(57)【要約】      （修正有）【課題】生理的条件に暴露されると非酵素的過程でより小さい可溶性成分に分解されるヒドロゲル、及びそれを調製する方法の提供。【解決手段】直交性の第一及び第二の官能基を含む基であって、該第一の直交性官能基は該第二の直交性官能基とは異なる官能基である基を各アームの末端に有する第１のマルチアームポリマーと、第二のマルチアームポリマーと結合した切断可能な架橋剤化合物であって、前記第二の直交性官能基のみと反応する官能基を有する架橋剤化合物とを反応させて、架橋されたポリマーを得ることを含む、生分解性ヒドロゲルを調製する方法による。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交性の第一及び第二の官能基を含む基であって、該第一の直交性官能基は該第二の直交性官能基とは異なる官能基である基を各アームの末端に有する第１のマルチアームポリマーと、第二のマルチアームポリマーと結合した切断可能な架橋剤化合物であって、前記第二の直交性官能基のみと反応する官能基を有する架橋剤化合物とを反応させて、架橋されたポリマーを得ることを含む、生分解性ヒドロゲルを調製する方法。
【請求項２】
前記架橋剤化合物が脱離反応により分解可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記分解可能な架橋剤化合物が、式（１）で表される化合物であるか、
【化１】
2019031498.tif 000058
ここで、
ｍは、０又は１であり、
Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは官能基であり、かつ、Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは第二のマルチアームポリマーと結合しており、ただし、Ｘは該官能基であるか又は該第二のマルチアームポリマーに結合しているかのいずれかでなければならず、
ここで、Ｒ１及びＲ２の一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方又は両方は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３； 
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
ここで、上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであるか、
あるいは、
前記分解可能な架橋剤化合物が、式（２）で表される化合物である方法
【化２】
2019031498.tif 000059
ここで、
ｍは、０又は１であり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化３】
2019031498.tif 000060
であり、
ここで、Ｒ６はＨであるか、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の１つは、官能基Ｚ１を含み、かつ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の１つは、前記第二のマルチアームポリマーと結合しており；かつ
少なくとも一方又は両方のＲ１及びＲ２は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ
Ｒ１及びＲ２の一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
【請求項４】
（ａ）直交性の第一及び第二の官能基を含む基であって、該第一の直交性官能基は該第二の直交性官能基とは異なる官能基である基を各アームの末端に有する第１のマルチアームポリマーを提供すること、及び
（ｂ）前記（ａ）の第一のマルチアームポリマーを第二のマルチアームポリマーと結合した架橋剤化合物であって、前記第二の直交性官能基のみと反応する官能基を有する架橋剤化合物と反応させて、架橋されたポリマーを得ること
により、調製された生分解性ヒドロゲル。
【請求項５】
前記架橋剤化合物が脱離反応により分解可能である、請求項４に記載の生分解性ヒドロゲル。
【請求項６】
前記架橋剤化合物が式（１）又は式（２）で表される、請求項５に記載の生分解性ヒドロゲル：
ここで、式（１）は以下の構造を有し：
【化４】
2019031498.tif 000061
ここで、
ｍは、０又は１であり、
Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは官能基であり、かつ、Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは第二のマルチアームポリマーと結合しており、ただし、Ｘは該官能基であるか又は該第二のマルチアームポリマーに結合しているかのいずれかでなければならず、
ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
ここで、上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ、
ここで、残りのＲ１及びＲ２は、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
かつ、
式（２）は以下の構造を有する：
【化５】
2019031498.tif 000062
ここで、Ｒ１，Ｒ２及びＲ５の一つは官能基であり、かつＲ１、Ｒ２及びＲ５の一つは前記第二のマルチアームポリマーと結合しており；
ｍは、０又は１であり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化６】
2019031498.tif 000063
であり、
ここで、Ｒ６はＨであるか、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；かつ
ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ
残りのＲ１及びＲ２は、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
【請求項７】
請求項４に記載の生分解性ヒドロゲルであって、各官能基が独立して、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、ＳＨ、Ｓ−ｔｅｒｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリレート、又はアクリルアミドであり；かつ、官能基の一つがＮ３を含有するとき、他はアルキン又はシクロオクチンを含有せず；官能基の一つがＳＨを含有するとき、他はマレイミド、アクリレート、又はアクリルアミドを含有せず；官能基の一つがＮＨ２を含有するとき、他はＣＯ２Ｈを含有せず；官能基の一つが１，３−ジエン又はシクロペンタジエンを含有するとき、他はフランを含有せず；かつ／または、
ここで、第一及び／又は第二のポリマーは、式［−（ＣＨ２）ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｔＱを有し、ここで、
ｎは、１０〜１０００であり；
ｓは、０〜２であり；
ｔは、２、４、８、１６又は３２であって、当該ポリマーのアームの数を表し；かつ、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基である。
【請求項８】
薬剤放出分解性ヒドロゲルの調製方法であって、
（ａ）直交性の第一及び第二の官能基を含む基であって、該第一の直交性官能基は該第二の直交性官能基とは異なる官能基である基を各アームの末端に有する第１のマルチアームポリマーを提供すること；
（ｂ）前記（ａ）の第一のマルチアームポリマーを、リンカー−薬剤コンジュゲートであって、第一の直交性官能基のみと反応する第三の官能基を有するコンジュゲートと反応させて、誘導体化第一ポリマーを得ること；及び
（ｃ）前記（ｂ）で得られた誘導体化第一ポリマーを、第二のマルチアームポリマーと結合した架橋剤化合物であって、該誘導体化第一ポリマーに存在する第二の直交性官能基のみと反応する第四の官能基を有する架橋剤化合物と反応させて、薬剤放出分解性ヒドロゲルを得ること、あるいは
（ｄ）前記（ａ）の第一のマルチアームポリマーを、第二のマルチアームポリマーと結合した架橋剤化合物であって、第二の直交性官能基のみと反応する第四の官能基を有する架橋剤化合物と反応させて、架橋ポリマーを得ること、及び
（ｅ）前記（ｄ）の架橋ポリマーを、リンカー−薬剤コンジュゲートであって、第一の直交性官能基のみと反応する第三の官能基を有するコンジュゲートと反応させて、薬剤放出分解性ヒドロゲルを得ること、を含む方法。
【請求項９】
請求項８に記載の薬剤放出分解性ヒドロゲルの調製方法であって：
リンカー−薬物コンジュゲートが、式（３）で表され、
【化７】
2019031498.tif 000064
式（３）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも１つは、前記第三の官能基を有し；
ｍは０又は１であり；
Ｄは薬物又はプロドラッグであり；
ＹはＮＨ又はＮＢＣＨ２であり、ここで、ＢはＨであるか、置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアリールアルキルであり；
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方若しくは両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
ここで、上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ、
ここで、残りのＲ１及びＲ２は、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり；かつ／または
前記架橋剤化合物が式（１）又は式（２）で表され：
ここで、式（１）は以下の構造を有し：
【化８】
2019031498.tif 000065
ここで、
ｍは、０又は１であり、
Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは前記第四の官能基であり、かつ、Ｘ又はＲ１，Ｒ２及びＲ５の一つは第二のマルチアームポリマーと結合しており、ただし、Ｘは該第四の官能基であるか又は該第二のマルチアームポリマーに結合しているかのいずれかでなければならず、
ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
ここで、上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ、
ここで、残りのＲ１及びＲ２は、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
かつ、
式（２）は以下の構造を有する：
【化９】
2019031498.tif 000066
ここで、Ｒ１，Ｒ２及びＲ５の一つは前記第四の官能基であり、かつＲ１、Ｒ２及びＲ５の一つは前記第二のマルチアームポリマーと結合しており；
ｍは、０又は１であり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化１０】
2019031498.tif 000067
であり、
ここで、Ｒ６はＨであるか、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
又は、ＳＲ４であり
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
上述の通り定義されたＲ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；かつ
残りのＲ１及びＲ２は、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり；かつ／または
前記第一及び／又は第二のポリマーは、式［−（ＣＨ２）ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｔＱを有し、ここで、
ｎは、１０〜１０００であり；
ｓは、０〜２であり；
ｔは、２、４、８、１６又は３２であって、当該ポリマーのアームの数を表し；かつ、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基である、方法。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９の方法により調製された、薬剤放出性ヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年９月７日出願の米国特許出願第６１／５３１，９９０号の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、水（最大９９％）が分散媒である、天然又は合成の親水性ポリマー鎖の三次元ネットワークである。脆弱な巨大分子は、活性及び構造を維持するために十分な水和環境を必要とすることが多く、また、ヒドロゲルの水和度が高いとタンパク質の生物活性に必要なフォールディングを保つことができる。ヒドロゲルの含水量が高いことにより、材料は生体適合性となり、ゲルと接触する組織の炎症反応が最小限に抑えられ、生体組織の柔軟性と同等の柔軟性が提供される。従って、ヒドロゲルは、創傷被覆材及び使い捨ておむつのための吸収材料として、並びに薬物を徐放するための担体として、生体医用工学において関心がもたれている。ヒドロゲルは、天然又は合成の親水性ポリマーの物理的又は化学的架橋によって調製されてきた。
【０００３】
天然ポリマーの架橋により形成されたヒドロゲルの例としては、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、ポリリシン、ゼラチン又はアガロースから形成されたヒドロゲルが挙げられる（Ｈｅｎｎｉｎｋ、Ｗ．Ｅ．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）５４：１３〜３６頁；Ｈｏｆｆｍａｎ、Ａ．Ｓ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）４３：３〜１２頁参照）。これらのヒドロゲルは、高分子量の多糖又はポリペプチド鎖からなる。それらの使用のいくつかの例としては、組換ヒトインターロイキン−２の化学的に架橋されたデキストランベースのヒドロゲルへの封入（Ｃａｄｅｅ、Ｊ．Ａ．ら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２年）７８：１〜１３頁）、インスリンのイオン的に架橋されたキトサン／ヒアルロナン複合体への封入（Ｓｕｒｉｎｉ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２００３年）９０：２９１〜３０１頁）が挙げられる。
【０００４】
合成ポリマーの化学的又は物理的架橋によって形成されたヒドロゲルの例としては、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、（メタ）アクリラート−オリゴラクチド−ＰＥＯ−オリゴラクチド−（メタ）アクリラート、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＯ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＯ）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリラート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ−ＰＥＯ−ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）等（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ、Ａ．Ｓ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ（２００２年）４３：３〜１２頁参照）が挙げられる。このようなヒドロゲルを使用するタンパク質−ポリマー封入の例としては、インスリンを、物理的に架橋されたＰＥＧ−ｇ−ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡ−ｇ−ＰＥＧコポリマーに封入すること（Ｊｅｏｎｇ、Ｂ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００２年）３：８６５〜８６８頁）、及び、ウシ血清アルブミンを、化学的に架橋されたアクリラート−ＰＧＡ−ＰＥＯ−ＰＧＡ−アクリラートマクロモノマーに封入すること（Ｓａｗｈｎｅｙ  Ａ．Ｓ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９３年）２６：５８１〜５８７頁）が挙げられる。
【０００５】
細孔径に応じて、封入化合物を放出するために、ヒドロゲルの分解が典型的には必要がである。分解により、薬物がヒドロゲル内部から周囲の体液に拡散し得る程度まで、細孔径が増大する。使用済みヒドロゲル担体の外科的除去にはしばしば痛みが伴うため、薬物送達が完了したら、体内からヒドロゲルが除去されるために分解されることは、さらに望ましい。公知のヒドロゲルの多くは、理論的には生分解性であるが、実際にはその分解は制御することができず、従って予測不可能である。従って、所定の速度で生分解される新しいヒドロゲル材料が必要である。
【０００６】
ヒドロゲルを分解させるために、生理的条件下で切断可能な架橋薬剤を有することが有益である。一つの手法では、架橋剤を基質として酵素的に切断することで、この様な効果を得ることができる。しかし、酵素分解への依存は、患者間の個体差、及びインビボとインビトロ間で結果に差異が生じてしまう。
【０００７】
本発明は、異なる状況で用いられている切断機序、すなわち、例えば、米国特許出願第２００６／０１７１９２０号、並びに国際公開第２００９／１５８６６８号、国際公開第２０１１／１４０３９３号、国際公開第２０１１／１４０３９２号及び国際公開第２０１１／１４０３７６号に開示されている、巨大分子担体からの薬物放出の利点を応用するものである。脱離反応は、プロトンの酸性度を制御する調節基に依存し、該プロトンが電離すると、薬物が放出される。
【０００８】
出願人らが知る限り、このような機序は、ゲルの分解をもたらす、ヒドロゲルのための切断可能な架橋剤を確立するためには使用されていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、生理的条件に暴露されると非酵素的過程でより小さい可溶性成分に分解されるヒドロゲル、及びそれを調製する方法を提供するものである。該ヒドロゲルは、生理的条件下で脱離反応を受ける架橋薬剤により調製され、よって架橋薬剤はヒドロゲル骨格から切断され得る。本発明はまた、架橋薬剤自体、及び本発明のヒドロゲルを形成するための中間体に関する。本発明の方法に従って調製される生分解性ヒドロゲルは、生体医用工学を含む多様な分野で、吸収材料として、及び薬物送達のための担体として使用することができる。
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、脱離反応によって分解されるリンカーにより架橋された１つ以上のポリマーを含む、生理的条件下で生分解可能なヒドロゲルに関する。より具体的には、ヒドロゲルは、ポリマー内に配置される場合、式（１）で示される基であるリンカーを含有する：
【００１１】
【化１】
2019031498.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２又はＲ５の少なくとも１つは、Ｘと共に、前記１つ以上のポリマーと結合している）。
あるいは、リンカーは、式（２）で示される基である：
【００１３】
【化２】
2019031498.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２又はＲ５の少なくとも２つは、１つ以上のポリマーと結合している）。
【００１５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ、Ｘ、Ｗ、ｓ、ｎ、ｔ及びＱの定義を、以下に詳細に説明する。式（２）の場合、同じ式（２）の分子内に存在する２つのＲ１を介して、又は、例えば、式（２）の１つのＲ１及び１つのＲ５を介して結合していてもよい。すなわち、これらの少なくとも２つの置換基が１つ以上のポリマーに結合する必要があるということは、単に、式（２）の架橋剤自体に少なくとも２つの結合部位が存在しなければならないことを意味する。いくつかの実施形態では、ｔ個の「アーム」のそれぞれにおいて、置換基Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は均一である。
【００１６】
ヒドロゲルは、更に、１つ以上の薬物を含有していてもよい。薬物は、ヒドロゲルの細孔に単に含有されていてよく、又は、架橋薬剤に結合され、結果的にヒドロゲルのポリマー骨格に結合されていてもよい。
【００１７】
