(57)【要約】      （修正有）【課題】低コスト化が可能で、固体状態でもより高い蛍光強度を有する蛍光色素の提供。【解決手段】４，７−ビス（４−メトキシフェニル）−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−スクシンイミド−１−イルオキシカルボニルブチルオキシ）アミノカルボニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジン、４，７−ビス（４−メトキシフェニル）−６−（２−スクシンイミド−１−イルオキシカルボニル−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジン等のアゾール誘導体から成る蛍光色素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）、（２）または（３）で表されるアゾール誘導体から成る蛍光色素。
【化１】
2019031604.tif 000041
（式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表され、式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２であり、ここで、ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、ｎは１〜１５の整数、ｍは１〜２０の整数、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい、窒素含有５〜７員環式化合物であり、
式（２）のＲ１とＲ４の残部、式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示し、
Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示し、
Ｒ’は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。）
【化２】
2019031604.tif 000042
【化３】
2019031604.tif 000043
【化４】
2019031604.tif 000044
【請求項２】
前記のＲ２およびＲ３が、それぞれ独立に、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である請求項１記載の蛍光色素。
【請求項３】
前記窒素カチオン含有基が、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、ピリミジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基またはベンゾオキサゾリウム基である、請求項１または２に記載の蛍光色素。
【請求項４】
以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）または（８）で表されるイミダゾール誘導体からなる蛍光色素。
【化５】
2019031604.tif 000045
（式（４）および式（６）ではＲ１は、そして式（５）ではＲ１とＲ４の一方は、
以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表され、式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２であり、であり、ここで、ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、ｎは１〜１５の整数、ｍは１〜２０の整数、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい、窒素含有５〜７員環式化合物であり、
式（５）のＲ１とＲ４の残部、式（４）から式（６）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示し、
Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示し、
Ｒ’、Ｒ“は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。）
【化６】
2019031604.tif 000046
【化７】
2019031604.tif 000047
【化８】
2019031604.tif 000048
【請求項５】
上記のＲ２およびＲ３が、それぞれ独立に、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である請求項４記載の蛍光色素。
【請求項６】
前記窒素カチオン含有基が、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、ピリミジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基またはベンゾオキサゾリウム基である、請求項４または５に記載の蛍光色素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューバイオケミストリー分野では、現在特定遺伝子解析、遺伝子治療、テーラーメイド医療を目的とした研究が盛んに行われている。この分野では有機蛍光試薬を用いる研究が殆どであり蛍光色素が存在しなければ、ＤＮＡ解析や抗体を含むタンパク質を用いた解析技術は完成しなかったと言われている。これらの分野で主に使用されている既存の蛍光試薬として、シアニン骨格を有するＣｙ色素やローダミン骨格を有するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒなどの有機蛍光色素が多く用いられている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、上記の既存の蛍光色素は、固体状態でも発光する利点を有するが、非常に高価であるため、生体分子の検出方法が高コストにならざるを得ないという問題がある。これに対し、本出願人は、アゾール誘導体からなる有機ＥＬ色素を蛍光色素として用いることを提案しており、これによれば、検出方法の低コスト化が可能で、固体状態でも高い蛍光強度を得ることが可能である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６２０４６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science 283,1,January,1999,83-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、より一層の検出感度向上のために、より高い蛍光強度を有する蛍光色素が必要とされている。
【０００７】
そこで、本発明は、低コスト化が可能で、固体状態でもより高い蛍光強度を有する蛍光色素を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、Ｎ−置換アミド結合を有するアゾール誘導体が高い蛍光強度を有することを見出して本発明を完成させたものである。すなわち、本発明の一態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（１）、（２）または（３）で表されるアゾール誘導体からなることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
2019031604.tif 000002
【００１０】
式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表され、式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２であり、ここで、ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、ｎは１〜１５の整数、ｍは１〜２０の整数、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい、窒素含有５〜７員環式化合物であり、
