(57)【要約】【課題】比較的簡便かつ安価に製造することができ、かつ難治性の前立腺がんに対しても抗がん効果を発揮する低分子化合物を有効成分とする、前立腺がんの予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】フルフェナジン若しくはその医薬的に許容される塩、又はそれらの医薬的に許容されるエステルを、前立腺がん（好ましくは、浸潤性前立腺がん又は転移性前立腺がん）の予防又は治療剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルフェナジン若しくはその医薬的に許容される塩、又はそれらの医薬的に許容されるエステルを含むことを特徴とする前立腺がんの予防又は治療剤。
【請求項２】
経口投与されることを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんであることを特徴とする請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前立腺がんが、浸潤性前立腺がん又は転移性前立腺がんであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
抗がん剤と併用されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
抗がん剤がドセタキセルであることを特徴とする請求項５に記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルフェナジン（Fluphenazine）若しくはその医薬的に許容される塩、又はそれらの医薬的に許容されるエステル（以下、これらを総称して「フルフェナジン類」ということがある）を含む、前立腺がんを予防及び／又は治療するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは、男性の生殖器の一つである前立腺で発症するがんであり、欧米、特に米国では男性で最も多いがんである。前立腺がんは、動物脂肪の摂取量の多い食生活や、高齢が関連していると考えられている。実際に、日本でも食生活の欧米化や高齢化に伴い、近年、前立腺がんの罹患数が急速に増加しており、例えば、２０１３年の部位別癌罹患数において前立腺がんは第４位であった。前立腺がんは７０歳以降になると罹患率が飛躍的に増加することから、日本をはじめ高齢化の進む先進諸国において今後さらなる増加が予想される。このため、前立腺がんに対する効果的な治療方法の開発が求められている。
【０００３】
前立腺がんの治療方法として、臨床的には外科的治療、ホルモン療法、化学療法、放射線治療等が知られている。このうち、第一選択は、前立腺摘出術をはじめとする外科的治療であるが、進行がんと診断された場合や、外科的治療後の再発等により手術が困難な場合は、ホルモン療法等の治療方法や、ドセタキセル等の抗がん剤による化学療法が選択される。
【０００４】
前立腺がんの増殖は、男性ホルモンであるアンドロゲンによって刺激され、その発生や進行には、アンドロゲン受容体（androgen receptor；ＡＲ）が大きな役割を果たしていることが知られている。このため、前立腺がんのホルモン療法（内分泌療法）として、アンドロゲンの作用を抑制する方法（アンドロゲン遮断療法［Androgen Deprivation Therapy；ＡＤＴ］）が一般的である。ＡＤＴは一時的には有効ではあるが、通常、数年以内には、ＡＤＴに抵抗性を示すホルモン不応性前立腺がん（Hormone Refractory Prostate Cancer；ＨＲＰＣ）やアンドロゲン非依存性前立腺がん（Androgen Independent Prostate Cancer；ＡＩＰＣ）へと進展していく。このように進展した去勢抵抗性前立腺がん（Castration Resistant Prostate Cancer；ＣＲＰＣ）（「再燃性進行前立腺がん」ともいう）は難治性であり、根治的という意味で有効な治療法は存在しない。そのため、前立腺がんが去勢抵抗性にならないようにするとともに、その転移を予防することが重要であるが、それらのことは実現できていないのが現状である。
【０００５】
最近、ＡＲと結合又は協調する転写共役因子を標的とする薬剤（特許文献１）や、２'−ヒドロキシフラバノン（特許文献２）がＣＲＰＣの治療に有効であることが報告されている。
【０００６】
一方、フルフェナジン二マレイン酸塩を有効成分とするフルメジン（田辺三菱製薬社製）は、精神神経安定剤として市販されている。しかしながら、フルフェナジンが、前立腺がんの予防又は治療効果を有することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１７−１７１６４１号公報
