(57)【要約】      （修正有）【課題】２型糖尿病、嚢胞性線維症、Ｃ型肝炎及び脂肪過多からなる群より選択されるα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物の提供。【解決手段】少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-グルコシダーゼを阻害するための、少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含む組成物。
【請求項２】
２型糖尿病、嚢胞性線維症、Ｃ型肝炎及び脂肪過多からなる群より選択されるα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのVAPペプチド及び/又は少なくとも１つのAPペプチドを含む、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
APX'型ペプチド(Aはアラニンアミノ酸であり、Pはプロリンアミノ酸であり、X'はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩又はアスパラギン酸、システイン、グルタミン酸塩又はグルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンから選択されるアミノ酸又は一群のアミノ酸である)と組み合わせて、少なくとも１つのVAPペプチド及び/又は少なくとも１つのAPペプチドを含む、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
単位形態であり、約5mg〜2250mg又は約>2250mg〜3000mgの量のXAPペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
【請求項６】
約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド、及び/又は約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のAPペプチド、及び/又は約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチド、特に約5mg〜約7.4mgの量若しくは約7.5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド及び/又はAPペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
【請求項７】
単位形態であり、医薬的に許容され得るビヒクルと共に、約5mg〜約7.4mgの量のXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含み、特にVAPペプチドを含むときにビタミンBを欠いている、医薬組成物。
【請求項８】
約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド、及び/又は約5mg〜約7.4mgの量のAPペプチド、及び/又は約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１以上のアミラーゼ阻害剤及び/又は１以上のリパーゼ阻害剤を含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、特に少なくともVAPペプチドであるか、又は少なくともAPペプチドであるか、又は少なくともVAPペプチド及び少なくともAPペプチドである少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)の使用。
【請求項１１】
少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含み、単位形態であり、約5mg〜<50mg又は約50mg〜約1000mgの量のXAPペプチドを含み、特にVAPペプチドを含むときにビタミンBを欠いている、α-グルコシダーゼを阻害するための栄養補助食品組成物又は食品組成物。
【請求項１２】
約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド、及び/又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のAPペプチド、及び/又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含む、請求項１１に記載の栄養補助食品組成物又は食品組成物。
【請求項１３】
α-グルコシダーゼを阻害するための、少なくとも0.05％〜<５％若しくは少なくとも５％のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなり、該加水分解物はXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)である組成物。
【請求項１４】
２型糖尿病、嚢胞性線維症、Ｃ型肝炎及び脂肪過多からなる群より選択されるα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つのAPX’型ペプチド(Aはアラニンアミノ酸であり、Pはプロリンアミノ酸であり、X'はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩又はアスパラギン酸、システイン、グルタミン酸塩又はグルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンから選択されるアミノ酸又は一群のアミノ酸である)と組み合わせての請求項１３又は１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、少なくとも0.05％〜<５％若しくは少なくとも５％のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物(該加水分解物はXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)である)の使用。
【請求項１７】
少なくとも0.05％〜<５％若しくは少なくとも５％のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物により構成され、該加水分解物はXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)である、α-グルコシダーゼを阻害するための栄養補助食品組成物又は食品組成物。
【請求項１８】
‐  少なくとも0.05％〜<５％若しくは少なくとも５％のXAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質を水に溶解させ、水溶液を得る工程と；
‐  前記水溶液に少なくとも１つの酵素を適量添加し、前記タンパク質を加水分解する工程と：
を含む、少なくとも0.05％〜<５％若しくは少なくとも５％のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物(該加水分解物はXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)である)の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の予防及び/又は治療のための組成物の使用に関する。
本発明は、２型糖尿病の予防及び/又は治療のための組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病は、糖尿病の最もありふれた病態である。これは、慢性的高血糖、すなわち異常に高い血中の糖濃度(血糖値)により特徴付けられる、慢性的な進行性の代謝の病的状態である。インスリン抵抗性及び所与の代謝状態に応答しての不十分なインスリン分泌が主な原因であるが、その他の要因、例えば座ることの多い生活が慢性的高血糖の状態に関与し得る。
２型糖尿病は、主要な公衆衛生上の問題になっている。多くの工業国では、既知の症例の糖尿病の有病率は、45〜64歳の人において6〜7%であり、徐々に増加して80歳以上の人においては20%を越えている。
【０００３】
２型糖尿病を治療及び/又は予防するための様々な種類の製品が既に知られている。特に酵素阻害剤、とりわけジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤又はα-グルコシダーゼ阻害剤が提案されている。
ジペプチジルペプチダーゼIV及びα-グルコシダーゼは、いずれも食後血糖低減効果を有するが、これらの酵素は、無関係な異なる作用機序を有する。よって、α-グルコシダーゼ阻害剤がジペプチジルペプチダーゼIVを阻害すること、及びジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤がα-グルコシダーゼを阻害することは自明ではない。
【０００４】
事実、ジペプチジルペプチダーゼIV (DPP-IV)は、多くの組織、とりわけペプチドの分解に関与する組織(特に腎臓、消化管、肝臓及び胆管、子宮、前立腺及び皮膚)において発現する多機能性の膜貫通型糖タンパク質である。この糖タンパク質は３つの生物学的特性(アデノシンデアミナーゼ(ADA)を結合する特性、細胞外マトリクスへの細胞の結合に寄与する特性及びペプチターゼとしての特性)を有する。
【０００５】
ペプチターゼとして、ジペプチジルペプチダーゼIV は、特にグルカゴン様ペプチド1 (GLP-1)などのホルモンを切断する。GLP-1は、インクレチン、すなわち食事に応答して回腸のL細胞により分泌される腸ホルモンである。GLP-1の役割の１つは、インスリン分泌を促進させて食後血糖を低減させることである。しかしながら、GLP-1は、DPP-IVにより血漿中で急速に分解されるので、約１分又は２分の短い半減期を有する。
【０００６】
ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害により、GLP-1の循環半減期を増大させることが可能になり、かくして、GLP-1は、より長時間活性となる。このことは、食後血糖を低減させるためにインスリン分泌が延長されることに反映される。
【０００７】
かくして、ジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤、特に国際出願WO2006/068480号に記載されるようなタンパク質加水分解物由来のペプチドが提案されている。
α-グルコシダーゼ酵素は、グルコース代謝に関与する４つの酵素(マルターゼ、サッカラーゼ、グルコアミラーゼ及びイソマルターゼ)に亜群分類できる。これらの酵素の全てが小腸の絨毛の表面に位置しており、複雑な多糖を吸収可能な単糖(グルコース)に変換する。
【０００８】
事実、吸収される多糖は、唾液アミラーゼ及び膵臓アミラーゼによって二糖(スクロース、ラクトース又はマルトース)に分解され、その後α-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼ(ラクターゼ及びインベルターゼ)によって吸収可能な単糖に分解される。
【０００９】
マルターゼ及びイソマルターゼは、マルトース及びデキストリンのグルコースへの加水分解を触媒する。
サッカラーゼは、スクロースをフルクトース分子とグルコース分子とに分ける。
グルコアミラーゼは、マルトトリオース及びデキストリンのグルコースへの加水分解を触媒する。
ラクターゼは、ラクトースのグルコース及びガラクトースへの解離を促進する。
インベルターゼは、サッカラーゼファミリーに属するβ-フルクトフラノシダーゼであり、したがって、スクロースを加水分解する。
【００１０】
既知のα-グルコシダーゼ阻害剤には、日本国特許出願JPH10-292000号に記載されるような生物活性ペプチド、例えばペプチドIle-Ile-Ser-Ile-Gly; Ile-Ile-Ser-Ile-Gly-Arg; Val-Phe-Ile-Lys-Ala-Ala; Val-Phe-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala及びVal-Phe-Ile-Lys-Ala、又は化合物、例えばアカルボース (フランスでは商品名グルコール及びヨーロッパではグルコバイ(登録商標)でBayer AGにより販売)及びミグリトール(ヨーロッパでは商品名ジアストボール(登録商標)で販売)がある。
【００１１】
アカルボース及びミグリトールの両方が、α-グルコシダーゼ、特にサッカラーゼを競合的かつ可逆的に阻害する(サッカラーゼについてのそれらのIC50は、それぞれ0.5μM及び0.19μMである)。それら化合物は、糖消化の最終段階を阻害する。糖は、吸収されないので、腸を通過し続け、結腸で細菌により発酵されて揮発性脂肪酸となるか、又は排泄物として排除される。したがって、それら化合物は、糖消化を遅延させ、糖吸収を低減させることを可能にし、短期的には食後血糖の低減を、中期的には糖化ヘモグロビンの低減をもたらす。
【００１２】
しかしながら、これら２つの化合物には、腸における未消化の糖の停滞及び発酵に起因する副作用、具体的には腹痛、膨満、鼓腸及び下痢などの消化系障害がある。さらに、これらの化合物は、平均で、糖化ヘモグロビンを0.5〜1%低減させる(これは、平均的に、0.17〜0.35g/Lの血漿中血糖値の低下として反映される)ことを可能にするに過ぎない。
【００１３】
比較すると、栄養補助食品として用いられるα-アミラーゼ(長鎖炭水化物の加水分解を担う酵素)阻害剤の方が、糖化ヘモグロビンをより大幅に低減させることができる。かくして、炭水化物が豊富な食事(白色のパン)を摂る前に、DIALPHA社が販売するシナモン抽出物であるMealShape(登録商標)を500mgの用量で２回消費すると、食後血糖値が約20%低下する(曲線下面積を1時間にわたって測定し、健常ボランティアにおけるプラセボと比較；査読付きの科学誌としててはないが、公表されたDIALPHA社のデータ)。MealShape (登録商標)は、国際出願WO2012/085266 A2号の主題であった。同様に、類似の条件下で、3000mgのStarchLite(登録商標)粉末を摂取することが、ある食物の血糖指数の約30%の低下を誘導するようである(Udani JKら、Nutr J 2009, 8: 52)。StarchLite (登録商標)は、Ingredia Nutritional社が販売するシロマメ(ファセオラス  ヴルガリス(Phaseolus vulgaris))の抽出物である。
【００１４】
しかしながら、MealShape (登録商標)及びStarchLite (登録商標)は、栄養補助食品分野又は食品分野でのみ用いられ、治療分野では用いられない。さらに、シナモン又はシナモン抽出物の大量消費は有毒であり得ることが文献に記載されている(マウスにおける半数致死量(LD50)は0.196g／kgである)。
【００１５】
さらに、酵素阻害剤である生物活性ペプチドは、２型糖尿病の予防及び/又は治療以外の分野でも用いられている。これに関連して、VAPペプチド(バリン-アラニン-プロリントリペプチド)及びAPペプチド(アラニン-プロリンジペプチド)は、アンジオテンシン変換酵素に対して阻害活性を有することが特に知られている(例えば、Maruyamaら, Agric. Biol. Chem., 51 (6), 1581-1586, 1987の文献及びCheungら, J. Biol. Chem. 1980, 255: 401-407の文献又は国際出願WO2006/084560号を参照)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、既存の治療と比べて副作用が少ない、２型糖尿病の治療及び/又は予防のための血糖降下分子を提供する現実的ニーズがある。
また、先行技術のものより効果的な、２型糖尿病の治療及び/又は予防のための血糖降下分子を提供する現実的ニーズがある。
また、２型糖尿病の治療及び/又は予防において、治療分野だけでなく、食品及び/又は栄養補助食品分野でも用いることができる血糖降下分子を提供する現実的ニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
かくして、本発明は、先行技術のものより効果的で、より天然に近い血糖降下分子を提供することを目的とする。
また、本発明は、治療分野と食品及び/又は栄養補助食品分野との両方で用いることができる血糖降下分子を提供することを目的とする。
【００１８】
かくして、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態、特に２型糖尿病の治療及び/又は予防のための、α-グルコシダーゼ阻害剤であるペプチドを含む組成物に関する。
また、本発明は、かかるペプチドを含む医薬組成物に関する。
また、本発明は、栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、かかるペプチドの使用に関する。
また、本発明は、かかるペプチドを含む栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
【００１９】
最後に、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態、特に２型糖尿病の治療及び/又は予防のための、α-グルコシダーゼ阻害剤であるアミノ酸ユニットをそのアミノ酸配列中に有する少なくとも１つのタンパク質の加水分解物を含む組成物に関する。
