(57)【要約】【課題】ケラチノサイトからのＶＥＧＦ産生を促進する物質を探索し、当該物質を唇の色味及び質感の改善を目的とするための外用組成物として提供する。【解決手段】クレマティスの抽出物を有効成分として含有するＶＥＧＦ産生促進剤、及び該産生促進剤を含む唇用外用組成物を提供する。本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、ケラチノサイトによる血管やリンパ管形成に関与するＶＥＧＦの産生を促進することで、唇の色味及び質感を改善するための唇用外用組成物として、医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレマティスの抽出物を含有することを特徴とするＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項２】
ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ｂ及び／又はＶＥＧＦ−Ｄであることを特徴とする請求項１記載のＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＶＥＧＦ産生促進剤を含む唇用外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）の産生を促進し得るＶＥＧＦ産生促進剤、及び該産生促進剤を含む唇用外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞に特異的に作用する増殖因子である。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞の増殖をはじめとした血管新生過程の促進、血管透過性の亢進作用を有することから、創傷治癒、肌色改善等の分野で注目されている。正常な皮膚において、ＶＥＧＦは主にケラチノサイトから産生され、真皮の血管内皮細胞に局在する受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２等）に結合し、血管新生を誘導する。又、ＶＥＧＦＲ−３等に結合し、リンパ管新生を誘導する。
【０００３】
炎症或いは創傷治癒時に肥厚した表皮におけるＶＥＧＦは非常に高く発現しており、真皮での血管増加と栄養供給を導いていることが知られている（非特許文献１）。従って、真皮での血管増加と栄養供給に関与しているＶＥＧＦの産生を促進することは、創傷の回復や治癒に有効であるし、皮膚のくすみや肌の透明感の低下といった肌色改善や唇の赤み改善に有効であると考えられる。
【０００４】
唇は顔の印象に大きく影響を及ぼす部位であり、赤みのあるいきいきとした唇の色味及び質感が求められている。皮膚は、外側から表皮、真皮、皮下組織から成り、唇の皮膚も同様ではあるが、他の部位の皮膚と組織学的に相違している。即ち、唇は表皮の角質層が極端に薄く、皮脂腺や汗腺が存在しないために乾燥しやすく、物理的、化学的、環境的要因によって影響を受けやすい。
【０００５】
唇の色味及び質感の低下の原因は、加齢による血行不良、紫外線や摩擦による色素沈着、糖化による黄ぐすみ等が挙げられる。唇の表皮は薄いため、下部に存在する毛細血管の影響を直接受けやすく、血行が悪い等の状態で唇の赤みが大きく左右される。従って、加齢による血管機能の低下を予防、改善することは、唇の色味及び質感の低下改善にとって大切なことである。
【０００６】
このため、これまでに様々なＶＥＧＦ産生促進剤が開発されている。例えば、シクロアルタン型トリテルペノイド配糖体（特許文献１）、アロエエキス（特許文献２）、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス  Ｈ−６１株の発酵代謝物（特許文献３）等にＶＥＧＦ産生促進作用があることが報告されている。しかしながら、これらのＶＥＧＦ産生促進剤は、有効性、安定性、安全性等の点で実用上十分に満足できるものではなかった。
【０００７】
クレマティスはキンポウゲ科センニンソウ属に属する植物であり、これまでクレマティスの抽出物に、アクアポリン産生増強作用（特許文献４）、痩身作用（特許文献５）、シワ改善作用（特許文献６）等の薬効があることが知られている。しかしながら、ケラチノサイトに対するＶＥＧＦ産生促進効果については、これまで何ら知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−０１２３５５
【特許文献２】特開２０１３−１４４６５０
【特許文献３】特開２０１６−１１７６８３
【特許文献４】特開２０１３−０８７０５８
【特許文献５】特開平１０−２６５３５８
【特許文献６】特開２０００−０６３２６１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ，Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．，２４（Ｓｕｐｐｌ  １），Ｓ７８−Ｓ８４（２０００）
【非特許文献２】高橋知子，東北医科薬科大学研究誌，６３，１５−２０（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＶＥＧＦの産生を促進する物質を探索し、唇の色味及び質感を改善するための唇用外用組成物として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、クレマティスの抽出物が、ケラチノサイトにおけるＶＥＧＦの産生を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）クレマティスの抽出物を含有することを特徴とするＶＥＧＦ産生促進剤。
（２）ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ｂ及び／又はＶＥＧＦ−Ｄであることを特徴とする（１）記載のＶＥＧＦ産生促進剤。
（３）（１）又は（２）記載のＶＥＧＦ産生促進剤を含む唇用外用組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、ケラチノサイトによるＶＥＧＦの産生を促進することで、唇の色味及び質感を改善するための唇用外用組成物として利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明について詳細に述べる。
【００１５】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、クレマティスの抽出物を含有することを特徴とする。「クレマティス」は、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、センニンソウ属（Ｃｌｅｍａｔｉｓ）の植物：クレマティス（Ｃｌｅｍａｔｉｓ  ｖｉｔａｌｂａ）、Ｃｌｅｍａｔｉｓ  ｈｙｂｒｉｄｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ  ａｌｐｉｎａ、ボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ  ａｐｉｉｆｏｌｉａ）、センニンソウ（Ｃｌｅｍａｔｉｓ  ｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）で、多年草である。北半球の各地に存在し、草丈は２０〜３００ｃｍと幅広く、白、赤、黄、黒色等の花を咲かせる。古くからガーデンプランツとして親しまれており、イギリスではつる性植物の女王として位置づけられている。
【００１６】
本発明において、クレマティスの抽出物は、全草或いは花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子等の植物体の一部又はそれらの混合物の抽出物をいうが、全草や葉の抽出物が好ましい。又、抽出には、これらの植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。
【００１７】
抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、又は水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌又はカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類等を用いることができるが、エタノール、メタノール、アセトン等の水溶性有機溶媒が好ましく、これらの一種又は二種以上を用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、又は水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば、上記クレマティスの葉（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。又、抽出温度や時間は用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で３０分〜２４時間、より好ましくは１〜１０時間を例示することができる。又、抽出物は抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００１８】
本発明における「ＶＥＧＦ産生促進」とは、生体レベル又は培養レベルでケラチノサイトによるＶＥＧＦの産生を促進させることをいう。
【００１９】
本発明における「ＶＥＧＦ」には、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ等のアイソフォームが存在する（非特許文献２）。ＶＥＧＦ−Ａは受容体ＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２に結合して血管新生を誘導する。ＶＥＧＦ−Ｂは受容体ＶＥＧＦＲ−１に結合して血管新生を誘導する。ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄは受容体ＶＥＧＦＲ−２に結合して血管新生を、受容体ＶＥＧＦＲ−３に結合してリンパ管新生を誘導する。
【００２０】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、ケラチノサイトの性質を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物のケラチノサイトに対して効果を発揮することができる。
【００２１】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物と共に皮膚外用組成物に含有して提供することが好ましい。本発明の皮膚外用組成物には、医薬品、医薬部外品、化粧品等が含まれる。好ましくは、唇用の外用組成物が良い。
【００２２】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、血管新生やリンパ管新生の誘導を促進することができるので、当該物質を含む唇用外用組成物は、唇の色味及び質感を改善するのに有効である。
【００２３】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を医薬品に含有する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容し得る添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容し得る添加物としては、その剤形、用途に応じて賦形剤、増粘剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、分散剤、乳化剤、ゲル化剤、色素、香料等を用いることができる。本発明の医薬品に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤等が挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤であり、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。
【００２４】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を外用組成物に含有する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、又は水−油−粉末三層系等のいずれでも良い。又、当該医薬部外品や化粧品は、ＶＥＧＦ産生促進剤と共に、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜含有し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであっても良い。含有成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α−ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。
【００２５】
本発明の唇用外用組成物におけるＶＥＧＦ産生促進剤の含有量は、ケラチノサイトからＶＥＧＦの産生促進作用が発揮できる量である限り特に限定はされないが、例えば、クレマティス抽出物の乾燥固形物重量として０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましい。上記の量はあくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果、及びコスト等を考慮して適宜設定・調製すれば良い。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
（製造例１）クレマティス１，３−ブチレングリコール抽出物の調製
クレマティスの全草２０ｇに１，３−ブチレングリコール２００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、クレマティス１，３−ブチレングリコール抽出物を１４１ｇ得た。クレマティス抽出物の乾燥固形物重量としては、約０．７ｇであった。
【００２８】
（製造例２）クレマティス熱水抽出物の調製
クレマティスの全草５０ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してクレマティス熱水抽出物を３．３ｇ得た。
【００２９】
（製造例３）クレマティス５０％エタノール抽出物の調製
クレマティスの葉５０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、クレマティス５０％エタノール抽出物を２．８ｇ得た。
【００３０】
（製造例４）クレマティスエタノール抽出物の調製
クレマティスの葉５０ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、クレマティスエタノール抽出物を３．１ｇ得た。
【００３１】
（実験例１）老化誘導による血管新生誘導因子（ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ）遺伝子の発現変化
コンフルエントになったヒトケラチノサイト由来細胞であるＨａＣａＴに老化誘導試薬である５−ｂｒｏｍｏ−２−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ、シグマ）を最終濃度が３、１０及び３０μＭとなるように添加し、４日間培養した後、ＲＮＡｉｓｏ  ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用い、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ用のプライマーは以下に示すものを用いた。内部標準として、β−アクチンを用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるβ−アクチン  ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００３２】
