(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの健康に対する、微生物叢改変の有害な影響に対抗するための、効果的なアプローチ、特に医薬品の品質規格で製造され得る組成物の提供。【解決手段】寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）少なくとも１のＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）少なくとも１のＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）少なくとも１のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含む、組成物。【選択図】図４−１
2019189609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）少なくとも１のＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）少なくとも１のＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）少なくとも１のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）が酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、酢酸塩、トリブチリン、酪酸ピバロイルオキシメチル、及びモノアセトングルコース  ３−ブチラートから成る群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
（ａ）が酪酸塩である、請求項１又は２の組成物。
【請求項４】
（ａ）が酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、及び酢酸塩の、塩の混合物である、請求項１の組成物。
【請求項５】
（ｆ）がフラジェリン、フラジェリン様配列、フラジェリンの成分、ＣＢｉｒ１、Ｆｌａ−Ｘ、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＣ及びＦｌｇＥから成る群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項６】
（ｆ）がフラジェリンである、請求項１の組成物。
【請求項７】
（ｅ）の細菌が、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＩＶからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＩＶからの細菌、クロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌の組み合わせを含む、請求項１の組成物。
【請求項８】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、酪酸塩及びフラジェリンを含む、組成物。
【請求項９】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、及び酢酸塩の、塩の混合物並びにフラジェリンを含む、組成物。
【請求項１０】
組成物を結腸粘膜に選択的に指向する送達システムを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物及び医薬的に許容可能な成分を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
寛容の誘導、腸管バリアの完全性の強化、及び炎症の低減を、それらを必要とする個体においてする方法であって、請求項１〜６のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物を、該個体に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、及び感染性疾患から選択される少なくとも１の疾患の治療、治療補助、重篤度の低減、又は予防を、それらを必要とする個体においてする方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物を該個体に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
投与が結腸送達システムを伴う、請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法において用いるための医薬を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
クロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌に発現する抗原に特異的なＴ細胞の活性化を決定する方法であって、（ａ）該抗原を認識する細胞を含むと疑われる被験体由来の試料を提供する工程；（ｂ）試料と該抗原のエピトープを含有するＭＨＣクラスＩＩテトラマー複合体とを接触させる工程；及び（ｃ）試料の細胞とエピトープを含有するＭＨＣクラスＩＩテトラマーとの結合が生じているか否か決定する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
腸内微生物叢に由来する分子の治療用の組み合わせ、より具体的には、結腸送達システムを介して経口投与されるタンパク質抗原と小分子との、治療用の組み合わせが本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒトを含む動物は、口、食道、胃、小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸、膣、皮膚、鼻腔、耳、及び肺を含む解剖学的部位に、数多くの微生物（宿主微生物叢と総称される）を有している。ヒトの微生物叢は、数多くの重要な過程（特に、免疫系の発生、糖質、タンパク質、及び生体異物の代謝、上皮の形成及び再生、脂肪の貯蔵、ホルモンの産生、ビタミンの産生、並びに病原体感染の防御を含む）に関与している（Ｈｏｏｐｅｒ  ＬＶ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９２：１１１５；Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  Ｓ，Ｐａｇｌｉｎｏ  Ｊ，Ｅｓｌａｍｉ−Ｖａｒｚａｎｅｈ  Ｆ，Ｅｄｂｅｒｇ  Ｓ，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．Ｃｅｌｌ．２００４；１１８：２２９；Ｂａｃｋｈｅｄ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４；１０１：１５７１８；Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  ＴＳ，Ｈｏｏｐｅｒ  ＬＶ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２；９９：１５４５１；ｌ  Ｓｏｎｎｅｎｂｕｒｇ  ＪＬ，Ａｎｇｅｎｅｎｔ  ＬＴ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：５６９；Ｈｏｏｐｅｒ  ＬＶ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９１：８８１）。抗生物質の使用、過度の衛生状態、食事制限、遺伝的背景、又は上記の組み合わせ等の多くの要因によって惹起され得るヒト微生物叢の改変が、特に、多くの感染性疾患（例、Ｃ．ディフィシルの感染）、炎症性疾患、自己免疫疾患、及びアレルギー疾患（例、潰瘍性大腸炎、クローン病、１型糖尿病、食物アレルギー、喘息、関節リウマチ）、並びに代謝性疾患（例、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、栄養失調）に関連している。これらの改変により、無害な食物抗原又は無害な共生細菌抗原に対する寛容の喪失、引き続く過剰な炎症反応、代謝調節異常、及び腸組織への（腸管内腔と体循環との間のバリアとしての役目を果たすその能力を無効にする）損傷がもたらされ得る。微生物叢改変の、健康に対する有害な影響に対抗するアプローチは、かかる改変がヒトの病状の進行に重要な役割を果たすにもかかわらず、限られる。微生物叢を調節することが知られている治療介入としては、抗生物質、プレバイオティクス、プロバイオティクス及び糞便移植が挙げられるが、これらはそれぞれ効果が限られ、潜在的な副作用を有する。ヒトの健康に対する、微生物叢改変の有害な影響に対抗するための、効果的な更なるアプローチ、特に医薬品の品質規格で製造され得る組成物が、明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
要旨
ヒトの健康に対する、微生物叢改変の有害な影響に対抗し、有効であり、及び医薬品規格で製造され得る組成物を提供することが本開示の目的である。特に、微生物叢に対する寛容を誘導し、腸管バリアを強化し、及び代謝及び免疫の恒常性を維持又は回復する薬物を開発するために、宿主に対する有益な効果に関与する微生物叢によって産生される、生理学的に活性のある物質を同定すること、及びそれらの物質を、それらがかかる有益な効果を調節し得る、まさにその解剖学的部位に送達する方法を考案することは望ましいであろう。
【０００４】
本開示の組成物及び方法は、当該技術分野における上記課題を考慮して開発された。特定の微生物叢由来抗原及び微生物叢由来小分子は、組み合わせで、寛容、腸管バリアの完全性及び炎症の低減の、個々又はそれらのいずれかの組み合わせの誘導に対して（例、寛容及び腸管バリアの完全性の誘導に対して、寛容及び炎症の低減の誘導に対して、腸管バリアの完全性及び炎症の低減の誘導に対して、又は、寛容、腸管バリアの完全性及び炎症の低減の誘導に対して、相乗効果を有する。（１）（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは１以上の短鎖脂肪酸誘導体、（ｂ）（少なくとも１の、１以上の）ＧＰＲ１０９リガンド、（ｃ）（少なくとも１の、１以上の）ＧＰＲ４３リガンド、（ｄ）（少なくとも１の、１以上の）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、（ｅ）クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の細菌由来の１以上の抗原、又はクロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩのいずれかの組み合わせからの細菌由来の１以上の抗原（例、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩ由来の１以上の抗原、クロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌由来の１以上の抗原、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌由来の１以上の抗原）、或いは（ｆ）（少なくとも１の、１以上の）フラジェリンポリペプチドを含むか、或いは（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの少なくとも１との組み合わせを含み；（２）寛容を誘導し（例、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖及び／若しくは蓄積を誘導し）、腸管バリアの完全性を強化し、炎症を低減するか、又はそれらのいずれかの組み合わせをする組成物が、本明細書中に記載される。例えば、組成物は、（１）（ａ）及び（ｅ）、（ａ）及び（ｆ）、（ｂ）及び（ｅ）、（ｂ）及び（ｆ）、（ｃ）及び（ｅ）、（ｃ）及び（ｆ）、（ｄ）及び（ｅ）又は（ｄ）及び（ｆ）の組み合わせを含み；並びに（２）単に寛容を誘導する、単に腸管バリアの完全性を強化する、単に炎症を低減する、寛容を誘導し及び腸管バリアの完全性を強化する、寛容を誘導し及び炎症を低減する、腸管バリアの完全性を強化し及び炎症を低減する、又は寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し及び炎症を低減するものであり得る。
【０００５】
