(57)【要約】      （修正有）【課題】白髪又は白斑の予防又は治療に有用な、メラニン合成促進組成物の提供。【解決手段】化学構造式１〜７で表されるリグナンを有効成分とするメラニン合成促進組成物。前記リグナンがモクレン属の植物から抽出したエキスであり、前記エキスのヘキサン画分又は酢酸エチル画分である組成物。2019026605.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグナンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とするメラニン合成促進組成物。
【請求項２】
前記リグナンは、下記の化学構造式１〜化学構造式７のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のメラニン合成促進組成物。
【化３】
2019026605.tif 000004
【請求項３】
前記リグナンは、モクレン属の植物から抽出したエキスであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のメラニン合成促進組成物。
【請求項４】
前記リグナンは、前記エキスをさらにヘキサン画分又は酢酸エチル画分したものであることを特徴とする請求項３に記載のメラニン合成促進組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの合成を促進させる組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラニンは、皮膚や毛球などの内部でメラノサイト（メラニン細胞）によって産生される色素である。このメラニンに関しては、皮膚内で過剰に産生された場合には、シミやソバカスなどの色素沈着の原因となることが知られている。従来においては、シミやソバカスなどの色素沈着の予防や治療を行うために、メラニンの合成を抑制する組成物の研究・開発が活発に行われている（たとえば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−９７９４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、メラノサイトにおけるメラニン合成能の低下や欠落などによって皮膚や毛球などでメラニンが良好に産生されない場合には、白斑や白髪の原因となることが知られている。
【０００５】
しかしながら、白斑に対しては、紫外線照射療法が臨床応用されてはいるものの、治療後にまだら模様になることや治療範囲が狭いことなどの種々の問題があり、より臨床に適合した白斑治療法の確立が望まれている。また、白髪に対しては、カラーリング剤で染めることがほとんどで、予防や治療を行うことが成されていないのが現状である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、白髪や白斑の予防や治療を目的として鋭意研究を重ねたところ、メラニンの合成を促進させる組成物に関する本発明に至ったのである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、リグナンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とするメラニン合成促進組成物を提供するものである。
【０００８】
特に、前記リグナンは、下記の化学構造式１〜化学構造式７のいずれかであること、また、モクレン属の植物から抽出したエキスであること、さらには、前記エキスをさらにヘキサン画分又は酢酸エチル画分したものであることにも特徴を有するメラニン合成促進組成物を提供するものである。
【０００９】
【化１】
2019026605.tif 000002
【発明の効果】
【００１０】
そして、本発明では、以下に記載する効果を奏する。
【００１１】
すなわち、本発明では、メラニンの合成を促進させることができ、白髪や白斑のなどのメラニン合成能の低下や欠落などに起因する症状の予防や治療に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例１の内容を示す説明図。
【図２】実験例２の結果を示すグラフ。
【図３】実験例３の内容を示す説明図。
【図４】実験例４の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の実施形態を具体的に説明する。なお、以下の説明は一実施例であり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１４】
本発明者らは、白斑や白髪の予防や治療を目的として鋭意研究を重ねたところ、以下に説明するように、辛夷メタノールエキス、さらに辛夷メタノールエキスから調製した酢酸エチル画分、酢酸エチル画分から得られたリグナン類が、メラニン合成促進作用を有することを見出した。
【００１５】
