(57)【要約】【課題】防御ＡｐｏＥアイソフォームを哺乳動物の中枢神経系に送達する方法を提供すること。【解決手段】本開示は、防御ＡｐｏＥアイソフォームを哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、前記非齧歯類哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを、前記上衣細胞が前記ＡｐｏＥを前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に分泌するように、前記哺乳動物のＣＳＦに投与することを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年５月１８日に出願された米国特許出願第６１／６４８，８０１号の優先権の利益を請求し、その出願は、本開示に参照によって組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の補助金援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＲＣ１ＡＧ０３６２６５による国庫補助によってなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含有する。２０１３年３月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは１７０２３．１２２ＷＯ１．ｔｘｔという名称であり、サイズが２０，２３４バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
遺伝子導入は、細胞および分子レベル両方で生物学的現象および疾患過程を分析するための強力なツールとして現在広く認識されている。より最近では、遺伝性（例えば、ＡＤＡ欠損症）または後天性（例えば、癌または感染性疾患）のヒト疾患の処置のための遺伝子療法の適用がかなり注目されている。改良された遺伝子導入技術の出現および絶えず拡大する欠陥遺伝子関連疾患ライブラリーの識別により、遺伝子療法は処置理論から実際の現実のものへと急速に発展している。
【０００５】
伝統的に、遺伝子療法は、先天性遺伝子エラーを訂正するために患者の細胞に外因性遺伝子を患者の細胞に導入する手当と定義されている。より最近では、遺伝子療法は、罹患生物への新規遺伝情報の導入による疾患表現型の訂正と広く定義されている。インビボ遺伝子療法では、導入遺伝子をインサイチューで（すなわち、レシピエント内で）レシピエント生物の細胞に導入する。インビボ遺伝子療法は動物モデルで実験されている。臓器および組織、例えば、筋肉、造血幹細胞、動脈壁、神経系および肺へのインサイチューでの直接遺伝子導入の実行可能性が報告されている。ＤＮＡの骨格筋、心筋への直接注射およびＤＮＡ−脂質複合体の血管系への注射もまた、検出可能な発現レベルの挿入遺伝子産物をインビボで生成すると報告されている。
【０００６】
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば、アルツハイマー病などの遺伝性脳疾患の処置は、依然として解決困難な問題である。脳疾患の処置の主な問題は、治療用タンパク質が、静脈内送達の場合には血液脳関門を通過せず、または脳への直接送達の場合には広く分布しないことである。したがって、アルツハイマー病を処置するための治療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるアルツハイマー病を処置する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸であって、前記非齧歯類哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することを含み、前記上衣細胞が、前記疾患を処置するように前記ＡｐｏＥを分泌する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「防御ＡｐｏＥアイソフォーム」は、アルツハイマー病のリスクを少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上低減するＡｐｏＥアイソフォームを識別するのに使用される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明は、防御ＡｐｏＥアイソフォームを非齧歯類哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、前記非齧歯類哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを、前記上衣細胞が前記ＡｐｏＥを前記哺乳動物のＣＳＦに分泌するように、前記非齧歯類哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４の感染率よりも２０％超高い比率、例えば、ＡＡＶ４の感染率よりも５０％超または１００％、１０００％または２０００％高い比率で、非齧歯類上衣細胞に感染するｒＡＡＶ２粒子である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明は、非齧歯類哺乳動物における疾患を処置する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを前記哺乳動物の上衣細胞に投与し、それにより、前記核酸を前記上衣細胞に送達することを含み、前記上衣細胞が、前記疾患を処置するように前記ＡｐｏＥタンパク質を分泌する方法を提供する。本発明は、核酸を哺乳動物における上衣細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むＡＡＶ粒子を前記哺乳動物に投与し、それにより、前記核酸を前記哺乳動物における上衣細胞に送達することを含む方法を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本発明は、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物の上衣細胞に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むベクターとを前記上衣細胞に投与し、それにより、前記核酸を前記上衣細胞に送達することを含む方法を提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本発明は、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むベクターとを前記哺乳動物由来の上衣細胞に投与すること、および前記上衣細胞を前記哺乳動物に戻し、それにより、前記核酸を前記哺乳動物に送達することを含む方法を提供する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、本発明は、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物における上衣細胞に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むベクターとを前記哺乳動物に投与し、それにより、前記核酸を前記哺乳動物における上衣細胞に送達することを含む方法を提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物脳の上衣細胞をトランスフェクトする方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、前記哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを、前記上衣細胞が前記薬剤を前記哺乳動物のＣＳＦに分泌するように、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、哺乳動物は非齧歯類哺乳動物である。ある特定の実施形態では、非齧歯類哺乳動物は、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはイヌである。ある特定の実施形態では、霊長類はヒトである。
【００１５】
ある特定の実施形態では、防御ＡｐｏＥアイソフォームは、ＡｐｏＥε２と少なくとも約８０％の相同性を有する。ある特定の実施形態では、防御ＡｐｏＥアイソフォームは、ＡｐｏＥε２と１００％の相同性を有する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ４粒子である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ２粒子である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３と少なくとも８０％の相同性を有する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２カプシドＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３と１００％の相同性を有する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物における上衣細胞をトランスフェクトして治療結果をもたらすのに使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトなどの動物におけるアルツハイマー病の処置または予防に有用な医薬を製造するためのｒＡＡＶ粒子の使用であって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子の使用を提供する。
【００１９】
本発明は、医学的な処置または診断に使用するための上記細胞を提供する。
【００２０】
本発明は、哺乳動物におけるアルツハイマー病を処置するのに有用な医薬を調製するための上記細胞を提供する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、動物におけるアルツハイマー病を処置するためのキットであって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子の化合物と、容器と、ＣＳＦへの前記ＡＡＶ粒子の投与を指示する添付文書またはラベルとを含むキットを提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
哺乳動物におけるアルツハイマー病を処置する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸であって、該哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを該哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することを含み、該上衣細胞が、該アルツハイマー病を処置するように該ＡｐｏＥを分泌する、方法。
（項目２）
防御ＡｐｏＥアイソフォームを哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、該防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、該哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを、該上衣細胞が該ＡｐｏＥを該哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に分泌するように、該哺乳動物のＣＳＦに投与することを含む、方法。
（項目３）
哺乳動物における疾患を処置する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを該哺乳動物の上衣細胞に投与し、それにより、該核酸を該上衣細胞に送達することを含み、該上衣細胞が、該疾患を処置するように該ＡｐｏＥタンパク質を分泌する、方法。
（項目４）
防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物の上衣細胞に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された該核酸を含むベクターとを該上衣細胞に投与し、それにより、該核酸を該上衣細胞に送達することを含む、方法。
（項目５）
防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された該核酸を含むベクターとを該哺乳動物由来の上衣細胞に投与すること、および該上衣細胞を該哺乳動物に戻し、それにより、該核酸を該哺乳動物に送達することを含む、方法。
（項目６）
防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物における上衣細胞に送達する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された該核酸を含むベクターとを該哺乳動物に投与し、それにより、該核酸を該哺乳動物における上衣細胞に送達することを含む、方法。
（項目７）
哺乳動物脳の上衣細胞をトランスフェクトする方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、該哺乳動物における上衣細胞に感染するのに有効な様式で一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターとを、該上衣細胞が該薬剤を該哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に分泌するように、該哺乳動物のＣＳＦに投与することを含む、方法。
（項目８）
前記哺乳動物が非齧歯類哺乳動物である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記非齧歯類哺乳動物が霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはイヌである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記非齧歯類哺乳動物がイヌである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記非齧歯類哺乳動物が霊長類である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記霊長類がヒトである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記防御ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥε２と８０％の相同性を有する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記防御ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥε２と１００％の相同性を有する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
哺乳動物における上衣細胞をトランスフェクトして治療結果をもたらすのに使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有する、ｒＡＡＶ粒子。
（項目１６）
前記哺乳動物が非齧歯類哺乳動物である、項目１５に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目１７）
前記非齧歯類哺乳動物が霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはイヌである、項目１６に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目１８）
前記非齧歯類哺乳動物がイヌである、項目１７に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目１９）
前記非齧歯類哺乳動物が霊長類である、項目１７に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目２０）
前記霊長類がヒトである、項目１９に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目２１）
前記防御ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥε２と８０％の相同性を有する、項目１５〜２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目２２）
前記タンパク質がＡｐｏＥε２と１００％の相同性を有する、項目１５〜２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目２３）
ヒトなどの動物におけるアルツハイマー病の処置または予防に有用な医薬を製造するためのｒＡＡＶ粒子の使用であって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子の使用。
（請求項２４）
動物におけるアルツハイマー病を処置するためのキットであって、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子の化合物と、容器と、ＣＳＦへの該ＡＡＶ粒子の投与を指示する添付文書またはラベルとを含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＡＡＶ４−ＡｐｏＥを脳室内注射すると、脳でｈｕＡＰＯＥが安定的に発現し、組換えｈｕＡｐｏＥタンパク質が持続的に検出される。
【００２３】
【図２】各ＡｐｏＥアイソフォームの．過剰発現は、アミロイドーシスの進行に差次的に影響を与える。
【００２４】
【図３】アミロイドプラークのサイズは、各ＡｐｏＥアイソフォームによって異なる。
【００２５】
【図４】アミロイド負荷の死後評価により、アミロイド沈着に対するＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４の効果を確認する。
【００２６】
【図５】各ＡｐｏＥアイソフォーム（ｉｓｆｏｒｍ）は、アミロイド沈着周囲のシナプス密度に差次的に影響を与える。
【００２７】
【図６Ａ−１】図６Ａは、ＡＡＶ２（配列番号１）およびＡＡＶ４（配列番号２）タンパク質のアライメントであり、図６Ｂは、ＡＡＶ２（配列番号３）およびＡＡＶ４（配列番号４）ヌクレオチドのアライメントであり、これらはＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）の配列に基づくものである。
【図６Ａ−２】同上。
【図６Ａ−３】同上。
【図６Ｂ−１】同上。
【図６Ｂ−２】同上。
【図６Ｂ−３】同上。
【図６Ｂ−４】同上。
【図６Ｂ−５】同上。
【図６Ｂ−６】同上。
【図６Ｂ−７】同上。
【００２８】
【図７】図７は、様々な脳領域におけるＴＰＰ１活性の上昇を示す。
【００２９】
【図８】図８は、対照および処置イヌのＴ迷路行動の結果を示す。白丸は、罹患イヌのものである；黒四角は、正常なイヌのものであり、黒丸は、ＡＡＶ２−ＣＬＮ２で処置したＴＰＰ−／−イヌのものである。
【００３０】
【図９】図９Ａ〜９Ｂ。ＡＡＶ血清型４の脳室内注射によるＡＰＯＥ遺伝子導入法の検証。ＧＦＰまたはＡｐｏＥの免疫組織標識により、上衣および脈絡叢におけるＧＦＰまたはヒトＡｐｏＥタンパク質の存在が明らかになった。（Ａ）種特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、注射マウスの脳ホモジネート内の組換えヒトＡｐｏＥタンパク質濃度を定量した。（Ｂ）マウス１匹当たりの内因性ａｐｏＥと比較した、ヒトＡｐｏＥタンパク質の割合の評価。ヒトＡｐｏＥとマウス内因性ａｐｏＥとの比を、各動物について計算した。特異的抗ヒトＡｐｏＥ抗体３Ｈ１を使用して、組換えタンパク質の存在がいくつかのアミロイド沈着周囲で検出することができたところ、それは、ＡＰＰ／ＰＳ１注射マウスの皮質実質内に蓄積する傾向がある。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４ベクターを注射したａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）マウスのＩＳＦ試料におけるウエスタンブロットによるＡｐｏＥの検出。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の高感度（しかし、非種特異的）ヤギ抗ａｐｏＥ抗体（ＡＢ９４７）を検出抗体として使用した。アルブミンを対照として使用した。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３１】
【図１０−１】Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射トランスジェニックマウスの皮質（左のパネル）および海馬（右のパネル）におけるアミロイド沈着密度の分析。両脳領域間で同様の傾向を観察することができたが、データは皮質においてのみ統計的有意に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分におけるＡβ４０およびＡβ４２ペプチド濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後のＴＢＳ可溶性画分におけるＡβ４０およびＡβ４２ペプチドレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターをＡＰＰ／ＰＳ１マウスに脳室内注射した５カ月後の血漿Ａβ４０ペプチドレベルの定量。ｎ＝動物４〜７匹／群。＊ｐ＜０．０５
【図１０−２】Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射トランスジェニックマウスの皮質（左のパネル）および海馬（右のパネル）におけるアミロイド沈着密度の分析。両脳領域間で同様の傾向を観察することができたが、データは皮質においてのみ統計的有意に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分におけるＡβ４０およびＡβ４２ペプチド濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後のＴＢＳ可溶性画分におけるＡβ４０およびＡβ４２ペプチドレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターをＡＰＰ／ＰＳ１マウスに脳室内注射した５カ月後の血漿Ａβ４０ペプチドレベルの定量。ｎ＝動物４〜７匹／群。＊ｐ＜０．０５
【００３２】
