(57)【要約】【課題】リポソームの外部から内部へ物質を輸送して内包させるための新規な手段を提供する。【解決手段】リポソームの外側表面に配置した光架橋性修飾核酸を光架橋して、核酸凝集体を形成することによって、リポソーム内部へ核酸凝集体を輸送して、核酸凝集体を内包したリポソームを製造する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの外側表面に配置した光架橋性修飾核酸を光架橋して、核酸凝集体を形成することによって、リポソーム内部へ核酸凝集体を輸送して、核酸凝集体を内包したリポソームを製造する方法。
【請求項２】
光架橋性修飾核酸が、
脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、
該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置されている、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
脂質親和性化合物が結合した光架橋性修飾核酸を、リポソームに添加することによって、リポソームの外側表面に配置する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
光架橋性修飾核酸が、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されており、
核酸凝集体を内包したリポソームが、薬剤を内包したリポソームである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
光架橋性修飾核酸が、
光架橋性ヌクレオシドアナログを、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えている、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
光架橋性ヌクレオシドアナログが、ヌクレオシドアナログの塩基部分として、次の式Ｉで表される基を有する光架橋性人工塩基を備えている、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法：
（Ｉ）
2019026570.tif 000014
（ただし、式Ｉ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子である）。
【請求項７】
核酸凝集体が、光架橋性修飾核酸によって形成された二重鎖を含む凝集体であり、該二重鎖は二重鎖内の鎖間に光架橋が形成されている、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
核酸凝集体の形成によって、負電荷の集中する領域が形成される、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２を有し、
光架橋性修飾核酸１は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側には一重鎖部分を備えておらず、
光架橋性修飾核酸１の５’末端側から始まる二重鎖部分の塩基配列とループ部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸１の３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列と３’末端までさらに続く一重鎖部分を、あわせてＯＲ配列とし、
光架橋性修飾核酸２は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側には一重鎖部分を備えておらず、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、
光架橋性修飾核酸２の５’末端側から始まる一重鎖部分の塩基配列とそれに続く二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸２のループ部分の塩基配列と３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＯＲ配列とし、
ＢＬ配列は、ＢＬ配列とＢＬ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＢＬ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
ＯＲ配列は、ＯＲ配列とＯＲ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＯＲ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
トリガー核酸は、その塩基配列がＯＲ配列又はＢＬ配列である核酸であり、
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、トリガー核酸を添加することによって、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）にしたがって二重鎖の形成と伸長が進行して、核酸凝集体が形成される、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置可能であり、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、少なくともいずれかが、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されている、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
二重鎖の形成と伸長の進行の間に、光照射を行って光架橋を形成する、請求項９〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２を有する、薬剤内包リポソーム製造用キットであって、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置可能であり、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、少なくともいずれかが、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されており、
光架橋性修飾核酸１は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側には一重鎖部分を備えておらず、
光架橋性修飾核酸１の５’末端側から始まる二重鎖部分の塩基配列とループ部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸１の３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列と３’末端までさらに続く一重鎖部分を、あわせてＯＲ配列とし、