いくつかの実施形態においては、（ｇ）の組み合わせとしては：以下：（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは１以上の短鎖脂肪酸誘導体；又は（ｂ）（少なくとも１の、１以上の）ＧＰＲ１０９リガンド；又は（ｃ）（少なくとも１の、１以上の）ＧＰＲ４３リガンド；又は（ｄ）（少なくとも１の、１以上の）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤のうちの１つと：（ｅ）クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の細菌由来の１以上の抗原、又はクロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩのいずれかの組み合わせからの細菌由来の１以上の抗原（例、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原；クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌由来の１以上の抗原；クロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌由来の１以上の抗原、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌由来の１以上の抗原、クロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌由来の１以上の抗原及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌由来の１以上の抗原）又は（ｆ）（少なくとも１の、１以上の）フラジェリンポリペプチドのいずれかの、いずれかとの組み合わせが挙げられる。
【０００６】
（１）（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）（少なくとも１以上の）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｅ）クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌の１以上に由来する抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と、（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含み、（２）寛容（例、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖及び／又は蓄積）を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、並びに炎症を低減する組成物が、本明細書中に記載される。本発明は腸内微生物叢由来分子の、治療用の組み合わせ、より具体的には結腸送達システムを用いて経口投与される、タンパク質抗原と小分子との組み合わせに属する。
【０００７】
１つの実施形態においては、短鎖脂肪酸又は短鎖脂肪酸誘導体は：酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、酢酸塩、トリブチリン、酪酸ピバロイルオキシメチル、及びモノアセトングルコース  ３−ブチラートから成る群から選択される物質である。１つの実施形態においては、ＧＰＲ１０９リガンドは：ピリジン−３−カルボキシル酸（ナイアシン又はビタミンＢ３としても知られる）、ナイアシン誘導体、４，５−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−５−フェニル−２−フランカルボキシル酸、５−カルボキシ−２−メチル−１−オキシドピラジン−１−イウム、ＧＳＫ−２５６０７３、ＧＳＫ２５６０７３、ＡＲＩ−３０３７ＭＯ、ＩＮＣＢ０１９６０２、ＩＮＣＢ１９６０２、ＭＫ−０３５４、ＭＫ−０３５４、バルビツール酸誘導体、アントラニル酸誘導体、ピラゾール誘導体、イソキサゾール誘導体、キサンチン誘導体、シクロアルカン誘導体、ピラゾロピリミジン、及びチオフェン（ｔｈｙｏｐｈｅｎｅ）から成る群から選択される物質である。１つの実施形態においては、ＧＰＲ４３リガンドは：酢酸塩、ギ酸塩、フェニルアセトアミド  １  ［（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチル−Ｎ−（チアゾール−２−イル）ブタンアミド］、フェニルアセトアミド  ２  ［（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（５−フルオロチアゾール−２−イル）−３−メチルブタンアミド］、プロピオン酸塩、及び吉草酸塩から成る群から選択される物質である。他の態様においては、ＨＤＡＣ阻害剤は：トリコスタチンＡ、（Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド）、２−（４−ブトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、ＭＳ−２７５、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、及びＲＧ  ２８３３から成る群から選択される物質である。いくつかの実施形態においては、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌由来の１以上の抗原は：熱処理された、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の不活化細菌、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の細菌からの精製膜画分、フラジェリン、フラジェリン様配列、フラジェリンの成分タンパク質、ＣＢｉｒ１、Ｆｌａ−Ｘ、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＣ及びＦｌｇＥからなる群から選択される物質である。
【０００８】
１つの実施形態においては、組成物は、Ｔｒｅｇ誘導を介して炎症を調節し、腸管バリアの透過性を制御するサイトカインである、ＴＧＦ−βの活性型産生を最も有利に促進できる、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、イソ酪酸ナトリウムを含む短鎖脂肪酸の混合物、又は酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、及びイソ酪酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない短鎖脂肪酸の、２、３、４（若しくはそれ以上）のいずれかの組み合わせを含有する。
【０００９】
本明細書中に記載の組成物は、それを必要とする個体（それを必要とする患者等）に経
口投与される。組成物は、ｐＨ感受性製剤（例、胃を通過後に、ｐＨがよりアルカリになると薬物を放出する腸溶性ポリマーで被覆された製剤）；おおよそ小腸の通過時間に等しい、３〜５時間の遅延時間の間、薬物の放出を遅延させ、それによって結腸への送達を確立する製剤；結腸粘膜への接着を選択的にもたらす生体接着性ポリマーを含有する製剤；並びに樹状細胞、腸上皮細胞、及びマクロファージに選択的に発現する受容体を標的にする分子を含有する製剤を含む、活性剤を結腸組織に選択的に送達する多くの経口形態で投与され得る。
【００１０】
１つの態様においては、本明細書中に記載の組成物の投与は、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ又はＩＬ−１０産生性ＴｒｅｇであるＴｒｅｇの誘導を惹起する。本明細書中に記載の組成物の投与に起因する、Ｔｒｅｇ増殖又は蓄積の誘導度の評価は、患者試料（生検又は血液の試料等）中の、Ｆｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇ数、ＩＬ−１０発現促進、ＣＴＬＡ４発現促進、ＩＤＯ発現促進、又はＩＬ−４発現抑制の測定による等、様々なアプローチによって行われ得る。
【００１１】
個体における免疫は、医薬組成物の投与によるか、或いは食物若しくは飲料中の、又は栄養補助食品としての組成物の摂取による等、主題の組成物の投与により抑制され得る。主題の組成物は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患を予防又は治療するため、移植臓器の免疫学的拒絶を抑制するため、又は癌を治療するために用いられ得る。
【００１２】
寛容の誘導、腸管バリアの強化及び／又は炎症の低減を、それらを必要とする個体においてする方法も本明細書中で提供される。該方法は、個体に、本明細書中に記載の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態においては、該組成物は、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）ＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）ＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、及びＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含み、状態又は疾患の予防、低減又は治療を必要とする個体に投与される。
【００１３】
被験体における寛容の誘導を検出及び定量するための方法も提供される。該方法は、被験体由来試料において、クロストリジウムクラスターＩＶに属する細菌、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌に発現する抗原を認識するＴｒｅｇ数を定量する。いくつかの実施形態においては、Ｔｒｅｇに認識される抗原はフラジェリンである。蛍光色素が結合した、４つのビオチン結合部位を有する分子であるストレプトアビジンを含む、４つのＭＨＣクラスＩＩのテトラマーを含む複合体が調製される。所望のエピトープ、例えばクロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌に発現する抗原中に存在するエピトープをコードするポリヌクレオチドの組換え発現により、ＭＨＣクラスＩＩ鎖が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、酪酸塩（Ｂｕｔ）が、インビトロで、Ｔｒｅｇ細胞の蓄積を誘導することを示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図２】図２は、抗アセチルヒストンＨ３抗体（ＡｃＨ３）又は陰性対照としてのウサギＩｇＧを用いて、酪酸塩を含めて（白棒）か、又は含めない（黒棒）で培養したＣＤ４＋Ｔ細胞で行った、Ｆｏｘｐ３のプロモーター及びエンハンサー領域のＣｈＩＰ−ＰＣＲ解析を示す。
【図３】図３は、０．５ｍＭの酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、イソ酪酸ナトリウムのいずれかか、又はそれらの混合物（ＳＣＦＡミックス）で２４時間刺激された上皮細胞株ＨＴ２９の培養上清中の活性型ＴＧＦ−β濃度を示す。
【図４−１】図４ａは、同種抗原により引き起こされる抑制アッセイの模式図を示す。
【図４−２】図４ｂは、クロストリジウム細菌が定着したノトバイオートマウスの固有層中のＴｒｅｇにより、クロストリジウム抗原が認識されることを示す。
【図５】図５は、１７のクロストリジウム株の混合物が定着したノトバイオートマウス由来の、固有層のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞の、ＯＴ−Ｉ  オボアルブミンペプチドにより引き起こされる増殖を相当程度阻害し、オートクレーブされた、クロストリジウムが定着したマウスからの盲腸内容物、又は、オートクレーブされた、インビトロでの培養クロストリジウム株の存在下で、この抑制が顕著に亢進されたが、ＯＴ−ＩＩ  ＯＶＡペプチド又はＧＦマウスからの盲腸内容物存在下ではそうではなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
Ｉ．定義
用語「微生物叢」は、集合的に、ヒト等の高等動物に関連して見出される微生物全体を指す。
【００１６】
用語「片利共生生物」は、宿主にとって通常無害であり、該宿主と共生関係も成立させ得る生物を指す。
【００１７】
用語「ヒト微生物叢」は、人体中の微生物全体、それらの遺伝学的要素全体（ゲノム）、及び環境相互作用全体を指す。
【００１８】
用語「寛容」及び「免疫寛容」は、免疫系が抗原を攻撃しなくする過程を指す。
【００１９】
用語「寛容誘導」又は「寛容を誘導する」は、免疫系を操作することで、外部抗原に対する寛容をもたらすことができる過程を指す。
【００２０】
用語「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」は、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容に関与するＴ細胞を指す。制御性Ｔ細胞は、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４陽性のＴ細胞である。本発明の制御性Ｔ細胞には、ＩＬ−１０産生性のＣＤ４陽性Ｔ細胞である、転写因子Ｆｏｘｐ３陰性の制御性Ｔ細胞も含まれる。
【００２１】
用語「制御性Ｔ細胞の増殖又は蓄積を誘導する」は、未成熟Ｔ細胞の制御性Ｔ細胞への分化（該分化は制御性Ｔ細胞の増殖及び／又は蓄積をもたらす）の誘導効果を指す。更に、「制御性Ｔ細胞の増殖又は蓄積を誘導する」の意味には、インビボの効果、インビトロの効果、及びエックスビボの効果が含まれる。
【００２２】
用語「腸管バリアの完全性を強化する」は、内腔「外側」と宿主組織との間のバリアとして、その透過性及び漏出を減少させることにより作用する、消化管上皮バリアの能力を向上させる過程を指す。自己免疫疾患及び炎症性疾患に罹った患者においては、腸のバリア機能に関するいくつかの異常が見出されている。例えば、「腸管壁浸漏」は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）発症における最初の異常であるし；ＮＳＡＩＤ等の、バリアを損傷させる物質は、ＩＢＤ患者において、炎症を惹起し、腸管バリアにおける異常は慢性的な腸内炎症をもたらすのに十分である。