【図１１】各ＡＰＯＥ変異体の過剰発現は、インビボにおけるアミロイドーシスの進行を調節する。ＡＡＶ−ＧＦＰ、−ＡＰＯＥ２、−３または−４ベクターを脳室内注射した１週間（Ｔ０）、１カ月（Ｔ１）および２カ月（Ｔ２）後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着のインビボ二光子画像を現像した。同じ視野を経時的に追跡することができるように、デキストラン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（７０，０００Ｄａ）の静脈内注射をイメージング前に実施した。２カ月の期間内では、いくつかの新たなアミロイドプラークを検出することができたのに対して、当初目に見えた偶発的な沈着は、１または２カ月後にはもはや検出不可能であった。（Ａ）ＡＡＶ−ＧＦＰ、−ＡＰＯＥ２、−ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４を７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに脳室内注射した後２カ月間にわたるアミロイド沈着の体積皮質密度の評価。各動物について６〜８つの視野を縦方向にイメージングし、皮質体積当たりのプラーク密度を計算し、ベースライン（Ｔ０）における各動物の初期値に対して報告した。アミロイド沈着密度０．２３の全体的な進行が経時的に観察された（Ｔ２／Ｔ１、ｐ＜０．０１１）。加えて、ＡｐｏＥ２は密度を有意に、ＧＦＰとの比較では０．６６（ｓｅ＝０．２１、ｐ＝０．００２）、ＡｐｏＥ３との比較では０．６７（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）およびＡｐｏＥ４との比較では０．７４（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）減少させる。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける遺伝子導入後２カ月間にわたるアミロイドーシス進行の線形回帰フィットは、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ４のみがこの期間中に有意な正の斜線をもたらすことを示している。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３３】
【図１２】ＡｐｏＥ２、−３および−４を注入した１または２カ月後のアミロイド沈着サイズの変遷。Ｔ１とＴ０との間のプラークサイズの比を表す散布ドットプロットにより、１カ月後において、ＡｐｏＥ４は、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３の両方と比較して増加したプラーク成長に関連していたことが示された。２カ月後において、この効果は持続していない。ｎ＞測定したプラーク５０個／群（動物３〜４匹以内）。＊ｐ＜０．０５。
【００３４】
【図１３−１】アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、各ＡＰＯＥ変異体によって差次的に影響を受ける。ＡＡＶ−ＧＦＰ、−ＡＰＯＥ２、−ＡＰＯＥ３および−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＰＳＤ９５（シナプス後要素）およびアミロイド沈着について免疫染色したアレイトモグラフィー切片の画像を作成した。毒性Ａβオリゴマー種を選択的に標識することを先に示した抗体ＮＡＢ６１を使用して、アミロイド沈着を標識した。（Ａ）ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の両方を発現させた場合のアミロイドプラーク周辺では、ＧＦＰまたはＡＰＯＥ２と比較して有意に多くのシナプシン１マーカーの消失が観察された。（Ｂ）シナプス後要素を定量したところ同様の効果が観察され、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後において、沈着周囲のＰＳＤ９５密度が減少していた。ＴｈｉｏＳおよび軸索マーカーＳＭＩ３１２について免疫染色した後に、注射ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳において、神経病理学的変化のさらなるパラメータとして、アミロイドプラーク当たりの神経突起ジストロフィーの数を評価した。（Ｃ）ＡｐｏＥ４をマウスに注入した場合、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２群と比較して、ジストロフィーの数がより多くなる有意な傾向が観察されたが、これは、ＡｐｏＥ４がアミロイドプラーク形成の他にも有害効果を有し、より小さなオリゴマーアミロイド凝集体の神経毒性潜在能力を調節し得ることを示唆している。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【図１３−２】アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、各ＡＰＯＥ変異体によって差次的に影響を受ける。ＡＡＶ−ＧＦＰ、−ＡＰＯＥ２、−ＡＰＯＥ３および−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＰＳＤ９５（シナプス後要素）およびアミロイド沈着について免疫染色したアレイトモグラフィー切片の画像を作成した。毒性Ａβオリゴマー種を選択的に標識することを先に示した抗体ＮＡＢ６１を使用して、アミロイド沈着を標識した。（Ａ）ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の両方を発現させた場合のアミロイドプラーク周辺では、ＧＦＰまたはＡＰＯＥ２と比較して有意に多くのシナプシン１マーカーの消失が観察された。（Ｂ）シナプス後要素を定量したところ同様の効果が観察され、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後において、沈着周囲のＰＳＤ９５密度が減少していた。ＴｈｉｏＳおよび軸索マーカーＳＭＩ３１２について免疫染色した後に、注射ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳において、神経病理学的変化のさらなるパラメータとして、アミロイドプラーク当たりの神経突起ジストロフィーの数を評価した。（Ｃ）ＡｐｏＥ４をマウスに注入した場合、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２群と比較して、ジストロフィーの数がより多くなる有意な傾向が観察されたが、これは、ＡｐｏＥ４がアミロイドプラーク形成の他にも有害効果を有し、より小さなオリゴマーアミロイド凝集体の神経毒性潜在能力を調節し得ることを示唆している。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３５】
【図１４】Ｔｇ２５７６マウスでＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、−３、−４を脳室内注射した後のＩＳＦでは、オリゴマーＡβ種の含有量の初期変化が観察される。８２Ｅ１／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＩＳＦのｏＡβ含有量の定量は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４注射後において、オリゴマーアミロイドβ種の濃度がＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２および−ＧＦＰと比較して高いのに対して、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３注射マウスは中間レベルに達したことを示している。ｎ＝動物３〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３６】
【図１５−１】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＡＡＶ４を脳室内注射した後のヒトおよび内因性マウスＡＰＯＥ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出。（Ａ）注射マウスの脳における内因性マウスａｐｏＥタンパク質の量を表すボックスブロットグラフ。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＡＡＶ４を脳室内注射した２および５カ月後のＡｐｏＥタンパク質レベルの比較（ＡＰＯＥ変異体を区別せずに、２および５カ月の時点において、すべてのＡｐｏＥ注射マウス由来の試料を共にプールした）。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【図１５−２】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＡＡＶ４を脳室内注射した後のヒトおよび内因性マウスＡＰＯＥ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出。（Ａ）注射マウスの脳における内因性マウスａｐｏＥタンパク質の量を表すボックスブロットグラフ。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでＡＡＶ４を脳室内注射した２および５カ月後のＡｐｏＥタンパク質レベルの比較（ＡＰＯＥ変異体を区別せずに、２および５カ月の時点において、すべてのＡｐｏＥ注射マウス由来の試料を共にプールした）。ｎ＝動物４〜６匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３７】
【図１６−１】短期（２カ月間）曝露後において、Ａβに対する効果は、各ＡｐｏＥアイソフォームに関連している。注射２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着の画像を作成した。Ｂａｍ１０抗体およびＴｈｉｏＳの両方を使用した免疫染色を使用して、それぞれすべてのアミロイド沈着または高密度コアプラークを染色した。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着密度の立体分析により、ＡＰＯＥ４を過剰発現させると早ければ注射２カ月後にプラーク数が増加したのに対して、他の実験群間では差異が観察されなかったことが明らかになった。（Ｂ）他方、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳ染色との間の比は、すべての異なる群間で依然として不変であった。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体を短期曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０（左のパネル）およびＡβ４２（右のパネル）ペプチド濃度の決定。ｎ＝動物３〜５匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【図１６−２】短期（２カ月間）曝露後において、Ａβに対する効果は、各ＡｐｏＥアイソフォームに関連している。注射２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着の画像を作成した。Ｂａｍ１０抗体およびＴｈｉｏＳの両方を使用した免疫染色を使用して、それぞれすべてのアミロイド沈着または高密度コアプラークを染色した。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着密度の立体分析により、ＡＰＯＥ４を過剰発現させると早ければ注射２カ月後にプラーク数が増加したのに対して、他の実験群間では差異が観察されなかったことが明らかになった。（Ｂ）他方、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳ染色との間の比は、すべての異なる群間で依然として不変であった。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体を短期曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０（左のパネル）およびＡβ４２（右のパネル）ペプチド濃度の決定。ｎ＝動物３〜５匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【００３８】
【図１７】Ｔｇ２５７６マウスにおける注射３カ月後に検出された可溶性および不溶性Ａβ種の変化。（Ａ）ＥＬＩＳＡによるＩＳＦのＡβ４０およびＡβ４２（Ｂ）含有量の定量は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４注射後の可溶性アミロイドβペプチド濃度が、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、−ＡＰＯＥ３および−ＧＦＰと比較して高い傾向があることを示している。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスで先に観察されたように、ＡｐｏＥ４でより強い効果が観察され、これが、Ｔｇ２５７６マウスのギ酸画分におけるＡβ４２の量が有意に高い原因である。ｎ＝動物３〜５匹／群。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
いくつかの異なるヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）アイソフォームがあり、これらのアイソフォームのいくつかが脳に存在することはアルツハイマー病（ＡＤ）のリスクを増加させるのに対して、他のアイソフォームの存在はＡＤのリスクを減少させる。ＡｐｏＥε４アイソフォームの存在は、遅発性散発性ＡＤの強力な遺伝的リスク因子である。（Ｃａｓｅｌｌａｎｏら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，３（８９）：８９ｒａ５７（２９  Ｊｕｎｅ  ２０１１）．）。ＡｐｏＥε４対立遺伝子はＡＤのリスクを強く増加させ、発症年齢を低下させる。他方、ＡｐｏＥε２対立遺伝子の存在は、ＡＤのリスクを減少させると思われる。ヒトＡｐｏＥアイソフォームは、インビボでアミロイドβ（Ａβ）のクリアランスまたは合成に差次的に影響を与えることが示唆されている。
【００４０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小型の非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製をヘルパーウイルスに依存する点でこの科の他のメンバーと区別可能である。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、第１９染色体のｑ腕に遺伝子座特異的に組み込まれ得る。ＡＡＶの約５ｋｂのゲノムは、＋または−いずれかの極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノム末端は短い逆方向末端リピートであり、ヘアピン構造にフォールディングしてウイルスＤＮＡの複製起点として機能し得る。物理的には、パルボウイルスビリオンは、エンベロープで包まれておらず、その正二十面体カプシドは、直径約２０ｎｍである。
【００４１】
今日までに、血清学的に区別可能な８つのＡＡＶが同定されており、５つがヒトまたは霊長類から単離されたものであり、ＡＡＶ１〜５型と称される。Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ４，”Ｊ．Ｖｉｒ．，８０（２３）：１１５５６−１１５７０（２００６）。ＡＡＶ２のゲノムは長さが４６８０ヌクレオチドであり、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。左側のＯＲＦは、非構造的Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８をコードし、これらは、一本鎖子孫ゲノムの産生に加えて複製および転写の調節に関与する。さらに、Ｒｅｐタンパク質の２つが、ヒト第１９染色体のｑ腕領域へのＡＡＶゲノムの選択的な組み込みに関連している。Ｒｅｐ６８／７８もまた、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示されている。Ｒｅｐタンパク質は、核局在化シグナルおよびいくつかの潜在的リン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位の１つの突然変異は、複製活性の喪失をもたらした。
【００４２】
ゲノム末端は短い逆方向末端リピート（ＩＴＲ）であり、ウイルスＤＮＡの複製起点として機能するＴ型ヘアピン構造にフォールディングする可能性がある。ＩＴＲ領域内において、２つの要素（ＧＡＧＣ反復モチーフおよび末端解離部位（ｔｒｓ））がＩＴＲの機能の中心であると言われている。この反復モチーフは、ＩＴＲが直線またはヘアピン構造のいずれかである場合に、Ｒｅｐに結合することが示されている。この結合は、部位および鎖特異的に起こるｔｒｓにおける切断のためにＲｅｐ６８／７８を配置するのに役立つ。複製におけるその役割に加えて、これら２つの要素は、ウイルス組み込みの中心であると思われる。隣接するｔｒｓを含むＲｅｐ結合部位が、第１９染色体組み込み遺伝子座内に含まれている。これらの要素は、遺伝子座特異的組み込みに機能的および必要であることが示されている。
【００４３】
ＡＡＶ２ビリオンは、エンベロープで包まれていない直径約２５ｎｍの正二十面体粒子であり、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と称される３つの関連タンパク質からなる。右側のＯＲＦは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質はそれぞれ１：１：１０の比で見られ、すべてが右側のＯＲＦにすべて由来する。このカプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび珍しい開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失分析により、選択的スプライシングされたメッセージから翻訳されたＶＰ１の除去または変化は、感染生粒子の産生量の減少をもたらすことが示されている。ＶＰ３コード領域内の突然変異は、いかなる一本鎖子孫ＤＮＡおよび感染性粒子も生産することができなくする。ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶ２カプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のポリペプチド全体をコードし得る。粒子は、ＡＡＶ２および他のＡＡＶカプシドタンパク質を含む粒子（すなわち、ＡＡＶ４およびＡＡＶ２などのキメラタンパク質）であり得る。ＡＡＶ２カプシドを含む得られたウイルス粒子が、標準的な方法によってルーチンに決定した場合にＡＡＶ４と抗原的または免疫学的に依然として区別可能である限り、本明細書では、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子がＡＡＶ４と抗原的または免疫学的に区別可能であるかを決定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、ＡＡＶ４と区別可能な組織親和性を保持する。
【００４４】
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードするＡＡＶ２カプシドポリペプチドは全体的に、配列番号１に記載されているヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＡＶ２カプシドタンパク質）と少なくとも約６３％の相同性（または同一性）を有し得る。カプシドタンパク質は、配列番号１に記載されているタンパク質と約７０％の相同性、約７５％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性またはさらに１００％の相同性を有し得る。カプシドタンパク質は、配列番号１に記載されているタンパク質と約７０％の同一性、約７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性またはさらに１００％の同一性を有し得る。粒子は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ２カプシドタンパク質の両方を含む粒子（すなわち、キメラタンパク質）であり得る。ＡＡＶ２カプシドを含む得られたウイルス粒子が、標準的な方法によってルーチンに決定した場合にＡＡＶ４と抗原的または免疫学的に依然として区別可能である限り、本明細書では、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子がＡＡＶ４と抗原的または免疫学的に区別可能であるかを決定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、ＡＡＶ４と区別可能な組織親和性（例えば、本明細書の実施例に例示されているもの）を保持するが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子のものと異なる組織親和性を有し得る。
【００４５】
図６Ａおよび６Ｂに示されているように、ＡＡＶ２カプシド配列およびＡＡＶ４カプシド配列は、約６０％相同である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２カプシドは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも６５％相同の配列を含む（または、からなる）。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本発明はさらに、一対のＡＡＶ２逆方向末端リピートを含むベクターを含有する（すなわち、カプシド化する）ＡＡＶ２粒子提供する。ＡＡＶ２  ＩＴＲのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。さらに、粒子は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ２カプシドタンパク質の両方を含む粒子（すなわち、キメラタンパク質）であり得る。また、粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ８）由来の一対のＡＡＶ逆方向末端リピートを含むベクターをカプシド化する粒子であり得る。粒子中にカプシド化されたベクターは、逆方向末端リピート間に挿入された外因性核酸をさらに含み得る。
【００４７】
ＡＡＶの以下の特徴によって、ＡＡＶは、魅力的な遺伝子導入用ベクターとなっている。ＡＡＶベクターは、インビトロで細胞のゲノムに安定に組み込まれ；広い宿主域を有し；インビトロおよびインビボで、分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入して高レベルの形質導入遺伝子の発現を維持することが示されている。ウイルス粒子は熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨ変化、温度に耐性であり、ＣｓＣｌ勾配で濃縮され得る。ＡＡＶプロウイルスの組み込みは、細胞の成長または分化に対するいかなる長期の負の効果にも関連しない。ＩＴＲは、複製、パッケージングおよび組み込みに必要とされる唯一のシス要素であり、いくつかのプロモーター活性を含有し得ることが示されている。