光架橋性修飾核酸２は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側には一重鎖部分を備えておらず、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、
光架橋性修飾核酸２の５’末端側から始まる一重鎖部分の塩基配列とそれに続く二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸２のループ部分の塩基配列と３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＯＲ配列とし、
ＢＬ配列は、ＢＬ配列とＢＬ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＢＬ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
ＯＲ配列は、ＯＲ配列とＯＲ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＯＲ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、トリガー核酸を添加することによって、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）にしたがって二重鎖の形成と伸長が進行して、核酸凝集体を形成可能であり、
二重鎖の形成と伸長の進行の間に、光照射を行って光架橋を形成可能である、キット。
【請求項１３】
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、リポソームの外側表面に配置された形態である、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤内包リポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは脂質二重膜構造を備えた数μｍ程度の球状の構造体であり、ドラッグデリバリーの担体として研究開発が進められている。例えば、リポソームの表面に修飾を施すことによって、癌細胞などを特異的に識別する技術が知られている（非特許文献１）。そのために、識別された癌細胞などへ薬剤を配送して、副作用の少ない治療を可能とするために、薬剤内包リポソームの研究開発が進められている。
【０００３】
リポソームに薬剤を内包させるために、リポソームの作成時に、あらかじめ薬剤を存在させておき、リポソームの形成とともに内包させる技術が知られている。あるいは、リポソームの作成後に、リポソーム内外での濃度勾配を与えることによって濃度勾配により薬剤を内包させる技術が知られている（非特許文献２）。これらの場合には、作成後に、透析やゲル濾過によって、薬剤内包リポソームを回収することになる。
【０００４】
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結及び核酸の架橋がある。核酸の連結や架橋は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用され、あるいは、例えば、遺伝子発現の阻害に使用される。そのために、核酸の連結及び架橋の技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。
【０００５】
核酸の光反応技術として、５−シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３−ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３７５３９３８号公報
【特許文献２】特許第３７５３９４２号公報
【特許文献３】特許第４８１４９０４号公報
【特許文献４】特許第４９４０３１１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，２００８，２３，６４５
【非特許文献２】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２０１４，９，ｅ１０７９７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
リポソームはその構造そのものが最安定な構造をしており、様々な脂質を用いてリポソームを作成することによって、リポソームの安定性、血中滞留性、標的集積性などを精密に制御することができる。しかし、そのような安定な構造であるために、いったん形成されたリポソームでは、脂質二重膜の表面が親水性、内部は疎水性となり、膜の内外で物質交換がされにくい構造となっている。大きな濃度勾配によって、リポソームの外部から薬剤を導入する手法はあるが、精密に制御されたリポソームに対して過酷な条件であり、またリポソーム内に導入されない薬剤の損失割合も多いため、大きな濃度勾配によらずに、リポソーム内へ薬剤を導入して薬剤内包リポソームを調整する新規な手段が求められていた。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、リポソームの外部から内部へ、物質を輸送して内包させるための新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、リポソームの脂質二重膜を通過して、外部から内部へ物質を輸送して内包させるための手段を鋭意研究してきたところ、所定条件の下で、リポソーム外部の表面において光反応性架橋剤によって核酸を連結させると、リポソーム内部へこれらの外部物質が取り込まれることを発見して、本発明に到達した。
【００１１】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
リポソームの外側表面に配置した光架橋性修飾核酸を光架橋して、核酸凝集体を形成することによって、リポソーム内部へ核酸凝集体を輸送して、核酸凝集体を内包したリポソームを製造する方法。
（２）
光架橋性修飾核酸が、
脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、
該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置されている、（１）に記載の製造方法。
（３）
脂質親和性化合物が結合した光架橋性修飾核酸を、リポソームに添加することによって、リポソームの外側表面に配置する、（２）に記載の製造方法。
（４）
光架橋性修飾核酸が、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されており、
