(57)【要約】【課題】虚血性発作（虚血性脳血管障害）を効果的に処置できる製薬学的組成物の提供。【解決手段】組織プラスミノーゲンアクチベータ―（ｔ−ＰＡ）を内包した環状ニトロキシドラジカル担持共重合体含有組成物及びそのナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるブロック共重合体とポリアニオン性ポリマーとｔ−ＰＡを含有する製薬学的製剤。
【化１】
2019189578.tif 000005
上式中、各変動可能な基等の略号は次のとおり定義される：
Ａは、非置換又は置換Ｃ1−Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ’Ｒ”ＣＨ−基を表し、ここで、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ1−Ｃ4アルコキシ又はＲ’とＲ”は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。
Ｌ1は、直接結合又は二価の連結基を表す。
Ｘは、個別に次の（ａ）及び（ｂ）に記載される基を含んでなり：
（ａ）Ｌ2−Ｒ1で表され、Ｌ2は−（ＣＨ2）p−ＮＨ−（ＣＨ2）p−であり、ｐは独立して、整数０又は１〜３であり、Ｒ1は、式
【化２】
2019189578.tif 000006
のいずれかであり、
（ｂ）Ｒ2で表され、Ｒ2はクロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
ここで、（ａ）及び（ｂ）を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、（ａ）を有する単位は総数ｎの５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であり、残りは（ｂ）を有する単位であり、（ｂ）は０％であることができる。
Ｚは、ＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）−Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
ｍは、５〜１０，０００、好ましくは、１０〜５００、より好ましくは２０〜３００の整数を表す。
ｎは、２〜５００、好ましくは４〜２００、より好ましくは６〜８０の整数を表す。
ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸から選ばれる。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物から形成されたナノ粒子。
【請求項３】
有効成分としての態様１の組成物又は態様２のナノ粒子と製薬学的賦形剤を含んでなる、虚血性発作を処置するための製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベータ―（ｔ−ＰＡ）含有レドックス活性型の製薬学的組成物に関し、より具体的にはｔ−ＰＡとカチオン荷電性ポリマー化環状ニトロキシドラジカルとポリアニオン性ポリマーを含む製薬学的組成物、並びに該組成物のナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｔ−ＰＡ静注療法は脳梗塞の治療に画期的な効果を発揮している。しかし、臨床上ｔ−ＰＡの使用は、主として、その短い治療可能時間域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）及び出血性合併症リスクに起因して、限定されたままである。加えて、再灌流後、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成が増大し、細胞生存の減少をもたらし、かつ、神経機能をさらに悪化させることが指摘されてきた。
【０００３】
一方、本発明者等は、レドックス作用物質ともいえ、抗酸化化合物にも分類できる環状ニトロキシドラジカル（特に、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰ））を高分子化することにより、生体内で安定であり、かつ、安全に使用できる化合物を創製することに成功し、提案した（特許文献１及び特許文献２）。こうして提供された高分子化環状ニトロキシドラジカル（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）由来のナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）は、例えば、静脈投与により長期にわたる血中滞留性が達成され、一定の炎症性疾患を予防または治療できることが記載されている。上記において、ＰＭＮＴはポリ（メチルスチレン）の側鎖として環状ニトロキシドラジカルが結合していることを意味し、Ｎ−・・・及びＯ−・・・は、それぞれ高分子主鎖に−ＮＨ−及び−Ｏ−を介してＴＥＭＰＯが結合していることを意味する。また、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰについては虚血再灌流障害の処置剤としての使用についても提案した（特許文献３）。さらにまた、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰは、低分子疎水性薬物（例えばインドメタシン、ピペリン等）を内包することができ、薬物の毒性を軽減できると共に、水溶性を高めることができることから、一定薬物のドラッグデリバリー用担体として使用できることも提案した（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１３３６４７
【特許文献２】ＷＯ２０１６／０５２４６３
【特許文献３】特開２０１３−１６６７１１
【特許文献４】特開２０１１−１８４４２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、組織プラスミノーゲンアクチベータ―（ｔ−ＰＡ）の静脈若しくは動脈からの投与又は血管内投与療法（例えば、動注療法）に利用でき、ｔ−ＰＡの生物学的利用能及び再灌流後に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）によるリスクを低減できる手段の提供にある。本発明者等は、仮に、ｔ−ＰＡ及び高分子化環状ニトロキシドラジカル（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の作用が相互に悪影響を及ぼすことなく、静注療法において安定かつ、安全に使用できる組成物を提供できるなら、前記課題を解決できる可能性があるものと推測し、検討してきた。その結果、ここに、ポリアニオン性ポリマーとレドックス活性型ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、ｔ−ＰＡの生物活性に何ら悪影響をおよぼすことなく、ｔ−ＰＡ静注療法に利用でき、かつ、安定性及び安全性
を示すドラッグデリバリー用担体として使用できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、前記課題を解決するための手段として、次の態様の発明を提供する。