【００４８】
本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクターおよび組換えＡＡＶビリオンを投与する方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子であり、またはＡＡＶ４粒子は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２の少なくとも１つのユニークな核酸を含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含有する粒子である。用語「ＡＡＶ２  ＩＴＲ」の範囲内であるとみなされるためには、ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２  ＩＴＲをＡＡＶ４  ＩＴＲと区別する本明細書に記載される特徴：（１）（ＡＡＶ４のように４つではなく）３つの「ＧＡＧＣ」リピート、および（２）ＡＡＶ２  ＩＴＲ  Ｒｅｐ結合部位において、最初の２つの「ＧＡＧＣ」リピートの４番目のヌクレオチドがＴではなくＣであること、の一方または両方を保持しなければならない。
【００４９】
プロモーターは、そのプロモーターに機能的に連結された核酸の発現レベル、およびベクターを使用するべき細胞型などの公知の検討事項によって選択される任意の所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外因性または内因性プロモーターであり得る。プロモーターとしては、例えば、公知の強力なプロモーター、例えばＳＶ４０または誘導性メタロチオネインプロモーター、またはＡＡＶプロモーター、例えばＡＡＶ  ｐ５プロモーターが挙げられ得る。プロモーターのさらなる例としては、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などが挙げられる。具体的には、プロモーターは、ＡＡＶ２  ｐ５プロモーターまたはＡＡＶ４  ｐ５プロモーターであり得る。さらに、プロモーター活性を保持するより小さなｐ５プロモーター断片は、例えば、一連の欠失をｐ５プロモーターに構築すること、前記欠失をレポーター遺伝子に関連付けること、および前記レポーター遺伝子が発現（すなわち、転写および／または翻訳）されるかを決定することを含む標準的な手順によって容易に決定することができる。
【００５０】
ＡＡＶベクターは、プロモーターに機能的に連結された外因性（異種）核酸をさらに含み得る。「異種核酸」は、任意の異種または外来性核酸が、細胞、組織または生物への導入用のベクターに挿入され得ることを意味する。例えば、ある特定の実施形態では、異種核酸は、防御ＡｐｏＥアイソフォームをコードする。「機能的に連結された」は、プロモーターが、当技術分野で公知のように異種核酸の発現を促進し得るようなこと、例えば、異種核酸に対するプロモーターの適切な方向を意味する。さらに、異種核酸は、好ましくは、機能的にコードする（すなわち、核酸の発現を可能にする）ために当技術分野で公知の核酸の発現に適切なすべての配列を有する。核酸は、例えば、発現制御配列、例えばエンハンサーおよび必要な情報処理部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。核酸は、パッケージングされ得る核酸のサイズによってのみ制限される複数の遺伝子産物をコードし得る。
【００５１】
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶ２カプシドを含む得られたウイルス粒子が、標準的な方法によってルーチンに決定した場合にＡＡＶ４と抗原的または免疫学的に依然として区別可能である限り、本明細書では、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が他のＡＡＶ血清型と抗原的または免疫学的に区別可能であるかを決定することができる。
【００５２】
ＡＡＶ４は、ＡＡＶファミリーのユニークなメンバーである。ＡＡＶ４についての議論は、米国特許第６，４６８，５２４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。ＤＮＡハイブリダイゼーションデータにより、ＡＡＶ１〜４について類似レベルの相同性が示された。しかしながら、他のＡＡＶとは対照的に、ＡＡＶ４では、カプシドタンパク質に対応するＯＲＦが１つしか同定されず、Ｒｅｐタンパク質についてはＯＲＦが検出されなかった。本発明は、ＡＡＶ４ウイルスおよびＡＡＶ４ウイルス粒子を含むベクターを提供する。ＡＡＶ４はＡＡＶ２に類似するが、この２つのウイルスは、物理的および遺伝的に区別可能であることが本明細書で見出されている。これらの差異は、それを遺伝子療法用ベクターとしてより適したものにするいくつかのユニークな利点をＡＡＶ４に与える。例えば、野生型ＡＡＶ４ゲノムはＡＡＶ２よりも大きく、より大きな組換えゲノムの効率的なカプシド化を可能にする。さらに、野生型ＡＡＶ４粒子はＡＡＶ２粒子よりも大きい浮遊密度を有するので、混入したヘルパーウイルスおよび空のＡＡＶ粒子から、ＡＡＶ２ベースの粒子よりも容易に分離される。加えて、ＡＡＶ１、２および３とは対照的に、ＡＡＶ４は、ヒト、モルモットおよびヒツジ赤血球を凝集させることができる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＡＶ５ウイルスを含むベクター、またはこのウイルスのサブパート（ｓｕｂｐａｒｔ）を含むベクター、ならびにＡＡＶ５ウイルス粒子を提供する。米国特許第６，８５５，３１４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）には、ＡＡＶ５についての議論が示されている。ＡＡＶ５はＡＡＶ２に類似するが、この２つのウイルスは、物理的および遺伝的に区別可能であることが本明細書で見出されている。これらの差異は、それを遺伝子療法用ベクターとしてより適したものにするいくつかのユニークな利点および特性をＡＡＶ５に与える。例えば、ＡＡＶ２を遺伝子療法用ベクターとして使用することの限定的特徴の１つは、大量のウイルスの生産である。標準的な生産技術を使用して、ＡＡＶ５は、ＡＡＶ２と比較して１０〜５０倍高いレベルで生産される。そのユニークなＴＲＳ部位およびｒｅｐタンパク質により、ＡＡＶ５はまた、ＡＡＶ２と比較して区別可能な組み込み遺伝子座を有するはずである。
【００５４】
さらに、ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、また驚くべきことに、ＡＡＶ２カプシドタンパク質と区別可能であり異なる組織親和性を示すので、ＡＡＶ５カプシドを含有する粒子は、ＡＡＶ２が不適切であるかまたは十分に適切ではない細胞型に形質導入するのに適切である。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は血清学的に区別可能であることが示されているので、遺伝子療法適用において、ＡＡＶ５およびＡＡＶ５由来のベクターは、天然の免疫学的防御の結果として、または過去にＡＡＶ２ベクターに曝露されたことによりＡＡＶ２に対する中和抗体を既に保有する患者の形質導入を可能にする。ＡＡＶ５の別の利点は、ＡＡＶ５が他の血清型によってレスキューされ得ないことである。ＡＡＶ５のみが、組み込まれたＡＡＶ５ゲノムをレスキューして複製をもたらし、それにより他のＡＡＶ血清型によって引き起こされる非意図的なＡＡＶ５複製を回避することができる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質およびその断片を含む。したがって、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では互換的に使用されることが多い。置換は、中立であるように公知のパラメータによって選択され得る。当業者であれば理解するように、本発明はまた、アミノ酸配列または他の特性にわずかな変化を有するポリプチドを含む。このような変化は、（例えば、遺伝的多型に起因する）対立遺伝子の変化として天然に生じ得るか、または誘導点突然変異体、欠失突然変異体、挿入突然変異体および置換突然変異体の誘導などの人為的介入によって（例えば、クローニングされたＤＮＡ配列の突然変異誘発によって）生成され得る。アミノ酸配列の軽微な変化（例えば、保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失または挿入、および分子末端における付加または欠失）が一般に好ましい。これらの改変は、アミノ酸配列の変化をもたらし得るか、サイレント突然変異を提供し得るか、制限部位を改変し得るか、または他の特定の突然変異を提供し得る。
【００５６】
本方法は、核酸を細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を前記細胞に投与し、それにより、前記核酸を前記細胞に送達することを含む方法を提供する。場合により所望の液体（例えば、組織培養培地または緩衝生理食塩水溶液）に含まれる粒子と細胞とを単に接触させることを含む任意の手段によって、細胞への投与を達成することができる。任意の所望の長さの時間にわたって粒子を細胞と接触した状態にすることができ、典型的には粒子を投与して無期限に放置することができる。このようなインビトロ方法の場合、ウイルスは、当技術分野で公知の、および本明細書に例示される標準的なウイルス形質導入法によって細胞に投与することができる。投与するウイルスの力価は、特に細胞型に応じて変化し得るが、ＡＡＶ形質導入に一般に使用されるものに典型的なものであろう。加えて、本実施例で特定の細胞に形質導入するのに使用した力価を利用することができる。細胞としては、ヒトならびに他の大型（非齧歯類）哺乳動物、例えば霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびイヌにおける任意の所望の細胞が挙げられ得る。
【００５７】
より具体的には、本発明は、核酸を上衣細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を前記上衣細胞に投与し、それにより、前記核酸を前記上衣細胞に送達することを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明はまた、核酸を被験体に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むＡＡＶ粒子を前記被験体由来の細胞に投与すること、および前記細胞を前記被験体に戻し、それにより、前記核酸を前記被験体に送達することを含む方法を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得る。例えば、このようなエクスビボ投与では、細胞型にしたがって標準的な手段によって細胞を被験体から単離し、再び細胞型にしたがって適切な培養培地に配置する。次いで、上記のようにウイルス粒子を細胞と接触させ、ウイルスを細胞にトランスフェクトさせる。次いで、再び細胞型および組織について標準的な手段によって、細胞を被験体の身体に再移植し得る。所望であれば、移植前に、公知の検出手段によって、本明細書に記載されるように、ウイルスによるトランスフェクションの程度について細胞を研究し得る。
【００５９】
本発明はさらに、核酸を被験体における細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むＡＡＶ粒子を前記被験体に投与し、それにより、前記核酸を前記被験体における細胞に送達することを含む方法を提供する。投与は、被験体から取り出した細胞（例えば、上記で列挙した細胞のいずれか）への直接的なエクスビボ投与であり得、続いて細胞を被験体に戻して交換し得るか、または投与は、被験体における細胞へのインビボ投与であり得る。エクスビボ投与の場合、細胞型にしたがって標準的な手段によって細胞を被験体から単離し、再び細胞型にしたがって適切な培養培地に配置する。次いで、上記のようにウイルス粒子を細胞と接触させ、ウイルスを細胞にトランスフェクトさせる。次いで、再び細胞型および組織について標準的な手段によって、細胞を被験体の身体に再移植し得る。所望であれば、移植前に、公知の検出手段によって、本明細書に記載されるように、ウイルスによるトランスフェクションの程度について細胞を研究し得る。
【００６０】
また、核酸を被験体における上衣細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ逆方向末端リピート間に挿入された前記核酸を含むＡＡＶ粒子を前記被験体に投与し、それにより、前記核酸を前記被験体における上衣細胞に送達することを含む方法提供される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的とするアミノ酸配列は、疾患、例えばアルツハイマー病を有する被験体における脳血管内皮を標的とする。
【００６２】
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的とするアミノ酸配列は、アルツハイマー病を有しない被験体における脳血管内皮を標的とする。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、治療剤をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、治療剤は、防御ＡｐｏＥアイソフォームである。
【００６４】
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウイルスベクターを含む細胞を提供する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、細胞は、非齧歯類哺乳動物の哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は霊長類細胞である。ある特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞はインビトロである。ある特定の実施形態では、細胞はインビボである。ある特定の実施形態では、細胞は上衣細胞である。
【００６６】
本開示のある特定の実施形態は、哺乳動物における疾患を処置する方法であって、本明細書に記載されるウイルスベクターまたは細胞を前記哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００６７】
ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６８】
本開示のある特定の実施形態は、薬剤を被験体の中枢神経系に送達する方法であって、形質導入上衣細胞が前記治療剤を発現し、前記薬剤を前記被験体の前記中枢神経系に送達するように、本明細書に記載されるウイルスベクターをＣＳＦに投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、上衣細胞に形質導入する。
【００６９】
本開示のある特定の実施形態は、医学的処置に使用するための本明細書に記載されるウイルスベクターまたは細胞を提供する。
【００７０】
本開示のある特定の実施形態は、哺乳動物における疾患、例えばアルツハイマー病を処置するのに有用な医薬を調製するための本明細書に記載されるウイルスベクターまたは細胞の使用を提供する。
【００７１】
ベクターは、防御ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、用語「分泌タンパク質」は、天然に分泌されるか、またはそれが分泌され得るようなシグナル配列を含有するように改変されるかにかかわらず、任意の分泌タンパク質を含む。
【００７２】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係におかれた場合に「作動可能に連結されている」。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が連続的であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来のプラクティスにしたがって使用する。加えて、酵素をコードする核酸の複数コピーを発現ベクター内で共に連結することができる。このような複数の核酸は、リンカーによって分離され得る。
【００７３】
本開示はまた、本明細書に記載されるベクターを含有する哺乳動物細胞を提供する。細胞はヒトのものであり得るか、または脳に由来し得る。細胞型は、幹細胞または前駆細胞集団であり得る。
【００７４】
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクターまたは細胞を投与することによって、哺乳動物における疾患、例えば遺伝性疾患または癌を処置する方法を提供する。遺伝性疾患は、アルツハイマー病などの神経変性疾患であり得る。
【００７５】
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクターおよび（インビボで改変された）遺伝子操作細胞、ならびにそれらの使用に関する。特に、本開示は、治療有効用量の治療剤を全身送達することができる遺伝子またはタンパク質治療法に関する。
【００７６】
一態様によれば、哺乳動物レシピエントにおいて治療剤を発現させるための細胞発現系が提供される。発現系（本明細書では「遺伝子改変細胞」とも称される）は、細胞と、治療剤を発現させるための発現ベクターとを含む。発現ベクターとしては、限定されないが、ウイルス、プラスミド、および異種遺伝物質を細胞に送達するための他のビヒクルが挙げられる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、異種遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクルを指す。特に、発現ベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【００７７】
発現ベクターとしてはさらに、異種遺伝子の転写を制御するためのプロモーターが挙げられる。プロモーターは、（下記）誘導性プロモーターであり得る。発現系は、哺乳動物レシピエントへの投与に適切である。発現系は、それぞれが、少なくとも１つの治療剤をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含有する複数の遺伝子改変非不死化細胞を含み得る。
【００７８】
細胞発現系は、インビボで形成され得る。さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、例えば、静脈内投与によって、異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターをインサイチューで患者の細胞に導入することを含む。発現系をインビボで形成するためには、治療剤を発現させるための発現ベクターを、インビボで哺乳動物レシピエントの静脈（ここで、ベクターは血管系を通って脳に移動する）に導入する。
【００７９】
さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、インビボで標的タンパク質を患者に導入することを含む。
【００８０】
異種遺伝子を発現させるための発現ベクターとしては、異種遺伝子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターが挙げられ得る。したがって、インサイチューにおける治療剤の送達は、異種遺伝子の転写を誘導する条件に対して細胞をインサイチューで曝露することによって制御される。
【００８１】
哺乳動物レシピエントは、遺伝子置換療法に適した症状を有し得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子置換療法」は、治療剤をコードする外因性遺伝物質をレシピエントに投与し、続いて、投与した遺伝物質をインサイチューで発現させることを指す。したがって、語句「遺伝子置換療法に適した症状」は、遺伝性疾患などの症状（すなわち、１つまたは複数の遺伝子欠陥に起因する疾患症状）、後天性病状（すなわち、先天的欠陥に起因しない病理学的症状）、癌および予防的プロセス（すなわち、疾患または望ましくない医学的症状の予防）を包含する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「治療剤」は、哺乳動物レシピエントに対して有益な効果を有する任意の薬剤または物質を指す。したがって、「治療剤」は、核酸またはタンパク質成分を有する治療および予防分子の両方を包含する。
【００８２】
一実施形態によれば、哺乳動物レシピエントは遺伝性疾患を有し、外因性遺伝物質は、前記疾患を処置するための治療剤をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、哺乳動物レシピエントは後天性病状を有し、外因性遺伝物質は、前記病状を処置するための治療剤をコードする異種遺伝子を含む。別の実施形態によれば、患者は癌を有し、外因性遺伝物質は、抗新生物剤をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、患者は望ましくない医学的症状を有し、外因性遺伝物質は、前記症状を処置するための治療剤をコードする異種遺伝子を含む。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「防御ＡｐｏＥアイソフォーム」は、このポリペプチドの変異体または生物学的に活性もしくは不活性な断片を含む。ポリペプチドの１つの「変異体」は、天然タンパク質と完全に同一ではないポリペプチドである。このような変異体タンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によってアミノ酸配列を変化させることによって得ることができる。天然ポリペプチドと比較して実質的に同じかまたは改善された性質を有するポリペプチドを作るために、例えば、置換によってタンパク質のアミノ酸配列を改変する。置換は、保存的置換であり得る。「保存的置換」は、類似側鎖を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換することである。保存的置換は、ペプチド全体がその空間的立体構造を保持するが、変化した生物学的活性を有するように、アミノ酸の電荷またはアミノ酸側鎖のサイズ（あるいは、側鎖内の化学基のサイズ、電荷または種類）についての可能な最小変化を作るアミノ酸で置換することである。例えば、一般的な保存的変化は、ＡｓｐからＧｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＨｉｓからＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅ；ＡｓｎからＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕおよびＳｅｒからＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり得る。アラニンは、他のアミノ酸に置換するのに一般に使用される。２０種の必須アミノ酸は、以下のように分類することができる：非極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；非荷電極性側鎖を有するグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニンおよびヒスチジン。
