(57)【要約】      （修正有）【課題】脈管障害を治療又は予防するための方法の提供。【解決手段】必要とする対象において脈管障害を治療又は予防するための方法であって、前記対象に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物とを投与することを含む、方法。【選択図】図６
2019031566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法であって、前記対象
に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、
前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物とを投与することを含む、方
法。
【請求項２】
前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、同時に投与される、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】
前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、別々に投与される、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】
さらに、前記投与前に、前記ＭＳＣまたは前記培地の一部を、プロスタサイクリンと接
触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＳＣの成分が、エクソソーム、微小小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮ
Ａ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子およびそれらの組み合わせからなる群か
ら選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記対象に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与することを含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項７】
前記ＥＰＣが、前記対象から取得される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＰＣが、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ
１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパ
ク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換されている、請求項６に記載
の方法。
【請求項９】
前記核酸が、前記タンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロスタサイクリンが、エポプロステノール、トレプロスチニル、ベラプロスト、
イルプロスト、ＰＧＩ２受容体アゴニストおよび薬学的に許容され得るそれらの塩からな
る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もし
くはそのエステルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＳＣが、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＳＣが、骨髄から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脈管障害が、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚
血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害からなる群から選択される、請求項
１に記載の方法。
【請求項１５】
治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと
接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物と、薬学的に
許容され得るキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＭＳＣまたは前記培地の一部が、プロスタサイクリンと接触している、請求項１５
に記載の組成物。
【請求項１７】
さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成
分を含む培地を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するための方法であって、
前記ＭＳＣをプロスタサイクリンと接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
前記プロスタサイクリンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの濃度で存在す
る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により取得可能な処理された組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年１月９日に出願された米国仮出願番号第６１／７５０，４５８号
に対する３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ  １１９条（ｅ）に基づく利益を請求する。その内容は、その
全体が参照により本開示内に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本出願は、脈管障害、例えば、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）および他の種類の肺高血圧
症、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患、糖尿病性脈管障
害等の処置における間葉系幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺動脈性高血圧症は、進行性の肺傷害であり、未処置の場合、診断された後、平均２．
８年以内に死に至る。肺循環の進行する狭窄が、右心のストレス増大をもたらし、右心不
全に発展し得る。定義によれば、慢性の肺高血圧症の症例における平均肺動脈圧（ｍＰＡ
Ｐ）は、安静時に２５ｍｍＨｇより大きく、労作中に３０ｍｍＨｇより大きい（正常値は
、２０ｍｍＨｇ未満である。）。肺動脈性高血圧症の病態生理学は、血管収縮および肺血
管の組織修復により特徴付けられる。慢性ＰＡＨでは、最初に筋肥大していない肺血管の
筋肥大新生が存在し、既に筋肥大した血管の血管筋は、外周で増加する。肺循環のこの進
行する閉塞は、右心における進行性のストレスをもたらす。前記ストレスは、右心からの
低下した出力をもたらし、最終的に、右心不全をもたらす（M. Humbert et al., J. Am. 
Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S）。ＰＡＨは、１００万人あたりに１〜２人の有病率
である、非常に稀な障害である。患者の平均年齢は、３６歳であると推定されており、患
者の１０％のみが、６０歳を超えていた。明確に、男性より女性が罹患する（G. E. D'Al
onzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349）。
【０００４】
上市されている標準的な治療剤（例えば、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受
容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤）は、患者の生活の質、運動耐性およ
び予後を改善することが可能である。これらの治療剤の原理は、主に、血管緊張に影響を
及ぼすが、病原性の組織修復プロセスにおける直接的な影響を有しない血流力学的なもの
である。さらに、これらの薬剤を使用する可能性は、場合により、深刻な副作用および／
または混合型の投与により制限される。患者の臨床状態が特定の単剤療法により改善また
は安定化され得る期間は限定的である。最終的には、治療は段階的に拡大するため、混合
療法が適用される。この場合、複数の薬剤が、同時に提供されなければならない。肺動脈
性高血圧症の治療における全ての利点に関わらず、この深刻な障害の治癒の見通しは未だ
に存在しない。
【０００５】
末梢血管疾患（ＰＶＤ）の用語は、末梢の動脈および静脈内の傷害、機能不全または障
害を意味する。末梢動脈疾患は、ＰＶＤの最も一般的な形式である。末梢血管疾患は、動
脈の最も一般的な疾患であり、米国において非常に一般的な症状である。末梢血管疾患は
、ほとんどが、５０歳を超える人々において起こる。末梢血管疾患は、５０歳を超える人
々および糖尿病を有するそれらの人々における能力障害の主因である。米国において約１
０００万人が、末梢血管疾患を有し、これは、５０歳を超える人々の約５％に換算される
。前記症状を有する人数は、人口の高齢化と共に増加することが予測される。男性は、女
性よりわずかに多く、末梢血管疾患を有するであろう。
【０００６】
進行した末梢動脈閉塞による重症下肢虚血（ＣＬＩ）は、休息時の血流および酸素輸送
の低下により、休息時の筋肉痛および、非治癒性の皮膚潰瘍または壊疽を生じることによ
り特徴付けられる（Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest 31:651-666 (2001)；Dorma
ndy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31: S1-S296 (2000)）。重症下肢虚血は、１年間
で、１００万人あたりに５００〜１０００人において発症すると推測される（「Second E
uropean Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia」, Circulation 84(4 
Suppl.) IV 1-26 (1991)）。重症下肢虚血を有する患者において、その関連する病的状態
、死亡および機能的関連に関わらず、切断が、多くの場合、身体的障害の兆候に対する解
決策として推奨される（M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993)；M. 
Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)）。重症下肢虚血に最適な医療的治
療は存在しない（Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)）。
【０００７】
冠状動脈疾患（アテローム硬化症）は、ヒトにおける進行性疾患である。この場合、１
つ以上の冠状動脈が、プラークの蓄積により徐々に閉塞される。この疾患を有する患者の
冠状動脈は、多くの場合、部分的に閉塞した動脈を開くのを支える、バルーン血管形成ま
たはステントの挿入により処置される。最終的に、これらの患者は、非常に高価でリスク
のある、冠状動脈バイパス手術を受ける必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
一実施形態では、本開示は、対象に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物と
を投与することを含む、必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方
法に関する。プロスタサイクリンおよび組成物は、同時または別々に投与され得る。
【０００９】
一部の実施形態では、投与前に、ＭＳＣは、プロスタサイクリンと接触している。同様
に、培地またはＭＳＣ（該ＭＳＣから培地を取得する）は、このような投与の前に、プロ
スタサイクリンとの接触に供され得る。したがって、一部の実施形態では、前記方法は、
さらに、このような前処理工程を含む。
【００１０】
ＭＳＣ培養物の一部から取得された成分の非限定的な例としては、エクソソーム、微小
小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖
因子またはそれらの組み合わせがあげられる。
【００１１】
一態様において、このような方法は、さらに、対象に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与
することを必要とする。一態様において、ＥＰＣは、対象から取得される。一部の態様で
は、ＥＰＣは、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１
）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク
質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換される。一態様において、核酸
は、タンパク質をコードする。
【００１２】
プロスタサイクリンの例としては、限定されるものではないが、エポプロステノールナ
トリウム、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロストおよびＰＧＩ２受容体アゴニ
ストがあげられる。一態様において、プロスタサイクリンは、トレプロスチニルまたは薬
学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである。
【００１３】
実施形態において、さらに、治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（
ＭＳＣ）またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣから放出された化合物を含む培地と、薬学
的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。一部の態様では、組成物は
、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。
【００１４】
さらに別の実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣ
から放出された化合物を含む培地を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するため
の方法であって、ＭＳＣをプロスタサイクリンと接触させることを含む方法を提供する。
このような方法により取得可能な処理された組成物も提供される。
【００１５】
他の実施形態では、医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキ
ャリアまたは少なくとも１つの治療剤を含む。別の実施形態では、対象は、脈管障害、例
えば、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）
、冠状動脈疾患または糖尿病性脈管障害に罹患している。他の実施形態では、本方法は、
肺動脈における血栓症を低減し、肺動脈における炎症を低減し、肺動脈における内膜平滑
筋の増殖を低減し、肺動脈における叢状病変の形成を低減し、肺動脈における一酸化窒素
の量を増加させ、肺動脈におけるＰＧＩ２の量を増加させ、肺動脈におけるエンドセリン
−１のレベルを低下させ、または、肺動脈における増殖因子の量を低下させる。他の実施
形態では、本方法は、肺動脈における適切な内皮形態を促進する。
【００１６】
この開示の実施形態として図面を提供するが、これは例示のみを目的とし、限定するも
のではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト骨髄由来のＭＳＣにおける免疫表現型分析の結果を示す。
【００１８】
【図２】トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後のヒト骨髄ＭＳＣによる、ＶＥＧＦ分泌を示すチャートである。
【００１９】
【図３Ａ】トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後におけるＶＥＧＦの、ＭＳＣ分泌チャートを表す。
【図３Ｂ】トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後におけるＶＥＧＦの、遺伝子発現チャートを表す。
【００２０】
【図４】増大した濃度のトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの典型的な画像を表す。
【００２１】
【図５】トレプロスチニルに曝されたＭＳＣの細胞生存率を示すチャートである。
【００２２】
【図６】細胞のシグナル伝達、遺伝子発現およびパラクリン因子の放出における、トレプロスチニルの効果についてのモデルを図示する。
【００２３】
【図７Ａ】２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルで処理されたＭＳＣまたは同処理をされていないＭＳＣを示す、画像を表す。
【図７Ｂ】２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルで処理されたＭＳＣまたは同処理をされていないＭＳＣを示す、チャートを表す。
【００２４】
【図８】トレプロスチニルで処理されたＭＳＣにおいて、選択された遺伝子の変化した発現を示す２つのチャートを表す。
【００２５】
【図９Ａ】最も明確に特異的に発現した遺伝子を用いて、トレプロスチニルで処理されたＭＳＣをコントロールからクラスター化する、２つのヒートマップを表す。
【図９Ｂ】他の遺伝子配列もしくは配列タグを用いて、トレプロスチニルで処理されたＭＳＣをコントロールからクラスター化する、２つのヒートマップを表す。
【００２６】
【図１０】ＭＳＣ由来のエクソソームにおけるＲＮＡ含量が、トレプロスチニル処理により変化することを示すチャートを表す。
【００２７】
【図１１Ａ】トレプロスチニル処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を示す。
【図１１Ｂ】トレプロスチニル未処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
一部または全ての図は、例示のための模式的表現である。このため、それらは、示され
た構成要素の実際の相対的なサイズまたは位置を必ずしも図示しない。図は、それらが、
以下の特許請求の範囲の範囲または意味を限定するのに使用されないであろうという明白
な理解を伴って、１つ以上の実施形態を説明する目的のために表される。
【００２９】
特に断らない限り、「ａ」または「ａｎ」は、「１以上（one or more）」を意味する
。
【００３０】
特に他に規定しない限り、本願明細書において使用される全ての技術的および科学的用
語は、（例えば、幹細胞の生物学、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タン
パク質化学および生化学における）当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有す
るであろう。
【００３１】
特に断らない限り、本開示において使用される組換えタンパク質、細胞培養および免疫
技術は、当業者に周知の標準的な手法である。このような技術は、例えば、J. Perbal, A
Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook e
t al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Pr
ess (1989)、T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Appro
