(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた色素細胞活性化剤を提供すること、及びＳＣＦ産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤を提供することである。【解決手段】オウバク又はそのエキスが優れた色素細胞の活性化作用、ＳＣＦ産生促進作用、ＶＥＧＦ産生促進作用を有することを見出した。すなわち、本発明は、オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞活性化剤、色素細胞増殖促進剤、メラニン産生促進剤、ＭＩＴＦ産生促進剤、メラニン合成酵素産生促進剤、メラニン輸送促進剤、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤、ＳＣＦ産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤である。【選択図】図１
2019031482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞活性化剤。
【請求項２】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞増殖促進剤。
【請求項３】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞におけるメラニン産生促進剤。
【請求項４】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＭＩＴＦ産生促進剤。
【請求項５】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、メラニン合成酵素産生促進剤。
【請求項６】
メラニン合成酵素がチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びドーパクロームトートメラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５に記載の産生促進剤。
【請求項７】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、メラニン輸送促進剤。
【請求項８】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤。
【請求項９】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＳＣＦ産生促進剤。
【請求項１０】
オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項１１】
さらにヒバマタ又はそのエキスを含む、請求項９又は１０に記載の産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素細胞を活性化する色素細胞活性化剤、より詳細には、色素細胞増殖促進剤、メラニン産生促進剤、ＭＩＴＦ産生促進剤、メラニン合成酵素産生促進剤、メラニン輸送促進剤、及びＳＣＦ（幹細胞因子、Stem cell factor、KITL、KIT ligand、Steel factor、Mast cell growth factor）産生促進剤、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子、Vascular endothelial growth factor）産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む動物において、皮膚や毛髪の色調は、皮膚及び毛髪に存在する色素であるメラニンの量によって決定されている。メラニンは、表皮基底層や毛包に存在する色素細胞が持つメラニン合成酵素群によって生合成される。現在知られている酵素群は、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１、ＤＨＩＣＡ oxidase）、及びドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ、ＴＹＲＰ２）である。さらに、これらの酵素群は、転写因子である小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）により遺伝子発現が亢進することが知られている。（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００３】
色素細胞内で生合成されたメラニンは、細胞内に存在する低分子量Ｇタンパク質ＲＡＢ２７Ａを含む複合体により、輸送される事が知られており（非特許文献３）、このようなメラニン輸送機構により、色素細胞から上皮系細胞内に転送されることで、皮膚や毛髪は着色する。
【０００４】