ここで、辛夷（シンイ、生薬ラテン名Magnoliae Flos）は、モクレン科（Magnoliaceae）のタムシバMagnolia salicifolia Maximowicz（学名）、コブシMagnolia kobus De Candolle（学名）、Magnolia biondii Pampanini（学名）、Magnolia sprengeri Pampanini（学名）又はハクモクレンMagnolia heptapeta Dandy（学名）のつぼみである。
【００１６】
［実験例１］
まず、辛夷を用いて、辛夷メタノールエキスを調整し、その辛夷メタノールエキスを分画することによりヘキサン画分、酢酸エチル画分、n-ブタノール画分を作製した。
【００１７】
（１）試験方法
辛夷粉末500 gをメタノールで超音波抽出した。その抽出液を濾過し、得られた抽出液を減圧下溶媒留去し、メタノール抽出エキス（75.0 g、収率 15.0%）を得た。
【００１８】
また、得られたメタノール抽出エキスをヘキサン、酢酸エチル、n-ブタノールで分配抽出し、ヘキサン画分 （10.4 g、2.08%）、酢酸エチル画分（35.0 g、7.00%）及びn-ブタノール画分（28.7 g、5.74%）を得た（図１）。
【００１９】
［実験例２］
次に、メラノーマ培養細胞を用いて辛夷メタノールエキス及び辛夷メタノールエキスを分画することにより得られるヘキサン画分、酢酸エチル画分、n-ブタノール画分のメラニン合成促進効果の評価を行った。
【００２０】
（１）試験方法
マウス由来のメラノーマ細胞B16-F1を用いて、辛夷メタノールエキス及び辛夷メタノールエキスを分画することにより得られるヘキサン画分、酢酸エチル画分、n-ブタノール画分のメラニン合成促進作用を調べた。
【００２１】
（１−１）細胞の培養方法と各検体の処理方法
マウスメラノーマ細胞B16-F1の培養は、10％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を使用した。各細胞を24ウェルプレートに2 × 104個／ウェルで播種し、37℃、5％ CO2下で培養した。24時間後、培地に各検体を添加した。48時間後、新しい培地に交換し、再度各検体を添加し、24時間培養した。また、ポジティブコントロールとしてα-メラニン細胞刺激ホルモン（α-MSH）を用いた。
【００２２】
（１−２）細胞中のメラニン量測定法
上記のように培養後、培地を除去し、ウェル中に1N NaOHを120μL加え細胞を溶解した。細胞溶解液を80℃、30分加熱し、メラニンを溶解させた。その後、得られた細胞溶解液を96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（415nm）を測定することでメラニン合成能を評価した。各検体のメラニン産生量はコントロール（検体非処理）群の吸光度の平均を１とした倍率で算出した。
【００２３】
（２）結果
図２に示すように、コントロール群と比べて、辛夷メタノールエキスは、メラニン合成を誘導していることが分かる。また同様な結果がヒトメラノーマHMV-IIでも確認された。
【００２４】
さらに辛夷メタノールエキスを分画することにより得られるヘキサン画分、酢酸エチル画分、n-ブタノール画分のメラニン合成促進能を比較したところ、ヘキサン画分や酢酸エチル画分がメラニン合成を誘導し、特に、酢酸エチル画分が顕著にメラニン合成を誘導した。
【００２５】
以上の結果から、辛夷メタノールエキス及び辛夷メタノールエキスを分画することにより得られるヘキサン画分や酢酸エチル画分は、メラニン合成誘導能を持つことが明らかになった。
【００２６】
［実験例３］
次に、酢酸エチル画分からリグナン類の単離・同定を行った。
【００２７】
（１）試験方法
酢酸エチル画分（29.0 g）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン‐酢酸エチル （10:1 → 5:1 → 2:1、v/v）→ クロロホルム‐メタノール（10:1 → 5:1、v/v）→ メタノール］で分画し、MK-1 （7.50 g、1.81%）、 MK-2（7.50 g、1.81%）、MK-3（7.50 g、1.81%）、MK-4（9.50 g、2.29%）、MK-5（14.8 g、3.57%）、MK-6（3.50 g、0.84%）を得た。
【００２８】
MK-4（5.00 g）を逆相ODSカラムクロマトグラフィー［メタノール‐水（3:2、v/v）］により分離し、MK-41（3.10 g、1.42%）、及び MK-42 （0.45 g、0.21%）を得た。
【００２９】
MK-42（0.23 g）から、HPLC ［移動相：アセトニトリル‐水（50：50、v/v）、流速：5 mL/min、カラム：TSKgel ODS-100V（5μm、250 × 10 mm i.d.）、波長：280 nm］により (+)-kobusin（1、87.6 mg、0.080%）（参考文献１：Nat. Prod. Sci., 19 (2), 160-165 (2013)）、(+)-aschantin（2、47.5 mg、0.043%）（参考文献１）及び (+)-fargesin（3、22.6 mg、0.021%）（参考文献１、参考文献２：J. Agric. Food Chem., 56, 2655-2659 (2008)） が単離された。