【００２３】
ＩＩ．寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物
著者らは、動物において結腸制御性Ｔ細胞を誘導し、ＩＢＤの発症を予防する能力を有することが以前示されていた（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３１（６０１５）：３３７−４１，２０１１）、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌が、共同して、相乗作用をもって寛容を誘導し、バリア機能を強化し、及び炎症を低減する２種類の分泌物を産生することを発見した。該２種類の分泌物は、短鎖脂肪酸、特に酪酸塩、及びタンパク質抗原、特にフラジェリンポリペプチドである。
【００２４】
寛容を誘導（例、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖及び／又は蓄積を誘導）し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する組成物が、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態においては、該組成物は、有効成分として、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）（少なくとも１以上の）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含む。
【００２５】
１つの実施形態においては、短鎖脂肪酸は：酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、及び酢酸塩から成る群から選択される物質である。かかる分子は、ヒト結腸において、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌によって、天然に大量に産生される。好ましい実施形態においては、短鎖脂肪酸物質は酪酸塩である。対応する天然物と同様の性質を有する、トリブチリン、ピバロイルオキシメチル酪酸、及びモノアセトングルコース  ３−ブチラート等の、酪酸塩の合成誘導体も、この趣旨で用いられ得る。
【００２６】
酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、及びイソ酪酸ナトリウムの混合物を含有する組成物は、上皮細胞株の培養上清において、活性型ＴＧＦ−βの産生を最も有利に促進できる。活性型ＴＧＦ−βに富む環境は、今度はＴｒｅｇの増幅及び分化を補助し、炎症を低減し、並びに腸管バリアの完全性を強化する。
【００２７】
１つの実施形態においては、ＧＰＲ１０９Ａに結合する物質が、本明細書中に記載の組成物の成分として用いられ得る。ＧＰＲ１０９Ａは、当該技術分野で以前示された通り、酪酸塩を低親和性で認識し、結腸及び腸の上皮細胞の内腔に面する頂端膜に発現する、Ｇタンパク質共役受容体である。結腸内腔における典型的な酪酸塩濃度（ミリモラー）は、受容体の活性化を最大にするのに十分である。本明細書中に記載の組成物の成分として用いられるＧＰＲ−１０９Ａ結合物質は：ピリジン−３−カルボキシル酸（ナイアシン又はビタミンＢ３としても知られる）、ナイアシン誘導体、４，５−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−５−フェニル−２−フランカルボキシル酸、５−カルボキシ−２−メチル−１−オキシドピラジン−１−イウム、ＧＳＫ−２５６０７３、ＧＳＫ２５６０７３、ＡＲＩ−３０３７ＭＯ、ＩＮＣＢ０１９６０２、ＩＮＣＢ１９６０２、ＭＫ−０３５４、ＭＫ−０３５４、バルビツール酸誘導体、アントラニル酸誘導体、ピラゾール誘導体、イソキサゾール誘導体、キサンチン誘導体、シクロアルカン誘導体、ピラゾロピリミジン、及びチオフェン（ｔｈｙｏｐｈｅｎｅ）から成る群から選択され得る。
【００２８】
１つの実施形態においては、ＧＰＲ４３に結合する物質が、本明細書中に記載の組成物の成分として用いられ得る。ＧＰＲ４３は、酢酸塩及びプロピオン酸塩を認識するＧタンパク質共役受容体である。本明細書中に記載の組成物の成分として用いられるＧＰＲ４３
結合物質は：酢酸塩、ギ酸塩、フェニルアセトアミド  １  ［（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチル−Ｎ−（チアゾール−２−イル）ブタンアミド］、フェニルアセトアミド  ２  ［（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（５−フルオロチアゾール−２−イル）−３−メチルブタンアミド］、プロピオン酸塩、及び吉草酸塩から成る群から選択され得る。
【００２９】
１つの実施形態においては、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を阻害する物質が、本明細書中に記載の組成物の成分として用いられ得る。酪酸塩によるナイーブＴ細胞の処理で、Ｆｏｘｐ３遺伝子座のヒストンＨ３のアセチル化が亢進され、従って酪酸塩は、エピジェネティックな修飾を介してＴｒｅｇ細胞の分化を調節する。本明細書中に記載の組成物の成分として用いられるＨＤＡＣ阻害物質は：トリコスタチンＡ、（Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド）、２−（４−ブトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、ＭＳ−２７５、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、及びＲＧ  ２８３３から成る群から選択され得る。
【００３０】
短鎖脂肪酸の産生単独では、クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＶＩＩＩに属する細菌の、寛容を誘導し、バリア機能を強化し、及び炎症を低減する能力は十分に説明されない。クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＩＶａ、又は（ｏｒ  ｏｒ）クロストリジウムクラスターＶＩＩＩに属する細菌が発現する抗原も、寛容を誘導し、バリア機能を強化し、及び炎症を低減することに寄与する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組成物は：熱処理された、クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の不活化細菌又はクロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌のいずれかの組み合わせ；クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の細菌又はクロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌のいずれかの組み合わせからの精製膜画分、フラジェリン、フラジェリン様配列、フラジェリンの成分タンパク質、ＣＢｉｒ１、Ｆｌａ−Ｘ、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＣ及びＦｌｇＥからなる群から選択される１以上の細菌抗原を含有する。精製膜画分は、細菌細胞の他の成分から、少なくとも部分的に精製された、細菌の膜を指す。クロストリジウムクラスターＩＶ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌からの精製膜画分は、細菌細胞の機械的な破砕に続く超遠心分離、続いてのトリフルオロエタノール及びクロロホルムによる抽出等の、当該技術分野における公知の方法を用いることにより得ることができる。好ましい実施形態においては、精製膜画分は、クロストリジウム・サッカログミア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｇｕｍｉａ）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｏｓｕｍ）ＪＣＭ１２９８、クロストリジウム・ラモーサム、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ  ２９７９９、クロストリジウム・ハセワイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈａｔｈｅｗａｙｉ）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＷＭ１、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｓｐ．）ＭＡＮＧ、クロストリジウム・サッカロリティカム、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）５＿１＿５７ＦＡＡ、ラクノスピラ科細菌６＿１＿６３ＦＡＡ、クロストリジウム菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）１４６１６、クロストリジウム・ボルテアエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ）Ａ
ＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３、ｃｆ．クロストリジウム菌種（ｃｆ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｓｐ．）ＭＬＧ０５５、エリシペロトリクス科細菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２＿２＿４４Ａ、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）、クロストリジウム・ボルテアエ、ラクノスピラ科細菌ＤＪＦ＿ＶＰ３０、ラクノスピラ科細菌３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１、アナエロツルンカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、アナエロツルンカス・コリホミニスＤＳＭ  １７２４１、ルミノコッカス菌種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＤ８、ラクノスピラ科細菌２＿１＿４６ＦＡＡ、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ）ＤＳＭ１５９８１、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、クロストリジウム・シンビオサムＷＡＬ−１４１６３、ユーバクテリウム・コントルタム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ）、クロストリジウム菌種Ｄ５、オシロスピラ科細菌（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＭＬ  ０６１０４８、オシリバクター・バレリシゲネス（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ）、ラクノスピラ科細菌Ａ４、クロストリジウム菌種３１６００２／０８、及びクロストリジウム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿７＿４７ＦＡＡ、ブラウティア・ココイデス（Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｏｉｄｅｓ）、及びアナエロスティペス・カカエＤＳＭ  １４６６２から選択される、クロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する１以上の細菌又はクロストリジウムクラスターＩＶ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌のいずれかの組み合わせから得られる。フラジェリンタンパク質は、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、及びＸＶＩＩＩに属する細菌により、大量に産生される。フラジェリン、フラジェリン様配列、フラジェリンの成分タンパク質、及びフラジェリンポリペプチドは、例えば、細菌の組換え宿主内での産生、又は液相若しくは固相のペプチド合成を含む、当該技術分野で公知の方法を用いて製造され得る。
【００３１】
該組成物は、医薬組成物、栄養補助食品、又は食料若しくは飲料（動物試料でもあり得る）の形態で投与されてもよく、或いは動物モデル実験用の試薬として用いられてもよい。該組成物は、免疫抑制効果を有する組成物として、好適に用いられ得る。免疫抑制効果は、例えば、以下のようにして評価され得る。本発明の組成物が経口投与されたマウス等の実験動物から単離された制御性Ｔ細胞が、脾臓から単離されたエフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞）に作用するよう惹起され、その増殖能が、［３Ｈ］チミジンの取り込み量を指標として用いることにより測定される。