【００８４】
アミノ酸の変化は、対応する核酸配列のコドンを変化させることによって達成される。このようなポリペプチドは、生物学的活性を改変または改善するために、ポリペプチド構造中の他のアミノ酸をある特定のアミノ酸で置換することに基づいて得られ得ることが公知である。例えば、代替アミノ酸の置換によって、活性の増加をもたらすポリペプチドに小さな立体構造変化を与えることができる。あるいは、ある特定のポリペプチドにおけるアミノ酸置換を使用して残基を提供し、次いでこれを他の分子に連結して、他の目的のために十分に有用な出発ポリペプチドの特性を保持するペプチド−分子コンジュゲートを提供することができる。
【００８５】
相互作用生物学的機能をポリペプチドに付与する際に、アミノ酸の疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）指標を使用することができ、ここで、ある特定のアミノ酸は、類似の疎水性指標を有する他のアミノ酸で置換することができ、類似の生物学的活性を依然として保持することができることが見出されている。あるいは、特に、生成されるべきポリペプチドにおける所望の生物学的機能が免疫学的実施形態で使用するためのものである場合、親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換を行うことができる。その隣接するアミノ酸の親水性によって決定される「タンパク質」の最大の局所的な平均親水性は、その免疫原性と相関する。したがって、各アミノ酸に割り当てられる親水性に基づいて置換を行うことができることに留意する。
【００８６】
値を各アミノ酸に割り当てる親水性指標もしくは疎水性指標のいずれかを使用する際に、これらの値が±２であるアミノ酸置換を行うことが好ましい（±１が特に好ましく、±０．５以内のものが最も好ましい置換である）。
【００８７】
変異体タンパク質は、対応する天然タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも約８０％またはさらに少なくとも約９０％だが１００％未満の連続的なアミノ酸配列相同性または同一性を有する。
【００８８】
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列に本質的に対応する。本明細書で使用される場合、「本質的に対応する」は、天然タンパク質によって生成される反応と実質的に同じ生物学的反応を引き起こすであろうポリペプチド配列を指す。このような反応は、天然タンパク質によって生成されるレベルの少なくとも６０％であり得、さらには、天然タンパク質によって生成されるレベルの少なくとも８０％であり得る。
【００８９】
変異体は、対応する天然タンパク質に存在しないアミノ酸残基または対応する天然タンパク質に対する欠失を含み得る。変異体はまた、対応する天然タンパク質と比較して短縮型「断片」（すなわち、全長タンパク質の一部のみ）であり得る。タンパク質変異体はまた、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を有するペプチドを含む。
【００９０】
変異体タンパク質は、変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列から発現させることができる。「組換え体」は、遺伝子工学の方法によって生産されたペプチドまたは核酸と定義される。遺伝コードの重複により、個々のヌクレオチドのコドンを簡単に交換しても、同一のアミノ酸配列が依然として得られ得ることが当技術分野で周知であることに留意すべきである。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。
【００９１】
本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって、哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。遺伝子療法について、分子生物学および遺伝子療法の分野の通常の当業者であれば、過度の実験を伴うことなく、本開示の新規方法に使用される発現ベクターの適切な投与量および投与経路を決定することができるであろう。
【００９２】
一実施形態によれば、細胞は形質転換されるか、または別の方法によりインビボで遺伝子改変される。治療剤をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現させるための外因性遺伝物質を含有するベクターで哺乳動物レシピエント由来の細胞をインビボで形質転換（すなわち、形質導入またはトランスフェクト）し、治療剤をインサイチューで送達する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「外因性遺伝物質」は、細胞に天然に見られない天然または合成の核酸またはオリゴヌクレオチドを指す；または、それが細胞に天然に見られる場合には、それは、細胞によって生物学的に有意なレベルで転写または発現されないものである。したがって、「外因性遺伝物質」としては、例えば、アンチセンスＲＮＡに転写され得る天然に存在しない核酸、および「異種遺伝子」（すなわち、同じ種類の天然に存在する細胞において、生物学的に有意なレベルで発現されないかまたは発現されるタンパク質をコードする遺伝子）が挙げられる。
【００９４】
ある特定の実施形態では、哺乳動物レシピエントは、遺伝子置換療法に適した症状を有する。本明細書で使用される場合、「遺伝子置換療法」は、治療剤をコードする外因性遺伝物質をレシピエントに投与し、続いて、投与した遺伝物質をインサイチューで発現させることを指す。したがって、語句「遺伝子置換療法に適した症状」は、遺伝性疾患などの症状（すなわち、１つまたは複数の遺伝子欠陥に起因する疾患症状）、後天性病状（すなわち、先天的欠陥に起因しない病理学的症状）、癌および予防的プロセス（すなわち、疾患または望ましくない医学的症状の予防）を包含する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「治療剤」は、哺乳動物レシピエントに対して有益な効果を有する任意の薬剤または物質を指す。したがって、「治療剤」は、核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）および／またはタンパク質成分を有する治療および予防分子の両方を包含する。
【００９５】
あるいは、遺伝子置換療法に適した症状は、予防的プロセス（すなわち、疾患または望ましくない医学的症状の予防を予防するためのプロセス）である。したがって、本開示は、予防機能（すなわち、予防剤）を有する治療剤を哺乳動物レシピエントに送達するための細胞発現系を包含する。
【００９６】
要約すると、用語「治療剤」は、限定されないが、上記症状に関連する薬剤およびそれらの機能的等価物を含む。本明細書で使用される場合、用語「機能的等価物」は、機能的に等価であると考えられる治療剤として、哺乳動物レシピエントに対して同じまたは改善された有益な効果を有する分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を指す。
【００９７】
上記に開示された治療剤および遺伝子置換療法に適した症状は単に例示であり、本開示の範囲を限定するためのものではない。公知の症状を処置するのに適切な治療剤の選択は、過度の実験を伴うことなく当業者の範囲内であると考えられる。
【００９８】
ＡＡＶベクター
一実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターはアデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すのに使用され得る。この用語は、他に必要とされる場合を除いて、すべてのサブタイプ、血清型およびシュードタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。本明細書で使用される場合、用語「血清型」は、規定の抗血清とのカプシドタンパク質反応性によって同定され、それに基づいて他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶには８つの公知の血清型（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８）がある。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ２血清型由来の５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムとを含有するＡＡＶを指すのに使用される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶは、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すのに使用され得るか、またはそれは、ある血清型由来のカプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型由来の５’−３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ血清型２由来のカプシドおよびＡＡＶ血清型５由来のＩＴＲ）を有するＡＡＶを指し得る。本明細書で例証される各実施例については、ベクターの設計および製造の説明には、カプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型が記載されている。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【００９９】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質のすべてによる）およびカプシド化ポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達するべき導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的には「ｒＡＡＶ」と称される。
【０１００】
一実施形態では、転写開始領域、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御要素を、転写方向に作動可能に連結された成分として少なくとも提供するように、公知の技術を使用してＡＡＶ発現ベクターを構築する。制御要素は、哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含有する得られた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に（５’および３’で）隣接している。
【０１０１】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端リピート」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓで共に機能することが当技術分野で認識されているＡＡＶゲノムの各末端に見られる領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と共に、２つの隣接するＩＴＲ間に介在するヌクレオチド配列を効率的に切り出してそれからレスキューし、それを哺乳動物細胞ゲノムに組み込む。
【０１０２】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示されている野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変化させることができる。加えて、ＡＡＶ  ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合に目的通りに機能する（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切り出してそれをレスキューし、異種配列をレシピエント細胞ゲノムに組み込むことを可能にする）限り、同じＡＡＶ血清型または分離株と同一である必要はなく、これに由来する必要もない。
【０１０３】
一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合に目的通りに機能する（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列を切り出してそれをレスキューし、ＤＮＡ分子をレシピエント細胞ゲノムに組み込むことを可能にする）限り、同じＡＡＶ血清型または分離株と同一である必要はなく、これに由来する必要もない。
【０１０４】
一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２に由来し得る。ＡＡＶベクターに使用するのに適切なＤＮＡ分子は、サイズが約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満であり、当技術分野で公知のものである。
【０１０５】
一実施形態では、選択されたヌクレオチド配列は、被験体においてインビボでその転写または発現を指示する制御要素に作動可能に連結される。このような制御要素は、選択された配列に通常関連する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が用いられ得る。有用な異種制御配列としては、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものが挙げられる。例としては、限定されないが、ＳＶ４０早期プロモーター；マウス乳ガンウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ即時初期型プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター；ハイブリッドプロモーター；などが挙げられる。加えて、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）由来の配列もまた、本明細書で使用される。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０１０６】
一実施形態では、異種プロモーターおよび他の制御要素の両方、例えばＣＮＳ特異的誘導性プロモーター、エンハンサーなどは、特定の用途のものであろう。異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の遺伝子から単離されたものが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびアウフィン（ａｕｆｉｎ）のＤＮＡ応答要素が挙げられる。
【０１０７】
一実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲに結合された目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列を、そこから切り出された主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノム中に直接挿入することによって構築され得る。ＩＴＲの部分が、複製およびパッケージング機能を可能にするのに依然として十分である限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた欠失させ得る。このような構築物は、当技術分野で周知の技術を使用して設計され得る。
【０１０８】
あるいは、ウイルスゲノムまたはこれを含有するＡＡＶベクターからＡＡＶ  ＩＴＲを切り出して、標準的なライゲーション技術を使用して、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合することができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０℃では４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」ライゲーションの場合）、または１４℃では１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーションの場合）のいずれかで達成され得る。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総最終濃度）で実施される。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクター
【０１０９】
加えて、キメラ遺伝子は、１つまたは複数の選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように合成的に生産され得る。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンが使用され得る。完全なキメラ配列が、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。
【０１１０】
ｒＡＡＶビリオンを生産するため、ＡＡＶ発現ベクターが、トランスフェクションなどの公知の技術を使用して適切な宿主細胞に導入される。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で一般に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。特に適切なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、および高速度マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを生産するのに適切な宿主細胞としては、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられ、それは、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るか、または使用されている。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、通常、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。安定なヒト細胞株２９３（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションからアクセッション番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３で容易に入手可能）に由来する細胞を本開示の実施に使用することができる。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型のＤＮＡ断片で形質転換したヒト胚腎細胞株であり、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生産するための特に便利なプラットフォームを提供する。
【０１１２】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」は、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当技術分野で認識された領域を指す。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または、他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するのに集団として必要である。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切なホモログは、ＡＡＶ２  ＤＮＡ複製を媒介することも公知のヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む。
【０１１３】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの当技術分野で認識された領域を指す。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集団として必要とされるパッケージング機能を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前、またはそれと同時に、宿主細胞をＡＡＶヘルパー構築物でトランスフェクトすることによって宿主細胞に導入される。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供して、生産的ＡＡＶ感染に必要なＡＡＶ機能の誤りを補完するのに使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠損しており、自身を複製することもパッケージすることもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐの両方の発現産物をコードする多くのＡＡＶヘルパー構築物、例えば、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５が記載されている。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。
【０１１５】
ウイルスベクターの送達方法は、ＡＡＶをＣＳＦに注射することを含む。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロ形質導入技術のいずれかを使用してＣＮＳの細胞に導入され得る。インビトロで形質導入する場合、所望のレシピエント細胞を被験体から取り出し、ｒＡＡＶビリオンで形質導入し、被験体に再導入する。あるいは、細胞が被験体内で不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異系細胞が使用され得る。
【０１１６】
形質導入細胞の被験体への送達および導入のための適切な方法が記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンを例えば適切な培地中でＣＮＳ細胞と混ぜ合わせることによって、細胞をインビトロで形質導入することができ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、目的のＤＮＡを有する細胞をスクリーニングすることができる。次いで、形質導入細胞を以下に詳述される医薬組成物に製剤化し、様々な技術によって、例えば、移植、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射によって組成物を被験体に導入することができる。
【０１１７】
