(57)【要約】【課題】  効果的なドラッグデリバリーを可能にする担体又は生体接触基材表面の修飾に用いることの材料の提供【解決手段】  無水マレイン酸とスチレンの共重合体であって、無水マレイン酸単位を介してポリ（エチレングリコール）鎖がグラフト鎖として、かつ、環状ニトロキシドラジカル、ホウ素含有化合物、ヨウ素含有化合物及びトリアルコキシシリルアルキルアミンから選ばれる作用化合物残基がペンダント基として共有結合した共重合体、並びにその使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）に表される各反復単位を含んでなる共重合体：
【化１】
2019123773.tif 000037
式中、
ｘ＋ｙは５〜１４００の整数であり、ｎは５〜１４００の整数であり、ｘ＋ｙ：ｎは１：１〜５の比率にあり、ｘ：ｙは１〜６０：１の比率にある。
（１）下付き記号ｙの付された反復単位において、Ｌ−ＰＥＧ−Ａ中、
Ｌは、Ｏ又はＮＨであり、ＰＥＧは次式で表され、
【化２】
2019123773.tif 000038
ここで、ｐは１〜６の整数であり、ｑは５〜５００の整数であり、
Ａは、  Ａ１：非置換若しくは置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基、又は
Ａ２：次式
【化３】
2019123773.tif 000039
で表される基を表し、当該反復単位は式（Ｉ）で表される共重合体の総単位の２％〜１５％を占める。
（２）下付き記号ｘの付された反復単位において、
（ａ）Ｒ１又はＲ２のいずれか一方は、
ａ１  ：次式
【化４】
2019123773.tif 000040
で表され、ここで、
ＴＥＭＰＯは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基；
ａ２：次式
【化５】
2019123773.tif 000041
のいずれかで表される残基；
ａ３：次式
【化６】
2019123773.tif 000042
のいずれかで表される残基；
ａ４：次式
【化７】
2019123773.tif 000043
で表され、ここで、Ｒ３はＣ１−３のアルキル基であり、ｒは２〜６の整数である、残基；
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はＯＨであり、又は
（ｂ）Ｒ１及びＲ２は、一緒になって−Ｏ−を表し、環式無水物残基を形成し、又は
（ｃ）Ｒ１及びＲ２は、各ＯＨを表す。
かつ、前記ｘの付された反復単位において、
（ｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基のみを含むか、
（ｉｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）及び（ｃ）を含む単位のいずれか１つが相互に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つを含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｉｉｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）を含む単位と（ｃ）を含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ
１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｉｖ）（ａ）を含む単位の中の、ａ４の残基を含む単位とａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）及び（ｃ）のいずれか１つを含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｖ）（ａ）を含む単位の中の、ａ４の残基を含む単位とａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）を含む単位と（ｃ）を含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占める。
【請求項２】
請求項１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ１の残基を含む単位である、共重合体。
【請求項３】
請求項１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ２の残基を含む単位である、共重合体。
【請求項４】
請求項１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ３の残基を含む単位である、共重合体。
【請求項５】
請求項１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ４の残基を含む単位である、共重合体。
【請求項６】
請求項１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ１の残基を含む単位とａ４の残基を含む単位である、共重合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載された共重合体であって、下付き記号ｙの付された反復単位において、Ｌ−ＰＥＧ−Ａ中のＡが、Ａ２の式
【化８】
2019123773.tif 000044
で表される基である、共重合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載された共重合体であって、ＴＥＭＰＯが、次式
【化９】
2019123773.tif 000045
上式中、Ｒ’はメチル基である、
で表されるいずれかの残基である、共重合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載された共重合体であって、水性媒体中で動的光散乱を測定すると、平均粒径がナノサイズにあるナノ粒子として存在する、共重合体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載された共重合体と塩化ベンザルコニウムを含んでなる複合体。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載された共重合体と抗癌剤含んでなる医療用組成物。
【請求項１２】
抗癌剤がパクリタキセル又はソラフェニブである請求項１１に記載の医療用組成物。
【請求項１３】
次式（ＩＩ）で表される共重合体。
【化１０】
2019123773.tif 000046
式中、
Ｒ１−１又はＲ２−１のいずれか一方は、
ａ１  ：次式
【化１１】
2019123773.tif 000047
で表され、ここで、
ＴＥＭＰＯは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基；
ａ２：次式
【化１２】
2019123773.tif 000048
のいずれかで表される残基；
ａ３：次式
【化１３】
2019123773.tif 000049
のいずれかで表される残基；
ａ４：次式
【化１４】
2019123773.tif 000050
で表され、ここで、Ｒ３はＣ１−３のアルキル基であり、ｒは２〜６の整数である、残基；
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はＯＨであり、式（ＩＩ）における環式無水物残基部分はｍ１の１０％まで加水分解され開環していてもよく、
そして
ｍ１＋ｍ２は、５〜１４００の整数であり、ｎは５〜１４００の整数であり、ｍ１＋ｍ２：ｎは１：１〜５の比率にある。
【請求項１４】
下付き記号ｍ２の付された反復単位において，Ｒ１−１又はＲ２−１のいずれか一方が、
ａ１  ：次式
【化１５】
2019123773.tif 000051
で表される請求項１３に記載の共重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾されたスチレン−無水マレイン酸共重合体及びその使用に関し、特に、ポリ（エチレングリコール）グラフト化スチレン−無水マレイン酸共重合体及びそのナノメディシン材料としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新薬の創出は、低分子有機化合物を中心とした合成物質から天然物やタンパク質へと移行してきており、まさに薬物ターゲットのパラダイムシフトが起こりつつある。しかし分子標的薬などのタンパク質や核酸を医薬に用いようとする場合、内在性の酵素による分解を受けるため、バイオアベイラビリティーが極めて短いだけでなく、その抗原性や腎臓からの排出など、様々な問題が避けられない。米国ラトガース（Ｒｕｔｇｅｒｓ）大学のＤａｖｉｓらはタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合させると言う奇抜なアイディアで、その抗原性の回避や滞留性の延長を示した（非特許文献１参照）。デリケートなタンパク質に合成高分子を共有結合させるという無謀とも言える試みではあるものの、初の高分子化薬物が誕生し、現在１０種以上のＰＥＧ化タンパク質が上市されている。しかしタンパク質とＰＥＧを直接反応させるため、著しい活性低下やコスト増大など問題が残る。
【０００３】
我が国では１９８６年、前田らが癌に高分子物質が受動的に集積するＥＰＲ効果を発見した（非特許文献２又は特許文献１参照）。すなわち固形癌組織内の血管は、その構造が正常組織内の血管に比べて粗雑で、低分子物質のみならず高分子物質も容易に血管から癌組織へ漏出する。癌組織内に漏れ出した低分子物質は拡散や毛細リンパ管によって回収されるのに対し、高分子は拡散性が乏しく、毛細リンパ系での回収が間に合わない。このため、長時間にわたり癌組織内に蓄積される。この結果、固形癌組織には、高分子物質が選択的に滞留・蓄積することになり、これがＥＰＲ効果と名付けられた。そこで前田らはポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体に抗癌剤、ネオカルシノスタチンを結合し、１９９３年に世界初の高分子型抗癌剤スマンクスとして認可・販売された。高分子化薬の腫瘍集積効果は確認されたものの、分散安定性が悪く、動脈からのカテーテル投与のみが認可され、普及には至らなかった。そうであっても、ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体を、その他の抗癌剤をはじめとする医薬化合物の担体として使用する多くの試みが行われてきた（例えば、パクリタキセルコンジュゲートに関する非特許文献３参照）。
【０００４】
長崎をはじめとする本発明者らは、高分子薬が低分子に比較して飛躍的にバイオアベイラビリティーが延長されることと体内臓器分布を著しく変化されることで、抗酸化ナノメディシンに関する開発を進めてきた（特許文献２参照）メディシンに関する開発を進めてきた（下記先行特許参照）。すなわち、酸素から誘導される過剰な活性酸素種（ＲＯＳ）は様々な疾病の原因となる。このような疾病に関与するＲＯＳを消去するため、ビタミンＣやＥなどの天然物や様々な合成抗酸化剤が開発され、検討されてきたものの、殆どすべての臨床結果で「良い」という結果が出たものはない。本発明者らはこれら低分子抗酸化剤が非特異的に体内に広がり、正常細胞のミトコンドリア内のレドックス反応を破壊し、副作用を誘引してしまうことに注目した。特許文献２の図１９に示す自己組織化ナノ粒子に抗酸化能を創り込み、正常な細胞やそのミトコンドリアに入り込むことなく、疾病に関与するＲＯＳを選択的に取り除く新しいナノメディシンの設計を進めてきた。その結果、例えば、高分子化抗酸化剤（ＴＥＭＰＯＬ）は産まれたばかりのゼブラフィッシュが低分子抗酸化剤（ＴＥＭＰＯＬ）で全滅する３ｍＭの１０倍高濃度条件でも、完全にミトコンドリアのダメージを抑制し、ほぼ１００％生存することを確認した（非特許文献４）。こ