ＶＥＧＦ−Ｂ用のプライマーセット
ＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴ（配列番号１）
ＧＣＧＣＧＡＧＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴ（配列番号２）
ＶＥＧＦ−Ｄ用のプライマーセット
ＧＴＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＴ（配列番号３）
ＴＡＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣ（配列番号４）
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号５）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号６）
【００３３】
その結果を表１に示す。ケラチノサイトにＢｒｄＵを添加して老化誘導すると、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡの発現量が減少した。従って、老化誘導により、ケラチノサイトから放出される血管新生誘導因子が減少することで、血管の能力が低下することが示された。
【００３４】
【表１】
2019189534.tif 000002
【００３５】
（実験例２）クレマティスが血管新生誘導因子（ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ）遺伝子の発現に及ぼす効果
コンフルエントになったヒトケラチノサイト由来細胞であるＨａＣａＴにクレマティス１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例１）を最終濃度が０．１、１及び１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地にて２４時間培養した後、ＲＮＡｉｓｏ  ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。以下のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は、実験例１と同様に行った。
【００３６】
その結果を表２に示す。ケラチノサイトにクレマティス１，３−ブチレングリコール抽出物を添加すると、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡの発現量が増加した。従って、クレマティスの抽出物は優れた血管新生促進効果を示した。特に、クレマティス１，３−ブチレングリコール抽出物により、ＶＥＧＦ−Ｄが顕著に増加した。製造例２〜４も同様に試験を行い、いずれも優れたＶＥＧＦ産生促進効果が認められた。
【００３７】
【表２】
2019189534.tif 000003
【００３８】
（処方例）製品の処方例
以下に示す処方例に従い、製造例１〜４で製造したクレマティスの抽出物を含有したリップエッセンス、リップクリーム、リクイドリップクリームを常法により調製した。
【００３９】
処方例１  リップエッセンス
成分                                                          含有量（重量％）
１．グリセリン                                                    ５．０
２．１，３−ブチレングリコール                                    ５．０
３．精製水                                                        残量
４．カルボキシメチルセルロース                                    ０．５
５．ヒドロキシプロピルメチルセルロース                            ０．５
６．水酸化カリウム                                                ０．５
７．セスキオレイン酸ソルビタン                                    ０．５
８．モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）    １．５
９．流動パラフィン                                                ５．０
１０．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．３
１１．フェノキシエタノール                                          ０．０１
１２．製造例１〜４のクレマティス抽出物                              ０．３
【００４０】
処方例２  リップクリーム
成分                                                          含有量（重量％）
１．ポリエチレンワックス                                          １．５
２．パラフィンワックス                                            ９．０
３．マイクロクリスタリンワックス                                  ３．０
４．カルナウバロウ                                                ３．０
５．パルミチン酸デキストリン                                      ０．２５
６．流動パラフィン                                              １０．０
７．トリイソステアリン酸ポリグリセリル−２                        残量
８．製造例１〜４のクレマティス抽出物                              ０．０５
【００４１】
処方例３  リクイドリップクリーム
成分                                                          含有量（重量％）
１．ポリエチレンワックス                                          ２．０
２．マイクロクリスタリンワックス                                  ５．０
３．カルナウバロウ                                                ０．５
４．ステアリン酸イヌリン                                          ０．１
５．ミリスチン酸デキストリン                                      ０．０５
６．重質流動イソパラフィン                                      ３５．０
７．リンゴ酸ジイソステアリル                                    １０．０
８．トリイソステアリン酸ポリグリセリル−２                        残量
９．製造例１〜４のクレマティス抽出物                              ０．１
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、唇の色味及び質感の改善を目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。
【配列表】
2019189534000001.app