式（２）のＲ１とＲ４の残部、式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示し、
Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示し、
Ｒ’は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。
【００１１】
【化２】
2019031604.tif 000003
【００１２】
【化３】
2019031604.tif 000004
【００１３】
【化４】
2019031604.tif 000005
【００１４】
また、本発明に別の態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）または（８）で表されるイミダゾール誘導体からなることを特徴とする。
【００１５】
【化５】
2019031604.tif 000006
【００１６】
式（４）および式（６）ではＲ１は、そして式（５）ではＲ１とＲ４の一方は、
以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表され、式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２であり、であり、ここで、ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、ｎは１〜１５の整数、ｍは１〜２０の整数、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい、窒素含有５〜７員環式化合物であり、
式（５）のＲ１とＲ４の残部、式（４）から式（６）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示し、
Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示し、
Ｒ’、Ｒ“は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。
【００１７】
【化６】
2019031604.tif 000007
【００１８】
【化７】
2019031604.tif 000008
【００１９】
【化８】
2019031604.tif 000009
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛍光色素は、固体状態でも高い量子収率を有しており、マイクロアレイなどの基盤上もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、Ｃｙ色素等の従来の蛍光色素に比べ安価に製造可能であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】合成例２の化合物の粉末の発光状態を示す写真である。
【図２】合成例３の化合物の粉末の発光状態を示す写真である。
【図３】合成例５の化合物の粉末の発光状態を示す写真である。
【図４】合成例６の化合物の粉末の発光状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
実施の形態１．
本実施の形態に係る蛍光色素は、アゾール誘導体からなる蛍光色素であり、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示すことができる。
【００２３】
【化９】
2019031604.tif 000010
【００２４】
式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される。一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は一端にＮ置換アミド基を有し、そのＮ置換アミド基がアゾール誘導体のピリジン骨格に直接結合する（以下、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）をＮ置換アミド基含有構造ということもある）。
【００２５】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基またはイソプロピル基、より好ましくはメチル基である。
【００２６】
また、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２である。ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、例えばメチレンオキサイド基、エチレンオキサイド基、プロピレンオキサイド基、テトラメチレンオキサイド基を挙げることができる。好ましくは、エチレンオキサイド基またはプロピレンオキサイド基である。また、ｎは１〜１５の整数、好ましくは１〜６の整数である。また、ｍは１〜２０の整数、好ましくは１〜６の整数である。また、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、好ましくは１〜６の整数である。窒素カチオン含有基は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピリミジニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基またはベンゾオキサゾリウム基である。好ましくは、置換基を有してもよいピリジニウム基、より好ましくは無置換のピリジニウム基である。窒素カチオン含有基の置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。該置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、該置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、該置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、該置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、該置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、該置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。また、該置換基としての複素環基は、例えばチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基である。Ｂ１−Ｃ−Ｂ２の一例として、窒素カチオン含有基としてピリジニウム基を用いた場合の例を以下に示す。
【００２７】
【化１０】
2019031604.tif 000011
ここで、Ａｎはハロゲン化物イオンを示す。この例では、ピリジン環の１，４位に連結基を有するが、４位ではＮ置換アミド基に直接結合している。
【００２８】
【化１１】
2019031604.tif 000012
この例では、ピリジン環の１，４位に連結基を有している。
【００２９】
また、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、好ましくはカルボン酸基である。
【００３０】
また、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい窒素含有５〜７員環式化合物である。窒素含有５〜７員環式化合物としては、ピロリジン、ピロール、ピペリジン、ピリジン、ヘキサメチレンイミンおよびアザトロピリデンを挙げることができる。好ましくは、ピロリジンまたはピペリジンである。また、Ｚの置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボン酸基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、およびアルキルエステル基の少なくとも１種を挙げることができる。アルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基である。また、アルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキルエステルである。