態様１：下記式（Ｉ）で表されるブロック共重合体とポリアニオン性ポリマーとｔ−ＰＡを含有する製薬学的製剤。
【０００７】
【化１】
2019189578.tif 000002
【０００８】
上式中、各変動可能な基等の略号は次のとおり定義される：
Ａは、非置換又は置換Ｃ1−Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ’Ｒ”ＣＨ−基を表し、ここで、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ1−Ｃ4アルコキシ又はＲ’とＲ”は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。
Ｌ1は、直接結合又は二価の連結基を表す。
Ｘは、個別に次の（ａ）及び（ｂ）に記載される基を含んでなり：
（ａ）Ｌ2−Ｒ1で表され、Ｌ2は−（ＣＨ2）p−ＮＨ−（ＣＨ2）p−であり、ｐは独立して、整数０又は１〜３であり、Ｒ1は、式
【０００９】
【化２】
2019189578.tif 000003
【００１０】
のいずれかであり、
（ｂ）Ｒ2で表され、Ｒ2はクロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
ここで、（ａ）及び（ｂ）を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、（ａ）を有する単位は総数ｎの５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であり、残りは（ｂ）を有する単位であり、（ｂ）は０％であることができる。
Ｚは、ＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）−Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
ｍは、５〜１０，０００、好ましくは、１０〜５００、より好ましくは２０〜３００の整数を表す。
ｎは、２〜５００、好ましくは４〜２００、より好ましくは６〜８０の整数を表す。
ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸から選ばれる。
態様２：態様１の組成物から形成されたナノ粒子。
態様３：有効成分としての態様１の組成物又は態様２のナノ粒子と製薬学的賦形剤を含んでなる、虚血性発作、例えば、脳梗塞、心筋梗塞を処置するための製剤。
態様４：虚血性発作、例えば脳梗塞を処置方法であって、投与の必要な患者に、態様１の組成物又は態様２のナノ粒子と製薬学的賦形剤を含んでなる製剤を有効量静注することを含んでなる、方法。
【００１１】
なお、本発明で用いるブロック共重合体の構造式中のＬ1等の方向性を持ち得る結合の方向性は、特記しない限り表示されているままの方向性を有する（以下、同じ。）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製薬学的組成物は、水性媒体中で、式（Ｉ）のブロック共重合体がポリアニオン性ポリマーと共に自己組織化してナノ粒子を形成することができ、また、この自己組織化に際してｔ−ＰＡをナノ粒子に内包若しくは搭載若しくは装着若しくは充填若しくは固定化できる。本明細書において、内包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、搭載若しくは充填（ｌｏａｄｅｄ）、装着（ｉｎｓｔａｌｌｅｄ）、固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）は夫々互換可能な用語として使用されている。理論に拘束されるものでないが、前記組成物は、水性媒体中で高い可溶性及び高い可動性を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントをシェルとし、ｔ−ＰＡを、主として、ＰＭＮＴセグメントとポリアニオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックス領域（コア）中に含有するコア−シェル型ナノ粒子を形成するものと理解できる。そのため、このようなナノ粒子は水性媒体中に均一に可溶化又は分散でき、静注用の製剤原薬として適する特性を有する。一方で、このようなナノ粒子は、ｔ−ＰＡの生物学的もしくは生理学的活性に当該ブロック共重合体もポリアニオン性ポリマーも悪影響を及ぼさず、むしろブロック共重合体に起因するレドックス活性（例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）の脱除（（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）作用）を有することが認められることから、ｔ−ＰＡの本来の血栓溶解活性に加えて、活性酸素種を消去する作用をも有する。したがって、本発明によれば、ｔ−ＰＡ静注療法に利用でき、ｔ−ＰＡの生物学的利用能及び再灌流後に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）によるリスクを低減できる組成物が提供できる。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明に関して記述された用語等は、特に言及しない限り、当該技術分野で常用されている意味又は内容を有するものとして使用されている。一般的に、本発明について以下の追加の説明をすることができる。
【００１４】
組織プラスミノーゲンアクチベータ―（ｔ−ＰＡ）は、既に臨床上実用されているアルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｅ）をはじめとするｔ−ＰＡであれば、天然物由来の調製物、遺伝子組み換えにより作製された、所謂、ｔ−ＰＡ又はｔ−ＰＡ活性物質と称されているものを包含し、また、本発明の課題解決（又は目的を達成するために）に使用できるものであれば、これらの改変体をも包含する概念である。
【００１５】
式（Ｉ）で表されるブロック共重合体において、Ｌ1を定義する二価の連結基は、ポリ（エチレングリコール）（以下、ＰＥＧと略記する場合あり。）セグメントと側鎖としての環状ニトロキシドラジカルが結合したポリ（メチルスチレン）（以下、ＰＭＮＴと略記する場合あり。）セグメントの機能が本発明の目的に沿うものであれば、限定されるものでない。しかし、二価の連結基は、一般的には、最大３４個、好ましくは１８個、より好ましくは最大１０個の炭素、並びに任意に酸素及び窒素原子を含有する基を意味する。かような連結基として、具体的には次の基を挙げることができる：
【００１６】
【化３】
2019189578.tif 000004
【００１７】