核酸凝集体を内包したリポソームが、薬剤を内包したリポソームである、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）
光架橋性修飾核酸が、
光架橋性ヌクレオシドアナログを、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えている、（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）
光架橋性ヌクレオシドアナログが、ヌクレオシドアナログの塩基部分として、次の式Ｉで表される基を有する光架橋性人工塩基を備えている、（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法：
（Ｉ）
2019026570.tif 000002
（ただし、式Ｉ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子である）。
（７）
核酸凝集体が、光架橋性修飾核酸によって形成された二重鎖を含む凝集体であり、該二重鎖は二重鎖内の鎖間に光架橋が形成されている、（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）
核酸凝集体の形成によって、負電荷の集中する領域が形成される、（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）
光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２を有し、
光架橋性修飾核酸１は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側には一重鎖部分を備えておらず、
光架橋性修飾核酸１の５’末端側から始まる二重鎖部分の塩基配列とループ部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸１の３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列と３’末端までさらに続く一重鎖部分を、あわせてＯＲ配列とし、
光架橋性修飾核酸２は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側には一重鎖部分を備えておらず、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、
光架橋性修飾核酸２の５’末端側から始まる一重鎖部分の塩基配列とそれに続く二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸２のループ部分の塩基配列と３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＯＲ配列とし、
ＢＬ配列は、ＢＬ配列とＢＬ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＢＬ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
ＯＲ配列は、ＯＲ配列とＯＲ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＯＲ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
トリガー核酸は、その塩基配列がＯＲ配列又はＢＬ配列である核酸であり、
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、トリガー核酸を添加することによって、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）にしたがって二重鎖の形成と伸長が進行して、核酸凝集体が形成される、（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置可能であり、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、少なくともいずれかが、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されている、（９）に記載の製造方法。
（１１）
二重鎖の形成と伸長の進行の間に、光照射を行って光架橋を形成する、（９）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）
光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２を有する、薬剤内包リポソーム製造用キットであって、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、該脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置可能であり、
光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２は、少なくともいずれかが、リポソーム内部へ輸送される薬剤を結合されており、
光架橋性修飾核酸１は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側には一重鎖部分を備えておらず、
光架橋性修飾核酸１の５’末端側から始まる二重鎖部分の塩基配列とループ部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸１の３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列と３’末端までさらに続く一重鎖部分を、あわせてＯＲ配列とし、
光架橋性修飾核酸２は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有しており、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側には一重鎖部分を備えておらず、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側にはさらに一重鎖部分を備えており、
光架橋性修飾核酸２の５’末端側から始まる一重鎖部分の塩基配列とそれに続く二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とし、
光架橋性修飾核酸２のループ部分の塩基配列と３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＯＲ配列とし、