【００３１】
【化１２】
2019031604.tif 000013
【００３２】
【化１３】
2019031604.tif 000014
【００３３】
【化１４】
2019031604.tif 000015
【００３４】
また、式（２）のＲ１とＲ４の残部、式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示す。置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。アルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基またはエチル基である。また、アルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基であり、好ましくはメトキシ基またはエトキシ基である。また、アルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキルエステルであり、例えば、酢酸メチル基、酢酸エチル基、酢酸プロピル基、酢酸ブチル基または酢酸イソブチル基であり、好ましくは酢酸メチルまたは酢酸エチルである。また、芳香族炭化水素基は単環または多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基またはナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基またはキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基またはチオフェン基である。また、脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基である。好ましくは、式（２）のＲ１とＲ４の残部、式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、より好ましくは、置換基を有していてもよいフェニル基、さらに好ましくは置換基としてアルコキシ基を有するフェニル基である。
【００３５】
また、Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示す。置換基としては、炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基である。
【００３６】
また、Ｒ’は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基である。ここで、その脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
【００３７】
また、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。
【００３８】
上記の一般式（１）〜（３）で示される蛍光色素は、アゾール誘導体にアミド結合を導入する方法を用いて製造することができる。例えば、アゾール誘導体の活性エステル体にアミン化合物を反応させることで製造することができる。
【００３９】
また、上記の一般式（１）〜（３）で示される蛍光色素は、生体分子に結合する反応性基を含んでいてもよい。反応性基は共有結合またはイオン結合により生体分子と結合する。この場合、上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表されるＮ置換アミド基含有構造は、アゾール誘導体の主骨格と反応性基とを連結するリンカーとして機能する。
【００４０】
共有結合として、例えばアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、またはグアニジン結合を形成する場合、反応性基には、生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基、カルボキシル基またはヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水マレイン酸基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基または活性エステル化したカルボニル基である。これら反応性基と反応する窒素カチオン含有基の官能基としては、例えばカルボキシル基を用いることができる。例えば、活性エステル化したカルボニル基には、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドを用い、縮合剤としてＤＣＣを用いることによりＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子が結合する。また、カルボジイミド基には、Ｎ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子とを結合させることができる。
【００４１】
また、イオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基やカチオン性基を用いることができる。アニオン性基としては、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。また、カチオン性基としては、４級アンモニウム基やピリジニウム基等の窒素カチオン含有基を用いることができる。これらカチオン性基は、生体分子のアニオン性基、例えばカルボキシル基とイオン結合する。
【００４２】
本実施の形態に係る蛍光色素では、上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表されるＮ置換アミド基含有構造は、固体状態でも高い蛍光強度を有しており、またＮ置換されていないアミド基の場合と比べても、高い蛍光強度を有している。この理由としては、必ずしも限定されるものではないが、Ｎ−置換アミドの場合、カルボニル基との立体障害により分子構造の回転がある程度抑制されることや、水素が脱離しないことで運動エネルギーの消費が抑えられて熱や振動としてエネルギーが消費されず、効率よく蛍光に変換されることが考えられる。
【００４３】
実施の形態２
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）または（８）で表されるイミダゾール誘導体からなる蛍光色素である。
【００４４】
【化１５】
2019031604.tif 000016
【００４５】
式（４）および式（６）ではＲ１は、そして式（５）ではＲ１とＲ４の一方は、以下の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される。一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は一端にＮ置換アミド基を有し、そのＮ置換アミド基がアゾール誘導体のピリジン骨格に直接結合する。
【００４６】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｌ１は炭素数１〜６のアルキル基、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＡＯ）ｍ−、またはＢ１−Ｃ−Ｂ２である。ＡＯは炭素数１〜６のアルキレンオキサイド基を示し、例えばメチレンオキサイド基、エチレンオキサイド基、プロピレンオキサイド基、テトラメチレンオキサイド基を挙げることができる。好ましくは、エチレンオキサイド基またはプロピレンオキサイド基である。また、ｎは１〜１５の整数、好ましくは１〜６の整数である。また、ｍは１〜２０の整数、好ましくは１〜６の整数である。また、Ｃは窒素カチオン含有基、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に直接結合または−（ＣＨ２）ｐ−で表される連結基であり、ｐは０〜１５の整数、好ましくは１〜６の整数である。窒素カチオン含有基は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、ピリミジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基またはベンゾオキサゾリウム基である。