(57)【要約】【課題】早期スクリーニングによって特定されない大多数の患者のためのロバストな処置方法を提供する。【解決手段】本明細書中に記載される発明により、結腸直腸癌を、ＳＭＡＤ７の阻害を介して、すなわち、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の重要なアンタゴニストとしてのＳＭＡＤ７の役割を利用して処置するための新規な方法が提供される。結腸直腸癌における治療的介入のための他の潜在的標的が提案されているが、本発明は、結腸直腸腫瘍細胞成長を防止すること、遅らせること、停止させること、または覆すことが示される新規な処置を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９０，４８８号および２０１３年７月１７日に出願された米国仮出願第６１／８４７，２８７号（これら各々の全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は一般には、結腸直腸癌および結腸直腸癌細胞成長をＳＭＡＤ７阻害剤（特にＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）の投与により処置および／または防止する方法、同様にまた、結腸直腸癌を処置する際に使用されるＳＭＡＤ７阻害剤を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
結腸直腸癌は、結腸または直腸の細胞を含めて、大腸の細胞の歯止めのきかない増殖によって特徴づけられる疾患である。結腸直腸癌腫瘍は、正常な粘膜に起源を有すると考えられている。腫瘍形成には、増殖異常および生化学的異常を示す肥大した陰窩のクラスターの出現が伴う。原因となる変異（１つまたは複数）を有する上皮細胞の増殖が、高度異形成によって特徴づけられる初期段階の腫瘍になる可能性がある。さらなる成長により、筋肉層内への、また、腸壁を突き抜ける浸潤性成長が生じる可能性がある。処置されないならば、これらの腫瘍は所属リンパ節に広がり、かつ、その後、遠位部位に転移する可能性があり、そのような時点では、腫瘍は、現在利用可能な技術を使用して多くが処置不能になる（ＭａｒｋｏｗｉｔｚおよびＢｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ（２００９）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３６１（２５）：２４４９−２４６０）。様々な腫瘍がデノボで生じ得るが、証拠は、およそ６０％の癌腫が既存の腺腫に起源を有することを示している（Ｓｏｒｅｉｄｅら（２０１１）、Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．、１２（６６）：３９３−４０４）。したがって、圧倒的多数の結腸直腸癌が腺癌として分類される可能性があり、しかし、リンパ腫および扁平上皮癌もまた、症例のより少ないサブセットにおいて認められる。発癌現象を生じさせる遺伝子変異には、Ｗｎｔシグナル伝達経路のメンバーにおける変異、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路のメンバー（例えば、ＴＧＦ−β１ファミリーおよびＳＭＡＤファミリーのメンバーなど）における変異、細胞増殖と細胞死とのバランスを調節するタンパク質（例えば、ＴＰ５３など）における変異、および、他のタンパク質（例えば、ＤＣＣなど）における変異が含まれる（ＲｅｙａおよびＣｌｅｖｅｒｓ（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ、４３４（７０３５）：８４３−８５０；Ｂａｋｅｒら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：２１７−２２１；ＭａｒｋｏｗｉｔｚおよびＢｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ、上掲）。異常なＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化および下流側のｍＴＯＲシグナル伝達が結腸直腸癌の腫瘍形成に伴う（Ｒｙｃｈａｈｏｕ他（２００６）、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、２４３（６）：８３３−８４２）。高レベルのＥＧＦＲ発現もまた、結腸癌細胞株において認められており、結腸直腸癌腫瘍進行と相関する（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１７）：７７９２−７７９６）。家族性要因および遺伝的要因のほかに、結腸直腸癌についての危険性要因として、低レベルの身体活動、アルコール消費、脂肪および肉の高食事摂取、ならびに、繊維および野菜の低摂取が挙げられる場合がある。結腸直腸癌の症状として典型的には、直腸出血、貧血、便秘、血便、体重減少、発熱、食欲不振、および、悪心または嘔吐が挙げられる。
【０００４】
結腸直腸癌は、アメリカ人男性およびアメリカ人女性の癌生存者の中では２番目に最も一般的な形態の癌である（Ｓｉｅｇｅｌら（２０１２）、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．、６２（４）：２２０−４１）。加えて、結腸直腸癌は、西洋世界では癌死亡の最も一般的な上位３つの原因のうちの１つである（Ｓｏｒｅｉｄｅら（２０１１）、Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．、１２（６６）：３９３−４０４）。より近年には多くのアジア諸国が西洋型生活様式に適合化することによりまた、結腸直腸癌における著しい増大がそれらの人口において生じている（Ｙａｎｇら（２０１１）、Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．、２８（５−６）：３７９−３８５）。２０１２年においては、合衆国では１２０万人が結腸直腸癌の事前の診断とともに生活していたと見積もられている。この同じ年については、さらに１４３，４６０人がこの疾患と診断されるであろうことが予測された。結腸直腸癌の診断時におけるメジアン年齢が男性については６８歳であり、女性については７２歳である（Ｈｏｗｌａｄｅｒら（２０１１）、ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２００８、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。結腸直腸癌の発生は高齢者において希ではないが、５０歳の年齢を超える個体のほんの５９．１％が結腸直腸癌スクリーニングを指針（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ＆  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）に従って受けているだけである。早期検出のこの不足は、患者の３９％のみが、癌が局所段階を超えて進行していないときに診断されることをもたらしている（Ｈｏｗｌａｄｅｒら、上掲）。結腸直腸癌に罹患する患者の数が増大していることを考えると、ロバストな処置方法、とりわけ、早期スクリーニングによって特定されない大多数の患者のためのロバストな処置方法を開発することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＭａｒｋｏｗｉｔｚおよびＢｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００９）３６１（２５）：２４４９〜２４６０
【非特許文献２】Ｓｏｒｅｉｄｅら、Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．（２０１１）１２（６６）：３９３−４０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書中に記載される発明により、結腸直腸癌を、ＳＭＡＤ７の阻害を介して、すなわち、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の重要なアンタゴニストとしてのＳＭＡＤ７の役割を利用して処置するための新規な方法が提供される。結腸直腸癌における治療的介入のための他の潜在的標的が提案されているが、本発明は、結腸直腸腫瘍細胞成長を防止すること、遅らせること、停止させること、または覆すことが示される新規な処置を提供する。
【０００７】
本発明は、結腸直腸癌を、ＳＭＡＤ７を阻害することによって処置するための方法を提供する。具体的には、本発明は、ＳＭＡＤ７を患者における直腸結腸腫瘍において阻害する方法を提供する。本発明はまた、結腸直腸癌細胞の成長を、ＳＭＡＤ７を阻害することによって阻害する方法を提供する。本発明はまた、ＳＭＡＤ７を阻害すること、結腸直腸癌を処置すること、および／または、結腸直腸癌細胞の成長を阻害することを、有効量のＳＭＡＤ７の阻害剤を投与することにより行うための方法を提供する。例えば、ＳＭＡＤ７の阻害剤（例えば、抗ＳＭＡＤ７アンチセンス治療、すなわち、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、ＳＭＡＤ７に対する抗体）。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は本明細書中で使用される場合、標的タンパク質（例えば、ＳＭＡＤ７）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して相補的である短い合成オリゴヌクレオチド配列を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列はそのようなｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、これにより、遍在する（ｕｂｉｑｕｉｔａｒｙ）触媒酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ（これはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を分解し、したがって、タンパク質翻訳を妨げる）など）の活性化を引き起こすことができる二重鎖ハイブリッドをもたらす。
【０００８】
ＳＭＡＤ７の阻害剤は、ＳＭＡＤ７の特異的阻害剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）、または、ＳＭＡＤ７を高い特異性で標的とするどのような他の手段でもある場合がある。ＳＭＡＤ７のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、本明細書中に記載される配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の群より選択される場合があり、しかし、ＳＭＡＤ７のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤はこれらに限定されない。例えば、ＳＭＡＤ７のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤には、配列番号５または配列番号９が含まれる場合があり、あるいは、配列番号６または配列番号１０が含まれる場合がある。本発明の例示的なＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つが、配列番号６の形態によって表される配列であって、すべてのリン酸結合がホスホロチオアート結合である配列である（配列番号１０、これは本明細書中ではＧＥＤ−０３０１として示される）。
【０００９】
「阻害剤」は本明細書中で使用される場合、遺伝子またはＤＮＡ配列の発現を低下させること、遺伝子のＲＮＡ産物の産生、活性、またはタンパク質への翻訳を妨げるか、または抑制すること、あるいは、遺伝子のタンパク質産物の活性を妨げるか、または抑制することを、遺伝子、遺伝子のＲＮＡ産物またはタンパク質産物、あるいは、これらの実体の何らかの過渡的形態、あるいは、意図された標的の活性または発現に対してその活性または発現が影響を与える別の分子的実体との直接的または間接的のどちらかでの相互作用を介して行うことができる作用剤を示す。そのような阻害剤には、例えば、抗体、特異的な分子標的に結合する小分子、および、特異的なｍＲＮＡ転写物に標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる場合があるが、これらに限定されない。したがって、「ＳＭＡＤ７の阻害剤」は本明細書中で使用される場合、ＳＭＡＤ７の発現を低下させること、ＳＭＡＤ７のＲＮＡ産物の産生、活性、またはタンパク質への翻訳を妨げるか、または抑制すること、あるいは、ＳＭＡＤ７のタンパク質産物の活性を妨げるか、または抑制することを、ＳＭＡＤ７の遺伝子、ＲＮＡ産物またはタンパク質産物、あるいは、これらの実体の何らかの過渡的形態、あるいは、ＳＭＡＤ７の活性または発現に対してその活性または発現が影響を与える別の分子的実体との直接的または間接的のどちらかでの相互作用を介して行うことができる作用剤を示す。
【００１０】
本発明はまた、結腸直腸癌を、ＳＭＡＤ７の特異的阻害剤を投与することにより処置する方法を提供する。「特異的阻害剤」は本明細書中で使用される場合、当該特異的阻害剤が分子標的に対して排他的に、または高い選択性で作用することを可能にする構造的性質および／または機能的性質を有する作用剤を示す。したがって、ＳＭＡＤ７の特異的阻害剤は、ＳＭＡＤ７遺伝子、そのＲＮＡ産物またはタンパク質産物、あるいは、ＳＭＡＤ７またはその産物の活性または発現に対して、排他的にまたは高い特異性でのどちらかでその活性または発現が影響を与える別の分子的実体を標的化する固有の機能的性質を有する。ＳＭＡＤ７の抗体阻害剤の場合には、特異性を、ＳＭＡＤ７タンパク質エピトープと高い特異性で結合することが知られているタンパク質配列を含むことにより当該抗体に組み込むことができる。ＳＭＡＤ７の小分子阻害剤の場合には、ＳＭＡＤ７タンパク質の特異的構成に結合することを可能にする化学基を当該小分子の構築において含むことができる。様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込まれたヌクレオチド配列の標的化部分がＳＭＡＤ７のｍＲＮＡ配列に対して完全に、またはほとんど完全に相補的であるように設計することができる。そのような相補的なヌクレオチド配列またはほぼ相補的なヌクレオチド配列が組み込まれることにより、所与の標的に対する高い特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを操作することが可能になる。特異性を、様々なパラメーター（例えば、解離定数など）の測定により、あるいは、他の基準（例えば、タンパク質またはＲＮＡの発現レベルにおける変化など）、または、ＳＭＡＤ７の活性もしくは発現を測定する他のアッセイにより評価することができる。
【００１１】
特異的なＳＭＡＤ７阻害剤には、例えば、結腸直腸癌を処置するための、および／または、結腸直腸癌細胞成長を阻害するための小さい結合性分子（例えば、天然化合物および合成化合物）、抗体、アプタマー、イントラマー、ＲＮＡｉ（二重鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）分子および抗ＳＭＡＤ７アンチセンス分子を挙げることができる。ＳＭＡＤ７阻害剤はまた、ＳＭＡＤ７の活性、結合パートナーまたは基質を妨害し、かつ、それにより、ＳＭＡＤ７の機能を阻害する短縮化および／または変異化されたＳＭＡＤ７分子を含む場合がある。