ヒトは、美しく白い肌を望む一方、近年の若年層においては、褐色の肌を望む場合も多く、皮膚の褐色化には日光浴を行ったり、屋内で紫外線照射を受けたりすることが行われてきた。しかし、過度の紫外線はＤＮＡ損傷を引き起こし、その結果、皮膚癌等が発症することが知られている。また、ジヒドロキシアセトンなどを主成分とするセルフタンニング剤も知られているが、色合いのコントロールの難しさや紫外線防御能低下の可能性がある。そのため、ＤＮＡ損傷を介さず色素細胞にメラニンを作らせることが求められている。また、メラニンは紫外線照射から皮膚を守る役割を担っており、メラニン産生により皮膚のダメージを予防することができる。
【０００５】
さらに、色素細胞が消失するか、あるいはその機能が低下してメラニン産生が減少する皮膚疾患（白斑）がある。白斑は先天的な場合もあるが後天的に発症することもあり、治療法としては、日光照射、紫外線照射等の光線療法、ステロイドホルモンの内服、外用等が挙げられるが有効なものがなく、安全性についても問題があるのが現状である。
また、加齢に伴う白髪は、毛包に存在する色素細胞の変化によってメラニンが減少する生理的老化現象の一つであるが、その発生機序の多くは未だ解明されておらず、染毛剤による染毛が中心となっているのが現状である。しかし、これらの白髪染めは、発生した白髪を事後的に黒色に染める対処療法的なものであって、白髪の発生を根本的に解決するものではない。
【０００６】
従って、色素細胞に直接作用して色素細胞を活性化させ、細胞自体の増殖を高めたり、メラニン量を増加させる成分を見出したりすることができれば、本来メラニンが持つ生体防御能を促進させて皮膚のダメージを予防すると共に、肌の褐色化や白斑の予防又は治療、白髪の防止又は改善が実現できると考えられる。
【０００７】
また、ＳＣＦは造血細胞、肥満細胞、色素細胞等、種々の細胞の増殖や分化を促す因子として知られており、造血、精子形成及びメラニン形成において重要な役割を果たしている。皮膚においては角化細胞や線維芽細胞が産生し、色素細胞の増殖やメラニン産生を促すことで、健康的な皮膚色の維持・改善に寄与する。また毛包においては、毛包上皮系細胞やその幹細胞、毛乳頭細胞が産生し、色素細胞やその幹細胞の増殖及び生存能力を向上することで、頭髪や睫毛、その他の体毛色を維持・改善し、白髪を予防、改善することが期待される。
【０００８】
ＶＥＧＦは血管内皮細胞の増殖や生存能力を向上させることで、血管新生・形成に関与する因子として知られる。主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体に結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きをもつが、その他単球・マクロファージの活性化にも関与する。皮膚においては角化細胞や線維芽細胞が分泌し、皮膚の血行を促進することによってクスミや透明感の改善等、皮膚色の改善に寄与する。また毛包においては、外毛根鞘細胞等の毛包上皮系細胞や毛乳頭細胞が産生し、毛包周囲の血管網を発達させたり、直接的に種々の細胞増殖を促進することにより、健全な毛髪成長に寄与する。
【０００９】
従って、これら因子の産生を促進することで、様々な症状の治療、改善につなげることが可能であると考えられる。これまでに様々な色素細胞活性化剤、ＳＣＦ産生促進剤、及びＶＥＧＦ産生促進剤が見出されている。従来、色素細胞を活性化する成分としては、例えば、チロシナーゼ産生促進剤としてスカシユリ等（特許文献１）、ＭＩＴＦ産生促進剤としてフォルスコリン等（特許文献２）が報告されており、ＳＣＦの発現を促進する成分としては、例えば、ステュライラ、コビダラ、サルマリ等が報告されており（特許文献３）、ＶＥＧＦの発現を促進する成分としては、ゲンコウ、ウンシュウミカン等が知られている（特許文献４）。
【００１０】
一方、オウバクは、ムクロジ目ミカン科キハダ属キハダ又はその他同属植物の周皮を除いた樹皮に由来する生薬であり、消炎、健胃、清熱、解毒などの効能があり、下痢、腹痛、黄疸、湿疹、腫れ物などに用いられており、ヒバマタは、ヒバマタ目ヒバマタ科ヒバマタ属に属する褐藻であり、ターンオーバー促進、免疫力向上、健胃等の作用があることは知られている。また、オウバク、ヒバマタには、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）や白髪に関する作用が報告されている（特許文献５、特許文献６）が、色素細胞活性化、ＳＣＦ産生、ＶＥＧＦ産生に関する作用は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2016-121113
【特許文献２】特許5836666
【特許文献３】特開2006-176437
【特許文献４】特許5836421
【特許文献５】特開2016-121134
【特許文献６】特開2016-121135
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Fang D et al（2002）Nucleic Acids Res., 15;30(14):3096-106.
【非特許文献２】Newton RA et al（2007）J Invest Dermatol., 127(9):2216-27.