【特許文献２】特開２０１５−１９９６９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、比較的簡便かつ安価に製造することができ、かつ難治性の前立腺がんに対しても抗がん効果を発揮する低分子化合物を有効成分とする、前立腺がんの予防又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める過程において、Gene Expression Omnibus（ＧＥＯ）に蓄積されている前立腺がん患者検体のマイクロアレイデータを基に、限局性前立腺がんから、転移性前立腺がんへの遺伝子発現プロファイルの変化率を解析した。次いで、かかる変化率と、臨床上使用可能な化合物のライブラリーによる遺伝子発現プロファイルの変化率との比較・検証を、米国ブロード研究所（Broad Institute）のConnectivity map（ＣＭＡＰ）解析を応用して行い、転移性前立腺がん患者の遺伝子発現プロファイルを、限局性前立腺がん患者の遺伝子発現プロファイルへ変化し得る７７種の化合物を、前立腺がんの候補薬剤としてスクリーニングの結果見出した。そして、これら７７種の前立腺がんの候補薬剤について、転移性ＣＲＰＣ細胞株を用いたインビトロやインビボによる解析を行ったところ、細胞の増殖抑制効果や浸潤抑制効果が認められない化合物も多数あったが、試行錯誤の末に、フルフェナジンは、転移性ＣＲＰＣに対して、既存の抗がん薬（ドセタキセル）よりも、高い増殖抑制効果や浸潤抑制効果を有することを見出した。さらに、フルフェナジンは、既存の抗がん剤（ドセタキセル）と併用することにより、転移性ＣＲＰＣに対する抗がん効果をさらに高めることも確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕フルフェナジン若しくはその医薬的に許容される塩、又はそれらの医薬的に許容されるエステルを含むことを特徴とする前立腺がんの予防又は治療剤。
〔２〕経口投与されることを特徴とする上記〔１〕に記載の予防又は治療剤。
〔３〕前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の予防又は治療剤。
〔４〕前立腺がんが、浸潤性前立腺がん又は転移性前立腺がんであることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
〔５〕抗がん剤と併用されることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
〔６〕抗がん剤がドセタキセルであることを特徴とする上記〔５〕に記載の予防又は治療剤。
【００１１】
また本発明の実施の他の形態として、フルフェナジン類を、前立腺がんの予防又は治療を必要とする対象に投与するステップを含む、前立腺がんを予防又は治療する方法；や、前立腺がんの予防又は治療剤として使用するためのフルフェナジン類；や、前立腺がんの予防又は治療における使用のためのフルフェナジン類；や、前立腺がんの予防又は治療剤を製造するための、フルフェナジン類の使用；を挙げることができる。なお、本発明の前立腺がんの予防又は治療剤は、前立腺がんの予防又は治療のための医薬組成物として用いることができる。
【発明の効果】
【００１２】
フルフェナジン類は、前立腺がん、特に難治性の前立腺がんである転移性ＣＲＰＣに対して、細胞増殖抑制効果及び浸潤抑制効果を有する。また、これらの効果は、既存の抗がん剤と併用することにより、さらに高めることもできる。また、本発明の前立腺がんの予防又は治療剤は、比較的簡便に製造できる低分子化合物であるフルフェナジン類を、前立腺がんの予防又は治療の有効成分とするため、比較的簡便かつ安価に製造できる点でも優れている。さらに、フルフェナジン類を低濃度で使用すると、細胞増殖に影響を及ぼすことなく前立腺がん細胞の浸潤を抑制することができるため、副作用が少ない転移性前立腺がんの予防又は治療剤の開発が十分期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、転移性ＣＲＰＣ細胞株であるＰＣ３細胞株を、フルフェナジンやドセタキセル存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。図１Ｂは、転移性ＣＲＰＣ細胞株であるＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジンやドセタキセル存在下で培養したときの生細胞レベルを解析した結果を示す図である。図中の「Ｆ０」、「Ｆ１」、及び「Ｆ１０」は、それぞれ培養液中のフルフェナジン濃度が、０μＭ、１μＭ、及び１０μＭであることを示し、「Ｄ０」、「Ｄ１」、及び「Ｄ１０」は、それぞれ培養液中のドセタキセル濃度が、０μＭ、１μＭ、及び１０μＭであることを示す。縦軸の「生細胞レベル」は、フルフェナジン及びドセタキセルの非存在下で培養したときの生細胞数（図中の「Ｆ０／Ｄ０」）を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）があることを示す。
【図２】ＰＣ３細胞株を用いて作製した皮下腫瘍モデルマウスの４群（対照群、Ｆｌｕ投与群、Ｄｏｃ投与群、及び「Ｆｌｕ＋Ｄｏｃ投与群」）について、腫瘍体積の変化を解析した結果を示す図である。縦軸の「腫瘍体積」は、投与直後（０日）の対照群における腫瘍体積を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を示す。横軸の「日数」は、フルフェナジンやドセタキセルを投与後の日数を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）があることを示す。