また、本発明は、かかる加水分解物を含む医薬組成物に関する。
また、本発明は、栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、かかる加水分解物の使用に関する。
また、本発明は、かかる加水分解物を含む栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アカルボース濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
【図２】APペプチド濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
【図３】VAPペプチド濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
【図４】種々の濃度のペプチド阻害剤LKPの存在下におけるp-NPG（p-ニトロフェニルグルコピラノシド）の加水分解反応についてのLineweaver-Burk線形近似を示す。
【図５】種々の濃度のペプチド阻害剤APの存在下におけるp-NPG（p-ニトロフェニルグルコピラノシド）の加水分解反応についてのLineweaver-Burk線形近似を示す。
【図６】マルトース耐性試験中の血糖値の変化(生の値、すなわち総血糖値)を示す。
【図７】マルトース耐性経口試験から安静時の値を差し引いた最大血糖値を示す。
【図８】試験された上記の4つの群（Ctrl、AP、VAP、AP＋VAP）の結果について、安静時の値を差し引いた曲面下面積を表す。
【図９】ヤギホエー由来のタンパク質の加水分解により得られる低分子量のペプチドの分画及び濃縮に用いた方法を示す。
【図１０】pHが調整されたか、又は調整されていない酵素(フレーバザイム又はプロタメックス)により産生されたタンパク質加水分解物の質量プロファイルを示す。
【図１１】超純水中のフレーバザイムによるLCからの加水分解物の、Waters BEHカラムを用いてのLC-MS分析(HPLC-MS)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
第１の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防において用いるための、少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチドからなる組成物に関する。
「Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す」との表現は、XAPがVAPトリペプチド又はAPジペプチドであり得ることを意味する。
【００２２】
VAPトリペプチドは、バリン、アラニン、プロリンの順の３つのアミノ酸配列で構成される。アミノ酸はペプチド結合で結合している。プロリンはC末端側に位置する。
APジペプチドは、アラニン、プロリンの順の２つのアミノ酸配列で構成される。アミノ酸はペプチド結合で結合している。プロリンはC末端側に位置する。
上記のVAPペプチド及びAPペプチドは、食後の血糖に作用することができ、特にこれを低減させることができる。
【００２３】
上記のVAPペプチド及びAPペプチドにおいて、バリン、アラニン及びプロリンのアミノ酸は、左旋性であってもよいし、右旋性であってもよい。
本発明のペプチドの連続するアミノ酸残基は、好ましくは、すべて左旋性異性体により構成される。しかしながら、上記のペプチドの１以上のアミノ酸残基は右旋性の形態であってもよい。このことが、生分解性の低い生成物をもたらす。
本発明の具体的かつ好ましい態様では、用いられるペプチドは、APペプチドである。
本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼは、マルターゼ又はサッカラーゼである。
【００２４】
かくして、本発明者らは、驚くべきことに、VAPペプチド又はAPペプチドがα-グルコシダーゼ阻害剤、特にマルターゼ阻害剤として非常に強い活性を有すること、具体的には、２つの参照用α-グルコシダーゼ阻害剤であるアカルボース及びミグリトールと比較して、それぞれ約600倍及び約900倍低い、α‐グルコシダーゼ、特にマルターゼの阻害濃度の中央値を有することを見出した。
【００２５】
本発明の具体的態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ阻害剤として使用するための少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチドにより構成される組成物に関する。
事実、本発明は、α-グルコシダーゼ阻害剤として使用するためのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)にも関する。
【００２６】
VAPペプチド及びAPペプチドの阻害活性は、例えば以下のプロトコールに従ってインビトロで測定できる：
-  10% DMSO (ジメチルスルホキシド)を含む脱イオン水に検査対象のペプチド又はコントロールの分子(例えば、今回の場合はVAPペプチド又はAPペプチド及びアカルボース又はミグリトール)を可溶化する；
-  0.1mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)中最終濃度0.2 U/mLのα-グルコシダーゼ20μLを、種々の濃度(0.01〜50 mmol/L)のペプチド、アカルボース又はミグリトールのサンプル8μLと混合する。ここで、参照用α-グルコシダーゼ阻害剤と考えられている市販の合成阻害剤であるアカルボース又はミグリトールは、ポジティブコントロールとして用いる；
-  37℃で20分間インキュベートする；
-  (上記と同じ緩衝液中に調製された)2.5 mMのp‐NPG（p-ニトロフェニルグルコピラノシド）基質20μLを混合液に添加して、反応を開始させる；
-  37℃で30分間インキュベートする；
-  0.3 Mの炭酸ナトリウム(Na2CO3)溶液80μLを添加して反応を停止させる；
-  形成された生成物(黄色のp-ニトロフェニル(p-NP))の量を分光法(410 nmにおける吸光度、VersaMax(商標)、Microplate Reader)で測定する。好ましくは、アッセイは96ウェルマイクロプレート中で3回行う。
-  以下の式から、阻害パーセンテージを算出する：
【数１】
2019189647.tif 000002
(式中、
・  ODsample assayは、「サンプル＋酵素＋基質」の混合液について得られた光学密度に相当し、
・  ODsample assay blankは、「サンプル＋緩衝液」の混合液について得られた光学密度に相当し、
・  ODcontrol assayは、「緩衝液＋酵素＋基質」の混合液について得られた光学密度に相当し、
・  ODcontrol blankは、緩衝液について得られた光学密度に相当する。)
【００２７】
VAPペプチド及びAPペプチドの阻害活性は、例えば以下のプロトコールに従ってインビボで測定できる：
VAPペプチド及びAPペプチドの阻害活性及び血糖応答に対するVAPペプチド及びAPペプチドの効果は、db/dbマウスにおけるスクロース耐性及びマルトース耐性のインビボ経口試験で測定できる。
4週齢のマウスが用いられ、各マウスは、それ自体がコントロールである。
スクロース及び/又はマルトース(4g/kg)耐性について５つの経口試験を最小72時間の間隔で各マウスについて行った。順番は、3週間の試験中のマウスの身体組成の変化における潜在的な交絡効果を打ち消すように測定する。
【００２８】
５つの試験は、以下の通りである：
・  (0.9%生理食塩水を含む)コントロールの試験；
・  APペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  VAPペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  APペプチド(濃度500mg/kg)及びVAPペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  アカルボース(濃度10mg/kg)を用いての試験。APペプチド及びVAPペプチドの阻害活性の測定に対して、最後に記載したアカルボースを用いるこの試験は任意である。
【００２９】
スクロース又はマルトース及び試験対象の生成物を0.9%生理食塩水中で希釈して、次に胃経路で直接投与する。
血糖値を測定するために、胃経路投与の5分後、最初の血液サンプルを尾から採取し(t＝0)、その後15分後、30分後、45分後、60分後、90分後及び120分後に他の6つのサンプルを採取する。
主要な評価基準は、スクロース又はマルトース投与後の2時間にわたる血糖値曲線下面積の測定値(AUC、曲面下面積、0〜120分、単位g*min/L)である。
【００３０】
上記のプロトコールの目的で用いられ得るα-グルコシダーゼは、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の組換えα-グルコシダーゼ(これは、マルターゼである)であり得る。
当業者によって同等であるか又はより適切であると判断され得る他のプロトコールを用いてもよい。
【００３１】
本発明の１つの態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態は、例えば２型糖尿病、嚢胞性線維症(国際出願WO2005046672 A2号を参照)、C型肝炎(国際出願WO2006096769号を参照)、脂肪過多(特許EP0638317 B1号を参照)である。
本発明のより具体的な態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態は、２型糖尿病である。
【００３２】
本発明の具体的態様において、上記のペプチドは、前糖尿病、特に２型前糖尿病を有するか又はそのリスクがある患者に使用する。上記の患者は、循環器疾患、特に動脈性高血圧、冠動脈疾患又は慢性心不全を必ずしも有しない。事実、前糖尿病、特に２型前糖尿病を有する患者は、動脈性高血圧（AH）を必ずしも有しない。
【００３３】
前糖尿病は、糖血レベルが正常よりも高いが、糖尿病と診断されるほどではない状態に相当する。前糖尿病は、メタボリックシンドロームと呼ばれる医学的概念の一部を形成し得る。メタボリックシンドロームの定義は、腹部型肥満、脂質パラメータの異常、動脈性高血圧などを含めた様々なデータを含む。メタボリックシンドロームは、それ自体、心血管疾患発症のリスク要因である。必ずしも、すべての前糖尿病患者が糖尿病を発症するとは限らない。しかし、メタボリックシンドロームがあれば健常者と比べてこのリスクが10倍高まる。
【００３４】
前糖尿病は、1 g/l以上の空腹時血糖値(特に、正常な臨床検査値であるかどうかに拘らず1 g/l〜1.26 g/l)又はグルコース不耐性で定義される。
連続した２つのサンプルについての空腹時血糖値が1.26 g/l以上であるとき、又は血糖値が１日のうちの任意の時点で2 g/l以上であるとき、糖尿病と診断される。
【００３５】
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物は、少なくとも１つのVAPペプチド及び/又は少なくとも１つのAPペプチドを含む。このことは、本発明の組成物が少なくとも１つのVAPペプチド又は少なくとも１つのAPペプチドを含むか、あるいは上記の組成物が少なくとも１つのVAPペプチド及び少なくとも１つのAPペプチドを含むことを意味する。
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物は、少なくとも１つのAPX’型ペプチドと組み合わせて、少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００３６】
「APX’型ペプチド」との表現は、Aがアラニンのアミノ酸であり、Pがプロリンのアミノ酸であり、X’が生物において普遍的に分布している20アミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩又はアスパラギン酸、システイン、グルタミン酸塩又はグルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン)から選択されるアミノ酸又は一群のアミノ酸に相当するペプチドに相当する。アミノ酸は、ペプチド結合によって結合している。
本発明の具体的態様において、APX’型ペプチドは、APFPE (配列番号1)又はAPFPEVF(配列番号2)から選択される。
かくして、本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物は、少なくとも1つのAPFPE及び/又はAPFPEVFペプチドを伴って、少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００３７】
かくして、本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物は、少なくとも以下のペプチドの組合せを含むか、又は当該ペプチドにより構成される：
-  AP + APFPE (配列番号1) 又は
-  AP + APFPEVF (配列番号 2) 又は
-  VAP + APFPE (配列番号1) 又は
-  VAP + APFPEVF (配列番号2) 又は
-  AP + APFPE (配列番号1) + APFPEVF (配列番号2) 又は
-  VAP + APFPE (配列番号1) + APFPEVF (配列番号2) 又は
-  AP + VAP + APFPE (配列番号1) + APFPEVF (配列番号2) 又は
-  AP + VAP + APFPE (配列番号1) 又は
-  AP + VAP + APFPEVF (配列番号2)
【００３８】
本発明の別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06 mg/kg〜約40.0 mg/kgのXAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのXAPペプチド、有利な実施形態では約0.06 mg/kg〜約0.099 mg/kgのXAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
用量は、体重75kgの成人患者を想定して決めた。
【００３９】
「約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg」との表現は、特に体重が75kgでない患者について、0.06mg/kgより僅かに小さい値、例えば0.059mg/kg又は30.0mg/kgより僅かに大きい値、例えば30.1mg/kgを包含し得ると解されるべきである。
「約>30.0 mg/kg〜約40.0 mg/kg」との表現は、特に体重が75kgでない患者について、40.0mg/kgより僅かに大きい値、例えば40.1mg/kgを包含し得ると解されるべきである。
「約>30.0 mg/kg」との表現は、厳密に、30.0mg/kgより大きい値を意味する。
【００４０】
よって、「約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg」との表現は、本発明の組成物が、0.06mg/kg〜30.0mg/kgの全ての値、特に0.06 mg/kg〜0.08 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.09 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.1 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.5 mg/kg；0.06 mg/kg〜1.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜2.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜5.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜10.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜15.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜20.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜25.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜30.0 mg/kg；0.2 mg/kg〜0.4 mg/kg；0.2 mg/kg〜0.5 mg/kg；0.6 mg/kg〜0.9 mg/kg；0.6 mg/kg〜1 mg/kg；2 mg/kg〜3 mg/kg又は4 mg/kg又は5 mg/kg又は6 mg/kg又は7 mg/kg又は8 mg/kg又は9 mg/kg又は10 mg/kg又は11 mg/kg又は12 mg/kg又は13 mg/kg又は14 mg/kg又は15 mg/kg又は16 mg/kg又は17 mg/kg又は18 mg/kg又は19 mg/kg又は20 mg/kg又は21 mg/kg又は22 mg/kg又は23 mg/kg又は24 mg/kg又は25 mg/kg又は26 mg/kg又は27 mg/kg又は28 mg/kg又は29 mg/kg又は30 mg/kgを含み得ることを意味する。