一実施形態では、医薬組成物は、治療有効量（すなわち、問題の疾患状態の徴候を低減もしくは改善するのに十分な量、または所望の利益を与えるのに十分な量）の目的の核酸を生産するために十分な遺伝物質を含む。医薬組成物はまた、薬学的に許容され得る賦形剤を含む。このような賦形剤は、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体で誘導せず、過度な毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに水、生理的食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容され得る塩、例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩がそこに含まれ得る。加えて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質は、このようなビヒクルに存在し得る。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
【０１１８】
本明細書の教示を考慮した当業者には明らかであるように、追加しなければならないウイルスベクターの有効量は、経験的に決定することができる。投与は、処置過程を通して連続的または断続的に単回投与で行うことができる。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成、標的細胞および処置される被験体によって変化するであろう。単回投与および複数回投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンによって行うことができる。
【０１１９】
送達されるウイルスベクターによって複数の導入遺伝子を発現させ得ることを理解すべきである。あるいは、それぞれが１つまたは複数の異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターを、本明細書に記載されるようにＣＮＳに送達することもできる。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターを、他の適切な組成物および治療と組み合わせることも意図される。
【０１２０】
遺伝物質を細胞に導入するための方法
トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子導入法によって、外因性遺伝物質（例えば、１つまたは複数の治療用タンパク質をコードするｃＤＮＡ）をエクスビボまたはインビボで細胞に導入して、遺伝子改変細胞を提供する。様々な発現ベクター（すなわち、標的細胞への外因性遺伝物質の送達を促進するためのビヒクル）は当業者に公知である。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」は、追加ＤＮＡの組み込みによって、細胞が新規遺伝物質を獲得することを指す。したがって、トランスフェクションは、物理的または化学的方法を使用して核酸を細胞に挿入することを指す。いくつかのトランスフェクション技術が当業者に公知であり、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；陽イオンリポソーム媒介トランスフェクション；およびタングステン粒子促進微粒子銃が挙げられる。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿は、別の可能なトランスフェクション方法である。
【０１２２】
対照的に、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを使用して核酸を細胞に導入する方法を指す。核酸を細胞に導入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルス内に含まれる外因性遺伝物質は、形質導入細胞のゲノムに組み込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療剤をコードするｃＤＮＡを有するアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれる外因性遺伝物質を有しないが、細胞内で染色体外に保持される外因性遺伝物質を発現することができる。
【０１２３】
典型的に、外因性遺伝物質は、（通常は、治療用タンパク質をコードするエクソンを含むｃＤＮＡの形態の）異種遺伝子を、新規遺伝子の転写を制御するプロモーターと一緒に含む。プロモーターは、特徴的に、転写を開始するのに必要な特定のヌクレオチド配列を有する。場合により、外因性遺伝物質は、所望の遺伝子転写活性を得るのに必要なさらなる配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含む。この議論のために、「エンハンサー」は、単純に、プロモーターによって指令された基礎転写レベルを変化させるように（ｃｉｓで）コード配列と隣接して働く任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。プロモーターおよびコード配列が作動可能に連結されてコード配列の転写が可能になるように、外因性遺伝物質をプロモーターのすぐ下流の細胞ゲノムに導入することができる。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御する外因性プロモーター要素を含み得る。このような外因性プロモーターとしては、構成的および誘導性プロモーターの両方が挙げられる。
【０１２４】
天然に存在する構成的プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を制御する。結果として、構成的プロモーター制御下の遺伝子は、すべての細胞増殖条件下で発現される。例示的な構成的プロモーターとしては、ある特定の構成的または「ハウンキーピング」機能をコードする以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼのプロモーター、アクチンプロモーターおよび当業者に公知の他の構成的プロモーターが挙げられる。加えて、多数のウイルスプロモーターは、真核生物細胞において構成的に機能する。これらとしては、とりわけ、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）；ならびに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターその他が挙げられる。したがって、上記構成的プロモーターのいずれかを使用して異種遺伝子インサートの転写を制御することができる。
【０１２５】
誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤の存在下においてわずかにまたはかなりの程度まで発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下の転写は、ある特定の金属イオンの存在下で大きく増加する）。誘導性プロモーターは、それらの誘導性因子が結合した場合に転写を刺激する応答性要素（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックＡＭＰのＲＥが挙げられる。誘導反応を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、いくつかの場合、ＲＥ自体を様々なプロモーターに結合させることによって、誘導性を組換え遺伝子に与えることができる。したがって、適切なプロモーター（構成的対誘導性；強対弱）を選択することによって、遺伝子改変細胞における治療剤の存在および発現レベルの両方を制御することが可能である。治療剤をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、例えば、該薬剤の転写を制御する誘導性プロモーターの特異的誘導因子を腹腔内注射することによって、治療剤の転写を可能にする条件に遺伝子改変細胞をインサイチューで曝露することによって、インサイチューにおける治療剤の送達が引き起こされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下の遺伝子によってコードされる治療剤の遺伝子改変細胞によるインサイチュー発現は、遺伝子改変細胞と、適切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液とをインサイチューで接触させることによって増強される。
【０１２６】
したがって、インサイチューで送達される治療剤の量は、（１）挿入された遺伝子の転写を指示するのに使用されるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるかまたは誘導性であるか、強いかまたは弱いか）；（２）細胞に挿入される外因性遺伝子のコピー数；（３）患者に投与される（例えば、埋め込まれる）形質導入／トランスフェクト細胞の数；（４）インプラント（例えば、移植片または封入される発現系）のサイズ；（５）インプラントの数；（６）形質導入／トランスフェクト細胞またはインプラントを放置する時間長さ；および（７）遺伝子改変細胞による治療剤の生産速度などの因子を制御することによって調節される。治療有効量の特定の治療剤の送達のためのこれらの因子の選択および最適化は、上記に開示された因子および患者の臨床プロファイルを考慮して、過度の実験を伴うことなく当業者の範囲内であると考えられる。
【０１２７】
少なくとも１つのプロモーターおよび治療剤をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、好ましくは、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択を容易にするためのネオマイシン耐性遺伝子などの選択遺伝子を含み得る。あるいは、細胞は、２つ以上の発現ベクター、治療剤をコードする遺伝子を含有する少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含有する他のベクターでトランスフェクトされる。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列（下記）の選択は、過度の実験を伴うことなく当業者の範囲内であると考えられる。
【０１２８】
細胞外、細胞内または膜位置への送達のために、治療剤をターゲティングすることができる。遺伝子産物が細胞から分泌されることが望まれる場合、治療剤を細胞から細胞外環境に分泌するのに適切な分泌「シグナル」配列を含むように発現ベクターを設計する。遺伝子産物が細胞中内に保持されることが望まれる場合、この分泌シグナル配列は省かれる。同様に、治療剤を細胞原形質膜内にアンカリングするための「保持」シグナル配列を含むように発現ベクターを構築することができる。例えば、膜タンパク質はすべて、膜内におけるタンパク質の移動を停止し、タンパク質を分泌させない疎水性膜貫通領域を有する。遺伝子産物を特定の位置にターゲティングするためのシグナル配列を含む発現ベクターの構築は、過度の実験を必要とすることなく当業者の範囲内であると考えられる。
【実施例】
【０１２９】
実施例１
アミロイド枯渇の進行の変化
本実施例では、アデノ随伴ウイルス血清型４（ＡＡＶ４）の脳室内注射によって異なるＡｐｏＥアイソフォームを過剰発現させた後のａｐｐ／ｐｓマウスにおけるアミロイド沈着の進行の変化を研究した。
【０１３０】
ＡｐｏＥのイプシロン４対立遺伝子（ＡｐｏＥε４）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の第１の遺伝的リスク因子であるのに対して、ＡｐｏＥの珍しいイプシロン２対立遺伝子（ＡｐｏＥε２）の遺伝はこのリスクを半減する。しかしながら、ほぼ１７年前にはこれらの強力な遺伝的手掛かりが発見されていたにもかかわらず、ＡｐｏＥがリスクを与える機構は依然として不明である。
【０１３１】
異なるＡｐｏＥアイソフォーム（ＡｐｏＥε２、ε３およびε４）が線維性アミロイドプラークの形成および安定性にどのように影響を与えるかを解明するために、各ＡｐｏＥアイソフォームをコードするＡＡＶ４ベクターを７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳマウスの脳室に注射した。インビボ多光子イメージングに使用して、ベースライン時およびＡｐｏＥ曝露後に２カ月間隔でアミロイド沈着の集団を追跡することにより、生きている動物におけるアミロイドーシスの進行を動的に見ることができた。
【０１３２】
２カ月後において、アミロイドプラーク沈着の速度は各アイソフォームに応じて変動することが観察されたところ、ＡｐｏＥε３と比較して、ＡｐｏＥε４注射マウスでは老人斑が３８％増加したのに対して、ＡｐｏＥε２処置マウスではアミロイド沈着数が１５％減少した。死後分析によりこれらの結果を確認し、プラークをデコレイトするヒトＡｐｏＥタンパク質が皮質に存在することが明らかになったが、これは、このタンパク質が実質全体に広く拡散しており、Ａβペプチドの沈着部位に局所的に蓄積していることを反映している。このＡｐｏＥε４タンパク質含有量の増加はまた、アミロイド沈着周囲におけるより重度のシナプス消失に関連していたことに留意することが重要である。
【０１３３】
全体として、本データにより、異なるＡｐｏＥアイソフォームの過剰産生は疾患進行に影響を与えることができ、シナプス消失（これは、ＡＤ患者における認知機能障害と最も良く相関するパラメータの１つである）の程度を調節し得ることが実証された。
【０１３４】
１．ＡＡＶ４−ＡｐｏＥを脳室内注射すると、脳でｈｕＡＰＯＥが安定的に発現し、組換えヒトＡｐｏＥ（ｈｕＡｐｏＥ）タンパク質が持続的に検出された。
【０１３５】
簡潔に言えば、ＡＡＶ４ベクターを注射したＡＰＰ／ＰＳマウスにおいて、ＧＦＰおよびｈｕＡｐｏＥを免疫検出した。ヒトＡＰＯＥと同様に、ＧＦＰシグナルが、脳室領域全体（上のパネル）および脳室の内側を覆う細胞の中に入るのを観察することができた。
【０１３６】
本方法を評価するために、ＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓ（対照）、−ＡｐｏＥ２、−ＡｐｏＥ３および−ＡｐｏＥ４を野生型マウスの脳室に注射した。注射の２カ月後、アミロイド沈着周囲の皮質実質において、ヒトＡｐｏＥタンパク質を検出することができた（ＡＡＶ４−ＧＦＰ注射マウスでは、３Ｈ１抗体；非特異的バックグラウンドのみが観察されたことに留意する）。したがって、有意なレベルのヒトＡｐｏＥがＥＬＩＳＡによって脳で検出され、ＶｅｎｕｓおよびＡｐｏＥの免疫組織学的染色により、脳室の内側を覆う細胞による異なる導入遺伝子の発現を確認した。
【０１３７】
導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。標準曲線により、本発明者らは、内因性ＧＡＰＤＨレベルに応じたｈｕＡｐｏＥ  ｍＲＮＡの濃度を決定することができた。２または５カ月間曝露したマウス由来の試料が含まれていた。ヒトＡＰＯＥを特異的に検出するように設計したＥＬＩＳＡアッセイを脳ホモジネートに対して実施した（図１Ａ）。ヒトＡＰＯＥに対して特異的なＥＬＩＳＡによって定量し（図１Ｂ）、ウエスタンブロットによって確認したところ、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ注射マウスでは、ＡＡＶ４−ＧＦＰ処置マウスと比較して低レベルの組換えタンパク質を検出することができた。
【０１３８】
２．各ＡＰＯＥアイソフォームの過剰発現は、アミロイドーシスの進行に差次的に影響を与える。
【０１３９】
インビボ二光子イメージングを使用して、生きている動物におけるアミロイド沈着を経時的に追跡した。簡潔に言えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４およびＶｅｎｕｓをコードするＡＡＶ４ベクターをＡＰＰ／ＰＳマウス（７カ月齢）に定位注射した。１週間後に頭蓋窓を移植し、開頭後にアミロイド沈着を経時的にイメージングした。２カ月後に動物を屠殺し、死後分析を実施した。
【０１４０】
ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３またはＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したＡＰＰ／ＰＳマウスの二光子画像を作成した。メトキシ−ＸＯ４（５ｍｇ／ｋｇ）およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄデキストラン（分子量７０，０００Ｄａ；１２．５ｍｇ／ｍｌ滅菌ＰＢＳ溶液）の腹腔内注射を外側尾静脈に注射して蛍光血管造影図を得た後、アミロイドプラークを検出することができた。注射の１週間（＝Ｔ０）、１カ月および２カ月後に画像を取得した。同じ領域を経時的に撮影して、病変の進行を追跡した。いくつかの新たなアミロイド沈着が現れたが、それらのいくつかは２カ月の期間にわたってもはや検出することができなかった。
【０１４１】
インビボ画像の全分析は、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４注射ＡＰＰ／ＰＳマウスでは、アミロイド沈着数が、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３およびＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓ処置動物の両方と比較して有意により急速に増加していることを示している。対照的に、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を使用した場合、少ないが有意なプラーク密度の減少が測定されている（図２）。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したＡＰＰ／ＰＳマウスでは、プラークがより大きい傾向が観察されるが（ｐ＜０．０６）、全体的なプラークサイズは依然として一定である。インビボイメージングの要約データは、各ＡＰＯＥアイソフォームの過剰発現が、インビボにおけるアミロイド沈着の進行に差次的に影響を与えることを示している。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を注射すると、アミロイド密度が経時的にわずかに低下するのに対して、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射はアミロイドーシスを悪化させる。
【０１４２】
３．アミロイドプラークのサイズは、各ＡｐｏＥアイソフォームに応じて異なる。
【０１４３】
インビボ二光子イメージングにより、各アミロイド沈着のサイズの変化を２カ月の期間にわたって追跡した。プラークのサイズは依然として安定であり得るか、経時的に増加または減少し得る。Ｔ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１とのサイズ比の分布は、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したマウスでは、アミロイドプラークが他の群と比較して大きい傾向があることを示している（図３）。
【０１４４】
４．アミロイド負荷の死後評価により、アミロイド沈着に対するＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４の効果を確認する。
【０１４５】
ＡＡＶ４注射の２カ月後、立体的死後評価により、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４注射動物では、皮質におけるアミロイドプラークがより高密度であるのに対して、他の群間では差異を検出することができなかったことが明らかになった（図４Ａ）。プラークをＴｈｉｏＳまたはＢａｍ１０で標識した場合、このアミロイド沈着数の増加が観察される。しかしながら、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳとの比の変化は検出されなかった。注射の５カ月後、各ＡｐｏＥアイソフォームの効果は、２カ月と比較して顕著である（図４Ｂ）。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４をマウスに注射した場合、沈着密度の有意な増加が観察されたのに対して、ＡｐｏＥ２では逆の効果が検出された。やはり、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳとの比の変化は検出されなかった。
【０１４６】
５．各ＡｐｏＥアイソフォーム（ｉｓｆｏｒｍ）は、アミロイド沈着周囲のシナプス密度に差次的に影響を与える。
【０１４７】
アレイトモグラフィーを使用して、アミロイド沈着周囲のシナプス前要素およびシナプス後要素の密度を正確に決定した。この新たなイメージング法は、組織分子構造の高解像イメージングの可能性を提供する。アレイトモグラフィーは、標本を超薄切片化し（７０ｎｍ）、免疫染色し、３Ｄ再構成することに基づくものである。アレイトモグラフィー試料の代表的な画像を、アミロイドプラークおよびシナプス後マーカー（ｍａｋｅｒ）ＰＳＤ９５について染色した。アレイトモグラフィーの画像は、アミロイド沈着周囲ではシナプス後マーカーＰＳＤ９５の数の減少が観察されるが、プラークから離れた場所ではこの効果が消失することを示している。ＡＡＶ４を注射した各マウス群において、プラーク周辺またはプラークから離れた場所におけるシナプス前マーカー（シナプシン−１）およびシナプス後マーカーの定量を決定した（図５Ａ〜Ｄ）。広範囲にわたるシナプス前要素およびシナプス後要素の定量により、シナプシン１およびＰＳＤ９５の密度の減少はアミロイドプラークに関連しており、この効果は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳でＡｐｏＥ４を過剰発現させた場合に劇的に増幅されることが確認された（図５Ｃ、図５Ｄ）。ＡｐｏＥ４の過剰発現は、他の群と比較して、アミロイド沈着周辺のスパイン消失の増加に関連している。反対に、ＡｐｏＥ２処置動物のプラーク周囲では、シナプシンの斑点密度がより高い。
【０１４８】
結論
ＡＡＶウイルス血清型４を脳室内注射すると、可溶性組換えタンパク質が脳実質全体で持続的かつ慢性的に過剰産生された。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の過剰発現は、ＡＰＰ／ＰＳマウスにおける病状経過に差次的に影響を与え、ＡｐｏＥ４を注射した場合、アミロイド負荷の進行がＡｐｏＥ３と比較して有意に増加した。逆に、ＡｐｏＥ２は防御効果に関連しており、いくつかのアミロイド沈着は注射の２カ月後にはもはや検出不可能である。死後免疫組織学的分析により、ＡｐｏＥ４の有害効果が確認された。ＡｐｏＥ４の持続的な過剰産生は、ＡｐｏＥ３と比較して、アミロイド沈着周囲で観察されたシナプス消失を悪化させたのに対して、ＡｐｏＥ２は軽度の効果を有していた。本研究により、ＡｐｏＥアイソフォーム、アミロイドーシスの進行およびシナプス消失の間のインビボにおける直接的な関連性が実証された。
【０１４９】
実施例２
大型哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）を介した中枢神経系障害の処置