本発明はまた、少なくとも１つの反応性ポリマーと、切断可能な架橋剤化合物とを、同時又は逐次的に接触させるステップを含む、生分解性ヒドロゲルを調製する方法であって、ここで、前記切断可能な架橋剤化合物が、反応性ポリマーと反応する官能基と、１つ以上のポリマーと反応する官能基を含む生理的条件下で脱離により切断される部分とを含む方法を提供する。本発明はまた、薬物放出速度及びヒドロゲル生分解速度が制御された、薬物放出生分解性ヒドロゲルを調製する方法を提供する。
【００１８】
従って、薬物又は他の薬剤は、ヒドロゲルに単に捕捉されていてよく、又は、ゲル自体の分解を必要とせず、脱離反応によって薬物を放出するリンカーを介してヒドロゲルに結合することにより含まれていてもよい。
【００１９】
別の態様では、本発明は、生理的条件下で脱離によって切断され得る部分を含み、かつ、反応性ポリマーと共有結合を形成することができる反応基を含む架橋試薬を提供する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の架橋試薬と、少なくとも１つの反応性ポリマーとの反応により形成された中間体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】多分岐ポリマーを式（１）の架橋剤で架橋することによってヒドロゲルが形成される、本発明の一実施形態を示す模式図である。各アーム末端にシクロオクチン（ＣＯ）を有する４分岐ポリマー、及び、一つのＲ５が（ＣＨ２）ｒＮ３であり、ＸがＯ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ−Ｎ３である式（１）の架橋剤（実施例２０）から、各架橋にベータ脱離性リンカーＬを含む４×４ヒドロゲルが得られる。ヒドロゲルの分解速度は、リンカーＬ上の調節基Ｒ１を適切に選択することによって制御される。また、図１には、スクシンイミジルカルボナートとアミノ−ＰＥＧ−アジドとの反応による、（１）の形成も示している。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂには、多分岐ポリマーを式（２）の化合物で架橋することによってヒドロゲルを形成する、本発明の２つの実施形態を示す模式図である。パネルＡは、各アーム末端にシクロオクチン（ＣＯ）を有する４分岐ポリマーの、各アーム末端にベータ脱離性リンカーアジド（Ｌ２−Ｎ３）を有する式（２）の別の４分岐ポリマーによる架橋を示す。得られた４×４ヒドロゲルは、各架橋にベータ脱離性リンカーを含む。ヒドロゲルの分解速度は、リンカーＬ２を適切に選択することによって制御される。パネルＢは、４つのアーム末端にシクロオクチン（ＣＯ）を有し、残りのアームに浸食プローブ（ＥＰ）か放出可能に連結した薬物（Ｌ１−Ｄ）のいずれかが結合している、８分岐ポリマーの架橋を示す。各アーム末端にベータ脱離性リンカーアジド（Ｌ２−Ｎ３）を有する４分岐ポリマーで架橋することにより、各架橋にベータ脱離性リンカーＬ２を含み、かつ、別のベータ脱離性リンカーＬ１を介して共有結合した薬物Ｄを含む、４×８ヒドロゲルが得られる。ヒドロゲルからの薬物放出速度及びヒドロゲル分解速度は、それぞれリンカーＬ１及びＬ２を適切に選択することによって制御される。
【図３】実施例２８に記載の可溶化フルオレセイン−ＰＥＧ断片によって測定した、ｐＨ７．４、３７℃における４×４ＰＥＧヒドロゲルの分解を示すグラフである。異なる調節因子を使用した逆ゲル化時間：Ｒ１＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２、３０時間；Ｒ１＝フェニル−ＳＯ２、５５時間；Ｒ１＝Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＳＯ２、２２日；Ｒ１＝ＣＮ、１０５日。可溶化フルオレセインを浸食プローブとして使用し、その脱ゲル化時間を完全溶解点とした。
【図４】実施例２８の４×４ヒドロゲルについて測定した脱ゲル化時間と、当量のリンカーを使用した可溶性ＰＥＧコンジュゲートから測定された５−（アミノアセトアミド）フルオレセインの放出速度との相関を示すグラフである。
【図５】Ｌ２が調節因子Ｒ１＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２を有する、実施例２８の４×４ＰＥＧヒドロゲルの、脱ゲル化のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図６】実施例２８のゲルの、ｐＨと脱ゲル化時間との相関を示すグラフである。
【図７】実施例２９の４×８ＰＥＧヒドロゲルからの、薬物サロゲートである５−（アミノアセトアミド）フルオレセインの放出を示すグラフである。
【図８】実施例２９の４×８ＰＥＧヒドロゲルからの、薬物サロゲートである５−（アミノアセトアミド）フルオレセインの放出のｐＨ依存性を示すグラフである。放出半減期を、以下のｐＨで測定した：ｐＨ７．４（２３．０時間）、ｐＨ７．８（１４．０時間）、ｐＨ８．１（６．９時間）、ｐＨ８．４（３．２時間）、ｐＨ８．７（１．９時間）及びｐＨ９．０（１．１時間）。
【図９】ｐＨと、実施例２９の８×４ヒドロゲルのからの薬物放出半減期との相関を示すグラフである。
【図１０】調節因子Ｒ１１＝ＣＨ３ＳＯ２を有する放出可能なリンカーＬ１を介して、調節因子Ｒ１＝ＣＮを有する分解性リンカーＬ２で架橋された８×４ＰＥＧヒドロゲルに共有結合で結合した、ペプチドであるエキセナチド（エキセンディン−４）の、ｐＨ８．８、３７℃における放出を示すグラフである（実施例３３）。リンカー放出及びゲル分解のｐＨ依存度を知るために、ｐＨ７．４における対応する目盛りを併せて示す。全可溶化エキセナチド（丸）は、ｐＨ８．８では見掛けのｔ１／２＝２０．７時間で放出され、これは、ｐＨ７．４ではｔ１／２＝２１日目に相当する。脱ゲル化（四角＝可溶化フルオレセイン浸食プローブ）は、ｐＨ８．８では１７２時間目に観測され、これは、ｐＨ７．４では１８０日目に相当した。
【図１１】少なくとも２つの直交性官能基（Ｂ及びＣ）を含む第１のポリマーを、式（３）のリンカー−薬物（該リンカー−薬物は、第１のポリマー上に存在する直交性官能基の一つ（Ｂ）のみと反応する官能基（Ｂ’）を含む）と反応させ、残基Ｂ＊を介して該リンカー−薬物を第１のポリマーに結合させることによって形成される、本発明の一実施形態である薬物放出ヒドロゲルを示す模式図である。得られた薬物導入した第１のポリマー上の残りの直交性官能基（Ｃ）を利用して、式（１）又は（２）の化合物（これらの化合物は、薬物導入した第１のポリマー上に存在する残りの直交性官能基のみと反応して、残基Ｃ＊を介してヒドロゲルを架橋する、官能基（Ｃ’）を含む）と反応させることによりヒドロゲルを形成させる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のヒドロゲルは、リンカーによって架橋されたポリマーであり、このリンカーは、「脱離」によってポリマーを分離する。「脱離」は、プロトンＨと脱離基Ｘが分子から除去されて、アルケンを形成する反応機序である。本発明の一実施形態において、脱離は、以下に示す１，２−脱離である。
【００２３】
【化３】
2019031498.tif 000004
【００２４】
本発明の他の実施形態では、脱離は、以下に示す１，４−脱離である。
【００２５】
【化４】
2019031498.tif 000005
【００２６】
脱離機序では、図示したプロトンＨが塩基によって除去される。水性媒体中では、塩基は典型的に水酸化物イオンであり、従って脱離速度は、媒体のｐＨによって決定される。生理的条件下では、ヒドロゲルを取り囲み、ヒドロゲルに浸透する流体のｐＨが、脱離速度を制御する主因子になると思われる。従って、Ｘ及びＹが、生理環境下に置かれたポリマーマトリックス内の鎖を表す場合、ｐＨ依存性の脱離により、ＸとＹの間の結合が切断され、その後、酵素作用を必要としない過程により、ポリマーマトリックスが生分解される。
【００２７】
「生理的条件下で脱離によって切断され得る部分」とは、基Ｈ−Ｃ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｍ−Ｃ−Ｘ（式中、ｍは０又は１であり、Ｘは脱離基である）を含む構造を意味し、ここでＨＸ要素を除去する前記脱離反応は、反応の半減期が、生理的ｐＨ及び温度条件下で１〜１０，０００時間になるような速度で生じ得る。好ましくは、反応の半減期は、生理的ｐＨ及び温度条件下で１〜５，０００時間、より好ましくは１〜１，０００時間である。生理的ｐＨ及び温度条件とは、ｐＨ７〜８及び温度３０〜４０℃を意味する。
【００２８】
本願で１〜１，０００時間など、本明細書において範囲が記載されている場合、その中間に含まれる区間の数値は、具体的に明記されているのと同様に開示されているとみなすべきである。これにより、冗長な数値の一覧は必要でなくなるが、出願人らは、外側境界の間のいかなる任意の範囲も含まれていることを明らかに企図する。例えば、１〜１，０００の範囲には、１〜５００及び２〜１０も含まれる。
【００２９】
ヒドロゲルとは、多量の水を含む、主に親水性の三次元ポリマーネットワークを意味し、天然又は合成ホモポリマー、コポリマー又はオリゴマーの化学的又は物理的架橋によって形成される。ヒドロゲルは、架橋ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシドと同義である）、ポリプロピレングリコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメタクリラート、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリアクリルアミド、ポリグリコラート、ポリエチレンイミン、アガロース、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリリシン、キトサン、アルギナート、ヒアルロナン、ペクチン、カラゲニンによって形成され得る。ポリマーは、以下に示す通り、多分岐ポリマーであってよい。
【００３０】
また、ヒドロゲルは、環境感受性であってよく、例えば、低温では液体であるが３７℃ではゲル化するもの、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）から形成されたヒドロゲルであってよい。
【００３１】
メソ多孔性ヒドロゲルとは、直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍの細孔を有するヒドロゲルを意味する。メソ多孔性ヒドロゲルの細孔は、タンパク質などの生体分子を自由に拡散させることができる程度に十分な大きさを有する。マクロ多孔性ヒドロゲルとは、直径約１００ｎｍ超の細孔を有するヒドロゲルを意味する。微孔性ヒドロゲルとは、直径約１ｎｍ未満の細孔を有するヒドロゲルを意味する。
【００３２】
反応性ポリマー及び反応性オリゴマーとは、他の官能基に対して反応性がある官能基、最も好ましくは、穏やかな条件下で、ペプチド、タンパク質及び他の生体分子の安定性要件と適合性がある官能基を含むポリマー又はオリゴマーを意味する。反応性ポリマーにおける適切な官能基としては、マレイミド、チオールもしくは保護チオール、アルコール、アクリラート、アクリルアミド、アミンもしくは保護アミン、カルボン酸もしくは保護カルボン酸、アジド、シクロアルキンを含むアルキン、シクロペンタジエン及びフランを含む１，３−ジエン、アルファ−ハロカルボニル、並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、又はニトロフェニルエステルもしくはカルボナートが挙げられる。
【００３３】
反応性ポリマーと結合することができる官能基とは、反応性ポリマーの対応する官能基と反応して、ポリマーと共有結合を形成する官能基を意味する。反応性ポリマーと結合することができる官能基に適するものとしては、マレイミド、チオールもしくは保護チオール、アクリラート、アクリルアミド、アミンもしくは保護アミン、カルボン酸もしくは保護カルボン酸、アジド、シクロアルキンを含むアルキン、シクロペンタジエン及びフランを含む１，３−ジエン、アルファ−ハロカルボニル、並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、又はニトロフェニルエステルもしくはカルボナートが挙げられる。
【００３４】
生分解性ヒドロゲルとは、生理的ｐＨ及び温度条件下で成分の化学結合が切断されることによって、その構造的完全性を喪失するヒドロゲルを意味する。生分解は、酵素的に触媒され、又は、ｐＨや温度などの環境因子のみに依存する。生分解により、可溶性となるのに十分に小さく、従って通常の生理的経路を介して全身から排出される、ポリマーネットワークの断片が形成される。
【００３５】
架橋試薬とは、１つ以上の反応性ポリマー又はオリゴマーと共有結合を形成することができる少なくとも２つの官能基を含む化合物を意味する。典型的には、反応性ポリマー又はオリゴマーは可溶性であり、架橋によって、不溶性の三次元ネットワーク又はゲルが形成される。架橋試薬の２つの官能基は、同一であってよく（ホモ二官能性）、又は異なっていてもよい（ヘテロ二官能性）。ヘテロ二官能性架橋試薬の官能基は、一の官能基が、反応性ポリマー又はオリゴマーの同系基と反応することができ、第２の官能基が、同じ又は異なる反応性ポリマー又はオリゴマーの同系基と反応することができるように選択される。二官能性架橋試薬の２つの官能基は、それら同士が反応しないように、すなわち同系とならないように選択される。
【００３６】
官能基の同系反応対の例としては、以下が挙げられる：
アジド      ＋  アセチレン、シクロオクチン、マレイミド
チオール    ＋  マレイミド、アクリラート、アクリルアミド、ビニルスルホン、
ビニルスルホンアミド、ハロカルボニル
アミン      ＋  カルボン酸、活性化カルボン酸
マレイミド  ＋  １，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン
【００３７】
従って、一例として、アジドとアミン基を有するヘテロ二官能性架橋試薬を調製することができるが、アジドとシクロオクチン基を有するヘテロ二官能性架橋試薬を調製することはできない。
【００３８】
「置換されている」とは、１つ以上の水素原子の代わりに１つ以上の置換基を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール基を意味する。置換基は、一般に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩを含むハロゲン；直鎖、分枝及び環式を含む低級アルキル；フルオロアルキル、クロロアルキル、ブロモアルキル及びヨードアルキルを含む低級ハロアルキル；ＯＨ；直鎖、分枝及び環式を含む低級アルコキシ；ＳＨ；直鎖、分枝及び環式を含む低級アルキルチオ；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルシリル、アルコキシシリル及びアリールシリルを含むシリル；ニトロ；シアノ；カルボニル；カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド；アミノカルボニル；アミノアシル；カルバマート；尿素；チオカルバマート；チオ尿素；ケトン；スルホン；スルホンアミド；フェニル、ナフチル及びアントラセニルを含むアリール；ピロール、イミダゾール、フラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、オキサジアゾール及びテトラゾールを含む５員ヘテロアリール、ピリジン、ピリミジン、ピラジンを含む６員ヘテロアリール、並びにベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、インドール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソオキサゾール及びベンゾイソチアゾールを含む縮合ヘテロアリールを含むヘテロアリールから選択することができる。
【００３９】
Ｒ１及びＲ２の特性は、電子供与性又は電子求引性の置換基を任意選択により付加することによって調節することができる。用語「電子供与基」とは、Ｒ１Ｒ２ＣＨの酸性度を低減させる置換基を意味する。電子供与基は、典型的には、負のハメットσ又はタフトσ＊定数に関連し、物理有機化学の技術分野で周知である（ハメット定数は、アリール／ヘテロアリール置換基に関するものであり、タフト定数は、非芳香族部分上の置換基に関するものである）。適切な電子供与置換基の例としては、これに限定されるものではないが、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ及びシリルが挙げられる。同様に、「電子求引基」とは、Ｒ１Ｒ２ＣＨ基の酸性度を増大させる置換基を意味する。電子求引基は、典型的には、正のハメットσ又はタフトσ＊定数に関連し、物理有機化学分野で周知である。適切な電子求引置換基の例としては、これに限定されるものではないが、ハロゲン、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、Ｃ（＝Ｏ）−ＲＸ（ＲＸは、Ｈ、低級アルキル、低級アルコキシ又はアミノである）、又はＳ（Ｏ）ｍＲＹ（ｍ＝１〜２であり、ＲＹは、低級アルキル、アリール又はヘテロアリールである）が挙げられる。当技術分野で周知の通り、置換基の電子的な影響は、置換基の位置に応じて決まり得る。例えば、アリール環のオルト位又はパラ位上のアルコキシ置換基は電子供与性であり、負のハメットσ定数を特徴とするが、アリール環のメタ位上のアルコキシ置換基は電子求引性であり、正のハメットσ定数を特徴とする。ハメットσ及びタフトσ＊定数値の表を、以下に示す。
【００４０】
【表１】
2019031498.tif 000006
【００４１】
「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、１〜８個の炭素、１〜６個の炭素、又は１〜４個の炭素の直鎖、分枝又は環式炭化水素基が含まれる。アルキルは、飽和炭化水素であり、アルケニルは、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含み、アルキニルは、１つ以上の炭素−炭素三重結合を含む。別段特定されない限り、これらは、１〜６個のＣを含有する。
【００４２】
「アリール」は、６〜１８個の炭素、好ましくは６〜１０個の炭素の芳香族炭化水素基を含み、例えば、フェニル、ナフチル及びアントラセニルなどの基を含む。「ヘテロアリール」は、３〜１５個の炭素を含み、少なくとも１つのＮ、Ｏ又はＳ原子を含有する芳香環、好ましくは３〜７個の炭素を含み、少なくとも１つのＮ、Ｏ又はＳ原子を含有する芳香環を含み、例えば、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、インデニル及びそれらの類似物などの基を含む。
【００４３】
「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードが含まれる。
【００４４】
「マレイミド」は、次式の基である。
【００４５】
【化５】
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【００４６】
用語「タンパク質」及び「ペプチド」は、鎖長に関係なく交換可能に使用され、これらの用語は、ＣＨ２ＮＨ２結合などのアミド結合以外の結合を含む擬似ペプチド、及びペプチド模倣物をさらに含む。
【００４７】
用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」も、鎖長に関係なく交換可能に使用される。核酸又はオリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、又は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは、その修飾形態で、ホスホジエステル、ホスホロアミド酸などの変形結合を有するもの等であってもよい。本発明の薬物として有用なタンパク質及び核酸の両方に関して、これらの用語は、タンパク質の場合には天然に存在しない側鎖を有するもの、及び、核酸の場合には天然に存在しない塩基を有するものも含む。
【００４８】
薬物の説明における低分子とは、当技術分野で十分に理解されている用語であり、合成され又は自然から単離され、一般にはタンパク質又は核酸と類似しない、タンパク質及び核酸以外の化合物を含む。低分子は、典型的には分子量が１，０００未満であるが、特に認識されているカットオフ値は存在しない。低分子という用語は、薬理及び医薬分野で十分に理解されている。
【００４９】
本発明は、生理的条件下で脱離によって切断され得る部分を含み、かつ、反応性ポリマーと共有結合を形成することができる反応基を含む架橋試薬を提供する。一実施形態において、架橋試薬は、式（１）を有する：
【００５０】
【化６】
2019031498.tif 000008
【００５１】
ここで、ｍは、０又は１であり；
Ｘは、生理的条件下でリンカーから脱離可能な反応性ポリマーに結合することができる官能基、及び、反応性ポリマーと結合する第２の反応基Ｚ２とを含み；
ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の少なくとも１つは、ポリマーと結合することができる第１の官能基Ｚ１を含み、
少なくともＲ１及びＲ２の一方又は両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル；
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル；
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル；又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルを示すか、又は、両方のＲ９基は、それらが結合するする窒素原子と一緒になって複素環を形成している；
ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル；
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよいヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
又は、Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
又は、Ｒ１及びＲ２の一方のみが、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は、置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
【００５２】
式（１）の架橋試薬は、生理的条件下で脱離によって切断され得る部分を含む。従って、式（１）の架橋試薬を使用して形成されたヒドロゲルは、生理的条件下で生分解可能である。脱離機序は、媒体のｐＨ及び温度に依存する。架橋試薬は、低ｐＨ及び低温では脱離による切断に対して安定であるが、生理的ｐＨ値（約７．４）及び生理的温度（約３７℃）では、主にＲ１及びＲ２基、及び程度は低いがＲ５基によって制御される速度で脱離が起こる。
【００５３】
脱離反応速度は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５基の構造に基づいて予測することができる。Ｒ１及びＲ２が電子求引性基である場合、脱離反応を促進するが、Ｒ１及びＲ２が電子供与基である場合、脱離反応を遅延させ、それにより、脱離半減期が数分から数年であるリンカーを提供するように、得られる速度を変化させることができる。アルキルであるＲ５基は、アリールであるＲ５基と比べて脱離反応がわずかに緩慢である。従って、Ｒ１及びＲ２基を変更することによって、脱離が起きる速度を制御することが可能となり、結果的にはヒドロゲルの生分解速度を、広範囲にわたって制御することができる。従って、式（１）の架橋試薬を使用して形成されたヒドロゲルは、例えば、薬物送達のための担体もしくはデポーとして、又は組織再生のための一時的足場として、一時的なゲルマトリックスが必要とされ用途において使用することが期待される。
【００５４】
Ｘの実施形態
Ｘは、反応性ポリマーに結合することができる官能基を含み、かつ、生理的条件下で脱離可能である。典型的には、得られる酸ＨＸは、ｐＫａが１０以下、好ましくは８以下である。従って、適切なＸ基の例としては、カルボナート、ハロゲン化カルボニル、カルバマート、チオエーテル、エステル及び置換されていてもよいフェノールが挙げられる。本発明の一実施形態では、Ｘは、スクシンイミジルカルボナート、スルホスクシンイミジルカルボナート又はニトロフェニルカルボナートなどの活性化カルボナートである。本発明の別の実施形態では、Ｘは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｃｌ又はＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｆなどのハロゲン化カルボニルである。本発明の別の実施形態では、Ｘは、次式で表されるカルバマートである：
【００５５】
【化７】
2019031498.tif 000009
【００５６】
ここで、Ｔ＊は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６であり、ここで、Ｒ６は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；ｚは１〜６であり；かつ、Ｙは、存在しないか、又はＯＲ７もしくはＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、かつ、Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基である。本発明の特定の実施形態では、Ｙは（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり；又は、Ｙは（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１００）であり；又は、Ｙは（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０）である。
【００５７】
別の実施形態では、Ｘは、ＯＲ７又はＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン、又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、かつ、Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基である。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５のうち、Ｒ５がポリマーに結合することができる官能基を含む置換基である、式（１）の架橋試薬を提供する。さらに特定の実施形態では、本発明は、Ｒ５の一つが、ポリマーに結合することができる官能基を含み、他のＲ５がＨである、式（１）の架橋試薬を提供する。
【００５９】
従って、本発明は、式（１ａ）で表される架橋試薬を提供する：
【００６０】
【化８】
2019031498.tif 000010
【００６１】
ここで、ｍは０〜１であり；ｒは２〜８であり；かつ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ、Ｘ及びＺは、上述で定義された通りである。特定の実施形態では、本発明は、Ｒ５がＨである、式（１ａ）の架橋試薬を提供する。さらに特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、ＣＮ又はＲ８ＳＯ２であり、ここで、Ｒ８は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、又はＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は、両方のＲ９基が、それらが結合するする窒素原子と一緒になって複素環を形成し；Ｒ２及びＲ５がＨであり、かつ、ｍ＝０である、式（１ａ）の架橋試薬を提供する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、Ｘが次式を有する、式（１ａ）の架橋試薬を提供する
【００６３】
【化９】
2019031498.tif 000011
【００６４】
ここで、Ｔ＊は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６であり、ここで、Ｒ６は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；ｚは１〜６であり；かつ、Ｙは、存在しないか、又はＯＲ７もしくはＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、かつ、Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基である。本発明の特定の実施形態では、Ｙは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であるか、又は、Ｙは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１００）であるか、又は、Ｙは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０）である。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、Ｘは、ＯＲ７又はＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン、又は、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、かつ、Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基である。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、式（１ｂ）の架橋試薬を提供する
【００６７】
【化１０】
2019031498.tif 000012
【００６８】
ここで、ｍは０〜１であり、かつ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ、Ｘ及びＺ２は、上述において定義した通りである。特定の実施形態では、本発明は、Ｒ５がＨである式（１ｂ）の架橋試薬を提供する。さらに特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１がＣＮ又はＲ８ＳＯ２であり、ここで、Ｒ８は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、又はＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は、両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し；Ｒ２及びＲ５がＨであり、かつ、ｍ＝０である、式（１ｂ）の架橋試薬を提供する。
【００６９】
Ｘが、ＯＨ、Ｃｌ又はＯ−スクシンイミジルである式（１）の化合物を調製する方法は、国際公開第２００９／１５８６６８号、国際公開第２０１１／１４０３９３号及び国際公開第２０１１／１４０３９２号に既に開示されている。Ｘが、次式のカルバマートである式（１）の化合物
【００７０】
【化１１】
2019031498.tif 000013
【００７１】
は、以下の実施例に例示される方法を使用して、ＸがＣｌ又はＯ−スクシンイミジルである式（１）の化合物から、式Ｒ６−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚＹ−Ｚ２のアミンと反応させることによって調製することができる。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、式（２）の多価架橋試薬が提供される
【００７３】
【化１２】
2019031498.tif 000014
【００７４】
ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の少なくとも１つは、ポリマーと結合することができる官能基Ｚ１を含み、かつ、その他においては式（１）において定義されている通りであり；
ここで、ｍは、０又は１であり；
ｎは、１〜１０００であり；
ｓは、０〜２であり；
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり；
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【００７５】
【化１３】
2019031498.tif 000015
【００７６】
であり；かつ、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、ここで、ｔ＝２、４、８、１６又は３２である。
【００７７】
コア基Ｑは、架橋試薬の複数のアームと結合する、価数＝ｔの基である。Ｑの典型的な例として、Ｃ（ＣＨ２）４（ｔ＝４）、ここで、多分岐試薬は、ペンタエリスリトールコアに基づいて調製される；（ｔ＝８）、ここで、多分岐試薬は、ヘキサグリセリンコアに基づいて調製される；、及び（ｔ＝８）、ここで、多分岐試薬は、トリペンタエリスリトールコアに基づいて調製される、が挙げられる。
【００７８】
【化１４】
2019031498.tif 000016
【００７９】
式（２）の化合物は、多分岐ポリエチレングリコールを、式（１）の試薬と反応させることによって調製することができる。様々な多分岐ポリエチレングリコールが、例えばＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。
【００８０】
本発明の特定の実施形態では、ｔは４である。本発明の別の実施形態では、ｔは８である。
【００８１】
ヒドロゲルの調製
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの反応性ポリマーと、切断可能な架橋剤化合物とを、同時又は逐次的に接触させるステップを含む、生分解性ヒドロゲルを調製する方法であって、ここで、前記切断可能な架橋剤化合物が、反応性ポリマーと反応する官能基と、生理的条件下で脱離によって切断される部分とを含む、方法を提供する。
【００８２】
本発明の一実施形態では、生分解性ヒドロゲルは、単一の反応性ポリマーと、切断可能な架橋剤化合物とを反応させることによって形成され、ここで、前記切断可能な架橋剤化合物は、反応性ポリマーと反応する官能基と、反応性ポリマーと反応する官能基であって生理的条件下で脱離によって切断される官能基を含む部分とを含む。この実施形態では、反応性ポリマーは、三次元ヒドロゲルマトリックスの結節部（ｎｏｄｅ）を形成することができるように、多価である。本方法の一例として、以下に定義される通りに各アーム末端に反応性官能基Ｚ３を有する多分岐ＰＥＧを、式（１）又は（２）の架橋剤試薬と反応させて、ヒドロゲルを形成させる。様々なサイズで、様々な反応性官能基を伴う多分岐ＰＥＧが、例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。本方法の別の例として、反応性官能基Ｚ３の複数のコピーを含む線状ポリマーを、式（１）又は（２）の架橋剤試薬と反応させて、ヒドロゲルを形成させることができる。複数のＺ３基を含むこのような線状ポリマーの例としては、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、デキストラン、コラーゲン、キトサン、アルギナート及びアガロースを挙げることができる。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、第１の反応性ポリマーと、第２の反応性ポリマーと、切断可能な架橋剤化合物とを反応させることによって、生分解性ヒドロゲルを形成させる方法を提供し、該架橋剤化合物は、第１の反応性ポリマーと反応する第１の官能基、第２のポリマーと反応する第２の官能基、及び、生理的条件下で脱離によって切断される部分を含む。第１及び第２の官能基は、同一又は異なっていてもよい。三次元ゲルネットワークを形成するために、反応性成分（第１の反応性ポリマー、もしあれば第２の反応性ポリマー）は、多分岐であって、ゲルマトリックス内に結節部を形成させるように働く。本発明の好ましい実施形態では、この結節部を形成する反応性成分は、少なくとも３つのアーム、より好ましくは少なくとも４つのアームを含む。
【００８４】
各実施形態では、反応性ポリマーは、それらの天然状態に適切な反応性官能基を含むか、又は適切な反応性官能基を含むように誘導体化されている、ホモポリマー又はコポリマーのポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメタクリラート、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリアクリルアミド、ポリグリコラート、ポリエチレンイミン、アガロース、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリリシン、キトサン、アルギナート、ヒアルロナン、ペクチン又はカラゲニンであってよい。典型的には、適切な反応性官能基は、マレイミド、チオールもしくは保護チオール、アルコール、アクリラート、アクリルアミド、アミンもしくは保護アミン、カルボン酸もしくは保護カルボン酸、アジド、シクロアルキンを含むアルキン、シクロペンタジエン及びフランを含む１，３−ジエン、アルファ−ハロカルボニル、並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、又はカルボナートを含む。有効な数の反応基を含まない天然ポリマーは、ヒドロゲルを形成する前に、有効な数の反応基を導入する試薬と反応させることによって変換させることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、式［Ｚ３−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｔＱで表される多価の分枝構造を含み、ここで、Ｚ３は、Ｚ１及びＺ２について上述において記載した選択肢から選択される反応性官能基であり、ｓは０〜２であり、Ｑは、価数ｔを有する多価コア基であり、ｔは、２、４、８、１６又は３２である。ｎの値は、１０〜１０００であってよく、又は２０、５０、１００などの中間値等であってもよい。この列挙は、１０〜１０００の間の全ての中間の整数を含むものとする。
【００８６】
ゲル形成反応は、様々な適切な溶媒、例えば水、アルコール、アセトニトリル又はテトラヒドロフラン中で実施することができ、好ましくは水性媒体中で実施される。
【００８７】
ヒドロゲルの形成は、段階的に又は協奏的に実施することができる。従って、本発明の一実施形態では、第１の反応性ポリマーを、式（１）又は（２）の架橋試薬と反応させて、中間体である架橋されていない組合せを形成させ、この組合せを、任意で単離する。次に、架橋されていない組合せを、第２の反応性ポリマーと反応させて、最終的な架橋ゲルを形成させることができる。本発明の別の実施形態では、第１の反応性ポリマーと、第２の反応性ポリマーと、式（１）又は（２）の架橋試薬とを、単一の操作で組み合わせ、反応させ、ヒドロゲルを形成させることができる。
【００８８】
一実施形態においては、本発明は、ポリマーを式（１）の架橋試薬で架橋することによってヒドロゲルを形成する方法を提供する。存在する官能基に応じて、ポリマーは、その天然状態であってもよく、又は当技術分野で公知の方法を使用して最初に誘導体化して、式（１）の化合物上の官能基と交差反応する官能基を導入してもよい。本実施形態では、式（１）の化合物上のポリマーと反応することができる２つの官能基は、典型的には同じものである。本実施形態の一例を、図１に示す。示されている通り、２つのアジド官能基を有する式（１）の切断可能な架橋剤は、シクロオクチン官能基を有する４分岐ポリマーを架橋する。Ｚ１、Ｚ２及びＺ３について上述した他の実施形態のゲルも、類似又は同一の結果が得られるように調製される。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、一方が脱離可能な架橋剤を含む、異なって置換されている２つのポリマーを架橋することによって、ヒドロゲルを形成する方法を提供する。この実施形態の２つの例を、図２に示す。パネルＡは、各アーム末端にシクロオクチン（ＣＯ）を有する第１の４分岐ポリマーを、各アーム末端に式（１）のベータ脱離性リンカーアジド化合物（Ｌ２−Ｎ３）を有する第２の４分岐ポリマー（よってこれは４分岐の式（２）の化合物である）で架橋している。得られた４×４ヒドロゲルは、それぞれの架橋にベータ脱離性リンカーを含む。従って、ゲルは、４分岐ポリマー及び式（２）から導出される交互の結節部を含有する。
【００９０】
パネルＢに示されている通り、この方法では、非常に多数のアームを有するポリマーを使用することもできる。示されている通り、８分岐ポリマーのアームのいくつかは、以下に示す式（３）の化合物に結合させることによって、薬物に誘導体化することができる。さらに、又はその代わりに、１つ以上のアームを蛍光色素などのマーカー化合物と結合させ、ゲルの崩壊速度を、環境条件の関数として、並びに／又は、Ｒ１、Ｒ２及び／もしくはＲ５の性質の関数として評価することもできる。この「浸食プローブ」により、所望の崩壊速度を有するゲルを設計することができる。
【００９１】
このような設計の一態様では、薬物の存在下でゲルを形成することによって、単にゲルの細孔内に薬物が含まれていてよく、薬物の送達速度は、ゲルを形成する架橋化合物における置換基を適切に選択することによって制御される。
【００９２】
細孔内に薬物を含有し、かつ、以下の式（３）に示す連結を介してポリマーに結合した薬物を含有するゲルを調製することもできる。それにより、連結からの放出速度と、細孔からの放出速度とを比較することができる。
【００９３】
第３の代替手段として、薬物は、式（３）の形態で単純に供給することができ、この場合、ゲルからの放出速度は、ゲルからの薬物の脱離反応によってのみ決定される。