【００１２】
「有効量」は本明細書中で使用される場合、患者に投与されたときには状態を少なくとも部分的に処置するために十分である作用剤の量を示す。治療有効量は、状態、成分の投与経路、および、処置されている患者の年齢、体重などに依存して変化するであろう。したがって、ＳＭＡＤ７の特異的阻害剤の有効量は、結腸直腸癌を患者において処置するために必要な阻害剤の量であって、当該作用剤の投与により、当該結腸直腸癌が対象において生じることを妨げるか、結腸直腸癌の進行を妨げる（例えば、腫瘍形成、腫瘍成長または転移などの事象の開始を妨げる）か、あるいは、当該結腸直腸癌のすべての関連症状を緩和するか、または完全に改善する、すなわち、当該疾患の退縮を引き起こすような量である。
【００１３】
本発明はまた、結腸直腸癌を、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することにより処置するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、結腸直腸癌を処置する際に使用される医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＳＭＡＤ７の阻害剤（例えば、ＳＭＡＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）と、医薬的に許容され得るキャリアとから構成される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、例えば、指定量の治療化合物、例えば、治療有効量の治療化合物を医薬的に許容され得るキャリアに含有する混合物で、結腸直腸癌を処置するために哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されるためのそのような混合物を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書中では、ＳＭＡＤ７に対する意図されたアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が意図される。別の局面において、本発明は、結腸直腸癌を処置するための医薬品の製造における、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示する。「医薬品」は本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」と本質的に同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容され得るキャリア」は、過度な毒性、刺激、アレルギー応答あるいは他の問題または合併症を伴わない、すなわち、合理的な利益／危険性比に相応するヒトおよび動物の組織との接触での使用のために好適である緩衝剤、キャリアおよび賦形剤を意味する。そのようなキャリアは、配合物の他の成分と適合性があり、かつ、レシピエントに対して有害でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。医薬的に許容され得るキャリアには、薬学的投与と適合し得る緩衝剤、溶媒、分散媒体、被覆、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当該技術分野で公知である。１つの実施形態において、医薬組成物は経口投与され、消化系または消化管の内部における封入物質の吸収部位を調節するために好適な腸溶性被覆を含む。例えば、腸溶性被覆はエチルアクリラート−メタクリル酸コポリマーを含むことができる。
【００１５】
１つの実施形態において、ＳＭＡＤ７の意図されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、どのような医薬組成物であれ、その医薬組成物は、経口投与、局所投与、非経口投与（例えば、皮下注射）、吸入スプレーによる投与、または直腸投与を含めて１つまたはいくつかの経路によって投与される場合がある。非経口の用語は本明細書中で使用される場合、皮下注射、膵臓内投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内への注射技術または注入技術を包含する。例えば、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは対象に皮下投与される場合がある。別の一例では、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは対象に経口投与される場合がある。別の一例では、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結腸直腸腫瘍細胞または結腸直腸癌細胞に直接、非経口投与により投与される場合がある。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
結腸直腸癌を処置する方法であって、ＳＭＡＤ７を患者における結腸直腸腫瘍において阻害することを含む、方法。
（項目２）
結腸直腸癌細胞の成長を阻害する方法であって、ＳＭＡＤ７を前記結腸直腸癌細胞において阻害することを含む、方法。
（項目３）
結腸直腸癌を処置する方法であって、結腸直腸癌の処置を必要とする患者に有効量のＳＭＡＤ７の特異的阻害剤を投与することを含む、方法。
（項目４）
結腸直腸癌細胞の成長を患者において阻害する方法であって、結腸直腸癌患者に有効量のＳＭＡＤ７の特異的阻害剤を投与することを含む、方法。
（項目５）
前記阻害剤が、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項目３または４に記載の方法。
（項目６）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号５または配列番号９を含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号６または配列番号１０を含む、項目５または６に記載の方法。
（項目９）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが非経口投与される、項目５〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが経口投与される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を投与することを含む、項目３または４に記載の方法。
（項目１２）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号５または配列番号９を含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
ＳＭＡＤ７に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号６または配列番号１０を含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１５）
前記医薬組成物が非経口投与される、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記医薬組成物が経口投与される、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記医薬組成物が、エチルアクリラート−メタクリル酸コポリマーを含む腸溶性被覆を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記患者がヒトである、項目１または３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
少なくとも１００μｇの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、項目５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
３５ｍｇ〜５００ｍｇの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
結腸直腸癌を処置する際に使用するための医薬組成物であって、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む、医薬組成物。
（項目２２）
結腸直腸癌を処置するための医薬品の製造における、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
（項目２３）
結腸直腸癌の処置において使用するためのＳＭＡＤ７の阻害剤。
（項目２４）
結腸直腸癌の処置において使用するためのＳＭＡＤ７の阻害剤であって、項目２〜１０のいずれかにおいて定義されるようなものであるＳＭＡＤ７の阻害剤。
（項目２５）
結腸直腸癌の処置において使用するためのＳＭＡＤ７の阻害剤であって、前記阻害剤は、項目１１〜２０のいずれかにおいて定義されるようなものであり、かつ、前記阻害剤は、項目１１〜２１のいずれかにおいて定義されるような医薬組成物において医薬的に許容され得るキャリアと一緒になっている、ＳＭＡＤ７の阻害剤。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）は、ＩｇＧアイソタイプコントロールの免疫染色（アイソタイプ、左側パネル）、ならびに、散発性結腸直腸癌を有する患者の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域におけるＳＭＡＤ７の免疫染色（中央パネルおよび右側パネル、それぞれ）を示す；図１（Ｂ）は、散発性結腸直腸癌を有する２名の患者に由来するＮＴ組織およびＴ組織におけるＳＭＡＤ７およびβ−アクチンのレベルを示すウエスタンブロット（左側パネル）、ならびに、ＳＭＡＤ７のウエスタンブロットシグナルのデンシトメトリー分析（右側パネル）である；図１（Ｃ）は、ＩＥＣならびにＤＬＤ−１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞におけるＳＭＡＤ７およびβ−アクチンのレベルを示すウエスタンブロットである；図１（Ｄ）は、ＨＣＴ−１１６細胞（左側）およびＤＬＤ−１細胞（右側）におけるＦＩＴＣコンジュゲート化ＩｇＧアイソタイプコントロール（アイソタイプ）およびＦＩＴＣコンジュゲート化ＳＭＡＤ７抗体のシグナルのＦＡＣＳ分析を示す；図１（Ｅ）は、４つの結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１１５、ＨＴ−２９およびＤＬＤ−１）および１つの肝細胞癌腫細胞株（ＨｅｐＧ２）におけるＳＭＡＤ７およびβ−アクチンの発現レベルを示すウエスタンブロット（左側パネル）、ならびに、同じブロットから得られるＳＭＡＤ７のウエスタンブロットシグナルのデンシトメトリー分析（右側パネル）である。
【図２】図２（Ａ）は、細胞総数を表し、かつ、非標識のＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドにより、または、増大する用量のＦＩＴＣコンジュゲート化ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＥＤ−０３０１（ＧＥＤ−０３０１、ＦＩＴＣコンジュゲート化）によりそのどちらかでトランスフェクションされているヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性ＨＣＴ−１１６細胞および蛍光（ＦＩＴＣ）陽性ＨＣＴ−１１６細胞の百分率を示す一連のドットプロットである；図２（Ｂ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかによるトランスフェクションの後のＨＣＴ−１１６細胞におけるＳＭＡＤ７およびβ−アクチンのレベルを示すウエスタンブロットである；図２（Ｃ）は、非処置（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後における増殖中のＨＣＴ−１１６細胞（黒棒）またはＤＬＤ−１細胞（白棒）の割合を示すグラフ（左側）、および、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（上段）またはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチド（下段）によるトランスフェクションの後における増殖中のＨＣＴ−１１６細胞の割合を示すヒストグラムを表す；図２（Ｄ）は、非処置（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後における異なる細胞周期段階にあるＨＣＴ−１１６細胞の割合を示すグラフである；図２（Ｅ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされ、かつ、未処置のままにされたか、あるいは、過剰なＴＧＦ−βタンパク質（ＴＧＦ−β）またはＴＧＦ−β抗体（抗ＴＧＦ−β）にさらされた増殖中のＨＣＴ−１１６細胞の割合を示す。
【図３】図３（Ａ）は、非処置（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかによるトランスフェクションの後の２４時間（上段）または４８時間（下段）でのＨＣＴ−１１６細胞死の割合を表すグラフ、ならびに、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後におけるＰＩ染色およびアネキシンＶ（ＡＶ）染色を例示するドットプロット（下段）を示す；図４（Ｂ）は、非処置（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのトランスフェクションの後の異なる時点でのＨＣＴ−１１６細胞における活性なカスパーゼ−３を定量化するドットプロットを示す；図４（Ｃ）は、非処置、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後における活性なカスパーゼ−３を有する、Ｎ−（２−キノリル）バリル−アスパルチル−（２，６−ジフルオロフェノキシ）メチルケトン（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）にさらされた細胞の割合を示すグラフである；図４（Ｄ）は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨにさらされ、その後、非処置、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションにさらされた細胞における細胞死の割合（％）を示すグラフである；図４（Ｅ）は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨにさらされ、その後、非処置、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションのどちらかにさらされた増殖細胞の割合（％）を示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）は、トランスフェクションされなかった細胞（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞から得られ、リン酸化ＣＤＫ２（ｐ−ＣＤＫ２（Ｔｈｒ−１４／Ｔｙｒ−１５））、ＣＤＫ２、サイクリンＡおよびβ−アクチンについてプローブ探査されるＨＣＴ−１１６細胞抽出物のウエスタンブロットを示す；図４（Ｂ）は、トランスフェクションされなかった細胞（Ｕｎｔｒ）、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞から得られ、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５ＢおよびＣＤＣ２５Ｃについてプローブ探査されるＨＣＴ−１１６細胞抽出物のウエスタンブロットを示す；図４（Ｃ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされたＨＣＴ−１１６細胞における異なる時点でのＣＤＣ２５ＡのｍＲＮＡ発現の定量化を示す；図４（Ｄ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞から得られ、プロテアソーム阻害剤のＭＧ１１５およびＭＧ１３２にさらされた後でＣＤＣ２５Ａまたはβ−アクチンについてプローブ探査される細胞抽出物のウエスタンブロットを示す；図４（Ｅ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞から得られ、リン酸化ＥｉＦ２α（ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１））、総ＥｉＦ２α、ＣＤＣ２５Ａ、サイクリンＡおよびβ−アクチンについて異なる時点でプローブ探査される細胞抽出物のウエスタンブロットである；図４（Ｆ）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＳａｌｕｂｒｉｎａｌにさらされた後で、ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）、ＥｉＦ２α、ＣＤＣ２５Ａおよびβ−アクチンについてプローブ探査されるＨＣＴ−１１６細胞抽出物のウエスタンブロットを示す；図４（Ｇ）は、ＳＭＡＤ７抗体により免疫沈降され、プロテインホスファターゼ１抗体（上段パネル）、ＥｉＦ２α抗体（中段パネル）またはＳＭＡＤ７抗体によりプローブ探査されるＨＣＴ−１１６細胞抽出物（左側パネル）または原発性結腸直腸癌細胞（右側パネル）から作製されるウエスタンブロットを示す；図４（Ｈ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされ、ＰＰ１抗体免疫沈降またはＥｉＦ２α抗体免疫沈降のどちらかに供され、反対側の抗体よりプローブ探査されるＨＣＴ−１１６細胞抽出物のウエスタンブロットを示す。
【図５】図５（Ａ）は、アゾキシメタンおよびデキストラン硫酸ナトリウム（ＡＯＭ＋ＤＳＳ）による処置の後のマウスから得られる非腫瘍組織または腫瘍組織におけるＳＭＡＤ７免疫染色を示す；図５（Ｂ）は、ＡＯＭ＋ＤＳＳによる処置の後のマウスから得られる非腫瘍組織および腫瘍組織における相対的なＳＭＡＤ７のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかによりトランスフェクションされた結腸直腸癌組織外植片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）免疫染色を示す；図６（Ｂ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかによりトランスフェクションされたヒト結腸直腸癌組織外植片の、ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡ、サイクリンＡ、ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）およびＣＤＣ２５Ａの免疫染色を示す。
【図７】図７（Ａ）は、ＨＣＴ−１１６がコロニー形成したＲａｇ１−／−マウスへの注射の後でＰＢＳ（ＣＴＲ）またはＦＩＴＣコンジュゲート化ＧＥＤ−０３０１のどちらかの単回注射にさらされたＨＣＴ−１１６由来異種移植片におけるＦＩＴＣシグナルの分布を示す；図７（Ｂ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかにさらされたＨＣＴ−１１６由来異種移植片のタンパク質抽出物におけるＳＭＡＤ７およびβ−アクチンの発現を示すウエスタンブロットである；図７（Ｃ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかにより処置されたマウスに由来する異種移植片の腫瘍体積を定量化するグラフ（左側）、および、同じ実験から得られる異種移植片の代表的な写真である；図７（Ｄ）は、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドのどちらかにより処置された異種移植片の、ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの免疫染色を示す。
【図８−１】図８（Ａ）は、ＡＯＭにさらされ、続いて、ＳＭＡＤ７のセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置されたＡｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスから得られる内視鏡画像（左側パネル）、同様にまた、腫瘍数および腫瘍スコアの内視鏡分析（グラフ、右側）、ならびに、Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスの結腸切片から得られるＨ＆Ｅ染色（中段パネル）を示す；図８（Ｂ）〜図８（Ｆ）は、ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡ、サイクリンＡ、ＣＤＣ２５Ａおよびｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）についてそれぞれ免疫染色される、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）により処置されたマウスから得られる腫瘍（Ｔ）組織切片および非腫瘍（ＮＴ）組織切片を示す；図８（Ｇ）は、Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスにおける腸組織へのＦＩＴＣコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドの局在化を示す。
【図８−２】図８（Ａ）は、ＡＯＭにさらされ、続いて、ＳＭＡＤ７のセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置されたＡｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスから得られる内視鏡画像（左側パネル）、同様にまた、腫瘍数および腫瘍スコアの内視鏡分析（グラフ、右側）、ならびに、Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスの結腸切片から得られるＨ＆Ｅ染色（中段パネル）を示す；図８（Ｂ）〜図８（Ｆ）は、ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡ、サイクリンＡ、ＣＤＣ２５Ａおよびｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）についてそれぞれ免疫染色される、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）により処置されたマウスから得られる腫瘍（Ｔ）組織切片および非腫瘍（ＮＴ）組織切片を示す；図８（Ｇ）は、Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスにおける腸組織へのＦＩＴＣコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドの局在化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
結腸直腸癌
本発明は結腸直腸癌の処置方法を提供する。「結腸直腸癌」は本明細書中で使用される場合、結腸または直腸の細胞を含めて、大腸の細胞の歯止めのきかない増殖によって特徴づけられる疾患を示す。結腸直腸癌は典型的には、大腸の上皮細胞に起源を有し、腸陰窩幹細胞がもっともらしい起源細胞である。発癌現象を生じさせる遺伝子変異には、Ｗｎｔシグナル伝達経路のメンバー（例えば、β−カテニン、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＴＣＦ７Ｌ２およびＮＫＤ１など）における変異、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路のメンバー（例えば、ＴＧＦ−β１ファミリーおよびＳＭＡＤファミリーのメンバーなど）における変異、細胞増殖と細胞死とのバランスを調節するタンパク質（例えば、ＴＰ５３など）における変異、および、他のタンパク質（例えば、ＤＣＣなど）における変異が含まれる。原因となる変異（１つまたは複数）を有する上皮細胞の増殖により、筋肉層内への、また、腸壁を突き抜ける浸潤性成長が生じる可能性がある。結腸直腸癌の症状として典型的には、直腸出血、貧血、便秘、血便、体重減少、発熱、食欲不振、および、悪心または嘔吐が挙げられる。圧倒的多数の結腸直腸癌が腺癌として分類される可能性があり、その一方で、リンパ腫および扁平上皮癌が症例のより少ないサブセットにおいて認められる。したがって、用語「結腸直腸癌」は本明細書中で使用される場合、大腸に起源を有する細胞または結腸直腸癌病理学に関連する組織のどのような異常な悪性成長も示す。
【００１８】
用語「結腸直腸癌細胞」は本明細書中で使用される場合、結腸直腸癌または結腸直腸腫瘍を生じさせるどのような起源細胞も、結腸直腸腫瘍の腫瘍形成、成長、進化、維持または支援に関連する細胞、あるいは、結腸直腸癌の病理学的出現に関連するどのような他の細胞も示す。「結腸直腸癌細胞の成長」は本明細書中で使用される場合、起源となる結腸直腸癌細胞、結腸直腸腫瘍細胞、または、結腸直腸癌病理の出現に関連するどのような細胞にも関連する細胞の歯止めのきかない増殖または異常な増殖を示す。結腸直腸癌細胞の成長は、異常な細胞周期活性、細胞周期チェックポイントの誘導不良、アポトーシスの誘導不良、または、他の腫瘍抑制因子活性の喪失の結果である場合がある。
【００１９】
処置および評価
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、用語「処置」、用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および同様な用語は、所望される薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般には意味するために本明細書中では使用される。効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に防止するという観点で予防的である場合があり、ならびに／あるいは、疾患および／または該疾患に起因する悪影響を部分的または完全に治すという観点で治療的である場合がある。用語「処置」は本明細書中で使用される場合、哺乳動物（特にヒト）における疾患のどのような処置も包含し、（ａ）該疾患が、該疾患に罹りやすいかもしれないが、該疾患を有するとして未だ診断されていない対象において生じることを防止すること、（ｂ）該疾患を阻害すること、すなわち、その発達を停止させること、または、（ｃ）該疾患を緩和すること、すなわち、該疾患の退縮を引き起こすことを包含する。
【００２０】
処置の効力が、結腸直腸癌に関連する全体的症状の評価、組織の組織学による分析、生化学的アッセイ、画像化方法（例えば、磁気共鳴画像法など）または他の知られている方法によって評価される場合がある。例えば、処置の効力が、貧血状態、直腸出血、腫瘍サイズ、または、結腸直腸癌に関連する肉眼的な病理の他の局面を、ＳＭＡＤ７阻害剤を結腸直腸癌患者に投与した後で分析することによって評価される場合がある。処置の効力はまた、例えば、組織生検物または腫瘍生検物を得て、組織または細胞の肉眼的な形態学特性または染色特性を評価することによって組織レベルまたは細胞レベルで評価される場合がある。タンパク質またはＲＮＡの発現を調べる生化学的アッセイもまた、処置の効力を評価するために使用される場合がある。例えば、ＰＣＮＡ、ｐ−ＣＤＫ２（Ｔｈｒ−１４／Ｔｙｒ−１５）、あるいは、細胞増殖活性または細胞死活性の指標となる別のタンパク質のレベルが、解離細胞または非解離組織において、免疫細胞化学的方法、免疫組織化学的方法またはウエスタンブロッティング方法により評価される場合がある。血漿あるいは腫瘍組織または非腫瘍組織に見出される有用なバイオマーカーの発現の存在またはレベルもまた、癌の進行および処置の効力を評価するために評価される場合がある。
【００２１】
処置の効力を評価する際には、好適なコントロールが、有効な評価を保証するために選定される場合がある。例えば、ＳＭＡＤ７の阻害剤の投与の後で結腸直腸癌の患者において評価される症状を、処置前の同じ患者、または、結腸直腸癌と診断されていない別の患者におけるそのような症状と比較することができる。代替において、ＳＭＡＤ７阻害剤投与後における腫瘍組織の生化学的分析または組織学的分析の結果が、同じ患者から得られる非腫瘍組織の結果、あるいは、結腸直腸癌と診断されていない個体から、または、ＳＭＡＤ７阻害剤投与前の同じ患者から得られる結果と比較される場合がある。
【００２２】
ＳＭＡＤ７阻害の有効性確認が、ＳＭＡＤ７の発現レベルまたは活性の直接的または間接的な評価によって明らかにされる場合がある。例えば、ＳＭＡＤ７のタンパク質発現またはＲＮＡ発現を測定する生化学的アッセイが、全体的なＳＭＡＤ７阻害を評価するために使用される場合がある。例えば、腫瘍組織におけるＳＭＡＤ７のタンパク質レベルが、全体的なＳＭＡＤ７レベルを評価するためにウエスタンブロットによって測定される場合がある。ＳＭＡＤ７のｍＲＮＡレベルがまた、全体的なＳＭＡＤ７阻害を明らかにするためにノーザンブロットまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定される場合がある。ＳＭＡＤ７のタンパク質レベル、または、ＳＭＡＤ７活性の指標となる別のタンパク質のレベルがまた、解離細胞または非解離組織において、免疫細胞化学的方法または免疫組織化学的方法により評価される場合がある。ＳＭＡＤ７阻害はまた、様々なパラメーター（例えば、細胞周期段階分布など）を測定すること、細胞死のマーカー（例えば、アネキシンＶまたはカスパーゼＩＩＩなど）による染色、または、ＳＭＡＤ７活性における変化と相関させられる他のパラメーターにおける変化を測定することによって間接的に評価される場合がある。例えば、ＳＭＡＤ７阻害剤により処置される腫瘍の細胞における活性なカスパーゼ−３のレベルが、前記細胞におけるＳＭＡＤ７活性の目安として測定される場合がある。血漿あるいは腫瘍組織または非腫瘍組織に見出される有用なバイオマーカーの発現の存在またはレベルもまた、ＳＭＡＤ７阻害の効力を評価するために評価される場合がある。
【００２３】
ＳＭＡＤ７ノックダウンの効力を評価する際には、好適なコントロールが、有効な評価を保証するために選定される場合がある。例えば、ＳＭＡＤ７阻害剤投与後における腫瘍組織の生化学的分析または組織学的分析の結果が、同じ患者から得られる非腫瘍組織の結果、あるいは、結腸直腸癌と診断されていない個体から、または、ＳＭＡＤ７阻害剤投与前の同じ患者から得られる結果と比較される場合がある。
【００２４】
