）でありうる。「抗体」という用語の意味の中にはまた、任意の「抗体断片」も包含される。
【００９９】
「抗体断片」とは、（ｉ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン、および定常重鎖（ＣＨ１）ドメイン１からなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ（Ｆｄ）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる可変断片（Ｆｖ）、（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年））；（ｖｉ）ラクダ科動物の抗体；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが会合して、抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーにより連結された単鎖Ｆｖ断片（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年）；（ｉｘ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖において発現させた二価の二特異性抗体であるが、同じ鎖における２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用い、これにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創出したダイアボディー（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．  Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、（１９９３年））；ならびに（ｘ）相補性の軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む直鎖状抗体；（ｘｉ）多価抗体断片（ｓｃＦｖの二量体、三量体および／または四量体（ＰｏｗｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４２巻：１９３〜２０４頁（２０００年））；ならびに（ｘｉｉ）単独もしくは任意の組合せにおける、重鎖および／もしくは軽鎖の他の非全長部分、またはその変異体、改変体、もしくは誘導体を含めた、全長ではない、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【０１００】
抗体は、多数の方式で改変しうるので、「抗体」という用語は、要求される特異性を伴う結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を網羅するものとして理解されたい。したがって、この用語は、天然であれ、完全にまたは部分的に合成であれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物、および相同体を網羅する。したがって、別のポリペプチドへと融合させた免疫グロブリンの結合ドメイン、または同等物を含むキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびに米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号において記載されている。
【０１０１】
「抗体接合部位」とは、とりわけ、抗原に結合する軽鎖または重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【０１０２】
その多様な文法的形態において本明細書で用いられる「抗体分子」という語句は、無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の両方を想定する。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の部分であって、当技術分野ではＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として公知の部分を含めたパラトープを含有する部分であり、本明細書で記載される治療法において用いられることが好ましい部分である。
【０１０３】
その多様な文法的形態における「モノクローナル抗体」という語句は、特定の抗原と免疫反応することが可能な、唯一の種類の抗原接合部位を有する抗体を指す。したがって、モノクローナル抗体は、それが免疫反応する任意の抗原に対する単一の結合アフィニティーを提示することが典型的である。したがって、モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対して免疫特異的な複数の抗原接合部位を有する抗体分子、例えば、二特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含有しうる。
【０１０４】
「特異的」という用語は、特異的結合対のうちの一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子への結合を著明には示さない状況を指すのに用いることができる。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により保有される特定のエピトープに特異的である場合であって、抗原結合ドメインを保有する特異的結合メンバーが、このエピトープを保有する多様な抗原に結合しうる場合にも適用可能である。
【０１０５】
「〜を含む」という用語は一般に「〜を包含する」の意味で用いられ、すなわち１または複数の特徴または成分の存在を許容する。
【０１０６】
「〜から本質的になる」という用語は、大型の産物へと共有結合的に接合されない規定された数の残基の産物、特に、ペプチド配列を指す。しかし、本明細書における本発明のペプチドの場合、当業者は、末端の、保護基などを付加する化学的修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化など、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する微細な修飾が想定されうることを察知するであろう。
【０１０７】
「単離された」という用語は、本発明のリシンポリペプチド（複数可）、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸が、本発明に従う状態を指す。ポリペプチドおよび核酸は、それらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施される組換えＤＮＡ法を介する場合、それらが調製される環境（例えば、細胞培養物）において共に見出される他のポリペプチドまたは核酸など、それらが自然に会合する物質を含まないかまたは実質的に含まない。ポリペプチドおよび核酸は、希釈剤または補助剤と調合し、やはり、実際的な目的のために、単離することができる（例えば、ポリペプチドは通常、ポリマーもしくは粘膜接着剤または他の担体と混合するか、または診断もしくは治療において用いられる場合は、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合する）。
【０１０８】
核酸
本明細書では、本発明のＳ．ｓｕｉｓリシンポリペプチド（複数可）をコードすることが可能な核酸が提供され、本発明の態様を構成する。この文脈において代表的な核酸配列は、図３および４のうちのいずれかのポリペプチド、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のポリペプチド、ならびにストリンジェントな条件下で図３または４のＤＮＡ配列（複数可）の相補的な配列とハイブリダイズする配列をコードするポリヌクレオチド配列である。また、得ることが可能な天然の改変体を含め、これらの配列およびこれらの図中に示されている核酸配列とハイブリダイズする核酸配列のさらなる改変体も、本開示による溶菌酵素を作製するための使用に想定される。ファージ関連溶菌酵素をコードする多種多様な単離核酸配列または単離ｃＤＮＡ配列、およびこのような遺伝子配列とハイブリダイズする部分的な配列は、本発明のリシン酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）を組換えにより作製するために有用である。
【０１０９】
「レプリコン」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する任意の遺伝子エレメント、すなわち、それ自身の制御下で複製が可能な任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【０１１０】
「ベクター」とは、付着したセグメントの複製をもたらすように、プラスミド、ファージ、またはコスミドなど、別のＤＮＡセグメントを付着させうるレプリコンである。
【０１１１】
「ＤＮＡ分子」とは、その一本鎖形態または二本鎖へリックスにおけるポリマー形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）を指す。この用語は、ＤＮＡ分子の一次構造および二次構造だけを指し、これを任意の特定の三次形態へと限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。本明細書では、特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じるとき、配列を、転写されていないＤＮＡ鎖に沿って、５’〜３’方向の配列（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）だけを与える通常の慣例により記載することができる。
【０１１２】
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【０１１３】
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて転写されて、ポリペプチドへと翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン、および３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびまた、合成ＤＮＡ配列が含まれうるがこれらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列に対して３’側に位置する。
【０１１４】
転写制御配列および翻訳制御配列とは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど、宿主細胞内のコード配列の発現をもたらすＤＮＡ調節配列である。
【０１１５】
「プロモーター配列」とは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡの調節領域である。本発明を規定する目的では、プロモーター配列が、転写開始部位によりその３’末端で境界づけられ、上流（５’方向）に及び、バックグラウンドを上回って検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを包含する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより規定するのが好都合である）のほか、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。真核生物のプロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多いであろうが、常にそうであるわけではない。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含有する。
【０１１６】
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡへと転写し、次いで、これがコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されるとき、細胞内の転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【０１１７】
「シグナル配列」は、コード配列の前に包含されうる。この配列は、ポリペプチドに対してＮ末端側のシグナルペプチドであって、このポリペプチドを細胞表面へと方向付けるか、またはこのポリペプチドを培地へと分泌するように宿主細胞とコミュニケーションするシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドが宿主細胞により切り離されると、タンパク質が細胞から放出される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然の多様なタンパク質と会合して見出されうる。
【０１１８】
本発明のプローブに言及して本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確なサイズは、多くの因子に依存するであろうし、これらの因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。
【０１１９】
本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、精製された制限消化物におけるように天然に存在する場合であれ、合成により作製される場合であれ、ある核酸鎖と相補的なプライマーによる伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、適切な温度およびｐＨにおいて、合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分な程度に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および用いられる方法を含めた多くの因子に依存するであろう。例えば、診断的適用のためには、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜２５以上のヌクレオチドを含有することが典型的であるが、少数のヌクレオチドを含有する場合もある。
【０１２０】
本明細書では、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖と「実質的に」相補的となるようにプライマーを選択する。これは、プライマーが、それらの各々の鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列が、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片を、プライマーの５’端へ、プライマー配列の残りが鎖と相補的な状態で付着することができる。代替的に、プライマー配列が、鎖の配列との、これとハイブリダイズするのに十分な相補性を有することを前提とすれば、非相補的な塩基または長い配列をプライマー内に散在させ、これにより、伸長産物を合成するための鋳型を形成することもできる。
【０１２１】
本明細書で用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それらの各々が、特異的ヌクレオチド配列において、またはこの近傍で、二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
【０１２２】
外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを細胞内に導入した場合、この細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡへ組み込まれる（共有結合的に連結される）場合もあり、そうでない場合もある。原核細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡが、プラスミドなどのエピソームエレメントにおいて維持される場合もある。真核細胞に関して述べると、安定的に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが、染色体の複製を介して娘細胞により受け継がれるように、これが染色体へと組み込まれた細胞である。この安定性は、真核生物の細胞が、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系またはクローンを樹立する能力により裏付けられる。「クローン」とは、有糸分裂を介して単一の細胞または共通の祖先から派生する細胞集団である。「細胞系」とは、幾世代にもわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける安定的な増殖が可能な初代細胞のクローンである。
【０１２３】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドのうちの少なくとも約７５％（好ましくは、少なくとも約８０％であり、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％である）が、規定される長さのＤＮＡ配列にわたりマッチするとき、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより同定することもでき、例えば、その特定の系について規定されるストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験により同定することもできる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当技術分野の範囲内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩおよびＩＩ巻、前出；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、前出を参照されたい。
【０１２４】
本明細書で想定される改変体ＤＮＡ分子の多くは、Ｍ１３プライマーによる変異誘発など、標準的なＤＮＡ変異誘発法により創出される改変体ＤＮＡ分子を包含する。これらの技法の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）において提示されている。このような技法を用いることにより、開示される改変体とは微細な形で異なる改変体を創出することができる。本開示では、リシンポリペプチド（複数可）の機能的特徴を保有するタンパク質をやはりコードしながらも、とりわけ、本明細書で開示されるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列の誘導体であり、開示されるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列とは、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換により異なるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が想定される。また、開示されるＤＮＡ分子に由来する小型のＤＮＡ分子も包含される。このような小型のＤＮＡ分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとしての使用に適するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの小型のＤＮＡ分子はそれら自体、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのバクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素のうちの少なくとも１つのセグメントを含み、ＰＣＲの目的では、遺伝子のうちの少なくとも１０〜１５ヌクレオチドの配列を含み、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチドの配列を含むであろう。また、上記の通りに開示されるＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列も、ストリンジェントな条件下で開示されるＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列またはその断片として規定することができる。
【０１２５】
特定のストリンジェンシーの程度に対応するハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質、ならびに用いられるハイブリダイズ用ＤＮＡの組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーション緩衝液のハイブリダイゼーション温度およびイオン強度（とりわけ、ナトリウムイオン濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。特定のストリンジェンシーの程度を達成するのに要求されるハイブリダイゼーション条件についての計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、９および１１章（参照により本明細書に組み込まれる）により論じられている。
【０１２６】
このような計算の例は、以下の通りである。ハイブリダイゼーション実験は、ＤＮＡ分子（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージにより遺伝的にコードされる溶菌酵素の天然の変異）の、標的のＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションにより実施することができる。標的のＤＮＡとは、例えば、アガロースゲル内で電気泳動させ、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている技法であるサザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、９８巻：５０３頁）によりニトロセルロース膜へと転写した、対応するｃＤＮＡでありうる。同位体Ｐ３２標識ｄＣＴＰで標識した標的プローブとのハイブリダイゼーションを、融解温度であるＴｍ（以下で記載される）を摂氏２０〜２５度下回る温度での６倍濃度ＳＳＣなど、イオン強度の大きな溶液中で実行する。サザンブロット上における標的のＤＮＡ分子が１０ｎｇ以上のＤＮＡを含有するようなサザンハイブリダイゼーション実験では、ハイブリダイゼーションを、１〜２ｎｇ／ｍｌの放射性標識したプローブ（比放射能が１０９ＣＰＭ／ｍｕｇ以上である）を用いて、６〜８時間にわたり実行する。ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを保持しながらバックグラウンドハイブリダイゼーションを除去するため、可能な限りストリンジェントなものとする。「Ｔｍ」という用語は、それを上回ったイオンが優勢な条件下では、放射性標識したプローブ分子が、その標的のＤＮＡ分子とハイブリダイズしない温度を表す。このようなハイブリッド分子のＴｍは、以下の式：Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ナトリウムイオン濃度のｌｏｇ１０）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−０．６３（ホルムアミドの％）−（６００／ｌ）［式中、ｌ＝塩基対内のハイブリッドの長さ］から推定することができる。この式は、０．０１Ｍ〜０．４Ｍの範囲にあるナトリウムイオン濃度については有効であり、ナトリウムイオン濃度が大きな溶液中におけるＴｍを計算するにはそれほど正確でない（ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、４８巻：１３９０頁）（参照により本明細書に組み込まれる）。この式はまた、Ｇ＋Ｃ含量が３０％〜７５％以内であるＤＮＡについても有効であり、また、１００ヌクレオチドを超える長さのハイブリッドにも適用される。オリゴヌクレオチドプローブの挙動は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（参照により本明細書に組み込まれる）の１１章において詳細に記載されている。この文献において記載されている好ましい例示的な条件は、特に、溶菌遺伝子の変異を選択するのに用いることが想定される。
【０１２７】
本開示の好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件を、その下では配列の変異が２５％を超えるＤＮＡ分子（また、「ミスマッチ」とも称する）はハイブリダイズしない条件として定義することができる。より好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが１５％を超えるＤＮＡ分子はハイブリダイズしない条件であり、なおより好ましくは、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが１０％を超えるＤＮＡ配列はハイブリダイズしない条件である。好ましくは、ストリンジェントな条件が、その下ではミスマッチが６％を超えるＤＮＡ配列はハイブリダイズしない条件である。
【０１２８】
遺伝コードの縮重は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列における大きな変異を可能とするので、実施形態の範囲をさらに広げる。例えば、代表的なアミノ酸残基は、アラニンである。ｃＤＮＡにおいて、アラニンは、ヌクレオチドのコドントリプレットであるＧＣＴによりコードされうる。遺伝コードの縮重のために、他の３つのヌクレオチドのコドントリプレット（ＧＣＴ、ＧＣＣ、およびＧＣＡ）もまた、アラニンをコードする。したがって、遺伝子のヌクレオチド配列を、この位置において、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはこのタンパク質の特徴に影響を及ぼさずに、これらの３つのコドンのうちのいずれかへと変化させうるであろう。当業者には、特定のアミノ酸についての遺伝コードおよびヌクレオチドコドンの変異が周知である。遺伝コードの縮重に基づき、上記の通りの標準的なＤＮＡ変異誘発法を用いて、またはＤＮＡ配列の合成により、改変体のＤＮＡ分子を、本明細書で開示されるｃＤＮＡ分子から派生させることができる。本開示では、遺伝コードの縮重に基づく配列の変異により開示される、ｃＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下ではハイブリダイズしないＤＮＡ配列も、本明細書に包含する。
【０１２９】