【００４１】
よって、「約>30.0 mg/kg〜約40.0 mg/kg」との表現は、本発明の組成物が、30.0mg/kgを超える値〜約40.0mg/kgの全ての値、特に31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg及び40mg/kgを含み得ることを意味する。
【００４２】
１つの態様において、本発明は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドからなるか、及び/又は約0.06mg/kg〜約30.0mg/kgのAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドからなるか、及び/又は約0.06mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドからなる、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物に関する。
【００４３】
具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又はα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又はα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４４】
別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又はα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又はα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチド若しくは約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４５】
本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、あるいはα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４６】
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、あるいはα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４７】
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、あるいはα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチド及びAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４８】
本発明の更に別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドから構成され、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００４９】
本発明の更に別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドから構成され、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>30.0 mg/kg〜40.0 mg/kgのAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００５０】
別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、13.3mg/kgのXAPペプチド、特にAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、単位形態であり、約5mg〜3000mgの量のXAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、単位形態であり、約5mg〜2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のXAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成される。
【００５１】
「約5mg〜約2250mg」との表現は、用量が、5mgより僅かに小さい値、例えば4.9mgであってもよいし、2250mgより僅かに大きい値、例えば2250.1mgであってもよいことを意味する。よって、この表現は、5mg〜2250mgの全ての値、例えば5 mg〜10 mg；10 mg〜15 mg；15 mg〜20 mg；20 mg〜25 mg；25 mg〜30 mg；30 mg〜35 mg；35 mg〜40 mg；45 mg〜50 mg；50 mg〜55 mg；55 mg〜60 mg；60 mg〜65 mg；65 mg〜70 mg；70 mg〜75 mg；75 mg〜80 mg；80 mg〜85 mg；85 mg〜90 mg又は95 mg〜100 mg、5mg〜100mg；〜200 mg；〜250 mg；〜300 mg；〜350 mg；〜400 mg；〜450 mg；〜500 mg；〜550 mg；〜600 mg；〜650 mg；〜700 mg；〜750 mg；〜800 mg；〜850 mg；〜900 mg；〜950 mg；〜1000 mg；〜1050 mg；〜1100 mg；〜1150 mg；〜1200 mg；〜1250 mg；〜1300 mg；〜1350 mg；〜1400 mg；〜1450 mg；〜1500 mg；〜1550 mg；〜1600 mg；〜1650 mg；〜1700 mg；〜1750 mg；〜1800 mg；〜1850 mg；〜1900 mg；〜1950 mg；〜2000 mg；〜2050 mg；〜2100 mg；〜2150 mg；〜2200 mgが含まれることを意味する。
【００５２】
具体的な態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1000mgの量のXAPペプチド、特にAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
「約>2250mg〜3000mg」との表現は、用量が3000mgより僅かに大きい値、例えば3000.1mgであってもよいことを意味する。よって、この表現は、>2250mg〜3000mgの全ての値、特に2260mg；2270mg；2280mg；2290mgが含まれることを意味する。
「約>2250mg〜」との表現は、値が厳密に2250mgより大きいことを意味する。
【００５３】
別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約5mg〜約7.4mgの量のAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成される。
「約5mg〜約7.4mg」との表現は、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3又は7.4の値の１つを示し得ると解すべきである。
【００５４】
更に別の態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約7.5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約7.5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成され、及び/又は約7.5mg〜約2250mg若しくは約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか若しくは当該ペプチドにより構成される。
【００５５】
本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約2250mg、特に約5mg〜約7.4mg若しくは特に約7.5mg〜約2250mgの量のVAPペプチド又は約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約2250mg、特に約5mg〜約7.4mg若しくは特に約7.5mg〜約2250mgの量のAPペプチド又は約>2250mg〜3000mgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約2250mg、特に約5mg〜約7.4mg若しくは特に約7.5mg〜約2250mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００５６】
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約5mg〜約2250mg、特に約5mg〜約7.4mg若しくは特に約7.5mg〜約2250mgの量のVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、約5mg〜約2250mg、特に約5mg〜約7.4mg若しくは特に約7.5mg〜約2250mgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、約>2250mg〜3000mgの量のVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、約>2250mg〜3000mgの量のAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。
【００５７】
更に別の態様において、本発明は、1日3回、食事開始時に約0.06mg/kg〜40.0mg/kgの量のXAPペプチドの経口投与に使用するための、上記のα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物に関する。
更に別の態様において、本発明は、1日3回、食事開始時に約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のXAPペプチドの経口投与に使用するための、上記のα-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物に関する。
【００５８】
「約0.06mg/kg〜約30.0mg/kgのXAPペプチド」との表現は、本発明の組成物が、0.06 mg/kg〜30.0 mg/kg、特に0.06 mg/kg〜0.08 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.09 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.1 mg/kg；0.06 mg/kg〜0.5 mg/kg；0.06 mg/kg〜1.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜2.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜5.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜10.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜15.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜20.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜25.0 mg/kg；0.06 mg/kg〜30.0 mg/kgの全ての値を含み得ることを意味する。
「約>30.0mg/kg〜40mg/kgまで」との表現は、本発明の組成物が、>30.0 mg/kg〜40 mg/kg、特に31 mg/kg〜40 mg/kg；32 mg/kg〜40 mg/kg；33 mg/kg〜40 mg/kg；34 mg/kg〜40 mg/kg；35 mg/kg〜40 mg/kg；36 mg/kg〜40 mg/kg；37 mg/kg〜40 mg/kg；38 mg/kg〜40 mg/kg；39 mg/kg〜40 mg/kgの全ての値を含み得ることを意味する。
【００５９】
１つの態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜約40mg/kgの量のVAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００６０】
具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドの量を含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００６１】
更に別の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチド、及び/又は約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のAPペプチド、及び/又は約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg若しくは約>30.0kg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の具体的態様において、病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg又は約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００６２】
別の具体的態様において、病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg又は約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
別の具体的態様において、病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kg又は約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
更に別の具体的態様において、病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgの量のVAPペプチド、及び約0.06mg/kg〜約30.0mg/kg、特に約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg若しくは特に約0.1mg/kg〜約30.0mg/kgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
更に別の具体的態様において、病的状態の治療及び/又は予防に使用するための上記の組成物は、1日3回、食事開始時に経口投与するための約>30.0mg/kg〜40mg/kgの量のVAPペプチド、及び約>30.0mg/kg〜約40mg/kgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００６３】
本発明は、医薬的に許容され得るビヒクルと併せて、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg、特に約0.066mg/kgの量のXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチド及びビヒクルにより構成される、XAPペプチドを含む医薬組成物に関する。
用量は、体重75kgの成人患者を想定して決めた。
【００６４】
「約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg」との表現は、0.06mg/kgより僅かに小さいか又は0.099mg/kgより僅かに大きい値、例えば0.059mg/kg又は0.0999mg/kgであってもよいことを意味する。
また、「約0.06mg/kg〜約0.099mg/kg」との表現は、0.06mg/kg〜0.07mg/kg；0.06mg/kg〜0.08mg/kg；0.06mg/kg〜0.09mg/kg；0.07mg/kg〜0.08mg/kg；0.08mg/kg〜0.09mg/kg又は0.07mg/kg〜0.09mg/kgの値を示していてもよい。
【００６５】
また、本発明は、具体的態様においてビタミンBを欠いている上記の医薬組成物に関する。有利には、ビタミンBがない方がよいようである(apparaissant avantageusement meilleure sans vitamin B)。
本発明の別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、VAPペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
本発明の別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、APペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
【００６６】