のようにして従来の抗酸化剤の欠点を克服したＲＮＰはＲＯＳが関与する種々疾病に対し著しい治療効果を示すことを確認してきた。しかし、これまでのブロック共重合体による抗酸化ナノ粒子は合成に高真空条件を必要とし、合成にコストがかかる難点があった。また、リガンドの導入も難しく、粒子調製時に凝集しやすいなどの難点があった。これまでの低分子薬やタンパク薬と異なり、長いバイオアベイラビリティーと副作用を削減するためにはデザインが容易で非特異核酸を抑制し、安定に分散する材料を提供する材料が求められている。
【０００５】
前述の前田らが利用したポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体は古くから知られている合成高分子であり、その環式無水物残基が求核試薬と容易に反応するため、例えば、前記共重合体とＴＥＭＰＯＬ（４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）及び４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）の反応生成物とみられる生体または生体に由来する物質と接触する表面を改質するのに使用できることが示唆されている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＥＰ  ００８７９５７  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ２００９／１３３６４７  Ａ１
【特許文献３】特開２０１１−７８７０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，１０：２５２（１１）：３５８２−３５８６
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍａｅｄａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４６，６３８７−６３９２（１９８６）
【非特許文献３】ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１５，７，２６５３０−２６５４８
【非特許文献４】Ｖｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１３，９，３０９１（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（以下、ＰＳＭＡと略記する場合あり。）は表面の改質等に使用する場合にはあまり問題とはならないが、当該共重合体と生理活性物質、例えば抗癌剤、とのコンジュゲートは、前述したように医薬としてヒトに投与する場合には、分散安定性が悪い等の問題があった。なお、特許文献１には、当該ＰＳＭＡの無水マレイン酸単位由来の薬物のハーフエステル単位とポリエチレングリコールのハーフエステル単位を含む高分子化抗癌剤が概括的に記載されているものの、具体的には記載されていないことのみならず、概括的にも、それらがどのような性質を有するかについては何ら記載されていない。また、これらの高分子化抗癌剤は高分子骨格に共有結合等を介して固定されているため、薬効を発揮するには標的部位で薬物が高分子化抗癌剤からリリースされ必要がある。本発明者等は、特許文献２に記載されるようなブロック共重合体の開発に際して対処すべき重大な課題としてきた高分子化生理活性物質の生体内又は生体外の水性媒体での分散安定性を向上させることを、ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体を用いる際にも、改善すべき課題として設定した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の課題は、ＰＳＭＡに、ポリ（エチレングリコール）を含む水溶性高分子を導入（又はグラフト化）し、ＰＳＭＡに導入すべき薬物（１種以上）を選択すること等により
前田らのスマンクスにおいて問題のあった分散安定性を向上させることが可能であること、さらに抗癌剤等の薬物を高分子骨格に共有結合やイオン結合させることなく前記の特定の薬剤を共有結合せしめた薬剤修飾共重合体から形成されるミセル（ナノ粒子）に封入又は内包できることが確認できたことにより解決された。
【００１０】
したがって、本発明によれば、次の態様の発明が提供される。
態様１：次式（Ｉ）に表される各反復単位を含んでなる共重合体：
【００１１】
【化１】
2019123773.tif 000002
【００１２】
式中、
ｘ＋ｙは５〜１４００の整数であり、ｎは５〜１４００の整数であり、ｘ＋ｙ：ｎは１：１〜５の比率にあり、ｘ：ｙは１〜２０：１の比率にあり、ｘ：ｙは１〜６０：１の比率にある。
（１）下付き記号ｙの付された反復単位において、Ｌ−ＰＥＧ−Ａ中、
Ｌは、Ｏ又はＮＨであり、ＰＥＧは次式で表され、
【００１３】
【化２】
2019123773.tif 000003
【００１４】
ここで、ｐは１〜６の整数であり、ｑは５〜５００の整数であり、
Ａは、  Ａ１：非置換若しくは置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基、又は
Ａ２：次式
【００１５】
【化３】
2019123773.tif 000004
【００１６】
で表される基を表し、当該反復単位は式（Ｉ）で表される共重合体の総単位の２％〜１５％を占める。
（２）下付き記号ｘの付された反復単位において、
（ａ）Ｒ１又はＲ２のいずれか一方は、
ａ１  ：次式
【００１７】
【化４】
2019123773.tif 000005
【００１８】
で表され、ここで、
ＴＥＭＰＯは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基；
ａ２：次式
【００１９】
【化５】
2019123773.tif 000006
【００２０】
のいずれかで表される残基；    
ａ３：次式
【００２１】
【化６】
2019123773.tif 000007
【００２２】
のいずれかで表される残基；
ａ４：次式
【００２３】
【化７】
2019123773.tif 000008
【００２４】
で表され、ここで、Ｒ３はＣ１−３のアルキル基であり、ｒは２〜６の整数である、残基；
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はＯＨであり、又は
（ｂ）Ｒ１及びＲ２は、一緒になって−Ｏ−を表し、環式無水物残基を形成し、又は
（ｃ）Ｒ１及びＲ２は、各ＯＨを表す。
かつ、前記ｘの付された反復単位において、
（ｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基のみを含むか、
（ｉｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）及び（ｃ）を含む単位のいずれか１つが相互に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つを含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｉｉｉ）（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）を含む単位と（ｃ）を含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ４のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｉｖ）（ａ）を含む単位の中の、ａ４の残基を含む単位とａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）及び（ｃ）のいずれか１つを含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占めるか、
（ｖ）（ａ）を含む単位の中の、ａ４の残基を含む単位とａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位と（ｂ）を含む単位と（ｃ）を含む単位が共に独立してランダムに存在し、（ａ）を含む単位中のａ１〜ａ３のいずれか１つの残基を含む単位はｘの付された反復単位の総数の１５％〜６０％を占める。態様２：態様１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ１の残基を含む単位である、共重合体。
態様３：態様１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ２の残基を含む単位である、共重合体。
態様４：態様１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ３の残基を含む単位である、共重合体。
態様５：態様１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ４の残基を含む単位である、共重合体。
態様６：態様１に記載された共重合体であって、前記（ａ）を含む単位が、ａ１の残基を含む単位とａ４の残基を含む単位である、共重合体。
態様７：態様１〜６のいずれかに記載された共重合体であって、下付き記号ｙの付された反復単位において、Ｌ−ＰＥＧ−Ａ中のＡが、Ａ２の式
【００２５】
【化８】
2019123773.tif 000009
【００２６】
で表される基である、共重合体。
態様８：態様１〜７のいずれかに記載された共重合体であって、ＴＥＭＰＯが、次式
【００２７】
【化９】
2019123773.tif 000010
【００２８】
上式中、Ｒ’はメチル基である、
で表されるいずれかの残基である、共重合体。
態様９：態様１〜８のいずれかに記載された共重合体であって、水性媒体中で動的光散乱を測定すると、平均粒径がナノサイズにあるナノ粒子として存在する、共重合体。
態様１０：態様１〜８のいずれかに記載された共重合体と塩化ベンザルコニウムを含んでなる複合体。
態様１１：態様１〜８のいずれかに記載された共重合体と抗癌剤含んでなる医療用組成物。
態様１２：抗癌剤がパクリタキセル又はソラフェニブである請求項１１に記載の医療用組成物。
態様１３：次式（ＩＩ）で表される共重合体。を
【００２９】
【化１０】
2019123773.tif 000011
【００３０】
式中、
Ｒ１−１又はＲ２−１のいずれか一方は、
ａ１  ：次式
【００３１】
【化１１】
2019123773.tif 000012
【００３２】
で表され、ここで、
ＴＥＭＰＯは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基；
ａ２：次式
【００３３】
【化１２】
2019123773.tif 000013
【００３４】
のいずれかで表される残基；
ａ３：次式
【００３５】
【化１３】
2019123773.tif 000014
【００３６】
のいずれかで表される残基；
ａ４：次式
【００３７】
【化１４】
2019123773.tif 000015
【００３８】
で表され、ここで、Ｒ３はＣ１−３のアルキル基であり、ｒは２〜６の整数である、残基；
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はＯＨであり、式（ＩＩ）における環式無水物残基部分はｍ１の１０％まで加水分解され開環していてもよく、
そして
ｍ１＋ｍ２は、５〜１４００の整数であり、ｎは５〜１４００の整数であり、ｍ１＋ｍ２：ｎは１：１〜５の比率にある。
態様１４：下付き記号ｍ２の付された反復単位において，Ｒ１−１又はＲ２−１のいずれか一方が、