好ましくは、置換基を有してもよいピリジニウム基、より好ましくは無置換のピリジニウム基である。窒素カチオン含有基の置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。該置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、該置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、該置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、該置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、該置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、該置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。また、該置換基としての複素環基は、例えばチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基である。Ｂ１−Ｃ−Ｂ２の一例として、ピリジニウム基を用いた場合の例を以下に示す。
【００４７】
【化１６】
2019031604.tif 000017
ここで、Ａｎはハロゲン化物イオンを示す。この例では、ピリジン環の１，４位に連結基を有するが、４位ではＮ置換アミド基に直接結合している。
【００４８】
【化１７】
2019031604.tif 000018
この例では、ピリジン環の１，４位に連結基を有している。
【００４９】
また、Ｙは水素原子またはカルボン酸基であり、好ましくはカルボン酸基である。
【００５０】
また、式（ＩＩＩ）中、Ｚは、置換基を有してもよい窒素含有５〜７員環式化合物である。窒素含有５〜７員環式化合物としては、ピロリジン、ピロール、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ヘキサメチレンイミンおよびアザトロピリデンを挙げることができる。好ましくは、ピロリジンまたはピペリジンである。また、Ｚの置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボン酸基、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、およびアルキルエステル基の少なくとも１種を挙げることができる。アルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基である。また、アルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキルエステルである。
【００５１】
【化１８】
2019031604.tif 000019
【００５２】
【化１９】
2019031604.tif 000020
【００５３】
【化２０】
2019031604.tif 000021
【００５４】
式（５）のＲ１とＲ４の残部、式（４）から式（６）のＲ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基または脂肪族炭化水素基または複素環基を示す。置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。それらの置換基には、実施の形態１で説明したものと同様のものを用いることができる。
【００５５】
Ｘは置換基を有していてもよい窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子またはボロン原子を示す。置換基としては、炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基である。
【００５６】
Ｒ’、Ｒ“は芳香環を含んでもよいアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、その脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
【００５７】
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−またはＰＦ６−を示す。
【００５８】
上記の一般式（４）〜（８）で示される蛍光色素は、イミダゾール誘導体にアミド結合を導入する方法を用いて製造することができる。例えば、イミダゾール誘導体の活性エステル体にアミン化合物を反応させることで製造することができる。
【００５９】
また、上記の一般式（４）〜（８）で示される蛍光色素は生体分子に結合する反応性基を含んでもよい。反応性基は共有結合またはイオン結合により生体分子と結合する。反応性基には、実施の形態１で説明したものと同様のものを用いることができる。
【００６０】
本実施の形態に係る蛍光色素によれば、実施の形態１のアゾール誘導体の場合と同様に、Ｎ置換アミド基含有構造を導入することで、固体状態でも高い蛍光強度を得ることが可能である。
【００６１】
本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするＤＮＡマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるＰＣＲ法に用いることができる。
【００６２】
また、タンパク質を検出対象とする場合、通常、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を浸透させてタンパク質を染色し、ＵＶを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が１００ｎｇ程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いると高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。
【００６３】
ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の蛍光色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、ＴＯＦ−Ｍａｓｓ等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、本発明の蛍光色素を用いてコラーゲンを標識することにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。
【００６４】
また、タンパク質と特異的に結合する抗体を本発明の蛍光色素で標識することにより、タンパク質を標識することもできる。例えば、ＩｇＧ抗体をペプシンで処理するとＦ（ａｂ’)2と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとＦａｂ’と呼ばれるフラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは1つもしくは２つのチオール基（−ＳＨ）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、本発明の蛍光色素に反応性基としてマレイミド基を導入し、フラグメントのチオール基と反応させることにより抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。
【００６５】
なお、本発明の蛍光色素でアプタマーを標識することもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、本発明の蛍光色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検出物質との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検出物質を検出することができる。
【００６６】