また、本発明は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドの量を含むか、又は当該ペプチドにより構成される、上記の医薬組成物に関する。
本発明の具体的態様において、上記の医薬組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
本発明の別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
更に別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のVAPペプチド及び約0.06mg/kg〜約0.099mg/kgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成される。
【００６７】
本発明の更に別の態様において、上記の医薬組成物は、医薬的に許容され得るビヒクルと併せて、約5mg〜約7.4mgの量のXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ペプチド及びビヒクルにより構成され、単位形態である。
本発明の具体的態様において、上記の医薬組成物は、ビタミンBを欠いており、有利にはビタミンBがない方がよいようである。
本発明の別の具体的態様において、上記の医薬組成物は、VAPペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
【００６８】
「約5mg〜約7.4mg」との表現は、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3又は7.4の値の１つを示し得ると解すべきである。
具体的態様において、上記の医薬組成物は、約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又は上記の医薬組成物は、約5mg〜約7.4mgの量のAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成され、及び/又は上記の医薬組成物は、約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含むか又は当該ペプチドにより構成される。このことは、本発明の具体的態様において、上記の医薬組成物が、約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド、若しくは約5mg〜約7.4mgの量のAPペプチド、若しくは約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド及びAPペプチド、若しくは約5mg〜約7.4mgの量のVAPペプチド及び約5mg〜約7.4mgの量のAPペプチドを含むか、又は当該ペプチドにより構成されることを意味する。
【００６９】
具体的態様において、上記の医薬組成物は、少なくとも１つのAPX’型ペプチドと組み合わせられてもよい。
上記の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、ピル、顆粒剤又は経口経路により投与可能なその他の剤形で投与されてもよいし、散剤のサシェ剤、液剤のアンプル剤、点滴器を備えたボトル及び液剤又は散剤のその他類似の剤形であってもよい。
好ましくは、上記の医薬組成物は、錠剤であり、食事開始時に少量の水で飲み込むか、又は食事の最初の一口と共に噛み砕く。
本発明の別の態様において、上記の医薬組成物は、１以上のアミラーゼ阻害剤及び/又は１以上のリパーゼ阻害剤を含んでいてもよい。
【００７０】
上記の治療的態様に加えて、本発明のXAPペプチドは、栄養補助食品分野(例えば食品サプリメント)又は食品分野(機能性食品)において用いてもよい。
栄養補助食品との用語は、健康に有益な効果を提供する、食物中に自然な状態又は合成物として存在する有効成分を言う。例えば、ダノン社のヨーグルトであるダナコール(登録商標)は、ヨーグルト中に自然に存在しない植物ステロールを含む。これは、添加されている有効成分である。毎日消費する食べ物(例えば飲料、乳製品、穀類、ビスケット)は、栄養補助食品の有効成分を含み得るし、身体の１以上の標的機能に対して、基礎的な栄養効果を上回る有益な効果を有することが証明されている場合には機能性食品と考えることができる。
【００７１】
食品を機能性とするには５つのアプローチがある：有害な効果を示すことが知られているか又は特定された成分を除去すること、食品中の天然成分の濃度を増大すること、(証明された有益な効果を有するが)大半の食品には通常ない成分を添加すること、成分を置き換えること、又は食品成分のバイオアベイラビリティを改善すること。
【００７２】
食品サプリメントは、通常の食事を補填することを目的とし、単独又は組合せで、栄養的又は生理学的な効果を示す栄養素又はその他の物質の濃縮源を構成する食物である。このような食物は、計量された少量単位を摂取することが意図される。
【００７３】
また、別の態様において、本発明は、栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)の使用に関する。
具体的態様において、本発明は、少なくとも１つのVAPペプチドの使用に関する。
具体的態様において、本発明は、少なくとも１つのAPペプチドの使用に関する。
具体的態様において、本発明は、少なくとも１つのVAPペプチド及び少なくとも１つのAPペプチドの使用に関する。
【００７４】
更に別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害するための、約0.06mg/kg〜約14mg/kgの量の少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含む栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
更に別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害するための、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量の少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含む栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、ビタミンBを欠いており、有利には、ビタミンBがない方がよいようである。
本発明の別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、VAPペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
本発明の別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、APペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
本発明の別の具体的態様において、栄養補助食品組成物又は食品組成物は、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg若しくは約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のVAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg若しくは約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のAPペプチド、及び/又は約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg若しくは約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含む。
【００７５】
「約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg」との表現は、0.06mg/kgより僅かに小さい値、例えば0.059mg/kgを包含し得ると解すべきである。
「<0.6mg/kg」との表現は、厳密に0.6mg/kgより小さい値を意味する。
「約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg」との表現は、0.06 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.08 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.1 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.12 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.13 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.15〜0.58 mg/kg、0.20 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.25 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.30 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.35 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.40 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.45 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.50 mg/kg〜0.58 mg/kg、0.55 mg/kg〜0.58 mg/kgの値を示していてもよい。
【００７６】
「約0.6mg/kg〜約14mg/kg」との表現は、0.6mg/kgより僅かに小さい値、例えば0.59mg/kg又は14mg/kgより僅かに大きい値、例えば14.1mg/kgを包含し得ると解すべきである。
「約0.6mg/kg〜約14mg/kg」との表現は、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg、1.0 mg/kg、1.2 mg/kg、1.4 mg/kg、1.6 mg/kg、1.8 mg/kg、2.0 mg/kg、2.2 mg/kg、2.4 mg/kg、2.6 mg/kg、2.8 mg/kg、3.0 mg/kg、3.2 mg/kg、3.4 mg/kg、3.6 mg/kg、3.8 mg/kg、4.0 mg/kg、4.2 mg/kg、4.4 mg/kg、4.6 mg/kg、4.8 mg/kg、5.0 mg/kg、5.2 mg/kg、5.4 mg/kg、5.6 mg/kg、5.8 mg/kg、6.0 mg/kg、6.2 mg/kg、6.4 mg/kg、6.6 mg/kg、6.8 mg/kg、7.0 mg/kg、7.2 mg/kg、7.4 mg/kg、7.6 mg/kg、7.8 mg/kg、8.0 mg/kg、8.2 mg/kg、8.4 mg/kg、8.6 mg/kg、8.8 mg/kg、9.0 mg/kg、9.2 mg/kg、9.4 mg/kg、9.6 mg/kg、9.8 mg/kg、10.0 mg/kg、10.2 mg/kg、10.4 mg/kg、10.6 mg/kg、10.8 mg/kg、11.2 mg/kg、11.4 mg/kg、11.6 mg/kg、11.8 mg/kg、12.2 mg/kg、12.4 mg/kg、12.6 mg/kg、12.8 mg/kg、13.0 mg/kg、13.2 mg/kg、13.4 mg/kg、13.6 mg/kg、13.8 mg/kg、14.0 mg/kg又は0.6 mg/kg〜0.9 mg/kg、2 mg/kg〜3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg若しくは14 mg/kgの値を示していてもよい。
【００７７】
更に別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のVAPペプチドを含む。
更に別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のAPペプチドを含む。
更に別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含む。
更に別の態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のVAPペプチド及び約0.06mg/kg〜<0.6mg/kg又は約0.6mg/kg〜約14mg/kgの量のAPペプチドを含む。
【００７８】
具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、少なくとも１つのAPX’型ペプチドと組み合わせられてもよい。
具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、ピル、顆粒剤又は経口投与され得るその他の剤形で投与されてもよいし、散剤のサシェ剤、液剤のアンプル剤、点滴器を備えたボトル、液剤又は散剤に類似のその他の剤形であってもよい。
好ましくは、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、錠剤であり、食事開始時に少量の水で飲み込むか、又は最初の一口で食事と一緒に噛み砕くことができる。
【００７９】
また、更に別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害するための、約5mg〜1000mgの量の少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含み、単位形態である栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
また、更に別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害するための、約5mg〜<50mg又は約50mg〜約1000mgの量の少なくとも１つのXAPペプチド(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含み、単位形態である栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
【００８０】
具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、ビタミンBを欠いており、有利には、ビタミンBがない方がよいようである。
本発明の別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、VAPペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
本発明の別の具体的態様において、上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物は、APペプチドを含み、ビタミンBを欠いている。
【００８１】
「約5mg〜<50mg」との表現は、5mg/kgより僅かに少ない値、例えば4.9mg／kgを包含し得ると解すべきである。
「<50mg」との表現は、厳密に50mg未満であることを意味する。
「約5mg〜<50mg」との表現は、10mg〜<50mg、例えば5 mg〜49 mg、10 mg〜49 mg、15 mg〜49 mg、20 mg〜49 mg、25 mg〜49 mg、30 mg〜49 mg、35 mg〜49 mg、40〜49 mg、45 mg〜49 mgの全ての値を示し得る。
「約50mg〜約1000mg」との表現は、50mgより僅かに小さい値、例えば49.9mg又は1000mgより僅かに大きい値、例えば1000.01mgを包含し得ると解すべきである。
「約50mg〜約1000mg」との表現は、50mg〜1000mg、例えば50 mg〜100 mg、100 mg〜200
mg、200 mg〜300 mg、300 mg〜400 mg、400 mg〜500 mg、500 mg〜600 mg、600 mg〜700
mg、800 mg〜900 mg又は900 mg〜1000 mgの全ての値を示し得る。
【００８２】
また、別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害するための、約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド、及び/又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のAPペプチド、及び/又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチドを含む栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。よって、このことは、α-グルコシダーゼを阻害するための上記の栄養補助食品組成物又は食品組成物が、約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド、又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のAPペプチド、又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド及びAPペプチド、又は約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のVAPペプチド及び約5mg〜<50mg若しくは約50mg〜約1000mgの量のAPペプチドを含むことを意味する。