ach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D. M. Glover and B. D. Hames (editors), 
DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)およびF
. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pu
b. Associates and Wiley-Interscience（1988、現在までの全てのアップデートを含む）
、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbour Laboratory, (1988)ならびにJ. E. Coligan et al. (editors) Current Proto
cols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全てのアップデートを含む）の出
典における文献全体を通して記載され、説明される。これらの文献は、参照により本願明
細書に組み込まれる。
【００３２】
本願明細書において、プロスタサイクリンおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の両方が、脈
管障害についての治療活性を有することが見出される。さらに、プロスタサイクリンおよ
びＭＳＣの組み合わせは、相乗効果を生じさせる。このような組み合わせは、患者に対す
る、プロスタサイクリンおよびＭＳＣの同時もしくは別々であり得る共投与、または、プ
ロスタサイクリンにより前処理されているＭＳＣ組成物の患者への投与のいずれかであり
得る。
【００３３】
ＭＳＣが、患者における脈管障害を改善し得ることが示され、このような治療効果は、
抗炎症因子および血管新生促進因子を疾患領域に送達させることにより、局所微小環境を
改善するＭＳＣの能力によって達成されると考えられる。ただし、ＭＳＣは、身体におい
て短命であり、再生しない。
【００３４】
プロスタサイクリン、例えば、トレプロスチニル（ＴＰ）は、肺動脈性高血圧（ＰＡＨ
）の患者を処置するのに使用されてきた。この観点から、プロスタサイクリンは、血管拡
張活性および抗血小板凝集活性を有することが示されてきた。
【００３５】
プロスタサイクリンが、脈管障害の処置のためのＭＳＣの活性を増大させて、このよう
な処置についての相乗性を示し得ることは、予期せぬ発見である。この観点から、プロス
タサイクリンが、血管成長におけるＭＳＣの有益な効果を増大させることが観察される。
例えば、プロスタサイクリンは、タンパク質および遺伝子のレベルの両方において、ＶＥ
ＧＦの発現を増大させる。分泌されたサイトカインの変化も、プロスタサイクリン暴露の
結果として観察される。例えば、ＩＬ−６は、約５０倍増大する。一方、ＭＣＰ−１は、
約６〜７倍低下する。
【００３６】
このような相乗性は、患者が、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与された場合にも
証明される。このため、プロスタサイクリンは、ＭＳＣによりＥＰＣの活性を増大させ得
ると考えられる。したがって、このような相乗性により、プロスタサイクリンとＭＳＣと
の組み合わせ（任意に、ＥＰＣも一緒に）の使用は、改善された治療結果および／または
各作用剤単独の必要性の低下を導くことができ、それは、次に、より高い用量において各
作用剤単独により潜在的に引き起こされる悪影響の低下をもたらすことができる。
【００３７】
さらに、このような相乗性は、ＭＳＣ馴化培地に適用可能であると考えられる。この目
的のために、プロスタサイクリン処理ＭＳＣのエクソソームが、より高いレベルのＶＥＧ
Ｆ−Ａを有し、それが、遺伝子水平伝播のメカニズムにより、ターゲット細胞におけるＶ
ＥＧＦ産生の増大を促進し得ることが観察される。さらに、プロスタサイクリンに対する
暴露は、より均質な集合のエクソソームを生じさせる。
【００３８】
本願明細書で使用する場合、「ＭＳＣ馴化培地」は、（例えば、ＭＳＣを培養する目的
で）ＭＳＣと接触しているため、ＭＳＣから放出された化合物を含む培地を意味する。こ
のような放出された化合物の非限定的な例としては、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲ
ＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子もしくは他の種の生物学的活性剤を封
入し得るエクソソームまたは他の微小小胞があげられる。
【００３９】
本願明細書で使用する場合、「培地」は、（ａ）ＭＳＣを培養するのに使用される典型
的な成分、例えば、アミノ酸、グルコースおよび種々の塩を含む、ＭＳＣを含むかもしく
は含まない培地、ならびに、（ｂ）培養中にＭＳＣから放出された化合物を含む培地から
単離された組成物の両方を包含する。
【００４０】
したがって、本開示の一実施形態は、必要とする対象において脈管障害を治療または予
防するための方法であって、対象に、プロスタサイクリンおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
またはＭＳＣ馴化培地を含む組成物（まとめて、「ＭＳＣ組成物」）を投与することを含
む方法を提供する。
【００４１】
一態様では、プロスタサイクリンおよびＭＳＣ組成物は、同時に投与される。別の態様
では、プロスタサイクリンおよびＭＳＣ組成物は、別々に投与される。別々に投与される
場合、プロスタサイクリンは、ＭＳＣ組成物の投与前または同投与後に投与され得る。
【００４２】
別の実施形態では、必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法
であって、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地を含む組成物をプロ
スタサイクリンと接触させ、ついで、ＭＳＣ組成物を対象に投与することを含む方法が提
供される。
【００４３】
脈管障害の非限定的な例としては、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶ
Ｄ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害があげられる。
【００４４】
本願明細書で使用する場合、「対象」（本願明細書では、「患者」とも呼ばれる）の用
語は、温血動物、好ましくは哺乳類、例えば、ヒトを含む。好ましい実施形態では、対象
は、霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【００４５】
本願明細書で使用する場合、「治療すること（treating）」、「治療する（treat）」
または「治療（treatment）」の用語は、脈管障害の少なくとも１つの兆候を低減または
除去するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与することを含む
。
【００４６】
本願明細書で使用する場合、「予防すること（preventing）、「予防する（prevent）
または「予防（prevention）」の用語は、脈管障害の少なくとも１つの兆候の進行を停止
または防止するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与すること
を含む。
【００４７】
Ａ．プロスタサイクリン
本願明細書で使用される「プロスタサイクリン」の用語は、任意のプロスタグランジン
Ｉ２（ＰＧＩ２）、任意のプロスタサイクリン類似体および任意のＰＧＩ２受容体アゴニ
ストを明示的に含む。本技術に適したプロスタサイクリンの非限定的な例としては、エポ
プロステノールナトリウム（例えば、Ｆｌｏｌａｎ（登録商標））、トレプロスチニル（
例えば、ＴＹＶＡＳＯ（登録商標）、レモジュリン（登録商標））、イルプロスト（例え
ば、Ｖｅｎｔａｖｉｓ（登録商標））およびＰＧＩ２受容体アゴニスト（例えば、Ｓｅｌ
ｅｘｉｐａｇ）があげられる。一態様では、プロスタサイクリンは、トレプロスチニルま
たは薬学的許容され得る塩もしくはそのエステルである。
【００４８】
Ｂ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳
、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋
、真皮および骨膜において見出される細胞であり、種々の生殖細胞株、例えば、中胚葉、
内胚葉および外胚葉に分化可能である。例えば、ＭＳＣは、数多くの細胞種、例えば、限
定されるものではないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維
性結合組織に分化可能である。特定の分化系列決定およびこれらの細胞が入る分化経路は
、機械的影響および／または内在的生体活性因子、例えば、増殖因子、サイトカインおよ
び／または宿主組織により確立された局所微小環境条件からの種々の影響により決まる。
ＭＳＣは、非造血前駆細胞であり、娘細胞を産生する。娘細胞は、分割されて、やがては
不可逆的に分化して表現型細胞を生じさせるであろう、幹細胞または前駆細胞のいずれか
である。ＭＳＣの例としては、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）があげられる。
【００４９】
本願明細書で使用する場合、「幹細胞」の用語は、表現型的および遺伝子型的に同一の
娘および少なくとも１つの他の最終的な細胞種（例えば、最終的に分化した細胞）を産生
し得る自己再生細胞を意味する。「幹細胞」の用語は、全能性、多能性および多分化能の
細胞ならびにそれらの分化由来の前駆細胞および／または前駆体細胞を含む。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、「全能性細胞（totipotent cellまたはtotipotential cel
l）」の用語は、完全な胚（例えば、胞胚）を形成可能な細胞を意味する。
【００５１】
本願明細書で使用する場合、「多能性細胞（pluripotent cellまたはpluripotential c
ell）」の用語は、完全に分化した万能性、すなわち、哺乳類の身体の約２６０の細胞種
のいずれかに成長する能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、自己再生することが
でき、組織内で休止または静止したままであることができる。
【００５２】
「多分化能細胞（multipotential cell）」または「多分化能細胞（multipotent cell
）」の用語は、複数の成熟細胞種のいずれかを生じ得る細胞を意味する。本願明細書で使
用する場合、この表現は、成体性または胚性の幹細胞および前駆細胞ならびにこれらの細
胞の多分化能子孫を包含する。多能性細胞と違って、多分化能細胞は、細胞種の全てを形
成する能力を有していない。
【００５３】
本願明細書で使用する場合、「前駆細胞（progenitor cell）」または「前駆体細胞（p
recursor cell）」の用語は、特定種の細胞に分化するか、または、特定種の組織を形成
することを約束された細胞を意味する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本開示の方法に使用される細胞は、対象から取得されたサンプ
ルから濃縮される。「濃縮される（enriched）」、「濃縮（enrichment）」の用語または
それらの変形は、本願明細書において、未処理の集合と比較した場合、１つの特定の細胞
種の割合または複数の特定の細胞種の割合が増加している細胞集合を説明するのに使用さ
れる。
【００５５】
好ましい実施形態では、本開示に使用される細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＳＴＲＯ−１＋、Ｖ
ＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋ま
たはそれらの任意の組み合わせである。
【００５６】
細胞が所定のマーカーについて「陽性」であると言う場合、その細胞は、マーカーが細
胞表面上に存在する度合いに応じて、そのマーカーの低い（ｌｏもしくは薄暗い）または
高い（明るい、ｂｒｉ）表現体のいずれかであり得る。ここで、用語は、細胞のカラー分
類プロセスにおいて使用される蛍光または他の色の強度に関連する。ｌｏ（または薄暗い
もしくはくすんでいる）とｂｒｉの区別は、分類される特定の細胞集合に使用されるマー
カーに関連して理解されるであろう。本願明細書において、細胞が所定のマーカーについ
て「陰性」であると言う場合、それは、マーカーがその細胞により全く発現されていない
ことを意味しない。マーカーが相対的に非常に低いレベルでその細胞により発現されてい
ること、および、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを生成することを意味
する。
【００５７】
本願明細書で使用する場合、「ＴＮＡＰ」の用語は、組織非特異的アルカリホスファタ
ーゼの全てのアイソフォームを包含することを意図する。例えば、前記用語は、肝臓のア
イソフォーム（ＬＡＰ）、骨のアイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓のアイソフォーム（
ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態では、ＴＮＡＰは、ＢＡＰである。特に好ましい
実施形態では、本願明細書で使用する場合、ＴＮＡＰは、２００５年１２月１９日にＡＴ
ＣＣに寄託された、ブダペスト条約の条項に基づいた受託番号ＰＴＡ−７２８２に基づく
、ハイブリドーマ細胞株により産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合し得る分子を意味する
。
【００５８】
前記方法に有用な幹細胞は、成体性組織、胚、胚体外組織または胎児由来であり得る。
「成体性」の用語は、出生後の対象を含むその最も広い意味に使用される。好ましい実施
形態では、「成体性」の用語は、思春期後の対象を意味する。本願明細書で使用する場合
、「成体性」の用語は、女性から採取した臍帯血も含み得る。
【００５９】
一部の態様では、幹細胞は、本願明細書に記載された幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養か
ら生じた子孫細胞であり得る（増殖細胞（expanded cell）とも呼ばれ得る）。本開示の
増殖細胞は、培養条件（例えば、培地中の刺激性因子の数および／または種類）、継代の
回数等に応じた広い各種の表現型を有し得る。特定の実施形態では、子孫細胞は、親集合
から、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回または約１０
回の継代後に取得される。ただし、子孫細胞は、親集合から任意の回数の継代後に取得さ
れ得る。
【００６０】
子孫細胞は、任意の適切な培地において培養することにより取得され得る。細胞培養に
言及して使用される場合の「培地」の用語は、細胞周囲の環境の成分を含む。培地は、固
体、液体、気体または相および材料の混合物であり得る。培地としては、液体増殖培地お
よび細胞増殖を維持しない液体培地があげられる。培地は、ゼラチン状の培地、例えば、
アガー、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリクスも含む。「培地」の用語は、
それがまだ細胞と接触していなくとも、細胞培養において使用することを意図した材料も
意味する。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分の高い液体は、培地である。
【００６１】
一実施形態において、子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体により標識された磁性ビーズを使
用して、骨髄からＴＮＡＰ＋細胞を単離することにより取得され、２０％ ウシ胎児血清
、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００μｍ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸を添加した
α−ＭＥＭに播種される。
【００６２】
一実施形態では、（少なくとも５回の継代後の）このような増殖細胞は、ＴＮＡＰ−、
ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−；ＣＤ３−
、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−および／またはＣＤ８０−であり得る。た
だし、本願明細書に記載された条件と異なる培養条件下においては、種々のマーカーの発
現が変動し得ることが可能である。また、これらの表現型の細胞が増殖細胞集合において
優位を占め得るが、このことは、少ない割合のこの表現型を有さない細胞が存在しないこ
とを意味しない（例えば、小さい割合の増殖細胞は、ＣＣ９−であり得る。）。好ましい
一実施形態では、本開示の増殖細胞は、種々の細胞種に分化する能力をまだ有する。
【００６３】
一実施形態では、本開示の方法に使用される増殖細胞集合は、少なくとも２５％、より
好ましくは少なくとも５０％の細胞が、ＣＣ９＋である細胞を含む。
【００６４】
別の実施形態では、本開示の方法に使用される増殖細胞集合は、少なくとも４０％、よ
り好ましくは少なくとも４５％の細胞が、ＳＴＲＯ−１＋である細胞を含む。
【００６５】
更なる実施形態では、子孫細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡ
Ｍ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９
、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、イン
テグリン  ベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤ
ＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴ
ＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ブライトおよびＣＤ１４６または
これらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から選択されるマーカーを発現し得る。
【００６６】
一実施形態では、子孫細胞は、国際公開第２００６／０３２０９２号パンフレットに規
定された多分化能の増殖ＭＳＣ子孫（ＭＥＭＰ）である。子孫が派生し得るＭＳＣの濃縮
された集合を調製するための方法は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットおよび
国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットに記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
の状況において、ＭＳＣは、絶対的に純粋な調製物としてはめったに存在しないであろう
し、組織特異的関連細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と共に一般的に存在するであろう。
国際公開第０１／０４２６８号パンフレットは、約０．１％〜９０％の純度レベルでの、
骨髄からのこのような細胞の採取に言及する。子孫が派生するＭＳＣを含む集合は、組織
供給源から直接的に採取することができ、あるいは、集合は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて既
に増殖している集合であってもよい。
【００６７】
例えば、子孫は、実質的に精製されたＭＳＣの採取された未増殖の集合から取得され得
る。精製されたＭＳＣは、それらが存在する集合の総細胞の少なくとも約０．１、１、５
、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む。このレベルは