ａ１  ：次式
【００３９】
【化１５】
2019123773.tif 000016
【００４０】
で表される態様１３に記載の共重合体。
【発明の効果】
【００４１】
本願発明によれば、水性媒体又は体液中で分散安定性の高い、生理活性物質若しくは診断用薬剤等の生体内デリバリー用又は生体と接触する表面を改質するための新規薬剤又は材料、さらには当該材料の前駆体としても使用できる新規材料が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】製造例１で得られるＳＭＡＰｏ（ｎ＝２）のサイズ分割クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定結果のグラフ表示
【図２】前記ＳＭＡＰｏ（ｎ＝２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図３】製造例４で得られるポリマー（ＳＭＡＴＮ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図４】製造例５で得られるポリマー（ＳＭＡＴＮ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図５】製造例６で得られるポリマー（ＳＭＡＴＮ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図６】製造例７で得られるポリマー（ｐＳＭＡＴＮ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図７】製造例８で得られるポリマー（ｐＳＭＡＴＮ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図８】製造例９で得られるポリマー（ＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２））のＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図９】前記ＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１０】製造例１０で得られるポリマー（ＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２））の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１１】製造例１１で得られるポリマー（ｐＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２））の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１２】製造例１２で得られるポリマー（ＳＭＡＰｏＢ（ｎ＝２））の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１３】製造例１３で得られるポリマー（ＳＭＡＰｏＩ（ｎ＝２））の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１４】製造例１４で得られるポリマー（ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２））のＴＯＦ−ＭＳスペクトル
【図１５】前記ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１６】前記ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２）のＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図１７】製造例１６で得られるポリマー（ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２））のＴＯＦ−ＭＳスペクトル
【図１８】製造例１６で得られるポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１９】製造例１６で得られるポリマーのＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図２０】製造例１７で得られるＳＭＡＰｏＴＮのナノ粒子溶液の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図２１】前記ナノ粒子のゼータ（ζ）電位の測定結果のグラフ表示
【図２２】製造例１８で調製される複合体の粒径の測定結果のグラフ表示
【図２３】前記複合体のゼータ電位測定結果のグラフ表示
【図２４】前記複合体の散乱強度（カウントレート）の測定結果のグラフ表示
【図２５】試験例１における複合体のイオン強度依存性の粒径分布の測定結果のグラフ表示
【図２６】試験例１における散乱強度の測定結果のグラフ表示
【図２７】製造例１９で得られる複合体の粒度分布測定結果のグラフ表示
【図２８】製造例１９で得られる複合体のイオン強度依存性の粒度分布の測定結果のグラフ表示
【図２９】製造例１９で得られる複合体のイオン強度依存性の散乱強度の測定結果のグラフ表示
【図３０】製造例２０で得られる複合体の粒度分布測定結果のグラフ表示
【図３１】製造例２０で得られる複合体のイオン強度依存性の粒度分布の測定結果のグラフ表示
【図３２】製造例２０で得られる複合体のイオン強度依存性の散乱強度の測定結果のグラフ表示
【図３３】製造例２１で得られるＳＭＡＰｏＩのナノ粒子溶液の動的光散乱の測定結果（粒径分布）のグラフ表示
【図３４】試験例２における被験動物への各サンプルの経口投与３０分後の各ナノ粒子の臓器分布測定結果のグラフ表示
【図３５】前記投与４時間後の各ナノ粒子の臓器分布測定結果のグラフ表示
【図３６】試験例３におけるポリスチレン表面への各ポリマーの練り込みによる生成スーパーオキシドの抑制についての検出結果のグラフ表示
【図３７】試験例４における薬物（ソラフェニブ）内包シリカ含有ナノ粒子の動的光散乱分析による粒子径分布の測定結果のグラフ表示
【図３８】試験例５における造影剤担持ポリマー（ＳＭＡＰｏＩ）の担癌マウスでの造影剤としての評価結果を示す図に代わる写真
【図３９】試験例６におけるパクリタキセルの内包されたＳＭＡＰｏＴＮのナノ粒子の動的散乱光解析による粒子径分布の測定結果のグラフ表示
【図４０】試験例７（１）におけるコラーゲンコートビーズへコーティングしたポリマーの洗浄に対する安定性の評価結果のグラフ表示
【図４１】試験例７（２）におけるコラーゲンコートビーズへコーティングしたポリマーの抗血栓形成能についての評価結果のグラフ表示
【図４２】試験例７（２）におけるコーティングによる血栓の形成に次いで、カラムを洗浄した後の状態を表す図に代わる写真。
【図４３】試験例８における、動物細胞の凍結保存の際のポリマー（ＳＭＡＰｏＴＮ）の保護効果の評価結果のグラフ表示
【図４４】製造例２２で得られるＮ６１８の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図４５】製造例２３で得られるＮ６２３の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図４６】試験例９のＮ５６３による基材表面改質（血液適合性の付与）試験の結果のグラフ表示
【図４７】製造例２４で得られるポリマーＳＭＡＴＮのＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図４８】製造例２５で得られるポリマーＳＭＡＰｎ１ＴＮの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図４９】製造例２６で得られるポリマーＳＭＡＰｎ３ＴＮの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図５０】製造例２７で得られるポリマーＳＭＡＴＮのＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図５１】製造例２８で得られるポリマーＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ（及び対照ＰＥＧ−ＮＨ２）のＳＥＣ測定結果のグラフ表示
【図５２】製造例２９においてＳＭＡＴＮから作製されるナノ粒子の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図５３】製造例２９においてＳＭＡＰｎ１ＴＮから作製されるナノ粒子の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図５４】製造例２９においてＳＭＡＰｎ３ＴＮから作製されるナノ粒子の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図５５】製造例３０においてＳＭＡＴＮから作製されるナノ粒子の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図５６】製造例３０においてＳＭＡＰｎ１．５ＴＮから作製されるナノ粒子の動的光散乱の測定結果のグラフ表示
【図５７】試験例１０におけるＳＭＡＴＮ応答性について測定した結果のグラフ表示
【図５８】試験例１０におけるＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ応答性について測定した結果のグラフ表示
【図５９】試験例１１におけるＳＭＡＴＮの経時的な動的散乱強度の測定結果のグラフ表示
【図６０】試験例１１におけるＳＭＡＴＮの経時的なＴＥＭＰＯに起因するシグナル変化
【図６１】試験例１１におけるＳＭＡＰｎ１．５ＴＮの経時的な動的散乱強度の測定結果のグラフ表示
【図６２】試験例１１におけるＳＭＡＰｎ１．５ＴＮの経時的なＴＥＭＰＯに起因するシグナル変化
【発明の詳細な説明】
【００４３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００４４】
上記式（Ｉ）で表される共重合体において、従来技術と比べて特徴のある点は、限定されるものでないが、一般的に共重合体骨格又は主鎖に、２つ以上のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略記することあり）鎖がグラフトされた状態にあることのみならず、当該共重合体を含有する組成物中に抗癌剤をはじめとする医薬が包含される場合に、それらの組成物の生体内へのドラッグデリバリーの際や組成物それ自体の安定性に寄与し得る特定の生理活性物質又は作用剤がペンダント基として共有結合されていることにもある。本発明に従う共重合体は、水性媒体（純水、体液、適当な緩衝剤で緩衝化された水溶液、水溶解性有機溶媒含有水溶液、等）中で、それ自体又はカチオン化合物等の助けをかりて自己集積化することでナノサイズのミセル（又は粒子）を形成することができる。かような共重合体はナノサイズのミセル、すなわち、ナノサイズの範囲内、例えば、１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは１５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲内のミセルを形成する際に、抗癌剤（ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセル及び抗癌性白金錯体、等）をはじめとする医薬を共重合体への共有結合を介することなく当該ミセルへ効果的又は安定に封入又は内包することができる。
【００４５】
式（Ｉ）の下付き記号ｘの付された反復単位にける（ａ）の定義において、ａ１の式：
【００４６】
【化１６】
2019123773.tif 000017
【００４７】