別の実施形態では、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の予防及び/又は治療のための、α-グルコシダーゼ阻害剤、特にマルターゼの阻害剤であって、α-グルコシダーゼ、特にマルターゼについて12.50 mM の最大IC50を有するペプチドを含む組成物の使用に関する。IC50は、酵素活性を50%阻害するのに必要なペプチド濃度を表す。
【００８３】
また、更に別の態様において、本発明は、上記のXAPペプチドの代わりに、少なくとも0.05%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用に関する。
具体的態様において、上記の加水分解物は、インスリン増感剤と併用されない。「インスリン増感剤」とは、グルコースの血中レベルを低下させる分子(XAPペプチド及び/又はAPX’を除く)を意味する。インスリン増感剤は、例えばクロム、バナジウム、ビタミンB (特にナイアシン)又は薬草抽出物若しくは植物抽出物、好ましくはバナバの葉、朝鮮人参の実、シナモンの抽出物、及びブドウ中の特定の化合物であり得る。以下の化合物も「インスリン増感剤」と考えられている：コロソリン酸、プテロスチルベン、メチルヒドロキシカルコンポリマー(MHCP)、ギンセノシド。「インスリン増感剤」の好ましい例は、ビグアニド類(メトホルミンなど、グルコファージ(登録商標))、チアゾリジンジオン類(ピオグリタゾンなど、アクトス(登録商標))、ロシグリタゾン(アヴァンジア(登録商標))である。
【００８４】
また、更に別の態様において、本発明は、上記のXAPペプチドの代わりに、少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用に関する。
よって、本発明は、上記のXAPペプチドの代わりに、少なくとも0.05%〜<5%のXAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用に関する。
【００８５】
また、別の態様において、本発明は、α-グルコシダーゼ阻害剤としての、少なくとも0.05%〜<5%のXAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用、又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の使用に関する。
別の具体的態様において、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる組成物に関する。
【００８６】
「少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物」との表現は、加水分解物が１つのタンパク質又はタンパク質の混合物に由来していてもよいことを意味する。
上記の「タンパク質の混合物」において、タンパク質は、異なる供給源に由来していてもよいし、同一の供給源に由来していてもよい。例えば、異なる供給源由来のタンパク質の混合物は、サケのタンパク質とコイのタンパク質との混合物であり得る。例えば、同一の供給源由来のタンパク質の混合物は、サケのタンパク質の混合物であり得る。
「<5%のXAPユニット」との表現は、厳密に5%未満、特に4.9%未満のXAPユニットを意味する。
【００８７】
「少なくとも0.05%〜<5%のXAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成されるタンパク質」との表現は、タンパク質の全アミノ酸配列が、当該配列を構成するアミノ酸の総計に対して、少なくとも0.05% (最大で5%未満)のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成されることを意味する。
「少なくとも0.05%のXAPユニット」との表現は、タンパク質が0.05%〜100%、特に0.05%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成され得ることを意味する。
【００８８】
「少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成されるタンパク質」との表現は、タンパク質の全アミノ酸配列が、当該配列を構成するアミノ酸の総計に対して、少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成されることを意味する。
「少なくとも5%のXAPユニット」との表現は、タンパク質が、5%〜100%、特に5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%のXAPユニットを含み得るか、又は当該ユニットにより構成され得ることを意味する。
【００８９】
上記のXAPユニットは、配列の全長にわたって分布していてもよいし、配列の一部のみに局在していてもよい。後者の場合、タンパク質の配列は、連続XAPユニット、例えばXAP-XAP-XAP-XAP又はバリン、アラニン若しくはプロリン以外のアミノ酸(AA)がインターカレーションされた連続XAPユニット、例えばAA-XAP-XAP-AA-XAP-XAP-XAP-AAを含む。
【００９０】
上記したように、用語「XAP」は、VAPトリペプチド又はAPジペプチドと解され、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成されるタンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット、又は少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニット、又は少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及びAPユニット、又は少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及び少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットにより構成され得る。
【００９１】
タンパク質が少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及びAPユニットを含むとき、後者の配列は、VAPユニット及びAPユニットを含み、当該配列を構成するアミノ酸の総計に対するVAPユニット及びAPユニットのパーセンテージの和は、少なくとも0.05%〜<5%又は5%でなくてはならない。
タンパク質が少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及びAPユニットを含むとき、VAPユニット及びAPユニットは、配列の全長にわたって分布していてもよいし、配列の一部のみに局在していてもよい。上記のVAPユニットは、APユニットから離れて分布していてもよいし、APユニットとつながっていてもよい。
【００９２】
本発明の１つの態様において、少なくとも１つ加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる上記の組成物は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態、特に２型糖尿病の治療及び/又は予防において用いられる。
本発明の別の態様において、加水分解物は、α-グルコシダーゼ阻害剤として用いられる。
【００９３】
別の態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる組成物において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成され、及び/又は少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか若しくは当該ユニットにより構成される。このことは、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる組成物において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成されるか、あるいは、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成されることを意味する。よって、このことは、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる組成物において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成され、かつ、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成されることを意味する。
本発明の１つの態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる組成物において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及びAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成される。
【００９４】
別の具体的態様において、本発明は、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか又は当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を、少なくとも１つのAPX’型ペプチドと組み合わせて含むか、又は当該加水分解物及びペプチドからなる組成物に関する。
【００９５】
別の具体的態様において、本発明は、少なくとも１つのAPFPEペプチド (配列番号1)及び/又はAPFPEVFペプチド (配列番号2)を伴って、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための、少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物により構成される組成物に関する。
よって、本発明の具体的態様において、α-グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の治療及び/又は予防に使用するための組成物は、少なくとも以下の組合せを含むか、又は当該組合せにより構成される：
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニット＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか、又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の加水分解物＋少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の加水分解物＋少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPE（配列番号1）を含むか又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物、又は
-  少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物＋少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット＋ペプチドAPFPEVF（配列番号2）を含むか又は当該ユニット及びペプチドにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物。
【００９６】
別の具体的態様において、本発明は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる医薬組成物に関する。
また、別の具体的態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる医薬組成物は、少なくとも１つのAPX’型ペプチドを含んでいてもよい。
【００９７】
具体的態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか、又は当該加水分解物からなる医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、ピル、顆粒剤又は経口投与可能なその他の剤形で投与してもよいし、散剤のサシェ剤、液剤のアンプル剤、点滴器を備えたボトル、液剤又は散剤に類似のその他の剤形であってもよい。
本発明の具体的態様において、加水分解物は、食品マトリクスに組み込まれていてもよい。食品マトリクスとは、飲料、ヨーグルト、菓子類、穀類、スープ、ソース、果物ジュース及び野菜ジュース、脂肪、調味料、パンを意味する。
好ましくは、少なくとも１つの加水分解物を含むか、又は当該加水分解物からなる医薬組成物は、錠剤であり、食事開始時に少量の水で飲み込むか、又は最初の一口で食事と共に噛み砕くことができる。
【００９８】
上記の治療的態様に加えて、本発明の少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物は、栄養補助食品分野又は食品分野(例えば食品サプリメント)において用いてもよい。
本発明は、栄養補助食品組成物又は食品サプリメントを製造するための、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用に関する。
【００９９】
具体的態様では、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される。
具体的態様では、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される。
具体的態様では、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニット及びAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される。
具体的態様では、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物の使用において、タンパク質は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のVAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成され、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のAPユニットを含むか又は当該ユニットにより構成される。
【０１００】
別の具体的態様において、本発明は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか若しくは当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる栄養補助食品組成物又は食品組成物に関する。
別の具体的態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる栄養補助食品組成物又は食品組成物は、少なくとも１つのAPX’型ペプチドを含んでいてもよい。
具体的態様において、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる栄養補助食品組成物又は食品組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、ピル、顆粒剤の剤形又は経口投与可能なその他の剤形で投与されてもよいし、散剤のサシェ剤、液剤のアンプル剤、点滴器を備えたボトル、液剤又は散剤に類似のその他の剤形であってもよい。
好ましくは、少なくとも１つの加水分解物を含むか又は当該加水分解物からなる栄養補助食品組成物又は食品組成物は、錠剤であり、食事開始時に少量の水で飲み込むか、又は最初の一口で食事と共に噛み砕く。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、少なくとも0.05%〜<5%若しくは少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の製造方法に関する。
加水分解物は、化学的経路又は酵素的経路で得ることができる。
化学的加水分解は、強酸、例えば3 M HClを用いて、12時間〜24時間行う。
化学的加水分解は、厳しいpH条件下、より具体的にはpH2で行ってもよい。
しかしながら、この化学的加水分解によって、得られる加水分解物の品質は損なわれ得ることに留意すべきである。よって、酵素的経路による加水分解が好ましい。
【０１０２】
１つの態様において、本発明は、以下の工程：
-  少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットからなる少なくとも１つのタンパク質を水に溶解させて水溶液を得る工程と、
-  上記の水溶液に少なくとも１つの酵素を適量添加し、上記のタンパク質を加水分解する工程と