で表される基から選ばれるか、又は−（ＣＨ2）cＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）cＳ−、−（ＣＨ2）cＮＨ−、−（ＣＨ2）cＣＯ−、−ＣＯ−、−ＯＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれ、ここで、それぞれ独立してｂは２〜６の整数であり、ｃは１〜５の整数である、ことができる。このような共重合体は、上記の特許文献１又は特許文献２に記載の方法、また、必要により、これらの方法を改変した方法により製造できる。典型的な共重合体の製造方法については後述する製造例に示ように実施するのが便宜である。ポリアニオン性ポリマーは、式（Ｉ）のブロック共重合体と一緒になって、水性媒体中でナノ粒子を形成でき、かつ、ｔ−ＰＡ及びブロック共重合体のレドックス活性に悪影響を及ぼさないものであれば、限定されるものでないが、一般的に、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等を挙げることができる。これらの中、好ましく使用できるものは、ポリ（メタ）アクリル酸（ポリ（アクリル酸）若しくはポリ（メタクリル酸））であり、これらの数平均分子量（Ｍｎ）は５００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは１０００〜１００００であることができる。これらは、市販のものをそのまま、又は必要に応じて精製して使用することができる。
【００１８】
前記の製薬学的組成物にいう、製薬学的とは、当該組成物が製薬学上又は薬学上使用されるものであることを意味する。当該組成物における各成分の含有割合は、本発明の目的の沿った組成物を提供できるものであれば限定されないが、一般的には、式（Ｉ）の共重合体対ポリアニオン性ポリマーの配合割合は、形成されるｔ−ＰＡ内包ナノ粒子の水性媒体中での安定性を考慮すれば、式（Ｉ）のポリマーのカチオン荷電性基（−ＮＨ−）の総電荷対後者のポリアニオン性基（例えば、−ＣＯＯＨ）の総電荷が、１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、より好ましくは１：２〜２：１、最も好ましくは１：１となるように選ばれる。こうして形成されるＰＩＣとｔ−ＰＡとの配合割合は、ｔ−ＰＡ内包ナノ粒子の水性媒体の分散溶液又は可溶化溶液中、室温（約２０℃）〜３７℃下で、ｔ−ＰＡが当該粒子から、少なくとも、１時間、実質的に溶離若しくは溶出しないことを基準に選ばれる。限定されるものでないが、アルテプラーゼについて例示すると、式（Ｉ）の共重合体に対し、重量基準で、一般に０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇとなるように選ばれる。共重合体は５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇとなるように選ばれる。
【００１９】
こうして提供される組成物は、水性媒体中形成されるナノ粒子として存在することができる。本明細書にいう、水性媒体とは脱イオン水、そのリン酸緩衝化溶液、必要により、エチルアルコール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の水可溶性有機溶媒を含有する水等を挙げることができる。かようなナノ粒子の形成方法は、組成物の各成分を必要により、前記のような有機溶媒を用いて溶解し、所定の分子量（例えば、３．５ｋＤ〜５０ｋＤ）カットオフ能を有する透析膜を介して水に対して透析することにより各成分が一体に自己組織化したナノ粒子を提供できる。ナノ粒子とは、水性媒体中の粒子を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により平均粒径がナノオーダー、特に、
１０ｎｍ〜５００ｎｍ，好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍ、より好ましくは１５ｎｍ〜１５０ｎｍ、最も好ましくは１５ｎｍ〜５０ｎｍにある粒子を意味する。
【００２０】
このようナノ粒子は、水性媒体中から遠心、又はその水溶液を凍結乾燥することにより固形物として提供できる。凍結乾燥品又は上記の透析物を、前述の水性媒体や、生理食塩水、必要により、マクロゴール、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン等のアミノ酸、緩衝剤リン酸緩衝液等を製薬学的賦形剤と混合して血管内投与用製剤とすることができる。当該ナノ粒子は、ｔ−ＰＡを内包した状態で被験動物（患者を含む）に効果的に静脈若しくは動脈からの投与又は血管内投与療法（例えば、動注療法）に使用でき、当該ナノ粒子からのニトロオキシドラジカルがＲＯＳを消去することによりニューロンの障害を防止すると同時に、ｔ−ＰＡの半減期を延長し、血栓溶解（ｅｒｏｓｉｏｎ）の効率を向上させる作用及び効果を奏する。
【００２１】
当該製剤は、虚血性発作の治療に際し、アルテプラーザを用いる虚血性脳血管障害の静注療法における用法、用量に準じ、また改良して使用できるが、必要があれば動物実験及び／又は臨床試験を行い、専門医により製剤中に含有されるｔ−ＰＡの用量、投与方法等を決定することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】製造例１に記載のＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル
【図２】製造例１に記載のＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡのゲル浸透クロマトグラフィーによる分離スペクトル
【図３】製造例２に記載のＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル
【図４】製造例２に記載のＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのゲル浸透クロマトグラフィーによる分離スペクトル
【図５】製造例３に記載のＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル
【図６】製造例３に記載のＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴのゲル浸透クロマトグラフィーによる分離スペクトル
【図７】実施例１に記載のＲＮＰ及びｔ−ＰＡ＠ＲＮＰのＤＳＬの測定結果としてのサイズ分布パターン
【図８】試験例１における中大脳動脈（Ａ，Ｂ）及び処置後ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰの皮質分布（Ｃ）のレーザー照射によるフォトトロボティックストローク（ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）の概略図
【図９】試験例１における照射時間に依存するマウス中大脳動脈閉塞の状態を表す図に代わる写真
【図１０】試験例１におけるマウスＭＣＡＯモデル（ｎ＝４）のレーザードップラー血流計による血流データのグラフ表示
【図１１】試験例１におけるマウスＭＣＡＯモデルの照射時間による梗塞容積の評価結果のグラフ表示
【図１２】試験例１におけるＭＣＡＯマウスに対するｔ−ＰＡ単独の梗塞容積のグラフ表示
【図１３】試験例１におけるＭＣＡＯマウス処置について遊離ＲＮＰの梗塞容積のグラフ表示
