(57)【要約】      （修正有）【課題】患者特有のドライバー変異を特定するための方法を提供する。【解決手段】癌患者の異常なシグナル伝達経路を引き起こす変異を同定する方法であって、ａ）患者の試料または患者の腫瘍分子プロファイリングデータを取得することと、ｂ）前記患者に存在する試験遺伝子変異を含む発現ベクターを作製することと、ｃ）前記試験遺伝子に対応する野生型遺伝子を含む対照の発現コンストラクトを作製することと、ｄ）蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）をコードする発現ベクターを作製することと、ｅ）前記発現ベクタ―をアッセイ細胞へトランスフェクトすることと、ｆ）前記変異試験遺伝子または野生型遺伝子と前記ＦＴＲの発現を可能にするのに十分な時間で前記アッセイ細胞をインキュベートすることと、ｇ）前記細胞内の前記ＦＴＲの細胞内局在を決定することと、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者からの試料中の異常なシグナル伝達経路を引き起こす変異を同定する方法であって
ａ）  患者の試料または患者の腫瘍分子プロファイリングデータを取得することと、
ｂ）  前記患者に存在する試験遺伝子変異を含む発現ベクターを作製することと、
ｃ）  前記試験遺伝子に対応する野生型遺伝子を含む対照の発現コンストラクトを作製することと、
ｄ）  蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）をコードする発現ベクターを作製することと、
ｅ）  前記変異試験遺伝子発現バクタ―または野生型発現コンストラクトの１つと、前記ＦＴＲをコードする発現バクタ―とをアッセイ細胞をトランスフェクトすることと、
ｆ）  前記変異試験遺伝子または野生型遺伝子と前記ＦＴＲの発現を可能にするのに十分な時間で前記アッセイ細胞をインキュベートすることと、
ｇ）前記細胞内の前記ＦＴＲの細胞内局在を決定することと、
を含み、
試験および対照のアッセイにおける異なる細胞内局在の前記ＦＴＲの存在が、前記試験遺伝子変異が前記ＦＴＲの標的遺伝子の異常なトランスロケーションを引き起こすことを示し、前記試験遺伝子変異が異常なシグナル伝達経路を引き起こすことを示す、方法。
【請求項２】
前記細胞内局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択されるか、または前記腫瘍分子プロファイリングデータがシーケンシングによって取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現ベクターのおよび／または前記対照の発現コンストラクトが２本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ベクターおよび／または前記対照の発現コンストラクトのプロモーターが構成的プロモーターであるか、または誘導性プロモーターであり、好ましくは
前記トランスフェクトされた細胞内での前記発現コンストラクトおよび／または発現ベクターの発現を誘導して前記患者からの前記試験遺伝子および前記アレイ中の各遺伝子座用の前記ＦＴＲの遺伝子産物を取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者の前記試験遺伝子の発現コンストラクトがプロモーターに作動可能に連結された特異的に増幅されたｃＤＮＡを含み、前記増幅されたｃＤＮＡが
ａ）前記生体試料から取得された複数のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを作製することと、
ｂ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な一対のプライマーを用いて前記ｃＤＮＡライブラリーの特異的なｃＤＮＡを増幅することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アッセイ細胞がＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９および癌患者の細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
異常なシグナル伝達変異タンパク質の候補が、患者特有のドライバー変異によって同定される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
患者特有のドライバー変異を特定するための方法を提供する。提供する方法は、癌患者の生体試料中の、異常なシグナル伝達経路に関連する患者由来の特異的マーカーを特定する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの様々な疾患状態にあると診断された患者の臨床治療プロトコルおよび予後は、原因となっている分子機構の正確な診断だけでなく、全てのドライバー変異の特定ならびに自己分泌およびパラ分泌効果に依存して著しく異なり得る。加えて、表現型的（病理学的）に類似し得る多くの疾患は、非常に異なる根本的な原因を有し得る。癌は、例えば、非常に多様であり、そのため、正確な診断および層別化した治療法が効果的な治療に重要である。癌と診断された患者では、細胞の増殖および分化を制御する、特に細胞増殖と細胞死の間のバランスを制御するシグナル伝達経路の多くが、異常な様式で調節されている。これらの経路の多くは、「ドライバー変異」と呼ばれる、重要なタンパク質における変異の蓄積により、または、腫瘍細胞もしくはストローマ細胞による増殖因子およびサイトカインの分泌ならびにこれらのシグナル伝達経路を活性化する腫瘍細胞膜上の受容体の再活性化により活性化される。これらの変異は広範囲なプロセスを包含するが、全てが発癌活性を細胞に付与する能力を共有する。したがって、特異的阻害薬によるこのようなドライバー変異の標的化（「標的化治療」）が癌治療における主な目標である。例えば、肺癌は、原因となっている多くの関与因子（例えば、ＥＧＦＲ変異およびＡＬＫ−ＥＬＭ４トランスロケーション）を有し得、その各々が異なる治療法を必要とする。同様に、乳癌の治療は、原因となっている分子プロファイル（ＥＲ／ＰＲ発現またはＨＥＲ２増幅など）によって決定される。異なる経路間の相互作用は非常に複雑であり、腫瘍特異的で、ほとんどの場合、患者特異的である。患者特有の腫瘍の原因となっているシグナル伝達機構の完全な理解は、細胞分裂を阻害して細胞死を誘導するために異常なシグナル伝達経路を遮断することにより有効になる可能性が高い、標的治療薬の最適な組み合わせを決定するのに必要とされる。個人の間での腫瘍の不均一性（遺伝子多型）は、薬効だけでなく、望ましくないオフターゲット副作用の可能性および最終的には生存率に深刻な影響を与える。
【０００３】
ヒトでの約３２０の既知のシグナル伝達経路の中で、約５０のシグナル伝達経路が直接的または間接的に腫瘍の増殖および進行に関与している。生存能力のある試験細胞で、様々なシグナル伝達タンパク質（例えば、膜局在および／または細胞内の受容体ならびにシグナル伝達タンパク質など）の活性化を監視することにより患者の腫瘍活性化シグナル伝達経路のプロファイルの特定を可能にするプラットフォームに対する、未だ満たされていない必要性が存在する。
【０００４】
癌の複雑さおよび不均一性により、定性的および定量的な方法で腫瘍シグナル伝達経路を反映し層別化療法の正確な選択を可能にする、より高感度な識別診断方法が求められている。現在の最新技術には、薬物の有効性および毒性を予測するために用いることができる個々のマーカーはほとんどない。さらに、標的療法の選択のための全ゲノムシーケンシング（次世代シーケンシング）の適合性は、腫瘍内に蓄積する変異の巨大プールおよび特定されたドライバー変異の限られたレパートリーにより制限されている。加えて、全ゲノムシーケンシングは、腫瘍増殖における主要なドライバーである自己分泌およびパラ分泌刺激を明らかにしない。
【０００５】
したがって、当技術分野において、コスト的にも時間的にも有効な患者の特定診断プラットフォームを提供し、それらの異常な活性に基づいて患者特有のドライバー変異および自己−パラ分泌変異を特異的に特定する能力を有し、その結果、特定の、個別化および最適化された治療を予測することができる、方法およびシステムに対する未だ満たされていない必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試験細胞において、ドライバー変異の機能に関連しているシグナル伝達経路の活性変化を特定することによって、患者特有のドライバー変異を特定するための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態によれば、シグナル伝達経路の活性変化は、ドライバー変異の機能に関連しているレポーター遺伝子の細胞内局在の変化を特定することによって決定される。いくつかの実施形態では、患者由来の特異的マーカー（ＰＤＭ）遺伝子を生体試料から取得し、対応する蛍光トランスロケーションレポーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＦＴＲ））遺伝子の細胞内トランスロケーションに対するそれらの効果を、生存能力のある試験細胞において試験し、試験したＰＤＭが変異しているか否かを決定する。いくつかの実施形態では、患者由来の特異的マーカーを取得し、蛍光レポーターと融合して患者由来のレポーター（ＰＤＲ）を作製し、ＰＤＲの細胞内トランスロケーションを生存能力のある試験細胞で試験し、試験したＰＤＲが変異しているか否かを決定する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で開示する方法およびシステムは、さらに、一般的に疾患と関連する細胞内経路の決定、および異常に影響されているシグナル伝達経路の特定成分の決定を可能にする。本明細書に開示する方法およびシステムによって提供される分析は、さらに、このように特定された患者特有のドライバー変異に適合される最適な個別化治療の決定および／または調整を可能にする。
【発明の効果】
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、癌に関与する患者特有のドライバー変異を特定するための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ドライバー変異は発癌性ドライバー変異である。いくつかの実施形態では、本方法およびシステムは、特定の癌およびその進行に対する様々なパラ分泌および自己分泌因子の効果を試験するための予測的プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、本方法およびシステムは、患者特有の細胞経路に対する試験薬または薬物の組み合わせの効果を決定するための予測的プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、本方法およびシステムは、患者に対して特別に調整された最適化治療を決定するための予測的プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、細胞内および細胞間のシグナル伝達経路に対する自己分泌ならびにパラ分泌作用の特定を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、先天性および後天性薬剤耐性機構の検出ならびに／または予測を可能にする。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、細胞内局在の変化がドライバー変異によって影響されるレポーターマーカー遺伝子の細胞内局在の変化を特定することによる、患者特有のドライバー変異を特定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者由来のマーカー（ＰＤＭ）は、患者の生体試料から取得され、レポーターキメラ遺伝子（レポーター遺伝子部分と標的遺伝子部分のキメラ産物を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ））の存在下で、生存能力のある試験細胞で発現するように操作（遺伝子工学処理）される。その後、試験細胞におけるＦＴＲの細胞内局在を決定する。試験ＰＤＭの存在下でのＦＴＲの細胞内局在が、通常の条件下（すなわち、対応するＷＴ ＰＤＭの存在下）でのＦＴＲの細胞内局在とおよび／または他の既知の参照物質と比較して異なる場合には、試験ＰＤＭが変異していることを示す。したがって、本明細書に開示する方法を用いて、患者特有のＰＤＭをドライバー変異として特定／特徴付けできる。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、ＰＤＲ（すなわち、レポーター遺伝子に連結／付着／融合されたＰＤＭ）を作製し、ＦＴＲを使用することなく、その細胞内局在を追跡することによって、ＰＤＭを直接試験できる。さらに、このようなドライバー変異を決定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化シグナル伝達経路を特定できる。さらに、これにより、特定の患者の腫瘍を根絶し、耐性機構を回避するのに必要な標的療法の治療を正確にかつ特異的に選択することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍組織から取得される生体試料に基づく、個別化された癌治療のための新規な診断プラットフォームを有利に提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化した生きている（生存能力のある）細胞でのＦＴＲに対する活性化ドライバー変異の効果、具体的には、腫瘍発生に関与することが知られているシグナル伝達経路を活性化する能力、を監視することにより、このような活性化ドライバー変異を感知できる細胞ベースアッセイである。いくつかの実施形態では、これは、蛍光レポータータンパク質（ＦＴＲ）を含む細胞内トランスロケーション事象ならびにタンパク質間相互作用（すなわち、細胞膜、サイトゾル、エンドソーム、および核などの様々な細胞内局在へのトランスロケーション／様々な細胞内局在間のトランスロケーション）を検出することにより行われ得る。したがって、本明細書に開示する方法およびシステムは、第１選択の治療前にそのような細胞内事象の特定を可能にし、それによって効果的な治療計画を推進できる。さらに、腫瘍耐性細胞の増殖に対する、薬物治療による刺激が防止され得る。
【００１１】
したがって、いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによりシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供し、アレイが癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する工程。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用の特異的レポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）を含む。
【００１３】
さらなる実施形態では、本方法は、さらに、（ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物およびベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；および（ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；癌患者の生体試料由来のｃＤＮＡおよび対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の間の異なる結果が患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在性および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される。いくつかの実施形態では、局在には、サイトゾル、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在が含まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。さらなる実施形態では、ＦＴＲのレポーター遺伝子部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１をコードする。
【００１６】
いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、発現構築物の第１および／または第２のセットは、２本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。他の実施形態では、発現構築物の第１および／または第２のセットのプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現構築物の第１および／または第２のセットのプロモーターは、構成的プロモーターである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、腫瘍からのｃＤＮＡの第１のセットの遺伝子産物およびアレイ中の各遺伝子座用のＦＴＲを取得するために、トランスフェクト細胞で発現構築物および／または発現ベクターの発現を誘導することを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、増幅ｃＤＮＡの発現構築物は、さらに、ＩＲＥＳおよび第２のレポーター遺伝子を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、トランスフェクション試薬の存在下で、固体支持体上のＤＮＡ構築物を乾燥させることを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）腫瘍細胞から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、工程（ｃ）の増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それにより腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）を含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、本方法は、さらに、（ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のコトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；および（ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；腫瘍細胞由来のｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達タンパク質の候補として腫瘍細胞からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は癌患者の腫瘍試料由来であり、前記腫瘍試料は、生検、手術後の腫瘍切片、血液試料、気管支肺胞洗浄、および骨髄から選択される。