、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ
１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーについて
陽性である細胞を選択することにより達成され得る。
【００６８】
ＭＳＣ開始集合は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットまたは国際公開第２０
０４／０８５６３０号パンフレットに提示された任意の１つ以上の組織種、すなわち、骨
髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚、または、おそらくより広義に、脂肪組織、歯、歯髄
、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨
、靭帯、骨髄、腱および骨格筋由来であり得る。
【００６９】
ＭＥＭＰは、それらがマーカーであるＳＴＲＯ−１  ｂｒｉについて陽性であり、マー
カーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について陰性である点で、新鮮に採取され
たＭＳＣから区別され得る。対照的に、新鮮に単離されたＭＳＣは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ
およびＡＬＰの両方について陽性である。本開示の好ましい実施形態では、投与された細
胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。更なる好ましい
実施形態では、ＭＥＭＰは、１つ以上のマーカー、Ｋｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣ
Ｄ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１について陽性である。さらに更なる好ましい
実施形態では、ＭＥＭＰは、ＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、マーカーであるＣ
Ｄ１８について陰性である。
【００７０】
一実施形態では、細胞は、脈管障害を有する患者から取得され、標準的な技術を使用し
てｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養され、自家移植または同種移植として患者に投与される
。別の実施形態では、１つ以上の確立されたヒト細胞株の細胞が使用される。本開示の別
の有用な実施形態では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合、別の種由来）の細
胞が使用される。
【００７１】
本技術は、任意の非ヒト動物種、例えば、限定されるものではないが、非ヒト霊長類の
細胞、有蹄類、イヌ科、ネコ科、ウサギ目、げっ歯類、鳥類および魚類の細胞を使用して
実施され得る。本開示が行われ得る霊長類の細胞としては、限定されるものではないが、
チンパンジー、ヒヒ、マカクならびに任意の他の新世界または旧世界のサルの細胞があげ
られる。本開示が行われ得る有蹄類の細胞としては、限定されるものではないが、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、スイギュウおよびバイソンの細胞があげられる。本開示が行
われ得るげっ歯類の細胞としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモ
ット、ハムスターおよびアレチネズミの細胞があげられる。本開示が行われ得るウサギ目
種の例としては、家畜化されたウサギ、ジャックウサギ、ノウサギ、ワタオウサギ、カン
ジキウサギおよびナキウサギがあげられる。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は
、本開示が行われ得る鳥類種の例示である。
【００７２】
細胞は、使用前に保存され得る。真核細胞、および特に哺乳類の細胞を保持および保存
するための方法およびプロトコルは、当分野において周知である（参照．例えば、Pollar
d, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, 
Humana Press, Totowa, N.J.；Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Four
th Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.）。単離された幹細胞、例えば、間葉系幹細胞
／前駆細胞またはそれらの子孫の生物学的活性を維持する任意の方法は、本開示と共に使
用され得る。好ましい一実施形態では、細胞は、凍結保存を使用することにより維持およ
び保存をされる。
【００７３】
細胞は、各種の技術を使用して取得され得る。例えば、細胞が細胞−抗体複合体または
抗体に結合した標識と関連する特性を参照することにより物理的に分離される、数多くの
細胞分取技術が使用され得る。この標識は、磁性粒子または蛍光分子であり得る。抗体は
、それらが複数の細胞の凝集体を形成するように、架橋され得る。凝集体は、その密度に
より分離可能である。また、抗体は、所望の細胞が付着する固定マトリクスに結合し得る
。
【００７４】
好ましい実施形態では、ＴＮＡＰ＋、ＳＴＲＯ−１＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋
、ＳＴＲＯ−２＋、３Ｇ５＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋と結合する抗体（または他の結
合剤）が、細胞を単離するために使用される。より好ましくは、ＴＮＡＰ＋またはＳＴＲ
Ｏ−１＋と結合する抗体（または他の結合剤）が、細胞を単離するために使用される。
【００７５】
非結合の細胞から抗体結合細胞を分離する種々の方法が公知である。例えば、細胞に結
合した抗体（または抗−同位体抗体）は標識され得、ついで、細胞は、標識の存在を検出
する機械的なセルソーターにより分離され得る。蛍光活性化セルソーターは、当分野にお
いて周知である。一実施形態では、抗−ＴＮＡＰ抗体および／またはＳＴＲＯ−１抗体は
、固体支持体に結合する。種々の固体支持体が、当業者に公知であり、例えば、限定され
るものではないが、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空の繊維膜、ポリマーお
よびプラスチックペトリ皿である。抗体が結合した細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を
単に物理的に分離することにより、細胞懸濁液から除去され得る。
【００７６】
超常磁性の微小粒子は、細胞分離に使用され得る。例えば、微小粒子は、抗−ＴＮＡＰ
抗体および／またはＳＴＲＯ−１抗体により覆われ得る。ついで、抗体タグ付き超常磁性
微小粒子は、所望の細胞を含む溶液と共にインキュベートされ得る。微小粒子は、所望の
幹細胞の表面に結合し、ついで、これらの細胞は、磁界において採取され得る。
【００７７】
別の例では、細胞のサンプルは、例えば、固相結合した抗−ＴＮＡＰモノクローナル抗
体および／または抗−ＳＴＲＯ−１モノクローナル抗体と物理的に接触させる。固相結合
は、例えば、プラスチック、ニトロセルロースまたは他の表面への抗体の吸着を含み得る
。抗体は、中空の繊維膜の大きな孔（細胞が通るのに十分大きい）の壁にも吸着され得る
。または、抗体は、ビーズ、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＭＢ
マクロビーズの表面に共有結合され得る。固相結合抗体と幹細胞含有懸濁液とのインキュ
ベーションの正確な条件および期間は、使用されるシステムに特異的な複数の要因により
決まるであろう。ただし、適切な条件の選択は、十分に当業者の技術範囲内である。
【００７８】
ついで、非結合の細胞は、幹細胞を結合させるのに十分な時間後に、生理学的なバッフ
ァーにより溶出または洗浄をされる。非結合の細胞は回収され、他の目的に使用されるか
、または、適切な試験によって所望の分離が達成されていることを確認した後に廃棄され
得る。ついで、結合した細胞は、固相から任意の適切な方法により、主に固相および抗体
の性質に応じて分離される。例えば、結合した細胞は、プラスチックペトリ皿から、激し
い振とうにより溶出され得る。あるいは、結合した細胞は、酵素的に「切れ目を入れるこ
と」または、固相と抗体との間における酵素感受性の「スペーサ」配列を消化することに
より溶出され得る。アガロースビーズに結合するスペーサは、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａから市販されている。
【００７９】
ついで、溶出され、濃縮された細胞画分は、遠心によりバッファーで洗浄され得る。前
記濃縮画分は、従来の技術に基づいて後の使用のために、生きた状態で凍結保存され、培
養増殖され、および／または、患者に導入され得る。
【００８０】
Ｃ．ＭＳＣ馴化培地
ＭＳＣは、増殖または分化中に細胞外環境内に放出され得る化合物を介してその活性を
発揮し得ることが見出されている。一部の態様では、このような化合物としては、エクソ
ソームと呼ばれる微小小胞があげられる。微小小胞は、直径が約３０ｎｍ〜約２００ｎｍ
である。エクソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、宿主細胞により取り込まれ得る。
【００８１】
エクソソームは、多小胞体選別経路由来の小胞である。最近の研究は、エクソソームが
、細胞内伝達および免疫調節プロセスの容易化に有用な生体活性小胞であることを示して
いる。ＭＳＣエクソソームは、２０Ｓプロテアソームおよび数多くのＲＮＡ（メッセンジ
ャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含む。
【００８２】
エクソソームに加えて、ＭＳＣは、本開示の目的に有用な他の生体活性分子／小胞も放
出する。このような分子および小胞としては、限定されるものではないが、ミトコンドリ
アおよび増殖因子があげられる。ＭＳＣから放出されたこのような分子および小胞を含む
培地を調製する方法ならびに特定の分子および小胞をさらに単離する方法は、当分野にお
いて公知である。例えば、Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)を参照
のこと。
【００８３】
Ｄ．プロスタサイクリンによるＭＳＣの前処理
一部の実施形態では、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地とプロスタサイクリンとを、患者に
共に投与する前に、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地は、任意に、プロスタサイクリンにより
前処理され得る。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用の間葉系幹細胞（
ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地を調製するための方法であって、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化
培地をプロスタサイクリンと接触させることを含む方法が提供される。さらに別の実施形
態は、このような方法により取得可能な、処理されたＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地を提供
する。
【００８４】
化合物による細胞または培地の前処理は、公知の技術を包含する。一態様では、プロス
タサイクリンは、ＭＳＣを含む培地に添加され、同培地と共にインキュベートされ得る。
ただし、任意に、このような共インキュベートは、さらに、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ
およびアンジオポイエチン−１または−２、血小板由来の増殖因子）および／または低酸
素の添加を含み得る。
【００８５】
ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地は、種々の方法において、プロスタサイクリンにより処理
され得る。例えば、プロスタサイクリンは、ＭＳＣの増殖中に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて
ＭＳＣを処理するために使用することができ、プロスタサイクリンは、投与後に、ＭＳＣ
を処理するために使用することもできる。一部の態様では、プロスタサイクリン濃度は、
少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、または、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／
ｍＬもしくは２５０μｇ／ｍＬである。一部の態様では、プロスタサイクリン濃度は、約
４００μｇ／ｍＬ以下、または、約３５０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬもしくは２５０
μｇ／ｍＬ以下である。
【００８６】
本開示の一実施形態に基づいて、ＭＳＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調
製され得る。その場合、プロスタサイクリンは、ＭＳＣがレシピエントから単離される前
に、ＭＳＣを処理するためにも使用され得る。
【００８７】
Ｅ．内皮前駆細胞（ＥＰＣ）
上述したように、患者が、さらに内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与される場合に、脈管障
害を処置するためのプロスタサイクリンとＭＳＣとの間の相乗性も証明される。例えば、
本開示の方法の任意の実施形態について、患者は、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投
与される。
【００８８】
一部の実施形態では、ＥＰＣも、プロスタサイクリンにより前処理され得る。プロスタ
サイクリンにより処理されたＥＰＣは、増大した血管新生特性を有する過剰増殖の表現型
を示し、未処理のＥＰＣと比較して、脈管障害を処置するのに有利である。
【００８９】
ＥＰＣは、種々の方法において、プロスタサイクリンにより処理され得る。例えば、プ
ロスタサイクリンは、ＥＰＣの増殖中に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＥＰＣを処理するた
めに使用され得る。プロスタサイクリンは、レシピエントに対して、ＥＰＣと共に投与さ
れ得る。プロスタサイクリンは、移植後に、ＥＰＣを処理するためにも使用され得る。本
開示の一実施形態に基づいて、ＥＰＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調製さ
れる。その場合、プロスタサイクリンは、ＥＰＣがレシピエントから単離される前に、Ｅ
ＰＣを処理するためにも使用され得る。
【００９０】
ＥＰＣは、増殖が誘導され得る未分化細胞である。ＥＰＣは、各細胞分割に関して、少
なくとも１つの娘細胞もＥＰＣ細胞であるように、自己維持可能である。ＥＰＣは、１０
０、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００倍またはそれ
以上に増殖し得る。
【００９１】
ＥＰＣの表現型検査は、これらの細胞が、関連する造血マーカーであるＣＤ４５を発現
することを証明する。さらに、ＥＰＣは、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＴｉｅ−２につ
いて免疫反応性であり得る。任意に、ＥＰＣは、ＣＤ１４について免疫反応性である。Ｅ
ＰＣは、多分化能前駆細胞である。
【００９２】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、胚の血管新生および造血に必須であるシグナルを伝
達する、ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）な
らびにＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４を含む、特定のチロシンキナーゼ受容体を介して作用
する。ＶＥＧＦは、３つ全ての受容体に結合するが、ほとんどの生物学的機能は、ＶＥＧ
ＦＲ−２により媒介される。ＶＥＧＦＲ−１の役割は、現在未知である。ＶＥＧＦＲ３／
Ｆｌｔ４のシグナル伝達は、リンパ性内皮細胞の発達に重要であることが公知であり、Ｖ
ＥＧＦＲ３のシグナル伝達は、内皮細胞に対して、リンパ性内皮様表現型を付与し得る。
ＶＥＧＦＲは、血管成長、血管弛緩、血管透過の誘導、内皮細胞の遊走、増殖および生存
の刺激に必須のプロセスについてのシグナルを中継する。内皮細胞は、全ての種々のＶＥ
ＧＦ−Ｒを発現する。胚形成中に、前駆細胞である血管芽細胞が造血系および血管系の両
方をもたらし得ることが報告されてきた。
【００９３】
Ｔｉｅ−２は、内皮特異的受容体チロシンキナーゼであり、アンジオポイエチン１に対
する受容体である。それは、活発に成長している血管の内皮において優先的に発現され、
最も初期の哺乳類の内皮細胞系統マーカーを表し得るＩ型膜タンパク質である。Ｔｉｅ−
２は、内皮細胞の増殖および分化の調節におそらく関与し、血管の形成中に内皮細胞の特
定の配向を方向付け得る。
【００９４】
ＣＤ１４抗原は、リポポリ多糖類（ＬＰＳ）とＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）との複
合体に対する高親和性受容体である。ＣＤ１４抗原は、ＣＤ１４、ＴＬＲ４およびＭＤ−
２から構成された機能性ヘテロマーＬＰＳ受容体複合体の一部である。ＣＤ１４は、末梢
血、他の体液ならびに種々の組織、例えば、リンパ節および脾臓における大部分のヒト単
球およびマクロファージにおいて強力に発現される。ＣＤ１４は、ヒト好中球および骨髄
樹状細胞の亜集合において弱く発現される。
【００９５】
ＣＤ４５抗原は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても公知のチロシンホスファターゼで
ある。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板およびその前駆細胞を除く、造血性由来の全て
のヒト細胞に存在する。ＣＤ４５分子は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に必要とされ、細
胞の活性化状態に応じて、少なくとも５つのアイソフォームで発現される。
【００９６】
ＶＥＧＦＲ−１＋、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋の細胞は、血液における単核
細胞の全集合の、それぞれ、約３．０＋−０．２％、０．８＋−０．５％、２．０＋−０
．３％を構成した。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋の細胞は、単球の全集合の約２．０＋
−０．５％を構成し、血液における単核細胞の０．０８＋−０．０４％を構成した。
【００９７】
ＥＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける長期培養において維持され得る。ＥＰＣは、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれ以上の培養において継代さ
れ得る。
【００９８】
ＥＰＣは、典型的には、１〜３週間の細胞培養後に増殖した、内皮コロニー形成細胞を
含む。内皮コロニー形成細胞は、内皮系統に関連付けられる前駆細胞の特徴を有し、Smar
dja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に基づいて、新生血管内に混合可能であ
る。
【００９９】
ＥＰＣの単離、精製、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養および特徴決定は、Hill et al, N.