ＢＬ配列は、ＢＬ配列とＢＬ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＢＬ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
ＯＲ配列は、ＯＲ配列とＯＲ配列とが二重鎖を形成可能な配列であり、
ＯＲ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有しており、
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、トリガー核酸を添加することによって、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）にしたがって二重鎖の形成と伸長が進行して、核酸凝集体を形成可能であり、
二重鎖の形成と伸長の進行の間に、光照射を行って光架橋を形成可能である、キット。
（１３）
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とが、リポソームの外側表面に配置された形態である、（１２）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リポソームの外部から内部へ、物質（薬剤）を輸送して内包させることができる。本発明によれば、大きな濃度勾配によらずに、リポソーム内へ薬剤を導入して薬剤内包リポソームを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】図１ａは光照射によるリポソーム内部へのＤＮＡの取り込みの流れを示す説明図である。
【図１ｂ】図１ｂは光照射によるリポソーム内部へのＤＮＡの取り込みの流れを示す説明図である。
【図１ｃ】図１ｃは光照射前と光照射後の顕微鏡写真である。
【図２】図２はＤＮＡ取り込みの温度依存性を検討した実験結果である。
【図３】図３はＤＮＡ取り込みの鎖長依存性を検討した実験結果である。
【図４ａ】図４ａはＨＣＲの原理の説明図である。
【図４ｂ】図４ｂはＤＮＡナノ構造体が構築されたことを示す電気泳動ゲルの写真である。
【図４ｃ】図４ｃはＤＮＡをトリガーとしてリポソームの構造変化が誘起される様子を示す説明図である。
【図４ｄ】図４ｄはＯＤＮ１とビーコンプローブ１、２から形成される二重鎖の様子の説明図である。
【図４ｅ】図４ｅは二重鎖が形成される流れの説明図である。
【図５ａ】図５ａは外部ＤＮＡによるリポソーム内部へのＤＮＡ輸送の説明図である。
【図５ｂ】図５ｂはＤＮＡ輸送が、マッチするＯＤＮ１を用いた場合の光照射では起こり、マッチしないＯＤＮ２を用いた場合の光照射では起こらないことを示す顕微鏡写真である。
【図６】図６はCNVＫ、CNVＤ、ｐｓｏｒａｌｅｎを対比した実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１５】
［リポソーム内部への物質輸送］
本発明によれば、リポソームの外側表面に配置した光架橋性修飾核酸を光架橋して、核酸凝集体を形成することによって、リポソーム内部へ核酸凝集体を輸送して、核酸凝集体を内包したリポソームを製造することができる。この光架橋性修飾核酸には、薬剤を結合するものとできるから、核酸凝集体を内包したリポソームの製造は、すなわち、薬剤を内包したリポソームの製造となる。
【００１６】
［光架橋性修飾核酸］
光架橋性修飾核酸は、光架橋性ヌクレオシドアナログを、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて、リン酸ジエステル結合によって結合して、塩基配列中に備えている。
【００１７】
［光架橋性ヌクレオシドアナログ］
光架橋性ヌクレオシドアナログとして、公知の光架橋性ヌクレオシドアナログを使用することができる。例えば、特許文献１、２に開示された５−シアノビニルデオキシウリジン構造を有する光架橋性ヌクレオシドアナログを使用することができ、特許文献３、４に開示された３−ビニルカルバゾール構造を有する光架橋性ヌクレオシドアナログを使用することができる。
【００１８】
好適な実施の態様において、光架橋性ヌクレオシドアナログが、ヌクレオシドアナログの塩基部分として、次の式Ｉで表される基を有する光架橋性人工塩基を備えている：
（Ｉ）
2019026570.tif 000003
【００１９】
式Ｉ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子である。
【００２０】
式Ｉ中、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子である。
【００２１】
アルコキシカルボニル基としては、例えばＣ２〜Ｃ７、好ましくはＣ２〜Ｃ６、Ｃ２〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用できる。
【００２２】
好適な実施の態様において、Ｒ１１を、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はＣ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基とすることができ、Ｒ１２及びＲ１３を水素原子とすることができる。
【００２３】
上記の光架橋性ヌクレオシドアナログが導入された一重鎖の光架橋性修飾核酸は、通常の核酸と同様に、二重鎖を形成することができる。二重鎖の形成にあたり、光架橋性人工塩基と相補的な位置に位置する天然の核酸塩基としては、特に制約はない。このように二重鎖が形成された後に、光照射すると、光架橋性人工塩基は、光架橋可能な位置に配置されたピリミジン塩基との間に光架橋を形成する。照射する光は、例えば３４０ｎｍ〜３９０ｎｍの範囲の波長を含む光とすることができる。ピリミジン塩基としては、例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンをあげることができ、好ましくはチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）をあげることができる。光架橋可能な位置とは、二重鎖を形成した相補的な塩基配列中において、光架橋性人工塩基と相補的な位置にある塩基から１塩基だけ５’末端側の位置である。
【００２４】
好適な実施の態様において、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される光架橋性ヌクレオシドアナログを使用することができる：
（ＩＩ）
2019026570.tif 000004
【００２５】
式ＩＩにおいて、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ式Ｉにおいて記載した基である。Ｒ２１は、水素原子又は水酸基である。
【００２６】
（ＩＩＩ）
2019026570.tif 000005
【００２７】