【図１４】試験例１におけるＭＣＡＯマウス処置についてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  ５ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）の梗塞容積のグラフ表示
【図１５】試験例１におけるＭＣＡＯマウス処置についてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）の梗塞容積のグラフ表示
【図１６】試験例１におけるＭＣＡＯマウス処置についてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇ）の梗塞容積のグラフ表示
【図１７】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについてｔ−ＰＡ単独を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候についてのグラフ表示
【図１８】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて遊離ＲＮＰを用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候についてのグラフ表示
【図１９】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  ５ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候についてのグラフ表示
【図２０】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候についてのグラフ表示
【図２１】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについてｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇ）を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候についてのグラフ表示
【図２２】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、生理食塩水注入処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２３】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ単独（１ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２４】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ単独（５ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２５】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ単独（１０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝４、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ、なお、Ａ〜Ｄは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２６】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、遊離ＲＮＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２７】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、遊離ＲＮＰ（２０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝４、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ、なお、Ａ〜Ｄは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２８】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  ５ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図２９】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【図３０】試験例１におけるＭＣＡＯマウスについて、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞マウス脳組織の同定のための組織病理学的染色としてのＴＴＣ染色スライドを表す図に代わる写真（ｎ＝５、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、なお、Ａ〜Ｅは同一群内の個々のマウス脳切片の染色図に代わる、写真）
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明で使用するブロック共重合体の典型的な製造例、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の調製例、ナノ粒子の調製例、さらには、ナノ粒子の作用、効果を例証するための具体的な試験例を開示するが、本発明はこれらの例に限定されるものでない。
【００２４】
＜製造例１＞  ブロック共重合体ＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡの合成
１１０℃にて，５０ｇのポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，ＭＷ＝５，０００，Ｆｌｕｋａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を減圧下で水及び水分がなくなるまで、２〜１２時間撹拌した。安定化のため窒素雰囲気下、撹拌しながら６５℃で１時間インキュベーションした。窒素流条件下で、脱水ポリマーにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬをゆっくり加えた。１０ｍＬのブチルリチウム（ＢｕＬｉ，１６ｍｍｏｌ）を加えることによりヒドロキシル基をリチオ化した（１０ｍｍｏｌ  ＰＥＧ＋１６ｍｍｏｌ  ＢｕＬｉ，ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＬｉ）。次いで、リチオ化ＰＥＧ溶液に１０倍過剰量のα、α−ジブロモ−ｐ−キシリレン（ＤＰＸ，Ｃ8Ｈ8Ｂｒ2，ＭＷ＝２６３．９６）（２５ｇ）を加え、撹拌しながら６５℃で、２４時間（必要があれば、最大２〜３日間）撹拌した。混濁したネオングリーンへの色変化に注意し、ＬｉＢｒの沈殿（容器の上部）を観察する。反応溶液を冷イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）へ投入し、ポリマーを沈殿させ、遠心分離にて回収した（８，８００ｒｐｍ、２分間、−４℃）。