【００３２】
該組成物が治療（有害作用の軽減又は予防）に有用な対象疾患の具体的な例としては、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染性疾患、及び臓器移植における拒絶反応である、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、スプルー、自己免疫性関節炎、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、骨髄移植に続く移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病（パセドゥ病）、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性
肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群１型及び多腺性機能不全症候群２型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化、アレルギー性大腸炎、アトピー性アレルギー、食物アレルギー（ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、卵アレルギー、乳アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、魚介アレルギー、貝アレルギー又はゴマアレルギー等）、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織関連疾患肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺（１ｕｎｇ）疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ１抗体肝炎）、自己免疫性低血糖、黒色表皮腫によるＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した急性免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症又はＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全てのサブタイプに関する）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎（花粉アレルギー）、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、皮膚エリテマトーデス、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、並びに下痢等が挙げられる。
【００３３】
組成物が治療に有用である対象疾患の更なる例としては、結腸癌、嚢胞性線維症、セリアック病、２型糖尿病、及び自閉症関連の免疫病が挙げられる。これらの疾患は、胃腸の微生物叢における、クロストリジウムクラスターＩＶ及びＸＩＶに属する細菌の減少、又はクロストリジウムクラスターＩＶ若しくはクロストリジウムクラスターＸＩＶに属する細菌の減少を特徴とする。
【００３４】
本明細書中に記載の組成物は、例えば、免疫により惹起された過度の炎症に起因するか、又は患者の微生物叢の改変に起因する損傷のために感染性疾患への抵抗性が損なわれた個体における、感染性疾患の、予防又は治療用の医薬組成物としても用いられ得る。宿主恒常性の維持又は回復を損ない、結果的に、かかる免疫病理学的な組織損傷を引き起こす感染性病原体の例としては、サルモネラ属、シゲラ属、クロストリジウム・ディフィシル、マイコバクテリウム属（結核症を惹起する）、原虫（マラリアを惹起する）、糸状線虫類（フィラリア症を惹起する）、シストソーマ属（住血吸虫症を惹起する）、トキソプラズマ属（トキソプラズマ症を惹起する）、リーシュマニア属（リーシュマニア症を惹起する）、ＨＣＶ及びＨＢＶ（Ｃ型肝炎症及びＢ型肝炎症を惹起する）、及び単純ヘルペスウイルス（ヘルペス症を惹起する）が挙げられる。
【００３５】
投与又は摂取されるべき組成物量は、それを受容する個体の年齢、体重、性別、状態、健康状態、及び投与又は摂取されるべき組成物の種類（医薬品、食料又は飲料）等の要因を考慮して経験的に決定され得る。例えば、投与又は摂取ごとの量は、一般的には０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、特定の実施形態においては１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。組成物は、個体に１回投与されてもよいし、１回を超えて投与されてもよい。組成物が１回を超えて投与される場合は、定期的（例えば、１日１回、２日ごとに１回、週に１回、２週ごとに１回、月１回、６ヶ月ごとに１回、又は年１回）、又は必要に応じて又は不定期的に投与され得る。適切な投与回数（とりわけ宿主の遺伝的特徴、年齢、性別、及び被験体の健康状態又は疾病状態の要因に左右され得る）は、経験的に決定され得る。
【００３６】
ＩＩＩ．送達システム
クロストリジウム由来の短鎖脂肪酸とクロストリジウム由来の抗原との、寛容の誘導、腸管バリアの完全性、及び炎症の低減に対する組み合わせ効果は、これらの物質の、腸管バリアへの物理的近接性に強く依存する。生理学的な関連では、これらの物質は、典型的には結腸壁にごく近接して生存する細菌により分泌される。クロストリジウム由来の短鎖脂肪酸及びクロストリジウム由来の抗原が、結腸送達システムで製剤化されずに被験体に経口投与される場合、クロストリジウム由来の抗原は、消化管中を通過する間にプロテアーゼによって分解され、短鎖脂肪酸は、結腸に到達する前に小腸で迅速に吸収されるため、これらが有する効果は限定的又は不十分である。本明細書中に記載の組成物を、結腸組織を標的に選択して放出する送達システムで製剤化することにより、寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を増大させ、及び炎症を低減させる、該組成物の能力が非常に強化される。
【００３７】
結腸への送達を可能にするための総合的戦略
薬物の、結腸への全般的送達を可能にする非常に多くの方法が、当該技術分野で記述されており、それらのいずれもが、結腸中のニッチへの送達を向上するために、本発明の新規特徴と組み合わせられ得る。かかる方法としては、ｐＨ感受性製剤（例、胃を通過後、ｐＨがよりアルカリの範囲へと移る際に薬物を放出する腸溶性ポリマーで被覆された製剤）；薬物の放出を遅延時間３〜５時間の間（おおよそ小腸の通過時間に相当）遅らせ、それによって結腸への送達を確立する製剤；結腸粘膜への選択的な接着をもたらす生体接着性ポリマーで被覆した薬物（例、米国特許第６，３６８，５８６号を参照）；消化管において、タンパク質分解活性が生物学的薬剤を分解するのを防止するために、プロテアーゼ阻害剤を組み込んだ送達システム；並びにＣＤ２０５  樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３結合ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）及びランゲリン等の、樹状細胞に選択的に発現する受容体、腸上皮細胞に選択的に発現する受容体、並びにマクロファージに選択的に発現する受容体を標的とする、アニオン性脂質、ムラミルトリペプチド（ＭＴＰ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）、抗ＶＣＡＭ１、抗ＣＣ５２、抗ＣＣ５３１、抗ＣＤ１１ｃ／ＤＥＣ−２０５、レクチン（Ｍａｎｎ−Ｃ４−Ｃｈｏｌ、Ｍａｎ２ＤＯＧ、アミノプロピル−α−Ｄ−マンノピラノシド、Ｍａｎ３−ＤＰＰＥ等）、ウシ血清アルブミン誘導体、Ｏ−ステロイルアミロペクチン、フィブロネクチン、及びガラクトシル等の分子を含有する製剤が挙げられる。
【００３８】
製剤は、安全且つ有効であると考えられ、望ましくない生物学的副作用又は好ましくない相互作用を惹起せずに個体に投与され得る物質で構成される、医薬的に許容される「担体」を用いて調製される。該「担体」は、医薬製剤中に存在する、有効成分（単数）又は有効成分（複数）以外の全ての成分である。用語「担体」としては、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、充填剤及び被覆組成物が挙げられるがそれらに限定されない。「担体」としては、可塑剤、色素、着色剤、安定化剤及びグリダント（ｇｌｉｄａｎｔｓ）を含み得
る被覆用組成物の全ての成分も挙げられる。遅延放出投与製剤は、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｔａｂｌｅｔｓ”，Ｌｉｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ−Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”，第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００，及び“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，第６版，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）（これは、錠剤及びカプセル剤、並びに錠剤、カプセル剤及び顆粒剤の遅延放出の投薬形態の調製用の、担体、材料、装置及び方法に関する情報を提供している）等の参考文献に記載の通りに調製され得る。
【００３９】
好適な被覆材料の例としては、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート等のセルロースポリマー；ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、並びにメタクリル樹脂（商品名Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）（Ｒｏｔｈ  Ｐｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で市販されている）、ゼイン、シェラック並びに多糖類が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４０】
さらに、被覆材料は、可塑剤、色素、着色剤、グリダント、安定化剤、細孔形成剤（ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍｅｒｓ）及び界面活性剤等の従来の担体を含有し得る。
【００４１】
薬物を含有する錠剤、ビーズ、顆粒又は粒子に存在する、医薬的に許容可能な任意の賦形剤としては、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、安定化剤及び界面活性剤が挙げられるがそれらに限定されない。希釈剤（「充填剤」とも称される）は、典型的には、錠剤の圧縮又はビーズ及び顆粒の形成のために実用的な大きさを与えるために、固体投与形態の嵩を増加させるのに必要である。好適な希釈剤としては、例えば、リン酸二カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、加水分解デンプン、アルファー化デンプン、二酸化珪素、酸化チタン、珪酸アルミニウムマグネシウム及び粉糖が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４２】
結合剤は、固体の投与製剤に凝集性の性質を付与するため、従って、錠剤又はビーズ又は顆粒の原型を、投与形態の形成後に確実に保つために用いられる。好適な結合剤物質としては、デンプン、アルファー化デンプン、ゼラチン、糖（スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース及びソルビトールが挙げられる）、ポリエチレングリコール、ワックス、アラビアゴム、トラガカントゴム等の天然又は合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースを含むセルロース、並びにビーガム（ｖｅｅｇｕｍ）、並びにアクリル酸コポリマー及びメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリアクリル酸／ポリメタクリル酸並びにポリビニルピロリドン等の合成ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４３】
滑沢剤は、錠剤の製造を容易にするために用いられる。好適な滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、グリセロールベヘネート、ポリエチレングリコール、タルク、及び鉱物油が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４４】
崩壊剤は、投与後に、投与形態の崩壊又は「分解」を容易にするするために用いられ、