【図３】ＤＵ１４５細胞株を用いて作製した皮下腫瘍モデルマウスの上記４群について、腫瘍体積の変化を解析した結果を示す図である。縦軸の「腫瘍体積」は、投与直後（０日）の対照群における腫瘍体積を１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を示す。横軸の「日数」は、フルフェナジンやドセタキセルを投与後の日数を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）があることを示す。
【図４】図４Ａは、ＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン存在下（０．１  Ｆｌｕ処理群）又は非存在下（対照群）で培養したときの細胞浸潤性を解析した結果を示す図である。図４Ｂは、ＤＵ１４５細胞株を、ドセタキセル存在下（１．０  ＤＯＣ処理群）又は非存在下（対照群）で培養したときの細胞浸潤性を解析した結果を示す図である。縦軸の細胞指数（Cell index；ＣＩ）は、細胞浸潤レベル（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を示し、値が高いほど細胞浸潤レベルが高いことを示す。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．００１）があることを示し、図中の「ｎｓ」は、統計学的に有意差がないことを示す。
【図５】図５Ａ及びＢは、それぞれＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、１μＭのフルフェナジン（１Ｆｌｕ処理群）若しくは１０μＭのフルフェナジン（１０Ｆｌｕ処理群）存在下、又はフルフェナジン非存在下（対照群）で培養したときの４種類の因子（ネスチン［Nestin］、「Zinc finger protein SNAI1」、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」、及びビメンチン［Vimentin］）をコードする遺伝子（それぞれ、ＮＥＳ遺伝子、ＳＮＡＩ１遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＶＩＭ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「ｍＲＮＡの発現レベル」は、各種遺伝子について、対照群における発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］）として示す。
【図６】ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、１μＭのフルフェナジン（ＦＬＵ）若しくは１０μＭのフルフェナジン存在下、又はフルフェナジン非存在下で培養したときの４種類の因子（ネスチン、ＯＰＧ［Osteoprotegerin］、ＫＩＦＣ２、及びβアクチン［ＡＣＴＢ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の前立腺がんの予防又は治療剤は、「前立腺がんを予防又は治療するため」という用途が限定されたフルフェナジン類を含有する製剤（以下、「本件予防／治療剤」ということがある）であり、ここで前立腺がんの予防には、前立腺がんの発症予防の他、前立腺がんの症状悪化の予防も含まれる。本件予防／治療剤は、単独で医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（医薬組成物）として使用してもよい。
【００１５】
予防又は治療対象である前立腺がんとしては、悪性腫瘍（がん）が発生した臓器が前立腺であるがんであればよく、限局性前立腺がん、浸潤性前立腺がん、又は転移性前立腺がんを挙げることができ、後述する本実施例において、フルフェナジン類による前立腺がん増殖抑制効果に加えて、前立腺がん浸潤抑制効果が示されているため、浸潤性前立腺がん又は転移性前立腺がんが好ましい。また、上記前立腺がんとしては、本実施例において、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）に対する抗がん効果が具体的に示されているため、ＣＲＰＣが好ましい。
【００１６】
本明細書において、「限局性前立腺がん」とは、未浸潤及び未転移の前立腺がん、すなわち、がんが前立腺以外の組織又は臓器には広がっておらず、前立腺の中にとどまった状態を意味し、ステージＡ〜Ｂの前立腺がんに相当する。また、本明細書において、「浸潤性前立腺がん」とは、がんが前立腺の周囲の組織や臓器（例えば、膀胱、直腸、精嚢）に浸潤した状態であって、かつ転移は認められない状態を意味し、ステージＣの前立腺がんに相当する。また、本明細書において、「転移性前立腺がん」とは、がんが転移、すなわち、がんが血管やリンパ管に入り込み、血液やリンパ液の流れによって前立腺から離れた組織又は臓器（例えば、リンパ節、骨［脊柱、骨盤骨等］、肝臓、肺）まで広がった状態を意味し、ステージＤの前立腺がんに相当する。
【００１７】