したがって、その配列が、図３もしくは４、または配列番号１、２、もしくは３に提示される同じアミノ酸配列を有するが、これらと縮重しているかまたは図３もしくは４に提示される例示的な核酸配列と縮重しているポリペプチドをコードするＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳｓ１を含め、本発明のリシンをコードするＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内にあることを察知されたい。「〜と縮重である」とは、異なる３文字コドンを用いて、特定のアミノ酸を指定することを意味する。当技術分野では、以下のコドンを互換的に用いて、各特定のアミノ酸をコードしうることが周知である。
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）  ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）  ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）  ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）  ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ）  ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ）  ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ）  ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）  ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ）  ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ）  ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）  ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）  ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）  ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ）  ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）  ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）  ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ）  ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）  ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ）  ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）  ＵＧＧ
終止コドン  ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）  。
【０１３０】
上記で指定されたコドンは、ＲＮＡ配列のためのコドンであることを理解されたい。対応するＤＮＡのためのコドンは、ＵがＴに置換されている。
【０１３１】
当業者は、本明細書で記載され、当技術分野でも公知のＤＮＡ変異誘発法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのバクテリオファージリシンをコードし、さらに、本明細書で記載および提供される溶菌ポリペプチドの本質的な特徴も維持する、多種多様なＤＮＡ分子を作製しうることを認識するであろう。以下でより完全に記載される通り、新たに派生させたタンパク質はまた、溶菌ポリペプチド（複数可）に特徴的な変異を得るためにも選択することができる。このような派生体には、微細な欠失、付加、および置換を含めた、アミノ酸配列における変異を伴う派生体が含まれる。
【０１３２】
アミノ酸配列の変異を導入するための部位は所定でありうるが、変異自体が所定である必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的のコドンまたは領域においてランダム変異誘発を施し、発現させたタンパク質の改変体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記の公知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位において置換変異を施すための技法が周知である。
【０１３３】
アミノ酸置換は、典型的に単一の残基の置換であるか、または１もしくは複数の、１もしくは少数の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの残基の置換であることが可能であり；挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基の程度であり；欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、単一の形態でありうるが、隣接する対、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入で施すことが好ましい。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せを組み合わせて最終構築物に達することができる。明らかに、タンパク質をコードするＤＮＡ中に施される変異は、配列をリーディングフレームの外側に位置付けてはならず、ｍＲＮＡの二次構造をもたらしうる相補的領域を創出しないことが好ましい（ＥＰ７５，４４４Ａ）。
【０１３４】
置換改変体とは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される改変体である。このような置換は、タンパク質の特徴に対して著明な影響を及ぼさないように施すこともでき、タンパク質の特徴を細かく調節することが所望である場合に施すこともできる。タンパク質中で元のアミノ酸を置換することが可能であり、保存的置換とみなされるアミノ酸は、上記のアミノ酸であり、当業者により認知されているアミノ酸であろう。
【０１３５】
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、それほど保存的ではない置換を選択することにより、例えば、以下を維持することに対するそれらの効果がいっそう著明に異なる残基を選択することにより施すことができる：（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートコンフォメーションもしくはへリックスコンフォメーションとしての構造；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖のバルク。タンパク質特性における最大の変化をもたらすことが一般に予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルで、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（またはこれらにより置換する）置換；（ｂ）システインもしくはプロリンで、他の任意の残基を置換する（またはこれらにより置換する）置換；（ｃ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ）で、陰電性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（またはこれらにより置換する）置換；または（ｄ）巨大側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンで、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンを置換する（またはこれらにより置換する）置換であろう。
【０１３６】
これらのアミノ酸の置換または欠失または付加の効果は、誘導体タンパク質または改変体タンパク質が、感受性細菌を溶解させるかもしくは死滅させる能力、または感染させた細菌宿主内のファージにより呈示されるＤＮＡ架橋剤に対する感受性を補完する能力を解析することにより、溶菌ポリペプチド（複数可）の誘導体または改変体について評価することができる。これらのアッセイは、誘導体タンパク質または改変体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、上記の細菌へとトランスフェクトすることにより実施することもでき、細菌を、誘導体タンパク質または改変体タンパク質をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた宿主から発現させたタンパク質と共にインキュベートすることにより実施することもできる。
【０１３７】
アミノ酸配列の変異を導入するための部位は所定でありうるが、変異自体が所定である必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的のコドンまたは領域においてランダム変異誘発を施し、発現させたタンパク質の改変体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記の公知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位において置換変異を施すための技法が周知である。
【０１３８】
本発明の別の特徴は、本明細書で開示されるＤＮＡ配列の発現である。当技術分野では周知の通り、ＤＮＡ配列は、それらを適切な発現ベクター内の発現制御配列へと作動可能に連結し、この発現ベクターを使用して、適切な単細胞宿主を形質転換することにより発現させることができる。本発明のＤＮＡ配列の、発現制御配列への、このような作動的連結は、既にＤＮＡ配列の一部ではなくても、当然ながら、ＤＮＡ配列の上流にある適正なリーディングフレーム内への開始コドンであるＡＴＧの提供を包含する。多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることが可能である。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、ならびに公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉプラスミドであるｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドなどの酵母プラスミドまたはその誘導体；昆虫細胞内または哺乳動物細胞内で有用なベクターなど、真核細胞内で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどが含まれる。
【０１３９】
多種多様な発現制御配列（それへと作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のうちのいずれかをこれらのベクターにおいて用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、またはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの大型のオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母接合因子のプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの多様な組合せが含まれる。
【０１４０】
また、多種多様な単細胞の宿主細胞も本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主は、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の株、酵母などの真菌、および組織培養物中のＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、およびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、およびヒト細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞など、周知の真核生物宿主および原核生物宿主を包含しうる。
【０１４１】
全てのベクター、発現制御配列、および宿主が、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに同等に良好に機能するわけではないことが理解されるであろう。また、全ての宿主が、同じ発現系で同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するのに不要な実験なしに、適正なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することが可能である。
【０１４２】
ポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを用いて、改変体のスクリーニングおよびその後の選択のための多様化させたポリペプチド集団を発生させることができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、目的の二本鎖のＰＣＲ用コード配列の断片を、ニッキングが分子１個当たり約１回だけ生じる条件下において、ヌクレアーゼで処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を包含しうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処置を介して改質された二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として得られる断片ライブラリーを発現ベクターへとライゲーションすることにより発生させることができる。この方法により、多様なサイズの目的のタンパク質のＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを導出することができる。
【０１４３】
当技術分野では、点変異または切断により作製される組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための複数の技法が公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技法であって、ハイスループット解析に適する技法は、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングするステップと、適切な細胞を、結果として得られるベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で、組合せ遺伝子を発現させるステップとを包含することが典型的である。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を増大させる技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、タンパク質の改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。
【０１４４】
組成物
本発明によれば、本発明の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物または医薬組成物のほか、関連する使用法および製造法も提供される。治療用組成物または医薬組成物は、１または複数の溶菌ポリペプチドを含むことが可能であり、場合によって、天然溶菌酵素、切断型溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、またはシャフリングされた溶菌酵素を、場合によって、担体、ビヒクル、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ホリンタンパク質（複数可）、１もしくは複数の抗生物質、または適切な賦形剤、担体、もしくはビヒクルなど、他の成分と組み合わせて包含しうる。本発明は、細菌感染または関連する状態を含めたグラム陽性細菌の死滅、緩和、コロニー除去、予防、または処置において用いられるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１（特に、ΔＰｌｙＳｓ１）を含めた本発明のリシンによる治療用組成物または医薬組成物を提供する。本発明は、特に、皮膚などの外表面のまたはそれを介する汚染または感染を含めた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを含めたグラム陽性細菌による汚染および／または感染を処置、軽減、またはコントロールするのに用いられるＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１（特に、ΔＰｌｙＳｓ１）を含めた、本発明のリシンによる治療用組成物または医薬組成物を提供する。これにより、局所適用または皮膚適用および皮膚または他の外表面を含めた外部への一般的な投与のための組成物が想定および提供される。本明細書では、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよび抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属による細菌感染または関連する状態を含めた、グラム陽性細菌の死滅、緩和、コロニー除去、予防、または処置において用いられる、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２リシンまたはＰｌｙＳｓ１リシンを含む組成物が提供される。
【０１４５】
治療用組成物中に包含される酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、未改変ファージ関連溶菌酵素（複数可）、切断型溶菌ポリペプチド、改変体溶菌ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラ溶菌酵素および／またはシャフリングされた溶菌酵素のうちの１もしくは複数またはこれらの任意の組合せでありうる。加えて、異なるファージにより遺伝的にコードされる異なる溶菌ポリペプチド（複数可）を、同じ細菌を処置するのに用いることもできる。これらの溶菌酵素はまた、「未改変」溶菌酵素または溶菌ポリペプチド、切断型溶菌ポリペプチド（複数可）、改変体溶菌ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラ溶菌酵素およびシャフリングされた溶菌酵素の任意の組合せでもありうる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属を含めたグラム陽性細菌のための治療用組成物中または医薬組成物中の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、単独で用いることもでき、標的とされる他の細菌に特異的な他のファージ関連溶菌酵素と組み合わせて処置される他の侵襲性細菌生物が存在する場合は、抗生物質と組み合わせて用いることもできる。溶菌酵素、切断型酵素、改変体酵素、キメラ酵素、および／またはシャフリングされた溶菌酵素は、ホリンタンパク質と共に用いることができる。また、ホリンタンパク質の量も変化させることができる。場合によって、多様な抗生物質を、酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）と共に、かつ、リソスタフィンの存在を伴うかまたは伴わずに治療用組成物中に組み入れることもできる。複数の溶菌酵素または溶菌ポリペプチドを、治療用組成物中に組み入れることができる。
【０１４６】
医薬組成物はまた、化学的合成法またはＤＮＡ組換え法により作製されるそのアイソザイム、類似体、または改変体を含めた、１または複数の改変溶菌酵素も包含しうる。特に、改変溶菌タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、切断、キメラ化、シャフリング、またはこれらの組合せにより作製することができる。医薬組成物は、１または複数の天然の溶菌タンパク質と、１または複数の切断型溶菌タンパク質、改変体溶菌タンパク質、キメラ溶菌タンパク質、またはシャフリングされた溶菌タンパク質との組合せを含有しうる。医薬組成物はまた、１または複数の補完的薬剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤の任意選択の添加を伴う、同じ細菌種または異なる細菌種に由来する少なくとも１つの溶菌タンパク質のペプチド、またはペプチド断片も含有しうる。
【０１４７】
本発明は、殺菌活性を有するＰｌｙＳｓリシンポリペプチド改変体を含む細菌のリシンを提供する。本発明は、唯一の触媒ドメインまたは酵素ドメインを含有し、グラム陽性抗菌活性を保持するＰｌｙＳｓリシンの切断型変異体に関する。本発明は、例えば、予測されるアラニン−アミダーゼドメインおよび予測されるグルコサミニダーゼドメインから選択される唯一のドメインを含有する例示的なＰｌｙＳｓリシンの切断型変異体に関する。ＰＬｙＳＳ１の切断型変異体では、切断型リシンが、Ｎ末端の酵素ドメインおよび細胞壁結合ドメインを含み、含有するように、例えば、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインを欠失させる。ΔＰｌｙＳＳ１切断型がＮ末端の２５４アミノ酸を有するのに対し、全長ＰｌｙＳｓ１リシンは４５２アミノ酸を有する。したがって、本発明は、本明細書で提示され、裏付けられる通り、唯一の触媒ドメインを含有し、Ｓ．ｓｕｉｓおよび他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のほか、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、および他の細菌を含めた他の多数の菌株に対する死滅活性を保持する切断型変異体である、Ｓ  ｓｕｉｓのリシン変異体、特に、ＰｌｙＳｓ１リシンの変異体を提供する。本明細書では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓを含めたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細胞に対して、全長ＰｌｙＳｓ１リシンタンパク質を含めた全長ＰｌｙＳｓリシンタンパク質と比較して同等であるかまたはこれを超える死滅活性を有するＰｌｙＳＳ１変異体リシンを含めたＰｌｙＳｓ変異体リシンであって、ａ）ＰｌｙＳｓ変異体が、エンドペプチダーゼドメインおよびグルコサミニダーゼドメインからなる群から選択される唯一の触媒ドメインを含有する切断型変異体リシンである修飾；ｂ）ＰｌｙＳｓ変異体が、Ｃ末端の酵素ドメインを伴わない切断型変異体リシンである修飾；ｃ）ＰｌｙＳｓ変異体が、単一の触媒ドメインおよび細胞壁結合ドメインを有する修飾；ならびにｄ）ＰｌｙＳｓ変異体が、配列番号２または１もしくは複数の保存的置換を有するその改変体アミノ酸に対応する修飾からなる群から選択される修飾を伴う、配列番号１のアミノ酸配列によるポリペプチド改変体を有するＰｌｙＳｓ変異体リシンを含む組成物が提供される。
【０１４８】
治療用組成物はまた、ホリンタンパク質も含みうる。ホリンタンパク質（または「ホリン」）とは、細胞膜に小孔をもたらすタンパク質である。ホリンタンパク質は、細菌における細胞呼吸を停止させる致死性の膜病変を形成しうる。溶菌タンパク質と同様に、ホリンタンパク質は、ファージによりコードされ、保有される。実際に、ホリンタンパク質の遺伝コードが、ファージ溶菌タンパク質のコードに隣接するか、なおまたはこのコード内に存在することは極めて一般的である。大半のホリンタンパク質配列は短く、全体としては疎水性の性状であるが、高度に親水性のカルボキシ末端ドメインを伴う。多くの場合には、推定ホリンタンパク質が、ファージの酵素的活性ドメイン内の異なるリーディングフレームにおいてコードされる。他の場合には、ホリンタンパク質が、細胞壁の溶菌タンパク質をコードするＤＮＡに隣接または近接するＤＮＡにおいてコードされる。ホリンタンパク質は、ファージ感染の後期において高頻度で合成され、それらが膜病変を引き起こす細胞質膜において見出される。ホリンは、一次構造の解析に基づき、２つの一般的なクラスへと群分けすることができる。クラスＩのホリンは、通常は９５残基以上の長さであり、３つの潜在的な膜貫通ドメインを有しうる。クラスＩＩのホリンは、通常は小型で、約６５〜９５残基であり、荷電しかつ疎水性の残基の分布は、２つのＴＭドメインを示す（Ｙｏｕｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、８巻、４号、２０００年３月）。しかし、少なくとも、グラム陽性宿主のファージにとって、二成分の溶菌系は普遍的ではない。複数のファージについて、ホリンの存在が示されているかまたは示唆されているが、全てのファージについて、推定ホリンをコードする遺伝子が既に見出されているわけではない。ホリンは、例えば、乳酸球菌のバクテリオファージであるＴｕｃ２００９、乳酸球菌のＮＬＣ３、肺炎球菌のバクテリオファージであるＥＪ−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉのバクテリオファージであるＮａｄｈ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバクテリオファージであるＴｗｏｒｔ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのバクテリオファージ、肺炎球菌のファージであるＣｐ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓファージであるＭ２９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｋｉのバクテリオファージであるＬＬ−Ｈリシン、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバクテリオファージであるＮ  １１を含めた、複数の細菌において存在することが示されている（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９９年８月、４４５２〜４４６０頁）。
【０１４９】
例えば、ホリンタンパク質は、溶菌酵素と共に用いて、細菌を死滅させる速度および効率を加速化させることができる。ホリンタンパク質はまた、キメラ酵素および／またはシャフリングされた酵素の形態にある可能性もある。一部の実施形態によれば、ホリンタンパク質はまた、細菌感染を処置するのに単独で用いることもできる。
【０１５０】