式ＩＩＩにおいて、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ式Ｉにおいて記載した基である。Ｒ３１は、水素原子又はＣ１〜Ｃ３のアルキル基であり、好ましくは水素原子又はメチル基である。
【００２８】
［脂質親和性化合物］
光架橋性修飾核酸は、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する脂質親和性化合物を結合されており、この脂質親和性化合物の脂質親和性部分によってリポソームの外側表面に配置されている。このような脂質親和性化合物として、脂質二重膜の脂質層に親和性ある部分を有する公知の化合物を使用することができ、例えば、脂質をあげることができる。脂質としては、例えば、アシルグリセロール、セラミド、リン脂質（例えばスフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）、糖脂質（例えばスフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）、リポタンパク質、スルホ脂質、あるいは誘導脂質（例えば脂肪酸、テルペノイド、ステロイド、カロテノイド）をあげることができる。好ましくは、脂質として、例えばステロイド、好ましくはステロール、特に好ましくはコレステロールをあげることができる。この脂質親和性化合物は、光架橋性修飾核酸を、脂質二重膜に配置するための、いわばアンカーのように作用するものであるので、適度なアンカーの作用を考慮して、当業者は適宜選択することができる。好適な実施の態様において、リポソームの調整に用いた脂質と同じ脂質を、脂質親和性化合物として使用することができる。
【００２９】
［リポソーム内部へ輸送される薬剤］
光架橋性修飾核酸は、リポソーム内部へ輸送される薬剤を、結合している。このような薬剤としては、特に制限はなく、本発明によるリポソーム内部への輸送を妨げないものであれば使用できる。
【００３０】
リポソーム内部へ輸送される薬剤として、他の薬剤を結合可能である化合物を使用することもできる。すなわち、リポソーム内部へ輸送される薬剤として、他の薬剤を結合可能である化合物を使用して、いったん光架橋性修飾核酸を調整して、リポソームの外側表面上に配置しておいた後に、さらに所望の薬剤を結合させて、リポソーム内部への輸送を行うことができる。
【００３１】
［リポソーム］
本発明のリポソームは、脂質二重膜を備えたリポソームであり、公知の手段によって調整することができる。そして、脂質親和性化合物が結合した光架橋性修飾核酸を、そのリポソーム外部表面に配置する。好適な実施の態様において、この配置は、例えば、脂質親和性化合物が結合した光架橋性修飾核酸を、リポソームに添加するという簡便な手段により、実現することができる。
【００３２】
リポソームの調整の公知の手段として、例えば、静置水和法、界面通過法、Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ法、油中水滴エマルション遠心沈降法、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ法をあげることができる。静置水和法では、例えば、アルコールを含む有機溶媒相へ脂質を溶解した後に、乾燥して、乾燥した脂質膜を形成し、その後に、水を添加して水和させて、リポソームを形成する。
【００３３】
リポソームは、脂質二重膜を形成可能な脂質を用いて、調整することができる。脂質として、例えば、アシルグリセロール、セラミド、リン脂質（例えばスフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）、糖脂質（例えばスフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）、リポタンパク質、スルホ脂質、あるいは誘導脂質（例えば脂肪酸、テルペノイド、ステロイド、カロテノイド）をあげることができる。好ましくは、脂質として、例えばステロイド、好ましくはステロール、特に好ましくはコレステロールをあげることができる。
【００３４】
［リポソーム内部への核酸凝集体の輸送］
核酸凝集体が形成されると、核酸による負電荷が集中した領域が生じる。本発明による核酸凝集体のリポソーム内部への輸送は、この負電荷の集中によって生じているのではないかと、本発明者は考えている。核酸凝集体が、このように輸送されるために、この核酸凝集体を構成している光架橋性修飾核酸と、そこに結合した薬剤は、当然にリポソーム内部へと輸送される。この輸送は、おそらくは小さなリポソーム、すなわち、リポソームの外部の脂質二重膜の一部が、あたかもエンドサイトーシスによって、ちぎれて内部へ陥入して小胞を形成するかのように、小さなリポソームを形成して生じているのではないかと、本発明者は考えている。したがって、リポソームの二重膜を物理的に破壊して導入したかのような内包とは、異なった内包状態となっている。
【００３５】
［ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）による核酸凝集体の形成］
好適な実施の態様において、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）によって核酸凝集体を形成して、リポソーム内部へ核酸凝集体を輸送することができる。
【００３６】
この態様において、光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２を用いる。さらにＨＣＲの開始のために、トリガー核酸を用いる。
【００３７】
光架橋性修飾核酸１は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有している。そして、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側にはさらに一重鎖部分を備えている。しかし、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側には一重鎖部分を備えていない。
【００３８】
光架橋性修飾核酸１の５’末端側から始まる二重鎖部分の塩基配列とループ部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とする。光架橋性修飾核酸１の３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列と３’末端までさらに続く一重鎖部分を、あわせてＯＲ配列とする。
【００３９】
光架橋性修飾核酸２は、二重鎖部分と一重鎖のループ部分を備えたヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有している。そして、ヘアピン構造の二重鎖部分の３’末端側には一重鎖部分を備えていない。しかし、ヘアピン構造の二重鎖部分の５’末端側にはさらに一重鎖部分を備えている。