「患者」は本明細書中に記載される場合、哺乳動物、霊長類およびヒト（これらに限定されない）を含めて、どのような動物であれ、結腸直腸癌についての危険性があるか、または、結腸直腸癌に罹患している動物を示す。例えば、患者は、結腸直腸癌発達の危険性が高いと診断される個体、または、結腸直腸癌と診断されている誰かである場合がある。ある特定の実施形態において、患者はヒト以外の哺乳動物である場合があり、例えば、ネコ、イヌまたはウマなどである場合がある。
【００２５】
ＳＭＡＤ７の阻害剤
ある特定の実施形態において、抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＳＭＡＤ７  ｍＲＮＡの部位４０３、部位２３３、部位２９４、部位２９５、部位２９６、部位２９８、部位２９９および／または部位５３３（すなわち、ヌクレオチド４０３、ヌクレオチド２３３、ヌクレオチド２９４、ヌクレオチド２９５、ヌクレオチド２９６、ヌクレオチド２９８、ヌクレオチド２９９およびヌクレオチド５３３、それぞれ）を標的とする場合がある。１つの例示的な実施形態において、抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＭＡＤ７  ｍＲＮＡの核酸４０３〜核酸４２３を標的とする。
【００２６】
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが下記の抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する場合がある：５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３）。
【００２７】
ＳＭＡＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ対におけるシトシン残基が５’−メチルシトシン（これはＭｅ−ｄＣと略記される）によって置き換えられる混合型骨格を含む場合があることが本明細書中では意図される。メチルホスホナート連結もまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’端および／または３’端に配置される場合がある（これはＭｅＰと略記される）。意図された抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸骨格は場合により、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くのホスホロチオアート結合を含む場合がある（すなわち、ホスホロチオアート結合がホスホジエステル結合に取って代わるであろう）。１つの実施形態において、すべてのリン酸結合がホスホロチオアート結合である場合がある。
【００２８】
ＳＭＡＤ７を標的とする例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチド治療には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：
５’−ＧＴＸＹＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＹＣＡＧ−３’（配列番号４）、式中、Ｘは、シトシンおよび５−メチルシトシンまたは２’−Ｏ−メチルシトシンヌクレオシドからなる群より選択される含窒素塩基を含むヌクレオチドであり、かつ、Ｙは、グアニンおよび５−メチルグアニンまたは２’−Ｏ−メチルグアニンヌクレオシドからなる群より選択される含窒素塩基を含むヌクレオチドであり、ただし、ヌクレオチドＸまたはヌクレオチドＹのうちの少なくとも１つがメチル化含窒素塩基を含む；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’（配列番号５）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸である；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ−３’（配列番号６）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸である；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’（配列番号７）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸であり、かつ、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホナートである；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’（配列番号８）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸であり、かつ、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホナートである。
【００２９】
特定の実施形態において、意図されたＳＭＡＤ７アンチセンスは、下記の１つを含む配列である場合がある：
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’（配列番号９）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスホロチオアートである；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスホロチオアートである；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’（配列番号１１）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸であり、かつ、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルチオホスホナートである；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’（配列番号１２）、式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−一リン酸であり、かつ、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルチオホスホナートである。
【００３０】
例えば、配列番号９〜配列番号１２は、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くのホスホロチオアート結合を含む。１つの実施形態において、配列番号９〜配列番号１２のすべてのＯ，Ｏホスホナート結合がホスホロチオアート結合である。
【００３１】
医薬組成物および投与経路
ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物、例えば、本明細書中に開示される医薬組成物などは、投薬単位形態物で提示することができ、どのような方法であれ、好適な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性であるように配合されなければならない。有用な配合物を製薬分野において広く知られている方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）を参照のこと。
【００３２】
医薬配合物は好ましくは無菌である。無菌化を、例えば、無菌のろ過膜に通すろ過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、ろ過滅菌を凍結乾燥および再構成の前または後で行うことができる。
【００３３】
非経口投与
本発明の医薬組成物は非経口投与のために配合することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路または腹腔内経路による注射のために配合することができる。水性組成物、例えば、ＳＭＡＤ７阻害剤を含有する水性の医薬組成物などの調製は、本開示に照らして当業者には知られているであろう。典型的には、そのような組成物は、液状の溶液または懸濁物のどちらとしてでも注射物として調製することができる；液体を注射前に添加したときに溶液または懸濁物を調製するために使用するために好適な固体形態もまた調製することができる；調製物はまた、乳化させることができる。
【００３４】
注射剤使用のために好適である医薬形態物には、無菌の水性の溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む配合物；および、無菌の注射可能な溶液または分散物をその場で調製するための無菌の粉末が含まれる。すべての場合において、形態物は無菌でなければならず、かつ、容易なシリンジ注入性が存在する程度に流動性でなければならない。形態物は製造および貯蔵の条件のもとで安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌など）の汚染作用から保護されなければならない。
【００３５】
遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性な化合物の溶液を、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなど）と好適に混合される水において調製することができる。分散物もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物において、また、オイルにおいて調製することができる。加えて、無菌の固定油が溶媒または懸濁用媒体として用いられる場合がある。この目的のために、無刺激性の固定油はどれも、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリドを含めて用いることができる。加えて、脂肪酸（例えば、オレイン酸など）を注射物の調製において使用することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒における無菌の注射可能な溶液、懸濁物または乳濁液である場合があり、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液としてである場合がある。用いられることがある許容され得るビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液（米国薬局方）および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。１つの実施形態において、ＳＭＡＤ７阻害剤は、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）８０を含むキャリア流体に懸濁される場合がある。貯蔵および使用の通常の条件のもとで、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために保存剤を含有する。
【００３６】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁物が、好適な分散化剤または湿潤化剤および懸濁化剤を使用して、知られている技術に従って配合される場合がある。一般には、分散物が、様々な無菌化された有効成分を、基礎的な分散媒体と、上記で列記される成分からの要求される他の成分とを含有する無菌のビヒクルに組み込むことによって調製される。本発明の無菌の注射可能な溶液が、ＳＭＡＤ７阻害剤を、要求に応じて、上記で列記される様々な他の成分とともに要求量の適切な溶媒に組み込み、その後、ろ過滅菌することによって調製される場合がある。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合には、好ましい調製方法が、有効成分と、それに加えて、何らかのさらなる所望される成分との粉末を事前に無菌ろ過されたその溶液からもたらす真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。注射可能な配合物は、例えば、細菌保持フィルターに通してろ過することによって無菌化することができる。
【００３７】
筋肉内注射のためのより高濃度の溶液または高濃縮溶液の調製もまた意図される。これに関して、ＤＭＳＯを溶媒として使用することが好ましく、これは、ＤＭＳＯが極めて迅速な浸透をもたらし、これにより、高濃度のＳＭＡＤ７阻害剤を小さい面積に送達するであろうからである。
【００３８】
そのような溶液における使用のための好適な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、およびチメロサールなどが含まれる。好適な緩衝剤には、ｐＨを約ｐＨ６〜ｐＨ８の間で維持するために、好ましくは約ｐＨ７〜ｐＨ７．５の間で維持するために十分な量でのホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、１０炭酸ナトリウムおよび１０炭酸カリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  １０  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、酢酸ナトリウム、ならびに、二リン酸ナトリウムなどが含まれる。好適な等張化剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコールおよび塩化ナトリウムなどが挙げられ、その結果、点眼溶液の塩化ナトリウム相当量が０．９プラスまたはマイナス０．２％の範囲であるようにされる。好適な酸化防止剤および安定剤には、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆｉｔｅ）およびチオウレアなどが含まれる。好適な湿潤化剤および清澄剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが含まれる。好適な増粘剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースなどが含まれる。
【００３９】
１つの例示的な実施形態において、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下投与のための医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号６によって表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、その医薬的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム塩）と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む。
【００４０】
経口投与
いくつかの実施形態において、本明細書中では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達のために好適である組成物（例えば、錠剤）であって、腸溶性被覆（例えば、胃耐性被覆）を含み、その結果、組成物により、アンチセンス化合物が、例えば、患者の結腸に送達され得る組成物（例えば、錠剤）が意図される。例えば、そのような投与は、アンチセンス化合物を患者の結腸の罹患部分に対して直接に実質的には局所的に適用して局所的効果をもたらす場合がある。そのような投与により、いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物の望まれない全身的吸収が実質的に回避される場合がある。
【００４１】