【非特許文献３】Bahadoran P et al（2001）J Cell Biol., 19;152(4):843-50.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、色素細胞活性化剤を提供すること、及びＳＣＦ産生剤又はＶＥＧＦ産生剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、色素細胞増殖やメラニン輸送を促す素材、あるいはメラニン、ＭＩＴＦやチロシナーゼ（以下、「ＴＹＲ」ともいう）、チロシナーゼ関連タンパク質１（以下「ＴＹＲＰ１」ともいう）、ドーパクロームトートメラーゼ（以下「ＤＣＴ」ともいう）等のメラニン合成酵素、ＲＡＢ２７Ａ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦの産生を促す素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは鋭意検討した結果、オウバク又はそのエキスが、優れた色素細胞活性化作用、すなわち、色素細胞増殖促進作用、メラニン産生促進作用、ＭＩＴＦ産生促進作用やチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロームトートメラーゼ等のメラニン合成酵素産生促進作用、ＲＡＢ２７Ａ産生促進作用等のメラニン輸送促進作用を有することを見出した。また、オウバク又はそのエキスが、毛乳頭細胞におけるＳＣＦ産生促進作用、ＶＥＧＦ産生促進作用を有することを見出し、さらには、オウバク又はそのエキスのＳＣＦ及びＶＥＧＦの産生促進作用は、ヒバマタと組み合わせると顕著に増強されることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞活性化剤、
（２）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞増殖促進剤、
（３）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、色素細胞におけるメラニン産生促進剤、
（４）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＭＩＴＦ産生促進剤、
（５）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、メラニン合成酵素産生促進剤、
（６）メラニン合成酵素がチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びドーパクロームトートメラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種である、（５）に記載の産生促進剤
（７）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、メラニン輸送促進剤、
（８）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤、
（９）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＳＣＦ産生促進剤、
（１０）オウバク又はそのエキスを有効成分とする、ＶＥＧＦ産生促進剤、
（１１）さらにヒバマタ又はそのエキスを含む、請求項９又は１０に記載の産生促進剤、
である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の色素細胞活性化剤、ＳＣＦ産生促進剤及びＶＥＧＦ産生促進剤はその優れた作用により色素細胞、ＳＣＦ及びＶＥＧＦに関連した種々の症状や疾患に対する効果が期待できる。また、本発明の色素細胞活性化剤、色素細胞増殖促進剤、メラニン産生促進剤、ＭＩＴＦ産生促進剤、メラニン合成酵素産生促進剤、メラニン輸送促進剤、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤、ＳＣＦ産生促進剤及びＶＥＧＦ産生促進剤は、これらの作用を必要とする化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品の分野に利用可能である。また、素材スクリーニング等を行なうに際し、陽性対照薬としても用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、試験例１における色素細胞の増殖性を示したグラフである。
【図２】図２は、試験例２における色素細胞のメラニン産生量を示したグラフである。
【図３】図３は、試験例３におけるＭＩＴＦ発現量を示すグラフである。
【図４】図４は、試験例３におけるチロシナーゼ発現量を示すグラフである。
【図５】図５は、試験例３におけるチロシナーゼ関連タンパク質１発現量を示すグラフである。
【図６】図６は、試験例３におけるドーパクロームトートメラーゼ発現量を示すグラフである。
【図７】図７は、試験例３におけるＲＡＢ２７Ａ発現量を示すグラフである。
【図８】図８は、試験例４におけるＳＣＦ発現量を示すグラフである。
【図９】図９は、試験例４におけるＳＣＦ発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、試験例４におけるＶＥＧＦ発現量を示すグラフである。