を含む少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の製造方法に関する。
【０１０３】
「少なくとも１つの酵素の添加」とは、加水分解物が、酵素の混合又は連続的な加水分解によって産生され得ることを意味する。
「連続的な加水分解」とは、少なくとも２つの加水分解工程(例えば、最大の加水分解の達成に寄与する酵素Aの後に酵素B)を意味する。
【０１０４】
１つの態様において、本発明は、以下の工程：
-  少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質を水に溶解させ、水溶液を得る工程と、
-  上記の水溶液に酵素を適量添加し、上記のタンパク質を加水分解する工程と
を含む、少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニット(ここで、Xは、アミノ酸なし又はバリンを表す)を含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の製造方法に関する。
【０１０５】
本発明の具体的態様において、少なくとも１つのタンパク質の水への溶解は、少なくとも１つのタンパク質の供給源を磨り潰すことからなる。
したがって、このことは、加水分解物の製造方法の出発原料が、タンパク質、特に商業的に入手可能な精製タンパク質又は少なくとも１つのタンパク質の供給源を磨り潰したもののいずれかであり得ることを意味する。
例えば、精製タンパク質は、BNLfood (Belovo) (http://www.bnlfood.com/)；Setalg (http://www.setalg.fr/)；Copalis (http://www.copalis.fr/fr/)；Vegan (http://www.veganproteins.com/)；Solabia (http://www.solabia.fr)等から商業的に入手可能である。
【０１０６】
例えば、「少なくとも１つのタンパク質の供給源を磨り潰したもの」は、動物の粉であり、例えば魚粉又は魚肉を磨り潰したものなどである。タンパク質の供給源は、例えば植物由来のもの、海洋生物由来のもの若しくは動物由来のものであり得、昆虫由来のものであってもよい。
加水分解物の製造方法の出発原料が粉末の形態(例えば魚粉)であるとき、単純に溶解することが必要となる。
加水分解物の製造方法の出発原料がタンパク質を豊富に含む副産物(例えば魚の切り身、魚肉のかたまり、藻類など)を含むとき、磨り潰しの操作が必要となる。
【０１０７】
また、具体的態様において、本発明は、以下の工程：
-  少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質を水に溶解させ、水溶液を得る工程と、
-  得られた水溶液を90℃で15分間インキュベーションする工程と、
-  上記の水溶液に少なくとも１つの酵素を適量添加し、上記のタンパク質を加水分解する工程と、
-  上記の工程で得られた水溶液を、35℃〜55℃の温度で6〜24時間インキュベーションする工程と
を含む上記の加水分解物の製造方法に関する。
【０１０８】
別の具体的態様において、本発明は、以下の工程：
-  少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質を水に溶解させ、水溶液を得る工程と、
-  上記の水溶液を90℃で15分間インキュベーションする工程と、
-  上記の水溶液に酵素を適量添加し、タンパク質を加水分解する工程と、
-  上記の工程で得られた水溶液を、35℃〜55℃の温度で6〜24時間のインキュベーションする工程と
を含む、上記の加水分解物の調製方法に関する。
上記のインキュベーションは、タンパク質の変性と、タンパク質分解の促進とを目的としている。
【０１０９】
表現「6〜24時間」とは、6〜24時間の全ての時間、すなわち6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間及び24時間と解すべきである。また、これは、6時間30分、7時間30分、8時間30分、9時間30分、10時間30分、11時間30分、12時間30分、13時間30分、14時間30分、15時間30分、16時間30分、17時間30分、18時間30分、19時間30分、20時間30分、21時間30分、22時間30分、23時間30分及び24時間30分をも意味する。
表現「35℃〜55℃の温度」とは、35℃〜55℃の全ての温度、すなわち36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃及び55℃と解すべきである。
【０１１０】
上記の製造方法の具体的態様において、5〜25% (w/w)のタンパク質溶液を加水分解するのに適した酵素量は、タンパク質抽出物の重量の0.1%〜25%である。
上記の製造方法の具体的態様において、上記の方法は、用いる酵素に応じて、pHを調整するための１以上の工程、特にHCl若しくはKOH及び/又はNaOHを適量添加し、pHを3.5〜8とする工程を含む。
【０１１１】
上記の製造方法の具体的態様において、上記の方法は、酵素を不活性化するための１以上の工程を含む。
酵素は、反応媒体を15分間で95℃に昇温し、酵素の熱変性によりタンパク質分解を停止させることによって不活性化させることができる。
上記の製造方法の具体的態様において、上記の方法は、残りの反応媒体から得られる加水分解物を分離する工程を含む。
上記の製造方法の具体的態様において、残りの反応媒体から少なくとも１つのタンパク質の加水分解物の分離は、4000〜7000rpmの速度で遠心分離し、その後得られたペレットを除去することによって行われる。
上記の製造方法の別の具体的態様において、上記の方法は、遠心分離工程の前に濾過工程を含む。反応媒体の濾過により、固体の物質を除去することができる。
【０１１２】
酵素的加水分解は、少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含み、又は当該ユニットにより構成される少なくとも１つのタンパク質の加水分解物を得るために注意深く選択された酵素を用いて行われる。
酵素的加水分解は、精製された酵素製剤又は精製されていない混合物を用いて行われる。酵素製剤は、エンドペプチダーゼ若しくはエキソペプチダーゼ、プロテアーゼ又は混合物を含んでいてもよい。
上記の製造方法の具体的態様において、酵素は、アルカラーゼ(Alcalase)、フレーバザイム(Flavourzyme)、ペプチダーゼ、プロモード(Promod)、ペプシン、トリプシン、プロテアーゼN又はプロタメックス(Protamex)から選択される。
上記の製造方法の具体的態様において、用いる酵素製剤は、フレーバザイム(プロテアーゼ/ペプチダーゼ混合物)である。
【０１１３】
上記の製造方法の具体的態様において、用いる酵素製剤は、プロタメックス(プロテアーゼの混合物(バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来のアルカラーゼ及びバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のニュートラーゼ(Neutrase)))である。
別の態様において、加水分解は、酵素を連続で用いて、すなわちプロタメックスの後にペプシンを用いて行われる。
更に、本発明の具体的態様において、上記の少なくとも１つのタンパク質の加水分解物は、単独で又は他の分子と併用して用いてもよい。
【０１１４】
本発明の目的のために、VAPペプチド及びAPペプチドは、合成ペプチド、植物由来のペプチド、海洋生物由来のペプチド、動物由来のペプチド又は昆虫由来のペプチドもあり得る。
上記の加水分解物に含まれるペプチドについても同様である。
植物由来のペプチドは、マメ科植物由来のタンパク質、穀類由来のタンパク質、油脂性の種子由来のタンパク質、又は油脂性の果実由来のタンパク質に由来し得る。
海洋生物由来のペプチドは、魚肉タンパク質又は藻類由来のタンパク質に由来し得る。
動物由来のペプチドは、卵のタンパク質又は乳のタンパク質に由来し得る。
昆虫由来のペプチドは、食用昆虫タンパク質に由来し得る。
【０１１５】
さらに、本発明の目的のために、少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のXAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成されるタンパク質は、魚肉タンパク質、藻類由来のタンパク質、乳のタンパク質、マメ科植物由来のタンパク質、穀類由来のタンパク質、油脂性の種子由来のタンパク質、油脂性の果実由来のタンパク質、食用昆虫由来のタンパク質から選択される。
本発明の具体的態様において、魚肉タンパク質は、コイ、サケ、イワシ、メルルーサ、タラ、コダラから選択される。
別の具体的態様において、藻類由来のタンパク質は、ツノマタ属（chondrus）、ダルス属（palmaria）、アオサ属（ulva）、ポルフィラ属（porphyra）、コンブ属（laminaria）、アスコフィラム属（ascophyllum）、ワカメ属（undaria）、ヒマンタリア属（himanthallia）のタンパク質から選択される。
別の具体的態様において、卵のタンパク質は、オボムチン、リゾチーム、オボトランスフェリンから選択される。
別の具体的態様において、乳のタンパク質は、ホエータンパク質及びカゼインタンパク質から選択される。特に、乳は、雌ウシ、雌ウマ若しくは雌ロバ、雌ヒツジ由来であり得る。より具体的には、乳のタンパク質は、β-ラクトグロブリン、カゼイン、特にα-S1-カゼイン、β-カゼイン又はラクトフェリンであり得る。
【０１１６】
別の具体的態様において、マメ科植物由来のタンパク質は、レンズマメ、シロマメ及びサヤマメ、ヒヨコマメ、マメ、スプリットピー、ダイズ由来のタンパク質から選択される。より具体的には、上記のタンパク質は、レグミン、特にレグミンAであり得る。
別の具体的態様において、穀類由来のタンパク質は、トウモロコシ、キビ、オオムギ、ライムギ、ソバ、キノア、コメのタンパク質から選択される。
別の具体的態様において、油脂性の種子由来のタンパク質は、ピーナッツ、カボチャ、亜麻、ウリ類のタンパク質から選択される。
別の具体的態様において、油脂性の果実由来のタンパク質は、アーモンド、クルミ、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、松の実、ピスタチオ、アルガン、オリーブの木由来のタンパク質から選択される。
【０１１７】
別の具体的態様において、食用昆虫タンパク質は、コオロギ、イナゴ、バッタ、ミールワームのタンパク質から選択される。
本発明のタンパク質は、線維性タンパク質、特にエラスチン、コラーゲン又はアクチンであってもよい。特に、アクチンは、海洋生物由来(サケ由来)、動物由来のエラスチン(ウシ由来)、動物又は海洋生物由来のコラーゲン(ウシ又はサケ由来)のものであってもよい。
【０１１８】
以下の実施例及び図によって、本発明をより詳しく説明する。以下の実施例は、発明の主題を明瞭にし、有利な実施形態を説明することを目的とするものであるが、如何なる場合にも本発明の範囲が限定されることを意図するものではない。
【０１１９】
図の説明：
図１は、アカルボース濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
横軸はアカルボース濃度（mM）を示し、縦軸はα-グルコシダーゼ阻害のパーセンテージを示す。
図２は、APペプチド濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
横軸はAPペプチド濃度（mM）を示し、縦軸はα-グルコシダーゼ阻害のパーセンテージを示す。
図３は、VAPペプチド濃度の関数としてのα-グルコシダーゼ活性阻害のパーセンテージの変化を示す。
横軸はVAPペプチド濃度（mM）を示し、縦軸はα-グルコシダーゼ阻害のパーセンテージを示す。
【０１２０】
図４は、種々の濃度のペプチド阻害剤LKPの存在下におけるp-NPG（p-ニトロフェニルグルコピラノシド）の加水分解反応についてのLineweaver-Burk線形近似を示す。
横軸は基質濃度（1/[p-NPG] (mol-1)）を示し、縦軸は速度（1/Vi (μmol-1.min-1)）を示す。
４本の直線は、以下の濃度の阻害剤を表す： 
-  黒丸：阻害剤なし
-  白丸：5mM LKPの存在下における試験
-  黒三角：6mM LKPの存在下における試験
-  白三角：7.5mM LKPの存在下における試験
この線形近似により、インバースで表される酵素反応定数Km及びVmaxを決定することが可能になる。
【０１２１】
図５は、種々の濃度のペプチド阻害剤APの存在下におけるp-NPG（p-ニトロフェニルグルコピラノシド）の加水分解反応についてのLineweaver-Burk線形近似を示す。
横軸は基質濃度（1/[p-NPG] (mol-1)）を示し、縦軸は速度（1/Vi (μmol-1.min-1)）を示す。
3本の直線は、以下を表す：
-  黒丸：酵素なし
-  白丸：50 μM APの存在下における試験
-  黒三角：100 μM APの存在下における試験。
【０１２２】
図６は、マルトース耐性試験中の血糖値の変化(生の値、すなわち総血糖値)を示す。
横軸は時間(分)を、縦軸は血糖値(mg/dl)を表す。
【０１２３】
図７は、マルトース耐性経口試験から安静時の値を差し引いた最大血糖値を示す。
安静時の値は150mg/dlである。基底血糖値(安静時)は、胃経路による初回投与の５分前に測定した。参照としてのコントロール条件(マルトース経管栄養法の前に投与された生理食塩水)を考慮して、平均基底血糖値は143±34.2 mg/dlであった。
横軸は、異なるペプチドを用いて試験された群を示し、縦軸は血糖値(mg/dl)を示す。
異なるペプチドを用いて試験された群は以下のとおりである：
-  Ctrlはコントロールの群を表す
-  APはAPペプチドを用いて試験された群を表す
-  VAPはVAPペプチドを用いて試験された群を表す
-  AP+VAPはAP+VAPペプチドを用いて試験された群を表す
高さの最大値の変化量はΔPeak、すなわち(最大総血糖値)−(安静時血糖値)で表す。より正確には、これは、試験時の実験条件に関連付けられる血糖値の最大変化量、すなわち(最大血糖値)−(胃経路による初回投与の５分前に測定された基底値)を表す。
【０１２４】
図８は、試験された上記の4つの群（Ctrl、AP、VAP、AP＋VAP）の結果について、安静時の値を差し引いた曲面下面積を表す。
横軸は異なるペプチドを用いて試験された群を示し、縦軸は面積の値（mg/dl.hour = mg/dl.h）を示す。
【０１２５】
図９は、ヤギホエー由来のタンパク質の加水分解により得られる低分子量のペプチドの分画及び濃縮に用いた方法を示す。
UFは限外濾過を示す。
30kDa: 15分／7500／4℃とは、4℃で、7500gにて15分間の30kDaフィルターでの濾過を意味する。
10 kDa: 15分/15000g/4℃とは、4℃で、15000gにて15分間の10kDaフィルターでの濾過を意味する。
5 kDa: 15分/15000g/4℃とは、4℃で、15000gにて15分間の5kDaフィルターでの濾過を意味する。
【０１２６】
図１０は、pHが調整されたか、又は調整されていない酵素(フレーバザイム又はプロタメックス)により産生されたタンパク質加水分解物の質量プロファイルを示す。
横軸は加水分解物のサイズ(より正確には、分子量)を示し、縦軸は、クラス(すなわち、分子画分)別に回収したタンパク質のパーセンテージを示す。種々の分子画分は以下のとおりである：
> 30kDa：質量が30kDaを超えるタンパク質及びペプチド
30kDa > X > 10 kDa：質量が30kDa〜10kDaのタンパク質及びペプチド
10 kDa > X > 3 kDa：質量が10kDa〜3kDaのタンパク質及びペプチド
< 3 kDa：質量が3kDa未満のタンパク質及びペプチド
【０１２７】
図１１は、超純水中のフレーバザイムによるLCからの加水分解物の、Waters BEHカラムを用いてのLC-MS分析(HPLC-MS)を示す。
横軸は時間(分)を示し、縦軸は強度(mAU [AU＝任意単位])を示す。
実例Aは、215nm UVについてのUVスペクトル(任意単位mAU)を示す。
実例Bはイオン数の完全な質量スペクトルを示す。
実例Cはイオンm/z 187の質量スペクトルを示す。
【実施例】
【０１２８】
実施例1：異なる合成ペプチドの存在下でのα-グルコシダーゼ活性のインビトロ阻害試験材料及び方法
VW、VY、IY、KY、VY、KW、AP、LKP、GPL、VAP及びAKKの合成ペプチドの存在下でのα-グルコシダーゼ活性の阻害試験を以下のプロトコール（Kangら、Journal of Medicinal Plants Research 2012, 6: 2850-2856に記載されたものに基づく）に従って実施した。合成ペプチドはGENOSPHERE Biotechnologiesから供給された。
用いたα-グルコシダーゼは、マルターゼであるサッカロマイセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の組換えα-グルコシダーゼである。
【０１２９】
最終濃度0.2 U/mLで0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)中のα-グルコシダーゼ20μLを、異なる濃度（0.01〜50mmol/L）でペプチド又はアカルボース(Glucorの商品名でBayer AGが販売)のサンプル8μLと混合した。サンプルは、DMSO(ジメチルスルホキシド)を10％含む脱イオン水に予め可溶化した。