例えば、開示されたアンチセンス化合物、例えば、ＧＥＤ−０３０１と、医薬的に許容され得る賦形剤とを含む顆粒を含む（例えば、そのような顆粒から少なくとも一部が形成される）経口投与用の錠剤が提供される。そのような錠剤は腸溶性被覆により被覆される場合がある。意図された錠剤は、医薬的に許容され得る賦形剤、例えば、フィラー、バインダー、崩壊剤および／または滑剤、同様にまた、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、矯味矯臭剤（例えば、冬緑油、オレンジ、キシリトール、ソルビトール、フルクトースおよびマルトデキストリンなど）および芳香剤、保存剤ならびに／あるいは酸化防止剤などを含む場合がある。
【００４２】
いくつかの実施形態において、意図された医薬配合物は、意図されたアンチセンス化合物、例えば、ＧＥＤ−０３０１、または、医薬的に許容され得る塩、例えば、ＧＥＤ−０３０１、および、医薬的に許容され得るフィラーを含む顆粒内相を含む。例えば、ＧＥＤ−０３０１およびフィラーが、必要な場合には他の賦形剤と一緒にブレンドされ、顆粒にされる場合がある。いくつかの実施形態において、顆粒内相が、湿式造粒を使用して形成される場合があり、例えば、液体（例えば、水）が、ブレンドされたアンチセンス化合物およびフィラーに加えられ、その後、組合せ物が、顆粒を製造するために乾燥され、粉砕され、および／またはふるい分けされる。当業者は、他のプロセスが、顆粒内相を達成するために使用される場合があることを理解するであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態において、意図された配合物は顆粒外相を含む。この顆粒外相は、１つまたは複数の医薬的に許容され得る賦形剤を含む場合があり、かつ、開示された配合物を形成するために顆粒内相とブレンドされる場合がある。
【００４４】
開示された配合物は、フィラーを含む顆粒内相を含む場合がある。例示的なフィラーには、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、微結晶セルロース、ペクチン、ポリアクリラート、デキストロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、部分的アルファ化デンプン、炭酸カルシウム、およびそれらの組合せを含む他のフィラーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
いくつかの実施形態において、開示された配合物は、医薬配合物の成分を一緒に保持するように一般に機能し得るバインダーを含む顆粒内相および／または顆粒外相を含む場合がある。本発明の例示的なバインダーには、下記のものが含まれる場合があるが、それらに限定されない：デンプン、糖、セルロースまたは修飾セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、ラクトース、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースおよび糖アルコールなど、ならびに、それらの組合せ。
【００４６】
意図された配合物、例えば、顆粒内相および／または顆粒外相を含む配合物は崩壊剤を含む場合があり、この場合、崩壊剤としては、例えば、デンプン、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸塩、トウモロコシデンプン、クロスメロース（ｃｒｏｓｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースおよびアラビアゴムなどがそれらの組合せを含めて挙げられるが、これらに限定されない。例えば、顆粒内相および／または顆粒外相が崩壊剤を含む場合がある。
【００４７】
いくつかの実施形態において、意図された配合物は、開示されたアンチセンス化合物、ならびに、マンニトール、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびデンプングリコール酸ナトリウムまたはそれらの組合せから選ばれる賦形剤を含む顆粒内相と、微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムまたはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む顆粒外相とを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、意図された配合物は滑剤を含む場合があり、例えば、顆粒外相が滑剤を含有する場合がある。滑剤には、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化シリコーン（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｄｉｏｘｉｄｅ）、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルクおよびステアリン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの実施形態において、医薬配合物は腸溶性被覆を含む。一般に、腸溶性被覆により、薬物が消化管に沿って吸収される場所を制御する経口薬物療法のためのバリアがもたらされる。腸溶性被覆は、ｐＨに従って異なる速度で崩壊するポリマーを含む場合がある。腸溶性被覆は、例えば、酢酸フタル酸セルロース、アクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセタートスクシナート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタラート、メタクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、エチルアクリラート−メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマータイプＣ、ポリビニルアセタート−フタラートおよび酢酸フタル酸セルロースを含む場合がある。
【００５０】
例示的な腸溶性被覆には、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）ＡＭＢ、Ａｃｒｙｌ−ＥＺＥ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）の様々な品種が含まれる。いくつかの実施形態において、腸溶性被覆は、重量比で、意図された錠剤の約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、８％〜約１５％、約８％〜約１８％、約１０％〜約１２％、または、約１２％〜約１６％を含む場合がある。例えば、腸溶性被覆はエチルアクリラート−メタクリル酸コポリマーを含む場合がある。
【００５１】
例えば、約０．５重量％〜約７０重量％、例えば、約０．５重量％〜約１０重量％、または、約１重量％〜約２０重量％のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその医薬的に許容され得る塩（例えば、ＧＥＤ−０３０１）を含むか、あるいは、約０．５重量％〜約７０重量％、例えば、約０．５重量％〜約１０重量％、または、約１重量％〜約２０重量％のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその医薬的に許容され得る塩（例えば、ＧＥＤ−０３０１）から本質的になる錠剤が提供される。そのような錠剤は、例えば、約０．５重量％〜約６０重量％のマンニトール、例えば、約３０重量％〜約５０重量％のマンニトール、例えば、約４０重量％のマンニトール、および／または、約２０重量％〜約４０重量％の微結晶セルロース、もしくは、約１０重量％〜約３０重量％の微結晶セルロースを含む場合がある。例えば、開示された錠剤は、約３０重量％〜約６０重量％、例えば、約４５重量％〜約６５重量％、または、代替では、約５重量％〜約１０重量％のＧＥＤ−０３０１、約３０重量％〜約５０重量％、または、代替では、約５重量％〜約１５重量％のマンニトール、約５％〜約１５％の微結晶セルロース、約０％〜約４％、または、約１％〜約７％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、約０％〜約４％、例えば、約２％〜約４％のデンプングリコール酸ナトリウムを重量比で含む顆粒内相を含む場合がある。
【００５２】
別の実施形態において、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口投与のための医薬用錠剤配合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＧＥＤ−０３０１、または、その医薬的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム塩）と、医薬的に許容され得るフィラーとを含む顆粒内相を含み、かつ、該医薬用錠剤配合物はまた、医薬的に許容され得る賦形剤（例えば、崩壊剤など）を含む場合がある顆粒外相を含む場合がある。顆粒外相は、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウムおよびそれらの混合物から選ばれる成分を含む場合がある。この場合の医薬組成物はまた、錠剤の約１２重量％〜１６重量％の腸溶性被覆を含む場合がある。例えば、経口使用のための医薬的に許容され得る錠剤は、約．５重量％〜１０重量％のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＧＥＤ−０３０１、または、その医薬的に許容され得る塩、約３０重量％〜５０重量％のマンニトール、約１０重量％〜３０重量％の微結晶セルロース、および、エチルアクリラート−メタクリル酸コポリマーを含む腸溶性被覆を含む場合がある。
【００５３】
別の一例において、経口使用のための医薬的に許容され得る錠剤は、約５重量％〜約１０重量％のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＧＥＤ−０３０１、または、その医薬的に許容され得る塩、約４０重量％のマンニトール、約８重量％の微結晶セルロース、約５重量％のヒドロプロピルメチル（ｈｙｄｒｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌ）セルロースおよび約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む顆粒内相と、約１７重量％の微結晶セルロース、約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウム、約０．４重量％のステアリン酸マグネシウムを含む顆粒外相と、エチルアクリラート−メタクリル酸コポリマーを含む、該錠剤を覆う腸溶性被覆とを含む場合がある。
【００５４】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１３重量％または約１５重量％、１６重量％、１７重量％または１８重量％の、例えば、ＡｃｙｒｌＥＺＥ（登録商標）を含む腸溶性被覆を含有する場合がある（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０５４８２６（これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００５５】
被覆が溶解し、有効成分が放出される時点での割合が、その溶解割合である。１つの実施形態において、意図された錠剤は、例えば、米国薬局方／欧州薬局方のタイプ２装置（パドル）での試験が７．２のｐＨのリン酸塩緩衝液において１００ｒｐｍおよび３７℃で行われるとき、約５０％〜約１００％のオリゴヌクレオチドが約１２０分〜約２４０分の後において、例えば、１８０分後において放出されるという溶解プロフィルを有する場合がある。別の実施形態において、意図された錠剤は、例えば、米国薬局方／欧州薬局方のタイプ２装置（パドル）での試験が１．０のｐＨの希ＨＣｌにおいて１００ｒｐｍおよび３７℃で行われるとき、オリゴヌクレオチドが１２０分後において実質的に全く放出されない溶解プロフィルを有する場合がある。意図された錠剤は別の実施形態において、例えば、米国薬局方／欧州薬局方のタイプ２装置（パドル）での試験が６．６のｐＨのリン酸塩緩衝液において１００ｒｐｍおよび３７℃で行われるとき、約１０％〜約３０％のオリゴヌクレオチド、または約５０％もしくはそれ未満のオリゴヌクレオチドが３０分後において放出されるという溶解プロフィルを有する場合がある。
【００５６】
開示された配合物、例えば、錠剤はいくつかの実施形態において、患者に経口投与されたとき、患者におけるオリゴヌクレオチドの最小血漿中濃度をもたらす場合がある。別の実施形態において、開示された配合物は、患者に経口投与されたとき、患者の結腸または直腸に、例えば、患者の罹患部位または疾患部位に局所送達する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法はさらに、本明細書中に開示される疾患および障害を処置することに向けられる少なくとも１つの他の作用剤を投与することを含む場合がある。１つの実施形態において、意図された他の作用剤が共投与される場合がある（例えば、連続的または同時に）。
【００５８】
意図される作用剤には、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、イムノフィリンに作用する作用剤、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラートおよび小さい生物学的作用剤を含む免疫抑制剤が含まれる。例えば、意図された免疫抑制剤には、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ−ＣＤ３、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブおよびエタネルセプトが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
投薬量および投与頻度
例示的な配合物には、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの約３５ｍｇ〜約５００ｍｇを含むか、または、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの約３５ｍｇ〜約５００ｍｇから本質的になる投薬形態物が含まれる。例えば、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇまたは２５０ｍｇを含む配合物が本明細書中では意図される。１つの実施形態において、配合物は、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの約４０ｍｇ、８０ｍｇまたは１６０ｍｇを含む場合がある。いくつかの実施形態において、配合物は、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１００μｇを含む場合がある。例えば、配合物は、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇを含む場合がある。投与される量は、様々な変数に、例えば、処置されるべき疾患または適用症のタイプおよび程度、患者の全体的健康状態およびサイズ、アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ効力、医薬配合物、ならびに、投与経路などに依存するであろう。最初の投与量は、所望される血中レベルまたは組織中レベルを迅速に達成するために、上限レベルを超えて増大させることができる。代替において、最初の投薬量は最適量よりも少ないことが可能であり、投薬量が処置の経過期間中に徐々に増大させられる場合がある。ヒトでの投薬量を、例えば、４０ｍｇから１６０ｍｇにまで及ぶために設計される従来の第Ｉ相用量増加研究において最適化することができる。服用頻度が、様々な要因に依存して、例えば、投与経路、投薬量および処置される疾患などに依存して変化する可能性がある。例示的な服用頻度が、１日に１回、１週間に１回、および、２週間毎に１回である。いくつかの実施形態において、服用が７日間にわたって１日に１回である。