アルツハイマー病などの脳障害の遺伝子療法を達成するためには、治療酵素の長期的な定常状態レベルが哺乳動物で達成され得るかを決定する必要があった。上衣細胞（脳の脳室にある細胞）に形質導入し、標的酵素を脳脊髄液（ＣＳＦ）に分泌させることができることが発見された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ４）は、マウスモデルの上衣に高効率で形質導入することができることが決定された。（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ，２８：３４２８−３４３２，２０００．）マウスでは、ＡＡＶ４処置後の罹患脳における貯蔵基質レベルが正常化された。
【０１５０】
ＣＳＦにおける酵素の定常状態レベルを達成するために、ベクターの全体的な送達を有効に実施することができるかを調査した。最初に、ベクターが、大型哺乳動物の脳における上衣細胞（脳室の内側を覆う細胞）に形質導入することができるかを確認する必要があった。ＬＩＮＣＬのイヌモデルおよびＬＩＮＣＬの非ヒト霊長類モデルにおいて、研究を実施した。ＬＩＮＣＬイヌは出生時に正常であるが、約７カ月で神経学的兆候を発症し、約５〜６カ月で試験可能な認知障害を発症し、１０〜１１カ月で発作を発症し、進行性視力低下を発症する。
【０１５１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、そのサイズが小さく（２０ｎｍ）、ウイルス遺伝子が存在せず複製不能になるようにその遺伝物質のほとんどを除去（「ガット」）することができるので、ベクターとして選択した。β−グルクロニダーゼの欠損によって引き起こされるムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳ  ＶＩＩ）のマウスモデルにおいて、アデノ随伴ウイルス４型（ＡＡＶ４）ベクターは、全体的な機能的および病理学的な改善を媒介することができるかについて以前に試験された（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２５（４１）：９３２１−９３２７，２００５）。β−グルクロニダーゼをコードする組換えＡＡＶ４ベクターを、既存の疾患を有するＭＰＳ  ＶＩＩマウスの側脳室に片側注射した。形質導入上衣は高レベルの組換え酵素を発現し、分泌された酵素は大脳および小脳構造ならびに脳幹に浸透した。免疫組織化学的研究により、組換え酵素と脳微小血管系との密接な関連性が明らかになったが、これは、β−グルクロニダーゼが、血管の内側を覆う血管周囲腔を介して脳実質に到達したことを示している。文脈恐怖条件付けによって、嫌悪連合学習を試験した。年齢適合ヘテロ接合対照と比較して、罹患マウスは、条件付け恐怖反応および文脈識別の障害を示した。この行動障害は、ＡＡＶ４  β−グルクロニダーゼ処置ＭＰＳ  ＶＩＩマウスでは、遺伝子導入の６週間後に回復した。このデータは、上衣細胞が、脳実質周囲およびＣＳＦへの酵素分泌源として役立ち得ることを示している。
【０１５２】
しかしながら、驚くべきことに、これらの研究を大型哺乳動物（例えば、イヌおよび非ヒト霊長類）に拡大したところ、ＡＡＶ４ベクターは、これらの動物における上衣を標的とするのに有効ではなかった。代わりに、ＡＡＶ２ベクターを使用する必要があった。簡潔に言えば、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ２を作製し（ＡＡＶ２−ＣＬＮ２）、脳室内注射して上衣に形質導入した（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２５（４１）：９３２１−９３２７，２００５）。ＴＰＰ１はＬＩＮＣＬ欠損酵素である。このデータにより、ＮＨＰ脳における上衣形質導入は、ＣＳＦにおける酵素の有意な増加をもたらしたことが示された。この結果により、様々な脳領域におけるＴＰＰ１活性レベルの上昇が示された（図７）（縦軸は、対照の活性に対する％を示す）。
【０１５３】
処置した最初のイヌでは、ベクターの送達は最適以下であったが、脳では依然としてＣＬＮ２活性が示された。次のイヌは、定位脳手術によるＩＣＶ送達を受けた。処置イヌの認知能力は、Ｔ迷路行動によって測定した場合に非処置イヌよりも有意に改善したことが見出された（図８）。さらに、ＬＩＮＣＬのイヌモデルにおけるＡＡＶ２−ＣＬＮ２のＩＣＶ送達の効果は非常に顕著であった。未処置（−／−）動物では大きな脳室が存在するのに対して、未処置対照および処置動物の脳は脳室を示さなかった。ＡＡＶ．ＴＰＰ１をＬＩＮＣＬイヌの脳室に送達した後、小脳および上部脊髄を含む様々な脳領域において、検出可能な酵素活性が認められた。２匹の生きているさらなる罹患イヌでは、脳萎縮が有意に軽減され、寿命が増加し、認知機能が改善した。最後に、ＮＨＰにおいて、本発明者らは、この方法により野生型を２〜５倍上回るＴＰＰ１活性レベルを達成し得ることを示している。
【０１５４】
いくつかのＡＡＶベクターを作製および試験して、ＩＴＲおよびカプシドの最適な組み合わせを決定した。５つの異なる組み合わせを生産し、ＡＡＶ２  ＩＴＲが最も有効であると決定した：ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシド）、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８。大型哺乳動物（イヌおよびＮＨＰ）では、ＡＡＶ２／２がかなり良く機能し、続いてＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／４となることを発見した。ウイルスベクターの有効性の順番はマウスで観察されたものとは反対であるため、これは非常に驚くべきものであった。
【０１５５】
したがって、本研究により、脳室の内側を覆う細胞は、脳全体への分布のために、ＣＳＦにおける組換え酵素の供給源となり得ること、およびＡＡＶ２／２は、イヌおよび非ヒト霊長類において、ＣＬＮ２（ＴＰＰ１）をコードする遺伝子などの治療剤を投与するための有効なビヒクルであることが示された。
【０１５６】
実施例３
遺伝子導入によって送達したヒトＡＰＯＥアイソフォームは、アミロイド沈着、クリアランスおよび神経毒性に影響を与えることによってアルツハイマー病を差次的に調節する
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も多い加齢性神経変性障害であり、主な公衆衛生上の懸念になっている。遅発性散発型ＡＤに関連する感受性遺伝子の中では、アポリポタンパク質Ｅε４（ＡＰＯＥ遺伝子；ＡｐｏＥタンパク質）対立遺伝子は、飛び抜けて最も重要な遺伝的リスク因子である。１コピーのＡＰＯＥε４の存在は、最も一般的なＡＰＯＥε３対立遺伝子と比較して、疾患を発症するリスクを実質的に３倍増加させるのに対して、２コピーは１２倍増加させる。興味深いことに、ＡＰＯＥε２は逆の効果を有する防御因子であり、この特定の対立遺伝子を遺伝で受け継ぐと、ＡＰＯＥ３／３と比較して、ＡＤの年齢調整リスクが約半減する。認知症の発症の平均年齢もこれらのリスクプロファイルに対応しており、ＡＰＯＥ４／４保因者は６０代半ばに発症し、ＡＰＯＥ２／３保因者は９０代前半に発症する（ほぼ３０年のずれ）のに対して、ＡＰＯＥ３／３個体は発症年齢がその間（１９７０年代半ば）である。
【０１５７】
ＡｐｏＥがＡＤに影響を与える機構には議論がある。珍しい常染色体優性型疾患の公知の原因遺伝子すべてがＡβペプチドの産生に関与しているので、患者の海馬および皮質における老人斑を含有するＡβ蓄積は、ＡＤにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。興味深いことに、ＡＰＯＥ遺伝子型は、ＡＤ患者におけるアミロイド沈着の程度、および剖検試料で検出された神経毒性可溶性オリゴマーＡβの量に強く影響を与えることが示された。ＡｐｏＥアイソフォームは脳血管の完全性に差次的に影響を及ぼし、血液脳関門を通したＡβペプチドの流出に影響を与えて、血管周囲のアミロイド凝集体の蓄積（脳アミロイド血管症またはＣＡＡ）を調節することが示唆されている。加えて、ＡｐｏＥはまた、神経変性および神経可塑性に直接関与している。これらの状況において、ＡｐｏＥ２の効果は相対的には研究中である。
【０１５８】
ヒトＡＰＯＥ２、−Ｅ３および−Ｅ４を発現する遺伝子操作動物は、アミロイド負荷の順序がヒトと同様であり、これは、異なるＡｐｏＥアイソフォームがプラークの開始および／または成長に影響を与えるという仮説と一致している。しかしながら、既存のアミロイド沈着および現存の神経変性に対するＡｐｏＥ媒介性効果の機構を分析するためには、さらなる研究が必要とされる。この知識不足を克服するために、本発明者らは、様々なＡＰＯＥ対立遺伝子（またはＧＦＰ対照）を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを側脳室に注射して主に上衣に形質導入し、次いでこれが、ＡｐｏＥを脳脊髄液および間質液内に送達する生体工場として作用する遺伝子導入法を使用した。次いで、本発明者らは、生体多光子顕微鏡法を使用してプラークの形成、成長およびＡｐｏＥ２の場合には溶解に対する様々なＡｐｏＥアイソフォームの効果を追跡し、インビボ微小透析法を使用してＩＳＦにおけるＡｐｏＥおよびＡβの生化学的変動をモニタリングし、アレイトモグラフィーを使用してＡβ関連神経毒性の変化を評価した。本発明者らは、ＡｐｏＥアイソフォームが、ＩＳＦにおける可溶性オリゴマーＡβのレベル、Ａβ線維化および沈着の速度、一旦形成されたアミロイド沈着の安定性、それらのクリアランス、ならびにプラーク周囲の神経毒性効果の程度に影響を与えることを見出した。実際、ＡｐｏＥ４で処置したＡＤマウスは、可溶性Ａβの量の増加、より高密度な線維性プラーク、シナプス要素の消失の悪化、および各沈着周囲の神経突起ジストロフィーの数の増加を示すのに対して、ＡｐｏＥ２では相対的な防御効果が観察された。これらのデータは、ＡＰＯＥ対立遺伝子が主にＡβを介してＡＤに対するそれらの効果を媒介するという仮説を裏付けており、治療標的としてのＡｐｏＥを強調している。
【０１５９】
結果
ＡＡＶ４−ＡＰＯＥを脳室内注射すると、脳でＡＰＯＥ表現が安定的に発現し、ヒトＡｐｏＥが持続的に産生される
アポリポタンパク質Ｅは自然に分泌されるタンパク質であり、アストロサイトおよびミクログリア細胞によって主に産生され、脳実質全体に拡散することができる。本発明者らは、ＧＦＰ（対照）または各ＡＰＯＥ対立遺伝子をコードするＡＡＶ血清型４を７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの側脳室に注射することによって、この特性の利点を利用した。大脳領域がＡＤの特徴的病変によって冒されていることを考慮すると、この戦略により、複数回の実質内注射と比較して大きな利点が得られた。
【０１６０】
注射の２カ月後、脈絡叢および脳室の内側を覆う上衣において形質導入細胞が検出され、ＡＡＶ４ベクターの機能性が確認された。各種に対して特異的な抗体を使用してＥＬＩＳＡ（図９Ａ、９Ｂおよび１５Ａ）およびウエスタンブロットによって、ヒトおよびマウスＡｐｏＥタンパク質の両方を検出した。本発明者らは、ヒトアポリポタンパク質Ｅの濃度が平均で全タンパク質１ｍｇ当たり２０μｇに達したことを観察したが（図９Ａ）、これは、内因性マウスａｐｏＥの約１０％に相当する（図９Ｂ）。このわずかなさらなる量のヒトＡｐｏＥの存在は、内因性マウスａｐｏＥタンパク質のレベルを検出可能に変化させなかった（図１５Ａ）。ＡＡＶ４注射の２〜５カ月後、少ないが統計的に有意な減少が観察された（図１５Ｂ）。それにもかかわらず、ヒトタンパク質のレベルは対照群と比較して依然として検出可能であったが、これは、ＡＡＶ４を介した形質導入により、実質全体に分泌される組換えタンパク質の持続的生産プラットフォームが提供されたことを示唆している。実際、内因性マウスａｐｏＥタンパク質が蓄積することが公知の皮質マントル全体にわたって、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのアミロイド沈着周囲において、ヒトＡｐｏＥタンパク質を検出することができた。
【０１６１】
次に、本発明者らは、間質液（ＩＳＦ）（これは、非常に生物学的に活性なＡβ可溶性種を含有する細胞外区画である）におけるヒトＡｐｏＥの存在を評価した。脳溶解物全体で検出されたＡｐｏＥは比較的少量であるので、本発明者らは、各ＡＡＶ４−ＡＰＯＥベクターをいくつかのａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）マウスに注射し、高感度だが非種特異的な抗体を使用してヒトタンパク質の存在を追跡した。微小透析技術を使用して、本発明者らは、ａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）注射動物のＩＳＦにおけるＡｐｏＥの存在を確認した。
【０１６２】
全体として、これらのデータは、ＡＡＶ４の単回脳室内注射が、脳実質全体にわたるおよびＩＳＦ内における目的のタンパク質の持続的産生に十分であったこと、および上衣／脈絡叢が、治療用タンパク質を脳に潜在的に送達するための「生物学的ポンプ」として使用することができることを裏付けている。
【０１６３】
ＡｐｏＥアイソフォームの注入は、アミロイドペプチドおよびプラーク沈着に差次的に影響を与える
安楽死の５カ月前に、ＧＦＰまたは様々なＡｐｏＥのアイソフォームを発現するベクターをＡＰＰ／ＰＳ１マウスに形質導入した。アミロイドプラーク負荷の分析により、５カ月後において、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を注射した動物の皮質では、ＡＰＯＥ２を発現するものと比較して、アミロイド沈着密度の有意な増加が観察されたことが明らかになった。ＡＡＶ４−ＧＦＰおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３処置マウスにおけるプラーク密度は、中間レベルで互いに異なるものではなかった（図１６Ａ）。
【０１６４】
ギ酸抽出物から測定したＡβ４０およびＡβ４２ペプチド濃度は、アミロイドプラーク含有量について観察された変化に似ており、５カ月後において、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を発現するマウスではアミロイドペプチド濃度の増加が見られ（図１６Ｂ）、ＡＰＯＥ２では逆の効果が検出された。ＴＢＳ可溶性画分におけるＡβ４０およびＡβ４２ペプチド含有量は、各ＡＡＶ−ＡＰＯＥの注射によって同様に影響を受けた（図１６Ｃ）。加えて、凝集Ａβペプチドと可溶性Ａβペプチドとの比はＡｐｏＥ曝露によって依然として変化せず、これは、区別可能な各ヒトＡｐｏＥアイソフォームの過剰発現が線維性および可溶性アミロイド種の両方を同時に調節することを示唆している。
【０１６５】
各ＡｐｏＥアイソフォームを２カ月間だけ過剰発現させると、５カ月間の研究で観察されたよりも効果は小さい。それにもかかわらず、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４注射マウスの皮質領域内では、他の実験群と比較して、アミロイドプラーク密度の有意な増加が観察された（図１６Ａ）。これは、ギ酸画分に含まれるＡβの量と同等であったが（図１６Ｃ）、これは、この特定の変異体の優勢効果を実証している。それぞれＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２またはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を２カ月間発現させた場合、ＴＢＳ可溶性Ａβ４０／４２種のみがより低くなるかまたはより高くなる傾向を示した（データは示さず）。
【０１６６】
ヒトＡｐｏＥアイソフォームの存在が、Ａβ線維化の程度の初期変化を反映し得るかを決定するために、本発明者らはまた、注射の２カ月後に、（すべてのアミロイド沈着を標識する）Ｂａｍ１０および（高密度コアのみを染色する）Ｔｈｉｏ−Ｓを使用して、ロバストなＡβ免疫染色間の比を測定した。３つのアイソフォーム間で変化は検出されず、これは、この時間枠では実験群全体を通して、高密度および広範囲のアミロイド沈着集団の分布に対する差次的効果がなかったことを示唆している（図１６Ｂ）。これらのデータは、ＡｐｏＥ変異体へのより長期の曝露が、より短期の曝露よりもアミロイド沈着に対する効果が強いことを示している。
【０１６７】
ＡｐｏＥは、血液脳関門を通過するＡβ輸送において役割を果たすことが示唆されている。ＡｐｏＥアイソフォームへの曝露が、血液脳関門を介したＡβペプチドの流出を調節し得るかを試験するために、各注射動物の血漿中のＡβ４０濃度を測定した。本発明者らは、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した両マウスにおける血漿ヒトＡβ含有量が、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２およびＡＡＶ４−ＧＦＰの場合と比較して少なかったことを観察した（図１０Ｄ）。これは、Ｅ３およびＥ４変異体の両方がＡβを中枢神経系区画に保持するのを支援することを示唆しており、これは、Ａβ濃度の相対的な増加が脳実質で観察されたこと、およびＡｐｏＥによるＡβ半減期の増強を示唆する先のデータと一致している。
【０１６８】
ＡＰＯＥ４保因者は神経血管機能障害によりかかりやすく、血液脳関門の破壊は、アミロイド沈着が存在しない場合であってもＡＰＯＥ４トランスジェニックマウスでよく見られることが最近示された。ＡＰＰ／ＰＳにおけるＡＡＶ４−ＡＰＯＥの脳室内注射がＢＢＢの完全性を損ない得るかを評価するために、プルシアンブルーによる死後染色を実施した。すべての群において、いくつかのヘモジデリン陽性局所領域が脳全体にまばらに広がって存在していたにもかかわらず、いずれの動物実験群間においても明らかな差異は観察されなかった。
【０１６９】
ＡｐｏＥアイソフォームの発現は、アミロイドーシスの進行速度を調節する
５カ月後において、ＡｐｏＥ４はアミロイド沈着密度の増加に関連していたのに対して、ＡｐｏＥ２では反対の効果が観察された。これは、アミロイドβの沈着、クリアランスまたはその両方の速度の変化を反映している可能性がある。ＡｐｏＥ変異体がアミロイドーシスの動的進行にどのように影響を与えるかを評価するために、本発明者らは、インビボ二光子イメージングを使用してアミロイドプラークの形成およびクリアランスの速度を追跡した。７カ月齢の時点でマウスにＡＡＶ４ベクターを脳室内注射し、１回目のイメージングセッションを実施するために、注射の１週間後に頭蓋窓を移植した（Ｔ０）。１カ月（Ｔ１）および２カ月（Ｔ２）後、アミロイド沈着を同じ視野でイメージングした。２回目のイメージングセッションの後、死後分析のためにマウスを安楽死させた。
【０１７０】
アミロイド沈着の大部分は依然として安定であったが、２カ月の期間の間に新たな偶発的プラークを小さな視体積で検出することができた。また、まれに、実験開始時にイメージングしたメトキシ陽性プラークを１または２カ月後に検出することができなかったが、これは、一部のプラークが排出されなかったことを示唆している。時間と共に、本発明者らは、アミロイド沈着の体積密度が全体的に増加し、Ｔ２の密度はＴ１よりも平均２３％大きいことを観察した。２カ月後において、ＡｐｏＥ４処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスではアミロイド進行速度がより速かったのに対して、ＡｐｏＥ２曝露動物では、アミロイド沈着密度がＧＦＰ（０．６６）、ＡｐｏＥ３（０．６７）およびＡｐｏＥ４（０．７４）と比べて有意に減少した（図１１Ａ、１１Ｂ）。重要なことに、ＡｐｏＥ２の変化はベースラインからの減少を反映しおり、免疫を介さないプラークの活性クリアランスを初めて直接示すものである。ＡＰＯＥトランスジェニック動物から得られたデータとは対照的に、これらの結果は、アミロイド沈着が既に始まった後であっても、ＡｐｏＥ量のわずかな増加の誘導が進行中のアミロイド形成過程に影響を与えることができることを実証している。
【０１７１】
本発明者らは次に、個々の沈着の断面積についてＴ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１との比を測定することによって、単一のアミロイドプラークの成長を評価した。Ｔ１（Ｔ１／Ｔ０の比）時点では群間で差異が検出されたが、Ｔ２（Ｔ２／Ｔ１の比、図１２）時点では検出されず、これは、ヒトＡｐｏＥ変異体の存在が、曝露後の最初の１カ月間のプラーク成長に主に影響を与えるが、その後はこのパラメータに差異がないことを示唆している。特に、ＡｐｏＥ４処置マウスでは、アミロイド沈着のサイズは、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３の両方の場合と比較して有意に大きく成長したが、これは、プラークの数だけではなくそれらのサイズもこの対立遺伝子によって悪化したことを示唆している。したがって、ＡｐｏＥ４は、Ａβペプチドのシーディングおよび既存のプラークのサイズの両方に影響を与える。
【０１７２】
アミロイド沈着周囲のシナプス密度は、ＡｐｏＥ２と比較してＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４アイソフォームによって悪化する
シナプス消失は、認知機能障害と最も良く相関するパラメータである。本発明者らは最近、ＡｐｏＥ４の存在が、ヒトＡＤ患者の脳におけるシナプスオリゴマーＡβがより高レベルであることに関連しており、アミロイドプラーク周囲のシナプス密度をＡｐｏＥ３と比較して有意に減少させることを示した（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｆｆｉｅら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ４  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｏｔｏｘｉｃ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ．Ｂｒａｉｎ  １３５，２１５５（Ｊｕｌ，２０１２）；Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ，Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ４，Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２，１５１８１（Ｏｃｔ  ２４，２０１２））。加えて、最近のインビトロの証拠により、ＡｐｏＥ４は、Ａβ誘導性シナプス消失を防御することができなかったことが実証された（Ｍ．Ｂｕｔｔｉｎｉら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｌｉｋｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ，ａｇｉｎｇ，ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｎ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，１０５３９（Ｄｅｃ  １５，２００２）；  Ａ．Ｓｅｎ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ３（ＡｐｏＥ３）ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＡｐｏＥ４  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｏｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７，１５９４７（Ｍａｙ  ４，２０１２））。したがって、本発明者らは、各ＡｐｏＥアイソフォームの連続的な広範囲の分布は、ＡＰＰ／ＰＳマウスの脳におけるＡβの沈着およびクリアランスの速度だけではなく、アミロイド沈着周囲のシナプスの完全性にも差次的に影響を与え得ると仮説を立てた。