【００９４】
別の態様では、本発明は、上述方法に従って形成されるヒドロゲルを提供する。これらのヒドロゲルは、前述の、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメタクリラート、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリアクリルアミド、ポリグリコラート、ポリエチレンイミン、アガロース、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリリシン、キトサン、アルギナート、ヒアルロナン、ペクチン、カラゲニン、又は例示した多分岐ポリマーの天然形態又は修飾形態として含まれる様々な親水性ポリマーを含むことができ、生理的条件下で脱離によって切断され得る少なくとも１つの部分を含むそれらの架橋によって、特徴付けられる。従ってこれらのヒドロゲルは、ｐＨ依存過程を介して生分解可能である。
【００９５】
反応物及び化学量を適切に選択することにより、得られるヒドロゲルの細孔径を決定することができる。本発明のヒドロゲルは、微孔性、メソ多孔性又はマクロ多孔性であってよく、ヒドロゲルの調製に使用される架橋試薬の性質によって決定される、様々な範囲の生分解速度を有することができる。
【００９６】
本発明のヒドロゲルは、選択された化学量により、不完全な架橋により、又は直交反応性に起因してゲル化過程に関与しない官能基が組み込まれることにより、ゲル化過程で消費されずに残った反応基を含む場合もある。これらの残りの反応基を使用して、例えば薬物又はプロドラッグを共有結合により結合させることによって、得られるヒドロゲルをさらに修飾することができる。本発明の一実施形態では、残りの反応基を使用して、リンカーに結合した薬物を含むプロドラッグを結合させ、その後、そのリンカーにより、ヒドロゲルマトリックスから薬物を放出させる。本発明のさらに特定の実施形態では、ヒドロゲルマトリックスからの薬物の放出は、脱離機序を介して生じる。薬物共役のための脱離性リンカーの使用は、例えば参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５８６６８号及び国際公開第２０１１／１４０３９３号に記載されている。
【００９７】
本発明の薬物放出分解性ヒドロゲルの一実施形態は、図２Ｂに示されており、以下の実施例２９及び３３に示されている。第１のポリマー上の官能基のサブセットを、薬物放出速度を制御する第１の調節因子基を含む放出可能なリンカー−薬物と反応させることによって、中間体である薬物負荷ポリマーが提供される。残りの官能基が、ヒドロゲル分解速度を制御する第２の調節因子基を含む式（１）又は（２）の架橋試薬と反応すると、薬物を負荷した分解性ヒドロゲルが提供される。薬物リンカー及び架橋試薬上に存在する調節因子基を適切に選択することによって、薬物放出速度及びヒドロゲル分解速度を制御することができる。本発明のある方法では、第１のステップで第１のポリマーをリンカー−薬物で処理し、中間体である薬物負荷ポリマーを、場合によって単離する。ヒドロゲルは、別個のステップで架橋剤試薬と反応させることによって、形成される。本発明の第２の方法では、第１のポリマー、リンカー−薬物、及び架橋剤試薬は、単一ステップで組み合わされる。ポリマー上の全ての反応性官能基が、リンカー−薬物又は架橋のいずれかとの結合により消費されるとは限らないとしても、過剰の官能基は、適切な試薬と反応させることによって、場合によってキャップすることができる。例えば、過剰のシクロオクチンは、アジド−ヘプタエチレングリコールなどの短鎖ＰＥＧ−アジドと反応させることによって、キャップすることができる。
【００９８】
従って、本発明の一実施形態では、以下の、
（ａ）反応性官能基を含む第１の多価ポリマーを、準化学量論的量の式（３）を有するリンカー−薬物と反応させて、薬物を負荷した第１のポリマーを形成するステップと
【００９９】
【化１５】
2019031498.tif 000017
【０１００】
ここで、ｍ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は、式（１）及び（２）でこれらについて記載した実施形態を有することができるが、これらは、当然のことながら独立して選択され、従って、式（１）又は（２）の残基と式（３）の両方を含有するゲルは、これらの表記と同じ置換基を含む必要はなく、Ｄは、薬物の残基であり、この場合、Ｙは、ＮＨ又はＮＢＣＨ２であり、Ｂは、Ｈ、置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも１つは、第１のポリマー上の置換基と反応性があるＺ１に相当する官能基で置換されている、
（ｂ）場合によって、薬物を負荷した第１のポリマーを単離するステップと、
（ｃ）薬物を負荷した第１のポリマー上の残りの反応性官能基を、式（１）又は式（２）の化合物で架橋して、ヒドロゲルを形成するステップと
からなる、薬物放出分解性ヒドロゲルを形成する方法が提供される。
【０１０１】
式（３）のリンカー−薬物の調製については、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５８６６８号及び国際公開第２０１１／１４０３９３号に詳説されている。
【０１０２】
連結される薬物Ｄは、低分子又はペプチドを含むポリペプチド及びタンパク質であってよい。以下の実施例３２は、Ｄが、配列：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（配列番号１）を有するエキセナチドペプチドである、薬物放出分解性ヒドロゲルの調製を詳説している。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、エキセナチドペプチドは、アミノ基を介してリンカーに結合して、
【０１０４】
【化１６】
2019031498.tif 000018
【０１０５】
を提供する、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びｍは、先の式（３）で定義した通りである。特定の実施形態では、ｍ＝０、Ｒ２はＨであり、一方のＲ５はＨであり、他方のＲ５は、（ＣＨ２）ｎＹ（ｎ＝１〜６）又はＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＹ（ｐ＝１〜１０００）であり、Ｙは、Ｎ３、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート、アクリルアミド、ビニルスルホン又はビニルスルホンアミド基を含む基である。本発明の特定の実施形態では、Ｒ１は、ＣＮ又はＳＯ２Ｒ３であり、Ｒ３は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、ＯＲ９又はＮ（Ｒ９）２であり、各Ｒ９は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールであり、Ｎ（Ｒ９）２は、複素環を形成していてもよい。リンカーは、ペプチド上の任意の遊離アミン基、すなわちリシンのイプシロン−アミノ基などのＮ末端アミン又は任意の側鎖アミンに結合することができる。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態では、式（３）のリンカー−薬物は、一方のＲ５上に反応性アジド基を含む。従って、準化学量論的量のリンカー−薬物は、各アーム末端に反応性シクロオクチン基を含む多分岐ポリマーと反応する。反応性シクロオクチン基の例として、例えばジベンゾシクロオクチン、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）、及び歪みがある二環式シクロオクチン、例えばビシクロノニン（ＢＣＮ）を含めた、銅を用いないアジドとの１，３−双極性環化付加反応において有効なものが挙げられる。
【０１０７】
本発明の一実施形態では、第１のポリマーは、各アーム末端に反応性官能基を有する、少なくとも８つのアームを含む。図２Ｂに示されている通り、式（１）又は（２）の化合物に架橋するために、第１のポリマーの３つのアームが使用される。本発明の好ましい一実施形態では、式（１）又は（２）の化合物に架橋するために、第１のポリマーの少なくとも４つのアームが使用される。従って、使用されるリンカー−薬物の準化学量論的量は、第１のポリマーに対して０．０１〜５モル当量の範囲に及ぶことができ、従って８分岐の第１のポリマー１個当たり、分子０．０１〜５個の薬物Ｄが負荷される。本発明の一実施形態では、使用されるリンカー−薬物の準化学量論的量は、第１のポリマーに対して０．１〜５モル当量の範囲に及ぶことができる。本発明の別の実施形態では、使用されるリンカー−薬物の準化学量論的量は、第１のポリマーに対して１〜５モル当量の範囲に及ぶことができる。
【０１０８】
従って、本発明の特定の実施形態では、エキセナチドを放出する分解性ヒドロゲルは、各アームの末端にシクロオクチン基を含む多価の第１のポリマーを、準化学量論的量の式（４）のリンカー−薬物と反応させて、エキセナチドを負荷した第１のポリマーを形成することによって調製され
【０１０９】
【化１７】
2019031498.tif 000019
【０１１０】
ここで、Ｒ１＝ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよいアリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよいヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、
ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルである
か、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成している、又は
ＳＲ４
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよいアリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよいヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
このエキセナチドを負荷した第１のポリマーは、例えば沈殿、サイズ排除もしくはイオン交換クロマトグラフィー、又は当技術分野で公知の他の方法によって、任意で単離される。本発明の特定の実施形態では、式（４）のＲ１は、ＣＮ又はＳＯ２Ｒ３である。
【０１１１】
次に、エキセナチドを負荷した第１のポリマーを、式（１）又は（２）の切断可能な化合物と反応させて、エキセナチドを放出する分解性ヒドロゲルを形成する。本発明の特定の実施形態では、エキセナチドを放出する第１のポリマーは、８分岐ポリエチレングリコールであり、ヒドロゲルの形成に使用される切断可能な化合物は、式（２）の化合物である。本発明の特定の実施形態では、ヒドロゲルの形成に使用される切断可能な化合物は、ｍが０であり、ｎが１０〜１５０であり、ｓが０であり、ｔが４であり、ＱがＣ（ＣＨ２）４である式（２）の化合物である。
【０１１２】
前述の通り、薬物放出速度及びヒドロゲル分解速度は、それぞれ薬物−リンカー及び架橋剤上のＲ１及びＲ２基の選択によって主に制御される。選択される薬物放出速度は、典型的には、薬物の所望の薬物動態、例えば投与期間にわたる遊離薬物の最大濃度及び／又は最小濃度によって決定され、このことは、共に参照によって本明細書に組み込まれるＳａｎｔｉら、ＰＮＡＳ（２０１２年）（投稿）及び同時係属中のＰＣＴ出願（２０１２年９月７日出願）（代理人整理番号６７０５７３０００５４０号）に記載されている。次に、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物上のＲ１及びＲ２基は、投与期間にわたって必要な量の遊離薬物を供給すると同時に、体内の分解性ヒドロゲルの寿命を最小限に抑えるために、最適なヒドロゲルの分解速度を提供するように選択される。
【０１１３】
本発明の別の実施形態では、薬物放出分解性ヒドロゲルは、各アーム末端に少なくとも２つの直交性官能基を含む基を有する、多分岐の第１のポリマーを、第１のポリマー上に存在する直交性官能基の１つだけと反応する官能基を含む式（３）のリンカー−薬物と反応させる方法によって調製される。得られた薬物を負荷した第１のポリマー上の残りの直交性官能基を使用して、薬物を負荷した第１のポリマー上に存在する残りの直交性官能基の１つだけと反応する官能基を含む式（１）又は（２）の化合物との反応によって、ヒドロゲルを形成する。この方法は、化学量論的な対照成分によって形成される構造よりも規則的な構造の薬物放出分解性ヒドロゲルが提供されるはずであるという点で、有利である。この方法は、以下の実施例３７に示されている。各アーム末端に少なくとも２つの直交性官能基を含む基を有する、多分岐の第１のポリマーは、各アームが、適切な多官能性アダプターとの縮合により単一の官能基で終端している、多分岐ポリマーから調製することができる。このことは、図１１に示されている。
【０１１４】
本発明のヒドロゲルは、インビトロで調製され、次に必要に応じて移植することができる。ゲルは、特定の形状に成型することができ、又は注入用の微粒子もしくは微小球の懸濁液として調製することができる。あるいは、ヒドロゲルは、ｉｎ  ｓｉｔｕでのゲル化によって形成され得る。その場合、ヒドロゲル成分の薬学的に許容される製剤が調製される。成分を混合した後、その混合物は、ゲル化する前に注入又は適用される。注入は、皮下、筋肉内、眼内、腫瘍内又は静脈内で行うことができる。本発明のヒドロゲルは、例えば皮膚又は手術創に適用した後、混合成分のｉｎ  ｓｉｔｕでのゲル化によって、局所適用され得る。本発明のヒドロゲルは、医療機器上のコーティング又は外科用包帯剤として適用することもできる。
【０１１５】
本明細書で引用したあらゆる参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、本発明はそれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【０１１６】
６−アジドヘキサナールの調製
【０１１７】
【化１８】
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【０１１８】
（１）６−アジド−１−ヘキサノール：水２００ｍＬ中、６−クロロ−１−ヘキサノール（２５ｇ、１８３ｍｍｏｌ）及びナトリウムアジド（３２．５ｇ、５００ｍｍｏｌ）の混合物を、２０時間加熱還流し、次に周囲温度に冷却し、酢酸エチルで３回抽出した。組み合わせた抽出物を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、生成物を薄黄色油として得た（２８．３ｇ）。
【０１１９】
（２）６−アジドヘキサナール：固体トリクロロイソシアヌル酸（４．３ｇ）を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）中、６−アジド−１−ヘキサノール（７．１５ｇ）、ＴＥＭＰＯ（５０ｍｇ）及び重炭酸ナトリウム（５．０ｇ）の激しく撹拌した混合物に少量ずつ添加した。添加した後、混合物をさらに３０分間撹拌し、次にセライトパッドで濾過した。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、生成物（５．８ｇ）を得、それをさらなる精製なしに使用した。
【実施例２】
【０１２０】
ω−アジド−ＰＥＧ−アルデヒドの調製
【０１２１】
【化１９】
2019031498.tif 000021
【０１２２】
固体トリクロロイソシアヌル酸（６０ｍｇ）を、Ｏ−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール（ｎ＝７；２５０ｍｇ）、ＴＥＭＰＯ１ｍｇ、ＮａＨＣＯ３１００ｍｇ、ＣＨ２Ｃｌ２２ｍＬ及び水０．２ｍＬの、激しく撹拌した混合物に添加した。混合物はオレンジ色に変化し、約３０分後に白色懸濁液が形成された。ＴＬＣ分析（１：１アセトン／ヘキサン）は、生成物が形成されたことを示し、生成物はリンモリブデン酸で染色されていた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２１０ｍＬで希釈し、ＭｇＳＯ４と共に撹拌することによって乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製生成物を得た。この生成物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ヘキサンで平衡化した４ｇｍのシリカゲルカラムに載せ、それをそれぞれヘキサン、７５：２５ヘキサン／アセトン、５０：５０ヘキサン／アセトン及び２５：７５ヘキサン／アセトン２５ｍＬで逐次的に溶出した。生成物を含有する画分を組み合わせ、蒸発させて、精生成物を得た。
【実施例３】
【０１２３】
アジドアルコールの調製
【０１２４】
【化２０】
2019031498.tif 000022
【０１２５】
ヘキサン中ｎ−ブチルリチウム（３．１ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）の１．６Ｍ溶液を、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１５ｍＬ）中Ｒ−ＳＯ２ＣＨ３（５．０ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した撹拌溶液に滴下添加した。添加した後、冷却浴を除去し、混合物を約３０分かけてゆっくり０℃に温めた。次に、混合物を冷却して−７８℃に戻し、６−アジドヘキサナール（５．５ｍｍｏｌ）を添加した。１５分間撹拌した後、冷却浴を除去し、混合物を温めた。混合物が透明になった時点で、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液５ｍＬを添加し、混合物を周囲温度に温め続けた。混合物を酢酸エチルで希釈し、水及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製生成物を油として得た。ヘキサン中酢酸エチルの勾配を使用してシリカゲルでクロマトグラフィー処理して、精生成物を得た。
【０１２６】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
１−（４−（トリフルオロメチル）フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；４−（トリフルオロメチル）フェニルメチルスルホンから（１．７３ｇ、９４％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４−Ｈｚ）、７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４−Ｈｚ）、４．２１（１Ｈ，ｍ）、３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、３．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１４．４−Ｈｚ）、３．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，１４．４−Ｈｚ）、３．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８−Ｈｚ）、１．５８（２Ｈ，ｍ）、１．５〜１．３（６Ｈ，ｍ）；
１−（４−クロロフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；４−クロロフェニルメチルスルホンから；無色油（１．４９ｇ、収率９０％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８−Ｈｚ）、７．７０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８−Ｈｚ）、４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６−Ｈｚ）、３．８６（１Ｈ，ｍ）、３．３９（２Ｈ，ｍ）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、１．２〜１．５（８Ｈ，ｍ）；
１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；フェニルメチルスルホンから；薄黄色油（１．２５ｇ、８５％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．８９（２Ｈ，ｍ）、７．７２（１Ｈ，ｍ）、７．６３（２Ｈ，ｍ）、４．８４（１Ｈ，ｄ  Ｊ＝６−Ｈｚ）、３．８６（１Ｈ，ｍ）、３．３３（２Ｈ，ｍ）、３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２〜１．４（６Ｈ，ｍ）；