温メタノールで沈殿を可溶化し、残存するＤＰＸを除去するために遠心した（８，８００ｒｐｍ、２分間、−４℃）。遠心後、沈殿を分離し、透明なポリマーのメタノール溶液を得、ＩＰＡでポリマーを沈殿させた。遠心（８，８００ｒｐｍ、２分間、−４℃）、冷ＩＰＡを用いる再沈殿を３度繰り返した。こうして精製されたポリマーを室温で２４〜４８時間真空下で乾燥させた。丸底フラスコ中で撹拌しながらＮ2条件下で純ＴＨＦ（２００ｍＬ）に乾燥ポリマーを溶解させた。この段階でポリマー溶液は透明であった。このポリマー溶液に直ちにＭｇＢｒ−ＣＳ2Ｐｈ溶液を加えた（補足プロトコール参照）。更なるプロセスを行うまで、４０℃で、少なくとも１２〜７３時間撹拌した。冷ＩＰＡを用いて再沈殿させ、遠心した（８，８００ｒｐｍ、２分間、−４℃）。上層液の赤色が無くなるまで、ＩＰＡ沈殿を５〜８回繰り返した。この段階で、得られる沈殿の色はピンクであった。真空下で３６時間乾燥し、ＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡの生成物５０ｇを得た。
【００２５】
捕捉プロトコール（ＰｈＭｇＢｒ＋ＣＳ2溶液の調製）：
氷冷水浴中の窒素雰囲気下にある丸底フラスコ内でＰｈＣＳ2ＭｇＢｒを下記のごとく調製した。
【００２６】
ＴＨＦ５０ｍＬ、ＣＳ2４ｍＬ、ＰｈＭｇＢｒ（臭化フェニルマグネシウム溶液，ジエチルエーテル中３モル濃度）６．７ｍＬを順にフラスコに加えた。
【００２７】
ＰｈＭｇＢｒ添加後、数分間待つと、化学反応が起こったことを示す赤色に溶液が変化する。色が黒赤色になり、最早変化が起こらなくなったときが、反応の終点である。氷を取り除き、室温（２５℃）で１０〜３０分間撹拌した。１０〜３０分間の撹拌は溶液の色が赤色に変化する限りにおいては充分であり、この反応が起こったことを意味する。必要があれば１〜２時間延長してもよい。インキュベーション後、直ちにポリマー溶液にＰｈＭｇＢｒ＋ＣＳ2溶液を加えた。
【００２８】
得られたＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このポリマー２ｍｇを０．５％のＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬに溶解したときの、ゲル浸透クロマトグラフィーの結果を図２に示す。
【００２９】
＜製造例２＞  ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体の合成：
連鎖移動剤としてメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−Ｓ−Ｃ（＝Ｓ）Ｐｈ（ＭＷ＝５，０００）を用いるクロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーション
によりメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（クロロメチルスチレン）（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）を合成した。このＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのポリマー主鎖は親水性セグメントとしてのＰＥＧと疎水性セグメントしての反復単位２２のＰＣＭＳから構成されていることが1Ｈ  ＮＭＲデータから確認された。要約すると、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡ（３６ｇ）をフリーラジカル開始剤、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）の２４０ｍｇ及びＣＭＳ５６ｍＬと混合して高純度トルエン（２００ｍＬ）に溶解した。この混合物を窒素雰囲気下２４時間７０℃で撹拌した。
【００３０】
得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図３に示す。このポリマー２ｍｇを０．５％のＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬに溶解したときの、ゲル浸透クロマトグラフィーの結果を図４に示す。
【００３１】
＜製造例３＞  ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴブロック共重合体の合成：
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体のベンジルクロライドと４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル  フリーラジカル（ＮＨ2−ＴＥＭＰＯ；東京化学工業株式会社）とのアミノ化反応を介して、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのＣＭＳ基をニトロキシドラジカルに転化した。ＮＨ2−ＴＥＭＰＯ修飾の程度は、ほぼ１００％であった。要約すると、ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（１０ｇ）とＮＨ2−ＴＥＭＰＯ（１７ｇ＝５ｘ  ｅｑ．）を別々に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の５０ｍＬに溶解し、１時間撹拌して完全に溶解した。次に、この溶液を撹拌しながら２４時間室温で混合して反応させた。ポリマーを、４回冷ＩＰＡを用いて沈殿させ、４℃で２分間８８００ｒｐｍにて遠心した。次に、ポリマーをベンゼンに再溶解し、真空下で２４時間凍結乾燥した。
【００３２】
得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５に示す。このポリマー２ｍｇを０．５％のＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬに溶解したときの、ゲル浸透クロマトグラフィーの結果を図６に示す。
【００３３】
＜実施例１＞  ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰの調製：
ｔＰＡ内包レドックス活性型ナノ粒子は、側鎖としてＲＯＳ脱除部分を保持するカチオン性ジブロック両親媒性共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）、アニオン性ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡｃ）、及びｔ−ＰＡ（田辺三菱製薬株式会社から入手，ａｂ９２６３７）から構成されたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの形成を介して調製した。
【００３４】