【００２５】
さらなる実施形態では、本方法により特定される異常なシグナル伝達タンパク質の候補は、患者特有のドライバー変異である。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）アドレス可能なアレイにおいて、担体に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｆ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットをアッセイ細胞に添加する工程であって；発現構築物の各々がアッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アドレス可能な異なる遺伝子座にあるアッセイ細胞へ添加され；
それにより癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターをアッセイ細胞に添加する工程を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞でのＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較することを含み；その際、生体試料由来のｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との間の異なる結果を、患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞での異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程のうちの１つまたは複数を含む方法を提供する：
ａ）腫瘍細胞から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質のポリヌクレオチド（遺伝子または遺伝子部分）に相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、（ｃ）の増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）キメラ遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程；
ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞内で発現するＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
腫瘍由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００３１】
いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子の属性は、蛍光タンパク質の局在性および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲのレポーター遺伝子部分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１をコードするか、またはそれらから選択される。
【００３４】
追加の実施形態によると、局在には、サイトゾル、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在が含まれる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１および／または第２の発現構築物は、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。さらなる実施形態では、第１および／または第２の発現構築物のプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現構築物のプロモーターは構成的プロモーターである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、増幅ｃＤＮＡの発現構築物は、さらに、ＩＲＥＳおよび第２のレポーター遺伝子を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲの発現ベクターは、環状発現ベクターである。さらなる実施形態では、発現ベクターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、工程ｇ）は工程ｅ）および／または工程ｆ）に先行し、その場合アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加の前に各遺伝子座に添加される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、トランスフェクション試薬の存在下で、固体支持体上でＤＮＡ構築物を乾燥させることを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、アッセイ細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９および患者の細胞から選択される。
【００４１】
さらなる実施形態によれば、本方法により特定される異常なタンパク質の候補は、患者特有のドライバー変異である。
【００４２】
さらなる実施形態では、細胞は癌患者の生体試料から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、生検、術後の腫瘍切片、血液試料、気管支肺胞洗浄、および骨髄から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、腫瘍からのｃＤＮＡの第１のセットの遺伝子産物およびアレイ中の各遺伝子座用のＦＴＲを取得するために、トランスフェクト細胞で構築物および／または発現ベクターを発現させることを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの個々のｃＤＮＡ試料を増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および並行して対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子に連結された標的遺伝子を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程；
ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞内のレポーター遺伝子の少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
生体試料由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞間との間の異なる結果が患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００４５】
いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞、組織、生検、および体液から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、細胞タンパク質は、癌状態に関連し得る任意の種類の細胞タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、細胞タンパク質は、様々な細胞プロセスに関与し得る。いくつかの実施形態では、細胞タンパク質は、シグナル伝達経路に関与するタンパク質、細胞骨格タンパク質、酵素、翻訳に関与するタンパク質、細胞周期調節に関与するタンパク質、転写に関与するタンパク質、および代謝に関与するタンパク質など、またはそれらの組み合わせから選択できるが、これらに限定されない。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、さらに、癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するためのキットを提供する。さらなる実施形態では、患者の腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】いくつかの実施形態による、患者由来のマーカーを取得し、ドライバー変異を特定するための方法の工程の概略ブロック図である。
【図２】いくつかの実施形態による、患者特有のドライバー変異の特定を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。
【図３Ａ】野生型（ＫＲＡＳ ＷＴ）または変異型（ＫＲＡＳ変異体（Ｇ１３Ｄ））のＫＲａｓをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図３Ｂ】ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図４Ａ】野生型（ＫＲＡＳ ＷＴ）または変異型（ＫＲＡＳ変異体（Ｇ１３Ｄ））のＫＲａｓをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＦ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＦ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図４Ｂ】ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＦ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図５Ａ】野生型（ＫＲＡＳ ＷＴ）または変異型（ＫＲＡＳ変異体（Ｇ１３Ｄ））のＫＲａｓをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図５Ｂ】ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図６Ａ】野生型（ＫＲＡＳ ＷＴ）または変異型（ＫＲＡＳ変異体（Ｇ１３Ｄ））のＫＲａｓをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＡＫＴ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図６Ｂ】ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図７Ａ】野生型（ＡＫＴ２ ＷＴ）または変異型（ＡＫＴ２変異体（Ｒ２５１Ｗ））のＡＫＴ２をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＡＫＴ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図７Ｂ】ＰＤＭ（ＡＫＴ２）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図８Ａ】野生型（ＡＫＴ２ ＷＴ）または変異型（ＡＫＴ２変異体（Ｒ２５１Ｗ））のＡＫＴ２をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＲｅｌＡ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＲｅｌＡ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図８Ｂ】ＰＤＭ（ＡＫＴ２）および対応するＦＴＲ（ＲｅｌＡ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図９Ａ】野生型（ＡＫＴ３ ＷＴ）または変異型（ＡＫＴ３変異体（Ｒ４６５Ｑ））のＡＫＴ３をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＡＫＴ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図９Ｂ】ＰＤＭ（ＡＫＴ３）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１０Ａ】野生型（ＡＫＴ３ ＷＴ）または変異型（ＡＫＴ３変異体（Ｒ４６５Ｑ））のＡＫＴ３をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＲｅｌＡ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）細胞の蛍光顕微鏡画像に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＲｅｌＡ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１０Ｂ】ＰＤＭ（ＡＫＴ３）および対応するＦＴＲ（ＲｅｌＡ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１１Ａ】野生型（ＳＭＡＤ２ ＷＴ）または変異型（ＳＭＡＤ２変異体（Ｔ６７Ａ））のＳＭＡＤ２をコードする遺伝子を試験細胞で発現させ、細胞質および核における患者由来のレポーター（ＰＤＲ）タンパク質として機能するＳＭＡＤ２タンパク質の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のタンパク質の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１１Ｂ】患者由来のレポーター（ＰＤＲ）であるＳＭＡＤ２によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１２Ａ】野生型（ＥＧＦＲ１ ＷＴ）または変異型（ＥＧＦＲ１変異体（Ａ３４３Ｖ））のＥＧＦＲ１をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１２Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ１）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１３Ａ】野生型（ＥＧＦＲ１ ＷＴ）または変異型（ＥＧＦＲ１変異体（Ａ３４３Ｖ））のＥＧＦＲ１をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１３Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ１）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ１ａ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１４Ａ】野生型（ＥＧＦＲ１ ＷＴ）または変異型（ＥＧＦＲ１変異体（Ａ３４３Ｖ））のＥＧＦＲ１をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（Ｐ３８ｂ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（Ｐ３８ｂ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１４Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ１）および対応するＦＴＲ（Ｐ３８ｂ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１５Ａ】野生型（ＥＧＦＲ１ ＷＴ）または変異型（ＥＧＦＲ１変異体（Ａ３４３Ｖ））のＥＧＦＲ１をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＳＴＡＴ３）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１５Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ１）および対応するＦＴＲ（ＳＴＡＴ３）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１６Ａ】野生型（ＥＧＦＲ１ ＷＴ）または変異型（ＥＧＦＲ１変異体（Ａ３４３Ｖ））のＥＧＦＲ１をコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＡＫＴ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１６Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ１）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１７Ａ】野生型（ＢＲＡＦ ＷＴ）または変異型（ＢＲＡＦ変異体Ｇ４６４ＶまたはＶ６００ＥまたはＩ５５４Ｔ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１７Ｂ】ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１８Ａ】野生型（ＢＲＡＦ  ＷＴ）または変異型（ＢＲＡＦ変異体Ｇ４６４ＶまたはＶ６００ＥまたはＩ５５４Ｔ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＦ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＦ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す