一般的にデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、アルファー化デンプン、粘土、セルロース、アルギニン（ａｌｇｉｎｉｎｅ）、ゴム又は架橋ＰＶＰ（ＧＡＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ  からのＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ  ＸＬ）等の架橋ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４５】
安定化剤は、薬物分解反応（例として、酸化反応が挙げられる）を阻害する、又は遅らせるために用いられる。
【００４６】
界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、両性又はノニオン性の表面活性化剤であり得る。好適なアニオン性界面活性剤としては、カルボキシル酸塩、スルホン酸塩及び硫酸塩のイオンを含有するものが挙げられるが、それらに限定されない。アニオン性界面活性剤の例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の、長鎖のアルキルスルホン酸及びアルキルアリールスルホン酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム；ビス−（２−エチルチオキシル）−スルホコハク酸ナトリウム等の、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム；及びラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩が挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ポリオキシエチレン及びココナッツアミン等の第４級アンモニウム化合物が挙げられるが、それらに限定されない。ノニオン性界面活性剤の例としては、エチレングリコールモノステアレート、プロピレングリコールミリステート、グリセリルモノステアレート、グリセリルステアレート、ポリグリセリル−４−オレエート、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ＰＥＧ−１５０ラウレート、ＰＥＧ−４００モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、及びポリオキシエチレン水添タロウアミドが挙げられる。両性界面活性剤の例は、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアムフォアセテート、ラウリルベタイン及びラウリルスルホベタインが挙げられる。
【００４７】
所望される場合、錠剤、ビーズ顆粒又は粒子は、少量の、湿潤剤又は乳化剤、染料、ｐＨ緩衝剤、及び保存剤等の非毒性補助物質を含んでいてもよい。
【００４８】
当業者に理解され、関連する教科書及び文献中に記載されているように、種々の薬物放出プロファイルを提供する薬物含有錠剤、ビーズ、顆粒又は粒子を調製するために、多くの方法が利用可能である。かかる方法としては、以下：適切な被覆材料により薬物又は薬物含有組成物を被覆する（通常は、ポリマー物質を必ず取り入れなければならないというわけではない）；薬物粒子サイズを増大する；マトリクス内に薬物を入れる；及び好適な錯化剤により薬物の錯体を形成する、といったものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４９】
遅延放出投与単位形態は、従来の技術（例、従来の被覆パン（ｃｏａｔｉｎｇ  ｐａｎ）、無気吹付法、流動床被覆装置（Ｗｕｒｓｒａｒ挿入部を備えるか、又は備えない）など）を使用する遅延放出ポリマー被覆により被覆され得る。錠剤及び遅延放出投与形態を調製するための材料、装置及び過程に関する詳細な情報については、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９）及びＡｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ
ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第６版（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）を参照。
【００５０】
持続放出錠剤を調製するための好ましい方法は、薬物を含有する配合物（例、直接配合、湿式顆粒化又は乾式顆粒化過程を用いて調製された顆粒の配合物）を圧縮することによる。持続放出錠剤は、圧縮ではなく、好適な水溶性滑沢剤を含有する湿潤物質から出発して成形してもよい。しかしながら、好ましくは、錠剤は成形ではなく、圧縮を用いて製造される。持続放出の薬物を含有する配合物を形成するための好ましい方法は、薬物粒子を、１以上の、希釈剤（又は充填剤）、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、グリダント、及び着色剤等の賦形剤と直接混合することである。直接配合の代替として、湿式顆粒化又は乾式顆粒化法を用いて、薬物を含有する配合物を調製し得る。活性剤を含有するビーズも、多くの慣用的な技術のいずれか一つによって、典型的には流体の分散から出発して調製し得る。例えば、薬物を含有するビーズを調製するための典型的な方法は、活性剤を、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、タルク、金属ステアリン酸塩、二酸化ケイ素、可塑剤等といった医薬賦形剤を含有する被覆用懸濁液又は溶液中に分散又は溶解させることを含む。混合物は、約２０〜６０メッシュの大きさを有する糖の球（又はいわゆる“ノンパレイユ”）の等のビーズの核を被覆するために用いられる。
【００５１】
薬物のビーズを調製するための代替の方法は、薬物を、微結晶セルロース、ラクトース、セルロース、ポリビニルピロリドン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、崩壊剤、等といった１以上の医薬的に許容可能な賦形剤と配合し、配合物を押出し、押出物を球状化し、乾燥し、そして必要に応じて被覆して、即時放出ビーズを形成することによる。
【００５２】
遅延放出製剤は、胃の酸性環境で不溶性であり、小腸の中性環境で可溶性であるポリマーのフィルムで、固体投与形態を被覆することによって形成される。遅延放出投与単位は、例えば、薬物又は薬物含有組成物を、選択された被覆材料で被覆することによって調製され得る。薬物含有組成物は、例えば、カプセルに組み込まれる錠剤、「被覆コア」投与形態における内部コアとして用いられる錠剤、又は錠剤若しくはカプセルのいずれかに組み込まれる複数の薬物含有ビーズ、粒子若しくは顆粒であり得る。好ましい被覆材料としては、生体内分解性、漸次加水分解性、漸次水溶性、及び／又は酵素分解性のポリマーが挙げられるが、従来の「腸溶性」ポリマーであり得る。腸溶性ポリマーは、当業者に理解されるように、下部消化管のより高いｐＨ環境において可溶性になるか、又は投与形態が消化管を通るにつれてゆっくり浸食される。一方、酵素分解性ポリマーは、下部消化管、特に結腸中に存在する細菌性酵素によって分解される。遅延放出を達成するのに好適な被覆材料としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート及びカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロースポリマー、；アクリル酸ポリマー及びコポリマー（好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル及び／又はメタクリル酸エチルから形成される）、並びにＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ３０Ｄ−５５及びＬ１００−５５（ｐＨ５．５及びそれ以上で可溶性）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ−１００（ｐＨ６．０及びそれ以上で可溶性）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ（より高いエステル化度の結果として、ｐＨ７．０及びそれ以上で可溶性）、並びにＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＮＥ、ＲＬ及びＲＳ（種々の程度の透過性及び膨張性（ｅｘｐａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）を有する水不溶性ポリマー）を含む、商品名Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）（Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ；Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で商業的に入手可能な他のメタクリル樹脂；ポリビニルピロリドン、ビニルアセテート、ビニルアセテートフタレート、ビニルアセテートクロトン酸コポリマー、及びエチレン−ビニルアセテートコポリマー等のビニルポリマー及びコポリマー；アゾポリマー
、ペクチン、キトサン、アミロース及びグァーガム等の酵素分解性ポリマー；ゼイン及びシェラックが挙げられるがそれらに限定されない。種々の被覆材料の組み合わせも用いられ得る。種々のポリマーを用いた多層被覆物も適用し得る。
【００５３】
被覆組成物は、可塑剤、色素、着色剤、安定化剤、グリダント等といった、従来の添加剤を含み得る。可塑剤は、通常、被覆物の脆性を減少させるために存在し、ポリマーの乾燥重量に対して一般に約１０重量％〜５０重量％を占める。典型的な可塑剤の例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、ジメチルフタレート、ジエチルフタレート、ジブチルフタレート、ジブチルセバケート、トリエチルシトレート、トリブチルシトレート、トリエチルアセチルシトレート、ヒマシ油及びアセチル化モノグリセリドが挙げられる。安定化剤は、好ましくは、分散液中の粒子を安定化させるのに用いられる。典型的な安定化剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート及びポリビニルピロリドン等の、ノニオン性乳化剤である。グリダントは、フィルム形成及び乾燥の際の粘着作用を減少させるのに推奨され、一般に、被覆用溶液中のポリマー重量の約２５重量％〜１００重量％を占める。１つの有効なグリダントはタルクである。ステアリン酸マグネシウム及びグリセロールモノステアレート等の、他のグリダントも用いられ得る。二酸化チタン等の色素も用いられ得る。少量の、シリコーン（例えばシメチコン）等の消泡剤も、被覆用組成物に加えられ得る。
【００５４】
粒子は、治療剤から、或いは該剤と界面活性剤との組み合わせから専ら調製され得る。粒子は様々な材料で作製され得る。無機及び有機の両方の材料が用いられ得る。例えば、セラミックスが用いられ得る。ポリマー、及び脂肪酸等の非ポリマー材料が、空気力学的に軽い粒子を形成するために用いられ得る。他の好適な材料としては、ゼラチン、ポリエチレングリコール、トレハロース、及びデキストランが挙げられるが、それらに限定されない。秒単位から月単位までにわたる分解及び放出時間を有する粒子が、粒子材料等の因子に基づいて設計及び製造され得る。
【００５５】
治療剤又は診断剤（或いは他の所望の送達用分子であり得る）の他に、粒子は、ショ糖等、ラクトース等の賦形剤、アルブミン等のタンパク質、及び／又は界面活性剤を含み得る。
【００５６】
腸溶性カプセル：「胃耐性天然ポリマー」は、本明細書で用いる場合、胃の酸性ｐＨ中では不溶性の天然ポリマー又は天然ポリマーの混合物を指す。本明細書で用いる場合、「フィルム形成性天然ポリマー」は、噴霧、ブラッシング、又は多様な工業的過程により適用される、表面の被覆に有用で、フィルム形成を遂げるポリマーを指す。大抵のフィルム形成過程において、比較的低粘度の液体被覆材が固体基材に塗布され、使用者の所望の特性を有する、固体且つ、高分子量の、ポリマーベースの粘着性フィルムへの硬化を遂げる。大抵の一般的な塗布に関して、このフィルムは０．５マイクロメーター〜５００マイクロメーター（０．０００５ミリメーター〜０．５ミリメーター、又は０．００００２インチ〜０．０２インチ）の範囲の厚さを有する。
【００５７】
「ゲル化剤」は、本明細書で用いる場合、分散媒中で水和及び分散するか、又は分散媒中に溶解すると、高度に架橋又は結合を遂げる物質を指す。分散相の、この架橋又は結合は、分散媒の粘度を変化させる。分散媒の運動が分散相によって制限され、粘度が増大する。
【００５８】
（１）胃に抵抗性の天然ポリマー；（２）フィルム形成性の天然ポリマー；及び必要に応じて（３）ゲル化剤、を含有する、胃に抵抗性のフィルム形成性組成物が、本明細書中に記載される。典型的な、胃に抵抗性の天然ポリマーとしては、典型的には線状ポリサッカライド鎖を形成する、主としてガラクツロン酸及びガラクツロン酸メチルエステル単位