医薬組成物は、１または複数の抗微生物剤および／または１または複数の従来の抗生物質を含めた補完的薬剤を含有しうる。感染の処置を加速化させるために、治療剤は、また、溶菌酵素の殺菌活性も強化しうる、少なくとも１つの補完的薬剤をさらに包含しうる。抗微生物剤は主に、タンパク質およびＤＮＡの合成を含め、細胞壁の合成の阻害、細胞膜の機能の阻害、および／または代謝機能の阻害を介して、細菌細胞の構造または機能に干渉することにより作用する。抗生物質は、細胞壁のペプチドグリカンの生合成に影響を及ぼす抗生物質と、グラム陽性細菌におけるＤＮＡまたはタンパク質の合成に影響を及ぼす抗生物質とに広く細分することができる。ペニシリンおよびペニシリンと同様の抗生物質を含めた細胞壁合成阻害剤は、比較的支持の弱い細胞が膨潤し、最終的には破壊されるように、外側の硬質な細胞壁を破壊する。細胞壁のペプチドグリカンの生合成に影響を及ぼす抗生物質には、Ｎ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）のペプチドサブユニットの、ペプチドグリカンマトリックスへの組込みを防止することによりペプチドグリカンの合成を阻害する糖ペプチドが含まれる。入手可能な糖ペプチドには、バンコマイシンおよびテイコプラニン、ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することにより作用するペニシリンが含まれる。ペニシリンの官能基であるβ−ラクタム部分は、細菌中のペプチドグリカン分子を連結するＤＤ−トランスペプチダーゼに結合し、これを阻害する。加水分解酵素は、細胞壁を持続的に分解し、浸透圧に起因する細胞溶解または細胞死滅を引き起こす。一般的なペニシリンには、オキサシリン、アンピシリン、およびクロキサシリン；ならびに形質膜の外側におけるペプチドグリカンの構成要素を保有する分子であるＣ５５−イソプレニルピロリン酸の脱リン酸化に干渉するポリペプチドが含まれる。細胞壁に影響を及ぼすポリペプチドは、バシトラシンである。
【０１５１】
補完的薬剤は、溶菌酵素の治療的効果を相乗作用的に増強するのに有効な量におけるエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロリドファミリーの他のメンバー、ペニシリン、セファロスポリン、およびこれらの任意の組合せなどの抗生物質でありうる。他の事実上任意の抗生物質も、改変溶菌酵素および／または未改変溶菌酵素と共に用いることができる。同様に、他の溶菌酵素を、担体中に含ませて、他の細菌感染を処置することもできる。抗生物質の追加補充は、異なる疾患を処置する場合の、酵素の事実上全ての使用において用いることができる。医薬組成物はまた、少なくとも１つの溶菌タンパク質のペプチドもしくはペプチド断片、１つのホリンタンパク質、または溶菌タンパク質およびホリンタンパク質の各々が同じ細菌種もしくは異なる細菌種に由来し、補完的薬剤および適切な担体もしくは希釈剤の任意選択の添加を伴う、少なくとも１つのホリンタンパク質および１つの溶菌タンパク質も含有しうる。
【０１５２】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、有効量の溶菌ポリペプチド（複数可）、または溶菌ポリペプチド（複数可）のペプチド断片を発現させることが可能な、単独の、または他の核酸分子と組み合わせた核酸分子を含有する組成物も提供される。また、これらの核酸分子、ポリヌクレオチド、およびこれらの分子を保有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させるベクターを含有する細胞培養物も提供される。
【０１５３】
治療用組成物または医薬組成物は、感受性のグラム陽性細菌により引き起こされる疾病を処置するための、多様な担体と組み合わされた溶菌ポリペプチド（複数可）を含みうる。担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質など、微量の添加剤を含有することが適切である。このような物質は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸、もしくはこれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えば、ポリアルギニンもしくはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、もしくはアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、もしくはデキストリンを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性の界面活性剤；および／または中性の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２などを包含する。グリセリンまたはグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）は、医薬用に市販されている。グリセリンまたはグリセロールは、注射用滅菌水中で希釈することもでき、塩化ナトリウム注射液中で希釈することもでき、他の薬学的に許容される水性注射用流体中で希釈することもでき、０．１〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．０〜５０％、より好ましくは約２０％の濃度で用いることができる。ＤＭＳＯとは、局所適用される多くの薬物の透過を増強する顕著な能力を伴う非プロトン性溶媒である。ＤＭＳＯは、注射用滅菌水中で希釈することもでき、塩化ナトリウム注射液中で希釈することもでき、他の薬学的に許容される水性注射用流体中で希釈することもでき、０．１〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で用いることができる。担体ビヒクルにはまた、特に、静脈内用溶液を調製する場合には、リンゲル液、緩衝化された溶液、およびデキストロース液も含まれうる。
【０１５４】
溶菌ポリペプチド（複数可）のための担体のうちのいずれも、従来の手段で製造することができる。しかし、いずれの口内洗浄液または類似する種類の製品も、ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）／酵素の変性を防止するため、アルコールを含有しないことが好ましい。同様に、製造工程において、溶菌ポリペプチド（複数可）を風邪用ドロップ（ｃｏｕｇｈ  ｄｒｏｐ）、ガム、キャンディー、またはロゼンジに配置する場合、このような配置は、ロゼンジまたはキャンディーが硬化する前に行うべきであるが、酵素の熱変性を回避するためには、風邪用ドロップまたはキャンディーをある程度冷却した後で行うべきである。
【０１５５】
溶菌ポリペプチド（複数可）は、液体形態または凍結乾燥状態にあるこれらの物質へと添加することができ、凍結乾燥状態の場合、溶菌ポリペプチド（複数可）は、唾液などの体液と接触するときに可溶化しうるであろう。ポリペプチド（複数可）／酵素はまた、ミセル中またはリポソーム中に入れることもできる。
【０１５６】
改変溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）または未改変溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の、感染を処置するのに有効な投与速度または投与量は、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）が治療的に用いられるのか、予防的に用いられるのか、レシピエントの感染性細菌への曝露の持続期間、個体のサイズおよび体重などに部分的に依存するであろう。酵素／ポリペプチド（複数可）を含有する組成物を使用するための持続期間はまた、この使用が予防的目的の使用であって、短期間にわたり１時間ごと、毎日、または毎週の使用であるのかどうか、またはこの使用が治療的目的の使用であって、使用量が、数時間、数日間、数週間にわたり、かつ／もしくは毎日のベースで、または１日のうちの一定の時間間隔で持久しうるように、組成物の使用についてのより集約的なレジメンが必要とされうる使用であるのかどうかにも依存する。使用される任意の剤形は、最小限の時間の長さにわたる、最小限の単位数をもたらすものとする。酵素の有効量または有効用量をもたらすと考えられる酵素の活性単位の濃度は、鼻腔および口腔の湿潤環境内または湿った環境内の体液１ｍｌ当たり約１００単位〜約５００，０００単位の範囲であることが可能であり、おそらく、１ｍｌ当たり約１００単位〜約５０，０００単位の範囲でありうる。より具体的に述べると、活性酵素単位／ポリペプチド（複数可）単位への曝露時間は、１ｍｌ当たりの活性酵素単位の所望の濃度に影響を及ぼしうる。「長時間」放出担体または「緩徐」放出担体として分類される担体（例えば、特定の鼻腔内スプレーまたはロゼンジなど）であれば、１ｍｌ当たりで低濃度の活性（酵素）単位を、しかし、より長時間にわたり保有するかまたはもたらすことが可能であるのに対し、「短時間」放出担体または「急速」放出担体（例えば、含そう薬など）であれば、１ｍｌ当たりで高濃度の活性（酵素）単位を、しかし、より短時間にわたり保有するかまたはもたらすことが可能であろう。１ｍｌ当たりの活性単位量および曝露の持続時間は、感染の性質、処置が予防的であるのか、治療的であるのか、および他の変数に依存する。用量１ｍｌ当たりではるかに高値の単位を有することが必要でありうるか、または用量１ｍｌ当たりではるかに低値の単位を有することが必要でありうる状況が存在する。
【０１５７】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）は、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の活性を可能とするｐＨを有する環境にあるべきである。例えば、あるヒト個体が、細菌性上気道障害を伴う別のヒトへと曝露されている場合、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）が粘膜内層中に常在し、感染細菌の任意のコロニーの形成を防止するであろう。改変溶菌酵素を担体系または経口送達方式へと投入する時点より前において、またはこの時点において、酵素は、約４．０〜約９．０の間、より好ましくは約５．５〜約７．５の間のｐＨ範囲を維持するために、安定化緩衝液環境内にあることが好ましい。
【０１５８】
安定化緩衝液は、リシン酵素／ポリペプチド（複数可）の最適な活性を可能としうる。安定化緩衝液は、ジチオトレイトールなどの還元剤を含有しうる。安定化緩衝液はまた、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩など、金属キレート化剤であるかまたは金属キレート化剤を包含する場合もあり、また、リン酸緩衝液もしくはクエン酸リン酸緩衝液、または他の任意の緩衝液を含有する場合もある。これらのファージおよび他のファージのＤＮＡコード化を改変して、組換え酵素が、１つの細胞壁を、２つを超える場所で攻撃することを可能とするか、組換え酵素が複数の細菌種の細胞壁を切断することを可能とするか、組換え酵素が他の細菌を攻撃することを可能とするか、またはこれらの任意の組合せを可能とすることができる。組換えバクテリオファージにより産生される酵素に対する改変の種類および数は、無数である。
【０１５９】
低刺激性の界面活性剤を、治療用組成物または医薬組成物に、この組成物において用いられる溶菌酵素の／ポリペプチド（複数可）の治療的効果を強化するのに有効な量で含めることができる。適切な低刺激性の界面活性剤には、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタンおよび脂肪酸のエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、および生体由来の界面活性剤、例えば、脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコール酸、およびデオキシコール酸のエステルが含まれる。
【０１６０】
本発明ではまた、防腐剤も用いることができ、全組成物の重量で約０．０５％〜０．５％を構成することが好ましい。防腐剤の使用は、製品が微生物で汚染された場合、処方物により微生物の増殖を防止または減殺することを確保するであろう。本発明において有用な一部の防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭ  ヒダントイン、３−ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１６１】
本発明の全ての実施形態において用いられる医薬には、抗微生物剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、局所麻酔剤、コルチコステロイド、破壊療法剤（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇｅｎｔ）、抗真菌剤、および抗アンドロゲン剤が含まれる。にきびの処置において用いられうる活性医薬には、抗微生物剤、とりわけ、ダプソン、エリスロマイシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、および他の抗微生物剤など、抗炎症特性を有する抗微生物剤が含まれる。抗微生物剤に好ましい重量百分率は、０．５％〜１０％である。
【０１６２】
局所麻酔剤には、テトラカイン、テトラカイン塩酸塩、リドカイン、リドカイン塩酸塩、ジクロニン、ジクロニン塩酸塩、ジメチソキン塩酸塩、ジブカイン、ジブカイン塩酸塩、ブタンベンピクリン酸塩、およびプラモキシン塩酸塩が含まれる。局所麻酔剤に好ましい濃度は、全組成物の重量で約０．０２５％〜５％である。また、ベンゾカインなどの麻酔剤も、重量で約２％〜２５％の好ましい濃度により用いることができる。
【０１６３】
用いられうるコルチコステロイドには、ベタメタゾンジプロピオン酸塩、フルオシノロンアクチニド、ベタメタゾン吉草酸塩、トリアムシノロンアクチニド、クロベタゾールプロピオン酸塩、デソキシメタゾン、ジフロラゾン二酢酸塩、アムシノニド、フルランドレノリド、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、ヒドロコルチゾン酪酸塩およびデソニドが含まれ、重量で約０．０１％〜１．０％の濃度が推奨される。ヒドロコルチゾンまたはメチルプレドニゾロン酢酸塩など、コルチコステロイドに好ましい濃度は、重量で約０．２％〜約５．０％である。
【０１６４】
加えて、治療用組成物は、感受性のグラム陽性細菌と共に存在する任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌を処置するための酵素であるリソスタフィンなど、他の酵素もさらに含みうる。リソスタフィンなどの粘液溶解性ペプチドは、ヒトのＳ．  ａｕｒｅｕｓ感染を処置するのに有効であることが示唆されている（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  ＆  Ｍｅｄ．、３９巻：２３０頁（１９６７年）。リソスタフィンとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓの遺伝子産物であり、細胞壁のポリグリシン架橋を酵素的に分解することによりＳ．  ａｕｒｅｕｓに対して静菌効果および殺菌効果を及ぼす（Ｂｒｏｗｄｅｒら、Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、１９巻：３９３〜４００頁（１９６５年））。米国特許第３，２７８，３７８号は、リソスタフィンを、後にＳ．  ｓｉｍｕｌａｎｓと命名し直されるＳ．  ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓの培養培地から作製するための発酵法について記載している。他のリソスタフィンを作製するための方法も、米国特許第３，３９８，０５６号および同第３，５９４，２８４号においてさらに記載されている。その後、リソスタフィンの遺伝子がクローニングおよび配列決定された（Ｒｅｃｓｅｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：１１２７〜１１３１頁（１９８７年））。ｒ−リソスタフィンなどの組換え粘液溶解性殺菌タンパク質は、その標的化特異性、低毒性、および生物学的に活性な残留物を低減する可能性のために、現行の抗生物質療法と関連する問題を潜在的に回避しうる。さらに、リソスタフィンが、非分裂細胞に対してもまた活性であるのに対し、大半の抗生物質は、活発な分裂細胞がそれらの効果を媒介することを要求する（Ｄｉｘｏｎら、Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４１巻：６２〜６８頁（１９６８年））。改変溶菌酵素と組み合わせたリソスタフィンは、抗生物質の存在下で用いることもでき、抗生物質の非存在下で用いることもできる。リソスタフィンおよびリシン酵素の両方を同じ治療剤中で用いることには、ある程度の重要性が付加される。ヒトが細菌感染を有する場合、１つの細菌属による感染は、ヒトの身体を弱めるか、または身体の細菌叢を変えることから、他の潜在的な病原性細菌のその身体への感染を許すことが多い。場合によって、身体に共感染する細菌のうちの１つは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの多くの株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、および他のグラム陽性細菌の株が標準的な抗生物質により死滅しないように、ペニシリナーゼを産生させる。結果として、おそらく抗生物質と組み合わせたリシンおよびリソスタフィンの使用は、細菌感染の最も急速かつ有効な処置として用いられうる。治療用組成物はまた、ムタノリシンおよびリゾチームも包含しうる。
【０１６５】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物の適用手段には、直接的、間接的な担体および特殊な手段、または手段の任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の直接的な適用は、ポリペプチドを、鼻腔内領域（例えば、鼻腔内スプレー）、皮膚（ｄｅｒｍａｌまたはｓｋｉｎ）適用（例えば、局所用軟膏または局所用処方物）、坐剤、タンポン適用など、感染部位または細菌コロニー形成部位と直接的に接触させるのに適する任意の手段を介しうる。鼻腔内適用には、例えば、鼻腔内スプレー、点鼻液、鼻腔用軟膏、鼻腔内洗浄液、鼻腔内注射、鼻腔内パッキング、気管支内スプレーおよび吸入器、または咽頭用ロゼンジ、口腔洗浄液もしくは含そう薬の使用を介する間接的な適用、または鼻孔もしくは顔面へと適用される軟膏の使用を介する適用、あるいはこれらの適用法および類似の適用法の任意の組合せが含まれる。溶菌酵素が投与されうる形態には、ロゼンジ、トローチ、キャンディー、注射液、チューインガム、錠剤、粉末、スプレー、液体、軟膏、およびエアゾールが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６６】
天然の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）、および／または改変溶菌酵素（複数可）／改変ポリペプチド（複数可）を、スプレー、液滴、軟膏、洗浄液、注射、パッキング、および吸入器を用いて直接的に導入する場合、酵素は、担体として作用する液体と共に液体環境またはゲル環境にあることが好ましい。吸入器および気管支内スプレーにより改変酵素の乾燥させた無水形も投与しうるが、液体形態の送達が好ましい。
【０１６７】
局所感染または局所汚染を処置するための組成物は、本発明によるＰｌｙＳｓ１および／またはＰｌｙＳｓ２を含めた有効量の少なくとも１つの溶菌酵素、および少なくとも１つの溶菌酵素を、コンパニオン動物または家畜動物の、感染するかまたは汚染された皮膚、外被、または外表面へと送達するための担体を含む。溶菌酵素を適用するための方式は、多数の異なる種類の担体および担体の組合せを包含し、これらには、水性の液体、アルコールベースの液体、水溶性のゲル、ローション、軟膏、非水性の液体ベース、鉱油ベース、鉱油とペトロラタムとのブレンド、ラノリン、リポソーム、血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質担体、粉末化セルロース、カルメロース（ｃａｒｍｅｌ）、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。治療剤を含有する担体の送達方式には、塗抹、スプレー、長時間放出パッチ、液体吸収ワイプ（ｌｉｑｕｉｄ  ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｗｉｐｅ）、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。溶菌酵素は、包帯へと直接的に適用することもでき、他の担体のうちの１つにより適用することもできる。包帯は、湿潤させて市販することもでき、乾燥させて市販することもでき、この場合酵素は包帯上で凍結乾燥形態にある。この適用法は、感染した皮膚を処置するために極めて有効である。局所用組成物の担体は、ポリマー増粘剤、水、防腐剤、活性の界面活性剤または乳化剤、抗酸化剤、日焼け止め、および溶媒または混合溶媒系を包含する半固体のビヒクルおよびゲル様ビヒクルを含みうる。米国特許第５，８６３，５６０号（Ｏｓｂｏｒｎｅ）は、皮膚を医薬へと曝露する一助となりうる多数の異なる担体の組合せについて論じている。用いられうるポリマー増粘剤には、化粧品業界および医薬品業界でしばしば用いられる親水性ゲル化剤および含水アルコール性ゲル化剤など、当業者に公知の増粘剤が含まれる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）とは、多数の架橋アクリル酸ポリマーのうちの１つであり、カルボマーという一般名が与えられている。これらのポリマーは、水中で溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、または他のアミン塩基などの腐食物質で中和させると、透明であるかまたは若干濁ったゲルを形成する。ＫＬＵＣＥＬ（登録商標）とは、水中で分散させ、完全に水和させると、均一なゲルを形成するセルロースポリマーである。他の好ましいゲル化ポリマーには、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエン架橋ポリマー、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１６８】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を含む組成物は、上気道病と関連する細菌感染を防止または処置するためのキャンディー、チューインガム、ロゼンジ、トローチ、錠剤、粉末、エアゾール、液体、液体スプレー、または歯磨き粉の形態で投与することができる。その中に溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を添加するロゼンジ、錠剤、またはガムは、糖、コーンシロップ、多様な色素、糖以外の甘味剤、香料、任意の結合剤、またはこれらの組合せを含有しうる。同様に、任意のガムベースの製品は、アカシア、カルナウバロウ、クエン酸、トウモロコシデンプン、食品着色剤、香料、糖以外の甘味剤、ゼラチン、グルコース、グリセリン、ガムベース、セラック、ナトリウムサッカリン、糖、水、白色蝋、セルロース、他の結合剤、およびこれらの組合せを含有しうる。ロゼンジは、スクロース、トウモロコシデンプン、アカシア、トラガントガム、アネトール、アマニ、オレオレジン、鉱油、およびセルロース、他の結合剤、ならびにこれらの組合せをさらに含有しうる。また、糖置換体も、デキストロース、スクロース、または他の糖の代わりに用いることができる。
【０１６９】
溶菌酵素またはそれらのペプチド断片を含む組成物は、常在すると、コロニー形成する疾患細菌を死滅させる粘膜内層を指向しうる。本明細書で開示されて記載される粘膜内層には、例えば、上気道および下気道、眼、口腔、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸および結腸が含まれる。粘膜組織の天然の消失機構または浄化機構に起因して、従来の剤形は、いかなる有意な長さの時間にわたっても適用部位に保持されることがない。
【０１７０】
粘膜組織への接着を呈示する物質であって、１または複数のファージ酵素および他の補完的薬剤と共にある期間にわたり投与される物質を有することが有利でありうる。制御放出能を有する物質が特に所望であり、持続放出型粘膜接着剤の使用が大きな関心の的となっている。Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６１５，６９７号）は、経粘膜薬物送達において用いられる多様な制御放出型ポリマー組成物についての優れた総説を提示している。この特許は、生体接着剤と有効量の処置用薬剤とを包含する制御放出型処置用組成物について記載している。生体接着剤とは、水膨潤性であるが、水に不溶性で繊維性の、架橋されたカルボキシ官能基によるポリマーであって、（ａ）そのうちの少なくとも約８０パーセントが少なくとも１つのカルボキシル官能基を含有する複数の反復単位、および（ｂ）ポリアルケニルポリエーテルを実質的に含まない約０．０５〜約１．５パーセントの架橋剤を含有するポリマーである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎによるポリマーは、水膨潤性であるが不溶性である一方、架橋されており、熱可塑性ではなく、活性薬剤と調合し、多様な剤形へと調合することが本出願のコポリマー系ほど容易ではない。また、ミセルおよび多層状ミセルも、酵素の放出を制御するのに用いることができる。
【０１７１】
親水性物質と疎水性物質との組合せである粘膜接着剤を伴う他の手法も公知である。Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ＆  Ｃｏ製のＯｒａｈｅｓｉｖｅ（登録商標）は、口腔粘膜へと接着させるための粘着性の炭化水素ポリマー中におけるペクチン、ゼラチン、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムの組合せである接着剤である。しかし、このような親水性成分と疎水性成分との物理的な混合物は、最終的に解離する。これに対し、本出願における親水性ドメインと疎水性ドメインとは、不溶性のコポリマーを生成させる。これもまた参照により組み込まれる米国特許第４，９４８，５８０号は、生体接着性の経口薬物送達系について記載している。この組成物は、凍結乾燥させたポリマー混合物であって、ポリ（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）コポリマーとゼラチンとから形成され、分散ポリエチレンを含有する鉱油など、軟膏ベース中に分散させたポリマー混合物を包含する。米国特許第５，４１３，７９２号（参照により本明細書に組み込まれる）は、（Ａ）好ましくは３：６〜６：３の重量比で存在する、ポリ有機シロキサンおよび水溶性のポリマー材料を含むペースト様ベースと、（Ｂ）有効成分とを含むペースト様調製物について開示している。米国特許第５，５５４，３８０号は、少なくとも２つの相を有する油中水系を含有する、固体または半固体で生体接着性の経口摂取可能な薬物送達系を特許請求している。一方の相は、容量で約２５％〜約７５％の内部親水性相を含み、他の相は、容量で約２３％〜約７５％の外部疎水性相であって、３つの成分：（ａ）乳化剤、（ｂ）グリセリドエステル、および（ｃ）蝋材料からなる外部疎水性相を含む。参照により組み込まれる米国特許第５，９４２，２４３号は、抗菌剤を投与するために有用な一部の代表的な放出用材料について記載している。