【００４０】
光架橋性修飾核酸２の５’末端側から始まる一重鎖部分の塩基配列とそれに続く二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＢＬ配列とする。光架橋性修飾核酸２のループ部分の塩基配列と３’末端側に位置する二重鎖部分の塩基配列を、あわせてＯＲ配列とする。
【００４１】
ＢＬ配列は、ＢＬ配列とＢＬ配列とが二重鎖を形成可能な配列である。ＢＬ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有している。
【００４２】
ＯＲ配列は、ＯＲ配列とＯＲ配列とが二重鎖を形成可能な配列である。ＯＲ配列は、光架橋性ヌクレオシドアナログが、天然の核酸塩基のヌクレオシドに置換されて塩基配列中に備えており、該光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な位置に光架橋性ヌクレオシドアナログが光架橋可能な塩基を有している。
【００４３】
トリガー核酸は、その塩基配列がＯＲ配列又はＢＬ配列である核酸である。
【００４４】
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２とは、トリガー核酸を添加することによって、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）にしたがって、ヘアピン構造を交互に開裂しながら、二重鎖の形成と伸長が進行する。このハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）の進行原理は、後述する実施例において、説明図を用いてさらに詳細に説明する。
【００４５】
［ＨＣＲにおける光架橋の貢献］
本来は、核酸による二重鎖の形成と開裂は可逆的な反応であって熱力学的な安定性にしたがってある程度の速度によってしか進行しないはずである。そして、そのような条件下で、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）を進行させたとしても、核酸凝集体の形成は、おそらくはその形成速度のために不十分なものとなり、リポソーム内部への核酸凝集体の輸送は生じない。しかし、ハイブリダイゼーションチェインリアクション（ＨＣＲ）の進行において、光架橋性修飾核酸１、２による光架橋が生じると、二重鎖の形成は光架橋によって不可逆なものとなり、二重鎖の伸長は極めて迅速に進行する。おそらくはこの速度のために、核酸凝集体の形成は、リポソーム内部への核酸凝集体の輸送が生じるために、十分な状態に達する。
【００４６】
［光架橋のための光照射］
光架橋のための光照射は、ＨＣＲの進行に寄与するために、ＨＣＲの進行中に連続して、又は断続的に行うことができる。照射時間は、ＨＣＲの進行に応じて、適宜変更することができるが、光架橋による寄与が非常に大きいために、好適な実施の態様において、例えば３０秒〜１２０秒程度の照射で、十分にＨＣＲを進行させることができる。
【００４７】
照射の際の温度は、本来であればＨＣＲの進行のために温度の最適化が必要なところ、光架橋による寄与が非常に大きいために、好適な実施の態様において、例えば１℃〜３０℃、好ましくは１℃〜２５℃、さらに好ましくは１℃〜２０℃、さらに好ましくは１℃〜１５℃で行うことができる。温度が低いほど、リポソーム内部への核酸凝集体の輸送が、促進される。
【００４８】
［光架橋性修飾核酸の鎖長］
光架橋性修飾核酸の鎖長は、長いほど、リポソーム内部への核酸凝集体の輸送が、促進される。例えば、塩基配列の長さとして、１０塩基以上、１２塩基以上、１４塩基以上、１６塩基以上、１８塩基以上、２０塩基以上、２２塩基以上とすることができる。リポソーム内部への核酸凝集体の輸送が妨げられない限り、特に鎖長の上限はないが、例えば１０００００塩基以下、５０００塩基以下、１０００塩基以下、５００塩基以下、１００塩基以下とすることができる。本来であればＨＣＲの進行のために鎖長を制限しなければならないところ、光架橋による寄与が非常に大きいために、上記のような傾向となっていると考えられる。
【００４９】
［トリガー核酸の配列特異性と光架橋性修飾核酸のセットの複数使用］
トリガー核酸は、これがＨＣＲで反応開始のトリガーとなるために、高い配列特異性を必要とする。つまり、異なる配列の核酸が存在しても、トリガーにはならない。そのために、光架橋性修飾核酸として、光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２のセットの他に、例えば、光架橋性修飾核酸３と光架橋性核酸４のセットが、同時にリポソームの外部表面上に存在していたとしても、それぞれのセットに対応した正しい配列のトリガー核酸を使用しなければ、リポソーム内部への核酸凝集体の輸送は生じない。したがって、光架橋性修飾核酸のセットを、異なる物質輸送のために、リポソームの外部表面に同時に存在させたとしても、それぞれのセットに対応した正しい配列のトリガー核酸を使用することで、独立して、リポソーム内部への輸送を制御することができる。このような、光架橋性修飾核酸の複数のセットを、同時に使用する態様も、本発明の範囲内にある。
【００５０】
［複数の薬剤の使用］
光架橋性修飾核酸１と、光架橋性修飾核酸２は、これらに同じ薬剤を結合して、リポソーム内部に輸送してもよいが、これらに異なる薬剤を結合してもよい。また、光架橋性修飾核酸１及び２の分子集団において、異なる複数の薬剤を結合させてもよく、さらに、その薬剤の結合の比率を変えることで、リポソーム内部に輸送される薬剤の種類や比率を制御してもよい。このような複数の薬剤を使用する態様も、本発明の範囲内にある。このように、従来の技術では困難であった、内包される薬剤の種類や比率の精密な制御を、本発明によれば実現できる。
【００５１】
［遊離の核酸のトリガーとしての使用］
トリガー核酸は、上述の通り、高い配列特異性を求められ、そのような配列を準備して添加する。しかし、準備した核酸を添加するのではなく、その配列の遊離の核酸が存在していることを検出して、それをトリガーとして、リポソーム内部への輸送を開始することもできる。このように、遊離の核酸をトリガーとして使用する態様も、本発明の範囲内にある。
【００５２】
［薬剤内包リポソーム製造用キット］
本発明は、上述のように、核酸凝集体を内包したリポソームの製造方法にもあり、薬剤を内包したリポソームの製造方法にもある。そして、これらを実現するキットにもあり、すなわち、例えば上記した光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２を有するキットにもあり、光架橋性修飾核酸１と光架橋性修飾核酸２とトリガー核酸を有するキットにもある。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