【図１８Ｂ】ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＦ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図１９Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異型（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ）または３重変異型（ＥＧＦＲ３重変異体Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＲｅｌＡ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＲｅｌＡ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図１９Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＲｅｌＡ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図２０Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異型（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ）または３重変異型（ＥＧＦＲ３重変異体Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＡＫＴ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図２０Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図２１Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異型（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ）または３重変異型（ＥＧＦＲ３重変異体Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図２１Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図２２Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異型（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ）または３重変異型（ＥＧＦＲ３重変異体Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（Ｐ３８ｂ−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（Ｐ３８ｂ）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図２２Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（Ｐ３８ｂ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【図２３Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異型（ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ）または３重変異型（ＥＧＦＲ３重変異体Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子を、レポータータンパク質（ＦＴＲ）と共に試験細胞で発現させ、細胞質および核におけるＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量を細胞の蛍光顕微鏡画像（トランスフェクション後３０時間固定した）に基づいて定量化した、細胞ベースアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）中のＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度の間の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。測定した細胞数（ｎ）を各条件について示す。
【図２３Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けるシグナル伝達経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路活性における変化を特定することによって、患者特有のドライバー変異を特定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路活性における変化は、ドライバー変異によって影響されるレポーター遺伝子の細胞内局在の変化を特定することによって決定される。いくつかの実施形態では、患者由来マーカー（ＰＤＭ）が患者の生体試料から取得され、レポーターキメラ遺伝子（ＦＴＲ）の存在下で、試験細胞で発現するように操作（遺伝子工学処理）される。いくつかの実施形態では、追加的または代替的に、患者特有のマーカーを蛍光レポーターに融合して、患者由来レポーター（ＰＤＲ）を作製する。その後、試験細胞におけるＦＴＲ（および／またはＰＤＲ、該当する場合）の細胞内局在を決定する。試験ＰＤＭ（および／またはＰＤＲ、該当する場合）の存在下でのＦＴＲの細胞内局在が、通常条件下（すなわち、対応するＷＴ  ＰＤＭの存在下）でのＦＴＲ（および／またはＰＤＲ、該当する場合）の細胞内局在と、または他の所定の参照物質と比較して異なる場合には、試験ＰＤＭ（またはＰＤＲ）が変異していることを示す。したがって、本明細書に開示される方法を用いて、患者特有のＰＤＭはドライバー変異として特定／特徴付けできる。さらに、このようなドライバー変異を決定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化シグナル伝達経路を特定できる。さらに、これにより、腫瘍を根絶し、特定の患者の耐性機構を回避するのに必要な標的療法治療を正確にかつ特異的に選択することが可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、生体試料において試験されるシグナル伝達システムの詳細な解析を提供し、それに関連する複数の経路の活性レベルを正確に監視できる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、癌シグナル伝達経路に関与するタンパク質が様々な環境要因に応答して位置を変え、したがって、このようなシグナル伝達経路によって影響を受けるキメラレポーター遺伝子の局在化を試験することにより、患者特有のドライバー変異を特定できる、という考えに基づいている。いくつかの実施形態によれば、発癌性変異に関する大量の情報はあるが、本明細書に開示するように、同一患者の同一の生体試料中の複数の変異事象、ならびに未だ特定されていない変異を特定し、かつこのような変異の発癌活性を測定するための堅牢な方法およびシステムはこれまで利用できなかったため、本明細書に開示する方法およびシステムは有利である。例えば、現在使用されている治療法において、ｃＫｉｔ変異を保有する消化管間質腫瘍患者はグリベックで治療されている。しかし、一般的な耐性機構がｃＫｉｔ自体の中の２次変異を介して生じるか、または下流の経路で生じると、このような治療は無効になる。同様に、ＥＧＦＲ癌遺伝子が過剰発現している大腸癌患者は、ＫＲＡＳ癌タンパク質の正常型の存在下でのみセツキシマブ治療の対象となる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法およびシステムは、活性化シグナル伝達経路を特定するためだけでなく、発癌活性を特定するために、患者の腫瘍のエミュレーションを可能にする。さらに、本方法を用いて、抗癌治療に対する腫瘍感受性／抵抗性を予測できる。いくつかの実施形態では、これは、トランスフェクトした試験細胞を患者の体液（血漿、胸水、または間質液などの）と共にインキュベートすることによって行われる。
【００５２】
本明細書で言及する用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、互換的に使用され得る。これらの用語は、独立した断片の形態での、またはより大きな構築物、直鎖状もしくは分岐鎖状、一本鎖、二本鎖、三本鎖、もしくはそれらのハイブリッドの構成要素としてのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、およびそれらの修飾型のポリマーを対象にしている。この用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列またはセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、もしくはそのハイブリッドまたは例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得るが、これらに限定されない。したがって、本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」の配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指すことを意味する。これらの用語には、さらに、天然に存在する塩基、糖、およびヌクレオシド間共有結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれの天然に存在する部分と同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「構築物」は、コード配列（すなわち、最終生成物をコードする配列）、調節配列、非コード配列、もしくはそれらの任意の組み合わせを含み得る１つまたは複数の核酸配列を含み得る人工的に構築したまたは単離した核酸分子を指す。構築物という用語は、例えばベクターを含むが、これに限定されると解釈されるべきではない。
【００５４】
用語「発現ベクター」は、標的細胞で異種核酸断片（ＤＮＡなど）を組み込み、かつ発現させる能力を有するベクターを指す。言い換えると、発現ベクターは、転写可能な核酸配列／断片を含む。多くのウイルス、原核生物および真核生物の発現ベクターが公知であり、かつ／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００５５】
本明細書で使用する用語「上流」および「下流」は、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などのヌクレオチド配列での相対的な位置を指す。周知のとおり、ヌクレオチド配列は、いわゆるヌクレオチド骨格の糖（デオキシリボースまたはリボース）の環上の炭素について５'末端および３'末端を有する。したがって、ヌクレオチド配列上の位置に対して、下流という用語は、配列の３'末端に向かう領域に関する。上流という用語は、鎖の５'末端に向かう領域に関する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「プロモーターエレメント」、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、一般的にコード配列の５'末端に位置し（すなわち、コード配列に先行し、コード配列の上流に位置する）、コード配列の発現を活性化するスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コード配列が活性化される場合は、それは転写されると言われる。転写は一般的に、コード配列からのＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡなど）の合成を含む。したがって、プロモーターは、転写調節エレメントとして機能し、ｍＲＮＡへのコード配列の転写開始部位も提供する。プロモーターは、その全体が天然の供給源に由来するか、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されるか、または合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。異なるプロモーターが異なる組織または細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、または様々な発現レベルで、遺伝子発現を指示し得ることは、当業者には理解される。ほとんどの時間、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の組織で遺伝子発現を促進するプロモーターは、「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「導入する」および「トランスフェクション」は、互換的に使用され、標的細胞（複数可）への、より具体的には、細胞のサイトゾル、細胞の核、ミトコンドリアの内部空間、および小胞体（ＥＲ）などの、標的細胞（複数可）の膜に囲まれた空間の内部への、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、およびベクターなどの分子の移行または導入を指し得る。例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（２００１）により教示されるような当業者に公知の任意の手段により、分子が標的細胞（複数可）に「導入され」得る。例えば、細胞内に分子を「導入する」手段には、例えば、熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、トランスフェクション試薬（複数可）、およびウイルス媒介移入など、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、導入される核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態であり得る修飾された核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞にトランスフェクトされる前に脱水される。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、発現ベクターなどのベクターに組み込まれる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５８】
本明細書で使用する用語「発現」は、標的細胞における所望の最終生成物分子の産生を指す。最終生成物分子には、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチドもしくはタンパク質など、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００５９】
本明細書で言及する用語「患者」は、癌を有するまたは癌と診断された被験体を指す。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍生検の対象である。
【００６０】
本明細書で言及する用語「生体試料」は、任意の適切な体由来の試料を含むことを指す。試料は、全血、末梢血単核球、白血球、骨髄などの体液試料を含み得る。試料は、様々な細胞および組織を含み得る。試料は生検を含み得る。試料は、固定および／または埋め込まれた組織切片を含み得る。試料は新鮮に抽出されるかまたは凍結され得る。別の実施形態では、試料は血液試料である。別の実施形態では、試料は骨髄試料である。別の実施形態では、被験体からの血液細胞を含む試料を単離および維持するための方法は、平均的な当業者に知られている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体断片およびそれらの誘導体を含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性画分、または細胞が増殖した培地；細胞から単離もしくは抽出した染色体、細胞小器官、または膜；溶液中のもしくは担体に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；指紋、皮膚または髪；それらの断片および誘導体を含み得る。いくつかの実施形態では、生体試料は腫瘍から取得される。
【００６１】
本明細書で言及する用語「患者由来のマーカー」（「ＰＤＭ」）、および「被験体のＰＤＭ」は、被験体の生体試料から単離され、機能アッセイでその活性が決定される遺伝子または遺伝子産物を指す。いくつかの実施形態では、生体試料から取得されるＰＤＭ核酸配列に、５'および／もしくは３'調節エレメントならびに／または追加のレポーター遺伝子が付加される。いくつかの例では、本明細書で使用するＰＤＭは、５’調節エレメント（プロモーター）−ＰＤＭ配列−３’調節エレメント（ＩＲＥＳ）−レポーター遺伝子を含むキメラ核酸配列分子を含む。したがって、このような核酸分子を標的細胞に導入して発現させる場合には、ＰＤＭ遺伝子産物（タンパク質）およびレポーター遺伝子産物（タンパク質）が細胞で発現する。追加的または代替的に、ＩＲＥＳ配列は除くことができ、ＰＤＭ遺伝子産物およびレポーター遺伝子産物を含むキメラタンパク質が細胞内で発現する。このように形成されたキメラタンパク質は、「患者由来レポーター」（「ＰＤＲ」）、または「被験体ＰＤＲ」と呼ばれる。機能アッセイにより試験ＰＤＭが変異していると見出された場合は、それをドライバー変異とみなすことができる。いくつかの実施形態では、用語「対照ＰＤＭ」、「野生型ＰＤＭ」、「対応するＰＤＭ」および「対応する野生型ＰＤＭ」は、対照として使用される、ＰＤＭ遺伝子に対応する野生型（すなわち、変異していない、完全活性のある）遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、野生型ＰＤＭは、患者の生体試料に由来しない。対照ＰＤＭを用いて、被験体のＰＤＭおよび野生型（ｗｔ）ＰＤＭの活性を比較する。
【００６２】
本明細書で言及する場合、用語「蛍光トランスロケーションレポーター」（「ＦＴＲ」）は、キメラレポーター遺伝子および対応する遺伝子産物を指す。レポーター遺伝子部分（蛍光タンパク質など）を含むキメラＦＴＲは、所定の標的（マーカー）遺伝子部分（例えば、細胞シグナル伝達タンパク質、キナーゼ、および酵素など）に連結され、それによって、標的（マーカー）遺伝子の少なくとも１つの属性が、試験ＰＤＭにより影響を受ける（直接的または間接的に）可能性がある。
【００６３】
本明細書で言及する用語「試験細胞」、「標的細胞」および「アッセイ細胞」は、互換的に使用される。これらの用語は、本明細書に記載されるように、ＰＤＭおよび／またはＰＤＲおよび／またはＦＴＲおよび／または任意の対照遺伝子などのポリ核酸分子でトランスフェクトされる、アッセイ細胞を指す。いくつかの実施形態では、試験細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、試験細胞は、初代細胞または細胞株であり得る。別の実施形態では、アッセイ細胞は非癌性細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞は細胞株に由来する。別の実施形態では、アッセイ細胞は、少なくとも１つの癌分泌成長因子に応答する。別の実施形態では、アッセイ細胞は、トランスフェクションに適している。別の実施形態では、アッセイ細胞は、一過性トランスフェクションに適している。別の実施形態では、アッセイ細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の発現が、任意の分子方法によって低減または除去された細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞はＨｅＬａ細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞はＨＥＫ ２９３細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞はＰＣ１２細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞はＵ２ＯＳ細胞である。別の実施形態では、アッセイ細胞は、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などのＮＣＩ６０細胞株である。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は患者由来の細胞である。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は癌患者由来の細胞である。
【００６４】