からなるペクチン及びペクチン様ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。これらのポリサッカライドは、典型的には、ガラクツロン酸、ラムノース、アラビノース及びガラクトースに富む（例えば、ポリガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、並びにいくつかのアラビナン、ガラクタン及びアラビノガラクタン）。これらは、通常は、エステル化の程度によって分類される。高（メチル）エステル（「ＨＭ」）ペクチンでは、比較的高い割合のカルボキシル基がメチルエステルとして存在しており、残りのカルボキシル酸基は遊離酸又はそのアンモニウム、カリウム、カルシウム若しくはナトリウム塩としての形態である。有用な特性は、エステル化の程度及び重合の程度とともに変化し得る。メチルエステルとして存在しているカルボキシル酸単位が５０％未満のペクチンは、通常、低（メチル）エステルペクチン又はＬＭペクチンとして言及される。一般に、低エステルペクチンは、穏やかな酸又はアルカリ条件での処理により、高エステルペクチンから得られる。アルカリ性の脱エステル化過程において、アンモニアが用いられる場合、アミド化されたペクチンが、高エステルペクチンから得られる。この型のペクチンでは、残存するカルボキシル酸基の一部は、酸アミドへと変換されている。アミド化されたペクチンの有用な特性は、エステル単位とアミド単位の比率及び重合化の程度とともに変化し得る。一つの実施形態においては、胃に抵抗性の天然ポリマーは、ペクチンである。胃に抵抗性の天然ポリマーは、組成物の約５重量％未満の量で、好ましくは組成物の約２重量％〜約４重量％の量で存在する。
【００５９】
典型的なフィルム形成性天然ポリマーとしては、ゼラチン及びゼラチン様ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態においては、フィルム形成性天然ポリマーはゼラチンである。多くの他のゼラチン様ポリマーが、商業的に入手できる。フィルム形成性天然ポリマーは、組成物の約２０重量％〜約４０重量％、好ましくはその組成物の約２５重量％〜約４０重量％で存在する。
【００６０】
組成物は、必要に応じてゲル化剤を含有し得る。典型的なゲル化剤としては、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋等の二価カチオンが挙げられる。これらのイオンのソースとしては、無機カルシウム塩及びマグネシウム塩並びにカルシウムゼラチン（ｃａｌｃｉｕｍ  ｇｅｌａｔｉｎ）が挙げられる。ゲル化剤は、組成物の約２重量％未満の量で、好ましくは組成物の約１重量％未満の量で存在する。
【００６１】
１以上の可塑剤が、フィルム形成過程を容易にするために、組成物に加えられ得る。好適な可塑剤としては、グリセリン、ソルビトール、ソルビタン、マルチトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、３〜６の炭素原子を有する多価アルコール、クエン酸、クエン酸エステル、トリエチルシトレート、及びそれらの組み合わせが挙げられる。１以上の可塑剤の濃度は、組成物の約８重量％〜約３０重量％である。１つの実施形態においては、可塑剤はグリセリン及び／又はソルビトールである。
【００６２】
フィルム形成性組成物は、液体若しくは半固体の充填材料を封入できる軟殻ゼラチンカプセル若しくは硬殻ゼラチンカプセル、又は活性剤及び１以上の医薬的に許容可能な賦形剤を含有する固体の錠剤（Ｓｏｆｔｌｅｔ（登録商標））を調製するために用いられ得る。或いは、該組成物は、組成物中に溶解又は分散した活性剤を有する液体として投与され得る。
【００６３】
フィルム形成性組成物は、当該分野における周知の技術を用いて、軟カプセル又は硬カプセルを調製するために用いられ得る。例えば、軟カプセルは、典型的にはロータリーダイカプセル充填過程（ｒｏｔａｒｙ  ｄｉｅ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いて生産される。充填製剤は、重力により、カプセル充填機械中に供給される。
【００６４】
カプセル外殻は、グリセリン、ソルビトール、ソルビタン、マルチトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、３〜６の炭素原子を有する多価アルコール、クエン酸、クエン酸エステル、トリエチルシトレート、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、１以上の可塑剤を含有し得る。
【００６５】
可塑剤に加えて、カプセル外殻は、乳白剤、着色剤、保湿剤、防腐剤、香料、並びに緩衝塩及び緩衝酸等の、他の好適な外殻の添加物を含み得る。
【００６６】
乳白剤は、カプセルに封入される活性剤が光感受性の場合、カプセルの外殻を不透明にするために用いられる。好適な乳白剤としては、二酸化チタン、酸化亜鉛、炭酸カルシウム及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６７】
着色剤は、マーケィング及び製品の同定／区別目的のために用い得られる。好適な着色剤としては、合成色素及び天然色素並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６８】
保湿剤は、軟ゲルの水分活性を抑制するために用いられ得る。好適な保湿剤としては、グリセリン及びソルビトールが挙げられるが、それらはしばしば可塑剤組成物の成分である。乾燥され適切に貯蔵された軟ゲルの低い水分活性に起因して、糸状菌及び酵母により、微生物起因の最大のリスクが生じる。この理由のため、保存剤が、カプセル外殻中に組み込まれ得る。好適な保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸の、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及びヘプチルエステル等のアルキルのエステル（まとめて「パラベン」として知られる）又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
香料は、充填製剤の不快な匂い及び味をマスクするために用いられ得る。好適な香料としては、合成香料及び天然香料が挙げられる。香料の使用は、ゼラチンを架橋し得るアルデヒドの存在のために問題になり得る。結果として、緩衝塩及び緩衝酸が、ゼラチンの架橋を阻害するため、アルデヒドを含有する香料と合わせて用いられ得る。
【００７０】
軟カプセル又は硬カプセルが、医薬的活性のある、多様な薬剤を送達するために用いられ得る。好適な薬剤としては、小分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、及び生物全体が挙げられる。
【００７１】
充填製剤は、安全及び有効であると考えられる材料で構成される、医薬的に許容可能な担体を用いて調製され得、望ましくない生物学的副作用も、所望されない相互作用も惹起することなく個体に投与され得る。担体は、有効成分（単数）又は有効成分（複数）以外の、医薬製剤中に存在する全ての成分である。本明細書で一般的に用いられる場合、「担体」としては、界面活性剤、保湿剤、可塑剤、結晶化阻害剤、湿潤剤、増量剤、可溶化剤、バイオアベイラビリティー向上剤、ｐＨ調整剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
或いは、該組成物は、組成物中に溶解された活性剤を含む液体（例、溶液）として、又は分散された活性剤を含む液体（例、懸濁液）として投与され得る。好適な活性剤は、上記される。溶液又は懸濁液は、１以上の医薬的に許容可能な賦形剤を用いて調製され得る。好適な賦形剤としては、界面活性剤、保湿剤、可塑剤、結晶化阻害剤、湿潤剤、増量剤、可溶化剤、バイオアベイラビリティー向上剤、ｐＨ調整剤、香料及びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
粘膜付着性粒子及び製造方法：一般論としては、組織へのポリマーの付着は、（ｉ）物理的結合又は機械的結合、（ｉｉ）一次化学結合又は共有化学結合、及び／或いは（ｉｉｉ）二次化学結合（例、イオン結合）、によって達成され得る。物理的結合又は機械的結
合は、粘液の間隙又は粘膜の襞における、付着性物質の沈着又は凝集から生じ得る。二次化学結合は、生体接着特性に寄与し得、これは分散的な相互作用（例、ファンデルワールス相互作用）及びより強力な特異的相互作用（これには、水素結合が挙げられる）からなる。水素結合の形成に関与する親水性官能基は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）である。
【００７４】
付着性ポリマー性マイクロスフェアは、以下に詳細に記載する通り、化学的組成、及び、表面積等の物理的特性の関数に基づいて形成される、物理的結合及び化学的結合に基づいて、選択されている。これらのマイクロスフェアは、粘膜への付着力が１１ｍＮ／ｃｍ２超であることが特徴である。これらのマイクロスフェアのサイズは、ナノ粒子から直径でミリメートルまでの範囲である。付着力は、ポリマー組成、生物学的基材、粒子の形態、粒子の幾何学的性質（例、直径）及び表面修飾の関数である。
【００７５】
生体接着性マイクロスフェア形成に有用なポリマーの種類：生体接着性マイクロスフェアを形成するために用いられ得る好適なポリマーとしては、可溶性及び不溶性、生分解性及び非生分解性のポリマーが挙げられる。これらは、天然又は合成の、ハイドロゲル又は熱可塑性物質、ホモポリマー、コポリマー又はブレンド、であり得る。しかし、極めて重要な特徴は、このポリマーが、ラットの腸粘膜表面に適用されたとき、１１０Ｎ／ｍ２（１１ｍＮ／ｃｍ２）〜１００，０００Ｎ／ｍ２の生体接着性相互作用を生じなければならないことである。
【００７６】
生体接着性粒子が、ＧＩ管を裏打ちする粘液内層に埋め込まれ、又は、包み込まれるためには、個々の粒子の半径は天然粘液層の厚みと同じ程の厚さであるべきである。胃粘液層の厚さは、典型的には、ラットでは、５〜２００μまで、及びヒトでは、１０〜４００μで様々であることが示されている。しかし、時にはＳｐｉｒｏ，Ｒ．Ｇ．，“Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，５９９−６３８，１９７０；Ｌａｂａｔ−Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．＆  Ｄｅｃａｅｕｓ，Ｃ．，“Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕ  Ｍｕｃｕｓ  Ｇａｓｔｒｉｑｕｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｏｎｃｔｉｏｎ，ｅｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，”Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ｅｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ（Ｐａｒｉｓ），２４，２４１，１９７９；Ａｌｌｅｎ，Ａ．，Ｈｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，＆  Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｌ．Ａ．，“Ｍｕｃｕｓ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｇｅｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｕｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｓａ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １０９（Ｊ．Ｎｕｇｅｎｔ  ＆  Ｍ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ編），ｐｐ．１３７（Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｉｔｍａｎ，１９８４）に記載の通り、ヒトで１０００μもの厚さに達し得る。過去には、二種類のポリマー：親水性ポリマー及びハイドロゲル、が、有用な生体接着特性を示すように思われた。親水性ポリマーという大きな分類では、カルボキシル基（例、ポリ［アクリル酸］）を含有する親水性ポリマーが、最高の生体接着特性を示す。最高濃度のカルボキシル基を含むポリマーが、柔らかい組織上の生体接着に対して選択される材料であるはずだと推量できるであろう。他の研究では、最も有望なポリマーは：アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びメチルセルロース、であった。これらの材料のいくつかは、水溶性であるが、他は、ハイドロゲルである。
【００７７】
ポリ［ラクチド−ｃｏ−グリコリド］、ポリ無水物、及びポリオルトエステル等の、それらの平滑な表面が腐食するとき、外表面上にそのカルボキシル基が露出する迅速生体内分解性のポリマーは、生体接着性薬物送達システムの優れた候補である。さらに、ポリ無水物及びポリエステル等の不安定な結合を含有するポリマーは、それらの加水分解反応性に関しては周知である。それらの加水分解の分解速度は、一般に、ポリマー骨格中の簡単
な変化によって改変され得る。
【００７８】