１−（４−メチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；４−（メチルスルホニル）トルエンから；無色油（１．３９ｇ、収率８５％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４−Ｈｚ）、７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４−Ｈｚ）、４．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６−Ｈｚ）、３．８５（１Ｈ，ｍ）、３．３１（２Ｈ，ｍ）、３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、２．４１（３Ｈ，ｓ）、１．４〜１．５（２Ｈ，ｍ）、１．２〜１．４（６Ｈ，ｍ）；
１−（４−メトキシフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；４−メトキシフェニルメチルスルホンから調製（１．５３ｇ、収率９４％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８−Ｈｚ）、７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８−Ｈｚ）、４．１３（１Ｈ，ｍ）、３．９０（３Ｈ，ｓ）、３．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、３．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１４．４−Ｈｚ）、３．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１４．４−Ｈｚ）、２．４７（３Ｈ，ｓ）、１．５７（２Ｈ，ｍ）、１．５〜１．３（６Ｈ，ｍ）；
１−（２，４，６−トリメチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；（２，４，６−トリメチル）フェニルメチルスルホンから調製（４．０ｍｍｏｌの反応物から１．３０ｇ；９６％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６．９９（２Ｈ，ｓ）、４．３０（１Ｈ，ｍ）、３．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２−Ｈｚ）、３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、３．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１−Ｈｚ）、３．１７（１Ｈ，ｓ）、２．６６（６Ｈ，ｓ）、２．３１（３Ｈ，ｓ）、１．５９（２Ｈ，ｍ）、１．５〜１．３（６Ｈ，ｍ）；
１−（モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；１−モルホリノメチルスルホンアミドから調製（１０ｍｍｏｌの反応物から１．３６ｇ、８９％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、３．８８（１Ｈ，ｍ）、３．６２（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８−Ｈｚ）、３．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、３．２０〜３．１５（６Ｈ，重複）、１．５３（２Ｈ，ｍ）、１．４６〜１．２５（６Ｈ，ｍ）；及び
１−（メチルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプタノール；ジメチルスルホンから；無色油（８８０ｍｇ、７５％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）。
【実施例４】
【０１２７】
アジドアルコールの調製
【０１２８】
【化２１】
2019031498.tif 000023
【０１２９】
ヘキサン中ｎ−ブチルリチウム（３．１ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）の１．６Ｍ溶液を、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１５ｍＬ）中Ｒ−ＳＯ２ＣＨ３（５．０ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した撹拌溶液に滴下添加する。添加した後、冷却浴を除去し、混合物を約３０分かけてゆっくり０℃に温める。次に、混合物を冷却して−７８℃に戻し、ω−アジド−ヘプタエチレングリコールアルデヒド（ｎ＝７、１．２ｇ）を添加する。１５分間撹拌した後、冷却浴を除去し、混合物を温める。混合物が透明になった時点で、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液５ｍＬを添加し、混合物を周囲温度に温め続ける。混合物を酢酸エチルで希釈し、水及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて粗製生成物を得る。シリカゲルでクロマトグラフィー処理して、精生成物を得る。
【実施例５】
【０１３０】
アジド−リンカークロロホルマートの調製
【０１３１】
【化２２】
2019031498.tif 000024
【０１３２】
ピリジン（１６０μＬ）を、無水ＴＨＦ１５ｍＬ中、実施例３のアジドアルコール（１．０ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（５００ｍｇ）の撹拌溶液に滴下添加した。得られた懸濁液を１０分間撹拌し、次に濾過し、濃縮して、粗製クロロホルマートを油として得た。
【０１３３】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
１−（４−（トリフルオロメチル）フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート
１−（４−クロロフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；
１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；
１−（４−メチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；
１−（４−メトキシフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；
１−（２，４，６−トリメチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；
１−（４−モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート；及び
１−（メタンスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルクロロホルメート。
【０１３４】
他のクロロホルマートも、この一般法に従って調製することができる。
【実施例６】
【０１３５】
アジド−リンカークロロホルマートの調製
【０１３６】
【化２３】
2019031498.tif 000025
【０１３７】
ピリジン（１６０μＬ）を、無水ＴＨＦ１５ｍＬ中、実施例４のアジドアルコール（１．０ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（５００ｍｇ）の撹拌溶液に滴下添加する。得られた懸濁液を１０分間撹拌し、次に濾過し、濃縮して、粗製クロロホルマートを得る。
【実施例７】
【０１３８】
アジド−リンカースクシンイミジルカルボナートの調製
【０１３９】
【化２４】
2019031498.tif 000026
【０１４０】
ピリジン（３００μＬ）を、無水ＴＨＦ１５ｍＬ中、実施例５のクロロホルマート（１．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３５０ｍｇ）の撹拌溶液に滴下添加した。得られた懸濁液を１０分間撹拌し、次に濾過し、濃縮して、粗製スクシンイミジルカルボナートを得た。シリカゲルでクロマトグラフィーによって精製して、精生成物を油として得ると、自然に結晶化した。再結晶化は、酢酸エチル／ヘキサンを使用して行うことができた。
【０１４１】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
Ｏ−［１−（４−（トリフルオロメチル）フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：４０：６０酢酸エチル／ヘキサン由来の結晶（２８０ｍｇ、５５％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ８．１２（２Ｈ，ｍ）、８．０４（２Ｈ，ｍ）、５．１８（１Ｈ，ｍ）、４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．２）、３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１５．２）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）、２．８０（４Ｈ，ｓ）、１．６８（２Ｈ，ｍ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（４−クロロフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：４０：６０酢酸エチル／ヘキサン由来の結晶（３９２ｍｇ、８３％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．８５（２Ｈ，ｍ）、７．７２（２Ｈ，ｍ）、５．１４（１Ｈ，ｍ）、４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１５．６）、３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１５．６）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）、２．８１（４Ｈ，ｓ）、１．６８（２Ｈ，ｍ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：４０：６０酢酸エチル／ヘキサン由来の結晶（３９１ｍｇ、８９％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．９１（２Ｈ，ｍ）、７．７６（１Ｈ，ｍ）、７．６６（２Ｈ，ｍ）、５．１２（１Ｈ，ｍ）、３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１５．２）、３．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１５．２）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）、２．８１（４Ｈ，ｓ）、１．６９（２Ｈ，ｍ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（４−メチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：クロマトグラフィー後に静置したときの結晶（４０２ｍｇ、８９％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）；７．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０）；５．１１（１Ｈ，ｍ）、３．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１５．２）、３．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，１５．２）、３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）、２．８１（４Ｈ，ｓ）、２．４１（３Ｈ，ｓ）、１．６８（２Ｈ，ｍ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（４−メトキシフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：６０：４０酢酸エチル／ヘキサン由来の結晶（３２０ｍｇ、６８％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８）；７．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８）；５．１１（１Ｈ，ｍ）、３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１５．２）、３．８６（３Ｈ，ｓ）、３．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１５．２）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）、２．８０（４Ｈ，ｓ）、１．６８（２Ｈ，ｍ）、１．４７（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（２，４，６−トリメチルフェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：無色油（４５８ｍｇ、９５％）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ  ７．０９（２Ｈ，ｓ）、５．２０（１Ｈ，ｍ）、３．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１５．２−Ｈｚ）、３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，１５．２−Ｈｚ）、３．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、２．７９（４Ｈ，ｓ）、２．５８（６Ｈ，ｓ）、２．２８（３Ｈ，ｓ）、１．７５（２Ｈ，ｍ）、１．４９（２Ｈ，ｍ）、１．３０（４Ｈ，ｍ）；
Ｏ−［１−（モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：クロマトグラフィー後に静置したときの結晶（４３０ｍｇ、９５％）：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ５．２３（１Ｈ，ｍ）、３．７７（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，５，６−Ｈｚ）、３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１４．４−Ｈｚ）、３．３１（６Ｈ，重複）、３．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１４．４−Ｈｚ）、２．８５（４Ｈ，ｓ）、１．８８（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．４５（４Ｈ，ｍ）；及び
Ｏ−［１−メチルスルホニル−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｏ’−スクシンイミジルカルボナート：クロマトグラフィー後に静置したときの結晶（３６０ｍｇ、９５％）：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ５．３２（１Ｈ，ｍ）、３．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，１４．８−Ｈｚ）、３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８−Ｈｚ）、３．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，４．０，１４．８−Ｈｚ）、３．０２（３Ｈ，ｓ）、２．８５（４Ｈ，ｓ）、１．９０（２Ｈ，ｍ）、１．６２（２Ｈ，ｍ）、１．４６（４Ｈ，ｍ）。
【０１４２】
他のスクシンイミジルカルボナートも、この一般法に従って調製することができる。
【実施例８】
【０１４３】
アジド−リンカースクシンイミジルカルボナートの調製
【０１４４】
【化２５】
2019031498.tif 000027
【０１４５】
ピリジン（３００μＬ）を、無水ＴＨＦ１５ｍＬ中、実施例６のクロロホルマート（１．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３５０ｍｇ）の撹拌溶液に滴下添加する。得られた懸濁液を１０分間撹拌し、次に濾過し、濃縮して、粗製スクシンイミジルカルボナートを得る。シリカゲルでクロマトグラフィーにより精製して、精生成物を得る。
【実施例９】
【０１４６】
アジド−リンカースルホスクシンイミジルカルボナートの調製
【０１４７】
【化２６】
2019031498.tif 000028
【０１４８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドスルホン酸ナトリウムの撹拌懸濁液（１ｍｍｏｌ）を、ピリジン（３ｍｍｏｌ）及び実施例７のクロロホルマートで処理する。懸濁液が透明になった後、混合物を酢酸エチルで希釈する。
【実施例１０】
【０１４９】
アミノ−リンカーアルコールの調製
【０１５０】
【化２７】
2019031498.tif 000029
【０１５１】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬ中、実施例３のアジド−リンカーアルコールの撹拌溶液（Ｒ＝フェニル、１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．２ｍＬ）中トリメチル−ホスフィンの１．０Ｍ溶液で、周囲温度において１時間処理した。水（０．１ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１時間撹拌し、次に混合物を、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、生成物を得た。
【０１５２】
他のアミノ−リンカーアルコールも、この一般法に従って調製することができる。
【実施例１１】
【０１５３】
ｔＢＯＣ−アミノ−リンカーアルコールの調製
【０１５４】
【化２８】
2019031498.tif 000030
【０１５５】
ＴＨＦ２ｍＬ中、実施例１０のアミノ−リンカーアルコールの溶液（Ｒ＝フェニル、１．０ｍｍｏｌ）を、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（１．５ｍｍｏｌ）で１時間かけて処理し、次に蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、水及び塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、生成物を得た。ヘキサン中酢酸エチルの勾配を使用してシリカゲルでクロマトグラフィー処理して、精生成物を得た。
【０１５６】
他のｔＢＯＣ−アミノ−リンカーアルコールも、この一般法に従って生成することができる。
【実施例１２】
【０１５７】
４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）アニリンの調製
【０１５８】
【化２９】
2019031498.tif 000031
【０１５９】
（１）Ν，Ν−ジエチル４−ニトロベンズアミド：ジエチルアミン（５．６ｍＬ）を、ＤＣＭ１００ｍＬ中、４−ニトロベンゾイル塩化物（５．０ｇ）の氷冷溶液に添加した。１時間後、混合物を、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、無色液体を得、これを静置すると結晶化した。酢酸エチル／ヘキサンで再結晶化させて、生成物を薄黄色結晶として得た（４．６ｇ）。
【０１６０】
（２）４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）アニリン：メタノール１００ｍＬ中、Ｎ，Ｎ−ジエチル４−ニトロベンズアミド（４．４４ｇ）及び１０％パラジウム担持炭素（０．２ｇ）の混合物を、ギ酸アンモニウム（４．０ｇ）で周囲温度において２時間かけて処理した。混合物を、セライトを介して濾過し、濃縮した。残渣をＤＣＭに再溶解し、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、水及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、結晶性材料を得た。酢酸エチル／ヘキサンで再結晶化させて、生成物であるアニリンを得た。
【０１６１】
また、ジエチルアミンをモルホリンで置き換えることによって、同じ手順に従って４−（モルホリノカルボニル）アニリンを調製した。
【実施例１３】
【０１６２】
アジドカルバマートの調製
【０１６３】
【化３０】
2019031498.tif 000032
【０１６４】