【０１７２】
治療用組成物または医薬組成物はまた、生物学的に活性な薬剤を制御放出するための、親水性の主鎖および疎水性のグラフト鎖を含むグラフトコポリマーを含めたポリマー粘膜接着剤も含有しうる。グラフトコポリマーとは、（１）エチレン性不飽和官能基を有するポリスチレンのマクロモノマーと、（２）エチレン性不飽和官能基を有する少なくとも１つの親水性の酸性単量体との反応生成物である。グラフト鎖は、ポリスチレンと、親水性の単量体部分によるポリマー主鎖であって、その一部が酸性の官能基を有するポリマー主鎖とから本質的になる。グラフトコポリマー中のポリスチレンのマクロモノマーの重量パーセントは、約１〜約２０％の間であり、グラフトコポリマー中の全親水性単量体の重量パーセントは、８０〜９９％の間であり、ここで、前記全親水性単量体のうちの少なくとも１０％は酸性であり、前記グラフトコポリマーは、完全に水和すると、平衡における少なくとも９０％の水分含量を有する。コポリマーを含有する組成物は、適用部位において組織液を収着することにより徐々に水和して、極めて軟質のゼリー様の塊であって、粘膜表面への接着を呈示する塊をもたらす。組成物は、粘膜表面へと接着する時間において、粘膜組織により吸収される薬理学的に活性な薬剤の持続放出をもたらす。
【０１７３】
本出願の組成物は、場合によって、ポリ（アクリル酸）可塑剤、ポリ（ビニルピロリドン）可塑剤、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤など、他のポリマー材料、ならびに他の薬学的に許容される賦形剤を、組成物の粘膜接着性に対して有害作用を引き起こさない量において含有することも可能である。
【０１７４】
本発明の組成物の剤形は、従来の方法で調製することができる。筋内注射が選択される投与方式である場合には、等張性の処方物を用いることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。処方物には血管収縮剤を添加することができる。本出願による医薬調製物は、無菌かつ発熱物質非含有で提供される。
【０１７５】
本発明の溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）はまた、局所手段、経口手段、または非経口手段を含めた、薬学的に適用可能なまたは許容される任意の手段によっても投与することができる。例えば、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を、筋内投与、髄腔内投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、または静脈内投与して、グラム陽性細菌による感染を処置することができる。非経口注射が選択された投与方式である場合には、等張性処方物を用いることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。血管収縮剤を、処方物へと添加することができる。本出願による医薬調製物は、無菌および発熱物質非含有で提供される。
【０１７６】
任意の化合物について、まず細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて、治療有効用量を推定することができる。また、所望の濃度範囲および投与経路を達成するためにも、動物モデルが用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な投与量および経路を決定することができる。正確な投与量は、処置される患者を考慮して個別の医師により選択される。投与量および投与を調整して、十分な活性部分レベルを供給し、または所望の効果を維持する。考慮されうるさらなる因子には、患者の病状の重症度、年齢、体重、および性別；食餌、所望される処置の持続期間、投与方法、時間、および投与頻度、薬物の組合せ（複数可）、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答が含まれる。長時間作用型の医薬組成物であれば、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日間おき、毎週、または隔週１回投与しうるであろう。
【０１７７】
非経口投与される溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または量、および処置の持続期間は、感染の重篤度、患者、特に、ヒトの体重、レシピエントの感染性細菌への曝露の持続期間、感染する皮膚または組織の平方センチメートル数、感染の深さ、感染の重篤度、および他の多様な多数の変数に部分的に依存するであろう。組成物は、毎日１回〜複数回のいずれかで適用することができ、短期間または長期間にわたり適用することができる。使用は、数日間または数週間にわたり続く場合もある。使用される任意の剤形は、最小限の長さの時間にわたり最小限の単位数を供給すべきである。有効量または有効投与量の酵素を供給すると考えられる酵素の活性単位の濃度を、適宜選択することができる。１ｍｌ当たりの活性単位量および曝露の持続時間は、感染の性質、および担体が、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）に有することを可能とする接触量に依存する。
【０１７８】
方法およびアッセイ
本発明のリシンポリペプチド（複数可）により呈示される殺菌能、および実際の著明に広範な殺菌により、本発明のポリペプチド（複数可）の抗菌有効性に基づく多様な方法が提供される。したがって、本発明は、グラム陽性細菌を死滅させるための方法、グラム陽性細菌の集団を低減するための方法、細菌感染を処置または緩和するための方法、病原性細菌に曝露されたヒト被験体を処置するための方法、およびこのような曝露への危険性があるヒト被験体を処置するための方法を含めた抗菌法を想定する。本明細書では、感受性細菌に、本発明のファージ酵素（複数可）が元来それに由来する細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのほか、他の多様な連鎖球菌の菌株、ブドウ球菌の菌株、腸球菌の菌株、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株が含まれることが裏付けられる。また、連鎖球菌の感染、ブドウ球菌の感染、腸球菌の感染、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染に対する予防的処置法、連鎖球菌の感染、ブドウ球菌の感染、腸球菌の感染、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染に対する処置法、連鎖球菌の集団もしくは保菌、ブドウ球菌の集団もしくは保菌、腸球菌の集団もしくは保菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の集団もしくは保菌を低減する方法、下気道感染を処置する方法、耳感染を処置する方法、中耳炎（ｏｔｔｉｓ  ｍｅｄｉａ）を処置する方法、心内膜炎を処置する方法、および他の局所性感染もしくは局所性状態または全身性感染もしくは全身性状態を処置または防止する方法を含め、多様な状態を処置する方法も提供される。
【０１７９】
本発明のリシン（複数可）は、複数の連鎖球菌の種またはブドウ球菌の種など、多様な種に由来する細菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、および／またはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌の各々に由来する細菌など、異なる種群にわたる細菌、ならびに異なる目に由来する細菌を死滅させる顕著な能力およびこれらに対する有効性を顕示する。Ｂａｃｉｌｌｉの細菌分類学的分類は、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目という２つの目を包含する。Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属を包含し、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属も包含する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属を包含する。本発明のリシン（複数可）は、抗菌活性および異なる目の細菌に由来する細菌、特に、Ｂａｃｉｌｌｉ細菌の異なる目に由来する細菌を死滅させる能力を顕示する。本明細書では、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に由来する細菌を死滅させることが可能であり、また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に由来する細菌を死滅させることも可能な、リシン（複数可）が提供される。本明細書では、ＰｌｙＳｓ２リシンが、２つの異なる目、特に、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に由来する細菌を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて死滅させることが裏付けられる。本発明のリシンは、混合培養物およびｉｎ  ｖｉｖｏの混合感染においてＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目の細菌を死滅させることが可能である。したがって、本発明は、複数のグラム陽性細菌が疑われるかまたは存在する場合における細菌、培養物、または感染の処置、コロニー除去、および／または除染を想定する。特に、本発明は、複数種類のＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、複数種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、または少なくとも一種類のＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌、および１種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目細菌が疑われるか、存在するか、または存在しうる場合における細菌、培養物、または感染の処置、コロニー除去、および／または除染を想定する。
【０１８０】
本発明はまた、特に、ヒトにおける敗血症を処置するのにも用いることができる。例えば、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または細菌性髄膜炎など、敗血性感染を処置するには、静脈内において、治療剤を血流へと連続的に流入させるものとする。敗血症を処置するための酵素の濃度は、血中の細菌カウントおよび血液容量に依存する。
【０１８１】
また、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染、保菌、または集団を処置するための方法であって、感染を、有効量の、少なくとも１つの、本発明の溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）、特に、ＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１、特に、ＰｌｙＳｓ２を含む治療剤で処置するステップを含む方法も提供される。より具体的に述べると、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の菌株の細胞壁を溶解させることが可能な溶菌酵素／ポリペプチドを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに由来する遺伝子物質から作製する。本発明の方法では、ＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１を含めた本発明のリシンポリペプチド（複数可）、特に、ＰｌｙＳｓ２が、グラム陽性細菌、特に、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、またはＬｉｓｔｅｒｉａ属の感染または細菌のコロニー形成に対して方向付けられた予防法および処置法において有用および有効である。本発明の方法における標的として感受性および関与性の菌株には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれ、これらから選択することができる。
【０１８２】
本発明は、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓを含めた連鎖球菌および／またはＳ．  ａｕｒｅｕｓを含めたブドウ球菌に関連する、特に、ＭＲＳＡを含めた抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含めた感染もしくは状態を処置または緩和する方法であって、細菌、あるいは特定の細菌に感染しているかもしくはこれに曝露されているか、または曝露されていることが疑われるかもしくはその危険性があるヒト被験体を、特定の細菌を死滅させるのに有効な量の、本発明の単離リシンポリペプチド（複数可）と接触させるかまたはこれを投与する方法を包含する。したがって、関与性の細菌を死滅させるか、または細菌感染を他の形で緩和もしくは処置するのに有効であるように、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、または３において提示されるこのようなポリペプチドを含め、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１のうちの１または複数を、接触させるかまたは投与する。
【０１８３】
「薬剤」という用語は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化合物、および小型の分子を含めた任意の分子を意味する。特に、薬剤という用語は、被験化合物、添加されるさらなる化合物（複数可）、またはリシン酵素化合物など、化合物を包含する。
【０１８４】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で、リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。
【０１８５】
「アッセイ」という用語は、化合物の特定の特性を測定するのに用いられる任意の工程を意味する。「スクリーニングアッセイ」とは、化合物のコレクションに由来する化合物を、それらの活性に基づき特徴付けるかまたは選択するのに用いられる工程を意味する。
【０１８６】
「〜を防止する」または「防止」という用語は、疾患を引き起こす薬剤に曝露されているか、または疾患に対する素因がある可能性のある被験体における、疾患または障害を獲得するかまたは発症する危険性の、疾患の発生に先立つ低減（すなわち、疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを発症させないこと）を指す。
【０１８７】
「予防」という用語は、「防止」という用語と関連し、これに包含され、その目的が、疾患を処置するかまたは治癒させるよりもこれを防止することである手段または手順を指す。予防的手段の非限定的な例は、ワクチンの投与；例えば、低分子量ヘパリンの、動けないために血栓症の危険性がある入院患者への投与；およびクロロキンなど、抗マラリア剤の、マラリアが風土病であるか、またはマラリアに罹患する危険性が高い地理的領域への訪問に先立つ投与を包含しうる。
【０１８８】
「治療有効量」とは、薬物、化合物、抗微生物剤、抗体、ポリペプチド、または薬剤の量であって、医師または他の臨床医により探索されている被験体の生物学的応答または医学的応答を誘発する量を意味する。特に、グラム陽性細菌感染およびグラム陽性細菌の増殖に関する「有効量」という用語は、殺菌効果および／または静菌効果を有することを含め、グラム陽性細菌の量または感染の程度の生物学的に有意義な減少をもたらす、有効量の化合物または薬剤を包含することを意図する。本明細書では、「治療有効量」という語句を、感染性細菌の増殖もしくは量、または、例えば、その存在および活性に伴いうる高熱または白血球カウントなど、病態の他の特徴において臨床的に有意な変化である、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント防止し、好ましくは低減するのに十分な量を意味するのに用いる。
【０１８９】
一実施形態では、任意の疾患もしくは感染「を処置する」または任意の疾患もしくは感染の「処置」という用語が、疾患または感染を改善すること（すなわち、疾患または感染性因子もしくは細菌の増殖を停止させること、あるいはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発現、程度、または重症度を低減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、被験体により識別可能とならない可能性がある少なくとも１つの物理的パラメータを改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、物理的に、（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に、（例えば、身体パラメータの安定化）、または両方に、疾患または感染を調節することを指す。さらなる実施形態では、「〜を処置する」または「処置」が、疾患の進行を緩徐化するか、または感染を低減することに関する。
【０１９０】
「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容可能であり、ヒトへと投与するときに、アレルギー反応、または胃腸の不調、めまい感など、類似の有害反応をもたらさないことが典型的な分子実体および組成物を指す。
【０１９１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実行される処置法、または本出願および特許請求の範囲に従う医学的処置法および臨床処置法の文脈では、被験体、患者、または個体という用語が、ヒトを指すことを意図することが注意される。
【０１９２】
本明細書では、「グラム陽性細菌」、「グラム陽性細菌」、「グラム陽性」という用語、および具体的に列挙されているわけではない任意の変形を互換的に用いることができ、本出願および特許請求の範囲の全体で用いられる通り、これらの用語は、公知であり、かつ／あるいは特定の細胞壁および／もしくは細胞膜の特徴の存在により同定することもでき、かつ／またはグラム染色で染色することにより同定することもできるグラム陽性細菌を指す。グラム陽性細菌は公知であり、容易に同定することができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属から選択しうるがこれらに限定されず、これらの任意および全ての認識された種もしくは株、または認知されていない種または株が含まれる。本発明のある態様では、ＰｌｙＳリシン感受性のグラム陽性細菌には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属のうちの１または複数から選択される細菌が含まれる。
【０１９３】
「殺菌性の」という用語は、細菌細胞を死滅させることが可能なことを指す。
【０１９４】
「静菌性の」という用語は、増殖する細菌細胞の阻害を含め、細菌の増殖を阻害することが可能なことを指す。
【０１９５】
「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容可能であり、ヒトへと投与するときに、アレルギー反応、または胃腸の不調、めまい感など、類似の有害反応をもたらさないことが典型的な分子実体および組成物を指す。
【０１９６】
本明細書では、「治療有効量」という語句を、標的細胞塊のＳ相活性を防止し、好ましくは、臨床的に有意な変化である、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低減するか、または、例えば、その存在および活性に伴いうる高血圧、高熱、または白血球カウントの増大など、病態の他の特徴を防止し、好ましくは、これらを上記と同程度に低減するのに十分な量を意味するのに用いる。
【０１９７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌により引き起こされる全身性細菌感染または組織細菌感染を処置するための一方法は、感染を、有効量の１または複数の本発明のリシンポリペプチド、特に、本明細書の図３および４、ならびに配列番号１、２、または３において提示されるこのようなポリペプチドを含め、その切断型または改変体を含めたＰｌｙＳｓ２および／またはＰｌｙＳｓ１ならびに適切な担体を含む治療剤で非経口的に処置するステップを含む。他の多数の異なる方法を用いて、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を導入することができる。これらの方法は、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を静脈内、筋内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、髄腔内、および皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）を介して導入するステップを包含する。医療従事者を含めた当業者は、細菌性状態の性格および程度、ならびに関与するかまたは疑われる細菌の株または種類を踏まえ、最も適切な投与方式または投与手段を評価および認識することが可能であろう。例えば、１または複数の溶菌ポリペプチドの髄腔内における使用および投与であれば、細菌性髄膜炎を処置するのに極めて有益であろう。
【０１９８】
感染はまた、ヒト患者の感染組織へと、適切な溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）およびこれらの酵素のための担体を含む治療剤を注射することによっても処置することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清、またはこれらの任意の組合せを含みうる。より具体的に述べると、注入用または注射用の溶液は、従来の様式で、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩などの防腐剤またはエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩などの安定化剤の添加により調製することができ、次いで、これを、注入容器、注射用バイアル、またはアンプルへと移すことができる。代替的に、注射用化合物は、他の成分を伴うかまたは伴わずに凍結乾燥させ、使用時において必要に応じて、緩衝液または蒸留水中に可溶化させることもできる。本明細書ではまた、固定油、リポソーム、およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも有用である。他のファージ関連溶菌酵素も、ホリンタンパク質と共に、組成物中に含ませることができる。
【０１９９】
本明細書で例示されるＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳＳ１など、溶菌酵素／ポリペプチド（複数可）を、感受性細菌の保菌を消失させるかまたは低減し、感染の症状を有する他のヒトへと曝露されたヒトが発病することを防止するための予防的処置として、または感染に由来して既に発病しているヒトのための治療的処置として用いる多様な処置法が提供される。同様に、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を用いて、特に、酵素の気管支内スプレーまたは静脈内投与を用いることにより、例えば、下気道病を処置することができる。例えば、溶菌酵素は、結膜炎などの眼感染の予防的処置および治療的処置のために用いることができる。処置法は、有効量の、本発明の少なくとも１つの溶菌性ポリペプチド（複数可）および溶菌酵素を含有し、眼へと安全に適用することが可能な担体を含む点眼液または洗眼液を投与するステップを含む。点眼液または洗眼液は、等張性溶液の形態にあることが好ましい。溶液のｐＨは、他の生物による可能な感染をもたらし、眼を損傷しうる、眼の刺激が生じないように、調整されるものとする。ｐＨ範囲は、他の溶菌酵素の場合と同じ範囲にあるものとするが、最適なｐＨは、本明細書で裏付けられ、かつ、提示される範囲にあろう。同様にまた、他の溶菌酵素にも、上記の種類の緩衝液が用いられるものとする。点眼液において用いられるのに適する他の抗生物質も、酵素を含有する組成物へと添加することができる。また、殺菌剤および静菌化合物も添加することができる。溶液中の酵素（複数可）の濃度は、約１００単位／ｍｌ〜約５００，０００単位／ｍｌの範囲であることが可能であり、約１００〜約５，０００単位／ｍｌ、および約１００〜約５０，０００単位／ｍｌの範囲がより好ましい。濃度は、提示される範囲より高濃度の場合もあり、低濃度の場合もある。
【０２００】
本発明の溶菌性ポリペプチド（複数可）はまた、コンタクトレンズを浸漬および洗浄するためのコンタクトレンズ溶液においても用いることができる。通常は等張性溶液であるこの溶液は、酵素に加えて、塩化ナトリウム、マンニトール、および他の糖アルコール、ホウ酸塩、防腐剤などを含有しうる。本発明の溶菌酵素／ポリペプチドはまた、患者の耳へも投与することができる。したがって、例えば、本発明の溶菌性ポリペプチド（複数可）を用いて、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされる耳感染を処置することができる。中耳炎とは、耳痛、難聴、および発熱などの症状によって特徴付けられる中耳の炎症である。これらの症状の主要な原因のうちの１つは、中耳における流体（滲出液）の蓄積である。合併症には、永続的難聴、鼓膜穿孔、仮性真珠腫、乳様突起炎、および癒着性中耳炎が含まれる。１歳までに中耳炎を発症する小児は、再発性の急性または慢性の疾患の危険性がある。中耳炎の主要な原因のうちの１つが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。適切な担体中の酵素（複数可）を外耳道へと送達することにより、溶菌酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を感染した耳へと適用することができる。担体は、滅菌の水溶液もしくは水性懸濁液または油性溶液もしくは油性懸濁液を含みうる。溶菌酵素（複数可）を、適切な防腐剤もまた含有し、好ましくは界面活性剤もまた含有しうる担体へと添加することができる。好ましくは液滴中に包含される殺菌剤および殺真菌剤は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液を調製するのに適切な溶媒には、グリセロール、希釈アルコール、およびプロピレングリコールが含まれる。加えて、任意の数の他の点耳液担体も用いることができる。中耳炎および他の類似の耳感染を処置するために用いられる濃度および防腐剤は、眼感染について論じた濃度および防腐剤と同じであり、酵素を組み入れる担体も、眼感染を処置するための担体と類似であるかまたは同一である。加えて、担体は、ビタミン、ミネラル、炭水化物、糖、アミノ酸、タンパク質性物質、脂肪酸、リン脂質、抗酸化剤、フェノール性化合物、等張性溶液、油ベースの溶液、油ベースの懸濁液、およびこれらの組合せを包含しうることが典型的である。