Engl. J. Med. 348:593-600 (2003)、Assmus et al., Circulation 106:3009-16 (2002)
、Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)および、Kalka et al., P.N.
A.S. 97:3422-7 (2000)に記載されており、その内容は、その全体が参照により組み込ま
れる。さらに、内皮コロニー形成細胞の単離、精製、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養および
特徴決定は、Yoder et al., Blood 109:1801-1809 (2007)、Ingram et al., Blood 104:2
752-2760 (2004)および、Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に記載され
ており、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１００】
例えば、細胞集合は、ポジティブ選択により、または、いずれかの順序でポジティブお
よびネガティブ選択の両方を組み合わせて単離される。前駆細胞の集合は精製される。Ｅ
ＰＣの精製された集合は、その細胞が単離された細胞の粗集合より有意に高い割合のＥＰ
Ｃを含む。
【０１０１】
例えば、精製手法は、総集合に対するＥＰＣにおける、少なくとも５倍の増大、好まし
くは少なくとも１０倍の増大、より好ましくは少なくとも１５倍の増大、最も好ましくは
少なくとも２０倍の増大、および最適には少なくとも２５倍の増大をもたらすべきである
。精製されたＥＰＣの集合は、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好
ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３５％、および最適に少なくとも
５０％のＥＰＣを含むべきである。
【０１０２】
本願明細書に記載された方法は、７５％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは
８５％以下、最も好ましくは９０％以下、および最適には９５％以下の幹細胞を含む混合
物をもたらし得る。このような方法は、９９％、９９．９０％およびさらに１００％のＥ
ＰＣを含む混合物を製造可能である。したがって、精製された本開示の集合は、上記した
ように、天然に存在するそれらより顕著に高いレベルのＥＰＣを含む。
【０１０３】
精製されたＥＰＣの集合は、ＥＰＣの抗原特性を発現する幹細胞の集合を含む細胞の粗
製混合物を、抗原の細胞外部分に特異的に結合する分子と接触させることにより単離され
得る。このような技術は、ポジティブ選択として公知である。分子に対するＥＰＣの結合
は、ＥＰＣが、抗原を発現しない汚染細胞から十分に区別されることを可能にして、汚染
細胞から幹細胞を単離することを可能にする。抗原は、好ましくはＶＥＧＦＲであり、よ
り好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。
【０１０４】
汚染細胞から前駆細胞を分離するのに使用される分子は、ＥＰＣを特徴付ける抗原に特
異的に結合する任意の分子であり得る。分子は、例えば、モノクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体のフラグメントであることができ、または、受容体である抗原の場合には、そ
の受容体のリガンドであることができる。例えば、ＶＥＧＦ受容体、例えば、ＦＬＫ−１
の場合には、リガンドは、ＶＥＧＦである。
【０１０５】
本開示の固有の単離された細胞は、そのＣＤ４５＋状態および血管内皮成長因子受容体
（ＶＥＧＦＲ）、例えば、ＶＥＧＦＲ−２を有することにより、他の細胞から分離され得
る。細胞は、細胞を分離するための従来技術、例えば、Ｃｉｖｉｎの米国特許第４，７１
４，６８０号、同第４，９６５，２０４号、同第５，０３５，９９４号および同第５，１
３０，１４４号明細書、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，７５０，３９
７号明細書ならびにＬｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，１３７，８０９号明細書に
記載されたものにより単離され得る。前記文献はそれぞれ、その全体が参照により組み込
まれる。そして、例えば、ＣＤ４５特異的モノクローナル抗体またはＶＥＧＦＲ特異的抗
体は、固体支持体、例えば、ニトロセルロース、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ
、中空の繊維メンブレン、磁性ビーズおよびプラスチックペトリ皿上に固定され得る。つ
いで、細胞集合全体が、固体支持体を通過するか、または、ビーズに添加される。
【０１０６】
結合分子に結合した細胞は、残った細胞懸濁液から固体支持体を物理的に分離すること
により、細胞懸濁液から除去され得る。例えば、未結合の細胞は、固体支持体に幹細胞を
十分な時間結合させた後に、生理学的バッファーにより溶出または洗浄され得る。
【０１０７】
結合した細胞は、主に、固相および結合分子の性質に応じて、固相から任意の適切な方
法により分離され得る。例えば、結合した分子は、激しい振とうにより、プラスチックペ
トリ皿から溶出され得る。あるいは、結合した細胞は、酵素的に「切れ目を入れること」
、または、固相と抗体との間における酵素感受性の「スペーサ」配列を消化することによ
り溶出され得る。アガロースビーズに結合した適切なスペーサ配列は、例えば、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから市販されている。
【０１０８】
ついで、溶出され、濃縮された細胞画分は、遠心分離によりバッファーで洗浄され得、
従来技術に基づいて後の使用のために、生きた状態で低温において保存され得る。細胞は
、例えば、レシピエントの静脈内に注入されることにより、直ちに使用されてもよい。
【０１０９】
固体支持体に付着したままのものは、使用された抗体により認識されるマーカーを含む
細胞である。例えば、抗−ＣＤ４５抗体が使用される場合、得られる集合は、ＣＤ４５＋
細胞にかなり富んでいるであろう。使用される抗体がＶＦＧＦＲである場合、得られる集
合は、ＶＥＧＦＲ＋細胞にかなり富んでいるであろう。その後、その集合は、他のマーカ
ーに対する抗体が結合している固体支持体を使用して、工程を繰り返すことにより、他の
マーカーに富んだものとなり得る。
【０１１０】
ＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋細胞を分取する別の方法は、フローサイトメトリー、最も好ま
しくは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、例えば、名称ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡ
ＣＳＣａｌｉｂｕｒでＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎにより製造されたものによる。
この技術により、ＣＤ４５マーカーをその上に有する細胞は、このような染料にコンジュ
ゲートしている抗−ＣＤ４５抗体による特定の蛍光染料によりタグ付けされる。同様に、
細胞のＶＥＧＦＲマーカーは、他の染料にコンジュゲートした抗−ＶＥＧＦＲ抗体による
異なる蛍光染料によりタグ付けされる。染色された細胞が機器上にある場合、細胞流が、
光を発する蛍光色素を励起するアルゴンレーザビームにより方向付けられる。この発光は
、一連の光学フィルタによる蛍光色素の発光波長に特異的な光電子増倍管（ＰＭＴ）によ
り検出される。ＰＭＴにより検出されたシグナルは、それ自体のチャネルにおいて増幅さ
れ、各種の方式、例えば、ヒストグラム、ドット表示または対比表示において、コンピュ
ータにより表示される。例えば、１つの波長を発する蛍光細胞は、特異的な蛍光色素標識
試薬と反応性である分子を発現する。一方、非蛍光細胞または異なる波長において発光す
る蛍光細胞は、この分子を発現しないが、他の波長で蛍光を発する蛍光色素標識試薬と反
応性である分子を発現し得る。フローサイトメーターは、細胞により発せられた蛍光の量
（蛍光強度）を表示する点で、半定量的でもある。これは、相対的な意味で、細胞により
発現された分子の数に相関する。
【０１１１】
フローサイトメーターは、細胞がレーザビームを通過する際に、非蛍光パラメータ、例
えば、細胞容積または細胞により散乱された光を測定する装備も有し得る。細胞容積は、
通常、直接測定である。光散乱ＰＭＴは、前方角（前方散乱；ＦＳＣ）または直角（側方
散乱；ＳＳＣ）のいずれかにおける、細胞により散乱された光を検出する。ＦＳＣは、通
常、サイズの指標である。一方、ＳＳＣは、細胞の複雑性の指標であるが、両方のパラメ
ータは、他の要因により影響を受け得る。
【０１１２】
好ましくは、フローサイトメーターは、２つ以上のＰＭＴ発光検出器を備える。更なる
ＰＭＴは、他の発光波長を検出し、個々の分離したチャネルそれぞれにおいて、２つ以上
の蛍光色素の同時検出を可能にする。コンピュータは、各チャネルの分析または別のもの
との各パラメータの相関を可能にする。ＦＡＣＳ機器と共に典型的に使用される蛍光色素
としては、５２５ｎｍ（緑色）に発光ピークを有するフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）、５７５ｎｍ（オレンジ色〜赤色）に発光ピークを有するＲ−フィコエリス
リン（ＰＥ）、６２０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、
６６０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有する７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）
、６７０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有するＲ−フィコエリスリンＣｙ５（ＲＰＥ−Ｃｙ
５）および６５５〜７５０ｎｍ（紅色）に発光ピークを有するアロフィコシアニン（ＡＰ
Ｃ）があげられる。
【０１１３】
これらおよび他の種類のＦＡＣＳ機器は、異なる特性の細胞を異なる容器に向かわせる
ことにより、種々の画分を物理的に分離するための更なる能力を有し得る。
【０１１４】
開始材料、例えば、骨髄、末梢血または臍帯血のＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋集合を単離す
るための任意の他の方法も、本開示に基づいて使用され得る。本開示の種々の亜集合（例
えば、ＣＤ１４＋、Ｔｉｅ２＋、ＣＤ１４４−）は、類似する方法で単離され得る。
【０１１５】
粗製細胞集合が上述したように精製される前後のいずれかに、前駆細胞の集合は、さら
に、当分野において公知の方法により濃縮され得る。例えば、前駆細胞は、ＥＰＣの１つ
以上の抗原特性についてのポジティブ選択により濃縮され得る。このような抗原としては
、例えば、ＣＤ１４またはＴｉｅ−２があげられる。
【０１１６】
一実施形態では、血液は、ドナーの循環抹消血から直接回収される。血液は、ＥＰＣを
捕捉するための結合分子、例えば、抗体であるＶＥＧＦＲ−２を結合した固相を含むカラ
ムを通して連続的にろ過される。前駆細胞枯渇血液は、当分野において公知の方法、例え
ば、血漿交換により、ドナーの循環系に直ちに戻される。血液は、十分な数の前駆細胞が
カラムに結合するまで、この方法で処理される。ついで、幹細胞が、当分野において公知
の方法により、カラムから単離される。この方法は、骨髄を採取する費用および痛み、な
らびに、麻酔、痛覚消失症、輸血および感染の関連するリスクをドナーに対して負わせる
ことなく、少ない末梢血前駆細胞を、非常に多量の血液から採取することを可能にする。
【０１１７】
ＥＰＣは、本願明細書に記載された方法を使用して、培養および増殖をされる。細胞は
、密度勾配遠心により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することにより末梢血から取得
される。
【０１１８】
細胞懸濁液は、細胞を維持可能な任意の容器、特に培養フラスコ、培養プレートまたは
ローラーボトル、およびより具体的には、小さな培養フラスコ、例えば、２５ｃｍ２の培
養フラスコに播種される。懸濁液において培養された細胞は、約５×１０４〜２×１０５
個／ｍｌ（例えば、１×１０５個／ｍｌ）で再懸濁される。固定された基材に播種される
細胞は、約２〜３×１０３個／ｃｍ２で播種される。任意に、培養プレートは、マトリク
スタンパク質、例えば、コラーゲンによりコートされる。細胞は、細胞増殖を補助可能な
任意の公知の培地、例えば、細胞の代謝に必要とされる添加物、例えば、グルタミンおよ
び他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルならびにタンパク質、例えば、トランスフェリン等
を含む、ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２等に入れられ得る。培地は、酵母、細菌
および糸状菌による汚染を予防する抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン
、ゲンタマイシン等も含み得る。培地は、ウシ、ウマ、ニワトリ等由来の血清を含み得る
。
【０１１９】
培養のための条件は、生理学的条件に近くあるべきである。培地のｐＨは、生理学的ｐ
Ｈ（例えば、ｐＨ６〜８、約ｐＨ７か〜７．８またはｐＨ７．４）に近くあるべきである
。生理学的温度は、約３０℃〜４０℃の範囲である。ＥＰＣは、約３２℃〜約３８℃（例
えば、約３５℃〜約３７℃）の温度で培養される。
【０１２０】
任意に、培地は、少なくとも１つの増殖誘引（「分裂促進」）増殖因子を添加される。
「増殖因子」は、ＥＰＣにおける増殖、増殖誘引、分化誘引もしくは栄養作用を有するタ
ンパク質、ペプチドまたは他の分子である。「増殖誘引増殖因子」は、ＥＰＣが増殖する
ことを可能にする栄養因子、例えば、細胞の表面上の受容体に結合して、細胞上において
栄養または増殖誘引作用を果たす、任意の分子である。増殖誘引増殖因子としては、ＥＧ
Ｆ、アンフィレグリン、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性
繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ
α）、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせがあげられる。増殖因子は、通常、培地に、約
１ｆｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加される。約１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度
で、通常十分である。単純な滴定アッセイが、特定の増殖因子の最適な濃度を決定するの
に、容易に行われ得る。
【０１２１】
増殖因子および栄養因子の生物学的効果は、一般的には、細胞表面の受容体に結合する
ことにより媒介される。数多くのこれらの因子に対する受容体が特定されてきており、特
定の受容体に対する抗体および分子プローブが利用可能である。ＥＰＣは、分化の全ての
段階における増殖因子受容体の存在について分析され得る。多くの場合、特定の受容体の
特定は、外因性の増殖因子または栄養因子の添加による特定の増殖経路に沿って、細胞を
さらに分化させるのに使用するための戦略についてのガイダンスを提供する。
【０１２２】
一般的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて約３〜１０日後に、ＥＰＣの培地は、培地を吸
引し、培養フラスコに新鮮な培地を添加することにより補給される。任意に、吸引された
培地は、回収、ろ過され、後にＥＰＣを継代するための馴化培地として使用される。例え
ば、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上の馴化培地が使用される。
【０１２３】
ＥＰＣ細胞培養物は、増殖を再開するために容易に継代され得る。例えば、ｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏでの３〜７日後、培養フラスコは、十分振とうされ、ついで、ＥＰＣは、５０ｍｌ
の遠沈管に移され、低速で遠心分離される。培地は吸引される。ＥＰＣは、少量の培地に
再懸濁される。ついで、細胞は計測され、増殖を再開するために、所望の密度で再度播種
される。この手順は、毎週繰り返されて、各継代での生きた細胞の数における対数増加を