【図１１】図１１は、試験例４におけるＶＥＧＦ発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に用いるオウバクはムクロジ目ミカン科キハダ属キハダ（学名Phellodendron amurense）又はその他同属植物の周皮を除いた樹皮に由来する生薬である。また、本発明に用いるヒバマタ（学名Fucus vesiculosus）は、ヒバマタ目ヒバマタ科ヒバマタ属に属する褐藻である。オウバク及びヒバマタは、生薬末、生薬エキスの形で使用される。本発明に用いる生薬末としては、例えば乾燥刻み加工品を更に細かく粉砕した粉末状の乾燥品としてもよい。
【００１９】
本発明に用いるオウバクエキスは、水、低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなど）、多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンなど）、低級脂肪族ケトン（アセトンなど）などの溶媒や前記溶媒の混液により抽出したものを使用することができるが、このうち多価アルコールと水からなる混液で抽出することが最も好ましい。多価アルコールとしては、好ましくは１，３−ブチレングリコール、又はプロピレングリコールが挙げられるが、１，３−ブチレングリコールが最も好ましい。水と１，３−ブチレングリコールからなる溶媒で抽出する場合、溶媒中における１，３−ブチレングリコールの含有量は、３０〜７０体積％が好ましい。
【００２０】
本発明に用いるヒバマタエキスは、水、低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなど）、多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコールなど）、低級脂肪族ケトン（アセトンなど）などの溶媒により抽出したものを使用することができるが、エタノールと水の混液、又は多価アルコールと水の混液で抽出することが好ましく、１，３−ブチレングリコールと水の混液が最も好ましい。水と１，３−ブチレングリコールからなる溶媒で抽出する場合、溶媒中における１，３−ブチレングリコールの含有量は、３０〜７０体積％が好ましい。
【００２１】
また、エキスの形態は特に制限されるものではなく、加熱処理、凍結乾燥あるいは減圧乾燥などの処理により、乾燥エキス末、エキス末、軟エキス、流エキスなどにすることができる。オウバクエキスの市販品としては、オウバク抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬製）やオウバクリキッドＢ（一丸ファルコス製）、ヒバマタエキスの市販品としては、カイソウ抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬製）やファルコレックスヒバマタ（一丸ファルコス製）等が挙げられる。
【００２２】
本発明における色素とは、メラニンであり、本発明における色素細胞とは、色素、すなわちメラニンの産生能を有する細胞、例えば、メラノサイトやメラノーマ細胞であり、由来生物種は問わない。また、未熟な色素細胞である色素芽細胞（メラノブラスト）及び色素幹細胞も含む。
【００２３】
本発明における色素細胞活性化とは、色素細胞発生及び活性化のマスターレギュレーターとされるＭＩＴＦの産生促進、色素細胞の増殖促進、メラニン産生促進及びそれに関与する酵素であるチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロームトートメラーゼの産生促進、並びにメラニン輸送の促進及びそれに関連するタンパクであるＲＡＢ２７Ａの産生促進等の作用を含む包括的な作用である。本発明における色素細胞活性化作用により、色素細胞の不足、色素細胞におけるメラニン産生能の低下、及び、色素細胞におけるメラニン輸送能の低下を予防及び／又は改善することができる。つまり、これらが原因により発生する種々の症状や疾患、例えば、白髪、白斑等を予防及び／又は改善できる。また、色素細胞活性化剤は、健康的な肌色を目的として利用することができる。
【００２４】
本発明における色素細胞増殖促進剤によると、色素細胞の数を増加させることにより、メラニン産生を促進することができ、また、本発明におけるメラニン産生促進剤は、色素細胞におけるメラニン産生を促進することで、メラニン不足による諸症状や疾患、前記白髪や白斑等の予防及び／又は改善を目的として使用できる。
【００２５】
本発明におけるＭＩＴＦとは、小眼球症関連転写因子（microphthalmia-associated transcription factor）とも呼ばれ、メラニン合成酵素をコードしているチロシナーゼ遺伝子、チロシナーゼ関連タンパク質１及びドーパクロームトートメラーゼの発現を制御している転写因子であることが報告されており、ＭＩＴＦの産生促進により、メラニン産生が促進することが知られている。
【００２６】
本発明におけるメラニン合成酵素には、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロームトートメラーゼ等が挙げられる。それぞれメラニン合成における特定の反応を触媒するため、メラニン合成酵素の産生促進により、メラニンの産生が促進される。
【００２７】
チロシナーゼは、メラニン合成の律速酵素であり、メラニン合成の出発物質であるチロシンからドーパ、さらにはドーパからドーパキノンへの変換反応を触媒する。また、ドーパクロームトートメラーゼはドーパクロームからＤＨＩＣＡへの変換、チロシナーゼ関連タンパク質１はＤＨＩＣＡからユーメラニン（黒色メラニン）への変換を触媒する酵素である。
【００２８】