本明細書で使用する用語「細胞内局在」、「細胞内領域」および「細胞内区画」は、細胞の他の領域から様々な手段（例えば、視覚的手段など）によって区別できる細胞の任意の定義された部分を指す。いくつかの例では、細胞内領域は、細胞内の制限された領域であり得る。いくつかの実施形態では、細胞内領域は細胞小器官を含み得る。細胞内局在の非限定的な例としては、例えば、核、核小体、サイトゾル、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、膜、樹状突起棘、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、用語「細胞内トランスロケーション」は、様々な条件下でレポーター遺伝子（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）の細胞内局在における検出された変化を指す。
【００６５】
本明細書で言及する用語「薬物」は、病状の治療に効果を有する化合物を指す。用語「疾患の治療」または「病状の治療」は、疾患に関連する症状を改善し、重症度を軽減するか、疾患を治療するか、または疾患の発症を予防するのに有効な１つもしくは複数の化合物を投与することを指す。
【００６６】
用語「検出、「診断」は、疾患、症状、障害、病態または正常状態を検出する方法、疾患、症状、障害、病態を分類する方法、疾患、症状、障害、病態の重症度を決定する方法、疾患、症状、障害、病態の進行を監視する方法、その予後および／または回復の見通しを予測する方法を指す。用語「診断」は、病態の存在または性質を特定することを意味する。
【００６７】
用語「担体」は、核酸分子、構築物、ベクターおよび／またはアッセイ細胞が配置されている固体支持体を指す。担体は、チップ、スライド、ウェル、容器、チューブ、およびバイアルなどの任意の種類の適切な担体を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、担体はチップである。いくつかの実施形態では、担体は顕微鏡スライドである。いくつかの実施形態では、担体は、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、および３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。いくつかの実施形態では、担体は、各遺伝子座（またはアレイのポイント）が指定され、特定可能であるマトリックスアレイ（座位）を含むように構成されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、担体上で脱水される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、トランスフェクション試薬の存在下または非存在下で、担体上で脱水される。
【００６８】
用語「ドライバー変異」は、癌などの疾患をもたらすまたは引き起こし得る変異した遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００６９】
用語「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、対応するタンパク質もしくはその部分をコードするポリヌクレオチド配列または分子を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、対応するタンパク質をコードする、遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
これから、いくつかの実施形態による、患者の生体試料で患者の特定のドライバー変異を特定するための方法における例示的な工程のブロック図を模式的に示す、図１を参照する。図１に示すように、工程１００において、患者の生体試料を取得する。生体試料は、血液、血清、生検、針生検、気管支肺胞洗浄、胸水、腫瘍組織、尿、唾液および腫瘍組織から選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生体試料は、新鮮な（新鮮であるかまたは凍結したばかりの）、すなわち、固定されていない試料であってよい（工程１０２）。いくつかの実施形態では、生体試料は、当技術分野で公知の生体試料の固定法によって固定されてよい（工程１０４）。
【００７１】
図１に示すように、新鮮な生体試料（工程１０２）から様々な成分が、当技術分野で公知の適切な方法により、それぞれ抽出できる。例えば、工程１０６に示すように、間質液（ＩＦ）（細胞外液）が、将来の使用のために抽出および保存できる。さらに、ｍＲＮＡが新鮮な生体試料から抽出できる（工程１０８）。抽出／単離したｍＲＮＡはその後、当技術分野で公知の方法により（ポリｄＴプライマーなどの使用によって）、ｃＤＮＡライブラリーの作製のために使用される（工程１１０）。特定のＰＤＭ ｃＤＮＡは、所定のＰＤＭの所望の遺伝子領域（ポリヌクレオチド）に対応する適切なプライマー対を使用して、ｃＤＮＡライブラリーから増幅して作製する。選択ＰＤＭは、対応するＷＴ  ＰＤＭまたは様々な疾患状態における変異したＰＤＭ（例えば、癌遺伝子）の既知の機能／活性／役割に基づいて選択できる。次に、工程１１２において、ＰＤＭ ｃＤＮＡの５’末端に調節プロモーターエレメントを加え、かつ必要に応じて３’ＩＲＥＳならびにレポーター遺伝子、および蛍光タグなどのタグを加えることによってアッセイＰＤＭを作製する。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＭ ｃＤＮＡは、ＦＴＲコード部分を含む追加の発現カセットをさらに含んでもよい。
【００７２】
さらに図１に示すように、工程１１４において、ゲノムＤＮＡが、固定した生体試料（ホルマリン固定試料（工程１０４）など）から抽出できる。工程１１６において、抽出したＤＮＡを用いて特定の、所定のエクソン（癌症例において変異していることが知られている）を増幅し、続いて特定エクソンを欠く、対応する全長遺伝子を含む発現構築物にライゲーション／融合して、増幅して試験ＰＤＭを作製できる。
【００７３】
次に、工程１１８において、工程１１２および／または工程１１６で作製したＰＤＭのそれぞれの核酸分子は、指定された遺伝子座（位置）にて支持担体（スライド、ウェル（例えば、マイクロプレートウェル）、およびチップなど）上に配置／スポットできる。ＰＤＭは、キメラレポーター（ＦＴＲ）をコードする核酸分子と混合して配置し、ＦＴＲは、ＰＤＭに対応するように選択される（すなわち、選択されるＦＴＲは、ＰＤＭによって機能的に（直接的または間接的に）影響され得る）。ＰＤＭおよびＦＴＲをコードする核酸分子の混合物は、試験細胞への分子のトランスフェクションを可能にする適切なトランスフェクション試薬をさらに含んでもよい。必要に応じて、ＰＤＭ＋ＦＴＲ混合物を担体上で脱水する。別のオプションでは、ＰＤＭおよびＦＴＲは、単一核酸分子上に位置するように構築され、細胞における両方のタンパク質の独立した発現を可能にする。並行して、ＷＴ  ＰＤＭおよび対応するＦＴＲを含む、対照アッセイを調製する。さらに工程１１８において、十分な量の選択された試験細胞を、適切な増殖培地と共に担体に添加する。細胞は、核酸分子の添加前または後に添加できる。いくつかの実施形態では、十分な量の試験細胞は、１ウェル（９６マルチプレートウェル）あたり約１〜１００００の細胞を含む。いくつかの実施形態では、十分な量の試験細胞は、１ウェル（２４マルチプレートウェル）あたり約１〜５００００の細胞を含む。いくつかの実施形態では、十分な量の試験細胞は、１ウェル（１２マルチプレートウェル）あたり約１〜１０００００の細胞を含む。いくつかの実施形態では、十分な量の試験細胞は、１ウェル（９６マルチプレートウェル）あたり約１〜１０００の細胞を含む。いくつかの実施形態では、十分な量の試験細胞は、１ウェル（３８４マルチプレートウェル）あたり約１〜１０００の細胞を含む。いくつかの実施形態では、試験細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、およびＨＴ２９などから選択されるが、これらに限定されない。次いで細胞を、ＦＴＲおよび必要に応じてＰＤＭの発現を可能にするために指定された期間（約６〜６０時間の範囲などの）インキュベートする。必要に応じて、いくつかの実施形態では、工程１１８において、細胞をある期間（０．５〜４８時間など）固体担体に添加し（適切な増殖培地と共に）、その後ＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードする核酸分子を、細胞内への分子のトランスフェクションを可能にする条件下で細胞に添加する。
【００７４】
次に、工程１２０において、所定の時間後（４〜６０時間など）、細胞生育培地を新鮮な培地と交換できる。いくつかの実施形態では、交換培地は低血清培地である。次に、追加のインキュベーション期間（４〜１６時間の範囲など）後に、誘導性プロモーターにより制御されるＰＤＭ発現の誘導が開始される。誘導性プロモーターの誘導は、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターを使用した場合はテトラサイクリンを添加することによって開始され、エクジソン誘導性プロモーターを使用した場合はエクジソンを添加することによって、または当技術分野で公知の任意の他の方法により開始され得る。
【００７５】
必要に応じて、工程１２２において、固定試料から作製したＰＤＭ（工程１１６）については、所定の時間後に（４〜６０時間など）、細胞増殖培地を新鮮な培地と交換する。いくつかの実施形態では、交換培地は低血清培地である。次に追加のインキュベーション期間後に（４〜２４時間の範囲など）、ＰＤＭを構成的プロモーターの制御下で発現させる。
【００７６】
次に、工程１２４において、試験細胞内でＰＤＭの発現を可能にする追加の時間後（例えば、約４〜４８時間の範囲など）、ＦＴＲの細胞内局在を決定する。ＦＴＲの細胞内局在の決定は、蛍光顕微鏡を用いる画像化、および生化学的方法を用いる細胞内区画の分画などの様々な手段によって行うことができる。いくつかの例示的な実施形態では、細胞を固定し、蛍光ＦＴＲ局在化を蛍光イメージングにより決定する。様々な実験条件下でのＦＴＲの細胞内局在の分析および比較により、試験ＰＤＭが欠損しているか（すなわち変異している）否かについての決定が可能になる。例えば、ＦＴＲの細胞内局在は、ＦＴＲを試験ＰＤＭ（試験アッセイ）と共発現させる細胞で決定する。さらに、同一のＦＴＲの細胞内局在を、ＷＴ ＰＤＭと共発現させる細胞で決定する（対照アッセイ）。試験アッセイおよび対照アッセイ間でのＦＴＲの細胞内局在の違いは、試験ＰＤＭの機能活性について示唆する。したがって、例えば、工程１２６において、ＦＴＲが試験アッセイで対照アッセイと同じ細胞内局在にあると特定される場合には、試験ＰＤＭは変異していない。例えば、工程１２８において、ＦＴＲが試験アッセイで対照アッセイと同じ細胞内局在にあると特定される場合には、試験ＰＤＭは変異しており、このＰＤＭがドライバー変異であることを示す。
【００７７】
これから、いくつかの実施形態による、例示的な細胞シグナル伝達経路でのドライバー変異を特定するための本発明の方法の適用の模式図（正確な縮尺ではない）である、図２を参照する。図２に示すように、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路のメンバーである様々なＰＤＭ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、およびＭＥＫ）を、上記のように患者の生体試料から調製する。この例示的なアッセイにおけるＦＴＲは、（レポーター遺伝子部分としての）ＧＦＰレポーター遺伝子（レポーター遺伝子部分として）に融合された標的（マーカー）遺伝子部分としてＭＡＰＫタンパク質（ＥＲＫ１またはＥＲＫ２）を含むキメラレポーターである。本明細書で上述したようにＰＤＭおよびＦＴＲの各々を処理し、様々な実験条件下でＦＴＲの局在を決定する。左側のパネル（２００）に示すように、検出したＦＴＲの局在はＷＴ条件と同じである（すなわち、ＦＴＲは細胞質に局在する）ので、いずれの試験ＰＤＭも変異していない。右側のパネル（２０２）に示すように、ＦＴＲの細胞内局在はＷＴ条件下とは異なる（すなわち、この例においては、核内にある）ので、試験ＰＤＭの少なくとも１つが変異している。試験ＰＤＭの各々は別々の試験細胞で個々にＦＴＲと試験されるので、特異的に変異したＰＤＭの特定が達成可能である。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、このように癌患者の生体試料中の異常なシグナル伝達経路を特定するための方法、および／または１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定するための方法であって、以下の工程の１つもしくは複数を含む（任意の選択された順序で）方法を提供する：
ａ）腫瘍の生検などの癌患者の生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を取得する工程；
ｂ）当技術分野で公知の方法によって、複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子または遺伝子部分）に相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの個々のｃＤＮＡ試料を増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成して、試験患者由来のマーカー（試験ＰＤＭ）を生成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセットの、および並行して対応する（マッチする）野生型タンパク質（ＷＴ  ＰＤＭ）の発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）マーカー遺伝子が対応するＰＤＭにより直接的または間接的に影響を受ける、アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子（ＦＴＲ）に連結されたマーカー遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程；
ｇ）必要に応じて支持固体担体上でｃＤＮＡ構築物を乾燥させる工程；
ｈ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｉ）トランスフェクト細胞での構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第１のセットおよびアレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子の遺伝子産物を取得する工程；
ｊ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞内のレポーター遺伝子の少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
腫瘍由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍試料からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物に（すなわち、単一分子上に）配置されている。このような実施形態では、ＰＤＭ発現カセットおよびＦＴＲ発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモーターを有していてもよい（すなわち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同じまたは異なるプロモーターによって制御されてよい）。このような実施形態では、上記の工程ｄ）およびｆ）は、一つの工程に組み合わされる：（代替工程ｄ））：ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成し、試験患者由来のマーカー（試験ＰＤＭ）を生成する工程であって；前記発現構築物は特定のレポーター遺伝子（ＦＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＴＲは、プロモーター（ＰＤＭのプロモーターと同一でもまたは異なっていてもよい）に連結されている。さらなる実施形態では、ＦＴＲは、レポーター遺伝子部分に連結される標的遺伝子部分を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、工程ｇ）は工程ｅ）および／またはｆ）に先行し、その場合アッセイ細胞は発現カセットの添加前に各遺伝子座に添加される。
【００８１】
したがって、いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによって、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供し、アレイが癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適している、工程。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）を含む。
【００８３】
さらなる実施形態では、本方法は、さらに以下の工程を含む：（ｇ）ＤＮＡ構築物およびベクターのアッセイ細胞へのトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；および（ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；癌患者の生体試料由来のｃＤＮＡおよび対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の間の異なる結果が、患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）アドレス可能なアレイにおいて、担体に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｆ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットをアッセイ細胞に添加する工程であって；発現構築物の各々がアッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アドレス可能な異なる遺伝子座にてアッセイ細胞へ添加される工程であって；
それにより、癌患者の生体試料での患者特有のドライバー変異を特定するためのシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターをアッセイ細胞に添加する工程を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞でのＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較することを含み；その際、生体試料由来のｃＤＮＡおよび対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の間の異なる結果を、患者特有のドライバー変異の候補として生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、癌患者の生体試料中の異常なシグナル伝達経路を特定するための方法、および／または患者特有のドライバー変異を特定するための方法であって、以下の工程のうちの１つまたは複数を含む（任意の適切な順序で）方法を提供する：