簡潔には、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡｃを、それぞれ５ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．２）に溶解した。ｔ−ＰＡ内包ニトロオキシドラジカル含有ＲＮＰｓは、３．５ｍＬのＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ溶液を、０．５ｍＬのＰＡＡｃ及び１ｍｇ（４ｍｇ／ｍＬ，０．２５ｍＬ）のｔ−ＰＡの混合物に１：１のモル比（ｒ＝ＰＥＧ−ＰＭＮＴのカチオン性アミン基のモルユニット：ＰＡＡｃのアニオン性カルボキシル基のモルユニット）にて滴下することにより調製した。ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰは３０分間撹拌した後自己組織化することにより形成された。
【００３５】
・遊離ＲＮＰ又はＲＮＰ（ｔ−ＰＡ不含）及びｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（５ｍｇ／ｍＬ）の物理的性質：
平均粒径（ｎｍ）及びζ（ゼータ）電位は、動的光散乱（ＤＬＳ）技法を用いて測定した。動的光散乱（ＤＬＳ）の測定結果を図７に示す。遊離ＲＮＰ及びｔ−ＰＡ＠ＲＮＰのＤＳＬの測定結果を図７示す。
【００３６】
＜試験例＞  光誘起血栓型中大脳動脈閉塞マウスモデルにおけるｔ−ＰＡ＠ＲＮＰの効果の例証
病巣大脳虚血（ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｍｉａ）を、７〜８週齢雄ＩＣＲマウス（３２〜３５ｇ）を用いる光誘起血栓型中大脳動脈閉塞（Ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ＭＣＡＯ））により作製した。イソフルラン（誘導用３％、持続用２〜２．５％）で動物を麻酔し、左側面位で固定した。次いで、耳と目の間の皮膚に１ｃｍの外科的切開を行った。側頭筋を露出、剥離、収縮させた。頭蓋を抹消中大脳動脈（ＭＣＡ）まで優しく清浄し、骨を通して可視化し、レーザー照射のために標的をマーカーで標識した。ローズベンガル（Ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ）溶液１５ｍｇ／ｍＬの１０μＬ／ｋｇを腹空内投与し、５分後に１０分間５３２ｎｍグリーンレーザー（３００ｍＷ）で照射を行った。加熱及び追加の実質損傷を避けるため、レーザー表面に熱吸収フィルター（ＨＡＦ−５０Ｓ−５０Ｈ，Ｓｉｇｍａ）を加えた。レーザードップラー血流計（Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ）（ＭＣＡ領域の７５〜９０％血流低下）により成功裏のＭＣＡ閉塞を確認した。操作中ヒーティング毛布で３７℃に体温を維持した。全ての実験は、国立大学法人筑波大学の実験用動物の保護及び使用に関するガイドラインに従って行った。
【００３７】
中大脳動脈（Ａ，Ｂ）及び処置後ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰの皮質性の分布（Ｃ）のレーザー照射による光誘起血栓型脳梗塞（ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）作製の概略図を図８に示す。
【００３８】
照射時間に依存するマウス中大脳動脈閉塞の状態を示す図に代わる写真を図９に示す。
【００３９】
マウスＭＣＡＯモデル（ｎ＝４）のレーザードップラー血流計による血流データのグラフ表示を図１０に示す。ここで、コントロールはローズベンガルが注入されていない群である。
【００４０】
マウスＭＣＡＯモデルの照射時間による梗塞容積の評価結果のグラフ表示を図１１に示す。
【００４１】
この結果は、具体的には次の処置に基づく：
ＭＣＡＯ（ｎ＝３）の２４時間後にマウスを安楽死させた。迅速に脳を取り出し、１０分間氷冷生理食塩水中で冷却し、次いで、冠状の脳切片（１ｍｍ）をブレインマトリックス（１５０５、ＴＥＤＰＥＬＬＡ，ＩＮＣ．ＵＳＡ）を用いて切り出した。５個の連続するスライスを２％ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド）（Ｔ８８７７，Ｓｏｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色し、続けて、イメージ  ジェイ．インファクト  ボリウム（Ｉｍａｇｅ  Ｊ．Ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）の画像処理ソフトウエア―で画像化し、５つのコントロール切片における総梗塞（各２ｍｍ前方からブレグマまでの１ｍｍ切片）対反対側性半球（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）における総梗塞の比率（％梗塞容積）として計算して、脳水腫による梗塞領域の変形の低減について評価した。
【００４２】
・処置効果の例証：
ＭＣＡＯマウスを、ＭＣＡＯ後迅速にｔ−ＰＡ＠ＲＮＰを、後述する用量で静脈内注入することにより処置した。当該処理の比較として、コントロールを含む、ｔ−ＰＡ単独、ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ不含）を用いる処置（用量は括弧内に示す。）の結果をそれぞれ次に示す。
【００４３】
ＭＣＡＯマウスに対する、ｔ−ＰＡ単独投与群（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の梗塞容積を図１２にグラフ表示し、ＲＮＰ単独投与群（２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）の梗塞容積を図１３にグラフ表示し、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ投与群（５ｍｇ／ｋｇ  ｔ−ＰＡ＋５０ｍｇ／ｋｇ  ＲＮＰ）の梗塞容積を図１４にグラフ表示し、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ投与群（１ｍｇ／ｋｇ  ｔ−ＰＡ＋５０ｍｇ／ｋｇ  ＲＮＰ）の梗塞容積を図１５にグラフ表示し、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ投与群（１ｍｇ／ｋｇ  ｔ−ＰＡ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ＲＮＰ）の梗塞容積を図１６にグラフ表示する。
【００４４】
図１２によると、コントロール群としての生理食塩水投与に比べ、ｔ−ＰＡの１ｍｇ／ｋｇ投与は処置が何ら効果を持たない梗塞容積を示し、ｔ−ＰＡの５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの投与は梗塞容積の有意な低減を示す（Ｐ＜０．０１）。梗塞容積は、脳水腫によるばらつきを抑えるため、５つ冠状切片（各前方２ｍｍからブレグマまでの１ｍｍ切片毎）対反対側性半球（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）における総梗塞の比率（％梗塞容積）として計算して評価し、データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提供している（以下、同じ。）。
【００４５】