実施例５の手順に従って、アジドアルコール２．５ｍｍｏｌから調製した粗製クロロホルマートを、ＴＨＦ２０ｍＬに溶解し、アニリン（２．５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．７ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、混合物を酢酸エチルで希釈し、１ＮのＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル／ヘキサンを使用してシリカゲルでクロマトグラフィー処理して、生成物であるカルバマートを得た。
【０１６５】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニルカルバメート；
Ｏ−［１−（モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニルカルバメート；
Ｏ−［１−（メタンスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニルカルバメート；
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（モルホリノカルボキサミド）フェニルカルバメート；及び
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（モルホリノスルホニル）フェニルカルバメート。
【実施例１４】
【０１６６】
Ｎ−クロロメチルカルバマートの調製
【０１６７】
【化３１】
2019031498.tif 000033
【０１６８】
封止した２０ｍＬのバイアル中、実施例１３のアジドカルバマート（１．０ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（４５ｍｇ）、クロロトリメチルシラン（１ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）の混合物を、５５℃の浴中で１７時間加熱した。周囲温度に冷却した後、バイアルを開け、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して、濃厚な油とし、それを酢酸エチルに溶解し、再濃縮した。残渣を２：１酢酸エチル／ヘキサンに溶解し、濾過し、濃縮して、Ｎ−クロロメチルカルバマートを得、それをさらなる精製なしに使用した。
【０１６９】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−クロロメチルカルバメート；
Ｏ−［１−（モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−クロロメチルカルバメート；及び
Ｏ−［１−（メタンスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−クロロメチルカルバメート。
【実施例１５】
【０１７０】
Ｎ−アルコキシメチルカルバマートの調製
【０１７１】
【化３２】
2019031498.tif 000034
【０１７２】
実施例１４のＮ−クロロメチルカルバマート（０．４ｍｍｏｌ）を、ドライメタノール５ｍＬに溶解した。１時間後、混合物を蒸発乾固させ、残渣をシリカゲルでクロマトグラフィー処理して（酢酸エチル／ヘキサン）、生成物を得た。
【０１７３】
この方法に従って調製した化合物には、以下が含まれる。
Ｏ−［１−（フェニルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−メトキシメチルカルバメート；
Ｏ−［１−（モルホリノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−メトキシメチルカルバメート；及び
Ｏ−［１−（メタンスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチル］−Ｎ−［４−（ジエチルカルボキサミド）フェニル］−Ｎ−メトキシメチルカルバメート。
【実施例１６】
【０１７４】
７−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−（Ｒ１−スルホニル）−１−ヘプタノール
【０１７５】
【化３３】
2019031498.tif 000035
【０１７６】
ｐ−トルエンスルホニル塩化物（１ｍｍｏｌ）を、氷上で冷却したピリジン（２ｍＬ）中６−アジド−１−ヘキサノール（実施例１、１ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。３０分後、混合物を周囲温度に温め、Ｒ１−ＳＨ（１ｍｍｏｌ）でさらに１時間処理する。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、１ＮのＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び塩水で逐次的に洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。粗製チオエーテルを酢酸エチルに溶解し、過剰の過酢酸で処理して、スルホンを調製する。水による標準の後処理を行った後、スルホンを、シリカゲルでクロマトグラフィーにより精製する。ＤＭＦ中、スルホン、ギ酸エチル及び２当量の水素化ナトリウムの混合物を、５０℃に温めて、中間体であるアルデヒドを得、それをメタノール中水素化ホウ素ナトリウムで処理して、生成物であるアルコールを得る。
【実施例１７】
【０１７７】
【化３４】
2019031498.tif 000036
【０１７８】
アミノ−チオールヘテロ二官能性ＰＥＧのＴＨＦ溶液を、反応が完了するまで過剰のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナートで処理し、ジ−ＢＯＣ生成物をクロマトグラフィーによって単離する。チオカルボナートを、メタノール中１当量のＮａＯＭｅで処理することによって切断し、２−ブロモエタノールを添加して、ヒドロキシエチルチオエーテルを形成し、それを過酢酸で酸化すると、生成物が形成される。
【実施例１８】
【０１７９】
【化３５】
2019031498.tif 000037
【０１８０】
これらの化合物は、メトキシ−ＰＥＧ−ヒドロキシエチルスルホンについて記載した方法に類似の方法によって調製することができる（参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６年）７：３６３〜３６８頁）。例えば、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−オール（ｘ＝３）（３ｍｍｏｌ）のトルエン溶液を、共沸蒸留によって乾燥させる。ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、メタンスルホニル塩化物を添加し、その後トリエチルアミンを添加して、メシラートを形成する。メシラート水溶液を、２−メルカプトエタノール及び２ＮのＮａＯＨで処理して、ヒドロキシエチルスルフィドを形成する。その後、例えばタングステン酸触媒の存在下で過酸化水素を使用し、又は代替として過酢酸を使用して、スルフィドをスルホンに酸化する。次に、ヒドロキシエチルスルホンを、先の実施例に記載の方法に従って、スクシンイミジルカルボナートとして活性化する。
【実施例１９】
【０１８１】
【化３６】
2019031498.tif 000038
【実施例２０】
【０１８２】
式（１）の架橋剤の調製
【０１８３】
【化３７】
2019031498.tif 000039
【０１８４】
アセトニトリル２ｍＬ中、７−アジド−１−（フェニルスルホニル）−２−ヘプチル（ｈｅｐｙｌ）スクシンイミジルカルボナート（１１９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（６５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）で周囲温度において１０分間処理した。溶媒を蒸発させた後、残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２１ｍＬに溶解し、４ｇのシリカゲルカラムによって、ヘキサン、３：１ヘキサン／酢酸エチル、１：１ヘキサン／酢酸エチル及び１：２ヘキサン／酢酸エチルのステップ勾配を使用してクロマトグラフィー処理した。生成物を含有する画分を貯蔵し、蒸発させて、生成物を得た。
【実施例２１】
【０１８５】
４分岐ＰＥＧ−［ＤＢＣＯ］４の調製
【０１８６】
【化３８】
2019031498.tif 000040
【０１８７】
ＴＨＦ５ｍＬ中、ペンタエリスリトールコアを有するアミノプロピル末端基を有する４０ｋＤａの４分岐ポリエチレングリコール（ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ、ＰＴＥ４００ＰＡ）（５００ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、トリエチルアミン（２０μＬ）及び６−アザ−５，９−ジオキソ−９−（１，２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）ノナン酸スクシンイミジルエステル（「ＤＢＣＯ−ＮＨＳ」、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ、Ｍａｃｏｎ、ＧＡ）（３６ｍｇ、７５μｍｏｌ）の溶液を、周囲温度で２４時間撹拌した。反応混合物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）５０ｍＬに添加することによって、生成物を沈殿させた。沈殿物を真空濾過によって収集し、真空下で乾燥させて、生成物５１０ｍｇを得た。
【実施例２２】
【０１８８】
ヒドロゲルの形成
ｐＨ５の１０ｍＭアセテート緩衝液１００μＬ中、４分岐ＰＥＧ−［ＤＢＣＯ］４（実施例２１）４．５ｍｇの溶液を、実施例２０のジアジド架橋剤の４０ｍｇ／ｍＬ溶液５．０μＬで処理した。溶液が急速に固化して、弾性のヒドロゲルが得られた。
【０１８９】
同様に、ｐＨ５の１０ｍＭアセテート緩衝液１００μＬ中、４分岐ＰＥＧ−［ＤＢＣＯ］４（実施例２１）４．５ｍｇの溶液を、実施例２０のジアジド架橋剤の４０ｍｇ／ｍＬ溶液２．５μＬで処理した。溶液がゲル化して、粘性のヒドロゲルが得られた。
【実施例２３】
【０１９０】
式（２）の多価ＰＥＧ−（リンカー−アジド）ｘ架橋試薬の調製
多価ＰＥＧ−（リンカー−アジド）ｘ架橋試薬の調製は、ｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ１＝ＰｈＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３である式（２）の化合物の調製によって例示される。実施例７の適切なアジド−リンカー−スクシンイミジルカルボナートを置換することによって、式（２）の他の化合物を同じ方法を使用して調製した。必要に応じて、他の実施例の類似のアジド−リンカー−スクシンイミジルカルボナートを使用することもできる。
【０１９１】
従って、ＡＣＮ１ｍＬ中２５μｍｏｌのアジド−リンカー−スクシンイミジルカルボナート溶液（実施例７）を、水１ｍＬ及び１．０ＭのＮａＨＣＯ３４０μＬ（４０μｍｏｌ）中、２０ｋＤａの４分岐ＰＥＧ−アミン塩酸塩（ペンタエリスリトールコア、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５μｍｏｌ（１００ｍｇ）のミックスに添加した。周囲温度で１時間後、溶液を５０％メタノール１Ｌに対して、その後メタノール１Ｌに対して透析した（１２〜１４ｋのＭＷＣＯ）。蒸発させた後、残渣（１０９ｍｇ）を、滅菌濾過した１０ｍＭのＮａＯＡｃ２．１２ｍＬ、ｐＨ５．０に溶解し、−２０℃で凍結保存した。ＤＢＣＯ−酸との反応によって測定されたアジド濃度は、９．５ｍＭであった。
【実施例２４】
【０１９２】
多価ＰＥＧ−（シクロオクチン）ｘの調製
ＰＥＧ２０ｋＤａ−（ＤＢＣＯ）４：アセトニトリル（０．５ｍＬ、３０μｍｏｌ、１．５当量）中、新たにクロマトグラフィー処理したＤＢＣＯ−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）の６０ｍＭ溶液を、２０ｋＤａの４分岐ＰＥＧ−アミン塩酸塩（ペンタエリスリトールコア、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１００ｍｇ、５μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．０１０ｍＬ、５７μｍｏｌ）のアセトニトリル（１ｍＬ）溶液に添加した。周囲温度で２時間撹拌した後、混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残渣を５０％メタノール水溶液（４ｍＬ）に溶解し、５０％メタノール水溶液に対して、その後メタノールに対して透析した。蒸発させた後、残渣（１００ｍｇ）を水に溶解して、５０ｍｇ／ｍＬの原液を得（分光光度的アッセイによって１０ｍＭのＤＢＣＯ）、それを−２０℃で凍結保存した。
【０１９３】
ＰＥＧ４０ｋＤａ−（ＤＢＣＯ）８：ＴＨＦ中、ＤＢＣＯ−ＮＨＳの４０ｍＭ溶液１ｍＬ（４０μｍｏｌ）を、ＡＣＮ０．６ｍＬ中、４０ｋＤａの８分岐ＰＥＧ−アミン塩酸塩（トリペンタエリスリトールコア、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６８ｍｇ（４．２μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン１２．９μＬ（７４μｍｏｌ）の溶液に添加し、その混合物を周囲温度で一晩保持した。反応混合物を５０％メタノール２Ｌに対して、その後メタノール１Ｌに対して透析した。蒸発させた後、残渣（１４９ｍｇ）を水１．４９ｍＬに溶解し、−２０℃で凍結保存した。分光光度により測定したＤＢＣＯ濃度は、１６ｍＭであった。
【０１９４】
ＰＥＧ４０ｋＤａ（ＢＣＮ）８：ＤＭＦ２ｍＬ中、４０ｋＤａの８分岐ＰＥＧ−アミン・ＨＣｌ２００ｍｇ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；４０μｍｏｌのＮＨ２）、ＢＣＮ  ｐ−ニトロフェニルカルボナート２０ｍｇ（ＳｙｎＡｆｆｉｘ；６３μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２０μＬ（１１５μｍｏｌ）の溶液を、周囲温度で１６時間撹拌した。ｐＨ７．５の０．１ＭのＫＰｉ中１００ｍＭのタウリン０．５ｍＬで１時間クエンチした後、混合物を、水、１：１メタノール／水、及びメタノールに対して１２ｋＤａの膜を使用して逐次的に透析した。蒸発させた後、残渣をＴＨＦ２ｍＬに溶解し、メチルｔブチルエーテル１０ｍＬで沈殿させた。生成物を収集し、乾燥させた（１９０ｍｇ）。
【実施例２５】
【０１９５】
ＢＯＤＩＰＹ−アジド浸食プローブの調製
アセトニトリル（１３μＬ、１３μｍｏｌ）中、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンの１００ｍＭ溶液を、ＤＭＳＯ（１００μＬ、１．２８μｍｏｌ）中ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ  ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１２．８ｍＭ溶液に添加した。周囲温度で３０分間後、混合物をｐＨ７．４の０．１ＭのＫＰｉで２ｍＬに希釈し、５００ｍｇのＣ１８  ＢｏｎｄＥｌｕｔ（商標）抽出カラム（Ｖａｒｉａｎ）に載せた。カラムを、各回、水及び２０％ＡＣＮ／水５ｍＬで逐次的に洗浄し、次に５０％ＡＣＮ／水で溶出し、濃縮乾固させた。残渣を、ＡＣＮ１．０ｍＬに溶解し、濃度（１．０ｍＭ）を、ε５４４ｎｍ＝６０，０００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して測定した。
【実施例２６】
【０１９６】
フルオレセイン−アジド浸食プローブの調製
ＤＭＦ（１００μＬ）中５−（アミノアセトアミド）フルオレセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を、６−アジドヘキシルオキシスクシンイミジルカルボナート（１００μＬ）の２５ｍＭ溶液と１時間混合して、フルオレセイン−アジド浸食プローブの１２．５ｍＭ溶液を得た。
【実施例２７】
【０１９７】
式（２）の多価架橋試薬を使用するヒドロゲルの調製
４×４ヒドロゲルを調製するために、ＰＥＧ２０ｋＤａ（ＤＢＣＯ）４（実施例２４；２５０μＬ、２．５μｍｏｌのＤＢＣＯ末端基）の５０ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ＤＭＦ中フルオレセイン−アジド浸食プローブの１０ｍＭ溶液２５μＬ（実施例２６；０．２５μｍｏｌのアジド）と混合し、周囲温度で３０分間保持した。一定分量５０μＬ（０．４２μｍｏｌのＤＢＣＯ）を、ｐＨ５．０の１０ｍＭのＮａＯＡｃ２８μＬと混合し、その後５０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０ｋＤａ（リンカー−アジド）４４２μＬ（実施例２３；０．４２μｍｏｌのアジド）と混合した。成分をボルテックスすることによって混合し、手短に遠心分離処理して、任意の気泡を除去し、シラン処理したガラス顕微鏡スライド上に載せた６４μＬ（９×１ｍｍ）の円形ゴム灌流チャンバ（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）に、迅速にピペッティングし、一晩硬化させた。
【０１９８】
４×８ヒドロゲルの調製を、ＰＥＧ２０ｋＤａ（ＤＢＣＯ）４の代わりにＰＥＧ４０ｋＤａ（ＤＢＣＯ）８又はＰＥＧ４０ｋＤａ（ＢＣＮ）８（実施例２４）の溶液を使用して同じ方法に従って実施し、８分岐シクロオクチンと４分岐リンカー−アジドモノマーの比率を調整して、所望のｗｔ％の全ＰＥＧ及び架橋度を有するゲルを得た。
【実施例２８】
【０１９９】
逆ゲル化時間の測定
ゲルディスク（実施例２７）を、３７℃の緩衝液に懸濁させ、溶液のＯＤ４９３を周期的に測定して、フルオレセインの可溶化をモニタした。逆ゲル化時間（ｔＲＧＥＬ）は、ゲルが完全に可溶化した時間とした。ゲル化時間のｐＨ依存度を、ｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ１＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３である式（２）の化合物を使用して架橋したＰＥＧ２０ｋＤａ（ＤＢＣＯ）４から調製した４×４ゲル（重量５％の全ＰＥＧ）を使用して測定した。ゲルディスクを、ｐＨ７．８〜９．０の緩衝液に懸濁させた。脱ゲル化曲線を、以下の測定時間と共に図５に示す。ｐＨ７．８＝２０．９時間、ｐＨ８．１＝１０．９時間、ｐＨ８．４＝５．６時間、ｐＨ８．７＝２．８時間及びｐＨ９．０＝１．５時間。図６に示されている通り、脱ゲル化時間は、ｐＨと共に線形的に変わり、ｐＨがそれぞれ１単位低下すると１０倍延長する。
【０２００】
脱ゲル化時間に対するリンカーの調節因子Ｒ１の効果を、ｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３であり、Ｒ１が、（４−クロロフェニル）ＳＯ２、フェニル−ＳＯ２、モルホリノ−ＳＯ２又はＣＮのいずれかである式（２）の化合物を使用して架橋したＰＥＧ２０ｋＤａ（ＤＢＣＯ）４からヒドロゲルディスクを調製することによって決定した。調節因子をもたない（Ｒ１Ｒ２ＣＨが存在しない）対照ゲルを調製した。ｐＨ７．４、３７℃のＫＰｉに懸濁させたディスクの脱ゲル化曲線を、図３に示す。図４に示されている通り、参照によって本明細書に組み込まれる、５−（アミノアセトアミド）フルオレセインの放出によって決定されるリンカー切断の半減期と（Ｓａｎｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１２年）１０９：６２１１〜６２１６頁参照）、対応するヒドロゲルの脱ゲル化時間との間には、線形相関がある。
【実施例２９】
【０２０１】
ヒドロゲルからの薬物放出の制御
ヒドロゲルをＰＥＧ４０ｋＤａ−（ＤＢＣＯ）８から調製した。この場合、シクロオクチンの一部を、少量のアジド浸食プローブ及び式（３）のアジド−リンカー−薬物［リンカーは、調節基Ｒ１を含んでいた］とまず反応させ、次にｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３であり、Ｒ１が、（４−クロロフェニル）ＳＯ２、フェニル−ＳＯ２、モルホリノ−ＳＯ２又はＣＮのいずれかである式（２）の化合物を使用して架橋した。薬物放出が、ヒドロゲルの浸食及びその後の脱ゲル化よりも急速に生じ得るように、式（３）のアジド−リンカー−薬物の調節基及び式（２）の化合物を選択した。
【０２０２】