代表的な天然ポリマーとしては、ゼイン、改変ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、又はコラーゲン等のタンパク質、並びにセルロース、デキストラン、ポリヒアルロン酸等の多糖類、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステル及びアルギン酸のポリマーが挙げられる。代表的な合成ポリマーとしては、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、及びそれらのコポリマーが挙げられる。合成により改変された天然ポリマーとしては、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、及びニトロセルロースが挙げられる。目的の他のポリマーとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロースサルフェートナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルクロリド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルフェノールが挙げられるが、それらに限定されない。代表的な生体内分解性ポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド及びそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ［ラクチド−コ−グリコリド］、ポリ無水物、ポリオルトエステル、これらのブレンド及びコポリマーが挙げられる。
【００７９】
ＩＶ．クロストリジウム抗原及び短鎖脂肪酸を発現する改変細菌
少なくとも１のクロストリジウム由来の抗原及び少なくとも１の短鎖脂肪酸を発現する改変生物が、本明細書中に記載される。好ましい実施形態においては、クロストリジウム由来の抗原はフラジェリンであり、短鎖脂肪酸は酪酸塩である。該生物は、遺伝学的に改変された細菌又は遺伝学的に改変された酵母であり得る。好ましくは、該生物は、クロストリジウム属に属する細菌、乳酸菌、又はＥ．ｃｏｌｉ等の、遺伝学的に改変された細菌である。好ましい実施形態においては、該生物は、クロストリジウムクラスターＩＶ又はＸＩＶａに属する、グラム陽性生物である。該生物は、動物の結腸粘膜において、少なくとも１（ｏｎ）の抗原及び少なくとも１の短鎖脂肪酸をｉｎ  ｖｉｖｏで発現できる。例えば、フラジェリンのコード領域を含有するＰＣＲ断片（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５５１００５及び／又は（ａｏｒ）ＡＹ５５１００６））並びにアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ、及び酪酸キナーゼ等の、酪酸合成に関与する酵素のコード領域を含有するＰＣＲ断片を生物にクローニングでき、それらのＰＣＲクローンを含む組換えベクターを構築できる。これらの改変細菌により産生される組換え抗原及び短鎖脂肪酸は、寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を増大させ、及び炎症を低減することが、それらを必要とする被験体において、できる。本明細書は、上記の通りの、少なくとも１のクロストリジウム由来の抗原及び１の短鎖脂肪酸を発現する改変生物を含む、医薬組成物にも関する
。
【００８０】
Ｖ．治療方法
上記の通り、そして実施例で示す通り、組成物の個体への投与により、個体において寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減することが可能になる。これにより、寛容を誘導し、腸管バリアを強化し、及び炎症を低減する方法が、それらを必要とする個体において提供される。該方法は、本明細書中に記載の組成物を、個体に投与することを含む。いくつかの実施形態においては、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）（少なくとも１以上の）ＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）（少なくとも１以上の）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、若しくはＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含む組成物が、状態又は疾患の予防、低減、又は治療を必要とする個体に投与される。組成物は、寛容の誘導、腸管バリアの強化、及び炎症の低減の、所望の効果をもたらすのに十分な量で、個体に投与（提供）される。それは、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、又は感染性疾患から選択される少なくとも１の疾患の治療、重篤度の低減、又は予防を必要とする個体に投与され得る。
【００８１】
組成物の投与により、寛容が誘導されるか否かは、以下：制御性Ｔ細胞の数、結腸Ｔ細胞群中の制御性Ｔ細胞の割合、制御性Ｔ細胞の機能、若しくは制御性Ｔ細胞マーカーの発現、のうちの少なくとも１の増大又は増強を指標として用いて決定され得る。制御性Ｔ細胞の増殖又は蓄積の誘導の指標としての、生検又は血液の試料等の患者試料における、Ｆｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇ数若しくはパーセンテージ、ＩＬ−１０発現の促進（亢進）、ＣＴＬＡ４発現の促進（亢進）、ＩＤＯ発現の促進（亢進）、又はＩＬ−４発現の抑制の測定が、具体的なアプローチである。組成物の投与により、バリア機能が強化されるか否かは、腸上皮細胞による、活性型ＴＧＦ−β及び／又は密着結合関連タンパク質の産生の増加を指標として用いることにより決定され得る。組成物の投与により、炎症が低減されるか否かは、ＩＬ−１０及び／若しくはＴＧＦ−β等の抗炎症性サイトカイン産生の増加、又はＩＬ−４等の炎症性サイトカイン産生の減少を指標として用いることにより決定され得る。
【００８２】
かかる発現を検出する方法としては、遺伝子発現の転写レベルでの検出のための、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、及びドットブロット；遺伝子発現の翻訳レベルでの検出のための、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、免疫沈降、及びフローサイトメトリーが挙げられる。かかる指標を測定するために用いられ得る試料としては、個体から得られる、血液、生検、又は糞便の試料等の、組織及び体液が挙げられる。
【００８３】
ＶＩ．被験体における寛容の誘導を検出及び定量するための方法
Ｔ細胞、特にクロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、及びＸＶＩＩＩに属する細菌に発現する抗原を認識する特定のＴｒｅｇサブセット、の活性化を検出及び測定するためのイムノアッセイも、本明細書中に記載される。かかるイムノアッセイは、組成物の投与が、被験体において寛容を誘導するかどうかを決定及び定量するために用いられ得る。いくつかの実施形態においては、イムノアッセイは、ＭＨＣクラスＩＩ分子による提示に関係してフラジェリンエピトープを認識するＴｒｅｇ数を定量する。蛍光色素が結合した、４つのビオチン結合部位を有する分子であるストレプトアビジンを含む、４つのＭＨＣクラスＩＩのテトラマーの複合体が調製される。ＭＨＣクラスＩＩ鎖は、宿主細胞中の所望のエピトープ、例えばフラジェリンエピトープ、をコードするポリヌクレオチドの組換え発現により得られる。被験体からの試料中の、フラジェリンエピトープに特異的なＴｒｅｇ等の、クロストリジウム抗原に特異的なＴｒｅｇの集団は、たとえ存在がごく少数で
あっても、本方法の使用により、容易に検出される。例えば、多様なＴ細胞の集団を含有する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試料等の、被験体から得られる試料は、本明細書中に記載のテトラマー試薬と接触させられ得る。試料中のＴ細胞により認識されるエピトープを含有するテトラマーは、試料中の多様なＴ細胞集団と接触させられると、適合するＴ細胞に結合する。反応液内容物は、フローサイトメトリーを用いて解析して、結合したＭＨＣテトラマーを有するこれらのＴ細胞を定量し得る。
【実施例】
【００８４】
実施例
以下は、特定の態様を記述する実施例である。これらが限定をするものであるとは、決して意図されない。
【００８５】
実施例１：第一に、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ及びＸＶＩＩＩに属する細菌によるＴｒｅｇ誘導の機序についての知見を得るため、無菌マウスに、クロストリジウムクラスターＩＶに属する細菌株、クロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌株、及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌株を含む混合細菌を定着させた（「クロストリジウムが定着したマウス」）。Ｔｒｅｇ誘導に関与する可能性のある代謝産物を同定するため、クロストリジウムが定着した、外部細菌フリーのマウスの内腔組成物中に存在する数百の代謝産物を、主成分分析（ＰＣＡ）と合わせた、ＮＭＲに基づくメタボローム解析により丹念に調査した。これにより、Ｔｒｅｇ誘導に関与する、酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、及び特に、酪酸塩を含む短鎖脂肪酸の同定がもたらされた。インビトロでのＴｒｅｇ誘導に対する、酢酸塩、プロピオン酸塩、及び酪酸塩の影響は、以下の通り測定した：脾臓のナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを被覆したビーズで刺激し、Ｔ細胞抗原受容体シグナル伝達及びＴＧＦ−βの存在下、上記のこれら各短鎖脂肪酸を含めてか、又は含めずに培養した。各短鎖脂肪酸、ただしとりわけ酪酸塩、の補充により、Ｔｒｅｇの分化が、無処理コントロールと比較して亢進された（図１）。これらの所見は、短鎖脂肪酸、特に酪酸塩が、Ｔｒｅｇの誘導に重要な役割を果たすことを示す。
【００８６】
実施例２：第二に、酪酸塩がＴｒｅｇを誘導する作用の分子機構についての知見を得るため、Ｔ細胞において酪酸塩が遺伝子発現を調節するか否かを決定するための評価を行った。製造者のプロトコールに従って、ＭＡＧｎｉｆｙ  ＣｈｉＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った。該アッセイにより、酪酸塩が、Ｆｏｘｐ３遺伝子座において、プロモーター及び保存性非コード配列（ＣＮＳ）１におけるヒストンＨ３のアセチル化をアップレギュレートすることが示された（図２）。同様に、トリコスタチンＡ、（Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、２−（４−ブトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、ＭＳ−２７５、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、及びＲＧ  ２８３３等の、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害特性を有する他の分子は、Ｔｒｅｇに対して、同一の効果を媒介できる。
【００８７】
実施例３：第三に、同定された各短鎖脂肪酸、及び同定された全ての短鎖脂肪酸のナトリウム塩の混合物を、それらの、活性型ＴＧＦ−βを誘導する能力（組成物の、寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を増大させ、及び炎症を低減する能力を表す性質である）について試験した。個々の各短鎖脂肪酸の０．５ｍＭ溶液により、上皮細胞株ＨＴ２９の培養上清中の活性型ＴＧＦ−βの発現が増加した。驚くべきことに、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、及びイソ酪酸塩の、ナトリウム塩の０．５ｍＭ混合物により、活性型ＴＧＦ−βの発現が、いずれかの、個々の短鎖脂肪酸溶液単独よりも、３倍超高く上昇した（図３）。培養上清中の活性型ＴＧＦ−Ｂ１の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。これらのデータにより、短鎖脂肪酸の混合物が協調して、活性型ＴＧＦ−β産生の増大に寄与すること
が示される。
【００８８】
実施例４：第四に、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ及びＸＶＩＩＩに属する細菌が、Ｔ細胞に対して細菌性抗原を提供するか否かを決定するため、調査を行った。これを行うため、同種抗原により引き起こされる抑制アッセイを用いて、混合したクロストリジウムクラスター、ＸＩＶａ、及びＸＶＩＩＩ  ＩＶに属する１７株（「１７−ミックス」）が定着したマウス中に蓄積した、Ｔｒｅｇの抗原特異性評価を行った。１７−ミックスが定着したマウスからの、固有層のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８