本明細書において、「ＣＲＰＣ」とは、外科的去勢又は薬物による去勢状態で、かつ血清テストステロンが５０ｎｇ／ｄＬ未満であるにもかかわらず、抗アンドロゲン剤の投与とは無関係に、病勢の増悪やＰＳＡ（Prostate Specific Antigen；前立腺特異的抗原）の上昇が認められる前立腺がんを意味する。すなわち、精巣からのアンドロゲン分泌を排除し、血中アンドロゲンが非常に低濃度であるにもかかわらず、前立腺がんが進行し、ＰＳＡ値が上昇する状態を意味する。
【００１８】
予防又は治療対象である「浸潤性前立腺がん」には、前立腺におけるがんの他、浸潤先の組織又は臓器におけるがんも便宜上含まれるが、前立腺におけるがんが好ましい。また、予防又は治療対象である「転移性前立腺がん」には、前立腺におけるがんの他、転移先の組織又は臓器におけるがんも便宜上含まれるが、前立腺におけるがんが好ましい。
【００１９】
本発明のフルフェナジンは、4-[3-[2-(Trifluoromethyl)-10H-phenothiazin-10-yl]propyl]-1-piperazineethanolであり、下記の式で表される化合物である。
【００２０】
【化１】
2019123671.tif 000002
【００２１】
上記フルフェナジン類におけるフルフェナジン又はその医薬的に許容されるエステルの塩としては、医薬的に許容されるものであればよく、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。
【００２２】
上記フルフェナジン類におけるフルフェナジン又はその医薬的に許容される塩のエステルとしては、医薬的に許容されるものであればよく、例えば、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、イソ酪酸エステル、ペンタン酸エステル、ヘキサン酸エステル、ヘプタン酸エステル、オクタン酸エステル、デカン酸エステル、ドデカン酸エステル、テトラデカン酸エステル、ヘキサデカン酸エステル、オクタデカン酸エステル、シュウ酸ジエステル、マロン酸ジエステル、コハク酸ジエステル、グルタル酸ジエステル、アジピン酸ジエステル、スベリン酸ジエステル、セバシン酸ジエステル等の炭素数１〜４０程度の飽和脂肪族カルボン酸のエステル；アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、クロトン酸エステル、オレイン酸エステル、マレイン酸ジエステル、フマル酸ジエステル等の炭素数３〜４０程度の不飽和脂肪族カルボン酸のエステル；などを挙げることができる。
【００２３】
前立腺がんに対する抗がん作用をより高めるために、本件予防／治療剤に加えて、抗がん剤を併用することが好ましい。本件予防／治療剤と併用する抗がん剤としては、がんの増殖（好ましくは、前立腺がんの増殖）を抑制することが知られている物質であればよく、例えば、シクロフォスファミド（Cyclophosphamide）、ダカルバジン（Dacarbazine）、クロラムブシル（Chlorambucil）、メトトレキサート（Methotrexate）、シタラビン（Cytarabine）、アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）、ブレオマイシン（Bleomycin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ビンクリスチン（Vincristine）、ビンブラスチン（Vinblastine）、シスプラチン（Cisplatin）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、カルボプラチン（Carboplatin）、イリノテカン（Irinotecan）、ストレプトゾトシン（Streptozocin）、パクリタキセル（Paclitaxel）、ドセタキセル（Docetaxel）、カバジタキセル（Cabazitaxel）、エトポシド（Etoposide）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、リツキシマブ（Rituximab）、ブレフェルジンＡ（Brefeldin A）、トラスツズマブ（Trastuzumab）、イマチニブ（Imatinib）、ペメトレキセド（Pemetrexed）、カペシタビン（Capecitabine）、ボルテゾミブ（Bortezomib）、リュープロレリン（Leuprorelin）、エルロチニブ（Erlotinib）、スニチニブ（Sunitinib）、セツキシマブ（Cetuximab）、ゴセレリン（Goserelin）、ダサチニブ（Dasatinib）、ソラフェニブ（Sorafenib）、５−フルオロウラシル（ＦＵ）等を挙げることができ、これらの中でも、後述する本実施例において、フルフェナジン類との併用効果が実証されているため、ドセタキセルが好ましい。
【００２４】
本件予防／治療剤は、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分がさらに添加されたものを例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００２５】