一例では、５−（アセトアミド）フルオレセイン（ＡＡＦ）を薬物代替物として使用して、ゲルを調製した。式（３）のＲ１調節基を、下記の通り変更した。従って、１００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ４０ｋＤａ−（ＤＢＣＯ）８５０μＬ（１．０μｍｏｌのＤＢＣＯ末端基）を含有する水溶液（９９．６μＬ）を、１：１ＤＭＦ：アセトニトリル中、１２．５ｍＭのアジド−リンカー−ＡＡＦ（０．０７８μｍｏｌ）６．２μＬ（リンカーは、様々な調節因子の１つを含んでいた）、浸食プローブとしての、アセトニトリル中１．０ｍＭのＢＯＤＩＰＹ−アジド（０．０１５μｍｏｌ）１５μＬ、過剰のシクロオクチンをキャップするための、水中２０ｍＭのＯ−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール（０．４０μｍｏｌ）２０μＬ、及び水８．４μＬと混合した。周囲温度で１０分後、関与しなかった０．５μｍｏｌのＤＢＣＯ基を含有する溶液を、ｐＨ５．０の１０ｍＭのＮａＯＡｃ中、Ｒ１＝ＣＨ３−ＳＯ２である式（２）の化合物（０．５μｍｏｌのアジド基）の５０ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬと混合した。
【０２０３】
二重キャストゲルを、ｐＨ７．４、３７℃の０．１ＭのＨＥＰＥＳに懸濁させ、溶液中のフルオレセインのＯＤ４９３及びＢＯＤＩＰＹのＯＤ５４６を周期的に測定した。式３のＲ１が様々な基である場合のフルオレセインの放出時間を、図７に示した通り測定した。ＢＯＤＩＰＹ浸食プローブの完全な可溶化によって決定された逆ゲル化時間は、６３０±３９（Ｓ．Ｄ．）時間（ｎ＝８）であった。フルオレセインの可溶化は、一次速度則［Ｆ］ｔ／Ｆｔｏｔ＝ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｄｔ）に従い、放出された全フルオレセインについての見掛けのｋｏｂｓｄ±Ｓ．Ｅ．は、Ｒ１＝４−ＣｌＰｈ−ＳＯ２−では０．０２１±０．０００１４時間−１、Ｒ１＝Ｐｈ−ＳＯ２−では０．０１１±０．０００３１時間−１、Ｒ１＝４−ＭｅＯ−Ｐｈ−ＳＯ２−では０．００５３±０．０００２２時間−１、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２−では０．００３３±０．０００１０時間−１であった。速度データを、等式Ｓ６（実施例３０）を使用してゲルから直接放出されたフルオレセインに対するプロットに変換した。
【０２０４】
薬物放出のｐＨ依存度を、ｐＨ７．４〜ｐＨ９．０でＲ１＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２を使用して調製した先のゲルからのＡＡＦ放出を観測することによって決定した。図８及び９に示されている通り、薬物放出速度は、ｐＨの上昇に伴って増大する。
【実施例３０】
【０２０５】
薬物放出及びゲル浸食のモデル化
薬物放出及びゲル分解は、以下の通り生じ、最終生成物は、遊離薬物及びゲルモノマーである。
（ゲル）−（薬物）ｎ→薬物＋ＥＰ−ゲル断片−薬物→薬物＋ＥＰ−モノマー
【０２０６】
溶液への薬物又は薬物代替物の放出は、Ｌ１がゲルから切断されることによって直接的に、又はＬ２の切断によるゲルの浸食から生じる可溶化断片から、生じ得る。薬物が、無傷ゲルから放出されたか、可溶化ゲル断片から放出されたかを区別するために、時間ｔにおける無傷ゲルと溶液の間の薬物担持結節部の分布を決定する必要がある。本発明の研究では、ゲル分解をモニタしモデル化するための、報告済みの手法を改変したものを使用した（２）。ゲルの結節部に恒久的に結合する浸食プローブＥＰの出現により、溶液中の結節部の割合をＥＰ（ｔ）／Ｅ∞として算出することができる。従って、これらの可溶化結節部の上に元々存在する薬物の濃度Ｄｓ（ｔ）は、等式Ｓ１によって与えられる。
Ｄｓ（ｔ）＝Ｄ∞＊ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞又は（Ｄ∞／ＥＰ∞）＊ＥＰ（ｔ）［Ｓ１］
【０２０７】
時間ｔにおいて無傷ゲルから放出された薬物Ｄｇ（ｔ）は、等式Ｓ２に示す通り、放出された全薬物Ｄ（ｔ）と、可溶化ゲル断片に含有されているか、又はそれから放出される薬物Ｄｓ（ｔ）との差分である。
Ｄｇ（ｔ）＝Ｄ（ｔ）−Ｄｓ（ｔ）＝Ｄ（ｔ）−（Ｄ∞／ＥＰ∞）＊ＥＰ（ｔ）［Ｓ２］
【０２０８】
無傷ゲル結節部からの薬物放出の一次速度の算出は、浸食によってゲルの量が変化することに起因して、Ｄ（ｔ）の測定からは直接得られないが、無傷ゲル上の残りの薬物の割合に基づいて算出することができる。放出された浸食プローブＥＰ（ｔ）に基づくと、残りのゲルの割合は、１−ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞になる。従って、この量のゲルによって元々担持されていた薬物の量は、Ｄ∞＊（１−ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞）によって与えられる。無傷ゲル上の残りの薬物は、Ｄ∞−Ｄ（ｔ）なので、無傷ゲル上の残りの薬物の割合Ｄｆ，ｇｅｌ（ｔ）は、等式Ｓ３〜Ｓ４として与えられる。
Ｄｆ，ｇｅｌ（ｔ）＝［Ｄ∞−Ｄ（ｔ）］／［Ｄ∞＊（１−ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞）］［Ｓ３］
＝［１−Ｄ（ｔ）／Ｄ∞］／［１−ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞］［Ｓ４］
【０２０９】
ゲルからの薬物の一次放出については、Ｄｆ，ｇｅｌ（ｔ）によって、無傷ゲルからの薬物放出速度を説明する速度定数ｋＬ１を有する指数関数的減衰、等式Ｓ５が示される。等式Ｓ４及びＳ５を統合するとＳ６が得られ、これを使用すると、無傷ゲルからの直接的な薬物放出の速度を実験的に推定することができる。
Ｄｆ，ｇｅｌ（ｔ）＝ｅ−ｋＬ１ｔ［Ｓ５］
Ｄｆ，ｇｅｌ（ｔ）＝［１−Ｄ（ｔ）／Ｄ∞］／［１−ＥＰ（ｔ）／ＥＰ∞］＝ｅ−ｋＬ１ｔ［Ｓ６］
【０２１０】
経時的にゲルから放出される薬物の量は、ゲルの浸食速度と一緒に、放出速度ｋＬ１によって決まる。浸食プローブの可溶化が、速度ｋｓｏｌの時間ｔ＝０とｔ１の間の一次過程で近似できる場合、その時間の間にゲルから放出される薬物の量を、等式Ｓ７と近似することができる。
Ｄｇ（ｔ１）＝Ｄ∞＊（ｋＬ１／（ｋｓｏｌ））＊［１−ｅ−（ｋｓｏｌ）ｔ１］［Ｓ７］
【０２１１】
無傷ゲル上の残りの薬物が、時間ｔ１で無視できる場合、ゲルから直接放出される薬物の全ての割合は、等式Ｓ８で与えられる。
Ｄｇ（ｔ１）／Ｄ∞＝ｋＬ１／ｋｓｏｌ＝ｔ１／２，ｓｏｌ／ｔ１／２．Ｌ１［Ｓ８］
【実施例３１】
【０２１２】
脱ゲル化時間に対する架橋密度の効果
表２に詳説した通り、水中１００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ４０ｋＤａ−（ＢＣＮ）８（２０ｍＭのＢＣＮ末端基）の混合物を、水中適量の１０ｍＭのフルオレセイン−アジド及びｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３、Ｒ１＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２である式（２）の化合物（１０ｍＭのアジド）、及び水中５０ｍＭのＯ−アジドエチル−ヘプタエチレングリコールと組み合わせて、８分岐ＰＥＧモノマー１個当たり４、５、６、７又は７．８個の架橋を有する４％ＰＥＧヒドロゲルを調製した。キャストゲルを、ｐＨ９．２の０．１Ｍホウ酸塩１ｍＬに入れ、３７℃で保持した。ゲルの溶解を、上清中のＯＤ４９３の出現によってモニタした。
【０２１３】
【表２】
2019031498.tif 000041
【０２１４】
ゲルは、ｐＨ９．２では表２に示した脱ゲル化時間で、ｐＨ７．４では実施例２８で決定された通り、（ｐＨ９．２における脱ゲル化時間）＊１０（９．２−７．４）として算出される脱ゲル化時間で溶解した。予想通り、脱ゲル化時間は、それぞれの８分岐モノマーとの架橋数が増大するにつれて延長した。
【実施例３２】
【０２１５】
エキセナチドを放出する分解性ヒドロゲルの調製
調節因子としてＲ１＝ＭｅＳＯ２−を有するアジド−リンカーにα−末端で連結したエキセナチドを、既に記載した通りＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）で固相ペプチド合成によって合成し（Ｓａｎｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１２年）１０９：６２１１〜６２１６頁）、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、ｍ＝０、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３、Ｙ＝ＮＨ、Ｄ＝Ｎ−末端アミノ基を介して連結したエキセナチドである式（３）の化合物を得た。ｐＨ７．８の１．０Ｍリン酸３０μＬ中アジド−リンカー−エキセナチド（１．２ｍｇ、２７０ｎｍｏｌ）、及び水５０μＬ中８分岐ＰＥＧ４０ｋＤ−（ＢＣＮ）８（実施例２４；５ｍｇ；５０μＬ、１０００ｎｍｏｌのＢＣＮ基）を、周囲温度で１時間保持し、次に浸食プローブとしてのＡＣＮ中１ｍＭのＢＯＤＩＰＹ−アジド（２０ｎｍｏｌ）２０μＬ、及び水７１中、ｍ＝０、ｎ＝約１００、ｓ＝０、ｔ＝４、Ｗ＝Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｑ＝Ｃ（ＣＨ２）４、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３、Ｒ１＝ＣＮ（３．５５ｍｇ；７１０ｎｍｏｌのＮ３基；実施例２３）である式（２）の架橋剤を添加した。ゲルを一晩硬化させ、次にｐＨ７．４のＰＢＳ１ｍＬ中、４℃で保存した。
【実施例３３】
【０２１６】
エキセナチドを放出する分解性ヒドロゲルからのエキセナチドの放出
ゲルディスク（実施例３２）を、ｐＨ８．８の０．１Ｍホウ酸塩緩衝液１．０ｍＬに入れ、３７℃で保持した。エキセナチド（遊離ペプチドとして、又は可溶化ゲル−エキセナチド断片のいずれかとして）の可溶化及びゲル浸食を、上清を周期的にサンプリングすることによって、それぞれ２８０ｎｍ及び５４４ｎｍでモニタした。これらの結果を、図１０に示す。放出を、ゲル浸食に応じて調整される可溶化として算出した。エキセナチドの可溶化は、ｐＨ８．８でｔ１／２＝２０．７時間の一次過程であったが、これは、その反応が水酸化物イオンに関して一次であるものと想定され、ｐＨ７．４では５２０時間（２１日）の半減期に相当する。ゲルから直接放出された薬物（実施例３０）は、全エキセナチドの約８７．８％を占めており、ｐＨ８．８で２３．６時間のｔ１／２と算出され、これは、ｐＨ７．４では５９３時間（２４．７日）に相当する。逆ゲル化は、ｐＨ８．８では１７２時間目に観測され、これは、ｐＨ７．４では約１８０日目に相当していた。
【実施例３４】
【０２１７】
ヒドロゲルからの封入タンパク質の拡散
約９０ＯＤ２８０／ｍＬのミオグロビン（１７．７ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９．０ｋＤａ）及びＢＳＡ（６６．４ｋＤａ）の原液を、ｐＨ７．４の０．１ＭのＫＰｉ中で調製した。１００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０ｋＤａ−（ＮＨＣＯ２（ＣＨ２）６Ｎ３）４（５０ｕＬ）を、１００ｍｇ／ｍＬの２０ｋＤａのＰＥＧ−（ＤＢＣＯ）４（５０μＬ）、タンパク質原液（５０μＬ）及び１０×−ＰＢＳ（１００μＬ）の混合物に添加することによって、ＰＥＧヒドロゲル（４％）を調製した。キャストゲルを、ｐＨ７．４、３７℃の０．１ＭのＫＰｉ２ｍＬに懸濁し、溶液中のＯＤ２８０を周期的に測定した。溶液への放出についてのｔ１／２値は、ミオグロビンでは約２０分間、炭酸脱水酵素では２４分間、ＢＳＡでは１５０分間であった。
【実施例３５】
【０２１８】
誘導体化ヒアルロン酸の調製
ｍｗ＝１．６×１０６のヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；１０．４ｍｇ、０．０２７５ｍｍｏｌのカルボキシラート）を、ｐＨ５．５の０．１ＭのＭＥＳ緩衝液１．０５ｍＬ中、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩化物（ＤＭＴＭＭ；３０．４ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、４当量）の溶液で処理した。得られた混合物を１５分間激しく振とうして溶解させた。ＭＥＳ緩衝液０．３ｍＬ中、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ；２：１ＡＣＮ：ＭｅＯＨ中０．１１３ｍＬの２４．３ｍＭ、０．００２７５ｍｍｏｌ、０．１当量）の溶液を添加した。得られた混合物を２４時間静置し、次に以下の通り３．５時間及び２４時間目にＴＮＢＳアッセイを実施することによって、遊離アミンの消費について分析した。反応混合物０．０５ｍＬを、０．００４％ｗ／ｖの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸及び２５％メタノールを含有する０．０７５Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．３４）中で１ｍｌまで希釈した。４２０ｎｍにおける反応物の吸光度を、安定になるまで追跡調査した（約１時間）。ある量のＤＭＴＭＭ、ヒアルロン酸又はＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２を含有する場合の反応を、対照として使用した。反応が完了したら、反応混合物を水８ｍＬで希釈し、水に対して５回、次にメタノールに対して１回透析した（１２０００〜１４０００ＭＷＣＯ）。透析した生成物を減圧下で濃縮乾固させ、高真空下によりＰ２Ｏ５上で乾燥させて、ＤＢＣＯ−ヒアルロン酸（１１ｍｇ、約０．０２９ｍｍｏｌの二糖）を透明なガラス状の乾燥固体として得た。この材料を、水３ｍＬに溶解させて、０．２７６ｍＭのＤＢＣＯを含有する（ε３０９＝１３，４４８Ｍ−１ｃｍ−１に基づく、わずかに脂肪分の多い非常に粘性の高い溶液を得た。これは、置換度２．９％に相当する（ＴＮＢＳアッセイで消費されたアミンに対して５．３％）。異なる分子量のヒアルロン酸を、この方法に従って、ＤＩＦＯ又はＢＣＮなどのシクロオクチン試薬で誘導体化することができる。
【０２１９】
アミン誘導体化ヒアルロン酸を、以下の方法に従って調製した。ＭＷ＝７６，０００のヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；１５４ｍｇ、０．３８５ｍｍｏｌの二糖／カルボキシラート）の水（４ｍＬ）溶液に、１，３−ジアミノプロパン（０．９７３ｍＬ、８５６ｍｇ、１１．６ｍｍｏｌ、３０当量）を添加した。得られた溶液のｐＨを、６ＮのＨＣｌ（最終体積は約７ｍＬ）で７．０に調整し、次に固体Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し（１７７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、４当量）、その後、固体１−（３−ジメチルアミノ）プロピル−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ塩（２９４ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応が進行するにつれて、酸性になった（１０分後にｐＨ５．３）。安定になるまで、１０分毎にｐＨを調整して７．２に戻した（約１時間）。１８時間撹拌した後、混合物を、ＰＢＳに対して、５％ＮａＣｌに対して、水に対して２回、次にメタノールに対して透析した（１２〜１４ｋ  ＭＷＣＯ）。混合物を濃縮乾固させて、プロピルアミノ−ヒアルロン酸８５ｍｇを白色固体として得た。一定分量のこの材料（７．４ｍｇ、約０．０１９ｍｍｏｌの二糖）を、水（０．５ｍＬ）に溶解して、約３８ｍＭの二糖溶液を得た。この溶液（０．０２５ｍＬ）を、ＴＮＢＳアッセイにより０．０２％ｗ／ｖのＴＮＢＳを含有するｐＨ９．３６のホウ酸塩緩衝液（１ｍＬ）中でインキュベートすることによって、遊離アミン含量について評価した。４２０ｎｍにおける吸光度を、安定になるまでモニタした（約１時間）。アッセイでは、７％の置換度が示された。
【０２２０】
ｍｗ＝１．６×１０６の７％ＤＳプロピルアミノＨＡ（０．６４ｍＭのＮＨ２０．５ｍＬ、３２０ｎｍｏｌのＮＨ２）の水溶液に、１００ｍＭのＰＢＳ０．１ｍＬを添加し、その後、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ；ε３０９＝１３，４４９Ｍ−１ｃｍ−１で決定して０．０３０８ｍＬの２５ｍＭ、７７０ｎｍｏｌ、２．４当量）のメタノール溶液を添加した。得られた混合物を４時間静置した。ＴＮＢＳアッセイでは、誘導体化ヒアルロン酸上の利用可能なアミンの８１％が喪失したことが示された。１．２当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルを使用する並発反応によって、利用可能なアミンの６４％が消費された。精製のために、２つの反応物を組み合わせ、ＰＢＳに対して、次に５％ｗ／ｖのＮａＣｌに対して、次に水に対して２回、次にメタノールに対して１回透析した（１２〜１４ｋ  ＭＷＣＯ）。透析混合物を濃縮乾固させて、白色ガラス状固体２．６ｍｇを得た。この材料を、水１ｍＬに溶解して、ε３０９＝１３，４４８Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて６．５ｍＭの二糖及び０．３１ｍＭのＤＢＣＯの溶液を得たが、これは、ＤＢＣＯ置換度４．８％及びアシル化収率７１％に相当する。
【実施例３６】
【０２２１】
ヒアルロン酸ヒドロゲルの調製
シクロオクチン誘導体化ヒアルロン酸（実施例３５）を、ｍ＝０、Ｘ＝Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、Ｒ１＝ＰｈＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、一方のＲ５＝Ｈ、他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３である式（１）のジアジド架橋剤で架橋することによって、ヒアルロン酸ヒドロゲルを調製する。ゲルの形成は、典型的には、場合によっては封入されるタンパク質又は低分子溶液の存在下で、２：１モル比のシクロオクチンとジアジド架橋剤を使用して、水又は緩衝水中で実施される。
【０２２２】
ヒアルロン酸ヒドロゲルマトリックスからのタンパク質の拡散を研究するために、ＤＢＣＯ−ＨＡ（実施例３５）、６．６％ＤＳ  ＤＢＣＯ、３．９ｍＭのＤＢＣＯ）の水溶液（０．０６５ｍＬ）を、ＭＷ＝２０００又は５０００のいずれかのジアジド−ＰＥＧの溶液（０．００５ｍＬの２５ｍＭ、０．５当量／ＤＢＣＯ）と混合することによって、安定なヒドロゲルを調製した。このヒドロゲルマスターミックス０．０７ｍＬを直ちに、標準の２．５ｍＬのプラスチック製キュベットの底部で封入用のタンパク質又は低分子基質溶液（０．０１ｍＬ）と混合した。ゲルからの拡散半減期を、以下の表３に示す。
【０２２３】
【表３】
2019031498.tif 000042
【０２２４】
あるいは、薬物は、先の実施例２９及び実施例３２に記載の通り、利用可能なシクロオクチンのサブセットをアジド−リンカー−薬物と反応させることによって、ゲルが形成される前に、ヒアルロン酸に放出可能に連結させることができる。この場合、ゲルの形成に使用されるジアジド架橋剤の量は、薬物が結合した後に残る利用可能なシクロオクチンに基づいて算出される。ＲＤ＝（４−クロロフェニル）ＳＯ２のリンカーを介する５−（アミノアセトアミド）フルオレセインの結合によって、ヒアルロン酸ヒドロゲルが得られ、これは、ｐＨ７．４、３７℃においてｔ１／２＝４９時間でＡＡＦを放出した。
【実施例３７】
【０２２５】
化学量が制御されたヒドロゲルを調製する方法
図１１に図示した通り、市販のＳ−ｔ−ブチルチオ−システイン（Ｈ  Ｃｙｓ（ｔＢｕＳ））を、シクロオクチンスクシンイミジルエステル（例えば、ＤＢＣＯ−ＨＳＥ又はＢＣＮ−ＨＳＥ）でアシル化して、ＣＯ−Ｃｙｓ（ｔＢｕＳ）ＯＨ（Ａ’＝ＣＯＯＨ；Ｂ＝シクロオクチン；Ｃ＝ｔＢｕＳ）を得る。４分岐アミノＰＥＧ（Ａ＝ＮＨ２）を、このＣＯ−Ｃｙｓ（ｔＢｕＳ）ＯＨでアシル化して（例えば、カルボジイミドを使用する）、ＣＯ／ｔＢｕＳ官能化ＰＥＧを得る。アジド−リンカー（Ｒ１１）−薬物を、シクロオクチン残基に結合させ、次に例えばジチオトレイトールなどのチオール又はＴＣＥＰなどのホスフィンを使用してｔＢｕＳ基を除去し、チオール誘導体化ＰＥＧから小さいチオールを精製し（例えば、透析又はゲル濾過クロマトグラフィーを使用して）、シクロオクチン−マレイミド、シクロオクチン−ハロアセトアミド又はシクロオクチン−ビニルスルホンアミドと反応させて、分子１個当たり正確に４つのシクロオクチンゲル化部位を導入する。次に、この中間体を、反応性官能基がアジドである式（１）又は（２）の化合物を使用して架橋して、ヒドロゲルを形成する。あるいは、チオール誘導体化ＰＥＧ（シクロオクチン−マレイミドと反応する前）は、反応性官能基がＭｉｃｈａｅｌ受容体、又はアルキル化剤、例えばマレイミド、ビニルスルホン、ビニルスルホンアミド、アクリラート、アクリルアミド、ハロアセタートもしくはハロアセトアミドである式（１）又は（２）の化合物で重合することもできる。Ｓ−ｔ−ブチルチオ−システイン以外の直交的に保護されたアダプター、例えば適切に保護されたリシン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸、又はアミノ酸ベースではない合成アダプターも同様に使用することができる。