【実施例】
【００６０】
本発明がさらに、下記の実施例によって例示される。下記の実施例は例示目的のためにだけ提供されており、本発明の範囲または内容を限定するものとしていかなる点においても解釈してならない。
【００６１】
実施例１：結腸直腸癌細胞におけるＳＭＡＤ７タンパク質発現レベル
ＳＭＡＤ７のタンパク質発現レベルを、結腸直腸癌についての結腸切除を受ける６名の患者から採取されるペアにした結腸直腸癌の腫瘍結腸粘膜試料および非腫瘍結腸粘膜試料において評価した。腫瘍（Ｔ）組織および非腫瘍（ＮＴ）組織のＳＭＡＤ７免疫染色により、ＳＭＡＤ７タンパク質の顕著な蓄積が、非腫瘍組織と比較した場合、腫瘍組織において明らかにされ、一方、結腸直腸癌切片がＩｇＧアイソタイプコントロールとインキュベーションされたときには、染色が全く認められなかった（アイソタイプ；図１Ａ、結腸直腸癌の６名の患者の切片が分析された３つの別々の実験を表す）。加えて、結腸直腸癌患者から得られる腫瘍（Ｔ）組織および隣接する非腫瘍（ＮＴ）組織の１４個の対応したペアにおけるＳＭＡＤ７タンパク質レベルをウエスタンブロッティングによって評価した。細胞抽出物のウエスタンブロッティングにより、際立ってより高いレベルのＳＭＡＤ７が、非腫瘍組織と比較して腫瘍組織において明らかにされた（図１Ｂ、２つの代表的な患者サンプルから得られる抽出物のウエスタンブロッティングが示される）。β−アクチンを負荷コントロールとして使用した。デンシトメトリー分析による同じブロットにおけるＳＭＡＤ７発現レベルの定量化により、ＳＭＡＤ７レベルが、同じ患者に由来する非腫瘍粘膜と比較した場合、結腸直腸癌サンプルにおいて有意に増大したことが確認された（図１Ｂ）。
【００６２】
ＳＭＡＤ７タンパク質発現を結腸直腸癌細胞株においても調べた。総タンパク質抽出物を結腸直腸癌細胞株のＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６の細胞から、同様にまた、正常な結腸上皮細胞細胞（ＩＥＣ）から集め、ウエスタンブロッティングによってＳＭＡＤ７発現について評価した（図１Ｃ）。ＩＥＣを、散発性結腸直腸癌についての結腸切除を受ける患者の肉眼的および微視的な非患部粘膜から単離した。ウエスタンブロッティングにより、ＳＭＡＤ７タンパク質の顕著により高い発現が、ＩＥＣと比較してＤＬＤ−１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞において明らかにされた。ＳＭＡＤ７抗体シグナルの特異性が、ＦＩＴＣコンジュゲート化ＳＭＡＤ７抗体（ＳＭＡＤ７）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（アイソタイプ）により標識されるＨＣＴ−１１６細胞およびＤＬＤ−１細胞のＦＡＣＳ分析によって確認された（図１Ｄ）。加えて、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−１１５、ＨＴ−２９およびＤＬＤ−１を含めて一連の結腸直腸癌細胞株から集められる抽出物におけるＳＭＡＤ７タンパク質レベルのウエスタンブロット検出およびデンシトメトリー分析により、高レベルのＳＭＡＤ７発現が明らかにされた（図１Ｅ）。同じ実験において、ＳＭＡＤ７発現を、ＨｅｐＧ２細胞において、すなわち、高レベルのＳＭＡＤ７タンパク質を発現することが知られている肝細胞癌細胞株において評価した。β−アクチンを両方の一組のウエスタンブロット実験における負荷コントロールとして、また、図１Ｅに示されるバンドデンシトメトリー分析のための正規化標準物として使用した。
【００６３】
実施例２：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドによる結腸直腸癌細胞のＳＭＡＤ７タンパク質レベルのノックダウン
ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのＧＥＤ−０３０１による癌細胞のトランスフェクションをＨＣＴ−１１６細胞株の細胞において評価した。ＨＣＴ−１１６細胞を非標識のセンス（ＳＭＡＤ７センス）オリゴヌクレオチドにより、または、増大する用量（０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌ）のＦＩＴＣコンジュゲート化ＧＥＤ−０３０１によりそのどちらかで６時間トランスフェクションした。図２Ａは、ＰＩ陽性およびＦＩＴＣ陽性のトランスフェクションされたＨＣＴ−１１６細胞の百分率を定量化する代表的なドットプロットを示す。高いトランスフェクション効率が、ＰＩ染色およびＦＩＴＣ染色によって評価された場合、非常に低いレベルの細胞死とともに達成された。類似する結果が得られた２つの代表的な実験のうちの一方が図２Ａに示される。
【００６４】
様々な量のＧＥＤ−０３０１をトランスフェクションした後におけるＳＭＡＤ７タンパク質レベルのノックダウンもまた、ＨＣＴ−１１６細胞において評価した。ＨＣＴ−１１６細胞をＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドにより（２μｇ／ｍｌで）、またはＧＥＤ−０３０１により（０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌで）そのどちらかで１２時間トランスフェクションした。その後、細胞をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、新鮮な培地を用いて６時間培養し、ＰＢＳにより再び洗浄し、さらに２４時間培養した。その後、ＳＭＡＤ７およびβ−アクチンのレベルをウエスタンブロッティングによって分析した。図２Ｂは３つの代表的な実験のうちの１つを示し、ＳＭＡＤ７タンパク質レベルにおける際立ったノックダウンを、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションされる細胞と比較した場合、増大する量のＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされる細胞において明らかにしている。これらの結果は、ＳＭＡＤ７のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＧＥＤ−０３０１）は結腸直腸癌細胞にトランスフェクションすることができ、かつ、ＳＭＡＤ７タンパク質レベルのロバストなノックダウンを誘導することができたことを明らかにした。
【００６５】
実施例３：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は結腸直腸癌細胞における細胞周期動力学に影響を及ぼす
細胞増殖を、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドおよびＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドを投与した後でのＨＣＴ−１１６細胞およびＤＬＤ−１細胞において評価した。ＨＣＴ−１１６細胞およびＤＬＤ−１細胞をトランスフェクションに供しなかった（Ｕｎｔｒ）か、あるいは、１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションに供した。トランスフェクション後１２時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、さらに６時間培養し、ＰＢＳにより再洗浄し、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により３０分間標識した。その後、標識された細胞をＰＢＳにより洗浄し、新鮮な培地でさらに２４時間、再培養した。増殖細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価した。細胞増殖における有意な低下が、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションされた細胞と比較した場合、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされたＤＬＤ−１細胞（白棒）およびＨＣＴ−１１６細胞（黒棒）の両方において認められた（図２Ｃ；ＨＣＴ−１１６：ＳＭＡＤ７センストランスフェクション細胞対ＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞、＊Ｐ＜０．００１；ＤＬＤ−１：ＳＭＡＤ７センストランスフェクション細胞対ＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞、†Ｐ＜０．００１）。グラフにおけるデータは３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。図２Ｃにおけるヒストグラムは、１回だけの実験から得られる細胞増殖の総割合をＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（８２％）またはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチド（４７％）のどちらかによりトランスフェクションされたＨＣＴ−１１６細胞において表す。したがって、結腸直腸癌腫細胞株のＨＣＴ−１１６およびＤＬＤ−１において、ＳＭＡＤ７のＡＳオリゴヌクレオチドの投与は細胞増殖における有意な低下をもたらした。
【００６６】
異なる細胞周期段階にある細胞の分布もまた、ＧＥＤ−０３０１のトランスフェクションの後でのＨＣＴ−１１６細胞において分析した。ＨＣＴ−１１６細胞をトランスフェクションに供しなかった（Ｕｎｔｒ）か、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションに供した。ＨＣＴ−１１６細胞を１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドによりトランスフェクションした。トランスフェクション後１２時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、新鮮な培地でさらに２４時間培養した。その後、細胞周期の異なる段階にある細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価した。Ｓ期に存在する細胞の百分率における統計学的に有意な増大、および、Ｇ０／Ｇ１集団を構成する細胞の百分率における統計学的に有意な付随する低下が、コントロールと比較して、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされた細胞において認められた（図２Ｄ；ＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞対ＳＭＡＤ７センストランスフェクション細胞、Ｓ期については、＊＊Ｐ＝０．００１；Ｇ０／Ｇ１期については、＊Ｐ＝０．０１）。類似する結果が得られた３つの代表的な実験のうちの１つが示される。これらの結果は、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのＧＥＤ−０３０１の投与によって促進されるＳＭＡＤ７タンパク質のノックダウンが結腸直腸癌細胞における変化した細胞周期段階集団分泌をもたらしたことを明らかにする。
【００６７】
結腸直腸癌細胞は多くの場合、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を媒介する遺伝子に変異を有しており、このことが、結腸直腸癌細胞をＴＧＦ−β１活性における変化に対して非応答性にしている。したがって、ＳＭＡＤ７活性における変化によって誘導される細胞増殖に対する認められた影響と、ＴＧＦ−β１シグナル伝達活性との関係を、ヒト結腸直腸癌細胞株のＨＣＴ−１１６およびＤＬＤ−１において調査した。ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）によりトランスフェクションされた細胞をＴＧＦ−β１タンパク質またはＴＧＦ−β１中和抗体のどちらかにさらした。増大したＴＧＦ−β１に対する暴露、または、抗体暴露を介したＴＧＦ−β１活性の阻害はどちらも、細胞増殖における際立った変化をもたらさなかった。加えて、ＧＥＤ−０３０１（ＡＳ）によりトランスフェクションされ、かつ、同じ処理にさらされた細胞もまた、処置されなかったＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞に対して、細胞増殖における変化を何ら示さなかった（図２Ｅ、ＨＣＴ−１１６のデータが示される）。これらの結果から、結腸直腸癌細胞において認められるＳＭＡＤ７シグナル伝達の細胞分裂促進（ｐｒｏ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）影響はＴＧＦ−β１活性とは無関係であることが明らかにされた。
【００６８】
実施例４：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は結腸直腸癌細胞における増大した細胞死を引き起こす
細胞死を、細胞周期分布における認められた変化が細胞死プログラムの活性化と相関したかどうかを明らかにするために、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのＧＥＤ−０３０１を投与した後でのＨＣＴ−１１６細胞において評価した。細胞死を調査するために、ＨＣＴ−１１６細胞を非処置（Ｕｎｔｒ）のままにしたか、あるいは、１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドにより１２時間トランスフェクションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、さらに６時間培養し、ＰＢＳにより再洗浄し、新鮮な培地でさらに２４時間〜４８時間培養した（図３Ａ、上段パネルおよび中段パネル、それぞれ）。細胞死をＡＶ染色および／またはＰＩ染色のフローサイトメトリー分析によって評価した。一緒になったＡＶ−／ＰＩ＋集団、ＡＶ＋／ＰＩ＋集団およびＡＶ＋／ＰＩ−集団によって評価されるような細胞死における有意な増大が、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションされた細胞と比較して、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされたＨＣＴ−１１６細胞について４８時間において認められた（図３Ａ、中段パネル；ＳＭＡＤ７センス対ＧＥＤ−０３０１、Ｐ＜０．００１）。結果が３回の実験の平均±ＳＤとして表される。代表的なドットプロット（図３Ａ、下段パネル）はトランスフェクション後４８時間でのＡＶ陽性および／またはＰＩ陽性のＨＣＴ−１１６細胞の百分率を示す。
【００６９】
