(57)【要約】【課題】新規な腫瘍治療組成物を提供すること。【解決手段】各化合物ライブラリーからグリオーマ幹細胞株に対して増殖抑制効果を有する化合物を特定して、該化合物を含む腫瘍治療組成物を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分であるフルオロパルミチン酸を、有効成分であるテモゾロミドと組み合わせたことを特徴とする腫瘍治療組成物。
【請求項２】
前記フルオロパルミチン酸は、２−フルオロパルミチン酸である請求項１に記載の腫瘍治療組成物。
【請求項３】
前記腫瘍は、脳腫瘍である請求項１又は２に記載の腫瘍治療組成物。
【請求項４】
前記脳腫瘍は、神経膠腫である請求項３に記載の腫瘍治療組成物。
【請求項５】
前記神経膠腫は、膠芽腫である請求項４に記載の腫瘍治療組成物。
【請求項６】
フルオロパルミチン酸を有効成分として含む腫瘍治療組成物。
【請求項７】
前記フルオロパルミチン酸は、２−フルオロパルミチン酸である請求項５に記載の腫瘍治療組成物。
【請求項８】
前記腫瘍は、脳腫瘍である請求項６又は７に記載の腫瘍治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分であるフルオロパルミチン酸を、有効成分であるテモゾロミドと組み合わせたことを特徴とする腫瘍治療組成物に関する。また、本発明は、フルオロパルミチン酸を有効成分として含む腫瘍治療組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（脳腫瘍）
脳腫瘍（頭蓋内腫瘍）は、頭蓋内に発生する新生物のみならず、過誤腫や肉芽腫などの占拠性病変を含めた総称である。
一般には、（１）神経上皮組織から発生する神経膠腫、（２）神経鞘細胞から発生する腫瘍、（３）脳膜及び関連組織から発生する腫瘍、（４）悪性リンパ腫、（５）血管原性腫瘍、（６）胚細胞腫、（７）奇形腫様腫瘍（頭蓋咽頭腫など）と腫瘍様病変（過誤腫など）、（８）下垂体前葉腫瘍、（９）周辺組織の腫瘍の頭蓋内進展（褐色細胞腫や脊索腫など）及び（１０）転移性脳腫瘍等に分類される。
【０００３】
（神経膠腫）
神経膠腫（glioma）は、髄上皮（medullary epithelium）から分化してくる細胞系（グリア細胞、神経細胞、松果体実質細胞）の細胞から発生する腫瘍（新生物）の総称である。
一般に、グリア細胞系の腫瘍としては星細胞腫瘍系、乏突起細胞腫系、上衣腫系及び膠芽腫であり、神経細胞系としては髄芽腫、髄様上皮腫、神経芽細胞腫、神経節性神経腫及び神経細胞神経膠腫であり、松果体実質細胞系としては松果体細胞腫及び松果体芽細胞腫である。
なお、悪性神経膠腫のうち退形成性星細胞腫の割合は約30％、膠芽腫の割合は約57％であり、合わせて約80％以上を占める。
【０００４】
（膠芽腫）
膠芽腫（神経膠芽腫；glioblastoma）は、原発性脳腫瘍の約9％を占め、神経膠腫の中でも最も分化度が低い悪性の腫瘍である（WHO grade IV）。成人の大脳半球に好発し、脳実質内にび慢性に浸潤増殖する。
標準的な治療方法は、開頭手術により新たな神経学的脱落症状を来たさない範囲で腫瘍を摘出する。そして、摘出手術後は放射線療法及び化学療法を行う。
しかし、上記治療を行っても、ほぼ100％の症例に再発を認め、平均生存期間は発症より約1年と、生命予後は極めて悪い。
これにより、膠芽腫の治療剤の開発要望が非常に高い。
【０００５】
また、本発明者らは、以下の特許出願及び非特許文献発表を行っている。
特許文献１は、「GSK3βのがん細胞の生存・増殖への関与を明らかにし、がんの治療・診断のための新たな手段を提供すること」を開示している。
特許文献２は、「複数のGSK3β阻害効果を有する化合物投与を特徴とする脳腫瘍治療方法、特に再発脳腫瘍治療方法並びに該治療方法を実施可能な脳腫瘍治療用キット」を開示している。
特許文献３は、「フロクスウリジン及び／又はプリカマイシンを有効成分として含む脳腫瘍治療組成物」を開示している。
非特許文献１は、「GSK3βがヒト膠芽腫細胞の生存及び増殖に関与していること」を開示している。
【０００６】