【０１７３】
アレイトモグラフィー（これは、超薄組織切片の免疫蛍光染色に基づく高解像技術である）を使用して、シナプス前要素およびシナプス後要素（それぞれシナプシン−１およびＰＳＤ９５）の密度を決定した（Ｋ．Ｄ．Ｍｉｃｈｅｖａ，Ｓ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｒｒａｙ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，２５（Ｊｕｌ  ５，２００７）；Ｒ．Ｍ．Ｋｏｆｆｉｅら、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｌｏｓｓ  ｎｅａｒ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，４０１２（Ｍａｒ  １０，２００９））。アミロイドオリゴマー種はアミロイド沈着のすぐ周辺で高濃度であることが示されたので、以前に確立されたプロトコール（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｆｆｉｅら、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｌｏｓｓ  ｎｅａｒ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，４０１２（Ｍａｒ  １０，２００９））を使用して、プラークから離れた場所（５０μｍ超）またはプラークの近くの場所（５０μｍ未満）のいずれかにおいて、シナプシン−１およびＰＳＤ９５の斑点を定量した。本発明者らは、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４のいずれかを発現させた場合、プラーク付近のシナプス前要素の消失が悪化したことを観察したが、これは、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２またはＡＡＶ４−ＧＦＰの注射後のケースではなかった（図１３Ａ）。対照的に、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３注射マウス間ではシナプス後斑点の密度は依然として不変であったのに対して、ＡｐｏＥ４処置動物は、アミロイド沈着周囲における有意なＰＳＤ９５消失を示し、これが、Ａβの神経毒性効果に対するＡｐｏＥ４の有害効果を増強した（図１３Ｃ）。アミロイド沈着から離れた位置の領域（５０μｍ超）においてシナプス要素の密度を評価したところ、群間で差異を検出することができず、これは、ヒトＡｐｏＥ変異体それ自体にはシナプス密度に対して効果がないが、ＡｐｏＥアイソフォームはＡβ誘導性神経毒性に対して重要な効果があることを示唆している。したがって、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４で観察された相対的なシナプス消失は、各プラーク周囲の（その端から５０μｍ未満の距離にある）Ａβペプチドの存在に直接関係している。
【０１７４】
さらなる神経病理学的パラメータとして、本発明者らはまた、ＡＡＶ４注射ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着に関連する神経突起ジストロフィーの数を評価した。また、老人斑は、それらの周囲のスパイン密度の減少に加えて、神経突起の湾曲が増加した神経網および膨張性ジストロフィーの出現というより一般的な変化を引き起こす。これらの病理学的変化は、プラーク表面５０μｍ内の領域に豊富にある可溶性オリゴマーＡβ種に起因する可能性がある。本発明者らは、ＡｐｏＥ４の過剰発現が、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３と比較して、アミロイド沈着に関連するＳＭＩ３１２陽性神経突起ジストロフィーの形成を悪化させることを観察した（図１３Ｃ）。この結果は、ＡｐｏＥ４アイソフォームが最も強力な効果を有し、プラーク形成を調節するだけではなく、アミロイド関連神経毒性にも影響を与えるという観察結果を裏付けている。
【０１７５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡＤの別のマウスモデルの間質液に含まれるオリゴマーＡβ種の量を変化させる
本発明者らは次に、ＩＳＦ内の異なるＡｐｏＥアイソフォームの存在が、その同じ細胞外区画における可溶性アミロイド種の量を変化させ得るかという問題に取り組んだ。本発明者らの先の知見を異なるトランスジェニックマウス系統で検証するために、本発明者らは別のＡＤモデル（Ｔｇ２５７６マウス）に注射することを選択した。Ｔｇ２５７６マウスは、スウェーデン突然変異を含有する突然変異型ＡＰＰを過剰発現し、所定の年齢でＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもはるかに軽度の表現型を示す。本発明者らは、１６〜１８カ月齢の動物のコホートに注射したところ、アミロイド沈着がＡＡＶ４−ＡＰＯＥ形質導入時に既に存在していた。遺伝子導入の３カ月後、微小透析プローブを海馬に挿入し、試料を採取して、ＩＳＦ内の各ＡＰＯＥ変異体に関連する初期変化を特性決定した。
【０１７６】
本発明者らは、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後において、特異的８２Ｅ１／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定したＡβオリゴマー種の濃度がＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の場合と比較して有意に（４２±７％）高かったことを観察したが（図１４）、これは、ＡｐｏＥの存在が、この細胞外区画におけるアミロイド凝集体の性質を調節し得ることを示唆している。また、ＩＳＦにおいてＡβ４０およびＡβ４２の合計を評価したところ、同じ傾向が観察されたが有意には達せず（図１７Ａ）、これは、ＩＳＦにおける異なるＡｐｏＥアイソフォームの存在が、アミロイドペプチドの凝集状態に対して、総量よりもいくらか影響を及ぼすことを示唆している。
【０１７７】
予想通り、様々なＡｐｏＥアイソフォームに曝露したＴｇ２５７６マウス由来の脳の死後生化学分析により、ＡｐｏＥ４処置動物では、ギ酸画分におけるＡβ４２濃度が有意に増加していたことが示され（図１７Ｂ）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける本発明者らの観察結果が第２のトランスジェニックモデルで裏付けられた。
【０１７８】
統合すると、これらの生化学的な測定結果は、Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡｐｏＥ発現が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスで観察されたのと同様のアミロイド生態変化を誘導することを示唆している。重要なことに、これらの神経毒性種がシナプス末端と直接相互作用し得るＩＳＦ内において、ｏＡβ含有量の初期変化が観察されている。
【０１７９】
考察
ＡＰＯＥ４対立遺伝子（これは、リスクを増加させる）およびＡＰＯＥ２対立遺伝子（これは、ＡＤの発症について劇的な逆の効果を有する）遺伝間の顕著な関連性により、このリスクがどのように媒介されるかについての複数の示唆が得られた。ＡｐｏＥは、Ａβクリアランスに関与するＡβ結合タンパク質として関与している。しかしながら、ａｐｏＥノックアウトマウスにおける研究では、驚くべきことに、ａｐｏＥの非存在下ではＡβ沈着が実質的に少なかったことを報告した。ヒトＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４で置換すると、ＡＤ患者と同じ順序でアミロイド沈着が増加したが、これは、プラークの開始または線維形成に対する効果を介して起こると仮定した。別の仮説は、神経突起伸長に対する差次的効果に注目するものであり、またはアルツハイマー病表現型に対するＡＰＯＥ遺伝子型の効果は、別の遺伝子が第１９染色体上のＡＰＯＥと遺伝的不平衡にある結果であるとさらに提案するものである。
【０１８０】
リソソーム蓄積症およびハンチントン病の状況で以前に試験された方法を使用して、２匹の異なるマウスモデルの研究から得られた本発明者らのデータは、インビボ多光子イメージング、標準定量免疫組織病理学、シナプス構造のアレイトモグラフィー研究、およびオリゴマーＡβの検査を可能にする新規な高分子量微小透析法の組み合わせを使用することによって、これらの問題に直接取り組んだ。本発明者らは、既存の疾患を有する動物におけるＩＳＦ  ＡｐｏＥ微小環境の変化が、Ａβエコノミーに対して顕著かつ急速な対立遺伝子特異的効果を有することを示した。本発明者らの研究により、ＩＳＦに送達されるＡｐｏＥ４レベルのわずかな（約１０％）増加でさえ、Ａβの表現型およびクリアランス速度に著しく影響を与え（増加した可溶性Ａβならびに抽出可能な線維およびギ酸形態がＡｐｏＥ４に関連して保持される）、シナプス消失および神経突起ジストロフィーの増加を特徴とするプラーク周囲の神経毒性を増加させることが実証された。逆に、ａｐｏＥ２はＡβを減少させ、顕著な神経防御効果を有する。
【０１８１】
ＩＳＦのＡｐｏＥレベルのわずかな変化はこのような劇的な結果を招くので、これらの結果から、ＡＰＯＥ発現に影響を及ぼすことによってＡＤまたはＡＤ進行のリスクを変化させ得る多種多様な環境的および遺伝的因子の効果に関する洞察が導かれ得る。本発明者らが実証した規模よりも実質的に大きなＡｐｏＥの増加が、外傷、癲癇、虚血および高コレステロール食（これらはすべて、脳Ａβの上昇に関連している）の後に起こり得る。また、ＡＰＯＥ４対立遺伝子と遺伝的不平衡にあると先に見出されたプロモーターの多型は、ＡＰＯＥ発現に影響を与える。
【０１８２】
ＣＮＳにおけるＡｐｏＥまたはＡｐｏＥリポタンパク質の恒常性に影響を与える他の操作は、Ａβ沈着を明らかに変化させる。例えば、ＡＰＯＥレンチウイルスによる局所遺伝子導入（主に海馬ニューロン）実験では、ＡＰＯＥ４過剰発現は、ＡＰＯＥ３と比べて、アミロイドに対して強い効果を発揮する。また、先の研究により、内因性のａｐｏＥ合成の増強を含む複数の効果を有するＲＸＲアゴニストは、おそらくは血液脳関門通過クリアランスに対する効果によって、脳からのＡβクリアランスにつながることが示された。加えて、ＣＮＳにおけるコレステロールを代謝し、そのレベルを低下させるＣＹＰ４６Ａを脳に形質導入すると、脳におけるＬＤＬ−Ｒ（これは、ａｐｏＥを減少させることが公知である）が増加するにつれてＡβ沈着が減少する。最後に、遺伝子操作は、ａｐｏＥ発現を半分に変化させることによりＡβ表現型に影響を与え得ることを示唆している。興味深いことに、本発明者らの結果は、よりわずかな変化も劇的な効果を有し得ることを示唆している。
【０１８３】
本発明者らのデータは、ＡＰＯＥ−アルツハイマー文献で論争のある４つの他の重要な分野に直接取り組むものである。１）本発明者らは、シナプス消失および神経突起ジストロフィー（これらは両方とも、神経系機能の障害に関係する可能性がある）によって評価した、神経毒性に対するＡｐｏＥアイソフォームの明らかな効果を実証する。これらの効果は、プラークから離れた領域ではなくプラークのすぐ周辺で明白であったので、ＡｐｏＥ４と比較したＡｐｏＥ２のシナプス防御性は、シナプス安定性に対するＡｐｏＥの直接的な効果によるのではなくプラーク周囲のＡβに対する効果によって媒介される可能性がある。２）縦断的多光子インビボイメージングを使用したプラークの沈着および成長の速度についての直接的な観察は、ＡｐｏＥ４はプラークの沈着および成長を増強するのに対して、ＡｐｏＥ２はプラークの分解に実際に関連することを示している−ＡｐｏＥアイソフォームは、線維性プラーク形成に対する初期効果よりも、疾患の速度および進行に対して強い影響を与えるといえる。この結果は、ＡｐｏＥ４はアミロイド沈着および神経毒性の両方の点で疾患過程を加速させ得る（したがって、より低年齢の発症につながる）が、ＡｐｏＥ２は反対に作用するという考えを補強するものであり、ＣＮＳへのＡｐｏＥ２（またはＡｐｏＥ２模倣体）の導入は、疾患が十分に確立された後であっても治療的価値を有し得るという可能性を提起する。３）ＡｐｏＥは、脳からのＡβ排出機構として、またはクリアランス半減期を増加させる保持分子として様々に示唆されている；本発明者らの今回の結果は、ＩＳＦへのわずかな量のＡｐｏＥの導入が、それがＡｐｏＥ２ではない限り、ＣＮＳにおけるＡβ保持を増強するのに十分であることを示している。４）部分的には、ＡｐｏＥ２はＡｐｏＥ受容体に比較的弱く結合するという理由から、ＡＤにおけるＡＰＯＥ２の顕著な防御作用機構は長く不明であった。本発明者らの今回のデータは、血漿へのＡβクリアランスに対する効果が中立的であるかまたは全くない可能性に加えて、ＡｐｏＥ２が獲得型機能を有する（確立されたＡβ沈着を実際に回復させ、シナプスおよび神経突起の可塑性を支援することができる）ことを示唆している。これは、ＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２対立遺伝子を遺伝で受け継いでいる患者間で発症年齢が数十年間異なるのは、沈着に関連する神経毒性の程度に関する対立遺伝子特異的な差異だけではなく、異なる開始点ならびにＡβの沈着およびクリアランスの速度に関する継続的な差異の両方を反映している可能性があることを示唆している。ＡｐｏＥ２のこの二重機能は、そのプラーク除去およびシナプス修復能を模倣することを目的とした治療的アプローチにつながり得る。
【０１８４】
これらの結果は、ａｐｏＥがＡβオリゴマー形成の足場として作用するモデル、オリゴマーＡβの形成および安定化の効率（ＡｐｏＥ４＞ＡｐｏＥ３＞ＡｐｏＥ２）、ならびにヒトＡＤ患者のＣＮＳでは（プラーク負荷を症例全体で標準化する場合であっても）オリゴマーＡβが上昇している（ＡｐｏＥ４＞ＡｐｏＥ３）という本発明者らの最近の観察結果と一致している。ＡｐｏＥ、特にＡｐｏＥ４が神経毒性オリゴマーＡβの形成を媒介する場合、本発明者らは、今回のデータの場合のように、ＡｐｏＥ４を増強するとシナプスおよび神経突起の変化が増加すると予測した。これらの結果に基づいて、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を遺伝で受け継いでいるＡＤ患者の脳におけるＡｐｏＥレベルを増加させる薬剤に関して注意を払うべきである。
【０１８５】
最後に、本発明者らのデータは、ＡＡＶを介した上衣の形質導入が分泌タンパク質を脳およびその皮質マントル全体に送達する力を裏付けている。ａｐｏＥ４を減少させるかまたはａｐｏＥ２を増加させる遺伝子導入または他のアプローチは、ＡＤの疾患進行に影響を与える強力な手段である。
【０１８６】
材料および方法
動物。ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９（ＡＰＰ／ＰＳ１）ダブルトランスジェニックマウス（Ｄ．Ｒ．Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １９，９３９（Ｏｃｔ，１９９７））（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから入手）およびＴｇ２５７６マウス（Ｋ．Ｈｓｉａｏら、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ，Ａｂｅｔａ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９（Ｏｃｔ  ４，１９９６））の両方を使用して、実験を実施した。スウェーデン二重突然変異Ｋ５９４Ｎ／Ｍ５９５Ｌを含有するヒト突然変異体アミロイド前駆体タンパク質遺伝子を、プリオンタンパク質プロモーターの制御下でこれら２つのマウス系統のゲノムに挿入した。加えて、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルは、（同じプロモーターによって駆動される）エクソン９が欠失した変異体プレセニリン１遺伝子を過剰発現する。ＡＰＰｓｗｅおよびＰＳＥＮ１をＡＰＰ／ＰＳ１マウスで同時に過剰発現させると、より重度の表現型が得られ、６カ月齢になるとすぐにかなりのアミロイド沈着が目に見える。他方、Ｔｇ２５７６マウス系統は、約１歳でアミロイドプラークのみを発症するかなり軽度のモデルである。異なるＡｐｏＥアイソフォームの導入が疾患進行に影響を与えるかを決定するために、本発明者らは、７カ月齢および１６カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１（条件当たり動物４〜７匹）およびＴｇ２５７６（条件当たり動物３〜５匹）マウスにそれぞれ注射した。ＡｐｏＥ欠損マウス（ＡｐｏＥノックアウト（ＫＯ），ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）も使用した。ＮＩＨおよび施設内ガイドラインにしたがって、実験を実施した。
【０１８７】
ウイルスベクターの構築および生産
寛大にも、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のＤｒ．ＬａＤｕがＡＰＯＥ−２、−３および−４のｃＤＮＡを提供してくれた。ＰＣＲによる増幅後、それらをそれぞれＢａｍＨＩによって消化し、ＡＡＶ２−ｐＣＭＶ−ｈｒＧＦＰ骨格に挿入した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ  ＣｉｔｙのＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅによるバキュロウイルス系を使用して、高力価のＡＡＶ血清型４ベクター（ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４およびＡＡＶ４−ＧＦＰ）を生産した。定量ＰＣＲを使用してウイルスを滴定した。
【０１８８】
定位脳室内注射。
以前に記載されているように（Ｔ．Ｌ．Ｓｐｉｒｅｓら、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，７２７８（Ａｕｇ  ３，２００５）；Ｇ．Ｌｉｕ，Ｉ．Ｈ．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｂ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４（ＡＡＶ４）ｔａｒｇｅｔｓ  ｅｐｅｎｄｙｍａ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ  ａｎｄ  ＲＭＳ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２，１５０３（Ｏｃｔ，２００５））、ＡＡＶ血清型４ベクターの定位脳室内注射を実施した。ケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によって動物を麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）上に配置した。１０μｌハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を取り付けた３３ゲージシャープマイクロピペットを使用して０．２５μｌ／分の速度で、ベクターの注射を各側脳室に５μｌのウイルス調製物（力価２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）で実施した。ブレグマから注射部位の定位座標を計算した（前後０．３ｍｍ、内外±１ｍｍおよび背腹−２ｍｍ）。
【０１８９】
頭蓋窓移植および多光子イメージング。
（Ｔ．Ｌ．Ｓｐｉｒｅｓら、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，７２７８（Ａｕｇ  ３，２００５）に以前に記載されているように）脳室内注射の１週間後、マウスをイソフルラン（１．５％）で麻酔し、頭蓋骨片を取り出してそれを直径８ｍｍのガラスカバースリップと交換することによって頭蓋窓を移植した。イメージングのために、頭蓋窓の境界に沿ってワックスリングを構築して、対物レンズ（２０倍対物レンズ、開口数０．９５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）用のウォーターウェルを作った。アミロイド沈着を可視化するために、手術の２４時間前にメトキシ−ＸＯ４（５ｍｇ／ｋｇ）（これは、血液脳関門を通過してアミロイド沈着に結合する蛍光化合物である）をトランスジェニック動物に腹腔内注射した（Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｓｋａｉ，Ｗ．Ｅ．Ｋｌｕｎｋ，Ｃ．Ａ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｂ．Ｔ．Ｈｙｍａｎ，Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２２，１０３５（Ｓｅｐ，２００２））。イメージング前に、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄデキストラン（分子量７０，０００Ｄａ；１２．５ｍｇ／ｍｌ滅菌ＰＢＳ溶液ＰＢＳ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を外側尾静脈に注射して蛍光血管造影図を得、正確に同じ視野を経時的に追跡するランドマークとして血管系の形状を使用した。アミロイド沈着のベースラインレベルを評価するために、マウスをＡＡＶ注射の１週間後にイメージングし、次いで注射の１および２カ月後にイメージングした。
【０１９０】
多光子イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １０２４ＥＳ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にマウントしたモードロックＴｉ：サファイアレーザー（ＭａｉＴａｉ，Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、８６０ｎｍの二光子蛍光励起光を生成した。三光電子増倍管を含有する特注の外部検出器（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）によって、３８０〜４８０、５００〜５４０および５６０〜６５０ｎｍの範囲内で放出光を収集した。プラークおよび血管造影に関する２色の画像を同時に取得した。低倍率のインビボ画像（６１５×６１５μｍ；ｚステップ２μｍ、深さ約２００μｍ）を取得し、６〜８つの視野をイメージングして大皮質領域を網羅した。