ＳＭＡＤ７ノックダウン後の結腸直腸癌細胞における細胞死経路の活性化をさらに評価するために、活性なカスパーゼ−３を発現する細胞の割合を、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされる細胞において調査した。ＨＣＴ−１１６細胞を非処置（Ｕｎｔｒ）のままにしたか、あるいは、１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドにより１２時間トランスフェクションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、新鮮な完全培地を用いてさらに６時間培養し、その後、ＰＢＳにより洗浄し、新鮮な培地でさらに１６時間、２４時間または３６時間培養した。その後、カスパーゼ−３の活性化をフローサイトメトリーによって評価した。図３Ｂにおけるドットプロットは、ＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞での活性なカスパーゼ−３における顕著な増大をＳＭＡＤ７センストランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞と比較して示す。そのうえ、ＧＥＤ−０３０１のトランスフェクションは、カスパーゼ−３が活性な細胞の徐々により大きい百分率をそれぞれの時点でもたらした。これらの結果は、ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌細胞株において、ＧＥＤ−０３０１の投与が、コントロールと比較して、細胞死を受けるか、または活性なカスパーゼ−３を発現する細胞の割合（％）における有意な増大をもたらしたことを明らかにする。
【００７０】
細胞死が、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされる細胞において阻止され得るかどうかを明らかにするために、細胞を通常の培地で、あるいは、汎カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはＤＭＳＯの存在下で１時間培養し、その後、非処置のままにしたか、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドにより３６時間トランスフェクションした。活性なカスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）−３を発現する細胞の割合をフローサイトメトリーによって評価した。有意差が非トランスフェクション群またはＳＭＡＤ７センストランスフェクション群のいずれにおいても何ら認められなかったが、活性なカスパーゼ−３を発現する細胞の割合における有意な低下が、薬物に何らさらされなかったか、または、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨにさらされたＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞の間において認められた（図３Ｃ；薬物非存在対Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｐ＝０．００２）。
【００７１】
同じプロトコルを使用して、細胞死の割合を評価したが、この場合には、細胞をトランスフェクション後４８時間で評価し、細胞死の割合を、総細胞集団内の一緒になったＡＶ陽性および／またはＰＩ陽性の集団を検討することによって評価した。有意差が非トランスフェクション群またはＳＭＡＤ７センストランスフェクション群のいずれにおいても何ら認められなかったが、細胞死を受ける細胞の割合における有意な低下が、薬物に何らさらされなかったか、または、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨにさらされたＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞の間において認められた（図３Ｄ；薬物非存在対Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｐ＝０．００８）。
【００７２】
ＧＥＤ−０３０１誘導のＨＣＴ−１１６細胞成長停止が細胞死の誘導に対して二次的であるかどうかを明らかにするために、細胞増殖を、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨにさらされるＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞において評価した。細胞を通常の培地で、あるいは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはＤＭＳＯの存在下または非存在下で１時間培養し、その後、非処置のままにしたか、あるいは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションした。２４時間後、増殖細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価した。Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ暴露にもかかわらず、すべてのＧＥＤ−０３０１トランスフェクション細胞集団が、ＳＭＡＤ７センストランスフェクション群および非トランスフェクション群と比較して、増殖細胞の割合における低下を示し、このことから、細胞死が、ＳＭＡＤ７タンパク質のノックダウンに供された結腸直腸癌細胞における低下した増殖の二次的な影響であることが明らかにされた（図３Ｅ）。図３Ｃ〜図３Ｅに示される結果は３回の実験の平均±ＳＤである。
【００７３】
実施例５：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは下流側のＴＧＦβ１シグナル伝達成分の相互作用を中断させ、細胞周期調節タンパク質の発現および活性に影響を与える
細胞周期の進行が様々なサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって調節され、この場合、これらのサイクリン依存性キナーゼは活性化パートナー（これらはサイクリンとして知られている）と会合して、様々な役割を細胞周期進行において果たす様々なタンパク質の活性を調節する。ＣＤＫ活性はそれ自体、阻害性のリン酸化および活性化するリン酸化の両方によって調整される。例えば、ＣＤＫ−サイクリン複合体が、ＣＤＫのＡＴＰ結合ポケット内のＴｈｒ−１４残基およびＴｙｒ−１５残基のリン酸化によって阻害され得る。ＣＤＫ２がＳ期の制御において中心的役割を果たしており、サイクリンＥまたはサイクリンＡのどちらかに結合して、Ｇ１／Ｓ移行およびＳ期進行をそれぞれ調節する。
【００７４】
結腸直腸癌細胞におけるＣＫＤ２／サイクリン活性に対するＳＭＡＤ７発現の影響を分析するために、ＣＤＫ２のリン酸化状態をＧＥＤ−０３０１によるトランスフェクションの後でのＨＣＴ−１１６細胞において分析した。ＨＣＴ−１１６細胞を非トランスフェクション（Ｕｎｔｒ）のままにしたか、あるいは、１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションした。トランスフェクション後６時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、新鮮な培地を用いてさらに１６時間に再培養した。ｐ−ＣＤＫ２（Ｔｈｒ−１４／Ｔｙｒ−１５）、ＣＤＫ２、サイクリンＡおよびβ−アクチンのレベルを細胞抽出物のウエスタンブロッティングによって分析した。類似する結果が得られた３つの代表的な実験のうちの１つが図４Ａに示される。図４Ａにおけるブロットは、ＧＥＤ−０３０１によるＨＣＴ−１１６細胞のトランスフェクションにより、ｐ−ＣＤＫ２（Ｔｈｒ−１４／Ｔｙｒ−１５）レベルにおける際立った増大がコントロールと比較してもたらされたこと、同様にまた、サイクリンＡレベルにおける低下がもたらされたことを明らかにし、このことは、ＧＥＤ−０３０１投与後でのＳ期における細胞の蓄積を説明するための機構を提供する。
【００７５】
ＣＤＫ２の活性化が、ＣＤＫ／サイクリン複合体をリン酸化し、これを活性化する特化したホスファターゼ（ＣＤＣ２５）の活性に厳密に依存している。ヒトＣＤＣ２５ファミリーの３つのメンバーが存在する。ＣＤＣ２５ＡがＳ期経由の進行を制御し、一方、ＣＤＣ２５ＢおよびＣＤＣ２５ＣがＧ２から有糸分裂への移行の制御に関与する。ＣＤＣ２５ファミリーメンバーのレベルを、ＳＭＡＤ７欠損細胞におけるＣＤＫ２の不活性化／リン酸化がＣＤＣ２５タンパク質の損なわれた発現と関連したかどうかを明らかにするために調べた。ＨＣＴ−１１６細胞を非処理（Ｕｎｔｒ）のままにしたか、あるいは、１μｇ／ｍｌでのＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）により血清非含有培地において２０時間トランスフェクションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地でさらに２４時間培養した。ＳＭＡＤ７のノックダウンには、ＣＤＣ２５Ａタンパク質発現の顕著な低下が伴い、一方、ＣＤＣ２５ＢおよびＣＤＣ２５Ｃのレベルは変化しないままであった（図４Ｂ；結果は３回の実験を表す）。したがって、ＳＭＡＤ７活性が、結腸直腸癌細胞におけるロバストなＣＤＣ２５Ａ発現のために必要であるようである。
【００７６】
ＣＤＣ２５Ａの細胞内濃度が多数のレベルで調節され得る。ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導によるＣＤＣ２５Ａタンパク質のダウンレギュレーションがＣＤＣ２５Ａ転写の阻害から生じたかどうかを明らかにするために、総ＲＮＡを、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされ、異なる期間にわたって培養されたＨＣＴ−１１６細胞から抽出し、リアルタイムＰＣＲによってＣＤＣ２５ＡのｍＲＮＡレベルについて分析した。ＣＤＣ２５ＡのリアルタイムＰＣＲシグナルをβ−アクチンのシグナルに対して正規化した。すべての細胞を１μｇ／ｍｌでの（ａｔ  ａｔ）オリゴヌクレオチドにより血清非含有培地において２０時間トランスフェクションし、ＰＢＳにより洗浄し、１０％のＦＢＳを含有する培地を用いて培養した。その後、細胞を４時間後に再洗浄し、示された時点について血清非含有培地で培養した。ＣＤＣ２５ＡのＲＮＡ転写物レベルが、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置された細胞（黒棒）では、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドにより処置された細胞（白棒）と比較して、ダウンレギュレーションされたのではなく、むしろ増大した（図４Ｃは３回の実験の平均（ＳＥＭ）の平均±標準誤差を示す）。このデータは、ＣＤＣ２５Ａのタンパク質レベルとＲＮＡレベルとがＳＭＡＤ７欠損の結腸直腸癌細胞では連動していないことを明らかにし、また、ＳＭＡＤ７によるＣＤＣ２５Ａタンパク質発現の調節が翻訳機構または翻訳後の（例えば、プロテアソーム依存的な）機構を介して生じていることを示唆した。
【００７７】
プロテアソーム依存的機構により、ＳＭＡＤ７ノックダウン細胞における認められたＣＤＣ２５Ａの低下が説明されたかを明らかにするために、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞をプロテアソーム阻害剤のＭＧ１１５およびＭＧ１３２にトランスフェクション後２４時間にわたってさらした。これらのプロテアソーム阻害剤による結腸直腸癌細胞の処置はＣＤＣ２５Ａタンパク質発現の阻害を妨げなかった（図４Ｄ；３回の実験のうちの１つに由来する代表的なブロット）。
【００７８】
ＣＤＣ２５Ａタンパク質発現はまた、様々なタンパク質の翻訳減衰のために不可欠である真核生物翻訳開始因子２アルファ（ＥｉＦ２α）によって調節される（ＴｏｍｋｏおよびＬａｚｏ（２００８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６８（１８）：７４５７−７４６５）。ＥｉＦ２α活性がＳｅｒ５１におけるリン酸化によって調節され、これにより、ＥｉＦ２αの隔離がもたらされる（Ｗｅｋら（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３４：７−１１）。したがって、ＥｉＦ２αの過剰リン酸化はＣＤＣ２５Ａタンパク質発現の顕著な低下を生じさせる。したがって、ＳＭＡＤ７アンチセンスにより処置された結腸直腸癌細胞におけるＥｉＦ２αリン酸化の状態を、ＥｉＦ２α活性における変化がＣＤＣ２５Ａレベルにおける認められた変化の原因となり得るであろうかを明らかにするために調査した。細胞を１μｇ／ｍｌで血清非含有培地において２０時間トランスフェクションし、ＰＢＳにより洗浄し、１０％のＦＢＳを含有する培地を用いて培養した。その後、細胞を４時間後に再洗浄し、示された時点について血清非含有培地で培養した（図４Ｅ；１２時間、１８時間または２４時間）。ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）にさらすことによるＨＣＴ−１１６細胞およびＤＬＤ−１細胞の両方におけるＳＭＡＤ７の沈黙化はＥｉＦ２αのＳｅｒ５１のリン酸化を増大させ、ＣＤＣ２５Ａタンパク質およびサイクリンＡタンパク質のダウンレギュレーションに先行した（図４Ｅ；３つの代表的なブロットのうちの１つが示される）。
【００７９】
結腸直腸癌細胞におけるＥｉＦ２α活性とＣＤＣ２５Ａ発現との連係を確認するために、ＥｉＦ２α機能をＳａｌｕｂｒｉｎａｌによって、すなわち、ＥｉＦ２αのＳｅｒ５１の脱リン酸化を妨害する化合物によってＨＣＴ−１１６細胞およびＤＬＤ−１細胞において特異的に阻害した。ＨＣＴ−１１６細胞をＤＭＳＯまたはＳａｌｕｂｒｉｎａｌにより６時間〜２４時間処理し、その後、細胞抽出物を、ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）、総ＥｉＦ２α、ＣＤＣ２５Ａまたはβ−アクチンについてウエスタンブロットによってプローブ探査した。Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌによる結腸直腸癌細胞の処理は、ＤＭＳＯ処理のコントロールに対して、リン酸化ＥｉＦ２αの増大およびＣＤＣ２５Ａタンパク質レベルの付随する低下をもたらした（図４Ｆ；３つの代表的なブロットのうちの１つが示される）。これらの結果から、ＳＭＡＤ７のノックダウンはＥｉＦ２αのリン酸化を変化させ、このことは結果として、結腸直腸癌細胞におけるＣＤＣ２５Ａ発現レベルをもたらす（ｅｆｆｅｃｔ）ことが明らかにされた。
【００８０】
ＳＭＡＤ７はまた、成長停止・ＤＮＡ損傷タンパク質（Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＡＤＤ３４）、すなわち、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）ホロ酵素の調節サブユニットと相互作用して、それにより、ＴＧＦβタイプＩ受容体のシグナル伝達を促進させる。ＧＡＤ３３４／ＰＰ１複合体はまた、ＥｉＦ２αと相互作用し、その脱リン酸化を促進させることができる。結腸直腸癌細胞におけるこれらの異なる分子成分の間での会合を、免疫沈降実験およびウエスタンブロッティング実験を行うことによって調べた。ＨＣＴ−１１６細胞（左側パネル）、ＤＬＤ−１細胞（示されず）および原発性結腸直腸癌細胞（右側パネル）から得られる全細胞抽出の免疫沈降を、抗ＳＭＡＤ７抗体を使用して、その後、抗ＰＰ１抗体（上段）、抗ＥｉＦ２α抗体（中段）または抗ＳＭＡＤ７抗体（下段）によるウエスタン分析を使用して行った（図４Ｇ、３つの代表的なブロットのうちの１つがそれぞれの実験について示される；ＩＰ＝免疫沈降、ｎ．ｓ．＝非特異的バンド）。ブロットはまた、アイソタイプ特異的なコントロール抗体によりプローブ探査した（それぞれのブロットにおける右側レーン；ｖｅ−）。この実験から、内因性ＳＭＡＤ７が、結腸直腸癌細胞株、および、新鮮な結腸直腸癌腫瘍組織から単離される原発性細胞においてＰＰ１およびＥｉＦ２αと相互作用することが明らかにされた。