しかし、上記特許文献及び非特許文献では、有効成分であるフルオロパルミチン酸を、有効成分であるテモゾロミドと組み合わせたことを特徴とする腫瘍治療組成物、並びにフルオロパルミチン酸を有効成分として含む腫瘍治療組成物の開示又は示唆がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再表２００６−０７３２０２号公報
【特許文献２】特開２０１２―０４１３１４号公報
【特許文献３】特開２０１６−２１０７１８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Miyashita K, et al. Potential therapeutic effect of glycogen synthese kinase 3βinhibition against human glioblastoma. Clin Cancer Res 2009;15(3): 887-97.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、膠芽腫は極めて分化度が低く悪性度が最も高い神経膠腫である。実際の腫瘍は手術で完全摘出できないことが多く、既存の抗癌剤治療や放射線照射治療に対しても耐性を示し、極めて難治性である。このように、本腫瘍に対する有効な治療法がないことから、その生命予後は最近の30年間、改善されていない実情であり、脳腫瘍に対する新しい治療薬剤の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、各化合物ライブラリーから、単剤又はテモゾロミドとの併用で、脳腫瘍に関連する細胞株に対して増殖抑制効果を有する化合物を特定して、該化合物を含む脳腫瘍治療組成物を提供した。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の腫瘍治療組成物は、脳腫瘍に関連する細胞株に対しての増殖抑制効果を有する。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．有効成分であるフルオロパルミチン酸を、有効成分であるテモゾロミドと組み合わせたことを特徴とする腫瘍治療組成物。
２．前記フルオロパルミチン酸は、２−フルオロパルミチン酸である前項１に記載の腫瘍治療組成物。
３．前記腫瘍は、脳腫瘍である前項１又は２に記載の腫瘍治療組成物。
４．前記脳腫瘍は、神経膠腫である前項３に記載の腫瘍治療組成物。
５．前記神経膠腫は、膠芽腫である前項４に記載の腫瘍治療組成物。
６．フルオロパルミチン酸を有効成分として含む腫瘍治療組成物。
７．前記フルオロパルミチン酸は、２−フルオロパルミチン酸である前項５に記載の腫瘍治療組成物。
８．前記腫瘍は、脳腫瘍である前項６又は７に記載の腫瘍治療組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における２−フルオロパルミチン酸（2-FPA、候補薬剤）及び／又はテモゾロミド（TMZ）によるグリオーマ幹細胞株に対しての増殖抑制結果。縦軸は、薬剤未添加サンプルの細胞生存率を１００％とする細胞生存率（％）、横軸は薬剤濃度（μＭ）を示す。
【図２】実施例２における２−フルオロパルミチン酸及び／又はテモゾロミドによるグリオーマ幹細胞株に対しての増殖抑制結果。縦軸は、薬剤未添加サンプルの細胞生存率を１００％とする細胞生存率（％）、横軸は薬剤濃度（μＭ）を示す。Ａ：528PN細胞の結果。Ｂ：1123M細胞の結果。
【図３】実施例３におけるスフェアの観察結果。上段の左図はDMSO（コントロール）の結果、上段の中央図は２−フルオロパルミチン酸（2-FPA）２μＭの単剤投与の結果、上段の右図は2-FPA２０μＭの単剤投与の結果、下段の左図はテモゾロミド（TMZ）２μＭの単剤投与の結果、下段の中央図はTMZ２μＭ＋2-FPA２μＭの併用投与の結果、下段の右図はTMZ２μＭ＋2-FPA２０μＭの併用投与の結果を示す。