本発明におけるメラニン輸送とは、色素細胞から毛包や皮膚等の上皮系細胞等へのメラニンの受け渡しを意味し、メラニンを受け取った上皮系細胞が増殖・分化することで色のついた毛や皮膚が形成される。このメラニン輸送過程に異常が生じることも白髪や白斑等につながるため、本発明におけるメラニン輸送促進剤により、このような白髪や白斑等の予防や改善が可能である。
【００２９】
本発明におけるＲＡＢ２７Ａとは、低分子量Ｇタンパクの一種であり、上記のメラニン輸送において重要な役割を担うことが知られている因子である。
【００３０】
本発明のＳＣＦ産生促進剤によると、優れたＳＣＦ産生促進作用を通じて、例えば、色素細胞の増殖活性化に基づくメラニン生成作用により、白髪や白斑の予防及び／又は改善、あるいは皮膚においては健康的な肌色を目的として利用することができる。また、ＳＣＦは造血の中心をなすサイトカインであり、多能性造血幹細胞、巨核球系前駆細胞、肥満細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞などに作用し、その増殖や分化を促進するため、これら造血に関連する症状や疾患、例えば、好中球減少症、無顆粒球症の予防及び／又は治療に利用可能である。また、これらの用途以外にもＳＣＦ産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。
【００３１】
本発明のＶＥＧＦ産生促進剤によると、優れたＶＥＧＦ産生作用を通じて、例えば、毛包周辺の血管新生作用により育毛・養毛・発毛剤として利用できる。また、ＶＥＧＦの強力な血管新生作用により、冠動脈疾患・閉塞性末梢動脈硬化症の治療や、血管形成不全、軟骨損傷、創傷等の改善にも用いることができる。また、これらの用途以外にもＶＥＧＦ産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。
【００３２】
本発明の色素細胞活性化剤、色素細胞増殖促進剤、メラニン産生促進剤、ＭＩＴＦ産生促進剤、メラニン合成酵素産生促進剤、チロシナーゼ産生促進剤、チロシナーゼ関連タンパク質１産生促進剤、ドーパクロームトートメラーゼ産生促進剤、メラニン輸送促進剤、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤、ＳＣＦ産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品等として提供することができる。なお、好ましくはヒトに対して適用されるものであるが、作用効果が奏される限りヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００３３】
投与形態としては、特に限定されるものではないが、外用や内服が挙げられ、好ましくは頭皮を含む皮膚に適用する外用である。本発明を外用で適用する場合の剤形としては、例えば、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、シャンプー、コンディショナー、石鹸等が挙げられ、内服で適用する場合の剤形としては、錠剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、ゼリー剤、液状食品、半固形食品、固形食品等が挙げられる。
【００３４】
これらは、公知の方法で製造することができる。製造に際しては、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品又は試薬に含有可能な種々の添加物を配合することができる。
【００３５】
本発明の色素細胞活性化剤、色素細胞増殖促進剤、メラニン産生促進剤、ＭＩＴＦ産生促進剤、メラニン合成酵素産生促進剤、チロシナーゼ産生促進剤、チロシナーゼ関連タンパク質１産生促進剤、ドーパクロームトートメラーゼ産生促進剤、メラニン輸送促進剤、ＲＡＢ２７Ａ産生促進剤、ＳＣＦ産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤は、例えば、関連する症状や疾患の研究のため、あるいは、色素細胞を活性化するための、又はＳＣＦ産生若しくはＶＥＧＦ産生を促進するための試薬として用いることも可能であり、好適には素材スクリーニング等を行なうに際し陽性対照薬として利用可能である。また、本発明は色素細胞を活性化する方法、すなわち、色素細胞増殖、メラニン産生、ＭＩＴＦ産生、メラニン合成酵素産生、チロシナーゼ産生、チロシナーゼ関連タンパク質１産生、ドーパクロームトートメラーゼ産生、メラニン輸送又はＲＡＢ２７Ａ産生を促進する方法、さらにはＳＣＦ産生又はＶＥＧＦ産生を促進する方法を提供する。色素細胞又はＳＣＦ産生若しくはＶＥＧＦ産生を促進させたい細胞にオウバク若しくはそのエキス、又はオウバク若しくはそのエキス及びヒバマタ若しくはそのエキスを添加する工程を含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明のオウバク若しくはそのエキス、又はヒバマタ若しくはそのエキスの配合量は、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品又は試薬で提供する場合、それぞれ組成物全体に対して０．０００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００１〜５質量％、より好ましくは０．００１〜１質量％である。
【００３７】