【００８１】
ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によりトランスフェクションされたＨＣＴ−１１６細胞におけるさらなる免疫沈降／免疫ブロッティング実験では、ＳＭＡＤ７の沈黙化がＰＰ１とＥｉＦ２αとの間での会合を著しく低下させたことが示された（図４Ｈ；３つの代表的なブロットのうちの１つがそれぞれの実験について示される；ｎ．ｓ．＝非特異的バンド）。トランスフェクション細胞から得られるＨＣＴ−１１６細胞抽出物をＰＰ１抗体による免疫沈降に供し、ＥｉＦ２α抗体を使用するウエスタンブロットによってプローブ探査し（上段）、または、逆に、ＥｉＦ２α抗体による免疫沈降に供し、ＰＰ１抗体を使用するウエスタンブロットによってプローブ探査した（下段）。ブロットはまた、コントロールとしてのアイソタイプ特異的抗体（Ｖｅ−）によりプローブ探査した。したがって、ＳＭＡＤ７は、ＰＰ１ホロ酵素とＥｉＦ２αとの間での会合を媒介することにおいて重要な役割を果たし、これにより、ＥｉＦ２α活性に影響を与えている。そのうえ、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、これらの成分の分断、ならびに、その結果として生じる、サイクリンＡおよびＣＤＣ２５Ａの発現における低下をもたらした。このことは、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされたときに結腸直腸癌細胞において認められる変化した細胞増殖および細胞周期進行を説明するための機構を提供する。
【００８２】
実施例６：インビボでのＳＭＡＤ７のタンパク質発現およびｍＲＮＡ発現が誘発結腸直腸癌のマウスモデルにおいて増大する
ＳＭＡＤ７のタンパク質発現およびｍＲＮＡ発現を、結腸直腸癌のインビボでの誘発が増大したＳＭＡＤ７レベルと関連したかどうかを明らかにするために、大腸炎随伴結腸直腸癌を有するマウスの腫瘍領域および非腫瘍領域において評価した。本実施例で利用されるモデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＯＭを投与し、その後で、反復したＤＳＳ摂取を続け（ＡＯＭ＋ＤＳＳ）、これにより、結腸の炎症と、多数の結腸腫瘍のその後の発達とを引き起こした。動物を、ＡＯＭ＋ＤＳＳによる処置の８４日後に屠殺した。ＳＭＡＤ７のタンパク質レベルを、大腸炎随伴結腸直腸癌を有するマウスから採取される組織の非腫瘍領域および腫瘍領域の免疫染色によって評価した。図５Ａは、ＡＯＭ＋ＤＳＳにより処置されたマウスの腫瘍領域でのＳＭＡＤ７免疫染色の明瞭な増大を示す。画像が、行われた３回の実験のうちの１つから撮影される。ＳＭＡＤ７のｍＲＮＡ発現もまた、リアルタイムＰＣＲによって評価される場合、ＡＯＭ＋ＤＳＳにより処置されたマウスの非腫瘍領域と比較して、腫瘍領域において増大した（図５Ｂ）。図５Ｂにおける値は平均±ＳＥＭを表しており、６匹のマウスがそれぞれの群に含まれた。したがって、インビボでのＳＭＡＤ７の増大したｍＲＮＡ発現、また、特にタンパク質発現が、もっぱら腫瘍組織における結腸直腸癌の誘導と相関した。
【００８３】
実施例７：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は低下した組織外植片細胞増殖をもたらす
ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドにより促進されるノックダウンの、組織における細胞増殖に対する影響を評価するために、Ｈ＆Ｅ染色またはＰＣＮＡ免疫染色をエクスビボ結腸直腸癌組織外植片から得られる切片に対して行った。新鮮な組織外植片をＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドにより３６時間トランスフェクションし、その後、染色した。図６Ａは、新たに得られた外植片から得られるＨ＆Ｅ染色切片およびＰＣＮＡ染色切片の代表的な画像を示す。Ｈ＆Ｅ染色およびＰＣＮＡ免疫シグナルの両方における明瞭な低下が、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションされる外植片と比較して、ＧＥＤ−０３０１によりトランスフェクションされる組織外植片において認められ、このことから、ＧＥＤ−０３０１が細胞増殖をトランスフェクションされた組織において効率的に低下させたことが明らかにされた。２回の代表的な実験のうちの１つから得られる画像が示される。
【００８４】
同様に、ＳＭＡＤ７のセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）をヒト結腸直腸癌組織外植片の器官培養物に加え、細胞成長および細胞周期関連タンパク質を２４時間後に分析した。結腸直腸癌組織外植片の連続切片の免疫組織化学は、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡ、サイクリンＡおよびＣＤＣ２５Ａを発現する結腸直腸癌細胞の割合を低下させ、かつ、ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）について陽性である細胞の百分率を増大させたことを示した（図６Ｂ）。画像は５つの代表的な結果のうちの１つを示し、それと同時に、アイソタイプコントロールの染色（アイソタイプ）が左側の欄に示される。
【００８５】
実施例８：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は異種移植片マウスモデルにおいてインビボでの結腸直腸癌の腫瘍成長および細胞増殖を低下させる
ＨＣＴ−１１６異種移植片モデルを使用して、結腸直腸癌腫瘍発達および結腸直腸癌細胞増殖に対するＧＥＤ−０３０１投与の影響を評価した。その目的のために、Ｒａｇ−１−／−マウスにＨＣＴ−１１６細胞を接種した（５×１０５個の細胞を５００μｌのマトリゲルにおいて）。接種後１週間で、マウスはＰＢＳ（図７Ａ、ＣＴＲ）または１００μｇのＦＩＴＣコンジュゲート化ＧＥＤ−０３０１（図７Ａ、ＧＥＤ−０３０１  ＦＩＴＣコンジュゲート化）のどちらかの単回腹腔内注射を受けた。マウスを試薬注射後２４時間で屠殺し、腫瘍を切除し、ＦＩＴＣコンジュゲート化ＧＥＤ−０３０１の分布を免疫蛍光シグナルによって評価した。ＦＩＴＣシグナルが明瞭に、異種移植片細胞に由来する核シグナルとともに共局在化していた（図７Ａ、Ｄａｐｉ／ＦＩＴＣパネル）。
【００８６】
ＳＭＡＤ７タンパク質シグナルもまた、ＧＥＤ−０３０１投与に供された動物から得られる異種移植片において評価した。ＨＣＴ−１１６細胞をＲａｇ−１−／−マウスに接種し、動物をＳＭＡＤ７センスまたはＧＥＤ−０３０１のどちらかにより腹腔内処置した。両方のオリゴヌクレオチドを１００μｇ／マウスで、ＨＣＴ−１１６注入後７日で開始して毎日投与した。マウスをＨＣＴ−１１６細胞接種後２１日で屠殺した。異種移植片組織から得られる総タンパク質抽出物のウエスタンブロッティングにより、ＳＭＡＤ７シグナルの際立って低下したレベルが、ＳＭＡＤ７センス処置マウスではなく、ＧＥＤ−０３０１処置マウスから得られるサンプルにおいて明らかにされた（図７Ｂ）。β−アクチンを負荷コントロールとして使用した。したがって、ＧＥＤ−０３０１は結腸直腸癌異種移植片細胞におけるＳＭＡＤ７タンパク質のレベルをインビボにおいてノックダウンすることができた。
【００８７】
上記と同じプロトコルに供されるマウスから集められる異種移植片を、それぞれの群において生じる腫瘍の体積について分析した。腫瘍体積における有意な低下が、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドにより処置されるマウスと比較して、ＧＥＤ−０３０１により処置されるＨＣＴ−１１６接種マウスにおいて認められた（図７Ｃ）。図７Ｃにおけるグラフは、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドまたはＧＥＤ−０３０１オリゴヌクレオチドにより処置されるマウスについて２１日において平均腫瘍体積を示す（図７Ｃ、左側パネル；ＳＭＡＤ７センス対ＧＥＤ−０３０１、Ｐ＜０．００１；２回の独立した実験の平均、群あたり１２匹以上のマウス；棒は平均±ＳＤを示す）。図７Ｃ（右側パネル）は、ＳＭＡＤ７センス処置マウス（上段列）およびＧＥＤ−０３０１処置マウス（下段列）において発達した異種移植片の代表的な写真を提供する。これらの結果から、ＳＭＡＤ７のＧＥＤ−０３０１ノックダウンは直腸結腸腫瘍成長を異種移植片モデルにおいて阻害したことが明瞭に明らかにされる。
【００８８】
ＳＭＡＤ７、細胞増殖マーカーＰＣＮＡおよびＣＤＫ２パートナーのサイクリンＡについての免疫染色もまた、上記と同じプロトコルを受けたマウスから集められる異種移植片組織切片において行った。ＳＭＡＤ７、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡについて染色された異種移植片切片の代表的な画像が図７Ｄに示される。６回の代表的な実験のうちの１つから得られる画像が示される。アイソタイプコントロールの染色が左側の欄に示される（アイソタイプ）。３つすべてのシグナルにおける低下が、ＳＭＡＤ７センス処置マウス（Ｓ）に由来する組織切片と比較して、ＧＥＤ−０３０１処置マウス（ＡＳ）において発達した異種移植片から得られる組織切片において認められ、このことから、ＳＭＡＤ７タンパク質のＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド媒介のノックダウンがインビボでの結腸直腸癌細胞における低下した細胞増殖をもたらしたことが明らかにされた。
【００８９】
実施例９：ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は腫瘍形成を自然発症結腸直腸癌のモデルにおいて阻害する
ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドが腸腫瘍原性をインビボで阻害し得るかを、自然発症結腸直腸癌のマウスモデルを使用して調べた。具体的には、多発性腸新形成（Ｍｉｎ）マウス（これは大腸腺腫性ポリポーシス（Ａｐｃ）遺伝子における優性の変異を有する）をこれらの実験のために使用した。このマウスモデルは、家族性腺腫性ポリポーシスとして知られているヒト疾患に類似している（この疾患もまた、ＡＰＣ遺伝子における変異によって引き起こされる）。発癌物質ＡＯＭによるＡｐｃ（Ｍｉｎ／＋）マウスの処置は、腫瘍の発生率、数およびサイズを特に結腸において増大させる。マウスを、ＡＯＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）により週に１回、２週間にわたって腹腔内（ｉ．ｐ）処置し、腫瘍形成についてモニターした。最後のＡＯＭ注射の１週間後、マウスを、８０日目での屠殺まで週に３回、１２５μｇ／マウスのＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）またはＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）のどちらかにより経口処置した。平行して、マウスは、非標識のオリゴヌクレオチド（ＣＴＲ）またはＦＩＴＣコンジュゲート化ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＦＩＴＣコンジュゲート化ＡＳ；１２５μｇ／マウス）の経口服用を、オリゴヌクレオチドの腸管取り込みを評価するために受け、マウスを８時間後に屠殺した（図８Ｇ）。腸組織切片の分析により、ＦＩＴＣシグナルの存在が明らかにされ、このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的組織に局在化したことを示していた。
【００９０】
７２日目での内視鏡検査では、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチドにより処置されるマウスが多数の大きい腫瘍を発達させ、これに対して、腫瘍の数およびサイズが、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置されたマウスの結腸では低下したことが示された（図８Ａ、左側パネル）。腫瘍数および腫瘍スコアの内視鏡分析では、これらのパラメーターにおける有意な低下がＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド処置マウスにおいてＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド処置マウスに対して明らかにされた（図８Ａ、グラフ；腫瘍数について、Ｓ対ＡＳ、Ｐ＝０．００４；腫瘍スコアについて、Ｓ対ＡＳ、Ｐ＝０．００１；両方のグラフについて、棒は平均±ＳＥＭを示す（３回の個々の実験、群あたり５匹以上のマウス））。これらの結果が、８０日目に屠殺されたマウスにおける腫瘍の直接評価によって確認された。具体的には、結腸組織のＨ＆Ｅ染色により、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド処置マウスではなく、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド処置マウスにおける大きい成長の存在が明らかにされた（図８Ａ、中段パネル）。
【００９１】
腫瘍切片（Ｔ）および非腫瘍切片（ＮＴ）の免疫組織化学では、ＳＭＡＤ７が、ＳＭＡＤ７センスオリゴヌクレオチド（Ｓ）にさらされる新生物領域においてアップレギュレーションされ、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置（ＡＳ）によって阻害されたことが示された（図８Ｂ）。ＰＣＮＡ染色により、Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの抗増殖効果が確認された（図８Ｃ）。そのうえ、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置は腫瘍領域においてサイクリンＡおよびＣＤＣ２５Ａのレベルを低下させ（図８Ｄ、図８Ｅ）、ｐ−ＥｉＦ２α（Ｓｅｒ５１）のレベルをアップレギュレーションした（図８Ｆ）。したがって、ＧＥＤ−０３０１はインビボでの腫瘍の形成および成長を結腸直腸癌の多発性動物モデルにおいて首尾よく阻害した。
【００９２】
参照による組み込み
本明細書中で引用される特許文献および科学論文のそれぞれの開示全体がすべての目的のために参照によって組み込まれる。
【００９３】
均等物
本発明は、その本質的な特徴から出発することにより他の具体的な形態で具体化することができる。したがって、前記実施形態は、本明細書中に記載される発明に対する限定であるのではなく、むしろ、例示であると見なされるものとする。本発明の範囲は、前記の記載によってではなく、むしろ、添付された請求項によって示される。請求項と同等である意味および範囲に含まれるすべての変化が、本発明に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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