【図４】実施例３における１００μm以上のスフェア数の計測結果。縦軸は、１００μm以上のスフェア数、横軸は、添加薬剤の種類を示す。Ａ：２−フルオロパルミチン酸（2-FPA）単剤を添加した結果。「DMSO」はDMSOの結果、「２μＭ」は2-FPA２μＭの単剤投与の結果、「４μＭ」は2-FPA４μＭの単剤投与の結果、「８μＭ」は2-FPA８μＭの単剤投与の結果、「２０μＭ」は2-FPA２０μＭの単剤投与の結果を示す。Ｂ：テモゾロミド（TMZ）及び２−フルオロパルミチン酸を組み合わせて添加した結果。「DMSO」はDMSOの結果、「TMZ(２μＭ)」はTMZ２μＭの単剤投与の結果、「TMZ＋２μＭ」はTMZ２μＭ＋2-FPA２μＭの併用投与の結果、「TMZ＋４μＭ」はTMZ２μＭ＋2-FPA４μＭの併用投与の結果、「TMZ＋８μＭ」はTMZ２μＭ＋2-FPA８μＭの併用投与の結果、「TMZ＋２０μＭ」はTMZ２μＭ＋2-FPA２０μＭの併用投与の結果を示す。
【図５】実施例４における吸光度の測定結果。縦軸は、吸光度の対数、横軸は、培養時間を示す。「DMSO」はDMSOの結果、「TMZ２５０μＭ」はTMZ２５０μＭの単剤投与の結果、「１μＭ」は2-FPA１μＭの単剤投与の結果、「１μＭ＋ＴＭＺ」は2-FPA１μＭ＋TMZ２５０μＭの併用投与の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明の腫瘍治療組成物）
本発明の腫瘍治療組成物は、有効成分であるフルオロパルミチン酸及びテモゾロミド、又は、有効成分であるフルオロパルミチン酸を含む。
【００１５】
｛テモゾロミド（Temozolomide：TMZ）｝
化学名3,4-dihydro-3-methyl-4-oxoimidazo[5,1-d]-as-tetrazine-8-carboxamide、分子式C6H6N6O2の悪性神経膠腫に適用される経口投与可能な抗癌剤である。テモゾロミドは、癌細胞のDNAなどの核酸の一部にアルキル基という原子集団を結合させることによって、DNAの合成を阻害して癌細胞を死滅させる。
膠芽腫は、テモゾロミド経口投与による治療過程において、テモゾロミドに対する耐性を獲得するという問題がある。テモゾロミドに対する耐性の原因の１つは、腫瘍形成能と治療抵抗性を備えるグリオーマ幹細胞の存在である。
また、商品名「テモダール」として市販されている。
【００１６】
｛フルオロパルミチン酸（fluoropalmitic acid）｝
フルオロパルミチン酸は、分子式C16H31FO2で表される全ての化合物及びそれらの誘導体を含む。フルオロパルミチン酸としては、例えば、２−フルオロパルミチン酸（2-fluoropalmitic acid：2-FPA）、３−フルオロパルミチン酸、４−フルオロパルミチン酸、１６−フルオロパルミチン酸、及びそれらの誘導体が含まれるが、好ましくは、２−フルオロパルミチン酸である。
２−フルオロパルミチン酸は、スフィンゴシン合成阻害剤である。
【００１７】
（薬学的に許容しうる塩）
上記した化合物だけではなく、上記した化合物の薬学的に許容し得る塩、例えば塩基性の酸付加塩、無機もしくは有機の酸またはアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等もまた、本発明に係るグリオーマ幹細胞（グリオーマ細胞）に対しての増殖抑制効果を有する化合物として利用することができる。
加えて、上記した化合物は、通常、それ自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。
本発明の腫瘍治療組成物に使用される有効成分の投与経路は特に制限されず、例えば、経口投与、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与等であってもよいが、静脈内注射又は経口投与が好ましい。
【００１８】
（本発明の腫瘍治療用キット）
本発明の腫瘍治療用キットは、フルオロパルミチン酸及びテモゾロミドを同時に、別々に、又は逐次的に投与可能とするために、各有効成分が別々に複数の容器に収納されているか、又は、各有効成分が空間的に隔離可能な複数の領域を有する１つの容器に収納されている。
さらに、本発明の腫瘍治療用キットは、各有効成分の投与に関する説明書を含んでも良い。なお、該説明書は、下記で示す本発明の腫瘍治療方法における各有効成分の投与スケジュールが記載されている。
特に、本発明の腫瘍治療用キットにおける各有効成分は、経口投与可能な錠剤が好ましいが、徐放性顆粒剤、シロップ、細粒、及び／又は注射剤とすることも可能である。
【００１９】
（本発明の腫瘍治療方法）