【０２０１】
本発明のリシンポリペプチド（複数可）の認識および単離によりもたらされる診断的可能性および診断的適用、予防的可能性および予防的適用、ならびに治療的可能性および治療的適用は、本発明のポリペプチドが、感受性細菌内で直接的効果および特異的効果（例えば、死滅）を引き起こすという事実から導出される。したがって、本発明のポリペプチドを用いて、関与性の細菌および感受性細菌を消失させることもでき、特徴付けることもでき、同定することもできる。
【０２０２】
したがって、本発明の診断法は、細胞の試料または培地を、それが感受性細菌を含有するのかどうか、または試料もしくは培地中の細菌が感受性であるのかどうかを決定することを目的として、有効量の１もしくは複数のリシンポリペプチド、および試料中の１もしくは複数の細胞を特徴付けるための手段、または細胞溶解が生じたのかどうか、もしくは細胞溶解が生じつつあるのかどうかを決定するための手段を含めたアッセイにより検討するステップを含みうる。この方法から利益を得ることが可能な患者は、未決定の感染、認識された細菌感染に罹患するか、または特定の細菌に曝露されているかもしくはこれを保有することが疑われる患者を包含する。被験体または患者と接触する流体、食物、医療デバイス、組成物、または他のこのような試料を、感受性細菌について検討することもでき、これらから関与性の細菌を消失させることもできる。このような一態様では、体液、食物、医療デバイス、組成物、または他のこのような試料を、１または複数の本発明の溶菌性ポリペプチドとのインキュベーションにより、またはこれらへの曝露により、任意の潜在的な関与性の細菌を消失させるか、または除去するために、滅菌するか、または他の形で処置することができる。
【０２０３】
当業者は手順およびそれらの適用全てに精通しており、したがって、本発明の範囲内で使用することができる。一例では、本発明の溶菌性ポリペプチド（複数可）が、試料中の関与性または感受性の細菌と複合体化するか、またはこれらに他の形で結合するか、またはこれらと会合し、複合体の１つのメンバーが、検出可能な標識で標識される。複合体が形成されたという事実、および、所望の場合はその量を、標識の検出に適用可能な公知の方法により決定することができる。これらの研究のために最も一般に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光に曝露されると蛍光発光する化学物質などである。多数の蛍光物質が公知であり、標識として使用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＭＣＡ  ｂｌｕｅ、およびＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗが含まれる。放射性標識は、現在のところ入手可能な計数手順のうちのいずれかにより検出することができる。好ましいアイソトープは、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。酵素標識も同様に有用であり、現在使用されている比色分析法、分光光度分析法、蛍光分光光度分析法、電流測定法、または気体定量法のうちのいずれかにより検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアン酸塩、グルタルアルデヒドなど、架橋分子との反応により、選択された粒子へとコンジュゲートする。これらの手順において用いられうる多くの酵素が公知であり、これらを使用することができる。好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；同第３，８５０，７５２号；および同第４，０１６，０４３号は、それらにおける代替的な標識化材料および標識化法の開示についての例を目的として参照される。
【実施例】
【０２０４】
本発明は、本発明を例示するものとして提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解することができる。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示されるものであり、本発明の広範な範囲を限定するものとしては決してみなされないものとする。
【０２０５】
（実施例１）
Ｓ．ｓｕｉｓに由来するファージリシンのクローニングおよび特徴付け
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓとは、世界中でブタに感染するグラム陽性病原体である。ブタからヒトへの人畜共通の伝染についての報告が増大している（Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎ  Ｓ．ら（２００６年）、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻（５号）：５８５〜５６７頁）。Ｓ．ｓｕｉｓは、今後数年間においてヒト集団内で恒常的な存在となる可能性がある。ヒトおよびブタは、ペニシリンまたはゲンタマイシンで処置されてきたが、これらの抗生物質に対して耐性であるＳ．ｓｕｉｓ分離株が存在する（Ｃａｎｔｉｎ，  Ｍ．ら（１９９２年）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、４巻：１７０〜１７４頁）。
【０２０６】
本発明者らは、Ｓ．ｓｕｉｓ株に由来する２つのファージリシン（ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２）を精製および特徴付けし、それらの多様なＳ．ｓｕｉｓ株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性を確認した。加えて、Ｓ．ｓｕｉｓリシン、特に、ＰｌｙＳｓ２リシンは、Ｂ群連鎖球菌を含め、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の他の多様な株および異なる株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて死滅させることも示された。ＰｌｙＳｓ２リシンはまた、他の病原性および臨床的に有意な細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、また、ＭＲＳＡなどの抗生物質耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを含めたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを含めたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属を含め、他の多数の細菌を死滅させるのにも有効である。
【０２０７】
結果
Ｓ．ｓｕｉｓプロファージゲノムＤＮＡを用いる機能的なゲノムスクリーンを介してＰｌｙＳｓ１を単離およびクローニングし、Ｓ．ｓｕｉｓプロファージゲノム配列を配列解析することにより、ＰｌｙＳｓ２を同定し、次いで、単離およびクローニングした。ＰｌｙＳｓ１リシンは、Ｓ．ｓｕｉｓの血清型７株である７７１１のゲノムの機能的ショットガンスクリーニングを介してクローニングした。マイクログラム量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、短時間にわたりＴｓｐ５０９Ｉ（ＮＥＢ）による制限消化にかけた。アガロースゲル電気泳動を介して１．５〜４ｋｂの長さの断片を単離し、ＥｃｏＲＩで直鎖化されたｐＢＡＤ２４プラスミドへとライゲーションした。このプラスミドは、アンピシリン耐性を付与し、アラビノースによる組換え挿入の誘導を可能とする。リシンをコードするクローンを同定するために、ライブラリーを、隣接してコードされるホリンタンパク質の毒性に依拠する新規のスクリーニング法（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｊ．Ｅ．ら（２０１０年）、Ａｄｖ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７６巻（２１号）：７１８１〜７１８７頁）にかけた。略述すると、Ｅ．  ｃｏｌｉのＴＯＰ１０形質転換体を、アンピシリンおよびヒツジの血液を補充したＬＢ寒天上へと播種した。肉眼で見えるコロニーまで増殖させた後、プレートを、アラビノースのミストへと曝露して、組換え転写を誘導した。毒性クローンは、周囲の溶血帯域の発生により明らかとなった。これらのコロニーを同定し、再増殖させ、それらを熱殺菌された細菌と重ね合せる二次スクリーンにかけた（溶菌酵素の産生へと方向付けられたアッセイにかけた）。ＰｌｙＳｓ１リシンをもたらしたＳ．ｓｕｉｓ株（７７１１）については、約３，５００個のクローンを元の溶血スクリーンにかけ、これらのうちの１００個のクローンを二次スクリーンのために選択し、これらのうちの２個のクローンに溶菌酵素をコードさせた。理論的な翻訳タンパク質については、Ｐｆａｍ解析（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）により、推定酵素および推定結合ドメインの割当てを行った。この情報に基づき、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインの上流に挿入される終止コドンを伴って構築される切断型（以下ではＰｌｙＳｓ１と称する）を合成するためのプライマーをデザインした。全長ＰｌｙＳｓ１リシンの核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに切断型酵素のアミノ酸配列を、図３に提示する。
【０２０８】
ＰｌｙＳｓ２を同定およびクローニングするには、Ｓ．ｓｕｉｓの配列決定された８つの分離株のゲノムを、リシンをコードする遺伝子の、組み込まれたプロファージ内の存在について精査した。これらの株は、０５ＺＹＨ３３（ＮＣＢＩゲノムプロジェクト＃１７１５３）；９８ＨＡＨ３３（＃１７１５５）；ＢＭ４０７（＃３２２３７）；ＧＺ１（＃１８７３７）；Ｐ１／７（＃３５２）；ＳＣ８４（＃３２２３９）；０５ＨＡＳ６８  ０５ＨＡＨ３３（＃１７１５７）；および８９／１５９１（＃１２４１７）であった。各ゲノムにつき、注記のなされたＯＲＦの、位相幾何学的に配置されたリストを、潜在性プロファージ領域について、手作業で精査した。あるプロファージが疑われる場合は、その領域における各ＯＲＦを理論的翻訳にかけ、予測される酵素ドメインと結合ドメインとの組合せに基づき、推定リシン状態を割り当てた。この様式で同定されるリシン遺伝子（８９／１５９１株に由来するＰｌｙＳｓ２）だけを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲクローニングし、これを、ｐＢａｄ２４  Ｅ．  ｃｏｌｉ発現プラスミドへとクローニングした（以下を参照されたい）。ＰｌｙＳｓ２リシンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図４に提示する。
【０２０９】
上記の通りに、２つのＳ．ｓｕｉｓリシンを、公表されているＳ．ｓｕｉｓゲノムについての機能的組換えスクリーニングとコンピュータ解析との組合せを介して同定およびクローニングした。これらのリシンをクローニングし、ＰｌｙＳｓ１およびＰｌｙＳｓ２と命名した。他のリシンと同様に、Ｓ．ｓｕｉｓリシン、特に、ＰｌｙＳｓ２は、Ｎ末端の触媒ドメインおよびＣ末端の細胞結合ドメイン（ＰｌｙＳｓ２におけるＳＨ−３  ５型結合ドメイン）を有する（図２）。実のところ、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７７１１株からクローニングされたＰｌｙＳｓ１の天然の構造は、結合ドメインの下流においてさらなる二次触媒ドメインを含有した（非典型的なリシン配置）が、このドメインは、組換えにより消失させて（上記の通りに）、標準的な構築に適合させた。
【０２１０】
リシンをコードする遺伝子ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２  ８９／１５９１株（ＮＣＢＩゲノムプロジェクト＃１２４１７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＺＰ＿０３６２５５２９）（Ｌｕｃａｓ，Ｓ．ら、ＵＳ  ＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、直接寄託）の配列決定されたゲノムに沿って組み込まれたプロファージゲノム内に見出された。ＰｌｙＳｓ２は、８９／１５９１株に由来するゲノムＤＮＡから、以下のプライマー：ＡＡＴＧＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＡＧＡＣＣ−ｆｗｄ（配列番号９）およびＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧ−ｒｅｖ（配列番号１０）によりＰＣＲクローニングされた。プライマーは、ｐＢＡＤ２４へとクローニングするための制限部位（ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を包含する。フォワードプライマーは、複数のインフレームのＡＴＧトリプレットが、５’端において互いの近傍に位置するために、遺伝子開始点の約６０ｂｐ上流の位置に対応する。これは、天然のリボソーム結合部位（ｐＢＡＤ２４の操作されたＲＢＳの代わりに）が転写を導くことを可能とする。ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓ内のプロファージゲノムから、ｐＢＡＤ２４ベクターへとクローニングし（ｐＢＡＤ２４＿ＰｌｙＳｓ２；図５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０細胞へと形質転換した。ｐＢＡＤ２４は、β−ラクタマーゼをコードし、転写の緊密な制御を可能とし、廉価なアラビノースにより誘導される。ベクターで形質転換したＥ．  ｃｏｌｉは、軟質寒天中に懸濁させたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のペプチドグリカンハローを含有する不透明プレート（Ｗａｎｇ，  Ｙら（２００９年）、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５８巻（６号）：６０９〜６１５頁）上で増殖させた。透明帯が、Ｅ．  ｃｏｌｉコロニーの周囲に現れたことから、軟質寒天中のペプチドグリカンを加水分解する活性ＰｌｙＳｓ２の発現が示された。ＰｌｙＳｓ２の構造は、ＬｙＳＭＰの構造とは極めて異なる。ＰｌｙＳｓ２は、予測されるＮ末端のＣＨＡＰドメイン（システイン−ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ、ＰＦ０５２５７）およびＣ末端のＳＨ３−５型ドメイン（ＰＦ０８４６０）をコードする（図４）。Ｎ末端の配列決定により、「ＭＴＴＶＮＥＡ・・・」としての開始が確認された。
【０２１１】
リシンタンパク質の作製
ｐＢＡＤ２４＿ＰｌｙＳｓ２プラスミドを含有するＥ．  ｃｏｌｉを、１０ＬのＬＢ  ＡＭＰ１００中、３７℃で増殖させ、約０．８のＯＤ６００で、一晩の発現にわたり０．２％アラビノースにより誘導した。培養物を、１０，７２２ｒｃｆで２０分間にわたりスピニングした。ペレットを、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４  １００ｍＬ中に再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠と混合した。この混合物をホモジナイズし、ホモジネートを、１，７２３ｒｃｆで２０分間にわたり遠心分離した。上清を、３０，０００ｒｐｍで１時間にわたり超遠心分離した。十分な１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０を、上清へと添加し、ｐＨを７．４とした。
【０２１２】
タンパク質に、ＰｌｙＳｓ２を結合させないアニオン性のＨｉＴｒａｐ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＤＥＡＥカラム（１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４（ＰＢ）、ｐＨ７．４）を流過（ｒｕｎ  ｏｖｅｒ）させた（図６Ａ）。硫酸アンモニウムを、４０％の濃度までフロースルーへと添加した。沈殿物を遠心分離し、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７  ２００ｍＬ中に再懸濁させた。タンパク質を、２０μｍの管により、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７中で一晩にわたり透析した。透析物に、カチオン性のＨｉＴｒａｐ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＣＭカラムを流過させたところ、ＰｌｙＳｓ２は、フロースルーのショルダーのほか、７０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．７で明確に溶出した（図６Ｂ）。純粋なＰｌｙＳｓ２を示す全ての画分をプールした（図６Ｃ）。ＰｌｙＳｓ２の上流には、３つの開始コドンがインフレームで存在する「ＡＴＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡ・・・」（「ＭＭＲＧＫＥＫＰＭＴ  ＴＶＮＥＡＬ・・・」に対応する）ことは注目に値する。純粋なタンパク質試料を、タンパク質の配列決定にかけ、開始が「ＭＴＴＶＮＥＡＬ・・・」であることを確認した。
【０２１３】
ＰｌｙＳｓ１を発現させるために、クローンを、Ｐｏｗｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋ＬＢ−Ｂｏｏｓｔｅｒ（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）中でＯＤ６００≒１．０まで増殖させ、０．２％アラビノースで誘導した。培養物を３７℃で４時間にわたり振とうした（より長い時間では封入体が形成される）。発現細胞をペレット化し、１５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．２中に再懸濁させ、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ−５ホモジナイザーを３回にわたり通過させることにより溶解させた。残留破砕物を遠心分離（１時間、３５，０００×Ｇ）により除去し、硫酸アンモニウムを２２５ｇ／Ｌ（４０％の飽和）で添加した。沈殿したタンパク質は、ペレット化し、１５ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．４中で再可溶化させ、この緩衝液に対して一晩にわたり透析した。次に、透析物に、同じ緩衝液に対して平衡化させたＤＥＡＥアニオン交換カラムを流過させた（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）。
【０２１４】
前述の調製物は、わずか２つのクロマトグラフィーステップにより、高度に純粋なリシン調製物をもたらした（図６）。ｐＩが９．０１と予測されるＰｌｙＳｓ２は、ＤＥＡＥカラムへと固着した夾雑物タンパク質のバルクを残して、ｐＨ＝７．４のＤＥＡＥカラムをそのままフロースルーした。ＰｌｙＳｓ２は、フロースルーのショルダーおよび１７ｍＭのＮａＣｌにおいて明確に溶出し、ＣＭ樹脂を急速にフロースルーしたタンパク質から精製された。この調製物は、純度が＞９９％で、約１．５ｍｇ／ｍｌでのＥ．  ｃｏｌｉ培養物１リットル当たり約６０ｍｇのタンパク質をもたらした。ＣＭカラムによるステップを取りやめたところ、収量は、純度が＞９０％で、約２．０ｍｇ／ｍｌでのＥ．  ｃｏｌｉ培養物１リットル当たり約１５０ｍｇまで増大した。必要な場合は、後者の産物を透析し（５ｍＭのＰＢ、１５ｍＭのＮａＣｌへと）、凍結乾燥させ、再構成し（元の容量の１０％で）、遠心分離し、濾過滅菌した（任意の不溶性物質を除去するため）。これは、可溶性のＰｌｙＳｓ２溶液を、約２０ｍｇ／ｍｌで生成させ、これは、低濃度の出発物質の濃度調整活性を保持した。ＰｌｙＳｓ２は、公表されている多くのリシンより効率的に、高濃度で作製することができる（Ｄａｎｉｅｌ  Ａら（２０１０年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５４巻（４号）：１６０２〜１６１２頁；Ｗａｎｇ，  Ｙ．ら（２００９年）、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５８巻（６号）：６０９〜６１５頁；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄら（２００６年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３巻（２８号）：１０７６５〜１０７７０頁）。
【０２１５】
ＰｌｙＳｓ２の生化学的特徴付け
最適なｐＨ、最適な塩分、温度安定性、およびＥＤＴＡの効果を含めた生化学的条件を決定するため、Ｓ．ｓｕｉｓリシンをさらに特徴付けし、試験にかけた。活性は、３２μｇ／ｍｌでＰｌｙＳｓ２を添加した後における、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７の濁度（ＯＤ６００）の低減の程度により決定した。略述すると、５ｍＬのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）によるＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７の一晩にわたる培養物を、４５ｍＬのＢＨＩへと接種し、３７℃で２時間にわたり増殖させた。５０ｍＬの培養物を、１，７８９ｒｃｆで１０分間にわたりスピニングした。５０ｍＬのＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７培養物を遠心分離した。ペレットを、ｐＨ試験のためには、５０ｍＬの２回蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で洗浄するか、または他の試験のためには、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０  ２５ｍＬで洗浄し、再度遠心分離した。次いで、ペレットを、十分なｄｄ  Ｈ２Ｏまたは１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に再懸濁させ、各試験条件について、最終ＯＤ６００を約１．０とした。全ての対照では、ＰｌｙＳｓ２をＰＢで置きかえた。各試料の分光光度分析の読取りは、ＯＤ６００で、１時間にわたり１分間ごとに行った。最適なｐＨ、最適な塩分、温度安定性、およびＥＤＴＡの効果についての全体的な結果を図７Ａ〜７Ｄに示す。まず、ｐＨ範囲が隣接する２つの緩衝液セット：クエン酸／リン酸緩衝液：４．６〜８．０；ビス−トリス−プロパン（ＢＴＰ）（ｂｉｓ−ｔｒｉ−ｐｒｏｐａｎｅ  （ＢＴＰ））緩衝液：７．０〜９．７を用いて、酵素のｐＨ依存性に取り組んだ。また、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、およびＤＴＴも、ＰｌｙＳｓ２活性についての条件を調べるために変化させた。最適なｐＨを決定するため、多様なｐＨレベルのリン酸／クエン酸緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対するＰｌｙＳｓ２活性を調べた（図７Ａ）。ＰｌｙＳｓ２は、ｐＨ８．０において最も強力な活性を有した。最高のｐＨ値では、広域溶菌スペクトルが観察された。同様に、今度は、高ｐＨレベルまでの評価を可能とするビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）緩衝液を用いて、Ｓ  ｓｕｉｓ  ７９９７株に最適なｐＨも決定した（図８）。ＰｌｙＳｓ２は、９．７のｐＨまで急性の活性を有することが示された。ＢＴＰ中では、最高のｐＨである９．７で溶菌が最大となったが、これは、生細胞に適する緩衝液ではない。溶菌はまた、ｐＨ７．０〜８．０のＢＴＰ中でも生じたが、同等のｐＨ値では、クエン酸／リン酸（被験培養物を増殖させるためにより生理学的な緩衝液）におけるＯＤ低下の大きさがはるかに顕著となった。ｐＨ６．０までは活性が認められ、これは、血液のｐＨが約７．４であるために、有意である。最適な塩濃度を決定するため、１９５μｌの細胞中で、５μｌのリシンを、５０μｌの多様なＮａＣｌ濃度へと添加した（図７Ｂ）。ＰｌｙＳｓ２は、０ｍＭのＮａＣｌ中で最大の活性を有した。細胞は、より低張性の溶液中で、溶菌に対してより感受性である。塩は、ＰｌｙＳｓ２により誘導される溶菌を増強しなかった。酵素濃度を一定とすると、溶菌は、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ中で減少した。したがって、細胞はより低張性の溶液中で溶菌に対して感受性であるために、０ｍＭのＮａＣｌが最���である。
【０２１６】
リシンの温度安定性を決定するため、リシンを、多様な温度で３０分間にわたりインキュベートし、冷却し、次いで、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた２４５μｌの細胞へと添加した（図７Ｃ）。ＰｌｙＳｓ２の過剰量のＤＴＴへの曝露は、活性に対して影響（正または負の）を及ぼさなかった（データは示さない）。ＥＤＴＡによる処理は、ＰｌｙＳｓ２に誘導されるＳ．ｓｕｉｓの溶菌を妨げた。リシンを、多様な濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に、１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた細胞へと添加して、リシンが補因子を要求するかどうかを決定した。対照では、全ての試験について、ｄｄ  Ｈ２Ｏでリシン（ＰｌｙＳｓ２）を置きかえた。ＰｌｙＳｓ２活性は、極めて低濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により減衰した（図７Ｄ）。これは、ＰｌｙＳｓ２が、補因子または他の何らかの修飾剤を要求することを意味する。リシン（ＰｌｙＳｓ２）を、極めて低濃度のＥＤＴＡと共に試験にかけて、いかなるレベルにより、ある程度の残留活性が可能となるのかを決定した。このレベル（４ｕＭ〜２００ｕＭの間のＥＤＴＡ）では、低（５〜５０ｕＭ）量の異なる二価カチオン（Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋）を添加して、補因子を決定する。