Ｔ細胞の、ＯＴ−Ｉ  オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドにより引き起こされる増殖を相当程度阻害し、オートクレーブされた、＋１７ミックスのマウスからの盲腸内容物、又は、オートクレーブされた、インビトロでの培養１７株の存在下で、この抑制が顕著に亢進されたが、ＯＴ−ＩＩ  ＯＶＡペプチド又はＧＦマウスからの盲腸内容物の存在下ではそうではなかった（図４ａ〜ｂ及び図５）。ＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＣＤ１１ｃ＋細胞を単離し、０．５μＭ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＯＴ−Ｉペプチド単独でか、又は５μＭ  ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ  ＯＴ−ＩＩペプチド若しくはオートクレーブされた、＋１７ミックスマウスからの盲腸内容物のいずれかと組み合わせてパルスし、５ｘ１０４／ウェルで播種した。ＣＤ８  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を、５ｘ１０４／ウェルで、ＣＤ１１ｃ＋細胞を播種したプレートに加えた。次いで、＋１７ミックスマウスの結腸ＬＰから選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＬＰ  Ｔｒｅｇ）又はＳＰＦ  ＯＴ−ＩＩマウスの脾臓から選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＯＴ−ＩＩ
Ｔｒｅｇ）を、表示された、Ｔｅｆｆ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の比率で培養液に加えた。３日後、すべての細胞を回収し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで解析してＣＤ８  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞数を数えた。図４ｂに表示したデータは、デュプリケートの平均を表す。更に、ＯＴ−Ｉマウス（Ｔｅｆｆ）からのＣＤ８  Ｔ細胞及び＋１７ミックスマウスからの、結腸固有層の、表示された比率のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、ＯＴ−Ｉペプチド単独でか、又はオートクレーブされた、＋１７ミックスマウス（＋１７−ミックス  盲腸）若しくはＧＦマウス（＋ＧＦ  盲腸）からの盲腸内容物又はオートクレーブされた、インビトロで培養された１７株（＋１７ｓｔ  インビトロ）のいずれかと組み合わせてパルスしたＣＤ１１ｃ＋細胞とインキュベーションした。図５に表示されたデータは、デュプリケートの平均を表す。これらの結果により、クロストリジウムが定着したマウス中の結腸固有層Ｔｒｅｇ細胞のいくつかの画分が、クロストリジウム菌に特異的であることが証明される。総合すると、前の実施例と共に、これらの所見により、クロストリジウム株は、結腸Ｔｒｅｇの分化及び増幅に共に寄与する、短鎖脂肪酸及び細菌性抗原を提供することが証明される。フラジェリン（配列番号１）を加えて同様の実験を繰り返した。フラジェリンは、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ及びＸＶＩＩＩに属する細菌中で非常に豊富な抗原である。フラジェリン配列は種々の微生物間で様々である。３日後、フラジェリン特異的な結腸固有層Ｔｒｅｇ細胞を単離した。
【００８９】
配列番号１
atggtagtac agcacaattt acaggcaatg aactctaaca gaatgttagg catcacacag
aagacagcat ctaagtctac agaaaagtta tcttcaggtt acgcaatcaa ccgcgcagca
gacaacgcag caggtcttgc tatttctgag aagatgagaa agcagatcag aggacttaca
caggcttcta caaatgctga ggacggcatc agctctgtac agacagcaga aggcgctttg
acagaagtgc atgatatgct tcagagaatg aacgagctgg caattcaggc agcaaacggc
acaaactcag aagatgaccg ctcatacatt caggacgaaa ttgaccagct gacacaggaa
atcgatcgtg ttgctgagac aacaaagttc aatgagacat atctcttgaa gggtgacaca
aagaacgttg acgctatgga ctatacatat agctataagg cagttacaac gaatactgta
gcaagagctt cggttttagc agcagagaac acagctacag gtatgtcagt tagtatttca
tttgctgcaa acagcggcaa ggttactgca gctgactcta acaaccttgc aaaggctatc
agagatcagg gcttcacaat cacaacatct acccagaatg gtaaggttgt ttacggtctt
gagctgaacg gaagcgatgc aaaggcaaac tatacagttt caacagtaag tatggaagct
ggtacattca agatcctgaa ttctaataag caggttgttg catctgtaac aatatctaca
acagctagct ttaaaaaggt atctggtatg tcacagatcg ttacggcgta ctctgtatca
gcagcttatg cgacgggtga tgtatactct ctctatgacg cagacggaaa tgcaatttca
gcaaacaagc tggataagta ctttacggca ggcggcgcta cagaggcagg cggaatagct
actacacttt cagcaaactc tggtgtgcct aaggtttatg acgtactcgg aaaagaggtt
tctgcagtaa gcattgcaag tactttagta acagcagtta aggataagac ggctgcattg
aagatgaact tccatgtagg tgctgacgga acagataaca acaagattaa gatcaacatt
gaggctatga cagctaagag tcttggagtt aacggtctga aggtgagcgg ttcgagcgga
acaaacgcta caaacgctat cgagataatc gctggcgcta tcaagaaggt ttctacacag
agatctgctc ttggtgcggt tcagaacaga ttagagcaca caatcaacaa cttggataac
atcgttgaga acacaacagc agctgagtca ggaatccgcg atacagatat ggctacagag
atggttaagt actctaacgc taatatcctt tcacaggcag gtcagtctat gcttgcacag
tctaaccagt ctaaccaggg tgtacttcag ctcttacagt aa
【図１】
2019189609.tif 000003
【図２】
2019189609.tif 000004
【図３】
2019189609.tif 000005
【図４−１】
2019189609.tif 000006
【図４−２】
2019189609.tif 000007
【図５】
2019189609.tif 000008
【配列表】
2019189609000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月14日(2019.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、（ａ）１以上の短鎖脂肪酸若しくは短鎖脂肪酸誘導体；（ｂ）少なくとも１のＧＰＲ１０９リガンド；（ｃ）少なくとも１のＧＰＲ４３リガンド；（ｄ）少なくとも１のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｅ）１以上の、クロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、若しくはクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌由来の抗原；（ｆ）フラジェリンポリペプチド；又は（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１と（ｅ）〜（ｆ）のうちの１との組み合わせを含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）が酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、酢酸塩、トリブチリン、酪酸ピバロイルオキシメチル、及びモノアセトングルコース  ３−ブチラートから成る群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
（ａ）が酪酸塩である、請求項１又は２の組成物。
【請求項４】
（ａ）が酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、及び酢酸塩の、塩の混合物である、請求項１の組成物。
【請求項５】
（ｆ）がフラジェリン、フラジェリン様配列、フラジェリンの成分、ＣＢｉｒ１、Ｆｌａ−Ｘ、ＦｌｉＣ、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＣ及びＦｌｇＥから成る群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項６】
（ｆ）がフラジェリンである、請求項１の組成物。
【請求項７】
（ｅ）の細菌が、クロストリジウムクラスターＩＶからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＩＶからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌とクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌との組み合わせ、又はクロストリジウムクラスターＩＶからの細菌、クロストリジウムクラスターＸＩＶａからの細菌及びクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩからの細菌の組み合わせを含む、請求項１の組成物。
【請求項８】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、酪酸塩及びフラジェリンを含む、組成物。
【請求項９】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び炎症を低減する効果を有する組成物であって、酪酸塩、イソ酪酸塩、プロピオン酸塩、及び酢酸塩の、塩の混合物並びにフラジェリンを含む、組成物。
【請求項１０】
組成物を結腸粘膜に選択的に指向する送達システムを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物及び医薬的に許容可能な成分を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び／又は炎症を低減するための、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、及び感染性疾患から選択される少なくとも１の疾患を治療し、治療補助し、重篤度を低減し、又は予防するための、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
寛容を誘導し、腸管バリアの完全性を強化し、及び／又は炎症を低減するための医薬を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、及び感染性疾患から選択される少なくとも１の疾患を治療し、治療補助し、重篤度を低減し、又は予防するための医薬を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物又は請求項１１の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
クロストリジウムクラスターＩＶ、クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、又はクロストリジウムクラスターＸＶＩＩＩに属する細菌に発現する抗原に特異的なＴ細胞の活性化を決定する方法であって、（ａ）該抗原を認識する細胞を含むと疑われる被験体由来の試料を提供する工程；（ｂ）試料と該抗原のエピトープを含有するＭＨＣクラスＩＩテトラマー複合体とを接触させる工程；及び（ｃ）試料の細胞とエピトープを含有するＭＨＣクラスＩＩテトラマーとの結合が生じているか否か決定する工程を含む、方法。
【外国語明細書】
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