本発明の腫瘍治療方法において、フルオロパルミチン酸及びテモゾロミド投与量、投与回数及び投与間隔は、特に限定されず、予防（特に再発防止）及び／又は臨床的治療の目的、疾患のタイプ、患者の体重、年齢、疾患の重篤さなどの条件に応じて適宜選定される。
例えば、以下の投与形態を利用することができるが、特に限定されない。
テモゾロミド：10 mg/m2体表面積〜500 mg/m2体表面積、好ましくは50 mg/m2体表面積〜100 mg/m2体表面積、より好ましくは60 mg/m2体表面積〜90 mg/m2体表面積、最も好ましくは65 mg/m2体表面積〜85 mg/m2体表面積を１日に１回又は１日数回（朝、昼、夕）に分けて投与する。加えて、10 mg/m2体表面積〜500 mg/m2体表面積、好ましくは50 mg/m2体表面積〜300 mg/m2体表面積、より好ましくは100 mg/m2体表面積〜250 mg/m2体表面積、最も好ましくは150 mg/m2体表面積〜200 mg/m2体表面積を３〜５週間に３〜７日間、好ましくは４週間に５日間だけ連続投与することもできる。
テモゾロミドとの併用投与の場合のフルオロパルミチン酸：0.010mg/kg体重〜0.300mg/kg体重、0.020mg/kg体重〜0.250mg/kg体重又は0.011mg/kg体重〜0.212mg/kg体重であってもよく、好ましくは0.044mg/kg体重〜0.212mg/kg体重、より好ましくは0.044mg/kg体重〜0.088mg/kg体重を１日に１回又は１日数回（朝、昼、夕）に分けて投与する。
単剤投与の場合のフルオロパルミチン酸：0.010mg/kg体重〜0.300mg/kg体重、0.011mg/kg体重〜0.212mg/kg体重、0.044mg/kg体重〜0.088mg/kg体重又は0.050mg/kg体重〜0.250mg/kg体重であってもよく、好ましくは0.044mg/kg体重〜0.212mg/kg体重、より好ましくは0.088mg/kg体重〜0.212mg/kg体重を１日に１回又は１日数回（朝、昼、夕）に分けて投与する。
加えて、連日投与、数日に１回投与又は隔週に数回投与とすることもできる。３〜５週間に３〜７日間、好ましくは４週間に５日間だけ連続投与することもできる。
【００２０】
（テモゾロミド及びフルオロパルミチン酸の併用投与）
テモゾロミド及びフルオロパルミチン酸は、同時投与、数時間の間隔を空けての投与、１日の間隔を空けての投与、数日の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与、数か月の間隔を空けての投与でもよいが、好ましくは同時投与である。より詳しくは、月に一度5日間連日で一日一回の同時投与が好ましい。
また、テモゾロミド及びフルオロパルミチン酸を、生理学的に許容されうる溶媒、担体、賦形剤、結合剤等と混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。
溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、アルコール、生理食塩水等が挙げられる。
担体としては、特に限定されないが、例えば、酸、塩基、緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤等が挙げられる。
賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、充填剤、凝固剤、滑たく剤、崩壊剤、色素、甘味料、香料、コーティング剤等が挙げられる。
結合剤としては、特に限定されないが、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
さらに、テモゾロミド及びフルオロパルミチン酸を別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤等を用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。
【００２１】
（本発明の腫瘍治療組成物、腫瘍治療用キット又は腫瘍治療方法の治療対象）
本発明の腫瘍治療組成物、腫瘍治療用キット又は腫瘍治療方法の治療対象は、いずれの段階（早期、進行、末期）のすべての悪性腫瘍（又は悪性腫瘍の可能性）を含む。例えば、副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、脳腫瘍を含む。