【００５４】
［リポソームの作成］
実験で用いたリポソームは静置水和法により作成した。試験管内に２０μＬの２ｍＭ  ＤＯＰＣ（クロロホルム溶液）と１２μＬの１０ｍＭグルコース（メタノール溶液）、２ｍＭコレステロール（メタノール溶液）を加え、窒素を吹きかけ乾燥させた。その後、真空ポンプを用いて一晩乾燥させた。翌日２００μＬの水を加え、３７℃で２時間以上水和させ、リポソームを作成した。
【００５５】
［実験で使用したＤＮＡ鎖］
実験で使用したＤＮＡ鎖はリポソーム表面を修飾するため、５’末端にコレステロール（Ｃｈ）を付与した。また、共焦点顕微鏡で観察するために３’末端に蛍光色素であるＣｙ３を付与したＤＮＡ鎖を合成した。
【００５６】
［光機能化リポソームの作成］
リポソーム水溶液１０μＬに対してＤＮＡを終濃度１μＭになるように加え、室温で３０分以上静置した。その後、リポソームの観察を行い、リポソーム表面にＤＮＡ由来のＣｙ３蛍光を確認した。光照射は温度を制御した条件下で３６６ｎｍの光を２時間照射した。
【００５７】
［実験例１］
実験で用いた配列を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2019026570.tif 000006
【００５９】
核酸配列中のcnvＫの位置には、天然のヌクレオシドに代えて、cnvＫで示される光架橋性人工ヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）が導入されている。このcnvＫで示される人工ヌクレオシドの構造を次式に示す：
2019026570.tif 000007
【００６０】
Ｃｈで示される位置には、コレステロールが付与されている。コレステロール（ＤＮＡ合成用の５’−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ＴＥＧ−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の構造を次式に示す：
2019026570.tif 000008
【００６１】
ＤＮＡ鎖中でのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの構造を次式に示す：
2019026570.tif 000009
【００６２】
［リポソーム内部へのＤＮＡの取り込み］
上記のＤＮＡをリポソームに添加した後、４℃で２時間光照射を行い、共焦点顕微鏡により観察した。
【００６３】
光照射前には、リポソーム内部に蛍光は確認できないが、光照射後にはリポソーム内部にＤＮＡ由来のＣｙ３蛍光が確認できた。光刺激によりリポソーム表面にＤＮＡが凝集し、負電荷が集まったため、リポソーム表面の一部がリポソーム内部に取り込まれて、小さなリポソームができたと考えられる。このように、リポソーム表面のＤＮＡを内部に取り込むことに成功した。
【００６４】
この光照射によるリポソーム内部へのＤＮＡの取り込みの流れを示す説明図を図１ａ、図１ｂに示す。光照射前と光照射後の顕微鏡写真を図１ｃに示す。図１ｃにおいて、視野中のリポソームは直径約３μｍである。
【００６５】
共焦点顕微鏡での観察は、次のような手順で行った。スライドガラス上にプラスチック製の薄いシートを貼り付けた。プラスチック製のシートの中央部には穴があいており、そこにリポソーム溶液をキャストし、上からもカバーガラスで挟み込み固定した。これを共焦点顕微鏡で測定した。視野は最初２００μｍ×２００μｍ四方で測定し、リポソームを探し、その後、リポソームを測定するために拡大した。
【００６６】
［ＤＮＡ取り込みの温度依存性］
このリポソーム内部への取り込みがＤＮＡナノ構造体の構築により誘起されているかどうかを確認するため、光照射時の温度を変化させた際の変化を共焦点顕微鏡により観察した。光照射時の温度を４℃、２５℃、３７℃と変化させた。この結果を図２にまとめて示す。
【００６７】
この結果、光照射時の温度が低いほど、リポソーム内部への取り込みが起こりやすいことが明らかとなった。
【００６８】
［ＤＮＡ取り込みの鎖長依存性］
次に鎖長の異なるオリゴＤＮＡを用いた場合の検証を行った。実験で使用した配列を次の表２に示す。
【００６９】
【表２】
2019026570.tif 000010
【００７０】
これらは、それぞれ二本鎖を形成する鎖長が異なる。これらを用い、４℃で２時間光照射を行った。この結果を図３にまとめて示す。
【００７１】
この結果、ＤＮＡ鎖長が長いほど、リポソーム内部への取り込みが起こりやすいことが明らかとなった。光照射温度が低ければ低いほど、ＤＮＡ鎖が長ければ長いほど、ＤＮＡナノ構造体を構築しやすく、その結果、リポソーム内部への取り込みが起こりやすいと考えられる。
【００７２】
［実験例２］
上記の実験例１では、リポソーム内部へのＤＮＡの取り込みが明らかになった。この取り込みの現象を利用して、ＤＮＡをリポソーム内部へ輸送する系をさらに洗練して構築するための実験を行った。そのシステムとして、ＨＣＲと呼ばれる増幅系を用い、シグナルＤＮＡをトリガーとしてリポソーム表面にＤＮＡナノ構造体を構築した。ヘアピン型のＤＮＡを用い、リポソームを光機能化した後、トリガーＤＮＡの添加と光照射をトリガーとしてＤＮＡナノ構造が構築された。このシステムの説明のために、リポソーム表面でのＨＣＲ反応のイメージの説明図を示す。図４ａはＨＣＲの原理の説明図である。図４ｂは、トリガーＤＮＡに依存して光重合が生じて、ＤＮＡナノ構造体が構築されたことを示す電気泳動ゲルの写真である。図４ｃは、ＤＮＡをトリガーとしてリポソームの構造変化が誘起される様子を示す説明図である。実験に使用した配列を表３に示す。
【００７３】
図４ａには大きな右向きの矢印が３個記載されていて、左端から矢印１、矢印２、矢印３とする。矢印１の左側には、２種類のビーコンプローブＡ及びＢがある。ビーコンプローブはいずれもヘアピン構造を備えており、配列の向きを矢印で示している。プローブの矢印はＤＮＡの向き（５’→３’）を表す。プローブＡの配列のうち、矢印の根元からヘアピンの二重鎖部分を経て、ヘアピンのループ部分の終わりまでを青色配列（ＢＬ配列）と称し、それに続く二重鎖部分とそこから矢印の先端までの一重鎖部分の配列をオレンジ配列（ＯＲ配列）と称する。プローブＢの配列のうち、矢印の根元の一重鎖部分とヘアピンの二重鎖部分の配列が青色配列であり、それに続くヘアピンのループ部分とそこから矢印の先端までの相補部分の配列が、オレンジ配列である。青色配列とオレンジ配列は、それぞれが相補鎖を形成するように設計されている。すなわち、青色配列と青色配列で二重鎖を形成し、オレンジ配列とオレンジ配列で二重鎖を形成する。トリガーＤＮＡはその全体がオレンジ配列である。