中の環状ニトロキシドラジカル化合物の残基は、高分子化した場合にそのニトロキシドラジカルが生体環境下で発揮し得るレドックス機能を利用して、生体内における過剰な活性酸素等の産生、存在に起因するとみなせる疾患等を予防又は治療するのに役立つことが知られている（前記の特許文献２等参照）。
【００４８】
理論により拘束されるものでないが、本発明に従う式（Ｉ）で表される共重合体は、特許文献２に記載のブロック共重合体とは前述した特徴を持つ点で異なるにもかかわらず、当該ブロック共重合体に勝るとも劣らない特性を有する。例えば、ＰＥＧ鎖の数を選択することによりナノサイズのミセル又は粒子の平均粒径を制御できると共に水性媒体中での安定性の向上したナノミセルを提供できる。さらに、例えば、前記ｘの付された反復単位における（ｂ）に定義される、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって−Ｏ−を表すことで形成される環式無水物残基と同（ａ）に定義される残基の機能、例えば当該残基がＴＥＭＰＯを含む場合には環状ニトロキシドラジカル化合物の残基に起因するニトロキシドラジカルのレドックス機能に悪影響を及ぼすことなく、コラーゲン等のタンパク質等でコートされた医療用デバイス等の表面を、修飾又は改変できる。
【００４９】
前記（ａ）の定義においてａ２の式
【００５０】
【化１７】
2019123773.tif 000018
【００５１】
のいずれかで表される残基は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）において機能する残基であり、当該残基の共有結合した形態にある式（Ｉ）の共重合体は、前述のａ１につて述べたレドックス機能でなく、ホウ素中性子捕捉療法において機能すること以外、同等の特性を発揮する。
【００５２】
前記（ａ）の定義においてａ３の式
【００５３】
【化１８】
2019123773.tif 000019
【００５４】
のいずれかで表される残基は、Ｘ線造影剤として機能する残基であり、当該残基の共有結合した形態にある式（Ｉ）の共重合体は、前述のａ１につて述べたレドックス機能でなく
、Ｘ線造影剤として機能すること以外、同等の特性を発揮する。また、このような残基は、例えば、当該共重合体が生体内で滞留又は蓄積する部位の追跡にも役立つ。
【００５５】
前記（ａ）の定義においてａ４の式
【００５６】
【化１９】
2019123773.tif 000020
【００５７】
で表され残基の共有結合した形態にある式（Ｉ）の共重合体は、当該残基のトリアルコキシシリル基を介して、また、必要によりテトラアルコキシシラン若しくはナノサイズのシリカの共存下で、例えば、１０℃〜３０℃において、所謂ゾルゲル反応を介して架橋結合を形成し得ることから、シリカ含有コアとＰＥＧ鎖を主体として構築されるシェルを有するナノサイズの、所謂コア−シェル型ミセルを作製できる。かようなミセルはそれらの形成中又は形成後にシリカ含有コア部位に前述した抗癌剤等を吸着若しくは含ませることができる。また、当該残基を有する単位は、かようなシリカに起因する特性に加え、前述のａ１につて述べたレドックス機能以外、同等の特性を発揮する。
【００５８】
式（Ｉ）の共重合体は、少なくとも前述したａ１〜ａ４について述べた機能を有し、また、これらのａ２〜ａ４に述べた機能の他、ａ１に関連して前述した（ｂ）に定義される、Ｒ１及びＲ２は、一緒になって−Ｏ−を表すことで形成される環式無水物残基に基づき発揮される機能も併せ持つ。以上に述べたａ１〜ａ４の機能は、前述したように抗癌剤等を標的にデリバリーする際に役立ち、また、適当な場合（例えば、標的領域においてハーフエステル若しくはハーフアミドが加水分解される場合）には、前記（ｂ）に定義される環式無水物残基を介して当該抗癌剤等を共重合体のペンダント基として共有結合させることもできる。当該（ｂ）に定義される環式無水物残基は、全部または一部が（ｃ）に定義されるとおり加水分解され開環した状態にあることができるが、全て若しくは８０％以上の残基が（ｂ）で定義されるものであることが好ましい。
【００５９】
式（Ｉ）の共重合体において、ａ４の残基とａ１〜ａ３のいずれか一つの残基が組み合わさって共存するときには、前述したａ４の機能と、各ａ１〜ａ３について前述した各機能が組み合わさって発揮される。したがって、当該共重合体が形成するミセルに前述した抗癌剤等を内包し、水性媒体中での安定性を高め、また、ミセルの平均粒子径を調整する等の場合には、ａ４の残基とａ１〜ａ３のいずれか一つの残基が組み合わさって利用されていることが好ましい。
【００６０】
式（Ｉ）の共重合体において、ｘ＋ｙ及びｎは、限定されるものでないが、無水マレイン酸及びスチレンのラジカル共重合によって得られるランダム共重合体、好ましくは交互共重合体、それぞれの反復単位を構成する単位数に由来することができる。前述した（ａ）に定義される単位及び（ｂ）に定義される単位の各機能を発揮するものであれば限定されるものでないが、ｘ＋ｙは５〜１４００の整数であることができ、ｎは５〜１４００の整数であることができ、ｘ＋ｙ：ｎは１：１〜５、好ましくは１：１〜３、より好ましくは１：２の比率にあることができる。かようなｘ＋ｙにいうｘ：ｙは、１〜６０：１、好ましくは１〜４０：１の比率にあることができる。さらに、ｙは、前記ＬがＯであるとき２以上であり、ＮＨであるとき１以上であることができる。
【００６１】
式（Ｉ）の共重合体において、下付き記号ｙの付された反復単位におけるＬ−ＰＥＧ−
Ａ中のＰＥＧは、式
【００６２】
【化２０】
2019123773.tif 000021
【００６３】
で表され、ここで、ｐは１〜６、好ましくは２〜４、特に２の整数であり、ｑは５〜５００、好ましくは１０〜３００、より好ましくは２０〜１５０の整数であることができる。なお、本明細書における式又は部分若しくは基は、特記しない限り、表示した方向性を持つものとして記載している。
【００６４】
一方、Ａは、Ａ１に定義されるとおり、非置換若しくは置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基であるか、又は
Ａ２に定義される式
【００６５】
【化２１】
2019123773.tif 000022
【００６６】
で表される特定の基であることができる。
【００６７】
Ａ１に定義される保護されたホルミル基やＡ２に定義される特定の保護されたホルミル基がＰＥＧ鎖末端に存在する場合には、当該基を介して標的指向性リガンド等をＰＥＧ鎖末端に導入することができる。特に、後者の場合には、それ自体が粘膜や臓器の表面のアミノ基と容易に結合するので式（Ｉ）の共重合体の生体内局所滞留性の向上に資することができる。
【００６８】
式（Ｉ）の共重合体は、前記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）について定義した基に由来するか又は他方のものとして定義するＯＨであるとき（カルボキシル基を形成する）、カルボキシル基の対イオン化合物である第四級アンモニュウム又はアミン化合物と一緒になってポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成することができる。このようなＰＩＣは水性媒体中で安定なＰＩＣミセルとして存在でき、しかも、当該ミセルの形成中に前述した抗癌剤等を充填又は内包できる。限定されるものでないが、第四級アンモニュウム化合物としては、ベンザルコニウム、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（クロリド）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（クロリド）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（メチルサルフェート）、キトサン、ポリ（メタクリル酸  ２−トリエチルアミノエチルクロリド）等を挙げることができる。
【００６９】
前述の共重合体が形成するミセル、シリカ含有ミセル、ＰＩＣミセルは、グラフトされ
るＰＥＧ鎖の数、シリカの含有量等により、ミセル水溶液について動的光散乱（ＤＬＳ）の測定を行った場合の平均粒径が約１０ｎｍ〜約６００ｎｍ、好ましくは約１５ｎｍ〜約１５０ｎｍのミセル粒子として得ることができる。
【００７０】
こうして得られるミセルは、遠心等の分離手段により分離でき、また、凍結乾燥することにより、乾燥組成物として保存でき、必要に応じて、水性媒体中で再構成できる。このような乾燥組成物は、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むＰＩＣミセルの水溶液として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、生理食塩水、生理学的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、賦形剤としては、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。このような水性溶液は、その投与を必要とする哺乳動物、特に、ヒトに静脈もしくは動脈を介し、また、該水溶液もしくは乾燥組成物は腫瘍局所に直接投与することもできる。有効な用量は、共重合体の内包又は含有される薬剤の種類、患者の状態、等により最適値が変動するので限定されないが、後述する試験例等を参考にさらなる臨床試験等を行った結果に基づき専門医によって決定できる。
【００７１】
式（Ｉ）の共重合体は、限定されるものでないが、前述した無水マレイン酸及びスチレンのラジカル共重合によって得ることができ、市販されているランダム共重合体、好ましくは交互共重合体として入手できる原料共重合体の環式無水物残基又は無水マレイン酸環残基又は部分に、式（Ｉ）のＬ−ＰＥＧ−Ａで表されるグラフト鎖、（ａ）について定義されるａ１、ａ２、ａ３、ａ４のいずれかひとつの残基、にそれぞれ対応する化合物とを、同時又は相互に前後して、それ自体公知の、所謂、求核反応的に反応せしめることにより入手できる。
【００７２】
式（Ｉ）の共重合体は、例えば、原料共重合体とＬ−ＰＥＧ−Ａで表されるグラフト鎖に対応する化合物及び／又は（ａ）について定義されるａ１、ａ２、ａ３、ａ４のいずれかひとつの残基、にそれぞれ対応する化合物を無水有機溶媒中で、必要によりアルカリ等の存在下で室温にて、数時間から２４時間反応させることにより製造できる。前記化合物がヒドロキシ化合物である場合には、反応に際して、予めアルカリ金属のアルコラートとしておくこともできる。これに対し、前記化合物がアミン化合物である場合には、アルコラート形成処理等を必要とすることなく、当該反応を進行させることができる。かような有機溶媒は限定されるものでないが、非プロトン性溶媒、好ましくは双極性非プロトン性溶媒、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を挙げることができる。Ｌ−ＰＥＧ−Ａで表されるグラフト鎖に対応する化合物と前記共重合体の反応は、当該化合物残基を前記共重合体の環式無水物残基に導入しようとする数に応じて、前者の化合物の添加量を調整することにより実施することができる。例えば、前記環式無水物残基の当量当たり前記化合物の当量が２以上になるように適度に選択することにより約２本以上のＬ−ＰＥＧ−Ａで表されるグラフト鎖を原料共重合体に導入することができる。（ａ）について定義されるａ１、ａ２、ａ３、ａ４のいずれかひとつの残基を前記環式無水物残基に導入する際に、前者と後者の当量割合が、２０以上対１となるように選択すると実質的にすべての環式無水物残基へ前者の残基を導入でき、当該割合が１０以下対１となるように選択すると、通常、当該導入率を１００％未満、例えば、１０〜６０％とすることができる。残存する環式無水物残基は、さらに前記以外の化合物を含む追加の化合物を求核的に反応せしめることにより、追加の化合物残基を当該環式無水物残基に導入することができる。また、当該環式無水物残基は加水分解することにより開環しジカルボキシル残基とすることもできる。