また、本発明の蛍光色素を用いて金属イオンの検出を行うこともできる。体内のＤＮＡやタンパク質などの安定性や高次構造の維持、機能発現、そして生体内のすべての化学反応を司る酵素の活性化など、生体内で起こるあらゆる生命現象に金属イオンは関与している。そのため、生体内での金属イオンの動きをリアルタイムで観察できる金属イオンセンサは医療分野を初めとしてその重要性が叫ばれている。従来、生体分子に蛍光色素を導入した金属イオンセンサが知られている。例えば、Ｋ＋イオン存在化において、Ｋ＋イオン取り込んで特殊な構造をとる配列を有する核酸を利用する金属イオンセンサが提案されている（J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 14286-14287）。エネルギートランスファーを起こす蛍光色素を核酸の両端に導入する。通常は色素間距離があるためエネルギートランスファーは起きない。しかし、Ｋ＋イオン存在下では核酸が特殊な形をとる結果、蛍光色素がエネルギートランスファーを起こす距離に近接することで、蛍光を観察することができる。また、ペプチドに蛍光色素を導入した亜鉛イオンセンサも提案されている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3053-3054）。これらの従来の蛍光色素に代えて本発明の蛍光色素を用いることにより、従来に比べ高感度で取り扱いが容易な金属イオンセンサを提供することが可能となる。なお、生体内に存在する金属イオンであれば、すべての金属イオンを検出することが可能である。
【００６７】
また、本発明の蛍光色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このＣａ２＋依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。
【００６８】
ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではＧ−タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の有機ＥＬ色素からなる蛍光色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。
【００６９】
また、本発明の蛍光色素を、組織または細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織または細胞の染色色素としても用いることができる。すなわち、本発明の染色色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ソリゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。
【００７０】
また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Ｃｙ色素及びＡｌｅｘａ色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ本発明の蛍光色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。
【００７１】
また、ガンや感染症等の診断には、抗体の特異的認識能を利用したイムノアッセイが用いられている。イムノアッセイは、標識抗体を用いて目的の抗原を検出する方法であり、標識物質に酵素を用いる酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）や標識物質に蛍光色素を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）等が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、最終的な検出は標識物質である酵素の反応によって生じるさまざまなシグナル（発色、発光、化学発光等）を検出及び定量することにより行う。一方、ＦＩＡ法は、標識物質である蛍光色素に励起光を照射し、それによる蛍光を検出及び定量することにより行う。ＦＩＡ法は蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し定量性に優れ、またＥＬＩＳＡ法に比べ、より短時間での検出が可能でかつ操作も簡便であるという特徴を有している。本発明の蛍光色素を用いることにより、より高感度の検出を行うことが可能となる。
【００７２】
また、本発明の蛍光色素を化粧用組成物に用いることもできる。蛍光色素を含む化粧用組成物は、夜間や室内における演出用の化粧としてだけでなく、蛍光色素の明色化効果を利用して、ファンデーションや毛髪の染色剤等に用いられている。ここで、明色化効果とは、蛍光色素が紫外光を吸収して可視光を放出して、皮膚や毛髪に明るさや鮮やかさを与える効果をいう。日本の室内照明には、昼光色や白色の蛍光灯が使われているが、これらの蛍光灯からの光は、青や緑が主であり赤が少ない。そのため、女性の化粧肌は青白くくすんで見えるという問題がある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、例えば、橙色の光を放出する蛍光色素を用い、鮮やかな赤味の色を発色させてくすみの解消を図ることが可能である。また、毛髪の染色に用いると、蛍光色素は可視領域の放出光線により毛髪の色を変えるだけでなく、毛髪の輝きを増加させることも可能である。
【００７３】
また、本発明の蛍光色素をマーキング剤に用いることもできる。本発明の蛍光色素を含むマーキング剤は、通常の可視光下では不可視であるが、紫外線等の励起光を照射することにより蛍光色素を発光させて視認することができる。この性質を利用し、犯罪防止や犯罪捜査を目的として、物品や人体等の識別や物質の検出等に使用することができる。マーキング剤の対象物には、偽造や盗難等の犯罪の防止や犯罪捜査の対象となる物品や人体が含まれる。例えば、紙幣、小切手、株券、各種証明書等の重要文書や、自動車、オートバイ、自転車、美術品、家具、ブランド品、衣服等の物品、人体の皮膚、頭髪、爪等の身体表面部分、潜在指紋等の遺留物質等を挙げることができる。さらに、対象物を構成する材料に関しては、上質紙、ＯＣＲ紙、ノーカーボン紙、アート紙等の紙や、塩化ビニル、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等のプラスチックや、金属や、ガラスや、セラミックスや、羊毛、木綿、絹、麻等の天然繊維や、再生セルロース繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリアミド繊維、ポリエステル繊維等の合成繊維や、人体皮膚や体液中のタンパク質等を挙げることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例により限定されるものではない。
【００７５】
合成例１
Ｎ−アルキルアミド体の活性エステル体の合成について説明する。
【００７６】
（１）４，７−ジ（メトキシフェニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジンの活性エステル体の合成
【００７７】
（１−１）Ｎ−オキシド体の合成
Ｎ−オキシド体の合成スキームを以下に示す。
【００７８】
【化２１】
2019031604.tif 000022
【００７９】
５００ｍｌの三口フラスコに、４−メトキシアセトフェノン１を４０．０ｇ（２６６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０９と酢酸１００ｍｌを入れ、３０℃に設定したオイルバス中で撹拌した。これに、亜硝酸ナトリウム１．４ｇ（２０．２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０７６）、を添加後、硝酸７５ｍｌ（１６４０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：６．２）と酢酸７５ｍｌの混合溶液をゆっくりと滴下して反応を開始した。３日間反応させた後、ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、大量の水に反応溶液を入れ室温で撹拌した。これを吸引濾過、回収し酢酸の酢酸臭が無くなるまで水で洗浄して結晶を乾燥させた。結晶をエタノールで洗浄後、吸引濾過、真空乾燥させて目的物であるＮ−オキシド体２を得た。収量は３１ｇ、収率は６６％であった。