好ましくは脳腫瘍｛神経上皮組織から発生する神経膠腫、神経鞘細胞から発生する腫瘍、脳膜及び関連組織から発生する腫瘍、悪性リンパ腫、血管原性腫瘍、胚細胞腫、奇形腫様腫瘍（頭蓋咽頭腫など）と腫瘍様病変（過誤腫など）、下垂体前葉腫瘍、周辺組織の腫瘍の頭蓋内進展（褐色細胞腫や脊索腫など）及び転移性脳腫瘍等｝、特に神経膠腫｛グリア細胞（星細胞腫瘍系、乏突起細胞腫系、上衣腫系及び膠芽腫）、神経細胞（髄芽腫、髄様上皮腫、神経芽細胞腫、神経節性神経腫及び神経細胞神経膠腫）、松果体実質細胞（松果体細胞腫及び松果体芽細胞腫）｝、さらには膠芽腫である。
さらに、これらの腫瘍が再発、又は、開頭手術後に残存する腫瘍（原発性病変）も治療対象とする。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」とは、哺乳動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、より好ましくはヒトをいう。
【００２３】
本発明の腫瘍治療組成物、腫瘍治療用キット、及び／又は腫瘍治療方法は、癌組織及び／又は腫瘍の大きさを縮小、腫瘍細胞の増殖を遅延、及び／又は消滅させることを提供する。
腫瘍の大きさの縮小及び／又は増殖の抑制は、固形腫瘍における応答評価基準（RECIST）の指針によって測定できる。
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、以下の実施例は金沢大学医学倫理委員会の承認を得て、実施されている。
【実施例１】
【００２５】
（薬剤ライブラリーからのプレスクリーニング）
FDA Approved Drug Library、Kinase Inhibitor Library、Phosphatase Inhhibitor Library、Fatty acid Drug Library及びICCB Known Bioactives Libraryの５つの薬剤ライブラリーから既存の１３０１の化合物を候補薬剤として選択した。そして、グリオーマ幹細胞に対しての増殖抑制効果を有する化合物を選択した。
詳細は、以下の通りである。
【００２６】
（ＷＳＴ−８増殖アッセイによるプレスクリーニング）
グリオーマ幹細胞株を使用して、グリオーマ幹細胞の増殖抑制効果を調べるために、以下に示す方法に従って、ＷＳＴ−８増殖アッセイを行った。グリオーマ幹細胞株としては、1123M（Mesenchymal type）を使用した。ＷＳＴ−８増殖アッセイに使用したＷＳＴ−８試薬には、Microbial Viability Assay Kit-WST（DOJINDO）を用いた。各種試薬の添加には、多機能・卓上ピペットステーション：EDR-384SII（BioTec）を用いた。
（１）グリオーマ幹細胞をDMEM/F-12培地（B27、EGF、bFGF、Glutamax、Penicilin-Streptavidinを含む）に添加し、培養した。さらに、DMEM/F-12にて2000細胞／ウェルになるように希釈し、細胞懸濁液を調製した。
（２）テモゾロミド（TMZ、SIGMA-ALDRICH社製）を、50μＭで（１）の細胞懸濁液に添加し、「TMZ単剤」サンプルとした。
（３）１３０１の候補薬剤について、各薬剤を、1μＭ、5μＭ、20μＭの3種類の濃度で（１）の細細胞懸濁液に添加し、「候補薬剤単剤」サンプルとした。
（４）テモゾロミド50μＭと候補薬剤1μＭ、5μＭ、20μＭを、（１）の細胞懸濁液に添加し、「TMZと候補薬剤」の併用サンプルとした。
（５）非接触３８４穴プレートの各ウェルに（１）〜（４）の細胞懸濁液36μlを播種した。発色試薬を各ウェルに4μl添加した。インキュベーター内で37℃、3時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダー｛ReadersInfiniten 200 Pro（TECAN）｝を用いて450 nmの吸光度を測定した。測定結果より、薬剤を添加しなかったコントロールを１００％として、細胞生存率を算出した。
（６）「TMZ単剤」及び「候補薬剤単剤」の細胞生存率の算出結果から「相加効果」による細胞生存率を算出した。より詳しくは、以下の計算式により算出した。