【００３０】
また、MK-5（5.00 g）を逆相ODSカラムクロマトグラフィー［メタノール‐水 （4:3、 v/v）］により分離し、MK-53 （3.3 g、2.36%）を得た。
【００３１】
MK-53（0.26 g）から、HPLC［移動相：アセトニトリル‐水（45:55、v/v）、 流速：5 mL/min、カラム：TSKgel ODS-100V（5μm、250 × 10 mm i.d.）、波長：280 nm］により (+)-eudesmin（4、29.8 mg、0.27%）（参考文献３：Biotechnol. Bioprocess Eng., 15, 400-406 (2010)）、(+)-magnolin（5、139.4 mg、1.27%）（参考文献３）、(+)-yangambin（6、26.8 mg、0.24%）（参考文献４：北海道大学農学部演習林研究報告, 53 (1), 1-28 (1996)、参考文献５：Helv. Chem. Acta, 91 (12), 2361-2366 (2008)）及び (+)-epimagnolin A（7、4.5 mg、0.041%）（参考文献３）が単離された（図３）。
【００３２】
既知化合物については、質量分析（MS）及び核磁気共鳴（NMR）などのスペクトルデータ及び旋光度を文献値と比較することにより同定した。
【００３３】
その結果、酢酸エチル画分から下記の化学構造式１〜７で示される7種のリグナン類(+)-kobusin、(+)-aschantin、(+)-fargesin、(+)-eudesmin、(+)-magnolin、 (+)-yangambin、(+)-epimagnolin Aを単離・同定した。
【００３４】
【化２】
2019026605.tif 000003
【００３５】
［実験例４］
次に、酢酸エチル画分から単離・同定されたリグナン類のメラニン合成促進効果の評価を行った。
【００３６】
（１）試験方法
マウス由来のメラノーマ細胞B16-F1を用いて、酢酸エチル画分から単離・同定されたリグナン類1〜7のメラニン合成促進作用を調べた。
【００３７】
（１−１）細胞の培養方法と各検体の処理方法
実験例２の（１−１）と同じ。
【００３８】
（１−２）細胞中のメラニン量測定法
実験例２の（１−２）と同じ。
【００３９】
（２）結果
図４に示すように、コントロール群と比べて、化学構造式1〜7で示されるリグナン類は、メラニン合成を誘導していることが分かる。
【００４０】
一番収率の高かった(+)-magnolin（5）が、もっともメラニン合成能が強く、同様に(+)-kobusin（1）、(+)-aschantin（2）も強いメラニン合成能を示した。(+)-magnolin（5）はヒトメラノーマHMV-IIにおいてもメラニン合成能が確認された。
【００４１】
以上の結果から、酢酸エチル画分から単離されたリグナン類1〜7は、メラニン合成誘導能を持つことが明らかになった。
【００４２】
以上に説明したように、モクレン属の植物である辛夷から抽出したエキスはメラニン合成誘導能を有しており、そのエキスのヘキサン画分又は酢酸エチル画分はメラニン合成誘導能に優れ、その分析の結果、少なくとも化学構造式１〜７で示されるリグナンが特にメラニン合成誘導能に優れることがわかった。
【００４３】
そのため、リグナン、特に、化学構造式１〜化学構造式７のいずれかであること、また、モクレン属の植物から抽出したエキスであること、さらには、前記エキスをさらにヘキサン画分又は酢酸エチル画分したものは、メラニンの合成を促進させることができ、白髪や白斑のなどのメラニン合成能の低下や欠落などに起因する症状の予防や治療に応用することができる。
【図１】
2019026605.tif 000006
【図２】
2019026605.tif 000007
【図３】
2019026605.tif 000008
【図４】
2019026605.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月13日(2018.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグナンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させるメラニン合成促進組成物の製造方法において、
辛夷粉末からメタノールで抽出したエキスを酢酸エチルで分画することで酢酸エチル画分に含有される下記の化学構造式１，２，４，６，７のいずれかを含むメラニン合成促進組成物の製造方法。
【化３】
2019026605.tif 000010
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
特に、辛夷粉末からメタノールで抽出したエキスを酢酸エチルで分画することで酢酸エチル画分に含有される下記の化学構造式１，２，４，６，７のいずれかを含むメラニン合成促進組成物の製造方法を提供するものである。