【０１９１】
画像処理および分析。Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して、イメージングした皮質体積当たりのアミロイド沈着の総数を報告することによって、各視野におけるプラーク密度を定量した。本発明者らは、表面の最初のｚスタックスライスから始まって、アミロイド沈着を検出することができた最後のスライスまでの皮質体積を検討した。二次元投影後の最大強度から断面積を測定することによって、アミロイド沈着のサイズを経時的に評価した。各プラークについて、最初の時点と１カ月目との面積比（Ｔ１／Ｔ０）または２カ月目と１カ月目との面積比（Ｔ２／Ｔ１）を計算した。
【０１９２】
多光子顕微鏡（レーザー出力およびＰＭＴ）の設定は、全実験期間中の異なるイメージングセッションを通して変更しなかった。
【０１９３】
インビボ微小透析サンプリング。各ＡＡＶ４を脳室内注射した３カ月後に、脳間質ＡβおよびＡｐｏＥのインビボ微小透析サンプリングをＴｇ２５７６マウスで実施した（Ｓ．Ｔａｋｅｄａら、Ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｆｒｅｅ−ｍｏｖｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８６，１１０（Ｊｕｌ  １４，２０１１））。微小透析プローブは、３．０ｍｍ、カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）１０００ｋＤａのポリエチレン（ＰＥ）膜（ＰＥＰ−４−０３，Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備える４ｍｍシャフトを有していた。使用前に、プローブをエタノールに簡単に浸漬することによって調整し、次いで、孔径０．２μｍの膜に通してろ過した人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）灌流緩衝液（ｍＭ単位：１２２ＮａＣｌ、１．３ＣａＣｌ２、１．２ＭｇＣｌ２、３．０ＫＨ２ＰＯ４、２５．０ＮａＨＣＯ３）で洗浄した。フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）チューブ（内径φ２５０μｍ）を使用して、予め調整したプローブの排出口および注入口をそれぞれ蠕動ポンプ（ＥＲＰ−１０，Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）およびマイクロシリンジポンプ（ＥＳＰ−３２，Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）に接続した。
【０１９４】
わずかに修正を加えたが以前に記載されているように（Ｓ．Ｔａｋｅｄａら、Ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｆｒｅｅ−ｍｏｖｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８６，１１０（Ｊｕｌ  １４，２０１１；Ｊ．Ｒ．Ｃｉｒｒｉｔｏら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｌａｑｕｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，８８４４（Ｏｃｔ  １，２００３））、プローブの埋め込みを実施した。簡潔に言えば、ガイドカニューレ（ＰＥＧ−４，Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、麻酔した動物（１．５％イソフルラン）の海馬（ブレグマ−３．１ｍｍ、中線の外側−２．５ｍｍ、腹部の腹側−１．２ｍｍ）に定位的に埋め込んだ。次いで、バイナリ歯科用セメントを使用して、ガイドを頭蓋骨に固定した。
【０１９５】
ガイドカニューレを埋め込んだ４日後、マウスを標準的な微小透析ケージに入れ、ガイドを介してプローブを挿入した。プローブの挿入後、安定した記録を得るために、プローブおよび接続チューブを試料採取前に流速１０μｌ／分で２４０分間にわたってａＣＳＦで灌流した。流速０．２５（Ａβ定量の場合）および０．１μｌ／分（ＡｐｏＥ検出の場合）で試料を採取した。試料をポリプロピレンチューブに４℃で保存した。微小透析の試料採取中、プローブアセンブリに加圧することなく、動物が無制限に動けるように設計された微小透析ケージ（ＡｔｍｏｓＬＭ  ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）内で、マウスは覚醒して自由に運動していた。
【０１９６】
免疫組織学的分析。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは脳室内注射の２または５カ月後（短期および長期の曝露）にＣＯ２吸入によって安楽死させたのに対して、Ｔｇ２５７６動物は３カ月後に屠殺した。免疫組織学的分析のために１つの大脳半球全体を４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩水で固定し、パラフィンワックスに包埋した。前頭葉の１ｍｍ冠状断面はアレイトモグラフィーアッセイのために加工したのに対して、半脳の残りの部分は生化学的生体分子分析を実施するために急速凍結した。
【０１９７】
アミロイド沈着、ＡｐｏＥおよびＧＦＰを検出するために、パラフィン包埋切片（１０μｍ）をキシレンで順次に脱パラフィン化し、エタノールで再水和し、クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）で処理し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳで透過処理し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳによって室温で２時間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションを４℃で一晩行った：アミロイドプラークに対するＢａｍ１０（ＳＩＧＭＡ  １：１０００）およびＲ１２８２（１：５００、Ｄｒ  Ｄｅｎｎｉｓ  Ｓｅｌｋｏｅより提供）、ヒトＡｐｏＥに対するマウスモノクローナル抗体３Ｈ１（Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００，Ａｖｅｓ）および神経突起ジストロフィーに対するＳＭＩ−３１２（Ｃｏｖａｎｃｅ）。翌日、二次抗体とのインキュベーションを室温で２時間行った。マウント前に、切片をＴｈｉｏ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．０５％の５０％エタノール溶液中で８分間インキュベートすることによって、アミロイド高密度コアプラークを標識した。
【０１９８】
アレイトモグラフィーのための試料調製、免疫染色およびイメージング分析
以前に記載されているように（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｆｆｉｅら、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｌｏｓｓ  ｎｅａｒ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，４０１２（Ｍａｒ  １０，２００９））、シナプス前要素およびシナプス後要素のアレイトモグラフィー分析を実施した。簡潔に言えば、脳室領域に隣接する皮質組織切片（１ｍｍ３）を解剖し、４％パラホルムアルデヒド、２．５％スクロースの０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液で３時間固定した。エタノールで脱水した後、試料をＬＲ  Ｗｈｉｔｅ  ｒｅｓｉｎ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、４℃で一晩インキュベートしてから、５３℃で重合させた。次いで、ｕｌｔｒａｃｕｔミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）上でジャンボヒストダイヤモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ）を使用することによって、リボン状の切片（７０ｎｍ）を切断した。
【０１９９】
５０ｍＭグリシンのＴＢＳ溶液で５分間再水和した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎおよび０．１％ＢＳＡのＴｒｉｓ溶液で切片を５分間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液中、一次抗体を１：５０で２時間アプライした（ＰＳＤ９５  Ａｂｃａｍ  Ａｂ１２０９３、シナプシンＩ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ１５４３、およびＤｒ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＬｅｅからのＮＡＢ６１（これは、オリゴマーＡβ種を選択的に染色する）、Ｅ．Ｂ．Ｌｅｅら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ（Ａｂｅｔａ）ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｂｙ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  Ａｂｅｔａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，４２９２（Ｆｅｂ  １７，２００６））。スライドをＴＢＳで洗浄し、二次抗体をアプライした（抗ヤギ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、抗マウスＣｙ３または抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。前頭葉の７〜３０個の連続切片の画像を得て、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ＬＳＭ５１０共焦点／多光子顕微鏡（６３ｘ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ａｐｅｒｔｕｒｅ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用することによって取得した。
【０２００】
以前に記載されているようにＩｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）およびＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｆｆｉｅら、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｌｏｓｓ  ｎｅａｒ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，４０１２（Ｍａｒ  １０，２００９））を使用して、画像を分析した。各画像セットをスタックに変換し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＭｕｌｔｉＳｔａｃｋＲｅｇおよびＳｔａｃｋＲｅｇプラグイン（Ｂｒａｄ  Ｂｕｓｓｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｈｅｖｅｎａｚ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの厚意によるもの）を使用することによってアライメントした。既知体積を選択し、閾値ベースの自動化検出プログラムを使用して、複数の連続切片に現れたＰＳＤ９５およびシナプシンの斑点の両方を計数した（Ｂｒａｄ  Ｂｕｓｓｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｉｎａ  Ｍｉｃｈｅｖａ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから提供を受けた流域プログラム）。複数のアレイスライスに存在した斑点を示す（各チャネルについて別個の）閾値画像スタックを流域からエクスポートした。マウス１匹当たりいくつかの皮質部位をサンプリングし、プラーク端からの距離を測定した。
【０２０１】
Ａβの定量
製造業者の説明書にしたがってＢＮＴ−７７／ＢＡ−２７（Ａβ４０の場合）およびＢＮＴ−７７／ＢＣ−０５（Ａβ４２の場合）サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によって、ＴＢＳ可溶性画分、ギ酸画分および微小透析液におけるＡβ４０およびＡβ４２濃度を決定した。同じＮ末端（残基１〜１６）抗体を捕捉および検出の両方に使用した８２Ｅ１／８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、試料中のオリゴマーＡβの量を決定した（Ｗ．Ｘｉａら、Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６６，１９０（Ｆｅｂ，２００９））。
【０２０２】
イムノブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ＭＯＰＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜１２％Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、脳ＴＢＳ可溶性画分および微小透析液（２０μｇのタンパク質）を電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、５％ミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温（ＲＴ）で６０分間ブロッキングした。ヤギ抗ＡｐｏＥ抗体（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ９４７）で膜をプローブして、ＡＰＯＥヌル動物のＩＳＦにおける少量のＡＰＯＥを検出し、アルブミンを対照として検出した。ＥＰ１３７３Ｙ抗体（１：１０００，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１１０−５５４６７）およびウサギポリクローナルａｐｏＥ抗体（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ２０８７４）でヒトおよびマウスＡｐｏＥのブロットをそれぞれプローブした。ＨＲＰコンジュゲートヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）とのインキュベーションを２時間行った。ＥＣＬキット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して免疫反応性タンパク質を開発し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で検出した。
【０２０３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５５９６−０２６）を使用して脳試料由来の全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１２５７４−０１８）の製造業者の説明書にしたがってｃＤＮＡを合成した。組換えヒトＡＰＯＥ  ｍＲＮＡならびに内因性ＡｐｏｅおよびＧａｐｄｈ  ｍＲＮＡを増幅するようにＰＣＲプライマーを特別に設計した（Ａｐｏｅフォワード：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡ；Ａｐｏｅリバース：５’−ＧＴＴＧＣＧＴＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴ；ＡＰＯＥフォワード：５’−ＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣ；ＡＰＯＥリバース：５’−ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ；Ｇａｐｄｈフォワード：５’−ＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧおよびＧａｐｄｈリバース：５’−ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧ）。
【０２０４】
ＡＰＯＥ  ＥＬＩＳＡ
特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトおよび内因性マウスＡＰＯＥタンパク質の両方を検出した。簡潔に言えば、１．５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（マウスＡＰＯＥの検出用）または１．５ｕｇ／ｍｌのＷＵＥ４抗体（ヒトＡＰＯＥの検出用）でＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングし、ＰＢＳで希釈した１％脱脂乳によって３７℃で１．５時間ブロッキングした。ヒト組換えａｐｏＥタンパク質を標準として（ヒト特異的アッセイの場合、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）または脳抽出物由来のインハウスマウス標準（マウス特異的アッセイの場合）を使用し、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液）で試料を希釈し、一晩インキュベートした。洗浄後、ヒト（ヤギａｐｏｅ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）またはマウス（Ａｂｃａｍ  ａｂ２０８７４；１：２，０００）に対して特異的な検出抗体をそれぞれ使用し、続いて、適切なＨＲＰコンジュゲート二次と共に１．５時間インキュベートした。ＴＭＢ基質を使用してシグナルの可視化を行ってから、Ｈ３ＰＯ４を使用して溶液を停止させた。比色分析結果を４５０ｎｍで測定した。
【０２０５】
統計分析
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、統計分析を実施した。試料のサイズが小さいので、分析のほとんどについて正規性を仮定することができなかった。すべての死後分析について、注射した各ベクターの効果を評価するために、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を実施し、続いてダンの多重比較検定を実施した。マウスについてはランダム効果とし、ベクター、時間およびベースライン体積密度については固定効果とする混合効果モデルを使用して、アミロイド進行のインビボイメージングデータを分析した。この分析では、時間とベクターとの間の相互作用を検討したが有意ではなかった。経時的なプラークサイズの分析では、マウスについてはランダム効果とし、対数ベースラインサイズについては固定効果として、連続する２時点の対数比について２つの混合効果モデルをフィッティングした（第１の分析のｔ０、第２の分析のｔ１）。
【０２０６】
すべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記明細書では、ある特定の好ましい実施形態に関連して本発明を説明し、多くの詳細を例示目的で記載したが、当業者であれば、本発明はさらなる実施形態の影響を受けやすいこと、および本発明の基本原理から逸脱することなく、本明細書に記載される詳細の一部を大幅に変更し得ることが明らかであろう。
【０２０７】
本発明を説明する文脈で用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似指示語を使用することは、特に本明細書で指示がないかまたは文脈上明らかな矛盾がない限り、単数形および複数形の両方を包含するように解するべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に注記がない限り、非限定的な用語（すなわち、「限定されないが、〜を含む」を意味する）と解するべきである。本明細書における値域の記載は、特に本明細書で指示がない限り、単にその範囲内にある別個の各値を個々に言及する略記方法としての役割を果たすためのものであり、別個の各値は、本明細書で個々に言及されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される方法はすべて、特に本明細書で指示がないかまたは文脈上明らかな矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意およびすべての例または例示的文言（例えば、「などの」）を使用することは、単に本発明をより良く説明するためのものであり、特に特許請求の範囲に記載されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書における文言は、特許請求の範囲に記載されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解するべきではない。
【０２０８】
本発明者らが理解している発明を実施するための最良の形態を含む本発明の実施形態が本明細書に記載されている。当業者であれば、上記説明を読むことによりこれらの実施形態の変形物が明らかになるであろう。本発明者らは、当業者であればこのような変形物を採用することを予想しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法が許容するように、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変物および均等物を含む。また、特に本明細書で指示がないかまたは文脈上明らかな矛盾がない限り、上記要素をそのすべての可能な変形で任意に組み合わせたものが本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図６Ｂ−４】
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【図６Ｂ−５】
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【図６Ｂ−６】
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【図６Ｂ−７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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