【０２１７】
異なる温度で３０分間にわたり；３７℃で数時間にわたり；４℃で数日間にわたり；−８０℃で数カ月間にわたりインキュベートしたときのＰｌｙＳｓ２の安定性について調べた。上記で概括した通りに、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７に対する各アリコート（３２μｇ／ｍｌ）の活性を、分光光度分析により決定した。また、ＰｌｙＳｓ２を、室温〜−８０℃における１〜１０回連続の凍結−融解の後でも試験にかけた。２２℃〜８５℃で３０分間にわたりインキュベートしたところ、ＰｌｙＳｓ２活性は、５５℃を含めたかなりの温度範囲の全体にわたり基本的に影響を受けなかったが、６０℃において、ＰｌｙＳｓ２活性は、完全に消失した。３７℃で２４時間にわたるインキュベーション後において、ＰｌｙＳｓ２は完全な活性を保持したが、３７℃で４８時間にわたるインキュベーション後において、ＰｌｙＳｓ２は、活性の減衰を示した。４℃で１５日間にわたるインキュベーション後において観察可能な活性の減少は認められなかった。加えて、ＰｌｙＳｓ２は、−８０℃でも活性を低減せずに７カ月間にわたり持続した。リシンは、室温〜−８０℃における１０回連続の凍結−融解を、その活性に対する観察可能な影響を伴わずに持ちこたえうる。緩衝液中、３７℃で４８時間後まで維持したときの精製ＰｌｙＳｓ２リシンの安定性を決定した。図９において示される通り、Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株に対する死滅の有効性を定期的に決定した。ＰｌｙＳｓ２リシンは、２４時間まで、＞９０％が安定的であり、４８時間後において少なくとも５０％の活性を維持する。ＰｌｙＳＳ２リシンの安定性を、−８０℃の冷凍庫における保管について評価した。ＰｌｙＳｓ２リシンは、緩衝液中の保管で、−８０℃で少なくとも７カ月間までにわたり、本質的に１００％の活性を保持する（図１０）。
【０２１８】
ＰｌｙＳｓ２リシンによって触媒される結合を決定するための探索を企図した。ＰｌｙＳｓ２を、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）および炭水化物をはく奪した精製Ｓ．ｓｕｉｓペプチドグリカンと共に、３７℃で一晩にわたりインキュベートし、生成物を質量分析にかけた。データは、切断が、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼであることを示唆する。
【０２１９】
ＰｌｙＳｓ１の生化学的特徴付け
プロファージ溶菌酵素を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ１に由来する血清型７分離株であるＳ．ｓｕｉｓ  ７７１１株の機能的ゲノムスクリーンからクローニングした。完全なＰｌｙＳｓ１リシン遺伝子は、４５２残基のタンパク質をコードする：Ｐｆａｍ解析は、Ｎ末端における５型アラニン−アミダーゼドメイン（ＰＦ０５８３２）に続き、中央領域における二重ＣＰＬ−７細胞壁結合ドメイン（ＰＦ０８２３０）、およびＣ末端における二次グルコサミニダーゼドメイン（ＰＦ０１８３２）を予測する。構築的に述べると、クローニングされたリシンのドメイン配置は、高度に非典型的である。グラム陽性リシンは、Ｎ末端の酵素ドメインとＣ末端の結合ドメインとからなることが典型的である。場合によって、リシンは、Ｎ末端の２つの溶菌性ドメインを伴って見られるが、第２の酵素ドメインが、結合ドメインの後で機能的にコードされることは稀である。一例は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのＬａｍｂｄａＳａ２リシンである（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＤＧら（２００７年）、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７３巻（２２号）：７１５０〜７１５４頁）。ＬａｍｂｄａＳａ２について研究する中で、ＤｏｎｏｖａｎおよびＦｏｓｔｅｒ−Ｆｒｅｙは、驚くべきことに、Ｃ末端のグルコサミニダーゼドメインを除去した後で、酵素活性が増大することを観察した（Ｄｏｎｏｖａｎ  ＤＭおよびＦｏｓｔｅｒ−Ｆｒｅｙ  Ｊ（２００８年）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、２８７巻（１号）：２２〜３３頁）。これを動機として、本発明者らは、Ｎ末端の酵素および中央の結合ドメインだけを伴う、クローニングされたリシンの切断型構築物を創出した。この切断型構築物をその後の機能的解析のために発現させ、精製した；本明細書で記載される活性および特徴付けの研究は、本明細書では切断型ＰｌｙＳｓ１またはΔＰｌｙＳｓ１と称する、切断型ＰｌｙＳＳ１に基づく。上記で言及した通り、全長ＰｌｙＳｓ１リシンおよび切断型ＰｌｙＳｓ１リシンの構造およびアミノ酸配列を、図３に示す。
【０２２０】
Ｓ．ｓｕｉｓ株（７７１１）の生細胞に対するＰｌｙＳｓ１に最適な生化学的条件を決定した。これらの実験では、リシンを添加した後における水性細菌懸濁液の濁度（ＯＤ６００）の低減の程度を介して活性を測った。まず、ｐＨ範囲が隣接する２つの緩衝液セット：クエン酸／リン酸緩衝液：４．６〜８．０；ビス−トリス−プロパン（ＢＴＰ）緩衝液：７．０〜９．７を用いて、酵素のｐＨ依存性に取り組んだ。５．４〜９．４の広域溶菌スペクトルが観察された（図１１Ａ）。ＢＴＰでは、溶菌が８．２〜９．０で最大となったが、同等のｐＨ値では、クエン酸／リン酸におけるＯＤ低下の大きさが若干顕著となった（図１１Ｂ）。
【０２２１】
塩濃度の役割も同様に考慮したが、塩濃度は、ＰｌｙＳｓ１に誘導される溶菌にそれほど大きな影響を及ぼさなかった。酵素濃度を一定としたとき、溶菌は、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌにおいてほとんど変化せず、最も低張性の条件下におけるわずかな数値の増大だけを伴った（図１２）。ＰｌｙＳｓ１の、過剰量のＤＴＴまたはＥＤＴＡへの曝露が、活性に負の影響を及ぼさなかったことから、酵素は、分子内のジスルフィド架橋または補因子としてのキレート化可能なカチオンに依拠しないことが示される（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＰｌｙＳｓ１の熱安定性は、酵素を、使用前に多様な高温でインキュベートすることにより検討した（ＯＤ低下実験自体は、常に３７℃で行った）。３５℃〜６０℃で３０分間にわたり保持した場合、リシン活性は、５０℃までは事実上影響を受けなかったが、５０℃で、リシン活性は完全に消失した（図１４Ａ）。６時間にわたるインキュベーションでは、４５℃で部分的な活性の減少が観察される一方、４０℃の試料は影響を受けなかった（図１４Ｂ）。後者は、典型的なブタの体温に対応する。
【０２２２】
ＰｌｙＳｓ１の酵素ドメインの結合特異性を決定するため、精製されたＳ．ｓｕｉｓ細胞壁（Ｓ７３５型株に由来する）を、ＨＥＷＬ（ムラミダーゼ）およびＰｌｙＳｓ１による二重消化にかけた。２つの主要ピークは、ｍ／ｚ＝７１８およびｍ／ｚ＝７３４であった。これは、ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−ＬＡｌａ−Ｄ−Ｇｌｎの［Ｎａ−Ｍ］＋付加物および［Ｋ−Ｍ］＋付加物の予測質量に正確に対応する。これは、ＰｌｙＳｓ１が、γ−Ｄ−グルタミニル−Ｌ−リシンエンドペプチダーゼに特徴的な、Ｄ−ＧｌｎとＬ−Ｌｙｓとの間のペプチドグリカンステムを切断するガンマ−エンドペプチダーゼ活性を保有することを示唆する。未消化の細胞壁についての質量スペクトルを採取したところ、上記の２つのピークは見られなかった。
【０２２３】
（実施例２）
リシン比活性についてのＩｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ＰｌｙＳｓ２活性
異なる細胞型に対するＰｌｙＳｓ２リシン活性を決定するため、１．６μｇ／μＬ（８μｇ）のＰｌｙＳｓ２  ５μＬを、マイクロタイターウェル内の２４５μＬの細胞（１５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ８．０中に懸濁させた）へと添加した。対照としての対応するウェルには、５μＬのｄｄ  Ｈ２Ｏを、２４５μＬの細胞へと添加した。１分間ごと１時間にわたり、分光光度計により各ウェルについて読取り（ＯＤ６００）を行った。ＯＤ密度とは、マイクロタイターウェル内の細菌細胞増殖の量を示す。
【０２２４】
この活性試験をまず、病原性Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７株について、多様なＰｌｙＳｓ２濃度により決定した（図１５Ａ）。また、精製ＰｌｙＳｓ２リシンの比活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓ．ｓｕｉｓ  Ｓ７３５株に対しても評価した（図１５Ｂ）。次いで、この試験を、３２ｕｇ／ｍＬ（溶菌アッセイに基づき、他の生物に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける死滅研究にもこれが良好な濃度であることが見出された）のＰｌｙＳｓ２を用いて実施して、他の細菌種に対するＰｌｙＳｓ２活性を決定した（図１６Ａ〜１６Ｄ）。さらなる株の死滅結果を図１７Ａおよび１７Ｂに示す。さらなる結果は、以下の表１に表にして示す。
【０２２５】
上記の結果で裏付けられ、示される通り、ＰｌｙＳｓ２リシン酵素は、Ｓ．ｓｕｉｓに対してだけでなく、特に、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、およびＢ群連鎖球菌を含めた他の病原体に対しても広範な死滅活性を有する。示された結果は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株（ＭＲＳＡ）の増殖の低減および死滅を裏付ける。同等なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、ＰｌｙＳｓ２は、加えて、かつ、同様に、バンコマイシン中間感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）株に対しても有効である（図１８）。
【０２２６】
このＳ．ｓｕｉｓリシンは、病原性細菌を早急に死滅させるその能力において、既に同定されて特徴付けされたリシンと類似している。しかし、このＳ．ｓｕｉｓリシンは、主要な病原体に対するその広範な活性において稀であり、注目に値する。また、上記で示した通り、このリシンが、容易に作製し、精製することが可能であり、多様な関与性の温度、ｐＨ、および塩分において安定的であることから、魅力的な治療的酵素の候補となっていることも注目に値する。
【０２２７】
【表１】
2019022504.tif 000004
ＰｌｙＳｓ１の活性
切断型ＰｌｙＳｓ１（ΔＰｌｙＳｓ１）リシン活性を、異なる細胞型に対して決定した。上記の実験を踏まえ、ΔＰｌｙＳｓ１による全てのさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために、以下の最適な緩衝条件：２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．８、２ｍＭのＥＤＴＡを使用した。６．５〜１３０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のリシンを、この緩衝液中のＳ．ｓｕｉｓの生細胞へと導入した。３つの株：ＰｌｙＳｓ１をコードする血清型７株である７７１１株；基準の血清型２株であるＳ７３５株；および毒性の高い血清型９株である７９９７株を、特に、関与性であると考えた。これらの株の各々について、多様なＰｌｙＳｓ１用量における時間依存的なＯＤ６００応答を図１９に示す。細菌の生存率については、最高のＰｌｙＳｓ１濃度（１３０μｇ／ｍｌ）だけが、１時間の処理後において、７７１１、Ｓ７３５、および７９９７について、ＣＦＵの＞９０％の減少をもたらした（表２）。そのリシンはまた、培養液中の活発な分裂細胞（７７１１株）に対しても調べた（図２０）。ΔＰｌｙＳｓ１リシンは、細菌の増殖を用量依存的な様式で遅延させたが、これらの効果は一般に軽微であり、Ｓ．ｓｕｉｓの増殖を完全に阻害することはできなかった。
【０２２８】
【表２】
2019022504.tif 000005
１時間の処理（最適な緩衝条件）後において、２つのΔＰｌｙＳｓ１濃度（１３０および１３μｇ／ｍｌ）について、Ｓ．ｓｕｉｓのＳ７３５株、７９９７株、および７７１１株に対するＣＦＵ解析を行った。各実験では、未処理試料と対比した処理試料について、ＣＦＵの百分率による減少を決定した。各株について観察される（３回の独立した実験にわたり）値の範囲を報告する。各株の血清型をカッコ内に示す。
【０２２９】
ΔＰｌｙＳｓ１を、様々な血清型の他の１９のＳ．ｓｕｉｓ株のパネルのほか、他のグラム陽性細菌種に対してもさらに調べた。上記と同じリシン濃度を用いた。各用量について、１時間後において観察される溶菌値を、表３および表４に列挙し、情報を図２１のグラフにまとめる。
【０２３０】
【表３】
2019022504.tif 000006
【０２３１】
【表４】
2019022504.tif 000007
全てのＳ．ｓｕｉｓ株は、ある程度の感受性を裏付けた。興味深いことに、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の連鎖球菌の多く（およびなお一部の非連鎖球菌）もまた、同等の酵素濃度で溶解した。上記の結果で裏付けられ、かつ、示される通り、ＰｌｙＳｓ１リシン酵素は、Ｓ．ｓｕｉｓに対するだけでなく、Ｂ群連鎖球菌を含めた多数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属株にも対し、加えて、特に、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属を含めた他の病原体にも対する、広範かつ同等の死滅活性を有する。古典的に、ファージリシンは、その宿主種内から宿主種外へと移行するとき、顕著な活性の減少を顕示している。しかし、この例では、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の細菌間で広範囲にわたる感受性が見られ、一部の細菌は、Ｓ．ｓｕｉｓ自体と同一の溶菌を裏付けた。
【０２３２】
（実施例３）
ＣＦＵ死滅アッセイ
１５ｍＭのＰＢ、ｐＨ８．０中３２ｕｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２へと６０分間にわたり曝露したときの、Ｓ．ｓｕｉｓのＳ７３５および７９９７の特異的死滅、ならびにこれらのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の低下を決定した（図２２）。
【０２３３】
（実施例４）
耐性の評価
感受性細菌内のＳ．ｓｕｉｓリシンに対する耐性の発生について調べるために、ブドウ球菌であるＳ．  ａｕｒｅｕｓのＭＷ２株および８３２５株、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの５００５株の各々を、濃度を段階的に増大させるＰｌｙＳｓ２へと曝露した。いずれのＳ．  ａｕｒｅｕｓ株も、研究期間中において耐性を発生させなかった（図２３）。ムピロシン耐性株を発生させるために確立されたプロトコール（Ｒｏｕｓｅ，  Ｍ．Ｓ．ら（２００５年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４９巻（８号）：３１８７〜３１９１頁；Ｐａｓｔａｇｉａ  Ｍら（２０１１年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５５巻（２号）：７３８〜４４頁）に従い、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのＭＷ２株および８３２５株、ならびにＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの５００５株を、ＰｌｙＳｓ２の存在下で増殖させた。ＰｌｙＳｓ２の濃度は、各株に対するＰｌｙＳｓ２の最低阻害濃度（ＭＩＣ）の３２分の１の濃度から、各株に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣの４倍の濃度まで、８日間にわたり毎日倍増させた。まず、ＭＨＢ中、ＭＩＣの３２分の１の濃度のＰｌｙＳｓ２の存在下、３７℃で一晩にわたり、１ｍｌ当たり５×１０８ＣＦＵの細菌細胞を増殖させた。これらの細胞を、９００ｒｃｆで１０分間にわたり遠心分離し、２つのアリコートへと分割した。一方のアリコートは、元のＰｌｙＳｓ２濃度の２倍の濃度の新鮮なＭＨＢ培地中へと、１０倍に希釈し；他のアリコートの一部は、ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２を含有するＭＨＡプレートの表面に広げ、耐性クローンについてスクリーニングした。各株個別の培養物を、陽性対照と同じ様式のムピリシン存在下で増殖させた。
【０２３４】
この実験では、丸型のポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅ）製プレートウェルの底部におけるペレットの形成を検出することにより、ＭＩＣを決定した。各日、各培養物に由来する１．０μＬずつの試料を、各培養物が曝露されるＭＩＣの各薬物を含有する選択プレート上に広げた。上記の通りに各系列継代培養を微量希釈することにより、毎日培養物１つ当たり４つずつのコロニーについて、ＰｌｙＳｓ２またはムピロシンのＭＩＣを調べて（Ｗｉｅｇａｒｄ，  Ｉら（２００８年）、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３巻（２号）：１６３〜１７５頁）、耐性（ＭＩＣの４倍の増大として規定される）クローンが出現したかどうかを決定した。ムピロシンおよび陽性対照としての各株により手順を繰り返した。
【０２３５】
（実施例６）
口腔内微生物叢研究
ラットでの口腔内微生物叢研究を用いて、Ｓ．ｓｕｉｓリシンの天然の微生物叢に対する効果を評価した。血液寒天プレートに、２匹のラットの口腔に由来するスワブで画線した。２サイクルの継代培養を介して培養物を各プレートから単離し、ＢＨＩブロス中で一晩にわたり増殖させた。翌日、１ｍＬの各培養物を乾燥させたＢＨＩ寒天プレートへと播種し、結果として、寒天上にこれらの培養物のローンがもたらされた。それらを乾燥させた後で、１０μＬのＰｌｙＳｓ２を、対照としての中央の１０μＬのｄｄ  Ｈ２Ｏ液滴の両側に堆積させた。６つの培養物のうち、ＰｌｙＳｓ２の液滴周囲に透明帯が現れたのは、１つの培養物だけであった（データは示さない）。この培養物を送付し、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと確認した。Ｈａｒｌａｎ製のラット３匹、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ製の４匹、およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ製の別個のラット２匹の各々の口腔をスワブで擦過した。各ラットに由来するスワブで画線した各マンニトール塩プレート上では、黄色のコロニーが増殖したことから、それら全てが口腔内においてＳ．  ａｕｒｅｕｓを含有したことが示される（データは示さない）。
【０２３６】
（実施例７）
ＭＲＳＡマウス敗血症モデル
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓに対するＰｌｙＳｓ２リシン活性を、ＭＲＳＡマウス敗血症モデルによりさらに評価した。ＭＲＳＡマウス敗血症モデルでは、感受性のマウス（ＦＶＢ／ＮＪマウス、１５〜２０ｇの重量範囲）に、ＰＢＳ中に５％のブタ胃粘素中１ｍＬ当たり５×１０５個（約ＬＤ１００）のＭＲＳＡ細胞５００μＬを腹腔内（ＩＰ）注射した。３時間後、マウス全てが、それらの臓器（脾臓、肝臓、腎臓、および心臓／血液を含めた）中のＭＲＳＡにより菌血症となる。このモデルにおけるＰｌｙＳｓ２活性を決定するため、ＭＲＳＡを注射した３時間後に、２ｍｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２  ５００μＬをＩＰ注射した。これにより、各試験のマウスの血流中に約１ｍｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２が結果としてもたらされる。対照マウスには、５００μＬのＰＢＳを注射した。生存は、１０日間にわたり評価した。対照マウスは、１８〜２０時間以内に死亡する。この研究は有望な結果をもたらし、このことからＰｌｙＳｓ２で処置したマウスの顕著な生存が示される（図２５）。
【０２３７】
（実施例８）
創傷感染モデル
ラットにおけるＭＲＳＡ創傷感染モデルにより、Ｓ．ｓｕｉｓリシンについて調べた。このモデルでは、３センチメートルの切開を、ラットの背側に沿って創出する。その後、長さ１ｃｍで、深さ１ｃｍの切開を、脊柱僧帽筋（ｓｐｉｎｏｔｒａｐｅｚｉｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ）へと施す。次いで、１ｍＬ当たり１×１０８ＣＦＵの（合計５×１０６ＣＦＵ）のＭＲＳＡ５０μＬを、創傷へと接種する。３〜５分間後、被験ラットを、１０ｍｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２  ５００μＬで処置する。さらに３〜５分間後、創傷を吻合して閉止し、１００μＬのＰｌｙＳｓ２を、１０ｍｇ／ｍＬで創傷の外側へと添加する。創傷をステープルで封止するときに、細菌またはリシンのいずれも創傷から逸出しないことを確保するように注意する。１０日後、感染部位内におけるＭＲＳＡのＣＦＵを検討する。試験の最初の２ラウンドにおいて、ＰｌｙＳｓ２は、背創傷におけるＭＲＳＡに対して有害効果を及ぼし、ＰｌｙＳｓ２により処置されたラットでは、ＭＲＳＡのＣＦＵが対照ラットと比較して３〜４ｌｏｇ減少することが示された。
【０２３８】
動物実験
ラットの創傷において感染を引き起こすのに必要なＭＲＳＡの感染用量を決定することにより、動物実験を開始した。最大１０９ＣＦＵの用量であっても、感染は生じないことが見出された。しかし、異物（滅菌のガラスビーズ）を添加したところ、＜１０８ＣＦＵで感染が生じた。具体的に述べると、切開をラットの背部（５〜６ｃｍの長さ）に施し、２〜３ｍｍの切開を深部組織に施した。これに１００ｍｇの滅菌砂および５０μｌのＭＲＳＡを添加した。創傷を吻合して閉止し、動物を１０日間にわたり追跡し、創傷を開き、肉眼で見える変化について検討し、細菌学的検討のために組織試料を採取した。
【０２３９】
結果
滅菌砂だけを施された対照動物は、正常な治癒を示し、異常な特徴および細菌汚染を伴わなかった。ＭＲＳＡを施された動物は、明確な膿瘍形成、壊死性組織、および膿を示した。開いた創傷から採取された試料（秤量されてホモジナイズされた組織）から、組織１グラム当たり約１０７ＣＦＵのＭＲＳＡがもたらされた。このモデルは、再現性が高く、少なくとも１０匹の動物において同じ結果をもたらした。
【０２４０】
処置
上記のモデルを用いて、ＰｌｙＳｓ２リシンで処置し、処置の効果を決定した。この場合には、ＭＲＳＡおよび砂を施された動物のうちの半数を、ＭＲＳＡ投与の１０分間後に、５０ｕｌのリン酸緩衝液（ＰＢ）中に１０ｍｇのＰｌｙＳｓ２で処置し、対照動物には、代わりにＰＢを施した。動物を１０日間にわたり追跡した。この時点において、動物を、肉眼で見える変化および微生物学について解析した。対照動物における創傷は、膿（ｐｕｓｓ）、壊死、および治癒不良を呈示する。これは、ＰｌｙＳＳ２の単回投与で処置された動物に対して鋭く対照的である。これらの創傷は、膿または壊死を呈示せず、治癒の良好を呈示した。
【０２４１】
結果
表５に見られる通り、緩衝液単独で処置されたラットの創傷が、組織１グラム当たり平均４．２７×１０６ＣＦＵのＭＲＳＡを呈示したのに対し、ＰｌｙＳｓ２で処置された動物は、組織１グラム当たり平均１．４１×１０２ＣＦＵを有し、＞４ｌｏｇのＭＲＳＡの低減であった。ＰｌｙＳｓ２で処置された創傷の大半は、本発明者らの検出可能限界未満であったので、この数は、４ｌｏｇより小さい。
【０２４２】
【表５】
2019022504.tif 000008
（実施例１９）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける鼻腔内ＭＲＳＡコロニーの除去
ヒト前鼻孔におけるＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方の保菌は、大きなＳ．  ａｕｒｅｕｓ感染の貯蔵庫である。研究は、人口のうちの約８０％が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにより鼻腔内コロニー形成している可能性があり、このコロニー形成は、他のより重篤なＳ．  ａｕｒｅｕｓ感染を発生させる危険性因子の増大でありうることを示している（Ｋｌｕｙｔｍａｎｓ，  Ｊ．、Ａ．  ｖａｎ  Ｂｅｌｋｕｍ（１９９７年）、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、１０巻（３号）：５０５〜５２０頁）。実際、米国の病院では、救命救急ケア環境への入院時における鼻腔内コロニー形成の評価が制度化されつつある。したがって、コミュニティーまたは病院環境における鼻腔内保菌を消失させれば、おそらく、感染の危険性を低減し、薬物耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの拡大を緩徐化しうるであろう。Ｓ．ｓｕｉｓリシンが、鼻腔内粘膜のＭＲＳＡコロニー形成を低減する能力を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、約２×１０７個のＭＲＳＡの自発性ストレプトマイシン耐性株（１９１−ＳＭＲ）を鼻腔内接種する。感染の２４時間後、マウスに１時間ごと３回にわたり、リン酸緩衝生理食塩水（対照）またはＰｌｙＳｓリシン（１ｍｇずつ）を鼻道へと投与する。最終回の処置の１時間後に、マウスを屠殺し、細菌コロニーを、Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＲＳＡ寒天（ＭＲＳＡの鼻腔内コロニー形成を診断的に検出するために開発された選択性の発色性培地）およびＣｏｌｕｍｂｉａ血液寒天上で数え上げる。３回の独立した実験を実施して、各処置群につき、少なくとも１０匹ずつのマウスを評価する。Ｓ．ｓｕｉｓリシンにより処置したときの鼻腔内粘膜における平均ＣＦＵの著明な低減を決定する。
【０２４３】
参考文献
【０２４４】
【化３】