【００７３】
したがって、式（ＩＩ）：
【００７４】
【化２２】
2019123773.tif 000023
【００７５】
式中、Ｒ１−１、Ｒ２−１、ｍ１、ｍ２、ｎは前記に定義したとおりである。
で表される共重合体にＬ−ＰＥＧ−Ａで表されるグラフト鎖に対応する化合物又はＰＥＧ誘導体を求核的に反応せしめることにより式（Ｉ）の共重合体を提供することもできる。かような観点から、式（ＩＩ）で表される共重合体は、式（Ｉ）の共重合体の前駆体であり、また、それ自体、環式無水物残基の単位を利用して医療用デバイス等の表面のコーティング用材料して使用することもできる。
【実施例】
【００７６】
以下、具体例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲をこれらの例に限定することを意図するものでない。
【００７７】
製造例１：ＳＭＡＰｏ（ｎ＝２）の合成（Ｎ５５７）（２本のＰＥＧをＰＳＭＡにエステ
ルで結合したもの）
【００７８】
【化２３】
2019123773.tif 000024
【００７９】
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）３８ｇを無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍＬに溶解させた。市販の片末端メトキシ、他末端ヒドロキシ  ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ＝５，０００，ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨと略記）５０ｇを２００ｍＬナス型フラスコに計り取り、８０℃で１日間減圧乾燥させた後、乾燥ＴＨＦ２００ｍＬに溶解させ、市販ブチルリチウム（ヘキサン溶液、１．６Ｍ）６．５ｍＬ加え、ＰＥＧ末端をアルコラートにした。この溶液を先のＰＳＭＡのＴＨＦ溶液に加え、室温で１日反応させた。反応溶液を１Ｌのイソプロピルアルコールに投入し、遠心（９，０００ｒｐｍ、２分間）により沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をヘキサンに分散し、遠心で沈殿物を精製した（２回）。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した（７６ｇ）。上記で得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の測定結果を図１に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。
【００８０】
製造例２：ＳＭＡＰｏ（ｎ＝５）の合成（Ｎ６０５Ｉ）（５本のＰＥＧをＰＳＭＡにエス
テルで結合したもの）
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）７．６ｇを無水ＴＨＦ５０ｍＬに溶解させた。市販の片末端メトキシ、他末端ヒドロキシ  ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ＝５，０００，ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨと略記）２５ｇを１００ｍＬナス型フラスコに計り取り、８０℃で１日間減圧乾燥させた後、乾燥ＴＨＦ２００ｍＬに溶解させ、市販ブチルリチウム（ヘキサン溶液、１．６Ｍ）３．３ｍＬ加え、ＰＥＧ末端をアルコラートにした。この溶液を先のＰＳＭＡのＴＨＦ溶液に加え、室温で１日反応させた。反応溶液を１Ｌのイソプロピルアルコールに投入し、遠心（９，０００ｒｐｍ、２分間）により沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をヘキサンに分散し、遠心で沈殿物を精製した（２回）。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した（３０ｇ）。得られたポリマーの構造は、製造例１のものを参照。
【００８１】
製造例３：ＳＭＡＰｏ（ｎ＝１０）の合成（Ｎ６０５ＩＩ）（１０本のＰＥＧをＰＳＭＡ
にエステルで結合したもの）
ＰＳＭＡ（分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）３．８ｇ用いた以外、製造例２と同様の方法を実施した（収量３０ｇ）。得られたポリマーの構造は、製造例１のものを参照。
【００８２】
製造例４：ＴＥＭＰＯ導入ＰＳＭＡ（ＳＭＡＴＮ、Ｎ５４７）の合成
【００８３】
【化２４】
2019123773.tif 000025
【００８４】
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）９ｇを無水ＴＨＦ５０ｍＬに溶解させた。市販の４−アミノ―２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル  ＮＨ２−ＴＥＭＰＯ）５ｇをＴＨＦ１５ｍＬに溶解させ、上のＰＳＭＡ／ＴＨＦ溶液に加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液を１Ｌのエーテルに投入し、沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をエーテルに分散し、ろ過にて精製した（２回）。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した（１４ｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり１４個であった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。なお、上記式における無水マレイン酸残基の一部又は全部は加水分解されていることができる。
【００８５】
製造例５：ＴＥＭＰＯ導入ＰＳＭＡ（ＳＭＡＴＮ、Ｎ５６８）の合成その２
ＰＳＭＡ、分子量２３０ＫＤａ、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝１：１）７ｇを無水ＴＨＦ５０ｍＬに溶解させたこと以外、製造例４と同様の方法を実施して目的物を合成した（１１ｇ）。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり４６４個であった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に示す。
【００８６】
製造例６：ＴＥＭＰＯ導入ＰＳＭＡ（ＳＭＡＴＮ、Ｎ５６９）の合成その３
無水ＴＨＦの代わりに無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を使ったこと以外、製造例５と同様の方法を実施して目的物を得た（７ｇ）。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり４６８個であった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５に示す。
【００８７】
製造例７：ｐＳＭＡＴＮ（Ｎ５７２）の合成（ＰＳＭＡの無水マレイン酸の一部にＮＨ２
−ＴＥＭＰＯを導入したもの）
【００８８】
【化２５】
2019123773.tif 000026
【００８９】
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量１，６００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝１．３：１）１０ｇを無水ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させたこと以外、製造例４と同様の方法を実施して目的物を合成した（１４．６ｇ）。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり２．６個であった（残存無水マレイン酸４．４個）。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図６に示す。
【００９０】
製造例８：ｐＳＭＡＴＮ（Ｎ５７４）の合成その２
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量１，６００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝１．３：１）１５ｇを無水ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させたこと以外、製造例７と同様の方法を実施して目的物を合成した（１９．５ｇ）。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり２．２個であった（残存無水マレイン酸４．８個）。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に示す。
【００９１】
製造例９：ＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２，Ｎ５６４）の合成（２本のＰＥＧをＰＳＭＡにエス
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にＮＨ２−ＴＥＭＰＯを導入したもの）
【００９２】
【化２６】
2019123773.tif 000027
【００９３】
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ  ２０ｇを無水ＴＨＦ１５０ｍＬに溶解した。ＮＨ２−ＴＥＭＰＯ５ｇを１５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、上記溶液に加え室温で２時間攪拌する。反応溶液を１Ｌのエーテルに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行い、目的物を得た（収量２５ｇ）。上記で得られたポリマーのＳＥＣの測定結果を図８に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に示す。ＳＥＣの測定結果から、ＴＥＭＰＯ導入量は１６個／鎖、カルボキシル基２５個／鎖であった。
【００９４】
製造例１０：ＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２，Ｎ６０７）の合成（２本のＰＥＧをＰＳＭＡにエ
ステルで結合し残りの無水マレイン酸環にＮＨ２−ＴＥＭＰＯを導入したも
の）（一段合成）
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）３８ｇを無水ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させた。市販の片末端メトキシ、他末端ヒドロキシポリエチレングリコール（ＭＷ＝５，０００，ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨと略記）５０ｇを２００ｍＬナス型フラスコに計り取り、８０℃で１日間減圧乾燥させた後、乾燥ＴＨＦ２００ｍＬに溶解させ、市販ブチルリチウム（ヘキサン溶液、１．６Ｍ）６．５ｍＬ加え、ＰＥＧ末端をアルコラートにした。この溶液を先のＰＳＭＡのＴＨＦ溶液に加え、室温で２時間反応させた。ＮＨ２−ＴＥＭＰＯ２０ｇを６０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、上記溶液に加え室温で２時間攪拌する。反応溶液を１Ｌのエーテルに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った。（収量１０４ｇ）ＥＳＲより１本あたりのＴＥＭＰＯ導入量は１６．５であった。得られたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１０に示す。