ａ）腫瘍の生検などの癌患者の生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を取得する工程；
ｂ）当技術分野で公知の方法によって、複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの個々のｃＤＮＡ試料を増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成し、試験患者由来のキメラレポーター（試験ＰＤＲ）を生成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット（試験ＰＤＲ）、および並行してｃＤＮＡ（ｗｔ  ＰＤＲ）の発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）必要に応じて支持固体担体上でｃＤＮＡ構築物を乾燥させる工程；
ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡの第１のセットの遺伝子産物を取得するために、トランスフェクト細胞での構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第１のセットの遺伝子産物を取得する工程；
ｉ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞でのキメラレポーター遺伝子の少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
腫瘍由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞での異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程の１つまたは複数を含む（任意の適切な順序で）方法を提供する：
ａ）インビトロまたはインビボで、例えば腫瘍生検から、取得される、腫瘍細胞からｍＲＮＡの試料を取得する工程；
ｂ）取得した複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質に相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの個々のｃＤＮＡ試料を増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および並行して対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）キメラ遺伝子のコトランスフェクション用の発現ベクターを添加する工程；
ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；
ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞で発現するＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
腫瘍由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍細胞からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＭ発現カセットおよびＦＴＲ発現カセットは、１つの発現構築物（すなわち、単一分子上）に配置されている。このような実施形態では、ＰＤＭ発現カセットおよびＦＴＲ発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモーターを有していてもよい（すなわち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同じまたは異なるプロモーターによって制御されてよい）。いくつかの実施形態では、工程ｇ）は工程ｅ）および／または工程ｆ）に先行してもよく、その場合アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターを添加する前に各遺伝子座に添加される。
【００９１】
したがって、いくつかの実施形態によると、腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するための方法であって、以下の工程のうちの１つまたは複数を含む（任意の適切な順序で）方法を提供する：
ａ）インビトロまたはインビボで、例えば腫瘍生検から、取得される、ｍＲＮＡの試料を腫瘍細胞から取得する工程；
ｂ）取得した複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの個々のｃＤＮＡ試料を増幅する工程；
ｄ）されている増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であって、ｃＤＮＡが作動可能に第１のプロモーターへ連結され；前記発現構築物が第２のプロモーターを含み蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）キメラ遺伝子をコードする発現カセットをさらに含み、前記ＦＴＲがレポーター遺伝子部分に連結される標的遺伝子部分を含む、工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡおよびＦＴＲカセットを保有する発現構築物の第１のセット、ならびに並行して対応する野生型ｃＤＮＡおよびＦＴＲカセットの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程；
ｆ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程；および
ｇ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する細胞で発現するＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；
腫瘍由来のｃＤＮＡを発現する細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達経路タンパク質の候補として腫瘍細胞からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程。
【００９２】
いくつかの実施形態では、第１および第２のプロモーターは、同一であるか、または異なっている。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）腫瘍細胞から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）ｃＤＮＡが作動可能にプロモーターへ連結される、工程（ｃ）の増幅ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程；
ｅ）腫瘍からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それにより腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む、蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）を含む。
【００９５】
さらなる実施形態では、本方法は、さらに、（ｇ）アッセイ細胞へのＤＮＡ構築物のコトランスフェクションを可能にする条件下で、各遺伝子座に生存能力のあるアッセイ細胞を添加する工程：および（ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性を、その対応する野生型発現ｃＤＮＡの場合と比較する工程であって；腫瘍細胞由来のｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞および対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の間の異なる結果が異常なシグナル伝達タンパク質の候補として腫瘍細胞からのｃＤＮＡを特定するために使用される工程を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、患者は、癌に罹患している患者である。いくつかの実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および混合タイプの腫瘍などの癌を含む。腫瘍の特定のカテゴリは、リンパ増殖性疾患、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、骨癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、および上記の全ての転移を含む。治療の影響を受けやすい腫瘍の特定の種類には、肝細胞癌、肝癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、ガングリオブラストーマ、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋皮肉腫、浸潤性乳管癌、乳頭腺癌、メラノーマ、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（高分化、中分化、低分化または未分化の）、腎細胞癌、副腎、副腎様腺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌および大細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽腫、結腸癌、直腸癌、ならびに、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む全ての種類の白血病およびリンパ腫を含む造血器悪性腫瘍が含まれる。
【００９７】
特定の実施形態によれば、癌は、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、骨髄腫、白血病、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、患者は、癌に対して陽性と診断されている。いくつかの実施形態では、患者は、治療結果が既知または未知の標的療法の治療計画下にある。いくつかの実施形態では、患者は、利用可能な患者の腫瘍分子プロファイリング（ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＰＣＲおよびシーケンシング）を有する。いくつかの実施形態では、患者は、利用可能な患者の病歴、ならびに予後（患者の応答、耐性、再発および生存率）を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、血清、生検、組織、針生検、気管支肺胞洗浄液、胸膜滲出液、尿、唾液および腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、生体試料は新鮮に単離されてもよい。いくつかの実施形態では、生体試料は凍結されてもよい。いくつかの実施形態では、生体試料は固定されてもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、アッセイ細胞で発現した各タンパク質（試験ＰＤＭ、ＦＴＲ、ＷＴ ＰＤＭ、ＰＤＲなど）は差次的に特定可能である。別の実施形態では、各タンパク質は、直接的または間接的に、異なるマーカーもしくはレポーターまたは異なる蛍光タンパク質によって特定できる。別の実施形態では、各キメラタンパク質（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）は異なるレポーター部分を含む。別の実施形態では、異なるタンパク質が蛍光タンパク質またはレポーターを共有してもよい。別の実施形態では、本発明の各キメラタンパク質は、異なるレポーター部分を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、ＰＤＭは癌の増殖と関連している。別の実施形態では、ＰＤＭは癌遺伝子または腫瘍抑制因子である。別の実施形態では、ＰＤＭは細胞骨格の調節因子である。別の実施形態では、ＰＤＭは腫瘍増殖および転移において役割を担っている。別の実施形態では、ＰＤＭは小胞輸送タンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭは小胞繋留タンパク質（ｖｅｓｉｃｌｅ ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。別の実施形態では、ＰＤＭは細胞接着タンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭは核完全タンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。別の実施形態では、ＰＤＭは成長因子受容体である。別の実施形態では、ＰＤＭはサイトカイン受容体である。別の実施形態では、ＰＤＭは細胞接着タンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭは腫瘍炎症に関与している。別の実施形態では、ＰＤＭは細胞極性タンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭはシグナル伝達タンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭはアダプタータンパク質である。別の実施形態では、ＰＤＭはタンパク質キナーゼである。別の実施形態では、ＰＤＭは交換因子である。別の実施形態では、ＰＤＭは細胞骨格タンパク質である。いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＥＳＲ１、ＡＲ、ＰＲ、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１もしくはそれらの任意の組み合わせを含むか、またはそれらからなる群から選択される。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０２】
別の実施形態では、ＰＤＭは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）などのマーカー（タグ）と結合して発現される。いくつかの実施形態では、マーカーは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓのモチーフ（配列番号４７）を含み、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２またはＲｅＡｓＨ−ＥＤＴ２に画像化する前に、試験アッセイに添加され、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフを含む組換えタンパク質への結合の際に蛍光を発する。いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓを含むタンパク質はＰＤＭであるか、蛍光タンパク質のみであるか、または、例えば、細胞膜もしくは核などの細胞内小器官をタグ付けするためにさらに使用できる細胞内マーカーに融合した、蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤＭに結合して発現するマーカー（タグ）を、アッセイ細胞におけるＰＤＭのトランスフェクションおよび発現を確認するためのマーカーとして使用する。
【０１０３】
別の実施形態では、ＰＤＲは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）などのマーカー（タグ）と融合したＰＤＭである。いくつかの実施形態では、ＰＤＲは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号４７）モチーフを含む、マーカー（タグ）と融合したＰＤＭである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）またはＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフ、ならびに限定されないが、以下のものから選択される標的タンパク質部分などのレポーター部分を含む融合（キメラ）タンパク質である：癌の増殖に関連するタンパク質、癌遺伝子産物、細胞骨格調節因子、小胞輸送タンパク質、小胞繋留タンパク質、細胞接着タンパク質、核完全タンパク質、成長因子受容体、細胞接着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、腫瘍炎症に関与するタンパク質、細胞極性タンパク質、増殖因子シグナル伝達タンパク質、アダプター、および細胞骨格タンパク質など。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０５】
いくつかの例示的な実施形態では、ＦＴＲは、蛍光タンパク質などのレポーター部分と、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ｍＴＯＲ、ＲｅｌＡ、ＮＦΚＢ１、ＮＦΚＢ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＣＴＮＮＢ１、ＪＮＫ１ａｌｐｈａ、ＪＮＫ１ｂｅｔａ、ＪＮＫ２ａｌｐｈａ、ＪＮＫ２ｂｅｔａ、ＥＲＫ５、Ｐ３８ａｌｐｈａ、Ｐ３８ｂｅｔａ、ＡＭＰＫ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＰ５３、ＥＳＲ１、ＧＡＴＡ３、ＣＤＫ２、ＳＭＡＤ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＲＫＡＣＡ、ＮＬＫもしくはそれらの任意の組み合わせを含むか、またはそれらからなる群から選択される、標的（マーカー）タンパク質部分とを含む融合タンパク質である。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０６】
いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭはＫＲａｓであり得、ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＪＮＫおよびＡＫＴ１から選択され得る。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０７】
いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭはＡＫＴ２またはＡＫＴ３であり得、ＦＴＲの標的部分はＡＫＴ１およびＲｅｌＡから選択され得る。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０８】
いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭはＦＧＦＲ１であり得、ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＪＮＫ（ＪＮＫ１ａｌｐｈａ１など）、ｐ３８ｂ、ＡＫＴ１およびＳＴＡＴ３から選択され得る。各実現性は別々の実施形態である。