2019022504.tif 000009
（実施例２０）
広域の溶菌活性を伴うバクテリオファージリシンＰｌｙＳｓ２は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染に対して防御する
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌：ＧｒＡＳ）は、複数の感染性ヒト疾患を引き起こす。これらの細菌の病原体は、主要な抗生物質に対する耐性が確立された多くのグラム陽性病原体のうちにある。これらの感染性因子に対抗するには、代替的な療法が必要とされている。本発明者らは、ＭＲＳＡ、バンコマイシン中間感受性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｇ群連鎖球菌、Ｅ群連鎖球菌、およびＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する活性を伴う新規のバクテリオファージ（ファージ）リシンを開発した。このＳ．ｓｕｉｓに由来するファージリシンを、ＰｌｙＳｓ２と称した。ＰｌｙＳｓ２がいかなるグラム陰性細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）にも活性を提示しなかったことは、元の外因性リシンと一致する。ＰｌｙＳｓ２は、Ｎ末端のシステインヒスチジンアミノペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメインと、Ｃ末端のＳＨ３ｂ結合ドメインとを有する。ＰｌｙＳｓ２は、５０℃で３０分間にわたり、３７℃で２４時間にわたり、４℃で１５日間にわたり安定であり、−８０℃で＞８カ月間にわたり安定である。ＰｌｙＳｓ２は、１０回にわたる凍結−融解後において、完全な活性を維持する。１２８μｇ／ｍｌで、ＰｌｙＳｓ２は、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、それぞれ、５ｌｏｇおよび３ｌｏｇ低減することが可能であった。ＰｌｙＳｓ２の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、ＭＲＳＡについて１６μｇ／ｍｌであった。ＰｌｙＳｓ２の２ｍｇ単回投与は、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染のマウス敗血症モデル内の２４匹中２２匹のマウスを防御した。ＰｌｙＳｓ２への曝露を系列的に増大させた後、ＭＲＳＡまたはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓのいずれも、ＭＲＳＡがムピロシンに対して確立した耐性をＰｌｙＳｓ２に対しては確立しなかった。リシンが、このように有効で広域の溶菌活性；安定性；およびヒトの主要な細菌病原体に対する有効性を示したことはなかった。ＰｌｙＳｓ２は、耐性の発生を伴わない、ＭＲＳＡ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、および他の多くの病原体に対する有望な治療剤である。
【０２４５】
世界中で、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属などを含め、多くのグラム陽性病原体が疾患および感染を引き起こしている。それらは、多様な疾患を引き起こし、現行の処置には限界がある。
【０２４６】
ヒト集団のうちの３０％超では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓが、上気道（良性コロニー形成のうちで唯一の公知の部位）でコロニー形成している可能性がある［１］。コロニー形成している個体は、疾病を伝染させる可能性が、重度に罹患した患者よりはるかに低い［１］。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌（ＧｒＡＳ））は、毎年７億５千万人超に感染する［２〜４］。毎年、重度の感染へと進行する約６５０，０００例における死亡率は２５％に上る［２］。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓは、上気道において咽頭炎を引き起こし、ヒト宿主の皮膚内に膿痂疹を引き起こす［５］。猩紅熱、丹毒、蜂巣炎、壊疽性筋膜炎、およびトキシックショック症候群、ならびに他の疾病も、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染から出現する。これらの感染の死亡率は、壊疽性筋膜炎の２０％、およびトキシックショック症候群の５０％を含め、極めて高くなりうる［６］。リウマチ熱、急性糸球体腎炎、および強迫性障害の形態は、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓと関連する非化膿性続発症である［７］。１９８０年以来、世界中でリウマチ熱の発生が増大している［８］。稀ではあるが、リウマチ熱は、軟部組織へと深く侵入すると、重度の疾病へと進行する可能性がある［４］。
【０２４７】
全てのグラム陽性病原体のうちで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、処置するのが最も困難となっている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとは、ヒトにおける大半のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属感染を引き起こす、通性嫌気性のグラム陽性細菌である。ヒト前鼻孔（ｎａｒｅｓ（ｎｏｓｔｒｉｌｓ））は、侵入のためのさらなる部位として用いられる身体上の他の湿潤性の開口部と共に、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓによるコロニー形成の主要部位であることが典型的である［９〜１２］。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは、免疫障害性個体において重度の二次感染を引き起こすほか、他の点では健康な個体における疾患を引き起こすことが多い。皮膚感染および軟部組織感染（ＳＳＴＩ）に加えて、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは、敗血症、トキシックショック症候群、および壊疽性肺炎、壊疽性筋膜炎、ならびに化膿性筋炎、心内膜炎、および膿痂疹を引き起こしうる。これらの感染は通常、メチシリン、ムピロシン、またはバンコマイシンにより処置される。
【０２４８】
メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）など、多くのＳ．  ａｕｒｅｕｓ株が、標準的な処置として用いられる１または複数の抗生物質に対する耐性を発生させており［１３］、これらのＳ．  ａｕｒｅｕｓ株を、利用可能な抗微生物剤により処置することが、なおより困難となっている［１３］。多数の院内感染の原因病原体であるＭＲＳＡは、肺炎および敗血症を引き起こすＳ．  ａｕｒｅｕｓの院内分離株のうちの５０％超を占める［１４］。問題をさらに悪化させることに、ＭＲＳＡは、院内の患者間で容易に伝染する［１５］。集中治療室内の全ての菌血症例のうちの半数近くは、ＭＲＳＡにより引き起こされ、死亡率は３０〜４０％に上る［１６、１７］。ＭＲＳＡは、下気道感染、手術部位感染の主要原因であり、死亡例は米国だけで約１９，０００例／年に上る［１４、１８］。
【０２４９】
医療関連型ＭＲＳＡが感受性の患者に感染するのに対し、市中感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）感染は健康な個体において生じる［１９、２０］。ＣＡ−ＭＲＳＡ株は、毒性および伝染性がヒトおよび動物モデルにおける従来のＭＲＳＡ株より強く、より重度の疾患を引き起こすと思われる［２１〜２４］。欧州、北米、オセアニア、および他の領域では、異なるＣＡ−ＭＲＳＡ株が流行している［２０、２５、２６］。ＭＷ２株（パルスフィールドによるＵＳＡ４００型）とは、米国におけるＣＡ−ＭＲＳＡの初期発生に寄与し、したがって、流行をもたらした原型的ＣＡ−ＭＲＳＡである［１９、２７］。
【０２５０】
ベータ−溶血性グラム陽性連鎖球菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ））は、抗食作用性莢膜を、その主要な毒性因子として含有する［２８、２９］。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト消化器系内に存在する可能性があり、場合によって、女性のうちの３３％超において膣などの二次部位にコロニー形成する［３０、３１］。コロニー形成するＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、出産時の新生児に感染し、細菌性敗血症をもたらす可能性があり、初期発生型Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅを、４０年間超にわたり新生児における死亡の主要原因としている［３２〜３４、３５］。現行の実施上の基準は、母体を、耐性の可能性を助長する抗生物質へと曝露している。
【０２５１】
近年のグラム陽性病原体の発生は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属を伴い、２０１１年７〜１１月に、米国において２９名を死亡させている（１９７０年以来、米国で最も致死性の高い食物経由の疾病発生）［３６］。汚染された食物を摂取した後、大半の個体は、リステリア症に罹患し、抗生物質治療を伴う場合であっても、２０〜３０％の死亡率に直面している［３７、３８］。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属は、食物加工システムおよびヒトの消化管における生存が良好であり、ｐＨ、塩分、および温度の急速な変化へと容易に適合する［３７、３９、４０］。
【０２５２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（歯垢および虫歯）；Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（心内膜炎）；Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属；Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属；およびＳ．  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ（肺炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、心内膜炎、腹膜炎、および蜂巣炎）を含め、他の多くのグラム陽性ヒト病原体が存在する。
【０２５３】
人畜共通のグラム陽性病原体には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ（ウマ科動物、例えば、ウマにおける窒息（ｓｔｒａｎｇｌｅｓ）（上気道感染））；およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ（ブタおよびヒトにおける敗血症および髄膜炎）が含まれる。病原性Ｓ．ｓｕｉｓ血清型９  ７９９７株は、ブタからヒトへの人畜共通の伝染についての報告の増大と関連している［４１］。ヒトおよびブタは、ペニシリンまたはゲンタマイシンで処置されてきたが、これらの抗生物質に対して耐性であるＳ．ｓｕｉｓ分離株が存在する［４２］。Ｓ．ｓｕｉｓは、今後数年間においてヒト集団内で恒常的な存在となる可能性がある。
【０２５４】
これらのグラム陽性微生物の全てにおいて、抗生物質耐性が急激に増大している。したがって、細菌病原体を処置するための代替療法を開発しなければならない。新規の抗微生物剤供給源には、ファージ溶菌酵素（また、エンドリシンまたは「リシン」としても公知である）など、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス」）が含まれる。
【０２５５】
リシンは、近年、新規の抗菌剤として大きな関心を集めている（［１８、４３、４４］において総説されている）。バクテリオファージウイルスが宿主内部で複製された後、それらの子孫ウイルスは、逸出しなければならない。ファージは、細菌膜に小孔を開けるホリンと、細菌壁における結合を切断するリシンと呼ばれるペプチドグリカンヒドロラーゼとの両方をコードする［４５］。グラム陽性細菌は、それらの周囲に対して低張性であるので、細胞壁の破壊は、細菌の浸透圧溶解および子孫ウイルスの放出をもたらす［１８］。これらのペプチドグリカンヒドロラーゼ（多様な特異的結合を触媒する）は、事実上全ての二本鎖ＤＮＡファージによりコードされる。
【０２５６】
リシンは、細菌ゲノム内のウイルスプロファージ配列からクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて組換え発現させ、精製し、処置に用いることができる［４６］。体外適用する場合も、グラム陽性細菌種のペプチドグリカンは、細胞外空間と連続しているので、これらのタンパク質は、グラム陽性細菌細胞壁の結合に到達することが可能である［１８］。リシンは、いかなる公知の非化学的薬剤の生物学的化合物よりも急速に細菌を死滅させる［４７〜４９］。
【０２５７】
リシンは、多数のグラム陽性病原体（一般に、コードするファージが感染する種、または近縁の生物）に対する致死性の高い活性を顕示することが示されている［１８、４７］。潜在的なエンザイバイオティクス剤として提起されているリシンは、それらが特定の細菌に対して顕示する効力および特異性について注目に値する［４７、４８、５０、５１］。リシンは、それら自体では、宿主における正常な非病原性叢に対しては、広域作用型抗生物質ほど劇的な効果を及ぼさないものとする［１８］。現在のところ、複数の細菌病原体種に対してｉｎ  ｖｉｖｏにおける広範な活性を示すリシンは見られない。
【０２５８】
ＣｌｙＳ（本発明者らの研究室において既に開発されたブドウ球菌特異的なキメラリシン）を含め、ＭＲＳＡに対するリシンが開発されている［５０］。リシンは、ウイルスを介して、細菌に感染しようとする数十億年間にわたる進化的闘争において進化した。したがって、リシンには、正常な細菌機能にとって不可欠な特徴を選択しようとする選択圧が存在する（したがって、変化する可能性が低い）。
【０２５９】
Ｓ．ｓｕｉｓに感染する２つのファージが既に単離されており、研究されている。Ｈａｒｅｌらは、シホウイルスプロファージを血清型２  ８９−９９９株のゲノムから誘導したが、そのリシンの同一性は、依然として決定されていない［５２］。より近年になって、ＭａおよびＬｕは、溶菌性ファージを、健康なブタの鼻腔内スワブから単離し、その３６ｋｂのゲノムを配列決定した［５３］。このＳＭＰと称するファージは、限定された宿主範囲を顕示し、Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２内の２／２４株だけに感染した。後に同じグループがＰＣＲクローニングし、ＳＭＰリシンを組換えにより発現させた（ＬｙＳＭＰ）ところ、この酵素は、複数のＳ．ｓｕｉｓ（Ｓ．  ｓｉｕｉｓ）血清型に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶菌活性を顕示した。組換えタンパク質としてのＬｙＳＭＰは、それ自体で適正にフォールドせず、還元剤の存在下だけで活性であり、このため、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に対するその可能性が限定される可能性がある［５４］。
【０２６０】
ＮＣＢＩデータベースには、１１を超える完全なＳ．ｓｕｉｓゲノムが存在する。Ｓ．ｓｕｉｓ株の配列を解析して、潜在的なファージリシンの候補をプロファージ領域内で同定し、新たなＳ．ｓｕｉｓに由来するファージリシン（ＰｌｙＳｓ２と称する）を、最終的に同定し、単離し、クローニングし、特徴付けした（上記の実施例を参照されたい）。今日では、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するＰｌｙＳｓ２の急性活性を含め、さらなる特徴付けが提示されている。
【０２６１】
材料および方法
菌株：全ての株を−８０℃で保管した（表６）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種の株を、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地中で培養した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、ルリアベルターニ（Ｂｅｒｔａｉｎ）（ＬＢ）培地中で増殖させた。別段に言明しない限り、全ての培地は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）から入手した。細菌は、３７℃で維持した。一晩培養物は、３７℃、必要な場合は、２００ｒｐｍで振とうして増殖させた。
【０２６２】
【表６−１】
2019022504.tif 000010
【０２６３】
【表６−２】
2019022504.tif 000011
ＣＦＵ研究：対数期の細菌を、０．１のＯＤ６００（＝０．５マクファーランド≒１０８ＣＦＵ／ｍｌ）まで緩衝液Ａ中に再懸濁させた。ＰｌｙＳｓ２を、１２８μｇ／ｍｌで、ポリプロピレン製のマイクロ滴定プレート（Ｃｏｓｔａｒ）へと、各被験生物について三連で添加した。プレートを密封し、３７℃で５分間ごとに振とうしながら１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの１時間後、細胞を１０倍の増分で段階希釈し、ＢＨＩ上に播種した。各株につき三連ずつの対照実験を、ＰｌｙＳｓ２を置きかえる緩衝液Ｂにより実施した。
【０２６４】
ＭＩＣ研究：以下に詳述される補正を伴う、最小阻害濃度を決定するためのＷｉｅｇａｎｄらによるプロトコールに従った［５７］。滅菌濾過されたリシンまたはビヒクルを適切な濃度で添加した後、ＭＨＢ（またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓにはＢＨＩ）中に１ｍｌ当たり約５×１０５個の細胞による最終懸濁液が結果としてもたらされた［５７］。これらの被験物質を、９６ウェルマイクロ滴定プレート内に分配した。この実験では、丸型のポリスチレン製プレートウェルの底部におけるペレット形成を検出することにより、ＭＩＣを決定した。ＭＩＣはまた、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を伴う比色分析によっても確認した。
【０２６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル：Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより、全てのｉｎ  ｖｉｖｏプロトコールが承認された。複数のグラム陽性細菌に対するＰｌｙＳｓ２のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性について調べるために、Ｄａｎｉｅｌ，Ａ．らにおいて記載される全身性感染モデルを用いた［５０］。略述すると、４〜５週齢の雌ＦＶＢ／ＮＪマウス（重量範囲：１５〜２０ｇ）を、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。順応期間の後、マウスに、生理食塩水中５％のブタ胃粘素（Ｓｉｇｍａ）で希釈した、対数中期の（ＯＤ６００が０．５の）細菌０．５ｍｌを腹腔内（ＩＰ）注射した。細菌懸濁液は、１ｍｌ当たり約５×１０５ＣＦＵの、ＰＶＬ毒素をコードするＭＲＳＡ株であるＭＷ２、ヒトおよびマウスにおいて毒性（Ｍｕｓｓｅｒ）のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭ１血清型である、約１×１０７個のＭＧＡＳ５００５、または混合感染実験には、上記の濃度で同時に、両方の細菌の組合せを含有した。細菌の実際の接種力価は、各実験について、系列希釈およびＣｏｌｕｍｂｉａ血液寒天プレートへの播種により計算した。マウスは、１〜３時間以内に菌血症となり、それらの臓器（脾臓、肝臓、腎臓、および心臓／血液を含めた）内にＭＲＳＡおよび／またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓを含有した（［５０］、および未公表の観察）。感染の３時間後、動物を４〜５つの処置群へと分割し、２０ｍＭのリン酸緩衝液、２ｍｇ／ｍｌの連鎖球菌のリシンＰｌｙＣ［５９］、２ｍｇ／ｍｌのＣｌｙＳ［５０］、２〜４ｍｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２、または２ｍｇ／ｍｌのＰｌｙＣと２ｍｇ／ｍｌのＣｌｙＳとの組合せ０．５ｍｌを腹腔内投与した。生存率を、各実験群について、最初の２４時間は１２時間ごとに、次いで、感染の１０日後まで２４時間ごとにモニタリングした。データは、カプランマイヤー生存曲線、およびＰｒｉｓｍコンピュータプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて９５％の信頼区間にわたり実施されたログランク検定により統計学的に解析した。
【０２６６】
結果
ＰｌｙＳｓ２の広域の溶菌活性
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの被験株は全て、ＰｌｙＳｓ２による溶菌に対して高度に感受性であった（図２５）。これには、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、およびリソスタフィンに対して耐性の株が含まれる。バンコマイシン中間感受性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）およびＮｅｗｍａｎ株に対するＰｌｙＳｓ２活性は、他の株に対する場合ほど激しくはなかったが、それにもかかわらず、頑健であった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに加えて、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ）の感受性も良好であった。ＰｌｙＳｓ２は、その天然のＳ．ｓｕｉｓに対しては従来の活性を呈示した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の２つの株は、ＰｌｙＳｓ２による著明な溶菌を呈示したが、他のＬｉｓｔｅｒｉａ属株は、ＰｌｙＳｓ２による処置に対して不応性であった。ＰｌｙＳｓ２のＳ．  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ、Ｓ．  ｅｑｕｉ、ＩＩ型（莢膜型）Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ０９０Ｒに対する活性は、低度であった。ＰｌｙＳｓ２が、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの全ての株に対してもまた活性を有したことは注目に値する。これには、血清型Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６、Ｍ１８、Ｍ４９、およびＭタンパク質を伴わない改変体が含まれる。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの無莢膜型株、莢膜型株、およびムコイド株は全て、ＰｌｙＳｓ２に対して同等な感受性を提示した。
【０２６７】
上記の種より低度な溶菌を提示する種が数多く認められた。それらは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳ．  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓのうちの１つの株であった。Ｓ．  ｇｏｒｄｏｎｉｉは、ＰｌｙＳｓ２がそれに対して実質的な活性を有する唯一の片利共生細菌であった。グラム陰性ペプチドグリカンを取り巻く外膜は、予測される通り、ＰｌｙＳｓ２がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に対する活性を提示することを阻止した。
【０２６８】
ＰｌｙＳｓ２活性を、同じ細胞バッチを用いる同時的な対比試験により、ＣｌｙＳの活性と比較した（データは示さない）。各々の活性は同等であったが、ＰｌｙＳｓ２の方がはるかに扱いやすく、本発明者らは、ＭＲＳＡに対する治療剤としてのＰｌｙＳｓ２を引き続き追求した。従来、ファージリシンは、その宿主種以外の検体に対する顕著な活性の減少を顕示している。しかし、Ｓ．ｓｕｉｓ以外の細菌において広範な感受性が見られ、一部は、Ｓ．ｓｕｉｓより大きな感受性を顕示した。
【０２６９】
グラム陽性病原体に対するＰｌｙＳｓ２の有効性
ＰｌｙＳｓ２は、Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、およびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの数を低減する著明な活性を提示した（図２６）。ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの被験株全てを、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５の場合を超えて低減した。陰性対照であるＥ．  ｃｏｌｉの数は、ＰｌｙＳｓ２による処置後において低減されなかった。
【０２７０】
病原体に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣ
ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＳ．  ａｕｒｅｕｓに対して比較的低値であった（図２７）。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、類似するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣを記録した。陰性対照であるＥ．  ｃｏｌｉに対するＭＩＣは、計算するにはあまりに高値であった。
【０２７１】
混合ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによるマウス敗血症モデル
ＰｌｙＳｓ２の広域の溶菌活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、単独の、または混合感染としてのグラム陽性病原体による感染からの防御をもたらしうるのかどうかを決定するため、ＦＶＢ／ＮＪマウスに、約５×１０５ＣＦＵのＭＲＳＡ  ＭＷ２株、約１×１０７個のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ５００５株、および／または両方の細菌を同時に、上記の濃度で腹腔内注射した。３時間後に、マウスを、５つの処置群へと分け、２０ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍｇの対照ブドウ球菌のリシンであるＣｌｙＳ、１ｍｇの対照連鎖球菌のリシンであるＰｌｙＣ、１ｍｇのＣｌｙＳ＋１ｍｇのＰｌｙＣ、またはＰｌｙＳｓ２（ＭＲＳＡ感染には１ｍｇ、または連鎖球菌感染および混合感染のそれぞれには２ｍｇずつ）をＩＰ注射した。次いで、マウスを、生存について１０日間にわたりモニタリングした。４回の独立した実験に由来する結果を組み合わせ、マウスの生存データを、カプランマイヤー生存曲線によりプロットした（図２８）。