図１３では、ＲＮＰ単独の５０ｍｇ／ｋｇ処置はＲＯＳを消去すること（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）により梗塞容積を有意に抑制することができ（Ｐ＜０．０５）、ＲＮＰの２０ｍｇ／ｋｇ処置では何ら有意な変化を示さないことが見られる。この結果は、ＭＣＡＯマウス処置についてＲＮＰの用量応答性を示す。
【００４６】
図１４では、５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡが内包された５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）の梗塞容積について表示されており、当該ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置は５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独及び５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ単独に比べ梗塞容積を有意に低減することが見られる（それぞれ、Ｐ＜０．０１）。
【００４７】
図１５では、ＭＣＡＯマウス処置について１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ内包５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）の梗塞容積について表示されており、当該ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置は１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置に比べて有意に（Ｐ＜０．０１）、また、５０ｍｇ／ｋｇの遊離ＲＮＰ処置に比べて有意に（Ｐ＜０．０５）梗塞容積を低減することを示す。
【００４８】
図１６では、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡが内包された２０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）のシリンダテストによる梗塞容積について表示されており、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置及び２０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ処置後には梗塞容積に有意な低減は見られないものの、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇ）処置は１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置及び２０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ処置に比べそれぞれ有意に梗塞容積を低減することを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５）。
【００４９】
以上から、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰはマウスモデルにおける梗塞容積を有意に低減することが明らかである。
【００５０】
・ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置おける神経症候について：
ＭＣＡＯマウスについてｔ−ＰＡ単独を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候について図１７にグラフ表示する。
【００５１】
当該シリンダテストは前肢の非対称性に対する病巣虚血性障害を予測するために日常的に使用されている方法にしたがった。簡潔には、シリンダテストによる肢ドラッグ（引きずり効果）は、背面から四肢状態にもどしたとき、マウスが壁から直接的に離れるよりはむしろ、シリンダーの壁に沿って影響を受けた肢を引きずる動作である。肢ドラッグは、試験期間中の肢の触れる総数当たりの肢を引きずるパーセンテージとして表示される。肢ドラッグ数は影響を受けた前肢について総肢接触数のパーセンテージとしての表示され、データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表示さる（以下、同じ）。
【００５２】
図１７の結果は、ＭＣＡＯマウスに対する、ｔ−ＰＡ単独の１ｍｇ／ｋｇ処置では神経症候は何ら改善されないことを示すが、ｔ−ＰＡ単独の５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ処置はコントロール群の生理食塩水に比べ有意に神経学的欠損を有意に改善することを示す。
【００５３】
同様に、ＭＣＡＯマウスに対する、ｔ−ＰＡ単独（２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）、並びにｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（ｔ−ＰＡ  ５ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）、同（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）及び同（ｔ−ＰＡ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＲＮＰ  ２０ｍｇ／ｋｇ）を用いる用量応答性処置のシリンダテストによる神経症候の結果を、それぞれ図１８、図１９、図２０及び図２１にグラフ表示する。
【００５４】
図１８では、ＲＮＰの５０ｍｇ／ｋｇ処置はコントロール群としての生理食塩水に比べ神経学的な欠損を有意に改善することができるが（Ｐ＜０．０５）、ＲＮＰの２０ｍｇ／ｋｇ処置では、有意な改善はみられない。
【００５５】
図１９では、５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡが内包された５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）の処置は、コントロール群としての生理食塩水の処置に比べ、シリンダテストによる神経症状を有意に改善することがわかる。
【００５６】
図２０では、ＭＣＡＯマウス処置について１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡが内包された５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）のシリンダテストによる神経症状について表示されており、ｔ−ＰＡ単独の５０ｍｇ／ｋｇ処置及びｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置はコントロール群としての生理食塩水に比べ有意に神経学的な欠損を有意に改善した（Ｐ＜０．０５）。
【００５７】