もたらし得る。手順は、所望の数のＥＰＣが取得されるまで継続される。
【０１２４】
ＥＰＣおよびＥＰＣの子孫は、それらが必要とされるまで、当分野における任意の公知
の方法により凍結保存され得る（例えば、米国特許第５，０７１，７４１号明細書、国際
公開第９３／１４１９１号、同第９５／０７６１１号、同第９６／２７２８７号、同第９
６／２９８６２号および同第９８／１４０５８号パンフレット、Karlsson et al., 65 Bi
ophysical J. 2524-2536 (1993)を参照のこと。）。ＥＰＣは、等張性溶液、好ましくは
、特定の凍結保存剤を含む細胞培地に懸濁され得る。このような凍結保存剤としては、ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール等があげられる。これらの凍結保存剤は
、５〜１５％（例えば、８〜１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃〜−１５０
℃（例えば、−２０℃〜−１００℃または−７０℃〜−８０℃）の温度に徐々に凍結され
る。
【０１２５】
Ｆ．細胞の遺伝子組換え
一実施形態では、本開示の細胞であるＭＳＣおよび／またはＥＰＣは、遺伝子組み換え
される。一態様では、このような遺伝子組換えは、細胞の治療活性を増大させる。このよ
うな修飾の非限定的な例としては、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲ
ナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）の増大した発現
または活性化があげられる。
【０１２６】
一態様では、細胞は、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（Ｈ
ＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択される
タンパク質の生物学的活性の発現を増加させる核酸により形質転換される。一態様では、
核酸は、タンパク質をコードする。
【０１２７】
一部の態様では、細胞は、異種タンパク質を産生するように遺伝子組み換えされる。任
意に、細胞は、異種タンパク質が細胞から分泌されるように遺伝子組み換えされるであろ
う。ただし、実施形態において、細胞は、機能性の非タンパク質コードポリヌクレオチド
、例えば、ｄｓＲＮＡ（典型的には、ＲＮＡサイレンシング用）、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドまたは触媒性核酸（例えば、リボザイムもしくはＤＮＡザイム）を発現するよ
うに修飾され得る。
【０１２８】
遺伝子組み換えされた細胞は、修飾された細胞の増殖を補助するのに十分な量の少なく
とも１つのサイトカインの存在下で培養され得る。このため、取得された遺伝子組換え細
胞は、（例えば、移植において）直ちに使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養および
増殖され、または、後の使用のために保存され得る。修飾された細胞は、当分野において
周知の方法、例えば、液体窒素における凍結により保存され得る。
【０１２９】
本願明細書で使用する場合、遺伝子組換えは、本願明細書に記載された細胞への外因性
もしくは外来性のポリヌクレオチドの導入、または、細胞内の内在性遺伝子の修飾を含む
、任意の遺伝子組換え法を包含する。遺伝子組換えとしては、限定されるものではないが
、形質導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの、宿主またはドナー
からレシピエントへの宿主ＤＮＡのウイルス媒介性転移）、トランスフェクション（単離
されたウイルスＤＮＡゲノムによる細胞の形質転換）、リポソーム媒介性転移、エレクト
ロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクションまたは共沈等があげられる。形
質導入法としては、細胞と産生細胞との直接共培養（Bregni et al., 1992）または、適
切な増殖因子およびポリカチオンを伴うか伴わずに、ウイルス上清のみと培養することが
あげられる。
【０１３０】
外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクターにおいて細胞に導入される。ベクタ
ーは、好ましくは、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含む。
このようなベクターを構築するのに使用される方法は、当分野において周知である。例え
ば、適切な発現ベクターを構築するための技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning
: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000)；および、A
usubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 
New York (1999)に詳細に記載されている。
【０１３１】
ベクターは、限定されるものではないが、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス
、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス；コスミド；プラス
ミドベクター；合成ベクター；および、当分野において典型的に使用される他の組換え媒
体を含み得る。ポリヌクレオチドが操作可能に結合され得るプロモータおよびクローニン
グサイトの両方を含むベクターは、当分野において周知である。このようなベクターは、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＲＮＡを転写可能であり、供給元、例
えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）から市販されている。具体的な例として
は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸｔｌ；ならびに、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａからのｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＰＶおよびｐＳＶＫ３があげられる。
【０１３２】
ベクターは、レトロウイルスベクターを含み得る（Coffin et al., 「Retroviruses」,
Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997を参照のこと。
）。本開示に有用なベクターは、当分野において周知の手法により組換え的に産生され得
る。例えば、国際公開第９４／２９４３８号、同第９７／２１８２４号および同第９７／
２１８２５号パンフレットには、プラスミドをパッケージングし、細胞株をパッキングす
るレトロウイルスの構築が記載されている。例示となるベクターとしては、ｐＣＭＶ哺乳
類発現ベクター、例えば、ｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．
）、ｐＳＦＦＶ−ＮｅｏならびにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｓｋ＋があげられる。有用な
レトロウイルスベクターの非限定的な例は、マウス、鳥類または霊長類のレトロウイルス
由来のものである。一般的なレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウ
イルス（ＭｏＭＬＶ−ベクター）に基づくものがあげられる。他のＭｏＭＬＶ由来のベク
ターとしては、Ｌｍｉｌｙ、ＬＩＮＧＦＥＲ、ＭＩＮＧＦＲおよびＭＩＮＴがあげられる
。更なるベクターとしては、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＩＮ）およびモロニーマウ
ス肉腫ウイルス（ＭＯＭＳＶ）および脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）に基づくも
のがあげられる。マウス幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）由来のベクターとしては、ＭＥＳＶ
−ＭｉＬｙがあげられる。レトロウイルスベクターとしては、レンチウイルスに基づくベ
クターもあげられ、非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２）に基づくベクターがあげられる。
【０１３３】
レトロウイルスベクター構築物の産生において、ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎ
ｖ配列が、ウイルスから除去され、外来性のＤＮＡ配列の挿入用の余地を形成し得る。外
来性ＤＮＡによりコードされた遺伝子は、通常、長い末端反復（ＬＴＲ）における強力な
ウイルスプロモータの制御下において発現される。適切な制御調節配列の選択は、使用さ
れる宿主細胞により決まり、選択は、当業者の技術範囲内である。数多くのプロモータが
、ＬＴＲのプロモータに加えて公知である。非限定的な例としては、ファージラムダＰＬ
プロモータ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ；モロニーマウス肉
腫ウイルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）または脾フォーカス形成ウイル
ス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモータ；グランザイムＡプロモータ；およびグランザイム
Ｂプロモータがあげられる。さらに、誘導性または複数の制御エレメントが使用され得る
。適切なプロモータの選択は、当業者に明らかであろう。
【０１３４】
このような構築物は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの機能がパッキング細胞株によりｔ
ｒａｎｓで提供された場合、効率的にウイルス粒子内に詰め込まれ得る。したがって、ベ
クター構築物がパッキング細胞内に導入された場合、細胞により産生されたｇａｇ−ｐｏ
ｌおよびｅｎｖのタンパク質は、ベクターＲＮＡと共にアッセンブリされ、培地中に分泌
される感染性のウイルス粒子を産生する。このため、産生されたウイルスは感染し、標的
細胞のＤＮＡ内に組み込まれ得るが、必須のパッケージング配列を欠いているため、感染
性のウイルス粒子を産生しない。現在使用されているパッキング細胞株のほとんどは、別
々のプラスミドにより形質転換されており、複数の組換え事象が、複製コンピテントウイ
ルスが産生され得る前に必要となるように、それぞれ、必須のコード配列の１つを含む。
あるいは、パッキング細胞株は、プロウイルスを有する。プロウイルスは、それが感染性
ウイルスをアッセンブリするのに必要とされる全てのタンパク質を産生し得るが、それ自
体のＲＮＡが、ウイルス内に詰め込まれ得ないように、無能にされている。組換えウイル
スから産生されたＲＮＡが、代わりにパーケージングされる。したがって、パーケージン
グ細胞から放出されたウイルスストックは、組換えウイルスのみを含む。レトロウイルス
パーケージング系統の非限定的な例としては、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、ＰＥ５０１、ＰＧ
１３、ＰＳＩ．ＣＲＩＰ、ＲＤＩ  １４、ＧＰ７Ｃ−ｔＴＡ−Ｇ１０、ＰｒｏＰａｋ−Ａ
（ＰＰＡ−６）およびＰＴ６７があげられる。
【０１３５】
他の適切なベクターとしては、アデノウイルスベクター（国際公開第９５／２７０７１
号パンフレットを参照のこと。）および、アデノ関連ウイルスベクターがあげられる。こ
れらのベクターは全て、例えば、Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenber
ry et al., John Wiley & Sons, 1998；ならびに、米国特許第５，６９３，５３１号およ
び同第５，６９１，１７６号明細書に記載されているように、当分野において周知である
。アデノウイルス由来のベクターの使用は、特定の状況下において有利である。それらが
、非分割細胞に感染し得ないためである。レトロウイルスＤＮＡと違って、アデノウイル
スＤＮＡは、標的細胞のゲノム内に組み込まれない。さらに、外来性ＤＮＡを運ぶ能力は
、レトロウイルスベクターよりアデノウイルスベクターにおいて非常に大きい。アデノ関
連ウイルスベクターは、別の有用な送達システムである。このウイルスのＤＮＡは、非分
割細胞内に組み込まれることができ、数多くのポリヌクレオチドが、アデノ関連ウイルス
ベクターを使用して、種々の細胞種内に上手く導入されている。
【０１３６】
一部の実施形態では、構築物またはベクターは、２つ以上の異種性のポリヌクレオチド
配列を含むであろう。好ましくは、更なる核酸配列は、選択マーカー、構造的遺伝子、治
療遺伝子またはサイトカイン／ケモカインの遺伝子をコードするポリヌクレオチドである
。
【０１３７】
選択マーカーは、成功した遺伝子組換えをモニターする目的で、および、ＤＮＡが組み
込まれている細胞の選択用に、構築物またはベクターに含まれ得る。非限定的な例として
は、薬剤耐性マーカー、例えば、Ｇ１４８またはヒグロマイシンがあげられる。例えば、
マーカーがＨＳＶ−ｔｋ遺伝子である場合、さらに、ネガティブ選択が使用され得る。こ
の遺伝子は、作用剤、例えば、アシクロビルおよびガンクロビルに感受性の細胞を形成す
るであろう。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ１４８耐性）遺伝子が一般的に使用されるが、
マーカー遺伝子配列が、使用され得る標的細胞に予め存在しない場合には、任意の都合の
良いマーカー遺伝子が使用され得る。更なる非限定的な例としては、低親和性神経成長因
子（ＮＧＦＲ）、増大した蛍光緑色タンパク質（ＥＦＧＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子（ＤＨＦＲ）、細菌性のｈｉｓＤ遺伝子、マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）、マウスＣＤ８ａ
（ｌｙｔ）、プロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を付与する細菌性遺伝子お
よびベータ−ガラクトシダーゼがあげられる。
【０１３８】
更なるポリヌクレオチド配列は、同じベクターにおいて、細胞内に導入されてもよいし
、または、第２のベクターにおいて、宿主細胞内に導入されてもよい。好ましい実施形態
では、選択マーカーは、ポリヌクレオチドとして、同じベクター上に含まれるであろう。
【０１３９】
本開示は、内因性の遺伝子の発現が上方制御され、野生型細胞と比較して、コードされ
たタンパク質の増大した産生をもたらすように、内因性遺伝子のプロモータ領域を遺伝子
組み換えすることも包含する。
【０１４０】
Ｇ．医薬組成物および投与方法
本開示の一実施形態は、治療的に有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培
地およびプロスタサイクリンと、薬学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を提
供する。一態様では、組成物は、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。
【０１４１】
一態様では、医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリア
を含む。「薬学的に許容され得る」の表現は、正常な医療判断の範囲内において、合理的
な利益／リスク比と釣り合った、過剰の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もし
くは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させるのに適した、それらの化合物、材
料、組成物および／または剤形を意味する。本願明細書で使用する場合、「薬学的に許容
され得るキャリア」の表現は、薬学的に許容され得る材料、組成または媒体、例えば、液
体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒封入材料を意味する。
【０１４２】
薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理食塩水、バッファー水溶液、溶媒および
／または分散媒体があげられる。このようなキャリアの使用は、当分野において周知であ
る。溶液は、好ましくは、無菌であり、容易シリンジ性が存在する程度まで流動性である
。好ましくは、溶液は、製造および保存条件下において安定であり、例えば、パラベン、
クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の使用により、微生物
、例えば、細菌および糸状菌の汚染作用に対して保存される。
【０１４３】
薬学的に許容され得るキャリアとして機能し得る材料および溶液のいくつかの例として
は、（１）、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン
、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびそ
の誘導体、例えば、セルロースカルボキシメチルナトリウム、エチルセルロースおよびセ
ルロースアセテート；（４）粉末状のトラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）
タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、
ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、とうもろこし油および大豆油
；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、
グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エス
テル、例えば、エチルオレエートおよびエチルラウレート；（１３）アガー；（１４）緩
衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（
１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９
）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートお
よび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）薬学的配合物に使用される他の非毒性の適
合性物質があげられる。
【０１４４】
本開示の方法に有用な医薬組成物は、ポリマー性キャリアまたは細胞外マトリクスを含
み得る。
【０１４５】
各種の生物学的または合成の固体マトリクス材料（すなわち、固体支持体マトリクス、
生物学的接着剤またはドレッシング材および生物学的／医療的骨格）は、この開示におけ
る使用に適している。マトリクス材料は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途に使用するの
に医療的に許容され得る。このような医療的に許容され得るおよび／または生物学的にも
しくは生理学的に許容され得るまたは適合性の材料の非限定的な例としては、限定される
ものではないが、吸収性および／または非吸収性の固体マトリクス材料、例えば、小腸粘
膜下組織（ＳＩＳ）、例えば、ブタ由来（および他のＳＩＳ供給源）；架橋または非架橋
のアルギン酸、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグ
リコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、ポリグラクチン（ＰＧＬ）メッシュ、フリース、フォー
ムドレッシング材、生体接着剤（例えば、フィブリンのりおよびフィブリンゲル）および
、１つ以上の層における死んだ非表皮化皮膚相当物があげられる。
【０１４６】
フィブリンのりは、種々の臨床状態で使用されてきた手術用シーラントの分類である。
長年の取り組みから気付き得るように、数多くのシーラントが、本開示の方法に使用する
ための組成物に有用である。ただし、本開示の好ましい実施形態は、本願明細書に記載さ
れた細胞と組み合わせたフィブリンのりの使用に関する。
【０１４７】
本願明細書で使用する場合、「フィブリンのり」の用語は、カルシウムイオンの存在下
で、フィブリンポリマーの架橋により形成される不溶性のマトリクスを意味する。フィブ
リンのりは、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝物、フィブリン（可溶性のモ
ノマーもしくはポリマー）および／または、フィブリンマトリクスを形成する生体組織も
しくは流体由来のそれらの複合体から形成され得る。あるいは、フィブリンのりは、組換
えＤＮＡ技術により産生された、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝物または
フィブリンから形成され得る。
【０１４８】
フィブリンのりは、フィブリノゲンとフィブリンのり形成触媒（例えば、トロンビンお
よび／または因子ＸＩＩＩ）との相互作用によっても形成され得る。当業者に理解され得
るように、フィブリノゲンは、触媒（例えば、トロンビン）の存在下において、タンパク
質分解的に開裂され、フィブリンモノマーに変換される。ついで、フィブリンモノマーは
、フィブリンのりマトリクスを形成するために架橋し得るポリマーを形成し得る。フィブ
リンポリマーの架橋は、触媒、例えば、因子ＸＩＩＩの存在により増大し得る。フィブリ
ンのり形成触媒は、血漿、クリオプレシピテートまたは、フィブリノゲンもしくはトロン
ビンを含む他の血漿画分に由来し得る。あるいは、触媒は、組換えＤＮＡ技術により産生
され得る。
【０１４９】
血塊形成の速度は、フィブリノゲンと混合されたトロンビンの濃度により決まる。酵素
依存性反応であるため、温度が高いほど（３７℃まで）、血塊形成速度は速くなる。血塊
の引張強度は、使用されるフィブリノゲンの濃度により決まる。
【０１５０】
フィブリンのりの使用ならびにその調製および使用方法は、米国特許第５，６４３，１
９２号明細書に記載されている。米国特許第５，６４３，１９２号明細書には、単独のド
ナーからのフィブリノゲンおよびトロンビン成分の抽出ならびにフィブリンのりとして使
用するためのこれらの成分のみの組み合わせが開示されている。米国特許第５，６５１，
９８２号明細書には、フィブリンのりの別の調製および使用方法が記載されている。米国
特許第５，６５１，９８２号明細書は、哺乳類における局所シーラントとして使用するた
めに、リポソームと共にフィブリンのりを提供する。
【０１５１】
複数の刊行物には、治療剤を送達するためのフィブリンのりの使用が記載されている。
例えば、米国特許第４，９８３、３９３号明細書には、アガロース、アガー、グリコサミ
ノグリカン生理食塩水溶液、コラーゲン、フィブリンおよび酵素を含む膣内挿入物として
使用するための組成物が開示されている。さらに、米国特許第３，０８９，８１５号明細
書には、フィブリノゲンおよびトロンビンから構成された注射用医薬調製物が開示されて
いる。米国特許第６，４６８，５２７号明細書には、身体内の特定部位への種々の生物学
的製剤および非生物学的製剤の送達を容易にするフィブリンのりが開示されている。この
ような手法は、本開示の方法に使用され得る。
【０１５２】
適切なポリマー性キャリアとしては、合成もしくは天然のポリマーから形成された多孔
質のメッシュもしくはスポンジ、ならびに、ポリマー溶液があげられる。マトリクスの一
形態は、ポリマー性のメッシュまたはスポンジであり、他のものは、ポリマー性ヒドロゲ
ルである。使用され得る天然ポリマーとしては、タンパク質、例えば、コラーゲン、アル
ブミンおよびフィブリン；ならびに、多糖類、例えば、アルギン酸塩およびヒアルロン酸
のポリマーがあげられる。合成ポリマーとしては、生分解性および非生分解性のポリマー
の両方があげられる。生分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸のポリマー、例えば
、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（Ｐ
ＬＧＡ）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合
わせがあげられる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレー
ト、エチレンビニルアセテートおよびポリビニルアルコールがあげられる。
【０１５３】
展性のある、イオン性または共有的架橋性のヒドロゲルを形成し得るポリマーが、細胞
を封入するのに使用される。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結
合、イオン結合または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三
次元的開格子構造を形成する際に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するのに使用
され得る材料の例としては、イオン的に架橋される多糖類、例えば、アルギン酸塩、ポリ
ホスファジンおよびポリアクリレート、または、温度もしくはｐＨそれぞれにより架橋さ
れる、ブロックコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）もしくはＴｅｔｒｏｎ
ｉｃｓ（商標）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー
があげられる。他の材料としては、タンパク質、例えば、フィブリン、ポリマー、例えば
、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンがあげられる。
【０１５４】
一般的には、これらのポリマーは、水溶液、例えば、水、緩衝化された塩溶液またはア
ルコール水溶液において、少なくとも部分的に可溶性である。ポリマーは、荷電した側鎖
またはその一価のイオン性塩を有する。カチオンと反応し得る酸性側鎖を有するポリマー
の例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル
酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（ビニルアセテート）およびスルホン酸化ポリマ
ー、例えば、スルホン酸化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニル
エーテルモノマーまたはポリマーとの反応により形成された酸性側鎖を有するコポリマー
も使用され得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは
、フッ化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。アニオンと反応
し得る塩基性側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジ
ン）、ポリ（ビニルイミダゾール）および一部のイミノ置換されているポリホスファゼン
である。ポリマーのアンモニウムまた四級塩は、骨格窒素またはペンダント性イミノ基か
らも形成され得る。塩基性側鎖の例は、アミノ基およびイミノ基である。
【０１５５】
さらに、本開示の方法に使用される組成物は、少なくとも１つの治療剤を含んでもよい
。例えば、組成物は、炎症もしくは疼痛を処置するのに役立つ鎮痛剤、または、組成物に
より処置された部位の感染を予防する抗感染症剤を含んでもよい。より具体的には、有用
な治療剤の非限定的な例としては、下記治療剤カテゴリー：鎮痛剤、例えば、非ステロイ
ド抗炎症薬、オピエートアゴニスト、サリチル酸塩；抗感染症剤、例えば、駆虫剤、抗嫌
気性菌、抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、抗真菌抗生物質、セファロスポリン系抗
生物質、マクロライド系抗生物質、種々のベータ−ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗
生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質
、抗マイコバクテリア、抗結核抗マイコバクテリア、抗原虫、抗マラリア性抗原虫剤、抗
ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、殺疥癬虫薬、抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤
、鎮痒剤／局所麻酔剤、局所抗感染症剤、抗真菌性局所抗感染症剤、抗ウイルス性局所抗
感染症剤；電解質および腎臓作用剤、例えば、酸性化剤、アルカリ性化剤、利尿剤、炭酸
脱水酵素阻害性利尿剤、ループ利尿剤、浸透圧利尿剤、カリウム保持性利尿剤、チアジド
利尿剤、電解質置換および尿酸排泄剤；酵素、例えば、膵酵素および血栓溶解酵素；胃腸
薬、例えば、止瀉薬、胃腸性抗炎症剤、胃腸性抗炎症剤、制酸性抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻
害性抗潰瘍剤、胃粘膜性抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカ抗潰瘍剤、胆石溶解性剤、消化薬、催吐
剤、緩下剤、便軟化剤および消化管運動改善薬；全身麻酔剤、例えば、吸入麻酔、ハロゲ
ン化吸入麻酔、静脈内麻酔、バルビツール酸静脈内麻酔、ベンゾジアゼピン静脈内麻酔お
よびオピエート作動性静脈内麻酔；ホルモンおよびホルモン修飾因子、例えば、堕胎剤、
副腎性剤、副腎皮質ステロイド副腎性剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、免疫生物学剤
、例えば、免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイドおよびワクチン；局所麻酔、例えば
、アミド局所麻酔およびエステル局所麻酔；筋骨格剤、例えば、抗痛風性抗炎症剤、副腎
皮質ステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤
（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸塩抗炎症剤、ミネラル；ならびに、ビタミン、例えば、ビタ
ミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫがあげられ
る。
【０１５６】
本開示の方法に有用な組成物は、細胞培養成分、例えば、アミノ酸、金属、補酵素因子
を含む培地および少数の他の細胞、例えば、幹細胞のその後の分化により生じ得るいくつ
かのものを含み得る。
【０１５７】
本開示の方法に有用な組成物は、例えば、対象となる細胞を、培地から沈降させ、それ
らを所望の溶液または材料中に再懸濁させることにより調製され得る。細胞は、例えば、
遠心、ろ過、限外ろ過等により、培地から沈降および／または取り出され得る。
【０１５８】
当業者は、本開示の方法で投与するために、組成物中の細胞および任意にキャリアの量
を容易に決定し得る。一実施形態において、（活性な細胞に加えて）任意の添加剤が、リ
ン酸緩衝生理食塩水中に、０．００１〜５０％（重量）の量の溶液で存在する。活性成分
は、マイクログラムからミリグラムの単位、例えば、約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ま
しくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、さらにより好ましくは約０．０００１〜約０．０５
ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、およ
びさらにより好ましくは、約０．０５〜約５ｗｔ％で存在する。当然、動物またはヒトに
投与される任意の組成物について、および、任意の具体的な投与方法について、例えば、
適切な動物モデル、例えば、げっ歯類、例えば、マウスにおける致死量（ＬＤ）およびＬ
Ｄ５０を決定することによる毒性、適切な応答を引き出す組成物の用量、組成物における
成分濃度、および組成物を投与するタイミングを決定するのが好ましい。このような決定
は、当業者の知識、この開示および本願明細書に引用された文献から、過度の試行錯誤を
必要としない。そして、連続的な投与のタイミングは、過度の試行錯誤をすることなく確
定され得る。
【０１５９】
本開示の方法に有用な組成物は、特に、局所注入、例えば、カテーテル投与、全身性注
入、局所注入、静脈内注入、子宮内注入または非経口投与により投与され得る。本願明細
書に記載された治療組成物（例えば、医薬組成物）を投与する際、それは、一般的には、
単位用量の注入剤型（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されるであろう。
【０１６０】
本開示の一実施形態に基づいて、組成物は、脈管障害用の少なくとも１つの他の薬剤と
共に投与され得る。薬剤は、プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）、プロスタサイクリン