【０１０９】
いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭはＢＲａｆであり得、ＦＴＲの標的部分はＥＲＫ２およびＥＲＦから選択され得る。各実現性は別々の実施形態である。
【０１１０】
いくつかの例示的な実施形態では、ＰＤＭはＥＧＦＲであり得、ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＲｅｌＡ、ＡＫＴ１、ｐ３８ｂ、ＪＮＫ１ａ１から選択され得る。各実現性は別々の実施形態である。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明は、各アッセイ細胞がＰＤＭおよび／またはＦＴＲを発現する、アッセイ細胞を含む。別の実施形態では、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲを発現する、アッセイ細胞を含む。別の実施形態では、本発明は、異なるＤＮＡ断片で各アッセイ細胞がトランスフェクトされる、アッセイ細胞を含み、各ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードしている。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は、座位（位置）が指定されている固体担体上で配置／播種／生育される。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は、各遺伝子座について同一である。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は、各遺伝子座について同一ではない。いくつかの実施形態では、アッセイ細胞は培地中で各遺伝子座に添加される。いくつかの実施形態では、細胞は、既にＤＮＡ構築物がそこへ脱水されている固体担体に添加される。いくつかの実施形態では、細胞は最初に固体担体上に播種され、所定時間後にトランスフェクトされる。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、異なるＤＮＡ断片で各アッセイ細胞がトランスフェクトされる、アッセイ細胞を含み、各ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲをコードしている。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＦＴＲの局在の特定は、タンパク質アッセイ、結合アッセイ、イムノアッセイ、顕微鏡イメージング、または当業者に公知の任意の他の適切なアッセイを使用して実行される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、さらに、アッセイ細胞における形態学的変化を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、任意の患者のＤＮＡのシーケンシングを必要としない。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、患者における癌を診断するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞における異常な細胞シグナル伝達経路を特定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、患者特有のドライバー変異を特定するためのキットを提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者特有のドライバー変異を特定することによる、被験体における癌または癌の分子プロファイルを診断するためのキットを提供する。キットは、いくつかの実施形態によれば、治療の成功を予測するか、または癌に関与するパラ分泌もしくは自己分泌の因子を特定するために使用できる。別の実施形態では、キットは、レポーター遺伝子を検出する少なくとも１つの手段を含む。別の実施形態では、キットは、マーカーを検出するための手段を含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸分子および／または試験細胞を保持するための担体または容器、検出／トランスロケーションアッセイ（複数可）を実行するための説明書、試験細胞、トランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む。
【０１１７】
本発明の診断用組成物は、所望であれば、診断試薬および使用説明書を含み得る製品、例えば、ＦＤＡ承認キットなどのキットで提示されてもよい。キットはまた、製造、使用、または医薬品の販売を規制する政府機関により定められた形式で容器に付けられた通知を収容していてもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物での使用の当局による承認を反映している。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明の方法およびキットは、癌患者の生存を延長させる。本発明のアッセイは、キットの調製に理想的に適している。このようなキットは、容器手段の各々が細胞アッセイの別々の要素を含む、バイアル、チューブ、プレート、およびスライドなどの１つまたは複数の容器手段と共に、厳重に閉じ込められるように区画化されているキャリア手段を含んでもよい。
【０１１９】
一実施形態では、それぞれが本発明の異なるタンパク質を含むアッセイ細胞のパネルを含む、被験体における癌を診断するためのキットが提供され、キットはＰＤＭ（患者の生体試料由来の）および／またはＦＴＲをコードする核酸分子を有する担体を含み、担体は、アッセイ細胞、および癌を有することが疑われるヒト被験体から単離された生体試料をさらに保持することができ、かつ反応、トランスロケーション事象の測定および／または検出のための説明書が印刷されている。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、トランスフェクトされたアッセイ細胞は、組換えタンパク質またはタグ付きタンパク質の発現を可能にする有効な条件下で培養される。一実施形態では、本発明のタグ付きタンパク質またはマーカータンパク質（ＰＤＭ、ＦＴＲなど）は、組換えタンパク質またはキメラである。いくつかの実施形態では、有効な培養条件は、タンパク質発現を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、ＣＯ２、ｐＨおよび酸素条件を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、有効な培地は、本発明の組換えポリペプチドを産生するために細胞が培養される、任意の培地を指す。いくつかの実施形態では、培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属およびビタミンなどの他の栄養分を有する水性溶液を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養できる。いくつかの実施形態では、培養は、組換え細胞に適する温度、ｐＨ、および酸素含有量で行われる。いくつかの実施形態では、培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質トランスロケーション事象を監視および記録するための再分配技術を利用する。別の実施形態では、タンパク質標的は、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質で標識され、安定的または一過的なトランスフェクト細胞株が作製される。別の実施形態では、本発明のアッセイは、ハイスループット、光学顕微鏡ベースの機器を使用して読み取られる。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、細胞培地の成分としての生体試料由来のＰＤＭのリードシリーズのプロファイリング、一次スクリーニングのために主に使用される高含有量、ハイスループットアッセイである。別の実施形態では、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、スピニングディスク技術または任意の他の顕微鏡ベースの技術を使用する、生細胞イメージングを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、トポノミック  ローカライゼーション（ｔｏｐｏｎｏｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）技術を用いて、タンパク質トランスロケーション事象を追跡および記録する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質の免疫蛍光手段が利用される。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質は蛍光マーカーで標識される。いくつかの実施形態では、共焦点顕微鏡画像が評価および処理される。別の実施形態では、標準的なデータセットは、生物学的条件につき各細胞の２〜４０画像を含む。別の実施形態では、自動化画像解析が行われる。別の実施形態では、自動化画像分析は、細胞内コンパートメントまたは構造の識別を含む。
【０１２４】
別の実施形態では、空間的関係が、異なる次元で取り込まれる。別の実施形態では、有界領域中のタンパク質マーカー濃度の定量的評価が行われる。別の実施形態では、本発明は、さらに、画素間の距離の等方性分布の測定および評価に基づく、タンパク質の共局在研究を提供する。別の実施形態では、本発明は２次元解析（領域）を提供する。別の実施形態では、本発明は０次元解析（ポイント）をさらに提供する。別の実施形態では、本発明は１次元モデリングを提供する。
【０１２５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」およびそれらの活用語は、「含むがそれに限定されない」を意味する。いくつかの実施形態では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、それぞれ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」に制限される。用語「からなる」は、「含み、それらに限定される」を意味する。用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得るが、追加の成分、工程および／または部分が特許請求されている組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。
【０１２６】
文脈が明確に指示しない限り、本明細書で使用する単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は複数の言及を含む。例えば、用語「１つの（ａ）化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含んでもよい。
【０１２７】
本明細書に記載の数値を参照して、本明細書で使用する用語「約」は、規定値＋／−１０％と理解されるべきである。
【０１２８】
本明細書で使用する用語「方法」は、特定のタスクを達成するための方法、手段、技術ならびに手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学および医学技術の実行者に周知の方法、手段、技術ならびに手順、または化学、薬理学、生物学、生化学および医学技術の実行者によって既知の方法、手段、技術ならびに手順から容易に開発された方法、手段、技術ならびに手順を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定することを意図するものではないが、以下の実施例を検討する際に、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記のおよび特許請求の範囲で請求するような本発明の様々な実施形態ならびに態様のそれぞれは、以下の実施例の実験によって支持される。
【０１３０】
より完全に本発明のいくつかの実施形態を説明するために、以下の実施例を提示する。しかし、それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３１】
実施例
一般に、本明細書で使用する用語および本発明で利用する実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「分子生物学の最新プロトコル」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．（編）（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコル」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、メリーランド州ボルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングの実用ガイド」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ社、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「ゲノム解析：実験室マニュアルシリーズ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載の方法；「細胞生物学：実験ハンドブック」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｅ．（編）（１９９４）；「動物細胞の培養−基本技術のマニュアル」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４）、第３版；「免疫学における最近プロトコル」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．（編）（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「基礎および臨床免疫学」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ社、コネティカット州ノーウォーク、（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「細胞免疫学の厳選された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）を参照されたい。利用可能な免疫測定法は特許および科学文献に広く記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション」Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．（編）（１９８５）；「転写および翻訳」Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．（編）（１９８４）；「動物細胞培養」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（編）（１９８６）；「固定化細胞と酵素」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社（１９８６）；「分子クローニングの実用ガイド」、Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．（１９８４）および「酵素学における方法」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社；「ＰＣＲプロトコル：方法と応用へのガイド」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニ��州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク質の精製と特徴付けのための戦略−研究室コースマニュアル」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ社（１９９６）を参照されたく、これらの全ては参照により組み込まれる。他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。
【０１３２】
生体試料の採取
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍生検と凍結した新鮮な腫瘍部分または生検の両方を採取する。ＦＦＰＥ試料を用いて、癌の進行に関与することが知られている特定のゲノムエクソン（ｃＫｉｔのエクソン１１など）を抽出する。新鮮な（新鮮であるまたは新鮮に凍結された）生検を、ｍＲＮＡの抽出および間質液抽出の両方に使用する。
【０１３３】
このように、レトロスペクティブ試料およびプロスペクティブ試料の両方を採取する。レトロスペクティブ研究は、治療の有効性が知られている症例からの凍結腫瘍切片に基づく。
【０１３４】
プロスペクティブ研究は、手術／生検／気管支鏡検査の直後に採取された新鮮なまたはスナップ凍結した試料／生検組織／腫瘍部に基づく。これは、関連する全ての試験タンパク質（癌遺伝子または指示薬など）の増幅を可能にする。気管支鏡検査により得られる血漿試料（ヘパラン硫酸ゲルチューブを用いる）、血液試料、腹水、胸水および肺液などの他の体液は、それらが多くの腫瘍分泌物を蓄積するので非常に重要であり、かつまた採取される。
【０１３５】
腫瘍切除（手術、生検、気管支鏡検査）後に、腫瘍組織を氷上の無菌袋またはチューブ内に入れる（ホルマリンで処理しない）。病理医は腫瘍を、固定に必要なものと、さらなる分析のために氷上で新鮮なまま搬送される、腫瘍を最もよく表すものとに分ける（生存腫瘍部のサイズおよび位置を考慮して）。病理医は、悪性細胞に富む組織切片または領域、ならびに間質の量が減少した組織切片または領域もしくは他の非悪性組織を特定し、それを切除する。組織の正味重量が１ｇを超える場合には、組織をさらに数片に切断し、セルロースカラム上に置き、１０分間、１００ｇで遠沈させる（全グラムの組織から、ＩＦは１００±５０マイクロリットルと予想される）。その後、組織を別の１５／５０ｍｌチューブに移し、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。間質液（IＦ）として知られる遠沈した液体は元のチューブ内で凍結させる。
針生検−組織を１５円錐管に入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支鏡検査による生検−組織を１５円錐管に入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支肺胞洗浄液−抽出液を２〜５０ｍｌのファルコンチューブに分け、遠沈させる（３０００ ＲＰＭ、１５分）。液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブで）の両方を−８０℃で凍結させる。