図２１では、ＭＣＡＯマウス処置について１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡが内包された２０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ）のシリンダテストによる神経症状について表示されており、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置及び２０ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置後には神経学的な欠損に有意な改善は見られないものの、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置は１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置及び２０ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置に比べそれぞれ有意に神経学的な改善が見られる（それぞれ、Ｐ＜０．０５）。
【００５８】
以上より、ｔ−ＰＡ単独の５ｍｇ／ｋｇ処置、ＲＮＰの５０ｍｇ／ｋｇ処置、及びｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ処置はコントロール群としての生理食塩水に比べ神経学的な欠損を有意に改善することがわかる（Ｐ＜０．０５）。
【００５９】
・梗塞マウス脳組織の同定：
梗塞マウス脳組織を同定するための組織病理学的染色として、コントロール群を含む、処置動物について前述したように、２％ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド）（Ｔ８８７７，Ｓｏｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色し、続けて、イメージ  ジェイ．インファクト  ボリウム（Ｉｍａｇｅ  Ｊ．Ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）の画像処理ソフトウエア―で画像化処理した。
【００６０】
組織病理学的染色としての２％ＴＴＣ染色を行った生理食塩水注入処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）を示す図に代わる写真を図２２に示す。
【００６１】
同様に、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２３に示し、５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２４に示し、１０ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置群についての写真を図２５に示し、５０ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ単独処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２５に示し、５０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真
を図２６に示し、２０ｍｇ／ｋｇのＲＮＰ処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２７に示し、５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ内包５０ｍｇ／ｋｇＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ  ５ｍｇ／ｋｇ  ５０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２８に示し、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ内包５０ｍｇ／ｋｇＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ  １ｍｇ／ｋｇ  ５０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図２９に示し、１ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡ内包２０ｍｇ／ｋｇＲＮＰ（ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ  １ｍｇ／ｋｇ  ２０ｍｇ／ｋｇ）処置群の梗塞スライド（ｎ＝５）についての写真を図３０に示す。
【００６２】
これらの写真から、上述の定量結果で示したように、ｔ−ＰＡ単独（１ｍｇ）やＲＮＰ（２０ｍｇ）では梗塞サイズ減少がほとんど見られないのに対し、ｔ−ＰＡ＠ＲＮＰ（１ｍｇ／２０ｍｇ）において有意に高い効果が現われていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
ｔ−ＰＡ内包ＲＮＰは、ｔ−ＰＡの徐放性を示し、血栓溶解（ｅｒｏｓｉｏｎ）効果が低減することなく、その持続時間が延長できることから、一回の投与量を少なくできると同時に、ＲＮＰのニトロキシドラジカルがＲＯＳを消去することによりニューロン損傷を防止する。したがって、本発明は少なくとも製薬業において利用可能である。
【図１】
2019189578.tif 000007
【図２】
2019189578.tif 000008
【図３】
2019189578.tif 000009
【図４】
2019189578.tif 000010
【図５】
2019189578.tif 000011
【図６】
2019189578.tif 000012
【図７】
2019189578.tif 000013
【図８】
2019189578.tif 000014
【図９】
2019189578.tif 000015
【図１０】
2019189578.tif 000016
【図１１】
2019189578.tif 000017
【図１２】
2019189578.tif 000018
【図１３】
2019189578.tif 000019
【図１４】
2019189578.tif 000020
【図１５】
2019189578.tif 000021
【図１６】
2019189578.tif 000022
【図１７】
2019189578.tif 000023
【図１８】
2019189578.tif 000024
【図１９】
2019189578.tif 000025
【図２０】
2019189578.tif 000026
【図２１】
2019189578.tif 000027
【図２２】
2019189578.tif 000028
【図２３】
2019189578.tif 000029
【図２４】
2019189578.tif 000030
【図２５】
2019189578.tif 000031
【図２６】
2019189578.tif 000032
【図２７】
2019189578.tif 000033
【図２８】
2019189578.tif 000034
【図２９】
2019189578.tif 000035
【図３０】
2019189578.tif 000036