類似体、ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤、エンドセリン受容体アンタゴ
ニスト（ＥＴＲＡ）、チロシンキナーゼ阻害剤および可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤
を含む。
【０１６１】
本開示の一実施形態に基づいて、脈管障害を処置するための方法は、さらに、肺動脈に
おける血栓症を低減し、肺動脈における炎症を低減し、肺動脈における内膜平滑筋の増殖
を低減し、肺動脈における叢状病変の形成を低減し、肺動脈における一酸化窒素の量を増
加させ、肺動脈におけるＰＧＩ２の量を増加させ、肺動脈におけるエンドセリン−１のレ
ベルを低下させ、肺動脈における増殖因子の量を低下させ、または、肺動脈における適切
な内皮形態を促進することを含み得る。
【０１６２】
前駆細胞を投与／移植することにより脈管障害を処置することは、Wang et al., J. Am
. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)、Zhao et al. Circ. Res. 96:442-450 (2005)およ
び、Nagaya et al., Circulation 108:889-895(2003)に記載されている。それらの内容は
、その全体が参照により組み込まれる。
【０１６３】
傷ついた血管内への細胞の投与／移植は、傷ついた血管組織、例えば、静脈、動脈、毛
細血管を修復する可能性を有することにより、血管機能を回復させる。ただし、移植目的
に適した細胞が存在しないことは、この手法の最大の可能性が満たされるのを妨げてきた
。「適切な」細胞は、下記評価基準の１つ以上に合致する細胞である。（１）大量に取得
され得る；（２）必要であれば、遺伝子材料の挿入を可能にするためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ
で増殖され得る；（３）無期限に生存可能であり、移植において血管修復を容易にする、
および（４）非免疫原性である、好ましくは、患者自身の組織または適切なドナーから取
得される。適切な細胞は、自家、同種または異種であり得る。
【０１６４】
細胞は、異常な脈管構造または冠動脈不全の兆候を有する対象に投与され得る。細胞は
、レシピエント自身の血液または骨髄から調製され得る。このような例では、ＥＰＣは、
分離された組織から産生され得、上述した方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖
され得る。細胞数の適切な増殖に基づいて、ＥＰＣは、採取され、必要に応じて遺伝子組
み換えされ、レシピエントの脈管構造内への直接注入用に準備され得る。
【０１６５】
細胞は、宿主に対して異種であるドナー組織から調製され得る。成功した異種移植片に
ついて、移植組織への免疫応答を低下または除去するいくつかの方法が、通常使用される
。例えば、レシピエントは、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンの使用、または、局所
適用された免疫抑制剤を使用する局所免疫抑制戦略のいずれかにより、免疫抑制され得る
。局所免疫抑制は、Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)により開示されている。米
国特許第５，０２６，３６５号明細書には、局所免疫抑制に適した封入法が開示されてい
る。
【０１６６】
免疫抑制技術を使用する代替手段として、Smithies et al., 317 Nature 230-234 (198
5)により教示され、細胞株における遺伝子置換またはノックアウトに拡大された（Zheng 
et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)）、胚性幹細胞における相同組換
えを使用する遺伝子置換またはノックアウトの方法が、主要組織適合性遺伝子複合体（Ｍ
ＨＣ）遺伝子の除去について、ＥＰＣに適用され得る。ＭＨＣ発現を欠くＥＰＣにより、
レシピエントを免疫抑制する必要なく、同種、おそらくさらに異種の組織適合性障壁を超
えた、濃縮された内皮細胞集合の移植が可能となる。ドナー細胞の抗原性を低下させる組
換え法の使用についての全体的なレビューおよび引用は、Gruber, 54 Transplantation 1
-11 (1992)によっても開示されている。表面修飾による移植の免疫原性低下に対する例示
となるアプローチは、国際公開第９２／０４０３３号パンフレットおよび国際特許出願Ｕ
Ｓ９９／２４６３０号により開示されている。あるいは、移植片の免疫原性は、ＭＨＣ抗
原が変異または欠失しているトランスジェニック動物からＥＰＣを調製することにより低
下し得る。
【０１６７】
細胞は、公知の封入技術、例えば、マイクロ封入（例えば、米国特許第４，３５２，８
８３号；同第４，３５３，８８８号および同第５，０８４，３５０号明細書を参照のこと
。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。）および、マクロ封入（例えば、米
国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号
および同第４，９６８，７３３号明細書ならびに国際公開第９２／１９１９５号および同
第９５／０５４５２号パンフレットを参照のこと。それぞれは、参照により本願明細書に
組み込まれる。）に基づいて、宿主に因子を送達するために、封入され、使用され得る。
マクロ封入は、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，
９７６，８５９号；同第４，９６８，７３３号；同第５，８００，８２８号明細書および
国際公開第９５／０５４５２号パンフレットに記載されている。それぞれは、参照により
本願明細書に組み込まれる。複数のマクロ封入装置が、宿主に埋め込まれ得る。
【０１６８】
レシピエントの組織に対して同種である組織から調製された細胞は、組織分類の周知の
方法により、使用するために試験され、レシピエントの組織適合性型を密接にマッチさせ
る。
【０１６９】
脈管構造に投与された細胞は、細胞が隣の血管細胞と正常な結合を形成し、移植された
内皮細胞または既存の内皮細胞との接触を維持するように、血管グラフトを形成し得る。
例えば、移植された細胞は、疾患および加齢により傷害されている血管組織を再確立し得
る。
【０１７０】
宿主の血管組織内への移植片の機能的な一体化は、種々の機能の回復における移植片の
有効性を試験することにより評価され得る。
【０１７１】
本開示の一実施形態に基づいて、細胞は、レシピエントに、少なくとも１つの増殖因子
、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ等と共に
投与され得る。
【実施例】
【０１７２】
本技術は、さらに、下記の非限定的な実施例への言及により規定される。組成物および
方法の両方に対する多くの修飾が、本発明の範囲を逸脱することなく実施されてもよいこ
とは、当業者に明らかであろう。
【０１７３】
実施例１．ＢＭ−ＭＳＣにおける細胞応答のためのトレプロスチニル濃度の最適化
この実施例では、ヒト骨髄の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の血管新生能を増大させる
のに必要とされる、最少トレプロスチニル濃度を特定する。
【０１７４】
１つのバイアルのヒト骨髄由来のＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して、増殖させ、
６ウェルプレートの２０ウェルに播種した。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分洗浄した。ついで、細胞を、０、０．１、１．０
、１０または１００μｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含む培地に曝した（各濃度について
、ｎ＝４ウェル）。
【０１７５】
２４時間の培養後、馴化培地を、各レプリケートから回収し、血管内皮成長因子（ＶＥ
ＧＦ）タンパク質について、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。この実
験の目的を、（出力としてＶＥＧＦを使用して）ＭＳＣにおける細胞応答を引き出すのに
必要とされるトレプロスチニルの最適濃度を決定することとした。
【０１７６】
フローサイトメトリー分析（図１）は、この試験において使用した骨髄ＭＳＣは、ＭＳ
ＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＨＬＡ−ＡＢＣについて陽性で
あったことを証明した。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＨＬＡ
−ＤＲについて、陰性または低かった（ｌｏｗ）。ＭＳＣの定義は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Dominici et 
al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006）により確立された。
【０１７７】
図２は、トレプロスチニルに対する暴露２４時間後のヒト骨髄ＭＳＣによる、ＶＥＧＦ
分泌を示すチャートである。細胞培養上清を、ＶＥＧＦについてＥＬＩＳＡによりアッセ
イした（群あたりにｎ＝４）。図２に示したように、統計学的に有意な差異は、用量群に
おいて観察されなかった（エラーバーは、試験群の標準偏差を表す。）。
【０１７８】
この実験は、１００μｇ／ｍＬ以下のトレプロスチニル濃度が、ヒト骨髄ＭＳＣの血管
新生能を顕著に増大させないことを示唆する。しかしながら、トレプロスチニルを増加さ
せた場合、ＶＥＧＦ分泌のわずかな増加傾向が存在している。次の実施例では、より高い
濃度のトレプロスチニルについて試験した。
【０１７９】
実施例２．ＢＭ−ＭＳＣにおける細胞応答のためのトレプロスチニル濃度の最適化
この実施例では、ヒトＢＭ−ＭＳＣの血管新生能を増大させるための、トレプロスチニ
ルの良好な濃度として、２５０μｇ／ｍＬを特定する。
【０１８０】
実施例１に対する追跡実験を行い、１００μｇ／ｍＬを上回るトレプロスチニル濃度が
、ＭＳＣのＶＥＧＦ分泌に影響を及ぼすかどうかを決定した。前述のように、１つのバイ
アル（同ロット／バッチ）の骨髄由来のＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して、６ウェ
ルプレートの３０ウェルに増殖させた。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、ＰＢ
Ｓで十分洗浄した。ついで、細胞を、０、１００、２００、３００または４００μｇ／ｍ
Ｌのトレプロスチニルを含む培地に曝した（各濃度について、ｎ＝６ウェル）。
【０１８１】
馴化培地を、トレプロスチニル暴露の２４時間後、ＶＥＧＦについてＥＬＩＳＡにより
分析した（ｎ＝４レプリケート）。これらのレプリケートからの細胞を溶解し、ＲＮＡを
抽出して、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。残りの２つのレプ
リケートからの細胞をトリプシン処理し、細胞生存率についてトリパンブルー色素排除に
よりアッセイした。
【０１８２】
細胞培養上清を、ＶＥＧＦタンパク質についてＥＬＩＳＡによりアッセイした（図３Ａ
、ｎ＝４）。それらの培養からの細胞ライゼートを、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現について、
ｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイし、コントロール値に対して正規化した（図３Ｂ、ｎ＝４
）。両図において、エラーバーは、各試験群における標準偏差を表す。
【０１８３】
図４は、増大した濃度のトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの典型的な画像を含む。最
も高い用量（４００μｇ／ｍＬ）において、増加した数の集まった剥離細胞は、ＭＳＣに
おけるトレプロスチニルの細胞傷害作用を示唆した。
【０１８４】
ＭＳＣを、トリパンブルーで染色して、各ウェルにおける生細胞および死細胞の総数を
測定した（図５、群あたりにｎ＝２ウェル）。パーセント生存率を、トリパンブルー陰性
細胞と総数との間の比として算出した（１００×生細胞／総数）。統計学的分析を行うに
は、レプリケートが少なすぎるが、トレプロスチニル濃度を、１００μｇ／ｍＬを上回っ
て増大させた場合、生存率の低下傾向が存在した。ただし、細胞生存率は、この実験にお
いて試験したいずれの用量レベルにおいても、８５％を下回って低下しなかった。
【０１８５】
この実施例は、高レベルのトレプロスチニルが、ＭＳＣの細胞生存率にネガティブな影
響を及ぼしたことを証明した。１００μｇ／ｍＬにおいて、ＶＥＧＦ分泌は、約２倍に増
加したが、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現は、暴露の２４時間後に、処理されていないコント
ロールとは顕著な差異がなかった。ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現は、２００μｇ／ｍＬレベ
ルのトレプロスチニルにおいて、５倍を超えて増大し、ＶＥＧＦ分泌は、コントロール値
の約３倍観察された。ＶＥＧＦ分泌は、より高い濃度のトレプロスチニルによっても、こ
の値を上回って増大しなかった。このことは、作用が飽和したことを示唆する。したがっ
て、２５０μｇ／ｍＬを、その後の試験に使用する最適なトレプロスチニル濃度として選
択した。
【０１８６】
実施例３．２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの網羅的分析
先の実施例に基づいて、この実施例では、ＭＳＣにおける細胞応答を引き出すトレプロ
スチニル用量として、２５０μｇ／ｍＬを選択した。この濃度は、処理されていないコン
トロール細胞と比較したＶＥＧＦ産生および最少の細胞毒性作用に基づいた。
【０１８７】
ヒト骨髄ＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して増殖させ、６本のＴ２２５フラスコに
播種した（表１）。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、ＰＢＳで十分洗浄した。
３本のフラスコを、２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含む基本培地で満たした、（
＋）Ｔｒｅ。残りの３本のフラスコを、トレプロスチニルを添加していない基本培地で満
たした、（−）Ｔｒｅ。
【表１】
2019031566.tif 000003
【０１８８】
２４時間の培養後、典型的な画像を、（＋）Ｔｒｅおよび（−）Ｔｒｅの培養物から得
た。馴化培地を、各レプリケートから回収し、適切な容量の２つのサンプルに分割し、１
）分泌タンパク質（Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ  ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＭＡＰ（登録商標
）１．０）、および、２）エクソソームＲＮＡ含量について、別々に分析した。細胞を、
培養フラスコから直接溶解し、全ＲＮＡ単離用に処理し、遺伝子発現について、マイクロ
アレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ＨＴ１２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣ
ｈｉｐ）により分析した。
【０１８９】
図６は、細胞のシグナル伝達、遺伝子発現およびパラクリン因子の放出における、トレ
プロスチニルの効果についてのモデルを図示する。以下の表を用いて、効果を試験するの
に有用なアッセイを示す。
【表Ａ】
2019031566.tif 000004
【０１９０】
ＭＳＣにおけるトレプロスチニルの効果を特徴付けるために、細胞を、ｑＲＴ−ＰＣＲ
およびマイクロアレイにより分析して、遺伝子発現における変化を特定した（４）。細胞
培養上清培地を、選択した炎症性サイトカインについて、ビーズ系免疫アッセイによりア
ッセイした（２）。分泌された小胞を、細胞培養上清から単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより
ＲＮＡ含量をアッセイした（７）。小胞も、サイズおよび濃度について、調節可能な抵抗
パルスセンシングまたはＴＲＰＳによりアッセイした（７）（実施例４を参照のこと）。