【００８０】
（１−２）ジケトン体の合成
ジケトン体の合成スキームを以下に示す。
【００８１】
【化２２】
2019031604.tif 000023
【００８２】
３００ｍｌの三口フラスコに、Ｎ−オキシド体２を５．０ｇ（１４．１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とアセトニトリル  １５０ｍｌを入れ、３０℃に設定したオイルバス中で撹拌した。これに、酢酸２．５ｍｌ（４３．６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：３．１）と無水酢酸７．０ｍｌ（７．４７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：５．３）を添加した後、亜鉛１４ｇ（２１１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１５）を少量ずつ添加した。添加後、４０℃で６時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム：ヘキサン＝７：３）で反応が進行したのを確認後、反応溶液をセライト濾過した。ろ液を分液ロートに入れ水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を重曹水、希塩酸水、で洗浄して硫酸マグネシウムで乾燥させ吸引濾過、減圧留去を行った。残渣をエタノールで洗浄して吸引濾過後、結晶を真空乾燥して、目的物であるジケトン体３を得た。収量は２．５ｇ、収率は５２％であった。
【００８３】
（１−３）エチルエステル体の合成
エチルエステル体の合成スキームを以下に示す。
【００８４】
【化２３】
2019031604.tif 000024
【００８５】
１００ｍｌの三口フラスコに、ジケトン体３を５．０ｇ（１４．７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、グリシンエチルエステル塩酸塩を１４．４ｇ（１０３ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：７．０）、およびピリジン４８ｍｌを入れ、１０５℃に設定したオイルバス中で１９時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム：ヘキサン＝７：３）で反応が進行したのを確認後、反応溶液を分液ロートに入れ希塩酸水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を希塩酸水、蒸留水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ吸引濾過、減圧留去を行った。残渣をクロロホルム：ヘキサン＝７：３で溶解させ、シリカゲルカラムクロマト精製（ｋａｎｔｏ  ６０Ｎ，クロロホルム：ヘキサン＝７：３）した後、減圧留去、真空乾燥させた。これをエタノールで再結晶した後、結晶を吸引濾過、真空乾燥させ目的物であるエチルエステル体４を得た。収量は３．０４ｇ、収率は５１％であった。
【００８６】
（１−４）カルボン酸体の合成
カルボン酸体の合成スキームを以下に示す。
【００８７】
【化２４】
2019031604.tif 000025
【００８８】
２０ｍｌのナス型フラスコに、エチルエステル体４を０．１ｇ（０．２４７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、水２ｍｌに溶解させた、水酸化ナトリウム０．０１５ｇ（０．３７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）とエタノール７ｍｌを入れ、８０℃に設定したオイルバス中で１時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、反応溶液を水に入れｐＨが１になる様に塩酸を加えて室温で撹拌した。これをクロロホルムで抽出し、有機層を水で数回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、エタノール：水＝１：１で再結晶して吸引濾過後、結晶を真空乾燥させ目的物であるカルボン酸体５を得た。収量は０．０８２ｇ、収率は８８％であった。
【００８９】
（１−５）活性エステル体の合成
活性エステル体の合成スキームを以下に示す。
【００９０】
【化２５】
2019031604.tif 000026
【００９１】
５０ｍｌのナス型フラスコに、カルボン酸体５を０．０７ｇ（０．１８５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを０．０２６ｇ（０．２２２ｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．２）と、１，４−ジオキサン  ２０ｍｌを入れ室温で撹拌した。これに、１，４−ジオキサン  １０ｍｌに溶解させたＤＣＣ  ０．０４６ｇ（０．２２２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．２）を反応溶液に滴下した後、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）で反応が進行したのを確認後、吸引濾過、減圧留去の順に処理を行った。残渣をクロロホルム：酢酸エチル＝９：１で溶解させ、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｗａｋｏ  Ｇｅｌ  Ｃ３００、クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）した後、減圧留去、真空乾燥させて目的物である活性エステル体６を得た。収量は０．０４６ｇ、収率は５２％であった。
【００９２】
（２）４，７−ジ（メトキシフェニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジンの活性エステル体からのＮ−メチル体の合成
（２−１）Ｎ−メチル体のカルボン酸体の合成
カルボン酸体の合成スキームを以下に示す。
【００９３】
【化２６】
2019031604.tif 000027
【００９４】
１００ｍｌのナス型フラスコに活性エステル体６を０．３ｇ（０．６３２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れＤＭＦ３０ｍｌ中、室温で撹拌した。これに、サルコシン０．０７ｇ（０．７５８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．２）、を反応溶液に添加して反応を開始した。添加後、室温で１３時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水１５０ｍｌに反応溶液を入れ室温で撹拌した。これにｐＨが１以上になるように塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過後、真空乾燥させ目的物であるカルボン酸体７を得た。収量は０．１５ｇ、収率は５３％であった。
【００９５】
（２−２）活性エステル体の合成
活性エステル体の合成スキームを以下に示す。
【００９６】
【化２７】
2019031604.tif 000028
【００９７】
１００ｍｌのナス型フラスコにカルボン酸体７を０．３ｇ（０．６６９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．１２ｇ（１．０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を入れ１，４−ジオキサン３０ｍｌ中、室温で撹拌した。これに、クロロホルム２０ｍｌに溶解させたＤＣＣ  ０．２ｇ（１．０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を１５分かけて滴下した。滴下後、室温で３時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、食塩を一サジ添加した水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で二回洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥させ吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，クロロホルム：アセトニトリル＝９：１）した後、アセトニトリルで再結晶を行った。吸引濾過後、結晶を真空乾燥して目的物である活性エステル体８を得た。収量は０．１ｇ、収率は２４％であった。