本件予防／治療剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射（例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射）、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができ、経口投与が好ましい。
【００２６】
本件予防／治療剤におけるフルフェナジン類の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定され、例えば、０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。後述する本実施例において、モデルマウスを用いた実験により、２．５ｍｇ／ｋｇ／日のフルフェナジン二マレイン酸塩の投与量が具体的に示されている。かかる投与量は、マウスにおけるヒト等価用量（ＨＥＤ）１２．３（資料「Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」参照）を基に、ヒトへの投与量に換算した場合、２０３μｇ／ｋｇ／日である。このため、本件予防／治療剤におけるフルフェナジン類の投与量としては、１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日が好ましく、１０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ／日がより好ましく、３０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日がさらに好ましく、６０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ／日がさらにより好ましく、１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日が最も好ましい。なお、本件予防／治療剤は、一日あたり単回又は複数回（例えば、２〜４回）に分けて投与してもよい。
【００２７】
本件予防／治療剤としては、フルフェナジン類以外にも、前立腺がんに対して抗がん作用（抗前立腺がん作用）を有する成分を含むものであってもよいが、フルフェナジン類単独でも抗前立腺がん作用を発揮するため、フルフェナジン類以外の抗前立腺がん作用成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、植物由来の抽出物、ポリマー）を含まないものであってもよい。
【００２８】
上記フルフェナジン類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、フルメジン（フルフェナジン二マレイン酸塩）（田辺三菱製薬社製）、フルフェナジン二マレイン酸塩（和光純薬工業社製）、フルデカシン（フルフェナジンデカン酸エステル）（田辺三菱製薬社製）等の市販品を挙げることができる。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
１．前立腺がんの候補薬剤のスクリーニング
ＧＥＯに蓄積されている前立腺がん患者検体のマイクロアレイデータを基に、限局性前立腺がんから、転移性前立腺がんへの遺伝子発現プロファイルの変化率を解析した。次いで、かかる変化率と、臨床上使用可能な化合物のライブラリーによる遺伝子発現プロファイルの変化率との比較・検証を、米国ブロード研究所のＣＭＡＰ解析を応用して行い、転移性前立腺がん患者の遺伝子発現プロファイルを、限局性前立腺がん患者の遺伝子発現プロファイルへ変化し得る７７種の化合物を、前立腺がんの候補薬剤としてスクリーニングした。その結果、かかる候補薬剤の１つに、フルフェナジンが含まれることが示された。
【実施例２】
【００３１】
２．前立腺がん細胞の細胞増殖性の解析
フルフェナジン類が、抗前立腺がん効果を有することを確認するために、転移性ＣＲＰＣ細胞株であるＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株をフルフェナジン類存在下で培養し、細胞増殖性を解析した。
【００３２】
［方法］
ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株（両細胞ともにＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］より入手）を、９６ウェルプレート上で２４時間培養した後、フルフェナジン二マレイン酸塩（和光純薬工業社製）を１μＭ又は１０μＭとなるように培養液に添加し（図１の「Ｆ１／Ｄ０」及び「Ｆ１０／Ｄ０」）、さらに２４時間培養した後、生細胞数を「Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System」（Takara Bio社製）を用いて測定した。また、コントロールとして、ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、前立腺がんの既存薬であるドセタキセル（和光純薬社製）が１μＭ又は１０μＭとなるように添加した培養液中（図１の「Ｆ０／Ｄ１」及び「Ｆ０／Ｄ１０」）や、１μＭ又は１０μＭのフルフェナジンと、１μＭ又は１０μＭのドセタキセルの両方を含む培養液中（図１の「Ｆ１／Ｄ１」、「Ｆ１／Ｄ１０」、「Ｆ１０／Ｄ１」、及び「Ｆ１０／Ｄ１０」）や、フルフェナジン及びドセタキセルの両方を含まない培養液中（図１の「Ｆ０／Ｄ０」）で培養した実験もあわせて行った。なお、以降の実施例も含めて、ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株の培養は、ＲＰＭＩ１６４０培養液中で５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で行った。