【００９５】
製造例１１：ｐＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２，Ｎ５６３）の合成（２本のＰＥＧをＰＳＭＡに
エステルで結合し残りの無水マレイン酸環の一部にＮＨ２−ＴＥＭＰＯを導
入したもの）
【００９６】
【化２７】
2019123773.tif 000028
【００９７】
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ（Ｎ５５７）５ｇを無水ＴＨＦ５０ｍＬに溶解した。ＮＨ２−ＴＥＭＰＯの０．６ｇを３ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、上記溶液に加え室温で２時間攪拌した。反応溶液を４００ｍＬのエーテルに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。１Ｈ−ＮＭＲ及びＥＳＲの測定結果よりｘ＝１５，ｙ＝７．６，ｚ＝２（収量５．６ｇ）と決定された。
【００９８】
製造例１２：ＳＭＡＰｏＢ（ｎ＝２，Ｎ５５９）の合成（２本のＰＥＧをＰＳＭＡにエス
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にボロン化合物を導入したもの）
【００９９】
【化２８】
2019123773.tif 000029
【０１００】
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ（Ｎ５５７）５ｇを無水ＴＨＦ  ５０ｍＬに溶解した。４−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル２ｇを２０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、６ｍＬのブチルリチウムを加得（１．６Ｍ）室温で１０分間攪拌後、上記溶液に加え室温で１２時間攪拌した。反応溶液を１Ｌのエーテルに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行い回収した（収量４．１ｇ）。ＩＣＰ−ＭＳ側定よりホウ素含有量は６．９個／ポリマーであった。得られたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１２に示す。
【０１０１】
製造例１３：ＳＭＡＰｏＩ（ｎ＝２，Ｎ５６１）の合成（２本のＰＥＧをＰＳＭＡにエス
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にヨウ素化合物を導入したもの）
【０１０２】
【化２９】
2019123773.tif 000030
【０１０３】
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ（Ｎ５５７）２．５ｇを無水ＤＭＦ  ３０ｍＬに溶解した。２，４−ジヨードアニリン１．７３ｇを２０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、３ｍＬのブチルリチウムを加得（１．６Ｍ）室温で１０分間攪拌後、上記溶液に加え室温で５時間攪拌した。反応溶液を５００ｍＬの２−プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行い目的のポリマーを回収した（収量２．１ｇ）。ＩＣＰ−ＭＳによりヨウ素含有量は１．８／ポリマーであった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１３に示す。
【０１０４】
製造例１４：ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２，Ｎ６０６Ｉ）の合成その１（ＰＥＧ末端
にベンジルアセタール基を導入したＳＭＡＰｏの合成）
【０１０５】
【化３０】
2019123773.tif 000031
【０１０６】
窒素下２００ｍＬナスフラスコ中、４−（ジメトキシメチル）ベンジルアルコーる０．４５ｇを５０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させ、カリウムナフタレン（Ｋ−Ｎａｐｈ）のＴＨＦ溶液（１．０５Ｍ）３ｍＬを加えた。その後冷却エチレンオキシ度（ＥＯ）を１２．５ｇ加え、水冷下、１日攪拌した（溶液Ａとする）。市販のＰＳＭＡ（分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）５ｇを無水ＴＨＦ４０ｇに溶解し溶液Ｂとする、溶液Ａを１１ｇ、溶液Ｂを１８ｇ混合し、５時間反応させた。反応溶液を１Ｌの２−プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った（収量４．２ｇ）。得られたポリマーのＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図１４に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１５に、ＳＥＣ測定結果を図１６に示す。
【０１０７】
製造例１５：ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝５，Ｎ６０６ＩＩ）の合成その２
製造例１４で調製した溶液Ａ  ４３ｇと溶液Ｂ２７ｇを混合し、室温で５時間攪拌した。反応溶液を１Ｌの２−プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行ない、目的のポリマーを得た（収量７ｇ）。
【０１０８】
製造例１６：ＳＭＡＣＨＯ−ＰｈＰｏ（ｎ＝２，Ｎ６０４）の合成その３（ＰＥＧ鎖２Ｋ
Ｄａ）
窒素下１００ｍＬナスフラスコ中、４−（ジメトキシメチル）ベンジルアルコール０．５４ｇを３０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させ、カリウムナフタレンのＴＨＦ溶液（１．０５Ｍ）３．３ｍＬを加えた。その後冷却エチレンオキシ度（ＥＯ）を７ｇ加え、水冷下、１日攪拌した。市販のＰＳＭＡ（分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）２．３ｇを無水ＴＨＦ１０ｇに溶解し上の溶液に混合し、５時間反応させた。反応溶液を１Ｌの２−プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行い目的のポリマーを得た（収量８．２ｇ）。得られたポリマーのＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図１７に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１８に、ＳＥＣ測定結果を図１９に示す。
【０１０９】
製造例１７：ＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）のナノ粒子の調製
製造例９で合成したＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）の５０ｍｇを１０ｍＬのＤＭＦに溶解し、分画分子量３．６ＫＤａの透析膜を用いて２Ｌの水に対して透析を行った。１２時間ごとに透析水を２度交換したのち、遠心エバポレータで濃縮して１０ｍｇ／ｍＬとした。その溶液の動的光散乱及びゼータ電位を測定した。動的光散乱の測定結果を図２０に、ゼータ（ζ）電位の測定結果を図２１に示す。
【０１１０】
製造例１８：ＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）とＢＫＣｌとの複合体調製
塩化ベンザルコニウム（ＢＫＣｌ）（１０％水溶液）を０．２８ｇとミリＱ水３．７ｍＬとを混合させた（溶液Ａ）。ＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）７０ｍｇをミリＱ水２ｍＬと０．１Ｍ  ＮａＯＨ一滴加え混合した（溶液Ｂ）。溶液Ａ、Ｂを下記の表１に示すように混合し、複合体を調製した。
【０１１１】
【表１】
2019123773.tif 000032
【０１１２】
複合体の粒径、ゼータ電位及び散乱強度（カウントレート）の測定結果をそれぞれ、図２２、図２３及び図２４に示す。
【０１１３】
試験例１：ＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）と塩化ベンザルコニウム（ＢＫＣｌ）との複体の
イオン強度安定性
製造例１８で調製したＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）と塩化ベンザルコニウ無（ＢＫＣｌ）との複合体（５０：５０）溶液にＮａＣｌを加えてイオン強度を６０から５００ｍＭとして動的光散乱および散乱強度等を測定した。当該複合体のイオン強度依存性の粒径分布を図２５に、散乱強度を図２６に示す。
【０１１４】
製造例１９：ＳＭＡＰｏＢ（Ｎ５８６）と塩化ベンザルコニウム（ＢＫＣｌ）との複合体
調製及び特性の決定
ＳＭＡＰｏＢ（Ｎ５５９）を用いたこと以外、製造例１８と同様の方法で溶液を調製し、複合体を調製し、試験例１に記載のごとく粒度分布、イオン強度依存性の粒度分布及び散乱強度の測定を行った。測定結果をそれぞれ、図２７、図２８及び図２９に示す。
【０１１５】
製造例２０：ＳＭＡＰｏＩ（Ｎ５６１）と塩化ベンザルコニウ無（ＢＫＣｌ）との複合体
調製及び特性の決定
製造例１３で得られるＳＭＡＰｏＩ（Ｎ５６１）を用いたこと以外、製造例１９と同様の方法で溶液を調製し、複合体を調製し、試験例１に記載のごとく粒度分布、イオン強度依存性の粒度分布及び散乱強度の測定を行った。測定結果をそれぞれ、図３０、図３１及び図３２に示す。
【０１１６】
製造例２１：ＳＭＡＰｏＩ（ｎ＝２，Ｎ５６１）の  ナノ粒子調製
製造例１３で合成したＮ５６１の２０ｍｇを４ｍＬのメタノールに溶解し、４ｍＬのミリＱ水を加え、エバポレートした。半量になったところで４ｍＬの水を加え、再度エバポレートした。これを二度繰り返した後全量を４ｍＬとして動的光散乱により粒径を測定した。測定結果を図３３に示す。図から平均粒径は体積分布で１１ｎｍであることが解かる。
【０１１７】
試験例２：各サンプルの経口投与による臓器分布
製造例４、９及び１５でそれぞれ、合成したサンプルＮ５４７（ＰＥＧなしＳＭＡＴＮ）、Ｎ５６４（ＳＭＡＰｏＴＮ，ｎ＝２）及びＮ６０６Ｉ（ＳＭＡａｃｅ−ＰｈＰｏＴＮ；ｎ＝２）１．５ｇをそれぞれ１５ｍＬのＤＭＦに溶解し、２Ｌの透析水に対して２日間透析した。最終濃度はそれぞれ３０ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ及び２６ｍｇ／ｍＬであった。これらの各溶液０．５ｍＬをＩＣＲマウスに経口投与し、３０分後及び４時間後に臓器を採取して電子スピン共鳴装置により分布を計測した。投与３０分後及び４時間後の各ナノ粒子の臓器分布測定結果を図３４及び３５に示す。これらの結果から上記の３つのナ
ノ粒子は経口投与で血中には全く移行することが無かった。また、ＰＥＧのないＮ５４７は小腸には殆ど集積が見られないが、Ｎ５６４は小腸に良く集積した。ベンズアセタール末端を有するナノ粒子は胃への残存が長い傾向が認められる。
【０１１８】
試験例３：ポリスチレン表面へのポリマーの練り込み