「相加効果」による細胞生存率（％）＝１００−（１００−「テモゾロミド単剤」の細胞生存率）−（１００−「候補薬剤単剤」の細胞生存率）
（７）（４）の「TMZと候補薬剤」の細胞生存率の算出結果が、（６）の「相加効果」による細胞生存率よりも５％以上低下した、すなわち、「相加効果」を上回る「相乗効果」を示した候補薬剤を抽出した。
【００２７】
（結果）
プレスクリーニングにより１３０１の化合物から５４の候補薬剤を抽出した。
代表例として、２−フルオロパルミチン酸の結果を図１に示す。
以上により、２−フルオロパルミチン酸（2-FPA）を含む５４の候補薬剤を抽出した。これらの薬剤は、テモゾロミドと併用することにより、単なる相加効果ではなく、相乗効果を有することが確認できた。
【実施例２】
【００２８】
（低濃度におけるＷＳＴ−８増殖アッセイによるスクリーニング）
実施例１で抽出した５４の候補薬剤について、より低濃度の条件で、ＷＳＴ−８増殖アッセイを行った。1123M（Mesenchymal type）及び528PN（Proneural type）の２種類のサブタイプのグリオーマ幹細胞株を使用した。詳細は、以下の通りである。
（１）グリオーマ幹細胞をDMEM/F-12培地に添加し、培養した。さらに、DMEM/F-12にて2000細胞／ウェルになるように希釈し、細胞懸濁液を調製した。
（２）テモゾロミドを、50μＭで（１）の細胞懸濁液に添加し、「TMZ単剤」サンプルとした。
（３）５４の候補薬剤について、各薬剤を、0.1μＭ、0.5μＭ、1μＭの３種類の濃度で（１）の細細胞懸濁液に添加し、「候補薬剤単剤」サンプルとした。
（４）テモゾロミド50μＭと候補薬剤0.1μＭ、0.5μＭ、1μＭを、（１）の細胞懸濁液に添加し、「TMZと候補薬剤」の併用サンプルとした。
（５）非接触96穴プレートの各ウェルに（１）〜（４）の細胞懸濁液200μlを播種した。発色試薬を各ウェルに20μl添加した。インキュベーター内で37℃、3時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。測定結果より、薬剤を添加しなかったコントロールを１００％として、細胞生存率を算出した。
（６）（３）の「候補薬剤単剤」及び（４）の「TMZと候補薬剤」での細胞生存率が最も低下する１剤を選択した。
【００２９】
（結果）
スクリーニングにより５４の候補薬剤から２−フルオロパルミチン酸を抽出した。２−フルオロパルミチン酸の結果を図２に示す。
２−フルオロパルミチン酸は、「単剤」及び「TMZとの併用」の場合で、グリオーマ幹細胞（1123M及び528PN）に対する増殖抑制効果（細胞生存率低減効果）を有することを確認した。
【実施例３】
【００３０】
（スフェア形成アッセイ）
ヒト脳腫瘍から樹立したヒト脳腫瘍幹細胞をマウスに移植して、形成された腫瘍から樹立したグリオーマ幹細胞株サブタイプＫＧＳ−０１を使用して、テモゾロミド（TMZ）と２−フルオロパルミチン酸（2-FPA、CAYMAN CHEMICAL COMPANY社製）のグリオーマ幹細胞への増殖抑制効果を定量するために、以下の方法でスフェア形成アッセイを行った。
（１）ＫＧＳ−０１細胞をDMEM/F-12培地（B21、EGF、bFGF、Glutamax、Penicilin-Streptavidinを含む）に懸濁し、1000細胞／ウェル程度の濃度で96穴プレートに播種した。
（２）各ウェルに2-FPA２μＭ、2-FPA４μＭ、2-FPA８μＭ、2-FPA２０μＭ、TMZ２μＭ、TMZ２μＭ＋2-FPA２μＭ、TMZ２μＭ＋2-FPA４μＭ、TMZ２μＭ＋2-FPA８μＭ、又はTMZ２μＭ＋2-FPA２０μＭとなるように薬剤を添加した。薬剤の溶媒はDMSOであり、薬剤投与量は1μlとなるように調製したため、コントロールとするウェルにはDMSOを1μl添加した。
（３）インキュベーター内で37℃、10日間培養した。
（４）培養後、各ウェル内のスフェアの大きさ・形成数を観察し、さらに１００μm（マイクロメートル）以上のスフェア数を計測した。
【００３１】
（結果）
観察結果の代表例を図３に示す。