本発明の活性化剤又は促進剤（医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品、試薬等）やその説明書は、色素細胞活性化のために用いられる旨の表示、色素細胞増殖促進のために用いられる旨の表示、色素細胞におけるメラニン産生促進のために用いられる旨の表示、ＭＩＴＦ産生促進のために用いられる旨の表示、メラニン合成酵素産生促進のために用いられる旨の表示、メラニン輸送促進のために用いられる旨の表示、ＲＡＢ２７Ａ産生促進のために用いられる旨の表示、ＳＣＦ産生促進のために用いられる旨の表示、又はＶＥＧＦ産生促進のために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで、「表示を付した」とは、活性化剤又は促進剤を含む製品の本体、容器、包装などに記載すること、あるいは製品情報を開示する説明書、添付文書、パンフレット、その他の印刷物などの書類に記載すること、及び各種チラシ、インターネットを含む宣伝のために用いられる広告に記載することを含む。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例および試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００３９】
（試験例１）ヒト色素細胞に対する細胞増殖促進作用の評価
＜試験方法＞
ヒト色素細胞（倉敷紡績）を96穴プレートに1.5×104 cells/ウェルの密度で播種し、37℃、CO2 5%にセットしたインキュベーター内で培養した。培地には、DermaLife M Comp kit（倉敷紡績）を用いた。播種翌日に、サプリメントStiMel 8 Life Factor を除いた同培地に交換し、被験物質を添加して、CO2 インキュベーターで3 日間培養した。その後 Cell Counting Kit-8 （同仁化学研究所）を添加し、2 時間培養した後、450 nm における吸光度を測定した。被験物質は、１，３−ブチレングリコール50体積％と水50体積％の混液により抽出したオウバクエキスを図１に記載の終濃度で用いた。コントロールは、オウバク添加群からオウバクエキスを除いたもの（溶媒等の他の条件は全てオウバク添加群と同一）とした。
【００４０】
＜試験結果＞
細胞増殖促進作用の評価結果を図１に示す。各穴において吸光度からブランク穴（培地及びCell Counting Kit-8 のみ）の吸光度を引いた値を求め、さらにオウバクを添加していないコントロール群の値を100としたときの相対値を算出し評価に用いた。コントロール群と比較してオウバク添加群が有意に高い値を示し、オウバクが色素細胞の増殖促進作用を示すことが確認できた。 
【００４１】
（試験例２）マウスメラノーマ細胞に対するメラニン産生促進作用の評価
＜試験方法＞
マウスメラノーマ細胞（B16F1 細胞、DSファーマバイオメディカル）を6穴プレートに1×105 cellsウェルの密度で播種し、37℃、CO2 5%にセットしたインキュベーター内で培養した。翌日に、被験物質を添加し、さらに5日間培養した後、細胞を剥離し回収した。細胞ペレットに１mLのPBSを加えて懸濁し、そのうち0.8mLに1 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液を加えて，100℃で加熱することにより溶解した。溶解液の405 nm の吸光度を測定し、化学合成メラニン（シグマアルドリッチ）を用いて作成した検量線に当てはめることでメラニン濃度を算出した。残り0.2mLの細胞懸濁液に1％Triton X-100 溶液を添加して溶解し、溶解液のタンパク質濃度をPierce BCA Protein Assay Kit （サーモフィッシャーサイエンティフィック）のプロトコールに従い測定した。細胞各穴のメラニン量とタンパク量から、各穴のタンパク質量あたりのメラニン量（μg melanin /μg protein）を求めた。被験物質は、１，３−ブチレングリコール50体積％と水50体積％の混液により抽出したオウバクエキスを図２に記載の終濃度で用いた。コントロールは、オウバク添加群からオウバクエキスを除いたもの（溶媒等の他の条件は全てオウバク添加群と同一）とした。
【００４２】
＜試験結果＞
メラニン産生促進作用の評価結果を図２に示す。オウバクを添加していないコントロール群の値を1 としたときの相対値を算出し、評価に用いた。コントロール群と比較してオウバク添加群が有意に高い値を示した。
【００４３】
（試験例３）ヒト色素細胞に対する遺伝子発現促進作用の評価
＜試験方法＞
ヒト色素細胞（倉敷紡績）を培養プレートに播種し、サブコンフルエントになるまで、37℃、CO2 5%にセットしたインキュベーター内で培養した。培地には、DermaLife M Comp kit（倉敷紡績）を用いた。培養後、StiMel 8 Life Factor を除く同培地に交換し、被験物質を添加して48時間培養した。その後、ライセートバッファーを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液を回収した。細胞溶解液より、RNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いて添付のプロトコールに従いRNAを回収し、これを鋳型として、Prime Script RT Master mix（タカラバイオ）を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。合成したcDNAから、リアルタイムPCRシステム（Step One Plus、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により、GAPDH、MITF、TYR、TYRP1、DCT及びRAB27AのmRNAの発現量をSYBR Green法により測定し、MITF、TYR、TYRP1、DCT及びRAB27Aの発現量をGAPDH発現量により補正した。プライマーは、次の型番のものを用いた。GAPDH：HA067812、MITF：HA153228、TYR：HA286635、TYRP1：HA255361、DCT：HA169364、RAB27A：HA182623（いずれもタカラバイオ）。被験物質は、１，３−ブチレングリコール50体積％と水50体積％の混液により抽出したオウバクエキスを図３〜７に記載の終濃度で用いた。コントロールは、オウバク添加群からオウバクエキスを除いたもの（溶媒等の他の条件は全てオウバク添加群と同一）とした。