スチレン（１００ｍｇ／ｍｌ）のトルエン溶液にＳＭＡＴＮ（Ｎ５４７）（１００ｍｇ／ｍｌ）、ｐＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６３）（１００ｍｇ／ｍｌ）又はＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）（１００ｍｇ／ｍｌ）のトルエン溶液を１：１の割合で混合し１００μＬずつ９６ｗｅｌｌの白色プレートに加え真空乾燥させトルエンを除去し、プレート表面にキャストした。比較対象としてスチレンのみでのキャストも同様におこなった。ヒポキサンチン及びキサンチンオキシダーゼを加え発生したスーパーオキシドをＭＰＥＣ（アトー）により検出した。結果を図３６に示す。Ｎ５６３及びＮ５６４をスチレンに練りこんでキャストしたものは発光量がスチレンのみの場合と比較して減少しており、スーパーオキシドを消去していることが確認できた。
【０１１９】
試験例４：ソラフェニブ（抗がん剤）のｐＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６３）への薬物封入
（１）製造例１１で得られるｐＳＭＡＰｏＴＮ（ｎ＝２，Ｎ５６３）の２２ｍｇをガラスバイアル中で１ｍＬのＤＭＦに完全に溶解し、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ｄ＝０．９４６）の２１μＬと混合した。次いで、溶液に２．２ｍｇのソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、２１μＬのテトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）及び３０  μＬのアンモニア水（ＮＨ３，２８％）を連続的に加えた。混合２時間後、前記溶液に５００μＬのミリＱ水を加えてさらに５分間混合した。その後、分画分子量３．６ＫＤａの透析膜を用いて２Ｌの水に対して透析を行った。水を１２時間後に交換し、さらに２４時間後に回収した。溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２（２０ｍＭ  ＰＯ４３−））に１：１の比率で混合することにより動的光散乱分析に供し、粒子径分布を求めた。得られた結果を図３７に示す。
（２）薬物の内包量を次のとおり試験した。サンプルをアセトにトリスと混合（５０：５０）し、２時間超音波浴中に放置した後、０．２μｍ孔のフィルターを用いて濾過した。薬物量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い２５４ｎｍにおける吸収波長を試験することにより決定した。結果を表２に示す。
【０１２０】
【表２】
2019123773.tif 000033
【０１２１】
試験例５：ＳＭＡＰｏＩ（Ｎ５６１）を用いた担癌マウスでの造影剤評価
Ｎ５６１を１２５ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ担癌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ５週齢）に１００μＬを癌に局所投与し、ＡＬＯＫＡ  ＬａＴｈｅｔａ  ＬＣＴ−１００にて撮影を行った。比較対象として、イオメロン（エーザイ）をヨウ素含有量にして等量局所投与した。測定結果を示す図に代わる写真を図３８に示す。Ｎ５６１の場合に３０分後においても腫瘍部分で検出できていることが確認された（同図矢印）。
【０１２２】
試験例６：パクリタキセル（ＰＴＸ，抗癌剤）のＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）への薬物封
入
Ｎ５６４（４０ｍｇ）に対してＰＴＸをポリマー重量の１０％（４ｍｇ）と２０％（８ｍｇ）をそれぞれ入れ、１ｍＬのＤＭＦガラスバイアル中で３時間混合した。その後２Ｌの超純水に対して分画分子量３．６ｋＤａの透析膜を用いて透析を行い１２時間後に水を交換し、さらに１２時間後に回収した。未封入のドラッグを０．２μｍ孔のフィルターで除いた後、動的散乱光解析により粒子径分布を測定した。結果を図３９に示す。その後、以下の通りに薬物封入量を調べた。サンプルを凍結乾燥しアセトニトリルに溶解後（１ｍｇ／ｍＬ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて２２７ｎｍの波長吸収を調べることでＰＴＸ薬物量を定量した。結果を以下の表３に示す。
【０１２３】
【表３】
2019123773.tif 000034
【０１２４】
試験例７：  プラビーズカラム（コラーゲンコート）へのポリマーのコーティング
ｐＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６３）、ＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）のメタノール溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）でコラーゲンコートされた市販プラビーズカラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｅｖ．ｍｅｄｉｃａｌｏｎｌｉｎｅ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｅｉｄ／４５１５５）をコーティングした。コーティング条件は下記のとおりである。
＜コーティング条件＞
（マル１）：プラビーズそのまま
（マル２）：Ｎ５６３コーティング
（マル３）：Ｎ５６４  コーティング
Ｉ群：試料コーティング後風乾
ＩＩ群：試料コーティング後風乾し、再度コーティング風乾を繰り返す
ＩＩＩ群：試料コーティング後１週間密閉し放置
（１）上記のように準備したカラム（マル２）、（マル３）をリン酸緩衝液で３回洗浄した。洗浄液のＥＳＲ強度を測定した結果を図４０に示す。図（マル３）４０から、Ｎ５６４（（マル３）シリーズ、無水マレイン酸（ＭＡ）の残存が無いか又は少ないサンプル）では洗浄ごとにコーティングポリマーが剥離しているのに対し、Ｎ５６３（ＭＡが明らかに残存している）では殆ど溶出しないことがわかり、安定なコーティングが達成された。図４０参照。
（２）作製したカラムにヘパリン等の抗凝固剤無添加のマウス全血５００μＬを注入し２
０分間静置した。その後１μＬのリン酸緩衝溶液で洗浄した。コーティングによる血栓の形成について測定した結果を図４１に示し、洗浄後のカラムの状態を表す図に代わる写真を図４２に示す。コラーゲンコーティングカラムでは極めて大量の血栓ができており、ほぼ洗浄ができない状況にあった。Ｎ５６４コーティングでもかなりの血栓が残っているのに対し、Ｎ５６３ではほぼ完全に血栓形成が押さえられており、極めて高性能な表面コーティング材となる。
【０１２５】
試験例８：動物細胞の凍結保存におけるＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）の保護効果
ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を１５０ｍｍのシャーレで培養後コンフルエントに達した時、培地で細胞を１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに分散し、１ｍＬずつバイアルに分注した。ＤＭＳＯ１％とＳＭＡＰｏＴＮ（Ｎ５６４）の所定量を加えピペッティング後、−８０℃の冷凍庫で急速冷凍した。２日後バイアルを３７℃の温湯の中に入れ、素早く融解させ、３７℃のＤＭＥＭ培地４ｍＬと細胞懸濁液１ｍＬを１５ｍＬファルコンに入れた。希釈した細胞懸濁液５０μＬと市販０．４ｗ／ｖ％トリパンブルー染色液５０μＬを１．５ｍＬチューブに取り、混合し、血球計算盤により生細胞数を計測した。結果を図４３に示す。図から、Ｎ５６４の添加で著しい細胞生存率の向上が見られる。一般に培養細胞は５〜１０％程度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を培養液に加え、１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞を−８０℃で凍結保存し、再度利用するときに解凍さる。再生医療や臓器保存を考えたときＤＭＳＯの量を極力減らし、大量に凍結できることが望ましい。
【０１２６】
製造例２２：Ｎ６１８の製造
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ（Ｎ５５７）の２．５ｇを無水ＴＨＦ２５ｍＬに溶解した。ＮＨ２−ＣＨ２Ｐｈ−Ｉ（４−ヨードベンジルアミン）１．０ｇの２５ｍＬのＤＭＦ溶液を、上記溶液に加え室温で２時間攪拌した。反応溶液を４００ｍＬの２−
プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った。ＩＣＰ解析より得られたポリマー中のＮＨ−ＣＨ２Ｐｈ−Ｉ導入量は１８であった。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４４に示す。（収量２．５ｇ）。
【０１２７】
製造例２３：Ｎ６２３の製造
製造例１で合成したＳＭＡＰｏ（Ｎ５５７）２．５ｇを無水ＴＨＦ２５ｍＬに溶解した。ＮＨ２−ＣＨ２Ｐｈ−Ｂ（ピナコール）：
【０１２８】
【化３１】
2019123773.tif 000035
【０１２９】
１．０ｇの２５ｍＬのＤＭＦ溶液を、上記溶液に加え室温で２時間攪拌した。反応溶液を透析膜（分画分子量２，５００）で水に対して透析して精製し、透析乾燥にて標題のポリマーを得た。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４５に示す。
【０１３０】
試験例９：Ｎ５６３による基材表面改質（血液適合性の付与）
スチレン溶液（１００ｍｇ／ｍＬ  トルエン）及びスチレン・Ｎ５６３混合溶液（前記スチレン溶液とＮ５６３溶液（１０ｍｇ／ｍＬトルエン溶液を遠心して得た上澄み液）を１：１で混和した溶液）を３００μＬずつ４８ウェルプレートに加えた後乾燥させて薄膜を形成させた。マウスより得た全血を１００μＬずつ加え５分間静置させた後、生理食塩水で５回洗浄した。吸着したタンパク質成分をＲＩＰＡバッファーにより溶解させ、吸着量をＢＣＡ法により測定した。結果を図４６に示す。図からＮ５６３を加えた薄膜の方がタンパク質の吸着量が少ない事が確認できた。
【０１３１】
製造例２４：ＴＥＭＰＯ導入ＳＭＡ（ＳＭＡＴＮ）の合成その４
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）２００ｍｇを無水ＤＭＦ５ｍＬに溶解させた。市販の４−アミノ―２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル  ＮＨ２−ＴＥＭＰＯ）１７１ｍｇをＤＭＦ０．８５ｍＬに溶解させ、上のＰＳＭＡ／ＤＭＦ溶液に加え、室温で１日攪拌した。反応溶液を透析膜（分画分子量３５００）に入れ、蒸留水に対し２４時間透析させＤＭＦと残存ＮＨ２−ＴＥＭＰＯを除いた。その後透析後の溶液を液体窒素で凍結させ減圧下で凍結乾燥を行うことでポリマーを回収した（５０３ｍｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり２１個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の測定結果を図４７に示す。
【０１３２】
製造例２５：ＴＥＭＰＯ・ＰＥＧ導入ＳＭＡＰ（ＳＭＡＰｎ１ＴＮ）（１本のＰＥＧをＰ
ＳＭＡにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にＴＥＭＰＯを導入したも
の）の合成
【０１３３】
【化３２】
2019123773.tif 000036