【００９８】
合成例２
Ｎ−アルキルアミドエーテル体の活性エステル体の合成について説明する。
【００９９】
（１）ヒドロキシ体の合成
ヒドロキシ体の合成スキームを以下に示す。
【０１００】
【化２８】
2019031604.tif 000029
【０１０１】
２００ｍｌのナス型フラスコに活性エステル体６を２．０ｇ（４．２１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とＮ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩０．７ｇ（８．４２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２）を入れ、１，４−ジオキサン５０ｍｌ中、５０℃に設定したオイルバス中で撹拌した。これに、１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶解させたトリエチルアミン  ０．８５ｇ（８．４２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２）、を反応溶液に滴下して反応を開始した。添加後、５０℃で１３時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、反応溶液を吸引濾過後、減圧留去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，クロロホルム：アセトニトリル＝９：１）した後、これを真空乾燥させ目的物であるヒドロキシ体９を得た。収量は０．６ｇ、収率は３５％であった。
【０１０２】
（２）ペンタン酸メチル体の合成
ペンタン酸メチル体の合成スキームを以下に示す。
【０１０３】
【化２９】
2019031604.tif 000030
【０１０４】
２００ｍｌのナス型フラスコに、ヒドロキシ体９を０．６ｇ（１．４７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）入れ、ＤＭＦ３０ｍｌ中、室温で撹拌した。これに、トリエチルアミン０．２２ｇ（２．２０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を反応溶液に添加した後、５−ブロモペンタン酸メチル０．３４ｇ（１．７６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．２）を加えて反応を開始した。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れクロロホルムで抽出し、有機層を水で２回洗浄した。これに硫酸マグネシウムを加えて吸引濾過後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，クロロホルム１００％）した後、減圧留去、真空乾燥して目的物であるペンタン酸メチル体１０を得た。収量は０．２ｇ、収率は２６％であった。
【０１０５】
（３）カルボン酸体の合成
カルボン酸体の合成スキームを以下に示す。
【０１０６】
【化３０】
2019031604.tif 000031
【０１０７】
１００ｍｌのナス型フラスコに、ペンタン酸メチル体１０を０．２ｇ（０．３９５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）入れ、エタノール４０ｍｌ中、８０℃に設定したオイルバス中で撹拌した。これに、水２０ｍｌに溶解させた水酸化カリウム０．０４４ｇ（０．７９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．０）、を添加して反応を開始した。添加後、８０℃で３時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水１５０ｍｌに反応溶液を入れ、ｐＨが１以上になるように塩酸を加えて室温で撹拌した。これを吸引濾過後、真空乾燥して目的物であるカルボン酸体１１を得た。収量は０．１５ｇ、収率は７７％であった。
【０１０８】
（４）活性エステル体の合成
活性エステル体の合成スキームを以下に示す。
【０１０９】
【化３１】
2019031604.tif 000032
【０１１０】
１００ｍｌのナス型フラスコに、カルボン酸体１１を０．１５ｇ（０．２４９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とＮＨＳ  ０．６１ｇ（０．３７４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を入れ、１，４−ジオキサン３０ｍｌ中、５０℃に設定したオイルバス中で撹拌した。これに、１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶解させたＤＣＣ  ０．０７７ｇ（０．３７４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を反応溶液に添加して反応を開始した。添加後、５０℃で１５時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れクロロホルムで抽出した。有機層を水で２回洗浄した。これに硫酸マグネシウムを加えて吸引濾過後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，クロロホルム１００％）した後、減圧留去し、真空乾燥して目的物である活性エステル体１２を得た。収量は０．１ｇ、収率は５６％であった。
【０１１１】
合成例３
ヒドロキシプロリン体の活性エステル体の合成について説明する。
【０１１２】
（１）ヒドロキシプロリンカルボン酸体の合成
ヒドロキシプロリンカルボン酸体の合成スキームを以下に示す。
【０１１３】
【化３２】
2019031604.tif 000033
【０１１４】
１００ｍｌのナス型フラスコに、活性エステル体６を０．５ｇ（１．０５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とＬ−ヒドロキシプロリン０．２８ｇ（２．１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．０）を入れ、１，４−ジオキサン２５ｍｌ中、室温で撹拌した。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水１５０ｍｌに反応溶液を入れ室温で撹拌した。これを吸引濾過後、真空乾燥して目的物であるヒドロキシプロリンカルボン酸体１３を得た。収量は０．２ｇ、収率は３９％であった。
【０１１５】
（２）活性エステル体の合成
ヒドロキシプロリン体の活性エステル体の合成スキームを以下に示す。
【０１１６】
【化３３】
2019031604.tif 000034
【０１１７】