ここでは、参照用α-グルコシダーゼ阻害剤として、市販の合成阻害剤であるアカルボースをポジティブコントロールとして用いる。
【０１３０】
37℃で20分間インキュベーション後、(上記と同じ緩衝液中に調製した)2.5 mMの基質p-NPG (p-ニトロフェニルグルコピラノシド) 20μLを混合物に添加して、反応を開始させた。
反応媒体を37℃で30分間インキュベーションし、その後0.3 Mの炭酸ナトリウム(Na2CO3)溶液80μLを添加して反応を停止させた。
形成された生成物(黄色のp-ニトロフェニル(p-NP))の量を分光法(410 nmにおける吸光度、VersaMax (商標), Microplate Reader)で測定した。
【０１３１】
試験は96-ウェルマイクロプレート中で実施した。
全ての阻害試験は3回実施した。
下記の式から阻害のパーセンテージを計算する：
【数２】
2019189647.tif 000003
【０１３２】
ODsample assayは、「サンプル＋酵素＋基質」の混合物について得られた光学密度に相当する。
ODsample assay blankは、「サンプル＋緩衝液」の混合物について得られた光学密度に相当する。
ODcontrol assayは、「緩衝液＋酵素＋基質」の混合物について得られた光学密度に相当する。
ODcontrol blankは、緩衝液について得られた光学密度に相当する。
【０１３３】
結果
VW、VY、IY、KY、VY、KW、AP、LKP、GPL、VAP及びAKKの各ペプチドを、材料及び方法のセクションにおいて上記したプロトコールに従って試験した。
異なる濃度のこれらペプチドを、α-グルコシダーゼ活性を50%阻害するのに必要な濃度IC50の測定に用いた。
アカルボース濃度(ポジティブコントロール)の関数としての阻害のパーセンテージの変化を図1に示す。
APペプチド濃度及びVAPペプチド濃度の関数としての阻害のパーセンテージの変化を図2及び図3にそれぞれ示す。
ペプチドのIC50及びアカルボースについてのIC50の結果を以下の表1に示す。
【表１】
2019189647.tif 000004
【０１３４】
したがって、特定のペプチドは、インビトロでα-グルコシダーゼ活性の阻害を示す。
これらのペプチドの中で、APペプチド及びVAPペプチドは、それぞれ13.64±0.92 μM及び20.01±0.21 μMのIC50を示し、試験したペプチドの中で最も高い阻害活性を有する。
APペプチドのIC50は、ポジティブコントロール(IC50=11920±1444 μM)のアカルボースより約874倍低く、一方、VAPペプチドのIC50は、アカルボースより約595倍低い。
【０１３５】
したがって、これらの結果は、海洋生物の副産物のタンパク質において広く存在するVAP、AP、VY、LKP、IY、KY、KW及びGPLペプチドがα-グルコシダーゼ、特にマルターゼを阻害することを確認する。
にも拘らず、LKP、GPL、IY、KY、KW及びVYペプチドは、APペプチド及びVAPペプチドより弱いα-グルコシダーゼ阻害剤である。事実、IY、KY及びKWペプチドは、アカルボースのものに近いIC50を有し、一方、LKP、GPL及びVYペプチドは、APペプチド及びVAPペプチドのものと比較して、それぞれ約355倍、約243倍及び約135倍高いIC50値を有する。
【０１３６】
実施例2：合成ペプチドによるα-グルコシダーゼ阻害のインビトロ測定‐試験番号2 
材料及び方法
1.6 U/mlの0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH 6.8)中のα-グルコシダーゼ20μlを、異なる濃度のペプチドサンプル又は参照用阻害剤8μlと混合する。
サンプルは、10% DMSOを含むミリQ水(参照番号472301でSigmaから入手可能)に予め可溶化する。
37℃で15分間のプレインキュベーション後、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH 6.8)中20 mMの基質p-NPG 20μLを混合物に添加して、反応を開始させる。
反応媒体を37℃で30分間インキュベーションし、その後1 M炭酸ナトリウム(Na2CO3)溶液80μlを添加して反応を停止させる。
【０１３７】
形成された生成物(p-ニトロフェニル)の量を、Fluostar Omega分光計(BMG Labtech社製、ドイツ)を用いて410 nmにおける吸光度を読み取ることによって測定した。
全ての阻害試験を3回実施した。
用いた酵素は、S.セレビシエ由来の組換えα-グルコシダーゼ(参照番号G0660 - 750UNでSigmaから入手可能なマルターゼ)である。
用いた基質は、4-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド(p-NPG) (参照番号N1377でSigmaから入手可能)である。
【０１３８】
ペプチドは、Genosphereから供給され、> 95%の純度を有する。
用いた阻害剤は、アカルボース(参照番号A8980でSigmaから入手可能)、ミグリトール(参照番号M1574でSigmaから入手可能)及びボグリボース(参照番号50359でSigmaから入手可能)である。
試験したペプチド及びアカルボース、ミグリトール、ボグリボースについてのIC50の結果を以下の表2に示す。
【表２】
2019189647.tif 000005
【０１３９】
この結果は、APペプチド及びVAPペプチドが、アカルボース、ミグリトール及びボグリボースの３つの参照(公知のグルコシダーゼ阻害剤)と比べて、α-グルコシダーゼを強く阻害することを確認する。
【０１４０】
実施例3： LKPペプチド及びAPペプチドのインビトロにおける阻害タイプの決定
初速度に基づき、各濃度の阻害剤LKPについてのLineweaver-Burk表現を示し、阻害タイプを決定した。合成LKPペプチドは、GENOSPHERE Biotechnologiesにより供給された。
結果を図4に示す。
結果によれば、LKPペプチドによるp-NPG分解の阻害は拮抗タイプである：全ての直線が点1/Vmaxで交わる。
この試験は、LKPペプチドが膵臓α-グルコシダーゼに対して阻害活性を有することを示す。
また、この試験は、GENOSPHERE Biotechnologiesにより供給されたAPペプチドを用いて実施した。
【０１４１】
初速度に基づき、各濃度の阻害剤APについてのLineweaver-Burk表現を示し、阻害タイプを決定した。
結果を図5に示す。
結果によれば、APペプチドによるp-NPG分解の阻害は拮抗タイプである：全ての直線が点1/Vmaxで交わる。
この試験は、APペプチドが膵臓α-グルコシダーゼに対して強い阻害活性を有することを示す。
【０１４２】
実施例4：異なる合成ペプチドの存在下でのα-グルコシダーゼ活性のインビボ阻害試験
材料及び方法
血糖応答に対する、VAPペプチド及びAPペプチドの阻害活性及びVAPペプチド＋APペプチドの効果は、db/dbマウスのインビボにおけるスクロース耐性及びマルトース耐性の経口試験において測定することができる。
マウスは4週齢であり、各マウスはそれら自身がコントロールである。
スクロース及び/又はマルトース(4g/kg)耐性に関する５つの経口試験を最小72時間の間隔で、各マウスについて実施した。
3週間の試験中、マウスの身体組成における変化の潜在的な交絡効果を打ち消すように順番を決定する。
【０１４３】
５つの試験は以下のとおりである：
・  (0.9%食塩水を含む)コントロールアッセイ；
・  APペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  VAPペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  APペプチド(濃度500mg/kg)及びVAPペプチド(濃度500mg/kg)を用いての試験；
・  アカルボース(濃度10mg/kg)を用いての試験。
【０１４４】
スクロース又はマルトース及び試験生成物を0.9%食塩水中で希釈し、次に胃経路で直接投与する。
血糖値を測定するために、胃経路投与の５分後に、最初の血液サンプル(t＝0)を尾から採取する；次に15分後、30分後、45分後、60分後、90分後及び120分後に６つのさらなるサンプルを採取する。
主要な評価基準は、スクロース又はマルトース投与後２時間にわたっての血糖値曲線下面積の測定値(AUC、曲面下面積、0〜120分、g*min/L)である。
上記のプロトコールのために用いることができるα-グルコシダーゼは、例えば、マルターゼであるサッカロマイセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の組換えα-グルコシダーゼであり得る。
【０１４５】
実施例5：合成APペプチド及び合成VAPペプチドの存在下でのα-グルコシダーゼ活性のインビボ阻害試験
血糖応答に対するVAPペプチド及びAPペプチドの阻害活性及びVAPペプチド＋APペプチドの効果は、遺伝的原因によるグルコース不耐性を有するdb/dbマウスのインビボにおけるマルトース耐性の経口試験において測定することができる。
マウスは4週齢であり、各マウスはそれら自身がコントロールである。
血糖値の一時的増大を引き起こすために、マルトース用量(2g/kg)を用いた。
【０１４６】
実験プロトコール
マルトース(2g/kg)耐性の４つの経口試験を最小48 hの間隔で、各マウスについて実施した。3週間の試験中、マウスの身体組成における変化の潜在的な交絡効果を打ち消すように順番を決定する。
【０１４７】
以下の４つの試験をランダムな順序で実施した：
-  コントロール(0.9%食塩水)；
-  APペプチド(500mg/kg)の摂取；
-  VAPペプチド(500mg/kg)の摂取；
-  APペプチド(500mg/kg)＋VAPペプチド(500mg/kg)の摂取。
0.9%食塩水中に希釈されたマルトース及び試験生成物を経口経路(胃管栄養法)で直接投与した。
【０１４８】
実験サンプル
血糖値を測定するために、胃経路投与の５分前に、最初の血液サンプル(t＝0)を尾から採取した；次に15分後、30分後、60分後、90分後及び120分後に５つのさらなるサンプルを採取した。
【０１４９】
評価基準
-  主要な基準：主要な評価基準は、マルトース投与後２時間にわたっての血糖値曲線下面積の測定値である(AUC、曲面下面積、0〜120分、mg*h/dl)。曲面下面積が小さいほど、用いるペプチドは、より有効である。曲面下面積は、到達した血糖値の最大レベルだけでなく、炭水化物の摂取後２時間にわたっての血糖値の変化の動態も考慮しているので、炭水化物による経口負荷に対する血糖応答をより表している。
-  副次的な基準：二次的な評価基準は、Cmax血糖値(120分で測定される最大値)、ΔCmax血糖値(ΔCmax血糖値＝Cmax血糖値−t0における血糖値＝150)、AUCnet (t0における値を差し引いた血糖値から算出したAUC)であった。AUC (曲面下面積)は、トラペジウム法により評価した。AUCnetについて、測定時間(2h)を乗じた基底血糖値を、上記で算出したAUCから差し引いた。
【０１５０】
マルトース耐性試験中の血糖値の変化を図6に示す。それは、グロス値(すなわち、安静時の値が差し引かれた「正味の」値とは対照の直接測定値)を示す。試験は、4群のマウス(8匹/群)を用いて実施し、曲線は、結果の平均値を用いて構築した。
単独で又は併用して用いたAPペプチド及びVAPペプチドは、試験対象のマウスの血糖値を低下させることができる。
マルトース耐性の経口試験中の安静時の値を差し引いた最大血糖値を図7に示す。例えば、APについての値は、約280mg/dlである(430−150＝280、すなわち最大値−経管栄養法の５分前に測定した安静時の値。これは、いくらかの変動を示し得る基底血糖値とは独立して、実験条件の影響のより直接的な証明を提供する)。
これらの値は、マルトース耐性試験中に得られた最大血糖値に対するAPペプチドによる治療の顕著な効果を証明する。
【０１５１】
APペプチドの顕著な効果は、図８に示すAUCの結果によって確認される。
事実、APペプチドを用いての治療は、マルトース耐性の経口試験中のグルコースAUCに対して有益な効果を示す。
【０１５２】
実施例6：pHが調整されたヤギ乳由来のホエータンパク質加水分解物の産生
タンパク質の供給源
ヤギ生乳から単離されたホエータンパク質の濃縮物(WPC) (タンパク質の80%)
使用した酵素
プロタメックス(EC番号3．4．21．14)：
これは、Novozymes Corp社の登録商標である。この酵素は、参照番号P0029でSigma社から入手可能である。
それは、プロテアーゼ混合物である(バシラス・リケニフォルミス由来のアルカラーゼ(Alcalase)及びバシラス・アミロリケファシエンス由来のニュートラーゼ(Neutrase))。
酵素活性は、1.5 U/g固体である。
バッチ番号：119K1454V
【０１５３】
フレーバザイム(Flavourzyme)：
これは、Novozymes Corp社の登録商標である。この酵素は、参照番号P6110でSigma社から入手可能である。
それは、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のプロテアーゼ/ペプチダーゼ混合物である。
酵素活性は、500 U/gである。
バッチ番号：SLBJ3967U
【０１５４】
プロリン特異的エンドプロテアーゼ：
この酵素は、Brewers clarexの商標でDSMが販売している(この酵素は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)から単離される)。酵素は、参照番号E1411でSigma社から入手可能である。
それは、フラボバクテリウム属の１種(Flavobacterium sp)のプロリン特異的エンドペプチダーゼである。より具体的には、酵素は、ペプチド配列のプロリンのC末端側の結合を特異的に加水分解する。
酵素活性は、5 U/mgである。
バッチ番号：SLBD9700V
【０１５５】
ペプシン：
酵素は、参照番号P7000でSigma社から入手可能である。それは、ブタ胃粘膜のペプシンである。
酵素活性は、250 U/mg固体である。
バッチ番号：SLBH3879V
【０１５６】
加水分解は、温度及びpHの調整並びに加水分解のモニタリングが可能なMetrohm社のpH-Stat 718 Stat Titrinoステーションで実施する。このステーションは、200〜1900 r.p.mでの撹拌を可能にするMetrohm社の728 Stirrer cellも備えている。
ヤギ乳由来のホエータンパク質の溶液は、水中5%の乾燥物に相当する(これは、例えば、超純水30 mL中の1500 mgに相当する)。
加水分解の前に、溶液を80℃で10分間加熱することによる変性工程を行う。
加水分解反応を停止させるために、溶液の温度を15分間90℃に上昇させて媒体中になお存在する酵素を変性させる。
次に、加水分解物をアリコートに分け、精製及び分析まで−20℃で保存する。
【０１５７】
１．  １つの酵素(フレーバザイム)による加水分解の実例
溶液を温度50℃まで加熱し、6M NaOHを添加してpHを8.0とする。750μLのフレーバザイム(750μL/30 mL/1500 mgのWPC、5% v/w)を添加して、加水分解を開始させる。pHは、0.1M NaOH を添加することによって8で維持する。
【０１５８】
２．  二重の加水分解(プロタメックス及びペプシン)の実例
溶液を温度50℃まで加熱し、6M NaOHを添加してpHを8.0とする。60mgのプロタメックス(60 mg/30 mL/1500 mgのWPC、4% w/w)を添加して、加水分解を開始させる。pHは、0.1M NaOHを添加することによって8で維持する。
加水分解が停止したら、pHを2まで低下させ、30mgのペプシン(30 mg/30 mL/1500 mgのWPC、2% w/w)を添加する。今回、pH は、0.1M HClを添加することによって調整する。
【０１５９】
実施例7：pHが調整されていないヤギ乳由来のホエータンパク質の加水分解物の産生
タンパク質の供給源
ヤギ生乳から単離されたホエータンパク質の濃縮物(WPC)(タンパク質の80%)
用いた酵素
プロタメックス(参照番号P0029でSigma社から入手可能)(60 mg/30 mL/1500 mgのWPC、4% w/w)又はフレーバザイム(参照番号P6110でSigma社から入手可能)(750μL/30 mL/1500 mgのWPC、5% v/w)。
【０１６０】
加水分解は、超純水又はリン酸カリウム緩衝液(pH8.0、モル濃度50mM)中で実施する。
ヤギ乳由来のホエータンパク質の溶液は、緩衝液又は超純水中5%の乾燥物に相当する。
加水分解前に、溶液を80℃で10分間加熱することによる変性工程を行う。
次に、媒体の内部温度を50℃に制御し、600rpmの撹拌を提供するRadley Tech Carousel 6 supports (Radley社製の慣用の反応ステーション)で加水分解を行う。
加水分解反応を停止させるために、6 h後、溶液の温度を15分間90℃に上昇させ、媒体中になお存在する酵素を変性させる。
次に、加水分解物をアリコートに分け、分画及び分析まで−20℃で保存する。
【０１６１】