【０１３４】
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）３７３ｍｇとＮＨ２−ＰＥＧをＰＳＭＡに対してモル比で１：１（２４６ｍｇ）の割合で無水ＤＭＦ５ｍＬに溶解させたこと以外、製造例９と同様の方法を実施してＳＭＡＰｎ１ＴＮを合成した（７３２ｍｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり１７個であった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４８に示す。
【０１３５】
製造例２６：ＴＥＭＰＯ・ＰＥＧ導入ＳＭＡＰ（ＳＭＡＰｎ３ＴＮ）（３本のＰＥＧをＰ
ＳＭＡにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にＴＥＭＰＯを導入したも
の）の合成
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）２００ｍｇとＮＨ２−ＰＥＧをＰＳＭＡに対してモル比で１：３（３９９ｍｇ）の割合で無水ＤＭＦ５ｍＬに溶解させたこと以外、製造例９と同様の方法を実施してＳＭＡＰｎ３ＴＮを合成した（５３６ｍｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり１６個であった。得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定結果を図４９に示す。
【０１３６】
製造例２７：ＴＥＭＰＯ導入ＳＭＡ（ＳＭＡＴＮ）の合成その５
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）３００ｍｇを無水ＴＨＦ１０ｍＬに溶解させた。市販の４−アミノ―２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル  ＮＨ２−ＴＥＭＰＯ）２００ｍｇをＴＨＦ１．２ｍＬに溶解させ、上のＰＳＭＡ／ＴＨＦ溶液に加え、室温で３日攪拌した。反応溶液を１Ｌのエーテルに投入し、沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をエーテルに分散し、ろ過にて精製した（２回）。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した（３９７ｍｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり１７個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の測定結果を図５０に示す。
【０１３７】
製造例２８：ＴＥＭＰＯ・ＰＥＧ導入ＳＭＡＰ（ＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ）（１．５本のＰ
ＥＧをＰＳＭＡにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にＴＥＭＰＯを導
入したもの）の合成
市販のポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）共重合体（ＰＳＭＡ、分子量７，５００、スチレン：無水マレイン酸ユニット比＝２：１）（ＰＳＭＡと略記）３００ｍｇとＮＨ２−ＰＥＧをＰＳＭＡに対してモル比で１：１．５（３００ｍｇ）の割合で無水ＴＨＦ１０ｍＬに溶解させたこと以外、製造例２５と同様の方法を実施してＳＭＡＰｎ１．５ＴＮを合成した（７２０ｍｇ）。得られたポリマーの電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトル測定によりＴＥＭＰＯ導入率は１ポリマーあたり２１．５個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の測定結果を図５１に示す。
【０１３８】
製造例２９：ＳＭＡＴＮ、ＳＭＡＰｎＴＮ（ｎ＝１及び３）のナノ粒子の調製
製造例２４、２５、２６でそれぞれ合成した３つのサンプルＳＭＡＴＮ、ＳＭＡＰｎＴＮ（ｎ＝１、３）の２０ｍｇを２ｍＬのメタノールに溶解し、分画分子量３．５ＫＤａの透析膜を用いて２Ｌの水に対して透析を行った。数時間おきに透析水を交換し、最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ前後となるように調製し、その溶液の動的光散乱を測定した。動的光散乱の測定結果を、それぞれ図５２、図５３及び図５４に示す。
【０１３９】
製造例３０：ＳＭＡＴＮ、ＳＭＡＰｎＴＮ（ｎ＝１．５）のナノ粒子の調製
製造例２７、２８でそれぞれ合成した２つのサンプルＳＭＡＴＮ、ＳＭＡＰｎＴＮ（ｎ＝１．５）の２０ｍｇを２ｍＬのメタノールに溶解し、分画分子量３．５ＫＤａの透析膜を用いて２Ｌの水に対して透析を行った。数時間おきに透析水を交換し、最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ前後となるように調製し、その溶液の動的光散乱を測定した。動的光散乱の測定結果を図５５及び５６に示す。
【０１４０】
試験例１０：ＳＭＡＴＮ（反応溶媒ＤＭＦ）とＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ（反応溶媒ＴＨＦ）
のｐＨ応答性の評価
ＴＥＭＰＯ導入率がほぼ等しいＳＭＡＴＮ（反応溶媒ＤＭＦ）とＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ（反応溶媒ＴＨＦ）に対し、上記のミセル調製法に基づき、最終ミセル濃度が約１０ｍｇ／ｍＬとなるようにミセルを調製し、ｐＨに対する応答性を評価した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーに対して０．１Ｍおよび０．０１Ｍ  ＨＣｌと０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えてさまざまなｐＨとなるようにバッファーを調製したあと、調製したミセル３００μＬに対してバッファー３００μＬを加え数秒攪拌し、動的散乱強度を測定した。ＳＭＡＴＮ及びＳＭＡＰｎ１．５ＴＮに関する測定結果をそれぞれ図５７及び５８に示す。体積別散乱強度で見た結果、ＰＥＧを導入していないＳＭＡＴＮはｐＨ＝２前後で顕著に凝集する傾向を示したのに対し、ＰＥＧ鎖を１．５本導入したＳＭＡＰｎ１．５ＴＮはｐＨ＝３まで３０ｎｍ前後の粒径を保つことが分かった。
【０１４１】
試験例１１：ＰＢＳ滴下後のＳＭＡＴＮ（反応溶媒ＤＭＦ）とＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ（反
応溶媒ＴＨＦ）の安定性評価
ＳＭＡＴＮ（反応溶媒ＤＭＦ）とＳＭＡＰｎ１．５ＴＮ（反応溶媒ＴＨＦ）に対し、上記のミセル調製法に基づき最終ミセル濃度が約１０ｍｇ／ｍＬとなるようにミセルを調製し、ＰＢＳ滴下後のミセルの安定性を評価した。調製したミセル５００μＬに対し、ｐＨ＝７．７のＰＢＳ５００μＬを加えて攪拌したあと、動的散乱強度及びＥＳＲ測定を行った。なお、恒温水槽を用いて生体温度である３７．４℃に保存して時間経過を測定した。ＳＭＡＴＮにつていの結果をそれぞれ図５９及び６０に、ＳＭＡＰｎ１．５ＴＮについての結果をそれぞれ図６１及び６２に示す。ＰＥＧを導入していないＳＭＡＴＮは時間経過につれ粒径や散乱強度に大きな変化は見られなかったが、ＰＢＳ滴下後からＴＥＭＰＯのシグナルがはっきりとみられた。ＰＥＧ鎖を１．５本導入したＳＭＡＰｎ１．５ＴＮは時間経過につれ粒径および散乱強度が増加し、ＴＥＭＰＯシグナルも徐々にはっきりとしていったことから、イオンを含むＰＢＳ溶媒と親和していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明は、医薬又は診断薬の製造業で利用可能である。
【図１】
2019123773.tif 000052
【図２】
2019123773.tif 000053
【図３】
2019123773.tif 000054
【図４】
2019123773.tif 000055
【図５】
2019123773.tif 000056
【図６】
2019123773.tif 000057
【図７】
2019123773.tif 000058
【図８】
2019123773.tif 000059
【図９】
2019123773.tif 000060
【図１０】
2019123773.tif 000061
【図１１】
2019123773.tif 000062
【図１２】
2019123773.tif 000063
【図１３】
2019123773.tif 000064
【図１４】
2019123773.tif 000065
【図１５】
2019123773.tif 000066
【図１６】
2019123773.tif 000067
【図１７】
2019123773.tif 000068
【図１８】
2019123773.tif 000069
【図１９】
2019123773.tif 000070
【図２０】
2019123773.tif 000071
【図２１】
2019123773.tif 000072
【図２２】
2019123773.tif 000073
【図２３】
2019123773.tif 000074
【図２４】
2019123773.tif 000075
【図２５】
2019123773.tif 000076
【図２６】
2019123773.tif 000077
【図２７】
2019123773.tif 000078
【図２８】
2019123773.tif 000079
【図２９】
2019123773.tif 000080
【図３０】
2019123773.tif 000081
【図３１】
2019123773.tif 000082
【図３２】
2019123773.tif 000083
【図３３】
2019123773.tif 000084
【図３４】
2019123773.tif 000085
【図３５】
2019123773.tif 000086
【図３６】
2019123773.tif 000087
【図３７】
2019123773.tif 000088
【図３８】
2019123773.tif 000089
【図３９】
2019123773.tif 000090
【図４０】
2019123773.tif 000091
【図４１】
2019123773.tif 000092
【図４２】
2019123773.tif 000093
【図４３】
2019123773.tif 000094
【図４４】
2019123773.tif 000095
【図４５】
2019123773.tif 000096
【図４６】
2019123773.tif 000097
【図４７】
2019123773.tif 000098
【図４８】
2019123773.tif 000099
【図４９】
2019123773.tif 000100
【図５０】
2019123773.tif 000101
【図５１】
2019123773.tif 000102
【図５２】
2019123773.tif 000103
【図５３】
2019123773.tif 000104
【図５４】
2019123773.tif 000105
【図５５】
2019123773.tif 000106
【図５６】
2019123773.tif 000107
【図５７】
2019123773.tif 000108
【図５８】
2019123773.tif 000109
【図５９】
2019123773.tif 000110
【図６０】
2019123773.tif 000111
【図６１】
2019123773.tif 000112
【図６２】
2019123773.tif 000113