テモゾロミド単剤及び２−フルオロパルミチン酸単剤において、スフェアの形成数がDMSOの場合よりも減少した。さらに、テモゾロミド及び２−フルオロパルミチン酸の併用により、スフェアの形成数が減少し、さらにスフェアの大きさも低下した。このことから、テモゾロミド及び２−フルオロパルミチン酸の併用により、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を阻害した。
１００μm以上のスフェア数の計測結果を図４に示す。
２−フルオロパルミチン酸単剤において、DMSO及びテモゾロミド単剤よりも１００μm以上のスフェア数が低下した。
また、２−フルオロパルミチン酸は、テモゾロミドとの併用において、テモゾロミド単剤及び２−フルオロパルミチン酸単剤よりも高い効果が得られた。
以上より、２−フルオロパルミチン酸がテモゾロミドのグリオーマ幹細胞への増殖抑制の作用増強効果を有することを定量的に確認できた。また、テモゾロミド及び２−フルオロパルミチン酸の併用により、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を阻害できることを確認した。
【実施例４】
【００３２】
（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ増殖アッセイ）
グリオーマ細胞株U87、U251、T98G、SNB19及びA172を使用して、以下の方法でＡｌａｍａｒＢｌｕｅ増殖アッセイを行った。
（１）各細胞をDMEM（1X）培地（FBS：Fetal Bovine Serumを0.1%になるように添加）に懸濁し、1000細胞／ウェル程度の濃度で96穴プレートに播種した。
（２）各ウェルにDMSO１μl、TMZ２５０μＭ、2-FPA１μＭ、TMZ２５０μＭ＋2-FPA１μＭとなるように薬剤を添加した。
（３）インキュベーター内で37℃、９６時間培養し、培養開始後０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間において、吸光度（吸収波長570 ｎｍ）を測定した。
【００３３】
結果を図５に示す。
使用した５種類のヒト脳腫瘍由来細胞株全てにおいて、２−フルオロパルミチン酸及びテモゾロミドの併用は、テモゾロミド単剤よりも吸光度が低くなり、細胞増殖をより抑制したことを確認した。
５種類の細胞株は、それぞれ摘出患者が違っており、形態学的・分子生物学的に異なり、増殖速度等も異なる。例えば、O-6-methylguanine-DNA methyltransferase（MGMT）サブタイプについては、T98細胞以外は全てmethylated（メチル化）であり、T98はmethylatedとunmethylated（非メチル化）が混在している。よって、２−フルオロパルミチン酸及びテモゾロミドの併用による細胞増殖抑制効果は、脳腫瘍の形態学的・分子生物学的態様により限定されず、あらゆる脳腫瘍に対して有効であることを確認した。
よって、２−フルオロパルミチン酸は、１μＭという低濃度であっても、テモゾロミドの作用増強効果を有することを確認できた。
【００３４】
（総論）
本実施例により、フルオロパルミチン酸が、テモゾロミドのグリオーマ幹細胞に対する増殖抑制作用を増強する効果を有することを確認した。さらに、該効果が単なる相加効果ではなく、相乗効果であることを確認した。
また、フルオロパルミチン酸が、単独でもグリオーマ幹細胞に対して増殖抑制効果を有することを確認した。
フルオロパルミチン酸は、グリオーマ幹細胞に対しての増殖抑制効果を有することにより、神経膠腫、特に膠芽腫に治療効果を有する。
また、フルオロパルミチン酸は、テモゾロミドとの併用により、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を阻害する効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明では、腫瘍治療組成物を提供することができる。
【図１】
2019026611.tif 000002
【図２Ａ】
2019026611.tif 000003
【図２Ｂ】
2019026611.tif 000004
【図３】
2019026611.tif 000005
【図４Ａ】
2019026611.tif 000006
【図４Ｂ】
2019026611.tif 000007
【図５】
2019026611.tif 000008