【００３３】
［結果］
ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン存在下で培養すると、フルフェナジン非存在下で培養した場合と比べ、濃度依存的に生細胞数が有意に減少することが示された（図１の「Ｆ１／Ｄ０」及び「Ｆ１０／Ｄ０」と、「Ｆ０／Ｄ０」との比較）。さらに、フルフェナジンとドセタキセルを併用すると、フルフェナジン単独で使用した場合と比べ、生細胞数の減少レベルが、さらに高まることが示された（図１の「Ｆ１／Ｄ１」、「Ｆ１／Ｄ１０」、「Ｆ１０／Ｄ１」、及び「Ｆ１０／Ｄ１０」と、「Ｆ１／Ｄ０」及び「Ｆ１０／Ｄ０」との比較）。
これらの結果は、フルフェナジン類が前立腺がん細胞の細胞増殖抑制効果を有することを示すとともに、フルフェナジン類を既存の抗がん剤と併用することにより、その効果はさらに向上することを示している。
【実施例３】
【００３４】
３．前立腺がん腫瘍の増殖性の解析
さらに、フルフェナジン類の抗前立腺がん効果を確認するために、ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株の皮下腫瘍モデルマウスに、フルフェナジン類を投与し、腫瘍体積の変化を解析した。
【００３５】
［方法］
１×１０６個のＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、それぞれ去勢したオスヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の皮下に接種し、皮下腫瘍モデルマウスを作製した。腫瘍の大きさが２００ｍｍ３前後に達したとき、皮下腫瘍モデルマウスを４種類の群（対照群、Ｆｌｕ投与群、Ｄｏｃ投与群、及び「Ｆｌｕ＋Ｄｏｃ投与群」）に分け、Ｆｌｕ投与群（ｎ＝６）には、２．５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のフルフェナジン二マレイン酸塩（和光純薬工業社製）を経口投与し、Ｄｏｃ投与群（ｎ＝６）には、５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のドセタキセル（和光純薬社製）を経口投与し、「Ｆｌｕ＋Ｄｏｃ投与群」（ｎ＝６）には、２．５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のフルフェナジン二マレイン酸塩を経口投与するとともに、５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日のドセタキセルを経腹膜的投与した。なお、対照群（ｎ＝６）には、フルフェナジン二マレイン酸塩及びドセタキセルのいずれも投与しなかった。経口投与直後（０日）、並びに経口投与４日後、８日後、１２日後、及び１６日後に、腫瘍体積を測定し、平均値を算出した。
【００３６】
［結果］
ＤＵ１４５細胞株の皮下腫瘍モデルマウス、及びＰＣ３細胞株の皮下腫瘍モデルマウスのいずれにおいても、Ｆｌｕ投与群における腫瘍体積は、対照群における腫瘍体積と比べ、減少することが示された（図２及び３参照）。また、Ｆｌｕ投与群における腫瘍体積の減少レベルは、Ｄｏｃ投与群における腫瘍体積の減少レベルと比べ、高いことも示された。さらに、「Ｆｌｕ＋Ｄｏｃ投与群」における腫瘍体積の減少レベルは、Ｆｌｕ投与群における腫瘍体積の減少レベルと比べ、高いことも示された。
これらの結果は、フルフェナジン類が、前立腺がん腫瘍に対して、既存の抗がん薬（ドセタキセル）よりも高い増殖抑制効果を有することを示すとともに、フルフェナジン類を既存の抗がん薬と併用すると、その効果はさらに向上することを示している。
【実施例４】
【００３７】
４．前立腺がん細胞の浸潤性の解析
さらに、フルフェナジン類の抗前立腺がん効果を確認するために、ＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン類存在下で培養し、これら細胞株の浸潤性を解析（Invasion assay）した。
【００３８】
［方法］
リアルタイム細胞アナライザーxCELLigence（ACEA Biosciences社製）の各ウェルに、０．１μＭのフルフェナジン含有培養液（０．１  Ｆｌｕ処理群）、１．０ｎＭのドセタキセル含有培養液（１．０  ＤＯＣ処理群）、又は、フルフェナジン及びドセタキセルのいずれも含まない培養液（対照群）を添加し、それぞれに４．０×１０４個のＤＵ１４５細胞株を添加した後培養し、マトリゲル基底膜マトリックス（Corning社製）を通過した細胞数を経時的（０〜３０時間）に計測した。なお、０．１μＭのフルフェナジンは、正常の細胞増殖に影響を及ぼすことがない濃度である。
【００３９】
［結果］
ＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン及びドセタキセルのいずれも含まない培養液中で培養すると、細胞が浸潤することが確認された（図４Ａ及びＢの「対照群」参照）。一方、ＤＵ１４５細胞株をドセタキセル含有培養液中で培養した場合、細胞の浸潤はほとんど抑制されなかったのに対して（図４Ｂの「１．０  ＤＯＣ処理群」）、フルフェナジン含有培養液中で培養すると、細胞の浸潤が効果的に抑制された（図４Ａの「０．１  Ｆｌｕ処理群」）。
この結果は、フルフェナジンが、既存の抗がん薬（ドセタキセル）よりも、前立腺がんの細胞浸潤を効果的に抑制する効果を有することを示すとともに、細胞増殖に影響を及ぼすことがない低濃度でもかかる効果が認められたことから、副作用が少ない転移性前立腺がんの予防又は治療剤の開発が十分期待される。
【実施例５】
【００４０】
５．遺伝子発現解析
フルフェナジン類の抗前立腺がん効果を裏付けるために、遺伝子発現解析を行った。
【００４１】
［方法：リアルタイプＰＣＲ法］
ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、１μＭ若しくは１０μＭのフルフェナジン含有培養液、又はフルフェナジン不含の培養液中に添加し、２４時間培養した後、ｍＲＮＡを、「RNeasy Mini kit」（Qiagen社製）を用いて抽出した。抽出したｍＲＮＡを、「PrimeScript RT reagent Kit」（Takara Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。４種類の因子（ネスチン、「Zinc finger protein SNAI1」、「Zinc finger E-box-binding homeobox 1」、及びビメンチン）をコードする遺伝子（それぞれ、ＮＥＳ遺伝子、ＳＮＡＩ１遺伝子、ＺＥＢ１遺伝子、及びＶＩＭ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表１に示すプライマー及びTaqManプローブセット（TaqMan Gene Expression Assays）（Applied Biosystems社製）と、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Bio-Rad社製）を用いて定量ＰＣＲ解析を行った。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
［方法：ウエスタンブロッティング法］
ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、１μＭ若しくは１０μＭのフルフェナジン含有培養液、又はフルフェナジン不含の培養液中に添加し、２４時間培養した後、ＲＩＰＡ細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、及びプロテアーゼインヒビター)を用いてタンパク質を抽出し、１ウェルあたり５０μｇのタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル中に電気泳動した後、ニトロセルロース膜へ転写した。タンパク質を転写したニトロセルロース膜を、３種類の因子（ネスチン、ＯＰＧ、及びＫＩＦＣ２）に対する抗体（抗ネスチン抗体［abcom社製］、抗ＯＰＧ抗体［NOBUS社製］、抗ＫＩＦＣ２抗体［Santa Cruz社製］）と、内部標準であるβアクチンに対する抗体（抗βアクチン抗体［SIGMA社製］）とを含む溶液中で室温で１時間インキュベートし、ペルオキシダーゼで標識した２次抗体（Dako社製）を含む溶液中で室温で１時間インキュベートした後、「ECL Plusウエスタンブロッティング検出システム」（Pierce Biotechnology社製）を用いて上記３種類の因子及びβアクチンを検出した。
【００４４】
［結果］
ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン存在下で培養すると、フルフェナジン非存在下で培養した場合と比べ、がんの悪性化や転移に関連するＮＥＳ遺伝子、転移制御のマスターレギュレーターであるＳＮＡＩ１遺伝子及びＺＥＢ１遺伝子、並びに間葉系マーカーであるＶＩＭ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が、フルフェナジンの濃度依存的に減少することが示された（図５参照）。
同様に、ＰＣ３細胞株及びＤＵ１４５細胞株を、フルフェナジン存在下で培養すると、フルフェナジン非存在下で培養した場合と比べ、がんの悪性化や転移に関連するネスチン、ＯＰＧ、及びＫＩＦＣ２の発現量が、フルフェナジンの濃度依存的に減少することが示された（図６参照）。
これらの結果により、フルフェナジン類の抗前立腺がん効果が、遺伝子レベルの解析からも裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、前立腺がん、特に難治性の前立腺がんの予防又は治療に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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