胸水−胸水を遠沈させ（３０００ ＲＰＭ、１５分）、液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブで）の両方を−８０℃で凍結させる。
凍結切片−可能であれば、腫瘍をミクロトームで凍結し、薄片を作る。
【０１３６】
ホルマリン固定した包埋腫瘍生検からのゲノムＤＮＡの抽出
エクソン１１のｃＫｉｔ変異、エクソン１９、２０のＥＧＦＲ変異、エクソン２０のＨＥＲ２変異などの、特定のエクソン中での既知の変異が存在する遺伝子を特定するために、ＦＦＰＥ組織から抽出したＤＮＡを用いる。この目的のために、標準的なＤＮＡ抽出キットおよびプロトコルを用いる（例えば、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織、カタログ番号５６４０４）。
【０１３７】
エクソンの増幅および全長遺伝子への挿入
所望のエクソンを発現させるために、ゲノムＤＮＡの増幅を行い、このエクソンを欠く全長遺伝子にこのエクソンを挿入する。この目的のために、発現準備ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅａｄｙ ｖｅｃｔｏｒ）中のこのエクソンを欠く全長遺伝子を作製し、その後、このエクソンを従来の分子生物学技術を用いて構築物中に組み込む。
【０１３８】
新鮮な生検：冷凍生検からの必要量の組織の抽出
生検のフラクションを、ＲＮＡ精製および間質液抽出のために使用する。生物材料の残りを、将来の参考または追加の分析（免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＦＩＳＨなど）のために保存する。
【０１３９】
間質液（IＦ）の抽出
腫瘍細胞が分泌し、抗がん剤に対する耐性を付与できる物質の存在を検出するために、試験細胞に対するアゴニストとして後で使用するために、以下に詳述するように抽出した間質液（ＩＦ）を保存する。
【０１４０】
組織試料をガラス繊維フィルター付きカラム中で１５００ｇで７分間、４℃で遠心分離することによって、ＩＦ抽出を行う。その後、液体をカラムの底部から新しいチューブに収集する。
【０１４１】
ｍＲＮＡの抽出
試料から抽出したｍＲＮＡは、患者由来のマーカー（ＰＤＭ）、すなわち、既知の癌遺伝子であり、細胞に癌特性をもたらす変異を潜在的に保有する遺伝子（ドライバー変異を保有する可能性を有する遺伝子）の増幅のために必要である。試験される代表的な遺伝子には、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＡＲ、ＰＲ、ＥＳＲ１、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１、およびＭＥＫ２が含まれる。
【０１４２】
ＲＮＡ抽出は、グアニジウム−塩化セシウム法、グアニジウム酸（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  Ａｃｉｄ）−フェノール法およびカオトロピック塩の存在下で核酸に結合するガラス繊維フィルターを含む、当技術分野で公知の方法によって、かつ／または市販のキット（製造者の取扱説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙキット、カタログ番号７４１０６など）を用いて行う。
【０１４３】
ｃＤＮＡの作製
ＰＤＭの増幅を可能にするために、組織から抽出したｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡを、鋳型ｍＲＮＡに基づき、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサマープライマー、または特異的プライマーを用いて合成する。代表的なプロトコルには、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩファーストストランド合成ＳｕｐｅｒＭｉｘプロトコル（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号１８０８０−０５１）を使用するプロトコルが含まれる。
【０１４４】
試験ＰＤＭの作製
試験ＰＤＭの作製を以下の２段階で行う：選択したＰＤＭの増幅、およびアッセイ細胞での適切な発現を可能にするための追加要素の取り付け。
【０１４５】
増幅される試験ＰＤＭに関連するオリゴヌクレオチドを含む予備ＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡ試料中のこれらの選択された遺伝子の過剰提示を可能にする。
【０１４６】
いくつかの実施例では、増幅される各遺伝子について別々のウェル／チューブにｃＤＮＡ試料を等分する。
【０１４７】
各ＰＤＭ用に設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡライブラリーから選択したＰＤＭ遺伝子を増幅する。
【０１４８】
以下の試験ＰＤＭのＰＣＲ増幅のために、以下のプライマーセットを用いる（表１）：
【０１４９】
【表１】
2019022506.tif 000002
2019022506.tif 000003
2019022506.tif 000004
【０１５０】
ＰＤＭ遺伝子領域が増幅された後、各ＰＤＭ遺伝子配列の５’末端にプロモーター（ＣＭＶなどの構成的プロモーターまたはテトラサイクリンプロモーターなどの誘導性プロモーターのいずれか）を加え、３’末端に蛍光レポーター遺伝子（名付けられたとおりのＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、または任意の他のレポーター遺伝子など）が後ろに続くＩＲＥＳを加えるために、第２のＰＣＲ反応を行う。
【０１５１】
いくつかの実施例では、プロモーターおよびＩＲＥＳ＋蛍光レポーターエレメントの添加を、分子生物学クローニングツールにより、ＰＣＲ手法、ライゲーション酵素または組換え手法（それぞれ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはインフュージョン酵素（ＩｎＦｕｓｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）（クロンテック社）など）による所望の要素へのＰＣＲ産物の結合により行う。
【０１５２】
全長核酸分子が形成されると（すなわち、５’プロモーターＰＤＭ−３’ＩＲＥＳ＋レポーター（またはこれらの要素の任意の他の順序））、ＰＣＲ反応を用いる増幅を行って、細胞へのトランスフェクションに十分な量の核酸分子を取得する。
【０１５３】
場合によって、核酸分子の増幅は、適切な発現ベクターへの全長核酸分子のライゲーションおよび細菌の形質転換によって達成する。このように形成されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐミニプレップキットなどの標準的なプラスミド抽出キットを用いて抽出する。場合によって、様々なＰＤＭの直鎖状ＰＣＲ断片を、試験細胞へのトランスフェクションに使用する。
【０１５４】
ＦＴＲの作製
以下のプライマーセットを、以下のＦＴＲの標的部分のＰＣＲ増幅に使用した（表２）：
【０１５５】
【表２】
2019022506.tif 000005
【０１５６】
発現構築物のトランスフェクション（ＦＴＲおよびＰＤＭ混合物）
あらかじめデザインしたマトリックスに従って、分析に使用する各レポーター遺伝子（ＦＴＲ）を、上述のように調製した、対照の野生型ＰＤＭ遺伝子また試験ＰＤＭ遺伝子のいずれかと混合し、適切なトランスフェクション試薬と混合する。
【０１５７】
一つの選択肢では、トランスフェクション混合物を適切な固体支持基板上に配置し、必要に応じて脱水する。様々な設定において、基板には、顕微鏡スライド、チップ、細胞培養プレート、マルチウェルプレート、９６ウェルプレート、および３８４ウェルプレートなどの、様々な固体基板が含まれる。各混合物を、指定された、追跡可能な位置／スポット（すなわち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された場所）に配置する。基板上のトランスフェクション混合物に、一定数の細胞（基板の種類に依存して、上記のように、約１００〜１００,０００個の範囲で）を、通常の完全増殖培地中で、各スポット上に分注する。細胞は、試験ＰＤＭおよびアッセイに基づいて、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などのＮＣＩ６０細胞株または任意の他の適切な細胞株から選択される。試験細胞を固体基板上に置き、細胞の種類、増殖培地およびトランスフェクション条件に応じて１２〜４８時間インキュベートする。インキュベーション時間は、細胞を基板に付着させ、ＦＴＲおよびＰＤＭの導入および発現を可能にする。
【０１５８】
別の選択肢では、細胞を、あらかじめデザインしたマトリックスに従って固体基板上に播種する（指定された、追跡可能な位置／スポット（すなわち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された場所）に）、。所定時間後、細胞を適切なトランスフェクション条件下で、ＦＴＲおよび適切なＰＤＭ（ＷＴ  ＰＤＭまたは試験ＰＤＭ）でトランスフェクトする。ＦＴＲおよび適切なＰＤＭは、２つの別々の分子上に、または両方の遺伝子をコードする単一分子上に配置してもよい。
【０１５９】
アッセイの実施：誘導性プロモーター
レポーターＦＴＲの十分な発現後、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在するいかなる増殖因子／リガンドも除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０１６０】
シグナル伝達レベルが著しく減少した時（４〜１６時間以内）に、ＰＤＭ発現の誘導を開始する。これは、テトラサイクリン誘導性プロモーターを使用した場合には、テトラサイクリンの添加によって、エクジソン誘導性プロモーターを使用した場合には、エクジソンの添加によって達成される。
【０１６１】
いくつかの実施例では、間質液（IＦ）および／または抗癌薬を添加してＰＤＭの発現を誘導し、それによって、ＰＤＭに対するＩＦまたは薬物の効果を試験する。
【０１６２】
アッセイの実施−構成的プロモーター
細胞におけるＦＴＲおよびＰＤＭの十分な発現後（両方とも構成的プロモーターの制御下で）、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在するいかなる増殖因子／リガンドも除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０１６３】
いくつかの実施例では、間質液および／または抗癌薬を添加してＰＤＭの発現を誘導し、それによって、ＰＤＭに対するＩＦまたは薬物の効果を試験する。
【０１６４】
画像の取得および分析
ＰＤＭ発現後（トランスフェクション後３０時間）に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄することにより固定する。その後、スライドをカバースリップでカバーし、対応する各ＦＴＲの局在を画像化する。
【０１６５】
対照の野生型細胞ならびにＰＤＭトランスフェクト細胞の両方における各ＦＴＲの画像解析を行い、比較する。対照細胞対ＰＤＭトランスフェクト細胞におけるＦＴＲの局在化の差を定量化し、それを用いて、試験ＰＤＭの発癌性形態または野生型形態が試験試料中に存在するか否かを決定する。定量は、ＩｍａｇｅＪなどの標準的な画像分析ソフトウェアを用いて行う。
【０１６６】
アッセイ細胞としてＨｅＬａ細胞を用いる代表的なアッセイ：
０日目：スライドを０.０１％のポリ−Ｌ−リジンで、室温（ＲＴ）にて５分間プレコーティングした後、滅菌水（ＤＤＷ）で洗浄する。水を吸引し、２時間スライドを乾燥させる。
ＨｅＬａ細胞（１５０００細胞）を、各ウェルにつき２００μ１の完全培地（完全培地：ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））中で播種する。
【０１６７】
１日目：トランスフェクション試薬（ＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇｅ社、カタログ番号Ｅ２３１１）をＲＴに温め、ボルテックスする。各ウェルについて、トランスフェクション混合物をチューブに用意する。トランスフェクション混合物には、チューブ内にＰＤＭ発現構築物が５０／１００／２００ｎｇ；適切なＦＴＲ発現構築物が５０／１００ｎｇ；Ｏｐｔｉｍｅｍ緩衝液（全量１０μｌまで）およびＦｕｇｅｎｅＨＤ（各３μｇのＤＮＡに対して１μｌ）が含まれる。トランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベートする。
【０１６８】
細胞培地をウェルから吸引し、各ウェルに１００μｌのトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、抗生物質なし）を補充する。トランスフェクション混合物１０μｌを各ウェルに添加する。その後、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。
【０１６９】
６８時間後、培地を飢餓培地１（０.１％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）と置換し、細胞を３７℃にて加湿インキュベーター、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０１７０】
２日目：２６時間後（すなわち、細胞の固定の４時間前）に、培地を飢餓培地２（０.１％ＦＣＳ、１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ）に変更する。その後、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。
【０１７１】
シグナル伝達の誘導を必要とするアッセイでは、培地を２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを補充した飢餓培地２と５分間交換する。次いで、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。これを、実施例１（図６）および実施例２（図９〜１０）で行った。
【０１７２】
トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を以下のプロセスにより固定する（全ての工程を室温で行う）：細胞をＰＢＳで３回洗浄し、固定液（ＰＢＳ中５％グルコース／４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ））で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄する。必要に応じて、細胞をＤＡＰＩ溶液で染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
【０１７３】
実施例１：ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびＡＫＴ経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＫＲａｓを区別し、かつＫＲａｓドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲとともに、示したＷＴおよび変異体ＰＤＭ（ＫＲＡＳ−ＷＴおよび既知のドライバー変異（Ｇ１３Ｄ）を保有する変異ＫＲＡＳ）でトランスフェクトした（上記のように）。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図３Ａ〜図６Ａに示す。図３Ａでは、ＦＴＲはＥＲＫ２であり、図４Ａでは、ＦＴＲはＥＲＦあり、図５Ａでは、ＦＴＲはＪＮＫ１α１であり、図６Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１である。図３Ｂ〜図６Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、Ｇ１３Ｄ変異を保有する試験ＫＲＡＳが、３つの異なるシグナル伝達経路：ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびＡＫＴを活性化することを示す。
【０１７４】
実施例２：ＡＫＴおよびＮＦκＢ経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＡＫＴ２を区別し、かつＡＫＴ２ドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲとともに、示したＷＴおよび変異体ＰＤＭ（ＡＫＴ２−ＷＴおよび阻害因子結合部位近傍のＡＫＴ２キナーゼドメインに存在する機能未知の変異（Ｒ２５１Ｗ）を保有する変異ＡＫＴ２）でトランスフェクトした（上記のように）。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図７Ａおよび図８Ａに示す。図７Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１であり、図８Ａでは、ＦＴＲはＲｅｌＡである。図７Ｂ〜図８Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＡＫＴ２）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、Ｒ２５１Ｗ変異を保有する試験ＡＫＴ２が、試験ＦＴＲの核トランスロケーションの減少により、試験した２つの異なるシグナル伝達経路（ＡＫＴおよびＮＦκＢ）に影響を与えることを示す。
【０１７５】
実施例３：ＡＫＴおよびＮＦκＢ経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＡＫＴ３を区別し、かつＡＫＴ３ドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲとともに、示したＷＴおよび変異体ＰＤＭ（ＡＫＴ３−ＷＴおよび著しく拡大した脳のサイズに関連する散発的な異常増殖障害の症候群に関与すると報告されている活性化変異（Ｒ４６５Ｑ）を保有する変異ＡＫＴ３）でトランスフェクトした（上記のように）。上記のように、試験ＰＤＭの誘導性プロモーターを誘導した。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図９Ａおよび図１０Ａに示す。図９Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１であり、図１０Ａでは、ＦＴＲはＲｅｌＡである。図９Ｂ〜図１０Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＡＫＴ３）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、Ｒ５６４Ｑ変異を保有する試験ＡＫＴ３が、試験ＦＴＲの核トランスロケーションの増加により、試験した２つの異なるシグナル伝達経路（ＡＫＴおよびＮＦκＢ）に影響を与えることを示す。