１００ｍｌのナス型フラスコに、ヒドロキシプロリンカルボン酸体１３を０．２ｇ（０．４０８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）とＮＨＳを０．０７ｇ（０．６１２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を入れ、１，４−ジオキサン２５ｍｌ中、室温で撹拌した。これに、１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶解させたＤＣＣ  ０．１３ｇ（０．６１２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を反応溶液に滴下して反応を開始した。添加後、室温で３時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１）で反応が進行したのを確認後、反応溶液に水、食塩（スプーン１さじ）を入れクロロホルムで抽出した。有機層を水で２回洗浄した。これに硫酸マグネシウムを加えて吸引濾過後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，クロロホルム：メタノール＝９：１）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である活性エステル体１４を得た。収量は０．０２ｇ、収率は９％であった。
【０１１８】
合成例４
ピリジニウム体の活性エステル体の合成について説明する。
【０１１９】
（１）ピリジニウム体の合成
ピリジニウム体の合成スキームを以下に示す。
【０１２０】
【化３４】
2019031604.tif 000035
【０１２１】
１００ｍＬのナス型フラスコに化合物５を１．０ｇ（２．６５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、４−メチルアミノピリジン  ０．４３ｇ（３．９７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を入れＤＭＦ２０ｍＬ中、室温で撹拌した。これに、ＤＭＴ−ＭＭ  １．１ｇ（３．９７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）、を反応溶液に添加して反応を開始した。添加後、室温で１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水２００ｍＬに反応溶液を入れクロロホルムで抽出した。有機層を希塩酸水３回、飽和重曹水２回、水２回で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（ワコーゲルＣ３００、クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物１５を得た。収量は０．４ｇ、収率は３２％であった。
【０１２２】
（２）活性エステル体の合成
ピリジニウム体の活性エステル体の合成スキームを以下に示す。
【０１２３】
【化３５】
2019031604.tif 000036
【０１２４】
３０ｍＬのナス型フラスコに化合物１５を０．４ｇ（０．８５５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、５−ブロモペンタン酸スクシンイミジルエステル  ０．７１ｇ（２．５６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：３．０）を入れトルエン２０ｍＬ中、アルゴン置換後、１００℃で２日間反応させた。反応終了後、吸引濾過後、結晶を真空乾燥させ目的物である化合物１６を得た。収量は０．２５ｇ、収率は３９％であった。
【０１２５】
合成例５（比較例）
比較例として、以下の構造式で表される４，７−ジ（メトキシフェニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジンのピリジニウム体を用いた。
【０１２６】
【化３６】
2019031604.tif 000037
【０１２７】
４−メトキシアセトフェノンを出発原料として用いて、酢酸中、硝酸と亜硝酸ナトリウムの存在下、３０℃で２日間反応を行い、Ｎ−オキシド体２を収率７８％で得た。次に、アセトニトリル中、塩化第一銅次亜リン酸ナトリウムの存在下、８０℃で１４時間の還元反応を行いジケトン体３を収率６２％で得た。さらに、エタノール中、４−ピコリルアミンの存在下、８０℃で２日間の反応を行い、ピリジニウム体を収率７０％で得た。トルエン中、１００℃で３日間、５−ブロモペンタン酸スクシンイミジンエステルと反応させ、ピリジニウム体の活性エステル体１７を収率７８％で得た。
【０１２８】
合成例６（比較例）
比較例として、４，７−ジ（メトキシフェニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジンのアミド体を用いた。
【０１２９】
（１）カルボン酸体の合成
カルボン酸体の合成スキームを以下に示す。
【０１３０】
【化３７】
2019031604.tif 000038
【０１３１】
１００ｍＬのナス型フラスコに化合物６を０．４４ｇ（０．９９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れＴＨＦ  ４０ｍＬ中、６０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、水１０ｍＬに溶解させたグリシン０．１８ｇ（２．４７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．５）、炭酸水素ナトリウム０．２５ｇ（２．９９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：３．０）を反応溶液に添加して反応を開始した。添加後、６０℃で５時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、水１５０ｍＬに反応溶液を入れ室温で撹拌した。これにｐＨが１以上になるように塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過後、真空乾燥させ目的物である化合物７を得た。収量は０．３９ｇ、収率は９８％であった。
【０１３２】
（２）アミド体の合成
アミド体の合成スキームを以下に示す。
【０１３３】
【化３８】
2019031604.tif 000039
【０１３４】
１００ｍＬのナス型フラスコに化合物７を０．３９ｇ（０．９６９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．１７ｇ（１．４５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を入れ、ＴＨＦ３５ｍＬ中、室温で撹拌した。これに、クロロホルム１５ｍＬに溶解させたＷＳＣ・ＨＣｌ  ０．２８ｇ（１．４５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を１５分かけて滴下した。滴下後、室温で１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、食塩を一サジ添加した水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で２回洗浄し吸引濾過、減圧留去を行った。結晶を真空乾燥させ目的物であるアミド体化合物１８を得た。収量は０．３２ｇ、収率は６２％であった。
【０１３５】
（吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
合成した蛍光色素について、溶媒にＤＭＳＯを用いて、蛍光波長の測定および吸収波長の測定を行った。その結果を表１に示す。また、合成例２〜６の化合物の粉末の発光状態を示す写真を図１〜４に示す。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
（結果）
合成例２，３，４の化合物は、アゾール誘導体のピリジン骨格に直接結合するＮ置換アミド基が有している。合成例５の化合物は、アゾール誘導体のピリジン骨格にピリジニウム体が直接結合した化合物である。また、合成例６の化合物は、アゾール誘導体のピリジン骨格に直接結合するアミド基を有している。合成例２，３，４は、合成例５に比べて量子効率も高く、蛍光強度も増加すること、および、化合物６は、合成例２，３，４に比べて、量子効率も小さく、蛍光強度も小さいことを確認した。これより、Ｎ置換アミド基を用いることで、より一層の検出感度の向上が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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