以下、本発明の参考形態の一例を付記する。
＜１＞
少なくとも一つの第１の反応性ポリマーを、切断可能な架橋剤化合物と反応させるステップを含む、生分解性ヒドロゲルを調製する方法であって、
ここで、前記切断可能な架橋剤化合物が、前記反応性ポリマーと反応する第１の官能基と、生理的条件下で脱離によって切断される部分とを含み、ここで、前記部分が、反応性ポリマーと反応する第２の官能基を含む方法。
＜２＞
前記切断可能な架橋剤化合物が、式（１）で表される化合物である、＜１＞に記載の方法
【化１】
2019031498.tif 000043
ここで、
ｍは、０又は１であり、
Ｘは、生理的条件下で脱離可能な反応性ポリマーに結合することができる官能基と、前記第２の官能基であるＺ２とを含み、
ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の少なくとも１つは、ポリマーに結合することができる前記第１の官能基であるＺ１を含み、
Ｒ１及びＲ２の一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方又は両方は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３； 
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
＜３＞
Ｘが、スクシンイミジルカルボナート、スルホスクシンイミジルカルボナート、ニトロフェニルカルボナート、クロロホルマート、フルオロホルマート、又は、以下の化合物である、＜２＞に記載の方法：
【化２】
2019031498.tif 000044
ここで、Ｔ＊は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６であり、ここで、Ｒ６は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり、ｚは１〜６であり、Ｙは、存在しないか、又はＯＲ７もしくはＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン、又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基である。
＜４＞
Ｚ１及びＺ２が、独立して、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート又はアクリルアミドを含む、＜３＞に記載の方法であって、ここで、一方のＺがＮ３を含む場合、他方はアルキン又はシクロオクチンのいずれも含まず；一方のＺがＳＨを含む場合、他方はマレイミド、アクリラート又はアクリルアミドのいずれも含まず；一方のＺがＮＨ２を含む場合、他方はＣＯ２Ｈを含まず；一方のＺが１，３−ジエン又はシクロペンタジエンを含む場合、他方はフランを含まない方法。
＜５＞
前記切断可能なリンカー化合物が、次式で表される、＜１＞に記載の方法
【化３】
2019031498.tif 000045
ここで、
ｍは、０又は１であり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化４】
2019031498.tif 000046
であり、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の少なくとも１つは、ポリマーに結合することができる官能基であるＺ１を含み、
少なくとも一方又は両方のＲ１及びＲ２は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されて
いてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
あるいは、Ｒ１及びＲ２の一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
＜６＞
Ｚ１が、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート又はアクリルアミドを含む、＜５＞に記載の方法。
＜７＞
Ｚ１が、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート又はアクリルアミドを含む、＜２＞に記載の方法。
＜８＞
各Ｚ１及びＺ２が、独立して、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート又はアクリルアミドを含む、＜３＞に記載の方法。
＜９＞
第１のポリマー、及び任意の第２のポリマーが、適切な反応性官能基をそれらの天然状態で含むか、もしくは適切な反応性官能基を含むように誘導体化されている、ホモポリマー又はコポリマーのポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメタクリラート、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリアクリルアミド、ポリグリコラート、ポリエチレンイミン、アガロース、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリリシン、キトサン、アルギナート、ヒアルロナン、ペクチン又はカラゲニンからなる群から選択されるか、あるいは、式［Ｚ３−（ＣＨ２）ｓ（ＣＨ２ＣＨ
２Ｏ）ｎ］ｔＱである、請求項１に記載の方法であって、ここで、Ｚ３は、反応性官能基であり、ｎは、１０〜１０００であり、ｓ、Ｑ及びｔは、＜５＞に定義されている通りである。
＜１０＞
第１の反応性ポリマー及び第２の反応性ポリマーを、前記切断可能な架橋剤化合物と逐次的又は同時に反応させる、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞
第１の官能基及び第２の官能基が同じである、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の方法によって生成されるヒドロゲル。
＜１３＞
薬物をさらに含む、＜１２＞に記載のヒドロゲル。
＜１４＞
薬物が、式（３）の残基に含有されている、＜１３＞に記載のヒドロゲル
【化５】
2019031498.tif 000047
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも１つは、ポリマーに連結するための第１の官能基を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びｍは、＜２＞に定義されている通りであり、
Ｄは、薬物の残基であり、
Ｙは、ＮＨ又はＮＢＣＨ２であり、ここでＢは、Ｈ、置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
＜１５＞
脱離反応によって分解されるリンカーによって架橋された１つ以上のポリマーを含む、生理的条件下で生分解可能なヒドロゲル。
＜１６＞
リンカーが、ポリマー内に配置される場合、式（１）の残基である、＜１３＞に記載のヒドロゲル
【化６】
2019031498.tif 000048
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも１つは、Ｘと同様に、前記１つ以上のポリマーに結合しており、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ及びＸは、＜２＞に定義されている通りである。
＜１７＞
前記リンカーが、式（２）の残基である、＜１５＞に記載のヒドロゲル
【化７】
2019031498.tif 000049
ここで、前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも２つは、前記１つ以上のポリマーに結合しており、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍは、請求項２に定義されている通りであり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、１６又は３２であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化８】
2019031498.tif 000050
である。
＜１８＞
薬物をさらに含む、＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
＜１９＞
式（３）の残基を含む、＜１８＞に記載のヒドロゲル
【化９】
2019031498.tif 000051
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５の少なくとも１つは、ポリマーに連結するための第１の官能基を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びｍは、＜２＞に定義されている通りであり、
Ｄは、薬物の残基であり、
Ｙは、ＮＨ又はＮＢＣＨ２であり、ここでＢは、Ｈ、置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
＜２０＞
ポリマーが、式［Ｚ３−（ＣＨ２）ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｔＱである、請求項１６又は１７に記載のヒドロゲルであって、ここで、Ｚ３は、反応性官能基であり、ｎは１０〜１０００であり、ｓ、Ｑ及びｔは、＜５＞に定義されている通りであるヒドロゲル。
＜２１＞
式（４）で表される架橋化合物
【化１０】
2019031498.tif 000052
ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の少なくとも１つは、ポリマーに結合することができる第１の官能基Ｚ１をさらに含み、
ｍは、０又は１であり、
Ｒ６は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、又は置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり、
ｖは、１〜６であり、
Ｙは、存在しないか、又はＯＲ７もしくはＳＲ７であり、ここで、Ｒ７は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいフェニレン、又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ｐ＝１〜１０００）であり、
Ｚ２は、反応性ポリマーと結合することができる官能基であり、
少なくとも一方又は両方のＲ１及びＲ２は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルであり、
Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
あるいは、Ｒ１及びＲ２の一方及び一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
＜２２＞
各Ｚ１及びＺ２が、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート、ビニルスルホン、ビニルスルホンアミド又はアクリルアミドを含む、＜２１＞に記載の化合物であって、ここで、一方のＺがＮ３を含む場合、他方のＺはアルキン又はシクロオクチンのいずれも含まず；一方のＺがＳＨを含む場合、他方のＺはマレイミド、アクリラート又はアクリルアミドのいずれも含まず；一方のＺがＮＨ２を含む場合、他方のＺはＣＯ２Ｈを含まず；一方のＺが１，３−ジエン又はシクロ
ペンタジエンを含む場合、他方のＺはフランを含まない化合物。
＜２３＞
式（２）で表される架橋化合物
【化１１】
2019031498.tif 000053
ここで、Ｒ１、Ｒ２及び／又はＲ５の少なくとも２つは、ポリマーに結合することができる官能基Ｚをさらに含み、
ｍは、０又は１であり、
ｎは、１〜１０００であり、
ｓは、０〜２であり、
ｔは、２、４、８、９、１６又は３２であり、
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化１２】
2019031498.tif 000054
であり、
Ｑは、価数＝ｔを有するコア基であり、
少なくとも一方又は両方のＲ１及びＲ２は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のＲ９基は、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成している）、
ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである）で
あり、
Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
あるいは、Ｒ１及びＲ２の一方及び一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
＜２４＞
Ｚ１が、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＯ２ｔＢｕ、ＳＨ、ＳｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ｔＢｕ、１，３−ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリラート、アクリルアミド、ビニルスルホン又はビニルスルホンアミドを含む、＜２３＞に記載の化合物。
＜２５＞
Ｑが、ペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール又はヘキサグリセリンである、＜２３＞に記載の化合物。
＜２６＞
薬物放出分解性ヒドロゲルを調製する方法であって、
（ａ）反応性官能基を含む第１の多価ポリマーを、サブ化学量論的量の下記式（３）で表されるリンカー−薬物と反応させて、薬物を負荷した第１のポリマーを形成するステップと
【化１３】
2019031498.tif 000055
ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５の１つは、第１のポリマー上に存在する反応性官能基と反応性がある基で置換されており、
ｍは、０又は１であり、
Ｄは、薬物の残基であり、
Ｙは、Ｏ、ＮＨ又はＮＢＣＨ２であり、ここでＢは、Ｈ、置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり、
少なくとも一方又は両方のＲ１及びＲ２は、独立して、ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである）であり、
Ｒ１及びＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく、
あるいは、Ｒ１及びＲ２の一方及び一方のみは、Ｈであってよく、又は置換されていてもよい、アルキル、アリールアルキルもしくはヘテロアリールアルキルであってよく、
各Ｒ５は、独立して、Ｈであるか、又は置換されていてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ−アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである、
（ｂ）必要に応じて、薬物を負荷した第１のポリマーを単離するステップと、
（ｃ）薬物を負荷した第１のポリマー上の残りの反応性官能基を、式（１）又は式（２）の切断可能な架橋化合物で架橋して、ヒドロゲルを形成するステップとを含む方法。
＜２７＞
＜２６＞に記載の方法によって調製された、薬物放出分解性ヒドロゲル。
＜２８＞
第１のポリマー上の反応性官能基が、シクロオクチンであり、式（１）、（２）及び（３）の化合物上の反応性官能基が、アジドである、＜２７＞に記載の薬物放出分解性ヒドロゲル。
＜２９＞
Ｄがエキセナチドである、＜２７＞に記載の薬物放出分解性ヒドロゲル。
＜３０＞
第１のポリマーが、各アーム末端にシクロオクチン基を含む、８分岐ポリエチレングリコールであり、
式（３）のリンカー−薬物が、下記式で表される、＜２７＞に記載の薬物放出分解性ヒドロゲル：
【化１４】
2019031498.tif 000056
ここで、Ｒ１＝ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである
＜３１＞
切断可能な架橋化合物が、式（２）で表される化合物、＜３０＞に記載のヒドロゲル。
＜３２＞
前記式（２）において、ｍが０であり、ｎが９０〜１１０であり、ｓが０であり、ｔが４であり、ＷがＯ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨであり、ＱがＣ（ＣＨ２）４であり、Ｒ１がＣＮであり、Ｒ２及びＲ５の一方がＨであり、他方のＲ５が（ＣＨ２）５Ｎ３である、＜３１＞に記載のヒドロゲル。
＜３３＞
前記式（３）において、Ｒ１が、ＳＯ２Ｒ３であり、
ここで、Ｒ３が、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９が、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成している、＜３２＞に記載のヒドロゲル。
＜３４＞
前記式（３）におけるＲ１が、ＭｅＳＯ２である、＜３３＞に記載のヒドロゲル。
＜３５＞
式［Ｚ３−（ＣＨ２）ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｔＱで表される多分岐ポリマー（ここで、Ｚ３は、反応性官能基であり、ｎは１０〜１０００であり、ｓ、Ｑ及びｔは、請求項５に定義されている通りである）が、下記式（３）で表されるリンカー−薬物を結合させた式（１）又は式（２）の切断可能な架橋化合物によって架橋されている、薬物放出分解性ヒドロゲル：
【化１５】
2019031498.tif 000057
ここで、Ｒ１＝ＣＮ、ＮＯ２、
置換されていてもよいアリール、
置換されていてもよいヘテロアリール、
置換されていてもよいアルケニル、
置換されていてもよいアルキニル、
ＣＯＲ３又はＳＯＲ３又はＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９は、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成し、
又は、ＳＲ４であり、
ここで、Ｒ４は、置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、又は
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキルである。
＜３６＞
切断可能な架橋化合物が、前記式（２）で表される化合物である、＜３５＞に記載のヒドロゲル。
＜３７＞
前記式（２）において、ｍが０であり、ｎが９０〜１１０であり、ｓが０であり、ｔが４であり、ＷがＯ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨであり、ＱがＣ（ＣＨ２）４であり、Ｒ１がＣＮであり、Ｒ２及びＲ５の一方がＨであり、他方のＲ５が（ＣＨ２）５Ｎ３である、＜３６＞に記載のヒドロゲル。
＜３８＞
前記式（３）において、Ｒ１が、ＳＯ２Ｒ３であり、ここで
Ｒ３が、Ｈ、又は置換されていてもよいアルキル、
置換されていてもよい、アリールもしくはアリールアルキル、
置換されていてもよい、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールアルキル、又は
ＯＲ９もしくはＮＲ９２であり、ここで各Ｒ９が、独立して、Ｈもしくは置換されていてもよいアルキルであるか、又は両方のＲ９基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって複素環を形成している、＜３５＞〜＜３７＞のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
＜３９＞
前記式（３）におけるＲ１が、ＭｅＳＯ２である、＜３８＞に記載のヒドロゲル。
【図１】
2019031498.tif 000068
【図２】
2019031498.tif 000069
【図３】
2019031498.tif 000070
【図４】
2019031498.tif 000071
【図５】
2019031498.tif 000072
【図６】
2019031498.tif 000073
【図７】
2019031498.tif 000074
【図８】
2019031498.tif 000075
【図９】
2019031498.tif 000076
【図１０】
2019031498.tif 000077
【図１１】
2019031498.tif 000078
【配列表】
2019031498000001.app