このプローブＡとＢに、トリガーＤＮＡ（矢印１の上側）を投入すると、プローブＡの矢印の先端のオレンジ配列の一重鎖部分に対して、オレンジ配列であるトリガーＤＮＡが相補鎖を形成する（矢印１の下側）。相補鎖の形成が進むことによってプローブＡのヘアピン構造の二重鎖部分が開裂して、プローブＡの矢印先端側のオレンジ配列とトリガーＤＮＡのオレンジ配列が二重鎖を形成し、プローブＡの矢印根元側の青色配列が一重鎖となった状態の構造が生じる（矢印１の左側）。このようにトリガーＤＮＡとの二重鎖を形成して開裂した状態の構造のプローブＡに、ヘアピン構造のプローブＢが加わると（矢印２の上側）、開裂したプローブＡの一重鎖となった青色配列に対して、ヘアピン構造のプローブＢの一重鎖部分である青色配列が、相補鎖を形成する（矢印２の下側）。相補鎖の形成が進むことによってプローブＢのヘアピン構造の二重鎖部分が開裂して、上記のプローブＡの矢印根元側の青色配列とプローブＢの矢印根元側の青色配列が二重鎖を形成して、プローブＢの矢印先端側のオレンジ配列が一重鎖となった状態の構造が生じる（矢印２の左側）。このようにプローブＡとの二重鎖を形成して開裂した状態のプローブＢに、ヘアピン構造のプローブＢが加わると（矢印３の上側）、開裂したプローブＢの一重鎖となったオレンジ配列に対して、ヘアピン構造のプローブＡの一重鎖部分であるオレンジ配列が、相補鎖を形成する。このように、プローブＡとプローブＢとが、交互に開裂して、結果として二重鎖構造が伸長してゆく（矢印３の左側）。
【００７４】
この二重鎖構造の伸長は、相補鎖の形成によるものであるが、プローブに光架橋性ヌクレオシドアナログを導入しておくことにより、光架橋を形成させると、相補鎖の形成は不可逆的なものにすることができるから、効率的な二重鎖構造の伸長が可能になる。
【００７５】
【表３】
2019026570.tif 000011
【００７６】
表３に示すビーコン１において、５’末端にはＣｈ（コレステロール）が付加されており、Ｃｈが付加されているＴから・・・cnvＫＣＴまでが上述の青色配列に対応しており、この次のＡから３’末端のＡまでが上述のオレンジ配列に対応する。ビーコン１の３’末端にはＣｙ３が付加されている。ビーコン２において、５’末端にはＣｈ（コレステロール）が付加されており、Ｃｈが付加されているＡから・・・ＣＣＡＧＡまでが上述の青色配列に対応しており、この次のＴから３’末端のＴまでが上述のオレンジ配列に対応する。ビーコン２の３’末端にはＣｙ３が付加されている。ＯＤＮ１はその全体が上述のオレンジ配列になっている。
【００７７】
図４ｄに、表３に示すＯＤＮ１とビーコンプローブ１、２から形成される二重鎖の様子の説明図を示す。図４ｄにおいて、cnvＫは相補鎖の対応する塩基とそれぞれ光架橋している。ＣｈとＣｙ３は、それぞれ相補鎖の外にあって、ビーコンプローブとの結合を維持している。図４ｅにこの二重鎖が形成される流れの説明図を示す。
【００７８】
実験例１と同様に作成したリポソームにＢｅａｃｏｎ１とＢｅａｃｏｎ２を終濃度１μＭになるように添加した。その後トリガーとなるＯＤＮ１を終濃度１０ｍＭになるように添加し、光照射を４℃で５時間行った。
【００７９】
光機能化リポソームを作成後、外部からＤＮＡを導入し、リポソーム内部へのＤＮＡ輸送を確認したところ、ＯＤＮ１のトリガーとして正しい配列を用いた場合にのみ、リポソーム内部へＤＮＡが輸送されていることが明らかとなった。
【００８０】
外部ＤＮＡによるリポソーム内部へのＤＮＡ輸送の説明図を、図５ａに示す。図５ｂは、このようなＤＮＡ輸送が、マッチするＯＤＮ１を用いた場合の光照射では起こり、マッチしないＯＤＮ２を用いた場合の光照射では起こらないことを示す顕微鏡写真である。
【００８１】
このように、トリガーＤＮＡに様々な修飾を施すことにより、リポソーム内部への輸送が可能となり、リポソームを用いたドラックデリバリーにおける薬剤内包技術として利用可能であることがわかった。
【００８２】
［実験例３］
光架橋素子（光架橋性ヌクレオシドアナログ）として上記の実験で使用したCNVＫの他に、CNVＤ、ｐｓｏｒａｌｅｎを用いた場合を比較した。CNVＤで表される光架橋性ヌクレオシドアナログの構造を次に示す：
2019026570.tif 000012
【００８３】
［リポソームの作成］
実験で用いたリポソームは静置水和法により作成した。試験管内に２０μＬの２ｍＭＤＯＰＣ（クロロホルム溶液）と１２μＬの１０ｍＭグルコース（メタノール溶液）、２ｍＭコレステロール（メタノール溶液）を加え、窒素を吹きかけ乾燥させた。その後、真空ポンプを用いて一晩乾燥させた。翌日２００μＬの水を加え、３７℃で２時間以上水和させ、リポソームを作成した。
【００８４】
［実験で使用したＤＮＡ鎖］
実験で使用したＤＮＡ鎖はリポソーム表面を修飾するため、５’末端にコレステロールを付与した。また、共焦点顕微鏡で観察するために３’末端に蛍光色素であるＣｙ３を付与したＤＮＡ鎖を合成した。実験で使用した配列を次の表４にまとめて示す。
【００８５】
【表４】
2019026570.tif 000013
Ch :  コレステロール, Cy3 : 蛍光色素
X = CNVK、CNVD、psoralen
【００８６】
上記のＤＮＡをリポソームに添加した後、４℃で光照射を行い、共焦点顕微鏡により観察した。また、変性ＰＡＧＥにより重合度の変化を確認した。この実験の結果を図６にまとめて示す。
【００８７】
共焦点顕微鏡による観察の結果、CNVＫ、CNVＤを含むオリゴＤＮＡを用いた場合には光照射によるリポソームの構造変化が確認できた。一方、ｐｓｏｒａｌｅｎを用いた場合にはリポソームの構造変化は確認できなかった。また、変性ＰＡＧＥの結果からも、ｐｓｏｒａｌｅｎはCNVＫ、CNVＤと比較して重合度が少ないことから、光架橋の速度が非常に重要であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によれば、リポソーム内へ薬剤を導入して薬剤内包リポソームを製造することができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１ａ】
2019026570.tif 000015
【図１ｂ】
2019026570.tif 000016
【図１ｃ】
2019026570.tif 000017
【図２】
2019026570.tif 000018
【図３】
2019026570.tif 000019
【図４ａ】
2019026570.tif 000020
【図４ｂ】
2019026570.tif 000021
【図４ｃ】
2019026570.tif 000022
【図４ｄ】
2019026570.tif 000023
【図４ｅ】
2019026570.tif 000024
【図５ａ】
2019026570.tif 000025
【図５ｂ】
2019026570.tif 000026
【図６】
2019026570.tif 000027