【０１７６】
実施例４：ＳＭＡＤ２経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＳＭＡＤ２を区別し、かつＳＭＡＤ２ドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、示したＷＴおよび変異体ＰＤＲ（ＳＭＡＤ３−ＷＴおよび他の転写因子と相互作用するＭＨ１ドメインに存在する未知の変異（Ｔ６７Ａ）を保有する変異ＳＭＡＤ３）でトランスフェクトした（上記のように）。ＳＭＡＤ２は、ＴＧＦβのシグナルを媒介し、したがって、細胞の増殖、アポトーシス、および分化などの複数の細胞プロセスを調節する。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＰＤＲ（ＳＭＡＤ２）の量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＷＴ  ＳＭＡＤ２ならびに変異ＳＭＡＤ２の強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図１１Ａ〜図１１Ｂに示す。図に示すように、ＳＭＡＤ２内のＴ６７Ａ変異は、細胞の他のいかなる刺激も誘導することなく、ＳＭＡＤ２を核内に移行させる。
【０１７７】
実施例５：ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびＰ３８経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＦＧＦＲ１を区別し、かつＦＧＦＲ１ドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲと共に、示したＷＴおよび変異体ＰＤＲ（ＦＧＦＲ１−ＷＴおよび細胞外領域のＩｇ様Ｃ２型３ドメインに存在する機能未知の変異（Ａ３４３Ｖ）を保有する変異ＦＧＦＲ１）でトランスフェクトした（上記のように）。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図１２Ａ〜図１６Ａに示す。図１２Ａでは、ＦＴＲはＥＲＫ２であり、図１３Ａでは、ＦＴＲはＪＮＫ１α１であり、図１４Ａでは、ＦＴＲはＰ３８であり、図１５Ａでは、ＦＴＲはＳＴＡＴ３であり、図１６Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１である。図１２Ｂ〜１６Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＦＧＦＲ１）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、Ａ３４３Ｖ変異を保有する試験ＦＧＦＲ１はＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８シグナル伝達経路に影響を与えるが、ＳＴＡＴ経路（図１５Ａ〜１５Ｂ）またはＡＫＴ経路（図１６Ａ〜１６Ｂ）には影響を与えないことを示す。
【０１７８】
実施例６：ＥＲＫ１／２経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＢＲＡＦを区別し、かつＢＲＡＦドライバー変異を特定できる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲと共に、ＷＴ  ＰＤＭ（ＢＲＡＦ−ＷＴ）または示した変異体ＰＤＭ（以下の変異：ＢＲＡＦのキナーゼドメインに存在する既知のドライバー変異（Ｇ４６４Ｖ）、既知のドライバー変異（Ｖ６００Ｅ）または機能未知の変異（Ｉ５５４Ｔ）の１つを保有する、変異ＢＲａｆ）でトランスフェクトした（上記のように）。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図１７Ａ〜図１８Ａに示す。図１７Ａでは、ＦＴＲはＥＲＫ２であり、図１８Ａでは、ＦＴＲはＥＲＦである。図１７Ｂ〜１８Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、２つの機能既知の変異（Ｇ４６４ＶおよびＶ６００Ｅ）が、実際にシグナル伝達経路を活性化する（試験した両方のＦＴＲによって決定されるとおり）ことを示している。結果は、さらに、機能未知の変異（Ｉ５４４Ｔ）も試験したシグナル伝達経路を活性化することを示し、これがドライバー変異であることを示す。さらに、ＦＴＲとしてＥＲＫ２を使用した場合（図１７Ａ）、機能未知のＩ５４４Ｔ変異を保有する変異ＢＲＡＦによる活性化レベルは、Ｇ４６４Ｖ変異よりも活性があると以前に報告されている、既知のＶ６００Ｅ変異を保有するＢＲＡＦについて観察されるものと同じくらい高い。
【０１７９】
したがって、本明細書に開示する方法を用いることによって、活性があると以前には知られていなかったＢＲＡＦ変異体（Ｉ５４４Ｔ）が、異常なシグナル伝達経路を誘導できる機能的に活性な変異体として特定される。
【０１８０】
実施例７：ＮＦκＢ、ＡＫＴおよびＪＮＫ経路の細胞内トランスロケーションアッセイは、ＷＴおよび変異体ＦＧＦＲを区別し、かつＦＧＦＲ変異の重症度をランク分けできる
ＨｅＬａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲと共に、ＷＴ  ＰＤＭ（ＥＧＦＲ−ＷＴ）または示した変異体ＰＤＭ（以下の変異：既知のドライバー変異（Ｇ７１９Ｓ）または３つの既知のドライバー変異Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０Ｍ（小分子ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を付与することが知られている）およびＬ８６１Ｑを含む変異体（３重変異）の１つを保有する、変異ＥＧＦＲ）でトランスフェクトした（上記のように）。トランスフェクション後３０時間の時点で、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。細胞質内および核内のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）内のＦＴＲの強度比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図１９Ａ〜図２３Ａに示す。図１９Ａでは、ＦＴＲはＲｅｌＡであり、図２０Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１であり、図２１Ａでは、ＦＴＲはＪＮＫ１α１であり、図２２Ａでは、ＦＴＲはＰ３８βであり、図２３Ａでは、ＦＴＲはＥＲＫ２である。図１９Ｂ〜２３Ｂは、それぞれのＦＴＲの局在化によって決定されるとおり、ＰＤＭ（ＦＧＦＲ）によって影響を受けるシグナル伝達経路の発癌マップを模式的に示す。要するに、結果は、試験ＦＧＦＲ変異体（Ｇ７１９Ｓおよび三重変異）はＮＦκＢのシグナル伝達経路に影響を与えるが（図１９Ａ〜１９Ｂ）、Ｐ３８経路には影響を与えない（図２２Ａ〜２２Ｂ）ことを示す。さらに、ＦＴＲとしてＡＫＴ１（図２０Ａ）またはＦＴＲとしてＥＲＫ２（図２３Ａ）を用いた場合は、いずれの変異体もこの経路を活性化するが、３重変異が（統計的に有意に）Ｇ１７９Ｓ変異よりも大きな程度まで活性化した。同様に、ＦＴＲとしてＪＮＫ１α１を用いた場合は、Ｇ７１９Ｓ変異体による活性化レベルはＷＴと類似していたが、３重変異はこの経路の活性化を引き起こした。
【０１８１】
したがって、本明細書に開示する方法を用いることによって、小分子阻害剤に対する固有の耐性を有するＥＧＦＲ３重変異（Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）が、単一のドライバー変異（Ｇ７１９Ｓ）と比較して強化されたシグナル伝達経路の活性化パターンを誘導することが示された。
【０１８２】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、現在の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、かつ一般的な概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を容易に変更および／または様々な用途のために適合させることができ、したがって、そのような適応および修正は、開示される実施形態の意味および均等物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、変更および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入る全てのそのような代替、変更、および変形を包含することが意図される。
【０１８３】
本願は以下の発明をも包含する。
（１）
癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）前記複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用してｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）増幅されたｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であってｃＤＮＡがプロモーターへ作動可能に連結されている工程；
ｅ）腫瘍からの前記増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによって、前記癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、前記シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
（２）
アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）
以下の工程をさらに含む、（２）に記載の方法：
ｇ）前記アッセイ細胞中への前記ＤＮＡ構築物およびベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で生存能力のあるアッセイ細胞を各遺伝子座に添加する工程；および
ｈ）前記腫瘍からの前記ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較する工程であって；
その際、前記癌患者の生体試料由来の前記ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞と、前記対応する野生型ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞との間の異なる結果が、患者特有のドライバー変異の候補として前記生体試料からのｃＤＮＡを特定するために使用される方法。
（４）
前記ＦＴＲの属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、（３）に記載の方法。
（５）
前記局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、（４）に記載の方法。
（６）
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、（２）に記載の方法。
（７）
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１をコードする、（２）に記載の方法。
（８）
前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される、（１）に記載の方法。
（９）
前記発現構築物の第１および／または第２のセットが２本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、（１）に記載の方法。
（１０）
前記発現構築物の第１および／または第２のセットの前記プロモーターが誘導性プロモーターである、（１）に記載の方法。
（１１）
トランスフェクト細胞内での前記発現構築物および／または発現ベクターの発現を誘導して前記腫瘍からのｃＤＮＡの前記第１のセットと前記アレイ中の各遺伝子座用の前記ＦＴＲの遺伝子産物を取得することをさらに含む、（１０）に記載の方法。
（１２）
前記発現構築物の第１および／または第２のセットの前記プロモーターが構成的プロモーターである、（１）に記載の方法。
（１３）
前記増幅されたｃＤＮＡの前記発現構築物がＩＲＥＳおよび第２のレポーター遺伝子をさらに含む、（１）に記載の方法。
（１４）
トランスフェクション試薬の存在下で固体支持体上の前記ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１５）
腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記腫瘍細胞から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）前記複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）工程（ｃ）の前記増幅されたｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であって、ｃＤＮＡがプロモーターへ作動可能に連結されている工程；
ｅ）前記腫瘍からの前記増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによって、前記腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、前記シグナル伝達タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
（１６）
前記アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）をさらに含む、（１５）に記載の方法。
（１７）
以下の工程をさらに含む、（１６）に記載の方法：
ｇ）前記アッセイ細胞内への前記ＤＮＡ構築物のコトランスフェクションを可能にする条件下で生存能力のあるアッセイ細胞を各遺伝子座に添加する工程；および
ｈ）前記腫瘍からの前記ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞内で発現した前記ＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較する工程であって；
腫瘍細胞由来のｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達タンパク質の候補として前記腫瘍細胞からの前記ｃＤＮＡを特定するために使用される方法。
（１８）
前記ＦＴＲの前記属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、（１７）に記載の方法。
（１９）
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、（１６）に記載の方法。
（２０）
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択されるタンパク質をコードする、（１６）に記載の方法。
（２１）
前記アッセイ細胞がＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９および癌患者の細胞から選択される、（１５）に記載の方法。
（２２）
前記腫瘍細胞が癌患者の腫瘍試料由来であり、前記腫瘍試料が生検、手術後の腫瘍切片、血液試料、気管支肺胞洗浄、および骨髄から選択される、（１５）に記載の方法。
（２３）
本方法により特定される異常なシグナル伝達タンパク質の候補が患者特有のドライバー変異である、（２２）に記載の方法。
（２４）
癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）前記複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）増幅されたｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であってｃＤＮＡがプロモーターへ作動可能に連結されている工程；
ｅ）アドレス可能なアレイにおいて、生存能力のあるアッセイ細胞を担体に添加する工程；
ｆ）前記腫瘍からの前記増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および前記対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットを添加する工程であって；発現構築物の各々が、前記アッセイ細胞中への前記発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アッセイ細胞にアドレス可能な異なる遺伝子座で添加される工程であって；
それにより、前記癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
（２５）
アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを前記アッセイ細胞に添加する工程（ｆ）をさらに含む、（２４）に記載の方法。
（２６）
腫瘍からの前記ｃＤＮＡを発現する前記細胞でＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較する工程をさらに含み；生体試料由来のｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞と、前記対応する野生型ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞との間の異なる結果が患者特有のドライバー変異の候補として前記生体試料からの前記ｃＤＮＡを特定するために使用される、（２５）に記載の方法。
（２７）
前記ＦＴＲの属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、（２６）に記載の方法。
（２８）
前記局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、（２７）に記載の方法。
（２９）
前記ＦＴＲの前記標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、（２５）に記載の方法。
（３０）
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択されるタンパク質をコードする、（２５）に記載の方法。
（３１）
前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される、（２４）に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
2019022506.tif 000044
【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
2019022506.tif 000046
【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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