実施例8：ヤギ乳由来のホエータンパク質加水分解物の分画
上記で産生した加水分解物(実施例6及び7)を一連の分画に付し、標的の低分子量ペプチドを濃縮させる。
第１の遠心分離工程は、ペレットに含まれる、加水分解されていない高分子量のタンパク質の除去を目的とする。
【０１６２】
次に、30〜3 kDaのカットオフで一連の連続的限外濾過を、加水分解されたタンパク質を含む上清について行う。限外濾過は、Millipore社の参照用アミコンウルトラ(Amicon Ultra)(30、10及び3 kDaのカットオフで2 mL)の遠心分離ユニットを用いて行う。用いる遠心分離機は、Fisher Bioblock Scientific Sigma 3-18K - 3-16Kモデルである。
【０１６３】
用いる方法を図9に示す。
各中間段階において、透過物、残留物、ペレット及び上清の部分をアリコートに分け、その後凍結乾燥する。
遠心分離の結果、ペレット(固体、チューブの底)及び上清(液体画分)の２つの画分が得られる。
限外濾過により、残留物及び透過物が得られる。
残留物は、膜分離技術において用いられる用語であり、濾過中に留まった粒子を言い表す。残留物の対義語が透過物である。
残留物は、濾物とも呼ばれる。
透過物は、膜によってペプチドが除去された液体である。透過物は、濾液とも呼ばれる。
その後、分析までサンプルを−20℃で保存する。
【０１６４】
実施例9：ヤギ乳由来ホエータンパク質加水分解物の質量プロファイルの測定
分画の各段階において、予め生成された加水分解物(実施例６及び７)について、タンパク質の残量をBCA法(ビシンコニン酸アッセイ)で測定した。この定量によりタンパク質の加水分解物の質量プロファイル測定が可能になる。
【０１６５】
試薬
用いる試薬は、ビシンコニン酸(参照番号B9643でSigmaから入手可能)、硫酸銅(II)(参照番号C2284でSigmaから入手可能)、BSA (ウシ血清アルブミン)(参照番号A7888でSigmaから入手可能)である。
【０１６６】
プロトコール
96-ウェルマイクロプレート中で、25μLの試験サンプルに、200μLのBCA試薬(ビシンコニン酸：硫酸銅(II)の比(V:V)が25:0.5の混合物に相当)を添加する。
濃度を測定するために、標準レンジのBSAを調製し、0〜0.6mg/mLの濃度で試験する。サンプルを添加したら反応を37℃で30分間実施し、次にOD (光学密度)を526nmで読み取る。
【０１６７】
結果を図10に示す。
プロタメックスに代えてフレーバザイムを用いることで、3kDa未満のものの割合がより高いペプチドを生成させることが可能になる。
より具体的には、pHを調節せずにフレーバザイムを用いることは、分画後に、標的である3kDa未満の分子量のペプチドの最大量を得ることを可能にする加水分解方法である。
反対に、緩衝液及びプロタメックス酵素を用いることは、3kDa未満のペプチドを25%生成させることを可能にするに過ぎない。したがって、このプロトコールは、低分子量のペプチドの放出に適していないようである。
【０１６８】
実施例10：ヤギ乳由来ホエータンパク質加水分解物中のAPペプチドの同定
１．  HPLC-MS分析による合成APペプチドの特徴
同定は、C18 Prontosilカラム(250×4 mm、2.0μm)又はWaters Xbridge BEH130 C18カラム(5μm、4.6x250 mm)を用いてのAgilent analytical HPLC (1100LC)及び215nmにおけるUV及び質量分析(MS-イオントラップ、ポジティブスキャンモードでのエレクトロスプレイタイプのイオン化による)の二重検出を用いて実施する。
【０１６９】
MS条件は、60〜600m/zのスキャン、187の標的質量(m/ｚ)、温源300℃、10 L/分の窒素流速である。勾配は、0.1% TFA (トリフルオロ酢酸)及びミリQ水からなる溶媒Aと、0.1% TFA及びアセトニトリルからなる溶媒Bの２つの溶媒を用いて、1% Bから開始して、55分後に30%、60分に50%、最後に65分に100%に到達し、75分において1%に戻る。
【０１７０】
UV及び質量に関して、参照用質量スペクトル及び保持時間を得るために、Genosphereからの(95%を超える純度の)APペプチドを分析する。
C18 Prontosilカラムで分離を行うとき、純粋なAPペプチドは、3.4分の保持時間及び、質量スペクトルにおいて187及び116における２つの特徴的なm/zピークを有する。187フラグメントはMH+に、209はMNa＋に、116はペプチドの、プロリンのC末端側でのフラグメンテーションに相当する。
C18 Waters BEHカラムで分離を行うとき、純粋なAPペプチドは、10.5分の保持時間及び、質量スペクトルにおいて187及び116における２つの特徴的なm/zピークを有する。187フラグメントはMH+に、209はMNa＋に、373は2MH＋に、395は2MNa＋に、116はペプチドの、プロリンのC末端側でのフラグメンテーションに相当する。
【０１７１】
２．  フレーバザイムを用いて得られた加水分解物におけるAPペプチドの同定
pHが調整されたフレーバザイム酵素及び調整されていないフレーバザイム酵素を用いて産生した実施例6.1及び7の加水分解物をC18 Waters BEHカラムでHPLC-MSで分析する。ここで、APペプチドは10.5分に近い保持時間を有する。図11は、UV、質量スペクトル及び、加水分解物の187(APのMH＋)の標的質量/電荷についての抽出イオンクロマトグラムを示す。
【０１７２】
EIC187に基づけば、pHが調整されたフレーバザイム及び調整されていないフレーバザイムによる加水分解中、11分台の標準APペプチド(すなわち、化学合成による純粋なAP分子)に相当する保持時間を有する優勢なピークが見られる。このピークの質量スペクトル分析は、APペプチドの特異的マーカー(m/z=187; 116; 373)を明らかにしており、これらの加水分解物中におけるAPペプチドの存在を保証している。EICに第2のピークが存在するが、標準PAペプチド(すなわち、化学合成による純粋なPA分子)に相当する7分台の保持時間を有する。このピークの質量スペクトル分析は、PAペプチドの特異的マーカー(m/z=187; 90; 373)を明らかにしている。
【０１７３】
質量187の２つのペプチド(所望のAPペプチドだけでなく、PAペプチドも)が存在する。
これらの分析は、pHが調整されたか、又は調整されていないフレーバザイムを用いる加水分解プロトコールにより、ヤギホエータンパク質の濃縮物からAPペプチドを放出することが可能になることを確認する。
【０１７４】
３．  プロタメックス/ペプシンのペアを用いて得られた加水分解物におけるAPペプチドの同定
次に、Prontosilカラムを用いてのHPLC-MSで実施例6.2の加水分解物を分析する。ここで、APペプチドは、3.5分台の保持時間を有する。プロタメックスによる加水分解の第１工程の後、及びペプシンによる加水分解の第２フェーズの後における187の標的質量/電荷(APのMH＋)についての抽出イオンクロマトグラムを測定する。
【０１７５】
プロタメックスによる加水分解の後、187m/zを含む優勢なピークは、16分台の保持時間について見られる。この保持時間は、より大きなペプチドのものに相当する。ペプシンの作用後、3.5分において、加水分解物中に質量187のAPペプチドが現れる。
これらの分析は、２つの酵素製剤(プロタメックス及びその後のペプシン)を用いる加水分解プロトコールにより、ヤギホエータンパク質の濃縮物からAPペプチドを放出することが可能になることを確認する。
【０１７６】
実施例11： APペプチドを含む加水分解物を産生するためのタンパク質の選択
(少なくとも0.05%〜<5%又は少なくとも5%のAPユニットを含むか、又は当該ユニットにより構成される)AP配列を有する全てのタンパク質、特に以下の配列を有するタンパク質を本発明において用いることができる：
【０１７７】
1)乳のタンパク質(雌ウシ、雌ウマ若しくは雌ロバ、雌ヒツジ)
a/  β-ラクトグロブリン(雌ウシの乳)
Uniprotデータ：P02754
1つのAP, 178 AA, 19883 Da
【化１】
2019189647.tif 000006
【０１７８】
b/  α-S1-カゼイン(雌ウシの乳)
Uniprotデータ：P02754
1つのVAPを含む2つのAP, 214 AA, 24529 Da
【化２】
2019189647.tif 000007
【０１７９】
c/  β-カゼイン(雌ウシの乳)
Uniprotデータ：P02666
1つのAP, 214 AA, 24529 Da
【化３】
2019189647.tif 000008
【０１８０】
d/  ラクトフェリン(雌ウシの乳)
Uniprotデータ：P24627
1つのVAPを含む5つのAP, 708 AA, 78056 Da
【化４】
2019189647.tif 000009
【０１８１】
2)  線維性タンパク質(エラスチン、コラーゲン、アクチン)
a/  アクチン(大西洋サケ)
Uniprotデータ：B5XFZ3
1つのVAPを含む4つのAP, 376 AA, 41584 Da
【化５】
2019189647.tif 000010
【０１８２】
b/  コラーゲンα2(I)(オンコリンカス・ケタ(Oncorhynchus keta)、シロザケ)
Uniprotデータ：Q8UUJ4 
8つのAP, 1352 AA, 126443 Da
【化６】
2019189647.tif 000011
【０１８３】
c/  コラーゲンα1 (II)配列(ウシ)
Uniprotデータ：P02459
21のAP, 1487 AA, 141828 Da
【化７】
2019189647.tif 000012
【０１８４】
d/  エラスチン(ウシ)
Uniprotデータ：FINOH9
2つのVAPを含む9つのAP, 805 AA, 72317 Da
【化８】
2019189647.tif 000013
【０１８５】
3)  卵タンパク質
a/  オボトランスフェリン(鶏卵)
Uniprotデータ: P02789 Uniprotデータ：P02789
5つのAP, 705 AA, 75828 Da
【化９−１】
2019189647.tif 000014
【化９−２】
2019189647.tif 000015
【０１８６】
4)  植物性タンパク質
a/   レグミンA（ピスム・サティブム(Pisum sativum)、エンドウのタンパク質）
Uniprotデータ：P02857 
1つのAP, 517 AA, 58805 Da
【化１０】
2019189647.tif 000016
【０１８７】
実施例12：フレーバザイムによるエンドウのタンパク質、魚ゼラチン、牛ゼラチンの加水分解物の産生
タンパク質の供給源
エンドウのタンパク質(RoquetteのNutralisから入手可能)、魚ゼラチン(Sigmaから入手可能)、牛ゼラチン(Sigmaから入手可能)
用いる酵素
フレーバザイム(参照番号P6110でSigma社から入手可能)(WPCの750μL/30 mL/1500 mg、5% v/w)
【０１８８】
加水分解の前に、タンパク質溶液（超純水中5%の乾燥物）を80℃で10分間加熱することによる変性工程を行う。
次に、媒体の内部温度を50℃に制御し、600rpmでの撹拌を可能にするRadley Tech Carousel 6 supportsで、フレーバザイムによる酵素的加水分解を行う。
反応を停止させるために、6時間後、溶液温度を15分間90℃に上昇させて媒体中になお存在する酵素を変性させる。次に、加水分解物はアリコートに分け、分画及び分析まで−20℃で保存する。
【０１８９】
フレーバザイム酵素により産生した加水分解物を、C18 Waters BEHカラムを用いるHPLC-MSで分析する。
図11は、(A)215nmにおけるUV検出を用いて、(B)全イオンの質量検出を用いて、(c)AP及びPAに特徴的なイオンm/z 187に選択的な質量検出を用いて得られたHPLC-MSクロマトグラムを示す。
【０１９０】
実施例13： APユニット及び/又はVAPユニットを含むタンパク質に対するサーモライシン型のプロテアーゼの仮説的作用
1/  β-ラクトグロブリン(雌ウシの乳) P02754に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表3に示す。
【表３】
2019189647.tif 000017
【０１９１】
2/  α-S1-カゼイン(雌ウシの乳) P02754に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表4に示す。
【表４】
2019189647.tif 000018
【０１９２】
3/  β-カゼイン(雌ウシの乳) P02666に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表5に示す。
【表５】
2019189647.tif 000019
【０１９３】
4/  ラクトフェリン(雌ウシの乳) P24627に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表6に示す。
【表６】
2019189647.tif 000020
【０１９４】
5/  アクチン(大西洋サケ)B5XFZ3に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表7に示す。
【表７】
2019189647.tif 000021
【０１９５】
6/  コラーゲンα2 (I)(オンコリンカス・ケタ、シロザケ) Q8UUJ4に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表8に示す。
【表８】
2019189647.tif 000022
【０１９６】
7/  コラーゲンα1 (II)配列(ウシ) P02459に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表9に示す。
【表９】
2019189647.tif 000023
【０１９７】
8/  エラスチン(ウシ) FINOH9に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表10に示す。
【表１０】
2019189647.tif 000024
【０１９８】
9/  オボトランスフェリン(鶏卵) P02789に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表11に示す。
【表１１】
2019189647.tif 000025
【０１９９】
10/  レグミンA（ピスム  サティブム、エンドウのタンパク質）P02857に対するサーモライシンの作用
150〜250 Daのペプチドに関する試験結果を以下の表12に示す。
【表１２】
2019189647.tif 000026
【０２００】
実施例14：合成ペプチドによるDPP- IV (ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害のインビトロ測定
合成ペプチドの阻害活性は、下記のプロトコールに従ってインビトロで測定できる。
0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中1.6mMの基質Gly-L-Pro-p-ニトロアニリド25μlを、ペプチドサンプル又は参照用阻害剤25μlと種々の濃度で混合する。サンプルは、Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で予め可溶化する。
37℃で10分間のプレインキュベーション後、0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中0.01 U/mlの濃度のDPP-IV酵素50μlを混合物に添加し、反応を開始させる。反応媒体を37℃で60分間インキュベーションし、その後、100μlの1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)を添加することによって反応を停止させる。
形成された生成物(p-ニトロアニリド)の量を、Fluostar Omega分光計(BMG Labtech社製、ドイツ)を用いて385 nmにおける吸光度を読み取ることによって測定する。
全ての阻害試験を3回実施する。
【０２０１】
用いる基質は、Gly-L-Pro-p-ニトロアニリド塩酸塩(参照番号G0513でSigmaから入手可能)である。
用いる酵素は、ブタ腎臓由来DPP-IV(参照番号D7052でSigmaから入手可能)である。
参照用阻害剤は、Ile-Pro-Ileトリペプチドに相当するジプロチンA (参照番号I9759でSigmaから入手可能)である。
【０２０２】
インビトロで試験したDPP-IV阻害活性に対するペプチドのIC50の結果を以下の表13に示す。
【表１３】
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【０２０３】
この結果は、用いるペプチドが、既知のDPP-IV阻害剤である参照用のジプロチンAと比べて、DPP-IVを弱く阻害することを確認している。特に、APペプチド及びVAPペプチドは、参照用ジプロチンAと比べて、DPP-IVを非常に弱く阻害する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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