【００４４】
＜試験結果＞
遺伝子発現促進作用の評価結果を図３〜７に示す。オウバクを添加していないコントロール群の値を1 としたときの相対値を算出し、評価に用いた。オウバク添加群で、MITF、TYR、TYRP1、DCT及びRAB27A 発現量の有意な上昇が確認された。
【００４５】
（試験例４）ヒト毛乳頭細胞に対するSCF及びVEGF産生促進作用の評価
＜試験方法＞
ヒト毛乳頭細胞（東洋紡）を培養プレートに播種し、サブコンフルエントになるまで、37℃、CO2 5%にセットしたインキュベーター内で培養した。培地には、12%FBS及び規定量のペニシリン・ストレプトマイシンを含むEarle’s MEM（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いた。培養後、FBS非含有Earle’s MEMに交換し、被験物質を添加して24時間培養した。その後、ライセートバッファーを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液を回収した。細胞溶解液より、RNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いて添付のプロトコールに従いRNAを回収し、これを鋳型として、Prime Script RT Master mix（タカラバイオ）を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。合成したcDNAから、リアルタイムPCRシステム（Step One Plus、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により、GAPDH、SCF及びVEGFそれぞれのmRNAの発現量を測定し（GAPDH及びSCFはSYBR Green法，VEGFはTaqmanプローブ法）、SCF及びVEGFの発現量をGAPDH発現量により補正した。プライマーは、次の型番のものを用いた。GAPDH：HA067812（タカラバイオ）、SCF：HA122146（タカラバイオ）、VEGF（VEGFA）：Hs00900055_m1（サーモフィッシャーサイエンティフィック）。被験物質は、１，３−ブチレングリコール50体積％と水50体積％の混液により抽出したオウバクエキス及びヒバマタエキスを図８〜１１に記載の終濃度で用いた。コントロールは、オウバク又はヒバマタ添加群から当該エキスを除いたもの（溶媒等の他の条件は全てオウバク又はヒバマタ添加群と同一）とした。
【００４６】
＜試験結果＞
図８は、オウバク及びヒバマタのSCF産生促進作用を評価した結果である。被験物質を添加していないコントロール群の発現量を１としたときの各群のSCF相対発現量を示す。オウバクは、SCF発現量を有意に増加させた。一方で、ヒバマタは全く作用を示さず、高濃度においてはむしろSCF発現量を低下させた。図９は、オウバク及びヒバマタを混合添加した際のSCF産生促進作用を評価した結果である。オウバク単独添加群と比較して、オウバク及びヒバマタ混合添加群のSCF発現量は有意に高く、驚くべきことにオウバクのSCF産生促進作用はSCF産生抑制作用を示すヒバマタの同時添加により著しく促進されることが判明した。
【００４７】
図１０は、オウバク及びヒバマタのVEGF産生促進作用を評価した結果である。被験物質を添加していないコントロール群の発現量を１としたときの各群のVEGF相対発現量を示す。オウバクはVEGF発現量を有意に増加させた。またヒバマタはごく微弱なVEGF産生促進作用を示した。図１１は、オウバク及びヒバマタを混合添加した際のVEGF産生促進作用を評価した結果である。オウバク及びヒバマタのVEGF産生促進作用は、これらの混合添加により相乗的に促進されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の色素細胞活性化剤は、色素細胞に対し増殖促進作用、メラニン産生促進作用、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロームトートメラーゼ及びＲＡＢ２７Ａ産生促進作用を有するため、これらの作用を必要とする化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品の分野に利用可能である。また、本発明のＳＣＦ及びＶＥＧＦ産生促進剤もこれらの作用を必要とする化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品の分野に利用可能である。さらに、本発明の色素細胞活性化剤、ＳＣＦ及びＶＥＧＦ産生促進剤は、素材スクリーニング等を行なうに際し、陽性対照薬として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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