【０１９１】
２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに２４時間曝された細胞（図７Ａ、右パネル）は
、処理されていない細胞（図７Ａ、左パネル）と比較して、形態学において、明確な変化
を示さなかった。細胞生存率を、トリプシン処理された細胞において、トレプロスチニル
処理された培養物およびトレプロスチニル処理されていない培養物の両方において評価し
た。顕著な細胞死は、トレプロスチニル暴露の結果として観察されなかった。図７Ｂを参
照のこと（全てのレプリケートおよび条件において、＞９５％の生存率）。
【０１９２】
ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現を、ＭＳＣにおいてｑＲＴ−ＰＣＲにより確認した。トレプ
ロスチニルは、処理されていないコントロールに対して、ＶＥＧＦ−Ａ発現を約３．５倍
増大させた（図８、上側パネル）。さらに、ｍｉＲ−２１は、トレプロスチニル暴露ＭＳ
Ｃ由来のエクソソームにおいて、より多量であった。一方、ｌｅｔ−７ｂは、コントロー
ルと比較して、より少なかった（図８、下側パネル；アスタリスクは、統計学的有意（ｐ
＜０．０５）を示す。）。
【０１９３】
マイクロアレイ遺伝子発現分析も、２５０ｕｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含まない（
−）または含む（＋）培養物からのＭＳＣにおいて行った。各条件からの３つの生物学的
レプリケートを分析した。全てのレプリケートにおいて特定された７７，６１２個の配列
のうち、２４，２７３個のみが、５０カウントの任意のバックグラウンドを上回って検出
された。２，９８４個のＲＮＡ配列は、Ｔｒｅ（−）培養物に固有であったが、１，７８
１個のＲＮＡ配列は、Ｔｒｅ（＋）培養物に固有であった（パネルＡ）。両条件において
検出された遺伝子を、特異的発現について、さらに分析した（パネル）。通常に発現した
１９，５０８個の遺伝子のうち、１，６９０個のみが、有意に異なった（ｐ＜０．０１）
。２６８個の遺伝子が、処理されていないＭＳＣにおいて、少なくとも４倍以上高いこと
が見出された。１７１個は、Ｔｒｅ（＋）ＭＳＣ培養物において、少なくとも４倍以上高
いことが見出された。
【０１９４】
図９Ａおよび９Ｂに示したように、特異的に発現した遺伝子は、Ｔｒｅ（＋）ＭＳＣ培
養物とコントロールとを（クラスター化に関して）明確に分離した。このことは、トレプ
ロスチニルが、ＭＳＣ細胞の機能または活性に顕著な影響を示したことを示唆する。
【０１９５】
表２〜３は、トレプロスチニルに対する応答において上方制御された遺伝子を列記する
。少なくとも５００カウントの平均値を有し、Ｔｒｅ（＋）培養物においてのみ発現した
遺伝子を、表２に示す。処理されていない細胞と比較して、Ｔｒｅ（＋）において少なく
とも１０倍以上発現した遺伝子を、表３に示す。
【０１９６】
表４〜５は、トレプロスチニルに対する応答において下方制御された遺伝子を列記する
。Ｔｒｅ（＋）培養物において少なくとも１０倍下方制御された遺伝子を、表４に示す。
Ｔｒｅ（−）培養物においてのみ発現された（すなわち、Ｔｒｅ（＋）培養物において完
全に発現されなかった）遺伝子を、表５に示す。
【表２−１】
2019031566.tif 000005
【表２−２】
2019031566.tif 000006
【表３−１】
2019031566.tif 000007
【表３−２】
2019031566.tif 000008
【表４−１】
2019031566.tif 000009
【表４−２】
2019031566.tif 000010
【表５−１】
2019031566.tif 000011
【表５−２】
2019031566.tif 000012
【０１９７】
ビーズ系免疫アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を行い、細胞培養上清中の４６個のサイトカ
イン濃度を評価した（Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＭ
ＡＰ（登録商標）１．０）。評価した４６個のうちの６個が、トレプロスチニル処理およ
び未処理ＭＳＣ培養物において、特異的に分泌された（表６を参照のこと。群あたりにｎ
＝３）。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づいて、群間における統計学的有意
性を示す（＊ｐ＜０．００１または＊＊ｐ＜０．０００１）。
【表６】
2019031566.tif 000013
【０１９８】
全ＲＮＡを、エクソソーム調製物から抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、親細胞についての実
験（図８を参照のこと。）において使用したのと同じプライマー／プローブセットにより
行った。ＭＳＣ由来エクソソーム中に存在するＶＥＧＦ−Ａ遺伝子転写物は、トレプロス
チニル暴露の結果として、約４倍増大した（図１０）。さらに、ｍｉＲ−２１およびｍｉ
Ｒ−１９９−３ｐは、トレプロスチニル処理された細胞由来のエクソソーム中に、有意に
より豊富であった（ｐ＜０．０５）。
【０１９９】
この実施例は、ＭＳＣの遺伝子発現および分泌プロファイルが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにお
いて、トレプロスチニルに２４時間曝されたことに基づいて変化したことを示す。トレプ
ロスチニルは、ＶＥＧＦタンパク質および遺伝子の両方が増大した観察に基づいて、ＭＳ
Ｃの血管新生能を増大させた。さらに、トレプロスチニル処理されたＭＳＣのエクソソー
ムは、より高いレベルのＶＥＧＦ−Ａを有した。前記より高いレベルのＶＥＧＦ−Ａは、
遺伝子水平伝播のメカニズムにより、ターゲット細胞におけるＶＥＧＦの産生増大を促進
し得た。
【０２００】
さらに、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１９９ａ−３ｐが観察された。ｍｉＲ−２１およ
びｍｉＲ１９９ａ−３ｐは、ターゲット細胞における活性にも影響を及ぼし得た（Lee et
al., Circulation 126(22):2601-11, 2012）。分泌されたサイトカインにおける変化も
、トレプロスチニル暴露の結果として観察された。特に、ＩＬ−６が、コントロールＭＳ
Ｃと比較して、約５０倍高く産生された。一方、ＭＣＰ−１は、約６〜７倍少なく分泌さ
れた。
【０２０１】
実施例４．２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝されたＭＳＣ由来のエクソソーム
の物理的分析
実施例３に記載された実験手法を繰り返して、更なる分析に十分なエクソソームを生成
した。トレプロスチニル処理および未処理のＭＳＣ培養物からの馴化培地を、調節可能な
抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により分析した。この方法は、サンプルに懸濁した粒
子数および各粒子のサイズを、サンプルを通る電流の変化に基づいて定量する。
【０２０２】
トレプロスチニル処理および未処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を、図１１
Ａ〜Ｂに表す。トレプロスチニル処理されたＭＳＣからのエクソソーム調製物（図１１Ａ
）および未処理ＭＳＣ（図１１Ｂ）を、５０〜６００ｎｍサイズの粒子について、調節可
能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により分析した。各エクソソーム集合についての
これらの典型的なヒストグラムは、大部分の粒子が、両群において、１５０〜２００ｎｍ
のサイズであったことを証明した。トレプロスチニル処理ＭＳＣは、ほぼ６０％の集合が
約２００ｎｍサイズのカテゴリーに入る、より均質なエクソソーム集合を生じさせた。各
条件についての合計粒子カウントは、＞５００カウントであった。
【０２０３】
エクソソーム調製物の粒子濃度を、ＴＲＰＳにより測定した。より少ない粒子が、コン
トロール（ｎ＝１）と比較して、（＋）トレプロスチニル調製物において観察された。平
均サイズ、モードサイズおよびサイズ範囲は、二群間において類似し、表７に含まれる。
【０２０４】
【表７】
2019031566.tif 000014
【０２０５】
この実施例は、トレプロスチニルが、より均質なエクソソーム集合を生じさせ得たこと
を示唆する。
【０２０６】
前述は、特定の好ましい実施形態を意味するが、本開示は、そのように限定されないこ
とが理解されるであろう。種々の修飾が開示された実施形態になされ得ること、および、
このような修飾が本開示の範囲内であることを意図することが、当業者に明らかとなるで
あろう。
【０２０７】
この明細書において引用された刊行物、特許出願および特許は全て、その全体が参照に
より本願明細書に組み込まれる。
【図１】
2019031566.tif 000015
【図２】
2019031566.tif 000016
【図３Ａ】
2019031566.tif 000017
【図３Ｂ】
2019031566.tif 000018
【図４】
2019031566.tif 000019
【図５】
2019031566.tif 000020
【図６】
2019031566.tif 000021
【図７Ａ】
2019031566.tif 000022
【図７Ｂ】
2019031566.tif 000023
【図８】
2019031566.tif 000024
【図９Ａ】
2019031566.tif 000025
【図９Ｂ】
2019031566.tif 000026
【図１０】
2019031566.tif 000027
【図１１Ａ】
2019031566.tif 000028
【図１１Ｂ】
2019031566.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来のエクソソームを含む組成物であって、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームは、ＭＳＣ培養物をプロスタサイクリンでｅｘ  ｖｉｖｏ処理することによって得られたものであり、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームは、処理されていないＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームと比較して１つ以上の抗炎症因子および血管新生促進因子の産生が増大している組成物。
【請求項２】
前記プロスタサイクリンが、エポプロステノール、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロスト、ＰＧＩ２受容体アゴニストおよび薬学的に許容され得るそれらの塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記血管新生促進因子は、ＶＥＧＦである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＳＣが、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＭＳＣが、骨髄から取得されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＭＳＣが、前記対象から取得されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＥＰＣが、前記対象から取得されたものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＰＣが、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸が、前記タンパク質をコードする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記脈管障害が、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
治療有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来のエクソソームと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物であって、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームは、ＭＳＣ培養物をプロスタサイクリンでｅｘ  ｖｉｖｏ処理することによって得られたものであり、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームは、処理されていないＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエクソソームと比較して１つ以上の抗炎症因子および血管新生促進因子の産生が増大している医薬組成物。
【請求項１４】
前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記血管新生促進因子は、ＶＥＧＦである請求項１３に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
この明細書において引用された刊行物、特許出願および特許は全て、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法であって、前記対象に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物とを投与することを含む、方法。
［２］  前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、同時に投与される、［１］に記載の方法。
［３］  前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、別々に投与される、［１］に記載の方法。
［４］  さらに、前記投与前に、前記ＭＳＣまたは前記培地の一部を、プロスタサイクリンと接触させることを含む、［１］に記載の方法。
［５］  前記ＭＳＣの成分が、エクソソーム、微小小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［６］  さらに、前記対象に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与することを含む、［１］に記載の方法。
［７］  前記ＥＰＣが、前記対象から取得される、［６］に記載の方法。
［８］  前記ＥＰＣが、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換されている、［６］に記載の方法。
［９］  前記核酸が、前記タンパク質をコードする、［８］に記載の方法。
［１０］  前記プロスタサイクリンが、エポプロステノール、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロスト、ＰＧＩ２受容体アゴニストおよび薬学的に許容され得るそれらの塩からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［１１］  前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである、［９］に記載の方法。
［１２］  前記ＭＳＣが、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である、［１］に記載の方法。
［１３］  前記ＭＳＣが、骨髄から取得される、［１］に記載の方法。
［１４］  前記脈管障害が、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［１５］  治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物と、薬学的に許容され得るキャリアとを含む、医薬組成物。
［１６］  前記ＭＳＣまたは前記培地の一部が、プロスタサイクリンと接触している、［１５］に記載の組成物。
［１７］  さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、［１５］に記載の組成物。
［１８］  間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するための方法であって、
前記ＭＳＣをプロスタサイクリンと接触させることを含む、方法。
［１９］  前記プロスタサイクリンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、［１８］に記載の方法。
［２０］  ［１８］に記載の方法により取得可能な処理された組成物。