【０２７２】
ＭＲＳＡ感染単独の２４時間以内に、１８匹中１７匹の緩衝液対照マウス、および１２匹中１０匹のＰｌｙＣ連鎖球菌リシン処置マウスが、それらの臓器（脾臓、肝臓、腎臓、および心臓／血液を含めた）の全体にわたる細菌性敗血症により死亡した。ＰｌｙＳｓ２処置マウスで４８時間で死亡したのは、１８匹中２匹だけであり、残りのＰｌｙＳｓ２処置マウスは、１０日間の実験期間にわたり生存し、マウスによる結果は、ブドウ球菌特異的リシンと同等であった：ＣｌｙＳ（２８匹中２４匹、８６％）対ＰｌｙＳｓ２（１８匹中１６匹、８８％）（図２８Ａ）。
【０２７３】
Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ単独に感染したマウスは、より緩慢に死ぬ傾向にあり、１５匹中１４匹の緩衝液処置マウス、および１２匹中１２匹のＣｌｙｓブドウ球菌特異的リシン処置マウスは、それぞれ、３日目および４日目までに死亡した。これに対し、３日目に死亡したＰｌｙＳｓ２マウスは、１６匹中１匹だけであり、残りは生存して（１６匹中１５匹、９４％）、連鎖球菌特異的リシンであるＰｌｙＣ（１２匹中１２匹、１００％）と同等な結果をもたらした（図２８Ｂ）。混合細菌感染をシミュレートするために、マウスに、上記の細菌接種物に由来するＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの両方の混合物をＩＰ注射した。緩衝液または単一の特異的リシン対照による処置は、マウスの生存をそれほど延長させなかった。ＰｌｙＣ処置マウスの大半（１８匹中１５匹）および緩衝液処置マウスの大半（２３匹中２１匹）は、それぞれ、２４および４８時間以内に死亡した（図２８Ｃ）。一方、ＣｌｙＳで処置された混合感染動物の死は緩慢であり、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓだけに感染したマウスと同様、１６匹中１４匹が４日目までに死亡した。対照とは異なり、ＰｌｙＳｓ２処置マウスの大半は、混合感染を生き抜き（２４匹中２２匹、９２％）、Ｃｌｙｓ＋ＰｌｙＣの両方で同時に処置されたマウス（２０匹中１６匹、８０％）より良好ではないにせよ、同等であった（図２８Ｃ）。
【０２７４】
ＰｌｙＳｓ２は、ＭＲＳＡ株において、抗生物質と比べて急速な死滅を顕示する
全てがＰｌｙＳｓ２について類似のＭＩＣ値（約３２μｇ／ｍｌ）を顕示する複数のＭＲＳＡ株（２４５、２２３、９２６および９３２株）を、ＰｌｙＳｓ２と抗生物質であるバンコマイシン（１μｇ／ｍｌ）との間の直接的な比較により、対数による死滅について調べた。約５×１０５個の細菌の培養物を、ＰｌｙＳｓ２単独、バンコマイシン単独と組み合わせて、または添加剤と組み合わせずに、３７℃、２２５ｒｐｍで最長６時間にわたり振とうしながら、５０ｍｌの円錐管内のＭＨＢ培地中で増殖させる。多様な時点（１５分間後、３０分間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、および６時間後）において、アリコート試料（約３００μｌ）を取り出す。溶菌酵素または抗生物質を、木炭溶液を全てのアリコート試料へと添加することにより不活化する。試料を希釈し、寒天プレート上に播種して、細菌の生細胞カウントを決定する。対数によるＣＦＵの低減を、図２９に示す。ＰｌｙＳｓ２は、試験にかけられて図示される全てのＭＲＳＡ株に対して、標準治療抗生物質であるバンコマイシンと比べて増強された活性により、急速かつ有効な死滅をもたらす。
【０２７５】
考察
本明細書では、新規の天然Ｓ．ｓｕｉｓリシンである、ＰｌｙＳｓ２が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．  ａｕｒｅｕｓを含めた複数のグラム陽性病原体に対して広域の溶菌活性を提示することが裏付けられる。このリシンは、このような無差別な活性を提示する最初のリシンであり、既に特徴付けられたリシンは全て、狭いスペクトルの種に対して活性を提示する［４８、５０、６１〜６４］。ＣｌｙＳは、敗血性ＭＲＳＡ感染を除去することが示されている［５０］が、現在のところ、リシンが複数の敗血性感染を除去することは示されておらず、いかなる種類の混合感染を除去するリシンも見られていない。ＰｌｙＳｓ２がブドウ球菌および連鎖球菌による混合感染を除去する能力は、その広域の溶菌活性に由来する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰｌｙＳｓ２活性は、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するよりＭＲＳＡに対して頑健であるが、本明細書で提供されるｉｎ  ｖｉｖｏデータは、両方の細菌に対する有効な治療剤としてのその有効性を裏付ける。これは、基質への到達可能性に影響を及ぼすＳ．  ａｕｒｅｕｓの細胞壁の構造または組成の、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの細胞壁の構造または組成と比較した差違に起因しうる。ＰｌｙＳｓ２が活性を有するグラム陽性病原体の全ては、従来の抗生物質に対する耐性を発生させている。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＭＲＳＡのいずれも、ＰｌｙＳｓ２に対する耐性を確立することが可能ではなかった。
【０２７６】
多くのリシン（ＰｌｙＳｓ２を含めた）の強みは、それらの特異性である。抗生物質は、非特異的に作用し、標的の病原体と共に片利共生微生物も死滅させる。これは、多くの負の副作用（例えば、下痢）を結果としてもたらし、抗生物質は、日和見病原体（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が、全く新たな感染を引き起こすことを可能としうる。リシンは、微生物叢の全体を破壊することなく、単一の病原体を処置するのに用いることができる［１８］。多くの既に記載されているリシンの特異性はまた、複数の病原体を処置するのに複数のリシンが必要とされる点で限界でもありうる。本発明者らの知見は、多くの病原体を処置する一方で、ある程度の特異性を保持するのに用いうる単一のリシンを提示する。ＰｌｙＳｓ２は、多様なグラム陽性病原体に対して活性であるが、グラム陰性体には影響を及ぼさない。
【０２７７】
ＰｌｙＳｓ２は、猩紅熱；丹毒；蜂巣炎；壊疽性筋膜炎；心内膜炎；菌血症／敗血症；多様な膿瘍形成型ＳＳＴＩおよび非膿瘍形成型ＳＳＴＩ；ならびに膿痂疹など、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓおよび／またはＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓにより引き起こされる感染症に対する実行可能な処置として用いられうる。また、ＰｌｙＳｓ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００５に対するより大きな活性を提示するために、新生児の敗血症および食物経由の疾病に対する処置も適用可能である（図２５〜２７）。
【０２７８】
リシンとして、ＰｌｙＳｓ２は、その標的を急速に死滅させ、これは、抗生物質よりはるかに急速である（図２９）。その効果を媒介するためには、ＰｌｙＳｓ２を、外側細胞壁の結合に接触させるだけでよい；従来の抗生物質は、高い濃度で長期間にわたり保持しなければならず、その結果として、大きな副作用がもたらされた。この特徴により、ファージリシンは、過去に全身性感染を処置することが可能となった［４８、６１］。本明細書で裏付けられる通り、ＰｌｙＳｓ２は、ＰｌｙＳｓ２の単回投与を用いて、敗血性ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる感染を、高い百分率でマウスから除去することが可能であった。加えて、敗血性ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染も、ＰｌｙＳｓ２の単回投与により、対照の場合の約４％の除去と比較して、約９２％のマウスから除去された。死滅または除去のさらなる増強は、用量を増大させることから得ることもでき、投与を反復することから得ることもできる。
【０２７９】
ＰｌｙＳｓ２は、既に開発されているリシンより扱いやすく安定的である。ＰｌｙＳｓ２の調製は単純であり、少数のステップで大きな量がもたらされる。加えて、高度に可溶性のリシンは、それが高濃度での容易な使用を可能とするために、不可欠でもある。ＰｌｙＳｓ２が、数分間で標的生物の対数倍の死滅をもたらすのに必要とされる濃度より何桁か大きな濃度である、２０ｍｇ／ｍｌを超える濃度でも可溶性のまま保持されることは注目に値する（データは示さない）。ＰｌｙＳｓ２はまた、リシンを評価するために開発された多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいても良好に挙動する。ＰｌｙＳｓ２は、長期間にわたり高温下または低温下に置くことができ、凍結−融解を繰り返した場合であっても、その活性に対してほとんど影響が及ばない。ＰｌｙＳｓ２の安定性は、治療剤としての生産および市販に高度に適する。
【０２８０】
ＰｌｙＳｓ２活性に対してＤＴＴが影響を及ぼさないことから、［１］そのリシンは、ジスルフィド架橋に依拠しないこと、および［２］それは、組換え発現および精製の後で、適正にフォールドしたことの両方が示される。ＬｙＳＭＰが使用前に還元剤で処理しなければならなかったことを踏まえると、後者の点は有意である［５４］。２つの相同リシン間のこの不一致の理由は不明であるが、これらのタンパク質間で多数の可変システイン残基が関与している可能性がある。ＥＤＴＡにより誘導されるＰｌｙＳｓ２の阻害は、ＰｌｙＳｓ２が補因子としての二価カチオンに依拠しうることを示唆する。
【０２８１】
２つのリシンは、多数の種に対して溶菌活性を有することが既に示されているが、いずれのリシンも、複数の種に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏでは調べられておらず［６５、６６］、各リシンが、それがクローニングされた種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属またはＢ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に対してより大きな活性を保持したのに対し、ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ｓｕｉｓよりＳ．  ａｕｒｅｕｓに対してより大きな活性を有する。
【０２８２】
ＰｌｙＳｓ２がプロファージ溶菌酵素構造の異なるクラスを表すことは、その新規の広域の溶菌活性と符合する。ＣＨＡＰドメインは、複数の既に特徴付けされた連鎖球菌［５９、６７］のファージリシン内およびブドウ球菌［５０、６８］のファージリシン内に包含される。しかし、一次配列レベルでは、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインが、他のデータベースのＣＨＡＰドメイン（全て対応のあるＥ値＞１０−１５）とはやや異なる。図３０では、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインを、十分に特徴付けされた連鎖球菌のＰｌｙＣリシンのＣＨＡＰドメインと共に整列させることから、保存的な触媒残基が顕示されているが、全体としては中等レベルの同一性（２８％の配列同一性、Ｅ値＝１０−８）が顕示されるにとどまる［５９］。
【０２８３】
ＣＨＡＰドメインは、触媒的に様々であり、特定のリシンに応じて、アラニン−アミダーゼ活性［４７］または架橋エンドペプチダーゼ活性［５０］を保有しうる。さらに、Ｓ．ｓｕｉｓ内のペプチドグリカン架橋の分子的性格は、株間で変化しうる［６９］。ＣＨＡＰドメインは、ＰｌｙＳｓ２の触媒活性を媒介するが、特異性を完全に付与するわけではない。ファージリシン結合ドメインが、リシンの特異性を決定すると考えられている［７０、７１］。リソスタフィンは、細菌細胞壁のペプチドグリカン中の架橋におそらく結合するＳＨ３様結合ドメインを含有する［７１］。ＳＨ３ドメインは一般に、ウイルス性および細菌性の細胞壁結合タンパク質中で見られるが、正確な分子標的は、依然として未知である［７２］。ＳＨ３ｂ（ＳＨ３ドメインの細菌性相同体）は、金属およびポリペプチドに結合することが示されている［７３、７４］。Ｂ．  ｃｅｒｅｕｓエンドペプチダーゼのＳＨ３ｂドメインは、ペプチドグリカンステム内のＮ末端アラニンの遊離アミン基に結合することが示されており［７５］、このアミン基は、ＰｌｙＳｓ２のＳＨ３ｂドメインの可能な基質である。架橋は、全てのＰｌｙＳｓ２感受性の検体間で大きく変化するので、それがＰｌｙＳｓ２のＳＨ３結合ドメインの標的である可能性は低い。これらの架橋は、リソスタフィン耐性をもたらす変異を獲得しうるが、ＰｌｙＳｓ２が、リソスタフィン感受性のＳ．  ａｕｒｅｕｓ株およびリソスタフィン耐性のＳ．  ａｕｒｅｕｓ株（ＬｙｒＡ）の両方に対して活性を提示したことは注目に値する。
【０２８４】
ＰｌｙＳｓ２は、２つの異なる系統発生目：Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属など）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属など）に対する活性を有する。ペプチドグリカンステムは、これらの２つの目の間で類似しているが、それらの架橋は、組成および長さが大きく変化する［７６、７７］。以前、ファージリシンは、異なる科または属に対する活性を提示していない（そして、異なる種に対しても稀である）［５０］。天然のファージリシンは通常、天然のファージが感染する種に対する種特異性を示す［４８、６１］。メチシリンに対して耐性の株（ＭＲＳＡ）、バンコマイシンに対して耐性の株（ＶＩＳＡ）、ムピロシン、ダプトマイシン、およびリソスタフィンに対して耐性の株を含め、全ての被験Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株は、ＰｌｙＳｓ２に誘導される溶菌に対して感受性であった。ＰｌｙＳｓ２は、病原性Ｓ．ｓｕｉｓ  ７９９７も類似の有効性で溶解させた。溶菌が、試験された６株中２株だけであったので、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に対するＰｌｙＳｓ２活性は、それほど決定的ではなかった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉに対するＰｌｙＳｓ２活性は、結合ドメインの基質が架橋の外側に存在することのさらなる証拠をもたらす。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ周囲の多糖莢膜は、その毒性を増強する。ＩＩ型Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、大半のものよりも厚い莢膜を有し、したがって、より高レベルの毒性を有する［２８］。莢膜が薄いＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ株は、毒性が小さい［２９、７８］。ＰｌｙＳｓ２は、莢膜を伴うＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよび莢膜を伴わないＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ：ＩＩ型Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ０９０Ｒに対して同等な活性を有する。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓには、２００を超えるＭ型が存在する［４］。注目すべきことに、ＰｌｙＳｓ２は、本発明者らがそれらに対してＰｌｙＳｓ２を調べた全てのＭ型に対して活性を有する。Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓに対するＰｌｙＳｓ２活性は、それが歯垢を処置する可能性を示す。ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．  ｇｏｒｄｏｎｉｉに対する活性を提示するが、片利共生細菌であるＳ．  ｏｒａｌｉｓおよびＳ．  ｍｕｔａｎｓに対して提示する活性は小さい。Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ．  ｆａｃａｅｌｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．  ｒａｔｔｕｓ、およびＳ．  ｓｏｂｒｉｎｕｓに対しては中程度量の活性が認められる。Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの他の株は、それほど感受性ではなかった。一連の多剤耐性ＭＲＳＡ、莢膜厚型Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、および他の多数の毒性病原体に対するＰｌｙＳｓ２活性は、それを極めて重要な治療剤候補物質とする。注目すべきことに、ＰｌｙＳｓ２は、薬物耐性、莢膜形成、およびバイオフィルムの創出で異なる多様な株のＣＦＵを低減することが可能であった。ムコイド型Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ４に対するＰｌｙＳｓ２活性は、他の��意の被験Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓについて観察される活性より強力であった。さらに、ＰｌｙＳｓ２は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対しても、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するより大きな活性を示した（これらから敗血性マウスを防御することが可能であった）。ＰｌｙＳｓ２のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する有効性を踏まえると、ＰｌｙＳｓ２は、これらの他の病原体のうちのいずれに対する治療剤としても用いられうる。ＭＩＣの結果により、ＣＦＵによる知見が確認された。
【０２８５】
マウス研究では、単独感染動物により、ＰｌｙＳｓ２が、複数の細菌種の感染に対して独立に防御することができることが裏付けられる。混合感染では、特異的リシン対照（ＰｌｙＣおよびＣｌｙＳ）により、ＰｌｙＳｓ２がマウスを混合感染または二重感染におけるいずれの生物からも防御することが示される。ＰｌｙＣまたはＣｌｙＳを用いて混合モデルにおける感染性病原体のうちの１つだけを処置したところ、やはり動物の死亡が結果としてもたらされた。さらに、動物は、単独感染した非処置対照と同じ時間枠で死亡する。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓは、ヒトにおける感染病態および感染部位が類似する疾患を引き起こす。場合によって、医療従事者は、当初どの生物が、重度の外傷症例における混合感染でありうる疾患を引き起こしているのかわからない。重度の侵襲性Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染は、抗生物質による処置が容易ではない［８２］。場合によって、それらは、手術手順を要求する［８２］。本発明者らの敗血性モデルにおいて用いられるＭ１血清型は、世界中で連鎖球菌性咽頭炎および侵襲性疾患を引き起こすことが見出される主要な臨床分離株のうちの１つである［８３、８４］。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓは、上皮表面を通り抜けることが可能であり、侵襲性細菌血症をもたらす［８３］。この内部感染および他の重度の内部感染は、症例の１９％において１週間未満に結果として死をもたらす［８５］。多くの場合、ＳＳＴＩまたは膿痂疹の背後にある原因病原体がＳ．  ａｕｒｅｕｓであるのか、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓであるのかはわからない。
【０２８６】
病原性標的（ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が、ＰｌｙＳｓ２に対する耐性を確立できないことは、ＰｌｙＧを含めた他のリシンについての知見と符合する［６１］。現在のところ、外因的にリシンを分解しうる分子は同定されていない。ペプチドグリカンの性格を踏まえると、病原体が標的部位を容易に変化させうる可能性は低い。耐性の確率が極めて低いことが、ＰｌｙＳｓ２を有力な治療剤とする。ムピロシンおよびポリスポリンは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを処置するために施されることが典型的であるが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは、各々に対する耐性を発生させうる。ムピロシンおよびポリスポリンは、粘膜においてコロニー形成する病原性細菌を低減するのに施される唯一の抗感染剤である［８６］。ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質に対して耐性な病原性細菌のヒト粘膜における貯蔵庫を予防的に除去するのに用いることができる。ペニシリンは、急性の感受性を保持するＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓを処置するのに用いることができるが、ＭＲＳＡにより膿痂疹が引き起こされると、ペニシリンは無効となりうる。
【０２８７】
近年の研究は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＭＲＳＡにより引き起こされる二次感染が、インフルエンザの大流行による死亡の＞９０％を占めることを示す［９２、９３］。２０１０  Ｈ１Ｎ１の大流行時の症例のうちの３０％近くでは、同じ病原体が、合併症を引き起こした［９４］。予防的使用であれば、これらの致死率を低下させうるであろう。ＰｌｙＳｓ２は、一次感染を処置し、二次感染の可能性を予防的に低下させうる。
【０２８８】
病原体を同定する前の標準ケアは、感染の性格および環境を踏まえ、最も可能性が高い候補を処置することである［９５、９６］。これらの病原体の多く、とりわけ、ＭＲＳＡは、従来および新規の抗生物質、とりわけ、ベータ−ラクタムに対する耐性を容易に発生させる。ＭＲＳＡはまた、より新しい薬剤である糖ペプチドのオキサゾリジノンに対しても耐性である［９７、９８］。ＰｌｙＳｓ２は、グラム陽性病原体に対する特異性を有するが、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＭＲＳＡ、および他の主要な病原体を広く処置しうるであろう。
【０２８９】
処置としてのＰｌｙＳｓ２であれば、グラム陰性細菌に害を及ぼすことなく、病原体を標的とするであろう。この新規の能力は、異なるＣＨＡＰドメインおよび固有のＳＨ３結合ドメインに存する。抗生物質は、標的の病原体に加えて多くの種を死滅させる。かつてなら、リシンを用いうるのは、１つの病原性種に対してだけであったろう。ＰｌｙＳｓ２は、堅固なリシンの特異性と非選択的な抗生物質活性との間のスペクトルで必須の領域を占める。治療剤は、片利共生細菌に影響を及ぼさずに、全ての主要な病原体に対する活性を有することが理想的であるが、ＰｌｙＳｓ２は、リシンがその機能に役立ちうることを示す最初の治療剤である。ＰｌｙＳｓ２とは、ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、Ｓ．ｓｕｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓ．  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓ．  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ、Ｓ．  ｅｑｕｉ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ、およびＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する広域の溶菌活性を伴うリシンである。ＰｌｙＳｓ２は、作製が容易であり、扱いやすく、極めて安定的である。ＰｌｙＳｓ２は、敗血性マウスを、ＭＲＳＡおよびＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓによる混合感染から防御し、これらの病原体のうちのいずれもＰｌｙＳｓ２に対する耐性を確立することが可能でなかった。
【０２９０】
参考文献
【０２９１】
【化４】
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【０２９２】
【化５】
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【０２９３】
【化６】
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【０２９４】
【化７】
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【０２９５】
【化８】
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【化９】
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本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱しない限りにおいて、他の形態で実施することもでき、他の方式で実行することもできる。したがって、本開示は、全ての態様
において、例示的なものであり、制限的なものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲により示されると考えられたい。同等性の意味および範囲内に収まる全ての変化をその中に包含することを意図する。
【０２９６】
本明細書の全体では、多様な参考文献が引用され、それらの各々は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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